Diagnostik infektiöser Durchfallerkrankungen bei

Saug- und Absetzferkeln in der Steiermark

Gemeinschaftsprojekt des TGD Steiermark und der AGES (IVET Graz, IVET Mödling, IMED Wien)

TGD Themenabend Retzhof, 19.6.2013

Projektziele

• Hilfestellung für TGD-Betriebe und TGD-TÄ bei der Diagnostik und der Bekämpfung von infektiösen Durchfällen bei Saug- und Absetzferkeln bis zu einem Alter von 9 Wochen.

• Durch Pathohistologie kombiniert mit dem Erregernachweis soll sich ein klareres Bild der Ursache der Durchfälle ergeben.

• Mittels Elektronenmikroskopie können viele für Durchfallerkrankungen entscheidende virale Enteritiserreger detektiert werden (Rota-, Corona-, Circo-, Calici-, Adeno-, Entero-, Parvo-, Toroviren).

• Untersuchung der verschiedenen Darmabschnitte erkrankter Ferkel verglichen mit Untersuchung des Enddarmkotes soll über den Grad der Effizienz der Virusdiagnostik bei lebenden Ferkel anhand von ausgeschiedenem Kot Auskunft geben.

• Auf Basis eines detaillierten Vorberichtes soll auch die Rolle von E. coli, Clostridium perfringens Typ A und C, Clostridium difficile, Rotaviren und Isospora suis abgeklärt werden.

• Festlegung eines definiertes diagnostisches Vorgehens (Diagnostikprotokoll) bei Durchfallerkrankungen auf Basis der Ergebnisse dieser Studie, damit in Zukunft diese betrieblichen Probleme von den Betreuungstierärzten gezielt behandelt werden können

• Die isolierten Bakterienstämme werden einer Resistenztestung unterzogen, um Hinweise für die Behandlung und über die Resistenzlage zu erhalten.

Probenaufkommen • Probenziehung aus 20 ausgewählten TGD-Betrieben • Auswahl erfolgt durch TGD-Tierärzte • Probennahme (Tupfer- und Kotproben, Auswahl lebender

Ferkel) durch TGD-TA • Lebende Ferkel werden am IVET Graz euthanasiert und

anschließend die Proben entnommen. • Es werden nur so viele Proben entnommen bzw.

Untersuchungen durchgeführt als für einen aussagekräftigen Befund nötig sind.

• Die Tiere dürfen nicht vorbehandelt sein. • Es werden nur lebende Ferkel oder Läuferschweine für

die Untersuchung herangezogen. • 3 Ferkel/Betrieb mit Symptomen unterschiedlicher

Ausprägung • 6 Kottupfer/Kotproben von erkrankten Tieren für bakt. u.

parasit. Untersuchung

Probenarten

Proben euthanasierter Tiere

Formalinfixierung (10% gepuffert) bzw. nativ:

• 2 x 3 cm Colon

• 6 x 3 cm Dünndarm

• Lunge bei Bedarf

• Gehirn bei Bedarf Nativ für EM

• 1 x 3 Magen mit Inhalt

• 2 x 3 cm Dünndarm (Jejunum) mit Inhalt

• 2 x 3 cm Dickdarm mit Inhalt

• 1 x 3 cm Enddarm mit Inhalt Bakteriologische Untersuchung

• 2/3 vom Colon

• 2 x 20 cm Jejunum

• 1 x 20 cm Ileum

• Gehirn bei Bedarf

• Lunge bei Bedarf

Pathohistologische Untersuchung

Bakteriologische Untersuchung

Histologie, Bakteriologie, IHC

Histologie, Bakteriologie, PCR

Elektronenmikroskopische Untersuchung

Rektaltupfer oder Kotproben weiterer erkrankter Tiere: Bakteriologische Untersuchung

Probenbearbeitung Magen: 2x2 cm Histo 1: DUDA

3x3 cm ELMI/TP1 nativ

3x3 cm ELMI/TP1 Karnovsky

Duodenum: 1x3 cm Histo 1: DUDA

Jejunum: 2x3 cm; Anfang 2. und 3.Drittel Histo 1: DUDA

1x3 cm; 3. Drittel vor Histoprobe ELMI/TP2 nativ

1x3 cm; 3. Drittel nach Histoprobe ELMI/TP2 Karnovsky

Ileum: 1x3 cm ELMI/TP3 nativ

1x3 cm ELMI/TP3 Karnovsky

Ileum-Zäkum (Übergang): 4 cm; Histo 2: DIDA

Zäkum halb aufschneiden

Colon: 2x4 cm; 2. und 3. Drittel Histo 2: DIDA

1x3 cm; 2. Drittel vor Histoprobe ELMI/TP4 nativ

1x3 cm; 2. Drittel nach Histoprobe ELMI/TP4 Karnovsky

1x3 cm; 3. Drittel vor Histoprobe ELMI/TP5 nativ

1x3 cm; 3. Drittel nach Histoprobe ELMI/TP5 Karnovsky

5 cm PCR/einfrieren

Rectum: 1x3 cm; nahe Anus ELMI/TP6 nativ

1x3 cm; angrenzend ELMI/TP6 Karnovsky

Daten

• 19 Betriebe, je Betrieb 1-3 Tiere, bis zu 6 Tupfer • 23.4.2012 bis 6.3.2013 • Vorbericht BTA, BT-Protokoll, Sauenplaner • Pathohistologische Untersuchung • ELMI • Kultur auf E.coli, Clostridium perfringens und Cl

difficile • Typisierung von Cl perfringens, Cl difficile • Gramfärbung auf Brachyspira • Flotation für Parasitennachweis

Methodik, Vorgangsweise

Bakteriologie: • Kultur aerob (E.coli) und anaerob (Clostridium perfringens) • Dünndarm • Dickdarm • Selektivagar

• Kultur inklusive Anreicherung (Clostridium difficile) • Dickdarm • Selektivagar • Gram - Färbung (Brachyspira sp)

• Typisierung (Clostridium difficile, perfringens) • Ribotypisierung • Bestimmung des Toxintypes

Methodik, Vorgangsweise

Histologie: • Schnitte durch alle GI-Lokalisationen • Magen • Dünndarm (kraniale, mittlere und kaudale Abschitte) • Ileozäkaler Übergang • Dickdarm

• HE-Färbung • selektive PAS- und Versilberungsfärbungen, Polarisation

• Beurteilung • Magen • Dünndarm • Dickdarm

Methodik, Vorgangsweise

Elekronenmikroskopie: • Negative Staining

Virusdiagnostik mittels Elektronenmikroskopie - Sensitivität ELISA Elektronenmikroskopie (EM)

Negative Staining

PCR

Konz.: 5-10ng/ml

bis zu Verdünnung:

< 1: 1 000

Virusart !

Dauer 1d

Konz.: 5-10ng/ml

bis zu Verdünnung:

< 1:100 000 (UZ)

Virusfam. /Virusart mittels

Seren

Dauer ½-1d

Konz.: 5-10ng/ml

bis zu Verdünnung:

< 1: 500 000

Virusart !

Dauer: 1d

1:1000 1:500 000

EM

Vorteile:

• „Offener Blick („Open View)“ • Mehrfachinfektionen in einem Test (Schweinediarrhoe: 8 verschied. Viren möglich)

Nachteile: geschultes Personal, Gerätekosten

Kosten: 30€ /Probe

Ausg

angsm

ate

rial

Grundlagen der Diagnostik

Einfachinfektionen

Mehrfachinfektionen

„Symptom bestimmte“ Testsysteme = Tsy. basierend auf ein ziel-gerichtetes Agens (PCR, ELISA)

Ja/Nein Ergebnis „Offene Sicht“ Testsysteme = Tsy. ohne Agens (Pathohistologie, bak-

terielle Kultur, Elektronenmikroskopie, ... Qualitatives Ja/Nein Ergebnis / Betriebsstruktur

Wahl des

Testsystem

Resultat

Primärinfektion Sekundärinfektion Erreger

„Blindstudie“

4 Cluster (A,B,C,D) inkl. Graduierung (1=ggr. 2=mgr. 3=hgr.)

• A = lymphoplasmozytäre Infiltration der Propria, Ödemisierung in der Submukosa/Subserosa Läsionen ohne besondere Spezifität (Viren, Bakterien, sekretorische Diarrhoe durch (bakterielle) Toxine...)

• B = neutrophile Granulozyten und Detritus im Bereich der lymphoglandulären Komplexe, neutrophile Infitrate in der Propria Läsionen durch Bakterien bzw. –toxine

• C = Zottenverkürzungen und –fusionen virale Läsionen

• D = Nekrosen im Bereich der Zotten(spitzen), Ulzerationen bakterielle Läsionen

Mischformen auch möglich, z.B. A1B2

Beurteilungsschema Histologie

Ergebnisse

A

B

C

D

C

A

B

D

Unspezifisch Bakterien Viren Nekrosen - Bakt

• Saugferkel 0-4 Wo.

• Aufzuchtferkel I 4-8 Wo.

• Aufzuchtferkel II 8-12 Wo.

Altersschema

Ergebnisse

C D

B

C

A

B

C

A

B

D

Saugferkel Aufzucht I

Aufzucht II

Saugferkel 0-4 W Aufzucht I 4-8 W Aufzucht II 8-12 W

• Viren Corona (19) Rota (18) Circo (11) Calici-like (5)

• Bakterien Clostridium perfr. A (40) Cl. difficile (9) haem. E.coli (26)

Brachyspira sp. (17) E.coli (44) sonstige (11)

• Parasiten Kokzidien (5) Trichuris suis (1)

Erregerspektrum

Auswertung Projekt Ferkeldiarrhoe

Virusbefall n %

Coronav. geringer Befall 12 20 33,3%

Coronav. mittlerer Befall 8

Rotav. geringer Bef. 7

18 30,0% Rotav. mittlerer Bef. 5

Rotav. starker Bef. 6

Circov. geringer Bef. 10

17 28,3% Circov. mittlerer Bef. 6

Circov. starker Bef. 1

Caliciv. geringer Bef. 2

5 8,4% Caliciv. mittlerer Bef. 1

Caliciv. starker Bef. 2

55 Tiere von 19 Betrieben

pro Tier 6 Proben:

a) Magen,

b) vorderer Dünndarm,

c) hinterer Dünndarm,

d) vorderer Dickdarm,

e) hinterer Dickdarm,

f) Rectum

Virusbefall/Betriebe n %

Negative 13 23,6%

Positive 42 76,4%

Einfachinfektion 26 47,3%

Mehrfachinfektionen 16 29,1% 2-fach 14 25,5%

3-fach 2 3,6%

Rotavirus: Serogruppe A-, B-, C-, E-type nur A-type genau beschrieben z.B. Typ C: Epidemien in Saugferkel, bei frisch entwöhnte Ferkel und ältere Schweine; Anstieg von Typ E zu erwarten ? wie TGE aber schwächerer Verlauf, Kot wässrig-pastös, geringe Mortalität

Coronavirus: PRCV, HEV, TGEV, PEDV PRCV: als Primärerreger wenig bedeutsam; PRCV/TGEV HEV: 4-14 Tage, Auftreiben der Magengegend, Erbrechen + Kümmern,

ne. Encephalitis, Diarrhoe +/-

TGEV: jede Altersgruppe, bes. Saugferkel bis 10 Tage graugelber übelriechender Kot, hohe Mortlität, Düdarm-Zottenatrophie

PEDV: hochansteckend, jede Altersgr., bes. Mast betroffen, 20-30% (80%) Mortal. wässrig, grünlich-gelber Durchfall, Erbrechen, Düdarm-Zottenatrophie,

Caliciförmige Viren: Sapovirus-Gruppe, Norovirus-Gruppe Norovorus-Gruppe: erwachsenen Schweine ohne klinische Symptome Sapovirus-Gruppe: jede Altersgruppe (21% Saugferkel, 85% frisch entwöhnte Ferkel;

18% 0-9Wo, ), Diarrhoe, z.B. Coinfektion mit Rotav. Hepeviren (Hepatitis E-Viren): Schweine im Alter 1-3 Monate: 8-16% Befall (Reisp-IVET

MOE Projekt)

Circovirus: PCV1 (4-8%), Rest PCV2 bis zu 95% Durchseuchung in D (Tischler et al. 1987): keine klin. Symptome; placentale Transmission, Nasenkontakt, fecal-orale Route PCV2 in Zusammenhang mit PMWS (Postweaning multisystemic wasting syndrome): Diarrhoe

Ø 50-80nm

Ø 80-120nm

Ø 30-40nm

Ø 20-30nm

Auswertung Projekt Ferkeldiarrhoe

2. vor. Dünndarm

1. Magen

3. hint. Dünndarm 5. hint.

Dickdarm

4. vor. Dickdarm

6. Rectum/Kot

Coronav. 1x

Coronav.+ Rotav.+ Circov.+

Coronav.++ Rotav.+++ Circov.+

Coronav.+(+) Rotav.+++ Circov.+ Coronav.+

Rotav.++ Circov.+

1. 2. 3.

Probenahme

totes Tier lebendes Tier

Kot

Bakteriologie

• Clostridium perfringens Typ A (CptA): Durchfall cremig, pastös, oder gelb und schaumig. Morbidität ist hoch, Mortalität niedrig.

• Cl. Difficile (Cd) ist von Infektionen mit CptA und E.coli nicht immer unterscheidbar. RT: AI-12, 005, 078, 241, 598

• E. coli: Durchfall klar-wässrig, weiß-gelb, ev. Erbrechen, ev hohe Mortalität bei schlechten Bedingungen

Clostridium difficile beim Menschen

• Im Darm von Mensch, Tier. In Umwelt

• Nosokomialer Erreger: im Krankenhaus erworben

• Hypervirulenter Stamm: RT 027

• Schaden in EU-KH: 3 Mia €

• Durchfall nach Antibiotikagabe

• AAD: antibiotika-assoziierter Durchfall

• AAC: antibiotika-assoziierte Colitis,

• Toxin-A, Toxin-B.

• In Ö seit 2002 3x

Referenzzentrale 2012

• Anzahl der typisierten Isolate

Übersicht

Be/A Klinik E.Coli Clost Coc Brach Rota Coro Circ Cali Histo

1 / 1 w N A - - - + + - A1, D2

2 / 1 ö H , N A,diff - - - + - + A1, A0

3 / 34 w s H, N - - + + - + + B1,B2,C2

4 / 5 w s H, N A - + + + - - A2,CD2,AD1

5 / 50 w s b N A - + + + - - CB2,CB3,A1

6 / 50 w H, N - - + + + + - CB3,C3,

7 / 21 N A + - - - + + CB1,CB2,D2

8 / 7 w H, N A - - - - - - A2, A1

9 / 25 s p H, N A - - + + - - A2,CB2,C3

10/ 3 w s N A - - + + A1,D2,D3

11/ 2 w H, N A,diff - - - - + + A2,AD2,

Übersicht

Be/A Klinik E.Coli Clost Cocc Brach Rota Coro Circ Cali Histo

12/ 1 w N A,diff - - - - + - A2,AC1,CD2

13 80 w s N A +, Tr + - + + - A3,CB1,CB2

14 20 w c N A + + + - + - CB2,A2

15 18 w s N A - - - + - - AC2,CB1,2

16 /3 N A,diff - - - - - - A1

17 40 ö H - - + - + - - CB2,B2

18 11 w H, N A,diff - - - - + - B2,B3

19 /3 w s N A - + - - A1

Cl difficille 1 Düda 1 Dida 2 Düda 2 Dida 3 Düda 3 Dida 4 Tupfer 5 Tupfer 6 Tupfer 7 Tupfer 8 Tupfer 9 Tupfer

Betrieb 2 neg neg neg pos

Ribotyp AI-12

Betrieb 11 neg neg pos neg pos neg pos neg neg neg neg neg

Ribotyp RT005 AI-12 RT005

Betrieb 12 pos pos neg neg pos neg neg neg neg pos pos neg

Ribotyp R078 AI-12 R078 R078 R078

Betrieb 16 neg neg neg pos neg pos neg pos neg pos neg pos

Ribotyp AI-12 598 241 AI-12 AI-12

Betrieb 18 neg pos neg pos neg pos pos pos pos pos

Ribotyp 598 598 598 598 598 598 598

Düda: Dünndarm, Dida: Dickdarm

Detailergebnisse Clostridium difficile

Detailergebnisse Brachyspira spp. Betrieb Ferkel 1 Ferkel 2 Ferkel 3

3 pos. pos. pos.

4 pos. pos.

5 B.i.i. B. i.i. pos.

6 pos. pos. pos.

13 B.i.i. pos. pos.

14 pos. pos.

17 pos. pos. pos.

Pos: Mikroskopie spricht für Brachyspira spp. PCR neg. B.i.i.: PCR pos auf Br. Intermedia/Innocens

Antibiogramme E.coli nicht hämolysierend 2009 2010 2011 2012 Projekt

N=13 N=8 N=12 N=14 N=15

Antibiotika I R S I R S I R S I R S I R S

Amoxicillin 3 8 2 1 6 1 3 9 5 8 1 11 4

Ampicillin 2 9 2 2 6 4 8 5 8 1 9 4 2

Apramycin 13 5 1 1 10 4 9 2 11

Cefquinom 2 11 1 7 2 10 4 10 15

Ceftiofur 1 3 9 2 2 4 1 2 9 2 4 8 1 14

Colistin 3 6 4 3 3 3 4 5 3 1 9 3 1 10

Doxycyclin 11 2 1 7 12 4 9 5 9 1

Enrofloxacin 1 1 11 1 7 6 6 3 3 8 1 14

Lincom/Spectinom 5 8 2 2 4 3 7 2 2 8 3 4 7 4

Marbofloxacin 1 12 8 6 6 3 11 15

Neomycin 2 7 4 4 3 1 1 6 5 1 12 2 13

Tetracyclin 1 10 2 7 12 4 9 1 3 9 3

Tiamulin 13 7 11 1 1 11 1 1 12 1

Trimethoprim 7 6 5 2 7 5 5 9 2 13

Tulathromycin 13 1 6 4 6 2 1 11 1 2 13

Antibiogramme E.coli hämolysierend 2009 2010 2011 2012 Projekt

N=19 N=20 N=10 N=17 N=22

Antibiotika I R S I R S I R S I R S I R S

Amoxicillin 2 12 5 6 12 2 4 4 2 5 9 3 14 7 1

Ampicillin 5 12 2 6 14 4 4 2 6 10 1 12 9 1

Apramycin 2 17 20 2 8 2 14 3 19

Cefquinom 1 18 1 19 10 2 15 22

Ceftiofur 2 2 15 1 19 10 1 2 14 1 21

Colistin 6 4 9 9 4 6 1 3 6 1 3 12 7 5 10

Doxycyclin 1 12 6 6 13 1 3 5 2 5 11 1 8 12 2

Enrofloxacin 2 2 14 1 19 1 9 3 2 12 2 1 19

Lincom/Spectinom 4 6 9 3 5 12 1 9 5 4 8 5 17

Marbofloxacin 1 18 20 10 1 16 1 21

Neomycin 3 9 7 6 9 5 2 1 7 2 14 1 5 14 3

Tetracyclin 1 13 5 1 17 2 6 4 2 12 3 3 12 7

Tiamulin 1 18 3 13 4 2 5 3 1 16 22

Trimethoprim 8 11 6 14 3 7 4 13 2 6 14

Tulathromycin 2 17 1 1 18 2 3 5 2 15 2 19 1

Zentrum für lebensmittelassoziierte Infektionskrankheiten,

Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Graz,

Beethovenstrasse 6

• Abteilung Veterinärmikrobiologie

• Puchstrasse 11, 8020 Graz

• Telefon 050555 62110, Fax 05055562119