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Die Bedeutung Adenosin-abhängiger Signalkaskaden in präklinischen Modellen der systemischen Sklerose Medizinische Klinik III Klinik für Rheumatologie und Immunologie Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent. vorgelegt von Florian Philip Layritz aus Erlangen

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Die Bedeutung Adenosin-abhängiger Signalkaskaden

in präklinischen Modellen

der systemischen Sklerose

Medizinische Klinik III

Klinik für Rheumatologie und Immunologie

Der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

Dr. med. dent.

vorgelegt von

Florian Philip Layritz

aus

Erlangen

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-$ürnberg

Tag der mündlichen Prüfung:

04.04. 2016

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. med. Jörg Distler

Gutachter: Prof. Dr. med. univ. Georg Schett

Für meine Eltern

Gliederung

1. Zusammenfassung .................................................................................................. 1

2. Summary ................................................................................................................. 3

3. Einleitung ................................................................................................................ 5

3.1 Überblick über die Systemische Sklerose ........................................................... 5

3.1.1 Klinische Manifestation und Epidemiologie ............................................... 5

3.1.2 Pathogenese der systemischen Sklerose ...................................................... 6

3.2 Mausmodelle zur Erforschung der Systemischen Sklerose ................................ 8

3.2.1 Mausmodell der sklerodermiformen chronischen Graft-versus-Host Erkrankung . 8

3.2.2 Fra-2-Mausmodell ....................................................................................... 9

3.3 Das Adenosin-Rezeptor-System ........................................................................ 11

3.3.1 Die Adenosinrezeptoren: Aufbau und Funktion ........................................ 11

3.3.2 Der Adenosin-Metabolismus ..................................................................... 12

3.3.3 Störungen des Adenosin-Rezeptor-Systems in der Fibrose ....................... 13

4. Fragestellung ........................................................................................................ 15

5. Material und Methoden ....................................................................................... 16

5.1 cGvHD-Mausmodell ......................................................................................... 16

5.1.1 Hintergrundinformationen zum cGvHD-Mausmodell............................... 16

5.1.2 Klinische Verlaufskontrolle ....................................................................... 17

5.1.3 Analyse der Hautveränderung ................................................................... 18

5.1 3.1 Histologische Analyse ............................................................................. 18

1.) Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................... 18

2.) Masson-Trichrom-Färbung ........................................................................ 18

5.1.3.2 Immunhistochemische Analyse der Myofibroblasten ................................. 19

5.1.3.3 Hydroxyprolin-Assay .............................................................................. 19

5.2 Fra-2-Mausmodell ............................................................................................ 21

5.2.1 Hintergrundinformationen zum Fra-2-Mausmodell .................................. 21

5.2.2 Analyse der Hautveränderung ................................................................... 21

5.2.2.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung .............................................. 22

5.2.2.2 Immunhistochemische Analyse der Myofibroblasten ................................. 22

5.2.2.3 Hydroxyprolin-Assay ............................................................................. 22

5.2.3 Analyse der Lungenveränderung ............................................................... 23

5.2.3.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung .............................................. 23

5.2.3.2 Immunhistochemische Analyse der Myofibroblasten ................................. 23

5.2.3.3 Hydroxyprolin-Assay ............................................................................. 23

5.2.4 Analyse der Lungenarterien mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung ............ 23

5.2.4.1 Analyse der Gefäßwanddicke .................................................................. 24

5.2.4.2 Quantifizierung der stark stenosierten Lungenarterien ............................... 24

5.3 Statistische Auswertung ........................................................................................... 24

6. Ergebnisse ............................................................................................................. 24

6.1 cGvHD-Mausmodell ......................................................................................... 25

6.1.1 Klinischer Verlauf...................................................................................... 25

1. Körpergewicht ............................................................................................... 25

2. Klinische Beurteilung ..................................................................................... 26

6.1.2 Histologische Veränderungen der Haut ..................................................... 27

6.1.2.1 Histologische Analyse ............................................................................. 27

1.) Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................... 27

2.) Masson-Trichrom-Färbung ........................................................................ 28

6.1.2.2 α-SMA Immunhistologie ......................................................................... 30

6.1.2.2 Hydroxyprolin-Assay .............................................................................. 31

6.2 Fra-2-Mausmodell ............................................................................................ 33

6.2.1 Histologische Veränderungen der Haut ..................................................... 33

6.2.1.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung .............................................. 33

6.2.1.2 α-SMA Immunhistologie ......................................................................... 35

6.2.1.3 Hydroxyprolin-Assay .............................................................................. 36

6.2.2 Histologische Veränderungen der Lunge .................................................. 38

6.2.2.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung .............................................. 38

6.2.2.2 α-SMA Immunhistologie ......................................................................... 40

6.2.2.3 Hydroxyprolin-Assay .............................................................................. 41

6.2.3 Ergebnisse zur Umgestaltung der Lungenarterien ..................................... 42

6.2.3.1 Gefäßwanddicke: Hämatoxylin-Eosin-Färbung ......................................... 42

6.2.3.2 Stark stenosierte Lungenarterien: Hämatoxylin-Eosin-Färbung .................. 43

7. Diskussion ............................................................................................................. 45

8. Literaturverzeichnis ............................................................................................. 49

9. Abkürzungsverzeichnis........................................................................................ 57

10. Chemikalien/Materialien ................................................................................... 59

11. Danksagung ........................................................................................................ 61

12. Lebenslauf ........................................................................................................... 62

1

1. Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele der Arbeit. Bei der systemischen Sklerose (SSc) handelt es

sich um eine autoimmun-vermittelte seltene Krankheit mit signifikant erhöhter Sterb-

lichkeit. Die Kennzeichen dieser Erkrankung sind u.a. der Verlust von Kapillaren,

die Umformung von Lungenarterien und eine Gewebefibrose aufgrund einer erhöh-

ten Kollagenproduktion pathologisch aktivierter Fibroblasten. Diese vermehrte Pro-

duktion von Kollagen beruht unter anderem auf einer durch Adenosin gesteuerten

Aktivierung des A2A-Rezeptors. Der Gewebespiegel von extrazellulärem Adenosin

wird hauptsächlich durch das Enzym Adenosin-Desaminase (ADA) gesteuert. Tier-

experimentelle Studien zeigten, dass Mäuse mit einem Mangel an ADA einen daraus

resultierenden Anstieg von endogenem Adenosin haben und eine Fibrose in der

Haut, der Lunge und anderen Organen entwickelten, welche durch Gabe eines A2A-

Rezeptor-Antagonisten verhindert werden konnte. Ziel dieser Arbeit war es, anhand

tierexperimenteller Mausmodelle die Wirkung rekombinanter Adenosin-Desaminase

(r-ADA) bei der Entstehung und der Therapie einer SSc zu beurteilen.

Methoden. Die Wirksamkeit r-ADA wurde anhand zweier verschiedener Mausmo-

delle untersucht. Zuerst wurde die Wirksamkeit r-ADA anhand eines Mausmodells

der sklerodermiformen chronischen Graft-versus-Host-Erkrankung (cGvHD) analy-

siert. Mittels allogener Stammzelltransplantation bei sich in minor histocompatibility

Antigenen unterscheidenden Mäusen wurden klinische und histopathologische

Symptome einer cGvHD induziert und die Wirksamkeit einer nach Transplantation

beginnenden Behandlung mit r-ADA hinsichtlich Krankheitsverlauf und Ausprä-

gungsgrad untersucht. Hierzu wurden Hautschnitte zur Bestimmung der Hautdicke

histologisch gefärbt, die Anzahl der Myofibroblasten wurde immunhistologisch un-

tersucht. Ein Hydroxyprolin-Assay diente zur Quantifizierung des Kollagengehaltes.

Der Krankheitsverlauf wurde anhand einer zuvor definierten klinischen Bewertung

zusammen mit dem Körpergewicht täglich ab Stammzelltransplantation erhoben. In

einem zweiten Modell wurde die Wirksamkeit von r-ADA bei Fos-related-antigen-2

(Fra-2) transgenen Mäusen untersucht. Fra-2 ist ein Transkriptionsfaktor der Aktiva-

tor-Protein-1 (AP-1)-Familie, dessen transgene Überexpression zu Haut- und Lun-

genfibrose und Gefäßveränderungen (Lungenarterienstenose sowie Gefäßwandverdi-

ckung) führt, welche charakteristische Symptome einer SSc sind. Die Wirksamkeit

der Therapie mit r-ADA wurde in der Haut und Lunge untersucht. Die analysierten

Punkte der Haut und der Lunge waren denen der cGvHD identisch. Zusätzlich er-

2

folgte eine Beurteilung der Lungenfibrose und der Veränderungen von Lungenarte-

rien mit Hilfe von histologischen Färbungen.

Ergebnisse und Beobachtungen. In beiden Modellen zeigte die Gabe von r-ADA

antifibrotische Effekte. Im Modell der cGvHD linderte diese sowohl den Krankheits-

verlauf als auch den Grad der Krankheitsausprägung. So zeigten mit r-ADA behan-

delte Mäuse eine geringere Hautdicke, eine geringere Anzahl an Myofibroblasten in

der Haut sowie einen niedrigeren Kollagenhalt. Bei den Fra-2 transgenen Mäusen be-

wirkte eine Therapie mit r-ADA eine Besserung der Haut und Lungenfibrose. Durch

Gabe von r-ADA konnte die Anzahl an Myofibroblasten und die Kollagenmenge in

Haut und Lunge gesenkt werden, was die Abnahme fibrotischer Lungenbereiche so-

wie der Hautdicke widerspiegelt. Der Umbau der Lungenarterien mit Verdickung der

Gefäßwand wurde ebenfalls reduziert. So zeigten sich durch die Therapie weniger

stark stenosierte Pulmonalarterien und dünnere Gefäßwände. Nebenwirkungen der

Therapie wurden in beiden Modellen nicht beobachtet.

Praktische Schlussfolgerungen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in beiden Maus-

modellen der SSc die Gabe von r-ADA sowohl vaskuläre als auch fibrotische Verän-

derungen reduzieren kann. Diese Ergebnisse liefern weitere Hinweise auf die zentra-

le Bedeutung Adenosin-abhängiger Signalkaskaden in der SSc und zeigen, dass die

Gabe von r-ADA ein möglicher Behandlungsansatz sein könnte.

3

2. Summary

Objectives. Systemic sclerosis (SSc) is a systemic, autoimmune mediated, orphan

disease with significantly increased mortality. The hallmarks of the disease are vas-

cular changes such as loss of capillaries and remodeling of the pulmonary arteries

and tissue fibrosis due to increased release of collagen from pathological activated

fibroblasts. This increased collagen production is caused e.g. by adenosine triggered

activation of the A2A-Receptor. The tissue level of extracellular adenosine is mainly

controlled by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Mice with deficiency in

ADA have increased levels of endogenous adenosine and develop systemic fibrotic

manifestations. These fibrotic changes were prevented by treatment with an A2A-

receptor antagonist. Aim of this study was, to evaluate the effect of exogenous re-

combinant ADA in murine models of SSc.

Methods. The efficiency of recombinant ADA was examined in two murine models.

The first model was a model of chronic-graft-versus-host-disease (cGvHD) induced

by allogenic bone marrow transplantation with a mismatch in minor histocompatibi-

lity antigens. The effects of treatment with recombinant adenosine deaminase were

analyzed with clinical, histological and biochemical readouts. Skin sections were

stained with Hematoxylin and eosin (HE) to quantify dermal thickening and stained

for α-smooth muscle actin (αSMA) to identify myofibroblasts. The collagen content

in skin was determined by hydroxyproline assays. Clinical changes were assessed

using an established score for cutaneous cGvHD. As a second model, we analyzed

Fos-related-antigen-2 (Fra-2) transgenic mice. Fra-2 is a transcription factor of the

Activator-Protein-1 (AP-1)-family. The transgenic overexpression of Fra-2 results in

fibrosis of the skin and lungs. In addition, Fra-2 transgenic mice develop SSc-like

vascular manifestations with pulmonary-arterial hypertension like changes. Fibrotic

changes were assessed by determination of dermal thickness (skin) and of the Sirius

Red stained area (lungs), by assessment of myofibroblast counts and by quantifica-

tion of the hydroxyproline content. Vascular changes were analyzed by assessment

of the average thickness of the vessel walls of pulmonary arteries and by counting

the number of highly narrowed vessels.

Results. In both models treatment with recombinant adenosine deaminase exerted

anti-fibrotic effects. In the cGvHD model, preventive treatment with recombinant

ADA ameliorated fibrotic manifestations with decreased dermal thickening, reduced

myofibroblast counts and lower hydroxyproline content. Treatment with recombinant

4

ADA also reduced the cutaneous cGvHD score. Treatment with recombinant ADA

also ameliorated dermal and pulmonary fibrosis in Fra-2 transgenic mice. Moreover,

pulmonary arterial remodeling was reduced. The average thickness of the vessel wall

in pulmonary arteries was reduced and less highly narrowed pulmonary arteries were

detected. Adverse events of the treatment were not observed in the two models.

Conclusions. The present study demonstrates that recombinant ADA ameliorates

both vascular and fibrotic changes in two murine models of SSc. These results fur-

ther highlight the role of adenosine signaling in the pathogenesis of systemic sclero-

sis and may provide first evidence that recombinant ADA may be a potential treat-

ment option for SSc.

5

Tab.1: Prozentuale Verteilung der klinischen Merkmale der limitiert kutanen und der diffus kutanen

SSc in vier verschiedenen Ländern [26]

Gabrielli A, M.D., Avvedimento EV, M.D., Krieg T, M.D. Scleroderma Mechanisms of Disease, review article, . Engl J Med 2009; 360:1989-200.

3. Einleitung

3.1 Überblick über die Systemische Sklerose

3.1.1 Klinische Manifestation und Epidemiologie

Bei der systemischen Sklerose (SSc) handelt es sich um eine komplexe Krankheit, zu

deren Hauptmerkmalen Fibrose der Haut und verschiedener Organe (Tab.1), Gefäß-

veränderungen und Autoimmunität mit Autoantikörpern gegen verschiedene Zellan-

tigene zählen [46].

Man unterscheidet zwei Formen der SSc: Die limitiert-kutane und die diffus-kutane

SSc (siehe Tab. 1) [41]. In der limitiert-kutanen SSc bleibt die Fibrose hauptsächlich

auf Hände, Arme und das Gesicht beschränkt, bei der diffus-kutanen SSc findet eine

rasch voranschreitende Umstrukturierung großer Hautflächen einschließlich der

Schädigung einer oder mehrerer innerer Organe statt [26]. Obwohl die Fibrose des

Bindegewebes ein Hauptmerkmal der systemischen Sklerose ist, treten die ersten

pathologischen Veränderungen vermutlich in mikrovaskulären Endothelzellen auf

[33, 58]. So ist das Raynaud-Phänomen gerade bei Patienten mit limitiert-kutaner

SSc meist schon einige Jahre vor den ersten fibrotischen Erscheinungen vorhanden

[33]. Auch Autoantikörper treten oft Jahre vor klinischen Symptomen auf [58].

6

Ergebnisse epidemiologischer Studien zur Prävalenz schwanken zwischen 50-300

Fällen pro Million Einwohner und einer Inzidenz mit 2,3-22,8 neuen Erkrankungen

im Jahr pro Million Einwohner [8]. Frauen sind hierbei mit einem Verhältnis von

3-14:1 deutlich häufiger als Männer betroffen. Ebenso wird von einer leicht erhöhten

Anfälligkeit an SSc zu erkranken, bei Afroamerikanern berichtet [45, 55]. Aufgrund

familiärer Häufung der systemischen Sklerose, einer zusätzlich erhöhten Inzidenz

anderer Autoimmunkrankheiten bei Familienmitgliedern der an SSc erkrankten Pati-

enten, z.B. systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis und Sjögren-

Syndrom sowie unterschiedlicher Phänotypen in verschiedenen ethnischen Gruppen,

liegt es nahe, dass genetische Faktoren zu der Entstehung einer SSc beitragen [55,

18]. So hat man festgestellt, dass bei SSc-Patienten gehäuft Polymorphismen bei

Genen auftreten, die Immunantworten regulieren, wobei viele dieser Abweichungen

nur bei einzelnen Patienten-Kohorten beobachtet wurden und nur wenige dieser Po-

lymorphismen unabhängig bestätigt werden konnten [1]. Bestimmte Human Leu-

kocyte Antigen (HLA) Klasse II-Moleküle und damit verbundenen klinischen Er-

scheinungsbildern der systemischen Sklerose sowie spezielle Autoantikörper zeigen

demgegenüber eine hohe Evidenz [42]. Diese Erkenntnisse unterstützen die Ansicht,

dass die systemische Sklerose nicht als ein klar definiertes Krankheitsbild betrachtet

werden sollte, sondern vielmehr als ein Syndrom, welches viele Erscheinungsbilder

umfasst [26]. Weiter unterstützt wird diese Sichtweise durch die Tatsache, dass be-

stimmte Umweltgifte, z.B. Vinylchlorid oder Siliziumdioxid, klinische Erschei-

nungsbilder hervorrufen können, welche der systemischen Sklerose ähneln [48].

3.1.2 Pathogenese der systemischen Sklerose

Man unterscheidet bei der SSc zwischen frühen und späten pathologischen Gewebe-

veränderungen, wobei zu Beginn Gefäßschäden, vor allem an kleinen Gefäßen, ins-

besondere Arteriolen [51, 22], und entzündliche Veränderungen im Vordergrund

stehen. Die fortgeschrittene Krankheit zeichnet sich durch exzessive Fibrose, Zellun-

tergang und Atrophie aus [26].

Histopathologisch zeichnen sich die mikrovaskulären Veränderungen durch große

Lücken zwischen den Endothelzellen, dem Verlust der endothelialen Integrität, der

Vakuolisierung des Zellplasmas sowie vermehrter Apoptose von Endothelzellen aus

[27, 31]. Zudem kommt es zur Aufsplittung der Basallamina und es bilden sich peri-

7

vaskuläre Infiltrate aus mononukleären Entzündungszellen [21]. So finden sich peri-

vaskulär zu Beginn der Erkrankung vor allem T-Lymphozyten, Makrophagen und

Mastzellen [36, 59, 63]. Bei Hautläsionen findet man hauptsächlich CD4+-T-Zellen

[59], vornehmlich vom Typ 2 (Th2) [44, 59]. Dies ist in Übereinstimmung mit er-

höhten Th2 Zytokinen im Serum [28, 29]. Außerdem befinden sich auch CD20+ -B-

Zellen in den Hautläsionen [63]. Diese könnten durch die Sekretion von Interleukin-

6, TGF-β [14, 29, 63] sowie von Autoantikörpern Fibroblasten direkt aktivieren und

so zur Entstehung der Fibrose beitragen. Zusätzlich kommt es zur Obliteration

kleinster Gefäße und einem Verlust an Kapillaren [21, 22, 23, 27, 51].

Ein Kennzeichen der fortgeschrittenen SSc ist eine vermehrte Ansammlung von Be-

standteilen der extrazellulären Matrix (EZM) aufgrund einer Überproduktion von

Kollagen, v.a. Typ I und Glykoproteinen, wie z.B. Fibronektin und Fibrillin [15, 40].

Fibroblasten spielen bei der Produktion, der extrazellulären Ansammlung sowie bei

der Umformung von Kollagen und anderen EZM-Bestandteilen eine zentrale Rolle

[26]. Die Mechanismen der Kollagenüberproduktion durch die pathologisch aktivier-

ten Fibroblasten sind vielfältig [40]. Fibroblasten von SSc-Patienten scheinen endo-

gen über epigenetische Veränderungen aktiviert zu sein und behalten diesen aktivier-

ten Phänotyp auch in vitro [12]. Vor allem in frühen Krankheitsstadien scheint aber

die exogene Aktivierung zu dominieren. So sezernieren Endothelzellen, Epithelzel-

len und Leukozyten profibrotische Zytokine, wie z.B. Transforming-Growth-Factor-

β (TGF-β) und platelet-derived growth factor (PDGF), die die Kollagensynthese in

Fibroblasten steigern [60].

Fibroblasten von SSc-Patienten können sich unter dem Einfluss von TGF-β in Myo-

fibroblasten umwandeln [52]. Myofibroblasten sind spezialisierte kontraktile Fibro-

blasten, welche das Protein α-Smooth-Muscle-Actin (α-SMA) exprimieren und große

Mengen Kollagen sowie andere Bestandteile der extrazellulären Matrix produzieren

[60]. Während Myofibroblasten bei der normalen Wundheilung im Granulationsge-

webe nur vorübergehend auftreten und mittels programmierten Zelltods wieder ent-

fernt werden, persistieren sie in fibrotischen Erkrankungen und tragen zur Überpro-

duktion der extrazellulären Matrix bei [60].

8

3.2 Mausmodelle zur Erforschung der Systemischen Sklerose

Die komplexe Pathogenese der SSc ist nur zum geringen Teil verstanden. Viele Zu-

sammenhänge sind weiterhin rätselhaft [3]. Ein besseres Verständnis der Erkrankung

wäre jedoch für die Entwicklung neuer Therapien essentiell [3]. Eine wichtige Hilfe-

stellung könnten hierbei Tiermodelle geben [3]. Keines der vorhandenen Tiermodelle

kann jedoch alle Merkmale dieser komplexen Erkrankung widerspiegeln. Es lassen

sich mittels unterschiedlicher Tiermodelle einzelne Aspekte der Erkrankung abbilden

[3]. Diese Tiermodelle können in genetische und induzierbare Tiermodelle der SSc

eingeteilt werden [3]. In genetischen Modellen entwickeln sich Schlüsselmerkmale

der humanen SSc anhand spezifischer Änderung im Genom der Tiere, bei induzier-

baren Tiermodellen bewirken von außen zugeführte Agenzien oder Prozeduren einen

der SSc ähnlichen Phänotyp [3].

3.2.1 Mausmodell der sklerodermiformen chronischen Graft-versus-Host Erkrankung

Eine chronische Graft-versus-Host-Erkrankung (cGvHD) tritt bei 40-60% der Lang-

zeitüberlebenden nach einer Stammzelltransplantation auf [4]. Sie ist der Hauptfaktor

bezüglich der Langzeitprognose [3]. Es gibt zwei Hauptformen der cGvHD: Die zy-

totoxische und die sklerodermiforme cGvHD, wobei letztere die Fibrose hervorru-

fende und der SSc ähnelnde Variante ist und 10-15% der cGvHD Fälle verursacht

[61]. Aufgrund der im klinischen Erscheinungsbild großen Ähnlichkeit zwischen der

sklerodermiformen cGvHD und der diffus-kutanen SSc kam man zu der Hypothese,

dass die SSc eine Variante der cGvHD sein könnte [39], welche durch Mikrochimä-

rismus, das heißt durch das Überleben einiger körperfremder Zellen eines anderen

Individuums, im Körper entsteht [37, 47]. In dem von uns verwendeten Mausmodell

der sklerodermiformen cGvHD sind Spender- und Empfänger-Mäuse bezüglich der

major histocompatibility complexes (MHCs) identisch, aber in den minor histocom-

patibility Antigenen (MHA) verschieden [3]. Deshalb kann es zu einer „Fremderken-

nung“ des Empfängergewebes durch das transplantierte Immunsystem des Spenders

kommen, die sich als sklerodermiforme cGvHD mit Fibrose und Entzündung mani-

festiert [3]. In unserem Modell werden Splenozyten zusammen mit Knochenmarks-

zellen aus der Tibia und des Femur von B10.D2 Spender-Mäusen in die Schwanzve-

ne der Empfänger Balb/c-Maus, welche kurz zuvor subletal bestrahlt wurde, injiziert

9

[32]. Ungefähr zwei Wochen nach der Knochenmarktransplantation sind die be-

troffenen Empfänger-Gewebe von T-Zellen, Monozyten, Mastzellen und Leukozyten

infiltriert, was ortsständige Fibroblasten dazu stimuliert, große Mengen an extrazellu-

lärer Matrix freizusetzen [11, 32]. Ab der dritten Woche nach Transplantation entwi-

ckeln die Mäuse eine Hautfibrose mit Verlust an subkutanem Fettgewebe [9, 32].

Dieses Tiermodell stellt ein gut etabliertes und standardisiertes Mausmodell der SSc

dar [3].

3.2.2 Fra-2-Mausmodell

Es handelt sich hier um ein genetisch induziertes Tiermodell der SSc. Fra-2 ist ein

Transkriptionsfaktor, der zur Aktivator-Protein-1-Familie zählt [3]. Dieser ist an

Zellproliferation, Entzündung und Wundheilung mit beteiligt [62]. In Abb.1 ist die

Gensequenz zu sehen.

Abb.1: Gensequenz der Fra-2 Mäuse [4]

Beyer C, Schett G, Distler O, Distler JH: Animal models of systemic sclerosis: prospects and limitations. Arthritis Rheum. 2010; 62(10):2831-44

Das transgene Konstrukt der Fra-2 Maus besteht aus einem ubiquitär exprimierten

H2Kb Promotor, dem Fra-2 Genom, einem grün fluoreszierenden Reporter-Gen mit

interner Ribosomenbindungsstelle (IRES-EGFP) sowie einem Polyadenylierungs-

signal (PolyA) [3]. Die transgene Überexpression von Fra-2 führt zu generalisierter

Entzündung und Fibrose, vor allem in der Haut und der Lunge [54]. Zusätzlich zur

Entzündung und Fibrose entwickeln Fra-2 transgene Mäuse einen vaskulären Phäno-

typ, welcher sich unter anderem in der Lunge und der Haut manifestiert [3]. Dieser

lässt sich ab einem Alter von neun Wochen zuerst als Apoptose in mikrovaskulären

Endothelzellen mit konsekutiver Abnahme der Kapillardichte in der Haut nachwei-

sen [43]. Zusätzlich zum Verlust kleiner Blutgefäße entwickeln Fra-2 transgene

Mäuse eine proliferierende Gefäßerkrankung in der Lunge, ähnlich den histologi-

schen Veränderungen der pulmonal-arteriellen Hypertonie (PAH). Aufgrund der

Lungenfibrose und der PAH sterben Fra-2 transgene Mäuse in einem Alter von

10

16-20 Wochen an Herz-Lungen-Versagen [17]. Interessanterweise zeigt sich bei Pa-

tienten mit SSc eine erhöhte Expression von Fra-2 in Myofibroblasten, Endothelzel-

len sowie in glatten Muskelzellen, was darauf hindeutet, dass Fra-2 an der Pathoge-

nese der humanen SSc mitbeteiligt sein könnte [43, 54]. Des Weiteren konnte gezeigt

werden, dass profibrotische Mediatoren, wie TGF-β und PDGF, die Expression von

Fra-2 in Fibroblasten stimuliert [54]. Die Manifestationen im Fra-2-Modell entwi-

ckeln sich dabei in einem zeitlichen Ablauf, der dem systemischer Sklerose ähnelt

[3]. Das Fra-2-Modell kann damit auch die komplexen Interaktionen zwischen Fib-

rose und Vaskulopathie widerspiegeln [3].

11

3.3 Das Adenosin-Rezeptor-System

Da es Ziel dieser Arbeit ist, die Aktivierung des Adenosin-Rezeptors bei der Entste-

hung und Therapie der SSc zu bewerten, sind Grundkenntnisse zum Adenosin-

Rezeptor-System zum Verständnis nötig, welche im folgenden Kapitel dargestellt

werden.

3.3.1 Die Adenosinrezeptoren: Aufbau und Funktion

Die Adenosinrezeptoren gehören zur Familie der P1-Rezeptoren und sind Mitglied

der Rhodopsin ähnlichen G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie [6]. So besitzen die

Adenosin-Rezeptoren sieben Transmembran-Domänen, welche vor allem aus hydro-

phoben Aminosäuren bestehen, wobei man annimmt, dass jede der Transmembran-

domänen eine α-Helix aus 21-28 Aminosäuren darstellt [25, 53]. Die Transmem-

brandomänen sind mittels drei extrazellulärer und drei zytoplasmatischer, hydrophi-

ler Schleifen ungleicher Länge verbunden [53] (siehe Abb. 2). Man unterscheidet bei

den Adenosinrezeptoren vier unterschiedliche Vertreter, nämlich ADORA1 (A1R),

Abb.2: Aufbau der Adenosinrezeptoren [38]

Latta V, Cabiati M, Rocchicciolia S, Del Ry S, Morales MA. Review: The role of the adenosinergic system in lung fibrosis,

Pharmacological Research 2013; 76:182–189

12

ADORA2A (A2AR), ADORA2B (A2BR) und ADORA3 (A3R) [38]. Die A2-

Rezeptoren unterteilt man in hoch-affine A2A- und niedrig-affine A2B-Rezeptoren be-

züglich eines Anstiegs an zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) [68]. So sind

die A1R- und A3R-Rezeptoren an inhibitorische G-Proteine gekoppelt, was zu einem

intrazellulären Abfall an cAMP führt. Im Gegensatz dazu sind A2-Rezeptoren an sti-

mulatorische G-Proteine gekoppelt und induzieren einen Anstieg der intrazellulären

cAMP-Konzentration [6, 10, 24]. Die durch Stimulation der verschiedenen Adeno-

sinrezeptoren erzielten Wirkungen sind sowohl innerhalb dieser als auch in den ver-

schiedenen Geweben sehr unterschiedlich [16]. So stimuliert die Aktivierung des

A2A-Rezeptors auf humanen dermalen Fibroblasten die Kollagenproduktion [7]. Auf-

grund dieser vielfältigen Wirkungen der Adenosinrezeptoren werden diese als poten-

tieller Angriffspunkt zur Therapie vieler verschiedener Erkrankungen in Betracht

gezogen [34].

3.3.2 Der Adenosin-Metabolismus

Adenosin ist ein Nukleosid, bestehend aus der Purinbase Adenin, welche über eine

β-N9-glykosidische Bindung mit einer Ribose verknüpft ist [38].

Abb.3: Schematische Darstellung des Adenosin-Metabolismus [38]

Latta V, Cabiati M, Rocchicciolia S, Del Ry S, Morales MA. Review: The role of the adenosinergic system in lung fibrosis, Pharmacological Research 2013; 76:182– 189

Abbildung 3 veranschaulicht den Adenosin-Metabolismus. Im Zytoplasma ist Ade-

nosin hauptsächlich in seinen phosphorylierten Formen Adenosinmonophosphat

(AMP), Adenosindiphosphat (ADP) und Adenosintriphosphat (ATP) vorhanden [38].

Adenosin wird intrazellulär über das Enzym Ecto-5‘-Nucleotidase (CD73) aus AMP

13

generiert [38]. Unter physiologischen Bedingungen wird die intrazelluläre Adenosin-

Konzentration mittels der Enzyme S-Adenosylhomo-cysteinase und S-Adenosyl-

homocystein-Hydrolase niedrig gehalten [2]. Als Antwort auf zellulären Stress und

Zellschaden wird ATP in den Extrazellularraum freigegeben und schnell anhand der

Enzyme Ectonucleoside triphosphate Diphosphohydrolase (CD39) zu AMP und an-

schließend durch Ecto-5‘-Nucleotidase (CD73) zu Adenosin umgesetzt [38]. Dieses

Adenosin kann entweder mit den vorausgehend erklärten Adenosinrezeptoren intera-

gieren [38] oder mittels passiver Diffusion anhand eines beidseitig funktionierenden

Adenosin-Transport-Systems (equilibrative nucleoside transporter (ENT)) wieder in

die Zelle gelangen [38]. Durch das Enzym Adenosin-Desaminase (ADA) kann so-

wohl extra- als auch intrazelluläres Adenosin zu Inosin (INO) desaminiert werden

[38]. Intrazelluläres Adenosin muss hierfür entweder durch das Adenosin-

Transporter-System nach außen sezerniert werden oder wieder zu ATP phosphory-

liert werden, wobei die Umwandlung von Adenosin zu AMP durch das Enzym Ade-

nosinkinase (ADK) stattfindet [11, 30, 57, 64]. Adenosin-Desaminase (ADA) ist

dagegen das bedeutendste Enzym zum Abbau von Adenosin [20].

3.3.3 Störungen des Adenosin-Rezeptor-Systems in der Fibrose

Neben den physiologischen Funktionen des Adenosin-Rezeptor-Systems sind auch

die Störungen dieses Systems zum Erkenntnisgewinn von Bedeutung. So hat man

festgestellt, dass eine Aktivierung der A2A-Rezeptoren in humanen Fibroblasten die

Kollagenproduktion steigert [50]. Ebenso konnte man zeigen, dass Mäuse, welche

einen Mangel an Adenosin-Desaminase aufwiesen und daraus resultierend erhöhte

Gewebespiegel an Adenosin bekamen, spontan Fibrose in der Haut und Lunge ent-

wickelten [16, 20]. Durch Gabe eines A2A-Rezeptor-Antagonisten, z.B. ZM-241385,

konnte man bei diesen Mäusen die Entwicklung der Fibrose verhindern [20]. Durch

Gabe von A2A-Rezeptor-Antagonisten oder durch Knockout des A2A-Rezeptors konn-

te zudem eine anhand von externer Bleomycin-Gabe induzierte Fibrose bei Mäusen

verhindert werden [20]. Mäuse, denen die Enzyme CD39 oder CD73 fehlen, sind

dagegen weitgehend resistent gegen eine Bleomycin-induzierte Hautfibrose [19].

Man stellte fest, dass bei ihnen im Vergleich zu nicht CD39/ CD73-defizienten Mäu-

sen niedrigere Gewebespiegel an profibrotischen Zytokinen, wie TGF-β und connec-

tive tissue growth factor (CTGF), vorhanden waren [19]. Aufgrund dieser Ergebnisse

14

kam man zu der Hypothese, dass extrazelluläres Adenosin, welches anhand der En-

zyme CD39 und CD73 erzeugt wird, die Fibrogenese der Haut unterstützt [19]. Die-

selbe Arbeitsgruppe zeigte, dass der A2A-Rezeptor möglicherweise an der Rekrutie-

rung peripherer im Blut zirkulierender Fibroblastenvorläufer, sog. Fibrozyten, zum

Ort der Fibrose beteiligt ist [35].

15

4. Fragestellung

Das Adenosin-Rezeptor-System scheint aufgrund der im letzten Kapitel beschriebe-

nen Erkenntnisse eine wichtige Rolle in der Pathogenese fibrotischer Erkrankungen

zu spielen. Deshalb ist es Ziel dieser Arbeit anhand tierexperimenteller Mausmodelle

zu untersuchen, ob die Gabe rekombinanter Adenosin-Desaminase einen positiven

Effekt bei der Entstehung und der Therapie der systemischen Sklerose haben könnte.

Rekombinante Adenosin-Desaminase ist zur Behandlung bei Kindern mit angebore-

nem Adenosin-Desaminase (ADA)-Mangel zugelassen und stünde damit auch zur

Behandlung der SSc zur Verfügung.

16

5. Material und Methoden

5.1 cGvHD Mausmodell

5.1.1 Hintergrundinformationen zum cGvHD Mausmodell

Die in dieser Arbeit beschriebene cGvHD wurde mittels einer allogenen Stammzel-

lentransplantation hervorgerufen. Spender- und Empfänger-Mäuse sind bezüglich der

major histocompatibility complexes (MHCs) aufeinander abgestimmt, aber unter-

scheiden sich in den minor histocompatibility Antigenen (MHA). Bei den allogenen

Spendermäusen handelt es sich um B10.D2 (H-2d)-Mäuse, welche von der Firma

Jackson Laboratory (Bar Harbour, ME) bestellt wurden. Von diesen wurden Kno-

chenmarkzellen und Splenozyten gewonnen und in die Schwanzvene der Empfänger

Balb/c (H-2d)-Mäuse injiziert. Die Balb/c (H-2d)-Mäuse wurden von der Firma Jan-

vier (Le Genest, St. Isle, France) bestellt. Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien

Bedingungen besonders gepflegt. Sie erhielten sterile Pellet-Nahrung sowie steriles

Wasser und hatten einen normalen Tag-Nacht-Zyklus. Zur Knochenmarkzellgewin-

nung wurden die Tibia und der Femur der Spendermäuse unter sterilen Bedingungen

präpariert. Um die Knochenmarkzellen aus den präparierten Knochenkavitäten zu

spülen, verwendete man eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (Life technolo-

gies, Germany). Anschließend wurden die Knochenmarkzellen mittels 70 µm Nylon-

Netzen (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) filtriert und es erfolgte eine Hämo-

lyse. Die erhaltenen Knochenmarkzellen wurden bis zur Transplantation in Eis gela-

gert.

Die Empfänger Balb/c (H-2d)-Mäuse waren zum Zeitpunkt der Knochenmarkzellen-

und Splenozytentransplantation acht Wochen alt. Sechs Stunden vor der Transplanta-

tion bekamen sie eine Ganzkörperbestrahlung mit einer Dosis von 700 Zentigray

(cGy). Zur Transplantation erhielten alle Empfänger Balb/c (H-2d)-Mäuse Knochen-

mark von entweder gleichen „syngenen“ Balb/c (H-2d) oder allogenen B10.D2 (H-

2d) Mäusen. Zur Transplantation wurden 5 × 106 Splenozyten und 1 × 106 Kno-

chenmarkzellen von den Spendermäusen in 0,2 ml PBS (Life technologies, Germa-

ny) resuspendiert und in die Schwanzvene injiziert. Die Behandlung der Knochen-

markempfängermäuse mit rekombinanter Adenosin-Desaminase begann zehn Tage

nach der Knochenmarktransplantation. 45 Tage nach der Knochenmarktransplantati-

on wurden die Mäuse getötet und Proben zur Analyse gewonnen. Um die Effekte der

17

Gabe rekombinanter Adenosin-Desaminase zu studieren, gab es vier Gruppen mit je

acht Mäusen.

• Die erste Gruppe war die syngene Kontrollgruppe. Hierbei erfolgte eine

syngene Transplantation der Splenozyten und Knochenmarkzellen Balb/c (H-

2d) �Balb/c (H-2d). Jede Woche wurden 100 µl 0,9% NaCl (Carl Roth,

Karlsruhe, Germany), welches als Lösungsmittel für rekombinante ADA

diente, intraperitoneal injiziert.

• Bei der zweiten Gruppe handelte es sich um eine allogene Gruppe, bei der

man eine allogene Knochenmarkzellen- und Splenozytentransplantation

B.10D2 (H-2d)� Balb/c (H-2d) durchführte. Jede Woche wurden hier ebenso

100 µl 0,9% NaCl intraperitoneal injiziert.

• Gruppe drei war Behandlungsgruppe 1: Es erfolgte eine allogene Knochen-

markzellen- und Splenozytentransplantation B.10D2 (H-2d)� Balb/c (H-2d).

Wöchentlich wurde rekombinante ADA gegeben, die hierzu in 0,9% NaCl

gelöst wurde und mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml (0,5 Units = 0,5 U)

wurden 100 µl intraperitoneal injiziert.

• Gruppe vier war Behandlungsgruppe 2: Es erfolgte eine allogene Knochen-

markzellen- und Splenozytentransplantation B.10D2 (H-2d)� Balb/c (H-2d).

Auch hier wurde wöchentlich rekombinante ADA gegeben, die hierzu in

0,9% NaCl gelöst wurde und mit einer Konzentration von 5 mg/ml (5 Units =

5 U) injizierte man 100 µl intraperitoneal.

5.1.2 Klinische Verlaufskontrolle

Zur Beurteilung des klinischen Verlaufs und Ausprägungsgrades der Erkrankung

erfolgten nach der Transplantation täglich eine Bestimmung des Körpergewichtes der

Mäuse sowie die Einstufung in ein klinisches Bewertungssystem. Dieses unterteilte

man in Haarverlust sowie in das Erscheinungsbild der Ohren und des Schwanzes. Es

erfolgte eine Punktevergabe, wobei 0 Punkte bei gesundem Erscheinungsbild und 3

Punkte bei max. krankhaftem Erscheinungsbild gegeben wurden. Die Punktevergabe

bei Ohr und Schwanz erfolgte anhand optischer Beurteilung.

18

Der Haarverlust wurde zuvor graduiert in:

• Kein Haarverlust und gesundes Erscheinungsbild der Haut = 0 Punkte.

• Haut-Läsion mit Apoplezie ≤ 1cm2 = 1 Punkt.

• Haut-Läsion mit Apoplezie 1-2cm2 = 2 Punkte.

• Haut-Läsion mit Apoplezie ≥ 2cm2 = 3 Punkte.

Die einzelnen Punkte der unterschiedlichen Kategorien addierte man hierbei und es

konnte somit ein Maximalergebnis von 9 Punkten erreicht werden.

5.1.3 Analyse der Hautveränderung

5.1.3.1 Histologische Analyse

Um die Hautfibrose der Mäuse zu analysieren, wurden Hautareale herausgeschnitten,

in 4%igem Formalin (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) für sechs Stunden fixiert und

in Paraffin eingebettet. 5 µm Schnitte wurden hergestellt.

1.) Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Um die Hautdicke zu bestimmen, wurden die histologischen Schnitte mit Hämatoxy-

lin (Merk, Germany) und Eosin (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) (HE) - wie be-

schrieben (Distler et al. 2007) - gefärbt [13] und mithilfe eines Nikon Eclipse 80i

Mikroskops (Nikon, Badhoevedorp, Niederlande) untersucht. Die Hautdicke wurde

mit 100-facher Vergrößerung bestimmt, indem die größte Distanz von der dermoepi-

dermalen Junktionszone bis zur Grenze zwischen Dermis und Subkutis an vier ver-

schiedenen Stellen je Präparat gemessen wurde (Distler et al. 2007) [13]. Die Aus-

wertung erfolgte verblindet.

2.) Masson-Trichrom-Färbung

Um die Kollagenfasern selektiv darzustellen, führten wir eine Trichrom-Färbung

nach Masson durch. Dazu wurden die Hautschnitte entparaffiniert und rehydriert,

bevor sie in Bouin’scher Lösung (Sigma-Aldrich, USA) bei 56°C für 15 Minuten

inkubiert wurden. Anschließend erfolgte die Färbung der Schnitte mittels Wei-

gert’scher Hämatoxylin-Eisenlack-Lösung (Sigma, Germany) und Biebrich-Schar-

19

lachrot-Säurefuchsin-Lösung (Sigma-Aldrich, USA). Im Anschluss an die Behand-

lung mit Phosphor-Wolframsäure (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) und Molybdato-

phosphorsäure (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) wurden die Schnitte mit Anilinblau

(Sigma-Aldrich, USA) für zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, danach die

Schnitte dehydriert und mit dem Einschlussmittel Roti®-Histokitt (Carl Roth, Karls-

ruhe, Germany) fixiert. Repräsentative Areale wurden durch das Nikon Eclipse 80i

Mikroskop (Nikon, Badhoevedorp, Niederlande) dargestellt. Die Auswertung erfolg-

te verblindet.

5.1.3.2 Immunhistochemische Analyse der Myofibroblasten

Zur Quantifizierung der Myofibroblasten führte man eine immunhistochemische

Darstellung des Proteines α-smooth muscle actin (α-SMA) durch. Myofibroblasten

sind durch die Produktion α-SMA charakterisiert.

Zunächst wurden die histologischen Schnitte deparaffinisiert und mit 5%igem Pfer-

deserum (Life technologies, Germany) und anschließend mit 3%igem H2O2 (Carl

Roth, Karlsruhe, Germany) inkubiert. α-SMA-positive Zellen konnte man durch In-

kubation mit monoklonalen anti-α-SMA-Antikörpern (clone 1A4, Sigma-Aldrich,

Steinheim, Germany) nachweisen. Als Sekundär-Antikörper wurden mit Meerrettich-

Peroxidase (Dako, Hamburg, Deutschland) verknüpfte Antikörper verwendet. Die

Expression von α-SMA machte man mittels DAB (3,3‘-Diaminobenzidin tetrahydro-

chloride) Peroxidase-Substrat-Lösung (Sigma-Aldrich, USA) sichtbar. Als Kontroll-

gruppe wurden monoklonale IgG Maus-Antikörper (Calbiochem, San Diego, CA,

USA) verwendet.

Zur Bestimmung der Anzahl der Myofibroblasten wurde ein Nikon Eclipse 80i Mik-

roskop (Nikon, Badhoevedorp, Niederlande) verwendet. Die Auswertung erfolgte

verblindet.

5.1.3.3 Hydroxyprolin-Assay

Man bestimmte den Kollagengehalt in den Hautproben mit Hilfe eines Hydroxypro-

lin-Assay. Hierfür wurden Stanzbiopsien mit einem Durchmesser von 3 mm herge-

stellt und in 6 M HCl (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) bei 120°C für drei Stunden

20

verarbeitet. Danach wurde der pH-Wert mittels 6 M NaOH (Carl Roth, Karlsruhe,

Germany) auf einen pH-Wert von 6 eingestellt. Als Farbindikator wurde Lackmus-

papier (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) verwendet. Anschließend wurde 0,06 M

Chloramin T (Sigma, Germany) den Proben zugegeben und man ließ sie für 20 Mi-

nuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach gab man 3,15 M Perchlorsäure

(Merck, Germany) und 20%igen para-Dimethylaminobenzaldehyd (Fluka, Germany)

hinzu und inkubierte die Proben für weitere 20 Minuten bei 60°C. Die Absorption

der Proben wurde bei einer Wellenlänge von 557 nm mit einem Spectra MAX 190

Mikroplatten-Spektralphotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) be-

stimmt.

21

5.2 Fra-2-Mausmodell

5.2.1 Hintergrundinformationen zum Fra-2-Mausmodell

In diesem Modell führte, wie bereits in Abschnitt 3.2.2 ausführlich erläutert, die

transgene Überexpression von Fra-2 zu systemischer Fibrose, zu Mikroangiopathien

und zu einer proliferierenden Gefäßerkrankung in der Lunge, ähnlich den histologi-

schen Veränderungen der pulmonal-arteriellen Hypertonie (PAH). Aufgrund der

Lungenfibrose und der PAH starben die Fra-2 transgenen Mäuse in einem Alter von

16-20 Wochen an Herz-Lungen-Versagen. Die Manifestationen im Fra-2-Modell

entwickeln sich dabei in einem zeitlichen Ablauf, der dem der systemischen Sklerose

ähnelt. So zeigen sich die ersten mikrovaskulären Veränderungen in einem Alter von

neun Wochen vor Beginn der Fibrose. Deshalb begann die Behandlung mit rekombi-

nanter Adenosin-Desaminase in einem Alter von acht Wochen. Mit einem Alter von

16 Wochen wurden die Mäuse getötet und Proben zur Analyse der Lunge und Haut

gewonnen. Mäuse, welche eine Kopie des Transgens exprimieren, haben die Be-

zeichnung Fra2+/-. Die das Transgen nicht exprimierende Kontrollgruppe hat die

Bezeichnung Fra2-/-. In diesem Modell gab es vier Gruppen mit je sechs Mäusen.

• Gruppe eins war die das Transgen nicht exprimierende Kontrollgruppe

(Fra2-/-). Jede Woche wurden 100 µl 0,9% NaCl (Carl Roth, Karlsruhe,

Germany), welches als Lösungsmittel für rekombinante ADA diente, intrape-

ritoneal injiziert.

• Gruppe zwei waren Fra2+/- Mäuse, die mit dem Lösungsmittel NaCl behan-

delt wurden. Hierzu wurde ebenso jede Woche 100 µl 0,9% NaCl intraperi-

toneal injiziert.

• Gruppe drei war Fra2+/- Behandlungsgruppe 1. Wöchentlich wurde rekombi-

nante ADA gegeben, die hierzu in 0,9% NaCl gelöst wurde und mit einer

Konzentration von 0,5 mg/ml (0,5 Units = 0,5 U) wurden 100 µl intraperi-

toneal injiziert

• Gruppe vier war Fra2+/- Behandlungsgruppe 2. Auch hier wurde wöchentlich

rekombinante ADA gegeben, die hierzu in 0,9% NaCl gelöst wurde und mit

22

einer Konzentration von 5 mg/ml (5 Units = 5 U) injizierte man 100 µl intra-

peritoneal.

5.2.2 Analyse der Hautveränderung

Um die Hautfibrose der Mäuse zu analysieren, wurden Hautareale herausgeschnitten,

in 4%igem Formalin für sechs Stunden fixiert und in Paraffin eingebettet.

5.2.2.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung

Um die Hautdicke zu bestimmen, führte man eine Sirius Red-Färbung durch. Dazu

wurden die Hautschnitte entparaffiniert und rehydriert, bevor man sie mittels Wei-

gert’scher Hämatoxylin-Eisenlack-Lösung (Sigma, Germany) für acht Minuten färb-

te. Danach wurden die Schnitte für fünf Minuten mit Leitungswasser gewaschen.

Darauf folgte die Färbung mit Picro-Sirius Red (Sigma-Aldrich, USA) für eine Stun-

de. Abschließend wurden die Schnitte dehydriert und mit dem Einschlussmittel Ro-

ti®-Histokitt (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) fixiert.

Mit Hilfe eines Nikon Eclipse 80i Mikroskops (Nikon, Badhoevedorp, Niederlande)

wurden die Hautschnitte im Dunkelfeld untersucht. Die Hautdickenbestimmung

wurde bei 100-facher Vergrößerung, identisch der im Punkt 5.1.3.1 beschriebenen

Methode, durchgeführt.

5.2.2.2 Immunhistochemische Analyse der Myofibroblasten

Wurde identisch Punkt 5.1.3.2 vorgenommen.

5.2.2.3 Hydroxyprolin-Assay

Wurde identisch Punkt 5.1.3.3 vorgenommen

23

5.2.3 Analyse der Lungenveränderung

Zur Analyse der Lunge wurde der linke Lungenflügel in 4%igem Formalin für acht

Stunden fixiert, in Paraffin eingebettet und anschließend stellte man 5 µm dicke

Schnitte her.

5.2.3.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung

Die Färbung erfolgte identisch der im Punkt 5.2.2.1 aufgeführten Beschreibung.

Zur histologischen Quantifizierung der Lungenfibrose wurden die aufgrund der Fib-

rose mit Sirius Red gefärbten Lungenbereiche ins Verhältnis zum Gesamtlungenge-

webe gesetzt. Hierfür wurde ein mit Digitalkamera und Bild-Analyse-Programm

OsteoMeasure (Osteometrics, Decatur, GA) ausgestattetes Zeiss Axioskop-2 Mikro-

skop (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) verwendet. Man schoss hierzu Bilder

von allen auf dem Präparat befindlichen Lungenabschnitten. Anschließend markierte

man mit Hilfe eines Eingabestiftes und des Programmes OsteoMeasure alle fibroti-

schen Lungenbereiche. Das Programm gab den prozentualen Anteil der markierten

Fläche - bezogen auf die Gesamtfläche eines Bildes - an. Dieser Vorgang wurde bei

jedem Bild des Präparates wiederholt und abschließend berechnete man den Gesamt-

durchschnitt an fibrotischem Lungengewebe, bezogen auf das ganze Präparat.

5.2.3.2 Immunhistochemische Analyse der Myofibroblasten

Wurde identisch Punkt 5.1.3.2 vorgenommen.

5.2.3.3 Hydroxyprolin-Assay

Wurde identisch Punkt 5.1.3.32 vorgenommen.

5.2.4 Analyse der Lungenarterien mittels HE-Färbung

Um die Veränderungen der Lungenarterien zu bestimmen, wurden die histologischen

Schnitte mit Hämatoxylin (Merk, Germany) und Eosin (Carl Roth, Karlsruhe, Ger-

many) - wie beschrieben (Distler et al. 2007) - gefärbt [13].

24

5.2.4.1 Analyse der Gefäßwanddicke

Unter Zuhilfenahme eines Nikon Eclipse 80i Mikroskops (Nikon, Badhoevedorp,

Niederlande) und des Programmes LC Micro berechnete man hierfür die Differenzen

zwischen innerem und äußerem Gefäßwanddurchmesser. Eine Gefäßwanddicke von

>10% des Gesamtgefäßdurchmessers wurde als pathologisch bewertet. Pro Gefäß

wurden drei Messungen vorgenommen und anschließend der Durchschnitt gebildet.

Pro Maus wurden hierbei mindestens fünf Gefäße vermessen.

5.2.4.2 Quantifizierung der stark stenosierten Lungenarterien

Unter Zuhilfenahme eines Nikon Eclipse 80i Mikroskops (Nikon, Badhoevedorp,

Niederlande) wurden die stark stenosierten Lungenarterien manuell gezählt. Als stark

stenosiert wurden hierbei Lungenarterien, deren Lumendurchmesser < 10% der Ge-

fäßwanddicke beträgt, gewertet. Pro Maus wurden mindestens drei Bilder geschos-

sen. Anschließend berechnete man bei jedem Bild den Anteil der stark stenosierten

Gefäße an allen auf dem Bild befindlichen Gefäßen und bildete im Anschluss den

Gesamtdurchschnitt an stark stenosierten Gefäßen pro Maus und pro Gruppe.

5.3 Statistische Auswertung

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Die Unterschiede

zwischen den Gruppen wurden durch nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test

auf ihre statistische Signifikanz untersucht. Ein p-Wert von kleiner als 5% wurde als

statistisch signifikant erachtet.

* entspricht einem signifikanten p-Wert, ** entspricht einem sehr signifikanten und

*** einem hoch signifikanten p-Wert.

Zur Verarbeitung der statistischen Daten und der Erstellung der Graphen sowie Bal-

kendiagramme wurden die Programme Excel (Microsoft Corporation, USA) und

GraphPad PrismV (GraphPad Software, USA) verwendet.

25

Abb. 4: Veränderung des Körpergewichtes nach der Knochenmarkzellen- und Splenozyten-transplantation. Die aufgrund der allogenen Knochenmarkzellen- und Splenozytentransplantation verursachte sklerodermiforme cGvHD senkte das Durchschnittskörpergewicht der Mäuse. Bei der syngenen Transplantation kam es zu keinem Gewichtsverlust, sondern zu einer Gewichtszunahme. Die Therapie der cGvHD mit rekombinanter ADA bewirkte ein höheres Durchschnittsgewicht als mit dem Lösungsmittel NaCl.

6.Ergebnisse

6.1 cGvHD-Mausmodell

6.1.1 Klinischer Verlauf

1. Körpergewicht

Die durch allogene Knochenmarkzellen- und Splenozytentransplantation hervorgeru-

fene sklerodermiforme cGvHD verursachte ein signifikant niedrigeres Durchschnitts-

körpergewicht bei den mit dem Lösungsmittel behandelten Mäusen - verglichen mit

der syngenen Kontrollgruppe am 45. Tag nach der Transplantation („allogene Grup-

pe + .aCl“ 99 ± 5% gegenüber der „syngenen Kontrollgruppe + .aCl“ 122 ± 4%

(p = 0,0003); verglichen zum Durchschnittskörpergewicht am Transplantationstag).

Eine Behandlung mit rekombinanter ADA reduzierte den durch die allogene

Splenozyten- und Knochenmarkzellentransplantation verursachten Gewichtsverlust

und bewirkte eine signifikante Steigerung des Durchschnittskörpergewichtes. Hierbei

bewirkte die Gabe rekombinanter ADA mit der Konzentration 0,5 U bzw. 5 U eine

Steigerung des Durchschnittkörpergewichtes auf 111 ± 8% (p = 0,032) bzw. 106 ±

4% (p = 0,039), verglichen mit dem Durchschnittskörpergewicht der Mäuse am

Transplantationstag. (siehe Abb. 4)

26

Abb. 5: Klinische Bewertung der nach Knochenmarkzellen- und Splenozytentransplantation auftretenden Haar-, Schwanz- und Ohrveränderungen. Die Gabe rekombinanter ADA konnte das klinische Erscheinungsbild der allogen transplantierten Mäuse signifikant bessern. Nach syngener Knochenmarkzellen- und Splenozytentransplantation waren keine Krankheitsmerkmale klinisch erkennbar.

2. Klinische Beurteilung

Die ersten klinischen Zeichen der cGvHD wurden am 24.Tag nach der Knochen-

markzellen- und Splenozytentransplantation sichtbar. Die aus Haarverlust sowie

Schwanz- und Ohrveränderungen zusammengesetzte klinische Bewertung stieg bei

der allogenen transplantierten mit Lösungsmittel behandelten Gruppe kontinuierlich

auf 2,75 ± 1,50 am 45.Tag nach Transplantation an. Im Gegensatz hierzu entwickelte

die syngene Kontrollgruppe keine klinisch sichtbaren Erkrankungszeichen (Score 0 ±

0). Die Gabe rekombinanter ADA besserte die klinischen Zeichen der sklerodermi-

formen cGvHD und reduzierte die zusammengesetzte klinische Bewertung signifi-

kant auf 1,38 ± 0,52 (p = 0,036) bei einer Konzentration von 0,5 U bzw. 1,13 ± 0,64

(p = 0,022) bei der höheren 5 U Konzentration. (siehe Abb. 5)

27

Abb. 6: Histologische Veranschaulichung der Hautveränderungen mit Hilfe der HE-Färbung. Deutliche Zunahme der Hautdicke bei der allogen transplantierten mit Lösungsmittel behandelten Gruppe. Die Gabe rekombinanter ADA konnte die Zunahme der Hautdicke verbessern. (100 fache Vergrößerung)

6.1.2 Histologische Veränderungen der Haut

6.1.2.1 Histologische Analyse

1.) Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Die zur Veranschaulichung der Hautveränderungen durchgeführten HE-Färbungen

zeigen die typischen Merkmale der sklerodermiformen cGvHD. So führte die alloge-

ne Knochenmarkzellen- und Splenozytentransplantation bei der mit dem Lösungs-

mittel NaCl behandelten Gruppe zu einer Zunahme der Hautdicke und einem Verlust

an subkutanem Fettgewebe. Durch Therapie mit rekombinanter ADA konnte die Zu-

nahme der Hautdicke deutlich verringert werden. (siehe Abb. 6)

syngene Kontrollgruppe + NaCl allogene Gruppe + NaCl

allogene Gruppe + 5 U rekomb. ADA allogene Gruppe + 0.5 U rekomb. ADA

28

Abb. 7: Histologische Analyse der Hautdicke und selektive Kollagendarstellung mit Hilfe der Masson-Trichrom-Färbung. Starke Zunahme der Hautdicke und der blau dargestellten Kollagen-menge bei der allogen transplantierten mit Lösungsmittel behandelten Gruppe. Rekombinante ADA verminderte sowohl die Zunahme der Hautdicke als auch der Kollagenmenge. (100 fache Vergröße-rung)

2.) Masson-Trichrom-Färbung

Die zur Hautdickenbestimmung sowie zur selektiven Kollagendarstellung angefertig-

ten Masson-Trichrom-Färbungen zeigen die aufgrund der allogenen Knochenmark-

zellen- und Splenozytentransplantation hervorgerufene Hautfibrose. Diese zeigt sich

deutlich in Form einer Zunahme der Kollagenmenge (blau) und daraus resultierender

Vergrößerung der Hautdicke. Zudem erkennt man einen Verlust an subkutanem Fett-

gewebe. Die Gabe rekombinanter ADA verringerte die Kollagen- und Dickenzu-

nahme der Haut. (siehe Abb. 7)

allogene Gruppe + NaCl syngene Kontrollgruppe + NaCl

allogene Gruppe + 5 U rekomb. ADA allogene Gruppe + 0.5 U rekomb. ADA

29

Abb. 8: Statistische Auswertung der Hautdicke. Die statistische Auswertung der Hautdicke zeigt eine Zunahme der Hautdicke bei der allogen transplantierten mit NaCl behandelten Gruppe. Die Therapie mit rekombinanter ADA verringerte die Zunahme der Hautdicke.

Die folgenden statistischen Auswertungen werden in Form von Balkendiagrammen

dargestellt, welche mit GraphPad PrismV erstellt wurden.

Die allogen transplantierten mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten Mäuse besa-

ßen eine 1,51 ± 0,1 -fach (p < 0,0001) hoch signifikant erhöhte Hautdicke im Ver-

gleich zur syngenen Kontrollgruppe. Die Behandlung mit rekombinanter ADA ver-

minderte die Zunahme der Hautdicke. Durch Behandlung mit einer Konzentration

von 0,5 U und 5 U war die Hautdicke auf das 1,29 ± 0,12 -fache (p < 0,0001) bzw.

1,14 ± 0,10 -fache (p < 0,0001) in beiden Fällen hoch signifikant im Vergleich zur

mit Lösungsmittel NaCl therapierten allogenen Gruppe verringert. (siehe Abb. 8)

30

Abb. 9: Immunhistologische Analyse der in der Haut befindlichen Myofibroblasten anhand der Darstellung des Proteins α-Smooth-Muscle-Actin. Myofibroblasten erkennt man anhand des Proteins α-SMA, welches braun angefärbt und charakteristisch für diese ist. Man sieht eine deutliche Zunahme der Myofibroblasten bei der allogenen mit Lösungsmittel behandelten Gruppe. Rekombi-nante ADA verringerte die Anzahl der in der Haut befindlichen Myofibroblasten deutlich. (200 fache Vergrößerung)

6.1.2.2 α-SMA Immunhistologie

Um die Anzahl der Myofibroblasten zu bestimmen, wurden Gewebeschnitte der

Mäuse immunhistochemisch für α-SMA braun angefärbt und die Anzahl der α-SMA-

positiven Fibroblasten ausgezählt. Die allogene Splenozyten- und Knochenmarkzel-

lentransplantation stimulierte die Differenzierung ortsständiger Fibroblasten zu Myo-

fibroblasten. Die Bilder veranschaulichen die deutliche Zunahme an Myofibroblasten

bei der allogen transplantierten mit Lösungsmittel behandelten Gruppe gegenüber der

syngenen Kontrollgruppe. Ebenso sieht man die Verringerung der Myofibroblasten-

anzahl bei den mit rekombinanter ADA therapierten Gruppen. (siehe Abb. 9)

syngene Kontrollgruppe + NaCl allogene Gruppe + NaCl

allogene Gruppe + 0.5 U rekomb. ADA allogene Gruppe + 5 U rekomb. ADA

31

Abb. 10: Statistische Auswertung der Änderung der Myofibroblastenanzahl in der Haut. Die statistische Auswertung der Myofibroblastenanzahl ergab eine Zunahme in der Haut befindlicher Myofibroblasten bei den allogen transplantierten mit Lösungsmittel behandelten Mäusen gegenüber der Kontrollgruppe. Die Gabe rekombinanter ADA verringerte die Zunahme der Myofibroblasten.

Abb. 11: Statistische Auswertung des Hydroxyprolingehaltes der Haut. Die aufgrund der allo-genen Knochmarkzellen- und Splenozytentransplantation ausgelöste sklerodermiforme cGvHD verursachte eine Kollagenzunahme in der Haut, welche biochemisch anhand eines Hydroxyprolin-Assays ermittelt wurde. Durch Gabe rekombinanter ADA konnte die Kollagenzunahme der Haut verringert werden.

Durch die allogene Splenozyten- und Knochenmarkzellentransplantation kam es zu

einem hoch signifikanten Anstieg der Myofibroblastenzahlen auf das 3,67 ± 0,91 -

fache (p < 0,0001) im Vergleich zur syngenen Kontrollgruppe. Eine Gabe von re-

kombinanter Adenosin-Desaminase senkte die Anzahl der zu Myofibroblasten diffe-

renzierten Fibroblasten deutlich. So senkte rekombinante ADA der Konzentration 0,5

U bzw. 5 U die Myofibroblastenzunahme auf 2,25 ± 0,86 (p < 0,0001) bzw. 1,79 ±

0,80 (p < 0,0001) hoch signifikant verglichen mit der mit Lösungsmittel behandelten

allogen transplantierten Gruppe. (siehe Abb. 10)

6.1.2.2 Hydroxyprolin-Assay

32

Um den Kollagengehalt mit einer biochemischen Methode zu vergleichen, wurde der

Hydroxyprolin-Assay durchgeführt. Es zeigte sich eine sehr signifikante Zunahme

der Kollagenmenge bei der mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten allogenen

Transplantationsgruppe auf das 1,55 ± 0,24 -fache (p = 0,009) im Vergleich zur

syngenen Kontrollgruppe. Die Gabe rekombinanter ADA konnte die erhöhte Kol-

lagenproduktion senken. So verringerte 0,5 U bzw. 5 U rekombinante Adenosin-

Desaminase den Kollagengehalt der Haut auf 1,11 ± 0,3 (p = 0,029) bzw. 5 U 0,95 ±

0,30 (p = 0,006) signifikant und sehr signifikant im Vergleich zur allogenen mit dem

Lösungsmittel NaCl behandelten Gruppe. (siehe Abb. 11)

33

Abb. 12: Histologische Analyse der Hautdicke mit Hilfe der Sirius Red-Färbung. Die das Fra-2 Gen exprimierenden Mäuse entwickelten eine Fibrose in der Haut mit deutlicher Zunahme der Haut-dicke. Eine Therapie mit rekombinanter ADA verringerte die Hautdickenzunahme. (100 fache Ver-größerung)

6.2 Fra-2-Mausmodell

6.2.1 Histologische Veränderungen der Haut

6.2.1.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung

Die zur Veranschaulichung der Hautfibrose und zur Hautdickenbestimmung angefer-

tigten Sirius Red-Färbungen, deren Bilder im Dunkelfeld geschossen wurden, zeigen

die aufgrund der transgenen Überexpression von Fra-2 ausgelöste Hautfibrose sehr

deutlich. Fra2-/- steht für die das Transgen nicht exprimierende Kontrollgruppe,

Fra2+/- kennzeichnet Tiere mit einer Kopie des Transgens. Durch Therapie mit re-

kombinanter ADA konnte die Zunahme der Hautdicke in beiden Konzentrationen

vermindert werden. (siehe Abb. 12)

Fra2-/- NaCl Fra2+/- NaCl

100X

Fra2+/- 0.5 U rekomb. ADA Fra2+/- 5 U rekomb ADA

34

Abb. 13: Statistische Auswertung der Hautdicke. Man erkennt eine starke Zunahme der Hautdi-cke bei den mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten Fra2+/- Mäusen verglichen mit der Fra2-/- Kontrollgruppe. Eine Therapie mit rekombinanter ADA verringerte die Zunahme der Hautdicke deut-lich.

Die mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten Fra2+/- Mäuse entwickelten eine star-

ke Hautfibrose mit einer 2,57 ± 0,75 -fach (p < 0,0001) hoch signifikant erhöhten

Hautdicke gegenüber der das Transgen nicht exprimierenden Kontrollgruppe. Die

Gabe rekombinanter ADA der Konzentrationen 0,5 U und 5 U konnte die Zunahme

der Hautdicke auf 1,44 ± 0,23 (p < 0,0001) bzw. 1,49 ± 0,16 (p < 0,0001) hoch signi-

fikant im Vergleich zur mit Lösungsmittel therapierten Fra2+/- Gruppe senken.

(siehe Abb. 13)

35

Abb. 14: Immunhistologische Analyse der in der Haut befindlichen Myofibroblasten anhand der Darstellung des Proteins α-Smooth-Muscle-Actin. Myofibroblasten erkennt man anhand des Proteins α-SMA, welches braun angefärbt und charakteristisch für diese ist. Man sieht eine deutliche Myofibroblastenzunahme bei den mit Lösungsmittel behandelten Fra-2+/- Mäusen. Rekombinante ADA verringerte die Anzahl der in der Haut befindlichen Myofibroblasten. (200 fache Vergrößerung)

6.2.1.2 α-SMA Immunhistologie

Um die Anzahl der Myofibroblasten zu bestimmen, wurden im Fra-2-Mausmodell

ebenfalls Gewebeschnitte der Mäuse immunhistochemisch für α-SMA braun ange-

färbt und die Anzahl der α-SMA-positiven Fibroblasten ausgezählt. Die transgene

Überexpression von Fra-2 stimulierte die Differenzierung ortsständiger Fibroblasten

zu Myofibroblasten. Die Bilder veranschaulichen eine deutliche Zunahme an Myo-

fibroblasten bei der mit Lösungsmittel behandelten Fra2+/- Gruppe gegenüber der

Fra2-/- Kontrollgruppe. Ebenso erkennt man eine Verringerung der Myofibroblas-

tenanzahl bei den mit rekombinanter ADA therapierten Gruppen. (siehe Abb. 14)

Fra2+/- NaCl

Fra2+/- 0.5 U rekomb. ADA Fra2+/- 5 U rekomb. ADA

Fra2+/- NaCl

36

Die statistische Auswertung der α-SMA Immunhistologie ergab eine hoch signifikan-

te Zunahme an Myofibroblasten bei den mit Lösungsmittel behandelten Fra2+/-

Mäusen auf das 2,75 ± 0,54 -fache (p < 0,0001) im Vergleich zur Fra2-/- Kontroll-

gruppe. Durch Therapie der transgenen Mäuse mit rekombinanter ADA konnte die

Anzahl der Myofibroblasten in beiden Konzentrationen deutlich gesenkt werden. So

verringerte rekombinante ADA der Konzentrationen 0,5 U bzw. 5 U die Zunahme

der Myofibroblastenanzahl mit 1,76 ± 0,60 (p = 0,0005) bzw. 1,56 ± 0,61 (p <

0,0001) hoch signifikant gegenüber den mit NaCl behandelten Fra2+/- Mäusen.

(siehe Abb.15)

6.2.1.3 Hydroxyprolin-Assay

Abb. 15: Statistische Auswertung der Änderung der Myofibroblastenanzahl in der Haut. Die statistische Auswertung der Myofibroblastenanzahl ergab eine starke Zunahme in der Haut befindli-cher Myofibroblasten bei den mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten Fra2+/- Mäusen gegenüber der Fra2-/- Kontrollgruppe. Die Gabe rekombinanter ADA verringerte die Zunahme an Myofibroblas-ten.

Abb. 16: Statistische Auswertung des Hydroxyprolingehaltes der Haut. Die durch Überexpres-sion von Fra-2 ausgelöste Fibrose bewirkte eine starke Kollagenzunahme in der Haut der mit Lö-sungsmittel therapierten Fra2+/- Mäuse. Die Therapie mit rekombinanter ADA verringerte in beiden Konzentrationen die Kollagenmenge in der Haut.

37

Der mit Hilfe eines Hydroxyprolin-Assays quantifizierte Kollagengehalt der Haut

zeigt einen hoch signifikanten Anstieg bei den mit dem Lösungsmittel behandelten

Fra2+/- Mäusen auf 2,39 ± 0,47 -fach (p < 0,0001) verglichen mit der Fra2-/- Kon-

trollgruppe. Die Therapie mit rekombinanter ADA verringerte den Kollagengehalt

der transgenen Mäuse auf das 1,67 ± 0,60 -fache (p = 0,029) bei 0,5 U signifikant

bzw. auf das 1,16 ± 0,53 -fache (p < 0,0001) bei 5 U hoch signifikant gegenüber den

mit Lösungsmittel behandelten Fra2+/- Mäusen. (siehe Abb. 16)

38

6.2.2 Histologische Veränderungen der Lunge

6.2.2.1 Histologische Analyse: Sirius Red-Färbung

Zur Bestimmung der Lungenfibrose wurden Sirius Red-Färbungen angefertigt und

Bilder im Dunkelfeld gemacht. Zur histologischen Quantifizierung der Lungenfibro-

se wurden die aufgrund der Fibrose mit Sirius Red gefärbten Lungenbereiche ins

Verhältnis zum Gesamtlungengewebe gesetzt. An den dargestellten Bildern ist die

massive Lungenfibrose der transgenen Fra2+/- Mäuse im Gegensatz zur Fra2-/- Kon-

trollgruppe, welche keine Lungenfibrose entwickelte, sehr gut erkennbar. (siehe Abb.

17)

Fra2-/- NaCl Fra2+/- NaCl

Fra2+/- 0.5 U rekomb. ADA Fra2+/- 5 U rekomb. ADA

Abb. 17: Histologische Analyse der Lungenfibrose mit Hilfe der Sirius Red-Färbung. Die das Fra-2 Gen exprimierenden Mäuse entwickelten eine starke Lungenfibrose. Die fibrotisch veränderten Lungenbereiche färbten sich mit Sirius Red an. Eine Therapie mit rekombinanter ADA verringerte den prozentualen Anteil von fibrotisch verändertem Lungengewebe. (200 fache Vergrößerung)

39

Die mit Lösungsmittel Fra2+/- behandelten Mäuse entwickelten einen 5,94 ± 1,83 -

fach (p < 0,0001) hoch signifikant erhöhten Anteil an fibrotischem Lungengewebe

gegenüber den Fra2-/- Kontrollmäusen. Die Gabe der hohen Dosis rekombinanter

ADA konnte den Anteil an fibrotischem Lungengewebe signifikant im Vergleich zu

den Fra2+/- mit NaCl behandelten Mäusen senken. So verminderte eine Dosis von

0,5 U bzw. 5 U den fibrotischen Anteil auf das 3,71 ± 0,34 -fache bzw. 2,58 ± 0,72

-fache (p = 0,011) der Fra2-/- Kontrollgruppe. (siehe Abb. 18)

Abb. 18: Statistische Auswertung der Lungenfibrose. Man erkennt bei den mit dem Lösungsmit-tel NaCl behandelten Fra2+/- Mäusen eine starke Zunahme des Prozentsatzes fibrotischer Lungen-bereiche. Die Gabe rekombinanter ADA verringerte den Anteil fibrotisch veränderter Lungenberei-che.

40

Abb. 19: Immunhistologische Analyse der in der Lunge befindlichen Myofibroblasten anhand der Darstellung des Proteins α-Smooth-Muscle-Actin. Myofibroblasten erkennt man anhand des Proteins α-SMA, welches braun angefärbt und charakteristisch für diese ist. Man sieht eine Myo-fibroblastenzunahme bei den mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten Fra-2+/- Mäusen. Rekombi-nante ADA verringerte die Anzahl der in der Lunge befindlichen Myofibroblasten deutlich. (200 fache Vergrößerung)

6.2.2.2 α-SMA Immunhistologie

Fra2-/- NaCl Fra2+/- NaCl

Fra2+/- 0.5 U rekomb. ADA Fra2+/- 5 U rekomb. ADA

Abb. 20: Statistische Auswertung der Änderung der Myofibroblastenanzahl in der Lunge. Die statistische Auswertung der Myofibroblastenanzahl ergab eine starke Zunahme in der Lunge befind-licher Myofibroblasten bei den mit Lösungsmittel behandelten Fra2+/- Mäusen gegenüber der Fra2-/- Kontrollgruppe. Die Gabe rekombinanter ADA verringerte die Zunahme an Myofibroblasten.

41

Abb. 21: Statistische Auswertung des Hydroxyprolingehaltes der Lunge. Die durch Überex-pression von Fra-2 ausgelöste Fibrose bewirkte eine Kollagenvermehrung in der Lunge der mit Lö-sungsmittel therapierten transgenen Mäuse. Die Therapie mit rekombinanter ADA verringerte in beiden Konzentrationen die Zunahme der Kollagenmenge in der Lunge.

Die mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten Fra2+/- Mäuse besaßen eine 5,44 ±

0,22 -fach (p < 0,0001) hoch signifikant erhöhte Anzahl an Myofibroblasten gegen-

über der Fra2-/- Kontrollgruppe. Die Therapie mit rekombinanter ADA verringerte

die Myofibroblastenzunahme. Die Konzentrationen 0,5 U bzw. 5 U verringerten die-

se auf 4,25 ± 0,23 (p = 0,009) bzw. 3,28 ± 0,19 (p = 0,007) sehr signifikant vergli-

chen mit den mit NaCl therapierten Fra2+/- Mäusen. (siehe Abb. 20)

6.2.2.3 Hydroxyprolin-Assay

Die bei Fra2+/- Mäusen entstehende Lungenfibrose ist an einem erhöhten Kollagen-

gehalt in der Lunge erkennbar. Der Kollagengehalt der Lunge wurde biochemisch

mit Hilfe eines Hydroxyprolin-Assays gemessen. Die nur mit Lösungsmittel behan-

delten Fra2+/- Mäuse haben einen 1,61± 0,06 -fach (p = 0,007) sehr signifikant er-

höhten Hydroxyprolingehalt im Vergleich zur Fra2-/- Kontrollgruppe. Die Gabe re-

kombinanter ADA der Konzentration 0,5 U bzw. 5 U verminderte die Erhöhung des

Hydroxyprolingehalt mit 1,21 ± 0,29 (p = 0,028) signifikant bzw. 1,06 ± 0,31 (p =

0,008) sehr signifikant. (siehe Abb. 21)

42

Abb. 22: Analyse der Gefäßwanddicke mit Hilfe der HE-Färbung. Die dargestellten Bilder veran-schaulichen den vaskulären Phänotyp des Fra-2-Modells mit verdickten Gefäßwänden und perivas-kulären Infiltraten von Entzündungszellen. Mit dem Lösungsmittel NaCl therapierte Fra2+/- Mäuse entwickelten dicke Gefäßwände. Durch Therapie mit rekombinanter ADA entstanden dünnere Ge-fäßwände im Vergleich zu den mit NaCl therapierten Fra2+/- Mäusen. (200 fache Vergrößerung)

6.2.3 Ergebnisse zur Umgestaltung der Lungenarterien

6.2.3.1 Gefäßwanddicke: Hämatoxylin-Eosin-Färbung

.

Fra2-/- NaCl Fra2+/- NaCl

Fra2+/- 0.5 U rekomb. ADA Fra2+/- 5 U rekomb. ADA

Abb. 23: Statistische Auswertung der Gefäßwanddicke. Man sieht eine deutlich höhere Gefäß-wanddicke bei den mit NaCl therapierten Fra2+/- Mäusen im Vergleich zur Fra2-/- Kontrollgruppe. Fra2+/- transgene Mäuse, welche mit rekombinanter ADA therapiert wurden, haben geringere Ge-fäßwanddicken als die mit NaCl therapierten Fra2+/- Mäuse.

43

Abb. 24: Darstellung stark stenosierter Lungenarterien mit Hilfe der HE-Färbung. Neben den verdickten Gefäßwänden sind stark stenosierte Lungenarterien typisch für den vaskulären Phänotyp des Fra-2 Modelles. Man sieht, dass die das Transgen nicht exprimierende Fra2-/- Kontrollgruppe keine stark stenosierten Lungenarterien aufweist. Fra2+/- transgene Mäuse besitzen dagegen stark stenosierte Gefäße und diese sind auch nach Therapie mit rekombinanter ADA noch vorhanden. (200 fache Vergrößerung)

Der durchschnittliche Lungenarteriengefäßwanddurchmesser war bei den mit Lö-

sungsmittel NaCl behandelten Fra2+/- Mäusen mit 1,81 ± 0,31 -fach (p = 0,016) sehr

signifikant gegenüber der Kontrollgruppe erhöht. Eine Behandlung der transgenen

Fra2+/- Mäuse mit rekombinanter ADA bewirkte im Vergleich zu den mit NaCl be-

handelten Fra2+/- Mäusen sehr signifikant geringere Gefäßwanddicken. Hierbei

wurde bei einer Konzentration von 0,5 U bzw. 5 U die Gefäßwanddicke auf das 1,21

± 0,19 -fache (p = 0,006) bzw. 1,09 ± 0,04 -fache (p = 0,003) der Fra2-/- Kontroll-

gruppe verringert. (siehe Abb. 23)

6.2.3.2 Stenosierte Lungenarterien: Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Fra2-/- NaCl Fra2+/- NaCl

Fra2+/- 5 U rekomb. ADA Fra2+/- 0.5 U rekomb. ADA

44

Abb. 25: Statistische Auswertung der stark stenosierten Lungenarterien. Man sieht, dass die Fra2-/- Kontrollgruppe keine stenosierten Gefäße besaß. Die mit NaCl behandelten Fra2+/- Mäuse haben den höchsten Prozentsatz an stark stenosierten Gefäßen. Mit rekombinanter ADA therapierte Fra2+/- Mäuse haben einen geringeren Prozentsatz an stark stenosierten Gefäßen als die mit NaCl therapierten Fra2+/- Mäuse.

Als stark stenosierte Lungenarterien wertete man Arterien, deren Lumendurchmesser

kleiner 10% der Gefäßwanddicke betrug. Die Therapie mit rekombinanter ADA an-

statt NaCl senkte signifikant den Prozentsatz an stark stenosierten Gefäßen mit 40,6

± 15,7% (p = 0,027) bei 0,5 U und 25,0 ± 20,4% (p = 0,015) bei 5 U. Die mit dem

Lösungsmittel NaCl therapierten Fra2+/- Mäuse wiesen mit 69,2 ± 20,5% den höchs-

ten Anteil an stenosierten Gefäßen auf. (siehe Abb. 25)

45

7. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit konnten wir zeigen, dass die Behandlung mit rekombi-

nanter ADA antifibrotische Effekte in dem cGvHD und dem Fra-2 Modell der SSc

bewirkte. Zusätzlich reduzierte die Behandlung mit ADA die vaskulären Verände-

rungen im Fra-2 Modell.

Das sklerodermiforme cGvHD Mausmodell spiegelte die Schlüsselmerkmale Fibro-

se, Entzündung und Autoimmunität der SSc wider. Durch Gabe rekombinanter ADA

konnte das Durchschnittsgewicht gegenüber mit Lösungsmittel therapierten alloge-

nen Mäusen erhöht werden. Die Therapie mit rekombinanter ADA bewirkte eine

signifikante Besserung der klinischen Beurteilung.

Die histologischen, immunhistologischen und biochemischen Untersuchungen verifi-

zierten die bessere klinische Beurteilung der mit rekombinanter ADA behandelten

Mäuse. So zeigten diese Mäuse eine signifikant geringere Hautdicke und Kollagen-

menge in der Haut im Vergleich zu den allogenen mit Lösungsmittel behandelten

Mäusen. Dieselben Ergebnisse brachte die immunhistologische Analyse. Rekombi-

nante ADA konnte die Anzahl der differenzierten Myofibroblasten hoch signifikant

gegenüber den mit dem Lösungsmittel NaCl behandelten allogenen Mäusen senken.

Insgesamt bewirkte die Gabe rekombinante ADA im Modell der cGvHD eine Ab-

schwächung des Krankheitsverlaufes und eine Besserung der Krankheitssymptome.

Gleichzeitig ließen sich keine Nebenwirkungen feststellen.

Das Fra-2-Mausmodell entwickelte neben Entzündung und Fibrose auch noch einen

vaskulären Phänotyp. So entwickelten die Fra-2 transgenen Mäuse neben der Fibrose

zusätzlich Gefäßveränderungen, wie den Verlust kleinster Hautkapillaren, eine Ver-

dickung der Gefäßwand in Lungenarterien und die Zunahme von stark stenosierten

Lungenarterien.

Wir untersuchten in diesem Modell die Wirkung der rekombinanten ADA in der

Haut und in der Lunge. Die starke Hautfibrose der Fra2+/- transgenen Mäuse konnte

durch Therapie mit rekombinanter ADA gebessert werden. So verringerte sich die

Hautdicke, die Kollagenmenge und die Myofibroblastenanzahl bei den mit rekombi-

nanter ADA therapierten Mäusen signifikant gegenüber den mit Lösungsmittel be-

handelten Fra2+/- Mäusen. Bei der Untersuchung der Lunge bewirkte die Therapie

mit rekombinanter ADA ähnliche Ergebnisse. Mit rekombinanter ADA therapierte

46

Mäuse besaßen signifikant weniger fibrotische Lungenbereiche, weniger Myo-

fibroblasten und einen niedrigeren Kollagengehalt in den Lungen als mit NaCl thera-

pierte Fra2+/- Mäuse. Die Therapie mit rekombinanter ADA bewirkte signifikant

dünnere und weniger stark stenosierte Lungengefäße im Vergleich zur Therapie der

Fra2+/- Mäuse mit dem Lösungsmittel NaCl.

Zusammengefasst brachte die Gabe rekombinanter ADA auch in diesem Modell sehr

gute therapeutische Effekte, ohne dass Nebenwirkungen beobachtet werden konnten.

Unsere Arbeit liefert damit nicht nur Hinweise darauf, dass die Behandlung mit re-

kombinanter ADA ein potentieller Behandlungsansatz sein könnte, sondern unter-

streicht in Übereinstimmung mit vorherigen Arbeiten die Bedeutung des Adenosin-

Systems für die Pathogenese fibrotischer Erkrankungen. So zeigte die Arbeitsgruppe

um Fernández et al. [20], dass Mäuse mit einem Mangel an ADA und einen daraus

resultierend erhöhten Gewebespiegel an Adenosin spontan Fibrose in der Lunge und

Haut entwickelten. Diese Fibrosierung kann durch Gabe eines A2A-Rezeptor-

Antagonisten ZM-241385 verhindert werden [20]. Ebenso zeigten sie in einem

Mausmodell, dass eine aufgrund externer Bleomycin-Gabe hervorgerufene Fibrose

durch Blockade des A2A-Rezeptors oder Knockout desselben verhindert werden

konnte [20]. Sie stellten zudem fest, dass Mäuse mit einem Mangel an den Enzymen

CD39 oder CD73 keine Bleomycin induzierte Hautfibrose entwickelten und geringe-

re Gewebespiegel an profibrotischen Zytokinen aufwiesen [19]. Die Enzyme CD39

und CD73 sind für den extrazellulären Umbau von ATP zu Adenosin verantwortlich

[65]. Das Enzym Adenosin-Desaminase kann sowohl extra- als auch intrazelluläres

Adenosin zu Inosin (INO) desaminieren [38] und es ist das bedeutendste Enzym zum

Abbau von Adenosin [20].

Rekombinante Adenosin-Desaminase wird bereits seit 1986 als Therapiemöglichkeit

bei Kindern mit angeborenem Adenosin-Desaminase (ADA)-Mangel angewendet,

welche bei Nichtbehandlung ansonsten einen schweren kombinierten Immundefekt

entwickeln [5]. Bis heute wurde dieses rekombinante Enzym bei mehr als 150 Pati-

enten verwendet und gut vertragen [5]. Bei Menschen mit angeborenem Mangel an

ADA kommt es neben einer Adenosin- auch zu einer Desoxyadenosin (dAdo)-

Anhäufung. Desoxyadenosin wird zu Desoxadenosintriphosphat (dATP) umgebaut

[5]. Der daraus resultierend erhöhte dATP-Spiegel hat eine toxische Wirkung auf

Lymphozyten und behindert die Lymphozytenproliferation [5]. Rekombinante ADA

senkt den extrazellulären dATP-Spiegel [5].

47

Bei ADA-defizienten Mäusen konnte bewiesen werden, dass die Stoffwechselpro-

zesse, welche zu Fibrose führen, trennbar von denen sind, die den Immundefekt aus-

lösen. [5]. Blackburn et al. [4] stellte fest, dass bei Mäusen, die aufgrund ADA-

Mangel einen Immundefekt sowie eine Fibrose und Entzündung in der Lunge entwi-

ckelten, die Gabe rekombinanter ADA in niedriger Konzentration zwar die Lungen-

fibrose und Entzündung besserte, aber auf den Immundefekt keine Wirkung hatte [4].

Durch Gabe rekombinanter ADA in niedriger Konzentration konnten die erhöhten

Gewebespiegel an dATP in der Lunge gesenkt werden [4]. Die dATP-Spiegel im

Thymus und der Milz blieben allerdings weiterhin erhöht [4]. Durch Therapie mit

einer hohen Konzentration rekombinanter ADA konnte auch der Immundefekt ver-

bessert werden [4]. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Lungenfibrose und der

Immundefekt zwei voneinander trennbare Erscheinungsbilder darstellen, welche

durch einen unterschiedlichen Grad an Stoffwechselstörungen im Zusammenhang

mit ADA-Mangel entstehen [4].

Diese Ergebnisse verstärken, zusammen mit unseren Ergebnissen, dass rekombinante

ADA einen positiven Einfluss auf mehrere pathologische Stoffwechselprozesse ha-

ben könnte.

Neben den antifibrotischen und antiinflammatorischen Effekten rekombinanter

ADA, welche bereits Blackburn et al. [4] feststellten, konnten wir in unserer Arbeit

zusätzlich noch eine gefäßschützende Wirkung rekombinanter ADA im Fra-2-

Modell feststellen.

Rekombinante ADA wird mittlerweile seit knapp 30 Jahren in der Klinik verwendet.

Bis heute gibt es keine Berichte von toxischen Reaktionen oder Überempfindlich-

keitsreaktionen, welche durch rekombinante ADA ausgelöst wurden [5]. Somit

scheint es sich um ein sicheres Medikament mit großer klinischer Erfahrung zu han-

deln.

A2A-Rezeptorantagonisten, wie z.B. ZM-241385, bewirkten bei ADA-defizienten

Mäusen ebenfalls eine Besserung der Fibrose [16, 20]. Diese wirken eventuell auch

selektiver als rekombinante ADA. ZM-241385 befindet sich derzeit in klinischer

Erprobung, unter anderem bei der Therapie von Morbus Alzheimer und Morbus Par-

kinson [49]. Im Vergleich zu rekombinanter ADA fehlen jedoch Langzeitergebnisse

und Erfahrungen mit diesem Medikament.

48

Diese Arbeit untersuchte die Wirkung rekombinanter ADA zur Prävention SSc-

artiger Veränderungen in zwei etablierten Mausmodellen. Für die klinische Anwen-

dung wäre es jedoch ebenfalls interessant, ob eine Behandlung mit ADA auch bei

bereits manifesten Symptomen wirksam ist. Hierzu sollte in weiteren Studien die

Wirksamkeit von ADA auch im therapeutischen Einsatz bei bereits klinisch manifes-

ten Symptomen in präklinischen Modellen untersucht werden. Außerdem sollte wei-

ter analysiert werden, welche molekularen Mechanismen der gefäßprotektiven Wir-

kung zugrunde liegen.

Zusammenfassend konnten wir somit zeigen, dass rekombinante ADA in zwei ver-

schiedenen Mausmodellen der SSc sowohl vaskuläre als auch fibrotische Verände-

rungen reduzieren kann, ohne dass Nebenwirkungen durch die Therapie ausgelöst

wurden.

49

8. Literaturverzeichnis

1. Agarwal SK, Tan FK, Arnett FC. Genetics and genomic studies in sclero-

derma (systemic sclerosis). Rheum Dis Clin .orth Am. 2008; 34:17-40

2. Antonioli A, Fornai M, Colucci R, Ghisu $, Tuccori M, Del Tacca M, et

al. Pharmacological modulation of adenosine system: novel options for

treatment of inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 2008;

14:566–74

3. Beyer C, Schett G, Distler O, Distler JH: Animal models of systemic scle-

rosis: prospects and limitations. Arthritis Rheum. 2010; 62(10):2831-44

4. Blackburn MR, Aldrich M, Volmer JB, et al. The use of enzyme therapy to

regulate the metabolic and phenotypic consequences of adenosine deaminase

deficiency in mice. Differential impact on pulmonary and immunologic ab-

normalities. J Biol Chem. 2000; 275(41):32114–32121

5. Booth C, Gaspar HB. Review: Pegademase bovine (PEG-ADA) for the

treatment of infants and children with severe combined immunodeficiency

(SCID). Biologics. 2009; 3:349-58

6. Burnstock G. Purine and pyrimidine receptors. Cell Mol Life Sci. 2007;

64:1471–83

7. Chan ES, Fernandez P, Merchant AA, Montesinos MC, Trzaska S, Desai

A, et al. Adenosine A2A receptors in diffuse dermal fibrosis: pathogenic role

in human dermal fibroblasts and in a murine model of scleroderma. Arthritis

Rheum. 2006; 54(8):2632–42

8. Chifflot H, Fautzi B, Sordet C, Chatelus E, Sibilia J. Incidence and preva-

lence of systemic sclerosis: a systematic literature review. Semin Arthritis

Rheum. 2008; 37:223-35

50

9. Claman H$, Jaffee BD, Huff JC, Clark RA. Chronic graft-versus-host dis-

ease as a model for scleroderma. II. Mast cell depletion with deposition of

immunoglobulins in the skin and fibrosis. Cell Immunol. 1985; 94:73–84

10. Del Ry S, Cabiati M, Lionetti V, Aquaro GD, Martino A, Mattii L, et al.

Pacing-induced regional differences in adenosine receptors mRNA expres-

sion in as wine model of dilated cardiomyopathy. PLoS O.E 2012;

7(10):e4701

11. Del Ry S, Cabiati M, Martino A, Simioniuc A, Morales M-A, Picano E.

Adenosine-receptor mRNA expression in normal and failing minipig hearts. J

Cardiovasc Pharmacol. 2011; 58:149–56

12. Derk CT, Jimenez SA. Systemic sclerosis: current views of its pathogenesis.

Autoimmun Rev. 2003; 2:181-91.

13. Distler JH, Jungel A, Huber LC, Schulze-Horsel U, Zwerina J, Gay RE,

Michel BA, Hauser T, Schett G, Gay S, Distler O. Imatinib mesylate

reduces production of extracellular matrix and prevents development of

experimental dermal fibrosis. Arthritis Rheum. 2007; 56:311-22.

14. Duncan MR, Berman B. Stimulation of collagen and glycosaminoglycan

production in cultured human adult dermal fibroblasts by recombinant human

interleukin 6. J Invest Dermatol. 1991; 97:686-92.

15. Eckes B, Mauch C, Hüppe G, Krieg T. Differential regulation of transcrip-

tion and transcript stability of pro-alpha1(I) collagen and fibronectin in acti-

vated fibroblasts derived from patients with systemic scleroderma. Biochem

J. 1996; 315:549-54.

16. Edwin S. L., Chan ES, Cronstein B$. Adenosine in fibrosis. Mod Rheu-

matol. 2010; 20(2): 114–122

51

17. Eferl R, Hasselblatt P, Rath M, Popper H, Zenz R, Komnenovic V, et al.

Development of pulmonary fibrosis through a pathway involving the tran-

scription factor Fra-2/AP-1. Proc .atl Acad Sci USA 2008; 105:10525–30

18. Englert H, Small-McMahon J, Chambers P, et al. Familial risk estimation

in systemic sclerosis. Aust .ZJ Med. 1999; 29:36-41

19. Fernández P, Perez-Aso M, Smith G, Wilder T, Trzaska S, Chiriboga L,

Franks A Jr, Robson SC, Cronstein B$, Chan ES. Extracellular genera-

tion of adenosine by the ectonucleotidases CD39 and CD73 promotes dermal

fibrosis. Am J Pathol. 2013; 183(6):1740-6

20. Fernández P, Trzaska S, Wilder T, Chiriboga L, Blackburn MR,

Cronstein B$, Chan ES. Pharmacological blockade of A2A receptors pre-

vents dermal fibrosis in a model of elevated tissue adenosine. Am J Pathol.

2008; 172(6):1675-82

21. Fleischmajer R, Perlish JS, West WP. Ultrastructure of cutaneous cellular

infiltrates in scleroderma. Arch Dermatol. 1977; 113:1661

22. Fleischmajer R, Perlish JS. Capillary alterations in scleroderma. J Am Acad

Dermatol. 1980; 2:161-70

23. Fleming J$, $ash RA, McLoad DO, et al. Capillary regeneration in sclero-

derma: stem cell therapy reverses phenotype? PLoS One 2008; 3(1):e1452

24. Freedholm BB, Arslan G, Halldner L, Kull B, Schulte G, Wasserman W.

Structureand function of adenosine receptors and their genes. .aunyn-

Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. 2000; 362:364–74

25. Freedholm BB, Ljzerman AP, Jacobson KA, Klotz K$, Linden J. Inter-

national Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of

adenosine receptors. Pharmacol Rev. 2001;53:527–52

52

26. Gabrielli A, M.D., Avvedimento EV, M.D., Krieg T, M.D. Scleroderma

Mechanisms of Disease, review article, . Engl J Med. 2009; 360:1989-2003

27. Harrison $K, Myers AR, Corrin B, et al. Structural features of interstitial

lung disease in systemic sclerosis. Am Rev Respir Dis. 1991; 144:706-13

28. Hasegawa M, Fujimoto M, Kikuchi K, Takehara K. Elevated serum levels

of interleukin 4 (IL-4), IL 10, and IL-13 in patients with systemic sclerosis. J

Rheumato.l 1997; 24:328-32

29. Hasegawa M, Sato S, Fujimoto M, Ihn H, Kikuchi K, Takehara K. Serum

levels of interleukin 6 (IL-6), oncostatin M, soluble IL-6 receptor, and soluble

gp130 in patients with systemic sclerosis. J Rheumatol. 1998; 25:308-13

30. Hasko G, Cronstein B$. Adenosine: an endogenous regulator of innate im-

munity. Trends Immunol. 2004; 25:33–9

31. Hoskins LC, $orris HT, Gottlieb LS, Zamcheck $. Functional and mor-

phologic alterations of the gastrointestinal tract in progressive systemic scle-

rosis (scleroderma). Am J Med. 1962; 33:459-70

32. Jaffee BD, Claman H$. Chronic graft-versus-host disease (GVHD) as a

model for scleroderma. I. Description of model systems. Cell Immunol. 1983;

77:1–12

33. Kahaleh, M.D. Raynaud phenomenon and the vascular disease in SSc.

Curr. Opin. Rheumatol. 2004; 16:718–722

34. Karmouty-Quintana H, Xia Y, Blackburn MR. Adenosine signaling dur-

ing acuteand chronic disease states. J Mol Med. 2013; 91:173–81

35. Katebi M, Fernandez P, Chan ES, Cronstein B$. Adenosine A2A receptor

blockade or deletion diminishes fibrocyte accumulation in the skin in a mu-

rine model of scleroderma, bleomycin-induced fibrosis. Inflammation. 2008;

31(5):299-303

53

36. Kräling BM, Maul GG, Jimenez SA. Mononuclear cell infiltrates in clini-

cally involved skin from patients with systemic sclerosis of recent onset pre-

dominantly consist of monocytes/macrophages. Pathobiology 1995; 63:48-56

37. Lambert $C, Lo YM, Erickson TD, Tylee TS, Guthrie KA, Furst DE, et

al. Male microchimerism in healthy women and women with scleroderma:

cells or circulating DNA? A quantitative answer. Blood 2002; 100:2845–51

38. Latta V, Cabiati M, Rocchicciolia S, Del Ry S, Morales MA. Review: The

role of the adenosinergic system in lung fibrosis, Pharmacological Research

2013; 76:182– 189

39. Lawley TJ, Peck GL, Moutsopoulos HM, Gratwohl AA, Deisseroth AB.

Scleroderma, Sjögren-like syndrome, and chronic graft-versus-host disease.

Ann Intern Med. 1977; 87:707–9

40. LeRoy EC. Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts in

vitro: a possible defect in the regulation or activation of the scleroderma fi-

broblast. J Clin Invest. 1974; 54:880-9

41. LeRoy EC, Black C, Fleischmajer R, et al. Scleroderma (systemic sclero-

sis): classification, subsets and pathogenesis. J Rheumatol 1988; 15: 202-5

42. Loubière LS, Lambert $C, Madeleine MM, et al. HLA allelic variants en-

coding DR11 in diffuse and limited systemic sclerosis in Caucasian women.

Rheumatology (Oxford) 2005; 44:318-22

43. Maurer B, Busch $, Jungel A, Pileckyte M, Gay RE, Michel BA, et al.

Transcription factor fos-related antigen-2 induces progressive peripheral vas-

culopathy in mice closely resembling human systemic sclerosis. Circulation

2009; 120:2367–76

54

44. Mavalia C, Scaletti C, Rom agnani P, et al. Type 2 helper T-cell predomi-

nance and high CD30 expression in systemic sclerosis. Am J Pathol. 1997;

151:1751-1758

45. Mayes MD, Lacey JV, Beebe-Dimmer J, et al. Prevalence, incidence, sur-

vival, and disease characteristics of systemic sclerosis in a large US popula-

tion. Arthritis Rheum. 2003; 48:2246-55

46. Medsger TA. Systemic sclerosis (scleroderma): clinical aspects. In:

Koopman WJ. ed.: Arthritis and allied conditions: a textbook of rheumatol-

ogy. Philadelphia: Williams & Wilkins 1997:1433-65

47. $elson JL, Furst DE, Maloney S, Gooley T, Evans PC, Smith A, et al.

Microchimerism and HLA-compatible relationships of pregnancy in sclero-

derma. Lancet 1998; 351:559–62

48. $ietert PJ, Silver R M. Systemic sclerosis: environmental and occupational

risk factors. Curr Opin Rheumatol. 2000; 12:520-6

49. Oscar P Dall'lgna, Lisiane O Porciúncula, Diogo O Souza, Rodrigo A

Cunha, and Diogo R Lara :Neuroprotection by caffeine and adenosine A2A

receptor blockade of β-amyloid neurotoxicity Br J Pharmacol. 2003; 138(7):

1207–1209

50. Perez-Aso M, Fernandez P, Mediero A, Chan ES, Cronstein B$. Adeno-

sine 2A receptor promotes collagen production by human fibroblasts via

pathways involving cyclic AMP and AKT but independent of Smad2/3. FA-

SEB J. 2014; 28(2):802-12

51. Prescott RJ, Freemont AJ, Jones CJ, Hoyland J, Fielding P. Sequential

dermal microvascular and perivascular changes in the development of sclero-

derma. J Pathol. 1992; 166:255-63

52. Rajkumar VS, Howell K, Csiszar K, Denton CP, Black CM, Abraham

DJ. Shared expression of phenotypic markers in systemic sclerosis indicates a

55

convergence of pericytes and fibroblasts to a myofibroblast lineage in fibro-

sis. Arthritis Res Ther. 2005; 7: R1113-R1123

53. Ralevic V, Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol

Rev. 1998; 50:413–92

54. Reich $, Maurer B, Akhmetshina A, Venalis P, Dees C, Zerr P, et al. The

transcription factor Fra-2 regulates the production of extracellular matrix in

systemic sclerosis. Arthritis Rheum. .2010; 62:280–90

55. Reveille JD. Ethnicity and race in systemic sclerosis: how it affects suscepti-

bility, severity, antibody genetics, and clinical manifestations. Curr Rheu-

matol Rep. 2003; 5:16 0 -7

56. Roumm AD, Whiteside TL, Medsger TA Jr, Rodnan GP. Lymphocytes in

the skin of patients with progressive systemic sclerosis: quantification, sub-

typing, and clinical correlations. Arthritis Rheum. 1984; 27:645-53

57. Sachdeva S, Gupta M. Adenosine and its receptors as therapeutic targets: an

overview. Saudi Pharmaceutical Journal 2013; 21:245-53

58. Sakkas, L.I. and Platsoucas, C.D. Is systemic sclerosis an antigen-driven T

cell disease? Arthritis Rheum. 2004; 50:1721–1733

59. Sakkas LI, Xu B, Artlett CM, Lu S, Jiminez SA, Platsoucas CD. Oligo-

clonal T cell expansion in the skin of patients with systemic sclerosis. J Im-

munol. 2002; 68:3649-59

60. Varga J, Abraham D Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic

disorder. J Clin Invest. 2007; 117:557-567

61. Vogelsang GB, Lee L, Bensen-Kennedy DM. Pathogenesis and treatment of

graft-versus-host disease after bone marrow transplant. Annu Rev Med. 2003;

54:29–52

56

62. Wagner EF, Eferl R. Fos/AP-1 proteins in bone and the immune system.

Immunol Rev. 2005; 208:126–40

63. Whitfield ML, Finlay DR, Murray JI, et al. Systemic and cell type-specific

gene expression patterns in scleroderma skin. Proc .atl Acad Sci USA 2003;

100:12319-24

64. Zhou Y, Murthy J$, Zeng D, Belardinelli L, Blackburn MR. Alterations

in adeno-sine metabolism and signaling in patients with chronic obstructive

pulmonary disease and idiopathic pulmonary fibrosis. PLoS O.E 2010;

5(2):e9224

65. Zhou Y, Schneider DJ, Blackburn MR. Adenosine signaling and the regu-

lation of chronic lung disease. Pharmacol Ther. 2009; 123:105–16

57

9. Abkürzungsverzeichnis

ADA Adenosin-Desaminase

ADK Adenosinkinase

ADP Adenosindiphosphat

AMP Adenosinmonophosphat

AP-1 Aktivator-Protein-1

ATP Adenosintriphosphat

A1R Adenosin-Rezeptor-1

A2AR Adenosin-Rezeptor-2A

A2BR Adenosin-Rezeptor-2B

A3R Adenosin-Rezeptor-3

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

CD39 Ectonucleoside triphosphate Diphosphohydrolase

CD73 Ecto-5‘-Nucleotidase

cGvHD chronische Graft-versus-Host-Erkrankung

cGy Zentigray

CTGF connective tissue growth factor

DAB 3,3’-Diaminobenzidin tetrahydrochloride

dAdo Desoxyadenosin

dATP Desoxadenosintriphosphat

ENT equilibrative nucleoside transporter

EZM Extrazelluläre Matrix

Fra-2 Fos-related-Antigen-2

HE Hämatoxylin und Eosin

HLA Human Leukocyte Antigen

INO Inosin

MHA minor histocompatibility Antigene

58

MHCs major histocompatibility complexes

PAH pulmonal-arterielle Hypertonie

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PDGF platelet-derived growth factor

r-ADA rekombinante Adenosin-Desaminase

rekomb. ADA rekombinante Adenosin-Desaminase

αSMA α-Smooth-Muscle-Actin

SSc Systemische Sklerose

TGF-β Transforming-Growth-Factor-β

59

10. Chemikalien/ Materialien

PBS Life technologies, Germany

70 µm Nylon-Netze BD Biosciences, Heidelberg, Germany

NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany

4%iges Formalin Carl Roth, Karlsruhe, Germany

Hämatoxylin Merk, Germany

Eosin Carl Roth, Karlsruhe, Germany

Nikon Eclipse 80i Nikon, Badhoevedorp, Niederlande

Mikroskop

Bouin’scher Lösung Sigma-Aldrich, USA

Weigert’sche Hämatoxylin Sigma, Germany

-Eisenlack-Lösung

Biebrich-Scharlachrot- Sigma-Aldrich, USA

Säurefuchsin-Lösung

Phosphor-Wolframsäure Carl Roth, Karlsruhe, Germany

Molybdatophosphorsäure Carl Roth, Karlsruhe, Germany

Anilinblau Sigma-Aldrich, USA

Roti®-Histokitt Carl Roth, Karlsruhe, Germany

5%iges Pferdeserum Life technologies, Germany

3%iges H2O2 Carl Roth, Karlsruhe, Germany

monoklonaler anti- clone 1A4, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany

α-SMA-Antikörper

Meerrettich-Peroxidase Dako, Hamburg, Deutschland

60

DAB (3,3‘-Diaminobenzidin Sigma-Aldrich, USA

tetrahydrochloride)

Peroxidase-Substrat-Lösung Sigma-Aldrich, USA

monoklonaler IgG Maus Calbiochem, San Diego, CA, USA

Antikörper

6 M HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany

6 M NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany

Lackmuspapier Carl Roth, Karlsruhe, Germany

0,06 M Chloramin T Sigma, Germany

3,15 M Perchlorsäure Merck, Germany

20%iger para-Dimethyl- Fluka, Germany

aminobenzaldehyd

Spectra MAX 190 Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA

Mikroplatten Spektral

Photometer

Picro-Sirius Red Sigma-Aldrich, USA

Zeiss Axioskop 2 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany

Mikroskop

OsteoMeasure Osteometrics, Decatur, GA

GraphPad PrismV GraphPad Software, USA

Excel Microsoft Corporation, USA

61

Verwendete Mäuse

B10.D2 (H-2d) Mäuse Laboratory (Bar Harbour, ME)

Balb/c (H-2d) Mäuse Janvier (Le Genest, St. Isle, France)

Fra-2-Mäuse Arbeitsgruppe Prof. Erwin F. Wagner

62

11. Danksagung

Zuallererst möchte ich mich bei meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Jörg Distler,

für die Überlassung des Dissertationsthemas und die außerordentlich gute Betreuung

während der gesamten Arbeitszeit bedanken.

Mein ganz besonderer Dank geht an Frau Yun Zhang, ohne deren Unterstützung und

Rat bei Problemen das Gelingen dieser Arbeit sicher nicht möglich gewesen wäre.

Ebenso möchte ich mich bei Herrn PD Dr. Christian Beyer sehr bedanken, der stets

ein offenes Ohr hatte, wenn Probleme auftauchten.

Allen Mitarbeitern der AG Distler gilt ebenso großer Dank für das angenehme Ar-

beitsklima und der Hilfestellung bei Laborarbeiten.

Meinem Bruder Dr. Christian Layritz möchte ich für hilfreiche Ratschläge während

meines Studiums und bei der Dissertation sehr danken.

Schließlich möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir stets hilfsbereit

zur Seite standen und mich in jeder erdenklichen Art und Weise während meines

gesamten Studiums unterstützten.

63

12. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Florian Philip Layritz

Geburtsdatum: 16.03.1989

Geburtsort: Erlangen

Adresse: Erlenstraße 40

90562 Kalchreuth

Familienstand: Ledig

Persönlicher Werdegang

Schulbildung:

09/1995 - 07/1999 Grundschule Kalchreuth

09/1999 - 07/2008 Gymnasium Eckental

Abschluss: Abitur

Zivildienst:

09/2008 - 05/2009 Bayerisches Rotes Kreuz Erlangen

Studium:

10/2009 - 06/2015 Studium der Zahnmedizin an der Fried-

rich-Alexander-Universität Erlangen-

Nürnberg

Studienabschluss: Staatsexamen

08/2010 Naturwissenschaftliche Vorprüfung

Gesamtnote:1

03/2012 Zahnärztliche Vorprüfung

Gesamtnote: 1

06/2015 Zahnärztliche Prüfung

Gesamtnote: 2

11/2012 - 11/2015 Promotionsstudien in der Medizinischen

Klinik III des Universitätsklinikums Er-

langen