Die Bedeutung des extrazellulären Matrixproteins Reelin...

Die Bedeutung des

extrazellulären Matrixproteins Reelin

für kognitive Funktionen der Ratte

Aus dem Institut für Hirnforschung, Abteilung Neuropharmakologie,

Zentrum für Kognitionswissenschaften

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Vorgelegt dem Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) der Universität Bremen

von

Jan Brosda

im August 2009

1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Koch

2. Gutachter: Prof. Dr. Ursula Dicke

Erklärung

Die Untersuchungen, auf denen die hier vorliegende Dissertation beruht, habe ich

selbständig durchgeführt und ausgewertet. Das Manuskript habe ich eigenständig

verfasst. Es wurden keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel

benutzt. Wörtlich und inhaltlich entnommene Stellen aus den angegebenen Quellen

sind gekennzeichnet.

Jan Brosda

Bremen, den 20. August 2009

Für Nina

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ................................................................................ 1

1.1 Allgemeine Einführung ............................................................ 1

1.2 Reelin – von der reeler-Mausmutante zum Protein .................. 3

1.2.1 Das Reelin-Gen und das Reelin-Molekül .................................................... 4

1.2.2 Das Reelin-Signal: Rezeptoren und Signaltransduktion............................. 7

1.2.3 Das Reelin-Signal im adulten Organismus................................................ 10

1.3 Der präfrontale Cortex............................................................15

1.3.1 Die Anatomie des PFC ................................................................................15

1.3.2 Die Konnektivitäten, zelluläre Organisation und Neurotransmitter

des PFC........................................................................................................17

1.4 Schizophrenie ........................................................................ 21

1.4.1 Symptomatik ...............................................................................................21

1.4.2 Ätiologie ..................................................................................................... 22

1.4.3 Neuropathologie......................................................................................... 23

1.4.4 Der PFC und die Schizophrenie................................................................. 26

1.4.5 Reelin und die Schizophrenie .................................................................... 27

1.5 Tiermodelle ........................................................................... 32

1.5.1 Die Präpulsinhibition der akustisch ausgelösten Schreckreaktion........... 32

1.5.2 Bewertung des Kurzzeitgedächtnisses: Der T-Maze- und der Object-

Recognition-Test ........................................................................................ 36

1.5.3 Messung der lokomotorischen Aktivität: Der Open-Field-Test................ 37

1.5.4 Bewertung des spontanen Angstverhaltens: Der Elevated-Plus-

Maze-Test ...................................................................................................40

1.5.5 Bewertung der Motivation: Die Breakpoint-Bestimmung im

Progressive-Ratio-Test...............................................................................40

1.6 Zielsetzung der Arbeit............................................................ 43

2. Material und Methoden.......................................................... 45

2.1 Versuchstiere......................................................................... 45

IX

Inhaltsverzeichnis

2.2 Antisense-Oligonukleotide .....................................................46

2.3 Experimentelles Design .........................................................48

2.4 Stereotaktische Operation .....................................................50

2.5 Injektionsphase ......................................................................51

2.6 Tiermodelle ........................................................................... 52

2.6.1 Präpulsinhibition der akustisch ausgelösten Schreckreaktion ................. 52

2.6.2 T-Maze-Test ............................................................................................... 54

2.6.3 Object-Recognition-Test ............................................................................ 56

2.6.4 Lokomotorische Aktivität .......................................................................... 56

2.6.5 Elevated-Plus-Maze-Test ........................................................................... 58

2.6.6 Progressive-Ratio-Test............................................................................... 59

2.7 Histologische und biochemische Untersuchungen .................60

2.7.1 Präparation der Gehirne – Histologie (Nissl-Färbung) .............................61

2.7.2 Nissl-Färbung..............................................................................................61

2.7.3 Histologische Auswertung ..........................................................................61

2.7.4 Präparation der Gehirne – Biochemie (Western Blot)...............................61

2.7.5 Proteinbestimmung nach Bradford ........................................................... 62

2.7.6 SDS-Page .................................................................................................... 62

2.7.7 Western Blot............................................................................................... 63

2.8 Statistische Datenanalyse.......................................................64

3. Ergebnisse ............................................................................. 67

3.1 Histologische und biochemische Auswertung – Pubertäre

und adulte Gruppe ................................................................. 67

3.1.1 Histologische Auswertung ......................................................................... 67

3.1.2 Biochemische Auswertung......................................................................... 70

3.2 Verhaltenstests – Pubertäre Gruppe ...................................... 73


3.2.3 T-Maze-Test ............................................................................................... 75

3.2.4 Object-Recognition-Test .............................................................................77

X

Inhaltsverzeichnis

XI

3.2.5 Lokomotorische Aktivität .......................................................................... 79

3.2.6 Elevated-Plus-Maze-Test ...........................................................................80

3.2.7 Progressive-Ratio-Test...............................................................................82

3.3 Verhaltenstests – Adulte Gruppe............................................84

3.3.1 Präpulsinhibition der akustisch ausgelösten Schreckreaktion .................84

3.3.2 T-Maze-Test ...............................................................................................86

3.3.3 Lokomotorische Aktivität ..........................................................................88

4. Diskussion ............................................................................. 91

4.1 Histologische und biochemische Auswertung ........................ 93

4.2 Angewandte Tiermodelle .......................................................96


4.2.2 Kurzzeitgedächtnis: Der T-Maze- und Object-Recognition-Test............ 102

4.2.3 Lokomotorische Aktivität ........................................................................ 106

4.2.4 Angstverhalten: Der Elevated-Plus-Maze-Test ....................................... 108

4.2.5 Motivation: Der Progressive-Ratio-Test...................................................110

4.3 Zusammenfassung ................................................................ 113

5. Literaturverzeichnis.............................................................. 117

6. Danksagung .......................................................................... 151

Abkürzungsverzeichnis


5-HT 5-Hydroxytryptamin (Serotonin)

ACd Anteriorer cingulärer Cortex

ACh Acetylcholin

AMPA �-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-Propionsäure

ANOVA Analysis of variance

AON Antisense-Oligonukleotid

ApoE Apolipoprotein E

Arc Activity regulated cytoskeletal protein

AS Reelin-antisense

ASR Akustisch ausgelöste Schreckreaktion

BSA Rinder-Serum-Albumin

Ca2+ Calcium

cm Zentimeter

CP Cortikalplatte

CPu Nucleus caudatus, Putamen

CR Cajal-Retzius Zellen

CREB Cyclic adenosine monophosphate response element binding protein

CRF Continuous reinforcement

DA Dopamin

Dab1 Cytoplamatisches Adapterprotein disabeld 1

dB Dezibel

dlPFC Dorsolateraler präfrontaler Cortex

DNA Desoxyribonukleinsäure

Dnmt1 DNA-Methyltransferase 1

DSM IV Diagnostisches und Statistisches Handbuch Psychischer Störungen

EGF Epidermal growth factor

EPM Elevated-Plus-Maze

EZM Extrazelluläre Matrix

FR Fixed ratio

FR 2 Frontales Areal 2

F-SP F-Spondin

g Gramm

GABA �-Aminobuttersäure

XIII


GAD67 Glutamat-Decarboxylase 67kDa

Glu Glutamat

GSK3� Glykogen-Synthase-Kinase 3�

h Stunde

i.p. Intraperitoneal

IL Infralimbisches Areal

ITI Intertrialintervall

kb Kilobasen(-paare)

kDa Kilodalton

kg Kilogramm

Lis1K Lissenzephalie-1-Komplex

LTP Langzeitpotenzierung

M Mol

mA Milliampere

MDT Mediodorsaler Thalamus

mg Milligramm

min Minute

mm Millimeter

mPFC Medialer präfrontaler Cortex

mRNA Messenger Ribonukleinsäure

ms Millisekunde

MS Scramble-missense

n Anzahl der Tiere

MZ Marginalzone

NAc Nucleus accumbens

nm Nanometer

NMDA N-Methyl-D-Aspartat

OF Open-Field

OR Object-Recognition

PBS Phosphat buffered saline

PCP Phencyclidin

pd postnatal Tag

PFC Präfrontaler Cortex

pH Pondus Hydrogenii

PKB Proteinkinase B

XIV


XV

PL Prälimbisches Areal

Pl3K Phosphatidylinositol-3-Kinase

PM Pia mater

PnC Nucleus reticularis pontis caudalis

PPI Präpulsinhibition

PPTg Pedunculopontiner tegmentaler Nucleus

PR Progressive ratio

PSD95 Postsynaptic density protein 95

PTO Phosphothioat-Oligonukleotid

PVDF Polyvinylidenfluorid

RG Radialgliazellen

RM Repeated measure

S Signalpeptid

SDS-Page Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

sek Sekunde

SP Subplatte

SPL Sound pressure level

V Volt

VLDL Very-low-density Lipoprotein

VP Ventrales Pallidum

VTA Ventrales tegmentales Areal

ZNS Zentrales Nervensystem

°C Grad Celsius

�3�1I Alpha-3-beta-1 Integrin

μl Mikroliter

� tau-Protein

Einleitung

1. Einleitung

1.1 Allgemeine Einführung

Reelin ist ein Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das eine wichtige Rolle sowohl

während der Embryogenese als auch im adulten Organismus spielt. Einhergehend

mit der Entdeckung des Reelin-Gens im Jahr 1995, wurden in verschiedenen

Arbeiten interessante und auch überraschende Erkenntnisse über Reelin gewonnen.

Trotz dieses Erkenntnisfortschritts sind noch viele Fragen im Bereich der Reelin-

Forschung ungeklärt und weitere Studien sind notwendig, um das Protein im Kontext

der Cortikogenese aber auch seine Rolle bei der Ätiologie neuropsychiatrischer

Erkrankungen besser verstehen und einordnen zu können.

Reelin moduliert während der Embryogenese entscheidende Schritte der

neuronalen Entwicklung. Das Protein bindet an verschiedene Rezeptoren, die das

Reelin-Signal intrazellulär verarbeiten, und kontrolliert sowohl wichtige Prozesse der

Neuronenmigration als auch die Strukturierung der cortikalen Cytoarchitektur. Die

schwerwiegenden Konsequenzen einer Dysfunktion dieses zentralen Signalsystems

zeigen sich deutlich bei der reeler-Mausmutante, die bereits in den 50er Jahren des

vergangenen Jahrhunderts entdeckt und beschrieben wurde. Diese Spontanmutante

ist durch spezifische Merkmale wie eine gestörte Reelin-Expression, Anomalien der

cortikalen und cerebellären Struktur sowie motorischen Verhaltensdefiziten

charakterisiert.

Neben der bereits gut verstandenen Funktion des Proteins während der

Embryogenese, weisen verschiedene Studien auf eine entscheidende Rolle von Reelin

sowohl bei schizophrenen Störungen als auch bei molekularen Prozessen der

Gedächtnisbildung hin. Die Schizophrenie ist eine chronische psychische

Erkrankung, die das Leben betroffener Personen sowie ihrer Angehörigen massiv

beeinflusst. Nach heutigem Wissensstand sind sowohl Störungen in der Homöostase

verschiedener Transmittersysteme als auch hirnmorphologische Anomalien

entscheidende Faktoren der Erkrankung. Interessanterweise ergaben verschiedene

Studien zu diesem Thema, dass eine cortikale Reduktion der Reelin-Konzentration

sowohl die Abnahme des Neuropilvolumens als auch eine Beeinträchtigung der

Transmitterbalance verursacht, so dass von einer zentralen Rolle von Reelin in der

Pathophysiologie der Schizophrenie ausgegangen werden kann. Ob diese Reelin-

Verarmung jedoch primär durch epigenetische bzw. genetische Faktoren oder

1

Einleitung

sekundär durch einen allgemeinen zellulären Verlust der Reelin-positiven

GABAergen Interneurone verursacht wird, konnte in bisherigen Studien nicht

eindeutig geklärt werden. Des Weiteren bildet Reelin im adulten Organismus einen

funktionellen Komplex mit dem NMDA-Rezeptor und nimmt so auf physiologischer

Ebene Einfluss auf Lern- und Gedächtnisprozesse, was durch verschiedene in vitro

Studien nachgewiesen werden konnte. Trotz dieser wichtigen Erkenntnisse auf dem

Gebiet der Reelin-Forschung konnten in vivo bisher noch keine aussagekräftigen

Ergebnisse zur physiologischen Funktionsweise bzw. Rolle von Reelin im adulten

Organismus erzielt werden.

Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt eines

temporären Reelin-knockdowns im medialen präfrontalen Cortex auf das Verhalten

von Ratten untersucht. Der mediale präfrontale Cortex ist ein Hirnareal, das in

verschiedenen Verhaltensleistungen und kognitiven Funktionen von Säugetieren

involviert ist. Zudem werden präfrontocortikale Dysfunktionen als Ursache von

kognitiven Störungen und Verhaltensauffälligkeiten, wie sie bei bestimmten

neuropsychiatrischen Erkrankungen auftreten, angesehen.

Die Hemmung der Reelin-Synthese im Rattenhirn wurde durch eine lokale

Mikroinfusion von Reelin-antisense-Oligonukleotiden induziert und erfolgte

entweder bei adulten Ratten oder während der Pubertät, einer durch progressiven

sowie regressiven neuronalen Wandel charakterisierten kritischen

Entwicklungsphase. Die antisense-Technik besitzt gegenüber Untersuchungen an der

reeler-Maus den entscheidenden Vorteil, dass ein temporärer und topographisch

begrenzter Reelin-knockdown durchgeführt werden kann und dass sowohl die

Befunde der biochemischen und histologischen Untersuchungen als auch die

Ergebnisse der verschiedenen Verhaltenstests direkt auf das spezifisch induzierte

Reelin-Defizit im medialen präfrontalen Cortex der Ratte zurückzuführen sind.

2

Einleitung

1.2 Reelin – von der reeler-Mausmutante zum Protein

Im Jahr 1948 trat in einer Versuchstierhaltung in Edinburgh, Schottland, spontan die

rezessive reeler-Mausmutante auf, die nach ihrem schwankenden Gang benannt

wurde (to reel: wackeln, taumeln). Der britische Genetiker FALKONER beschrieb den

Phänotyp der Mutante erstmalig 1951 und fasste dessen Charakteristika allgemein als

eine Störung der Motorik zusammen [FALCONER, 1951; D’ARCANGELO & CURRAN,

1998]. Wie erste anatomische Studien zeigten, wiesen homozygote reeler-Mäuse

neuroanatomische cortikale, cerebelläre und hippocampale Anomalien auf und waren

daraufhin Gegenstand intensiver Untersuchungen, um Aufschlüsse über die damals

noch nicht vollständig verstandene Cortikogenese zu erhalten (Exkurs 1) [HAMBURGH,

1963; D’ARCANGELO & CURRAN, 1998; TISSIR & GOFFINET, 2003].

Interessanterweise ist der in Exkurs 1 beschriebene Entwicklungsprozess der

sogenannten inside-out Schichtung des Cortex bei homozygoten reeler-Mäusen

schwerwiegend gestört. Verglichen mit Wildtyp-Tieren sind sowohl die Anzahl der

Neurone und der Zeitpunkt der Neuronendifferenzierung als auch die initiale

Neuronenmigration identisch. Jedoch scheint die Steuerung und Modulation der

Migrationsterminierung, die unerlässlich für die inside-out Schichtung ist, bei den

Mutanten gestört zu sein � es kommt zu einer lockeren und unstrukturierten

Cytoarchitektur (Abb. 1.1) [LAMBERT DE ROUVROIT & GOFFINET, 1998; FROTSCHER,

1998]. Die weitere Differenzierung der Neurone ist größtenteils unbeeinflusst, d.h. es

bilden sich normale neuronale Populationen, die Dendritenbäume und Axone

verästeln sich vergleichbar zum Wildtyp und bilden zum Teil Verbindungen mit ihren

physiologischen Zielen aus. Aufgrund der fehlerhaften Neuronenpositionierung sind

diese Verbindungen jedoch oft deformiert und fehlgeleitet (Abb. 1.2) [LAMBERT DE

ROUVROIT & GOFFINET, 1998].

Durch anatomische Studien an der homozygoten reeler-Maus konnten jedoch

keine Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Mutation gewonnen

werden. Erst nachdem 1995 die Klonierung des Gens erfolgte und zeitgleich ein

Antikörper (CR-50) entwickelt wurde, der an ein Epitop des Translationsprodukts

bindet, erfolgte die Entdeckung und Bezeichnung des Proteins: Reelin [D’ARCANGELO

ET AL., 1995; OGAWA ET AL., 1995A].

3

Einleitung

Während der frühen Cortikogenese migrieren Pionierneurone aus der Ventrikularzone, in

der sie sich aus Vorläuferzellen differenzieren, an Radialgliazellen assoziiert in Richtung Pia mater

[BERRY & ROGERS, 1965]. Dort formen sie die Präplatte, bestehend aus zwei transienten

Zellpopulationen: Zum einen die Cajal-Retzius Zellen, welche in der Marginalzone verbleiben und

Reelin sezernieren und zum anderen die Neurone der Subplatte [MARIN-PADILLA, 1971; RICKMANN

ET AL., 1977; D’ARCANGELO, 2005]. Cortikale Neurone wandern in folgenden Migrationswellen

zwischen die pial gelegene Marginalzone und in die tiefer gelegene Subplatte ein und bilden die

Cortikalplatte [KOSTOVIC & RAKIC, 1980; ABOITIZ ET AL., 2005]. Chronologisch früh migrierende

Neurone bilden dabei Schicht VI. Später generierte Neurone passieren diesen Bereich in Richtung

pialer Oberfläche und bilden Schicht V. Während der Cortikogenese werden die innersten

Schichten also zuerst gebildet, so dass sich die charakteristische inside-out-Strukturierung des

Cortex bildet (Abb.1.1 A) [ANGEVINE & SIDMAN, 1961; PARNAVELAS, 2000; RAKIC, 2006].

Der Neocortex adulter Säuger ist meist in sechs Schichten unterteilt. Innerhalb jeder Schicht sind

Neurone gleicher morphologischer und physiologischer Charakteristika, Innervationsstrukturen

und Entwicklungszeitpunkte vorzufinden. Die unterhalb der Pia mater lokalisierte Schichtung, die

Marginalzone oder Schicht I, ist arm an neuronalen Somata und enthält verschiedene tangential

ziehende axonale Termini aus tiefer gelegenen Schichten sowie apikale Dendriten der

Pyramidenzellen. In Schicht II und III sind vornehmlich kleinere Neurone positioniert, die

Afferenzen und Efferenzen in andere cortikale Gebiete besitzen, wohingegen größere

Pyramidenzellen mit ihren Projektionen in subcortikale Regionen in Schicht V lokalisiert sind.

Neurone, die hauptsächlich thalamische Afferenzen erhalten, sind in Schicht IV, solche mit

Efferenzen in den Thalamus in Schicht VI positioniert [MARIN-PADILLA, 1978; D’ARCANGELO &

CURRAN, 1998]. Aufgrund dieses Netzwerkes, bestehend aus diversen verschiedenen cortikalen und

subcortikalen Verbindungen, nimmt der Neocortex eine dominante Rolle bei motorischen,

sensorischen und perzeptionellen Prozessen ein.

Exkurs 1 : Cortikogenese

1.2.1 Das Reelin-Gen und das Reelin-Molekül

Das extrazelluläre Matrix (EZM) Glykoprotein Reelin zeigt ein breites

Expressionsmuster – Reelin-positive Zellen sind im gesamten Neocortex,

Hippokampus, Cerebellum, olfaktorischen Bulbus, Striatum, Hypothalamus und

Colliculus superior immunhistologisch nachweisbar. Während der Embryogenese

finden sich die höchsten Konzentrationen in der Marginalzone, in der Reelin-

4

Einleitung

5

Abb. 1.1 Cortikale Schichtung bei Wildtyp und homozygoten reeler-Mäusen. (A) Im Cortex von

Wildtyp-Mäusen wird die Präplatte durch radial einwandernde Neurone in die Marginalzone und

Subplatte geteilt und es entwickelt sich die charakteristische cortikale inside-out-Schichtung. (B) Eine

Reelin-Verarmung, wie sie bei homozygoten reeler-Mäusen vorzufinden ist, induziert eine

unstrukturierte neuronale Anordnung (outside-in). Abbkürzung: CR, Cajal-Retzius Zellen; PM, Pia

mater; MZ, Marginalzone; CP, Cortikalplatte; SP, Subplatte; RG, Radialgliazellen [nach TISSIR &

GOFFINET, 2003].

Abb. 1.2 Golgi-Färbung cortikaler Pyramidenzellen. (A) Cortikale Pyramidenzellen von Wildtyp-

Mäusen zeigen eine gleichmäßige Ausprägung apikaler Dendriten (Pfeil), welche vom Zellkörper zur

Marginalzone verlaufen (cortikale Schicht I). (B) Die normale Orientierung der Dendriten ist bei

homozygoten reeler-Mäusen verloren. Eine Ausrichtung erfolgt diffus in verschiedene Richtungen

(Pfeil). Maßeinheit 100μm [FROTSCHER ET AL., 2009].

Reelin

PM PM

CP CP

MZ

SP

RG RG

A B

Einleitung

Moleküle von Cajal-Retzius Zellen sezerniert werden. Im adulten Organismus kommt

es vornehmlich zu einer topographischen Sekretionsverlagerung auf cortikale

GABAerge Interneurone der Schichten II-IV, zum Teil aber auch auf cerebrale

Granulazellen und hippocampale Interneurone. Zusätzlich ist das Protein in

Geweben wie Retina, Rückenmark, Blut, Leber, Milz und Nieren zu finden

[IMPAGNATIELLO ET AL., 1998; PESOLD ET AL., 1998; FATEMI ET AL., 2000; LACOR ET AL.,

2000; MARTINEZ-CERDENO ET AL., 2002].

Das Reelin-Gen kann in allen Wirbeltieren gefunden werden und ist bei

Mäusen, Ratten und Menschen auf dem jeweiligen Chromosom 5, 4 bzw. 7q22

lokalisiert. Es umfasst bei diesen Spezies ungefähr 450kb und kodiert eine 12kb lange

mRNA, die aus 65 Exons besteht. Zwei alternative Splicevarianten sind bekannt: Die

Insertation eines sechs Nukleotiden großen Mikroexons in neuronale mRNA sowie

eine alternative Form der Polyadenylierung (die funktionelle Bedeutung konnte noch

nicht vollständig geklärt werden). Die mRNA kodiert für das aus 3461 Aminosäuren

bestehende Reelin-Protein, welches in Abb. 1.3 illustriert ist [DESILVA ET AL., 1997;

ROYAUX ET AL., 1997; LAMBERT DE ROUVROIT ET AL., 1999A]. Dem N-Terminus, der ein

Signalpeptid (27 Aminosäuren) trägt, folgt eine Region, die Ähnlichkeiten zu F-

Spondin aufweist. Außerdem schließt sich ein Bereich an, der einzig bei Reelin

vorzufinden ist und als Epitop für verschiedene Antikörper (CR-50, G-10, 142) agiert.

Der zentrale Teil des Proteins ist aus acht homologen Sequenzen, die jeweils durch

ein EGF-Motiv in zwei Wiederholungen unterteilt sind, aufgebaut. Der basische C-

Terminus besteht aus 33 Aminosäuren und ist hochgradig konserviert in allen

untersuchten Säugern vorgefunden worden [DE BERGEYCK ET AL., 1998].

H-Region

Abb. 1.3 Aufbau des Reelin-Proteins. Die Sequenz beginnt mit einem Signalpeptid (S), gefolgt von

einer Region, die Ähnlichkeit zu F-Spondin aufweist (F-SP) und der sogenannten H-Region

(Bindungsstelle für verschiedene Antikörper, z.B. CR-50), gefolgt von acht Wiederholungen, in deren

Zentrum ein EGF-Motiv lokalisiert ist. Die Sequenz endet mit einer basischen Region (+). Die Pfeile

markieren die Bereiche der in vivo Prozessierung [nach TISSIR & GOFFINET, 2003].

S

F-SP

EGF-Motiv +

3 4 5 6 2 7 8 1

6

Einleitung

In vivo wird Reelin proteolytisch prozessiert und zwischen den homologen

Sequenzen zwei und drei sowie sechs und sieben gespalten, so dass letztendlich

Fragmente verschiedener Länge im extrazellulären Milieu vorliegen. Die beteiligten

Enzyme gehören zu der Gruppe der Metallproteinasen, konnten jedoch noch nicht

weiter spezifiziert werden [LAMBERT DE ROUVROIT ET AL., 1999B; JOSSIN, 2008]. Auch

die physiologische Funktion der einzelnen Reelin-Fragmente ist noch nicht

vollständig verstanden. So zeigten JOSSIN und Mitarbeiter eine pivotale Rolle des

zentralen Fragments während der Embryogenese [JOSSIN ET AL., 2004; JOSSIN ET AL.,

2007], während weitere Studien die N-terminale Region [UTSUNOMIYA-TATE ET AL.,

2000; KUBO ET AL., 2002], die C-terminale Region [NAKANO ET AL., 2007; KOHNO ET

AL., 2009A] bzw. das unprozessierte Molekül [KOHNO ET AL., 2009B] als essentiell in

Bezug auf die Signaltansduktion herausstellten.

1.2.2 Das Reelin-Signal: Rezeptoren und Signaltransduktion

Wie bereits erwähnt ist Reelin bzw. die Reelin-Signalkaskade unerlässlich für die

Neuronenpositionierung während der Embryogenese. Neurone migrieren an

Radialgliazellen assoziiert aus der Ventrikularzone in Richtung Marginalzone. Das

durch die hier lokalisierten Cajal-Retzius Zellen sezernierte Reelin vermittelt über

spezifische Rezeptoren (s.u.) Positionierungs- bzw. Stoppsignale bei den

einwandernden Zellen und kontrolliert so die finale Cortexlaminierung.

Doch wie steuert und moduliert Reelin diesen Prozess auf molekularer Ebene?

Intrazellulär ist das Protein in Golgi-Vesikeln gespeichert und wird über einen

konstitutiven Sekretionsweg axonal via Exocytose in die EZM sekretiert [DERER ET

AL., 2001]. Dieser Prozess wird demnach nicht durch eine Depolarisation der Zelle

reguliert bzw. ist unabhängig von einer Ca2+-vermittelten Exocytose [LACOR ET AL.,

2000; MARTINEZ-CERDENO ET AL., 2002]. Im extrazellulären Milieu wird Reelin

anschließend prozessiert und induziert die Signaltransduktion.

Durch ausgiebige Studien in den letzten Jahren ist es mit Hilfe genetischer

und biochemischer Methoden gelungen, einen linearen Signaltransduktionsweg zu

etablieren, in dem das extrazelluläre Binden von Reelin an den Apolipoprotein E

(ApoE)-Rezeptor 2 und very-low-density Lipoprotein (VLDL)-Rezeptor bzw. den

alpha-3-beta-1 Integrin (�3�1I)-Rezeptor zu einer Aktivierung des cytoplamatischen

Adapterproteins disabled 1 (Dab1) führt. Interessanterweise scheinen Reelin-

7

Einleitung

Oligomere ein clustering von ApoE-Rezeptoren 2 bzw. VLDL-Rezeptoren auszulösen,

welches wiederum eine Dimerisation/Oligomerisation von Dab1-Molekülen (welche

intrazellulär mit NPxY-Motiven der Rezeptoren assoziiert sind) zur Folge hat und im

Weiteren zu deren Phosphorylierung an bestimmten Tyrosinresten führt – Reelin-

Monomere sind dagegen nicht in der Lage in vitro ein Signal zu induzieren

[D’ARCANGELO ET AL., 1999; HIESBERGER ET AL., 1999; DULABON ET AL., 2000;

UTSUNOMIYA-TATE ET AL., 2000; STRASSER ET AL., 2004]. Die Phosphorylierung der

Dab1-Oligomere durch die nicht-transmembranen Tyrosinkinasen Scr und Fyn

(Mitglieder der Kinasen-Familie SFK) induziert eine positive

Rückkoppelungsschleife, die die Phosphorylierung der beteiligten Moleküle – und

dadurch das Reelin-Signal – potenziert (Abb. 1.4) [ARNAUD ET AL., 2003; BOCK &

HERZ, 2003; FENG & COOPER, 2009].

Die hohe lokale Konzentration der phosphorylierten Dab1- und SFK-Moleküle

aktiviert verschiedene Signalkaskaden, die mit der Cytoskelett- und Mikrotubuli-

Dynamik interagieren und dadurch einen direkten Einfluss auf die neuronale

Migration ausüben. So aktivieren phosphorylierte Dab1-Moleküle eine

cytoplasmatische Kinase-Kaskade, beginnend mit der Phosphatidylinositol-3-Kinase,

resultierend in der Aktivierung der Proteinkinase B und endend mit der Inhibition

der Glykogen-Synthase-Kinase 3�, welche (aktiviert) das Mikrotubuli-stabilisierende

Protein tau phosphoryliert (Abb. 1.4). Der Phosphorylierungsgrad von tau gilt als gut

untersuchter Marker für die Stabilität des Cytoskeletts, wobei sich eine tau-

Hyperphosphorylierung negativ auf die Stabilität der Mikrotubuli auswirkt

[BILLINGSLEY & KINCAID, 1997; MERRICK ET AL., 1997; BEFFERT ET AL., 2002].

Ferner aktivieren phosphorylierte Dab1-Moleküle zwei weitere

Signalkaskaden. Zum einen interagieren Proteine der CRK-Familie mit Dab1 und

induzieren über die Aktivierung einer GTPase die Formation von Rap1-GTP-

Molekülen. Zum anderen aktiviert Dab1 den Lissenzephalie-1-Komplex, der wie Rap1,

mit seinen �-Untereinheiten regulatorisch auf die Mikrotubuli- und Cytoskelett-

Dynamik wirkt (Abb. 1.4) [ASSADI ET AL., 2003; BALLIF ET AL., 2004].

Zusammenfassend scheint Reelin über seine Rezeptoren und Dab1 wichtige

Komponenten des Signalsystems der Neuronenpositionierung zu koordinieren.

Störungen dieses Systems führen zum reeler- bzw. reeler-like-Phänotyp [HOWELL ET

AL., 1997; TROMMSDORFF ET AL., 1999]. Die Zellen passieren die zuvor migrierten

Neurone nicht mehr und anstelle der charakteristischen inside-out-Schichtung

entsteht eine diffuse outside-in-Positionierung (Abb. 1.1 und 1.2; Exkurs 1).

8

Einleitung

- Migrationsstop? - Strukturelle Plastzität

- Organistation der Mikrotubuli - Neuronale Migration - Cortikale Laminierung

Plasmamembran

VLDL- Rezeptor

ApoE- Rezeptor 2

SFK

Pl3K

PKB

GSK3�

�

CRK

GTPase

RAP1 RAP1

GDP GTP

Lis1K

�1 �2

Dab1

�3�1I- Rezeptor

1 2 3

Reelin Reelin

Abb. 1.4 Schematische Darstellung des Reelin-Signaltransduktionsweges. Reelin bindet extrazellulär

mit hoher Affinität an die ApoE-Rezeptoren 2 und VLDL-Rezeptoren. Intrazellulär werden Dab1- und

SFK-Moleküle in einer positiven Rückkopplungsschleife phosphoryliert, was in einer Aktivierung

verschiedener Signalkaskaden resultiert. (1) Dab1 aktiviert die Phosphatidylinositol-3-Kinase (Pl3K),

die wiederum die Proteinkinase B (PKB) aktiviert. PKB inhibiert die Aktivität der Glykogen-Synthase-

Kinase 3� (GSK3�) und unterstützt, durch eine reduzierte Phosphorylierung des tau-Proteins (�), die

Mikrotubuli-Stabilität. (2) Dab1 aktiviert Proteine der CRK-Familie, die über eine GTPase die

Formation von Rap1-GTP-Molekülen induzieren und (3) den Lissenzephalie-1-Komplex (Lis1K), der

wie Rap1, mit seinen �-Untereinheiten die Mikrotubuli- und Cytoskelett-Dynamik unterstützt. Die

Interaktion zwischen Reelin und Integrinrezeptoren (�3�1I) induziert vermutlich Prozesse der

strukturellen Plastizität [nach HERZ & CHEN, 2006; QIU & WEEBER, 2008].

9

Einleitung

Wie bereits in Abschnitt 1.2 erläutert, zeigt sich postnatal ein zellulärer und

topographischer Wechsel der Reelin-Expression. Zusätzlich werden essentielle

Moleküle des beschriebenen Signalwegs weiterhin im adulten Organismus

exprimiert. Es stellt sich die Frage, welche Funktion das Protein nach Beendigung der

Embryogenese im heranwachsenden bzw. adulten Organismus erfüllt.

1.2.3 Das Reelin-Signal im adulten Organismus

Im Gegensatz zu der gut untersuchten Funktion von Reelin während der

Cortikogenese, ist dessen Rolle im adulten zentralen Nervensystem (ZNS) bisher nur

oberflächlich verstanden.

HERZ und Mitarbeiter vermuteten 2002 erstmals, dass Reelin auf

physiologischer Ebene einen modulierenden Einfluss auf kognitive Prozesse ausüben

könnte. Anhand hippocampaler Hirnschnitte wurde verdeutlicht, dass das Protein

über ApoE-Rezeptoren 2 und VLDL-Rezeptoren verstärkend auf Prozesse der

Langzeitpotenzierung (LTP), einem elektrophysiologischen Korrelat zu Lern- und

Gedächtnisprozessen, wirkt. Ebenso verschlechterte sich bei ApoE-Rezeptor 2 und

VLDL-Rezeptor knockout-Mäusen die Lernleistung bei der Furchtkonditionierung

[WEEBER ET AL., 2002]. Weiterführende Studien bestätigten diese Ergebnisse und

offenbarten, dass insbesondere der ApoE-Rezeptor 2 postsynaptisch vermehrt in

exzitatorischen Synapsen lokalisiert ist und einen funktionellen Komplex mit N-

Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren bildet. Reelin scheint zum einen über

NMDA-Rezeptoren den Ca2+-Einstrom in cortikale Neurone zu verstärken und zum

anderen die entwicklungsabhängige Veränderung der NMDA-

Rezeptoruntereinheiten, nämlich von NR2B zu NR2A, zu kontrollieren [BEFFERT ET

AL., 2005; CHEN ET AL., 2005; SINAGRA ET AL., 2005; CAMPO ET AL., 2009].

Darüber hinaus kamen Untersuchungen an Neuronenkulturen zu dem

Ergebnis, dass das Reelin-Signal für die normale Entwicklung dendritischer

Strukturen benötigt wird. Eine Inhibition von Reelin oder Dab1 induziert ein

vermindertes Dendritenwachstum und eine Reduktion dendritischer Fortsätze [NIU

ET AL., 2004; QIU & WEEBER, 2008]. Während in den vorausgegangenen

Beschreibungen der ApoE-Rezeptor 2 und der VLDL-Rezeptor im Mittelpunkt

standen, ist die Funktion des in Abschnitt 1.2.2 erwähnten �3�1I-Rezeptors noch

relativ unbekannt. Allerdings gibt es interessante Studien der COSTA-Gruppe, in

10

Einleitung

denen verdeutlicht wurde, dass Reelin über den Integrinrezeptor maßgeblich an der

Expression des Proteins Arc (activity regulated cytoskeletal protein) und somit an der

Formation des Cytoskeletts beteiligt ist (Abb. 1.4) [GUIDOTTI ET AL., 2000A; DONG ET

AL., 2003].

Eine ausgeglichene Reelin-Konzentration scheint somit bedeutend für die

Entwicklung dendritischer Strukturen sowie der NMDA-Rezeptorfunktion zu sein

und ist deshalb wahrscheinlich von zentraler Bedeutung für die neuronale

Informationsverarbeitung. Dieser Gedanke steht im Einklang mit Untersuchungen an

heterozygoten reeler-Mäusen, die neben einer reduzierten Dendritendichte Defizite

in verschiedenen Verhaltens- und Lernparadigmen aufwiesen [QIU & WEEBER, 2008].

Beispielsweise zeigten reeler-Mäuse eine verminderte Präpulsinhibition der akustisch

ausgelösten Schreckreaktion [TUETING ET AL., 1999; QIU ET AL., 2006], eine

verschlechterte Furchtkonditionierung [QIU ET AL., 2006], ein erhöhtes

Angstverhalten [TUETING ET AL., 1999] oder Defizite im reversal learning [BRIGMAN ET

AL., 2006]. Der Vollständigkeit halber sei jedoch erwähnt, dass einige Studien keine

Verhaltensunterschiede zwischen reeler- und Wildtyp-Mäusen nachweisen konnten

[SALINGER ET AL., 2003; PODHORNA & DIDRIKSEN, 2004; KRUEGER ET AL., 2006].

Doch wie reguliert Reelin den NMDA-Rezeptor, die Dendritenmorphologie

und das Verhalten des adulten Nagers? Der Reelin-Signalkomplex ist intrazellulär

über das postsynaptic density protein 95 (PSD95) mit NMDA-Rezeptoren assoziiert.

Zusätzlich phosphorylieren Reelin-aktivierte SFKs die NMDA-

Rezeptoruntereinheiten NR2A und NR2B und modulieren so einen verstärkten

Glutamat (Glu)-ausgelösten, NMDA-Rezeptor vermittelten, Ca2+-Einstrom. Die

potenzierte intrazelluläre Ca2+-Konzentration aktiviert Transkriptionsfaktoren

(CREB, cyclic AMP-response element binding protein) und dadurch möglicherweise

die Expression von Genen, die wichtig für Prozesse der synaptischen Plastizität, der

Dendritenentwicklung und Gedächtnisleistung sind (Abb. 1.5) [WEEBER ET AL., 2002;

BEFFERT ET AL., 2005; CHEN ET AL., 2005].

Zusammenfassend lässt sich herausstellen, dass Reelin als transneurales

Botenmolekül agiert, das direkt die NMDA-Rezeptorfunktion und -homöostase sowie

Abläufe der synaptischen Plastizität reguliert und dadurch auf physiologischer Ebene

wesentlich an Lern-, Gedächtnis- und Verhaltensleistungen beteiligt sein könnte.

Darüber hinaus sind Störungen dieses Systems an der Pathophysiologie

verschiedener neuropsychiatrischer Erkrankungen wie der

11

Einleitung

Reelin

VLDL-

Rezeptor ApoE-

Rezeptor 2 Ca2+

NMDA- Plasma-membran Rezeptor

PSD95

Abb. 1.5 Model für den funktionellen Komplex des Reelin-Signalsystems mit dem NMDA-Rezeptor.

Das Reelin-Signal aktiviert sowohl das intrazelluäre postsynaptic density protein 95 (PSD95) als auch

SFK-Moleküle, welche eine Phosphorylierung der NMDA-Rezeptoruntereinheiten NR2A und NR2B

vermitteln. Daraus resultiert ein verstärkter Ca2+-Einstrom durch den NMDA-Rezeptor. Ca2+ aktiviert

Transkriptionsfaktoren, die Prozesse der synaptischen Plastizität modulieren. Transparent dargestellt

sind die in Abb. 1.4 beschriebenen Signalkaskaden [nach BEFFERT ET AL., 2005; HERZ & CHEN, 2006].

SFK

CRK Pl3K

PKB

GSK3�

�

RAP1

GDP GTP

�1

Dab1

Lis1KCa2+

�2

GTPase

RAP1

CREB

- Synaptische Plastizität - Modifizierung der NMDA-Rezeptoren - Einfluss auf Lern- Gedächtnisleistungen?

12

Einleitung

Schizophrenie, involviert. Dieses soll in Exkurs 2 und Abschnitt 1.4.5 näher erläutert

werden.

Neben der Rolle von Reelin bei schizophrenen Erkrankungen scheint das Protein auch am

Krankheitsbild des Autismus beteiligt zu sein. Biochemische Untersuchungen stellten eine

Reduktion von Reelin in verschiedenen Gehirnarealen [FATEMI ET AL., 2002; FATEMI ET AL., 2005]

und eine Abnahme der 410- und 330kDa Reelin-Fragmente in Blutproben von Autisten fest

[FATEMI ET AL., 2002; LUGLI ET AL., 2003]. Zusätzlich offenbarten verschiedene Studien eine

Verbindung zwischen einem Reelin-Gen-Polymorphismus und der Krankheit [PERSICO ET AL.,

2001; ZHANG ET AL., 2002].

Mitarbeiter der COSTA-Gruppe zeigten anhand neuroanatomischer post mortem Studien

eine Reelin-Verarmung im Cerebellum, Hippocampus und frontalen Cortex bei Patienten mit

schizophrenen, bipolaren oder depressiven Störungen. Sie nahmen an, dass Reelin-Anomalien

mögliche Vulnerabilitätsfaktoren für die Pathogenese dieser Erkrankungen darstellen könnten

[IMPAGNATIELLO ET AL., 1998; GUIDOTTI ET AL., 2000B]. Die Reduktion der Reelin-Konzentration

war zudem mit einer Abnahme der Glu-Decarboxylase 67kDa (GAD67) assoziiert (einem Enzym des

�-Aminobuttersäure (GABA)-Metabolismus), was anschließend zu der Theorie einer Reelin-

abhängigen GABAergen Dysfunktion führte [FATEMI ET AL., 2005A; GUIDOTTI ET AL., 2005]. In

jüngerer Vergangenheit konnte zudem gezeigt werden, dass eine Hypermethylierung des Reelin-

Promotors verantwortlich für die Reelin-Verarmung schizophrener Patienten ist [COSTA ET AL.,

2003B; ABDOLMALEKY ET AL., 2004]. Demnach könnte eine verstärkte Expression der DNA-

Methyltransferase 1 (Dnmt1) in GABAergen Interneuronen präfrontaler Cortizes schizophrener

Patienten eine verstärkte Methylierung der Reelin- und GAD67-Promotoren und so eine

Herunterregulierung dieser Gene induzieren [COSTA ET AL., 2003B]. Interessanterweise konnte eine

durch L-Methionin ausgelöste Hypermethylierung und Reelin-Verarmung sowie eine Störung der

sensomotorischen Informationsverarbeitung im Tiermodell durch das Antiepileptikum Valporat

antagonisiert werden [TREMOLIZZO ET AL., 2005; DONG ET AL., 2007].

Viele Proteine des Säugergehirns partizipieren an Wachstums- und Entwicklungsprozessen des

CNS. Hierbei übernimmt Reelin wesentliche Aufgaben bei der Neuronenmigration und

synaptischen Plastizität. Störungen des Reelin-Signals werden mit verschiedenen

neuropsychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, z.B. Schizophrenie [IMPAGNATIELLO

ET AL., 1998; FATEMI ET AL., 2000; COSTA ET AL., 2003A], bipolare Störung [IMPAGNATIELLO ET AL.,

1998; FATEMI ET AL., 2000; GUIDOTTI ET AL., 2000A], Depression [FATEMI ET AL., 2001; KNABLE ET

AL., 2004], Autismus [PERSICO ET AL., 2001; FATEMI ET AL., 2002; ZHANG ET AL., 2002],

Lissenzephalie [HONG ET AL., 2000; MIYATA ET AL., 2004] und Alzheimersche Erkrankung [SAEZ-

VALERO ET AL., 2003; BOTELLA-LOPEZ ET AL., 2006].

Exkurs 2: Die Rolle von Reelin in der Ätiologie psychiatrischer Erkrankungen

13

Einleitung

Letztendlich könnten Dysfunktionen des Reelin-Signalwegs an Entstehung und Verlauf der

Alzheimerschen Erkrankung beteiligt sein. SAEZ-VALERO und BOTELLA-LOPEZ maßen eine erhöhte

Konzentration des 180kDa-Reelin-Fragments und des unprozessierten Proteins in der

Rückenmarksflüssigkeit und im frontalen Cortex betroffener Patienten und führten das Ergebnis

auf eine fehlerhafte Protein-Prozessierung zurück [SAEZ-VALERO ET AL. 2003; BOTELLA-LOPEZ ET AL.

2006]. Inwiefern ein dadurch gestörtes Reelin-Signal zu einem Anstieg der tau-Phosphorylierung

führt und in Folge dessen in einer Cytoskelettinstabilität und Neuronendegeneration resultiert, ist

in zukünftigen Studien zu klären. Fraglich ist zudem, ob eine Dysfunktion des Reelin-Signals ein

Vulnerabilitätsfaktor der Erkrankung darstellt oder nur Resultat des neurodegenerativen

Krankheitsverlaufs ist.

Lissenzephalien sind eine klinisch und genetisch heterogene Gruppe cerebraler

Fehlbildungen, die durch embryonale Migrationsstörungen charakterisiert sind [UYANIK ET AL.,

2003]. Auch hier scheint Reelin in der Pathogenese involviert zu sein. Arbeiten von HONG und

CHANG zeigten zum einen eine Abnahme der Reelin-Konzentration in Seren betroffener Patienten

[HONG ET AL., 2000; CHANG ET AL., 2007], und zum anderen, dass Störungen des in der Reelin-

Signalkaskade involvierten Proteins LIS1 zu einer charakteristischen Fehlentwicklung des Gehirns

beitragen können [ASSADI ET AL., 2003].

14

Einleitung

1.3 Der präfrontale Cortex

Der präfrontale Cortex (PFC) steht seit Jahren im Zentrum verschiedener Studien, da

Dysfunktionen in diesem Hirngebiet mit verschiedenen kognitiven Störungen und

Verhaltensauffälligkeiten, wie sie bei neuropsychiatrischen Erkrankungen auftreten,

assoziiert werden. So treten als Folge von präfrontalen Störungen beispielsweise

Defizite des Kurzzeitgedächtnisses, der Aufmerksamkeitsleistung oder emotionale

Beeinträchtigungen auf [MILLER & MAYFORD, 1999; DALLEY ET AL., 2004; ROBBINS,

2005].

Phylogenetisch und ontogenetisch repräsentiert der PFC eine der am spätesten

entwickelten Hirnstrukturen und wird den cortikalen Assoziationsarealen

zugeordnet. Diese stellen die höchste Ebene der funktionellen cortikalen Hierarchie

dar und sind maßgeblich an kognitiven und emotionalen Prozessen beteiligt [FUSTER,

2001; FUSTER, 2002]. Studien an Menschen, Primaten und Nagern offenbarten

zudem, dass dem PFC eine exekutive Funktionalität zugeordnet wird, die es dem

Organismus ermöglicht sowohl zielgerichtetes Verhalten zu generieren und zu

steuern als auch adäquate Verhaltensprogramme in verschiedenen Situationen zu

aktivieren bzw. unangemessenes Verhalten zu unterdrücken [FUSTER, 2001; DALLEY

ET AL., 2004].

1.3.1 Die Anatomie des PFC

Als PFC wird derjenige Teil des cerebralen Cortex bezeichnet, der reziproke

Konnektivitäten mit dem mediodorsalen Thalamus (MDT) aufweist. Aufgrund dieses

hodologischen Kriteriums zeigt sich, dass der PFC bei allen Säugetieren vorhanden

ist, obwohl es deutliche Variationen zwischen den Spezies gibt. So ergaben

anatomische Studien sowohl Unterschiede in der Cytoarchitektur und den

Konnektivitäten als auch in der Anzahl der Cortexschichten – beispielweise ist die

Schicht IV bei Ratten nicht vorhanden. Trotz dieser vielfältigen Variationen geht man

von einer starken funktionellen und organisatorischen Äquivalenz der Hirnareale aus

[UYLINGS & VAN EDEN, 1990; FUSTER, 2001; UYLINGS ET AL., 2003].

Aufgrund der Konnektivitäten mit verschiedenen Bereichen des MDT kann der

PFC der Ratte in eine mediale und laterale Komponente unterteilt werden, wobei der

mediale PFC (mPFC) topographisch in einen dorsalen (frontales Areal 2, anteriore

15

Einleitung

IL

PL

ACd

FR 2

Abb. 1.6 Anatomische Einteilung des medialen präfrontalen Cortex (mPFC) der Ratte

(Coronalansicht, 2.7mm anterior von Bregma). Der mPFC ist in ein dorsales (frontales Areal 2 (FR 2),

anteriorer cingulärer Cortex (ACd)) und ventrales (prälimbisches Areal (PL), infralimbisches Areal

IL)) Gebiet unterteilt [nach PAXINOS & WATSON, 1998].

Dorsolateraler präfrontaler Cortex

Abb. 1.7 Lateralansicht des menschlichen Gehirns. Die Farbmarkierung kennzeichnet das

dorsolaterale Areal des präfrontalen Cortex (dlPFC), entsprechend Brodmann-Areale 9 und 46 [nach

BUDSON, 2009].

16

Einleitung

cinguläre Cortex) und ventralen (prälimbisches Areal, infralimbisches Areal) Bereich

gegliedert wird (Abb. 1.6) [DALLEY ET AL., 2004].

Für die vorliegende Arbeit war insbesondere der mPFC der Ratte bedeutend,

auf den sich die folgenden Ausführungen hauptsächlich beziehen werden. Weiter

wird die Annahme unterstützt, dass der mPFC der Ratte dem dorsolateralen PFC

(dlPFC) des Primaten bzw. Menschen äquivalent ist (Abb. 1.7) [MITCHELL &

LAIACONA, 1998; UYLINGS & VAN EDEN, 1990; FUSTER, 2001; UYLINGS ET AL., 2003].

1.3.2 Die Konnektivitäten, zelluläre Organisation und Neurotransmitter

des PFC

Konnektivitäten

Der PFC ist anatomisch mit verschiedenen Strukturen des Gehirns verbunden, unter

anderem mit dem Thalamus, dem limbischen System, dem Hirnstamm, den

Basalganglien und weiteren cortikalen Arealen. Speziell die topographisch gut

organisierte Verbindung mit dem MDT ist ausgiebig untersucht und als Kriterium

genutzt worden, um den PFC verschiedener Spezies zu identifizieren [UYLINGS &

EDEN, 1990; FUSTER, 2001]. Bei dieser thalamo-cortikalen Verbindung ziehen zum

größten Teil glutamaterge Efferenzen aus dem MDT zum PFC, welcher reziprok mit

diesem glutamaterg assoziiert ist [KURODA ET AL., 1998; FUSTER, 2001].

Cortiko-cortikale Projektionen sind ebenfalls meist reziprok und glutamaterg

organisiert und verbinden den PFC sowohl mit somatosensorischen und motorischen

Arealen des Cortex als auch mit dem Entorhinalcortex und Hippocampus. Ferner

sind die einzelnen Unterregionen des PFC mit ihren homologen Bereichen

kontralateral verbunden [FUSTER, 2001; MILLER & COHEN, 2001].

Wichtige reziproke subcortikale Konnektivitäten sind zwischen dem PFC und

den dopaminergen Zellen des ventralen tegmentalen Areals (VTA) oder der Amygdala

topographisch angeordnet. Außerdem sind das Striatum und der Nucleus accumbens

(NAc) zentrale, reziprok verschaltete Zielgebiete, welche durch die

präfrontocortikalen Pyramidenzellen glutamaterg innerviert werden [FUSTER, 2001;

UYLINGS, 2003]. Zusätzlich erhält der PFC noradrenerge und serotonerge

Innervationen aus entsprechenden im Hirnstamm lokalisierten Kerngebieten

[UYLINGS ET AL., 2003; DALLEY ET AL., 2004].

17

Einleitung

Zelluläre Organisation

Auf zellulärer Ebene findet man im PFC im Wesentlichen die exzitatorischen

Pyramidenzellen und inhibitorischen GABAergen Interneurone. Letztere bilden

ungefähr 20-25% der cortikalen Neurone und lassen sich aufgrund ihrer

morphologischen und physiologischen Charakteristika sowie der spezifischen

Feuermuster in verschiedene Subtypen unterteilen [KAWAGUCHI & KONDO, 2002;

WONDERS & ANDERSON, 2006].

Wie in Kapitel 1.2.1 beschrieben, wird die Reelin-mRNA im adulten

Organismus durch GABAerge Interneurone exprimiert, die das Protein hauptsächlich

in die Umgebung der pyramidalen Dendriten sezernieren [PESOLD ET AL., 1998;

RODRIGUEZ ET AL., 2000; COSTA ET AL., 2001]. Reelin-positive GABAerge Interneurone

sind nahezu in jedem cortikalen Areal vorzufinden, wobei der Anteil dieser Zellen in

den einzelnen Cortexschichten variiert. So exprimieren in den oberflächigen

Schichten I und II ungefähr 100% der GABAergen Interneurone Reelin-mRNA,

wohingegen in den Schichten V und VI nur 30-50% der Zellen Reelin-positiv sind

[COSTA ET AL., 2008].

Während die GABAergen Interneurone eine entscheidende Funktion bei der

Modulierung des cortikalen outputs und der cortikalen Plastizität übernehmen,

spielen die in Cortexschicht V positionierten Pyramidenzellen eine zentrale Rolle in

Bezug auf die cortikalen Efferenzen. Die Zellen sind rekurrent mit anderen

Pyramidenzellen verschaltet und projizieren in die oben beschriebenen Hirnregionen

[DEUCHARS ET AL., 1994; WONDERS & ANDERSON, 2006].

Neurotransmission

Die Neurotransmission des PFC wird durch eine ganze Reihe von Transmittern

reguliert, dementsprechend sind die neurochemischen Interaktionen innerhalb des

PFC vielfältig und komplex. Im Folgenden soll eine Übersicht über diesen

komplizierten Transmitterhaushalt gegeben werden.

Die beiden Aminosäuren Glu und GABA sind die wichtigsten exzitatorischen

bzw. inhibitorischen Neurotransmitter des PFC. Die glutamatergen Pyramidenzellen

bilden reziproke synaptische Verbindungen mit glutamatergen Terminalen anderer

Hirnregionen und sind rekurrent mit anderen Pyramidenzellen assoziiert. Glu bindet

an die ionotropen NMDA-Rezeptoren und �-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-

Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren, die sowohl auf den Pyramidenzellen als auch den

GABAergen Interneuronen lokalisiert sind. Interessanterweise zeigten verschiedene

18

Einleitung

Studien, dass der NMDA-Rezeptor bevorzugt die Aktivität der GABAergen

Interneurone reguliert [OLNEY ET AL., 1999; HOMAYOUN & MOGHADDAM, 2007]. Der

Neurotransmitter GABA wird lokal durch die Interneurone des mPFC sezerniert;

darüber hinaus projizieren GABAerge Neurone aus dem VTA in das Areal und sind

mit den Pyramidenzellen und Interneuronen verschaltet. Der inhibitorische Effekt

der GABAergen Aktivität wird über GABAA- und GABAB-Rezeptoren vermittelt.

Während die ionotropen GABAA-Rezeptoren im mPFC auf den Pyramidenzellen und

Interneuronen lokalisiert sind, ist die Positionierung der metabotropen GABAB-

Rezeptoren noch nicht völlig geklärt [PIROT ET AL., 1992; DUNN ET AL., 1996; MARGETA-

MITROVIC ET AL., 1999]. Zusätzlich wird Dopamin (DA) aus Terminalen des VTA in

den mPFC sezerniert und bindet an exzitatorischen DA-D1- und inhibitorischen DA-

D2-Rezeptoren, die ebenfalls auf den Pyramidenzellen und Interneuronen zu finden

sind. Darüber hinaus agiert DA über D2-Autorezeptoren an Terminalen der VTA-

Projektionen [CONDE ET AL., 1995; STEKETEE, 2003].

Die Stärke des exzitatorischen Ausgangs des mPFC ist folglich, neben den

glutamatergen lokalen Verschaltungen und Afferenzen anderer Hirngebiete,

zusätzlich von der modulatorischen Aktivität der GABAergen Neurone und der

mesocortikalen dopaminergen Innervation abhängig. Störungen der sensiblen

Transmitterbalance oder anderer Neuromodulatoren im PFC nehmen eine

Schlüsselrolle in der Pathologie psychiatrischer Erkrankungen ein. In diesem Kontext

soll auf die Kapitel 1.4.3 und 1.4.5 verwiesen werden, in denen unter anderem eine

Dysfunktion der Reelin-Homöostase besprochen wird, die ein Ungleichgewicht in der

GABAergen und glutamatergen Neurotransmission zur Folge hat.

Zusätzlich wird der mPFC durch das größte efferente Transmittersystem des

Telencephalons, welches seinen Ursprung in den dorsalen und medianen Raphé-

Kernen des Hirnstamms hat, serotonerg innerviert [AZMITIA & WHITAKER-AZMITIA,

1995]. Serotonin (5-HT) scheint im Allgemeinen einen inhibitorischen Einfluss auf

den mPFC auszuüben. Hier agiert der Transmitter vornehmlich über 5-HT1 bis 5-

HT3-Rezeptoren, die auf den Pyramidenzellen und Interneuronen lokalisiert sind.

Innerhalb des mPFC fungiert 5-HT als Modulator der GABAergen, dopaminergen

und glutamatergen Neurotransmission [WILLINS ET AL., 1997]. Ferner erhält der

mPFC noradrenerge Projektionen aus dem Locus coeruleus. Wie auch bei anderen

Hirnregionen, die den mPFC innervieren, empfängt der Locus coeruleus reziproke

exzitatorische Eingänge aus dem mPFC. Noradrenalin aktiviert über Subtypen der �-

und �-adrenergen Rezeptoren die Pyramidenzellen. Die adrenergen Rezeptoren sind

19

Einleitung

auf glutamatergen Terminalen lokalisiert und fördern hier die Ausschüttung von Glu

im mPFC [ROHRER & KOBILKA, 1998; MAREK & AGHAJANIAN, 1999]. Letztendlich wird

der Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) sowohl durch lokale Neurone als auch über

Projektionen aus dem Nucleus basalis magnocellularis und dem laterodorsalen

tegmentalen Kern in den mPFC sezerniert. Der Transmitter agiert vermutlich über

ACh-M1-Rezeptoren und übt einen exzitatorischen Effekt auf die Pyramidenzellen

des mPFC aus [CHESSELL ET AL., 1993; DIJK ET AL., 1995].

Wie bereits angedeutet, bedingt ein Ungleichgewicht der Transmitterbalance

kognitive Störungen und Verhaltensanomalien, die mit psychiatrischen

Erkrankungen wie der Schizophrenie assoziiert werden. Diese Erkrankung wird in

den nächsten Kapiteln näher vorgestellt.

20

Einleitung

1.4 Schizophrenie

Zu Beginn des 20. Jahrhunderts berichteten die Psychiater KRAEPELIN und BLEULER

erstmals von einer psychiatrischen Erkrankung, die durch das Auftreten

verschiedener Verhaltensstörungen gekennzeichnet war. Aufgrund der Tatsache, dass

die von ihnen beobachteten Symptome, wie z.B. Wahnvorstellungen und

Halluzinationen, nicht spezifisch der Erkrankung zugeordnet werden konnten,

charakterisierten sie die psychiatrische Störung mit einer Verschlechterung der

Fähigkeit, klare, flüssige und logische kognitive Prozesse durchzuführen [ANDREASEN,

2000]. KRAEPELIN benannte die Erkrankungen zunächst als Dementia praecox

(geistiger Verfall mit frühem Beginn), bevor BLEULER die Symptomatik erstmals mit

dem Begriff „Schizophrenie“ bezeichnete [ANDREASEN, 1997; BOGERTS, 1999;

ANDREASEN, 2000].

Heutzutage gehört die Schizophrenie mit einer Prävalenz von einem Prozent

zu den häufigsten geistigen Erkrankungen weltweit und ist noch immer eine der am

stärksten erforschten psychiatrischen Störungen [LEWIS & LIEBERMAN, 2000; KOCH,

2006]. Aufgrund der komplexen Symptomatik, zu der kognitive Dysfunktionalitäten

und emotionale Störungen gehören, werden verschiedene Subtypen mit Hilfe des

DSM IV (Diagnostisches und Statistisches Handbuch Psychischer Störungen)

diagnostiziert. Beispiele für diese Subtypen sind der katatone Typus, welcher durch

psychomotorische Störungen gekennzeichnet ist oder ein durch Wahnvorstellungen

oder auditorische Halluzinationen charakterisierter paranoider Typus [KESHAVAN,

1999; ANDREASEN, 2000; LIEBERMAN ET AL., 2001].

Allgemein lässt sich herausheben, dass die Erkrankung eines der größten

medizinischen Probleme der Gegenwart darstellt und Menschen aus allen sozialen

Schichten und Ethnien betrifft. Erste Symptome der Erkrankung können im frühen

Erwachsenenalter auftreten und die Lebensqualität dramatisch beeinflussen, was

durch eine ca. 10%ige – vergleichsweise hohe – Suizidquote der Betroffenen

verdeutlicht wird [BAYER ET AL., 1999; ANDREASEN, 2000; LEWIS & LIEBERMAN, 2000].

1.4.1 Symptomatik

Die Symptome schizophrener Erkrankungen umfassen den gesamten Bereich

menschlicher mentaler Aktivitäten, weshalb es nicht möglich ist, schizophrene

Subtypen durch ein einzelnes Symptom zu charakterisieren. Die Betroffenen leiden

21

Einleitung

vielmehr unter verschiedenen Symptomen, die individuell variieren [ANDREASEN,

2000].

Im Allgemeinen werden positive (Typ 1-Schizophrenie) und negative (Typ 2-

Schizophrenie) Symptome unterschieden [HARRISON, 1999; ANDREASEN, 2000]. Die

Positivsymptomatik wird durch Charakterzüge und Verhaltensweisen definiert, die

bei gesunden Menschen nicht beobachtet werden können, aber aus der Krankheit

resultieren. Dazu zählen Halluzinationen aller Sinnesbereiche (am häufigsten treten

akustische Halluzinationen auf), Wahnvorstellungen, bizarres Verhalten und formale

und inhaltliche Denkstörungen (Paranoia). Dagegen beschreibt die

Negativsymptomatik den Verlust bestimmter humaner Charakteristika und

manifestiert sich durch apathisches und anhedonisches Verhalten sowie

Sprachstörungen und Motivationsverlust [WYATT & HENTER, 1997; HARRISON, 1999;

LIEBERMAN ET AL., 2001].

Neben der Positiv- und Negativsymptomatik gehören Defizite der

Aufmerksamkeits- und Informationsverarbeitung zu den Hauptsymptomen

schizophrener Störungen [GOLDBERG & GOLD, 1995; GEYER ET AL., 2001; MEINCKE ET

AL., 2001]. Solche kognitiven Störungen verhindern, dass Informationen aus der

Umwelt gezielt aufgenommen und gefiltert werden können und führen zu

Reizüberflutung, intrusiven Gedanken sowie zu Defiziten der sensomotorischen

Integration. Schizophrene Patienten besitzen demnach nicht mehr die Fähigkeit,

adäquat auf verschiedene Umweltreize zu reagieren [VOLZ, 2000].

1.4.2 Ätiologie

Die Entstehung schizophrener Erkrankungen und die den Verlauf der Psychose

bestimmenden Faktoren sind bis heute weitestgehend ungeklärt. Verschiedene

Studien konnten nachweisen, dass es sich bei der Erkrankung um eine

Entwicklungsstörung handelt, an der prä- und perinatale, genetische, physiologische

und psychologische Faktoren beteiligt sein können [DUNCAN ET AL., 1999; KOCH,

2006].

Familien-, Zwillings- und Adoptionsstudien konnten ferner zeigen, dass eine

genetische Prädisposition für eine schizophrene Erkrankung besteht, so dass

Verwandte von Patienten mit schizophrenen Störungen ein erhöhtes Risiko tragen,

zu erkranken. Die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung bei Verwandten ersten

22

Einleitung

Grades liegt bei 6-17%, bei eineiigen Zwillingen bei 40-50%. Im Vergleich zu der

Möglichkeit einer Erkrankung von einem Prozent in der Normalbevölkerung, bietet

die genetische Komponente einen wichtigen Erklärungsansatz. Sie kann aber das

Auftreten der Schizophrenie nicht ausschließlich erklären, da eine

Erkrankungswahrscheinlichkeit von nur 45% bei genetischer Identität vorliegt

[SCHULTZ & ANDREASEN, 1999; ANDREASEN, 2000; LEWIS & LIEBERMAN, 2000].

Epidemiologische Studien ergaben des Weiteren, dass neben der genetischen

Komponente umweltbedingte, frühe Entwicklungsstörungen einen wichtigen

epigenetischen Faktor darstellen, der die Vulnerabilität für die Entwicklung einer

Schizophrenie begünstigt [LIEBERMAN ET AL., 2001; VAN DEN BUUSE ET AL., 2003;

KOCH, 2006]. Aus dieser Annahme leitet sich die Vulnerabilitäts-Stress-Hypothese

(Two-Hit-Model) der Schizophrenie ab. Diese geht davon aus, dass es mindestens

zwei schädigender Ereignisse bedarf, ehe die Erkrankung klinisch manifest wird

[BAYERET AL., 1999; KOCH, 2006]. Hierbei bewirken genetische Faktoren und/oder

prä- bzw. perinatal ausgelöste Entwicklungsstörungen des Gehirns (z.B. durch

Hypoxie, Virusinfektionen oder Toxine) während des 2. bis 3. Trimesters der

Schwangerschaft ein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Diese ersten Noxen führen in den

meisten Fällen jedoch noch nicht zum Ausbruch der Krankheit, sondern erhöhen als

sogenannter first hit die Vulnerabilität des Gehirns für spätere Störungen, die als

second hit bezeichnet werden [LIEBERMAN ET AL., 2001; KOCH, 2006]. Als second hit

gelten Einflüsse wie Stress, Geburtskomplikationen, Hormonschwankungen während

der Pubertät oder Drogenkonsum. Diese beeinflussen bzw. stören abschließende

Entwicklungsprozesse des Gehirns (z.B. die Eliminierung überflüssiger Synapsen

bzw. die Myelinisierung) und können letztendlich beim Erwachsenen zum Ausbruch

der Krankheit führen [BAYER ET AL., 1999; LEWIS & LIEBERMAN, 2000; KOCH, 2006].

Die meisten Betroffenen erscheinen bis zur späten Pubertät oder dem frühen

Erwachsenenalter (Periode des größten Erkrankungsrisikos: �20-30, �25-35 Jahre)

unauffällig, so dass zwischen dem first hit und dem Ausbrechen der Krankheit bis zu

20 Jahre liegen können [LEWIS & LIEBERMAN, 2000; KOCH, 2006].

1.4.3 Neuropathologie

Eine wichtige Aufgabe der Schizophrenieforschung ist es zu verstehen, warum eine

genetisch vermittelte, neuronale Entwicklungskrankheit in den ersten Dekaden des

23

Einleitung

Lebens klinisch nicht nachweisbar ist, dann aber zu einer progressiven Behinderung

der Betroffenen führt [LEWIS & LIEBERMAN, 2000]. Die Suche nach

neuropathologischen Ursachen zeigte schnell, dass sich die breite

Symptomvariabilität auch auf biologischer Ebene widerspiegelt.

Post mortem-Untersuchungen verdeutlichten morphologische Auffälligkeiten

in den Gehirnen schizophrener Patienten. So wurden Erkenntnisse über eine

Vergrößerung des lateralen und dritten Ventrikels [GOLDBERG & GOLD, 1995;

ANDREASEN, 1997; HARRISON, 1999], eine Veränderung der Cytoarchitektur, der

Zellgröße und der Dichte des Neuropils bei unveränderter Neuronenzahl publiziert

[GLANTZ & LEWIS, 2001; PIERRI ET AL., 2001]. Diese Veränderungen zeigten ähnliche

topographische Zentren und waren hauptsächlich im frontalen und temporalen

Cortex, im Hippocampus und Thalamus nachweisbar. Zudem bestätigten

bildgebende in vivo-Verfahren strukturelle Veränderungen im Gehirn schizophrener

Patienten [YAMASUE ET AL., 2004; VENKATASUBRAMANIAN ET AL., 2008].

Weiter konnten Studien erhebliche Veränderungen in Gehirnen schizophrener

Patienten auf molekularer Ebene nachweisen. So zeigte sich eine verminderte

Expression von Reelin und der GAD67, SNAP25, verschiedener

Transmitterrezeptoren und zusätzlich eine quantitative Veränderung bei

Adhesionsmolekülen, Cytoskelettproteinen oder Neurotrophinen [IMPAGNATIELLO ET

AL., 1998; EASTWOOD & HARRISON, 2006].

Neben diesen anatomischen Befunden werden funktionelle Störungen

beschrieben, in deren Zentrum eine subcortikale Hyper- und cortikale Hypofunktion

stehen und mit der Dysfunktionen verschiedener Transmittersysteme physiologisch

erklärt werden können. Hierbei wurde in den letzten Jahren dem dopaminergen und

glutamatergen Transmittersystem besondere Bedeutung zugeschrieben [CARLSSON ET

AL., 1999; OLNEY ET AL., 1999; MELTZER, 1999].

Das DA-System ist an Regulationsmechanismen verschiedener

Verhaltensweisen wie der sensomotorischen Informationsverarbeitung beteiligt. In

Bezug auf die Schizophrenie postuliert die DA-Hypothese eine Überfunktionalität der

mesolimbischen Bahn, woraus beispielsweise im NAc eine verstärkte präsynaptische

DA-Freisetzung resultiert. Diese wird als Hauptursache für die Positivsymptomatik

der Schizophrenie angesehen [CARLSSON ET AL., 1999; JENTSCH & ROTH, 1999; MÜLLER,

2002; KOCH, 2006]. Die Beteiligung des dopaminergen Systems an der Schizophrenie

beruht auf zwei Tatsachen. Zum einen handelt es sich bei den meisten in der

Schizophreniebehandlung klinisch wirksamen, klassischen Antipsychotika wie

24

Einleitung

Haloperidol um DA-D2-Rezeptor-Antagonisten. Zum anderen können durch potente

DA-Agonisten wie Amphetamin bei gesunden Probanden schizophrenieartige

Psychosen ausgelöst sowie bei bereits Erkrankten schizophrene Psychosen verstärkt

werden [CARLSSON ET AL,, 1999; LEWIS & LIEBERMAN, 2000; KOCH, 2006]. Diese

Hypothese bietet demnach einen guten Erklärungsansatz für die Positivsymptomatik

der Schizophrenie, die Negativsymptomatik kann jedoch durch sie nur unzureichend

erklärt werden. In diesem Zusammenhang wird dem Neurotransmitter Glu bzw. dem

NMDA-Rezeptor eine entscheidende Rolle zugeschrieben. NMDA-Rezeptoren

befinden sich in besonders hoher Dichte im Cortex, im Hippocampus, der Substantia

nigra und dem Striatum, wodurch sie an der Regulation verschiedenster zentraler

Funktionen beteiligt sind [MICHAELIS, 1998]. Die Glu-Hypothese der Schizophrenie

formuliert primär eine NMDA-Rezeptor-Hypofunktion bzw. eine defizitäre Glu-

Neurotransmission sowie -Signalkaskade und wird vor allem dadurch gestützt, dass

schizophrenieartige Symptome im gesunden Probanden und Versuchstier durch

nicht-kompetitive NMDA-Rezeptorantagonisten wie Phencyclidin (PCP) oder

Dizocilpin modelliert werden können [OLNEY ET AL., 1999; KOCH, 2006]. Da Glu ganz

wesentlich an der cortikalen Neurotransmission beteiligt ist (s. Kapitel 1.3.2), lässt

sich ein Zusammenhang mit den cortikalen Aktivitätsstörungen herstellen. Darüber

hinaus üben glutamaterge Projektionen einen inhibitorischen Einfluss auf

subcortikale Gebiete aus, so dass eine cortikale Dysfunktionalität bzw. Hypofunktion

eine subcortikale dopaminerge Hyperfunktion zur Folge haben könnte. Daraus ergibt

sich eine funktionelle Schnittstelle der Glu- und DA-Hypothese, in der erstere

vornehmlich einen Erklärungsversuch für die kognitiven Defizite und das Auftreten

der Negativsymptomatik bietet, während letztere sekundäre Folgeerscheinungen der

Positivsymptomatik erklärt.

Beide pharmakologischen Modelle stellen wichtige heuristische Konzepte der

experimentellen Schizophrenieforschung dar. Allerdings deutet das Wirkungsprofil

der klinisch oft wirkungsvolleren atypischen Antipsychotika darauf hin, dass an den

schizophrenen Störungen mehr als die beiden angesprochenen Transmittersysteme

beteiligt sind [CARLSSON ET AL., 1999; KOCH, 2006]. So besitzen Pharmaka wie

Clozapin, Olanzapin oder Risperidon ein geringes Wirkungsprofil an DA-D2-

Rezeptoren, dafür große Affinitäten zu Rezeptoren des serotonergen, noradrenergen

und cholinergen Systems [KOCH, 2006].

25

Einleitung

1.4.4 Der PFC und die Schizophrenie

Dysfunktionen des PFC haben in der Regel eine Vielzahl von kognitiven Defiziten und

Verhaltensstörungen zur Folge. So zeigten sich unter anderem Beeinträchtigungen

des Kurzzeitgedächtnisses, der Aufmerksamkeitsleistung und Handlungsplanung, der

Verhaltensinhibition und des Sozialverhaltens sowie emotionale Störungen. Neben

diesen funktionellen Störungen, wird dem Areal eine wichtige Beteiligung an

pathophysiologischen Prozessen der Schizophrenie zugeschrieben [WEINBERGER &

LIPSKA, 1995; BENES ET AL., 2000; SELEMON, 2001; CALLICOTT ET AL., 2003].

Wie bereits beschrieben, ist das Krankheitsbild der Schizophrenie durch eine

breite Symptomatik bzw. Komplexität charakterisiert, was die Zuordnung zu einer

klar abgrenzbaren Dysfunktion, beispielsweise eines Tranmittersystems oder

Gehirnareals, als neuropathologische Ursache, erschwert. Verschiedene Studien

verdeutlichten zwar Störungen einzelner Systeme, allerdings konnte keine der

ermittelten Ursachen die enorme Heterogenität der Erkrankung hinreichend

erklären [HARRISON, 1999; SELEMON, 2001]. Es gibt jedoch verschiedene Studien, die

dem dlPFC des Menschen (Abb. 1.7) eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der

Schizophrenie zuordnen [LEWIS, 1997; SELEMON, 2001]. Meist wird eine erhebliche

Reduktion synaptischer Konnektivitäten, eine unstrukturierte neuronale Architektur

und eine Volumenverringerung im humanen dlPFC beobachtet [SHELTON ET AL. 1988;

BREIER ET AL. 1992; ZIPURSKY ET AL. 1992; SCHLAEPFER ET AL. 1994]. Interessanterweise

scheint es sich jedoch ausschließlich um eine Abnahme des Neuropils zu handeln, da

die Anzahl präfrontaler Neurone bei schizophrenen Patienten nicht beeinflusst wird

[AKBARIAN ET AL., 1995; LEWIS, 1997; THUNE ET AL., 2001]. Neben diesen anatomischen

Befunden wurden funktionelle Besonderheiten beschrieben, welche durch

bildgebende Untersuchungen als eine präfrontale Hypo- oder Hyperfrontalität

charakterisiert wurden. Zunächst wurde ausschließlich eine Hypofunktionalitäts-

Hypothese des Cortex postuliert. CALLICOTT und Mitarbeiter verdeutlichten später,

dass schizophrene Patienten bei der Durchführung von Arbeitsgedächtnisaufgaben

sowohl durch eine cortikale Minderaktivität als auch Hyperfrontalität charakterisiert

sind. Diese Aktivitätsbeeinträchtigung trat begleitend zur Arbeitsgedächtnisleistung

auf. Patienten, bei denen keine Störung der Gedächtnisleistung vorlag, zeigten eine

Hyperfrontalität, wohingegen diejenigen mit verminderten Leistungen durch eine

verminderte Aktivität auffielen. Demnach ist beiden Patientengruppen im Vergleich

zu den Kontrollpersonen eine funktionelle Störung des dlPFC bzw. eine damit

26

Einleitung

einhergehende Strategieänderung zur adäquaten Bearbeitung der geforderten

Leistung zu eigen [THUNE ET AL., 2001; CALLICOTT ET AL., 2003]. Weitere funktionelle

Anomalien sind die in Abschnitt 1.4.3 beschriebenen präfrontalen Dysfunktionen des

glutamtergen Transmittersystems und eine daraus resultierende Fehlregulation

subcortikaler DA-Systeme.

Wie Eingangs erwähnt, ist es nahezu unmöglich, ein klar abgrenzbares

neurophysiologisches Korrelat der Schizophrenie zu bestimmen. Die Hypothese einer

Fehlentwicklung des PFC als mögliche Basis einer Erkrankung vereint zumindest die

pharmakologischen Modelle der DA- und Glu-Hypothese und ist zudem in der Lage

die enorme Heterogenität der Schizophrenie zu erfassen. Im Folgenden soll auf ein

weiteres neuropathologisches Modell eingegangen werden, in dem der Fokus auf das

bereits ausführlich besprochene Glykoprotein Reelin gerichtet wird.

1.4.5 Reelin und die Schizophrenie

Die Funktionalität des Säugercortex hängt von der intakten Formation des

neuronalen Netzwerkes ab, in dem Neurone, Interneurone und Neurotransmitter wie

Glu und GABA fehlerlos miteinander kommunizieren. Neben morphologischen

Anomalien und Dysfunktionen einzelner Tranmittersysteme gehören molekulare

Veränderungen zur Neuropathophysiologie der Schizophrenie (s. 1.4.3). Bei einer

dieser Störungen handelt es sich um eine präfrontale GABAerge Hypofunktion, die

mit einer verminderten Reelin-Expression in die EZM assoziiert ist [AKBARIAN ET AL.,

1995; IMPAGNATIELLO ET AL., 1998; GUIDOTTI ET AL., 2000B; BENES & BERRETTA, 2001;

GUIDOTTI ET AL., 2005].

Da die GABAerge Unterfunktion nicht mit einem quantitativen neuronalen

Verlust einhergeht, muss man diese Dysfunktion als eine Veränderung des

GABAergen Phänotyps interpretieren bzw. als eine Funktionsstörung bestimmter

GABAerger Interneurone, wobei die beteiligten molekularen Mechanismen oder die

Spezifikation der Interneurone (vermutlich Horizontal- und double-bouquet-Zellen)

erst unvollständig verstanden sind [GUIDOTTI ET AL., 2000B; LEWIS ET AL., 2004;

GUIDOTTI, 2005; COSTA ET AL., 2008]. Aus der Dysfunktion dieser vornehmlich in den

cortikalen Schichten I bis III positionierten Interneurone resultiert eine verminderte

inhibitorische GABAerge Neurotransmission und eine Beeinträchtigung der

cortikalen Regulation pyramidaler Funktionen durch GABA. Da Reelin vornehmlich

27

Einleitung

in GABAergen Neuronen der cortikalen Schichten I und II lokalisiert ist und sich das

stärkste Detektionsmuster von extrazellulärem Reelin in den Schichten I bis III zeigt

[PESOLD ET AL., 1998; GUIDOTTI ET AL., 2000A; RODRIGUEZ ET AL., 2002], kommt es

zusätzlich zu einer erheblichen Reduktion der Reelin-Molekülkonzentration. Wie

bereits erwähnt, agiert Reelin im adulten Organismus unter anderem als trophischer

Faktor und kontrolliert die Dendritenmorphologie (s.u.). Sezerniertes Reelin bindet

an Integrinrezeptoren auf Dendriten benachbarter Pyramidenzellen, aktiviert die

Translation der Dendriten-mRNA und reguliert deren Reifungsprozesse [DONG ET

AL., 2003]. So zeigt sich neben der pyramidalen Fehlregulierung eine

Neuropilverarmung durch das gestörte Reelin-Signal. Dass diese Reduktion auch

wirklich mit der Reelin-Verarmung korreliert, bewiesen Studien an heterozygoten

GAD67-Mausmutanten, die ein vermindertes GABAerges Signal und eine normale

Reelin-Expression aufwiesen – hier fielen keine Anomalien der neuronalen

Strukturen auf [LIU ET AL., 2001; CARBONI ET AL., 2004].

Neben der morphologischen Beeinträchtigung führt das verebbte Reelin-

Signal zu funktionellen Störungen des NMDA-Rezeptors. Offenbar induziert Reelin

u.a. über den auf GABAergen Interneuronen lokalisierten ApoE-Rezeptor 2 und

VLDL-Rezeptor eine intrazelluläre Phosphorylierung des NMDA-Rezeptors und

einen dadurch verstärkten Ca2+-Einstrom [WEEBER ET AL., 2002; CHEN ET AL., 2005;

CAMPO ET AL., 2009]. Eine reduzierte Reelin-Expression führt demnach zu einer

Unterfunktion von auf GABAergen Interneuronen lokalisierten NMDA-Rezeptoren

und resultiert des Weiteren in einer verminderten inhibitorischen GABAergen

Neurotransmission [COSTA ET AL., 2008]. Diese zusätzliche cortikale Beeinträchtigung

des inhibitorischen GABAergen Tonus (neben der primären GABAergen

Hypofunktion) bedingt eine erhebliche Reduktion der inhibitorischen Kontrolle der

glutamatergen Pyramidenzellen bzw. einen Anstieg der exzitatorischen

Neurotransmission in cortikalen und subcortikalen Bereichen des Gehirns (Abb. 1.8)

[COSTA ET AL., 2001; COSTA ET AL., 2008].

28

Einleitung

Reelin

GABA

GABAerges Interneuron


NMDA-Hypofunktion

Reelin



GABA

GLU GLU

NMDA-Rezeptor Glutamat

GABA-Rezeptor GABA

Reelin-Rezeptor Reelin

Cortiko-cortikale Axone

Abb. 1.8 Die GABA-Reelin-Hypothese der Schizophrenie. Links: Reelin wird durch Interneurone in

den oberflächigen cortikalen Schichten durch einen konstitutiven Sekretionsweg in die EZM

sezerniert. Es bindet (1) an Integrinrezeptoren auf apikalen Dendriten der Pyramidenzellen, wo es die

Formation von Dendritenfortsätzen induziert, indem es dendritische mRNA aktiviert. Reelin bindet

(2) an ApoER2 und VLDLR auf GABAergen Interneuronen, wo es die Wirkung von Glutamat an

NMDA-Rezeptoren und dadurch eine verstärkte GABAerge Ausschüttung auf apikale Dendriten,

Somata und soma-nahe Axonsegmente der Pyramidenzellen induziert.

Rechts (Schizophrenie): Die Reelin- und GAD67-Expression sowie die Reelin- und GABA-

Ausschüttung sind reduziert. Das Reelin-Defizit verursacht (1) eine Integrinrezeptor-vermittelte

Abnahme der Dornfortsätze apikaler Dendriten der Pyramidenzellen und (2) eine ApoER2- und

VLDLR-vermittelte Hypofunktion der NMDA-Rezeptoren auf GABAergen Interneuronen, die eine

weitere Abnahme der GABA-Ausschüttung auf apikale Dendriten, Somata oder soma-nahe

Axonsegmente der Pyramidenzellen bewirkt. Die GABAerge Hypofunktion resultiert in einer

verstärkten glutamatergen Neurotransmission [nach COSTA ET AL., 2008].

29

Einleitung

Bestätigt wird diese These durch die Befunde tierexperimenteller Studien, in

denen heterozygote reeler-Mäuse eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem nicht-

kompetitiven NMDA-Rezeptorantagonisten Dizocilpin zeigten, welche auf eine

verminderte telencephale GABAerge Neurotransmission zurückzuführen ist [CARBONI

ET AL., 2004; QIU ET AL., 2006].

Aus diesen neuropathologischen Befunden ergibt sich für die weitreichenden

funktionellen Störungen, die die Veränderung des GABAergen Phänotyps bewirken

könnte, eine GABA-Reelin-Hypothese der Schizophrenie. Neben der primären

Unterfunktion GABAerger Interneurone verursacht ein Reelin-Defizit (1) eine

Integrinrezeptor-vermittelte Abnahme der Dornfortsätze apikaler Dendriten der

Pyramidenzellen. Außerdem verursacht es (2) eine ApoER2- und VLDLR-vermittelte

Hypofunktion der NMDA-Rezeptoren auf GABAergen Interneuronen, die eine

weitere Abnahme der GABA-Ausschüttung auf apikale Dendriten, Somata oder soma-

nahe Axonsegmente der Pyramidenzellen bewirkt. Die Folge ist ein Wegfall der

GABAergen Hemmung und eine Überfunktion cortikaler Pyramidenzellen, da

cortikale, limbische und thalamische Afferenzen unmoduliert die Neurone

durchlaufen können. Durch die prominenten Projektionen des PFC in weitere

cortikale und subcortikale Areale ergeben sich funktionelle Störungen verschiedener

neuronaler Schaltkreise, die sowohl an perzeptionellen und emotionalen als auch an

Lern- und Gedächtnisprozessen beteiligt sind (Abb. 1.8) [GUIDOTTI ET AL., 2005;

KOCH, 2006; COSTA ET AL., 2008].

Eine Disinhibition cortikaler Pyramidenzellen und/oder eine Reduktion des

Neuropils stellt demnach ein Modell dar, an dem die klinischen Befunde sensorischer

und kognitiver Störungen, welche bei schizophrenen Patienten auftreten, erklärt

werden könnten. Ob dieser Phänotyp genetischen oder epigenetischen Faktoren zu

Grunde liegt und inwiefern dieser Ansatz ein möglicherweise vielversprechendes Ziel

neuer Pharmaka ist, muss in zukünftigen Studien geklärt werden. In diesem Kontext

soll auf eine epigenetische Hypothese von ERMINIO COSTA und Mitarbeitern verwiesen

werden, die eine aufschlussreiche Erklärung für die Abnahme von Reelin und GABA

(ohne zellulären Verlust) bietet. In diesem Modell spielt die Überexpression der

Dnmt1 in telencephalen GABAergen Interneuronen schizophrener Patienten und eine

damit assoziierte Abnahme der Reelin-Konzentration durch eine Promoter-

Hypermethylierung eine Schlüsselrolle. Diese Hypermethylierung konnte in post

mortem Studien nachgewiesen und im Tierexperiment abgebildet werden. Mäuse, die

durch eine Behandlung mit L-Methionin eine Hypermethylierung der Reelin- und

30

Einleitung

GAD67-Promotoren erfuhren, zeigten Verhaltensauffälligkeiten und strukturelle

Hirnveränderungen, die denjenigen von schizophrenen Patienten entsprechen

[TREMOLIZZO ET AL., 2002; VELDIC ET AL., 2004; ABDOLMALEKY ET AL., 2005; GRAYSON

ET AL., 2005; VELDIC ET AL., 2005]. Dass diese Hyopthese einen neuen

pharmakologischen Ansatz der Schizophrenieforschung bietet, zeigt die Erkenntnis,

dass die induzierten molekularen Veränderungen und Verhaltensanomalien durch

das Antiepileptikum Valproat anatgonisiert werden konnte [TREMOLIZZO ET AL.,

2005].

31

Einleitung

1.5 Tiermodelle

Tiermodelle bieten vielfältige Möglichkeiten die Ätiologie neuropathologischer

Veränderungen oder das neuronale Substrat verschiedener Lernprozesse zu

untersuchen und dadurch besser verstehen zu können. So können durch gezielte

Manipulationen neuronaler Funktionen Verhaltensänderungen ausgelöst werden, die

auf ursächliche Zusammenhänge von Verhaltensdefiziten und neuropathologischen

Veränderungen hinweisen. Es muss allerdings darauf verwiesen werden, dass

beispielsweise bei schizophrenen Störungen oder verschlechterten

Gedächtnisfunktionen, aufgrund einer individuellen Symptomatik bzw.

unterschiedlichen Krankheitsverläufen, die Störungen als Ganzes wohl kaum in

einem einzigen Tiermodell erfasst werden kann. Aufgrund des Konzeptes der

Homologie der Hirnstrukturen und der Äquivalenz vieler Funktionen bei Mensch

und Tier (s. Kapitel 1.3.1), geht man jedoch davon aus, dass wesentliche Teilaspekte

verschiedener Störungen durch valide Tierexperimente dargestellt und untersucht

werden können [LIGHT & BRAFF, 1999; KOCH, 2006]. Tiermodelle basieren im

Allgemeinen auf dem Konzept der Endophänotypen. Diese beschreiben

physiologische Merkmale, die im Vergleich zum klinischen Symptom näher an der

biologischen Ursache der Störung orientiert sind und daher im Versuchstier

abgebildet werden können. Beispiele für Endophänotypen sind eine fehlende

Reaktionsunterdrückung, Störungen des Kurzzeitgedächtnisses oder der Motorik

[JENTSCH & ROTH, 1999; KOCH, 2006].

Im Folgenden sollen die dieser Arbeit zugrunde liegenden Tiermodelle

vorgestellt werden, in denen der temporäre Reelin-knockdown im mPFC der Ratte

untersucht wurde.

1.5.1 Die Präpulsinhibition der akustisch ausgelösten Schreckreaktion

Bei der akustisch ausgelösten Schreckreaktion (ASR) handelt es sich um eine durch

laute (>80dB) und plötzliche Reize ausgelöste, phylogenetisch alte, bei Säugetieren

universell auftretende, protektive Verhaltensreaktion. Die ASR ist charakterisiert

durch eine Kontraktion der Nacken-, Gesichts- und Skelettmuskulatur, den

Lidschluss, eine Erhöhung der Herzfrequenz und eine Unterbrechung gerader aktiver

Verhaltensprogramme [KOCH, 1999; KOCH & FENDT, 2003]. Die Reizantwort wird

32

Einleitung

üblicherweise beim Menschen elektromyographisch am Lidschlussreflex, bei der

Ratte als Ganzkörperkontraktion in der sogenannten Startle-Box gemessen.

Verschiedene elektrophysiologische und neuroanatomische Studien führten zu

einer genauen Identifikation von den an der ASR beteiligten Hirnstrukturen. Ein

Schreckreiz verläuft über den auditorischen Nerv über das vestibulo-cochleare

Ganglion und dem Nucleus reticularis pontis caudalis (PnC), der direkt auf craniale

und spinale Motorneurone projiziert und so eine motorische Antwort vermittelt (Abb.

1.9). Innerhalb dieser primären Schreckbahn stellt der PnC das zentrale Element dar

bzw. kann als eine Empfangsstation für inhibitorische und exzitatorische Afferenzen

anderer Hirnstrukturen, die modulierend auf die Schreckreaktion einwirken,

verstanden werden [KOCH ET AL., 1998; KOCH, 1999; MEINCKE ET AL., 2001].

ACh

Schreckantwort

vestibulo-cochleares Ganglion

Nucleus reticularis

pontis caudalis (PnC)

Motorneuron> 80dB

Glu

akustischer Schreckreiz

Abb. 1.9 Darstellung der primären Schreckbahn der Ratte. Abkürzungen: ACh: Acetylcholin; Glu:

Glutamat; erregender Neurotransmittereinfluss; hemmender Neurotransmittereinfluss [nach

KOCH ET AL., 1998; KOCH, 1999].

Die Stärke der ASR kann durch verschiedene Manipulationen beeinflusst

werden. So führen kurz vor dem Schreckreiz präsentierte aversiv emotionale Stimuli

(z.B. ein Fußschock) zu einer verstärkten Schreckantwort, während positiv

emotionale Stimuli (z.B. Futtergabe) die ASR abschwächen [DAVIS ET AL., 1993;

SCHMID ET AL., 1995; KOCH, 1999].

Eine weitere Möglichkeit, die ASR zu beeinflussen, ist die Präpulsinhibition

(PPI) der ASR (Abb. 1.10). Wird 30-500ms vor dem Schreckreiz ein so genannter

Präpuls präsentiert, also ein schwächerer Stimulus, der selbst keine Schreckreaktion

auslöst, kommt es zu einer abgeschwächten Schreckreaktion. Die PPI ist ein wichtiger

unbewusster Mechanismus, der eine gleichzeitige Informationsverarbeitung

getrennter Reize und daraus entstehende Verhaltensinterferenzen vermeiden soll

[BRAFF ET AL., 2001; GEYER ET AL., 2001].

33

Einleitung

Schreckreiz

Schreckantwort

Präpuls

Schreckreakti

30-500ms

A B

Schreckantwort

Schreckreiz

Abb. 1.10 (A) Die akustisch ausgelöste Schreckreaktion (ASR) und (B) die Modulation der ASR durch

einen Präpuls [nach WEGENER & KOCH, 2009].

Diese, durch einen Präpuls, hervorgerufene Inhibition der Verarbeitung des

Schreckreizes ist beispielsweise bei schizophrenen Patienten beeinträchtigt und stellt

eine empfindliche Messmethode zur Untersuchung von sensomotorischen Defiziten

dar [KOCH, 1999; GEYER ET AL., 2001;]. Man nimmt an, dass der Präpuls über eine

Freisetzung von ACh aus Neurone des pedunculopontinen tegmentalen Nucleus

(PPTg) zu einer Hemmung der Erregbarkeit der Riesenneurone des PnC führt.

Dadurch wird die Verarbeitung des folgenden Schreckreizes unterdrückt und eine

ungestörte Prozessierung des Präpulses gewährleistet [KOCH ET AL., 1998]. Neben

dem PnC kommt dem NAc als Kerngebiet zwischen Frontalhirn und limbischen

Strukturen große Bedeutung bei der Regulation der PPI zu. Er ist durch direkte und

indirekte (über das ventrale Pallidum (VP)) GABAerge Projektionen an der

Hemmung des PPTg und somit über den PnC an der Regulation der Stärke der PPI

beteiligt [KOCH ET AL., 1998]. Am NAc konvergieren des Weiteren glutamaterge

Afferenzen aus dem Hippocampus und der Amygdala, dopaminerge Innervation aus

dem VTA sowie serotonerge Projektionen aus den Raphé-Kernen des Hirnstamms.

Hinsichtlich der Fragestellung der vorliegenden Arbeit soll auf die direkten und

indirekten (über das VTA) Projektionen vom mPFC zum NAc verwiesen werden (Abb.

1.11) [KOCH, 1999; MEINCKE ET AL., 2001; SWERDLOW ET AL., 2001].

Die PPI ist ein experimentell einfach zu untersuchendes und anerkanntes

Tiermodell der Schizophrenieforschung, welches durch eine breite Anzahl von

Parametern (z.B. Interstimulusintervall, Intensität und Länge des

Präpulses/Schreckreizes) beeinflusst werden kann und ein gutes operationales Maß

für die Funktion eines sensomotrischen Filtermechanismus bietet.

34

Einleitung

ventrales tegmentales

Areal

medialer präfrontaler Cortex

DA

Glu

Nucleus accumbens

ventrales Pallidum

Raphé- Kerne

pedunculopontiner tegmentaler Kern

Colliculus inferior / superior

auditorischer Cortex

DA

Hippocampus

Amygdala

ACh

Glu

Glu

Glu

5-HT

Glu

GABA

GABA

5-HT

5-HT

ACh

GABA

mediales Septum

5-HT

Nucleus

cochlearis

PnC Präpuls

Abb. 1.11 Hypothetischer neuronaler Schaltkreis zur Beeinflussung der Präpulsinhibition (PPI) bei

der Ratte. Grün: PPI-modulierende Hirnstrukturen; Blau: Hirnstrukturen des neuronalen

PPI-Schaltkreises. Abkürzungen: 5-HT: Serotonin; ACh: Acetylcholin; DA: Dopamin; GABA:

�-Aminobuttersäure; Glu: Glutamat; PnC: Nucleus reticularis pontis caudalis; erregender

Neurotransmittereinfluss; hemmender Neurotransmittereinfluss [nach KOCH ET AL., 1998; KOCH,

1999].

35

Einleitung

1.5.2 Bewertung des Kurzzeitgedächtnisses: Der T-Maze- und der Object-

Recognition-Test

Störungen des Kurz- und Langzeitgedächtnisses wie sie bei schizophrenen Patienten

auftreten, lassen sich durch verschiedene Methoden feststellen, können jedoch nicht

ohne weiteres auf die Ratte übertragen werden. Dem Tierexperimentator stehen zur

Untersuchung des (kurzen) Aufrechterhaltens internalisierter Informationen eine

Reihe verschiedener Versuche wie der Object-Recognition-(OR)-Test oder Labyrinthe

wie das T-Maze zur Verfügung [OLTON, 1979; GOLDMAN-RAKIC, 1995;].

Bei dem T-Maze-Test muss das Tier erlernen zwischen zwei so genannten

Zielarmen zu alternieren, um eine Belohnung zu erhalten. Jeder einzelne Durchlauf

ist abhängig von dem zuvor gewählten Zielarm bzw. der Gedächtnisleistung der

Ratte. Durch eine zeitliche Verzögerung zwischen den einzelnen Durchgängen stellt

dieser Test eine sensible Methode dar, das räumliche Kurzzeitgedächtnis im

Versuchstier zu untersuchen [SANCHEZ-SANTED ET AL., 1997].

Eine Reihe von Hirnarealen scheint bei dieser Gedächtnisleistung involviert zu

sein, wenngleich noch Unklarheit darüber besteht, welche Struktur in welchem Maße

eine Rolle spielt. Die Fähigkeit, verzögert eine Gedächtnisleistung abzurufen, scheint

jedoch insbesondere von der bilateralen Integrität des mPFC und seiner

dopaminergen Transmission abhängig zu sein: Eine experimentell induzierte DA-

Hypofunktion im PFC von Affen oder Ratten führte dementsprechend zu einem

Arbeitsgedächtnisdefizit [SIMON ET AL., 1979; STAM ET AL., 1989]. Zusätzlich zeigten

WANG & CAI, dass nicht nur eine bilaterale Muskimolinhibition des ventralen mPFC

oder ventralen Hippocampus, sondern auch eine unilaterale Inhibition des ventralen

mPFC und des kontralateralen ventralen Hippocampus zu einer verminderten

räumlichen Arbeitgedächtnisleistung führten [WANG & CAI, 2006]. Weiter scheinen

Afferenzen aus dem VTA (DA) und dem mediodorsalen Thalamus (Glu) sowie

Neurotransmitter wie ACh und GABA wichtige modulatorische Eigenschaften auf das

Arbeitsgedächtnis auszuüben [Di SCALA ET AL., 1990; ROMANIDES ET AL., 1999;

HIRONAKA ET AL., 2001]. Demzufolge führen Manipulationen dieser

Transmittersysteme, z.B. eine Blockade von NMDA-Rezeptoren durch die

Rezeptorantagonisten Ketamin oder Dizocilpin [VERMA & MOGHADDAM, 1996], zu

Störungen dieser Gedächtnisleistung.

Eine weitere Möglichkeit das Erinnerungsvermögen bzw. das

Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen, bietet der OR-Test. Das Wiedererkennen ist ein

36

Einleitung

Prozess, bei dem sich ein Versuchstier daran erinnert, einen Stimulus (hier ein

Objekt) zuvor schon einmal erfahren zu haben. Im Vergleich zum T-Maze-Test, bei

dem die Gedächtnisleistung durch Abruf der vorausgegangenen Verhaltensleistung

bzw. -antwort beschrieben werden kann, wird bei dem Wiedererkennen

vorausgesetzt, elementare Charakteristika eines Ereignisses oder Gegenstandes

wahrzunehmen, zu identifizieren, zu unterscheiden und diese mit charakteristischen

Elementen bereits erfahrener Ereignisse zu vergleichen [STECKLER ET AL., 1998A].

Bei dem OR-Test wird einem Tier in gewohnter Umgebung genug Zeit gegeben

einen Gegenstand ausgiebig zu erkunden. Nachdem das Objekt für eine bestimmte

Zeit entfernt wurde, kann in der Regel bei einer erneuten Präsentation eine Abnahme

der Explorationszeit festgestellt werden, da das Objekt von dem Tier als bekannt

identifiziert wird. Dass diesem Prozess tatsächlich Gedächtnisleistungen zu Grunde

liegen, zeigt sich an der Abhängigkeit der Wiedererkennungsleistung von der Zeit

zwischen zwei Präsentationen bzw. dem Einsatz eines unbekannten Objektes als

zweiten Stimulus.

Im Vergleich zum räumlichen Kurzzeitgedächtnis, bei dessen Leistung eine

Beteiligung des PFC als obligat angesehen wird, ist eine präfrontocotikale Interaktion

bei der Objektwiedererkennung umstritten [STECKLER ET AL., 1998B]. So zeigten

immunhistochemische c-fos-Studien eine verstärkte, von der

Informationsverarbeitung abhängige, präfrontale Aktivität [ZHU ET AL., 1995],

wohingegen eine Läsion des mPFC keine Beeinträchtigung des Wiedererkennens

induzierte [ENNACEUR ET AL., 1997]. Jedoch scheinen neben den Neurotransmittern

Glu, GABA und ACh aufsteigende dopaminerge Projektionen zum PFC, ventralen

Hippocampus und Amygdala entscheidend an der Erbringung von Erinnerungs- und

Differenzierungsleistungen beteiligt zu sein. Auch hier führten induzierte

Dysfunktionen der DA-Transmission im PFC zu Defiziten im OR-Test [STECKLER ET

AL., 1998B; MORROW ET AL., 2000; VENTURA ET AL., 2004].

1.5.3 Messung der lokomotorischen Aktivität: Der Open-Field-Test

Die Konfrontation mit einer neuen Umgebung initiiert bei der Ratte verschiedene

Verhaltensweisen, die sowohl durch allgemeine lokomotorische Aktivität und

zielgerichtetem Explorationsverhalten als auch durch emotionales Verhalten wie

Ängstlichkeit charakterisiert sind. Im Tiermodell werden diese Verhaltensleistungen

in der Regel im Open-Field-(OF)-Test untersucht. Bei diesem Test wird das Tier in

37

Einleitung

eine von Seitenwänden umschlossene Box gesetzt, in der die Lokomotion nicht

eingeschränkt ist. Während des Versuchs werden verschiedene Verhaltensparameter

aufgezeichnet, um lokomotorische, exploratorische und emotionale

Verhaltensmuster zu untersuchen. Da der Lokomotion eine Prozessierung interner

Motivation und externer sensorischen Stimuli zugrunde liegt, kann in diesem

Tiermodell die Umsetzung motivierten Verhaltens in motorische Abläufe untersucht

werden. Vermittelt wird dies durch voneinander separaten, jedoch anatomisch und

funktionell miteinander interagierenden Systemen, dem limbischen und motorischen

System sowie den Basalganglien (Abb. 1.12) [MORGENSON ET AL., 1980; SKINNER &

GARCIA-RILL, 1993]. Als zentrales Element in diesem neuronalen Schaltkreis fungiert

der NAc, der innere und äußere Stimuli zu zielgerichtetem motorischen Verhalten

verarbeitet, während das dorsale Striatum (Nucleus caudatus und Putamen, CPu) an

der eigentlichen Bewegungsinitiation beteiligt ist. MOGENSON beschreibt diese

Interaktion als Übersetzung von Motivation in Bewegung [MOGENSON ET AL., 1993].

Der NAc empfängt glutamaterge Afferenzen von cortikalen und limbischen

Hirnstrukturen und projiziert zum VP, welches direkt oder indirekt über den PPTg

die Aktivität des Thalamus beeinflusst. Dieser moduliert über glutamaterge

Projektionen seinerseits die Aktivität des motorischen Cortex. [SKINNER & GARCIA-

RILL, 1993].

Das CPu innerviert hingegen direkt oder indirekt über den Globus pallidus

externus und den subthalamischen Kern die Ausgangsstrukturen der Basalganglien

(Substantia nigra pars reticulata, Globus pallidus internus) und bewirkt dadurch eine

nachfolgende Modulation des Thalamus. Ein Gleichgewicht zwischen den zentralen

motorischen Arealen und den modulierenden `Satelliten-Strukturen´ wie der

Substantia nigra pars compacta ist für die korrekte Bewegungskoordination von

entscheidender Bedeutung (Abb.1.12) [MINK, 1999; SCHMIDT, 2000].

38

Einleitung

Entorhinalcortex

Nucleus accumbens

Nucleus caudatus/Putamen

Amygdala Hippocampuspräfrontaler Cortex

Thalamus

Globus pallidus externus

Globus pallidus internus/ Substantia nigra

Nucleus subthalamicus

motorischer Cortex

GABA

Glu Glu Glu Glu

DA

Glu

GABA

GABA

GABA

GABA

GABA

Glu

GABA

GABA

5-HT

5-HT

Raphé-Kerne

5-HT

ventrales tegmentales Areal

pedunculopontiner tegmentaler Kern

ventrales Pallidum

mediale medulläre Formatio reticularis

Glu

Abb. 1.12 Hypothetischer neuronaler Schaltkreis der cortiko-limbisch-striato-thalamo-cortikalen

Feedback-Schleife, die an der Regulation der lokomotorischen Aktivität beteiligt ist. Blau: Ein- bzw.

Ausgangsstrukturen der Basalganglien; Grün: modulierende Hirnstrukturen. Abkürzungen: 5-HT:

Serotonin; DA: Dopamin; GABA: �-Aminobuttersäure; Glu: Glutamat [nach SCHMIDT, 2000].

39

Einleitung

1.5.4 Bewertung des spontanen Angstverhaltens: Der Elevated-Plus-

Maze-Test

Das Elevated-Plus-Maze (EPM) ist ein weit verbreiteter Standardtest der

experimentellen Angstforschung, welcher vornehmlich Furcht-motiviertes

Vermeidungsverhalten misst. [LIEBSCH ET AL., 1998; HO ET AL., 2002; WALL ET AL.,

2003]. Das EPM besteht im Wesentlichen aus vier erhöhten rechtwinklig zueinander

angeordneten Armen, die über eine zentrale Plattform miteinander verbunden sind.

Die jeweils gegenüberliegenden Arme sind entweder von einer Seitenwand flankiert

(geschlossene Arme) oder randlos (offene Arme). Grundlegend für dieses Paradigma

ist der Konflikt des Tieres zwischen Explorationsverhalten und der angeborenen

Angst vor offenen, erhöhten oder ungeschützten Flächen. Demzufolge wird die

Vermeidung des Eintretens in die offenen Arme als Angstverhalten interpretiert.

Bestätigung erfährt dieses Paradigma durch pharmakologische Studien: Anxiolytisch

wirkende Substanzen wie Benzodiazepine (z.B. Diazepam) vermindern ein aversives

Verhalten gegenüber dem ungeschützten Arm, wohingegen Anxiogenika das

Angstverhalten, also die Aufenthaltszeit im vermeintlich sicheren Arm des EPM,

verstärken [HO ET AL., 2002; CORNÉLIO & NUNES-DE-SOUZA, 2007]. Die diesem

Verhalten zugrunde liegenden neuronalen Substrate sind noch nicht vollständig

verstanden, verhaltenspharmakologische Studien implizieren jedoch eine Beteiligung

des GABAergen und des 5-HT-Systems bei der Modulation von Ängstlichkeit.

Untersuchungen zeigten deutliche 5-HT-Konzentrationsunterschiede im ventralen

Striatum, nicht jedoch im PFC, der Amygdala oder im ventralen Hippocampus bei

Ratten mit erhöhtem oder erniedrigtem Angstverhalten [HO ET AL., 2002], eine

erhöhte 5-HT2C-Rezeptor-Stimulation in der Amygdala [CAMPBELL & MERCHANT,

2003] oder 5-HT1A-Rezeptor-Stimulation im Hippocampus [FILE ET AL., 1996] nach

Applikation anxiogener Substanzen. Zusätzlich scheint DA einen Einfluss auf das

Angstverhalten auszuüben, wobei von einer untergeordneten bzw. modulierenden

Funktion ausgegangen werden kann [WALL ET AL., 2003].

1.5.5 Bewertung der Motivation: Die Breakpoint-Bestimmung im

Progressive-Ratio-Test

Ein grundlegendes Problem in der Verhaltenspharmakologie ist die Bewertung und

Messung einer Belohnung in Bezug auf deren Wert, Stärke und Effektivität [MOBINI

40

Einleitung

ET AL., 2000]. Ein scheinbar einfacher instrumenteller Verhaltenstest ist die

Bestimmung des sogenannten Breakpoints im Progressive-Ratio (PR)-Test, der auf

Arbeiten von HODOS zurückzuführen und dem Paradigma der operanten

Konditionierung zuzuordnen ist. Bei diesem Versuch, an dem motorische und

motivationale Aspekte beteiligt sind, wird von dem Tier eine permanente

Leistungssteigerung für das Erlangen einer konstanten Belohnung gefordert [Hodos,

1961; SALAMONE ET AL., 2002]. Die Ratten werden zunächst in einer Skinner-Box

darauf trainiert, für eine Futterbelohnung einen Hebel zu drücken. Nach dem

Erreichen einer konstanten Grundleistung, wird die Anforderung (operante Leistung)

stetig erhöht. Derjenige Punkt, an dem die Ratte gemäß eines zuvor festgelegten

Kriteriums die geforderte Leistung nicht mehr erbringt, wird als Breakpoint

bezeichnet und ist ein Index für die relative Stärke einer Belohnung, unabhängig von

der zu verrichtenden Arbeit (Hebeldruckrate) [REILLY, 1999] bzw. beschreibt die

Motivation des Tieres an eine Belohnung zu gelangen [MOBINI ET AL., 2000]. Dabei

steigt der Breakpoint bzw. die Motivation bei Futter-deprivierten Ratten mit der

Stärke einer Belohnung (z.B. Konzentrationsanstieg einer Zuckerlösung), wohingegen

dies bei durstigen Ratten keinen Einfluss auf die Motivation zeigte; ein wichtiger

Hinweis auf die Effektivität einer Belohnung [REILLY, 1999].

Es wird davon ausgegangen, dass zwei voneinander trennbare psychologische

Prozesse bzw. Phasen an der Belohnungsantwort beteiligt sind. Hierbei scheint zum

einen das cortiko-limbisch-striato-pallidale System von entscheidender Bedeutung

für die Umsetzung von Motivation in zielgerichtetes Verhalten zu sein [MOGENSON ET

AL., 1980; MOGENSON ET AL., 1993; AHN & PHILLIPS, 2002], wobei vermutlich

dopaminerge Interaktionen auf Ebene des NAc eine elementare Rolle in der

Vermittlung des Antriebs spielen (präparatorische Phase). So führen zum einen DA-

Antagonisten zu einer Abschwächung des instumentellen Verhaltens oder 6-

Hydroxydopamin induzierte Läsionen dopaminerger Kerngebiete zu aphagischen

Verhalten [UNGERSTEDT, 1971]. Zum anderen scheint die hedonische oder

konsumatorische Phase unabhängig von einer dopaminergen Modulation zu sein.

Diese beruht vielmehr auf GABAergen, glutamatergen und opioiden Schaltkreisen

des Vorderhirns [BERRIDGE & CROMWELL, 1990; DOYLE ET AL., 1993].

Pharmakologisch kann der Breakpoint durch Applikation von Substanzen

manipuliert werden, die durch eine direkte oder indirekte Beeinflussung der

dopaminergen Neurotransmission charakterisiert sind. Das atypische

Antipsychotikum Clozapin verbessert das Motivationsverhalten, wohingegen eine

41

Einleitung

Injektion des D2-Rezeptorantagonisten Haloperidol oder des NMDA-

Rezeptorantagonisten PCP zu einer Reduktion des Breakpoint führt [MOBINI ET AL.,

2000; WILEY & COMPTON, 2004].

42

Einleitung

43

1.6 Zielsetzung der Arbeit

Das Reelin-Molekül und der Reelin-Signaltransduktionsweg spielen neben der

Beteiligung an der neuronalen Entwicklung vor allem in der Schizophrenieforschung

und beim Verständnis von Lern- und Gedächtnisfunktionen eine elementare Rolle.

Verschiedene Tiermodell (homo- oder heterozygote reeler-Maus) oder in vitro-

Untersuchungen haben die Reelin-Forschung bereits weit vorangetrieben. Leider

kann durch die genannten Methoden keine spezifische und zeitlich begrenzte Reelin-

Reduktion induziert werden, welche jedoch neue und aufschlussreiche Erkenntnisse

über das Wirkungsspektrum von Reelin liefern könnte. Diesbezüglich fokussiert sich

die vorliegende Arbeit auf drei Aspekte:

(1) Etablierung einer Methode, um einen temporären und topographisch

spezifischen Reelin-knockdown zu induzieren. Hierzu wurde eine intracerebrale

Infusion der für die Reelin-mRNA spezifischen antisense-Oligonukleotide

durchgeführt und anschließend die Reelin-Konzentration in verschiedenen

Hirnregionen quantifiziert.

(2) Klärung der Beteiligung eines im mPFC ausgelösten pubertären Reelin-

Defizits an Verhaltensänderungen der Ratte mit Hilfe der lokalen Reelin-antisense-

Infusion. Grundlage der Untersuchung war die Unterdrückung der Reelin-

Gentranslation während der Pubertät, um so in anschließenden Verhaltenstests die

potentielle Rolle von Reelin als neurotrophen Faktor zu untersuchen.

(3) Bewertung der Effekte eines akuten Reelin-knockdowns im mPFC auf die

Verhaltensleistung adulter Ratten. Hier stellte sich die Frage, inwiefern der Reelin-

Verlust zu Störungen verschiedener Transmittersysteme führt und eine

Beeinflussung der untersuchten Verhaltensweisen bewirkt.

Zusammenfassend kann das Auslösen eines sowohl zeitlich als auch

topographisch begrenzten spezifischen Reelin-knockdowns sowie die anschließende

qualitative und quantitative Bestimmung der daraus resultierenden Effekte auf die

allgemeine Verhaltensleistung der Ratte im weiteren Kontext der

Schizophrenieforschung als das allgemeine Ziel dieser Arbeit definiert werden.

Material und Methoden

2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Die Versuche wurden mit zwei Gruppen männlicher Wistar Ratten durchgeführt

(pubertäre und adulte Gruppe). Die Tiere der adulten Versuchsgruppe (n=29)

wurden von Harlan-Winkelmann (Borchen, Deutschland) bezogen, diejenigen der

pubertären Versuchsgruppe (n=37) stammten aus eigener Züchtung.

Die Temperatur im Zuchtraum betrug konstant 21°C±1 und eine Zeitschaltuhr

regelte den Hell-Dunkel-Rhythmus in 12-Stunden Intervallen (Licht an um 06.30h).

Leitungswasser und Zuchtfutter (Nohrlin, Bad Salzuflen, Deutschland) standen den

Ratten ad libitum zur Verfügung. Für die Verpaarung wurden adulte weibliche und

männliche Zuchttiere in Standard Makrolonkäfigen des Typs IV paarweise

zusammengesetzt. Das männliche Tier wurde nach einer Woche aus dem Käfig

genommen. Jeder Wurf wurde direkt nach der Geburt auf acht männliche Welpen

reduziert bzw. mit weiblichen Welpen auf eine Wurfgröße von acht vervollständigt.

An postnatal Tag (pd) 21 wurden die männlichen Welpen von ihrer Mutter getrennt

und in einen separaten Haltungsraum (Haltungsbedingungen des Haltungsraums

entprachen denen des Zuchtraums) überführt. In Standard Makrolonkäfigen Typ IV

erhielten die Ratten (n=3-6) solange Leitungswasser und Haltungsfutter (Nohrlin,

Bad Salzuflen, Deutschland) ad libitum, bis sie ein Körpergewicht von 180g erreicht

hatten. Im Anschluss wurden die Tiere für den gesamten Zeitraum der Versuche

kontrolliert mit 12g Haltungsfutter/Tag/Ratte gefüttert, so dass ein Körpergewicht

von 250-300g gewährleistet war (entspricht ungefähr 85% des Körpergewichts bei ad

libitum-Fütterung). Die adulte Versuchsgruppe wurde unter identischen

Bedingungen im Haltungsraum gehalten.

Eine Reinigung der Tierräume, der Käfige sowie der Trinkflaschen wurde

zweimal pro Woche durch ausgebildetes Fachpersonal durchgeführt. Um

Stresssituationen zu vermeiden, erfolgte ein tägliches, individuelles Handling der

Tiere während der präoperativen Phase; die Bestimmung des Körpergewichts erfolgte

in einem Abstand von drei Tagen. Alle Operationen, Substanzapplikationen und

Experimente erfolgten während der Lichtphase und waren von der lokalen

Aufsichtsbehörde (Senatorin für Arbeit, Frauen, Gesundheit, Jugend und Soziales)

genehmigt.

45


2.2 Antisense-Oligonukleotide

Theorie

Durch die im Zuge des Human Genome Projects mehr und mehr sequenzierten und

auch kartierten Gene, ist die Funktionsanalyse noch unbekannter Gene von

entscheidender Bedeutung für die biomedizinische Forschung. Eine populäre

Methode, um den Effekt eines einzelnen Gens auf den Organismus zu untersuchen,

ist der Einsatz transgener Mäuse, die durch eine Über- oder Unterexpression

verschiedener Gene charakterisiert sind. Eine weitere elegante Methode ist der

Einsatz speziell designter antisense-Oligonukleotide (AON), die effektiv die

Translation spezifischer Gentranskripte in vitro oder in vivo herunterregulieren – ein

Prozess der als Protein-knockdown bezeichnet wird. Obwohl AONs nicht in

Überexpressionsstudien eingesetzt werden können, weisen sie einige Vorteile

gegenüber dem Einsatz von trangenen Mäusen auf:

� Sie sind in verschiedenen Spezies einsetzbar.

� Der jeweilige Protein-knockdown ist reversibel.

� Sie besitzen ein hohes therapeutisches Potential und bieten die Möglichkeit

eines Polyprotein-knockdows durch den simultanen Einsatz verschiedener

AONs [LESLIE ET AL., 1999].

Bei den hier eingesetzten synthetischen AONs handelt es sich um spezifisch

modifizierte Moleküle, an deren Nukleinsäurerückgrat ein Sauerstoffatom der

Phosphodiesterbindung durch ein Schwefelatom substituiert wurde (Abb. 2.1). Diese

Moleküle werden als Phosphothioat-Oligonukleotide (PTO) bezeichnet und weisen

nach endocytotischer Aufnahme in die Zelle einen erhöhten Schutz gegenüber

enzymatischem Abbau auf. Intrazellulär hybridisieren die PTOs mit der

komplementären mRNA des Zielgens und inhibieren so spezifisch die Translation des

Proteins bzw. rufen einen effektiven knockdown hervor (Abb. 2.2). Die Hemmung der

Translation beruht auf Degradation des Hybrids durch RNase H-Aktivität oder einer

sterischen Blockade des Ribosoms [AGRAWAL, 1999; JULIANO ET AL., 2008].

Reelin-antisense Phosphothioat-Oligonukleotide

Zwei partiell phosphothioat-modifizierte Oligonukleotidsequenzen (Reelin-antisense

(AS), scramble-missense (MS)) wurden durch die Firma Biognostik (Göttingen,

46


OO

O P O

O O O

O

OO

OPO

S OO

O

Base

Base

Base

Base

Abb. 2.1 Phosphothioat-Bindung zweier Nukleotide (3´-5´-Bindung). Ein Sauerstoffatom an dem

Nukleinsäurerückgrat wird durch ein Schwefelatom substituiert.

Reelin-antisense

mRNA

DNA

Transkription Translation

Ribosom Aminosäuren Reelin

Abb. 2.2 Theoretische Darstellung des Protein-knockdowns durch Reelin-antisense Phosphothioat-

Oligonukleotide (PTO). PTOs hybridisieren mit der mRNA des Zielproteins und inhibieren so die

Translation.

47


Deutschland) bzw. biomers.net (Ulm, Deutschland) synthetisiert und gereinigt. Die

Oligonukleotidsequenzen waren wie folgt strukturiert:

AS: 5' - AACTGCTCGGGTTCTC - 3'

MS: 5' - GCTCTATGACTCCCAG - 3'

Die AS-Sequenz entspricht den Nukleotiden 3566-3581 der Reelin-mRNA der Ratte.

Um sequenz- und substanzbasierende Nebeneffekte auszuschließen, wurde neben

einer Vehikel-behandelten Rattengruppe einer weiteren Gruppe die MS-PTOs

infundiert, die durch identische Basenpaarlänge und -komposition in randomisierter

Anordnung im Vergleich zur Reelin-AS charakterisiert waren. Die PTOs wurden in

steriler Saline (0.9%) in einer Konzentration von 2nmol/μl gelöst – einer

Konzentration, die schon zuvor zu einem effektiven intracerebralen Protein-

knockdown geführt hatte [PERSICO ET AL., 1998; COLÓN-CESARIO ET AL., 2008].

2.3 Experimentelles Design

Pubertäre Gruppe

Die Versuchstiere der pubertären Gruppe wurden ab pd21 zu Gruppen von drei bis

sechs Tieren zusammengesetzt und an pd43±1 stereotaktisch operiert (s. 2.4). Nach

einer einwöchigen Ruhephase begann die pubertäre (pd50-60) intracerebrale

Injektionsphase, in der die Tiere pseudorandomisiert einer der drei Versuchsgruppen

(AS-Gruppe, MS-Gruppe, Vehikel-Gruppe) zugeordnet wurden und jeweils fünf

Substanzapplikationen an zehn Tagen erhielten. Mit Erreichen des jung-adulten

Alters (pd67) bis zum pd100 durchliefen die Tiere verschiedene Verhaltenstests, um

den Effekt des pubertären Reelin-knockdowns zu untersuchen. Gemessen wurden:

� Präpulsinhibition (PPI) der akustisch ausgelösten Schreckreaktion (ASR)

� Räumliches Kurzzeitgedächtnis im T-Maze-Test

� Wiedererkennungsleistung im Object-Recognition (OR)-Test

� Lokomotrische Aktivität im Open-Field (OF)-Test

� Angstverhalten im Elevated-Plus-Maze (EPM)-Test

� Motivation bzw. der Breakpoint im Progressive-Ratio (PR)-Test

48


Nach Beendigung der Verhaltensversuche wurden die Gehirne histologisch

untersucht. Zusätzlich wurden einige Tiere 24h nach der Injektionsphase getötet, um

eine quantitative Reelin-Bestimmung mittels Western Blot-Analyse und

densitometrischer Proteinmessung durchzuführen.

Adulte Gruppe

Neben den Versuchen mit jung-adulten Tieren wurde ebenfalls ein akuter Reelin-

knockdown in der Versuchgruppe der adulten Ratten induziert. Die Tiere wurden in

Gruppen von drei bis sechs Tieren eingeteilt und an pd93 einer stereotaktischen

Operation unterzogen. Nach einer einwöchigen Ruhephase erfolgte die adulte

(pd100-110) intracerebrale Injektionsphase, in der die Tiere, identisch zu den

juvenilen Ratten, pseudorandomisiert einer der drei Versuchsgruppen (AS-Gruppe,

MS-Gruppe, Vehikel-Gruppe) zugeordnet wurden und jeweils fünf

Substanzapplikationen an zehn Tagen erhielten. Während der Injektionsphase

durchliefen die Tiere folgende Verhaltensparadigmen:

� PPI der ASR

� Räumliches Kurzzeitgedächtnis im T-Maze-Test

� Lokomotrische Aktivität im OF-Test

Nach Beendigung der Verhaltensuntersuchungen wurden die Tiere getötet und die

Gehirne histologisch aufgearbeitet. Eine quantitative Reelin-Bestimmung erfolgte bei

einigen der Tiere 24h nach Abschluss der letzten Injektion.

Eine Übersicht über das experimentelle Design beider Versuchstiergruppen ist in

Abb. 2.3 dargestellt.

49


pd0

Stereotaktische Operation

PPI Open-Field

T-Maze Objekt-Recognition Elevated-Plus-Maze

Progressive-Ratio

pd43 pd50-60 pd67-100

Injektionen während der

Pubertät

pd61

Sektion� Western Blot

PPIOpen-Field

T-MazeObjekt-Recognition Elevated-Plus-Maze

Progressive-Ratio

Histologische Auswertung

pd110

pd0

Stereotaktische Operation

pd93 pd100-110 pd111

Sektion � Western Blot

pd117

Histologische Auswertung

Pubertäre Gruppe

Adulte Gruppe

Injektionen während des

adulten Stadiums gefolgt von:

PPI

Open-Field T-Maze

Abb. 2.3 Experimentelles Design der pubertären und adulten Versuchstiergruppe.

2.4 Stereotaktische Operation

Voraussetzung für die Durchführung des stereotaktischen Eingriffs war ein mittleres

Körpergewicht von 190g±10 (adult) bzw. 170g±10 (pubertär). Die Einleitung der

Narkose erfolgte durch Chloralhydrat (360mg/kg; Sigma-Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland), welches in Saline (0.9%) gelöst und intraperitoneal (i.p.) verabreicht

wurde. Nach Rasur der Kopfhaare wurden die Tiere in einem Stereotakten (TSE-

Systems, Bad Homburg, Deutschland) mittels Ohrstiften und Kopfhalterung fixiert.

Die Oberkieferhalterung des Stereotakten war auf -3.3mm ventral der Interaurallinie

eingestellt, so dass Lambda und Bregma auf einer Ebene lagen. Nach der

stereotaktischen Fixierung erfolgte die Inzision der Kopfhaut in rostrocaudaler

Richtung, anschließend wurde das Periost der darunter liegenden Schädeldecke mit

Hilfe eines Knochenschabers entfernt. Zur Säuberung der Schädeldecke sowie zur

Stillung von Blutungen wurde der freigelegte Schädelbereich mit einer 30%igen

Wasserstoffperoxidlösung (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) behandelt.

Bregma wurde mit einer im Stereotaktenarm eingespannten Edelstahlnadel

bestimmt und die Trepanationsstellen für die Führungskanülen (Länge: 10mm,

50


Aussendurchmesser: 0.8mm) an den Zielkoordinaten (anterior-posterior: 2.7mm;

lateral: ±1.1mm; dorso-ventral: 2.7mm) relativ zu Bregma gekennzeichnet. Mit einem

Elektrobohrer erfolgte die Trepanation des Schädels für die Führungskanülen und

Ankerschrauben. Drei dieser Schrauben wurden etwa 5mm rostral und caudal zu den

Zielkoordinaten in der Schädeldecke befestigt ohne die Dura mater zu beschädigen.

Darauf folgte ein Absenken der Führungskanülen bis 1mm oberhalb des mPFC in

einem Winkel von 5°, wodurch eine exakte Lokalisierung der später eingesetzten

11mm langen Injektionskanülen in der Zielregion gewährleistet war. Die Fixierung

der Führungskanülen erfolgte durch Zahnzement (Paladur, Heraeus Kulzer, Hanau),

welcher über die Ankerschrauben auf dem Schädelknochen befestigt wurde. Die

Wundränder wurden anschließend vernäht und die Führungskanülen zum Schutz vor

möglichen Pathogenen mit sterilen Stiletts (Außendurchmesser: 0.45mm)

verschlossen. Nach erfolgreicher Operation wurden die Tiere zunächst separiert und

nach zwei Tagen in die Haltungskäfige (n=3-6) überführt. Nach einwöchiger

Erholungszeit folgte die Injektionsphase.

2.5 Injektionsphase

Die bilaterale Injektion von Reelin-AS, scramble-MS und 0.9%iger Saline (Vehikel)

fand fünfmal im Abstand von 24h statt. Nach Entfernung der Stiletts erfolgte ein

Absenken der Injektionskanülen durch die Führungskanülen in den mPFC der

wachen Tiere. Die Kanülen waren mit Polyethylenschläuchen (Kleinfeld, Gehrden,

Deutschland) über ein Flüssigdrehgelenk („Swifel“, verhindert ein Verknoten der

Schläuche) mit zwei 5�l Mikroliterspritzen (SGE Analytical Science, Ringwood,

Australien) verbunden. 1μl der jeweiligen Substanz wurde mit einer Infusionspumpe

(PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, Holliston, USA) über einen Zeitraum von

30min in den mPFC infundiert (0.033μl/min). Nach der Injektion wurden die

Kanülen für zwei weitere Minuten an der Injektionsstelle belassen, um eine Diffusion

in das Gewebe zu ermöglichen und ein Zurückfließen der Lösung durch den

Einstichkanal zu verhindern. Abschließend wurden die Kanülen entfernt und die

Führungskanülen wieder mit den Stiletts verschlossen.

51


2.6 Tiermodelle

2.6.1 Präpulsinhibition der akustisch ausgelösten Schreckreaktion

Apparatur zur Messung der PPI und ASR

Die Experimente wurden in sechs beleuchteten, schallgedämpften und belüfteten

Startle-Boxen (38x41x58cm; SR-LAB, San Diego Instruments, San Diego, USA) (Abb.

2.4) durchgeführt. Diese waren an eine Steuereinheit und einen PC inklusive

Steuerungs- und Auswertungssoftware (SR-LAB Software, San Diego Instruments,

San Diego, USA) angeschlossen.

Die Ratten wurden in einem geschlossenen, transparenten Plexiglaszylinder

(19.5x8.8cm) platziert, welcher auf einer Plattform mit einer

bewegungsempfindlichen Messeinheit (piezoelektrischer Akzelerometer) befestigt

war. Die akustischen Stimuli wurden den Tieren über eine in der Boxendecke

befindliche Lautsprechereinheit präsentiert (Abstand zwischen Lautsprechereinheit

und Zylinder: 30cm). Bewegungen der Ratte während des Versuchs verursachten

Spannungsänderungen des Akzelerometers, die proportional zur Bewegungsstärke

waren. Diese Signale wurden mit einem Analog/Digital-Wandler verarbeitet und zur

Analyse an den PC weitergeleitet.

Lichtquelle

Lautsprechereinheit

Akzelerometer

Abb. 2.4 Startlebox zur Messung der Präpulsinhibition (PPI) der akustisch ausgelösten

Schreckreaktion (ASR).

52


PPI der ASR

Das verwendete Testprogramm bestand aus einer initialen Habituationsphase

(5min), in der keine Stimuli präsentiert wurden und einer Testphase, in der die

Datenaufnahme für die ASR und PPI erfolgte. Die Habituations- und Testphase

wurde bei einem kontinuierlichen Hintergrundrauschen von 60dB durchgeführt. In

der Testphase wurden in 75 einzelnen Messungen fünf verschiedene Reize bzw.

Reizkombinationen (Trials) präsentiert, die den Tieren im Experiment randomisiert

jeweils fünzehnmal präsentiert und wie folgt unterschieden wurden:

1.Trial: Kontrolle (kein Reiz)

2.Trial: Schreckreiz (105dB sound pressure level (SPL), Dauer 20ms, ohne Anstiegs-/

Abstiegsflanke)

3.Trial: Präpuls (78dB SPL, Dauer 20ms)

4.Trial: Schreckreiz mit vorausgehendem Präpuls (69dB SPL, Dauer 20ms, 120ms vor

Einsetzen des Schreckreizes) (Abb. 2.5)

5.Trial: Schreckreiz mit vorausgehendem Präpuls (78dB SPL, Dauer 20ms, 120ms vor

Einsetzen des Schreckreizes)

Präpuls

Schreckreiz

69dB

105dB

20ms 20ms

120ms

500ms

Abb. 2.5 Schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs eines Schreckreizes mit vorausgehendem

Präpuls.

53


Die Trials waren 500ms lang und wurden durch ein variables Intertrialintervall (ITI;

20-30sek) voneinander abgegrenzt. Die gesamte Versuchsdauer erstreckte sich über

einen Zeitraum von ungefähr 45min.

Die PPI eines Tieres bezeichnet den prozentualen Unterschied zwischen der

Reaktionsstärke auf einen Schreckreiz im Gegensatz zu der Reaktionsstärke auf einen

Schreckreiz, dem ein Präpuls vorausgeht. Sie wird nach folgender Formel errechnet:

PPI (%) = 100 - (a x 100 / b)

Abb. 2.6 Formel zur Berechnung der prozentualen PPI. a: Messwert der Reaktion auf den

Schreckreiz, dem ein Präpuls vorausgeht; b: Messwert der Reaktion auf den Schreckreiz.

2.6.2 T-Maze-Test

Apparatur zur Messung des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses

Die Analyse des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses wurde in einem T-Maze (graues

PVC; eigene Herstellung) durchgeführt. Das Labyrinth bestand aus einem zentralen

Arm (70x10x30cm) mit einem Startkompartiment (die ersten 20cm des zentralen

Arms) sowie zwei Seitenarmen (50x10x30cm). Das Startkompartiment war durch

eine Guillotinentür vom Zentralarm separiert; am Ende jedes Seitenarms befand sich

ein Futterschälchen (Ø 4.5cm) (Abb. 2.7). In dem Versuchsraum waren verschiedene

visuelle Landmarken platziert und es herrschten konstante Lichtverhältnisse. Um

olfaktorische Anhaltspunkte zu vermeiden, wurde das gesamte Labyrinth bzw. die

Labyrinthgabelung zwischen den Testdurchläufen der einzelnen Tiere mit 70%igen

Ethanol gereinigt.

Räumliches Kurzzeitgedächtnis

Zur Eingewöhnung wurden die Tiere an den ersten beiden Tagen in Gruppen von

zwei bis drei Tieren in das T-Maze gesetzt. Die Tiere konnten die Apparatur für

10min frei erkunden. Zusätzlich wurde die Guillotinentür mehrfach geöffnet und

geschlossen, um die Tiere an die Bewegungen und Geräusche im Raum zu gewöhnen.

Nach dieser Habituationsphase durchliefen die Tiere tägliche Trainingseinheiten, in

denen sie erlernen mussten, die Seitenarme alternierend abzulaufen. Hierzu wurden

die Ratten in das Startkompartiment gesetzt und die Guillotinentür geöffnet. Im

ersten Durchgang wurde das Begehen beider Seitenarme belohnt (45mg Kaseinpellet;

54


Bioserve, Frenchtown, NJ, USA) und die Ratte konnte den jeweiligen Armeintritt frei

wählen. Nach erfolgter Belohnung wurde die Ratte zurück in das Startkompartiment

gesetzt und die Belohnung in den darauf folgenden 15 Durchläufen im alternierenden

Arm platziert. Diese Trainingsphase endete, nachdem das Testkriterium von �80%

belohnten Läufen an drei aufeinander folgenden Tagen erreicht worden war. Danach

erfolgte der eigentliche Test des Kurzzeitgedächtnisses, indem die einzelnen

Durchläufe durch Verzögerungsintervalle von 10 oder 30sek (pubertäre Gruppe) bzw.

30sek (adulte Gruppe) getrennt waren. Während dieser Testphase wurde die Anzahl

der Arbeitsgedächtnisfehler, also der Wiedereintritte in einen bereits zuvor besuchten

Arm, aufgezeichnet, um so die Kurzzeitgedächtnisleistung der Tiere zu bewerten.

Seitenarme

Abb. 2.7 T-Maze zur Bestimmung des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses.

Zentralarm Guillotinentür

Startkompartiment

55


2.6.3 Object-Recognition-Test

Für den OR-Test wurden die Tiere drei Stunden vor Versuchsbeginn einzeln in

Markrolonkäfige des Typs III gesetzt, um eine ungestörte Objektexploration zu

gewährleisten. Der Test wurde an drei aufeinanderfolgenden Versuchstagen

durchgeführt:

Tag 1: Haupttest: Nach der initialen Präsentation eines Objekts erfolgte die erneute Präsentation des

selben Objekts nach 30min

Tag 2: Kontrolltest I: Die erneute Präsentation des bekannten Objekts erfolgte nach 120min

Tag 3: Kontrolltest II: Die Präsentation eines neuen/unbekannten Objekts erfolgte nach 30min

Während der einzelnen Präsentationen der verschiedenen Stimuli (jeweils für 5min)

wurde die Investigationszeit der Tiere bestimmt. Als Objekt-Explorationsverhalten

wurden folgende Verhaltensweisen definiert: Schnüffeln, Knabbern, Lecken, Stoßen

und Ziehen. Für den Haupttest wurde ein Glasmesszylinder für den Kontrolltest I

eine (Trinkflaschen-)Verschlusskappe aus Edelstahl und für den Kontrolltest II ein

Glasmessbecher sowie eine weiße Mörserschale aus Porzellan verwendet. Alle

Objekte wurden zwischen den einzelnen Durchgängen mit 70%igem Ethanol

gereinigt und gründlich getrocknet.

2.6.4 Lokomotorische Aktivität

Apparatur zur Messung der lokomotorischen Aktivität

Die lokomotorische Aktivität der Ratten wurde in drei Photozellboxen (45x45x45cm,

ActiMot-System, TSE Systems, Bad Homburg, Deutschland) gemessen (Abb. 2.8).

Diese waren an eine Steuerungseinheit und einen PC inklusive Steuerungs- und

Auswertungssoftware (ActiMot-System Software, TSE Systems, Bad Homburg,

Deutschland) angeschlossen. Die Boxen waren gleichmäßig beleuchtet und mit einem

hellgrauen PVC-Boden ausgekleidet; die Seitenwände bestanden aus transparentem

Plexiglas. Sowohl die Position als auch die Horizontalbewegung der Ratte konnte

durch 16 Infrarotquellen und -sensoren an jeder einzelnen Boxenseite detektiert

werden. Zusätzlich befand sich in einer Höhe von 12cm ein weiteres Infrarotsystem,

um die vertikale Bewegung zu registrieren. Die engmaschige Anordnung der

Infrarotstrahlen in den Ebenen X, Y und Z (Abb. 2.8) sowie die Messung der

56


lokomotorischen Aktivitäten in 50ms-Intervallen ermöglichte eine präzise

Bewegungsaufzeichnung.

y

x

z

Abb. 2.8 Open-Field-Box zur Messung der lokomotorischen Aktivität. Die Bewegungen der Ratte

wurden mit Hilfe von seitlichen Infrarotsensoren detektiert.

Lokomotorische Aktivität

Zu Beginn des Versuchs wurde die Ratte im Zentrum der OF-Box platziert. Folgende

Parameter wurden innerhalb der nächsten 35min untersucht:

1. Allgemeine Aktivität in sek

2. Zurückgelegte Distanz in m

3. Aufenthalt im Zentrum der OF-Box in sek

4. Häufigkeit des Aufrichtens

Für Signale, die die Software als Aufrichteverhalten analysierte, musste ein

Infrarotstrahl (Ebene Z) für mindestens 500ms unterbrochen werden. Die

Lichtschrankenunterbrechungen für die jeweiligen Parameter wurden additiv in

Intervallen von 5min durch die Software des Kontrollsystems aufgezeichnet.

57


2.6.5 Elevated-Plus-Maze-Test

Apparatur zur Messung des spontanen Angstverhaltens

Das Experiment zur Bestimmung des spontanen Angstverhaltens wurde in einem

EPM (schwarzes PVC; eigene Herstellung) durchgeführt. Die Apparatur bestand aus

vier rechtwinklig zueinander angeordneten Armen (75x14cm), die über eine zentrale

Plattform (14x14cm) miteinander verbunden waren. Die jeweils gegenüberliegenden

Arme wurden von einer Seitenwand (26cm, geschlossene Arme) oder einer Erhöhung

(1cm, offene Arme) begrenzt (Abb. 2.9). Das EPM wurde nach jedem Testdurchlauf

mit 70%igem Ethanol gereinigt.

Spontanes Angstverhalten

Zu Beginn des Versuches wurde die Ratte auf die zentrale Plattform des EPM gesetzt

(Kopf in Richtung offener Arm). Mittels einer über dem Maze positionierten

Videokamera wurde das Verhalten der Tiere über einen Zeitraum von 10min

aufgezeichnet. Folgende Parameter wurden untersucht:

1. Anzahl der Eintritte in die offenen Arme

2. Anzahl der Eintritte in die geschlossenen Arme

3. Aufenthalt in sek in den offenen Armen

4. Aufenthalt in sek in den geschlossenen Armen

Als Maß für die Ängstlichkeit diente das Verhältnis von Parameter 1 zu 2 bzw. 3 zu 4.

geschlossener Arm

offener Arm

Abb. 2.9 Elevated-Plus-Maze zur Bestimmung des spontanen Angstverhaltens.

58


2.6.6 Progressive-Ratio-Test

Apparatur zur Messung der Motivation

ationsverhaltens der Ratte wurde in fünf

rogressive-Ratio-Test

gsphase wurden die Tiere an die Skinnerboxen habituiert,

Der PR-Test zur Bestimmung des Motiv

Skinnerboxen (31x33x25cm; Operant-Lever-Box, Coulbourn Instruments, Whitehall,

USA) durchgeführt, die über ein Interface durch eine entsprechende Software

gesteuert wurden (eigene Entwicklung und Programmierung). Die Seitenverkleidung,

die Decke und der Boden der Boxen bestand aus grauem PVC, die aufklappbare

Vorderseite aus transparentem Plexiglas. Die rechte Seitenwand war mit zwei

Hebeln, über denen jeweils eine Lichtquelle angebracht war, versehen. Zur

Ausstattung gehörten außerdem ein Hauslicht und eine Futterluke, die durch eine

transparente Schwenkklappe von der Box separiert war (Abb. 2.10). Durch einen

Druckimpuls auf den rechten Hebel wurde ein Pelletspender aktiviert, worauf die

Ausgabe eines 45mg Kaseinpellets in die Futterluke der Skinnerbox erfolgte – der

linke Hebel war während der Versuche inaktiv.

P

Vor Beginn der Trainin

indem sie für 15min innerhalb der Boxen an die Umgebung sowie die Geräusche des

Pelletspenders gewöhnt wurden. Außerdem befanden sich einige der Kaseinpellets in

der Futterluke. Während des Trainings durchliefen die Tiere drei verschiedene

Phasen: Auf den continuous reinforcement (CRF)-Modus (ein Hebeldruck entspricht

einer Belohnung) erfolgte eine Konditionierung im fixed ratio 3-Modus (FR3; drei

Hebeldrücke entsprechen einer Belohnung) bzw. FR5-Modus (fünf Hebeldrücke

entsprechen einer Belohnung). Um in der jeweils höheren Phase trainiert zu werden,

mussten die Tiere an drei aufeinander folgenden Tagen innerhalb von 30min 200mal

das jeweilige Kriterium erreichen. Am Tag nach der erfolgreichen Beendigung des

FR5-Modus erfolgte der progressive ratio (PR)-Test. In diesem veränderte sich die

instrumentelle Anforderung an das Versuchstier insofern, als dass die Anzahl der

Hebeldrücke nach erfolgter Belohnung kontinuierlich anstieg. Für das Absolvieren

des jeweiligen Kriteriums stand den Tieren ein Intervall von 3min nach erfolgtem

letztem Hebeldruck zur Verfügung. Der Breakpoint wurde definiert als dasjenige

Intervall, in dem das Tier innerhalb von 3min keinen Hebeldruck mehr absolvierte.

59


belohnter

Futterluke

Hebel

unbelohnter Hebel

Abb. 2.10 Skinnerbox, in der der progressive ratio-Test zur Bestimmung des Motivationsverhaltens

durchgeführt wurde.

Futterpräferenztest

Drei Tage nach dem Ende des PR-Tests wurde ein Futterpräferenztest durchgeführt,

um einen möglichen Behandlungseffekt auf die Futterpräferenz oder den allgemeinen

Futterkonsum der Tiere auszuschließen. Dazu wurden die Tiere einzeln für jeweils

5min in Makrolonkäfige (Typ III) überführt, in denen sich frei zugängliche Schalen

mit jeweils 20g Kaseinpellets oder kalorisch äquivalentem Zuchtfutter befanden.

Nach Beendigung des Versuchs wurde das Gewicht des verzehrten Futters bestimmt.

2.7 Histologische und biochemische Untersuchungen

Nach Abschluss der Verhaltensexperimente wurden die Gehirne der Tiere mittels

histologischer oder biochemischer Methoden untersucht. Bei denjenigen Tieren, die

zuvor an den Verhaltensversuchen teilgenommen hatten, wurde im Anschluss eine

Nissl-Färbung (Thionin) der Gehirne durchgeführt, um zum einen die Lage der

Injektionsstelle zu überprüfen und um zum anderen mögliche Substanz-induzierte

Läsionen im Gewebe auszuschließen. Zusätzlich wurden einige Gehirne von Tieren

jeder Behandlungsgruppe einer Westen Blot-Analyse unterzogen, um die Reelin-

Konzentration zu quantifizieren.

60


2.7.1 Präparation der Gehirne – Histologie (Nissl-Färbung)

Die Tiere wurden mit einer letalen Dosis Chloralhydrat (720mg/kg) injiziert und

anschließend mit 0.1M PBS (100ml) und 4%iger Formalinlösung (250ml; pH-Wert

7.4) transkardial über die aufsteigende Aorta perfundiert (20-25min). Abschließend

wurden die Gehirne freipräpariert und in einer 30%igen Saccharoselösung bis zur

weiteren Verwendung aufbewahrt. Nach zwei bis drei Tagen erfolgte das Schneiden

der Gehirne mittels Gefriermikrotom (Jung CM 3000, Leica, Nussloch, Deutschland).

Es wurden Frontalschnitte (40μm dick, Abstand 160μm) angefertigt, die auf

entfettete und mit Gelantine-Chromalaun-Lösung beschichtete Objektträger

aufgezogen und luftgetrocknet wurden.

2.7.2 Nissl-Färbung

Die Schnitte wurden zunächst in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert, um sie

anschließend für 75-90sek in einer Thioninlösung (Sigma-Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland) zu färben. Es folgte eine Dehydrierung der Schnitte in einer

aufsteigenden Alkoholreihe und eine anschließende Fixierung in einem Terpineol-

RotiHistol-Gemisch (1:1; Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland). Abschließend wurden

die Objekträger mit Entellan (Merck, Darmstadt, Deutschland) eingedeckt.

2.7.3 Histologische Auswertung

Die Gehirnschnitte wurden mit Hilfe eines Mikroskops (Axioskop 2 mot., Zeiss,

Göttingen, Deutschland) und eines Hirnatlanten histologisch ausgewertet. Hierzu

wurde zum einen die genaue Lage der Injektionsstellen bestimmt und zum anderen

mögliche Läsionen bewertet. In der vorliegenden Arbeit wurden nur die Daten der

Tiere ausgewertet, bei denen eine korrekte Injektion in den mPFC erfolgte und keine

strukturellen Anomalien festgestellt werden konnten.

2.7.4 Präparation der Gehirne – Biochemie (Western Blot)

Ungefähr 24h nach Beendigung der intracerebralen Injektionsphase wurden jeweils

drei Tiere aus den verschiedenen Behandlungsgruppen dekapitiert. Die Gehirne

61


wurden entnommen und auf einem Kälteblock (-10.9°C; RK 20 KS, Lauda-

Königshofen, Deutschland) mittels Skalpell sektioniert. Gewebeproben wurden aus

verschiedenen Gehirnarealen (mPFC, ventraler Hippocampus) herauspräpariert, in

Eppendorfcups überführt und abschließend in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Bis zur weiteren Verwendung erfolgte eine Lagerung bei -80°C.

2.7.5 Proteinbestimmung nach Bradford

Der Bradford-Test ist eine sensitive photometrische Methode zur

Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Das Prinzip des Tests beruht auf einer

Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 an basischen Seitenketten

der Aminosäuren und einer daraus resultierenden unspezifischen Färbung der

Proteine bzw. Verschiebung des Absorptionsmaxiums des entstandenen Komplexes,

welche photometrisch ausgewertet werden kann.

Für den eigentlichen Test wurden die Proben zunächst in Lyse-Puffer (15μl/mg

Probe) mittels eines Ultraschallstabs homogenisiert. Die Lösung wurde zentrifugiert

(15min, 14000U/min; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und der Überstand 1:5

und 1:10 mit Lyse-Puffer verdünnt. Zur Kalibrierung einer Eichgeraden diente eine

Rinder-Serum-Albumin (BSA) Stammlösung [20mg/ml], die in verschiedenen

Verdünnungsstufen vorgelegt wurde (2.0mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml,

0.125mg/ml, 0.0625mg/ml, 0.0313mg/ml). Im Folgenden wurden jeweils 5μl der

Proben (Triplettmessung) und Standards (Doppelmessung) auf 96-well Platten

(Eppendorf, Hamburg, Deutschland) pipettiert. Mittels Multipipetten wurden 100μl

der Bradfordreagenz (Thermo Scientific, Rockford, USA) hinzugegeben. Nachdem die

Platten mit Parafilm verschlossen und für 5min auf dem Schüttler platziert wurden,

kam es zu einer abschließenden Inkubation der Proben bei 36°C. Mit Hilfe eines

Photometers (VWR, Darmstadt, Deutschland) konnten die Proteinkonzentrationen

[μg/μl] der einzelnen Proben photometrisch bei 595nm evaluiert werden.

2.7.6 SDS-Page

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ist eine

Methode mit der Proteine aus einem Proteingemisch im elektrischen Feld

aufgetrennt werden können. Das Prinzip der Methode liegt darin begründet, dass

62


Proteine durch Erhitzen und Zugabe von SDS denaturieren und negativ maskiert

werden. Dadurch entstehen langgestreckte Protein-SDS-Komplexe, die in einem

identischen Ladungs-Masse-Verhältnis stehen und somit im Trenngel aufgrund ihres

Molekulargewichts und nicht aufgrund ihrer Ladung getrennt werden. Diese

Aufspaltung erfolgt in einem diskontinuierlichen System, welches aus verschiedenen

Gelen und Puffern besteht. Im großporigen Sammelgel (Tris-Glycin-Puffer; pH-Wert

6.8) werden die Proben konzentriert, im kleinporigen Trenngel (Tris-Glycin-Puffer;

pH-Wert 8.8) aufgrund ihres Molekulargewichts voneinander getrennt.

Für die SDS-Page wurden die Proben homogenisiert, mit SDS-haltigem

Probenpuffer auf eine Proteinkonzentration von 50μg verdünnt und anschließend bei

95°C für 10min denaturiert. Die Taschen des in der Gelelektrophoresekammer (Bio-

Rad, München, Deutschland) befindlichen Sammelgels wurden mit jeweils 5μl der

Protein-Probenpuffer-Lösungen, die linke Tasche mit 5μl eines

Molekulargewichtsmakers (200kDa; Bio-Rad, München, Deutschland) beladen.

Daraufhin wurde eine elektrische Stromstärke von 15mA angelegt, wodurch sich die

Proben im Sammelgel konzentrierten und das Trenngel erreichten. Abschließend

wurde die Stromstärke auf 20mA erhöht und die SDS-Page nach Durchlaufen des

Protein-Standards durch das Trenngel beendet.

2.7.7 Western Blot

Der Western Blot ist eine Methode, um die in der SDS-Page aufgetrennten Moleküle

aus dem Gel auf eine Trägermembran zu transferieren und abschließend durch den

Einsatz von spezifischen Antikörpern gegen das gesuchte Protein bzw. ein Epitop des

Proteins zu visualisieren.

Im Anschluss an die SDS-Page wurde eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-

Membran (Bio-Rad, München, Deutschland) in Methanol aktiviert (20sek) und

zweimal in destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel, die aktivierte Membran und

Filterpapiere sowie Fasertücher (Bio-Rad, München, Deutschland) wurden

anschließend für 15min im Western Blot Puffer (Tris-Glycin-Puffer; pH-Wert 8.3)

platziert, bevor die Komponenten nach der Sandwichmethode zusammengelegt und

in ein mini-Blot-System (Bio-Rad, München, Deutschland) übertragen wurden. Bei

einer konstanten Spannung (100V) wurden die Proteine für 60min elektrophoretisch

auf die Membran transferiert, auf der sie aufgrund von hydrophoben

63


Wechselwirkungen binden konnten. Nach dem Transfer folgte die Proteindetektion

mittels Antikörper. Dafür wurde die Membran in einem TBS-Puffer (Tris-NaCl-

Puffer; pH-Wert 7.5) gewaschen und für 60min in einer 5%igen Magermilch-TBS-

Lösung (Biomagermilchpulver, Heiler Cenovis, Radolfzell, Deutschland) geblockt.

Ein monoklonarer Primärantikörper (mouse-anti-reelin, Calbiochem, Darmstadt,

Deutschland) wurde 1:1000 in TBS-Puffer verdünnt und nach dem Blocken mit

einem Volumen von 1ml mittels einer Pipette auf die Membran gegeben. Die

Membran wurde über Nacht bei 4°C mit der Antikörperlösung inkubiert. Am

nächsten Tag folgten drei 10-minütige Waschschritte in TBS-Puffer und ein weiteres

Blocken in 5%iger Magermilch-TBS-Lösung (60min). Ein Peroxidase-konjugierter

sekundärer Antikörper (goat-anti-mouse, Calbiochem, Darmstadt, Deutschland)

wurde 1:2000 in TBST verdünnt und auf die Membran pipettiert (1ml). Nach 60-

minütiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden 2ml eines Luminolreagenzes

(Amersham, Braunschweig, Deutschland) auf die Membran hinzugefügt. Nach 5min

wurde die Membran mit transparenter Plastikfolie versiegelt und auf einem Film

(Amersham, Braunschweig, Deutschland) für 5min belichtet. Die Proteinbanden

wurden durch die Entwicklung des Films visualisiert.

Nach Fertigstellung der Western Blots wurden die Ergebnisse mittels Scanner

(Canon, Tokio, Japan) und Bildbearbeitungssoftware (Photoshop, Adobe Systems,

San Jose, USA) densitometrisch ausgewertet, indem der mittlere Grauanteil der

einzelnen Banden analysiert wurde. Die Reelin-Konzentration wurde durch Division

der mittleren absoluten Intensität des Grauanteils von Reelin mit der

korrespondierenden Intensität des Kontrollproteins �-Aktin bestimmt.

2.8 Statistische Datenanalyse

Die statistische Analyse wurde mit Hilfe der Software Sigma-Stat (Sigma Aldrich,

Statistical Software 2.03) durchgeführt. Alle angegebenen Daten sind die

Mittelwerte-± Standardfehler (S.E.M.) der jeweiligen Parameter und wurden mittels

Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) ausgewertet. Es wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0.05 als signifikant betrachtet.

Die statistische Auswertung der ermittelten Reelin-Konzentrationen nach

durchgeführter Western Blot-Analyse erfolgte durch eine einfaktorielle ANOVA (one-

way ANOVA), gefolgt von einem post hoc Tukey t-Test.

64


65

Die Daten für die statistische Auswertung des PPI-Versuchs ergaben sich aus

den Mittelwerten der einzelnen PPI- und Startle-Trials, anhand derer die prozentuale

PPI (Abb. 2.6) errechnet wurde. Signifikante Unterschiede für die Faktoren Gruppe

und Präpuls wurden mittels zweifaktorieller ANOVA mit Messwiederholungen (two-

way RM ANOVA) ermittelt. Weiterführende Analysen wurden mit einem Tukey t-

Test durchgeführt. Unterschiede in der ASR der einzelnen Gruppen wurde mittels

one-way ANOVA identifiziert.

Die statistische Auswertung der mittleren Lerntage im T-Maze-Test erfolgte

mittels one-way ANOVA. Sowohl die Auswertung der Gedächtnisleistung über die

Zeit in der Trainingsphase (Faktoren Tag und Behandlung) als auch die Bestimmung

der Kurzzeitgedächtnisleistung (Faktoren delay und Behandlung) wurden mittels

einer two-way RM ANOVA durchgeführt. Post hoc Analysen erfolgten durch Tukey t-

Tests.

Der Haupt- und die beiden Kontrolltests des OR-Paradigmas wurden mit Hilfe

von one-way ANOVAs, gefolgt von Tukey t-Tests, ausgewertet.

Die Messwerte der lokomotorischen Aktivität (Parameter: allgemeine

Aktivität, zurückgelegte Distanz, Aufenthalt in der Mitte, Aufrichtverhalten) wurden

additiv über 35min ermittelt und mittels einer one-way ANOVA ausgewertet. Die

Daten der verschiedenen Parameter über die Zeit wurden additiv in 5min Intervallen

erfasst und mit Hilfe einer two-way RM ANOVA in Bezug auf die Faktoren Gruppe

und Intervall ausgewertet.

Die statistische Auswertung der untersuchten Parameter im EPM (allgemeine

Aktivität, Armeintritte, Aufenthalt in den Armen) wurde mit Hilfe einer one-way

ANOVA bestimmt.

Die Daten des PR-Tests, d.h. der Breakpoint und die Gesamtanzahl der

Hebeldrücke wurden mittels one-way ANOVAs, der Futterpräferenztest mittels two-

way RM ANOVA (Faktoren Futter und Gruppe) ausgewertet.

Ergebnisse

3. Ergebnisse

Im Folgenden werden die histologischen und biochemischen Auswertungen sowie die

Ergebnisse der Verhaltenstests statistisch ausgewertet und graphisch dargestellt. Die

Tiere, die während der Injektionsphase einer bilateralen Saline-Injektion unterzogen

wurden, werden als VEH-Tiere, diejenigen mit scramble-missense-Injektionen als

MS-Tiere und diejenigen mit Reelin-antisense-Injektionen als AS-Tiere bezeichnet.

Aus Gründen der Übersicht sind die pubertären und adulten

Behandlungsgruppen farblich unterschieden.

3.1 Histologische und biochemische Auswertung – Pubertäre und

adulte Gruppe

3.1.1 Histologische Auswertung

Die histologische Auswertung zur Lokalisation der Führungskanülen ergab, dass bei

allen Tieren eine korrekte, bilaterale Positionierung der Kanülen vorlag – es musste

demnach keines der operierten Tiere von der Daten-Analyse ausgeschlossen werden.

Eine Analyse der Hirnschnitte bestätigte, dass die Injektionsorte 2.2mm und 3.2mm

anterior von Bregma innerhalb medialer präfrontocortikaler Areale (anteriores

cinguläres (Cg1), prälimbisches (PL) und infralimbisches Areal (IL)) lokalisiert waren

(Abb. 3.1, 3.2).

Bei sechs Tieren (gleiche Verteilung über die einzelnen Behandlungsgruppen)

wurden Zeichen einer Infektion (Neuronenverlust, Mikrogliose) festgestellt. Diese

Tiere wurden von der Auswertung ausgeschlossen. Die Gehirne der Tiere, auf deren

Daten die vorliegenden Ergebnisse beruhen, wiesen neben den durch die

Führungskanülen verursachten leichten physikalischen Schäden keine Anzeichen von

cytoarchitektonischen Anomalien auf (Abb. 3.1, 3.2).

67

Ergebnisse

MS

AS

VEH

+2.7mm

+2.2mm

+3.2mm

Abb. 3.1 Pubertäre Gruppe. Links: Übersicht über die Injektionsorte im mPFC der Ratte (n=37;

schematische Zeichnungen aus dem Hirnatlas von PAXINOS & WATSON, 1998). Die Millimeterangaben

kennzeichnen die relative Lage zu Bregma. Injektionsorte sind durch

veranschaulicht. Rechts: Fotomikrographien von Nissl-gefärbten Coronalschnitten des mPFC bei

+2.7mm anterior von Bregma eines VEH-, MS- und AS-Tieres. Es sind keine Anomalien der

Cytoarchitektur zu erkennen. Kalibrationsbalken: 250μm.

68

Ergebnisse

AS

MS

VEH

+2.7mm

+2.2mm

+3.2mm

Abb. 3.2 Adulte Gruppe. Links: Übersicht über die Injektionsorte im mPFC der Ratte (n=29;

schematische Zeichnungen aus dem Hirnatlas von PAXINOS & WATSON, 1998). Die Millimeterangaben

kennzeichnen die relative Lage zu Bregma. Injektionsorte sind durch

veranschaulicht. Rechts: Fotomikrographien von Nissl-gefärbten Coronalschnitten des mPFC bei

+2.7mm anterior von Bregma eines VEH-, MS- und AS-Tieres. Es sind keine Anomalien der

Cytoarchitektur zu erkennen. Kalibrationsbalken: 250μm.

69

Ergebnisse

3.1.2 Biochemische Auswertung

Die biochemische Auswertung mittels Western Blot-Analyse und die darauf folgende

densitometrische Quantifikation ergab, dass die eingesetzte Reelin-antisense sowohl

bei pubertär als auch adult behandelten Tieren einen spezifischen und signifikanten

Reelin-knockdown im mPFC im Vergleich zu den Kontrollgruppen induzierte (Abb.

3.3, 3.4). Zudem verdeutlichten Kontrollmessungen von Homogenaten des ventralen

Hippocampus eine Toposelektivität der Reelin-Verarmung – hier zeigten sich keine

Unterschiede in der Reelin-Konzentration zwischen den einzelnen

Behandlungsgruppen (Daten nicht gezeigt).

Die statistische Auswertung (one-way ANOVA) zeigte innerhalb der pubertär

behandelten Gruppe einen signifikanten Gruppenunterschied zwischen der 180kDa-

Bande [F2,6=33.884; p<0.001], der 330kDa-Bande [F2,6=19.097; p=0.003] und der

410kDa-Bande [F2,6=6.327; p=0.033]. Folgende post hoc Analysen ergaben eine

signifikante Konzentrationsabnahme der 180kDa- und 330kDa-Banden im mPFC

AS-behandelter Tiere gegenüber den Kontrollgruppen sowie eine

Konzentrationsabnahme der 410kDa-Bande gegenüber der MS-behandelten Gruppe

[Tukey t-Test; p<0.05].

Zudem ergaben one-way ANOVAs einen signifikanten Unterschied innerhalb

der adulten Gruppe zwischen der VEH-, MS- und AS-Gruppe bezüglich des 180kDa-

Fragments [F2,6=12.867; p=0.007], jedoch nicht im Hinblick auf die 330kDa-Bande

[F2,6=2.644; p=0.150] und die 410kDa-Bande [F2,6=0.866; p=0.467]. Post hoc Tukey

t-Tests bestätigten eine effektive Reelin-antisense induzierte Reelin-Verarmung

(180kDa) im Vergleich zu den Kontrollgruppen [p<0.05].

70

Ergebnisse

A VEH AS MS

410kDa 330kDa

180kDa

�-Aktin

C B

Veh MS AS0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*Ratio

Ree

lin 3

30kD

a/ß-

aktin

Veh MS AS0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*

Ratio

Ree

lin 1

80kD

a/ß-

aktin

D

Veh MS AS0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

+Ratio

Ree

lin 4

10kD

a/ß-

aktin

Abb.3.3 Pubertäre Gruppe. (A) Reelin- (410, 330 und 180kDa) und �-Aktin-Banden von mPFC

Homogenaten (20μg pro Bande) repräsentativer VEH-, MS- und AS-Tiere sowie (B, C, D) das

Konzentrationsverhältnis der einzelnen Banden zum Kontrollprotein �-Aktin. Signifikante

Unterschiede zwischen der AS- und den Kontrollgruppen sind durch *, zwischen der AS und der MS-

Gruppe durch + gekennzeichnet. Die Daten repräsentieren die jeweiligen Mittelwerte und die

zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.; one-way ANOVA, Tukey t-Test; p<0.05).

71

Ergebnisse

A VEH AS MS

410kDa 330kDa

180kDa

�-Aktin

B C

Veh MS AS0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*

Ratio

Ree

lin 1

80kD

a/ß-

aktin

Veh MS AS0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ratio

Ree

lin 3

30kD

a/ß-

aktin

D

Veh MS AS0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ratio

Ree

lin 4

10kD

a/ß-

aktin

Abb.3.4 Adulte Gruppe. (A) Reelin- (410, 330 und 180kDa) und �-Aktin-Banden von mPFC

Homogenaten (20μg pro Bande) repräsentativer VEH-, MS- und AS-Tiere sowie (B, C, D) das

Konzentrationsverhältnis der einzelnen Banden zum Kontrollprotein �-Aktin. Signifikante

Unterschiede zwischen der AS- und den Kontrollgruppen sind durch * gekennzeichnet. Die Daten

repräsentieren die jeweiligen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.; one-way

ANOVA, Tukey t-Test; p<0.05).

72

Ergebnisse

3.2 Verhaltenstests – Pubertäre Gruppe


PPI

Der Effekt des pubertären Reelin-knockdowns auf die PPI und ASR jung-adulter

Ratten wurde anhand der Daten von insgesamt 35 Tieren untersucht, davon 12 VEH-

Tiere, 11 MS-Tiere und 12 AS-Tiere. Jeweils ein VEH- und AS-Tier mussten zuvor aus

der Auswertung ausgeschlossen werden, da sie keine Reaktionen auf die akustischen

Reize zeigten.

Eine Reduktion der Reelin-Konzentration im mPFC während der Pubertät

induzierte bei jung-adulten Ratten im Vergleich zu den Kontrollgruppen bei beiden

Präpulsintensitäten eine Störung der sensomotorischen Integrationsleistung, was

sich in einer Abnahme der PPI manifestierte. Die Stärke des Präpulses beeinflusste

den Behandlungseffekt nicht (Abb. 3.5).

Die statistische Analyse (two-way RM ANOVA) der verschiedenen

Behandlungsgruppen ergab einen signifikanten Behandlungseffekt [F2,32=11.313;

p<0.001] sowie einen Unterschied für den Faktor Präpulsintensität [F1,32=32.659;

p<0.001]. Weitere Analysen zeigten eine signifikante Abnahme der PPI bei beiden

Präpulsintensitäten in der AS-Gruppe im Vergleich zu den VEH- oder MS-Tieren

[post hoc Tukey t-Test; p<0.05].

ASR

Neben der PPI der ASR wurde auch die Höhe der ASR-Amplituden ohne einen

vorausgehenden Präpuls ausgewertet. Die verschiedenen Behandlungen hatten

keinen Einfluss auf die ASR der Tiere.

Eine one-way ANOVA konnte nur einen Trend zu einem Unterschied

zwischen den Behandlungsgruppen in Bezug auf die Stärke der ASR feststellen (Abb.

3.6) [F2,32=2.985; p=0.065].

73

Ergebnisse

69dB 78dB0

25

50

75

100 VehMSAS

**

%PP

I

Abb. 3.5 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die Präpulsinhibition der akustisch ausgelösten

Schreckreaktion. Abgebildet sind die Mittelwerte der prozentualen Präpulsinhibition für zwei

verschiedene Präpulsintensitäten (69, 78dB) und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.).

Signifikante Unterschiede der AS-Gruppe gegenüber den Kontrollgruppen sind durch *

gekennzeichnet (two-way RM ANOVA, Tukey t-Test; p<0.05).

Veh MS AS 0

1000

2000

3000

Stär

ke d

er A

SR

Abb. 3.6 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die akustisch ausgelöste Schreckreaktion. Die

Daten repräsentieren die mittlere Reaktionsstärke auf 15 Schreckreize und die zugehörigen

Standardfehler (+S.E.M.). Es zeigte sich ein Trend zu einem Unterschied zwischen den

Behandlungsgruppen in Bezug auf die Reaktionsstärke (one-way ANOVA; p=0.065).

74

Ergebnisse

3.2.3 T-Maze-Test

Ausgewertet wurde der Effekt eines Reelin-knockdowns auf die räumliche

Kurzzeitgedächtnisleistung der Ratte. Für die Analyse wurden die Verhaltensdaten

von 13 VEH-, 11 MS- und 13 AS-Tieren untersucht.

Innerhalb von 14 Tagen erreichten alle Tiere das geforderte Kriterium von

�80% richtigen Armeintritten an drei aufeinander folgenden Tagen, wobei die Tiere

der MS-Gruppe das Kriterium zuerst erfüllten (Abb. 3.7). Die statistische Auswertung

ergab einen signifikanten Gruppenunterschied [F2,34=3.783; p=0.033]; Post hoc

Tukey t-Tests ergaben eine erhöhte Lerndauer der AS-Tiere im Vergleich zu MS-

Tieren [p<0.05].

Während die MS-Gruppe das geforderte Kriterium am schnellsten erreichte,

zeigte sich kein Gruppenunterschied an den einzelnen Trainingstagen. Alle Gruppen

wiesen eine ähnliche Performanz über die letzten neun Trainingstage auf (Abb. 3.8).

Eine two-way RM ANOVA ergab zwar einen signifikanten Unterschied für den Faktor

Trainingstag [F8,272=31.661; p<0.001], jedoch keinen Behandlungseffekt

[F2,272=0.748; p=0.481] und keine Interaktion der beiden Faktoren [F16,272=1.278;

p=0.211].

Der pubertär induzierte Reelin-knockdown im mPFC verschlechterte die

Kurzzeitgedächtnisleistung der Ratten im T-Maze bei einer Verzögerungsdauer von

30sek. Zusätzlich wählten die Tiere aller Behandlungsgruppen bei den

Verzögerungsintervallen von 10 und 30sek, im Vergleich zu keiner Verzögerung, öfter

den unbelohnten Arm (Abb. 3.9). Eine two-way RM ANOVA ergab einen

signifikanten Effekt der Behandlung [F2,68=4.725; p=0.015] und der zeitlichen

Verzögerung [F2,68=50.099; p<0.001], jedoch keinen Interaktionseffekt [F4,68=1.723;

p=0.153]. Weitere Analysen verdeutlichten für die 30sek-Verzögerung eine

signifikante Abnahme der Gedächtnisleistung nach dem Reelin-knockdown im

Vergleich zu der VEH- und MS-Gruppe. Des Weiteren ergab sich unter verzögerten

Testbedingungen eine allgemeine Verschlechterung der Performanz innerhalb der

jeweiligen Behandlungsgruppe [Tukey t-Test, p<0.05].

75

Ergebnisse

Veh MS AS 0

2

4

6

8

10

12 +

Lern

tage

Abb. 3.7 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die durchschnittliche Anzahl von Lerntagen zur

Erlangung des geforderten Kriteriums im T-Maze-Test. Abgebildet sind die Mittelwerte der Lerntage

und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Ein signifikanter Unterschied der AS-Gruppe

gegenüber der MS-Gruppe ist durch ein + gekennzeichnet (one-way ANOVA, Tukey t-Test; p<0.05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

25

50

75

100

VEHMSAS

Tag

% ri

chtig

e Lä

ufe

Abb. 3.8 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die Trainingsphase des T-Maze-Tests. Die

Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der richtigen Läufe an den einzelnen Trainingstagen und die

zugehörigen Standardfehler (±S.E.M.; two-way RM ANOVA; p>0.05).

76

Ergebnisse

0sek 10sek 30sek0

25

50

75

100

*

VehMSAS

% ri

chtig

e Lä

ufe

Abb. 3.9 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf das räumliche Kurzzeitgedächtnis im T-Maze-

Test (Verzögerungsintervalle von 0, 10 und 30sek). Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der

richtigen Läufe an den einzelnen Testtagen und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Ein

signifikanter Unterschiede der AS-Gruppe gegenüber den Kontrollgruppen ist durch ein *


3.2.4 Object-Recognition-Test

Für den OR-Test wurde die Abnahme der Investigationszeit während der 2.

Präsentation des jeweiligen Objekts (P2) gegenüber der 1. Präsentation (P1)

prozentual analysiert. Ausgewertet wurden die Daten von 33 Tieren (11 VEH, 9 MS,

13 AS; Unterschiede zu der Gesamttierzahl anderer Verhaltensversuche sind durch

einen Verlust der stereotaktisch implantierten Führungskanülen bedingt).

Die Behandlung mit Reelin-antisense Oligonukleotiden beeinträchtigte das

Wiedererkennen von Objekten. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen beschäftigten

sich die AS-Tiere bei der P2 länger mit dem bekannten Objekt (Abb. 3.10). Die

statistische Auswertung (one-way ANOVA) verdeutlichte einen Behandlungseffekt

[F2,30=3.447; p=0.045]; weitere post hoc Analysen zeigten eine signifikante Zunahme

der Investigationszeit nach P2 bei AS-Tieren im Vergleich zu VEH-Tieren [Tukey t-

Test, p<0.05].

Die one-way ANOVA der Kontrollexperimente I (Präsentation des gleichen

Objekts nach 120min) [F2,30=1.224; p=0.309] und II (Präsentation eines neuen

Objekts nach 30min) [F2,30=0.500; p=0.612] ergab keine signifikanten Unterschiede

zwischen den Gruppen. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1 dargestellt.

77

Ergebnisse

Veh MS AS 0

20

40

60

80

100

*

% R

eduk

tion

der

Inve

stig

atio

nsze

it

#

Abb. 3.10 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf das Wiedererkennen von Objekten im Object-

Recognition-Test. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der Reduktion der Investigationszeit

und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Ein signifikanter Unterschied der AS-Gruppe

gegenüber der VEH-Gruppe ist durch # gekennzeichnet (one-way ANOVA; p<0.05).

Tab. 3.1 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf das Wiedererkennen von Objekten im Object-

Recognition-Test in den Kontrolltests I und II. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der

Reduktion der Investigationszeit und die zugehörigen Standardfehler (±S.E.M.). Es zeigten sich keine

signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen in Bezug auf die

Objektwiedererkennung (one-way ANOVA, p>0.05).

Reduktion der Investigationszeit %

VEH MS AS Kontrolltest 1 -11.8 (± 21.3) 3.4 (± 11.1) 19.8 (± 8.4) Kontrolltest 2 4.2 (± 20.5) 1.2 (± 16.7) -6.8 (± 24.2)

78

Ergebnisse


Die lokomotorische Aktivität im OF-Test wurde bei insgesamt 37 Tieren untersucht,

davon 13 VEH-Tiere, 11 MS-Tiere und 13 AS-Tiere.

Der pubertäre Reelin-knockdown im mPFC hatte keinen Einfluss auf die

Lokomotion der jung-adulten Ratten in der Open-Field-Box (Abb. 3.11). So konnten

nach statistischer Auswertung (one-way ANOVA) der lokomotorischen

Verhaltensdaten keine signifikanten Unterschiede zwischen der VEH-, MS- und AS-

Gruppe bezüglich der allgemeinen Aktivität [F2,34=0.792; p=0.461], der

zurückgelegten Distanz [F2,34=0.651; p=0.528], des Aufrichtverhaltens [F2,34=1.290;

p=0.288] und der Verweildauer in der Feldmitte [F2,34=1.072; p=0.354] festgestellt

werden. Ferner ergab die Auswertung des Zeitverlaufs in Intervallen über die

Messzeit keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (Daten

nicht gezeigt).

Aktivität (sek) Distanz (m) Mitte (sek) Aufrichten0

100

200

300

400

500

600 VEHMSAS

Loko

mot

oris

che

Akt

ivitä

t

Abb. 3.11 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die lokomotorische Aktivität. Die Daten

repräsentieren die Mittelwerte der untersuchten lokomotorischen Parameter und die zugehörigen

Standardfehler (+S.E.M.). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen

Behandlungsgruppen in Bezug auf die lokomotorische Aktivität (one-way ANOVA; p>0.05).

79

Ergebnisse

3.2.6 Elevated-Plus-Maze-Test

Insgesamt wurden für die Auswertung des Angstverhaltens im EPM-Test die Daten

von 35 Ratten einbezogen, davon 12 VEH-, 10 MS- und 13 AS-Tiere. Jeweils ein VEH-

und MS-Tier wurde aufgrund des Verlustes der stereotaktisch implantierten

Führungskanülen von der Auswertung ausgeschlossen.

Ein bilateraler Reelin-knockdown im mPFC pubertärer Tiere hatte keinen

Einfluss auf das spontane Angstverhalten. Weder bezüglich der Gesamtaktivität im

EPM, noch für die relative Häufigkeit der Eintritte bzw. der Verweildauer in den

offenen Armen zeigten sich Unterschiede zwischen den einzelnen

Behandlungsgruppen (Abb. 3.12-3.14). Eine one-way ANOVA ergab keinen

signifikanten Behandlungseffekt für die Faktoren Gesamtaktivität [F2,32=0.626;

p=0.541], Eintritte in die offenen Arme [F2,32=0.540; p=0.588] oder Verweildauer in

den offenen Armen [F2,32=1.756; p=0.189].

Veh MS AS 0

10

20

30

Arm

eint

ritte

Abb. 3.12 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die allgemeine Aktivität im Elevated-Plus-

Maze. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der gesamten Armeintritte und die zugehörigen


Behandlungsgruppen in Bezug auf die allgemeine Aktivität (one-way ANOVA; p>0.05).

80

Ergebnisse

Veh MS AS 0

25

50

75

100

% E

intr

itte

offe

ne A

rme

Abb. 3.13 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf das spontane Angstverhalten im Elevated-

Plus-Maze-Test. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte der Eintritte in die offenen Arme und die

zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den

einzelnen Behandlungsgruppen in Bezug auf die Eintritte in die offenen Arme (one-way ANOVA;

p>0.05).

Veh MS AS 0

25

50

75

100

% V

erw

eild

auer

offe

ne A

rme

Abb. 3.14 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf das spontane Angstverhalten im Elevated-

Plus-Maze-Test. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der Verweildauer in den offenen Armen

und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede

zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen in Bezug auf die Verweildauer auf den offenen Armen

(one-way ANOVA; p>0.05).

81

Ergebnisse

3.2.7 Progressive-Ratio-Test

Für die Auswertung des Experiments zur Bestimmung der allgemeinen Motivation

erfolgte die Evaluation des Breakpoints und der Gesamthebeldruckzahl der Tiere. Die

Auswertung wurde mit den Daten von insgesamt 28 Tieren durchgeführt, davon 10

aus der Veh-, 7 aus der MS- und 11 aus der AS-Gruppe. Unterschiede zu der

Gesamttierzahl anderer Verhaltensversuche sind durch einen Verlust der

stereotaktisch implantierten Führungskanülen bedingt.

Der Futterpräferenztest ergab, dass die jeweiligen Behandlungen keine

Beeinflussung der aufgenommenen Gesamtfuttermenge induzierte [F2,25=0.025;

p=0.975]. Zudem bevorzugten alle Tiere die Kaseinpellets; die Behandlungsgruppen

unterschieden sich diesbezüglich nicht [F2,25=0.021; p=0.979] (Daten nicht gezeigt).

Ein temporärer Reelin-knockdown im mPFC der Tiere hatte keinen Einfluss

auf die Motivation der Tiere (Abb. 3.15, 3.16). Es konnte kein Unterschied zwischen

den Gruppen in Bezug auf den Breakpoint [one-way ANOVA; F2,25=2.087; p=0.145]

oder die Gesamtzahl der Hebelbetätigungen [F2,25=2.929; p=0.072] festgestellt

werden.

Veh MS AS 0

10

20

30

40

50

60

Bre

akpo

int

Abb. 3.15 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die Motivation im Progressive-Ratio-Test. Die

Daten repräsentieren die Mittelwerte des Breakpoints und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.).

Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen in

Bezug auf die Motivation (one-way ANOVA; p>0.05).

82

Ergebnisse

Veh MS AS 0

500

1000

1500

2000

Anz

ahl H

ebel

drüc

ke

Abb. 3.16 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die Motivation im Progressive-Ratio-Test. Die

Daten repräsentieren die Mittelwerte der Anzahl der Hebeldrücke und die zugehörigen Standardfehler

(+S.E.M.). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen

Behandlungsgruppen in Bezug auf die Motivation (one-way ANOVA; p>0.05).

83

Ergebnisse

3.3 Verhaltenstests – Adulte Gruppe


PPI

Die Auswirkung einer akuten Reduktion der Reelin-Konzentration auf die PPI und

ASR adulter Ratten wurde anhand der Daten von insgesamt 29 Tieren untersucht,

davon 10 VEH-Tiere, 9 MS-Tiere und 10 AS-Tiere.

Eine Abnahme der Reelin-Konzentration im mPFC bei adulten Ratten löste im

Vergleich zu den Kontrollgruppen bei beiden Präpulsintensitäten ein PPI-Defizit aus.

Die Stärke des Präpulses beeinflusste den Behandlungseffekt nicht (Abb. 3.17).

Diese Ergebnisse wurden durch die statistische Auswertung (two-way RM

ANOVA) bestätigt. Es zeigte sich für die verschiedenen Gruppen sowohl ein

signifikanter Unterschied für den Faktor Behandlung [F2,26=12.942; p<0.001] als

auch für den Faktor Präpulsintensität [F1,26=9.752; p=0.004]. Post hoc Analysen

ergaben eine Reduktion der PPI bei beiden Präpulsintensitäten in der AS-Gruppe im

Vergleich zu den Kontrolltieren [Tukey t-Test; p<0.05].

ASR

Der Reelin-knockdown im mPFC adulter Ratten hatte keinen Effekt auf die ASR. Es

konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der VEH-, MS- und AS-Gruppe

[F2,26=0.481; p<0.623] festgestellt werden (Abb. 3.18).

84

Ergebnisse

69dB 78dB0

25

50

75

100

**

ASMSVeh

%PP

I

Abb. 3.17 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die Präpulsinhibition der akustisch

ausgelösten Schreckreaktion. Abgebildet sind die Mittelwerte der prozentualen Präpulsinhibition für

zwei verschiedene Präpulsintensitäten (69, 78dB) und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.).

Signifikante Unterschiede der AS-Gruppe gegenüber den Kontrollgruppen sind durch *


Veh MS AS 0

1000

2000

3000

Stär

ke d

er A

SR

Abb. 3.18 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die akustisch ausgelöste Schreckreaktion. Die

Daten repräsentieren die mittlere Reaktionsstärke auf 15 Schreckreize und die zugehörigen

Standardfehler (+S.E.M.). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den

Behandlungsgruppen in Bezug auf die Reaktionsstärke (one-way ANOVA; p>0.05).

85

Ergebnisse

3.3.2 T-Maze-Test

Der Effekt des akuten Reelin-knockdowns auf die Kurzeitgedächtnisleistung adulter

Ratten wurde anhand der Daten von insgesamt 28 Tieren untersucht, davon 11 VEH-

Tiere, 8 MS-Tiere und 8 AS-Tiere. Die Ergebnisse einer AS-Ratte konnten nicht in die

Auswertung eingehen, da das Tier während der Trainingsperiode die stereotaktisch

implantierten Führungskanülen verlor.

Die Tiere aller Behandlungsgruppen erfüllten das geforderte Kriterium von

�80% richtigen Armeintritten an drei aufeinander folgenden Tagen innerhalb von 11

Tagen (Abb. 3.19). Eine statistische Auswertung ergab keinen signifikanten

Unterschied zwischen den Gruppen [F2,25=0.635; p=0.538].

Innerhalb der einzelnen Trainingstage zeigte sich kein Unterschied in der

Performanz zwischen den einzelnen Gruppen (Abb. 3.20). Eine statistische

Auswertung (two-way RM ANOVA) belegte einen Unterschied für den Faktor

Trainingstag [F8,200=24.371; p<0.001], nicht jedoch für den Faktor Behandlung

[F2,200=0.049; p=0.952] oder die Interaktion der beiden Faktoren [F16,200=0.905;

p=0.564].

Die akute Reduktion der Reelin-Konzentration im mPFC hatte keinen Effekt

auf die Kurzzeitgedächtnisleistung adulter Tiere. Bei der Durchführung des Tests mit

einer Verzögerungsdauer von 30sek offenbarte sich eine Abnahme der korrekten

Läufe im Vergleich zu keiner Verzögerung; es zeigten sich jedoch keine Unterschiede

zwischen den einzelnen Gruppen innerhalb des Verzögerungsintervalls (Abb. 3.21).

Eine two-way RM ANOVA bestätigte dieses Ergebnis. Die Analyse ergab einen

Unterschied zwischen den Verzögerungsintervallen [F1,25=73.485; p<0.001],

wohingegen kein Gruppenunterschied [F2,25=0.899; p=0.420] und keine Interaktion

der Faktoren festgestellt werden konnte [F12,25=0.024; p=0.977].

86

Ergebnisse

Veh MS AS 0

2

4

6

8

10

12

Lern

tage

Abb. 3.19 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die durchschnittliche Anzahl von Lerntagen

zur Erlangung des geforderten Kriteriums im T-Maze-Test. Abgebildet sind die Mittelwerte der

Lerntage und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Es konnte kein signifikanter Unterschied

festgestellt werden (one-way ANOVA; p>0.05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

20

40

60

80

100

VEHMSAS

Tag

% ri

chtig

e Lä

ufe

Abb. 3.20 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die Trainingsphase des T-Maze-Tests. Die

Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der richtigen Läufe an den einzelnen Trainingstagen und die

zugehörigen Standardfehler (±S.E.M.). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den

einzelnen Behandlungsgruppen an den einzelnen Trainingstagen in Bezug auf die Anzahl der richtigen

Läufe (two-way ANOVA; p>0.05).

87

Ergebnisse

0sek 30sek0

25

50

75

100 VehMSAS

% ri

chtig

e Lä

ufe

Abb.3.21 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf das räumliche Kurzzeitgedächtnis im T-Maze-

Test (Verzögerungsintervalle von 0 und 30sek). Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (%) der

richtigen Läufe an den einzelnen Testtagen und die zugehörigen Standardfehler (+S.E.M.). Es konnte

kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (two-way RM ANOVA, Tukey t-Test; p>0.05).


Für die Untersuchung der lokomotorischen Aktivität der adulten Tiere wurden die

Daten von 29 Tieren (VEH: 10; MS: 9; AS: 10) aufgezeichnet und ausgewertet.

Wie schon in der pubertären Gruppe hatte eine Reelin-Verarmung im mPFC

adulter Ratten keinen Einfluss auf die untersuchten lokomotorischen Parameter

(Abb. 3.22). Eine one-way ANOVA konnte keine signifikanten Gruppenunterschiede

bezüglich der allgemeinen Aktivität [F2,26=0.494; p=0.616], der zurückgelegten

Distanz [F2,26=0.250; p=0.781], des Aufrichtverhaltens [F2,26=3.106; p=0.065] und

des Aufenthalts in der Mitte [F2,26=0.618; p=0.547] feststellen. Auch die Auswertung

der Intervallanalyse über den Messzeitraum zeigte keine signifikanten

Behandlungseffekte für die erfassten Parameter (Daten nicht gezeigt).

88

Ergebnisse

Aktivität (sek) Distanz (m) Mitte (sek) Aufrichten0

100

200

300

400

500

600

AS

VehMS

Loko

mot

oris

che

Aktiv

ität

Abb. 3.22 Effekt des Reelin-knockdowns im mPFC auf die lokomotorische Aktivität. Die Daten

repräsentieren die Mittelwerte der untersuchten lokomotorischen Parameter und die zugehörigen


Behandlungsgruppen in Bezug auf die lokomotorische Aktivität (one-way ANOVA; p>0.05).

89

Diskussion

4. Diskussion

Die Entdeckung des extrazellulären Glykoproteins Reelin durch GABRIELLA

D’ARCANGELO im Jahr 1995 führte zu umfangreichen Untersuchungen bezüglich der

Rolle von Reelin bei der cortikalen Entwicklung. Während essentielle Teilaspekte der

Neuronenmigration und deren Signalterminierung erforscht und verstanden wurden,

entwickelte sich über die Jahre ein neues Forschungsfeld, in dessen Zentrum sich

verschiedene Arbeitsgruppen bis heute mit der Rolle von Reelin in der

Pathophysiologie der Schizophrenie befassen und die Funktion von Reelin bei

Gedächtnis- und Lernvorgängen hinterfragen. Zu diesem Zweck werden zum einen

tierexperimentelle Studien an der heterozygoten reeler-Maus durchgeführt, die durch

eine prä- und postnatale Reelin-Verarmung charakterisiert ist. Zum anderen sollen in

vitro Untersuchungen an cortikalen und hippocampalen Neuronen helfen, den

physiologischen Einfluss von Reelin auf diese Zellen zu erforschen.

Die aufschlussreichen Arbeiten zum Reelin-Molekül der letzten Jahre, konnten

bis heute jedoch noch keine sicheren Aussagen über die Funktionsweise und Rolle

des Proteins im adulten Organismus treffen. Aus diesem Grund bestand die primäre

Aufgabe der vorliegenden Arbeit darin, eine Methode zu etablieren, die einen

spezifischen und sensiblen sowie einen temporären und topographisch begrenzten

Expressions-Stop des Moleküls induziert. Mit der intracerebralen Infusion von

Reelin-antisense Oligonukleotiden in den mPFC der Ratte und anschließender

Reelin-Quantifizierung konnte dieses erste Teilprojekt erfolgreich abgeschlossen

werden.

Zudem wurde die intracerebrale Reelin-antisense-Infusion angewandt, um das

Reelin-Signal während der Pubertät oder während des adulten Stadiums der Ratte zu

unterdrücken, um so Verhaltensänderungen bei jung-adulten Tieren (nach

mehrfachen Injektionen während der Pubertät) oder bei adulten Ratten (nach akuten

Injektionen) auszulösen. Dazu wurden in mehreren, von der funktionellen Integrität

des mPFC abhängigen, Tests spezifische Verhaltensleistungen untersucht und die

Ergebnisse im Kontext der Schizophrenieforschung aber auch in Bezug auf Lern- und

Gedächtnisfunktionen betrachtet.

Um eine abschließende sichere Interpretation der erhobenen Verhaltensdaten

im Kontext der Reelin-Funktion zu gewährleisten, müssen zunächst die im Rahmen

91

Diskussion

dieser Arbeit durchgeführten histologischen und biochemischen Analysen betrachtet

werden.

92

Diskussion

4.1 Histologische und biochemische Auswertung

Die Injektionen der Phosphothioat-modifizierten antisense- oder missense-

Oligonukleotide während der Pubertät oder bei adulten Tieren führten im Vergleich

zu den Kontrollgruppen zu keinen makroskopischen oder mikroskopischen

Auffälligkeiten der Gehirne. Es konnten in den Nissl-gefärbten Hirnschnitten keine

Läsionscharakteristika wie eine Verringerung der Cortexdichte, ein narbenförmiges

Einziehen des Gewebes, Anomalien der Cytoarchitektur bzw. ein allgemeiner

Neuronenverlust [KÖHLER & SCHWARCZ, 1983] festgestellt werden, so dass eine

neurotoxische Wirkung der eingesetzten antisense-Oligonukleotide ausgeschlossen

werden kann. Obwohl sich bereits die ersten PTOs in fortgeschrittenen klinischen

Phasen befinden [COPPELLI & GRANDIS, 2005; CHAN ET AL., 2006], stellten einige

Untersuchungen unspezifische antisense-Protein-Interaktionen fest, die

möglicherweise für eine zelluläre Toxizität verantwortlich sein könnten [BROWN ET

AL., 1994; LEVIN, 1999; KURRECK, 2003]. Um eine möglichst sensitive Infusion

durchzuführen, d.h. eine Akkumulation toxischer PTO-Konzentrationen im mPFC zu

vermeiden, wurde mittels einer vollautomatisierten Injektionspumpe die

Injektionsdauer im Vergleich zu anderen Studien um ein Vielfaches auf 30min

erhöht. Da sowohl die PTO-Verteilung im Gewebe (Verteilungs-Halbwertszeit: 30-

60min) als auch die zelluläre Aufnahme (die ersten Oligonukleotide sind bereits nach

15min intrazellulär nachzuweisen) in relativ kurzer Zeit erfolgen [OGAWA ET AL.,

1995B; DEAN & BENNETT, 2003], kann davon ausgegangen werden, dass Nebeneffekte

minimiert wurden und dadurch unerwünschte Verfälschungen der gesammelten

Daten auszuschließen sind. Ein weiteres Indiz hierfür bieten tierexperimentelle

Studien, in denen die Auswirkung einer Ibotenat-Läsionierung des mPFC auf die PPI

untersucht wurde. Es zeigte sich, dass neonatale mPFC-Läsionen sowohl bei

juvenilen [SCHNEIDER & KOCH, 2005] als auch bei jung-adulten Ratten [SCHWABE ET

AL., 2004] eine Erhöhung der PPI induzierten, ein Effekt, der auch nach adulter

Ibotenat-Läsionierung des mPFC zu beobachten war [LACROIX ET AL., 2000A]. Diese

Ergebnisse verdeutlichen zum einen den starken modulatorischen Einfluss des mPFC

auf den neuronalen Schaltkreis der PPI, stehen zum anderen aber im Gegensatz zu

den PPI-Daten der vorliegenden Studie, in der der Reelin-knockdown ein PPI-Defizit

induzierte (siehe hierzu 4.2.1).

Für eine quantitative Bewertung der Auswirkung der eingesetzten Reelin-

antisense Oligonukleotide ist es wichtig, die auftretenden Unterschiede in der Reelin-

93

Diskussion

Konzentration der einzelnen Gruppen zu charakterisieren. Das Reelin-Protein wird

vermutlich nach der Translation in das Axon transportiert, wo es in lokalen Speichern

angereichert und von dort in den Extrazellularraum sekretiert wird [DERER ET AL.,

2001]. Dort erfährt das Molekül eine Spaltung an zwei definierten Stellen, so dass

verschiedene Reelin-Fragmente entstehen (Abb. 1.3) [LAMBERT DE ROUVROIT ET AL.,

1999B; JOSSIN ET AL., 2004].

Mit Hilfe der hier durchgeführten Western-Blot Analyse sowie der

eingesetzten Antikörper konnten drei dieser Reelin-Fragmente (180, 330, 410kDA),

die möglicherweise für die Änderungen der Reelin-Signalstärke durch

unterschiedliche Bindungseigenschaften und/oder Downstream-Effektoren

verantwortlich sind, visualisiert werden. In den untersuchten Proben der einzelnen

Gruppen (VEH-, MS-, AS-Gruppe) dominierte das 180-kDa-Fragment, wobei dessen

Konzentration in den jung-adulten und adulten Ratten nach der antisense-

Behandlung deutlich reduziert war (74 bis 90% im Vergleich zu den

Kontrollgruppen). Zusätzlich zeigte sich eine Konzentrationsreduktion der größeren

Fragmente bei jung-adulten Tieren. Da in der Analyse von Proben des ventralen

Hippocampus keine Unterschiede in Bezug auf die Reelin-Konzentration der

einzelnen Gruppen festzustellen waren, verdeutlichen diese Ergebnisse sowohl einen

lokalen als auch funktionellen Reelin-knockdown im mPFC. Allerdings kann nicht

ausgeschlossen werden, dass einzelne methodische Schritte der Western-Blot Analyse

einen Einfluss auf die Reelin-Fragmente hatten. So zeigten LUGLI und Mitarbeiter

anhand einer Studie mit menschlichem Plasma, dass wiederholtes Einfrieren und

Auftauen, Hitzeeinwirkung oder Langzeitlagerung eine Degradation des Moleküls

hervorrufen können. Vermutlich beeinflussen diese Faktoren spezifische Bindungen

des Moleküls und unterstützen seine Fragmentierung [LUGLI ET AL., 2003].

Zudem kann aufgrund der vorliegenden Resultate nicht auf die Effektivität der

quantifizierten Fragmente in Bezug auf ihre physiologische Aktivität bzw.

Signaltransduktion geschlossen werden, da die Funktion der einzelnen Reelin-

Fragmente noch nicht vollständig verstanden ist [JOSSIN ET AL., 2008]. Der zentrale

Teil des Proteins (Abb. 1.3), der sowohl im Gesamtprotein als auch in einigen

Spaltprodukten enthalten ist, bindet an den ApoE-Rezeptor 2 und VLDL-Rezeptor

und induziert eine intrazelluläre Phosphorylierung von Dab1. Möglicherweise ist das

unprozessierte Reelin-Molekül über den N- und/oder C-Terminus mit der EZM

assoziiert und nur das abgespaltene zentrale Element kann zu den Rezeptoren auf

den Zielzellen diffundieren [JOSSIN ET AL., 2004; Jossin et al., 2007]. Der N-Terminus

94

Diskussion

scheint dagegen eine Aggregation von Reelin-Homopolymeren zu unterstützen, was

zu einer gleichzeitigen Bindung mehrerer Rezeptoren führt und in einer Verstärkung

der Signalaktivierung resultiert [UTSUNOMIYA-TATE ET AL., 2000; KUBO ET AL., 2002].

Zusätzlich bindet die N-terminale Region des Moleküls an �3�1-Integrin-Rezeptoren

und inhibiert dadurch die neuronale Migration, indem eine Abtrennung der Neurone

von Radialgliazellen induziert wird [DULABON ET AL., 2000] oder unterstützt Prozesse

der synaptischen Plastizität [DONG ET AL., 2003]. Auch die C-terminale Region

scheint die Stärke des Reelin-Signals zu beeinflussen. NAKANO und KOHNO zeigten,

dass diese Region strukturelle Veränderungen des Reelin-Moleküls induziert, welche

möglicherweise eine Interaktion mit noch unbekannten Molekülen auf der

neuronalen Zellmembran erleichtert und letztendlich ein starkes Reelin-Signal

auslösen kann [NAKANO ET AL., 2007; KOHNO ET AL., 2009A].

Es zeigt sich also, dass aufgrund verschiedenster Variablen die Rolle von

Reelin und seiner Fragmente in vivo schwer vollständig erfasst und bewertet werden

kann. Obwohl einige Prozesse in diesem System analysiert worden sind, bedarf es

weiterer Studien, die klären, was der Auslöser für die Prozessierung von Reelin ist

und inwiefern die einzelnen Fragmente möglicherweise mit noch unbekannten

Molekülen interagieren und somit in der Lage sind, ein verstärktes Reelin-Signal zu

vermitteln.

Zusammengefasst bestätigen die histologischen und biochemischen

Ergebnisse dieser Studie das Auftreten einer starken Reelin-Verarmung (induziert

durch intracerebrale AS-Infusion) im mPFC der Ratte, welche sowohl durch eine

deutliche Sensibilität und Spezifität als auch Toposelektivität charakterisiert ist.

Aussagen über die physiologische Aktivität der einzelnen Reelin-Fragmente in Bezug

auf Signaltransduktionsprozesse können weder durch die vorliegende Arbeit noch

durch die Ergebnisse bereits veröffentlichter Studien endgültig getätigt werden. Die

Auswirkungen einer präfrontalen Reelin-Verarmung bei der Ratte wurden in dieser

Studie mit Hilfe verschiedener Verhaltenstests untersucht und sollen im Folgenden

diskutiert werden.

95

Diskussion

4.2 Angewandte Tiermodelle


Die ASR ist eine protektive Verhaltensantwort, die durch verschiedene unerwartete

Schreckstimuli bei Säugern ausgelöst werden kann. Aufgrund der gut untersuchten

Neuroanatomie und Neuropharmakologie des beteiligten neuronalen Schaltkreises,

gilt die ASR als bevorzugtes und anerkanntes Modell zur Untersuchung der

sensomotorischen Integrationsleistung. Eine Möglichkeit die ASR zu modulieren ist

durch das Phänomen der PPI gegeben. Bei dieser Methode findet eine Abschwächung

der Reaktion auf den Schreckreiz statt, wenn diesem ein schwacher nicht-

schreckauslösender Reiz, ein so genannter Präpuls, vorausgeht. Die Limitierung der

sensorischen Verarbeitung ist nötig, um zu vermeiden, dass irrelevante Stimuli zu

einer Beeinträchtigung der regulären Verhaltensantwort führen. Die PPI ist ein gutes

operationalisiertes Maß zur Untersuchung des sensomotorischen Filtermechanismus

und wird durch einen cortiko-limbisch-striatopallidalen Schaltkreis moduliert [KOCH,

1999; SWERDLOW ET AL., 2001].

Die intracerebrale Mikroinjetion der Reelin-antisense in den mPFC führte

sowohl bei der pubertären als auch bei der adulten Gruppe zu einer deutlichen

Abnahme der PPI, ohne dabei die ASR der einzelnen Gruppen unterschiedlich zu

beeinflussen. Die Homogenität der ASR-Amplitude in Abwesenheit von Präpulsen ist

von grundsätzlicher Bedeutung für die Interpretation der PPI-Daten, da hierdurch

motorische Defizite als eine Folge der jeweiligen Behandlung ausgeschlossen werden

können und somit Gruppenunterschiede eindeutig auf Störungen der

sensomotorischen Integration zurückzuführen sind [Swerdlow et al., 2001]. Wie

erwartet konnten keine relevanten Unterschiede in der ASR und der PPI zwischen

jung-adulten und adulten Tieren festgestellt werden. Eine Studie von PARISI & ISON

zeigte zwar ontogenetische Differenzen in Bezug auf die genannten Parameter [PARISI

& ISON, 1979], diese scheinen postpubertär jedoch nicht mehr feststellbar zu sein.

Die Reduktion der Reelin-Konzentration im mPFC führte bei beiden

Tiergruppen zu einer verstärkten ASR im PPI-Paradigma und somit zu einem PPI-

Defizit. Dieses Defizit offenbarte sich bei beiden gemessenen Präpulsintensitäten von

69 und 78dB, wobei die relative Stärke der PPI mit der Intensität des Präpulses

zunahm. Dieser Befund stimmt mit Beobachtungen von REIJMERS & PEETERS überein,

die in ihrer Studie zeigen konnten, dass ein Anstieg der Präpulsintensität in einem

96

Diskussion

Anstieg der PPI resultiert [REIJMERS & PEETERS, 1994]. Aufgrund dieser Ergebnisse

scheint es offensichtlich, dass Reelin als Modulator der EZM die

Transmitterhomöostase des neuronalen PPI-Schaltkreises beeinflusst. Im Vergleich

zu bereits vorliegenden Studien sind diese Ergebnisse jedoch mit Vorsicht zu

interpretieren. TUETING und Mitarbeiter waren kurz nach Entdeckung des Reelin-

Moleküls die Ersten, die die phänotypischen Charakteristika der heterozygoten

reeler-Maus untersuchten. Unter anderem verdeutlichte diese Studie, dass die Maus-

Mutante durch eine altersabhängige Abnahme der PPI charakterisiert ist. Während

zu Beginn der Pubertät kein Unterschied zu den Kontrollgruppen herausgestellt

werden konnte, manifestierte sich am Ende der Pubertät bzw. bei jung-adulten

Mäusen ein deutliches PPI-Defizit. Diese Ergebnisse konnten in späteren Studien

nicht reproduziert werden. PODHORNA & DIDRIKSEN sowie SALINGER und Mitarbeiter

fanden weder Unterschiede in der PPI noch in der ASR zwischen reeler- und Wildtyp-

Mäusen. Die Interpretation dieser Diskrepanzen ist möglicherweise mit

Unterschieden in der Versuchsdurchführung erklärbar, da das PPI-Paradigma

sensibel auf experimentelle Anpassungen bzw. Variationen reagiert [GEYER ET AL.,

2002]. So untersuchten TUETING und Mitarbeiter die PPI von Mäusen im pubertären

und jung-adulten Alter zwischen pd40 und pd63 bei einer Präpulsintensität von

80dB. In den späteren Studien hingegen wurde die sensomotorische

Integrationsleistung bei jung-adulten und adulten Mäusen (pd70 und pd102) bei

(teilweise) geringeren Präpuls-Intensitäten getestet (67-77dB) [TUETING ET AL., 1999;

SALINGER ET AL., 2003; PODHORNA & DIDRIKSEN, 2004; TUETING ET AL., 2008].

Insbesondere der gewählte Testzeitpunkt während unterschiedlicher

Entwicklungsphasen bietet eine gute Erklärung für die beschriebenen Abweichungen

der Befunde, da die Pubertät u.a. durch zahlreiche Veränderungen der neuronalen

Integrität gekennzeichnet ist. So unterliegen Hirnareale wie der mPFC oder limbische

Regionen einem progressiven und regressiven neuronalen Wandel, der beispielsweise

durch Reifungsprozesse (z.B. Myelinisierung, Differenzierung der

Neurotransmittersysteme, Eliminierung von Synapsen) charakterisiert ist [SPEAR,

2000; DE BELLIS ET AL., 2001; SISK & FOSTER, 2004; GRAAF-PETERS & HADDERS-ALGRA,

2006].

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen ebenfalls ein PPI-Defizit

bei jung-adulten Tieren und in der adulten Gruppe. Hier ist (neben dem Gattungs-

Unterschied) möglicherweise der Unterschied in der Reelin-Konzentration in dem

Sinne ausschlaggebend, als dass die Reelin-Verarmung bei adulten heterozygoten

97

Diskussion

reeler-Mäusen nicht ausreicht, um eine Störung der sensomotorischen

Integrationsleistung auszulösen (die Reduktion der Reelin-Konzentration bei den

adulten Ratten der vorliegenden Arbeit betrug im Mittel 75%).

Wie bereits erwähnt, ergaben Untersuchungen der sensomotorischen

Integrationsleistung an der heterozygoten reeler-Maus konträre Ergebnisse,

verdeutlichten jedoch auch die Funktionalität des Reelin-Moleküls in diesem

Paradigma. Diese Interpretation wird zusätzlich durch die folgende Diskussion

verschiedener tierexperimenteller Studien unterstützt.

In einer aufschlussreichen Studie aus dem Labor der COSTA-Gruppe konnte die

Reelin-Konzentration durch eine chronische Behandlung mit L-Methionin zum einen

bei Wildtyp-Mäusen deutlich verringert und zum anderen bei reeler-Mäusen – über

die charakteristische 50%ige Reelin-Verarmung hinaus – reduziert werden. Die

chronische Methioninehandlung führte hierbei zu einer epigenetischen

Hypermethylierung von CpG-Inseln, die auf verschiedenen Gen-Promotoren

(einschließlich der Promotoren für Reelin und GAD67) lokalisiert sind und induzierte

so eine Reduktion der Expressionsrate dieser Gene. Auch in dieser Studie führte die

Reelin-Verarmung bei Wildtyp- und reeler-Mäusen zu einem PPI-Defizit, wobei sich

die Störung der sensomotorischen Integrationsleistung ausschließlich bei langen

Interstimulusintervallen (400msek) zeigte [TREMOLIZZO ET AL., 2002; TREMOLIZZO ET

AL., 2005]. Verstärkt wurde die Annahme, dass Reelin einen modulatorischen

Einfluss auf die PPI ausübt, durch eine Studie mit Mäusen, die einen knockout für die

in GABAergen Interneurone expressierten Transkriptionsfaktoren NPAS1 und

NPAS3 trugen. Diese Tiere waren neben einer deutlichen Reelin-Verarmung durch

eine Verschlechterung der sensomotorischen Integrationsleistung charakterisiert

[ERBEL-SIELER ET AL., 2004].

In zwei aktuellen Studien konzentrierten sich BARR und Mitarbeiter auf den

sensomotorischen Filtermechanismus bei reeler-like Mäusen. Hierbei handelt es sich

um knockout-Mäuse, die im Vergleich zu Kontrolltieren durch ein Fehlen der Reelin-

Rezeptoren ApoE 2 oder VLDL charakterisiert sind. Interessanterweise konnte bei

beiden knockout-Stämmen keine Beeinflussung der PPI festgestellt werden, wobei

eine Tendenz zu einer Störung des Filtermechanismus bei VLDL-Rezeptor knockout-

Mäusen zu erkennen war. Weiter zeigte sich bei beiden knockout-Mutanten ein

deutliches PPI-Defizit sowohl nach pharmakologischer Challenge mit PCP als auch in

einem crossmodalen PPI-Paradigma, in dem einem akustischen Präpuls ein taktiler

Schreckreiz folgte. Da diesem Paradigma aufgrund des Einflusses von zwei

98

Diskussion

verschiedenen sensorischen Stimuli möglicherweise zusätzliche neuronale

Schaltkreise zu Grunde liegen als solche, die die unimodale akustische PPI

modulieren [BULLOCK ET AL., 1997; RALPH ET AL., 2001], ist dieses Ergebnis schwer mit

den vorliegenden PPI-Daten zu vergleichen. Offensichtlich scheinen jedoch die

Reelin-Rezeptoren an dem neuronalen Schaltkreis der PPI beteiligt zu sein und

reeler-like Mutanten durch eine erhöhte Sensibilität auf die NMDA-Rezeptorblokade

durch PCP charakterisiert zu ein [BARR ET AL., 2007; BARR ET AL., 2008].

Diese Erkenntnis ist interessant, da sowohl Glu als auch DA eine zentrale Rolle

in der Regulation der PPI einnehmen, was durch verschiedene Studien verdeutlicht

werden konnte [zusammengefasst in GEYER ET AL., 2001]. Beispielsweise induzierten

MANSBACH & GEYER durch systemische Injektionen der NMDA-Rezeptorantagonisten

PCP oder Dizocilpin ein PPI-Defizit bei Ratten und verdeutlichten so den

neuropharmakologischen Einfluss von Glu auf den neuronalen PPI-Schaltkreis.

Insbesondere scheint der mPFC hierbei eine essentielle Funktion einzunehmen. Es

wird vermutet, dass NMDA-Rezeptorantagonisten bevorzugt GABAerge Interneurone

im mPFC inaktivieren und dadurch eine Disinhibtion der glutamatergen Neurone

sowie eine verstärkte glutamaterge Ausschüttung vermitteln [MANSBACH & GEYER,

1989]. MANSBACH & GEYER zeigten in weiteren Studien, dass die Administration der

DA-Agonisten Apomorphin oder Amphetamin zu einem PPI-Defizit bei Ratten führt,

welches vermutlich durch eine Hyperfunktion des mesolimbischen DA-Systems

bedingt ist. Interessanterweise konnte diese Verschlechterung der sensomotorischen

Informationsverarbeitung durch die Applikation von Haloperidol, einem DA-D2/D1-

Rezeptorantagonisten und typischem Antipsychotikum, unterdrückt werden

[MANSBACH ET AL., 1988; GEYER ET AL., 2001].

Die Erkenntnisse, dass sowohl Reelin als auch der mPFC bzw.

Neurotransmitter wie Glu, DA oder GABA zur Modulation der PPI beitragen sowie

die bereits unter 1.4.5 beschriebene Theorie der präfrontalen GABAergen

Hypofunktion, die mit einer verminderten Reelin-Expression in der EZM assoziiert

ist, bergen verschiedene hypothetische Interpretationsmöglichkeiten in Bezug auf das

in dieser Arbeit festgestellte PPI-Defizit. Ein vermindertes Reelin-Signal im mPFC

führt möglicherweise zu einer funktionellen Störung der hier lokalisierten

GABAergen Interneurone. Wie verschiedene Studien verdeutlichten, bildet Reelin

über den ApoE-Rezeptor 2 eine funktionelle Einheit mit dem NMDA-Rezeptor

[WEEBER ET AL., 2002; BEFFERT ET AL., 2005; CHEN ET AL., 2005; CAMPO ET AL., 2009],

welcher im mPFC vornehmlich die Aktivität GABAerger Interneuronen reguliert

99

Diskussion

[OLNEY ET AL., 1999; HOMAYOUN & MOGHADDAM, 2007]. Eine reduzierte Reelin-

Expression führt demnach zu einer Hypofunktion dieser NMDA-Rezeptoren, indem

das verebbte intrazelluläre Reelin-Signal eine verminderte Phosphorylierung des

NMDA-Rezeptors bedingt. Dadurch kommt es zu einer Abnahme des Glu-

vermittelten Ca2+-Einstroms in die Zelle, was letztendlich zu einer verminderten

GABAergen Neurotransmission im mPFC führt. Die Vermutung, dass eine akute

Reelin-Verarmung bzw. eine daraus resultierende Veränderung der NMDA-

Rezeptoraktivität dem PPI-Defizit zu Grunde liegt, wird durch eine Studie von BAKSHI

& GEYER unterstützt, in der die lokale Gabe des NMDA-Rezeptorantagonisten

Dizocilpin in den mPFC zu einem PPI-Defizit führte. Eine cortikale Beeinträchtigung

des inhibitorischen GABAergen Tonus löst möglicherweise eine Disinhibtion der

glutamatergen Pyramidenzellen bzw. einen Anstieg der exzitatorischen

Neurotransmission in verschiedenen Bereichen des Gehirns aus [BAKSHI & GEYER.

1998; COSTA ET AL., 2008]. Diese Vermutung stimmt mit den Erkenntnissen einer

Studie von JAPHA & KOCH überein, in der der lokal in den mPFC injizierte GABAA-

Rezeptorantagonist Pikrotoxin ein deutliches PPI-Defizit induzierte. Die Autoren

postulierten eine Disinhibition der medial präfrontocortikalen glutamatergen

Neurone, deren Efferenzen sowohl im NAc präsynaptisch auf dopaminergen Termini

als auch in das VTA projizieren, das seinerseits prominente dopaminerge

Projektionen in den NAc besitzt. Sowohl die indirekten als auch direkten

Projektionen vermitteln eine potenzierte DA-Ausschüttung im NAc, eine lokale

exzessive Stimulation der DA-D2-Rezeptoren auf medium spiny Neuronen und

letztendlich eine Störung der PPI. Dass das PPI-Defizit durch eine systemische

Applikation des D2/D1-Rezeptorantagonisten Haloperidol aufgehoben werden

konnte, bestätigt die Theorie der subcortikalen dopaminergen Hyperfunktion

[SWERDLOW ET AL., 1990; TABER ET AL., 1995; JAPHA & KOCH, 1999; CARR & SESACK,

2000].

Zudem hat die Reelin-Verarmung möglicherweise die DA-Transmission im

mPFC beeinflusst. MATSUZAKI und Mitarbeiter zeigten in einer interessanten Studie

zum einen, dass die Anzahl der DA-D1- und D2-Rezeptoren in Gehirnen von reeler-

Mäusen reduziert ist und zum anderen, dass eine intraventrikulare Injektion des

Reelin-Antikörpers CR-50 zu einer akuten Beeinflussung der dopaminergen

Transmission führt [MATSUZAKI ET AL., 2007]. Dass sowohl eine mediale

präfrontocortikale DA-Verarmung [BUBSER & KOCH, 1994; KOCH & BUBSER, 1994] und

die Infusion selektiver D1- oder D2-Rezeptorantagonisten in den mPFC [ELLENBROEK

100

Diskussion

ET AL., 1996] als auch der D1/2-Rezeptoragonist Apomorphin [BROERSEN ET AL., 1999;

LACROIX ET AL., 2000B] ein PPI-Defizit induzierten, verdeutlicht die modulatorische

Funktion von DA im mPFC in Bezug auf die PPI. Es ist eine durchaus plausible

Annahme, dass lokale Störungen des Reelin-Signals über die dopaminerge

Neurotransmission einen zusätzlichen Einfluss auf die PPI ausüben. Ob die DA-

Rezeptoren ähnlich wie NMDA-Rezeptoren direkt über den Reelin-Signalweg

moduliert werden oder Interaktionen intrazellulärer Signalmoleküle wie DARPP-32

und Dab1 das DA-System kontrollieren, muss in weiteren Studien untersucht werden.

Neben diesen pharmakologischen Erklärungen basiert das PPI-Defizit

möglicherweise auch auf anatomischen Anomalien, die aus der Reelin-Verarmung

resultieren. DONG und Mitarbeiter berichteten, dass Reelin im postnatalen

Organismus über Integrinrezeptoren als neurothropher Faktor agiert und so einen

essentiellen Einfluss auf die Dendritenmorphologie ausübt [DONG ET AL., 2003].

Demnach führt eine Reelin-Verarmung im mPFC zu einer lokalen Abnahme der

Dendritendichte. Tatsächlich ist eine interneuronale Reduktion des Neuropils im

dlPFC eine prominente Begleiterscheinung der cortikalen Pathologie der

Schizophrenie und repräsentiert ein anatomisches und funktionelles Substrat für die

die Erkrankung begleitenden Symptome. So führt eine Veränderung der

Dendritenmorphologie zu Störungen der prominenten thalamo-cortikalen, cortiko-

cortikalen und meso-cortikalen Konnektivitäten, welche letztendlich ein

pathologisches Ungleichgewicht der lokalen Transmitterbalance bedingen [SELEMON

& GOLDMAN-RAKIC, 1999; ROSOKLIJA ET AL., 2000; GLANTZ & LEWIS, 2001; BLACK ET AL.,

2004]. Eine Verringerung des Neuropilvolumens, als Folge von Reelin-antisense

Injektionen während der für die neuronale Entwicklung sensiblen Periode der

Pubertät, bietet demnach eine gute Erklärung für das beobachtete PPI-Defizit bei

jung-adulten Tieren. Da in der adulten Behandlungsgruppe der akute Effekt der

Reelin-Verarmung untersucht wurde, sollte das hier auftretende PPI-Defizit als

Störung der lokalen cortiko-cortikalen Konnektivität bzw. als präfrontocortikale

GABAerge/glutamaterge Dysbalance bzw. dopaminergen Hypofunktion verstanden

werden.

Zusammengefasst zeigt sich, dass das hier gemessene PPI-Defizit

möglicherweise (1.) über den auf GABAergen Interneuronen lokalisierten ApoE-

Rezeptor 2 vermittelt wird, der einen funktionellen Komplex mit dem NMDA-

Rezeptor bildet, und/oder (2.) durch ein Ungleichgewicht der dopaminergen

101

Diskussion

Transmitterbalance im mPFC und/oder (3.) durch eine präfrontocortikale

Neuropilverarmung bedingt ist.

Die PPI der ASR ist durch eine hohe Validität im Tiermodell gekennzeichnet,

d.h. sie ist ein endophänotypischer Marker für psychotische Störungen, der eine hohe

Übereinstimmung bei Mensch und Tier zeigt [SWERDLOW ET AL., 1994; SWERDLOW ET

AL., 2000; BRAFF ET AL., 2001; KOCH, 2006]. Neben den bekannten und oft ausgiebig

untersuchten Neurotransmittern und Hirnarealen im Kontext schizophrener

Erkrankungen, sollten in zukünftigen Studien die Funktionen des Reelin-Moleküls –

als pleiotroper Modulator der EZM – stärker hinterfragt werden.

4.2.2 Kurzzeitgedächtnis: Der T-Maze- und Object-Recognition-Test

Verschiedene Hirnstrukturen wie der Hippocampus, PFC oder das Cerebellum bilden

das neuronale Substrat des Gedächtnisses, welches sich in Bezug auf die Dauer der

Informationsspeicherung in das sensorische bzw. in das Kurzzeit- und

Langzeitgedächtnis unterteilen lässt. Letzteres wird in das explizite (das bewusste

Abrufen von vergangenen Ereignissen) und das implizite (das unbewusste,

automatisierte Abrufen von Erinnerungen) Gedächtnis gegliedert. Beispiele für das

explizite Gedächtnis sind das episodische oder semantische Gedächtnis (also das

Erinnern an Ereignisse oder Fakten), wohingegen implizite Gedächtnisinhalte durch

nicht-assoziative (Habituation, Sensitivierung) und assoziative (klassische und

operante Konditionierung) Lernformen charakterisiert sind. Demgegenüber ist das

Kurzeitgedächtnis durch ein kurzes Aufrechterhalten aktueller Informationen

gekennzeichnet, dessen Inhalt durch stetige Wiederholungen im Langzeitgedächtnis

gespeichert werden kann. Da sowohl Störungen des räumlichen

Kurzzeitgedächtnisses als auch Defizite der Wiedererkennungsleistung zu den

prominenten kognitiven Symptomen schizophrener Psychosen gehören [GOLDMAN-

RAKIC, 1994; SPINDLER ET AL., 1997], ist die Evaluierung mnemonischer Prozesse im

Tiermodell ein wichtiges Hilfsmittel, um die Merkmale psychischer Störungen besser

verstehen zu können. Der T-Maze-Test stellt in diesem Fall eine gute Methode dar,

das räumliche Kurzzeitgedächtnis der Ratte zu untersuchen. In diesem Versuch muss

das Versuchstier erlernen, alternierend in einen von zwei möglichen Armen des T-

Maze zu laufen, um eine Futterbelohnung zu erhalten. Jeder einzelne Testdurchlauf

ist also von der vorausgegangenen Wahl des Tieres abhängig [SANCHEZ-SANTED ET AL.,

102

Diskussion

1997]. Das Wiedererkennen von Objekten im OR-Test ist eine weitere anerkannte

Methode, um die Kurzzeitgedächtnisleistung der Ratte zu überprüfen [EVERTS &

KOOLHAAS, 1997] und ist im Allgemeinen mit den in Humanstudien verwendeten

Messmethoden zur Objektwiedererkennung vergleichbar. Bei dem OR-Test wird dem

Versuchstier ausreichend Zeit gewährt, ein unbekanntes Objekt in bekannter

Umgebung zu explorieren. Nachdem dieses für eine bestimmte Zeit entfernt wurde,

zeigt sich in der Regel bei der wiederholten Präsentation des Objekts eine deutliche

Abnahme der Investigationszeit – das Objekt wird demnach von dem Tier als

bekannt eingestuft.

Aufgrund des experimentellen Designs wurde die Gedächtnisleistung im T-

Maze bei beiden Versuchstiergruppen untersucht, im OR-Test dagegen ausschließlich

bei jung-adulten Tieren bestimmt (siehe 2.3). Infolge des induzierten Reelin-Defizits

im mPFC konnte bei jung-adulten Ratten eine Verschlechterung der

Kurzzeitgedächtnisleistung im T-Maze- und OR-Test festgestellt werden. Konträr

dazu konnte bei adulten Tieren keine Beeinträchtigung der T-Maze-Performanz

festgestellt werden. In beiden Kontrollexperimenten des OR-Tests (siehe 2.6.3), in

denen (Test I) ein identisches Objekt nach einer Verlängerung der Wartezeit

zwischen den Präsentationen gezeigt wurde oder (Test II) nacheinander zwei

unterschiedliche Objekte präsentiert wurden, zeigten sich bei jung-adulten Tieren

kein Behandlungseffekt. Da die Explorationszeiten der Tiere in Bezug auf die jeweils

erste und zweite Objektpräsentation annähernd gleich waren, unterstützten die

Kontrolltests die Annahme, dass dem OR-Test tatsächlich Gedächtnisprozesse

zugrunde liegen, so dass von einer selektiven Beeinflussung der

Kurzzeitgedächtnisleistung und nicht etwa von der Enkodierung sensorischer

Informationen gesprochen werden kann. Ein Anstieg der Investigationszeiten

während der zweiten Präsentation im Haupttest und die Verschlechterung der T-

Maze-Performanz sind demnach nicht auf motorische Defizite oder ein verstärktes

exploratives Verhalten zurückzuführen. Diese Interpretation wird zudem durch die

Tatsache bestätigt, dass die Tiere aller Behandlungsgruppen eine normale

lokomotorische Aktivität im OF-Test aufwiesen (siehe 4.2.3).

Es liegen verschiedene Studien vor, in denen das Kurzzeitgedächtnis mit teils

unterschiedlichen Resultaten bei heterozygoten reeler- oder reeler-like-Mäusen

untersucht worden ist. SALINGER und KRUEGER konnten bei dem so genannten

nosepoke-Test keine Störungen der Gedächtnisleistung bei den untersuchten

Mutanten feststellen [SALINGER ET AL., 2003; KRUEGER ET AL., 2006]. In einem

103

Diskussion

weiteren Testparadigma zur Bestimmung des Kurzzeitgedächtnisses, dem Barnes-

Test, konnten BARR und Mitarbeiter bei homozygoten ApoE-Rezeptor 2 knockout-

Mäusen ebenfalls keine Beeinträchtigung der Gedächtnisleistung beobachten.

Allerdings zeigten sich Defizite im reversal learning und in verschiedenen

Suchstrategien für die Belohnung, was auf eine Beteiligung dieses Reelin-Rezeptors

an allgemeinen Lernprozessen hindeutet [BARR ET AL., 2007]. Aufgrund der

methodischen Differenzen und der Gattungs-Unterschiede der Versuchstiere sind die

beschriebenen Ergebnisse jedoch nur schwer miteinander zu vergleichen, weisen

aber auf eine funktionelle Rolle des Proteins in Lern- und Gedächtnisprozessen hin.

Die dem räumlichen Kurzzeitgedächtnis und der Objektwiedererkennung zu

Grunde liegenden neuronalen Schaltkreise und Neurotransmitter sind ausgiebig

untersucht, jedoch noch nicht bis ins Detail verstanden worden. Der PFC spielt eine

wichtige Rolle in mnemonischen Prozessen und bei räumlichen Fähigkeiten. Er wird

als zentrales Hirnareal des im T-Maze untersuchten räumlichen

Kurzzeitgedächtnisses angesehen [GOLDMAN-RAKIC, 1994; MCCARTHY ET AL., 1994;

VERMA & MOGHADDAM, 1996]. Zusätzlich sind weitere cortikale und subcortikale

Strukturen wie der posteriore parietale Cortex und der Hippocampus in einem

neuronalen Netzwerk an den komplexen Prozessen der Kurzzeitgedächtnisbildung

beteiligt [COMPTE ET AL., 2000; FUSTER, 2001; WANG & CAI, 2006]. Neben den

Neurotransmittern ACh und GABA scheinen insbesondere DA und Glu

modulatorische Eigenschaften auf diese Gedächtnisform auszuüben [Di SCALA ET AL.,

1990; ROMANDIES ET AL., 1999; HIRONAKA ET AL., 2001]. Die wichtige Rolle von

präfrontalem DA konnte durch verschiedene tierexperimentelle Studien verdeutlicht

werden. So führten sowohl Manipulationen des dopaminergen Systems im dlPFC bei

Primaten [BROZOSKI ET AL., 1979; SAWAGUCHI & GOLDMAN-RAKIC, 1994] als auch im

mPFC bei Nagern [STAM ET AL, 1989; WILCOTT & QU, 1990] zu deutlichen Defiziten des

Kurzzeitgedächtnisses. VERMA & MOGHADDAM zeigten zudem, dass eine durch NMDA-

Rezeptorantagonisten induzierte Hypofunktion der im mPFC lokalisierten NMDA-

Rezeptoren zu einer Verschlechterung der Kurzzeitgedächtnisleistung führt [VERMA &

MOGHADDAM, 1996].

Das Wiedererkennen von Objekten im OR-Test ist ebenfalls ein vielschichtiger

Prozess, der es ermöglicht, charakteristische Stimulusmerkmale zu identifizieren, zu

unterscheiden und diese mit charakteristischen Elementen bereits erfahrener

Ereignisse zu vergleichen [STECKLER ET AL., 1998A]. Welcher bzw. welche dieser

Prozesse durch die Reelin-Verarmung beeinträchtigt wurden, ist nicht zu

104

Diskussion

unterscheiden. Da jedoch die Objektdiskriminierung im Allgemeinen nicht den

Aufgaben des Präfrontalcortex zugeordnet ist, liegt bei der verlängerten

Objektuntersuchung nach wiederholter Präsentation vermutlich eine

Beeinträchtigung der im Kurzzeitgedächtnis gespeicherten Objektinformationen vor.

Dass es sich um Defizite des Kurzzeitgedächtnisses handelt und nicht um Ausfälle in

der Objekterkennung per se, wird zudem durch die Tatsache verdeutlicht, dass im

Langzeitgedächtnis gespeicherte Objekte wie der zu drückende Hebel im PR-Test

(siehe 4.2.5), problemlos wiedererkannt werden.

Die Feststellung, ob ein Objekt bekannt oder nicht bekannt ist, scheint nach

AGGLETON & BROWN grundlegend mit der Funktion des perirhinalen Cortex verknüpft

zu sein [MURRAY & MISHKIN, 1998; AGGLETON & BROWN, 2005]. Diese Erkenntnis wird

durch verschiedene Humanstudien [HOLDSTOCK, 2005] und tierexperimentelle

Arbeiten unterstützt. So verdeutlichten HANNESSON und Mitarbeiter, dass die

Inaktivierung des perirhinalen Cortex bei adulten Ratten eine Störung der

Objektwiedererkennung induziert [HANNESSON ET AL., 2004A, B], während WINTERS

& BUSSEY nachwiesen, dass dieses Cortexareal sowohl bei der Codierung und

Speicherung als auch bei dem Abruf der Objektinformation involviert ist [WINTERS &

BUSSEY, 2005]. Neben der wichtigen Rolle des perirhinalen Cortex scheint eine

Beteiligung des PFC als modulatorisches Areal für die Objektwiedererkennung bei

Ratten und Primaten obligat zu sein [RAINER & MILLER, 2000; RAGOZZINO ET AL.,

2002]. Möglicherweise repräsentiert der PFC neben dem perirhinalen Cortex und

dem MDT den Teil des Schaltkreises, der das neuronale Substrat für die

Prozessierung der Objektwiedererkennung bildet [MEUNIER ET AL., 1997; PARKER ET

AL., 1997; PARKER & GAFFAN, 1998]. Wie auch bei der räumlichen

Kurzzeitgedächtnisleistung scheint eine ungestörte DA-Transmission im mPFC für

die kognitiven Leistungen der Objektwiedererkennung wichtig zu sein [MORROW ET

AL., 2000; VENTURA ET AL., 2004]. Inwiefern den in den beiden Test-Paradigmen

beobachteten Gedächtnisdefiziten eine dopaminerge Dysbalance zu Grunde liegt,

kann durch die vorliegende Arbeit jedoch nicht geklärt werden. Offenbar unterliegt

die Mnemonik des T-Maze und des OR-Tests unterschiedlichen neuronalen

Schaltkreisen, in denen der mPFC eine wichtige Rolle einnimmt. Ein

Ungleichgewicht in der Reelin-Balance des mPFC scheint verantwortlich für die

beobachteten Gedächtnisdefizite zu sein.

Doch lassen sich diese Störungen auch auf zellulärer Ebene erklären? WEEBER

und Mitarbeiter vermuteten erstmals, dass das Reelin-Signalsystem einen wichtigen

105

Diskussion

modulatorischen Einfluss auf kognitive Prozesse ausübt. Zudem scheint das Reelin-

Signal direkt über den NMDA-Rezeptor den Ca2+-Einstrom in die Zelle zu verstärken

und über eine Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren eine wichtige

Grundlage für Prozesse der synaptischen Plastizität und Gedächtnisleistung zu bilden

[RICE & CURRAN, 2001; WEEBER ET AL., 2002; BEFFERT ET AL., 2005; CHEN ET AL.,

2005]. Da die akute Beeinflussung des Reelin-Signals im adulten Tier jedoch keinen

Einfluss auf die Lern- und Gedächtnisleistung des Tieres hatte, sind die vorliegenden

Ergebnisse nur unzureichend mit dieser Theorie zu vereinbaren. Wie schon unter

4.2.1 diskutiert, kann der Verlust des neurotrophen Modulators Reelin zu einer

lokalen Verringerung der Neuropildichte führen. Die daraus resultierenden

Störungen der thalamo-cortikalen, cortiko-cortikalen und meso-cortikalen

Konnektivitäten bzw. eine Störung der Transmitterhomoöstase könnten den

beobachteten kognitiven Defiziten bei jung-adulten Tieren zu Grunde liegen

[SELEMON & GOLDMAN-RAKIC, 1999; ROSOKLIJA ET AL., 2000; GLANTZ & LEWIS, 2001;

BLACK ET AL., 2004].

Zusammenfassend bieten die vorliegenden Resultate neue Erkenntnisse über

die Rolle von Reelin in Lern- und Gedächtnisprozessen. Die Ergebnisse zeigen, dass

eine mediale präfrontocortikale Reelin-Verarmung komplexe Veränderungen der

Gedächtnisleistungen zur Folge hat. Tatsächlich ist der PFC essentiell sowohl an der

kurzen Aufrechterhaltung von Informationen als auch an dem ständigen Erneuern

von vergangenen und aktuellen Informationen in einem Augenblick-zu-Augenblick-

Schema beteiligt. Störungen dieses präfrontocortikalen Systems führen womöglich zu

den charakteristischen kognitiven Dysfunktionen, insbesondere des

Kurzzeitgedächtnisses, wie sie oft bei schizophrenen Patienten beobachtet werden

können [MATHES ET AL., 2005].


Die lokomotorische Aktivität unterliegt der Prozessierung interner motivationaler

und externer sensorischer Stimuli. Vermittelt wird dieses Verhalten durch separate,

jedoch anatomisch und funktionell miteinander interagierende Systeme – dem

limbischen und dem motorischen System sowie den Basalganglien [MORGENSON ET

AL., 1980; SKINNER & GARCIA-RILL, 1993].

106

Diskussion

Es konnten im Rahmen der vorliegenden Studie weder bei jung-adulten noch

bei adulten Ratten Unterschiede in der lokomotorischen Aktivität als eine Folge der

medialen präfrontocortikalen Reelin-Verarmung festgestellt werden. Dieses Ergebnis

bestätigt somit Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen, die keine Abweichungen in

der Analyse von verschiedenen lokomotorischern Parameter zwischen reeler- und

Wildtyp-Mäusen finden konnten [TUETING ET AL., 1999; WEEBER ET AL., 2002;

SALINGER ET AL., 2003; PODHORNA& DIDRIKSEN, 2004; BEFFERT ET AL., 2005; KRUEGER

ET AL., 2006; QIU ET AL., 2006]. Die lokomotorische Aktivität bei Nagern ist im

Allgemeinen mit limbisch-striatalen Funktionen assoziiert. Verschiedene Studien

belegen, dass hierbei im Speziellen die dopaminerge Neurotransmission im NAc eine

zentrale Rolle spielt. Beispielsweise führen Psychostimulantien wie Amphetamin zu

einem verstärkten lokomotorischen Verhalten, indem eine erhöhte dopaminerge

Transmission in subcortikale Areale wie den NAc induziert wird [CARBONI ET AL.,

1989; TAKAHATA & MOHADDAM, 2003; WHITE ET AL., 2006]. Zudem lösen NMDA-

Rezeptorantagonisten wie PCP eine Hyperlokomotion bei Nagern aus. Vermutlich

inhibiert PCP die tonische GABAerge Transmission auf cortikale und/oder

hippocampale Neurone, was zu einer Enthemmung der glutamatergen Efferenzen

führt und letztendlich in einem Anstieg der DA-Konzentration in subcortikalen

Arealen resultiert [STURGEON ET AL., 1982; OLNEY ET AL., 1999]

Interessanterweise führen Manipulationen der dopaminergen und

glutamatergen Neurotransmission bei reeler-Mäusen zu Störungen der

lokomotorischen Aktivität. MATSUZAKI und Mitarbeiter legten dar, dass eine

Methamphetamin-induzierte Hyperlokomotion in reeler-Mäusen im Vergleich zu

Kontrolltieren deutlich abgeschwächt ist. Dieser Effekt könnte über eine

Veränderung des postsynaptischen Systems erklärt werden. Es zeigte sich sowohl

eine striatale Abnahme der DA-D1- und -D2-Rezeptordichte als auch eine Abnahme

dopaminerger intrazellulärer Signalmoleküle. In der gleichen Studie wurde durch die

intraventrikuläre Infusion des Reelin-Antikörpers CR-50 bei naiven adulten Tieren

das Reelin-Signal unterdrückt. Auch diese Teilstudie hatte eine verminderte

lokomotorische Aktivität nach Methamphetamin-Injektionen zum Ergebnis. Offenbar

scheint Reelin also einen akuten Einfluss auf das dopaminerge System auszuüben.

Die Autoren spekulieren, dass das Reelin-Signaltransduktions-System die DA-

Rezeptoren direkt beeinflusst (ähnlich der Beeinflussung des NMDA-Rezeptors, (s.

4.2.1 und BEFFERT ET AL., 2005; CHEN ET AL., 2005) oder Interaktionen zwischen

dopaminergen Signalmolekülen wie DARPP32 und Reelin-Signalmolekülen wie Dab1

107

Diskussion

für die Beeinflussung des DA-Systems verantwortlich sind [MATZUSAKI ET AL. 2007].

In einer zweiten Studie wurde bei reeler-Mutanten der Effekt des NMDA-

Rezeptorantagonisten Dizocilpin auf die Lokomotion untersucht. Die Tiere zeigten

eine erhöhte Empfindlichkeit auf die Substanz-induzierte Hyperlokomotion. Die

Autoren vermuten, dass dieser Effekt weder auf pharmakokinetischen Unterschieden

noch auf Differenzen der Glu-Konzentration beruht, sondern eher mit einer

Hypofunktion der GABAergen Neurotransmission erklärt werden kann [CARBONI ET

AL., 2004].

Obwohl diese Studien nicht direkt auf das in dieser Arbeit vorliegende Modell

übertragen werden können, verdeutlichen sie doch die Rolle von Reelin als

pleiotropen Modulator, der direkt oder indirekt mit den dopaminergen, glutamtergen

und GABAergen Systemen interagiert. Im Rahmen des möglichen

Forschungsumfanges dieser Arbeit, scheint eine Erkenntnis zu sein, dass eine

temporär begrenzte Reelin-Verarmung im mPFC das neuroantomische bzw. das

neurophysiologische Substrat der lokomotorischen Aktivität nicht beeinflusst.

4.2.4 Angstverhalten: Der Elevated-Plus-Maze-Test

Das EPM-Paradigma ist ein gut untersuchtes und allgemein anerkanntes Modell zur

Erforschung von unkonditioniertem angstassoziierten Verhalten bei Nagern. PELLOW

und Mitarbeiter zeigten 1985 erstmalig anhand des EPM, das auf Studien von

MONTGOMERY basiert, dass Ratten erhöhte und offene Bereiche meiden und sich

bevorzugt in den geschützten Armen des Labyrinths aufhalten. Grundlegend für diese

Untersuchung ist der Konflikt des Tieres zwischen dem Explorationstrieb und der

natürlichen Angst vor ungeschützten und erhöhten Flächen. Demzufolge gilt der

EPM-Test als operationalisiertes Maß für die Ängstlichkeit bei Nagern

[MONTGOMERY, 1955; PELLOW ET AL., 1985].

In der vorliegenden Arbeit wurde aufgrund des unterschiedlichen

experimentellen Designs für die beiden Versuchstiergruppen (Abb. 2.3)

ausschließlich der Effekt einer pubertären Reelin-Verarmung bei jung-adulten Tieren

auf das Angstverhalten untersucht. Hierbei zeigte sich keine Veränderung der

allgemeinen lokomotorischen Aktivität im EPM, ein Befund der mit den Ergebnissen

des OF-Tests übereinstimmt (siehe 4.2.3). Im Weiteren hatte der mediale

präfrontocortikale Reelin-knockdown bei pubertären Tieren im Vergleich zu den

108

Diskussion

Kontrolltieren keinen Einfluss auf die Ängstlichkeit. Letzteres wird zudem durch die

Auswertung der Startle-Amplituden und der Aufenthaltsdauer im Zentrum der Open-

Field-Box bestätigt (siehe 4.2.1, 4.2.3) – auch hier zeigten sich keine Unterschiede

zwischen den Behandlungsgruppen. Vergleichbar mit der im EPM-Test untersuchten

Ängstlichkeit sind diese Parameter ebenfalls sensitive Marker für Angst und Furcht

[KOCH, 1999; DAENEN ET AL., 2001].

Weitere Studien, in denen das Angstverhalten von reeler-Mäusen untersucht

wurde, lieferten uneinheitliche Befunde. So konnten KRUEGER und Mitarbeiter

ebenfalls keine Unterschiede im Angstverhalten zwischen reeler- und Wildtyp-

Mäusen feststellen [KRUEGER ET AL., 2006], wohingegen TUETING und Kollegen ein

verstärktes neophobes Verhalten bei den reeler-Mäusen beobachteten [TUETING ET

AL. 1999]. Allerdings müssen hierbei die methodischen Unterschiede genauer

betrachtet werden. Während das neophobe Verhalten bei Mutanten während der

Pubertät auftrat (pd50), zeigten adulte Tiere (pd90) keine Anzeichen von

Angstverhalten. In der Tat stellt die Pubertät eine kritische Entwicklungsphase dar,

die durch hormonelle Veränderungen, und einen progressiven sowie regressiven

neuronalen Wandel, der beispielsweise durch Reifungsprozesse (z.B. Myelinisierung,

Ausbildung der Neurotransmittersysteme, Eliminierung von Synapsen)

charakterisiert ist [LEVITT, 2003; SISK & FOSTER, 2004; GRAAF-PETERS & HADDERS-

ALGRA, 2006]. Offensichtlich scheint der Verlust von Reelin in dieser sensiblen

Entwicklungsphase neophobes Verhalten nachhaltiger zu beeinflussen als zu

späteren Zeitpunkten der Ontogenese. Auch die Unterschiede dieser Arbeiten zu den

Ergebnissen der vorliegenden Studie sind durch die sich unterscheidenden

Versuchsansätze erklärbar. Es ist durchaus evident, dass ein über die Ontogenese

beständiges Reelin-Defizit von ungefähr 50% einen stärkeren Einfluss auf die

neuronalen Entwicklungsprozesse ausübt als der in der vorliegenden Studie

induzierte zehntägige Reelin-knockdown, der zudem topographisch auf den mPFC

begrenzt war.

Welche Rolle der mPFC bezüglich der emotionalen Kontrolle im Allgemeinen

und an neophobem Verhalten im Speziellen spielt ist noch nicht vollständig

verstanden. In einer immunhistologischen Studie konnte gezeigt werden, dass der

mPFC von Ratten, bei denen kurz zuvor das Angstverhalten im EPM ermittelt wurde,

eine verstärkte Immunoreaktivität aufwies [DUNCAN ET AL., 1996]. Zusätzlich wurde

deutlich, dass DA im mPFC als wichtiger Neurotransmitter im Kontext des

Angstverhaltens agiert [ESPEJO, 1997; MORROW ET AL., 2000] und medial

109

Diskussion

präfrontocortikale Läsionen anxiogenes Verhalten im EPM induzieren [HOLSON &

WALKER, 1986; JINKS & MCGREGOR, 1997]. Demgegenüber stehen Studien anderer

Arbeitsgruppen, in denen sowohl exzitotoxische Läsionen des mPFC [MAASWINKEL ET

AL., 1996; LACROIX ET AL., 2000B] oder lokale reversible Inaktivierungen durch den

direkten GABAA-Agonisten Muscimol [SHAH ET AL., 2004A] als auch intracerebrale

Injektionen des selektiven DA-D4-Antagonisten L-745,870 [SHAH ET AL., 2004B]

einen anxiolytischen Effekt in Bezug auf das untersuchte Verhalten im EPM-Test

auslösten. Weitere tierexperimentelle Studien zeigten, dass diverse Hirnregionen an

der Vermittlung von Angstverhalten beteiligt sind. So interagieren neben dem mPFC

verschiedene limbische Strukturen wie der Hypothalamus und die Amygdala und

auch der Hippocampus in einem neuronalen Netzwerk zur Modulation von Angst-

spezifischem Verhalten [GRAY & MCNAUGHTON, 1983; GRIJALVA ET AL. 1990; PESOLD &

TREIT 1992; INGLEFIELD ET AL., 1994].

Diese vielfältigen und teils widersprüchlichen Ergebnisse identifizieren zum

einen die funktionelle Rolle des mPFC bei der Vermittlung und Modulierung von

Angst und Furcht, verdeutlichen zum anderen aber auch, dass der Einfluss des mPFC

bezüglich der Ängstlichkeit im EPM noch nicht eindeutig geklärt werden konnte.

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann jedoch angenommen werden, dass das

Reelin-Signal im mPFC eine weniger essentielle Funktion bei der emotionellen

Kontrolle bzw. bei der Modulierung von Angst und Furcht einnimmt.

4.2.5 Motivation: Der Progressive-Ratio-Test

Die Bestimmung des Breakpoints im sogenannten PR-Test geht auf die Arbeiten von

HODOS zurück und kann als instrumenteller Verhaltenstest zur experimentellen

Erfassung motivationaler Zustände beim Versuchstier verstanden werden. Es handelt

sich hierbei um eine operante Belohnungskonditionierung, bei der der zur Erlangung

einer Futterbelohnung benötigte instrumentelle Aufwand permanent gesteigert wird,

bis das Tier nicht mehr adäquat reagiert. Da die Motivation eines Tieres einer

Kosten-Nutzen-Rechnung unterliegt, ist der Punkt an dem die Leistungsbereitschaft

zum Erhalt einer Belohnung „einbricht“ als Breakpoint charakterisiert. Somit dient

der Breakpoint sowohl als operationalisiertes Maß des Motivationsverhaltens als

auch als Maß zur Bewertung der Effektivität des eingesetzten Verstärkers bzw. der

Belohnung [HODOS, 1961; BARR & PHILLIPS, 1999; ELLEBBROEK & COOLS, 2000].

110

Diskussion

Wie auch bei der Untersuchung des Angstverhaltens wurde die Motivation im

PR-Test aufgrund des experimentellen Designs dieser Studie (Abb. 2.3)

ausschließlich bei jung-adulten Tieren bestimmt. Hinsichtlich der hohen

instrumentellen Anforderung in diesem Testparadigma war es zunächst wichtig

herauszustellen, dass zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen keine

motorischen Unterschiede bestanden, was durch den OF-Test verdeutlicht wurde

(siehe 4.2.3). Eine durch den pubertären Reelin-knockdown induzierte motorische

Beeinflussung des Testparadigmas kann dadurch ausgeschlossen werden. Im

weiteren Verlauf zeigten sich weder Gruppenunterschiede beim Lernen des

jeweiligen Kriteriums (200 Hebeldrücke im jeweiligen CRF- oder FR-Modus) noch in

Bezug auf die Gesamtmenge des konsumierten Futters bzw. bei der Futterpräferenz

der Tiere. Die untersuchten Ratten bevorzugten ausnahmslos die verwendeten

Kaseinpellets, was ein Zeichen für die hohe Belohnungsstärke der Pellets ist. Im

Rahmen des durchgeführten PR-Tests konnten keine Gruppenunterschiede in Bezug

auf den Breakpoint festgestellt werden; die pubertäre Reelin-Verarmung im mPFC

hatte demnach keinen Effekt auf die Motivation der Tiere für eine Futterbelohnung

Arbeit zu verrichten. Dass der gemessene Breakpoint auch wirklich als deutlicher

Abfall der Hebeldruckrate und damit als Motivationsverlust verstanden werden kann

und nicht eine allgemeine Erschöpfung der Tiere reflektiert, wird durch die Tatsache

verdeutlicht, dass die Anzahl der Hebeldrücke am letzten Trainingstag höher war als

die mittlere Anzahl der Hebeldrücke unter PR-Bedingungen.

Bedauerlicherweise liegen keine Arbeiten vor, in denen eine mögliche

funktionelle Rolle von Reelin im Kontext des Motivationsverhaltens untersucht

wurde. Zudem existieren nur wenige Studien über die neuronale modulatorische

Beteiligung verschiedener Hirnareale an der Vermittlung der Motivation im PR-Test

bei Verwendung einer Futterbelohnung. Mit Hilfe verschiedener Läsionsstudien

konnte jedoch die Beteiligung des NAc und des PPTg, aber auch eine Beteiligung

präfrontocortikaler Gebiete (insbesondere der orbitofrontalen) nachgewiesen werden

[ROBERTS, 1989; EAGLE ET AL., 1999; ALDERSON ET AL., 2002; PEARS ET AL., 2003]. Eine

Studie von FLORESCO und Mitarbeitern erwähnt zudem die Beteiligung des anterioren

cingulären Areals bei der Kosten-Nutzen-Rechnung der Ratte [FLORESCO & GHODS-

SHARIFI, 2007]. Demgegenüber ist das Belohnungssystem bzw. die allgemeine

Belohnungsantwort relativ gut erfasst. Wie bereits unter 1.5.5 erwähnt scheint vor

allem das cortiko-limbisch-striato-pallidale System von entscheidender Bedeutung

für die Umsetzung von Motivation in zielgerichtetes Verhalten zu sein [MOGENSON ET

111

Diskussion

AL., 1980; MOGENSON ET AL., 1993; AHN & PHILLIPS, 2002], wobei im Speziellen DA auf

Ebene des NAc eine modulatorische Rolle in der Vermittlung des Antriebs spielt

(präparatorische Phase). Offenbar nimmt der NAc eine entscheidende Position bei

der Kosten-Nutzung-Bewertung für das Erlangen der konstanten Belohnung im PR-

Test bzw. bei der Entscheidungsfindung für die Belohnungskosten ein [ABERMAN ET

AL., 1998; KOCH ET AL., 2000; SALAMONE ET AL., 2003]. Dies wird durch

pharmakologische Studien belegt, in denen konventionelle Neuroleptika wie

Racloprid, Haloperidol oder Chlorpromazin, die durch einen DA-D2-Antagonismus

charakterisiert sind, zu einer Abnahme des Breakpoints führen [CHEETA ET AL., 1995;

FERGUSON & PAULE, 1996; ABERMAN ET AL., 1998]. In diesem Zusammenhang ist es

interessant, dass das zur Behandlung der Negativsymptomatik der Schizophrenie

eingesetzte atypische Antipsychotikum Clozapin, welches einen vergleichsweise

schwachen DA-D2-Antagonismus aufweist, eine Steigerung der Motivation auslöst

[MOBINI ET AL., 2000; CILIA ET AL., 2001]. Im Vergleich zur präparatorischen Phase

wird das konsumatorische Element der Belohnungsantwort durch GABAerge,

glutamaterge und opioide Schaltkreise des Vorderhirns gesteuert [Berridge &

Cromwell, 1990; Doyle et al., 1993]. So zeigte sich beispielsweise, dass eine lokale

Injektion verschiedener μ-Opioid-Rezeptoragonisten in den NAc einen Anstieg des

Breakpoints zur Folge hat [ZHANG ET AL., 2003].

Zusammengefasst verdeutlichen die vorliegenden Ergebnisse des PR-Tests,

dass eine Störung des Reelin-Signals im mPFC während der Pubertät keinen Einfluss

auf das futterbelohnte Motivationsverhalten nimmt. Das Interesse an operanten

Belohnungsaufgaben bzw. an der Messung motivationaler Leistungen bei Ratten liegt

insbesondere darin begründet, dass sie eine Möglichkeit bieten, die

Negativsymptomatik der Schizophrenie oder Symptome depressiver Erkrankungen

im Tiermodell modulieren zu können [ELLENBROEK & COOLS, 2000; KOCH, 2006]. So

bietet der als Kontrolltest durchgeführte Futterpräferenztest die Möglichkeit, das

hedonische Verhalten der Ratte zu studieren, während die Messung des Breakpoints

eher die Avolition des Tieres bestimmt.

112

Diskussion

4.3 Zusammenfassung

Reelin ist ein Glykoprotein, das durch GABAerge Interneurone vornehmlich in die

extrazelluläre Matrix des Neocortex und Hippocampus sekretiert wird [PAPPAS ET AL.,

2001; MARTINEZ-CERDENO & CLASCA, 2002]. Neben der modulatorischen Rolle von

Reelin bei neuronalen Migrationsprozessen weisen verschiedene Studien darauf hin,

dass Störungen des Reelin-Signalsystems zusammen mit Dysbalancen des

GABAergen Phänotyps als Vulnerabilitäts-Faktoren für die Pathophysiolgie der

Schizophrenie verstanden werden können. Diese Vermutung beruht auf

verschiedenen Erkenntnissen. IMPAGNATIELLO und Mitarbeiter stellten in einer post

mortem Studie anhand von Gehirnen schizophrener Patienten sowohl einen Verlust

von Reelin (~50%) als auch GAD67 (~70%) fest [IMPAGNATIELLO ET AL., 1998]. Zudem

konnten bei heterozygoten reeler-Mäuse neuroanatomische Anomalien und

Verhaltensauffälligkeiten, wie sie auch bei der Schizophrenie auftreten, gefunden

werden. Diese sind (1) eine Verarmung der Reelin-mRNA und des Reelin-Proteins,

(2) eine Abnahme des cortikalen Volumens und des Neuropils, (3) eine daraus

resultierende erhöhte Neuronendichte bei konstanter Zellzahl und (4)

Verhaltensdefizite wie ein Defizit der sensomotorischen Informationsverarbeitung im

PPI-Paradigma [TUETING ET AL. 1999; LIU ET AL., 2001; SELEMON & GOLDMAN-RAKIC,

1999]. Neuere Befunde gehen zudem davon aus, dass eine Reelin-Verarmung nicht

die Folge eines genetischen Defekts ist (es zeigten sich keine Veränderungen des

Reelin-Gens), sondern eher durch epigenetische Faktoren hervorgerufen wird, die im

Speziellen über DNA-Regulationsmechanismen die Aktivität verschiedener Gene

regulieren und so u.a. eine verminderte Reelin- und GABAerge Expression induzieren

[TREMOLIZZO ET AL., 2002; AKAHANE ET AL.,2002; VELDIC ET AL., 2004; ABDOLMALEKY

ET AL., 2005; GRAYSON ET AL., 2005; VELDIC ET AL., 2005]. Darüber hinaus zeigte sich,

dass Reelin die Aktivität und Reifung des NMDA-Rezeptors moduliert und so direkt

physiologische Prozesse der Lern- und Gedächtnisleistungen kontrolliert [BEFFERT ET

AL., 2005; CHEN ET AL., 2005; SINAGRA ET AL., 2005; CAMPO ET AL., 2009]. Aufgrund

dieser Tatsachen ist es durchaus plausibel anzunehmen, dass ein verebbtes Reelin-

Signal, wie es bei schizophrenen Patienten auftritt, Störungen der

Dendritenmorphologie und kognitive Defizite hervorruft. Sowohl mit dem

tierexperimentellen Ansatz, in dessen Zentrum die heterozygote reeler-Mutante steht

als auch in begleitenden in vitro Untersuchungen konnten aufschlussreiche

Informationen über physiologische und verhaltensbiologische Funktionen des

113

Diskussion

Proteins erlangt, jedoch niemals der direkte bzw. akute Einfluss von Reelin

untersucht, werden. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit der

Effekt einer (zeitlich begrenzten) Reduktion der Reelin-Konzentration im mPFC der

Ratte in verschiedenen Tiermodellen der präklinischen Schizophrenieforschung

untersucht.

Das primäre Ziel dieser Arbeit, eine Methode für einen Reelin-knockdown zu

etablieren, wurde durch den Einsatz von Reelin-antisense-PTOs erreicht. Im

Speziellen handelte es sich hierbei um eine spezifische, zeitlich begrenzte Reelin-

Verarmung, die keine toxischen Nebeneffekte auf das neuronale Gewebe ausübt.

Zudem konnte gezeigt werden, dass eine mediale präfrontocortikale Reelin-

Verarmung zu Veränderungen auf der Verhaltensebene der Ratte, die beim

Menschen zum Symptombild der Schizophrenie gezählt werden, führte. Es lassen

sich folgende Ergebnisse zusammenfassen:

(1) Die Reelin-Verarmung während der Pubertät löste in jung-adulten Tieren

eine Beeinflussung der sensomotorischen Integrationsleistung aus, was sich in einem

PPI-Defizit manifestierte. Zusätzlich ergab sich eine Beeinflussung der kognitiven

Informationsverarbeitung – die behandelten Tiere waren durch eine

Verschlechterung der Kurzzeitgedächtnisleistung im T-Maze- und im OR-Test

charakterisiert. Demgegenüber konnte weder ein Effekt der Reelin-Verarmung auf

die lokomotorische Aktivität noch auf emotionale (EPM) oder motivationale (PR-

Test) Aspekte festgestellt werden.

(2) Die Untersuchung eines akuten Reelin-Verlusts bei adulten Tieren führte

ebenfalls zu Störungen der sensomotorischen Integrationsleistung im PPI-

Paradigma, ergab jedoch keine offensichtlichen Beeinträchtigungen der

lokomotorischen Aktivität oder kognitiven Leistung im T-Maze-Test.

Warum die Reelin-Verarmung im Allgemeinen zu Effekten auf der

Verhaltensebene geführt hat und hierbei im Speziellen Unterschiede zwischen der

pubertären und adulten Versuchsgruppe festgestellt wurden, ist schwer zu deuten.

Wie in der vorausgegangenen Diskussion bereits detailliert erläutert, ergeben sich

jedoch verschiedene hypothetische Interpretationsmöglichkeiten. Zum einen führt

das verminderte Reelin-Signal möglicherweise zu einer Beeinflussung von medial

präfrontocortikal lokalisierten Subtypen GABAerger Interneurone, indem es zu einer

funktionellen Störung des Reelin-NMDA-Rezeptor-Komplexes kommt [WEEBER ET

114

Diskussion

AL., 2002; BEFFERT ET AL., 2005; CHEN ET AL., 2005; CAMPO ET AL., 2009]. Die Folge ist

eine verminderte lokale GABA-Ausschüttung, die in einer Disinhibition der

glutamatergen Pyramidenzellen resultiert. Eine Enthemmung dieser Neurone und

eine daraus resultierende, exzessive Glu-Sekretion in cortikale und subcortikale

Bereiche des Gehirns, bietet eine mögliche Erklärung für die festgestellten

Verhaltensdefizite. Eine weitere Interpretationsmöglichkeit der vorliegenden Daten

beruht auf Studien, in denen die funktionelle Rolle von Reelin bei der Reifung von

Dendriten beschrieben wird [RODRIGUEZ ET AL., 2000; LIU ET AL., 2001; DONG ET AL.,

2003]. Eine Reduktion des Neuropils ist demnach auf eine Abnahme der lokalen

Reelin-Konzentration zurückzuführen bzw. auf eine verminderte Interaktion von

Reelin mit Integrinrezeptoren, die in einer verminderten Umsatzrate der Proteine des

Cytoskeletts resultiert. Veränderungen der Dendritenmorphologie führen zu

ausgeprägten Störungen der cortikalen Konnektivitäten und bedingen letztendlich

eine pathologische Dysbalance der Transmitterhomöostase. Eine weitere Studie

ergab zudem, dass Reelin direkt über den Signaltransduktionsweg oder indirekt über

intrazelluläre Interaktionen verschiedener Signalmoleküle (bspw. Dab1, DARPP32)

die lokale DA-Transmission beeinflusst [MATSUZAKI ET AL., 2007]. Inwiefern die

neurochemischen und neuroanatomischen Beeinträchtigungen den hier festgestellten

Verhaltensdefiziten zu Grunde liegen, kann im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht

abschließend geklärt werden. Die Ergebnisse verdeutlichen jedoch, dass ein lokaler

Reelin-knockdown im mPFC sowohl deutliche Störungen der sensomotorischen

Integrationsleistung als auch kognitive Defizite im Tiermodell auslöst. Da die

eingesetzten Modelle eine entscheidende Rolle in der präklinischen

Schizophrenieforschung spielen, sollte das Reelin-Molekül als pleiotroper Modulator

der EZM in zukünftigen Studien intensiver untersucht und stärker hinterfragt

werden.

Da sich die Reelin-Forschung noch in einem frühen Stadium befindet,

ergeben sich aus den Erkenntnissen der vorliegenden Arbeit neue Fragestellungen

und Problematiken. Um die Ergebnisse dieser Studie sowohl bestätigen als auch

weitreichender interpretieren und verstehen zu können, sind demnach weitere

Untersuchungen notwendig. Pharmakologische Studien könnten auf

Transmitterebene wichtige Erkenntnisse über die der Reelin-Verarmung zugrunde

liegenden Verhaltensdefizite erbringen. Zeigen Tiere mit einem Reelin-knockdown

ähnlich wie reeler-like-Mäuse eine erhöhte Sensitivität gegenüber Substanzen, die die

GABAerge Transmission beeinflussen (z.B. der GABAA-Rezeptorantagonist

115

Diskussion

116

Pikrotoxin) bzw. gegenüber NMDA-Rezeptorantagonisten wie PCP oder Dizocilpin

[Barr et al., 2007]? Sind die beobachteten Defizite auf der Verhaltensebene mit

Neuroleptika antagonisierbar? Und sind in diesem Kontext typische Antipsychotika,

wie der spezielle DA-D2/1-Rezeptorantagonist Haloperidol oder atypische

Antipsychotika wie Clozapin, das eher durch die Modulation des 5-HT-Systems

charakterisiert ist, wirkungsvoller? Neben den klassischen neuropharmakologischen

Untersuchungen ist es außerdem von grundlegender Bedeutung, weitere

Erkenntnisse zum Reelin-System auf zellulärer Ebene zu gewinnen. Wie interagiert

Reelin mit verschiedenen Neurotransmittersystemen? Wie ist die topographische

Verteilung der einzelnen Reelin-Rezeptoren und wie kann das Molekül speziell im

Kontext psychiatrischer Erkrankungen und kognitiver Funktionen betrachtet

werden? Schließlich wären auch detaillierte neurophysiologische sowie

morphologisch-anatomische Studien angebracht (z.B. Golgi-Färbung), die die Effekte

des Reelin-knockdowns auf zellulärer Ebene darstellen.

Mit dem kurzfristigen Ziel, Erkrankungen wie die Schizophrenie besser

verstehen zu können und der langfristigen Hoffnung, die biomedizinische Forschung

in Bezug auf die Pharmakotherapie voranzubringen, ist es also notwendig, das

Glykoprotein Reelin intensiver zu betrachten, um seine Rolle und Funktion sowohl

im gesunden als auch im erkrankten Organismus letztendlich besser verstehen und

bewerten zu können.

Literaturverzeichnis

5. Literaturverzeichnis

Abdolmaleky HM, Cheng KH, Russo A, Smith CL, Faraone SV, Wilcox M, Shafa R,

Glatt SJ, Nguyen G, Ponte JF, Thiagalingam S, Tsuang MT (2005)

Hypermethylation of the reelin (RELN) promoter in the brain of schizophrenic

patients: a preliminary report. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 134B:

60-66.

Abdolmaleky HM, Smith CL, Faraone SV, Shafa R, Stone W, Glatt SJ, Tsuang MT

(2004) Methylomics in psychiatry: Modulation of gene-environment

interactions may be through DNA methylation. Am J Med Genet B

Neuropsychiatr Genet 127B: 51-59.

Aberman JE, Ward SJ, Salamone JD (1998) Effects of dopamine antagonists and

accumbens dopamine depletions on time-constrained progressive-ratio

performance. Pharmacol Biochem Behav 61: 341-348.

Aboitiz F, Montiel J, Garcia RR (2005) Ancestry of the mammalian preplate and its

derivatives: evolutionary relicts or embryonic adaptations? Rev Neurosci 16:

359-376.

Aggleton JP, Brown MW (2005) Contrasting hippocampal and perirhinal cortex

function using immediate early gene imaging. Q J Exp Psychol B 58: 218-233.

Agrawal S (1999) Importance of nucleotide sequence and chemical modifications of

antisense oligonucleotides. Biochim Biophys Acta 1489: 53-68.

Ahn S, Phillips AG (2002) Modulation by central and basolateral amygdalar nuclei of

dopaminergic correlates of feeding to satiety in the rat nucleus accumbens and

medial prefrontal cortex. J Neurosci 22: 10958-10965.

Akahane A, Kunugi H, Tanaka H, Nanko S (2002) Association analysis of

polymorphic CGG repeat in 5' UTR of the reelin and VLDLR genes with

schizophrenia. Schizophr Res 58: 37-41.

117


Akbarian S, Kim JJ, Potkin SG, Hagman JO, Tafazzoli A, Bunney WE, Jr., Jones EG

(1995) Gene expression for glutamic acid decarboxylase is reduced without

loss of neurons in prefrontal cortex of schizophrenics. Arch Gen Psychiatry 52:

258-266.

Alderson HL, Brown VJ, Latimer MP, Brasted PJ, Robertson AH, Winn P (2002) The

effect of excitotoxic lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus on

performance of a progressive ratio schedule of reinforcement. Neuroscience

112: 417-425.

Andreasen NC (1997) The evolving concept of schizophrenia: from Kraepelin to the

present and future. Schizophr Res 28: 105-109.

Andreasen NC (2000) Schizophrenia: the fundamental questions. Brain Res Brain

Res Rev 31: 106-112.

Angevine JB, Jr., Sidman RL (1961) Autoradiographic study of cell migration during

histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature 192: 766-768.

Arnaud L, Ballif BA, Forster E, Cooper JA (2003) Fyn tyrosine kinase is a critical

regulator of disabled-1 during brain development. Curr Biol 13: 9-17.

Assadi AH, Zhang G, Beffert U, McNeil RS, Renfro AL, Niu S, Quattrocchi CC,

Antalffy BA, Sheldon M, Armstrong DD, Wynshaw-Boris A, Herz J,

D'Arcangelo G, Clark GD (2003) Interaction of reelin signaling and Lis1 in

brain development. Nat Genet 35: 270-276.

Azmitia EC, Whitaker-Azmitia PM (1995) Anatomy, cell biology, and plasticity of the

serotonergic system. In: Bloom FE and Kupfer DJ (Eds.) Psychopharmacology:

The fourth generation of progress. Raven Press Ltd., New York, S.443-449.

Bakshi VP, Geyer MA (1998) Multiple limbic regions mediate the disruption of

prepulse inhibition produced in rats by the noncompetitive NMDA antagonist

dizocilpine. J Neurosci 18: 8394-8401.

Ballif BA, Arnaud L, Arthur WT, Guris D, Imamoto A, Cooper JA (2004) Activation of

a Dab1/CrkL/C3G/Rap1 pathway in Reelin-stimulated neurons. Curr Biol 14:

606-610.

118


Barr AM, Fish KN, Markou A (2007) The reelin receptors VLDLR and ApoER2

regulate sensorimotor gating in mice. Neuropharmacology 52: 1114-1123.

Barr AM, Fish KN, Markou A, Honer WG (2008) Heterozygous reeler mice exhibit

alterations in sensorimotor gating but not presynaptic proteins. Eur J

Neurosci 27: 2568-2574.

Barr AM, Phillips AG (1999) Withdrawal following repeated exposure to d-

amphetamine decreases responding for a sucrose solution as measured by a

progressive ratio schedule of reinforcement. Psychopharmacology (Berl) 141:

99-106.

Bayer TA, Falkai P, Maier W (1999) Genetic and non-genetic vulnerability factors in

schizophrenia: the basis of the "two hit hypothesis". J Psychiatr Res 33: 543-

548.

Beffert U, Morfini G, Bock HH, Reyna H, Brady ST, Herz J (2002) Reelin-mediated

signaling locally regulates protein kinase B/Akt and glycogen synthase kinase

3beta. J Biol Chem 277: 49958-49964.

Beffert U, Weeber EJ, Durudas A, Qiu S, Masiulis I, Sweatt JD, Li WP, Adelmann G,

Frotscher M, Hammer RE, Herz J (2005) Modulation of synaptic plasticity

and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor

Apoer2. Neuron 47: 567-579.

Benes FM, Berretta S (2001) GABAergic interneurons: implications for

understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology

25: 1-27.

Benes FM, Taylor JB, Cunningham MC (2000) Convergence and plasticity of

monoaminergic systems in the medial prefrontal cortex during the postnatal

period: implications for the development of psychopathology. Cereb Cortex 10:

1014-1027.

Berridge KC, Cromwell HC (1990) Motivational-sensorimotor interaction controls

aphagia and exaggerated treading after striatopallidal lesions. Behav Neurosci

104: 778-795.

119


Berry M, Rogers AW (1965) The migration of neuroblasts in the developing cerebral

cortex. J Anat 99: 691-709.

Billingsley ML, Kincaid RL (1997) Regulated phosphorylation and dephosphorylation

of tau protein: effects on microtubule interaction, intracellular trafficking and

neurodegeneration. Biochem J 323 ( Pt 3): 577-591.

Black JE, Kodish IM, Grossman AW, Klintsova AY, Orlovskaya D, Vostrikov V,

Uranova N, Greenough WT (2004) Pathology of layer V pyramidal neurons in

the prefrontal cortex of patients with schizophrenia. Am J Psychiatry 161: 742-

744.

Bock HH, Herz J (2003) Reelin activates SRC family tyrosine kinases in neurons.

Curr Biol 13: 18-26.

Bogerts B (1999) The neuropathology of schizophrenic diseases: historical aspects

and present knowledge. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 249 Suppl 4: 2-13.

Botella-Lopez A, Burgaya F, Gavin R, Garcia-Ayllon MS, Gomez-Tortosa E, Pena-

Casanova J, Urena JM, Del Rio JA, Blesa R, Soriano E, Saez-Valero J (2006)

Reelin expression and glycosylation patterns are altered in Alzheimer's

disease. Proc Natl Acad Sci USA 103: 5573-5578.

Braff DL, Geyer MA, Swerdlow NR (2001) Human studies of prepulse inhibition of

startle: normal subjects, patient groups, and pharmacological studies.

Psychopharmacology (Berl) 156: 234-258.

Breier A, Buchanan RW, Elkashef A, Munson RC, Kirkpatrick B, Gellad F (1992)

Brain morphology and schizophrenia. A magnetic resonance imaging study of

limbic, prefrontal cortex, and caudate structures. Arch Gen Psychiatry 49: 921-

926.

Brigman JL, Padukiewicz KE, Sutherland ML, Rothblat LA (2006) Executive

functions in the heterozygous reeler mouse model of schizophrenia. Behav

Neurosci 120: 984-988.

120


Broersen LM, Feldon J, Weiner I (1999) Dissociative effects of apomorphine

infusions into the medial prefrontal cortex of rats on latent inhibition,

prepulse inhibition and amphetamine-induced locomotion. Neuroscience 94:

39-46.

Brown DA, Kang SH, Gryaznov SM, DeDionisio L, Heidenreich O, Sullivan S, Xu X,

Nerenberg MI (1994) Effect of phosphorothioate modification of

oligodeoxynucleotides on specific protein binding. J Biol Chem 269: 26801-

26805.

Brozoski TJ, Brown RM, Rosvold HE, Goldman PS (1979) Cognitive deficit caused by

regional depletion of dopamine in prefrontal cortex of rhesus monkey. Science

205: 929-932.

Bubser M, Koch M (1994) Prepulse inhibition of the acoustic startle response of rats

is reduced by 6-hydroxydopamine lesions of the medial prefrontal cortex.


Budson AE (2009) Understanding memory dysfunction. Neurologist 15: 71-79.

Bullock AE, Slobe BS, Vazquez V, Collins AC (1997) Inbred mouse strains differ in the

regulation of startle and prepulse inhibition of the startle response. Behav

Neurosci 111: 1353-1360.

Callicott JH, Mattay VS, Verchinski BA, Marenco S, Egan MF, Weinberger DR (2003)

Complexity of prefrontal cortical dysfunction in schizophrenia: more than up

or down. Am J Psychiatry 160: 2209-2215.

Campbell BM, Merchant KM (2003) Serotonin 2C receptors within the basolateral

amygdala induce acute fear-like responses in an open-field environment. Brain

Res 993: 1-9.

Campo CG, Sinagra M, Verrier D, Manzoni OJ, Chavis P (2009) Reelin secreted by

GABAergic neurons regulates glutamate receptor homeostasis. PLoS ONE 4:

e5505.

121


Carboni E, Imperato A, Perezzani L, Di Chiara G (1989) Amphetamine, cocaine,

phencyclidine and nomifensine increase extracellular dopamine

concentrations preferentially in the nucleus accumbens of freely moving rats.

Neuroscience 28: 653-661.

Carboni G, Tueting P, Tremolizzo L, Sugaya I, Davis J, Costa E, Guidotti A (2004)

Enhanced dizocilpine efficacy in heterozygous reeler mice relates to GABA

turnover downregulation. Neuropharmacology 46: 1070-1081.

Carlsson A, Waters N, Carlsson ML (1999) Neurotransmitter interactions in

schizophrenia-therapeutic implications. Biol Psychiatry 46: 1388-1395.

Carr DB, Sesack SR (2000) Projections from the rat prefrontal cortex to the ventral

tegmental area: target specificity in the synaptic associations with

mesoaccumbens and mesocortical neurons. J Neurosci 20: 3864-3873.

Chan JH, Lim S, Wong WS (2006) Antisense oligonucleotides: from design to

therapeutic application. Clin Exp Pharmacol Physiol 33: 533-540.

Chang BS, Duzcan F, Kim S, Cinbis M, Aggarwal A, Apse KA, Ozdel O, Atmaca M,

Zencir S, Bagci H, Walsh CA (2007) The role of RELN in lissencephaly and

neuropsychiatric disease. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 144B: 58-

63.

Cheeta S, Brooks S, Willner P (1995) Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3

antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav

Pharmacol 6: 127-132.

Chen Y, Beffert U, Ertunc M, Tang TS, Kavalali ET, Bezprozvanny I, Herz J (2005)

Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J Neurosci 25:

8209-8216.

Chessell IP, Francis PT, Pangalos MN, Pearson RC, Bowen DM (1993) Localisation of

muscarinic (m1) and other neurotransmitter receptors on corticofugal-

projecting pyramidal neurones. Brain Res 632: 86-94.

122


Cilia J, Piper DC, Upton N, Hagan JJ (2001) Clozapine enhances breakpoint in

common marmosets responding on a progressive ratio schedule.


Colón-Cesario WI, Martínez-Montemayor MM, Morales S, Félix J, Cruz J, Adorno M,

Pereira L, Colón N, Maldonado-Vlaar CS, Peña de Ortiz S (2008) Knockdown

of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination

learning and memory. Learn Mem 13:734-44.

Compte A, Brunel N, Goldman-Rakic PS, Wang XJ (2000) Synaptic mechanisms and

network dynamics underlying spatial working memory in a cortical network

model. Cereb Cortex 10: 910-923.

Conde F, Maire-Lepoivre E, Audinat E, Crepel F (1995) Afferent connections of the

medial frontal cortex of the rat. II. Cortical and subcortical afferents. J Comp

Neurol 352: 567-593.

Coppelli FM, Grandis JR (2005) Oligonucleotides as anticancer agents: from the

benchside to the clinic and beyond. Curr Pharm Des 11: 2825-2840.

Cornelio AM, Nunes-de-Souza RL (2007) Anxiogenic-like effects of mCPP

microinfusions into the amygdala (but not dorsal or ventral hippocampus) in

mice exposed to elevated plus-maze. Behav Brain Res 178: 82-89.

Costa E, Davis J, Grayson DR, Guidotti A, Pappas GD, Pesold C (2001) Dendritic

spine hypoplasticity and downregulation of reelin and GABAergic tone in

schizophrenia vulnerability. Neurobiol Dis 8: 723-742.

Costa E, Grayson DR, Guidotti A (2003a) Epigenetic downregulation of GABAergic

function in schizophrenia: potential for pharmacological intervention? Mol

Interv 3: 220-229.

Costa E, Grayson DR, Mitchell CP, Tremolizzo L, Veldic M, Guidotti A (2003b)

GABAergic cortical neuron chromatin as a putative target to treat

schizophrenia vulnerability. Crit Rev Neurobiol 15: 121-142.

123


Costa E, Chen Y, Dong E, Grayson DR, Guidotti A, Veldic M (2008) Reelin

downregulation as a prospective treatment target for GABAergic dysfunction

in schizophrenia. In: Fatemi SH (Ed.) Reelin Glycoprotein – Structure, biology

and roles in health and disease. Springer Science+Business Media, New York,

S.341-364.

Daenen EW, Van Der Heyden JA, Kruse CG, Wolterink G, Van Ree JM (2001)

Adaptation and habituation to an open field and responses to various stressful

events in animals with neonatal lesions in the amygdala or ventral

hippocampus. Brain Res 918: 153-165.

Dalley JW, Cardinal RN, Robbins TW (2004) Prefrontal executive and cognitive

functions in rodents: neural and neurochemical substrates. Neurosci Biobehav

Rev 28: 771-784.

D'Arcangelo G (2005) The reeler mouse: anatomy of a mutant. Int Rev Neurobiol 71:

383-417.

D'Arcangelo G, Curran T (1998) Reeler: new tales on an old mutant mouse. Bioessays

20: 235-244.

D'Arcangelo G, Homayouni R, Keshvara L, Rice DS, Sheldon M, Curran T (1999)

Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron 24: 471-479.

D'Arcangelo G, Miao GG, Chen SC, Soares HD, Morgan JI, Curran T (1995) A protein

related to extracellular matrix proteins deleted in the mouse mutant reeler.

Nature 374: 719-723.

Davis M, Falls WA, Campeau S, Kim M (1993) Fear-potentiated startle: a neural and

pharmacological analysis. Behav Brain Res 58: 175-198.

De Bellis MD, Keshavan MS, Beers SR, Hall J, Frustaci K, Masalehdan A, Noll J,

Boring AM (2001) Sex differences in brain maturation during childhood and

adolescence. Cereb Cortex 11: 552-557.

De Bergeyck V, Naerhuyzen B, Goffinet AM, Lambert de Rouvroit C (1998) A panel of

monoclonal antibodies against reelin, the extracellular matrix protein

defective in reeler mutant mice. J Neurosci Meth 82: 17-24.

124


Dean NM, Bennett CF (2003) Antisense oligonucleotide-based therapeutics for

cancer. Oncogene 22: 9087-9096.

Derer P, Derer M, Goffinet A (2001) Axonal secretion of Reelin by Cajal-Retzius cells:

evidence from comparison of normal and Reln(Orl) mutant mice. J Comp

Neurol 440: 136-143.

DeSilva U, D'Arcangelo G, Braden VV, Chen J, Miao GG, Curran T, Green ED (1997)

The human reelin gene: isolation, sequencing, and mapping on chromosome 7.

Genome Res 7: 157-164.

Deuchars J, West DC, Thomson AM (1994) Relationships between morphology and

physiology of pyramid-pyramid single axon connections in rat neocortex in

vitro. J Physiol 478 Pt 3: 423-435.

Di Scala G, Meneses S, Brailowsky S (1990) Chronic infusions of GABA into the

medial frontal cortex of the rat induce a reversible delayed spatial alternation

deficit. Behav Brain Res 40: 81-84.

Dijk SN, Francis PT, Stratmann GC, Bowen DM (1995) Cholinomimetics increase

glutamate outflow via an action on the corticostriatal pathway: implications

for Alzheimer's disease. J Neurochem 65: 2165-2169.

Dong E, Caruncho H, Liu WS, Smalheiser NR, Grayson DR, Costa E, Guidotti A

(2003) A reelin-integrin receptor interaction regulates Arc mRNA translation

in synaptoneurosomes. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5479-5484.

Dong E, Guidotti A, Grayson DR, Costa E (2007) Histone hyperacetylation induces

demethylation of reelin and 67-kDa glutamic acid decarboxylase promoters.

Proc Natl Acad Sci USA 104: 4676-4681.

Doyle TG, Berridge KC, Gosnell BA (1993) Morphine enhances hedonic taste

palatability in rats. Pharmacol Biochem Behav 46: 745-749.

Dulabon L, Olson EC, Taglienti MG, Eisenhuth S, McGrath B, Walsh CA, Kreidberg

JA, Anton ES (2000) Reelin binds alpha3beta1 integrin and inhibits neuronal

migration. Neuron 27: 33-44.

125


Duncan GE, Knapp DJ, Breese GR (1996) Neuroanatomical characterization of Fos

induction in rat behavioral models of anxiety. Brain Res 713: 79-91.

Duncan GE, Sheitman BB, Lieberman JA (1999) An integrated view of

pathophysiological models of schizophrenia. Brain Res Brain Res Rev 29: 250-

264.

Dunn E, Fritschy JM, Carter DB, Merchant KM (1996) Differential distribution of

gamma-aminobutyric acidA receptor subunit (alpha 1, alpha 2, alpha 3, alpha

5 and beta 2 + 3) immunoreactivity in the medial prefrontal cortex of the rat.

Neurosci Lett 210: 213-217.

Eagle DM, Humby T, Dunnett SB, Robbins TW (1999) Effects of regional striatal

lesions on motor, motivational, and executive aspects of progressive-ratio

performance in rats. Behav Neurosci 113: 718-731.

Eastwood SL, Harrison PJ (2006) Cellular basis of reduced cortical reelin expression

in schizophrenia. Am J Psychiatry 163: 540-542.

Ellenbroek BA, Budde S, Cools AR (1996) Prepulse inhibition and latent inhibition:

the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience 75: 535-

542.

Ellenbroek BA, Cools AR (2000) Animal models for the negative symptoms of

schizophrenia. Behav Pharmacol 11: 223-233.

Ennaceur A, Neave N, Aggleton JP (1997) Spontaneous object recognition and object

location memory in rats: the effects of lesions in the cingulate cortices, the

medial prefrontal cortex, the cingulum bundle and the fornix. Exp Brain Res

113: 509-519.

Erbel-Sieler C, Dudley C, Zhou Y, Wu X, Estill SJ, Han T, Diaz-Arrastia R, Brunskill

EW, Potter SS, McKnight SL (2004) Behavioral and regulatory abnormalities

in mice deficient in the NPAS1 and NPAS3 transcription factors. Proc Natl

Acad Sci USA 101: 13648-13653.

126


Espejo EF (1997) Selective dopamine depletion within the medial prefrontal cortex

induces anxiogenic-like effects in rats placed on the elevated plus maze. Brain

Res 762: 281-284.

Everts HG, Koolhaas JM (1997) Lateral septal vasopressin in rats: role in social and

object recognition? Brain Res 760: 1-7.

Falconer DS (1951) Two new mutants, Trembler and Reeler, with neurological actions

in the house mouse (mus musculucs L.). J Gen 50: 192-200.

Fatemi SH, Earle JA, McMenomy T (2000) Reduction in Reelin immunoreactivity in

hippocampus of subjects with schizophrenia, bipolar disorder and major

depression. Mol Psychiatry 5: 654-63, 571.

Fatemi SH, Kroll JL, Stary JM (2001) Altered levels of Reelin and its isoforms in

schizophrenia and mood disorders. Neuroreport 12: 3209-3215.

Fatemi SH, Stary JM, Earle JA, Araghi-Niknam M, Eagan E (2005) GABAergic

dysfunction in schizophrenia and mood disorders as reflected by decreased

levels of glutamic acid decarboxylase 65 and 67 kDa and Reelin proteins in

cerebellum. Schizophr Res 72: 109-122.

Fatemi SH, Stary JM, Egan EA (2002) Reduced blood levels of reelin as a

vulnerability factor in pathophysiology of autistic disorder. Cell Mol Neurobiol

22: 139-152.

Feng L, Cooper JA (2009) Dual functions of Dab1 during brain development. Mol

Cell Biol 29: 324-332.

Ferguson SA, Paule MG (1996) Effects of chlorpromazine and diazepam on time

estimation behavior and motivation in rats. Pharmacol Biochem Behav 53:

115-122.

File SE, Gonzalez LE, Andrews N (1996) Comparative study of pre- and postsynaptic

5-HT1A receptor modulation of anxiety in two ethological animal tests. J

Neurosci 16: 4810-4815.

Floresco SB, Ghods-Sharifi S (2007) Amygdala-prefrontal cortical circuitry regulates

effort-based decision making. Cereb Cortex 17: 251-260.

127


Frotscher M (1998) Cajal-Retzius cells, Reelin, and the formation of layers. Curr Opin

Neurobiol 8: 570-575.

Frotscher M, Chai X, Bock HH, Haas CA, Forster E, Zhao S (2009) Role of Reelin in

the development and maintenance of cortical lamination. J Neural Transm.

Epub.

Fuster JM (2001) The prefrontal cortex--an update: time is of the essence. Neuron

30: 319-333.

Fuster JM (2002) Frontal lobe and cognitive development. J Neurocytol 31: 373-385.

Geyer MA, Krebs-Thomson K, Braff DL, Swerdlow NR (2001) Pharmacological

studies of prepulse inhibition models of sensorimotor gating deficits in

schizophrenia: a decade in review. Psychopharmacology (Berl) 156: 117-154.

Geyer MA, McIlwain KL, Paylor R (2002) Mouse genetic models for prepulse

inhibition: an early review. Mol Psychiatry 7: 1039-1053.

Glantz LA, Lewis DA (2001) Dendritic spine density in schizophrenia and depression.

Arch Gen Psychiatry 58: 203.

Goldberg TE, Gold JM (1995) Neurocognitive deficits in schizophrenia. In: Hirsch

SR, Weinberger DR (Eds.) Schizophrenia. Blackwell Science, S.146-162.

Goldman-Rakic PS (1994) Working memory dysfunction in schizophrenia. J

Neuropsychiatry Clin Neurosci 6: 348-357.

Goldman-Rakic PS (1995) Cellular basis of working memory. Neuron 14: 477-485.

Graaf-Peters VB, Hadders-Algra M (2006) Ontogeny of the human central nervous

system: what is happening when? Early Hum Dev 82: 257-266.

Gray JA, McNaughton N (1983) Comparison between the behavioural effects of septal

and hippocampal lesions: a review. Neurosci Biobehav Rev 7: 119-188.

Grayson DR, Jia X, Chen Y, Sharma RP, Mitchell CP, Guidotti A, Costa E (2005)

Reelin promoter hypermethylation in schizophrenia. Proc Natl Acad Sci USA

102: 9341-9346.

128


Grijalva CV, Levin ED, Morgan M, Roland B, Martin FC (1990) Contrasting effects of

centromedial and basolateral amygdaloid lesions on stress-related responses

in the rat. Physiol Behav 48: 495-500.

Guidotti A, Auta J, Davis JM, Dong E, Grayson DR, Veldic M, Zhang X, Costa E

(2005) GABAergic dysfunction in schizophrenia: new treatment strategies on

the horizon. Psychopharmacology (Berl) 180: 191-205.

Guidotti A, Auta J, Davis JM, Giorgi-Gerevini V, Dwivedi Y, Grayson DR,

Impagnatiello F, Pandey G, Pesold C, Sharma R, Uzunov D, Costa E (2000a)

Decrease in reelin and glutamic acid decarboxylase67 (GAD67) expression in

schizophrenia and bipolar disorder: a postmortem brain study. Arch Gen

Psychiatry 57: 1061-1069.

Guidotti A, Pesold C, Costa E (2000b) New neurochemical markers for psychosis: a

working hypothesis of their operation. Neurochem Res 25: 1207-1218.

Hamburgh M (1963) Analysis of the postnatal developmental effects of reeler, a

neurological mutation in mice. A study in developmental genetics. Dev Biol 19:

165-185.

Hannesson DK, Howland JG, Phillips AG (2004a) Interaction between perirhinal and

medial prefrontal cortex is required for temporal order but not recognition

memory for objects in rats. J Neurosci 24: 4596-4604.

Hannesson DK, Vacca G, Howland JG, Phillips AG (2004b) Medial prefrontal cortex

is involved in spatial temporal order memory but not spatial recognition

memory in tests relying on spontaneous exploration in rats. Behav Brain Res

153: 273-285.

Harrison PJ (1999) The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data

and their interpretation. Brain 122: 593-624.

Herz J, Chen Y (2006) Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat Rev

Neurosci 7: 850-859.

129


Hiesberger T, Trommsdorff M, Howell BW, Goffinet A, Mumby MC, Cooper JA, Herz

J (1999) Direct binding of Reelin to VLDL receptor and ApoE receptor 2

induces tyrosine phosphorylation of disabled-1 and modulates tau

phosphorylation. Neuron 24: 481-489.

Hironaka N, Tanaka K, Izaki Y, Hori K, Nomura M (2001) Memory-related

acetylcholine efflux from rat prefrontal cortex and hippocampus: a

microdialysis study. Brain Res 901: 143-150.

Ho YJ, Eichendorff J, Schwarting RK (2002) Individual response profiles of male

Wistar rats in animal models for anxiety and depression. Behav Brain Res 136:

1-12.

Hodos W (1961) Progressive ratio as a measure of reward strength. Science 134: 943-

944.

Holdstock JS (2005) The role of the human medial temporal lobe in object

recognition and object discrimination. Q J Exp Psychol B 58: 326-339.

Holson RR, Walker C (1986) Mesial prefrontal cortical lesions and timidity in rats. II.

Reactivity to novel stimuli. Physiol Behav 37: 231-238.

Homayoun H, Moghaddam B (2007) NMDA receptor hypofunction produces

opposite effects on prefrontal cortex interneurons and pyramidal neurons. J

Neurosci 27: 11496-11500.

Hong SE, Shugart YY, Huang DT, Shahwan SA, Grant PE, Hourihane JO, Martin ND,

Walsh CA (2000) Autosomal recessive lissencephaly with cerebellar

hypoplasia is associated with human RELN mutations. Nat Genet 26: 93-96.

Howell BW, Hawkes R, Soriano P, Cooper JA (1997) Neuronal position in the

developing brain is regulated by mouse disabled-1. Nature 389: 733-737.

Impagnatiello F, Guidotti AR, Pesold C, Dwivedi Y, Caruncho H, Pisu MG, Uzunov

DP, Smalheiser NR, Davis JM, Pandey GN, Pappas GD, Tueting P, Sharma RP,

Costa E (1998) A decrease of reelin expression as a putative vulnerability

factor in schizophrenia. Proc Natl Acad Sci USA 95: 15718-15723.

130


Inglefield JR, Schwarzkopf SB, Kellogg CK (1994) Alterations in behavioral responses

to stressors following excitotoxin lesions of dorsomedial hypothalamic regions.

Brain Res 633: 151-161

Japha K, Koch M (1999) Picrotoxin in the medial prefrontal cortex impairs

sensorimotor gating in rats: reversal by haloperidol. Psychopharmacology

(Berl) 144: 347-354.

Jentsch JD, Roth RH (1999) The neuropsychopharmacology of phencyclidine: from

NMDA receptor hypofunction to the dopamine hypothesis of schizophrenia.

Neuropsychopharmacology 20: 201-225.

Jinks AL, McGregor IS (1997) Modulation of anxiety-related behaviours following

lesions of the prelimbic or infralimbic cortex in the rat. Brain Res 772: 181-190.

Jossin Y, Gui L, Goffinet AM (2007) Processing of Reelin by embryonic neurons is

important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J

Neurosci 27: 4243-4252.

Jossin Y, Ignatova N, Hiesberger T, Herz J, Lambert dR, Goffinet AM (2004) The

central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is

critical to its function during cortical plate development. J Neurosci 24: 514-

521.

Jossin Y (2008) Chemistry of Reelin. In: Fatemi SH (Ed.) Reelin Glycoprotein –

Structure, biology and roles in health and disease. Springer Science+Business

Media, New York, S.37-47.

Juliano R, Alam MR, Dixit V, Kang H (2008) Mechanisms and strategies for effective

delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res 36: 4158-

4171.

Kawaguchi Y, Kondo S (2002) Parvalbumin, somatostatin and cholecystokinin as

chemical markers for specific GABAergic interneuron types in the rat frontal

cortex. J Neurocytol 31: 277-287.

Keshavan MS (1999) Development, disease and degeneration in schizophrenia: a

unitary pathophysiological model. J Psychiatr Res 33: 513-521.

131


Knable MB, Barci BM, Webster MJ, Meador-Woodruff J, Torrey EF (2004)

Molecular abnormalities of the hippocampus in severe psychiatric illness:

postmortem findings from the Stanley Neuropathology Consortium. Mol

Psychiatry 9: 609-20, 544.

Koch M (2006) Animal models of schizophrenia. In: M Koch (Ed.) Animal Models of

Neuropsychiatric Diseases. Imperial College Press, London. S.337-402.

Koch M, Pilz PKD, Schnitzler HU (1998) Mechanismen sensomotorischer Integration

bei Säugetieren: Die Schreckreaktion der Ratte als Modell. Neuroforum 4:

260-266.

Koch M, Fendt M (2003) Startle response modulation as a behavioral tool in

neuropharmacology. Curr Neuropharamacol 1: 175-185.

Koch M (1999) The neurobiology of startle. Prog Neurobiol 59: 107-128.

Koch M, Bubser M (1994) Deficient sensorimotor gating after 6-hydroxydopamine

lesion of the rat medial prefrontal cortex is reversed by haloperidol. Eur J

Neurosci 6: 1837-1845.

Koch M, Schmid A, Schnitzler HU (2000) Role of muscles accumbens dopamine D1

and D2 receptors in instrumental and Pavlovian paradigms of conditioned

reward. Psychopharmacology (Berl) 152: 67-73.

Köhler C, Schwarcz R (1983) Comparison of ibotenate and kainate neurotoxicity in

rat brain: a histological study. Neuroscience 8: 819-835.

Kohno T, Nakano Y, Kitoh N, Yagi H, Kato K, Baba A, Hattori M (2009a) C-terminal

region-dependent change of antibody-binding to the Eighth Reelin repeat

reflects the signaling activity of Reelin. J Neurosci Res

Kohno S, Kohno T, Nakano Y, Suzuki K, Ishii M, Tagami H, Baba A, Hattori M

(2009b) Mechanism and significance of specific proteolytic cleavage of Reelin.

Biochem Biophys Res Commun 380: 93-97.

Kostovic I, Rakic P (1980) Cytology and time of origin of interstitial neurons in the

white matter in infant and adult human and monkey telencephalon. J

Neurocytol 9: 219-242.

132


Krueger DD, Howell JL, Hebert BF, Olausson P, Taylor JR, Nairn AC (2006)

Assessment of cognitive function in the heterozygous reeler mouse.


Kubo K, Mikoshiba K, Nakajima K (2002) Secreted Reelin molecules form

homodimers. Neurosci Res 43: 381-388.

Kuroda M, Yokofujita J, Murakami K (1998) An ultrastructural study of the neural

circuit between the prefrontal cortex and the mediodorsal nucleus of the

thalamus. Prog Neurobiol 54: 417-458.

Kurreck J (2003) Antisense technologies. Improvement through novel chemical

modifications. Eur J Biochem 270: 1628-1644.

Lacor PN, Grayson DR, Auta J, Sugaya I, Costa E, Guidotti A (2000) Reelin secretion

from glutamatergic neurons in culture is independent from neurotransmitter

regulation. Proc Natl Acad Sci USA 97: 3556-3561.

Lacroix L, Broersen LM, Feldon J, Weiner I (2000a) Effects of local infusions of

dopaminergic drugs into the medial prefrontal cortex of rats on latent

inhibition, prepulse inhibition and amphetamine induced activity. Behav Brain

Res 107: 111-121.

Lacroix L, Spinelli S, White W, Feldon J (2000b) The effects of ibotenic acid lesions

of the medial and lateral prefrontal cortex on latent inhibition, prepulse

inhibition and amphetamine-induced hyperlocomotion. Neuroscience 97: 459-

468.

Lambert de Rouvroit C, Bernier B, Royaux I, de Bergeyck V, Goffinet AM (1999a)

Evolutionarily conserved, alternative splicing of reelin during brain

development. Exp Neurol 156: 229-238.

Lambert de Rouvroit C, de Bergeyck V, Cortvrindt C, Bar I, Eeckhout Y, Goffinet AM

(1999b) Reelin, the extracellular matrix protein deficient in reeler mutant

mice, is processed by a metalloproteinase. Exp Neurol 156: 214-217.

Lambert de Rouvroit, Goffinet AM (1998) The reeler mouse as a model of brain

development. Adv Anat Embryol Cell Biol 150: 1-106.

133


Leslie RA, Hunter AJ, Robertson HA (1999) Antisense oligonucleotide regulation of

gene expression in the CNS: an overview. In: Leslie RA, Hunter AJ, Robertson

HA (Eds.) Antisense technology in the central nervous system. Oxford

University Press, Oxford, S.1-7.

Levin AA (1999) A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of

phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochim Biophys Acta 1489: 69-

84.

Levitt P (2003) Structural and functional maturation of the developing primate brain.

J Pediatr 143: S35-S45.

Lewis DA (1997) Development of the prefrontal cortex during adolescence: insights

into vulnerable neural circuits in schizophrenia. Neuropsychopharmacology

16: 385-398.

Lewis DA, Lieberman JA (2000) Catching up on schizophrenia: natural history and

neurobiology. Neuron 28: 325-334.

Lewis DA, Volk DW, Hashimoto T (2004) Selective alterations in prefrontal cortical

GABA neurotransmission in schizophrenia: a novel target for the treatment of

working memory dysfunction. Psychopharmacology (Berl) 174: 143-150.

Lieberman JA, Perkins D, Belger A, Chakos M, Jarskog F, Boteva K, Gilmore J (2001)

The early stages of schizophrenia: speculations on pathogenesis,

pathophysiology, and therapeutic approaches. Biol Psychiatry 50: 884-897.

Liebsch G, Montkowski A, Holsboer F, Landgraf R (1998) Behavioural profiles of two

Wistar rat lines selectively bred for high or low anxiety-related behaviour.

Behav Brain Res 94: 301-310.

Light GA, Braff DL (1999) Human and animal studies of schizophrenia-related gating

deficits. Curr Psychiatry Rep 1: 31-40.

Liu WS, Pesold C, Rodriguez MA, Carboni G, Auta J, Lacor P, Larson J, Condie BG,

Guidotti A, Costa E (2001) Down-regulation of dendritic spine and glutamic

acid decarboxylase 67 expressions in the reelin haploinsufficient heterozygous

reeler mouse. Proc Natl Acad Sci USA 98: 3477-3482.

134


Lugli G, Krueger JM, Davis JM, Persico AM, Keller F, Smalheiser NR (2003)

Methodological factors influencing measurement and processing of plasma

reelin in humans. BMC Biochem 4: 9.

Maaswinkel H, Gispen WH, Spruijt BM (1996) Effects of an electrolytic lesion of the

prelimbic area on anxiety-related and cognitive tasks in the rat. Behav Brain

Res 79: 51-59.

Mansbach RS, Geyer MA (1989) Effects of phencyclidine and phencyclidine biologs

on sensorimotor gating in the rat. Neuropsychopharmacology 2: 299-308.

Mansbach RS, Geyer MA, Braff DL (1988) Dopaminergic stimulation disrupts

sensorimotor gating in the rat. Psychopharmacology (Berl) 94: 507-514.

Marek GJ, Aghajanian GK (1999) 5-HT2A receptor or alpha1-adrenoceptor activation

induces excitatory postsynaptic currents in layer V pyramidal cells of the

medial prefrontal cortex. Eur J Pharmacol 367: 197-206.

Margeta-Mitrovic M, Mitrovic I, Riley RC, Jan LY, Basbaum AI (1999)

Immunohistochemical localization of GABA(B) receptors in the rat central

nervous system. J Comp Neurol 405: 299-321.

Marin-Padilla M (1971) Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex)

of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical

organization. Z Anat Entwicklungsgesch 134: 117-145.

Marin-Padilla M (1978) Dual origin of the mammalian neocortex and evolution of the

cortical plate. Anat Embryol (Berl) 152: 109-126.

Martinez-Cerdeno V, Clasca F (2002) Reelin immunoreactivity in the adult

neocortex: a comparative study in rodents, carnivores, and non-human

primates. Brain Res Bull 57: 485-488.

Martinez-Cerdeno V, Galazo MJ, Cavada C, Clasca F (2002) Reelin immunoreactivity

in the adult primate brain: intracellular localization in projecting and local

circuit neurons of the cerebral cortex, hippocampus and subcortical regions.

Cereb Cortex 12: 1298-1311.

135


Mathes B, Wood SJ, Proffitt TM, Stuart GW, Buchanan JA, Velakoulis D, Brewer WJ,

McGorry PD, Pantelis C (2005) Early processing deficits in object working

memory in first-episode schizophreniform psychosis and established

schizophrenia. Psychol Med 35: 1053-1062.

Matsuzaki H, Minabe Y, Nakamura K, Suzuki K, Iwata Y, Sekine Y, Tsuchiya KJ,

Sugihara G, Suda S, Takei N, Nakahara D, Hashimoto K, Nairn AC, Mori N,

Sato K (2007) Disruption of reelin signaling attenuates methamphetamine-

induced hyperlocomotion. Eur J Neurosci 25: 3376-3384.

McCarthy G, Blamire AM, Puce A, Nobre AC, Bloch G, Hyder F, Goldman-Rakic P,

Shulman RG (1994) Functional magnetic resonance imaging of human

prefrontal cortex activation during a spatial working memory task. Proc Natl

Acad Sci USA 91: 8690-8694.

Meincke U, Gouzoulis-Mayfrank E, Saß H (2001) Der Startle-Reflex in der

Schizophrenieforschung. Der Nervenarzt 72: 844-852.

Meltzer HY (1999) The role of serotonin in antipsychotic drug action.

Neuropsychopharmacology 21: 106S-115S.

Merrick SE, Trojanowski JQ, Lee VM (1997) Selective destruction of stable

microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine

phosphatases in cultured human neurons. J Neurosci 17: 5726-5737.

Meunier M, Bachevalier J, Mishkin M (1997) Effects of orbital frontal and anterior

cingulate lesions on object and spatial memory in rhesus monkeys.

Neuropsychologia 35: 999-1015.

Michaelis EK (1998) Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous

system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Prog

Neurobiol 54: 369-415.

Miller EK, Cohen JD (2001) An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu

Rev Neurosci 24: 167-202.

Miller S, Mayford M (1999) Cellular and molecular mechanisms of memory: the LTP

connection. Curr Opin Genet Dev 9: 333-337.

136


Mink JE (1999) Basal Ganglia. In: Zigmond MJ, Bloom FE; Landis SC, Roberts JL,

Squire LR (Eds.) Fundamental neuroscience. Academic Press, San Diego,

S.951-972.

Mitchell JB, Laiacona J (1998) The medial frontal cortex and temporal memory: tests

using spontaneous exploratory behaviour in the rat. Behav Brain Res 97: 107-

113.

Miyata H, Chute DJ, Fink J, Villablanca P, Vinters HV (2004) Lissencephaly with

agenesis of corpus callosum and rudimentary dysplastic cerebellum: a subtype

of lissencephaly with cerebellar hypoplasia. Acta Neuropathol 107: 69-81.

Mobini S, Chiang TJ, Ho MY, Bradshaw CM, Szabadi E (2000) Comparison of the

effects of clozapine, haloperidol, chlorpromazine and d-amphetamine on

performance on a time-constrained progressive ratio schedule and on

locomotor behaviour in the rat. Psychopharmacology (Berl) 152: 47-54.

Mogenson GJ, Jones DL, Yim CY (1980) From motivation to action: functional

interface between the limbic system and the motor system. Prog Neurobiol 14:

69-97.

Mogenson GJ, Brudzynski SM, Wu M, Yang CR, Yim CCY (1993) From motivation to

action: a review of dopaminergic regulation of limbic – nucleus accumbens –

ventral pallidum – pedunculopontine nucleus circuitries involved in limbic-

motor interaction. In: Kalivas PW, Barnes CD (Eds.) Limbic motor circuits and

neuropsychiatry. CRC Press, Boca Raton, S.193-236.

Montgomery KC (1955) The relation between fear induced by novel stimulation and

exploratory behavior. J Comp Physiol Psychol 48: 254-260.

Morrow BA, Roth RH, Elsworth JD (2000) TMT, a predator odor, elevates

mesoprefrontal dopamine metabolic activity and disrupts short-term working

memory in the rat. Brain Res Bull 52: 519-523.

Müller WE (2002) Partieller D2-Agonismus und dopaminerge Stabilisierung durch

Aripiprazol. Psychopharmakotherapie 9: 120-127.

137


Murray EA, Mishkin M (1998) Object recognition and location memory in monkeys

with excitotoxic lesions of the amygdala and hippocampus. J Neurosci 18:

6568-6582.

Nakano Y, Kohno T, Hibi T, Kohno S, Baba A, Mikoshiba K, Nakajima K, Hattori M

(2007) The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary

for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J

Biol Chem 282: 20544-20552.

Niu S, Renfro A, Quattrocchi CC, Sheldon M, D'Arcangelo G (2004) Reelin promotes

hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1

pathway. Neuron 41: 71-84.

Ogawa M, Miyata T, Nakajima K, Yagyu K, Seike M, Ikenaka K, Yamamoto H,

Mikoshiba K (1995a) The reeler gene-associated antigen on Cajal-Retzius

neurons is a crucial molecule for laminar organization of cortical neurons.

Neuron 14: 899-912.

Ogawa S, Brown HE, Okano HJ, Pfaff DW (1995b) Cellular uptake of intracerebrally

administered oligodeoxynucleotides in mouse brain. Regul Pept 59: 143-149.

Olney JW, Newcomer JW, Farber NB (1999) NMDA receptor hypofunction model of

schizophrenia. J Psychiatr Res 33: 523-533.

Olton DS (1979) Mazes, maps, and memory. Am Psychol 34: 583-596.

Pappas GD, Kriho V, Pesold C (2001) Reelin in the extracellular matrix and dendritic

spines of the cortex and hippocampus: a comparison between wild type and

heterozygous reeler mice by immunoelectron microscopy. J Neurocytol 30:

413-425.

Parisi T, Ison JR (1979) Development of the acoustic startle response in the rat:

ontogenetic changes in the magnitude of inhibition by prepulse stimulation.

Dev Psychobiol 12: 219-230.

Parker A, Eacott MJ, Gaffan D (1997) The recognition memory deficit caused by

mediodorsal thalamic lesion in non-human primates: a comparison with

rhinal cortex lesion. Eur J Neurosci 9: 2423-2431.

138


Parker A, Gaffan D (1998) Interaction of frontal and perirhinal cortices in visual

object recognition memory in monkeys. Eur J Neurosci 10: 3044-3057.

Parnavelas JG (2000) The origin and migration of cortical neurones: new vistas.

Trends Neurosci 23: 126-131.

Paxinos G, Watson C (1998) The rat brain in stereotaxic coordinates. 4th edn.

Academic Press, New York.

Pears A, Parkinson JA, Hopewell L, Everitt BJ, Roberts AC (2003) Lesions of the

orbitofrontal but not medial prefrontal cortex disrupt conditioned

reinforcement in primates. J Neurosci 23: 11189-11201.

Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M (1985) Validation of open:closed arm entries in

an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods

14: 149-167.

Persico AM, D'Agruma L, Maiorano N, Totaro A, Militerni R, Bravaccio C, Wassink

TH, Schneider C, Melmed R, Trillo S, Montecchi F, Palermo M, Pascucci T,

Puglisi-Allegra S, Reichelt KL, Conciatori M, Marino R, Quattrocchi CC, Baldi

A, Zelante L, Gasparini P, Keller F (2001) Reelin gene alleles and haplotypes as

a factor predisposing to autistic disorder. Mol Psychiatry 6: 150-159.

Persico AM, Schindler CW, Davis SC, Ambrosio E, Uhl GR (1998) Medial prefrontal

cortical injections of c-fos antisense oligonucleotides transiently lower c-Fos

protein and mimic amphetamine withdrawal behaviours. Neuroscience 82:

1115-1129.

Pesold C, Impagnatiello F, Pisu MG, Uzunov DP, Costa E, Guidotti A, Caruncho HJ

(1998) Reelin is preferentially expressed in neurons synthesizing gamma-

aminobutyric acid in cortex and hippocampus of adult rats. Proc Natl Acad Sci

USA 95: 3221-3226.

Pesold C, Treit D (1992) Excitotoxic lesions of the septum produce anxiolytic effects

in the elevated plus-maze and the shock-probe burying tests. Physiol Behav

52: 37-47.

139


Pierri JN, Volk CL, Auh S, Sampson A, Lewis DA (2001) Decreased somal size of deep

layer 3 pyramidal neurons in the prefrontal cortex of subjects with

schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 58: 466-473.

Pirot S, Godbout R, Mantz J, Tassin JP, Glowinski J, Thierry AM (1992) Inhibitory

effects of ventral tegmental area stimulation on the activity of prefrontal

cortical neurons: evidence for the involvement of both dopaminergic and

GABAergic components. Neuroscience 49: 857-865.

Podhorna J, Didriksen M (2004) The heterozygous reeler mouse: behavioural

phenotype. Behav Brain Res 153: 43-54.

Qiu S, Korwek KM, Pratt-Davis AR, Peters M, Bergman MY, Weeber EJ (2006)

Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin

haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem 85: 228-242.

Qiu S, Weeber EJ (2008) Reelin and cognition. In: Fatemi SH (Ed.) Reelin

Glycoprotein – Structure, biology and roles in health and disease. Springer

Science+Business Media, New York, S.171-192.

Ragozzino ME, Detrick S, Kesner RP (2002) The effects of prelimbic and infralimbic

lesions on working memory for visual objects in rats. Neurobiol Learn Mem

77: 29-43.

Rainer G, Miller EK (2000) Effects of visual experience on the representation of

objects in the prefrontal cortex. Neuron 27: 179-189.

Rakic P (2006) A century of progress in corticoneurogenesis: From silver

impregnation to genetic Engineering. Cereb Cortex 1:i3-i17 .

Ralph RJ, Paulus MP, Geyer MA (2001) Strain-specific effects of amphetamine on

prepulse inhibition and patterns of locomotor behavior in mice. J Pharmacol

Exp Ther 298: 148-155.

Reijmers LG, Peeters BW (1994) Effects of acoustic prepulses on the startle reflex in

rats: a parametric analysis. Brain Res 661: 174-180.

Reilly S (1999) Reinforcement value of gustatory stimuli determined by progressive

ratio performance. Pharmacol Biochem Behav 63: 301-311.

140


Rice DS, Curran T (2001) Role of the reelin signaling pathway in central nervous

system development. Annu Rev Neurosci 24: 1005-1039.

Rickmann M, Chronwall BM, Wolff JR (1977) On the development of non-pyramidal

neurons and axons outside the cortical plate: the early marginal zone as a

pallial anlage. Anat Embryol (Berl) 151: 285-307.

Robbins TW (2005) Chemistry of the mind: neurochemical modulation of prefrontal

cortical function. J Comp Neurol 493: 140-146.

Roberts DC (1989) Breaking points on a progressive ratio schedule reinforced by

intravenous apomorphine increase daily following 6-hydroxydopamine lesions

of the nucleus accumbens. Pharmacol Biochem Behav 32: 43-47.

Rodriguez MA, Caruncho HJ, Costa E, Pesold C, Liu WS, Guidotti A (2002) In Patas

monkey, glutamic acid decarboxylase-67 and reelin mRNA coexpression varies

in a manner dependent on layers and cortical areas. J Comp Neurol 451: 279-

288.

Rodriguez MA, Pesold C, Liu WS, Kriho V, Guidotti A, Pappas GD, Costa E (2000)

Colocalization of integrin receptors and reelin in dendritic spine postsynaptic

densities of adult nonhuman primate cortex. Proc Natl Acad Sci USA 97: 3550-

3555.

Rohrer DK, Kobilka BK (1998) Insights from in vivo modification of adrenergic

receptor gene expression. Annu Rev Pharmacol Toxicol 38: 351-373.

Romanides AJ, Duffy P, Kalivas PW (1999) Glutamatergic and dopaminergic

afferents to the prefrontal cortex regulate spatial working memory in rats.

Neuroscience 92: 97-106.

Rosoklija G, Toomayan G, Ellis SP, Keilp J, Mann JJ, Latov N, Hays AP, Dwork AJ

(2000) Structural abnormalities of subicular dendrites in subjects with

schizophrenia and mood disorders: preliminary findings. Arch Gen Psychiatry

57: 349-356.

Royaux I, Lambert dR, D'Arcangelo G, Demirov D, Goffinet AM (1997) Genomic

organization of the mouse reelin gene. Genomics 46: 240-250.

141


Saez-Valero J, Costell M, Sjogren M, Andreasen N, Blennow K, Luque JM (2003)

Altered levels of cerebrospinal fluid reelin in frontotemporal dementia and

Alzheimer's disease. J Neurosci Res 72: 132-136.

Salamone JD, Correa M, Mingote S, Weber SM (2003) Nucleus accumbens dopamine

and the regulation of effort in food-seeking behavior: implications for studies

of natural motivation, psychiatry, and drug abuse. J Pharmacol Exp Ther 305:

1-8.

Salinger WL, Ladrow P, Wheeler C (2003) Behavioral phenotype of the reeler mutant

mouse: effects of RELN gene dosage and social isolation. Behav Neurosci 117:

1257-1275.

Sanchez-Santed F, de Bruin JP, Heinsbroek RP, Verwer RW (1997) Spatial delayed

alternation of rats in a T-maze: effects of neurotoxic lesions of the medial

prefrontal cortex and of T-maze rotations. Behav Brain Res 84: 73-79.

Sawaguchi T, Goldman-Rakic PS (1994) The role of D1-dopamine receptor in working

memory: local injections of dopamine antagonists into the prefrontal cortex of

rhesus monkeys performing an oculomotor delayed-response task. J

Neurophysiol 71: 515-528.

Schlaepfer TE, Harris GJ, Tien AY, Peng LW, Lee S, Federman EB, Chase GA, Barta

PE, Pearlson GD (1994) Decreased regional cortical gray matter volume in

schizophrenia. Am J Psychiatry 151: 842-848.

Schmid A, Koch M, Schnitzler HU (1995) Conditioned pleasure attenuates the startle

response in rats. Neurobiol Learn Mem 64: 1-3.

Schmidt WJ (2000): Zur Verhaltensbiologie der Parkinson-Krankheit. Neuroforum

3: 229-234.

Schneider M, Koch M (2005) Behavioral and morphological alterations following

neonatal excitotoxic lesions of the medial prefrontal cortex in rats. Exp Neurol

195: 185-198.

Schultz SK, Andreasen NC (1999) Schizophrenia. Lancet 353: 1425-1430.

142


Schwabe K, Enkel T, Klein S, Schütte M, Koch M (2004) Effects of neonatal lesions of

the medial prefrontal cortex on adult rat behaviour. Behav Brain Res 153: 21-

34.

Selemon LD (2001) Regionally diverse cortical pathology in schizophrenia: clues to

the etiology of the disease. Schizophr Bull 27: 349-377.

Selemon LD, Goldman-Rakic PS (1999) The reduced neuropil hypothesis: a circuit

based model of schizophrenia. Biol Psychiatry 45: 17-25.

Shah AA, Sjovold T, Treit D (2004a) Inactivation of the medial prefrontal cortex with

the GABAA receptor agonist muscimol increases open-arm activity in the

elevated plus-maze and attenuates shock-probe burying in rats. Brain Res

1028: 112-115.

Shah AA, Sjovold T, Treit D (2004b) Selective antagonism of medial prefrontal cortex

D4 receptors decreases fear-related behaviour in rats. Eur J Neurosci 19:

3393-3397.

Shelton RC, Karson CN, Doran AR, Pickar D, Bigelow LB, Weinberger DR (1988)

Cerebral structural pathology in schizophrenia: evidence for a selective

prefrontal cortical defect. Am J Psychiatry 145: 154-163.

Simon H, Scatton B, Le Moal M (1979) Definitive disruption of spatial delayed

alternation in rats after lesions in the ventral mesencephalic tegmentum.

Neurosci Lett 15: 319-324.

Sinagra M, Verrier D, Frankova D, Korwek KM, Blahos J, Weeber EJ, Manzoni OJ,

Chavis P (2005) Reelin, very-low-density lipoprotein receptor, and

apolipoprotein E receptor 2 control somatic NMDA receptor composition

during hippocampal maturation in vitro. J Neurosci 25: 6127-6136.

Sisk CL, Foster DL (2004) The neural basis of puberty and adolescence. Nat Neurosci

7: 1040-1047.

Skinner RD, Garcia-Rill E (1993) Mesolimbic interactions with mesopontine

modulation of locomotion. In: Kalivas PW, Barnes CD (Eds.) Limbic motor

circuits and neuropsychiatry. CRC Press, Boca Raton, S.155-191.

143


Spear LP (2000) The adolescent brain and age-related behavioral manifestations.

Neurosci Biobehav Rev 24: 417-463.

Spindler KA, Sullivan EV, Menon V, Lim KO, Pfefferbaum A (1997) Deficits in

multiple systems of working memory in schizophrenia. Schizophr Res 27: 1-10.

Stam CJ, de Bruin JP, van Haelst AM, van der GJ, Kalsbeek A (1989) Influence of the

mesocortical dopaminergic system on activity, food hoarding, social-agonistic

behavior, and spatial delayed alternation in male rats. Behav Neurosci 103: 24-

35.

Steckler T, Drinkenburg WH, Sahgal A, Aggleton JP (1998a) Recognition memory in

rats--I. Concepts and classification. Prog Neurobiol 54: 289-311.

Steckler T, Drinkenburg WH, Sahgal A, Aggleton JP (1998b) Recognition memory in

rats--II. Neuroanatomical substrates. Prog Neurobiol 54: 313-332.

Steketee JD (2003) Neurotransmitter systems of the medial prefrontal cortex:

potential role in sensitization to psychostimulants. Brain Res Brain Res Rev

41: 203-228.

Strasser V, Fasching D, Hauser C, Mayer H, Bock HH, Hiesberger T, Herz J, Weeber

EJ, Sweatt JD, Pramatarova A, Howell B, Schneider WJ, Nimpf J (2004)

Receptor clustering is involved in Reelin signaling. Mol Cell Biol 24: 1378-

1386.

Sturgeon RD, Fessler RG, London SF, Meltzer HY (1982) Behavioral effects of

chronic phencyclidine administration in rats. Psychopharmacology (Berl) 76:

52-56.

Swerdlow NR, Braff DL, Geyer MA (2000) Animal models of deficient sensorimotor

gating: what we know, what we think we know, and what we hope to know

soon. Behav Pharmacol 11: 185-204.

Swerdlow NR, Braff DL, Masten VL, Geyer MA (1990) Schizophrenic-like

sensorimotor gating abnormalities in rats following dopamine infusion into

the nucleus accumbens. Psychopharmacology (Berl) 101: 414-420.

144


Swerdlow NR, Geyer MA, Braff DL (2001) Neural circuit regulation of prepulse

inhibition of startle in the rat: current knowledge and future challenges.


Swerdlow NR, Braff DL, Taaid N, Geyer MA (1994) Assessing the validity of an

animal model of deficient sensorimotor gating in schizophrenic patients. Arch

Gen Psychiatry 51: 139-154.

Taber MT, Das S, Fibiger HC (1995) Cortical regulation of subcortical dopamine

release: mediation via the ventral tegmental area. J Neurochem 65: 1407-1410.

Takahata R, Moghaddam B (2003) Activation of glutamate neurotransmission in the

prefrontal cortex sustains the motoric and dopaminergic effects of

phencyclidine. Neuropsychopharmacology 28: 1117-1124.

Thune JJ, Uylings HB, Pakkenberg B (2001) No deficit in total number of neurons in

the prefrontal cortex in schizophrenics. J Psychiatr Res 35: 15-21.

Tissir F, Goffinet AM (2003) Reelin and brain development. Nat Rev Neurosci 4:

496-505.

Tremolizzo L, Carboni G, Ruzicka WB, Mitchell CP, Sugaya I, Tueting P, Sharma R,

Grayson DR, Costa E, Guidotti A (2002) An epigenetic mouse model for

molecular and behavioral neuropathologies related to schizophrenia

vulnerability. Proc Natl Acad Sci USA 99: 17095-17100.

Tremolizzo L, Doueiri MS, Dong E, Grayson DR, Davis J, Pinna G, Tueting P,

Rodriguez-Menendez V, Costa E, Guidotti A (2005) Valproate corrects the

schizophrenia-like epigenetic behavioral modifications induced by methionine

in mice. Biol Psychiatry 57: 500-509.

Trommsdorff M, Gotthardt M, Hiesberger T, Shelton J, Stockinger W, Nimpf J,

Hammer RE, Richardson JA, Herz J (1999) Reeler/Disabled-like disruption of

neuronal migration in knockout mice lacking the VLDL receptor and ApoE

receptor 2. Cell 97: 689-701.

145


Tueting P, Costa E, Dwivedi Y, Guidotti A, Impagnatiello F, Manev R, Pesold C (1999)

The phenotypic characteristics of heterozygous reeler mouse. Neuroreport 10:

1329-1334.

Tueting P, Pinna G, Costa E (2008) Homozygous and heterozygous reeler mouse

mutants. In: Fatemi SH (Ed.) Reelin Glycoprotein – Structure, biology and

roles in health and disease. Springer Science+Business Media, New York,

S.291-310.

Ungerstedt U (1971) Adipsia and aphagia after 6-hydroxydopamine induced

degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiol Scand Suppl

367: 95-122.

Utsunomiya-Tate N, Kubo K, Tate S, Kainosho M, Katayama E, Nakajima K,

Mikoshiba K (2000) Reelin molecules assemble together to form a large

protein complex, which is inhibited by the function-blocking CR-50 antibody.

Proc Natl Acad Sci USA 97: 9729-9734.

Uyanik G, Hehr U, Aigner L, Winkler J (2003) Neuronal migration disorders: Clinic

and moleculargenetics of Lissencephalies. Akt Neurol 30: 328-334.

Uylings HB, Groenewegen HJ, Kolb B (2003) Do rats have a prefrontal cortex? Behav

Brain Res 146: 3-17.

Uylings HB, Van Eden CG (1990) Qualitative and quantitative comparison of the

prefrontal cortex in rat and in primates, including humans. Prog Brain Res 85:

31-62.

Van Den Buuse M, Garner B, Koch M (2003) Neurodevelopmental animal models of

schizophrenia: effects on prepulse inhibition. Curr Mol Med 3: 459-471.

Veldic M, Caruncho HJ, Liu WS, Davis J, Satta R, Grayson DR, Guidotti A, Costa E

(2004) DNA-methyltransferase 1 mRNA is selectively overexpressed in

telencephalic GABAergic interneurons of schizophrenia brains. Proc Natl Acad

Sci USA 101: 348-353.

146


Veldic M, Guidotti A, Maloku E, Davis JM, Costa E (2005) In psychosis, cortical

interneurons overexpress DNA-methyltransferase 1. Proc Natl Acad Sci USA

102: 2152-2157.

Venkatasubramanian G, Jayakumar PN, Gangadhar BN, Keshavan MS (2008)

Automated MRI parcellation study of regional volume and thickness of

prefrontal cortex (PFC) in antipsychotic-naive schizophrenia. Acta Psychiatr

Scand 117: 420-431.

Ventura R, Pascucci T, Catania MV, Musumeci SA, Puglisi-Allegra S (2004) Object

recognition impairment in Fmr1 knockout mice is reversed by amphetamine:

involvement of dopamine in the medial prefrontal cortex. Behav Pharmacol 15:

433-442.

Verma A, Moghaddam B (1996) NMDA receptor antagonists impair prefrontal cortex

function as assessed via spatial delayed alternation performance in rats:

modulation by dopamine. J Neurosci 16: 373-379.

Volz HP, Kasper S, Möller HJ, Sachs G, Höse A (2000): Die Rolle der Kognition in

der Therapie schizophrener Störungen. Deutscher Universitäts-Verlag GmbH,

Wiesbaden.

Wall PM, Blanchard RJ, Yang M, Blanchard DC (2003) Infralimbic D2 receptor

influences on anxiety-like behavior and active memory/attention in CD-1 mice.

Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 27: 395-410.

Wang GW, Cai JX (2006) Disconnection of the hippocampal-prefrontal cortical

circuits impairs spatial working memory performance in rats. Behav Brain Res

175: 329-336.

Weeber EJ, Beffert U, Jones C, Christian JM, Forster E, Sweatt JD, Herz J (2002)

Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic

plasticity and learning. J Biol Chem 277: 39944-39952.

Wegener NIGSEN, Koch M (2009) Neurobiology and systems physiology of the

endocannabinoid system. Pharmacopsychiatry 42: 79-86.

147


Weinberger DR, Lipska BK (1995) Cortical maldevelopment, anti-psychotic drugs,

and schizophrenia: a search for common ground. Schizophr Res 16: 87-110.

White IM, Whitaker C, White W (2006) Amphetamine-induced hyperlocomotion in

rats: Hippocampal modulation of the nucleus accumbens. Hippocampus 16:

596-603.

Wilcott RC, Qu XM (1990) Delayed response, preoperative overtraining, and

prefrontal lesions in the rat. Behav Neural Biol 53: 393-401.

Wiley JL, Compton AD (2004) Progressive ratio performance following challenge

with antipsychotics, amphetamine, or NMDA antagonists in adult rats treated

perinatally with phencyclidine. Psychopharmacology (Berl) 177: 170-177.

Willins DL, Deutch AY, Roth BL (1997) Serotonin 5-HT2A receptors are expressed on

pyramidal cells and interneurons in the rat cortex. Synapse 27: 79-82.

Winters BD, Bussey TJ (2005) Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts

encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. J

Neurosci 25: 52-61.

Wonders CP, Anderson SA (2006) The origin and specification of cortical

interneurons. Nat Rev Neurosci 7: 687-696.

Wyatt RJ, Henter ID (1997) Schizophrenia - An Introduction. The

NeuroscienceNewsletter 7: 1-8.

Yamasue H, Iwanami A, Hirayasu Y, Yamada H, Abe O, Kuroki N, Fukuda R, Tsujii K,

Aoki S, Ohtomo K, Kato N, Kasai K (2004) Localized volume reduction in

prefrontal, temporolimbic, and paralimbic regions in schizophrenia: an MRI

parcellation study. Psychiatry Res 131: 195-207.

Zhang H, Liu X, Zhang C, Mundo E, Macciardi F, Grayson DR, Guidotti AR, Holden

JJ (2002) Reelin gene alleles and susceptibility to autism spectrum disorders.

Mol Psychiatry 7: 1012-1017.

Zhang M, Balmadrid C, Kelley AE (2003) Nucleus accumbens opioid, GABaergic, and

dopaminergic modulation of palatable food motivation: contrasting effects

revealed by a progressive ratio study in the rat. Behav Neurosci 117: 202-211.

148


149

Zhu XO, Brown MW, McCabe BJ, Aggleton JP (1995) Effects of the novelty or

familiarity of visual stimuli on the expression of the immediate early gene c-fos

in rat brain. Neuroscience 69: 821-829.

Zipursky RB, Lim KO, Sullivan EV, Brown BW, Pfefferbaum A (1992) Widespread

cerebral gray matter volume deficits in schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 49:

195-205.

Danksagung

6. Danksagung

Spezieller Dank gilt meinen großartigen Eltern, die mich immer und ohne Zögern in allen Bereichen

des Lebens unterstützt haben. Ohne Euch hätte diese Arbeit nicht entstehen können!

Außerdem danke ich…

…Prof. Dr. Michael Koch, der es mir ermöglicht hat, das „Reelin-Projekt“ unter einer ausgezeichneten

Betreuung, sowohl selbstständig etablieren als auch bearbeiten zu können. Zudem danke ich für eine

einmalige und schöne Zeit in der AG, für die gemeinsamen und legendären sportlichen Erfolge um die

„Krone des Geistes“ und für die nicht nur kulinarisch wertvollen privaten Abende!

…den (alten und neuen) Mitarbeitern der AG Koch, für eine tolle Zusammenarbeit und einer

Arbeitsatmosphäre, die ihresgleichen sucht. Im Speziellen danke ich Frau Nagler-Timm, Maja, Simone

und Steffen für ihre Unterstützung.

…Prof. Dr. Ursula Dicke, für die Erstellung des Zweitgutachtens.

…Frank, Ketan, Thaddeus und Hendrik (AG Kelm), für die Hilfe bei der Etablierung der

biochemischen Methoden.

…Nicole, die es mal wieder geschafft hat sich für die Durchsicht dieser Arbeit Zeit „freizuschaufeln“.

Tolle Schwester!

…meiner Großmutter, für interessante und ergiebige Gespräche.

…Martin, der über die gemeinsamen Studienjahre – trotz Zerrungen & Zipperlein – zu einem guten

Freund geworden ist. Außerdem danke ich meinen Freunden Asja, Katrin, Raffaella, Sascha, Jost,

Philipp, Frederik und Arne.

…Dr. Nico, für eine Freundschaft die mich mit Stolz erfüllt!

…meiner Liebe, Nina, die immer an meiner Seite steht und die mir, durch ihre klugen und

überraschenden Interpretationen der Dinge, immer wieder zu neuen Ansichten verholfen und so den

richtigen Weg in vielerlei Hinsicht geebnet hat. Ohne deine Kraft und Ermutigungen hätte ich das alles

so nicht geschafft und vor allem: Nicht so viel Spaß gehabt!

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Die Bedeutung des extrazellulären Matrixproteins Reelin...

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