Die Beteiligung von mTOR an der Regulation des Haarzyklus ... · Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II...

Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Vorstand: Prof. Dr. F. Paulsen

Die Beteiligung von mTOR an der Regulation des

Haarzyklus und Einfluss von Bimatoprost auf die

mTOR Aktivierung

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorgelegt von

Antonia Judit Kellenberger

aus

Sathmar (Satu-Mare)

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Vorsitzender: Prof. Dr. Dr. med. h.c. W. A. Kalender Referent: Prof. Dr. med. E. Lütjen-Drecoll Korreferent: Prof. Dr. med. M. Eichhorn Tag der mündlichen Prüfung: 14. Januar 2011

Meinen Kindern

Patrick und Robert Kellenberger

gewidmet

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Die Beteiligung von m-TOR an der Regulation des Haarzyklus und der

Einfluss von Bimatoprost auf die m-TOR Aktivierung

1. Zusammenfassung und Abstract ............................................................. 1

1.1. Zusammenfassung ........................................................................... 1

1.2. Abstract ............................................................................................. 2

2. Einleitung ................................................................................................. 4

2.1. Haare und Haarwachstum bei der Maus........................................... 4

2.1.1. Morphogenese des Haarfollikels ................................................... 4

2.1.2. Der murine Haarzyklus .................................................................. 6

2.1.2.1. Die Katagenphase………………………………………………...6

2.1.2.2. Die Telogenphase…………………………………………….......7

2.1.2.3. Die Anagenphase………………………………………………....7

2.1.3. Synchronisiertes und nicht synchronisiertes Wachstum ................ 9

2.2. mTOR ............................................................................................. 10

2.2.1. mTOR und Rapamycin– Name und Geschichte .......................... 10

2.2.2. Biochemie und Funktion von mTOR ............................................ 11

2.2.3. Rezeptoren und intrazelluläre Signalwege .................................. 12

2.2.4. Vorkommen von mTOR im Haarfollikel ....................................... 14

2.3. Prostaglandin F2α-Analoga .............................................................. 15

2.3.1. Definition, Struktur und Biosynthese der Prostaglandine ............. 15

2.3.2. Rezeptoren und intrazelluläre Signaltransduktion ....................... 17

2.3.3. Abbau der Prostaglandine ........................................................... 17

2.3.4. Prostamide/Bimatoprost .............................................................. 18

2.3.5. Wirkungen und medizinische Verwendung der Prostaglandine ... 18

2.3.6. Prostaglandine und Haarwachstum ............................................. 20

2.3.7. Aktivierung von mTOR durch Prostaglandine .............................. 20

2.4. Hypothese ....................................................................................... 21

Inhaltsverzeichnis

3. Material und Methoden .......................................................................... 22

3.1. Tiere und Tierhaltung ...................................................................... 22

3.2. Qualitative und quantitative Bestimmung der haarzyklus-abhängigen

mTOR Aktivierung .................................................................................... 22

3.2.1. Probengewinnung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Toluidin-blau-

Färbung zur Haarphasenbestimmung ................................................... 22

3.2.2. Lokalisation von p-mTOR durch immunhistochemische

Markierung. ........................................................................................... 24

3.2.3. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivierung mittels Kinase-

Aktivitätsassay ....................................................................................... 25

3.2.3.1. Probengewinnung mit Abtrennung der Epidermis von der

Dermis und Subkutis……………………………………………………………...25

3.2.3.2. Kinase Aktivitätsassay…………………………………………..27

3.3. Hemmung der haarzyklusabhängigen mTOR Aktivierung durch

Rapamycin ................................................................................................ 28

3.3.1. Rapamycin ................................................................................... 28

3.3.2. Rasur ........................................................................................... 29

3.3.3. Bestimmung der Wirkung von Rapamycin auf den Haarzyklus ... 29

3.4. Bestimmung der Wirkung von Bimatoprost auf die mTOR

Aktivierung. ............................................................................................... 31

3.4.1. Bimatoprost ................................................................................. 31

3.4.2. Effekt von Bimatoprostbehandlung auf die mTOR Aktivierung .... 31

3.5. Einfluss von Rapamycin auf die durch Bimatoprost vermittelte

Initiation der Anagenphase.. ..................................................................... 33

3.6. Statistische Analye ......................................................................... 35

4. Ergebnisse ............................................................................................ 36

4.1. Haarzyklus der C57Bl/6 Kontrollmäuse .......................................... 36

4.2. Analyse der mTOR Aktivierung im Haarzyklus ............................... 38

4.2.1. Lokalisation von p-mTOR in den Wachstumsphasen .................. 38

4.2.2. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivität in verschiedenen

Phasen des Haarzyklus ......................................................................... 45

4.3. Einfluss von Rapamycin auf den Haarzyklus .................................. 46

Inhaltsverzeichnis

4.4. Der Einfluss von Bimatoprost auf die mTOR Aktivierung ................ 54

4.4.1. Verteilung von p-mTOR in verschiedenen Wachstumsphasen nach

Bimatoprostbehandlung ........................................................................ 54

4.4.2. Einfluss von Rapamycin auf die Initiation des Anagens durch

Bimatoprost ........................................................................................... 58

4.5. Der Einfluss von Rapamycin auf die p-mTOR-Expression .............. 63

5. Diskussion ............................................................................................. 66

6. Literaturverzeichnis ............................................................................... 71

7. Abkürzungsverzeichnis.......................................................................... 79

8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen .................................................. 83

9. Danksagung .......................................................................................... 85

10. Lebenslauf ......................................................................................... 87

1

Zusammenfassung

1. Zusammenfassung und Abstract

1.1. Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele: Hypertrichosis wird infolge verschiedener

Krankheiten oder als Nebenwirkung bestimmter Medikamente beobachtet.

Da es überwiegend in der Gesichtsregion auftritt, kann für den Betroffenen

psychisch belastend sein und zum Therapieabbruch führen. Bimatoprost wird

in der Glaukomtherapie zur Senkung des Augeninnendruckes verwendet. Zu

den Nebenwirkungen solch einer Therapie zählt vermehrtes Haar- und

Wimpernwachstum, deren Ursache und Wirkmechanismus weitgehend

unbekannt sind. Die Kinase mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) spielt

eine zentrale Rolle in der Regulation von Zellproliferation und Wachstum.

Seine aktivierte Form (p-mTOR) wird in der „bulge region“ des Haarfollikels

exprimiert. Es stellt sich die Frage, ob mTOR an dem durch Bimatoprost

induzierten Haarwachstum beteiligt ist. Ziel dieser Studie war zunächst die p-

mTOR Expression im Haarfollikel während des Haarzyklus zu bestimmen

und anschließend zu untersuchen, ob die unter Bimatoprost-behandlung

beobachtete Hypertrichose über eine Aktivierung von mTOR vermittelt wird.

Methoden: Alle Untersuchungen wurden an der Rückenhaut von weiblichen

C57Bl/6 Mäusen durchgeführt. Nach histologischer Bestimmung des

Haarzyklus wurde die Verteilung von p-mTOR in den Haarfollikeln

immunhistochemisch in jeder Haarphase analysiert. Die Messung der mTOR

Kinaseaktivität in Hautpräparaten erfolgte mit dem Kinase-Aktivitätsassay

über einen kompletten Haarzyklus. Der Einfluss von lokal über die Haut

appliziertes Bimatoprost auf die mTOR Aktivierung wurde

immunhistochemisch durch Bestimmung der p-mTOR Expression in

Haarfollikeln in verschiedenen Wachstumsphasen analysiert. Zusätzlich

wurde der Einfluss des spezifischen mTOR Inhibitors Rapamycin auf das

spontane Haarwachstum und auf die durch Bimatoprost induzierte Anagen

Initiation makroskopisch und histologisch untersucht.

2

Zusammenfassung

Ergebnisse und Beobachtungen: Aktiviertes mTOR war während des

gesamten Haarzyklus in den Haarfollikeln nachweisbar. Die Verteilung von p-

mTOR war haarphasenspezifisch. Im Telogen war die p-mTOR Expression

auf die „bulge region“ beschränkt und die Kinaseaktivität war niedrig. Im

Anagen exprimierten, zusätzlich zur „bulge region“, zunächst die äußere,

dann die innere epitheliale Wurzelscheide p-mTOR. Gleichzeitig nahm die

Kinaseaktivität zu. Im Katagen wurde p-mTOR zunächst nur in der äußeren

epithelialen Wurzelscheide unterhalb der „bulge region“, in späteren Stadien

zunehmend in der „bulge region“ nachgewiesen. Die Kinaseaktivität sank mit

Fortschreiten des Katagens. Rapamycin führte zur Verzögerung des

Eintrittes der Haarfollikel ins Anagen. Bimatoprost zeigte keine sichtbare

Wirkung auf die mTOR Aktivierung. Dennoch wurde durch Rapamycin

sowohl die spontane, als auch die durch Bimatoprost induzierte Anagen

Initiation gehemmt.

Praktische Schlussfolgerungen: Die vorgelegte Arbeit liefert erste

Erkenntnisse über die Beteiligung von mTOR im Haarzyklus und trägt zu

einem besseren Verständnis der Regulation des Haarwachstums bei.

1.2. Abstract

Background and Goal of the study: Hypertrichosis can be associated with

various diseases or drug treatments. Since in most cases the face region is

affected, psychological strain can occur and cause a termination of the

therapy. Bimatoprost is an antiglaucoma drug that reduces intraocular

pressure. One of its side effects is hypertrichosis of hairs and eyelashes. The

causes and mechanisms of controling growth are largely obscure. The

intracellular kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) is a central

regulator of cell proliferation and growth. Its activated form (p-mTOR) is

expressed in the “bulge region” of the hair follicle. From this background the

question arose, if mTOR is involved in the bimatoprost induced stimulation of

3

Zusammenfassung

hair growth. The intention of this work was to investigate in a first step the p-

mTOR expression in the hair follicle during the hair cycle. In a second step

we addressed the question; if the bimatoprost-induced hypertrichosis is

associated with an activation of mTOR.

Methods: The back skin of female C57BL/6 mice was used in all

experiments. First the time course of the hair cycle was histologically

determined. Subsequently hair follicles in all growth phases were stained

immunhistochemically using an antibody against p-mTOR and the

localization of p-mTOR was investigated. The relative kinase activity of p-

mTOR was measured with a kinase activity assay from protein extracts of

skin samples in each growth phases of the hair follicle. For the study of the

effect of bimatoprost on mTOR activation, bimatoprost was applied on back

skin and p-mTOR expression was determined by immunhistochemical

staining in all growth phases of the hair cycle. Additionally, the effect of

mTOR signaling inhibition on spontaneously hair growth and bimatoprost-

induced anagen initiation was investigated.

Results and observations: Activated mTOR was found in every growth

phase of hair follicles. The expression of p-mTOR was hair phase specific. In

telogen, expression was found in the “bulge region” and the kinase activity

was low. In anagen, in addition to the “bulge region”, p-mTOR was also

expressed first in the outer, later in the inner root sheath. The kinase activity

was significantly higher than that of telogen. At the beginning of catagen, p-

mTOR expression was observed in the outer root sheath proximal to the

“bulge region”, but the “bulge region” was negative. At the end of catagen, p-

mTOR+ cells appeared in the “bulge region” again. The kinase activity was

lower than during anagen. Bimatoprost did not show any effect on mTOR

activation. However, treatment of rapamycin induced delay of both

spontaneous and bimatoprost-induced hair cycle initiation.

Conclusions: This study is the first to show the involvement of mTOR

signaling in normal hair cycle regulation and will contribute to our

understanding in molecular control mechanisms of hair growth.

4

Einleitung

2. Einleitung

2.1. Haare und Haarwachstum bei der Maus

Der Haarfollikel ist ein hochsensitives Organ, dessen zyklische

Veränderungen aus einer Wachstumsphase (Anagen), einer durch Apoptose

herbeigeführten Rückbildungsphase (Katagen) und einer Ruhephase

(Telogen) bestehen(22, 101).

Haaraufbau und –zyklus sind, abgesehen von der Länge der einzelnen

Phasen, bei Mensch(44) und Maus(10, 11, 44, 58, 60, 71, 74, 75, 101, 102) ähnlich. Der

Zyklus des Fellhaares auf dem Rücken von C57BL/6 Mäusen ist mit einer

Dauer von 3-4 Wochen deutlich kürzer als der des menschlichen Kopfhaares

mit einer Dauer von 2-6 Jahren. In tierexperimentellen Studien zur

Untersuchung der Biologie des Haarfollikels werden dorsale Hauthaare von

C57BL/6 Mäusen am häufigsten verwendet. Somit repräsentieren diese das

bisher in der Haarforschung am besten charakterisierte Tiermodell(10, 58, 76, 94).

2.1.1. Morphogenese des Haarfollikels

Bereits in utero, kurz nachdem mesenchymale Zellen die Haut besiedeln, um

die Dermis auszubilden, beginnt die Morphogenese der Haarfollikel(3, 76, 91).

Dabei führt ein Prozess fein aufeinander abgestimmter Zellproliferationen

und Apoptosen zur Ausbildung der typischen Architektur des Haarfollikels(54).

Spezialisierte dermale Fibroblasten – die Zellen der späteren dermalen

Papille - gruppieren sich unter der Epidermis, stimulieren die über ihnen

liegenden epithelialen Zellen in die Tiefe zu wachsen und beginnen einen

Haarfollikel zu bilden(114) (Stadien 0–3)(76). Dieser verlängert sich in der

Dermis und fängt an die ersten charakteristischen Strukturen einer

heranreifendes Haarfollikels auszubilden. Die dermale Papille wird

zunehmend von den Zellen, die die zukünftige äußere epitheliale

Wurzelscheide (ORS) und die Haarmatrix bilden, umgeben und es entsteht

5

Einleitung

die innere epitheliale Wurzelscheide (IRS). Die „bulge region“ (Wulstregion) -

die Stammzellnische – und die ersten Talgdrüsenzellen differenzieren sich

aus. Bei pigmentierten Stämmen setzt die Melaninbildung über dem distalen

Teil der dermalen Papille ein (Stadien 4-5)(76). Der Haarfollikel wächst weiter

nach unten in die Subkutis. Der Haarschaft (HS) und die Talgdrüse werden

ausgebildet. Der Haarkanal wird lichtmikroskopisch sichtbar (Stadien 6-7)(76).

Ab dem Stadium 5 finden apoptotische Prozesse statt(54), um eine

Überproliferation zu vermeiden und die Feinstruktur des Haarfollikels zu

gewährleisten. Die Morphogenese geschieht asynchron, deswegen zeigen

morphologische Untersuchungen der Haut neonataler Mäuse

unterschiedliche Entwicklungsstadien der Haarfollikel(76). Bis Tag 8 post

partum (d8 p.p.) erreichen alle Haare das Stadium eines reifen Follikels(76),

der durch die maximale Länge charakterisiert ist. Der Haarfollikel reicht bis

zum M. panniculus carnosus und der HS durchbricht die Epidermis (Stadium

8)(76) (Abb. 1). In diesem Stadium wird die Haut dicker und färbt sich bei

pigmentierten Mausstämmen dunkelgrau bis schwarz.

Abb. 1: Schematische Abbildung eines reifen murinen Haarfollikels im

Stadium 8 der Morphogenese.

6

Einleitung

2.1.2. Der murine Haarzyklus

2.1.2.1. Die Katagenphase

Auf die Haarfollikelmorphogenese folgt die Katagenphase (Katagen I –

VIII)(58), womit der reife Haarfollikel in seinen lebenslangen Zyklus eintritt. In

der Literatur ist nicht klar definiert, wann der erste wahre Haarzyklus beginnt.

Einige Wissenschaftler definieren den Anfang ab dem ersten Katagen nach

Stadium 8 der Morphogenese(76), beziehungsweise ab dem ersten Telogen

oder Anagen(10, 100). Auch die Meinung ist vertreten, dass der Zyklus mit der

Morphogenese beginnt, jede Trennung wäre artifiziell(100).

Auch für den Übertritt der Haarfollikel in die Regressionsphase gibt es

mehrere Theorien. Nach Cotsarelis wird sie durch die terminale

Ausdiffenzierung und den daraus resultierenden Proliferationsstopp der

Keratinozyten der Haarmatrix eingeleitet(18). Sobald der Vorrat an

Matrixzellen verbraucht wird, kommt das Haarwachstum zum Stillstand. Nach

Stenn und Paus erfolgt dieser Übertritt durch Ansammlung

wachstumsinhibierender parakriner und proapoptotischer Faktoren oder

durch Änderung in der Aktivität der Mastzellen und Makrophagen(100). Auch

eine Kombination all dieser Ursachen ist möglich(99). Die Melanozyten

beenden die Produktion von Melaningranula(58, 95) und der Haarbulbus

verengt sich durch Apoptosen in der ORS(49). Proximal bildet die ORS eine

Keimkapsel („germ capsule“) um das Haar, die nach außen in Richtung des

Epithels vorgeschoben wird (Kolbenhaar)(58) (Katagen I-VI). Zwischen der

Keimkapsel und der dermalen Papille befindet sich zunächst als Rest vom

unteren Teil des Follikels ein epithelialer Strang, der sich anfangs verlängert,

später aber komplett zurückbildet(58). Innerhalb weniger Tage erfolgt eine

massive Organinvolution, an deren Ende sich der Haarfollikel so weit

verkürzt, bis die dermale Papille die sogenannten „bulge region“ erreicht(58)

(Katagen VII-VIII). An dieser Stelle befinden sich die Stammzellen(18). Bei

pigmentierten Mausstämmen entfärbt sich während der 3-4 Tage

andauernden Regressionsphase die Haut von schwarz (Anagen) bis hellrosa

7

Einleitung

(Telogen) und wird deutlich dünner(58). Der Zeitpunkt, an dem das erste

Katagen anfängt, ist vom Mäusestamm abhängig und variiert signifikant

zwischen verschiedenen Hautregionen(3, 102). Die Entfärbung fängt am Kopf

an und schreitet wellenförmig nach kaudal und lateral voran(3, 58, 102). In der

von der Mittellinie genommenen dorsalen Rückenhaut von C57BL/6 Mäusen

befinden sich die Haarfollikel im Nackenbereich etwa ab d17 p.p.(102), im

Schwanzbereich erst ab d19-20 im Katagen(10, 11, 58, 101).

2.1.2.2. Die Telogenphase

Wenn der epitheliale Strang komplett abgebaut ist und die dermale Papille

das Kolbenhaar erreicht, gelangen die Haarfollikel in die Telogenphase(58). In

dieser Phase ruhen die Follikel, es findet keine Haarproduktion statt und

Größe und Morphologie des Follikels verändern sich nicht(58). Bei Mäusen ist

diese erste Telogenphase kurz(102) und dauert nur 1 oder 2 Tage(3). Die

Angaben in der Literatur zum Auftreten des ersten Telogens sind

uneinheitlich und variieren von d19-21(3) bis d25 p.p.(102). In diesem Stadium

ist die Haut der Mäuse hellrosa(58).

2.1.2.3. Die Anagenphase

Derzeit sind die genauen Mechanismen, die zur Induktion des Anagens

führen, noch nicht vollständig bekannt. Eine Hypothese nimmt die Aktivierung

von ruhenden Stammzellen in der „bulge region“ des Telogenfollikels an(18).

Aber auch die dermale Papille hat eine wichtige Rolle in der Regulation des

Haarzyklus(123) und könnte am Übergang von der Telogen- in die

Anagenphase beteiligt sein. Schließlich wurde in der murinen Epidermis ein

Inhibitor des Haarwachstums identifiziert, der nur in der Telogen-, nicht aber

in der Anagenphase nachweisbar ist(77).

8

Einleitung

Im Gegensatz zur spontanen Katagenentwicklung, fängt die spontane

Anagenphase kaudal im Beckenbereich an und schreitet wellenförmig nach

kranial voran(58). Durch massive Proliferation der Keratinozyten, erlangt der

Haarfollikel erneut seine maximale Größe (Anagen I-VI)(58). Die Länge der

Haare wird von der Dauer der Anagenphase bestimmt, während die

Haardicke von der Dicke des Haarbulbus in der Wachstumsphase

derterminiert wird(99). Durch fortschreitende Proliferation und Differenzierung

des Epithels erreicht der Haarfollikel zunächst die Dermis-Subkutis-Grenze

(Anagen I-II). Der Bereich der ORS, der an die dermale Papille angrenzt, ist

der „secondary germ“(73). Hier befinden sich ebenfalls Stammzellen, die eine

wichtige Rolle in der Ausbildung des proximalen, cyclischen Teiles der

Haarfollikel spielen(73). Im weiteren Verlauf wird der Anagenbulbus mit der

Haarmatrix gebildet, die die induktive mesenchymale Zellgruppe, die dermale

Papille (DP), umwächst(58). Dadurch wird sie permanenter Teil der

Follikelbasis. In Anagen III-IV bildet die Haarmatrix, die aus sogenannten

„transit-amplifying“ Zellen besteht, die sechs Schichten des Haarschaftes

(HS) und der umliegenden inneren epithelialen Wurzelscheide (IRS), die von

der äußeren epithelialen Wurzelscheide (ORS) umgeben wird(58). IRS und

HS gliedern sich von außen nach innen in folgende Schichten: Henley

Schicht, Huxley Schicht, Scheidenkutikula, Haarkutikula, Haarrinde und

Haarmark (Abb. 2). Die IRS und der HS wachsen nach distal, bis im Anagen

IV die Spitze des HS den Haarkanal erreicht. In späten Anagenstadien

wächst die IRS bis zur Einmündung der Talgdrüse in das Infundibulum und

der HS verlängert sich bis er schließlich durch die Epidermis tritt (Anagen V-

VI).

9

Einleitung

Abb. 2: Schematische Zeichnung einer Haarfollikel im Bereich des Bulbus

(modifiziert nach Rohen)(83).

2.1.3. Synchronisiertes und nicht synchronisiertes Wachstum

Nach der Anagenphase schließt sich etwa ab d42 p.p. die zweite

Katagenphase an. Nach wenigen Tagen, etwa ab d49 p.p., gelangen die

Haarfollikel wieder ins Telogenstadium, welches ca. 3-4 Wochen anhält(58)

(Abb. 3). Bis zu diesem Zeitpunkt verläuft das Haarwachstum völlig

synchron, d.h. alle Haarfollikel eines Tieres durchlaufen die einzelnen

Stadien gleichzeitig(99). In den danach folgenden Haarzyklen geht die

synchrone Kopplung der Haarzyklen für das gesamte Tier verloren und bleibt

nur für einzelne zusammenhängende Hautareale erhalten. Mit

zunehmendem Alter der Tiere nimmt die Frequenz des wellenförmig

fortschreitenden Follikelwachstums ab und führt dazu, dass die Hautflächen,

auf denen der Haarzyklus synchronisiert verläuft mit dem Alter der Tiere

kleiner werden(99).

10

Einleitung

Abb. 3: Zeitskala für den Haarzyklus weiblicher C57BL/6 Mäusen während

der ersten 14 Wochen nach Geburt (modifiziert nach Müller-Röver)(58).

2.2. mTOR

2.2.1. mTOR und Rapamycin – Name und Geschichte

TOR (Target Of Rapamycin) wurde erstmals in Hefen 1991 identifiziert(35).

Seitdem wurden aber die Orthologe in vielen Pflanzen- und Tierspezies, wie

z.B. bei Arabidopsis thaliana(56), C. elegans(50), Drosophila melanogaster(69,

124) und auch bei Säuger(6, 16, 84, 85) nachgewiesen. mTOR(85) (mammalian

TOR) ist auch unter dem Namen FRAP (=FKBP12 rapamycin associated

protein)(6), RAFT (rapamycin and FKBP12 target)(84), SEP (Sirolimus effector

protein)(15) und RAPT (rapamycin target)(16) bekannt.

Rapamycin (=Sirolimus) ist eine Substanz mit Makrolidstruktur, welches aus

dem Bakterienstamm Streptomyces hygroscopicus isoliert wird(7). Es hat

immunsuppressive, antimikrobielle, das Tumorwachstum hemmende und

fungizide Eigenschaften(7). Da diese Bakterien auf den Osterinseln

einheimisch sind, die in der Sprache der Landesbewohner „Rapa Nui“

heißen, wurde der aus ihnen gewonnene Stoff Rapamycin genannt(80).

Rapamycin ist ein hochspezifischer Inhibitor der mTOR-Funktion(28, 32, 80, 90).

11

Einleitung

2.2.2. Biochemie und Funktion von mTOR

Eine zentrale Rolle in der Regulation von Zellproliferation und Wachstum

spielt das intrazelluläre Signalmolekül mTOR (mammalian Target Of

Rapamycin), das als ein Sensor für ATP und Aminosäuren wirkt(28, 108). In

frühen Mäuseembryonen und embryonalen Stammzellen wurde

nachgewiesen, dass mTOR sowohl die Zellgröße als auch die

Zellproliferation kontrolliert(59). Abhängig von der Qualität und Quantität der

Nährstoffe koordiniert diese Proteinkinase das Gleichgewicht zwischen

Proteinsynthese und –degradierung durch Integration unterschiedlicher

Signalwege(80).

mTOR ist Bestandteil von zwei Proteinkomplexen. Der eine Komplex ist

mTORC1 (mTOR complex 1), der neben mTOR und einem weiteren Protein

aus Raptor (regulatory associated protein of mTOR) besteht und durch

Rapamycin gehemmt wird(121). In diesem Komplex regulieren TOR-Proteine

(i) die Initiation- und Elongationphasen der Translation, (ii) die Ribosomen-

Biosynthese, (iii) den Import von Aminosäuren, (iv) die Transkription

zahlreicher Enzyme und (v) die Autophagie(80, 121). Der zweite Komplex ist

mTORC2 (mTOR complex 2), der von mTOR, Rictor (rapamycin-insensitive

companion of mTOR) und weiteren Proteinen gebildet wird und nicht durch

Rapamycin gehemmt werden kann(39). Über diesem Komplex kann mTOR

die Aktinorganisation regulieren(39, 121). Während mTORC1 in den zeitlichen

Ablauf der Proliferation eingreift, spielt mTORC2 eine Rolle in der räumlichen

Organisation der Proliferation(121).

mTOR ist eine Serin/Threonin-Kinase mit einem Molekulargewicht von 289

kDa(90, 121) und gehört zu der Familie der, in der Evolution hochkonservierten

Phosphatidylinositol-Kinase-verwandten Kinasen (PIKK)(80, 121). Mensch,

Maus und Ratte zeigen eine >95% Übereinstimmung der mTOR-Proteine auf

Aminosäureebene(80). (Abb. 4).

12

Einleitung

Abb. 4: Schematische Darstellung des mTOR Moleküls (modifiziert nach

Schmelzle)(90). Die Inaktivierung von mTOR erfolgt durch die Bindung des

FKBP12-Rapamycin-Komplexes an die FRB-Domäne. Die HEAT-Gruppen(78,

90, 121) und die FAT-Domäne(5), benannt nach Vertreter der Hauptgruppen, die

diese Domänen enthalten, vermitteln wahrscheinlich Protein-Protein-

Interaktionen. Zusätzlich soll die FAT-Domäne auch als Gerüst dienen(90).

Die FATC-Domäne spielt wahrscheinlich eine Rolle für die katalytische

Aktivität von mTOR(5, 43).

Der intrazelluläre Rapamycinrezeptor ist in allen eukaryotischen Zellen das

kleine ubiquitär vorkommende Protein FKBP12 (FK506-binding protein 12

kDa). Durch Bindung des Rapamycin-FKBP12-Komplexes an mTOR, wird

dieser inaktiviert(80, 90). Die FRB-Domäne (FKBP12-Rapamycin-Bindungs-

Domäne) des Moleküls interagiert mit dem FKBP12-Rapamycin-Komplex,

dessen Bindung zur Hemmung der Funktion von mTOR führt.

2.2.3. Rezeptoren und intrazelluläre Signalwege

Einer der Hauptsignalwege, der durch Wachstumsfaktoren aktiviert wird,

involviert den Insulinrezeptor, Insulinrezeptor Substrate und PI3K

(Phosphoinositid 3-Kinase)(28, 121) (Abb. 5).

13

Einleitung

Abb. 5: Model des mTOR Signalweges in Säugerzellen (modifiziert nach

Wullschleger)(121).

PI3K aktiviert Proteinkinase B (PKB oder Akt), die mTOR phosphorylieren

kann. Die Aktivierung von mTOR wird durch TSC1 (tuberous sclerosis

complex 1, bekannt auch als Hamartin) und TSC2 (tuberous sclerosis

complex 2 oder Tuberin) inhibiert(45, 55, 106, 121). Der inhibierende Effekt von

TSC2 kann entweder Akt-abhängig oder durch die Aktivierung von

Proteinkinase C (PKC) und des Raf-MEK-Erk-Signalweges aufgehoben

werden(104).

Energie- und Nährstoffmangel führt zum Abfall der Konzentrationen von ATP

und Aminosäuren in der Zelle und über verschiedene Signalmoleküle zur

Hemmung von mTOR(28, 64, 121). Stress führt ebenfalls zur Hemmung von

mTOR(121).

14

Einleitung

Die Regulation der Translation erfolgt über die Phosphorylierung des

eukaryotischen Initiationsfaktor 4E (eIF4E)-Bindungsproteins (4EBP1) und

der 70 kDa ribosomalen Protein S6-Proteinkinase 1 (S6K1)(p70S6K)(28, 30, 90,

113, 121). 4EBP1 ist ein Repressor der Translation, der durch mTOR gehemmt

wird. Aktiviert durch mTOR, erhöht S6K1 die Effizienz funktionsfähiger

Ribosomen(80). Sie ermöglicht die Translation von mRNAs, die hauptsächlich

für ribosomale Proteine und andere Komponenten des Translationsapparates

kodieren(90).

mTOR Aktivierung erhöht die Aktivität der RNA-Polymerase I (Transkription

der 40S rRNAs) und der RNA-Polymerase III (Transkription der 5S rRNAs

und tRNAs)(90, 121). In Säugerzellen aktiviert mTOR auch die RNA-

Polymerase II(90, 121).

Die Inaktivierung von mTOR führt zur Verminderung des Aminosäure-Imports

in Hefezellen und zur Induktion von Autophagie, sogar im nährstoffreichen

Medium, sowohl in Hefe- als auch in Säugerzellen(90).

2.2.4. Vorkommen von mTOR im Haarfollikel

Die Verteilung von mTOR wurde bisher nur in einer Studie

immunhistochemisch an Mäusehaaren und ausschließlich im

Telogenstadium des Haarzyklus untersucht(2). Die Autoren fanden mTOR+

Zellen in der „bulge region“ der Haarfollikel, im Infundibulum und in den

Basalzellen der Epidermis. Ihre Ergebnisse im Bereich des murinen Epithels

weisen daraufhin, dass mTOR hier eventuell für die Proliferation der Zellen

eine Rolle spielt.

15

Einleitung

2.3. Prostaglandin F2α-Analoga

2.3.1. Definition, Struktur und Biosynthese der Prostaglandine

Prostaglandine (PG) gehören einer der wichtigsten Klasse der

Lipidmediatoren, bekannt als Eicosanoide an(24). Diese sind endogene

Derivate essentieller Fettsäuren mit 20 Kohlenstoffatomen, die im

Säugerorganismus ubiquitär vorkommen. Sie sind durch einen

Cyclopentanring, sowie eine Carboxyl- und einer Alkylseitenkette

charakterisiert.

Abhängig von der Ausgangssubstanz werden drei Hauptgruppen der

Prostaglandine gebildet: die Serie-1 Prostaglandine entstehen aus

Dihomogammalinolensäure (8,11,14-Eicosatriensäure), die Serie-2

Prostaglandine aus Arachidonsäure (5,8,11,14-Eicosatetraensäure) und die

Serie-3 Prostaglandine aus Timnodonsäure (5,8,11,14,17-

Eicosapentaensäure). Die Zahlen 1 – 3 weisen auf die Anzahl der

Doppelbindungen in den Seitenketten der PG hin. Am wichtigsten sind die

Serie-2 Prostaglandine, die unter anderem für die Entstehung oder

Verstärkung von Entzündungen verantwortlich sind, sowie auch für die

Intensivierung der Schmerzwahrnehmung. Sie lösen im Körper die

notwendigen Reaktionen aus, um auf Wunden oder andere Verletzungen zu

reagieren.

Wenn aus den Phospholipiden der Zellmembran durch Phospholipase A2

oder durch Phospholipase C und Diacylglyceridlipase Arachidonsäure

freigesetzt wird, erfolgt sofort nach der Synthese ihre Umwandlung in eine

Reihe unterschiedlicher Stoffgruppen durch Einwirkung verschiedener

Enzyme(98) (Abb. 6).

16

Einleitung

Abb. 6: Schematische Darstellung der Prostaglandinsynthese (modifiziert

nach Smith et al.)(98).

So entsteht aus freier Arachidonsäure durch Prostaglandin H-Synthasen

(PGHS-1, und PGSH-2), bekannt auch als Cyclooxigenasen (COX-1 und

COX-2)(97), die intermediären PG-Endoperoxide Prostaglandin G2 (PGG2)

und Prostaglandin H2 (PGH2)(27), durch die Einwirkung von Lipoxygenasen

die Gruppe der Leukotrienen und durch Epoxygenase

Epoxyeicosatriensäure(24, 98). Aus PGH2 werden durch zelltypspezifische

Synthasen oder durch nichtenzymatische Transformation die biologisch

aktiven Prostanoide synthetisiert(27, 98). Zu diesen zählen sowohl die stabilen

Prostanoide, die Prostaglandine PGD2, PGE2, PGF2, PGJ2, als auch die

labilen Prostanoide, neben den schon erwähnten PG-Endoperoxiden auch

Prostazyklin (PGI2) und Thromboxan A2 (TxA2)(27). Die

Buchstabenbezeichnungen charakterisieren die Substitutionen an dem

Cyclopentanring des Moleküls. Die sterische Position der OH-Gruppe an C9

wird bei den Prostaglandinen F durch die Bezeichnung α oder β angegeben.

17

Einleitung

2.3.2. Rezeptoren und intrazelluläre Signaltransduktion

Die Prostaglandine, bis auf PGD2, vermitteln ihre Wirkung über die Bindung

an G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren (GPCR). Der Prostaglandin-D-

Rezeptor DP2 ist ein Chemokinrezeptor. Zusätzlich zu

Zelloberflächenrezeptoren binden PGI2 und ein Abbauprodukt von PGD2

auch an intrazelluläre Rezeptoren. Die Rezeptoren, entsprechend der

höchsten Affinität für die unterschiedlichen PG, werden in die fünf Hauptypen

DP, FP, IP, EP und TP unterteilt.

Die Bindung der PG an ihren Rezeptor kann entweder zu einem Anstieg oder

Abfall der zellulären cAMP-Konzentration führen oder zu einem Anstieg der

Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol-Konzentration und letztlich zum

Anstieg der zellulären Ca2+-Konzentration. Ein bekannter Signalweg für die

Wirkung von PGF2α erfolgt über die Bindung an seinem GPCR, was die

Aktivierung von Phospholipase C-β (PLCβ) und die Bildung von

Diacylglycerol und Inositoltriphosphat bewirkt(20). Es erfolgt die Proteinkinase

C (PKC)-abhängige Aktivierung von Raf(14, 29). Über andere Signalwege ist

wenig bekannt.

2.3.3. Abbau der Prostaglandine

Prostaglandine wirken vorwiegend autokrin oder parakrin. Ihre Halbwertszeit

ist kurz. Prostaglandin E und F werden rasch durch 15-Hydroxy-

Prostaglandin-Dehydrogenase zu den entsprechenden 15-Keto-

Verbindungen und in einem zweiten Schritt durch Prostaglandin-Δ13-

Reduktase zu 15-Keto-13,14-Dihydro-Derivaten überwiegend in der Lunge,

aber auch in der Niere, Milz, im Gastrointestinaltrakt und in der Placenta

metabolisiert und inaktiviert. Von einer injizierten Dosis werden bei einer

einzigen Lungenpassage ca. 95% metabolisiert. Der weitere Abbau der 15-

Keto-13,14-Dihydro-Derivaten erfolgt langsamer vorwiegend in der Leber. Es

18

Einleitung

dauert ca. 4 Minuten bei 37°C für den Abbau von PGI2 zum biologisch

inaktiven 6-Keto-PGF1α und ca. 30 Sekunden bei 37°C für die

nichtenzymatische Inaktivierung von TxA2(27).

2.3.4. Prostamide/Bimatoprost

Parallel zur Synthese von Prostaglandin H2 durch Oxidation der

Arachidonsäure wird aus dem Endokannabinoid Anandamid

(=Arachidonylethanolamid) durch Oxidation, katalysiert ausschließlich von

dem Enzym COX-2, über das Zwischenprodukt Prostamid G2, Prostamid H2

hergestellt(119). Dieses wird durch die unterschiedlichen Prostaglandin-

Synthasen zu einer Vielzahl von Prostamiden umgewandelt, unter anderem

zu Prostamid F2α(119). Prostamide sind Prostaglandin-Ethanolamide, die sich

von den Prostaglandinen durch Substitution einer Hydroxyl-Gruppe durch

eine Ethanolamid-Gruppe unterscheiden(119).

Ein synthetisches Prostamid F2α-Analogon ist Bimatoprost, (Lumigan™), das

sich als ein sehr effektives augeninnendrucksenkendes Therapeutikum

heraus gestellt hat(118, 119).

2.3.5. Wirkungen und medizinische Verwendung der Prostaglandine

Die Wirkung dieser Gewebshormone ist überaus vielfältig, da es einerseits

eine Vielzahl von verschiedenen Prostaglandinen gibt und andererseits für

ein Prostaglandin unterschiedliche Rezeptoren mit unterschiedlicher Wirkung

existieren. So bindet zum Beispiel PGE2 an vier verschiedene Rezeptoren,

EP1-EP4, die je nach Subtyp die Adenylatcyclase aktivieren, inhibieren oder

die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration erhöhen können. So werden durch

den gleichen Stimulus unterschiedliche, zum Teil sogar antagonistische

Reaktionen hervorgerufen. Im Kreislaufsystem erweitern PGE1 und PGE2 die

19

Einleitung

Gefäße und senken dadurch den peripheren Widerstand und den arteriellen

Blutdruck, während PGF2α den Blutdruck für mäßig steigern kann(61). Vor der

Geburt induzieren PGF2α und PGE2 beim Menschen die Uteruskontraktion

und die Zervixdilatation. Der Grund dieser Erweiterung ist ein Anstieg der

kollagenolytischen Aktivität durch Induktion von Metalloproteinasen in der

Cervix(111). Im Myokard und im Skelettmuskel werden Prostaglandine durch

Dehnung induziert(12, 112). PGF2α-Behandlung führt am Herzen zu einer

Hypertrophie der Herzmuskelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen in

vitro und in vivo bei Ratten(1, 46). Dementsprechend vielfältig sind auch die

Anwendungen von PGs in der Medizin.

Ihre natürlichen oder synthetischen Vertreter werden in der Geburtshilfe (zur

Einleitung von Wehen)(63, 72), der Augenheilkunde (Behandlung von

Glaukomen)(37, 42, 96), der Angiologie (bei arteriellen Gefäßverschlüssen oder

Gefäßverengungen)(34, 57, 70, 109) und Gastroenterologie (zur Ulkusprophylaxe

bei Gabe von nicht-steroidalen Antiphlogistika)(21, 33, 92) eingesetzt.

Bimatoprost wird in der Glaukomtherapie(65, 66, 118) und neuerdings zur

Anregung des Wimpernwachstums(17, 47, 120, 122) verwendet. Das primäre

Offenwinkelglaukom gehört weltweit zu einer der häufigsten Ursachen von

Erblindung(25). Mit der Einführung von Bimatoprost zur Senkung des erhöhten

intraokulären Augeninnendrucks wurden die medikamentösen

Behandlungsoptionen beim Glaukom wesentlich erweitert. Auf Grund seiner

potenten Augendruck senkenden Wirkung und der Tatsache, dass es nur

einmal am Tag als Augentropfen appliziert werden muss, zählt Bimatoprost

zu den am häufigsten verordneten Medikamenten beim Glaukom. Nach

Aufnahme zum größten Teil über die Sklera(118), erfolgt die

augeninnendrucksenkende Wirkung der Prostaglandine durch eine Erhöhung

des uveoskleralen(37, 51-53, 103) und des trabekulären(37) Kammerwasser-

abflusses. Bimatoprost entfaltet seine therapeutische Wirkung durch die

Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen(67, 68, 115, 116), die kollagene Fibrillen

abbauen, dadurch die intermuskulären Spalten im M. ciliares erweitern und

somit den Abflusswiderstand für das Kammerwasser erniedrigen(51-53, 103).

20

Einleitung

2.3.6. Prostaglandine und Haarwachstum

Hypertrichosis oder Trichomegalie ist durch ein erhöhtes Längen- und

Dickenwachstum der Haare, sowie durch Zunahme der Steifigkeit und der

Pigmentierung definiert. Eine Verdickung und Verlängerung der

Augenwimpern, sowie das Auftreten zusätzlicher Wimpernreihen, was früher

nur eine unerwünschte Nebenwirkung der Prostaglandin-Behandlung war(8,

26, 36, 89, 93, 110), kann heute medizinisch und kosmetisch zur Förderung des

Wimpernwachstums eingesetzt werden(17, 47, 120, 122).

Bei Glaukompatienten kann die Prostaglandinbehandlung zum verstärkten

Wachstum der Vellushaare in der Jochbein-Region führen(8), was für den

Betroffenen sehr störend sein kann. Auch ein verstärktes Wimpernwachstum

ist eher unerwünscht, weil dadurch das Aussehen des Patienten verändert

wird und zu psychischen Belastungen führen kann. Die Ursache und der

Wirkmechanismus des vermehrten Wimpern- und Haarwachstums sind noch

weitgehend unbekannt. Es wurde aber gezeigt, dass auch bei Mäusen

Prostaglandin F2α das Haar-(86) und Wimpernwachstum(105), infolge der

Induktion der Wachstumsphase in telogenen Follikeln und der Prolongation

der Anagenphase(41, 105), fördert. Aus diesem Grund eignet sich das

Mausmodell für Untersuchungen zur Erforschung der Wirkmechanismen

einer Prostaglandinbehandlung.

2.3.7. Aktivierung von mTOR durch Prostaglandine

Aus Untersuchungen am Rind ist bekannt, dass Prostaglandin F2α die Akt-

unabhängige Phosphorylierung von TSC2 und die Aktivierung von mTOR in

Corpus luteum-Zellen induzieren kann(4). Ebenso ist bekannt, dass die

21

Einleitung

PGF2α-induzierte Hypertrophie glatter Muskelzellen in Blutgefäßen mit der

Phosphorylierung von mTOR einhergeht(81).

2.4. Hypothese

Aus den vorliegenden Daten wurde die Arbeitshypothese formuliert, dass die

unter Bimatoprostbehandlung beobachtete Zunahme des Haarwachstums

über eine Aktivierung von mTOR in den Stammzellen der Haarfollikel

vermittelt wird.

Aus der Kenntnis des Wirkungsmechanismus von Bimatoprost auf das

Haarwachstum könnten neue Strategien entwickelt werden, um sowohl

unerwünschte Trichomegalie als Nebenwirkung einer Glaukombehandlung

zu vermeiden, als auch Haarwachstum zu stimulieren, um, z.B. die Folgen

von Haarausfall besser als bisher behandeln zu können.

22

Material und Methoden

3. Material und Methoden

3.1. Tiere und Tierhaltung

Weibliche C57BL/6J Mäuse unterschiedlichen Alters wurden von der Société

Janvier (Le Genest-St-Isle, Frankreich) bezogen. Die Mäuse wurden in

Gruppen von vier bis acht Tieren in Gemeinschaftskäfigen bei

automatisiertem zwölfstunden Hell/Dunkel Rhythmus gehalten. Der Raum

wurde kontinuierlich auf Temperatur und Luftfeuchtigkeit kontrolliert.

Trockennahrung und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

3.2. Qualitative und quantitative Bestimmung der haarzyklus-

abhängigen mTOR Aktivierung

3.2.1. Probengewinnung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Toluidin-

blau-Färbung zur Haarphasenbestimmung

Die Charakterisierung des Haarzyklus der in der vorgelegten Arbeit

verwendeten Kontrollmäuse erfolgte mit Hilfe Toluidinblau gefärbter

Semidünnschnitten. Es wurden 66 unbehandelte Mäuse in 11

unterschiedliche Altersgruppen unterteilt: d14, d17, d20, d23, d26, d30, d34,

d38, d41, d44 und d47 p.p. Dadurch wurde sichergestellt, dass ein

kompletter Haarzyklus untersucht werden konnte(58). Die Tiere wurden durch

zervikale Dislokation getötet. Jeweils ein 1 cm2 großes Stück dorsale

Rückenhaut wurde kaudal des Halses, über dem linken Schulterblatt,

chirurgisch abgetrennt (Region 1) (Abb. 7). Davon wurde je ein 2-4 mm

breiter Streifen parallel zur Ausrichtung der Haarreihen ausgeschnitten, in

ITO-Lösung (2,5% Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd, 0,01% Pikrinsäure

in 0,1 mM Cacodylat-Puffer) über Nacht fixiert und in Epon eingebettet. Die

restlichen Hautstückchen wurden für immunhistochemische Untersuchungen,

wie weiter unten beschrieben, aufgehoben. Von den Eponblöcken wurden

1µm dicke sagittale Schnitte hergestellt und mit Toluidinblau (Sigma,

23


Hannover, Deutschland) angefärbt. Die Bestimmung der Wachstumsphase

der Haarfollikel erfolgte durch die lichtmikroskopische Analyse der

Hautpräparate nach den Kriterien von Müller-Röver(58). Repräsentative

Schnitte wurden fotografiert (Mikroskop: Carl Zeiss, Software: AxioVision 4.0,

Göttingen, Deutschland).

Abb. 7: Schemazeichnung der Probengewinnung. Die Hautfläche von Region

1 wurde für alle Versuche dorsal, kaudal des Halses über dem linken

Schulterblatt entnommen (kleines weißes Rechteck). Diese wurde für

histologische/immunhistochemische Untersuchungen verwendet. Die

Hautfläche von Region 2 ist 2 cm2 groß und wurde weiter kaudal, unterhalb

des Ersten entnommen (großes weißes Rechteck) und für die quantitative

Bestimmung der p-mTOR Kinaseaktivität verwendet.

Alle histologischen Haarphasenbestimmungen für die folgenden Versuche

erfolgten mit Hilfe Hämatoxylin-Eosin gefärbter Paraffinschnitte. Dafür wurde

jeweils ein Stück Rückenhaut (Region 1) abgetrennt und in 4%iger

Paraformaldehyd-TBS-Lösung (TBS: Tris buffered saline, 0,05 M, pH 7,4;

6,61 g Salzsäure, 0,97 g Tris-Base, 8 – 10 g Natriumchlorid pro Liter Lösung)

über Nacht bei 4°C immersionsfixiert. Davon wurden, wie für die Herstellung

von Semidünnschnitten, Streifen ausgeschnitten und in Paraffin eingebettet.

Mit Hilfe eines Schlittenbahnmikrotoms (Leica, Nussloch, Deutschland)

24


wurden 5 μm dicke Sagittalschnitte hergestellt und im Anschluss daran

Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt. Unter dem Lichtmikroskop erfolgten die

Bestimmung der Wachstumsphase der Haarfollikel und das Fotografieren

repräsentativer Schnitte.

Alle Chemikalien wurden von der Firma Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

erworben, sofern nicht anders vermerkt.

3.2.2. Immunhistochemische Lokalisation von p-mTOR positiven Zellen

Um die Verteilung von p-mTOR in den Haarfollikeln in verschiedenen

Wachstumsphasen zu bestimmen, wurden Paraffinschnitte von der Haut

(Region 1, Abb. 7) von je drei Mäusen im Alter von 3, 4, 5, 6 und 7 Wochen

untersucht. Der Alter der Tiere wurde so ausgewählt, dass ein kompletter

Haarzyklus untersucht werden konnte(58). Zur Demaskierung vernetzter

Antikörperbindungsstellen wurden die Schnitte für 10 min in 10mM

Zitratpuffer, pH 6,0 (9 ml 0,1 M Zitronensäurelösung, 41 ml 0,1 M

Natriumcitrat in 450 ml gereinigtem Wasser) gekocht. Die Aktivität der

endogenen Peroxidase wurde durch Inkubation mit 3%iger

Wasserstoffperoxidlösung inhibiert. Um unspezifische Hintergrungfärbung zu

verhindern, wurden die Schnitte für 30 min mit Blockierungslösung [5%

Ziegenserum in TBST-Puffer (TBS mit 0,1% Tween 20)] inkubiert. Der

monoklonale Hase-α-Maus αPhospho-mTOR (Ser2448) Primärantikörper

(Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt am Main,

Deutschland) wurde in einer Verdünnung von 1:200 in Blockierungslösung

über Nacht bei 4°C zugegeben. Nach dreimal 5 min Waschen mit TBST-

Puffer wurde der biotinilierte Ziege-α-Hase Sekundärantikörper in der

Verdünnung von 1:200 (Vector Laboratories, Linaris, Wertheim-Bettingen,

Deutschland) in Blockierungslösung für 30 min zugegeben. Ungebundene

Antikörper wurden durch dreimaliges Spülen für je 5 min mit TBST-Puffer

entfernt. Um das Signal zu verstärken, erfolgte die Inkubation mit ABC-

25


Reagenzlösung (Vector Laboratories, Linaris, Wertheim-Bettingen,

Deutschland) nach Anweisung des Herstellers. Nach dreimaligem Spülen mit

TBST-Puffer erfolgte die Entwicklung durch Zugabe des chromogenen

Substrats 3,3´-Diaminobenzidin (DAB) (SERVA, Heidelberg, Deutschland) für

3 min. Die Farbreaktion wurde in destilliertem Wasser gestoppt. Nach

Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (Ethanol 70%-100%) und

Entfernung des Alkohols durch Xylol, wurden die Schnitte in Entellan (Merck,

Darmstadt, Deutschland) eingedeckt.

Die Verteilung von p-mTOR in den Haarfollikeln in jeder Wachstumsphase

wurde lichtmikroskopisch analysiert. Repräsentative Schnitte wurden

fotografiert.

3.2.3. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivierung mittels Kinase-

Aktivitätsassay

3.2.3.1. Probengewinnung mit Abtrennung der Epidermis von der

Dermis und Subkutis

Zur Erstellung eines quantitativen mTOR Aktivierungsprofils wurden je 6

unbehandelte Mäuse unterschiedlichen Alters (d14, d17, d20, d23, d26, d30,

d34, d38, d41, d44 und d47 p.p.) untersucht. Das Altersintervall wurde so

gewählt, dass ein kompletter Haarzyklus untersucht werden konnte(58).

Es wurden jeweils zwei Hautstückchen pro Maus entnommen (Abb. 7). Das

Erste (Region 1) diente der histologischen Haarphasenbestimmung und

wurde wie oben beschrieben verarbeitet. Das zweite Hautstückchen wurde

weiter kaudal, mittig, in einer Größe von 2 cm2 entnommen (Region 2) und

auf einer Silikonplatte mit der Epithelseite nach unten befestigt. Von diesem

Gewebestück wurde unter einem Stereomikroskop (Carl Zeiss, Göttingen,

Deutschland) nach grober Entfernung des unter der Subkutis liegenden

Bindegewebes, beginnend mit dem M. panniculus carnosus die Subkutis und

26


der größte Teil der Dermis, bis einschließlich der Talgdrüsen, abpräpariert

und zur Herstellung eines Proteinextrakts in flüssigem Stickstoff tiefgefroren

(Abb. 8). Um die Qualität der Präparation zu beurteilen, wurde das restliche

Epithelgewebe in 4%iger Paraformaldehyd-TBS-Lösung über Nacht fixiert,

mehrfach in TBS-Puffer ausgewaschen und die Hälfte zur Herstellung von 20

μm dicken Serienschnitten mit Hilfe eines Gefriermikrotoms (Leica, Nussloch,

Deutschland) verwendet. Nach H.E.-Färbung wurde eine mikroskopische

Kontrolle durchgeführt.

Abb. 8: Hämatoxylin-Eosin gefärbte histologische Schnitte (a) vor

Präparation (Paraffinschnitt, 5 µm), (b) nach Präparation (Gefrierschnitt, 20

µm) zur Darstellung des Gewebes, das zur Gewinnung des Proteinextraktes

für die quantitative Bestimmung der p-mTOR Kinase Aktivität verwendet

wurde. Das Gewebe besteht aus der Dermis, einschließlich der Talgdrüsen,

der angrenzenden Subkutis und dem Musculus panniculus carnosus.

[Balken: 50 µm]

Es wurden nur Proben für die Proteinisolierung verwendet, die in dem

Kontrollschnitt nach Präparation (Abb. 8 b) weniger als 10% Talgdrüsen, in

27


Relation zur Zahl der Haarfollikel, enthielten. Durch die Präparation wurde

sichergestellt, dass 1) durch die im Epithel befindlichen Stammzellen, die

selbst eine hohe mTOR-Aktivität aufwiesen, eine Aktivitätsänderung von

mTOR, abhängig von der Haarzyklus, nicht übersehen werden konnte und 2)

der Bulbus und die „bulge region“ der Haarfollikel hinsichtlich der mTOR

Aktivierung untersucht werden konnten.

Das in flüssigem Stickstoff tiefgefrorene Gewebe wurde in gefrorenem

Zustand gemörsert und in TBST-Puffer aufgenommen. Zur Vermeidung der

Proteindegradation wurden dem TBST-Puffer 4 μl pro ml eines Protease-

Inhibitor Cocktails (20 µl Aprotinin 10 mg/ml, 100 µl Leupeptin 5 mg/ml, 100

µl 10 mg/ml Pepstatin A, 200 µl Glycerin pro ml Lösung) und 20 μl pro ml

PMSF zugefügt (alle Protease-Inhibitoren: Sigma, Hannover, Deutschland).

Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben bei 11.000

rpm/min in einer Kühlzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 4°C

abzentrifugiert. Im Überstand wurde die Proteinkonzentration mit der

Methode nach Bradford (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) nach

Anweisung des Herstellers bestimmt. Der Proteinextrakt diente der

quantitativen Bestimmung der mTOR Aktivierung.

3.2.3.2. Kinase-Aktivitätsassay

Um die Aktivierung von mTOR quantitativ zu bestimmen und ein mTOR

Aktivierungsprofil zu erstellen, wurde ein Kinase-Aktivitätsassay (K-LISA

mTOR™ Activity Kit, Calbiochem, Merck, Darmstadt, Deutschland) nach

Anweisung des Herstellers angewandt.

Der Test funktioniert nach dem Prinzip eines Enzyme-linked immuno sorbent

Assay´s (ELISA), der als spezifisches Substrat für mTOR ein p70S6K-GST

Fusionsprotein verwendet. Das mTOR Substrat wurde in den Wells einer mit

Glutathion beschichteten 96 Well-Platte gebunden. Für jeden Assay zur

quantitativen mTOR Aktivitätsbestimmung wurde von jeder Probe die gleiche

28


Proteinmenge eingesetzt, wobei man sich an der Probe mit der niedrigsten

Proteinkonzentration orientierte. Das eingesetzte Maximalvolumen betrug 50

μl, die eingesetzte Proteinmenge 80-130 µg. Damit die Ergebnisse des

Kinaseassays untereinander vergleichen werden können, wurde eine

Verdünnungsreihe der mitgelieferten Standardlösung als Doppelbestimmung

mitgeführt. Die mTOR-haltige Probe wurde zusammen mit ATP in den Wells

der Platte bei 30°C für 30 min inkubiert. Während dieser Zeit erfolgt die

Phosphorylierung von p70S6K an Thr389. Anschließend wurde die

Phosphorylierung mit einem Anti-p70S6K-T389 Antikörper (Verdünnung

1:1000) nachgewiesen. Nach Entfernung ungebundenen Antikörpers,

erfolgte die Detektion von gebundenen Anti-p70S6K-T389 Antikörpern durch

ein HRP-Antikörper-Konjugat und TMB Substrat. Die Farbreaktion wurde

nach ca. 10-20 min durch Zugabe von Elisa Stopplösung, die einen

Farbumschlag von blau nach gelb bewirkt und dadurch die Sensitivität des

Assay erhöht, beendet. Die relative mTOR Aktivität wird durch Messung der

Absorption bei den Wellenlängen 450 nm und 590 nm mit Hilfe eines ELISA-

Gerätes (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Deutschland) bestimmt.

3.3. Hemmung der haarzyklusabhängigen mTOR Aktivierung durch

Rapamycin

Um zu bestimmen, wie die Aktivierung von mTOR den Wachstumszyklus der

Haarfollikel beeinflusst, wurde Mäusen mit telogenen Haarfollikeln der

spezifische mTOR Inhibitor Rapamycin verabreicht, und seine Wirkung auf

den Haarzyklus analysiert.

3.3.1. Rapamycin

Rapamycin (LC Laboratories, Woburn, MA) wurde in einer Stammlösung von

10 mg/ml in absolutem Ethanol angesetzt(13). Die Gebrauchslösung von 0,05

μg/µl wurde durch Verdünnen der Stammlösung in 5% Tween 80/PEG-400 in

29


gereinigtem Wasser erhalten(13). Diese wurde den Mäusen in einer Dosis von

0,5 μg Rapamycin pro Gramm Körpergewicht pro Tag verabreicht(79). Die

Vehikellösung hatte dieselbe Zusammensetzung, enthielt aber kein

Rapamycin.

3.3.2. Rasur

Die Rückenhaut aller behandelten Mäuse wurde mit einem handelsüblichen

elektrischen Rasierapparat am Anfang jedes Versuches unter Anästhesie

rasiert. Die Anästhesie erfolgte durch eine intraperitoneale Injektion eines

Cocktails von Ketamin/Xylazin (90 µg Ketamin und 10 µg Xylazin pro Gramm

Körpergewicht). Da das Ziehen an den Haaren zur Induktion der

Anagenphase und somit zu verfälschten Ergebnissen führen kann, wurde die

Rasur besonders vorsichtig durchgeführt, die Haut sofort auf eventuelle

Verletzungen untersucht und auf Farbunterschiede der Rückenhaut nach

einem Tag geachtet. Tiere mit Hautverletzungen wurden von weiteren

Versuchen ausgeschlossen. Zeigte sich bei der Rasur eine punkt- oder

fleckförmige Dunkelfärbung bzw. eine Veränderung der Rückenhautfarbe, die

auf Probleme in der Tierhaltung hindeutete(107), wurde es dokumentiert und

die entsprechenden Hautstellen weder makroskopisch noch mikroskopisch

weiter untersucht.

3.3.3. Bestimmung der Wirkung von Rapamycin auf den Haarzyklus

Die Wirkung von Rapamycin auf den Haarzyklus wurde an insgesamt 32 drei

Wochen alten Mäusen mit Haare im Telogen, untersucht. Die Mäuse wurden

in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 wurde zwei Wochen lang, Gruppe 2 vier

Wochen lang behandelt. Beide Gruppen wurden weiterhin in je eine Vehikel-

und Rapamycingruppe unterteilt. Vierundzwanzig Stunden nach Rasur und

30


fotografischer Dokumentation der Rückenhaut wurde die Behandlung

begonnen. Nach täglichem Wiegen der Mäuse wurde die Vehikel- bzw.

Rapamycinlösung [Konzentration: 0,5 µg/g Körpergewicht(79)] einmal am Tag

intraperitoneal injiziert. Um festzustellen, ob die Inhibierung von mTOR den

Eintritt telogener Haarfollikel in den Haarzyklus verhindern kann, wurden die

Tiere der Gruppe 1 (Vehikelkontrollen n=6, Rapamycin-Behandlungsgruppe

n=6) für zwei Wochen behandelt und anschließend die Rückenhaut

fotografiert. Die Tiere der Gruppe 2 (Vehikelkontrollen n=10, Rapamycin-

Behandlungsgruppe n=10) wurden vier Wochen lang behandelt und der

Rücken der Mäuse, während der gesamten Dauer der Behandlung, zweimal

pro Woche fotografiert (Abb. 9).

Abb. 9: Schema für die Rapamycinbehandlung. Schematische Darstellung

der zwei- und vierwöchigen Behandlung von Vehikel- bzw.

Rapamycingruppen. Dicke horizontale Pfeile: Behandlungsdauer (einmal

täglich Injektion von Vehikel- bzw. Rapamycinlösung), X: Tötung der Tiere.

Der erste Behandlungstag ist mit dem vertikalen Pfeil markiert.

Nach der Behandlung wurden die Tiere getötet. Es wurde jeweils ein

Hautstückchen aus Region 1 (Abb. 7) entnommen und in Paraffin

31


eingebettet. Für jede Maus wurden an drei bis acht H.E. gefärbten

Sagittalschnitten je 60 (Gruppe 1 - zweiwöchige Behandlung) bzw. 28

(Gruppe 2 - vierwöchige Behandlung) Haarfollikel mit sichtbarer dermaler

Papille den unterschiedlichen Zyklusphasen zugeordnet, die Anzahl der

Follikel pro Phase bestimmt und damit der prozentuale Anteil jeder

Wachstumsphase errechnet.

3.4. Bestimmung der Wirkung von Bimatoprost auf die mTOR

Aktivierung

3.4.1. Bimatoprost

Bimatoprost ist ein synthetisches Prostamidanalogon, welches in einer

0,03%igen ophthalmologischen Lösung unter dem Namen Lumigan®

(Allergen, Irvine, CA) erhältlich ist. Sowohl Bimatoprost, als auch sein Vehikel

(NaCl, Na2HPO4, Zitronensäure, Benzalkoniumchlorid als

Konservierungsmittel in gereinigtem Wasser) wurden von der Firma Allergan

für die Experimente bereitgestellt.

Auf die rasierte Rückenhaut der Mäuse wurden einmal täglich je 2 Tropfen

Bimatoprost (40-50 μl)(23) aufgebracht und gründlich eingerieben.

3.4.2. Effekt von Bimatoprostbehandlung auf die mTOR Aktivierung

Da Bimatoprost einen induktiven Effekt auf den Eintritt ruhender Haarfollikel

(Telogen) in die Wachstumsphase (Anagen) hat(105), wurde untersucht, ob

diese durch Aktivierung von mTOR in Haarfollikeln im Telogen vermittelt

wird. Die Behandlung mit Bimatoprost führt auch zur Verdickung und

Verlängerung der Vellushaare beim Menschen(8). Da diese Vorgänge im

Anagen stattfinden(99), wurde die Aktivierung von mTOR in Haarfollikeln auch

im Anagen untersucht. Es wurden zwei Altersgruppen untersucht: d26

(Anagen) bzw. d56 p.p. (Telogen). Nach Rasur wurde in jeder Altersgruppe

je vier Mäusen Vehikellösung auf den Rücken aufgebracht, je sechs erfuhren

eine einmalige Bimatoprost Behandlung und je vier blieben unbehandelt

32


(Abb. 10). Da die Aktivierung von mTOR über eine posttranslationale

Modifikation (Phosphorylierung)(62) rasch erfolgt, wurden die Tiere nach 2h

getötet und von jeder Maus je ein Hautstückchen der Region 1 (Abb. 7) in

Paraffin eingebettet und phosphoryliertes mTOR immunhistochemisch

dargestellt.

Abb. 10: Schema für die einmalige Bimatoprostbehandlung. Schematische

Darstellung der Behandlung von Tieren im Alter von d26 und d56. In beiden

Altersgruppen gab es je drei Untergruppen: Unbehandelt, Vehikel und

Bimatoprost. Horizontale Pfeile: Behandlungsdauer (einmalige

Verabreichung von Vehikel- bzw. Bimatoprostlösung), X: Tötung der Tiere.

Der Zeitpunkt der Verabreichung der Bimatoprost bzw. Vehikellösung ist mit

dem vertikalen Pfeil markiert.

In einem weiteren Versuch wurde der Einfluss von Bimatoprost auf die

mTOR Aktivierung nach zweitägiger Behandlung in allen Wachstumsphasen

untersucht. Dafür wurden je vier Mäuse an d28 (Anagen), d40 (Katagen) und

d54 (Telogen) behandelt. Die entsprechenden Kontrollgruppen blieben

unbehandelt (Abb. 11). Nach Tötung der Mäuse wurde je ein Stück von der

dorsalen Haut analog zu der vorher beschriebenen Prozedur präpariert,

eingebettet und immunhistochemisch markiert.

33


Abb. 11: Schema für die zweitägige Bimatoprostbehandlung. Schematische

Darstellung der Behandlung von Tieren im Alter von d28, d40 und d54 (zu

Anfang der Behandlung). In jede Altersgruppe wurden unbehandelte

Kontrollen mitgeführt. Dicke horizontale Pfeile: Behandlungsdauer (einmal

täglich Injektion von Vehikel- bzw. Rapamycinlösung), X: Tötung der Tiere.


3.5. Einfluss von Rapamycin auf die durch Bimatoprost vermittelte

Initiation der Anagenphase

Wenn Bimatoprost die Initiation von Anagen in Telogenfollikeln durch eine

Aktivierung von mTOR bewirkt, dann sollte dieser Effekt durch die

zusätzliche Gabe von Rapamycin inhibiert werden können. Diese Hypothese

wurde durch Doppelbehandlung mit Bimatoprost (2 Tropfen pro Tag pro Tier)

und Rapamycin [Injektionslösung (Gebrauchslösung 0,1 µg/µl), Dosis 0,5 µg

pro Gramm Körpergewicht] überprüft. Dafür wurden 29 acht Wochen alte

Mäuse in vier Gruppen mit je 7 bis 8 Tieren eingeteilt und für 3 Wochen

behandelt. Gruppe 1 erhielt gleichzeitig Bimatoprostvehikel und

Rapamycinvehikel [Ve(B)+Ve(R)] (n=7), Gruppe 2 Bimatoprostvehikel und

34


Rapamycin [Ve(B)+Rap] (n=7), Gruppe 3 wurde mit Bimatoprost behandelt

bei gleichzeitiger Gabe von Rapamycinvehikel [Bi+Ve(R)] (n=7) und bei den

Tieren der Gruppe 4 erfolgte die Doppelbehandlung mit Bimatoprost und

Rapamycin (Bi+Rap) (n=8) (Abb. 12). Während der gesamten Dauer der

Behandlung wurde der Rücken der Tiere zweimal pro Woche fotografiert.

Nach der Behandlung wurden die Tiere getötet, je ein Hautstückchen aus der

Region 1 entnommen und in Paraffin eingebettet. Für jede Maus wurden an

drei bis acht H.E. gefärbten Sagittalschnitten je 24 Haarfollikel mit sichtbarer

dermaler Papille den unterschiedlichen Zyklusphasen zugeordnet, die Anzahl

der Follikel pro Phase bestimmt und damit der prozentuale Anteil jeder

Wachstumsphase errechnet. Um eine eventuelle Änderung der p-mTOR

Expression zu untersuchen, wurden zusätzlich Paraffinschnitte

immunhistochemisch untersucht.

Abb. 12: Schema für die Doppelbehandlung mit Bimatoprost und Rapamycin.

Schematische Darstellung der dreiwöchigen Behandlung (einmal täglich) mit

Bimatoprost (Bi), Rapamycin (Rap) bzw. den wirkstofffreien Vehikellösungen:

Bimatoprostvehikel [Ve(B)] und Rapamycinvehikel [Ve(R)]. Dicke horizontale

Pfeile: Behandlungsdauer (einmal tägliche Behandlung), X: Tötung der Tiere.


35


3.6. Statistische Analyse

Für den Vergleich der p-mTOR Aktivität in den verschiedenen Haarphasen

mit derjenigen im Telogen wurde die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA),

und der anschließende Dunnett´s Test verwendet. p-Werte kleiner als 0,05

sind statistisch signifikant.

36

Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1. Haarzyklus der C57Bl/6 Kontrollmäuse

Bei den 14 Tage alten Tieren befanden sich alle Haare synchron im

Endstadium der Morphogenese (Abb. 13 a). Der erste Haarzyklus begann an

d17 bei Mäusen, bei denen die Haare morphologisch eine synchronisierte

Katagenphase (Katagen I-VI) aufwiesen (Abb. 13 b). Makroskopisch war für

das Katagen die schwarze Hautfarbe der Tiere charakteristisch. An d20

waren die Haarfollikel noch im Katagen (Katagen VII-VIII) (Abb. 13 c). In

dieser Studie wurde das Katagen in frühes Katagen (Katagen I-VI) und in

spätes Katagen (Katagen VII-VIII) unterteilt. An d23 befanden sich die Haare

im Telogen (Abb. 13 d), makroskopisch sichtbar an der rosa Hautfarbe. An

d26 war der Übergang in die frühe Anagenphase (Anagen I) zu beobachten

(Abb. 13 e). Das Anagen verlief bei den einzelnen Tieren unterschiedlich. An

d30–38 hatten die Haarfollikel bei einigen Mäusen gerade die Dermis-

Subkutis-Grenze erreicht (Anagen II) (Abb. 13 f), bei anderen waren die

Follikel in dieser Zeit bis zum Musculus panniculus carnosus vorgewachsen,

wobei die innere epitheliale Wurzelscheide (IRS) im Bulbusbereich voll

ausgebildet war und der Bulbus seine maximale Größe erreicht hatte

(Anagen IIIc-IV) (Abb. 13 g). Das makroskopische Kennzeichen des Eintrittes

in die Wachstumsphase war die Graufärbung der Haut ab dem Anagen III-IV.

An d41 war bei allen Tieren das Stadium der mittleren bis späten

Anagenphase (Anagen IV-VI) erreicht, das sich durch das weitere

Vorwachsen der IRS und des Haarschaftes nach distal auszeichnet (Abb. 13

h). Die Anagenphase war zwischen d41 und 44 abgeschlossen. In der

vorgelegten Arbeit wurde die Anagenphase in frühes Anagen (Anagen I-II),

mittleres Anagen (Anagen III-IV) und spätes Anagen (Anagen V-VI) unterteilt.

An d44 waren die Haare bei den meisten Tieren im Katagenstadium

(Katagen III-VI), am Beginn des neuen Zyklus (Abb. 13 i). An d47 waren die

Haarfollikeln im späten Katagen (Katagen VII-VIII) oder bereits im Telogen.

37

Ergebnisse

Abb. 13: Zeitskala für den Haarzyklus der C57Bl/6 Kontrollmäuse.

(Semidünnschnitte, 1 µm, Toluidinblau-Färbung). (a) Morphogenese, (b)

Katagen I-IV, (c) Katagen VI-VIII, (d) Telogen, (e) Anagen I, (f) Anagen II, (g)

Anagen IIIc-IV, (h) Anagen IV-VI, (i) Katagen III-IV, (j) Telogen. [Balken = 100

µm]

38

Ergebnisse

4.2. Analyse der mTOR Aktivierung im Haarzyklus

4.2.1. Lokalisation von p-mTOR in den Wachstumsphasen

p-mTOR war immunhistochemisch während des gesamten Haarzyklus in den

Haarfollikeln nachweisbar. Auch das Stratum germinativum der Epidermis

wies immer zahlreiche markierte Zellen auf.

Telogen

Im Telogen waren vereinzelt p-mTOR+ Zellen in der „bulge region“ der

Haarfollikel detektierbar (Abb. 14).

Abb. 14: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut

mit Haarfollikel im Telogen (Paraffinschnitt, 5 µm). In der „bulge region“

(Pfeilspitze) erkennt man eine p-mTOR exprimierende Zelle (Pfeil). [Balken =

20 µm]

39

Ergebnisse

Anagen

Die Anzahl der p-mTOR+ Zellen stieg in der frühen Anagenphase (Anagen I-

II) deutlich an (Abb. 15).

Fig. 15: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut

mit Haarfollikeln im frühen Anagen (Anagen I-II) (Paraffinschnitte, 5 µm).

Nahezu alle Zellen der „bulge region“ (a, b, Pfeilspitzen) und der „secondary

germ“ in der äußeren epithelialen Wurzelscheide (outer root sheath, ORS)

(a-c, Pfeile) exprimieren p-mTOR. [Balken = 50 µm]

40

Ergebnisse

In der „bulge region“ waren nahezu alle Zellen des äußeren Bereichs

markiert und auch die angrenzenden Zellen der äußeren epithelialen

Wurzelscheide (ORS) (vor allem im Bereich der „secondary germ“) waren

nahezu alle p-mTOR+. Die dermale Papille blieb vollständig unmarkiert.

Im Übergang zum Anagen III und der Ausbildung der IRS änderte sich das

Verteilungsmuster. Zwar war auch in diesem Stadium der Großteil der Zellen

der „bulge region“ p-mTOR+, zusätzlich waren aber alle Zellen der IRS

markiert (Abb. 16). Die dermale Papille blieb auch in dieser

Wachstumsphase ungefärbt. Die ORS (mit Ausnahme der „bulge region“)

war ebenfalls vollständig unmarkiert.

Fig. 16: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut

mit Haarfollikel im Anagen III (Paraffinschnitt, 5 µm). Neben Zellen der „bulge

region“ (Pfeilspitze) sind auch Zellen der inneren epithelialen Wurzelscheide

(inner root sheath, IRS) (Pfeile) p-mTOR+, während die Zellen der ORS in

diesem Stadium ungefärbt bleiben. [Balken = 50 µm]

41

Ergebnisse

Die Verteilung von p-mTOR+ Zellen in der „bulge region“, in der dermalen

Papille und in der ORS änderte sich während späteren Anagenphasen kaum

(Abb. 17).

Abb. 17: (a)-(c) Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der

Rückenhaut mit Haarfollikeln im mittleren und späten Anagen (Anagen IV-VI)

42

Ergebnisse

(Paraffinschnitte, 5 µm). Nahezu alle Zellen der „bulge region“ (a, Pfeilspitze)

und der IRS (b, c, schwarze Pfeile) exprimieren von der Höhe der Bulbus bis

zu einer deutlich markierten Grenze (c, weiße Pfeile), die etwa auf der Hälfte

zwischen Bulbus und „bulge region“ liegt, p-mTOR. Die ORS ist ungefärbt.

(d) Darstellung der Trichohyalingranulae (d, schwarze Pfeile) durch

Nachfärbung des Paraffinschnittes von (c) mit Eosin. Der Vergleich von (c)

mit (d) zeigt die Kolokalisation von p-mTOR mit den eosinophilen

Trichohyalingranulae in der IRS. [Balken = 50 µm]

Mit Fortschreiten der IRS-Entwicklung während der anschließenden

Anagenstadien (Anagen IV-VI) wurde die p-mTOR Expression in einem

Bereich detektiert, der sich vom Bulbus bis etwa zur Hälfte zwischen Bulbus

und „bulge region“ erstreckte. In diesem Bereich der IRS wurden eosinophile

Trichohyalingranulae nachgewiesen. Weiter distal war die IRS unmarkiert.

Katagen

In der frühen Katagenphase (Katagen I-VI) drehte sich diese Verteilung um

(Abb. 18).

43

Ergebnisse


in Haarfollikeln im frühen Katagen (Katagen I-VI) (Paraffinschnitt, 5 µm). In

diesen Stadien sind noch p-mTOR+ Zellen der IRS, vor allem in der Nähe der

Bulbus (weiße Pfeile) erkennbar. Mit Fortschreiten des Katagens werden

immer weniger IRS-Zellen markiert und auch die Intensität der Markierung

nimmt ab. Die Zellen der ORS, die an die „bulge region“ angrenzen

(zwischen den schwarzen Pfeilen) sind p-mTOR+. Die „bulge region“ ist nicht

gefärbt. [Balken = 20 µm]

44

Ergebnisse

Die Zellen der „bulge region“ waren unmarkiert, wohingegen die distalen

Zellen der ORS, ab etwa der Mitte zwischen Bulbus und „bulge region“, p-

mTOR exprimierten. Die Zellen der IRS blieben im frühen Katagen in der

Nähe der Bulbus markiert. Im Gegensatz zum Anagen waren nun vereinzelte

Zellen der dermalen Papille markiert. Im weiteren Verlauf, einhergehend mit

einer Distalbewegung des Follikels, blieb die „bulge region“ zunächst

unmarkiert und nur Zellen der ORS, die proximal der „bulge region“ lagen,

zeigten eine intensive p-mTOR Markierung. Mit Fortschreiten der

Regressionsphase (Katagen VII) näherte sich diese intensiv markierte

Region kontinuierlich der „bulge region“ (Abb. 19).


mit Haarfollikeln im späten Katagen (Katagen VII-VIII) (Paraffinschnitte, 5

µm). Die Zellen der ORS, die an der „bulge region“ angrenzen sind sehr

intensiv gefärbt (schwarze Pfeile in a, b). Am Ende der Katagenphase sind

die Zellen der „bulge region“ nahezu alle p-mTOR+ (weißer Pfeil in b) und es

treten auch einzelne intensiv markierte Zellen im Bereich der dermalen

Papille auf (Pfeilspitze in b). [Balken = 50 µm]

Die ORS-Zellen der gegenüber liegenden Seite waren deutlich weniger

intensiv markiert. Am Ende des Katagens (Katagen VIII) waren nahezu alle

45

Ergebnisse

Zellen der „bulge region“ p-mTOR+ und in der dermalen Papille einzelne

intensiv markierte Zellen detektierbar (Abb. 19 b).

4.2.2. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivität in verschiedenen

Phasen des Haarzyklus

Die Quantifizierung der mTOR Aktivität, durch eine modifizierte ELISA-

Methode, zeigte deutliche phasenkorrelierte Aktivitätsänderungen. Die

höchste Aktivität wurde im Anagen bestimmt, zum Katagen hin nahmen die

Werte ab, und reduzierten sich im Telogen bis an die Nachweisgrenze (Abb.

20).

Abb. 20: Veränderungen der mTOR Aktivität in den verschiedenen

Wachstumsphasen des Haarzyklus, dargestellt als Vielfaches der Aktivität

der Telogenphase (Statistik: einfaktorieller ANOVA, anschließend Dunnett´s

Test, signifikanter Unterschied zum Telogen: * p≤0,01, ** p≤0,005, ***

p≤0,0001).

46

Ergebnisse

Die relative mTOR Aktivität wurde als Vielfaches des Mittelwertes der im

Telogen gemessenen Aktivität (n=6) angegeben.

Im Endstadium der Morphogenese war der Mittelwert der mTOR Aktivität mit

15,31±1,26 (m.a.±SEM) gegenüber dem Telogen signifikant erhöht (n=6;

p≤0,0001). Zu Beginn des ersten Haarzyklus, im frühen Katagenstadium

(Katagen I-II), nahm dieser Wert auf 10,98±1,46 (n=6; p≤0,005) ab, war aber

noch signifikant gegenüber der Telogenphase erhöht. In der späten

Katagenphase (Katagen VII-VIII) wurde ein Wert von 4,64±1,18 (n=6)

ermittelt, der Unterschied zum Telogen war jedoch nicht signifikant. Gleiches

galt für das Anagen I (2,36±1,12; n=5). An d30, als sich die Haarfollikel in

den Anagenstadien II-III befanden, steigerte sich die Aktivität auf 9,45±3,38

(n=6; p≤0,005). Als die meisten Tiere das Anagenstadium III-IV erreicht

hatten, lag die mTOR Aktivität bei 14,21±1,65 (n=5, p≤0,0001) an d34, bzw.

bei 11,45±0,82; (n=4; p≤0,005) an d38. Sowohl an d30, als auch an d34 und

d38, war der Unterschied zum Telogen signifikant. In den Anagenstadien IV-

VI lag der Mittelwert bei 10,0±0,44 (n=4; p≤0,01). Auch im frühen Katagen

(Katagen I-VI) wurde ein Wert von 9,46±2,99 (n=6; p≤0,005) ermittelt. Im

Anagen IV-VI, sowie in den frühen Katagenstadien war die mTOR Aktivität

gegenüber dem Telogen signifikant erhöht. Im späten Katagen- (Katagen VII-

VIII) bis zum Telogen sank die Aktivität auf einem Mittelwert von 3,81±1,11

(n=6), der Unterschied zum Telogen war nicht signifikant.

4.3. Einfluss von Rapamycin auf den Haarzyklus

Der Vergleich Rapamycin behandelter Mäusen mit Vehikelkontrollen zeigte in

beiden Gruppen (drei Wochen alte Tiere, Behandlung der Tiere der Gruppe

1: zwei Wochen, Gruppe 2: vier Wochen), dass der spezifische mTOR

Inhibitor Rapamycin einen Einfluss auf den Haarzyklus ausübt. Bei

unbehandelten Kontrollmäusen, das heißt ohne Verabreichung von

Rapamycin- oder Vehikellösung, verlief der Haarzyklus im Alter von drei bis

47

Ergebnisse

sieben Wochen synchron, wie vorher beschrieben. Nach einem kurzen, ca.

drei Tage andauernden Telogen um d23, traten die Haarfollikel spontan in

das Anagen ein, makroskopisch durch eine Graufärbung der Haut nach ca.

eine Woche sichtbar.

In der Gruppe 1 Vehikelkontrollen (das heißt Injektion von Vehikellösung

einmal täglich für zwei Wochen) zeigten am Ende des Versuches acht von

neun Tiere Haarwachstum (Abb. 21).

Abb. 21: Änderung der Hautfarbe nach zweiwöchiger Vehikel/Rapamycin -

Behandlung. Es wurde repräsentativ aus der Vehikelkontroll- bzw.

Rapamycin-Behandlungsgruppe je ein Tier ausgewählt und die Rückenhaut

am Anfang (d0 = 20 Tage alt) und am Ende des Versuches (d15 = 36 Tage

alt) gegenübergestellt. Die mit Rapamycin behandelten Mäuse hatten am

Ende des Experimentes keine Haare am Rücken, im Gegensatz zu denen,

die mit Vehikellösung behandelt wurden.

48

Ergebnisse

Bei einer Maus war die Haut dunkelgrau gefärbt, was auch als Zeichen für

den Eintritt der Haarfollikel ins Anagen gewertet wurde. Im Gegensatz dazu

war bei Rapamycin behandelten Mäusen kein Haarwachstum sichtbar. Bei

einem von zehn Tieren wurde keine Änderung der Hautfarbe beobachtet

(rosa), fünf zeigten eine Verfärbung nach Hellgrau und bei vier Mäusen

wurde die Haut dunkelgrau. Die histologische Analyse ergab, dass die

Haarfollikel der Vehikelkontrollen alle das späte Anagen (Anagen V-VI)

erreicht hatten, wohingegen sich die Follikel der behandelten Mäuse im

frühen und mittleren Anagen (Anagen I-IV) oder späten Anagen (Anagen V-

VI) befanden (Abb. 22).

Abb. 22: Histologische Kontrolle der Haut (H.E.-Färbung, Paraffinschnitt, 5

µm) nach zwei wöchiger Vehikel/Rapamycin Behandlung. Es wurde jeweils

49

Ergebnisse

eine repräsentative Maus aus der Vehikelkontroll- bzw. Rapamycin-

Behandlungsgruppe ausgewählt. (a) Die Haarfollikel des Tieres aus der

Vehikelgruppe sind in Anagen V-VI. Die Follikel sind bis zum M. panniculus

carnosus vorgewachsen, die innere epitheliale Wurzelscheide (IRS) ist

ausgebildet. (b) Die Haarfollikel der Maus aus der Rapamycingruppe

befinden sich in Anagen IIIa. Die Follikel sind erst gerade über die Grenze

Dermis-Subkutis getreten, die ersten Anzeichen der IRS-Bildung sind zu

beobachten. [Balken = 100 µm]

In Übereinstimmung zur optischen Beurteilung der Hautfarbe als Hinweis auf

die Haarphasen, ergab die histologische Bestimmung der prozentualen

Anteile der einzelnen Haarphasen bei den behandelten Mäusen folgende

Ergebnisse: 9,7%±9,7 für Anagen I-II, 50,3%±16,6 für Anagen III-IV und

40,0%±16,3 für Anagen V-VI (Abb. 23).

Abb. 23: Prozentuale Verteilung der Haarphasen nach zweiwöchiger

Vehikel/Rapamycin Behandlung. Bei den Tieren der Vehikelkontrollgruppe

waren alle Haarfollikel im späten Anagen (Anagen V-VI), während bei den

mit Rapamycin behandelten Tieren ein Großteil der Haarfollikel sich noch im

frühen und mittleren Anagen (Anagen I-IV) befanden.

50

Ergebnisse

In Gruppe 2 (Behandlung der Tiere für vier Wochen) kam es in der

Rapamycin-Behandlungsgruppe (n=5) zu einer verzögerten Änderung der

Hautfarbe der Tiere von rosa nach grau und dementsprechend zum

verspäteten Haarwachstum im Vergleich zu den Kontrollen (n=4) (Abb. 24).

Abb. 24: Änderung der Hautfarbe während der vierwöchigen

Vehikel/Rapamycin - Behandlung. Es wurde repräsentativ aus beiden

Gruppen je ein Tier ausgewählt und die Rückenhaut an verschiedenen

Behandlungstagen gegenübergestellt. Bei der Maus aus der

Rapamycingruppe, erfolgte das Haarwachstum etwa 7 Tage später, als bei

der Vehikelkontrolle.

Die Analyse der Hautfarbe (Tab. 1.) zeigte bei den Vehikelkontrollen eine

Änderung der Hautfarbe nach hellgrau frühestens an d11 des Versuches und

spätestens an d18. Bei den Rapamycin behandelten Tieren trat diese

Farbänderung zwischen d18 und d24 auf. Eine dunkelgraue bis schwarze

Färbung der Haut war bei den Vehikelkontrollen frühestens an d14 zu sehen,

51

Ergebnisse

bei den mit Rapamycin behandelten Mäusen deutlich später an d21. Haare

waren bei den Vehikelkontrollen erstmals an d18 sichtbar, ab d24 hatten alle

Kontrolltiere ein komplettes Fell. Bei der Rapamycingruppe war

Haarwachstum erst an d24 der Behandlung sichtbar. Am Ende des

Versuches, nach 28d Behandlung, hatten nur drei behandelte Tiere ein

komplettes Fell, zwei wiesen noch kahle Stellen auf.

Tab. 1.: Semiquantitative Auswertung der Änderung der Hautfarbe während

der vierwöchigen Vehikel/Rapamycin Behandlung. Für jede Maus aus beiden

Gruppen wurde für jeden Behandlungstag der Farbe der Rückenhaut nach

folgenden Kriterien eine Zahl zwischen 1 und 4 zugeordnet: 1 – rosa Haut, 2

– hellgraue Haut, 3 – dunkelgraue/schwarze Haut, 4 – Haut, aufgrund des

kompletten Fellwachstums nicht mehr sichtbar. Jeder Zahl wurde in der

Tabelle ein bestimmter Grauton zugeordnet.

Der Vergleich der Hautfarbe der Vehikelkontrollen der Gruppe 1 und 2

untereinander (Vehikelinjektion einmal täglich für zwei Wochen vs. vier

Wochen) zeigte an d14 deutliche Unterschiede im Haarwachstum. Während

fast alle Vehikelkontrollen der Gruppe 1 an d14 ein komplettes Fell hatten,

zeigten die Tiere der Gruppe 2 zum selben Zeitpunkt höchstens eine

Graufärbung der Rückenhaut. Diese Verzögerung im Haarwachstum konnte

52

Ergebnisse

stressbedingt entstanden sein, verursacht durch das Absetzen der Tiere des

zweiten Versuches im jüngeren Alter.

Die histologische Analyse zeigte bei den Vehikelkontrollen Haarfollikel im

Anagen, Katagen und Telogen, während bei der Behandlungsgruppe nur

Anagenfollikel (Anagen III-VI) nachweisbar waren (Abb. 25).

Abb. 25: Histologische Kontrolle der Haut (H.E. Färbung, Paraffinschnitt, 5

µm) nach vierwöchiger Vehikel/Rapamycin Behandlung. Es wurde jeweils

eine repräsentative Maus aus der Vehikelkontroll- bzw. Rapamycin-

Behandlungsgruppe ausgewählt. (a) Die Haarfollikel des Tieres aus der

53

Ergebnisse

Vehikelgruppe befinden sich in den Katagenstadien I-VI. Die Bulbi sind

schmal und es sind keine Melaningranula in der präkortikalen Region des

Haarschaftes. (b) Die Haarfollikel der Maus aus der Rapamycingruppe

befinden sich in den Anagenstadien V-VI. Die Bulbi sind sehr breit und in der

präkortikalen Region des Haarschaftes ist starke Melaninproduktion zu

beobachten. [Balken = 100 µm]

Die prozentualen Anteile der einzelnen Haarphasen bei den Kontrollen lagen

bei 50,0% für Anagen III-VI, 25,0% für Katagen I-VI, 1,8% für Katagen VII-

VIII und 23,2% für Telogen. In der Behandlungsgruppe waren alle Follikel im

mittleren bis späten Anagen (Stadien III-VI) (Abb. 26).

Abb. 26: Prozentualer Anteil der unterschiedlichen Wachstumsphasen der

Haarfollikel nach vierwöchiger Vehikel/Rapamycin Behandlung. Während alle

Haarfollikel der Mäuse der Rapamycin-Behandlungsgruppe sich noch im

mittleren bis späten Anagen (Anagen III-VI) befanden, war bei den Tieren der

Vehikelkontrollgruppe schon die Hälfte der Follikel im Katagen (Katagen I-

VIII) bis Telogen.

54

Ergebnisse

Die makroskopischen und mikroskopischen Ergebnisse deuten darauf hin,

dass die Hemmung der mTOR Aktivierung zu einer verzögerten Initiation der

Anagenphase führt. Auf den weiteren Verlauf des Haarzyklus ist kein Einfluss

erkennbar.

4.4. Der Einfluss von Bimatoprost auf die mTOR Aktivierung

4.4.1. Verteilung von p-mTOR in verschiedenen Wachstumsphasen

nach Bimatoprostbehandlung

Sowohl nach einmaliger Behandlung und nachfolgender Tötung der Tiere

nach zwei Stunden, als auch nach zweitägiger Behandlung mit Bimatoprost

waren in telogenen Follikeln nur einzelne Zellen in der „bulge region“ p-

mTOR+ (Abb. 27). Im frühen Anagen (Anagen I-II) nahm bei beiden

Behandlungsgruppen die Anzahl der p-mTOR+ Zellen in der ORS – „bulge

region“ und „secondary germ“ – zu, wohingegen in der dermalen Papille

keine p-mTOR+ Zellen nachgewiesen wurden (Abb. 27).

Im weiteren Verlauf des Anagens (Anagen III-VI) war zwei Stunden nach

einmaliger und nach zweitägiger Behandlung der überwiegende Anteil der

Zellen in der „bulge region“ p-mTOR+; die proximalen IRS-Zellen waren bis

etwa zur Hälfte zwischen Bulbus und „bulge region“ markiert. Distal von

dieser Region wurden in der IRS keine p-mTOR+ Zellen nachgewiesen. Auch

die dermale Papille sowie die übrige ORS (mit Ausnahme der „bulge region“)

zeigten keinerlei Markierung (Abb. 28).

55

Ergebnisse


(Paraffinschnitt, 5 µm) nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung bei 30 Tage

altem Tier. Der rechte Haarfollikel ist im Telogen mit p-mTOR+ Zellen in der

„bulge region“ (schwarze Pfeile), links daneben der Follikel im frühen Anagen

(Anagen I-II) mit p-mTOR+ Zellen im ORS (schwarze Pfeilspitze). Die

dermale Papille des Anagenfollikels ist, wie bei den Kontrollen, unmarkiert

(weißer Pfeil). [Balken = 20 µm]

56

Ergebnisse


nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung (Paraffinschnitt, 5 µm). Alle

Haarfollikel sind im mittleren bis späten Anagen (Anagen IV-VI). Wie bei

unbehandelten Kontrollen befinden sich p-mTOR+ Zellen in der „bulge

region“ (a, weißer Pfeil) und IRS (b, Pfeilspitze). Die Markierung endet abrupt

in derselben Höhe, wie bei den Kontrollmäusen (a, b, schwarze Pfeile).

[Balken = 100 µm]

57

Ergebnisse

Im späten Katagen waren nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung die

Zellen der „bulge region“ und der ORS unterhalb der „bulge region“ p-

mTOR+, darüber hinaus traten einzelne intensiv markierte Zellen im Bereich

der dermalen Papille auf (Abb. 29).


(Paraffinschnitt, 5 µm) nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung. Alle

Haarfollikel sind im späten Katagen (Katagen VI-VIII). Wie bei unbehandelten

Kontrollen befinden sich p-mTOR+ Zellen in der „bulge region“ (Pfeilspitze)

und der ORS unterhalb dieser Region (Pfeil). [Balken = 50 µm]

58

Ergebnisse

Die imunhistochemische Färbungen für p-mTOR zeigten sowohl nach

zweistündiger, als auch nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung keine

Unterschiede zu den unbehandelten Kontrollen.

4.4.2. Einfluss von Rapamycin auf die Initiation des Anagens durch

Bimatoprost

Die Haarfollikel der Kontrollmäuse befanden sich ab der 8. Woche p.p. im

Telogen, makroskopisch durch rosa Haut gekennzeichnet. Nach

dreiwöchiger gleichzeitiger Gabe von Bimatoprostvehikel und

Rapamycinvehikel blieb die dorsale Haut aller elf Wochen alten Mäusen der

Vehikelkontrollgruppe (n=7) rosa. Dasselbe Ergebnis zeigte die Rapamycin

behandelte Gruppe bei zusätzlicher Gabe von Bimatoprostvehikel (n=7)

(Abb. 30).

Behandlung mit Bimatoprost bei zusätzlicher Gabe von Rapamycinvehikel

führte zur Initiation der Anagenphase. Die makroskopische Beurteilung der

Rückenhaut am Ende des Versuches zeigte ein Haarwachstum bei drei von

sieben Tieren und eine Graufärbung der Haut bei zwei Tieren; bei zwei

Mäusen wurde weder Hautverfärbung noch Haarwachstum beobachtet. Die

gleichzeitige Behandlung mit Bimatoprost und Rapamycin führte dagegen zu

einer Hemmung des Bimatoprost vermittelten Anagen induzierenden Effekts.

Bei keinem der Tiere zeigte sich Fellwachstum oder Hautfärbung (n=8).

59

Ergebnisse

Abb. 30: Fotografische Darstellung der Rückenhautfarbe von C57Bl/6

Mäusen nach 11, 14, 18, 21 Tagen Behandlung (Bilder in einer Reihe von

links nach rechts) am Beispiel eines repräsentativen Tiers aus jeder der

Gruppen. (a) – Bei den Vehikelkontrollen (Bimatoprostvehikel +

Rapamycinvehikel) blieb die Haut bis ans Ende der dreiwöchigen

Behandlung rosa. (b) - Dies war auch der Fall, wenn Tiere mit

Bimatoprostvehikel und mit Rapamycin behandelt wurden. (c) Behandlung

der Mäuse mit Bimatoprost und mit Rapamycinvehikel führte zur Induktion

der Anagenphase bei telogenen Haaren und am Ende der dreiwöchigen

Behandlung zum Haarwachstum, erkennbar an der Graufärbung der Haut.

(d) Bei der gleichzeitigen Behandlung der Tiere mit Bimatoprost und

Rapamycin trat kein sichtbarer Effekt auf. Die Haut bleibt rosa,

Haarwachstum ist nicht nachweisbar.

Die histologische Bestimmung der Haarzyklusphasen bestätigte die

makroskopischen Beobachtungen (Abb. 31).

60

Ergebnisse

Abb. 31: Histologische Schnitte, H.E.-Färbung (Paraffinschnitt, 5 µm) zur

Bestimmung der Haarphasen am Ende der dreiwöchigen Behandlung. Für

jede Gruppe wurde je ein repräsentatives Tier ausgewählt. (a) Bei den

Vehikelkontrollen ist der überwiegende Anteil der Haarfollikel im Telogen

oder frühem Anagen (Anagen I-II). (b) Dies ist auch der Fall, wenn Mäuse bei

gleichzeitiger Verabreichung von Bimatoprostvehikel mit Rapamycin

behandelt werden. (c) Die Behandlung mit Bimatoprost bei gleichzeitiger

Gabe von Rapamycinvehikel führt zur Induktion der Anagenhase. Der

61

Ergebnisse

überwiegende Anteil der Haarfollikel ist im mittleren Anagen (III-IV). Die

Haarfollikel sind bis in die Subkutis vorgewachsen, die IRS ist ausgebildet.

(d) Doppelbehandlung mit Bimatoprost und Rapamycin führte zur Hemmung

dieses Effektes. Der überwiegende Anteil der Haarfollikel ist im Telogen-

oder frühem Anagen (Anagen I-II). [Balken = 100 µm]

In der Tabelle 2. sind die Ergebnisse der histologischen Auswertung

zusammengefasst. Die Mittelwerte (±SEM) der prozentualen Anteile der

einzelnen Wachstumsphasen in den vier Gruppen sind tabellarisch und als

Grafik zusammengefasst (Abb. 32).

Tab. 2.: Zusammenfassung der histologischen Ergebnissen nach der

gleichzeitigen Behandlung acht Wochen alter Tieren mit Bimatoprostvehikel

und Rapamycinvehikel, Bimatoprostvehikel und Rapamycin, Bimatoprost und

Rapamycinvehikel, bzw. Bimatoprost und Rapamycin. Zwar sind bei allen

Tieren Haarfollikel im frühen Anagen zu sehen, aber nur nach Behandlung

mit Bimatoprost und Rapamycinvehikel treten bei allen Tieren der Gruppe

Haarfollikel im mittleren Anagen auf; telogene Follikel kommen in dieser

Gruppe nur selten vor. Bei der Doppelbehandlung mit Bimatoprost und

Rapamycin ist die Anzahl der Tiere mit Haarfollikel im mittleren Anagen

62

Ergebnisse

deutlich niedriger; bei der überwiegender Anteil der Mäuse treten telogene

Follikel auf. In den Kontrollgruppen besitzen alle Tiere Haarfollikel im

Telogen, aber kaum welche Follikel im mittleren Anagen.

Abb. 32: Grafik: Prozentuale Anteile der Wachstumsphasen der Haarfollikel

nach vier wöchiger Behandlung mit Bimatoprostvehikel und

Rapamycinvehikel [Ve(B)+Ve(R)], Bimatoprostvehikel und Rapamycin

[Ve(B)+Rap], Bimatoprost und Rapamycinvehikel [Bi+Ve(R)], bzw.

Bimatoprost und Rapamycin [Bi+Rap]. Tabelle: Prozentuale Anteile der

Haarfollikeln in verschiedenen Wachstumsphasen als Mittelwert in % ±SEM.

63

Ergebnisse

4.5. Der Einfluss von Rapamycin auf die p-mTOR-Expression

Die Verteilung von p-mTOR war im Telogen (Abb. 33) in den Nullkontrollen,

den Vehikelkontrollen, den Bimatoprost-, den Rapamycin-, und den

Bimatoprost/Rapamycin doppelbehandelten Tieren identisch.

Abb. 21.: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut

(Paraffinschnitt, 5 µm) mit Haarfollikel im Telogen nach dreiwöchiger

gleichzeitiger Behandlung mit Bimatoprost und Rapamycin. p-mTOR+ Zellen

befinden sich, wie bei den unbehandelten Kontrollen, in der „bulge region“

(Pfeile). Die dermale Papille weist keine p-mTOR exprimierende Zellen auf.

[Balken = 20 µm]

Im frühen (Anagen I-II) und mittleren Anagen (Anagen III-IV) (Abb. 34 und

35) war die Verteilung von p-mTOR in allen vier Gruppen identisch, aber es

gab Unterschiede in der Intensität der Färbung. Die Zellen der „bulge region“

waren in jeder untersuchten Haarphase in allen Gruppen gleich stark

markiert. Außerhalb der „bulge region“ waren nur in den Follikeln Rapamycin

64

Ergebnisse

behandelter Tiere Unterschiede erkennbar. Zum einen war die p-mTOR

Markierung in jeder Haarphase deutlich weniger intensiv, zum anderen

waren deutlich weniger Zellen markiert. Ein ähnliches Bild ergab sich für die

Zellen des Stratum germinativum des Epithels. Im frühen Anagen waren im

Vergleich zu den übrigen Gruppen in der „secondary germ“ und der

restlichen ORS nur vereinzelte p-mTOR+ Zellen nachweisbar, die ebenso,

wie die Zellen der IRS im mittleren Anagen eine schwache Markierung

zeigten.


(Paraffinschnitt, 5 µm) eines Tieres aus der Gruppe, die mit Bimatoprost und

Rapamycin behandelt wurde. In die frühen Anagenfollikel färben sich die

Zellen der „bulge region“ (Pfeilspitze), wie die der unbehandelten Kontrollen,

an. In der ORS sind aber, im Gegensatz zu unbehandelten Kontrollen, nur

wenige Zellen sehr schwach angefärbt (Pfeile). [Balken = 50 µm]

65

Ergebnisse


(Paraffinschnitt, 5 µm) mit Haarfollikel im mittleren Anagen nach Behandlung

mit (a) Bimatoprost und Rapamycin, bzw. (b) Bimatoprost und

Rapamycinvehikel behandelt wurde. Bei beiden sind die Zellen der „bulge

region“ (Pfeilspitzen) und der IRS (Pfeile) gefärbt. Die Intensität der Färbung

ist in der IRS bei dem mit Bimatoprost und Rapamycin behandelten Tier

deutlich geringer, als bei dem mit Bimatoprost und Rapamycinvehikel

behandelten Tier. [Balken = 50 µm]

66

Diskussion

5. Diskussion

Unsere Ergebnisse bestätigen die Befunde von Affara et al.(2), dass p-mTOR

in der „bulge region“ von telogenen Haarfollikeln vorkommt. In der

vorgelegten Arbeit wurde das erste Mal gezeigt, dass mTOR zyklusabhängig

aktiviert wird. Die Änderung des Expressionsmusters in den verschiedenen

Haarphasen weist auf eine phasenspezifische Funktion von mTOR hin.

Im Telogen war p-mTOR auf die „bulge region“ beschränkt und die

immunhistochemische Markierung blieb durch Rapamycinbehandlung

unverändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass mTOR in den Stammzellen des

Haares in einem Rapamycin-insensitiven Komplex, mTOR Complex 1

(mTORC1), vorliegt(121). Dies änderte sich bei Haaren in Anagen. In der

frühen Wachstumsphase war mTOR zusätzlich zur „bulge region“ auch in

ORS-Zellen, vor allem im Bereich des „secondary germ“´s nachzuweisen.

Diese Region zeichnet sich durch hohe Mitoseraten aus(105). Dabei handelt

es sich um proliferierende Zellen, die in der Wachstumsphase den zyklischen

Teil des Haarfollikels bilden. Dies spricht dafür, dass mTOR eine Rolle bei

der Zellproliferation hat. Eine entsprechende Funktion wird mTOR auch in

anderen Geweben zugesprochen(121). In der mittleren bis späten

Anagenphase wurde p-mTOR in der IRS nachgewiesen. Die Nachfärbung

der Paraffinschnitte mit Eosin zeigte, dass in den IRS-Zellen proximal einer

Stelle, die etwa auf der Mitte zwischen dem Bulbus und „bulge region“ liegt,

p-mTOR mit den eosinophilen Trichohyalingranula kolokalisiert war(31).

Mitosen sind in diesen Zellen eher selten zu finden, das heißt, hier spielt

mTOR für proliferative Prozesse kaum eine Rolle. Zusätzlich enthalten diese

Zellen viele Mitochondrien(82). In Zellkultur und in-vivo konnte gezeigt

werden, dass mTOR die oxidative Funktion der Mitochondrien reguliert(19, 88).

Ob mTOR für die Bildung der Trichohyalingranula eine Rolle spielt oder im

funktionellen Zusammenhang mit den Mitochondrien steht, muss weiteren

Untersuchungen vorbehalten bleiben.

67

Diskussion

Interessanterweise zeigte mTOR auch im Katagen eine hohe Aktivität. Im

Vergleich zum Anagen war das Verteilungsmuster ein völlig anderes.

Abhängig vom Katagenstadium, war p-mTOR in unterschiedlichen Regionen

der ORS nachweisbar: in frühen Stadien in Zellen der distalen ORS, im

späten Katagen in den ORS-Zellen direkt unter der „bulge region“ und am

Ende der Katagenphase in den Zellen der „bulge region“. In Katagen erfolgt

die Regression der Haarfollikel durch massive Apoptose der proximalen

epithelialen Haarfollikelzellen(49). Nach der „Prädeterminationshypothese“

von Panteleyev(73), wird der „secondary germ“ von den Zellen des unteren,

proximalen Teils der Anagenfollikel gebildet, die das Katagen überleben(11, 38,

73), und nicht von den Zellen der „bulge region“. Die ORS-Zellen, die nicht

durch Apoptose zugrunde gehen(38, 73), wandern nach distal, in Richtung zum

Epithel. Diese Zellen müssen überleben um im nächsten Haarzyklus aktiviert

werden zu können. Das hier beschriebene Expressionsmuster von p-mTOR

im Katagen könnte den Migrationsweg dieser Zellen repräsentieren. Die

Expressionsverteilung von mTOR in Haarfollikeln in den verschiedenen

Haarphasen ist nahezu identisch mit der des intestinalen Stammzellmarkers

Lgr5(40). Lgr5+ Zellen repräsentieren eine Population von Stammzellen, die im

Verlauf des Haarzyklus zyklisch von der „secondary germ“ nach unten in den

Bulbus und wieder zurück migrieren(40). Diese Zellen stellen eine andere

Population von Stammzellen dar, als die sogenannten LRC´s („label retaining

cells“)(18), die nur in der „bulge region“ vorkommen und durch niedrige

Proliferationsraten gekennzeichnet sind. Es ist bekannt, dass mTOR, als Teil

des Akt-Signalweges auch antiapoptotische Wirkung hat(9, 117). Wenn das

auch für den Haarzyklus zutrifft, könnten die Ergebnisse dieser Arbeit auf

eine mögliche protektive Funktion von p-mTOR für die Zellen, die den

späteren „secondary germ“ bilden, hindeuten, indem p-mTOR diese Zellen

während der Regressionsphase vor apoptotischen Prozessen schützt. Die

fehlende p-mTOR Expression in der „bulge region“ während des frühen und

mittleren Katagens könnte die Apoptosen erklären, die in dieser Region

vorkommen(38).

68

Diskussion

Die quantitative Bestimmung der mTOR Aktivität durch den modifizierten

ELISA-Assay bestätigte die Ergebnisse der immunhistochemischen

Untersuchungen. Die höchsten Aktivitätswerte wurden im Anagen gemessen,

die niedrigsten im Telogen.

Die Behandlung der Mäuse mit dem spezifischen mTOR Inhibitor Rapamycin

für 14 bzw. 28 Tage führte zur Hemmung des Eintrittes in den Haarzyklus.

Die regelmäßigen makroskopischen und mikroskopischen Kontrollen der

Haare am Ende der jeweiligen Versuche deuteten darauf hin, dass diese

Hemmung auf einen verzögerten Eintritt telogener Haarfollikel in die

Anagenphase zurückzuführen ist und dass damit mTOR an der zeitlichen

Determinierung der Anagen-Initiation beteiligt ist. Nach Eintritt in die

Anagenphase verlief der weitere Haarzyklus normal. Es konnten keine

morphologischen Unterschiede zu den Vehikelkontrollen beobachtet werden.

Die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen zeigten,

dass sowohl die Intensität der Immunreaktivität als auch die Anzahl der p-

mTOR+ Zellen in Anagenfollikeln bei Rapamycin behandelten Tieren deutlich

geringer war als bei den Vehikelkontrollen. Dies traf sowohl für die Zellen der

ORS, als auch die des IRS zu. Im Gegensatz hierzu war die Markierung in

der „bulge region“ durch Rapamycin unbeeinflusst. Diese Ergebnisse

unterstützen die „Prädeterminationshypothese“ von Panteleyev(73),

derzufolge der „secondary germ“ für das Follikelwachstum im Anagen eine

entscheidende Rolle spielt. Die Ursache für das unterschiedliche Verhalten

der Zellen in der „bulge region“ bzw. in der „secondary germ“ könnte darin

begründet sein, dass mTOR in den verschiedenen Regionen in

unterschiedliche Komplexe eingebunden ist. So könnte die mTOR-Wirkung in

der „secondary germ“ über den Rapamycin-sensitiven mTOR Complex 1

(mTORC1) vermittelt werden, von dem bekannt ist, dass er den zeitlichen

Ablauf des Zellwachstum beeinflusst(121). Dadurch kann mTOR den Zeitpunkt

des Eintrittes in das Anagen regulieren. In der „bulge region“ dagegen kann

mTOR an mTOR Complex 2 (mTORC2) gebunden sein, der den räumlichen

Aspekt des Zellwachstums reguliert(121).

69

Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin untersucht, ob die Beeinflussung

des Haarwachstums durch Bimatoprost durch eine mTOR Aktivierung

vermittelt werden könnte.

Es wurde gezeigt, dass Bimatoprost die Initiation der Anagenphase bei

telogenen Haaren und Wimpern bei der Maus(86, 105) bewirkt. Bimatoprost

führt auch zur Verdickung und Verlängerung sowohl der Haare und Wimpern

bei der Maus(86, 105), als auch der Vellushaare der Jochbein-Region beim

Menschen(8). Die Versuche mit dem spezifischen mTOR Antagonisten

Rapamycin zeigten eine mögliche Beteiligung der mTOR Aktivierung an der

Anagen-Induktion durch Bimatoprost. Rapamycin führte zur Hemmung der

Bimatoprost-induzierten Anagen Initiation. Allerdings konnte das durch

Bimatoprost verursachte Haarwachstum durch die gleichzeitige

Verabreichung von Rapamycin nicht komplett gestoppt werden.

Die immunhistochemische Untersuchung von Haarfollikeln im Telogen und

im Anagen zeigte zwei Stunden nach einmaliger und nach zweitägiger

Bimatoprostbehandlung weder in der Intensität noch in der Verteilung der p-

mTOR Markierung einen Unterschied zu unbehandelten Kontrolltieren.

Wenn die Wirkung von Bimatoprost über eine Aktivierung von mTOR

vermittelt wird, ist es wahrscheinlich, dass diese erst zu einem späteren

Zeitpunkt erfolgt. Auch dieser Teil der Befunde lässt die Möglichkeit offen,

dass die das Haarwachstum fördernde Wirkung von Bimatoprost mTOR

unabhängig erfolgt.

Zum Wirkmechanismus von Bimatoprost wird angenommen, dass es an

Bimatoprost Rezeptor bindet(48). Die weiteren Signalwege sollen ähnlich, wie

bei dem FP Rezeptor sein, da Bimatoprost denselben Effekt hat wie PGF2α.

In der vorgelegten Arbeit wurde gezeigt, dass mTOR die Anagen Initiation

beeinflusst. Für die Initiation des Anagens und die Aufrechterhaltung der

Wachstumsphase sind auch andere Signalwege, wie zum Beispiel NF-κB,

von Bedeutung. So wurde zum Beispiel vor kurzem gezeigt, dass bei TAK1

(transforming growth factor beta activated kinase 1) defizienten Mäusen die

Haarfollikeln später aus dem Telogen in das Anagen übertreten und auch die

70

Diskussion

Anagen – Katagen - Transition früher erfolgt(87). Zum jetzigen Zeitpunkt ist

die Frage, ob diese Signalwege sich gegenseitig beeinflussen, und wenn ja,

wie das exakte Verhältnis zwischen der einzelnen Signalmolekülen ist, nicht

eindeutig zu beantworten. Ob mTOR, TAK1 oder andere derzeit nicht

bekannte Mechanismen bei der Vermittlung des Bimatoprosteffektes auf das

Haarwachstum eine Rolle spielen, muss in weiteren Studien untersucht

werden.

Zusammenfassend wurde in der vorgelegten Arbeit das erste Mal gezeigt,

dass aktiviertes mTOR in die Regulation des Haarzyklus involviert ist, und

dass die mTOR Aktivierung und infolgedessen das Follikelwachstum durch

Rapamycin gehemmt wird. Die Funktion von p-mTOR in den verschiedenen

Haarphasen umfassen 1. Initiation des Haarzyklus im Telogen, 2.

Zellproliferation im ORS und eventuell Beeinflussung der

Trichohyalinsynthese oder Mitochondrienfunktion der IRS im Anagen, sowie

3. antiapoptotische Wirkung während der Katagenphase. Darüber hinaus

konnte gezeigt werden, dass der Anagen initiierende Effekt von Bimatoprost

durch den spezifischen mTOR Inhibitor Rapamycin gehemmt wird, was

bedeutet, dass eine Beteiligung von mTOR an der Haarwachstum

induzierenden Wirkung von Bimatoprost möglich ist.

71

Literaturverzeichnis

6. Literaturverzeichnis

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79

Abkürzungsverzeichnis

7. Abkürzungsverzeichnis

4EBP1 eIF4E-Bindungsprotein

Abb. Abbildung

ABC Avidin-Biotin-Komplex

AS Aminosäure

ATP Adenosin-5´-triphosphat

α Anti-

Bi Bimatoprost

bzw. Beziehungsweise

C Kohlenstoff

°C Grad Celsius

ca. Circa

Ca2+ Kalcium Ion

cAMP cyclisches Adenosin-5´-monophosphat

cm Zentimeter

COX Cyclooxygenase

d Tag

d.h. das heißt

DP dermale Papille

eIF4E eukaryotischer Initiationsfaktor 4E

ELISA Enzyme-linked immuno sorbent Assay

EP Prostaglandin E Rezeptor

FKBP12 FK506-binding protein 12 kDa

FP Prostaglandin F-Rezeptor

FRB FKBP12 rapamycin binding

80


g Gramm

GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor

GST Glutathion-S-Transferase

h Stunde

H.E. Hämatoxylin-Eosin

HRP Merrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase)

HS Haarschaft

IRS innere epitheliale Wurzelscheide (inner root sheath)

kDa Kilodalton

M Molar

m.a. Mittelwert (mean average)

mM Millimolar

M. Musculus

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

mRNA messenger RNA

mTOR mammalian Target of Rapamycin

mTOR+ mTOR positiv

mTORC mTOR complex

n Anzahl

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

81


nm Nanometer

OH- Hydroxyl-

ORS äußere epitheliale Wurzelscheide (outer root sheath)

p70S6K 70 kDa ribosomalen Protein S6-Proteinkinase 1

PDK1 3´-Phosphoinisitid abhängige Proteinkinase

PEG-400 Polyethylenglykol 400

PFA Paraformaldehyd

PG Prostaglandine

PGE Prostaglandin E

PGF Prostaglandin F

PGHS Prostaglandin H-Synthase

PI3K Phosphoinositid 3-Kinase

PI4K Phosphoinositid 4-Kinase

PMSF Phenylmethansulfonylfluorid

Pol. Polymerase

p.p. post partum

Rap Rapamycin

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen (rotation per minute)

rRNA ribosomale RNA

S Svedberg

S6K1 70 kDa ribosomalen Protein S6-Proteinkinase 1

SEM Standard error of the mean

Ser Serin

Tab. Tabelle

TBS tris buffered saline

82


TBST TBS mit 0,1% Tween 20

Thr Threonin

TM trade mark

TMB Tetramethylbenzidin

TOR Target of Rapamycin

tRNA transfer RNA

TSC2 Tuberous sclerosis complex 2

Tx Thromboxan

usw. und so weiter

Ve Vehikel

Ve(B) Vehikel für Bimatoprost

Ve(R) Vehikel für Rapamycin

vs. versus

83

Vorveröffentlichungen

8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

E.R. Tamm, A. Kellenberger (2008). Aqueous Humor Dynamics and

Trabecular Meshwork. In: Eye, Retina, and Visual System of the Mouse. III

Organization of the Adult Mouse Eye and Central Visual System (Eds.

Chalupa L.M., Williams R.W.). MIT Press, p. 129-33.

M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, E. Lütjen-Drecoll

(2009). “Murine eyelashes as a study model for hypertrichosis or alopecia of

eyelashes”. The 14th Annual Meeting of European Hair Research Society,

Graz, Austria.

M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, E. Lütjen-Drecoll

(2009). “Murine eyelashes as a study model for hypertrichosis or alopecia of

eyelashes”. The Society of Investigational Dermatology, annual meeting,

Montreal, Canada.

M.Tauchi, T.A. Fuchs, A. J. Kellenberger, D.F. Woodward, R. Paus, E.

Lütjen-Drecoll (2010). “Caracterisation of an in vivo model for the study of

eyelash biology and trichomegaly: mouse eyelash morphology, development,

growth cycle and anagen prolongation by bimatoprost.” British Journal of

Dermatology

M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, R. Paus, E.

Lütjen-Drecoll (2010). “Characterization of an in vivo-model for the study of

eyelash biology.” The 6th World Congress for Hair Research, Cairns,

Australia

84

Vorveröffentlichungen

M. Tauchi, A.J. Kellenberger. „The involvement of mTOR signaling

activation in the murine hair cycle.“ (in Vorbereitung).

85

Danksagung

9. Danksagung

Mein größter Dank gilt Frau Prof. Dr. E. Lütjen-Drecoll für die Vergabe des

Themas, die Betreuung und außerordentliche Unterstützung bei der Arbeit.

Ich danke ihr für die jederzeit gewährte Hilfe und ihr Engagement, die diese

Arbeit ermöglicht haben, sowie für die Übernahme des Erstgutachtens.

Meinen besonderen Dank möchte ich Frau Dr. med. vet. Dr. rer. nat. M.

Tauchi widmen für die intensive und freundschaftliche Betreuung während

der gesamten Zeit, ihre Hilfe und die kritischen und konstruktiven

Diskussionen bezüglich meiner Arbeit.

Danken möchte ich Herrn Prof. Dr. M. Eichhorn für die Bereitschaft diese

Arbeit zu korrigieren und für die Übernahme des Zweitgutachtens.

Herrn Dr. M.T. Birke gebührt mein großer Dank für das Korrekturlesen der

Arbeit und seine vielfältige Hilfe sowohl bei wissenschaftlichen wie auch

technischen Fragen.

Ich danke den früheren und jetzigen Mitarbeiter des histologischen und

elektronenmikroskopischen Labors für ihre freundliche und kompetente

technische Unterstützung, wobei ich mich an dieser Stelle besonders bei

Frau H. Nguyen und G. Link bedanke.

Außerdem danke ich Herrn J. Pekarsky für die Hilfe bei Erstellung der

Zeichnungen.

Ich danke Herrn Prof. Dr. F. Paulsen, dass er mich nach Übernahme des

Lehrstuhls großzügig und hilfsbereit bei der Fertigstellung dieser Arbeit

unterstützte.

Ich danke Herrn Prof. Dr. E.R. Tamm für das mir entgegengebrachten

Vertrauen und dafür, dass er mir den Anstoß für meine wissenschaftliche

Laufbahn gegeben hat.

Allen Mitgliedern des Lehrstuhles Anatomie 2 möchte ich für die

Freundlichkeit, Hilfsbereitschaft und nicht zuletzt für die gute

Arbeitsatmosphäre danken.

Zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie, insbesondere bei meinen

Kindern bedanken, die immer für mich da waren. Ihre Liebe und ihre

86

Danksagung

Unterstützung haben mich durch jede Lebenslage sicher geführt und mir den

nötigen Rückhalt gegeben.

87

Lebenslauf

10. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Antonia Judit Kellenberger, Dipl.-Ing. univ.

Geburtsdatum 22. Januar 1968

Geburtsort Sathmar (Satu-Mare), Rumänien

Staatsangehörigkeit deutsch

Familienstand verheiratet, seit 12.08.1989

Ehemann Atila Alfred Kellenberger, Dipl.-Ing. Maschinenbau

Kinder Patrick Kellenberger, 22.02.1992

Robert Kellenberger, 20.03.2003

Eltern Balogh Carol, Lebensmittelchemiker

Balogh Judit Julianna, medizinisch-technische

Assistentin

Schulbildung und Studium

1974 – 1978 Grundschule Sathmar, Rumänien

1978 – 1986 „Kölcsey Ferenc“-Gymnasium Sathmar,

Rumänien, Abitur

1986 – 1991 Universität „Traian Vuia“, Temeschburg

(Timisoara), Rumänien, Studium: Technologie der

anorganischen Chemie

Juni 1991 Staatsexamen, Note 9,0

Juni 2009 Vorprüfung für die Promotion als Dr.rer.biol.hum.,

Bestanden

88

Lebenslauf

Sonstige Ausbildungen

1995 – 1998 Staatliche Berufsfachschule für Technische

Assistenten in der Medizin, Erlangen, Deutschland

Abschluss: MTLA – Medizinisch Technische

Laborassistentin

Anstellungen

Juni – Dez. 1991 Umweltschutz, Sathmar, Rumänien, Chemiker

1998 – 2004 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg, Deutschland, MTA

2004 –2005 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg, Deutschland,

Doktorand

2005 - 2008 Anatomisches Institut LS II, Universität

Regensburg, Deutschland, Doktorand

2008-28.02.2010 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg, Doktorand

Sprachenkenntnisse Deutsch

English

Rumänisch

Ungarisch (Muttersprache)

Erfahrung im Unterricht

2004 – 2010 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen,

Deutschland, „Funktionelle Histologie“ - Kurs für

Studenten der Human- Zahn- und Molekular-

Medizin, Unterrichtsassistent

Die Beteiligung von mTOR an der Regulation des Haarzyklus ... · Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II...

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