Die Muskelrelaxanzien Rocuronium, Vecuronium,

Pancuronium, Atracurium und Succinylcholin aktivieren TRPA1 - und TRPV1 - Rezeptoren nozizeptiver Neurone

Aus der Klinik für Anästhesiologie

der

Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Bernhard Kellner

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F. Neurath

Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachterin: Prof. Dr. Carla Nau

Tag der mündlichen Prüfung: 28. Januar 2020

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung 1

1.1. Deutsch 1

1.2. Englisch 2

2. Einleitung 4

2.1. Einführung in das Thema 4

2.2. Muskelrelaxanzien 5

2.2.1. Historie 5

2.2.2. Chemische Entwicklung der Muskelrelaxanzien 7

2.2.3. Rocuronium 8

2.2.4. Pharmakokinetik 8

2.2.5. Pharmakodynamik 9

2.2.6. Einsatz bei Nieren- und Lebererkrankungen 10

2.2.7. Einsatz bei sehr jungen und alten Patienten 12

2.2.8. Zusammensetzung der Rocuronium-Injektionslösung 12

2.3. Nozizeptives System 13

2.3.1. Allgemeines 13

2.4. Transient receptor potential-Kanäle 15

2.4.1. Hitzenozizeption 15

2.4.2. Kältenozizeption 16

2.4.3. Chemonozizeption 17

2.4.4. Mechanonizizeption 19

2.4.5. Zentrales nozizeptives System 20

2.4.6. Struktur und Funktion der TRP-Kanäle 22

3. Material und Methoden 26

3.1. Chemikalien und Lösungen 26

3.2. Zellkultur und heterologe Expression in HEK293t-Zellen 26

3.3. Patch-Clamp-Experimente 27

4. Ergebnisse 30

4.1. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPA1 30

4.2. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPA1-

exprimierende Zellen durch die TRPA1-Antagonisten AP-18 und

HC-030031 32

4.3. Für die Aktivierung von hTRPA1 durch Rocuronium sind bestimmte

Aminosäuren im N-terminalen Ende des Proteins notwendig 33

4.4. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPV1 35

4.5. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPV1-

exprimierende Zellen durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin 38

4.6. Rocuronium verursacht keine Sensibilisierung der Protonen-induzierten

Stromantwort bei hTRPV1 38

4.7. Die Thermo-TRPs als weitere Mitglieder der TRP-Kanalfamilie werden

durch Rocuronium nicht aktiviert 40

4.8. Weitere klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien aktivieren ebenfalls

hTRPA1 41

5. Diskussion 43

5.1. Injektionsschmerz durch Anästhetika und andere Medikamente 43

5.2. Aktivierung von hTRPA1 und hTRPV1 durch Rocuronium 45

5.3. Saurer pH-Wert der klinisch-verwandten Rocuronium-Präparationen 48

5.4. Andere Muskelrelaxanzien 49

5.5. Klinische Relevanz 50

6. Literaturverzeichnis 52

7. Abbildungsverzeichnis 68

8. Abkürzungsverzeichnis 70

1

1. Zusammenfassung

1.1. Deutsch

Hintergrund und Ziele: Bei der Applikation des Muskelrelaxans Rocuronium (Esmeron®) im Rahmen

der Einleitung einer Allgemeinanästhesie wird sehr häufig ein Injektionsschmerz

beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die direkte Aktivierung

nozizeptiver C-Fasern. Diese Arbeit soll untersuchen, ob Rocuronium und die

chemisch-verwandten Muskelrelaxanzien Pancuronium und Vecuronium sowie

die strukturell unterschiedlichen Wirkstoffe Atracurium und Succinylcholin

Agonisten an nozizeptiven TRP-Kanälen - und hier insbesondere am

Irritanzienrezeptor TRPA1 und am Capsaicinrezeptor TRPV1 - sind und über

diesen Mechanismus nozizeptive Nervenfasern aktivieren können.

Methoden: Human embryonic kidney (HEK) 293t-Zellen wurden mit Wildtyp- und Mutanten-

cDNAs von TRPA1, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 und TRPM8 mit Hilfe des

Nanofectin Kits transient transfiziert. Zusätzlich wurde CD8-pih3m cotransfiziert

um Zellen, die das gewünschte Protein exprimieren, mittels anti-CD8-

Immunobeads identifizieren zu können. Zur Messung wurden die Zellen in ein

Bad aus calciumfreier Extrazellularlösung eingebracht und aus Borosilikat

gezogene Pipetten zur Hälfte mit Intrazellularlösung gefüllt. Die Patch-Clamp-

Experimente wurden in der Whole-Cell-Konfiguration bei Zimmertemperatur

durchgeführt. Das Haltepotential wurde auf -60 mV eingestellt.

Ergebnisse und Beobachtungen: Rocuronium aktiviert hTRPA1 dosisabhängig ab einer Konzentration von

10 nM, hTRPV1 ab einer Konzentration von 1 nM. In hohen Konzentrationen

verringert sich die Stromamplitude bei beiden Kanälen wieder, was auf eine

zusätzlich blockierende Eigenschaft von Rocuronium in hohen Konzentrationen

an beiden Kanälen hinweisen kann. Dazu konnte gezeigt werden, dass

Rocuronium Carvacrol-induzierte Ströme in hTRPA1-exprimierende Zellen und

Capsaicin-induzierte Ströme in hTRPV1-exprimierende Zellen anteilig blockiert.

Die Mutante hTRPA1-3C zeigt im Vergleich zum Wildtyp stark verminderte und

die Mutante hTRPA1-3CK keine Einwärtsströme durch Rocuronium. Ein

2

niedriger pH sensibilisiert hTRPV1 für die Aktivierung durch Rocuronium nicht,

es zeigte sich tendenziell eine Blockade von hTRPV1. Vecuronium,

Pancuronium, Atracurium und Succinylcholin induzieren ebenfalls deutliche

Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende Zellen.

Schlussfolgerung: Rocuronium aktiviert hTRPA1 und hTRPV1 im heterologen Expressionssystem

in klinisch-relevanten Konzentrationen. In höheren Konzentrationen werden

beide Kanäle durch Rocuronium blockiert. Die Aktivierung von hTRPA1 wird

über bestimmte Aminosäuren im N-terminalen Rest vermittelt. Die Aktivierung

beider Kanäle in nozizeptiven Neuronen könnte mit verantwortlich sein für den

klinisch-beobachteten Brennschmerz durch Rocuronium.

1.2. Englisch

Background and objective: Pain on injection of rocuronium is a frequently observed side effect during

induction of general anaesthesia. A possible explanation is a direct activation of

nociceptive C-fibres. This study explores whether rocuronium and the chemical

analogs vecuronium and pancuronium as well as the structurally distinct muscle

relaxants atracurium and succinylcholin are agonists of nociceptive TRP-

channels, especially of the irritant receptor TRPA1 and the capsaicin receptor

TRPV1 and thus could lead to an activation of nociceptive C-fibres.

Methods: Recombinant TRPA1, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 and TRPM8 were

transiently expressed in human embryonic kidney (HEK) 293t-cells and were

transfected with the Nanofectin Kit. In order to identify transfection-positive cells

by anti-CD8-immunobeads, cells were cotransfected with the reporter plasmid

CD8-pih3m. To perform patch clamp experiments, the cells were covered with

calcium-free extracellular solution and borosilicate patch pipettes were filled half

with internal solution. The experiments were performed by means of whole-cell

patch clamp recordings at room temperature. Cells were clamped at -60 mV

during recordings.

Results: Rocuronium evokes inward currents in hTRPA1 beginning at a concentration of

10 nM and in hTRPV1 at a concentration of 1 nM. At higher concentrations

3

rocuronium-evoked inward currents decreased. This could indicate a blocking

effect of rocuronium in both channels. Carvacrol-evoked inward currents in

hTRPA1 expressing cells and capsaicin-evoked inward currents in hTRPV1

expressing cells are both partially blocked by rocuronium. Rocuronium-evoked

inward currents in the mutant hTRPA1-3C are markedly smaller compared to

wild-type TRPA1. In the mutant hTRPA1-3CK rocuronium did not induce any

current. A pH of 6 was not able to sensitize hTRPV1 for the activation by

rocuronium. Rocuronium tends to block hTRPV1 instead. Vecuronium,

pancuronium, atracurium and succinylcholin also evoked distinct inward

currents in hTRPA1-expressing cells.

Conclusion: Rocuronium activates hTRPA1 und hTRPV1 in clinically relevant concentrations

in a heterologous expression system. At higher concentrations both channels

are blocked. The activation of hTRPA1 is mediated by distinct N-terminal amino

acids. The activation of both channels in nociceptive fibres could be

accountable for the clinically observed burning pain evoked by the application of

rocuronium.

4

2. Einleitung

2.1. Einführung in das Thema

Rocuronium ist ein in der Anästhesiologie weit verbreitetes, nicht-

depolarisierendes Muskelrelaxans, welches sich durch einen schnellen

Wirkungseintritt und eine mittellange Wirkdauer auszeichnet [70]. Eine

unerwünschte und oft beobachtete Nebenwirkung ist allerdings ein

Injektionsschmerz bei der intravenösen Injektion mit einer Inzidenz von

75 - 100% [2, 40, 127]. Dieser äußert sich, je nach Lage der intravenösen

Kanüle, durch heftige Abwehrbewegungen im Handgelenk oder des gesamten

Arms, in den Rocuronium injiziert wurde. Bereits 1995, im Jahr der

Markteinführung, wurden die brennenden Schmerzen im Rahmen der

Präkurarisierung von wachen Patienten mit Rocuronium von Moorthy et al.

sowie bei bewusstlosen Patienten nach der Applikation von Propofol durch

Lockey et al. beschrieben [97, 109]. Als mögliche Ursachen wurden die

Freisetzung von Bradykinin, der saure pH der Zubereitung oder die

unphysiologische Osmolarität der Lösung diskutiert, welche alle für sich oder in

Kombination nozizeptive Nervenendigungen aktivieren können [20, 88, 97]. Von

Borgeat und Kwiatkowski konnte bei fünf Patienten gezeigt werden, dass

physiologische Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 4 keinen

Injektionsschmerz verursachte, [19] wohingegen Arndt und Klement einen

Injektionsschmerz bei einem pH ab 4 beobachteten [88]. Genauso konnte

gezeigt werden, dass verdünntes Rocuronium mit einer Konzentration von

0,5 mg/ml im Gegensatz zu unverdünntem Rocuronium mit einer Konzentration

von 10 mg/ml keinen Injektionsschmerz verursachte, obwohl beide

Aufbereitungen die gleiche Osmolarität und den gleichen pH-Wert hatten [134].

2003 zeigten Koppert et al. einen konzentrationsabhängigen (1 und 10 mg/ml)

Injektionsschmerz von Vecuronium und Rocuronium in vivo, welcher

unabhängig vom pH zu sein schien. Da die Schmerzintensität unabhängig von

den gemessenen Mediatoren wie Bradykinin, Histamin und Trypsin war, wurde

eine direkte Aktivierung der Nozizeptoren in unmyelinisierten C-Fasern über

einen noch unbekannten Mechanismus postuliert [17].

Ziel dieser Arbeit ist es zu untersuchen, ob Rocuronium ein Agonist an

bestimmten nozizeptiven Kanälen ist, vor allem an TRPA1, einem

Irritanziensensor, der durch Senföl, Tränengas und Umweltgifte aktiviert werden

5

kann, sowie an TRPV1, dem Sensor für den scharfen Inhaltsstoff von

Chilischoten (Capsaicin), der auch durch Hitze und Protonen aktiviert werden

kann. Weiterhin soll untersucht werden, über welchen Mechanismus die

Aktivierung der Nozizeptoren vermittelt wird. Aufgrund widersprüchlicher

Aussagen vorhergehender Untersuchungen wird außerdem der Einfluss des

pH-Wertes auf das Öffnungsverhalten der Kanäle untersucht. Vecuronium

verursacht ebenso wie Rocuronium einen Injektionsschmerz, jedoch mit viel

geringerer Intensität, [17, 41, 83] sodass Vecuronium und das ebenfalls aus

einem Steroidgerüst bestehende Pancuronium als potenzielle Agonisten

untersucht werden. Auch wenn keine Berichte über Schmerzsensationen bei

der intravenösen Injektion von Atracurium und Succinylcholin vorliegen, werden

zu Vervollständigung der Experimente diese Relaxanzien ebenso auf ihre

Fähigkeit hin TRP-Kanäle zu aktivieren untersucht.

2.2. Muskelrelaxanzien

Muskelrelaxanzien sind ein bedeutender pharmakologischer Bestandteil der

modernen balancierten Anästhesie. Die erste Unterteilung der

Muskelrelaxanzien in zwei große Klassen stammt aus dem Jahr 1951 von

Daniel Bovent. Er traf eine Einteilung der Muskelrelaxanzien in pachycurares

mit nicht-depolarisierenden und leptocurares mit depolarisierenden

Eigenschaften [21]. Die Wirkung von depolarisierenden Muskelrelaxanzien

konnte im Gegensatz zu den nicht-depolarisierenden Muskelrelaxanzien nicht

durch Acetylcholinesteraseinhibitoren aufgehoben werden.

Bis heute ist eine Einteilung in diese zwei Gruppen üblich, wobei in dieser

Arbeit Succinylcholin als alleiniger Vertreter der depolarisierenden

Muskelrelaxanzien untersucht wird und auf der Seite der nicht-

depolarisierenden die Substanzen Atracurium, Pancuronium, Vecuronium und

insbesondere Rocuronium untersucht werden.

2.2.1. Historie

Erstmals wurden muskelrelaxierende Substanzen von Peter Martyr d’Anghera

im Jahr 1516 in seiner Briefsammlung „De Orbe Novo“ beschrieben, in denen er

6

von vergifteten Pfeilen berichtete, welche von den Ureinwohnern Südamerikas

bei der Jagd nach Tieren eingesetzt wurden [129].

78 Jahre später wurde das Pfeilgift in dem Buch „The Discovery of the Large,

Rich, and Beautiful Empire of Guiana“ unter dem Namen Urari erwähnt [124].

Der Versuch einer europäischen Übersetzung gab dem Gift aus zahlreichen

Übersetzungsmöglichkeiten den allgemein anerkannten Namen Curare. Dieses

Gift wurde aus den Reben der alkaloidhaltigen Pflanzen Chondrodendron

tomentosum und Strychnos toxifera gewonnen [16].

Die Entwicklung analytischer Methoden machte es 1935 Harold King in Oxford

erstmals möglich, aus einer Probe des Museums der Pharmaceutical Society

d-Tubocurarine zu isolieren. Er fand heraus, dass es sich um ein großes,

starres Molekül mit zwei terminalen, tertiären Ammoniumgruppen handelt [86].

Später zeigte sich, dass diese Erkenntnis nur teilweise richtig war, da es sich

bei einer der Ammoniumgruppen in Wahrheit um ein tertiäres Amin handelt.

Schließlich waren es 1942 Oscar Winterstein und James Dutcher, denen es

zuerst gelang, das Alkaloid d-Tubocurarine aus Proben einer Chondrodendron

tomentosum zu gewinnen [150].

Zwischenzeitlich hatte Claude Bernard bewiesen, dass Curare an der Nerv-

Muskel Reizweiterleitung wirkt [13]. Zudem wurde die Funktionsweise von

Acetylcholin, bei der neuromuskulären Reizweiterleitung Mitte des 19.

Jahrhunderts unter anderem von Dale et al. erforscht [49]. Erste Anwendungen

von Curare an Kleintieren [25] sowie an zwei Patienten [14] zeigten, dass durch

eine Beatmung die Komplikation der Apnoe behandelt werden konnte.

Mit diesem Wissen applizierten die Anästhesisten Harold Randall Griffith und

Enid Johnson einem jungen Mann während einer Appendektomie Curare und

publizierten im Juli 1942 die erfolgreiche Anwendung von Curare im

Fachjournal „Anesthesiology“ [66].

John Halton, ein Anästhesist aus Liverpool, publizierte zusammen mit CecilI

Gray 1946 die Erfahrungen mit Intocostrin, das erste durch die Firma Squibb in

den Vereinigten Staaten kommerziell produzierte Muskelrelaxans. Sie

beschrieben erstmals die als Liverpool-Technik bekannte Triade aus Hypnose,

Analgesie und Muskelrelaxation, die bis heute in Form der balancierten

Anästhesie Anwendung findet [64].

7

2.2.2. Chemische Entwicklung der Muskelrelaxanzien

Im Jahr 1860 erkannten Thomas Richard Fraser und Alexander Cum Brown

erstmals, dass die Umwandlung der tertiären Stickstoffgruppe von Alkaloiden

wie Atropin, Brucine, Codein, Morphin und Nikotin in ihre quartäre Form

Curare-ähnliche Aktivität zeigen [30]. In der zweiten Hälfte des 20.

Jahrhunderts wurden die ersten synthetischen Muskelrelaxanzien entwickelt.

Aufgrund der Erkenntnis, dass Dekamethylen mit zwei tertiären

Ammoniumgruppen gute neuromuskuläre Blockadeeigenschaften hat sowie

dem Wissen, dass kleine Moleküle einen depolarisierenden und große

Moleküle eine nicht-depolarisierenden Block generieren können, [28]

entwickelten mehrere Arbeitsgruppen in den 1950er Jahren Suxamethonium.

Es handelt sich um einen Bischolinester der Bernsteinsäure, welcher zwei

Moleküle Cholin miteinander verbindet (Abb. 1).

In den 1960ern entwickelte C.L. Hewett Pancuronium, indem er zwei

Acetylcholin-Moleküle in ein Steroidgerüst einbrachte [27]. Die Erkenntnis, dass

der vagolytische Effekt von Pancuronium auf die quartäre Gruppe am A-Ring

und die muskelrelaxierende Eigenschaft auf die Gruppe des D-Rings

zurückzuführen ist, [26] machte die chemische Modifikation der Substanz

möglich. Durch eine Demethylierung des A-Rings konnte mit Vecuronium eine

nebenwirkungsärmere Substanz hergestellt werden. Mit der Erkenntnis, dass

die Anschlagszeit bei weniger potenten Mitteln kürzer ist, erfolgte die weitere

Modifikation der Aminogruppen. Durch eine Substitution der quartären Gruppe

entstand das weniger potente, aber schneller wirkende, monoquartäre

Aminosteroid Rocuronium mit einer Anschlagszeit nahe der von

Succinylcholin [23].

Parallel arbeiteten andere Gruppen mit Bisbenzylisochinolinen vom

Tubocurarine-Typ. So entwickelten J.B. Stenlake und seine Mitarbeiter

Atracurium, [72] das in seiner Darreichungsform ein Razemat aus 10 Isomeren

ist und eine relevante Histaminfreisetzung verursacht. Heute wird das reine

Cis-Isomer von Atracurium, Cisatracurium, klinisch häufig verwendet (Abb. 1).

8

Abbildung 1: Strukturformeln von Rocuronium, Vecuronium, Pancuronium, Atracurium und Suxamethonium

2.2.3. Rocuronium

2.2.4. Pharmakokinetik

Die Pharmakokinetik von Rocuronium entspricht, mit Ausnahme des

schnelleren Wirkeintritts, der von Vecuronium [18, 104]. Es hat eine ED95 von

0,3 mg/kg [46, 58].

Bei normaler Nieren- und Leberfunktion beträgt das Verteilungsvolumen

203 ml/kg, die Clearance 3,7 ml/kg/min und die t½β-Eliminationshalbwertszeit

73 min [54]. Die Plasmaproteinbindung beträgt 25%, so dass Änderungen der

Plasmaprotein-Konzentration lediglich zu geringen Veränderungen der freien

Plasmafraktion führen [148].

Die Verstoffwechselung von Rocuronium findet durch Decarboxylierung am

17. Kohlenstoffatom statt. Dabei entsteht 17-Desacetylrocuroniom, welches der

einzige im Plasma nachgewiesene Metabolit ist [1, 135]. Er trägt

höchstwahrscheinlich nicht zur neuromuskulären Blockade bei, da er 20fach

weniger potent als Rocuronium ist [111].

Rocuronium) Vecuronium) Pancuronium)

Atracurium) Suxamethonium)

9

2.2.5. Pharmakodynamik

Muskelrelaxanzien wirken als Antagonisten an der postsynaptischen Membran

der motorischen Endplatte. Sie blockieren die elektrochemische Koppelung am

nikotinischen Acetylcholinrezeptor. Diese befinden sich dort in einer Dichte von

10000 – 20000 Moleküle/μm2 [50]. Der Rezeptor ist ein Transmembranprotein,

welches einen Liganden-gesteuerten Ionen-Kanal bildet, der in erster Linie für

Natrium- (Na+), aber auch für Kalium- (K+) und Calcium- (Ca2+) Ionen

durchlässig ist. Der reife Rezeptor setzt sich aus den fünf homologen

Untereinheiten (α, β, α, ε, δ) zusammen [87, 102]. Die Bindungsstelle befindet

sich jeweils zwischen der α/β und der α/ε-Einheit. Beide Bindungsstellen

müssen für die Aktivierung des Kanals besetzt sein. Sind mehr als 75% der

Rezeptoren besetzt, kann man erste Effekte der Relaxation beobachten, bis es

schließlich nach Blockierung von 95% der Rezeptoren zur schlaffen Lähmung

der quergestreiften Muskulatur kommt [144]. So lange sich das Relaxans im

synaptischen Spalt befindet, ist seine Aktivität durch eine sich wiederholende

Besetzung und Dissoziation der Bindungsstellen gekennzeichnet [22]. Die dafür

erforderliche Dosis wird durch die ED95 beschrieben. Sie beträgt für Rocuronium

0,3 mg/kg. Die empfohlene Einleitungsdosis von Rocuronium für die

endotracheale Intubation beträgt 0,6 mg/kg (2 x ED95), eine Vollrelaxation

besteht nach 60 - 90 s [44]. Vervierfacht man die Dosis der ED95 auf insgesamt

1,2 mg/kg, so können sehr schnell gute Intubationsbedingungen erreicht

werden, die denen nach Applikation von 1 mg/kg Succinylcholin entsprechen

(rapid sequence induction, RSI) [101]. Allerdings besteht bei dieser Dosierung

eine verlängerte Wirkdauer. Rocuronium ist in einer Dosierung von 1,0 mg/kg

zur RSI zugelassen. Die Erhaltungsdosis von Rocuronium beträgt 0,15 mg/kg,

wobei bei einer Coapplikation mit Substanzen wie Antibiotika, Steroiden,

Anticholinergika, intravenöse und insbesondere inhalative Anästhetika die

Dosis aufgrund einer Wirkungsverstärkung auf etwa 0,075 - 0,1 mg/kg

angepasst werden muss [93, 147].

Rocuronium ist in Kombination mit Hypnotika und ggf. Analgetika zur Einleitung

sowie auch zur Aufrechterhaltung einer Allgemeinanästhesie geeignet. Es hat

aufgrund seiner vergleichsweise geringen Potenz eine kurze Anschlagszeit,

wodurch die 95%ige Blockade der Muskelantwort rasch erreicht wird. Unter

Isofluran-Anästhesie liegt nach Applikation von 0,6 mg/kg Rocuronium die

10

Erholung der train-of-four-ratio (T4/T1) auf 25% bei 42 min [135]. Der sog. train-

of-four (TOF) ist das während einer Narkose am meisten verwendete

Stimulationsmuster für die Überwachung der Muskelrelaxation. Hierbei werden

mit einer Frequenz von 2 Hz vier Impulse abgegeben, wobei die Reizabnahme

von der ersten bis zur vierten Muskelantwort mit der zunehmenden Relaxation

korreliert. Dieses Verhältnis (T4/T1) wird als TOF-Ratio bezeichnet. Beim nicht

relaxierten Muskel beträgt sie 1,0 und wird bei zunehmender Relaxierung

kleiner.

Zusätzlich zu den nebenwirkungsbehafteten Acetylcholinesterasehemmern wie

z.B. Neostigmin steht seit Oktober 2008 ein Medikament zur Reversierung der

Wirkung von Rocuronium zur Verfügung: Sugammadex (Bridion®) ist ein

γ-Cyclodextrin, welches die Wirkung von Rocuronium durch Aufnahme eines

Rocuronium-Moleküls in das Innere des Zuckerrings (Enkapsulierug) aufhebt

[114]. Die Affinität von Sugammadex ist für Rocuronium am höchsten, aber

auch die Wirkung anderer steroidaler Muskelrelaxanzien wie z.B. Vecuronium

kann aufgehoben werden. Das Anwendungsspektrum für Sugammadex

umfasst neben der Reversierung einer postoperativen Restkurarisierung

(PORC) ebenso die Reversierung einer Einleitungsdosis von Rocuronium bei

einer RSI. Dies stellt einen großen Fortschritt in der Anwendungssicherheit von

Rocuronium dar, da nun im Falle einer gefürchteten cannot intubate, cannot

ventilate-Situation die durch Rocuronium verursachte neuromuskuläre Blockade

vollständig innerhalb von ca. 1,5 min aufgehoben werden kann. Dies erfordert

die Applikation von Sugammadex in einer Dosierung von 16 mg/kg. Für die

routinemäßige Aufhebung der Relaxation richtet sich die Dosis nach der

Akzeleromyographie. Die Dosen bewegen sich hierbei zwischen 2 - 4 mg/kg bei

einer mittleren Dauer zur Erholung des T4/T1-Verhältnisses auf 0,9 von 2 -

3 min [114].

2.2.6. Einsatz bei Nieren- und Lebererkrankungen

Die Angaben in der Literatur über die Ausscheidung von Rocuronium sind

uneinheitlich. In der Fachinformation wird angegeben, dass die Ausscheidung

in 24 Stunden unverändert zu 30 - 47% über den Urin erfolgt [54, 146]. Mittels

radioaktiv-markiertem Rocuronium konnte gezeigt werden, dass innerhalb von

9 Tagen 47% des Rocuroniums über den Urin und 43% über den Stuhl

11

ausgeschieden werden [54]. Khuenl-Brady et al. zeigten 1990 im Tierversuch

bei Katzen, dass 73% des Rocuroniums in der Leber gespeichert, respektive

biliär ausgeschieden wurden [85].

Anders verhält sich die Ausscheidung bei einer Nieren- bzw. Leberinsuffizienz.

Zahlreiche Untersuchungen erbrachten unterschiedliche Ergebnisse. In einer

Studie, welche terminal-niereninsuffiziente Patienten untersuchte, die eine

allogene, postmortale Nierenspende erhalten hatten, ergaben sich ein um 28%

gesteigertes Verteilungsvolumen und eine um 37% verlängerte Eliminations-

halbwertszeit. Die Clearance war in beiden Gruppen gleich und es zeigten sich

keine Unterschiede bezüglich der Pharmakodynamik [130]. In einer weiteren

Studie von Cooper et al. zeigten sich nach Applikation von 0,6 mg/kg

Rocuronium längere Erholungszeiten, jedoch ohne statistische Signifikanz [45].

Die gleiche Studie zeigte die Unvorhersehbarkeit der Wirkdauer. Die Erholung

der T4/T1-Ratio auf 25% zeigte nach einer Applikation von 0,6 mg/kg

Rocuronium eine Variation von 35 - 115 min bei niereninsuffizienten gegenüber

32 - 60 min bei gesunden Patienten. Zusammenfassend betrachtet ist die

Wirkdauer bei eingeschränkter Nierenfunktion verlängert und auch weniger gut

vorauszusehen [45].

Die Funktion der Leber hat ebenfalls starken Einfluss auf die Pharmakokinetik

von Rocuronium. Allerdings sind die Ergebnisse verschiedener Studien

divergent. Eine Studie zeigte, dass die Wirkung von Rocuronium bei

leberinsuffizienten Patienten, ähnlich wie bei eingeschränkter Nierenfunktion

einer großen Variabilität unterliegt und der Wirkeintritt (108 ± 33 s bei

Gesunden vs. 158 ± 56 s bei Patienten mit Zirrhose) sowie die Wirkdauer

verlängert sind [84]. Die Erholung der TOF-Ratio auf 75% und 90% des

Ausgangswerts betrug 75 ± 25 und 88 ± 29 min bei Patienten mit Zirrhose vs.

57 ± 11 und 64 ± 13 min bei Gesunden. Das zentrale Verteilungsvolumen war

bei den Erkrankten mit 104 ± 21 ml/kg im Gegensatz zu den Gesunden mit

78 ± 24 ml/kg deutlich erhöht, wobei sich eine lineare Abhängigkeit zwischen

dem Verteilungsvolumen und der Anschlagszeit ergab. Die Eliminationskinetik

zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen [84].

Eine Leberinsuffizienz führte zudem zu keiner Veränderung der

Rezeptoraffinität. Eine Bestimmung der EC50 ergab für Gesunde 1030 µg/l und

Patienten mit Zirrhose 1060 µg/l, was darauf schließen lässt, dass die

12

verlängerten Erholungszeiten auf pharmakokinetische Effekte zurückzuführen

sind [135].

2.2.7. Einsatz bei sehr jungen und alten Patienten

Eine Studie an Kindern zwischen 4 und 11 Jahren zeigte, dass jüngere Kinder

eine relativ zu ihrem Körpergewicht höhere Clearance besitzen. Unterschiede

bezüglich des Verteilungsvolumens ergaben sich nicht, sodass sich mit

steigendem Alter und Gewicht eine längere t½β ergab [54, 141].

Untersuchungen bei Säuglingen ergaben verlängerte t½β-Eliminations-

halbwertszeiten von 1,1 ± 0,2 min bei Reifgeborenen (0 - 27 Tage) im Rahmen

signifikant-höherer Verteilungsvolumina und einer geringeren relativen

Clearance [54, 147].

Bei geriatrischen Patienten ergeben sich Änderungen der Pharmakokinetik

unter anderem aufgrund schlechterer renaler Clearance. Die maximale

neuromuskuläre Blockade wurde bei 65- bis 80-Jährigen im Vergleich zu 20- bis

45-Jährigen mit 3,7 ± 1,1 min gegenüber 3,1 ± 0,9 min langsamer erreicht, bei

jedoch ähnlicher Potenz der Blockade. Die Zeit bis zu einer Erholung der TOF-

Ratio um 25% war mit 11,8 ± 8,1 min vs. 8,0 ± 6,5 min signifikant länger.

Unterschiede bezüglich der Potenz ergaben sich nicht [15].

2.2.8. Zusammensetzung der Rocuronium-Injektionslösung

Rocuronium ist unter dem Handelsnamen Esmeron® seit 1994 als

Injektionslösung erhältlich. Die fertige Injektionslösung hat einen pH-Wert

zwischen 3,8 und 4,2. Neben Wasser für Injektionszwecke und Natriumchlorid

enthält die Zubereitung Essigsäure (50%) und Natriumacetat zur pH-Einstellung

[54].

13

2.3. Nozizeptives System

2.3.1. Allgemeines

2.3.2. Peripheres nozizeptives System

Der menschliche Körper ist in der Lage, potenziell schädliche Reize von nicht-

schädlichen zu differenzieren. Bei überschwelligen, potenziell schädlichen

Reizen werden hierfür spezialisierte Nervenfasern aktiviert, die sog.

Nozizeptoren [153]. Nozizeptoren sind durch ihre biophysiologische wie

molekulare Konfiguration dazu in der Lage schädliche thermische,

mechanische und chemische Stimuli zu erfassen. Nozizeptoren sind

pseudounipolare Nervenzellen, die ihr Zellsoma in den Spinalganglien und

zentral im Ganglion trigeminale haben. Nach Erlanger und Gasser kann man

zwei große Klassen von Nozizeptoren unterscheiden: die dünnen,

myelinisierten Aδ-Fasern, welche den ersten, akuten, gut lokalisierbaren

Schmerz übertragen, und die unmyelinisierten C-Fasern, die für die

Wahrnehmung des zweiten, dumpfen und weniger gut-lokalisierbaren

Schmerzes verantwortlich sind. Die Aδ-Fasern lassen sich in zwei weitere

Subpopulationen einteilen. Typ I nimmt chemische und mechanische Stimuli

wahr und hat eine sehr hohe Reizschwelle für thermische Reize (> 50°C). Der

Typ II Aδ-Nozizeptor hat eine niedrigere Schwelle für Hitze, dafür eine höhere

für mechanische Reize [8].

Die unmyelinisierten C-Fasern sind polymodale Rezeptoren, welche Hitze und

mechanische Stimuli wahrnehmen können. Von besonderem Interesse sind

hierbei hitzesensible Fasern, die ihre mechanische Sensibilität erst im Rahmen

einer Verletzung entwickeln. Sie reagieren vergleichsweise sensibel auf

chemische Reize. Die Heterogenität der Nozizeptoren erfordert eine weitere

Unterteilung der C-Fasern nach neuroanatomischen und molekularen

Gesichtspunkten. So setzen die peptidergen C-Nozizeptoren die Neuropeptide

Substanz P und calcitonin gene–related peptide (CGRP) frei und tragen den

Neurotrophin Rezeptor tropomyosin receptor kinase A (TrkA), welcher nerve

growth factor (NGF) binden kann. Die nicht-peptidergen C-Fasern tragen den

Ret proto-oncogene (c-Ret) Neurotrophin Rezeptor, welcher Angriffspunkt für

den glia-derived neurotrophic factor (GDNF) Neurturin und Artemin ist.

14

Eine weitere Unterscheidung der Nozizeptoren kann anhand der Expression

verschiedener Transmembranproteine getroffen werden, welche sowohl im

Verlauf des Axons wie auch an den Zellkörpern exprimiert werden (Abb. 2). So

können Reize in beide Richtungen sowohl detektiert als auch übertragen

werden. Zur Depolarisation der nozizeptiven Endigung kann entweder die

Initiierung eines Einwärtsstroms oder die Blockade eines Auswärtsstroms

führen. Ein Einwärtsstrom entsteht durch die Aktivierung oder Öffnung von

unterschiedlichen liganden- oder spannungsgesteuerten Na+- und Ca2+-

Kanälen. Für den Auswärtsstrom sind hauptsächlich K+-Ionen verantwortlich

welche durch spezifische K+-Kanäle die Zelle verlassen. Zu den

ligandengesteuerten Kanälen zählen u.a. die transient receptor potential (TRP)

-Rezeptoren sowie die acid sensing ion channels (ASICs). Die wichtigsten

Vertreter der K+-Kanäle sind die der Subfamilie K, Nummer 2 und 4 (KCNK2/4).

Abbildung 2: Schematische Darstellung des zentralen und peripheren Endes eines Nozizeptors (aus Woolf 2007)

15

2.4. Transient receptor potential-Kanäle

2.4.1. Hitzenozizeption

Für die Wahrnehmung von angenehmer Wärme einerseits und schädlicher

Hitze andererseits sind unterschiedliche Transduktionsproteine in sensorischen

Nerven zuständig. Es konnten nozizeptive Fasern mit unterschiedlichen

Schwellen gefunden werden. Der Mensch empfindet Wärme > 42°C als

schädlich bzw. schmerzhaft. Dies entspricht z.B. der Reizschwelle von

Schmerzreiz-wahrnehmenden C- und Typ II Aδ-Nozizeptoren.

Ein Fortschritt in der Aufklärung der sensorischen Vorgänge auf molekularer

Ebene ergab sich durch die Entdeckung des Capsaicin-Rezeptors, TRPV1, der

durch den Inhaltsstoff der Chilischote und andere Vanilloide sowie auch durch

Temperaturen > 42°C aktiviert wird. Parallelen leiten sich aus mehreren

Beobachtungen ab: a) in der Mehrzahl der hitzesensiblen Nozizeptoren werden

TRPV1-Kanäle exprimiert; b) Hitze- und Capsaicin-induzierte Ströme in

elektrophysiologischen Experimenten zeigen Gemeinsamkeiten;

c) Schmerzreizsensibilisierende und proinflammatorische Substanzen

(Protonen, Neurotrophine, Bradykinin) verstärken die Reizantwort von TRPV1.

Die weitere Erforschung der auf molekularer Ebene gewonnenen Erkenntnisse

erfolgte im Tierexperiment. Es konnte gezeigt werden, dass Knockout-Mäuse,

bei denen TRPV1 nicht exprimiert wurde (TRPV1-/-), in der Wahrnehmung von

schädlicher Hitze deutlich eingeschränkt waren. Nachdem die Hitzenozizeption

jedoch nicht vollständig erloschen war, mussten weitere Mechanismen zur

Wahrnehmung schmerzhafter Hitzereize beitragen. In Untersuchungen an

präparierten Nervenzellen aus Spinalganglien (dorsal root ganglion, DRG)

konnten vorwiegend solche Neurone mit einer Reizschwelle von 42°C

nachgewiesen werden [35]. Spinalganglien mit einer Reizschwelle > 50°C

waren seltener [115]. Bei Wild-Typ Mäusen konnte eine Hypersensibilisierung

der Hitzewahrnehmung durch die gleichen Substanzen wie in vitro erreicht

werden. Die Ergebnisse lassen so weiterhin folgern, dass der Nozizeptor

sowohl chemisch als auch thermisch durch Hitze moduliert werden kann.

Weitere Untersuchungen an Mäusen verglichen TRPV1-/- Mäuse mit Mäusen,

bei denen das zentrale Nervenende von nozizeptiven Neuronen mit

hochdosiertem Capsaicin zerstört wurde. Die mit Capsaicin behandelten Mäuse

waren deutlich unempfindlicher gegenüber schmerzhafter Hitze. Daraus kann

16

man folgern, dass sowohl die TRPV1-abhängige wie auch TRPV1-unabhängige

Wahrnehmung schädlicher Hitze über Nozizeptoren vermittelt wird, welche

TRPV1 exprimieren [33]. 2007 identifizierten Lumpkin und Catarina weitere

Wärmesensoren der TRP-Familie, die sowohl auf große Hitze (> 50°C) als auch

auf moderate Wärme (ca. 30°C) reagieren. Im heterologen Expressionssystem

wird TRPV2 bei ca. 50°C aktiviert, TRPV3 und TRPV4 haben ihre Reizschwelle

zwischen 25 und 30°C. TRPV2 wird in einer Subpopulation der Aδ-Fasern

exprimiert. Sie entsprechen in ihren biophysischen Eigenschaften denen der

Nozizeptoren mit einer sehr hohen Reizschwelle. TRPV3- und TRPV4-Knock-

out-Mäuse zeigten zudem in der Wahrnehmung von Temperatur ein

verändertes Verhalten [67]. Generell sind die Mechanismen der

Hitzenozizeption aber noch nicht vollständig erforscht.

2.4.2. Kältenozizeption

Die meisten Kältsensoren zeigen sowohl für Menthol als auch bei

Temperaturen von ca. 25 °C eine Aktivierung. Der herausragende Rezeptor

zur Wahrnehmung von unschädlicher Kälte ist TRPM8. TRPM8-/--Mäuse zeigen

auf zellulärer und neuronaler Ebene einen substantiellen Verlust der Menthol-

und Kältesensitivität über eine große Temperaturspanne von 30°C bis 10°C,

meiden aber im Experiment kalte Oberflächen ab einer Temperatur kleiner

10°C [11, 43]. Wie im Fall von TRPV1 bei Hitze ist die Sensibilität für Kälte nicht

komplett erloschen, sodass es weitere Sensoren geben muss, welche für die

nozizeptive Aktivierung ab < 12°C verantwortlich sind. Der Irritanziensensor

TRPA1 ist hierfür ein potenzieller Kandidat, da dieser auch bei der

Registrierung von Kälte und der Wahrnehmung kühlender Agentien wie Icilin

und Menthol eine Rolle zu spielen scheint [7, 79]. Dennoch sind bezüglich der

intrinsischen Kältesensitivität noch nicht alle Fragen geklärt [7, 79, 113, 155].

Diese Diskrepanzen konnten auf zellulärer Ebene nicht in letzter Konsequenz

geklärt werden. Eine Untersuchung zeigte z.B. eine normale Kälteantwort in

TRPA1-/- trigeminalen Neuronen bei einer Temperaturreduktion von 23°C auf

6°C, [9] wogegen eine andere Untersuchung eine Abnahme der

Kältesensitivität an trigeminalen Neuronen bei TRPA1-/--Mäusen zeigen

konnte [82]. Bautista et al. untersuchten 2006 das Verhalten von TRPA1-

Knock-out-Mäusen, und konnten in der Wahrnehmung von Kälte keinen

17

Unterschied zu den Wild-Typ-Mäusen feststellen. Weitere Untersuchungen von

Karashima et al. bestätigten diese Ergebnisse, konnten jedoch auch zeigen,

dass bei längerer Kältexposition die Wild-Typ-Mäuse zu springen begannen.

Sieht man dieses Phänomen als Hypersensibilisierung bei prolongierter

Kälteexposition, so lässt sich ableiten, dass TRPA1 im Rahmen einer akuten

Verletzung zur Kältewahrnehmung beiträgt, nicht jedoch per se zur

schmerzhaften Wahrnehmung von Kälte. Einzelfaser-Messungen von TRPA1

Knock-out-Mäusen zeigten im Einklang mit den vorher genannten Ergebnissen

keine Einbußen in der Kältesensibilität [33].

Weitere Membranproteine in Form spannungsgesteuerter Na+-, K+-Kanäle und

zweiporiger KCNK K+-Kanäle steuern die Feineinstellung der Reizschwelle und

die Verbreitung des Kältereizes [137, 154]. Sie können wie z.B. der

spannungsabhängige K+-A-Kanal (Kv1) spezifisch geblockt werden, was eine

Erhöhung der Temperaturreizschwelle und eine Verhaltensänderung der Mäuse

im Tierexperiment zur Folge hat. Die Modulation von KCNK2 (TREK-1) und

KCNK4 (TRAAK) spielt nicht nur bei der Kältewahrnehmung sondern auch bei

der Wahrnehmung mechanischer Stimuli und Stimuli durch schädliche Hitze

eine Rolle. Mäuse, die diese Kanäle nicht exprimieren, haben Defizite in der

Wahrnehmung von Druck, Hitze und Kälte [117]. Welche Aufgabe diese

Sensoren neben der Modulation der Nozizeptorsensibilität haben ist jedoch bis

dato unklar.

2.4.3. Chemonozizeption

Die Wahrnehmung schädigender (Umwelt-)Reize an den natürlichen

Körperbarrieren sowie im Körperinneren ist die Aufgabe der Chemonozizeption.

In diesem Feld spielt TRPA1 eine wichtige Rolle, da der Rezeptor sowohl bei

der akuten Schmerzwahrnehmung als auch an Sensibilisierungsvorgängen

beteiligt ist.

TRPA1 ist wie die bereits vorher besprochenen Mitglieder der TRP-Kanal-

Familie sensibel für reizende/ schädliche Umweltstoffe, welche in

Nahrungsmitteln zu finden sind. Hierzu zählen Isothiocyanate (Senf,

Meerrettich), Zimtaldehyde und Allicin (Knoblauch) [10, 73, 99]. Die Aktivierung

des Kanals durch die chemisch sehr unterschiedlichen Substanzen erfolgt

durch kovalente Bindung mit reaktiven Aminosäuren auf der Basis ihrer

18

Elektrophilie. So scheint nicht das Grundgerüst der chemischen Struktur für die

Aktivierung des Kanals entscheidend zu sein, sondern die Reaktionsfähigkeit

mit der Thiolgruppe N-terminaler Cysteine [69, 98]. Weitere Liganden des

Rezeptors sind das Alkylierungsmittel Iodacetamid, das im Zigarettenrauch

vorkommende Acrolein, Acetaldehyd und Formaldehyd sowie das endogene

4-Hydroxynonenal, welches unter anderem verantwortlich für Schäden durch

oxidativen Stress ist [100, 133]. Ca2+, obgleich es keinen direkten schädlichen

Reiz darstellt, verstärkt die Wirkung anderer Liganden, die zu einer Erhöhung

des intrazellulären Ca2+ führen [155]. Die Komplexität der Wirkung auf den

Kanal wird aufgrund der Tatsache deutlich, dass Ca2+ ebenso

desensibilisierende Eigenschaften aufweist [3]. Weiterhin sind Lokalanästhetika

(Lidocain), intravenöse Hypnotika (Propofol, Etomidat) und volatile Anästhetika

Liganden des Kanals [53, 57, 95].

Abbildung 3: Übersicht der TRP-Rezeptoren exprimiert in sensorischen Neuronen (aus Levine und Alessandri-Haber, 2007)

19

2.4.4. Mechanonizizeption

Die qualitativ und quantitativ differenzierte Wahrnehmung mechanischer Reize

unterschiedlicher Intensität erfordert eine Vielzahl von Neuronen mit

unterschiedlichen Reizschwellen. Neben den schon erwähnten, für die

Nozizeption wichtigen Fasern, spielen auch die Aβ-Fasern mit einer niedrigeren

Reizschwelle bei der Wahrnehmung von leichter Berührung, leichtem Druck

und Vibration eine Rolle.

Die Transformation des Reizes erfolgt auch hierbei durch spezielle

Transduktionsproteine, die in den freien Nervenenden in der Haut exprimiert

werden. Die Ionenkanaluntereinheiten des MEC-4- und MEC-10-Gens der

Degenerinen/ Epithelialen Natriumkanäle (DEG/ ENaC) konnten in

Caenorhabditis elegans als Mechanotransduktoren identifiziert werden [36].

Die Suche nach einem Korrelat bei Säugetieren hatte bis dato keinen Erfolg. So

zeigten die in Säugetieren orthologen Ionenkanäle ASIC 1, 2 und 3 in Knock-

out-Versuchen bei Nagetieren keinen entscheidenden Einfluss auf die

Mechanotransduktion [52, 118, 122]. Fehlt jedoch das orthologe

stomatinähnliche Protein MEC-2, das im Komplex mit MEC-4/10 auftritt, so

kommt es zur reduzierten Wahrnehmung leichter Berührung, die

Mechanonozizeption bleibt jedoch unbeeinträchtigt [145]. Neben den

epithelialen Natriumkanälen sind auch die in der Kältenozizeption bereits

vorgestellten Kalliumkanäle KCNK 2 und 4 Gegenstand der Forschung [117].

TRPV2 wird in Nervenfasern exprimiert, die sowohl auf thermische als auch auf

mechanische Reize reagieren [31]. Der Kanal kann in vitro durch Saugen an

der Zelle und osmotische Stimuli direkt aktiviert werden [112]. Ein weiterer

Vertreter der TRP-Familie, TRPV4, kommt wohl als Dehnungssensor in der

Niere und im Urothel vor [62, 107]. TRPV4-/--Knock-out-Mäuse zeigen z.B. nach

einer Entzündung Veränderungen in Form einer mechanischen wie

thermischen Hyperalgesie. Auf die akute Nozizeption scheint das Fehlen von

TRPV4 keinen Einfluss zu haben [4, 38, 63].

Der Stellenwert von TRPA1 in der Mechanonozizeption ist nicht eindeutig

geklärt. In zwei Studien zeigten TRPA1-Knock-out-Mäuse eine unveränderte

mechanische Wahrnehmung, [12, 119] wohingegen zwei andere Arbeiten hier

Defizite zeigten [91, 92]. Abschließend bleibt festzuhalten, dass die meisten

bisher untersuchten Proteine keine signifikanten Beiträge sowohl im Rahmen

20

der Mechanozeption als auch im Rahmen der Mechanonozizeption in

Säugetieren zu leisten scheinen. Eine relativ neue Kandidatenfamilie ist die

Familie der Piezo-Proteine, von welcher bisher die Subgruppen Piezo 1 und

Piezo 2 bekannt sind. Sie umfassen vermutlich 30 Transmembrandomänen und

ähneln keinen bis dato bekannten Ionenkanälen oder Proteinklassen. Piezo-

Proteine könnten weiterhin als nicht-leitende Untereinheiten von Kanalproteinen

fungieren, indem sie die Expression steuern oder die Kanaleigenschafften

verändern [125].

2.4.5. Zentrales nozizeptives System

Die primär afferenten nozizeptiven Neurone ziehen in das Hinterhorn des

Rückenmarks, wo der synaptische Kontakt mit dem zweiten Neuron der

nozizeptiven Bahn hergestellt wird. Das Hinterhorn wird nach Rexed in die

anatomisch und elektrophysiologisch unterschiedlichen Laminae I - X eingeteilt.

Die thermorezeptiven und nozizeptiven Afferenzen (Aδ- und C-Fasern)

projizieren in die oberflächlich gelegenen Laminae wobei C-Fasern in die

Laminae I und II und Aδ-Fasern in die Laminae I und V projizieren. Die

synaptische Übertragung erfolgt durch exzitatorische Neurotransmitter wie z.B.

die Aminosäure Glutamat und durch Neuropeptide wie Substanz P und CGRP,

die bei Verletzungen und anhaltendem Schmerz modulierend auf die

Nozizeption wirken. Die niederschwelligen Aβ-Fasern der Mechanorezeptoren

und Propriozeptoren projizieren in die tiefer gelegenen Laminae III, IV und V;

sie reagieren in der Regel nicht auf Schmerzreize. Lamina V enthält vorwiegend

wide dynamic range (WDR) Neurone, die Input von den dicken, myelinisierten

Aβ-Faser der Mechanorezeptoren und dazu sowohl direkten als auch indirekten

Input der nozizeptiven afferenten Aδ- und C-Fasern erhalten [149]. Die Neurone

der Lamina V sind vermutlich für das Schmerzphänomen des übertragenen

Schmerzes verantwortlich, bei dem Stimuli aus unterschiedlichen Regionen auf

ein und das selbe Neuron konvergieren. Höhergelegene Zentren können dann

den eigentlichen Ursprungsort des Schmerzes nicht mehr diskriminieren.

Die Nervenfasern verlaufen nachdem sie auf Segmentebene gekreuzt haben

kontralateral im Vorderseitenstrang zum Thalamus und Hirnstamm und

schließlich weiter zum Kortex (Abb. 4). Der Vorderseitenstrang untergliedert

sich in fünf aufsteigende Bahnen: der spinoretikuläre, der spinomesenzephale,

21

der spinothalamische, der cervikothalamische und der spinothalamische Trakt.

Der Vorderseitenstrang ist die zentrale nozizeptive Bahn und weist eine

somatotope Gliederung auf, wobei zervikal eintretende Fasern lateral und

sakrale Fasern medial verlaufen. Wie aus dem Namen bereits hervorgeht,

projiziert die Bahn in den Thalamus, wo im Nucleus ventralis posteromedialis

und posterolateralis die Umschaltung auf das dritte Neuron der nozizeptiven

Bahn stattfindet. Deren Fasern projizieren unter anderem zu den

somatosensorischen Kortexarealen S1 und S2 [8]. Die viszeralen Afferenzen

nehmen ihren Weg zum Thalamus über den Nervus Vagus [47].

Dem aufsteigenden nozizeptiven System steht das absteigende inhibitorische

System gegenüber, welches seinen Ursprung im periaquäduktalen Grau (PAG)

hat. Das PAG selbst wiederum steht mit dem Kortex, dem limbischen System

und dem Hypothalamus in Kontakt und wird aus diesen Bereichen heraus

reguliert. Im PAG werden unterschiedliche inhibitorische Rezeptoren wie Opiat-,

Cannabinoid- und GABA-Rezeptoren exprimiert. Die wichtigsten hemmenden

Systeme sind das noradrenerge System mit dem Locus coeruleus als zentralen

Kern in der Pons und das serotonerge System mit seinem Ursprung im Nucleus

raphe magnus in der rostroventralen Medulla [8].

Kortikale wie subkortikale Zentren, die an der Schmerzverarbeitung teilnehmen,

sind das vordere Zingulum, die Insel, der frontale Kortex, der primäre (S1) und

sekundäre (S2) somatosensorische Kortex sowie die Amygdala [120]. Stark

vereinfacht kann man das System in einen vom medialen Thalamus und einen

vom lateralen Thalamus ausgehenden Teil differenzieren. Das laterale System,

auch somatosensorisches System, ist für die Diskriminierung von Ursprung und

Intensität des Schmerzes zuständig und leitet die Wahrnehmung zu den

entsprechenden Hirnarealen [29, 78]. Über die medialen Kernanteile des

Thalamus wird die schmerzhafte Wahrnehmung auf vorwiegend limbische

Gebiete projiziert, die für die affektiv-emotionale Schmerzwahrnehmung

zuständig sind [123, 139]. Die Insel nimmt einen Platz zwischen beiden

Systemen ein. Sie prozessiert schmerzhafte und nicht-schmerzhafte Stimuli und

hat vermutlich auch eine Rolle bei der Affektbewertung von

Schmerzreizen [120].

22

Abbildung 4: Überblick über das nozizeptive System des Menschen (aus Basbaum 2009)

2.4.6. Struktur und Funktion der TRP-Kanäle Einteilung der TRP-Rezeptorfamilie Die TRP-Rezeptoren, welche sich wie bereits beschrieben stark in ihrem

Aktivierungsmechanismus und ihrer Selektivität unterscheiden, werden auf

Basis ihrer Aminosäuresequenzhomologie in 6 große Unterfamilien eingeteilt;

TRPC 1-2 (Canonical), TRPV (Vanilloid) 1-6, TRPM (Melastatin) 1-8, TRPP 1-3

(Polycystin), TRPML 1-3 (Mucolipin) und TRPA1 (Ankyrin) [42, 92, 108]. Neben

TRPV1 sind auch TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPA1 und TRPM8 in den

Neuronen der Spinalganglien exprimiert und tragen zur Transduktion

chemischer, thermischer und mechanischer Stimuli bei (Abb. 5). Es handelt

sich um Kationenkanäle mit einer selektiven Permeabilität für Ca2+ und Na+ [42,

140]. Ihr Aufbau ist gleich dem vieler spannungsgesteuerter Ionenkanäle. Sie

bestehen aus 6 Transmembrandomänen. Beide Enden, N- und C-terminal,

liegen intrazellulär und sind unterschiedlich beschaffen. Die Pore besteht aus

einem pore-loop zwischen den Transmembranregionen 5 und 6 (Abb. 5).

23

TRPA1 TRPA1 stellt das einzige Mitglied der Ankyrin-Subfamilie bei Säugetieren dar.

Er ist in zahlreichen Geweben und Zellen, wie etwa sensorischen Neuronen,

Haarzellen des Innenohrs, im vaskulären Endothel, im Herz, Hirn und Pankreas

zu finden [151]. Die Pore des Kanals weißt einen Durchmesser von 110 pm auf

und erweitert sich bei Aktivierung je nach Agonist bis auf einen Durchmesser

von 138 pm [81]. Änderungen in der Leitfähigkeit eines einzelnen Kanals sind

weniger durch den Agonisten selbst als vielmehr durch die Anwesenheit von

Polyphosphaten bedingt, welche vermutlich an die Ankyrin-Repeat-Domäne

(ARD) binden [48, 80] und so eine Aktivierung über die ARD und die Pore

selbst verursachen.

Die am N-terminalen Ende befindliche ARD baut sich aus 14 Ankyrin-Repeats

auf. Diese Repeats stellen eine 33 Aminosäuren lange Sequenz dar, welche

eine β-α-α-β Struktur ausbilden, über die Proteininteraktionen vermittelt werden.

Der ARD wird eine Funktion in der Mechanonozizeption, [113] als

Bindungsstelle für Proteine [60] und zahlreiche weitere Liganden, vergleichbar

wie bei TRPV1, zugesprochen [96]. Zur näheren Untersuchung wurden die

Ankyrin-Repeats in zwei Schritten entfernt, Δ 1-4 und Δ 1-12. Beide Mutationen

zeigten in elektrophysiologischen Untersuchungen einen vollständigen

Funktionsverlust [116].

TRPA1 kann durch zahlreiche elektrophile Substanzen über kovalente

Wechselwirkung an N-terminal gelegenen Cysteinen und Lysinen aktiviert

werden [69, 98] (Abb. 5): Isothiocyanate (wie sie in Senföl, Wasabi und

Meerrettich enthalten sind), Methylsalicylate (in Wintergrünöl), Zimtaldehyde (in

Zimt) [7], Allicin und Diallyldisulfide (in Knoblauch) [9, 98], Acrolein (in Abgasen

und Tränengas) [9], und endogene Substanzen wie H2O2, Alkenyl-Aldehyd,

4-Hydroxynonenal, 4-Oxo-Nonenal, 4-Hydroxyhexenal, Cyclopentanon,

Prostaglandin, 15-Deoxy-δ (12,14) -Prostaglandin [5, 133].

Weiter Substanzen wie Δ9-Tetrahydrocannabinol [73], Menthol und Menthol-

Analoga [79], Nikotin [131], Clotrimazol [106], Dihydropyridine [55] und

Allgemeinanästhetika [103] aktivieren TRPA1 über einen langsamen,

unbekannten Mechanismus. Sie zeigen zudem oft bimodale Eigenschaften, d.h.

sie können Einwärtsströme in hohen Konzentrationen auch blockieren.

Die kovalenten Wechselwirkungen mit den Thiolgruppen der N-terminal

gelegenen Cysteine stellen den stärksten Aktivierungsmechanismus dar. Diese

24

Wechselwirkung kann in Form von Thiocarbamaten (z.B. Senföl), Michael-

Addition (z.B. Enone), Cystein-Disulfidbrücken oder Alkylierung stattfinden [34].

Ein Kanal lagert sich aus vier TRPA1-Untereinheiten zusammen. Gezeigt sind die Transmembrandomänen (TM1 - TM6), welche die Membran durchspannen sowie der lange zytoplasmatisch gelegene N-Terminus. Die ovalen Formen sind Ankyrin-Repeat-Domänen; die gestrichelte Box zeigt eine EF-Hand (Helix-Loop-Helix-Motiv aus geladenen Aminosäuren, welche Ca2+-Ionen binden können). Die farbigen Kreise stehen für die Cystein-Reste, die nach Macpherson et al. und Hineman et al. für die kovalente Aktivierung von mouse TRPA1 (rot), human TRPA1 (grün) oder beide (blau) sind. Reprented by the permission from Springer Nature: Nature 445, Chemical biology: Sticky spices; Michael J. Caterina; Copyright © Springer Nature 2007. DOI: https://doi.org/10.1038/nature05565 TRPV1 Der transient receptor potential Vanilloid Typ 1 Ionenkanal (TRPV1) ist ein

Mitglied der TRPV-Unterfamilie. Er wurde 1997 entdeckt und stellte das erste

Membranprotein dar, von dem gezeigt werden konnte, dass es direkt an der

Nozizeption beteiligt ist. Die TRPV-Rezeptorfamilie ist in zwei Gruppen

aufgeteilt. Die eine Gruppe bildet die thermosensiblen TRPV1, TRPV2, TRPV3

und TRPV4, die andere die nicht-thermosensiblen TRPV5 und TRPV6. Der

molekulare Aufbau des Kanals entspricht dem der anderen TRP-Kanäle und

besteht aus 6 Transmembrandomänen (S1-S6), einer pore-loop zwischen S5-

S6 und intrazellulär gelegenen N- und C-Termini [32] (Abb. 6). N-terminal findet

man bei TRPV1 lediglich 6 ARDs, welche in der Kanalzusammensetzung, [37]

Abbildung 5: Struktur einer TRPA1 Untereinheit

25

bei der Interaktion mit Hilfsproteinen [110] und in der Ausbildung einer

tetrameren Struktur eine Rolle zu spielen scheinen [96]. Zusätzlich haben sie

eine ATP- und Calmodulin-Bindungsstelle, [96] welche die Kanal-Sensitivität in

Bezug auf Calciumkonzentration und vielleicht sogar metabolischen Status

beeinflussen [121]. Der C-Terminus hat ebenso einen entscheidenden Einfluss

auf die Kanalfunktion. Schneidet man die 31 bzw. 72 C-terminal gelegenen

Aminosäuren ab, so kommt es zunehmend zu Einbußen bei der Sensitivität für

Capsaicin, für pH, Hitze und spannungsaktivierter Ströme [138]. Im

C-terminalen Ende liegt die sogenannte TRP-box welche für die tetramere

funktionelle Zusammenlagerung von TRP-Kanälen zuständig ist [59]. TRPV1

bildet nämlich, wie auch andere TRP-Kanäle, quartäre Strukturen, welche einen

TRP-Kanal, ein Proteingerüst und andere Moleküle wie Phospholipase C (PLC)

und Proteinkinase C (PKC) enthalten [136]. Diese Gruppierung in

Makromolekülen bedingt die Spezifität, Sensitivität und Geschwindigkeit

intrazellulärer Signalwege [90]. Außerdem stellt eine solche Makromolekül-

bildung eine Erklärung für die unterschiedlichen pharmakologischen Reaktionen

auf Vanilloide oder Protonen der nativen Kanälen dar. Tatsächlich zeigt die

Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie eine viereckige Anordnung von TRPV1

um eine zentrale wässrige Pore [71]. Dabei kann es sich um homo- und

heterotetramere Moleküle mit TRPV2 und 3 handeln, die unterschiedliche

Sensitivität und Spezifität aufweisen [39, 68].

Die Aktivierung des Kanals findet durch viele unterschiedliche Mechanismen

statt. Der wohl bekannteste Ligand Capsaicin aktiviert den Kanal über eine

kooperative Bindung an einer intrazellulären Bindungsstelle an der

Transmembrandomäne S3 [74]. Es gibt jedoch Hinweise, dass Capsaicin

mehrere Bindungsstellen am Rezeptor besitzt [61, 77, 138]. Im Gegensatz zu

Capsaicin treten Protonen mit einer extrazellulär gelegenen Bindungsstelle in

Wechselwirkung, wodurch sie den Kanal aktivieren und für Capsaicin wie auch

Hitze sensibilisieren können [75]. Protonen können in sehr hohen

Konzentrationen den Kanal auch über die Capsaicin-Bindungsstelle aktivieren

[126]. Die temperaturabhängige Kanalaktivität wird über die eben schon

angesprochene C-terminal gelegene Region reguliert. Entfernt man die

Aminosäuren 741 bis 752, so verliert der Kanal jegliche

Temperatursensibilität [24].

26

3. Material und Methoden

3.1. Chemikalien und Lösungen

Die getesteten Muskelrelaxanzien wurden in Extrazellularlösung gelöst und

Stocklösungen in Konzentrationen von 100 mM und 1 mM für Rocuronium,

10 mM für Pancuronium, 0,01 mM für Vecuronium (alle Sigma-Aldrich,

Taufkirchen, Deutschland), 10 mM für Atracurium (von Euticals, Rozzano,

Italien) und 100 mM für Succinylcholin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas,

USA) hergestellt. Als Standard-/ Kontrollagonisten dienten Capsaicin,

Carvacrol, 4αPDD (4α-Phorbol 12,13-didecanoate), Menthol (alle Sigma-

Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und 2-APB (Tocris/Biozol, Eching,

Deutschland). Der Capsaicin-Stock (0,01 mM) war in Ethanol gelöst; Menthol

(100 mM), 2-APB (50 mM), Carvacrol (100 mM), 4αPDD (10 µM) wurden in

DMSO gelöst. Zur Blockade von Einwärtsströmen wurden die spezifischen

Antagonisten, Capsazepin (10 mM), AP-18 (beide Sigma-Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland) und HC-030031 (100 µM) (BioTrend, Köln, Deutschland), alle

gelöst in DMSO, eingesetzt.

Die calciumfreie Standard-Extrazellularlösung enthielt 140 mM NaCl, 5 mM KCl,

2 mM MgCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES und 5 mM EGTA als Ca2+-

Komplexbildner. Die Lösung wurde mit Tetramethylammonium (TMA) auf einen

pH von 7,4 titriert. Die Intrazellularlösung bestand aus 140 mM KCl, 2 mM

MgCl2, 10 mM HEPES und 5 mM EGTA, die Lösung wurde mit KOH auf pH 7,4

eingestellt.

3.2. Zellkultur und heterologe Expression in HEK293t-Zellen

HEK293t-Zellen (human embryonic kidney-Zellen) sind embryonale

Nierenstammzellen, die sich durch ihre problemlose Kultivierung, einfache

Möglichkeit der Transfektion und niedrige endogene Expression der zu

untersuchenden Kanäle auszeichnen. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2

und 95% O2 in DMEM (Nährmedium Dulbecco’s modified Eagle medium), 1%

Penicillin/ Streptomycin, 30 mM HEPES, 10% FBS (fetal bovin serum) (alle von

Gibco/Inyitrogen, Karlsruhe Deutschland) und 1% Taurin (Sigma-Aldrich,

27

München, Deutschland) bis zu einer Dichte von 70 - 80% in 7 ml-

Zellkulturflaschen kultiviert.

Zur Transfektion wurden die Zellen mittels 0,05% Trypsin-EDTA

(Gibco/Inyitrogen, Karlsruhe, Deutschland) in 35 mm Zellkulturschälchen

aufgeteilt und am selben Tag bei einer Dichte von erneut 70 - 80% transfiziert.

Die Transfektion erfolgte mit dem Nanofectin Kit der Firma PAA-The Cell

Culture Company. Nanofectin ist ein positiv geladenes Polymer, welches in

einen offenporigen Nanopartikel eingebettet ist. Nur der DNA-Nanopartikel-

Komplex kann dann bevorzugt in die Zelle aufgenommen werden und führt so

zu einer gut reproduzierbaren Transfektionsrate der Zellen. Nach einer

Inkubationszeit von 12 - 15 h wurden die Zellen in 35 mm Zellkulturschälchen

ausgesät und nach 4 - 8 h gemessen. Die verwendete hTRPA1-cDNA stammt

von Dr. Paul Heppenstall (EMBL, Monoterondo, Italien), die restlichen cDNAs

wurden von Dr. David Julius (UCSF, San Francisco, USA) zu Verfügung

gestellt. Die Mutation von drei Serinen zu Cysteinen in hTRPA1 erfolgte

schrittweise durch das Einfügen von Cystein an den Positionen 621, 641 und

665 in den Plasmid-Vektor pTRE. Bei der Mutation hTRPA1-3CK wurde analog

an Position 710 ein Arginin für ein Lysin eingefügt. Die cDNAs wurden

entsprechend ihrer Expression in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt:

hTRPA1 (1,6 µg), rTRPV1 (1 µg), mTRPA1 (5 µg), rTRPV2 (2 µg), rTRPV3

(2 µg), rTRPV4 (2 µg), rTRPM8 (2 µg), hTRPA1-C621S/C641S/C665S (1,6 µg),

hTRPA1-C621S/C641S/C665S/K708R (1,6 µg). Um transfizierte Zellen zu

identifizieren wurde als Reporterplasmid CD8-pih3m (1 µg) zugegeben. Mittels

anti-CD8-Immunobeads (anti-CD8 Dynabeads®, Dynal Biotech, Oslo,

Norwegen) konnten so transfizierte Zellen identifiziert werden.

3.3. Patch-Clamp-Experimente

Die Messungen der Ströme durch die Ionenkanäle erfolgte durch die von den

beiden Physiologen Sakmann und Neher 1976 beschriebene Patch-Clamp-

Technik, bei der sehr kleine Ströme in der Größenordnung von pA über

Zellmembranen detektiert werden können. So wurde die Untersuchung

einzelner Ionenkanäle in der Zellmembran erst möglich.

Die Membranströme wurden mit einem Verstärker der Marke Axopatch 200B

registriert und mit einem Analog-Digital-Wandler (Digitizer, Digidata 1440A)

28

digitalisiert. Die Erfassung und Auswertung der Daten am Computer erfolgte mit

der Software pCLAMP 8.1/ 10.0 und Clampfit (alle von: Axon Instruments/

Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien USA). Die zur Messung verwendeten

Elektroden wurden aus Borosilikat-Glasröhren (TW150F-3, World Precision

Instruments, Berlin, Deutschland) mit einem Pipettenziehgerät (PP830,

Narishge, Japan) gezogen. Der Widerstand der verwendeten Pipetten betrug

1,5 - 2 MΩ.

Die am Tag der Messung gesplitteten Zellen wurden von Nährmedium befreit,

mit Extrazellularlösung gewaschen, anti-CD8 Dynabeads® zugegeben und das

Zellkulturschälchen schließlich mit etwa 2 ml Extrazellularlösung aufgefüllt. Die

Pipette wurde bis zur Hälfte mit Intrazellularlösung gefüllt und an dem

Vorverstärker angebracht. Mit Hilfe eines Mikromanipulators (Typ PP-830,

Naishige, Japan) und eines auf einem Anti-Schwingungstisch gelagerten

Mikroskops (Eclipse TE2000-S, Nikon, Düsseldorf, Deutschland) näherte man

sich der Zelle an. Die Messung erfolgte mit der Methode der Ganz-Zell-

Spannungsklemme, die eine Detektion der Ströme über der ganzen

Zellmembran ermöglicht (Abb. 6). Hierbei bewegt man die Pipette bis zum

Kontakt mit der Zelle, der Widerstand erhöht sich dabei um wenige MΩ. Durch

einen kurzen Sog an der Pipette wird die Verbindung zwischen der Pipette und

der Zelle vollständig, worauf sich ein hoher Widerstand > 1 GΩ, der sog.

Gigaseal, zwischen der Zelle und der Pipette ausbildet (Abb. 6 A). Saugt man

nun weiter an der Pipette, durchbricht man die Zellmembran und es entsteht

eine hochohmige, sehr stabile Verbindung zwischen der Pipette und der

Zelle (Abb. 6 B).

Abbildung 6: Whole-Cell Konfiguration

(A) Annäherung an die Zelle, der Widerstand erhöht sich um wenige Ohm. Durch kurzen Sog bildet sich der sog. „Gigaseal“ aus. (B) Die Zellmembran wird durch weiteren Sog durchbrochen und so eine Öffnung zum Zellinneren geschaffen.

29

Da man beim Öffnen der Zelle zwangsläufig Membranbestandteile in den

Mündungsbereich der Pipette zieht kann man als Faustregel eine Verdopplung

des Widerstands zwischen Pipette und Bad annehmen. Durch diese Methode

erhält man eine Konfiguration, die es ermöglicht Ströme über der gesamten

Zellmembran zu messen. Weiterhin werden durch den hochohmigen

Widerstand Leckströme und das daraus folgende Hintergrundrauschen stark

vermindert, wodurch sich die Aufnahmequalität verbessert.

Alle Patch-Clamp-Experimente wurden bei einem Haltemembranpotential von

-60 mV und bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Applikation der Lösungen erfolgte schwerkraftgetrieben mit einem

Polytetrafluorethylen-Glas-Multiperfusionssystem.

30

4. Ergebnisse

4.1. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPA1

Zunächst wurde untersucht, ob Rocuronium mit dem Irritanziensensor TRPA1

interagiert. Hierfür wurde Rocuronium in steigender Konzentration auf in

HEK293t-Zellen heterolog-exprimierten humanen TRPA1 (hTRPA1) bis zum

Erreichen eines Steady States appliziert. Die Zellen wurden während der

Applikation bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten. Bereits ab einer

Konzentration von 10 nM konnten durch Rocuronium induzierte Einwärtsströme

beobachtet werden. Die Größe der Einwärtsströme war konzentrations-

abhängig. Die mittleren Stromamplituden betrugen bei 10 nM 198,2 ± 131,6 pA,

n=6; bei 100 nM 210,9 ± 35,4 pA, n=10; bei 1 µM 507,3 ± 204,4 pA, n=12; bei

10 µM 646,3 ± 200,1 pA, n=9; bei 100 µM 1207,2 ± 212,0 pA, n=35; bei 1 mM

281,3 ± 46,2 pA, n=18; bei 10 mM 229,7 ± 58,2 pA, n=16; bei 15mM 143,4 ±

19,5 pA, n=10. Wie bereits aus den Werten zu entnehmen ist, zeigte sich ab

einer Konzentration von 1 mM eine Abnahme der durchschnittlichen

Stromamplituden, möglicherweise bedingt durch eine parallele Blockade des

Rezeptors durch Rocuronium. Ab einer Konzentration von 10 mM war zudem

eine rasche Zunahme des Einwärtsstroms nach Auswaschen durch

Extrazellularlösung zu beobachten (Abb. 7 A, B). Dieses als resurgent current

bezeichnete Phänomen wurde bereits für Maus-TRPA1 (mTRPA1) bei einer

Aktivierung durch Lidocain oder Menthol beschrieben, bei hTRPA1 wurden

durch diese Substanzen keine resurgent currents verursacht [95, 152] (Abb. 7

A). Die Zunahme der Stromamplitude nach Auswaschen erfolgte deutlich

rascher als die ursprüngliche Aktivierung durch Rocuronium. Auch dies ist

möglicherweise auf einen Block des Kanals im offenen Zustand

zurückzuführen.

Um die blockierenden Eigenschaften von Rocuronium weiter zu untersuchen

wurde getestet, ob Rocuronium auch Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende

HEK-Zellen durch den Standard-Agonisten Carvacrol verringert. Hierzu wurden

Einwärtsströme durch 250 µM Carvacrol induziert und anschließend

Rocuronium in verschiedenen Konzentrationen coappliziert (6 - 8 Zellen pro

Konzentration). Im Durchschnitt blockiert Rocuronium in einer Konzentration

von 1 µM den Carvacrol-Einwärtsstrom zu 61 ± 14%, bei 10 µM zu 47 ± 19%

31

und bei 100 µM zu 86 ± 5%. Die Blockade war nach Beendigung der

Rocuronium-Applikation teilweise auswaschbar (Abb. 7 C, D).

Abbildung 7: Rocuronium aktiviert und blockiert hTRPA1

(A) Repräsentative Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen. Rocuronium aktiviert hTRPA1 ab einer Konzentration von 100 nM. Die Konzentration der klinischen Rocuronium-Präparation (10 mg/ml) beträgt 16,4 mM, der Plasmaspiegel nach Einleitungsdosis beträgt 5 - 10 µg/ml (8 - 16 µM). Untransfizierte Zellen zeigten keinen Einwärtsstrom auf 100 µM Rocuronium (nicht gezeigt). Um einer Desensibilisierung vorzubeugen wurde pro Zelle nur eine Konzentration getestet. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert. (B) Dosis-Wirkungskurve von Rocuronium an hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen. Rocuronium aktiviert hTRPA1 mit einer EC50 von ca. 3 µM, die EC50 wurde nur anhand der Konzentrationen von 100 nM bis 100 µM errechnet. In Konzentrationen > 100 µM scheint die Aktivierung von hTRPA1 durch eine gleichzeitige Blockade des Rezeptors überlagert zu werden. Pro Konzentration wurden zwischen 6 und 35 Zellen getestet. (C) Rocuronium blockiert eine Aktivierung von hTRPA1. hTRPA1 wird durch 250 µM Carvacrol aktiviert, die anschließende, zusätzliche Applikation von 100 µM Rocuronium führt zu einer schnellen Blockade des Carvacrol-induzierten Einwärtsstroms. Nach Beendigung der Rocuronium-Applikation ist die Blockade teilweise auswaschbar. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Carvacrol wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Rocuronium, welches ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurde. (D) Die Blockade von hTRPA1 durch Rocuronium ist konzentrationsabhängig. 1 µM Rocuronium blockiert im Durchschnitt 61 ± 14% des Carvacrol-induzierten Einwärtsstroms, 10 µM 47 ± 19%, 100 µM Rocuronium blockieren 86 ± 5% des Einwärtsstroms. Für jede Konzentration wurden 6 - 8 Zellen getestet.

A"

B"

C"

!!!ds!

32

4.2. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPA1-exprimierende Zellen durch die TRPA1-Antagonisten AP-18 und HC-030031

Um zu zeigen, dass die gemessenen Einwärtsströme durch eine Aktivierung

von hTRPA1 verursacht werden, wurden Rocuronium-induzierte

Einwärtsströme mit AP-18 blockiert. 2007 zeigten Petrus et. al, dass AP-18 eine

Aktivierung von hTRPA1 durch Zimtaldehyd in einer Konzentration von 50 µM

mit einer IC50 von 4,5 µM blockiert [119]. Die Aktivierung von hTRPA1 durch

Rocuronium konnte in unseren Experimenten durch 50 µM AP-18 jedoch

lediglich zu 76,5 ± 26,3% (p < 0,05) und in einer Konzentration von 200 µM zu

81,7 ± 34% (p < 0,05) blockiert werden. Durch erneute Applikation von

Rocuronium ließ sich die Blockade nur sehr langsam und lediglich zu einem

geringen Anteil aufheben (Abb. 8 A).

In weiteren Experimenten wurden Rocuronium-induzierte Ströme mit

HC-030031 blockiert. HC-030031 ist spezifisch für TRPA1 und blockiert

Einwärtsströme unabhängig von der aktivierenden Substanz [105]. Die

Aktivierung von hTRPA1 erfolgte mit Rocuronium in einer Konzentration von

100 µM. HC-030031 wurde mit der Rocuronium-Testlösung coappliziert und

blockierte in einer Konzentration von 100 µM die Einwärtsströme im

Durchschnitt um 99,4 ± 0,9% (p < 0,05) (Abb. 8 A, B). Die Blockade erfolgte

schnell und war durch alleinige Applikation der Rocuronium-Testsubstanz

wieder auswaschbar.

33

Abbildung 8: Rocuronium-induzierte Ströme lassen sich durch die hTRPA1 Antagonisten HC-030031 und AP-18 blockieren

(A) HC-030031 blockiert die Aktivierung von hTRPA1 vollständig in einer Konzentration von 100 µM, AP-18 verursacht eine partielle Blockade in einer Konzentration von 200 µM. hTRPA1 wurde mit Rocuronium in einer Konzentration von 100 µM aktiviert. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit HC-030031 oder AP-18, welche ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurden. (B) Bei den Experimenten erfolgte eine Aktivierung von hTRPA1 mit Rocuronium in einer Konzentration von 100 µM. HC-030031 blockiert in einer Konzentration von 100 µM den Einwärtsstrom im Durchschnitt zu 99,4 ± 0,9% (p < 0,05), AP-18 in einer Konzentration von 50 µM zu 76,5 ± 26,3% (p<0,05) und in einer Konzentration von 200 µM zu 81,7 ± 34% (p < 0,05).

4.3. Für die Aktivierung von hTRPA1 durch Rocuronium sind bestimmte Aminosäuren im N-terminalen Ende des Proteins notwendig

Für TRPA1 wurden unterschiedliche Aktivierungsmechanismen beschrieben.

So sind für die Aktivierung und Blockade durch Menthol bestimmte

Aminosäuren in der Transmembranregion 5 notwendig, [152] für die Aktivierung

durch Calcium wurde eine sog. EF-Hand-Domain im N-Terminus identifiziert

[155]. Irritierende Substanzen beinhalten auf molekularer Ebene häufig reaktive

chemische Gruppen. So besitzt das im Senföl vorkommende Allylisothiocyanat

(AITC, TRPA1-Aktivator) eine reaktive Schwefelgruppe. Das u.a. im

Zigarettenrauch vorkommende Irritanz Acrolein (ebenfalls ein TRPA1-Agonist)

ist ein starkes Elektrophil und fungiert häufig als sog. Michael-Akzeptor. Viele

700 pA 20 S

100µM Rocuronium 200µM AP-18

Nor

mal

isie

rter R

ocur

oniu

m-

Ein

wär

tsst

rom

Roc

. 100

µM

Roc. 1

00 µM

+

HC–030

031 1

00 µM

Roc. 1

00 µM

Roc

. 100

µM

Roc. 1

00 µM

+

AP-18 50

µM

Roc. 1

00 µM

+

AP-18 20

0 µM

100µM Rocuronium 100µM HC-03003

300 pA

20 S

A

B

34

TRPA1-Agonisten haben sehr unterschiedliche Molekülgrundstrukturen,

besitzen aber eine chemisch-reaktive Gruppe, welche mit bestimmten Cystein-

Resten im N-Terminus interagiert und eine kovalente Bindung mit diesen

eingehen kann.

Hinman et al. zeigten, dass nach Mutation von drei Cystein-Resten an den

Stellen 621, 641 und 665 zu Serin der Kanal durch elektrophile Agonisten (z.B.

Acrolein, AITC) nur noch in exorbitant hohen Dosen aktivierbar ist. Die

zusätzliche Mutation eines Lysin-Restes zu Arginin an der Stelle 710 macht den

Kanal komplett insensitiv für AITC. 2-APB, welches über einen bis dato

unbekannten Mechanismus TRPA1 aktiviert, ruft weiterhin eine Aktivierung des

Kanals hervor. Gegenüber den Agonisten wie Menthol oder Carvacrol ist den

reaktiven oder elektrophilen Agonisten gemein, dass die Kinetik der

Einwärtsströme sehr langsam ist und die Agonisten manchmal über Minuten

appliziert werden müssen bis sich ein Strommaximum einstellt. Diese

Zeitverzögerung im Gegensatz zur schnellen Stromkinetik bei Menthol und

Carvacrol wird der Diffusion über die Zellmembran sowie dem Eingehen der

kovalenten Bindung zugeschrieben. Vergleicht man die Kinetik der

Rocuronium-induzierten Einwärtsströme mit denen von AITC oder Carvacrol, so

ähnelt diese stark der Kinetik von AITC. Auf der Suche nach einem

Aktivierungsmechanismus von Rocuronium untersuchten wir also zunächst die

für elektrophile Substanzen nahezu insensible hTRPA1-Mutation

C621S/C641S/C665S (hTRPA1-3C). Diese zeigte analog zur Aktivierung von

hTRPA1 durch AITC ebenso um 75,3% (p < 0,05) reduzierte Einwärtsströme

auf die Applikation von 100 µM Rocuronium, jener Konzentration, welche beim

Wildtyp die durchschnittlich größten Ströme hervorruft (Abb. 9 A, B). Die

zusätzliche Mutation des Lysins zu Arginin an der Stelle 710

(C621S/C641S/C665S/K710R, hTRPA1-3CK) machte die Mutation für 100 µM

Rocuronium vollständig insensibel (p < 0,05), zeigte allerdings weiterhin eine

Aktivierbarkeit durch 1 mM 2-APB (Abb. 9 A, B). Die Abnahme der

Stromamplitude von hTRPA1-3C gegenüber der Mutanten hTRPA1-3CK war

statistisch nicht signifikant (p > 0,05). Letztendlich konnten wir mit diesen

Experimenten zeigen, dass sich Rocuronium trotz einer sehr unterschiedlichen

Molekularstruktur bei der Aktivierung von TRPA1 analog zu den elektrophilen

Agonisten wie AITC und Acrolein verhält [57, 69, 98, 152].

35

Abbildung 9: Aminosäuren im N-terminalen Rest von TRPA1 vermitteln die Rocuronium-induzierte Aktivierung

(A) Die hTRPA1-Mutante C621S/C641S/C665S zeigt im Vergleich zum Wildtyp um 75,3% verkleinerte Einwärtsströme durch 100 µM Rocuronium (p < 0,05). Die hTRPA1-Mutation C621S/C641S/C665S/K710R kann durch Rocuronium nicht mehr aktiviert werden (p > 0,05), die Mutation ist aber durch 1 mM 2-APB weiterhin aktivierbar (nicht gezeigt). Zellen wurden bei -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States oder aber für mindestens 1,5 min appliziert. (B) Vergleich der durch 100 µM Rocuronium verursachten durchschnittlichen Einwärtsstromamplituden. Für jeden Genotyp wurden zwischen 8 und 35 Zellen gemessen.

4.4. Rocuronium aktiviert und blockiert TRPV1

TRPA1 und TRPV1 sind in nozizeptiven Neuronen coexprimiert und bilden

möglicherweise Heterotetramere [56]. Aus diesem Grund untersuchten wir im

Folgenden den humanen TRPV1-Rezeptor auf seine Aktivierbarkeit durch

Rocuronium im heterologen Expressionssystem in HEK293t-Zellen. Auch hier

ließen sich bereits mit sehr niedrigen Konzentrationen ab 1 nM Einwärtsströme

induzieren und es zeigte sich eine Konzentrationsabhängigkeit der Aktivierung.

Die mittleren Stromamplituden betrugen bei 1 nM 173,8 ± 89,3 pA, n=6; bei

10 nM 433,5 ± 334,5 pA, n=10; bei 100 nM 783,0 ± 615,7 pA, n=10; bei 1 µM

1116,7 ± 1513,3 pA, n=7; bei 10 µM 836,4 ± 1603,9 pA, n=13; bei 100 µM

186,8 ± 185,6 pA, n=9; bei 1 mM 115,4 ± 114,0 pA, n=8; bei 15mM

30,0 ± 25,4 pA, n=10 (Abb. 10 A, B). Ähnlich wie die Aktivierung von hTRPA1

verläuft die Aktivierung von hTRPV1 zweiphasig: in Konzentrationen zwischen

1 nM und 1 µM nehmen die Einwärtsströme an Größe zu; in höheren

Konzentrationen ab 10 µM nehmen die Einwärtsströme wieder ab. Im Bereich

der klinisch-verwendeten Konzentration in Höhe von 15 mM kommt es nur noch

zu einer transienten und kleinen Aktivierung. Nach Applikation dieser

Konzentrationen zeigten sich auch hier beim Auswaschen der Rocuronium-

Lösung häufig resurgent currents, welche bis zur höchsten getesteten

36

Konzentration von 15 mM deutlich an Größe zunahmen. Auch hier lag

wiederum eine zusätzliche blockierende Komponente von Rocuronium an

hTRPV1 nahe, sodass in weiteren Experimenten untersucht wurde, ob

Rocuronium in Coapplikation mit anderen Agonisten den Kanal suffizient

blockieren kann. Hierzu wurde hTRPV1 zunächst mit 100 nM Capsaicin

aktiviert, anschließend erfolgte die Coapplikation von 100 nM Capsaicin und

1 µM oder 100µM Rocuronium. 1 µM Rocuronium führte zu einer Reduktion des

Einwärtsstroms um 49,9 ± 18,6%, 100 µM Rocuronium zu einer Reduktion des

Capsaicin-induzierten Einwärtsstroms um 54,4 ± 24,4% (Abb. 10 E).

Für einige Agonisten von TRPA1 und/oder TRPV1 sind speziesspezifische

Aktivierungsmechanismen bekannt. Aus diesem Grund untersuchten wir

TRPV1 der Ratte (rTRPV1) auf seine Aktivierbarkeit durch Rocuronium.

Zunächst wurde 1 µM Rocuronium auf rTRPV1-exprimierende HEK-Zellen

gegeben, im Anschluss erfolgte die Gabe von 100 nM Capsaicin zur

Generierung eines maximalen Einwärtsstroms für jede individuelle Zelle. Rein

morphologisch waren die induzierten Einwärtsströme sehr ähnlich (Abb. 10 A,

C). Normierte man die Rocuronium-Ströme auf den jeweils folgenden

Capsaicin-Strom, so erreichten die Rocuronium-Ströme bei rTRPV1 im Schnitt

54,2 ± 41,6% des Capsaicin-Stroms, bei hTRPV1 allerdings nur 15,9 ± 14,9%

(Abb. 10 D).

1 nM 10 nM 1 µM 100 nM 10 µM 100 µM 1 mM 15 mM

25 S

500 pA

A

Inw

ard

curr

ent i

n pA

cRocuronium in µM

B

37

Abbildung 10: Rocuronium aktiviert und blockiert TRPV1

(A) Repräsentative Einwärtsströme in hTRPV1-exprimierende HEK293t-Zellen. Rocuronium aktiviert hTRPV1 ab einer Konzentration von 1 nM. Die Konzentration der klinischen Rocuronium-Präparation (10 mg/ml) beträgt 16,4 mM, der Plasmaspiegel nach Einleitungsdosis beträgt 5 - 10 µg/ml (8 - 16 µM). Untransfizierte Zellen zeigten keinen Einwärtsstrom auf 100 µM Rocuronium (nicht gezeigt). Um einer Desensibilisierung vorzubeugen, wurde pro Zelle nur eine Konzentration getestet. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert. (B) Dosis-Wirkungskurve von Rocuronium an hTRPV1-exprimierenden HEK293t-Zellen. In Konzentrationen > 1 µM scheint die Aktivierung von hTRPV1 durch eine gleichzeitige Blockade des Rezeptors überlagert zu werden. (C) Repräsentativer Einwärtsstrom in eine rTRPV1-exprimierende HEK293t-Zelle. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert. (D) Normalisiert man die Einwärtsströme von hTRPV1 und rat TRPV1 auf die Capsaicin-Kontrollströme, so zeigt sich im direkten Speziesvergleich bei hTRPV1 eine Aktivierung von 15,9 ± 14,9% und bei ratTRPV1 von 54,2 ± 41,6%. (E) Repräsentative Ströme der Blockade der Capsaicin-induzierten Ströme durch Coapplikation von Rocuronium 1 µM und 100 µM. (F) Normalisierte Rocuronium-Einwärtsströme. Rocuronium blockiert eine Aktivierung von hTRPV1 durch Capsaicin ab einer Konzentration von 1 µM. hTRPV1 wird durch 100 nM Capsaicin aktiviert. Die anschließende Coapplikation von 1 µM Rocuronium führt zu einer Blockade von 49,9 ± 18,6%, bei 100 µM Rocuronium zu einer Blockade von 54,4 ± 24,4% des Capsaicin-induzierten Einwärtsstroms. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Capsaicin wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Rocuronium, welches ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurde.

Roc 1 µM

25 S

500 pA

C

Capsaicin 100 nM Rocuronium 100 µM

Capsaicin 100 nM Rocuronium 1 µM

25 S

!

500 pA

No

rmie

rter

Ro

curo

niu

m-

Ein

wär

tsst

rom

Capsaicin 100 nM

hTRPA1 ratTRPV1

D

E F

No

rmie

rter

Ro

uro

niu

m-

Ein

wär

tsst

rom

Capsicin 100 nM

Capsaicin 100nM + Roc. 1µM

Capsaicin 100nM +

Roc. 100µM

!

38

4.5. Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPV1-exprimierende Zellen durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin

Zur Kontrolle, dass es sich bei der Applikation von Rocuronium auf hTRPV1

nicht um unspezifische Effekte handelt, wurde Rocuronium mit dem TRPV1-

Antagonisten Capsazepin coappliziert. Capsazepin, welches ein synthetisches

Analogon von Capsaicin ist, blockiert spezifisch die Aktivierung von TRPV1

durch Agonisten wie Capsaicin und Resiniferatoxin, allerdings nicht die TRPV1-

Antwort auf Hitze [142]. Ein durch 1 µM Rocuronium induzierter Einwärtsstrom

in hTRPV1-exprimierende HEK-Zellen wurde durch die Coapplikation von

10 µM Capsazepin vollständig blockiert (Abb. 11 A, B).

Abbildung 11: Blockade von Rocuronium-induzierten Einwärtsströmen in TRPV1-exprimierende Zellen durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin.

Capsazepin blockiert die Aktivierung von hTRPV1 in einer Konzentration von 10 µM. hTRPV1 wurde mit Rocuronium in einer Konzentration von 1 µM aktiviert. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Capsazepin, welches ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States appliziert wurde.

4.6. Rocuronium verursacht keine Sensibilisierung der Protonen-induzierten Stromantwort bei hTRPV1

Klinisch-gebräuchliche Injektionslösungen von Rocuronium (z.B. Esmeron®)

haben zur Stabilisation der Lösung einen sauren pH-Wert in Höhe von 3,8 - 4,2.

TRPV1 lässt sich durch Protonen, also einen sauren pH-Wert, der kleiner als

6,3 ist, aktivieren [32]. Für TRPV1 ist ebenfalls bekannt, dass bei Applikation

Rocuronium 1µM Capsazepin 10 µM

25 S

!

500 pA

A" B"

Roc

uron

ium

Ein

wär

tsst

rom

Rocuronium 1 µM Rocuronium 1 µM + Capsazepin 10 µM

39

niedriger Konzentrationen zweier Agonisten eine Sensibilisierung des

Rezeptors erfolgen kann, z.B. durch Protonen für Capsaicin und Hitze [132]

oder durch Lidocain für Capsaicin und Hitze [94]. Bisher wurde, wie bereits

erwähnt, der Injektionsschmerz von Rocuronium-haltigen Lösungen nur dem

sauren pH-Wert der Lösung zugeschrieben. Hier stellte sich nun die Frage, ob

die kombinierte Applikation der TRPV1-Agonisten Rocuronium und Protonen

ebenfalls eine Sensibilisierung der Einwärtsströme in TRPV1-exprimierende

Zellen verursacht. Hierzu wurde zunächst in calciumfreier Lösung durch einen

pH-Wert von 6 ein Strom in hTRPV1-exprimierende HEK-Zellen induziert, in

einer zweiten Applikation wurde pH 6 mit 10 µM oder 100 µM Rocuronium

kombiniert (Abb. 12 A). Die für andere Agonistenkombinationen beschriebene

Sensibilisierung konnte in unseren Experimenten nicht nachvollzogen werden,

vielmehr zeigten sich in der Tendenz bei der kombinierten zweiten Applikation

leicht rückläufige Einwärtsstromamplituden. Während bei einer Konzentration

von 10 µM Rocuronium eine Stromabnahme von 1,3 ± 11% beobachtet wurde,

zeigte sich bei einer Konzentration von 100 µM eine Abnahme des

Einwärtsstroms um 27 ± 32 % (Abb. 12 B).

ES pH 6,0

ES pH 6,0 + Roc. 100 µM

ES pH 6,0

ES pH 6,0 + Roc. 10 µM

10 s

3 nA

Nor

mal

isie

rter

Roc

uron

ium

–

Einw

ärts

stro

m

Roc. 1

00 µM

+

ES pH 6,

0

ES pH 6

ES pH 6

Roc. 1

0 µM +

ES pH 6,

0

A"

B"

40 Abbildung 12: Rocuronium verursacht keine Sensibilisierung der Protonen-induzierten Stromantwort bei hTRPV1

(A) Bei Coapplikation von Rocuronium und Protonen kommt es zu keiner Sensibilisierung der Stromantwort bei hTRPV1. Bei steigenden Rocuroniumkonzentrationen (10 µM/ 100 µM) zeigt sich eine in der Tendenz verringerte Stromantwort. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, pH 6,0 wurde bis zum Erreichen eines Steady States appliziert, gefolgt von der kombinierten Applikation mit Rocuronium, ebenfalls bis zum Erreichen eines Steady States. (B) Rocuronium blockiert in einer Konzentration von 10 µM die Stromantwort um durchschnittlich 1,3 ± 11%, in einer Konzentration von 100 µM um durchschnittlich 27 ± 32%.

4.7. Die Thermo-TRPs als weitere Mitglieder der TRP-Kanalfamilie werden durch Rocuronium nicht aktiviert

Während TRPV1 als Markerprotein für nozizeptive Neurone angesehen werden

kann, da der Kanal in der Mehrzahl der entsprechenden Neuronen exprimiert

wird, ist TRPA1 nur in einem kleineren Anteil der nozizeptiven Neurone zu

finden, hier aber in einer signifikanten Überlappung mit TRPV1. Die

sogenannten Thermo-TRPs (TRP-Kanäle welche durch bestimmte

Temperaturen aktiviert werden) TRPV2, TRPV3, TRPV4 sowie TRPM8 werden

ebenso in Nozizeptoren exprimiert. Da in der Vergangenheit durch

verschiedene Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte, dass Substanzen, welche

TRPV1 und/ oder TRPA1 aktivieren, ebenso die Thermo-TRPs aktivieren

können, [57] untersuchten wir die genannten Kanäle auf deren Aktivierbarkeit

durch 10 µM bzw. 100 µM Rocuronium (n = mindestens 7 für jeden Rezeptor

für jede Konzentration). Die jeweiligen Rocuronium-Konzentrationen wurden für

100 s appliziert. Um zu zeigen, dass die Zellen den gewünschten Kanal auch

exprimieren, wurde im Anschluss mit einem Kontrollagonisten ein Strom

induziert. Um unerwünschte Effekte wie z.B. eine Desensibilisierung zu

vermeiden, wurde pro Zelle nur eine Rocuronium-Konzentration getestet. Alle

untersuchten Kanäle (TRPV2-V4 sowie TRPM8) zeigten auf die Applikation von

10 µM bzw. 100 µM Rocuronium keine Einwärtsströme oder sonstige

Veränderungen der Stromkurve, wohingegen alle Kontrollagonisten suffiziente

Ströme auslösen konnten (Abb. 13).

41

Abbildung 13: TRPV2-V4 und TRPM8 werden durch Rocuronium nicht aktiviert

Weder 10 µM (nicht gezeigt) noch 100µM Rocuronium verursachen Einwärtsströme in HEK293t-Zellen, die nozizeptive Thermo-TRP-Kanäle rTRPV2, hTRPV3, rTRPV4 oder rTRPM8 exprimierten. Pro Kanal und Konzentration wurden mindestens 7 Zellen getestet, die Expression des jeweiligen Kanals wurde mit einem Kontrollagonisten verifiziert. Die Zellen wurden bei -60 mV gehalten, Rocuronium wurde bis zum Erreichen eines Steady States oder aber für mindestens 100 s appliziert.

4.8. Weitere klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien aktivieren ebenfalls hTRPA1

Schmerzen bei intravenöser Injektion sind nur für Rocuronium klinisch

beschrieben, aber die enge strukturelle Verwandtschaft mit Pancuronium und

Vecuronium lässt vermuten, dass diese beiden Derivate ebenso das Potential

aufweisen hTRPA1 zu aktivieren. Wie einleitend beschrieben, ist TRPA1 dafür

bekannt, dass er durch viele nicht-strukturverwandte Chemikalien aktiviert

werden kann. Deswegen wurde die Familie der Benzylisochinolone mit einem

ihrer Vertreter, dem Atracurium, und ebenso Succinylcholin als einziger

Vertreter der nicht-depolarisierenden Muskelrelaxanzien, welches aus zwei

Acetylcholin-Molekülen besteht, getestet.

Erstaunlicherweise induzierten alle getesteten Substanzen Einwärtsströme in

hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen mit folgenden mittleren Stromstärken:

10 µM Pancuronium: 765,5 ± 345,9 pA, n=6; 100 µM Vecuronium:

544,1 ± 497,3 pA, n=10; 10 µM Atracurium: 143,9 ± 114,3 pA, n=9; und

schließlich 100 µM Succinylcholin: 664,1 ± 491,6 pA, n=10 (Abb. 14).

42

Abbildung 14: Weitere klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien aktivieren ebenfalls hTRPA1 in HEK293t-Zellen

(A) Repräsentative, durch verschiedene Muskelrelaxanzien verursachte Einwärtsströme in hTRPA1-exprimierende HEK293t-Zellen. Sowohl nicht-depolarisierende als auch depolarisierende Muskel-relaxanzien sind potente Agonisten für hTRPA1. Für jedes Relaxanz wurde eine Konzentration getestet. Die Zellen wurden bei einem Membranpotential von -60 mV gehalten, die verschiedenen Substanzen wurden bis zum Erreichen eines Steady-states appliziert. (B) Vergleich der durchschnittlichen Einwärtsstromamplituden der verschiedenen Muskelrelaxanzien. Für jede Substanz wurden zwischen 5 und 10 Zellen gemessen.

Rocuronium Vecuronium Pancuronium Atracurium Succinylcholin

43

5. Diskussion Rocuronium ist eines der am häufigsten verwendeten, nicht-depolarisierenden

Muskelrelaxanzien im klinischen Alltag. Die Anwendung wird jedoch durch eine

unerwünschte Wirkung, nämlich einen unangenehmen, brennenden

Injektionsschmerz eingeschränkt. Dieser limitiert die Anwendung besonders für

die Präkurarisierung oder das Priming bei bewusstseinsklaren Patienten und in

der Kinderanästhesie. Neben dem sauren pH-Wert der klinisch-gebräuchlichen

Lösungen sowie einer unphysiologischen Osmolalität der Aufbereitung wurde

ebenfalls eine Aktivierung von nozizeptiven Neuronen durch Rocuronium selbst

diskutiert, wie sie bereits für zahlreiche Anästhetika wie Propofol, Lidocain und

auch volatile Anästhetika gezeigt werden konnte [94, 95, 103]. Alle genannten

Substanzen aktivieren Mitglieder der TRP-Kanal-Familie und scheinen einen

Großteil ihrer algogenen Wirkung über die Irritanziensensoren TRPA1 und

TRPV1 zu vermitteln. Die molekularen Mechanismen, welche aber zur

Verursachung des Injektionsschmerzes von Rocuronium-haltigen Lösungen

beim Menschen beitragen, sind bis dato ungeklärt.

Mit der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Rocuronium und

weitere, klinisch-gebräuchliche Muskelrelaxanzien sowohl aus der Gruppe der

Aminosteroide als auch aus anderen Gruppen, Agonisten für nozizeptive TRP-

Kanäle im heterologen Expressionssystem sind.

5.1. Injektionsschmerz durch Anästhetika und andere Medikamente

In der Anästhesie verwendete Medikamente verursachen relativ häufig sowohl

Schmerzen bei intravenöser Injektion als auch in der Folge nach Injektion

Rötungen, Schwellungen und Thrombophlebitiden. Als in den 1980er Jahren

Etomidat und Propofol in der Klinik eingeführt wurden und beide Medikamente

heftige Schmerzen bei intravenöser Injektion verursachten, entstand eine rege

wissenschaftliche Diskussion, welchem Umstand diese Schmerzen

zuzuschreiben seien. Immer wieder diskutiert wurden als Algogene in

entsprechenden Präparationen sowohl die Lösungsmittel für diese lipophilen

Wirkstoffe als auch der pH-Wert und die Osmolalität der entsprechenden

Lösungen. Ebenso wurde lange darüber diskutiert, ob es sich um einen direkten

Effekt durch entsprechende Substanzen handelt, oder ob die Schmerzen erst

44

durch die Freisetzung von körpereigenen algogenen Substanzen wie Histamin

oder Bradykinin verursacht werden. In einer richtungsweisenden Arbeit konnten

Arndt und Kollegen 1991 zeigen, dass der Injektionsschmerz von

unterschiedlichen Präparationen in menschlichen peripheren Venen durch

polymodale Nozizeptoren in der Venenwand vermittelt wird [6]. Die

entsprechenden Wirkstoffe selbst (Propofol, Etomidat und in der Folge auch

Rocuronium) wurden lange Zeit nicht als die Verursacher von

Injektionsschmerzen verdächtigt. Erst Blunk et al. zeigten in einer Arbeit 2003

mittels verschiedener Versuchsansätze, dass die Aminosteroid-

Muskelrelaxanzien Rocuronium und Vecuronium selbst konzentrationsabhängig

Schmerzen im Humanversuch hervorrufen, sowie kutane nozizeptive C-Fasern

im Tierversuch aktivieren können.

Mittels dermaler Mikrodialyse wurde im Humanversuch gezeigt, dass

Vecuronium und Rocuronium in einer Konzentration von 10 mg/ml (16,4 mM)

bei den Probanden deutliche Schmerzen hervorrufen und algogene Mediatoren

wie Histamin, Tryptase und Bradykinin im Gewebe freisetzen. Weiterhin

konnten sie in diesem Versuchsaufbau zeigen, dass beide Substanzen eine

lokale Vasodilatation verursachen und in einer Konzentration von 10 mg/ml

auch eine Axon-Reflex-Antwort verursachen. Die Medikamentenzubereitung

entsprach allerdings nicht den klinisch-verwandten Lösungen, es wurden

Präparationen mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet, um den sauren pH der

klinischen Lösungen als Schmerzverursacher auszuschließen.

Überraschenderweise zeigte sich, dass der Umfang der beobachteten

Mediatorenfreisetzung nicht mit den empfundenen Schmerzen der Probanden

korrelierte, sodass den Autoren ein indirekter Weg der Schmerzentstehung

über die gemessenen Mediatoren unwahrscheinlich erschien. Im in vitro

Versuch am Haut-Nerven-Präparat der Maus verursachten sowohl Rocuronium

als auch Vecuronium in einer Konzentration von 10 mg/ml (pH 7,4) eine direkte

Aktivierung von nozizeptiven C-Fasern sowie eine Desensibilsierung bei

verlängerter Applikation.

Lidocain und andere Lokalanästhetika verursachen bei der Injektion z.B. zur

Leitungsanästhesie auch einen brennenden Schmerz, welcher wahrscheinlich

aufgrund der begleitenden Natriumkanalblockade schnell abnimmt. Leffler und

Kollegen konnten 2008 zeigen, dass die Aktivierung von nozizeptiven Neuronen

durch Lokalanästhetika von der Expression von TRPA1 und TRPV1 abhängt.

45

Ebenso konnten sie zeigen, das Lokalanästhetika das pronozizeptive Peptid

CGRP aus Nerven freisetzen können. Die gleichen molekularen Mechanismen

konnte die Arbeitsgruppe ebenso für die Aktivierung von nozizeptiven Neuronen

durch Propofol zeigen. Matta et al. zeigten in einer anderen Arbeit im

Tierversuch, dass für nozizeptives Verhalten ausgelöst durch Propofol TRPA1

der Hauptmediator zu sein scheint.

5.2. Aktivierung von hTRPA1 und hTRPV1 durch Rocuronium

Aufgrund der beschriebenen Vorarbeiten lag es nahe, die von Blunk und

Mitarbeitern beschriebenen algogenen Wirkungen von Rocuronium und

Vecuronium auf ihre Vermittlung hin durch TRP-Kanäle zu untersuchen. Die

hier gezeigten Daten zeigen im heterologen Expressionssystem eine klare

Aktivierung von TRPA1 und TRPV1 von Mensch und Nagern in einem

Konzentrationsbereich ab ca. 10 nM für hTRPV1 und ca. 100 nM für hTRPA1.

Die Aktivierung findet in Konzentrationsbereichen statt, die noch unter dem

Plasmaspiegel nach Gabe einer Einmaldosis liegen (ca. 8 - 16µM).

Untransfizierte HEK293t-Zellen zeigten nie eine Reaktion auf die Applikation

von Rocuronium.

Eine Besonderheit, die bei der Aktivierung von TRPA1 und TRPV1 durch

Propofol und Lokalanästhetika auftritt, sind sogenannte resurgent currents, wie

sie von Leffler et al. für Lidocain bei rTRPA1, jedoch nicht bei hTRPA1 gezeigt

werden konnten [95].

Resurgent currents wurden zunächst bei spannungsgesteuerten Natrium-

Kanälen gezeigt und werden auf eine Blockade des offenen Kanals

zurückgeführt [65]. Nach Applikation von hohen Dosen von Rocuronium an

hTRPA1 und hTRPV1 konnte beobachtet werden, dass es nach der

eigentlichen Aktivierung des Kanals während des Ausspülens von Rocuronium

zu einem zweiten Einwärtsstrom kommt (Abb. 10 A, 1 mM und 15 mM). Von

daher wurden ebenso etwaige zusätzliche, blockierende Eigenschaften von

Rocuronium bei beiden Kanälen untersucht und es konnte gezeigt werden,

dass Rocuronium TRPA1 und TRPV1 nicht nur aktiviert, sondern in höheren

Konzentrationsbereichen (nachgewiesen ab ca. 1 µM) die Aktivierung der

Kanäle durch andere Agonisten auch blockiert.

46

Für die Aktivierung von TRPA1 und TRPV1 sind in der Literatur verschiedene

Bindungsstellen und Mechanismen beschrieben. So gibt es Agonisten, welche

die Zellmembran erst überwinden müssen um den Kanal mittels einer

kooperativen [76] oder gar einer kovalenten Bindung [69, 98] zu aktiveren.

Andere Agonisten wiederum können die Kanäle von der Außenseite her

aktivieren [75] oder aber durch second-messenger Kaskaden, wie etwa durch

Bradykinin bei TRPA1 [143]. Der bereits beschriebene kovalente

Aktivierungsmechanismus von TRPA1 basiert auf Wechselwirkungen mit

C-terminal gelegenen Cysteinen des Proteins. Eine Mutation von bestimmten

Cystein-Resten im Bereich des N-Terminums (Austausch durch Serin) macht

TRPA1 für die Aktivierung durch Agonisten mit reaktiven Gruppen (Senföl,

Acrolein) weniger oder gar unempfindlich.

Rocuronium zeigte bei dieser Mutante (hTRPA1-C621S/C641S/C665S;

hTRPA1-3C) wesentlich geringere Einwärtsströme bei voll-erhaltener

Sensibilität für den Kontrollagonisten Carvacrol. Der zusätzliche Austausch

eines an Position 708 gelegenen Lysins durch Arginin führte zu

einer vollständigen Unempfindlichkeit der Mutante (hTRPA1-

C621S/C641S/C665S/K708R; hTRPA1-3CK) für Rocuronium.

Aus diesen Ergebnissen kann prinzipiell gefolgert werden, dass eine Interaktion

mit den oben genannten Aminosäuren den wahrscheinlichen

Aktivierungsmechanismus für TRPA1 durch Rocuronium darstellt. Für die

Aktivierung von TRPA1 scheint im Gegensatz zu den „normalen“ Interaktionen

zwischen Rezeptoren und Agonisten nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip nicht

die sterische Grundstruktur, sondern das Vorhandensein von reaktiven

Gruppen entscheidend zu sein [69, 98]. Allerdings besitzt Rocuronium keine

hoch-reaktiven Gruppen wie sie klassische TRPA1-Agonisten besitzen.

Außerdem erfolgt die Aktivierung von TRPA1 über diesen Mechanismus aus

dem Zellinneren. Die Diffusion über die Zellmembran ist für die lipophilen und

reaktiven Agonisten problemlos möglich.

Rocuronium liegt bei pH 7,4 als einfach-geladenes, quarternäres Ammonium

vor. Dieser Umstand erschwert die Diffusion über die Zellmembran erheblich,

sodass nicht davon ausgegangen werden kann, dass durch Diffusion

nennenswerte intrazelluläre Konzentrationen erreicht werden können. Eine

mögliche Erklärung könnte sein, dass TRPA1 eine große Membranpore besitzt,

über die Moleküle wie der Farbstoff Yo-Pro mit einem Molekulargewicht von

47

630 g/mol ins Zellinnere gelangen können. Rocuronium wäre mit einem

Molekulargewicht von knapp 530 g/mol möglicherweise ebenso dazu in der

Lage das Zellinnere über die geöffnete Pore von TRPA1 zu erreichen. Da sich

eine geringe Anzahl von TRPA1-Kanälen immer in einem geöffneten Zustand

befinden, könnte die Permeation über diese offenen Kanäle die langsame

Stromkinetik in niedrigeren Konzentrationen erklären. Durch die intrazelluläre

Aktivierung von TRPA1 käme es nach und nach zu einer schnelleren

Stromkinetik.

Rocuronium-induzierte Einwärtsströme bei hTRPA1 wurden mit den

Antagonisten AP-18 und HC-030031 untersucht. Während AP-18, welches die

Aktivierung von hTRPA1 durch Zimtaldehyd vollständig blockiert, Rocuronium-

induzierte Ströme selbst in hoher Konzentrationen nur teilweise verringern

konnte, blockierte HC-030031 (ein weiterer Antagonist für TRPA1) die Ströme

vollständig. Da für beide Antagonisten die Blockademechanismen unzureichend

geklärt sind, kann letztendlich hieraus kein weiterer Hinweis für die

Aktivierungsmechanismen von TRPA1 generiert werden.

Einwärtsströme von hTRPV1 ließen sich nahezu vollständig durch Capsazepin

blockieren. Capsazepin interagiert ebenso wie Capsaicin mit der intrazellulär

gelegenen Vanilloid-Bindungsstelle, die sich in den Transmembranregionen

3 und 4 befindet [74]. Hieraus könnte man folgern, dass Rocuronium TRPV1

möglicherweise durch Interaktion mit der Capsaicin-Bindungsstelle von TRPV1

aktiviert. Zur endgültigen Aufklärung des Aktivierungsmechanismus für TRPV1

durch Rocuronium sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich.

In nozizeptiven Neuronen werden mehrere, unterschiedliche Thermo-TRP-

Kanäle exprimiert. Hierzu zählen neben TRPA1 und TRPV1 auch TRPV2,

TRPV3, TRPV4 und TRPM8. Für Propofol konnte durch Fischer et al. 2010 eine

Aktivierung von TRPV3 gezeigt werden. Lidocain aktiviert TRPV1, TRPA1 und

interagiert auch mit TRPM8 (Leffler et al., unpublizierte Daten der AG Nau) [57].

Für Rocuronium konnten in zwei unterschiedlichen Konzentrationen keine

Interaktionen mit anderen Thermo-TRP-Kanälen gezeigt werden. Es zeigten

sich weder Hinweise auf Aktivierung, noch auf Blockade der entsprechenden

Kanäle.

48

5.3. Saurer pH-Wert der klinisch-verwandten Rocuronium-Präparationen

Aus Gründen der Stabilität haben klinisch-verwandte Rocuronium-

Präparationen einen pH-Wert zwischen 3,8 und 4,2. Lange Zeit wurde

angenommen, dass allein dieser saure pH-Wert die Schmerzhaftigkeit der

Rocuronium-Injektion verursacht. Für die Wahrnehmung von Protonen in

nozizeptiven Neuronen sind Mitglieder der ASICs sowie der Capsaicinrezeptor

TRPV1 verantwortlich. Neuere Untersuchungen zeigen bei TRPA1 eine

Spezies-Abhängigkeit, so scheint der humane TRPA1 ebenfalls durch Protonen

aktiviert zu werden [51]. TRPV1 zeichnet sich als Integrator unterschiedlicher

Stimuli aus, denn er ist nicht nur durch Capsaicin und Hitze aktivierbar, sondern

eben auch durch Protonen im sauren Milieu und viele andere Stoffe [32, 75].

Die Aktivierung von TRPV1 durch Protonen kann bei Raumtemperatur und

einem niedrigem pH < 6 direkt erfolgen. Neben den aktivierenden

Eigenschaften haben Protonen vor allem einen sensibilisierenden Einfluss auf

TRPV1, so sind Ströme durch Capsaicin oder Hitze erheblich größer im sauren

als im neutralen Milieu. Als mögliche Bindungsstellen wurden extrazelluläre

Protonen-Bindungsstellen an den Aminosäuren E600 und E648 identifiziert

[75]. Bei sehr niedrigem pH ist auch eine Aktivierung über die Capsaicin-

Bindungsstelle möglich [126]. In unserem Versuchsaufbau erfolgte nach der

Applikation von calciumfreier Extrazellularlösung mit einem pH-Wert von 6 die

kombinierte Applikation von pH 6 mit 10 µM bzw. 100 µM Rocuronium. In

diesem Setting zeigte sich unabhängig von der Rocuronium-Konzentration

keine Vergrößerung der Stromamplitude unter kombinierter Applikation von

Protonen und Rocuronium. Vielmehr konnte eine, wenn auch nicht signifikante,

Reduktion der Ströme unter Kombination der Agonisten gesehen werden. Dies

ist zum einen durch den Umstand erklärbar, dass Rocuronium im sauren Milieu

protoniert wird und dadurch zweifach positiv geladen ist. Wie bereits zuvor

diskutiert, ist die Permeation von Rocuronium über die Zellmembran

möglicherweise notwendig um TRPV1 über die Capsaicin-Bindungsstelle zu

aktivieren. Dies könnte durch die Verdoppelung der positiven Ladung deutlich

erschwert oder unmöglich sein. TRPV1 verfügt ebenso wie TRPA1 über eine

große Membranpore, durch die Substanzen wie z.B. das Membran-

impermeable Lokalanästhetikum QX-314 die Membran überwinden

können [128]. Eine mögliche Permeation durch die Pore von TRPV1 könnte

49

durch die Veränderung der Ladung ebenso erschwert oder unmöglich werden.

Ebenso muss aber auch bedacht werden, dass Rocuronium die Capsaicin-

induzierte Aktivierung von TRPV1 blockiert. Möglicherweise ist Rocuronium in

Gegenwart eines (potenteren) Agonisten nur ein Partialagonist, der sich bei

entsprechender Konzentration der potenteren Substanz als Antagonist verhält

und dadurch eine Abnahme der Stromamplitude bewirkt.

Insgesamt erscheint es jedoch unklar, ob ein pH-Wert von 4 einen Schmerzreiz

bei der Applikation hervorruft. So beschrieben Klement und Arndt 1991 in einer

kleinen Studie, dass erst ein pH-Wert < 3,5 Schmerzen bei intravenöser

Injektion hervorruft [88]. Auch bei den Mikrodialyse-Versuchen von Blunk hatten

die Probanden bei Infusion einer Testlösung mit einem pH-Wert von 3,8 keine

Schmerzen. Erst die Kombination mit Rocuronium oder Vecuronium

verursachte bei den Probanden einen Injektionsschmerz.

5.4. Andere Muskelrelaxanzien

Vecuronium wird klinisch meist in einer Konzentration von 1 mg/ml verwendet,

da es als Muskelrelaxans deutlich potenter als Rocuronium ist. Blunk und

Mitarbeiter konnten zeigen, dass Vecuronium in einer Konzentration von

10 mg/ml im humanen Schmerzmodell ebenso algogen wirkt wie Rocuronium.

Es erscheint von daher naheliegend, dass die verminderte Inzidenz von

Injektionsschmerzen bei der Injektion von Vecuronium der niedrigeren

Konzentration geschuldet ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass

100 µM Vecuronium ebenso dazu in der Lage ist, hTRPA1 zu aktivieren. Dies

stellt eine mögliche Erklärung für die von Blunk beobachteten nozizeptiven

Wirkungen von Vecuronium dar.

Durch Koppert und Kollegen wurde bereits 2001 gezeigt, dass Atracurium im

humanen Schmerzmodell durch dermale Mikrodialyse (pH 3,5; gleicher

Versuchsaufbau wie die Versuche zu Rocuronium und Vecuronium durch Blunk

et al.) keine Schmerzen, sondern einen Juckreiz verursacht, was im Einklang

mit der klinischen Beobachtung der Schmerzlosigkeit der Injektion steht [89].

Erstaunlicherweise zeigte sich durch Atracurium eine stabile Aktivierung von

hTRPA1 in Patch-Clamp-Experimenten im heterologen Expressionssystem.

Ebenso verursachten Pancuronium und Succinylcholin eine Aktivierung von

hTRPA1 in HEK293t-Zellen. Diese Befunde stehen im Widerspruch zur

50

klinischen Beobachtung, dass die Injektion aller drei genannten

Muskelrelaxanzien schmerzlos verläuft.

Limitierend ist an dieser Stelle allerdings, dass nur ein Screening auf die

Aktivierung von hTRPA1 mit jeweils einer Konzentration durchgeführt wurde

und keine Dosis-Wirkungskurven erstellt wurden. Ebenso fehlen zur genaueren

Charakterisierung Experimente mit TRPA1-Antagonisten. Inwieweit die

beobachtete Aktivierung von TRPA1 durch Pancuronium, Atracurium und

Succinylcholin somit eine Relevanz hat, kann momentan nicht beurteilt werden.

5.5. Klinische Relevanz

Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse stellen eine mögliche Erklärung für

den brennenden Injektionsschmerz von Rocuroniumpräparationen (pH 4) bei

der Einleitung einer Narkose dar. Außerdem könnte die von Blunk et al.

postulierte Aktivierung von C-Fasern durch Rocuronium bei einem pH-Wert von

7,4 im Haut-Nerven-Präparat der Maus durch eine Aktivierung von TRPA1 und

TRPV1 erklärt werden [17].

Trotzdem ist eine definitive kausale Zuordnung, welcher Anteil der

Rocuroniumpräparation welche Schmerzen bei Injektion verursacht nicht ohne

weiteres möglich. Die große Unbekannte stellt hierbei der pH-Wert dar. Blut und

Gewebe besitzen eine große Pufferkapazität und somit kann nicht davon

ausgegangen werden, dass der injizierte pH-Wert auch dem pH-Wert

entspricht, welcher an der nozizeptiven Endigung in der Venenwand ankommt.

Die Arbeiten von Klement und Blunk zeigen zwar, dass ein pH-Wert von 4 bzw.

3,8 im humanen Schmerzmodell keine Schmerzen verursacht, allerdings

können auch sie nicht quantifizieren, welcher pH-Wert letztendlich am

Nozizeptor ankommt.

So kann aus der Kombination dieser Arbeiten mit den hier gezeigten Daten

nicht die These generiert werden, dass der Injektionsschmerz nach

Rocuroniumapplikation ausschließlich auf Rocuronium zurückzuführen ist. Es

spricht jedoch vieles dafür, dass es in vivo zu einer Aktivierung von TRPA1,

TRPV1 und möglicherweise anderen nozizeptiven Transduktionsproteinen

durch Rocuronium und den sauren pH-Wert der Rocuroniumpräparation kommt.

Spannend bleibt ferner die Frage, in wie weit die Applikation von TRPA1- und

TRPV1-Agonisten das nozizeptive System während einer Anästhesie

51

modulieren und somit auf die Entstehung von akuten und chronischen

postoperativen Schmerzen Einfluss nehmen können.

So kann mit dieser Arbeit zur Liste von perioperativ-verabreichten TRP-Kanal-

Aktivatoren und -Modulatoren (Propofol, volatile Anästhetika, Lokalanästhetika)

die Gruppe der Muskelrelaxanzien hinzugefügt werden. Ob alle verwendeten

Medikamente möglicherweise die Entstehung von chronischen postoperativen

Schmerzen begünstigen bleibt Gegenstand weiterer klinischer Forschung.

52

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7. Abbildungsverzeichnis Abb.1:

Rocuronium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2019.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Rocuronium_structure.png, „Rocuronium structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Vecuronium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Vecuronium_structure.png,

„Vecuronium structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Pancuronium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pancuronium.svg, „Pancuronium

structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Atracurium Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Atracurium.svg, „Atracurium structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Succinylcholin Strukturformel: gesehen und heruntergeladen am 27.09.2015.

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Suxamethonium-chloride-2D-

skeletal.svg, „Succinylcholin structure“, als gemeinfrei gekennzeichnet. Abb. 2:

Reprinted from the publication: Neuron 2007: 55; Clifford J.Woolf, Qiufu Ma;

Nociceptors – Noxious Stimulus Detectors, Page No. 354, Figure 1B: The

Nociceptor, Copyright © 2007, with permission from Elsevier.

DOI: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.07.016

Abb. 3:

Reprinted from the publication: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular

Basis of Disease 2007, Volume 1772; Jon D. Levine, Nicole Alessandri-Haber;

TRP channels: targets for the relief of pain, Page 997, Figure 1, Copyright ©

2007, with permission from Elsevier.

DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2007.01.008

Abb. 4:

Reprinted form the publication: Cell 2009, Volume139; Allan I. Basbaum, Diana

M. Bautista, Grégory Scherrer, David Julius; Cellular and Molecular

Mechanisms of Pain, Page 269, Figure 2: Anatomy of the Pain Pathway;

Copyright © 2009, with permission from Elsevier.

DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.09.028

69

Abb. 5:

Reprinted with permission from Springer Nature: Nature 445, Chemical biology:

Sticky spices; Michael J. Caterina; Copyright © Springer Nature 2007. DOI:

https://doi.org/10.1038/nature05565

Abb. 6:

Reprented from Elsevier books: Medical Physiology 2017; Edward G. Moczydlowski; Chapter 6, 141-172, Electrophysiology of the Cell Membrane, figure 6-14, Patch-clamp methods; Copyright © 2017, with permission from Elsevier.

Abb. 7-14:

Eigenproduktion

70

8. Abkürzungsverzeichnis 4αPDD 4α-Phorbol 12,13-didecanoate

2-APB 2-Aminoethoxydiphenyl borate

AITC 3-Isothyocyanato-1-propen

AP-18 4-(4-Chlorophenyl)-3-methyl-3-buten-2-one oxime

ARD Ankyrin-Repeat-Domäne

ASICs acid sensing ion channels

ATP Adenositriphospaht

BCTC 4-(3-Chloro-2-pyridinyl)-N-[4-(1,1-dimethylethyl)phenyl]-1-

piperazin-carboxamid

cDNA complementary deoxyribonucleic acid

CD8-pih3m Reporter Antigen, cluster of differentiation 8

CGRP calcitonin gene-related peptide

c-Ret Rezeptor-Tyrosinkinase

CO2 Kohlendioxid

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DRG dorsal root ganglion (Spinalganglion)

EC50 mittlere effektive Konzentration

ED50 mittlere effektive Dosis

ED95 effektive Dosis für gewünschte Wirkung bei 95%

der Patienten

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure

ENaC/DEG epithelialer Natriumkanal

FBS fetal bovin serum

GABA γ-Aminobuttersäure

GDNF glia-derived neurotrophic factor

HC-030031 2-(1,3-Dimethyl-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-7H-purin-7-yl)-

N-(4-isopropylphenyl)acetamid, selektiver TRPA1-

Antagonist

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

HEK293t-Zellen human embryonic kidney 293t-Zellen

H2O2 Wasserstoffperoxid

IC50 mittlere inhibitorische Konzentration

71

KCl Kaliumchlorid

KCNK2/4 Kalium-Kanal Subfamilie K, Mitglied 2/4

KOH Kaliumhydroxid

Kv1 Spannungsabhängiger Kalium-A-Kanal

MEC-2 Gen der Untereinheit 2 epithelialer Na+-Kanäle

MEC-4/10 Gene der Untereinheiten 4/10 epithelialer N+-Kanäle

MgCl2 Magnesiumchlorid

NaCl Natriumchlorid

NGF nerve growth factor

O2 Sauerstoff

PAG Periaquäduktales Grau

PKC Proteinkinase C

PLC Phospholipase C

pTRE Plasmid Vektor

RSI rapid sequence induction

TOF Train-of-Four

TMA Tetramethylammonium

TM 5/6 Transmembranregionen fünf und sechs

TRAAK Synonym für KCNK4

TREK-1 Synonym für KCNK2

TrkA tropomyosin receptor kinase A

TRP transient receptor potential

T½β Eliminationshalbwertszeit

PORC postoperative Restkurarisierung

WDR wide dynamic range Neurone