Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d....

10
Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff

Transcript of Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d....

Page 1: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Die Parochipanalyse

Institut für orale MikrobiologieUnivers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads

c.m.d. Wiebke Schulthoff

Page 2: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Das Verfahren zur Auswertung der Genchipanalyse

• Der ParoChip1 ist ein Glasobjektträger, der eine Patientenprobe aufnehmen kann. Er umfasst auf einer Fläche von 24 mm² 86 Messpunkte, die einen Durchmesser von ca. 200 µm und einen Abstand von ca. 300 µm haben. Für jedes Bakterium liegen drei Messpunkte vor. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei dem neueren ParoChip2 um einen Plexiglasobjektträger, der 12 Patientenproben in 6x6mm großen Vertiefungen aufnehmen kann. In jeder dieser Vertiefungen liegen auf 8 mm² 120 Messpunkte, die einen Durchmesser von 150 µm und einen Abstand von 275 µm haben. Für jedes Bakterium liegen fünf Messpunkte vor.

• Für beide Chips wurden Fluorophor markierte Primer für die PCR (cy5 markiert) und Fluorophor markierte Sonden für interne Kontrollsysteme (cy3 markiert) verwendet.

• Für die Auswertung wird der Chip im Microarray Scanner (GenePix Personal 4100A von Axon) bei den Wellenlängen λ1=532 nm (Cy3) und λ2=635 nm (Cy5) eingelesen. Durch die Anregung mit monochromatischem Licht werden die gebundenen und markierten Sonden detektiert.

• D.h.: Grün=Cy3 gebundene Sonden Rot=Cy5 gebundene Sonden

Page 3: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Zur Erläuterung der Begriffe:

feature :Jeder Punkt dieses Bildes ist ein

feature. Sie werden über die in der Datenliste enthaltenen feature-indicator definiert.

Das Bild: ParoChip1 1 Block mit:

Die Datenliste (array-list): Gitter, das über den Block

gelegt wird und alle Informationen enthält:

Position und Größe der feature-indicators, sowie die

Identifizierung dieser.

8 R

eih

en =

„ro

ws“

12 Säulen = „columns“

feature-indicator: Er kann jedem feature individuell angepasst

werden und ist die Einheit, der die Analyse

zu Grunde liegt

Unserer Auswertung liegt die GenePix Array List ( =Datenliste ) zu Grunde.Sie ist ein Gitter, das die Größe und Position des Blocks, sowie das Layout der feature-indicator darin umfasst. Jedem feature-indicator ist dabei eine eindeutige Identifizierung sowie ein Name zugeordnet.

Page 4: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Das Bild: ParoChip2 1 Block

mit10 Säulen

12 R

eih

en

Mit bereits darüber gelegten

Datenliste

Im Vergleich zu ParoChip1 hat ParoChip2 insgesamt 12 Blocks. D.h. es können auf

diesem Chip 12 Proben gleichzeitig ausgewertet

werden.

Der gesamte ParoChip2: Hier sind 9 Blocks zu sehen, d.h. es wurden 9

Proben aufgebracht. E2, F1 und F2 sind

noch frei und können noch genutzt

werden.

Page 5: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Bei unserer Auswertung handelt es sich um eine Bildanalyse, bei der Pixelintensitäten gemessen werden.

Für die gesamte Messung der Pixelintensitäten

gelten folgende Messbereiche:

• Schwarzer Bereich:

• Messbereich der Hintergrund- Pixelintensitäten,

• Der Durchmesser des Messkreises ist dreimal so groß wie der des zugehörigen feature-indicators

• Dunkelgrauer Bereich:

• Messbereich der feature- Pixelintensitäten,

• Pixel, die den feature- indicator berühren, jedoch nicht vollständig darin liegen, werden nicht berücksichtigt

• Hellgrauer Bereich:

• Bereich nicht berücksichtigter Pixel

Page 6: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Die Ergebnisse der Bildanalyse

Durchmesser des feature-

indicators in µmAngabe der feature-

Position im BlockName und eindeutige

Identifikation des jeweiligen feature in Anlehnung an die

Datenliste (array list)

X- bzw. Y- Koordinate in µm

ausgehend von der Mitte eines jeden feature-indicators.

Der 0I0 – Punkt des Bildes ist dabei oben

links

Das Programm kann selbständig einzelne features durch „flags“ bewerten. Dabei wird

„good“, „bad“, „absent“ und „not found“ unterschieden.

Es ist auch möglich, die Flaggen selber zu setzen

Die Normalisierung wird zur Standardisierung der Werte

benutzt. Dabei wird der höchste Wert gleich eins

gesetzt und der niedrigste gleich null. Sie ist eine Art

Kalibrierung und ein typisches statistische Verfahren.

Page 7: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Medianwert der feature-

Pixelintensität der Wellenlänge #2, λ= 635 nm (rot)

Medianwert = Bezeichnung für ein Messergebnis, dessen

zugrundeliegende Messwerte mit gleicher Häufigkeit Unter- und

Überschreitungen aufweisen; er entspricht daher nicht dem

arithmetischen Mittelwert (=„mean“). Von extremen Abweichungen nach

oben und unten wird er nicht beeinflusst und deshalb für das Gesamtergebnis herangezogen.

Medianwert der Hintergrund-

Pixelintensität bei λ= 635 nm

Arithmetischer Mittelwert der Hintergrund- Pixelintensität

beiλ= 635 nm

Standardabweichung der Hintergrund- Pixelintensität

bei λ= 635 nm

Prozent der feature- Pixel mit Intensitäten, die eine

Standardabweichung größer sind als die Hintergrund-

Pixelintensität bei λ= 635 nm

Prozent der gesättigten

feature- Pixel bei λ= 635 nm

„standard deviation“: Standardabweichung

der feature- Pixelintensität bei

λ= 635 nm

Arithmetisches Mittel = Durchschnittswert, der aus der

Summe einer Anzahl von Zahlen, dividiert durch ihre Anzahl, entsteht; das arithmetische Mittel von 5, 8 und

11 z. B. ist (5 + 8 + 11): 3 = 8.Dieser Wert wird von extremen

Abweichungen nach oben und unten sehr beeinflusst und wird zur

Beurteilung der Streuung herangezogen.

Die Messung der feature- und Hintergrund- Pixelintensitäten für die Wellenlänge #1, λ= 532 nm

(grün) ist analog

Arithmetischer Mittelwert der

feature- Pixelintensität bei

λ= 635 nm

Medianwert der feature-

Pixelintensität bei λ= 635 nm

D.h.: Der Wert gibt an, wieviel Prozent der Pixel außerhalb der Standardabweichung

liegen und somit statistisch interessant werden. Noch signifikanter für die Statistik sind die

Werte mit zweifach abgezogener Standardabweichung.

Prozent der feature- Pixel mit Intensitäten, die zwei

Standardabweichung größer sind als die

Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635

nm

Dies ist ein Wert zur Fehleranalyse. Er muss null

sein.

Page 8: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Das Verhältnis der Mittelwerte:Hier werden die arithmetischen Mittel ins

Verhältnis gesetzt.Dazu wird von jeder einzelnen feature-

Pixelintensität der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität abgezogen. Von den gesamten

Pixelintensitäten eines features wird der Mittelwert genommen und ins Verhältnis zum Mittelwert der anderen Wellenlänge gesetzt.

Es gilt also:

Die Summe aller feature-

Pixelintensitäten bei λ= 635 nm

Die Summe aller feature-

Pixelintensitäten bei λ= 532 nm

Signal to Noise Ratio bei λ= 635 nm

Signal to Noise Ratio ist definiert als das Verhältnis zwischen der Intensität des Signals eines features und

der Abweichung im Hintergrund (= „Hintergrundgeräusch“ = the „noise“). Letzteres entspricht der

Standardabweichung der Hintergrund- Pixelintensität. Für die Intensität des Signals wird der Medianwert der

Hintergrund- Pixelintensität von dem Medianwert der feature- Pixelintensität abgezogen.Für λ= 635 nm (als Bsp.) gilt also:

SNR635 = (F635 Median – B635 Median) / B635 SDJe kleiner die Standardabweichung, desto glaubhafter die

Beurteilung des Signals!

Signal to Noise Ratio bei λ= 532 nm

„Ratio“ = Verhältnis: Jedes feature eines Bildes setzt sich aus vielen Pixeln

zusammen. Es wird eine Methode benötigt, um eine repräsentative Intensität für jedes

feature anzugeben. Dafür wird das Verhältnis berechnet: es werden die Pixelintensitäten

der beiden Wellenlängen ins Verhältnis gesetzt. Dabei wird jeweils die Hintergrund-

Pixelintensität von der feature- Pixelintensität einer Wellenlänge abgezogen.

In GenePix Pro wird angenommen bzw. festgelegt, dass bei diesen Berechnungen die

Wellenlänge #2 (635 nm) immer im Zähler steht; Wellenlänge #1 (532 nm) steht im

Nenner.

Das Verhältnis der Medianwerte:

Von dem Medianwert der feature- Pixelintensität ist

jeweils der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität für jede Wellenlänge abgezogen.

Es gilt also:

I P, λk = Intensität eines einzelnen feature- Pixels bei der Wellenlänge kI B, λk = Intensität eines einzelnen Hintergrund- Pixels bei der Wellenlänge kn = Anzahl der feature- Pixelm = Anzahl der Pixel Hintergrund- Pixel

II

II

medmB,λmednP,λ

medmB,λmednP,λ

11

22

Obwohl hier das arithmetische Mittel berechnet wird, wird der

Medianwert der Hintergrundpixel benutzt, da

dieser nicht durch extrem abweichende Werte verfälscht

wird.

n

1iimedmλ,Bλ,P

n

1iimedmλ,Bλ,P

11

22

II

II

Page 9: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Bei „Median of Ratios“ wird jedes einzelne Pixel der beiden

Wellenlängen ins Verhältnis gesetzt. Dabei wird wie immer jeweils die

mediane Hintergrund- Pixelintensität abgezogen. Erst am Ende wird der Medianwert genommen. Das heißt,

tendenzielle Abweichungen einzelner Pixel sowohl bei roter als

auch bei grüner Wellenlänge mitteln sich raus und fallen somit nicht ins

Gewicht.Es gilt:

Für „Mean of Ratios“ gilt dasselbe wie für „Median of Ratios“.Im Unterschied wird hier zum Schluss der

Mittelwert gezogen. Es gilt also:

mednmedmλ,Bλ,P

medmλ,Bλ,P

11

22

II

II

n

1iimedmλ,Bλ,P

medmλ,Bλ,P

11

22

II

II

n

1

Standardabweichung der ratio- PixelintensitätRegression Ratio: Die Werte geben

die Steigung einer Ausgleichsgerade an, die zu allen Pixeln den

minimalsten Abstand aufweist. Für jedes feature werden die Pixel in

einem zweimal so großen Kreis wie das feature selber um dieses herum

berückichtigt.

Regression R²: Es ist ein Wert für die Güte der

Ausgleichsgerade, ein sogenanntes

Bestimmtheitsmaß. Er gibt an wie stark die Pixel um die

Gerade herum gestreut sind.Bei Rgn R²=0 liegen alle Pixel

auf der Geraden.

Der Logarithmus der Ratio wird berechnet, um aus

exponentiellen Funktionen lineare zu machen

Page 10: Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

Der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität wird vom Medianwert der

feature- Pixelintensität abgezogen. Der Wert gibt die Leuchtintesität der Probe für die jeweilige Wellenlänge

wider.

Der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität

wird vom Mittelwert der feature- Pixelintensität

abgezogen. Der Wert gibt die Leuchtintesität der Probe für die jeweilige Wellenlänge

wider, wobei hier auch einzelne leuchtintensivere Pixel

herausstechen.

Hier werden der Median- bzw. der Mittelwert mit den

abgezogenen Hintergrund- Pixelintensitäten beider

Wellenlängen addiert. Werden in dem Bild beide

Wellenlängen übereinander gelegt, gibt uns dieser Wert die Lichtintensität der Probe

wider.

Summe aller gemessenen Pixel des Hintergrundes bzw. des features in dem jeweiligen

Meßbereich