Die Rolle des CD137-/CD137-Ligand-Systems in der anti ... · Die Rolle des...

Die Rolle

des CD137-/CD137-Ligand-Systems

in der anti-Tumor-Immunantwort

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

der naturwissenschaftlichen Fakultät III

- Biologie und vorklinische Medizin -

der Universität Regensburg

vorgelegt von

Margarethe Wittmann

aus Hof/Saale

2003

Promotionsgesuch eingereicht am: 10. 12. 2003

Die Arbeit wurde angeleitet von: Prof. Dr. H. R. Kalbitzer (fakultätsintern)

PD Dr. H. Schwarz

Prüfungsausschuß:

Vorsitzender: Prof. Dr. R. Wirth

1. Prüfer: Prof. Dr. H. R. Kalbitzer

2. Prüfer: PD Dr. H. Schwarz

3. Prüfer: Prof. Dr. S. Schneuwly

Tag des Kolloquiums: 02.02.2004

Inhaltsverzeichnis

3

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis.................................................................................................................3

1. Einleitung................................................................................................................8

1.1. Das CD137-/CD137-Ligand-System .....................................................................8

1.1.1. CD137 und sein Ligand.......................................................................................8

1.1.1.1. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137 .........8

1.1.1.2. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137-

Ligand .............................................................................................................10

1.1.1.3. Expression und Gewebeverteilung von CD137 ................................................10

1.1.1.4. Expression und Gewebeverteilung des CD137-Liganden .................................12

1.1.2. Bidirektionale Signalübertragung durch das CD137-/CD137-Ligand-System.....13

1.1.2.1. Signaltransduktion durch CD137 und seinen Liganden ....................................14

1.1.2.1.1. Signaltransduktion durch CD137........................................................14

1.1.2.1.2. Signaltransduktion durch CD137-Ligand............................................15

1.1.2.1.3. Physiologische Funktionen, die durch CD137 vermittelt werden ........16

1.1.2.1.4. Physiologische Funktionen, die durch CD137-Ligand vermittelt

werden ...............................................................................................20

1.1.2.1.5. Physiologische Funktionen, die durch das CD137-/CD137-

Ligand-System vermittelt werden – Studien an knockout-

bzw. transgenen Tieren.......................................................................21

1.2. Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL)......................................................22

1.3. Zielsetzung dieser Arbeit.....................................................................................24

2. Material und Methoden........................................................................................25

2.1. Material...............................................................................................................25

2.1.1. Organismen.......................................................................................................25

2.1.1.1. Bakterien .........................................................................................................25

2.1.1.2. Säugerzellen ....................................................................................................25

2.1.2. Nährmedien ......................................................................................................27

2.1.3. Antibiotika ........................................................................................................28

2.1.4. Antikörper und Konjugate.................................................................................28

2.1.4.1. Antikörper gegen CD-Antigene .......................................................................28

2.1.4.2. Antikörper gegen Immunglobuline...................................................................28

Inhaltsverzeichnis

4

2.1.4.3. Antikörper gegen sonstige Antigene.................................................................28

2.1.4.4. Isotypkontrollantikörper...................................................................................28

2.1.4.5. sonstige Immunglobuline .................................................................................29

2.1.5. Chemikalien und Reagenzien ............................................................................29

2.1.6. Enzyme.............................................................................................................30

2.1.7. Kits ...................................................................................................................30

2.1.8. Nukleinsäuren ...................................................................................................31

2.1.8.1. Desoxyoligonukleotide ....................................................................................31

2.1.8.2. Primer..............................................................................................................31

2.1.8.3. Plasmide und Konstrukte .................................................................................32

2.1.9. Molekulargewichtsstandards .............................................................................32

2.1.10. Puffer und Lösungen ..........................................................................................32

2.1.11. Sonstiges Material..............................................................................................35

2.1.12. Geräte ................................................................................................................35

2.2. Methoden ............................................................................................................37

2.2.1. Molekularbiologische Methoden .......................................................................37

2.2.1.1. Konzentrationsbestimmungen ..........................................................................37

2.2.1.1.1. Absorptionsmessungen.......................................................................37

2.2.1.1.2. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels des Nucleic

Dot Metric Assays ..............................................................................38

2.2.1.1.3. Bestimmung der Konzentration von Proteinlösungen nach Bradford ..38

2.2.1.2. Arbeiten mit RNA............................................................................................38

2.2.1.1.1. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen .....................38

2.2.1.1.2. Reverse Transkription ........................................................................39

2.2.1.3. Arbeiten mit DNA ...........................................................................................39

2.2.1.3.1. Präparation von Plasmid-DNA ...........................................................39

2.2.1.3.2. Reinigung und Fällung von DNA .......................................................41

2.2.1.3.3. Enzymatische Hydrolyse von DNA....................................................42

2.2.1.3.3. Elektrophorese von DNA in Agarosegelen .........................................42

2.2.1.3.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit dem QIA-

quick Gel Extraction Kit .....................................................................43

2.2.1.3.5. Ligation von DNA-Fragmenten mit dem pcDNA3.1/V5-His TA-

TOPO-Kit der Firma Invitrogen..........................................................43

2.2.1.3.6. DNA-Amplifizierung mittels PCR......................................................43

Inhaltsverzeichnis

5

2.2.2. Zellbiologische Methoden ..................................................................................45

2.2.2.1. Arbeiten mit E. coli..........................................................................................45

2.2.2.1.1. Kultur von E. coli-Stämmen...............................................................45

2.2.2.1.2. Aufnehmen von Wachstumskurven ....................................................46

2.2.2.1.3. Anlegen von Glyzerin-Dauerkulturen.................................................46

2.2.2.1.4. Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen ......................46

2.2.2.1.5. Chemische Transformation von E. coli-Zellen....................................46

2.2.2.1.5. Transformation von E. coli mittels des pcDNA3.1/V5-His TOPO

TA-Kits von Invitrogen.......................................................................46

2.2.2.2. Arbeiten mit Säugerzellen................................................................................47

2.2.2.2.1. Kultur löslicher Zellen........................................................................47

2.2.2.2.2. Kultur adhärenter Zellen.....................................................................47

2.2.2.2.3. Ermittlung von Zellzahl und -Konzentration (Trypanblaufärbung) .....48

2.2.2.2.4. Herstellung von Gefrierkulturen .........................................................48

2.2.2.2.5. Isolierung von PBMC über Dichtegradientenzentrifugation................48

2.2.2.2.6. Isolierung reiner B- bzw. T-Lymphozyten mittels magnetischer Se-

paration mit dem Dynabead-System...................................................49

2.2.2.2.7. In vitro-Stimulation von Zellen ..........................................................50

2.2.2.2.8. Proliferationsassays mittels 3H-Thymidin-Einbau...............................50

2.2.2.2.9. CARE-LASS (Calcein release assay).................................................51

2.2.3. Immunologische Methoden ................................................................................52

2.2.3.1. ELISA .............................................................................................................52

2.2.3.1.1. ELISA für sCD137.............................................................................53

2.2.3.1.2. ELISA für humanes IL-10..................................................................53

2.2.3.1.3. ELISA für humanes TGFß1 ...............................................................54

2.2.3.2. Aktivitätsassay für Caspase 3...........................................................................56

2.2.3.3. Durchflußzytometrie........................................................................................57

2.2.3.3.1. PI-Färbung toter Zellen ......................................................................57

2.2.3.3.2. Einfache Antikörperfärbung ...............................................................57

2.2.3.3.3. Antikörperdoppelfärbung ...................................................................57

2.2.3.3.4. AnnexinV-FLUOS/PI-Doppelfärbung mit dem AnnexinV-FLUOS

Staining Kit der Firma Roche Diagnostics (Mannheim)......................57

2.2.3.3.5. Messung und Auswertung am FACS-Calibur .....................................58

2.2.3.4. Immunhistochemie/ Immunzytochemie............................................................58

Inhaltsverzeichnis

6

2.2.3.4.1. Herstellung von Zytospins..................................................................58

2.2.3.4.2. Fixierung von Zytospins.....................................................................59

2.2.3.4.3. Fixierung für Immunfluoreszenzfärbungen.........................................59

2.2.3.4.4. Färbung mit der DAB-Methode..........................................................59

2.2.3.4.5. Immunfluoreszenzfärbung (Dreifachmarkierung) ...............................60

2.2.3.4.6. Einbettung der Präparate ....................................................................60

2.2.3.4.7. Photografie.........................................................................................61

3. Ergebnisse .............................................................................................................62

3.1. Screening des CLL-Patienten-Materials...............................................................62

3.1.1. Das verwendete Patientenmaterial .....................................................................62

3.1.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen..................................................62

3.1.2.1. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene.......................62

3.1.2.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene....................63

3.1.3. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen ...................................................66

3.1.3.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene ........................66

3.1.3.2. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene .....................67

3.1.3.2.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen in Zellkulturüber-

ständen...............................................................................................67

3.1.3.2.2. Nachweis von sCD137 in Patientenseren............................................67

3.1.3.2.2. Herkunft von sCD137 in Patientenseren .............................................69

3.2. Funktion von mCD137 in der CLL.......................................................................70

3.2.1. Die Rolle von mCD137 bezüglich des Überlebens von CLL-Zellen ...................70

3.2.2. Ursache der höheren Anzahl überlebender B-CLL-Zellen auf CD137-Fc ...........72

3.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort ......................................................73

3.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort...................................................74

3.3.2. Verifizierung der durch mCD137 vermittelten Verminderung der zytotoxi-

schen Lyse .........................................................................................................77

3.3.2.1. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Transfektion mit

einem antisense-Vektor....................................................................................77

3.3.2.2. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Vorinkubation

der Zielzellen mit dem anti-CD137-Antikörper bbk-2 ......................................80

3.3.3. Mechanismus der Verminderung der LAK-Antwort durch mCD137 ..................82

3.3.3.1. Verminderung der Lyserate mCD137-tragender Zellen durch Apoptose-

Inhaltsverzeichnis

7

induktion in LAK-Zellen .................................................................................82

3.3.3.2. Die Rolle von Zytokinen in der mCD137-vermittelten Reduktion der LAK-

Lyse..... ............................................................................................................87

3.3.3.2.1. Die Rolle von IL-10 in der mCD137-vermittelten Reduktion der

LAK-Lyse..........................................................................................88

3.3.3.2.2. Die Rolle von TGFß1 in der mCD137-vermittelten Reduktion der

LAK-Lyse..........................................................................................89

3.3.3.3. Spezifität der Zytokinwirkung..........................................................................91

3.3.3.4. Induktion der TGFß-Freisetzung durch mCD137 oder den CD137-Ligand.......94

3.4. Die Rolle von sCD137 während der LAK-Antwort...............................................99

3.4.1. Die Wirkung von sCD137 auf die LAK-Zellen..................................................99

3.4.2. Die Wirkung von sCD137 auf die Target-Zellen .............................................100

4. Diskussion ...........................................................................................................106

4.1. Screening des CLL-Patientenmaterials hinsichtlich der Expression von CD137..106

4.2. Die Funktion von mCD137 in der CLL .............................................................109

4.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort ....................................................110

4.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort..................................................110

4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –

direkte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts..........................................112

4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –

indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts.......................................115

4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –

indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch IL-10 .................116


indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch TGFß.................117

4.3.2.3. Vermittlung der TGFß-Freisetzung durch CD137 oder CD137-Ligand ..........119

4.4. Die Rolle von sCD137 in der LAK-Antwort.......................................................122

4.5. Ausblick.............................................................................................................129

5. Zusammenfassung ..............................................................................................130

6. Literaturverzeichnis ...........................................................................................132

7. Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................167

8. Danksagung ........................................................................................................174

Einleitung

8

1. Einleitung

1.1. Das CD137-/CD137-Ligand-System

1.1.1. CD137 und sein Ligand

1.1.1.1. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137

Abb. 1.-1.: Schematischer Überblick über die Molekülstruktur von humanem CD137 (Darstellung

nach der Analyse der Proteinsequenzen in VINAY D. S. und KWON B. S., 1998; ALDERSON M. R. et al.,

1994; SCHWARZ H., et al., 1993). Der zytoplasmatische Teil des Proteins ist hellblau unterlegt.

CD137 gehört zur Familie der TNF-Rezeptoren. Dies ist eine Molekülfamilie strukturell ver-

wandter Glykoproteine. Die Liganden dieser Moleküle bilden die Proteine der korrespondie-

renden TNF-Superfamilie (GRUSS H.-J. und DOWER S. K., 1995).

Das humane CD137 wurde 1993 von H. SCHWARZ (SCHWARZ H. et al., 1993) als ILA (induced by

lymphocyte activation) bei der Suche nach induzierbaren Rezeptoren auf aktivierten T-Lym-

phozyten entdeckt. Vier Jahre zuvor wurde das murine CD137 oder 4-1BB von B. S. KWON

erstmalig beschrieben (KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989). Die homologen Gene wurden

1996 unter der Bezeichnung CD(w)137 in die CD (cluster of differentiation)-Nomenklatur

aufgenommen (KISHIMOTO T. et al., 1996). Innerhalb der TNFR-Familie firmiert CD137 unter

TNFRSF9 (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/ tnfrec2.html).

Das humane CD137 ist auf Chromosom 1p36 lokalisiert. Dort befinden sich weitere Gene der

TNFR-Familie, wie TNFR2, HVEM, OX40 und TRAMP. Deletionen in dieser chromosoma-

len Region werden mit soliden Tumoren, Translokationen mit verschiedenen hämatopoeti-

schen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht (SCHWARZ H. et al., 1997).

Das murine CD137-Gen liegt auf Chromosom 4 (KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; KWON B.

S. et al., 1994).

Leader-Peptid

Cys-reiche Domäne (CRD)((CRD)

N-Glykosy-lierungs-stellen

Ser/Thr-reicheRegion

Trans-membran-

Region

Casein-Kinase

II

1

IFKQPF-Motiv

saure Sequenzen(TRAF-

Interaktion)

p56Ick-Bindungs-

stelle

GG-Sequenz

255

Einleitung

9

Als Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie ist CD137 ein Typ I-Transmembranprotein. Das hu-

mane Protein besteht aus 255 AS, das murine aus 256. Die Aminosäuresequenz der beiden

Moleküle ist zu 60 % identisch (VINAY D. S. und KWON B. S., 1998).

Sowohl das humane als auch das murine Homolog enthalten ein leader-Peptid für den Mem-

brandurchtritt. Darauf folgt die Cys-reiche Region, welche die TNF-Rezeptor-Proteine cha-

rakterisiert und der Ligandbindung dient. Beim humanen CD137 besteht diese Region aus

drei, beim murinen aus vier Wiederholungen der CRD (SCHWARZ H. et al., 1993; KWON B. S. et al.,

1994).

Vergleiche des errechneten mit dem tatsächlichen Molekulargewicht von CD137 machen so-

wohl für das murine (25 kD vs. 30 kD) als auch für das humane Homolog (28 kD vs. 35 kD)

posttranslationale Modifikationen wahrscheinlich. Die Sequenz des murinen 4-1BB beinhaltet

mehrere Stellen für eine potentielle O-Glykosylierung (POLLOK K. E. et al., 1993). Das humane

CD137 enthält zwei Asn-Reste, an denen N-Glykosylierung möglich ist (SCHWARZ H. et al.

1993).

In der intrazellulären Domäne von CD137 finden sich kurze homologe Sequenzabschnitte

zwischen Mensch und Maus. Dazu gehören ein IFKQPF-Motiv und zwei aufeinander folgen-

de Tyr-Reste, die mögliche Phosphorylierungsstellen der Casein Kinase II darstellen, sowie

zwei kurze Sequenzabschnitte mit sauren AS, die die Interaktion mit TRAF-Molekülen

vermitteln. Zudem liegt im zytoplasmatischen Teil eine potentielle Bindungsstelle für die T-

Zell-spezifische Proteinkinase p56Ick, gefolgt von mehreren Gly-Resten (SCHWARZ H. et al., 1993;

VINAY D. S. und KWON B. S., 1998; YE H. et al., 1999).

Innerhalb der TNFR-Familie zeigt das murine CD137 Homologien zu CD27, OX40 und

GITR (NOCENTINI G. et al., 1997), das humane Homolog zu CD40 und HVEM (SCHWARZ H. et al.,

1993).

In der Maus konnten zwei splice-Varianten der mRNA für CD137 mit einer Größe von 1,5 kb

und 2,4 kb nachgewiesen werden. Die kürzere mRNA codiert für ein lösliches Protein, dem

die Transmembranregion fehlt (SETAREH M. et al., 1995; WILCOX R. A. et al., 2002). In humanen

aktivierten T-Zellen wurden drei CD137-mRNA-Isoformen beschrieben: Sie sind 4,4 kb, 4,0

kb und 1,8 kb lang. In Chondrozyten kommen zusätzlich Isoformen von 3,2 kb, 1,5 kb und

1,2 kb vor (VON KEMPIS J. et al., 1997). Das Vorhandensein von löslichem CD137 konnte auch für

den Menschen nachgewiesen werden (MICHEL J. et al., 1998; SHARIEF M. K., 2002).

Murines CD137 bindet außer an seinen Liganden an extrazelluläre Matrixproteine, wie Fibro-

nectin, Vitronectin, Laminin und Collagen VI (CHALUPNY N. J. et al., 1992; LOO D. T. et al., 1997).

Einleitung

10

1.1.1.2. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137-

Ligand

In der Maus und im Menschen gibt es einen Liganden für CD137. Das murine CD137-Li-

gand-Gen befindet sich auf Chromosom 17, in der Nähe der murinen Gene für TNF und LTß.

Die Gene für CD137-Ligand in Maus und Mensch werden jeweils von einem einzigen ORF

gebildet. Das Gen für den humanen CD137-Ligand liegt auf Chromosom 19p13.3. Es lokali-

siert in einem Bereich, in dem weitere Gene der TNF-Familie, wie z. B. der CD27-Ligand, zu

finden sind. (GOODWIN R. G. et al., 1993; ALDERSON M. R. et al., 1994).

Sowohl in der Maus als auch im Menschen wird der CD137-Ligand als Typ II-Transmem-

branprotein synthetisiert (GOODWIN R. G. et al., 1993; ALDERSON M. R. et al., 1994; POLLOK K. E. et al.,

1994). Das murine CD137-Ligand-Protein hat eine Länge von 309 AS und ein errechnetes

Molekulargewicht von 34 kD. Das tatsächliche Gewicht von 50 kD läßt auf

posttranskriptionelle Modifikation schließen. In der Aminosäuresequenz finden sich neben 3

Asn-Resten für eine N-Glykosylierung, ein Pro/Ser/Thr-reicher Bereich, an dem O-Glykosy-

lierung möglich wäre. Die Analyse des Proteins unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigt,

daß der Ligand in der Zelloberfläche als ein Homodimer vorliegt, dessen Untereinheiten über

Disulfidbrücken verknüpft sind (GOODWIN R. G. et al., 1993).

Der humane CD137-Ligand umfaßt nur 254 AS. Ihm fehlen die Asn-Reste, sowie die Pro/-

Ser/Thr-reiche Region im Extrazellulärteil (ALDERSON M. R. et al., 1994). Aus der Membran kann

CD137-Ligand durch Metalloproteinasen als biologisch aktives lösliches Protein freigesetzt

werden (SALIH H. R. et al., 2001).

Die Homologie des CD137-Ligand-Proteins zu anderen TNF-Familienmitgliedern beschränkt

sich auf die Extrazellulärdomäne. Dies läßt auf Unterschiede der durch den Liganden in die

Zelle vermittelten Funktionen schließen. Zwischen dem menschlichen und dem murinen Ho-

molog ist die Ähnlichkeit mit 36 % vergleichsweise gering. Andere Mitglieder der TNF-Fa-

milie weisen zwischen den Arten zwischen 70 % und 80 % Homologie auf (GOODWIN R. G. et

al., 1993; ALDERSON M. R. et al., 1994).

1.1.1.3. Expression und Gewebeverteilung von CD137

CD137 wurde in der Maus und im Menschen bei der Untersuchung aktivierungsabhängig ex-

primierter T-Zell-Gene gefunden (KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; SCHWARZ H. et al., 1993).

CD137 wird in der Maus auf den Zellen lymphatischen Ursprungs strikt aktivierungsabhängig

exprimiert. Stimulation mit Concavalin A, PMA und Kalziumionophor, PHA oder anti-CD3-

Antikörpern induziert die CD137-Expression in T-Lymphozyten auf RNA- und Proteinebene

Einleitung

11

(KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; KWON B. S. et al., 1989; GRAVESTEIN L. A. et al., 1993; POLLOK K.

E. et al., 1993; POLLOK K. E. et al., 1995; ZHANG X. et al., 2002). CD137 wird transient exprimiert: Die

Dichte des Rezeptors steigt langsam an und erreicht nach 60 h ein Maximum (POLLOK K. E. et

al., 1993).

Auch auf NK1.1-Zellen der Maus wird CD137 aktivierungsabhängig exprimiert (MELERO I. et

al., 1998).

In Zellen der myelotischen Reihe konnte die Expression von CD137 ebenfalls nachgewiesen

werden, so auf Makrophagen (SETAREH M. et al., 1995), Mikroglia (PAULY S., 2000) und dendriti-

schen Zellen (DCs) (FUTAGAWA T. et al., 2002; WILCOX R. A. et al., 2002).

Außerdem wurde in der Maus die mRNA für CD137 in 3T3-Fibroblasten und Epithelzellen

gefunden (SETAREH M. et al., 1995).

Die Expression des menschlichen CD137 kann über den MEK/ Erk- und JNK/ SAPK-Signal-

weg induziert werden (KIM J. O. et al., 2003). Wie murines wird humanes CD137 in gesunden

Zellen lymphatischen Ursprungs ausschließlich aktivierungsabhängig synthetisiert (SCHWARZ

H. et al., 1995; VON KEMPIS J. et al., 1997). Die CD137-mRNA kann in T-Lymphozyten 90 min

nach der Stimulation detektiert (SCHWARZ H. et al., 1995), das Protein nach 17 h nachgewiesen

werden. Die Expression erreicht nach ca. 48 h einen Höhepunkt und fällt in den nächsten vier

Tagen wieder auf das Ausgangsniveau ab (MICHEL J., 1998). Die Transienz ist eine Folge von

proteolytischem shedding des membranständigen Rezeptors (TARABAN V. Y. et al., 2002). Die

lösliche Form des Proteins ist wie die membranständige 17 h nach Stimulation nachweisbar

und erreicht nach drei Tagen ein Expressionsmaximum. Induzierbar ist humanes CD137 in T-

Zellen durch anti-CD3-Antikörper, IL-2, PMA und Kalziumionophor und PHA (MICHEL J.,

1998). In primären B-Lymphozyten kann die mRNA anti-IgM- oder SAC-Behandlung nach-

gewiesen werden, während das Protein nicht detektierbar ist (KIENZLE G. et al., 1997; MICHEL J.,

unveröffentlichte Daten). Anders als gesunde, nicht aktivierte Lymphozyten können entartete oder

transformierte Lymphozyten konstitutiv CD137 exprimieren (SCHWARZ H. et al., 1995).

Auf Zellen myelotischer Herkunft wird CD137 konstitutiv exprimiert, so auf Monozyten/Ma-

krophagen (KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000; SÖLLNER L., 2001) und neutrophilen Granulozyten

(HEINISCH I. V. et al., 2000). Mikrogliazellen synthetisieren CD137 aktivierunsabhängig (PAULY S.,

2000).

Als Zellen des Immunsystems unbestimmter Herkunft exprimieren FDCs in Keimzentren

CD137 (PAULY S. et al., 2002; LINDSTEDT M. et al., 2003). Mastzellen synthetisieren das Molekül

nach Aktivierung (HEINISCH I. V. et al., 2001; NAKAJIAMA T. et al., 2002).

Einleitung

12

CD137 kommt beim Menschen – und bei der Maus – auch in Geweben außerhalb des Im-

munsystems vor: So konnten J. VON KEMPIS et al. die differenzierungs- und stimulusabhängi-

ge Expression von CD137 in Chondrozyten zeigen (VON KEMPIS J. et al., 1997). Endotheliale Zel-

len der Lunge und basale epitheliale Lungenzellen gesunder Probanden zeigen konstitutiv

eine deutliche CD137-Expression (BOUSSAUD V. et al., 1998). Bei immunhistochemischen Un-

tersuchungen konnte CD137 in den Gefäßwänden der Kapillaren maligner Tumore detektiert

werden (BOUSSAUD V. et al., 1998; BROLL K. et al., 2001).

Lösliches CD137 kann beim gesunden Probanden im Serum nur in geringer Menge gefunden

werden, während es bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (M ICHEL J. et al., 1998) oder

hämatopoetischen Erkrankungen – insbesondere der CLL – im Serum erhöht auftritt (FURTNER

M., 2001). MS-Patienten zeigen in aktiven Stadien ihrer Erkrankung eine deutlich gesteigerte

Konzentration an sCD137 in Serum und Cerebrospinalflüssigkeit (SHARIEF M. K., 2002).

1.1.1.4. Expression und Gewebeverteilung des CD137-Liganden

Der murine CD137-Ligand wird konstitutiv auf den Stromazellen des Knochenmarks und des

Thymus’ exprimiert (GOODWIN R. G. et al., 1993). Im murinen Immunsystem wird CD137-Ligand

von myelotischen Zellen konstitutiv synthetisiert: Er konnte auf Monozyten/Makrophagen

(POLLOK K. E. et al., 1994) und DCs (DEBENEDETTE M. A. et al., 1997) nachgewiesen werden. Von

den Zellen der lymphatischen Reihe exprimieren B-Zellen den Ligand (POLLOK K. E. et al.,

1994). Das bedeutet, daß CD137-Ligand von den APCs der Maus konstitutiv synthetisiert wird

(POLLOK K. E. et al., 1994; DEBENEDETTE M. A. et al., 1997).

Auf T-Lymphozyten der Maus wird CD137-Ligand aktivierungsabhängig synthetisiert (GOOD-

WIN R. G. et al., 1993). Darüber hinaus konnte der murinen CD137-Liganden auf verschiedenen

Maus-Lymphomzellinien gefunden werden (DEBENEDETTE M. A. et al., 1995).

Die mRNA des humanen CD137-Liganden konnte in Gehirn, Plazenta, Lunge, Skelettmuskel

und Niere nachgewiesen werden. Keine oder sehr wenig Transkripte sind in Herz, Leber und

Pankreas detektierbar (ALDERSON M. R. et al., 1994; PHILLIPS T. A. et al., 2001).

Auf Geweben myelotischen Ursprungs im humanen Immunsystem wird der CD137-Ligand

konstitutiv auf Monozyten/Makrophagen (ALDERSON M. R. et al., 1994; SALIH H. R. et al., 2001; SÖLL-

NER L., 2001) und in einer Unterklasse der dendritischen Zellen exprimiert, die in den T-Zell-

Zonen der Tonsillen in engem Kontakt zu den T-Lymphozyten stehen (SUMMERS K. L. et al.,

2001).

Einleitung

13

Auf Lymphozyten kommt der CD137-Ligand auf T-Zellen in geringer Dichte konstitutiv vor,

wird durch Aktivierung jedoch induziert (ALDERSON M. R. et al., 1994; ZHOU Z. et al., 1995). Primäre

B-Lymphozyten exprimieren humanen CD137-Ligand konstitutiv; sie reagieren auf Stimulie-

rung ebenfalls mit einer Synthesesteigerung (ALDERSON M. R. et al., 1994; PAULY S., 2000).

Transformierte und entartete Zellen tragen z.T. hohe Dichten an CD137-Ligand auf ihrer

Oberfläche: CD137-Ligand-Protein kann auf EBV-transformierten B-Zellen, verschiedenen

B- und monozytären Tumorzellinien, Zellinien aus soliden Tumoren, sowie primären Ovarial-

und Pankreaskarzinomen nachgewiesen werden (ALDERSON M. R. et al., 1994; SALIH H. R. et al.,

2000).

Die lösliche Form des CD137-Liganden konnte in den Zellkulturüberständen von nativen und

aktivierten B-Zellen sowie den Überständen aktivierter T-Lymphozyten und monozytärer

Zellen nachgewiesen werden. Gegenüber gesunden Probanden erhöhte Konzentrationen von

löslichem CD137-Ligand-Protein sind in den Seren von Patienten mit hämatopoetischen Er-

krankungen, u.a. der CLL, zu finden (SALIH H. R. et al., 2001).

1.1.2. Bidirektionale Signalübertragung durch das CD137-/CD137-

Ligand-System

Abb. 1.-2.: Schema der bidirektionellen Signalübertragung.

Einige Rezeptor-Ligand-Paare der TNFR-/TNF-Familie besitzen die Fähigkeit zur bidirektio-

nellen oder reversen Signalübertragung. Das bedeutet, sowohl der membranständige Rezep-

tor als auch der membrangebundene Ligand kann ein Signal in die jeweilige Zelle übertragen.

Signal 2 Signal 1

CD137

CD137-Ligand

Einleitung

14

CD137

TRAF-2

?

?

GCKR

MEKK1ASK1

MKK IKKa/ IKKß

p38JNK/ SAPK IkB/ NF-kB

jun ATF2 NF-kB

Bcl-xL, Bfl-1

LRR-1

1.1.2.1. Signaltransduktion durch CD137 und seinen Liganden

1.1.2.1.1. Signaltransduktion durch CD137

Murines CD137 interagiert mit der T-Zell-spezifischen src-Tyrosinkinase p56lck. Sie ist für

die optimale Aktivierung von T-Lymphozyten als Antwort auf die Antigenpräsentation essen-

tiell. Auch humanes CD137 enthält eine Konsensussequenz für diese Kinase (KIM Y.-J. et al.,

1993; SCHWARZ H. et al., 1993).

Die intrazellulären Domänen beider Homologe binden TRAF1 und 2 (ARCH R. H. UND THOMPSON

C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998; SAOULLI K. et al., 1998), humanes CD137 auch TRAF3 (JANG I. K. et

al., 1998). TRAF2 rekrutiert seinerseits ASK1. Dies hat die Aktivierung der JNK/SAPK bzw.

der p38 MAPK zur Folge (ARCH R. H. et al., 2000; CANNONS J. L. et al., 2000; KIM H. H. et al., 2000).

Die Assoziation von CD137 und TRAF2 führt zur Freisetzung von NFkB und dessen Trans-

lokation in den Zellkern (ARCH R. H. UND THOMPSON C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998). Diese Vor-

gänge haben in der Regel eine Aktivierung der betroffenen Zelle zur Folge.

Durch die Vernetzung von CD137 werden die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL und Bfl-1

induziert (LEE H. W. et al., 2002). L. K. JANG et al. (2001) beschreiben, daß das Protein LRR-1

(leucine rich repeat protein) die mCD137-vermittelte NFkB-Aktivierung supprimiert und die

JNK1 herunterreguliert.

Abb. 1.-3. : Signaltransduktion durch CD137. Graphik nach CANNONS J. L. et al. 2000, ergänzt durch

JANG K. et al., 2001 und LEE H. W. et al. 2002.

Einleitung

15

CD137-Ligand

PTK

MEK1/ 2

p38 MAPK

z. B. IL-8

ERK1/ 2

PI3-Kinase

1.1.2.1.2. Signaltransduktion durch CD137-Ligand

Das CD137/CD137-Ligand-System funktioniert bidirektionell, d.h. der CD137-Ligand kann

in die ihn exprimierende Zellen ebenfalls ein Signal übertragen. Obwohl verschiedene Auto-

ren dies auf Grund der physiologischen Veränderungen von Zellen nach Stimulation mit

immobilisierten CD137 oder Antikörpern gegen CD137-Ligand belegen konnten (POLLOK K. E.

et al., 1994; DEBENEDETTE M. A. et al., 1995; 1997; CHU N. R. et al., 1997; LANGSTEIN J. et al., 1998;

SCHWARZ H. et al., 1998; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; MICHEL J. et al., 1999; TAN J. T. et al., 1999;

LANGSTEIN J. et al., 2000; SALIH H. R. et al., 2000; CANNONS J. L. et al., 2001; NOWAZA K. et al., 2001; SALIH

H. R et al., 2001), herrschte über die Signalwege lange Unklarheit.

2001 wies L. SÖLLNER in ihrer Dissertation nach, daß in monozytären Zellen durch die Liga-

tion des CD137-Liganden Tyr-Phosphorylierung unter der Betiligung von src-Kinasen indu-

ziert wird. An der Signaltransduktion wirken außerdem die p38 MAPK, MEK1, Erk1 und 2

mit. Die Proteinkinase A übt einen hemmenden Einfluß auf die reverse Signalübertragung

durch CD137-Ligand aus (SÖLLNER L., 2001).

Abb. 1.-4.: Signaltransduktion durch CD137-Ligand. Graphik nach SÖLLNER L., 2001.

Über cDNA-Arrays konnten u.a. folgende Zielgene einer Aktivierung monozytärer Zellen

über den CD137-Ligand identifiziert werden: die Proteintyrosinkinase hck, die Ser-/Thr-Kina-

se ILK, die a-Untereinheit des Fibronectin-Rezeptors, die g-Kette des IL-2-Rezeptors und der

Transkriptionsfaktor NFkB (SÖLLNER L., 2001).

Einleitung

16

1.1.2.1.3. Physiologische Funktionen, die durch CD137 vermittelt werden

Zellen myelotischer Herkunft können CD137 synthetisieren (KWON B. et al., 2002; 2003). Die Sti-

mulation von CD137 auf DCs erhöht die Sekretion von Zytokinen, wie IL-6 und IL-12, durch

die DCs. Zudem induziert es die Expression kostimulatorischer Moleküle (FUTAGAWA T. et al.,

2002; WILCOX R. A. et al., 2002). Die Proliferation antigenspezifischer T-Lymphozyten wird von

CD137-tragenden DCs gegenüber Kontrollzellen deutlich angeregt (WILCOX R. A. et al., 2002).

CD137 spielt bei der Aktivierung und der Fähigkeit von DCs ihrerseits T-Zellen zu aktivieren

eine Rolle (FUTAGAWA T. et al., 2002; KWON B. et al., 2002; WILCOX R. A. et al., 2002).

In Monozyten bewirkt die Vernetzung von CD137 Aktivierung, erkennbar an der Induktion

der proinflammatorischer Zytokine sowie der Inhibition von IL-10. Die Stimulation von

CD137 auf Monozyten führt in der Kokultur zur Apoptose von B-Lymphozyten. Dazu ist ein

direkter Kontakt zwischen B-Zellen und Monozyten notwendig (KIENZLE G. und VON KEMPIS J.,

2000).

NK-Zellen exprimieren CD137 nach Aktivierung durch IL-2 oder IL-15. Für die Entwicklung

einer effizienten anti-Tumor-Antwort nach der Gabe von anti-CD137-Antikörpern in Mäusen

ist dieser Zelltyp verantwortlich. CD137-stimulierte NK-Zellen fördern die Proliferation und

die IL-2-Empfindlichkeit aktivierter CTLs. Daher kann CD137 als kostimulatorischer Rezep-

tor auf NK-Zellen betrachtet werden, der in der anti-Tumor-Antwort als Vermittler zwischen

angeborenem und erworbenem Immunsystem fungiert (MELERO I. et al., 1998; WILCOX R. A. et al.,

2002i).

Entdeckt wurde CD137 bei Studien zur differentiellen Genexpression in aktivierten T-Zellen

(KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; SCHWARZ H. et al., 1993). Die Vernetzung von CD137 auf

der Oberfläche stimulierter T-Lymphozyten führt zu einem Signal, das die Proliferation der

T-Zellen, deren Produktion an proinflammatorischen Zytokinen und die Entwicklung zytoly-

tischer Effektorfunktionen steigert (GOODWIN R. G. et al., 1993; POLLOK K.E.. et al., 1993; ALDERSON

M. R. et al., 1994; DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; HURTADO J. C. et al., 1995; DEBENEDETTE M. A. et al.,

1997; SEO G. K. et al., 2001; WEN T. et al., 2002). CD137-Ligation fördert die Adhäsion humaner T-

Lymphozyten an Fibronectin. Somit könnte CD137 zusätzlich zur Aktivierung von T-Zellen

an deren Migration aus den Blutgefäßen ins Gewebe beteiligt sein (KIM Y.-J. et al., 1999). Fehlt

T-Zellen das kritische kostimulatorische Signal durch CD28 für die Aktivierung, kann über

CD137 CD28-unabhängig Kostimulation erfolgen. Die Proliferation der Zellen, die Synthese

von Zytokinen, von Aktivierungsmarkern und von erhöhten Perforinspiegeln und die Stei-

gerung der zytolytischen Effektorfunktion und ein verlängertes Überleben der Zellen durch

Einleitung

17

die Induktion des antiapoptotischen Moleküls Bcl-xL sind die Folge dieser Kostimulation (DE-

BENEDETTE M. A. et al., 1997; BUKZYNSKI J. et al., 2003). Werden CD3-aktivierte T-Zellen über

CD137 kostimuliert, exprimieren sie FasL und erlangen die Fähigkeit Tumorzellen in die

Apoptose zu treiben (EBATA T. et al., 2002).

Für Effektor-T-Zellen stellt CD137 ein starkes kostimulatorisches Molekül dar.

Chronisch aktivierte T-Zellen treibt ein Signal durch CD137 in die Apoptose (ALDERSON M. R.

et al., 1994).

Im allgemeinen wird zwischen den Funktionen CD4- und CD8-positiver T-Zellen differen-

ziert. T-Lymphozyten, die CD8 als kostimulatorisches Molekül tragen, werden als zytotoxi-

sche T-Zellen bezeichnet. CD4-positive T-Zellen unterschiedet man in Th1- und in Th2-Zel-

len. Th1-Zellen sekretieren proinflammatorische Zytokine, wie z.B. IL-2, TNF und IFN-g. Ih-

re Aufgabe ist die Unterstützung der zellvermittelten Immunität gegen intrazelluläre Patho-

gene durch Makrophagen. Th2-Zellen sekretieren IL-4, -5, -6, -10 und -13. Sie fördern da-

durch die humoralen Immunantworten gegen extrazelluläre Erreger (JANEWAY C. A. et al., 2002).

CD4-positive T-Zellen können durch Quervernetzung von CD137 zur Sekretion von Il-2, IL-4

und IFN-g angeregt werden. Unter CD137-Kostimulation erhöht sich sowohl die

Proliferation, als auch die Anzahl an langzeitüberlebenden Zellen (HURTADO J. C. et al., 1995;

CANNONS J. L. et al., 2001; WEN T. et al., 2002). Stimuliert man CD3-aktivierte Th2-Lymphozyten

über CD137, antworten sie mit verstärkter Proliferation und IL-4-Sekretion. Th1-Zellen

reagieren auf dieselbe Kostimulation durch CD137 deutlich weniger stark, entsprechend ihrer

weitaus geringeren CD137-Expression (VINAY D. S. und KWON B. S., 2000).

Insgesamt stellt CD137 ein wichtiges kostimulatorisches Molekül für die Aktivierung CD4-

positiver T-Zellen dar.

Im Gegensatz dazu steht, daß in Mäusen durch Injektion von CD137-Antikörpern Langzeit-

Anergie antigenspezifischer CD4-T-Zellen induziert werden kann. Dadurch wird auch die hu-

morale Immunantwort beeinträchtigt: Die so behandelten Tiere sind nicht mehr in der Lage,

nach Antigenkontakt adäquate Antikörperantworten zu entwickeln (KWON B. et al., 2000; MITTLER

R. S. et al., 2002).

Während des Alterns erhöht sich die Empfindlichkeit gegenüber infektiösen Substanzen

parallel zu einer verminderten Fähigkeit des Körpers, angemessen auf diese Antigene zu rea-

gieren. Dafür verantwortlich ist, daß gealterte CD4-positive T-Zellen in ihrer Kapazität be-

einträchtigt sind, nach Antigenkontakt zu proliferieren und zu überleben. Ähnliche Gründe

bringt man mit dem Phänotyp der Toleranz in Zusammenhang. Quervernetzung von CD137

durch agonistische Antikörper können die Toleranz junger Individuen im Tierversuch

Einleitung

18

aufheben und darüber hinaus das korrekte Antigen-priming der T-Lymphozyten älterer Tiere

wiederherstellen (BANSAL-PAKALA P. und CROFT M., 2002).

Differentiert man naive CD8-positive Nabelschnurblut-T-Zellen in Richtung zytotoxischer T-

Zellen und stimuliert diese Zellen über die Vernetzung von CD137, unterziehen sich die Lym-

phozyten massiven phänotypischen Veränderungen: Sie synthetisieren Oberflächenmarker,

die für Gedächtniszellen charakteristisch sind. Ihr Gehalt an Granzym B steigt und die CTLs

weisen eine erhöhte zytolytische Aktivität auf. Zudem zeigen diese Zellen ein verlängertes

Langzeitüberleben. Dies alles deutet darauf hin, daß der CD137-Signalweg an der Differen-

zierung zu von CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen zu Effektor-Gedächtniszellen beteilt ist

(KIM Y.-J. et al., 2000).

Die Kostimulation von CD8-positiven T-Zellen durch Vernetzung der CD137-Moleküle auf

ihrer Oberfläche führt zur Steigerung der Zellteilung, der Produktion proinflammatorischer

Zytokine, verlängertem Überleben sowie erhöhten zytolytischen Effektorfunktionen (ZHOU Z.

et al., 1994; SHUFORD W. W. et al., 1997; VINAY D. S. und KWON B. S., 1999i; CANNONS J. L. et al., 2001;

LADERACH D. et al., 2002; WEN T. et al., 2002; MAUS M. V. et al., 2003). Das Überleben der Effektor-T-

Zellen nach einem CD137-Signal kann auf eine NF-kB-vermittelte Expressionssteigerung von

Bcl-xL und Bfl-1 zurückgeführt werden; Änderungen in der Expression von Bcl-2 werden

durch die CD137-Kostimulation nicht induziert (TAKAHASHI C. et al., 2000; LADERACH D. et al.,

2002; LEE H.-W. et al., 2002). Der Interaktion zwischen CD137 und seinem Liganden kommt

daher eine bedeutende Funktion hinsichtlich der Regulation zytotoxischer T-Zell-Antworten

zu.

Im Falle viraler Infektionen werden Virus-infizierte Zellen von CD8-positiven T-Zellen er-

kannt und zerstört. Werden Influenza TypA-infizierte Mäuse mit agonistischen monoklona-

len Antikörpern gegen CD137 behandelt, zeigen diese eine gesteigerte CD8-T-Zell-Antwort.

Diese äußert sich in einer vermehrten Anzahl antigenspezifischer CD8-T-Zellen in der Lunge

er-krankter und behandelter Tiere, sowie einer stark erhöhten ex vivo-Zytotoxizität dieser T-

Lymphozyten (HALSTEAD E. S. et al., 2003).

In der Erkennung und Abwehr von Tumoren spielen CD8-positive, zytotoxische T-Zellen

eine zentrale Rolle. Die Vernetzung von CD137 stellt die Induktion, Amplifikation und Auf-

rechterhaltung der CTL-Antwort sicher. Dieses „priming“ tumor-spezifischer T-Zellen durch

anti-CD137-Antikörper ist ebenso effektiv wie durch Helfer-T-Zellen (DIEHL L. et al., 2002).

Einleitung

19

Eine Behandlung tumortragender Mäusen mit agonistischen anti-CD137-Antikörpern führt

zur T-Zell-vermittelten Tumorabnahme. In vivo-Depletionsexperimente zeigen, daß dieses

Phänomen auf CD8-positive T-Zellen, nicht aber CD4-positive T-Lymphozyten oder NK-

Zellen zurückgeht. CD4-positive T-Zellen sind jedoch für die Aufrechterhaltung eines effek-

tiven Antitumorgedächtnisses erforderlich (MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002).

Helfer-T-Lymphozyten werden außerdem bei der Induktion neuer CTL-Antworten benötigt,

indem sie DCs aktivieren, CTL-Vorläuferzellen Antigene zu präsentieren. Zudem erhöht der

auf CD4-Helferzellen exprimierte CD137-Ligand Proliferation und Überleben von CTLs

während der Tumorantwort (GIUNTOLI R. L. et al., 2002).

CD137-Signalen kommt während der anti-Tumor-Immunantwort eine große Bedeutung zu.

Tragen Tumorzellen in Mäusen, beispielsweise durch Transfektion, CD137-Ligand, so ent-

wickeln die Tiere eine starke CTL-Antwort gegen diese Tumoren und erlangen langanhal-

tende Immunität gegen den Wildtyp-Tumor (MELERO I. et al., 1998i).

1997 veröffentlichte I. MELERO, daß die intraperitoneale Gabe von anti-CD137-Antikörpern

etablierte hoch- sowie niedrig-immunogene Tumoren in Mäusen zum Verschwinden bringt.

Diese Immunantwort benötigt CD4- und CD8-positive Lymphozyten. Begleitet wird sie von

einer deutlich gesteigerten tumorspezifischen CTL-Aktivität (MELERO I. et al., 1997; KIM J. A. et

al., 2001).

Um die immunologische „Ignoranz“ durch Anergie oder Deletion der CTLs im Falle niedrig-

immunogener Tumoren zu brechen, setzen R. A. WILCOX et al. zur Behandlung außer anti-

CD137-Antikörpern Tumorpeptide ein, die alleine für eine kurative CTL-Antwort nicht

ausreichen. Darufhin tritt die Regression der Tumore ein (WILCOX R. A. et al., 2002ii). Eine

weitere Arbeit aus dieser Gruppe kann IFN-g als entscheidenden Faktor für die CD137-ab-

hängige Regulation der Infiltration antigen-spezifischer CTLs in das Tumorgewebe charak-

terisieren (WILCOX R. A. et al., 2002iii).

In jüngerer Zeit werden Vakzinierungen als therapeutische Maßnahme gegen etablierte

Tumoren diskutiert. Die meisten tumordestruktiven Immunantworten sind zellvermittelt. Es

erscheint daher sinnvoll, mit DCs zu impfen, die mit Tumor-Antigen beladen wurden. DCs

präsentieren die Antigene dann den Effektor-T-Zellen, die für die anti-Tumor-Antwort verant-

wortlich sind. Um die anti-Tumor-Antwort noch zu steigern, können die DCs außerdem zur

Expression kostimulatorischer Moleküle veranlaßt werden. Bringt man im Mausmodell mit-

tels eines Vektors ein Modellantigen sowie das Gen für CD137-Ligand in DCs ein und ver-

wendet diese Zellen zur Immunisierung, zeigen die so behandelten Tiere eine deutlich erhöhte

Effektor- und Gedächtnis-CTL-Antwort gegenüber Mäusen, denen nur das Modellantigen

Einleitung

20

transferiert wurde (WIETHE C. et al., 2003). Transfiziert man zusammen mit dem CD137-Ligand-

das IL-12-Gen in DCs, erreicht man eine Regression der Tumoren und ein verstärktes

Überleben der therapierten Tiere (MARTINET O. et al., 2002; MARTINET O. et al., 2000).

Auch durch modifizierte Tumorzellen kann Immunisierung erfolgen (MOGI S. et al., 2000). Hu-

mane LAK-Zellen bzw. PBMCs, die mit CD137-Ligand-infizierten Tumorzellen kokultiviert

wurden, zeigen eine deutlich erhöhte Antitumor-Aktivität gegen diese Zellen. Dies ist auf eine

gesteigerte Sekretion von IFN-g, IL-2 und GM-CSF der LAK-Zellen zurückzuführen. Inhibi-

tion des Tumorwachstums durch die Gabe von LAKs und Vektor konnte auch für ein huma-

nes Tumormodell in SCID-Mäusen gezeigt werden (KATAYOSE Y. H.. et al., 2003).

1.1.2.1.4. Physiologische Funktionen, die durch CD137-Ligand vermittelt werden

Nicht nur durch den CD137-Rezeptor, auch durch den Liganden können Signale transduziert

werden. Immobilisiertes CD137-Fc stellt einen starken Aktivator für Monozyten dar. Die

Ligation des CD137-Liganden induziert die Expression proinflammatorischer Zytokine und

die Inhibition der Freisetzung von IL-10 und IL-1-RA. Die Vernetzung des CD137-Liganden

kann den aktivierungs-abhängigen Zelltod (AICD) in Monozyten und die Synthese apoptose-

assoziierter Proteine wie z.B. Fas-L auslösen. Zudem erhöht die Stimulation über den Ligan-

den die Adhärenz von Monozyten und die Vermittlung der Migration in Sphäroide. Damit in

Einklang steht die gesteigerte Expression von Adhäsionsmolekülen (LANGSTEIN J. et al., 1998;

LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J. et al., 2000; BECKE F., LANGSTEIN J.:

unveröffentlichte Daten). CD137-Ligand-Signale verlängern das Überleben von Monozyten durch

eine starke Induktion von GM-CSF. Außerdem können durch immobilisiertes CD137 – als

einzigem bislang bekannten Molekül – Proliferation und Endomitosen in Monozyten induziert

werden (LANGSTEIN J. et al., 1998; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J.

et al., 2000). Myeloide Vorläuferzellen erhalten über den CD137-Ligand Signale, die sie dazu

veranlassen, erhöhte CD11c-Level zu synthetisieren. Die Produktion immunstimulatorischer

Moleküle, wie IL-12, CD86, MHC II und CD137-Ligand selbst, wird ebenfalls gesteigert.

Diese Veränderungen werden von einer morphologischen Differenzierung hin zu adhärenten

Zellen begleitet (KIM Y.-J. et al., 2002). Dies bedeutet, daß CD137 für Monozyten CD137 einen

wichtigen Aktivierungs-, und Differenzierungsfaktor darstellt.

Die Vernetzung des CD137-Liganden auf stimulierten murinen oder humanen B-Zellen führt

zu einer erhöhten Proliferation der Zellen und gesteigerter IgM-Produktion (POLLOK K. E. et al.,

1994; PAULY S. et al., 2002). Dies bedeutet die Aktivierung der B-Zellen durch CD137-Ligand-

Signale.

Einleitung

21

In stimulierten humanen T-Lymphozyten kann die Vernetzung des CD137-Liganden die anti-

CD3-induzierte Proliferation vollständig verhindern (SCHWARZ H. et al., 1996). Signaltransduk-

tion durch CD137-Ligand induziert Fas-unabhängig Apoptose (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J.

et al., 1999).

Funktioneller CD137-Ligand wird auf verschiedenen Karzinomzellinien exprimiert. Eine

Ver-netzung von CD137-Ligand auf der Oberfläche dieser Zellen führt zur Steigerung der IL-

8-Expression. Keine signifikanten Änderungen konnten für IL-6, IL-12, TNF, IL-10 und

TGFß nachgewiesen werden (SALIH H. R. et al., 2000).

1.1.2.1.5. Physiologische Funktionen, die durch das CD137-/CD137-Ligand-System

vermittelt werden – Studien an knockout- bzw. transgenen Tieren

Eine Sonderstellung nehmen Studien ein, die mit CD137- bzw. CD137-Ligand-defizienten

Mäusen durchgeführt wurden, da sich hier die Rolle der bidirektionellen Signalübertragung

direkt offenbart. Phänotypen, die sich in knockout-Tieren zeigen, können sowohl von einem

fehlenden Signal durch den Rezeptor, als auch durch ein ungenügendes Signal durch den Li-

ganden verursacht sein. Dies trifft jedoch nur zu, wenn für das jeweilige Molekül keine

weiteren Interaktionspartner zur Verfügung stehen.

Die CD137-knockout-Maus entwickelt sich normal, ist lebensfähig und fertil. Die humoralen

Immunantworten auf virale Infektionen sind mit denen von wt-Mäusen vergleichbar. Die

IgG2a- und IgG3-Antworten auf KLH sind reduziert. CD137-defiziente Tiere zeigen nach Sti-

mulation erhöhte T-Zell-Proliferation, sind in ihrer Fähigkeit IL-2, IFN-g, sowie IL-4 zu se-

kretieren jedoch eingeschränkt. Auch die CTL-Aktivität der knockout-Mäuse ist verringert.

Darüber hinaus zeigt sich die Rolle von CD137 in der Regulation des Zellwachstums myelo-

ider Vorläuferzellen darin, daß sich diese Zellen im peripheren Blut, im Knochenmark und in

der Milz CD137-defizienter Mäusen anreichern (KWON B. S. et al., 2002).

CD137-Ligand-defiziente Mäuse entwickeln weitgehend normale humorale Immunantworten

gegen Viren. Ihre antivirale CTL-Aktivität ist im Vergleich zu wt-Mäusen jedoch geschwächt

(BERTRAM E. M. et al., 2002; DEBENEDETTE M. A. et al., 1999; TAN J. A. et al., 1999). Dies kann als

Hinweis darauf gewertet werden, daß CD137-Kostimulation in vivo in erster Linie für CD8-

T-Zell-Antworten von Bedeutung ist. Ein weiteres Modell für intrazelluläre Infektionen stellt

das Bakterium L. monocytogenes dar. Während Infektionen mit diesem Organismus ist in

CD137-Ligand-defizienten Mäusen die CD8-T-Zell-Antwort gestört (SHEDLOCK D. J. et al. ,

2003).

Einleitung

22

Stellt man das CD137-Ligand-Gen unter die Kontrolle des MHCII-Ea-Promotors und expri-

miert ihn in APCs über, so entwickeln transgene Mäuse Splenomegalie und eine selektive De-

pletion von B-Zellen. Die Mäuse zeigen unzureichende humorale Antworten nach Antigen-

Kontakt. Milzzellen transgener Tiere sind nicht mehr imstande, allogene T-Zellen zu stimu-

lieren. Aus diesen Untersuchungen ergibt sich für den CD137-Liganden eine weitere Funktion

in der Regulation humoraler Immunantworten und der Antigenpräsentation (ZHU G. et al.,

2001).

1.2. Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL)

Die chronisch lymphatische Leukämie vom B-Zell-Typ ist ein niedrig-maliges Non-Hodgkin-

Lymphom. Die CLL stellt die häufigste Leukämieerkrankung des höheren Lebensalters in der

westlichen Welt dar.

Der schleichende Verlauf der CLL manifestiert sich durch eine Vielzahl diffuser Symptome,

wie Lymphknotenschwellungen, Gewichtsabnahme, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Blutungen

und Infektneigung. Im fortgeschrittenen Stadium kommt es zu Spleno- und Hepatomegalie.

Es treten Zeichen der Knochenmarksinfiltration auf, so Anämie, Thrombo- und Neutropenie

trotz peripherer Leukozytose durch die malignen B-CLL-Zellen. Außerdem neigen CLL-

Patienten zu Autoimmunphänomenen. Das mittlere Überleben nach Diagnosestellung beträgt

ca. 12 Jahre (ACHENBACH W., 1997; BERGER D. P. et al., 1998).

Charakterisiert ist die CLL durch klonale Expansion und Akkumulation morphologisch reif

erscheinender, immunologisch inkompetenter B-Lymphozyten in der G0/G1-Phase des Zell-

zyklus. Die Zellen zeigen Expression von CD5 sowie Membranimmunglobulin mit niedriger

Affinität gegenüber Autoantigenen (BERGER D. P. et al., 1998; JURLANDER J., 1998).

Beim Auftreten der Erkrankung spielen zytogenetische Faktoren eine Rolle. Es wurden in B-

CLL-Zellen Deletionen und Translokationen des kurzen Arms von Chromosom 13 beobach-

tet. Dort lokalisieren u.a. bekannte Onkogene, wie BRCA und Rb. Chromosom 6 maligner

Zellen kann im Bereich der Gene für TNF und LT-ß von Deletionen betroffen sein,

Chromosom 11 in der Bcl1-Region, wo das Cyclin1-Gen lokalisiert. All diese Gene spielen

bei der Zellzyklus- und/ oder Apoptoseregulation eine Rolle. Eine weitere genetische Abnor-

malität stellen t(14;19)-Translokationen dar, welche die Isotypwechselregionen von IgA auf

Chromosom 14 betreffen und in einer gesteigerten Expression von Bcl3 resultieren, einem

Transkriptionsfaktor der IkB-Familie. Assoziiert ist diese Translokation häufig mit einer Tri-

somie von Chromosom 12. Auf Chromosom 17 gehen Aberrationen häufig mit dem Verlust

des Tumorsuppressorgens TP53 einher. Diese chromosomale Mutation ist einer der wenigen

Einleitung

23

Faktoren, die eine Prognose über den Krankheitsverlauf zulassen (DÖHNER H. et al., 1998;

JULIUSSON G. und MERUP M., 1998; KIPPS T. J., 1998; REED J. C., 1998; STILGENBAUER S. et al., 1998;

KEATING M. J., 1999).

Außerdem spielen zur Zeit für die klinische Prognose folgende Parameter eine Rolle: Lym-

phozytenverdopplungszeit, Knochenmarksinfiltration, CD20-Expression auf CD5-positiven

B-CLL-Zellen, sowie die ICAM1-, CD23- und IL-2R-Spiegel im Serum. Die Konzentration

an löslichem ß2-Mikroglobulin, einem Bestandteil des HLA-Komplexes, gibt gute

Anhaltspunkte für das Überleben der Patienten. Als Zytokinlevel, die eine Vorhersage

erlauben, gelten die Mengen an TNF, bFGF, IL1, IL1ß, IL-6 und IL-10. Außer für ß2-

Mikroglobulin sind die Korrelationen mit dem Krankheitsverlauf jedoch wenig zufriedenstel-

lend (MAVRIDIS A. K., et al., 1998; ZWIEBEL J. A. UND CHESON B. D.., 1998; AGUILAR-SANTELISES M. et al.,

1999; MOLICA S. et al., 1999;).

Die scheinbare Expansion und Akkumulation der malignen B-Lymphozyten in der CLL ist

auf eine gestörte Apoptoseregulation dieser Zellen zurückzuführen. B-CLL-Zellen exprimie-

ren große Mengen der antiapoptotischen Proteine Bcl2 und Bcl-xL. Dagegen wird nur wenig

Bax und Bcl-xS synthetisiert. Dies verschiebt das Gleichgewicht zwischen pro- und antiapo-

ptotischen Faktoren in Richtung der antiapoptotischen. Da diese Moleküle in Form von

Homo- und Heterodimeren wirken, beeinflußt dies die Apoptoseempfindlichkeit der CLL-

Zellen. CLL-Zellen sind imstande, selbst der Apoptoseinduktion durch Fas-Ligation nach

CD40-Stimulation zu widerstehen (KIPPS T. J., 1997; OSORIO L. M. et al., 1997; KITADA S. et al., 1998;

JURLANDER J., 1998; KIPPS T. J., 1998; MEINHARDT G. et al., 1998; OSORIO L. M und AGUILAR-SANTELISES

M., 1998; REED J. C.; 1998; SÖDERBERG O., 1998; KEATING M. J.; 1999; LAGNEAUX L. et al., 1999; FURMAN R.

R. et al., 2000).

Da CLL-Zellen in Kultur spontan apoptotisch absterben, wird postuliert, daß die für das

Langzeitüberleben notwendigen Signale u.a. auf Interaktionen der B-CLL-Zellen in vivo zu-

rück zu führen sind. Autokrine Zytokine, die B-CLL-Zellen vor Apoptose zu schützen vermö-

gen, sind IL-1, -6, -8, -10 bFGF und IFN-g. Zudem üben IL-4, IL-13 und IFN-a eine antiapo-

ptotische Funktion aus (KIPPS T. J., 1998; MEINHARDT G. et al., 1998; SÖDERBERG O.; 1998).

Direkte Wechselwirkungen zwischen CLL-Zellen und anderen Zelltypen tragen ebenfalls zum

Überleben des malignen Klons bei. Hierbei spielen Zell-Zell-Kontakte über CD11b/ CD18 so-

wie die Ligation von CD6 und die Stimulation über den BCR eine Rolle (KIPPS T. J., 1998;

MEINHARDT G. et al., 1998; SÖDERBERG O.; 1998).

Einen Faktor mit umstrittenen Funktionen stellt TGFß dar: In in Kultur zur Proliferation sti-

mulierten Zellen inhibiert TGFß die DNA-Synthese, wenn auch in schwächerem Maß als bei

gesunden B-Lymphozyten. B-CLL-Zellen zeigen eine deutlich erniedrigte Expression für den

Einleitung

24

TGFß-Rezeptor. So erlangen diese Zellen trotz der gesteigerten Produktion von TGFß einen

Überlebensvorteil. B-CLL-Zellen zeigen darüber hinaus Resistenz gegenüber den Apoptose-

induzierenden Effekten von TGFß (MEINHARDT G. et al., 1998; SÖDERBERG O.; 1998).

1.3. Zielsetzung dieser Arbeit

M. FURTNER wies in seiner Dissertation nach, daß CLL-Patienten erhöhte Serumspiegel an

sCD137 aufweisen und die Konzentration an CD137 mit der Leukozytenzahl dieser Patienten

korreliert (FURTNER M., 2001). Weitere Vorarbeiten von Dr. S. POLEY vom Klinikum der

Ludwig-Maximilians-Universität München Großhadern beinhalten FACS-Analysen, die die

Synthese der membrangebundenen Form von CD137 auf Leukozyten von Patienten mit

verschiedenen Leukämieerkrankungen belegen. Normalerweise exprimieren B-Lymphozyten

jedoch kein CD137-Protein (KIENZLE G. et al., 1997; MICHEL J., unveröffentlichte Daten).

Dies und die Tatsache, daß immobilisiertes CD137 Apoptose in aktivierten T-Lymphozyten

induzieren kann (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al. , 1999), weisen darauf hin, daß die

Expression von CD137 Tumorzellen einen Vorteil bieten kann.

Die hier vorliegende Arbeit untersucht die Freisetzung von löslichem CD137 in den Seren

von B-CLL-Patienten und den Kulturüberständen von Patientenzellen, sowie die Expression

von membrangebundenen CD137 auf den B-CLL-Lymphozyten. Ein weiteres Ziel dieser

Arbeit stellte die Charakterisierung der Funktion von mCD137 auf Tumorzellen und die

Beleuchtung der dahinterstehenden Mechanismen dar.

Material und Methoden

25

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Organismen

2.1.1.1. Bakterien

E.coli-Stämme

DN10B

F-, mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), F80d, lacZDM15, Bethesda Research Laboratories

DlacX174, deoR, recA1, araD139, D(ara, leu) 7697,

galU, galK, l-, rpsL, endA1, nupG

TOP10

F-, mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), F80lacZDM15, Invitrogen, Paisley, UK

DlacX74, deoR, recA1, araD139, D(ara, leu)7697,

galU, galK, rpsL (StrR), endA1, nupG

2.1.1.2. Säugerzellen

Zellinien

CHO ATCC-Nr.: CLL 61, Ovarialepithelzellen des Chinesischen Hamsters

COS-1 ATCC-Nr.: CRL 1650, Passage 9 der CV-1 Zellinie, mit Origin-defekter Mu-

tante des SV-40 transfiziert, Nierenepithelzellen der grünen Meerkatze

Jurkat ATCC-Nr.: CRL 8130; akute T-Zell-Leukämie, T-Lymphozyten

K562 ATCC-Nr.: CCL 243; Chronisch myelotische Leukämie (CML), Lympho-

blasten

Raji ATCC-Nr.: CCL 86; Burkitt-Lymphom, B-Lymphozyten

Primäre humane Zellen

PBMC gesunder männlicher Probanden als Isolate aus Frischblut im Rahmen dieser

Arbeit

PBMC von CLL-Patienten als Kryopräparationen; M. GOLLER, Würzburg


26

Anteil an

Name

Ge-

schlecht Alter

x 103

Leuko-

zyten/

µl Blut

B-

Zellen

CD5+

B-

Zellen

CD23+

B-

Zellen

T-

Zellen

HLA-

DR+

T-

Zellen

NK-

Zellen

ß2-

Mikro-

globulin

[mg/ l]

1 w 73 14,0 90,3 90,3 n.b. 4,8 n.b. n.b. n.b.

2 m 67 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.

3 w 65 50,7 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.

4 m 64 16,0 65,0 61,0 55,0 29,0 11,0 19,0 n.b.

5 m 62 n.b. 88,8 n.b. 75,6 5,0 n.b. n.b. n.b.

6 n.b. n.b. n.b. 79,0 19,2 55,2 11,4 n.b. n.b. n.b.

7 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.


9 w 79 40,0 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.

101

102

m 77 n.b.

122,0

83,5

96,6

79,3

97,3

68,0

78,2

10,5

1,1

n.b.

1,1

n.b.

13,0

n.b.

2,88

11 m 65 110,0 96,6 0 93,5 1,2 1,2 1,2 2,40

12 m 62 52,0 69,0 18,0 17,0 17,0 11,0 8,0 1,80

13 n.b. 57 57,0 94,5 n.b. 88,3 2,7 n.b. n.b. n.b.

14 m 69 71,5 97,0 95,0 92,0 1,0 0,2 7,0 2,60

15 m 57 66,7 93,8 93,8 88,6 3,1 1,6 3,3 0,90

16 m 67 84,0 91,0 91,0 74,0 1,0 0,2 14,0 4,10

17 m 85 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.

18 m 61 16,8 81,4 79,6 69,1 14,9 2,7 7,7 1,99


20 w 61 233,0 97,5 19,2 86,6 11,4 n.b. n.b. n.b.

21 w 60 19,5 83,0 83,0 63,8 13,1 1,8 10,6 1,20

22 m 61 30,0 90,0 89,2 80,1 3,1 3,1 7,6 1,50


24 w 63 39,0 90,0 91,0 90,0 5,0 5,0 n.b. n.b.

25 m 57 54,1 87,2 n.b. 85,9 2,5 n.b. n.b. n.b.

Tab. 2.-1.: Klinische Parameter des Würzburger CLL-Patientenkollektivs, (GOLLER M.: persönliche

Mitteilung); die Lymphzytenpopulationen sind in Prozent an der Lymphozytengesamtzahl an-

gegeben; 101: Proben vom 11.02.99, 102: Proben vom 27. 10. 99, n.b.: nicht bekannt


27

Einordnung oben stehender Daten zu den Würzburger CLL-Aliquots: Die Leukozyten-

zahl Gesunder beträgt 4,8 – 10,0 x103 Leukozyten/µl Blut. 20 bis 30 % der zirkulierenden

Lymphozyten sind B-Zellen. Bei der CLL sind Leukozytenzahl, sowie der Anteil an B-Zellen

stark erhöht. ß2-Mikroglobulin ist ein Marker für den klinischen Verlauf der CLL (ZWIEBEL J.

A. und CHESON B. D., 1998; MAVRIDIS A. K. et al., 1998; MOLIKA S. et al., 1999). Eine Konzentration von

0,8 bis 2,4 mg/l findet man auch im Serum gesunder Individuen (PSCHYREMBEL, 1998). Das hohe

Lebensalter der Patienten (>57 y) und der Anteil von 68 % männlichen Patienten am Gesamt-

kollektiv spiegelt die Epidemiologie der B-CLL wieder (vgl. auch BERGER D. P. et al., 1997).

2.1.2. Nährmedien

für Bakterien

LB-Medium 10 g/l Trypton

5 g/l Hefeextrakt

10 g/l NaCl

für Platten: 15 g/l Agar

autoklavieren

zur Selektion: 100 µg/ml Ampicillin

für Säugerzellen

RPMI 1640 (MOORE G. E. et al., 1967) Sigma, Deisenhofen

DMEM (DULBECCO R. und FREEMAN G., 1959) Biochrom, Berlin

RPMI 1640 und DMEM wurden als vorgemischtes Pulver bezogen und in demineralisiertem

Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit NaHCO3 für DMEM auf 7,3 und für RPMI auf 8,1

eingestellt. Nach Sterilfiltration wurden die Medien mit folgenden Zusätzen versehen:

10% (v/v) FKS

0,1% (v/v) Penicillin/ Streptomycin

und je nach Pulvercharge:

1 mM Natriumpyruvat

2 mM L-Glutamin

sowie 0,0005% (w/v) Phenolrot, wenn es die Fragestellung erforderte.


28

2.1.3. Antibiotika

Penicillin Pansystems, Aidenbach

Streptomycin Pansystems, Aidenbach

Ampicillin Sigma, Deisenhofen

2.1.4. Antikörper und Konjugate

2.1.4.1. Antikörper gegen CD-Antigene

anti-human CD3-FITC (Klon UCHT1, Maus IgG1k) Dako, Glostrup, Dänemark

anti-human CD5-RPE (Klon DK23, Maus IgG1k) Dako, Glostrup, Dänemark

anti-human CD19-FITC (Klon HD37, Maus IgG1k) Dako, Glostrup, Dänemark

anti-human CD20 (Kaninchen) Dako, Glostrup, Dänemark

anti-human CD20-PE (Klon B-Ly1, Maus) Dako, Glostrup, Dänemark

anti-human CD95 (Klon SM1/23 Maus IgG2b) Bender Med Systems,Wien,

Österreich

anti-human CD137 (Klon m127, Maus IgG1) Immunex, Seattle, USA

anti-human CD137 (Klon BBK-2, Maus IgG1) Biosource Int., Camarillo,

CA, USA

anti-human CD137 (polyklonales Serum, Ziege) R&D Systems, Wiesbaden

anti-human CD137-RPE (Klon 4B4-1, Maus IgG1k) Ancell, Bayport, MN, USA

2.1.4.2. Antikörper gegen Immunglobuline

anti-Multilink: anti-Ziege, -Maus, -Kaninchen (Schwein) Dako, Glostrup, Dänemark

anti-Maus IgG-FITC (Ziege) Dianova, Hamburg

anti-Maus IgG-RPE (Ziege) Dianova, Hamburg

2.1.4.3. Antikörper gegen sonstige Antigene

anti TGFß1 (Klon 9016.2 Maus IgG1 anti-human) R&D Systems, Wiesbaden

anti IL-10 (Klon 23738.111 Maus IgG2B anti-human) R&D Systems, Wiesbaden

2.1.4.4. Isotypkontrollantikörper

Maus-IgG Sigma Deisenhofen

Maus-IgG1k Sigma, Deisenhofen

Maus-IgG1-bio Cymbus Biotechnology, Chandlers Ford, UK

Maus-IgG1-FITC Dako, Glostrup, Dänemark


29

Maus-IgG1-FITC Cymbus Biotechnology, Chandlers Ford, UK

Maus-IgG1-RPE Dako, Glostrup, Dänemark

Maus-IgG1-RPE Cymbus Biotechnology, Chandlers Ford, UK

2.1.4.5. sonstige Immunglobuline

rek. CD137-humanIgG-Fc-Fusionsprotein Ancell, Bayport, USA

human IgG, Fc-Fragment Accurate Chemical & Scientific Corp, Westbury,

USA

2.1.5. Chemikalien und Reagenzien

Wenn nicht gesondert aufgeführt, wurden die verwendeten Chemikalien mit dem Reinheits-

grad p. a. von der Firma Merck (Darmstadt) bezogen.

ABTS Roche Diagnostics, Mannheim

ABTS-Puffer Roche Diagnostics, Mannheim

Agar Behrens, Hamburg

Agarose Ultra PureTM Gibco, Eggenstein

AP-Substrat (p-Nitrophenylphosphat,

20 mg-Tabletten) Sigma, Deisenhofen

Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen

BSA (Rinderserumalbumin) Sigma, Deisenhofen

CalceinAM Molecular Probes, Leiden, Niederlande

DAB-Tabletten Dako, Glostrup, Dänemark

DMEM (D-2902) Sigma, Deisenhofen

EDTA (Ethylendiamintetraacetylsäure) Sigma, Deisenhofen

Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen

FKS (F-7524) Sigma, Deisenhofen

Heparin Novo Nordisk, Mainz

Histopaque-1077 Sigma, Deisenhofen

Hoechst 33342 Sigma, Deisenhofen

Humanes rekombinantes IL-2 R&D Systems, Wiesbaden

Kalziumionophor A23187 Sigma, Deisenhofen

L-Glutamin Pansystems, Aidenbach

Magermilchpulver (Trockenmilch) Nestle, Vevey, Schweiz


30

Methyl-3H-Thymidin (1 mCi/ ml wäßrige Lösung) Pharmacia, Freiburg

MikroscintTM 20 Packard Bioscience, Groningen, Nieder-

lande

MoBiGlow MoBiTec, Göttingen

Natrium-Pyruvat Sigma, Deisenhofen

PHA Boehringer Mannheim, Mannheim

PMA Calbiochem, Bad Soden

Phenol Roth, Karlsruhe

Phenolrot Biochrom, Berlin

PI Sigma, Deisenhofen

Pyruvat Pansystems, Aidenbach

RNAzolB AMS, Lugano, Schweiz

RPMI 1640 Biochrom, Berlin

Streptavidin-Alkalische Phosphatase Dako, Glostrup, Dänemark

Trypanblau Biochrom, Berlin

Trypsin Gibco, Eggenstein

Vectashield H-1000 Linaris GmbH, Wertheim-Bettingen

2.1.6. Enzyme

Superscript II Reverse Transkriptase Gibco, Eggenstein

Taq-Polymerase Pharmacia, Freiburg

HindIII Roche Diagnostics, Mannheim

NotI Roche Diagnostics, Mannheim

BamHI Roche Diagnostics, Mannheim

2.1.7. Kits

Annexin-V-FLUOS Staining Kit Roche Diagnostics, Mannheim

Caspase3 Cellular Activity Assay Kit Calbiochem, La Jolla, CA, USA

CD3 pan T-Dynabeads M450 Dynal, Oslo, Norwegen

Nucleic Dot Metric Geno Technology, St. Louis, MO, USA

Nucleobond, DNA-Präparationskit Macherey & Nagel, Düren

pcDNA3.1./V5-His TOPO TA Expression Kit Invitrogen, Paisley, UK

Quantikine human IL-10 R&D-Systems, Wiesbaden

Quantikine human TGFß1 R&D-Systems, Wiesbaden


31

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden

StreptABComplex/HRP Duet Detection Kit Dako, Glostrup, Dänemark

T Cell Negative Isolation Kit Dynal, Oslo, Norwegen

2.1.8. Nukleinsäuren

2.1.8.1. Desoxyoligonukleotide

dNTPs Pharmacia, Freiburg

Hexanukleotid (N6) Pharmacia, Freiburg

2.1.8.2. Primer

Primer für die RT-PCR zur Analyse der CD137-Expression

Primer für humanes mCD137

G-ILA-sen 5´-ATC ATG GGA AAC AGC TGT TAC AAC-3´ (nt 3-21)

G-ILA-AS 5´-TGG TCC ACA GAC CAC GTC CCT CTC-3´ (nt 480-457)

Primer für humanes mCD137 und sCD137:

ILA-241-sen 5’-ACC AGC AAT GCA GAG TGT GAC-3’ (nt 241-262)

ILA-3’-UTR-AS 5’-TAT GTA GGA TGG TGT TCT TGC-3’ (in der 3’ untranslatierten

Region nt 840-861))

Primer für G3PDH

G3PDH-S 5´-TGG TAT CGT GGA AGG ACT CAT GAC-3´

G3PDH-AS 5´-ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AGC-3´

Primer für die Klonierung mittels des pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Expression Kits

Primer für das ILAtrunc-Fragment:

5’ ILA 5’-CAC CAT GGG AAA CAG CTG TTA CAA C-3’ (nt 1-21)

3’ ILAtrunc 5’-TCA TCA GAA ACG GAG CGT GAG GAA GAA-3’ (nt 613-639)

Primer für das ILAw/otm-Fragment:

5’ ILA 5’-CAC CAT GGG AAA CAG CTG TTA CAA C-3’ (nt 1-21)

3’ ILAw/otm 5’-TCA TCA CTG CGG AGA GTG TCC TGG CTC-3’ (nt 534-560)

Die fett gedruckten Basen sind für die Integration des Fragments in den pcDNA3.1/V5-His-

TOPO-TA-Vektor notwendig.


32

2.1.8.3. Plasmide und Konstrukte

pcDNA3 Invitrogen, Paisley, UK

pcDNA3.1./V5-His TOPO Version G Invitrogen, Paisley, UK

pcDNA3::(h)CD137 ( = pcDNA-ILA-sense) H. SCHWARZ, Regensburg

pcDNA3::gfp H. SCHWARZ, Regensburg

pcDNA3.1.::ILAtrunc diese Arbeit

pcDNA3.1.::ILAw/otm diese Arbeit

pRc/RSV (= RSV) Invitrogen, Paisley, UK

pRc/RSV::ILA-sense (= RIS) H. SCHWARZ, Regensburg

pRc/RSV::ILA-antisense (= RIA) H. SCHWARZ, Regensburg

2.1.9. Molekulargewichtsstandards

DNA-Standard II Roche Diagnostics, Mannheim

DNA-Standard VI Roche Diagnostics, Mannheim

DNA-Standard X Roche Diagnostics, Mannheim

2.1.10. Puffer und Lösungen

10 x Agarosegel-Ladepuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau

0,25 % (w/v) Xylencyanol

30 % (v/v) Glyzerin

1 mM EDTA

Ampicillin-Stammlösung (1000x) 50 mg/ ml Ampicillin

in Aqua bidest

AP(Alkalische Phosphatase)-Puffer (VOLLER A. et al., 1976)

1 mM MgCl2

1 mM ZnCl2

100 mM Glyzin

pH 10,4 (mit NaOH einstellen)


33

AP(Alkalische Phosphatase)-Puffer (alternativ zu obigem)

48 ml Diethanolamin

50 ml HCl

24,5 mg MgCl2

ad 500 ml mit Aqua bidest

pH 9,8

DEPC-H2O 0,1 % DEPC (v/v) in Aqua bidest

ün unter Rühren inkubiert und autoklaviert

DNA-Präparationslösung I 50 mM Glukose

25 mM Tris/ HCl, pH 8,0

10 mM EDTA

DNA-Präparationslösung II 0,2 M NaOH

1 % SDS

DNA-Präparationslösung III 60 ml 5 M NaOAc

11,5 ml Eisessig

28,5 ml Aqua bidest

Erythrozyten-Lysepuffer 8,2 g/l NH4Cl

0,84 g/l NaHCO3

3,7 mg/l EDTA

pH 7,4

Ethidiumbromid-Stammlösung Ethidiumbromid (10 mg/ml)

in Aqua bidest

EtBr-Gebrauchslösung 0,004 % (v/v) der Stammlösung

in Aqua bidest


34

Hämalaun 2,0 g Hämatoxylin

in 2 l Aqua bidest lösen

0,4 g Natriumjodat

100 g Aluminiumkaliumsulfat (Kalialaun)

bei RT lösen

100 g Chloralhydrat

2 g Zitronensäure-Monohydrat

Hämatoxylin-Eosin-Lösung 2 l Hämalaun

20 g Eosin

lösen und filtrieren

einige Tropfen 96% Essigsäure dazu

FACS-Puffer 0,5 % FKS

0,1 % NaN3 in PBS

2% Paraformaldehyd-Lösung 1 g Paraformaldehyd

25 ml Aqua bidest

50 µl 10 N NaOH

bei 650C unter Rühren lösen

25 ml 0,2 M Phosphatpuffer

10x PBS (phosphate-buffered saline)

80,0 g/l NaCl (150 mM)

2,0 g/l KCl (2,5 mM)

14,4 g/l Na2HPO4 (8 mM)

2,4 g/l KH2PO4 (2 mM)

ad 1 l Aqua bidest

pH 7,4 mit HCl

0,2 M Phosphatpuffer 6,35 g NaH2PO4 * H2O

55,25 g Na2HPO4 * 2 H2O

ad 1 l Aqua bidest


35

5 x TAE-Puffer 200 mM Tris/Acetat, pH 8,0

5 mM EDTA

pH 8,3

10 x TBE-Puffer 890 mM Tris/Acetat pH 8,0

890 mM H2BO3

2 mM EDTA

pH 8,0

X-Gal-Stammlösung 40 mg/ml X-Gal in DMS

zur Selektion: 40 µl/Platte

Lagerung bei –20°C im Dunkeln

2.1.11. Sonstiges Material

Deckgläser Engelbrecht, Edermünde

Einmalartikel für die Zellkultur Greiner, Frickenhausen

Einmal-Sterilfilter Millipore, Eschborn

ELISA-Platten (Falcon 3912) Becton Dickinson, Oxnard, Kalifornien

FACS-Röhrchen, Falcon-2052 Labor Schubert, Schwandorf

Filterplatten UniFilterTM-96 (6F/CTM) Packard, Meriden, USA

Gewebekulturplatten Costar, Corning, New York

Halbmikroküvetten Sarstedt, Nümbrecht

Silicagelsäulen Nucleobond AX 500 Macherey & Nagel, Düren

Slide-A-Lyzer 10 kD Pierce, Rockford, IL, USA

Superfrost+-Objektträger Labor Schubert & Weiss, Iphofen in den

Weinbergen

Thomakammern Labor Schubert, Schwandorf

TopSealTM-A (Sealing Film) Packard, Meriden, USA

2.1.12. Geräte

Spannungsgeräte

200/2,0 Constant Voltage Power Supply Bio-Rad, München

Gene Power Supply GPS 200/400 Pharmacia, Freiburg

LKB 2303 Multidrive XL LKB, Heidelberg


36

Zentrifugen

Zentrifuge 5417 C Eppendorf, Hamburg

J2-21 M/E Ultrazentrifuge Beckmann, Palo Alto, USA

Biofuge 13 Heraeus, Osterode

Sepatech Heraeus, Osterode

Waagen

R160P Sartorius, Göttingen

L2200S Sartorius, Göttingen

Mikroskope

Labovert FS Leitz, Wetzlar

HM Lux 3 Leitz, Wetzlar

Axiovert 10 Zeiss, Jena

Leica DMLS Leica, Bensheim

Axiovert S 100 Zeiss, Jena

Objektive

Plan-Neofluar 10x, 20x, 40x Zeiss, Jena

Plan-Apochromat 63x/1,40 Zeiss, Jena

C-Plan 4x, 10x, 20x, 40x Leica, Bensheim

Periplan GF 12,5x, 10x Leitz, Wetzlar

sonstige Geräte

Autoklav 2540 EK Tuttnauer/ Systec, Wettenberg

DNA Thermal Cycler Perkin Elmer, Norwalk, USA

Durchflußzytometer FACSCalibur Becton Dickinson, New Jersey, USA

Emax Microplate Reader (Molecular Devices) MWG-Biotech, Ebersberg

Fluoroskan II Titertek, Meckenheim

Geldokumentationssystem 2000i MWG-Biotech, Ebersberg

Gelelektrophoresekammer DNA SUB CELLMM Bio-Rad, München

Harvester Unifilter-96 Canberra Packard, Frankfurt a. M.

Heizblock TR-L288 Liebisch, Bielefeld

Lamin Air HBB 2472S, 2448 Heraeus, Hanau


37

Magnetrührer-Heizblock MR 2002 Heidolph, Kehlheim

Magnetständer Boehringer-Mannheim, Mannheim

Mikrowelle MR 6415 Hitachi, Feldkirchen

pH-Meter pH 522 WTW, Weilheim

Photometer Ultraspec II LKB, Heidelberg

Pipettus Akku Hirschmann, Eberstadt

QSH Gelelektrophoresis Unit Int. Biotechnologies, New Haven, Con-

neticut, USA

Rührer Universität Regensburg, TZ

Schüttler IKA-Vibrax VXR IKA-Labortechnik

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

TopCount Microplate Scintillation Counter Canberra Packard, Frankfurt a. M.

UV-Transilluminator Bachofer, Regensburg

Vortex REAX 2000 Heidolph, Kehlheim

Wasserbad 5P Haake, Karlsruhe

Zellinkubator 6000 Haereus, Hanau

2.2. Methoden

2.2.1. Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1. Konzentrationsbestimmungen

2.2.1.1.1. Absorptionsmessungen

Die Absorptionsmessungen wurden am LKB-Spektralphotometer Modell Ultraspec II durch-

geführt. Für Messungen im Bereich des sichtbaren Lichts wurden Kunststoffküvetten benutzt.

Die optische Dichte von Bakterienkulturen wurde bei 578 nm gemessen. Die DNA-Konzen-

tration wäßriger Lösungen wurde durch Absorptionsmessung bei 260 nm und 280 nm in

Quarzküvetten bestimmt. Dabei gilt, daß 1 A260 einer DNA-Konzentration von 50 µg ds-

DNA/ ml, 40 µg RNA/ ml oder 33 µg Oligonukleotid/ ml entspricht (SAMBROOK J. et al.,

1989).

Der Quotient A260/A280 gibt den Reinheitsgrad an und sollte zwischen 1,8 und 2,0 für DNA

liegen, für RNA zwischen 1,6 und 1,8.


38

2.2.1.1.2. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels des Nucleic Dot

Metric Assays

Die Konzentrationsbestimmung mittels des Nucleic Dot Metric-Kits (Geno Technology, St.

Louis, MO, USA) beruht auf einer Farbreaktion der Nukleinsäure mit einem Farbstoff und

wurde nach dem dem Kit beiliegenden Protokoll ausgeführt. In Kürze: Auf ein Filterpapier

wird 1 µl der geeignet verdünnten Nukleinsäure über Kapillarkräfte aufgebracht. Anschlie-

ßend wird der Filter mit Nucleic Dye angefärbt und gewaschen. Der Durchmesser des Farb-

flecks wird bestimmt und von einer beigepackten Schablone die Konzentration der aufgetra-

genen Verdünnung abgelesen. Diese Methode ist für die Bestimmung der Konzentration mini-

maler Volumina von DNA-, RNA- und Oligonukleotidlösungen geeignet.

2.2.1.1.3. Bestimmung der Konzentration von Proteinlösungen nach Bradford

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration in Lösung wurde der „Protein-Assay” von Bio-

Rad verwendet, der auf der Methode von Bradford basiert (BRADFORD M. M., 1976).

Dazu wurde 1 ml Farbstoffreagenz (20 % (v/v) Protein-Assay-Farbstoffkonzentrat in Aqua

bidest.) mit 20 µl Proteinlösung bzw. 20 µl Aqua bidest. als Referenz versetzt und gemischt.

Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei RT wurde die Absorption der Lösung bei 595 nm

gegen die Referenz gemessen. Die Proteinkonzentration wurde anhand einer mit BSA- bzw.

IgG-Lösung erstellten Eichgerade ermittelt.

2.2.1.2. Arbeiten mit RNA

2.2.1.1.1. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen

Gemäß des Protokolls der Firma AMS Biotechnology wurde die Gesamt-RNA aus 106 Zellen

isoliert, indem die in PBS gewaschenen, pelletierten Zellen in 200 µl RNAzolB aufgeschlos-

sen wurden. Das Homogenat wurde mit 1/10 Volumen Chloroform überschichtet, 15 sec hef-

tig geschüttelt und für 5 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (12.000g) für 15 min

bei 4°C wurde die obere wäßrige Phase abgenommen, die die RNA enthält, und in ein

frisches Reaktionsgefäß überführt. In der unteren organischen Phase sowie der Interphase rei-

chern sich die Zellproteine und -lipide an. Die wäßrige Phase wurde mit demselben Volumen

an Isopropanol versetzt und 15 min auf Eis gefällt. Hieran schloß sich ein 15minütiger Zentri-

fugationsschritt bei 12.000g und 4°C an. Das so erhaltene RNA-Pellet wurde mit 75 % EtOH

gewaschen und in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Danach wurde es in 25 µl DEPC-H2O

aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.


39

2.2.1.1.2. Reverse Transkription

Die reverse Transkription dient dem Umschreiben von zellulärer RNA in cDNA, die später in

spezifischen PCR-Reaktionen zur Transkriptionsanalyse eingesetzt wurde. Als Primer für die

Transkriptionsreaktion dienten Hexanukleotide (N6) mit zufälliger Sequenz. Ein Ansatz für

RNA aus 106 Zellen wurde nach folgendem Protokoll revers transkribiert:

23 µl RNA-Lösung

8 µl 5 x RT-Puffer

4 µl 100 mM DTT

2 µl 10 mM dNTPs

1 µl Superscript II

1 µl RNAse-Inhibitor

1 µl Hexanukleotid (2 mg/ml)

Die Ansätze wurden im Heizblock für 120 min bei 42°C inkubiert. Anschließend wurde die

reverse Transkriptase für 15 min bei 72°C inaktiviert. In einer späteren PCR wurden in der

Regel 2 µl der so gewonnenen cDNA eingesetzt.

2.2.1.3. Arbeiten mit DNA

2.2.1.3.1. Präparation von Plasmid-DNA

2.2.1.3.1.1. Präparation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab

Plasmide wurden aus Flüssigkulturen isoliert, die zur Selektion Antibiotikum enthielten. Für

kleine Mengen DNA wurde mit 2 ml-ÜNKs gearbeitet, die jeweils aus Einzelkolonien ange-

impft wurden. Die DNA wurde über alkalische Lyse mit anschließender Phenol/ Chloroform-

Extraktion gewonnen (BIRNBOIM H. C. und DOLY J., 1979).

Hierzu wurden die Bakterien aus 1,5 ml Kultur pelletiert und nacheinander mit 100 µl Lö-

sung I, 200 µl Lösung II und 150 µl Lösung III (DNA-Präparationslösungen) versetzt. Nach

5-minütigem Aufschluß der Zellen bei 4°C wurden die Zellproteine und –lipide durch Zen-

trifugation abgetrennt und die DNA aus dem Überstand mit eiskaltem, absolutem EtOH ge-

fällt. Das DNA-Pellet wurde mit 70 % EtOH gewaschen. Das luftgetrocknete Pellet wurde in

20 µl H2O aufgenommen und bei -20°C gelagert.


40

2.2.1.3.1.3. Isolierung von Plasmid-DNA im großen Maßstab (Maxiprep)

ÜNKs für die Isolierung von Plasmid-DNA im großen Maßstab wurden in 300 ml LB mit

geeignetem Antibiotikum aus einer 3 ml-ÜTK angesetzt. Die ÜTK wurde aus einer Einzelko-

lonie von einer Platte mit E. coli-Klonen, die das gewünschte Plasmid trugen, angeimpft.

Die Zellen aus der 300 ml ÜNK wurden durch Zentrifugation (8.000 rpm, 4°C, 10 min) ge-

erntet und in 24 ml S1-Puffer resuspendiert. Zur Lyse wurden 24 ml S2-Lösung für 5 min bei

RT zugegeben. 4 ml S3-Puffer zur Fällung von Zelltrümmern und Proteinen vervollständig-

ten den Ansatz, der 15 min auf Eis inkubiert wurde. Anschließend wurde die Lösung durch

einen Faltenfilter auf eine mit 5 ml N2-Puffer äquilibrierte AX50-Säule (Nucleobond) aufge-

bracht. Das Filtrat wurde mit 3 x 12 ml N3-Puffer gewaschen und die DNA mit 2 x 6 ml auf

50°C vorgewärmtem N5-Puffer eluiert. Die Fällung der DNA erfolgte durch Zugabe von 0,7

Volumina Isopropanol und anschließender Zentrifugation (10.000 rpm, 4°C, 45 min). Nach-

dem die DNA mit 70 % EtOH gewaschen und für 5 min luftgetrocknet worden war,

wurde sie in 300 µl H2O bidest aufgenommen. Anschließend wurden Konzentration und

Reinheitsgrad spektralphotometrisch bestimmt.

S1-Puffer 10 mM EDTA

50 mM Tris-HCl, pH 8,0

100 µg/ml RNaseA

pH 8,0

S2-Puffer 200 mM NaOH

1 % SDS

S3-Puffer 2,55 M Kaliumacetat

pH 4,8

N1-Puffer 100 mM Tris/H3PO4

400 mM KCl

15 % Ethanol p.a.

pH 6,3


41


900 mM KCl

15 % Ethanol p.a.

pH 6,3


1150 mM KCl

15 % Ethanol p.a.

pH 6,3


1000 mM KCl

15 % Ethanol p.a.

pH 6,3

2.2.1.3.2. Reinigung und Fällung von DNA

2.2.1.3.2.1. Phenolextraktion

Dazu wurde die zu deproteinierende DNA-Lösung zunächst mit TE-Puffer auf ein Mindestvo-

lumen von 200 µl gebracht. Anschließend erfolgte die Zugabe von einem Volumen Phenol-

Tris und die Lösung wurde 1 min gründlich von Hand gemischt, so daß eine trübe Suspension

entstand. Zur Phasentrennung schloß sich eine 10-minütige Zentrifugation bei 8.000 rpm und

4°C an. Die wäßrige, DNA-haltige Oberphase wurde nun in ein frisches Eppendorfgefäß

überführt und mit einem Volumen Phenol/Chloroform extrahiert. Nach erneuter Zentrifuga-

tion zur Phasentrennung für 10 min bei 8.000 rpm und 4°C erfolgte wiederum ein Transfer

des Überstandes in ein neues Eppendorfgefäß. Zur Entfernung verbliebener Phenolmoleküle

aus der DNA-Lösung wurde noch 2 x mit je einem Volumen Chloroform/IAA extrahiert, wo-

bei zur Phasentrennung jeweils 5 min bei 12.000 rpm und 4°C zentrifugiert wurde. Anschlie-

ßend wurde die DNA gefällt.

2.2.1.3.2.2. Ethanolfällung

Dazu wurden der DNA-Lösung 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 4.8) sowie 2,5 Volu-

mina 96 % Ethanol zugegeben. Nach gründlicher Durchmischung von Hand erfolgte die Fäl-

lung entweder über Nacht bei -20°C, mindestens 30 min bei -80°C oder 1 min in flüssigem

Stickstoff. Durch 30-minütige Zentrifugation bei 12.000 rpm und 4°C wurde das Na+-DNA-


42

Präzipitat pelletiert und zur Reinigung von überschüssigen Salzen zweimal mit 70 % EtOH

gewaschen. Zur Trocknung überführte man das Pellet für 30 min in die Vakuumzentrifuge.

Schließlich wurde die DNA in einem angemessenen Volumen TE-Puffer resuspendiert, wobei

berücksichtigt werden muß, daß bei einer Ethanolfällung mit 5 %, bei Fällung mit vorange-

gangener Phenolextraktion mit ca. 10 % Verlust an DNA zu rechnen ist. Die DNA-Lösungen

wurden kurzfristig bei 4°C, langfristig bei -20°C aufbewahrt.

2.2.1.3.2.1. Reinigung mit dem QIAquick PCR-Purification-Kit

Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Qiagen). Zur Kontrolle wurden

1-2 µl des Eluats durch Agarosegelelektrophorese auf Integrität überprüft.

2.2.1.3.3. Enzymatische Hydrolyse von DNA

Für die enzymatische Spaltung von DNA wurden Restriktionsendonukleasen vom Typ II

(ARBER W., 1978) verwendet, welche die DNA innerhalb spezifischer Erkennungssequenzen

hydrolysieren. Alle Reaktionen wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen

durchgeführt. Bei Restriktionen mit verschiedenen Enzymen, die unterschiedliche Reaktions-

puffer benötigen, wurden die Hydrolysen nacheinander – mit dazwischen liegender Reinigung

mit Hilfe des QIAquick PCR-Purification Kits der Firma Qiagen – durchgeführt.

2.2.1.3.3. Elektrophorese von DNA in Agarosegelen

Analytische Auftrennungen von DNA-Molekülen wurden in horizontalen Kammern mit Gel-

volumina zwischen 10 ml und 200 ml durchgeführt. Je nach Größe der Fragmente wurde

Aga-rose in Konzentrationen von 0,6 % bis 2 % (w/ v) in TAE- bzw. TBE-Puffer suspendiert,

im Mikrowellenherd verflüssigt und in die vorbereiteten Flachbettapparaturen gegossen. Nach

dem Festwerden wurde das Agarosegel mit 1 x TAE- bzw. TBE-Puffer überschichtet. Die

DNA-Proben wurden mit 1/10 Volumen 10 x Ladepuffer für Agarosegele versetzt, in die Gel-

taschen pipettiert und mit einer Spannung von 0,5 - 1 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.

Als Größenstandard dienten die Standards II, VI und X von Roche Diagnostics. Nach Ab-

schluß der Elektrophorese wurden die Agarosegele für ca. 10 min in 10 µg/ml EtBr-Lösung

gefärbt und anschließend für weitere 10 min zum Auswaschen von überschüssigem EtBr ge-

wässert. Auf einer UV-Durchlichtbank (Bachofer, 254 nm) wurden die angefärbten DNA-

Fragmente sichtbar gemacht und mit dem Geldokumentationssystem 2000i (MWG-Biotech)

photografiert.


43

2.2.1.3.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel

Extraction Kit

Die zu untersuchende DNA wurde nach Hydrolyse in einem präparativen Agarosegel elektro-

phoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde mit EtBr angefärbt. Das gesuchte DNA-Fragment wur-

de durch UV-Beleuchtung im Gel lokalisiert, mit einem Skalpell ausgeschnitten und gewo-

gen. Die Extraktion der DNA erfolgte mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit der Firma

Qiagen.

Pro 100 mg Gelbande wurden 300 µl QX1-Puffer zugegeben. Durch 10-minütige Inkubation

bei 50°C unter gelegentlichem Vortexen wurde die Agarose-Matrix solubilisiert. Das Ge-

misch (max. 800 µl) wurde auf eine QIAquick-Zentrifugensäule aufgetragen, welche vorher in

ein 2 ml Elutionsgefäß überführt wurde. Durch einminütige Zentrifugation erfolgte der Ein-

tritt und die Bindung der DNA an das Säulenmaterial. Nachfolgende Waschschritte und Elu-

tion der DNA entsprechen dem Protokoll des QIAquick Nucleotide Removal Kits.

Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Qiagen).

2.2.1.3.5. Ligation von DNA-Fragmenten mit dem pcDNA3.1/V5-His TA-TOPO-Kit

der Firma Invitrogen

Hierbei wurden 4 µl des frischen PCR-Ansatzes mit den amplifizierten, zu klonierenden

DNA-Fragmenten, 1 µl der dem Kit beigepackten Salzlösung (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2)

und 1 µl des pcDNA3.1/V5-His TOPO-Vektors für 5 min bei RT inkubiert. Aus dieser Mix-

tur wurden je 200 µl zu transformierender Zellen 2 µl verwendet.

Am verwendeten Vektor ist auf beiden Seiten der Klonierungsstelle kovalent ein Molekül

Topoisomerase gebunden, das den Einbau des PCR-Fragmentes über überstehende Adenin-

moleküle katalysiert. Die Primer der PCR-Reaktion dürfen keine 5’-Phosphatgruppen tragen,

da das Phosphat, an das die Topoisomerase an den Vektor gebunden ist für den Einbau des

PCR-Fragments verantwortlich ist. Beim Einbau des PCR-Fragments an diese Phosphatgrup-

pe wird die Topoisomerase vom Vektor freigesetzt.

2.2.1.3.6. DNA-Amplifizierung mittels PCR

Zur spezifischen Amplifikation von DNA-Fragmenten wurde die Polymerasenkettenreaktion

angewendet (SAIKI R. K. et al., 1985; MULLIS K. B. und FALOONA F. A., 1987).


44

2.2.1.3.6.1. PCR-Reaktion mit der Vent DNA-Polymerase

In die PCR für Klonierungen wurde wegen der höheren Genauigkeit und ihrer proofreading-

Fähigkeit die Vent-DNA-Polymerase statt der Taq-DNA-Polymerase eingesetzt. Da aber für

die Klonierung mit dem pcDNA3.1/V5-His TA TOPO-Kit überhängende Adeninbasen, wie sie

von der Taq-Polymerase unspezifisch angehängt werden, notwendig waren, wurde an die

PCR mit der Vent-DNA-Polymerase eine PCR-Zyklus angeschlossen, vor dem 1µl Taq-DNA-

Polymerase in den PCR-Ansatz gegeben wurde.

Für Klonierungen wurde folgender PCR-Ansatz gewählt:

5 µl 10 x PCR-Puffer

0,5 µl 50 mM dNTPs (je 12,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

100 ng sense-Primer (entspricht 2 µM)

100 ng antisense- Primer (entspricht 2 µM)

10 – 100 ng Matrizen-DNA

1 µl Vent-Polymerase

ad 50 µl steriles Aqua bidest

Der Ansatz wurde auf Eis pipettiert und mit sterilem Mineralöl überschichtet.

Die PCR wurde in einem Thermocycler der Firma Perkin Elmer durchgeführt: Zum

Aufschmelzen wurde die DNA für 5 min bei 94°C inkubiert. Daran schlossen sich 20 Zyklen

an, auf die, nach einer Aufschmelzphase von 1 min bei 94°C, das annealing des Primers bei

53 - 63°C (je nach Primer) für 1 min und ein Extensionsschritt bei 72°C für 1 min pro kb

Fragmentlänge folgten. Zur Vervollständigung angefangener Amplifikate endete die PCR mit

10 min bei 72°C. Danach wurde das PCR-Gemisch auf 4°C gehalten.

10 x Reaktions-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8.3

500 mM KCl

15 mM MgCl2

0,01 % (w/v) Gelatine


45

2.2.1.3.6.2. Semiquantitative PCR

Die semiquantitative PCR wurde in der Regel im Rahmen von Transkriptionsanalysen mittels

RT-PCR angewendet. Sie erfolgte üblicherweise in einem 50 µl-Ansatz mit

5 µl 10 x Puffer (vom Hersteller der Polymerase mitgeliefert)

0,5 µl 10 mM dNTPs

0,5 µl sense-Primer (20 µM oder 200 µg/ ml)

0,5 µl antisense-Primer (20 µM oder 200µg/ ml)

0,5 µl Taq-Polymerase

2 µl cDNA

ad 50 µl Aqua bidest

Nach einem Denaturierungsschritt von 3,5 min bei 94°C wurde zur semiquantitativen Ampli-

fikation üblicherweise ein Programm mit 35 Zyklen aus folgenden Komponenten gefahren

Denaturierung: 30 sec bis 1 min bei 94°C

annealing: 1 min bei 55 bis 63°C

Extension: 1 min/ kb Fragmentlänge bei 72°C

Am Ende wurde ein weiterer Extensionsschritt für 10 min bei 72°C angefügt und die Proben

dann auf 4°C abgekühlt.

Zur Quantifizierung wurde jeweils in einem parallelen Ansatz eine PCR für das Haushaltsgen

G3PDH durchgeführt, von dem man annimmt, daß es in jeder Zelle unabhängig von einer

Stimulation der Zellen gleich stark exprimiert ist. Da dieses Gen sehr stark exprimiert wird

und in der linearen Phase der PCR quantitative Unterschiede der eingesetzten cDNA besser

sichtbar sind, wurde diese PCR-Reaktion bereits nach 20 Zyklen abgestoppt.

2.2.2. Zellbiologische Methoden

2.2.2.1. Arbeiten mit E. coli

2.2.2.1.1. Kultur von E. coli-Stämmen

E. coli-Zellen wurden bei 37°C in LB-Flüssigmedium (5 - 500 ml) oder auf LB-Agarplatten

angezogen. Vorkulturen wurden mit Einzelkolonien von LB-Platten angeimpft. Das

Wachstum der Bakterien wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm spektro-

metrisch verfolgt. Eine OD600 von 1,0 entspricht etwa 8x108 Bakterien pro ml Kultur (SAM-

BROOK J. et al., 1989).


46

2.2.2.1.2. Aufnehmen von Wachstumskurven

Für jede Wachstumskurve wurden 100 ml des entsprechenden Mediums (gegebenenfalls mit

Antibiotikum) mit einer ÜNK des entsprechenden Bakterienstammes auf eine OD578 von 0,05

inokuliert und bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Änderungen der OD578 der Kulturen

wurden in 1/2- bis 1-stündigen Abständen gemessen.

2.2.2.1.3. Anlegen von Glyzerin-Dauerkulturen

Von dem zu konservierenden Bakterienstamm wurde eine 4-ml-ÜNK angelegt, von der 1 ml

mit 200 ml sterilem Glycerin versetzt und 2 min gründlich gevortext wurde. Diese Suspension

wurde 2 h bei RT belassen und in regelmäßigen Abständen durchmischt, abschließend 1 h bei

4°C inkubiert und dann bei -80°C gelagert.

2.2.2.1.4. Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen

Nach der Methode von CHUNG C. T. et al. (1989) konnten kompetente Zellen in einem Ein-

schrittverfahren hergestellt und ohne weitere Behandlung bei -80°C eingefroren werden.

2.2.2.1.5. Chemische Transformation von E. coli-Zellen

Aliquots von 200 µl kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe der zu

transfizierenden DNA (ca. 0,1 µg) wurden die Zellen 30 min lang auf Eis inkubiert, 45 sec bei

42°C hitzegeschockt, mit 1 ml SOC-Medium ohne Antibiotikum versetzt und 1 h bei 37°C

geschüttelt. Der Transformationsansatz wurde dann auf entsprechenden Selektionsplatten aus-

plattiert und ün bei 37°C inkubiert.

Am nächsten Tag ausgewachsene Einzelkolonien wurden zur DNA-Präparation angeimpft.

2.2.2.1.5. Transformation von E. coli mittels des pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-Kits

von Invitrogen

Die Transformation der TOP10-E. coli-Zellen im pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-Kit ist im

wesentlichen eine Variante der oben beschriebenen chemischen Transfektion und unterschei-

det sich davon nur geringfügig hinsichtlich der Inkubationszeiten.

200 µl-Aliquots kompetenten TOP10-Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Zu diesen Zellen wur-

den 2 µl der „TOPO cloning reaction“ pipettiert, die dem Reaktionsansatz der Ligation ent-

spricht. Die Zellen wurden für 5 bis 30 min auf Eis inkubiert, anschließend 30 s bei 42°C hit-

zebehandelt und unmittelbar auf Eis transferiert. Nach der Zugabe von 250 µl SOC-Medium

wurden die Zellen 1 h bei 37°C sanft geschüttelt. Zwischen 25 und 200 µl des Transforma-


47

tionsansatzes wurden auf entsprechenden Selektionsplatten ausplattiert und ün bei 37°C inku-

biert.

Zur Kontrolle der Effizienz der Transfektion wurde die oben beschriebene Transfektion mit

dem pcDNA3.1/V5-His-TOPO/lacZ-Vektor durchgeführt, in den in die MCS das lacZ-Gen

hinter einem T7-Promotor kloniert wurde, das für eine bakterielle ß-Galaktosidase codiert.

Die Expression dieses Gens läßt sich leicht nachweisen, da Kolonien von Bakterien, die auf

X-Gal beschichteten Platten wachsen, wegen der Spaltung von X-Gal durch die ß-Galaktosi-

dase eine blaue Färbung annehmen.

Aus dem Verhältnis der blauen Kolonien zur Gesamtzahl der Kolonien kann man die Trans-

fektionseffizienz ermitteln.

Am nächsten Tag ausgewachsene Einzelkolonien wurden zur DNA-Präparation angeimpft.

SOC-Medium 2,0 % Trypton

0,5 % Hefeextrakt

10,0 mM NaCl

2,5 mM KCl

10,0 mM MgCl2

10,0 mM MgSO4

20,0 mM Glukose

2.2.2.2. Arbeiten mit Säugerzellen

2.2.2.2.1. Kultur löslicher Zellen

Zellinien und primäre Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 in Wasserdampf-gesättigter Luft

im Brutschrank kultiviert. Lösliche Zellen wurden in der Regel in RPMI gehalten, das mit

10 % FKS sowie Natriumpyruvat, L-Glutamin und Penicillin/Streptamycinsulfat supplemen-

tiert wurde.

Lösliche Zellen wurden in regelmäßigen Abständen von 2 - 3 Tagen bei 300 g zentrifugiert,

der Überstand größtenteils verworfen und die Zellen in frischem Medium in verdünnter Form

wieder ausgesät. Für primäre Lymphozyten, CLL-Zellen und B-Zellinien wurden 5 bis 10 %

des konditionierten Überstand beibehalten.

2.2.2.2.2. Kultur adhärenter Zellen

Adhärente Zellen wurden beim Erreichen der Konfluenz mit PBS gewaschen und anschlie-

ßend mit Trypsin (0,1 µg/ml) oder EDTA (10 mM) in PBS im Brutschrank inkubiert, bis sich


48

die Zellen vom Boden des Gefäßes ablösten. Dann wurde FKS-haltiges Medium zugesetzt

und die Zellen pelletiert. Die Zellen wurden in frisches Medium überführt und verdünnt

wieder ausgesät. Für die Kultur adhärenter Zellen wurde mit FKS supplementiertes DMEM-

Medium verwendet.

2.2.2.2.3. Ermittlung von Zellzahl und -Konzentration (Trypanblaufärbung)

Die Zellen wurden im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau versetzt und in einer Neubauerkammer

ausgezählt, gegebenenfalls nach Verdünnen der Zellsuspension in Medium oder PBS. Die

Zellkonzentration berechnet man nach der Formel:

Zellzahl / mm2 x Verdünnungsfaktor x 104 = Zellen/ ml

Da nur tote Zellen durch Trypanblau anfärbbar sind, können sie ausgeschlossen werden.

2.2.2.2.4. Herstellung von Gefrierkulturen

106 Zellen wurden in 1,8 ml des auch für die Kultur der Zellen verwendeten Mediums sus-

pendiert, mit 200 µl DMSO versetzt und über Nacht auf -70°C gelagert. Anschließend wurden

die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt. Zum Auftauen wurden die Röhrchen im

Wasserbad bei 37°C geschwenkt, von außen mit Ethanol (70 % v/v) sterilisiert und der Inhalt

in ein Falcon-Röhrchen mit dem entsprechenden serumhaltigen Kulturmedium überführt.

Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen.

2.2.2.2.5. Isolierung von PBMC über Dichtegradientenzentrifugation

Einem gesunden männlichen Probanden wurden 50 ml Frischblut aus der Armvene entnom-

men. Diese wurden bereits in der Spritze mit 500 I.U. Heparin versetzt, um die Gerinnung zu

verhindern. Das heparinisierte Blut wurde auf zwei Falcon-Röhrchen aufgeteilt und zur Ab-

trennung des Serums bei 2.500 rpm 20 min bei RT zentrifugiert. Das Serum wurde abgenom-

men und das Pellet, in der Hauptsachen aus Erythrozyten und Leukozyten bestehend, wurde

mit serumfreiem RPMI, das 5 I.U. Heparin enthielt, auf 120 ml Gesamtvolumen gebracht. In

Falconröhrchen wurden 15 ml Histopaque vorgelegt und mit 30 ml des verdünnten Blutes

überschichtet. Die Gradienten wurden 35 min mit 1.800 rpm bei RT ungebremst zentrifugiert.

Während der Zentrifugation sammeln sich die PBMC an der Grenzschicht zwischen Histopa-

que und dem Blut/RPMI- Gemisch (BOYUM A., 1968). Diese Interphase wurde abgenommen

und in ein frisches Röhrchen überführt, wo sie zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen

wurde. Gegebenenfalls wurden die Lymphozyten mit 10 ml Erythrozyten-Lysepuffer behan-

delt, 5 min inkubiert und anschließend zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen. Danach


49

wurden die Zellen in supplementiertem RPMI aufgenommen, gezählt und in einer Dichte von

2,5 bis 3 x 106 Zellen/ml ausgelegt.

Aus 50 ml Frischblut können auf diese Weise je nach Spender zwischen 5 und 12 x 107 Zellen

gewonnen werden.

2.2.2.2.6. Isolierung reiner B- bzw. T-Lymphozyten mittels magnetischer Separation

mit dem Dynabead-System

B- bzw. T- Lymphozyten wurden aus CLL-Zellaliquots aufgereinigt. Dazu wurde die Metho-

de magnetischer Separation nach dem Dynabead-System angewandt, die darauf beruht, daß

die Zellen mit magnetischen beads inkubiert werden, an die Antikörper gegen die Oberflä-

chenantigene der betreffenden Zellsorte gekoppelt sind. Durch Bindung der Antikörper-beads

an die Zellantigene werden sich die betreffenden Zellen, wenn man sie in ein einseitiges Mag-

netfeld bringt, entland des Magneten anordnen, so daß man sie abtrennen kann. Um keine der

gewünschten Zellen über die Antigen-Antikörper-Bindung zu aktivieren, wurde im Rahmen

dieser Arbeit ausschließlich negativ separiert, d.h. „unerwünschte“ Zellen wurden mit den

magnetischen beads abgetrennt.

Es wurden zum einen magnetische anti-CD3-beads der Firma Dynal zur Abtrennung der T-

Zellen von den CLL-Zellen verwendet; zum anderen der T-Cell Negative Isolation Kit dersel-

ben Firma, um die T-Lymphozyten aus CLL-PBMC-Aliquots aufzureinigen. Die Aufreini-

gung erfolgte nach dem Protokoll der Firma. In Kürze:

Die beads wurden in PBS gewaschen, um Reste des zur Konservierung zugesetzten Azids zu

entfernen und in PBS/0,1 % BSA aufgenommen. Die Zellen wurden in geeigneter Konzentra-

tion geerntet, in PBS gewaschen und für die T-Zell-Isolierung in einer Dichte von 1 x 107 Zel-

len/ml aufgenommen. Pro 100 µl wurden 20 µl hitzeinaktiviertes FKS und 20 µl Antikörper-

Mix zugefügt. Unter sanftem Schütteln wurden die Zellen 10 Minuten bei 4°C mit dem Anti-

körper-Mix inkubiert und danach gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen erneut in

einer Dichte von 1 x 107 Zellen/ml in PBS/0,1 % BSA aufgenommen, die Zellen bei der B-

Zell-Isolierung wurden in dieser Dichte eingesetzt. Für 1 x 107 Zellen wurden 100 µl beads

verwendet. Das Zell-bead-Gemisch wurde 15 min bei 4°C unter sanftem Schütteln inkubiert,

dann in den Magnetständer eingespannt und der Überstand entnommen, der die gewünschte

Zellpopulation enthielt. Die Zellen wurden gewaschen und in Kultur genommen. Die Reinheit

der gewünschten Population lag bei > 98 %, wie die Überprüfung im FACS ergab.


50

2.2.2.2.7. In vitro-Stimulation von Zellen

Die Zellen wurden in Gewebekulturgefäßen ausgesät und, wie in Tabelle Tab. 2.-1. ange-

geben, mit verschiedenen Stimulanzien versetzt. Falls im Ergebnisteil nicht anders beschrie-

ben, wurden die Stimulanzien in löslicher Form direkt ins Medium gegeben. Zur Stimulation

mit immobilisiertem CD137-Fc- oder Fc-Kontrollprotein wurden die Gewebekulturgefäße mit

5 µg/ml CD137-Fc bzw. der äquimolaren Menge an Fc-Protein (2,5 µg/ml) in PBS ün bei 4°C

oder für 2 h bei 37°C beschichtet. Auf diese Weise binden beliebige Proteine über van der

Waals-Wechselwirkungen an die Polystyroloberflächen der Kulturgefäße. Lösliches CD137-

Fc-Protein wurde den Zellen in zuvor mit FKS beschichteten Gewe-bekulturplatten zugege-

ben, um zu verhindern, daß es seinerseits während der Kulturdauer an die Wände des Gefäßes

adhärieren konnte und auf diese Weise ungewollt immobilisiert wurde.

Agens Konzentration Zweck

anti-CD137 (Klon bbk-2) 10 µg/ml Blockieren von mCD137 und sCD137

anti-Fas 2,5 µg/ml Induktion von Apoptose

anti-IL-10 10 µg/ml Neutralisation von IL-10

anti-TGFß1 10 µg/ml Neutralisation von TGFß1

MausIgG1 10 µg/ml Isotypkontrolle zu obigen Antikörpern

CD137-Fc löslich 5 µg/ml Wirkung in dieser Arbeit untersucht

CD137-Fc immobilisiert 5 µg/ml Wirkung in dieser Arbeit untersucht

Fc löslich 2,5 µg/ml Kontrollprotein zu CD137-Fc

Fc immobilisiert 2,5 µg/ml Kontrollprotein zu CD137-Fc

IL-2 100 ng/ml Aktivierung von PBMCs

Differenzierung zu LAK-Zellen

PHA 5 µg/ml Aktivator für Lymphozyten

PMA/ A23187 10 µg/ ml/1 mM Aktivator für Lymphozyten

Tab. 2.-2.: In dieser Arbeit verwendete Aktivatoren und Antikörper zur in vitro-Stimulation von

Zellen.

2.2.2.2.8. Proliferationsassays mittels 3H-Thymidin-Einbau

Zu den Zellen wurde nach 24 h Kultur in einer 96-well-Platte pro well 0,5 µCi 3H-Thymidin

in 50 µl des entsprechenden Kulturmediums (entspricht 10 µCi/ml) gegeben. Nach weiteren

16 bis 24 h Inkubation im Brutschrank wurden die Zellen in einem Harvester der Firma Pa-

ckard-Canberra auf eine Filterplatte gebracht und nach mehreren Waschschritten der radio-

aktive Einbau in einem ß-Szintillisationszähler der gleichen Firma gemessen.


51

Zur Ermittlung von Mittelwert und Standardabweichung wurden Drei- oder Sechsfach-Be-

stimmungen durchgeführt.

2.2.2.2.9. CARE-LASS (Calcein release assay)

Um die Effekte von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAKs) zu untersuchen, wurde das

von R. LICHTENFELS et al. (1994) entwickelte CARE-LASS-Assay verwendet. Ähnlich dem

bekannteren Chrom-Release-Assay beruht das Prinzip des experimentellen Ansatzes darauf,

daß die Zielzellen der lytischen Aktivitäten von Effektorzellen mit Substanzen beladen wer-

den, die nach der Lyse der Targetzellen aus diesen ins umgebende Medium übertreten. Die

Konzentration dieser Substanzen wird dann bestimmt.

Beim CARE-LASS-Assay wird eine geeignete Anzahl an Zielzellen geerntet, in PBS/5 %

FKS gewaschen und in einer Konzentration von 1x 106 Zellen/ml in PBS/5 % FKS aufge-

nommen. Die Zellen wurden gegebenenfalls vorher ün mit 10 µg/ml eines entsprechenden

Antikörper bzw. eines Isotypantikörpers oder 5 µg/ ml CD137-Fc bzw. der äquimolaren Men-

ge Fc-Kontrollprotein vorinkubiert. Der Zellsuspension wurden 20 µg/ml CalceinAM beige-

fügt und diese 20 min bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Dabei tritt der organi-

sche Calcein-Acetomethylester durch die Membran in die Zellen ein, wird im Zytosol durch

dort vorhandene Lipasen zum ionischen Calcein gespalten und muß so in der Zelle ver-

bleiben. Calcein besitzt im Gegensatz zum farblosen Ester eine intensiv hellgrüne Farbe. Die

Zellen werden gewaschen und in einer Konzentration von 1 x 104 pro well in 100 µl PBS/5 %

FKS in eine U-well-Mikrotiter-Patte ausgesät. Die LAK-Zellen sind unspezifische Killer-T-

Zellen, zu denen PBMCs innerhalb von 3 d unter hohen Dosen IL-2 differenzieren. LAK-Zel-

len werden mindestens 3 Tage mit 100 ng/ml rIL-2 inkubiert. Die LAK-Zellen, die gegebe-

nenfalls vorher ün mit 10 µg/ml eines entsprechenden Antikörper oder 5 µg/ml CD137-Fc

bzw. der äquimolaren Menge Fc-Kontrollprotein vorinkubiert wurden, werden ebenfalls in

geeigneter Menge geerntet, gewaschen und in 100 µl PBS/5 % FKS im gewünschten

Effektor-:Targetzell-Verhältnis eingesetzt. Alle Bedingungen wurden als Sechsfachbestim-

mungen durchgeführt. Um den spontanen Austritt an Farbstoff zu bestimmen, wurden belade-

ne Targetzellen ohne Effektorzellen in 200 µl PBS/5 % FKS inkubiert. Die Farbstoffkonzen-

tration bei Lyse aller beladenen Targetzellen wurde durch Zugabe von 100 µl Lysepuffer (50

mM Na-Borat, 0,1 % Triton X 100, pH 9,0) zu 100 µl Targetzellsupension ermittelt. Spontane

Lyse, sowie die Gesamtlyse wurden jeweils als Zwölffachbestimmungen ausgeführt.


52

Das CARE-LASS-Assay wurde 4 h im Brutschrank inkubiert, bei längeren Inkubationszeiten

wird der Hintergrund an spontan lysierten Zellen zu hoch. Geringere Zeiten ergeben sehr nie-

drige Lyseraten, die keine Aussagen erlauben.

Die Platten wurden bei 1.200 rpm für 5 min zentrifugiert und 150 µl der Überstände in eine

neue Platte überführt. Die Fluoreszenz wurde in einem automatisierten Fluoreszenz-Scanner

(Titertek Fluoroskan II, Meckenheim) mit den Filtereinstellungen 2 für Extinktion und Emis-

sion (ex2 485 nm, em2 538 nm) gemessen.

Die prozentuale Lyse wurde wie folgt berechnet:

(FAssay – Fspontane Lyse)/ (FGesamtlyse – Fspontane Lyse) = % Zytotoxizität

2.2.3. Immunologische Methoden

2.2.3.1. ELISA

Zur Konzentrationsbestimmung von spezifischen Proteinen in Zellkulturüberständen und

Seren wurden Sandwich-ELISAs verwendet.

Hierzu wurden 96-well-Platten mit einem spezifischen Antikörper beschichtet, unspezifische

Bindungen durch Inkubation mit proteinhaltigem Puffer blockiert und dann die Zellkultur-

überstände oder Seren zugegeben. Die zu untersuchenden Proteine aus dem Überstand oder

dem Serum binden spezifisch an die immobilisierten Antikörper. Nach Inkubation wird über-

schüssiges Protein weggewaschen und das gebundene Protein durch einen zweiten spezifi-

schen, biotingekoppelten Antikörper erkannt. Mit Streptavidin gekoppelte alkalische Phos-

phatase bzw. Meerrettich-Peroxidase bildet über das Streptavidin einen Komplex mit dem

biotinylierten Zweitantikörper. Nach der Zugabe eines entsprechenden Farbsubstrates im

Überschuß wird dieses durch die Enzyme relativ zur Konzentration des zu untersuchenden

Proteins umgesetzt. Je nach Farbe des Substrates wird bei einer definierten Wellenlänge die

Farbstoffkonzentration photometrisch bestimmt, und über eine Standardreihe mit bekannten

Konzentrationen verglichen. Dazu wurde das Programm SOFTmax der Firma MWG Biotech

verwendet.

In dem für lösliches CD137 verwendeten ELISA wurde alkalische Phosphatase in Kombi-

nation mit dem Substrat pNPP von Sigma verwendet. Dieses entwickelt durch den Enzym-

umsatz eine gelbe Färbung, die durch Messung der Absorption bei 405 nm abzüglich 650 nm

in einem Emax Mikrotiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices) und Vergleich mit einer

Standardreihe quantifiziert werden konnte.


53

In den ELISAs gegen humanes IL-10 und TGFß (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt)

wurde mit Meerrettich-Peroxidase und dem Farbstoff ABTS (Roche Diagnostics, Mannheim)

detektiert, dessen Absorption bei 405 nm gemessen wird.

2.2.3.1.1. ELISA für sCD137

Um sCD137 nachzuweisen, entwickelte J. MICHEL einen ELISA, der auf dem oben beschrie-

benen sandwich-System beruht (MICHEL J.; 1998). Eine 96-well-Platte wurde bei 4°C ün mit 50

µl/well einer 1 µg/ml-Lösung des anti-CD137-Antikörpers M127 beschichtet. Die Platte wur-

de mit PBS gewaschen und für 1 h bei RT mit 200 µl/well PBS/3 % Trockenmilch (TM) blo-

ckiert. Die Blockierlösung wurde durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer (PBS/ 0,05 %

Triton X100) entfernt. Hierauf wurden 50 µl Aliquots der Proben, Leerwert und Standardwer-

te aufgetragen, die ggf. in PBS/0,3 % TM verdünnt worden waren. Als Standard diente ein

Fusionsprotein aus dem extrazellulären Teil von CD137 und einem His-tag, das in Konzentra-

tionen zwischen 20 und 0,2 ng/ml eingesetzt wurde. Die Proben wurden 1 h bei RT auf der

Platte belassen, die danach dreimal gewaschen wurde. Es wurden 50 µl/well des in PBS/0,3 %

TM 1: 3.000 verdünnten Zweitantikörper (4B4-1-bio; Ancell) aufgetragen und 30 min bei RT

inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden 50 µl/well eines Streptavidin-AP-Kon-

jugates (1: 1000 in PBS) (Dako) aufgetragen. Nach einer halben Stunde bei RT wurde die

Platte gründlich mit PBS/0,05 % Triton X100 gewaschen und ausgeklopft. Je 100 µl der Sub-

stratlösung aus einer Tablette pNPP (Sigma) und 30 ml AP-Puffer wurden zugegeben und der

ELISA im Dunkeln inkubiert, bis deutliche Intensitätsunterschiede beim Standard zu erken-

nen waren. Dann wurde der ELISA im Emax (MWG Biotech) bei 405 nm abzüglich einer

Korrekturwellenlänge von 650 nm gemessen und die Werte mit dem SOFTmax-Programm

analysiert.

Für Seren wurde zusätzlich ein ELISA auf einer mit dem Isotypantikörper MOP-C21

beschichteten Platte zu den gleichen Bedingungen durchgeführt, um individuelle, falsch posi-

tive Ergebnisse zu erkennen und ausschließen zu können.

2.2.3.1.2. ELISA für humanes IL-10

ELISAs gegen humanes IL-10 wurden mit dem Duo Set ELISA Development Kit der Firma

R&D Systems nach einem modifizierten Protokoll der Firma durchgeführt. In Kürze: Der

capture-Antikörper wurde auf eine Konzentration von 4 µg/ml in PBS verdünnt. Bei RT wur-

den ün je 100 µl/well in eine 96-well-Platte beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit

Waschpuffer wurden mit 300 µl Blockierlösung bei RT für 1 h unspezifische Bindungen ab-


54

gesättigt. Die Platte wurde erneut dreimal gewaschen. Daraufhin wurden die in Probenpuffer

verdünnten Proben (in der Regel: 1:2 bis 1:10), Standards und Probenpuffer alleine als Leer-

wert pipettiert. Als Standard diente im Kit enthaltenes rekombinantes humanes IL-10, das in

Konzentrationen von 4.000 – 40 pg/ml eingesetzt wurde. Nach 2 h Inkubation bei RT wurde

der ELISA erneut gewaschen und mit 100 µl 400 ng/ml Detektionsantikörper, ebenfalls ein

Bestandteil des Kits, versehen. Es schlossen sich 2 h Inkubation bei RT an, die Platte wurde

dreimal gewaschen und es wurden 100 µl eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugates beige-

fügt. Die Platte wurde für eine halbe Stunde im Dunklen aufbewahrt, gewaschen und mit

einer 2 µg/ml ABTS-Lösung entwickelt. Nach 5 bis 10 min konnte bei 405 nm im Emax-

Gerät der Firma MWG Biotech gemessen werden. Die Werte wurden mit dem SOFTmax-

Programm der gleichen Firma ausgewertet. Inkubiert man bei 37°C, können die Zeiten um die

Hälfte verkürzt werden.

Waschpuffer 0,05 % Tween

in PBS

pH 7,2 – 7,4

Blockierungslösung 1 % BSA

5 % Sucrose

0,05 % NaN3

in PBS

Probenpuffer 1 % BSA

in PBS

pH 7,2 – 7,4

sterilfiltriert

Verdünnungspuffer für den Detektionsantikörper

400 ng/ml normales Ziegenserum

in Probenpuffer

2.2.3.1.3. ELISA für humanes TGFß1

Dieser ELISA wurde ebenfalls mit einem Duo Set ELISA Development Kit der Firma R&D

Systems nach einem modifizierten Protokoll der Firma durchgeführt. Der Ablauf des Experi-


55

ments war im Prinzip derselbe wie bei dem oben beschriebenen ELISA gegen IL-10.

TGFß1 liegt jedoch im Serum oder Kulturüberstand als „latent complex“, N-terminal nicht-

kovalent an das LAP (latency associated protein) gebunden, vor; dieser Komplex bindet wie-

derum an das LTBP (latent TGFß binding protein). An diese Proteine gebunden ist TGFß

immunologisch nicht aktiv. Um die Konzentration von TGFß bestimmen zu können, ist es da-

her notwendig, TGFß aus seinen Komplexen freizusetzen. Dies geschieht mittels Ansäuerung

und anschließender Neutralisierung: Die (verdünnten) Zellkulturüberstände werden mit 1/5

Volumen 1 N HCl gut gemischt und 10 min bei RT belassen. Danach werden sie mit 1/5 des

Ausgangsvolumen mit einem NaOH-Puffer neutralisiert. Die so aktivierten Proben werden im

ELISA eingesetzt.

Da in den gängigen Seren, die in der Zellkultur verwendet werden, nicht unbeträchtliche

Mengen TGFß zu finden sind, die im ELISA kreuzreagieren, ist es notwendig, zusätzlich zum

Leerwert, Mediumkontrollen anzufertigen und die Assaywerte um diesen „TGFß-Hinter-

grund“ zu bereinigen.

NaOH-Puffer 1,2 N NaOH

0,5 M HEPES

in Aqua bidest

Waschpuffer 0,05 % Tween 20

in PBS

pH 7,2 – 7,4

Blockierungslösung 5 % Tween 20

5 % Sucrose

0,05 % NaN3

in PBS

Probenpuffer 1,4 % delipidiertes Rinderserum

0,05 % Tween 20

in PBS

pH 7,2 – 7,4

sterilfiltriert


56

2.2.3.2. Aktivitätsassay für Caspase 3

Die Menge an aktiver Caspase 3 wurde mittels des Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit der

Firma Calbiochem (San Diego, CA, USA) bestimmt. Caspase 3 ist eine der Effektorcaspasen

in der apoptotischen Zelle und verknüpft den Rezeptorweg der Apoptoseinduktion mit dem

mitochondrien-induzierten Weg.

Die Bestimmung der Caspaseaktivität erfolgt über die Spaltung ihres Substrates DEVD-pNA

zu einem farbigen, bei 405 nm im ELISA-Reader Emax (MWG Biotech) detektierbaren Sub-

strat pNA. Das Protokoll in Kürze:

2 x 107 Zellen wurden geerntet, in PBS gewaschen und in 1 ml eiskaltem Lysepuffer (im Kit

beigepackt) aufgenommen. Die Zellen wurden 5 min auf Eis inkubiert, bis sie vollständig ly-

siert waren. Nachdem die Proben bei 10.000 g für 10 min bei 4°C zentrifugiert worden waren,

wurden die Überstände, die die zytosolischen Proteine enthielten, abgenommen und entweder

auf Eis aufbewahrt oder bei -80°C bis zur Weiterverwendung gelagert.

Die Proteinkonzentrationen wurden mittels des Bradfordreagenzes bestimmt.

Für die Caspasebestimmung wurde zunächst der im Kit enthaltene Caspase-3-Inhibitor in

Assay-Puffer zu einer 5 x Stammlösung verdünnt. Dann wurde die gereinigte Caspase 3 auf

eine Konzentration von 2 U/µl gebracht.

Dann wurden Kontrollen und Proben nach unten stehendem Schema pipettiert.

Nach dem Pipettieren von Assay Puffer, Zellextrakt, Caspase3 und Inhibitor wurde das Assay

für 10 min bei 37°C inkubiert, um die Interaktion zwischen dem Enzym und dem Inhibitor zu

ermöglichen. Danach wurde das Substrat zugegeben und wieder bei 37°C im Dunkeln inku-

biert. Nach drei Stunden wurden die Proben bei 405 nm im Emax (MWG Biotech) gemessen.

Die gemessene OD405 der unbehandelten Zellextrakte wurde um die OD405 der Inhibitor-be-

handelten Extrakte bereinigt, um unspezifische Aktivitäten auszuschließen. Als Negativkon-

trolle fungierte der Leerwert, als Positivkontrolle die gereinigte Caspase 3.

Probe Assay-Puffer Zellextrakt

2U/ µl

Caspase 3 Inhibitor

2 mM

Substrat

Leerwert 90 µl --- --- --- 10 µl

Zellextrakt 80 µl 10 µl --- --- 10 µl

Inhibitor-behandelter

Zellextrakt 60 µl 10 µl --- 20 µl 10 µl

gereinigte Caspase 3 75 µl --- 15 µl --- 10 µl

Tab. 2.-3.: Pipettierschema des Caspase-Aktivitäts-Assays


57

2.2.3.3. Durchflußzytometrie

Die durchflußzytometrischen Messungen wurden an einem FACS-Calibur der Firma Becton-

Dickinson durchgeführt. Die Experimente wurden entweder mit dem Programm CellQuest

derselben Firma ausgewertet oder mit dem Programmen FCSPress (Mac) und winMDI (Win),

die als shareware-Versionen vorliegen.

2.2.3.3.1. PI-Färbung toter Zellen

1 x 106 Zellen in 450 µl FACS-Puffer wurden direkt vor der Messung im FACS-Calibur mit

2,5 µg/ml Propidiumjodid versetzt. In tote Zellen kann dieser Farbstoff sehr schnell eindrin-

gen und sich in die DNA einlagern. Dies kann durch erhöhte Fluoreszenz im Kanal 3 de-

tektiert werden.

2.2.3.3.2. Einfache Antikörperfärbung

Pro Ansatz wurden 1 x 106 Zellen in 50 µl FACS-Puffer mit dem Primärantikörper in der

angegebenen Konzentration für 30 min bei 4°C inkubiert.

Sofern dieser nicht direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff (FITC für Kanal 1, R-PE für Kanal

2) gekoppelt war, wurde danach zweimal mit einem Überschuß FACS-Puffer gewaschen und

ein weiterer Inkubationsschritt für 30 min bei 4°C im Dunklen mit einem fluoreszenzfarb-

stoffgekoppelten Sekundärantikörper angeschlossen.

Danach wurden die Zellen nochmals gewaschen und in 350 µl PBS für die Messung am

FACS-Calibur aufgenommen.

2.2.3.3.3. Antikörperdoppelfärbung

Sofern keine Kreuzreaktion zu erwarten war, wurden die beiden FITC- und PE- gekoppelten

Antikörper gleichzeitig mit den Zellen inkubiert. Bei der Auswertung von solchen Doppel-

färbungen ist darauf zu achten, daß durch Überlappung der Emissionsspektren der beiden

Farbstoffe falsch-positive Resultate entstehen können, sofern diese nicht durch Adaption der

Geräteeinstellungen über eine vorausgehende Testfärbung durch Kompensation unterdrückt

werden.

2.2.3.3.4. AnnexinV-FLUOS/ PI-Doppelfärbung mit dem AnnexinV-FLUOS Stain-

ing Kit der Firma Roche Diagnostics (Mannheim)

In frühen Phasen der Apoptose zeigen sich Membranveränderungen wie die Translokation

von Phosphatidylserin-Resten an die Membranaußenseite. AnnexinV ist ein Ca2+-abhängiges


58

Phospholipid-bindendes Protein mit einer hohen Affinität zu Phosphatidylserin. Jedoch ist die

Membran in der frühen Phase der Apoptose noch so „dicht“, daß kein PI eindringen kann.

Schreiten die Zellen in der Apoptose jedoch voran, wird auch die Membran undicht, so daß

eine PI-Färbung der Zell-DNA stattfinden kann. Nekrotische Zellen sind PI-anfärbbar, und

exponieren ebenfalls Phosphatidylserin. Daß in dieser Arbeit AnnexinV/PI-positive Zellen als

„spätapoptotisch“ bezeichnet werden, beruht auf time-course-Experimenten, die zeigen, daß

die Zellen eine AnnexinV-positive Phase durchlaufen, bevor sie doppelt positiv werden.

Apoptotische Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit mit dem AnnexinV-FLUOS-Staining-

Kit der Firma Roche Diagnostics (Mannheim) nach deren Protokoll gefärbt und im FACS-

Calibur detektiert.

1 x 106 Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 200 g für 5 min zentrifugiert. Der Über-

stand wurde verworfen und das Pellet in 100 µl staining solution resuspendiert. Die Zellen

wurden für 15 min im Dunkeln bei RT inkubiert, anschließend wurden 400 µl binding puffer

zugefügt und die Zellen mittels des FACS-Calibur analysiert.

staining solution 20 µl AnnexinV-Fluorescein-Reagenz

20 µl PI-Reagenz

in 1 ml binding puffer

2.2.3.3.5. Messung und Auswertung am FACS-Calibur

Da sich lebende von toten Zellen im FACS-Calibur anhand ihrer Größe (FSC) und Granulari-

tät (SSC) unterscheiden, wurde in der Regel im FSC/SSC-dotplot eine Region definiert, wel-

che nur die lebenden Zellen enthielt. Dies wurde durch PI-Färbung mehrerer Zellaliquots

überprüft. Es erfolgte dann die Messung von 20.000 Zellen jeder Probe im Lebendgate. Dabei

wurden die toten Zellen mit aufgenommen, jedoch nicht mitgezählt.

Die Daten wurden in den Software-Programmen CellQuest, FCSPress oder winMDI in Form

von dotplots und Histogrammen statistisch ausgewertet.

2.2.3.4. Immunhistochemie/ Immunzytochemie

2.2.3.4.1. Herstellung von Zytospins

Pro Objektträger wurden je nach Größe der zu untersuchenden Zellen zwischen 2 x 104 und 5

x 105 Zellen geerntet, gewaschen und in 100 µl PBS aufgenommen. Objekträger, Filterpapier

und Trichter wurden in die Einsätze der Zytospinzentrifuge eingespannt. In den Trichter wur-

den 50 µl 20 % BSA in PBS vorgelegt und mit 100 µl Zellsuspension vorsichtig überschich-


59

tet. Dies bewirkt, daß die Zellen bei der Zentrifugation durch dieses Kissen aus dichterem

Medium abgebremst werden und beim Aufprall auf dem Objektträger nicht kaputt gehen. Die

Zentrifugation wurde bei 800 rpm für 10 min bei RT durchgeführt.

Die Objektträger wurden ün getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbe-

wahrt.

2.2.3.4.2. Fixierung von Zytospins

Die Zytospins wurden vor der immunhistochemischen Färbeprozedur in einer frisch angesetz-

ten 2 %igen Paraformaldehyd-Lösung fixiert.

2.2.3.4.3. Fixierung für Immunfluoreszenzfärbungen

Für Immunfluoreszenzfärbungen wurden die Zytospins für 10 min in eiskaltem Aceton fixiert,

da die Fixierung mit Paraformaldehyd zu einer erhöhten unspezifischen Eigenfluoreszenz der

Zellen führen kann.

2.2.3.4.4. Färbung mit der DAB-Methode

Zur Färbung mit DAB wurde die sog. StreptABC-Methode von Dako verwendet. Diese Me-

thode ist aufgrund der Verstärkung des Signals über einen Brückenantikörper und Streptavi-

din-Biotin besonders sensitiv.

Die Objektträger mit den fixierten Zellen wurden in einer Küvette zunächst in PBS rehydriert.

Hierauf wurden mit Methanol/2 % H2O2 für 15 min bei RT endogene Peroxidasen inaktiviert.

Nach dreimaligem Waschen der Objektträger in PBS wurden die Objektträger in eine feuchte

Kammer überführt und die Zytospins mit PBS/3 % TM (100 µl pro Objektträger) überschich-

tet. Nach 30 min bei RT wurde die Lösung abgeklopft und durch den Primärantikörper in

PBS/3 % TM ersetzt. Dieser wurde auf den Zellen entweder für 30 min bei 37°C, 2 h bei RT

oder ün bei 4°C belassen. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS in einer Küvette gewa-

schen, wieder in die feuchte Kammer gebracht und für eine Stunde bei 37°C mit einer Lösung

des biotinylierten Sekundärantikörpers (für Primärantikörper aus der Maus: Reagenz C des

StreptABC-Kit, biotinylierter Ziegen-anti-Maus/Hasen-Ig; Dako;) in PBS/3 % TM bedeckt.

Nach erneutem Waschen folgte ein weiterer einstündiger Inkubationsschritt bei 37°C mit je

einer 1: 100-Verdünnung der Reagenzien A und B des StreptABC-Kits in PBS/3 % TM.

Die Enzymaktivität der nun an die Zellen gebundenen Peroxidase wurde über das Substrat

DAB (2 Tabletten in 40 ml PBS und 0,006 % H2O2) detektiert. Hierbei entsteht eine braune


60

Färbung, deren Entwicklung nach 5 min Inkubation durch Spülen mit Leitungswasser abge-

stoppt wurde.

Das DAB-Endprodukt ist sowohl in organischen als auch in wäßrigen Lösungsmitteln unlös-

lich. Daher können Gegenfärbungen in organischem oder löslichem Medium durchgeführt

werden und die Präparate in organischem oder löslichem Einbettmedium eingebettet werden.

Zur besseren Orientierung auf den Präparaten wurde eine Zellkern-Färbung durch kurzes

Eintauchen der Objektträger in Hämalaun-Lösung durchgeführt. Diese ergibt nach gründli-

chem Wässern mit Leitungswasser eine blau-violette Färbung.

2.2.3.4.5. Immunfluoreszenzfärbung (Dreifachmarkierung)

Für die Immunfluoreszenzfärbung von CD137 und B-Zellen im Zytospin wurden diese nach

Fixierung mit eiskaltem Aceton in PBS rehydriert und wie folgt inkubiert: In einem ersten

Schritt wurden die Zytospins in PBS/2 % BSA für 30 min bei RT in einer feuchten Kammer

blockiert. Nach dem Entfernen der Blockierlösung wurden die Zellen mit einer Mischung aus

2 µg/ml anti-CD137-bio (Klon 4B4-1, Ancell) und 1: 1.000 anti-CD19-FITC (Klon HD37,

Dako) in PBS/2 % BSA für 1 h bei 37°C im Dunklen inkubiert. Nach sorgfältigem dreimali-

gen Waschen in PBS schloß sich eine einstündige Inkubation bei 37°C im Dunkeln mit einem

Strep-Cy3-Konjugat an. Die Präparate wurden gewaschen und anschließend mit 4 µg/ml

Hoechst 33342 in PBS für 30 min bei 37°C in Dunkeln gegengefärbt. Dieser Farbstoff inter-

kaliert in die DNA und färbt so die Zellkerne an.

Es wurden gegen menschliche Proteine adsorbierte Sekundärantikörper verwendet und durch

Kontrollfärbungen mit Isotypantikörpern die Spezifität der Färbung überprüft.

2.2.3.4.6. Einbettung der Präparate

Die Schnitte und Zytospins, die mit der DAB-Methode gefärbt wurden, wurden anschließend

in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und mit dem organischen Einbettmedium En-

tellan eingedeckt.

Dieses hat gegenüber wäßrigen Einbettmedien den Vorteil, daß die Präparate dauerhaft auf-

gehoben werden können, da keine Austrocknungsgefahr besteht.

Immunfluoreszenzfärbungen wurden mit dem wäßrigen Einbettmedium Vectashield einge-

deckt und mit Nagellack umrandet. Alternativ wurden Immunfluoreszenzfärbungen mit

MoBiGlow eingedeckt, das zwar ebenfalls zu den wäßrigen Einbettmedien zählt, aber – ähn-

lich Entellan – aushärtet.


61

Fluoreszenzpräparate sind aufgrund der Instabilität der Fluoreszenzfarbstoffe nur sehr be-

grenzt haltbar und sollten stets im Dunkeln aufbewahrt werden, da sie bei Lichteinwirkung

sehr schnell ausbleichen.

2.2.3.4.7. Photografie

Die Immunfluoreszenzaufnahmen wurden an einem Bildanalysesystem mit dem Mikroskop

Zeiss Axiovert S100 und dem Objektiv Plan-Neofluar 40x/0,75 Ph2 über eine elektrisch ge-

kühlte CCD-Kamera aufgenommen.

Die Auswertung und Überlagerung der Bild-files erfolgte über die Software MetaMorph

(Universal Imaging Corp.).

Fotos von Agarosegelen (PCR) wurden mit Hilfe des über einem UV-Transilluminator instal-

lierten Geldokumentationssystems 2000i aufgenommen.

Ergebnisse

62

3. Ergebnisse

Ausgangspunkt dieser Untersuchung über die Rolle von CD137 in der Tumorantwort waren

die Untersuchungen von M. FURTNERS, in denen er nachweist, daß CLL-Patienten erhöhte Se-

rumspiegel an sCD137 aufweisen und die Konzentration an CD137 mit der Leukozytenzahl

der Patienten korreliert (FURTNER M., 2001). Weitere Vorarbeiten von S. POLEY vom Klinikum

Großhadern der Ludwig-Maximilians-Universität München beinhalten FACS-Analysen, die

die Synthese der membrangebundenen Form von CD137 auf Leukozyten von Patienten mit

verschiedenen Leukämieerkrankungen belegen. Dies weist zusammen mit der Tatsache, daß

immobili-siertes CD137 Apoptose in aktivierten T-Lymphozyten induzieren kann (SCHWARZ H.

et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999), darauf hin, daß die Expression von CD137 Tumorzellen einen

Vorteil bietet.

Darauf aufbauend untersuchte ich in dieser Arbeit zuerst die Expression von löslichem

CD137 in den Seren von B-CLL-Patienten und den Kulturüberständen von Patientenzellen

sowie die Expression von mCD137 auf den Lymphozyten von CLL-Patienten. Weitere Ziele

dieser Dissertation stellten die Charakterisierung der durch CD137 vermittelten Effekte und

die Aufklärung der Funktionsmechanismen von CD137 als Neoantigen auf den malignen

Lymphozyten dar.

3.1. Screening des CLL-Patienten-Materials

3.1.1. Das verwendete Patientenmaterial

Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Patientenmaterial handelte es sich um kryokonservierte

Lymphozytenaliquots von B-CLL-Patienten aus einer Studie, die an der Medizinischen Poly-

klinik der Universität Würzburg von M. GOLLER durchgeführt wurde. Außerdem standen von

einem Teil dieses Patientenkollektivs Serumproben zur Verfügung. In Kapitel 2.1.1.2. (Tab.

2.-1.) sind die in Würzburg erhobenen Daten, die im Rahmen meiner Arbeit von Interesse

sind, zusammengefaßt. Auf Grund der Begrenztheit des Materials wurden nicht alle Versuche

mit den Zellen aller Patienten durchgeführt.

3.1.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen

3.1.2.1. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene

Die Vorarbeiten von Dr. S. POLEY zeigten, daß die Leukozyten von Patienten mit Leukämie-

erkrankungen mCD137 exprimieren. Die uns zur Verfügung stehenden CLL-Zellen wurden

Ergebnisse

63

mit 10 ng/ml PMA und 1 µM A23187 (Kalziumionophor) oder 5 ng/ ml PHA stimuliert, um

das durch die Kryokonservierung veränderte Expressionsmuster an Zelloberflächenproteinen

(GOLLER, M., persönliche Mitteilung) zu rekonstruieren. Aus den kultivierten Zellen unterschiedli-

cher CLL-Patienten wurde die Gesamt-RNA isoliert. Die RNA wurde revers transkribiert und

die so gewonnene cDNA in einer PCR mit den CD137-spezifischen Primern G-ILA-sen und

G-ILA-AS eingesetzt. Es ergab sich folgendes Bild (Abb. 3.-1.):

mCD137

G3PDH

Abb. 3.-1.: Aktivierte Lymphozyten von CLL-Patienten exprimieren die mRNA für CD137. 2%iges

Agarosegel der PCR mit den mCD137-spezifischen Primern G-ILA-sen und G-ILA-AS; je-

weils rechts aufgetragen: Probennahme nach 48 h mit 10 ng/ml PMA, 1 µM A23187; links

aufgetragen: nicht aktivierte Proben; Als Kontrollen sind aufgetragen: - PCR ohne DNA-Matri-

ze, + mit 10 ng/ml PMA, 1 µM A23187 aktivierte Lymphozyten eines gesunden Spenders. Im

unteren Teil der Abbildung ist eine parallel angefertigte PCR mit Primern gegen das durch die

Aktivierung unbeeinflußte Haushaltsgen G3PDH mit den Primern G3PDH-sen und G3PDH-

AS gezeigt, um zu demonstrieren, daß gleiche cDNA-Mengen in der PCR eingesetzt wurden.

Nach Stimulation transkribieren die Zellen aller untersuchten Patienten CD137. Jedoch kann

die Expression der CD137-mRNA durch B-Lymphozyten gesunder Spender nach Stimulation

ebenfalls gezeigt werden (SCHWARZ H. et al., 1995), nicht aber die Proteinexpression (KIENZLE G.

und VON KEMPIS J., 2000; KIENZLE G. et al., 1997; MICHEL J., unveröffentlichte Daten).

3.1.2.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene

Aus diesem Grund wurden von den stimulierten CLL-Zellen FACS-Färbungen gegen CD137

angefertigt. Der Gehalt an B-Lymphozyten dieser Zellaliquots ist in Tab. 2.-1. (Kap. 2.1.1.2.)

aufgeführt.

- + 1 5 6 17 20 25

- akt - akt - akt - akt - akt - akt

Ergebnisse

64

Abb. 3.-2.: Die Lymphozyten von CLL-Patienten exprimieren mCD137. FACS-Analyse der Lympho-

zyten von 13 CLL-Patienten.

Abb. 3.-2. zeigt die mCD137-Expression (durchgezogene Linien) gegenüber einer Färbung

mit einem Isotypantikörper (getüpfelte Linien). Dabei wird deutlich, daß auf den Lympho-

zyten aller untersuchten Patienten (13/13) mCD137 nachzuweisen ist. Der Anteil CD137-po-

sitiver Zellen lag zwischen 2,68 und 52,31 %. Zusammen mit Tab. 2.-1., die über den B-Zell-

Patient 1 Patient 5 Patient 6




Patient 24 Patient 25

Ergebnisse

65

Anteil in den Proben Auskunft gibt, ergab sich, daß in mindestens 10 der 13 untersuchten Pro-

ben mCD137 auf den entarteten B-Lymphozyten als Neoantigen exprimiert wird. Bei diesen

Patienten wird mCD137 auf einem deutlich höheren Anteil an Zellen exprimiert, als T-Zellen

in den Aliquots enthalten sind. Dieser Bezug ist notwendig, da T-Lymphozyten nach Stimu-

lation mCD137 exprimieren und so das Ergebnis verfälschen können (SCHWARZ H. et al., 1995;

VON KEMPIS J. et al., 1997; MICHEL J., 1998).

Um sicherzustellen, daß wirklich die B-CLL-Zellen mCD137 exprimieren, und das nachge-

wiesene Protein nicht von aktivierten T-Zellen stammt, wurden zusätzlich Immunfluores-

zenz-Doppelfärbungen durchgeführt

Abb. 3.-3. zeigt die Koexpression von CD19 und CD137 auf einer Patientenzelle.

Abb. 3.-3.: Aktivierte CLL-Zellen koexprimieren CD137 und den B-Zell-Marker CD19. Immunfluo-

reszenzfärbung eines Cytospins der Lymphozyten eines CLL-Patienten, die 12 h mit 5 ng/ml

PHA aktiviert wurden; blau: Kernfärbung mit Hoechst 33342, grün: antiCD19-FITC, rot: anti-

CD137-RPE; oben ist die Überlagerung der Färbung dargestellt, die kleinen Bilder unten zei-

gen die Färbungen einzeln.

Ergebnisse

66

Es ist deutlich zu erkennen, daß der B-Zell-Marker CD19 (grün) und CD137 (rot) auf dersel-

ben Zelle kolokalisieren. Die Überlagerung der Lichtemission grünen und roten Lichts in un-

mittelbarer Nähe ergibt den Mischton gelb-orange. Die Zellkerne sind mit Hoechst 33342 ge-

gengefärbt und erscheinen nach Anregung blau.

Bei acht von 10 untersuchten Patienten läßt sich die Koexpression beider Marker nachweisen.

Bemerkenswert ist, daß sich die rote Färbung auf sehr eng begrenzte „Punkte“ konzentriert.

Dies kann als Hinweis gewertet werden, daß CD137 auf der Membran in sog. clustern, raft-

Strukturen oder Mikrodomänen angeordnet und aktiv an der Signalübertragung beteiligt ist.

3.1.3. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen

Außer der membranständigen Form konnten von der CD137-mRNA mehrere splice-Varian-

ten nachgewiesen werden, darunter welche, die für lösliche Formen des Proteins codieren (MI-

CHEL J. et al., 1998, MICHEL J., 1998). Bei gesunden Probanden können nur geringe Konzentratio-

nen der löslichen Form des Proteins im Serum detektiert werden. M. FURTNER weist in seiner

Dissertation nach, daß in den Seren von CLL-Patientendie Spiegel an stark erhöhte sCD137-

Spiegel zu finden sind (FURTNER M., 2001). Dies konnte auch für das Würzburger Patientenkol-

lektiv gezeigt werden.

3.1.3.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene

Um zu nachzuweisen, daß das sCD137 in den Patientenseren von den CLL-Lymphozyten her-

rührt, wurde die CD137-Expression zuerst auf Transkriptionsebene untersucht.

CLL-Zellen wurden 48 h mit 10 ng/ml PMA und 1 µM A32187 stimuliert. Aus diesen Zellen

wurde die Gesamt-RNA isoliert. Über RT-PCR mit den Primern ILA-241-sen und ILA-

3’UTR-AS konnte zwischen der löslichen und der membranständigen Form von CD137 un-

terschieden werden.

Die PCR ist in Abb. 3.-4. dargestellt: Die Lymphozyten von 10 der 12 untersuchten Patienten

exprimieren nach Stimulation die lösliche Form von CD137 auf RNA-Ebene.

Ergebnisse

67

Abb. 3.-4.: Aktivierte Lymphozyten von CLL-Patienten exprimieren sowohl membranständiges

CD137 als auch die lösliche Form. 2%iges Agarosegel der PCR mit den Primern ILA-241-

sen und ILA-3’UTR-AS; jeweils rechts aufgetragen: Probennahme 48 h nach Aktivierung

durch PMA/ A23187, jeweils links aufgetragen: nicht aktivierte Proben. Als Kontrollen: - PCR

ohne DNA-Matrize, + mit 1 µM A23187, 10 ng/ml PMA aktivierte Lymphozyten eines

gesunden Spenders. Im unteren Teil der Abbildung ist eine parallel angefertigte PCR mit

Primern gegen das durch Aktivierung unbeeinflußte Haushaltsgen G3PDH mit den Primern

G3PDH-sen und G3PDH-antisen gezeigt, um zu demonstrieren, daß gleiche cDNA-Mengen in

der PCR eingesetzt wurden. Die sCD137-Banden sind sehr schwach. Bei Patient E ist keine

Expression von sCD137 zu erkennen.

3.1.3.2. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene

3.1.3.2.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen in Zellkulturüberständen

Es wurde untersucht, in wieweit CLL-Zellen sCD137 in Kulturüberstände abgeben.

1,0 x 106 Zellen wurden mit 10 ng/ml PMA und 1 µM A23187 oder 5 µg/ml PHA stimuliert

und zwei Tage kultiviert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert, die Überstände abge-

nommen und im ELISA analysiert.

Bei 14 von 17 daraufhin untersuchten Patienten konnte sCD137 in Konzentrationen zwischen

0,1 und 1,2 ng/ml nach Stimulation der Zellen in den Überständen detektiert werden.

3.1.3.2.2. Nachweis von sCD137 in Patientenseren

Von 10 der Patienten standen Serumaliquots zur Verfügung, so daß die Konzentration an

sCD137 im Serum dieser Patienten bestimmt werden konnte. M. FURTNER konnte in seiner

Dissertation zeigen, daß bei CLL-Patienten sCD137 im Serum signifikant erhöht ist und dies

mit der Leukozytenanzahl korreliert (FURTNER M., 2001). In allen getesteten Patientenseren war

sCD137 nachweisbar. Die Konzentrationen lagen zwischen 0,08 und 1,1 ng/ml. Von den 10

in Rahmen dieser Arbeit untersuchten Seren wiesen fünf einen signifikant erhöhten sCD137-

Spiegel auf, d.h. die CD137-Konzentration in diesen Proben war größer als der durchschnitt-

- + 5 6 13 17 20

- akt - akt - akt - akt - akt

mCD137

sCD137

G3PDH

Ergebnisse

68

liche Spiegel an sCD137 in den Seren 100 gesunder Probanden zzgl. der doppelten Standard-

abweichung. Dieser Wert beträgt 0,512 ng/ml.

A B

Leukozytenzahl - sCD137

R2 = 0,87320

20

40

60

80

100

120

140

0 0,2 0,4 0,6 0,8

ng/ ml sCD137

Leu

kozy

tenz

ahl

CD5+ B-Zellen - sCD137

R2 = 0,21510

20

40

60

80

100

120

140

0 0,2 0,4 0,6 0,8

ng/ ml sCD137C

D5+

B-Z

elle

n

C D

aktivierte T-Zellen - sCD137

R2 = 0,6655

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

ng/ ml sCD137

T-L

ymph

ozyt

en

ß2-Mikroglobulin - sCD137

R2 = 0,58050

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

ng/ ml sCD137

µg/

ml ß

2-M

ikro

glou

lin

Abb. 3.-5.: Korrelation verschiedener klinischer Parameter mit der Menge an sCD137 im Serum von

CLL-Patienten; A Leukozytenanzahl, B Zahl der CD5-postiven B-Zellen, C Zahl der T-

Lym-phozyten, D Serumkonzentration an ß2-Mikroglobulin. A – C: Die Zellzahlen sind in

103/µl angegeben; dargestellt sind jeweils die Einzelwerte der Patienten, sowie eine

Trendlinie.

Die Korrelation mit der Anzahl an Leukozyten konnte bestätigt werden. Außerdem können

aus Abb. 3.-5. folgende Aussagen getroffen werden: (i) Der Level an sCD137 korreliert we-

der mit dem Anteil noch mit der Anzahl an CD5+-B-Zellen. (ii) Der sCD137-Spiegel korre-

liert weder mit dem Anteil noch mit der Anzahl an T-Zellen. Er korreliert jedoch negativ mit

dem Anteil und der Anzahl an aktivierten, HLA-DR-positiven T-Lymphozyten. (iii) Zwischen

dem Serumspiegel an sCD137 und ß2-Mikroglobulin kann eine Korrelation gefunden werden.

Bei ß2-Mikroglobulin handelt es sich um einen der wenigen zuverlässigen diagnostischen

Ergebnisse

69

Marker, die den klinischen Verlauf der CLL abbilden (ZWIEBEL J. A. und CHESON B. D., 1998).

Beim Erstellen der Korrelationen wurden zwei Patienten ausgeschlossen, die Autoimmun-

erkrankungen entwickelt hatten (GOLLER M., persönliche Mitteilung).

3.1.3.2.2. Herkunft von sCD137 in Patientenseren

Es war von Interesse herauszufinden, welcher Zelltyp für die Produktion von sCD137 verant-

wortlich ist, da dies aus den Korrelationen nicht hervorgeht. Obwohl die Konzentration an

sCD137 mit der Leukozytenzahl eine gute Korrelation aufweist, nimmt diese Übereinstim-

mung ab, wenn man sich die Korrelation zwischen sCD137 und der Anzahl an CD5-positiven

B-CLL-Zellen ansieht. Zudem zeigt sich eine negative Korrelation zwischen der Anzahl an

aktivierten T-Zellen und der sCD137-Konzentration. Um zu untersuchen, von welchen Zellen

das lösliche CD137 sekretiert wird, wurden die T-Lymphozyten aus CLL-Zell-Aliquots mit

magnetischen anti-CD3-beads abgetrennt. Sowohl diese depletierten B-Zellen als auch un-

depletierte Zellen des gleichen Spenders wurden zwei Tage mit PMA/A23187 stimuliert. An-

schließend wurde mittels ELISA die Konzentration an sCD137 bestimmt. Dabei ergab sich

folgendes (s. Abb. 3.-6.):

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Serum undepletiert B-Zellen

ng/ m

l CD

137

Abb. 3.-6.: Das im Serum von CLL-Patienten gefundene sCD137 stammt nicht von den B-Lympho-

zyten. Bestimmung der Konzentration an löslichem CD137 im Serum eines CLL-Patienten so-

wie im Zellkulturüberstand nicht depletierter Lymphozyten oder aufgereinigter B-Lymphozy-

ten desselben Patienten nach 48 h Kultur unter PMA/ Ca2+-Ionophor-Stimulation durch einen

ELISA gegen CD137; dargestellt ist der Mittelwert einer Dreifachbestimmung ± Standardab-

weichung. Exemplarisch ist eines von drei Experimenten mit den Zellen verschiedener Patien-

ten gezeigt.

Dies wies darauf hin, daß das im Serum beobachtete sCD137 nicht – wie es die Korrelation

mit der Leukozytenanzahl nahelegte – von den leukämischen B-Zellen stammt.

Ergebnisse

70

Von zwei weiteren Patienten konnten sowohl B- als auch T-Lymphozyten betrachtet werden.

Dabei ergab sich eindeutig, daß das gefundene sCD137 von den T-Lymphozyten stammt (vgl.

Abb. 3.-7.). Dies stimmt mit den Beobachtungen von J. MICHEL überein, daß sCD137 in

erster Linie von (CD8-positiven) T-Zellen exprimiert wird (MICHEL J. et al., 1998).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

undepletiert B-Zellen T-Zellen

ng C

D13

7/ m

l

Abb. 3.-7.: Das im Patientenserum und in den Überständen kultivierter B-CLL-Zellen gefundene

sCD137 wird von T-Lymphozyten produziert. ELISA gegen sCD137 von Zellkulturüber-

ständen nicht depletierter Lymphozyten, aufgereinigter B- und T-Lymphozyten desselben Pa-

tienten nach 48 h PMA/ Ca2+-Ionophor-Stimulation; gezeigt ist der Mittelwert einer Dreifach-

bestimmung ± Standardabweichung.

3.2. Funktion von mCD137 in der CLL

3.2.1. Die Rolle von mCD137 bezüglich des Überlebens von CLL-Zellen

Um die Rolle von mCD137 in vitro untersuchen zu können, wurden Polystyrol-Zellkultur-

platten mit einem CD137-Fc-Fusionsprotein beschichtet, das aus dem extrazellulären Teil von

CD137 und einen IgG-Fc-Teil besteht. Diese Moleküle lagern sich über den Fc-Teil zu Ho-

modimeren zusammen. Die CLL-Zellen wurden in CD137-Fc-, Kontrollprotein- oder unbe-

schichteten Platten kultiviert. Im Abstand von einigen Tagen wurde die Anzahl der lebenden

Zellen mittels Trypanblau-Ausschluß bestimmt.

Dabei ergab sich für sechs von sechs untersuchten Patienten, daß die Zellen auf CD137-Fc

signifikant länger überlebten als in Platten, die mit einer äquimolaren Menge an Fc-Kontroll-

protein beschichtet worden waren.

Tab. 3.-1. zeigt das prozentuale Überleben der CLL-Zellen am Tag 8. Der Anteil überleben-

der Zellen schwankt sehr stark zwischen den Patienten. Es ist für CLL-Lymphozyten bekannt,

daß die Zellen verschiedener Probanden große Unterschiede hinsichtlich ihres Überlebens so-

Ergebnisse

71

wie des Ansprechens auf Zytokine und Mitogene aufweisen (PFEFFER K. et al., 1987; KARRAY S. et

al., 1987; ALVAREZ-MON M. et al., 1993).

5 µg/ml Fc 10 µg/ml CD137-Fc p-Wert

2 45,1 ± 1,2 71,7 ± 2,3 0,000

102 16,0 ± 1,8 34,0 ± 9,2 0,030

14 12,4 ± 1,0 18,8 ± 3,5 0,040

15 73,1 ± 6,9 84,8 ± 0,9 0,043

16 26,4 ± 3,4 36,5 ± 1,0 0,008

22 32,9 ± 5,6 71,0 ± 5,1 0,001

Tab. 3.-2.: An Tag 8 überleben signifikant mehr Lymphozyten von CLL-Patienten auf immobilisier-

tem CD137-Fc als auf Fc-Kontrollprotein. Die Platten wurden mit den angegebenen äqui-

molaren Mengen an CD137-Fc-Fusionsprotein bzw. Fc-Kontrollprotein beschichtet. Angege-

ben ist der Anteil der überlebenden Zellen von den im Experiment eingesetzten lebenden Zel-

len in Prozent als Mittelwert aus einer Vierfachbestimmungen ± Standardabweichung, sowie

die Signifikanz (p-Wert).

In Abb. 3.-8. ist für den Patienten 22 exemplarisch eine Absterbekurve der CLL-Zellen über

mehrere Wochen Kultur gezeigt.

0

20

40

60

80

100

120

0 3 6 9 12 15 18

Tag

Proz

ent ü

berl

eben

de Z

elle

n

---FcCD137-Fc

Abb. 3.-8.: CLL-Zellen, die auf immobilisierten CD137-Fc kultiviert wurden, sterben langsamer ab,

als Zellen, die auf unbeschichteten Platten oder Kontrollprotein-beschichteten Platten

kultiviert wurden. Bestimmung der lebenden Zellen über Trypanblau-Ausschluß über einen

Zeitraum von 18 Tagen; betrachtet wurden Zellen, die in unbeschichteten 24-well-Polystyrol-

platten, mit CD137-Fc-Fusionsprotein (10 µg/ml in 300 µl PBS) oder der äquimolaren Menge

an Fc-Kontrollprotein (5 µg/ml in 300 µl PBS) beschichteten kultiviert wurden; gezeigt sind

Vierfachbestimmungen ± Standardabweichung.

Ergebnisse

72

Auf immobilisiertem CD137-Fc überleben nicht nur mehr Zellen, sondern die B-CLL-Lym-

phozyten überleben auch über einen längeren Zeitraum.

sCD137 oder lösliches Fc im Medium hat keinen überlebensverlängernden Effekt, es scheint

im Gegenteil zu einem geringfügig schnelleren Absterben zu führen. Auch hier ist exempla-

risch Patient 22 betrachtet (s. Abb. 3.-9.). Bei den anderen fünf betrachteten Patienten hat

CD137-Fc ebenfalls einen geringfügig negativen oder keinen Effekt auf das Überleben der

CLL-Zellen.

0

20

40

60

80

100

120

0 3 6 9 12 15 18

Tage

Proz

ent Ü

berl

eben

de

---FcCD137-Fc

Abb. 3.-9.: Die Zugabe von löslichem CD137 zu CLL-Zellen hat keinen Einfluß auf deren Überleben

in Kultur. Zugegeben wurden entweder 10 µg/ml CD137-Fc-Fusionsprotein oder die äquimo-

lare Menge von 5 µg/ml Fc-Protein zu Zellen, die in FCS-blockierten 24-well-Polystyrolplatten

kultiviert wurden; gezeigt sind Vierfachbestimmungen ± Standardabweichung.

3.2.2. Ursache der höheren Anzahl überlebender B-CLL-Zellen auf

CD137-Fc

Für die deutlich erhöhte Überlebenrate der CLL-Zellen an Tag 8 auf immobilisiertem CD137-

Fc-Protein kann es zwei Gründe geben: Erstens, daß die Zellen durch das immobilisierte

CD137-Fc nicht absterben. Zweitens, daß einige Zellen zwar absterben, andere aber prolife-

rieren und so die Zahl an lebenden Zellen auf CD137-Fc langsamer abnimmt, als auf mit dem

Kontrollprotein beschichteten Platten.

Um die Ursache des verlängerten Überlebens aufzuklären, wurden Proliferationsassays durch-

geführt: 2,5 x 105 Zellen wurden in einer Konzentration von 1,25 x 106 Zellen/ml in den Lö-

chern einer 96-well-Platte für zwei Tage kultiviert. Dann wurde über Nacht 50 µCi 3H-Thymi-

din zugegeben, welches im Falle der Zellteilung in die neu synthetisierte DNA eingebaut

Ergebnisse

73

wird. Am nächsten Tag wurden die Zellen auf einer Filtermembran lysiert und die Menge an

Radioaktivität auf dieser Membran in einem Szintilisationszähler bestimmt.

Dabei ergab sich, daß immobilisiertes CD137-Fc in den Zellen aller fünf untersuchten Patien-

ten keine Proliferation zu induzieren vermag. In Abb. 3.-10. sind zwei der Experimente ge-

zeigt.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fc CD137-Fc

Fc CD137-Fc

Cou

nts

Patient 8 Patient 14

Abb. 3.-10.: Immobilisiertes CD137 hat keinen Einfluß auf die Proliferation von CLL-Zellen. Prolife-

rationsassay mit CLL-Zellen zweier Patienten auf unbeschichteten Platten bzw. Polystyrolplat-

ten, die mit äquimolaren Mengen an CD137-Fc- bzw. Fc-Protein beschichtet waren; gezeigt

sind Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung.

Wie aus Abb. 3.-10. zu entnehmen ist, ist kaum Radioaktivität meßbar; das bedeutet, daß das

verlängerte Überleben der CLL-Zellen auf immobilisiertem CD137-Fc nicht auf Proliferation

zurückzuführen ist. Die etwas höheren Strahlungswerte der CD137-Fc-Bedingung sind darauf

zurückzuführen, daß auf immobilisiertem CD137-Fc mehr Zellen überleben. Dies wurde in

Kapitel 3.2.1. gezeigt.

3.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort

Die bisherigen Untersuchungen beschäftigen sich lediglich mit der Wirkung von CD137 auf

die leukämischen Zellen an sich. Um einen Einblick in die Interaktion der entarteten Zellen

mit dem Immunsystem zu bekommen, ist es jedoch notwendig, beide Seiten – die der Tumor-

zellen und die der interagierenden Immunzellen – zu betrachten.

Da – wie oben bereits erwähnt – die CLL-Zellen in vitro sehr rasch absterben (PFEFFER K. et al.,

1987; KARRAY S. et al., 1987; ALVAREZ-MON M. et al., 1993; KIPPS T. J., 1998; MEINHARDT G. et al., 1998;

Ergebnisse

74

SÖDERBERG O., 1998), wurden für die folgenden Untersuchungen verschiedene (Tumor-)Zelli-

nien statt der CLL-Zellen verwendet.

3.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort

Um herauszufinden, ob mCD137 einen für die Tumorzellen positiven Effekt bzgl. der LAK-

Antwort bewirkt, wurden ausgewählte Zellinien (COS, Jurkat, K562, Raji) mit dem Vektor

CMV-ILA-sense transient transfiziert, der auf dem Expressionsvektors pcDNA3.1. basiert.

Dieser trägt unter der Kontrolle des CMV-Promotors eine Kopie des vollständigen Tran-

skripts von mCD137. Alternativ wurde der Vektor RSV-ILA-sense verwendet. Dieser Vektor

beruht auf Expressionsvektor pRc/RSV und besitzt die codierende Region für CD137 hinter

dem RSV-Promotor. Der Zeitpunkt der maximalen Expression dieser Konstrukte wurde über

die Transfektion der analogen Vektoren mit der codierenden Region von gfp (green fluores-

cent protein) getestet. Ein Expressionsmaximum dieses Membranproteins ist nach ca. 48 h er-

reicht. Alle Experimente mit transfizierten Zellen wurden daher zwei Tage nach der Trans-

fektion der Zellen durchgeführt.

Die in dieser Arbeit verwendeten Zellinien wurden aus folgenden Gründen ausgewählt:

COS-Zellen lassen sich sehr effizient transfizieren. Sie sind adhärent und stammen aus dem

Nierenepithel von grünen Meerkatzen.

K562 sind stark undifferenzierte humane myelotische Suspensionszellen, die aus einem Pa-

tienten mit akuter myelotischer Leukämie (AML) kultiviert wurden. Diese Zellinie dient bei

Studien mit LAK-Zellen häufig als Zielzellinie. Bei meinen Untersuchungen war zudem von

Interesse, daß diese Zellen nicht nur – wie CLL-Zellen – hämatopoetischer Abstammung,

sondern auch gut transfizierbar sind.

Jurkats sind T-Lymphozyten einer akuten T-Zell-Leukämie. Sie wachsen ebenfalls in Lösung

und lassen sich gut transfizieren. Sie sind der lymphatischen Reihe zuzuordnen.

Rajis stammen von den Lymphozyten eines Patienten mit einem Burkitt-Lymphom ab. Diese

Suspensionszellen sind B-Lymphozyten, wie auch die CLL-Zellen. Leider lassen sich Rajis

nichtviral wenig effizient transfizieren.

Für COS-, Jurkat-, K562- und Raji-Zellen ist in Abb. 3.-11. die Modulation der mCD137-

Expression durch die Transfektion gezeigt.

Ergebnisse

75

Abb. 3.-11.: 48 h nach Transfektion mit einem CD137-sense-Expressionsvektor synthetisieren die an-

gegebenen Zellinien deutlich mehr mCD137 als nach der Transfektion mit einem Kon-

trollvektor. FACS-Analysen der angegebenen Zellinien mit einem anti-CD137-RPE-Anti-

körper (durchgezogene Linie); zur Kontrolle ist die Färbung mit einem RPE-gekoppelten Iso-

typantikörper gezeigt (getüpfelte Linie); Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS:

CMV-ILA-sen, RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sen; angegeben ist der Anteil CD137-positiver Zel-

len bezogen auf die Isotypkontrolle in Prozent.

COS

K562

Jurkat

Raji

Ergebnisse

76

Die transfizierten Zellen wurden als Zielzellen im LAK-Assay eingesetzt. LAK-Zellen sind

PBMCs, die für drei Tage hohen IL-2-Konzentrationen (100 ng/ml) ausgesetzt waren. Bei

diesen Zellen handelt es sich hauptsächlich um unspezifische zytotoxische T-Zellen.

Für alle untersuchten Zellinien ergab sich, daß Zellen, die mCD137 auf ihrer Oberfläche ex-

primieren, gegenüber Zellen, die mit dem Kontrollvektor transfiziert wurden, eine verminder-

te Lyserate aufwiesen (vgl. Abb. 3.-12.).

COS K562

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1: 2,5 1: 10 1:25 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACMV-ILA-sen

05

10152025

3035404550

1: 2,5 1:10 1: 25 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSVRSV-ILA-sen

Jurkat Raji

05

10152025

3035404550

1: 2,5 1: 10 1: 25 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACMV-ILA-sen

02468

10

1214161820

1: 2,5 1: 10 1: 25 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSVRSV-ILA-sen

Abb. 3.-12.: Die Expression von mCD137 durch verschiedene Zellinien schützt diese vor LAK-vermit-

telter Zytolyse. LAK-Assays mit den angegebenen Konstrukten transfizierter Zellinien. Ge-

zeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist

eines von je drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

77

3.3.2. Verifizierung der durch mCD137 vermittelten Verminderung

der zytotoxischen Lyse

Die Verminderung der zytotoxischen Lyse durch mCD137 wurde mit zwei weiteren Ver-

suchsansätzen bestätigt: Zum einen wurden Transfektionen mit einem antisense-Konstrukt

auf der Basis des Vektors pcDNA3.1. durchgeführt, um die CD137-Expression der Zellen

spezifisch zu inhibieren, zum anderen wurde das von den transfizierten Zellen gebildete

mCD137 mit einem Antikörper gegen CD137 blockiert.

3.3.2.1. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Transfektion mit

einem antisense-Vektor

Um eine Veränderung der Zytolyse über die Regulation von mCD137 an COS-Zellen nach-

weisen zu können, wurden Transfektionsexperimente mit sense- und antisense-Vektoren

durchgeführt.

Das Blockieren der Translation durch antisense-RNAs beruht zum einen darauf, daß sich der

Translationsapparat der Zelle an die dsRNAs, die durch die Hybridisierung der sense- und an-

tisense-RNA entstehen, nicht anlagern kann. Zum anderen werden dsRNAs in der Zelle von

spezifischen RNasen abgebaut, da in der gesunden Zelle dsRNAs vorwiegend als Folge vira-

ler Infektion vorkommen.

COS-Zellen, die selbst kein endogenes mCD137 exprimieren, wurden mit 0,3 µg RSV-ILA-

sen/2,7 µg RSV, mit 0,3 µg RSV/2,7 µg RSV-ILA-antisen, mit 0,3 µg RSV-ILA-sen/2,7 µg

RSV-ILA-antisen und zur Kontrolle mit 3,0 µg RSV alleine transfiziert. Das hier verwendete

Verhältnis von 1:10 sense-:antisense-Vektor wurde in Vorversuchen als optimal ermittelt. Ein

Überschuß an antisense-RNA ist notwendig, wenn mit full-length-Transkripten die Trans-

lation einer mRNA verhindert werden soll. Die transfizierten Zellen wurden nach zwei Tagen

im LAK-Assay eingesetzt. Dabei zeigte sich, wie erwartet, daß eine Transfektion mit dem

antisense-Vektor alleine keinen Einfluß hat, da die COS-Zellen CD137 nicht konstitutiv ex-

primieren. Eine Transfektion mit RSV-ILA-sen vermindert die gemessene Zytolyse deutlich,

während die mit RSV-ILA-sen und RSV-ILA-antisen kotransfizierten Zellen deutlich stärker

lysiert werden (vgl. Abb. 3.-13.).

Die verminderte zytotoxische Lyse ist folglich auf die Anwesendheit von CD137 in der

Membran der Zielzellen zurückzuführen.

Ergebnisse

78

0

5

10

15

20

25

2,5 10 25 50

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSVRSV/ RISRIA/ RSVRIA/ RIS

Abb. 3.-13.: Kotransfektion mit einem CD137-antisense-Vektor hebt die durch mCD137-vermittelte

Verminderung der Empfindlichkeit gegenüber zytotoxischer Lyse teilweise auf. LAK-

Assay mit COS-Zellen, die 48 h vor dem Experiment mit den angegebenen Konstrukten trans-

fiziert wurden; RSV: pcDNA-Expressionsvektor mit RSV-Promotor, RSV/ RIS: 2,7 µg RSV /

0,3 µg RSV-ILA-cis, RIA/ RSV: 2,7 µg RSV-ILA-antisense / 0,3 µg RSV, RIA/ RIS: 2,7 µg

RSV-ILA-antisense/ 0,3 µg RSV-ILA-cis. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestim-

mungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.

In Abb. 3.-14. ist die Rekonstitution der Empfindlichkeit antisense-transfizierter Zielzellen

gegenüber der LAK-Lyse für Zellinien dargestellt, die konstitutiv mCD137 exprimieren. Die

konstitutive Expression von mCD137 in K562 und Rajizellen, sowie die Modulation der Ex-

pression nach Transfektion dieser Zellinien zeigen Abb. 3.-11. und 3.-15..

K562 Raji

05

10152025

303540

4550

1: 1 1: 10 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSV

RIS

RIA

0

5

10

15

20

25

30

1: 1 1: 10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSV

RIS

RIA

Abb. 3.-14.: Korrelation der CD137-Expression mit der Sensibilität verschiedener Zellinien gegen-

über LAK-Lyse. LAK-Assay der mit den angegebenen Vektoren transfizierten Zellen. Trans-

fektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense. Gezeigt sind

die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von

je drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

79

K562 Raji

Abb. 3.-15.: Durch die Transfektion mit einem CD137-antisense-Konstrukten kann die mCD137-Ex-

pression verschiedener Zellinien moduliert werden. FACS-Analysen mit CD137-sense- und

-antisense Vektoren transfizierter Zellinien; dargestellt ist die Färbung mit einem anti-CD137-

RPE-Antikörper (durchgezogene Linien) gegenüber der Färbung mit einem Isotypkontrollanti-

körper (getüpfelte Linie); angegeben ist der Anteil an CD137-positiven Zellen in Prozent ge-

genüber der Kontrollfärbung; dargestellt ist eines von je drei unabhängigen Experimenten.

Da K562 und Rajis mCD137 endogen exprimieren, bewirkt die Transfektion mit RSV-ILA-

sen eine Erhöhung der konstitutiven Expression, wie sie nach der Transfektion mit dem Leer-

vektor RSV detektiert werden kann. Die Transfektion mit RSV-ILA-antisen verringert die Ex-

pression an CD137-Protein auf der Zelloberfläche der transfizierten Zellen. In Einklang mit

der veränderten Dichte an mCD137 werden Raji- und K562-Zellen, die mit RSV-ILA-sen

transfiziert wurden, weniger stark lysiert. Dieser Schutz wird durch die Transfektion des anti-

sense-Vektors jedoch aufgehoben: antisense-transfizierte Zellen werden stärker lysiert als

kontroll-transfizierte.

Ergebnisse

80

3.3.2.2. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Vorinkubation der

Zielzellen mit dem anti-CD137-Antikörper bbk-2

Für transfizierte COS- sowie für Raji-Zellen wurden Neutralisierungsexperimente durchge-

führt. Dabei wurden CD137-exprimierende Zellen mit einem Antikörper gegen CD137 inku-

biert. Dadurch kann keine Interaktion zwischen CD137 und seinem Liganden mehr stattfin-

den, da der Antikörper an CD137-Moleküle auf der Zelloberfläche bindet und so die Bin-

dung von CD137 an seinen Liganden verhindert.

Wieder dienten die gut transfizierbaren COS-Zellen dazu, das Prinzip zu belegen. Mit der Zu-

gabe des Serums nach der Transfektion erfolgte die Gabe von 5 µg/ml des blockierenden anti-

CD137-Antikörpers bbk-2 (LEE U.-H. et al., 2002) bzw. seiner Isotypkontrolle MOP-C21. Die so

behandelten Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion im LAK-Assay eingesetzt.

Die mit dem Antikörper inkubierten und pcDNA-ILA-sen-transfizierten Zellen zeigen eine

deutlich höhere Empfindlichkeit gegenüber der Lyse als Zellen, die mit einem Isotypkontroll-

Antikörper behandelt wurden, wenngleich sie nicht so empfindlich wie die kontrolltransfizier-

ten Zellen reagieren. Auf die kontrolltransfizierten Zellen hat die Zugabe der Antikörper er-

wartungsgemäß keinen Einfluß (vgl. Abb. 3.-16.).

Abb. 3.-16.: Die Neutralisierung von mCD137 erhöht die Empfindlichkeit von CD137-transfizierten

COS-Zellen gegenüber der LAK-Lyse. LAK-Assay von COS-Zellen, die mit den angegebe-

nen Konstrukten transfiziert und mit je 5 µg/ml der angegebenen Antikörper ün inkubiert wur-

den; CIS: CMV-ILA-sense; bbk-2: Maus-IgG1 anti-CD137-Antikörper, MOP-C21 Maus-

IgG1. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dar-

gestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.

0

5

10

15

20

25

1: 5 1: 10 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNA3---

pcDNA3 MOP-C21

pcDNA3 bbk-2

CIS ---

CIS MOP-C21

CIS bbk-2

Ergebnisse

81

Daß CD137-transfizierte COS-Zellen trotz der Antikörperbehandlung nicht so sensitiv auf die

LAK-Lyse reagieren wie pcDNA-transfizierte COS kann zwei Gründe haben: Zum einen muß

damit gerechnet werden, daß es zu einer Überexpression von CD137 in der Membran kommt,

da CD137 vom verwendeten Expressionskonstrukt über den sehr starken viralen CMV-Pro-

motor exprimiert wird. Es ist daher möglich, daß die eingesetzte bbk-2-Konzentration nicht

ausreicht, um sämtliche CD137-Molekülkomplexe in der Membran zu blockieren. Ein weite-

rer Grund für die eingeschränkte Sensibilität der bbk-2-behandelten, CD137-transfizierten

COS-Zellen kann darin bestehen, daß eine Signalübertragung durch CD137 selbst für einen

Teil des Effekts verantwortlich ist. In diesem Fall könnte der Antikörper eine Oligomeri-

sierung von mCD137 und damit ein Signal in die Zelle verhindern.

Um auf Transfektionen und die damit verbundene Überexpression verzichten zu können, wur-

den Neutralisierungsexperimente mit untransfizierten Raji-Zellen durchgeführt.

Rajis exprimieren CD137 konstitutiv auf ihrer Oberfläche (vgl. Abb. 3.-14.). Sie wurden ohne

vorherige Transfektion über Nacht mit bbk-2 vorinkubiert und anschließend im LAK-Assay

eingesetzt. Die Empfindlichkeit gegenüber der zytotoxischen Lyse der LAK-Zellen erhöht

sich mit ansteigenden Antikörperkonzentrationen, wie durch dose-response-Experimente mit

bbk-2-Konzentrationen von 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml und 5,0 µg/ml gezeigt werden konnte (Abb.

3.-17.).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1: 5 1: 10 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

---MOP-C21bbk-2 [0,5]bbk-2 [1,0]bbk-2 [5,0]

Abb. 3.-17.: Mit steigender Konzentration erhöht der anti-CD137-Antikörper bbk-2 die Empfindlich-

keit der Raji-Zellen gegenüber der Lyse durch LAK-Zellen. LAK-Assay der über Nacht

mit den angegebenen Antikörperkonzentrationen vorinkubierten Raji-Zellen; bbk-2: Maus-

IgG1 anti-CD137-Antikörper, MOP-C21 Maus-IgG1. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechs-

fachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experi-

menten.

Ergebnisse

82

Aus den obigen Experimenten folgt, daß die Reduktion der zytotoxischen Lyse von CD137-

exprimierenden Zellen spezifisch durch mCD137 vermittelt wird. Die Neutralisation von

membrangebundenem CD137 hebt die durch mCD137 vermittelte verminderte Empfindlich-

keit gegenüber der LAK-Lyse zumindest teilweise auf. Das läßt darauf schließen, daß der

Effekt nicht zuletzt auf reverser Signalübertragung durch den CD137-Liganden beruht.

3.3.3. Mechanismus der Verminderung der LAK-Antwort durch

mCD137

Für die Reduzierung der LAK-vermittelten Zytolyse kommen mehrere Mechanismen in Fra-

ge: So können zum einen direkte Effekte durch mCD137 eine Rolle spielen, wie z.B. die In-

duktion von Apoptose in LAKs. Dieser Effekt von mCD137 bzw. immobilisiertem CD137

auf aktivierte T-Zellen ist bei SCHWARZ H. et al., 1996 und MICHEL J. et al., 1999 beschrie-

ben. Zum anderen sind indirekte Effekte, beispielsweise die Induktion von Zytokinen denk-

bar, die die LAK-Lyse hemmen.

3.3.3.1. Verminderung der Lyserate mCD137-tragender Zellen durch Apoptosein-

duktion in LAK-Zellen

Aufgrund der Arbeiten von H. SCHWARZ und J. MICHEL (SCHWARZ H. et al., 1996, MICHEL J. et al.,

1999), wurde vermutet, daß auf den Zielzellen exprimiertes mCD137 in den LAK-Zellen Apo-

ptose induziert, so daß diese weniger Zielzellen lysieren können. Um diese Hypothese zu

überprüfen, wurden folgende Versuche durchgeführt:

pcDNA- oder CMV-ILA-sen-transfizierte Tumorzellinien wurden zwei Tage nach der Trans-

fektion zusammen mit unterschiedlichen Verhältnissen an LAK-Zellen für 5 bzw. 20 h inku-

biert. Die Zellen wurden gewaschen und mit AnnexinV-Fluorescin, sowie PI gefärbt. In der

FSC/SSC-Darstellung am Durchflußzytometer (FACS) konnten die LAK-Zellen und die

transfizierten Tumorzellen auf Grund ihrer Größe und Granularität unterschieden und so

einzeln analysiert werden (vgl. Abb. 3.-19.).

Die LAK-Zellen wurden hinsichtlich der Verteilung lebender, apoptotischer und nekrotischer

Zellen betrachtet. Dabei zeigte sich, daß die Inkubation der Effektorzellen mit mCD137-ex-

primierenden Zielzellen die Menge an apoptotischen LAK-Zellen innerhalb von 6 bis 20 h

allenfalls leicht erhöht (vgl. Tab. 3.-3.).

Ergebnisse

83

COS K562 Raji

Abb. 3.-18.: FSC/SSC-FACS-Diagramm der Gemische aus den transfizierten Zellinien (R3) und den

LAK-Zellen (R1 und R2), um zu zeigen, daß man beide Populationen anhand der Unter-

schiede in der Größe (FSC) und der Granularität (SSC) der Zellen auseinanderhalten

und so einzeln analysieren kann. R1: sterbende Lymphozyten (apopototische, spätapoptoti-

sche und nekrotische Zellen), R2: lebende Lymphozyten, R3: eingesetzte Zellinie. Dargestellt

ist eines von je drei repräsentativen Experimenten.

Zielzellen

transfiziert

mit

t:e-

Verhältnis

AnnexinV-

PI-

(vitale Zellen)

AnnexinV-

PI+

(nekrotische

Zellen)

AnnexinV+

PI-

(frühapoptoti-

sche Zellen)

AnnexinV+

PI+

(spätapoptoti-

sche Zellen)

ohne 76,45 2,42 5,30 15,83

1: 1 70,71 2,64 9,50 17,15

pcDNA 1:2,5 76,97 2,09 5,83 15,11

1: 10 78,31 2,07 5,08 14,53

1: 1 71,29 2,94 6,27 19,51

CMV-ILA-sen 1:2,5 72,05 3,17 6,00 18,78

1: 10 74,83 2,92 5,57 16,68

Tab. 3.-3.: Durch mCD137 vermittelte Apoptose von LAK-Zellen hat nur einen geringen Einfluß auf

den Zytolyse-vermindernden Effekt, der im LAK-Assay beobachtet wurde. Angegeben

sind die prozentualen Anteile an LAK-Zellen im jeweiligen Quadranten aus einem von drei

FACS-Experimenten. Transfizierte COS-Zellen wurden ün mit LAK-Zellen inkubiert, die da-

nach über AnnexinV-Fluorescin/ PI-Färbung im FACS analysiert wurden.

Auch für K562 und Rajis konnte gezeigt werden, daß mCD137-Expression der Zielzellen die

Apoptose der LAK-Zellen nur geringfügig erhöht (vgl. Abb. 3.-20.).

Ergebnisse

84

K562

CMV-ILA-sen

K562

pcDNA

Lymphozyten

alleine

Ergebnisse

85

Abb. 3.-19.: LAK-Zellen, die mit mCD137-exprimierenden Tumorzellen kultiviert wurden, zeigen nur

geringfügig mehr Apoptose als LAKs, die mit Kontrollzellen inkubiert wurden. FACS der

Lymphozyten eines Zellgemisches aus LAK- und transfizierten Tumorzellen in verschiedenen

e:t-Verhältnissen; Färbung: AnnexinV-Fluorescin(FL1-H)/PI(FL3-H)-Doppelfärbung; unter

den dotplots sind die prozentualen Anteile der in den jeweiligen Quadranten enthaltenen Ereig-

nisse angegeben. Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experimenten.

Raji

pcDNA

Raji

CMV-ILA-sen

Ergebnisse

86

Der lediglich leichte Anstieg an apoptotischen LAK-Zellen innerhalb von 20 h kann die signi-

fikanten Unterschiede in den Lyseraten zwischen pcDNA- und CMV-ILA-sen-transfizierten

Zellen in den LAK-Assays, bei denen die Ziel- und Effektorzellen nur 4 h miteinander inku-

biert werden, nicht erschöpfend erklären.

Um auszuschließen, daß es sich um eine Form der Apoptose handelt, bei der die Apoptose-

kennzeichen an der Membran verzögert auftreten, wurden Caspase3-Aktivitätsassays durch-

geführt. Caspase3 ist eine Effektorcaspase am Ende der Caspase-Kaskade und verbindet zu-

sammen mit Caspase7 den mitochondrialen Weg der Apoptoseinduktion mit dem rezeptorver-

mittelten Weg. Für die Caspase3-Assays wurden Zellextrakte von LAK-Zellen, die für 20 h

auf immobilisierten CD137-Fc bzw. Fc-Protein kultiviert worden waren, verwendet.

Aber auch hier zeigten sich nur geringe Unterschiede zwischen der Caspaseaktivität von

LAK-Zellextrakten nach Kultur auf immobilisierten CD137-Fc und solchen nach Inkubation

mit Fc-Kontrollprotein. Untersucht man Zellextrakte von LAKs, die für 20 h auf Glutaralde-

hyd-fixierten, mit CMV-ILA-sen bzw. pcDNA3-transfizierten COS-Zellen kultiviert wurden,

erhält man vergleichbare Ergebnisse (vgl. Abb. 3.-20.).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Casp3gereinigt(30 U)

--- Fc CD137-Fc

COSpcDNA

COSCIS

OD

405

nm

Abb. 3.-20.: LAK-Zellen zeigen nach Inkubation mit mCD137-tragenden Zellen bzw. immobilisiertem

CD137-Fc-Protein nur geringfügig höhere Caspase3-Aktivität als LAKs, die auf

Kontroll-zellen oder Kontrollprotein kultiviert wurden. Caspase3-Aktivitätsassay mit

Zellextrakten von Zellen die 20 h auf Fc- bzw. CD137-Fc beschichteten Platten kultiviert

wurden bzw. mit Glutharaldehyd-fixierten, pcDNA- oder CMV-ILA-cis (CIS)-transfizierten

COS-Zellen (Fixierung 48h nach der Transfektion); eingesetzt wurden jeweils 10 µg Gesamt-

protein. Da es sich bei den Balken im Diagramm um den Mittelwert von Doppelbestimmungen

handelt, sind keine Standardabweichungen angegeben. Gezeigt ist eines von drei unabhängigen

Experimenten.

Ergebnisse

87

3.3.3.2. Die Rolle von Zytokinen in der mCD137-vermittelten Reduktion der

LAK-Lyse

Da kein signifikanter direkter Effekt über die Induktion von Apoptose in den Effektorzellen

nachzuweisen war, wurde untersucht, ob Effektor- oder Zielzellen durch mCD137 angeregt

werden, Zytokine zu sekretieren, die den Tumorzellen einen Überlebensvorteil bzw. ein Ent-

kommen aus der Immunüberwachung verschaffen können.

IL-10 ist ein wichtiges antiinflammatorisches Zytokin. Es fungiert als starker Inhibitor der

Th1-Zytokine, einschließlich IL-2 und IFNg und kann von B-Zellen sekretiert werden (OPAL

M. S. und DEPALO V. A., 2000). IL-10 gehört zu den Zytokinen, die von Tumoren sezerniert wer-

den, um der Immunabwehr zu entkommen (SALAZAR-ONFRAY F., 1999). Die Rolle von IL-10 in

der CLL wird kontrovers diskutiert: MEINHARDT G. et al. (1999) sprechen von „überzeugen-

den Hinweisen“ darauf, daß IL-10 das Überleben und die Proliferation aktivierter CLL-Zel-

len fördert und diese vor programmiertem Zelltod schützt (KITABAYASHI A., 1995). Andere

Autoren beschreiben, daß IL-10 die in vitro-Proliferation aktivierter B-CLL-Zellen hemmt

(TANGYE S. G. et al., 1998) und Apoptose induziert (FLUCKINGER A. C. et al., 1994). IL-10 kann im

Serum von CLL-Patienten detektiert werden und korreliert revers mit dem Krankheitsverlauf

(AGUILAR-SANTELISES M. et al., 1999; SJÖBERG J. et al., 1995; 1996).

TGFß ist ein weiteres antiinflammatorisches Zytokin, das während der Tumorentstehung und

-progression eine nicht unbedeutende Rolle spielt. So reguliert dieses Zytokin normalerweise

das Zellwachstum. Viele Zelltypen werden jedoch während der Entartung unempfindlich

gegen die inhibitorischen Wirkungen von TGFß. Aktiv von Tumorzellen sezerniertes TGFß

kann zu Tumorwachstum, -metastasierung und Angiogenese beitragen (HATA A., 2001; PASCHE

B., 2001; WIESER R., 2001). TGFß wird von B-Zellen und Zellen myeloiden Ursprungs sekretiert

(BECK C. et al., 2001), so auch von B-CLL-Zellen (SCHULER M. et al., 1998). Die Effekte von TGFß

auf CLL-Zellen scheinen nicht eindeutig zu sein: Im erwähnten Artikel beschreibt M. SCHU-

LER die antiproliferative Wirkung von endogenem und von exogenem TGFß. L. LANGNEAUX

et al. hingegen zeigen in einer Studie, daß die Lymphozyten von sechs von 21 CLL-Patienten

keinerlei Proliferationsinhibition durch TGFß erfahren (LANGNEAUX L. et al., 1997). G. MEIN-

HARDT führt TGFß unter „Faktoren mit vermischten oder widersprüchlichen Effekten“ an:

Zum einen inhibiert TGFß die Proliferation von B-CLL-Zellen, wenn auch in geringerem

Maße als die nativer B-Zellen, andererseits spricht er von einem proliferativen Vorteil für den

malignen B-Zell-Klon durch die verminderte Sensitivität der CLL-Zellen gegenüber dem Zy-

tokin, so daß eine verstärkte TGFß-Sekretion von leukämischen und Stroma-Zellen in der

CLL zwar normale Knochenmarkszellen hemmt, der leukämische B-Zellen aber expandieren

Ergebnisse

88

kann. Zudem sind B-CLL-Zellen resistent gegenüber TGFß-vermittelter Apoptose (DOUGLAS R.

S. et al., 1989).

3.3.3.2.1. Die Rolle von IL-10 in der mCD137-vermittelten Reduktion der LAK-

Lyse

Um Aufschluß über sezernierte Zytokine zu erhalten, wurden die LAK-Zellen auf mit im-

mobilisierten CD137-Fc-Fusionsprotein bzw. Fc-Kontrollprotein beschichteten Polystyrol-

platten kultiviert. Nach 48 h wurden zellfreie Überstände präpariert und deren Konzentration

an IL-10 im ELISA analysiert.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

--- Fc CD137-Fc

pg/ m

l IL

-10

Abb. 3.-21.: Immobilisiertes CD137 hat keinen Einfluß auf die IL-10-Sekretion von LAK-Zellen.

ELISA gegen IL-10 mit Überständen von LAK-Zellen, die 48 h auf immobilisierten CD137-Fc

bzw. Fc-Kontrollprotein kultiviert wurden. Die Zellkulturplatten wurden mit 10 µg/ml CD137-

Fc oder der äquimolaren Menge von 5 µg/ml Fc-Kontrollprotein beschichtet. Eingesetzt wur-

den 5 x 106 Zellen/ml. Gezeigt sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardab-

weichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.

Wie Abb. 3.-21. zeigt, gibt es keine Unterschiede in der IL-10-Produktion der LAK-Zellen in

Abhängigkeit von der Anwesendheit von immobilisiertem CD137.

Da ein im LAK-Assay wirksames Zytokin nicht notwendig von den LAK-Zellen selbst gebil-

det werden muß, untersuchte ich Überstände der transfizierten Tumorzellinien auf CD137-

vermittelte IL-10-Freisetzung. Hierbei zeigte sich, daß K562-Zellen keinerlei nachweisbares

IL-10 sezernieren. Raji-Zellen produzieren zwar IL-10, die Konzentration dieses Zytokins im

Überstand steht jedoch nicht in Zusammenhang mit der Menge an mCD137, die auf der Ober-

fläche exprimiert wird (s. Abb. 3.-22.). Offensichtlich ist IL-10 für die mCD137-vermittelte

Inhibition der Lyse im LAK-Assay nicht verantwortlich.

Ergebnisse

89

0

500

1000

1500

2000

2500

RSV RIS RIA

pg/m

l IL

-10

Abb. 3.-22.: Die Höhe der Expression von mCD137 durch Raji-Zellen beeinflußt deren IL-10-Produk-

tion nicht. IL-10-ELISA von zellfreien Überständen transfizierter Rajis, die 48 h nach der

Transfektion gewonnen wurden. Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sense,

RIA: RSV-ILA-antisense. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen ± Standard-

abweichung. Dargestellt ist eines von fünf unabhängigen Experimenten.

3.3.3.2.2. Die Rolle von TGFß1 in der mCD137-vermittelten Reduktion der LAK-

Lyse

Wir betrachteten daher TGFß, ein weiteres als nicht nur als immunsuppressiv (OPAL S. M. und

DEPALO V. A., 2000), sondern auch als Überlebensfaktor für Tumore bekanntes Zytokin (WIESER

R., 2001). Analog zu den obigen Versuchen wurden zellfreie Überstände von LAK-Zellen prä-

pariert, die 48 h auf immobilisiertem CD137 bzw. Fc-Kontrollprotein kultiviert worden wa-

ren. Diese wurden mittels ELISA auf ihren Gehalt an TGFß1 untersucht.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

--- Fc CD137-Fc

pg/ m

l TG

Fß1

Abb. 3.-23.: Die Kultur auf immobilisiertem CD137-Fc hat keinen Einfluß auf die TGFß1-Sekretion

von LAK-Zellen. TGFß1-ELISA mit Überständen von 5 x 106 LAK-Zellen/ ml, die 48 h auf

mit 5 µg/ml Fc-Protein bzw. 10 µg/ml CD137-Fc beschichteten Polystyrolplatten kultiviert

wurden. Die Überstände stammen aus dem gleichen Experiment wie die für Abb. 3-22.. Ge-

zeigt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist

eines von fünf unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

90

Abb. 3.-23. zeigt, daß die durch LAK-Zellen sekretierte TGFß-Konzentration auf immobili-

siertem CD137 nicht ansteigt, sondern im Gegenteil eher leicht abnimmt.

Auch hier untersuchte ic, in wieweit die transfizierten Zellen selbst in der Lage sind, auf die

Anwesendheit von mCD137 mit der Produktion von TGFß zu reagieren. Zellfreie Überstän-

de, die 48 h nach Transfektion präpariert wurden, zeigen für alle untersuchten Zellinien einen

Anstieg von TGFß, wenn mCD137 auf den Zellen vorhanden ist (Abb. 3.-24.).

K562

0

200

400

600

800

1000

1200

RSV RIS RIA

pg/m

l TG

Fb

Raji

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

RSV RIS RIA

pg/m

l TG

Fß1

Abb. 3.-24.: Die Menge an membrangebundenen CD137 transfizierter Zellen hat deutlichen Einfluß

auf die TGFß1-Sekretion der Zellen: Je mehr CD137 auf der Membran exprimiert wird,

um so höher ist die TGFß1-Sekretion der Zellen. TGFß1-ELISA der Überstände transfizi-

erter Zellen 48 h nach der Transfektion; Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-

sense, RIA: RSV-ILA-antisense; die Rajis-Überstände stammen aus dem gleichen Experiment,

das für Abb. 3.-22. verwendet wurde. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen

± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von je fünf unabhängigen Experimenten.

Ein Anstieg der in den Zellkulturüberständen vorhandenen TGFß1-Konzentration konnte so-

wohl für K562 als auch für Rajis gezeigt werden. Wird auf der Zelle vorhandenes mCD137

Ergebnisse

91

durch Transfektion mit einem antisense-Vektor herabreguliert, sinkt auch die TGFß1-Kon-

zentration. Die TGFß1-Freisetzung durch die transfizierten Zellen erfolgt in Abhängigkeit

von der mCD137-Expression der Zellen. Da TGFß1 ein durch verschiedene Tierarten hoch

kon-serviertes Molekül ist, konnte der Anstieg von TGFß nach Transfektion mit mCD137

auch für COS-Zellen belegt werden (nicht gezeigt).

3.3.3.3. Spezifität der Zytokinwirkung

Um nachzuweisen, daß das sezernierte TGFß1 für die Reduktion der LAK-Lyse verantwort-

lich ist, fertigten wir LAK-Assays an, zu denen in den Assay-Ansatz 5 µg/ml neutralisieren-

de TGFß1- bzw. Isotypkontrollantikörper gegeben wurden.

K562

0

5

10

15

20

25

30

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSV/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ IgGRIS/ antiTGFßRIA/ IgGRIA/ antiTGFß

Raji

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSV/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ IgGRIS/ antiTGFßRIA/ IgGRIA/ antiTGFß

Abb. 3.-25.: Die Zugabe neutralisierender anti-TGFß1-Antikörper direkt zum LAK-Assay hat kaum

Einfluß auf die Lyserate von K562- und Raji-Zellen. LAK-Assays mit transfizierten Zellen

unter Zugabe von 5 µg/ml neutralisierenden Antikörpern gegen TGFß1 direkt in das LAK-

Assay; Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense.

Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt

ist eines von drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

92

Dabei zeigte sich, daß die direkte Zugabe neutralisierender anti-TGFß1-Antikörper in das

LAK-Assay kaum Einfluß auf die Lyserate hat (Abb. 3.-25.).

Da alle Zellen, bevor sie im LAK-Assay eingesetzt wurden, gewaschen wurden, sind die lösli-

chen Zytokine im Assay selbst nicht mehr vorhanden. Eine Neusynthese ist bei der Assay-

dauer von vier Stunden vernachlässigbar. Um auszuschließen, daß bereits während der Inku-

bation nach der Transfektion der Zielzellen die Sensitivität dieser Zellen gegenüber der spä-

teren Lyse durch Zytokine beeinflußt wurde, wurde mit der Zugabe des Serums nach der

Transfektion den transfizierten Zellen 5 µg/ml neutralisierender anti-IL-10- bzw. anti-TGFß1-

Antikörpers oder der jeweiligen Isotypkontrolle zugefügt.

Diese Versuchsanordnung zeigte, daß die Inkubation der Zielzellen mit einem neutralisieren-

den anti-IL-10-Antikörper deren Empfindlichkeit gegenüber zytotoxischer Lyse etwas erhöht,

ohne jedoch das Verhältnis der Lysekurven für CD137-sense-, -antisense- und kontrollvektor-

transfizierte Zellen zu verändern (s. Abb. 3.-26.).

0

10

20

30

40

50

60

1:5 1:10 1:50

e:t-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSV/ IgGRIS/ IgGRIA/ IgGRSV/ antiIL-10RIS/ antiIL-10RIA/ antiIL-10

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RSV RIS RIA

Pro

zent

Zyt

otox

iozi

tät

Abb. 3-26.: Vorinkubation mit neutralisierenden anti-IL-10-Antikörpern hebt die Empfindlichkeit

der Targetzellen gegenüber der LAK-Lyse an, unabhängig von der Expression von

mCD137. LAK-Assay mit transfizierten Raji-Zellen, die 5 µg/ml der angegebenen Antikörper

zusammen mit dem Serum nach der Transfektion erhielten; Transfektionskonstrukte: RSV:

RSV, RIS: RSV-ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense. Die Abb. rechts zeigt zur Verdeutli-

chung ein Balkendiagramm der 1:10-Bedingung; die jeweils dunkleren Balken eines Balken-

paares zeigen die Isotypkontrolle der jeweiligen Bedingung, die helleren Balken die Lyserate

nach Vorinkubation der Zellen mit neutralisierenden anti-IL-10-Antikörpern. Die Abb. zeigt

ein Experiment mit Raji-Zellen. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ±

Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

93

Der Einfluß neutralisierender IL-10-Antikörper auf die CD137-vermittelte Reduktion der

LAK-Lyse paßt gut zu den Ergebnissen aus den ELISAs, nach denen IL-10 in Raji-Kulturen

unabhängig vom Vorhandensein von mCD37 auf den Zellen in ähnlichen Konzentrationen

freigesetzt wird. IL-10 hemmt die Zytolyse unabhängig von mCD137.

Neutralisierende anti-TGFß1-Antikörper heben die Zytolyserate ebenfalls an. Daher liegen

die Lysekurven der RSV-, RIS- und RIA-transfizierten Zellen auf etwa demselben Niveau

und der deutliche, durch mCD137 bewirkte Schutz der Targetzellen vor der LAK-Lyse unter

dem Einfluß des anti-TGFß1-Antikörpers verschwindet (vgl. Abb. 3-27.).

Neutralisierende anti-TGFß1-Antikörper bewirken erst nach der Vorinkubation mit den Ziel-

zellen eine Aufhebung des mCD137-vermittelten Schutzes vor Lyse. Das ist ein deutlicher

Hinweis darauf, daß die Hemmung der Zytolyse über die Targetzellen vermittelt wird. Das

dafür verantwortliche Molekül ist TGFß1.

Ergebnisse

94

K562

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ätRSV/ IgGRIS/ IgGRIA/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ antiTGFßRIA/ antiTGFß

0

5

10

15

20

25

30

RSV RIS RIA

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

Raji

0

10

20

30

40

50

60

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

RSV/ IgGRIS/ IgGRIA/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ antiTGFßRIA/ antiTGFß

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RSV RIS RIA

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

Abb. 3-27.: Vorinkubation mit neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern hebt die Empfindlichkeit

der Targetzellen gegenüber der LAK-Lyse abhängig von der mCD137-Expression an.

LAK-Assay mit transfizierten Zellen, die 5 µg/ml der angegebenen Antikörper zusammen mit

dem Serum nach der Transfektion erhielten; Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-

ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense; Die Abb. rechts zeigen zur Verdeutlichung ein Balken-

diagramm der 1:10-Bedingungen. Die jeweils dunkleren Balken eines Balkenpaares zeigen die

Isotypkontrolle der jeweiligen Bedingung, die helleren Balken die Lyserate nach Vorinkuba-

tion der Zellen mit neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern. Gezeigt sind die Mittelwerte

aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhän-

gigen Experimenten.

3.3.3.4. Induktion der TGFß-Freisetzung durch mCD137 oder den CD137-Ligand

Bisher wurde die Frage, durch welchen Mechanismus die TGFß-Induktion und die Reduktion

der Lyserate bewirkt wird, nur am Rand behandelt: Über mCD137 oder seinen Liganden?

Weder die Ergebnisse, der Zytolyse-Experimente mit den antisense-Konstrukten noch die

Versuche, die CD137-CD137-Ligand-Wechselwirkung durch anti-CD137-Antikörper zu blo-

ckieren, enthalten keine eindeutige Antwort auf die Frage, ob der zytolysesenkende Effekt des

Ergebnisse

95

membrangebundenen CD137 auf einem mCD137-Signal oder einem Signal durch den Li-

ganden beruht.

Um zu klären, auf welchem Molekül die Senkung der Zytolyse CD137-tragender Zellen be-

ruht, konstruierte ich einen Expressionsvektor auf der Basis des Vektors pcDNA3.1. In diesen

wurde ein über PCR amplifiziertes Fragment von CD137 kloniert, das dem full-length-Tran-

skript ohne die zytoplasmatische Domäne entspricht. Ein von diesem Vektor exprimiertes

CD137-Molekül besitzt die extrazelluläre Domäne, die Signalsequenz zum Membrandurch-

tritt und die Transmembrandomäne von CD137, die es in der Zellmembran verankert. Ihm

fehlt aber der gesamte intrazelluläre Anteil, der für die Signalübertragung notwendig ist.

Eine mit diesem Vektor transfizierte Zelle präsentiert mCD137 seinem Liganden und ver-

netzt diesen. Ein Signal durch mCD137 ins Zellinnere ist jedoch aufgrund der fehlenden intra-

zellulären Domänen des Proteins nicht mehr möglich. Im Gegenteil, trimerisiert solch ein

trunkiertes CD137-Molekül im Zuge der Multimerisierung mit intakten CD137-Molekülen in

der Zelloberfläche CD137-tragender Zellen, wie Rajis oder K562, so kann es aufgrund des

dominant-negativen Effekts die Signaltransduktion reduzieren oder völlig ausschalten.

Mit pcDNA-ILA-trunc transfizierte Zellen wurden zum einen im LAK-Assay eingesetzt, um

zu prüfen, ob ohne Signal durch mCD137 der zytolysesenkende Effekt weiterhin beobachtet

werden kann. Zum anderen wurden ELISAs gegen TGFß1 anfertigt, um den Einfluß eines

Signals durch mCD137 auf den TGFß1-Spiegel zu bestimmen. Zur Kontrolle wurde auch IL-

10 betrachtet.

Abb. 3.-28. zeigt das Ergebnis: pcDNA-ILA-trunc-transfizierte Zellen sind nicht gegen die

zytotoxische Lyse durch LAKs geschützt. Dies ist ein Hinweis darauf, daß der Schutz der

transfizierten Zellen vor der Zytolyse durch ein Signal über CD137 und nicht ein Signal durch

den Liganden vermittelt wird.

Ergebnisse

96

COS

0

5

10

15

20

25

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACIS/ pcDNApcDNA/ truncCIS/ trunc

K562

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACIStrunc

Raji

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACIStrunc

Abb. 3-28.: Die Expression eines CD137-Konstruktes ohne die intrazelluläre Domäne des Proteins

schützt Tumorzellen nicht vor Zytolyse. LAK-Assays mit transfizierten Zellinien; Transfek-

tionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS: CMV-ILA-sense, trunc: CMV-ILA-trunc. Gezeigt

sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist je-

weils eines von drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

97

Die Intrazellulärsequenz von CD137 ist für die Vermittlung der Reduktion der LAK-Lyse es-

sentiell. Es stellte sich daher die Frage, ob die intrazelluläre Domäne von CD137 auch für die

Freisetzung von TGFß verantwortlich ist. Die TGFß-Wirkung ist – wie oben gezeigt – (Kap.

3.3.3.2. und 3.3.3.3.) ebenfalls eine Vorraussetzung für die Herabsetzung der Empfindlich-

keit der Targetzellen gegenüber der Zytolyse.

K562

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

pcDNA CIS trunc

pg/ m

l TG

Fß1

Raji

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

pcDNA CIS trunc

pg/ m

l TG

Fß1

Abb. 3.-29.: Für die Erhöhung der TGFß1-Sekretion durch mCD137 ist die intrazelluläre Domäne

von CD137 nicht notwendig. TGFß1-ELISA mit Transfektionsüberständen der angegebenen

Zellinien, die 48 h nach der Transfektion gewonnen wurden. Transfektionskonstrukte: pcDNA:

pcDNA3.1., CIS: CMV-ILA-sense, trunc: CMV-ILAtrunc. Dargestellt sind die Mittelwerte aus

Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung. Gezeigt ist eines von je drei un-abhängigen

Experimenten. Die Überstände stammen aus dem in Abb. 3.-28. gezeigten Experiment.

Wie in Abb 3.-29. dargestellt, wird das Signal, TGFß1 zu sezernieren, nicht über mCD137

vermittelt. Die Signalübertragung zur TGF-Freisetzung erfolgt vielmehr über den Liganden,

der auf B-Lymphozyten (Raji), sowie auf myelotischen Zellen (K562) konstitutiv exprimiert

Ergebnisse

98

wird (KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000). CD137trunc-Moleküle unterscheiden sich auf der

Zellaußenseite nicht von intakten CD137-Molekülen und sollten über ihre plad-Domänen, die

im Molekül extrazelluär liegen, ihre Fähigkeit zur Oligomerisierung – auch mit intakten

CD137-Proteinen – beibehalten haben. Somit wären diese Moleküle durchaus in der Lage,

den CD137-Liganden zu vernetzen und damit die CD137-Ligand-tragenden Zellen zu stimu-

lieren.

Zur Kontrolle wurden IL-10-ELISAs angefertigt, da die IL-10-Produktion von Rajis in allen

vorherigen Experimenten unabhängig von der mCD137-Expression war. Abb. 3.-30. zeigt,

daß auch ein trunkiertes CD137 keinen Einfluß auf die IL-10-Sekretion besitzt.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

pcDNA CIS trunc

pg/ m

l IL

-10

Abb. 3.-30.: Die Fähigkeit von mCD137 zur Signaltransduktion beeinflußt die IL-10-Sekretion nicht.

IL-10-ELISA mit den Überständen transfizierter Raji-Zellen, die 48 h nach der Transfektion

gewonnen wurden; Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA3.1., CIS: CMV-ILA-sense,

trunc: CMV-ILAtrunc. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen ± Standard-

abweichung. Gezeigt ist eines von drei unabhängigen Experimenten. Die in diesem Experiment

verwendeten Überstände stammen aus demselben Versuch wie die Zellen und Überstände der

Abb. 3.-28. und 3.-29..

Zusammenfassend läßt sich sagen: Trunkiertes CD137 übt im LAK-Assay fast keinen zytoly-

sesenkenden Effekt aus. Das läßt vermuten, daß ein Signal durch mCD137 selbst für die

Reduktion der Lyse verantwortlich ist. Da eine Neutralisierung von TGFß1 ebenfalls den zy-

totoxizitätssenkenden Effekt aufhebt (vgl. Abb. 3.-27.), liegt die Vermutung nahe, daß die

Freisetzung von TGFß1 ebenfalls durch ein mCD137-Signal erreicht wird. Erstaunlicherweise

wird die TGFß-Sekretion durch das trunkierte CD137 jedoch nicht beeinflußt. Dies ist ein

Hinweis darauf, daß die Modulation von TGFß1 über CD137-Ligand vermittelt wird. Die IL-

Ergebnisse

99

10-Sekretion wird weder durch die Modulation der Expression von mCD137 noch durch die

Funktionsfähigkeit des CD137-Moleküls beeinflußt, wie Abb. 3-30. belegt.

3.4. Die Rolle von sCD137 während der LAK-Antwort

Wie in den Kapiteln 3.1.3.2.1. und 3.1.3.2.2. dieser Arbeit gezeigt wurde, wird in der CLL

sCD137 von T-Lymphozyten ins Serum der Patienten abgegeben. Während sich die B-CLL-

Zellen als entartete Zellen gegen die Immunabwehr zu schützen versuchen, ist es Aufgabe der

T-Lymphozyten, die leukämischen Zellen zu bekämpfen. Welche Rolle sCD137 dabei

zukommt, wird in diesem Abschnitt genauer untersucht.

3.4.1. Die Wirkung von sCD137 auf die LAK-Zellen

Um die Wirkung von sCD137 in der Interaktion zwischen Tumor- und LAK-Zellen zu

charakterisieren, wurden LAK-Zellen über Nacht mit 5 µg/ml CD137-Fc-Fusionsprotein oder

10 µg/ml Fc-Protein vorinkubiert und am nächsten Tag im LAK-Assay eingesetzt. Abb. 3.-

31. zeigt das Resultat:

0

5

10

15

20

25

30

35

1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

---FcCD137-Fc

Abb. 3.-31.: Die Vorinkubation von LAK-Zellen mit löslichem CD137-Fc-Protein erhöht deren Fä-

higkeit Zielzellen zu lysieren. LAK-Assay mit LAK-Zellen, die über Nacht mit 10 µg/ml

CD137-Fc bzw. der äquimolaren Menge von 5 µg/ml Fc-Kontrollprotein in FKS-blockierten

wells vorinkubiert wurden. Im dargestellten Assay wurden K562 als Zielzellen verwendet.

Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt

ist eines von drei unabhängigen Experimenten.

Mit löslichem CD137-Fc vorbehandelte LAK-Zellen zeigen eine bis zu fünffach höhere Lyse-

rate als mit Kontrollprotein vorinkubierte oder unbehandelte LAK-Zellen. Dieses Ergebnis ist

unabhängig von den eingesetzten Targetzellen: LAK-Assays mit COS- oder Jurkatzellen zei-

Ergebnisse

100

gen eine vergleichbare Steigerung der Lyserate nach Vorinkubation der Effektorzellen mit

löslichem CD137-Fc-Fusionsprotein (nicht gezeigt).

3.4.2. Die Wirkung von sCD137 auf die Target-Zellen

Target-Zellen wurden über Nacht mit 10 µg/ml CD137-Fc-Fusionsprotein oder der äquimo-

laren Menge von 5 µg/ml Fc-Protein vorinkubiert. Am Tag darauf wurden diese Zellen im

LAK-Assay eingesetzt.

In Abb. 3.-32. ist das Ergebnis dargestellt.

COS K562

0

10

20

30

40

50

60

1: 10 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

---FcCD137-Fc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät---FcCD137-Fc

Jurkat

0

5

10

15

20

25

1: 10 1: 50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

FcCD137-Fc

Abb. 3.-32.: Vorinkubation mit löslichem CD137-Fc-Protein erhöht die Anfälligkeit verschiedener

Zielzellen gegenüber der LAK-Lyse im Vergleich zu Zellen, die mit Fc-Kontrollprotein

behandelt wurden. LAK-Assay nach Vorinkubation der angegebenen Zellen mit 10 µg/ml

CD137-Fc bzw. 5 µg/ml Fc-Protein über Nacht; dargestellt sind die Mittelwerte aus Sechsfach-

bestimmungen ± Standardabweichung. Gezeigt ist je eines von drei unabhängigen Experi-

menten.

Ergebnisse

101

Die Sensitivität der Zielzellen gegenüber der zytotoxischen Lyse erhöht sich durch die Inku-

bation mit löslichem CD137-Fc. Dies kann nicht auf die Steigerung der Lyseaktivität der

LAK-Zellen durch CD137 zurückzuführen sein, da sowohl die eingesetzten Target- als auch

die LAK-Zellen vor dem Assay mehrmals gewaschen werden, so daß kein CD137-Fc im

Assay selbst vorhanden ist. Es muß sich hierbei um einen Effekt von löslichem CD137 auf die

Targetzellen handeln.

Die Verwendung des Fusionsproteins wirft das Problem auf, daß – durch die Zusammenlage-

rung der Fc-Teile zweier Moleküle – die beiden CD137-Anteile zwei Ligandmoleküle vernet-

zen könnten. Daher, und um lösliches CD137 zur Verfügung zu haben, das endogenem

sCD137 entspricht, wurde der Expressionsvektor pcDNA-ILA-w/otm auf der Basis von

pcDNA 3.1. konstruiert. Dieser enthält nach dem CMV-Promotor die cDNA für CD137 ohne

den intrazellulären Anteil und die Transmembrandomäne.

In Abb. 3.-33. ist das Ergebnis der LAK-Assays mit CMV-ILA-w/otm transfizierten Zellinien

dargestellt. Die Expression löslichen CD137s durch transfizierte Zellen wurde im ELISA

nachgewiesen und lag bei COS-Zellen bei etwa 4 ng/ml, bei K562- und Raji-Zellen zwischen

1 und 2 ng/ml. Die Experimente mit den transfizierten Targetzellen bestätigen die Ergebnisse

der Versuche, in denen die Zielzellen mit löslichem CD137-Fc vorinkubiert wurden: Lös-

liches CD137 steigert die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber zytotoxischer Lyse durch

LAK-Zellen.

Ergebnisse

102

COS K562

0

5

10

15

20

25

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACIS/ pcDNApcDNA/ w/otmCIS/ w/otm

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACISw/otm

Raji

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1:5 1:10 1:50

t:e-Ratio

Pro

zent

Zyt

otox

izit

ät

pcDNACISw/otm

Abb. 3-33.: Zellen, die nach der Transfektion lösliches CD137 produzieren und diesem für zwei Tage

ausgesetzt sind, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegen zytotoxische Lyse durch LAK-

Zellen. LAK-Assay mit transfizierten Zellinien; Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA

3.1., CIS: CMV-ILA-sense, w/otm: CMV-ILA-w/otm; Kotransfektionen: pcDNA: pcDNA 3.1.

3,0 µg, pcDNA/ CIS: 2,7 µg pcDNA 3.1./ 0,3 µg CMV-ILA-sense, w/otm/ pcDNA: 2,7 µg

CMV-ILA-w/otm/ 0,3 µg pcDNA 3.1., w/otm/ CIS: 2,7 µg CMV-ILA-w/otm/ 0,3 µg CMV-

ILA-sense; dargestellt sind die Mittelwerte von Sechsfachbestimmungen ± Standardabwei-

chung. Gezeigt ist je eines von drei unabhängigen Experimenten.

Lösliches CD137 kann zweierlei Funktion ausüben: Zum einen kann es durch Interaktion mit

mCD137-Molekülen verhindern, daß ein funktioneller trimerer Komplex zur Signaltransduk-

tion in die mCD137-tragende Zelle entsteht. Dieser Mechanismus ist für andere Mitglieder

der TNF-Rezeptorfamilie gezeigt, wie Fas oder TNFR1 und 2 (PAPOFF G. et al., 1999; SIEGEL M. R.

et al., 2000). Das Prinzip beruht darauf, daß die plad-Domäne im Extrazellulärbereich der Mo-

leküle für die Oligomerisierung ausreicht, so daß lösliche Moleküle über diese Domäne mit

membranständigen interagieren können. Da es jedoch zur Ausbildung eines funktionellen

Ergebnisse

103

Komplexes notwendig ist, daß alle Moleküle des Komplexes intakte Intrazellulärdomänen be-

sitzen, kann bei solch einem gemischten Komplex kein Signal in die Zelle übertragen werden.

Lösliche Rezeptoren wirken daher dominant-negativ.

Die zweite Wirkung, die lösliche CD137-Moleküle im System der reversen Signalübertra-

gung spielen können, besteht darin, daß einzelne lösliche Moleküle an Ligandtrimere, die in

der Membran schwimmen, binden und so die Multimerisierung des Liganden verhindern.

Dieser zweite Mechanismus hemmt die Signalübertragung durch den Liganden, während der

erste die Signaltransduktion durch den CD137-Rezeptor inhibiert.

Um einen Hinweis darauf zu erhalten, ob lösliches CD137 den Liganden blockiert, wurden

ELISAs gegen TGFß1 angefertigt, da in Kapitel 3.3.3.4. (Abb. 3.-29.) gezeigt werden konnte,

daß die Induktion der TGFß-Sekretion über ein durch den CD137-Liganden vermitteltes Sig-

nal erfolgt. In diesen ELISAs wurden Überständen von ün mit löslichem CD137-Fc inkubier-

ten Zellen verschiedener Zelllinien, sowie zellfreien Transfektionüberständen derselben Zell-

linien getestet. Das Ergebnis ist in Abb. 3.-34. gezeigt.

Diese Experimente belegen einen inhibitorischen Einfluß von löslichem CD137 auf die Sig-

naltransduktion durch den CD137-Ligand. Die TGFß1-Sekretion ist deutlich vermindert,

wenn die Zellen mit löslichem, rekombinantem CD137-Fc-Protein oder mit von den Zellen

endogen synthetisiertem sCD137 inkubiert werden. Die Steigerung der Empfindlichkeit ge-

genüber der LAK-Lyse durch sCD137 ist somit – zumindest teilweise – auf die Blockierung

der Signaltransduktion durch CD137-Ligand zurückzuführen.

Ergebnisse

104

A B

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

--- Fc CD137-Fc

pg/ m

l TG

Fß1

600

620

640

660

680

700

720

740

760

780

--- Fc CD137-Fc

pg/ m

l TG

Fß1

C D

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

pcDNA CIS w/otm

pg/ m

l TG

Fß1

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

pcDNA CIS w/otm

pg/ m

l TG

Fß1

Abb. 3.-34.: Inkubation mit löslichem CD137-Fc-Fusionsprotein senkt die TGFß1-Sekretion bei ver-

schiedenen Tumorzellinien (A, B). Sind transfizierte Zellinien endogenem löslichem

CD137 ausgesetzt, so verringert sich ihre TGFß1-Sekretion gegenüber kontrolltransfi-

zierten Zellen (C, D). ELISAs gegen TGFß1 mit zellfreien Überständen von für 48 h mit 10

µg/ ml CD137-Fc bzw. 5 µg/ ml Fc-Kontrollprotein kultivierten Zellen (A, B), sowie mit

zellfreien Transfektionsüberständen von Zellinien, die 48 h nach der Transfektion gewonnen

wurden (C, D); Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS: CMV-ILA-sense, w/otm:

CMV-ILA-w/otm; A, C: K562; B, D: Raji; dargestellt sind die Mittelwerte von Dreifachbe-

stimmungen ± Standardabweichung. Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experi-

menten. Die in Teilabbildung C und D dargestellten Versuche sind mit Überständen aus den in

Abb. 3.-33. gezeigten Experimenten durchgeführt.

Als zusätzliche Kontrolle zeigt Abb. 3.-35., daß die IL-10-Sekretion der Raji-Zellen nach

Inkubation mit löslichem CD137-Fc oder einer Transfektion mit CMV-ILA-w/otm

unbeeinflußt bleibt.

Ergebnisse

105

A B

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

--- Fc CD137-Fc

pg/ m

l IL

-10

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

pcDNA CIS w/otm

pg/ m

l IL

-10

Abb. 3-35.: Inkubation mit löslichem CD137-Fc-Fusionsprotein läßt die IL-10-Sekretion von Raji-

Zellen unbeeinflußt (A). Sind transfizierte Raji-Zellen endogenem löslichem CD137

ausgesetzt, so verändert sich ihre IL-10-Produktion gegenüber kontrolltransfizierten

Zellen nicht (B). ELISAs gegen IL-10 mit zellfreien Überständen von für 48 h mit 10 µg/ ml

CD137-Fc bzw. 5 µg/ ml Fc-Kontrollprotein kultivierten Zellen (A), sowie mit zellfreien

Transfektionsüberständen von Zellinien, die 48 h nach der Transfektion gewonnen wurden (B);

Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS: CMV-ILA-sense, w/otm: CMV-ILA-

w/otm; dargestellt sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung.

Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experimenten. Die Überstände, die in Teil-

abbildung B verwendet wurden, sind die aus den in Abb. 3.-33. und 3.-34. gezeigten Experi-

menten.

Diskussion

106

4. Diskussion

4.1. Screening des CLL-Patientenmaterials hinsichtlich der

Expression von CD137

Das in dieser Studie betrachtete Kollektiv von B-CLL-Patienten umfaßte 25 Personen. Sechs

davon waren weiblich, 13 männlich, vom Rest war die Geschlechtszugehörigkeit nicht be-

kannt. Das entspricht einem Verhältnis von etwa 2:1 männlichen zu weiblichen Patienten;

dieses Geschlechterverhältnis ist für die CLL charakteristisch (BERGER D. P. et al., 1997). Das

durchschnittliche Alter der Patienten betrug 65,6 Jahre. Auch das ist typisch für CLL-Patien-

ten. Bei der CLL handelt es sich um eine Erkrankung des höheren Lebensalters, die im Mittel

in einem Lebensalter von 65 Jahren auftritt (BERGER D. P. et al., 1997). Das betrachtete Kollektiv

spiegelt folglich die Epidemiologie der CLL gut wieder.

CLL-Patienten haben eine stark erhöhte Anzahl an weißen Blutkörperchen im peripheren

Blut, die vorwiegend aus CD5-positiven B-Zellen besteht (vgl. Kap. 2.1.1.2., Tab. 2.-1.). Der

Anteil an B-Lymphozyten ist in den untersuchten CLL-Patientenproben auf 65 bis 97,5 % der

Blutleukozyten erhöht. Durchschnittlich steigt der B-Zell-Anteil der Lymphozytenaliquots auf

87,5 %. Beim gesunden Probanden beträgt der B-Zell-Anteil 20 bis 30 % (PSCHYREMBEL, 1998).

Für das Würzburger Patientenkollektiv konnte gezeigt werden, daß für alle untersuchten Pro-

ben nach Stimulation durch PMA/Kalziumionophor die mRNA für die membrangebundene

Form von CD137 nachweisbar war (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-1.). Dies entspricht früheren Beob-

achtungen, nach denen die CD137-mRNA auf gesunden, EBV-transformierten B-Zellen und

B-Zellinien nach Stimulation nachgewiesen werden kann (SCHWARZ H. et al., 1995; KIENZLE G. et

al., 1997).

Bisher konnte die Expression von CD137-Protein auf humanen B-Lymphozyten selbst nach

Stimulation nicht detektiert werden (KIENZLE G. et al., 1997; KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000; MI-

CHEL J.: unveröffentlichte Daten). Die PBMCs aller untersuchten CLL-Patienten exprimieren nach

Stimulation mCD137, wie über die FACS-Analyse mit anti-CD137-Antikörpern nachgewie-

sen werden konnte (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-2.). Dieses Ergebnis hielt auch einer Überprüfung

durch Immunfluoreszenzdoppelfärbung stand: 8 von 10 untersuchten Proben zeigten Koex-

pression des B-Zell-Markers CD19 mit CD137 auf denselben Zellen (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-

3.). Damit konnte erstmalig gezeigt werden, daß mCD137 auf Proteinebene von humanen B-

Zellen exprimiert werden kann. Dabei muß berücksichtigt werden, daß B-CLL-Lymphozyten

Diskussion

107

entartete Zellen sind, die ein gegenüber gesunden B-Zellen verändertes Expressionsmuster an

zellulären Proteinen aufweisen (KIPPS T. J., 1998; JURLANDER J., 1989).

Die diskrete, eng begrenzte Expression von mCD137 auf der Zelloberfläche, die in der Im-

munfluoreszenzfärbung sichtbar wird, kann dahingehend gedeutet werden, daß CD137 in der

Membran in clustern vorliegt. Mitglieder der TNFR-Familie aggregieren und bilden für die

Signalübertragung Multimere aus (BANNER D. W. et al., 1993; JONES E. Y. et al., 1990; ECK J. M. und

SPRANG S. R., 1989). Daher kann diese Beobachtung als erster Hinweis auf die Teilnahme von

raft-Strukturen an der aktiven Signaltransduktion durch CD137 gewertet werden. Hierfür

sprechen auch die Daten mit pcDNA-ILA-trunc- und pcDNA-ILA-w/otm-transfizierten Zel-

len (Kap. 3.3.3.4. und 3.4.2.). Das trunkierte bzw. das lösliche Protein kann in Zellinien, die

endogen mCD137 exprimieren, den zytolysesenkenden Effekt aufheben, der durch das konsti-

tutiv exprimierte CD137 vermittelt wird (Kap. 3.3.3.4., Abb. 3.-28. und Kap. 3.4.2., Abb. 3.-

33.). Die dominant-negativ Inhibition Signalübertragung durch sCD137 oder CD137trunc der

ist nur möglich, wenn das native mCD137 zusammen mit dem trunkierten oder löslichen Pro-

tein Oligo- oder Multimere ausbilden kann. Für einen endgültigen Beweis sind jedoch weitere

Studien nötig.

Die Ergebnisse aus Kapitel 3.1.2.1. zeigen, daß B-CLL-Lymphozyten CD137 als Neoantigen

synthetisieren, da bislang für native B-Zellen eine Proteinexpression nicht nachgewiesen wer-

den konnte. Die Expression von Neoantigenen – Molekülen, die auf der Ursprungszellpopula-

tion von entarteten Zellen nicht exprimiert werden – ist bei Tumoren, auch der CLL, ein

bekanntes Phänomen (KIPPS T. J., 1998; JURLANDER J., 1989).

In der Regel verschafft die Neusynthese bestimmter Moleküle auf entarteten Zellen diesen

einen Überlebens- oder Wachstumsvorteil. Auch Mitglieder der TNFR- und der TNF-Familie

werden von Tumoren als Neoantigene synthetisiert. Ein bekanntes Beispiel stellen die

Mitglieder der TNF-Familie TNF und FasL dar, die durch Tumorzellen verstärkt exprimiert

werden und in infiltrierenden T-Zellen über den TNFR1 bzw. Fas Apoptose induzieren

können (JURLANDER J., 1989; SUDA T. et al., 1997; VILLUNGER A. et al., 1997; OSORIO L. M. und AGUILAR-

SANTELISES M., 1998; BUZYN A. et al., 1999; O’CONNELL J. et al., 1999; HOLTZMANN M. J. et al., 2000;

RESTIFO N. P., 2000). Dieser Mechanismus ist auch für die CLL beschrieben (TINHOFER I. et al.,

1998).

M. FURTER konnte in seiner Dissertation in den Seren von CLL-Patienten die lösliche Form

von CD137 nachweisen und fand, daß die Konzentration des vorhandenen sCD137 mit der

Leukozytenzahl korreliert (FURTNER M., 2001).

Diskussion

108

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die PBMCs von 10 von 12 CLL-Patienten in der

RT-PCR ein positives Signal für sCD137 geben – sie synthetisieren die mRNA für sCD137

(Kap. 3.1.3.1., Abb. 3.-4.). sCD137-Protein konnte in den Überständen von 14 von 17 unter-

suchten Patientenzellaliquots detektiert werden (Kap. 3.1.3.2.1.). In allen untersuchten Seren

konnte sCD137 nachgewiesen werden, bei fünf von 10 Patienten lag die Konzentration an

sCD137 über der Grenze von 0,512 ng/ml. Dieser Wert entspricht dem Mittelwert an sCD137

im Serum von 100 gesunden Probanden zzgl. der doppelten Standardabweichung (Kap.

3.1.3.2.2.).

Die Konzentration an sCD137 in den Patientenseren korreliert mit der Anzahl an Leukozyten

im Blut (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.A). Dies bestätigt die frühere Aussage von M. FURTNER

(FURTNER M., 2001).

Es besteht außerdem eine Korrelation zwischen den Konzentrationen an sCD137 und ß2-

Mikroglobulin im Serum (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-2.D). ß2-Mikroglobulin dient als einer der

wenigen zuverlässigen Marker für den klinischen Verlauf der CLL. Ist der Spiegel an ß2-Mi-

kroglobulin im Serum erhöht, stellt dies einen Hinweis auf einen progressiven Krankheitsver-

lauf dar (KEATING M. J., 1999; KIPPS T. J., 1998; ZWIEBEL J. A. und CHESON B. D., 1998; JURLANDER J.,

1989). Die sCD137-Konzentration im Serum von CLL-Patienten könnte daher in der Zukunft

für die Prognose der CLL an Bedeutung gewinnen.

Die im Blut der CLL-Patienten zirkulierenden Leukozyten sind im wesentlichen CD5-posi-

tive, maligne B-Lymphozyten. Daher liegt die Vermutung nahe, eine Korrelation des Serum-

CD137 mit der Leukozytenzahl könnte mit einer Korrelation zwischen Serum-CD137 und

malignen B-Zellen einhergehen (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.B). Diese Annahme konnte jedoch

nicht bestätigt werden.

Auch eine Korrelation zwischen der Konzentration an sCD137 im Serum und dem Anteil

bzw. der Anzahl an T-Zellen konnte nicht hergestellt werden. Allerdings besteht eine negative

Korrelation zwischen der Serumkonzentration an sCD137 und dem Anteil und der Anzahl an

HLA-DR-positiven, aktivierten T-Lymphozyten (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.C). Je mehr akti-

vierte T-Zellen in den Patientenproben enthalten waren, desto weniger sCD137 konnte im Se-

rum nachgewiesen werden.

Das nach Stimulation in Kulturüberstände sekretierte sCD137 stammt von den T-Zellen der

Patienten (Kap. 3.1.3.2.2., Abb. 3.-6. und Abb. 3.-7.). In den Überständen reiner B-CLL-Zel-

len ohne T-Lymphozyten konnte sCD137 nur knapp oberhalb der Nachweisgrenze detektiert

werden. Dies deutet darauf hin, daß auch das in den Seren gefundene sCD137 von T-Lym-

Diskussion

109

phozyten synthetisiert wurde. Dieser Befund deckt sich mit den Daten von J. MICHEL, der hu-

manes sCD137 in den Überständen aktivierter PBMCs und aufgereinigter, aktivierter CD4-

und CD8-positiver T-Zellen nachweisen konnte, nicht aber in B-Zell-Überständen (MICHEL J.,

1998).

J. MICHEL weißt in seiner Dissertation nach, daß sCD137 durch aktivierte PBMCs bei Aktiva-

torkonzentrationen exprimiert wird, die bereits eine Hemmung der Proliferation nach sich zie-

hen. Zudem konnte er eine starke Korrelation zwischen sCD137-Freisetzung und AICD fest-

stellen (MICHEL J., 1998). Dies kann erklären, warum in den späten Stadien der CLL mehr

CD137, sowie weniger aktivierte T-Lymphozyten vorhanden sind. Die „überaktivierten“ T-

Zellen begehen demnach aktivierungsabhängig Apoptose, die mit einer erhöhten sCD137-

Freisetzung einhergeht. Diese Sekretion von sCD137 durch stark aktivierte T-Zellen kann

durch dominant-negative Interaktionen mit dem mCD137 der T-Lymphozyten eine weitere

Aktivierung der Zellen durch CD137 unterbinden. Im Falle der anti-Tumor-Immunantwort

könnten so spezifische anti-Tumor-T-Zellen vor dem AICD bewahrt werden.

4.2. Die Funktion von mCD137 in der CLL

Werden CLL-Zellen auf immobilisiertem CD137-Fc-Fusionsprotein kultiviert, so leben nach

einem definierten Zeitraum signifikant mehr Zellen als auf einem Kontrollprotein. Zellen in

den CD137-Fc-beschichteten wells einer Kulturplatte überleben länger als Kontrollzellen

(Kap. 3.1.2., Tab. 3.-2. und Abb. 3.-8.). Die höhere Anzahl an lebenden Zellen geht nicht auf

eine gesteigerte Proliferation zurück (Kap. 3.2.1., Abb. 3.-10.).

Die CLL ist eine Erkrankung, bei der die Zellakkumulation in vivo nicht in erster Linie auf

eine Fehlregulation der Proliferation zurückzuführen ist, sondern auf eine Anreicherung der

B-Lymphozyten in die Folge einer gestörten Apoptoseregulation. Diese läßt sich zurückfüh-

ren auf ein verschobenes Gleichgewicht von Bcl-2 und Bcl-xL zu Bax. Die apoptose-inhibie-

renden Moleküle Bcl-2 und Bcl-xL werden in der CLL überexprimiert und die Apoptose der

entarteten B-Zellen unterdrückt (MEINHARDT G. et al., 1999; KIPPS T. J., 1998; OSORIO L. M. und

AGUILAR-SANTELISES M., 1998; OSORIO L. M. et al., 1998; REED J. C., 1998; SÖDERBERG O., 1998; ZWIEBEL J.

A. und CHESON B. D., 1998; JURLANDER J., 1989). Die Vernetzung von CD137-Ligand führt zur

Induktion des Transkriptionsfaktors NF-kB (SÖLLNER L., 2001). In B-CLL-Zellen ist die NF-

kB-Aktivität gegenüber normalen B-Lymphozyten konstitutiv erhöht und schützt diese Zellen

vor Apoptose (FURMAN R. R. et al., 2000; OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998) Über NF-

kB wird u.a. die Transkription der Gene bcl-2 und bcl-x reguliert (BUI N. T. et al., 2001; SEVILLA

L. et al., 2001; KHOSHNAN A. et al., 2000; ROTHSTEIN T. L., 2000). Über diesen Weg wäre eine Verlän-

Diskussion

110

gerung des Überlebens der CLL-Zellen in vitro möglich: Das immobilisiertes CD137 vernetzt

auf den entarteten B-Zellen deren konstitutiv exprimierten CD137-Ligand (PAULY S., 2000; AL-

DERSON M. R. et al., 1994). Durch diesen werden NF-kB-vermittelt Bcl-2 und Bcl-xL induziert.

Dies wiederum führt zu einer verminderten Apoptoserate und einem erhöhten Überleben der

CLL-Zellen. Dafür spricht auch die Beobachtung, daß in vivo direkter Zell-Zell-Kontakt für

das Überleben von B-CLL-Zellen essentiell ist (LAGNEAUX L. et al., 1999; SÖDERBERG O., 1998).

Die Synthese von mCD137 bietet CLL-Zellen so die Möglichkeit, sich gegenseitig Überle-

benssignale zu übermitteln. Das bedeutet für die entarteten Zellen einen Vorteil.

Bei Zugabe des löslichen CD137-Fc-Proteins zu kultivierten CLL-Zellen kann dieser überle-

bensfördernde Effekt von CD137 nicht beobachtet werden. Dies ist darauf zurückzuführen,

daß für eine Signalübertragung durch CD137-Ligand nicht nur die Bindung des Rezeptor-

moleküls sondern auch die Vernetzung durch CD137-Rezeptormultimere essentiell ist. Ein-

zelne Fusionsproteine in Lösung binden zwar den Liganden, verhindern jedoch die Vernet-

zung und so die Übertragung des überlebensfördernden Signals in die Zelle.

Daß sCD137 keinen überlebensfördernden Effekt auf die B-CLL-Zellen besitzt (Kap. 3.2.1.,

Abb. 3.-9.), paßt zu den Daten, die zeigen, daß das in den Überständen von Patientenzellen

detektierte sCD137 nicht von den CLL- sondern von den T-Lymphozyten herrührt. Für den

Organismus würde es einen Nachteil darstellen, wenn die zellvermittelte anti-Tumor-Antwort

des Körpers einen Tumor durch Überlebensfaktoren unterstützte (Kap. 3.2.1., Abb. 3.-9.).

4.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort

4.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort

Um Aufschluß über das Zusammenspiel zwischen anti-Tumor-Immunzellen und Tumorzellen

sowie der Funktion von mCD137 in diesem Kontext zu erhalten, wurden LAK-Assays ange-

fertigt. So war es möglich, die Expression von mCD137 durch die eingesetzten Tumorzellen

mittels Transfektion zu modulieren und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die zyto-

toxische Lyse durch die LAK-Zellen zu betrachten.

Daß die Modulation der CD137-Expression verschiedener Zellinien durch die Transfektion

mit CD137-sense- und/oder -antisense-codierenden Vektoren möglich ist, konnte in Kapitel

3.3.1., Abb. 3.11. für COS-, K562-, Jurkat- und Raji-Zellen gezeigt werden.

Exprimieren Tumorzellen CD137 auf ihrer Oberfläche, werden sie im LAK-Assay weniger

stark lysiert (Kap. 3.3.1., Abb 3.12.). Die Reduktion der Lyse ist – wie die Experimente zei-

gen – nur zum Teil von der Dichte der mCD137-Expression abhängig: mCD137-transfizierte

Diskussion

111

Raji-Zellen exprimieren weniger mCD137 als mCD137-transfizierte COS-Zellen. Trotzdem

erfahren auch diese Zellen einen wirksamen Schutz vor der LAK-Lyse.

Um die Spezifität des zytolysesenkenden Effekt durch mCD137 zu verfizieren, wurden zwei

verschiedene Strategien angewandt:

Zum einen wurde die mCD137-Expression auf den Zielzellen durch Transfektion mit einem

sense- oder einem antisense-Konstrukt moduliert. Die Modulation von mCD137 konnte über

Antikörperfärbung per FACS gezeigt werden (Kap. 3.3.1., Abb. 3.-11. und Kap. 3.3.2.1., 3.-

15.). Die so transfizierten K562- bzw. Raji-Zellen wurden in LAK-Assays eingesetzt. Es ließ

sich nachweisen, daß die Lysehemmung durch mCD137 auf den Targetzellen der Dichte des

Rezeptors auf der Oberfläche dieser Zellen abhängig ist (Kap. 3.3.2.1., Abb. 3.-14.).

mCD137 ist ein Membranprotein. Starke Expression von Membranproteinen kann zu Verän-

derungen der Zellmembran führen. Membranveränderungen können das Verhalten der trans-

fizierten Zellen im LAK-Assay unspezifisch beeinflussen, da CTL- und LAK-Lyse auf Zell-

Zell-Interaktionen beruhen. LAKs und CTLs induzieren im direkten Kontakt zu ihrer Ziel-

zelle Poren in deren Membran durch Porine, wie Perforin. Dies führt zum raschen Absterben

der Targetzelle durch Wasser- und Salzverlust. Daher mußte die verminderte Lyserate der

mCD137-transfizierten Zellen durch eine weitere Methode verifiziert werden, die keinen Ein-

fluß auf die Höhe der Expression des membrangebundenen Proteins hat.

Dafür wurden mCD137- sowie kontrolltransfizierte COS-Zellen nach der Transfektion mit

dem blockierenden anti-CD137-Antikörper bbk-2 (LEE U. H. et al., 2002) inkubiert. bbk-2 bindet

an mCD137 auf der Zelloberfläche und verhindert dadurch die Interaktion mit CD137-Li-

gand-Molekülen auf den Nachbarzellen. Außerdem unterbindet der gebundene Antikörper im

LAK-Assay die Wechselwirkung zwischen dem mCD137 auf den Zielzellen und CD137-Li-

gand-Molekülen auf den LAK-Zellen. Im Falle transfizierter COS-Zellen hebt der anti-

CD137-Antikörper bbk-2 die Zytolyseminderung durch mCD137 teilweise auf. Dies wird aus

einem Vergleich zwischen der Lyserate CD137-transfizierter, Antikörper-behandelter Zellen

mit der kontrolltransfizierter, bbk-2-behandelter Zellen ersichtlich (Kap. 3.3.2.2., Abb. 3.-

16.).

Daß die CD137-transfizierten Zellen nach Antikörperbehandlung nicht so empfindlich auf die

LAK-Lyse reagieren wie kontrolltransfizierte Zellen, kann daran liegen, daß auf den COS-

Zellen die mCD137-Expression durch die starken viralen Promotoren der Expressionsvekto-

ren so hoch ist, daß die eingesetzte bbk-2-Konzentration nicht sättigend ist, d.h. nicht alle

mCD137-Moleküle neutralisiert werden können. Deshalb wurden diese Experimente mit Raji-

Diskussion

112

Zellen wiederholt, die konstitutiv geringe Mengen an CD137 in der Membran tragen. So

konnte auf die Transfektion und die damit verbundene Überexpression von CD137 verzichtet

werden. Zudem war es eher möglich, sättigende Antikörperkonzentrationen zu erreichen. Um

die Spezifität der Blockierung durch bbk-2 mit zu überprüfen, wurden Antikörperkonzentra-

tionen von 0,5 bis 5,0 µg/ml eingesetzt. Steigende Konzentrationen an bbk-2 führen zu einer

steigenden Empfindlichkeit der Raji-Zellen gegenüber der LAK-Lyse (Kap. 3.3.2.2., Abb. 3.-

17.). Die Blockierung der Wechselwirkung zwischen CD137 und seinem Liganden hebt den

schützenden Effekt der mCD137-Expression vor zytotoxischer Lyse auf.

Für einige Moleküle ist bekannt, daß ihre Expression auf der Zelloberfläche Zielzellen vor

LAK-Lyse schützen kann. Zu diesen zählen MHC II- (LOBO P. I. und PATEL H. C., 1994), MHC I-

(PALUCKA K. A. et al., 1998) und nichtklassische MHC-Moleküle (CHANG C. S. et al., 1999; CHIANG E.

Y. et al., 2002), sowie HSP70 (DRESSEL R. et al., 2000) und ICAM-1 (TRIOZZI P. L. et al., 1992). Für

Mitglieder der TNFR-Familie gab es hierfür jedoch bisher keine Hinweise. Das von den

Tumorzellen exprimierte mCD137 könnte insofern auf die LAKs wirken, als die Ligation des

Liganden auf aktivierten T-Zellen zur Anergie bzw. Apoptose führt (SCHWARZ H. et al., 1996; MI-

CHEL J. et al., 1999).

Im Falle der CLL könnte die ektopische Neoexpression von mCD137 den entarteten Zellen

durch den vermittelten Schutz vor tumorreaktiven T-Zellen einen weiteren Vorteil bieten,

zusätzlich zu dem überlebensfördernden Effekt, der durch den CD137-Liganden in die CLL-

Zellen übertragen werden kann (vgl. Kap. 3.2.1.).

4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der

LAK-Lyse – direkte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts

Weder für CD137 noch für andere Mitglieder der TNFR-Familie war bisher bekannt, daß sie

in ihrer membrangebundenen Form Schutz vor zytotoxischer Lyse vermitteln können. Daher

versuchten wir Aufschluß über den Mechanismus gewinnen, über den die LAK-Lyse redu-

ziert wird.

Das CD137-/CD137-Ligand-System kann seinen zytolysesenkenden Effekt entweder direkt

oder indirekt vermitteln: Eine direkte Vermittlung wäre gegeben, wenn das durch CD137 oder

CD137-Ligand übertragene Signal unmittelbar zu einer Reaktion der Zelle führt, z.B. NF-kB-

Aktivierung und erhöhte Expression von Bcl-xL nach der Ligation von CD137 (DEBENDETTE M.

A. et al., 1997; LEE H. W. et al., 2002; BUKZYNSKI J. et al., 2003) oder Apoptoseinduktion nach der

Vernetzung des CD137-Liganden auf LAK-Zellen (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).

Diskussion

113

Eine indirekte Zytolyseminderung bestünde darin, daß durch das CD137 bzw. CD137-Li-

gand-vermittelte Signal weitere Moleküle induziert werden, die ihrerseits die LAK-Lyse hem-

men. Dies kann beispielsweise durch die Freisetzung antiinflammatorischer Zytokine gesche-

hen.

In dieser Arbeit wurden zuerst die direkten Effekte betrachtet, da bekannt war, daß immobili-

siertes bzw. membrangebundenes CD137 in ruhenden und aktivierten T-Lymphozyten Apo-

ptose induzieren kann (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).

Apoptoseinduktion in anti-Tumor-T-Zellen durch Tumorzellen ist ein Mechanismus für das

Entkommen eines Tumors aus der Immunüberwachung. In Leukämien und anderen Krebsar-

ten ist die Expression apoptoseinduzierender Moleküle wie FasL beschrieben (VILLUNGER A. et

al., 1997; BUZYN A. et al., 1999; O’CONNELL J. et al., 1999). Dieses Mitglied der TNF-Familie ist in

der Lage, Fas auf aktivierten T-Lymphozyten zu binden und diese dadurch in die Apoptose zu

treiben (SUDA T. et al., 1997; HOLTZMANN M. J. et al., 2000; RESTIFO N. P., 2000). Dies ist auch für die

CLL beschrieben (OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998; TINHOFER I. et al., 1998): Das

pathologische Zusammenspiel zwischen Fas und FasL besitzt klinische Relevanz: Eine hohe

Fas-Expression auf T-Lymphozyten korreliert mit einem niedrigerem Überleben der CLL-

Patienten GRONEBERG C. et al., 2003).

Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein energieabhängiger, definierter Prozeß der Zelle,

der im gesunden Organismus bei der Differenzierung und Beibehaltung der Integrität von Ge-

weben von Bedeutung ist. Gegenüber der Nekrose ist Apoptose dadurch gekennzeichnet, daß

die Kern-DNA durch endogene Nukleasen fragmentiert wird und der Zellkern kondensiert.

Die Zellproteine werden durch Proteasen abgebaut und die Zelle schrumpft, indem sie mem-

branumgebene Vesikel abgibt, die von phagozytischen Zellen aufgenommen und abgebaut

werden. In der frühen Apoptose erscheinen Phosphatidylserinreste auf der Zellaußenseite. An

diese bindet AnnexinV. In dieser frühen Phase der Apoptose ist die Zellemembran normaler-

weise noch „dicht“: Ein DNA-Farbstoff, wie PI, kann nicht in die Zelle eindringen. Dies

konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Im Laufe der Zeit wurden die Zellmembranen

der verwendeten apoptotischen Zellen jedoch undicht. Die in dieser Arbeit betrachteten Zellen

treten nach einer AnnexinV-positiven, PI-negativen frühen Apoptosephase, in eine späte ein,

in der beide Färbungen positiv werden.

Die LAK-Zellen, die mit mCD137-exprimierenden Zielzellen kultiviert worden waren, wur-

den mittels AnnexinV-/PI-Färbung im FACS analysiert. LAK-Zellen, die mit CD137-sense-

transfizierten Zielzellen inkubiert wurden, zeigten nur wenig mehr Apoptose, als solche, die

mit kontrolltransfizierten Zellen kokultiviert wurden (Kap. 3.3.3.1., Tab. 3.-3. und Abb. 3.-

Diskussion

114

20.). Die Färbungen wurden nach 6 bzw. 20 h Kokultur durchgeführt. Die Bedingungen der

LAK-Assays wurden – bis auf die verlängerten Inkubationszeiten – beibehalten. Parallel

durchgeführte LAK-Assays zeigten das gewohnte Ergebnis einer starken Lyseminderung,

wenn mCD137-transfizierte Zellen als Targetzellen eingesetzt wurden (nicht gezeigt).

Zusätzlich angefertigte Caspase3-Aktivitätsassays ergaben ein ähnliches Bild (Kap. 3.3.3.1.,

Abb. 3.-20.): LAK-Zellen, die immobilisiertem oder membrangebundenem CD137 ausgesetzt

waren, zeigen eine geringfügig höhere Caspase3-Aktivität als Kontrollzellen. Caspase3 ist

eine der Effektorcaspasen, die während der Induktion der Apoptose aktiviert wird. Caspase3

integriert zusammen mit Caspase7 den rezeptorvermittelten und den mitochondrialen Weg der

Apoptoseinduktion und wird in beiden Fällen aktiviert.

Interessant ist die Tatsache, daß K562- und Rajizellen in der FACS-Analyse bei Effek-

tor:Target-Verhältnissen von 1:2,5 und 1:5 in einem höheren Anteil an LAK-Zellen Apoptose

zu induzieren vermögen als COS-Zellen, die nach der Transfektion weitaus höhere Mengen

an CD137 exprimieren. Da man davon ausgehen muß, daß die LAK-Zellen in allen Experi-

menten vergleichbar viel CD137-Ligand exprimieren, muß der Unterschied zelltypspezifisch

zu erklären sein. Möglicherweise verfügen diese Zellen über Oberflächenmoleküle oder se-

kretieren Zytokine, die eine Apoptoseinduktion durch mCD137 in CTLs supplementieren

können. Da K562 und Rajis in Suspension wachsen, konnten für Kokulturen aus LAK-Zellen

und diesen Zellen keine Caspase3-Aktivitätstests durchgeführt werden. Die ebenfalls lösli-

chen LAK-Zellen konnten nicht mehr abgetrennt und einzelnen analysiert werden.

Die stärkere Apoptoseinduktion durch K562- und Raji-Zellen in den LAKs kann als Hinweis

gelten, daß in vivo dieser Weg bei der Lysehemmung durch entartete Zellen eine größere Rol-

le spielt, als dies in vitro der Fall ist. In der CLL spielen die Mikroumgebung und akzes-

sorische Zellen für das Überleben und Wachstum des malignen B-Zell-Klons eine entschei-

dende Rolle (DECKER T. et al.,1995; OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998; SÖDERBERG O.,

1998; LAGNEAUX L. et al., 1999). Die Mikroumgebung des LAK-Assays ist gegenüber der in vivo-

Situation sehr reduziert: So wird als Medium PBS mit 5 % FKS eingesetzt und es interagieren

lediglich zwei Zelltypen. Unterstützende Zytokine oder Zellen werden in den LAK-Assays

nicht berücksichtigt.

Es bleibt auch ein weiterer Punkt unberücksichtigt: Durch den Zell-Zell-Kontakt mit den

transfizierten Tumorzellen können LAK-Zellen möglicherweise in eine Anergie treten, die

dem endgültigen Eintritt der Apoptose vorangeht. Der Eintritt der Apoptose kann teilweise

erst Tage nach der Induktion erfolgen (BOSSU P. et al., 1993; MIXTER P. F. et al., 1994; SUDA T. et al.,

1997; DAS S. et al., 2000). So wäre die Fähigkeit der LAK-Zellen zur Lyse im Assay vermindert,

Diskussion

115

ohne daß nach 6 bis 20 h Apoptosekennzeichen nachweisbar wären. Zytotoxische T-Zellen in

der CLL weisen häufig Dysfunktionen bis hin zur Anergie auf. Die Gründe hierfür sind

bislang unklar (ZAKNOEN S. L. und KAY N. E., 1990; BARTIK M. M. et al., 1998; GOOLSBY C. L. et al.,

2000).

Ein weiterer direkter Effekt zum Schutz der Zielzellen kann die Induktion überlebensver-

längernder Moleküle, wie Bcl-xL, nach der Ligation von mCD137 sein (DEBENDETTE M. A. et al.,

1997; LEE H. W. et al., 2002; BUKZYNSKI J. et al., 2003). Bcl-xL ist ein Mitglied der zur Bcl-2-

Proteinfamilie. Diese Klasse von Proteinen ist an der Apoptoseregulation und der Regulation

der Permeabilität der Mitochondrienmembran beteiligt. Die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL

und Bcl-2 können sich in die äußere Mitochondrienmembran einlagern und die Veränderun-

gen der Mitochondrienmembran, die zur Apoptose führen, verhindern (FUKUDA K. und YAMAMO-

TO M., 1999; HARRIS M. H. und THOMPSON C. B., 2000). Ob CD137-sense-transfizierte Zellen eine

höhere Bcl-xL-Expression zeigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht analysiert. Die

Zytolyse, die im LAK-Assay gemessen wird, geht nicht auf den Anteil an Tumorzellen ein,

die durch die LAK-Zellen in Apoptose getrieben wird. Sie mißt den Anteil an Zellen, die über

Perforine und GranzymB getötet wird. Diese Proteine bilden in der Membran der Targetzellen

Poren, über die das Zytosol – und damit das Farbreagenz mit dem die Zielzellen beladen

wur-den – ausläuft. Der Schutz, den Zielzellen vor CTL-vermittelter Apoptose erfahren, läßt

sich über die LAK-Assays nicht bestimmen.

4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der

LAK-Lyse – indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Ef-

fekts

Die in vitro beobachtete CD137-vermittelte Senkung der Zytolyse wird vermutlich nur zu

einem Teil durch die Induktion von Apoptose bzw. Anergie in den T-Zellen bewirkt. Der nur

geringfügig höhere Anteil an apoptotischen LAK-Zellen nach Kontakt mit mCD137-trans-

fizierten Zielzellen läßt eine derart hohe Reduktion der Lyse innerhalb der LAK-Assay-Dauer

von 4 h unwahrscheinlich erscheinen. Wir untersuchten daher, ob der Schutz vor Zytotoxizität

durch ein mCD137- oder CD137-Ligand-induziertes Zytokin vermittelt wird.

Diskussion

116


indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch IL-10

IL-10 ist ein wichtiges, antiinflammatorisches Zytokin, das im gesunden Organismus die Ak-

tivierung, Proliferation, Effektorfunktion und die Zytokinantworten von T-Zellen hemmt (AK-

DIS C. A. und BLASER K., 2001; AKDIS C. A. et al., 2001; MOORE K. W. et al., 2001). Es wird vorwiegend

von CD4-positiven Th2-, sowie B-Lymphozyten synthetisiert (OPAL S. M. und DE-PALO V. A.,

1999). IL-10 vermindert die Expression von Molekülen der TNF-Rezeptor-Familie auf Zellen

und fördert das shedding dieser Rezeptoren (OPAL S. M. und DEPALO V. A., 1999).

Tumoren verwenden IL-10, um durch Suppression des Immunsystems der Immunüberwa-

chung zu entkommen (SALAZAR-ONFRAY F., 1999). Die Funktion von IL-10 in der CLL wird kon-

trovers diskutiert: So soll es die Proliferation und das Überleben der B-CLL-Zellen unterstüt-

zen (JURLANDER J. et al., 1997) und sie vor Apoptose schützen (KITABAYASHI A. et al., 1995). Andere

Autoren finden in vitro eine Inhibition der Proliferation und die Induktion von Apoptose

durch IL-10 (SJÖBERG J. et al., 1995; TANGYE S. G. et al., 1998; MAINOU-FOWLER T. et al., 2001). Klinisch

korreliert die IL-10-Konzentration im Serum von CLL-Patienten negativ mit dem Krank-

heitsverlauf; d.h. eine hohe IL-10-Konzentration im Serum kommt nur in frühen Krankheits-

stadien vor. Schreitet die CLL voran ist kaum noch IL-10 detektierbar (SJÖBERG J. et al., 1995).

Für die mCD137-vermittelte Inhibition der Zytolyse spielt IL-10 keine Rolle.

LAK-Zellen sekretieren auf immobilisiertem CD137-Fc ebenso viel IL-10 wie auf Fc-Kon-

trollprotein bzw. auf unbeschichteten Platten (Kap. 3.3.3.2.1., Abb. 3.-21.). Die Freisetzung

von IL-10 durch die LAK-Zellen ist folglich unabhängig von der Gegenwart immobilisierten

CD137s.

Ein Zytokin, daß im LAK-Assay wirksam ist, muß nicht zwangsläufig von den LAK-Zellen

selbst synthetisiert werden. Daher wurde die IL-10-Konzentration in den Transfektions-

überständen der eingesetzten transfizierten Zielzellen untersucht: K562-Zellen produzieren –

gemäß ihrer Abstammung als myelotische Zellen – kein IL-10, unabhängig von der mCD137-

Dichte auf ihrer Oberfläche. Bei Raji-Zellen ist die IL-10-Sekretion unabhängig von der

mCD137-Expression (Kap. 3.3.3.2.1., Abb. 3.-22.).

CD137-sense, -antisense und kontrolltransfizierte Raji-Zellen wurden mit neutralisierenden

anti-IL-10-Antikörpern inkubiert und im LAK-Assay eingesetzt. Die Zellen zeigten eine er-

höhte Sensitivität gegenüber Zytolyse. Die Empfindlichkeit ist jedoch in allen Transfektions-

bedingungenleicht erhöht (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-26.), unabhängig von der mCD137-Expres-

sion der Zellen. Das weist darauf hin, daß durch die Neutralisation von IL-10 ein durch dieses

Diskussion

117

Zytokin vermittelter Lyseschutz für die Targetzellen reduziert wird. Da aber die Freisetzung

unabhängig von der mCD137-Expression der Zellen erfolgt, hat auch die Neutralisa-tion nur

einen allgemeinen Effekt, und keinen Einfluß auf die durch mCD137-vermittelte Herabset-

zung der Lyse.


indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch TGFß

TGFß ist ein weiteres potentes, immunsuppressives Molekül. TGFß supprimiert die Prolifera-

tion und Differenzierung von T- und B-Lymphozyten und ist in der Lage in lympoiden Zellen

Apoptose und Toleranz zu induzieren. Zudem hemmt es die IL-2-, IFN-g- und TNF-Produk-

tion (LETTERIO J. J. und ROBERTS A. B., 1997; OPAL S. M. und DEPALO M. D., 2000; CHEN W. et al., 2001;

KOLI K. et al., 2001; TOTTH A. et al., 2001).

Im gesunden Menschen wird TGFß1 von myelotischen Zellen, T-, und B-Lymphozyten expri-

miert (PASCHE B., 2001). LAK-Zellen, die auf immobilisiertem CD137-Fc-Fusionsprotein kulti-

viert wurden, sekretieren ebensoviel TGFß1 wie LAK-Lymphozyten, die auf Kontrollprotein

oder in unbeschichteten Platten inkubiert wurden. Die TGFß-Freisetzung liegt demnach nicht

auf der Seite der LAK-Zellen und ist unabhängig von der Vernetzung des CD137-Liganden

auf der Oberfläche dieser Zellen (Kap. 3.3.3.2., Abb. 3.-23.).

Während der Tumorentstehung und -progression spielt TGFß eine bedeutende Rolle. Von

Tumorzellen sezerniertes TGFß kann zu Tumorwachstum, -metastasierung und der Angioge-

nese beitragen; dazu kommt, daß viele Zellen während ihrer Entartung gegen die inhibitori-

schen Wirkungen von TGFß unempfindlich werden (DE VISSER K. E. und KAST W. M., 1999; HATA

A., 2001; WIESER R., 2001). Durch die immunsuppressive Wirkung bietet TGFß den Tumorzellen

darüber hinaus Schutz vor der Zerstörung durch CTLs und NK-Zellen (LETTERIO J. J. und RO-

BERTS A. B., 1997; BECK C. et al., 2001; PASCHE B., 2001; WIESER R., 2001).

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Überstände CD137-sense-, -antisense- und kontroll-

transfizierter Tumorzellen auf ihre TGFß1-Freisetzung hin untersucht. Sowohl K562 als auch

Raji-Zellen sekretieren TGFß1. Nach der Transfektion mit dem CD137-sense-Expressions-

vektor steigt die freigesetzte TGFß1-Menge gegenüber der kontrolltransfizierter Zellen an.

Nach Transfektion mit dem antisense-Vektor fällt sie ab (Kap. 3.3.3.2., Abb. 3.-24.). Das be-

deutet, daß mit steigender Dichte an mCD137 auf der Oberfläche eine zunehmende Menge an

TGFß durch die entsprechenden Zellen sekretiert wird.

Die Funktionalität des von den Tumorzellen sekretierten TGFß wurde über Neutralisierungs-

experimente geprüft. Eine direkte Zugabe von neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern zu

Diskussion

118

LAK-Assays mit transfizierten K562- und Raji-Zellen zeigte keine Wirkung auf die

Zytolyserate nach CD137-sense-Transfektion (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-25.). Dies beruht ver-

mutlich darauf, daß in den LAK-Assays gewaschene Zellen eingesetzt werden; für die Frei-

setzung von löslichen Mediatoren, deren Bindung und die Induktion von Effekten stellt die

Assaydauer von 4 h eine zu kurze Zeitspanne dar.

Durch die mCD137-Expression transfizierter Zellen wird die TGFß1-Freisetzung verändert.

Deren Auswirkungen sind die transfizierten Tumorzellen bereits während der Inkubationspha-

se nach der Transfektion ausgesetzt. Daher wurden CD137-sense-, -antisense- und kontroll-

transfizierte Zellen mit neutralisierendem anti-TGFß1-Antikörper vorinkubiert. Die Antikör-

per bzw. ihre Isotypkontrolle wurde nach der Transfektion zusammen mit dem Serum den

Ansätzen zugefügt. Diese Versuche ergaben, daß die Vorbehandlung mit neutralisierenden

TGFß1-Antikörpern die CD137-vermittelte Lysesenkung aufhebt (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-27.).

Die Lyseraten CD137-sense- und kontrolltransfizierter Zellen wurden auf das Niveau antisen-

se-transfizierter Zellen gesteigert. Der durch die mCD137-Expression vermittelte Schutz vor

zytotoxischer Lyse wurde also aufgehoben. Offensichtlich wird die in vitro beobachtete Inhi-

bition der zellvermittelten Lyse von Tumorzellen durch mCD137 mittels TGFß1 bewirkt.

In welcher Hinsicht TGFß den mCD137-tranfizierten Zellen ein Signal zum Schutz vor Lyse

vermittelt, ist in dieser Arbeit nicht näher untersucht. Doch gibt es in der Literatur Hinweise,

daß TGFß Tumorzellen mit hoher MHC I- und ICAM-1 Expression dahingehend verändert,

daß diese keine Entwicklung zytotoxischer T-Zellen zulassen (NAKY N. und VANKY F., 1998).

MHC I-Moleküle und ICAM-1 werden auch als schützend gegen die zytotoxische Lyse disku-

tiert (TRIOZZI P. L. et al., 1992; PALUCKA K. A. et al., 1998).

Auf den immunsuppressiven Anteil der TGFß-Wirkung gegen zytotoxische T- und NK-Zellen

geht diese Arbeit nicht näher ein, da sich dieser Teil der TGFß-Wirkung nur charakterisieren

ließe, wenn in den Überständen der LAK-Assays Unterschiede in der TGFß-Freisetzung

durch die eingesetzten Tumorzellen nachweisbar wären. Die TGFß1-Konzentrationen in den

Assay-Überständen der LAK-Assays lagen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze (nicht ge-

zeigt).

TGFß selbst und Fehlsteuerungen des TGFß-Signalweges vermittelten Tumorgenese sowie

eine erhöhte Malignizität von Tumoren (JIRTLE R. L. und MEYER S. A., 1991; JACHIMCZAK P. et al.,

1996; MORINGA Y. et al., 1997; SIESE A. et al., 1999; STANDER M. et al., 1999; HATA A., 2001; PASCHE B.,

2001). So konnte u.a. eine enge Verzahnung des Smad2-, JNK- und Ras-pathways und die

nachfolgende NF-kB-Aktivierung nach TGFß1-induzierten Signalen nachgewiesen werden

(PARK J. I. et al., 2003). Über NF-kB werden eine Vielzahl aktivierender und überlebensför-

Diskussion

119

dernder Signale in Zellen übermittelt (KARIN M. et al., 2002; LI Q. und VERMA I. M., 2002). Auch

Synergismen mit der NF-kB-Aktivierung durch mCD137 und membrangebundenen CD137-

Ligand und den dadurch vermittelten physiologischen Funktionen (siehe Kap. 1.1.2.1.4. und

1.1.2.1.5.) sind denkbar.

Auch B-CLL-Zellen exprimieren hohe Mengen an TGFß (KREMER J. P. et al. 1992; SCHULER M. et

al., 1998). Die Effekte von TGFß auf CLL-Zellen sind jedoch nicht eindeutig: Einige Autoren

beschreiben eine antiproliferative Wirkung von endo- und exogenem TGFß auf CLL-Zellen.

Diese ist jedoch geringer als die Wirkung auf native B-Zellen (JURLANDER J., 1997; LAGNEAUX L.

et al., 1997; 1998; SCHULER M. et al., 1998). Dagegen finden L. LAGNEAUX et al. in einer Studie

keinerlei Proliferationsinhbition der CLL-Zellen bei sechs von 21 Patienten (LAGNEAUX L. et al.,

1997; 1998). In einem Artikel von G. MEINHARDT wird TGFß hinsichtlich seiner Funktion

während der CLL unter „Faktoren mit vermischten oder widersprüchlichen Effekten“ ange-

führt: Zum einen inhibiert TGFß die Proliferation der entarteten B-Lymphozyten, wenn auch

in geringerem Maße als die Zellteilung gesunder B-Zellen. Der maligne Klon erhält jedoch

einen proliferativen Vorteil durch seine verminderte Sensitivität gegenüber TGFß. So hemmt

die verstärkte Zytokinsekretion durch leukämische und Stromazellen während der CLL nor-

male Knochenmarkszellen, aber der entartete B-Zell-Klon kann expandieren (MEINHARDT G. et

al., 1999). Die gestörte Empfindlichkeit gegenüber der TGFß-Wirkung ist meist auf Mutatio-

nen der TGFß-Rezeptoren oder der Herabregulation ihrer Expression auf den CLL-Zellen zu-

rückzuführen (LAGNEAUX L. et al., 1998). B-CLL-Zellen zeigen sich resistent gegen TGFß-indu-

zierte Apoptose (DOUGLAS R. S. et al., 1989; LAGNEAUX L. et al., 1998).

Die Induktion von TGFß durch die mCD137-Expression kann so zusätzlichen Vorteil für das

Wachstum und Überleben der CLL-Zellen bedeuten, neben den überlebensfördernden und zy-

tolysesenkenden Wirkungen von mCD137 und einer möglichen Suppression der anti-Tumor-

Immunantwort durch TGFß.

4.3.2.3. Vermittlung der TGFß-Freisetzung durch CD137 oder CD137-Ligand

Bisher blieb die Frage unbeantwortet, ob die reduzierte Empfindlichkeit gegenüber der Zyto-

lyse von einem Signal durch CD137 oder durch CD137-Ligand vermittelt wird.

Die meisten LAK-Assays wurden mit transfizierten Zellen durchgeführt. In transfizierten Zel-

len wird das transfizierte Gen häufig sehr stark exprimiert, wenn es über einen viralen Promo-

tor, wie den CMV- oder RSV-Promotor in unserem System, transkripiert wird. Eine hohe Ex-

pression von Membranproteinen kann zur Folge haben, daß sich diese ohne weitere Stimula-

tion in der Membran zu Multimeren zusammenlagern und auf diese Weise entweder selbst

Diskussion

120

konstitutiv ein Signal in die sie tragende Zelle transduzieren oder auf einer Nachbarzelle vor-

kommende Liganden vernetzen und so ein Signal durch den Liganden in die Nachbarzelle

senden (FENG X. H. und DERYNCK R., 1996; LEONI C. und VALTORTA F., 2002; HUR E. M. et al., 2003).

Dies könnte zu einer Assoziation der CD137-Proteine in der Membran und u.U. der Trans-

duktion von Signalen in die transfizierten Zellen geführt haben. Die Ligation von CD137

kann zur NF-kB-Aktivierung und der Induktion der überlebensfördernden Proteine Bcl-xL

und Bfl-1 in den Tumorzellen führen (ARCH R. H. und THOMPSEN C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998;

LEE H. W. et al., 2002). Denkbar ist auch die Transkription und Freisetzung weiterer Moleküle

nach mCD137-Vernetzung, die das Überleben der Tumorzellen bzw. die Aktivität der LAK-

Zellen beeinflussen. Die durch mCD137 vermittelten physiologischen Funktionen in Zellen

außerhalb des Immunsystems sind kaum bekannt. Geht man von den Signalwegen aus, die

nach mCD137-Stimulation im Immunsystem beschritten werden, so sollte CD137-Ligation

eine eher aktivierende, überlebensfördernde Wirkung besitzen und entsprechende Oberflä-

chenmoleküle und Zytokine induzieren.

Zudem oder alternativ ist eine Wirkung des CD137-Moleküls über die Ligation von CD137-

Ligand-Molekülen auf den Tumorzellen möglich. Sowohl myeloide Zellen (K562), als auch

Lymphozyten (Jurkat, Raji) exprimieren CD137-Ligand (ALDERSON M. R. et al., 1994; PAULY S.,

2000; SALIH H. R. et al., 2001; SÖLLNER L., 2001). Die Vernetzung des CD137-Liganden auf ver-

schiedenen Karzinomzellinien führt zu einer deutlichen Steigerung der IL-8-Expression dieser

Zellen. IL-8 ist ein proinflammatorisches Zytokin (SALIH H. R. et al., 2000). Die Ligation von

CD137-Ligand auf Monozyten/Makrophagen hat ebenfalls aktivierende Wirkung (LANGSTEIN J.

et al., 1998; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN et al., 2000; SÖLLNER L.,

2001). Zudem hemmt eine Quervernetzung des CD137-Ligand-Proteins aktivierte T-Zellen

durch die Induktion von Apoptose (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).

Auch aus den antisense- und Blockierungsexperimenten kann nicht rückgeschlossen werden,

ob der CD137-Rezeptor oder der CD137-Ligand das Signal überträgt:

Steigt die Lyserate nach der Transfektion des CD137-antisense-Vektors an, kann dies darauf

zurückzuführen sein, daß durch die Herabregulation von CD137 in der Membran weniger

CD137-Ligand quervernetzt werden kann. Das führt zu einer Abschwächung der Lyseminde-

rung, wenn die Hemmung der Zytolyse durch ein CD137-Ligand-Signal vermittelt wird. Das

gleiche ist zu erwarten, wenn der Effekt über CD137 transduziert wird: Weniger CD137 in

der Membran entspricht weniger Signaltransduktion über dieses Molekül und damit einem ge-

ringeren „funktionellen“ Effekt (vgl. Abb. 3.-13., 3.-14. und 3.-15.).

Diskussion

121

Das Blockieren der CD137-CD137-Ligand-Wechselwirkung durch neutralisierende Antikör-

per verändert das Verhältnis der CD137-Rezeptor- zu den Ligand-Molekülen in den Mem-

branen der beteiligten Zellen nicht nicht. An CD137 gebundener Antikörper verhindert je-

doch, daß dieses Protein seinen Ligand binden und vernetzen kann. Dadurch kann weder ein

Signal durch CD137 noch eines durch CD137-Ligand übertragen werden. Im Falle der Trans-

fektion bzw. weniger CD137-Moleküle ist es darüber hinaus denkbar, daß blockierende anti-

CD137-Antikörper an eben synthetisierte oder einzeln in der Membran schwimmende

CD137-Moleküle binden, und dadurch eine Zusammenlagerung von CD137 zu Multimeren

verhindert. Ohne Multimerisierung ist jedoch die Signaltransduktion durch CD137, wie sie als

Artefakt in CD137-sense transfizierten Zellen auftreten könnte, ebenfalls nicht möglich.

Um nachweisen zu können, über welches Molekül – CD137 oder CD137-Ligand – die Lyse-

inhibition durch mCD137 vermittelt wird, wurde der Vektor pcDNA-ILA-trunc konstruiert

und in der Transfektion eingesetzt. Dieses Konstrukt verfügt nur über die Extrazellulär- und

Transmembransequenz der codierenden Region von CD137. Dadurch ist ein von diesem Vek-

tor exprimiertes trunkiertes membranständiges Protein in der Lage, über den Extrazellulärbe-

reich zu multimerisieren und den CD137-Liganden zu vernetzen, nicht aber Signale in die

Zelle zu transduzieren. Durch Oligomerisierung mit intakten CD137-Proteinen entstehen do-

minant-negative Effekte, da eine effiziente Signalübertragung davon abhängt, daß alle kom-

plexierten CD137-Moleküle über Intrazellulärregionen verfügen.

Tumorzellen, die mit dem Vektor pcDNA-ILA-trunc transfiziert wurden, sind nicht mehr im-

stande sich gegen die LAK-Lyse zu schützen (Kap. 3.3.3.4., Abb. 3.-28.). Ein Signal über

CD137 ist für die Reduktion der Lyse folglich ebenso essentiell wie das Vorhandensein von

TGFß1.

Dennoch wird TGFß1 – wie weitere Versuche mit pcDNA-ILA-trunc ergaben – unabhängig

von der Anwesendheit einer intakten Intrazellulärsequenz von mCD137 freigesetzt (Kap.

3.3.3.4., Abb. 3.-29.). Die Experimente legen nahe, daß die Induktion der TGFß-Sekretion

durch den CD137-Liganden vermittelt wird, dessen Signalübertragung durch CD137trunc

nicht gestört ist. CD137-Ligand wird sowohl auf B-Lymphozyten (Raji), wie auch auf mye-

lotischen Zellen (K562) exprimiert (ALDERSON M. R. et al., 1994;; PAULY S., 2000; SALIH H. R. et al.,

2001; SÖLLNER L., 2001).

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß für den CD137-vermittelten Schutz vor LAK-Lyse so-

wohl ein Signal durch CD137 als auch ein Signal durch CD137-Ligand essentiell ist. TGFß

wird auf das Signal durch CD137-Ligand hin freigesetzt. Um einen höchstmöglichen Schutz

Diskussion

122

vor zytotoxischer Lyse zu erreichen, müssen Tumorzellen sowohl CD137-Rezeptor als auch

CD137-Ligand exprimieren und die Fähigkeit zur TGFß-Sekretion besitzen. Um den Körper

bei der Tumorbekämpfung zu unterstützen, muß dieser parakrine Kreislauf unterbrochen wer-

den.

4.4. Die Rolle von sCD137 in der LAK-Antwort

Die Frage, warum sCD137 in den Seren von CLL-Patienten auftaucht, wurde bislang nicht

ausreichend betrachtet. Wie in Kapitel 3.1.3. nachgewiesen werden konnte, wird sCD137 in

der CLL von den T-Lymphozyten der Patienten sekretiert. Hier sind die wichtigsten Ergebnis-

se aus Kapitel 3.1.3. noch einmal zusammengefaßt:

(i) Je aggressiver die CLL verläuft und je weiter sie fortgeschritten ist, desto mehr

sCD137 ist im Serum der Patienten nachweisbar.

(ii) Je mehr aktivierte T-Lymphozyten im Blut der CLL-Patienten vorhanden sind, desto

weniger sCD137 kann im Serum Erkrankter detektiert werden.

(iii) Auf das Überleben der CLL-Zellen hat sCD137 keine positive Wirkung.

Das erscheint widersprüchlich: Die B-CLL-Zellen scheinen keinen Vorteil vom Vorhanden-

sein des löslichen CD137 zu haben, ebensowenig die aktivierten T-Lymphozyten. Dennoch

ist sCD137 ein Kennzeichen fortgeschrittener CLL.

Um die Wirkung von sCD137 auf die anti-Tumor-Immunreaktion zu charakterisieren, wurde

die Wirkung von löslichem CD137-Fc auf LAK-Zellen untersucht. Mit CD137-Fc-Fusions-

protein vorinkubierte LAK-Zellen vermögen fünffach effizienter Lyse zu induzieren als LAK-

Zellen, die mit Fc-Kontrollprotein vorinkubiert wurden, unabhängig von der Art der Ziel-

zellen (Kap. 3.4.1., Abb. 3.-31., bzw. nicht gezeigt).

Behandelt man dagegen die Zielzellen mit löslichem CD137-Fc vor, so ergibt sich eine Stei-

gerung der Lyseempfindlichkeit der Zellen abhängig von der eingesetzten Tumorzellinie

(Kap. 3.4.1., Abb. 3.-32.). Da die Inkubation der Zellen vor dem Einsatz im Assay erfolgte,

kann hierfür die Erhöhung der Lysekapazität der LAK-Zellen ausgeschlossen werden. Es muß

sich also um einen Effekt des löslichen CD137-Proteins auf die Targetzellen handeln.

Ein Problem bei der Verwendung von CD137-Fc-Fusionsprotein kann darin bestehen, daß

über den Fc-Teil des Proteins zwei CD137-Moleküle vernetzt sind, die u.U. die Ligation von

zwei Ligandmolekülen erlauben. Das kann eine Signalübertragung durch den CD137-Ligand

bewirken. Zudem sind durch den Fc-Anteil weitere Probleme bei der Interaktion zwischen

CD137-Fc, CD137, sowie CD137-Ligand denkbar.

Diskussion

123

Um lösliches CD137 zur Verfügung zu haben, das endogenem sCD137 entspricht aber den

CD137-Liganden nicht vernetzen kann, wurde der Vektor pcDNA-ILA-w/otm entwickelt, der

für sCD137 codiert. In mCD137-exprimierenden Zellinien, wie K562 und Jurkats, konnte die

Lyse gegenüber den CD137-negativen COS-Zellen durch lösliches CD137-Fc stärker gestei-

gert werden (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-32.); daher wurden die Auswirkungen des endogen von

pcDNA-ILA-w/otm exprimierten sCD137 an mCD137-tragenden Zellen untersucht.

Kotransfektionen von CD137-sense- und sCD137-codierenden Vektoren in COS-Zellen re-

sultierten in einer vollständigen Rekonstitution der Lyseempfindlichkeit gegenüber CD137-

sense-transfizierten Zellen. pcDNA-ILA-w/otm-transfizierte K562 oder Raji-Zellen zeigten

eine gegenüber kontrolltransfizierten Zellen deutlich gesteigerte Sensibilität für die LAK-Ly-

se (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-33.).

Lösliche Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie können durch folgenden Mechanismus wir-

ken: In der Extrazellulärdomäne tragen die TNFR-Moleküle die sog. plad-Domäne, die die

Oligomerisierung der Moleküle vermittelt. Diese Domäne ist bei löslichen Molekülen erhal-

ten, so daß diese mit membranständigen Isoformen Komplexe bilden können. Dies bewirkt

dominant-negatives Verhalten bzgl. der Signaltransduktion: Durch die gemischten Komplexe

kann wegen der fehlenden Intrazellulärbereiche der löslichen Proteine kein Signal in die Zelle

transduziert werden. Dies ist für die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie TNFR1 und Fas

nachgewiesen (ORLINICK J. R. et al., 1997; PAPOFF G. et al., 1999; CHAN F. K.-M. et al., 2000; SIEGEL R. M.

et al., 2000). Auch für CD137 erscheint dieser Mechanismus wahrscheinlich.

Darüber hinaus können lösliche Moleküle der TNF-Rezeptorfamilie ihre membranständigen

Liganden blockieren, indem einzelne lösliche Rezeptormoleküle an Liganden(trimere) binden,

die in der Membran schwimmen. So kann eine Multimerisierung der Liganden und dadurch

eine Signalübertragung in die Ligand-tragende Zelle verhindert werden. Dies ist u.a. für Fas

beschrieben (OWEN-SCHAUB L. et al., 2000; KAMIHIRA S. und YAMADA Y., 2001). Das in Abb. 3.-33.

gezeigte LAK-Assay mit COS-Zellen steht jedoch in scheinbarem Widerspruch zu dieser

These, da die Anwesendheit von sCD137 auf kontrolltransfizierte Zellen keinen Einfluß hat.

Dies kann aber auch darauf zurückzuführen sein, daß die in diesem Assay verwendeten COS-

Zellen keine oder eine nur niedrige Konzentration an CD137-Ligand aufweisen.

Die Wirkung von sCD137 auf die Lyseempfindlichkeit der eingesetzten Tumorzellen kann

dadurch zum Teil erklärt werden, da in Kapitel 3.3. gefunden wurde, daß die schützende

TGFß-Induktion über ein CD137-Ligand-Signal vermittelt wird. Auch ist auf Zellen B-

lymphatischen und myelotischen Ursprungs, wie K562 und Raji-Zellen, eine deutlich höhere

konstitutive Expression an CD137-Ligand zu erwarten, als auf Nieren-Epithelzellen (COS).

Diskussion

124

Um zu überprüfen, ob sCD137 die Signaltransduktion durch den Liganden blockiert, wurden

die Überstände von K562- und Raji-Zellen auf ihre TGFß-Freisetzung hin untersucht. Die

Zellen wurden vorher mit löslichem CD137-Fc inkubiert. Im Vergleich zu Zellen, die mit Fc-

Kontrollprotein kultiviert wurden, nahm in CD137-Fc-behandelten Zellen die TGFß-Sekre-

tion ab (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-34. A und B). In pcDNA-ILA-w/otm- transfizierten Zellen zeig-

te sich die Reduktion der TGFß-Freisetzung gegenüber kontroll- und CD137-sense-transfi-

zierten Zellen noch deutlicher (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-34. C und D).

sCD137 hat in den LAK-Assays eine doppelte Funktion: Es unterbricht die schützenden Sig-

nale durch mCD137 durch dominant-negative Interaktion. Die CD137-vermittelten Signale

werden zusätzlich zu der CD137-Ligand vermittelten TGFß-Induktion benötigt, um den

Schutz gegenüber der Zytolyse zu bewirken. Die CD137-Ligand vermittelte TGFß-Induktion

vermag sCD137 durch die Blockierung des Liganden ebenfalls zu hemmen. Dies macht

sCD137 zu einem potenten Molekül, um die tumorschützenden Effekte des CD137-/CD137-

Ligand-Systems zu unterbrechen.

Dem sCD137 im Serum der CLL-Patienen scheint daher eine eher T-Zell-unterstützende Wir-

kung zu zuzukommen, da es den Schutzmechanismus durch den parakrinen loop zwischen

CD137- und CD137-Ligand-Signalen durchbricht, die zum Schutz der entarteten Zellen vor

Zytolyse führen. sCD137 greift jedoch auch auf der Seite der CTL-Zellen in die Regulation

der anti-Tumor-Antwort ein, da eine mCD137-vermittelte Stimulation in T-Zellen die Pro-

duktion proinflammatorischer Zytokine, die Entwicklung zytolytischer Immunantworten und

die anti-Tumor-Immunität erhöht (DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; HURTADO J. C. et al., 1995; DEBE-

NEDETTE M. A. et al., 1997; MELERO I. et al., 1997; 1998i; SHUFORD W. W. et al., 1997; MOGI S. et al., 2000;

KIM J. A. et al., 2001; DIEHL L. et al., 2002; MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002; WILCOX

R.A. et al., 2002ii; 2002iii; YOSHIDA H. et al., 2003).

Zusammengefaßt ergibt sich für B-Zell-Tumoren oder Leukämien myelotischen Ursprungs

folgende Situation:

Myelotische oder B-lymphatische Zellen exprimieren CD137-Ligand. Durch diesen kann die

betreffende Zelle mit mCD137 – beispielsweise auf einer aktivierten T-Zelle – interagieren.

Durch dieses Signal wird die Tumorzelle zur Sekretion von TGFß angeregt. TGFß wirkt auf

die anti-Tumor-Immunzellen supprimierend. Aktivierte anti-Tumor-T-Zellen tragen CD137

und CD137-Ligand auf ihrer Membran. Signale durch die Vernetzung von CD137 durch den

CD137-Ligand auf B- oder myelotischen Zellen, wie DCs oder Monozyten, führen zu einer

starken Aktivierung der T-Lymphozyten. Dies resultiert in einer gesteigerten Proliferation, er-

höhten zytotoxischen Effektorfunktionen und der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine,

Diskussion

125

wie IL-2 oder TNF. Außerdem beginnen die aktivierten T-Zellen CD137-Ligand zu exprimie-

ren (Abb. 4.-1.). In dieser Phase der Tumorantwort liegen die Vorteile auf der Seite der anti-

Tumor-T-Zellen. Eine Vernichtung der entarteten Zellen scheint möglich.

Abb. 4.-1.: Potentielle Wirkung der CD137-Ligand-Expression durch die Tumorzelle auf die anti-

Tumor-Antwort. Die Vernetzung von CD137-Ligand auf Tumorzellen führt zur TGFß-Se-

kretion. TGFß supprimiert die anti-Tumor-Antwort. Anti-Tumor-T-Lymphozyten erhalten je-

doch durch den CD137-Ligand auf der Tumorzelle über CD137 ein starkes aktivierendes Sig-

nal. Dies führt zum Überleben, der Proliferation, einer Steigerung der Gedächtnisfunktion und

der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine durch die T-Zellen. Dadurch werden diese pa-

rakrin stimuliert und exprimieren infolge ihrer starken Aktivierung CD137-Ligand. In dieser

Phase der Tumorentwicklung überwiegt das CTL-stimulierende Signal durch CD137 gegen-

über dem supprimierenden TGFß-Signal. In diesem Stadium ist eine Vernichtung der Tumor-

zellen noch möglich.

Stimulation durch den CD137-Ligand^ TGFß-Freisetzung, die aber ohne zusätzliches Signal durch CD137 ohne für die Tumorzelle von nur geringer Wirkung bleibt

CD137

CD137-Ligand

TumorzelleaktivierteT-Zelle

Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ Steigerung der CTL-Funktion^ gesteigertes Überleben^ Steigerung der Gedächtnisfunktion

^

TGFß

TGFß

Wirkung von TGFß auf Tumorzellen^ eventuell Steigerung der Proliferation^ eventuell Verringerung der Apoptose-

rate (z. B. in der CLL)^ eventuell Induktion von Apoptose

Wirkung von TGFß auf aktivierte T-Lym-phozyten^ Suppression^ Induktion von Apoptose und Anergie

Diskussion

126

Die Tumorzelle exprimiert im Verlauf der weiteren Tumorentwicklung – z.B. durch ein Mu-

tationsereignis ausgelöst – mCD137 als Neoantigen. Via CD137-vermittelte Signaltransduk-

tion durch den mCD137-Ligand von Nachbartumorzellen erhält die entartete Zelle überle-

bensfördernde Signale, z.B. durch NF-kB-Aktivierung oder die Induktion von apoptosehem-

mender Proteine, wie Bcl-xL oder Bfl-1. mCD137 schützt die malignen Zellen zudem vor der

Zytolyse durch die anti-Tumor-T-Zellen. Außerdem ist die Tumorzelle in der Lage parakrin

die CD137-Liganden auf Nachbarzellen zu vernetzen und dadurch deren TGFß-Freisetzung

zu steigern. Das sekretierte TGFß wirkt einerseits – zusammen mit den mCD137-vermittelten

Signalen – überlebensfördernd auf die Tumorzellen, andererseits supprimiert es die anti-Tu-

mor-T-Zellen und treibt sie in Apoptose und Anergie. Durch mCD137 sind die entarteten

Zellen in der Lage über die Ligation des CD137-Liganden ein weiteres apoptoseinduzie-

rendes Signal in die T-Lymphozyten zu übermitteln. Durch ihren CD137-Rezeptor erhalten

die T-Zellen weiterhin stimulierende Signale, die aber bereits der Regulation durch die gleich-

zeitige Expression von CD137-Ligand unterliegen – die Zelle bekommt mehr Signale in Rich-

tung Apoptose und Anergie (Abb. 4.-2.).

In diesem Stadium zeigen sich deutliche Vorteile für die Tumorzellen: Sie sind vor der

Zytolyse durch die CTLs geschützt. Zusätzlich erhalten sie überlebensfördernde Signale.

Gleichzeitig supprimieren die Tumorzellen die Tumorabwehr durch die Induktion von

Anergie und Apoptose.

Diskussion

127

Abb. 4.-2.: Potentielle Wirkung der gleichzeitigen Expression von CD137 und CD137-Ligand

Expression durch Tumorzellen auf die anti-Tumor-Antwort. Die zusätzliche Expression

von CD137 durch die Tumorzelle schützt diese – zusammen mit dem nach CD137-Ligand-

Vernetzung induzierten TGFß – vor der Zytolyse durch tumorreaktive T-Zellen und fördert

das Überleben und die weitere TGFß-Produktion der entarteten Zellen. Die T-Lymphozyten

sind nicht nur vermehrt dem immunsuppressiv wirkenden TGFß ausgesetzt, sondern erhalten

durch die Ligation des CD137-Liganden Apoptosesignale. Die Vorteile hinsichtlich des

Überlebens liegen nun auf der Seite der Tumorzellen.

Um der Anergie und dem CD137-Ligand vermittelten AICD zu entgehen, exprimieren die T-

Lymphozyten sCD137. sCD137 blockiert zum einen die aktivierenden Signale durch CD137

in die T-Zellen durch dominant-negative Interaktion mit mCD137-Molekülen auf der T-Zell-

Oberfläche. Zum anderen hemmt es die Transduktion apoptosefördernder Signale durch

CD137-Ligand in die T-Zellen. Auf der Seite der Tumorzelle inhibiert das freigesetzte

sCD137 ebenfalls die Signaltransduktion durch das CD137-/CD137-Ligand-System: Der pa-

Stimulation durch den CD137-Ligand^ TGFß-Freisetzung

CD137

CD137-Ligand


Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ Steigerung der CTL-Funktion^ gesteigertes Überleben^ Steigerung der Gedächtnisfunktion

TGFß

TGFß

Wirkung von TGFß auf Tumorzellen^ Zusammen mit dem CD137-Signal: Schutz vor Zytolyse

Wirkung von TGFß auf aktivierte T-Zellen^ Suppression^ Induktion von Apoptose und Anergie

Stimulation von CD137-Ligand^ Induktion von Anergie und Apoptose

Stimulation durch CD137^ Überleben^ Zusammen mit TGFß: Schutz vor Zytolyse

Diskussion

128

rakrine loop aus CD137-vermittelten Überlebenssignalen und tumorfördernden Wirkungen

von CD137-Ligand-induzierten TGFß wird unterbrochen (Abb. 4.-3).

Abb. 4.-3.: Potentielle Wirkung der sCD137-Expression durch die anti-Tumor-T-Lymphozyten auf

die Interaktion zwischen Tumor- und T-Zellen. Sowohl die Signaltransduktion durch

CD137 als auch durch CD137-Ligand wird unterbrochen. Dies hebt sowohl die tumorfördern-

den Signale durch CD137 und die CD137-Ligand vermit-telte TGFß-Freisetzung auf. Zum

anderen schützt es die T-Lymphozyten vor Apoptose. Jedoch ist eine Aktivierung der T-Zellen

durch mCD137 durch sCD137 gehemmt.

Aus den zusammenfassenden Schemata geht hervor, daß es sich bei der Tumorkontrolle durch

CD137/-CD137-Ligand-Signale um ein fein abgestimmtes Netzwerk handelt. In einer Viel-

zahl von Tumoren sind Signaltransduktionswege mutiert und die Empfindlichkeit gegenüber

regulatorischen Molekülen daher modifiziert. CD137 stellt einen Immunregulator dar. Seine

Neoexpression auf Tumorzellen vermittelt zusammen mit der TGFß-Induktion durch CD137-

Ligand einen starken Schutz vor CTL-Lyse.

Stimulation durch den CD137-Ligand^ durch sCD137 aufgehoben

CD137

CD137-Ligand


Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ durch sCD137 aufgehoben

Wirkung von sCD137 auf aktivierte T-Lymphozyten^ hebt die Effekte von CD137- und CD137-Ligand auf

Stimulation von CD137-Ligand^ durch sCD137 aufgehoben Stimulation durch den CD137

^ durch sCD137 aufgehoben

sCD137

Wirkung von sCD137 auf Tumorzellen^ hebt die Effekte von CD137- und CD137-Ligand auf

Diskussion

129

4.5. Ausblick

Ein wichtiges Ziel bei der Aufklärung der Bedeutung des CD137-/CD137-Ligand-Systems

bei der Tumorantwort ist es, die Relevanz dieses Systems in vivo zu bestimmen. Denkbar sind

für diese Fragestellung Experimente mit Mäusen, denen syngene Tumoren injiziert werden,

die sich in ihrer mCD137-Expression unterscheiden. Solche Versuche sollten eine klare

Aussage darüber erlauben, ob die Expression von mCD137 auch in der in vivo-Situation das

Überleben und den Schutz des Tumors vor der Zytolyse durch Immunzellen vermitteln kann.

Die deutliche Rekonstitution der Zytolyseempfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber den

zytotoxischen Immunzellen durch sCD137 läßt die Inhibition der CD137-/CD137-Ligand-

Wechselwirkung als einen Ansatzpunkt für eine Tumortherapie erscheinen. sCD137 stellt ein

potentes Molekül dar, um den Lyseschutz zu verhindern, da es die Signaltranduktion durch

CD137 sowie die durch den CD137-Ligand zu unterbrechen vermag. Inwieweit eine Thera-

pie mit sCD137 die Regulation der anti-Tumor-Antwort auf der Seite der zytotoxischen

Zellen stört, bedarf weiterer Forschung. Die mCD137-Stimulation in T-Zellen vermittelt nicht

nur die Produktion proinflammatorischer Zytokine sondern auch die Entwicklung der

zytolytischen und tumordestruktiven Immunantworten (DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; 1997; ME-

LERO I. et al., 1997; 1998i; SHUFORD W. W. et al., 1997; CANNONS J. L. et al., 2001; KIM J. A. et al., 2001;

DIEHL L. et al., 2002; MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002; W ILCOX R.A. et al., 2002iii;

YOSHIDA H. et al., 2003).

Zusammenfassung

130

5. Zusammenfassung

Das CD137-/CD137-Ligand-System spielt in der Regulation von anti-Tumor-Immunantwor-

ten eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurden zu ersten Mal die Auswirkungen der Expres-

sion von mCD137 auf Tumorzellen untersucht.

Das Screening von Lymphozyten-Proben eines CLL-Patientenkollektivs ergab, daß die RNA

für mCD137 in den stimulierten Zellen aller daraufhin untersuchten Patienten exprimiert

wurde. Zudem konnte die Expression des membranständigen Proteins über FACS-Analysen

und Immunfluoreszenzdoppelfärbungen bei 16 von 21 Patienten nachgewiesen werden. Dabei

handelt es sich um den ersten Nachweis von mCD137-Expression auf Proteinebene in B-Zel-

len. Auf stimulierten B-Lymphozyten gesunder Spender ist mCD137 nicht detektierbar (MI-

CHEL J., 1998). mCD137 wird auf den CLL-Zellen demnach als Neoantigen exprimiert.

In den Seren der aller getesteten Patienten wurde die lösliche Form von CD137 in Konzen-

trationen zwischen 0,08 und 1,1 ng/ml gefunden. In den Überständen stimulierter B-CLL-

Zellen konnte bei 14 von 17 Proben zwischen 0,1 und 1,2 ng/ml sCD137 detektiert werden.

RT-PCRs ergaben, daß die Zellen der überwiegenden Mehrheit der untersuchten Patienten

(10/12) die mRNA für sCD137 exprimieren. Durch Depletionsexperimenten konnte nachge-

wiesen werden, daß sCD137 – im Gegensatz zu mCD137 – während der CLL nicht von den

entarteten B-Lymphozyten, sondern von T-Zellen freigesetzt wird. Die von M. FURTNER ge-

fundene Korrelation (FURTNER M., 2001) zwischen der Leukozytenzahl und der sCD137-Kon-

zentration in den Seren von CLL-Patienten konnte bestätigt werden. Darüber hinaus konnte

gezeigt werden, daß eine positive Korrelation mit dem Prognosemarker ß2-Mikroglobulin

besteht, sowie eine inverse Korrelation mit der Anzahl an aktivierten T-Lymphozyten der

Patienten.

mCD137 wirkt auf B-CLL-Zellen überlebensverlängernd ohne Proliferation zu initiiren.

mCD137-transfizierte Tumorzellen schützt die Expression von mCD137 vor LAK-Lyse. Die-

ser Effekt wird spezifisch durch mCD137 vermittelt: Sowohl die Transfektion mit einem

CD137-antisense-Vektor als auch die Neutralisation der CD137-/CD137-Ligand-Interaktion

durch Antikörper heben den Schutz vor der zytotoxischen Lyse durch die LAK-Zellen auf.

Für den schützenden Effekt durch die mCD137-Expression der Tumorzellen konnten

folgende Mechanismen ermittelt werden:

mCD137-tragende Zellen können in LAK-Zellen geringfügig mehr Apoptose induzieren als

Kontrollzellen. Dieser Mechanismus spielt zumindest in vitro jedoch eine eher untergeordnete

Rolle. Darüber hinaus sekretieren Raji- und K562-Zellen nach Transfektion mit einem

Zusammenfassung

131

CD137-sense-Vektor TGFß. IL-10 spielt im Zusammenhang mit der mCD137-spezifischen

Reduktion der Lyse keine Rolle. Der im LAK-Assay analysierte Schutz durch TGFß wird in

erster Linie parakrin zwischen den Tumorzellen vermittelt, wie durch Neutralisierungsexperi-

mente gezeigt werden konnte. Die Freisetzung dieses Zytokins erfolgt durch reverse Signal-

transduktion via CD137-Ligand. Dies konnte durch Experimente mit transfizierten Zellen

nachgewiesen werden, die ein trunkiertes CD137-Protein exprimieren. Diese CD137-trunc-

Moleküle können weiterhin den Liganden vernetzen, sind aber selbst nicht mehr zur Signal-

transduktion befähigt. Darüber hinaus supprimieren sie die Signalübertragung von endogenem

CD137 dominant-negativ.

sCD137 hebt den die mCD137-vermittelte Reduktion der Zytolyse vollständig auf. So hemmt

es dominant-negativ die Signalübertragung durch mCD137. Zum anderen blockiert es die

TGFß-Freisetzung durch CD137-Ligand.

Insgesamt bietet die Koexpression von CD137 und CD137-Ligand myelotischen und B-

lymphatischen Leukämiezellen Vorteile: Durch ein Signal durch mCD137 und die CD137-

Ligand-induzierte TGFß-Freisetzung wird ein starker Schutz gegen Zytolyse durch anti-

Tumor-Immunzellen vermittelt. Dieser Schutz kann durch die Bereitsstellung von sCD137-

Molekülen, die beide Signalwege hemmen, aufgehoben werden.

Literaturverzeichnis

132

6. Literaturverzeichnis

Achenbach W.Rationale Praxis-Onkologie: Fakten, Daten, Übersichten für den täglichen Umgang mit Tu-morpatientenBalingen, 1997

Aguilar-Santelises M., Gigliotti D., Osorio L. M., Santiago A. D., Mellstedt H., Jondal M.Cytokine expression in B-CLL in relation to disease progression and in vitro activationMed. Oncol. 1999; 16 (4): 289 – 295

Akdis C. A., Blaser K.Mechanisms of interleukin-10-mediated immune suppressionImmunology 2001; 103: 131 - 136

Akdis C. A., Joss A., Akdis M., Blaser K.Mechanism of Il-10-induced T cell inactivation in allergic inflammation and normal responseto allergensInt. Arch. of Allergy Immunol. 2001; 124: 180 - 182

Alderson M. R., Smith C. A., Tough T. W., Davis-Smith T., Armitage R. J., Falk B.,Roux E., Baker E., Sutherland G. R., Din W. S., Goodwin R. G.Molecular and biological characterization of human 4-1BB and its ligandEur. J. Immunol. 1994; 24 (9): 2219 - 2227

Alvarez-Mon M., Garcia-Suarez J., Prieto A., Manzano L., Reyes E., Lorences C.,Peraile G., Jorda J., Durantez A.Heterogeneous proliferative effect of tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin on mito-gen-activated B cells from B-chronic lymphocytic leukemia.Am. J. Hematol. 1993; 43 (2): 81 - 85

Arber W.RestriktionsendonukleasenAngew. Chemie 1987; 90: 79 - 85

Arch R. H., Thompson C. B.4-1BB and Ox-40 are members of the tumor necrosis factor (TNF) – nerve growth factor re-ceptor superfamily that bind TNF receptor-associated factors and activate nuclear factor kBMol. Cell Biol. 1998; 18 (1): 558 - 565

Arch R. H., Gedrich R. W., Thompson C. B.Translocation of TRAF proteins regulates apoptotic threshold of cellsBiochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 272 (3): 936 - 945

Armitage R. J.Tumor necrosis factor receptor superfamily members and their ligandsCurr. Opin. Immunol. 1994; 6 (3): 407 - 413


133

Aruffo A., Farrington M., Hollenbaugh D., Li X., Milatovich A., Nonoyama S., BajorathJ., Grosmaire L. S., Stenkamp R., Neubauer M.The CD40 ligand, gp39, is defective in activated T cells from patients with X-linked hyper-IgM syndromeCell 1993; 72 (2): 291 - 300

Aslakson C. J., Lee G., Boomer J. S., Gilman-Sachs A., Kucuk O., Beaman K. D.Expression of regeneration and tolerance on B cell chronic lymphocytic leukemias: a possiblemechanism for escaping immune surveillanceAm. J. Hematol. 1999; 61 (1): 46 - 52

Banchereau J., Bazan F., Blanchard D., Briere F., Galizi J. P., van Kooten C., Liu Y. J.,Rouset F., Saeland S.The CD40 antigen and its ligandAnnu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881 - 922

Banner D. W., D’Arcy A., Janes W., Gentz R., Schoenfeld H. J., Broger C., LoetscherH., Lesslauer W.Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNFß complex; implica-tions for TNF receptor activationCell 1993; 73 (3): 431 - 445

Bannerji R., Byrd J. C.Update on the biology of chronic lymphocytic leukemiaCurr. Opin. Oncol. 2000; 12 (1): 22 - 29

Bansal-Pakala P., Croft M.Defective T cell priming associated with aging can be rescued by signaling through 4-1BB(CD137)J. Immunol. 2002; 169: 5005 - 5009

Barry M., BleackleyCytotoxic T lymphocytes: all roads lead to deathNat. Rev. Immunol. 2002; 2: 401 - 409

Bartik M. M., Welker D., Kay N. E.Impairment in immune cell function in B cell chronic lymphocytic leukemiaSemin. Oncol. 1998; 25: 27 - 33

Bazzoni F., Beutler B.How do tumor necrosis factor receptors work?J. Infammat. 1995; 45: 221 - 238

Beck C., Schreiber H., Rowley D. A.Role of TGF-ß in immune-evasion of cancerMicrosc. Res. Tech. 2001; 52: 387 - 395

Berger D. P., Engelhardt R., Mertelsmann R.Das Rote Buch 1997/ 98: Hämatologie und internistische OnkologieLandsberg/Lech 1997


134

Berke G.The CTL’s kiss of deathCell 1995; 81: 9 - 12

Bertram E. M., Lau P., Watts T. H.Temporal segregation of 4-1BB versus CD28-mediated costimulation: 4-1BB ligand influen-ces T cell numbers late in the primary response and regulates the size of the T cell memory re-sponse following influenza infectionJ. Immunol. 2002; 168: 3777 - 3785

Birnboim H. C., Doly J.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNANucleic Acids Res. 1979; 7 (6): 1513- 1523

Bishop G. A., Hostager B. S., Brown K. D.Mechanisms of TNF receptor-associated factor (TRAF) regulation in B-lymphocytesJ. Leukoc. Biol. 2002; 72: 19 - 23

Biswas D. K., Martin K. J., McAlister C., Cruz A. P., Graner E., Dai S., Pardee A. B.

Apoptosis caused by chemotherapeutic inhibition of nuclear factor-kB activationCancer Res. 2003; 63: 290 - 295

Bjornberg F., Lantz M., Gullberg U.Metalloproteases and serinproteases are involved in the cleavageof the two tumor necrosisfactor receptors to soluble forms in the myeloid cell lines U-937 and THP-1Scand. J. Immunol. 1995; 42 (4): 418 - 424

Blair P. J., Riley J. L., Harlan D. M., Abe R., Tadaki D. K., Hoffmann S. C., White L.,Francomano T., Perfetto S. J., Kirk A. D., June C. H.CD40 ligand (CD154) triggers a short term CD4(+) T cell activation response that results insecretion of immunomodulatory cytokines and apoptosisJ. Exp. Med. 2000; 191 (4): 651 - 660

Blazar B. R., Lees C. J., Martin P. J., Noelle R. J., Kwon B., Murphy W., Taylor P. A.Host T cells resist graft-versus-host disease mediated by donor leukocyte infusionsJ. Immunol 2000; 165: 4901 - 4909

Blazar B. R., Kwon B. S., Panoskaltsis-Mortari A., Kwak K. B., Peschon J. J., Taylor P.A.Ligation of 4-1BB (CDw137) regulates graft-versus-host disease, graft-versus-leukemia, andgraft rejection in allogenic bone marrow transplant recipientsJ. Immunol. 2001; 166: 3174 - 3183

Blobel C. P.Function and biochemical characterization of ADAMs and their predicted role in protein ecto-domaine sheddingInflamm. Res. 2002; 51 (2): 83 - 84

Bodmer J. L., Schneider P., Tschopp J.The molecular architecture of the TNF superfamilyTrends Biochem. Sci. 2002; 27 (1): 19 - 26


135

Bossu P., Singer G. G., Andres P., Ettinger R., Marshak-Rothstein A., Abbas A. K.Mature CD4+ T lymphocytes from MRL/lpr mice are resistant to receptor-mediated toleranceand apoptosisJ. Immunol. 1993; 151 (12): 7233 - 7239

Boussaud V., Soler P., Moreau J., Goodwin R. G., Hance A. J.Expression of three members of the TNF-R family of receptors (4-1BB, lymphotoxin-breceptor, and Fas) in human lungEur. Respir. J. 1998; 12: 926 - 931

Boyum A.Separation of leukocytes from blood and bone marrowScand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; 21 (Suppl. 97): 77

Bradford M. M.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye bindingAnal. Biochem. 1976; 72: 248 - 254

Bradley J. R., Pober J. S.Tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs)Oncogene 2001; 20 (44): 6482 - 6491

Broll K., Richter G., Pauly S., Hofstaedter F., Schwarz H.CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumorsAm. J. Clin. Pathol. 2001; 115 (4): 543 - 549

Bui N. T., Livolsi A., Peyron J. F., Prehn J. H.Activation of nuclear factor kappaB and Bcl-x survival gene expression by nerve growth fac-tor requires tyrosine phosphorylation of IkappaBalphaJ. Cell. Biol. 2001; 152 (4): 753 - 64

Bukczynski J., Wen T., Watts T. H.Costimulation of human CD28- T cells by 4-1BB ligandEur. J. Immunol. 2003; 33: 446 - 454

Buzyn A., Petit F., Ostankovitch M., Figueiredo S., Varet B., Guillet J. P., Ameisen J. C.,Estaquier J.Membrane-bound Fas (Apo-1/ CD95)ligand on leukeemic cells: a mechanism of tumorimmu-ne escape in leukemia patientsBlood 1999; 94 (9): 3135 - 3140

Caligaris-Cappio F.B-chronic lymphocytic leukemia: a malignancy of anti-self B cellsBlood 1996; 87 (7): 2615 - 2620

Caligaris-Cappio F.Relationship between autoimmunity and immunodefiency in CLLHematol. Cell. Ther. 1997; 39: 513 - 516


136

Cannons J. L., Hoeflich K. P., Woodgett J. R., Watts T. H.Role of the streß kinase pathway in signaling via the the T cell costimulatory receptor 4-1BBJ. Immunol. 1999; 163 (6): 2990 - 2998

Cannons J. L., Choi Y., Watts T. H.Role of TNF receptor-associated factor 2 and p38 mitogen-activated protein kinase activationduring 4-1BB-dependent immune responseJ. Immunol. 2000; 165: 6193 - 6204

Cannons J. L., Lau P., Ghumman B., DeBenedette M. A., Yagita H., Okumura K., WattsT. A.4-1BB ligand induces cell division, sustains survival, and enhances effector function of CD4and CD8 T cells with similar efficacyJ. Immunol. 2001; 167: 1313 - 1324

Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G.Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are producedby alternative splicingJ. Immunol. 1995; 154 (6): 2706 - 2713

Cayabayab M., Phillips J. H., Lanier L. L.CD40 preferentially costimulates activation of CD4+ T lymphocytesJ. Immunol. 1994; 152 (4): 1523 - 1531

Chalupny N. J., Peach R., Hollenbaugh D., Ledbetter J. A., Farr A. G., Aruffo A.T-cell activation molecule 4-1BB binds to extracellular matrix proteinsPNAS 1992; 89: 10360 - 10364

Chan F. K-M., Chun H. J., Zheng L., Siegel R. M., Bui K. L., Lenardo M. J.A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signalingScience 2000; 288: 2351 - 2354

Chang C. S., Brossay L., Kronenberg M., Kane K. P.The murine nonclssical class I major histocompatibility complex-like CD1.1 molecule pro-tects target cells from lymphokine-activated killer cell cytolysisJ. Exp. Med. 1999; 189 (3): 483 - 491

Chen N. J., Huang M. W., Hsieh S. L.Enhanced secretion of IFN-g by activated Th1-cells occurs via reverse signaling throughTNF-related activation-induced cytokineJ. Immunol. 2001; 166 (1): 270 - 276

Chen W., Jin W., Tian H., Sicurello P., Frank M., Orenstein J. M., Wahl S.Requirement for transforming growth factor beta1 in controlling T cell apoptosisJ. Exp. Med. 2001; 194 (4): 439 - 453

Cheng J., Zhou T. Z., Liu J., Shapiro M. J., Brauer M. J., Kiefer M. C., Barr P. J.,Mountz J. D.Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas moleculeScience 1994; 263 (5154): 1759 - 1762


137

Chen S. H., Pham-Nguyen K. B., Martinet O., Huang Y., Yang W., Thung S. N., ChenL., Mittler R., Woo S. L.Rejection of disseminated metastases of colon carcinoma by synergism of IL-12 gene therapyand 4-1BB costimulationMol. Ther. 2000; 2 (1): 39 - 41

Chiang E. Y., Henson M., Stroynowski L.The nonclassical major histocompatibility complex molecule Qa-2 protects tumor cells fromNK cell- and lymphokine-activated killer cell-mediated cytolysisJ. Immunol. 2002; 168 (5): 2200 - 2211

Chu N. R., DeBenedette M. A., Stiernholm B. J. N., Barber B. H., Watts T.H.Role of IL-12 and 4-1BB ligand in cytokine production by CD28+ and CD28- T cellsJ. Immunol. 1997; 158: 3081 - 3089

Chung C. T., Niemela S. L., Miller R. H.One step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterialcells in the same solutionPNAS 1989; 86 (7): 2172 - 2175

Cooper D., Bansal-Pakala P., Croft M.4-1BB (CD137) controls the clonal expansion and survival of CD8 T cells in vivo but doesnot contribute to the development of cytotoxicityEur. J. Immunol. 2002; 32: 521 - 529

Crawford D. H., Catovsky D.In vitro activation of leukaemic B cells ly interleukin-4 and antibodies to CD40Immunology 1993; 80: 40 - 44

Damle R. N., Wasil T., Fais F., Ghiotto F., Valetto A., Allen S. A., Buchbinder A.,Budman D., Dittmar K., Kolitz J., Lichtman S. M., Schulman P., Vinciguerra V. P., RaiK. R., Ferrerini M., Chiorazzi N.Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lym-phocytic leukemiaBlood 1999; 94 (6): 1840 - 1847

Darley R., Morris A., Passas J., Bateman W.Interactions between interferon gamma and retinoic acid with transforming growth factor betain the induction of immune recognition moleculesCancer Immunol. Immunother. 1993; 37 (2): 112 - 118

Das S., Varalakshmi C., Khar A.Target-cell-induced anergy in natural killer cells: suppression of cytotoxic functionCancer Immunol. Immunother. 2000; 49 (2): 109 - 115

DeBenedette M. A., Chu N. R., Pollok K. E., Hurtado J., Wade W. F., Kwon B. S., WattsT. H.Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12B lymphomas by cAMPJ. Exp. Med. 1995; 181: 985 - 992


138

DeBenedette M. A., Shahinian A., Mak T. W., Watts T. H.Costimulation of CD28- T lymphocytes by 4-1BB ligandJ. Immunol. 1997; 158: 551 - 559

DeBenedette M. A., Wen T., Bachmann M. F., Ohashi P. S., Barber B. H., Stocking K.L., Peschon J. J., Watts T. H.Analysis of 4-1BB ligand (4-1BBL)-deficient mice and of mice lacking both 4-1BBL in skinallograft rejection and in the cytotoxic T cell response to influenza virusJ. Immunol. 1999; 163: 4833 - 4841

Decker T. Flohr T., Trautmann P., Aman M. J., Holter W., Majdic O., Huber C., Pen-schel C.Role of accessory cells in cytokine production by T cells in chronic B-cell lymphocytic leuke-miaBlood 1995; 86 (3): 1115 - 1123

Desbarats J., Duke R. C., Newell M. K.Newly discovered role for Fas ligand in the cell-cycle arrest of CD4+ T cellsNat. Med. 1998; 4 (12): 1377 - 1382

DeTogni P., Goellner J., Ruddle N. H., Streeter P. R., Fick A., Mariathasan S., Smith S.C., Carlson R., Shornick L. P., Strauss-Schönberger J.Abnormal development of peripheral lymhoid organs in mice deficient in lymphotoxinScience 1994; 264 (5159): 551 - 559

de Visser K. E., Kast W. M.Effects of TGF-beta on the immune system: implications for cancer immunotherapyLeukemia 1999; 13 (8): 1188 - 1199

Diehl L., van Mierlo G. J. D., den Boer A. T., van der Voort E., Fransen M., van Boste-len L., Krimpenfort P., Melief C. J. M., Mittler R., Toes R. E. M., Offringa R.In vivo triggering through 4-1BB enables Th-independent priming of CTL in the presence ofan intact CD28 costimulatory pathwayJ. Immunol. 2002; 168: 3755 - 3762

DiSanto J. P., Bonnefoy J. Y., Gauchat J. F., Fischer A., de Saint Basile G.CD40 ligand mutations in X-linked immunodefiency with hyper-IgMNature 1993; 361 (6412): 541 - 543

Döhner H., Stilgenbauer S., Döhner K., Bentz M., Lichter P.Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on mo-lecular cytogenetic analysisJ. Mol. Med. 1999; 77: 266 - 281

Dougall W. C., Glaccum M., Charrier K., Rohrbach K., Brasel K., De Smedt T., DaroE., Smith J., Tometsko M. E., Maliszewski C. R., Armstrong A., Shen V., Bain S., Cos-man D., Anderson D., Morrissey P. J., Penschon J. J., Schuh J.RANK is essential for osteoclast and lymph node developmentGenes Dev. 1999; 13 (18): 2412 - 2424


139

Douglas R. S., Capocasale R. J., Lamb R. J., Nowell P. C., Moore J. S.Chronic lymphocytic leukemia B cells are resistant to the apoptotic effects of transforminggrowth factor-betaBlood 1997; 89: 941 - 947

Dressel R., Elsner L., Quentin T., Walter L., Gunther E.Heat shock protein 70is able to prevent heat shock-induced resistance of target cells to CTLsJ. Immunol. 2000; 164 (5): 2362 - 2372

Dulbecco R., Freeman G.Plaque production by the polyoma virusVirology 1959; 8: 396 - 397

Ebata T., Mogi S., Hata Y., Fujimoto J.-I., Yagita H., Okumura K., Azuma M.Rapid induction of CD95 ligand and CD4+ T cell-mediated apoptosis by CD137 (4-1BB) co-stimulationEur. J. Immunol. 2001; 31: 1410 - 1416

Eck J. M., Sprang S. R.The structure of tumor necrosis factor-alpha at 2.6 Å resolution. Implications for receptor bin-dingJ. Biol. Chem. 1989; 264 (29): 17595 - 17605

Endres R., Alimzhanov M. B., Plitz T., Futterer A., Kosco-Vilbois M. H., Nedospasov S.A., Rajewsky K., Pfeffer K.Mature follicular dendritic cell networks depend on expression of lymphotoxin beta receptorby radioresistant stromal cells and of lymphotoxin beta and tumor necrosis factor by B cellsJ. Exp. Med. 1999; 189 (1): 159 - 168

Feng X. H., Derynck R.Ligand-independent activation of transforming growth factor (TGF) beta signaling pathwaysby heterodimeric cytoplasmic domains of TGF-beta receptorsJ. Biol. Chem. 1996; 271 (22): 123 - 129

Fisher G. H., Rosenberg F. J., Straus S. E., Dale J. K., Middleton L. A., Lin A. Y.,Strober W., Lenardo M. J., Puck J. M.Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lympho-proliferative syndromeCell 1995; 81 (6): 935 - 946

Fluckinger A. C., Durand I., Banchereau J.Interleukin-10 induces apoptotic cell death of B-chronic lymphocytic leukemia cellsJ. Exp. Med. 1994; 179: 91 - 99

Foell J., McClausland M., Burch J., Corriazzi N., Yan X. J., Suwyn C., O’Neil S. P.,Hoffmann M. K., Mittler R. S.CD137-mediated T cell co-stimulation terminates existing autoimmune disease in SLE-proneNZB/ NZW F1 MiceAnn. N. Y. Acad. Sci. 2003; 987: 230 - 235


140

Fu Y. X., Chaplin D. D.Development and maturation of secundary lymphoid tissuesAnnu. Rev. Immunol. 1999; 17: 399 - 433

Fukuda K., Yamamoto M.Acquisition of resistance to apoptosis and necrosis by Bcl-xL over-expression in rat hepatomaMcA-RH8994 cellsJ. Gastroenterol. Hepatol. 1999; 14 (7): 682 - 690

Fuleihan R., Ramesh N., Loh R., Jabara H., Rosen R. S., Chatila T., Fu S. M.,Stamenkovic I., Geha R. S.Defective expression of the CD40 ligand in X chromosome-linked immunglobulin deficiencywith normal or elevated IgMPNAS 1993; 90 (6): 2170 - 2173

Furman R. R., Asgary Z., Mascarenhas J. O., Liou H.-C., Schattner E.Modulation of NFkB activity and apoptosis in chronic lymphocytic leukemia B cellsJ. Immunol. 2000; 164: 2200 - 2206

Furtner, M.Untersuchung von löslichem CD137 in Seren von Patienten mit hämatologisch-onkologischenErkrankungen Dissertation. Regensburg 2001

Futagawa T., Akiba H., Kodama T., Takeda K., Hosoda Y., Yagita H., Okumura K.Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cellsInt. Immunol. 2002; 14 (3): 275 - 286

Futterer A., Mink K., Luz A., Kosco-Vilbois M. H., Pfeffer K.The lymphotoxin beta receptor controls organogenesis and affinity maturation in peripherallymphoid tissuesImmunity 1998; 9 (1): 59 - 70

Gamberale R., Geffner J. R., Trevani A., Chernavsky A., Scolnik M., Arrosagaray G.,Sarmiento M., Giordano M.Immune complexes inhibit apoptosis of chronic lymphocytic leukaemia B cellsBr. J. Hematol. 1999; 107 (4): 870 - 876

Garni-Wagner B. A., Lee Z. H., Kim Y.-J., Wilde C., Kang C.-Y., Kwon B. S.4-1BB is expressed on CD45RAhiROhi transitional T cell in humansCell. Immunol. 1996; 169: 91 - 98

Ghia P., Caligaris-Cappio F.The indispensable role of microenvironment in the natural history of low-grade B-cell neo-plasmsAdv. Cancer Res. 2000; 79: 157 - 173

Giuntoli II R. L., Lu J., Kobayashi H., Kennedy R., Celis E.Direct costimulation of tumor-reactive CTL by helper T cells potentiate their proliferation,survival, and effector functionClin. Can. Res. 2002; 8: 922 – 931


141

Goldstein P.FasL binds preassembled FasScience 2000; 288: 2328

Goodwin R. G., Din W. S., Davis-Smith T., Anderson T. M., Gimpel S. D., Sato T. A.,Maliszewski C. R., Brannan C. I., Copeland N. G., Jenkins N. A., Farrah T., ArmitageR. J., Fanslow W. C., Smith C. A.Molecular cloning of a ligand for the inducible T cell gene 4-1BB: a member of an emergingfamily of cytokines with homology to tumor necrosis factorEur. J. Immunol. 1993; 23 (10): 2631 - 2641

Goodwin R. G.CDw137J. Biol. Regul. Homeost. Agents 2000; 14 (2): 139 – 141

Goolsby C. L., Kuchnio M., Finn W. G., Peterson L. A.Expansions of clonal and oligoclonal T cells in B-cell chronic lymphocytic leukemia are pri-marily restricted to the CD3+CD8+ T-cell populationCytometry 2000; 42: 188 - 195

Granziero L., Ghia P., Circosta P., Gottardi D., Strola G., Geuna M., Montagna L.,Piccoli P., Chilosi M., Caligaris-Cappio F.Survivin is expressed on CD40 stimulation and interfaces proliferation and apoptosis in B-cellchronic lymphocytic leukemiaBlood 2001; 97 (9): 2777 - 2783

Gravestein L. A., Blom B., Nolten L. A., de Vries E., van der Horst G., Ossendorp F.,Borst J., Loenen W. A. M.Cloning and expression of murine CD27: comparison with 4-1BB, another lymphocyte-speci-fic member of the nerve growth factor receptor familyEur. J. Immunol. 1993; 23: 943 - 950

Gravestein L. A., Borst J.Tumor necrosis factor receptor family members in the immune systemSem. Immunol. 1998; 10: 423 - 434

Grewal I. S., Xu J., Flavell R. A.Impairment of anigen-specific T-cell priming in mice lacking CD40 ligandNature 1995; 378 (6557): 617 - 620

Griffith T. S., Brunner T., Fletcher S. M., Green D. R., Fergusson T. A.Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilegeScience 1995; 270: 1189 - 1192

Groneberg C., Pickartz T., Binder A., Ringel F., Srock S., Sieber T., Schoeler D., Schrie-ver F.Clinical relevance of CD95 (Fas/ Apo-1) on T cells of patients with B-cell chronic lympho-cytic leukemiaExp. Hematol. 2003; 31 (8): 682 - 685


142

Gruss H. J.Molecular and structural characteristics of the tumor necrosis ligand superfamilyInt. J. Clin. Res. 1996; 26 (3): 143 - 159

Gruss H. J., Dower S. K.Tumor necrosis factor ligand superfamily: Involvement in the pathology of malignant lym-phomasBlood 1995; 85 (12): 3378 - 3404

Gruss H. J., Dower S. K.The TNF ligand superfamily and its relevance for human diseasesCytokines Mol. Ther. 1995i; 1 (2): 75 - 105

Halstead E. S., Müller Y. M., Altmann J. D., Katsikis P. D.In vivo stimulation of CD137 broadens primary antiviral CD8(+) T cell responsesNat. Immunol. 2002; 3 (6): 536 - 541

Hamblin T. J., Davis Z., Gardiner A., Oscier D. G., Stevenson F. K.Unmutated Ig VH genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocyticleukemiaBlood 1999; 94 (6): 1848 - 1854

Harris M. H., Thompson C. B.The role of the Bcl-2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeabilityCell Death Diff. 2000; 7: 1182 - 1191

Hata A.TGFß signaling and cancerExp. Cell Res. 2001; 264: 111 - 116

Heinisch I. V., Daigle I., Knöpfli B., Simon H. U.CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated an-ti-apoptosis in neutrophilesEur. J. Immunol. 2000; 30: 3441 - 3446

Heinisch I. V., Bizer C., Volger W., Simon H. U.Functional Cd137 receptors are expressed by eosinophils from patients with IgE-mediatedallergic responses but not by eosinophils from patients with non-IgE-mediated eosinophilicdisordersJ. Allergy Clin. Immunol. 2001; 108 (1): 21 - 28

Hellström K. E., Hellström I.Therapeutic vaccination with tumor cells that engage CD137J. Mol. Med. 2003; 81: 71 - 86

Hintzen R. Q., de Jong R., Hack C. E., Chamuleau M., de Fries E. F., ten Berge I. J.,Borst J., van Lier R. A.A soluble form of the human cell diferentiation antigen CD27 is released after triggering ofthe TCR/ CD3 complexJ. Immunol. 1991; 147 (1): 29 - 35


143

Holtzman M. J., Green J. M., Jayaraman S., Arch R. H.Regulation of T cell apoptosisApoptosis 2000; 5: 459 - 471

Hong H. J., Lee J. W., Park S. S., Kang Y. J., Chang S. Y., Kim K.-M., Kim J.-O.,Murthy K. K., Payne J. S., Yoon S. K., Park M.-J., Kim I.-C., Kim J. G., Kang C.-Y.A humanized anti-4-1BB monoclonal antibody suppresses antigen-induced humoral immuneresponse in nonhuman primatesJ. Immunother. 2000; 23 (6): 613 - 621

Hur E. M., Son M., Lee O. H., Choi Y. B., Park C., Lee H. Yun Y.LIME, a novel transmembrane adaptor protein, associates with p56lck and mediates T cell ac-tivationJ. Exp. Med. 2003; 198 (10): 1463 - 1473

Hurtado J. C., Kim S. H., Pollok K. E., Lee Z. H., Kwon B. S.Potential role of 4-1BB in T cell activation – comparison with ccostimulatory molecule CD28J. Immunol. 1995; 155: 3360 - 3367

Jachimczak P., Schwulera U., Bogdahn U.In vitro studies of cytokine-mediated interactions between malignant glioma and autologousperipheral blood mononuclear cellsJ. Neurosurg. 1994; 81: 579 - 586

Jachimczak P., Hessdörfer B., Fabel-Schulte K., Wismeth C., Brysch W., Schlingensie-ben K.-H., Bauer A., Blesch A., Bogdahn U.Transforming growth factor-ß-mediated autocrine growth regulation of gliomas as detectedwith phosphorothioate antisense oligonucleotidesInt. J. Cancer 1996; 65: 332 - 337

Janeway C. A., Travers P., Walport P., Shlomchik M.ImmunologieHeidelberg, Berlin 20025

Jang I. K., Lee Z. H., Kim Y.-J., Kim S. H., Kwon B. S.Human 4-1BB (CD137) signals are mediated by TRAF2 and activate nuclear factor-kappa BBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998; 242 (3): 613 - 620

Jang L. K., Lee Z. H., Kim H. H., Hill J. M., Kim J. D., Kwon B. S.A novel leucine-rich repeat protein (LRR-1):potential involvement in 4-1BB-mediated signaltransductionMol. Cell. 2001; 12 (3): 304 - 312

Jirtle R. L., Meyer S. A.Liver tumor promotion: effect of phenobarbital on EGF and protein kinase C signal transduc-tion and transforming growth factor –beta 1 expressionDig. Dis. Sci. 1991; 36 (5): 659 - 668

Jones E. Y., Stuart D. I., Walker N. P.Structure of the tumor necrosis factorNature 1989; 338 (6212): 225 - 228


144

Jones E. Y., Stuart D. I., Walker N. P.The structure of tumor necrosis factor-alpha – implications for biological functionJ. Cell Sci. Suppl. 1990; 13: 11 - 18

Juliusson G., Merup M.Cytogenetics in chronic lymphocytic leukemiaSemin. Oncol. 1998; 25: 19 - 25

Jurlander J.The cellular biology of B-cell chronic lymphocytic leukemiaCrit. Rev. Oncol. Hematol. 1997; 27: 29 - 52

Jurlander J., Lai C.-F., Tan J., Chou C.-C., Geisler C. H., Schriber J., Blumeson L. E.,Narula S. K., Baumann H., Caligiuri M. A.Characterization of interleukin-10 receptor expression of B-cell chronic lymphocytic leuke-mia cellsBlood 1997; 89 (11): 4146 - 4152

Kamihira S., Yamada Y.Soluble Fas (APO-1/ CD95) isoform in adult T-cell leukemiaLeuk. Lymphoma 2001; 41 (1 - 2): 169 - 176

Karin M., Cao Y., Greten F. R., Li Z.-W.NK-kB in cancer: from innocent bystander to major culpritNat. Rev. 2002; 2: 301 - 310

Karray S., Merle-Beral H., Vazquez A., Gerard J. P., Debre P., Galanaud P.Functional heterogeneity of B-CLL lymphocytes: dissociated responsiveness to growth fac-tors and distinct requirements for a first activation signal.Blood 1987; 70 (4): 1105 - 1110

Kawabe T., Naka T., Yoshida K., Tanaka T., Fujiwara H., Suematsu S., Yoshida N.,Kishimoto T., Kikutani H.The immune responses in CD40-deficient mice: impaired immunglobulin class switching andgerminal center foramtionImmunity 1994; 1 (3): 167 - 178

Keating M. J.Chronic lymphocytic leukemiaSemin. Oncol. 1999; 26 (5 Suppl. 14): 107 - 114

Khoshnan A., Tindell C., Laux I., Bae D., Bennett B., Nel A. E.The NF-kappaB cascade is important in Bcl-xL-Expression and for the antiapoptotic effectsof the CD28 receptor in primary human CD4+ lymphocytesJ. Immunol. 2000; 165 (4): 1743 - 1754

Kienzle G., Peter H.-H., Braun M., Illges H., von Kempis J.G. 9 Characterization of ILA (human 4-1BB/ CD137) expression in human primary Blymphocytes and B cell linesImmunobiology 1997; 199: 220


145

Kienzle G., von Kempis J.CD137 (ILA/ 4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activationand apoptosis of B lymphocytesInt. Immunol. 2000; 12 (1): 73 – 82

Kim D., Mebius R. E., MacMicking J. D., Jung S., Cupedo T., Castellanos Y., Rho J.,Wong B. R., Josien R., Kim N., Rennert P. D., Choi Y.Regulation of peripheral lymph node genesis by tumor necrosis factor member TRANCEJ. Exp. Med. 2000; 192 (10): 1467 - 1478

Kim H. H., Kwack K., Lee Z. H.Activation of c-jun N-terminal kinase by 4-1BB (CD137), a T cell costimulatory moleculeMol. Cell. 2000; 10 (3): 247 - 252

Kim J. A., Averbook B. J., Chambers K., Rothchild K., Kjaergaard J., Papay R., Shu S.Divergent effects of 4-1BB antibodies on antitumor immunity and on tumor-reactive Tcell generationCancer Res. 2001; 61: 2031 - 2037

Kim J.-O., Kim H. O., Baek K.-M., Kang C.-Y.NF-kB and AP-1 regulate activation-dependend CD137 (4-1BB) expression in T cellsFEBS Lett. 2003; 541: 163 - 170

Kim K.-M., Kim H. W., Kim J.-O., Baek K.-M. Kim J. G., Kang C.-Y.Induction of 4-1BB (CD137) expression by DNA damaging agents in human T lymphocytesImmunol. 2002; 107: 472 - 479

Kim Y.-J., Pollok K. E., Zhou Z., Shaw A., Bohlen J. B., Fraser M., Kwon B. S.Novel T cell antigen 4-1BB associates with the protein tyrosine kinase p56lck1

J. Immunol. 1993; 151: 1255 - 1262

Kim Y.-J., Kim S. H., Mantel P., Kwon B. S.Human 4-1BB regulates CD28 co-stimulation to promote Th1 cell responseEur. J. Immunol. 1998; 28: 881 - 890

Kim Y.-J., Mantel P., June C. H., Kim S. H., Kwon B. S.4-1BB costimulation promotes human T cell adhesion to fibronectinCell. Immunol. 1999; 192: 13 - 23

Kim Y.-J., Brutkiewicz R. R., Broxmeyer H. E.Role of 4-1BB (CD137) in the functional activation of cord blood CD28-CD8+ T cellsBlood 2002; 100: 3253 - 3260

Kim Y.-J., Li G., Broxmeyer H. E.4-1BB ligand stimulation enhances myeloid dendritic cell maturation from human umbilicalcord blood CD34(+) progenitor cellsJ. Hematother. Stem Cell Res. 2002i; 11 (6): 895 - 903


146

Kipps T. J.Signal transduction pathways and mechanisms of apoptosis in CLL B-lymphocytes: their rolein CLL pathogenesisHematol. Cell Ther. 1997; 39: 817 - 827

Kipps T. J.Chronic lymphocytic leukemiaCurr. Opin. Hematol. 1998; 5: 244 - 253

Kishimoto T., Goyert S., Kikutani D., Miyasaka M., Moretta L., Ohno T., Okumura K.,Shaw S., Springer T. A., Sugamura K., Sugawara H., von dem Borne A. E., Zola H.Update of CD antigens, 1996J. Immunol. 1997; 158 (7): 3035 - 3036

Kitabayashi A., Hirokawa M., Miura A. B.The role of interleukin-10 (IL-10) in chronic B-lymphocytic leukemia: IL-10 prevents leuke-mic cells from apoptotic cell death.Int. J. Haematol. 1995; 62 (2): 99 - 106

Kitada S., Zapata J. M., Andreeff M., Reed J. C.Bryostatin and CD40-ligand enhance apoptosis resistance and induce expression of cell sur-vival genes in B-cell lymphocytic leukaemiaBr. J. Haematol. 1999; 106: 995 - 1004

Kneitz C., Goller M., Seggewiss R., Yaman A., Serfling E., Tony H. P.STAT6 and the regulation of CD23 expression in B-chronic lymphocytic leukemiaLeuk. Res. 2000; 24 (4): 331 - 337

Knippers R.Molekulare GenetikStuttgart 19977

Kohno T., Brewer M. T., Baker S. L., Schwartz P. E., King M. W., Hale K. K., SquiresC. H., Thompson R. C., Vannice J. L.A second tumor necrosis factor receptor gene product can shed a naturally occurring tumornecrosis factor inhibitorPNAS 1990; 87 (21): 8331 - 8335

Koli K., Saharinen J., Hyytiäinen M., Penttinen C., Keski-Oja J.Latency, activation, and binding proteins of TGF-ßMicrosc. Res. Tech. 2001; 52: 354 - 362

Kong Y. Y., Feige U., Sarosi I., Bolon B., Tafuri A., Morony S., Capparelli C., Li J.,Elliott R., McCabe S., Wong T., Campagnuolo G., Moran E., Bogoch E. R., Van G.,Nguyen L. T., Ohashi P. S., Lacey D. L., Fish E., Boyle W. J., Penninger J. M.Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteo-protegerin ligandNature 1999; 402 (6759): 304 - 309


147

Koni P. A., Sacca R., Lawton P., Browning J. L., Ruddle N. H., Flavell R. A.Distinct roles in lymphoid organogenesis for lymphotoxins alpha and beta revealed in lym-photoxin beta-deficient miceImmunity 1997; 6 (4): 491 - 500

König A., Schwartz G. K., Mohammad R. M., Al-Katib A., Gabrilove J. L.The novel cyclin-dependend kinase inhibitor flavopiridol downregulates Bcl-2 and inducesgrowth arrest and apoptosis in chronic B-lymphocytic leukemia linesBlood 1999; 90 (11): 4307 - 4312

Korthäuer U., Graf D., Mages H. W., Briere F., Padayachee M., Malcolm S., Ugazio A.G., Notarangelo L. D., Levinski R. J., Kroczek R. A.Defective expression of T-cell CD40 ligand causes X-linked immunodeficiency with hyper-IgMNature 1993; 361 (6412): 539 - 541

Kremer J. P., Reisbach G., Nerl C., Dormer P.B-cell chronic lymphocytic leukaemia cells express and release transforming growth factor-betaBr. J. Haematol. 1992; 80 (4): 480 - 484

Kwon B., Moon C. H., Kang S., Seo S. K., Kwon B. S.4-1BB: still in the midst of darknessMol. Cells. 2002; 10 (2): 119 - 126

Kwon B., Lee H. W., Kwon B. S.New insights into the role of 4-1BB in immune responses: beyond CD8+ T cellsTrends Immunol. 2002i; 23 (8): 378 - 380

Kwon B., Kim B. S., Cho H. R., Park J. E., Kwon B. S.Involvement of tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) members in the patho-logy of inflammatory diseasesExp. Mol. Med. 2003; 35 (1): 8 - 16

Kwon B. S., Weissmann S. L.cDNA sequences of two inducible T-cell genesPNAS 1989; 86 (6): 1963 - 1967

Kwon B. S., Kestler D. P., Eshhar Z., Oh K. O., Wakulchik M.Expression characteristics of two potential T cell mediator genesCell. Immunol. 1989; 121 (2): 414 - 422

Kwon B. S., Kozak C. A., Kim K. K., Pickard R. T.Genomic organization and chromosomal lokalization of the T-cell antigen 4-1BBJ. Immunol. 1994; 152 (5): 2256 - 2262

Kwon B. S., Hurtado J. C., Lee Z. H., Kwack K. B., Seo S. K., Choi B. K., Koller B. H.,Wolisi G., Broxmeyer H. E., Vinay D. S.Immune responses in 4-1BB (CD137)-deficient miceJ. Immunol. 2002; 168: 5483 - 5490


148

Laderach D., Movassagh M., Johnson A., Mittler R. S., galy A.4-1BB co-stimulation enhances human CD8(+) T cell priming by augmenting the prolifera-tion and survival of effector CD8(+) T cellsInt. Immunol. 2002; 14 (10): 1155 - 1167

Lagneaux L., Delforge A., Bron D., Massy M., Bernier M., Stryckmans P.Heterogenous response of B lymphocytes to transforming growth factor-beta in B-cell chroniclymphocytic leukaemia: correlation with the expression of TGF-beta receptorsBr. J. Haematol. 1997; 97 (3): 612 - 620

Lagneaux L., Delforge A., Bernier M., Stryckmans P., Bron D.TGF-ß activity and expression of its receptors in B-cell chronic lymphocytic leukemiaLeuk. Lymphoma 1998; 31: 99 - 106

Lagneaux L., Delforge A., De Bruyn C., Bernier M., Bron D.Adhesion to bone marrow stroma inhibits apoptosis of chronic lymphocytic leukemia cellsLeuk. Lymphoma 1999; 35 (5-6): 445 - 453

Langstein J., Michel J., Fritsche J., Kreutz M., Andreesen R., Schwarz H.CD137 (ILA/ 4-1BB), a member of the TNF receptor family, induces monocyte activation viabidirectional signalingJ. Immunol. 1998; 160 (5): 2488 – 2494

Langstein J.Charakterisierung der Aktivitäten des CD137/ CD137-Ligand-Systems in humanen Mono-zytenDissertation. Regensburg 1999

Langstein J., Schwarz H.Identification of CD137 as a potent monocyte survivsl factorJ. Leukoc. Biol. 1999; 65: 829 - 833

Langstein J., Becke F. M., Söllner L., Krause G., Brockhoff G., Kreutz M., AndreesenR., Schwarz H.Comparative analysis of CD137 and LPS effects on monocyte activation, survival, andproliferationBiochem. Biophys. Res. Communic. 2000; 273: 117 - 122

Lee H.-W., Park S.-J., Choi B. S., Kim H. H., Nam K.-O., Kwon B. S.4-1BB promotes the survival of CD8+ T lymphocytes by increasing expression of Bcl-xL andBfl-1J. Immunol. 2002; 169: 4882 - 4888

Lee U.-H., Kwack K. B., Park J.-W., Kwon B. S.Molecular cloning og agonistic and antagonistic monoclonal antibodies against human 4-1BBEur. J. Immunogenet. 2002; 29: 449 - 452


149

Le Hir M., Bluethmann H., Kosco-Vilbois M. H., Muller M., di Padova F., Moore M.,Ryffel B., Eugster H. P.Differentiation of follicular dendritic cells and full antibody responses require tumor necrosisfactor receptor-1 signalingJ. Exp. Med. 1996; 183 (5): 2367 - 2372

Lenardo M., Chan K. M., Hornung F., McFarland H., Siegel R., Wang J., Zheng L.Mature T lymphocytes apoptosis – immune regulation in a dynamic and unpredictableantigenic environmentAnnu. Rev. Immunol. 1999; 17: 221 - 253

Lens S. M., Drillenburg P., den Drijver B. F., van Schijndel G., Pals S. T., van Lier R.A., van Oers M. H.Aberrant expression and reverse signaling of CD70 on malignant B cellsBr. J. Haematol. 1999; 106 (2): 491 - 503

Leoni C., Valtorta F.Constitutive TrkA activity in receptor-overexpressing PC12 clonesBiochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 291 (4): 972 - 978

Letterio J. J., Roberts A. B.TGF-ß: a critical modulator of immune cell functionClin. Immunol. Immunopathol. 1997; 84 (3): 244 - 250

Lewin B.Genes VOxford - New York 1995

Li Q., Verma I. M.NF-kB regulation in the immune systemNat. Rev. 2002; 2: 725 - 734

Lichtenfels R., Biddison W. E., Schulz H., Vogt A. B., Martin R.CARE-LASS (calcein release assay), an improved fluorescence-based test system to measurecytotoxic T lymphocyte activityJ. Immunol. Meth. 1994; 172: 227 - 239

Lindl T.Zell- und GewebekulturHeidelberg - Berlin 2000

Lindstedt M., Johansson-Lindbom B., Borrebaeck C. A. K.Expression of CD137 (4-1BB) on human follicular dendritic cellsScand. J. Immunol. 2003; 57: 305 - 310

Lobo P. I., Platel H. C.A novel role for MHC class II antigens: evidence implicating a protective effect on tumourcells against cytotoxicity by NK and LAK cellsImmunology 1994; 83 (2): 240 - 244


150

Locksley R. M., Killeen N., Lenardo M. J.The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biologyCell 2001; 104 (4): 487 - 501

Loenen W. A. M.Editorial overview: CD27 and (TNFR) relatives in the immune system: their role in healthand diseaseSem. Immunol. 1998; 10: 417 - 411

Loo D. T., Chalupny N. J., Bajorath J., Shuford W. W., Mittler R. S., Aruffo A.Analysis of 4-1BBL and laminin binding to murine 4-1BB, a member of the tumor necrosisfactor receptor superfamily, and comparison with human 4-1BBJ. Biol. Chem. 1997; 272 (10): 6448 - 6456

Lotz M., Setareh M., von Kempis J., Schwarz H.The nerve growth factor/ tumor necrosis factor receptor familyJ. Leukoc. Biol. 1996; 60 (1): 1 - 7

Lynch D. H., Ramsdell F., Alderson M.Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responsesImmunol. Today 1995; 16 (12): 569 - 574

Mainou-Fowler T., Miller S., Proctor S. J., Dickinson A. M.The levels of TNFa, IL-4 and IL-10 production by T-cells in B-cell chronic lymphocytic leu-kaemia (B-CLL)Leuk. Res. 2001; 25: 157 - 163

Mallet S., Barclay A. N.A new superfamily of cell surface proteins related to the nerve growth factor receptorImmunol. Today 1991; 12 (7): 220 - 223

Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J.Molecular cloning. A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982

Martinet O., Ermekova V., Qiao J. Q., Sauter B., Mandeli J., Chen L., Chen S.-H.Immunomodulatory gene therapy with interleukin 12 and 4-1BB ligand: long-term remissionof liver metastases in a mouse modellJ. Nat. Can. Inst. 2000; 92 (11): 931 - 936

Martinet O., Divino C. M., Zang Y., Gan Y., Mandeli J., Thung S., Pan P. Y., Chen S.-H.T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4-1BB ligand gene deliverycombined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancerGene Ther. 2002; 9 (12): 786 - 792

Mavridis A. K., Tsiara S., Makis A., Chaidos A., Christou L., Seferiadis K., BourantasK. L.Interleukins, TNF-alpha and beta-2M in patients with B cell chronic lymphocytic leukemiaJ. Exp. Clin. Cancer Res. 1998; 17 (4): 445 - 448


151

Meinhardt G., Wendtner C.-M., Hallek M.Molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia: factors and signaling pathwaysregulating cell growth and survivalJ. Mol. Med. 1999; 77: 282 – 293

Melero I., Shufford W. W., Newby S. A., Aruffo A., Ledbetter J. A., Hellström K. E.,Mittler R. S., Chen L.Monoclonal antibodies against the 4-1BB T cell activation molecule eradicate establishedtumorsNat. Med. 1997; 3 (6): 682 - 685

Melero I., Johnston J. V., Shufford W. W., Mittler R. S., Chen L.NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimulatory molecule and are required for tumorimmunity elicited by anti-4-4BB monoclonal antibodiesCell. Immunol. 1998; 190: 167 - 172

Melero I., Bach N., Hellström K. E., Aruffo A., Mittler R. S., Chen L.Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand:synergy with the CD28 co-stimulatory pathwayEur. J. immunol. 1998i; 28: 1116 - 1121

Melief C. J., Van Der Burg S. H., Toes R. E., Ossendorp F., Offringa R.Effective therapeutic anticancer vaccines based on precision guiding of cytolytic T lympho-cytesImmunol. Rev. 2002; 188 (1): 177 - 182

Michal G. (Hrsg.)Biochemical pathways – Biochemie-AtlasHeidelberg - Berlin 1999

Michel J.Untersuchungen zur Signalübertragung und Charakterisierung löslicher Formen des Zyto-kinrezeptors CD137Dissertation. Regensburg 1998

Michel J., Langstein J., Hofstaedter F., Schwarz H.A soluble form of CD137 (ILA/ 4-1BB), a member of the TNF receptor family is released byactivated lymphocytes and is detectable in sera of patients with rheumatoid arthritisEur. J. Immunol. 1998; 28 (1): 290 - 295

Michel J., Pauly S., Langstein J., Krammer P. H., Schwarz H.CD137-induced apoptosis is independend of CD95Immunology 1999; 98: 42 - 46

Miller R. E., Jones J., Le T., Whitmore J., Boiani N., Gliniak B., Lynch D. H.4-1BB monoclonal antibody promotes the generation of tumor-specific immune responses bydirect activation of CD8 T cells in a CD40 dependent mannerJ. Immunol. 2002; 169: 1792 - 1800


152

Mittler R. S., Bailey T. S., Klussman K., Trailsmith M. D., Hoffmann M. K.Anti-4-1BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses invivo through the induction of helper T cell anergyJ. Exp. Med. 1999; 190 (10): 1535 - 1540

Mixter P. F., Russell J. Q., Budd R. C.Delayed kinetics of T lymphocyte anergy and deletion in lpr miceJ. Autoimmun. 1994; 7 (6): 697 - 710

Miyajima A., Kitamura T., Harada N., Yokota T., Arai K.Cytokine receptors and signal transductionAnn. Rev. Immunol. 1992; 10: 295 - 331

Miyashita T., McIlraith M. J., Grammer A. C., Miura Y., Attrep J. F., Shimaoka Y.,Lipsky P. E.Bidirectional regulation of human B cell responses by CD40-CD40 ligand interactionsJ. Immunol. 1997; 158: 4620 - 4633

Mogi S., Sakurai J., Kohsaka T., Enomoto S., Yagita H., Okumura K., Azuma M.Tumour rejection by gene transfer of 4-1BB ligand into a CD80+ murine squamous cell car-cinoma and the requirements of co-stimulatory molecules on tumour and host cellsImmunology 2000; 101: 541 - 547

Molica S., Levato D., Cascavilla N., Levato L., Musto P.Clinico-prognostic implications of simultaneous increased serum levels of soluble CD23 andbeta2-microglobulin in B-cell chronic lymphocytic leukemiaEur. J. Haematol. 1999; 62 (2): 117 - 122

Moore G. E., Gerner R. E., Franklin H. A.Culture of normal human leukocytesJ. Am. Med. Assoc. 1967; 199 (8): 519 - 524

Moore K. W., de Waal Malefyt R., Coffman R. L., O’Garra A.Interleukin-10 end the interleukin-10 receptorAnnu. Rev. Immunol. 2001; 19: 683 - 765

Moss M. L., Lambert M. H.Shedding of membrane proteins by ADAM family of proteasesEssays Biochem. 2002; 38: 141 - 153

Moss P.A., Gillespie G.Clonal populations of T cells in patients with B cell malignanciesLeuk. Lymphoma 1997; 27: 231 - 238

Mülhardt C.Der Experimentator: MolekularbiologieStuttgart-Jena-Lübeck-Ulm 1999

Mullis K. B., Faloona F. A.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase chain reactionMeth. Enzymol. 1987; 155: 335 - 350


153

Myers L., Takahashi C., Mittler R. S., Rossi R. J., Vella A. T.Effector CD8 T cells possess suppressor function after 4-1BB and Toll-like receptor trigger-ingPNAS 2003; 100 (9): 5348 - 5353

Myers S. M., Ross G. M., Dostaler S. M., Anderson M. N., Weaver D. F., Riopelle R. J.Putative cytoplasmic amphiphilic domains in the nerve growth factor/ tumor necrosis factorreceptor superfamilyBiochim. Biophys. Acta 1994; 1196: 21 - 28

Nagy N., Vanky F.Transforming growth factor beta (TGFß) secreted by immunogenic ex vivo human carcinomacells counteracts the activation and inhibits the function of autologous cytotoxic lymphocytes.Pretreatment with interferon gamma and tumor necrosis factor alpha reduces the productionof active TGFbetaCancer Immunol. Immunother. 1998; 45 (6): 306 - 312

Nakajima T., Inagaki N., Tanaka H., Tanaka A., Yoshikawa M., Tamari M., HasegawaK., Matsumoto K., Tachimoto H., Ebisawa M., Tsujimoto G., Matsuda H., Nagai H.,Saito H.Marked increase in CC chemokine expression in both human and mouse mast cell transcrip-tomes following Fce receptor I cross-linking: An interspecies comparisonBlood 2002 (prepublished online )

Nilsson J., Söderberg O., Nilsson K., Rosén A.Thioredoxin prolongs survival of B-type chronic lymphocytic leukemia cellsBlood 2000; 95: 1420 - 1426

Nocentini G., Giunchi L., Ronchetti S., Krausz L. T., Bartoli A., Moraca R., MiglioratiG., Riccardi C.A new member of the tumor necrosis factor/ nerve growth factor receptor family inhibits Tcell receptor-induced apoptosisPNAS 1997; 94 (12): 6216 - 6221

Noelle R. J., Ledbetter J. A., Aruffo A.CD40 and its ligand, an essential ligand-receptor pair for thymus-dependent B-cell activationImmunol. Today 1992; 13 (11): 431 - 433

Nozawa K., Ohata J., Sakurai J., Hashimoto H., Miyajima H., Yagita H., Okumura K.,Azuma M.Preferential blockade of CD8+ T cell responses by administration of anti-CD137 ligand mo-noclonal antibody results in differential effect on development of murine acute and chronicgraft-versus-host diseasesJ. Immunol. 2001; 167: 4981 - 4986

O’Connell J., Bennett M. W., O’Sullivan G. C., Collins J. K., Shanahan F.Fas counter-attack – the best form of tumor defenseNat. Med. 1999; 3 (8): 267 - 268


154

Opal S. M., DePalo V. A.Anti-Inflammatory CytokinesChest 2000; 117 (4): 1162 – 1172

Osorio L. M., Jondal M., Aguilar-Santelises M.Regulation of B-CLL apoptosis through membrane receptors and Bcl-2 family proteinsLeuk. Lymphoma 1997; 30: 247 - 256

Osorio L. M., Aguilar-Santelises M.Apoptosis in B-chronic lymphocytic leukaemiaMed. Oncol. 1998; 15: 234 - 240

Owen-Schaub L., Chan H., Cusack J. C., Roth J., Hill L. L.Fas and Fas ligand interactions in malignant diseaseInt. J. Oncol. 2000; 17 (1): 5 - 12

Palucka K. A., Reizenstein P., Ost A., Porwit-MacDonald A.Blocking of MHC class I antigens on leukemic B-cells enhances their conjugate formationwith cytotoxic lymphocytes and their susceptibility to lysisLeuk. Lymphoma 1998; 28 (5 - 6): 573 - 581

Pan P. Y., Zang Y., Weber K., Meseck M. L., Chen S. H.OX40 ligation enhances primary and memory cytotoxic T lymphocyte response in an im-munotherapy for hepatic colon metastasesMel. Ther. 2002; 6 (4): 528 - 536

Papoff G., Hausler P., Eramo A., Pagano M. G., Di Leva G., Signore A., Ruberti G.Identification and characterization of a ligand-independent oligomerization domain in theextracellular region of the CD95 death receptorJ. Biol. Chem. 1999; 274 (53): 38241 - 38250

Park J. I., Lee M. G., Cho K., Park B. J., Chae K. S., Byun D. S., Ryu B. K., Park Y. K.,Chi S. G.Transforming growth factor –beta 1 activates interleukin-6 expression in prostate cancer cellsthrough synergistic collaboration of the Smad2, p38-NF-kB, JNK, and Ras signaling path-waysOncogene 2003; 22 (28): 4314 - 4332

Pasche B.Role of Transforming Growth Factor Beta in CancerJ. Cell. Physiol. 2001; 186: 153 – 168

Pasparakis M., Alexopoulou L., Episkopou V., Kollias G.Immune and inflammatory responses in TNFa-deficient mice: a critical requirement forTNFa in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks, andgerminal centers, and in the maturation of the humoral immune responseJ. Exp. Med. 1996; 184 (4): 1397 - 1411


155

Pauly S.Untersuchungen zur Funktion des CD137-/ CD137-Ligand-Systems inantigenpräsentierenden ZellenDissertation. Regensburg 2000

Pauly S., Broll K., Wittmann M., Giegerich G., Schwarz H.CD137 is expressed by follicular dendritic cells and costimulates B lymphocyte activation ingerminal centersJ. Leukoc. Biol. 2002; 72: 35 - 42

Peitsch M. C., Jongeneel C. V.A 3-D model for the CD40 ligand predicts that it is a compact trimer similar to the tumornecrosis factorsInt. Immunol. 1993; 5 (2): 233 - 238

Pfeffer K., Nerl C., Kabelitz D.B cell maturation in chronic lymphocytic leukemia. II. Clonal heterogeneity in the response tovarious B cell activators and recombinant cytokines (rIFN-gamma, rIFN-alpha, rIL2).Immunobiology 1987; 175 (3): 172 - 182

Pfeffer K., Matsuyama T., Kundig T. M., Wakeham A., Kishihara K., Shahinian A.,Wiegmann K., Ohashi P. S., Kronke M., Mak T. W.Mice deficient for the 55 kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock,yet succumb to L. monocytogenes infectionCell 1993; 73 (3): 457 - 467

Phillips T. A., Ni J., Hunt J. S.Death-inducing tumour necrosis factor (TNF) superfamily ligands and receptors aretranscribed in human placentae, cytotrophoblasts, placental macrophages and placental celllinesPlacenta 2001; 22 (8-9): 663 - 672

Pizzolo G., Stein H., Josimovic-Alsevic O., Vinante F., Zanotti R., Chilosi M., Feller A.C., Diamantstein T.Increased serum levels of soluble IL-2 receptor, CD30 and CD8 molecules, pathogenetic roleof immunoactivation mechanismsBr. J. Haematol. 1990; 75 (4): 485 - 488

Pollok K. E., Kim Y.-J., Zhou Z., Hurtado J., Kim K. K., Kwon B. S.Inducible T cell antigen 4-1BB. Analysis of expression and functionJ. Immunol. 1993; 150 (3): 771 - 181

Pollok K. E., Kim Y.-J., Hurtado J., Zhou Z., Kim K. K., Kwon B. S.4-1BB T-cell antigen binds to mature B cells and macrophages, and costimulates anti-µ-pri-med splenic B cellsEur. J. Immunol. 1994; 24: 367 - 374

Pollok K. E., Kim S. H., Kwon B. S.Regulation of 4-1BB expression by cell-cell interactions and the cytokines, interleukin-2 andinterleukin-4Eur. J. Immunol. 1995; 25: 488 – 494


156

Pritsch O., Maloum K., Dighiero G.Basic biology of autoimmune phenomena in chronic lymphocytic leukemiaSemin. Oncol. 1998; 25: 34 - 41

Pschyrembel -Klinisches WörterbuchBerlin 1998258

Reddy P., Slack J. L., Davis R., Cerretti D. P., Kozlosky C. J., Blanton R. A., Shows D.,Penschon J. J., Black R. A.Functional analysis of the domain structure of tumor necrosis factor-alpha converting enzymeJ. Biol. Chem. 2000; 275 (19): 14608 - 14614

Reed J. C.Molecular biology of chronic lymphocytic leukemiaSemin. Oncol. 1998; 25: 1 – 18

Rehm H.Der Experimentator: ProteinchemieStuttgart-Jena-Lübeck-Ulm 1997

Restifo N. P.Not so Fas: re-evaluating the mechanisms of immune privilege and tumor escapeNat. Med. 2000; 5 (6): 493 - 495

Rieux-Laucat F., Le Deist F., Hivroz C., Roberts I. A., Debatin K. M., Fischer A., deVillartay J. P.Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunityScience 1995; 268 (5215): 1347 - 1349

Rothe J., Lesslauer W., Lotscher H., Lang Y., Koebel P., Kontgen F., Althage A.,Zinkernagel R., Steinmetz M., Bluethmann H.Mice lacking the tumor necrosis factor receptor I are resistant to TNF-mediated toxicity buthighly susceptible to infection with Listeria monocytogenesNature 1993; 364 (6440): 798 – 802

Rothstein T. L.Inducible resistance to Fas-mediated apoptosis in B-cellsCell Res. 2000; 10 (4): 245 - 266

Ruby J., Bluethmann H., Peschon J. J.Antiviral activity of tumor necrosis factor (TNF) is mediated via p55 and p75 TNF receptorsJ. Exp. Med. 1997; 186 (9): 1591 - 1596

Sabel M. S., Conway T. F., Chen F. A., Bankert R. B.Monoclonal antibodies directed against the T cell activation molecule CD137 (interleukin-Aor 4-1BB) block human lymphocyte-mediated suppression of tumor xenografts in severecombined immunodeficient miceJ. Immunother. 2000; 23 (3): 362 - 368


157

Saiki R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn G. T., Erlich H. A., Arnheim N.Enzymatic amplification of ß-globulin genomic sequences and restriction site analysis for dia-gnosis of sickle cell anemiaScience 1985; 230: 1350 - 1354

Salazar-Onfray F.Interleukin-10: a cytokine used by tumors to escape immunosurveillanceMed. Oncol. 1999; 16 (2): 86 - 94

Salih H. R., Kosowski S. G., Haluska V. F., Starling G. C., Loo D. T., Lee F., Aruffo A.A., Trail P. A., Kiener P. A.Constitutive Expression of functional 4-1BB (CD137) ligand on carcinoma cellsJ. Immunol. 2000; 165: 2903 - 2910

Salih H. R., Schmetzer H. M., Burke C., Starling G. C., Dunn R., Pelka-Fleischer R.,Nuessler V., Kiener P. A.Soluble CD137 (4-1BB) ligand is released following leukocyte activation and is found in seraof patients with hematological malignanciesJ. Immunol. 2001; 167: 4059 - 4066

Salih H. R., Kiener P. A., Nuessler V.4-1BB ligand – just another costimulating molecule?Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 2002; 40 (8): 348 - 353

Sambrook J., Fritsche E. F., Maniatis T.Molecular CloningCold Spring Harbor Laboratory Press 1989

Saoulli K., Lee S. Y., Cannons J. L., Yeh W. C., Santana A., Goldstein M. D., Bangia N.,DeBenedette M. A., Mak T. W., Choi Y., Watts T. H.CD28-independent, TRAF2-dependent costimulation of resting T cells by 4-1BB ligandJ. Exp. Med. 1998; 187 (11): 1849 - 1862

Sartorius U., Schmitz I. Krammer P. H.Moecular mechanism of death-receptor-mediated apoptosisChembiochem 2001; 2 (1): 20 - 29

Schmitz I., Kirchhoff S., Krammer P. H.Regulation of death receptor-mediated pathwaysInt. J. Biochem. Cell Biol. 2000; 32: 1123 - 1136

Schneider P., Holler N., Bodmer J. L., Hahne M., Frei K., Fontana A., Tschopp J.Conversion of membrane bound Fas (CD95) to its soluble form is associated with downre-gulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicityJ. Exp. Med. 1998; 187 (8): 1205 - 1213

Schuler M., Tretter T., Schneller F., Huber C., Peschel C.Autocrine transforming growth factor-ß from chronic lymphocytic leukemia-B cells interfereswith proliferative T cell signalsImmunobiol. 1999; 200: 128 – 139


158

Schwarz H., Tuckwell J., Lotz M.A receptor induced by lymphocyte activation (ILA): a new member of the human nerve-growth-factor/ tumor-necrosis-factor receptor familyGene 1993; 134 (2): 295 - 298

Schwarz H., Valbracht J., Tuckwell J., von Kempis J., Lotz M.ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineagesBlood 1995; 85 (4): 1043 - 1052

Schwarz H., Blanco F. J., von Kempis J., Valbracht J., Lotz M.ILA, a member of the human nerve growth factor/ tumor necrosis factor receptor family, re-gulates T-lymphocyte proliferation and survivalBlood 1996; 87 (7): 1 – 7

Schwarz H., Arden K., Lotz M.CD137, a member of the tumor necrosis factor receptor family, is located on chromosome1p36, in a cluster of related genes, and colocalizes with several malignanciesBiochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 235 (3): 699 - 703

Seko Y., Ishiyama S., Takahashi N., Oshima H., Shimozato O., Akiba H., Takeda K.,Kobata T., Yagita H., Okumura K., Azuma M., Nagai R.Expression of tumour necrosis factor (TNF) ligand superfamily co-stimulatory moleculesCD30L, CD27L., OX40L, and 4-1BBL in murine hearts with acute myocarditis caused byCoxsackievirus B3J. Pathol. 2001; 195 (5): 593 - 603

Seko Y., Ishiyama S., Nishikawa T., Hiroe M., Suzuki S., Ishiwata S., Kawai S., TanakaY., Azuma M., Kobata T., Yagita H., Okumura K., Nagai R.Expression of tumor necrosis factor ligand superfamily costimulatory molecules CD27L,CD30L, OX40L and 4-1BBL in the heart of patients with acute myocarditis and dilatedcardiomyopathyCardiovasc. Pathol. 2002; 11 (3): 166 - 170

Seo S. K., Gebhard B. M., Lim H. Y., Kang S. W., Higaki S., Varnell E. D., Hill J. M.,Kaufmann H. E., Kwon B. S.Murine keratinocytes function as antigen-presenting cellsEur. J. Immunol. 2001; 195 (5): 593 - 603

Setareh M., Schwarz H., Lotz M.A mRNA variant encoding a soluble form of 4-1BB, a member of the murine NGF/ TNF re-ceptor familyGene 1995; 164 (2): 311- 315

Sevilla L., Zaldumbide A., Pognonec P., Boulukos K. E.Transcriptional regulation of the bcl-x gene encoding the anti-apoptotic Bcl-xL protein byEts, Rel/ NfkappaB, STAT and AP1 transcription familiesHistol. Histopathol. 2001; 16 (2): 595 - 601

Sharief M. K.Heightened intrathecal release of soluble CD137 in patients with multiple sclerosisEur. J. Neurol. 2002; 9: 49 - 54


159

Shedlock D. J., Whitmire J. K., Tan J., MacDonald A. S., Ahmed R., Shen H.Role of CD4 T cell help in CD8 T cell responses during Listeria monocytogenes infectionJ. Immunol. 2003; 170 (4): 2053 - 2063

Shimoni A., Marcus H., Dekel B., Shkarchi R., Arditti F., Shvidel M., Bucher W.,Canaan A., Ergas D., Berrebi A., Reisner Y.Autologous T cells control B-chronic lymphocytic leukemia tumor progression in hu-manÆmouse radiation chimeraCancer Res. 1999; 159 (23): 5968 - 5974

Shuford W. W., Klussman K., Tritchler D. D., Loo D. T., Chalupny J., Siadak A. W.,Brown T. J., Emswiler J., Raecho H., larsen C. P., Pearson T. C., Ledbetter J. A., AruffoA., Mittler R. S.4-1BB costimulatory signals preferentially induce CD8+ T cell proliferation and lead to theamplification in vivo of cytotoxic T cell responsesJ. Exp. Med. 1997; 186 (1): 47 - 55

Siegel R. M., Frederiksen J. K., Zacharias D. A., Chan F. K.-M., Johnson M., Lynch D.,Tsien R. Y., Lenardo M. J.Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenicmutationsScience 2000; 288: 2354 - 2357

Siese A., Jaros P. P., Willig A.Analysis of interleukin (IL)-1 beta and transforming growth factor (TGF)-beta induced signaltransduction pathways in IL-2 and TGF-beta secretion and proliferation in the Thymoma cellline EL4.NOB-1Scand. J. Immunol. 1999; 49 (2): 139 - 148

Simon H. U.Evidence for a pro-apoptotic function of CD137 in granulocytesSwiß Med. Wkly. 2001; 131: 455 - 458

Sjöberg J., Aguilar-Santelises M., Sjögren A.-M., Pisa E. K., Ljungdahl A., BjörkholmM., Jondal M., Mellstedt H., Pisa P.Interleukin-10 mRNA expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemia inversely cor-relates with progression of diseaseBr. J. Haematol. 1996; 92: 393 - 400

Smith C. A., Farrah T., Goodwin R. G.The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: Activation, costimulation, anddeathCell 1994; 76 (6): 959 - 962

Sneller M. C., Straus S. E., Jaffe E. S., Jaffe J. S., Fleisher T. A., Stetler-Stevenson M.,Strober W.A novel lymphoproliferative/ autoimmune syndrome resembling murine lpr/ gld diseaseJ. Clin. Invest. 1992; 90 (2): 334 - 341


160

Söderberg O.Growth and survival of B-chronic lymphocytic leukaemia cellsMed. Oncol. 1998; 15: 73 - 78

Söllner L.Untersuchungen zur reversen Signalübertragung von CD137 in monozytären ZellenDissertation. Regensburg 2001

Stander M., Naumann U., Wick W., Weller M.Transforming growth factor-beta and p-21: multiple molecular targets of decorin-mediatedsuppression of neoplastic growthCell Tissue Res. 1999; 296 (2): 221 - 227

Stilgenbauer S., Döhner K., Bentz M., Lichter P., Döhner H.Molecular cytogenetic analysis of B-cell chronic lymphocytic leukemiaAnn. Hematol. 1998; 76: 101 - 110

Stüber E., Neurath M., Calderhead D., Fell H. P., Strober W.Crosslinking OX-40 ligand, a member of the TNF/ NGF cytokine family, induces prolifera-tion and differentiation in murine splenic B cellsImmunity 1995; 2 (5): 507 - 521

Suda T., Hashimoto H., Tanaka M., Ochi T., Nagata S.Membrane Fas ligand kills human peripheral blood T lymphocytes, and soluble Fas ligandblocks the killingJ. Exp. Med. 1997; 186 (12): 2045 - 2050

Summer K. L., Hock B. D., McKenzie J. L., Hart D. N. J.Phenotypic characterization of five dendritic cell subsets in human tonsilsAm. J. Pathol. 2001; 159: 285 - 295

Sun Y., Lin X., Chen H. M., Wu Q., Subudhi S. K., Chen L., Fu Y.-X.Administration of 4-1BB monoclonal antibody leads to the amelioration of experimental auto-immune encephalomyelitisJ. Immunol. 2002; 168: 1457 - 1465

Sun Y., Chen H. M., Subudhi S. K., Chen J., Koka R., Chen L., Fu Y.-X.Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune diseaseNat. Med. 2002i; 8 (12): 1405 - 1413

Suzuki I., Fink P. J.Maximal proliferation of cytotoxic T lymphocytes requires reverse signaling through Fas li-gandJ. Exp. Med. 1998; 187 (1): 123 - 128

Suzuki I., Fink P. J.The dual functions of Fas ligand in the regulation of peripheral CD8+ and CD4+ T cellsPNAS 2000; 97 (4): 1707 - 1712


161

Takahashi C., Mittler R. S., Vella A. T.Cutting Edge: 4-1BB is a bona fide CD8 T cell survival signalJ. Immunol. 1999; 162: 5037 - 5040

Takahashi C., Mittler R. S., Vella A. T.Differential clonal expansion of CD4 and CD8 T cells in response to 4-1BB ligation: contri-bution of 4-1BB during inflammatory responsesImmunol. Letters 2001; 76: 183 - 191

Tan J. T., Cho H. R., Tucker-Burden C., Hendrix R. C., Mittler R. S., Pearson T. C.,Larsen C. P.Analysis of expression and function of the costimulatory molecule 4-1BB in alloimmune res-ponsesTransplantation 2000; 70 (1): 175 - 183

Tan J. T., Whitmire J. K., Ahmed R., Pearson T. C., Larsen C.4-1BB ligand, a member of the TNF family, is important for the generation of antiviral CD8 Tcell responsesJ. Immunol. 1999; 163: 4859 - 4868

Tan J. T., Whitmire J. K., Murali-Krishna K., Ahmed R., Altman J. D., Mittler R. S.,Sette A., Pearson T. C., Larsen C.4-1BB costimulation is required for protective anti-viral immunity after peptide vaccinationJ. Immunol. 2000; 164: 2320 - 2325

Tangye S. G., Weston K. M., Raison R. L.Interleukin-10 inhibits t he in vitro proliferation of human activated leukemic CD5+ B-cellsLeuk. Lymphoma 1998; 31 (1 – 2): 121 - 130

Taraban V. Y., Rowley T. F., O’Brien L., Chan H. T. C., Haswell L. E., Green M. H. A.,Tutt A. L., Glennie M. J., Al-Shamkhani A.Expression and costimulatory effects of the TNF receptor superfamily members CD134(OX40) and CD137 (4-1BB), and their role in the generation of anti-tumor immune responsesEur. J. Immunol. 2002; 32: 3617 - 3627

Tinhofer I., Marschitz I., Kos M., Henn T., Egle A., Villunger A.Differential sensitivity of CD4+ and CD8+ T lymphocytes to killing efficiancy of Fas (Apo-1/CD95) ligand+ tumor cells in B chronic lymphocytic leukemiaBlood 1998; 91 (11): 4273 - 4281

Toes R. E. M., Schoenberger S. P., van der Voort E. I. H., Offringa R., Melief C. J. M.CD40-CD40ligand interactions and their role in cytotoxic T lymphocyte priming and anti-tumor immunitySem. Immunol. 1998; 10: 443 - 448

Totth A., Sebestyen A., Barna G., Nagy K., Gondor A., Bocsi J., Mihalik R., Petak I.,Houghton J., Kopper L.TGF beta 1 induces caspase-dependent but death-receptor independent apoptosis in lymphoidcellsAnticancer Res. 2001; 21 (2A): 1207 - 1212


162

Trentin L., Cerutti A., Zambello R., Sancetta R., Tassinari C., Facco M., Adami F.,Rodeghiero F., Agostini C., Semenzato G.Interleukin-15 promotes the growth of leukemic cells of patients with B-cell chronic lympho-proliferative disordersBlood 1996; 87 (8): 3327 - 3335

Trentin L., Zambello R., Agostini C., Enthammer C., Cerutti A., Adami F., Zamboni S.,Semenzato G.Expression and regulation of tumor necrosis factor, interleukin-2, and hematopoetic growthfactor receptors in B-cell chronic lymphocytic leukemiaBlood 1994; 84 (12): 4249 - 4256

Triozzi P. L., Eicher D. M., Smoot J., Rinehart J. J.Modulation of leukemic cell sensitivity to lymphokine-activated killer cytolysis: role of inter-cellular adhesion molecule-1Exp. Hematol. 1992; 20 (9): 1092 - 1096

van den Hofe L. E., van Gool S. W., Vandenberghe P., Bakkus M., Thielemans K., Boo-gaerts M. A., Ceuppens J. L.CD40 triggering of chronic lymphcytic B cells results in efficient alloantigen presentation andcytotoxic T lymphocyte induction by upregulation of CD80 and CD86 costimulatory mo-leculesLeukemia 1997; 11: 572 - 580

van Essen D., Kikutani H., Gray D.CD40 ligand-transduced costimulation of T cells in the development of helper functionNature 1995; 378 (6557): 620 - 623

van Kooten C., Banchereau J.CD40-CD40 ligand: a multifunctional receptor-ligand pairAdv. Immunol. 1996; 61: 239 - 241

Villunger A., Egle A., Marschitz I., Kos M., Bock G., Ludwig H., Geley S., Kofler R.,Greil R.Constitutive expression of Fas (Apo-1/ CD95) ligand on multiple myeloma cells: a potentialmechanism of tumor-induced suppression of immune surveillanceBlood 1997; 90 (1): 12 - 20

Vinay D. S., Kwon B. S.Role of 4-1BB in immune responsesSemin. Immunol. 1998; 10 (6): 481 - 489

Vinay D. S., Kwon B. S.Relative abilities of 4-1BB (CD137) and CD28 to co-stimulate the response of cytokine de-flected Th1 and Th2 cellsImmunobiology 1999; 200: 246 - 263

Vinay D. S., Kwon B. S.Differntial expression and costimulatory effect of 4-1BB (CD137) and CD28 molecules oncytokine-induced murine CD8+ Tc1 and Tc2 cellsCell. Immunol. 1999i; 192: 63 - 71


163

Vogel L. A., Noelle R. J.CD40 and its crucial role as a member of the TNFR familySem. Immunol. 1998; 10: 435 - 442

Voller A., Bartlett A., Bidwell D. E., Clark M. F., Adams A. N.The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)J. Gen. Virol. 1976; 33 (1): 165 - 167

von Kempis J., Schwarz H., Lotz M.Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB homo-logue, in cells of mesenchymal originOsteoarthritis cartilage 1997; 5 (6): 396 - 406

Wajant H., Scheurich P.Tumor necrosis factor receptor-associated factor (TRAF) 2 and ist role in TNF signalingInt. J. Biochem. Cell Biol. 2001; 33 (1): 19 - 32

Wallach D., Varfolomeev E. E., Malinin N. L., Goltsev Y. V., Kovalenko A. V., BoldinM. P.Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanismsAnnu. Rev. Immunol. 1999; 17: 331 - 367

Watanabe-Fukunaga R., Brannan C. I., Itoh N., Yonehara S., Copeland N. G., JenkinsN. A., Nagata S.The cDNA structure, expression, and chromosomal assignment of the mouse Fas antigenJ. Immunol. 1992; 148 (4): 1274 - 1279

Waterhouse N. J., Trapani J. A.CTL: caspases terminate life, but that’s not the whole storyTissue Antigens 2002; 59 (3): 175 - 183

Weinberg A. D., Vella A. T., Croft M.OX-40: life beyond the effector T cell stageSem. Immunol. 1998; 10: 471 - 480

Wen T., Bukczynski J., Watts T. H.4-1BB ligand-mediated costimulationof human T cells induces CD4 and CD8 T cell expan-sion, cytokine production, and the development of cytolytic effector functionJ. Immunol. 2002; 168: 4897 - 4906

Whu Z.-Q., Khan A. Q., Shen Y., Wolcott K. M., Dawicki W., Watts T. H., Mittler R. S.,Snapper C. M.4-1BB (CD137) differentially regulates murine in vivo protein- and polysaccharide-specificimmunoglobulin isotype responses to Streptococcus pneumoniaeInfection and Immunity 2003; 71 (1): 196 - 204

Wierda W. G., Kipps T. J.Gene therapy of hematologic malignanciesSemin. Oncol. 2000; 27: 502 - 511


164

Wieser R.The transforming growth factor-beta signaling pathway in tumorigenesisCurr. Opin. Oncol. 2001; 13 (1): 70 – 77

Wiethe C., Dittmar K., Doan T., Lindenmaier W., Tindle R.Provision of 4-1BB ligand enhances effector and memory CTL responses generated byimmunization with dendritc cells expressing a human tumor-associated antigenJ. Immunol. 2003; 170: 2912 - 2922

Wilcox R. A., Chapoval A. I., Gorski K. S., Otsuji M., Shin T., Flies D. B., Tamada K.,Mittler R. S., Tsuchiya H., Pardoll D. M., Chen L.Cutting edge: expression of functional CD137 receptor by dendritic cellsJ. Immunol. 2002; 168: 4262 - 4267

Wilcox R. A., Tamada K., Strome S. E., Chen L.Signaling through NK cell-associated CD137 promotes both helper function for CD8+

cytolytic T cells and responsiveness to IL-2 but not cytolytic activityJ. Immunol. 2002i; 169: 4230 - 4236

Wilcox R. A., Flies D. B., Zhu G., Johnson A. J., Tamada K., Chapoval A. I., Strome S.E., Pease L. R., Chen L.Provision of antigen and CD137 signaling breaks immunological ignorance, promoting re-gression of poorly immunogenic tumorsJ. Clin. Invest. 2002ii; 109: 651 - 659

Wilcox R. A., Flies D. B., Wang H., Tamada K., Johnson A. J., Pease L. R., RodriguezM., Guo Y., Chen L.Impaired infiltration of tumor-specific cytolytic T cells in the absence of interferon-g despitetheir normal maturation in lymphoid organs during CD137 monoclonal antibody therapyCancer Res. 2002iii; 62: 4413 - 4418

Willey S. R., Goodwin R. G., Smith C. A.Reverse signaling via CD30 ligandJ. Immunol. 1996; 157 (8): 3635 - 3639

Wroblewski V. J., Witcher D. R., Becker D. W., Davis K. A., Dou S., Micanovic R.,Newton C. M., Noblitt T. W., Richardson J. M., Song H. Y., Hale I. E.Decoy receptor 3 (DcR3) is proteolytically processed to a metabolic fragment having dif-ferential activities against Fas ligand and LIGHTBiochem. Pharmakol. 2003; 65 (4): 657 - 667

Xu J., Foy T. M., Laman J. D., Elliott E. A., Dunn J. J., Waldschmidt T. J., Elsemore J.,Noelle R. J., Flavell R. A.Mice deficient for the CD40 ligandImmunity 1994; 1 (5): 423 - 431

Ye H., Park Y. C., Kreishman M., Kieff E., Wu H.The structural basis for the recognition of diverse receptor sequences by TRAF2Mol. Cell. 1999; 9 (3): 321 - 330


165

Ye H., Wu H.Thermodynamic characterization of the interaction between TRAF2 and tumor necrosis factorreceptor peptides by isothermal titration calorimetryPNAS 2000; 97 (16): 8961 - 8966

Ye Z., Hellström I., Hayden-Ledbetter M., Dahlin A., Ledbetter J. A., Hellström K. E.Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BBNat. Med. 2002; 8 (4): 343 - 348

Yndestad A., Damås J. K., Eiken H. G., Holm T., Haug T., Simonsen S., Froland S. S.,Gullestad L., Aukrust P.Increased gene expression of tumor necrosis factor superfamily ligands in peripheral bloodmononuclear cells during chronic heart failureCardiovasc. Res. 2002; 54: 175 - 182

Yoshida H., Katayose Y., Unno M., Suzuki M., Kodama H., Takemura S., Asano R.,Hayashi H., Yamamoto K., Matsuno S., Kudo T.A novel adenovirus expressing human 4-1BB ligand enhances antitumor immunityCancer Immunol. Immunother. 2003; 52 (2): 97 - 106

Zaknoen S. L., Kay N. E.Immunoregulatory cell dysfunction in chronic B-cell leukemiasBlood Rev. 1990; 4: 165 - 174

Zhang X., Chen Z., Huang H., Gordon J. R., Xiang J.DNA microarray analysis of the gene expression profiles of naive versus activated tumor-specific T cellsLife Sci. 2002; 71: 3005 - 3017

Zheng G., Chen A., Sterner R. E., Zhang P. J., Pan T., Kiyatkin N., Tykocinski M. L.Induction of antitumor immunity via intratumoral tetra-costimulator protein transferCancer Res. 2001; 61 (22): 8127 - 8134

Zhou Z., Pollok K. E., Kim K. K., Kim Y.-J., Kwon B. S.Functional analysis of T cell antigen 4-1BB in activated intestinal intra-epithelial T lym-phocytesImmunol. Letters 1994; 41: 177 - 184

Zhou Z., Kim S., Hurtado J., Lee Z. H., Kim K. K., Pollok K. E., Kwon B. S.Characterization of human homologue of 4-1BB and its ligandImmunol. Letters 1995; 45: 67 - 73

Zhu G., Flies D. B., Tamada K., Sun Y., Rodriguez M., Fu Y.-X., Chen L.Progressive depletion of peripheral B lymphocytes in 4-1BB (CD137) ligand/II-Ea-transgenicmiceJ. Immunol. 2001; 167: 2671 - 2676


166

Zupan A. A., Osborne P. A., Smith C. E., Siegel N. R., Leimgruber R. M., Johnson E. M.Jr.Identification, purification, and characterization of truncated forms of the human nervegrowth factor receptorJ. Biol. Chem. 1989; 264 (20): 11714 - 11720

Zupo S., Isnardi L., Megna M., Massara R., Malavasi F., Dono M., Cosulich E., Ferra-rini M.CD38 expression distinguishes two groups of B-cell chronic lymphocytic leukemias with dif-ferent responses to anti-IgM antibodies and propensity to apoptosisBlood 1996; 88 (4): 1365 - 1374

Zupo S., Massara R., Dono M., Rossi E., Malavasi F., Cosulich E., Ferrarini M.Apoptosis or plasma cell differentiation of CD38-positive B-chronic lymphocytic leukemiacells induced by cross-linking of surface IgM or IgDBlood 2000; 95 (4): 1199 - 1206

Zwiebel J. A., Cheson B. D.Chronic lymphocytic leukemia: staging and prognostic factorsSemin. Oncol. 1998; 25 (1): 42 - 59

Abkürzungsverzeichnis

167

7. Abkürzungsverzeichnis

A Adenin

A260 Absorption bei 260 nm

A280 Absorption bei 280 nm

aa amino acid(s)

Ab antibody

Abb. Abbildung

abs. absolut

ABTS 2,2’-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat(6)]diammonium

ADAM a disintegrin and metalloproteinase

AICD activation induced cell death

ALPS autoimmune lymphoproliferative syndrome

AML akute myelotische Leukämie

Ap Ampicillin

AP Alkalische Phosphatase

AP(-1) activating protein

APC antigen presenting cell

ASK apoptosis signal regulating kinase

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosin-5’-triphosphat

Bcl B cell lymphoma

bFGF basic fibroblast growth factor

Brca breast cancer

ß-Gal ß-Galaktosidase

bidest. doppelt destilliertes

bp Basenpaar(e)

BSA bovine serum albumine

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

C Cytidin

ca. Circa

CalceinAM Calcein-Acetomethylester

CD cluster of differentiation


168

cDNA complementary DNA

Ci Curie (Einheit des radioaktiven Zerfalls)

CLL chronisch lymphatische Leukämie

cm Zentimeter

cpm counts per minute (Maß für radioaktiven Zerfall)

CRD cystein rich domain

CTP Cytidin-5’-triphosphat

CTL cytotoxic T-lymphocyte

d Tage

d Desoxy-

Da Dalton

DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid

DC dendritische Zelle

DD death domain

ddH2O doppelt destilliertes Wasser

DED death effector domain

DEPC Diethylpyrocarbonat

d.h. das heißt

DMEM Dulbecco’s modified eagle medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

DNase Desoxyribonuclease

dNTP Desoxynukleotid(e)

ds doppelsträngig

DTT Dithiotreitol

EAE experimental autoimmune enzephalomyelitis

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraacetat

ELISA enzyme linked immunosorbend assay

Erk extracellular signal activated kinase

et al. et alteri (und andere)

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

FACS Fluorescence activated cell sorter


169

FADD Fas-associated death domain protein

FDC follicular dendritic cells

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

FKS Fötales Kälberserum

FSC forward scatter

g Normalfallbeschleunigung

g Gramm

G Guanin

gfp green fluorescent protein

GITR glucocorticoid induced TNF receptor family related gene

GM-CSF granulocyte/ macrophage colony stimulating factor

G3PDH Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GTP Guanosin-5’-triphosphat

h Stunde

HGNC Human Genome Nomenclature Comitee

HLA human lymphocyte antigen

HRP horseradish peroxidase

IAA Isoamylalkohol

IAP inhibitor of apoptosis proteins

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

ILA induced by lymphocyte activation

ILK integrin linked kinase

IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalaktisid

I.U. Internationale Einheiten

JNK c-jun-Kinase

jun japanisch für 17; Onkogen aus Avian Sarcoma Virus 17

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

KLH keyhole limpet hemocyanin

l Liter

L Ligand

LAK lymphokine activated killer


170

LB Luria broth (Luria Bertani)

LCMV lymphocytic choriomeningitis virus

L. monocytogenes Listeria monocytogenes

LRR leucin rich repeat protein

lpr lymphoproliferative

LT Lymphotoxin

m Milli

m membrangebunden

M Molar

m Mikro

mA Milliampere

MAPK mitogen activated protein kinase

max. Maximal

MCS multiple cloning site

MEK MAP kinase kinase/ Erk activating kinase

MHC major histocompatibility complex

min Minute

MLR mixed lymphocyte reaction

MOPS Morpholinopropansulfonsäure

mRNA messenger RNA

MS multiple Sklerose

MW Molekulargewicht

n Nano

NFkB nuclear factor kB

NIK NF-kB inducing kinase

NK natural killer

nm Nanometer

nt nucleotide(s)

ODx Optische Dichte bei einer Wellenlänge von x nm

ORF open reading frame

ori origin of replication

p pico

p.a. pro analysis

PBMC peripheral blood mononuclear cells


171

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

pers. persönlich

pH pondus hydrogenii,

negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration

PHA Phytohämagglutinin-M

PI Propidiumjodid

PI3K phosphoinositid-3 kinase

plad pre-ligand assembly domaine

PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat

pNA p-Nitroanillin

pNPP pNitrophenylphosphat

RANK receptor activator of NFkB

RIP receptor interacting protein

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuclease

RPE R-Phycoerythrin

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR PCR nach reverser Transkription von mRNA in cDNA

S soluble

s. siehe

S. Seite

SAC Staphyllococcus aureus Cowan A

SAPK stress activated protein kinase

sec Sekunde

SDS Natriumdodecylsulfat

SLE spontaneous lupus erythematosus

sog. sogenannt

S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae

src-Kinasen Rous-Sarcoma-Virus kinase (virale Kinase; Namensgeber eine Gruppe

von Kinasen, zu der u. a. blk, csk, fyn, hck und lck gehören

ss einzelsträngig

SSC sideward scatter


172

T Thymidin

Tab. Tabelle

TACE TNF-alpha converting enzyme

TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer

TCR T cell receptor

TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer

TGF tumor growth factor

THD TNF homology domain

TLR Toll-like receptor

TM Trockenmilch

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

TNFR Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor

TNFRSF Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Superfamilie

TNFSF Tumor-Nekrose-Faktor-Superfamilie

TP tumor protein

TRADD TNF-receptor associated death domain protein

TRAF TNF-receptor associated factor

Tris Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan

Triton-X-100 Polyoxymethylenether

Tween-20 Polyoxyethylensorbitan-Monolaurat

TZ Technische Zentrale

U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

u.a. unter anderem

ün über Nacht

ÜNK Übernachtkultur(en)

ÜTK Übertagkultur(en)

usw. und so weiter

UTP Uracil-5’-triphosphat

UTR untranslatierte Region

u.U. unter Umständen

UV Ultraviolett

V Volt

VE-Wasser vollentsalztes Wasser


173

Vol. Volumen

vs. versus

VSV vesicular stomatitis virus

(v/v) Volumen/Volumen

(w/v) Gewicht/Volumen

wt Wildtyp

X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid

z.B. zum Beispiel

ZNS Zentralnervensystem

zzgl. zuzüglich

Die Aminosäuren sind nach dem international gebräuchlichen Ein- oder Dreibuchstabencode

abgekürzt.

Danksagung

174

8. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt:

Herrn Prof. Dr. Ferdinand Hofstädter, der die Anfertigung dieser Arbeit und ihre Weiterfüh-rung nach dem Weggang von Dr. Herbert Schwarz ermöglichte, indem ich die Räumlichkei-ten und Laboreinrichtungen an seinem Institut benutzen durfte.

Dr. Herbert Schwarz, der mir das interessante Thema für diese Arbeit zur Verfügung stellteund die Arbeit in Regensburg und von Cambridge aus in Theorie und Praxis engagiert betreu-te und begleitete. Er stand jederzeit mit Rat zur Verfügung, ließ mir aber auch die Freiheit,eigene Ideen umzusetzen. Ohne sein Engagement, seine Anregungen, Diskussionen und daszur Verfügung gestellte Fachwissen wäre diese Arbeit nicht das, was sie ist.

Dr. Rainer Apfel, der die Betreuung des praktischen Teils meiner Arbeit übernahm, als Dr.Herbert Schwarz nach England wechselte. Er hatte immer ein offenes Ohr für auftretende La-borprobleme und das Wissen und die Bereitschaft, diese zu lösen.

Dr. Pjotr Jachimczak für seine hervorragende Einführung in die LAK-Assays.

Allen Mitgliedern der AG Schwarz für die gute Zusammenarbeit. Besonders erwähnt seienSusanne Pauly und Liane Söllner, meine Mitdoktorandinnen, Gitte Krause, die mich im Laboranlernte und die dieser Arbeit am Ende noch einmal richtig Schwung verlieh und DanielaDrenkard, die die vollen vier Laborjahre Labor, Computer, Kaffee, wissenschaftliche undprivate Sorgen und Nöte mit mir teilte.

Allen Mitgliedern der AGs Männel, Bosserhoff und Apfel sowie den Mitglieder des Institutsfür Pathologie für ihre freundliche Unterstützung und Zusammenarbeit, wann immer Ideen,Protokolle und Material benötigt wurden. Herzlichen Dank an Dr. Bernd Echtenacher für diewissenschaftlichen und privaten Diskussionen im Labor und „am Berg“.

Meinen „gesunden männlichen Probanden“ Nils Pollak, Thorsten Lieb, Peter Müller, Chri-stoph Scherübel und Dr. Michael Woenckhaus für das Sillhalten beim Blutspenden.

Dr. Hagen Blasczik, Dr. Georg Richter, Dr. Ellen Obermann, Dr. Thomas Schubert für dasBlutabnehmen für die Lymphozytenpräparationen trotz „Schnellschnitt“ und anderer Ver-pflichtungen.

Meinen Eltern, die mir durch ihre Unterstützung Studium und Promotion ermöglichten undmich nicht nur in schwierigen Phasen unterstützten.

Meiner Tochter Friederike, die immer wieder unter dieser Arbeit litt und trotzdem sonntägli-che Besuche im Labor ertrug .

Thorsten, dessen Liebe und Geduld mich durch diese Arbeit begleitete.

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