This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Schmp. = 235° , C 2 1 H 2 0 O n • H 2 0 (466,38) . Ber. C 54,06 H 4 , 7 5 ; Gef. C 54,25 H 4,36. UV-Spektrum: (Max. A = 259, 272, 350 m,«, log £ = 4,23, 4,32, 4 ,35) .

5. Iso-Quercitrin (3.5.7.3'.4'-Pentahydroxy-3-mono-/9-D-glucopyranosid). Schmp. = 2 2 1 - 2 2 2 ° , C2 1H2 0O1 2 (464,37) . Ber. C 54,31 H 4 , 3 4 ; Gef. C 54,05 H 4,59.

UV-Spektrum: (Max. I = 258, 360 m// , l ö g e = 4,35, 4 ,32) .

Über Einzelheiten dieser Untersuchungen, die fort-gesetzt werden, berichten wir an anderer Stelle.

Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und dem F o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e danken wir für die Förderung dieser Arbeit.

Zur Biosynthese von Phosphonoaminosäuren. Die Verteilung der Radioaktivität in Amino-

äthylphosphonsäure nach Einbau von positions-markierter Glucose durch Tetrahymena

A . T R E B S T u n d F . G E I K E

Pflanzenphysiologisches Institut der Universität Göttingen, Abteilung Biochemie der Pflanzen

( Z . Natur f o r s chg . 22 b , 9 8 9 — 9 9 1 [ 1 9 6 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 3. Juni 1967)

In den letzten Jahren sind Phosphonoaminsäuren aus den verschiedensten Organismen isoliert w o r d e n 1 - 9 . Charakteristikum dieser Substanzklasse ist die stabile P —C-Bindung, die im Gegensatz zu allen anderen or-ganischen Phosphorverbindungen der Zelle selbst durch 72-stdg. Kochen in 6-n. HCl nicht zu spalten ist. For-mal kann man 2-Aminoäthylphosphonsäure (AEP) so-wohl als Analogon von Phosphoäthanolamin, als auch von /3-Alanin auffassen.

C H 2 - N H 2

CH2

0 I

P 0 3 - H 2

Phospho-äthanol-

C H 2 - N H 2

CH2

PO3H2

Aminoäthyl-phosphonsäure

(AEP)

C H 2 - N H 2

I CH2

COOH

y?-Alanin

Das Vorkommen in Lipiden 1 - 8 läßt die Analogie zu Phosphoäthanolamin wahrscheinlicher erscheinen, ob-wohl AEP auch in Proteinfraktionen 3>9 gefunden wurde, aus denen sie jedoch durch Behandlung mit Pronase und Trypsin nicht freizusetzen war 3.

Kinetische Untersuchungen mit 32P-markiertem Phos-phat an Tetrahymena zeigten einen schnelleren Einbau in lipidgebundene, als in freie AEP, woraus geschlos-sen wurde, daß die Biosynthese von A E P an Lipidvor-

läufern erfolgt3 . Auf Grund der bisher veröffentlich-ten Daten sowie des Verhaltens von Modellverbindun-gen und Phospholipiden, hat SEGAL 10 einen Biosyn-these-Mechanismus über ein Rearrangement von Phos-phatidvläthanolamin zu Phosphatidyl-AEP vorgeschla-gen. Über die Herkunft des C-Gerüsts liegen bisher jedoch noch keine experimentellen Informationen vor.

Es soll hier über erste Versuche zur Biosynthese von AEP in Tetrahymena berichtet werden, in denen posi-tionsmarkierte Glucose an wachsende Kulturen von Tetrahymena pyriformis Wh 14 verfüttert, die gebildete AEP isoliert und zur Bestimmung der 14C-Verteilung chemisch abgebaut wurde. Dazu wurde Tetrahymena in 1 - Z - E r l e n m e y e r - Kolben in 300 ml Medium mit 6 g Proteose-Pepton, 1,5 g Hefeextrakt und 0,6 g Glu-cose angezogen. Nach 36 Stdn. Inkubation bei 37 °C wurde abzentrifugiert und weitere 10 Stdn. in neuem Medium mit 2 g Proteose-Pepton, 0,3 g Hefeextrakt und 0,1 g Glucose mit 0,03 mC 14C inkubiert. Die Zel-len wurden dann bei 2000 g abzentrifugiert und mit 250 ml 6-n. HCl 24 Stdn. am Rückfluß gekocht. Das eingeengte Hydrolysat wurde in 1 -n. HCOOH auf eine Dowex-50-H-Säule (1 -25 cm) gegeben und die beiden bisher in Tetrahymena beschriebenen Phosphonoamino-säuren, AEP und 2-Amino-3-Phosphonopropionsäure (APP) 4 , zunächst mit Wasser, dann mit 0,6-n. HCl von der Säule eluiert. Die AEP-enthaltenden Fraktio-nen wurden konzentriert, auf eine Dowex-l-Ac-Säule (1 -32 cm) gegeben und mit 0,001-re. Essigsäure eluiert. Die weitere Reinigung der A E P erfolgte nach Zugabe von Träger-AEP durch Umkristallisation aus 60-proz. Äthanol bis zur konstanten spezifischen Aktivität. Die-ser Aufarbeitungsgang — eine Kombination und Mo-difikation bekannter Methoden 4 — wurde in An-sätzen mit 32P-markiertem Phosphat ausgearbeitet. Die Reinigungsschritte sind in Tab. 1 aufgeführt.

Danach wurden unter den angewandten Bedingun-gen von Tetrahymena zwischen 3 und 6% des aufge-nommenen Phosphats in 2-AEP und 0,3% in A P P ein-gebaut. Nach K A N D A T S U und H O R I G U C H I 2 kann Tetra-

1 M . HORIGUCHI and M . K A N D A T S U , Nature [London] 184, 9 0 1 [ 1 9 5 9 ] .

2 M . K A N D A T S U and M . HORIGUCHI, Agric. biol. Chem. [To-k y o ] 2 6 , 7 2 1 [ 1 9 6 2 ] .

3 H . ROSENBERG, Nature [London] 203, 2 9 9 [ 1 9 6 4 ] . 4 J . S . KITTREDGE and R . R . H U G H E S , Biochemistry 3 , 9 9 1

[ 1 9 6 4 ] . 5 J . S . K I T T R E D G E , E . R O B E R T S , and D . G . SIMONSEN, Biochemi-

stry 1, 6 2 4 [ 1 9 6 2 ] .

6 G . ROUSER, G . KRITCHEVSKY, D . H E L L E R , a n d E . L I E B E R , J . Amer. Oil Chemists' Soc. 40, 425 [1963].

7 T . H O R I , O . I T A S A K A , H . INOUE, a n d K . Y A M A D A , J . B i o -chemistry [Tokyo] 56,477 [1964].

8 A. J . D E KONING, Nature [London] 210, 113 [1966]. 9 L. D . Q U I N , Science [Washington] 1 4 4 , 1133 [1964].

10 W. SEGAL, Nature [London] 2 0 8 , 1 2 8 4 [1965].

Angebot anorg. 23Phosphat Glucose-2-14C Fraktion Gesamt-ipm mg AEP spez. Gesamt-ipm mg AEP spez.

Radioakt. Radioakt.

Angebotene Radioaktivität

Im Medium verblieben Säure-Hydrolysat von

Tetrahymena APP-Fraktion nach der Dowex-

50-Säule (Fraktion 12 — 18) AEP-Fraktion nach der Dowex -

50-Säule (Fraktion 2 8 - 3 2 ) AEP-Fraktion nach der Dowex-

1-Säule (Fraktion 5—7) 1. Kristallisation nach Zugabe

von 50 mg inaktiver AEP 2. Umkristallisation 3. Umkristallisation

4 ,4- 107

3,6 • 107

4,2 • 105

1,36 • 104

3,8 • • 105

2,4 • 1 0 5 + 5 0 mg 4790

1,8 • 105 38,8 4770 1,3 • 105 28,2 4782 1,2 • 105 25,2 4801

9,0 • 107

[0,035 mC]

2,3 • 107

7,5 • 105

2,1 • 105 + 5 0 mg 4165

1,65 • 105 41.4 3988 1,23 • 105 30,9 3976

1,1 ' • 105 27,6 4001

Tab. 1. Isolierung und Reinigung von Phosphonoaminosäuren aus Tetrahymena nach Verfütterung von radioaktivem Phosphat bzw. Glucose.

hymena bis zu 13% des aufgenommenen Phosphates in A E P enthalten. Bereits nach der Reinigung über die Dowex-l -Säule änderte sich die spezifische Aktivität von A E P in den Phosphatversuchen nicht mehr.

Analog erfolgte die Aufarbeitung der Ansätze mit positionsmarkierter Glucose, wobei naturgemäß eine Vielzahl markierter Substanzen auftrat. Doch führte auch hier die Umkristallisation zur reinen 14C-markier-ten A E P (Tab. 1 ) .

Die aus positionsmarkierter Glucose entstandene A E P wurde nach der Methode von DE KONING 11 durch 8-stdg. Kochen mit Ninhydrin und SnCl2 in Methyl-cellosolve und Succinatpuffer pn 5,0 auf dem Wasser-bad zu Acetaldehyd abgebaut und dieser nach dem Übertreiben mit saurem K-dichromat zur Essigsäure oxydiert. Nach Wasserdampfdestillation und Neutrali-sation wurde das Na-Acetat dem S c h m i d t - Abbau mit Na-Azid in konzentrierter Schwefelsäure unterwor-fen. Das übergehende C 0 2 aus der Carboxylgruppe wurde zunächst als Ba-Carbonat gefällt und dann wie-der in Na-Carbonat überführt, das Methylamin nach

Austreiben mit Alkali aus dem Reaktionsansatz als Hydrochlorid erhalten. Beide wurden in einem Liquid-Scintillationszähler gemessen. 2 C H O — N E U

CHO COOH C H 3 - N H 2 1 CH 2 Ninhydrin Dichromat | NaN3_f-

CH3 CH3 C 0 2 PO3H0

Nach Fütterung verschiedener positionsmarkierter Glucosen tritt in A E P folgende Radioaktivitäts-Vertei-lung auf (Tab. 2 ) .

Nach Verfütterung von Glucose-l -1 4C und Glucose-6-14C ist die Radioaktivität zu 76 bzw. 80% in der Me-thylgruppe, dagegen nach Verfütterung von Glucose-2-14C zu 93% in der Carboxylgruppe der aus A E P erhal-tenen Essigsäure lokalisiert. Die Uberprüfung des Ab-baus mit uniform-markierter Glucose ergab nicht die erwartete Gleichverteilung und zeigte damit die noch vorhandenen Mängel des Abbaus. Trotz der 20-proz. Verschmierung ist der Unterschied in der Aktivitätsver-

Angebotene Glucose Radioaktivität in ipm

Glucose-U-1 4C 1-*4C 2-14C 6-1 4C

Eingesetzt 7,6 • 107 9 • 107 9 • 107 10,1 • 107

In AEP isoliert (nach Umkristallisation) 52.000 57.200 116.000 142.000 Zum Abbau eingesetzte

Essigsäure 2.750 1.835 4.800 5.540 Methylgruppe der Essig-

säure ( = C - l von AEP) 1.107 1.394 288 4.420 Carboxvlgruppe der Essig-

säure ( = C - 2 von AEP) 1.540 429 4.500 1.105

Tab. 2. Verteilung der Radioaktivität in der beim Abbau von AEP erhaltenen Essigsäure nach Verfütterung von 14C-markierter Glucose.

11 A. J . D E KONING, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 1 3 0 , 5 2 1 [ 1 9 6 6 ] .

teilung in der A E P nach Verfütterung von Glucose-1-bzw. -6- und -2-1 4C so groß, daß die Herkunft der bei-den C-Atome der A E P aus der Glucose eindeutig ist. Das C - l von A E P wird aus den C-Atomen 1 und 6 der Glucose, das C-2 von A E P aus C-2 der Glucose gebil-det Dies steht mit fo lgenden zwei möglichen Biosyn-thesewegen in Einklang:

1. Der Umlagerung von Phosphoenolpyruvat zu 2-Keto-3-phosphonopropionsäure, Transaminie-

rung zu 2-Amino-3-phosphonopropionsäure ( A P P ) und Decarboxylierung zu A E P .

2. Der von SEGAL 10 vorgeschlagenen Umwandlung von Phosphoäthanolamin (bzw. Phosphoserin) als Phosphatidyl-Verbindung zu lipid-gebundener A E P bzw. A P P .

Wir sind dem V e r b a n d d e r C h e m i s c h e n I n -d u s t r i e , F o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e , für seine Unterstützung dankbar.

Über die Akkumulation von Chorisminsäure bei Mutanten und Wildstämmen von Escherichia coli

und Saccharomyces cerevisiae

F . L I N G E N S u n d G . M Ü L L E R

Biochemische Abteilung des Chemischen Institutes der Universität Tübingen

( Z . N a t u r f o r s c h g . 22 b , 991 [ 1 9 6 7 ] ; e i n g e g a n g e n a m 22 . Juni 1967)

Chorisminsäure (3-Enolbrenztraubensäureäther der £7-ans-3.4-Dihydroxy-cyclohexa-l .5-diencarbonsäure) ist als Akkumulat bei Aerobacter aerogenes zuerst bei einer dreifach genetisch blockierten Mutante nachgewie-sen worden 1 . Es konnte nun gezeigt werden, daß Mu-tanten von E. coli mit einem einzigen genetischen Block in der Biosynthese des Phenylalanins oder Tyrosins zur Chorisminsäure-Akkumulation befähigt sind. Unter den günstigsten Bedingungen liefert eine solche Mutante 120 mg Chorisminsäure pro l Minimalmedium.

Auch einfach blockierte Mutanten von Saccharomyces cerevisiae können, wie schon früher berichtet wurde 2 , zur Akkumulation von Chorisminsäure veranlaßt wer-den. Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß auch eine Phenylalanin-Mutante von S. cerevisiae (HK 11) Chorisminsäure ans Medium abgibt. Dieser Mutante fehlt fast vollständig die Prephenatdehydratase 3 . Offen-sichtlich führt schon der Ausfal l dieses einzigen En-zyms zur Akkumulation der Chorisminsäure.

Tryptophanmangelmutanten von E. coli und S. cere-visiae, die entsprechend ihrer genetischen Blockierung normalerweise Anthranilsäure akkumulieren, liefern bei Zusatz von 5-Oxo-6-diazo-L-norleucin Chorismin-säure, da diese Verbindung die enzymatische Übertra-gung des Amidstickstoffs des Glutamins auf die Choris-minsäure h e m m t 4 . Bei Phenylalanin - - und Tyrosin"-Mutanten von E. coli und S. cerevisiae wird die Aus-beute an Chorisminsäure durch Zugabe von 5-Oxo-6-

1 F. GIBSON, Biochem. J. 9 0 , 256 [1964]. 2 F . LINGENS U . W . G O E B E L , Hoppe Seyler's Z . physiol. Chem.

342, 1 [1965]. 3 F. LINGENS, W . GOEBEL U. H. U E S S E L E R , Biochem. Z. 3 4 6 , 365

[1966].

diazo-L-norleucin gesteigert. Sogar die Wildstämme von E. coli und S. cerevisiae geben in Gegenwart dieses Hemmstoffes Chorisminsäure ans Medium ab. Dabei ist zu bedenken, daß 5-Oxo-6-diazo-L-norleucin nicht nur spezifisch in die Anthranilsäure-Biosynthese ein-greift. Es ist erstaunlich, daß die Wildstämme in Ge-genwart von 5-Oxo-6-diazo-L-norleucin Chorisminsäure akkumulieren, da bekannt ist, daß die Anthranilsäure-Biosynthese in E. coli sogar mit Ammoniumionen al-lein als Amindonator erfolgen kann 6.

Die Isolierung der Chorisminsäure erfolgte durch Essigesterextraktion des Minimalmediums. Der einge-engte Essigesterextrakt wurde der Papierchromatogra-phie im System Isopropanol, Ammoniak, Wasser 8 : 1 : 1 unterworfen. Die Verbindung wurde mit Methanol als Di-Ammoniumsalz eluiert. Für enzymatische Versuche kann diese Lösung direkt verwendet werden. Die Rei-nigung gelingt durch Umkristallisieren aus Methanol bei tiefer Temperatur und durch erneutes Auf lösen in Methanol und Ausfäl len mit Äther. Das Ammonium-salz ist bei — 2 5 ° sowohl in Substanz als auch in methanolischer Lösung monatelang haltbar.

Di-Ammoniumsalz, Schmp. 119 — 121° (Zers.) aus Methanol C 1 0 H 1 6 N 2 O 6 - H 2 O (278,3)

Ber. C 43,16 H 6,52 N 10,07, Gef. C 43 ,26 H 6,51 N 9,86,

43,06 6 ,68 9,90.

UV-Spektrum Am a x 278 nm (e = 2150) in Methanol. IR-Spektrum (in K B r ) . Intensive Banden bei 3350, 1590, 1400 und 1220 c m - 1 , weitere Banden bei 1105, 1070, 1020, 955, 858 und 833 c m " 1 .

Dem F o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e und der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t danken wir für materielle Hilfe bei diesen Untersuchungen.

4 F . LINGENS, W . L Ü C K U . G . M Ü L L E R , Hoppe Seyler's Z . phy-siol. Chem. 343, 282 [1966].

5 J . M . E D W A R D , F . GIBSON, L . M . JACKMAN U . J . S . SHANNON, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 93, 78 [1964].

6 F . GIBSON, J . P I T T A R D U . E . R E I C H , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 136,573 [1967].