Die Wirkung von Nikotin auf trigeminal exprimierte Ionenkanäle · Der Nervus mandibularis enthält...

Die Wirkung von Nikotin

auf trigeminal exprimierte Ionenkanäle

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl für Zellphysiologie

Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt

vorgelegt von

Benjamin Sven Philip Schreiner

aus

Essen

Bochum

Februar 2013

The Effect of Nicotine

on Trigeminal Expressed Ion Channels

Dissertation to obtain the degree

of Doctor Rerum Naturalium

at the Faculty of Biology and Biotechnology,

International Graduate School of Biosciences

Ruhr-University Bochum

prepared at the

Department of Cell Physiology,

Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt

submitted by

Benjamin Sven Philip Schreiner

from

Essen

Bochum,

February 2013

Referent: Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt

Korreferent: PD Dr. Matthias Schmidt

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild völlig

übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den

- Unterschrift -

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung 1

1.1 Der Nervus trigeminus 1

1.1.1 Anatomie des Nervus trigeminus 2

1.1.2 Der trigeminale Sinn 3

1.2 Liganden-gesteuerte Ionenkanäle 5

1.2.1 Cys-loop-Kanäle 6

1.2.2 Ionotrope Glutamatrezeptoren 8

1.2.3 P2X-Rezeptoren 9

1.3 TRP-Kanäle 9

1.4 Nikotin 11

1.5 Transkriptomanalyse 13

1.6 Zielsetzung der Arbeit 17

2. Material und Methoden 19

2.1 Material 19

2.1.1 Medien 19

2.1.2 Kits 20

2.1.3 Enzyme 20

2.1.4 Oligonukleotide 20

2.1.5 DNA-Längenstandard 20

2.1.6 Plasmide 21

2.1.7 Pharmakologisch wirksame Substanzen 21

2.1.8 Sonstige Chemikalien 22

2.1.9 Verbrauchsmaterialien 22

2.1.10 Versuchstiere 23

2.1.11 Geräte 23

2.1.12 Software 24

Seite

2.2 Methoden 24

2.2.1 Entnahme von Oozyten aus Xenopus laevis 24

2.2.2 Aufbereitung der Oozyten und Injektion der RNA 25

2.2.3 Die Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp Technik 26

2.2.4 Trigeminus-Primärzellkultur 28

2.2.5 Die Calcium-Imaging Methode 28

2.2.6 Isolation einzelner Neurone aus der trigeminalen Zellkultur 29

2.2.7 Molekularbiologische Methoden 30

2.2.7.1 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) 30

2.2.7.2 Agarosegelelektrophorese 32

2.2.7.3 Transformation 32

2.2.7.4 Anzucht von Bakterien 32

2.2.7.5 Präparative DNA-Aufreinigung 32

2.2.7.6 Ethanol/Natriumacetat-Fällung 32

2.2.7.7 Quantifizierung von DNA und RNA 33

2.2.7.8 In vitro-Transkription 33

2.2.7.9 Ammonium-Acetat-Fällung 33

2.2.7.10 Elution von DNA aus Agarosegelen 33

2.2.7.11 DNA-Sequenzierung 34

2.2.7.12 Restriktion von Plasmiden 34

2.2.7.13 RNA-Isolation 34

2.2.7.14 Transkriptom-Amplifikation und cDNA-Synthese bei Einsatz kleinster 35

Mengen RNA

2.2.7.15 Next Generation Sequencing-Verfahren 35

2.2.7.16 Transkriptomanalyse 35

3. Ergebnisse 40

3.1 Elektrophysiologische Untersuchung der Nikotin-Responsivität 40

rekombinanter Ionenkanäle

3.1.1 Antagonismus von Nikotin an humanen 5-HT3-Rezeptoren 40

3.1.2 Aktivierung humaner nikotinischer Azetylcholinrezeptoren 44

durch (+)-Nikotin

Seite

3.1.3 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an humanen 47

α1 Glycinrezeptoren (GlyR α1)

3.1.4 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an humanen GABAA-Rezeptoren 48

3.1.5 Untersuchung der Wirkung von Nikotin am humanen P2X-Rezeptor 50

3.1.6 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an humanen Glutamatrezeptoren 51

3.1.7 Die Wirkung von (+)-Nikotin auf den TRPA1-Kanal 54

3.1.8 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an den Vanilloid-Rezeptoren TRPV1-3 56

3.1.9 Untersuchung der Wirkung von Nikotin am humanen 58

Melastatinrezeptor TRPM8

3.1.10 Zusammenfassung der elektrophysiologischen Untersuchungen 60

3.2 Untersuchungen der Wirkung von Nikotin auf trigeminale Neurone der Maus 61

3.2.1 Stereoselektive Responsivität trigeminaler Ganglienzellen auf Nikotin 61

3.2.2 Suche nach weiteren Rezeptoren für Nikotin in trigeminalen Neuronen 62

3.2.2.1 Responsivität trigeminaler Neurone für (-)-Nikotin unter pharmakologischer 62

Inhibition von nAChR und TRPA1

3.2.2.2 Responsivität trigeminaler Neurone für (+)-Nikotin 65

3.2.3 Einfluss extrazellulären Calciums auf Nikotin-Responsivität trigeminaler 69

Neurone

3.2.4 Inhibitorischer Einfluss von Nikotin auf 5-HT3-vermittelte 70

Calcium-Signale trigeminaler Neurone

3.3 Transkriptomanalyse Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone 72

3.3.1 Vergleich der Transkriptome neuronaler Gewebe und einzelner Nikotin- 78

responsiver Neurone

3.3.1.1 Expression von housekeeping-Genen 78

3.3.1.2 Expression der Cys-loop-Rezeptoren 80

3.3.1.3 Expression der TRP-Kanäle 83

3.3.1.4 Expression der KCNK-Kanäle 85

3.3.2 Differentielle Expressionen zwischen einzelnen Nikotin-responsiven Zellen 86

4. Diskussion 91

4.1 Charakterisierung der stereospezifischen Wirkung von Nikotin 91

auf nAChR und TRPA1

4.2 Die Wirkung von Nikotin auf 5-HT3-Rezeptoren 95

4.3 Nikotinblock an NMDA-Kanälen 97

Seite

4.4 Keine Wirkung von Nikotin auf weitere untersuchte Ionenkanäle 99

4.5 Chemosensorisch relevante Nikotinkonzentrationen 100

4.6 Calcium-Imaging der trigeminalen Zellkultur – neue Nikotinrezeptoren 101

4.7 Vergleichende Transkriptomanalyse 104

4.7.1 Die Qualität der Sequenzierung 106

4.7.2 Die Expression der bekannten Nikotinrezeptoren nAChR und TRPA1 107

4.7.3 Die Expression der weiteren Cys-loop-Rezeptoren 109

4.7.4 Die Expression weiterer chemosensorisch relevanter Rezeptoren 110

4.7.5 Validierung der Sequenzierergebnisse 111

4.7.6 Differentielle Expression der einzelnen Nikotin-responsiven Neurone 113

4.7.7 Die Bedeutung der chemosensorischen Wahrnehmung von Nikotin 115

5. Zusammenfassung 117

5. Summary 120

6. Anhang 122

6.1 Literaturverzeichnis 122

6.2 Abbildungsverzeichnis 138

6.3 Tabellenverzeichnis 140

6.4 Abkürzungsverzeichnis 141

6.5 Publikationsliste 143

1

Einleitung

1. Einleitung

1.1 Der Nervus trigeminus

Die Wahrnehmung chemischer Signale aus der Umwelt ist für das Überleben jedes Lebewesens

essentiell. Der chemische Sinn ist demnach auch einer der ursprünglichsten Sinne im Tierreich. Bei

unterschiedlichsten tierischen Organismen vom Einzeller bis zu hochentwickelten Vertebraten

haben sich Mechanismen entwickelt, um Moleküle aus der Umgebung als Reiz für zielgerichtetes

Verhalten zu nutzen.

Der Geschmackssinn vermittelt Sinneseindrücke, die Lebewesen in die Lage versetzen, qualitative

Eigenschaften von Nahrung zu bewerten, zu der sie direkten Kontakt haben, weshalb der

Geschmackssinn auch als Nahsinn bezeichnet wird. Nicht immer muss dafür bei Vertebraten das

ausschließliche Sinnesorgan die Zunge sein, jedoch werden alle Geschmacksorgane in direkter

Berührung mit der Nahrung benutzt. Es handelt sich bei den wahrgenommenen Reizen um nicht

flüchtige, aber wasserlösliche Substanzen. Es werden die fünf Geschmacksrichtungen „süß“,

„sauer“, „salzig“, „bitter“ und „umami“ unterschieden. Geschmackseindrücke enthalten nicht nur

Informationen über den Nährstoffgehalt der Nahrung, Bittereindrücke weisen in der Regel auf

Giftstoffe, wie beispielsweise Pflanzenalkaloide, in der Nahrung hin.

Der Geruchssinn ist ein Fernsinn. Über ihn können leicht flüchtige Substanzen wahrgenommen

werden, die beispielsweise das Vorhandensein einer Nahrungsquelle sowie die Anwesenheit von

Fressfeinden oder Artgenossen anzeigen. Makrosmaten wie die Ratte richten einen Großteil ihres

Verhaltens an olfaktorischen Signalen aus (Doty, 1986; Wallace et al., 2002). Auch beim Menschen

ist der Geruchssinn bedeutend, obwohl er für das eigene Überleben nicht mehr essenziell ist

(Hatt, 1996). Trotzdem kann der Mensch eine Vielzahl verschiedener Geruchsqualitäten

unterscheiden, jedoch besitzt der Mensch nur ~350 funktionelle olfaktorische Rezeptorgene,

wohingegen bei Nagern wie der Maus ~1000 Gene funktionell sind (Niimura and Nei, 2005; Zhang

and Firestein, 2002; Zhang et al., 2004; Zozulya et al., 2001). Die Rezeptoren sind auf den Zilien

der Rezeptorneurone exprimiert, die in den Schleim des olfaktorischen Epithels ragen. Jedes

olfaktorische Rezeptorneuron exprimiert dabei nur einen Rezeptortyp (Chess et al., 1994; Ishii et

al., 2001; Serizawa et al., 2004). Ein Duft kann mehrere Rezeptortypen aktivieren (Hatt, 2004;

Malnic et al., 1999). Die Vielfalt unterschiedlicher Geruchsqualitäten wird durch spezifische

Aktivierungsmuster verschiedener olfaktorischer Rezeptoren für jeden Geruch kodiert

(Mombaerts, 2006; Mori et al., 2006). Der Vermeidung schädlicher chemischer Umwelteinflüsse

verschiedener Art dient insbesondere der allgemeine chemische Sinn, den der Nervus trigeminus

2

Einleitung

vermittelt. Reize, die mit diesem System wahrgenommen werden, können eine schmerzhafte

Empfindung, wie „Brennen“ und „Stechen“ erzeugen, die Vermeidungsverhalten oder aversive

Reflexe, wie „Nießen“ oder kurzfristigen Atemstopp nach sich ziehen. Daneben vermittelt der

Trigeminus Empfindungen wie Adstringenz, und „Prickeln“. Außerdem werden

Temperatureindrücke über den Trigeminus vermittelt. Diese Sensibilität des Trigeminus für Hitze

und Kälte sowie für mechanische Reize, die auch schmerzhafte Empfindungen erzeugen kann,

dient ebenfalls zur Vermeidung schädlicher Umwelteinflüsse.

1.1.1 Anatomie des Nervus trigeminus

Aufgrund seiner Gliederung in drei Hauptäste erhielt der fünfte Hirnnerv der Vertebraten, die

Bezeichnung Nervus trigeminus (lateinisch für Drillingsnerv). Er wird unterteilt in die Nervi

ophtalmicus, maxillaris und mandibularis. Der ausschließlich sensible Nervus ophtalmicus, teilt

sich wiederum in weitere Nerven, welche im Bereich der Augen unter anderem die Orbita,

Hornhaut, Bindehaut, Tränendrüsen und obere Bereiche der Gesichtshaut sowie die Stirn

innervieren (Abb. 1.1). Im Bereich der Nasenhöhle innerviert der Nervus ophtalmicus zudem die

Schleimhaut von Nasenscheidewand und Siebbein sowie die Keilbeinhöhle.

Abbildung 1.1: Schema des Nervus trigeminus des Menschen. Sensible Fasern der Hauptäste Nervus

opthalmicus (1), Nervus maxillaris (2) und Nervus mandibularis (3) haben ihren Ursprung im Ganglion

gasseri (Semilunarganglion). Aus “Gray’s Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery” (Gray,

2004).

3

Einleitung

Der ebenfalls ausschließlich sensible Nervus maxillaris innerviert im Bereich der Augen einen Teil

der Orbita und der Augenlider. Zudem innerviert er die Nasenschleimhaut und im Mundraum das

Gaumenepithel, Zahnfleisch sowie die Zähne des Oberkiefers. Außerdem werden weite Bereiche

der Gesichtshaut vom Nervus maxillaris innerviert.

Der Nervus mandibularis enthält sowohl motorische Fasern, welche vor allem die Kaumuskulatur

innervieren, als auch sensible Fasern. Diese innervieren die vorderen zwei Drittel der Zunge, die

Wangenschleimhaut, die Zähne und Zahnfleisch des Unterkiefers sowie untere Bereiche der

Gesichtshaut. Die sensiblen Afferenzen des Nervus trigeminus stammen von Neuronen, die im

Ganglion gasseri (auch Semilunarganglion) residieren. Diese Neurone erster Ordnung projizieren

in die zentralen Trigeminuskerne des Hirnstammes (Trepel, 1999). Das Ganglion gasseri ist als Sitz

der Neurone der sensiblen Afferenz den Ganglien der Dorsalwurzeln seriell homolog (Lazarov,

2002).

1.1.2 Der trigeminale Sinn

Die pseudounipolaren Neurone des Ganglion gasseri des trigeminalen chemosensorischen

Systems erstrecken ihre Afferenzen als freie Nervenendigungen in das innervierte Zielgewebe, zu

denen auch die Schleimhäute im Mund-, Nasen- und Rachenraum gehören (Trepel, 1999).

Chemische Reize werden vor allem über schwach myelinisierte Aδ- und unmyelinisierte C-Fasern

mit geringer Geschwindigkeit in den Hirnstamm geleitet (Anton and Peppel, 1991; Hensel et al.,

1974; Heppelmann et al., 2001; Jessel and Basbaum, 2000; Sekizawa and Tsubone, 1994),

wohingegen die stark myelinisierten Aα-Fasern mechanische Stimuli mit höherer Geschwindigkeit

weiterleiten (Jessel and Basbaum, 2000). Aδ-Fasern sind an der Vermittlung von Signalen beteiligt,

die zu einer kurzen, stechenden Schmerzempfindung führen (Mackenzie et al., 1975; Torebjork

and Hallin, 1973). C-Fasern vermitteln Signale, die brennenden, lang anhaltenden Schmerz zur

Folge haben (Mackenzie et al., 1975; Torebjork and Hallin, 1970).

Der Trigeminus kann jedoch auch einen Anteil zur Geschmacks- und Geruchsempfindung

beitragen. Bekannt ist, dass praktisch alle Duftstoffe, die in niedriger Konzentration das

olfaktorische System aktivieren, in höherer Konzentration eine trigeminale Komponente

vermitteln und damit bisweilen begrenztes Riechvermögen im Falle einer Anosmie

aufrechterhalten können (Cain, 1976; Doty et al., 1978; Silver et al., 1985; Hummel & Livermore,

2002). Stoffe, die eine starke trigeminale Empfindung auslösen, haben oft eine hohe

Lipidlöslichkeit, die es erst möglich macht, freie Nervenendigungen zu erreichen (Cometto-Muniz

et al., 1998). Zwischen olfaktorischem und trigeminalen System ist eine Interaktion bekannt, die

4

Einleitung

durch trigeminale Kollateralen zu olfaktorischen Rezeptorzellen in der Schleimhaut aber auch in

den Bulbus olfactorius entsteht (Schaefer et al., 2002). Es konnte daher an olfaktorischen

Rezeptorzellen des Frosches eine Modulation der Aktivität durch elektrische Stimulation des

ophtalmischen Astes des Trigeminus beobachtet werden (Bouvet et al., 1987). Eine Interaktion

konnte jedoch auch auf einer zentralen Ebene beobachtet werden. In einem Kerngebiet des

Thalamus der Ratte, dem Nucleus mediodorsalis, konnten Inokuchi et al. (1993) Aktivität bei

olfaktorischer Stimulation feststellen, die sich durch simultane Stimulation durch trigeminale

Reize verringert. In psychophysischen Studien konnten Cain und Murphy (1980), sowie Kobal und

Hummel (1988) zeigen, dass trigeminale Reize die empfundene Intensität verschiedener

Geruchsstoffe verringern, wenn beide Reize simultan appliziert werden. Auch der trigeminal

vermittelte Schmerz wurde gleichzeitig als geringer empfunden als bei alleiniger Applikation des

trigeminalen Reizes ohne Duftstimulus. Allerdings konnten Jacquot et al. (2004), ebenfalls in

psychophysischen Studien, ein Herabsenken der Wahrnehmungsschwelle und somit eine

Sensibilisierung für die Duftstoffe Phenylethylalkohol und Butanol nach vorangegangener

Stimulation mit dem trigeminalen Reiz Allylisothiocyanat beobachten. An schlafenden

Versuchspersonen, die durch einen trigeminalen Stimulus CO2 geweckt wurden, konnte zudem

beobachtet werden, dass eine simultane olfaktorische Stimulation mit Schwefelwasserstoff das

CO2-induzierte Erwachen fördert (Stuck et al., 2011). Offenbar kann sowohl durch trigeminale

Stimuli die olfaktorische als auch durch olfaktorische die trigeminale Wahrnehmung positiv wie

negativ moduliert werden. Ein gewisser Anteil dieser Modulation scheint auf der Ebene direkter

Zellkontakte zwischen olfaktorischen Rezeptorneuronen und trigeminalen Nervenendigungen

stattzufinden.

Trigeminale Neurone exprimieren eine Vielzahl von Rezeptoren, an die Stoffe verschiedenster

Substanzklassen binden können. Es wurde für unterschiedliche Klassen ionotroper Rezeptoren die

Expression im Nervus trigeminus nachgewiesen. Aus der Familie der transient receptor potential

Kanäle werden beispielsweise TRPV1-4, TRPM8 (Caterina et al., 1997; McKemy et al., 2002; Silver

et al., 2006; Xu et al., 2002; Yamamoto et al., 2009) und TRPA1 (Story et al., 2003; Kobayashi et

al., 2005) exprimiert. Aus der Familie der Cys-loop-Kanäle ist die Expression nikotinischer

Acetylcholinrezeptoren (Alimohammadi and Silver, 2000; Flores et al., 1996; Keiger and Walker,

2000; Liu et al., 1998; Liu et al., 1996; Liu et al., 1993), 5-HT3- (Hu et al., 2004; Tecott et al., 1993)

und GABA-Rezeptoren (Durkin et al., 1999; Hayasaki et al., 2006; Kondo et al., 1994) bekannt. Es

kommen zudem Glutamat- (Chun et al., 2008; Gu and Huang, 1994; Sahara et al., 1997) und

Purinozeptoren (Kuroda et al., 2012; Xiang et al., 1998; Spehr et al., 2004) vor. Aus der Familie der

KCNK Kanäle wurde die Expression von KCNK2, KCNK10 und KCNK18 nachgewiesen

5

Einleitung

(Lafreniere et al., 2010; Yamamoto et al., 2009). Daneben werden auch G-Protein gekoppelte

Rezeptoren, beispielsweise metabotrope Serotoninrezeptoren (Bonaventure et al., 1998a;

Bonaventure et al., 1998b) oder Opioidrezeptoren (Zhu et al., 1998), exprimiert. Alle diese

Rezeptoren könnten potentiell die sensorische Wahrnehmung eines chemischen Reizes direkt

oder modulatorisch beeinflussen, jedoch ist bei Weitem noch nicht die gesamte trigeminale

exprimierte Rezeptorvielfalt erfasst.

1.2 Liganden-gesteuerte Ionenkanäle

Zur Familie der „klassischen“ Liganden-gesteuerten Ionenkanäle rechnet man die Cys-loop-

Rezeptoren, die ionotropen Glutamatrezeptoren und die ionotropen Purinozeptoren. In die

Gruppe der Cys-loop-Rezeptoren fallen neben den nikotinischen Acetylcholinrezeptoren auch die

5-HT3-, die GABA-, die Glycinrezeptoren und die zuletzt bekannt gewordenen ZAC-Kanäle (Zn2+-

activated ion channel). GABA- und Glycinrezeptoren sind Cl--Ionenkanäle, nACh- und 5-HT3-

Rezeptoren sowie ZAC-Kanäle hingegen unspezifische Kationenkanäle. Glutamatrezeptoren und

Purinozeptoren sind ebenfalls Kationenkanäle. Untereinheiten aus den drei erwähnten

Rezeptorfamilien unterscheiden sich strukturell.

Eine Untereinheit der Cys-loop-Rezeptoren besteht aus vier Transmembrandomänen (Abb. 1.2

Mitte), dem extrazellulären N-Terminus - auf dem auch die Ligandenbindestelle liegt - und dem

ebenfalls extrazellulären C-Terminus (Corringer et al., 2000). Die zweite Transmembrandomäne

(TM2) bildet die Kanalpore. Das namensgebende Merkmal, der Cys-loop, liegt am N-Terminus der

α-Untereinheiten und ist an der Bildung der Ligandenbindestelle beteiligt (Brejc et al., 2001).

Eine Untereinheit ionotroper Glutamatrezeptoren besteht aus drei Transmembrandomänen und

einer Membranschlaufe auf zytoplasmatischer Seite, die die Kanalpore bildet (Abb. 1.2 rechts).

Der N-Terminus liegt extra-, der C-Terminus intrazellulär (Bennett und Dingledine, 1995;

Hollmann et al., 1994; Wo und Oswald, 1994; 1995; Wood et al., 1995).

Eine Untereinheit der P2X-Rezeptoren besteht aus zwei Transmembrandomänen, die durch eine

extrazelluläre Schlaufe verbunden sind (Abb. 1.2 links). C- und N-Terminus befinden sich

dementsprechend intrazellulär. P2X-Rezeptoren sind leitfähig für monovalente Kationen und Ca2+-

Ionen, der Selektivitätsfilter wird durch beide Transmembrandomänen, die Kanalpore durch TM2

gebildet (Egan and Khakh, 2004; Migita et al., 2001; Samways and Egan, 2007; Samways et al.,

2008).

6

Einleitung

Abbildung. 1.2: Schema der Untereinheiten Liganden-gesteuerter Ionennkanäle. Verändert nach Khakh

(2001).

1.2.1 Cys-loop-Kanäle

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle aus der Superfamilie der Cys-loop-Kanäle bilden homo- oder

heteropentamere funktionelle Ionenkanalproteine. Die in dieser Gruppe zusammengefassten

Rezeptorfamilien haben einen gemeinsamen entwicklungsgeschichtlichen Ursprung (Ortells und

Lunt, 1995).

Von der Subfamilie der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren wurden bisher 17 verschiedene

Untereinheiten identifiziert. In fester Stöchiometrie bilden die Untereinheiten (α1)2, β1, δ und ε

die Rezeptorkanäle der neuromuskulären Synapse. Die Untereinheit γ, kommt nur in

Jugendstadien vor und wird später durch die stabilere ε-UE ersetzt. Alle weiteren Untereinheiten

treten vorwiegend in neuronalem Gewebe auf. Die Untereinheiten α7-9 können Homomere

bilden oder Heteromere untereinander sowie mit α10 bilden. Bei den Untereinheiten α2-6 und

β2-4 sind verschiedene Heteromultimere in unterschiedlicher Stöchiometrie möglich

(Albuquerque et al., 2009; Millar und Gotti, 2009;). Im trigeminalen Ganglion der Ratte ist eine

relative Expression der Untereinheiten in der Reihenfolge α7 ≈ α3 > α6 > α4 ≈ α5 > α9 ≥ α2, und

β2 ≈ β3 > β4 festgestellt worden (Liu et al., 1998).

Die α2-Untereinheit, die bei Nagern sehr niedrig exprimiert wird, ist bei Primaten weit höher

exprimiert. Die Expression dieser Untereinheit ist in Primaten der von α4 in Stärke und Expression

sehr ähnlich, wobei bei Nagern die verbreitete Untereinheitenkombination α4β2 ist, bei Primaten

bei ähnlichem Expressionsmuster daneben auch α2β4 vorkommt (Han et al., 2000). Zumindest für

die Untereinheitenkombinationen α4β2 und α3β4 konnte die Expression in freien trigeminalen

Nervenendigungen festgestellt werden (Flores et al., 1996). Boyd et al. (1991) beobachteten eine

7

Einleitung

nAChR-abhängige Modulation primärer Neurone sensorischer Ganglien durch cholinerge Fasern,

welche keine fokussierten synaptischen Strukturen bilden, sondern Acetylcholin diffus

ausschütten.

Für Serotoninrezeptoren des 5-HT3-Typs sind die Untereinheiten A-E bekannt. Für eine

funktionelle Expression müssen die Untereinheiten B-E mit 5-HT3A heteromultimerisieren (Davies

et al., 1999; Niesler et al., 2007). Die Aktivierung von 5-HT3-Rezeptoren wird im

Zentralnervensystem mit der Vermittlung des Brechreizes in Verbindung gebracht. In zwei der

dafür verantwortlichen Strukturen, der Area postrema und dem Nucleus tractus solitarii, über den

auch gustatorische Informationen umgeschaltet werden, ist eine deutliche Expression von 5-HT3-

Rezeptoren bekannt (Kilpatrick et al., 1989; Pratt and Bowery, 1989). So werden spezifische 5-HT3-

Antagonisten als Antiemetika genutzt (Hsu, 2010). Obwohl 5-HT3-Rezeptoren in vielen Strukturen

des Zentralnervensystems vorkommen, konnte für diese Rezeptoren auch eine Funktion auf

primären afferenten Neuronen bei der Schmerzempfindung festgestellt werden. Freie nozizeptive

Nervenendigungen peripherer sensorischer Ganglien können durch Serotonin und 5-HT3-

spezifische Agonisten schmerzhafte Eindrücke erzeugen (Richardson, 1990), die durch spezifische

5-HT3-Antagonisten gehemmt werden können (Richardson et al., 1985).

Im zentralen Nervensystem, insbesondere im Gehirn der Vertebraten, ist GABA der wichtigste

inhibitorische Neurotransmitter (Somogyi et al., 1998). Die Gruppe der ionotropen GABA-

Rezeptoren, die GABAA-Rezeptoren, trägt demnach zur Steuerung vielfältiger

neurophysiologischer Prozesse bei (Hevers und Luddens, 1998) und sind bedeutende

pharmakologische Ziele für Anästhesie des Zentralnervensystems (Reynolds et al., 2003; et al,

2010). Es sind 19 GABAA-Untereinheiten (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, π, θ sowie ρ1-3) bekannt (Simon et

al., 2004). Die bis vor einigen Jahren noch als GABAC-Rezeptoren bekannten Untereinheiten ρ1-3

wurden hier, wie von Barnard et al. (1998) vorgeschlagen, zur Gruppe der GABAA-Rezeptoren

gezählt. Im trigeminalen Ganglion der Ratte konnte die Expression von α1-6, β1-3, γ1-3, und delta

festgestellt werden. Hayasaki et al. (2006) und Kondo et al. (1994) spekulieren, dass GABA nicht

synaptisch fokussiert, sondern diffus im trigeminalen Ganglion ausgeschüttet wird, um auf eine

große Anzahl von Neuronen modulatorisch zu wirken. Durch die Expression von Glutamat-

Decarboxylase, einem bei der Produktion von GABA notwendigen Enzym, in trigeminalen

Neuronen schließen die Autoren darauf, dass der Transmitter von den Neuronen selbst

ausgeschüttet wird.

Glycinrezeptoren kommen im Zentralnervensystem der Vertebraten vor allem im Rückenmark,

der Medulla oblongata und der Retina vor (Gisselmann et al., 2002; Lynch, 2009) und dienen an

inhibitorischen Synapsen als Rezeptorkanäle mit Cl--Leitfähigkeit. Bei willkürlicher oder

8

Einleitung

reflexartiger Kontraktion von Skelettmuskeln sorgen sie beispielsweise für die Relaxation

antagonistischer Muskelgruppen (West, 1985). Es gibt die Untereinheiten α1-4 (Grenningloh et

al., 1987; Lynch, 2004) und eine β-Untereinheit (Grenningloh et al., 1990). Die α1-3-

Untereinheiten können funktionelle Homopentamere oder Heteropentamere mit der β-

Untereinheit bilden (Lynch, 2009). Die α4-Untereinheit ist beim Menschen nicht funktionell

(Simon et al., 2004). Heteromere vor allem aus α1β aber auch aus α3β sind die am häufigsten

exprimierten Glycinrezeptoren (Malosio et al., 1991). Es werden einerseits Stöchiometrien von

(α)2(β)3 (Grudzinska et al., 2005), aber auch von (α)3(β)2 (Becker et al., 1988; Burzomato et al.,

2003; Kuhse et al., 1993) vermutet. Im trigeminalen Ganglion konnte die Expression von

Glycinrezeptoren bisher nicht nachgewiesen werden, jedoch in den Nuclei der Hirnnerven und

somit auch in den zentralen Trigeminuskernen des Hirnstammes (Zarbin et al., 1981).

1.2.2 Ionotrope Glutamatrezeptoren

Die Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren wird in die Subtypen AMPA- (α-amino-3-hydroxy-

5-methyl-4-isoxazolepropionic acid), Kainat- und die NMDA (N-Methyl-D-Aspartat)-Rezeptoren

unterteilt, die nach Substanzen benannt wurden, die neben Glutamat auch spezifisch aktivierend

auf einen dieser Ionenkanäle wirken. Es sind vier Untereinheiten von AMPA- (GluR1-4), fünf vom

Kainat- (GluR5-7, KA-1,2) und sechs vom NMDA-Typ (NR1, NR2A-D, NR3) bekannt (Dingledine et

al., 1999). Von AMPA-Rezeptoren existieren je Untereinheit zwei unterschiedliche splice-

Varianten „flip“ und „flop“, die sich um die Expression eines Exons unterscheiden. In adulten

Säugern dominiert die „flop“-Variante (Monyer et al., 1991; Sommer et al., 1990). Vier

Untereinheiten bilden ein funktionelles Ionenkanalprotein (Behe et al., 1995; Dingledine et al.,

1999). AMPA- und Kainatrezeptoren können miteinander heteromultimerisieren (Dingledine et

al., 1999), NMDA-Rezeptoren bestehen stets aus NR1 und weiteren NMDA-Untereinheiten (Behe

et al., 1995). Bisher wurden die AMPA-Rezeptoren GluR1, 2 und 3 (Chun et al., 2008), die

Kainatrezeptoren GluR5 und KA-2 und schwächer GluR6 (Sahara et al., 1997), sowie NMDA-

Rezeptoren (Gu und Huang, 1994) im Trigeminus festgestellt.

Seit langer Zeit ist die Bedeutung von Glutamatrezeptoren bei Lernvorgängen im Zusammenhang

mit synaptischer Plastizität insbesondere im Hippocampus bekannt. Die Leitfähigkeit von NMDA-

Rezeptoren für Ca2+-Ionen führen dabei zu einer intrazellulären Regulationskaskade, die eine

Potenzierung stark aktivierter Synapsen zur Folge hat. Ein spannungsabhängiger Block durch

Mg2+-Ionen sorgt jedoch dafür, dass eine Aktivierung von NMDA-Rezeptoren nur an aktiven,

bereits depolarisierten Synapsen stattfindet. Die Depolarisation ist meist auf die Koexpression von

9

Einleitung

AMPA-Kanälen zurückzuführen (Asztely und Gustafsson, 1996; Maren und Baudry, 1995; Nowak

et al., 1984).

1.2.3 P2X-Rezeptoren

Rezeptoren der P2X-Familie sind ionotrope Purinozeptoren, die durch den natürlichen Liganden

ATP aktiviert werden. Es sind sieben verschiedene Untereinheiten (P2X1-7) bekannt. Ein

funktionelles Kanalprotein besteht aus drei Untereinheiten, die sowohl homo- als auch heteromer

auftreten (Collo et al., 1996; Lambrecht, 2000; Nicke et al., 1998; Soto et al., 1997). Eine

bedeutende Funktion von P2X-Rezeptoren ist die Beteiligung an der Vermittlung von

Schmerzeindrücken bei Entzündungsprozessen (Barclay et al., 2002).

In primären sensorischen Nervenenden kommen alle Subtypen von P2X-Rezeptoren vor.

Insbesondere im Nervus trigeminus tritt die P2X2-Untereinheit sowohl homomer in nicht

nozizeptiven Neuronen (Spehr et al., 2004) als auch heteromer mit P2X3 auf nozizeptiven

Nervenendigungen auf (Chen et al., 1995). So erregt die Applikation von ATP auch Capsaicin-

sensitive Fasern auf der Zunge der Ratte (Rong et al., 2000). Zudem löst die Applikation von ATP

auf beschädigte Hautpartien eine schmerzhafte Empfindung aus. Nach mechanischen

Gewebeschäden kann ATP sowohl aus sympathischen Nervenendigungen als auch aus Zellen der

Haut freigesetzt werden (Burnstock, 2007). Da ohnehin ein Großteil trigeminaler Neurone ATP-

sensitiv ist (>80%), konnten trigeminale Ganglienzellen identifiziert werden, die sowohl auf

Capsaicin, ATP und Nikotin reagieren (Xu et al., 2010).

1.3 TRP-Kanäle

Die Bezeichnung der Familie der transient receptor potential Kanäle wurde durch die

Eigenschaften des zuerst entdeckten Kanals geprägt. Dieser vermittelte im Auge von Drosophila

melanogaster eine transiente Antwort auf einen Lichtstimulus (Minke et al., 1975; Montell et al.,

1985). TRP-Kanäle gibt es in vielen Organismen, von Hefen über Würmern, Taufliegen und auch in

Säugern wie Mäusen und Primaten inklusive dem Menschen (Venkatachalam und Montell, 2007).

Die Kanäle werden in sieben Subfamilien eingeteilt, von denen sechs auch bei Mäusen und

Menschen vorkommen. Beim Menschen werden 27 Kanäle unterschieden. Es gibt sieben

Mitglieder der „klassischen“ TRPC- (canonical) Familie, sechs in der TRPV- (vanilloid), acht in der

TRPM- (melastatin), TRPA1 (ankyrin-repeat), drei TRPML- (mucolipin) und drei in der TRPP-

(polycystic kidney disease-related protein) Familie (Clapham, 2003; Abb. 1.3).

10

Einleitung

Eine TRP-Kanaluntereinheit beinhaltet sechs Transmembrandomänen und eine Poren bildende

Schlaufe zwischen den Domänen 5 und 6. Beide Termini liegen auf der zytoplasmatischen Seite

(Ramsey et al., 2006). Vier Untereinheiten bilden ein funktionelles Kanalprotein (Moiseenkova-

Bell et al., 2008), welches als Homo- und Heteromer gebildet sein kann (Clapham, 2003). Die TRP-

Domäne, ein weiteres Merkmal von Kanälen der TRPC und M-Subfamilien, ist eine sehr

konservierte hydrophobe Region C-terminal der 6. Transmembrandomäne, die aus 23-25

Aminosäuren besteht (Montell et al., 2002). Obwohl die Funktion der TRP-Box weitgehend unklar

ist, haben Rohacs et al. (2005) herausgefunden, dass phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)

an diese Region binden kann und so modulierend auf den Kanal wirken könnte. Die N-terminalen

Enden insbesondere von TRPA1, aber auch bei den Subfamilien TRPV und TRPC beinhalten

Ankyrinsequenzen, die als Proteininteraktionssequenz vor allem auch der Verankerung am

Zytoskelett dienen (Kohl et al., 2003). TRP-Kanäle sind kationenselektiv, einige wie TRPV1

insbesondere für Ca2+- und Mg2+-Ionen, V5 und V6 ausschließlich für Ca2+-Ionen (Caterina et al.,

1997; Montell, 2001; Venkatachalam und Montell, 2007).

Abbildung 1.3: TRP-Kanaluntereinheiten verschiedener Subfamilien. Ankyrinsequenzen (A) sind grün, coiled coil-Domäne (cc) ist rosa dargestellt. Verändert nach Montell (2005).

Thermo-TRP-Kanäle

Die TRP-Kanäle, die im Trigeminus insbesondere exprimiert sind, dienen unter anderem als Sensor

für Temperatur. Zu den Thermo-TRP-Kanälen gehören TRPV1-4, TRPM8 und TRPA1 (Patapoutian

et al., 2003). TRPV3 und V4 werden aktiviert durch Wärme im Temperaturbereich von 33-40°C

(V3; Peier et al., 2002b; Smith et al., 2002; Xu et al., 2002) und 25-34°C (V4; Guler et al., 2002;

Watanabe et al., 2002b). Durch Hitze ab einer Temperatur von 43°C werden TRPV1 (Caterina et

al., 1997) und ab 52°C TRPV2 (Caterina et al., 1999) aktiviert. Durch niedrige Temperaturen

unterhalb von 25°C wird TRPM8 (McKemy et al., 2002; Peier et al., 2002a) unterhalb von 17°C

wird TRPA1 (Karashima et al., 2009; Sawada et al., 2007; Story et al., 2003) aktiviert.

11

Einleitung

Die genannten Kanäle sind jedoch durch multiple Reizmodi aktivierbar. So ist beispielsweise

TRPV4 auch als Mechanosensor bekannt (Liedtke und Friedman, 2003; Liedtke et al., 2003; Vriens

et al., 2004). Eine gemeinsame Eigenschaft der Thermo-TRP-Kanäle ist jedoch, dass sie auch durch

chemische Stimuli aktivierbar sind (Venkatachalam und Montell, 2007). Oft sind es

Pflanzeninhaltsstoffe, die als Agonisten wirken. Capsaicin, die Substanz, die Schärfe von Chili-

Schoten auslöst, ist ein bekanntes Beispiel für einen TRPV1-Agonisten (Caterina et al., 1997).

TRPV2 wird durch Inhaltsstoffe der Hanfpflanze (Cannabis sativa), wie Cannabidiol und

Tetrahydrocannabinol, aktiviert (Qin et al., 2008). Für TRPV3 wurden die Terpenoide Thymol und

Carvacrol (Vogt-Eisele et al., 2007), insbesondere aus dem Echten Thymian (Thymus vulgaris) und

für TRPV4 Phorbolester, aus dem Milchsaft einiger Wolfsmilchgewächse (Watanabe et al., 2002a)

als Agonisten bekannt. Menthol aus verschiedenen Minzpflanzen aktiviert TRPM8 (Peier et al.,

2002a) und weniger stark auch TRPV3 (Macpherson et al., 2006). Allylisothiocyanat, die Schärfe

gebende Substanz aus dem Schwarzen Senf (Brassica nigra), aktiviert TRPA1 (Jordt et al., 2004).

Die Aktivierung der genannten Kanäle durch einen chemischen Reiz vermittelt ein Signal, das wie

ein thermischer Reiz in einem Temperatureindruck resultiert. Die Wahrnehmung von Hitze und

starker Kälte ist mit einem schmerzhaften Eindruck verbunden. Die Aktivierung der

entsprechenden Thermosensoren wie TRPV1 für Hitze und TRPA1 für Kälte mittels eines

chemischen Agonisten geht dementsprechend mit Empfindungen wie „brennend“ bei Aufnahme

von Chili und „stechend“ bei Aufnahme von Senf einher (Caterina et al., 1997; Jordt et al., 2004).

Es sind zahlreiche weitere Substanzen, sowohl Natur- als auch synthetische Stoffe bekannt, die

durch eine Wirkung auf Thermo-TRP-Kanäle eine trigeminale Empfindung hervorrufen (Viana,

2011).

1.4 Nikotin

Nikotin gehört zu den Suchtmitteln, deren Genuss eine sehr große weltweite Verbreitung

erfahren hat. Es gibt weltweit ein bis zwei Milliarden Tabak-Raucher. Durch den Genuss von

Nikotin in Form von Tabakkonsum sterben durch damit verbundene Krankheitsbilder etwa 5

Millionen Menschen pro Jahr (Hatsukami et al., 2008). Das Pflanzenalkaloid Nikotin ist ein

sekundärer Pflanzeninhaltsstoff insbesondere der Gattung der Tabakpflanzen (Nicotiana spec.)

und dient diesen als Fraßschutz gegen Herbivoren (Ames, 1983; Davis et al., 1991; Kuhn, 1964). Da

das Molekül ein stereogenes Zentrum besitzt, existiert Nikotin in zwei Stereoisomeren (Barlow

und Hamilton, 1965; Pictet und Rotschy, 1900; Abb. 1.4).

12

Einleitung

Abbildung 1.4: Strukturformel beider Nikotin-Enantiomere. Links: (-)-Nikotin; rechts: (+)-Nikotin. Das

markierte C-Atom (*) ist das stereogene Zentrum.

Das (-)-Enantiomer wird von Pflanzen bei Weitem häufiger synthetisiert als die (+)-Isoform

(Armstrong et al., 1998; Perfetti and Coleman, 1998; Perfetti et al., 1998). Der Anteil des (+)-

Enantiomers an der Nikotingesamtmenge liegt im Rohtabak nur bei etwa 1%, jedoch findet

während der Pyrolyse im Verbrennnungsprozess eine Razemisierung statt, bei der sich der Gehalt

von (+)-Nikotin auf 2-3% erhöht (Baker und Bishop, 2004; Clayton et al., 2010). Bei Tabakkonsum

wird Nikotin über die Schleimhaut von Nase, Mund und Lunge aufgenommen und gelangt in die

Blutbahn.

Es sind bisher verschiedene Rezeptorproteine für Nikotin bekannt. Nikotinische Acetylcholin-

rezeptoren und TRPA1 werden durch Nikotin aktiviert, TRPV1 positiv moduliert und 5-HT3- und

spannungsgesteuerte Natriumkanäle sowie IH-Kanäle geblockt.

Die Wirkung von Nikotin im Zentralnervensystem ist seit geraumer Zeit erforscht (Aceto und

Martin, 1982; Domino, 1998; Rand, 1989; Zevin et al., 1998). Die maßgeblichen Rezeptoren, die

diese Wirkung vermitteln, sind nikotinische Acetylcholinrezeptoren (Dani und Bertrand, 2007;

Laviolette und van der Kooy, 2004). Griguoli et al. (2010) fanden ferner an Zellen des

Hippocampus der Maus heraus, dass Nikotin außerdem hyperpolarisationsaktivierte

IH-Kanäle inhibiert.

Die Wirkung von Nikotin auf chemosensorische Systeme hingegen ist bisher noch nicht

erschöpfend untersucht worden, wobei sich hierbei Ergebnisse mehren, die neben der Beteiligung

von nAChR auf eine größere Vielfalt verschiedener Rezeptoren deuten. In Abhängigkeit von der

Konzentration kann Nikotin verschiedene chemosensorische Eindrücke vermitteln. Beide

Enantiomere können sowohl das olfaktorische als auch das trigeminale System aktivieren

(Hummel et al., 1992a; Hummel et al., 1992b; Thuerauf et al., 2006). In niedrigen Konzentrationen

ruft Nikotin einen Geruchseindruck, in höheren Konzentrationen zudem sowohl brennende als

auch stechende Eindrücke hervor (Thuerauf et al., 1999; Walker et al., 1996). Aus einer Arbeit von

Thuerauf et al. (2006) geht hervor, dass trigeminale Chemorezeption in der Nase mit dem nAChR

Antagonisten Mecamylamin inhibiert werden kann. Der von Nikotin hervorgerufene

13

Einleitung

Geruchseindruck wird dadurch jedoch nicht verhindert und demnach nicht mit Beteiligung von

nAChR vermittelt. Die Autoren vermuten deshalb, dass olfaktorische Rezeptoren für die

Wahrnehmung niedriger Konzentrationen von Nikotin verantwortlich sind. Zudem konnte in

psychophysischen Studien festgestellt werden, dass das trigeminale System stereoselektiv auf

Nikotin reagiert (Thuerauf et al., 1999; Thuerauf et al., 2000; Walker et al., 1996). Für das (-)-

Enantiomer wurde dabei eine niedrigere Reizschwelle und stärkere subjektive Empfindungsstärke

festgestellt als für das (+)-Enantiomer. An Elektroolfaktogrammen am olfaktorischen Epithel des

Krallenfrosches wurde hingegen keine Stereoselektivität festgestellt (Thuerauf et al., 1995). Es

konnte mit dem TRPA1-Kanal von Mensch und Maus bereits ein weiterer trigeminal exprimierter

Rezeptor für (-)-Nikotin identifiziert werden (Talavera et al., 2009). Neben diesem und den nAChR

als direkt aktivierten Kanalklassen wurden mittlerweile antagonistische oder modulatorische

Wirkungen von (-)-Nikotin an einigen weiteren Ionenkanälen bekannt. Liu et al. (2004) konnten

eine positive Modulation der Capsaicin-induzierten Antworten am TRPV1-Kanal der Ratte

feststellen. Außerdem beobachteten sie eine Inhibition menschlicher Spannungsgesteuerter

Natriumkanäle, die sie als Ursache für eine analgetische Wirkung von Nikotin ansahen. Diese

Wirkung wurde beispielsweise in Schmerzvermeidungstest an Ratten festgestellt (Carstens et al.,

2001). An homomeren 5-HT3-Rezeptoren der Maus konnten Gurley und Lanthorn (1998) ferner

einen kompetitiven Antagonismus für beide Nikotin-Enantiomere feststellen. In Radioliganden-

Bindungsstudien am Gehirn der Ratte konnte eine Bindung von (-)-Nikotin an native 5-HT3-

Rezeptoren nachgewiesen werden (Drisdel et al., 2008).

Olfaktorische Rezeptoren für Nikotin wurden bisher nicht identifiziert. Die bisher bekannten

Rezeptoren, die durch Nikotin aktiviert, inhibiert oder moduliert werden können, sind nicht

ausreichend, um die Wahrnehmung von Nikotin auf zellulärer Ebene vollständig erklären zu

können.

1.5 Transkriptomanalyse

Das Transkriptom ist die Gesamtheit exprimierter RNA einer betrachteten biologischen Struktur,

wie beispielsweise eines Organs, eines Gewebetyps oder einer einzelnen Zelle. Es beinhaltet eine

Vielzahl verschiedener RNA-Klassen, von denen die mRNA mit etwa 1% den Anteil darstellt, von

dem Information bei der Translation in Proteine umgesetzt wird (He und Hannon, 2004). Da jedes

Organ, Gewebe oder jede einzelne Zelle charakteristische Transkriptome hat, die Rückschlüsse auf

die jeweilige Proteinausstattung zulassen, wurden schon seit langer Zeit Anstrengungen

unternommen, Transkriptome möglichst komplett zu analysieren, um qualitative, wie quantitative

14

Einleitung

Aussagen über die Expression der Gene treffen zu können. Dabei wurden in den letzten Jahren

technische Fortschritte insbesondere bei der DNA-Sequenziertechnik erreicht. Zu einer

Transkriptomanalyse auf diesem Wege muss die RNA des Transkriptoms, zunächst in cDNA

umgeschrieben werden. Trotzdem wird diese Sequenzierung üblicherweise als „RNA-Seq“

bezeichnet (Wang et al., 2009). Mit Hilfe der in den letzten Jahren entstandenen Techniken kann

eine wesentlich größere Anzahl von DNA-Fragmenten zu geringerem Preis sequenziert werden,

als es mit der Technik nach Sanger möglich ist. Eines dieser Verfahren, die auch unter dem Begriff

next generation sequencing zusammengefasst werden, ist das Illumina-Solexa

Sequenzierverfahren, das seinen Vorteil in einer sehr hohen Sequenzierleistung hat (bis zu 600

Gigabasen). Damit kann eine sehr große Anzahl von über 300 Millionen vergleichsweise kurzen

Fragmenten (35-150 bp) sequenziert werden (Liu et al., 2012). Das Verfahren ist in dieser Arbeit

zur Transkriptomanalyse genutzt worden.

Zunächst besteht bei dieser Technik der erste wichtige Schritt in der Generierung der „cDNA-

Library“. Dazu wird zunächst – wie erwähnt – eine cDNA-Synthese durchgeführt und entstandene

cDNA dann in Fragmente mit einer Länge von 200-300 Basenpaaren zerlegt. Einzelsträngige

Endabschnitte werden im nächsten Schritt aufgefüllt und an die Enden anschließend eine

Adaptersequenz ligiert (Abb. 1.5 A-D). An die Oberfläche der Reaktionskammer (flow cell) sind

nun Ankerfragmente gebunden, die zu den Adaptern komplementäre Sequenzen haben, sodass

im zweiten Schritt die einzelsträngigen DNA-Fragmente bei der Beschickung der Kammer an den

Ankerfragmenten haften. Um jedes Fragment wird anschließend mit der PCR-basierten

sogenannten „Bridge-Amplifizierung“ ein Cluster identischer DNA-Moleküle auf der

Reaktionsfläche der Kammer erzeugt (Abb. 1.5 E-G). Im dritten Schritt folgt die eigentliche

Sequenzierung, wobei eine Polymerase an den anhaftenden Fragmenten einen komplementären

Strang fortschreibt. Dazu sind die vier Nukleotide mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen

versehen und werden über die Kammer gespült. Das jeweils passende Nukleotid wird von der

Polymerase eingebaut. Durch einen Syntheseblock stoppt die Synthese nach dem Einbau jedes

Nukleotids und die Fluoreszenz kann gemessen werden. Nach dem Entfernen des Syntheseblocks

kann das nächste Nukleotid fortgeschrieben werden. Die Reihenfolge detektierter

Fluoreszenzfarben gibt die komplementäre Sequenz der Fragmente eines Clusters wieder (Abb.

1.5 H-K).

15

Einleitung

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung des Illumina-Solexa Sequenzierverfahrens. Verändert nach

Benutzerinformation (Illumina Genome Analyzer II Workflow, http://www.illumina.com/).

Die Funktionalität der Illumina-Solexa Sequenziertechnik ist neben Genomsequenzierungen auch

durch viele Transkriptomanalysen von Organen und Geweben, wie beispielsweise Gehirn, Muskel

und Leber, sowie Retina der Maus erfolgreich gezeigt worden (Mortazavi et al., 2008). Mittels

RNA-Sequenzierung ist bisher jedoch keine Transkriptomanalyse des trigeminalen Ganglions der

Maus durchgeführt worden. Es gibt dazu allerdings Studien auf der Basis von Microarrays.

Beispielsweise untersuchten Hill et al. (2001) mittels Microarray Expressionsunterschiede von 149

Genen unter Hitzestress- und stressfreien Bedingungen im trigeminalen Ganglion der Maus. Es

handelte sich um Gene, die an der Reaktion auf Stress beteiligt sind, jedoch nicht um

Transmembranrezeptoren. Obwohl mit Microarrays auch die Expressionsanalyse von

üblicherweise einer großen Anzahl von Genen parallel durchgeführt wird, kann hingegen mit einer

Analyse mittels RNA-Sequenzierung theoretisch das komplette Transkriptom erfasst werden. Dies

wurde von Lerch et al. (2012) bei der dem Trigeminus verwandten Struktur, den

16

Einleitung

Dorsalwurzelganglien (DRG), durchgeführt. Die oben erwähnten Einzelnachweise für die

Expression von Liganden-gesteuerten Ionen- (1.1.2, 1.2.1-1.2.3) und TRP-Kanälen (1.1.2, 1.3) im

Trigeminus eignen sich zwar nicht für einen quantitativen Vergleich mit diesen Ergebnissen,

jedoch ist in den Dorsalwurzelganglien eine ähnlich große Vielfalt an Ionenkanälen exprimiert. Die

Vielfalt exprimierter nikotinischer Acetylcholinrezeptoren ist in den DRG nach Lerch et al. (2012)

zwar geringer als im Trigeminus, jedoch scheint die Reihenfolge der Expressionsstärke ähnlich zu

sein (α3 > α7 > α4; β2 > β4). Auch in den DRG ist 5-HT3A exprimiert, 5-HT3B jedoch gemäß diesen

Ergebnissen nicht. Es werden ebenfalls weniger verschiedene GABAA-Rezeptoruntereinheiten

exprimiert (α1 >> α2 > α3; β3 >> β1 ≈ β3; γ2 > γ1 ≈ δ). Zudem sind Glycinrezeptoren (β >> α2),

TRP-Kanäle (V1 > M8 > M2 ≈ M4 > A1 > M7 > M3) und KCNK-Kanäle (3 > 12 > 2 ≈ 13 > 1 > 10 > 9 ≈

4) exprimiert. Auch Purinozeptoren und ionotrope Glutamatrezeptoren werden exprimiert. Da

das trigeminale Ganglion und die Dorsalwurzelganglien seriell homologe Strukturen sind, die auch

für ihren jeweiligen Innervationsbereich eine vergleichbare Funktion haben, ist zumindest eine

ähnliche Rezeptorausstattung zu erwarten.

Obwohl RNA-Sequenzierungen zur Transkriptomanalyse von Organen oder Gewebeverbänden

mittlerweile verbreitet sind, stellt dies auf der Ebene einzelner Zellen immer noch eine technische

Herausforderung dar. Analysen des Transkriptoms einzelner Zellen können immer dann von

Bedeutung sein, wenn man innerhalb eines Gewebes verschiedene Zellpopulationen mit sehr

heterogener Proteinausstattung erwartet. Handelt es sich um eine seltene Zellpopulation, so kann

auf herkömmlichem Weg nicht genug RNA isoliert werden, um eine ausreichende Probe für eine

RNA-Sequenzierung zu gewinnen. Einzelne Säugerzellen enthalten durchschnittlich etwa 10 pg

RNA (~ 0,1 pg mRNA; Gonzalez-Roca et al., 2010; Sambrook und Russell, 2001), für eine RNA-

Sequenzierung sind jedoch Mengen im Bereich von mehreren hundert ng bis wenigen µg

notwendig. Um diesen Anforderungen zu entsprechen, wird zur Transkriptomanalyse einzelner

Zellen ohne eine verlustreiche RNA-Aufreinigung, oftmals die cDNA-Synthese direkt im Zelllysat

vollzogen und eine anschließende Amplifikation durchgeführt. Diese kann im Wesentlichen auf

zwei verschiedenen Techniken basieren. Zum einen kann eine lineare Amplifikation mittels in-

vitro Transkription, zum anderen eine PCR-basierte exponentielle Amplifikation durchgeführt

werden (Tang et al., 2011). Da letztere größere Mengen cDNA ergeben, wurde in dieser Arbeit mit

dem „TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification System“ genau ein solches

Verfahren gewählt. Mit dieser Technik wurde bereits gezeigt, dass bei einem Einsatz von 100 pg

teilweise degradierter Gesamt-RNA bei der TransPlex Amplifikation und einer anschließenden

Analyse mittels Microarray reproduzierbar vergleichbare Expressionsmuster festgestellt werden

können wie durch quantitative PCR und ohne Amplifikation (Tomlins et al., 2006).

17

Einleitung

Gonzalez-Roca et al. (2010) konnten dies ebenfalls mit Microarrays bei einem Einsatz von zehn

Zellen bei der Amplifikation grundsätzlich bestätigen, was zeigt, dass die TransPlex Amplifikation

prinzipiell auch bei geringen Mengen eingesetzter RNA ein Amplikon erzeugen kann, das relative

Expressionsverhältnisse wiederspiegelt. In ihrer Studie haben sie jedoch auch gezeigt, dass in

Einzelfällen Expressionsunterschiede, die mittels qPCR festgestellt wurden, nach der Amplifikation

nicht erkannt werden konnten. In einer weiteren Studie konnte jedoch gezeigt werden, dass die

Kombination von PCR-basierter Amplifikation und der Transkriptomanalyse mittels next

generation sequencing das Erstellen von Expressionsprofilen aber auch auf Einzelzellebene

ermöglicht. Embryonale Stammzellen der Maus konnten mit Hilfe der Illumina Sequenziertechnik

durch die Expression von RNA für bekannte Markerproteine verschiedenen Zellpopulationen

zugeordnet werden (Islam et al., 2011).

1.6 Zielsetzung der Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der direkten oder modulatorischen Wirkung von

Nikotin auf Membranrezeptoren, die in primär afferenten chemosensorischen Neuronen des

Nervus trigeminus exprimiert werden. Die alte Erkenntnis, dass die chemosensorische

Wahrnehmung von Nikotin durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren vermittelt wird, wurde vor

einiger Zeit ergänzt durch die Feststellung, dass der TRPA1-Kanal durch Nikotin aktiviert werden

und somit an der Vermittlung des sensorischen Eindrucks von Nikotin beteiligt sein kann. Der

Mensch ist in der Lage beim olfaktorischen wie auch trigeminal vermittelten sensorischen

Eindruck zwischen (+)- und (-)-Nikotin zu unterscheiden. Die unterschiedlichen Qualitäten dieses

Eindruckes führen zu der Vermutung, dass weitere, noch unbekannte Transmembranrezeptoren

an der chemosensorischen Wahrnehmung von Nikotin beteiligt sind. Solche neuen „Targets“ für

Nikotin sollen im Rahmen dieser Arbeit gefunden werden. Die trigeminalen afferenten Neurone

weisen eine Vielfalt von Rezeptoren auf. Es sind Liganden-gesteuerte Ionenkanäle, TRP-Kanäle

sowie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren exprimiert. Unter diesen sind mit 5-HT3A und TRPV1

bereits „Targets“ bekannt, von denen eine Modulation durch (-)-Nikotin gezeigt wurde. Die

Entdeckung unbekannter modulatorischer Einflüsse von Nikotin auf Transmembranrezeptoren ist

weiteres Ziel dieser Arbeit. Eine systematische Studie, in der trigeminal exprimierte

Membranrezeptoren aus den Familien der klassischen Liganden-gesteuerten Ionenkanäle und der

TRP-Kanäle in ihrem Antwortverhalten auf Nikotin untersucht wurden, ist bisher nicht

durchgeführt worden. Um ein besseres Verständnis der physiologischen Basis der sensorischen

Wahrnehmung von Nikotin zu bekommen, soll die Wirkung des (+)- und (-)-Enantiomers auf

18

Einleitung

heterolog exprimierte humane Rezeptoren untersucht werden. Als Expressionssystem sollen

Oozyten von Xenopus laevis genutzt werden, um typische Vertreter humaner Cys-loop-

Rezeptoren, ionotroper Glutamatrezeptoren, ionotroper Purinozeptoren sowie TRP-Kanäle

verschiedener Unterfamilien zu exprimieren. Mittels der Voltage-Clamp Methode soll eine

mögliche pharmakologische Wirkung von (+)- und (-)-Nikotin auf diese Rezeptoren

elektrophysiologisch untersucht werden.

Um zunächst die Ergebnisse des ersten Projektteils zu bestätigen, soll in einem zweiten Ansatz die

Wirkung beider Nikotinenantiomere auf kultivierte trigeminale Neurone der Maus unter

Zuhilfenahme der Calcium-Imaging Technik analysiert werden. Im Weiteren sollen die bekannten

Nikotinrezeptoren nAChR und TRPA1 auf pharmakologischem Weg blockiert und persistierende

Antworten weiter untersucht werden.

Im dritten Teil dieser Arbeit sollen in einer Transkriptomanalyse die Expressionsprofile Nikotin-

responsiver Neurone miteinander verglichen werden, um Hinweise auf mögliche weitere

Rezeptoren für Nikotin zu finden. Es sollen dazu Neurone mit der erwähnten persistierenden

Nikotinantwort unter Blockerbedingungen für nAChR und TRPA1 im Calcium-Imaging identifiziert

und deren Transkriptom isoliert werden. Mittels Next-Generation Sequencing ist eine

Einzelzelltranskriptomanalyse schon mit verhältnismäßig wenigen Zellen möglich.

Membranrezeptoren, die insbesondere in Nikotin-responsiven Neuronen exprimiert sind, können

eine physiologische Bedeutung für die chemosensorische Wahrnehmung von Nikotin haben.

19

Material und Methoden

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Medien

Extrazellulär-Medium 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2,

1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4

(NaOH/HCl), 300-310 mOsmol (Glucose)

Hochkalium-Lösung 100 mM NaCl, 45 mM KCl, 2 mM CaCl2,

1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4


Ca2+-freies Extrazellulär-Medium 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,

5 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.4


ND96-Lösung 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2,

1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 100U/ml

Penicillin, 100 U/ml Streptomycin,

pH 7,2 (NaOH/HCl)

Ca2+-freie Barth-Lösung 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3,

7,5 mM Tris-HCl, 0,82 mM MgSO4, pH 7,4

Standard Barth-Lösung 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3,

7,5 mM Tris-HCl, 0,82 mM MgSO4,

0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca(NO3)2 pH 7,4

Standard Frosch-Ringer (NFR) 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2,

10 mM HEPES, pH 7,2

Mg2+ Frosch-Ringer 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM MgCl2,

10 mM HEPES, pH 7,2

Medien der Zellkultur

Leibovitz Medium (L15) Invitrogen “Dulbeccos´s Modified Eagle Medium”

(DMEM/F-12)

Invitrogen

“Minimum Essential Medium” (MEM) Invitrogen

PBS+/+ Invitrogen

“Fetal Bovine Serum” (FBS) Invitrogen

20


2.1.2 Kits

cDNA-Synthese iScript™ cDNA Synthesis Kits, Bio-Rad

Laboratories

In vitro Transkription von cRNA AmpliCap-T7 Message Maker Kit, Epicentre

Präparative DNA-Aufreinigung Pure Yield Maxiprep System, Promega PCR PCR- SYBR-Green-Mix Peglab

PCR-Aufreinigung und Gel-Extraktion QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen

Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System,

Promega

Transkriptom-Amplifikation Message Booster cDNA-synthesis from cell

lysates Kit, Epicentre

WT-Ovation One-Direct RNA-Amplification

System, NuGen

Transplex Complete WTA2 Kit, Sigma-Aldrich

RNA-Isolation RNeasy Micro-, Mini-Kit, Qiagen RNA-Aufreinigung RNA Clean & Concentrator, Zymo Research

2.1.3 Enzyme

Taq-DNA-Polymerase Invitrogen

Collagenase Typ 1 Sigma-Aldrich

Worthington Biochemical Corporation

DNase I Qiagen

Reverse Transcriptase SuperScript® III, Invitrogen

Restriktionsendonukleasen MBI Fermentas

New England Biolabs

2.1.4 Oligonukleotide

GAPDHmmfw TGTGTCCGTCGTGGATCTGA

GAPDHmmRV CCTGCTTCACCACCTTCTTGA RPL29mmfw TTGCCAAGAAGCACAACAAG

RPL29mmrv TGTCTTCACACTGGCAGGAG

BS_mmB3T-1555-fw GTCCACTTGGCTCTGTCCTC

BS_mmB3T-1646-rv CCCCCGAATATAAACACAACC

BS_mmCNPAse-2698-fw ACCCTGAGCTGGCAAGAGTA

BS_mmCNPAse-2802-rv CCAGATTCTCGGGTGACAAC

BS_mmACTB-fw AAGGTGACAGCATTGCTTCTG

BS_mmACTB-rv CCTGGGCCATTCAGAAATTA

2.1.5 DNA-Längenstandard

Für die Bestimmung der Länge von DNA-Fragmenten nach Agarosegelelektrophorese wurde der

Längenstandard „GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder“ der Firma „Fermentas - Thermo Fisher Scientific“

verwendet.

21


2.1.6 Plasmide

Vektor Insert Restriktionsenzym

zur Linearisierung

pSGEM 5-HT3A SacI

GlyR α1 PacI

GABAA α1-2, β1-3, γ2, ρ1 PacI

GluR1(Q)flop, GluK2(Q), NR1-3a,

NR2B

NheI

TRPA1 PacI

TRPV1-3 PacI

TRPM8 PacI

pcDNA3 5-HT3B SmaI

P2X2 XbaI

pCRBluntIITopo nAChR α2 XbaI

nAChR β4 NotI

pOTB7 nAChR α7 XhoI

2.1.7 Pharmakologisch wirksame Substanzen

Substanz Hersteller

2-APB (2-Aminoethoxydiphenylborat) Sigma-Aldrich

Acetylcholin Sigma-Aldrich

AITC (Allylisothiocyanat) Fluka

ATP (Adenosintriphosphat) Roche

Borneol Sigma-Aldrich

Capsaicin Calbiochem

mCPBG (m-Chlorophenylbiguanidhydrochlorid)

Tocris

Edelfosin Tocris

GABA (γ-Aminobuttersäure) Sigma-Aldrich

Gentamycin Sigma-Aldrich

Glutamat Sigma-Aldrich

Glycin Roth

HC030031 Tocris

Hexamethoniumchlorid Sigma-Aldrich

Mecamylamin Sigma-Aldrich

Menthol Henkel (-)-Nikotin Sigma-Aldrich

(+)-Nikotin Dr. Berthold Renner,

Universität Erlangen

Rutheniumrot Sigma-Aldrich

Serotonin Sigma-Aldrich

U-73122 Sigma-Aldrich

Zinkchlorid Riedel-de Haёn

22


2.1.8 Sonstige Chemikalien

Substanz Hersteller

Ethyl-3-Aminobenzoat, Sigma-Aldrich

Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich

Penicillin / Streptomycin, PAA Laboratories GmbH

Fura-2AM Invitrogen

Ethidiumbromid Serva/AppliChem

Agarose „ultra pure“ Gibco BRL Mineralöl 1:1 hoch-/niederviskos Sigma-Aldrich

SYBR Green Sigma-Aldrich

Puffer Rezeptur

TBE-Puffer 89 mM TRIS,2 mM EDTA-Na2-Salz, 89 mM

Borsäure

Laufpuffer 20% Ficoll (w/v), 100 mM EDTA,

0,025% Bromphenolblau (w/v),

0,025% Xylencyanol (w/v)

2.1.9 Verbrauchsmaterialien

Glaskapillaren, filamentiert GB 150 EFT-10 1.17 x 1.50 x 100 mm

with filament, Science Products GmbH

Glaskapillaren, ohne Filament Glass capillaries Nanoliter 2000; 3,5

inches, 1.14 ID, 0.5 mm OD, World

Precesion Instruments

Glasplättchen für Zellkultur Borosilikatdeckgläser 30 mm, Thermo

Scientific Homogenisator-Röhrchen Precellys-Keramik Kit, 1,4 mm PeqLab

Nahtmaterial MonoPlus®, resorbierbar, B. Braun

Aesculap

Pasteurpipetten Brand

PCR-Platte (96-wells) Thermo Scientific

PCR-Gefäße Low profil Thermo Strip, Thermo

Scientific

Reaktionsgefäße 15 / 50 ml, Sarstedt,

1,5 / 2 ml, Bio-Rad,

DNA LoBind® tube, Eppendorf Sterilfilter Schleicher & Schüll

Zellsieb 70 µm Cell Strainer, BD Falcon

Zellkulturplatten, 24-well plates Tissue culture testplates, gamma

sterilized, Orange Scientific

Zellkulturschälchen, 35 mm Sarstedt

23


2.1.10 Versuchstiere

Weibliche Frösche der Art Xenopus laevis wurden von der Firma „Xenopus Express France“

bezogen.

Zudem wurden frisch präparierte Xenopus laevis Oozyten von der Firma „EcoCyte Bioscience“

verwendet.

Alle verwendeten Mäuse entstammen der Zuchtlinie „Crl:CD1(ICR)“ und wurden von „Charles

River Laboratories“ bezogen.

2.1.11 Geräte

Analog-digitale Schnittstelle HEKA LIH 1600

Analysenwaage Sartorius

Applikationssystem 7-in-1 System aus lehrstuhleigener

Entwicklung

Automatische Pipette Eppendorf Research Pro

Brutschränke Heraeus Kelvitron K

Thermo Scientific Hera Cell 150

CCD-Kamera Zeiss Photometrics, Axiocam MRM Dyn Mag-Spin Invitrogen

Fluoreszenzlampe Lambda DG4 Sutter

Instrument Company

Geldokumentationsanlage Biozym Multiimage Light Cabinet

Gewebe-Homogenisator Bertin PreCellys 24

Kondensor Voltacraft

Magnetventile Lee Company 3-Way Ventil

Mikromanipulatoren Narishige Japan

Merzheuser

Monochromator T.I.L.L. Photonics Nanoinjektor WPI Nanoliter 2000 + Micro 4 Syringe

Pump Controler

Objektiv UplanApo (20x/0.75) Olympus

Photometer Peqlab ND-1000

Shutter Driver Uniblitz Vmm-D1

Stereomikroskop Zeiss Axiovert 200

Thermocycler Eppendorf realplex2 epgradient S

Tischheizblock Eppendorf Thermomixer comfort

Tischzentrifuge Eppendorf Mini-Spin Plus Vertikales Elektrodenziehgerät List Medical LM-2P-a

Voltage-Clamp Verstärker NPI Electronic Instruments Turbo Tec-03

Warmluftschüttler B. Braun Biotech international Centromat

Zentrifuge Sorvall RC 6+

24


2.1.12 Software

Elektrophysiologische Daten wurden mit dem Programm „Pulse“ der Firma „HEKA“ aufgezeichnet

und ausgewertet. Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden mit der 3-Parameter Hill Gleichung in

dem Programm „SigmaPlot“ (Systat Software Inc.) berechnet.

Die Aufzeichnung der Daten im Calcium-Imaging wurde mit dem Programm „SlideBook“ (3I

Imaging) geleistet. Zur Auswertung wurde die Software „IGOR Pro“ (WaveMetrics) herangezogen.

Analysen einzelner Nukleinsäuresequenzen wurden mit den Programmen „EditSeq, MapDraw und

SeqMan“ (DNA-Star) durchgeführt.

Für die Transkriptomanalyse wurden die Programme

- „TopHat” (Trapnell et al., 2009),

- „Cufflinks“ und „CuffDiff“ (Trapnell et al., 2010)

benutzt, die am “Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University”, den “Departments of

Mathematics“ und “Molecular and Cell Biology, University of California” und dem “Department of

Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University” entwickelt worden sind.

Für statistische Auswertungen wurde „MS Excel“ (Microsoft), für graphische Darstellungen „Corel

Draw X4“ (Corel Corporation) benutzt.

2.2 Methoden

2.2.1 Entnahme von Oozyten aus Xenopus laevis

Zur Vorbereitung der Operation wurden die Frösche zunächst in einer 1%-igen 3-Ethyl-3-

Aminobenzoat-Lösung (in NFR, Sigma-Aldrich) narkotisiert. Nach völliger Erschlaffung der

Muskulatur wurde das Tier auf Eis gelagert, bedeckt und für 30 Minuten dort belassen, sodass der

Stoffwechsel stark verlangsamte. Die eigentliche Operation fand ebenfalls auf Eis statt. Es wurde

hierzu lediglich die Bauchseite des Frosches mit dem Operationsbereich vom Eis befreit. Haut und

Muskelschicht wurden ventral etwa 1,5 cm bis 3 cm lateral der Medianlinie und etwa 2 cm cranial

der Hautfalte, zwischen Abdomen und Oberschenkel über eine Länge von circa 0,5 cm bis 1 cm

eingeschnitten. Dadurch wurde der Bauchraum eröffnet und der Ovariallappen wurde

entnommen.

25


Dieser wurde in Ca2+-freie Barth-Lösung überführt und anschließend wurden die

Bauchmuskelschicht sowie die Haut separat vernäht um die Öffnung der Bauchhöhle zu

verschließen. Nach ca. zwei bis vier Stunden Quarantäne wurden die Tiere wieder in die

Tierhaltung verbracht.

2.2.2 Aufbereitung der Oozyten und Injektion der RNA

In den entnommenen Ovariallappen kommen neben den Oozyten weitere Zelltypen vor, die die

Oozyten umgeben und den Gewebsverband des Ovariums bilden. Es handelt sich dabei in erster

Linie um Bindegewebe, Blutgefäße sowie Follikelzellen, die jede einzelne Oozyte umhüllen.

Insbesondere die Follikelschicht beeinflusst elektrophysiologische Messungen wegen der

Expression endogener K+-Kanäle und isoliert zudem die Zellmembran der Oozyte von applizierten

pharmakologisch wirksamen Substanzen (Arellano et al., 1996; Miledi und Woodward, 1989a; b).

Um diese umgebenden Zellschichten zu entfernen, wurden die Ovariallappen für 1,5 bis 2

Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln mit 0,02% Collagenase I in Ca2+-freier

Barth-Lösung behandelt. Nach erfolgter Defollikulierung wurde die Collagenase schrittweise durch

Barth-Lösungen mit aufsteigenden Ca2+-Konzentrationen ausgewaschen. Dadurch wurden die

Oozyten schonend in Ca2+-haltige Standard Barth-Lösung überführt und im Brutschrank bei 17°C

gelagert.

Etwa nach 24 Stunden nach der enzymatischen Dissoziierung der Oozyten erfolgte die Injektion

von cRNA zur Expression der zu untersuchenden Transmembranproteine. Dazu wurden äußerlich

einwandfreie Oozyten der Stadien IV, V und VI (Dumont, 1972) ausgewählt und in eine

Kulturschale mit eingefügtem Plastik-Gitternetz (0,7 x 0,7 mm Maschengröße) überführt, welches

die Oozyten für die Injektion ausreichend fixierte. Die cRNA wurde mit einem Nanoliter-

Injektionsgerät (WPI Nanoliter 2000 + Micro 4 Syringe Pump Controler) Mikromanipulator-

gesteuert (Merzheuser) über eine Glaskapillare in die Oozyten injiziert. Die dafür notwendigen

Glaspipetten (ohne Filament) wurden mit einem Vertikalelektrodenziehgerät (List Medical LM-2P-

a) zu einer feinen Spitze ausgezogen und durch Abschneiden manuell geöffnet. Die Glaspipette

wurde mit Mineralöl (Sigma-Aldrich) befüllt und mit Hilfe des Injektors wurden 1 – 2 µl cRNA

aufgezogen. Pro Oozyte wurden etwa 10–30 ng cRNA injiziert. Die Oozyten wurden nach der

Injektion in 1 ml antibiotikahaltige ND96-Lösung (Penicillin/Streptomycin, je 100 U/ml) überführt

und bei 18°C in 24-well Zellkulturplatten (Tissue culture testplates, gamma sterilized, Orange

Scientific) gelagert. Die Expression spezifischer Transmembranproteine wurde nach etwa 2-5

Tagen mit dem Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp Verfahren funktionell überprüft.

26


2.2.3 Die Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp Technik

Mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp Methode lassen sich in Oozyten exprimierte

Transmembranproteine elektrophysiologisch untersuchen. Gemäß dem Ohmschen Gesetz (U = R x

I) steigt an einer Zellmembran der über die Membran fließende Strom (I) bei konstanter Spannung

(U) mit sinkendem elektrischem Widerstand (R). Im Allgemeinen wird die elektrische Leitfähigkeit

an Zellmembranen im Bereich der gewählten Klemmspannungen von -40 - -80 mV maßgeblich

durch die Ionenleitfähigkeit von Transmembranproteinen vorgegeben. In Xenopus laevis Oozyten

sind dies nach der cRNA-Injektion vorwiegend heterolog exprimierte Ionenkanäle. Werden diese

Kanäle aktiviert, so verringert sich der Widerstand der Membran. Dadurch ändert sich der über

die Membran fließende Strom und führt zu einer Änderung der Membranspannung. Bei dem

Verfahren der Spannungsklemme wird über einen elektrischen Regelkreis das Potential an der

Membran auf einen konstanten Wert eingestellt und gehalten (-40 - -80 mV). Es werden dazu

zwei Elektroden, eine Strom- und eine Spannungselektrode in die Oozyte eingestochen. Die

Spannungselektrode dient zur Messung der an der Membran anliegenden Spannung, wobei eine

extrazelluläre Badelektrode als Referenz dient. Die Stromelektrode liefert genau die Menge

Strom, die zur Aufrechterhaltung des eingestellten Potentials an der Membran notwendig ist.

Dieser Haltestrom ist proportional zu der über die Membran fließenden Ladung, welche durch

Ionenkanalöffnung hervorgerufen wird. Dieser Regelkreis wird mit Hilfe eines Voltage-Clamp

Verstärkers (Turbo Tec-03, NPI Electronic Instruments) gesteuert und die Änderung des

Haltestroms als Maß für die Kanalöffnung wird über eine analog-digitale Schnittstelle (HEKA LIH

1600) mit dem Programm Pulse (HEKA) aufgezeichnet (Abb. 2.1).

27


Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Voltage-Clamp Messaufbaus. EI=intrazelluläres

Potential, ER=Referenzpotential, UM=Messspannung, UH=Haltespannung, IK=Kompensationsstrom,

EE=Erdpotential

Die Oozyten wurden während der Messung in eine spezielle Messkammer gelegt. Um ein

ungewolltes Bewegen der Oozyte während der Messung zu vermeiden, wurde diese in einer

Vertiefung fixiert. Zwischen den Applikationen pharmakologisch wirksamer Substanzen wurde die

Oozyte mit NFR oder Mg2+-Frosch Ringer gespült, um diese zu entfernen. Pro Applikation wurden

in der Regel 100 µl Testlösung mit einer automatischen Pipette (Eppendorf Research Pro) für eine

Dauer von 20 s appliziert und ein Stromverlauf von meist zwei Minuten aufgezeichnet. Die für die

Erstellung von Konzentrations-Wirkungsbeziehungen notwendigen Applikationen verschiedener

Substanzkonzentrationen wurden stets in aufsteigender Konzentrationsfolge vorgenommen. Für

die Aufzeichnung von Strom-Spannungsbeziehungen wurde mit dem Programm „Pulse“ eine

Spannungsrampe (-150 bis +50 mV) aufgezeichnet. Die Messung der Amplituden erfolgte mit

„Pulse“, die graphische Darstellung von Stromspuren mit „Corel Draw“ (X4, Corel Corporation).

Eine Prüfung auf statistische Signifikanz wurde mit dem Student’s t-Test (MS Excel) durchgeführt,

wobei p < 0,05 als Signifikanzlevel gewählt wurde. Konzentrations-Wirkungs-Kurven und

halbmaximale Agonisten-konzentrationen (EC50) wurden durch „SigmaPlot“ (Systat Software Inc.)

mit Hilfe der 3 Parameter Hill Gleichung berechnet.

28


2.2.4 Trigeminus-Primärzellkultur

Trigeminale Neurone wurden aus dem Ganglion gasseri zwei bis fünf Tage alter Mäuse (P2-P5)

präpariert. Dazu wurden die Mäuse dekapitiert, die Kopfhaut sagittal eingeschnitten, entfernt und

der kaum ossifizierte Schädel horizontal von occipital nach frontal eröffnet. Nach dem Entfernen

des Gehirns konnten beide trigeminalen Ganglien der Schädelbasis entnommen, in Phosphat

gepufferter Salzlösung (PBS+/+, Invitrogen) gewaschen und in eisgekühltes Leibovitz Medium (L15,

Invitrogen) überführt werden. Die gesammelten Ganglien wurden anschließend in 2 ml Minimum

Essential Medium (MEM, Invitrogen) und 0.025% Collagenase (T-1A, Sigma-Aldrich) für 45

Minuten in einen Brutschrank bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 6% CO2 inkubiert, um den

Gewebsverband enzymatisch zu dissoziieren. Im Anschluss erfolgte eine mechanische Trituration

mit einer feuerpolierten Pasteurpipette (Brand). Die Zellsuspension wurde dann durch ein Zellsieb

mit 70 µM Maschenweite (BD Falcon) gegeben, um eventuelle nicht vollständig dissoziierte

Gewebeteile aus der Suspension zu entfernen. Anschließend wurde die Suspension für vier

Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und das erhaltene Zellpellet im

Kulturmedium (Dulbeccos´s Modified Eagle Medium (DMEM/F12, Invitrogen), 10% fötales

Kälberserum (FBS, Invitrogen), 1% Penicillin/Streptomycin (PAA Laboratories GmbH)

resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) beschichtete 30 mm

Deckgläschen in 35 mm Zellkulturschalen mit etwa 50 µl Suspension pro Deckgläschen

aufgetragen. Die Kulturschalen wurden dann zunächst für eine Stunde in den Brutschrank bei

37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 6% CO2 verbracht, um den Zellen zu ermöglichen, in der

Suspension abzusinken und der Beschichtung anzuhaften. Im Anschluss wurden die

Zellkulturschalen mit 2 ml Kulturmedium aufgefüllt und für mindestens vier Stunden, maximal vier

Tage bis zum Gebrauch im Brutschrank unter vorher genannten Bedingungen gelagert.

2.2.5 Die Calcium-Imaging Methode

Der Fluoreszenzfarbstoff „Fura-2/AM“ (Invitrogen) dient im Calcium-Imaging als Reporter-

Farbstoff für die intrazelluläre Calcium-Konzentration. Bei einer Bindung von Ca2+-Ionen an den

Farbstoff kommt es zu einer Konformationsänderung des Moleküls, die eine Verschiebung des

elektromagnetischen Absorptionsspektrums bewirkt. Das Ca2+-gesättigte Molekül hat ein

Absorptionsmaximum bei 340 nm Wellenlänge, freies „Fura-2/AM“ hingegen bei 380 nm. Bei

einer Messung im Calcium-Imaging wird ein mit „Fura-2/AM“ beladene Zelle mit Licht beider

Wellenlängen hintereinander angeregt. Die Mit Hilfe der Emissionswellenlänge von 510 nm

werden die Fluoreszenzintensitäten (f) gemessen und der Quotient (f340/f380), der ein Maß der

29


intrazellulären Calcium-Konzentration ist, aus diesen beiden gebildet. Zelluläre

Signaltransduktionen in deren Verlauf es zu Ca2+-Konzentrationsänderung kommt, können durch

die resultierende Fluoreszenzveränderung untersucht werden.

Zur Beladung wurden die Zellen der trigeminale Zellkultur mit 3 µM des Farbstoffes für 45-60

Minuten vor dem Experiment im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die

Deckgläschen den Kulturschalen entnommen, in eine Messkammer aus rostfreiem Edelstahl

gelegt und diese mit Extrazellulär-Medium befüllt. Die Messungen wurden mit einem inversen

Stereomikroskop (Zeiss Axiovert 200) und einem 20-fach Objektiv (UplanApo 20x/0.75, Olympus)

durchgeführt. Die Zellen wurden bei einer Frequenz von 1 Hz für 100-200 ms bei 340 und 380 nm

Wellenlänge angeregt (Lambda DG4 Fluoreszenzlampe, Sutter Instrument Company, Uniblitz

Vmm-D1 Shutter Driver und Voltakraft Kondensor). Emittiertes Licht wurde bei 510 nm

Wellenlänge mit einer CCD-Kamera („charge-coupled device“, Zeiss Photometrics Axiocam MRM)

registriert und mit dem Programm „SlideBook“ (3I Imaging) aufgezeichnet. Die Auswertung

erfolgte mit „IGOR Pro“ (WaveMetrics), graphische Darstellung mit „Corel Draw X4“( Corel

Corporation).

Während des Experimentes wurde durch Flüssigkeitszufuhr und -absaugung ein permanenter

Austausch des Extrazellulär-Mediums in der Messkammer gewährleistet. Zudem wurde mittels

eines eigens entwickelten Applikationssystems, bei dem sieben separate Bevorratungsgefäße in

einen Applikationskopf münden, ein konstanter Flüssigkeitsstrom von Extrazellulär-Medium

angelegt, der bei gleicher Strömungsgeschwindigkeit übergangslos gegen die zu applizierende

Testlösung umgeschaltet werden konnte. Am Ende jeden Experiments wurde für 5 s Hochkalium-

Lösung appliziert, um gemessene Zellen als vitale Neurone zu verifizieren und somit von Gliazellen

unterscheiden zu können.

2.2.6 Isolation einzelner Neurone aus trigeminaler Zellkultur

Um die Rezeptortranskripte der zuvor im Calcium-Imaging charakterisierten trigeminalen Neurone

zu untersuchen, musste die identifizierten Zellen einzeln aus der Kultur herausgelöst werden. Für

diesen Zweck wurde ein Mikromanipulator gesteuertes (Merzheuser sowie Narishige Japan)

Nanoliter-Injektionsgerät (WPI Nanoliter 2000 + Micro 4 Syringe Pump Controler) benutzt,

welches für Aufnahme und Abgabe von Volumina im Nanoliterbereich geeignet ist. Um einzelne

Neurone aus dem Zellverband herauszulösen wurde das Gerät mit einer ölbefüllten Glaspipette

(ohne Filament, Glass capillaries Nanoliter 2000; 3,5 inches, 1.14 ID, 0.5 mm OD, World Precision

Instruments) bestückt, die zuvor mit einem Vertikalelektrodenziehgerät (List Medical LM-2P-a) zu

30


einer feinen Spitze ausgezogen wurde. Unter optischer Kontrolle mit Hilfe eines optischen

Eichgitters (100 µM Gitterweite, Neubauer-Zählkammer) wurde der Spitzendurchmesser auf 30-

60 µm eingestellt und anschließend feuerpoliert.

Vitale Neurone in der trigeminalen Zellkultur vernetzen sich in der Regel über zelluläre Ausläufer

mit den nächstgelegenen Zellen. Durch gezieltes Ansteuern und Aufsetzen der Pipettenspitze auf

das Zellkulturgläschen wurden zu isolierende Zellen zunächst vereinzelt, anschließend vom Glas

gelöst und mit 5 nl Extrazellulär-Lösung aufgesaugt. Dabei konnte eine Verunreinigung der Probe

durch benachbarte Zellen oder deren Fragmente durch dieses geringe Aufnahmevolumen

zuverlässig verhindert werden. Die aufgenommene Zelle wurde im Anschluss in ein

Reaktionsgefäß (0,5 ml, DNA LoBind® Tube, Eppendorf) mit RNA-stabilisierendem Lysis-Puffer zur

Transkriptom-Amplifikation überführt und bei -80°C bis zur Amplifikation gelagert.

2.2.7 Molekularbiologische Methoden

2.2.7.1 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)

Die PCR oder polymerase chain reaction ist eine Methode, mit der sich Teile einer DNA-Matrize –

auch Template genannt – vervielfältigen und damit nachweisen lassen können (Saiki et al., 1988).

Die Vervielfältigung wird dabei mit einer DNA-Polymerase erreicht, die entlang eines DNA-

Einzelstranges einen komplementären Strang aus freien Nukleotiden neu synthetisiert. Das Enzym

braucht dabei jedoch einen kurzen doppelsträngigen Abschnitt, um an die DNA-Matrize binden zu

können. Zu diesem Zweck werden künstlich erzeugte Oligonukleotide (engl. Primer) mit einer

Länge von 20-25 Basenpaaren verwendet, die jeweils an die 5‘-Enden beider komplementärer

Stränge des zu amplifizierenden Abschnittes spezifisch binden. Dieser Vorgang wird als Annealing

bezeichnet und kann sich bedingt durch die Oligonukleotidsequenz in seinem

Temperaturoptimum beträchtlich unterscheiden. Nach diesem Schritt folgt die Elongation, wobei

die Polymerase das Template in 3‘-Richtung fortschreibt. Dieser Schritt erfolgt am

Temperaturoptimum des Enzyms, was in der Regel 72°C beträgt. Im Anschluss folgt die

Denaturierung, wobei die Temperatur bis auf 94°C erhöht wird und der Doppelstrang wieder in

zwei Einzelstränge zerfällt. Da die auf diese Weise entstanden Stränge jeweils wieder als Matrize

dienen, kann der Vorgang in vielen Zyklen (Annealing, Elongation, Denaturierung) wiederholt

werden und so die Molekülanzahl des zu amplifizierenden Fragmentes exponentiell erhöht

werden.

Im Rahmen einer quantitativen PCR (realtime qPCR) wird diese exponentielle Erhöhung während

der Entstehung doppelsträngigen Amplifikats in der Elongation quantitativ erfasst. Dazu wird ein

31


Fluoreszenzfarbstoff (SYBR Green, Sigma-Aldrich) zum Reaktionsansatz gegeben, der in

doppelsträngige DNA interkaliert, was zu einem Anstieg an Fluoreszenz führt. Im Laufe der qPCR

gibt es einen Zeitpunkt ab dem die spezifische Fluoreszenz der Probe erstmalig über die Intensität

der Hintergrundfluoreszenz steigt und fortan in steilem exponentiellem Verlauf anwächst. Die

Anzahl der PCR-Zyklen, die in diesem Zeitpunkt bereits stattgefunden hat, wird bei einer qPCR als

CT-Wert (cycle treshold) bezeichnet und ist ein relatives Maß für die eingesetzte Anzahl von DNA-

Matrizen. Je mehr zu Anfang eingesetzt wurde, desto eher ist der cycle treshold erreicht; ein

niedriger CT-Wert bedeutet also eine hohe Anzahl eingesetzter Matrizen.

Jede Reaktion wurde aus demselben Ansatz in drei separaten Gefäßen (als Triplet) mit je 25 µl

Reaktionsansatz durchgeführt.

Dabei beinhaltete jeder Ansatz von 75 µl Gesamtvolumen:

37,5 μl SYBR Green Mix (Peqlab)

1,7 μl Template (20 ng)

1,7 μl forward-Primer (17 pmol)

1,7 μl reverse-Primer (17 pmol)

32,4 μl A.dest.

Das Standardprotokoll einer qPCR:

1. 95°C für 3 min, initiale Denaturierung

2. 95°C 45 s, Denaturierung im Zyklus

60-65°C 45 s, Annealing im Zyklus

72°C 1 Minute, Elongation im Zyklus

Es wurden 40 Zyklen je PCR durchgeführt.

3. 72°C 2 Minuten, terminale Elongation

4. 95°C 15 s, Temperaturrampe über 20 Minuten von 60°C bis 95°C, Schmelzkurve

5. 12°C dauerhaft, Stopp der PCR.

Die nach der terminalen Elongation durchgeführte Schmelzkurve diente einer Überprüfung der

Spezifität der durchgeführten Reaktion. Bei Amplifikaten verschiedener Sequenz setzt die

Denaturierung bei unterschiedlichen Temperaturen ein. Die Denaturierung setzt gebundenen

Fluoreszenzfarbstoff wieder frei, was bei einer spezifischen Temperatur zu punktuell starkem

quantifizierbarem Absinken der Fluoreszenz führt. Das benutzte PCR-Gerät (Thermocycler

Eppendorf realplex2) berechnet CT-Werte und spezifische Schmelztemperaturen automatisch.

32


2.2.7.2 Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung der DNA erfolgte unter Standardbedingungen in einem etwa 0,5-1,0%-igem

Agarosegel (Sambrook et al., 1989). Die fotografische Dokumentation erfolgte mit dem

„MultiImage Light Cabinet“ (Biozym).

2.2.7.3 Transformation

Um Fremd-DNA in Form eines Plasmids zu vervielfältigen, wurden Bakterien (E. coli XL1-Blue,

Stratagene) mit abgewandelter Rubidium-Chlorid-Methode nach Hanahan und Meselson (1983)

chemisch transformiert.

2.2.7.4 Anzucht von Bakterien

Transformierte Bakterien wurden in Abhängigkeit von der Plasmid-vermittelten

Antibiotikaresistenz auf Kanamycin- oder Ampicillin-haltigen (jeweils 100 mg/ml, PAA)

Agarplatten über Nacht bei 37°C im Brutschrank (Heraeus) angezogen (Sambrook et al., 1989).

Bakterien einer Einzelkolonie wurden in 200 ml LB-Medium ebenfalls mit entsprechendem

Antibiotikum über Nacht bei 37°C und 250 rpm im Warmluftschüttler (B. Braun) vermehrt.

2.2.7.5 Präparative DNA-Aufreinigung

Mit Hilfe des “Pure Yield Maxiprep Systems” (Promega) wurde die Plasmid-DNA aus den

Bakterienkulturen (siehe 2.2.7.4) nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isoliert (Birnboim und

Doly, 1979).

2.2.7.6 Ethanol/Natriumacetat-Fällung

Die Aufreinigung und Ankonzentrierung der DNA wurde mittels Ethanol/Natriumacetat-Fällung

durchgeführt. Bei dieser Methode macht man sich zu Nutze, dass Nukleinsäuren in Salzlösungen

unter Zugabe von Ethanol oder Isopropanol auszufallen. Dafür wurden der Probe 0,1 Volumina

3 M Natriumacetat und 0,7 Volumina Isopropanol hinzugefügt, der Ansatz für 30 Minuten bei -

20°C inkubiert und im Anschluss 10 Minuten mit 13.000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Mini-Spin

Plus). Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Dem Pellet wurden 400 µl Ethanol (70

%) zugegeben, und die Probe erneut für 20 Minuten mit 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand

wurde abgenommen und verworfen, das Pellet für fünf Minuten bei Raumtemperatur und

33


offenem Laborgefäß belassen, um restliches Ethanol zu entfernen (Evaporation). Im Anschluss

wurde die DNA in RNase-freiem, sterilem H2O aufgenommen und bei -20°C gelagert.

2.2.7.7 Quantifizierung von DNA und RNA

Zur Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäurelösungen wurde die Extinktion photometrisch

bei 260 nm Wellenlänge ermittelt. Die Messung erfolgte mit dem „Nano-Drop 2000“ Photometer

(Peqlab), das die optische Dichte kleiner Volumina im Bereich von 1-2 µl messen kann.

2.2.7.8 In vitro-Transkription

Zur Synthese von cRNA, die zur heterologen Expression von Proteinen in Xenopus Oozyten

benötigt wird, wurde isolierte linearisierte Plasmid-DNA als Matrize für eine RNA-abhängige

Polymerase genutzt. Dafür besitzen alle benutzten Plasmide die Promotorsequenz des T7-Phagen

und wurden mit der sehr effizienten T7-RNA-Polymerase transkribiert. Das linearisierte Plasmid

beinhaltet hinter der Promotorregion das Insert, welches die kodierende Sequenz für zu

exprimierende Ionenkanäle enthält. Zur in vitro-Transkription wurde das „AmpliCap-T7 Message

Maker Kit“ (Epicentre) nach Herstellerprotokoll benutzt. Im Anschluss wurde die synthetisierte

cRNA in einer Ammonium-Acetat-Fällung aufgereinigt.

2.2.7.9 Ammonium-Acetat-Fällung

Nukleinsäuren können aus einer wässrigen Lösung mit Ammonium-Acetat gefällt werden. Im

Gegensatz zur Natriumacetat Fällung (siehe 2.2.7.6) werden bei dieser Methode keine

kurzkettigen Oligonukleotide gefällt, so dass ein hoch reines Produkt entsteht. Die in der in vitro-

Transkription synthetisierte cRNA wurde nach diesem Prinzip aufgereinigt. Dabei wurden einer

Probe 0,5 Volumina NH4-Acetat (10 M) zugegeben, 15 Minuten auf Eis inkubiert und im Anschluss

für 15 Minuten bei 4°C mit 14.000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Mini-Spin Plus). Der Überstand

wurde abgezogen und verworfen, danach mit Ethanol (70%) gewaschen und die RNA in RNase-

freiem, sterilem H2O aufgenommen und bei -80°C gelagert.

2.2.7.10 Elution von DNA aus Agarosegelen

Um DNA, die mittels Gelelektrophorese aufgetrennt wurde, aus dem Agarose-Gel zu eluieren,

wurde die entsprechende unter UV-Licht identifizierte Bande mit einem Skalpell aus dem Gel

34


ausgeschnitten und in Lysis-Puffer des „Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up Systems“ (Promega)

eluiert.

2.2.7.11 DNA-Sequenzierung

Zur Sequenzierung von Plasmid-DNA und PCR-Produkten wurden durch den Service des

Lehrstuhls für Rezeptorbiochemie der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. Der Service nutzt

den Sequenzierautomaten „3130xl Genetic Analyzer“ (Applied Biosystems), der mit einem

Sequenzierverfahren nach Sanger (1975) analysiert.

2.2.7.12 Restriktion von Plasmiden

Mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen können spezifische doppelsträngige DNA-

Sequenzabschnitte erkannt und durch Hydrolyse an den Phosphodiesterbindungen aufgetrennt

werden. Neben der Erkennungssequenz sind auch Reaktionsbedingungen (Temperatur und

Puffer) spezifisch für diese Endonukleasen. Die Reaktion wurde hier genutzt, um den

Expressionsvektor für die anschließende In vitro-Transkription zu linearisieren. Dazu wird ein

Enzym ausgewählt, dessen Erkennungssequenz am 3‘-Ende der zu synthetisierenden Sequenz liegt

(2.1.6). Restriktionsenzyme wurden von Fermentas und New England Biolabs bezogen und unter

den vom Hersteller angegebenen Optimalbedingungen benutzt. Dabei wurden 10 µg zu

schneidendes Plasmid, 2 µl Restriktionspuffer (10x), 1 µl Enzym (10 U/µl) mit sterilem H2O auf 20

µl Gesamtvolumen aufgefüllt und für 60 Minuten inkubiert. Es folgte eine Aufreinigung wie unter

2.2.7.10 beschrieben.

2.2.7.13 RNA-Isolation

Mit Hilfe des „RNeasy-Systems“ (Qiagen) kann Total-RNA aus Gewebeproben isoliert und über

eine Silica-Säule aufgereinigt werden. Dabei wurden sowohl das Micro- als auch das Mini-Format

des Kits, in Abhängigkeit von der eingesetzten Gesamtprobenmasse benutzt. Dabei wurde stets

der zusätzliche Schritt eines säulengebundenen DNase-I-Verdaus durchgeführt. Das Kit wurde

nach Herstellerprotokoll für Gewebeaufschluss benutzt. Isolierte RNA wurde nach Elution in

sterilem RNase-freiem H2O bei -80°C gelagert.

35


2.2.7.14 Transkriptom-Amplifikation und cDNA-Synthese bei Einsatz kleinster Mengen RNA

Nach der Isolation einzelner trigeminaler Neurone zum Zweck der Einzelzelltranskriptomanalyse

muss das gesamte Transkriptom – also die Gesamtheit aller in der Zelle vorliegenden Transkripte

– in gleichbleibendem Verhältnis amplifiziert werden, denn aus einzelnen Zellen kann nicht genug

RNA gewonnen werden, um die für das gewählte Sequenzierverfahren erforderliche

Mindestmenge von 1 µg einsetzen zu können. Diese Amplifikation wurde mit Hilfe des „TransPlex

Complete WTA2-Systems“ (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Die Amplifikation erfolgt in zwei

Schritten: 1. eine reverse Transkription, welche eine cDNA-Bibliothek aus zufälligen,

sequenzüberlappenden Fragmenten einer Länge von 100-1000 Basenpaaren erzeugt und dabei

den Fragmenten ein universales Sequenzende angefügt und 2. einer PCR-basierten

repräsentativen Vervielfältigung, bei der das universelle Sequenzende als Primerbindestelle dient.

Das System wurde nach Herstellerprotokoll benutzt, wobei die Probe bei Bedarf nach der

reversen Transkription bis zur PCR-basierten Amplifikation bei -20°C gelagert wurde. Nach dem

gesamten Prozess wurde die erzeugte cDNA-Bibliothek aufgereinigt (2.2.7.10) und deren

Konzentration bestimmt (2.2.7.7).

2.2.7.15 Next Generation Sequencing-Verfahren

Zur Analyse amplifizierter Transkriptome einzelner isolierter Neurone mussten die wie unter

2.2.7.14 beschrieben gewonnenen cDNA-Proben zunächst sequenziert werden. Ein geeignetes

Verfahren muss dazu insbesondere eine hohe Anzahl paralleler Ansätze bieten können. Die

Transkriptomsequenzierungen wurden nach dem „Illumina Solexa“ Verfahren durchgeführt, was

durch den Service des „Cologne Center for Genomics“ geleistet wurde. Sequenzierergebnisse

wurden als Dateien des „fastq“-Formats übermittelt, wofür frei zugängliche Software zur

Datenanalyse von der homepage des „Center for Bioinformatics & Computational Biology“

(http://www.cbcb.umd.edu/) bezogen wurde.

2.2.7.16 Transkriptomanalyse

Eine Transkriptomanalyse nach einer Methode der Massensequenzierung beginnt zunächst mit

einem systematischen Vergleich der Sequenzierergebnisse mit einem Referenzgenom (Trapnell et

al., 2009). Zu diesem Zweck wurde das Referenzgenom „mm9“ (Mus musculus) verwendet. Um

die Sequenzierdaten an das Genom zu ‚alignen‘ wurde das Programm „TopHat“ benutzt, welches

auf den „Bowtie“-Algorithmus zurückgreift (Langmead et al., 2009). Dieser Algorithmus kann

36


neben den Übereinstimmungen mit dem verwendeten Referenzgenom auch Intron/Exon-

überspannende Transkripte zuordnen. Nach dieser ersten Zuordnung folgt die Analyse der

Expressionsstärke mit dem Programm „Cufflinks“ (Trapnell et al., 2010), wobei das

Referenztranskriptom „mm9refseq“ als Vergleich dient. Die relative Expressionsstärke eines

Transkriptes wird in „fragments per kilobase of exon per million mapped reads“ (FPKM)

angegeben. Dabei wird die Anzahl einem Gen zugeordneter reads wegen ihrer für gewöhnlich

unterschiedlichen Länge auf 1000 bp normiert und diese normierte Anzahl als Anteil an einer

Million reads ausgedrückt. Zum Vergleich der Expression können Sequenzierergebnisse anderer

Gewebe aus der NCBI SRA-Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/) herangezogen werden, um mit

dem Programm „CuffDiff“ gewebsspezifische Transkripte zu identifizieren. Außerdem ermöglicht

„CuffDiff“ die Untersuchung von Expressionsschwankungen in verschiedenen Sequenzierläufen

des gleichen Gewebes, was eine Analyse der physiologischen Expressionsvariabilität ermöglicht.

TopHat

Mit Hilfe des „Bowtie“-Algorithmusses vergleicht „TopHat“ kurze Nukleinsäure-Sequenzen, die im

„Next-Generation-Sequencing“ als sogenannte reads bezeichnet werden, mit dem

Referenzgenom (Mus musculus/mm9) und identifiziert so Exon-Exon-splice-junctions. Zunächst

findet das Programm potentielle Exone und legt eine splice-junction Datenbank an. Über einen

Abgleich mit den tatsächlichen reads werden die splice-junctions bestätigt. „TopHat“ unterteilt

reads in kleinere Sequenzfragmente, ordnet diese stückweise der Referenzsequenz zu und fügt

diese anschließend wieder als Exon zusammen (Trapnell et al., 2009). Das Softwarepacket zur

Transkriptomanalyse wurde in einer Linux-basierten Version benutzt. Eine Befehlszeile zur

Datenanalyse besteht beispielsweise aus folgenden Kommandokomponenten:

o Tophat –o mmTG1 –r 128 –solexa1.3-quals –F 0 -G /home/ubuntu/ngs/gtf/mm9refseq.gtf/home/ubuntu/ngs/ bowtie/idexes/mm9 mTG1_s_3_1.fq mTG1_s_3_2.fq

37


Option Funktion

TopHat Auswahl des Programms -o Speicherort der Analyseergebnisse

-r 128 Innere Distanz der Sequenzen auf dem

Genom bei paired end Sequenzierung

Solexa.1.3-quals Qualitätsbewertung der Analysen

-F 0 Isoform-Filter wurde deaktiviert

-G Referenzgenom

Anschließend folgt der Pfad der zu analysierenden Zieldateien. In diesem Beispiel wurde eine

paired end Sequenzierung durchgeführt.

SAMtools

Im Anschluss werden Ergebnis-Dateien der „TopHat“-Analyse mit dem Programm „SAMtools“

sortiert und indiziert. Mit dem Befehl „samtools sort accepted_hits.bam Sorted“ wird die

Sortierung, mit „samtools index sorted.bam“ die Indizierung gestartet.

Cufflinks

Das „Cufflinks“-Programm assembliert Transkripte und ermittelt deren Expressionsstärke in der

zugrunde liegenden Probe unter Berücksichtigung aller möglichen Isoformen. Das Programm

berechnet für jedes bekannte Transkript die FPKM. Sollte die Sequenzierung als paired-end

Experiment durchgeführt worden sein, existieren für jedes Transkript zwei reads, was „Cufflinks“

bei der Berechnung der zugeordneten reads berücksichtigt. Sollten einzelne reads mehreren

Positionen des Genoms zugeordnet werden, berechnet „Cufflinks“ die Expression an jedem

Genort anteilig (Mortazavi et al., 2008). Eine Befehlszeile zur Datenanalyse besteht beispielsweise

aus folgenden Kommandokomponenten:

o Cufflinks -v -u -o cloutput --min-frags-per-transfrag 1 -G /home/ubuntu/ngs/gtf/mm9refseq.gtf -b/home/ubuntu/ngs/bowtie/idexes/mm9.fa sorted.bam

38


Option Funktion

Cufflinks Auswahl des Programms -v Status updates und Diagnoseinformationen

-u Bewertet Zuordnung der reads die an

mehreren Stellen im Genom mappen

-o Speicherort der Analyseergebnisse

--min-frags-per-transfrag

Anzahl der reads wird auf 1 gesetzt, damit

das Programm pro read ein Transkript

zuordnet (niedrige Transkripte werden

detektiert)

-G Referenzgenom

-b Referenzsequenz zur Berechnung des Standardfehlers und Korrektur-Algorithmus

Anschließend folgt der Pfad der zu analysierenden Zieldateien.

CuffDiff

Mit dem „Cufflinks“-Unterprogramm „CuffDiff“ können Expressionslevel verschiedener

Sequenzierdurchläufe miteinander verglichen und auf Signifikanz untersucht werden. Dies macht

man es sich bei der vergleichenden Analyse verschiedener Gewebe oder zur Identifizierung

spezifischer Genregulationen zunutze. Eine Befehlszeile zur Datenanalyse besteht beispielsweise

aus folgenden Kommandokomponenten:

o Cuffdiff -o cuffdiff_Trig1_Trig2 -b /home/ubuntu/ngs/bowtie/indexes/mm9.fa -c 1 /home/ubuntu /ngs/gtf/mm9refseq.gtf/home/ubuntu/benjamin/DatenSeq/mmTG1/ accepted_hits.bam/home/benjamin/DatenSeq/mmTG1/mmTG2/ accepted_hits.bam

Option Funktion

CuffDiff Auswahl des Programms

-o Speicherort der Analyseergebnisse

-b Referenzsequenz zur Berechnung des

Standardfehlers und Korrektur-Algorithmus

-c Schwellendifferenzlevel der Expression ab dem das Programm Signifikanz prüft; in

Anzahl der alignments

39


Anschließend wird hier ebenfalls der Pfad der zu analysierenden Zieldateien angehängt.

Ergebnisse nach „Cufflinks“- oder „CuffDiff“-Analysen können im Weiteren in Excel überführt und

mit diesem Programm weiter verwaltet werden. Da die bisherigen Programme die Identität jedes

Gens mit der NM-Nummer darstellen, muss diesen im Anschluss eine gene-id zugeordnet werden,

die von der UCSC-Datenbank stammt (http://genome.ucsc.edu/). Die Differenz der Genexpression

wird als fold change (Änderungsfaktor) berechnet und logarithmisch ausgegeben. „CuffDiff“ führt

verschiedene statistische Analysen durch, um Signifikanz zu ermitteln

(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/howitworks.html). Die Berechnung der Signifikanz wird nach

Benjamini Hochberg korrigiert (FDR > 0.05).

40

Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1 Elektrophysiologische Untersuchungen der Nikotin-Responsivität rekombinanter

Ionenkanäle

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Nikotin auf humane Liganden-gesteuerte

Ionenkanäle und TRP-Kanäle untersucht. Es wurden dazu Subfamilien gewählt, deren Expression

und zumeist auch deren funktionelle Bedeutung im Trigeminus bekannt sind. Aus der Klasse der

Liganden-gesteuerten Ionenkanäle wurden die Subfamilien der 5-HT3-, nACh-, Glycin- und GABA-

Rezeptoren untersucht. Zudem wurden P2X-Rezeptoren und ionotrope Glutamatrezeptoren aus

den Subfamilien der AMPA-, Kainat- und NMDA-Rezeptoren untersucht. Die Bedeutung der

Thermo-TRP-Kanäle für die trigeminale Sensorik ist seit Längerem bekannt. Aus der Klasse der

TRP-Kanäle wurden daher TRPA1, TRPV1-3 und TRPM8 untersucht. Zu untersuchende

Ionenkanäle wurden heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert (2.2.2) und im Zwei-

Elektroden Voltage-Clamp Verfahren elektrophysiologisch charakterisiert (2.2.3). Zunächst wurde

dazu eine saturierende Konzentration des Agonisten des jeweiligen Ionenkanals appliziert, um

dessen Expression nachzuweisen. Im Anschluss wurde 1 mM (+)- oder (-)-Nikotin appliziert, um

einen direkten Agonismus von Nikotin auf die exprimierten Ionenkanäle festzustellen. Konnte

keine direkte Aktivierung festgestellt werden, wurde im Anschluss die konzentrationsabhängige

Wirkung des Agonisten sowie des Agonisten bei Koapplikation von (+)- oder (-)-Nikotin

untersucht. Dazu wurden je Zelle alternierend für beide Bedingungen Lösungen ansteigender

Agonistenkonzentrationen appliziert. Die Konzentration des Nikotins betrug dabei stets 1 mM.

Durch die Bildung des Quotienten aus absoluten Stromamplituden und dem maximal gemessenen

Strom an der Oozyte bei sättigender Agonistenkonzentration (I/I (max)), wurden die Antworten

normiert und konnten in Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen aufgetragen werden. Im

Anschluss wurde die Agonistenkonzentration bei halbmaximaler Antwort (EC50) und der Hill-

Koeffizient (nH) ermittelt.

3.1.1 Antagonismus von Nikotin an humanen 5-HT3-Rezeptoren

Von den ionotropen Serotoninrezeptoren (5-HT3) wurde zunächst die humane alpha-Untereinheit

5-HT3A untersucht, da diese zur Bildung eines funktionellen homo- wie heteropentameren

Serotoninrezeptoren essentiell ist (Davies et al., 1999). In einer vorangegangenen Studie konnte

bereits eine antagonistische Wirkung von Nikotin auf den 5-HT3A-Rezeptor der Maus

nachgewiesen werden (Gurley und Lanthorn, 1998), jedoch wurde die Wirkung des

41

Ergebnisse

(+)-Nikotin-Enantiomers und somit eine mögliche Stereoselektivität bzw. mögliche Spezies-

Unterschiede nicht untersucht. Die alleinige Applikation der beiden Nikotin-Enantiomere auf

heterolog exprimierte 5-HT3A-Rezeptoren führte zu keiner nennenswerten Stromamplitude. Es

konnte an keiner Oozyte bei keinem der beiden Enantiomere ein größerer Strom als 20 nA

gemessen werden (Imax[(-/+)-Nikotin] < 0,5% Imax[Serotonin]; n = 8). Durch den natürlichen

Agonisten Serotonin vermittelte Ströme erreichten hingegen bei saturierenden Konzentrationen

Stromamplituden von über 5 µA. Um eine modulatorische Wirkung des Nikotins auf die

exprimierten Kanäle zu untersuchen, wurden Konzentrationen von 0,3 µM – 100 µM Serotonin

mit und ohne Nikotin beider Enantiomere appliziert und Konzentrations-Wirkungs-Kurven

aufgetragen. Es konnte eine starke Reduktion der Ströme bei Serotoninkonzentrationen bis 10 µM

durch (-)-Nikotin (1 mM) beobachtet werden. Der inhibitorische Effekt von (-)-Nikotin wurde bei

Serotoninkonzentrationen von 30 µM und 100 µM geringer. Der EC50-Wert von Serotonin betrug

dabei 2,22 ± 0,55 µM (nH = 1,97 ± 0,16), wohingegen der EC50-Wert bei Koapplikation von 1 mM

(-)-Nikotin bei 17,7 ± 2,05 µM (nH = 3,08 ± 0,34) lag. Es konnte somit eine signifikante

Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve beobachtet werden (p < 0,001; n = 8).

Dies ist vergleichbar mit dem von Gurley und Lanthorn (1998) beobachteten kompetitiven

Wirkmechanismus von Nikotin auf den 5-HT3A-Rezeptor der Maus, wenngleich am menschlichen

Rezeptor die Maximalwirkung bei Koapplikation von (-)-Nikotin etwas niedriger bleibt als bei der

Kontrolle (Abb. 3.1 A, B).

Zur Untersuchung der Wirksamkeit des zweiten Stereoisomers wurden die Versuche mit (+)-

Nikotin wiederholt. Da dies an anderen Oozyten durchgeführt wurde und so auch die

Kontrollversuche ohne Nikotin wiederholt werden mussten, wurde hier eine zweite

Konzentrations-Wirkungskurve aufgetragen und für Serotonin ohne Nikotin erneut ein EC50-Wert

ermittelt. Hier konnte lediglich eine schwache Inhibition des Rezeptors beobachtet werden. Es

wurde für Serotonin ein EC50-Wert von 2,57 ± 0,28 µM (nH = 2,2 ± 0,27) festgestellt. Der EC50-Wert

für Serotonin unter Koapplikation von (+)-Nikotin betrug 3,76 ± 0,50 µM (nH = 2,17 ± 0,4; p =

0,031; n = 13). Für (+)-Nikotin wurde ebenfalls ein, wenngleich schwacher, doch signifikanter

Effekt der Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkung-Kurve beobachtet. Der untersuchte

humane 5-HT3A-Rezeptor wird somit von Nikotin stark stereospezifisch inhibiert (Abb. 3.1 C, D).

42

Ergebnisse

Abbildung 3.1: Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Serotonin am 5-HT3A-Rezeptor in Gegenwart und

Abwesenheit von Nikotin gemessen mit dem Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. (A)

Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (-)-Nikotin (n = 8). (B) Repräsentative

Stromspuren bei ansteigenden Serotoninkonzentrationen ohne (oben) und mit (unten) 1 mM (-)-Nikotin. (C)

Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (+)-Nikotin (n = 13). (D)

Repräsentative Stromspuren bei ansteigenden Serotoninkonzentrationen (5-HT) ohne (links) und mit

(rechts) 1 mM (+)-Nikotin. Das Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken

repräsentieren den SEM.

Um die Abhängigkeit der Stärke der inhibitorischen Wirkung von der Nikotinkonzentration

genauer zu untersuchen, wurden in weiteren Experimenten bei konstanter

Serotoninkonzentration von 10 µM (~EC90) aufsteigende Nikotinkonzentrationsreihen von 1–

10000 µM für beide Enantiomere appliziert. Daraus wurden die Konzentrationen berechnet, bei

der Nikotin den Serotonin-induzierten Strom halbmaximal inhibiert (IC50). Der IC50-Wert von

Nikotin bei 10 µM Serotonin für den 5-HT3A-Rezeptor betrug 512 ± 66 µM für (-)-Nikotin und 2070

± 168 µM für (+)-Nikotin (n = 7). In beiden Fällen ließen sich die Serotoninantworten mit

steigenden Konzentrationen von Nikotin komplett inhibieren. Auffällig ist, dass die inhibitorische

Wirkung von (+)-Nikotin sehr viel geringer ausfällt als das des(-)-Enantiomers; der IC50-Wert ist um

den Faktor 4 verschoben (Abb. 3.2 A, B).

43

Ergebnisse

Um die Wirkung von Nikotin auf andere Serotonin-Untereinheiten Kombinationen zu

untersuchen, wurden im Folgenden heteromultimere Rezeptoren aus 5-HT3A- und 5-HT3B

Untereinheiten exprimiert und charakterisiert. Auch bei diesen Rezeptoren ließen sich die

Serotoninantworten durch steigende Nikotin-Konzentrationen komplett inhibieren. Durch die

Heteromultimerisierung mit der 5-HT3B-Untereinheit verringerte sich der IC50-Wert von Nikotin bei

10 µM Serotonin sowohl für (-)-Nikotin (175 ± 48 µM) als auch für (+)-Nikotin (1587 ± 201 µM; n =

6), verglichen mit dem Homopentamer 5-HT3A. Die Stereospezifität des Effektes blieb jedoch

erhalten (Abb. 3.2 C, D).

Abbildung 3.2: Konzentrations-Inhibitions-Beziehung für Nikotin an 5-HT3A- und 5-HT3AB-Rezeptoren bei

konstanter Serotoninkonzentration (5-HT) gemessen mit dem Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.

(A) Konzentrations-Inhibitions-Kurve an 5-HT3A exprimierenden Oozyten für (-)-Nikotin (schwarz) und (+)-

Nikotin (weiß) in Anwesenheit von 10 µM Serotonin (n = 7). (B) Repräsentative Stromspuren bei

ansteigenden Konzentrationen von (-)-Nikotin (oben) und (+)-Nikotin (unten) mit 10 µM Serotonin. (C)

Konzentrations-Inhibitions-Kurve an 5-HT3AB exprimierenden Oozyten für (-)-Nikotin (schwarz) und (+)-

Nikotin (weiß) mit 10 µM Serotonin (n = 6). (D) Repräsentative Stromspuren bei ansteigenden

Konzentrationen von (-)-Nikotin (oben) und (+)-Nikotin (unten) mit 10 µM Serotonin. Das Klemmpotential

betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentieren den SEM. Diese Ergebnisse sind

entstanden in Zusammenarbeit mit Paul Ziemba.

44

Ergebnisse

3.1.2 Aktivierung humaner nikotinischer Acetylcholinrezeptoren durch (+)-Nikotin

Eine Aktivierung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (nAChR) durch (+)-Nikotin wurde zunächst

an der nAChR Untereinheit α7 untersucht, da diese funktionale Homopentamere bilden und die

am häufigsten vorkommenden nAChR im Trigeminus sind (Drisdel and Green, 2000; Liu et al.,

1998). Die direkte Aktivierung des nAChR α7 durch Nikotin wurde in einer vorhergehenden Studie

bereits untersucht (Peng et al., 1994). Die Stereoselektivität nikotinischer AChR ist seit langem

bekannt und wurde mehrfach anhand von Radioliganden-Bindungsstudien nachgewiesen

(Ikushima et al., 1982; Sloan et al., 1985; Zhang and Nordberg, 1993). Mit einer

elektrophysiologischen Messmethode im rekombinanten System wurde dies bei nAChR des

Haushuhns untersucht, wobei erwartungsgemäß (+)-Nikotin als ein schwächerer Agonist

nachgewiesen werden konnte (Amar et al., 1993). Eine elektrophysiologische Untersuchung der

Stereoselektivität eines humanen nAChR ist jedoch nicht bekannt. Um die Stereoselektivität von

Nikotin auf den humanen nAChR α7 zu untersuchen, wurden aufsteigende Nikotin-

Konzentrationen von (+)-Nikotin appliziert. Aus den normierten, relativen Stromamplituden

wurde eine Konzentrations-Wirkungs-Beziehung mit einem EC50 von 519 ± 189 µM (nH = 2,53 ±

1,4; n = 7-9) erstellt. Bei dieser Charakterisierung der Direktwirkung von (+)-Nikotin auf α7 wurden

durchschnittliche Ströme von 46 ± 16 nA (100 µM) bis 196 ± 44 nA (3 mM) gemessen. Ein

Vergleich der normierten Stromamplituden (I/I(ACh)) aller drei untersuchten Agonisten bei einer

sättigenden Konzentration von 1 mM zeigt, dass der natürliche Agonist Acetylcholin die höchste

gemittelte Stromamplitude hervorruft. Die durch (-)-Nikotin hervorgerufene Amplitude ist mit

0,77 ± 0,1 etwas geringer, jedoch unterscheiden sich beide Amplituden nicht signifikant

voneinander (p = 0,69). Die von (+)-Nikotin hervorgerufene Stromantwort beträgt lediglich 0,12 ±

0,02 des durch ACh induzierten Stroms (p < 0,001). Nikotin besitzt als Agonist am nAChR α7 in

Form des (-)-Enantiomers eine etwa 6,4-fach höhere Maximalwirkung als (+)-Nikotin (Abb. 3.3). Im

Vergleich zu Acetylcholin ist Nikotin in beiden Enantiomeren am nAChR α7 ein partieller Agonist.

45

Ergebnisse

Abbildung 3.3: Effekt von (+)-Nikotin am nAChR α7 gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren. (A) Repräsentative Stromspuren und (B) Vergleich der gemittelten, relativen Stromamplituden

(I/I(ACh)) zwischen Acetylcholin (ACh), (-)-Nikotin und (+)-Nikotin (jeweils 1 mM). (C) Repräsentative

Stromspuren bei ansteigenden Konzentrationen von (+)-Nikotin. (D) Konzentrations-Wirkungs-Kurve von

(+)-Nikotin (n = 7-9). Das Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentieren

den SEM.

Um die Auswirkungen der verschiedenen Nikotin-Enantiomere auf einen weiteren Vertreter der

nACh-Rezeptoren zu untersuchen, wurden die oben beschriebenen Experimente an dem

heteromeren α2β4 nACh-Rezeptor wiederholt. Die Kombinationen α4β2 und α3β4 kommen zwar

im Trigeminus häufiger vor (Flores et al., 1996), konnten jedoch in Xenopus-Oozyten nicht

erfolgreich exprimiert werden. Die Untereinheiten α2 und β4 kommen, wenn auch schwächer, im

Trigeminus jedoch ebenfalls vor (Liu et al., 1998).

Nach einer Positivkontrolle mit 1 mM ACh wurden zur Untersuchung der Konzentrations-

Wirkungs-Beziehung Lösungen mit ansteigenden Konzentrationen von (+)-Nikotin im Bereich von

3-1000 µM appliziert. Aus der aufgetragenen Konzentrations-Wirkungs-Kurve wurde ein EC50-

Wert von 51,2 ± 4,2 µM (nH = 2,38 ± 0,3; n = 7-9) berechnet. Dabei wurden Maximalamplituden

von 502 ± 79 nA (30 µM) bis 1895 ± 334 nA (300 µM) aufgezeichnet. Auch bei dieser

Rezeptorkombination zeigt ein Vergleich der normierten Stromamplituden (I/I(ACh)) bei

46

Ergebnisse

sättigenden Konzentrationen (jeweils 1 mM), dass Acetylcholin die höchste gemittelte

Stromamplitude hervorruft, während (-)-Nikotin mit 0,88 ± 0,07 ein starker Agonist ist. Die

Maximalwirkung von (-)-Nikotin unterscheidet sich nicht signifikant von der Wirkung von

Acetylcholin (p = 0,18). Mit 0,13 ± 0,03 des Acetylcholin-induzierten Maximalstromes ist (+)-

Nikotin ein schwacher partieller Agonist (p < 0,001). Als Agonist am nAChR α2β4 hat das (-)-

Enantiomer somit etwa eine 6,7-fach höhere Maximalwirkung als (+)-Nikotin. Beim Betrachten

der Kinetik wird deutlich, dass diese Untereinheitenkombination in Gegenwart von (+)-Nikotin

verglichen mit dem vollen Agonisten Acetylcholin und (-)-Nikotin weniger stark desensitisiert.

(Abb. 3.4).

Abbildung 3.4: Effekt von (+)-Nikotin am nAChR α2β4 gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren. (A) Repräsentative Stromspuren und (B) Vergleich der gemittelten, relativen Stromamplituden

(I/I(ACh)) bei Acetylcholin (ACh), (-)-Nikotin und (+)-Nikotin (jeweils 1 mM). (C) Repräsentative Stromspuren

bei ansteigenden Konzentrationen von (+)-Nikotin. (D) Konzentrations-Wirkungs-Kurve von (+)-Nikotin (n =

7-9). Das Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentieren den SEM.

47

Ergebnisse

3.1.3 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an humanen α1 Glycinrezeptoren (GlyR α1)

Um eine Wirkung von Nikotin auf die Anionen-leitenden Rezeptorkanälen zu untersuchen,

wurden zunächst Glycin-α1-Rezeptoren untersucht. Ströme nach Applikation von Glycin

erreichten im Maximum Stromamplituden von 6,5 - 7,5 µA (Imax[(-/+)-Nikotin] < 0.5% Imax[Glycin]; n

= 7). Zur Untersuchung einer modulatorischen Wirkung von Nikotin auf die exprimierten

Rezeptorkanäle wurden Lösungen ansteigender Konzentrationen von 10 µM – 1000 µM Glycin mit

und ohne Nikotin (1 mM) beider Enantiomere appliziert und Konzentrations-Wirkungs-Kurven

aufgetragen. Es konnte dabei für Glycin am GlyR α1 ein EC50-Wert von 211 ± 36,7 µM (nH = 1,66 ±

0,34) ermittelt werden. Der EC50-Wert für Glycin bei Koapplikation von (-)-Nikotin betrug 193 ±

37,8 µM (nH = 2,57 ± 0,83; n = 7). Beide Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind nahezu

deckungsgleich und zeigen keine signifikante Abweichung des EC50-Werts (Abb. 3.5 A, B).

Abbildung 3.5: Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Glycin (Gly) am Glycinrezeptor α1 in Gegenwart

und Abwesenheit von Nikotin gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. (A)


Stromspuren bei ansteigenden Glycinkonzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (-)-Nikotin. (C)

Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (+)-Nikotin (n = 7). (D) Repräsentative

Stromspuren bei ansteigenden Glycinkonzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (+)-Nikotin. Das

Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentieren den SEM. Diese

Ergebnisse sind entstanden in Zusammenarbeit mit Ramona Lehmann.

48

Ergebnisse

Für das (+)-Enantiomer wurden vergleichbare Ergebnisse festgestellt. Da Messungen für (+)- und

(-)-Enantiomer an verschiedenen Oozyten durchgeführt wurden, musste für diese zweite

Messreihe aus den entsprechenden Kontrollen erneut ein EC50-Wert für Glycin separat ermittelt

werden. Der EC50-Wert für Glycin betrug hier 172 ± 17,8 µM (nH 3,17 ± 0,22), der für Glycin unter

Koapplikation von (+)-Nikotin betrug 195 ± 16,7 µM (nH = 2,62 ± 0,15; n = 7) Die EC50-Werte und

der Hill-Koeffizient

unterscheiden sich nicht signifikant voneinander (Abb. 3.5 C, D). Die oben aufgeführten

Ergebnisse zeigen deutlich, dass beide Nikotin-Enantiomere keine Wirkung auf humane GlyR α1

Rezeptoren haben.

3.1.4 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an humanen GABAA-Rezeptoren

Als weiterer Vertreter der ligandengesteuerter Ionenkanäle wurden GABAA-Rezeptoren

untersucht. Dazu wurden fünf verschiedene Untereinheiten-Kombinationen untersucht, drei

Heteropentamere (α1β2γ2, α2β1γ2, α2β3γ2) und zwei Homopentamere (β3, ρ1). Von den

untersuchten Kombinationen gehören insbesondere α1β2γ2, α2β3γ2 zu den am weitesten

verbreiteten Kombinationen gehören (McKernan and Whiting, 1996; Nutt, 2006; Pirker et al.,

2000). Die einzelnen Untereinheiten mit Ausnahme von α2 und ρ1 gehören im Trigeminus zudem

zu den stark exprimierten GABA-Rezeptoren (Hayasaki et al., 2006).

Die Wirkung von Nikotin wurde mit dem (-)-Nikotin-Enantiomer charakterisiert. Um eine direkte

Wirkung auf GABAA-Rezeptoren zu untersuchen, wurde 1 mM (-)-Nikotin appliziert, worauf

Stromantworten im Bereich von 15 – 30 nA registriert werden konnten. Verglichen mit der

Applikation des Agonisten GABA, welcher in den verschiedenen Rezeptorkombinationen sich stark

unterscheidende Maximalstromamplituden hervorrief, waren die durch (-)-Nikotin induzierten

Amplituden vernachlässigbar gering (Imax[Nikotin] < 0.5% Imax[GABA]; n = 4-5). Im Anschluss

wurden durch ansteigende GABA-Konzentrationen (1 µM – 1000 µM) mit und ohne 1 mM

(-)-Nikotin Konzentrations-Wirkungs-Kurven erstellt.

Für GABA ergab diese Konzentrations-Wirkungs-Kurve im Falle des α1β2γ2 GABAA-Rezeptors ein

EC50-Wert von 52,3 ± 28,6 µM (nH = 1,62 ± 0,25), bei Koapplikation von (-)-Nikotin einen EC50-Wert

von 32,2 ± 6,81 µM (nH = 1,74 ± 0,15; n = 4). Die Koapplikation von Nikotin und GABA führte dabei

zu keiner signifikanten Veränderung der Konzentrations-Wirkungs-Beziehung (p = 0,45; Abb. 3.6

A).

Im Folgenden wurden α2β1γ2 GABAA-Rezeptoren wie oben beschrieben untersucht. Dabei

ergaben sich EC50-Wert für GABA von 53,3 ± 8,45 µM (nH = 1,43 ± 0,15) und GABA + (-)-Nikotin von

49

Ergebnisse

63,5 ± 7,14 µM (nH = 1,65 ± 0,13; n = 5), welche sich nicht signifikant voneinander unterscheiden

(p = 0,12; Abb. 3.6 B).

Des Weiteren wurde für den α2β3γ2 GABAA-Rezeptor ein EC50-Wert von 119 ± 1,74 µM (nH = 3,43

± 0,64) für den Agonisten GABA und 117 ± 2,87 µM (nH = 3,1 ± 0,33; n = 5) für die Koapplikation

von GABA und (-)-Nikotin ermittelt, welche sich ebenfalls nicht signifikant voneinander

unterscheiden (p = 0,78; Abb. 3.6 C).

Abbildung 3.6: Der Einfluss von (-)-Nikotin auf die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für GABA an

GABAA-Rezeptoren gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. Konzentrations-Wirkungs-

Kurven am GABAA-Rezeptor (A) α1β2γ2 (n = 4), (B) α 2β1γ2 (n = 5), (C) α 2β3γ2 (n = 5), (D) β3 (n = 5) und (E)

ρ1 (n = 5) mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (-)-Nikotin, sowie exemplarische Membranstromspuren

ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (-)-Nikotin. Das Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV,

Fehlerbalken repräsentieren den SEM.

50

Ergebnisse

Der GABAA-Rezeptor β3 kann homomer ohne eine α-Untereinheit funktionell exprimiert werden

(Saras et al., 2008). Für diesen homopentameren Rezeptor konnte ein GABA EC50-Wert von 29,9 ±

13,7 µM (nH = 2,35 ± 0,87) und 14,4 ± 2,55 µM (nH = 1,63 ± 0,4; n = 5) für GABA + (-)-Nikotin

festgestellt werden. Beide Werte unterscheiden sich ebenfalls nicht signifikant (p = 0,31; Abb. 3.6

D). Darüber hinaus wurde die GABAA-Untereinheit ρ1 untersucht, welche nativ sowohl

homopentamer als auch heteropentamer mit anderen ρ-Untereinheiten vorkommt (Cutting et al.,

1991). Der für GABA ermittelte EC50-Wert beträgt für diesen Rezeptor 0,88 ± 0,11 µM (nH = 1,32 ±

0,23), für GABA + (-)-Nikotin 1,51 ± 0,3 µM (nH = 0,93 ± 0,18; n = 5). Die Unterschiede in den

normierten Stromamplituden wie auch der Unterschied in den EC50-Werten sind nicht signifikant

(p = 0,21; Abb. 3.6 E). Es konnte für (-)-Nikotin an keinem der untersuchten GABAA-Rezeptoren

eine Wirkung nachgewiesen werden.

3.1.5 Untersuchung der Wirkung von Nikotin am humanen P2X-Rezeptor

Aus der Familie der Purinozeptoren wurde die Wirkung von Nikotin am P2X2-Rezeptor untersucht.

Die Applikation des Agonisten ATP führt zu Maximalstromamplituden von etwa 4,5-6,5 µA

(Imax[(-/+)-Nikotin] < 0.5% Imax[ATP]; n = 6). Zur Untersuchung einer modulatorischen Wirkung von

Nikotin auf P2X wurden Lösungen ansteigender Konzentrationen von ATP im Bereich von 0,1 µM

– 100 µM mit und ohne Nikotin (1 mM) beider Enantiomere appliziert. Es konnten aus den

normierten relativen Stromamplituden Konzentrations-Wirkungs-Kurven aufgetragen und EC50-

Werte berechnet werden. Für ATP wurde ein Wert von 13,7 ± 0,56 µM (nH = 2,37 + 0,19) und für

ATP mit (-)-Nikotin ein Wert von 14,2 ± 0,3 µM (nH = 2,03 + 0,07; n = 6) bestimmt. Beide

aufgetragenen Konzentrations-Wirkungs-Kurven verlaufen nahezu deckungsgleich. Die EC50-Werte

unterscheiden sich nicht signifikant voneinander (Abb. 3.7 A, B).

Für das (+)-Enantiomer wurden vergleichbare Experimente durchgeführt. Da Messungen für (+)-

und (-)-Enantiomer an verschiedenen Oozyten durchgeführt wurden, musste für diese zweite

Messreihe aus den entsprechenden Kontrollen erneut ein EC50-Wert für ATP separat ermittelt

werden. Es konnten ebenfalls Konzentrations-Wirkungs-Kurven aufgetragen und EC50-Werte

berechnet werden. Für ATP wurde hierbei ein Wert von 13,9 ± 0,2 µM (nH = 2,0 ± 0,1), für ATP und

(+)-Nikotin ein Wert von 9,64 ± 1,1 µM (nH = 2,51 + 0,87; n = 9) berechnet. Die Kurven verlaufen

nahezu deckungsgleich. Die EC50-Werte unterscheiden sich nicht signifikant (Abb. 3.7 C, D). Es

konnte für keines der beiden Nikotinenantiomere eine direkte oder modulatorische Wirkung am

humanen P2X-Rezeptor nachgewiesen werden.

51

Ergebnisse

Abbildung 3.7: Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Adenosintriphosphat (ATP) am P2X2-Rezeptor in

Gegenwart und Abwesenheit von Nikotin gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. (A)


Stromspuren bei ansteigenden ATP-Konzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (-)-Nikotin. (C)

Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (+)-Nikotin (n = 9). (D) Repräsentative

Stromspuren bei ansteigenden ATP-Konzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (+)-Nikotin. Das

Klemmpotential betrug bei allen Messungen -40 mV, Fehlerbalken repräsentieren den SEM. Diese


3.1.6 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an humanen Glutamatrezeptoren

Aus der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren wurden zunächst GluR1(Q)flop und GluR6(Q)

als Vertreter der AMPA- bzw. Kainatrezeptoren homomer exprimiert und eine mögliche Wirkung

von Nikotin auf diese Glutamatrezeptor-Typen untersucht. Ströme nach Applikation des

Agonisten Glutamat erreichten Maximalamplituden von 100-120 nA an GluR1(Q)flop (I [Nikotin] =

0 nA; n = 5) und von 1,5-2,5 µA an GluR6(Q) (I [Nikotin] < 0.5% Imax[Glutamat]; n = 3). Es konnten

nach der Applikation von Lösungen aufsteigender Konzentrationen im Bereich von 3 µM – 1000

µM mit und ohne 1 mM (-)-Nikotin Konzentrations-Wirkungs-Kurven aufgetragen und EC50-Werte

berechnet werden. Für GluR1(Q)flop wurde ein EC50-Wert für Glutamat von 22,4 ± 4,5 µM

(nH = 4,52 ± 2,73) und ein Wert für Glutamat und (-)-Nikotin von 41,5 ± 18,9 µM (nH = 3,7 ± 1,64; n

= 5) berechnet. Beide Kurven sind nahezu deckungsgleich. Die EC50-Werte unterscheiden sich

52

Ergebnisse

nicht signifikant (p = 0,45; Abb. 3.8 A, B). Für GluR6(Q) wurde ein EC50-Wert für Glutamat von 90,9

± 24,03 µM (nH = 1,18 ± 0,07) und für Glutamat und (-)-Nikotin ein EC50-Wert von 102 ± 49,4 µM

(nH = 1,35 ± 0,31; n = 3) berechnet. Auch hier verlaufen beide Kurven nahezu deckungsgleich.

Zwischen den beiden EC50-Werten gibt es keinen signifikanten Unterschied (p = 0,87). Weder am

AMPA-Rezeptor GluR1(Q)flop, noch am Kainat-Rezeptor GluR6(Q) konnte eine Wirkung von (-)-

Nikotin festgestellt werden (Abb. 3.8 C, D).

Abbildung 3.8: Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Glutamat an den Glutamatrezeptoren GluR1 und

GluR6 in Gegenwart und Abwesenheit von (-)-Nikotin gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren. (A) Konzentrations-Wirkungs-Kurve an GluR1(Q)flop mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (-)-

Nikotin (n = 5). (B) Repräsentative Stromspuren an GluR1(Q)flop bei ansteigenden Glutamat-

konzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (-)-Nikotin. (C) Konzentrations-Wirkungs-Kurve an

GluR6(Q) mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (-)-Nikotin (n = 3). (D) Repräsentative Stromspuren an

GluR6(Q) bei ansteigenden Glutamatkonzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (+)-Nikotin. Das

Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentieren den SEM.

53

Ergebnisse

Als weiterer Glutamatrezeptor wurde aus der Familie der NMDA-Rezeptoren ein Heteromer aus

NR1-3a und NR2B untersucht. Nach Applikation von Glutamat konnten Maximalströme von etwa

1,5-2 µA gemessen werden, nach Applikation von 1 mM (-)-Nikotin konnte hingegen an keiner

Oozyte wurde ein nennenswerter Strom (Imax[(-)-Nikotin] < 0.5% Imax[Glutamtat]; n = 5) gemessen

werden, weshalb eine direkte Aktivierung durch (-)-Nikotin ausgeschlossen werden konnte. Bei

einer Klemmspannung von -60 mV wurden nach Applikation ansteigender

Glutamatkonzentrationen (0,1 µM – 100 µM) mit und ohne 1 mM (-)-Nikotin Konzentrations-

Wirkungs-Kurven aufgetragen. Aus diesen konnte ein EC50-Wert von 3,88 ± 0,77 µM (nH = 1,92 ±

0,47) für Glutamat und 4,8 ± 3,74 µM (nH = 1,0 ± 0,12) für Glutamat und (-)-Nikotin berechnet

werden. Die gemittelte Stromamplitude ist nach jeder Applikation mit (-)-Nikotin geringer im

Vergleich zur Glutamat Kontrolle. Diese Unterschiede sind jedoch nicht signifikant und

beeinflussen den EC50-Wert nicht (p = 0,13; Abb. 3.9 A, B).

Für NMDA-Rezeptoren ist ein Block durch Mg2+-Ionen beschrieben, der von der

Membranspannung abhängig ist (Nowak et al., 1984). Dabei werden positiv geladene Mg2+-Ionen

von einer negativen Membranspannung (unter -40 bis -20 mV) angezogen und setzen sich in die

Kanalpore, was zu einer Blockierung des Ionenflusses und damit des NMDARs führt. Um diesen

möglichen Mg2+-Block auszuschließen, wurden die Messungen unter Mg2+-freien Bedingungen

durchgeführt. Interessanterweise konnte bei Applikation von 10 µM Glutamat und 100 µM – 10

mM (-)-Nikotin ein spannungsabhängiger Block beobachtet werden, wenn die Klemmspannung

von -40 mV auf -100 mV verringert wurde. Es zeigte sich, dass dieser Block stärker wurde je

negativer das gewählte Klemmpotential war und weist damit starke Ähnlichkeiten mit dem Mg2+-

Block auf (Abb. 3.9 C). Eine signifikante Verringerung des Stroms durch diesen Block tritt erst bei

Potentialen negativer als -80 mV bei Koapplikation von 10 mM (-)-Nikotin mit 10 µM Glutamat (p

= 0,016) auf. Durch eine Verringerung der Nikotin-Konzentration auf 1 mM (-)-Nikotin bei -80 mV

konnte keine signifikante Verringerung des Stroms mehr registriert werden; durch eine

Erniedrigung der Klemmspannung auf -100 mV zeigt sich jedoch ein signifikanter Block (p =

0,0039) bei gleichbleibender Nikotin Konzentration. Im Vergleich zum Mg2+-Block (1,8 mM), der

bei einem Klemmpotential von -60 mV den Glutamat-induzierten Strom nahezu vollständig

verhinderte, konnte der spannungsabhängige Nikotin-Block selbst bei hohen (-)-Nikotin-

Konzentrationen (10 mM) und einem Klemmpotential von -100 mV nur etwa 70% des Glutamat-

induzierten Stromes verhindern (Abb. 3.9 D).

54

Ergebnisse

Abbildung 3.9: Wirkung von (-)-Nikotin am NMDA-Rezeptor NR1-3a/NR2B gemessen im Zwei-Elektroden

Voltage-Clamp Verfahren. (A) Konzentrations-Wirkungs-Kurve für Glutamat mit (schwarz) und ohne (weiß)

1 mM (-)-Nikotin bei einem Klemmpotential von -60 mV (n = 5). (B) Repräsentative Stromspuren bei

ansteigenden Glutamatkonzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (-)-Nikotin. (C) gemittelte,

relative Stromamplituden (I/I (Glu)) bei 10 µM Glutamat ohne und mit ansteigenden Konzentrationen von

(-)-Nikotin, sowie in Gegenwart von 1,8 mM Mg2+

(MgR) bei Klemmspannungen von -100 mV (grau) und -40

mV (schwarz, n = 6). p < 0,05. (D) Strom-Spannungs-Beziehung von –120 mV – +40 mV Klemmspannung bei

10 µM Glutamat ohne und mit ansteigenden Konzentrationen von (-)-Nikotin, sowie in Gegenwart von 1,8

mM Mg2+

(n = 3). Fehlerbalken repräsentieren den SEM. Diese Ergebnisse sind entstanden in

Zusammenarbeit Ramona Lehmann.

3.1.7 Die Wirkung von (+)-Nikotin auf den TRPA1-Kanal

Im Folgenden haben wurde die Wirkung von Nikotin auf transient receptor potential (TRP) Kanäle

untersucht. An dem ersten untersuchten Rezeptorkanal aus dieser Familie, dem TRPA1-Kanal

wurde bereits in einer vorherigen Studie gezeigt, dass dieser partiell durch (-)-Nikotin aktiviert

wird (Talavera et al., 2009). Bisher wurde jedoch keine Untersuchung der Wirkung von (+)-Nikotin

auf den TRPA1 vorgenommen. Demnach wurden unmittelbar Lösungen ansteigender

Konzentrationen von 300 µM – 10 mM (+)-Nikotin appliziert und die Stromamplituden auf die

Maximalantwort von (+)-Nikotin an jeder Zelle normiert (I/I (max)). Es konnte eine

Konzentrations-Wirkungs-Kurve (Abb. 3.10) aufgetragen werden, die jedoch auch bei der

höchsten applizierten Konzentration von 10 mM (+)-Nikotin noch nicht die Sättigung erreicht.

55

Ergebnisse

Bei der Applikation höherer Konzentrationen setzten trotz der Spannungsklemme des

Messsystems starke Schwankungen der Membranspannung der Oozyte ein, sodass Messungen

nur noch schwer möglich waren. Aus diesem Grund konnte kein EC50-Wert berechnet werden. Als

Kontrolle der Expression von TRPA1 wurde nach jeder Nikotin Konzentrations-Wirkungs-Kurve der

TRPA1-Agonist Allylisothiocyanat (AITC) in einer Konzentration von 100 µM appliziert.

Abbildung 3.10: Effekt von (+)-Nikotin am TRPA1 gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.

(A) Repräsentative Stromspuren und (B) Vergleich der gemittelten, relativen Stromamplituden (I/I(AITC)) für

Allylisothiocyanat (AITC), (-)-Nikotin und (+)-Nikotin (jeweils 10 mM; n = 4-7). (C) Repräsentative

Stromspuren bei ansteigenden Konzentrationen von (+)-Nikotin. (D) Konzentrations-Wirkungs-Kurve für

(+)-Nikotin (n = 5-7). Das Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentieren

den SEM.

Zum Vergleich der relativen Effektivität beider Nikotin-Enantiomere wurden in weiteren

zusätzlichen Experimenten 10 mM (+)-Nikotin, 10 mM (-)-Nikotin und im Anschluss ein sättigender

Stimulus von 100 µM AITC (Bandell et al., 2004) appliziert (Abb. 3.10). Für (+)-Nikotin konnten

Maximalstromamplituden von 300-570 nA gemessen werden. Für (-)-Nikotin lagen diese bei etwa

bei 250-1800 nA, die Applikation von AITC hingegen führte zu Maximalströmen von 590-9300 nA

(n = 4-7). Ein Vergleich der normierten Stromamplituden (I/I(AITC)) aller drei applizierten

56

Ergebnisse

Agonisten zeigt, dass AITC der Agonist mit der bei Weitem höchsten Maximalwirkung ist. Die bei

(-)-Nikotin gemessene Amplitude beträgt etwa 16 ± 12%, die für (+)-Nikotin etwa 17 ± 9% des

AITC-induzierten Maximalstromes. Die Werte der beiden Nikotin-Enantiomere unterscheiden sich

nicht signifikant voneinander (p = 0,41). Am humanen TRPA1 wirkt demnach nicht nur das

(-)-Enantiomer, sondern auch (+)-Nikotin als partieller Agonist mit vergleichbar hoher

Maximalwirkung. Der TRPA1-Kanal weist den Ergebnissen zufolge in Bezug auf Nikotin keine

Stereoselektivität auf.

3.1.8 Untersuchung der Wirkung von Nikotin an den Vanilloid-Rezeptoren TRPV1-3

Als weitere Rezeptoren der Familie der TRP-Kanäle wurden TRPV1, TRPV2 und TRPV3 aus der

Unterfamilie der Vanilloidrezeptoren untersucht. Liu et al., (2004) zeigten, dass der TRPV1-Kanal

der Spezies Rattus norvegicus positiv durch (-)-Nikotin moduliert wird. Aufbauend auf diesen

Ergebnissen wurde die modulatorische und die direkte Wirkung von beiden Nikotin-Enantiomeren

auf den humanen TRPV1 untersucht. Bei der Applikation von 1 mM Nikotin beider Enantiomere

zeigte sich, dass Nikotin keine direkte Aktivierung des Kanals hervorruft, da keine Stromantwort

registriert werden konnte (Imax[(-/+)-Nikotin] = 0; n = 8-10). Als Positivkontrolle wurde der Agonist

Capsaicin (Caterina et al., 1997) verwendet, nach dessen Applikation Maximalstromamplituden

von 250-900 nA gemessen wurden. Um die modulatorische Wirkung auf TRPV1-Kanäle zu

untersuchen, wurden Lösungen ansteigender Konzentrationen von 10 nM – 10 µM Capsaicin mit

und ohne Nikotin (1 mM) beider Enantiomere appliziert. Die normierten, relativen

Stromamplituden (I/I(max)) wurden als Konzentrations-Wirkungs-Kurve aufgetragen. Die EC50-

Verschiebung für die Modulation der Capsaicin Aktivierung durch Nikotin konnte nicht berechnet

werden, da mit den verwendeten Konzentrationen keine Sättigung erreicht wurde. Die beiden

Nikotin-Enantiomere zeigten keine unterschiedliche Wirkung auf den TRPV1 Rezeptor, da sich der

Mittelwert der Stromamplituden bei keiner Capsaicinkonzentration signifikant voneinander

unterscheiden (Abb. 3.11 A, B). Es konnte am humanen TRPV1 bei keinem der beiden Nikotin-

Enantiomere eine direkte oder modulatorische Wirkung von Nikotin festgestellt werden.

Des Weiteren wurden die Vanilloidrezeptoren TRPV2 und TRPV3 in Hinblick auf ihre Modulation

durch Nikotin untersucht. Nach der Applikation von 1mM und Nikotin beider Enantiomere

konnten an diesen Kanälen keine Stromantwort festgestellt werden (Imax[(-/+)-Nikotin] = 0 nA; n =

5).

57

Ergebnisse

Abbildung 3.11: Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen an TRPV-Kanälen in Gegenwart und Abwesenheit

von Nikotin gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. Konzentrations-Wirkungs-Kurven für

Capsaicin (Cap) an TRPV1 mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (A) (-)-Nikotin (n = 8) und (B) (+)-Nikotin (n

= 10), sowie exemplarische Stromspuren ohne (links) und mit (rechts) 1 mM Nikotin. Konzentrations-

Wirkungs-Beziehungen für 2-Aminoethoxydiphenylboran (2-APB) an TRPV2 (n = 5) und TRPV3 (n = 5) mit

(schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (C), (E) (-)-Nikotin und (D), (F) (+)-Nikotin, sowie exemplarische

Stromspuren ohne (links) und mit (rechts) 1 mM Nikotin. Das Klemmpotential betrug bei allen Messungen

-60 mV, Fehlerbalken repräsentieren den SEM.

Als Positivkontrolle wurde bei beiden Kanälen der Agonist 2-APB appliziert (Chung et al., 2004;

Neeper et al., 2007), der an TRPV2-Maximalstromamplituden von 2-4 µA, an TRPV3-Amplituden

von 1-1,5 µA induzierte. Nach der Applikation von Lösungen ansteigender Konzentrationen von

58

Ergebnisse

1 mM - 10 mM 2-APB mit und ohne Nikotin (1 mM) beider Enantiomere zeigte sich keine

signifikante Änderung der normierten Stromamplituden. (Abb. 3.11 C, D).

Für TRPV3 wurde ein EC50-Wert von 3026 + 324 µM (nH = 3,75 ± 0,29) für 2-APB und 3522 ± 319

µM (nH = 3,85 ± 0,01; n = 5) für 2-APB und (-)-Nikotin über die Auftragung der Messdaten in einer

Konzentrations-Wirkungs-Beziehung errechnet. Die oben beschrieben Experimente wurden für

das (+)-Enantiomer wiederholt. Da Messungen für (+)- und (-)-Enantiomer an verschiedenen

Oozyten durchgeführt wurden, musste für diese zweite Messreihe aus den entsprechenden

Kontrollen erneut ein EC50-Wert für 2-APB ohne Nikotin separat ermittelt werden. Dabei betrug

der EC50-Wert für 2-APB 4059 ± 530 µM (nH = 2,42 ± 0,27), der für 2-APB und (+)-Nikotin betrug

3367 ± 375 µM (nH = 2,34 ± 0,17; n = 5). Die berechneten EC50-Werte unterscheiden sich nicht

signifikant (p [-] = 0,13; p [+] = 0,35; Abb. 3.11 E, F). Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass

weder (-)- noch (+)-Nikotin eine direkte oder modulatorische Wirkung auf TRPV2 oder TRPV3

haben.

3.1.9 Untersuchung der Wirkung von Nikotin am humanen Melastatinrezeptor TRPM8

Als letzter Kanal aus der Familie der TRP-Kanäle wurde TRPM8 untersucht. Nach Applikation des

Agonisten Menthol (McKemy et al., 2002) wurden Maximalstromamplituden im Bereich von 3-6,5

µA registriert, nach der Applikation von 1 mM Nikotin beider Enantiomere wurde hingegen keine

Stromantwort festgestellt (Imax[(-/+)-Nikotin] < 0,5% Imax[Menthol]). Eine mögliche modulatorische

Wirkung von Nikotin wurde durch die Applikation von Lösungen ansteigender Konzentration von

10 µM – 3 mM Menthol mit und ohne Nikotin (1 mM) beider Enantiomere untersucht. Diese

Messungen ergaben für Menthol einen EC50-Wert von 511 ± 125 µM (nH = 0,89 ± 0,1), für Menthol

und (-)-Nikotin ein Wert von 415 ± 122 µM (nH = 0,93 ± 0,14) und für Menthol und (+)-Nikotin ein

Wert von 291 ± 23,9 µM (nH = 1,02 ± 0,06; n = 7). Die berechneten EC50-Werte unterscheiden sich

nicht signifikant (Abb. 3.12). Es konnte anhand der Ergebnisse weder eine direkte noch eine

modulatorische Wirkung von Nikotin auf den humanen Melastatinrezeptor TRPM8 festgestellt

werden.

59

Ergebnisse

Abbildung 3.12: Der Einfluss von Nikotin auf die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Menthol (Men)

am TRPM8-Kanal gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. (A) Konzentrations-Wirkungs-

Kurve mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (-)-Nikotin (n = 7). (B) Repräsentative Stromspuren bei

ansteigenden Mentholkonzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (-)-Nikotin. (C) Konzentrations-

Wirkungs-Kurve mit (schwarz) und ohne (weiß) 1 mM (+)-Nikotin (n = 7). (D) Repräsentative Stromspuren

bei ansteigenden Mentholkonzentrationen ohne (links) und mit (rechts) 1 mM (+)-Nikotin. Das

Klemmpotential betrug bei allen Messungen -60 mV, Fehlerbalken repräsentiert den SEM.

60

Ergebnisse

3.1.10 Zusammenfassung der elektrophysiologischen Untersuchungen

Es wurden insgesamt 19 verschiedene humane Ionenkanäle oder Ionenkanal-

Untereinheitenkombinationen sowohl aus der Familie der „klassischen“ Liganden-gesteuerten

Ionenkanäle, sowie der transient receptor potential Kanäle auf ihre Nikotin-Responsivität

elektrophysiologisch untersucht. Die durch Nikotin-vermittelte Effekte und die EC50- bzw. IC50-

Werte, welche in den vorher beschriebenen Experimenten ermittelt wurden, sind in Tabelle 2.1

zusammengefasst.

Rezeptor (-)-Nikotin (+)-Nikotin

5-HT3A Antagonist (IC50 = 512 µM ± 66, 1-

3000 µM)

Antagonist (IC50 = 2070 µM ± 168, 1-

3000 µM)

5-HT3AB Antagonist (IC50 = 512 µM ± 66, 1-

3000 µM)

Antagonist (IC50 = 1587 µM ± 201, 1-

1000 µM)

nAChR α7 Agonist (Bertrand et al., 1992) Agonist (EC50 = 519 µM ± 189, 100-

3000 µM)

nAChR α2β4 Agonist (ChavezNoriega et al.,

1997; Duvoisin et al., 1989)

Agonist (EC50 = 51.2 ± 4.2 µM, 3-1000

µM)

GlyR α1 keine direkte Aktivierung, Inhibition oder Modulation bei 1 mM

GABAA α1β2γ2

keine direkte Aktivierung, Inhibition oder Modulation

bei 1 mM

hier nicht untersucht

GABAA α2β1γ2

GABAA α2β3γ2

GABAA β3

GABAA ρ1

P2X2 keine direkte Aktivierung, Inhibition oder Modulation bei 1 mM

GluR1(Q)flop keine direkte Aktivierung, In-

hibition oder Modulation bei 1 mM hier nicht untersucht GluK2(Q)

NR1-3a + NR2B Blocker (100-10000 µM)

TRPA1 Agonist (Talavera et al., 2009) Agonist (300-10000 µM)

TRPV1 keine direkte Aktivierung, Inhibition oder Modulation Capsaicin- (TRPV1),

2-APB- (TRPV2, TRPV3), Menthol- (M8)

induzierter Ströme bei 1 mM

TRPV2

TRPV3

TRPM8

Tabelle 3.1: Elektrophysiologischen Ergebnisse der Nikotin-Responsivität rekombinanter humaner

Ionenkanäle gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.

61

Ergebnisse

3.2 Untersuchungen der Wirkung von Nikotin auf trigeminale Neurone der Maus

Da freie Nervenendigungen trigeminaler Neurone auch Schleimhäute des Mund- und

Rachenraumes innervieren, sind die Neurone bei Rauchern regelmäßig einem nikotinhaltigem

Aerosol ausgesetzt. Zur Untersuchung des Einflusses von Nikotin auf trigeminale Neurone der

Maus wurden zunächst Trigeminus-Primärzellkulturen angelegt (2.2.4). Als

Untersuchungsmethode wurde die Calcium-Imaging Methode verwendet (2.2.5), da sie es erlaubt

die Wirkung pharmakologisch aktiver Substanzen auf eine Vielzahl von Zellen gleichzeitig zu

beobachten. Dabei diente die Auswahl applizierter spezifischer Agonisten und Antagonisten dem

Zweck, die Gesamtheit Nikotin-responsiver Neurone in der trigeminalen Zellkultur bestimmten

pharmakologischen Antwortprofilen zuzuordnen. Diese Antwortprofile ermöglichten Rückschlüsse

auf die funktionelle Expression bestimmter Membranrezeptoren. Als abschließende Kontrolle

wurde stets eine Hochkalium-Lösung appliziert, welche nur vitale Neurone aktiviert. Mit diesem

Test ist es möglich, funktionale Neurone von anderen Zellen in der Trigeminuskultur zu

unterscheiden.

3.2.1 Stereoselektive Responsivität trigeminaler Ganglienzellen auf Nikotin

Um zu untersuchen, ob trigeminale Neurone stereoselektiv auf Nikotin antworten, wurden im

ersten Ansatz 250 µM (-)-Nikotin und nach einer Auswaschphase (> 80 s) 250 µM (+)-Nikotin

appliziert. Um eine Beeinflussung von (-)-Nikotin auf die Antwort von (+)-Nikotin auszuschließen,

wurden die beiden Enantiomere in der Hälfte der durchgeführte Experimente vice versa appliziert.

Bei diesen Experimenten wurden 83 Neurone identifiziert, die auf einen K+-Stimulus mit einem

Calciumtransienten reagierten, wovon 66 keine Nikotin-Responsivität zeigten. Es reagierten 7

Neurone mit einem Calciumtransienten auf beide Nikotinenantiomere, 9 ausschließlich auf (+)-

Nikotin und lediglich 1 Neuron reagierte ausschließlich auf (-)-Nikotin (Abb. 3.13). Diese ersten

Ergebnisse zeigen, dass zum einen die Rezeptorausstattung von trigeminalen Neuronen

heterogen ist, da drei verschiedene Populationen anhand ihrer Nikotin-Responsivität identifiziert

wurden und zum anderen exprimiert demnach etwa die Hälfte der Nikotin-responsiven Neurone

einen Rezeptor, der selektiv auf (+)-Nikotin reagiert. Ein solcher Rezeptor ist bisher unbekannt.

Auch mit den elektrophysiologischen Untersuchungen, welche unter 3.1 beschrieben sind, wurde

kein Rezeptor identifiziert, der stereoselektiv auf (+)-Nikotin reagiert.

62

Ergebnisse

Abbildung 3.13: Calcium-Imaging Signale trigeminaler Neurone auf Stimuli von Nikotin beider

Enantiomere. (A) Exemplarische Messspuren eines (+)-Nikotin- (hellgrau), (-)-Nikotin- (schwarz) und (+/-)-

Nikotin- (dunkelgrau) responsiven Neurons. (B) Prozentualer Anteil der Populationen gemessener Neurone.

Diese Ergebnisse sind entstanden in Zusammenarbeit mit Ulrike Thiel.

3.2.2 Suche nach weiteren Rezeptoren für Nikotin in trigeminalen Neuronen

3.2.2.1 Responsivität trigeminaler Neurone für (-)-Nikotin unter pharmakologischer Inhibition von

nAChR und TRPA1

Für den Nachweis weiterer Membranrezeptoren welche auf Nikotin reagieren, mussten im

Calcium-Imaging der trigeminalen Zellkultur die bekannten Nikotin-induzierten Antworten von

nAChR und TRPA1-Kanälen auf pharmakologischem Wege ausgeschlossen werden. Dazu wurde

die Substanz Mecamylamin eingesetzt, die bei Konzentrationen höher als 1 mM sowohl

nikotinische Acetylcholinrezeptoren als auch TRPA1-Kanäle inhibiert (Talavera et al., 2009). In

weiteren Experimenten wurde Hexamethonium, ein Blocker neuronaler nAChRs (Bertrand et al.,

1992; Charnet et al., 1992; Liu et al., 1993) und HC030031, ein spezifischer TRPA1-Blocker

(McNamara et al., 2007), koappliziert, um Nikotin-induzierte Antworten dieser beiden Rezeptoren

zu inhibieren. Zuvor wurden diese Blocker einzeln eingesetzt. Dabei konnte durch 1 mM

Hexamethonium ein Großteil der durch 250 µM (-)-Nikotin-induzierte Antworten blockiert

werden. Antworten von 154 der 219 (70%) responsiven Neurone wurden inhibiert. Bei einer

Gesamtanzahl vitaler Neuronen von 727 beträgt der inhibierte Anteil etwa 21% (Abb. 3.14 A, B).

Der TRPA1 spezifische Blocker HC030031 (30 µM) konnte 46 von 94 (49%) der (-)-Nikotin-

induzierten Antworten inhibieren. Bei einer Gesamtanzahl gemessener vitaler Neurone von 435

beträgt der inhibierte Anteil hier etwa 11%. Dass es sich bei dieser Zellpopulation um TRPA1

63

Ergebnisse

exprimierende Neuronen handelt, wurde durch anschließende Applikation von AITC (100 µM)

gezeigt (Abb. 3.14 C, D).

Abbildung 3.14: Calcium-Imaging Signale (-)-Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone unter separatem

Block durch Hexamethonium (Hex) und HC030031 (HC). (A) Exemplarische Messspuren und (B)

prozentualer Anteil (-)-Nikotin- (250 µM) responsiver Neurone mit Hexamethonium (1 mM) blockierbaren

(schwarz) und nicht blockierbaren (grau) Antwort. (C) Exemplarische Messspuren und (D) prozentualer

Anteil (-)-Nikotin- (250 µM) responsiver Neurone mit HC030031 (30 µM) blockierbaren (schwarz) und nicht

blockierbaren (grau) Antworten.

Für die weiteren Experimente wurde Mecamylamin als Blocker eingesetzt, um in niedrigen

Konzentrationen die Antworten nAChR exprimierender, in hohen Konzentrationen TRPA1 und

nAChR exprimierender Neuronenpopulationen auszuschließen. Bei niedrigen Konzentrationen

von Mecamylamin (20 µM) wurden bereits 7 von 21 (33%) (-)-Nikotin-induzierter Antworten

inhibiert (nicht gezeigt). Konzentrationen von 2 mM Mecamylamin konnten die (-)-Nikotin-

induzierten Antworten von 15 der 17 (88%) responsiven Neurone blockieren (Abb. 3.15 A, B).

Durch Hexamethonium (1 mM) und HC030031 (30 µM) konnten 119 von 149 (80%) (-)-Nikotin-

induzierte Antworten inhibiert werden (Abb. 3.15 C, D). Unter beiden Doppelblockerbedingungen

64

Ergebnisse

antwortet weiterhin eine kleine Population (12%, bzw. 20%) der (-)-Nikotin-responsiven Neurone,

deren Antwort weder durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren noch durch TRPA1 vermittelt

wird. Dies ist ein Hinweis auf einen bisher unbekannten Rezeptor, der durch Nikotin aktiviert wird.

Abbildung 3.15: Calcium-Imaging Signale (-)-Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone unter separatem

Block durch Mecamylamin (Mec) und simultanem Block durch Hexamethonium (Hex) und HC030031 (HC).

(A) Exemplarische Messspuren und (B) prozentualer Anteil (-)-Nikotin- (250 µM) responsiver Neurone mit

Mecamylamin (2 mM) blockierbarer (schwarz) und nicht blockierbarer (grau) Antwort. (C) Exemplarische

Messspuren und (D) prozentualer Anteil (-)-Nikotin- (250 µM) responsiver Neurone mit Hex (1 mM) und HC

(30 µM) blockierbaren (schwarz) und nicht blockierbaren (grau) Antworten.

65

Ergebnisse

3.2.2.2 Responsivität trigeminaler Neurone für (+)-Nikotin

Unter 3.2.1 wurde bereits gezeigt, dass Populationen trigeminaler Neurone stereoselektiv auf

Nikotin reagieren. Anschließend sollte die Beteiligung verschiedener Membranrezeptoren an

(+)-Nikotin-induzierten Antworten der Neurone untersucht werden. Um die beteiligten

Rezeptoren einzugrenzen, wurden für die folgenden Experimente Rutheniumrot als Blocker

eingesetzt, da diese Substanz verschiedene TRP-Kanäle (TRPA1, TRPV und verschiedene

Calciumkanäle) blockiert (Clapham et al., 2005). Es wurden zuerst (+)-Nikotin (250 µM) und

(-)-Nikotin (250 µM) appliziert. Anschließend folgte die Koapplikation von (+)-Nikotin mit

Rutheniumrot (10 µM). Zuletzt wurde der TRPA1-Agonist AITC (100 µM) appliziert. Von 292

untersuchten trigeminalen Neuronen waren 85 (29%) Nikotin-responsiv. Die Neurone konnten

aufgrund ihrer Antwortmuster in verschiedene Populationen eingeteilt werden: 1) 24 (8%) Zellen

wurden identifiziert, die lediglich auf (-)-Nikotin reagierten, 2) 20 (7%) der Zellen reagierten auf

alle drei applizierten Agonisten. Die (+)-Nikotinantworten dieser Zellen konnten nicht durch

Rutheniumrot geblockt werden. 3) 25 (9%) Zellen antworteten auf beide Nikotinenantiomere,

jedoch nicht auf AITC. Die (+)-Nikotinantworten dieser Zellen konnten ebenfalls nicht geblockt

werden. 4) 16 (5%) Zellen antworteten ausschließlich auf (+)-Nikotin, wobei die Antworten durch

Rutheniumrot geblockt werden konnten (Abb. 3.16). Die Antworten dieser Zellen wurden nicht

durch TRPA1 vermittelt, denn diese zeigten keine Sensitivität für AITC. Außerdem wirkt

Rutheniumrot nicht auf nAChR. So können nAChR an diesen geblockten Antworten nicht beteiligt

sein. Die gemessene Antwort wird demnach offenbar von einem weiteren unbekannten

(+)-Nikotinrezeptor vermittelt.

66

Ergebnisse

Abbildung 3.16: Calcium-Imaging Antwortprofile Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone bei Block

durch Rutheniumrot (RR). (A) Prozentualer Anteil der Populationen gemessener Neurone. (B), (C)

Exemplarische Messspuren verschiedener Neurone. Legende unter (A) ist gleichermaßen für (B) und (C)

gültig. Es wurden 250 µM beider Nikotinenantiomere, 10 µM Rutheniumrot und 100 µM AITC appliziert.

In einem weiteren Experiment wurde mit Hilfe des spezifischen Antagonisten Gentamycin (Nagata

et al., 2005) die TRPA1 vermittelte (+)-Nikotinantwort geblockt. Dabei wurde zuerst (+)-Nikotin

(250 µM) appliziert, worauf die Koapplikation von (+)-Nikotin und Gentamycin (30 µM) folgte.

Anschließend wurden sukzessiv (+)-Nikotin und (-)-Nikotin (250 µM) appliziert. Von 165

untersuchten Neuronen wurden 44 (27%) als Nikotin-responsiv identifiziert. Anhand der

unterschiedlichen Antwortprofile wurden diese in unterschiedliche Populationen eingeteilt: 1) 20

(12%) ausschließlich (-)-Nikotin-responsive Neurone wurden charakterisiert. 2) Weitere 8 (5%)

Neurone waren responsiv für beide Enantiomere, wobei die (+)-Nikotinantwort durch Gentamycin

geblockt werden konnte. 3) Bei weiteren 6 (4%) Neuronen konnte die (+)-Nikotinantwort geblockt

werden, jedoch waren die Zellen nicht (-)-Nikotin-responsiv. Der Block der (+)-Nikotinantwort der

beiden Populationen 2) und 3) weist auf die Beteiligung des TRPA1-Kanals hin. Zudem wurden

67

Ergebnisse

zwei weitere Populationen festgestellt, deren Antwort auf (+)-Nikotin nicht geblockt werden

konnte: 4) Davon waren zum einen 5 Zellen (3%) auch (-)-Nikotin-responsiv, 5) zum anderen

weitere 5 Neurone (3%) ausschließlich (+)-Nikotin-responsiv (Abb. 3.17). Es ist möglich, dass die

Antworten Ersterer auf eine Aktivität nikotinischer Acetylcholinrezeptoren zurückgehen. Da bei

Letzteren jedoch Antworten auf (-)-Nikotin ausbleiben, scheint offenbar bei etwa 3% der Neurone

die Expression eines unbekannten Rezeptors für (+)-Nikotin vorzuliegen.


durch Gentamycin (A) Prozentualer Anteil der Populationen gemessener Neurone. (B), (C) Exemplarische

Messspuren verschiedener Neurone. Legende unter (A) ist gleichermaßen für (B) und (C) gültig. Es wurden

250 µM Nikotin bei beiden Enantiomeren und 30 µM Gentamycin appliziert.

In einem weiteren Experiment sollten die Ergebnisse des vorangegangenen Experimentes mit

Borneol, einem weiteren Blocker für TRPA1 (lehrstuhleigene Ergebnisse, Korrespondenz mit Azhar

Sherkheli) verifiziert werden. Zusätzlich wurden die nikotinischen Acetylcholinrezeptoren mit

Hexamethonium blockiert (Abb. 3.18).

68

Ergebnisse


durch Hexamethonium und Borneol. (A) Prozentualer Anteil der Populationen gemessener Neurone. (B),

(C) Exemplarische Messspuren verschiedener Neurone. Legende unter (A) ist gleichermaßen für (B) und (C)

gültig. Es wurden 250 µM Nikotin bei beiden Enantiomeren, 1 mM Hexamethonium und 1 mM Borneol

appliziert.

Zunächst wurden (+)-Nikotin (250 µM) und (-)-Nikotin (250 µM) appliziert. Anschließend folgte die

Koapplikation von (+)-Nikotin mit Hexamethonium (1 mM) und/oder Borneol (1 mM); darauf

folgte eine weitere Applikation von (+)-Nikotin. Von 392 untersuchten Neuronen wurden 135

(35%) als Nikotin-responsiv klassifiziert, die wieder anhand ihrer Antwortprofile in verschiedene

Klassen eingeordnet werden konnten: 1) 26 Neurone (7%) ausschließlich (-)-Nikotin-responsive

Neurone wurden identifiziert. 2) Weiterhin antworteten 14 (4%) Neurone auf beide Enantiomere,

wobei die (+)-Nikotinantwort durch das Antagonistengemisch geblockt wurde. 3) Bei einer

weiteren Population von 52 Neuronen (13%) konnte die (+)-Nikotinantwort geblockt werden,

jedoch waren die Zellen nicht (-)-Nikotin-responsiv. Hinzu kamen zwei Populationen, deren

69

Ergebnisse

(+)-Nikotinantwort nicht geblockt werden konnten: 4) zum einen waren dies 26 (7%) Neurone,

die auf beide Enantiomere antworteten, 5) zum anderen reagierten 17 (4%) der Neurone lediglich

auf (+)-Nikotin. Da die Zellen der letzten beiden Populationen unter simultaner Blockerbedingung

für nAChR und TRPA1 noch antworteten, konnte auch in diesem Experiment mit etwa 4% eine

Zellpopulationen gefunden werden, die offenbar unbekannte Rezeptoren für (+)-Nikotin

exprimiert. Da eine weitere Population zusätzlich auf das (-)-Enantiomer antwortet, deutet sich

hier an, dass weitere unbekannte Rezeptoren für Nikotin in diesen Zellen exprimiert sind.

3.2.3 Einfluss extrazellulären Calciums auf Nikotin-Responsivität trigeminaler Neurone

Bisher war ungeklärt, ob der im Calcium-Imaging registrierte Ca2+-Transient von einem Einstrom

von Ca2+-Ionen aus dem extrazellulären Medium oder einem Ausstrom von Ionen aus

intrazellulären Speichern herrührt. Um diese Frage zu klären, wurde in zwei Experimenten

(-)- oder (+)-Nikotin (250 µM) in Gegenwart und Abwesenheit von Ca2+-Ionen appliziert. Von 37

(-)-Nikotin-responsiven Neuronen und 31 (+)-Nikotin antwortete kein einziges Neuron unter

extrazellulär Ca2+-freien Messbedingungen (Abb. 3.19). Dies zeigt, dass extrazelluläre Ca2+-Ionen

bei der Applikation beider Enantiomere in die Zelle strömen und das Signal vermitteln.

Abbildung 3.19: Block der Nikotin-induzierten Calcium-Imaging Signale trigeminaler Neurone unter Ca2+

-

freien Bedingungen im Extrazellulärmedium. Exemplarische Messspuren eines (-)-Nikotin- (schwarz) und

(+)-Nikotin- (grau) responsiven Neurons unter Ca2+

-haltigen und Ca2+

-freien Messbedingungen.

Um herauszufinden, ob zusätzlich die Freisetzung von Ca2+-Ionen aus den intrazellulären

Speichern an dem Calcium-Imaging Signal beteiligt ist, wurde die Phospholipase C (PLC) mit dem

spezifischen Blocker Edelfosin inhibiert (Powis et al., 1992), welcher die Freisetzung von

70

Ergebnisse

Ca2+-Ionen aus intrazellulären Speichern verhindert. Trigeminale Zellkulturen wurden mit

Edelfosin (10 µM) für 20 Minuten präinkubiert und unter Gegenwart von Edelfosin im Calcium-

Imaging auf Nikotin-Responsivität untersucht. Dabei wurden (-)-Nikotin (250 µM) und die Blocker

HC030031 (30 µM) und Hexamethonium (1 mM) koappliziert, um zusätzlich TRPA1 und nAChR

vermittelte Antworten zu inhibieren. Die Applikation wurde in einem Experiment zwei weitere

Male wiederholt. Von den 56 untersuchten Neuronen waren 7 (12%) unter den beschriebenen

Blockerbedingungen (-)-Nikotin-responsiv (Abb. 3.20). Der (-)-Nikotin-induzierte Calciumtransient,

der hier beobachteten Population, scheint demnach offenbar nicht über eine PLC-gekoppelte

Signaltransduktion vermittelt zu werden.

Abbildung 3.20: Einfluss des Phospholipase C-Blockers Edelfosin auf (-)-Nikotin-induzierte Calcium-

Imaging Signale trigeminaler Neurone (A) Repräsentative Messspur mit 10 µM Edelfosin inkubierter,

(-)-Nikotin- (250 µM) responsiver Neurone unter simultanem Block durch Hexamethonium (1 mM) und

HC030031 (30 µM). (B) Prozentualer Anteil der Populationen unter Edelfosineinfluss gemessener Neurone.

3.2.4 Inhibitorischer Einfluss von Nikotin auf 5-HT3 vermittelte Calcium-Signale trigeminaler

Neurone

Die Serotonin-vermittelte Stromantwort rekombinant exprimierter 5-HT3-Rezeptoren konnte im

Voltage-Clamp Verfahren durch Koapplikation von Nikotin inhibiert werden. Im Folgenden wurde

nun mittels Calcium-Imaging untersucht, ob dieser Antagonismus auch an trigeminalen Neuronen

nachgewiesen werden kann. Dazu wurde 10 µM Serotonin appliziert. Da sowohl ionotrope wie

metabotrope Serotoninrezeptoren durch den Liganden aktiviert werden, wurde anschließend

1-(m-Chlorophenyl)-biguanid (mCPBG, 100 µM; Kilpatrick et al., 1990), ein spezifischer Agonist

71

Ergebnisse

für 5-HT3-Rezeptoren appliziert. Es folgte die Koapplikation von Serotonin und (-)-Nikotin (1 mM).

Im Anschluss wurde die Serotoninapplikation wiederholt. Von 377 untersuchten Neuronen waren

134 (36%) Serotonin-responsiv und davon ein Anteil von 44 (~12%) Neuronen auch mCPBG-

responsiv (Abb. 3.21 A). Von diesen konnten 16 Neurone nicht zur Auswertung herangezogen

werden, da diese Neurone während der Präinkubation von (-)-Nikotin bereits antworteten, also

einen zusätzlich durch Nikotin aktivierbaren Rezeptor exprimiert haben. Von den übrigen 28

Neuronen konnte die Serotonin-vermittelte Antwort von 22 (79%) Neuronen mit (-)-Nikotin

geblockt werden, wohingegen die Antwort bei 6 (21%) Zellen nicht inhibiert werden konnte (Abb.

3.21 B, C). Die Ergebnisse zeigen, dass (-)-Nikotin die 5-HT3-vermittelte Antwort in trigeminalen

Neuronen inhibieren kann.

Abbildung 3.21: Calcium-Imaging Signale Serotonin und mCPBG-responsiver trigeminaler Neurone. (A)

Prozentualer Anteil der Populationen gemessener Neurone. (B) Exemplarische Messspuren und (C)

prozentualer Anteil Serotonin- (10 µM) und mCPBG- (100 µM) responsiver Neurone mit (-)-Nikotin (1 mM)

blockierbaren (schwarz) und nicht blockierbaren (hellgrau) Serotoninantworten.

72

Ergebnisse

3.3 Transkriptomanalyse Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone

Im Rahmen der vergleichenden Transkriptomanalyse wurden Ergebnisse verschiedener

Massensequenzierungen ausgewertet. Dies waren zum einen Sequenzierungen von Gesamt-RNA

verschiedener Gewebe der Maus (Trigeminus, Dorsalwurzelganglien, Gehirn), wobei die

Ergebnisse für das Gehirn aus dem Datensatz einer bereits publizierten Studie stammen

(SRA001030; Mortazavi et al., 2008). Zum anderen waren dies Ergebnisse der Sequenzierungen

von Amplikons, die vom Transkriptom einzelner Zellen amplifiziert wurden, sowie einem

Amplikon, amplifiziert von der Gesamt-RNA des Trigeminus (RNA-Standard). Für die Gewinnung

der Proben wurde zum einen Gesamt-RNA aus ganzen trigeminalen Ganglien und

Dorsalwurzelganglien (weiterhin bezeichnet als Explantate) adulter Mäuse isoliert (2.2.7.13). Zum

anderen wurden die Amplikons der Transkriptome einzelner Neurone von trigeminalen

Primärkulturen amplifiziert, die sich vorher in Calcium-Imaging Experimenten als Nikotin-

responsiv erwiesen hatten. Dazu wurde ein Messprotokoll wie in Abbildung 3.15 durchgeführt, bei

der die Nikotinantwort der Neurone mit den spezifischen Blockern für nAChR (Hexamethonium,

Hex) und TRPA1 (HC030031, HC) in blockierbar und nicht blockierbar eingeordnet wird. Es wurden

sowohl blockierbare als auch nicht blockierbare Neurone aus der Zellkultur herausgelöst. Im

Anschluss wurden Transkriptome von je zwei Neuronen beider Populationen amplifiziert

(2.2.7.14), um für die nachfolgende Amplikonsequenzierung eine ausreichend große cDNA-Probe

zu erhalten. Dabei waren die (-)-Nikotinantworten der Zellen 5-1 und 6-1 nicht durch Hex und HC

blockierbar, jene von Zelle 2-1 und 2-2 waren blockierbar. Zellen 5-1 und 2-2, sowie Zellen 6-1 und

2-1 stammen aus derselben Charge kultivierter Zellen. Außerdem wurde mit dem Einsatz von

isolierter Gesamt-RNA (100 pg) aus trigeminalen Ganglien über die Amplifikationsreaktion ein

Amplikon (weiterhin als RNA-Standard bezeichnet) erzeugt, dass ebenfalls der

Massensequenzierung zugeführt wurde. Beim Vergleich dieser Probe mit denen der trigeminalen

Gesamt-RNA lässt sich beurteilen, ob der gesamte Prozess der Amplifikation die

Expressionsergebnisse beeinflusst.

Abbildung 3.22 zeigt ein Schema der Amplifikationsreaktion. Zunächst wurde an der RNA

einzelner Zellen beziehungsweise an trigeminaler Gesamt-RNA mit einem randomisierten

Primergemisch eine cDNA-Synthese vorgenommen, bei der Sequenzfragmente über die gesamte

Länge aller Transkripte entstehen können. Die erzeugte cDNA wird vom Hersteller des Systems als

„OmniPlex Library“ bezeichnet. Die Enden der darin enthaltenen Fragmente wurden bei der

cDNA-Synthese mit einer Sequenz versehen, die als Bindestelle für die Primer der anschließenden

PCR-basierten Amplifikation dient.

73

Ergebnisse

Abbildung 3.22: Schematische Darstellung der Transkriptomamplifikation. Mit dem Amplifikationssystem

„TransPlex Complete WTA2“ (Sigma-Aldrich) wurde in einer PCR-basierten Reaktion ein Amplikon des

gesamten Transkriptoms erzeugt. Verändert nach Benutzerinformation (WTA2 Procedure,

http://www.sigmaaldrich.com).

Die auf diese Weise erzeugten Amplikons des Transkriptoms der vier Neurone und der RNA-

Standard sowie die Proben aus Dorsalwurzel- und trigeminalen Ganglien wurden durch den

Service des „Cologne Center for Genomics“ im Next Generation Sequencing-Verfahren (2.2.7.15)

sequenziert. Die Daten der sieben Transkriptome sowie die Daten eines bereits publizierten

Datensatzes vom Gehirn der Maus wurden im Anschluss mit den - unter 2.2.7.16 genannten -

Algorithmen bioinformatisch prozessiert, wobei jedes einzelne sequenzierte Fragment (read)

einem Abschnitt des Referenzgenoms der Maus (mm9) zugeordnet wurde. Dieser Prozess ergab

ein Maß für relative Stärke der Expression eines Transkriptes innerhalb des untersuchten

Transkriptoms und wird als FPKM (fragments per kilobase of exon per million mapped reads)

74

Ergebnisse

angegeben. Der FPKM-Wert erlaubt eine Vergleichbarkeit von Expressionsstärken verschiedener

Transkripte.

Bei jedem Sequenzierdurchlauf wurden 22-38 Millionen Fragmente sequenziert (reads). Da jedoch

aus Kostengründen die vier Einzelzellamplikons und der RNA-Standard mit drei weiteren Proben

in einem Durchlauf sequenziert wurden, entfällt auf jede Probe nur ein Achtel der

Sequenzierleistung. Nur ein Anteil der sequenzierten reads kann einer Sequenz im

Referenzgenom zugeordnet werden. Je höher die Anzahl dieser gemappten reads ist, desto höher

ist die Aussagekraft über relative Expressionen. Tabelle 3.2 macht erkennbar, dass bei

Transkriptomsequenzierungen der Explantate (Explantatsequenzierungen) von Dorsalwurzel-,

trigeminalen Ganglien und Gehirn ein größerer prozentualer Anteil der reads gemappt werden

konnte (80-85%), als dies bei den Amplikonsequenzierungen der einzelnen Zellen

(Einzelzellsequenzierungen) der Fall war. Bei diesen konnten mit einer Gesamtzahl von 3-3,5

Millionen sequenzierten Fragmenten nur zwischen 240.000 – 640.000 Fragmente gemappt

werden, was einen Anteil zwischen 8-20% ergab. Der prozentuale Anteil gemappter reads der

Sequenzierung des RNA-Standards liegt mit ~42% zwar deutlich über denen der

Einzelzellsequenzierungen, jedoch um etwa die Hälfte unter denen der Explantat-

sequenzierungen. Da diese Probe - wie die Einzelzelltranskriptome - unter identischen

Bedingungen mit einer Amplifikationsreaktion generiert wurde, scheint offenbar die Amplifikation

die Anzahl gemappter reads zwischen Sequenzierung von Gesamt-RNA- und

Amplikonsequenzierungen zu beeinflussen.

Probe Länge der

reads

Anzahl der

reads

Anzahl

gemappter reads

N. trigeminus 36 bp 36.797.509 31.316.761 (85,1%)

DRG 36 bp 37.513.794 29.988.440 (79,9%)

Gehirn (Mortazavi et al., 2008) 25 bp 46.420.976 38.398.844 (82.72%)

RNA-Standard (100 pg) 75 bp 3.206.106 1.340.854 (41,8%)

Zelle 5-1 Nik-responsiv, nicht geblockt 75 bp 3.506.787 643.542 (18.35%)

Zelle 6-1 Nik-responsiv, nicht geblockt 75 bp 3.013.605 599.007 (19.88%)

Zelle 2-1 Nik-responsiv, geblockt 75 bp 2.986.630 241.740 (8.09%)

Zelle 2-2 Nik-responsiv, geblockt 75 bp 3.525.842 614.213 (17.42%)

Tabelle 3.2: Anzahl prozessierter und gemappter reads untersuchter Transkriptome nach Analyse mit

„TopHat“. In Klammern ist der prozentuale Anteil gemappter reads an der Gesamtzahl prozessierter reads

angegeben.

75

Ergebnisse

Die Gesamtzahl exprimierter Gene beträgt bei den Explantaten etwa 14000-16000, beim RNA-

Standard wurden in etwa 11000, bei den einzelnen Zellen zwischen 2000-5000 exprimierte Gene

festgestellt. Die geringe Anzahl festgestellter Gene bedeutet nicht zwangsläufig eine tatsächlich

geringere Anzahl exprimierter Gene in den einzelnen Zellen. Sie könnte aber dadurch begründet

sein, dass die Wahrscheinlichkeit sehr gering ist, dass unter wesentlich weniger prozessierten

reads bei Amplikonsequenzierungen im Vergleich zu den Explantatsequenzierungen, Transkripte

sehr schwach exprimierter Gene überhaupt festgestellt werden. In einer ersten näheren

Betrachtung wurden für die untersuchten Transkriptome die exprimierten Gene in Stufen der

Expressionsstärke eingeteilt, die von niedrigen FPKM-Werten von 0,1 bis sehr hohen im Bereich

zwischen 3000-10000 reichen. Mit einer Auftragung der Genanzahl gegen die zugehörige

Expressionsstärke wurde diese Klassifizierung in Abbildung 3.23 dargestellt.

Abbildung 3.23: Einteilung der Transkriptome in Expressionsklassen. Jede FPKM-Klasse stellt ein Intervall

dar, dem die Anzahl von Genen zugeordnet wurde, die dieser Expressionsstärke entspricht.

Der Darstellung entnimmt man, dass die meisten Gene bei den niedrigen Expressionsstärken

gelistet werden, wobei insbesondere bei den Transkriptomen von Trigeminus, Gehirn und den

76

Ergebnisse

Einzelzelltranskriptomen zwischen 3-10 FPKM viele Gene exprimiert sind. Bei den Transkriptomen

der Dorsalwurzelganglien und trigeminalem RNA-Standard fallen die meisten Gene in die Klasse

von 0,1-1 FPKM. Es fällt auf, dass der Anteil der sehr niedrig exprimierten Gene von 0,1-1 FPKM

bei den Transkriptomen der einzelnen Neurone sehr gering ist, bei den anderen Transkriptomen

hat er hingegen einen großen Anteil. Dies kann daran liegen, dass bei den

Einzelzelltranskriptomen bedingt durch die niedrige Gesamtzahl gemappter reads, einzelne

gemappte reads für ein Transkript bereits in einem FPKM von 1-2 resultieren können.

Da FPKM-Werte relative Expressionsanteile von 1.000.000 gemappter reads darstellen, wirft die

wesentlich geringere Anzahl gemappter reads und exprimierter Gene der Einzelzelltranskriptome

die Frage auf, inwieweit die FPKM-Werte von Explantat- und Einzelzelltranskriptomen

vergleichbar sind. Hohe FPKM-Werte können bei einer geringen Gesamtzahl gemappter reads auf

wenige sequenzierte Fragmente eines Transkriptes zurückgehen. So repräsentiert ein einzelnes

gemapptes Fragment bei angenommener Exonlänge von 1000 Basenpaaren im Transkriptom der

untersuchten Explantate einen FPKM von etwa 0,03-0,66. Bei den Einzelzelltranskriptomen ergibt

sich hingegen ein FPKM von etwa 1,6-4,1. Gleiche FPKM-Werte bei Explantat- und

Einzelzelltranskriptomen gehen somit aus deutlich verschiedenen Anzahlen absoluter gemappter

reads hervor. In dieser Arbeit wurden zusätzlich zu der Berechnung der relativen FPKM-Werte die

alignments sequenzierter Fragmente an das Genom für die Einzelzelltranskriptome bei

ausgewählten Genen überprüft und die absolute Anzahl der tatsächlichen gemappten Fragmente

ermittelt. Tang et al. (2011) kommen in einer Übersichtsarbeit zu dem Schluss, dass heutige

technische Möglichkeiten der Amplikonsequenzierung von Transkriptomen einzelner Zellen

quantitative Aussagen über Expressionsmuster prinzipiell zulassen. Allerdings sind die

resultierenden FPKM-Werte bisher nur bedingt vergleichbar mit denen der Sequenzierungen von

Gesamt-RNA, denn bei den geringen Mengen RNA, die bei der vorangehenden

Amplifikationsreaktion eingesetzt werden, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Expression sehr

schwach exprimierter Gene sich nicht verhältnisgenau im Amplikon wiederspiegelt, wenn nur sehr

wenige oder gar nur ein Transkript pro Zelle vorliegt. Andererseits können stark exprimierte Gene

im Amplikon überrepräsentiert sein. Die Generierung des Amplikons geht somit mit einer

gewissen Verzerrung des Transkriptoms einher, was einen direkten Vergleich von FPKM-Werten

erschwert.

In Abbildung 3.24 sind graphische Darstellungen zweier exemplarischer alignments gezeigt, die

mit dem Programm „Integrative Genomics Viewer“ (www.broadinstitute.org/igv/) aus den

Amplikonsequenzierungen der einzelnen Zellen und der Sequenzierung von trigeminalem Gewebe

erzeugt wurden.

77

Ergebnisse

Abbildung 3.24: Exemplarische alignments sequenzierter Transkripte aus Amplikonsequenzierungen

einzelner Zellen und der Trigeminus-Explantatsequenzierung an das Genom der Maus (mm9). Mit Gapdh

ist ein Beispiel für ein stark exprimiertes, mit Ldha ein Beispiel für ein schwächer exprimiertes

housekeeping-Gen dargestellt. Dick blaue Abschnitte markieren Exone des entsprechenden Gens im

Genom. Vereinzelt sind die alignments so tief gestapelt, dass nur ein Teil der Fragmente abgebildet werden

kann.

Im linken Teil ist mit Gapdh ein Beispiel für ein stark exprimiertes housekeeping-Gen gezeigt, für

das bei den Einzelzelltranskriptomen zwischen 88 und 321 Fragmente gemappt werden konnten,

die FPKM-Werte zwischen 118 und 1080 ergaben. Bei der Trigeminussequenzierung wurden

einige tausend reads gemappt, es ergab sich ein FPKM-Wert von 22,5. Dunkelgraue

Sequenzabschnitte stellen gemappte Fragmente dar, die einem Exon im Genom, blau dargestellt,

zugeordnet wurden. Bei stark exprimierten Genen konnten meist an allen Exonen Fragmente

gemappt werden. Auf der rechten Seite ist mit Ldha ein Beispiel für ein in den Einzelzelltranskrip-

tomen schwach exprimiertes housekeeping-Gen dargestellt. Für dieses Gen wurden bei den

einzelnen Zellen zwischen 1 und 37 Fragmente gemappt, die FKPM-Werte zwischen 1 und 38

78

Ergebnisse

ergaben. Es konnten hier nicht an allen Exonen Fragmente gemappt werden. Bei der Trigeminus-

Explantatsequenzierung wurden wieder einige tausend reads gemappt. Durch die ebenfalls sehr

hohe Gesamtanzahl gemappter reads bei dieser Sequenzierung ergab sich hier ein FPKM-Wert

von etwa 33, der in ähnlicher Größenordnung liegt, wie bei den Amplikonsequenzierungen. Dies

verdeutlicht die Abhängigkeit des FPKM als relatives Expressionsmaß von der Gesamtzahl der

gemappten reads.

3.3.1 Vergleich der Transkriptome neuronaler Gewebe und einzelner Nikotin-responsiver

Neurone

Um die große Menge an Expressionsdaten aus acht verschiedenen Transkriptomen betrachten zu

können, wurden FPKM-Werte in Expressionsklassen dargestellt, die bei aufsteigender

Expressionsstärke mit zunehmenden Farbintensitäten kodiert sind. Es wurden damit heatmaps

aufgetragen, die sowohl einen direkten Vergleich der Expressionen zwischen verschiedenen

Genen innerhalb eines Transkriptoms als auch zwischen verschiedenen Transkriptomen - bezogen

auf ein Gen - ermöglichen. Bei den Einzelzelltranskriptomen wurden zusätzlich die absoluten

Zahlen gemappter Transkripte angegeben.

Die Expression einer Vielzahl Liganden-gesteuerter Ionenkanäle, TRP-Kanäle und KCNK-Kanäle im

Trigeminus ist bekannt. Viele dieser Kanäle werden mit chemosensorischen Prozessen in

Verbindung gebracht. Daher wurde insbesondere die Expression der Gene dieser drei

Ionenkanalfamilien in Trigeminus, DRG und Gehirn im Vergleich zu den einzelnen Zellen in der

Darstellung als heatmaps betrachtet.

3.3.1.1 Expression von housekeeping-Genen

Vor der Beurteilung der Expression erwähnter Ionenkanäle wurde zunächst die Expression

sogenannter housekeeping-Gene betrachtet (Abb. 3.25). Diese Gene sind dafür bekannt, dass ihre

Expression über verschiedene Gewebetypen hinweg verhältnismäßig geringen Schwankungen

unterliegt, da ihre Genprodukte in der Regel allgemeine Funktionen für den Zellstoffwechsel

haben (Barber et al., 2005; Kouadjo et al., 2007; Zhou et al., 2010). Die Gene Actb, Gapdh und

Ppia sind bei den Einzelzelltranskriptomen besonders stark exprimiert. Dies trifft bei den Proben

der Explantate und dem RNA-Standard insbesondere auch auf Actb zu. Gapdh und Ppia sind auch

in DRG und Trigeminus, im Gehirn jedoch wesentlich schwächer exprimiert. Ldha und Ubc sind

allgemein schwächer, jedoch in den meisten Proben in ähnlicher Größenordnung exprimiert. Die

Gene Rpl5, Rpl19 und Rpl29 sind in den Einzelzellen stärker exprimiert.

79

Ergebnisse

Insbesondere Rpl19 und Rpl29 scheinen in den Explantaten kaum exprimiert zu sein. Im

Gegensatz dazu ist Hprt in den Explantaten hoch, jedoch in drei der vier Einzelzellen gar nicht und

in Zelle 2-2 nur schwach exprimiert.

Mit Tubb3 (Beta-3-Tubulin) ist ein Gen dargestellt, dass in Neuronen stark exprimiert wird, die

gerade Ausläufer bilden (Jiang et al., 1994a; b; Kost und Oblinger, 1993). Dieses Gen wird in allen

Explantaten exprimiert, jedoch konnte in den Einzelzellproben kein Fragment gefunden werden.

Cnp (CNPase) wird spezifisch in Oligodendrozyten und Schwann-Zellen exprimiert (Chandross et

al., 1999; Nishizawa et al., 1985; Radtke et al., 2011; Sprinkle, 1989; Trapp et al., 1988). Da erstere

im Gehirn und letztere in den DRG und dem Trigeminus vorkommen, wird das Gen in den

entsprechenden Proben exprimiert. In drei der vier Einzelzelltranskriptome ist Cnp

erwartungsgemäß nicht exprimiert. In Zelle 6-1 konnte lediglich 1 Fragment festgestellt werden.

Dies ist ein starker Hinweis, dass keine Kontamination der isolierten Proben durch RNA aus

Schwann-Zellen der Zellkultur auftrat. In der trigeminalen Zellkultur finden sich zumeist neben

intakten Zellen auch Zelltrümmer und vermutlich auch RNA zerstörter Schwann-Zellen, die jedoch

während der Messungen vom permanenten Flüssigkeitsstrom des Extrazellulärmediums stark

verdünnt, beziehungsweise fortgespült werden. Offenbar hat hier keine Kontamination der Probe

mit freier RNA untergegangener Zellen stattgefunden.

Zusammengefasst ist die Expression der housekeeping-Gene in Trigeminus und Einzelzell-

transkriptomen tendenziell ähnlich, jedoch wurden zwischen den einzelnen Neuronen größere

Schwankungen festgestellt als zwischen den verschiedenen Geweben. Ein nennenswerter

Expressionsunterschied zwischen blockierbaren und nicht blockierbaren Neuronen konnte nicht

festgestellt werden.

80

Ergebnisse

Abbildung 3.25: Heatmap der

Expressionsstärken untersuchter Trans-

kriptome für eine Auswahl von

housekeeping-Genen.

Die acht Expressionsklassen wurden durch

FPKM-Intervalle festgelegt. Bei den

Einzelzelltranskriptomen ist zusätzlich für

jedes Gen die absolute Anzahl gemappter

Transkripte angegeben. Zellen 5-1 und 6-1

sind Nikotin-responsiv, nicht Hex, HC

geblockt, Zellen 2-1 und 2-2 sind Nikotin-

responsiv, Hex, HC geblockt.

Gapdh: Glycerinaldehyd-3-Phosphat-

Dehydrogenase; Tubb3: Beta-3-Tubulin;

Ldha: Lactatdehydrogenase A; Actb: Beta-

Actin; Ubc: Ubiquitin C; Ppia: Peptidyl-

Prolyl-Isomerase; Tbp: TATA-Box

bindendes Protein; Hprt: Hypoxanthin-

Guanin-Phosphoribosyltransferase; Rpl:

Ribosomales Protein L; Cnp: Cyclic-

nucleotide-phosphodiesterase. Die

Transkriptomanalysen von DRG und

Trigeminus-Explantat erfolgten in

Zusammenarbeit mit Ramona Lehmann.

3.3.1.2 Expression der Cys-loop-Rezeptoren

In einer ersten Betrachtung der Expression der Subfamilien der Cys-loop Rezeptoren wurde

festgestellt, dass eine Vielzahl der 16 untersuchten Untereinheiten (α1-7, α9, 10, β1-4, γ, δ, ε) der

nikotinischen Acetylcholinrezeptoren in allen untersuchten Geweben exprimiert wird (Abb. 3.25

links). Im Gehirn sind α2-7 exprimiert, davon α4 am stärksten. Im Trigeminus und den DRG sind

α3, 4, 6 und 7 exprimiert, davon in den DRG α6 und 7 deutlich. Im Trigeminus ist die α7

Untereinheit am stärksten exprimiert, was sich auch im trigeminalen RNA-Standard

wiederspiegelt. Erstaunlicherweise wurden beim Trigeminus auch Fragmente der muskulären α1

Untereinheit festgestellt. In allen Proben der Explantate konnten β1-4 nachgewiesen werden,

wobei β2 am stärksten exprimiert wird. Auch hier wurden Fragmente der muskulären β1

Untereinheit festgestellt, jedoch konnte keine Expression der muskulären γ, δ, ε Untereinheiten


81

Ergebnisse

Die Nikotin-responsiven Neurone unterschieden sich im Calcium-Imaging in der Blockierbarkeit

ihrer Antwort durch ein Blockergemisch mit dem nAChR-Blocker Hexamethonium. Die Antwort

der Zellen 2-1 und 2-2 ließ sich blocken, was auf die Expression von nAChR hinweist. Dies konnte

mit einer Expression von α4, β2 und β4 zumindest für die Zelle 2-1 festgestellt werden. Bei den

nicht blockierbaren Zellen 5-1 und 6-1 erwartet man hingegen keine Expression nikotinischer

Acetylcholinrezeptoren. In beiden Zellen wurde jedoch eine sehr schwache Expression von β4, in

Zelle 5-2 zusätzlich α4 - sehr schwach exprimiert - festgestellt. In jeder einzelnen Zelle wurde

außerdem die muskuläre Untereinheit α1, in Zelle 5-1 auch β1 nachgewiesen, wohingegen γ, δ

und ε nicht vorkamen.

Von 5-HT3-Rezeptoren ist die Expression der Untereinheiten A und B im Trigeminus bekannt. Die

Expression beider Untereinheiten wurde im Gehirn und in den DRG festgestellt, jedoch ist die

Expression im Trigeminus wesentlich höher (Abb. 3.26 links). In keiner der einzelnen Neurone

konnten 5-HT3-Rezeptoren nachgewiesen werden.

Für die meisten GABA-Rezeptoruntereinheiten (α1-6, β1-3, γ1-3 und δ) wurde deutliche

Expression im Gehirn festgestellt, ε, θ und ρ2 sind schwach exprimiert (Abb. 3.25 rechts). In den

DRG und dem Trigeminus ist die exprimierte Vielfalt geringer, es sind α1, 2, β3 und γ2 deutlich

exprimiert. Zusätzlich konnten im Trigeminus α3 und 5, sowie β1, β2 und y1 nachgewiesen

werden. Im trigeminalen RNA-Standard spiegelt sich die hohe Expression dieser Untereinheiten

wieder. Ebenfalls sind α2 und 5 β3 und γ2 stark exprimiert, denn insbesondere die Untereinheiten

α2, β3 und γ2 sind an Bildung vieler Untereinheitenkombinationen von GABA-Rezeptoren

beteiligt. So wird auch α2 in vier der Einzelzelltranskriptome, β2 in den Zellen 2-1 und 2-2, sowie

γ2 auch in Zelle 2-1 nachgewiesen. In dieser kommen auch zusätzlich α3 und ρ3 vor. Lediglich eine

der vier Einzelzelltranskriptome (Zelle 2-1) zeigt für GABA-Rezeptoren tendenziell ähnliche

Expressionsschwerpunkte, wie man sie im Trigeminus-Explantat feststellen kann.

Glycin ist als inhibitorischer Transmitter insbesondere im Rückenmark bekannt. Glycinrezeptoren

werden aber auch im Gehirn exprimiert (Abb. 3.26 rechts). Die Expressionsdaten bestätigen dies

hier für alle fünf Untereinheiten, wobei α1 und 2, sowie die β-Untereinheit besonders stark

exprimiert sind. In den DRG wurde neben einer sehr schwachen Expression von α4 keine weitere

α-Untereinheit festgestellt, β hingegen ist stark exprimiert. Für den Trigeminus konnte bisher die

Expression einer α-Untereinheit der Glycinrezeptoren nicht nachgewiesen werden.

82

Ergebnisse

Abbildung 3.26: Heatmap der Expressionsstärken untersuchter Transkriptome für die Cys-loop-Kanäle.

Die sechs Expressionsklassen wurden durch FPKM-Intervalle festgelegt. Bei den Einzelzelltranskriptomen ist

zusätzlich für jedes Gen die absolute Anzahl gemappter Transkripte angegeben. Zellen 5-1 und 6-1 sind

Nikotin-responsiv, nicht Hex, HC geblockt, Zellen 2-1 und 2-2 sind Nikotin-responsiv, Hex, HC geblockt. Die

Transkriptomanalysen von DRG und Trigeminus-Explantat erfolgten in Zusammenarbeit mit Ramona

Lehmann.

83

Ergebnisse

Die Expressionsergebnisse bestätigen diese Abwesenheit mit der Ausnahme einer sehr schwachen

Expression von α2. β hingegen wird sowohl in den DRG als auch im Trigeminus deutlich

exprimiert, was durch den trigeminalen RNA-Standard bestätigt wird. In den

Einzelzelltranskriptomen von Zelle 2-1 und 2-2 konnten β-Untereinheiten festgestellt werden,

jedoch keine Expression einer α-Untereinheit bestätigt werden. Über die untersuchten

Transkriptome hinweg wird ein deutlicher Überschuss der β-Untereinheit deutlich.

3.3.1.3 Expression der TRP-Kanäle

Bei den TRP-Kanälen ist insbesondere die Expression der Thermo-TRPs von Interesse. Für den

durch Nikotin aktivierbaren TRPA1-Kanal ist die Expression in chemosensorischen afferenten

Ganglien - wie den DRG und dem trigeminalen Ganglion - bekannt. Die Expressionsdaten dieser

beiden Transkriptome bestätigen dies (Abb. 3.27). In den DRG und im Trigeminus gehört TRPA1 zu

den deutlich exprimierten TRP-Kanälen. Für das Gehirn konnte keine Expression festgestellt

werden. Bei zwei der einzelnen Zellen, Zellen 2-1 und 2-2, konnten im vorangegangenen Calcium-

Imaging die Nikotinantworten durch ein Blockergemisch aus Hexamethonium und dem

spezifischen TRPA1-Blocker HC030031 geblockt werden. Dieser Block der Antwort wäre durch die

Expression des TRPA1-Kanals erklärbar. In keinem der vier Einzelzelltranskriptome konnte jedoch

ein TRPA1-Transkript festgestellt werden.

Bei den TRPM-Kanälen 1-8 fällt insbesondere die starke Expression des TRPM8 im Trigeminus ins

Auge. Obwohl TRPM2-4 und TRPM7 im Trigeminus exprimiert sind, scheint TRPM8 der bei

Weitem am stärksten exprimierte TRP-Kanal im Trigeminus zu sein. In den DRG wurden ebenfalls

M2-4 und M7 festgestellt, M8 wird auch in den DRG exprimiert, fehlt jedoch im Gehirn. In den

Einzelzelltranskriptomen konnte bei keiner Zelle ein TRPM8-Fragment gemappt werden,

allerdings wurde in Zelle 2-1 eine sehr starke Expression von TRPM2 und M3 festgestellt.

Von den Vanilloid-Rezeptoren TRPV1-6 sind insbesondere V1 und V2 in den DRG und dem

Trigeminus stark exprimiert, wohingegen V3-6 sehr schwach bis gar nicht exprimiert wurde. V2

und V4 werden im Gehirn deutlich exprimiert. Für V1 konnte jedoch kein Fragment gemappt

werden. In den Einzelzelltranskriptomen konnte keine Expression für Vanilloidrezeptoren


Die TRPC-Kanäle 1-7 sind grundsätzlich alle im Gehirn exprimiert, wobei C1, C3 und C7 am

deutlichsten exprimiert sind. In den DRG und im Trigeminus sind C6 und ebenfalls C1 und C3

deutlich exprimiert, C2, C4, C5 und C7 sehr schwach bis gar nicht. Bei den

Einzelzelltranskriptomen konnte lediglich ein Transkript für TRPC1 in Zelle 2-1 gemappt werden,

84

Ergebnisse

ansonsten wurde kein TRPC exprimiert. Allgemein zeigt der trigeminale RNA-Standard eine

wesentlich geringere Expression von TRP-Kanälen.

Deutlich exprimiert waren jedoch TRPM3, M7, M8 und TRPV2 (Abb. 3.27).


Expressionsstärken untersuchter

Transkriptome für die TRP-Kanäle. Die

sechs Expressionsklassen wurden durch

FPKM-Intervalle festgelegt. Bei den

Einzelzelltranskriptomen ist zusätzlich für

jedes Gen die absolute Anzahl gemappter

Transkripte angegeben. Zellen 5-1 und 6-1

sind Nikotin-responsiv, nicht Hex, HC

geblockt, Zellen 2-1 und 2-2 sind Nikotin-

responsiv, Hex, HC geblockt. Die

Transkriptomanalysen von DRG und

Trigeminus-Explantat erfolgten in

Zusammenarbeit mit Ramona Lehmann.

85

Ergebnisse

3.3.1.4 Expression der KCNK-Kanäle

Von den KCNK-Kanälen scheinen im Gehirn fast alle Kanäle von KCNK1-15 exprimiert zu sein,

KCNK16 und 18 fehlen (Abb. 3.28). Die deutlichste Expression findet sich bei KNCK1-4, KCNK9, 12

und 13. In den DRG und im Trigeminus liegt der Expressionsschwerpunkt bei KCNK1-3, KCNK5,

KCNK10-13 und KCNK18. Dies bestätigt sich auf einer generell niedrigeren Expressionsebene am

trigeminalen RNA-Standard. Bei den Einzelzelltranskriptomen konnte in Zelle 5-1 eine starke

Expression von KCNK1 festgestellt werden, im Transkriptom von Zelle 2-1 wurde ein einzelnes

Fragment für KNCK6 gemappt. Ansonsten wurde für keine weiteren KCNK-Kanäle eine Expression

nachgewiesen.


Expressionsstärken untersuchter

Transkriptome für die KCNK-Kanäle.

Die sechs Expressionsklassen wurden

durch FPKM-Intervalle festgelegt. Bei

den Einzelzelltranskriptomen ist

zusätzlich für jedes Gen die absolute

Anzahl gemappter Transkripte

angegeben. Zellen 5-1 und 6-1 sind

Nikotin-responsiv, nicht Hex, HC

geblockt, Zellen 2-1 und 2-2 sind

Nikotin-responsiv, Hex, HC geblockt.

Die Transkriptomanalysen von DRG

und Trigeminus-Explantat erfolgten in

Zusammenarbeit mit Ramona

Lehmann.

86

Ergebnisse

3.3.2 Differentielle Expressionen zwischen einzelnen Nikotin-responsiven Zellen

Unter den Einzelzelltranskriptomen sind die der Neurone 5-1 und 6-1 besonders interessant, weil

ihre Antwort im Calcium-Imaging weder vom nAChR-Antagonist Hexamethonium, noch durch den

TRPA1-Antagonist HC030031 geblockt werden konnten. Aus den gleichen Zellkulturen wurden die

Neurone 2-1 und 2-2 entnommen, deren Antworten durch die Antagonisten geblockt werden

konnten. In einem Vergleich der Transkriptome beider Neuronentypen sollten daher exklusiv in

nicht blockierbaren Neuronen deutlich exprimierte Transkripte identifiziert werden, durch die die

Nikotinantworten vermittelt werden. Zuvor wurde eine minimale Expressionsstärke festgelegt,

um sehr schwach exprimierte Transkripte aus der Betrachtung zu entfernen. Dazu wurden alle

untersuchten Transkriptome zunächst in der Reihenfolge von stärkstem zum schwächsten

Transkript gegen die fortlaufende Nummer aufgetragen. In diesem Histogramm (Abb. 3.29) wird

erkennbar, dass bei den Transkriptomen der Explantate eine sehr große Menge an Transkripten

(3500-4000) noch mit einem niedrigen FPKM < 1 festgestellt werden, was der flachere Verlauf der

Kurven andeutet.

Abbildung 3.29: Darstellung der Expressionsstärke untersuchter Transkriptome als Histogramm.

87

Ergebnisse

Auch beim trigeminalen RNA-Standard verläuft die Kurve ähnlich. Es werden insgesamt weniger

Transkripte festgestellt, jedoch trotzdem noch viele (~3500) mit einem FPKM < 1. Die Kurven der

Einzelzelltranskriptome enden abrupter. Unterhalb des FPKM-Wertes von 1 knickt der Verlauf bei

den Zellen 2-1 und 2-2 stark, bei Zellen 5-1 und 6-1 leicht ab, was zeigt, dass ein FPKM < 1 in den

Einzelzelltranskriptomen für wesentlich weniger (zwischen 200-800) Transkripte festgestellt wird.

Die minimale Expressionsstärke wurde daher bei einem FPKM von 1 festgelegt und somit die am

schwächsten exprimierten 200-800 Gene aus der Betrachtung ausgenommen.

Da die Zellen 5-1 und 2-2 sowie die Zellen 6-1 und 2-1 jeweils eine nicht geblockte und eine

geblockte Zelle aus demselben Versuchsdurchlauf sind, wurden sie miteinander verglichen. Mit

einem FPKM > 1 wurde bei einer Gesamtzahl von 3101 exprimierten Genen in Zelle 5-1 eine

Anzahl von 2425 exklusiv exprimierter Gene festgestellt. Bei Zelle 6-1 wurde mit 1895

exprimierten Genen mit einem FPKM > 1 eine Anzahl von 1244 exklusiv exprimierter Gene

festgestellt (Abb. 3.30 oben). Ein Großteil dieser Gene kodiert für Proteine des Zellstoffwechsels

und Strukturproteine. Gene, die für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Ionenkanäle kodieren,

sind in Tabelle 3.3 in absteigender Expressionsstärke gelistet. Die Liste zeigt, dass in den

untersuchten Zellen eine große Vielfalt Transmembranproteine vorliegt, zu denen in beiden Zellen

auch stark exprimierte olfaktorische Rezeptoren (OR) gehören. Unter diesen Genen kann sich

auch ein weiterer unbekannter Rezeptor für Nikotin befinden, was jedoch schwer zu überprüfen

ist. Mit 75 gemappten reads ist in Zelle 5-1 Olfr293 das stärkste exklusiv exprimierte

Transmembranprotein. Tabelle 3.4 zeigt die Expression aller olfaktorischer Rezeptoren in allen

untersuchten einzelnen Zellen. Zum Vergleich sind für jeden exprimierten Rezeptor auch die

FPKM-Werte des RNA-Standards und des Trigeminus-Explantats angegeben. Es wurden einige

Rezeptoren als nicht exprimiert gewertet, deren Expression auf der Zuordnung sequenzierter

Fragmente an repetitive Sequenzabschnitte beruht. Da solche Sequenzabschnitte mehrfach im

Genom der Maus vorkommen, ist eine eindeutige Zuordnung des Fragments zu einem einzigen

Exon im Genom nicht möglich. Jede Zelle hat offenbar ein individuelles Expressionsprofil

unterschiedlicher olfaktorischer Rezeptoren. Dabei sind bei Zelle 2-1 mit 26 OR besonders viele

exprimiert, Zelle 5-1 exprimiert 6 OR, Zelle 6-1 und 2-2 nur einen OR. In Zelle 5-1 übertrifft

allerdings die Expression des Olfr293 die der anderen bei Weitem. Die Expression dieses

Rezeptors sowie der olfaktorischen Rezeptoren in Zellen 2-2 und 6-1 konnten entweder mit den

Ergebnissen für RNA-Standard oder für Trigeminus-Explantat zumindest auf niedriger

Expressionsebene bestätigt werden. Bei Zelle 2-1 ist kein Rezeptor besonders stark exprimiert

oder übertrifft die anderen stark in der Expression. Es wird auch lediglich die Expression zweier

Rezeptoren (Olfr1340, Olfr341) im Trigeminus-Explantat festgestellt.

88

Ergebnisse

Es wurde daneben eine gemeinsame Expression von 767 Genen zwischen den blockierbaren

Zellen 5-1 und 6-1 ermittelt (Abb. 3.30 unten). Diese beiden Zellen haben damit höhere

Übereinstimmungen im Transkriptom als zwischen 5-1 und 2-2 sowie 6-1 und 2-1 vorliegen. Es

wurde unter diesen gemeinsam exprimierten Genen ebenfalls nach G-Protein-gekoppelten

Rezeptoren und Ionenkanälen gesucht und mit Gpr137 lediglich ein Gen für einen G-Protein-

gekoppelten Rezeptor gefunden. Dieser wird jedoch in beiden Zellen von vielen anderen

Rezeptoren in der Expressionsstärke bei Weitem übertroffen.

Abbildung 3.30: Vergleich der Anzahl exprimierter Gene der Einzelzelltranskriptome. Es wurden

ausschließlich Gene gewertet, die mit einem FPKM > 1 exprimiert wurden. Schnittmengen zeigen die Anzahl

der Gene, die in beiden verglichenen Zellen exprimiert wurden. Zusätzlich ist die Gesamtzahl in einer Zelle

exprimierter Gene (Summe von Schnittmenge und jeweiliger Restmenge der exklusiv exprimierten Gene) zu

jeder Zelle angegeben.

89

Ergebnisse

gene_id Gen FPKM Zelle

5-1

Frag-

mente

gene_id Gen FPKM

Zelle 6-1

Frag-

mente

NM_001011752 Olfr293 114.8 75 NM_008310 Htr1f 25.17 30

NM_025791 Tmem223 84.03 40 NM_001005227 Olfr1200 24.66 13

NR_028418 Tmem179b 67.02 15 NM_008963 Ptgds 17.85 7

NM_147029 Olfr1120 53.89 28 NM_026582 Wls 14.75 24

NM_144534 Tmem38a 45.86 31 NM_001177362 Gpr137 7.46 6

NM_025460 Tmem126a 45.74 19 NM_013582 Lhcgr 5.85 9

NM_023671 Clns1a 32.07 28 NM_007937 Epha5 3.62 18

NM_133189 Cacng7 29.74 12 NM_001081405 Vmn2r28 3.61 6

NM_011695 Vdac2 27.33 27

NM_009601 Chrnb1 25.59 31

NM_008536 Tm4sf1 21.79 24

NM_146982 Olfr1257 21.61 11

NM_026211 Tmed9 17.13 15

NM_207567 Olfr1198 15.78 8

NM_019631 Tmem45a 14.25 17

NM_008430 Kcnk1 14.23 21

NM_010098 Opn3 14.08 14

NM_175502 Tmem74 13.47 12

NM_009630 Adora2a 10.37 14

NM_026145 Kctd10 9.84 19

NM_001011867 Olfr538 9.78 5

NM_001159392 Tnfaip1 8.93 22

NM_009144 Sfrp2 7.92 10

NM_001033271 Tmem55b 7.81 21

NR_033648 Vmn2r-ps129 7.78 11

NM_146498 Olfr490 7.69 4

NM_008169 Grin1 7.55 16

NM_178751 Orai2 6.63 17

NM_172671 Lgr4 5.85 17

NM_175519 Kctd8 5.29 10

NM_018733 Scn1a 5.16 37

NM_133683 Tmem19 5.07 10

NM_025781 Tmem170 4.91 6

NM_001008497 P2ry14 4.85 5

NM_176996 Smo 4.14 11

NM_032397 Kcnn1 4.07 11

NM_144830 Tmem106a 4.06 6

NM_001044741 Cacnb3 3.46 6

NM_144936 Tmem45b 3.11 4

NM_033444 Clic1 2.98 3

NM_010934 Npy1r 2.54 5

NM_029722 Gje1 2.42 4

NM_010348 Grik1 1.69 4

NM_153059 Tmem5 1.21 1

NM_009219 Sstr4 1.2 1

NM_001177362 Gpr137 1.16 1

90

Ergebnisse

gene_id Gen FPKM Zelle

5-1

Frag-

mente

gene_id Gen FPKM

Zelle 6-1

Frag-

mente

NM_013885 Clic4 1.1 3

NM_145987 Tmem82 1.08 1

Tabelle 3.3: Auflistung exklusiv exprimierter Transmembranproteine für die Zellen 5-1 und 6-1.

gene_id OR Zelle 2-1 Zelle 2-2 Zelle 5-1 Zelle 6-1 Strd TG

FPKM reads FPKM reads FPKM reads FPKM reads FPKM FPKM

NM_146923 Olfr20 14.11 4

NM_146313 Olfr145 18.99 4

NM_001011807 Olfr191 38.15 8

NM_001011752 Olfr293 114.84 75 1.20

NM_001011750 Olfr294 38.73 9

NM_146376 Olfr323 4.51 1

NM_146950 Olfr341 7.04 2 0.02

NM_146943 Olfr347 2.35 1

NM_146859 Olfr371 14.13 3

NM_146922 Olfr376 1.98 1

NM_146710 Olfr398 14.01 4

NM_146498 Olfr490 7.70 4

NM_001011867 Olfr538 9.78 5

NM_147079 Olfr547 18.81 4

NM_147101 Olfr549 4.63 1

NM_207146 Olfr670 14.13 3

NM_001011809 Olfr728 81.85 19 0.08

NM_146564 Olfr836 13.83 3

NM_147029 Olfr1120 53.89 28

NM_146660 Olfr1135 9.50 2

NM_146639 Olfr1138 4.73 1

NM_146650 Olfr1166 1.21 1

NM_146294 Olfr1167 3.86 2

NM_146532 Olfr1170 25.48 7

NM_207567 Olfr1198 15.78 8

NM_001005227 Olfr1200 24.66 13 1.20

NM_146982 Olfr1257 21.61 11

NM_001011856 Olfr1331 10.77 3

NM_207157 Olfr1333 10.77 3

NM_207703 Olfr1335 1.43 1

NM_146304 Olfr1340 13.96 3 0.03

NM_001199840 Olfr1354 11.65 7

NM_207571 Olfr1355 7.33 1

NM_001011737 Olfr1357 7.23 2

Tabelle 3.4: Auflistung der in den einzelnen Zellen exprimierten olfaktorischen Rezeptoren (OR). Zum

Vergleich ist die Expression für die entsprechenden Rezeptoren im RNA-Standard (Strd) und Trigeminus (TG)

angegeben.

91

Diskussion

4. Diskussion

4.1 Charakterisierung der stereospezifischen Wirkung von Nikotin auf nAChR und TRPA1

Im Rahmen dieser Arbeit habe ich mit elektrophysiologischen Experimenten die Wirkung von

Nikotin in seinen beiden stereoisomeren Erscheinungsformen auf verschiedene ionotrope

Rezeptoren untersucht. Im Fokus dieser Untersuchungen standen insbesondere die Rezeptoren

der Klasse der Liganden-gesteuerten Ionenkanäle und der TRP-Kanäle, die im Trigeminus

exprimiert sind. Bisher sind zwei ionotrope Rezeptortypen bekannt, die durch Nikotin aktiviert

werden können. Zum einen sind dies nikotinische Acetylcholinrezeptoren, zum anderen der

TRPA1-Kanal. Es ist bekannt, dass diese einerseits als maßgebliche Rezeptoren bei der

chemosensorischen Wahrnehmung von Nikotin fungieren, aber andererseits auch rekombinant

exprimiert in elektrophysiologischen Experimenten durch Nikotin aktiviert werden können

(Talavera et al., 2009; Thuerauf et al., 1999; Walker et al., 1996).

In der Familie der nAChR gibt es – wie in der Einleitung erwähnt – zwei verschiedene

Rezeptortypen: homo- und heteromere Rezeptoren. Es wurden deshalb α7 als Beispiel eines

homomeren Rezeptors mit starker Expression im Trigeminus (Liu et al., 1998) und α2β4 als

Beispiel eines heteromeren Rezeptors untersucht (3.1.2). Für die Untersuchung heteromerer

nAChR wären α4β2 und α3β4 interessantere Kandidaten gewesen, da diese Kombinationen sehr

deutlich im Trigeminus nachgewiesen worden sind (Flores et al., 1996). Die Expression dieser

Rezeptoren in Xenopus-Oozyten schlug jedoch fehl.

Bei Radioliganden-Bindungsstudien wurde hinsichtlich der Aktivierung von nAChR eine gewisse

Stereoselektivität für das (-)-Enantiomer von Nikotin festgestellt (Khan et al., 1994; Sloan et al.,

1985). Allerdings wurde eine Aktivierung heterolog exprimierter menschlicher nAChR durch (+)-

Nikotin mit elektrophysiologischen Methoden noch nicht gezeigt. Im Beispiel des nAChR α7 des

Haushuhns wurde eine Aktivierung durch (+)-Nikotin jedoch von Amar et al. (1993)

elektrophysiologisch im Voltage-Clamp Verfahren nachgewiesen. Die Autoren stellten allerdings

mit EC50-Werten von 24 ± 0,7 µM für (-)-Nikotin und 45 ± 1 µM für (+)-Nikotin eine nur geringe

Stereoselektivität fest. Ich habe in dieser Arbeit die Stereoselektivität für (+/-)-Nikotin beim

menschlichen α7 nAChR untersucht und einen EC50 von 519 ± 189 µM ermittelt. Die von

ChavezNoriega et al. (1997) publizierten Werte für (-)-Nikotin (113 µM) und Acetylcholin (180 µM)

wurden ebenfalls mittels Voltage-Clamp an Xenopus-Oozyten ermittelt und sind deshalb mit

meinen Ergebnissen vergleichbar. Ich habe erwartungsgemäß festgestellt, dass der EC50 für

(+)-Nikotin höher ist. Aus beiden letztgenannten Studien wird außerdem klar, dass (-)-Nikotin für

92

Diskussion

α7 beider Spezies eine höhere pharmakologische Potenz besitzt als Acetylcholin. Amar et al.

(1993) stellten zudem auch bei (+)-Nikotin für α7 eine höhere Potenz als Acetylcholin fest, was

den Ergebnissen dieser Arbeit entsprechend nicht für den menschlichen nAChR α7 gilt. In meinen

Ergebnissen wird zusätzlich deutlich, dass die Maximalwirkung für (-)-Nikotin am menschlichen

nAChR α7 über 6-mal größer ist als die von (+)-Nikotin. Die Autoren der letztgenannten Studie

fanden diesbezüglich beim nAChR α7 des Haushuhns hingegen keinen nennenswerten

Unterschied. Die Stereoselektivität für (-)-Nikotin scheint bei den nAChR α7 von Huhn und

Mensch unterschiedlich stark ausgeprägt zu sein. Zwischen den Extrazellulärdomänen von

menschlichem α7 und jenem der Ratte besteht eine Gemeinsamkeit von 91-99% (ChavezNoriega

et al., 1997). Galzi et al. (1991) zeigten, dass in diesem Bereich schon der Austausch einer einzigen

Aminosäure zu massiven Veränderungen der Pharmakologie führt. Die festgestellte

Stereoselektivität am menschlichen nAChR α7 passt näherungsweise zu der aus Radioliganden-

Bindungsstudien am Gehirn der Ratte bekannten 10-fach höheren Bindungsaffinität für (-)-

Nikotin, obwohl dabei eine Zuordnung zu einem Rezeptortyp nicht möglich ist (Sloan et al., 1985).

Die für den nAChR α7 im Voltage-Clamp aufgezeichneten Stromantworten zeigten eine schnelle

Desensitisierung. Hierbei geht die Stromantwort noch während der Applikation des Agonisten

zurück, was die Messung der Maximalstromamplitude erschwert. Die von ChavezNoriega et al.

(1997) aufgezeichneten α7-vermittelten Ströme und die für den nAChR α7 des Haushuhns (Amar

et al., 1993) publizierten, zeigten ebenso eine starke Desensitisierung. Auch diese Konzentrations-

Wirkungsbeziehungen wurden mit ähnlich stark desensitisierenden Stromantworten erstellt,

wobei die Autoren darauf hinwiesen, dass Maximalamplituden möglicherweise zu klein gemessen

werden. Nach Wagner et al. (2004) ist mit einer Unterschätzung der Maximalamplitude

grundsätzlich im Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp an Xenopus-Oozyten zu rechnen, da die

Konzentration des Agonisten während der Applikation nur langsam bis zur Zielkonzentration

ansteigt. Bei der benutzten manuellen Applikationsmethode wird ein Austausch der gesamten

Messkammerflüssigkeit in einem Zeitraum von maximal einer Sekunde erreicht. Innerhalb dieses

Zeitraumes erreicht auch die Agonistenkonzentration die maximale Konzentration. Während

dieser Zeit setzt aber bereits eine Desensitisierung ein, die dazu führen kann, dass die gemessene

Stromamplitude kleiner als die tatsächliche Maximalamplitude ist und dabei ermittelte

pharmakologische Kenngrößen wie den EC50 und den maximalen Effekt beeinflusst. Dieser

desensitisierende Effekt ist von der pharmakologischen Affinität des Liganden zum Rezeptor und

der applizierten Agonistenkonzentration abhängig. Bei Agonisten mit niedriger Affinität zum

Rezeptor fällt der Effekt nicht stark ins Gewicht. Mit steigender Konzentration steigt auch die

Desensitisierung und damit der Messfehler im Verlauf der Konzentrations-Wirkungskurve.

93

Diskussion

Diesen Effekt kann man nur mit Einzelkanalmessungen gänzlich ausschließen. Die für (+)-Nikotin

festgestellten Stromamplituden bei nAChR α7 sind jedoch wesentlich kleiner als die für (-)-Nikotin

und ACh festgestellten Amplituden, sodass ausgeschlossen werden kann, dass der Effekt auf

Desensitisierung zurückgeht. Die Differenz der Maximalstromantworten von ACh und (+)-Nikotin

im Gegensatz zu ACh und (-)-Nikotin wurde als signifikant festgestellt.

Bei nikotinischen Acetylcholinrezeptoren sind auch β-Untereinheiten an der Bildung der

Agonistenbindestelle beteiligt (Corringer et al., 2000) und beeinflussen pharmakologische

Eigenschaften, wie die Spezifität für cholinerge Agonisten (Luetje and Patrick, 1991). Die Autoren

letzterer Studie haben gezeigt, dass eine Spezifität für Acetylcholin und Nikotin von der

Untereinheitenkombination abhängt. Dabei war α2β4 eine der Kombinationen mit höherer

Spezifität für Nikotin. Als Beispiel eines heteromeren Rezeptors habe ich in dieser Arbeit die

Kombination α2β4 mit Blick auf eine Stereoselektivität für Nikotin untersucht. Ähnlich den

Ergebnissen bei α7 wurde hier festgestellt, dass die Maximalwirkung für (-)-Nikotin beim

menschlichen nAChR α2β4 über 6-mal größer ist als von (+)-Nikotin. Auch für nAChR α2β4 wurde

in dieser Arbeit keine Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für (-)-Nikotin und Acetylcholin

ermittelt. Da die von ChavezNoriega et al. (1997) publizierten EC50-Werte für (-)-Nikotin (20,7 µM)

und Acetylcholin (82,5 µM) ebenfalls im Voltage-Clamp Verfahren an Xenopus-Oozyten gemessen

wurden, konnten sie mit dem in dieser Arbeit ermittelten Wert für

(+)-Nikotin (51 µM) verglichen werden. Es zeigt sich, dass α2β4 stereoselektiv für (-)-Nikotin ist

und in diesem Fall sogar (+)-Nikotin wie das (-)-Enantiomer eine höhere pharmakologische Potenz

hat als der natürliche Agonist Acetylcholin.

Die Reihenfolgen der pharmakologischen Potenz für beide untersuchten menschlichen

nikotinischen Acetylcholinrezeptoren lautet somit für die nAChR α7: (-)-Nik > ACh > (+)-Nik und für

die Untereinheitenkombination α2β4: (-)-Nik > (+)-Nik > ACh.

Vor einiger Zeit haben Talavera et al. (2009) (-)-Nikotin als einen Agonisten vom TRPA1-Kanal

identifiziert. Dies ist bis jetzt nach dem nAChR die zweite Entdeckung eines Ionenkanals, der durch

Nikotin aktiviert wird, jedoch untersuchten die Autoren nicht die Wirksamkeit des

(+)-Enantiomers und ließen somit die Frage offen, ob TRPA1 in Bezug auf Nikotin stereoselektiv

ist. Diese Frage habe ich in dieser Arbeit untersucht. In letztgenannter Studie wurden

rekombinant exprimierte menschliche TRPA1-Kanäle mit elektrophysiologischen Experimenten in

chinese hamster ovary-Zellen (CHO- Zellen) untersucht. Die festgestellte Maximalwirkung von (-)-

Nikotin entspricht dabei etwa einem Viertel der Maximalwirkung des Agonisten AITC. Um eine

relative Stromantwort in etwa dieser Höhe hervorzurufen, habe ich in dieser Arbeit am

menschlichen TRPA1-Kanal eine Konzentration von 10 mM beider Nikotinenantiomere appliziert.

94

Diskussion

Sowohl (-)- als auch (+)-Enantiomer sind partielle Agonisten, wobei sie bei der applizierten hohen

Konzentration die gleiche Wirkung haben, der Kanal also nicht stereoselektiv antwortet (3.1.7). Da

allerdings in der vorliegenden Arbeit keine Konzentrations-Wirkungs-Kurve bis zur Sättigung

vorgelegt werden konnte, ist ein Vergleich der pharmakologischen Potenz von (+)-Nikotin mit dem

von Talavera et al. (2009) ermittelten EC50-Wert (20-30 µM) für (-)-Nikotin nur bedingt möglich.

Allerdings zeigt schon die Tatsache, dass die Stromantworten bei einer Konzentration von 1000

µM (+)-Nikotin weniger als ein Drittel der Stromantworten bei 10 mM beträgt, dass der EC50-Wert

für (+)-Nikotin wesentlich größer als 1000 µM sein muss und sich somit stark von dem publizierten

unterscheidet. Der pharmakologische Unterschied beruht jedoch nicht nur in einer Verschiebung

der Konzentrations-Wirkungs-Kurve. Talavera et al. (2009) stellen für (-)-Nikotin bei

Konzentrationen größer als 1000 µM einen Block des Kanals fest, sodass bei 10 mM (-)-Nikotin

bereits keine Stromantwort mehr registriert werden kann. In dieser Arbeit konnte dieser Befund

nicht bestätigt werden. Im Gegenteil dazu werden bei dieser Konzentration für beide Enantiomere

die größten Stromantworten gemessen. Da es sich in beiden Fällen um den menschlichen TRPA1

handelt, kommen Spezies bezogene Unterschiede nicht in Frage, somit könnte die Begründung

des beobachteten pharmakologischen Unterschiedes vor allem in unterschiedlicher Ausstattung

der Expressionssysteme Xenopus-Oozyten und CHO-Zellen liegen. Beispielsweise wurde ein bis zu

100-fach höherer EC50 beim TRPM8 des Hundes in Xenopus-Oozyten im Vergleich zu HEK-Zellen

für den Agonisten Icillin festgestellt (Liu et al., 2006). Die Tatsache, dass in dieser Arbeit keine

Stereospezifität des TRPA1 für ein Nikotinenantiomer festgestellt werden konnte, ist eine wichtige

Feststellung für die Interpretation psychophysischer Studien (Thuerauf et al., 1999; Thuerauf et

al., 2000; Walker et al., 1996). Die Ergebnisse machen klar, dass TRPA1 einen Beitrag zur

trigeminalen Empfindung von Nikotin leistet, jedoch kann der Kanal an der Vermittlung

unterschiedlicher trigeminaler Empfindungsstärken der beiden Nikotinenantiomere nicht beteiligt

sein.

Mit den Ergebnissen dieser Arbeit habe ich gezeigt, dass (+)-Nikotin den menschlichen nAChR im

rekombinanten System aktiviert. Obschon dies im Vergleich zu (-)-Nikotin mit reduzierter

pharmakologischer Potenz und Maximalwirkung auftritt, könnte durch (+)-Nikotin eine

trigeminale nAChR vermittelte Empfindung hervorrufen werden, denn trotz der für (+)-Nikotin

niedrigeren Potenz sind nAChR immerhin 10-100-mal sensitiver für (+)-Nikotin als der menschliche

TRPA1-Kanal im gleichen Expressionssystem.

95

Diskussion

In der Studie von Talavera et al. (2009) wurde jedoch auch in vivo die Bedeutung von TRPA1 für

Irritationen durch Nikotin nachgewiesen. Die Autoren haben festgestellt, dass TRPA1-knockout-

Mäuse weniger Nikotin-induzierte Atemwegsreflexe zeigen als Wildtyptiere. Zudem haben die

Autoren in Calcium-Imaging Experimenten 23% Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone

festgestellt, wobei 72% dieser Neurone ebenfalls auf den TRPA1-Agonisten AITC antworteten.

In dieser Arbeit habe ich ebenfalls im Calcium-Imaging Nikotinantworten trigeminaler Neurone

untersucht und konnte mit 20-35% Nikotin-responsiver Neurone eine ähnliche Größenordnung

feststellen. Es wurden hier etwa 49% Nikotin-induzierter Signale mit einem spezifischen TRPA1-

Blocker geblockt und somit durch diesen Kanal vermittelt (3.2.2.1). In weiteren Experimenten

wurden mit dem spezifischen nAChR-Blocker Hexamethonium 70% der Nikotin-induzierten

Signale geblockt und so gezeigt, dass nAChR einen großen Anteil der trigeminalen Nikotinantwort

vermitteln. Die Nikotinantworten wurden mit 250 µM bei einer niedrigeren Konzentration

beobachtet, als die Minimalkonzentration die bei rekombinanten TRPA1-Kanälen eine

Stromantwort erzeugte. Die Empfindlichkeit für Nikotin ist somit bei den TRPA1-exprimierenden

Neuronen wesentlich höher als im heterologen Expressionssystem.

Zusammenfassend kann man anhand der elektrophysiologischen Experimenten sagen, dass es bei

nAChR und TRPA1 die pharmakologische Voraussetzung für die trigeminale Wahrnehmung von

Nikotin beider Enantiomere gibt. An trigeminalen Neuronen konnte gezeigt werden, dass

Nikotinantworten über beide Rezeptoren vermittelt werden.

4.2 Die Wirkung von Nikotin auf 5-HT3-Rezeptoren

Neben der direkten Aktivierung habe ich die Modulation bzw. Inhibition ionotroper Rezeptoren

durch Nikotin untersucht und dabei zunächst rekombinant exprimierte 5-HT3-Rezeptoren

untersucht. 5-HT3-Rezeptoren treten als homomere 5-HT3A- und heteromere 5-HT3AB-Rezeptoren

auf, die sich sowohl pharmakologisch als auch in den Kanaleigenschaften unterscheiden. Aufgrund

des sehr geringen Leitwertes (< 1 pS) der Homomere vermuteten bereits Maricq et al. (1991) bei

der ersten Charakterisierung rekombinanter 5-HT3A-Rezeptoren die Expression weiterer

Untereinheiten, die in einem Heteromultimer mit 5-HT3A einen höheren Leitwert von

16 pS verursachen. Die Koexpression von homo-, wie heteromeren 5-HT3-Rezeptoren sind in

Serotonin-sensitiven Neuronen der Regelfall. Homo- und Heteromere haben unterschiedliche

pharmakologische Eigenschaften, da diese durch die A- und B-Untereinheit beeinflusst werden,

denn die Ligandenbindestelle wird an den Kontaktstellen einer A- mit einer weiteren A- oder einer

B-Untereinheit gebildet (Boyd et al., 2002). Für homomere 5-HT3A-Rezeptoren der Maus wurden

96

Diskussion

(+)- und (-)-Nikotin als kompetitive Antagonisten Serotonin-induzierter Stromantworten

festgestellt (Gurley und Lanthorn, 1998). Dabei wurde eine stereoselektiv stärkere

antagonistische Wirkung für das (-)-Enantiomer beobachtet. Die 5-HT3B-Untereinheit konnte in

letztgenannter Studie nicht untersucht werden, da sie erst ein Jahr später kloniert wurde (Davies

et al., 1999; Dubin et al., 1999). Eine Wirkung von Nikotin auf die heteromeren 5-HT3AB-

Rezeptoren wurde bisher nicht publiziert. In dieser Arbeit wurde deshalb die Wirkung von Nikotin

auf 5-HT3AB untersucht und gezeigt, dass in Xenopus-Oozyten exprimierte menschliche 5-HT3A- und

5-HT3AB-Rezeptoren sowohl durch (+)- als auch (-)-Nikotin geblockt werden (3.1.1). Von Gurley und

Lanthorn (1998) wurde am homomeren 5-HT3A der Maus ein kompetitiver Block mit niedrigeren

IC50-Werten ((-)-Nikotin: 32 µM; (+)-Nikotin: 107 µM) festgestellt. Allerdings wurden in diesem Fall

die Stromantworten auch durch niedrigere Serotoninkonzentrationen hervorgerufen (1 µM

anstatt 10 µM), was die höheren IC50-Werte in dieser Arbeit ((-)-Nikotin: 512 µM; (+)-Nikotin:

2070 µM) erklärt. Mit Radioliganden-Bindungsstudien zeigten Drisdel et al. (2008) die Bindung

von (-)-Nikotin auch an native 5-HT3-Rezeptoren aus dem Gehirn der Ratte. Es gibt viele

Substanzen, die Bindungsaffinitäten sowohl zu nAChR als auch zu 5-HT3-Rezeptoren besitzen,

jedoch nicht auf beide Rezeptorfamilien die gleiche Wirkung haben. Die Autoren letztgenannter

Studie zeigten beispielsweise in elektrophysiologischen Experimenten, dass das - wie Nikotin - als

cholinerger Agonist bekannte Epibatidin ebenfalls ein 5-HT3-Antagonist ist. Zudem ist das als

spezifischer 5-HT3-Antagonist eingesetzte Tropisetron ein starker partieller Agonist von nAChR α7

(Macor et al., 2001). Diese Tatsachen passen auch dazu, dass die zuerst für nAChR bekannt

gewordene Stereoselektivität für das (-)-Enantiomer von Nikotin auch bei 5-HT3-Rezeptoren

auftritt. In dieser Arbeit konnte diese Stereospezifität menschlicher 5-HT3-Rezeptoren sowohl für

Hetero- als auch Homomere gezeigt werden.

Die Bedeutung dieses Blocks für chemosensorische Prozesse an trigeminalen Neuronen wurde im

Rahmen dieser Arbeit mittels Calcium-Imaging untersucht, wobei ich zeigen konnte, dass 79%

Serotonin-induzierter Signale trigeminaler Neurone durch (-)-Nikotin inhibiert wurden (3.2.4).

Mittels der 5-HT3-spezifischen Agonisten mCPBG konnte bestätigt werden, dass es sich bei dieser

Population um 5-HT3-exprimierende Neurone handelt. Im Trigeminus werden neben den

ionotropen 5-HT3-Rezeptoren auch verschiedene metabotrope Serotoninrezeptoren exprimiert

(Amrutkar et al., 2012), was die Population der Zellen mit nicht inhibierten Serotoninsignalen

erklärt. Es wurde in diesen Experimenten zwar mit 1 mM Nikotin eine hohe Konzentration

appliziert, jedoch zeigt die Konzentrations-Inhibitionskurve insbesondere für 5-HT3AB bereits bei

100 µM (-)-Nikotin eine starke Inhibition des Serotonin-induzierten (10 µM) Stromes. Eine

Aktivierung von 5-HT3-Rezeptoren auf nozizeptiven

97

Diskussion

Fasern führt zu einem schmerzhaften Eindruck (Richardson, 1990). Nikotin kann somit einen

5-HT3-induzierten schmerzhaften Eindruck vermindern. 5-HT3-Rezeptoren können somit auch die

Wahrnehmung von Nikotin beeinflussen; die beschriebene Inhibition könnte aber auch im

Allgemeinen beim Vorliegen einer ausreichend hohen Nikotinkonzentration einen

modulatorischen Einfluss auf die Funktion des trigeminalen sensorischen Systems haben. Dies gilt

allerdings auch für das gustatorische System. Beim gustatorischen System wurde zum einen eine

Signalübertragung von gustatorischen Rezeptorzellen an die afferenten Nervenendigungen mit

ATP gezeigt (Finger et al., 2005), es konnte jedoch zum anderen auch die Ausschüttung von

Serotonin festgestellt werden (Huang et al., 2005). Kaya et al. (2004) konnten eine Expression von

5-HT3-Rezeptoren in gustatorischen Rezeptorzellen der Ratte zeigen. Durch den Block 5-HT3-

vermittelter Signale kann Nikotin einen gustatorischen Eindruck vermindern.

4.3 Nikotinblock an NMDA-Kanälen

Von der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren ist eine Beteiligung an chemosensorischen

Prozessen bekannt. Eine Funktion als olfaktorischer Rezeptor ist beispielsweise für die Taufliege

Drosophila melanogaster bekannt, bei der Glutamatrezeptoren in den Antennen exprimiert

werden (Abuin et al., 2011; Benton et al., 2009). Die bei Vertebraten vorkommenden

Glutamatrezeptoren werden in die drei Subfamilien der AMPA-, Kainat- und NMDA-Rezeptoren

unterteilt. Die Expression von NMDA- im olfaktorischen Epithel des Menschen (Borgmann-Winter

et al., 2009) und die Koexpression von AMPA- und NMDA-Rezeptoren im olfaktorischen System

der Maus sowohl in der Mucosa als auch im olfaktorischen Bulbus wurden bereits nachgewiesen

(Rash et al., 2005). Erst kürzlich wurde eine NMDA-Rezeptor-abhängige Potenzierung der

Duftstoff-induzierten Aktivität von Mitralzellen gezeigt, die durch NMDA-Rezeptor-Antagonisten

verhindert werden kann (Lethbridge et al., 2012). Es liegt die Vermutung nahe, dass durch die

Aktivierung ionotroper Glutamatrezeptoren somit im olfaktorischen System von Säugern eine

Modulation chemosensorischer Wahrnehmung stattfinden könnte. Da auch alle ionotropen

Glutamatrezeptoren in trigeminalen Neuronen exprimiert werden (Gu und Huang, 1994; Sahara

et al., 1997), könnte auch hier eine Modulation die trigeminale Empfindung beeinflussen. Aus

diesem Grund wurden in dieser Arbeit von jeder Subfamilie ionotroper Rezeptoren, die alle auch

im Trigeminus exprimiert werden, ein Rezeptor exemplarisch untersucht, um eine Wirkung von

Nikotin auf diese Rezeptoren zu identifizieren.

98

Diskussion

Es wurden in dieser Arbeit für die non-NMDA-Glutamat-Rezeptoren der AMPA- und

Kainatunterfamilie (GluR1(Q)flop, GluR6(Q)) Konzentrations-Wirkungskurven für den jeweiligen

Agonisten mit und ohne (-)-Nikotin einer Konzentration von 1 mM erstellt (3.1.6), wobei keine

Wirkung von (-)-Nikotin feststellt wurde.

Es konnte jedoch in dieser Arbeit das erste Mal ein Konzentrations-abhängiger Block rekombinant

exprimierter menschlicher NMDA-Rezeptoren durch (-)-Nikotin gezeigt werden. Die zunächst an

NMDA-Rezeptor-exprimierenden Xenopus-Oozyten durchgeführten Experimente zur

Konzentrations-Wirkungs-Beziehung ergaben bei der üblichen Klemmspannung von -60 mV

keinen signifikanten Effekt bei Koapplikation von (-)-Nikotin. Es wurden sodann Experimente zur

Strom-Spannungs-Beziehung durchgeführt. Der dabei entdeckte Block zeigt die gleiche

Spannungsabhängigkeit wie der von Nowak et al. (1984) für NMDA-Rezeptoren beschriebene

Mg2+-Block, bei dem das Mg2+-Ion im Inneren der Kanalpore den Durchfluss anderer Ionen

verhindert. Es handelt sich um einen spannungsabhängigen nicht-kompetitiven Block. Für NMDA-

Rezeptoren ist eine Vielzahl solcher Kanalblocker bekannt, die vor allem erforscht wurden, um

Substanzen wie beispielsweise Memantin zu finden, die mit hoher Spezifität aber niedriger

Affinität binden, um NMDA-Rezeptor vermittelte Excitotoxizität zu unterbinden, aber normale

physiologische Aktivität zu erlauben (Chen et al., 1992). Es konnte vor einiger Zeit gezeigt werden,

dass NMDA-vermittelte Excitotoxizität bei kultivierten cortikalen Neuronen der Ratte in der

Gegenwart von (-)-Nikotin verhindert wird (Akaike et al., 1994). Kürzlich wurde dies auch bei der

Gabe von Epibatidin, einem starken nAChR-Agonisten, auf retinales Gewebe festgestellt (Sieber,

2012). Die Autoren beider Studien vermuten eine Koexpression nikotinischer

Acetylcholinrezeptoren in den untersuchten Zellen, die der schädlichen Wirkung einer verstärkten

NMDA-Rezeptor-Aktivierung entgegenwirken. Allerdings könnten cholinerge Agonisten auch

direkt an der Inhibition von NMDA-Rezeptoren beteiligt sein. Es wurde eine große Anzahl von

Substanzen, wie beispielsweise Dextrorphan (Damaj et al., 2005; Wong et al., 1988) oder das oben

genannte Memantin gefunden, die sowohl als NMDA-Rezeptor-Blocker fungieren aber auch eine

Wirkung als Antagonist nikotinischer Acetylcholinrezeptoren haben. Dazu passt der in dieser

Arbeit dargestellte Block von (-)-Nikotin auf NMDA-Rezeptoren (3.1.6). Da dieser Effekt jedoch

erst bei Spannungen negativer als -80 mV und bei Konzentrationen von über 1 mM auftritt, hat er

vermutlich keine systemische Relevanz, kann höchstwahrscheinlich nicht bei NMDA-Rezeptor-

exprimierenden Mitralzellen im olfaktorischen Bulbus stattfinden, ist aber für experimentelle

Bedingungen, bei denen Zellen einer ausreichend hohen Konzentration von Nikotin ausgesetzt

werden, durchaus zu bedenken. Zudem könnte Nikotin in der Schleimhaut des

chemosensorischen Epithels durch die verschiedenen Wege der Selbstverabreichung höhere

99

Diskussion

Konzentrationen erreichen und so auch die trigeminale Chemosensorik über eine NMDA-

Rezeptor-vermittelte Modulation beeinflussen.

4.4 Keine Wirkung von Nikotin auf weitere untersuchte Ionenkanäle

In der umfangreichen systematischen Untersuchung zur Wirkung von Nikotin auf Liganden-

gesteuerter Ionenkanäle und TRP-Kanäle wurden im Rahmen dieser Arbeit viele weitere

ionotrope Rezeptoren untersucht, für die sich herausstellte, dass Nikotin auf diese keine Wirkung

hat. Dazu gehörten bei den klassischen Liganden-gesteuerten Ionenkanälen alle untersuchten

GABAA-Rezeptoren (α1β2γ2, α2β1γ2, α2β3γ2, β3, ρ1; 3.1.4), α1 Glycin-Rezeptoren (3.1.3) und die

Purinozeptoren P2X2 (3.1.5). Wie in der Einleitung erwähnt, ist die Expression von GABAA- und

P2X-Rezeptoren im Trigeminus gezeigt. Es konnte vor kurzen bei einem Großteil trigeminaler

Neurone GABA-induzierte Cl--Ausströme gezeigt werden (Schöbel et al., 2012).

Für P2X-Rezeptoren ist eine Beteiligung bei der Schmerzempfindung gezeigt, die durch ein

Vorkommen auf nozizeptiven Nervenendigungen begründet ist (Barclay et al., 2002; Chen et al.,

1995). Für bestimmte chemische Stimuli ist eine Modulation P2X-vermittelter Signale bei

trigeminalen Neuronen der Ratte festgestellt worden (Spehr et al., 2004). Von diesen

untersuchten Rezeptoren wurde bei den GABAA-Rezeptoren ausschließlich eine Wirkung des (-)-

Enantiomers untersucht. Aus der Klasse der TRP-Kanäle wurden zudem die Vanilloidrezeptoren

V1-3 (3.1.8) und der Melastatinrezeptor M8 (3.1.9) untersucht. Auch für diese Kanäle war keine

Wirkung von Nikotin festzustellen.

Es wurden bei diesen Experimenten Konzentrations-Wirkungskurven für den jeweiligen Agonisten

mit und ohne Nikotin einer Konzentration von 1 mM erstellt. Für 1 mM ist eine aktivierende

Wirkung bei nAChR und TRPA1 gezeigt worden, aber auch eine inhibierende Wirkung an 5-HT3-

und NMDA-Rezeptoren. Die Applikation auch einer 10-fach höheren Nikotinkonzentration wäre

problemlos möglich, bei noch höheren Konzentrationen setzen starke Potentialschwankungen der

Oozyten ein. Da jedoch eine Nikotinkonzentration von 10 mM auch am chemosensorischen

Epithel sehr unwahrscheinlich ist, wäre ein Effekt, der bei dieser Konzentration erst einsetzt,

physiologisch irrelevant.

Die Überschneidung des Ligandenspektrums, die für viele Rezeptoren unterschiedlichster

Rezeptorfamilien gezeigt wurde, ist neben der vielseitigen Expression der Rezeptorfamilien im

Trigeminus ein Grund für die umfassende Untersuchung in dieser Arbeit. Bereits an nAChR und 5-

HT3-Rezeptoren zeigt sich, dass innerhalb einer Rezeptorklasse (Cys-loop-Rezeptoren) eine

Substanz als Ligand für unterschiedliche Unterfamilien auftritt, allerdings auch mit gegensätzlicher

100

Diskussion

Wirkung. Dies tritt auch bei TRP-Kanälen auf. Beispielsweise ist Menthol als TRPM8-Agonist

bekannt, was jedoch auch für bestimmte Spezies in geringerem Maß auf TRPA1 zutrifft. TRPV1 ist

ein Rezeptor für Piperidin, was in schwächerem Maß auch auf TRPA1 zutrifft. TRPA1 ist hingegen

als Rezeptor für Allylisothiocyanat, Allicin und Dialllyldisulfid, schwefelhaltigen Inhaltsstoffen von

Knoblauch und Senf, bekannt. Jedoch aktivieren diese im Gegenzug in schwachem Maße auch

TRPV1 (Viana, 2011). Liu et al. (2004) zeigten für den TRPV1-Kanal der Ratte, eine positive

Modulation Capsaicin-induzierter Stromantworten durch 1 mM (-)-Nikotin. Diese Beobachtung

konnte ich jedoch in dieser Arbeit am menschlichen TRPV1 nicht bestätigen. Dies könnte zum

einen in der unterschiedlichen Ausstattung verschiedener Expressionssysteme beruhen, denn die

Autoren der genannten Studie nutzten CHO-Zellen (chinese hamster ovary), wohingegen die

Ergebnisse dieser Arbeit an Xenopus-Oozyten entstanden. Zum anderen könnten Spezies-

bezogene Unterschiede der Rezeptoren die Ursache sein. Es wurden beispielsweise für den

menschlichen TRPA1 und den TRPA1 der Maus unterschiedliche Aktivierungskinetiken durch

Menthol gezeigt (Karashima et al., 2007; Story et al., 2003). Ansonsten ist bisher für keinen der

anderen genannten Rezeptoren weder eine Bindung, noch eine pharmakologische Wirkung von

Nikotin bekannt.

4.5 Chemosensorisch relevante Nikotinkonzentrationen

Im Zusammenhang mit der Konzentration bestimmter Agonisten bei Experimenten im

heterologen Expressionssystem aber auch in Experimenten mit kultivierten Neuronen stellt sich

die Frage, ob die gewählten Konzentrationen der Applikationslösungen der physiologischen

Realität entsprechen. Generell überstiegen die Konzentrationen der hier applizierten Lösungen

die maximalen Blutplasmakonzentrationen von Nikotin bei Weitem. In dieser Arbeit wurde der

Einfluss von Nikotin bei allen Rezeptoren mit einer Konzentration von 1 mM getestet. Im

Blutplasma von Rauchern wurde bisher in Abhängigkeit vom Zigarettenkonsum eine

Konzentration im Bereich von 0,5–2 µM Nikotin gemessen (Pidoplichko et al., 1997; Zevin et al.,

1998). Die Nikotinkonzentration wurde allerdings auch bereits im Speichel von Rauchern

gemessen. Die Speichelkonzentration überstieg die des Plasmas in der Regel um etwa das 10-

fache auf bis zu 25 µM (Hukkanen et al., 2005; Teneggi et al., 2002). Für die Gewinnung der Probe

wurde dazu allerdings der Speichelfluss angeregt und die Konzentrationen des Flüssigkeitsfilms

der Schleimhaut dadurch verdünnt. Die tatsächliche Konzentration von Nikotin am

chemosensorischen Epithel könnte über die Bereiche der Schleimhaut im Mund- und Rachenraum

sowie in der Nasenhöhle stark variieren, da das lokale Volumen von Schleim oder Speichel, die als

101

Diskussion

Lösungsmittel fungieren, unterschiedlich sein kann. Konzentrationsmessungen über eine im

Mundraum gesammelte Speichelprobe können die verschiedenen Konzentrationsmaxima in der

Schleimhaut nicht repräsentieren. Ginzkey et al. (2012) betrachten deshalb eine Konzentration

von 1 mM Nikotin als sinnvoll für den Einsatz in physiologischen Experimenten, da millimolare

Konzentrationen von Nikotin in der Mucosa erreicht werden können. Die in dieser Arbeit

beschriebenen Nikotin-vermittelten Effekte bei 5-HT3-, TRPA1- und NMDA-Rezeptoren haben

vermutlich keine Relevanz auf der Ebene des Zentralnervensystems, jedoch könnten sie die

chemosensorische Wahrnehmung auf der Ebene des sensorischen Epithels beeinflussen.

4.6 Calcium-Imaging der trigeminalen Zellkultur – neue Nikotinrezeptoren

Neben den elektrophysiologischen Experimenten wurde in dieser Arbeit die Wirkung von Nikotin

auf kultivierte trigeminale Neurone charakterisiert. Auf diesem Wege konnten Hinweise auf

weitere Rezeptoren sowohl für (-)- als auch für (+)-Nikotin gewonnen werden. Ein Großteil

Nikotin-vermittelter Antworten geht auf nAChR und TRPA1-Kanäle zurück, wie bereits unter 4.1

dargestellt wurde. Mit den unter 3.2.2.1 zunächst einzeln eingesetzten Blockern für nikotinische

Acetylcholinrezeptoren (Hexamethonium, Hex) und TRPA1-Kanäle (HC030031, HC) konnte

erwartungsgemäß nur ein Teil der Nikotin-induzierten Signale geblockt werden. Es wurde

anschließend unter Einsatz beider Blocker, also simultanen Blockerbedingungen für nAChR und

TRPA1, ein noch größerer Anteil der Antworten geblockt als mit den einzeln eingesetzten

Blockern. Jedoch war stets eine Population von Zellen vorhanden, die nicht geblockt werden

konnte. In einem vergleichbaren Experiment, bei dem beide Kanalfamilien durch hohe

Konzentrationen von Mecamylamin geblockt wurden, konnte erneut der größte Anteil Nikotin-

vermittelter Signale geblockt werden und wiederum bleibt ein Anteil der Signale unter

Blockerbedingungen bestehen. Der Anteil der Nikotin-sensitiven Neurone, deren Signale auf einen

der bekannten Nikotinrezeptoren nAChR und TRPA1 zurückgehen, wurde demnach zwischen 80

und 88% ermittelt. Dies erklärt auf zellulärer Ebene, dass Mecamylamin die sensorische

Wahrnehmung von Nikotin teilweise inhibiert, wie Thuerauf et al. (2006) in psychophysischen

Tests mit Nikotin-haltigem Aerosol feststellte. Allerdings folgern die Autoren, dass die Wirkung

des Blockers ausschließlich auf der Inhibition nikotinischer Acetylcholinrezeptoren beruht. Die von

Thuerauf et al. (2006) in den psychophysischen Experimenten applizierte Konzentration von

Mecamylamin (> 2 mM) ist jedoch ausreichend, um gleichermaßen TRPA1 zu inhibieren.

Tatsächlich wurde sowohl durch Talavera et al. (2009) als auch in dieser Arbeit (3.2.2.1) gezeigt,

dass ein nicht unerheblicher Anteil Nikotin-sensitiver trigeminaler Neurone ebenfalls AITC-sensitiv

102

Diskussion

ist, beziehungsweise durch HC inhibiert werden kann. Ich habe in dieser Arbeit unter dem Einfluss

des nAChR- und in hoher Konzentration auch TRPA1-Blockers Mecamylamin sowie unter den

erwähnten simultanen Blockerbedingungen mit Hex und HC allerdings auch zwischen 12-20%

persistierende Nikotinsignale festgestellt, für die eine Signalvermittlung durch nAChR oder TRPA1

nicht in Frage kommt. Demnach wurde auf der Ebene sensorischer Neurone gezeigt, dass an der

trigeminalen Wahrnehmung von (-)-Nikotin ein weiterer, noch unbekannter Rezeptor beteiligt ist.

Wie einleitend erwähnt, reagiert das trigeminale System stereoselektiv auf Nikotin (Thuerauf et

al., 1999; Thuerauf et al., 2000; Walker et al., 1996). Von Thuerauf et al. (1999) wird dabei sowohl

für den brennenden als auch für den stechenden Anteil der Empfindung in psychophysischen

Versuchen eine niedrigere Schwelle und eine höhere Intensität für (-)-Nikotin als für (+)-Nikotin

beschrieben. Die allerdings unterschiedlich stark ausgeprägte Stereoselektivität zwischen beiden

Empfindungen erklären die Autoren durch die Ausstattung von C- und Aδ-Fasern mit

verschiedenen Untereinheitenkombinationen nikotinischer Acetylcholinrezeptoren. Talavera et al.

(2009) weisen nach, dass TRPA1, der die stechende Wirkung des Senfölinhaltsstoffes AITC

vermittelt durch Nikotin aktivierbar ist. Gemäß den elektrophysiologischen Ergebnissen in dieser

Arbeit ist es jedoch unwahrscheinlich, dass TRPA1 für eine stereospezifisch stechende

Empfindung verantwortlich ist. Thuerauf et al. (1999) vermuten, dass Subpopulationen

trigeminaler Neurone spezifisch auf ein Nikotinenantiomer antworten könnten. Das Vorkommen

solcher Nikotin-stereoselektiven trigeminalen Neurone konnte in dieser Arbeit mit einem

weiteren Experiment im Calcium-Imaging nachgewiesen werden (3.2.1), was die Vermutung von

Thuerauf et al. (1999) bestätigt. Ein großer Teil der Zellen reagiert auf beide Enantiomere. Es ist

wahrscheinlich, dass diese Zellen einen der bekannten Nikotinrezeptoren nAChR oder TRPA1

exprimieren. Die Fähigkeit beider Ionenkanalfamilien, durch beide Nikotinenantiomere aktiviert

zu werden, wurde bereits gezeigt. Trotz der größeren pharmakologischen Potenz von (-)-Nikotin

bei nAChR reicht die applizierte Konzentration von (+)-Nikotin (250 µM) aus – wie in dieser Arbeit

exemplarisch für homo- wie heteromere nAChR gezeigt wurde, um auch nAChR-vermittelte

(+)-Nikotinsignale hervorzurufen.

Ein weiterer großer Teil der untersuchten trigeminalen Neurone antwortet ausschließlich auf

(+)-Nikotin. Das Ausbleiben einer (-)-Nikotinantwort zeigt, dass der diese Antwort vermittelnde

Rezeptor weder ein TRPA1-Kanal noch ein nAChR sein kann. Neben der oben bereits gezeigten

Existenz eines unbekannten Typs von (-)-Nikotinrezeptoren scheint hier also ein weiterer

selektiver Rezeptortyp für (+)-Nikotin in trigeminalen Neuronen exprimiert zu sein. Ein solcher

Rezeptor ist bisher unbekannt.

103

Diskussion

In weiteren Experimenten im Calcium-Imaging wurde die Wirkung von (+)-Nikotin auf trigeminale

Neurone weiter untersucht, um den bisher nicht beschriebenen selektiven (+)-Nikotinrezeptor zu

identifizieren (3.2.2.2). Es wurde eine ausschließlich (+)-Nikotin-responsive Zellpopulation (5% der

untersuchten Neurone) identifiziert, deren (+)-Nikotinantwort bei Koapplikation von

Rutheniumrot, einem unspezifischen TRP-Kanalblocker, inhibiert werden konnte. Rutheniumrot

blockiert neben TRPA1 (Clapham et al., 2005) auch viele weitere Kanäle, wobei der Blocker nicht

auf nAChR wirkt (eigene Beobachtung, Daten nicht gezeigt). Die blockierbare Antwort kann also

einerseits nicht durch nAChR, andererseits aber auch nicht durch TRPA1 vermittelt worden sein,

denn die beschriebene Neuronenpopulation antwortet nicht auf AITC und nicht auf (-)-Nikotin.

Der Blocker muss in diesem Fall allerdings nicht direkt den gesuchten Rezeptor blockiert haben, es

könnte lediglich ein Ca2+-leitender Effektorkanal der pharmakologische Wirkort gewesen sein. In

einem weiteren Experiment wurde mit Gentamycin, einem spezifischen Blocker für TRPA1

(Nagata et al., 2005), eine kleine Neuronenpopulation (3%) nachgewiesen, deren Antwort nicht

blockiert werden konnte, die jedoch nur auf (+)- und nicht auf (-)-Nikotin antwortete. Eine

Signalvermittlung durch den TRPA1 wird hier ausgeschlossen, eine Beteiligung nikotinischer

Acetylcholinrezeptoren kann wegen der ausbleibenden (-)-Nikotinantwort ebenfalls

ausgeschlossen werden. Auch diese Ergebnisse deuten auf einen Rezeptor hin, der spezifisch (+)-

Nikotin-responsiv ist.

Diese Ergebnisse konnten mit einem weiteren Experiment bestätigt werden. Mit Borneol,

ebenfalls einem TRPA1-spezifischen Blocker (lehrstuhleigene Ergebnisse, Korrespondenz mit M.A.

Sherkheli) und Hexamethonium konnte unter simultanen Blockerbedingungen für nAChR und

TRPA1 eine ausschließlich (+)-Nikotin-responsive Population (4%) festgestellt werden. Bryant et al.

(2010) haben in olfaktorischen Rezeptorneuronen der Ratte ebenfalls Zellpopulationen

identifiziert, die selektiv auf (+)-Nikotin reagieren und vermuten, dass olfaktorische Rezeptoren an

dieser Antwort beteiligt sind. Die letztgenannten Autoren fanden, dass immerhin etwa 14%

Nikotin-responsiver olfaktorischer Rezeptorneurone ausschließlich auf (+)-Nikotin antworteten,

was den in dieser Arbeit ermittelten Anteil bei trigeminalen Neuronen nur geringfügig übertrifft.

Es konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass es im trigeminalen System

Neuronenpopulationen gibt, die einen unbekannten, ausschließlich für (+)-Nikotin-responsiven

Rezeptor funktionell exprimieren. Dies ist eine Erkenntnis, die zur Vervollständigung des

Verständnisses der sensorischen Wahrnehmung von Nikotin beiträgt.

Im Weiteren sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob die nachgewiesenen Rezeptoren für (-)-

und (+)-Nikotin zur Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören könnten. Verschiedene

G-Proteine können unterschiedliche second-messenger-Transduktionsprozesse einleiten.

104

Diskussion

Da es pharmakologische Substanzen gibt, die selektiv metabotrope Signaltransduktionskaskaden

inhibieren, kann mit weitergehenden Blockerexperimenten die Beteiligung bestimmter Kaskaden

ausgeschlossen werden. In dieser Arbeit wurde nun zunächst eine Beteiligung einer

Phospholipase C-gekoppelten Transduktion am Nikotin-induzierten Signal im Calcium-Imaging

untersucht. Das im Calcium-Imaging beobachtete Signal wird durch einen Anstieg der Ca2+-

Konzentration im Zellplasma verursacht, der entweder auf einem Einstrom von außen durch

Ionenkanäle der Zellmembran oder auf einer Ausschüttung aus intrazellulären Speichern durch

Ionenkanäle des endoplasmatischen Retikulums beruhen kann. In Bezug auf die Nikotinantworten

der trigeminalen Neurone würde der Einstrom von Ca2+-Ionen aus intrazellulären Speichern auf

eine Beteiligung einer Phospholipase C-gekoppelten Signaltransduktion deuten, wobei diese

durch Erzeugung eines second messengers IP3-gesteuerte Ionenkanäle aktiviert (Berridge, 1993).

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass alle im Calcium-Imaging messbaren

Nikotinantworten auf dem Einstrom extrazelluärer Ca2+-Ionen beruhen (3.2.3). Unter extrazellulär

Ca2+-freien Messbedingungen konnten weder (-)- noch (+)-Nikotin-induzierte Signale festgestellt

werden. Zudem konnten mit dem PLC-Blocker Edelfosin (Powis et al., 1992) und bei gleichzeitigen

Blockerbedingungen für nAChR und TRPA1 (Hex, HC) nicht alle (-)-Nikotinantworten geblockt

werden (3.2.3). Die hier persistierenden Nikotin-induzierten Signale sind offenbar nicht PLC-

gesteuert, wobei allerdings auch eine PLC-gesteuerte Signaltransduktion über den in der

Zellmembran verbleibenden second messenger Diacylglycerol (DAG) stattfinden kann. Dieser kann

beispielsweise TRPC2-Kanäle aktivieren (Zufall et al., 2005). Die Beteiligung weiterer ionotroper

oder metabotroper Prozesse bei der trigeminalen Nikotinwahrnehmung wie beispielsweise

zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Signaltransduktionskaskaden konnten gegen Ende der Arbeit nicht

mehr untersucht werden, kommen jedoch weiterhin in Frage als Ursache der persistierenden

Nikotinantworten in trigeminalen Neuronen.

4.7 Vergleichende Transkriptomanalyse

Bisher wurde weder eine Transkriptomanalyse des Trigeminus noch der Dorsalwurzelganglien der

Maus mittels Next-generation-sequencing publiziert. Um die Expression verschiedener

Transmembranrezeptoren und Ionenkanäle in den genannten Geweben in umfangreichem

Maßstab zu untersuchen, wurde eine Analyse des Transkriptoms mittels NGS im Rahmen dieser

Arbeit durchgeführt. Es wurden zudem bereits publizierte Sequenzierergebnisse für das Gehirn in

die Analyse einbezogen. Die Ergebnisse dieser RNA-Sequenzierungen wurden mit einigen

Amplikon-Sequenzierungen einzelner Nikotin-responsiver Neurone verglichen.

105

Diskussion

Aufgrund von Experimenten im Calcium-Imaging wurden diese Zellen zwei Typen zugeordnet. Bei

zwei der Zellen wurde das Nikotinsignal durch Blocker der bekannten Nikotinrezeptoren nAChR

und TRPA1 inhibiert. Bei zwei weiteren Zellen konnten diese Blocker das Nikotinsignal nicht

verhindern. Bei den letzteren wurde die Expression eines weiteren Nikotinrezeptors

angenommen, für den eine Transkriptomanalyse weitere Hinweise liefern kann.

Expressionsnachweise werden mittlerweile nicht mehr nur rein qualitativ geführt. Neue

Methoden ermöglichen zuverlässige quantitative Aussagen zur Expressionsstärke und erfahren

zunehmende technische Optimierung. Dabei kann man zwischen Methoden zur

Expressionsanalyse weniger bekannter Gene und Massenansätzen unterscheiden. Bei ersteren ist

die quantitative realtime PCR (qPCR) die verbreitete Referenzmethode, die aber für die Analyse

ganzer Transkriptome ungeeignet ist. Zu den Methoden, mit denen die große Anzahl von

Transkripten, die in einem Transkriptom vorkommen kann, möglichst umfassend quantifiziert

werden kann, zählen neben DNA-Microarrays vor allem auch das Next-generation-sequencing-

Verfahren. Wang et al. (2009) stellen im einer Übersichtsarbeit die Vorteile von Next-generations-

sequencing gegenüber DNA-Microarrays heraus. Zum einen können mit RNA-Sequenzierungen

alle Transkripte innerhalb eines Transkriptoms erfasst werden, mit Hilfe von DNA-Microarrays

lediglich jene, für die Sonden auf dem Microarray aufgebracht sind. Zum anderen enthalten

Sequenzierergebnisse im Gegensatz zu DNA-Microarrays kein Hintergrundsignal, weshalb auch

niedrige Expressionsstärken festgestellt werden können. Ebenfalls können sehr hohe

Expressionsstärken festgestellt werden. Arrays zeigen Expressionsstärken mit einer geringeren

dynamischen Breite an als Sequenzierergebnisse; ab einer gewissen Expressionshöhe

unterscheiden sich Signalstärken verschiedener Expressionshöhen nur noch gering, was die

Genauigkeit von Arrays bei sehr hohen Expressionsstärken abnehmen lässt. Mit RNA-

Sequenzierungen können mehrere tausendfache Expressionsunterschiede festgestellt werden,

mit DNA-Arrays lediglich einige hundert. Diese Eigenschaften machen Next-generation-sequencing

zur bisher brauchbarsten Methode zur Transkriptomanalyse.

Die erwähnten Expressionsnachweise für TRP- und Liganden-gesteuerte Ionenkanäle im

trigeminalen System wurden bisher mit Methoden geführt, mit denen in der Regel ein qualitativer

Nachweis geleistet wird. So wurden beispielsweise die Expressionsverhältnisse der Transkripte

verschiedener nikotinischer Acetylcholinrezeptoren im Trigeminus von Liu et al. (1998) mittels RT-

PCR ermittelt, wobei die Bandenstärke nach der Gelelektrophorese als Hinweis der

Expressionsstärke genutzt wurde. Tecott et al. (1993) weisen mittels In-situ-Hybridisierung 5-HT3-

Rezeptor exprimierende trigeminale Neurone nach. Kobayashi et al. (2005) zeigen die Expression

von TRPA1, M8 und V1 im Trigeminus sowohl mittels RT-PCR als auch In-situ-Hybridisierung.

106

Diskussion

Aus diesen Ergebnissen lassen sich keine zuverlässigen relativen Expressionsstärken zwischen

verschiedenen Transkripten ableiten. Die bisherigen Expressionsnachweise erübrigen also

keinesfalls einen systematischen quantitativen Ansatz. Die einzelnen Next-generation-sequencing-

Verfahren sind zurzeit noch in einem starken Optimierungsprozess begriffen (Wang et al., 2009),

was unter anderem dazu geführt hat, dass die angebotenen Sequenzierlängen auch bei dem in

dieser Arbeit benutzten Illumina-Solexa Verfahren mittlerweile gestiegen sind. So sind die aus der

früheren Studie herangezogenen Ergebnisse einer RNA-Sequenzierung des Gehirns der Maus mit

Sequenzlängen von 25 bp entstanden (Mortazavi et al., 2008). Die im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführten Sequenzierungen hatten Sequenzlängen von 35 und 75 bp (3.3). Um ein

sequenziertes Transkript an einen spezifischen Abschnitt des Genoms zu mappen, ist eine Länge

von 25 Basenpaaren generell ausreichend, allerdings kommen im gesamten Genom repetitive

Motive vor, die eine eindeutige Zuordnung eines sequenzierten Fragmentes erschweren. Mit

zunehmender Sequenzierlänge dürfte die Wahrscheinlichkeit einer eindeutigen Zuordnung

steigen. Es existieren weitere Next-generation-sequencing-Verfahren, die größere

Sequenzierlängen ergeben, jedoch wurde in dieser Arbeit eine Methode gewählt, die bei kürzerer

Sequenzierlänge eine wesentlich größere Anzahl von Sequenzierungen liefert, damit sich die

Berechnung der relativen Expressionsstärken auf eine große Datengesamtmenge stützt. Mit dem

in dieser Arbeit benutzten Illumina-Solexa Verfahren lassen sich mit Abstand die größten

Anzahlen sequenzierter Fragmente erzielen (Liu et al., 2012).

4.7.1 Die Qualität der Sequenzierung

Für den Trigeminus der Maus wurde in dieser Arbeit erstmals eine Transkriptomanalyse basierend

auf einer Sequenzierung nach dem Illumina-Solexa Verfahren durchgeführt. Ferner wurde auf

dem gleichen Weg auch das Transkriptom der Dorsalwurzelganglien der Maus untersucht. Der

Anteil gemappter reads an der gesamten Anzahl prozessierter reads dieser beiden untersuchten

Gewebe ist mit 80-85% in etwa so hoch, wie bei der von Mortazavi et al. (2008) durchgeführten

Sequenzierung. Es zeigt sich also, dass mit dem benutzten Verfahren reproduzierbar ein

vergleichbar großer Anteil von Sequenzierergebnissen verwerten lässt. Die restlichen 15-20%

prozessierter reads könnten unspezifisch während der cDNA-Synthese an Primerdimeren

entstanden sein. Diese Fragmente stören jedoch die Auswertung nicht, da sie wegen der nicht

möglichen spezifischen Zuordnung zum Genom der Maus keine falsch positiven Ergebnisse

erzeugen können. Allerdings wird ein gewisser Anteil der Sequenzierleistung durch diese

Fragmente beansprucht. Obwohl vermutlich in der Zukunft ein Ziel der technischen

107

Diskussion

Weiterentwicklung der Synthese der cDNA-Library die Verringerung unspezifischer cDNA-

Fragmente sein wird, ist die Einbuße der Sequenzierleistung durch nicht gemappte reads bei einer

Menge von etwa 30 Millionen gemappten reads bei den in dieser Arbeit sequenzierten

Transkriptomen von Trigeminus und DRG von geringer Bedeutung.

Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Amplikonsequenzierungen ist der Anteil

gemappter reads allerdings mit 8-42% deutlich geringer als bei den RNA-Sequenzierungen der

Explantate. Die für eine Sequenzierung des Transkriptoms einzelner Zellen notwendige

Amplifikation wurde in dieser Arbeit mit dem TransPlex Verfahren (3.3) durchgeführt. Wie in der

Einleitung dargestellt, kann mit der TransPlex Amplifikation prinzipiell auch bei geringen Mengen

eingesetzter RNA ein Amplikon erzeugt werden, dass relative Expressionsverhältnisse

wiederspiegelt. Neben den spezifisch vom Transkriptom amplifizierten Fragmenten scheint

allerdings bei dieser Reaktion auch ein großer Anteil unspezifischer Fragmente erzeugt zu werden,

die nicht an das Genom gemappt werden können. Es wird also bei der Amplikonsequenzierung

mit diesem System weit über die Hälfte der Sequenzierleistung eingebüßt, was zu einer starken

Verkleinerung der Datenmenge führt. Die Primersequenzen der PCR-basierten Amplifikation

dieses Verfahrens, die jedes Fragment des Amplikons flankieren, können für einen Teil der nicht

gemappten reads verantwortlich sein (Gonzalez-Roca et al., 2010). Auch die Methoden der

Amplikonerzeugung werden zurzeit stark weiterentwickelt. Die meisten optimierten Verfahren

starten die cDNA-Synthese am 3‘-Ende des Transkripts und erzeugen ein Amplikon, dass für eine

Analyse mit dafür optimierten DNA-Microarrays brauchbar ist (Caretti et al., 2008; Kurimoto et al.,

2007). Amplikonsequenzierungen nach derart 3‘-fokussierten Amplifikationsverfahren können

keine Sequenzierergebnisse über das gesamte Transkriptom hinweg erzeugen, was gegenüber

dem hier benutzten TransPlex Verfahren einen Nachteil darstellt. Die hierbei eingesetzten

randomisierten Primer ermöglichen einen cDNA-Synthesestart an jedem Abschnitt des

Transkriptoms.

4.7.2 Die Expression der bekannten Nikotinrezeptoren nAChR und TRPA1

In dieser Arbeit wurden die Transkriptome der erwähnten Gewebe Trigeminus und DRG mit den

amplifizierten Transkriptomen einzelner (-)-Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone verglichen

(3.3). Bei zwei der untersuchten vier (-)-Nikotin-responsiven Zellen konnte die Antwort durch die

spezifischen nAChR- und TRPA1-Blocker Hex und HC (3.2.2.1) geblockt werden (Zellen 2.1 und

2.2). Bei zwei weiteren (Zellen 5-1 und 6-1) persistierte das (-)-Nikotinsignal auch bei

Koapplikation der Blocker, sodass angenommen werden konnte, dass die Antworten nicht von

108

Diskussion

diesen beiden Rezeptoren vermittelt wurden. Die erste Erwartung an das Transkriptom dieser

beiden Zellen ist somit das Fehlen von Transkripten dieser beiden Kanäle. Tatsächlich ist TRPA1 in

keiner der vier untersuchten Zellen exprimiert (3.3.1.3). Dies passt zu dem Anteil TRPA1

funktionell exprimierender trigeminaler Neurone von 7-11%, der in dieser Arbeit in Calcium-

Imaging Experimenten mit dem spezifischen TRPA1-Blocker HC und dem TRPA1-Agonisten AITC

ermittelt wurde.

Allerdings zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit für die untersuchten Gewebe der Maus eine

durchaus deutliche Expression von TRPA1 in trigeminalen und Dorsalwurzelganglien und

bestätigen die Ergebnisse von Kobayashi et al. (2005), die ebenfalls keinen signifikanten

Unterschied der TRPA1-Expression zwischen Trigeminus und DRG bei der Ratte feststellten.

Für die Expression von nAChR wurden bei einer der beiden Zellen mit geblocktem (-)-Nikotinsignal

die Untereinheiten α4 und β2 festgestellt, die eine häufige Kombination in sensorischen Ganglien

miteinander bilden (Albuquerque et al., 2009). Das beobachtete Signal könnte demnach also

durch diesen Rezeptor vermittelt worden sein. Allerdings wurden in einer der beiden Zellen mit

nicht geblocktem (-)-Nikotinsignal ebenfalls neuronale nAChR, wenngleich auch sehr niedrig

exprimiert festgestellt. Hier ist der nAChR jedoch nicht für das Signal verantwortlich, denn dieses

würde durch Hexamethonium geblockt. Die Expression muskulärer nAChR α1 und β1 (3.3.1.2) ist

zwar erstaunlich, da sie nativ nur in Muskeln vorkommt, jedoch kann hier kein funktioneller

Rezeptor exprimiert worden sein, denn muskuläre nAChR bilden nativ nur in den beiden

Kombinationen α1β1γδ und α1β1δε funktionelle Rezeptoren (Millar und Gotti, 2009), die zum

einen hier nicht gebildet werden können und zum anderen wäre auch diese Antwort durch

Hexamethonium mit der applizierten Konzentration zu einem Großteil geblockt worden (Papke et

al., 2010).

Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit die Reihenfolge der Expressionsstärke nikotinischer

Acetylcholinrezeptoren für ein Explantat des trigeminalen Ganglions der Maus mit Next–

generation-sequencing herausgefunden. Für die Reihenfolge der nAChR gilt: α7 > α6 > α3 > α4 >

α1 und β2 > β3 > β1 > β4, was in etwa den Ergebnissen von Liu et al. (1998) entspricht, die diese

Reihenfolge mittels PCR feststellten: α7 ≈ α3 > α6 > α4 ≈ α5 > α9 ≥ α2, und β2 ≈ β3 > β4. Die

geringfügigen Unterschiede zwischen den Ergebnissen könnten durch Differenzen zwischen Ratte

und Maus begründet, oder auch den unterschiedlichen technischen Verfahren geschuldet sein.

Das nAChR-Expressionsprofil entspricht zudem dem der Dorsalwurzelganglien, was die

Ähnlichkeiten von Trigeminus und DRG als sensorisch afferente Ganglien unterstreicht. Es ist

bisher weder klar, aus welchem Grund eine derart hohe Zahl verschiedener nAChR in den

untersuchten Ganglien exprimiert wird, noch ob sich diese Expression mit dem Alter des Tieres

109

Diskussion

stark verändert. Durch die Vielfalt an nAChR wird eine große Zahl verschiedener

Untereinheitenkombinationen verschiedener pharmakologischer Profile in trigeminalen Ganglien

möglich.

4.7.3 Die Expression der weiteren Cys-loop-Rezeptoren

Für die weiteren Cys-loop-Rezeptoren wurde im Trigeminus eine ähnlich große Vielfalt festgestellt

(3.3.1.2). Für 5-HT3-Rezeptoren konnte die von Hu et al. (2004) und Tecott et al. (1993)

festgestellte Expression im Trigeminus bestätigt werden. Auch hier ähnelt das trigeminale

Expressionsmuster dem der DRG. Die von Hayasaki et al. (2006) und Kondo et al. (1994)

berichtete Expression der GABAA-Rezeptoren α1-6, β1-3, γ1-3 im Trigeminus konnte bestätigt

werden, zusätzlich wurde mit diesen Ergebnissen Hinweise auf die Expression von δ und ρ2

gefunden. Die von Mortazavi et al. (2008) festgestellte Rezeptorvielfalt im Gehirn bestätigt die

von Nutt (2006) nachgewiesene Expression von α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε und θ und unterstreicht die

Funktion von GABA als wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gehirn. Die im Gehirn

exprimierte Vielfalt der GABAA-Rezeptoren ist deutlich höher als die Vielfalt, die in den

sensorischen Ganglien exprimiert wird. Glycinrezeptoren werden, wie in der Einleitung

beschrieben, im Rückenmark zur Inhibition des motorischen Systems exprimiert. Im Gehirn sind

sie hingegen nicht die vorherrschenden Cl--Kanäle (Lynch, 2009; Somogyi et al., 1998). So sind vier

der sechs exprimierten GABAA-Rezeptor α-Untereinheiten im Gehirn deutlich stärker exprimiert

als die stärkste Glycinrezeptor α-Untereinheit α1. Für die Expression von Glycinrezeptoren im

Trigeminus ist β die am stärksten exprimierte Untereinheit. Dies ist insofern erstaunlich, als β

alleine keine funktionellen Rezeptoren bilden kann. Da die Expression von α2 nur einen Bruchteil

der Höhe von β erreicht, kann die Höhe der β-Expression auch nicht durch die Stöchiometrie von

(α)2(β)3 (Grudzinska et al., 2005) erklärt werden, weshalb der Grund der starken Expression der β-

Untereinheit hier unklar bleibt.

Die Expressionsprofile der Cys-loop-Rezeptoren der einzelnen Zellen spiegeln die Vielfalt der

Expression im Trigeminus nicht wieder. Für den Großteil der Cys-loop-Rezeptoren konnte keine

Expression festgestellt werden. Demnach kann man vermuten, dass die beobachtete

Rezeptorvielfalt im Trigeminus auf Zellpopulationen mit starker Expression eines individuellen

Teils der Rezeptorvielfalt beruht, die auf das Explantat bezogen eine durchschnittliche

Expressionsstärke zur Folge haben. Für GABAA-Rezeptoren widerspricht dem allerdings, dass im

Trigeminus der Ratte nahezu 100% der Neurone GABA-responsiv sind (Hayasaki et al., 2006;

Kondo et al., 1994).

110

Diskussion

Die als RNA-Standard bezeichnete Probe sollte als Amplikon, das vom trigeminalen Transkriptom

amplifiziert wurde, ein mit dem Trigeminus vergleichbares Expressionsprofil aufweisen. Dabei fällt

für die meisten Cys-loop-Rezeptoren auf, dass nur die im Trigeminus stark exprimierten Kanäle im

Amplikon festgestellt werden. Die Amplifizierung mit dem TransPlex Verfahren hat also offenbar

zur Folge, dass die schwach exprimierten Transkripte im Amplikon nicht repräsentiert werden,

was auch der Einschätzung von Gonzalez-Roca et al. (2010) entspricht.

4.7.4 Die Expression weiterer chemosensorisch relevanter Rezeptoren

Die Expression der weiteren TRP-Kanäle (TRPA1 wurde bereits erwähnt), TRPC, TRPM und TRPV,

konnte im Trigeminus bestätigt werden (3.3.1.3). Wie in der Einleitung dargestellt, sind die

Thermo-TRPs die Rezeptoren, die für die Temperaturwahrnehmung verantwortlich sind. Sie

vermitteln zudem die schmerzhaften Wirkungen von Irritantien. Die Expression von TRPV1-4 und

TRPM8 im Trigeminus ist nachgewiesen (Caterina et al., 1997; McKemy et al., 2002; Silver et al.,

2006; Xu et al., 2002; Yamamoto et al., 2009). Die Transkriptomanalyse zeigt Ähnlichkeiten des

Expressionsprofils von DRG und Trigeminus, die sich sehr deutlich nur durch die höhere

Expression von TRPM8 im Trigeminus unterscheiden. Dies entspricht den Ergebnissen von

Kobayashi et al. (2005), die in 35% trigeminaler Neurone und 22% DRG-Neuronen eine TRPM8-

Expression feststellten. Außerdem konnten letztgenannte Autoren keinen signifikanten

Unterschied der Expression von TRPA1 und TRPV1 zwischen Trigeminus und DRG feststellen. Dies

stimmt mit den Ergebnissen der Transkriptomanalyse überein. Von TRPC-Kanälen ist eine

vielseitige Expression über verschiedenste Gewebe hinweg bekannt. In einer Übersichtsarbeit

weist Montell (2005) auf eine starke Expression vor allem im Gehirn hin, wobei sie auch in nicht

neuronalem Gewebe auftreten. Zudem wurden alle TRPC-Kanäle in Dorsalwurzelganglien

festgestellt (Elg et al., 2007). Bei der hier durchgeführten Transkriptomanalyse wurden bis auf

TRPC7 alle Kanäle der Familie im Trigeminus und den DRG festgestellt. Bisher sind kaum

brauchbare spezifische Blocker für TRPC bekannt. Dies ist für eine Charakterisierung im nativen

System problematisch. Es sind vor allem intrazelluläre Modulationen bekannt. So ist für TRPC3, C6

und C7 eine Modulation durch Diacylglycerol bekannt, das durch die intrazelluläre Phospholipase

C gebildet wird (Hofmann et al., 1999; Okada et al., 1999). Es erscheint wahrscheinlich, dass diese

Kanäle bei chemosensorischen Prozessen des Trigeminus keine Funktion als ionotroper Rezeptor,

sondern als metabotroper Effektor ausüben.

Auch für KCNK-Kanäle 2, 4, 10, 18 ist eine Expression im Trigeminus bekannt (Lafreniere et al.,

2010; Yamamoto et al., 2009). Diese können als Rezeptoren für Reize von außen wirken und eine

111

Diskussion

irritierende Wirkung hervorrufen. Das durch den Inhaltsstoff Hydroxy-α-sanshool des

Szechuanpfeffers ausgelöste Prickeln wird durch KNCK-Kanäle vermittelt (Bautista et al., 2008;

Lennertz et al., 2010). Yamamoto et al. (2009) stellten eine Koexpression von KCNK-Kanälen und

vielen Thermo-TRP-Kanälen in kleineren trigeminalen Neuronen fest. Noel et al. (2009) konnten

nachweisen, dass durch KCNK-Kanäle die Schwellentemperatur, bei der ein thermischer Reiz ein

Vermeidungsverhalten auslöst, also eine Temperatur einen schmerzhaften Eindruck erzeugt,

durch KCNK-Kanäle bei Mäusen maßgeblich beeinflusst wird. Eine pharmakologisch wirksame

Substanz an KCNK-Kanälen kann also Schmerz- und Temperaturempfindung modulieren. Im

Rahmen einer weiteren Arbeit des Lehrstuhls wurde eine inhibierende Wirkung hoher

Konzentrationen von Nikotin auf die KCNK-Kanäle 2, 10 und 18 festgestellt (Daten hier nicht

gezeigt, persönliche Korrespondenz, L. Beltrán Márques ). Die Transkriptomanalyse bestätigt die

Expression von KCNK 1, 2, 10 und 18 im Trigeminus und den DRG und zeigt die Expression

weiterer zehn KCNK-Kanäle im Trigeminus (KCNK 4-6, 9, 12-14; 3.3.1.4).

4.7.5 Validierung der Sequenzierergebnisse

Im Rahmen der Transkriptomanalyse von Trigeminus und DRG in dieser Arbeit wurde auch die

Expression verschiedener housekeeping-Gene (Barber et al., 2005; Kouadjo et al., 2007; Zhou et

al., 2010) untersucht. Da dies Gene sind, die in der Regel keinen starken gewebespezifischen

Regulationen unterliegen, werden sie im Allgemeinen als Standard für Expressionsvergleiche

zwischen verschiedenen Strukturen genutzt. Zum einen zeigt beispielsweise die über die

verglichenen Gewebe hinweg starke Expression von Actb, Ubc und Ldha, mittelstarke Expression

von Tbp und schwache Expression ribosomaler Proteine Rpl5, 19 und 29, dass im Grunde

genommen das gewählte Sequenzierverfahren zur quantitativen Transkriptomanalyse geeignet ist

(3.3.1.1). In dieser Arbeit wurden housekeeping-Gene zum anderen als Positivkontrolle für eine

erfolgreiche Amplifikation genutzt. Um zu zeigen, dass mit einem per TransPlex Verfahren

erzeugten Amplikon ebenfalls eine zuverlässige quantitative Transkriptomanalyse möglich ist,

muss also für die housekeeping-Gene ein mit dem Trigeminus vergleichbares Expressionsprofil bei

den einzelnen Zellen festgestellt werden. Dies ist mit einigen Einschränkungen der Fall. Starke

Expression stimmt für Actb, deutliche bei Ldha, Ubc und Ppia im Wesentlichen überein. Mit Hprt

liegt allerdings ein Gen vor, dass im Trigeminus deutlich, in den einzelnen Zellen aber schwach

und teilweise gar nicht exprimiert wird, umgekehrt sind alle ribosomalen Proteine (RPL5, 19, 29)

im Trigeminus schwach, in den einzelnen Zellen jedoch stark exprimiert. Für den RNA-Standard

ergibt sich ein ähnliches Bild.

112

Diskussion

Dieses Amplikon wurde zum direkten Vergleich des trigeminalen Transkriptoms ohne und mit

Amplifikation generiert. Die Ähnlichkeit des Expressionsprofils stark exprimierter Gene und die

Abweichungen bei schwächer exprimierten Genen führt zu der Annahme, dass die von Gonzalez-

Roca et al. (2010) im Einzelfall festgestellten Unterschiede zwischen Expressionsergebnissen

mittels Sequenzierung nach TransPlex Amplifikation und der klassischen qPCR je stärker auftreten,

desto schwächer das Gen tatsächlich exprimiert ist.

Eine fehlende Expression von CNPase (bis auf einem Fragment im Amplikon von Zelle 6-1) in den

einzelnen Zellen wurde erwartet, da CNPase ein Marker für Schwann-Zellen ist und somit in

Amplikons trigeminaler Neurone nur als Kontamination auftreten kann. Im Transkriptom des

gesamten Ganglions kommt CNPase wegen der vorhandenen Schwann-Zellen vor (Chandross et

al., 1999; Nishizawa et al., 1985; Radtke et al., 2011; Sprinkle, 1989; Trapp et al., 1988). Beta-3-

Tubulin (Tubb3) ist für immunhistochemische Experimente ein allgemeiner Neuronenmarker.

Allerdings liegt die mRNA eher während der Wachstumsphasen von Zellausläufern in hohem

Maße vor (Jiang et al., 1994a; b; Kost und Oblinger, 1993). So könnte der Grund für die fehlende

Expression von Beta-3-Tubulin in den einzelnen Neuronen schlicht ein fehlendes Wachstum in der

Zellkultur sein.

Die bisher betrachteten Expressionsprofile der vier einzelnen Neurone ermöglichen einige

Folgerungen:

1. Die Expression der housekeeping-Gene zeigt, dass ein Transplex Amplikon eines Transkriptoms

mit einigen Einschränkungen für quantitative Expressionsanalyse geeignet ist. Einschränkungen

der Genauigkeit der Methode sind im Bereich der sehr niedrigen Expression zu erwarten.

2. Die fehlende Expression des Schwann-Zellmarker CNPase in den Transkriptomen der einzelnen

Neurone weist darauf hin, dass das Verfahren der Isolation einzelner Neurone aus der Zellkultur

kontaminationsfrei technisch durchführbar ist und die unbeabsichtigte Aufnahme von

Zellfragmenten oder freier mRNA vermeidbar ist.

Nur eines der beiden Neurone mit blockierbarem (-)-Nikotinsignal exprimiert einige der in

peripheren Ganglienzellen weit verbreiteten nAChR.

3. Es ist also offenbar mit Einschränkungen möglich, mit der TransPlex Amplifikation und

anschließender Amplikonsequenzierung, den für eine physiologische Eigenschaft

verantwortlichen Rezeptor zu identifizieren.

Im Gegensatz zu den housekeeping-Genen ist der Großteil der untersuchten Ionenkanäle nicht in

den einzelnen Neuronen exprimiert.

113

Diskussion

4. Die Vielfalt an ionotropen Rezeptoren im trigeminalen Transkriptom entsteht vermutlich nicht

durch weit verbreitete Expression, sondern durch verschiedene Zellpopulationen mit spezifischem

Expressionsprofil.

Allerdings zeigten Gonzalez-Roca et al. (2010) mittels qPCR, dass eine differentielle

Transkriptomanalyse zweier Amplikons des gewählten Systems bei einer derart geringen

eingesetzten RNA-Menge von etwa 10 pg (Sambrook und Russell, 2001), wie sie in einzelnen

Zellen enthalten ist, einen gewissen Anteil falsch negativer Ergebnisse ergibt. Die natürliche

Detektionsgrenze der Methode liegt bei einem RNA-Molekül. Allerdings ist sowohl die

Wahrscheinlichkeit gering, dass die Expression eines Genes mit einem einzelnen Transkript bei der

TransPlex Amplifikation repräsentiert, als auch bei der Sequenzierung festgestellt wird.

Vermutlich enthält demnach die Menge der gleichsam nicht exprimiert festgestellten Ionenkanäle

in den einzelnen Neuronen viele Gene, deren spezifische Expression aus technischen Gründen

nicht festgestellt werden konnten. Im Gegenzug ist es sehr wahrscheinlich, dass festgestellte

Expression auch tatsächlich auf einem ursprünglich vorliegenden Transkript beruht.

4.7.6 Differentielle Expression der einzelnen Nikotin-responsiven Neurone

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Transkriptome von vier (-)-Nikotin-responsiven trigeminalen

Neuronen untersucht. Bei zwei der Neuronen konnte das Nikotinsignal durch ein Gemisch aus

nAChR- und TRPA1-Blockern unterbunden werden. Da das Signal der anderen beiden Neurone in

der Gegenwart des Blockergemisches persistierte, ist zu vermuten, dass ein zusätzlicher, bisher

unbekannter Nikotinrezeptor für die Vermittlung des Signals verantwortlich ist. Aus diesem Grund

wurden die Transkriptome der Neurone mit nicht geblocktem Nikotinsignal mit denen der

Neurone mit geblocktem Signal aus jeweils demselben Versuchsdurchlauf verglichen, um

exprimierte Gene zu identifizieren, die exklusiv in den nicht geblockten Neuronen vorkommen

(3.3.2). Die nicht geblockten Zellen exprimierten 1244 (Zellen 6-1 vs 2-1) und 2425 (Zellen 5-1 vs

2-2) Gene exklusiv. Unter diesen befanden sich neben Strukturgenen auch 48 (Zelle 5-1)

beziehungsweise 8 (Zelle 6-1) Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Der Vergleich

dieser beiden „Exklusivlisten“ zeigte, dass mit dem Gpr137 einer dieser Rezeptoren in beiden

nicht geblockten Zellen exprimiert wird. Ginge man davon aus, dass man das Transkript eines

Rezeptors, der im Calcium-Imaging ein deutliches Signal vermittelt, in der Transkriptomanalyse

ebenfalls zuverlässig nachweisen kann, so wäre mit dem Gpr137 ein sinnvoller Kandidat für

weitergehende Experimente zur pharmakologischen Charakterisierung identifiziert. Gpr137

codiert für den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Latrophilin 1 (Vakonakis et al., 2008), der im

114

Diskussion

gesamten Nervensystem exprimiert wird (Magdaleno et al., 2006) und auch im olfaktorischen

Epithel vorkommt (persönliche Korrespondenz, N. Kanageswaran). Über die Funktion dieses

Rezeptors ist bisher nichts bekannt. Man weiß, dass das Spinnengift α-Latrotoxin an ihn bindet

(Grishin, 1998). Obwohl es denkbar wäre, dass dieser Rezeptor das (-)-Nikotinsignal der

trigeminalen Neurone vermittelt hat, ist die gemeinsame Expression des Rezeptors in den beiden

nicht geblockten Neuronen nur ein schwaches Indiz. Die bereits erwähnten Einschränkungen der

Einzelzelltranskriptomanalyse, die nicht auf das Sequenzierverfahren, sondern vielmehr auf der

Generierung des Amplikons beruhen, können Ursache dafür sein, dass exprimierte Rezeptoren in

Einzelfällen nicht festgestellt werden. Dies könnte auch bei den beiden geblockten Neuronen der

Fall sein. Aufgrund der Blockierbarkeit der Nikotinantwort durch die nAChR- und TRPA1-

spezifischen Antagonisten erwartet man, dass die Antwort durch einen dieser Kanäle vermittelt

wurde. Eine der Zellen zeigt eine Expression, der in sensorischen Ganglien verbreiteten nAChR

α4β2 (2.1), bei der anderen Zelle (2.2) ist kein neuronaler nAChR exprimiert. Zudem konnte auch

keine Expression von TRPA1 festgestellt werden. Da es aber bisher erst wenige Erkenntnisse

darüber gibt, wie hoch der Anteil der mittels Transkriptomanalyse eines TransPlex Amplikons

fälschlicherweise nicht festgestellten Gene bei minimalem RNA-Einsatz in der Amplifikation ist,

kann nicht ausgeschlossen werden, dass in den vier untersuchten Neuronen mehr

Transmembranproteine exprimiert werden, als festgestellt wurden. Zwischen den beiden

untersuchten nicht geblockten Zellen könnten mehr Transmembranproteine gemeinsam

exprimiert werden.

Es wurde zudem eine deutliche Expression olfaktorischer Rezeptoren in den untersuchten

Neuronen festgestellt. Mittlerweile wurden olfaktorische Rezeptoren außerhalb des

olfaktorischen Epithels schon in verschiedenen Geweben wie beispielsweise Muskel (Griffin et al.,

2009) und Hirngewebe der Maus (Otaki et al., 2004), sowie Leber (Yuan et al., 2001), Hoden

(Spehr et al., 2003) aber auch der Zunge von Mensch (Durzynski et al., 2005; Gaudin et al., 2001)

und Maus (Gaudin et al., 2006) nachgewiesen. Spehr et al. (2004) zeigten, dass im Trigeminus

keine olfaktorischen Rezeptoren exprimiert werden. Bei der im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführten Transkriptomanalyse wurde die Expression einiger olfaktorischer Rezeptoren

festgestellt. Jedoch lag die Expressionsstärke weit unterhalb von 1 FPKM. Dies traf zudem auch

auf gustatorische Rezeptoren zu. Die in den nicht geblockten Neuronen teils deutlich exprimierten

olfaktorischen Rezeptoren wie Olfr293 und Olfr1200, für die bisher kein Ligand bekannt ist,

könnten ebenfalls in Betracht gezogen werden, für die Vermittlung des Nikotinsignals

verantwortlich zu sein. Ihre Expression wurde allerdings im Explantat des Trigeminus nicht

gefunden, was darauf hinweist, dass es sich bei den Zellen, die diese Rezeptoren exprimieren, um

115

Diskussion

eine sehr kleine Neuronenpopulation handelt. Der Anteil der Transkripte für diese Rezeptoren am

Transkriptom des gesamten Trigeminus ist offenbar zu gering, um beim Next-generation-

sequencing ins Gewicht zu fallen. Die Ergebnisse unterstützen die Vermutung der Existenz Nikotin-

sensitiver olfaktorischer Rezeptoren von Thuerauf et al. (2006) und kann die von Bryant et al.

(2010) festgestellte in Gegenwart von nAChR-Blockern Nikotin-responsive Population

olfaktorischer Rezeptorneurone erklären.

4.7.7 Die Bedeutung der chemosensorischen Wahrnehmung von Nikotin

Die chemosensorische Wahrnehmung von Nikotin ist maßgeblich an der suchtstillenden Wirkung

beteiligt, die Zigarettenrauch auf Raucher ausübt (Rose et al., 1985). Eine zusätzliche sensorische

Stimulation über den Mund- und Rachenraum verstärkt so auch die Effektivität von

Nikotinersatzprodukten wie Nikotinpflastern, verringert also die Rückfallwahrscheinlichkeit

(Westman et al., 1995). Nikotin ist ein wesentlicher Bestandteil des Aromas von Zigarettenrauch

(Pritchard et al., 1996), dementsprechend wirkt der erste sensorische Eindruck nikotinfreier

Tabakprodukte weniger suchtstillend als bei nikotinhaltigen (Naqvi und Bechara, 2005). Allerdings

stellten Rose et al. (1993) fest, dass Raucher unter ad libitum Versuchsbedingungen den Konsum

eines verdünnten Zigarettenaerosols so erhöhen, dass der gesteigerte Konsum die Verdünnung

wieder aufwiegt. Dies passierte bei einem Aerosol mit starkem sensorischem Eindruck aber mit

sehr niedrigem Nikotingehalt nicht. Der Konsum des Aerosols wurde also durch den sensorischen

Eindruck bestimmt, nicht durch die Nikotindosis. Sehr deutlich wird die Bedeutung des

chemosensorischen Eindrucks für das Rauchverhalten an Zusatzstoffen in Tabakwaren. Als ein

verbreiteter Aromastoff wird Zigaretten Menthol zugegeben. Neben der Aktivierung von TRPM8

hat Menthol eine antagonistische Wirkung beim TRPA1-Kanal (Macpherson et al., 2006). Uhl et al.

(2011) stellten fest, dass ein menschlicher TRPA1-Haplotyp mit einem missense-Polymorphismus

insbesondere bei starken Rauchern mit einer häufigeren Wahl von Mentholzigaretten einhergeht.

Der durch den Rauch hervorgerufene sensorische Gesamteindruck beeinflusst hier durch den

Nikotinrezeptor TRPA1 also maßgeblich die Wahl des Tabakprodukts. Allerdings wird der Kanal

durch weitere Inhaltsstoffe des Tabakrauchs aktiviert, wie beispielsweise Formaldehyd

(McNamara et al., 2007). Es wurde außerdem festgestellt, dass Raucher von Mentholzigaretten

Anzeichen einer tendenziell stärkeren Nikotinabhängigkeit zeigen, was dadurch passieren kann,

dass die Hemmung des TRPA1 die durch Irritantien hervorgerufene Verringerung der Inhalation

verhindert (Fagan et al., 2010). Menthol im Aerosol führt also zu einer tieferen Inhalation und zu

größerer Nikotinaufnahme. Die gezielte Zugabe von Zusätzen in

116

Diskussion

Tabakwaren kann also – vor allem durch ein Zusammenspiel chemosensorischer Vorgänge – eine

Entwöhnung vom Tabakkonsum erschweren. Es ist zu vermuten, dass weitere Zusammenhänge –

wie sie für die Wirkung von Nikotin und Menthol im Zigarettenrauch gefunden wurden – das

Verhalten von Tabakkonsumenten beeinflussen. Nikotin kann zu einem konditionierten Reiz

werden, der neben der pharmakologischen Wirkung im Zentralnervensystem auch als

chemosensorischer Stimulus deutlich das Suchtverhalten beeinflusst (Bryant et al., 2010). Bisher

sind nAChR und TRPA1 als die einzigen Rezeptoren bekannt, die direkt durch Nikotin aktiviert

werden. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese beiden Rezeptoren nicht

ausreichen, um die chemosensorische Wirkung von Nikotin zu erklären. Es geht außerdem aus

dieser Arbeit hervor, dass es sowohl für das (+)- als auch das (-)-Enantiomer je einen weiteren

stereoselektiven Rezeptor im Trigeminus geben muss. Die weitere Aufklärung der

chemosensorischen Signalwege zur Wahrnehmung von Nikotin ist von Bedeutung, um das

Verständnis der Suchtwirkung von Nikotin zu vervollständigen.

117

Zusammenfassung

5. Zusammenfassung

Nikotin ist ein weit verbreitetes Suchtmittel, dessen Konsum mit schweren gesundheitlichen

Folgen verbunden sein kann. Der von Nikotin hervorgerufene chemosensorische Eindruck trägt

einen Anteil zur Wirkung der Droge bei. Nikotin existiert in zwei Stereoisomeren, das (+)- und das

(-)-Nikotin, von denen (-)-Nikotin das wesentlich häufiger in der Natur vorkommende Enantiomer

ist. Die Wirkung der Droge wird im Zentralnervensystem durch nikotinische

Acetylcholinrezeptoren vermittelt. Nikotin ruft einen chemosensorischen Eindruck hervor, der

unter anderem einen olfaktorischen Eindruck und trigeminale Eindrücke wie Brennen und

Stechen einschließt. Bei der chemosensorischen Wirkung von Nikotin tritt eine gewisse

Stereoselektivität auf. Probanden können die Enantiomere olfaktorisch unterscheiden, die

trigeminalen Komponenten haben für beide Enantiomere unterschiedliche Schwellen. Für den

chemosensorischen Eindruck von Nikotin ist neben der Beteiligung nikotinischer

Acetylcholinrezeptoren auch eine Beteiligung des transient receptor potential A1-Kanals bekannt,

der auch den stechenden trigeminalen Eindruck von Senf vermittelt. Psychophysische

Experimente lassen vermuten, dass der chemosensorische Eindruck von Nikotin nicht vollständig

durch nAChR und TRPA1 erklärt werden kann.

In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Nikotin auf im Trigeminus exprimierte ionotrope

Rezeptoren untersucht. Dazu wurde das Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Verfahren zur

elektrophysiologischen Charakterisierung der Wirkung von (+)- und (-)-Nikotin auf heterolog

exprimierte Rezeptoren genutzt. Für heterolog exprimierte menschliche nAChR sowie den TRPA1-

Kanal wurde in dieser Arbeit erstmals eine elektrophysiologische Untersuchung der

Stereoselektivität der Rezeptoren durchgeführt. Für je ein Beispiel eines homo- (α7) und

heteromultimeren (α2β4) menschlichen nAChR konnte die Stereoselektivität für das

(-)-Enantiomer auf diesem Wege gezeigt werden. Beim TRPA1-Kanal wurde erstmals (+)-Nikotin

als Agonist festgestellt und zudem im Vergleich mit (-)-Nikotin keine Stereospezifität beobachtet.

Für die mit den nAChR verwandten humanen 5-HT3-Rezeptoren wurde festgestellt, dass Nikotin

als Antagonist wirkt, wobei für (-)-Nikotin eine stärkere Wirkung beobachtet wurde. Diese Effekte

wurden sowohl am homomeren menschlichen 5-HT3A- als auch am heteromeren 5-HT3AB-

Rezeptor gezeigt. Bei einer Untersuchung ionotroper Glutamatrezeptoren wurde ein (-)-Nikotin-

hervorgerufener (10 mM), spannungsabhängiger Block von NMDA-Rezeptoren (NR1-3a/NR2B)

festgestellt, der in seiner Erscheinung dem bekannten Mg2+-Block ähnelt, jedoch nicht die Stärke

erreicht. Für GABAA-, Glycin-, AMPA- (GluR1(Q)flop), Kainat- (GluR6(Q)), P2X2-Rezeptoren sowie

TRPV1-3- und TRPM8-Kanäle wurde keine Wirkung von Nikotin beobachtet.

118

Zusammenfassung

Die positive Modulation von (-)-Nikotin bei TRPV1-Rezeptoren der Ratte konnte am menschlichen

TRPV1 nicht bestätigt werden.

Ferner wurde im Rahmen der Arbeit die Wirkung von Nikotin auf trigeminale Neurone der Maus

im Calcium-Imaging untersucht und in Experimenten unter simultanen Blockerbedingungen für

die bekannten Nikotinrezeptoren nAChR und TRPA1 festgestellt, dass es eine kleine

Neuronenpopulation gibt, deren (-)-Nikotinantwort sich durch die spezifischen Blocker für diese

Kanäle nicht blockieren lässt. Damit konnte ich zeigen, dass es in trigeminalen Neuronen einen

weiteren Rezeptor für (-)-Nikotin geben muss, der wahrscheinlich an der Vermittlung des

chemosensorischen Eindrucks von Nikotin beteiligt ist. Erstmals wurde zudem eine (+)-Nikotin-

spezifische Population trigeminaler Neurone entdeckt, für die ein Rezeptor bisher nicht bekannt

ist. In weiteren Experimenten konnte unter Blockerbedingungen für nAChR und TRPA1-Kanälen

gezeigt werden, dass die Signale der (+)-Nikotin-spezifischen Neuronenpopulation nicht durch die

bekannten Nikotinrezeptoren vermittelt werden. Es wurde in dieser Arbeit also nachgewiesen,

dass es im Trigeminus einen spezifischen (+)-Nikotinrezeptor gibt. Da die nicht nAChR- oder

TRPA1-vermittelten Nikotinantworten sowohl für (+)- als auch (-)-Nikotin möglicherweise durch G-

Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelt werden können, wurde in dieser Arbeit die Beteiligung

metabotroper Signalwege untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass weder (+)- noch

(-)-Nikotinsignale unter Ca2+-freien Messbedingungen auftreten, die Nikotinsignale sind also auf

Ca2+-Ionen von außen angewiesen. Es konnte außerdem erstmals gezeigt werden, dass der für

5-HT3-Rezeptoren bekannte Block durch Nikotin auch an nativen Rezeptoren in trigeminalen

Neuronen auftritt. Es wurde also mit 5-HT3-Rezeptoren ein drittes wichtiges Target für Nikotin im

Trigeminus nachgewiesen, das durch einen Nikotin-vermittelten Block trigeminales

Schmerzempfinden beeinflusst.

Mit einer systematischen Transkriptomanalyse von Trigeminus und Dorsalwurzelganglien mittels

Next-generation-sequencing wurden die bisher zumeist qualitativen Expressionsnachweise für die

chemosensorisch relevanten Cys-loop-, TRP- und KCNK-Kanäle im Trigeminus in einem

quantitativen Verfahren bestätigt und mit DRG verglichen. Mit Hilfe einer Amplikonsequenzierung

wurde das Transkriptom einiger einzelner im Calcium-Imaging unter den erwähnten simultanen

Blockerbedingungen identifizierten und aus der Zellkultur isolierten Neurone untersucht, um

Kandidaten eines unbekannten Rezeptors für (-)-Nikotin zu identifizieren. Dabei wurde eine

deutliche Expression olfaktorischer Rezeptoren in einzelnen Neuronen festgestellt. In einem der

zwei bei simultanem Block Nikotin-responsiven Neurone wurde der Olfr293, in dem anderen

Olfr1200 exprimiert. Aus der Menge bekannter Transmembranrezeptoren exprimierten diese

beiden Zellen nur den Latrophilinrezeptor Gpr137 gemeinsam.

119

Zusammenfassung

Die mit der Einzelzelltranskriptomanalyse gewonnen Expressionsergebnisse bieten weitere

Ansätze, unter den vielen im Trigeminus exprimierten Transmembranrezeptoren die gesuchten

unbekannten Rezeptoren für Nikotin zu finden.

120

Summary

5. Summary

The consumption of the widespread addictive drug nicotine can cause severe diseases. The

nicotine-induced sensory effect is known to contribute to the addictive effect. Nicotine exists in

two stereoisomers, (+)- and (-)-nicotine, of which the (-)-enantiomer is much more abundant in

nature. The drug’s central nervous effect is mediated by nicotinic acetylcholine receptors. Both,

the olfactory system as well as trigeminal sensations like “burning” and “stinging” contribute to

the chemosensory impression induced by nicotine. The chemosensory impressions are

stereoselective. Subjects can discriminate the two isomers by olfactory sensation; the trigeminal

effects appear at different detection thresholds for each enantiomer. Besides nicotinic

acetylcholine receptors, the transient receptor potential channel A1, that mediates the “stinging”

mustard oil impression, is known to contribute to the nicotine impression. Psychophysical studies

indicate that nAChR and TRPA1 cannot fully explain the nicotine-induced chemosensory

impression.

In this study, we investigated the effect of nicotine on trigeminal expressed ionotropic receptors.

We used the electrophysiological two-electrode-voltage-clamp technique to characterize the

effect of (+)- and (-)-nicotine on heterologously expressed receptors. For homo- (α7) and

heteromeric (α2β4) human nAChRs the stereoselectivity for (-)-nicotine could be shown. For the

first time, (+)-nicotine could be shown to be a TRPA1-agonist. Additionally, no stereospecifity was

observed. Further, nicotine was identified as an antagonist for human 5-HT3-receptors with a

stereospecifity for the (-)-enantiomer. These effects were observed for homomeric 5-HT3A- as well

as heteromeric 5-HT3AB-receptors. Experiments analyzing ionotropic glutamate receptors revealed

a voltage-dependent block of NMDA-receptors (NR1-3a/NR2B) induced by (-)-nicotine (10 mM),

which looks similar to the known voltage-dependent Mg2+-block, but remains incomplete. No

effect was observed at GABAA-, Glycine-, AMPA- (GluR1(Q)flop), Kainat- (GluR6(Q)), P2X2-

receptors as well as TRPV1-3- and TRPM8-channels. In our experiments with human TRPV1,

(-)-nicotine could not evoke the positive modulation, that is known for TRPV1 from rat.

Further, in this study the effect of nicotine on murine trigeminal neurons was investigated in

calcium-imaging experiments. Under nAChR and TRPA1 blocking conditions a certain population

of neurons was found, showing a persisting (-)-nicotine response. With these results I could prove

the existence of an unknown (-)-nicotine receptor, expressed in trigeminal neurons, that may

contribute to the chemosensory impression of nicotine. Further, a population of neurons was

identified, responding specifically to (+)-nicotine. A specific receptor for this enantiomer is not

known to date. In further experiments, again under nAChR and TRPA1 blocking conditions, we

121

Summary

could prove signals of specifically (+)-nicotine-responding neurons not to be mediated by both

known receptor families. Therefore, in this study the existence of a (+)-nicotine-specific receptor

expressed in trigeminal neurons was shown. As the unknown (+)- and (-)-nicotine-evoked signals

may be mediated by G-protein-coupled receptors, the involvement of metabotropic signal

pathways was investigated. Neither (+)- nor (-)-nicotine-induced signals were found under

Ca2+-free conditions, indicating that the observed nicotine-induced signals depend on extracellular

Ca2+-ions. Additionally, the blocking effect of nicotine on 5-HT3-receptors, for the first time, was

observed on native receptors in trigeminal neurons. 5-HT3-receptors were identified as the third

important target of nicotine in the trigeminal system with the capacity to influence nociception.

In a systematical approach, in this study, we analyzed the transcriptome of trigeminal and dorsal

root ganglia via next-generation-sequencing methods. We could quantify the trigeminal

expression of chemosensory relevant Cys-loop-, TRP- and KCNK-channels. In previous studies

these channels were detected by qualitative methods. Further, we tried to identify unknown

receptors of (+)- and (-)-nicotine by analyzing the amplicons of single cell transcriptomes, that

showed nicotine-signals independently from nAChRs and TRPA1. Transcriptome analysis of these

cells showed a clear expression of olfactory receptors in single neurons responsive under blocking

conditions. One neuron expressed Olfr293, the other Olfr1200. From the mass of known

transmembrane receptors, both cells shared just the expression of one single receptor, the

Latrophilin receptor Gpr137. Results gained from single-cell transcriptome analysis provide

further candidates of trigeminal expressed receptors that could be the unknown nicotine

receptors.

122

Anhang

6. Anhang

6.1 Literaturverzeichnis

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138

Anhang

6.2 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1 Schema des Nervus trigeminus des Menschen (Gray, 2004).

Abbildung 1.2 Schema der Untereinheiten Liganden-gesteuerter Ionennkanäle

(Khakh, 2001).

Abbildung 1.3 TRP-Kanaluntereinheiten verschiedener Subfamilien (Montell, 2005).

Abbildung 1.4 Strukturformel beider Nikotin-Enantiomere.

Abbildung 1.5 Schematische Darstellung des Illumina-Solexa Sequenzierverfahrens

(Illumina Genome Analyzer II Workflow, http://www.illumina.com/).

Abbildung 2.1 Schematische Darstellung des Voltage-Clamp Messaufbaus.

Abbildung 3.1 Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Serotonin am 5-HT3A-Rezeptor in Gegenwart und Abwesenheit von Nikotin gemessen mit dem Zwei-Elektroden

Voltage-Clamp Verfahren.

Abbildung 3.2 Konzentrations-Inhibitions-Beziehung für Nikotin an 5-HT3A- und 5-HT3AB-

Rezeptoren bei konstanter Serotoninkonzentration (5-HT) gemessen mit dem

Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.

Ergebnisse sind entstanden in Zusammenarbeit mit Paul Ziemba.

Abbildung 3.3 Effekt von (+)-Nikotin am nAChR α7 gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-

Clamp Verfahren.

Abbildung 3.4 Effekt von (+)-Nikotin am nAChR α2β4 gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-

Clamp Verfahren. Abbildung 3.5 Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Glycin (Gly) am Glycinrezeptor α1 in

Gegenwart und Abwesenheit von Nikotin gemessen im Zwei-Elektroden

Voltage-Clamp Verfahren.


Abbildung 3.6 Der Einfluss von (-)-Nikotin auf die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für

GABA an GABAA-Rezeptoren gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren.

Abbildung 3.7 Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Adenosintriphosphat (ATP) am P2X2-

Rezeptor in Gegenwart und Abwesenheit von Nikotin gemessen im Zwei-

Elektroden Voltage-Clamp Verfahren. Ergebnisse sind entstanden in Zusammenarbeit mit Ramona Lehmann.

Abbildung 3.8 Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für Glutamat an den Glutamatrezeptoren

GluR1 und GluR6 in Gegenwart und Abwesenheit von (-)-Nikotin gemessen im

Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.

Abbildung 3.9 Wirkung von (-)-Nikotin am NMDA-Rezeptor NR1-3a/NR2B gemessen im Zwei-

Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.


Abbildung 3.10 Effekt von (+)-Nikotin am TRPA1 gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren.

Abbildung 3.11 Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen an TRPV-Kanälen in Gegenwart und Abwesenheit von Nikotin gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren.

Abbildung 3.12 Der Einfluss von Nikotin auf die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung für

Menthol (Men) am TRPM8-Kanal gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp

Verfahren.

Abbildung 3.13 Calcium-Imaging Signale trigeminaler Neurone auf separate Stimuli von Nikotin

beider Enantiomere.

Ergebnisse sind entstanden in Zusammenarbeit mit Ulrike Thiel.

139

Anhang

Abbildung 3.14 Calcium-Imaging Signale (-)-Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone unter

separatem Block durch Hexamethonium (Hex) und HC030031 (HC). Abbildung 3.15 Calcium-Imaging Signale (-)-Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone unter

separatem Block durch Mecamylamin (Mec) und simultanem Block durch

Hexamethonium (Hex) und HC030031 (HC).

Abbildung 3.16 Calcium-Imaging Antwortprofile Nikotin-responsiver trigeminaler Neurone bei

Block durch Rutheniumrot (RR).


Block durch Gentamycin.


Block durch Hexamethonium und Borneol.

Abbildung 3.19 Block der Nikotin-induzierten Calcium-Imaging Signale trigeminaler Neurone unter Ca2+-freien Bedingungen im Extrazellulärmedium.

Abbildung 3.20 Einfluss des Phospholipase C-Blockers Edelfosin auf (-)-Nikotin-induzierte

Calcium-Imaging Signale trigeminaler Neurone.

Abbildung 3.21 Calcium-Imaging Signale Serotonin und mCPBG-responsiver trigeminaler

Neurone

Abbildung 3.22 Schematische Darstellung der Transkriptomamplifikation.

(Verändert nach Benutzerinformation WTA2 Procedure,

http://www.sigmaaldrich.com).

Abbildung 3.23 Einteilung der Transkriptome in Expressionsklassen.

Abbildung 3.24 Exemplarische alignments sequenzierter Transkripte aus Amplikon-

sequenzierungen einzelner Zellen und der Trigeminus-

Explantatsequenzierung an das Genom der Maus (mm9).

Abbildung 3.25 Heatmap der Expressionsstärken untersuchter Transkriptome für eine

Auswahl von housekeeping-Genen. Die Transkriptomanalysen von DRG und

Trigeminus-Explantat erfolgten in Zusammenarbeit mit Ramona Lehmann.

Abbildung 3.26 Heatmap der Expressionsstärken untersuchter Transkriptome für die Cys-loop- Kanäle. Die Transkriptomanalysen von DRG und Trigeminus-Explantat erfolgten

in Zusammenarbeit mit Ramona Lehmann.

Abbildung 3.27 Heatmap der Expressionsstärken untersuchter Transkriptome für die TRP-

Kanäle. Die Transkriptomanalysen von DRG und Trigeminus-Explantat erfolgten


Abbildung 3.28 Heatmap der Expressionsstärken untersuchter Transkriptome für die KCNK-

Kanäle. Die Transkriptomanalysen von DRG und Trigeminus-Explantat erfolgten


Abbildung 3.29 Darstellung der Expressionsstärke untersuchter Transkriptome als Histogramm. Abbildung 3.30 Vergleich der Anzahl exprimierter Gene der Einzelzelltranskriptome.

140

Anhang

6.3 Tabellenverzeichnis

Tabelle 3.1 Elektrophysiologischen Ergebnisse der Nikotin-Responsivität rekombinanter

humaner Ionenkanäle gemessen im Zwei-Elektroden Voltage-Clamp Verfahren.

Tabelle 3.2 Anzahl prozessierter und gemappter reads untersuchter Transkriptome nach

Analyse mit „TopHat“.

Tabelle 3.3 Auflistung exklusiv exprimierter Transmembranproteine für die Zellen 5-1 und

6-1.

Tabelle 3.4 Auflistung der in den einzelnen Zellen exprimierten olfaktorischen Rezeptoren

(OR).

141

Anhang

6.4 Abkürzungsverzeichnis

2-APB 2-Aminoethoxydiphenylborat

5-HT3A 5-Hydroxy-Tryptamin-Rezeptor Typ 3A

ACh Acetylcholin

AITC Allylisothiocyanat

AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

CCD-Kamera charge-coupled device-Kamera

cDNA complementary desoxyribonucleic acid

CHO-Zellen Chinese hamster ovary Zellen

CNPase cyclic nucleotide phosphodiesterase

cRNA complementary ribonucleic acid

CT cycle treshold

DAG Diacylglycerol

DMEM/F-12 Dulbeccos´s Modified Eagle Medium

DRG dorsal root ganglia

EC50 half maximal effective concentration

EGTA ethylene glycol tetraacetic acid

FBS fetal bovine serum

FPKM fragments per kilobase of exon per million mapped reads

GABA γ-Aminobuttersäure

GABAAR γ-Aminobuttersäure-Rezeptor Typ A

GluR Glutamatrezeptor

Gly Glycin

HC HC030031

HEK Zellen Human embryonal kidney 293 Zellen

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

Hex Hexamethonium

Hz Hertz I Strom

ICH-Kanäle hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-gated cation channel

KCNK Kanal Tandemporen-Kaliumkanal Typ K

L15 Leibovitz Medium 15

mCPBG m-Chlorophenylbiguanidhydrochlorid

Mec Mecamylamin

MEM minimum essential medium

mRNA messenger ribonucleic acid

nAChR nikotinische Acetylcholinrezeptoren

NFR normal frog ringer

Nik Nikotin

NMDA N-Methyl-D-Aspartat

NR N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor

OR olfaktorische Rezeptoren

P2X-Rezeptor Purinozeptor Typ 2X

PBS+/+ Phosphat gepufferte Salzlösung

PCR polymerase chain reaction

PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat

142

Anhang

PLC Phospholipase C

qPCR quantitative polymerase chain reaction rpm rounds per minute

RR Rutheniumrot

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

Strd RNA-Standard

TBE-Puffer Tris/Borate/EDTA-Puffer

TG Trigeminus

TM2 Transmembrandomäne 2

TRPA1 transient receptor potential ankyrin-repeat 1

TRPC transient receptor potential canonical

TRPM transient receptor potential melastatin TRPML transient receptor potential mucolipin

TRPP transient receptor potential polycystic kidney disease-related protein

TRPV transient receptor potential vanilloid

ZAC Zn2+

-activated ion channel

UE Untereinheiten

143

Anhang

6.5 Publikationsliste

Veröffentlicht

Schöbel, N., Radtke, D., Lubbert, M., Gisselmann, G., Lehmann, R., Cichy, A., Schreiner, B.S.P.,

Altmüller, J., Spector, A.C., Spehr, J., Hatt, H., Wetzel, C.H., 2012. Trigeminal Ganglion Neurons of Mice Show Intracellular Chloride Accumulation and Chloride-Dependent Amplification of

Capsaicin-Induced Responses. Plos One 7, e48005.

Eingereicht

Schreiner, B.S.P., Lehmann, R., Thiel , U., Ziemba, P., Beltrán, L.R., Sherkheli, M.A., Jeanbourquin,

P., Hugi, A., Werner, M., Gisselmann, G., Hatt, H.

Direct action and modulating effect of (+)- and (–)-nicotine on ion channels expressed in

trigeminal sensory neurons.

In Vorbereitung

Kanageswaran, N., Demond, M., Schreiner, B.S.P., Baumgart, S., Nagel, M., Altmueller, J., Becker,

C., Dörner, J.F., Benecke, H., Wetzel, C.H., Hatt, H., Gisselmann, G.

Deep sequencing of the murine olfactory epithelium transcriptome.

Manteniotis, S., Lehmann, R., Flegel, C., Vogel, F., Hofreuter, A., Schreiner, B.S.P., Schöbel, N.,

Altmüller, J., Hatt, H., Gisselmann, G.

Comprehensive RNA-Seq expression analysis of sensory neurons with focus on trigeminal ganglia.

Lebenslauf

Zur Person

Name Benjamin Schreiner

Geboren am 12.02.1980

Geburtsort Essen

Schulbildung

1986-1990 Katholische Grundschule Hattingen-Niederwenigern

1990-1999 Gymnasium Waldstraße in Hattingen

Akademische Ausbildung

1999 – 2008 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

2007- 2008 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Zellphysiologie der Ruhr-

Universität Bochum mit dem Titel „Die Funktion zyklisch-

Nukleotid gesteuerter Ionenkanäle bei der Chemorezeption von

Drosophila melanogaster“, betreut durch Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns

Hatt

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt für die Überlassung

des interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die Betreuung bedanken.

Für die freundliche Übernahme des Korreferats danke ich Herrn PD Dr. Matthias Schmidt.

Mein besonderer Dank geht an Herrn Dr. Markus Werner und Herrn Dr. Günter Gisselmann,

die in vielen konstruktiven Gesprächen zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben und in

deren wissenschaftlichem Erfahrungsschatz so mancher wertvolle Rat zu unerwarteten

Problemstellungen zu finden ist.

Für technische Unterstützung möchte ich Herrn Harry Bartel, Herrn Thomas Lichtleitner, Frau

Ute Müller und Frau Jasmin Gerkrath danken. Für die Unterstützung in Dingen der Bürokratie

danke ich Frau Ulrike Thomes.

Ein großes Dankeschön an alle Mitarbeiter des Lehrstuhls für Zellphysiologie für die grandiose

Atmosphäre. Besonders möchte ich mich bei aktuellen und ehemaligen Insassen vom „Raum

der Götter“ Sabrina Baumgart, Olaf Kletke, Lian Gelis, Stefan Kurtenbach, Sebastian Rasche und

Ivonne Wallrabenstein bedanken. Neben der Wissenschaft ging es mit Euch auch mal lustig zu.

Ihr habt meine Marotten ertragen. Es war eine gute Zeit. Ein weiteres herzliches Dankeschön

auch an die lieb gewonnenen Ehemaligen des Lehrstuhls Ainhara Aguado, Debbie Radtke,

Nicole Schöbel und Ramona Lehmann. Ohne Euch ist blöd.

Ganz besonders möchte ich meinen Eltern für die Unterstützung in jeder Hinsicht danken.

Mein ganzes Leben lang habt ihr mich noch nie im Regen stehen lassen.

Ein ganz großes Dankeschön an meine Familie, an Gott und an meine Freunde. Ihr habt mir viel

Verständnis entgegengebracht, selbst wenn ich mal irgendwie komisch geworden bin. Und

danke Oma für immer lecker Essen.

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