Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt

AG Nimmerjahn

Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung

Fc Rezeptoren (FcR)

Rezeptoren für Immunglobuline Expression auf Immunzellen Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern

Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems

FcR Arten

Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren

Fc Rezeptor für • IgA Fc R• IgG Fc R• IgE Fc R• IgM Fc R• IgD Fc R

Maus 4 Gene für

• FcgRI• FcgRII• FcgRIII• FcgRIV

Mensch 8 Gene für• FcgRI (A, B, C)• FcgRII (A, B, C)• FcgRIII (A, B)

Fc g Rezeptoren

Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion

ITIM

FcRIIBFcRI

2 2

FcRIII

Mouse

Human

2

hFcRIIIAFcRI

2ITIM

FcRIIB

FcRIIA

high affinity low/medium affinity

FcRIV

2 ITAM

ITAM

FcgR

Aktivierende FcgR• FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII

Inhibierende FcgR• FcgRIIB

werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert• Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen

Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und inhibitorischen Signalweg

Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der Immunantwort bestimmt

Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert• Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibody-

dependend cellular cytotoxity (ADCC)

Signalleitung

Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung assozierte Adaptermoleküle

Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig Am häufigsten ‚common chain‘ Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)

Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM)

Braucht kein Adaptormolekül

FcRI

2ITAM

ITIM

FcRIIB

Signalleitung aktivierender FcgR

Src-family Kinase phosphoryliert ITAM

SH2 Bindedomäne entsteht Syk bindet Signalkaskade wird eingeleitet Ras/Raf/MAP Kinase pathway

wird aktiviert Kalzium abhängige Signalwege

aktiviert

downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK)

cell activation-ADCC-Phagocytosis-Cytokine release-Oxidative burst

Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR

Co-Ligation beider FcgR führt zu Phosphorylierung des ITIM vom FcgRIIB

SHIP bindet an entstandene SH-2 Dömäne

Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ)

Inhibitorischer FcgRIIB (CD32)

Größe: 40 kDa Aufbau:

• 2 extrazelluläre Domänen

• 1 Transmembranregion

• 1 cytoplasmatischer Schwanz

geringe Affinität für monomeres IgG hohe Avidität für Immunkomplexe Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based

inhibitory motif) 2 Isoformen

• IIB-1 Signalwirkung

• IIB-2 Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch

Einziger FcR auf B-Zellen

ITIM

FcRIIB

FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen

Co-Ligation mit:

• Sich selbst führt zu Apoptose

• BCR Verminderung des BCR Aktivierungssignal

anti-apoptotisches Signal

Co-Ligation mit BCR führt zur Aktivierung der Kinase Lyn

Lyn phosphoryliert ITIM des FcgRIIB

Initiation des Signalwegs (SHIP) Blockiert Ras Weg und Kalzium-

signalkette (Btk und PLC-)

FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt

FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation

mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz

mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen

FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz

Untersuchung von Toleranz: Autoimmunanfällige Mausstämme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr)entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)

FcgRIIB und Toleranz

Bolland und Ravetch 2000 Fcgr2b -/- Mäuse

(Balb/C und C57.B6)

Balb/C• Wie WT

B6• Erhöhte Sterberate

• Entzündungen in Vielzahl von Organen

• Erhöhter Proteingehalt im Urin

• Glomerulonephritis

• Nierenversagen

genetischer Hintergrund ist sehr wichtig

Test auf anti-nucleäre AK

Immunfluoreszenzfärbung von Hep-2 Zellen

Inkubation mit Serum der Mäuse Detektion von gebundenem IgG

mit FITC-anti-mouse IgG

ELISA IgG AK gegen:• dsDNA

• dsDNA mit Histon 1

• dsDNA mit Histon 2A und 2B

Toleranzverlust in FcgRIIB-/-

Bolland und Ravetch 2000

Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB

McGaha et al. 2007 Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB

Fcgr2bKontrollvektor

Gewinnung von KM-Zellen aus autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen

Transduktion mit retroviralem Vektor

Rekonstitution bestrahlter Mäusemit autologem tranduziertem KM

FcgRIIB Mock

Untersuchung der Mäuse

McGaha et al.

Mock

Fcgr2b

Indirekter ImmunofluoreszenzassayANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen

Überlebensrate NZM2410

ELISA

Verbessertes Überleben Weniger Auto-AK

Schlussfolgerung

FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz

Bei Fehlen des Rezeptors entsteht • IgG anti-DNA AK

Verlust von Toleranz

Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB Levels

Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz

Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung

Wo genau reguliert er?

Keimzentrum (germinal center)

Induzierbare lymphoide Mikroumgebung Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die

Lymphorgane AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären

dendritischen Zellen (FDC) präsentiert Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region

des BCR in GC-B-Zellen

Selektion von hoch affinen B Zell Varianten Formation von Memory B Zellen

Keimzentrum

Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität

muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig affinen B-Zellen unterscheiden

Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt stimuliert Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten

Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion

durch IC Interaktion

FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen eliminieren

Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999

Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen

Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen

FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen

reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung

2.4G2 FcgRIIBGL7 GC

Rao et al. 2002

Histologie Milz

Facs

• Bestrahlte IIB -/- Mäuse• Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen Färbung des IIB Rezeptors im GC nur bei B-Zellen

2.4G2 FcgRIIB K9.361 FcgRIIB

B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen B220+IgD-GL7+ GC B-Zellen

Immunisiert mit NP-CGGHistologie 9 Tage nach Immun.

Milzzellen

Chimäre Mäuse

Verminderte FcgRIIB Expression in GCB-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen

Jiang et al. 1999

Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten Tieren

Autoimmunanfällig (SLE)• NZB• (NZB x NZW)F1

Nicht-anfällig• NZW

geringere Expression von FcgRIIB auf GC-B-Zellen in allen Mäusen

In autoimmunanfälligen Mäusen ist FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen geringer als bei nicht anfälligen Mäusen

Zusammenfassung Rao et al./Jiang

Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert

FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch geringer

Wirkmechanismus von FcgRIIB?

Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung?

Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC?

Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?

Modellsystem 3H9 Maus

Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt

• Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus

• Insertion im Igh Locus (IgMa Allel)

Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen

autoreaktive AK

Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer Argininreste DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste• 3H9/56R ein Arg Rest

• 3H9/56R/76R zwei Arg Reste

Modellsystem 3H9 Maus

Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK(je basischer höhere Autoreaktivität)

Fukuyama et al. 2004

Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b Expression• Balb/C und C57.B6

Untersuchung der Toleranzerhaltung

Spezifität des genetischen Hintergrundes

Balb/C Hintergrund:• Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R

Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten C57.B6 Hintergrund:

• Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R

Fukuyama et al.

C57.B6: 12 Wochen alt

IgM IgGAnti-DNAELISA

Serum

Mechanismus zum Erhalt der Toleranz

Fukuyama et al.

Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen• Vκ21D Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der

schweren Kette unterdrückt

• Vκ38c weniger effizient

Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den MausstämmenUnabhängig von FcgRIIB

FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion

Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl von IgG anti-DNA

durch erhöhtes Auftreten von IgG produzierenden Plasmazellen/Plasmablasten

Fukuyama et al.

IgG IgM

Serum

Splenocyten

Anti-DNA

ELISA

IgG anti-DNA ist pathologisch

C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach 6 Mo. starke Glomerulonephritis

Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche Pathologie wie pos. Kontrolle (Fcgr2b -/-)

• Glomerulonephritis• Immun-Komplex Ablagerung• Komplement C3 Ablagerung

Histologie der Niere

Fukuyama et al.

Nach 9 Mo.

Zusammenfassung Fukuyama et al.

„Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln• Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen

Mausstämmen

FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden Plasmablasten negatives Feedback-Signal ist gestört

Proliferation autoreaktiver Plasmazellen

Paul et al. 2007

Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz Prinzip:

follicular exclusion• Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von

Milzfollikeln

Hypothese:

folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling

Versuchsprinzip:

3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB

wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer Exclusion auftreten

Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/-

Bei Paarung von 3H9 mit λ1 leichter Kette entsteht autoreaktiver AK

λ1 B-Zellen exprimieren transgenen IgMa Allotypen

FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte Frequenz von λ1 B-Zellen

autoreaktive AK für weitere Nachweise

Paul et al.

Milz

Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz

Histologische Untersuchung der Milz

• 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse: λ1 B Zellen an T-B Grenze von Milzfollikeln• 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse: λ1 B Zellen in gesamten Follikel verteilt

λ1 B ZellenB-Zell ZoneT-Zell Zone

• Stärkere Keimzentrumsaktivität in FcgRIIB-/- Mäusen• λ1 B-Zellen im Keimzentrum

Paul et al.

100-fach 600-fach

Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren

Kein Unterschied bei IgM anti-DNA produzierenden B-Zellen

8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA produzierenden B-Zellen in 3H9RIIB-/- Tieren

Klassenwechsel der autoreaktiven B-Zellen hat stattgefunden

B220: B-Zell MarkerCD138: Marker für Plasmazellen

Paul et al.

ELISPOT

FACS Milz

Anti-DNA

Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum

3H9FcgRIIB-/- Mäuse:• Höhere Anzahl an IgG und IgM

anti-DNA AK

Paul et al.

Alle Beobachtungen waren Altersabhängig:• Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen

(2 Monate alt) zeigten WT verhalten

• Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA

Serum Anti-DNA

Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.)

FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen

Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert

Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen

Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB

FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz

Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich exprimiert (Rao et al.)

In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer exprimiert (Jiang et al.)

Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten

Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel (Paul et al.)

Unser Projekt

Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei der Toleranzerhaltung

FcgRIIB und Toleranz beim Menschen

systemischer Lupus Erythematodes (SLE)• hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern

Allele Varianten von FcgRIIB • Ile232Thr

Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen keine Assoziation in Europäern

Promoter Polymorphismus• in Europäern

Verminderte Expression in memory B-Zellen • in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung

Hohe Heterogenität im Menschen

Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig

Mensch vs. Maus• FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich

• Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen

Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt

humanisierte Maus

Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche Immunsystem gültig?

Versuchsaufbau

Bestrahlung

Neugeborenen Rag2-/- NOD/SCID

Rekonstitution mit hHSC

Mäuse entwickeln menschliches Immunsystem

Vorbereitung der hHSC:

Isolation

hHSCTransduktion mit lentivirus kodierter miRNA

Vorbereitung der Mäuse:

Promoter miRNA

GFP Reporter

Gen

n

Untersuchung des Immunstatus

Gesundheitszustand• Überleben

• Vitalität

Veränderte B-Zell Antwort• Schwellenwert

• Antikörper-Affinität

• Veränderter Klassenwechsel

• anti-DNA AK

• antinucleäre AK

• anti-Chromatin AK

Untersuchung des Auftretens von SLE

• Entwicklung von Glomerulonephritis

• Nierenfunktion

• Proteingehalt im Urin

• histologische Untersuchung der Leber

Derzeitige Arbeit

Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend), CD22 und CD72

Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren

Klonierung von miRNA/shRNA Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen

FcgRIIB, CD22, CD72 Aktivierende FcgR

Effektivitätstest der miRNA/shRNA(positive Kontrolle)

miRNA/shRNA sollten keinen Einfluss auf diese haben (negative Kontrolle)

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit