Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt AG Nimmerjahn Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung

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  • Folie 1
  • Dipl. Ing. Anne Brenwaldt AG Nimmerjahn Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung
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  • Fc Rezeptoren (FcR) Rezeptoren fr Immunglobuline Expression auf Immunzellen Binden konstante Domne der schweren Kette von Antikrpern Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems
  • Folie 3
  • FcR Arten Fr jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren Fc Rezeptor fr IgA Fc R IgG Fc R IgE Fc R IgM Fc R IgD Fc R Maus 4 Gene fr FcgRI FcgRII FcgRIII FcgRIV Mensch 8 Gene fr FcgRI (A, B, C) FcgRII (A, B, C) FcgRIII (A, B)
  • Folie 4
  • Fc g Rezeptoren Grte und am hufigsten vorkommende Gruppe von FcR verschiedene Spezifitt, Affinitt, Struktur, Expression und biochem. Funktion ITIM Fc RIIBFc RI 2 2 Fc RIII Mouse Human 2 hFc RIIIAFc RI 2 ITIM Fc RIIB Fc RIIA high affinity low/medium affinity Fc RIV 2 ITAM
  • Folie 5
  • FcgR Aktivierende FcgR FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII Inhibierende FcgR FcgRIIB werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und inhibitorischen Signalweg Schwellenwert fr Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Strke der Immunantwort bestimmt Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert Degranulation, Phagozytose, Antigen-Prsentation, antibody- dependend cellular cytotoxity (ADCC)
  • Folie 6
  • Signalleitung Aktivierende FcgR bentigen fr Signalleitung assozierte Adaptermolekle Adaptormolekl ist vom Zelltyp abhngig Am hufigsten common chain Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) Braucht kein Adaptormolekl Fc RI 2 ITAM ITIM Fc RIIB
  • Folie 7
  • Signalleitung aktivierender FcgR Src-family Kinase phosphoryliert ITAM SH2 Bindedomne entsteht Syk bindet Signalkaskade wird eingeleitet Ras/Raf/MAP Kinase pathway wird aktiviert Kalzium abhngige Signalwege aktiviert downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK) cell activation -ADCC -Phagocytosis -Cytokine release -Oxidative burst
  • Folie 8
  • Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR Co-Ligation beider FcgR fhrt zu Phosphorylierung des ITIM vom FcgRIIB SHIP bindet an entstandene SH-2 Dmne Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-)
  • Folie 9
  • Inhibitorischer FcgRIIB (CD32) Gre: 40 kDa Aufbau: 2 extrazellulre Domnen 1 Transmembranregion 1 cytoplasmatischer Schwanz geringe Affinitt fr monomeres IgG hohe Aviditt fr Immunkomplexe Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 2 Isoformen IIB-1 Signalwirkung IIB-2 Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch Einziger FcR auf B-Zellen ITIM Fc RIIB
  • Folie 10
  • FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen Co-Ligation mit: Sich selbst fhrt zu Apoptose BCR Verminderung des BCR Aktivierungssignal anti-apoptotisches Signal Co-Ligation mit BCR fhrt zur Aktivierung der Kinase Lyn Lyn phosphoryliert ITIM des FcgRIIB Initiation des Signalwegs (SHIP) Blockiert Ras Weg und Kalzium- signalkette (Btk und PLC- )
  • Folie 11
  • FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt FcgRIIB setzt Schwellenwert fr Aktivierung von B-Zellen Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation mgliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz mgliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen FcgRIIB wichtig fr B-Zell Toleranz Untersuchung von Toleranz: Autoimmunanfllige Mausstmme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr) entwickeln spontan Autoimmunitt (z.B. SLE)
  • Folie 12
  • FcgRIIB und Toleranz Bolland und Ravetch 2000 Fcgr2b -/- Muse (Balb/C und C57.B6) Balb/C Wie WT B6 Erhhte Sterberate Entzndungen in Vielzahl von Organen Erhhter Proteingehalt im Urin Glomerulonephritis Nierenversagen genetischer Hintergrund ist sehr wichtig
  • Folie 13
  • Test auf anti-nuclere AK Immunfluoreszenzfrbung von Hep-2 Zellen Inkubation mit Serum der Muse Detektion von gebundenem IgG mit FITC-anti-mouse IgG ELISA IgG AK gegen: dsDNA dsDNA mit Histon 1 dsDNA mit Histon 2A und 2B Toleranzverlust in FcgRIIB -/- Bolland und Ravetch 2000
  • Folie 14
  • Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB McGaha et al. 2007 Retroviraler Vektor fr Expression von FcgRIIB Fcgr2b Kontrollvektor Gewinnung von KM-Zellen aus autoimmunanflligen und FcgRIIb -/- Musen Transduktion mit retroviralem Vektor Rekonstitution bestrahlter Muse mit autologem tranduziertem KM FcgRIIB Mock
  • Folie 15
  • Untersuchung der Muse McGaha et al. Mock Fcgr2b Indirekter Immunofluoreszenzassay ANA Reaktivitt gegen fixierte HepG2 Zellen berlebensrate NZM2410 ELISA Verbessertes berleben Weniger Auto-AK
  • Folie 16
  • Schlussfolgerung FcgRIIB ist wichtig fr den Erhalt der Toleranz Bei Fehlen des Rezeptors entsteht IgG anti-DNA AK Verlust von Toleranz Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB Levels Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz
  • Folie 17
  • Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung Wo genau reguliert er?
  • Folie 18
  • Keimzentrum (germinal center) Induzierbare lymphoide Mikroumgebung Entstehen durch Antwort auf T-abhngige Antigene Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die Lymphorgane AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculren dendritischen Zellen (FDC) prsentiert Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region des BCR in GC-B-Zellen Selektion von hoch affinen B Zell Varianten Formation von Memory B Zellen
  • Folie 19
  • Keimzentrum Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinitt muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig affinen B-Zellen unterscheiden Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt stimuliert Aufnahme von AG und Prsentation fr Th Lymphozyten Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion durch IC Interaktion FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen eliminieren
  • Folie 20
  • Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999 Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen
  • Folie 21
  • Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen reduzierter Schwellenwert fr B-Zell Aktivierung 2.4G2 FcgRIIB GL7 GC Rao et al. 2002 Histologie Milz Facs Bestrahlte IIB -/- Muse Rekonstitution mit KM von IIB +/+ Musen Frbung des IIB Rezeptors im GC nur bei B-Zellen 2.4G2 FcgRIIB K9.361 FcgRIIB B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen B220+IgD-GL7+ GC B-Zellen Immunisiert mit NP-CGG Histologie 9 Tage nach Immun. Milzzellen Chimre Muse
  • Folie 22
  • Verminderte FcgRIIB Expression in GC B-Zellen von autoimmunanflligen Musen Jiang et al. 1999 Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten Tieren Autoimmunanfllig (SLE) NZB (NZB x NZW)F1 Nicht-anfllig NZW geringere Expression von FcgRIIB auf GC-B-Zellen in allen Musen In autoimmunanflligen Musen ist FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen geringer als bei nicht anflligen Musen
  • Folie 23
  • Zusammenfassung Rao et al./Jiang Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert FcgRIIB Expression in Autoimmunanfllige Mausstmme noch geringer
  • Folie 24
  • Wirkmechanismus von FcgRIIB? Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinittsreifung? Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC? Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?
  • Folie 25
  • Modellsystem 3H9 Maus Transgenes knock-in Modell fr Anti-DNA exprimierende B-Zellen Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus Insertion im Igh Locus (IgM a Allel) Editierung der leichten Kette ist wichtig fr den Erhalt von Toleranz Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen autoreaktive AK Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfgung weiterer Argininreste DNA Bindung von AK meist ber Arg-Reste 3H9/56R ein Arg Rest 3H9/56R/76R zwei Arg Reste
  • Folie 26
  • Modellsystem 3H9 Maus Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivitt der produzierten AK (je basischer hhere Autoreaktivitt)
  • Folie 27
  • Fukuyama et al. 2004 Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Musen mit und ohne Fcgr2b Expression Balb/C und C57.B6 Untersuchung der Toleranzerhaltung
  • Folie 28
  • Spezifitt des genetischen Hintergrundes Balb/C Hintergrund: Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R Allel wurde Toleranz in Balb/C Musen erhalten C57.B6 Hintergrund: Hhere IgM und IgG Produktion bei 56R Fukuyama et al. C57.B6: 12 Wochen alt IgM IgG Anti-DNA ELISA Serum
  • Folie 29
  • Mechanismus zum Erhalt der Toleranz Fukuyama et al. Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstmmen V 21D Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunitt der schweren Kette unterdrckt V 38c weniger effizient Vernderte Benutzung von leichten Ketten in den Mausstmmen Unabhngig von FcgRIIB
  • Folie 30
  • FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion Fcgr2b Defizienz erhht Anzahl von IgG anti-DNA durch erhhtes Auftreten von IgG produzierenden Plasmazellen/Plasmablasten Fukuyama et al. IgGIgM Serum Splenocyten Anti-DNA ELISA
  • Folie 31
  • IgG anti-DNA ist pathologisch C57.B6 Fcgr2b -/- entwickeln nach 6 Mo. starke Glomerulonephritis Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche Pathologie wie pos. Kontrolle (Fcgr2b -/-) Glomerulonephritis Im