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Aus dem Institut für Pathologie

der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr. med. H. K. Müller-Hermelink

Apoptosemessungen

bei Thymompatienten mit und ohne Myasthenia Gravis

Inaugural - Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Tobias Preisshofen

aus Ravensburg

Würzburg, Mai 2005

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Referent : Prof. Dr. med. Marx

Koreferent : Prof. Dr. med. Rieckmann

Dekan : Prof. Dr. med. Ertl

Tag der mündlichen Prüfung :

Der Promovend ist Arzt

Meinen Eltern Heidi und Lutz gewidmet,

als Dank für die Ermöglichung meines Studiums

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung _________________________________________________________ 1

1.1 Vorwort _____________________________________________________ 1

1.2 Fragestellungen und Zielsetzung der Arbeit _______________________ 6

2 Material und Methoden ______________________________________________ 7

2.1 Patientendaten und Gewebe ____________________________________ 7

2.2 Arbeitsgeräte und Hilfsmittel ___________________________________ 8

2.3 Lösungen ____________________________________________________ 9

2.4 Antikörper und Enzyme ______________________________________ 10

3 Methoden_________________________________________________________ 11

3.1 Thymus- und Thymomzellen___________________________________ 11

3.1.1 Isolation von Lymphozyten aus Frischgewebe __________________ 11

3.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerzählkammer________________ 11

3.1.3 Einfrieren _______________________________________________ 12

3.1.4 Auftauen ________________________________________________ 12

3.1.5 FACS-Färbung ___________________________________________ 13

3.1.6 Fixation_________________________________________________ 13

3.1.7 TUNEL-Färbung _________________________________________ 14

3.2 FACS-Analysen______________________________________________ 16

3.2.1 Antikörperprofil __________________________________________ 18

3.2.2 Auswertung der Messdaten _________________________________ 18

3.3 Immunhistologie und Immunfluoreszenz_________________________ 21

3.3.1 Bilderfassungssystem ______________________________________ 21

3.3.2 Bildanalyse ______________________________________________ 22

3.3.3 Statistische Auswertung der Daten____________________________ 22

4 Ergebnisse ________________________________________________________ 23

4.1 Stabilität des Phänotyps_______________________________________ 23

4.1.1 Optimierung der Auftaumethode _____________________________ 23

4.1.2 Veränderung der Subpopulationen nach dem Auftauen____________ 25

4.1.3 Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Subpopulationen _ 26

4.2 Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien von Thymomen ________ 29

4.3 FACS-Apoptosemessungen ____________________________________ 31

4.4 Auswertung anhand der Farbdifferenzmethode ___________________ 37

4.5 TUNEL und DAPI-Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten_________ 42

5 Diskussion ________________________________________________________ 43

5.1 Diskussion der Methodik ______________________________________ 43

5.1.1 Durchflusszytometrische TUNEL-Methode bei Thymozyten _______ 44

5.1.2 Immunhistochemische TUNEL-Methode bei Paraffinschnitten _____ 47

5.2 Untersuchung apoptotischer Thymozyten ________________________ 47

5.2.1 Diskussion der Reifungsstadien ______________________________ 48

5.3 Diskussion der Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der

Farbdifferenz-Methode zur Apoptose _________________________________ 49

6 Zusammenfassung _________________________________________________ 50

7 Anhang __________________________________________________________ 51

7.1 Eigene Publikationen _________________________________________ 51

7.2 Abbildungsverzeichnis ________________________________________ 52

7.3 Tabellenverzeichnis __________________________________________ 53

7.4 Literaturnachweis____________________________________________ 54

Abkürzungsverzeichnis

CD cluster of differentiation

DAPI 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DP doppelt positive (CD4+CD8+) Thymozyten

FACS fluorescence activated cellsorter

FCS fötales Kälberserum

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FL 1,2,3 Fluoreszenz 1,2,3

FSC forward scatter

HP Humanplasma

MG Myasthenia gravis

MHC major histocompatibility complex

NM Nanometer

PBS phophate buffered saline

PE Phycoerythrin

RE Recent Thymic Emigrants

RPMI Rosewell-Park-Memorial-Institute Medium

RT Raumtemperatur

SP single positive (CD4+CD8- oder CD4-CD8+)Thymozyten

SSC side scatter

TE Thymic Emigrants

TdT terminale deoxynukleotidyl Transferase

TRI Tricolor

TUNEL Terminale Desoxynukleotidyltransferase mediated dUTP Nick End Label

1

1 Einleitung

1.1 Vorwort

Das Immunsystem des Menschen ist für die Abwehr gegen Bakterien, Viren und andere

Eindringlinge verantwortlich. Es werden hierfür die allgemeine (angeborene) und die

spezifische (erworbene) Immunantwort unterschieden.

Die allgemeine Immunantwort besteht aus phagozytierenden Zellen (Makrophagen,

Monozyten, Neutrophile), inflammatorischen Zellen (Mastzellen, Basophile,

Eosinophile), und den natürlichen Killerzellen.

Die spezifische (erworbene oder adaptive) Immunantwort wird über die Proliferation

von Antigen-spezifischen B-und T-Lymphozyten vermittelt, wobei Ihnen das Antigen

durch sogenannte spezialisierte Antigen präsentierende Zellen angeboten wird. Die B-

Zellen werden nach Ihrer Differenzierung in verschiedene Subpopulationen unterteilt

(Memoryzellen, Plasmazellen). Die Plasmazellen sezernieren antigenspezifische

Antikörper, wodurch infizierte Zellen oder Mikroorganismen zerstört werden können.

Bei den T-Lymphozyten werden als Hauptgruppen die zytotoxischen CD8+ T-Zellen

und die CD4+ T-Zellen unterschieden.

Die CD8+ T-Zellen erkennen Körperzellen , die mit Viren infiziert sind und töten diese

ab, die CD4+ Zellen werden in Abhängigkeit von den Zytokinen, welche sie

ausschütten, in TH1, TH2 und regulatorische T-Zellen eingeteilt (Janeway, Travers et

al. 2002).

Ein zentrales Element für die Entwicklung von T-Lymphozyten stellt der Thymus dar.

Alle Immunzellen des menschlichen Körpers entwickeln sich aus einer pluripotenten

Stammzelle in der fetalen Leber oder im Knochenmark. Die B-Zellen verbleiben bis zur

Ausreifung im Knochenmark, während die T-Zellen ihre endgültige Reife im Thymus

erlangen. (Delves and Roitt 2000).

Im Laufe der T-Zell-Reifung im Thymus durchlaufen die T-Zellen verschiedene

Entwicklungsstadien, worin sie sich durch Expression bestimmter T-Zell-

2

Oberflächenmarker unterscheiden lassen (Vanhecke, Leclercq et al. 1995). Abbildung 1

zeigt die Ausprägung der verschiedenen CD-Antigene der T-Zellen und die damit

verbundene Zugehörigkeit zu einer Subpopulation.

In der Thymusdrüse lernen die Lymphozyten körpereigene von körperfremden

Antigenen zu unterscheiden. Dieser Vorgang erfolgt über zwei Schritte, die sogenannte

positive und negative Selektion.

Bei der positiven Selektion werden T-Zellen, die mit Ihrem T-Zellrezeptor körpereigene

Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) erkennen, selektioniert (Selbst-MHC-

Restriktion). Somit wird in diesem ersten Schritt sichergestellt, dass alle reifen T-Zellen

auf Fremdantigene antworten können, die von Selbst-MHC-Molekülen auf

antigenpräsentierenden Zellen vorgezeigt werden. Ca. 95 % der Thymozyten überstehen

diese positive Selektion nicht und sterben im Thymus ab (Surh and Sprent 1994; Delves

and Roitt 2000).

Als nächster Schritt folgt die negative Selektion, wobei hier diejenigen Lymphozyten,

deren Rezeptoren eine zu hohe Affinität gegen körpereigene Peptide aufweisen, zerstört

werden. In diesem zweiten Schritt werden somit autoreaktive T-Zellen eliminiert, und

der Körper wird vor Angriffen durch das eigene Abwehrsystem bewahrt. Störungen in

dem System der positiven und negativen Selektion können somit entweder zu einem

Immundefektsyndrom mit inadäquater Immunantwort oder zu einer

Autoimmunkrankheit führen.

3

Negative Selektion

PositiveSelektion

DP-Immature

CD4+CD8+CD3-CD69-CD1a+CD27-CD45RA-

SP-Immature

CD4+CD8-CD3-CD69-CD1a+CD27-CD45RA-

DP-post-Selektion

CD4+CD8+CD3+CD69+CD1a+CD27-CD45RA-

SP-Mature

CD4+CD8-CD3+CD69+CD1a-CD27+CD45RA-

SP-thymic emigrant

CD4+CD8-CD3+CD69+CD1a-CD27+CD45RA+CD45RA+

DP-prä-Selektion

CD4+CD8+CD3+CD69-CD1a+CD27-CD45RA-

Cortico-medulläreGrenzzone

Cortex

Medulla

Abbildung 1: Reifungstadien der Thymozyten in der menschlichen Thymusdrüse

In den einzelnen Entwicklungsstadien der humanen Thymusdrüse exprimieren dieThymozyten jeweils spezifischen Oberflächenmarker (CD). Die einfach positivenZellen (SP-Immature) entwickeln im Cortex der Thymusdrüse zunächst denOberflächenmarker CD8 (DP=doppelt positive Zellen). Nach der Positiven Selektionwird unter den doppelt positiven Zellen (CD4+,CD8+) zusätzlich derOberflächenmarker CD69 exprimiert (DP-post-Selektion). Nach der NegativenSelektion werden die einfach positiven Thymozyten (SP-Mature) durch dasVorhandensein von CD45RA unterschieden und sie verlassen als SP-thymic emigrantdie Medulla des menschlichen ThymusSP: einfach positive Zellen (CD4 +), DP: doppelt positive Zellen (CD4+CD8+)(Darstellung verändert nach (Vanhecke, Leclercq et al. 1995))

4

Ein klassisches Beispiel einer solchen Autoimmunkrankheit stellt die Myasthenia gravis

(MG) dar. Dieser Krankheitsbegriff wurde 1895 von Jolly et al. geprägt und ist mit dem

wesentlichen Merkmal einer raschen Ermüdbarkeit beschrieben worden. In zahlreichen

Untersuchungen konnten in den Seren der Patienten Autoantikörper gegen den

Acetylcholinrezeptor an der neuromuskulären Endplatte der quergestreiften Muskulatur

nachgewiesen werden (Lindstrom, Shelton et al. 1988). Klinisch zeigt sich die MG als

schwere generalisierte Muskelschwäche, die vor allem durch Beteiligung der

Atemmuskulatur zu bedrohlichen Zuständen führen kann.

Die Antikörperproduktion bei der MG ist ein T-Zell-abhängiger Prozess (Hohlfeld,

Kalies et al. 1986), der wiederum insbesondere durch TH2-Zellen (T-Helferzellen)

vermittelt wird (Marx, Wilisch et al. 1997).

Bei der Mehrheit der Patienten mit MG (80-90%) geht die Krankheit mit pathologischen

Thymusveränderungen einher, wobei die Art der Veränderungen mit klinischen und

epidemiologischen Befunden assoziiert wird und eine äthiologische Bedeutung für diese

Erkrankung besitzt (Marx, Wilisch et al. 1997). In Tabelle 1 werden folgende

Thymusveränderungen unterschieden :

Pathologische

Veränderungen

Häufigkeit innerhalb der

MG-Patienten in %Geschlecht / Alter

Rückbildung des

Thymus

(Atrophie)

10-20 %Überwiegend Männer

> 40 Jahre

Entzündlich

veränderter Thymus

(Thymitis)

70-80 %Überwiegend Frauen

bis 40 Jahre

Epithelialer

Thymustumor

(Thymom)

Ca. 10 %Keine Geschlechtsprävalenz

30 70 Jahre

Tabelle 1: Thymusveränderungen bei Myasthenia gravis (MG) (Vincent 2002).

5

Bei ca. 10% aller Patienten mit einer Myasthenia Gravis ist das Auftreten dieser

Krankheit die Folge einer paraneoplastischen Manifestation von epithelialen Tumoren

des Thymus (Thymome) (Müller-Hermelink, Engel et al. 2004). Thymome sind die

einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen produzieren können;

diese Fähigkeit ist sehr wahrscheinlich auch ursächlich für die sehr häufig mit

Thymomen assoziierten Autoimmunphänome.

Tabelle 2 zeigt die histopathologische Einteilung von Thymomen nach der

Klassifikation der Welt-Gesundheits-Organisation (WHO) (Müller-Hermelink, Engel et

al. 2004)

WHO-Typ Ältere, durch die WHO-Klassifikation abgelöste Synonyme

A Medulläres Thymom

AB Gemischtes Thymom

B1 Prädominantes kortikales Thymom

B2 Kortikales Thymom

B3 Gut differenziertes thymisches Karzinom

Thymuskarzinome Plattenepithelkarzinome

Lymphoepitheliom-ähnliche Karzinome

Sarkomatoide Karzinome

etc.

Tabelle 2: WHO-Klassifikation und Einteilung der Thymome nach WHO 2004

Bei der histopathologischen Einteilung können Thymome der WHO-Typen A, AB, und

B1-3 als organotypische den nicht-organotypischen thymischen Karzinomen

gegenübergestellt werden. Nur bei den organotypischen Thymomen sind wesentliche

Eigenschaften des Thymus einschließlich der Fähigkeit zur T-Zell-Reifung erhalten.

Praktisch alle Thymompatienten mit einer paraneoplastischen Myasthenia Gravis

besitzen zudem nachweisbare Autoantikörper gegen Acetylcholinrezeptoren..

In Abhängigkeit von den untersuchten Patientenkollektiven sind einige

Thymomsubtypen in bis zu 65 % der Fälle mit einer MG assoziiert (Okumura, Ohta et

6

al. 2002; Strobel, Bauer et al. 2004). Alle Myasthenie-assoziierten Thymome weisen als

Gemeinsamkeit die Fähigkeit einer vollständigen T-Zell-Reifung in der Thymusdrüse

auf und sind des weiteren in der Lage, die terminal reifen naiven T-Zellen in das

periphere Blut zu exportieren (Hoffacker, Schultz et al. 2000; Buckley, Douek et al.

2001; Strobel, Helmreich et al. 2002).

Ströbel et al. (2002) konnten in 22 Thymomen nachweisen, dass bei MG(-) Patienten im

Vergleich zu MG(+) Patienten die Anzahl terminal reifer thymic emigrant

CD45RA+CD4+ T-Zellen sowohl im Tumor als auch im peripheren Blut der Patienten

deutlich vermindert waren.

1.2 Fragestellungen und Zielsetzung der Arbeit

Vor dem Hintergrund, dass reife naive CD4+ T-Zellen in Thymomen mit großer

Wahrscheinlichkeit an der Pathogenese der paraneoplastischen Myasthenia gravis

beteiligt sind, wurden für diese Arbeit Apoptosemessungen der einzelnen

Reifungsstadien der T-Zellen bei Thymompatienten mit MG und ohne MG

durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen von Ströbel et al. 2002 (Strobel,

Helmreich et al. 2002) soll in dieser Arbeit zunächst untersucht werden, in welchem

Reifungsstadium die Entwicklung der CD4 T-Zellen bei Thymompatienten ohne MG

gestört ist und ob MG(-) Thymome eine höhere Apoptoserate der T-Lymphozyten

aufweisen als MG(+) Thymome. Da diese Störung in den späten T-Zell-Reifungsstadien

zu vermuten ist, soll durch diese Untersuchungen die Frage beantwortet werden, ob die

Myasthenia Gravis (MG) möglicherweise durch eine Störung der negativen Selektion

verursacht wird. Durch die Apoptosemessungen soll weiterhin geklärt werden, ob der

Verlust der terminalen Reifungsstufen in MG(-) Thymomen die Folge einer erhöhten

Apoptoserate oder Folge eines vorzeitigen release unreifer T-Zellen in das periphere

Blut im Sinne einer Schrankenstörung darstellt. Für die nachfolgenden Untersuchungen

bei der Durchflusszytometrie wurden Lymphozyten aus Thymomgewebe mit und ohne

MG miteinander verglichen. Aufgrund der Seltenheit dieser speziellen

Untersuchungsgruppen konnte trotz der damit verbundenen technischen Probleme nur

tiefgefrorenes Zellmaterial verwendet werden.

7

2 Material und Methoden

2.1 Patientendaten und Gewebe

Tabelle 3 zeigt eine Zusammenstellung der Patientendaten, deren T-Zellen für die

Untersuchungen herangezogen wurden. Die Diagnose der MG beruhte auf klinischen

Befunden, der Feststellung eines Dekrements bei einer Serienstimulation von 3 Hz

elektromyographischen Untersuchungen, sowie auf der Bestimmung der Konzentration

von Autoantikörpern gegen den nikotinischen Acetycholinrezeptor der motorischen

Endplatte mittels eines Radioimmuno-Assays (Nenninger, Schultz et al. 1998). Die

Thymome wurden entsprechend der WHO-Klassifikation eingeteilt (Müller-Hermelink,

Engel et al. 2004). Es wurden ausschließlich Patientenfälle ohne Vorbehandlung mit

Steroiden oder Immunsuppressiva verwendet.

Pat.No Case No MG Alter Geschl. Diagnose1 97/11704 Ja 33 m Thymitis

2 97/4494 Ja 18 m Thymitis

3 99/16725 Ja 20 w Thymitis

4 02/21795 Ja 24 w Thymitis

5 98/5633 Ja 36 m AB

6 00/28318 Ja 43 m AB

7 97/9669 Ja 57 w AB

8 00/25907 Ja 58 w B2

9 00/20223 Ja 50 w B2

10 99/3983 Ja 70 w B2

11 00/22717 Ja 74 w B2

12 99/13575 Ja 39 w B2

13 99/21994 Ja 65 m B2

14 01/4054 Nein 50 m AB

15 00/1495 Nein 53 w AB

16 00/1495 Nein 67 m AB

17 01/5447; H1492/01 Nein 58 m B2

18 98/5186 Nein 69 w B2

19 97/20308 Nein 68 w B2

20 00/3045; E00/16857 Nein 51 m B2

21 97/6335 Nein 83 w B2

Die Diagnose der Thymome (AB, B2) richtet sich nach der WHO-Klassifikation 2004m = männlich, w = weiblichTabelle 3: Klinische Daten der untersuchten Thymom- und Thymitispatienten mit

und ohne Myasthenia Gravis (MG)

8

2.2 Arbeitsgeräte und Hilfsmittel

Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden nachfolgende

Arbeitsgeräte verwendet :

Aquabidest-Anlage Milli-Q Plus PF Millipore

Eismaschine Scotman AF-10 Genheimer, Hettstadt

FACScan (488nm, Argonlaser) Becton Dickinson

Lichtmikroskop 201529 Wilovert

Lichtmikroskop Axioplan Zeiss, Oberkochen

Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena

Lichtmikroskop 201529 Wilovert

Pipettensatz Eppendorf

Farbkamera NIKON, DXM 1200

Sterilbank Lamin Air Heraeus

Vakuumpumpe VP 100 Two Stage Savant, Farmingdale, NY, USA

Vortex Model g-560E Bender & Hobein AG

Waage Satorius, Göttingen

Wasserbad Kottermann, Labortechnik, Uetze-Hänigsen

Zentrifuge Omnifuge 2.0 RS Heraeus, Sepatech, Osterode

Tabelle 4: Verwendete Arbeitsgeräte

9

2.3 Lösungen

Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden nachfolgende

Substanzen und Lösungen verwendet :

Tabelle 5: Verwendete Lösungen

CytofixTM 4% Paraformaldehyd

Einfriermedium 80 % (v/v) FCS, 20 % (v/v) DMSO

FACS-Puffer 0,5 % (w/v) BSA und 0,01 % Natriumazid in PBS gelöst

PBS (10x) 72,0 g/l NaCl, 14,8 g/l Na2HPO4, 4,3 g/l KH2PO4

Perm/WashTM

bufferSaponin, FBS

TdT Terminale desoxynukleotidyl Transferase

TRIS-Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Trypanblau-Lösung 5g/l Trypanblau, 9g/l NaCl gelöst in H2O

10

2.4 Antikörper und Enzyme

In der nachfolgenden Tabelle 6 sind die verwendeten Antikörper und Enzyme für die

durchflusszytometrischen Untersuchungen dargestellt.

Antikörper Konjugat Spezies Verdünnung Bezugsquelle

Maus IgG 1 FITC Isotyp 1:100 Sigma

Maus IgG 1 PE Isotyp 1:200 Sigma

Maus IgG 1 TRI Isotyp 1:100 Sigma

Maus IgG 2a unkonjugiert Isotyp 1:200 Sigma

Goat-anti-mouse TRI - 1:50 Sigma

CD 3 PE Maus anti Human 1:50 Dako

CD 3 TRI Maus anti Human 1:100 Dako

CD 4 PE Maus anti Human 1:25 Sigma

CD 4 TRI Maus anti Human 1:50 Sigma

CD 8 PE Maus anti Human 1:100 Dako

CD 8 TRI Maus anti Human 1:100 DAKO

CD 27 unkonjugiert Maus anti Human 1:12,5 Sigma

CD 45 RA PE Maus anti Human 1:50 Dianova

CD 69 PE Maus anti Human 1:50 BD

TUNEL FITC DNA-Markierung 50µl Roche

DAPI - - -Eigene

Herstellung

Tabelle 6: Verwendete Antikörper und Enzyme

Farbstoffe: FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, TRI = Tricolor,DAPI = 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol, CD = Oberflächenmarker,DNA: Desoxyribonukleinsäure, IgG: Immunglobulin G

11

3 Methoden

3.1 Thymus- und Thymomzellen

Das Thymus und Thymommaterial wurde uns aus den Universitätskliniken Würzburg,

Mainz und Regensburg in nativem Zustand zugesandt (in steriler 0,9% NaCl-Lösung

und auf Eis gekühlt).

3.1.1 Isolation von Lymphozyten aus Frischgewebe

Das native Thymomgewebe wurde von makroskopisch sichtbarem Fettgewebe und

Blutgefässen befreit und in kleine Stückchen geschnitten. Anschließend wurden diese

unter Zuhilfenahme eines Spritzenkolbens durch ein Stahlsieb gepresst, und die daraus

resultierende Zellsuspension durch eine Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation

aufgereinigt. Etwa 0-15 ml Ficoll-Lösung (RT) wurden in ein Falcon-Röhrchen

pippetiert und mit der maximal doppelten Menge einer Zellsuspension vorsichtig

überschichtet und zentrifugiert (20 Minuten bei 1480 U/min, 20°C). Danach konnten die

mononukleären Zellen (Thymozyten) als trüber Interphasering abpipettiert werden. Die

Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (10min 1480 U/min), in RPMI + 3 % HP

(Humanplasma) aufgenommen und auf Eis gestellt.

3.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerzählkammer

Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 10µl der Zellsuspension mit 90µl Trypanblau

gemischt und in die Neubauerzählkammer pipettiert. Nach dem mikroskopischen

Auszählen von 4 Großquadranten konnte der Zelltiter der Thymozyten anhand

folgender Formel ermittelt werden :

12

Der so ermittelte Wert stellt die Anzahl der Zellen pro Milliliter dar.

3.1.3 Einfrieren

Die Thymuszellen wurden in RPMI + 5 % FCS auf Eis gekühlt und mit einem

eisgekühlten Einfriermedium (80 % FCS + 20 % DMSO) 1:1 verdünnt. Danach wurden

die Zellen mit verschiedenen Zellkonzentrationen von 2 x 106 bis 1 x 108 Zellen/ml in 2

ml Kryoröhrchen bei 80° C eingefroren. Nach 36 h wurden die Röhrchen in flüssigen

Stickstoff überführt.

3.1.4 Auftauen

Die Zellen wurden aus dem Stickstofftank genommen und im Wasserbad bei 37° C für

ca. 2 Minuten aufgetaut. Danach wurde die Zellsuspension sofort vorsichtig in 10 ml

ebenfalls auf 37° C vorgewärmtes PBS versetzt und 5 Minuten bei 1480 U/min

zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit einer Pipette und 10ml

vorgewärmtem PBS behutsam resuspendiert. Die relativ starke Verklumpung, die auf

den Auftauvorgang lysierter Zellen zurückzuführen ist, wurde abpipettiert, da es sich

um ein nicht auflösbares Aggregat zerstörter Zellen und Epithelzelldetritus handelte.

Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt, so dass nach nochmaligem

Zentrifugieren, Absaugen und Resuspendieren die Zellzahl im 1 ml PBS mit Hilfe der

Neubauerzählkammer (siehe Abschnitt 3.1.2) nur 5 - 10 %, bezogen auf die Zahl der

eingefrorenen Thymozyten, betrug. Die Anzahl der Lymphozyten konnte durch einige

Modifikationen optimiert werden (siehe 4.1.1).

(Zahl der gezählten Zellen) x 105 = Konzentration der Zellen pro Milliliter (ml)4

13

3.1.5 FACS-Färbung

Für die jeweiligen Färbungen der Oberflächenmarker wurden 1x105 bis 2x105 Zellen in

einem Volumen von 100 µl FACS- Puffer aufgenommen und mit 10µl der speziellen

Antikörperverdünnung vermischt und für 15 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert.

Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch einen Waschschritt entfernt.

Dazu wurden 2ml FACS Puffer zu jedem Ansatz pipettiert, gevortext, und für 5

Minuten bei 1500 U/min und 4 °C zentrifugiert. Nach vorsichtigem Absaugen des

Überstandes war das Sediment für den nächsten Färbevorgang bereit. Als

Negativkontrollen wurden die entsprechenden Zellen mit den Isotypen der verwendeten

Antikörper gefärbt.

Da bei den Färbevorgängen der erste mit FITC-konjugierte Kanal durch die später

folgende TUNEL-Färbung benötigt wurde, wurde mit denjenigen direkt konjugierten

Antikörpern begonnen, die PE bzw. TRI-konjugiert waren. Die Antikörper wurden bei

den Mehrfachfärbungen im selben Arbeitsschritt zu den Zellen hinzugefügt.

Bei den Ansätzen, bei welchen ein unkonjugierter Antikörper zum Einsatz kam, wurden

die Proben als erstes mit diesem konjugiert (CD 27). Danach wurde ein gegen den

ersten gerichteten farbkonjugierter Antikörper (Goat-anti-Maus TRI konjugiert) der

Probe zugegeben, und wiederum 15 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubiert. Danach

wurde den Proben mit unkonjugiertem Antikörper ein Maus-IgG-Antikörper als Blocker

hinzugegeben. Nach nochmaliger Inkubation von 15 Minuten im Dunkeln auf Eis,

folgte ein Waschschritt mit 2ml FACS Puffer, sowie die Färbung mit den restlichen

direktfärbenden Antikörpern (siehe oben).

3.1.6 Fixation

Nach dem letzten Waschschritt wurden zu jeder Probe jeweils 200 µl Cytofix pipettiert

und 20 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Das CytofixTM diente der Fixierung und

der Stabilisierung der Zellmembran der Thymozyten für die nächsten

Inkubationsschritte (siehe 3.1.7).

14

Um das für die Zellen toxische Cytofix zu entfernen wurden die verschiedenen Proben

mit jeweils 2ml Perm/WashTMbuffer (Detergens) gewaschen (1480 U/min, 4°C) und der

Überstand mit einer Pipette abgesaugt. Dieser Vorgang wurde zweimal sorgfältig

durchgeführt, um sicherzugehen, dass das CytofixTM gründlich entfernt wurde.

3.1.7 TUNEL-Färbung

Das In Situ Cell Death Detektion Kit Fluorescein von Roche beinhaltet mehrere caps

mit einer 50 µl Enzym-Lösung, die zum einen die TdT (Terminalen desoxynukleotidyl

Transferase) und zum anderen die 550 µl Lösung mit markierten FITC gekoppelten

Nukleotiden enthält. Die bei 25 °C aufbewahrten Lösungen werden vor jeder

Versuchsreihe neu aufgetaut. Von der 550 µl Markierungslösung werden 450 µl

abpipettiert und mit der 50 µl TdT-Lösung gemischt. Die restlichen 100 µl der

Markierungslösung dienten den Negativkontrollen, die bei jeder Versuchsreihe zweimal

mitgeführt wurden.

Die bereits gefärbten und fixierten, in jeweils 100 µl Perm/WashTMbuffer befindlichen

Zellen wurden nun mit 50 µl der jetzt neugemischten Lösung (TdT + markierte

Nukleotide) pipettiert und für 30 Minuten bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen wiederum zweimal mit Perm/WashTMbuffer

gewaschen (siehe oben) und in 100-200 µl FACS-Puffer überführt.

Die für jede Versuchsreihe mitgeführte Positivkontrolle wurde ebenso mit CytofixTM

behandelt und zusätzlich mit 10 µl DNAse versetzt und 20 Minuten

inkubiert.Unmittelbar danach schloss sich die Analyse der Thymozyten mit Hilfe des

FACScanTM an. Die einzelnen Zellen der Proben 1-6, sowie die Positiv-, und

Negativkontrollen (siehe Versuchsprotokoll) befanden sich in einem Volumen von 50-

200 µl FACS Puffer.

15

Abbildung 2: Prinzip der TUNEL-Färbung

Das freie 3`OH-Ende der DNA-Fragmente (nicks) wird mit FITC-markiertenNukleotiden (dUTP) in Anwesenheit der terminalen Desoxyribonukleotidyltransferase(TdT) gekennzeichnet

TdT

Fluorescein markierte dUTP

DNA-Fragment ( nicks )

16

3.2 FACS-Analysen

In FACS-Röhrchen verteilt wurden die einzelnen Proben mit dem FACScanTM der

Firma Becton und Dickinson aufgezeichnet. Dieses Gerät ist mit einem Argon-Laser

(488 nm, 15 mW) ausgestattet und arbeitet mit der Lysis 2 -Software. Um die

einzelnen Fluoreszenzen auf dem Monitor übersichtlich darzustellen, wurden insgesamt

7 verschiedene Diagramme als Dot plot (FSC-SSC, FL-1-FL-2, FL-1-FL-3, FL-2-FL-3)

und als Histogramm (FL-1, FL-2, FL-3) gewählt. Die Aufnahmegeräteeinstellung des

zweiten und dritten Fluoreszenzkanals erfolgte wie bei einer normalen

Antikörperfärbung. Vor dem Einlesen der Proben wurde mit Hilfe der Isotypen und

Kompensationsproben (siehe Versuchsprotokoll, Tabelle 4) anhand der Histogramme

ein sogenannter Nullabgleich durchgeführt, so dass im Histogramm der jeweiligen

Färbung die Thymozyten im Bereich von 101 der logarhythmischen Skala abgebildet

waren.

Für den ersten Fluoreszenzkanal wurden zuerst die Kontrollproben (1 Positiv-Kontrolle

und 2 Negativ-Kontrollen) eingelesen, anhand derer bei der Auswertung mit PC-Lysis-

2TM die Marker gesetzt wurden.

Danach wurden bei langsamer Durchflussgeschwindigkeit alle events aufgenommen,

bis etwa 20 000 Zellen gezählt wurden. Um bei der Messung die größeren

Zellfragmente und Verunreinigungen auszuschließen, wurde als Schwelle (Threshold)

ein Wert von 60 eingestellt. Ein Gate wurde bei den Messungen nicht verwendet.

17

Proben 1.Antikörper 2. Antikörper 3.Antikörper

Negativkontrolle - - -

Isotyp Ig-G1-FITC IgG-1-PE IgG1-TRI

Isotyp IgG-2a-unkonjugiert - G.a.M.-TRI

Kompensation CD3-FITC - -

Kompensation - CD3-PE -

Kompensation - - CD3-TRI

Probe 1 TUNEL CD4-PE CD8-TRI

Probe 2 TUNEL CD4-PE CD3-TRI

Probe 3 TUNEL CD69-PE CD3-TRI

Probe 4 TUNEL CD4-PE

CD27 unkonjugiert

+ G.a.M

+ Blocker

Probe 5 TUNEL CD8-PE

CD27 unkonjugiert

+ G.a.M

+ Blocker

Probe 6 TUNEL CD45-RA CD4-TRI

Probe 7 TUNEL CD45-RA CD8-TRI

Positiv-Kontrolle TUNEL + 10µl DNAse -

Negativ-Kontrolle TUNEL - -

Negativ-Kontrolle TUNEL - -

Farbstoffe: FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, TRI = Tricolor,G.a.M.: Goat-anti Maus, CD: Oberflächenmarker, DNAse: Enzym zur DNA Spaltung

Tabelle 7: Versuchsprotokoll für TUNEL-Apoptosemessung

18

3.2.1 Antikörperprofil

Die verwendeten Antikörper dienen der Erfassung der verschiedenen Reifestadien von

Thymozyten. Zur Überprüfung dieser Reifestadien wurden Antikörper gegen folgende

Antigene verwendet

CD4 (Vanhecke, Verhasselt et al. 1995)

CD8 (Vanhecke, Verhasselt et al. 1995)

CD3 (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)

CD45 RA (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)

CD27 (Camerini, Walz et al. 1991; Vanhecke, Leclercq et al. 1995)

CD69 (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)

3.2.2 Auswertung der Messdaten

Die Messdaten der Antikörpermessungen und der Apoptosemessungen wurden unter

Zuhilfenahme eines PCs mit PC-LysisTM Software Version1.1 ausgewertet. Zuerst

wurde ein Dot plot Fenster der FL3 (y-Achse) und FL2 (x-Achse) dargestellt und darin

4 verschiedene Gates entsprechend den jeweiligen Färbungen bestimmt (siehe

Abbildung 3). Um die Apoptose mittels TUNEL im ersten Fluoreszenzkanal bestimmen

zu können, war es notwendig, in jedem Histogramm einen definierten Marker (M1) für

jedes Gate (R1-R4) zu setzen, ab welchem die Zellen als apoptotisch zu bezeichnen

sind.

Um diesen Marker für Fluoreszenz 1 möglichst objektiv zu bestimmen, wurde hierbei

als Markerbeginn der Schnittpunkt der Negativkontrollen mit der Positivkontrolle

gewählt. Jetzt wurden Fluoreszenz 1 aus den Gates R1-R4 zur besseren Übersicht in

Histogrammen dargestellt, in welchen die Marker für Apoptose (M1) schon definiert

waren.

19

Abbildung 3: Contour blot einer CD45 (FL-2) und CD8 (FL-3) Färbung

Nachdem die Thymozyten anhand des Versuchsprotokolls markiert wurden, konnten siein einem Contourblot entsprechend Ihrer Färbung im Fluoreszenzkanal (FL-3-FL-2)dargestellt werden. Die der Färbung entsprechend gesetzten Gates R1, R2, R3 und R4beinhalten alle darin enthaltenen Zellen. Die Thymozyten stammen von einemcortikalen Thymom mit Myasthenia Gravis (MG) (00/20223)R1 = doppelt negative Zellen (CD45-, CD8-)R2 = einfach positive Zellen (CD45-, CD8+)R3 = doppelt positive Zellen (CD45+, CD8+)R4 = einfach positive Zellen (CD45+, CD8-)

20

Abbildung 4: Histogramm bei Aufnahme der Apoptosefärbung mit TUNELDer Marker wurde am Schnittpunkt der Positivkontrolle mit der Negativkontrolle gesetzt.

Abbildung 5: Darstellung der Apoptoseauswertung anhand vonHistogrammenDarstellung einer TUNEL-Färbung in FL-1. Die Histogramme zeigeneine TUNEL-Färbung in FL1 mit definierten Gates R1-R4, die anhandeines Dotplots von FL2/FL3 gesetzt wurden. Der definierte Marker(M1) wurde anhand des Schnittpunktes der Positivkontrolle (sieheAbbildung 4) mit der Negativkontrolle gesetzt.

21

3.3 Immunhistologie und Immunfluoreszenz

Gemäß der Gebrauchsanleitung des In Situ Cell Death Detektion Kit Fluorescein von

Roche wurde anhand von Paraffinschnitten eine TUNEL-Färbung durchgeführt. Diese

Schnitte wurden danach mit einem Mikroskop einer digitalen Farbkamera

aufgenommen und ausgewertet (siehe 3.3.1)

Zusätzlich wurde bei manchen Paraffinschnitten noch eine Zellkernfärbung mit einer

DAPI-Lösung (4',6-Diamidin-2-phenyl-indol) durchgeführt. Dazu wurden die Schnitte

nach der Fixation durch Formaldehyd (10 Minuten bei RT) und Permeabilisation mit

0,2 % Triton X-100 in PBS(10 Minuten bei RT) mit 50µl einer DAPI-Färbelösung

überschichtet und 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach folgte

direkt die TUNEL-Färbung und die gefärbten Schnitte wurden danach mit einem

konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) bei einer Wellenlänge von 515-565 nm

aufgenommen. Bei der Analyse der Bilder (siehe 3.3.2) konnte somit anhand der

Überschneidung der TUNEL-Färbung mit der Zellkernfärbung bestimmt werden,

welche Lymphozyten Apoptose aufweisen.

3.3.1 Bilderfassungssystem

Die mit TUNEL-gefärbten corticalen Thymompräparate wurden in einem Mikroskop

(Axioplan, Zeiss, Oberkochen) mit einer digitalen Farbkamera (Nikon, DXM 1200)

erfasst und im Computer auf CD-ROMS gespeichert. Dem Betrachter waren jedoch

zum Zeitpunkt der Untersuchung Einzelheiten der Präparate (MG(+), MG(-), Thymom

oder Thymitis) nicht bekannt.

Jeder der drei Farbkanäle (rot, grün, blau) hatte einen Dynamikbereich von acht bit

(Wertebereich 0-255). Als Objektiv diente ein Ultrafluar (10x) mit einer numerischen

Apertur (NA) von 0,2 und ein Kondensor mit einer maximalen NA von 0,63. Zur

Beleuchtung wurde eine Halogenlampe (100 Watt) mit variabler Spannung verwendet.

22

Die digitalisierten Bildszenen hatten eine Größe von 2048 x 2560 Bildpunkten und in

jeder Bildszene wurde eine Fläche von 1,295 mm2 auf dem Objektträger erfasst.

3.3.2 Bildanalyse

Die zur Analyse der Bilder notwendigen Algorhythmen waren in FORTRAN

programmiert. Die gescannten Bildszenen wurden auf der Workstation mit Hilfe einer

Farbanalyse auf die verschiedenen Komponenten im gefärbten Schnitt untersucht. Die

angewendete Farbdifferenz-Methode zur Zellsegmentierung wurde für die

verschiedenen Arten von Farben entwickelt und hier in angepasster Form für die

TUNEL-Färbung der Thymompräparate benutzt. Als erstes wurden die hellsten Stellen

im Präparat ermittelt und dienten als Referenz (Weißpunkt) für die weiteren

Farbanalysen. Alle Bildpunkte, die sich nur wenig von dem Weißpunkt unterschieden,

gehörten zu Fettzellen oder waren zell- und gewebefreie Gebiete.

Die Braunfärbung der Apoptosezellen unterschieden sich folglich in den drei

Farbkanälen von dem umgebenen Gewebe, wobei ein Bildpunkt nur dann zu einer

Apoptosezelle gehörte, wenn der Wert im Rotkanal um einen definierten Betrag (15-20)

höher lag, als der im Grünkanal, und der Blauanteil eine ermittelte Schwelle nicht

überschritt (Devijer). Anhand dieser vorgegebenen Definitionen wurden die

apoptotischen Zellen bezogen auf nicht-gefärbte ( blaue ) Thymozytenzellkerne

prozentual berechnet.

3.3.3 Statistische Auswertung der Daten

Alle einzelnen statistischen Signifikanzen wurden mit Hilfe des Man-Whitney-U -Test

(p < 0.05 falls nicht anders angegeben) und Chi-Square ermittelt. Die

Signifikanzenanalysen wurden mit dem Computerprogramm SPSS (Version 2000,

SPSS Inc., Chicago) geprüft.

23

4 Ergebnisse

4.1 Stabilität des Phänotyps

Für die FACS-Untersuchungen konnte aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit und der

Seltenheit der Erkrankung ausschließlich in flüssigem Stickstoff asserviertes Material

herangezogen werden. Dieses Material stammt aus einer Sammlung, die über Jahre

hinweg aufgebaut wurde. Bei dieser Sammlung gehörte es zur Routinediagnostik, dass

Lymphozyten von jedem Frischmaterial (Thymom und Thymitis) anhand eines

Standardprotokolls gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert wurden. Anhand von

Auswertungen dieser Standardprotokolle konnten somit die Messergebnisse zwischen

Frischgewebe und aufgetautem Gewebe bezüglich der Stabilität des Phänotyps

verglichen werden.

Es sollte geklärt werden, ob sich der Immunphänotyp der aufgetauten Zellen in Bezug

auf die Oberflächenmarker der einzelnen Reifungsstadien in irgendeiner Weise von

Frischmaterial unterscheidet. Um diesen Sachverhalt zu klären, werden die dazu

notwendigen Experimente und Ergebnisse geschildert.

4.1.1 Optimierung der Auftaumethode

Die standardisierte Einfriermethode der Thymozytensuspensionen in Kryoröhrchen

erfolgte immer in einer Zellzahlkonzentration von 2x106-1x108 Zellen /ml. Bei Beginn

einer jeden Versuchsreihe wurden die Lymphozyten aus dem Stickstofftank

herausgeholt und in einem Wasserbad bei 37 °C schnell erwärmt. Sobald sich der Inhalt

verflüssigte (ca. 50 Sekunden), wurden die Thymozyten in ein 15 ml Falconröhrchen

pipettiert, welches mit 15 ml eisgekühltem FACS-Puffer gefüllt war. Das Ziel dieser

Auftaumethode war es, das auf die Zellen toxisch wirkende DMSO möglichst schnell zu

verdünnen. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesaugt und das pellet

wieder mit 15 ml eisgekühltem FACS-Puffer vorsichtig resuspendiert.

Während dieses Vorganges konnte regelmäßig eine starke Verklumpung beobachtet

werden, die auf eine Verklebung der Thymozyten mit der DNA von abgestorbenen und

24

lysierten Zellen zurückzuführen ist. Diese Zellaggregate wurden daraufhin abpipettiert,

nach nochmaligem Zentrifugieren in 1 - 1,5 ml FACS-Puffer aufgenommen und die

Zellzahl in der Neubauerzählkammer ermittelt (siehe 3.1.2).

Die Zellausbeute, bezogen auf die Anzahl der anfangs eingefrorenen Thymozyten

betrug im Durchschnitt nur 1-10% der ursprünglich eingefrorenen Zellpopulation. Da

für die optimale Durchführung der Versuchsreihe eine Zellzahl von 2x105 Zellen je

einzelne Probe notwendig war, musste diese Auftaumethode modifiziert und optimiert

werden, um einen derart großen Verlust von Zellen so gering wie möglich zu halten.

Im Verlauf der Versuchsreihen stellte sich heraus, dass die Einflussgrößen Temperatur

des FACS-Puffers und Art des Auftaumediums eine große Rolle spielen im Bezug auf

die Zellausbeute und Verklumpung der Lymphozyten. Bei einigen Versuchsreihen

wurden jeweils zwei identische Proben des gleichen Ursprungsgewebe unter

verschiedenen Auftaubedingungen aufgetaut, wodurch sich hinsichtlich der

Zellausbeute deutliche Unterschiede aufzeigten.

Es resultierte eine enorme Erhöhung der Zellausbeute, sobald die Mediumtemperatur

von 4 °C auf 36 °C gesteigert wurde, unabhängig davon, welches Medium benutzt

wurde. Eine weitere Steigerung der Zellzahl erbrachte die Erhöhung des prozentualen

Anteils des FCS im FACS-Puffer. Als optimales Auftaumedium erwies sich im

Parallelversuch zur herkömmlichen Methode die Verwendung von RPMI mit 10 % FCS

als Auftaumedium. Demzufolge wurde für die folgenden Experimente das

Auftauverfahren zu Gunsten der modifizierten Methode geändert. Die Kryoröhrchen

wurden somit nach dem Übergang in die flüssige Phase in einem 15 ml Falconröhrchen

mit im Wasserbad auf 36 °C vorgewärmten RPMI + 10 % FCS aufgenommen und mit

einer Pipette vorsichtig vermischt und zentrifugiert. Nach dem Absaugen des

Überstandes und dem Resuspendieren mit ebenfalls auf 37 °C vorgewärmtem Medium

waren immer noch kleinere Zellklümpchen zu erkennen, die danach sofort entfernt

wurden, um eine weitere Aggregation von Lymphozyten zu vermeiden. Das weitere

Vorgehen entsprach dem zuvor beschriebenen Prozess mit Zentrifugieren, Absaugen

und Zählen in der Neubauerzählkammer.

Durch diese Optimierung konnte bei allen Gewebetypen eine Steigerung der

durchschnittlichen Zellausbeute bis um den Faktor 10 gegenüber der herkömmlichen

Methode erreicht werden.

25

4.1.2 Veränderung der Subpopulationen nach dem Auftauen

Um Veränderungen in den Subpopulationen von aufgetauten Zellen im Vergleich zu

Nativzellen erkennen zu können, wurden durchflusszytometrische Messungen an frisch

aus dem Gewebe isolierten Thymozyten durchgeführt, und mit denjenigen nach dem

Auftauen aus demselben Ursprungsgewebe verglichen. Hierzu wurden die

Standardfärbungen CD4, CD8, CD45, und CD69 im FACScan analysiert und im

Dotplot und Histogramm miteinander verglichen. Hier konnte gezeigt werden, dass sich

die einzelnen Subpopulationen sowohl im nativen Zustand, als auch nach dem

Auftauvorgang gut darstellen ließen und dass das eingefrorene Material durchaus ein

gleiches Färbeverhalten in den einzelnen Subpopulationen aufweist. Somit ergeben sich

durch die Prozedur des Einfrierens und anschließenden Auftauens zumindest keine

schwerwiegenden Veränderungen in Bezug auf die quantitative Zusammensetzung der

untersuchten Zellpopulationen.

Folgende Patientenproben wurden jeweils im Nativzustand und nach dem Auftauen

hinsichtlich Ihrer Anfärbbarkeit untersucht

Pat.No Typ MG

97/4494 Thymitis Ja

00/1495 AB Nein

98/5186 B2 Nein

00/16857 B2 Nein

99/21994 B2 Ja

99/13575 B2 Ja

Tabelle 8: Untersuchte Patientendaten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG)

26

Abbildung 6: Dotplotdarstellung von Thymozyten

Auswirkungen des Einfrier- und Auftauvorganges von Thymozyten in Bezug auf dieDarstellung der Oberflächenmarker CD4, CD8 und CD27. Im Vergleich dazu nativeThymozyten aus demselben Ursprungsgewebe bei Myasthenia Gravis (MG).

4.1.3 Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Subpopulationen

Aufgrund der Versuchsanordnung und der darin verwendeten intrazellulären DNA-

Markierung durch das TUNEL-Reagenz mussten die Proben 1-7 (siehe

Versuchsprotokoll 3.2) nach der Oberflächenmarkierung zuerst mit CytofixTM fixiert

und anschließend mit Perm/WashTM-buffer permeabilisiert werden. Wegen einer

Zerstörung der Oberflächenstruktur durch das Paraformaldehyd und infolgedessen einer

Veränderung des Färbeverhaltens der Lymphozyten wurden zu Beginn der

Versuchsreihen Parallelproben mitgeführt, die ohne CytofixTM behandelt wurden. Nach

CD8-TRI CD8-TRI

CD4-PECD4-PE

CD4-PECD4-PE

CD27-TRICD27-TRI

27

der Analyse im FACScan® wurden die Zellen in einem Dotplot-Diagramm miteinander

verglichen. Bei der Durchflusszytometrie stehen als Maß für die Größe der Parameter

forward scatter (FSC) und für die Granularität der Parameter side scatter (SSC) zur

Verfügung. Die Thymozyten stellen sich in einem Diagramm, bei welchem FSC gegen

SSC aufgetragen wird, als zwei Populationen dar: eine Population mit geringer

Zellgröße und eine mit größeren Zellen bei etwa gleicher Granularität (siehe

Abbildung). Hier ist bei fast allen Proben zu erkennen, dass durch die Behandlung mit

CytofixTM und Perm/WashTM-buffer eine Vergrößerung der Thymozytenpopulation mit

geringer Zellgröße und etwa gleicher Granularität stattfindet (siehe Abbildung 7).

Zur Quantifizierung dieser Population wurde im Dotplot-Diagramm der nicht fixierten

Zellen ein definiertes Gate R3 gesetzt. Die mit CytofixTM behandelten Zellen wurden

nun in dem gleichen Diagramm mit vorher festgelegtem Gate R3 dargestellt und die

darin enthaltenen Zellen prozentual miteinander verglichen. Bei allen 10 untersuchten

Patientenproben entsprach die prozentuale Zunahme dieser Subpopulation, bei welcher

es sich wahrscheinlich um lysierte Zellen und Zelldetritus handelt, einem Betrag < 5 %

bezogen auf alle aufgenommenen Zellen.

28

Abbildung 7: Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Größe(FSC) und Granularität (SSC) der ThymozytenA-C: Thymozyten ohne Behandlung mit CytofixTM und

Perm/WashTM

A1-C1: Thymozyten nach 20 Minuten Inkubation in CytofixTM undanschließendem zweimaligem Waschen mitPerm/WashTMbuffer

R3: Definiertes Gate mit prozentual dargestellter Vermehrung indiesem Gate bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen

29

4.2 Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien von Thymomen

Bei den Untersuchungen bezüglich der speziellen T-Zellreifung von Thymozyten

konnte gezeigt werden, dass es hinsichtlich der einzelnen Reifungsstadien deutliche

Unterschiede innerhalb der MG(+) und MG(-) Thymome gibt. Im Vergleich mit den

MG(+) Thymomen kommt es bei allen MG(-) Thymomen zu einem quantitativen

Zellverlust innerhalb der Subpopulation der CD4+CD45RA+ Zellen (Strobel,

Helmreich et al. 2002; Strobel, Preisshofen et al. 2003). Zusätzlich konnten auch noch

unterschiedliche Reifungsstörungen in den einzelnen Thymom-Subtypen nachgewiesen

werden. So kommt es bei den Typ AB Thymomen offenbar während der positiven

Selektion (Acquisition von CD69) zu einem deutlichen quantitativen Zellverlust,

während die T-Zell-Reifung bei den corticalen Thymomen im Vergleich zu

Normalthymi keine signifikanten Veränderungen aufwies (Abb. 8). Interessanterweise

zeigten MG(-) Typ B einen besonders deutlichen Verlust von CD27+ (CD45RA+/-) T-

Zellen (Vanhecke, Verhasselt et al. 1997).

30

CD4im DP 1

CD3-

DP 2

CD3+

DP 3

CD69+

CD4m

CD27+

RE

CD45RA+

PositiveSel.

NegativeSel.

0

10

20

30

40

Thymus

%

AB MG(+) AB MG(-) B MG(+) B MG(-)

Abbildung 8 : Vergleich der Reifungsdaten von Thymozyten bei Normalthymus

sowie WHO Typ AB und B Thymomen

Diese Reifungsdaten lassen einen deutlichen Unterschied der prozentualen Anzahl derverschiedenen Zellpopulationen nach der positiven Selektion zwischen Thymomen mitund ohne Myasthenia Gravis (MG) erkennen. Vor allem bei den MG(-) kortikalenThymomen B MG(-) sind die Subpopulationen CD4 mature (CD4m, gelb) und RecentEmigrants (RE, grün) mit dem dafür spezifischen Oberflächenmarker CD27 undCD45RA deutlich vermindert. (Darstellung verändert nach Ströbel, Preisshofen et al.2003)

31

4.3 FACS-Apoptosemessungen

Die unterschiedlichen Reifungsstörungen der einzelnen Thymomsubtypen und der

damit verbundene Verlust von Lymphozyten in den letzten Reifungsstadien geht von

einer erhöhten Apoptoseaktivität im Laufe der T-Zellreifung im Thymus aus.

Um dem Hauptziel dieser Arbeit, der immunphänotypischen Charakterisierung der

Thymozyten und Bestimmung ihrer Apoptoseaktivität in den einzelnen Reifungstadien

näher zu kommen, musste eine Methode gefunden werden, die Apoptoserate jeder

Subpopulation quantitativ zu bestimmen. Mit Hilfe der zur Verfügung stehenden

Durchflusszytometrie bestand die Möglichkeit, drei Oberflächenantigene der

Lymphozyten zu detektieren, und sie je nach der Ausprägung der Antigene einem

Stadium zuzuordnen (Abbildung 9).

Abbildung 9: Oberflächenantigene der Lymphozyten in verschiedenen Stadien

Im Verlauf der Thymozytenreifung kommt es zur Ausbildung von spezifischenOberflächenmarkern, die für das jeweilige Entwicklungsstadium charakteristisch sindund anhand derer eine Einteilung in verschiedene Reifungsstadien erfolgen kann. Dieeinzelnen Oberflächenmarker (CD) sind entweder positiv (+) oder negativ (-).CD4im: unreife (immature) CD4+ Zellen,DPim: unreife (immature) CD4+ CD8+ ZellenDPpräSel: doppelt positive Zellen vor der positiven SelektionDPpostSel: doppelt positive Zellen nach der positiven SelektionSPm: reife (mature)CD4+ ZellenRE: Recent emigrants

CD4im DPim DPpräSel DPpostSel SPm RE

8- 8+ 8+ 8+ 4+/8- 4+/8-

3- 3- 3+ 3+ 3+ 3+

69- 69- 69- 69+ 69+ 69+

1a+ 1a+ 1a+ 1a+ 1+/- 1a-

27- 27- 27- 27- 27+ 27+

45RA- 45RA- 45RA- 45RA- 45RA- 45RA+

32

Nachdem die nach dem Versuchsprotokoll gefärbten Zellen mit Hilfe des FACScan®

analysiert wurden, konnten bei der Auswertung der Daten die TUNEL-Färbung auf FL-

1 in einem Histogramm, sowie die beiden anderen Antikörperfärbungen auf FL-2 und

FL-3 in einem Dotplot-Fenster dargestellt werden.

In den jeweiligen Dot-plot Diagrammen wurden daraufhin 4 Regionen von R1-4

entsprechend der jeweiligen Färbung definiert, und die jeweils darin auftretende

TUNEL-FITC-Färbung in einem Histogramm der FL-1 aufgezeigt. Anhand der bei

jedem Versuch mitgeführten Positiv- und Negativkontrollen für die TUNEL-Färbung

wurde der Punkt festgelegt, ab welchem die Thymozyten als apoptotisch zu betrachten

sind. Dieser Punkt definierte den Beginn des Markers und wurde für alle Proben einer

jeweiligen Versuchsreihe festgelegt. In der Statistik konnte danach der prozentuale

Anteil der apoptotischen Zellen der einzelnen Regionen einer jeden Färbung bestimmt

werden. Danach konnte für jede einzelne Subpopulation der Thymozyten eine Aussage

über den prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen gemacht werden (Tabelle 9).

Unter den 20 untersuchten Fällen fanden sich 3 Fälle mit Thymitis, 8 MG(-)Thymome

und 9 MG(+)Thymome. Abbildung 10 zeigt eine Zusammenfassung aller untersuchten

Thymome und Thymitiden. Bei allen MG(-) Thymomen war im Vergleich zu MG(+)

Thymomen eine signifikant (p< 0.5) erhöhte Anzahl TUNEL-positiver Zellen in der

Population der CD4+CD27+CD45RA- Zellen nachweisbar.

Um daraufhin noch genauere Angaben zu bekommen, wurden die einzelnen Thymome

nach ihrer histogenetischen Einteilung untersucht und miteinander verglichen. Es sollte

geklärt werden, inwiefern sich das Apoptoseverhalten bei gemischten und cortikalen

Thymomen untereinander unterscheidet. Bei cortikalen Thymomen konnte wiederum

eine deutlich signifikante Erhöhung der TUNEL-positiven Zellen in den

Subpopulationen der CD4+CD27CD45+ und CD4+CD27+CD45- Thymozyten bei

MG(+) Thymomen im Vergleich zu MG(-) Thymomen dargestellt werden (Abbildung

11).

33

Tabelle 9: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver (apoptotischer) Zellen in

verschiedenen Thymozytenreifungsstufen bei Thymomen mit und ohne assoziierte

Myasthenia gravis

Anhand der durchflusszytometrisch analysierten Dotplot-Färbungen wurde dieApoptoserate für die unterschiedlichen Zellpopulationen ermittelt. Dargestellt ist derprozentuale Anteil apoptotischer Zellen bezogen auf die jeweiligeThymoztenpopulation.WHO: histologischer Thymom-Subtyp nach WHO-Klassifikation, MG: Myastheniagravis; CD4im: unreife (CD3-4+8-) CD4+ Zellen, DPim: unreife doppelt positive (CD3-4+8+) Zellen, DP: doppelt positive (CD3+4+8+) Zellen, CD4m: reife(CD3+4+CD27+CD45RA-) CD4+ Zellen, CD4RE/CD8RE: CD4+/CD8+ RecentEmigrants (CD4 oder CD8+, CD27+CD45RA+), k.A.: keine Angaben möglich.

WHO MG CD4im DPim DP CD4m CD4RE CD8m CD8RE

1 Thymitis Ja 0 0 0 0 0 0 0,92 Thymitis Ja 0 0 1,0 0 1,5 0 0,43 Thymitis Ja 0,6 0 1,0 1,0 0,4 1,5 0,84 AB Ja 1,2 0 1,0 0,2 0,1 k.A. 0,15 AB Ja 0,2 0 0,4 0,7 3,7 0 2,66 AB Ja 1,5 0 1,1 0 4,0 0 7,27 AB Nein 3,8 0 1,3 0 1,9 0 4,18 AB Nein 2,3 k.A. 3,3 0,7 1,3 0,4 2,19 AB Nein 0,2 0 2,2 2,4 1,5 2,7 1,110 B2 Ja 3,9 0,5 2,8 0,8 1,4 0 2,511 B2 Ja 0,1 0 1,0 0 2,7 0 2,012 B2 Ja 0 0 0 0 0 0 013 B2 Ja 0,4 0 0,3 0 5,4 0,6 3,914 B2 Ja 0 0 0 0 0 0 0,315 B2 Ja 0 0 0,3 0,2 0 0,1 0,216 B2 Nein 0,8 0,5 1,6 0,6 2,5 0 2,517 B2 Nein 0,2 0 1,2 0,3 0,1 2,2 0,118 B2 Nein 2,0 0,3 1,8 1,3 1,8 0,1 2,919 B2 Nein 4,3 0,5 9,7 4,8 5,1 0 9,420 B2 Nein 0 0 0,6 0,2 0 0,6 0,2

34

CD4im

DPim

CD4m

CD4RE

CD8m

CD8RE

0

1

2

3

4

5

6

7

% T

UN

EL

-po

siti

ver

Zel

len

in d

er je

wei

ligen

Su

bp

op

ula

tio

n

Thymitis MG(+) MG(-)Thymome

P < 0.5

Abbildung 10: Darstellung der TUNEL-Befunde bei allen untersuchten MG(+)

und MG(-) Thymomen im Vergleich zu nicht-neoplastischen Thymi mit

Entzündung (Thymitis).

Beim Vergleich der Thymome mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) erkennt man einedeutlich erhöhte Apoptoserate (p < 0.05, grün) der CD4(+)mature Population (CD4m).Der prozentuale Anteil der TUNEL-positiven Zellen ist bei den MG(-)-Thymomengegenüber den MG(+)-Thymomen in allen Subpopulation erhöht. Im = immature, m =mature, RE = Recent Emigrants, DP = doppelt positive Zellen (CD4+, CD8+)

P < 0.05

35

0

2

4

6

8

B MG+B MG-

% T

UN

EL

-po

siti

ver

Zel

len

in d

er je

wei

ligen

Su

bp

op

ula

tio

n

CD8RECD4im DPim CD4m CD4RE CD8m

P < 0.5

Abbildung 11: Prozentualer Anteil Tunel positiver Zellen in den einzelnen

Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ B Thymomen.

Hier zeigt sich eine signifikante (p < 0.05) Erhöhung apoptotischer Zellen in denSubpopulationen CD4mature und CD4RE bei MG(-) Thymomen im Vergleich zuMG(+) Thymomen.B = corticale Thymome WHO Typ B, im = immature, m = mature, RE = RecentEmigrants, MG: Myasthenia Gravis, CD: Oberflächenmarker

Weiterhin wurden auch die gemischten Thymome (WHO-Typ AB) auf etwaige

Unterschiede bezüglich der Apoptose untersucht. Hier konnte man im Gegensatz zu den

cortikalen Thymomen keine statistisch signifikanten Unterschiede erkennen. Wie in der

Abbildung 12 dargestellt, konnte man aber auch hier eine Erhöhung der apoptotischen

Thymozyten bei der Subpopulation der DPim und CD4RE bei MG(-) im Vergleich zu

MG(+) erkennen.

P < 0.05

36

CD4im DPim CD4m CD4RE CD8m CD8RE

0

2

4

6

8AB MG+AB MG-

% T

UN

EL

-po

siti

ver

Zel

len

in d

er je

wei

ligen

Su

bp

op

ula

tio

n

Abbildung 12: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen

Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ AB Thymomen

Keine signifikante Erhöhung, jedoch besteht die Tendenz einer vermehrten Anzahlapoptotischer Thymozyten bei MG(-)-Thymomen (blau). Reifungsdaten bei DPim undCD4RE bei MG(+) Thymomen konnten nicht eindeutig eruiert werden.MG: Myasthenia Gravis, AB = gemischte Thymome, im = immature, m = mature, RE =Recent Emigrants, CD: Oberflächenmarker

Aus diesen mit Hilfe des FACScan® untersuchten Thymozyten wird anhand der obigen

Ergebnisse deutlich, dass es bei den MG(-) Thymomen in den letzten beiden

Reifungsstadien zu einer erhöhten Anzahl TUNEL-positiver Zellen kommt, was einer

erhöhten Apoptoserate entspricht. Zusätzlich konnte auch noch aufgezeigt werden, dass

bei den corticalen MG(-) und MG(+)Thymomen ein deutlicherer Unterschied

hinsichtlich des Apoptoseverhaltens gegeben ist als bei den gemischten Thymomen.

37

Diese Befunde korrelierten sehr gut mit den quantitativen Messungen bezüglich der T-

Zell-Reifung in Thymomen (s. Abb. 8).

4.4 Auswertung anhand der Farbdifferenzmethode

Die Paraffinschnitte wurden gemäß des Protokolls gefärbt und im Dunkeln aufbewahrt,

um sie vor Lichteinstrahlung zu schützen. Die einzelnen Präparate wurden in jeweils

derselben Art und Weise untersucht. Zuerst wurden die Objektträger in einem

verdunkelten Raum unter dem Mikroskop inspiziert und danach wurden die Bildszenen

einmal vertikal von oben bis unten und einmal horizontal von rechts nach links eines

jeden Präparates aufgenommen. Da in Typ AB Thymomen die lymphozytenreichen

Areale sehr heterogen verteilt sind und somit eine standardisierte Aufnahmesequenz bei

diesen Tumoren nicht möglich ist, wurden für diesen Teil der Studie ausschließlich Typ

B Thymome verwendet. Bei den Typ B Thymomen wurden insgesamt 23,7 Bildszenen

aufgenommen, wobei jedes Bild eine Präparatfläche von 1.295 mm² darstellt. Damit

wurde also in jedem der Präparate eine Gesamtfläche von 3,07 cm² aufgenommen und

anschließend mit der Farbdifferenz-Methode zur Zellsegmentierung analysiert und

ausgewertet. Mit dieser Methode wurden an insgesamt 6 corticalen Thymompräparaten

und drei Thymitiskontrollen eine TUNEL-Färbung durchgeführt. Es wurde nach

Möglichkeit darauf geachtet, dass die Patientenproben denen der

durchflusszytometrisch untersuchten Proben entsprachen, damit die Auswertungen

miteinander verglichen werden konnten.

38

Abbildung 13: Thymitis-Paraffinschnitt, H.E-Färbung mit TUNEL-Färbung

Apoptotische Zellen sind bei einem Thymitis-Paraffinschnitt im Vergleich zu Thymom-Paraffinschnitten deutlich reduziert und in diesem Präparat nicht vorhanden

39

Bei den einzelnen mikroskopischen Analysen stellte sich schon zu Beginn der

Untersuchungen heraus, dass die TUNEL-positiven Zellen bei den Thymomen deutlich

vermehrt vorkamen. Im Gegensatz dazu waren diese TUNEL gefärbten Zellen bei den

Thymitiden nur in einer sehr geringen Anzahl vorhanden. Bezüglich der

Aussagefähigkeit hinsichtlich des Apoptoseverhaltens jeder einzelnen Zelle wurde

folgender Gesamtwert als Vergleichsparameter gewählt:

Mit diesem Wert war es möglich, die TUNEL-positiven Zellen der einzelnen

Bildszenen eines jeden Präparates objektiv auszurechnen und den daraus resultierenden

durchschnittlichen Gesamtwert der einzelnen Präparate untereinander zu vergleichen.

Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Abbildung 14 graphisch dargestellt. Die

Graphik zeigt, dass die Anzahl der markierten Lymphozytenkerne pro Gewebefläche

bei den MG (-)-Fällen größer ist als bei den MG(+)-Fällen (p<0.05). Im Vergleich zu

den Thymitisfällen ist bei den Thymomem insgesamt eine deutlich vermehrte

Anfärbbarkeit der Zellkerne mit dem TUNEL-Reagenz zu erkennen. Die daraus

resultierende Signifikanz ergibt einen Wert von p<0.001.

Insgesamt zeigen die Resultate der gefärbten Paraffinschnitte, dass es Unterschiede bei

der Anfärbbarkeit der einzelnen Thymozyten mit dem TUNEL-Reagenz gibt. Anhand

dieser Untersuchungen kann man die Vermutung aufstellen, dass bei den Thymomen,

die nicht mit einer paraneoplastischen MG assoziiert sind, eine vermehrte apoptotische

Aktivität der Lymphozyten vorhanden ist.Somit korreliert dieses Ergebnis auch mit den

Ergebnissen der durchflusszytometrisch analysierten Thymozyten (siehe 4.2).

Gesamtwert = Anzahl der markierten Lymphozytenkerne x 105

aufgenommene Gewebefläche

40

0

100

200

p < 0.05

MG-3 Fälle, n = 70 HPF

MG+3 Fälle, n = 74 HPF

TU

NE

L(+

) Z

ellk

ern

e x

105

/ Gew

ebef

läch

e

Thymitis3 Fälle, n = 30 HPF

P < 0,001

Abbildung 14:Vergleich von Tunel-Färbungen an Paraffinschnitten von Thymitis

und Thymomen mit und ohne Myasthenia Gravis (MG)

Insgesamt wurden 9 Fälle mit Hilfe der Farbanalyse im gefärbten Schnitt untersucht.Signifikante Erhöhung (p < 0.05) der TUNEL-positiven Zellkerne bei MG(-) imVergleich zu MG(+), sowie im Vergleich der Thymome mit Thymitis (p < 0.001).HPF = High Power Field

41

Abbildung 15: TUNEL-Färbung an Paraffinschnitt, No. 28804, Thymom MG (-)

Die schwarzen Pfeile markieren die TUNEL-positiven (braunen)Lymphozytenzellkerne an einem H.E.-gefärbten Paraffinschnitt einesThymompräparates ohne Myasthenia Gravis (MG)

42

4.5 TUNEL und DAPI-Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten

Ein großer Vorteil der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist eine hohe Auflösung der

optischen Schnitte von Gewebearten ohne eine allzu komplizierte Gewebeaufbereitung.

Ziel dieser Methode war eine weitere qualitativ hochwertigere Darstellung von

apoptotisch veränderten Zellen bei Paraffinschnitten von Thymomen und Thymitiden.

Dazu wurde eine Zellkernfärbung mit DAPI durchgeführt, wodurch die einzelnen

Lymphozyten per se schon zu identifizieren waren. Danach wurden die Zellen mit dem

TUNEL-Farbstoff inkubiert und direkt mit dem Fluoreszenzmikroskop analysiert.

Zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurden die Schnitte im Dunkeln aufbewahrt,

so dass der Farbstoff nicht ausbleichen konnte. Um die apoptotischen Thymozyten

letztendlich bestimmen zu können, sollten die einzelnen Zellkerne eine Blaufärbung

(DAPI) aufweisen und zusätzlich noch mit dem FITC-gekoppelten TUNEL-Reagenz

(grün) markiert sein.

Abbildung 16: DAPI-Immunfluoreszenzfärbungen und TUNEL-Färbungen eines

Paraffinschnittes, Thymom mit Myasthenia Gravis (MG+)

Die mit dem grauen Pfeil markierten grünen Zellkerne sind TUNEL-positiv undgleichzeitig DAPI-positiv und können daher als apoptotisch bezeichnet werden.

43

5 Diskussion

Basierend auf der Tatsache, dass im peripheren Blut von Patienten ohne MG eine

signifikant verminderte Anzahl naiver CD4+-Zellen gefunden wurde (Hoffacker,

Schultz et al. 2000; Buckley, Douek et al. 2001) besteht eine Assoziation zwischen dem

Auftreten einer paraneoplastischen MG und der Effizienz von Thymomen, naive CD4+

T-Zellen zu produzieren und zu exportieren (Strobel, Helmreich et al. 2002).

Vor diesem Hintergrund sollte die vorliegende Arbeit klären, ob es hinsichtlich der

Apoptoserate zwischen MG(-) und MG(+) Thymomen einen quantitativen Unterschied

gibt und in welchem Reifungstadium dieser programmierte Zelltod vonstatten geht. Da

es sich bei den Thymomen um äußerst seltenene Krankheitsbilder handelt, waren die

durchflusszytometrischen Untersuchungen von vorneherein auf die Verwendung

eingefrorener, archivierter Thymozyten beschränkt. Um die Ergebnisse und die

Spezifität der FACS-Analysen noch besser beurteilen zu können, wurden mit Hilfe der

Immunhistologie und Immunfluoreszenz noch weitere Untersuchungen an

Paraffinschnitten durchgeführt.

Aufgrund der Komplexität der Versuchsanordnung und der Schwierigkeit einer

Apoptosemessung werden nachfolgend die einzelnen Methoden diskutiert.

5.1 Diskussion der Methodik

Einen Schwerpunkt der Diskussion über die Methodik stellt sicherlich die Art der

Untersuchung und das Material selber dar. Bei der Verwendung von eingefrorenem

Material lag die Zellausbeute nach dem Auftauvorgang zwischen 5-10 % der

ursprünglichen Menge. Aufgrund dieses hohen Verlustanteils musste eine große Menge

an eingefrorenen Thymozyten zur Verfügung stehen, um diese Ausfälle zu

kompensieren. Durch einige Modifikationen bei dem Auftauvorgang konnte letztendlich

die Zellausbeute an Thymozyten gesteigert werden, so dass sich keine Schwierigkeiten

mit der archivierten Materialmenge ergaben.

44

5.1.1 Durchflusszytometrische TUNEL-Methode bei Thymozyten

Die Art des Nachweises apoptotischer Zellen wird kontrovers diskutiert. Die TUNEL-

Färbung ist eine der am häufigsten verwendeten und spezifischsten Nachweismethoden

für apoptotische Zellen (Kelly, Sandoval et al. 2003; Prochazkova, Kylarova et al.

2003). In Kombination mit der Durchflusszytometrie können sowohl quantitative als

auch qualitative Aussagen über den programmierten Zelltod gemacht werden

(Afanasyev, Korol et al. 1993), jedoch muss die jeweilige Nachweismethode spezifische

Anforderungen erfüllen.

Um Lymphozyten, die sich im Stadium des programmierten Zelltodes befinden,

nachzuweisen, müssen Apoptose-spezifische Eigenschaften und Merkmale dieser Zellen

nachgewiesen werden. Diese Merkmale dienen vor allem dazu, eine Differenzierung

gegenüber denjenigen Zellen zu erreichen, die durch den Vorgang der Nekrose

zugrunde gegangen sind. Bei allen Nachweismethoden ist diese Unterscheidung ein

wichtiges Kriterium hinsichtlich der Validität der einzelnen Methoden.

Bei der Apoptose oder dem programmierten Zelltod aktiviert die Zelle ein internes

Zerstörungsprogramm mit charakteristischem Abbau der Kern-DNA, der Degeneration

und Kondensation von Zellkernen, sowie einer Phagozytose der Zellreste

(Darzynkiewicz, Bruno et al. 1992). Zu Beginn schrumpfen die Zellen aufgrund von

Wasserverlust und isoosmotischem Verlust von Ionen im Zytoplasma (Bortner and

Cidlowski 2000), die Kern-DNA wird währenddessen in hoch-und niedermolekulare

Fragmente ( nicks ) gespalten (Savill and Fadok 2000).

Im Gegensatz dazu ist die Nekrose ein nicht-programmierter Zelltod aufgrund von

chemischen oder physikalischen Schädigungen. Dieser Vorgang ist gekennzeichnet

durch den Verlust der Membranintegrität und das Anschwellen von Zytoplasma und

Mitochondrien. Dies ist auf die Unfähigkeit zur Aufrechterhaltung der Ionen-Hämostase

zurückzuführen. Schließlich kommt es zur völligen Lyse der Zelle und die

zytoplasmatischen Inhalte werden freigesetzt. Die DNA wird nach Lyse der Zellen nach

dem Zufallsprinzip in Stücke verschiedener Größe abgebaut (Wyllie, Kerr et al. 1980)

und im Gegensatz zur Apoptose entstehen hierbei große Mengen an Zelltrümmern, die

von Phagozyten beseitigt werden müssen.

45

Für den Nachweis eines programmierten Zelltodes wird deshalb genau dieser spezielle

Vorgang der Fragmentation bei der Apoptosemessung ausgenutzt und die dabei

entstehenden apoptotic bodies können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen

werden (Walker and Quirke 2001). Die Schwierigkeit des Nachweises besteht jedoch in

der exakten Quantifizierung, die für die Aussage bezüglich der Apoptoserate

unabdingbar ist.

Bei der TUNEL-Methode werden die 3´-Enden von den DNA-Fragmenten, die in

apoptotischen Zellen entstehen (sogenannte nicks ) durch die Reaktion der terminalen

Desoxynukleotidyltransferase (TdT) mit Fluorescein markiertem Uridin (dUTP)

markiert. Anschließend können diese markierten Zellen entweder mit der

Fluoreszenzmikroskopie oder mit der Durchflußzytometrie analysiert werden. Bei der in

dieser Arbeit verwendeten Methode besteht der Vorteil, dass durch die Verwendung von

direkt FITC-gekoppelten Nukleotiden der Zwischenschritt einer Enzym-gekoppelten

Substratumwandlung entfällt.

Mit Hilfe dieser Methode ist es gelungen, einen spezifischen Nachweis in Bezug auf die

Quantität für apoptotische Zellen zu etablieren (Kelly, Sandoval et al. 2003). Somit

kann aufgrund von diesen unterschiedlichen intrazellulären Vorgängen bei der Nekrose

und Apoptose eine TUNEL-Färbung durchaus als eine spezifische Art des Apoptose-

Nachsweises betrachtet werden (Negoescu, Guillermet et al. 1998; Lawry 2004). Um

das bei dieser Arbeit verwendete TUNEL-Reagenz für die intrazelluläre DNA-

Markierung anwenden zu können, mussten die aufgetauten Zellen zuerst fixiert und

anschließend permeabilisiert werden. Dieser Vorgang war notwendig, um sowohl die

inneren als auch die äußeren Zellmembranen für die Antikörper durchlässig zu machen.

Bei der Fixation (CytofixTM) wurden die Zellen durch das darin enthaltene

Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit einem Detergens (Perm/Wash bufferTM)

permeabilisiert. Die Markierung der Oberflächenmarker, und damit die Zuordnung zu

den einzelnen Reifestadien wurde jedoch aufgrund des Permeabilisationsvorganges vor

einer jeden TUNEL-Färbung durchgeführt, weil hierbei eine gewisse Zerstörung der

äußeren Zellmembran stattfindet. Da die spätere Auswertung der TUNEL-Färbung

darüber Auskunft geben sollte, in welchem Stadium der Thymozytenentwicklung die

höchste Apoptoserate stattfindet, wurde auf die Oberflächenmarkierung mittels

Antikörper großen Wert gelegt. Deshalb wurde, wie in 4.1.3 beschrieben, ein

46

durchflusszytometrischer Vergleich derselben Proben zuerst vor und nach der

Fixation/Permeabilisation durchgeführt. Somit konnte man den Einfluss dieser

Detergenzien auf die bereits mit Antikörpern markierten Zellen direkt erkennen.

Anhand der Darstellung der Zellen im Dot plot Diagramm ist bezüglich der Grösse und

Granularität der Zellen eine leichte Verschiebung zugunsten der Zellen mit geringer

Zellgröße und gleicher Granularität zu beobachten. Es zeigten sich aber keine

Unterschiede hinsichtlich der Anfärbbarkeit und Darstellung der Subpopulationen bei

fixierten/permeabilisierten Zellen gegenüber nativen Thymozyten, so dass der Einfluss

darauf vernachlässigt werden konnte.

Eine weitere Schwierigkeit bei der Anwendung dieser zytometrischen TUNEL-Methode

bestand darin, dass durch die DNA-Markierung mit dem direkt FITC-gekoppelten

dUTP der Fluoreszenzkanal 1 belegt war. Da aber für die Durchflusszytometrie nur ein

3-Farben FACS-Analysegerät zur Verfügung stand, waren für die übrigen

Oberflächenantigen-Bestimmungen noch zwei Kanäle bereit (FL-2 und FL-3).

Um jede einzelne Subpopulation der Thymozyten auf Ihre Apoptoserate untersuchen zu

können, wurde deshalb im Vorfeld der Untersuchungen eruiert, ob mit Hilfe einer

Depletion durch Trennsäulen die CD4+ T-Zellen von den CD4- T-Zellen getrennt

werden könnten. Die Ergebnisse der CD4/CD8 Depletion an sich waren sehr gut, jedoch

ergaben sich durch deren Zuhilfenahme weitere Schwierigkeiten. Zum einen kam es zu

einer weiteren Verminderung der absoluten Zellzahl, zum anderen litt darunter die

Qualität hinsichtlich der Apoptosemessung. Die Inkubationszeit der fixierten

Thymozyten belief sich auf mehrere Stunden, und Untersuchungen hinsichtlich des

Anfärbeverhaltens behandelter Zellen konnten zeigen, dass bei Zellen, die länger als 2

Stunden fixiert waren, verfälschte Ergebnisse bei der Apoptose-Messung herauskamen

(Tateyama, Tada et al. 1998). Eine weitere Alternative bestand in der Verwendung eines

fluoreszenzaktivierten Zellsorters. Jedoch erwies sich diese Methode aus technischen

und logistischen Gründen als nicht durchführbar. Somit blieben für die Fortsetzung der

TUNEL-Methode nur die Fluoreszenzkanäle FL-2 und FL-3 übrig, an welchen das

Versuchsprotokoll so gestaltet wurde, dass man jede einzelne Subpopulation in den Dot

plot Diagrammen darstellen und die quantitative Apoptoserate anhand der

dazugehörigen Histogramme analysieren und errechnen konnte.

47

5.1.2 Immunhistochemische TUNEL-Methode bei Paraffinschnitten

Die immunhistochemische TUNEL-Färbung von Gewebeschnitten ist eine weit

verbreitete und validierte Methode für den Nachweis apoptotischer Zellen. Im

Gegensatz zur Durchflusszytometrie können bei dieser Untersuchung die TUNEL-

markierten Zellen zusätzlich noch lichtmikroskopisch auf ihre morphologischen

Eigenschaften hin untersucht werden. Mit Hilfe von computerunterstützten

Bildanalysen können anschliessend die einzelnen Bildserien anhand der typisch

apoptotischen Zellmorphologie ausgewertet werden.

Bei Untersuchungen von Prostatakarzinomen wurde ein Vergleich von

immunhistochemischen Apoptosemarkern (Caspase 3 und Cytokeratin 18) und der

TUNEL-Methode durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass bei der Entdeckung

und Quantifizierung von apoptotischen Zellen eine gute Korrelation zwischen Caspase 3

Markern und der TUNEL-Färbung besteht (Duan, Garner et al. 2003).

Trotzdem muss der Nachweis apoptotischer Zellen an Schnittpräparaten kritisch

analysiert werden, da die Sensitivität doch erheblich variieren kann (Labat-Moleur,

Guillermet et al. 1998). Als zusätzliches Kriterium wurde deshalb die optisch

erkennbare Zellmorphologie und die DAPI-Zellkernfärbung verwendet, anhand derer

lichtmikroskopisch bzw. fluoreszenzmikroskopisch weitere Hinweise für eine

apoptotische Zelle zu erkennen waren.

5.2 Untersuchung apoptotischer Thymozyten

Nachdem die technischen Fragen, also die Aussagefähigkeit und die Anwendbarkeit der

TUNEL-Methode zur Darstellung und Quantifizierung apoptotischer Zellen, im ersten

Teil dieser Arbeit geklärt worden ist, konnte sich der Hauptteil der Doktorarbeit mit der

Fragestellung auseinandersetzen, ob bei MG(-) Thymomen eine höhere Apoptoserate zu

verzeichnen ist , als bei den MG (+) Thymomen und, falls dies der Fall sein sollte, in

welchem Stadium der T-Zellreifung dieser vermehrte Zelltod stattfindet.

48

5.2.1 Diskussion der Reifungsstadien

Die Zusammensetzung der T-Zell-Populationen in Thymomen und Kontrollthymi wies

signifikante Unterschiede auf. Hinsichtlich der T-Zellpopulation ist der Anteil an

unreifen Thymozyten in Thymomen größer, der Anteil reifer T-Zellen geringer, als in

nicht-neoplastischen Thymi (Nenninger, Schultz et al. 1998).

Im Gegensatz zu den gut untersuchten frühen Reifungsstadien der Thymozytenreifung

(Berg and Kang 2001; Hogquist 2001; MacDonald, Radtke et al. 2001) sind die

Mechanismen der späten Phase der Thymopoese weniger genau untersucht und

charakterisiert. Die entscheidende und äußerst wichtige Rolle der negativen Selektion

im Hinblick auf die Prävention von Autoimmunkrankheiten ist ein immunologisches

Paradigma welches anhand vieler wissenschaftlicher Modelle erörtert wurde (Laufer,

DeKoning et al. 1996; Laufer, Fan et al. 1999; Naquet, Naspetti et al. 1999; Rubin and

Kretz-Rommel 2001).

In Übereinstimmung mit einer Reihe von früheren Untersuchungen zur

Thymozytenreifung (Strobel, Helmreich et al. 2001; Strobel, Helmreich et al. 2002;

Strobel, Preisshofen et al. 2003) konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, dass

unmittelbar vor und nach dem Erwerb von CD27 ein wichtiger negativer

Selektionsprozess hinsichtlich der Entwicklung von reifen naiven CD4+ T-Zellen

stattfindet. CD27 ist ein glykosyliertes Typ-1 Membranprotein und gehört zu der

Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR) Superfamilie, zu der u.a. auch Fas/APO-1

(CD95) und CD40 zählen. Der Ligand von CD27 auf dem Thymusepithel ist CD70.

Diese Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle in Zellwachstum und differenzierung,

aber auch bei der Apoptose (Sugita, Hirose et al. 1992; Hintzen, Lens et al. 1995). Die

Aktivierung von CD27 z.B. durch Phytohämagglutinin oder agonistische anti-CD3

Antikörper resultiert in der Proliferation von T-Zellen. Daneben besitzt jedoch auch

CD27 pro-apoptotische Wirkungen (Prasad, Ao et al. 1997).

49

5.3 Diskussion der Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der Farbdifferenz-

Methode zur Apoptose

MG(-) und MG(+) Thymome sind gute Anschauungsmodelle für die Erklärung des

Mechanismus, der einerseits den Ablauf der Thymopoese reguliert, und andererseits die

Autoimmunität und damit das Aufreten der paraneoplastischen MG unter normalen

Bedingungen verhindert. Auch unter Berücksichtigung der jeweils limitierten

Aussagekraft beider Methoden, Analyse in situ und per FACS, kamen beide

Untersuchungsabschnitte zu einem vergleichbaren Ergebnis. Es konnte gezeigt werden,

dass die Apoptoserate bei MG(-) Thymomen signifikant über der in MG(+) Thymomen

liegt. In Übereinstimmung mit einer schon früher beschriebenen ineffizienten

Thymopoiese (Strobel, Helmreich et al. 2001) lag die Apoptoserate bei allen

Thymomen über der von Kontrollthymi. Die FACS-Daten zur Stadien-bezogenen

Apoptose korrelierten sehr gut mit der Beobachtung, dass speziell die späten

Reifungsstadien (gekennzeichnet durch den Erwerb von CD27) in Thymomen reduziert

waren.

In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen zur Anzahl reifer naiver T-Zellen im

peripheren Blut von MG(+) und MG(-) Thymompatienten darf also als gesichert gelten,

dass der Verlust terminaler Reifungsstadien in MG(-) Thymomen auf eine gesteigerte

T-Zell-Apoptose im Tumor und nicht auf eine Schrankenstörung mit Ausschwemmung

unreifer Vorstufen in das periphere Blut zurückzuführen ist. Nicht geklärt werden

konnte die Frage, ob dieser Verlust Ausdruck einer aktiven Deletion autoreaktiver T-

Zellen oder eines Neglectes durch Fehlen eines Überlebens- oder Reifungssignales

(z.B. auch CD27) war. Die Klärung dieser interessanten Frage in zukünftigen

Untersuchungen könnte zu genaueren Rückschlüssen über die noch weithin ungeklärten

Toleranzmechnismen der terminalen T-Zell-Reifung in einem humanen System führen.

Demzufolge sind weitere Untersuchungen hinsichtlich der Thymozyten in terminalen

Reifungstadien notwendig, um eine weitere Aufklärung bezüglich des Auftretens von

Myasthenia Gravis bei Thymomen zu ermöglichen.

50

6 Zusammenfassung

Die Myasthenia gravis (MG) ist eine der am besten untersuchten

Autoimmunerkrankungen des Menschen. Bei etwa 10 % der Patienten mit MG liegt

dem Auftreten der Erkrankung ein Thymom zugrunde. Die Thymozytenreifung in

Thymomen ist quantitativ in dem Sinne gestört, dass anteilig mehr unreife Stadien und

weniger reife CD4+ T-Zellen gebildet werden als im Normalthymus, jedoch sind in

MG-assoziierten Thymomen alle Reifungsstadien der T-Zellentwicklung nachweisbar.

Aus früheren Untersuchungen war bekannt, dass Thymome ohne MG einen Defekt der

terminalen Reifung von CD4+ Thymozyten aufweisen. In der hier vorliegenden Arbeit

sollte geklärt werden, ob MG(+) und MG(-) Thymome einen Unterschied bezüglich der

Apoptoserate intratumoröser T-Zellen aufweisen.

Die Untersuchung ergab, dass Thymozyten in MG(-) Thymomen eine signifikant

höhere Apoptoserate aufweisen als in MG(+) Thymomen. In guter Übereinstimmung

mit Messungen zur intratumorösen T-Zell-Reifung fanden sich im FACS-analytischen

Teil der Studie die größten Unterschiede bezüglich der Apoptoserate in den CD27+

CD45RA- und CD27+CD45RA+ terminalen Reifungsstadien. Ob der Verlust der

terminalen Reifungsstadien in MG(-) Thymomen Ausdruck eines gesteigerten

protektiven Mechanismus im Sinne einer vermehrten negativen Selektion oder

Ausdruck eines Reifungsdefektes durch Verlust eines Überlebenssignals war, konnte im

Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Ein möglicher Kandidat für ein solches

fehlendes Überlebenssignal ist der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor CD27

beziehungsweise sein Ligand CD70.

51

7 Anhang

7.1 Eigene Publikationen

Teile dieser Arbeit wurden publiziert in:

Pathomechanisms of paraneoplastic myasthenia gravis.

Ströbel P, Preisshofen T, Helmreich M, Müller-Hermelink HK, Marx A., Clin

Dev Immunol. 2003 Mar;10(1):7-12.

Weiterhin wurden Teile der hier verwendeten Methoden auch bei einer anderen

Fragestellung angewendet und publiziert:

Apoptosis and proliferation in lungs of ventilated and oxygen-

treated preterm infants

May M, Strobel P, Preisshofen T, Seidenspinner S, Marx A, Speer CP. Eur

Respir J. 2004 Jan;23(1):113-21.

52

7.2 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 : Reifungstadien der Thymozyten 3

Abbildung 2 : Prinzip der TUNEL-Färbung 15

Abbildung 3 : Contour blot einer CD45 (FL-2) und CD8 (FL-3) Färbung 19

Abbildung 4 : Histogramm bei Aufnahme der Apoptosefärbung mit TUNEL 20

Abbildung 5 : Darstellung der Apoptoseauswertung anhand von Histogrammen 20

Abbildung 6 : Dotplot-Darstellungen von Thymozyten 26

Abbildung 7 : Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Größe und

Granularität der Thymozyten 28

Abbildung 8 :Vergleich der Reifungsdaten von Thymozyten bei Normalthymus

sowie WHO Typ AB und B Thymomen 30

Abbildung 9: Oberflächenantigene der Lymphozyten in verschiedenen Stadien 31

Abbildung 10: Graphische Darstellung der TUNEL-Befunde bei allen

untersuchten MG(+) und MG(-) Thymomen im Vergleich zu nicht-

neoplastischen Thymi mit Entzündung (Thymitis) 34

Abbildung 11: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen

Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ B Thymomen 35

Abbildung 12: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen

Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ AB Thymomen 36

Abbildung 13: Thymitis-Paraffinschnitt, H.E-Färbung mit TUNEL-Färbung 38

Abbildung 14: Vergleich von TUNEL-Färbungen an Paraffinschnitten von

Thymitis und Thymomen mit und ohne Masthenia Gravis (MG) 40

Abbildung 15: TUNEL-Färbung an Paraffinschnitt, No.28804, Thymom MG(-) 43

Abbildung 16: DAPI-Immunfluoreszenzfärbungen und TUNEL-Färbungen eines

Paraffinschnittes, Thymom mit Myasthenia Gravis (MG+) 42

53

7.3 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Thymusveränderungen bei Myasthenia Gravis (MG) 4

Tabelle 2: WHO-Klassifikation und Einteilung der Thymome nach

WHO 2004 (Vincent 2002) 5

Tabelle 3: Klinische Daten der untersuchten Thymom- und Thymitispatienten

mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 7

Tabelle 4: Verwendete Arbeitsgeräte 8

Tabelle 5: Verwendete Lösungen 9

Tabelle 6: Verwendete Antikörper und Enzyme 10

Tabelle 7:Versuchsprotokoll für TUNEL-Apoptosemessung 17

Tabelle 8: Untersuchte Patientendaten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 25

Tabelle 9:Auswertung der durchflusszytometrisch bestimmten

Apoptoserate mittels TUNEL-Färbung 33

54

7.4 Literaturnachweis

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Danksagung

Diese Arbeit entstand am Institut für Pathologie der Universität Würzburg unter der

Leitung von Herrn Professor Dr. H.-K. Müller-Hermelink. Ihm sei für die Bereitstellung

der technischen Hilfsmittel und des Arbeitsplatzes gedankt.

Des weiteren möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Professor Dr. A. Marx für die

wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit bedanken.

Mein ganz spezieller Dank gebührt meinem Betreuer Dr. Philipp Ströbel, der mir in

schwierigen Situationen immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mich in jeglicher

Hinsicht bei dem Zustandekommen dieser Promotion unterstützt hat.

Bei Frau Andrea Homburger möchte ich mich ganz herzlich für die Einarbeitung in die

große Welt der Durchflusszytometrie bedanken, sowie für die zahlreichen FACS-

Färbungen mit diversen Ausflügen nach Ulm bei Nichtfunktionieren des Zellsorters !

Außerdem möchte ich mich noch bei Herrn H. Harms für die nette Betreuung und die

Hilfestellungen bezüglich der Bilderfassung und Bildanalysen der histologischen

Präparate bedanken.

Allen Mitarbeitern des Pathologischen Institutes sei für die gute Zusammenarbeit

gedankt.

Zum Schluss möchte ich mich noch bei meiner Familie und meiner Frau für die

vielfältige Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit sowie beim Korrekturlesen

bedanken.

Lebenslauf

Persönliche DatenName : Tobias Robert Georg PreißhofenGeburtsdatum : 24.09.1976Geburtsort : Friedrichshafen

Ausbildung1996 : Abschluss: Allgemeine Fachhochschulreife1996 : Rettungshelferausbildung, Deutsches Rotes Kreuz Ravensburg1997 : Rettungssanitäter-Ausbildung, Rotes Kreuz Ravensburg

Hochschulausbildung05/1998 : Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Humanmedizin03/2000 : Ärztliche Vorprüfung03/2001 : Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung03/2003 : Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung06/2004 : Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung

Praktika06/2000 - 07/2000 : Orthopädie, Elisabethenkrankenhaus Ravensburg08/2001 - 09/2001 : Pathologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg03/2002 - 04/2002 : Pädiatrie, Kantonsspital Münsterlingen, Schweiz08/2002 - 09/2002 : Allgemeinmedizin, Dr. med. L. Preisshofen, Ravensburg04/2003 - 08/2003 : Innere Medizin, Kantonsspital Aarau, Schweiz08/2003 - 12/2003 : Chirurgie, Whangarei-Area-Hospital, Neuseeland12/2003 - 04/2004 : Orthopädie, Schulthess Klinik Zürich, Schweiz06/2004 - 07/2004: Erwerb der Zusatzbezeichnung Sportmedizin, Akademie Damp

seit 10/04 tätig als Assistenzarzt Abteilung Chirurgie des Krankenhauses 14Nothelfer,Weingarten

Promotion06/01-5/05 Apoptosemessung in verschiedenen Stadien der

Thymozytenentwicklung im menschlichen Thymus undThymomen an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg,unter der Leitung von Prof. Dr. A. Marx

PublikationenMay M., Strobel P., Preisshofen T., Seidenspinner S., Marx A., Speer CPApoptosis and proliferation in lungs of ventilated and oxygen-treated preterm infants.Eur. Respir. J. 2004 Jan; 23 (1):113-21

Strobel P., Preisshofen T., Helmreich M., Mueller-Hermelink HK., Marx A.Pathomechanism of paraneoplastik myasthenia gravisClin Dev Immunolog. 2003 March;10(1):7-12

Ravensburg, Mai 2005