Dissertation Matthias Junkers: "Künstliche Rezeptoren zur Erkennung der RGD-Sequenz"
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Künstliche Rezeptoren zur Erkennung der RGD‐Sequenz
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem
Fachbereich Chemie
der Philipps‐Universität Marburg
vorgelegt von
Matthias Junkers
aus Leverkusen
Marburg an der Lahn 2006
Vom Fachbereich Chemie der Philipps‐Universität Marburg als Dissertation
angenommen.
Erstgutachter: Prof. Dr. T. Schrader
Zweitgutachter: Prof. Dr. A. Geyer
Tag der mündlichen Prüfung: 2. März 2006
Meiner Familie
Aus dem Codex Buranus, ca. 1230, Bayerische Staatsbibliothek (Signatur: clm 4660/4660a)
O Fortuna velut luna statu variabilis, semper crescis aut decrescis; vita detestabilis nunc obdurat et tunc curat ludo mentis aciem, egestatem, potestatem dissolvit ut glaciem.
Sors immanis et inanis, rota tu volubilis, status malus, vana salus semper dissolubilis, obumbrata et velata michi quoque niteris; nunc per ludum dorsum nudum fero tui sceleris.
Sors salutis et virtutis michi nunc contraria, est affectus et defectus semper in angaria. Hac in hora sine mora corde pulsum tangite; quod per sortem sternit fortem, mecum omnes plangite!
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Problemstellung 3
3 Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
3.1 Integrine 6
3.1.1 Das Integrin αvβ3 im Komplex mit einem RGD‐Liganden 8
3.1.2 Liganden der Integrine 10
3.1.3 Ansätze zur Entwicklung von Therapeutika 13
3.2 Anionenrezeptoren auf Basis von Guanidinen 15
3.3 Rezeptoren für die Guanidiniumfunktion und Arginin
3.3.1 Biologische Systeme 18
3.3.2 Künstliche Rezeptoren 21
4 Durchführung und Ergebnisse
4.1 Beiträge zu einem neuen, künstlichen RGD‐Rezeptor analog RENSING 26
4.2 Ein neues Trisphosphonat zur Argininerkennung
4.2.1 Synthese 30
4.2.2 Bindungsstudien 33
4.2.3 Verlängerung des Trisphosphonsäureesters 13 36
4.3 Eine Serie von künstlichen RGD‐Rezeptoren auf Basis von benzylischen
Bisphosphonaten
4.3.1 Synthese 37
4.3.2 Bindungsstudien 41
4.3.3 Kraftfeldrechnungen 44
4.4 Rezeptoren für die RGD‐Sequenz aus Bisphosphonat und
Guanidiniumcarbonylpyrrol
4.4.1 Synthese von BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44 47
4.4.1.1 Untersuchung auf Selbstassoziation 48
4.4.1.2 Bindungsstudien 50
4.4.1.3 Untersuchung auf Sequenzselektivitäten 52
4.4.2 BP2‐GlyPyrGua+ 47 54
4.4.3 BP2‐ASER‐PyrGua+ 49 57
4.5 Molekulare Pinzetten
4.5.1 Das Grundgerüst 59
4.5.2 Entwicklung von Synthesemethoden zur einseitigen
Funktionalisierung der molekularen Pinzette 60
4.5.3 Synthese der ersten, asymmetrisch funktionalisierten
Phosphonatpinzetten 65
4.5.4 Bindungsuntersuchung an der Glycinpinzette 67 69
4.5.5 Bindungsuntersuchungen an der Pinzette 68 72
5 Zusammenfassung 75
6 Ausblick 80
7 Experimenteller Teil
7.1 Materialien und Methoden 86
7.2 Synthesen
7.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 89
7.2.2 Synthesen zu Kapitel 4.2 (Trisphosphonat) 92
7.2.3 Synthese von 4b 101
7.2.4 Synthesen zu Kapitel 4.3 (Modellrezeptoren) 102
7.2.5 Synthesen zu Kapitel 4.4 (Bisphosphonatrezeptoren) 121
7.2.6 Synthesen zu Kapitel 4.5 (Molekulare Pinzetten) 131
7.3 Titrationen
7.3.1 Theoretische Grundlagen zu NMR‐Titrationen 156
7.3.2 Praktische Durchführung und Tabellen 158
7.3.3 Mikrokalorimetrische Verdünnungstitrationen 175
8 Abkürzungsverzeichnis 176
9 Literaturverzeichnis 179
Danksagung
Einleitung
1
1 Einleitung
Die supramolekulare Chemie befaßt sich mit nichtkovalenten
Assoziaten von Molekülen zu übergeordneten Strukturen.
Natürliches Vorbild für solche supramolekularen Strukturen sind
die Wechselwirkungen von Enzymen mit ihren Substraten.
Bereits 1894 formulierte EMIL FISCHER in seiner Schrift zum
„Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme“: „daß
nur bei ähnlichem geometrischem Bau diejenige Annäherung der
Moleküle stattfinden kann, welche zur Auslösung des
chemischen Vorganges erforderlich ist. Um ein Bild zu gebrauchen, will ich sagen,
dass Enzym und Glucosid wie Schloss und Schlüssel zu einander passen müssen, um
eine chemische Wirkung aufeinander ausüben zu können.“[1] Auch über einhundert
Jahre später behält dieses Bild von Schloß und Schlüssel noch weitestgehend
Gültigkeit, wurde höchstens durch etwas präzisere Metaphern ersetzt wie „Hand
und Handschuh“. Der Handschuh ist im Gegensatz zu einem Schloß flexibel und
anpassungsfähig und öffnet seine Tasche erst, wenn die Hand hineinschlüpft. Dies
entspricht vielen Enzymen besser, die durch „induced fit“ erst bei Annäherung des
Substrates ihre Konformation anpassen und einen exakt ausgebildeten Hohlraum
bilden.[2]
Vor allem für seine Beiträge zur chemischen Synthese von Purinen und Zuckern,
aber eben auch für die frühe Erkenntnis der Bedeutung von supramolekularen
Wechselwirkungen zwischen Molekülen, wurde EMIL FISCHER 1902 als zweiter
Träger mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.
Dennoch dauerte es noch bis in die sechziger Jahre des vergangenen Jahrhunderts,
bevor die ersten synthetischen Systeme entwickelt wurden, die das Schlüssel‐Schloß‐
Modell aufgreifen und auf rein künstliche Verbindungen anwenden. CHARLES J.
PEDERSEN veröffentlichte 1967 in einer einzelnen Zuschrift nicht weniger als 33
zyklische Polyether, die er Kronenether taufte. Die verschiedenen Kronenether sind
in der Lage, stabile Komplexe mit Alkalimetallkationen über elektrostatische
Emil Hermann Fischer
Einleitung
2
Anziehung auszubilden. Aufgrund ihres eigenen räumlichen Aufbaus können sie
zwischen verschieden großen Kationen differenzieren.[3]
Nur zwei Jahre später folgte JEAN‐MARIE LEHN mit der Entwicklung von
Kronenether‐ähnlichen, bizyklischen Strukturen.[4, 5] Diese, von ihm Kryptanden
genannte Rezeptoren, sind den Kronenethern in ihrer Selektivität gegenüber
Metallkationen überlegen. JEAN‐MARIE LEHN und DONALD J. CRAM übertrafen sich in
der folgenden Zeit immer wieder in der Präsentation neuer, künstlicher, organischer
Strukturen mit Hohlräumen und Spalten, die niedermolekulare Gäste anhand ihrer
spezifischen Geometrie erkennen und selektiv binden.[6] Darunter befindet sich z.B.
im Jahr 1984 auch ein frühes Beispiel von LEHN für einen künstlichen Rezeptor für
den biologisch hochrelevanten Botenstoff Acetylcholin.[7] Für ihre Pionierarbeiten
wurden PEDERSEN, LEHN und CRAM 1987 gemeinsam mit dem Nobelpreis für Chemie
geehrt. Sie ebneten den Weg für ein neues Arbeitsfeld der Chemie, für das Lehn den
Terminus „Supramolekulare Chemie“ prägte, während Cram den Begriff der „Wirt‐
Gast‐Chemie“ bevorzugte.
Die präparative organische Chemie besitzt nun Werkzeuge, um die Natur immer
besser nachzuahmen. Der Bogen kann hier wieder zurück zu EMIL FISCHER
geschlagen werden: In seiner Festrede zur Annahme des Nobelpreises 1902 forderte
er, die Chemie solle sich mehr den Problemen der Biologie zuwenden. Er „sah den
Tag voraus, an dem die Chemie nicht nur natürliche Enzyme intensiv als Agentien
nutzt, sondern auch künstliche Fermente für eigene Zwecke herstellen würde.“ Für
diese Prophezeiung gibt es heute unzählige Beispiele. Auch die vorliegende Arbeit
widmet sich, in dieser Tradition, der Synthese und Untersuchung von künstlichen
Rezeptoren für eine biologisch hochrelevante Zielstruktur.
Im Übrigen sei noch erwähnt, daß EMIL FISCHER in der selben Rede auch den
Zeitpunkt nahen sah, an dem Kaffeebohnen obsolet werden und Chemiker eine gute
Tasse Kaffee vollsynthetisch und kostengünstig herstellen können. Dieser Tag steht
wohl immer noch aus.[8]
Problemstellung
3
2 Problemstellung
Die membranständigen Integrine sind Schlüsselproteine bei der Zell‐Zell‐ und Zell‐
Matrix‐Adhäsion.[9] Sie induzieren Signaltransduktion durch die Zellmembran und
spielen eine entscheidende Rolle bei vielen biologischen Prozessen wie der
Regulation der Zellmigration, Zellproliferation, Angiogenese (Wachstum von
kapillaren Blutgefäßen), Apoptose (natürlicher Zelltod) und Hämostase
(Blutgerinnung).[10, 11] Entscheidend für die Funktion der Integrine ist die Interaktion
mit löslichen Proteinen der extrazellulären Matrix, die als Liganden die Aktivität der
Integrine regulieren.[12] Das bedeutendste Erkennungsmotiv, welches die Bindung
eines solchen Liganden an das jeweilige Integrin vermittelt, besteht in der
Aminosäuresequenz Arginin‐Glycin‐Aspartat (RGD), die der Ligand in einer dem
Lösemittel zugewandten Schleife trägt (s. Tabelle 1).[13]
RGD‐Protein Funktion
Fibrinogen Blutplättchenkoagulation
Fibronectin Zell‐Matrix‐Adhäsion
Osteopontin Knochenwachstum
Thrombospondin Blutplättchenkoagulation
Vitronectin Zell‐Matrix‐Adhäsion
Wachstumsfaktoren Zelldifferentiation und Angiogenese
Tabelle 1: Ausgewählte Proteine, die das RGD‐Bindungsmotiv enthalten, und die von ihnen hauptsächlich regulierte Funktion.
Fehlfunktionen in den natürlichen integrinabhängigen Steuerungsvorgängen führen
zu schwerwiegenden pathologischen Prozessen. Resultierende Krankheitsbilder sind
Thrombosen, Infarkte, Arthritis, chronische Entzündungen, Tumormetastasierungen
und Viruserkrankungen (Gelbfieber, Maul‐ und Klauenseuche, HIV).
Problemstellung
4
Kleine, rational entworfene synthetische Rezeptoren, die gezielt bestimmte
Integrin/RGD‐Protein ‐ Wechselwirkungen inhibieren, stellen daher einen Ansatz zur
Entwicklung neuartiger Therapeutika dar.
Dazu wurden in der Vergangenheit bereits zahlreiche peptidische und
nichtpeptidische RGD‐Mimetika hergestellt und getestet.[14] Viele sind bereits bis in
klinische Studien vorgedrungen und patentrechtlich geschützt. Die RGD‐Mimetika
ahmen möglichst spezifisch ein RGD‐Protein nach und binden mit hoher Affinität an
die Bindungsstelle des zugehörigen Integrins, um dessen Aktivität zu inhibieren. Der
umgekehrte, viel beschwerlicher scheinende Ansatz, das RGD‐Protein durch einen
künstlichen Rezeptor zu verkappen und so seine Bindung an sein Integrin zu
verhindern, ist dagegen in der Literatur kaum beschrieben. Dennoch kann dies in
bestimmten Fällen sogar der vielversprechendere Weg sein. Zwar inhibieren RGD‐
Mimetika passende Integrine erfolgreich, aktivieren gleichzeitig aber wie die
entsprechenden natürlichen Liganden deren Signaltransduktionswege. Ein Abfangen
des natürlichen Liganden umgeht dieses Problem.[15]
HNN
NNH
O
H O
H O
HNO
O
H2N NH2
R ---- G ---- D
Abb. 1: Tripeptidsequenz Arginin‐Glycin‐Aspartat (RGD) und schematischer Aufbau eines maßgeschneiderten Rezeptors Die RGD‐Sequenz bietet zwei Haftpunkte für einen möglichen Rezeptor an: die
kationische Guanidiniumfunktion der Argininseitenkette und das negativ geladene
Carboxylat des Aspartat. Ein modularer Aufbau des Rezeptors aus einem Baustein
zur Argininbindung und einem zur Carbonsäurebindung, die beide über einen
variablen Spacer verbunden sind, liegt daher nahe. Die gemeinsame Bindung der
beiden Module an das Zielmolekül sollte die Gesamtbindungsstärke gegenüber den
Bindungsstärken der einzelnen Bausteine wesentlich verstärken. Der Spacer hat
Problemstellung
5
dabei in erster Linie die Aufgabe, die beiden Module möglichst exakt
vorzuorientieren. Es ist auch denkbar, daß dieser zusätzliche Wasserstoffbrücken
zum Rückgrat des RGD‐Peptides ausbildet und somit die Bindung weiter verstärkt.
In der Arbeitsgruppe SCHRADER wurden bereits geeignete Bausteine zur
Komplexierung von basischen Aminosäuren wie Arginin oder auch Lysin auf Basis
von anionischen Bisphosphonaten entwickelt. Zur Carboxylaterkennung bieten sich
vor allem die in der Gruppe SCHMUCK entworfenen Guanidiniumcarbonylpyrrole an.
Die Vereinigung dieser beiden Konzepte und Anwendung auf die Entwicklung von
künstlichen Rezeptoren in polaren Lösungsmitteln für die RGD‐Sequenz war Ziel
der vorliegenden Arbeit.
In den folgenden Kapiteln dieser Arbeit wird nun zunächst der biologische
Hintergrund der Integrin‐RGD‐Wechselwirkung weitergehend ausgeführt, gefolgt
von einer näheren Betrachtung des möglichen Aufbaus der einzelnen
Rezeptormodule, einem Überblick über den aktuellen Wissensstand und bereits
erfolgte Vorarbeiten in den beteiligten Gruppen. Anschließend wird die tatsächliche
Synthese der Bausteine und Rezeptoren dargestellt und die Ergebnisse der
Bindungsstudien mit den hergestellten Rezeptoren diskutiert.
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
6
3.1 Integrine
Multizelluläre Organismen sind auf einen stabilen Verbund ihrer Zellen und der sie
umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) angewiesen. Die ECM besteht aus von
den Zellen sezernierten, immobilen Makromolekülen, im wesentlichen Proteinen
und Polysacchariden.[16] Adhäsive Kontakte von Zellen untereinander und Zellen mit
der ECM steuern das Zellverhalten und die Zellentwicklung. Sie spielen eine
entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Prozessen wie Zellmigration,
Zellproliferation, Angiogenese (Wachstum von kapillaren Blutgefäßen), Apoptose
(natürlicher Zelltod), Embryogenese, Hämostase (Blutgerinnung) und
Immunantwort. Aber auch für eine Reihe pathologischer Vorgänge sind sie
verantwortlich: tumorinduzierte Angiogenese, Tumormetastasierung, Thrombosen,
Infarkte, Osteoporose, Retinopathie, Arthritis und chronische Entzündungen.[17-19]
Vermittelt werden adhäsive Zellkontakte durch in der Zellmembran verankerte
Adhäsionsproteine. Neben den Cadherinen, der Immunglobulin‐Superfamilie und
den Selektinen ist die Proteinfamilie der Integrine hier von besonderem Interesse.[20‐23]
Dabei handelt es sich um eine hochkonservierte Klasse membranständiger Proteine,
die sowohl in primitiven Organismen wie Korallen und Schwämmen auftritt als auch
in Säugern.[24] Integrine regulieren nicht nur Zell‐Zell‐ und Zell‐Matrixadhäsion,
sondern ermöglichen auch bidirektionale Signaltransduktion durch die
Zellmembran.[17, 25‐27] Bislang sind 24 verschiedene Integrine gefunden worden, die
heterodimer durch den nichkovalenten Zusammenschluß einer etwa 180 kDa großen
α‐Einheit und einer etwa 95 kDa großen β‐Einheit gebildet werden.
Beide Untereinheiten sind membranständige Glycoproteine mit einer großen
extrazellulären Domäne, einer Transmembranhelix und einer kleinen intrazellulären
Domäne. Die Kopfgruppe der α‐Einheit besteht aus einem siebenblättrigen Propeller,
dessen Blätter jeweils aus einem viersträngigen, antiparallelen Faltblatt gebildet
werden. Der zentrale Rest zwischen den α‐ und β‐Untereinheiten scheint das Arg261
der β‐Untereinheit zu sein, das sich in den β ‐Propeller der α‐Untereinheit einschiebt
und den Komplex durch π‐Kation‐Wechselwirkung stabilisiert.[28] Die jeweilige
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
7
Kombination aus einer der 18 verschiedenen α‐Einheiten und einer der 8 β‐Einheiten
moduliert die Ligandenspezifität des gebildeten Integrins. Während einige Integrine
selektiv nur einen einzigen Liganden binden, erlauben andere ein verhältnismäßig
breites Ligandenspektrum.[29] Fast die Hälfte aller bekannten Integrine ist dabei in
der Lage, Proteine anhand der kurzen Aminosäuresequenz Arginin‐Glycin‐Aspartat
(RGD) zu erkennen.[30] Dieses Tripeptid wurde 1984 von PIERSCHBACHER und
RUOSLAHTI als die minimale essentielle Adhäsionssequenz in Fibronectin
identifiziert. Sie zeigten, daß immobilisierte RGD‐Peptide analog zu ECM‐Proteinen
integrinvermittelte Zelladhäsion induzieren, während lösliche RGD‐Peptide
antagonistisch dazu adhärierte Zellen ablösen.[13]
α10α11
β2α1
α2
α4
α6
α7
α8
α9
β3
β5
β6
β8
αIIb
β4 β7 αE
αd
αL
αM
αXα3α5
αv
β1
1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 20040
100
200
300
400
500
600
700
Anz
ahl
Jahr
Anzahl jährliche Publikation zu RGD
Abb. 2: Aus 18 verschiedenen α‐ und 8 verschiedenen β‐Einheiten werden die 24 bisher bekannten Integrine nichkovalent als Heterodimer verknüpft. Blau markierte Kombinationen geben Integrine an, die durch RGD‐Peptide inhibiert werden können (links).[31] Die Anzahl der jährlichen Publikationen über RGD‐haltige Strukturen (rechts; 2005 bis September).[32]
Daher ist diese Tripeptidsequenz eines der bedeutendsten natürlichen
Erkennungsmotive, das Schlüsselfunktionen in den oben genannten physiologischen
und pathologischen Prozessen ausübt. Das ubiquitäre Vorkommen der RGD‐
bindenden Integrine nutzen auch eine Reihe von Viren wie z.B. das Gelbfiebervirus,
HIV (human immunodeficiency virus) oder das MKS‐Virus (Maul‐ und
Klauenseuche) als Pforte zur Wirtszelle.[33‐35] Sie bieten selbst das RGD‐Motiv an und
assoziieren darüber an Integrine in der Wirtszellmembran. Bakterien wie E. Coli oder
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
8
Streptokokken bewegen sich mit Hilfe von RGD‐Proteinen im Wirtsorganismus.[36]
Auch in noch weiteren xenogenen Stoffen finden sich die RGD‐Sequenz tragende
Strukturen: In Schlangengift oder im Speichel von Blutegel und Zecke hemmen
sogenannte Disintegrine die Blutgerinnung.[12, 37] Aufgrund der enormen Bedeutung
dieses Erkennungsmotivs wird auf dem Gebiet der Integrin/RGD‐Wechselwirkung
seit rund 20 Jahren äußerst intensiv geforscht. Dies ist leicht ersichtlich anhand der
mittlerweile insgesamt weit über 7000 Publikationen mit einer kontinuierlich
steigenden Zahl pro Jahr.[32]
3.1.1 Das Integrin αvβ3 im Komplex mit einem RGD‐Liganden
2001 gelang der Gruppe ARNAOUT an der Harvard Medical School erstmals die
Aufnahme der Kristallstruktur eines Integrins, und zwar des extrazellulären
Segments von αvβ3.[38] Im Jahr darauf folgte in der selben Gruppe die zugehörige
Kristallstrukturaufklärung des αvβ3‐Segmentes im Komplex mit einem zyklischen,
künstlichen RGD‐Liganden.[28, 39] Zusammen mit früheren, elektronen‐
mikroskopischen Aufnahmen läßt sich nun genau analysieren, wie der natürliche
Rezeptor die Tripeptidsequenz bindet und welche Folgen die Ligandenbindung auf
Struktur und Funktion des Integrins hat.[40, 41]
Abb. 3: Die RGD‐Integrin‐Bindungsstelle im Komplex mit dem zyklischen Peptid cyclo(RGDf[NMe]V); αv‐Domäne in blau, β3‐Domäne in rot, Ligand in gelb, zusätzlich 3 Mn2+‐Kationen (violett, blau und grau); Oberflächendarstellung des Integrins (links), Stäbchenmodell von Integrin und Ligand (rechts). Wasserstoffbrücken und Salzbrücken zwischen dem Protein und dem Liganden bzw. den Metallkationen sind durch gepunktete Linien dargestellt.[39]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
9
Die Bindungstasche für den RGD‐Liganden liegt in der Kopfgruppe des Integrins, in
einer Spalte zwischen dem β‐Propeller und der βA‐Domäne. Alle drei Aminosäuren
des Erkennungsmotivs haben intensiven Kontakt zum Rezeptor. Die
Argininseitenkette des Liganden steckt in einer aus Schleifen zwischen den
Propellerblättern gebildeten Furche. Sie wird von einer bidentaten Salzbrücke zu
einem Aspartat (Asp218) am Boden der Furche und einem Aspartat (Asp150) im
hinteren Teil an ihrem Platz gehalten. Die hydrophobe Alkylkette des Arginins wird
von einem Tyrosin (Tyr178) und einem Alanin (Ala215) an der Nahtstelle zwischen der
α‐ und β‐Einheit des Integrins flankiert. Der obere Teil des Arginins bleibt dem
Lösungsmittel zugänglich. Das in der Mitte des Liganden sitzende Glycin geht enge
hydrophobe Kontakte mit αV ein. Der kritischste Kontakt besteht hier zur
Carbonylgruppe von Arg216. Der enge, dem Glycin zustehende Raum macht hier
einen großen Teil der Ligandenspezifität der Integrine deutlich. Mutation des Glycin
gegen Alanin in natürlichen Liganden, bzw. Austausch in dem verwendeten
zyklischen Peptid, verhindert die Bindung des RGD‐Liganden weitestgehend. Die
zusätzliche Methylgruppe des Alanins besitzt bereits einen zu großen
Raumanspruch.[42]
Die Aspartatseitenkette des Liganden taucht im Gegensatz zu der des Arginins
vollständig in eine Spalte ein und koordiniert dort an ein Mn2+‐Kation, an der sog.
MIDAS (Metal Ion Dependent Association Site). Zusätzlich bildet die
Aspartatcarboxylgruppe noch Wasserstoffbrücken zum Rückgrat des Rezeptors aus,
den Amidprotonen von Tyr122 und Asn215. Die Zugänglichkeit von MIDAS moduliert
die Aktivität des Integrins. Durch konformationelle Änderungen der Tertiär‐ und
Quartärstruktur des Integrins kann dieses zwischen einem hochaffinen und
niedrigaffinen Zustand durch Signale aus der Zelle heraus geschaltet werden. Im
niedrigaffinen Zustand ist die MIDAS für Liganden nicht erreichbar.
Umgekehrt bewirkt aber auch die Bindung eines Liganden weitere konformationelle
Änderungen des Integrins, die nun wiederum Signaltransduktionswege von außen
in die Zelle hinein aktivieren.
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
10
Die übrigen beiden Aminosäuren des ligierten zyklischen Peptids haben abgesehen
von einer π‐Stapel‐Wechselwirkung des D‐Phe mit Tyr122 keinen Kontakt zum
Integrin. Dies zeigt, daß tatsächlich nur die Tripeptidsequenz RGD für die Bindung
notwendig ist. Der Ligand muß diese lediglich an seiner Oberfläche in einer Schleife
präsentieren.
3.1.2 Liganden der Integrine
In zahlreichen natürlichen Liganden der Integrine wurde die RGD‐Sequenz
nachgewiesen (z. B. Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, von Willebrand Faktor,
Collagen, Laminin, Osteopontin, Tenascin und Thrombospondin). Teilweise ist sie
hier nicht direkt an der Bindung an den Rezeptor beteiligt, sondern andere
Aminosäuresequenzen im Liganden stellen die Hauptbindungsstellen dar. Aber
auch in den Fällen, in denen tatsächlich die RGD‐Sequenz das wesentliche
Bindungsmotiv ist, müssen noch andere Faktoren hinzugezogen werden, um die
Selektivität der Integrin‐Ligand‐Bindung zu verstehen. Selektivität kann zustande
kommen, wenn die RGD‐Sequenz bei einem Integrin‐Ligand‐Paar nicht die einzige
Bindungsstelle des Integrins ist, sondern gleichzeitig noch eine zweite Sequenz
erkannt wird. Die kooperative Bindung zweier Erkennungsmotive verstärkt in einer
Multipunktwechselwirkung die Ligandbindung wesentlich und steigert die
Selektivität gegenüber Liganden, die nur eines der Erkennungsmotive tragen,
deutlich. Mittlerweile wurden bereits zahlreiche andere Sequenzen in Liganden
identifiziert, die von bestimmten Integrinen unabhängig oder kooperativ zur RGD‐
Sequenz gebunden werden (s. Tabelle folgende Seite).
In einigen Fällen ist das Erkennungsmotiv auch um einige Aminosäuren verlängert.
So bindet das Integrin α5β1 hochspezifisch Fibronectin als Liganden, in dem die
längere RGDSP‐Sequenz erkannt wird. Auch mit Hilfe von kurzen, synthetischen
Peptiden konnte der Einfluß verlängerter Sequenzen gezeigt werden.[43, 44]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
11
Integrin Ligand Bindungsmotive Funktion
β1 α1 Natives Collagen, Laminin GFOGER Zell‐Matrix‐Adhäsion α2 Natives Collagen, Laminin,
Fibronectin RGD, DGEA, GFOGER
Zell‐Matrix‐Adhäsion, Knochenbau
α3 Natives Collagen, Laminin, Fibronectin
RGD Zell‐Matrix‐Adhäsion
α4 Fibronectin (Spleißdomäne), Invasin
EILDV, REDV
α5 Fibronectin (RGD‐Domäne) RGD, RGDSP Zellmigration/‐wachstum, T‐Zellproliferation
α6 Laminin α7 Laminin α8 Fibronectin, Vitronectin, Tenascin RGD Zell‐Matrix‐Adhäsion α9 Tenascin, Collagen, Laminin AEIDGIEL α10 Collagen Zell‐Matrix‐Adhäsion α11 Collagen Zell‐Matrix‐Adhäsion αv Vitronectin, Fibronectin,
Osteopontin RGD Knochenbau
β2 αL ICAM‐1, ICAM‐2, ICAM‐3 Zell‐Zell‐Adhäsion αM C3b, Fibrinogen, Faktor X, ICAM‐
1, VCAM‐1 KRLDGS, KQAGDV
Blutgerinnung, Leukozytenfunktion
αX С3b GPRP Zell‐Zell‐Adhäsion αD ICAM‐3, VCAM‐1 Zell‐Zell‐Adhäsion β3 αIIb Fibrinogen, Fibronectin, von
Willebrand Faktor, Vitronectin, Thrombospondin
RGD, KGD, KQAGDV (Fibrinogen)
Blutgerinnung
αv Vitronectin, denaturiertes Collagen, von Willebrand Faktor, Fibrinogen, Thrombospondin, Fibulin, Osteopontin, Sialoprotein
RGD, SNS, KRLDGS
Zelldifferentiation, Angiogenese, Knochenbau
β4 α6 Laminin, Desmin β5 αv Vitronectin, Fibronectin,
Osteopontin, Fibrinogen, Knochen‐Sialoprotein
RGD, RKKRRQRRR
Zelldifferentiation, Angiogenese, Knochenbau
β6 αv Fibronectin RGD, DLXXL Zell‐Matrix‐Adhäsion β7 α4 Fibronectin (Spleißdomäne),
VCAM‐1, MAdCAM‐1 EILDV, REDV, GNEH, LDT
Zell‐Zell‐Adhäsion
αE E‐Cadherin NRDKETKV Zell‐Zell‐Adhäsion β8 αv Vitronectin RGD
Tabelle 2: Die Integrine mit natürlichen Liganden und einigen für die Ligation notwendigen minimalen Bindungsmotiven. Liganden, in denen die RGD‐Sequenz nachgewiesen wurde, sind grau unterlegt. Einige physiologische Funktionen der Ligand‐Rezeptor‐Paare sind angegeben. (Die abgekürzten Liganden sind ICAM: intercellular adhesion molecule, VCAM: vascular cell adhesion molecule, MAdCAM: mucosal adressing cell adhesion molecule, C3b: Komplementfaktor 3b).[30, 45]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
12
Neben der Sequenz scheint nicht zuletzt die Konformation der RGD‐Sequenz im
jeweiligen Liganden eine entscheidende Rolle für die Selektivität der Integrine zu
spielen. Diese Abhängigkeit von Konformation und Integrinselektivität konnte von
KESSLER mit konformativ eingeschränkten zyklischen RGD‐Peptiden nachgewiesen
werden, die durch „spatial screening“ ermittelt wurden.[46‐49] Zyklische Pentapeptide
wie cyclo(RGDf[NMe]V) inhibieren selektiv die Bindung von Vitronectin an das
Integrin αvβ3. Dem gegenüber weisen zyklische Hexapeptide, die ein β‐turn‐
Mimetikum neben der RGD‐Sequenz enthalten, eine Selektivität für das Integrin
αIIbβ3 auf.[47] Konformationsanalysen solcher Peptide in wäßriger Lösung zeigen,
daß das Rückgrat der RGD‐Sequenz in den Pentapeptiden einen durch die relativ
bewegliche Peptidbindung des Glycins gebildeten Knick aufweist. Die Seitenketten
des Arginins und Aspartats rücken dadurch näher zueinander. Dagegen nehmen die
Hexapeptide eine weitgehend gestreckte Vorzugskonformation des RGD‐Rückgrats
ein. Die oben bereits beschriebene Kristallstruktur des Komplexes von
cyclo(RGDf[NMe]V) mit dem Integrin αvβ3 bestätigt die in freier Lösung ermittelte
Konformation des Liganden für die kondensierte Phase.
Abb. 4: Fünf verschiedene Klassen von zyklischen Peptiden sind mit der darin vorliegenden RGD‐Konformation dargestellt und dem Integrin, das von dem Peptid inhibiert wird. Die Pfeile deuten die Blickrichtung auf die jeweilige Kante des Peptidringes an. Die Kohlenstoffatome des Peptidrückgrats sind durch eine Linie verbunden, um ihre Anordnung zu verdeutlichen. Die Arginin‐ und Aspartatseitenkette sind vollständig in ihrer anti‐Konformation dargestellt zur Verdeutlichung des Knicks im Rückgrat (links).[50] Vier Beispiele aus Kristallstrukturen für die Konformation der RGD‐Sequenz (rechts; im Uhrzeigersinn von l.o.: Fibronectin, Thrombospondin, cyclo(RGDf[NMe]V), Vitronectin). [51]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
13
3.1.3 Ansätze zur Entwicklung von Therapeutika
Aufgrund der zahlreichen schwerwiegenden pathogenen Vorgänge, die durch
Fehlsteuerungen in Integrin‐Ligand‐Wechselwirkungen ausgelöst werden, wurde in
der Vergangenheit äußerst intensiv nach wirksamen Inhibitoren als Therapeutika
gesucht. Mittlerweile befinden sich eine ganze Reihe von Integrinantagonisten in
verschiedenen klinischen Phasen des Zulassungsverfahrens oder sind sogar bereits
zugelassen (s. Tabelle 3).
Therapeutikum Hersteller Indikation Integrin Status Integrilin (Eptifibatid, Cycloheptapeptid)
GlaxoSmithKline Myokardinfarkt, Herzoperationen
αIIbβ3 zugelassen
Reopro Abciximab (monoklonaler Antikörper)
Eli Lilly Ischämische kardio‐vaskuläre Erkrankungen
αIIbβ3 αvβ3
zugelassen
Lamifiban/Sibrafiban (nichtpeptidisch)
F. Hoffmann – La Roche
Myokardinfarkt, instabile Angina
αIIbβ3 Phase III
BIO1211 (LDV‐haltiger Ligand)
Biogen/ Merck & Co
Asthma, Lungenentzündung
α4β1 Phase I
Cilengitide, cyclo(RGDf[NMe]V)
E. Merck KGaA Krebs, Thrombose αvβ3 Phase II
Endostatin (Disintegrin)
Alchemgen Krebs αvβ3 Phase II
SB‐265123 (Peptidmimetikum)
SmithKline Beecham Pharmaceuticals
Osteoporose αvβ3, αvβ5
vorklinisch
Tabelle 3: Auswahl einiger Integrinantagonisten, die als Therapeutika eingesetzt oder getestet werden.
Interessanterweise beschränken sich dabei fast alle in der Literatur beschriebenen
Ansätze darauf, bestimmte Integrine durch peptidische und nichtpeptidische RGD‐
Analoga bzw. ‐Mimetika abzusättigen und ihre Adhäsion zu inhibieren.[52, 53] Der
umgekehrte Ansatz, spezifische, synthetische Rezeptoren für die RGD‐Sequenz
einzusetzen, um dem jeweiligen Integrin den natürlichen Liganden zu entziehen, ist
dagegen bisher praktisch nicht beschritten worden. Der nach wie vor einzige
synthetische Rezeptor für die RGD‐Sequenz wurde von SCHRADER beschrieben.[54]
Zugegebenermaßen scheint dieser Weg auch zunächst synthetisch und konzeptionell
anspruchsvoller zu sein. RGD‐Peptide sind im Vergleich deutlich leichter zugänglich
und selbst das einfache, lineare RGD‐Tripeptid zeigt als erste Leitstruktur bereits
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
14
eine inhibitorische Wirkung in vitro. Allerdings haben insbesondere Integrin
αIIbβ3 – Blocker teilweise nicht zufriedenstellende Ergebnisse in klinischen Studien
gezeigt. Der intrinsische aktivierende Effekt der Blocker wird als mögliche Ursache
hierfür vielfach diskutiert.[55‐57] Genauso wie die natürlichen Liganden induzieren
synthetische Blocker konformationelle Änderungen im Integrin und aktivieren so
Signaltransduktionswege der Integrine. Die direkte Adhäsion über das ligierte
Integrin wird zwar verhindert, aber sekundäre Stoffwechselwege, die wiederum zu
Aggregation führen, werden angeregt.[58] Auf diesem Hintergrund erscheint es
sinnvoller, künstliche RGD‐Rezeptoren einzusetzen, die ebenfalls die Integrin‐
Ligand‐Wechselwirkung inhibieren können und dabei das Integrin in seiner
Funktion nicht beeinflussen. Nach Identifizierung von Fibrinogenbindungsstellen im
Integrin αIIbβ3 konnte bereits gezeigt werden, daß aus dem Integrin abgeleitete
kleine Peptide wie EHIPA oder GAPL Fibrinogen binden und die
Thrombozytenaggregation inhibieren können.[59‐61] Daraufhin wurde vorgeschlagen,
in einer Komplementärmethode Peptidsequenzen zu bestimmen, die als künstliche
Rezeptoren für RGD‐Proteine eingesetzt werden können, was aber noch nicht zu
künstlichen RGD‐Rezeptoren geführt hat.[15, 62]
Für einen rationalen Ansatz zur Entwicklung von RGD‐Rezeptoren bietet die
Tripeptidsequenz im Wesentlichen zwei Angriffspunkte: die aliphatische Seitenkette
des Arginin mit der abschließenden, positiv geladenen Guanidiniumgruppe und das
negativ geladene Carboxylat in der Seitenkette des Aspartats. Ein künstlicher
Rezeptor sollte also aus einem Baustein zur Argininerkennung und einem weiteren
Baustein zur Carboxylaterkennung bestehen, die über einen geeigneten Spacer
miteinander verknüpft sind. Der Spacer kann gegebenenfalls weitere attraktive
Wechselwirkungen zum Rückgrat des Peptides ausbilden und sollte die beiden
Haftgruppen so vororientieren, daß möglichst bestimmte Konformationen der RGD‐
Sequenz bevorzugt gebunden werden.[54]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
15
3.2 Anionenrezeptoren auf Basis von Guanidinen
Sowohl in der Natur als auch in künstlichen Systemen hat sich die
Guanidiniumgruppe als eine äußerst vorteilhafte funktionelle Gruppe zur Bindung
von Oxoanionen wie Carboxylaten, Phosphaten, Sulfaten und Nitraten in
kompetitiven, polaren Lösungsmitteln erwiesen. Sie bildet starke nichtkovalente
Wechselwirkungen aus über Coulomb‐Anziehung der gegensinnigen Ladungen und
Wasserstoffbrücken zu anionischen Partnern. Die Aminosäure Arginin mit ihrer
Guanidiniumgruppe in der Seitenkette spielt eine Schlüsselrolle in vielen
biologischen Peptiden und Proteinen (z. B. Neuropeptid Y, Carboxypeptidase A,
Nukleasen, Histone).[63‐66]
In den späten 70er Jahren entwickelte LEHN einfache Makrozyklen mit jeweils zwei
bis drei Guanidiniumgruppen als Phosphatrezeptoren.[67] Einige Jahre später
verwendete SCHMIDTCHEN bizyklische Guanidiniumkationen zur Komplexierung
von Anionen in Chloroform.[68, 69]
N
CO2Et
NH HNHN
NH+ +HN
HN
OO
NH HN
NH2
N+N+
NH2
H
H
H
H
HN
NH
HN
NH
NH2+
NH2+
NH+
N
NH
R1 R2
Lehn Schmidtchen Hamilton Anslyn Abb. 5: Synthetische Anionenrezeptoren auf Basis von Guanidiniumkationen
1992 berichtete HAMILTON über ein Isophthaloyl‐verbrücktes Bisguanidiniumkation
als Rezeptor für Phosphodiester, welcher als Katalysator die Esterspaltung des
gebundenen Gastes 700fach beschleunigt (Ka = 4.6 ∙ 10‐4 M‐1 in Acetonitril).[70] Ein
ähnlicher Rezeptor mit zwei Guanidiniumfunktionen von ANSLYN bindet
Phosphodiester mit bis 700 M‐1 in wäßrigem DMSO (33/67).[71, 72]
Diese Beispiele zeigen bereits, daß die einfache Wechselwirkung eines isolierten
Guanidiniumkations mit einem Anion für eine Bindung in kompetitiver polarer
Lösung nicht ausreicht. Hier sind zusätzliche attraktive Wechselwirkungen bzw. die
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
16
Verwendung multipler Guanidiniumfunktionen notwendig. SCHMUCK führte auf
dieser Grundlage eine Klasse von Guanidiniumcarbonylpyrrolen als
Carboxylatrezeptoren mit neuen Eigenschaften ein.
NO O
N N N
N+R1
H
H
O-
OR2
H HH H H
Abb. 6: Von Schmuck entwickeltes Guanidiniumcarbonylpyrrol als Carboxylatrezeptor. Wasserstoffbrücken sind als gestrichelte Linien dargestellt Guanidine weisen pKS‐Werte im Bereich von 12‐14 auf, während die von SCHMUCK
verwendeten Acylguanidine bei 6‐8 liegen.[73] Dies beschränkt ihre Einsatzfähigkeit
auf das Arbeiten in sauren pH‐Bereichen. Dafür erhöht ihre stärkere Acidität
deutlich ihre Fähigkeit, Wasserstoffbrücken auszubilden. Zusätzliche
Wasserstoffbrücken von den Pyrrol‐ und Amid‐NHs steigern die Carboxylatbindung
wesentlich. Durch eine Wasserstoffbrücke zwischen der Guanidiniumgruppe und
der daneben liegenden Carbonylgruppe liegt der Rezeptor in einer vollständig
planaren Vorzugskonformation vor und ist damit optimal präorganisiert für die
Bindung ebenfalls planarer Anionen wie Carboxylaten. Der sterische Anspruch des
verwendeten Restes kann schließlich Selektivität zwischen verschiedenen
Carbonsäuren bewirken.
NH
O O
NH HN N
NH2+
H
HH2NOC
R
NH
O O
NH HN N
NH2+
R
H
HNH
O
HN N
NH2+
H
H
O
HN N
NH2+
H
HH2N NH2
NH2+
Abb. 7: Systematische Reihe von SCHMUCK zur Ermittlung der einzelnen Bindungsbeiträge der Guanidiniumcarbonylpyrrole Die einzelnen Beiträge der beteiligten Funktionen an der Bindung wurden in einer
systematischen Reihe mit N‐Acetylalanin als Substrat in 40 % Wasser/DMSO
untersucht.[74] Das einfache Guanidiniumkation zeigt unter diesen Bedingungen
keinerlei Bindung (Ka < 10 M‐1). Ein acideres Acetylguanidiniumkation weist bereits
eine schwache Bindung von Ka = 50 M‐1 auf. Eine weitere, durch das Pyrrol‐NH
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
17
angebotene Wasserstoffbrücke, erhöht die Assoziationskonstante um etwa den
Faktor drei (Ka = 130 M‐1). Mit wiederum einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke von
dem Amid‐NH erreicht man eine erneute fünffache Steigerung (Ka = 770 M‐1, R = Et).
Durch die Wahl einer geeigneten Seitengruppe am Pyrrol (Valin, R = iPr) kann die
Bindungskonstante bis zu Ka = 1630 M‐1 gesteigert werden.
Kürzlich wurde eine analoge Reihe getestet, in der der zentrale Pyrrolbaustein gegen
ein Pyridin substituiert wurde. Wegen der elektrostatischen Abstoßung des freien
Elektronenpaars des Pyridinstickstoffs und dem gebundenen Carboxylat sind die
Assoziationskonstanten jedoch signifikant niedriger (20‐460 M‐1).[75]
MeO O
NHZHN
ONH
HN
O
BocHN
HNn
n = 1-4
OH
ONH
HN
O
BocHN
HN
Abb. 8: Auf der Guanidiniumpyrrolcarbonsäure (links) basierende Argininanaloga (rechts)
Wird das Rezeptormotiv von SCHMUCK in die Seitenkette einer Aminosäure
inkorporiert, so erhält man argininanaloge synthetische Aminosäuren, die
kompatibel zu üblichen Peptidkupplungsmethoden sind und auch in
festphasengestützen Synthesen verwendet werden können.[76]
NH
O
O
NH
HNNH2
NH2+
Et Et
Et
NH
O
O
HN
NHH2N
NH2+
HN
O
O
HN
HN
NH2
+H2N
N
O
ON
NH2+
N
N
OH+N
N
NH
O R2N
O R1
O-
OH
H H HH
HH
Abb. 9: Ausbau des obigen Rezeptormotivs zum Dipeptidrezeptor (links) und Citratrezeptor (rechts) von SCHMUCK.
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
18
Wird dagegen das Rezeptormotiv um zusätzliche Bindungsstellen erweitert, so kann
die Bindungsstärke weiter erhöht und ein spezifischeres Substratspektrum erzielt
werden. Ein mit zwei weiteren Wasserstoffbrückendonoren in geeignetem Abstand
versehenes, dikationisches Guanidiniumcarbonylpyrrol komplexiert Dipeptide mit
freiem C‐Terminus mit Ka > 106 M‐1 in 40 % Wasser/DMSO und immer noch mit
Ka > 104 M‐1 in 90 % Wasser/DMSO (s. Abb.).[77] In einem weiteren Beispiel führt die
dreifache Verwendung des Rezeptormotivs in einem einzigen Molekül zu einem
effizienten Tricarboxylatrezeptor (s. Abb.), der Tricarbonsäuren wie Citrat in
wäßriger, gepufferter Lösung mit Ka = 8.6 ∙ 104 M‐1 bindet. Damit stellt er den
stärksten bis dato bekannten Citratrezeptor mit ausgezeichneter Selektivität dar, da
andere Anionen, vor allem auch Dianionen mit physiologischer Bedeutung wie
Malat oder Tartrat deutlich schwächer gebunden werden.[78, 79]
Mit diesen hervorragenden Ergebnissen sind Guanidiniumcarbonylpyrrole
prädestiniert als Bausteine zur Aspartaterkennung im größeren Kontext eines
künstlichen RGD‐Rezeptors.
3.3 Rezeptoren für die Guanidiniumfunktion und Arginin
3.3.1 Biologische Systeme
In der bereits beschriebenen Kristallstruktur des cyclo(RGDf[NMe]V) im Komplex
mit dem Integrin αvβ3 wird die Guanidiniumfunktion des Arginins im Liganden
von zwei Carboxylaten (von Asp150 und Asp218) im Protein chelatisiert und so durch
das kooperative Spiel von Wasserstoffbrücken und der elektrostatischen Anziehung
der gegensinnigen Ladungen gebunden (s. Abb. links).
An der Nahtstelle zwischen α‐ und β‐Untereinheit des Integrins findet sich ein
weiteres Beispiel für Argininbindung in der Natur, jedoch mit gänzlich anderem
Muster. Die beiden Untereinheiten berühren sich großflächig, durchdringen sich aber
praktisch nicht. Nur das Arginin261 der β‐Untereinheit taucht tief in einen von dem β‐
Propeller der α‐Untereinheit gebildeten Kanal ein. Dort wird es von zwei
konzentrischen Ringen aromatischer Aminosäuren des Propellers durch π‐Kation‐
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
19
Wechselwirkungen an seinem Platz gehalten (s. Abb. rechts). Somit erwächst dem
Arginin261 offensichtlich eine besondere Bedeutung bei dem nichtkovalenten
Zusammenhalt der beiden Untereinheiten des Integrins.
Abb. 10: 2 Beispiele für Argininbindung aus der Kristallstruktur des Integrins αvβ3 im Komplex mit dem zyklischen Peptid cyclo(RGDf[NMe]V) (PDB‐Code: 1L5G). Das Arginin des Liganden wird von zwei Aspartaten gebunden (links); das Arginin261 der β-Untereinheit schiebt sich in einen aus aroma-tischen Aminosäuren der α‐Untereinheit gebildeten Kanal (rechts). (Farben: α‐Einheit blau, β rot)
Vor allem von DOUGHERTY wurde die π‐Kation‐Wechselwirkung studiert, die für die
biologische Argininerkennung von immenser Bedeutung ist.[80] Die
Guanidiniumgruppe des Arginins wechselwirkt hierbei deutlich stärker mit
aromatischen Flächen als das einfachere Ammoniumkation des Lysins.
Proteindatenbankanalysen haben gezeigt, daß etwa 25 % aller Tryptophane in π‐
Kation‐Wechselwirkungen involviert sind.[80, 81]
Abb. 11: Kalottenmodell der π‐Kation‐Wechselwirkung zwischen Arginin77A und Tryptophan211A im Oligopeptidbindungsprotein. (links; ΔE = ‐8.4 kcal/mol)[80]. Alternierende kationische (Arg, Lys) und aromatische (Tyr, Phe, Trp) Aminosäurereste in der Kristallstruktur des humanen Wachstums‐hormons (hGHR, PDB‐Code: 3HHR, mittig).[82] Farblich hervorgehoben sind die elektrostatischen Potentialflächen der Seitenketten (blau: positiv, rot: negativ).[83] Parallele Stapelwechselwirkung zwischen dem Tyr970A und dem H‐Brücken‐Netz zwischen Arg918 und Asp969A in Xylanase 10B (rechts, PDB‐Code: 1GKK).[84]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
20
Mit den obigen Beispielen verwandte Bindungsmuster für Arginin wurden auch in
anderen Proteinen gefunden. Arginyl‐tRNA‐Synthetase z.B. benötigt für seine
katalytische Aktivität einen argininhaltigen Liganden, bindet aber auch bereits
monomeres L‐Arginin. Zwei in der Ebene des Guanidiniumkations liegende
Carboxylate, die hier von einem Aspartat und einem Glutamat bereitgestellt werden,
bilden Salz‐ und Wasserstoffbrücken zum Arginin aus. Zusätzlich kann ein Tyrosin
eine Wasserstoffbrücke akzeptieren, so daß alle fünf Guanidinium‐NHs an
Wasserstoffbrücken teilnehmen.[85]
Abb. 12: Argininbindungsmotiv in Arginyl‐tRNA‐Synthetase (links), schematische Darstellung für die Erkennung von Arginin (schwarze Linienstruktur) in Tar‐RNA durch Guanin26 und zwei Phosphate (mittig) und die von FRANKEL postulierte „Arginingabel“ (rechts).
FRANKEL fand Anfang der 90er Jahre ein weiteres natürliches Bindungsmotiv für
Arginin in Tar‐RNA, einem Teil der mRNA des HI‐Virus 1. Das
Transkriptionsaktivatorprotein Tat erkennt eine RNA‐Konformation, in der ein
einzelnes Arginin simultan von zwei Phosphaten gebunden wird. Diese Anordnung
wurde auch „Arginingabel“ genannt.[86] In späteren NMR‐Studien zeigte sich, daß
neben dieser Phosphatgabel auch Wasserstoffbrücken zu Basen (Guanin26) für die
Bindung bedeutsam sind.[87‐89]
In einer in vitro Selektionsreihe mit randomisierten RNA‐pools konnten von
FAMULOK Aptamere evolviert werden, die L‐Arginin enantioselektiv mit enormer
Bindungsstärke (Ka = 3∙106 M‐1) erkennen.[90] Allerdings ist das genaue Bindungsmotiv
für das Arginin hier noch unbekannt. Es kann aber angenommen werden, daß
NN
NH
H
H
R
HHO
O
O
O
P PO OO O
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
21
ebenfalls Phosphate und Wasserstoffbrückenakzeptorstellen in den Basen eine
entscheidende Rolle spielen.
3.3.2 Künstliche Rezeptoren
Künstliche Systeme zur selektiven Bindung von substituierten Guanidinen wie
Arginin in möglichst polaren Medien sind nach wie vor kaum vorhanden. Hier sind
zunächst lediglich drei herausragende Beispiele zu nennen.[91] DOUGHERTY stellte eine
Reihe von wasserlöslichen Cyclophanen vor, die vorwiegend durch π‐Kation‐
Wechselwirkungen positiv geladene Gäste zu binden vermögen. Ein in der
Peripherie mit acht Carboxylaten versehenes Cyclophan zeigte dabei eine hohe
Bindungsstärke und deutliche Selektivität für Argininamid (ΔG = ‐5.0 kcal/mol)
gegenüber Lysinamid (ΔG = ‐4.0 kcal/mol). Dipeptide aus Arginin und einer
weiteren basischen Aminosäure wiesen eine weiter gesteigerte Affinität auf
(ΔG = ‐5.8 kcal/mol).[92]
N NN N
O O- O- ON N+
NH R
H
H
H
H
Dougherty Bells ʺArgininkorkenʺ Eliseev
O
O-
O-
ON N+
NH R
H
H
H
H
Cs+-O2CCO2
-Cs+
OO
O
CO2-Cs+
Cs+-O2C
CO2-Cs+
+Cs-O2C+Cs-O2C
CO2-Cs+
O
Abb. 13: Drei herausragende Beispiele für künstliche Argininrezeptoren in polaren Medien. Mit einer perfekt vororientierten, starren Anordnung von Wasserstoffbrücken‐
bildenden Gruppen in annellierten sechsgliedrigen Ringen konnte BELL
Kationenrezeptoren mit optimaler Wirt‐Gast‐Komplementarität aufbauen. Die
Einführung zweier Carboxylate in das Rezeptorgerüst bewirkt auch hier
Wasserlöslichkeit und Bindungssteigerung durch die Bildung von Salzbrücken.
Arginin als Monokation wird selektiv gegenüber anderen Monokationen von dem
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
22
als „Arginin‐Korken“ bezeichneten Rezeptor mit Ka = 900 M‐1 erkannt. Eine zweite
positive Ladung in Diarginin potenziert die Bindung bis auf Ka = 2∙105 M‐1.[93]
Schließlich sei noch auf durch Licht schaltbare Argininrezeptoren von ELISEEV
hingewiesen und deren Anwendung in einem genetischen Algorithmus zur
Anreicherung des Photoisomers mit der höchsten Affinität zu Arginin, einem der
ersten Beispiele für eine evolutive Selektion in einem einfachen, rein chemischen
Prozeß.[94, 95] Später präsentierte HUNTER ein ähnliches photoisomerisierbares
Rezeptormodell für Arginin.[96]
SCHRADER stellte in einem biomimetischen Ansatz einfache, leicht zugängliche
Bisphosphonate als selektive Argininrezeptoren in polaren Lösungsmitteln vor, die
in ihrem Bindungsmuster ähnlich wie FRANKELS Arginingabel das
Guanidiniumkation pinzettenartig umgreifen und dabei noch ausreichend Raum für
Substituenten am Guanidin lassen.[97, 98] Weiterentwicklung dieses Grundmotivs
führte zu einem benzylischen Trisphosphonat, welches Arginin in Methanol mit
Ka = 3500 M‐1 durch ein Netzwerk von sechs Wasserstoffbrücken, π‐Kation‐
Wechselwirkung und die elektrostatische Anziehung der Ladungen bindet. Andere
natürliche, basische Aminosäuren zeigen in Methanol dagegen keine Affinität zu
diesem künstlichen Rezeptor.[99]
Me
P OO
O
N
N
H
POO
HO
HN
H H
Me
OCH2
CH3
HP
O
O
N
O
H
H NE H
O Abb. 14: Ein benzylisches Trisphosphonat von SCHRADER zur verbesserten Bindung von Arginin (links: Lewis‐Struktur; rechts: berechnete Struktur, bei der nur die Guanidiniumgruppe des Arginins zur besseren Veranschaulichung abgebildet ist))[99]
Das Trisphosphonat konnte, um eine m‐Aminobenzyleinheit verlängert, als erster
künstlicher Rezeptor erfolgreich Arginin im Kontext der RGD‐Sequenz erkennen.
Die Aniliniumfunktion mit ihrer positiven Ladung fungiert dabei als Einrastpunkt
für das Aspartat.[54]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
23
N
OHN
HH
HN
HN H
N
N N
N
N
H
OO
H O H
O
H
O
OO
OO
O
OP
H
HNH
OP
O
OO
Abb. 15: Der erste künstliche Rezeptor für die RGD‐Sequenz im Komplex mit KESSLERS Fibronectin‐Modell cyclo(RGDfV) als Lewis‐Struktur (links; Rezeptor in rot, das Peptid in blau) und als mit MacroModel 7.0 energieminimierte Struktur (rechts).[54] Der Rezeptor bindet das lineare RGD‐Tripeptid mit einer Bindungskonstante von
Ka = 1300 M‐1 und KESSLERS Fibronectin‐Modell cyclo(RGDfV) etwas schwächer mit
Ka = 700 M‐1. Da im Vergleich zu dem einfachen Trisphosphonat, welches gegen
cyclo(RGDfV) keinerlei Affinität in Wasser zeigt, die Bindung deutlich stärker ist,
kann man hier eine kooperative Bindung des Arginins und des Aspartats annehmen.
Allerdings fanden diese Bindungsexperimente in ungepufferter Lösung ohne
Fremdsalzzugabe statt, so daß zum einen noch keine Bindung unter physiologischen
Bedingungen erzielt wurde und zum anderen die Frage offen bleibt, inwiefern Säure‐
Base‐Gleichgewichte eine Rolle für die beobachteten Bindungen und Selektivitäten
spielen.
Phosphonate konnten von SCHRADER aber auch noch in anderen Systemen
erfolgreich zur Erkennung von Arginin eingesetzt werden. Ein am oberen Rand mit
vier Phosphonatgruppen versehenes Calix[4]aren bindet selektiv Arginin und konnte
in einem Membranmodell eingesetzt werden, um die Oberfläche basischer Proteine
zu erkennen.[100]
Multiplikation des einfachen benzylischen Bisphosphonatmotivs zu einem
wasserlöslichen Polymer verwandelt in einem weiteren Beispiel das in Wasser
praktisch nicht Arginin bindende, monomere Bisphosphonat durch multivalente
Wechselwirkungen in einen starken Proteinbinder. Sowohl in Lösung als auch
immobilisiert auf Glasoberflächen werden basische Proteine mit einer deutlichen
Selektivität für argininreiche Oberflächen fest gebunden.[101]
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
24
In weiteren Arbeiten von SCHRADER in Zusammenarbeit mit KLÄRNER wurde eine
wasserlösliche molekulare Pinzette mit zwei Phosphonatgruppen am zentralen
Hydrochinonbaustein hergestellt.[102] Als Gastprofil scheinen sich schlanke
Alkylkationen am besten zu eignen. Die N/C‐geschützten, basischen Aminosäuren
Arginin und Lysin werden selbst in gepufferter, wäßriger Lösung stark gebunden,
Lysin noch stärker als Arginin (s. Tab. folgende Seite). Abgesehen von Histidin,
welches ebenfalls eine schwache Affinität zeigt, binden andere Aminosäuren jedoch
nicht.
O
P
O
H3CO
P O
CH3
OLi+
Li+
Abb. 16: Molekulare Bisphosphonatpinzette von KLÄRNER und SCHRADER als Lewis‐Struktur (links), mit PM3 berechnete Struktur (mittig) und mit PM3 ermitteltes elektrostatisches Oberflächenpotential (rechts) Die rote Färbung indiziert die hohe Elektronendichte im Inneren der Pinzette.[102] Die Pinzette besitzt eine torusförmige, elektronenreiche Kavität. Die Seitenketten von
Lysin und Arginin schieben sich in diese Öffnung ein. Der resultierende Komplex
besitzt eine Pseudorotaxanstruktur. Dabei rasten die geladene Ammonium‐ bzw. die
Guanidiniumgruppe der Aminosäure durch Bildung einer Salzbrücke zu einem
Phosphonat an der Pinzette auf der einen Seite ein. Auf der gegenüberliegenden
Seite fungieren die Schutzgruppen der Aminosäuren als Stopper.
Mikrokalorimetrische Messungen zeigen, daß die Komplexbildung vorwiegend
enthalpisch getrieben ist.
Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten
25
Abb. 17: Energieminimierte Strukturen für die molekulare Bisphosphonatpinzette im Komplex mit Ac‐Lys‐OMe (links) und Tos‐Arg‐OEt (rechts). Die Aminosäuren sind jeweils als Kalottenmodell dargestellt. Als Puffer wurde ein Phosphatpuffer verwendet.[103] Auch in gepufferter wäßriger Lösung bleibt eine starke Bindung bestehen und selbst
in peptidischem Kontext werden die Seitenketten von Arginin und Lysin weiterhin
stark gebunden. Unter den getesteten Signalpeptiden befindet sich auch das lineare
RGD‐Peptid, welches eine starke Affinität in Wasser zu der Pinzette aufweist (s.
Tab.).
Ac-Lys-OMe Ka = 23000 M-1
Ac-Lys-OMe (25 mM Puffer pH 7)
Ka = 4339 M-1
Tos-Arg-OMe Ka = 7843 M-1
Tos-Arg-OMe (25 mM Puffer pH 7)
Ka = 1802 M-1
RGD (25 mM Puffer pH 7)
Ka = 1000 M-1
Durchführung und Ergebnisse
26
4 Durchführung und Ergebnisse
4.1 Beiträge zu einem neuen, künstlichen RGD‐Rezeptor analog RENSING
Ausgehend von dem ersten künstlichen Rezeptor für die RGD‐Sequenz von
SCHRADER und RENSING wurde zunächst versucht, eine Variante des bereits
vorgestellten Trisphosphonatrezeptors herzustellen, sowie Ausgangsmaterial für
eine Kupplung mit einem effektiveren Aspartatrezeptormodul zu gewinnen.[104]
O2, Co(II), ∆
25 %COOH COOMe
NBS, CCl4, ∆
30 %
HCl/MeOH
quant.COOMe
Br Br
COOMe
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
P(OMe3), ∆
quant.
COOH
P PMeO
MeO
O O
OMeOMeLiOH,
MeOH/H2O80 %
1
Schema 1: Reaktionsweg zum benzylischen Benzoesäurebisphosphonat 1.
Dazu wird Mesitylen mit Co(II)stearat als Katalysator mit Sauerstoff oxidiert. Die
entstehende Säure wird zur leichteren Aufarbeitung in einer späteren Stufe zunächst
mit HCl/MeOH verestert und anschließend die beiden übrigen benzylischen
Stellungen mit NBS in CCl4 einfach bromiert. Substitution der Bromide gegen
Phosphonsäuremethylester in einer Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion und folgende
selektive Verseifung des Carbonsäuremethylesters mit Lithiumhydroxid führen zum
benzylischen Benzoesäurebisphosphonat 1, welches als Ausgangsprodukt in
Peptidkupplungsreaktionen eingesetzt werden kann.[105‐107]
Zum Beispiel läßt sich Aminomethylphosphonsäurediethylester (AMPE) in sehr
guten Ausbeuten mit 1 und T3P als Hilfsreagenz zum von RENSING entwickelten
Trisphosphonsäureester 2 verknüpfen (s. Schema folgende Seite).[99]
Durchführung und Ergebnisse
27
COOH
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
1
+ H2N PO
OEtOEt P P
MeOMeO
O O
OMeOMe
90 %
O NH
PO
OEtOEt
2
T3P
Schema 2: Peptidkupplung zum Trisphosphonsäureester 2.
Von RENSING konnten für die vorliegende Arbeit größere Mengen der beiden Spacer‐
Module 3a und 3b zur Verfügung gestellt werden, wobei lediglich das
metasubstituierte Aminobenzylbromid 3a von RENSING auch selbst erfolgreich zum
direkten Vorläufer 4a des künstlichen RGD‐Rezeptors umgesetzt werden konnte.
N
O
O
N
O
O
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
O N
PO
EtOEtO
3a 3b 4a
Br
Br N
O
O
Schema 3: Die zwei Aminobenzylbromid‐Spacer 3a und 3b und der Rezeptorvorläufer 4a.
Die Schlüsselreaktion, nämlich die Deprotonierung des Amid‐NHs des
Trisphosphonsäureesters 2 und die nukleophile Substitution des Bromids im
Spacermolekül mit diesem in situ generierten Anion, erwies sich zunächst bei 3b als
problematisch. Die von RENSING ausgearbeitete Vorgehensweise erzielte hier
praktisch keinen Umsatz. Erst ein fünffacher Überschuß führte zum neuen
Rezeptorvorläufer 4b.
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
O N
PO
EtOEtO
N
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
O NH
PO
OEtOEt
2
40 %NaH, 5 Äq. 3b, DMF
O
O4b Schema 4: Optimierte Reaktion zum neuen Rezeptorvorläufer 4b mit para‐Aminobenzyl‐Spacer.
Durchführung und Ergebnisse
28
Der neue Trisphosphonsäureester 4b kann anschließend mit LiBr quantitativ zum
Trilithiumphosphonat 5b verseift werden. Für die Funktion des Moleküls als RGD‐
Rezeptor ist zuletzt die Abspaltung der Phthalimidschutzgruppe notwendig, um
eine Aniliniumfunktion zu generieren, die sich als Ankerpunkt für die
Aspartatseitenkette des RGD‐Peptids eignet.
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
O N
PO
EtOEtO
N
90 %
LiBr, CH3CN, ∆
O
O4b
P PMeO
+Li-O
O O
O-Li+OMe
O N
PO
+Li-OEtO
N
O
O5b
P PMeO
+Li-O
O O
O-Li+OMe
O N
PO
+Li-OEtO
NH2
6bH2NNH2, EtOH
3d
Schema 5: Syntheseroute zur neuen RGD‐Rezeptorvariante 6b.
Leider ergab jedoch in mehreren Ansätzen die Entschützung mit Hydrazin ein
komplexes Produktgemisch, so daß diese neue Variante aufgrund der gravierenden
Verunreinigungen nicht auf ihre Eigenschaft als künstlicher Rezeptor für die RGD‐
Sequenz getestet werden konnte. Eine Aufreinigung des Rohproduktes mit
Extraktionsmethoden gelang nicht. Chromatographische Trennmethoden mit
Kieselgel oder Aluminiumoxid sind wegen des Salzcharakters des Zielprodukts
ausgeschlossen. Als Alternative schien es lohnenswert, die Phthalimidschutzgruppe
bereits auf der Stufe der noch vollständig veresterten Trisphosphonate 4a und 4b zu
entfernen, um so an die freie Aminofunktion einen geeigneteren Aspartatrezeptor als
die bereits vorhandene Aniliniumfunktion ankuppeln zu können.
Von der Arbeitsgruppe SCHMUCK wurde hierfür in einem Kooperationsprojekt die in
der Einleitung bereits besprochene Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 mit
Durchführung und Ergebnisse
29
Boc‐geschützter Guanidiniumfunktion zur Verfügung gestellt, die sich in einem
Peptidkupplungsprotokoll mit PyBOP mit Aminen verknüpfen läßt.[74]
NH
O O
HNHN
NH
HOO
O
42
Abb. 18: Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 von SCHMUCK als Aspartat‐erkennungsmodul. Doch auch ausgehend von 4a und 4b konnte die Phthalimidabspaltung nicht zu
einem definierten Produkt durchgeführt werden. Zwar läßt sich die neutrale
Verbindung säulenchromatographisch reinigen, aber 7a und 7b sind offensichtlich
sehr empfindliche Verbindungen. Das zuvor farblose Rohprodukt der Entschützung
färbt sich noch auf der Trennsäule rosa. RENSING hatte bereits die leichte Spaltbarkeit
der Benzylamidbindung beobachtet.[104] Ein weiteres Problem scheint die Präsenz der
Anilinfunktion neben den nukleophil spaltbaren Phosphonsäureestern im selben
Molekül zu sein. Vor allem spielt aber sicherlich die Oxidationsempfindlichkeit des
Moleküls eine große Rolle.
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
O N
PO
EtOEtO N
O
O4a,b 7a,b
H2NNH2, EtOH
3d
P PMeO
MeO
O O
OMeOMe
O N
PO
EtOEtO NH2
Schema 6: Abspaltung der Phthalimidschutzgruppe in 4a und 4b ist unpraktikabel.
Die Herstellung geeigneter Mengen von 7a und 7b erwies sich als extrem schwierig.
Zudem bietet das so verfolgte Konzept nur wenig weitere Variationsmöglichkeiten
im Hinblick auf eine spätere Optimierung der synthetisierten Rezeptoren. Die
Spacer‐Einheiten 3a und 3b sind selbst nur in mehrstufigen Synthesen zugänglich
und nur sehr aufwändig weiter anpaßbar. Der von RENSING eingeschlagene Weg zu
künstlichen RGD‐Rezeptoren wurde daher vollständig verlassen.
Durchführung und Ergebnisse
30
4.2 Ein neues Trisphosphonat zur Argininerkennung
4.2.1 Synthese
Es sollte nun eine geradlinige Syntheseroute zu einem leichter zugänglichen
Trisphosphonat für die Argininerkennung gesucht werden, das gleichzeitig eine
Aminogruppe als Anknüpfungspunkt für die Aspartatrezeptormodule der Gruppe
SCHMUCK besitzt.[108] Dabei sollte der Spacer zwischen den beiden Rezeptormodulen
idealerweise durch käufliche Substanzen leicht variiert werden können.
NH2
P
O
OMe
O-O
NH
P
P
O-
OMeO
O-
OMeO
HN
POOMe
OMeO
NH2
P
P
OMe
OMeO
OMe
OMeO
HO SG+
8 9 10
Schema 7: Retrosynthetische Analyse des neuen Trisphosphonats 8.
Die einfache Umkehr der Amidbindung in dem Trisphosphonat 2 von RENSING zu
dem neuen Trisphosphonat 8 stellt unter Beibehaltung der vollständigen Geometrie
des bekannten Rezeptormotivs eine solche Vereinfachung dar. Die retrosynthetische
Analyse des neuen Rezeptors führt zu dem anilinischen Bisphosphonsäureester 9,
welcher in der Gruppe SCHRADER von ARENDT zuvor bereits hergestellt worden war,
und dem Phosphonoglycinester 10.[109]
NO2
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
NO2
1) NBS, CCl4, ∆2) POMe3, ∆
30 %
NH2
P PMeOMeO
OOMe
OMe
OH2/Pd-C, MeOHquant.
11 9
Schema 8: Dreistufige Reaktionssequenz zum anilinischen Bisphosphonsäureester 9 ausgehend von Nitroxylol.
Ausgehend von 5‐m‐Nitroxylol kann in einer, im Rahmen dieser Arbeit optimierten,
dreistufigen Reaktionssequenz der Aminobisphosphonsäureester 9 aufgebaut
werden.[109] Zunächst werden die beiden benzylischen Stellungen des 5‐m‐Nitroxylol
Durchführung und Ergebnisse
31
radikalisch mit NBS in CCl4 bromiert. Auf eine mühsame und verlustreiche
Aufarbeitung kann an dieser Stelle verzichtet werden. Statt dessen folgt direkt die
Substitution der eingeführten Bromatome in einer Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion mit
Trimethylphosphit. Nach der vergleichsweise einfachen säulenchromatographischen
Reinigung erhält man den Nitrobisphosphonsäureester 11 mit etwa 30 % Ausbeute
über die beiden ersten Stufen. Die folgende hydrogenolytische Reduktion der
Nitrogruppe zum Amin verläuft quantitativ mit Wasserstoff und Pd‐C als
heterogenem Katalysator. Die einzige problematische Stufe dieser Reaktionssequenz
liegt direkt am Anfang: Die radikalische Bromierung liefert zwar vorwiegend das
gewünschte Produkt, daneben aber auch alle anderen denkbaren, in Benzylstellung
bromierten Varianten, deren Auftrennung nicht ohne weiteren Ausbeuteverlust
möglich ist. Wesentlich günstiger ist der Verzicht auf die Aufreinigung, da die
Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion nur an den einfach bromierten Spezies erfolgt, so daß
sich das Trennproblem hier auf nur noch zwei Moleküle reduziert, nämlich dem
gewünschten Produkt und dem monophosphorylierten, wesentlich unpolareren
Derivat.
Der N‐geschützte Phosphonoglycinester 10 läßt sich leicht aus dem käuflichen,
vollständig veresterten Derivat 12 herstellen. Unter Eiskühlung kann mit LiOH
selektiv der Carbonsäuremethylester in Anwesenheit der Phosphonsäuremethylester
verseift werden. Das gewünschte Produkt entsteht zu etwa 60 %. Zu 10 % wird
unproduktiv ein Phosphonsäureester verseift. Im übrigen Anteil verbleibt das Edukt
unverändert und kann wiedergewonnen werden. Die drei Derivate lassen sich
einfach und vollständig durch Extraktion voneinander trennen.
HN
PO OMeOMe
O
HOO
OHN
PO OMeOMe
O
MeOO
O LiOH, MeOH/H2O0 °C, 14 h60 %
12 10
Schema 9: Selektive Verseifung des käuflichen Phosphonoglycintrimethylesters 12.
Durchführung und Ergebnisse
32
Zur Zusammenführung der beiden Komponenten 9 und 10 wurden mehrere
Peptidkupplungsreagenzien (T3P, TBTU, HBTU, PyBOP) getestet. Lediglich das
Mukaiyama‐Reagenz ist in der Lage, die Amidknüpfung effektiv zu dem noch
vollständig geschützten Rezeptor 13 zu katalysieren.
NHZ
PO OMeOMe
O
HONH2
P PMeOMeO
OOMe
OMe
OMukaiyama
80 %+
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
ZHN P
O
OMeOMe
O
LiBr, CH3CN, ∆
90 %
9 10 13
HN
P P+Li-OMeO
OO-Li+
OMe
O
ZHN P
O
OMeO-Li+
OHN
P P+Li-OMeO
OO-Li+
OMe
O
H2N P
O
OMeO-Li+
O
H2/Pd-C, MeOHquant.
14 15
Schema 10: Amidknüpfung zum Trisphosphonsäureester 13 und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppen. Auch bei dem Rezeptorvorläufer 13 zeigt sich wieder die schon zuvor beobachtete
Tendenz, daß freie Aminogruppen in Gegenwart von Phosphonsäuredimethylestern
zur Zersetzung der Substanz führen. Hier konnte deutlich die nukleophile
Verseifung der Ester nach Freisetzung der Aminogruppe beobachtet werden. Auf
dem Weg zum Trisphosphonat 15 müssen daher zuerst die
Phosphonsäuredimethylester zu dem N‐geschützten Trisphosphonat 14 mit
Lithiumbromid einfach gespalten werden. Am Phosphonatsalz 14 kann dann
anschließend problemlos die Z‐Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten werden.
Die bereits einfach anionischen Phosphonsäureester können von Aminen nicht mehr
weiter angegriffen werden.
Durchführung und Ergebnisse
33
4.2.2 Bindungsstudien
Mit dem Trisphosphonat 14 steht nun ein neues Rezeptormotiv für
Alkylguanidiniumgruppen bzw. die Aminosäure Arginin zur Verfügung. In NMR‐
Titrationsexperimenten in Methanol zeigt 14 eine Affinität von Ka = 1500 M‐1
gegenüber dem kleinen, einfach positiv geladenen Methylguanidiniumhydrochlorid
und Ka = 7.6 ∙ 105 M‐1 gegenüber dem zweifach positiv geladenen Argininmethylester.
Auftragungen der aus den Titrationen gewonnen Daten nach JOB ergeben in beiden
Fällen einen klaren Hinweis auf 1:1‐Komplexe.[110, 111]
Wie computergestützte Modelingrechnungen belegen, wird die Guanidiniumgruppe
von dem neuen Trisphosphonat in ganz ähnlicher Weise gebunden wie von dem
bereits beschriebenen Motiv von RENSING. Das positiv geladene, planare Kation
ordnet sich parallel zu dem Aromaten des Rezeptors an und wird von diesem durch
π‐Kation‐Wechselwirkungen stabilisiert. Die drei Phosphonatarme befinden sich
dann im optimalen Abstand, um durch drei Salzbrücken und ein Netzwerk von
Wasserstoffbrücken das Guanidiniumkation zu umklammern.
Durchführung und Ergebnisse
34
Titration von Methylguanidiniumhydrochlorid gegen Trisphosphonat 14
Äq. MeGUA0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14Job-Plot
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0,045
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Molenbruch χ
∆δ
∗ χ
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiMeO
O
vs.NH2Cl
HN
NH2
H
Titration von Argininmethylester gegen Trisphosphonat 14
Äq. Arginin
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16Job-Plot
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Molenbruch χ
∆δ
∗ χ
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiH3C
O
vs.
NH
NH2
NH2ClCOOMe
ClH3N
H
Abb. 18: NMR‐Titrationskurven in Methanol für Wirt 14 gegen Methylguanidiniumhydrochlorid und Argininmethylester, aus den Titrationsdaten gewonnene Auftragungen nach JOB und energieminimierte Darstellungen der Komplexe (MacroModel 7.2, MC 10K Schritte, Amber*, H2O).
Durchführung und Ergebnisse
35
Die enorme Steigerung der Bindungsstärke vom einfachen Guanidiniumkation zum
größeren Argininester läßt sich nur über die zweite positiv geladene Gruppe des
verwendeten Argininmethylesters erklären. Hier kann offensichtlich auch die
Aminogruppe der Aminosäure von einem der Phosphonatarme zusätzlich gegriffen
werden. Diese zusätzliche Bindungsstelle bewirkt hier eine dramatische Steigerung
um den Faktor 500 und macht das Trisphosphonat 14 zu einem ausgezeichneten,
neuen Rezeptormotiv für N‐terminale Arinine.
Damit ist der Komplex von 14 und Arginin stabil genug, um auch im wesentlich
kompetitiveren und polareren Wasser als Lösungsmittel zu bestehen.
Wiederholungen der NMR‐Titrationen in Wasser zeigen für den schwächeren
Methylguanidiniumkomplex erwartungsgemäß keine komplexinduzierten
Signallagenverschiebungen. Argininmethylester wird hingegen auch in Wasser mit
immerhin noch Ka = 140 M‐1 gebunden. Die starke Abnahme der Affinität in Wasser
deutet auf einen großen Beitrag elektrostatischer Wechselwirkungen zur Bindung
hin.
LM Ka [M‐1] ΔG [kJ/mol] Δδmax [ppm] 14 + MeGua MeOH 1500 M‐1 ± 24 % 18.1 0.142 ± 3 % 14 + MeGua H2O Keine Shifts Keine Shifts 14 + ArgOMe MeOH 7.6 ∙ 105 M‐1 ± 30 % 33.6 0.144 ± 1 % 14 + ArgOMe H2O 140 M‐1 ± 45 % 12.3 0.036 ± 22 % 15 + H‐RGD‐OH MeOH/H2O 3:1 95 M‐1 ± 18 % 11.3 0.334 ± 7 %
Tabelle 4: Ermittelte Bindungskonstanten für die Trisphosphonate 14 und 15. Die Ka‐Werte sind gemittelt über alle verfolgten Signale, Δδmax bezieht sich auf das jeweils am stärksten verschobene Signal.
Daraufhin wurde getestet, inwiefern das Trisphosphonat 15, bei dem im Vergleich zu
14 lediglich die Z‐Schutzgruppe zusätzlich entfernt wurde, Arginin auch im RGD‐
Peptid erkennen kann. 15 wurde verwendet, weil die darin frei liegende
Ammoniumgruppe (durch Zugabe von einem Äquivalent HCl zu 15 generiert)
gegebenenfalls eine zusätzliche Bindung zum Aspartat des Tripeptids aufbauen
kann. Die NMR‐Titration in einem Methanol‐Wasser‐Gemisch von 3:1 ergab eine
Bindung von Ka = 95 M‐1. Obwohl auch im linearen RGD‐Peptid die Aminogruppe
Durchführung und Ergebnisse
36
des Arginins frei liegt, ist die Bindung hier deutlich schwächer. Bei gesteigertem
Wassergehalt von 80 % des Lösungsmittelgemisches ist bereits keine Bindung mehr
durch NMR‐Titration detektierbar. Vermutlich stören die beiden negativen
Ladungen im Aspartat des RGD‐Peptides durch Abstoßung mit den ebenfalls
anionischen Phosphonaten die Bindung.
4.2.3 Verlängerung des Trisphosphonsäureesters 13
Wie im vorangehenden Kapitel bereits beschrieben, ist das aus dem vollständig
geschützten Trisphosphonsäureester 13 gebildete Z‐entschützte Produkt 16 in
Lösung nicht sehr stabil und daher ein Anknüpfen zusätzlicher Rezeptormodule
schwierig. Es konnte aber gezeigt werden, daß solche zusätzlichen Module alternativ
zuerst mit dem stabilen Phosphonoglycinamin 17 umgesetzt werden können. Nach
Verseifung des Carbonsäuremethylesters steht mit der Verbindung 19 nun ein neues,
verlängertes Phosphonat zur Verfügung, das mit dem Bisphosphonsäureester 9 zu
einem modifizierten Trisphosphonat umgesetzt werden kann.
NH3+TFA-
PO OMeOMe
O
MeOHN
PO OMeOMe
O
MeOO
O H2,Pd-C, MeOH1 Äq. TFAquant.
12 17 18
Z-Gly-OH, HCTU,Cl-HOBt, DIEA, DMF32 %
HNO
PO
OMeOMeO
COOMe
O
NHO
LiOH, MeOH/H2O0 °C50 %
HN
O P
O
MeO OMeO
O-Li+O NH
O
19
Schema 11: Z‐Entschützung des käuflichen Phosphonoglycintrimethylesters 12, folgende Verlängerung des Bausteins um ein Glycin und selektive Verseifung des Carbonsäureesters zum Diglycinbaustein 19.
Durchführung und Ergebnisse
37
4.3 Eine Serie von künstlichen RGD‐Rezeptoren auf Basis von
benzylischen Bisphosphonaten
4.3.1 Synthese
Wie zuvor bereits ausführlich diskutiert sind die Trisphosphonsäureester 7a und 7b
gar nicht, und der neue Trisphosphonsäureester 16 nur sehr eingeschränkt tauglich,
um über ihre freie Aminofunktion weitere Rezeptor‐ oder Spacer‐Module
anzuknüpfen. Daher wurde im Folgenden wieder ein um einen Phosphonatarm
reduziertes Argininrezeptormotiv verwendet.
P POMeO
OO
OMe
O
20
Tabelle 5: Bindungsstärke des einfachen benzylischen Bisphosphonats 20 gegenüber Methylguanidiniumhydrochlorid in Methanol im Vergleich zu Trisphosphonaten.[98, 99]
Das einfache benzylische Bisphosphonat 20 bindet Methylguanidiniumhydrochlorid
in Methanol bereits mit Ka = 800 M‐1.[98] Der dritte Phosphonatarm verdoppelt die
Bindungsstärke im Falle des Trisphosphonats 14 und vervierfacht sie im
Trisphosphonat 5a. Dennoch liegen alle diese Bindungsstärken insgesamt in
derselben Größenordnung.
Modulare Studien zum Aufbau von künstlichen Rezeptoren für die RGD‐Sequenz,
bestehend aus einem Argininrezeptormodul, einer variablen Spacer‐Gruppe und
einem Aspartatrezeptormodul, sollten daher auch ohne weiteres mit einem einfachen
benzylischen Bisphosphonat als Argininrezeptor möglich sein. Dieses weist bereits
eine ausreichende Bindungsstärke gegenüber Arginin auf, um die Auswirkungen
von Veränderungen in den übrigen beiden Rezeptormodulen zu untersuchen. Nach
Optimierung eines kompletten künstlichen RGD‐Rezeptors kann gegebenenfalls
wieder auf einen dritten Phosphonatarm zurückgegriffen werden, um die Affinität
des Rezeptors nochmals zu erhöhen.
Ka [M‐1] ΔG [kJ/mol]Bisphosphonat 20@MeGua 800 M‐1 16.6 kJ/molTrisphosphonat 14@MeGua 1500 M‐1 18.1 kJ/molTrisphosphonat 5a@MeGua 3500 M‐1 20.2 kJ/mol
Durchführung und Ergebnisse
38
Als Startpunkt für die Synthese wurde der Aminobisphosphonsäureester 9 gewählt,
der eine hinreichende Stabilität besitzt und an den sich beliebige Aminosäuren und
kurze Peptide in einer einfachen Peptidkupplungsreaktion anknüpfen lassen sollten.
NH2
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
9
HOOC-(AS)n-NH-SG
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
(AS)n-NH-Z
O
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
(AS)n-NH2
O
HN
P POMeO
OO
OMe
O
(AS)n-NH3+
O1) LiBr, CH3CN2) H2, Pd-C, MeOH3) H+
H 2, Pd-C, MeOH
Schema 12: Das Bisphosphonat 9 kann variabel mit Aminosäuren (AS) oder kurzen Peptiden als Spacer‐Modulen verknüpft werden. Entfernung der N‐terminalen Schutzgruppe ermöglicht die Anbindung weiterer Module, z.B. potenter Aspartatrezeptoren. Die Ammoniumfunktion kann aber auch bereits selbst als einfache Aspartaterkennungsgruppe in den so erhaltenen RGD‐Rezeptoren fungieren.
Die große Bandbreite an käuflichen Aminosäuren und auch Peptiden ermöglicht hier
eine leichte, auch kombinatorische Variation des Spacer‐Moduls. Gleichzeitig
ermöglichen Aminosäuren durch ihre Kopf‐Schwanz‐Verknüpfbarkeit jederzeit die
Verlängerung bereits erstellter Rezeptoren. Zuletzt kann die terminale
Aminofunktion des verwendeten Spacers in protonierter, kationischer Form als
einfache Rezeptoreinheit für die anionische Aspartatseitenkette fungieren. Alternativ
ist die Anbindung des bereits vorgestellten Aspartatrezeptors mit freier
Carbonsäurefunktion 42 von SCHMUCK in einer letzten Amidknüpfung möglich.[112]
Diesem Konzept folgend wurde eine systematische Reihe von Aminosäuren,
Dipeptiden und Tripeptiden an das Anilin 9 gekuppelt, wie der folgenden Tabelle 6
zu entnehmen ist.
Durchführung und Ergebnisse
39
# Aminosäure Ausb. # Dipeptid Ausb. # Tripeptid Ausb.21 Z‐Gly‐OH 75 % 22 Z‐GlyGly‐OH 82 % 23 Z‐GlyGlyGly‐OH 48 %24 Z‐Ala‐OH 39 % 25 Z‐Ala‐Ala‐OH 58 % 26 Z‐Gly‐Gly‐Ala‐OH 36 %‐ Z‐Val‐OH 0 % ‐ Z‐Val‐Val‐OH 0 % 27 Boc‐3ABz‐OH 60 % 28 Boc‐4ABz‐OH 79 % 29 Z‐Phe‐OH 24 % 30 Z‐Ser(tBu)‐OH 21 % 13 Z‐PGly‐OH 66 %
Tabelle 6: Mit dem Aminobisphosphonsäureester 9 durchgeführte Kupplungen mit Aminosäuren, Dipeptiden und Tripeptiden und die erzielten Ausbeuten (Abz: Aminobenzoesäure, PGly: Phosphonoglycinsäure). Für die Kupplungsreaktionen wurden zahlreiche Peptidkupplungsreagenzien
getestet, darunter T3P, TBTU, TCTU, HCTU, HATU, PyBOP, das Mukaiyama‐
Reagenz und ein Chlorenamin. Ein universell wirksames und effektives Hilfsreagenz
konnte dabei nicht identifiziert werden. Im Prinzip muß jede neue
Kupplungsreaktion trotz des stets gleich bleibenden Nukleophils 9 als neues System
betrachtet und neu optimiert werden. Einige der verwendeten Kupplungsreagenzien
erzielen für bestimmte Systeme außerordentlich gute Ausbeuten (insbesondere das
Mukaiyama‐Reagenz, T3P und das Chlorenamin), katalysieren andere Kupplungen
jedoch nur mäßig. Dagegen kuppeln die Reagenzien TBTU, TCTU und PyBOP in
Kombination mit 9 fast immer erfolgreich, allerdings nicht mit maximalen
Ausbeuten. Die hauptsächlichen Faktoren, die den Erfolg der vorliegenden
Amidkupplungen beeinflussen, sind die Polarität bzw. Löslichkeit und der sterische
Anspruch der zu kuppelnden Carbonsäuren. Die einzelnen Kupplungsprotokolle
sind dem experimentellen Teil dieser Arbeit zu entnehmen.
Die mit dem Bisphosphonat 9 verknüpften Aminosäuren und Peptide bilden die
Grundlage zur Synthese einer ersten Generation von kleinen, künstlichen RGD‐
Rezeptoren unter Variation des Spacer‐Moduls zwischen dem Arginin‐ und
Aspartatrezeptorbaustein. Dabei wurde durch die Anzahl der gekuppelten
Aminosäuren gezielt die Länge des angeknüpften Moduls variiert. Der Einbau von
Glycin oder alternativ Alanin ändert den sterischen Anspruch des Spacers. Die
Durchführung und Ergebnisse
40
Einführung noch raumfüllenderer Reste mit Valin bzw. Divalin gelang nicht; der
Unterschied im Raumanspruch zwischen Glycin und Alanin sollte aber bereits
ausreichend sein. Wie in den einführenden Kapiteln geschildert, können natürliche
Rezeptoren wie z.B. das Integrin α5β3 sehr gut zwischen diesen beiden Aminosäuren
unterscheiden.[42]
Die aromatischen Aminosäuren meta‐ und para‐Aminobenzoesäure stellen relativ
starre, rigide Module dar, während die ansonsten verwendeten Glycin‐ und Alanin‐
haltigen Spacer weitgehend flexibel und beweglich sind.
Mit Phenylalanin ließe sich der Einfluß aromatischer Gruppen in der
Rezeptorperipherie untersuchen. Serin wäre eventuell in der Lage, über die
zusätzliche Hydroxylgruppe Wasserstoffbrücken zum Rückgrat des RGD‐Peptids
auszubilden.
Zuletzt läßt sich durch das im vorhergehenden Kapitel bereits beschriebene
Kupplungsprodukt von 9 mit Phosphonoglycin der Einfluß eines dritten
Phosphonatarms auf die Bindung des RGD‐Tripeptids untersuchen.
Die in ausreichender Menge vorliegenden Kupplungsprodukte wurden nun zu neun
verschiedenen, einfachen Rezeptoren für die RGD‐Sequenz weiter umgesetzt. Dazu
erfolgte zuerst die einfache Verseifung der Phosphonsäureester mit LiBr in
Acetonitril und anschließend die hydrogenolytische bzw. saure Entfernung der
Schutzgruppen für die Aminofunktion. Falls notwendig wurde die Aminogruppe
zuletzt durch Zugabe von einem Äquivalent Salzsäure zur Ammoniumfunktion
protoniert.
Die Reihenfolge der Abspaltung der Schutzgruppen ist auch hier wieder von
essentieller Bedeutung. Nur wenn die Lithiumbromid‐Spaltung zuerst durchgeführt
wird, erhält man saubere Produkte in quantitativer Ausbeute.
Durchführung und Ergebnisse
41
4.3.2 Bindungsstudien mit den einfachen künstlichen RGD‐Rezeptoren auf Basis
des benzylischen Bisphosphonats 9
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
ONH3
+
Li+
Li+
Cl-NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH3
+
Li+
Li+Cl-N
HP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
ONH3
+
Li+
Li+
Cl-
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
ONH3
+
Li+
Li+
Cl-NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH3
+
Li+
Li+Cl-N
HP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
ONH3
+
Li+
Li+
Cl-
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
ONH3
+
Li+
Li+
Cl-
32: BP2--Gly-NH3+ 33: BP2--Gly-Gly-NH3
+ 34: BP2--Gly-Gly-Gly-NH3+
35: BP2--Ala-NH3+ 36: BP2--Ala-Ala-NH3
+ 37: BP2--Ala-Gly-Gly-NH3+
15: BP2--PGly--NH3+ 38: BP2--Gaba-NH3
+
PO OMe
O-Li+
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
ONH3
+
Li+
Li+
Cl-
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O
Li+
Li+
Cl-NH3+
39: BP2--3ABz--NH3+
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O
Li+
Li+ Cl-
40: BP2--4ABz--NH3+
NH3+
Abb. 19: Schematische Darstellung für das Konzept zum Aufbau künstlicher RGD‐Rezeptoren (r.u.) und 10 synthetisierte Varianten mit Kurzbezeichnungen. Dem Kreis‐Modul im Schema entspricht dabei das benzylische Bisphosphonat und dem Dreieck‐Modul die Ammoniumgruppe der hergestellten Rezeptoren. Dazwischen liegen variable, peptidische Spacer‐Module. (BP2‐Gaba‐NH3+ 38 wurde freundlicherweise von M. MAUE zur Verfügung gestellt.)
HNN
NNH
O
H O
H O
HNO
O
H2N NH2
R ---- G ---- D
Durchführung und Ergebnisse
42
Die zehn künstlichen RGD‐Rezeptoren in obiger Abbildung wurden mittels NMR‐
Titration gegen das lineare RGD‐Tripeptid auf ihre Bindungsstärke hin vermessen.
Alle Titrationen wurden in einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol‐d4 und
Wasser im Verhältnis 3:1 durchgeführt. In reinem Wasser zeigte keiner der zehn
Rezeptoren eine Bindung bei NMR‐gestützten Untersuchungen. Ein Vergleich der
Rezeptoren wäre in den unpolareren Lösungsmitteln Methanol oder DMSO wegen
der zu erwartenden höheren Bindungskonstanten leichter. In diesen Lösungsmitteln
löst sich das Gast‐Peptid jedoch nicht. Nur in Methanol‐Wasser‐Gemischen sind alle
Komponenten dagegen gut löslich und die besten Binder konnten bestimmt werden.
Die Ergebnisse der Titrationen sind in folgender Tabelle 7 zusammengefaßt:
AS‐Spacer Ka [M‐1] Dipeptid‐Spacer Ka [M‐1] Tripeptid‐Spacer Ka [M‐1] BP2‐Gly‐NH3+ 32
45 M‐1 ± 40 %
BP2‐GlyGly‐NH3+ 33
780 M‐1 ± 28 %
BP2‐GlyGlyGly‐NH3+
34 keine
SättigungBP2‐Ala‐NH3+
35 keine Shifts
BP2‐AlaAla‐NH3+
36 156 M‐1 ± 55 %
BP2‐AlaGlyGly‐NH3+
37 keine
SättigungBP2‐PGly‐‐NH3+
15 95 M‐1 ± 18 %
BP2‐Gaba‐NH3+
38 keine
Sättigung
BP2‐3Abz‐NH3+
39 keine Shifts
BP2‐4Abz‐NH3+
40 keine Shifts
Tabelle 7: Aus NMR‐Titrationen gewonnene Ergebnisse der Bindungsexperimente der Wirte 15 und 32‐40 gegen H‐RGD‐OH in Methanol/Wasser 3:1. Die Wirte sind spaltenweise nach der Länge der eingebauten Spacer sortiert (links eine, mittig zwei und rechts drei Aminosäuren). Die angegebene Bindungskonstante Ka ist das arithmetische Mittel, falls mehrere Protonen verfolgt werden konnten. Unter den getesteten Verbindungen zeigt die Verbindung 33 mit einem Diglycin‐
Spacer die stärkste Affinität zu H‐RGD‐OH. Deutlich dahinter folgt die Verbindung
36 mit einem Dialanin. Kurze Linker mit nur einer Aminosäure zeigen im Falle des
Glycins 32 und Phosphonoglycins 15 eine schwache Bindung. Andere gleichermaßen
kurze Linker wie das Alaninderivat 35 oder die beiden Aminobenzoesäurederivate
39 und 40 zeigen keinerlei Affinität zum RGD‐Peptid. Bei diesen letzten beiden
Verbindungen kommt als Problem der sehr niedrige pKs‐Wert (etwa 5) von Anilinen
hinzu.[113] In neutraler, ungepufferter wäßriger Lösung liegen Aniline praktisch
Durchführung und Ergebnisse
43
vollständig unprotoniert vor. Eine kooperative Bindung der Aspartatseitenkette ist
mit der neutralen Form der Aniline aber kaum möglich.
Linker mit drei Aminosäuren wie 34 und 37 weisen zwar minimale
komplexinduzierte Signallagenverschiebungen auf; diese ergeben jedoch keine
Sättigungskurve.
. RGD0 1 2 3 4 5 6 7
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
BP2-GlyGly-NH3+ vs H-RGD-OH
H-RGD-OH vs BP2-Gaba-NH3+
. BP2-Gaba-NH3+0 1 2 3 4
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Abb. 19: Exemplarisch zwei NMR-Titrationskurven aus obiger Meßreihe. Links der beste Binder 33 mit Diglycin-Linker, rechts 38 mit γ‐Aminobuttersäure‐Linker, bei dem die Signale keine Sättigung aufweisen und daher nur eine extrem schwache Bindung vorliegt. Verbindung 38 mit einem γ‐Aminobuttersäure‐Spacer nimmt eine Sonderstellung
ein. Zwar besteht dieser Spacer nur aus einer Aminosäure, die Kettenlänge ist aber
eher mit den Dipeptid‐Linkern zu vergleichen. Zusätzlich besitzt die Alkylkette aber
maximale Flexibilität, während die Dipeptid‐Linker durch die zusätzliche
Amidbindung konformationell eingeschränkter sind. Auch hier tritt jedoch wieder
keine Sättigung auf.
Zusammenfassend lassen sich die Titrationsergebnisse dahingehend interpretieren,
daß die besten Modellrezeptoren einen Linker aus zwei Aminosäuren besitzen. Eine
einzelne Aminosäure führt zu schwacher Bindung. Bei Linkern mit drei
Aminosäuren bricht die Affinität dagegen fast vollständig ein. Auch die
Verwendung sehr flexibler Spacer wie in 38 führt trotz geeigneter Länge zum Verlust
der Bindung.
Durchführung und Ergebnisse
44
Abb. 20: Graphische Darstellung der Abhängigkeit der Bindungsstärke von der Spacer‐Länge. Sterisch anspruchsvollere Seitenketten stören die Bindung. Schon eine zusätzliche
Methylgruppe, wie sie beim Wechsel von Glycin nach Alanin vorliegt, verhindert bei
dem kurzen Ein‐Aminosäure‐Linker die Bindung vollständig. Beim Zwei‐
Aminosäure‐Spacer liegt dieselbe Tendenz vor: die Bindungsaffinität von 33 und 36
unterscheidet sich um den Faktor 7.
Wie erwartet bewirkt dagegen ein zusätzlicher Phosphonatarm beim Wechsel vom
Glycin zum Phosphonoglycin‐Linker eine Bindungsverstärkung, die mit einem
Faktor zwei allerdings moderat ausfällt. Der Einfluß der Spacer‐Länge ist deutlich
entscheidender für die Komplexstärke.
4.3.3 Kraftfeldrechnungen
Computergestützte Kraftfeldrechnungen veranschaulichen die in NMR‐Titrationen
gewonnen Ergebnisse. Dazu wurden die Komplexe zunächst durch
Energieminimierung vororientiert und anschließend mit Hilfe einer MonteCarlo‐
Rechnung die günstigste, absolute Konformation des Komplexes gesucht
(MacroModel 7.2, Amber*‐Kraftfeld, GB/SA Solvatationsmodell für Wasser).
Der berechnete Komplex aus dem RGD‐Tripeptid und dem besten Rezeptor BP2‐
GlyGly‐NH3+ 33 aus obiger Serie zeigt eine gute Komplementarität der beiden
Komplexpartner. Die Guanidiniumgruppe des Arginins weist schräg auf die beiden
0
200
400
600
800
1000
1200 Ka [M-1]
1 AS 2 AS 3 AS
32 (Gly)
15 (PGly)
36(AlaAla)
33(GlyGly)
34(GlyGlyGly)
37 (AlaGlyGly)
Durchführung und Ergebnisse
45
Phosphonatgruppen des Rezeptors und bildet zu diesen vier Wasserstoffbrücken
aus. Sowohl das Peptidrückgrat als auch der Rezeptor liegen in einer entspannten,
gestreckten Konformation vor, in der am anderen Ende ein Kontakt des Aspartat‐
Seitenkettencarboxylats mit der Ammoniumgruppe des Rezeptors besteht. Diese
Ammoniumgruppe bildet gleichzeitig Wasserstoffbrücken zu dem Carboxylat und
dem Arginin‐Carbonylsauerstoffatom aus. Eine weitere Wasserstoffbrücke kann von
einem Carbonylsauerstoffatom des Rezeptors zum N‐Terminus des Peptids
geschlagen werden. An der Bindung sind also nicht nur die beiden expliziten
Arginin‐ bzw. Aspartaterkennungsmotive des Rezeptors beteiligt, sondern auch das
Rückgrat des Peptids und die Spacer‐Gruppe des Rezeptors tragen positiv zur
Bindung bei.
Abb. 21: Der berechnete Komplex aus dem RGD‐Tripeptid und dem besten künstlichen Rezeptor BP2‐GlyGly‐NH3+ 33 (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 10000 Schritte).
Im direkten Vergleich dazu zeigt die computergenerierte Struktur von BP2‐AlaAla‐
NH3+ 36 (s. Abb. folgende Seite) im Komplex mit dem RGD‐Peptid eine Störung der
Bindung durch die zusätzlichen Methylgruppen im Rezeptor. Eine dieser beiden
Methylgruppen zeigt in Richtung des Liganden und verhindert so attraktive
Kontakte des Peptidrückgrats zum Rezeptor. Das Peptid muß sich um diese
Methylgruppe herum falten, um dem Rezeptor die beiden Seitenketten anzubieten.
Folglich ist bei gleicher Länge des Rezeptors im Vergleich zu 33 die Bindungsaffinität
dennoch deutlich schwächer.
Durchführung und Ergebnisse
46
Experimentell haben die Rezeptoren mit einer einzelnen Aminosäure als Linker nur
schwache Affinität gegenüber dem RGD‐Tripeptid gezeigt. Die berechneten
Komplexstrukturen weisen darauf hin, daß diese kurzen Rezeptoren die RGD‐
Sequenz nur in einer Konformation binden, in der die beiden Seitenketten von
Arginin und Aspartat eng benachbart stehen.
Abb. 22: Die Rezeptoren BP2‐AlaAla‐NH3+ 36 (links; zur Verdeutlichung des sterischen Anspruchs der Methylgruppen wurde ihr Oberflächenpotential transparent eingezeichnet) und BP2‐Gly‐NH3+ 32 (rechts) im Komplex mit dem RGD‐Peptid (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 5000 Schritte).
Abb. 23: Die Rezeptoren mit aromatischem Spacer BP2‐3ABz‐NH3+ 39 (links) und BP2‐4Abz‐NH3+ 40 (rechts) im Komplex mit dem RGD‐Peptid (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 10000 Schritte, Wasserstoffatome wurden zur Verbesserung der Übersicht teilweise entfernt).
Durchführung und Ergebnisse
47
4.4 Rezeptoren für die RGD‐Sequenz aus Bisphosphonat und
Guanidiniumcarbonylpyrrol
4.4.1 Synthese von BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44
Da sich das Bisphosphonat mit einem Diglycin‐Linker 33 in der Testreihe der kurzen
Modellrezeptoren als bester Binder erwiesen hatte, wurde es ausgewählt, um mit
einem effektiveren Aspartatrezeptormodul verknüpft zu werden. Als
Aspartatrezeptor sollte das Guanidiniumcarbonylpyrrol 42 fungieren, das von
SCHMUCK und RUPPRECHT bereitgestellt wurde.
NH
O O
HNHN
NH
HOO
O
NH
PP OMeOMe
OMeO
MeO
O
O
HN
ONH
O
O
H2/Pd-C, MeOH HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
O
NH
ONH2
NH
P
P
OMeOMeO
OMeOMeO
O HNO
NH NH
O
O
HN NH
HN
PyBOP, NMM, DMF, 24 h
1) DCM/TFA2) HCl3) LiBr, CH3CN, ∆
HN
P P-OMeO
OO-
OMe
O
O
NH
OHN
HN
O
O
HN
NH2
+H2N
Li+
O
Oquant.
42
4344
22 41quant.
30 %
Schema 13: Synthese des neuen, künstlichen RGD‐Rezeptors 44.
Durchführung und Ergebnisse
48
Von BP2‐GlyGly‐Z 22 wurde dazu zunächst hydrogenolytisch die Z‐Schutzgruppe
abgespalten. Das Produkt 41 mit freier Aminogruppe weist im Gegensatz zu
ähnlichen Verbindungen mit Aminogruppen in Gegenwart von
Phosphonsäuredimethylestern eine hinreichende Stabilität auf, um weiter umgesetzt
zu werden. Frisch hergestelltes BP2‐GlyGly‐NH2 41 konnte so mit PyBOP an das
Guanidiniumcarbonylpyrrol 42 von SCHMUCK gekuppelt werden. Nach Entfernen
der Boc‐Schutzgruppe von der Guanidiniumfunktion mit Trifluoressigsäure,
anschließendem Umsalzen des Trifluoracetatsalzes mit Salzsäure und einfacher
Verseifung der Phosphonsäuredimethylester mit Lithiumbromid wurde der neue
künstliche RGD‐Rezeptor 44 erhalten. 44 ist bis in den millimolaren Bereich hinein in
Wasser gut löslich. In anderen Lösungsmitteln, auch polaren wie Methanol,
Acetonitril oder Dimethylsulfoxid löst es sich dagegen praktisch nicht.
4.4.1.1 Untersuchung von BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44 auf Selbstassoziation
Der grundsätzliche Aufbau des Rezeptors 44 aus einem benzylischen Bisphosphonat
und dem Guanidiniumcarbonylpyrrol macht eine Untersuchung auf
Selbstassoziation notwendig, da sowohl der Bisphosphonatbaustein als Rezeptor für
die Acylguanidiniumfunktion agieren kann, als auch das
Guanidiniumcarbonylpyrrol für eine Phosphonatgruppe. Um diese Wechselwirkung
modellhaft zu untersuchen, wurde das Lithiumsalz des einfachsten Bisphosphonats
20 in einer Mischung von Wasser und DMSO (40/60) gegen das
Guanidiniumcarbonylpyrrol 45 getestet.
P POMeO
OO
OMe
O
20
NH
O O
NH HN NH2
NH2+ Cl-45
Abb 24: Das einfachste benzylische Bisphosphonat 20 und das Guanidiniumcarbonylpyrrol 45.
Die NMR‐Titration ergab eine Bindungskonstante Ka = 744 M‐1 ± 17 % und liegt damit
exakt bei der von SCHMUCK ermittelten Bindungsstärke von 45 gegenüber N‐
Acetylalanin im selben Lösungsmittelgemisch (Ka = 770 M‐1).[74] Carboxylate und
Durchführung und Ergebnisse
49
Bisphosphonate verhalten sich demnach gegenüber dem
Guanidiniumcarbonylpyrrol 45 ähnlich. Die zweite Phosphonatfunktion in 20
bewirkt interessanterweise keine Bindungsverstärkung. Beim Wechsel von
wäßrigem Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel zu reinem Wasser sollte die Affinität
aber drastisch sinken und die potentiellen Wechselwirkungen der Rezeptormodule
einzeln miteinander vernachlässigbar sein. Bei ausreichend selbstkomplementärem
Aufbau könnten aber durch gleichzeitige, gegenseitige Erkennung der jeweiligen
Rezeptormodule in einer multivalenten Wechselwirkung dennoch stabile, dimere
Komplexe gebildet werden, die die Bindung eines RGD‐Liganden erschweren oder
sogar ganz verhindern.
Kraftfeldrechnungen zeigen, daß durchaus ein stabiler, dimerer Komplex aus zwei
Molekülen 44 denkbar ist. Allerdings liegt kein komplett zwitterartiger Komplex vor,
sondern das eine der beiden beteiligten Moleküle fungiert eher als
Oxoanionrezeptor, während das andere als Guanidiniumrezeptor wirkt (s. Abb.).
Jeweils eines der beiden Rezeptormodule ist also im Komplex weitgehend inaktiv.
Auch liegen im berechnete Komplex nicht die üblich angenommenen idealen
Bindungsmuster für die beiden Rezeptorbausteine vor. Die Muster sind leicht
verzerrt.
Abb. 25: Kraftfeldrechnung zur möglichen Selbstassoziation des RGD‐Rezeptors 44 (MacroModel 7.2, MonteCarlo, Wasser, Amber*, 5000 Schritte): der dimere Komplex in einer Seitenansicht (links) und mit Blick auf eine der Kopfgruppen (rechts). Wasserstoffatome wurden zur Verbesserung der Übersicht teilweise entfernt. Eines der beiden Moleküle ist violett eingefärbt.
Durchführung und Ergebnisse
50
Letztendlich lassen die Kraftfeldrechnungen die Fragen nach der möglichen
Selbstassoziation von 44 offen. Daher wurde mit verschiedenen experimentellen
Methoden dieser Frage nachgegangen:
Eine Verdünnungsreihe des Rezeptors 44 in Wasser zeigt mit UV/Vis‐
Spektroskopie ineares Absorptionsverhalten nach Lambert‐Beer.
Eine Verdünnungsreihe in Wasser im Bereich von 1∙10‐3 M‐1 bis 5∙10‐5 zeigt
keine Veränderung in den beobachteten chemischen Verschiebungen im 1H‐
NMR‐Spektrum.
1H‐NMR‐Spektren einer Probe bei variabler Temperatur von 5 °C bis 80 °C
zeigen ebenfalls keine Veränderung in den beobachteten chemischen
Verschiebungen.
Ein NOESY‐NMR‐Spektrum zeigt lediglich Kreuzpeaks für die erwarteten
intramolekularen Kontakte. Intermolekulare Kontakte der außen liegenden
Rezeptorteile sind nicht zu beobachten.
Die mikrokalorimetrische Messung der Verdünnung des Rezeptors 44 zeigt
eine normale, endotherme, lineare Abhängigkeit der Wärmetönung von der
Konzentration. Bei Selbstassoziation sollte diese asymptotisch verlaufen.
Zusammenfassend läßt sich daher sagen, daß mit verschiedenen spektroskopischen
und einem mikrokalorimetrischen Verfahren keinerlei Selbstassoziation des
Rezeptors 44 festgestellt werden konnte.
4.4.1.2 Bindungsstudien mit dem Rezeptor BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44
Nachdem eine Selbstassoziation des Rezeptors 44 ausgeschlossen werden konnte,
wurde nun die Bindung des RGD‐Liganden untersucht. Dabei ist der niedrige pKS‐
Wert der Acetylguanidiniumfunktion von ca. 7.0‐7.5 zu berücksichtigen, der bewirkt,
daß der Rezeptor in Wasser bei neutralem pH‐Wert teilweise dissoziiert und
deprotoniert vorliegt. Zutitrieren peptidischer, meist leicht saurer Gäste führt dann
zu einem Protonentransfer vom Gast zum Rezeptor, der die spektroskopischen
Observablen der Titration stärker beeinflussen kann als die eigentliche Bindung. In
Durchführung und Ergebnisse
51
ungepufferter, wäßriger Lösung wurden sowohl in NMR‐ als auch in UV‐Titrationen
sowie in mikrokalorimetrischen Messungen zunächst Bindungskurven gefunden, die
allein auf diesen Protonentransfer zurückzuführen sind und fälschlicherweise eine
hohe Assoziationskonstante vorspiegeln. Um dieses Problem zu vermeiden, sollte
der Rezeptor 44 möglichst ausschließlich in gepufferter Lösung bei einem leicht
sauren pH‐Wert von 6.0‐6.5 auf Ligandenaffinitäten untersucht werden. Da Puffer
und Fremdsalze die Bindungsaffinität jedoch drastisch absenken können, wurden
zusätzlich auch Experimente in ungepufferter Lösung durchgeführt, bei denen die
Stammlösungen zuvor jeweils mit Hilfe einer pH‐Elektrode und Salzsäure auf den
selben leicht sauren pH‐Wert (ca. 6) eingestellt wurden. Dadurch ist während der
Titration bei minimaler Fremdsalzkonzentration ein Protonentransfer
ausgeschlossen.
In wäßriger Lösung mit einem niedrig konzentrierten Phosphatpuffer (3 mM) weist
der Rezeptor 44 eine Affinität von Ka ~ 200 M‐1 für das RGD‐Tripeptid auf. Erhöht
man die Pufferkonzentration auf 80 mmol/L, so ist keine Bindung NMR‐
spektroskopisch mehr nachzuweisen. Die Phosphatanionen des Puffers konkurrieren
offensichtlich mit der Carboxylatfunktion des Aspartats um das
Guanidiniumcarbonylpyrrol des Rezeptors und verhindern bei ausreichendem
Überschuß dessen Bindung.
NHP
P
O OMeO
OOMe
O
O HN
ONH HN
O
OHN
NH2H2N
44
H3NO
NH O
HN COO
COONH
H2N
NH2
H-RGD-OH
Abb. 26: Der berechnete Komplex von 44 mit dem violett hervorgehobenen H‐RGD‐OH (links: MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 7000 Schritte, Wasserstoffatome sind für bessere Übersichtlichkeit teilweise nicht dargestellt) und die Lewis‐Formeln der beiden Moleküle (rechts).
Durchführung und Ergebnisse
52
Bei Verwendung eines anderen Puffersystems ohne Oxoanionen kann auch bei
höheren Pufferkonzentrationen noch eine ähnlich starke Bindung nachgewiesen
werden. So ergibt die NMR‐Titration desselben Systems in 40 mmol/L BisTris‐Puffer
die Bindungskonstante Ka = 230 M‐1 (BisTris = 2,2‐Bis(hydroxymethyl)‐2,2’,2’’‐
nitrilotriethanol).
In Kraftfeldrechnungen ergibt sich für die Komplexstruktur von 44 mit dem RGD‐
Peptid eine gute Komplementarität der beiden Partner. Die beiden Molekülketten
sind ineinander verschlungen; das Rückgrat des Peptids und der Wirtspacer haben
dabei intensiven Kontakt und werden durch intermolekulare Wasserstoffbrücken
zusätzlich stabilisiert. Das Bisphosphonat bindet die Arginin‐Guanidiniumgruppe
und simultan die terminale Ammoniumgruppe des RGD‐Peptids. Gleichzeitig
erkennt das Pyrrol‐Modul eines der beiden Carboxylate des Peptids.
4.4.1.3 Untersuchung auf Sequenzselektivitäten
Um die Sequenzselektivität des Rezeptors 44 überprüfen zu können, wurde in
automatisierter Festphasensynthese mit Standard‐Fmoc‐Protokoll an Wang‐ und Cl‐
Trt‐modifizierten Polystyrolharzen eine Serie von kleinen Peptiden aus je 3‐6
Aminosäuren hergestellt, die Arginin und Aspartat in unterschiedlichem Abstand,
Kontext und Reihenfolge enthalten.[114] Teilweise wurde auch eine der zu
erkennenden Aminosäuren ausgelassen.
Tripeptid Tetrapeptide Pentapeptide Hexapeptide+ H‐DGR‐OH H‐GRGG‐OH H‐GRGDG‐OH H‐GRGGDG‐OH H‐GRDG‐OH H‐GDGRG‐OH H‐RGGGDG‐OH H‐DGGR‐OH H‐GRADG‐OH H‐ARGDSG‐OH H‐GDGR‐OH H‐RGGDG‐OH H‐GARGDAG‐OH H‐GRGAG‐OH H‐GKGDG‐OH H‐DfVRG‐OH H‐GRGDS‐OH
Tabelle 8: In automatisierter Festphasensynthese an Wang‐ und Cl‐Trt‐modifizierten Polystyrolharzen mit Standard‐Fmoc‐Strategie hergestellte Peptide als Modellsubstanzen für künstliche RGD‐Rezeptoren.
Durchführung und Ergebnisse
53
Einige ausgewählte Peptide wurden in NMR‐Titrationen gegen den künstlichen
RGD‐Rezeptor 44 getestet. Die Ka‐Werte und die verwendeten Puffersysteme finden
sich zusammen mit den Titrationsergebnissen für das einfache RGD‐Peptid
vergleichend in nachfolgender Tabelle dargestellt. Bei Messungen ohne Puffer wurde
der pH‐Wert der Lösungen vorher genau auf 6.5 eingestellt.
Komplex Puffersystem pH‐Wert Ka [M‐1] 44 + RGD NaH2PO4/Na2HPO4 3 mM 6.5 190 M‐1 ± 24 % 44 + RGD NaH2PO4/Na2HPO4 80 mM 6.5 Keine Shifts 44 + RGD BisTris 40 mM 6.1 230 M‐1 ± 46 % 44 + GDGRG NaH2PO4/Na2HPO4 5 mM 6.5 180 M‐1 ± 23 % 44 + GRGDG NaH2PO4/Na2HPO4 6 mM 6.5 210 M‐1 ± 16 % 44 + DfVRG ‐ 6.5 350 M‐1 ± 15 % 44 + RGGDG ‐ 6.5 200 M‐1 ± 10 % 44 + GRGG ‐ 6.5 360 M‐1 ± 28 % 44 + GKGDG ‐ 6.5 Keine Shifts
Tabelle 9: In NMR‐Titrationen mit dem Rezeptor 44 ermittelte Bindungskonstanten für verschiedene lineare, peptidische Liganden in Wasser. Konnten mehrere Signale verfolgt und ausgewertet werden, so ist das angegebene Ka das arithmetische Mittel. Die angegebenen Fehler ergeben sich aus der Standardabweichung der Regressionsanalyse. Es zeigt sich, daß die Bindungsaffinitäten unabhängig von der exakten
Aminosäuresequenz alle im Bereich von 200 bis etwa 400 M‐1 liegen. Dabei sind
allerdings die in Puffer ermittelten Bindungskonstanten etwas höher zu bewerten, da
in gepufferter Lösung die Ionenstärken geringer sind. Der Rezeptor ist noch nicht in
der Lage, sehr ähnliche Sequenzen zu differenzieren. Zwischen Arginin und
Aspartat können ohne Affinitätsverlust auch zwei andere Aminosäuren liegen.
Aspartat darf sogar gegen ein C‐terminales Glycin substituiert werden. Wie auch
schon in der computergenerierten Komplexstruktur für 44 mit H‐RGD‐OH zu sehen
ist, kann der Rezeptor nicht zwischen dem Aspartat‐Seitenkettencarboxylat und
einem C‐terminalen Carboxylat in ähnlicher Entfernung unterscheiden.
Erfreulicherweise deutet die vollständig fehlende Bindung von H‐GKGDG‐OH an 44
allerdings darauf hin, daß ein Arginin essentiell notwendig ist und der Austausch
gegen das ebenfalls basische Lysin zum vollständigen Verlust der Bindung führt.
Dies ist ein Hinweis darauf, daß tatsächlich beide Erkennungsmodule des Rezeptors
Durchführung und Ergebnisse
54
kooperativ an der Bindung beteiligt sind und nicht nur ein Carboxylat vom
Guanidiniumcarbonylpyrrol gebunden wird.
4.4.2 Synthese und Bindungseigenschaften von BP2‐GlyPyrGua+ 47
Ganz analog zur Synthese des künstlichen RGD‐Rezeptors 44 wurde das um ein
Glycin kürzere Derivat 47 ausgehend von dem benzylischen Bisphosphonsäureester
21 hergestellt.
NH
PP OMeOMe
OMeO
MeO
O 1) H2/Pd-C, MeOH2) 42, PyBOP, NMM, DMF, 24 h
NH
P
P
MeO OMe
O
OMe
OMe
O
OHN
NH
O
HN
NH1) DCM/TFA2) HCl3) LiBr, CH3CNquant.
4621
28 %O
ZHNNHBocO
NHP
P
-O OMeO
OMeO-
O
O HN N
H
O
HNNH2
+
NH2
O
Li+
47
Schema 14: Die Synthese des kürzeren RGD‐Rezeptors 47 mit einem Glycin als Spacer gelingt analog zu der Synthese von 44 mit Diglycin‐Linker.
In NMR‐Titrationen ließ sich keine Affinität des Derivats 47 gegenüber dem RGD‐
Tripeptid feststellen. Im Computermodeling zeigt sich für 47 noch deutlicher
dieselbe Tendenz, die sich schon bei der Reihe von Bisphosphonatrezeptoren mit
Ammoniumgruppe als Aspartatrezeptor abzeichnete: ein einzelnes Glycin ist als
Spacer zu kurz. In der berechneten Struktur kommt eine Bindung nur dadurch
zustande, daß sich die Arginin‐Seitenkette eng an das Peptidrückgrat heran faltet (s.
Abb. folgende Seite).
Durchführung und Ergebnisse
55
HN
P
P
OOMe
O
O OMeO
NH HN
O
OHN
NH2H2N
47
H3NO
NH O
HN COO
COO
NH2H2N
H-RGD-OH
ONH
Abb. 27: Der berechnete Komplex von 47 mit dem RGD‐Peptid (links: MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 5000 Schritte) und die Lewis‐Formeln der beiden Komplexpartner (rechts). Neben der ungünstigeren sterischen Architektur von BP+2‐GlyPyrGua+ 47 im
Vergleich zum längeren BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44 kommt bei 47 noch als zusätzlicher
Faktor eine meßbare Selbstassoziation hinzu. Dies wird bereits in
Kraftfeldrechnungen sehr anschaulich.
Abb. 28: Der berechnete Komplexe eines Dimers aus zwei Molekülen 47 aus zwei verschiedenen Blickwinkeln betrachtet (links: MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 8000 Schritte) und die Lewis‐Formel des Komplexes (rechts). Der Rezeptor 47 kann sich wegen seiner vielen sp2‐Zentren in einer fast vollständig
planaren, gestreckten Konformation anordnen, bei der nur die beiden Phosphonate
aus der Ebene herausragen, jeweils eines nach oben, eines nach unten. Zwei
Moleküle 47 können sich dann genau parallel zueinander ausrichten und ein stabiles
Dimer ausbilden. Die Guanidiniumgruppen werden im Komplex wechselseitig
HN
P
P
OHOMe
O
O OMeO
NHO
O HN
NH
O
NH
NH2
HN
P
P
HOMeO
O
OMeOO
NH O
OHN
NH
O
HN
H2N
47@47
Durchführung und Ergebnisse
56
durch ein benzylisches Phosphonat des Partners gebunden. Prinzipiell sind in dieser
Stapelung auch noch höhere Aggregate denkbar.
Im Experiment sind bei Verdünnung einer in Wasser gelösten Probe von 47 im 1H‐
NMR‐Spektrum Signalverschiebungen zu beobachten. Trägt man den Logarithmus
der Konzentration gegen die Änderung der beobachteten Signale auf, so läßt sich aus
dieser Kurve eine Assoziationskonstante berechnen. Im konkreten Fall ergeben die
Meßwerte für 47 eine Selbstassoziationskonstante zwischen 200 und 700 M‐1, je nach
verfolgtem Signal, mit allerdings recht hohen statistischen Fehlern von etwa 65 %.
log c-4 -3 -2
∆δ
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Abb. 29: NMR‐Verdünnungsreihe des Rezeptors BP2‐GlyPyrGua+ 47 in D2O zur Ermittlung der Selbstassoziationskonstante Kass ~ 330 M‐1 ± 65 % (arithmetisches Mittel). Der große statistische Fehler wird zum einen durch die sehr kleinen
Signalverschiebungen verursacht, zum andern können höhere Aggregate nicht
ausgeschlossen werden. Die Selbstassoziation liegt in der selben Größenordnung wie
die Bindungsaffinität des RGD‐Peptids zum verwandten Rezeptor 44. Da diese
zunächst aufgebrochen werden muß, bevor ein anderer Ligand gebunden werden
kann, erklärt dies zusammen mit der ungünstigen Rezeptorgeometrie die fehlende
Affinität des Rezeptors 47 gegenüber dem RGD‐Peptid.
Durchführung und Ergebnisse
57
4.4.3 Synthese und Bindungseigenschaften von BP2‐ASER‐PyrGua+ 49
Aus dem von der Arbeitsgruppe SCHMUCK zur Verfügung gestellten
Argininanalogon 48 und dem Benzoesäurebisphosphonsäureester 1 konnte in 51 %
Gesamtausbeute ein drittes Derivat mit Bisphosphonat‐Modul, Aminosäure‐Linker
und Guanidiniumcarbonylpyrrol‐Gruppe synthetisiert werden. Zwar besteht auch
hier der Spacer zwischen den beiden Erkennungsgruppen nur aus einer einzelnen
Aminosäure (einem nicht proteinogenen Azaserin), doch verändert der C‐2 Linker
mit Chiralitätszentrum deutlich die Gesamtgeometrie des Rezeptors. Er
unterscheidet sich daher wesentlich vom gleich langen Rezeptor 47 mit Glycin‐
Linker. Das stereogene Zentrum und die sperrige Methylestergruppe induzieren
einen Knick im Molekül, so daß Selbstassoziation wie in 47 nicht mehr möglich ist
(vgl. Kraftfeldrechnung folgende Seite). Folglich finden sich auch in einer
Verdünnungsreihe des Rezeptors 49 im NMR‐Spektrum keine
verdünnungsabhängigen Signalverschiebungen.
1) PyBOP, NMM, DMF, 15 h2) DCM/TFA3) LiBr, CH3CN, ∆, 12 h4) HCl
COOH
P PMeO
MeO
O O
OMeOMeMeO
O
NH2HN
ONH
HN
O
BocHN
NH
+
51%
MeO O
NH
P
P
O-O
MeO
-O
MeO
O
OHN
ONH
HN
O
+H3N
HNLi+
48 1
49
Schema 15: Die Synthese des RGD‐Rezeptors 49 mit einem Azaserin als Spacer verläuft ähnlich wie die Synthesen von 44 und 47.
Durchführung und Ergebnisse
58
Nachdem eine Selbstassoziation für diesen Rezeptor 49 nicht nachgewiesen werden
konnte, wurde in einer NMR‐Titration seine Affinität gegenüber dem RGD‐Peptid
untersucht. In wäßriger, gepufferter Lösung (11 mmol/L BisTris‐Puffer, pH 6.3)
ergibt sich eine Bindungskonstante Ka = 280 M‐1.
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
OMeO
HN
P
P
-O OOMe
O-
OMe
O
ONH
OHN
HN
O
NH3+
NH
49
H-RGD-OH
Abb. 30: Die NMR‐Titration des RGD‐Rezeptors 49 gegen H‐RGD‐OH in D2O (BisTris‐Puffer 11 mM, pH 6.3) ergibt eine Bindungskonstante Ka = 276 ± 23 % (Verfolgt wurden die C‐H Protonen des Pyrrol). Damit bindet 49 das RGD‐Peptid in etwa gleicher Stärke wie der Rezeptor 44.
Abb. 31: Der mit Kraftfeldrechnungen modellierte Komplex von 49 mit dem violett hervorgehobenen Tripeptid H‐RGD‐OH (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 10000 Schritte, Wasserstoffatome sind zur besseren Übersicht teilweise nicht dargestellt). Der verwendete Azaserinlinker bewirkt einen Knick im Rezeptor, so daß die beiden verknüpften Rezeptormodule direkt übereinanderliegen.
. RGD0 2 4 6 8
∆δ
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
Durchführung und Ergebnisse
59
4.5 Molekulare Pinzetten
4.5.1 Das Grundgerüst
Da die bisher geschilderten Ansätze zur Entwicklung von künstlichen Rezeptoren
für die RGD‐Sequenz keine überzeugenden Bindungsaffinitäten erzielt haben, wurde
ein neues Konzept gesucht. 2004 wurde von FOKKENS eine wasserlösliche
Bisphosphonatpinzette hergestellt, die auf einem Grundgerüst von KLÄRNER
basiert.[115] Diese bindet Arginin in wäßriger, gepufferter Lösung im submillimolaren
KD‐Bereich und damit wesentlich stärker als die in dieser Arbeit bisher verwendeten
Bis‐ und Trisphosphonate. In der Gruppe von KLÄRNER wurde wenig später auch
noch eine analoge Bisphosphatpinzette synthetisiert. Es liegt daher nahe, einen
modularen RGD‐Rezeptor mit einer solchen Pinzette als Argininerkennungsmodul
zu konstruieren.
O
O
PMe
-O
O
Li+
PO
R1 RR1 = Me, OMe, O-
R+ = O-Linker-NH3+, O-Linker-PyrGua+
Abb. 31: Erstes Konzept für ein RGD‐Rezeptor‐Design, das eine Bisphosph(on)at‐Pinzette als Argininerkennungsmodul und eine Ammoniumgruppe oder das Guanidiniumcarbonylpyrrol von SCHMUCK als Aspartaterkennungsmodul besitzt. Das in dieser Arbeit bisher verwendete grundlegende Rezeptordesign, bestehend aus
zwei Modulen zur Arginin‐ und Aspartaterkennung sowie einem verknüpfenden
Linker soll beibehalten werden. Der Linker mit dem Aspartaterkennungsmodul
könnte als Alkohole über eines der Phosphonate bzw. Phosphate mit der Pinzette
esterartig verknüpft werden. Im Falle der Bisphosphonatpinzette würde dies für das
Rezeptormolekül allerdings den Verlust einer negativen Ladung bedeuten. Nur
Bisphosphatpinzetten könnten auf diesem Weg weiterhin als Dianion vorliegen. Die
Notwendigkeit zweier negativer Ladungen ergibt sich aus den Arbeiten von
FOKKENS allerdings nicht. Komplexstrukturuntersuchungen deuten lediglich darauf
Durchführung und Ergebnisse
60
hin, daß mindestens ein Phosphonatanion als Einrastpunkt für die positiv geladenen
Seitenketten von Liganden wie Arginin oder Lysin gebraucht wird.
Um eine bessere Löslichkeit in Wasser zu erzielen, wären mehrere negative
Ladungen im Pinzetten‐Modul jedoch äußerst förderlich, zumal eine negative
Ladung durch ein vorgesehenes Kation im Aspartaterkennungsmodul wieder
ausgeglichen wird. Zwitterionische Strukturen vermindern generell die Löslichkeit
in Wasser.
Synthesen zur Phosphorylierung der molekularen Pinzetten gehen von dem
Hydrochinonsystem 50 aus. In der von FOKKENS etablierten Synthese der
Bisphosphonatpinzette wird 50 mit Methylphosphonsäuredichlorid umgesetzt und
anschließend mit einem großen Überschuß Methanol vollständig verestert. Die
Phosphonsäuremethylester können anschließend mit Lithiumbromid selektiv wieder
gespalten werden, um die Bisphosphonatpinzette quantitativ in ihr Dilithiumsalz zu
überführen.[102, 103] Die Bisphosphatpinzette wird ähnlich hergestellt, nämlich über die
Umsetzung von 50 mit Phosphorylchlorid und anschließendem Abfangen des
Intermediats mit einem großen Überschuß Wasser.
4.5.2 Entwicklung von Synthesemethoden zur einseitigen Funktionalisierung der
molekularen Pinzette
Zur Erprobung und Optimierung von neuen Syntheserouten zu substituierten
Bisphosphat‐ und Bisphosphonatpinzetten wurde zunächst das verkürzte
Hydrochinongerüst 51 als Modell verwendet (s. Abb. folgende Seite). Dieses ist
synthetisch deutlich leichter und in größeren Mengen zugänglich als das
vollständige Pinzettengrundgerüst 50, besitzt aber dieselben funktionellen Gruppen.
Durchführung und Ergebnisse
61
OH
OH
OH
OH
1. NEt3, POCl32. 1-2 Äq. R-OH
1. NEt3, MePOCl22. 1-2 Äq. R-OH
1. NEt3, MeOPOCl22. 1-2 Äq. R-OH
1. NEt3, MePOCl22. großer Überschuß MeOH
O
OP
PMe
MeO
O
Me OMe
O
R-OH = H2O, MeOH, PrOH, Boc-N-Et-OH, Z-N-Pr-OHLM: THF, DCM, Benzol; 0 °C < T < Reflux
50
51
Abb. 32: Ungeeignete Syntheserouten mit dem verkürzten Pinzettengerüst 51. Sämtliche Syntheseversuche, das Hydrochinonsystem 51 zunächst mit
Säurechloriden der Phosphorsäure oder Methylphosphonsäure zu phosphorylieren
und anschließend mit äquimolaren Mengen aliphatischer Alkohole vollständig zu
verestern, schlugen fehl. Die verwendeten Alkohole bestanden aus kurzen
Alkylketten (C2‐ und C3‐Bausteine) mit einer Boc‐ oder Z‐geschützten
Aminofunktion an dem der Hydroxylgruppe gegenüberliegenden Molekülende.
Aber auch kleine, einfache Alkohole wie Propanol oder Methanol und sogar Wasser
führten bei äquimolarer Zugabe oder leichtem Überschuß bis zehn Äquivalenten
nicht zu den gewünschten Phosphor‐ und Phosphonsäureestern, sondern zu nicht
trennbaren, komplexen Gemischen. Um eine praktikable Synthesemethode zu
entwickeln, wurden verschiedene absolutierte Lösungsmittel (THF, DCM, Benzol)
mit den genannten Bedingungen getestet. Auch die Reaktionstemperatur wurde
systematisch zwischen Eiskühlung und Reflux‐Temperatur des jeweiligen
Lösungsmittels variiert. Dennoch wurden nie einheitliche Produkte erhalten.
Die Problematik dieser Reaktionen wurde schließlich mit einem einfachen
Testsystem untersucht: Selbst wenn man Phosphorsäuretrichlorid oder
Methylphosphonsäuredichlorid in absolutem THF bei Raumtemperatur mit jeweils
Durchführung und Ergebnisse
62
zwei Äquivalenten Methanol unter Zugabe einer Base für 24 Stunden rührt, erhält
man nicht die erwarteten Ester.
R-OH +
PCl
Cl Cl
O
PCl
MeO Cl
O
PCl
Me Cl
O
NEt3
PCl
RO OR
O
PCl
MeO OR
O
PCl
Me OR
O
1 Äq. R-OH
Schema. 16: Die bei der Reaktion von Alkoholen mit Säurechloriden der Phosphor‐ und Methylphosphonsäure entstehenden Intermediate sind zu stabil, um in stöchiometrisch geführten Reaktionen weiter umgesetzt werden zu können. Die intermediär entstehenden Säurechloride sind offensichtlich verhältnismäßig
stabil und können nicht mehr ohne weiteres substituiert werden. Erst wenn man sehr
reaktive Partner wie Methanol oder Wasser in äußerst großem Überschuß (100 –
1000fach) hinzugibt, wird auch das letzte Chlorid am Phosphor(V) substituiert.
Daraufhin mußte das Pinzettendesign angepaßt werden. Unter Verzicht auf die
zweite Phosphonatgruppe am Rezeptor konnten am Modellsystem 51 eine Reihe
wichtiger Reaktionen durchgeführt werden, die das Hydrochinonsystem auf der
einen Seite mit geeigneten aminosubstituierten Linkern verlängern und auf der
anderen Seite immer noch die Phosphorylierung erlauben.
Eine grundlegende Umsetzung ist die einfache Phosphorylierung des
Hydrochinonsystems 51 zum Methylphosphonsäureester 52 mit exakt einem
Äquivalent Methylphosphonsäuredichlorid. Diese Reaktion verläuft mit 60 %
Ausbeute zufriedenstellend, ermöglicht aber vor allem im Folgenden, die zweite
Hydroxylgruppe zielgerichtet zu funktionalisieren. Auch am kompletten
Pinzettengerüst 50 konnte diese einfache Phosphorylierung mit gleicher Ausbeute
erfolgreich durchgeführt werden.
Durchführung und Ergebnisse
63
OH
OH
OH
O
NH
OO
O
OH
PMe
MeO
O
OH
O O
NH
OO
R1
R1 = H, Me, iPr
OH
O
OHNR2
R2 = Ala, Ser
Boc-AS-OHDCM, DIEA, DIC90 %
DCM, KI, K2CO3Boc-NH-Et-Br, 70 %
Aceton, KI, K2CO390 %
1) MePOCl2, NEt32) MeOH60 %
BrO
NHR2
51
52
53
54a,b
55a,b
Schema 17: An dem verkürzten Pinzettengerüst 51 neu etablierte Synthesen. Eine weitere mögliche Reaktion ist eine Veretherung nach WILLIAMSON an einer der
beiden Hydroxylgruppen von 51.[116] Diese gelingt mit einem Boc‐geschützten 2‐
Bromethylamin und man erhält mit 70 %iger Ausbeute den Ether 53. Allerdings
konnte diese Reaktion bisher nicht auf die Dihydroxypinzette 50 übertragen werden.
Besser verlaufen ähnliche Synthesevarianten unter FINKELSTEIN‐Bedingungen mit
aktiveren Bromessigsäurederivaten.[117] In der Gruppe KLÄRNER wurden solche
Reaktionen bereits sehr erfolgreich zur symmetrischen Umsetzung von Pinzetten
und Klammern an beiden Hydroxylgruppen des Hydrochinonsystems verwendet.[118]
Am Testsystem 51 konnte nun gezeigt werden, daß auch Bromessigsäureamide
verwendbar sind. Die einseitige Umsetzung ist ebenfalls gut möglich. Mit 90 %
Ausbeute konnten auf diese Weise die Ether 54a aus Bromacetylalanin 56 und 54b
aus tert‐Butylether‐geschütztem Bromacetylserin 57 dargestellt werden. Diese
Durchführung und Ergebnisse
64
Reaktionen sind vollständig auf die komplette Pinzette 50 übertragbar. Als
problematischer hat sich hier die Synthese der benötigten Bromessigsäureamide
erwiesen. Bromacetylalanin 56 kann leicht mit Bromacetylchlorid hergestellt werden.
O‐tBu‐Serinmethylester reagierte dagegen nicht mit dem Säurechlorid. Statt dessen
war hier jedoch eine Peptidkupplung mit Bromessigsäure und dem Chlorenamin ‐
Kupplungsreagenz in fast quantitativer Ausbeute erfolgreich. Mit mäßiger Ausbeute
reagierte auch das interessantere Argininanalogon 48 von SCHMUCK mit
Bromessigsäure und dem Chlorenamin als Hilfsreagenz zum Bromessigsäureamid
58. In einem ersten Versuch konnte 58 bisher leider nicht an das Pinzettengerüst 50
kovalent angefügt werden.
NH
O
OONH2
O
OO
BrBr
Cl+
NH
O
OMeONH2
O
OMeO
BrBr
OH+
Chlorenamin, Py
OtBuOtBu
56
57
NEt3, DMAP
90 %
OBr
OH
+ Chlorenamin, Py 58OMeO
H2N HN
ONH
HN
O
NHBoc
NH
OMeO
HN HN
ONH
HN
O
NHBoc
NHOBr48
27 %
33 %
Schema 18: Synthese der Bromessigsäureamide 56, 57 und 58 als Edukte für WILLIAMSON‐Ethersynthesen. Einige andere Amine konnten dagegen gar nicht zum Bromessigsäureamid
umgesetzt werden. Bromessigsäure reagiert z.B. nicht mit dem
Aminobisphosphonsäureester 9, auch nicht mit zahlreichen, anderen gängigen
Kupplungsmethoden.
Durchführung und Ergebnisse
65
4.5.3 Synthese der ersten, asymmetrisch funktionalisierten Phosphonatpinzetten
Als letzte neu etablierte Synthesemethode zur einseitigen Funktionalisierung der
Hydrochinonsysteme 50 und 51 soll nun auf Veresterungen eingegangen werden.
Zuerst gelangen diese mit Boc‐geschütztem Glycin und Valin, welche mit Hilfe des
Kupplungsreagenzes DIC in ausgezeichneten Ausbeuten (ca. 90 %) zu den Estern 55a
und 55b reagierten. DIC erwies sich aber als vollkommen ungeeignet, um dieselben
Veresterungen am vollständigen Pinzettengerüst 50 durchzuführen.
OH
O O
NH
OO
55a 55b
OH
O O
NH
OO
Abb. 33: Die einseitig mit Aminosäuren veresterten Pinzetten‐Brückenköpfe 55a und 55b. Spätestens hier wird deutlich, daß das verkürzte Hydrochinongerüst 51 nur sehr
bedingt als synthetisches Modell für das vollständige Pinzettengerüst 50 dienen
kann. Es wurden mehrere Synthesemethoden entwickelt, die zwar am Brückenkopf
51 problemlos eingesetzt werden können, mit der Pinzette 50 aber trotz derselben
funktionellen Gruppen und derselben chemischen Umgebung gar nicht oder nur
sehr eingeschränkt durchführbar sind. Allen diesen Reaktionen ist gemein, daß eine
Hydroxylgruppe bzw. ein daraus gebildetes Phenolatanion als Nukleophil fungiert.
Die Pinzettenseitenwände in der Pinzette 50 schirmen die beiden Hydroxylgruppen
sterisch offenbar so stark ab, so daß ein nukleophiler Angriff an sperrige Substrate
wesentlich erschwert wird.
Der Durchbruch gelang schließlich mit dem Kupplungsreagenz PyBOP bei erhöhten
Reaktionstemperaturen und ‐zeiten, die bei Peptidknüpfungen mit diesem
Hilfsreagenz unüblich sind. Bei 40 °C und langen Reaktionszeiten von 3‐4 Tagen
konnten so Glycin, die SCHMUCKsche Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42
Durchführung und Ergebnisse
66
und eine um ein Glycin verlängerte Variante von 42 mit der Hydroxylpinzette 50 als
Ester verknüpft werden.
O
O O
NHBoc
O
BocHN
O
O O
NH3+
O
+H3N
TFA/DCMquant.63 64
TFA-
TFA-
OH
OH
DCM, PyBOP, NMM, 40 °C, 3-4 d,20-69 %
OH
O O
NH
ONH
NHBocHN
ONH
O
NH
HN
BocHN
OH
ONH
O
NH
HN
BocHN
HN OH
O1) H2N-Gly-OMe, PyBOP, NMM, DCM, RT2) LiOH, MeOH/H2O
42 59
50
Boc-Gly-OH, 42 oder 59
OH
O O
NHBoc
OH
O O
NH
OHN HN
ONH
NHBoc
60 61
62
a)
b)
c)
40 %
Schema 19: a) Synthese des um ein Glycin verlängerten Guanidiniumcarbonylpyrrols 59, b) Drei erfolgreich an einer Seite gezielt veresterte molekulare Pinzetten 60 bis 62 und c) Die Diglycinpinzette 63 fällt als Nebenprodukt bei der Herstellung von 60 an, kann aber auch gezielt hergestellt werden. Anschließend lassen sich die Schutzgruppen sauer abspalten.
Durchführung und Ergebnisse
67
Für die letzte dieser drei Reaktionen mußte zunächst der
Guanidiniumcarbonylpyrrol‐Baustein 42 mit Glycin verknüpft werden (s. Reaktion
a). Diese Peptidkupplung konnte mit PyBOP realisiert werden. Die folgende basische
Verseifung des Methylesters zur Carbonsäure 59 führte teilweise auch zur störenden
Abspaltung der Guanidiniumgruppe.[119]
Die anschließende Synthese des Esters 62 aus 50 und 59 konnte zwar durchgeführt
werden, insgesamt ist dieser Reaktionsweg jedoch noch nicht optimiert und führt zu
geringen Gesamtausbeuten. Als problematisch könnte sich später auch noch
erweisen, daß Kraftfeldrechnungen auf einen Einschluß der Guanidiniumgruppe
von 62 in der Kavität der Pinzette hindeuten (berechnet für Molekül 62 ohne Boc‐
Schutzgruppe mit MacroModel 7.2, MonteCarlo, Wasser, OPLS‐AA). Der Glycin‐
Linker könnte die dafür notwendige Faltung des Moleküls ermöglichen.
Wesentlich besser verlief die Veresterung von 50 mit Glycin allein. Tatsächlich ist
Glycin dabei ausreichend reaktionsfreudig, so daß als unerwünschte Nebenreaktion
zu etwa 25 % die beidseitig des Hydrochinonsystems symmetrisch veresterte
Diglycinpinzette 63 gebildet wird. Das eigentliche Hauptprodukt 60 wird daher nur
zu etwa 50 % erhalten. Die Diglycinpinzette 63 kann durch Verwendung von zwei
Äquivalenten Glycin in der Synthese auch gezielt hergestellt werden. Durch saure
Abspaltung der beiden Boc‐Schutzgruppen erhält man die dikationische, in
Methanol lösliche, C2‐symmetrische Pinzette 64.
Die mit 69 % beste Ausbeute für eine einseitige Veresterung der Dihydroxyl‐
pinzette 50 konnte mit der Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 erzielt
werden. Diese führt in vier Tagen Reaktionszeit bei 40 °C mit PyBOP zur Pinzette 61.
Mit der durch PyBOP vermittelten Veresterung steht nun also ein weitgehend
universelles Syntheseprotokoll zur Verfügung, um das Pinzettengerüst 50 gezielt auf
einer Seite des Hydrochinonsystems weiter zu funktionalisieren. Lediglich sterisch
anspruchsvolle Carbonsäuren wie z.B. der Benzoesäurebisphosphonsäure‐ester 1
konnten nicht an die ebenfalls sterisch gehinderte Pinzette 50 angeknüpft werden.
Durchführung und Ergebnisse
68
Die beiden einseitig veresterten Pinzetten 60 und 61 wurden an der verbliebenen
phenolischen Hydroxylgruppe über die von FOKKENS etablierte Methode mit
Methylphosphonsäuredichlorid phosphoryliert und in situ durch einen großen
Überschuß Methanol zu den Phosphonsäuremethylestern 65 und 66 umgesetzt (s.
Schema unten). Die Methylester wurden anschließend mit Lithiumbromid in
Acetonitril selektiv zum Lithiumphosphonatsalz gespalten. Zuletzt konnte mit
Trifluoressigsäure in Dichlormethan die Boc‐Schutzgruppe quantitativ sauer entfernt
werden. Die so vollständig protonierten Verbindungen wurden mit
Lithiumhydroxid bis zu einem neutralen pH titriert (67: pH = 7.0, 68: pH = 6.3). Auf
diese Weise wurden die beiden ersten asymmetrisch funktionalisierten,
zwitterionischen molekularen Pinzetten 67 und 68 erhalten.
OH
O
R
O
O
O
R
O
1) THF, NEt3, MePOCl2
2) Ü. MeOH
PMeO
OMe
1) CH3CN, LiBr
2) DCM, TFAO
O O
PMe
-O
O
NH
ONH
NH2+
H2N
O
O O
NH3+
PMe
-O
O
R = GlyBoc, PyrGuaBoc
60, 61 65, 66
67
68
42% 6569% 66
98% 6778% 68
Schema 20: Phosphorylierung der bereits einseitig veresterten Pinzetten 60 und 61 und die folgende Abspaltung der Schutzgruppen zu den beiden ersten asymmetrisch funktionalisierten, zwitterionischen molekularen Pinzetten 67 und 68. Hinsichtlich der zuletzt durchgeführten Schutzgruppenoperationen sind zwei
Beobachtungen wichtig: Zum einen ist auch hier die Reihenfolge der Entfernung der
Schutzgruppen von Bedeutung. Wird zuerst die Boc‐Entschützung vorgenommen,
Durchführung und Ergebnisse
69
kommt es zur teilweisen Zersetzung des Produktes. Diese Erfahrung wurde in der
vorliegenden Arbeit bereits bei der neutralen Hydrogenolyse von Z‐Schutzgruppen
in Gegenwart von Phosphonsäuremethylestern beschrieben. Hier trifft sie auch für
das Arbeiten in saurem Milieu zu. Da aus diesem Grund zuerst die
Phosphonsäureester gespalten werden müssen, ist zum anderen zu beachten, daß die
entstehenden Lithiumphosphonatsalze, vor allem im Falle der Pinzette mit
Guanidiniumcabonylpyrrolgruppe, partiell in Acetonitril löslich sind und nicht wie
gewöhnlich quantitativ ausfallen. Das Lösungsmittel wird daher abweichend vom
sonst üblichen Arbeitsprotokoll nach vollständiger Reaktion durch Destillation
entfernt. Waschen mit Wasser, in dem sich die Produkte nicht lösen, bietet im
Anschluß eine gute Möglichkeit zur Aufreinigung.
4.5.4 Bindungsuntersuchungen an der Glycinpinzette 67.
Im Gegensatz zur Bisphosphonatpinzette von FOKKENS ist die zwitterionische
Glycinpinzette 67 in Wasser absolut unlöslich. Ein geeignetes Lösungsmittel ist
Methanol, dem auch einige Anteile (bis etwa 30‐40 %) Wasser zugefügt werden
können, ohne daß die Pinzette wieder ausfällt.
In Methanol wurde die Pinzette 67 nun zunächst auf Selbstassoziation und
Selbstinklusion hin untersucht. Ein NOESY‐NMR‐Spektrum zeigt hier nur die zu
erwartenden intramolekularen Kreuzsignale, aber keine Anzeichen für eine
Dimerisierung oder Inklusion einer Glycinylgruppe in der Kavität der Pinzette.
Sowohl bei Verdünnung einer Probe des Rezeptors in Methanol als auch bei
Variation der Temperatur zwischen 0 °C und 45 °C verschieben sich einige Signale
leicht im 1H‐NMR‐Spektrum (< 0.3 ppm).
Die Temperaturabhängigkeit deutet auf Selbstassoziation mehrerer
Pinzettenmoleküle oder eine eingeschränkte konformationelle Freiheit der
Glycinylgruppe bei niedriger Temperatur hin. Bei vollständigem Einschluß dieser
Gruppe in der Kavität wäre allerdings ein wesentlich größerer Hochfeldshift zu
erwarten. Auch trägt die computermodellierte Struktur der Pinzette den Glycinylrest
Durchführung und Ergebnisse
70
klar außerhalb der Kavität. Allerdings ist eine Konformation denkbar, bei der die
Ammoniumgruppe des Glycinylrestes in den Eingangsbereich der Kavität gebracht
wird.
Abb. 34: Die Glycinpinzette 67 in einer Ansicht von der Seite (links) und von vorne, mit Blick in die Kavität hinein (rechts). Die Struktur wurde mit MacroModel 7.2 berechnet (MonteCarlo, 7000 Schritte, H2O, OPLS‐AA). Weiteren Kraftfeldrechnungen zufolge sollte die Glycinpinzette 67 gut als Rezeptor
für das RGD‐Peptid präorganisiert sein. Die Argininseitenkette kann in die Kavität
der Pinzette eingeschoben werden und die positiv geladene Guanidiniumgruppe am
gegensinnig geladenen Phosphonat einrasten. Das Rückgrat des Peptids kann seitlich
entspannt an der Pinzette entlang geführt werden, so daß die Carboxylatfunktion der
Aspartatseitenkette eine Salzbrücke zu der im richtigen Abstand befindlichen
Ammoniumgruppe des Glycins ausbildet.
Abb. 35: Energieminimierter Komplex der Glycinpinzette 67 mit dem RGD‐Peptid (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 10000 Schritte, H2O, OPLS‐AA).
Durchführung und Ergebnisse
71
Im Experiment mittels NMR‐Titration konnte eine solche Bindung jedoch leider nicht
nachgewiesen werden. Als Lösungsmittelgemisch für die Untersuchung wurde wie
bereits in zuvor beschriebenen Versuchen Methanol/Wasser im Verhältnis 3:1
gewählt, in dem sich beide Komponenten ausreichend lösen lassen. Eine erste
Messung mit zusätzlich 25 millimolarem BisTris‐Puffer ergab keinerlei
komplexinduzierte Verschiebungen von NMR‐Signalen. Um auch in ungepufferten
Medien eine definierte ionische Struktur des Rezeptors gewährleisten zu können,
wurde dieser in Lösung mit Hilfe einer pH‐Elektrode und Lithiumhydroxid auf
einen pH‐Wert von 7.0 eingestellt und das Lösungsmittel erneut abdestilliert. Der
nach Trocknen auf diese Weise erhaltene, zwitterionische Rezeptor wurde für die
folgenden Untersuchungen in ungepufferter Lösung verwendet.
Die Wiederholung der Titration von 67 gegen das RGD‐Peptid, nun in ungepufferter
Lösung, wies einige schwache Shifts < 0.1 ppm auf. Bei Inklusion des Gastes in der
Kavität muß bei den NMR‐Signalen der eingeschlossenen Gruppen ein drastischer
Hochfeldshift > 1 ppm zu sehen sein. Da dies nicht der Fall ist, muß davon
ausgegangen werden, daß die Argininseitenkette des RGD‐Peptids nicht in die
Kavität der Pinzette 67 hineingezogen wird, anders als in der Bisphosphonatpinzette
von FOKKENS, bei der dies zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte.
Daraufhin wurden einige alternative Gäste in methanolischer Lösung gegen die
Pinzette 67 titriert: Acetyllysinmethylester, das Tetrapeptid H‐GRGG‐OH und γ‐
Aminobuttersäure. Lysin wurde gewählt, um zu testen, ob gegebenenfalls die
anionischen Teile des RGD‐Peptids die Bindung an den Rezeptor stören. Zudem
bestünde hier wiederum ein guter Vergleich zu den Arbeiten von FOKKENS, dessen
Bisphosphonatpinzette Acetyllysinmethylester mit hoher Affinität erkennt. Das
Tetrapeptid bietet ein Arginin in peptidischem Kontext an und ist im Gegensatz zum
RGD‐Tripeptid auch in reinem Methanol ausreichend löslich. Zuletzt wurde mit γ‐
Aminobuttersäure noch ein wichtiger Neurotransmitter als Gast untersucht. Dieser
ist ebenfalls zwitterionisch. Die beiden geladenen Kopfgruppen sitzen an den Enden
einer kurzen aliphatischen Kette, die in die Pinzette hineingezogen werden könnte,
Durchführung und Ergebnisse
72
wobei die beiden geladenen Kopfgruppen von den entgegengesetzt geladenen
Seitengruppen an der Pinzette gebunden werden sollen. Die NMR‐Titrationen
ergaben jedoch für keinen der drei genannten Gäste in Methanol Änderungen der
Signallagen bei Zugabe der Glycinpinzette 67.
Daraus muß man schließen, daß die Kavität in der Glycinpinzette 67 für Gäste nicht
zugänglich ist. Eine mögliche Erklärung dafür könnte die Bildung von nichtkovalent
Kopf‐Schwanz‐verknüpften Pinzetten zu Oligomeren sein. Alternierende
Anordnung der ionischen Kopfgruppen der Pinzetten führt eventuell zu Stapeln, in
denen die Pinzetten gegenseitig ihre Hohräume versperren.
4.5.5 Bindungsuntersuchungen an der Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68.
Bei der Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 werden bereits in
Kraftfeldrechnungen einige potentielle Probleme offensichtlich. Die
Guanidiniumcarbonylpyrrolgruppe ist im Vergleich zu dem in der Pinzette 67
verwendeten Glycin deutlich größer. Zwar scheint ein direkter Einschluß dieses
Carboxylaterkennungsmoduls aus sterischen Gründen nicht möglich, jedoch
versperrt das Modul in der energetisch günstigsten, berechneten Struktur den
Eingang zur Kavität fast vollständig. Auch in einer Moleküdynamikrechnung bei
Raumtemperatur verbleibt die Pyrrolgruppe vor dem Eingang der Kavität.
Abb. 36: Die Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 in einer Ansicht mit Blick auf die Kavität durch die Guanidiniumgruppe hindurch (links) und schräg von vorne (rechts). Die Struktur wurde mit MacroModel 7.2 berechnet (MonteCarlo, 7000 Schritte, H2O, OPLS‐AA).
Durchführung und Ergebnisse
73
Im computergestützt berechneten Komplex der Pinzette 68 mit dem RGD‐Tripeptid
zeigt sich demzufolge auch, daß für eine Bindung und Inklusion der
Argininseitenkette in der Kavität zum einen die Guanidiniumgruppe im Rezeptor
aus der optimalen, zur Acylfunktion koplanaren Position herausgedreht werden
muß, und zum anderen das Peptid nur wenig Raum findet, um sich aus der Pinzette
„herauszuwinden“.
Abb. 37: Energieminimierter Komplex der Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 mit dem violett hervorgehobenen RGD‐Peptid (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 10000 Schritte, H2O, OPLS‐AA) in zwei verschiedenen Ansichten von der Seite (links) und von unten (rechts).
Was die berechneten Strukturen im Detail zu bedeuten haben, muß jedoch das
Experiment zeigen. Die Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 ist ebenfalls in
Wasser unlöslich. Auch in Methanol ist sie leider nur schwer löslich und ergibt dabei
stark verbreiterte NMR‐Signale. Dies könnte auf Aggregation in polaren Medien
hindeuten.
Für Bindungsuntersuchungen wurde als geeignetes Lösungsmittelgemisch
Chloroform/Methanol im Verhältnis 1:1 gewählt. Der Rezeptor löst sich in diesem
Gemisch bis zu einer Höchstkonzentration von etwa 1 mM. Ähnlich wie bei der
Glycinpinzette 67 wurde vor den folgenden Untersuchungen die Pinzette 68 mit
Hilfe einer pH‐Glaselektrode und Lithiumhydroxid auf einen pH‐Wert von 6.0
eingestellt, um einen zwitterionischen Zustand der Pinzette zu sichern.
Ein 1H‐NMR‐VT‐Experiment zeigt schwache Shifts der NMR‐Signale der beiden
Pyrrol‐Protonen. Vermutlich zeigt dies die mit steigender Temperatur aufbrechende
Durchführung und Ergebnisse
74
Bindung einer Phosphonatgruppe an die Guanidiniumcarbonylpyrrolgruppe eines
anderen Pinzettenmoleküls an. Die gleichartige intramolekulare Bindung zwischen
Phosphonat und Guanidiniumcarbonylpyrrol kann aufgrund von
Kraftfeldrechnungen ausgeschlossen werden. Die intramolekulare Annäherung der
beiden Rezeptorgruppen ist nämlich sowohl innerhalb der Kavität, als auch oberhalb
der Pinzette sterisch nicht möglich.
Da das RGD‐Peptid in der oben genannten Chloroform/Methanol‐Mischung nicht
löslich ist, konnte seine Affinität gegenüber der Pinzette 68 nicht bestimmt werden.
Statt dessen wurde zunächst freies L‐Lysin gegen 68 in Chloroform/Methanol 1:1
titriert und NMR‐spektroskopisch verfolgt. Es zeigten sich mäßige
komplexinduzierte Shifts kleiner 0.2 ppm im α‐Proton der Aminosäure. Die
nichtlineare Regression ergab eine Affinität Ka = 2500 M‐1 (± 50 %). Diese
verhältnismäßig schwache Bindung, die nur moderaten Shifts und vor allem das
vollständige Fehlen von Shifts in der Lysinseitenkette lassen schließen, daß die
Lysinseitenkette in diesem Fall nicht in die Kavität der Pinzette 68 eingeschlossen
wird. Die Bindung beruht vermutlich lediglich auf der Wechselwirkung des
Guanidiniumcarbonylpyrrols mit dem freien Carboxylat des Lysins.
Diese These wurde durch die Titration der Pinzette mit Acetyllysinmethylester
untermauert, welcher keine freie Carboxylatfunktion enthält,. Tatsächlich ist in der
NMR‐Titration mit 68 und diesem Gast keine komplexinduzierte Verschiebung des
α‐Protonensignals und somit keinerlei Bindung mehr feststellbar.
Wie bei der Glycinpinzette 67 wurden auch die alternativen Gäste H‐GRGG‐OH und
γ‐Aminobuttersäure gegen die Pinzette 68 titriert. Doch auch hier wurden keinerlei
Affinitäten festgestellt.
Es muß also leider tatsächlich angenommen werden, daß in der Pinzette 68 die
Kavität nicht zugänglich ist. Wahrscheinlich wird sie von der sterisch
anspruchsvollen Guanidiniumcarbonylpyrrolgruppe blockiert, die so die
Einlagerung von Gästen verhindert.
Zusammenfassung und Ausblick
75
5 Zusammenfassung
Ein neues Trisphosphonat als Argininrezeptor
Im Rahmen dieser Dissertation ist zunächst die Synthese des neuen Trisphosphonat‐
Bausteins 14 gelungen, der Alkylguanidiniumgruppen in vergleichbarer Stärke
bindet wie das ähnliche Trisphosphonat von RENSING. Gegenüber
Argininmethylester wurde in Methanol sogar eine Affinität von 7.6 ∙ 105 M‐1 ermittelt.
In reinem Wasser wird Argininmethylester immer noch mit 140 M‐1 komplexiert. Die
starke Bindung kann auf eine kooperative Komplexierung der Guanidinium‐ und
Aminofunktion des Arginins zurückgeführt werden. Das neue Trisphosphonat 14 ist
daher ein guter, künstlicher Rezeptor für N‐terminales Arginin.
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiH3C
O
vs.
NH
NH2
NH2ClCOOMe
ClH3N
H
14
Abb. 38: Das neue Trisphosphonat 14 als Rezeptor für Arginin als Lewis‐Struktur (links) und der mit Kraftfeldrechnungen energieminimierte Komplex (rechts; Wasserstoffatome wurden für bessere Übersichtlichkeit teilweise nicht abgebildet). Eine systematische Reihe von kleinen, künstlichen Modellrezeptoren für die
RGD‐Sequenz.
Ausgehend von dem einfachen Aminobisphosphonat 9 wurde eine Serie von
insgesamt zehn kleinen Rezeptoren für die RGD‐Sequenz hergestellt. Dabei dient das
benzylische Bisphosphonat‐Modul als Argininrezeptor und eine terminale
Ammoniumgruppe als einfacher Aspartatrezeptor. Dazwischen wurde ein
systematisch variierter, peptidischer Spacer eingebaut, mit dessen Hilfe die
grundsätzlichen sterischen Anforderungen an künstliche RGD‐Rezeptoren studiert
wurden.
Zusammenfassung und Ausblick
76
Es zeigte sich, daß der günstigste Abstand zwischen den beiden Rezeptormodulen
durch einen Dipeptidspacer eingestellt werden konnte. Einzelne Aminosäuren oder
Tripeptidspacer führten zu deutlich geringeren Bindungskonstanten. Sterisch
anspruchsvolle Seitenketten im peptidischen Linker führten ebenso zu niedrigeren
Affinitäten gegenüber dem RGD‐Peptid. Die durch die Peptidbindungen
eingeschränkte konformationelle Freiheit wirkte sich dabei günstig auf die
Bindungskonstanten aus. So zeigte ein den Dipeptidspacern in der Länge
entsprechender, jedoch flexiblerer γ‐Aminobuttersäure‐Linker keine Bindung des
RGD‐Peptids. Noch starrere Spacer wie meta‐ und para‐Aminobenzoesäure erzielten
allerdings ebenfalls keine Bindung. Aus Kraftfeldrechnungen geht hervor, daß hier
die Ammoniumgruppe nicht optimal zum Aspartat des RGD‐Peptides vororientiert
zu sein scheint Vor allem ist aber aufgrund des sehr niedrigen pKa ‐ Wertes von
Anilinen in wäßriger Lösung nicht von einer vollständigen Protonierung der
Aminofunktion auszugehen.
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH3
+
Li+
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O
NH3+
Li+
= peptischer Spacer 33 Abb. 39: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Serie von zehn künstlichen RGD‐Rezeptoren mit variablem peptidischem Spacer (links) und der beste Binder 33 aus dieser Serie (rechts). Der beste RGD‐Binder aus dieser Serie ist demzufolge der Rezeptor 33 mit einem
Diglycinspacer, der das RGD‐Peptid in wäßrigem Methanol (1:3) mit einer Affinität
von 780 M‐1 im Sinne eines 1:1‐Adduktes komplexiert.
Künstliche RGD‐Rezeptoren auf Basis von benzylischen Bisphosphonaten und
Guanidiniumcarbonylpyrrolen in Kooperation mit der Gruppe SCHMUCK.
Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden im Anschluß drei neue, künstliche RGD‐
Rezeptoren hergestellt, in denen die zuvor noch als Aspartatrezeptormodul
Zusammenfassung und Ausblick
77
verwendete Ammoniumgruppe gegen den wesentlich potenteren
Guanidiniumcarbonylpyrrol‐Baustein der Gruppe SCHMUCK ausgetauscht wurde. In
nur je acht linearen Stufen wurden der Rezeptor 44 mit Diglycinspacer, der Rezeptor
47 mit Glycinspacer und der Rezeptor 49 mit einem Azaserinspacer hergestellt. Die
dafür jeweils benötigten Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteine wurden von der
Gruppe SCHMUCK zur Verfügung gestellt.
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+
NH244Li+
HNP
P
-O OMe
O
O-
OMe
O
O
NH
O
HN
HN
O
NH2
+H2N47
Li+
OMeO
HN
P
P
-OO
OMe
O-
OMeO
O
NH
O NH
HN
O
NH3+
HN
49
Li+
Abb. 40: Die drei Rezeptoren 44, 47 und 49, bestehend aus einem benzylischen Bisphosphonatmodul, einem peptidischen Linker und einem Guanidiniumcarbonylpyrrol. Abgebildet sind die Lewis‐Strukturen der drei Rezeptoren (links) und die berechneten Komplexe von 44 und 49 mit dem RGD‐Peptid (in violett), bzw. das durch Selbstassoziation gebildete Dimer von 47 (rechts). Alle drei Rezeptoren dieser Serie sind dank einer negativen Überschußladung
wasserlöslich. Das einfache Glycin als Spacer in Rezeptor 47 führt zu einem
weitgehend selbstkomplementärem Bau dieses Moleküls mit einer Selbstassoziation
in Höhe von 330 M‐1. Eine Affinität gegenüber dem RGD‐Peptid konnte für 47 nicht
nachgewiesen werden.
Ebenfalls nur eine einzelne Aminosäure als Spacer trägt Rezeptor 49. Durch das hier
vorliegende Chiralitätszentrum und die unterschiedliche Anknüpfung des
Zusammenfassung und Ausblick
78
Pyrrolbausteins an die Seitenkette der Aminosäure weist 49 jedoch keine meßbare
Selbstassoziation in Wasser auf. Statt dessen kann sogar in gepufferter, wäßriger
Lösung mit Hilfe von NMR‐Titrationen eine Affinität gegenüber dem RGD‐Peptid in
Höhe von 280 M‐1 ermittelt werden.
Am intensivsten studiert wurden die Bindungseigenschaften des Rezeptors 44. Der
darin vorliegende Diglycinspacer hatte sich in der zuvor diskutierten Reihe kleiner
RGD‐Rezeptoren als der Günstigste erwiesen. Auch für 44 scheint der Spacer
geeignet zu sein. Es konnte mit verschiedensten Methoden keine Selbstassoziation
des Rezeptors in Wasser festgestellt werden. Die Affinität von 44 gegenüber dem
RGD‐Tripeptid beträgt in gepufferter, wäßriger Lösung rund 200 M‐1. Dies bedeutet
eine deutliche Steigerung gegenüber dem vergleichbaren Rezeptor 33 mit
Diglycinspacer aus der Vorserie, zumal dieser nur in wesentlich unpolarerer, wäßrig‐
methanolischer Lösung eine Bindung aufweist.
Anhand von NMR‐Titrationen mit verschiedenen über Festphasenmethoden
hergestellten, kleinen Peptiden konnte ein präzises Gastprofil für den Rezeptor 44
definiert werden. Für die moderate Bindung notwendig scheint ein Arginin und eine
in der Nähe befindliche Carboxylatfunktion zu sein. Diese muß nicht zwingend von
einem Aspartat zur Verfügung gestellt werden. Auch ein frei liegender C‐Terminus
des Gast‐Peptides reicht aus. Die Carboxylatfunktion kann von der Aminosäure
direkt neben dem Arginin oder in einem deutlichen Abstand erst von der dritten
Aminosäure nach dem Arginin angeboten werden. Die Affinitäten bewegen sich
dabei jeweils in einem Bereich von etwa 200 bis 400 M‐1.
Molekulare Pinzetten
In einem abschließendem Projekt wurde versucht, die noch niedrigen Affinitäten der
bisher hergestellten Rezeptoren durch ein wesentlich stärkeres Arginin‐
erkennungsmodul zu steigern. Statt des verhältnismäßig schwachen benzylischen
Bisphosphonats sollte das Gerüst der Bisphosphonatpinzette von FOKKENS in einen
neuen RGD‐Rezeptor eingebaut werden.
Zusammenfassung und Ausblick
79
Nach umfangreichen synthetischen Studien an dem Pinzettengerüst und einem
diesem zugrunde liegendem Modell konnten schließlich die beiden ersten
asymmetrisch substituierten Phosphonatpinzetten 67 und 68 hergestellt werden. Die
in dieser Arbeit entwickelten Methoden stellen nun erstmals einen generellen
Zugang dar, um das ausgezeichnete supramolekulare Rezeptorsystem der
molekularen Pinzetten von KLÄRNER mit zwei unterschiedlichen, variablen Gruppen
am oberen Rand zu funktionalisieren. Auf diese Weise können in Zukunft ganz neue
Gastprofile für die Pinzetten erschlossen werden.
O
O O
PMe
-O
O
NH
ONH
NH2+
H2N
O
O O
NH3+
PMe
-O
O
67 68
Abb. 41: Die beiden ersten asymmetrisch substituierten Phosphonatpinzetten 67 (links) und 68 (rechts, oben jeweils als Lewis‐Struktur, darunter als energieminimierte Struktur (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 8000 Schritte, OPLS‐AA, H2O). Um als künstliche Rezeptoren für die RGD‐Sequenz dienen zu können, wurde das
Pinzettengerüst in 67 auf der einen Seite des Hydrochinons mit einem Glycin
verestert. Die terminale Ammoniumgruppe des Glycins stellt wie in den zuvor
beschriebenen Rezeptorsystemen ein einfaches Aspartaterkennungsmodul dar. Auf
Zusammenfassung und Ausblick
80
der anderen Seite wurde ein Methylphosphonat angefügt, das der Argininseitenkette
einen Einrastpunkt bietet, wenn diese sich in die Kavität der Pinzette einschiebt.
In gleicher Weise wurde auch in der Pinzette 68 ein Methylphosphonat verwendet.
Auf der gegenüberliegenden Seite der Pinzette wurde jedoch statt des Glycins
wieder ein Guanidiniumcarbonylpyrrol der Gruppe SCHMUCK als
Aspartatrezeptorbaustein verwendet.
In Bindungsstudien zeigte sich leider für beide Rezeptoren, daß die Kavität der
Pinzette für die Seitenketten von Arginin oder Lysin nicht zugänglich ist. Lediglich
68 wies eine Affinität gegenüber einfachem Lysin in Höhe von 2500 M‐1 in einer
Chloroform/Methanol‐Mischung auf. Diese kann aber vollständig auf die
Wechselwirkung des Guanidiniumcarbonylpyrrolmoduls mit dem Carboxylat des
Lysins zurückgeführt werden. Um die Pinzette als aktiven Baustein in einem
künstlichen RGD‐Rezeptor einsetzen zu können, sind noch weitere Optimierungen
der angefügten Module notwendig. Insbesondere wirkt sich die zwitterionische
Struktur von 67 und 68 negativ auf die Löslichkeit der Rezeptoren in polaren
Lösungsmitteln oder Wasser aus.
6 Ausblick
Nach wie vor stellt die Entwicklung eines wirksamen künstlichen Rezeptors für die
RGD‐Sequenz, der in seiner Bindungsstärke und Selektivität mit biologischen
Rezeptoren konkurrieren kann, eine große Herausforderung an die supramolekulare
Chemie dar. Der modulare Aufbau solcher Rezeptoren aus einem benzylischen
Bisphosphonat und einem Guanidiniumcarbonylpyrrol mit variablem Linker
besticht durch seine hohe Flexibilität. Die Bindung von RGD‐Peptiden in wäßriger,
gepufferter Lösung konnte zwar nachgewiesen werden. Die bisher auf diesem Weg
erzielten Bindungsaffinitäten (~ 102 M‐1) sind jedoch noch um 4‐6 Größenordnungen
von denen der Natur entfernt.
Steigerungen könnten hier durch weitere Optimierung des Linkers erreicht werden.
Die bisher verwendeten peptidischen Linker weisen immer noch eine relativ große
Zusammenfassung und Ausblick
81
Flexibilität auf. Sterisch genau passende, starre Spacer, z.B. aromatische
Aminosäuren wie Aminobenzoesäure, lassen höhere Bindungskonstanten erwarten.
Dies wird gegenwärtig in der Gruppe SCHMUCK verfolgt.
Auch die Einführung eines dritten Phosphonatarmes im Argininerkennungsmodul
sollte mindestens eine Verdopplung der bisher erzielten Bindungskonstanten
bewirken. Synthetische Ansätze, das Trisphosphonat 14 mit einem
Guanidiniumcarbonylpyrrol zu verknüpfen, wurden in dieser Arbeit bereits
beschrieben.
RHN
ONHNH
OHN
NH
Abb. 42: Mögliches verbessertes Design des Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteins. Eine Modifizierung des Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteins läßt ebenfalls eine
Bindungsverstärkung erwarten. Die Einführung sterisch anspruchsvoller Gruppen
anstelle der Guanidiniumfunktion sollte die Eigenschaften der NH‐Donoren des
Bausteins als Carboxylatrezeptor in keiner Weise beeinträchtigen. Die zusätzlichen
Gruppen würden jedoch effektiv die Selbsterkennung der Guanidiniumfunktion
durch die im Rezeptor vorhanden Bis‐ bzw. Trisphosphonate und damit die störende
Selbstassoziation verhindern.
Nichtsdestotrotz werden durch diese Änderungen verbesserte Rezeptoren nicht mit
den natürlichen Integrinen konkurrieren können. Wesentlich vielversprechender
scheint der zuletzt verfolgte Ansatz zu sein, statt der benzylischen Bis‐ und
Trisphosphonate eine molekulare Pinzette als Argininerkennungsmodul zu
verwenden. Die für die einfache Bisphosphonatpinzette beschriebenen Affinitäten
gegenüber Lysin und Arginin prädestinieren diese für einen Einsatz in komplexeren
Rezeptorsystemen.[102]
Alternativ zu den Pinzetten 67 und 68 wurde in dieser Arbeit ein weiterer
synthetischer Zugang zu asymmetrisch substituierten Pinzetten entwickelt.
Bromacetylester und ‐amide lassen sich leicht etherartig an das Hydrochinonsystem
Zusammenfassung und Ausblick
82
der Pinzette kovalent anknüpfen. Mit dem bereits hergestellten Baustein 58 sind so
Varianten der vorliegenden Pinzetten darstellbar. Der zusätzliche Spacer in 58 sollte
sich günstig auf die RGD‐Bindung auswirken.
OMeO
HN HN
ONH
HN
O
NHBoc
NHOBr
O OP
Me O-O
58
OH
OH
OMeO
HNNH
O NH
HN
O
NH2+
HN
O
+
1) Aceton, KI, K2CO3, ∆2) THF, MePOCl2, NEt33) CH3CN, LiBr4) TFA/DCM
50
Abb. 43: Syntheseroute zu einer asymmetrisch substituierten Phosphonatpinzette über die in dieser Arbeit etablierte, einseitige WILLIAMSON‐Veretherung des Hydrochinonsystems der Pinzette 50 mit Bromacetylamiden.. Größtes Problem der beiden in dieser Arbeit hergestellten Phosphonatpinzetten
scheint jedoch deren zwitterionische Struktur zu sein, die ihre Löslichkeit zu sehr
herabsetzt. Um wieder Wasserlöslichkeit zu ermöglichen, ist eine zweite, anionische
Phosphonatgruppe notwendig. Unter Beibehalt des in dieser Arbeit etablierten
Syntheseweges könnte ein solches weiteres Phosphonat mit Hilfe der hier schon
verwendeten Phosphonoglycinsäure 10 eingeführt werden. Im einfachsten Fall
entstünde so eine direkt zum Rezeptor 67 analoge Bisphosphonatpinzette. Aber auch
die Anknüpfung eines Guanidiniumcarbonylpyrrols sollte möglich sein, wenn die
Phosphonoglycinsäure 10 zuvor mit der Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42
verknüpft wird.
Zusammenfassung und Ausblick
83
O
O O
NH3
PMe
O
O
PO
MeO
OH
OH
+ MePOCl2 +COOHZHN
POMeO
MeO
50 10
O
O O
NH
PMe
O
O
PO
MeO
OHN
O
HNNH2
NH2
OH
OH
+ MePOCl2 +
COOH
HNP O
MeO OMe
50
ONH2
HN
OBocHN
HN
Abb. 44: Retrosynthetische Analyse von zwei neuen Rezeptordesigns. In analoger Weise zur in dieser Arbeit ausgearbeiteten Synthese der Pinzetten 67 und 68 soll das Pinzettengrundgerüst 50 zunächst mit einer Aminosäure, die hier bereits eine zusätzliche Phosphonsäureestergruppe trägt, verestert werden. Anschließend kann mit Methylphosphonsäuredichlorid die übrige Hydroxylgruppe des Grundgerüsts phosphoryliert werden. Die Abspaltung der Schutzgruppen führt schließlich zu den zwei neuen Rezeptoren. In den beiden in dieser Arbeit hergestellten Rezeptoren 67 und 68 scheint die Kavität
der Pinzette jeweils für Gäste unzugänglich zu sein. Es ist nicht auszuschließen, daß
die gewählten Veresterungen zu einer räumlichen Anordnung der Rezeptoren
führen, in der die eingeführten Gruppen den Eingang zur Kavität versperren. Unter
Umständen ist daher ein Pinzettendesign notwendig, daß sich noch deutlich näher
an der Bisphosphonatpinzette von FOKKENS orientiert. Direkt an das Pinzettengerüst
sollten wie bei FOKKENS beidseitig je ein anionisches Phosphonat angeknüpft sein.
An eines (oder auch beide) der Phosphonate könnte wiederum ein
Aspartatrezeptormodul gebunden sein, das die Spezifität einer solchen, neuen
Pinzette für das RGD‐Peptid moduliert.
Zusammenfassung und Ausblick
84
O
OP
O
PMeO
O
ORn
R = NH3+, Carbonylpyrrolbaustein
OH
OH
50
+
+MePOCl2
PO
NSGnCl
Cl
PO
NSGnHO
HO + PCl5
PO
NSGnMeO
MeO+ KOH
BrNSGn
+ P(OMe)3
SG = Phtalimid, Carbonylpyrrolbaustein
Abb. 45: Ein neues Bisphosphonatrezeptordesign mit einem kovalent an eines der Phosphoratome gebundenen Aspartatrezeptormodul. Die Synthese geht von dem Phosphonsäuredichlorid des Aspartatrezeptormoduls aus, welches durch MICHAELIS‐ARBUZOV‐Reaktion aus dem entsprechenden Halogenalkan mit folgender Esterspaltung und Chlorierung hergestellt werden kann. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß kein praktikabler Weg existiert, ein
solches zusätzliches Rezeptormodul als Phosphor‐ oder Phosphonsäureester
einzuführen. Ein noch nicht beschrittener Weg besteht dagegen in der Herstellung
eines Phosphonsäuredichlorids, welches das gewünschte Aspartatrezeptormodul
kovalent an den Phosphor gebunden bereits enthält. Das benötigte Säurechlorid
könnte ausgehend von einem halogenierten Derivat des Aspartatrezeptormoduls in
einer Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion mit Trimethylphosphit hergestellt werden.
Folgende basische Verseifung des Phosphonsäuredimethylesters und Chlorierung
der Säure mit PCl5 führt schließlich zu dem Phosphonsäuredichlorid. Dieses kann je
nach zugegebener Menge ein‐ oder beidseitig mit dem Pinzettengerüst 50 reagieren
und wie bei dem Methylphosphonsäuredichlorid gewohnt mit Wasser oder
Methanol abgefangen werden. Als Aspartatrezeptormodul ist im einfachsten Fall
wieder eine Ammoniumgruppe vorzuschlagen, die während der Reaktionsfolge
sinnvollerweise phthalimidgeschützt vorliegt. Alternativ könnte auch ein
Zusammenfassung und Ausblick
85
entsprechender Guanidiniumcarbonylpyrrolbaustein hergestellt werden. Ein
vielversprechendes Modell wurde in einer Kraftfeldrechnung energieminimiert (s.
Abb. 46).
Abb. 46: Kraftfeldrechnung (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 10000 Schritte, OPLS‐AA, H2O) für ein neues RGD‐Rezeptordesign aus einer Bisphosphonatpinzette mit einem an ein Phosphonat angeknüpften Guanidiniumcarbonylpyrrol. Das RGD‐Peptid ist violett dargestellt. (Vgl. Abb. 45)
Experimenteller Teil
86
7 Experimenteller Teil
7.1 Materialien und Methoden
Dünnschichtchromatogramme wurden auf Aluminium‐Fertigplatten Kieselgel 60 F254
der Firma Merck ausgeführt. Die Substanzen wurden durch Betrachtung unter einer
UV Lampe (254 nm bzw. 366 nm) oder durch Anfärben mit CAM‐Tauchreagenz (2 g
Cersulfat, 50 mL konz. Schwefelsäure, 50 g Ammoniummolybdat und 400 mL
Wasser, Platte auf 100 °C erwärmen), bzw. mit Ninhydrin‐Tauchreagenz (0.3 %ige
Lösung in n‐Butanol, Essigsäure, Platte auf 100 °C erwärmen) sichtbar gemacht.
Für die Säulenchromatographie nach der Flash‐Methode wurde Kieselgel 60
(Korngröße 0.040‐0.063 mm) der Firma Merck verwendet. Die Elution erfolgte bei
Raumtemperatur unter Verwendung eines Preßluft‐Überdrucks.
HPLC‐Chromatographie wurde mit Merck‐Hitachi‐Anlagen (analytisch: L‐7150
Pumpe, L‐7400 UV Detektor, L‐7000 Interface Modul, Jasco Säulenofen, L‐7614
Lösungsmittel Entgaser; präparativ: K‐1800 Pumpe, K‐2501 UV‐Detektor, Advantec
SF‐3120 Probensammler) durchgeführt.
Schmelzpunkte wurden in offenen Glaskapillaren mit einer Kofler‐Apparatur
Thermophan von Reichert gemessen und sind nicht korrigiert.
UV/Vis‐Spektren wurden auf einem U‐3410 Spektrophotometer der Firma Hitachi
mit Temperiereinheit der Firma Haake gemessen. Die Basislinie wurde vor jeder
Messung mit reinem Puffer bestimmt. Für die Messungen wurden Küvetten der
Firma Helma verwendet mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einem
Strahlengang von 10 mm (Meßvolumen 500 µL).
Experimenteller Teil
87
Massenspektren (MS) wurden durch den MS‐Service des FB‐Chemie, Philipps‐
Universität Marburg, aufgenommen. ESI‐Massenspektren wurden auf einem
Finnigan TSQ 7000, Finnigan MAT 95 oder S“Qstar Pulsar i” ESI‐TOF
Massenspektrometer (Applied Biosystems, Darmstadt) gemesssen. FD‐Massenspektren
wurden mit einer Finnigan MAT 95 S aufgenommen. MALDI‐TOF‐Massenspektren
wurden auf einem Bruker Flex III gemessen. Es werden die wichtigsten Signal in m/z‐
Einheiten angegeben, wobei wenn möglich eine Zuordnung in Klammern angemerkt
ist.
ITC
Mikrokalorimetrische Messungen wurden an einem VP‐ITC‐Gerät der Firma
MicroCal (Modell aus dem Jahr 2003) durchgeführt.
Lösungsmittel und Chemikalien wurden falls nicht anders erwähnt, in den
kommerziell erhältlichen Qualitäten puriss. p.a. oder purum. eingesetzt und wurden
von den Firmen Fluka, Aldrich, Acros, und Merck bezogen. Aminosäuren, Peptide und
Kupplungsreagenzien wurden von den Firmen Novabiochem, Bachem, Advanced
Chemtech, Applied Biosystems und Iris Biotech bezogen. THF wurde über Natrium,
Dichlormethan über Calciumhydrid, Methanol über Magnesium und Ethanol über
Natrium / Phthalsäure‐diethylester getrocknet. DMF und NMP wurden speziell für
die Peptidsynthese von Fluka bezogen. Lösungsmittel für Extraktionen und
Säulenchromatographie waren von technischer Qualität und wurden vor der
Verwendung destilliert.
Schutzgasbedingungen
Reaktionen wurden grundsätzlich in einer inerten Argon‐Atmosphäre durchgeführt
und die verwendeten Glasgeräte zuvor im HV durch Erhitzen mit einem
Heißluftgebläse von Wasserspuren befreit.
Experimenteller Teil
88
Molecular Modeling Untersuchungen
Kraftfeldrechnungen wurden mit dem Programm MacroModel V 7.2 der Firma
Schroedinger INC. durchgeführt.[120] Verwendet wurden die Kraftfelder AMBER*
sowie OPLS‐AA und das GB/SA Solvatationsmodell für Wasser.[121, 122] Monte‐Carlo
Simulationen wurden mit 5000‐10000 Schritten gerechnet. Anschließende
Moleküldynamik‐Rechnungen wurden 100 ps bei 300 K durchgeführt und durch
Überlagerung der alle 10 ps gespeicherten Strukturen abgebildet.
Weitere Darstellungen von Proteinen und ihren Liganden wurden mit dem
Programm Sybyl 6.0 angefertigt und durch einfache Minimierung mit MMFF95*
strukturell optimiert.
Die Visualisierung der berechneten Strukturen erfolgte mit den frei erhältlichen
Programmen ISI WebLab Viewer Lite und PyMol.[123, 124]
Kernresonanzspektren (NMR) wurden falls nicht anders angegeben bei 300 K auf
den Geräten Bruker DRX 200, Bruker AMX 300, Bruker AMV 300, Bruker AMX 400 und
Bruker AMX 500 aufgenommen. In Klammern sind jeweils die Meßfrequenz in MHz
sowie das Lösungsmittel vermerkt. Die chemische Verschiebung δ ist in ppm und die
Kopplungskonstante J in Hz angegeben. Kalibriert wurde jeweils auf das
Restprotonensignal des Lösungsmittels.[125] Die Signalmultiplizitäten wurden mit den
Symbolen s (Singulett), br s (breites Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), m
(Multiplett) gekennzeichnet.
Experimenteller Teil
89
7.2 Synthesen
7.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften
Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV I zur Abspaltung von Z‐Schutzgruppen:
Die zu entschützende Substanz wird zusammen mit etwa fünf Gewichtsprozent
Hydrierkatalysator Pd/C (10 %) in einen Schlenckkolben gegeben und mit Methanol
überschichtet. Die resultierende Suspension wird 24 h unter einer
Wasserstoffatmosphäre bei RT gerührt. Anschließend wird die flüssige Phase durch
zwei doppelt gelegte Faltenfilter abfiltriert und der Rückstand mit reichlich
Methanol gewaschen. Die vereinigten methanolischen Phasen werden unter
vermindertem Druck so weit wie möglich eingeengt und der Rückstand im
Hochvakuum getrocknet, um in quantitativer Ausbeute das gewünschte Amin zu
erhalten.
Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV II zur Abspaltung von Boc‐Schutzgruppen:
Die zu entschützende Substanz wird in einer Mischung von fünf Teilen
Dichlormethan und einem Teil Trifluoressigsäure gelöst und 3 h bei RT gerührt.
Anschließend wird das Lösungsmittel nach Zugabe von reichlich Toluol unter
vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird noch weitere zwei Male in
Toluol aufgenommen und unter vermindertem Druck wieder eingeengt. Nach
Trocknen im Hochvakuum erhält man in quantitativer Ausbeute das gewünschte
Amin als Trifluoressigsäuresalz.
Zum Umsalzen kann das erhaltene Trifluoressigsäuresalz in 1 N Salzsäure gelöst
werden und unter vermindertem Druck wieder eingeengt, sowie im Hochvakuum
getrocknet werden. Bei empfindlichen Substanzen kann statt der Destillation die
wäßrige Phase auch schonender durch Lyophilisation entfernt werden.
Experimenteller Teil
90
Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV III zur LiBr‐Spaltung von benzylischen
Bis(phosphonsäuredimethylestern):
Der zu verseifende benzylische Bis(phosphonsäuredimethylester) wird in absolutem
Acetonitril gelöst und 2.4 Äquivalente sorgfältig getrocknetes LiBr (1.2 Äquivalente
pro Phosphonsäureestergruppe) zugegeben. Die Lösung wird mindestens 16 h unter
Rückfluß erhitzt. Das entstehende benzylische Bisphosphonatsalz fällt als weißer
Feststoff aus. Nach Abkühlen der Lösung kann der Feststoff durch Zentrifugation
(4000 Upm, 5 min) abgetrennt werden. Zur Entfernung von überschüssigem LiBr
und etwaigen Verunreinigungen wird der Feststoff noch dreimal in Diethylether
aufgenommen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknen im HV erhält man das
benzylische Bisphosphonat als weißes Lithiumsalz in quantitativer Ausbeute.
Bei reaktionsträgen Phosphonsäuredimethylestern kann die Reaktionszeit verlängert
werden und ein größerer Überschuß LiBr eingesetzt werden bis zum vollständigen
Umsatz. Die Reaktionskontrolle erfolgt am Einfachsten mittels 31P‐NMR.
In der Regel kann diese Vorschrift auch analog auf andere Substrate mit
unterschiedlicher Zahl von Phosphonsäuredimethylestergruppen angewendet
werden.
Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV IV zur Peptidknüpfung mit auf Hydroxybenz‐
triazol basierenden Kupplungsreagenzien (HBTU, TBTU, HCTU, TCTU) in Lösung:
Ein Äquivalent der Carbonsäure wird in absolutem Dichlormethan oder DMF (je
nachdem, worin sich die zu kuppelnde Carbonsäure und Amin vollständig lösen.
DCM ist vorzuziehen. Auch Mischungen aus DCM und DMF sind möglich.) gelöst
und auf 0 °C gekühlt. Dazu werden 2.5 Äquivalente HOBt, 1.0 Äquivalente des
Kupplunsreagenzes und 3.0 Äquivalente DIEA (wird das zu kuppelnde Amin als
Hydrochlorid eingesetzt, so wird die Menge an DIEA entsprechend erhöht)
zugegeben und 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Anschließend werden 1.0 Äquivalente
des zu kuppelnden Amins zugefügt und die Lösung 1‐3 h bei RT gerührt. Der
Fortschritt der Reaktion kann per DC kontrolliert werden (Wird DMF als
Experimenteller Teil
91
Lösungsmittel verwendet, so wird hierfür ein Aliquot entnommen, dieses in etwa
1 mL DCM aufgenommen und mit 1 mL Wasser gewaschen. Die organische Phase
kann nun auf eine DC‐Karte aufgetragen werden.). Die Reaktion wird schließlich
durch Zugabe von Wasser beendet. Wurde DMF als Lösungsmittel verwendet, so
wird nun Dichlormethan zugegeben. Die organische Phase wird je dreimal mit 1 M
NaHSO4‐Lösung, 1 M Natriumhydrogencarbonatpuffer pH 10 und gesättigter
Natriumchloridlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, unter vermindertem
Druck eingeengt und am HV getrocknet. Eine weitere Aufreinigung kann
säulenchromatographisch erfolgen.
Bei der Kupplung von Phosphonsäurebausteinen ist zu beachten, dass diese häufig
partiell wasserlöslich sind. Daher kann zur Verbesserung der Ausbeute in diesem
Fall das Waschen der organischen Phase unterbleiben und direkt
säulenchromatographisch aufgereinigt werden.
Experimenteller Teil
92
7.2.2 Synthesen zu Kapitel 4.2
Rac‐2‐(benzyloxycarbonylamino)‐2‐(dimethoxyphosphoryl)essigsäure
(Z‐PGly‐OH) 10
OHN
O POH
O
MeO OMeO
C12H16NO7P, MG: 317.23 g/mol
Darstellung:
392 mg (1.183 mmol) rac‐Z‐Phosphonoglycinsäuretrimethylester werden in 15 mL
Methanol gelöst und auf ‐18 °C gekühlt. Dazu gibt man in 5 mL Wasser gelöste
32 mg (1.336 mmol; 1.1 Äq.) Lithiumhydroxid. Die Mischung wird zunächst 4 h bei ‐
18 °C und danach noch weitere 20 h bei ‐4 °C gerührt. Nach Zugabe von etwa
weiteren 30 mL Wasser schüttelt man die Lösung mit 40 mL Dichlormethan aus. Aus
der organischen Phase kann übriges Edukt wiedergewonnen werden. Die wässrige
Phase wird mit 0.2 N angesäuert und wiederum mit Dichlormethan ausgeschüttelt.
Nach Trocknen der organischen Phase mit Natriumsulfat und Entfernen des
Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 262 mg (0.826 mmol; 69 %)
Rac‐2‐(benzyloxycarbonylamino)‐2‐(dimethoxyphosphoryl)essigsäure als farblosen,
leicht öligen Feststoff.
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.76 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, ‐O‐CH3), 3.85 (d, 3JHP =
11.3 Hz, 3 H, ‐O‐CH3), 4.97 (dd, 2JHP = 22.3 Hz, 3JHH = 9.1 Hz, 2 H, P‐CH), 5.11 (s, 2 H,
Z‐CH2‐), 5.81 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 1 H, NH), 7.31‐7.35 (m, 5 H, Ar‐H), 10.02 (br s, 1 H,
COOH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 20.4.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 340 [M+Na+].
Experimenteller Teil
93
3,5‐Bis(brommethyl)nitrobenzen 11a
NO2
Br Br
C8H7Br2NO2, MG: 308.95 g/mol
Darstellung:
20.0 g (132 mmol) 5‐m‐Nitroxylol werden in 300 mL Tetrachlorkohlenstoff gelöst und
54.2 g (304 mmol; 2.3 Äq.) N‐Bromsuccinimid sowie wenig AIBN zugefügt. Die
Suspension wird langsam erhitzt. Nach Anspringen der Reaktion, erkennbar an dem
sich bildenden und an der Oberfläche schwimmenden Succinimid, wird die
Suspension 3 h refluxiert. Nach dem Abkühlen wird das feste Succinimid abfiltriert
und der Filterkuchen mit etwas Tetrachlorkohlenstoff gewaschen. Die vereinigten
organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer abdestilliert und das
verbleibende Rohprodukt im HV getrocknet. Dabei handelt es sich um ein Gemisch
unterschiedlich häufig bromierter Derivate, wobei das gewünschte Produkt zu einem
Anteil von etwa 30 % enthalten sein sollte. Das Gemisch kann jedoch ohne weitere
Aufreinigung in der nächsten Reaktionsstufe eingesetzt werden und dort leicht
getrennt werden.
Ist dennoch eine Aufreinigung gewünscht, so können die Reaktionsprodukte in
möglichst wenig Essigsäureethylester gelöst werden. Daraufhin wird so lange n‐
Hexan zugegeben, bis eine leichte Trübung auftritt. 6.1 g 3,5‐
Bis(brommethyl)nitrobenzen (20 mmol, 15 %) fallen nach etwa 12 h Stehen bei 4 °C
als weißer Feststoff aus.
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 4.52 (s, 4 H, ‐CH2), 7.75 (s, 1 H, Ar‐H), 8.19 (d, 4JHH =
1.5 Hz, 2 H, Ar‐H).
Experimenteller Teil
94
3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)nitrobenzen (BP‐NO2) 11
NO2
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
C12H19NO8P2 ; MG: 367.23 g/mol
Darstellung:
4.5 g 3,5‐Bis(brommethyl)nitrobenzen 11a (14.6 mmol) werden in ca. 30 mL
Trimethylphosphit gelöst und 5 h unter Reflux erhitzt. Nach Abkühlen der nun in
der Regel dunkelbraunen Lösung wird überschüssiges Trimethylphosphit
abkondensiert. Der Rückstand wird säulenchromatographisch (DCM/MeOH 15:1
v/v) aufgereinigt. Man erhält nach Trocknung im HV 4.2 g 3,5‐
Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)nitrobenzen (11.6 mmol, 80 %) als weißen Feststoff.
Analytik:
DC: RF (EE/MeOH 2:1 v/v) = 0.45, RF (DCM/MeOH 10:1 v/v) = 0.59.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.25 (d, 2JHP = 22.3 Hz, 4 H, ‐PCH2), 3.73 (d, 3JHP = 10.7
Hz, 12 H, POCH3), 7.59(s, 1 H, Ar‐H), 8.04‐8.07 (m, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 27.3.
Experimenteller Teil
95
3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin (BP‐NH2) 9
NH2
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
C12H21NO6P2 , MG: 337.08 g/mol
Darstellung:
Etwa 50 mg Pd/C – Hydrierkatalysator (10 %) werden in einer Lösung von 1.0 g 3,5‐
Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)nitrobenzen 11 (2.72 mmol) in 15 mL Methanol
suspendiert. Diese Suspension wird in einer Wasserstoffatmosphäre 15 h bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird der Katalysator über zwei doppelt
gelegte Faltenfilter abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wird
unter vermindertem Druck abdestilliert und der verbleibende ölige, farblose
Rückstand im HV getrocknet, wobei er häufig auskristallisiert. Das Rohprodukt kann
ohne weitere Aufreinigung für nachfolgende Kupplungsreaktionen eingesetzt
werden.
Analytik:
DC (DCM/MeOH 10:1 v/v): RF = 0.20
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.04 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, ‐P‐CH2), 3.65 (d, 3JHP = 10.8
Hz, 12 H, ‐PO‐CH3), 6.64 (s, 1 H, Ar‐H), 7.98 (s, 3 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.4.
Experimenteller Teil
96
Rac‐Benzyloxycarbonyl‐2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinyl‐3,5‐
bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin (BP‐PGly‐Z) 13
OHN
O P
O
MeO OMeO
NH
P
P
MeOMeO
O
OMeMeO
O
C24H35N2O12P3 MG: 636.46 g/mol
Darstellung:
75 mg (0.236 mmol) Rac‐2‐(benzyloxycarbonylamino)‐2‐dimethoxyphosphoryl)essig‐
säure und 88 mg (0.260 mmol; 1.1 Äq.) 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
werden in 30 mL trockenem Dichlormethan gelöst. Dazu werden 67 mg (0.260 mmol;
1.1 Äq.) Mukaiyama‐Reagenz und 100 μL (0.709 mmol; 3 Äq.) Triethylamin gegeben.
Die Lösung wird für 15 h gerührt und anschließend je dreimal mit 1 M NaHSO4, 1 M
Na2CO3/NaHCO3 und Brine ausgeschüttelt. Nach Trocknen der organischen Phase
über Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels unter vermindertem
Druck werden 100 mg BP‐PGly‐Z 13 (0.157 mmol; 66 %) erhalten.
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Ethanol 1:1 v/v): RF = 0.37.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.12 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H, ‐PCH2), 3.70 (d, 3JHP = 10.8
Hz, 12 H, Bz‐POCH3), 3.78 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 3.89 (d, 3JHP = 11.0 Hz,
3 H, Gly‐POCH3), 5.00 (dd, 2JHP = 20.0 Hz, 3JHH = 8.0 Hz, 1 H, ‐PCHNH‐), 5.16 (s, 2 H,
Z‐CH2), 5.80 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H, Gly‐NH), 7.02 (s, 1 H, Ar‐H), 7.33‐7.37 (m, 7 H, Ar‐
H), 8.86 (s, 1 H, Ar‐NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 21.2, 28.9.
FD‐MS (MeOH): m/z = 636 [M+].
ESI‐MS (MeOH): m/z = 637 [M+H+], 659 [M+Na+], 675 [M+K+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C24H35NaN2O12P3+: 659.1301, gef.: 659.1313.
Experimenteller Teil
97
Rac‐2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐PGly‐NH2) 16
H2N
P
O
MeO OMeO
NH
P
P
MeOMeO
O
OMeMeO
O
C16H29N2O10P3, MG: 502.33 g/mol
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.14 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, ‐PCH2), 3.74 (d, 3JHP = 10.8
Hz, 12 H, Bz‐POCH3), 3.85 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 3.89 (d, 3JHP = 10.8 Hz,
3 H, Gly‐POCH3), 4.03‐4.11 (m, 1 H, Gly‐NH), 7.01 (s, 1 H, Ar‐H), 7.47 (s, 2 H, Ar‐H),
9.32 (s, 1 H, Ar‐NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 24.6, 28.9.
Experimenteller Teil
98
Rac‐N‐[Benzyloxycarbonyl‐2‐(methoxyphosphinato)glycinyl]‐3,5‐
bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Trilithiumsalz (BP2‐‐PGly‐‐Z) 14
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiMeO
O
C21H26Li3N2O12P3, MG: 612.18 g/mol
Darstellung:
30 mg BP‐PGly‐Z 13 (47 mmol, 1.0 Äq.) werden in absolutem Acetonitril gelöst und
5.0 Äq. sorgfältig getrocknetes Lithiumbromid zugegeben. Die Lösung wird 16 h
unter Rückfluß erhitzt. Das entstehende Trisphosphonatsalz fällt als weißer Feststoff
aus. Nach Abkühlen der Lösung kann der Feststoff durch Zentrifugation (4000 Upm,
5 min) abgetrennt werden. Er wird noch dreimal in Diethylether wieder
aufgenommen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknen im HV erhält man 28 mg
BP3‐‐PGly‐Z 14 (28 mg, 98 %) als weißen Feststoff.
Analytik:
1H‐NMR (400 MHz, D2O): δ = 3.06 (d, 2JHP = 20.3 Hz, 4 H, ‐PCH2), 3.55 (d, 3JHP = 9.4 Hz,
6 H, Bz‐POCH3), 3.65 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 4.62 (d, 2JHP = 20.7 Hz, 1 H,
PCHNH‐), 5.20 (s, 2 H, Z‐CH2), 7.05‐7.47 (m, 8 H, Ar‐H).
13C‐NMR (100 MHz, D2O): δ = 23.2, 32.7, 34.0, 51.8, 51.9, 52.8, 52.9, 54.2, 55.5, 67.3,
67.5, 67.8, 120.7, 127.7, 127.8, 128.4, 128.7, 135.7, 136.5, 157.9, 158.4, 168.8.
31P‐NMR (81 MHz, D2O): δ = 15.7, 26.7.
ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 197 [M3‐], 299 [M3‐+Li+]2‐.
Experimenteller Teil
99
Rac‐N‐[2‐(methoxyphosphinato)glycinyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin
Trilithiumsalz (BP2‐‐PGly‐‐NH2) 15
H2N
P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiMeO
O
C13H20Li3N2O10P3 , MG: 478.05 g/mol
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.90 (d, 2JHP = 21.0 Hz, 4 H, PCH2), 3.46 (d, 3JHP =
10.8 Hz, 6 H, Bz‐POCH3), 3.53 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 4.04 (d, 2JHP = 17.0
Hz, 1 H, PCHNH‐), 6.92 (s, 1 H, Ar‐H), 7.30 (d, 4JHP = 1.5 Hz, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 20.4, 25.9.
ESI‐MS (H2O, ESI‐negativ): m/z = 230 [M3‐+H+]2‐.
Experimenteller Teil
100
Rac‐ 2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinmethylester 17
H2N
P
O
MeO OMeO
COOMe
C6H12NO6P , MG: 225.14 g/mol
Darstellung: ΑAV I
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.82 (s, 3 H, ‐COCH3), 3.80 (d, 3JHP = 11.1Hz, 6 H, ‐
POCH3), 5.23 (d, 2JHP = 22.1Hz, 1 H, ‐PCHNH2).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 15.1.
(Benzyloxycarbonylglycinyl)‐(2‐phosphono)glycintrimethylester
(Z‐Gly‐PGly‐OMe) 18
HN
O P
O
MeO OMeO
COOMeO NH
O
C16H21N2O9P , MG: 416.32 g/mol
Darstellung:
Eine Lösung von 1.56 g Rac‐ 2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinmethylester 17
(6.91 mmol, 1.0 Äq.) in DMF wird auf 0 °C gekühlt und 1.44 g Z‐Gly‐OH (6.91 mmol,
1.0 Äq.), 2.93 g Cl‐HOBt (6.91 mmol, 1.0 Äq.), 2.86 g HCTU (6.91 mmol, 1.0 Äq.) und
4.70 mL DIEA (27.7 mmol, 4.0 Äq.) zugegeben. Die Mischung wird auf RT allmählich
erwärmt und 2 h gerührt. Anschließend wird Wasser zugegeben und dreimal mit
DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden wiederum je dreimal
mit 1M NaHSO4‐Lösung, 1 M Natriumhydrogencarbonatpuffer pH 10 und
gesättigter NaCl‐Lösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, unter vermindertem
Druck eingeengt und am HV getrocknet. Das so erhaltene Produkt kann
säulenchromatographisch (MeOH/EE 1:10 v/v) weiter aufgereinigt werden. Es
werden 920 mg Z‐Gly‐Pgly‐OMe 18 (2.21 mmol, 32 %)erhalten.
Experimenteller Teil
101
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.83 (s, 3 H, ‐COCH3), 3.79 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, ‐
POCH3), 3.82 (d, 3JHP = 11.2 Hz, 3 H, ‐POCH3), 3.98 (d, 3JHH = 5.3 Hz, 2 H, Gly‐CH2),
5.14 (s, 2 H, Z‐CH2), 5.25 (d, 2JHP = 22.0 Hz, 1 H, ‐PCHNH‐), 7.35‐7.36 (m, 5 H, Ar‐H),
8.02 (s, 1 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 18.5.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 439 [M+Na+]+.
N‐[4‐(1,3‐dioxoisoindolin‐2‐yl)benzyl]‐N‐[(diethoxyphosphoryl)methyl]‐3,5‐
bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzamid 4b
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
NO
P N
O
O
EtOEtO O
C33H39N2O12P3, MG: 750.19 g/mol
Darstellung:
100 mg (0.194 mmol) 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐N‐(diethoxyphosphoryl‐
methyl) benzamid werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und mit 1.3
Äq. Natriumhydrid versetzt. Die Suspension wird zwei Stunden bei RT gerührt,
bevor portionsweise 306 mg 2‐(4‐(Brommethyl)phenyl)isoindolin‐1,3‐dion
(0.97 mmol, 5.0 Äq.) zugegeben werden. Nach vier weiteren Stunden bei 60 °C wird
das Dimethylformamid im Vakuum abdestilliert und das Produkt
säulenchromatographisch (Essigsäureethylester/Ethanol 2:1 v/v) gereinigt.
Experimenteller Teil
102
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Ethanol 1:1 v/v): RF = 0.3.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.37 (t, 3JHH = 7.0 Hz, 6 H, CH3CH2‐), 3.17 (d, 2JHP =
22.0 Hz, 4 H, Ar‐CH2P), 3.65 (d, 3JHP = 10.8 H, 12 H, POCH3), 3.95 (d, 2JHP = 11.5 Hz, 2
H, NCH2P), 4.15‐428 (m, 4 H, PCH2CH3), 4.54 und 4.81 (s, 2 H, NCH2, Peptidbindung
cis‐ bzw. transständig), 7.31‐7.52 (m, 7 H, Ar‐H), 7.79‐7.83 (m, 2 H, Ar‐H), 7.95‐8.00
(m, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 22.6, 28.3.
ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 751 [M+H+], 773 [M+Na+].
FD‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 750 [M+].
(Benzyloxycarbonylglycinyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin (BP‐Gly‐Z)
21
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
O
NH
OO
C22H30N2O9P2, MG: 528.43 g/mol
Darstellung:
142 mg Z‐Gly‐OH (0.68 mmol, 1.0 Äq.), 283 mg Cl‐HOBt (1.67 mmol, 2.5 Äq.) und
0.35 mL Diisopropylethylamin (2.04 mmol, 3.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem
Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 240 mg TCTU (0.68 mmol, 1.0Äq.) wird
die Lösung zehn Minuten gerührt, bevor schließlich 270 mg 3,5‐
Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 (0.80 mmol, 1.2 Äq.) hinzugefügt werden
und weitere zwei Stunden bei RT gerührt wird. Die Reaktion wird durch Zugabe von
Experimenteller Teil
103
30 mL Wasser beendet und die wäßrige Phase vier Male mit je 40 mL Chloroform
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter
Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach
Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und
säulenchromatographischer Aufreinigung des Rückstandes (EE/Ethanol 2:1 v/v)
verbleiben 268 mg (0.51 mmol, 75 %) BP‐Gly‐Z als weißer Feststoff.
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Ethanol 2:1 v/v): RF = 0.20.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.10 (d, 2JHP = 22.2 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.66 (d, 3JHP = 10.5
Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.99 (s, 2 H, Gly‐α‐CH2), 5.12 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.94 (s, 1 H, Ar‐
H), 7.32 (m, 5 H, Ar‐H), 7.42 (s, 2 H, Ar‐H), 8.85 (s, 1 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.1.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 551 [M+Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C22H30N2NaO9P2+: 551.1319, gef.: 551.1289.
N‐Glycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐Gly‐NH2)
32
HN
P P-O
MeO
OO-
OMe
O
O
NH2
Li+ Li+
C12H18Li2N2O7P2, MG: 378.11 g/mol
Darstellung: AAV I
Experimenteller Teil
104
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.64 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.09 (s, 2 H, α‐
CH2), 3.22 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 6 H, POCH3), 6.72 (s, 1 H, Ar‐H), 7.08 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.9.
ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 182 [M2‐], 365[M2‐+H+]‐.
(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐Gly‐Gly‐Z) 22
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH
O
O
C24H33N3O10P2, MG: 585,48 g/mol
Darstellung: AAV IV
Kupplungsreagentien: HCTU, Cl‐HOBt
Edukte: 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 und Z‐GlyGly‐OH
Ausbeute: 82 %
Analytik:
DC (EE/MeOH 2:1 v/v): RF = 0.33, (EE/MeOH 5:1 v/v): RF = 0.09.
Smp.: 135 °C.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.06 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.67 (d, 3JHP = 10.8
Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.94 (d, 3JHH = 3.0 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 4.08 (d, 3JHH = 4.0 Hz, 2 H,
Gly‐α‐CH2), 5.11 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.71 (br s, 1 H, NH), 6.87 (s, 1 H, Ar‐H), 7.29‐
7.34 (m, 5 H, Ar‐H), 7.47 (s, 2 H, Ar‐H), 9.37 (s, 1 H, NH).
Experimenteller Teil
105
13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 32.1 (d, 1JCP = 91.0 Hz), 43.5, 44.3, 53.0, 67.0, 119.7,
126.4, 128.1, 128.2, 131.8‐132.0 (m, 1 C), 136.2, 138.7, 157.2, 167.6, 170.6, 174.9.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.4.
ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 608 [M+Na+], 624 [M+K+].
FD‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 585 [M]+, 608 [M+Na+].
N‐Glycinylglycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz
(BP2‐‐Gly‐Gly‐NH2) 33
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH2
Li+
Li+
C24H33N3O10P2, MG: 585,48 g/mol
Darstellung: AAV III
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.91 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.32 (s, 2 H,
Gly‐α‐CH2NH2), 3.48 (d, 3JHP = 10.3 Hz, 6 H, ‐OCH3), 4.00 (s, 2 H, Gly‐α‐CH2), 7.01 (s,
1 H, Ar‐H), 7.31 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 26.0.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 424 [M+3H+]+, 436 [M+H++2Li+]+, 468 [M+H++2Na+]+, 500
[M+H++2K+]+.
Experimenteller Teil
106
(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylglycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐
anilin (BP‐Gly‐Gly‐Gly‐Z) 23
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH
O HN O
O
C26H36N4O11P2, MG: 642.53 g/mol
Darstellung: AAV IV
Kupplungsreagentien: HCTU, Cl‐HOBt
Edukte: 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 und Z‐GlyGlyGly‐OH
Ausbeute: 48 %
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Methanol 10:1 v/v): RF = 0.03.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.06 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.43 (d, 3JHP = 10.8
Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.79 (d, 3JHH = 6.0 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 3.98 (d, 3JHH = 6.0 Hz, 2 H,
Gly‐α‐CH2), 4.14 (d, 3JHH = 6.6 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 5.30 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.70 (br s,
1 H, NH), 6.85 (s, 1 H, Ar‐H), 7.17‐7.25 (m, 5 H, Ar‐H), 7.68 (s, 2 H, Ar‐H), 7.77‐7.84
(m, 2 H, NH), 9.11 (s, 1 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 30.0.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 665 [M+Na+].
Experimenteller Teil
107
N‐(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylglycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐
methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐‐Gly‐Gly‐Gly‐Z) 23a
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
O HN O
OLi+
Li+
C24H30Li2N4O11P2, MG: 626.34 g/mol
Darstellung: AAV III
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.99 (d, 2JCP = 20.2 Hz, 4 H, CH2P), 3.50 (d, 3JCP =
10.5 Hz, 6 H, POCH3), 3.90 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.00 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.04 (s, 2 H, Gly‐
CH2), 5.11 (s, 2 H, Z‐CH2), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H), 7.19 (s, 2 H, Ar‐H), 7.38 (s, 5 H, Ar‐H).
13C‐NMR (75 MHz, d4‐MeOD): δ = 33.9 (d, 1JCP = 128.6 Hz), 43.1, 43.4, 44.3, 52.4, 67.9,
121.1, 128.3, 128.4,129.0, 129.3, 136.2, 136.7, 173.8.
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 26.8.
N‐Glycinylglycinylglycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz
(BP2‐‐Gly‐Gly‐Gly‐NH2) 34
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
ONH2
Li+
Li+
C16H24Li2N4O9P2, MG: 492.21 g/mol
Experimenteller Teil
108
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 2.96 (d, 2JCP = 20.2 Hz, 4 H, CH2P), 3.47 (d, 3JCP = 10.2 Hz,
6 H, POCH3), 3.96 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.00 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.03 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.96
(s, 1 H, Ar‐H), 7.14 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, D2O): δ = 26.7.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 486 [M2‐+ Li++H+], 537 [M2‐+ Na++HCl].
S‐(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylalaninyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphoryl‐
methyl)anilin (BP‐Ala‐Gly‐Gly‐Z) 26
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH
O HN O
O
C27H38N4O11P2, MG: 656.56 g/mol
Darstellung:
193 mg Z‐Gly‐Gly‐Ala‐OH (0.572 mmol, 1Äq.) werden in 20 mL absolutem DMF
gelöst und 292 μL DIEA (1.72 mmol, 3.0 Äq.), 242 mg Cl‐HOBt (1.43 mmol, 2.5 Äq.)
und 214 mg TCTU zugegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei RT gerührt, bevor
183 mg in wenigen mL absolutem DCM gelöstes 3,5‐
Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 (0.574 mmol, 1.0 Äq.) zugefügt werden und
weitere zwei Stunden gerührt wird. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe
von 3 mL H2O beendet und die flüssige Phase durch Abkondensieren entfernt. Der
Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (Essigsäureethylester/Methanol
2:1 v/v), um 136 mg Produkt (0.207 mmol, 36 %) als gelbliches Öl zu isolieren.
Experimenteller Teil
109
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Methanol 2:1): RF = 0.06.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.51 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 3.09 (d, 2JCP =
20.1 Hz, 4 H, CH2P), 3.45‐3.50 (m, 4 H, Gly‐CH2), 3.65 (d, 3JCP = 10.8 Hz, 12 H, POCH3),
4.12 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H, Ala‐α‐CH), 4.70 (d, 2JHH = 11.7 Hz, 1 H, Z‐CH2), 5.00 (d, 2JHH
= 12.0 Hz, 1 H, Z‐CH2), 6.89 (s, 1 H, Ar‐H), 7.13‐7.26 (m, 5 H, Ar‐H), 7.48 (br s, 1 H,
NH), 7.56‐7.69 (m, 2 H, NH), 7.76 (s, 2 H, Ar‐H), 8.97 (s, 1 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.4.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 657 [M+H+], 679 [M+Na+], 695 [M+K+].
(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylalaninyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐
methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐‐Ala‐Gly‐Gly‐Z) 26a
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
O HN O
O
Li+
Li+
C25H32Li2N4O11P2, MG: 640.37 g/mol
Darstellung: AAV III
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 1.43 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 2.97 (d, 2JCP = 20.5
Hz, 4 H, CH2P), 3.49 (d, 3JCP = 10.8 Hz, 6 H, POCH3), 3.86 (s, 2 H, Gly‐CH2), 3.95 (s, 2
H, Gly‐CH2), 4.41 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H, Ala‐α‐CH), 5.08 (s, 2 H, Z‐CH2), 6.99 (s, 1 H,
Ar‐H), 7.16 (s, 2 H, Ar‐H), 7.35‐7.37 (m, 5 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, D2O ): δ = 26.7.
ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 313 [M2‐].
Experimenteller Teil
110
N‐Glycinylglycinylalaninyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz
(BP2‐‐Ala‐Gly‐Gly‐NH2) 37
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
ONH2
Li+
Li+
C25H32Li2N4O11P2, MG: 640.37 g/mol
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 1.44 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 2.99 (d, 2JCP = 20.5
Hz, 4 H, CH2P), 3.49 (d, 3JCP = 10.4 Hz, 6 H, POCH3), 3.54 (s, 2 H, Gly‐CH2), 3.99 (s, 2
H, Gly‐CH2), 4.42 (q, 3JHH = 7.2 Hz, 1 H, Ala‐α‐CH), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H), 7.17 (s, 2 H,
Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, D2O ): δ = 26.7.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 246 [M2‐], 493 [MH‐], 499 [M2‐+Li+]‐.
Experimenteller Teil
111
(S)‐(Benzyloxycarbonylalaninyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐Ala‐Z) 24
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
O
NH
OO
C23H32N2O9P2, MG: 542.46 g/mol
Darstellung: AAV IV
Kupplungsreagentien: TBTU, HOBt
Edukte: 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 und Z‐Ala‐OH
Ausbeute: 39 %
Analytik:
DC (EE/EtOH 2:1 v/v): RF = 0.30.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.40 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, CHCH3), 3.07 (d, 2JHP = 21.8
Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.66 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, ‐OCH3), 4.30‐4.49 (m, 1 H, Ala‐α‐CH),
5.12 (d, 4JHH = 2.0 Hz, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 5.84 (d, 3JHH = 7.7 Hz, 1 H, Z‐NH), 6.92 (s, 1 H,
Ar‐H), 7.27‐7.38 (m, 7 H, Ar‐H), 9.04 (s, 1 H, Ar‐NH).
13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.6, 32.5 (1JCP = 91.4 Hz), 51.2, 53.0 (2JCP = 3.7 Hz), 67.1,
119.8, 126.7, 128.1, 128.2, 128.5, 132.2 (2JCP = 4.1 Hz), 136.2, 138.6, 156.2, 170.9.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.1.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 535 [M+Na+].
Experimenteller Teil
112
(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylalaninyl)]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin
Dilithiumsalz (BP2‐‐Ala‐Z) 24a
HN
P P-O
MeO
OO-
OMe
O
O
NH
OO
Li+ Li+
C21H26Li2N2O9P2, MG: 526.27/mol
Darstellung: AAV III
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.35 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 3 H, CHCH3), 2.88 (d, 2JHP =
20.8 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.44 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 6 H, ‐OCH3), 4.22 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H,
Ala‐α‐CH), 5.04 (d, 4JHH = 1.5 Hz, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.99 (s, 1 H, Ar‐H), 7.22‐7.30 (m, 7
H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.9.
(S)‐N‐Alaninyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz
(BP2‐‐Ala‐NH2) 35
HN
P P-O
MeO
OO-
OMe
O
O
NH2
Li+ Li+
C13H20Li2N2O7P2, MG: 392.14 g/mol
Experimenteller Teil
113
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.35 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 2.96 (d, 2JHP =
20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.46 (d, 3JHP = 10.2 Hz, 6 H, POCH3), 3.68 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H,
Ala‐α‐CH), 6.97 (s, 1 H, Ar‐H), 7.16 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 29.1.
ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 189 [M2‐], 379 [M2‐+H+]‐.
(S),(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylalaninyl)alaninyl]‐3,5‐
bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐anilin (BP‐Ala‐Ala‐Z) 25
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH
O
O
C26H37N3O10P2, MG: 613.53 g/mol
Darstellung: AAV IV
Eingesetzt: 95 mg Z‐Ala‐Ala‐OH (0.32 mmol).
Kupplungsreagenz: TBTU, Lösungsmittel: DCM.
Ausbeute: 115 mg (0.19 mmol, 58 %).
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.16‐1.36 (m, 6 H, CHCH3), 2.85‐3.10 (m, 4 H, CH2P),
3.55‐3.66 (m, 12 H, POCH3), 4.10‐4.33 (m, 1 H, α‐CH), 4.67‐4.82 (m, 1 H, α‐CH), 4.90‐
5.24 (m, 2 H, Z‐CH2), 6.77‐7.50 (m, 10 H, NH und Ar‐H), 9.51 (s, 1 H, NH)9.87 (s, 1 H,
NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.2, 29.8.
ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 636 [M+Na+].
Experimenteller Teil
114
(S),(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylalaninyl)alaninyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐
methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐‐Ala‐Ala‐Z) 25a
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
O
O
Li+
Li+
C24H31Li2N3O10P2, MG: 597.35 g/mol
Darstellung: AAV III
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.25‐1.36 (m, 6 H, CHCH3), 2.84 (d, 2JHP = 20.5 Hz,
4 H, CH2P), 3.40 (d, 3JHP = 10.2 Hz, 6 H, POCH3), 4.02‐4.12 (m, 1 H, α‐CH), 4.26‐4.45
(m, 1 H, α‐CH), 5.03 (s, 2 H, Z‐CH2), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.19‐7.33 (m, 7 H, Ar‐H).
13C‐NMR (50 MHz, d4‐MeOD): δ = 18.2, 18.7, 36.0 (d, 1JCP = 86.9 Hz), 50.3, 51.4, 52.6 (d,
2JCP = 4.5 Hz), 68.2, 120.7‐121.00 (m, 2 C), 129.1‐129.9 (m, 8 C), 137.7‐137.8 (m, 1 C),
139.2, 173.2, 175.8, 175.9.
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.9.
ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 584 [M2‐+H+]‐.
Experimenteller Teil
115
(S),(S)‐N‐Alaninylalaninyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz
(BP2‐‐Ala‐Ala‐Z) 36
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH2
Li+
Li+
C16H25Li2N3O8P2, MG: 463.21 g/mol
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.22‐1.27 (m, 3 H, CHCH3), 1.38‐1.41 (m, 3 H,
CHCH3). 2.90 (d, 2JHP = 21.0 Hz, 4 H, CH2P), 3.45 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 6 H, POCH3), 3.52‐
3.68 (m, 1 H, α‐CH), 4.40‐4.51 (m, 1 H, α‐CH), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H), 7.31 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.8.
ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 225 [M2‐], 479 [M2‐+Li++Na+], 493 [M2‐+Li++HCl].
(S)‐(Benzyloxycarbonylphenylalaninyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐Phe‐Z) 29
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
O
NH
OO
C29H36N2O9P2, MG: 618.55 g/mol
Experimenteller Teil
116
Darstellung: AAV IV
Eingesetzt: 90 mg Z‐Phe‐OH (0.30 mmol).
Kupplungsreagenz: TBTU, Lösungsmittel: DCM.
Ausbeute: 45 mg (0.073 mmol, 24 %).
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Ethanol 2:1 v/v): RF = 0.53.
1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 3.10 (d, 2JHP = 22.1 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.58 (d, 3JHP =
10.5 Hz, 12 H, ‐OCH3), 4.41 (m, 1 H, Phe‐α‐CH), 4.79 (s, 2 H, Phe‐CH2), 4.91 (s, 2 H,
Ar‐CH2‐O‐), 6.89 (s, 1 H, Ar‐H), 7.15 (m, 10 H, Ar‐H), 7.31 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 34.1.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 642 [M+Na+].
(S)‐(Benzyloxycarbonyl‐O‐tert‐butyl‐serinyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐
anilin (BP‐Ser‐Z) 30
HN
P PMeOMeO
OOMe
OMe
O
O
NH
OO
O
C27H40N2O10P2, MG: 614.56 g/mol
Darstellung: AAV IV
Eingesetzt: 89 mg Z‐Ser(OtBu)‐OH (0.30 mmol).
Kupplungsreagenz: TBTU, Lösungsmittel: DCM.
Ausbeute: 39 mg (0.063 mmol, 21 %).
Experimenteller Teil
117
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Ethanol 5:1 v/v): RF = 0.57.
1H‐NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.22 (s, 9 H, C(CH3)3), 3.12 (d, 2JHP = 22.1 Hz, 4 H, P‐
CH2‐), 3.45‐3.62 (m, 2 H, Ser‐OCH2), 3.67 (d, 3JHP = 13.5 Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.89 (br s, 1
H, Ser‐α‐CH), 4.35 (s, 1 H, NH), 5.14 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.33‐7.37
(m, 7 H, Ar‐H), 8.70 (s, 1 H, NH).
13C‐NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 27.4, 32.6 (d, 1JCP = 137.8 Hz), 52.9 (m), 55.1, 67.7, 67.2,
74.6, 119.6 (m), 127.1 (d), 128.2 (m), 132.5 (m), 132.6 (m), 136.0, 138.0, 156.1, 168.5.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.1.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 637 [M+Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C27H40N2NaO10P2+: 637.2050, gef.: 637.2056.
3‐tert‐Butyloxycarbonylaminobenzoyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐3ABz‐Boc) 27
NH
P
P
OMe
OMeO
OMe
O O
HNO
O
MeO
C24H34N2O9P2, MG: 556.48 g/mol
Darstellung: AAV IV
Eingesetzt: 100 mg Boc‐3ABz‐OH (0.422 mmol).
Kupplungsreagenz: TBTU, Lösungsmittel: DMF/DCM (1:1).
Ausbeute: 140 mg (0.253 mmol, 60 %).
Experimenteller Teil
118
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.53 (s, 9 H, Boc‐CH3), 3.15 (d, 2JHP = 22.0 Hz, 4 H,
PCH2), 3.69 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, OCH3), 6.80 (s, 1 H, Ar‐H), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H),
7.34‐7.57 (m, 5 H, Ar‐H), 7.93 (s, 1 H, NH), 8.26 (s, 1 H, NH).
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.4, 32.7 (1JCP = 91.7 Hz), 53.1 (2JCP = 3.7 Hz), 81.2,
117.0, 120.4, 121.7, 127.1, 129.5, 131.5, 132.5, 137.0, 139.0, 153.0, 159.1.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.0
ESI‐MS (MeOH): m/z = 579 [M+Na+].
4‐tert‐Butyloxycarbonylaminobenzoyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐4ABz‐Boc) 28
NH
P
P
OMe
OMeO
OMe
O O
MeO
NHO
O
C24H34N2O9P2, MG: 556.48 g/mol
Darstellung:
121 mg p‐t‐Butyloxycarbonylaminobenzoesäure (0.89 mmol, 1.0 Äq.) und 496 mg
PyBOP (0.89 mmol 1.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem DMF gelöst und 0.29 mL N‐
Methylmorpholin (2.63 mmol, 2.9 Äq.) sowie 380 mg 3,5‐Bis(dimethoxyphosphoryl‐
methyl)anilin 9 (1.13 mmol, 1.4 Äq.) zugegeben. Die Mischung wird 17 h lang bei RT
gerührt und an die Reaktion anschließend durch Zugabe von 40 mL gesättigter
Natriumchloridlösung beendet. Die wäßrige Phase wird zweimal mit je 80 mL
Chloroform extrahiert. Nach Vereinigung der organischen Phasen werden diese
wiederum dreimal mit je 30 mL gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Nach
Experimenteller Teil
119
Trocknen über Natriumsulfat, Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem
Druck und säulenchromatographischer Aufreinigung des Rückstandes
(Dichlormethan/Ethanol 15:1 v/v) werden 391 mg BP‐4ABz‐Boc (0.70 mmol, 79 %)
erhalten.
Analytik:
DC (Dichlormethan/Methanol 15:1 v/v): RF = 0.48.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.52 (s, 9 H, tBu‐CH3), 3.14 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, P‐
CH2), 3.68 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 12 H, POCH3), 6.82 (s, 1 H, NH), 6.99 (s, 1 H, Ar‐H), 7.46
(d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 7.55 (s, 2 H, Ar‐H), 7.78 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H),
7.95 (s, 1 H, NH).
13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 28.7, 33.0 (d, 1JCP = 91.5 Hz), 53.3 (d, 2JCP = 4.6 Hz), 81.2,
117.9, 120.4, 126.9, 128.5, 128.7, 132.5, 139.2, 142.3, 152.7, 165.5.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.0.
ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 523 [M+Na+‐C4H8], 579 [M+Na+].
HRMS (ESI, CHCl3/MeOH), ber. für C24H34N2NaO9P2+: 579.1632, gef.: 579.1690.
4‐Ammoniumbenzoyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)aniliniumtrifluoracetat
(BP‐4ABz+) 28a
NH
P
P
OMe
OMeO
OMe
O O
MeO
NH3+ F3C
O-
O
C21H27F3N2O9P2, MG: 570.39 g/mol
Darstellung: AAV II
Experimenteller Teil
120
Analytik:
DC (EE/Ethanol 2:1 v/v): RF = 0.27.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.10 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, P‐CH2), 3.64 (d, 3JHP = 10.8
Hz, POCH3), 4.75 (br s, 3 H, ‐NH3+), 6.60 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 6.91 (s, 1 H, Ar‐
H), 7.57 (s, 2 H, Ar‐H), 7.69 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 8.38 (br s, 1 H, NH).
13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 32.7 (d, 1JCP = 91.7 Hz), 53.2 (d, 2JCP = 4.5 Hz), 114.2,
120.4, 123.9, 126.7, 129.3, 132.3, 139.4, 150.4, 165.8.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.2.
ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 479 [M+Na+].
4‐Ammoniumbenzoyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Lithiumsalz
(BP2‐‐4ABz+) 40
NH
P
P
OMe
O-
O
O-
O O
MeO
NH3+ Li+
C17H21LiN2O7P2, MG: 434.25 g/mol
Darstellung: AAV III
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 2.99 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, P‐CH2), 3.53 (d, 3JHP = 10.3
Hz, 6 H, POCH3), 6.81 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.20 (s, 2 H,
Ar‐H), 7.65 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 26.9.
ESI‐MS (H2O, ESI negativ): m/z = 427 [M2‐+H+], 213 [M2‐].
Experimenteller Teil
121
N‐Glycinylglycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin BP‐Gly‐Gly‐NH2 41
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH2
C16H27N3O8P2, MG: 451.35 g/mol
Darstellung: AAV I
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Methanol 2:1 v/v): RF = 0.3.
1H‐NMR (300 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.94 (br s, 2 H, NH2), 3.22 (d, 2JHP = 21.6 Hz, 4 H, P‐
CH2‐), 3.27 (s, 2 H, ‐CH2NH2), 3.67 (d, 3JHP = 10.6 Hz, 12 H, ‐OCH3), 4.05 (s, 2 H, Gly‐α‐
CH2), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.22 (s, 1 H, NH), 7.44 (s, 2 H, Ar‐H), 7.65 (s, 1 H, NH).
13C‐NMR (50 MHz, d4‐MeOD): δ = 32.5 (d, 1JCP = 91.0 Hz), 41.6, 44.0, 53.8 (d, 2JCP = 4.5
Hz), 121.1, 128.2, 133.6 (d, 2JCP = 4.9 Hz), 139.9, 168.0, 169.4.
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 34.2.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 452 [M+H+]+, 474 [M+Na+]+.
Experimenteller Teil
122
N‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐carbonylglycinyl}‐3,5‐
bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐Gly‐PyrGua‐Boc) 46
NHP
P
OMeMeO
O
MeOMeO
O
O
HN
O
NH
NH
OHN
NH
O
O
C26H38N6O11P2, MG: 672.56 g/mol
N‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐carbonyl‐
glycinyl}glycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin
(BP‐Gly‐Gly‐PyrGua‐Boc) 43
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH
OHN HN
ONH
HNO
O
C28H41N7O12P2, MG: 729.61 g/mol
Gemeinsame Vorschrift zur Darstellung von 46 und 43:
49 mg der Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 (165 μmol, 1.0 Äq.) werden in
absolutem DMF gelöst und nacheinander 55 μL NMM (495 μmol, 3.0 Äq.) und 95 mg
PyBOP (182 μmol, 1.1 Äq.) zugegeben. Nach etwa 30 Minuten wird zu dieser Lösung
eine Suspension von 65 mg BP‐Gly‐NH2 21a bzw. 75 mg BP‐Gly‐Gly‐NH2 41 (165
μmol, 1.0 Äq.) in einigen mL absolutem DCM gespritzt. Die Mischung wird 40 h bei
RT gerührt und klart in dieser Zeit auf. Anschließend wird die Reaktion durch
Zugabe von gesättigter, wäßriger Natriumchloridlösung beendet und die wäßrige
Phase dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
werden bis zur Trockene unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene
Experimenteller Teil
123
Rohprodukt wird säulenchromatographisch (EE/EtOH 2:1) über Kieselgel
aufgereinigt. Es werden 31 mg BP‐Gly‐Pyr‐GUA‐Boc 46 (46 μmol, 28 %) bzw. 38 mg
BP‐Gly‐Gly‐Pyr‐GUA‐Boc 43 (52 μmol, 32 %) als weißer Feststoff erhalten.
Analytik 46:
DC: (EE/EtOH 2:1 v/v): RF = 0.12.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.45 (s, 9 H, tBu‐CH3), 2.99 (d, 2JHP = 20.3 Hz, 4 H,
PCH2), 3.59 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 12 H, POCH3), 4.09 (br s, 2 H, Gly‐CH2), 6.75 (br s, 1 H,
Pyr‐H), 6.81 (br s, 2 H, Pyr‐H und Ar‐H), 7.21 (s, 1 H, NH), 7.34 (s, 2 H, Ar‐H), 7.61
(br s, 1 H, NH), 7.68 (br s, 1 H, NH), 8.42 (s, 1 H, NH), 9.72 (s, 1 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.2.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 673 [M+H+], 695 [M+Na+], 711 [M+K+].
Analytik 43:
DC (EE/EtOH 2:1 v/v): RF = 0.17.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.48 (s, 9 H, tBu‐CH3), 3.06 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H,
PCH2), 3.64 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, POCH3), 3.93 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.02 (s, 2 H, Gly‐
CH2), 6.73 (s, 1 H, Pyr‐H), 6.83 (s, 2 H, Pyr‐H und Ar‐H), 7.16 (s, 1 H, NH), 7.46 (s, 2
H, Ar‐H), 7.60‐7.71 (m, 1 H, NH), 8.21 (s, 1 H, NH), 8.55 (s, 1 H, NH), 9.42 (s, 1 H,
NH).
13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 27.9, 31.9 (d, 1JCP = 90.2 Hz), 46.1, 46.2, 53.0 (d, 2JCP = 4.5
Hz), 82.5, 113.4, 114.4, 118.4, 119.8, 126.0, 128.5, 131.9, 138.6, 158.8, 161.9, 164.1, 168.1,
170.9.
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.6.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 630 [M‐Boc+H+], 652 [M‐Boc+Na+], 668 [M‐Boc+K+], 730
[M+H+], 752 [M+Na+], 768 [M+K+].
Experimenteller Teil
124
N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]‐3,5‐
bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin Hydrochlorid
(BP‐Gly‐PyrGua) 46a
NHP
P
OMeMeO
O
MeOMeO
O
O
HN
O
NH
NH
O
H2N
NH2+Cl-
C21H31ClN6O9P2, MG: 608.91 g/mol
Darstellung:
AAV II (Ausbeute quant.)
Anschließend wird das Produkt in 0.1 M Salzsäure aufgenommen und lyophilisiert,
um das Trifluoracetatsalz in ein Hydrochlorid umzusalzen.
Analytik:
1H‐NMR (400 MHz, D2O): δ = 3.29 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, PCH2), 3.72 (d, 3JHP = 10.9
Hz, 12 H, POCH3), 4.20 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.88 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.01 (s, 1
H, Ar‐H), 7.02 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.32 (s, 2 H, Ar‐H), 6.88‐7.61 (m, 3 H,
NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 35.3.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 573 [M+], 595 [M‐H++Na+].
Experimenteller Teil
125
N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]‐3,5‐
bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin Hydrochlorid
(BP‐Gly‐Gly‐PyrGua) 43a
NHP
P
MeO OMe
O
OMeOMe
O
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+Cl-
NH2
C23H34ClN7O10P2, MG: 665.96 g/mol
Darstellung:
AAV II (Ausbeute quant.)
Anschließend wird das Produkt in 0.1 M Salzsäure aufgenommen und lyophilisiert,
um das Trifluoracetatsalz in ein Hydrochlorid umzusalzen.
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 3.27 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H, PCH2), 3.65 (d, 3JHP = 11.0
Hz, 12 H, POCH3), 4.04 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.10 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.83 (d, 3JHH = 4.3 Hz,
1 H, Pyr‐H), 7.01 (s, 1 H, Ar‐H), 7.02 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.27 (s, 2 H, Ar‐H),
7.50‐7.83 (m, 2 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 35.1.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 630.2 [M+], 652.4 [M‐H++Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C23H34N7O10P2+: 630.1842, gef.: 630.1854.
Experimenteller Teil
126
N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐
methyl]anilin Lithiumsalz (BP‐Gly‐PyrGua 2Li+) 47
NHP
P
O-MeO
O
-OMeO
O
O
HN
O
NH
NH
O
H2N
NH2+
Li+
C19H25LiN6O9P2, MG: 550.33 g/mol
Darstellung: AAV III (Ausbeute quant.)
Analytik:
Smp.: >300 °C.
1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 2.97 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.55 (d, 3JHP = 10.5
Hz, 6 H, POCH3), 4.12 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.85 (d, 3JHH = 4.3 Hz, 1 H, Pyr‐H), 6.93 (s, 1
H, Ar‐H), 7.02 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.15 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, D2O): δ = 27.0.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 545 [M+2H+]+, 667 [M+H++Na+]+.
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C19H26N6NaO9P2+: 567.1129, gef.: 567.1119.
Ein 13C‐NMR‐Spektrum konnte wegen unzureichender Löslichkeit des Rezeptors nicht erhalten
werden.
Experimenteller Teil
127
N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]glycinyl‐3,5‐bis[(methoxy‐
phosphoryl)methyl]anilin Lithiumsalz (BP‐Gly‐Gly‐PyrGua 2Li+) 44
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+
NH2Li+
C21H28LiN7O10P2, MG: 607.38 g/mol
Darstellung: AAV III (Ausbeute quant.)
Analytik:
Smp.: Zers. > 245 °C.
1H‐NMR (400 MHz, D2O): δ = 3.06 (d, 2JHP = 20.4 Hz, 4 H, PCH2), 3.58 (d, 3JHP = 10.2
Hz, 6 H, POCH3), 4.13 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.20 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.96 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1
H, Pyr‐H), 7.06 (s, 1 H, Ar‐H), 7.09 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.27 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, D2O ): δ = 26.8.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 602.2 [M+2H+]+, 608.2 [M+H++Li+]+, 624.1 [M+H++Na+]+, 630.1
[M+Li++Na+]+.
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C21H29LiN7O10P2+: 608.1611, gef.: 608.1601.
Ein 13C‐NMR‐Spektrum konnte wegen unzureichender Löslichkeit des Rezeptors nicht erhalten
werden.
Experimenteller Teil
128
(S)‐3‐Amino‐N3‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐carbonyl}‐
2‐{3,5‐bis[(dimethoxyphosphoryl)methyl]benzamido}propionsäuremethylester
(BOC‐ASER‐BP) 48a
MeOO
NH
P
P
OMeO
MeO
MeO
MeOO
O
HN
ONH
HN
O
HN
NH
O
O
C29H42N6O13P2, MG: 744.62 g/mol
Darstellung:
20 mg (50.5 nmol; 1 Äq.) des Argininanalogons 48, 18.5mg (50.5 nmol; 1 Äq.) 3,5‐
Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzoesäure 1, 26.3 mg PyBOP (50.5 nmol; 1 Äq.)
und 17 μL (152 nmol; 3 Äq.) N‐Methylmorpholin werden in 5 mL absolutem
Dichlormethan gelöst und 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird unter
vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch
(EE/EtOH 5:1 v/v) gereinigt, um 19 mg (25.5 nmol; 51%) eines weißen Feststoffes zu
erhalten.
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.50 (s, 9 H, tBut‐CH3), 3.23 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H,
PCH2), 3.68 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 6 H, POCH3), 3.70 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 6 H, POCH3), 3.76
(s, 3 H, COCH3), 3.88‐4.10 (m, 2 H, NCH2), 4.67‐4.74 (m, 1 H, α‐CH), 6.78 (d, 3JHH = 4.0
Hz, 1 H, Pyr‐H), 6.95 (d, 4JHH = 2.7 Hz, 1 H, Ar‐H), 7.34 (s, 1 H, NH), 7.71 (d, 4JHH = 1.7
Hz, 2 H, Ar‐H), 8.12‐8.18 (m, 1 H, NH), 8.57 (d, 3JHH = 5.7 Hz, 1 H, Pyr‐H), 10.96 (br s,
1 H, NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 32.5.
ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 767 [M+Na+].
Experimenteller Teil
129
(S)‐3‐Amino‐N3‐[5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonyl]‐2‐{3,5‐bis[(dimethyl‐
phosphoryl)methyl]benzamido}propionsäuremethylester Trifluoracetat
(ASER‐BP) 48b
MeOO
NH
P
P
OMeO
MeO
MeO
MeOO
O
HN
ONH
HN
O
+H3N
NH
F
FF
O-
O
C26H35F3N6O13P2, MG: 758.53 g/mol
Darstellung:
19 mg (25.5 nmol) BOC‐ASER‐BP werden in eine Mischung aus 4 mL Dichlormethan
und 1 mL Trifluoressigsäure gegeben und 3 h bei RT gerührt. Anschließend werden
die Lösungsmittel dreimal nach Zugabe von ca. 10 mL Toluol unter vermindertem
Druck so weit wie möglich abdestilliert. Nach Trocknen im HV bleiben 19 mg
(25 nmol; quant.) eines weißen Feststoffes als Produkt zurück.
Nachfolgendes Umsalzen mit 0.1 M Salzsäure ergibt quantitativ das Hydrochlorid.
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.23 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H, PCH2), 3.62‐3.76 (m, 12 H,
POCH3), 3.90 (s, 3 H, COCH3), 4.48‐4.49 (m, 2 H, NCH2), 4.67‐4.75 (m, 1 H, α‐CH),
6.78 (br s, 1 H, Pyr‐H), 7.32‐8.05 (m, 6 H, Ar‐H, Pyr‐H und NH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 32.4.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 645.1 [M+], 667 [M+Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C24H34N6NaO11P2: 667.1653, gef.: 667.1664.
Experimenteller Teil
130
(S)‐3‐Amino‐N3‐[5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonyl]‐2‐{3,5‐bis[(methoxy‐
phosphoryl)methyl]benzamido)propionsäuremethylester Lithiumsalz
(ASER+BP2‐) 49
MeOO
NH
P
P
O-
O
MeO
-O
MeOO
O
HN
ONH
HN
O
+H3N
NH
Li+
C22H29LiN6O11P2, MG: 622.39 g/mol
Darstellung:
19 mg (25 nmol; 1 Äq.) ASERBP 48b werden zusammen mit 11 mg (125 nmol; 5 Äq.)
LiBr in 10 mL absolutem Acetonitril suspendiert und 12 h unter Rückfluß erhitzt. Das
ausgefallene Produkt wird abzentrifugiert und dreimal mit Diethylether
aufgeschlämmt und wiederum abzentrifugiert. Zur Entfernung von Trifluoracetat
wird mit Salzsäure umgesalzt. Dazu wird das Produkt in einigen mL 0.1 N Salzsäure
aufgenommen und unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. Zurück
bleiben 16 mg (25 nmol; quant.) Produkt als weißer Feststoff.
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.95 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.41 (d, 3JHP =
10.5 Hz, 6 H, POCH3), 3.63 (s, 3 H, COCH3), 3.72‐3.80 (m, 2 H, NCH2), 4.56 (dd, 3JHH =
4.7 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1 H, α‐CH), 6.63 (d, 3JHH = 4.3 Hz, 1 H, Pyr‐H), 6.97 (d, 3JHH = 4.3
Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.25 (s, 1 H, Ar‐H), 7.56 (s, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 28.5.
ESI‐MS (MeOH, ESI negativ): m/z = 615 [M‐].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C22H29N6O11P2: 615.1364, gef.: 615.1351.
Experimenteller Teil
131
(S)‐Bromacetyl‐O‐(tert‐butyl)alanin (BrAc‐Ala‐OtBu) 56
BrHN
OO
O
C9H16BrNO3, 266.13 g/mol
Darstellung:
48 μL (0.550 mmol; 1 Äq.) Bromacetylbromid werden in 5 mL absolutem
Dichlormethan gelöst und auf 0 °C gekühlt. Dazu wird langsam, weiterhin unter
Eiskühlung, eine Lösung von 100 mg (0.550 mmol; 1 Äq.) L‐Alanin‐
tertbutylesterhydrochlorid und 229 μL (1.65 mmol; 3 Äq.) Triethylamin in weiteren
5 mL absolutem Dichlormethan zugetropft. Die sich rot färbende Lösung lässt man
auf Raumtemperatur erwärmen und 2 Stunden rühren. Anschließend wird die
organische Phase mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck entfernt.
Der verbleibende feste Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt
(EE/MeOH 30:1), um 40 mg (0.15 mmol; 27 %) BrAcAlaOtBu 56 zu erhalten.
Analytik:
DC: RF = 0.71 (EE/MeOH 10:1).
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.28 (d, 3JHH = 4.9 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 1.45 (s, 9 H, tBu‐
CH3), 3.07 (d, 2JHH = 11.5 Hz, 1 H, Br‐CH), 3.19 (q, 3JHH = 4.8 Hz, q H, Ala‐α‐CH), 3.38
(d, 2JHH = 11.3 Hz, 1 H, Br‐CH).
Experimenteller Teil
132
(S)‐Bromacetyl‐O‐methyl‐(O‐tert‐butyl)serin (BrAc‐Ser(OtBu)‐OMe) 57
BrHN
OO
O
O
C10H18BrNO4, 296.16 g/mol
Darstellung:
100 mg Bromessigsäure (0.720 mmol, 1 Äq.) werden in 15 mL DCM gelöst und
0.105 mL Chlorenamin (0.720 mmol, 1 Äq.) langsam zugegeben. Die Mischung wird
3 h bei RT gerührt, bis 126 mg H‐Ser(tBu)‐OMe (0.720 mmol, 1 Äq.) und 60 μL
Pyridin (0.720 mmol, 1 Äq.) zugefügt werden. Die nun tiefgelbe Lösung wird weitere
16 h bei RT gerührt. Nach Ende der Reaktion wird die organische Phase mehrmals
mit Wasser extrahiert und anschließend bis zur Trockene eingeengt. Zurück bleiben
192 mg 57 (0.648 mmol, 90 %) als weißer Feststoff, der keiner weiteren Aufreinigung
bedarf.
Analytik:
DC (EE/MeOH 5:1 v/v): RF = 0.72
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.11 (s, 9 H, tBu‐CH3), 3.55 (dd, 2JHH = 9.1 Hz, 3JHH =
3.2 Hz, 1 H, OCH2), 3.73 (s, 3 H, OCH3), 3.81 (dd, 2JHH = 9.1 Hz, 3JHH = 2.9 Hz, 1 H,
OCH2), 4.02 (d, 2JHH = 11.0 Hz, 1 H, Br‐CH), 4.09 (d, 2JHH = 11.0 Hz, 1 H, Br‐CH), 4.65
(m, 1 H, α‐Ser‐CH), 7.32 (br s, 1 H, NH).
Experimenteller Teil
133
syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen
syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen
(BK‐OH‐GlyBoc) 55a (BK‐OH‐ValBoc) 55b
OH
O O
NH
OO
OH
O O
NH
OO
C23H25NO5, MG: 395.45 g/mol C26H31NO5, MG: 437.53 g/mol
Gemeinsame Vorschrift zur Darstellung von 55a und 55b:
100 mg 1,4,5,8‐Tetrahydro‐1,4,5,8‐dimethanoanthracen‐9,10‐diol 51 (0.42 mmol, 1.0
Äq.), 74 mg Boc‐Gly‐OH bzw. 91 mg Boc‐Val‐OH (0.42 mmol, 1.0 Äq.) 71 mg HOBt
(0.46 mmol, 1.1 Äq.), 8 mg DMAP (63 μmol, 0.15 Äq.) und 65 μL DIC (0.42 mmol, 1.0
Äq.) werden in 10 mL absolutem DCM gelöst und 24 h bei RT gerührt. Anschließend
wird je zweimal mit 0.2 M Salzsäure, ges. NaHCO3‐Lösung und ges. NaCl‐Lösung
extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO4 getrocknet, unter vermindertem
Druck abdestilliert und der verbleibende Rückstand säulenchromatographisch
gereinigt (DCM/Aceton 30:1 v/v).
Experimenteller Teil
134
Analytik:
syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen
Ausbeute: 90 mg (0.23 mmol, 54 %) weißer Feststoff
DC (DCM/Aceton 15:1 v/v): RF = 0.60.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.49 (s, 9 H, Boc‐CH3), 2.17‐2.24 (m, 4 H, ‐CH2‐), 3.80
(s, 2 H, ‐CH), 3.98‐4.01 (m, 2 H, ‐CH), 4.20 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 4.66 (br
s, 1 H, ‐OH), 5.13 (br s, 1 H, NH), 6.69‐6.75 (m, 4 H, =CH).
syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen
Ausbeute: 72 mg (0.165 mmol, 39 %) weißer Feststoff
DC (DCM/Aceton 15:1 v/v): RF = 0.57.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.06 (d, 3JHH = 7.1 Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.13 (d, 3JHH = 6.8
Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.49 (s, 9 H, Boc‐CH3), 2.18‐2.19 (m, 4 H, ‐CH2‐), 2.22‐2.35 (m, 1 H, ‐
CH(CH3)2), 3.82 (s, 2 H, ‐CH), 3.98 (s, 2 H, ‐CH), 4.42‐4.50 (m, 1 H, Val‐α‐CH), 5.08 (d,
3JHH = 9.3 Hz, 1 H, NH), 6.69‐6.79 (m, 4 H, =CH).
13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.1, 19.7, 28.7, 28.8, 31.5, 31.7, 46.7, 47.0, 48.2, 48.3,
48.4, 70.3, 70.4, 80.5, 136.7, 141.9, 143.0, 143.3, 143.4, 143.6.
Experimenteller Teil
135
syn‐9,10‐bis[(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl]‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen (BK‐(GlyBoc)2) 55c
O O
O HNO
O
ONHO
O
C30H36N2O8, MG: 552.62 g/mol
Darstellung:
50 mg 1,4,5,8‐Tetrahydro‐1,4,5,8‐dimethanoanthracen‐9,10‐diol 51 (0.21 mmol, 1.0
Äq.), 93 mg Boc‐Gly‐OH (0.53 mmol, 2.5 Äq.), 4 mg DMAP (31 μmol, 0.15 Äq.) und
65 μL DIC (0.42 mmol, 2.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem DCM gelöst und 24 h bei
RT gerührt. Anschließend wird je zweimal mit 0.2 M Salzsäure, ges. NaHCO3‐
Lösung und ges. NaCl‐Lösung extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO4
getrocknet, unter vermindertem Druck abdestilliert und der verbleibende Rückstand
säulenchromatographisch gereinigt (DCM/Aceton 30:1 v/v).
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.49 (s, 18 H, Boc‐CH3), 2.16‐2.22 (m, 4 H, ‐CH2‐),
3.79‐3.82 (m, 3 H, ‐CH), 3.99‐4.01 (m, 1 H, ‐CH), 4.20 (d, 3JHH = 8.6 Hz, 4 H, Gly‐α‐
CH2), 5.10‐5.17 (m, 2 H, NH), 6.71‐6.75 (m, 4 H, =CH).
Experimenteller Teil
136
syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)aminoethyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen (BK‐OH‐EtNBoc) 53
OH
O
NH
OO
C23H27NO4, MG: 381.46 g/mol
Darstellung:
54 mg (0.226 mmol; 1 Äq.) BKOH2 51, 34 mg (0.249 mmol; 1.1 Äq.) Kaliumcarbonat
und eine katalytische Menge Kaliumiodid werden in 10 mL absolutem Acetonitril
suspendiert und erhitzt, bis sich alle Komponenten unter Gelbfärbung lösen.
Daraufhin werden 51 mg (0.249 mmol; 1.1 Äq.) N‐Boc‐2‐Bromethylamin zugegeben
und 16 h bei 70 °C gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch
(Hexan/EE 10:1) gereinigt. Man erhält 45 mg (0.12 mmol; 48 %) eines weißen
Feststoffes.
Analytik:
DC: RF = 0.5 (CHCl3/EE 5:1), RF = 0.1 (Hexan/EE 20:1)
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.48 (s, 9 H, ‐CH3), 2.05‐2.25 (m, 4 H, CHCH2CH),
3.39‐3.43 (m, 2 H, CH2N), 3.90 (t, 3JHH = 5.1 Hz, 2 H, OCH2), 4.42 (s, 1 H, OH), 5.30 (br
s, 1 H, NH), 6.75‐6.91 (m, 4 H, =CH).
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.4, 46.3, 46.5, 52.0, 70.9, 100.0, 142.6, 143.1 (einige
Signale fehlen, da das Spektrum keine ausreichende Auflösung zeigt).
ESI‐MS (MeOH): m/z = 404.1 [M+Na+], 420.1 [M+K+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C23H27NNaO4+: 404.1832, gef.: 404.1833.
Experimenteller Teil
137
syn‐9‐[3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzoyloxyl]‐10‐hydroxy‐1,4,5,8‐
tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen (BK‐OH‐BP) 55d
OHO
O
P
P
OMe
OMeO
OMe
OMeO
C29H32O9P2, MG: 586.51 g/mol
Darstellung:
30 mg 1,4,5,8‐Tetrahydro‐1,4,5,8‐dimethanoanthracen‐9,10‐diol 51 (0.13 mmol, 1.0
Äq.), 46 mg 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzoesäure (0.13 mmol, 1.0 Äq.)
21 mg HOBt (0.14 mmol, 1.1 Äq.), 2 mg DMAP (19 μmol, 0.15 Äq.) und 20 μL DIC
(0.13 mmol, 1.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem DCM gelöst und 24 h bei RT
gerührt. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von einigen mL Wasser
beendet und die flüssige Phase unter vermindertem Druck abdestilliert. Der
verbleibende Rückstand säulenchromatographisch gereinigt (EE/MeOH 15:1 v/v),
um 22 mg (39 μmol, 30 %).
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.19‐2.25 (m, 4 H, CHCH2CH), 3.26 (d, 2JHP = 21.8 Hz,
4 H, PCH2), 3.74 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, OCH3), 3.81 (s, 2 H, ‐CH), 4.04 (br s, 2 H, ‐
CH), 6.72‐6.80 (m, 4 H, =CH), 7.57 (s, 1 H, Ar‐H), 8.06 (d, J = 1.7 Hz, 2 H, Ar‐H).
Experimenteller Teil
138
(S)‐tert‐butyl‐2‐[2‐(10‐hydroxy‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen‐9‐
yloxy)acetamido]propanoat (BK‐OH‐AcAlaOtBu) 54a
OH
O
NHOO
O
C25H29NO5, MG: 423.50 g/mol
Darstellung:
26 mg BK(OH)2 51 (0.109 mmol; 1.0 Äq.), 29 mg (S)‐Bromacetyl‐O‐(tert‐butyl)alanin
56 (0.109 mmol; 1.0 Äq.), 17 mg Kaliumcarbonat (0.120 mmol; 1.1 Äq.)und eine
katalytische Menge Kaliumiodid werden in 20 mL absolutem Acetonitril suspendiert
und zunächst 12 h bei 30 °C gerührt, anschließend noch 3 h unter Rückfluß. Die
Lösung färbt sich währenddessen gelb. Anschließend wird das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch
(DCM/Aceton 30:1 v/v) gereinigt. Man erhält 40 mg (0.094 mmol; 87 %) eines weißen
Feststoffes.
Analytik:
DC (DCM/Aceton 30:1 v/v): RF = 0.3.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.36‐1.44 (m, 3 H, Ala‐CH3), 1.48 (s, 9 H, ‐C(CH3)3),
2.46‐2.34 (m, 4 H, CHCH2CH), 3.87‐3.89 (m, 1 H, α‐Ala‐CH), 3.99‐4.10 (m, 4 H, CH),
4.37‐4.49 (m, 2 H, OCH2), 6.74‐6.88 (m, 4 H, =CH).
Experimenteller Teil
139
syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐
1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen 55e
syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐1,4,5,8‐
tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen 55f
(BK‐POMe‐GlyBoc) 55e (BK‐POMe‐ValBoc) 55f
O
O O
NH
OO
PMe
MeO
O
O
O O
NH
OO
PMe
MeO
O
C25H30NO7P, MG: 487.48 g/mol C28H36NO7P, MG: 529.56 g/mol
Gemeinsame Vorschrift zur Darstellung von 55e und 55f:
137 μmol des Alkohols (1.0 Äq., BK‐OH‐GlyBoc: 54 mg, BK‐OH‐ValBoc: 60 mg, BK‐
OH‐EtNBoc: 52 mg) werden in 10 mL absolutem THF gelöst und auf 0 °C abgekühlt.
Dazu werden 27 mg Methylphosphonsäuredichlorid (206 μmol, 1.5 Äq.) und 41 mg
Triethylamin (411 μmol, 3.0 Äq.) gegeben. Die Mischung wird zunächst eine Stunde
bei 0 °C und anschließend noch eine weitere Stunde bei RT gerührt. Dabei bildet sich
rasch ein weißer Niederschlag. Später kann sich die Lösung rötlich färben. Unter
Auflösung des Niederschlags werden 10 mL trockenes Methanol zugefügt und
nochmals 24 h gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck
entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt (DCM/Aceton 15:1
v/v).
Experimenteller Teil
140
Analytik:
syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐
1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen (BK‐POMe‐GlyBoc) 55e
Ausbeute: 53 mg (110 μmol, 80 %) weißer Feststoff.
DC (DCM/Ac 15:1 v/v): RF = 0.25.
1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.45 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.55 (d, 2JHP = 17.2 Hz, 3 H,
PCH3), 2.14‐2.16 (m, 4 H, CH2), 3.68 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, POCH3), 3.78 (br s, 2 H,
CH), 4.04 (br s, 2 H, CH), 4.46 (br s, 2 H, α‐Gly‐CH2), 5.04 (br s, 1 H, NH), 6.61‐6.74
(m, 4 H, =CH).
31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.3.
syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐1,4,5,8‐
tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen (BK‐POMe‐ValBoc) 55f
Ausbeute: 60 mg (114 μmol, 83 %) weißer Feststoff.
DC (DCM/Ac 15:1 v/v): RF = 0.22.
1H‐NMR (200 MHz, DMSO): δ = 1.03 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.06 (d, 3JHH = 7.0
Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.42 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.54 (d, 2JHP = 17.5 Hz, 3 H, PCH3), 2.15‐2.16
(m, 4 H, CH2), 2.22‐2.38 (m, 1 H, CH), 3.65 (d, 3JHP = 11.2 Hz, 3 H, POCH3), 3.77 (br s, 2
H, CH), 4.04 (br s, 2 H, CH), 4.36‐4.43 (m, 1 H, α‐Val‐CH), 5.01 (br s, 1 H, NH), 6.61‐
6.74 (m, 4 H, =CH).
31P‐NMR (81 MHz, DMSO): δ = 29.4.
Experimenteller Teil
141
syn‐9‐Valinyloxyl‐10‐(methyloxyphosphoryloxyl)‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐
dimethanoanthracen (BK‐PO‐Gly) 55g
O
O O
NH3+
PMe O-
O
C22H26NO5P, MG: 415.42 g/mol
Darstellung: Erst AAV I, dann AAV III, ausgehend von 55f (Ausbeute quant.)
Analytik:
1H‐NMR (200 MHz, DMSO): δ = 1.20 (m, 6 H, CH3), 1.46 (d, 2JHP = 17.0 Hz, 3 H,
PCH3), 2.17 (s, 4 H, CH2), 3.97 (s, 2 H, CH), 4.18 (s, 2 H, CH), 4.40 (br s, 1 H, α‐Val‐
CH), 6.75 (br s, 2 H, =CH), 6.88 (br s, 2 H, =CH).
31P‐NMR (81 MHz, DMSO): δ = 27.8.
Experimenteller Teil
142
8‐Hydroxy‐19‐((tert‐butyloxycarbonyl)alaninylacetyloxyl)‐5,7,9,11,16,18,20,22‐
octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐OH‐AcAlaBoc) 60a
OH
O
NHOO
O
C51H45NO5, MG: 751.91 g/mol
Darstellung:
100 mg Pi(OH)2 50 (0.176 mmol; 1.0 Äq.), 47 mg (S)‐Bromacetyl‐O‐(tert‐butyl)alanin
56 (0.176 mmol; 1.0 Äq.), 27 mg Kaliumcarbonat (0.194 mmol; 1.1 Äq.) und eine
katalytische Menge Kaliumiodid werden in 20 mL absolutem Acetonitril im
Ultraschallbad gelöst und 16 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird das
Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand
säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 5:1 v/v) gereinigt. Man erhält 50 mg
Produkt (0.066 mmol, 38 %).
Analytik:
DC (Chloroform/Aceton 5:1 v/v): RF = 0.81.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.32‐1.39 (m, 3 H, Ala‐CH3), 1.43 (s, 9 H, C(CH3)3),
2.25‐2.38 (m, 8 H, CH2), 3.38 (br s, 2 H, OCH2), 3.98 (s, 4 H, CH), 4.14 (s, 4 H, CH),
4.35‐4.44 (m, 1 H, α‐Ala‐CH), 6.67‐6.70 (m, 4 H, Ar‐H), 6.97‐7.05 (m, 4 H, Ar‐H), 7.04
(s, 2 H, Ar‐H), 7.05 (s, 2 H, Ar‐H).
MS (ESI, MeOH): m/z = 774.3 [M+Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C51H45NNaO5+: 774.3190, gef.: 774.3181.
Experimenteller Teil
143
8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐hydroxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐
5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐POMe‐OH) 60b
O
OH
PMe
MeO
O
C44H35O4P, MG: 658.72 g/mol
Darstellung:
50 mg (0.088 mmol, 1 Äq.) Pi(OH)2 50 werden in 15 mL absolutem THF gelöst und
auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 14 mg (0.106 mmol, 1.2 Äq.)
Methylphosphonssäuredichlorid und 27 μL Triethylamin (0.265 mmol, 3.0 Äq.) wird
die resultierende Lösung eine Stunde unter Eiskühlung gerührt und daraufhin eine
weitere Stunde bei Raumtemperatur. Nun werden 5 mL absolutes Methanol
zugefügt und wiederum 16 h bei RT gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand
säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 15:1 v/v) gereinigt, um 41 mg
(0.062 mmol, 70 %) des Produktes als weißem Feststoff zu erhalten.
Analytik:
DC (Chloroform/Aceton 3:1 v/v): RF = 0.46.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.53 (d, 2JHP = 21.0 Hz, 3 H, PCH3), 2.41 (d, 3JH‐P = 11.1
Hz, 3 H, POCH3), 2.43‐2.45 (m, 8 H, CH2), 4.05‐4.09 (m, 4 H, CH), 4.22 (d, 3JHH = 7.7
Hz, 2 H, CH), 4.42 (d, 3JHH = 8.7 Hz, 2 H, CH), 5.30 (s, 1 H, OH), 6.60‐6.74 (m, 4 H, Ar‐
H), 6.90‐7.05 (m, 4 H, Ar‐H), 7.12 (d, 2 H, Ar‐H), 7.38 (d, 2 H, Ar‐H).
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.6.
MS (ESI, MeOH): m/z = 681.3 [M+Na+], 697.3 [M+K+].
Experimenteller Teil
144
8‐Hydroxy‐19‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐
5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐OH‐GlyBoc) 60
OH
O O
NH
OO
C49H41NO5, MG: 723.85 g/mol
Darstellung:
150 mg (0.27 mmol, 1.0 Äq.) der Dihydroxylpinzette 50, 53 mg (0.30 mmol, 1.1 Äq.)
Boc‐Gly‐OH und 145 mg (0.27 mmol, 1.0 Äq.) PyBOP werden in 10 mL absolutem
Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 88 μL (0.79 mmol, 3.0 Äq.) N‐
Methylmorpholin wird die Lösung 3 Tage bei 40 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird
anschließend unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand
säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 15:1 v/v) gereinigt. Man erhält 117 mg
(0.16 mmol, 60%) PiOHGlyBoc 60.
Analytik:
DC: RF = 0.40 (Chloroform/Aceton 15:1 v/v).
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.54 (s, 9 H, C(CH3)3), 2.33‐2.46 (m, 8 H, CH2), 3.98 (s,
2 H), 4.07 (s, 4 H), 4.22‐4.26 (m, 4 H), 5.19 (s, 1 H), 6.74‐6.77 (m, 4 H, Ar‐H), 7.06‐7.09
(m, 4 H, Ar‐H), 7.13 (s, 2 H, Ar‐H), 7.16 (s, 2 H, Ar‐H).
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.4, 30.8, 42.5, 47.4, 48.7, 51.3, 51.4, 68.9, 70.1, 80.2,
82.6, 116.3, 116.7, 121.4, 121.5, 124.6, 126.6, 133.3, 135.8, 140.7, 142.3, 146.4, 146.7, 147.5,
150.3, 150.4, 155.8, 159.1, 168.8.
MS (ESI, MeOH): m/z = 746.3 [M+Na+], 762.3 [M+K+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C49H41NNaO5+: 746.2877, gef.: 746.2862.
Experimenteller Teil
145
8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐
5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen
(Pi‐POMe‐GlyBoc) 65
O
O O
NH
OO
PMe
MeO
O
C51H46NO7P, MG: 815.89 g/mol
Darstellung:
100 mg (0.138 mmol, 1 Äq.) Boc‐Gly‐Pi 60 werden in 10 mL absolutem THF gelöst
und auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 28 mg (0.21 mmol, 1.5 Äq.)
Methylphosphonssäuredichlorid und 57 μL Triethylamin (0.41 mmol, 3.0 Äq.) wird
die resultierende Lösung eine Stunde unter Eiskühlung gerührt und daraufhin eine
weitere Stunde bei Raumtemperatur. Nun werden 5 mL absolutes Methanol
zugefügt und wiederum 16 h bei RT gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand
säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 15:1 v/v) gereinigt, um 47 mg
(0.058 mmol, 42%) des Produktes als weißem Feststoff zu erhalten.
Analytik:
DC: RF = 0.5 (Chloroform/Aceton 15:1 v/v).
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.50‐1.62 (m, 3 H), 1.56 (s, 9 H), 2.36‐2.52 (m, 8 H),
2.72 (d, 3JH‐P = 11.1 Hz, 3 H), 4.00 (d, 3JH‐H = 3.2 Hz, 2 H), 4.07 (s, 4 H), 4.25‐4.29 (m, 3
Experimenteller Teil
146
H), 4.42 (s, 1 H), 5.18 (s, 3JH‐H = 3.2 Hz, 1 H), 6.71‐6.77 (m, 4 H), 7.01‐7.16 (m, 7 H), 7.32
(s, 1 H).
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.5.
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 10.2, 12.2, 16.5, 28.4, 30.9, 48.7, 51.2, 52.4, 68.4, 69.6,
80.3, 116.5, 116.6, 116.7, 117.2, 120.9, 121.6, 121.7, 124.6, 124.8, 136.1, 136.7, 136.8, 141.5,
141.8, 141.9, 146.1, 146.3, 146.5, 146.7, 147.6, 168.5.
MS (ESI, MeOH): m/z = 738.4 [M+Na+], 754.3 [M+K+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C51H46NNaO7P+: 838.2904, gef.: 838.2889.
8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐glycinyloxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐
5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen Trifluoracetat (Pi‐POMe‐Gly) 65b
O
O O
NH3+
PMe
MeO
O
CF3COO-
C48H39F3NO7P, MG: 829.80 g/mol
Darstellung:
20 mg PIPOMeGlyBOC 65 (0.025 mmol) werden in 5 mL Dichlormethan gelöst und
unter starkem Rühren 1 mL Trifluoressigsäure zugegeben. Die Mischung wird 2 h
bei RT gerührt und anschließend nach Zugabe von 10 mL Toluol unter
vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. Zur vollständigen azeotropen
Destillation überschüssiger Trifluoressigsäure wird noch mindestens zwei weitere
Male nach Zugabe von Toluol unter vermindertem Druck destilliert. Der zurück
bleibende weiße Feststoff wird im HV getrocknet und ergibt in quantitativer
Ausbeute das Ammoniumsalz.
Experimenteller Teil
147
Analytik:
1H‐NMR (300MHz, CDCl3): δ = 1.45‐1.53 (m, 3 H), 2.30‐2.35 (m, 8 H), 2.82 (d, 3JHP =
10.95 Hz, 3 H), 3.91‐4.30 (m, 10 H), 6.66‐6.68 (m, 4 H), 6.97‐7.25 (m, 8 H).
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.7.
MS (ESI, MeOH): m/z = 716.4 [M+H+], 738.3 [M+Na+], 754.3 [M+K+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C46H39NO5P+: 716.2560, gef.: 716.2565.
8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐
5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen Lithiumsalz
(Pi‐PO‐GlyBOC) 65a
O
O O
NH
PMe
-O
O
Li+
OO
C50H43LiNO7P, MG: 807.79 g/mol
Darstellung:
45 mg PIPOMeGlyBoc 65 (0.055 mmol, 1 Äq.) und 10 mg getrocknetes
Lithiumbromid (0.11 mmol, 2 Äq.) werden in 5 mL absolutem Acetonitril suspendiert
und 24 h unter Reflux erhitzt. Das Produkt fällt als weißes Präzipitat aus und wird
durch Zentrifugation von der auf RT abgekühlten Lösung getrennt (5 min, 4400 rpm)
und noch dreimal mit Diethylether gewaschen und wiederum zentrifugiert. Nach
Trocknen im HV erhält man 39 mg (0.048 mmol, 88%) Produkt.
Experimenteller Teil
148
Analytik:
1H‐NMR (300MHz, d4‐MeOD): δ = 1.15 (d, 2JHP = 16.41 Hz, 3 H), 1.42 (s, 9 H), 2.14 (d,
2JHH = 7.17 Hz, 2 H), 2.21 (s, 4 H), 2.33 (d, 2JHH = 6.60 Hz, 2 H), 3.86 (s, 2 H), 3.89 (s, 4
H), 3.98 (s, 2 H), 4.36 (s, 2 H), 6.66‐6.68 (m, 4 H), 6.89‐6.91 (m, 4 H), 6.94 (s, 2 H), 7.01
(s, 2 H).
31P‐NMR (121 MHz, d4‐MeOD): δ = 21.6.
13C‐NMR (75 MHz, d4‐MeOD): δ = 12.7, 28.9, 43.2, 52.4, 69.1, 69.4, 80.9, 117.3, 122.0,
122.2, 125.9, 142.6, 143.4, 148.4, 148.8, 149.0, 151.8, 151.9, 170.6, 185.7.
MS (ESI‐negativ, MeOH): m/z = 800.3 [M‐].
HRMS (ESI‐negativ, MeOH), ber. für C50H43NO7P‐: 800.2772, gef.: 800.2743.
8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐glycinyloxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐
5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐PO‐Gly) 67
O
O O
NH3+
PMe
-O
O
C45H36NO5P, MG: 701.74 g/mol
Darstellung:
39 mg PiPOGlyBoc 65a (0.048 mmol) werden in 5 mL Dichlormethan suspendiert
und unter starkem Rühren 1 mL Trifluoressigsäure zugegeben. Die nun klare Lösung
wird 2 h bei RT gerührt und anschließend nach Zugabe von 10 mL Toluol unter
vermindertem Druck bis zur Trockene destilliert. Der zurück bleibende weiße
Feststoff wird dreimal in Toluol aufgenommen und wieder bis zur Trockene
Experimenteller Teil
149
eingeengt und schließlich im HV getrocknet. Zurück bleiben 39 mg (quant.) Rezeptor
als weißer Feststoff.
Analytik:
Smp.: > 310 °C.
1H‐NMR (300 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.37 (d, 2JHP = 17.19 Hz, 3 H), 2.19 (d, 2JHH = 7.17
Hz, 2 H), 2.26 (s, 4 H), 2.38 (d, 2JHH = 6.60 Hz, 2 H), 3.93‐3.98 (m, 5 H), 4.19 (s, 2 H),
4.35 (s, 2 H), 6.72‐6.73 (m, 4 H), 7.00‐7.13 (m, 8 H).
31P‐NMR (121 MHz, d4‐MeOD): δ = 23.99.
19F‐NMR (282 MHz, d4‐MeOD): δ = ‐78.6.
MS (ESI, MeOH): m/z = 702.4 [M+H+], 724.4 [M+Na+], 740.5 [M+K+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C45H37NO5P+: 702.2404, gef.: 702.2409.
Experimenteller Teil
150
8‐Hydroxy‐19‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐
carbonyloxyl}‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐
tetramethanononacen Pi‐OH‐PyrGUABoc 61
OH
O O
NH
ONH
NHHN O
O
C54H44N4O6, MG: 844.95 g/mol
Darstellung:
150 mg (0.27 mmol, 1.0 Äq.) der Dihydroxylpinzette 50, 121 mg (0.30 mmol, 1.2 Äq.)
Boc‐Gly‐OH und 151 mg (0.29 mmol, 1.1 Äq.) PyBOP werden in 10 mL absolutem
Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 88 μL (0.79 mmol, 3.0 Äq.) N‐
Methylmorpholin wird die Lösung 3 Tage bei 40 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird
anschließend unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand
säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 15:1 v/v) gereinigt. Man erhält 97 mg
(0.11 mmol, 43%) Produkt als weißen Feststoff.
Analytik:
Smp.: >330 °C.
DC (Chloroform/Aceton 15:1 v/v): RF = 0.21.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.53 (s, 9 H), 2.35‐2.49 (m, 8 H), 4.02 (s, 2 H), 4.07 (s, 4
H), 4.25 (s, 2 H), 6.76‐6.78 (m, 4 H), 7.10‐7.17 (m, 10 H).
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.0, 30.8, 47.4, 48.7, 51.2, 68.9, 70.0, 116.3, 116.7, 117.4,
121.4, 121.5, 124.6, 133.2, 135.7, 141.1, 141.8, 146.3, 146.7, 147.5, 150.4, 158.0, 158.9.
MS (ESI, MeOH): m/z = 845.2 [M+H+], 867.4 [M+Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C54H44N4NaO6+: 867.3153, gef.: 867.3146.
Experimenteller Teil
151
8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinyl‐
carbonyl]pyrrol‐2‐carbonyloxyl}‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐
tetramethanononacen (Pi‐POMe‐PyrGUABoc) 66
O
O O
PMe
MeO
O
NH
ONH
NHHN O
O
C56H49N4O8P, MG: 936.98 g/mol
Darstellung:
47 mg (0.040 mmol, 1 Äq.) Boc‐PyrGua‐Pi 61 werden in 5 mL absolutem THF gelöst
und auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 8 mg (0.060 mmol, 1.5 Äq.)
Methylphosphonssäuredichlorid und 17 μL Triethylamin (0.12 mmol, 3.0 Äq.) wird
die resultierende Lösung eine Stunde unter Eiskühlung gerührt und daraufhin eine
weitere Stunde bei Raumtemperatur. Nun werden 3 mL absolutes Methanol
zugefügt und wiederum 16 h bei RT gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand
säulenchromatographisch (Essigsäureethylester/Methanol 20:1 v/v) gereinigt, um
26 mg (0.028 mmol, 69%) des Produktes als weißem Feststoff zu erhalten.
Analytik:
DC (Essigsäureethylester/Methanol 10:1 v/v): RF = 0.64.
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.56 (m, 3 H, PCH3), 1.58 (s, 9 H, C(CH3)3), 2.23‐2.61
(m, 8 H, CH2), 2.73 (d, 3JHP = 11.2 Hz, 3 H, POCH3), 4.03‐4.14 (m, 7 H, CH), 4.30‐4.43
(m, 1 H, CH), 6.74‐6.76 (m, 4 H, Ar‐H), 6.98‐7.32 (m, 10 H, Ar‐H und Pyr‐H).
Experimenteller Teil
152
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 14.2, 27.9, 48.7, 48.9, 51.1, 51.2, 60.4, 68.4, 69.7, 76.6,
78.0, 116.7, 117.2, 117.5, 120.9, 121.6, 124.6, 141.8, 142.3, 146.3, 147.5, 147.7, 147.8, 150.3,
150.4, 150.5, 150.6.
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.6.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 959.3 [M+Na+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C56H49N4NaO8P+: 959.3180, gef.: 959.3173.
8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐[5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐
carbonyloxyl]‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐
tetramethanononacen
Pi‐POMe‐PyrGUA 66b
O
O O
PMe
MeO
O
NH
ONH
NH2+
H2N CF3COO-
C53H42F3N4O8P, MG: 950.89 g/mol
Darstellung: AAV I
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.64 (d, 2JHP = 17.0 Hz, 3 H, PCH3), 2.34‐2.49 (m, 8 H,
CH2), 2.68 (d, 3JHP = 11.3 Hz, 3 H, POCH3), 3.99‐4.30 (m, 8 H, CH), 6.67‐6.69 (m, 4 H,
Ar‐H), 6.92‐7.54 (m, 10 H, Ar‐H und Pyr‐H).
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 29.3.
19F‐NMR (282 MHz, CDCl3): δ = ‐75.6.
Experimenteller Teil
153
8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]‐
pyrrol‐2‐carbonyloxyl}‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐
tetramethanononacen Lithiumsalz (Pi‐PO‐PyrGUA‐Boc) 66a
O
O O
PMe
-O
O
NH
ONH H
NHN
O
O
Li+
C55H46LiN4O8P, MG: 928.89 g/mol
Darstellung:
45 mg PiPOMePyrGUABoc 66 (0.048 mmol, 1 Äq.) und 10 mg getrocknetes
Lithiumbromid (0.11 mmol, 2.3 Äq.) werden in 5 mL absolutem Acetonitril
suspendiert und 24 h unter Reflux erhitzt. Das Produkt fällt als weißes Präzipitat aus
und wird durch Zentrifugation von der auf RT abgekühlten Lösung getrennt (5 min,
4400 Upm), noch dreimal mit Diethylether gewaschen und wiederum zentrifugiert.
Nach Trocknen im HV erhält man 35 mg (0.038 mmol, 78%) Produkt.
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.19 (d, 2JHP = 16.41 Hz, 3 H), 1.49, (s, 9 H), 2.20 (d, J =
7.35 Hz, 2 H), 2.25 (s, 4 H), 2.41 (d, J = 7.38 Hz, 2 H), 3.89‐3.98 (m, 6 H), 4.43 (s, 2 H),
6.70‐6.73 (m, 4 H), 6.85 (d, 3JHH = 3.96 Hz, 1 H), 6.93‐6.97 (m, 6 H), 7.05 (d,
3JHH = 4.5 Hz, 1 H), 7.10 (s, 2 H).
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 21.5.
ESI‐MS (ESI negativ, MeOH): m/z = 921.3 [M‐].
HRMS (ESI negativ, MeOH), ber. für C55H46N4O8P‐: 921.3048, gef.: 921.3017.
Experimenteller Teil
154
8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐(5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonyloxyl)‐
5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen
(Pi‐PO‐PyrGUA) 68
O
O O
PMe
-O
O
NH
ONH
NH2+
H2N
C50H39N4O6P, MG: 822.84 g/mol
Darstellung:
25 mg PiPOPyrGuaBoc 66a (0.027 mmol) werden in 5 mL Dichlormethan suspendiert
und unter starkem Rühren 1 mL Trifluoressigsäure zugegeben. Die nun klare Lösung
wird 2 h bei RT gerührt und anschließend nach Zugabe von 10 mL Toluol unter
vermindertem Druck bis zur Trockene destilliert. Der zurück bleibende weiße
Feststoff wird dreimal in Toluol aufgenommen und wieder bis zur Trockene
eingeengt und schließlich im HV getrocknet. Zurück bleiben 25 mg (quant.) Rezeptor
als weißer Feststoff.
Analytik:
1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.55 (d, 3JHP = 17.55 Hz, 3 H), 2.30‐2.45 (m, 8 H), 3.90‐
3.99 (m, 6 H), 4.40 (s, 2 H), 6.73‐6.76 (m, 4 H), 6.94‐6.98 (m, 4 H), 7.00 (s, 2 H), 7.08 (d,
3JHH = 4.5 Hz, 1 H), 7.16 (s, 2 H), 7.30 (d, 3JHH = 4.6 Hz, 1 H).
Experimenteller Teil
155
13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 31.8, 37.4, 42.7, 48.6, 51.0, 51.1, 52.5, 53.7, 109.3, 113.1,
116.9, 118.0, 120.7, 121.3, 121.6, 122.6, 124.2, 124.7, 124.8, 125.4, 128.6, 129.0, 136.2,
142.7, 146.7, 147.4, 148.3, 150.6, 151.1, 159.6, 160.2, 163.9, 164.9.
31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 24.7.
19F‐NMR (282 MHz, CDCl3): δ = ‐76.0.
ESI‐MS (MeOH): m/z = 823.3 [M+].
HRMS (ESI, MeOH), ber. für C50H40N4O6P+: 823.2680, gef.: 823.2689.
Experimenteller Teil
156
7.3 Titrationen
7.3.1 Theoretische Grundlagen zu NMR‐Titrationen
Für die Bildung eines dimeren Komplexes [WG] aus einem Wirtmolekül W und
einem Gastmolekül G gibt das Massenwirkungsgesetz die Assoziationskonstante Kass
an.
W + G [WG] GW
WGass cc
cK
⋅= ][ Gleichung 1
][0 WGWW ccc −= und ][0 WGGG ccc −= Gleichung 2
Die Lage des Gleichgewichts läßt sich über unterschiedliche spektroskopische
Methoden, z.B. durch UV/Vis‐, Fluoreszenz‐ oder insbesondere NMR‐Spektroskopie
durch ein Titrationsexperiment ermitteln, bei dem die Konzentration cW des Wirtes
möglichst konstant gehalten und die Konzentration cG des Gastes systematisch
variiert wird. Ersetzt man in Gleichung 1 die Gleichgewichtskonzentrationen cW und
cG gemäß den beiden Gleichungen 2 durch die Ausgangskonzentrationen cW0 und cG0
und die Komplexkonzentration c[WG], so erhält man durch Lösen des resultierenden
quadratischen Gleichungssystems für die Komplexkonzentration im
Gleichgewichtszustand:
⎪⎭
⎪⎬⎫
⎪⎩
⎪⎨⎧
⋅⋅−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛++−++⋅= 00
2
0000][ 41121
GWGWass
GWass
WG ccccK
ccK
c Gleichung 3
Ist die Austauschrate des dynamischen Gleichgewichts der Komplexbildung
langsam bezogen auf die NMR‐Zeitskala, so beobachtet man unterschiedliche
Signalsätze für Wirt, Gast und den Komplex. Ihre Konzentration im
Gleichgewichtszustand läßt sich dann direkt durch Integration der Signale
bestimmen. In der Regel geschieht dieser Austausch jedoch so schnell, daß man
lediglich gemittelte Signale detektiert. Die beobachtete chemische Verschiebung δobs
eines Kerns im Wirtmolekül setzt sich dann zusammen aus den Signalen δW für den
freien Wirt und δ[WG] für den im Komplex gebundenen Wirt:
Experimenteller Teil
157
][0
][
0
][0WG
W
WGW
W
WGWobs c
cccc
δδδ ⋅+⋅−
= Gleichung 4
oder mit WWG δδδ −=∆ ][max Gleichung 5
max0
][ δδδ ∆⋅+=W
WGWobs c
c Gleichung 6
Durch Einsetzen von Gleichung 6 in Gleichung 3 erhält man die beobachtete
chemische Verschiebung δobs eines Kerns im Wirtmolekül als:
⎪⎭
⎪⎬⎫
⎪⎩
⎪⎨⎧
⋅⋅−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛++−++⋅
⋅∆
+= 00
2
00000
max 4112 GWGW
assGW
assWWobs cccc
Kcc
Kcδ
δδ Gleichung 7
Nach Aufnahme von NMR‐Spektren der isolierten Wirtverbindung und Mischungen
mit verschiedenen Anfangskonzentrationen cW0 und cG0 von Wirt und Gast lassen sich
die Komplexbindungskonstante Kass und die maximale komplexinduzierte
Verschiebung Δδmax des beobachteten Kerns durch nichtlineare Regression iterativ
berechnen.
Für den Fall der Selbstassoziation eines Substrates S zu einem Dimer S2 ergibt sich
aus dem Massenwirkungsgesetz die Assoziationskonstante Kass:
2S S2 22
][][
SSK ass = Gleichung 8
Die beobachtete Verschiebung δobs eines Kerns im NMR‐Spektrum läßt sich als
Funktion von Kass, der Konzentration [S] des Substrats und den chemischen
Verschiebungen δagg und δfrei für das im Dimer gebundene Substrat bzw. bei
unendlicher Verdünnung ausdrücken. Gleichung 9 kann dabei direkt aus Gleichung
7 entwickelt werden.
][21][41][2
)(SK
SKSK
ass
assassaggfreiaggobs
+−+⋅−+= δδδδ Gleichung 9
Durch nichtlineare Regression kann Kass so aus einer Verdünnungsreihe NMR‐
spektroskopisch bestimmt werden.[126, 127]
Experimenteller Teil
158
7.3.2 Praktische Durchführung von NMR‐Titrationen
In dieser Arbeit kamen einige im Detail unterschiedliche Methoden der NMR‐
Titration zum Einsatz. Grundsätzlich ist zu berücksichtigen, daß die Konzentration
der Wirtverbindung etwa dem Kehrwert der erwarteten Bindungskonstante
entsprechen sollte, um durch einen günstigen Verlauf der Titrationskurve den
statistischen Fehler der Regressionsanalyse zu minimieren.[128] Nichtsdestotrotz liegt
aus meßtechnischen Erwägungen heraus die Konzentration für NMR‐Titrationen
i.d.R. zwischen 10‐4 und 10‐2 mol/L, unabhängig von der zu erwartenden
Bindungskonstante.
a) Titration in einem einzelnen NMR‐Probenröhrchen
600‐700 μL der Wirtlösung werden vorgelegt und bis etwa 250 μL Gastlösung
sukzessive zutitriert, bis mindestens 5 Äquivalente Gast zugefügt worden sind. Diese
Methode ist sehr einfach und erfordert nur minimalste Stoffmengen. Nachteile sind
ein relativ hoher Zeitaufwand, weil durch die periodisch notwendigen
Titrationsschritte nicht in Automation gemessen werden kann. Zu berücksichtigen ist
weiterhin, daß bei dieser Methode die Wirtlösung etwas verdünnt wird. Zuvor ist
daher zu testen, daß der Wirt im erforderlichen Bereich keine
konzentrationsabhängigen Signalverschiebungen aufweist.
Alternativ kann ein größeres Volumen der Wirtlösung hergestellt werden. Der Gast
wird dann in einem Teil dieser Wirtlösung gelöst. Wird diese Wirt/Gast‐Lösung
schließlich zu einer reinen Wirtlösung hinzutitriert, so ändert sich im Verlauf der
Titration die Wirtkonzentration nicht. Für diese Methode sind schon etwas erhöhte
Stoffmengen erforderlich.
b) Verteilte Meßreihe in mehreren NMR‐Probenröhrchen
Die komplette Titrationsreihe kann auch auf etwa 10 Proben verteilt werden. Hierfür
muß ein entsprechend größeres Volumen der Wirt‐ und Gastlösung hergestellt
werden. Falls gewünscht kann auch hier die Wirtkonzentration in allen Proben
konstant gehalten werden oder eine reine Gastlösung klassisch zutitriert werden. Die
Wirtlösung wird gleichmäßig auf 10 Proben aufgeteilt und die Menge an zugefügtem
Experimenteller Teil
159
Gast systematisch in dem verschiedenen Proben zwischen 0 und 5‐7 Äquivalenten
variiert. Es sollte beachtet werden, daß mindestens 4‐5 Proben vor dem
Äquivalenzpunkt der Titration liegen und einige im Sättigungsbereich, um später
eine gute Datenbasis für die nichtlineare Regression zu erhalten.
NMR‐Titration BP2‐PGly‐Z 14 (Wirt) gegen Methylguanidiniumhydrochlorid
(Gast)
Einwaage Wirt: 6.05 mg in 7.0 mL d4‐MeOD
Einwaage Gast: 3.57 mg in 1.29 mL d4‐MeOD
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm]
δc
[ppm] 0.00 1.622E‐03 0.000E+00 7.0700 4.6131 3.4725 0.25 1.599E‐03 4.018E‐04 7.0512 4.6153 3.4890 0.50 1.577E‐03 7.925E‐04 7.0269 4.6186 3.5100 0.75 1.556E‐03 1.172E‐03 7.0059 4.6230 3.5266 1.00 1.535E‐03 1.542E‐03 6.9915 4.6252 3.5388 1.25 1.514E‐03 1.902E‐03 6.9805 4.6274 3.5487 1.50 1.494E‐03 2.252E‐03 6.9750 4.6297 3.5587 2.01 1.456E‐03 2.926E‐03 6.9628 4.6308 3.5653 3.01 1.385E‐03 4.175E‐03 6.9506 4.6319 3.5753 5.02 1.262E‐03 6.340E‐03 6.9429 ‐ 3.5841 Δδmax 0.1423
± 3 %
0.0243
± 14 %
0.1256
± 3 % Ø (Ka) 1500 M‐1 Ka 1661
± 12 %
1295
± 49 %
1542
± 12 %
Experimenteller Teil
160
Äq. MeGUA0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Ka = 1660 +/- 12%; Ar-HKa = 1300 +/- 50%; α-CHKa = 1540 +/- 12%; POMe3
predictedpredictedpredicted
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiMeO
O
vs.NH2Cl
HN
NH2
Ha
c
b
Wiederholung der Titration in D2O ergab keine komplexinduzierten
Signalverschiebungen.
NMR‐Titration BP2‐PGly‐Z 14(Wirt) gegen Argininmethylesterdihydrochlorid
(Gast)
Einwaage Wirt: 8.45 mg in 7.0 mL d4‐MeOD
Einwaage Gast: 10.98 mg in 1.16 mL d4‐MeOD
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm] 0.00 1.972E‐03 0.000E+00 7.0711 3.4725 0.25 1.944E‐03 4.869E‐04 7.0396 3.4907 0.50 1.917E‐03 9.603E‐04 6.9943 3.5327 0.75 1.891E‐03 1.421E‐03 6.9567 3.5736 1.00 1.866E‐03 1.869E‐03 6.9324 3.5935 1.25 1.841E‐03 2.305E‐03 6.9268 3.5957 1.50 1.816E‐03 2.729E‐03 6.9290 3.5968 2.00 1.770E‐03 3.546E‐03 6.9302 3.5957 3.00 1.684E‐03 5.059E‐03 6.9268 3.5979 5.00 1.534E‐03 7.682E‐03 6.9302 3.5979 Δδmax 0.1437
± 1 %
0.1246
± 2 % Ø (Ka) 7.6 ∙ 105 M‐1 Ka 6.9 ∙ 105
± 27 %
8.3 ∙ 105
± 33 %
Experimenteller Teil
161
Äq. Arg
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiH3bC
O
vs.
NH
NH2
NH2ClCOOMe
ClH3N
Ha
NMR‐Titration BP2‐PGly‐Z 14 (Wirt) gegen Argininmethylesterdihydrochlorid
(Gast)
Einwaage Wirt: 8.45 mg in 7.0 mL D2O
Einwaage Gast: 10.98 mg in 1.16 mL D2O
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm]
δc
[ppm]
δd
[ppm] 0.00 2.300E‐03 0.000E+00 7.2175 7.0550 4.5649 3.6498 0.25 2.300E‐03 5.762E‐04 7.2175 7.0541 4.5640 3.6500 0.50 2.300E‐03 1.152E‐03 7.2194 7.0536 4.5635 3.6506 0.75 2.300E‐03 1.728E‐03 7.2216 7.0525 4.5668 3.6506 1.13 2.300E‐03 2.593E‐03 7.2243 7.0497 4.5685 3.6511 1.50 2.300E‐03 3.457E‐03 7.2291 7.0479 4.5688 3.6526 2.00 2.300E‐03 4.609E‐03 7.2306 7.0461 4.5692 3.6530 3.01 2.300E‐03 6.914E‐03 7.2323 7.0444 4.5709 3.6536 5.01 2.300E‐03 1.152E‐02 7.2372 7.0405 4.5725 3.6540 Δδmax 0.0352
± 25 %
0.0295
± 20 %
0.0358
± 22 %
0.0068
± 26 % Ø (Ka) 140 M‐1 Ka 129
± 48 %
95
± 34 %
145
± 45 %
189
± 56 %
Experimenteller Teil
162
. Argininmethylester * 2HCl
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
Ka = 129 +/- 48%; Ar-HKa = 95 +/- 34%; Ar-H (Z)Ka = 145 +/- 45%; POMeKa = 185 +/- 56%; α-CH
OHN
O P
O
MeO OLiO
NH
P
P
LiOMeO
O
OLiMeO
O
vs.
NH
NH2
NH2ClCOOMe
ClH3N
ab
c
d
NMR‐Titration H‐RGD‐OH (Wirt) gegen BP2‐PGly‐NH3+ 14 (Gast)
Einwaage Wirt: 7.467 mg in 3.12 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Einwaage Gast: 9.260 mg in 0.70 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
0.0 1.494E‐03 0.000E+00 3.9919 0.3 1.494E‐03 3.736E‐04 3.9676 0.5 1.494E‐03 7.472E‐04 3.9466 0.8 1.494E‐03 1.121E‐03 3.9223 1.0 1.494E‐03 1.494E‐03 3.9035 1.3 1.494E‐03 1.868E‐03 3.8914 1.5 1.494E‐03 2.242E‐03 3.8759 2.0 1.494E‐03 2.989E‐03 3.8560 3.0 1.494E‐03 4.483E‐03 3.8372 5.0 1.494E‐03 7.472E‐03 3.8051 Δδmax 0.3344
± 7 %
Ka 95
± 14 %
Experimenteller Teil
163
. BPPG
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
+H3N
P
O
MeO O-O
NH
P
P
-OMeO
O
O-MeO
O
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
Ha
Wiederholung der Titration mit größerem Wassergehalt (d4‐MeOD/D2O 1:4 v/v)
ergab keinerlei komplexinduzierte Signalverschiebungen mehr.
NMR‐Titration BP2‐Gly‐NH3+ 32 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 4.65 mg in 7.0 mL
d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Einwaage Gast: 19.08 mg in 2.0 mL
d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm] 0.0 1.200E-03 0.000E+00 3.5058 0.3 1.200E-03 3.442E-04 3.5058 0.6 1.200E-03 6.883E-04 3.5080 0.9 1.200E-03 1.032E-03 3.5091 1.1 1.200E-03 1.377E-03 3.5091 1.4 1.200E-03 1.721E-03 3.5102 1.7 1.200E-03 2.065E-03 3.5113 2.3 1.200E-03 2.753E-03 3.5135 3.4 1.200E-03 4.130E-03 3.5157 Δδmax 0.0686
± 32 % Ka 45
± 40 %
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
NH
PP O-
OMe
O-O
MeO
O
O
+H3N
a
Äq. RGD0 1 2 3 4 5 6 7
∆δ
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
0,018
Experimenteller Teil
164
NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐NH3+ 33 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 5.26 mg in 7.0 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Einwaage Gast: 19.08 mg in 2.0 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm] 0.0 1.195E‐03 0.000E+00 3.4194 2.4358 0.3 1.195E‐03 3.442E‐04 3.4393 2.4568 0.6 1.195E‐03 6.883E‐04 3.4590 2.4744 0.9 1.195E‐03 1.032E‐03 3.4750 2.4833 1.2 1.195E‐03 1.377E‐03 3.4900 2.4965 1.4 1.195E‐03 1.721E‐03 3.4950 2.5131 1.7 1.195E‐03 2.065E‐03 3.4950 2.5187 2.3 1.195E‐03 2.753E‐03 3.5300 2.5500 3.5 1.195E‐03 4.130E‐03 3.5300 2.5673 5.8 1.195E‐03 6.883E‐03 3.5300 2.5706 Δδmax 0.1518
± 13 %
0.1813
± 9 % Ø (Ka) 780 M‐1 Ka 937
± 39 %
624
± 24 %
Äq. RGD
0 1 2 3 4 5 6 7
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
abber.ber.
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH3
+
ab
Experimenteller Teil
165
NMR‐Titration BP2‐Ala‐Ala‐NH3+ 36 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 5.30 mg in 7.0 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Einwaage Gast: 19.08 mg in 2.0 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Äq. RGD0 1 2 3 4
∆δ
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
Ka = 156 +/- 55 %
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH3
+
a
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm] 0.0 1.226E‐03 0.000E+00 3.4857 0.3 1.226E‐03 3.442E‐04 3.4857 0.6 1.226E‐03 6.883E‐04 3.4890 0.8 1.226E‐03 1.032E‐03 3.4902 1.1 1.226E‐03 1.377E‐03 3.4902 1.4 1.226E‐03 1.721E‐03 3.4913 1.7 1.226E‐03 2.065E‐03 3.4913 2.2 1.226E‐03 2.753E‐03 3.4935 2.8 1.226E‐03 3.442E‐03 3.4957 3.4 1.226E‐03 4.130E‐03 3.4968 Δδmax 0.0299
± 36 % Ka 156
± 55 %
Experimenteller Teil
166
NMR‐Titration BP2‐Ala‐Gly‐Gly‐NH3+ 37 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 5.200 mg in 2.10 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Einwaage Gast: 6.000 mg in 0.70 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm] 0.0 1.071E‐03 0.000E+00 7.4082 7.0092 0.2 1.071E‐03 2.676E‐04 7.3861 7.0070 0.5 1.071E‐03 5.352E‐04 7.3949 7.0081 0.7 1.071E‐03 8.028E‐04 7.3894 7.0026 1.0 1.071E‐03 1.070E‐03 7.3872 7.0015 1.2 1.071E‐03 1.338E‐03 7.3861 7.0037 1.5 1.071E‐03 1.606E‐03 7.3883 7.0004 2.0 1.071E‐03 2.141E‐03 7.3839 7.0015 3.0 1.071E‐03 3.211E‐03 7.3839 7.0015 5.0 1.071E‐03 5.352E‐03 7.3795 6.9937 Δδmax 0.0283
± 24 %
0.0414
± 123 % Ka 2611
± 215 %
49
± 176 %
Äq. RGD
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
O HN
ONH
ONH3
+
Hb Ha
Die Bindung scheint tatsächlich sehr klein zu sein, wie die sehr kleinen Werte für
Δδmax andeuten. Die ermittelten Bindungskonstanten sind hier wegen der äußerst
hohen statistischen Fehler nur als Indiz für eine sehr schwache Bindung zu
verstehen. Die umgekehrt geführte NMR‐Titration mit H‐RGD‐OH als Wirt ergab
überhaupt keine auswertbare Sättigung.
Experimenteller Teil
167
NMR‐Titration BP2‐Gaba‐NH3+ 38 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 1.952 mg in 6.621 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Einwaage Gast: 2.440 mg in 0.610 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm]0.0 4.996E‐04 0.000E+00 3.5222 3.48790.2 4.996E‐04 1.249E‐04 3.5233 3.48900.5 4.996E‐04 2.498E‐04 3.5266 3.49130.7 4.996E‐04 3.746E‐04 3.5277 3.49351.0 4.996E‐04 4.995E‐04 3.5299 3.49571.2 4.996E‐04 6.244E‐04 3.5355 3.50011.5 4.996E‐04 7.493E‐04 3.5344 3.49903.0 4.996E‐04 1.499E‐03 3.5366 3.50344.0 4.996E‐04 1.998E‐03 3.5454 3.51125.0 4.996E‐04 2.498E‐03 3.5355 3.5012 Δδmax 0.0226
± 30 %
0.0248
± 34 % Ka 1796
± 98 %
1319
± 95 %
Äq. RGD0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
BP2-Gaba-NH3+ vs H-RGD-OH
H-RGD-OH vs BP2-Gaba-NH3+
Äq. BP2-Gaba-NH3+0 1 2 3 4
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Die Bindung scheint tatsächlich eher klein zu sein, wie die sehr kleinen Werte für
Δδmax andeuten. Die ermittelten Bindungskonstanten sind hier wegen der äußerst
hohen statistischen Fehler nur als Indiz für eine schwache Bindung zu verstehen. Die
Meßwerte erreichen keine richtige Sättigung, sondern streuen lediglich stark bei
Zugabe mehrerer Äquivalente Gast. Die umgekehrt geführte Reaktion führt zwar zu
deutlicheren Shifts. Die Meßwerte folgen aber einem eher linearen Verlauf und
erreichen überhaupt keine Sättigung mehr.
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
NHP
P
-O OMe
O
O-
OMeO
ONH3
+
Experimenteller Teil
168
NMR‐Verdünnungsreihe in D2O mit BP2‐Gly‐PyrGua+ 47
NHP
P
O-MeO
O
-OMeO
O
O
HN
O
NH
NH
O
H2N
NH2+Cl-
2Li+
a
b
c
d
c
[mol/L]
‐ log c δa
[ppm]
δb
[ppm]
δc
[ppm]
δd
[ppm] 5.00E‐03 ‐2.3010 7.0320 4.2464 3.7580 3.0302 3.00E‐03 ‐2.5229 7.0381 4.2560 3.7597 3.0337 1.50E‐03 ‐2.8239 7.0452 4.2630 3.7615 3.0364 6.00E‐04 ‐3.2218 7.0574 4.2762 3.7659 3.0399 5.00E‐04 ‐3.3010 7.0644 4.2797 3.7676 3.0425 3.00E‐04 ‐3.5229 7.0601 4.2779 3.7668 3.0408 1.00E‐04 ‐4.0000 7.0750 4.2806 3.7676 3.0434 5.00E‐05 ‐4.3010 7.0723 4.2797 3.7685 3.0434 Ø (Ka)
330 M‐1
Ka 744
± 56 %
109
± 70 %
285
± 70 %
198
± 65 %
log c-4 -3 -2
∆δ
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
abcd744 +/- 56%109 +/- 70%285 +/- 70%198 +/- 65%
Experimenteller Teil
169
NMR‐Titration EtPyrGua+ 45 (Wirt) gegen BP2(Gast) 20
Einwaage Wirt: 1.450 mg in 7.50 mL D2O/d6‐DMSO (40:60 v/v)
Einwaage Gast: 6.006 mg in 0.80 mL Wirt‐Lösung
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm] 0.0 7.436E‐04 0.000E+00 6.77930.5 7.436E‐04 3.608E‐04 6.76861.0 7.436E‐04 7.216E‐04 6.76991.5 7.436E‐04 1.082E‐03 6.76801.9 7.436E‐04 1.443E‐03 6.76672.4 7.436E‐04 1.804E‐03 6.76672.9 7.436E‐04 2.165E‐03 6.76365.8 7.436E‐04 4.330E‐03 6.75857.8 7.436E‐04 5.773E‐03 6.75739.7 7.436E‐04 7.216E‐03 6.7554
Δδmax 0.0281
± 6 % Ka 744
± 17 %
Äq. BP2-0 2 4 6 8 10 12
∆δ
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
P PMeO-O
OO-
OMe
O
NH
OHN HN
ONH2
+Cl-
NH2
Li+
Li+
vs.
Ha
Experimenteller Teil
170
NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 0.563 mg in 0.900 mL D2O (Phosphatpuffer 3 mM. pH 6.5)
Einwaage Gast: 2.412 mg in 0.450 mL D2O (Phosphatpuffer 3 mM. pH 6.5)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm]
δc
[ppm]
δd
[ppm] 0.0 1.030E‐03 0.000E+00 7.2644 7.0513 7.0408 6.9706 0.2 1.015E‐03 2.028E‐04 7.2652 7.0592 7.0495 6.9715 0.4 9.995E‐04 3.996E‐04 7.2687 7.0688 7.0583 6.9733 0.6 9.848E‐04 5.906E‐04 7.2670 7.0750 7.0662 6.9741 0.8 9.705E‐04 7.760E‐04 7.2705 7.0837 7.0732 6.9759 1.0 9.566E‐04 9.562E‐04 7.2714 7.0916 7.0811 6.9759 1.4 9.301E‐04 1.301E‐03 7.2731 7.1048 7.0943 6.9776 1.8 9.049E‐04 1.628E‐03 7.2731 7.1179 7.1074 6.9803 2.4 8.697E‐04 2.086E‐03 7.2784 7.1346 7.1241 6.9838 3.0 8.371E‐04 2.510E‐03 7.2784 7.1469 7.1363 6.9838 4.0 7.878E‐04 3.150E‐03 7.2810 7.1635 7.1539 6.9873 6.0 7.049E‐04 4.227E‐03 7.2845 7.1793 7.3688 6.9899 Δδmax 0.0442
± 23 %
0.3067
± 10 %
0.3034
± 9 %
0.0524
± 20 % Ø (Ka) 190 M‐1 Ka 214
± 38%
192
± 15%
196
± 14 %
153
± 29%
Äq. RGD0 1 2 3 4 5 6 7
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
214 +/- 38%192 +/- 15%196 +/- 14%153 +/- 29%
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+
NH2
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
Hc
HbHd
Ha
Die gleiche Titration wurde auch in 80 mM Phosphatpuffer durchgeführt. Hierbei
wurde bei minimalen Shifts (< 0.02 ppm) keine Sättigung erreicht.
Experimenteller Teil
171
NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 1.069 mg in 1.500 mL D2O (BisTrispuffer 40 mM. pH 6.1)
Einwaage Gast: 2.508 mg in 0.340 mL D2O (BisTrispuffer 40 mM. pH 6.1)
Äq. RGD0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006
∆δ
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+
NH2
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
Ha
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm] 0.0 1.174E‐03 0.000E+00 7.1442 0.2 1.156E‐03 2.794E‐04 7.1451 0.5 1.139E‐03 5.505E‐04 7.1460 0.7 1.122E‐03 8.136E‐04 7.1460 1.0 1.106E‐03 1.069E‐03 7.1477 1.2 1.090E‐03 1.317E‐03 7.1477 1.5 1.075E‐03 1.558E‐03 7.1486 2.4 1.017E‐03 2.459E‐03 7.1504 3.4 9.657E‐04 3.268E‐03 7.1530 5.8 8.572E‐04 4.973E‐03 7.1539 Δδmax 0.0163
± 26 % Ka 233
± 46%
Experimenteller Teil
172
NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen +H3N‐GDGRG‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 0.450 mg in 0.700 mL D2O (Phosphatpuffer 5 mM. pH 6.5)
Einwaage Gast: 8.220 mg in 1.000 mL D2O (Phosphatpuffer 5 mM. pH 6.5)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm]
δc
[ppm] 0.0 1.059E‐03 0.000E+00 7.0215 7.0110 6.9662 0.3 1.043E‐03 2.708E‐04 7.0267 7.0180 6.9671 0.5 1.027E‐03 5.334E‐04 7.0338 7.0241 6.9662 0.8 1.012E‐03 7.884E‐04 7.0390 7.0311 6.9689 1.0 9.973E‐04 1.036E‐03 7.0478 7.0373 6.9697 1.3 9.831E‐04 1.276E‐03 7.0513 7.0425 6.9697 1.6 9.693E‐04 1.510E‐03 7.0574 7.0478 6.9697 2.1 9.427E‐04 1.958E‐03 7.0671 7.0566 6.9715 3.1 8.937E‐04 2.785E‐03 7.0697 7.0697 6.9724 5.2 8.096E‐04 4.205E‐03 7.0943 ‐ 6.9733 Δδmax 0.1616
± 20 %
0.2039
± 9 %
0.0124
± 30 %Ø (Ka) 180 M‐1
(ohne δc)
Ka 204
± 32 %
162
± 13 %
391
± 60 %
Äq. GDGRG
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
204 +/- 32%162 +/- 13%
ber.ber.
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+
NH2
vs.+H3N-GDGRG-OH
HcHa
Hb
Experimenteller Teil
173
NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen +H3N‐GRGDG‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 0.400 mg in 0.700 mL D2O (Phosphatpuffer 6 mM. pH 6.5)
Einwaage Gast: 5.082 mg in 0.720 mL D2O (Phosphatpuffer 6 mM. pH 6.5)
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm] 0.0 9.411E‐04 0.000E+00 7.0215 7.0110 0.3 9.268E‐04 2.325E‐04 7.0267 7.0180 0.5 9.130E‐04 4.580E‐04 7.0338 7.0241 0.8 8.996E‐04 6.770E‐04 7.0390 7.0311 1.0 8.865E‐04 8.895E‐04 7.0478 7.0373 1.3 8.739E‐04 1.096E‐03 7.0513 7.0425 1.5 8.616E‐04 1.297E‐03 7.0574 7.0478 2.0 8.380E‐04 1.682E‐03 7.0671 7.0566 3.0 7.944E‐04 2.391E‐03 ‐ 7.0697 5.0 7.197E‐04 3.610E‐03 7.0943 ‐ Δδmax 0.1681
± 12 %
0.2029
± 9 % Ø (Ka) 210 M‐1 Ka 236
± 19 %
191
± 13 %
Äq. GRGDG
0 1 2 3 4 5 6
∆δ
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
abber.ber.
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+
NH2
vs.+H3N-GRGDG-OH
Ha
Hb
Experimenteller Teil
174
NMR‐Titration BP2‐ASer‐PyrGua+ 49 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)
Einwaage Wirt: 1.059 mg in 1.000 mL D2O (BisTrispuffer 11 mM. pH 6.3)
Einwaage Gast: 3.990 mg in 0.430 mL D2O (BisTrispuffer 11 mM. pH 6.3)
Äq. RGD0 2 4 6 8
∆δ
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
vs.
HN
NH2+H2N
+H3NO
NH O
HN COO-
COO-
OO
HN
P
P
-O OOMe
O-
OMe
O
ONH
OHN
HN
O
NH3+
NH
Ha,b
Äq. Gast c(Wirt)
[mol/L]
c(Gast)
[mol/L]
δa
[ppm]
δb
[ppm] 0.0 1.427E‐03 0.000E+00 7.1014 7.0965 0.3 1.406E‐03 3.515E‐04 7.1039 7.0987 0.5 1.385E‐03 6.925E‐04 7.1087 7.1020 0.8 1.364E‐03 1.023E‐03 7.1112 7.1042 1.0 1.344E‐03 1.345E‐03 7.1145 7.1072 1.3 1.325E‐03 1.657E‐03 7.1167 7.1109 1.5 1.307E‐03 1.960E‐03 7.1182 7.1130 2.0 1.271E‐03 2.542E‐03 7.1225 7.1173 3.0 1.205E‐03 3.615E‐03 7.1307 7.1234 5.0 1.091E‐03 5.458E‐03 7.1353 7.1283 7.0 9.975E‐04 6.984E‐03 7.1414 7.1338 Δδmax 0.0506
± 11 %
0.0494
± 10 %Ø (Ka) 280 M‐1 Ka 288
± 24%
263
± 21%
Experimenteller Teil
175
7.3.3 Mikrokalorimetrische Verdünnungstitrationen
Einwaage BP2‐Gly‐PyrGua+ 47: 840 μg in 650 μL aquabidest. mit 20 mM BisTris‐Puffer
(pH 6.3). Titration der Rezeptorlösung in die wäßrige Pufferlösung hinein.
0.00 33.33 66.67 100.00 133.33 166.67
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Time (min)
µcal
/sec
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
0.011
0.012
0.013
Equivalent Monomer Concentration (mM)
ucal
/inje
ctio
n
Einwaage BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44: 408 μg in 629 μL aquabidest. mit 20 mM BisTris‐
Puffer (pH 6.3). Titration der Rezeptorlösung in die wäßrige Pufferlösung hinein.
0.00 33.33 66.67 100.00 133.33 166.67
9.05
9.10
9.15
9.20
9.25
9.30
9.35
Time (min)
µcal
/sec
-0.020.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.200.22
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Equivalent Monomer Concentration (mM)
cal/i
njec
tion
NHP
P
O-MeO
O
-OMeO
O
O
HN
O
NH
NH
O
H2N
NH2+Cl-
2Li+
NHP
P
MeO O-
O
O-
OMeO
O HN
ONH
OHN HN
ONH2
+Cl-
NH22Li+
Literaturverzeichnis
176
8 Abkürzungsverzeichnis
Abu α‐Aminobuttersäure Abz Aminobenzoesäure Äq. Äquivalente Ar‐ Aryl‐; Phenyl‐ ber. berechnet BisTris 2,2‐Bis(hydroxymethyl)‐2,2’,2’’‐nitrilotriethanol Boc‐ t‐Butyloxycarbonyl‐ Brine Gesättigte Natrumchloridlösung Bz‐ Benzyl‐ Chlorenamin 1‐Chlor‐N,N,2‐trimethylpropenylamin Cl‐HOBt 6‐Chlorhydroxybenztriazol DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan DIEA Hünigbase; Diisopropylethylamin DMF Dimethylformamid ECM Extrazelluläre Matrix EE Essigsäureethylester ESI Elektronensprayionisation FD Felddesorption Gaba γ‐Aminobuttersäure h Horae; Stunden HBTU O‐(Benztriazol‐1‐yl)‐N,N,Nʹ,Nʹ‐
tetramethyluroniumtehexafluorophosphat HCTU 2‐(6‐Chlor‐1H‐benztriazol‐1‐yl)‐1,1,3,3‐
tetramethyluroniumhexafluorophosphat HOBt Hydroxybenztriazol HV Hochvakuum Mamb Meta‐Aminobenzoesäure MG Molekulargewicht min Minuten MS Massenspektrometrie Mukaiyama‐Reagenz N‐Methyl‐1‐chlorpyridiniumiodid N Normal NMM N‐Methylmorpholin NMR Kernresonanzspektroskopie PyBOP Benztriazol‐1‐yl‐oxytrispyrrolidino‐
phosphoniumhexafluorophosphat Pyr‐ Pyrrol‐ quant. quantitativ RF „ratio of fronts“ RT Raumtemperatur
Abkürzungsverzeichnis
177
TBTU O‐(Benztriazol‐1‐yl)‐N,N,Nʹ,Nʹ‐tetramethyluroniumtetrafluoroborat
tBu‐ tert‐Butyl‐, ‐C(CH3)3 TCTU 2‐(6‐Chlor‐1H‐benztriazol‐1‐yl)‐1,1,3,3‐
tetramethyluroniumtetrafluoroborat TFA Trifluoressigsäure Z‐ Benzyloxycarbonyl‐ Aminosäuren Aminosäure Abkürzung EinbuchstabencodeAlanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Aspartat Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutaminsäure Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F D‐Phenylalanin D‐Phe f Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V
Literaturverzeichnis
178
Verwendete Abkürzungen für häufig benutzte Strukturen
PP
NHR
O O
MeOMeO
OMeOMe
BP‐R BP2‐‐R
PP
NHR
O O
-OMeO
O-OMe
HO
ONH
HN
O
HN
NH
O
O
Boc‐GUA‐Pyr‐COOH H‐PGly‐OH
H2N
P
O
MeO OMeO
OH
BK‐R1‐R2OR1
OR2
Pi‐R1‐R2OR1
OR2
Literaturverzeichnis
179
9 Literaturverzeichnis
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Danke!
Zuvorderst möchte ich mich bei Prof. Dr. Thomas Schrader für die Bereitstellung und
intensive Betreuung des faszinierenden Arbeitsthemas bedanken, auch wenn die
neuen Rezeptoren am Ende nicht unser aller Hoffnungen auf neue Bindungsrekorde
erfüllen konnten.
Dank gilt Prof. Dr. C. Schmuck und Daniel Rupprecht für die Kooperation und die
Bereitstellung der Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteine. Weiterhin sei Prof. Dr. A.
Geyer für die freundliche Übernahme des Koreferates gedankt.
Allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des AK Schraders danke ich herzlich
für die angenehme, offene und freundschaftliche Arbeitsatmosphäre. Stellvertretend
seien hier besonders Bruce, Christian, Gerhard, Katrin, Lutz, Micha, Michael S.,
Michi, Olli und Petra genannt, die mich stets in theoretischen und praktischen
Fragen der Chemie, sowie moralisch unterstützt haben.
Für das Korrekturlesen meiner Dissertation möchte ich mich zusätzlich bei Katrin,
Christian und Tina bedanken.
Über die Semester haben zahlreiche Vertiefungsstudenten mich bei meiner Arbeit
unterstützt: Markus Rudisile, Karin Kiewisch, Joachim Zettler, Maik Bierschenk,
Markus Krause, Christoph Pohling und Klaus‐Georg Rheinsberg.
Besonders wertvolle Beiträge stammen von Kai Bernitzky, der mir zweimal in den
Semesterferien als studentische Hilfskraft zur Seite stand.
Tina und natürlich Jonathan danke ich für Liebe, Zuneigung und Zuflucht an den
freien Tagen.
Die letzte Danksagung gebührt meinen Eltern, ohne deren Unterstützung, Vertrauen
und Liebe diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.