DNA-ChipSeminar Bioanalytik

WS 2011/12

Lisa Kaiser

1. Einführung

Warum DNA-Chip ?

- Enormer Anstieg der Datenmenge

� Notwendigkeit eines Hochdurchsatz-Systems

- Microarrays sollen schnelle und umfassende Ergebnisse liefern

2. Definition

• Micro-Array = eine große Aufstellung bestimmter Moleküle auf einem sehr kleinen Raum (mehr als 200.000 Spots pro cm2)

• DNA-Chip= Festkörperoberfläche, auf der DNA-Sonden mit bekannter Sequenz rasterförmig durch kovalente Bindung immobilisiert sind

3. Anforderungen an das System

• Parallelität der Analyse

� Zeit- und Kostenersparnis

• Stabile Interaktion zwischen Reaktionspartner

• Ein Partner sollte Markierung tragen, die quantitative Auswertung ermöglicht

• Der andere Partner sollte kovalent an die Oberfläche des Microarrays gebunden sein

4. Prinzip und Aufbau

• Grundlegendes Prinzip:

� Komplementäre Basenpaarung von Nukleotidsequenzen

Aufbau eines DNA-Chip

1. Festkörperoberfläche

2. Hybridisierungssonden

3. Markierter Analyt

Festkörperoberfläche• speziell beschichtete bzw. modifizierte

Gläser oder Kunststoffe (selten auch Silizium)• Beschichtung aus Silanen, die reaktive Gruppen tragen (auch

Acrylamid- bzw. Nitrocelluloseartige, meist gelförmige Substanzen)

�Zweck der Beschichtungen ist, das Aufbringen der Sonden zu erleichtern

• Chemikalien für die Immobilisierung der Proben auf dem Glas:▫ � Poly-L-Lysine: Ionische Bindung zwischen der negativ

geladenen Phosphat-Gruppe der DNA und der positiv geladenen Amino-Schicht auf dem Glas

▫ � Aldehyde: Kovalente Bindung des Aldehyds mit der primären Amino-Gruppe der DNA

▫ � Epoxide: Auch zur Immobilisierung von Proteinen geeignet

Hybridisierungssonden

• „Fängermolekül“ auf Chip-Oberfläche

• Sowohl DNA als auch RNA möglich (Einzelstrang!)

• Synthese der DNA-Sonden

▫ On-Chip-Verfahren

▫ Off-Chip-Verfahren / Spotting

On-Chip Synthese

• Gebräuchlichste Form der DNA-Chip Synthese (Affymetrix)

• DNA- Moleküle werden direkt auf dem Glasträger synthetisiert

• Aufbringung von photolabilen Schutzgruppen auf Glasträger, die als Startpunkt für die Oligonukleotid-Synthese dienen

On-Chip Synthese

Off-Chip Synthese /Spotting

• Aufbringen von vorgefertigter DNA auf dem Microarray mittels Roboter• Trennung von Synthese und Deponierung der DNA auf Chip• Immobilisierung erfolgt auf modifizierten Glasoberflächen mit Hilfe von

Maschinen in Rasterform

- für größere DNA-Moleküle: Amino-modifizierte bzw. Poly-L- Lysine- behandelte Glasoberflächen

� elektrostatische WW zwischen positiv geladenen Amino-Gruppen und negativ geladenen Gruppen des DNA-Phosphatrückrades

- bei kleineren Oligonukleotid-Sonden werden diese mit einer 5´-Aminogruppe versehen� kovalente Bindung zwischen Träger und Oligonukleotid� Nukleophiler Angriff der Amino-Gruppe auf das C-Atom der Aldehydgruppe (Wasserabspaltung, Schiff´sche Base)

Vor-und Nachteile beider Verfahren

On-Chip Synthese Off-Chip Synthese /Spotting

+ hohe Dichte an Spots (250.000 pro cm2)

- max. 20-30 Oligonukleotide

- Herstellung kompliziert und teuer (an Hersteller gebunden)

- geringe Anwendungsflexibilität

- Qualitätsüberprüfung

� Vorteil bei niedriger Stückzahl und hoher Sondendichte

+ sowohl Oligonukleotide als auch längere DNA

+ Sonden sind zu 100% in ihrer Struktur bekannt

- Synthese teuer

- geringere Spotdichte

- geringere Oligomerdichte im Spot

� vor allem bei hohen Stückzahlen

Markierter Analyt

• Fluoreszierende Moleküle sind an Analyt gebunden, sodass nach Interaktion der Bindungspartner ein spezifisches Fluoreszenz-Signal detektiert werden kann

• Verwendung von Nukleotiden, die mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert sind

• v.a. Fluorophore Cyanine (Cy3 und Cy5)

• Auch möglich: DNA –Markierung durch radioaktive Markierung, Markierung mit Haptenen wie Biotin

5. Durchführung einer Analyse

Zwei Arten der DNA-Chip Analyse:

a) Welche Gene werden in Gewebe X exprimiert, die in Gewebe Y nicht vorkommt? � Expressionsstudien� quantitative Aussagen über das

Expressionsniveau der verschiedenen GeneBsp.: Tumorklassifizierung, Pharmakogenetik

b) Variation in genomischer DNA (z.B. Punktmutation, Deletion,Insertion),Untersuchung von SNPs

5. Durchführung einer Analyse

1. Isolierung und Vorbereitung der Nukleinsäuren

2. Hybridisierung

3. Detektion und Auswertung

1. Isolierung und Vorbereitung der Nukleinsäuren

• Isolierung RNA

• Mit Hilfe Reversen Transkriptase Herstellung von cDNA (Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden (Cy3� rot, Cy5 � grün)

• PCR

2. Hybridisierung

• Inkubieren des Chips mit der aufgereinigten DNA

• Hybridisierung der Sondennukleinsäuren mit den dazu komplementären Analytnukleinsäuren

• Abwaschen aller nicht gebundenen Targetmoleküle

3. Detektion und Auswertung

• Scannen des Chip mit einem

speziellen Microarray-Laserscanner

• Auswertung mit spezieller Software

6. Tierartennachweis mittels CarnoCheck®

• DNA-Chip mit Hilfe dessen 8 versch. Tierarten gleichzeitig nachgewiesen werden können (Schwein, Rind, Schaf, Pute, Huhn, Pferd, Esel, Ziege)

• Prinzip: Nachweis beruht auf Spezies-Unterschied in Gensequenz des Cytochrom b

• On-Chip Verfahren

6. Tierartennachweis mittels CarnoCheck®

1. Isolierung und Vorbereitung der Nukleinsäuren• Homogenisieren der Probe

• Extraktion der DNA

• PCR (ein 389 bp großes Fragment des Cytb-Gens wird amplifiziert):

� dabei wird das Fluorophor Cy5 an die Primer geknüpft

und somit sind alle Fragmente markiert

6. Tierartennachweis mittels CarnoCheck®

2. Hybridisierung

• Hybridisierung der markierten DNA-Fragmente auf

dem CarnoCheck-Chip

�markierte Amplifikationsprodukte

hybridisieren an tierartspezifische komplementäre DNA-Sonden, die an einer definierten Position auf dem Chip fixiert sind

• Waschen der nicht gebundenen DNA

6. Tierartennachweis mittels CarnoCheck®

3. Detektion und Auswertung• Die Detektion der gebundenen, Cy5-markierten PCR-

Produkte, sowie der Cy3-markierten Kontrollen erfolgt mittels eines Microarray-Scanners

• Messung der Extinktionen bei ~532 nm (Cy3) und ~635 nm (Cy5)

• Mit Hilfe der CheckReportTM Software kann das erhaltene Ergebnis über die enthaltenen Tierarten ausgewertet werden

• korrekte Durchführung der einzelnen Arbeitsschritte kann anhand der Kontrollen überprüft werden

• ein Träger beinhaltet 12 DNA-Chips und bietet Platz für 12 Proben

6. Tierartennachweis mittels CarnoCheck®

6. Tierartennachweis mittels CarnoCheck®

Vor-und Nachteile gegenüber bisherigen Nachweismethoden

Vorteile Nachteile

+ niedrige Nachweisgrenze

+ Zeitaufwand hält sich in Grenzen (ungefähr 8 Stunden, vergleichbarer ELISA 6 Stunden), kann 12 Proben parallel untersuchen

�Screening-Verfahren

+ einfaches, unkompliziertes Vorgehen

- zwar niedrige laufende Kosten, aber hohe Gerätekosten (Microarray-Scanner)

7. Zusammenfassende Bewertung des DNA-Chip

Vorteile Nachteile

+ Miniaturisierung

+ Parallelität der Analyse

� Zeitersparnis

+ Materialersparnis (geringe Probenvolumina, wiederverwendbarer Chip)

+ Automatisierbarkeit der Methode

- Abhängigkeit von Chipherstellern

- teuer

8. Literatur- und Abbildungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

• Hans-Joachim Müller, Thomas Röder, Der Experimentator Microarrays (2004), Spektrum Akademischer Verlag

• Ulrich Busch, Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik: Grundlegende Methoden und Anwendungen, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2010

• Elisabeth Johanna Stüber, Dissertation, Drei kommerzielle Testkits zur Tierartenidentifikation in Fleischerzeugnissen im Vergleich, München 2007

• Viola Podsadlowski, Dissertation, Neue Fluorophore für die Bioanalytik- Verwendung in der Tierartendifferenzierung mittels DNA-Biosensor und DNA-Chiptechnologie, Münster 2004

• www.greinerbioone.com/fr/france/files/58877/109fr_BQ-005-03ManualCarno_GP.pdf+Greiner+Bio-One+(2005)+CarnoCheck+Test+kit+for+the+detection+of+animal+species+in+food.+Manual,+Version+BQ-005-03&hl=de&gl=de&pid=bl&srcid=ADGEESgq64AoBDl_mEVvppB4VvpSKMF_GkmcA-AAIjgGzE9lq1ReftjY-u0VDR_EbC_mviNIHuiTDjdfAYZ9hU6rhjA7KSwDw5kHlHPLIzWVH0Ane3_l0CVKzehWnddWqU3omdiXoXxa&sig=AHIEtbTtZyALGYjwYS5m8zyAxGPimaXlwA (27.12.2011, 11:10)

• www.greinerbioone.com/en/row/files/84192/071055_CarnoCheck.PDF (27.12.2011, 11:13)• http://dbs.uni-leipzig.de/html/seminararbeiten/semWS0102/arbeit6/microarray_html.htm

(27.12.20111, 11:15)• http://grf.lshtm.ac.uk/microarrayoverview.htm (27.12.2011, 11:16)• http://www.ra.cs.uni-tuebingen.de/lehre/ws06/sem_inferenz/Microarrays_CDreischer.pdf (27.12.2011,

11:19)• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/ (27.12.2011, 16:53)• http://media.affymetrix.com/about_affymetrix/outreach/lesson_plan/downloads/student_manual_acti

vities/activity2/activity2_structure_function.pdf (27.12.2011, 17:28)

8. Literatur- und Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

• http://www.biotech.wisc.edu/Libraries/GEC_documents/MS200_Scanner_v2.sflb.ashx (27.12.2011, 12:38)

• http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/gd17/a3.gif (27.12.2011, 12:40)

• http://www.biotechnologyonline.gov.au/images/contentpages/helix.jpg (27.12.2011, 12:41)

• http://cs.au.dk/~chili/PBI/Exercises/figures/probesynthesis.jpg(27.12.2011, 12:43)

• http://candida2.bri.nrc.ca/whitewaylab/images/Microarray_Printer.jpg (27.12.2011, 12:44)

• http://www.igb.fraunhofer.de/content/dam/igb/de/images/presse/presseinformation/2003/downloads/dna-chip.jpg (27.12.2011, 13:00)

• www.agilent.com/about/newsroom/lsca/imagelibrary/images/cag_48_genome.jpg (27.12.2011, 16:57)

• http://www.agilent.com/about/newsroom/lsca/imagelibrary/images/cag_42_microarray_dna_print.jpg (27.11.2011, 17:01)

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit !