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Aus dem Institut für Physiologische Chemie I der Universität Würzburg

Vorstand: Professor Dr. rer. nat. Manfred Schartl

Biochemische Charakterisierung der basischen Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren Hey1 und Hey2 sowie Untersuchung ihrer

Rolle während der Herz- und Gefäßentwicklung

Inaugural – Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Andreas Fischer

aus Schneeberg

Würzburg, im November 2002

Referent: Professor Dr. med. Manfred Gessler

Koreferent: Professor Dr. med. Lutz Hein

Dekan: Professor Dr. med. Stefan Silbernagl

Tag der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2003

Der Promovend ist Arzt

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung................................................................................................................... 1 1.1 Der Notch-Signaltransduktionsweg ................................................................1 1.2 hairy- und Enhancer-of-split-verwandte Gene ...............................................5 1.3 Die Hey-Gene als neue Familie der hairy- und E(spl)-verwandten Gene.....7 1.4 Das Yeast Two-Hybrid System ......................................................................10 1.5 Zielsetzung ......................................................................................................12

2 Material ..................................................................................................................... 14 2.1 Plasmid-Vektoren............................................................................................14 2.2 Bakterien, Hefen und Zellinien ......................................................................15 2.3 Mausstämme ...................................................................................................16 2.4 Oligonukleotide...............................................................................................16 2.5 Medien, Puffer und Lösungen .......................................................................18 2.6 Enzyme und Kits .............................................................................................28 2.7 Genbanken und Proteinexpressionsfilter.....................................................28 2.8 Chemikalien und Hilfsmittel ...........................................................................29 2.9 Antikörper........................................................................................................29 2.10 Software...........................................................................................................30

3 Methoden ................................................................................................................. 31 3.1 DNA-Präparationen und Aufreinigung..........................................................31

3.1.1 Gewinnung von Plasmid-DNA nach der „Rapid-boiling“-Methode ............................... 31 3.1.2 Nucleobond-Minipräparation .............................................................................................. 31 3.1.3 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Bakterienkulturen ............................................. 31 3.1.4 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Hefekulturen ..................................................... 31 3.1.5 Isolierung von Hefeplasmiden nach der „Rapid-isolation“-Methode ............................ 32 3.1.6 Präparation von Träger-DNA für Hefetransformationen ................................................ 32 3.1.7 cDNA-Synthese.................................................................................................................... 32 3.1.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .............................................................. 33

3.2 Gelelektrophoresen ........................................................................................33 3.2.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese...................................................................................... 33 3.2.2 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese................................................ 33

3.3 DNA-Klonierungstechniken ...........................................................................34 3.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen ........................................................... 34 3.3.2 Ligation von DNA ................................................................................................................. 34

3.4 Transformation von kompetenten Bakterienzellen......................................35 3.4.1 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach Hanahan) ....... 35 3.4.2 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach Inoue) ............. 35 3.4.3 Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen .............................. 36

3.5 DNA-Sequenzierung .......................................................................................36 3.6 Amplifikation einer Plasmid-cDNA Bank ......................................................36

3.7 PCR-Methoden ................................................................................................36 3.7.1 Analytische PCR .................................................................................................................. 36 3.7.2 Präparative PCR .................................................................................................................. 37 3.7.3 Genotypisierung ................................................................................................................... 38

3.8 Radioaktive Markierung von DNA und Filterhybridisierungen...................38 3.8.1 Herstellen von Bakterienkolonie-Filtern............................................................................ 38 3.8.2 Herstellen von PCR-Produkt-Filtern.................................................................................. 38 3.8.3 Radioaktive Markierung von DNA ..................................................................................... 39 3.8.4 Filterhybridisierung .............................................................................................................. 39

3.9 Herstellung, Reinigung, Analyse von Proteinen..........................................39 3.9.1 In vitro Translation ............................................................................................................... 39 3.9.2 Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen ................................................. 40 3.9.3 Expression und Reinigung von MBP-Fusionsproteinen................................................. 40 3.9.4 Proteinexpression und Extraktion in Hefezellen.............................................................. 40 3.9.5 Herstellen und Aufreinigung eines AP-Fusionsproteins................................................. 41 3.9.6 In vitro Proteinsynthese, Reinigung und Nachweis ........................................................ 42 3.9.7 Western-Blot Analyse.......................................................................................................... 42

3.10 GST-Pulldown Assay......................................................................................43 3.11 Das Yeast Two-Hybrid System ......................................................................44

3.11.1 Herstellung kompetenter Hefezellen nach der Lithium-Acetat-Methode ................ 44 3.11.2 Transformation Lithium-Acetat-kompetenter-Hefezellen........................................... 44 3.11.3 Yeast Two-Hybrid Analyse nach der Mating-Methode .............................................. 44 3.11.4 Screening einer cDNA-Genbank mit der Mating-Methode........................................ 45 3.11.5 Screening einer cDNA-Genbank mit der Cotransformations-Methode ................... 45 3.11.6 Filter lift β-Galaktosidase Assay ................................................................................... 45 3.11.7 Quantitativer β-Galaktosidase Assay mit ONPG........................................................ 46

3.12 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Proteinen..........47 3.12.1 Herstellen von Proteinexpressionsfiltern ..................................................................... 47 3.12.2 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit AP-Fusionsproteinen......................... 47 3.12.3 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit einem Biotin-markierten Peptid ....... 48

3.13 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)...............................................48 3.13.1 Präparation der DNA-Sonden ....................................................................................... 48 3.13.2 Bindungsreaktion und nicht-denaturierende Gelelektrophorese.............................. 49

3.14 Zellkulturtechniken .........................................................................................49 3.14.1 Kultivierung und Lagerung ............................................................................................. 49 3.14.2 Transfektion mittels Calciumphosphat-Präzipitation .................................................. 50

3.15 Isolierung, Färbung, Einbettung und Schnitte von Mausgewebe ..............50 3.15.1 Präparation von Mausgewebe ...................................................................................... 50 3.15.2 lacZ-Färbung.................................................................................................................... 50 3.15.3 Einbetten und Schneiden von Mausgewebe in Paraffin............................................ 50

3.16 RNA in situ Hybridisierung ganzer Embryonen...........................................51 3.16.1 Herstellung der Digoxygenin-markierten RNA-Sonde ............................................... 51 3.16.2 Hybridisierung (Henrique et al., 1995) ......................................................................... 51

4 Ergebnisse............................................................................................................... 53 4.1 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Peptiden ...........53 4.2 Yeast Two-Hybrid Library Screening ............................................................56

4.2.1 Klonierung der Vektoren ..................................................................................................... 56 4.2.2 Screening mit dem Hey1-Carboxyterminus ..................................................................... 58

4.2.2.1 Hey1 aa 266-299 (GBK-YRPW) Screening............................................................ 59 4.2.2.2 Hey1 aa 173-299 (GBK-heyB) Screening .............................................................. 63

4.2.3 Screening mit verschiedenen Hey1-bHLH-Orange-Domänen ...................................... 64 4.2.3.1 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-bHLHOr, Hey1 aa 50-200) ............... 64

4.2.3.2 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-heyA, Hey1 aa 38-175) ..................... 65 4.2.3.3 Screening einer embryonalen (E17) cDNA-Bank mit GBK-heyA........................ 66

4.3 Test der Interaktion von Hey1 mit TLE1........................................................67 4.4 Hey-Homo- und Heterodimerisierung mit weiteren bHLH-Proteinen.........69

4.4.1 Hey-Homodimerisierung ..................................................................................................... 69 4.4.2 Hey-Protein Interaktion mit c-hairy1.................................................................................. 72 4.4.3 Hey1/2- und c-hairy1-Protein Interaktionen mit Klasse A E-Proteinen und MyoD..... 72

4.5 DNA-Bindung von Hey1/2, c-hairy1 und E-Proteinen..................................74 4.6 Genexpressions- und Funktionsanlysen an Hey2-Knockoutmäusen........78

4.6.1 Obduktion von Hey2-Knockoutmäusen ............................................................................ 78 4.6.2 lacZ-Expression in Herz und Gefäßen von Hey2-Knockoutmäusen............................ 80 4.6.3 Arteriographie von Hey2-Knockoutmäusen ..................................................................... 82 4.6.4 Elektrokardiogramm (EKG) ................................................................................................ 83 4.6.5 Expression von Hey1 und HeyL in Hey2-Knockout Embryonen................................... 85

5 Diskussion............................................................................................................... 88 6 Zusammenfassung................................................................................................ 98 7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 100 8 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 109

Danksagung Lebenslauf

Einleitung 1

1 Einleitung

Die Entwicklung eines vielzelligen Organismus aus einer einzigen befruchteten Eizelle ist

eines der faszinierendsten und spannendsten Kapitel der Medizin und Biologie. Obwohl

durch genetische und molekularbiologische Untersuchungen in den letzten Jahrzehnten

viele einzelne Mechanismen der Entwicklungsgeschichte aufgedeckt wurden, ist es nach

wie vor ein großes Rätsel, wie aus wenigen Stammzellen komplexe Organe wie Gehirn,

Herz oder Niere entstehen können.

Multiple Regulationsmechanismen steuern die Differenzierung von Vorläuferzellen zu

adulten ausgereiften Zellen. Dabei müssen zellspezifische Gene zum richtigen Zeitpunkt

an- bzw. abgeschalten werden. Dies wird in erster Linie durch Transkriptionsfaktoren

gesteuert, die ihrerseits durch komplizierte Signalkaskaden reguliert werden. Nur im

exakten Zusammenspiel von zahlreichen aktivierenden und hemmenden Faktoren

werden so zum richtigen Zeitpunkt die richtigen Gene transkribiert und translatiert.

Darüber hinaus müssen die einzelnen Zellen miteinander kommunizieren und sich

gegenseitig beeinflussen. Dies erfolgt über größere Distanzen z.B. mit Hilfe von

sezernierten Botenstoffen, während benachbarte Zellen direkt über Ligand-Rezeptor

Interaktionen Signale übermitteln können. Eines der wichtigsten dieser Regulations-

systeme, das die gesamte Differenzierung ab den frühesten Embryonalstadien steuert, ist

der Notch-Signaltransduktionsweg.

1.1 Der Notch-Signaltransduktionsweg

Die Notch-Signalkaskade spielt eine fundamentale Rolle während der

Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden, Fischen und Säugetieren. Durch die

Aktivierung von Notch können molekulare Unterschiede zwischen benachbarten Zellen

etabliert und somit unterschiedliche Zelldifferenzierungen und Gewebegrenzen

determiniert werden. Notch beeinflusst im komplexen Zusammenspiel mit zahlreichen

weiteren Faktoren die zelluläre Differenzierung, Proliferation und Apoptose in allen

Entwicklungsstadien und stellt somit einen zentralen Regulator der Entwicklungsbiologie

dar. In der Fruchtfliege Drosophila melanogaster gibt es wohl kaum ein Gewebe, dessen

Entwicklung nicht durch Notch beeinflusst wird (Hartenstein et al., 1992). So verwundert

es auch nicht, dass Mutationen von Notch-Genen zu zahlreichen Fehlbildungen und

Krankheiten in verschiedenen Spezies führen können.

Das Notch-Gen war eines der ersten Gene, das in Drosophila beschrieben wurde. Bereits

1919 zeigte O.L. Moohr, dass eine heterozygote Notch-Mutation Kerben (engl.: notches)

Einleitung 2

an den Flügelrändern verursacht (Moohr, 1919). Knapp 20 Jahre später entdeckte

D.F. Poulson, dass eine homozygote Notch-Mutation zu einem letalen „neurogenen“

Phänotyp führt, bei dem sich neuroektodermale Zellen nicht wie gewöhnlich zu

Epidermiszellen entwickeln, sondern überschüssiges Nervengewebe bilden (Poulson,

1937).

Notch kodiert einen Transmembranrezeptor, mit einer großen extrazellulären Domäne,

die durch 36 EGF-(epidermal growth factor)-ähnlichen „repeats“ und drei cysteinreichen

Notch/LIN12-Domänen charakterisiert wird. Als Liganden des Notch-Rezeptors agieren

die Transmembranproteine Delta und Serrate (Jagged bei Vertebraten, LAG-2 in

C. elegans). Die Bindung eines Liganden an den Notch-Rezeptor führt zur

proteolytischen Abspaltung seiner intrazellulären Domäne. An dieser komplizierten

Spaltung sind u.a. die Preseniline beteiligt, welche mit der erblichen Form der Alzheimer

Erkrankung assoziiert sind (Haass and De Strooper, 1999). Die aktivierte intrazelluläre

Notch-Domäne wird in den Zellkern importiert und bindet das Supressor-of-hairless

Protein (Su(H), bzw. CBF1/RBP-Jκ bei Säugetieren), das dadurch seine

Repressorfunktion verliert. Dies ermöglicht die Transkription von Enhancer-of-split

(E(spl))-Transkriptionsfaktoren, die dann weitere Zielgene regulieren (Artavanis-Tsakonas

et al., 1999). E(spl)-Transkriptionsfaktoren rekrutieren den Corepressor Groucho und

blockieren die Transkription proneuraler Gene, wie die des achaete-scute Komplexes,

was die Inhibition einer neuronalen Zelldifferenzierung zur Folge hat (s. Abb. 1). Die

Expression des Notch-Liganden Delta wird ebenfalls herunterreguliert und damit eine

Aktivierung von Notch in benachbarten Zellen verhindert. Der gesamte Prozess wird als

„laterale Inhibition“ beschrieben (Fisher and Caudy, 1998; Oellers et al., 1994). Neben

der „lateralen Inhibition“ wurden inzwischen noch weitere Mechanismen der Notch-

Kaskade beschrieben (Gaiano and Fishell, 2002).

Der Notch-Signalweg wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst, die bisher nur zum Teil

bekannt sind. Erwähnt werden soll hier nur das Fringe-Protein (lunatic, radical und manic

Fringe bei Vertebraten), ein negativer Regulator des Notch-Liganden Serrate. Fringe

besitzt eine Glykosyltransferase-Aktivität und verhindert durch N-

Acetylglukosaminylierung der Notch-EGF-„repeats“ eine Serrate-Notch Interaktion

(Bruckner et al., 2000; Moloney et al., 2000).

Einleitung 3

Abb. 1: Schema der Notch-Signalkaskade. Delta (Dl) interagiert mit Notch (N). Durch die Aktivierung kommt es zur Abspaltung der intrazellulären Notch-Domäne, die Supressor of Hairless (Su(H)) bindet und die Transkription von Enhancer-of-split (E(spl)) bewirkt. Durch Interaktion mit Groucho (G) reprimiert E(spl) die Transkription von Achaete-Scute (Ac-Sc). Weitere Faktoren des Signalweges sind gezeigt: Der Ligand Serrate (Ser) und sein Regulator Fringe (Fng), die Notch-spaltenden Enzyme Kuzbanian (Kuz), Presenilin und Furin, sowie die intrazellulär interagierenden Proteine Deltex (Dx), Disheveled (Dsh), Disabled (Dab) und Numb. Abbildung aus (Artavanis-Tsakonas et al., 1999).

Während in Drosophila nur ein Notch-Rezeptor, ein Delta- und ein Serrate-Protein

beschrieben wurden, gibt es bei der Maus vier bekannte Notch-Proteine sowie die Notch-

Liganden Delta-like(Dll)1,3,4 und Jagged-(=Serrate)1,2. Diese werden z.T.

unterschiedlich exprimiert, was die Erforschung ihrer jeweiligen Funktion noch erheblich

kompliziert. Trotzdem ist es teilweise gelungen, die Funktion einiger dieser Gene näher

zu ergründen. Bestimmte Mutationen von Notch oder seinen Liganden konnten sogar als

Ursache menschlicher Erkrankungen aufgedeckt werden.

So verursachen Mutationen in den extrazellulären EGF-„repeats“ des Notch3-Rezeptors

das autosomal dominant vererbte CADASIL-Syndrom (Cerebral autosomal dominant

arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy; OMIM 125310). Es ist

gekennzeichnet durch Arterienfehlbildungen, die zu subkortikalen Infarkten,

Leukenzephalopathie und zunehmender Demenz führen (Joutel et al., 1996).

Einleitung 4

Eine homozygote Notch1-Deletion bei Mäusen bewirkt eine frühe embryonale Letalität im

Stadium E9.5 (9,5 Tage post coitum) mit Somitogenese- und Neurogenesestörungen

sowie Hämorrhagien (Conlon et al., 1995; de la Pompa et al., 1997; Krebs et al., 2000;

Swiatek et al., 1994). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine hypomorphe Notch2-

Mutation zu glomerulären Schäden und myokardialer Hypoplasie führt (McCright et al.,

2001), während Notch4-Knockoutmäuse überraschenderweise einen normalen Phänotyp

zeigen, was auf eine gewisse Redundanz der Notch-Gene schließen lässt. Doppelt

homozygote Notch1/Notch4-Knockoutembryonen sterben allerdings in einem früheren

Stadium mit deutlich schwereren Defekten als Notch1-/--Mutanten. Der entscheidende

Defekt liegt hierbei in der Unfähigkeit der Doppelmutanten, größere Blutgefäße aus den

bereits angelegten primitiven Kapillarnetzwerken zu bilden (Krebs et al., 2000). Die

Expression eines aktivierten Notch4-Proteins unter Kontrolle des Flk1-Promoters im

Endothel führt ebenfalls zu einer stark reduzierten Gefäßbildung bzw. zu

Gefäßmissbildungen (Uyttendaele et al., 2001).

Die genannten Mutationsexperimente zeigen, dass Notch-Proteine insbesondere bei

Vaskulo- und Angiogenese eine zentrale Rolle spielen. Daneben sind weitere

Funktionen, in der Somitogenese, der Zelldifferenzierung von hämatopoetischen

Vorläuferzellen und in der Zellzykluskontrolle beschrieben worden (Robson MacDonald et

al., 2001). Da die Notch-Proteine an der Zelldifferenzierung beteiligt sind, liegt die

Vermutung nahe, dass sie auch in der Krebsentstehung involviert sein könnten.

Tatsächlich wurden das menschliche Notch1-(TAN1) und das murine Notch4-(int3) Gen

ursprünglich als Onkogene identifiziert. In einer geringen Anzahl von humanen T-Zell

Leukämien (T-ALL) kommt es durch eine chromosomale Translokation (7;9)(q34;q34.3)

zur Überexpression der intrazellulären Notch1-Domäne unter der Kontrolle des T-Zell

Rezeptor-β Promoters. Bei viral bedingten Brusttumoren der Maus wurde die Integration

des MMT-Virus in das Notch4-Gen beobachtet, was zur Überexpression der

intrazellulären Notch4-Domäne führt (Ellisen et al., 1991; Robbins et al., 1992).

Auch Mutationen der Notch-Liganden führen zu interessanten Phänotypen. Ein

Funktionsverlust des humanen Notch-Liganden Jagged1 ist verantwortlich für das

autosomal dominant vererbte Alagille-Syndrom (OMIM 118450) (Li et al., 1997; Oda et

al., 1997). Es ist gekennzeichnet durch Gallengangsanomalien und Herzfehler, wie

Pulmonalarterienstenose, Hypoplasie der pulmonalen Strombahn, Fallot-Tetralogie und

Septumdefekte. Weiterhin können faziale, vertebrale, renale und ophtalmologische

Anomalien assoziiert sein (Alagille et al., 1987). Inzwischen konnte auch eine familiäre

Form der Fallot-Tetralogie, einem kongenitalem Herzfehlbildungssyndrom mit

Ventrikelseptumdefekt, Pulmonalstenose und Dextroposition der Aorta auf eine Jagged1-

Einleitung 5

Mutation zurückgeführt werden (Eldadah et al., 2001). Jagged1-/- Mäuse sterben in utero

an der Folge schwerer Gefäßdefekte (Loomes et al., 1999; Xue et al., 1999). Jagged2-

Mutanten zeigen hingegen kraniofaziale Abnormalitäten sowie Thymus- und

Extremitätenfehlbildungen (Jiang et al., 1998).

Ein weiteres menschliches Fehlbildungssyndrom ist mit dem Delta-like3 (Dll3)-Liganden

assoziiert. Homozygote Dll3-Mutationen verursachen das Syndrom der spondylocostalen

Dysostosis (OMIM 277300), das auf Störungen der Somitenentwicklung beruht und der

pudgy-Mausmutante entspricht (Bulman et al., 2000; Kusumi et al., 1998). Dll1-

Knockoutmäuse weisen ebenfalls schwere Somitogenesestörungen auf, wobei keine

kranio-kaudale Differenzierung und Epithelialisierung der gebildeten Somiten erfolgt. Sie

sterben etwa im Stadium E12 an schweren Blutungen (Hrabe de Angelis et al., 1997).

1.2 hairy- und Enhancer-of-split-verwandte Gene Die Enhancer-of-split-Gene stellen die primären Zielgene des Notch-

Signaltransduktionsweges in Drosophila dar und sind, wie bereits erwähnt, verantwortlich

für den Prozess der „lateralen Inhibition“. E(spl)-Gene zeigen eine große Homologie zum

hairy-Gen, das allerdings unabhängig vom Delta-Notch Weg reguliert wird. hairy und

E(spl) kodieren basische Helix-Loop-Helix (bHLH) Transkriptionsfaktoren, die v.a. als

Repressoren agieren. Neben den Drosophila-Genen wurden inzwischen homologe

hairy/E(spl)-Gene in zahlreichen anderen Spezies gefunden.

hairy reguliert als Transkriptionsrepressor wichtige Entwicklungsprozesse in Drosophila.

Während der Neurogenese reprimiert hairy proneurale Gene wie Daughterless oder die

des achaete-scute Komplexes und inhibiert damit eine vorzeitige oder verstärkte

Differenzierung von Neuroektoderm (Botas et al., 1982; Campos-Ortega, 1993; Ish-

Horowicz et al., 1985; Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980). Eine Mutation führt zur

Ausbildung von ektopen Sinneshaaren, denen hairy seinen Namen zu verdanken hat

(Rushlow et al., 1989). Als „pair-rule gene“ steuert hairy weiterhin die Segmentation des

Körpers in frühen Embryonalstadien durch Repression von fushi tarazu (Fisher and

Caudy, 1998; Ish-Horowicz et al., 1985).

Über die Funktion der hairy- und E(spl)-Verwandten in Vertebraten ist dagegen noch

relativ wenig bekannt. Bisher sind die homologen Gene Hes1 bis Hes7 in Mensch und

Maus kloniert worden. Die Hey-Gene bilden eine neue Gruppe der hairy-verwandten

Gene, ihre Beschreibung erfolgt im nächsten Abschnitt.

Einleitung 6

Hes1, Hes5 und Hes7 werden wie E(spl) vom Notch-Signalweg gesteuert, während die

Expression von Hes2, Hes3 und Hes6, wie die von hairy, Notch-unabhängig zu sein

scheint (Bessho et al., 2001a; Koyano-Nakagawa et al., 2000; Nishimura et al., 1998).

Hes1-/--Mäuse sterben während der embryonalen Entwicklung mit schweren

Neurulationsdefekten, die auf die Überexpression des proneuralen Mash1-Gens

zurückgeführt werden. Die fehlende Repression durch Hes1 führt dabei zur vorzeitigen

neuronalen Differenzierung (Ishibashi et al., 1995). Diese Mäuse fallen außerdem durch

eine Hypoplasie der Bauchspeicheldrüse auf, da eine zu frühe Differenzierung endokriner

Zellen zur Depletion epithelialer Vorläuferzellen führt. Auch im Magen-Darm Trakt wird

eine Hyperplasie endokriner Zellen beobachtet (Jensen et al., 2000). Dies ist ein

deutlicher Hinweis für die Bedeutung von Hes1 als reprimierender Regulator in der

Differenzierung endokriner Zellen. Eine Aufgabe von Hes5 besteht darin, die

Differenzierung retinaler Stammzellen in Richtung Müller-Glia zu steuern (Hojo et al.,

2000), was auch für Hey2 postuliert wurde (Satow et al., 2001).

Im Genom des Huhns wurden zwei hairy/E(spl)-Homologe gefunden, die als c-hairy1 und

c-hairy2 publiziert wurden. Die Untersuchung der c-hairy1-Expression während der

Somitogenese führte zu einer sehr interessanten Beobachtung. Während der Bildung

eines Somiten aus dem präsomitischen Mesoderm (PSM), wandert die c-hairy1-

Expression vom kaudalen zum kranialen Abschnitt des PSM. Dieses rhythmische

Expressionsmuster wiederholt sich bei der Bildung aller Somiten in etwa 90 minütigen

Zyklen. Die c-hairy1-mRNA-Expression wird dabei nicht durch das umgebende Gewebe

gesteuert oder durch ein Signal von benachbarten Zellen von kaudal nach rostral geleitet,

was Explantations- und Durchtrennungsversuche bewiesen. Sie ist ebenso unabhängig

von Zellbewegungen oder der de novo Proteinbiosynthese (Palmeirim et al., 1997). Die

autonome, zyklische c-hairy1-Expression stellt damit ein Erklärungsmodell für die so

exakt ablaufende Somitogenese dar, die wie durch ein „molekulares Uhrwerk“ gesteuert

wird (Cooke and Zeeman, 1976). Ein ähnliches Verhalten wie c-hairy1 zeigt auch das

verwandte c-hairy2-Gen, sowie die murinen Gene Hes1, Hes7 und lunatic fringe (Aulehla

and Johnson, 1999; Bessho et al., 2001b; Jouve et al., 2000). Kürzlich wurde von zwei

Arbeitsgruppen ein Abschnitt im lunatic fringe-Promoter identifiziert, der für das „cycling“

des Gens verantwortlich ist. Interessanterweise wird auch dieses Element durch Notch

gesteuert (Cole et al., 2002; Morales et al., 2002).

Einleitung 7

1.3 Die Hey-Gene als neue Familie der hairy- und E(spl)-verwandten Gene

Bei der Suche nach Genen, die die Differenzierung von metanephrogenem Mesenchym

während der Nierenentwicklung der Maus steuern, wurde mit dem „Differential Display

PCR“-Verfahren ein unbekanntes Gen (Hey1: hairy and Enhancer of split related with

YRPW motif) entdeckt, das große Homologie zu den Hes-Genen aufwies (Leimeister et

al., 1999a; Leimeister et al., 1999b). Anschließende Datenbanksuchen führten zur

Identifikation von zwei weiteren verwandten Genen (Hey2, HeyL) und den

entsprechenden Genen des Menschen. Die chromosomale Kartierung ergab, dass Hey1

auf Chromosom 8q21, Hey2 auf 6q21 und HeyL auf 1q34.3 lokalisiert sind. Alle Gene

besitzen eine ähnliche Struktur mit fünf Exons (Steidl et al., 2000).

Promoterstudien belegten, dass die Hey-Gene Zielgene des Notch-Signalweges sind

(Maier and Gessler, 2000). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des

Notch-Weges durch seine Liganden zu einer RBP-Jκ-abhänigigen Expression von Hey1,

Hey2 und HeyL führt (Iso et al., 2002; Iso et al., 2001a; Lin et al., 2000).

Während der Embryonal- und Fetalentwicklung der Maus werden alle Hey-Gene

dynamisch exprimiert, wobei ihr Expressionsmuster teilweise überlappend und teilweise

komplementär ist. In neu entstehenden Somiten werden sie in der posterioren Hälfte

coexprimiert, während Hey1 und Hey2 bei der Herzentwicklung ein komplementäres

Expressionsmuster aufweisen. Dabei ist Hey1 in den atrialen und Hey2 in den

ventrikulären Abschnitten exprimiert, während HeyL nicht detektiert werden kann. Eine

Hey1-Expression wird v.a. in den Kiemenbögen, der kraniofazialen Region, der dorsalen

Aorta und Teilen des zentralen Nervensystems beobachtet. Hey2 wird in Arterien, den

Kiemenbögen, der kraniofazialen Region und Teilen des zentralen und peripheren

Nervensystem exprimiert, während HeyL in Arterien, im Telencephalon, den

Spinalganglien und in den Kiemenbögen exprimiert wird (Leimeister et al., 1999b;

Leimeister et al., 2000b).

Die Analyse der vorhergesagten Hey-Proteinstruktur zeigte, dass diese Gene nicht

weitere Mitglieder Hes-Familie darstellen, sondern sich von diesen abgrenzen. Die Hey-

Gene kodieren ebenfalls basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren, die neben der

bHLH-Domäne eine sogenannte Orange-Domäne (Helices 3 und 4) besitzen. Hey-

Proteine besitzen allerdings einen Glycinrest in der basischen Domäne anstelle eines

charakteristischen Prolins. Am Caboxyterminus besitzen alle hairy/E(spl)/Hes-Proteine

ein WRPW-Motiv (Trp-Arg-Pro-Trp). Dieses nur vier Aminosäuren lange Peptid ist

entscheidend für die Proteininteraktion mit dem Corepressor Groucho/TLE1 (Fisher et al.,

1996). Bei den Hey-Proteinen findet sich dagegen nicht das klassische WRPW-Motiv,

Einleitung 8

sondern ein YRPW, bzw. YQPW im murinen Hey2, und ein noch weiter abgewandeltes

YHSW im HeyL (Hey like) Protein (s. Abb. 2). Zusätzlich besitzen sie carboxyterminal

sechs konservierte Aminosäuren TE(I/V)GAF, die allerdings im evolutionär älteren

Drosophila Hey-Protein nicht gefunden werden. Die Analyse der phylogenetischen

Verwandtschaft verschiedener hairy/E(spl)/Hey-Proteine mit dem ClustalX Programm (s.

Abb. 3) ergab eindeutig, dass Hey-Proteine eine eigenständige Subklasse der hairy-

verwandten Transkriptionsfaktoren bilden (Leimeister et al., 1999b).

Hey1Orangebasic HLH YRPW

Abb. 2: Schematische Darstellung der wichtigsten Domänen des Hey1-Protein.

Abb. 3: Phylogenetische Verwandtschaft der hairy/E(spl)-verwandten Proteine verschiedener Spezies. h: Mensch, m: Maus, d: Drosophila, c: Huhn, zf: Zebrafisch. Der Baum wurde mit dem ClustalX Programm konstruiert und zeigt die Eigenständigkeit der Hey-Gene innerhalb der hairy/E(spl)/Hes-Familie.

Basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren bilden in der Regel Dimere über nicht-

kovalente Interaktionen im Bereich der Helices aus. Mit ihrer basischen Domäne (12-14

Aminosäuren) können sie dann spezifisch an DNA-Sequenzen in Promoterregionen

regulierter Gene binden, um deren Transkription zu steuern (s. Abb 4).

Einleitung 9

Abb. 4: Modell der Interaktion zweier bHLH-Faktoren. Die Proteine binden über die Helices aneinander. Die DNA-Bindung erfolgt durch basische Aminosäuren (Gilbert, 1997).

Die DNA-Bindung erfolgt an spezifischen

Erkennungssequenzen, wobei viele bHLH-

Proteine an sogenannte E-Box Sequenzen

(CANNTG) binden (Murre et al., 1989). hairy, E(spl)- und Hes-Proteine binden dagegen

die N-Box Sequenz CACGCG (Akazawa et al., 1992; Ohsako et al., 1994; Van Doren et

al., 1994). Jedoch wurde später für E(spl) die E-Box Sequenz CACGTG als ideale

Bindungsstelle postuliert (Jennings et al., 1999).

E(spl)-Proteine bilden Homo- und Heterodimere mit jeweils unterschiedlicher Affinität.

Eine Gruppe interagiert mit den proneuronalen Proteinen achaete, scute, asense und

atonal, eine andere mit dem E-Protein Daughterless und einige mit beiden. hairy

interagiert hingegen mit den zuvor genannten Proteinen nicht (Alifragis et al., 1997).

Hes1 und Hes3 bilden Heterodimere mit E47 (Sasai et al., 1992). Für Hey1 und Hey2

wurden im Verlauf dieser Arbeit von anderen Gruppen ebenfalls Interaktionsproteine

beschrieben. Sie können mit dem bHLH-PAS-Protein ARNT/HIF-1b Dimere bilden und

dadurch als Transkriptionsrepressoren wirken (Chin et al., 2000). Kürzlich wurde gezeigt,

dass Hey1 und Hey2 mit Hes1 interagieren und interessanterweise mit ihrer bHLH-

Domäne auch den Corepressorkomplex mSin3a rekrutieren können (Iso et al., 2001b).

Zudem können alle Hey-Proteine mit den bHLH-Faktoren eHAND und dHAND Dimere

bilden (Firulli et al., 2000).

Die Orange-Domäne ist ein Charakteristikum der hairy/E(spl)-bHLH-Faktoren. Sie bedingt

spezifische Funktionen verschiedener Mitglieder der hairy/E(spl)-Familie, wie z.B. die

Suppression von scute durch hairy (Dawson et al., 1995; Giebel and Campos-Ortega,

1997). Die Inhibition der Differenzierung und Proliferation von PC12-Zellen durch Hes1

wird ebenfalls durch die Orange-Domäne moduliert (Castella et al., 2000) und auch die

Repressoraktivität von ARNT/Hey2-Dimeren wird durch die Hey2-Orange-Domäne

beeinflusst (Chin et al., 2000).

Einleitung 10

Das charakteristische WRPW-Motiv der hairy/E(spl)/Hes-Proteine stellt eine

Transkriptionsrepressor-Domäne dar, da es den Corepressor Groucho bzw. die

homologen TLE-Proteine bindet. (Fisher et al., 1996; Grbavec and Stifani, 1996; Paroush

et al., 1994). Das ähnliche VWRPY-Motiv der runt-Proteinfamilie, zu der das humane

akute myeloische Leukämie-Gen 1 (AML1) gehört, interagiert ebenfalls mit Groucho und

seinen Homologen (Aronson et al., 1997; Imai et al., 1998). Schließlich ist auch eine

FRPW-Sequenz im aminoterminalen Abschnitt des Drosophila huckebein-Protein fähig

zur Interaktion mit Groucho (Goldstein et al., 1999). Die genannten Interaktionen deuten

darauf hin, dass Hey-Proteine mit ihrem YRPW-Motiv ebenfalls TLE-Proteine rekrutieren

könnten. Einen Hinweis für die Bedeutung des Hey2-Carboxyterminus liefert die Analyse

der gridlock-Mutation im Zebrafisch, die durch eine Punktmutation im Stopcodon des

Zebrafisch Hey2-(gridlock)-Gens verursacht wird. Dabei wird ein um 44 Aminosäuren

verlängertes Hey2-Protein translatiert. Diese Mutation führt zu einer gravierenden

Gefäßmissbildung am Zusammenfluss der beiden lateralen dorsalen Aorten, die der

Aortenisthmusstenose des Menschen ähnlich ist (Weinstein et al., 1995; Zhong et al.,

2000). Möglicherweise kann das verlängerte gridlock-Protein einen carboxyterminalen

Interaktionspartner nicht mehr binden und verliert dadurch seine Aktivität.

Wichtig für das Verständnis der Hey-Proteine ist daher die Erforschung ihrer

Interaktionspartner. Mit diesem Wissen können dann die DNA-Bindungseigenschaften

evaluiert werden und die Suche nach regulierten Genen begonnen werden. Der

entscheidende Schritt zum Verständnis der Funktion eines Genes liegt oft in der gezielten

Ausschaltung im Mausgenom und der anschließenden Analyse des Phänotyps, weshalb

diese Untersuchungen nach der biochemischen Charakterisierung angeschlossen

wurden.

Während dieser Arbeit wurden die Hey-Gene auch von anderen Arbeitsgruppen kloniert

und unter folgenden Namen publiziert: Hesr (hairy and E(spl) related) (Kokubo et al.,

1999), HRT (hairy related transcription factor) (Nakagawa et al., 1999), CHF

(cardiovascular helix-loop-helix factor) (Chin et al., 2000) und Herp (Hes related

repressor) (Iso et al., 2001a).

1.4 Das Yeast Two-Hybrid System

Das Yeast Two-Hybrid System ist eine der wichtigsten Techniken, die im Rahmen dieser

Arbeit zur Identifikation von Protein-Protein Wechselwirkungen eingesetzt wurde. Daher

soll das System hier kurz beschrieben werden.

Einleitung 11

Die Yeast Two-Hybrid Methode wurde 1989 erstmals von Fields und Song beschrieben,

die damit die Proteininteraktion SNF1-SNF4 nachwiesen (Fields and Song, 1989). Sie

basiert auf den Beobachtungen, dass die beiden isolierten Domänen des GAL4-

Transkriptionsfaktors, die GAL4-DNA bindende-Domäne (DBD) und die GAL4-

transkriptionsaktivierende Domäne (AD) nicht miteinander interagieren und damit auch

nicht mehr die Transkription von Genen bewirken können, wenn sie in einer Hefezelle

coexprimiert werden. Werden die beiden Domänen allerdings in enge räumliche Nähe

gebracht, wird die GAL4-Transkriptionsaktivität wiederhergestellt und die entsprechend

kontrollierten Gene transkribiert (Brent and Ptashne, 1985; Ma and Ptashne, 1987). Um

zwei Proteine auf mögliche Interaktion hin zu testen, wird daher das erste Protein („bait“,

Köder) an die DNA-bindende Domäne und das zweite („prey“, Beute) an die aktivierende

Domäne fusioniert. Binden die beiden Testproteine aneinander, wird die GAL4-

Transkriptionsaktivität wiederhergestellt, binden sie nicht, werden die Reportergene nicht

transkribiert (Abb. 5). Mit dem Yeast Two-Hybrid System können nicht nur Interaktionen

weniger Proteine analysiert werden (Chien et al., 1991; Gyuris et al., 1993), sondern es

ist auch möglich, neue Interaktionsproteine aus einer komplexen Genbank zu isolieren

(Bendixen et al., 1994).

DNA binding site Reporter gene

GAL4-DBD

bait

prey

GAL4-Activation Domain

Abb. 5: Prinzip des Yeast Two-Hybrid Assays. Zwei interagierende Proteine („bait“ und „prey“) sind die an die DNA-bindende Domäne (DBD) bzw. die aktivierende Domäne des GAL4-Transkriptionsfaktors gekoppelt. Durch die Interaktion zwischen den Testproteinen wird die Aktivität des GAL4-Transkriptionsfaktors wiederhergestellt und die Reportergene transkribiert.

Es wurden mehrere Yeast Two-Hybrid Systeme mit unterschiedlichen DBD (GAL4,

LexA), AD (GAL4, VP16, B42), Reportergenen (LEU2, HIS3, ADE2, TRP1, URA3, CYH2,

lacZ) und Hefestämmen entwickelt, die alle auf dem ursprünglichem Prinzip beruhen.

Inzwischen gibt es Variationen des Two-Hybrid Systems, mit denen auch Mutationen

Einleitung 12

eines Testproteins (reverse Two-Hybrid), Protein-DNA Bindungen (One-Hybrid) und

Protein-DNA Bindungen (Three-Hybrid) untersucht werden können (Vidal et al., 1996;

Vidal and Legrain, 1999). Es gibt ebenfalls Bemühungen ein Two-Hybrid System in

E. coli Bakterien zu etablieren, das die aufwendigen Hefetransformationen und Plasmid-

präparationen aus Hefezellen überflüssig macht (Hu et al., 2000).

Die Sensitivität des Yeast Two-Hybrid Assays ist hoch und es können auch schwache

Interaktionen (KD=10-6) nachgewiesen werden (Estojak et al., 1995). Ein Nachteil des

Verfahrens ist jedoch der große Anteil falsch-positiver Ergebnisse. Dies kann zu einem

grossen Teil auf Proteine („self activators“) zurückgeführt werden, welche die

Transkription der Reportergene direkt aktivieren, indem sie an bestimmte

Promoterregionen binden oder durch Interaktion mit endogenen Hefeproteinen die

Transkription der Reportergene starten. Der Anteil der „self activators“ aus einer Genbank

kann bis zu drei Größenordnungen höher sein als der wirklicher Interaktionsproteine

(Walhout and Vidal, 1999).

Im Rahmen der Proteomforschung wird versucht mit Hilfe von Yeast Two-Hybrid

Verfahren sämtliche Protein-Wechselwirkungen in einer Zelle zu finden, was einen

wichtigen Schritt zum Verständnis der hochkomplexen Vorgänge in einer Zelle darstellt.

Zudem dient die Technologie der Suche nach neuen Arzneimitteln und der Analyse von

Arzneimittelwirkungen (Colas and Brent, 1998).

1.5 Zielsetzung

Die Hey-Gene gehören zur Familie der hairy- und E(spl)-verwandten Gene. Ihre

dynamische Expression während der murinen Embryonalentwicklung, ihre Regulation im

Notch-Signaltransduktionsweg und ihre hohe Konservierung zwischen verschiedenen

Spezies deuten auf entscheidende entwicklungsbiologische Funktionen hin.

Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionen der Hey-Proteine mit anderen Proteinen zu

analysieren, neue Interaktionspartner zu identifizieren, die Protein-DNA-Bindung zu

untersuchen und die Hey2-Genfunktion anhand von Knockout-Mausmodellen weiter zu

erforschen.

Es sollte ein neues Screening-Verfahren zum Auffinden unbekannter Proteininteraktionen

auf Proteinexpressionsfiltern getestet werden. Weiterhin sollte der Yeast Two-Hybrid

Assay für Hey1 und Hey2 etabliert werden, um mit direkten Tests Protein-Protein

Bindungen in vivo nachzuweisen und embryonale Genbanken nach neuen Hey-

Bindungspartnern zu durchsuchen. Daraus isolierte Klone waren zu sequenzieren und

Einleitung 13

mit Hilfe vom Gen-Datenbanken zu analysieren. Mögliche Interaktionen mussten mit

GST-Pulldown Assays verifiziert werden.

Die Bindung von Hey1, Hey2 und weiteren bHLH-Proteinen an eine DNA-Zielsequenz

sollte mit Electrophoretic Mobility Shift Assays untersucht werden.

Zur weiteren Aufklärung der Funktion des Hey2-Gens sollten Hey2-Knockoutmäuse

phänotypisiert werden. Die lacZ-Expression dieser Mäuse war mit der von Hey2 im

Wildtyp in verschiedenen Entwicklungsstadien zu vergleichen. Da die frühe postnatale

Letalität der Homozygoten durch eine Herz- oder Gefäßerkrankung verursacht zu sein

schien, wurden sowohl klinische, als auch makro- und histopathologische

Untersuchungen des Herz- und Kreislaufsystems vorgenommen. Um eine mögliche

Redundanz der Hey-Gene festzustellen, waren Genexpressionsstudien von Hey1 und

HeyL mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierung an Hey2-Knockoutmäusen durchzuführen.

Material 14

2 Material 2.1 Plasmid-Vektoren

pBluescript II KS (+/-)

GenBank® X52327 bzw. X52329; Stratagene, La Jolla, CA, USA

pGBKT7

Expressionsvektor für Fusionsproteine,

kodiert die GAL4-DNA-bindende Domäne, c-

myc-Epitop und "„bait“"-Protein. Als Shuttle-

Vektor kann pGBKT7 sowohl in E. coli

(Selektionsmarker Kanamycin) als auch in

Hefezellen (Nutritionsmarker Tryptophan)

autonom repliziert werden. Clontech, Palo

Alto, CA, USA

pGADT7

Mit Hilfe dieses Vektors lassen sich

Fusionsproteine (GAL4-Aktivierungsdomäne-HA-

Epitop-„prey“-Protein) in Bakterien und Hefezellen

(Nutritionsmarker Leucin) herstellen. Der Vektor

besitzt wie pGBKT7 eine T7-Promotersequenz für

die in vitro Translation des „prey“-Proteins.

Clontech, Palo Alto, CA, USA

pACT2

Dieser Vektor hat die gleiche Funktion wie pGADT7, jedoch besitzt er keine T7-

Promotersequenz. Der Vektor liegt im Gegensatz zu pGADT7 nur in wenigen Kopien in

E. coli vor (low copy plasmid). Die im Yeast Two-Hybrid Screen verwendeten Genbanken

waren in diesen Vektor kloniert. GenBank® U29899; Clontech, Palo Alto, CA, USA

pGEX-Vektoren

Vektoren zur Produktion von Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteinen,

Pharmacia-Biotech, Freiburg.

Material 15

pMBP-Vektoren

Vektoren zur Produktion von Maltose-bindenden Fusionsproteinen, New England

Biolabs, Frankfurt.

pcDNA3-TLE1

TLE1-cDNA im pcDNA3-Vektor kloniert. Stefano Stifani, Montreal, Quebec, Kanada

pBS-MATH4A

Math4A-cDNA im Bluescript®-Vektor. Gèrald Gradwohl, IGBMC, Illkirch, Frankreich

pASV3-E12bHLH

pASV3 ist ein Yeast Two-Hybrid „prey“-Vektor. Hier wurde die bHLH-Domäne von E12

kloniert. Gèrald Gradwohl, IGBMC, Illkirch, Frankreich

pASV3-MASH1bHLH

pASV3 kodiert bHLH-Domäne von Mash1. Gèrald Gradwohl, IGBMC, Illkirch, Frankreich

pDC 952

Der Vektor kodiert eine Arginin t-RNA, um bei prokaryotischer Proteinexpression den

Einbau dieser Aminosäure zu verbessern.

2.2 Bakterien, Hefen und Zellinien

Bakterienstämme

E. coli DH5α (Hanahan, 1983)

E. coli BL21 (DE3)

Novagen, Bad Soden

E. coli BL21 (DE3) pLysS

BL21 (DE3) mit dem Plasmid pLysS transformiert, das für T7-Lysozym kodiert, einem

Inhibitor der T7-RNA-Polymerase. Dadurch werden Proteine, die unter Kontrolle des T7-

Promoters liegen, erst nach IPTG-Induktion exprimiert. Novagen, Bad Soden

Material 16

Hefestämme

S. cerevisiae AH109

MATa (James et al., 1996). Transformationsmarker: trp1, leu2; Reportergene: ADE2,

HIS3, lacZ; Clontech

S. cerevisiae Y187

MATα (Harper et al., 1993). Transformationsmarker: trp1, leu2; Reportergen: lacZ;

Clontech

Eukaryotische Zellinien

HEK 293T

Immortalisierte Linie humaner embryonaler Nierenzellen (ATCC CRL1573), welche das

große SV40-T-Antigen exprimieren.

2.3 Mausstämme

CD-1 (ICR)BR, Auszucht-Maus Charles River, Deutschland

C57 BL/6, Inzucht-Mausstamm Charles River, Deutschland

Dll1-Knockout Mäuse Martin Hrabe de Angelis, GSF, München

Hey2-Knockout Mäuse Manfred Gessler, Würzburg

2.4 Oligonukleotide

Oligonukleotide wurden mit Hilfe des Programms Primer 3 (http://www-

genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) konstruiert und von MWG Biotech

(Ebersberg) synthetisiert.

Name Sequenz 5‘→3‘ act2forw CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GC act2rev ATG CAC AGT TGA AGT GAA CTT clikBE CGC GGA TCC GAA TTC CCA TGT CCC CAA CGA clikSal CGA CGT CGA CTA GTC CAT AGC CAG GGC G

Material 17

clk4 CGC TGA GGC AAA CGG AAT clk7EcoRI CGC GAA TTC TCC ATG TCC CCA ACG ACA clk8BamHI CGC GGA TCC GAG GCC ACC GTG AGC GCC clk9EcoRI GCG GAA TTC GGT GGC CTC GGA CAC ATT clk10BamHI GCG GGA TCC AAG CTT TCC CCT CCC TTG clk11-EcoRI GCG GAA TTC CGA GAC CGA ATC AAT AAC AG clk12-EcoRI GCG GAA TTC TAT CGG AGT TTG GGG TTT C clk13-Bam CGC GGA TCC GTG CAG CAT TTT CAG GTG clk14-Bam CGC GGA TCC GCT CGC GGC TTC CCG CTG clkOr forw GCG GAA TTC AAA ATG CTG CAC ACT clkOr rev CGC CTG CAG CTA AGC GCC GCT CGC GGC E12B CGC GGA TCC AGG ACG ACC TTC TCC CC E12S CGA CGT CGA CTA TGG GTC CCC GAC CAC Eco-yrpw CGG CGA ATT CTT TTC CTT CAG CTC CTT CCA FOGforw GCG GGA TCC GCC TTT ACC CTG GAG CA gbkforward GTT GAC TGT ATC GCC GGA AT gbkreverse ACC CCT CAA GAC CCG TTT AG Hey2ko-test3‘ TCG GTG AAT TGG ACC TCA TCA CTG AGC Hey2ko-test5‘ GCT GTC TCA AGG CCT CAA CAG CAT TG Hey-tar-1a AGCTTGATATGGCACGTGCCAGTCTG Hey-tar-1b GATCCAGACTGGCACGTGCCATATCA ITF1B CGC GGA TCC GGG CCC GGA CCA G ITF1S CGA CGT CGA CTA GGC TGC TTT GGG ATT C ITF2B CGC GGA TCC AGC AGA AGG CAG AGC G ITF2S CGA CGT CGA CTA CTC CGA GGA CAC CTT C KGreverse CCG TCA TCA TCA CCG AAA CGC GCG M13 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC MyoB CGC GGA TCC GCT TGC TGT GGG CCT G MyoS CGA CGT CGA CTA CGG TCC AGG TGC GTA sWRPW GCT TTA AAG CCG TGG CGT CCG TGG GGT ACT sWRPY GCT TTA AAG CCG TAT CGT CCG TAC GGT ACT sYRPW GCT TTA AAG CCG TAT CGT CCG TGG GGT ACT T7pACT CGG GAT CCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG ACA GAC CAC CAT GGC TTA CCC

Hinweis: clik, blik und flik sind die ursprünglichen Labornamen von Hey1, Hey2 und

HeyL.

Material 18

2.5 Medien, Puffer und Lösungen Medien

LB-Medium

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Hefeextrakt 5 g/l

Natriumchlorid 5 g/l

SD-Medium

Yeast nitrogen base 6,7 g/l

Glukose 20 g/l

10x Aminosäurenmix 100 ml/l

10x Aminosäurenmix für SD-Medium:

L-Adeninhemisulfat 200 mg/l

L-Arginin/HCl 200 mg/l

L-Histidin/HCl-monohydrat 200 mg/l

L-Isoleucin 300 mg/l

L-Leucin 1000 mg/l

L-Lysin/HCl 300 mg/l

L-Methionin 200 mg/l

L-Phenylalanin 500 mg/l

L-Threonin 2000 mg/l

L-Tryptophan 200 mg/l

L-Tyrosin 300 mg/l

L-Uracil 200 mg/l

L-Valin 1500 mg/l

SOB-Medium

Bacto-Pepton 20 g/l


Kaliumchlorid 0,2 g/l

Natriumchlorid 0,6 g/l

pH 7,6 mit KOH einstellen. Unmittelbar vor Gebrauch 20 ml/l MgSO4 (1 M) zugeben.

Material 19

YPDA-Medium

Bacto-Pepton 20 g/l


Glukose 20 g/l

Adeninhemisulfat (0,2 %) 15 ml/l

2x YT-Medium

Bacto-Pepton 16 g/l


Natriumchlorid 5 g/l

Antibiotika

Ampicillin 100 mg/l

Chloramphenicol 12,5 mg/l

Kanamycin 30 mg/l

Agar

Zur Herstellung von Agarplatten werden 11 g/l Bacto-Agar zugesetzt.

Puffer und Lösungen

2x AP-Substrat-Puffer (Screening von Proteinexpressionsfiltern)

para-Nitrophenylphosphat 0,67 % (w/v) 6,67 g/l

Magnesiumchlorid (1 M) 1 mM 1 ml/l

Diethanolamin (pH 9,8, 2 M) ad 1 l

Bead-binding-buffer (GST-Pulldown)

Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,1 M) 50 mM 500 ml/l

Kaliumchlorid 150 mM 11,2 g/l


Glycerin (87 % v/v) 10 % (v/v) 115 ml/l

Triton X-100 1 % (v/v) 10 ml/l

CaCl/HEPES-Puffer (pH 7,0)

HEPES 100 mM 23,8 g/l

Calciumchlorid, Dihydrat 0,5 M 73,5 g/l

Material 20

Coating-Puffer (pH 9,6) für ELISA

Natriumcarbonat 15 mM 2,67 g/l

Natriumhydrogencarbonat 35 mM 2,94 g/l

Natriumazid 0,02 % (w/v) 0,2 g/l

Coomassie-Lösung

Coomassie Brillant Blue 3 mM 2,5 g/l

Methanol 50 % (v/v) 500 ml/l

Essigsäure 12,5 % (v/v) 125 ml/l

10x Cosmid-Einfrierpuffer

di-Kaliumhydrogenphosphat 360 mM 82,2 g/l

Kaliumdihydrogenphosphat 132 mM 17,9 g/l

tri-Natriumcitrat, Dihydrat 17 mM 4,90 g/l

Magnesiumsulfat 4 mM 0,98 g/l

Ammoniumsulfat 68 mM 8,98 g/l

Glycerin 44 % (v/v) 440 ml/l

Denaturierungspuffer (Filterhybridisierung)

Natriumchlorid 1,5 M 87,7 g/l

Natriumhydroxid 0,5 M 20,0 g/l

DEPC-H2O

Diethylpyrocarbonat (DEPC) 0,01 % (v/v) 100 µl/l

DEPC wird zugeben und über Nacht stehen gelassen, bevor die Lösung autoklaviert

wird.

DnD-Lösung (kompetente Zellen)

DTT 1 M 154,3 g/l

DMSO 90 % (v/v) 900 ml/l

Kaliumacetat (pH7,5, 1 M) 10 mM 10 ml/l

Entfärber I (Coomassie Färbung)


Essigsäure 10 % (v/v) 100 ml/l

Material 21

Entfärber II (Coomassie Färbung)


Essigsäure 5 % (v/v) 50 ml/l

EMSA-binding buffer

Tris/HCl (pH 7,9, 1 M) 20 mM 20 ml/l

HEPES (pH 7,9, 1 M) 20 mM 20 ml/l



EDTA (0,5 M) 1 mM 2 ml/l

DTT (1 M) 1 mM 1 ml/l

Glycerin (87 %) 12 % (v/v) 1138 ml/l

Gelladepuffer (DNA-Agarosegel)

Bromphenolblau 3,6 mM 2,5 g/l

EDTA (0,5 M) 10 mM 20 ml/l

Ficoll 15 % (w/v) 15,0 g/l

Glycinpuffer (pH10,4)

Glycin 100 mM 7,5 g/l

Zinkchlorid 1 mM 136 µg/l


2x HBS-Puffer (pH 7,05)

HEPES 50 mM 11,9 g/l

Natriumchlorid 280 mM 16,4 g/l

di-Natriumhydrogenphosphat, Dihydrat 1,5 mM 267 mg/l

Hybridisierungslösung 5 % (Church)


SDS (20 % w/v) 5 % (w/v) 250 ml/l

di-Natriumhydrogenphosphat (1 M) 0,5 M 500 ml/l

Hybridisierungspuffer (RNA in situ Hybridisierung)

Formamid (deionisiert) 50 % (v/v) 500 ml/l

20x SSC (pH 5) 1,3 x 65 ml/l


Material 22

CHAPS 0,5 % (v/v) 5 ml/l

Heparin 0,1 % (w/v) 100 mg/l

Tween-20 0,2 % (v/v) 2 ml/l

Hefe tRNA 0,1 % (w/v) 100 mg/l

Kaliumphosphatpuffer 0,1 M (pH 7,4)

Kaliumhydrogenphosphat (1 M) 80 mM 80 ml/l

Kaliumdihydrogenphosphat (1 M) 20 mM 20 ml/l

Lachssperma-DNA

10 mg/ml Lachssperma-DNA werden in TE-Puffer gelöst, durch Ultraschallbehandlung

auf eine durchschnittliche Fragmentlänge von 500 bp zerkleinert und anschließend bei

-20 °C aufbewahrt.

lacZ-Färbelösung

Kaliumferrocyanid (0,4 M) 0,8 mM 2 ml/l

Kaliumferricyanid (0,4 M) 0,8 mM 2 ml/l

X-Gal (40 mg/ml in DMSO) 1 g/l 25 ml/l

lacZ-Fixierpuffer

EDTA (0,5 M) 0,5 mM 1 ml/l


Glutaraldehyd (25 %) 0,2 % (v/v) 8 ml/l

ad 1 l 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer

lacZ-Waschpuffer

Magnesiumchlorid (1 M) 1,5 mM 1,5 ml/l

Desoxycholsäure (1 %) 0,01 % (v/v) 10 ml/l

NP-40 (2 %) 0,02 % (v/v) 20 ml/l

ad 1 l 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer

Lysis Puffer (Mausorgane für DNA-Extraktion)

Natriumchlorid (5 M) 100 mM 20 ml/l

Na-larosylsacrosyin (10 %) 0,5 % (v/v) 50 ml/l

MABT

Maleinsäure (1 M) 100 mM 100 ml/l

Material 23


Tween-20 1 % (v/v) 10 ml/l

Natriumphosphatpuffer

di-Natriumhydrogenphosphat 1 M 89,0 g/l

ortho-Phosphorsäure (85 % v/v) 4 ml/l

Neutralisationspuffer (pH 7,5) für Filterhybridisierung

Tris 0,5 M 60,6 g/l


Salzsäure, konzentriert ca. 50 ml/l

NTE (RNase Puffer)




NTMT


Tris/HCl (pH9,5, 1 M) 100 mM 100 ml/l


Tween-20 0,1 % (v/v) 1 ml/l

Oligo labeling (OLB-) Mix (2 ml)

Hexanukleotide (50 OD-Einheiten) ca. 50x 33 µg

Magnesiumchlorid (1 M) 100 mM 200 µl

DTT (1 M) 10 mM 20 µl

BSA (25 mg/ml) 125 mg/l 100 µl

dATP, dGTP, dTTP (je 0,1 M) 0,5 mM je 10 µl

Tris/HCl (pH 7,6, 1 M) 250 mM 500 µl

ddH2O ad 2 ml

10x PBS (pH 7,2)

Natriumchlorid 1,4 M 80 g/l

Kaliumchlorid 27 mM 2 g/l

di-Natriumhydrogenphosphat, Dihydrat 80 mM 14,4 g/l

Kaliumdihydrogenphosphat 18 mM 2,4 g/l

Material 24

10x PCR-Puffer

Tris 0,1 M 12,1 g/l

Kaliumchlorid 0,5 M 37,3 g/l

Magnesiumchlorid, Hexahydrat 66 mM 13,4 g/l

Triton X-100 (10 % v/v) 0,2 % (v/v) 20 ml/l

BSA (25 mg/ml) 2,0 g/l 135 ml/l

PEG/LiAc-Lösung (Hefetransformation)

Polyethylenglykol 3.350 (50 % w/v) 40 % (w/v) 800 ml/l

10x TE-Puffer (pH 7,5) 10 % (v/v) 100 ml/l

Lithiumacetat (pH 7,5, 1 M) 10 % (v/v) 100 ml/l

RIPA

SDS (20 % w/v) 0,1 % (w/v) 5 ml/l


NP-40 1 % (v/v) 10 ml/l

Deoxycholat 0,5 % (w/v) 5 g/l



Säulenpuffer (MBP-Proteine)




DTT (1 M) 1 mM 1 ml/l

10x SDS-Laufpuffer (pH 8,3) für PAGE

Tris 25 mM 3,02 g/l

Glycin 2,5 M 188 g/l

SDS (20 % w/v) 1 % (w/v) 50 ml/l

2x SDS-Probenpuffer (PAGE)


SDS (20 % w/v) 4 % (w/v) 200 ml/l

Bromphenolblau 3 mM 2 g/l

Glycerin 22,9 % (v/v) 229 ml/l

DTT (1 M) 200 mM 200 ml/l

Material 25

Spheroblast-Puffer (Hefe DNA-Extraktion)

Sorbitol 1,2 M 218,6 g/l

Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 1 M) 100 mM 100 ml/l

Yeast lytic Enzym (70T) 2,5 g/l

20x SSC

Natriumchlorid 3 M 175 g/l

tri-Natriumcitrat, Dihydrat 0,3 M 88,2 g/l

STET (“DNA boiling-prep”)

Saccharose 8 % (w/v) 80 g/l


EDTA (0,5 M) 50 mM 100 ml/l


Striplösung (Filterhybridisierung)

EDTA (0,1 M) 0,1 mM 1 ml/l


SDS (20 % w/v) 0,1 % (w/v) 5 ml/l

50x TAE-Puffer

Tris 2 M 242 g/l

EDTA 50 mM 18,6 g/l

Essigsäure 60 ml

TB-Puffer (pH 7,6)

PIPES 10 mM 3,2 g/l

Calciumchlorid 15 mM 1,7 g/l


Manganchlorid, Dihydrat 55 mM 8,9 g/l

TBS-Puffer


Tris/HCl (pH7,5, 1 M) 10 mM 10 ml/l

TBS-T

Tween-20 in TBS 0,1 % (v/v) 1 ml/l

Material 26

TBST-T

Triton X-100 in TBS-T 0,5 % (v/v) 5 ml/l

TE-Puffer

Tris/HCl (pH 7,6; 1 M) 10 mM 10 ml/l


TE/LiAc-Lösung (Hefetransformation)

10x TE-Puffer (pH 7,5) 10 % (v/v) 100 ml/l

Lithiumacetat (pH 7,5, 1 M) 10 % (v/v) 100 ml/l

TFB (pH 6,3) (kompetente Zellen)


Mangan(II)chlorid, Tetrahydrat 45 mM 8,9 g/l

Calciumchlorid, Dihydrat 10 mM 1,5 g/l

Hexamin Cobalt(III)chlorid 3 mM 0,8 g/l

MES 10 mM 1,9 g/l

Transferpuffer (Semi-dry Blot)

Tris 25 mM 3,0 g/l

Glycin 150 mM 11,25 g/l


10x Tris-Glycin-Puffer pH(8,3) für EMSA

Tris 250 mM 30,28 g/l

Glycin 1,9 M 142,7 g/l

EDTA (0,5 M) 10 mM 20 ml/l

Yeast-breaking-Puffer (Hefe DNA-Präparation)



SDS 1 % (w/v) 10 g/l



Material 27

Yeast-cracking-Puffer (Hefe Protein-Extraktion)

Stocklösung:

Harnstoff 8 M 480 g/l

SDS 5 % (w/v) 50 g/l


EDTA (0,5 M) 100 mM 0,2 ml/l

Bromphenolblau 0,6 mM 0,4 g/l

Kurz vor dem Gebrauch ansetzen:

Stocklösung 1 ml

β-Mercaptoethanol 10 µl

PMSF (0,1 M in Isopropanol) 50 µl

Proteaseninhibitorenmix 70 µl

Proteaseninhibitorenmix (1 ml):

Leupeptin 0,03 mM 14,3 µg

Benzamidine 145 mM 17,5 mg

Aprotinin 37 % (w/v) 0,37 mg

Waschlösung (Filterhybridisierung)

Natriumphosphatpuffer (1 M) 40 mM 40 ml/l

SDS (20 % w/v) 1 % (w/v) 50 ml/l

Z-Puffer (pH 7,0) (Hefe β-Galaktosidase Assay)

di-Natriumhydrogenphosphat, Dihydrat 60 mM 10,7 g/l

Natriumdihydrogenphosphat, Dihydrat 40 mM 7,8 g/l


Magnesiumsulfat 1 mM 246 µg/l

Z-Puffer/X-gal-Lösung (Hefe β-Galaktosidase Assay)

Z-Puffer 100 ml

β-Mercaptoethanol 270 µl

X-Gal (40 mg/ml in DMSO) 835 µl

Material 28

2.6 Enzyme und Kits

Alkalische Phosphatase (CIP) MBI Fermentas, St.Leon-Rot

DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

ECL-Chemilumineszenskit Amersham, Braunschweig

Lysozym Serva, Heidelberg

Pfu-Polymerase Stratagene, La Jolla, USA

Restriktionsendonukleasen Eurogentec, Seraing, Belgien

MBI Fermentas, St. Leon-Rot

NEB, Frankfurt

RNase A Roth, Karlsruhe

T4-DNA-Ligase MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Taq-DNA-Polymerase GibcoBRL, Eggenstein

TNT Transcription/Translation Kit Promega, Madison, USA

Yeast Lytic Enzym (Arthrobacter luteus) ICN, Meckenheim

Gelextraktions-Kit Qiagen, Hilden

Macherey & Nagel, Düren


Plasmid-DNA Extraktions-Kit Qiagen, Hilden

Macherey&Nagel, Düren


Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

2.7 Genbanken und Proteinexpressionsfilter

Prätransformierte MATCHMAKER cDNA-Genbank (Clontech)

Die mRNA stammte aus embryonalem murinen Gewebe (Tag 11 Embryo) und wurde in

λACT2 kloniert. Nach Umwandlung in eine pACT2-Genbank und Amplifizierung in E. coli

wurde die Plasmid-DNA isoliert und damit der Hefestamm Y187 transformiert.

Maus 17. Tag Embryo MATCHMAKER cDNA-Genbank (Clontech)

Die cDNA ist im Vektor pACT2 kloniert. Für Yeast Two-Hybrid Screens musste die Bank

amplifiziert und Plasmid-DNA isoliert werden.

Material 29

Proteinexpressionsfilter hEX1 (RZPD, Berlin)

Die zur Herstellung verwendete mRNA wurde aus humanem embryonalem

Gehirngewebe isoliert (14,8 und 15,8 Wochen p.mens.). Die Proteine sind an ein His-tag

gekoppelt und auf PVDF-Membranen immobilisiert (Bussow et al., 1998).

2.8 Chemikalien und Hilfsmittel Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien zum Ansetzen von Puffern, Medien und

Reaktionslösungen wurden von Roth, Karlsruhe, Sigma, Deisenhofen oder Merck,

Darmstadt bezogen.

Agarose GibcoBRL, Eggenstein

Biozym, Oldendorf

α32P-dCTP (3000 Ci/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig

Aminosäurenmischungen BIO101, Vista, CA, USA


Bacto-Agar, -Trypton, -Hefeextrakt GiboBRL, Eggenstein

BM-Purple (AP-Substrat) Boehringer, Mannheim

Cellulosenitrat-Membran Schleicher & Schuell, Dassel

Centrifugal-Filter-Tubes Eppendorf, Hamburg

CHAPS Boehringer, Mannheim

Glasperlen Labor Schubert & Weiss, München

L-(35S)-Methionin Amersham-Phamacia, Freiburg

Nylonmembranen (Hybond-NX) Amersham-Pharmacia, Braunschweig

Proteinmarker, gefärbt New England Biolabs, Schwalbach

PVDF-Membranen (Hybond-PVDF) Amersham-Pharmacia, Braunschweig

Yeast nitrogen base Difco, Heidelberg

2.9 Antikörper

AK anti-c-myc Christoph Winkler, Würzburg

AK anti-HA Christoph Winkler, Würzburg

AK anti-HA, Peroxidase gekoppelt Boehringer, Mannheim

AK goat-anti-mouse Amersham, Braunschweig

Material 30

2.10 Software

Bildverarbeitung Adobe-Photoshop

Graphik Micrografx Designer9, Paint Shop Pro

Textverarbeitung Microsoft Office 97, Office XP

Literaturverwaltung EndNote V5

DNA-Analysen Wisconsin Package V10 Genetics Computer

Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA

Blast, NCBI, Bethesda, USA

ClustalX, Genedoc

Proteinanalysen EMBL (http://www.embl-heidelberg.de)

BMERC`S Protein Structure Analyses (PSA)

(http://bmerc-www.bu.edu/psa/) ExPAsy (http://www.expasy.org)

Methoden 31

3 Methoden 3.1 DNA-Präparationen und Aufreinigung 3.1.1 Gewinnung von Plasmid-DNA nach der „Rapid-boiling“-Methode

Die „Rapid-boiling“-Methode (Evans and Wahl, 1987) wird genutzt für die schnelle

Isolierung von Plasmid-DNA, die anschließend für Restriktions- und PCR-Analysen

verwendet werden kann. 1,5 ml Bakterienlösung einer Übernachtkultur werden

30 Sekunden zentrifugiert, das Pellet in 300 µl STET-Lösung mit 250 µg Lysozym

aufgenommen, resuspendiert und für 90 Sekunden ins kochende Wasserbad gestellt.

Nach kurzem Abkühlen werden die Zellreste durch 10 minütige Zentrifugation

sedimentiert und entfernt. Zur Fällung der Plasmid-DNA wird der Überstand mit 300 µl

Isopropanol versetzt und 10 Minuten zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird mit Ethanol

gewaschen, luftgetrocknet, in 20 µl TE-Puffer aufgenommen und 15 Minuten im 68 °C

Wasserbad gelöst. Die ebenfalls isolierte RNA kann durch Zugabe von

1µl RNase (10 mg/ml) degradiert werden.

3.1.2 Nucleobond-Minipräparation

Um sehr saubere Plasmid-DNA für Klonierungen und Sequenzierungen zu gewinnen,

wird der Nucleobond Kit von Macherey & Nagel (Düren) verwendet.

3.1.3 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Bakterienkulturen

Werden geringere Mengen an reiner Plasmid-DNA benötigt, wird die GFXTM Micro

Präparation von Amersham-Pharmacia-Biotech (Freiburg) angewandt

3.1.4 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Hefekulturen Durch entsprechende Vorbehandlung kann mit dem GFXTM Micro Plasmid Prep Kit auch

Plasmid-DNA aus Hefezellen isoliert werden. Dazu werden 2 ml einer Hefekultur

abzentrifugiert, die Zellen in 500 µl Spheroplast-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei

37 °C inkubiert, um Zellwände aufzubrechen. Aus dieser Lösung kann nun so wie aus

Bakterienkulturen Plasmid-DNA isoliert werden.

Methoden 32

3.1.5 Isolierung von Hefeplasmiden nach der „Rapid-isolation“-Methode

Diese Variante der „smash and grab“-Methode (Hoffman and Winston, 1987) erlaubt die

sehr schnelle Präparation von Plasmid-DNA aus Hefezellen, die für PCR-Reaktionen und

Transformationen eingesetzt werden kann.

Es werden 1,5 ml Zellen einer Übernachtkultur sedimentiert und in 200 µl Yeast-breaking-

Puffer resuspendiert. Dann werden 200 µl Glasperlen (0,25-0,4 mm) und 200 µl

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 (v/v/v) hinzupipettiert und kräftig 2 Minuten

gemischt. Zur Phasentrennung wird 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Phase wird mit

1 Vol. Chloroform gereinigt und in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

2 µl dieser Lösung können nun zur Transformation von kompetenten E. coli DH5α

verwendet werden. Die Transformationseffektivität ist höher, wenn die DNA gefällt wird.

3.1.6 Präparation von Träger-DNA für Hefetransformationen

Für die Transformation von Hefezellen ist die Verwendung von hochwertiger Träger-DNA

essentiell, da die Transformationsrate durch die Qualität der Träger-DNA entscheidend

beeinflusst wird (Schiestl and Gietz, 1989).

Zur Herstellung von Träger-DNA (sheared salmon sperm DNA, sssDNA) wird getrocknete

DNA (Sigma) in TE-Puffer (pH 7,5) in einer Konzentration von 10 mg/ml eingewogen und

12 bis 16 Stunden bei 4 °C durch Rühren gelöst. Die visköse Lösung wird dreimal für

etwa 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt, um DNA mit einer durchschnittlichen Größe

von 7 kb bei einer Größenspanne von 2 bis 15 kb zu erhalten. Nach jeder

Ultraschallbehandlung wird ein kleines Aliquot elektrophoretisch aufgetrennt und das

Ausmaß der DNA-Fragmentierung begutachtet. Wenn die gewünschte Größe erreicht ist,

wird die DNA-Lösung mit der Phenol/Chloroform Methode extrahiert und anschließend

gefällt. Die sssDNA wird in TE-Puffer in einer Konzentration von 5 bis 10 mg/ml gelöst

und durch 20 minütiges Kochen denaturiert.

3.1.7 cDNA-Synthese

Zur Synthese von cDNA aus RNA wurde der SUPERSCRIPT-Kit von Gibco BRL

verwendet. Hierzu werden 2 µg RNA mit 0,5 µg oligo dT-Primer vermischt, bei 70 °C

denaturiert und nach Zugabe von Puffer und dNTPs 50 Minuten bei 42 °C inkubiert. Die

Synthese des DNA-Stranges wird durch reverse Transkriptase katalysiert. Anschließend

wird die RNA durch Zugabe von RNase H degradiert.

Methoden 33

3.1.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Konzentrationen von DNA- bzw. RNA-Lösungen werden im UV-Spektrometer bei

einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Dabei werden folgende Werte verwendet:

DNA (doppelsträngig) 1,0 OD260 entspricht 50 µg/ml

RNA 1,0 OD260 entspricht 40 µg/ml

3.2 Gelelektrophoresen 3.2.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese wird zur Trennung, Identifizierung, Isolierung und

Reinigung von DNA-Fragmenten eingesetzt.

Es werden in Abhängigkeit der erwarteten Größe der DNA-Fragmente 0,8-3 %ige Gele in

1x TAE-Puffer gegossen, die zum Sichtbarmachen der DNA 0,5 µg/ml Ethidiumbromid

enthalten. Die DNA-Proben werden mit 1-3 µl Gelladepuffer vermischt und in die

Geltaschen geladen. Zusätzlich wird ein Größenstandard aufgetragen. Die Auftrennung

erfolgt im elektrischen Feld bei einer Spannung von 60-110 V. Danach wird das Gel unter

UV-Lichtbestrahlung (254 nm) fotografiert.

Einzelne DNA-Banden können aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten werden und

mit dem Nucleotrap® Kit von Macherey & Nagel (Düren) aufgereinigt werden, um

sie für weitere Klonierungsexperimente einzusetzen. Für Hybridisierungsproben

wird LMP (low melting point)-Agarose verwendet.

3.2.2 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli

dient der Reinigung und Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Dazu

werden ein 5-16 %iges Trenn- und darauf ein 5% iges Sammelgel gegossen. Die

Proteinproben werden mit denaturierendem 2x SDS-Probenpuffer vermischt und 5 min im

Wasserbad gekocht, bevor sie in die Taschen des Sammelgels geladen werden. Die

Auftrennung im elektrischen Feld erfolgt bei einer Spannung von 100-120 V.

Nach der Elektrophorese können Proteinbanden durch Coomassie-Färbung sichtbar

gemacht werden. Dazu wird das Gel 10 Minuten in Coomassie-Lösung inkubiert, danach

10 Minuten in Entfärber I und mehrere Stunden in Entfärber II geschwenkt. Nach dem

Entfärben wird das Gel für zwei Stunden bei 60 °C getrocknet.

Methoden 34

Trenngel

Tris/HCl (pH 8,8) 375 mM

Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) 8-16 % (w/v)

SDS 0,1 % (w/v)

Ammoniumpersulfat 0,1 % (w/v)

TEMED 0,05 % (v/v)

Sammelgel

Tris/HCl (pH 6,8) 250 mM

Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) 5 % (w/v)

SDS 0,1 % (w/v)

Ammoniumpersulfat 0,1 % (w/v)

TEMED 0,1 % (v/v)

3.3 DNA-Klonierungstechniken 3.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen

In einen Reaktionsansatz werden 0,5-3 µg DNA und 1-5 U/µg DNA des entsprechenden

Restriktionsenzyms eingesetzt. Puffer, Temperatur und Inkubationsdauer werden

entsprechend den Herstellerangaben gewählt.

Für manche Klonierungsexperimente ist es notwendig, kohäsive Enden in glatte Enden

umzuwandeln. Dies kann durch Auffüllen der Überhänge mit Hilfe des Klenow-Fragments

der DNA-Polymerase I geschehen. Dazu werden nach dem Verdau 0,2 mM dNTPs und

1 U Klenow-Polymerase hinzupipettiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Zur Enzyminaktivierung wird die Lösung 10 Minuten auf 75 °C erhitzt.

3.3.2 Ligation von DNA

Nachdem der Vektor mit Restriktionsenzymen geschnitten worden ist, können die Enden

des linearisierten Vektors mit alkalischer Phosphatase (calf intestinal alkaline

phosphatase, CIP) dephosphoryliert werden, um eine Selbstligation zu vermeiden. Dabei

wird zum Restriktionsansatz 1 U CIP pipettiert und 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die

Isolierung der DNA von den verwendeten Enzymen erfolgt durch Auftrennung im

Agarosegel.

Methoden 35

Das Insert wird kompatibel zu den Vektorenden geschnitten und entsprechend gereinigt.

Um die Verknüpfung der Phosphodiesterbindung zwischen den aneinandergelagerten

Vektor- und Insertenden zu katalysieren, wird T4-DNA-Ligase verwendet. Das im

Ligationsansatz eingesetzte molare Verhältnis von Vektor zu Insert beträgt 1:3 bis 1:10.

Insgesamt werden in einem 10 µl Ansatz 100-200 ng DNA, 5 U T4-DNA-Ligase und 1 µl

10x Ligasepuffer, der den Cofaktor ATP enthält, eingesetzt und 3 bis 5 Stunden bei

Raumtemperatur bzw. über Nacht bei 16 °C inkubiert

3.4 Transformation von kompetenten Bakterienzellen 3.4.1 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach

Hanahan)

Diese Methode dient zur Herstellung ultra-kompetenter Bakterien, die allerdings nicht

länger als einen Tag gelagert werden können.

Es werden 50 ml SOB-Medium mit 2 ml einer Übernachtkultur E. coli DH5α Zellen

beimpft und 2 bis 3 Stunden bei 37 °C geschüttelt, bis eine optische Dichte OD600

zwischen 0,4 und 0,7 erreicht ist. Die Zellen werden bei 3500 rpm für 5 Minuten

abzentrifugiert und in 4 ml TFB-Lösung gewaschen. Danach werden sie erneut

abzentrifugiert und vorsichtig in 2 ml TFB resuspendiert. Man lässt die Bakterien für

30 Minuten im Eisbad stehen, gibt 70 µl DnD-Lösung hinzu und inkubiert die Zellen

15 Minuten auf Eis, bevor man sie erneut mit 70 µl DnD-Lösung versetzt. Nach

20 Minuten sind die Zellen kompetent und können für Transformationen verwendet

werden.

3.4.2 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach Inoue) Der Vorteil dieser Methode (Inoue et al., 1990) im Vergleich zu der von Hanahan besteht

darin, dass diese Zellen für Monate bei –80 °C gelagert werden können.

Es werden 250 ml SOB-Medium mit E. coli DH5α Zellen beimpft und bei

Raumtemperatur, ideal bei 18 °C, über Nacht geschüttelt bis die Kultur eine OD600 von

0,6 erreicht hat. Dann werden die Bakterien für 10 Minuten auf Eis gestellt, anschließend

pelletiert und in 80 ml eiskaltem TB-Puffer gewaschen. Nach 10 minütiger Inkubation im

Eisbad werden die Bakterien wie zuvor abzentrifugiert und in 20 ml TB-Puffer gelöst. Man

gibt 1,4 ml DMSO zu und lässt die Bakteriensuspension erneut für 10 Minuten im Eisbad

stehen. Danach werden die kompetenten Bakterien aliquotiert, sofort auf Trockeneis oder

in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei –80 °C gelagert.

Methoden 36

3.4.3 Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen

Es werden 10 bis 20 ng Plasmid-DNA mit 50 µl kompetenten Zellen vorsichtig vermischt

und 30 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend werden die Zellen einem Hitzeschock von

42 °C für 45 Sekunden ausgesetzt und sofort 2 Minuten auf Eis gekühlt. Nach Zugabe

von 250 µl LB-Medium werden die Bakterien 30 bis 60 Minuten bei 37 °C inkubiert, auf

LB-Agarplatten mit Selektionsantibiotikum ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C

inkubiert.

3.5 DNA-Sequenzierung

DNA-Sequenzen wurden mit dem ALF oder ALFexpress Sequencer von Kathrin Maier

und Barbara Klamt bestimmt.

Die Sequenzen wurden anschließend mit Hilfe der GCG V10 Software analysiert und mit

bekannten Sequenzen aus Datenbanken (GenBank, EMBL) verglichen.

3.6 Amplifikation einer Plasmid-cDNA Bank

Zunächst wird der Titer der Bank bestimmt. 50 und 100 µl von 1:103 und 1:106

Verdünnungen werden ausplattiert und die Kolonien gezählt. Daraus kann der Titer

(Kolonien/ml) bestimmt werden.

Zur Amplifikation werden etwa 6*106 Kolonien ausplattiert, 40.000 bis 60.000 Kolonien

pro 150 mm Platte. Nachdem die Platten konfluent bewachsen sind, werden die Kolonien

mit einem Glasspatel in LB Medium resuspendiert. Die sehr dichte Kultur wird mit

zusätzlichem LB-Selektionsmedium verdünnt und noch einmal drei Stunden bei 30 °C

geschüttelt. Es ist dabei wichtig, die Kultur nicht bei 37 °C zu inkubieren, um eine Lyse

durch in der Bank noch erhaltene Lambdaphagen zu verhindern. Aus der Kultur (ca. 3 l)

wird Plasmid-DNA nach Standardtechniken gewonnen.

3.7 PCR-Methoden 3.7.1 Analytische PCR

Zur Amplifizierung geringer Mengen DNA dient die Polymerase-Ketten-Reaktion

(polymerase chain reaction, PCR). Dabei wird ein DNA-Fragment, das von zwei Primern

Methoden 37

flankiert wird, durch eine hitzestabile DNA-Polymerase vervielfältigt. Als DNA-Matrize

können gereinigte DNA, aber auch Zellen, Bakterien-, Hefekulturen oder andere DNA-

haltige Flüssigkeiten verwendet werden.

Ein typischer Ansatz sieht folgendermaßen aus:

Plasmid-DNA 10-100 ng

10x PCR-Puffer 2 µl

dNTPs (25mM) 0,2 µl

Primer 1 (10 pmol/µl) 1 µl

Primer 2 (10 pmol/µl) 1 µl

Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) 0,2 µl

ddH2O ad 20 µl

Die Reaktion wird auf Eis pipettiert und anschließend in den auf 94 °C vorgeheizten PCR-

Cycler gestellt, um unspezifische Primer-Bindungen zu vermeiden. Werden Hefezellen

als DNA-Matrize eingesetzt, werden diese 10 Minuten mit Spheroplast-Puffer bei 37 °C

vorbehandelt.

Programm: Schritt 1 5 min 94 °C

Schritt 2 30 sec 94 °C

Schritt 3 30 sec Primer-Annealingtemperatur

Schritt 4 30 sec –2 min 72 °C

Schritt 5 20-40x Schritte 2-4 wiederholen

Schritt 6 5 min 72 °C

Schritt 7 4 °C

3.7.2 Präparative PCR

Die PCR kann eingesetzt werden, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das

anschließend in einen Vektor ligiert wird. Wenn in einem zu klonierenden DNA-Fragment

nicht die passenden Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, werden Primer konstruiert,

die an ihrem 5‘-Terminus die entsprechenden Schnittstellen, flankiert von meist drei

Nukleotiden, besitzen.

Bei präparativen PCR-Reaktionen wird neben der Taq-DNA-Polymerase auch eine DNA-

Polymerase mit der Fähigkeit zum Korrekturlesen wie Pwo- oder Pfu-DNA-Polymerase

eingesetzt.

Methoden 38

Für die in vitro-Translation müssen vor der zu translatierenden Region eine

Promotersequenz (z.B. T3, T7 oder Sp6) und ein Startcodon liegen. Die im Yeast Two-

Hybrid Screening verwendete Genbank ist im Vektor pACT2 kloniert, der eine solche

Promotersequenz nicht besitzt. Um die isolierten Plasmide dennoch für in vitro-

Translationen einsetzen zu können, wird das Plasmidinsert mit Hilfe von zwei

flankierenden Primern amplifiziert. Der 5‘-Primer (T7-pACT2) wurde in Anlehnung an den

Protein Truncation Test (Roest et al., 1993) so konstruiert, dass er eine T7-Promoter- und

die Kozak-Translations-Initiationssequenz besitzt.

3.7.3 Genotypisierung

Zur Genotypisierung von Mäusen muss zunächst genomische DNA isoliert werden. Dazu

wird ein kleines Gewebestück in 100 µl Lysis Puffer zerkleinert. Nach 15 Minuten Kochen

werden 100 µl 20 %iges Chelex-100 hinzupipettiert, 15 Minuten bei RT inkubiert und

anschließend erneut 15 Minuten gekocht. Nach Abzentrifugieren kann der Überstand für

PCR-Reaktionen verwendet werden. Durch spezifische Primer werden das Wildtyp- und

Knockout-Allel amplifiziert und elektrophoretisch unterschieden.

3.8 Radioaktive Markierung von DNA und Filterhybridisierungen 3.8.1 Herstellen von Bakterienkolonie-Filtern

Eine Mikrotiterplatte wird mit Bakterienkolonien beimpft und über Nacht bei 37 °C

inkubiert. Die Bakterien werden dann auf eine befeuchtete, ungeladene Nylonmembran

gestempelt, die anschließend vorsichtig auf eine Agarplatte gelegt und 12 bis 14 Stunden

bei 30 °C inkubiert wird. Die bewachsene Nylonmembran wird markiert und 10 Minuten in

Denaturierungspuffer, 10 Minuten in Neutralisationspuffer und 10 Minuten in 50 mM

Natriumphosphatpuffer getränkt. Um die DNA an die Membran zu fixieren wird die

getrocknete Membran mit UV-Licht (245 nm; 50mJ) bestrahlt (GS Gene linker, Biorad)

und 30 Minuten bei 80 °C gebacken. Die Mikrotiterplatte kann bei –80 °C tiefgefroren und

gelagert werden, wenn das Kulturmedium mit 10 % Cosmideinfrierpuffer versetzt wird.

3.8.2 Herstellen von PCR-Produkt-Filtern

Die PCR-Reaktion wird in einem 50 µl Ansatz durchgeführt und 5 bis 10 µl des Produkts

zur Kontrolle auf ein Agarosegel aufgetragen. Mit einem dicken Stempel werden dann

Methoden 39

einige Mikroliter der PCR-Lösung auf eine ungeladene Nylonmembran übertragen.

Anschließend wird die Nylonmembran wie unter 3.8.1 beschrieben weiterbehandelt.

3.8.3 Radioaktive Markierung von DNA

Hierzu wird die „random priming“-Methode (Feinberg and Vogelstein, 1983) verwendet.

200 ng der DNA-Sonde werden in 35 µl TE-Puffer 10 Minuten gekocht. Nachdem die

Lösung abgekühlt ist, werden 5 µl Oligo-labeling-Mix (OLB-Mix), 1 U DNA-Polymerase I

(Klenow-Fragment) und 0,5 µl α32P-dCTP (3000 Ci/mol; 10 µCi/µl) zugegeben und die

Lösung für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

3.8.4 Filterhybridisierung

Zunächst wird die Nylonmembran zur Absättigung unspezifischer Bindungen mit 10 ml

Hybridisierungslösung (Church) und 50 µg/ml denaturierter Lachssperma-DNA

30 Minuten bei 68 °C inkubiert. Die radioaktiv markierte DNA-Sonde wird mit 50 µl

denaturierter Lachssperma-DNA (10 mg/ml) versetzt, 10 Minuten aufgekocht und zu den

vorhybridisierten Filtern gegeben. Die Hybridisierung erfolgt bei 68 °C über Nacht.

Um nichtgebundene DNA zu entfernen, wird die Membran 10 Minuten bei

Raumtemperatur und 2x 10 Minuten bei 68 °C gewaschen und danach zur

Autoradiographie für 12 bis 48 Stunden in Röntgenkassetten bei –80 °C exponiert. Die

Filter können mehrmals verwendet werden, wenn die DNA-Sonde durch 30 minütiges

Waschen in Strip-Lösung bei 80 °C entfernt wird.

3.9 Herstellung, Reinigung, Analyse von Proteinen 3.9.1 In vitro Translation

Zur in vitro Translation wurde der TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit

von Promega (Madison, USA) verwendet. Die Reaktionslösung wird auf Eis angesetzt

und anschließend 90 Minuten bei 30 °C inkubiert.

50 µl Reaktionsansatz:

TNT Quick Master Mix 40 µl

(35S)-Methionin 2 µl

Plasmid-DNA (0,5 µg/µl) 2 µl

Methoden 40

3.9.2 Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen

E. coli Zellen werden mit einem pGEX-Vektor transformiert, der die cDNA für das zu

translatierende Protein enthält. Die Bakterien werden in 10 ml LB-Selektionsmedium über

Nacht kultiviert und am nächsten Tag 1:10 verdünnt. Nach einer Stunde wird die

Proteinexpression durch Zugabe von 0,1 mM IPTG induziert. Die Bakterienkulturen

werden im 27 °C Inkubator 5 Stunden geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Das

Pellet wird in 500 µl kalten PBS-Puffer gelöst und mit 0,5 mM des Proteaseninhibitors

PMSF versetzt. Dann wird die Suspension mit Ultraschall behandelt und das Detergenz

Triton X-100 zu einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Zellreste werden

abzentrifugiert und der Überstand bei –20 °C gelagert. Für GST-Pulldown Analysen

wurde dieses ungereinigte Proteinlysat eingesetzt. Jedoch war eine Aufreinigung für den

Einsatz in Electrophoretic Mobility Shift Assays nötig. Dabei wird das Proteinlysat einer

1 Liter Bakterienkultur mit 1 ml PBS-gewaschener Glutathion-Sepharose versetzt und

15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sepharose wird dreimal mit PBS

gewaschen und der Überstand komplett entfernt. Danach wird das GST-Protein mit 6x

500 µl Elutionspuffer (5 mM reduziertes Glutathion, pH 8) von der Sepharose eluiert.

10 µl jeder Fraktion werden auf einem SDS-Gel analysiert und das restliche Eluat mit

20 % Gycerin versetzt, aliquotiert und bei -70 °C gelagert.

3.9.3 Expression und Reinigung von MBP-Fusionsproteinen

Die Expression in E. coli entspricht dem Vorgehen bei GST-Fusionsproteinen. Lediglich

das LB-Medium wird mit 2 g/l Glukose angereichert, um die Synthese von Maltase zu

verhindern. Das Lysat wird mit Säulenpuffer auf 50 ml verdünnt und mit gewaschenem

Amylose-Resin 15 Minuten inkubiert. Nach Zentrifugation wird das Resin dreimal mit

Säulenpuffer gewaschen und anschließend auf eine Säule (Biorad #731-1550) geladen.

Die Elution (6x 500 µl) erfolgt mit 10 mM Maltose. Die Proteine werden mit 20 % Glycerin

vermischt und bei –70 °C gelagert.

3.9.4 Proteinexpression und Extraktion in Hefezellen

Zur Proteinextraktion aus Hefezellen, z.B. für Western-Blot Analysen, müssen im

Gegensatz zu E. coli, die Zellwände durch chemische und physikalische Methoden

aufgebrochen werden und die vielen endogenen Proteasen der Hefezellen inhibiert

werden. Dazu wurde die Harnstoff/SDS-Methode gewählt (Printen and Sprague, 1994).

Methoden 41

Eine 5 ml Übernachtkultur in SD-Selektionsmedium wird in 50 ml YPDA-Medium

überführt und bei 30 °C geschüttelt bis eine OD600 von 0,6 erreicht ist. Danach wird die

Hefekultur in Zentrifugenbecher überführt, die zur Hälfte mit eiskaltem Wasser gefüllt

sind, und 5 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das

Pellet in 50 ml eiskaltem Wasser resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wird das

Pellet in flüssigem Stickstoff gefroren.

Man erwärmt nun den Yeast-cracking-Puffer, dem kurz zuvor der Proteaseinhibitorenmix

zugefügt wurde, auf 60 °C und gibt 440 µl auf die gefrorenen Hefezellen. Die

Zellsuspension wird dann in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und 1 Vol Glasperlen

(Durchmesser 0,25 bis 0,5 mm) dazugegeben. Nach kräftigem, mindestens einminütigem

Durchmischen werden Glasperlen, Zelltrümmer und nicht aufgebrochene Zellen durch

5 minütiges Zentrifugieren sedimentiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß

überführt. Die Proben werden, falls sie nicht sofort weiterverarbeitet werden, bei –70 °C

gelagert.

3.9.5 Herstellen und Aufreinigung eines AP-Fusionsproteins

Die Herstellung des mit alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelten carboxyterminalen

Hey-Proteins erfolgt in HEK293T Zellen, die mit dem Vektor pcAP4-WRPW bzw. mit

pcAP4-YRPW transient transfiziert werden. Die Zellen sezernieren das Fusionsprotein in

den Zellüberstand. Das Medium wird nach 48 Stunden geerntet und 10 Minuten auf

65 °C erwärmt, um endogene alkalische Phosphatasen zu inaktivieren. Anschließend

werden 10 mM HEPES, pH 7,0 und 0,05 % NaN3 zugesetzt und das Medium bei 4 °C

gelagert. Da das Fusionsprotein in geringer Konzentration vorliegt, wird es durch

Zentrifugalfiltration (Centrifugal Filter Tubes, Eppendorf) aufkonzentriert. Nachdem das

gesamte Medium filtriert wurde, wird der aufkonzentrierte Überstand mehrfach mit HBS-

Puffer gewaschen. Schließlich wird der Überstand in 1 bis 2 ml HBS aufgenommen und

die Konzentration des AP-Fusionsprotein bestimmt.

Zur Konzentrationsbestimmung kann die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase

verwendet werden, welche direkt proportional zur molaren Stoffmenge der Proteine ist.

Dazu werden 10 µl der Proteinlösung mit 390 µl HBS und 400 µl 2x AP-Substrat-Puffer

versetzt, bei Raumtemperatur inkubiert und nach 2, 4, 6, 8 und 10 Minuten die optische

Dichte (OD405) im Photometer bestimmt. Zur Berechnung der Enzymaktivität wird eine

Eichgerade erstellt. Hierfür wird in HBS verdünnte alkalische Kälberdarmphosphatase

(CIP) mit bekannter Aktivität verwendet und die OD405 zwischen 0,01 und 0,2 U CIP

gemessen.

Methoden 42

3.9.6 In vitro Proteinsynthese, Reinigung und Nachweis

Von Prof. Dr. Dieter Palm, Würzburg, wurde ein carboxyterminales Proteinfragment des

Hey1-Proteins in vitro synthetisiert, das an seinem Aminoterminus mit einem

Biotinmolekül markiert ist.

Biotin-S G S G K P Y R P W G T E I G A F

Nach der Synthese wurde das Peptid chromatographisch (high liquid pressure

chromatography, HPLC) aufgereinigt und massenspektroskopisch untersucht. Die

einzelnen Fraktionen der HPLC-Analyse wurden außerdem mit einer abgewandelten

ELISA-Methode nach Konzentration und Biotinylierung analysiert.

Dabei werden in einer Mikrotiterplatte 100 ng Peptid jeder HPLC-Fraktion, gelöst in

100 µl Coating-Puffer, vorgelegt und serielle Verdünnungsreihen hergestellt. Die

Adsorption der Peptide an die Plastikoberfläche der Mikrotiterplatte erfolgt über Nacht bei

4 °C. Die Platte wird ausgeklopft und mit TBS-T gründlich gespült, bevor unspezifische

Bindungsstellen mit 3 % BSA in TBS-T abgesättigt werden. Anschließend pipettiert man

5 µg an Streptavidin gekoppelte alkalische Phosphatase in jede Tasche und inkubiert

eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem ungebundenes Enzym durch Waschen mit

TBS-T entfernt wurde, werden 100 µl Substratlösung (100 µg para-Nitrophenylphosphat

in 100 µl Glycin-Puffer) hinzugefügt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die

umgesetzte Substratmenge ist direkt proportional zur eingesetzten Biotinmenge und kann

qualitativ im Plattenphotometer bei 405 nm Wellenlänge bestimmt werden.

3.9.7 Western-Blot Analyse

Der Western-Blot kann eingesetzt werden, um ein Protein aus einem Zellextrakt

detektieren zu können. Dazu werden die Proteine in einer SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend mit dem Semi-dry Blot Verfahren

(Biometra) auf eine Nitrocellulose- bzw. PVDF-Membran transferiert. Der Transfer erfolgt

bei 5 mA/cm² für 30 Minuten im Kühlraum.

Die Membran wird anschließend 1 Stunde bzw. über Nacht bei 4 °C in Block-Puffer

(5 % Trockenmilch in PBS) zur Absättigung unspezifischer Bindungen inkubiert. Danach

wird die Membran 1x 15 Minuten und 2x 5 Minuten in PBS-Puffer gewaschen und eine

Stunde mit dem Erstantikörper (1:500 bis 1:10.000 in Blockpuffer) inkubiert.

Ungebundene Antikörper werden mit PBS-Puffer abgewaschen und die Membran eine

Stunde mit Peroxidase gekoppeltem Zweitantikörper (1:500 bis 1:10.000 in Blockpuffer)

Methoden 43

bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 5x 5 Minuten mit PBS-Puffer

gewaschen. Antigen-Antikörper-Komplexe können mit dem ECL-Detektionsreagenz

(Amersham) nach Angaben des Herstellers nachgewiesen werden.

Wird ein mit alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelter Zweitantikörper eingesetzt, so

sollte die Membran mit TBS-Puffer gewaschen und vor der Detektion mit NTMT (pH 9.5)

behandelt werden, da phosphathaltige Puffer die AP hemmen.

3.10 GST-Pulldown Assay

Mit dem GST-Pulldown Assay können Protein-Protein-Interaktionen in vitro

nachgewiesen werden.

Dazu wird ein Protein in vitro translatiert und mit (35S)-Methionin radioaktiv markiert. Das

zweite Test-Protein wird als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und extrahiert. Auf

eine Reinigung des Zellüberstandes wird bewusst verzichtet, da die übrigen bakteriellen

Proteine unspezifische Bindungen absättigen können. Man mischt 5 bis 7,5 µl des in vitro

translatierten (ivt) Proteins mit 1 bis 5 µg des GST-Fusionsproteinextrakts in 300 µl bead-

binding-buffer (bbb) mit 1 mM PMSF und inkubiert das Gemisch für 15 Minuten auf Eis.

Danach werden unlösliche Bestandteile abzentrifugiert und der Überstand mit 30 µl

Gluthation-Sepharose für 2 Stunden bei 4 °C auf dem Vertikalroller inkubiert.

Dabei kommt es zur Bindung des GST-Fusionsproteins an die Gluthation-Sepharose.

Wenn das ivt-Protein an das Testprotein bindet, wird es dadurch beim anschließenden

Waschen an der Sepharose festgehalten, ansonsten wird es mit dem Überstand

verworfen.

Die Sepharose wird pelletiert, dreimal mit je 1 ml bbb gewaschen und nachdem der

Überstand vollständig abgezogen wurde, mit 17,5 µl 2x SDS-Probenpuffer 5 Minuten

aufgekocht. Der Überstand wird auf einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel

aufgetrennt. Daneben wird ein Proteingrößenmarker und 20 % der in der Pulldown

Reaktion eingesetzten Menge ivt-Protein geladen. Das Gel wird mit Coomassie gefärbt

und dann für 30 Minuten in Amplify (Amersham) geschwenkt, um die Signalintensität der

radioaktiven Proteine zu verstärken. NachTrocknung wird das Gel zur Fluorographie 12

bis 48 Stunden bei –80 °C auf einem Röntgenfilm exponiert.

Methoden 44

3.11 Das Yeast Two-Hybrid System 3.11.1 Herstellung kompetenter Hefezellen nach der Lithium-Acetat-Methode

Es werden einige große Hefekolonien in 50 ml YPDA- bzw. SD-Medium kräftig vermischt

und bei 30 °C 12 bis 16 Stunden geschüttelt. Anschließend werden 300 ml YPDA-

Medium mit 30 bis 50 ml der Übernachtkultur versetzt, um eine OD600 von 0,2 bis 0,3 zu

erreichen. Diese Lösung wird für weitere 3 Stunden bei 30 °C inkubiert und die OD600

sollte dann bei 0,4 bis 0,6 liegen. Die Zellen werden abzentrifugiert, in 50 ml ddH2O

gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wird in 1,5 ml frisch angesetzter

1x TE/LiAc-Lösung resuspendiert. Daraufhin sind die Zellen kompetent für

Transformationen. Die kompetenten Zellen können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert

werden, die Transformationseffektivität nimmt dabei aber drastisch ab.

3.11.2 Transformation Lithium-Acetat-kompetenter-Hefezellen

In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß werden 100 µg denaturierte Träger-DNA (sssDNA) mit

0,2 bis 1,0 µg Plasmid-DNA vermischt und 100 µl kompetente Zellen hinzugefügt. Nach

kräftigem Durchmischen wird 600 µl PEG/LiAc-Lösung zugegeben und wieder kräftig

gemischt. Die Zellen werden 30 Minuten bei 30 °C geschüttelt und dann vorsichtig mit

70 µl DMSO versetzt. Der Hitzeschock erfolgt bei 42 °C für 15 Minuten. Nach

zweiminütigem Abkühlen auf Eis werden die Zellen sedimentiert, in 500 µl TE-Puffer

resuspendiert und 100 µl davon ausplattiert.

3.11.3 Yeast Two-Hybrid Analyse nach der Mating-Methode

Zum Test der Proteininteraktion müssen beide Expressionsvektoren in einer Hefezelle

lokalisiert sein. Dazu kann neben der simultanen oder sequentiellen Cotransformation

auch die Mating-Methode angewendet werden. Dabei verschmelzen zwei haploide

Hefezellen mit entgegengesetztem Konjugationstyp a und α zu einer diploiden Zelle

durch sexuelle Konjugation.

Je eine Kolonie der beiden Hefestämme wird in 500 µl YPDA-Medium in einem 1,5 ml

Reaktionsgefäß resuspendiert und 20 bis 24 Stunden auf einem Schüttler (200 rpm) bei

30 °C inkubiert. 100 µl davon werden auf Selektionsagarplatten ausgestrichen.

Man setzt einen MATa-Hefestamm (AH109) ein, der bereits mit einem pGBKT7-Plasmid

transformiert ist, das die Synthese von Tryptophan ermöglicht und einen MATα-

Hefestamm (Y187), der mit einem pGADT7-Plasmid transformiert ist, welches das

Wachstum auf Leucin-freien Nährböden ermöglicht. Diploide Zellen können somit auf

Methoden 45

Tryptophan- und Leucin-freien Nährböden (SD/-Leu/-Trp) wachsen. Falls die beiden

Testproteine miteinander interagieren, wachsen die diploiden Zellen auch auf Nährböden,

die kein Histidin und Adenin enthalten (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp). Zusätzlich wird auch das

lacZ-Gen exprimiert.

3.11.4 Screening einer cDNA-Genbank mit der Mating-Methode

Hierzu wurde eine im Vektor pACT2 klonierte murine cDNA-Genbank von Clontech

bezogen, die bereits in den Hefestamm Y187 transformiert war.

Eine große Kolonie des Hefestamms AH109, der das entsprechende pGBKT7-Plasmid

für das Testprotein trägt, wird in 50 ml SD/-Trp Medium resuspendiert und bei 30 °C 16

bis 24 Stunden auf dem Schüttler inkubiert bis die OD600 der Kultur größer als 0,8 ist. Die

Hefezellen werden bei 3000 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert, in 5 ml YPDA-Medium

resuspendiert und zusammen mit einem frisch aufgetauten 1 ml Aliqot der Genbank in

45 ml YPDA-Medium überführt. Die Suspension wird in einem 2 L-Erlenmeyerkolben

24 Stunden bei 30 °C langsam geschüttelt (40 rpm). Am nächsten Tag werden die Zellen

abzentrifugiert in 10 ml YPDA resuspendiert und ausplattiert. Man streicht etwa 200 µl

pro SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Agarplatte (∅ 15 cm) mit Hilfe von Glasperlen (∅ 0,5 mm)

aus. Alternativ können die Zellen erst auf SD/-Leu/-Trp ausplattiert und nach einigen

Tagen dann auf hochstringente SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp umplattiert werden, um den

Zellen Zeit zu geben, ausreichende Mengen der Interaktionsproteine zu synthetisieren.

3.11.5 Screening einer cDNA-Genbank mit der Cotransformations-Methode

Es wird eine 150 ml Übernachtkultur des mit dem „bait“-Plasmid transformierten Stamms

AH109 in SD/-Trp angeimpft. Am nächsten Tag wird die Kultur in 1 L YPDA verdünnt und

noch einmal drei Stunden geschüttelt. Nach Abzentrifugieren und Waschen, werden die

Zellen in 8 ml TE/LiAc Lösung aufgenommen und mit 100-300 µg cDNA der Genbank

versetzt. Das weitere Vorgehen entspricht der einfachen Hefetransformation.

3.11.6 Filter lift β-Galaktosidase Assay

Die Interaktion von Protein-Protein-Bindungen im Yeast Two-Hybrid System zeigt sich

u.a. in der Transkription des lacZ-Gens, das im Hefestamm Y187 unter der Kontrolle des

GAL1-Promoters, im Stamm AH109 unter Kontrolle des MEL1-Promoters liegt. Die

Enzymaktivität des Genprodukts β-Galaktosidase kann qualitativ und quantitativ bestimmt

werden.

Methoden 46

Der „colony-lift filter“-Test eignet sich für die schnelle Überprüfung der lacZ-Aktivität einer

großen Anzahl von Kolonien. Die Sensitivität des Testes ist hoch, der Nachteil besteht in

der schlechten Quantifizierbarkeit der Ergebnisse.

Ein Stück Cellulosepapier wird auf eine frisch bewachsene SD-Selektionsagarplatte

gelegt, vorsichtig angedrückt und markiert. Der Filter wird nun in flüssigen Stickstoff

getaucht und wieder aufgetaut, um die Zellwände aufzubrechen. Danach wird dieser

Filter auf einen zweiten Filter gelegt, der mit Z-Puffer/X-Gal-Lösung getränkt wurde. Die

Filter werden bei 30 °C inkubiert und die Blaufärbung der Kolonien dokumentiert.

3.11.7 Quantitativer β-Galaktosidase Assay mit ONPG

Zur Quantifizierung der Interaktionsstärke zweier Proteine wird der lacZ-Aktivitätstest mit

o-Nitrophenyl β-D-Galaktopyranosid (ONPG) als Substrat durchgeführt. Dazu werden

transformierte Y187-Zellen über Nacht in SD/-Leu/-Trp Medium kultiviert. 1 ml der Kultur

wird in 4 ml YPDA überführt und etwa drei Stunden weiter geschüttelt. Anschließend wird

die OD600 bestimmt, welche im Bereich 0,4-0,8 liegen sollte. 1,5 ml werden abzentrifugiert

und in 300 µl Z-Puffer resuspendiert. 100 µl dieser Suspension werden in ein neues

Reaktionsgefäß überführt, in flüssigen Stickstoff getaucht und wieder im 37 °C Bad

aufgetaut. Dieser Schritt muss zweimal wiederholt werden, um die Zellen komplett

aufzubrechen. Anschließend werden sie mit 700 µl Z-Puffer und 160 µl ONPG (4 mg/ml)

versetzt. Die Zeit wird ab der Zugabe von ONPG gemessen. Nachdem sich eine

Gelbfärbung zeigt, spätestens jedoch nach vier Stunden, wird die Reaktion durch Zugabe

von 400 µl 1 M NaCO3 gestoppt, die Suspension 10 Minuten lang zentrifugiert und die

OD420 des Überstandes gemessen.

Die β-Galaktosidase Aktivität wird mit folgender Formel bestimmt:

β-Galaktosidase/Units=2000*OD420 / (t(min)*OD600)

Eine Unit ist definiert als die Menge β-Galaktosidase, die 1 µmol ONPG in einer Minute

zu o-Nitrophenol und D-Galaktose hydrolysiert (Miller, 1972).

Methoden 47

3.12 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Proteinen

Zum Auffinden neuer Protein-Protein-Bindungen des carboxyterminalen Hey1-Motivs

wurde ein Screening von Proteinexpressionsfiltern durchgeführt. Dabei wurden ein mit

alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertes und ein in vitro synthetisiertes, mit Biotin

markiertes, Peptid verwendet.

3.12.1 Herstellen von Proteinexpressionsfiltern

Die Herstellung von Proteinexpressionsfiltern erfolgte nach der Methode von Konrad

Büssow (Bussow et al., 1998).

Eine Mikrotiterplatte wird mit E. coli, die das jeweilige Expressionsplasmid tragen, beimpft

und über Nacht bei 37 °C inkubiert. PVDF-Membranen (Hybond-N+, Amersham) werden

in Methanol befeuchtet, in autoklaviertem ddH2O und anschließend in 2x YT-Medium

gewaschen. Die noch feuchte PVDF-Membran wird mit den Bakterienkulturen

bestempelt, auf eine 2x YT-Agarplatte gelegt und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Zur

Induktion der Proteinexpression wird die Membran auf eine frische Agarplatte gelegt, die

1 mM IPTG enthält und für weitere 3 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Anschließend werden die Kolonien in Denaturierungspuffer 10 Minuten lysiert, zweimal

5 Minuten mit Neutralisationspuffer und schließlich 15 Minuten mit 2x SSC behandelt.

Nach dem Trocknen kann die Membran bei Raumtemperatur gelagert werden.

3.12.2 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit AP-Fusionsproteinen

Zunächst wird der Proteinexpressionsfilter vorbereitet. Dazu wird die Membran mit

Ethanol angefeuchtet und in TBST-T-Lösung gewaschen. Anhaftende Bakterienkolonien

werden vorsichtig abgewischt. Die Lösung wird zweimal gewechselt und danach wird

noch einmal 10 Minuten in TBS-Puffer gewaschen. Falls die Membran schon einmal

benutzt war, wird sie gründlich in TBS-T gewaschen und die Waschlösung viermal

gewechselt.

Anschließend werden ungesättigte Bindungsstellen auf dem Filter durch einstündige

Inkubation in Block-Puffer (3 % Trockenmilch in TBS) gesättigt und das AP-

Fusionsprotein (2-3 U/Membran) in Block-Puffer 12 bis 16 Stunden bei 4 °C inkubiert.

Ungebundene Proteine müssen durch gründliches Waschen der Membran mit TBST-T

entfernt werden. Um die gebundenen AP-Fusionsproteine nachweisen zu können, wird

als Substrat der alkalischen Phosphatase der präzipitierende Farbstoff BM-Purple

Methoden 48

(Boehringer, Mannheim) eingesetzt. Dazu wäscht man die Membran kurz in NTMT

(pH 9,5), um das pH-Optimum der alkalischen Phosphatase einzustellen und inkubiert

dann mit BM-Purple bei Raumtemperatur, bis die gebundenen Proteine durch

Blaufärbung sichtbar werden.

3.12.3 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit einem Biotin-markierten Peptid

1 nmol des in vitro synthetisierten und mit Biotin markierten Peptid wird mit 10 µg

Steptavidin, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, versetzt und 20 Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert, wobei sich stabile Biotin-Streptavidin-Komplexe bilden.

Überschüssige Streptavidinbindungen werden anschließend durch Zugabe von 12 µg

Biotin abgesättigt. Ungebundene Peptide werden durch Ultrazentrifugation (Centrifugal

Filter Tubes, Eppendorf) bei 7000 rpm abzentrifugiert und der Überstand in 1 ml TBS

aufgenommen. Mit dieser Lösung wird dann, analog zum Vorgehen mit AP-

Fusionsproteinen, das Proteinexpressionsfilter-Screening durchgeführt.

3.13 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Mit diesem Assay ist es möglich Protein-DNA Interaktionen nachzuweisen. Dazu wird

DNA radioaktiv markiert und mit Proteinen und evtl. kompetitiven DNA-Sequenzen

inkubiert. Bei der anschließenden Gelelektrophorese werden Protein-DNA-Komplexe

stärker im Gel zurückgehalten als ungebundene DNA.

3.13.1 Präparation der DNA-Sonden

Zunächst werden die beiden komplementären Oligonukleotide aneinandergelagert. Sie

sind so konstruiert, dass das doppelstängige Oligonukleotid freie 5‘-Enden aufweist.

Annealing: Plusstrang-Oligo (100 pmol/µl) 1,5 µl

Minusstrang-Oligo (100 pmol/µl) 1,5 µl

ddH2O 2 µl

Der Ansatz wird 5 Minuten auf 95 °C im Cycler erhitzt und langsam abgekühlt. Danach

werden die freien Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Die DNA kann dabei

radioaktiv markiert werden, indem α32P-dCTP eingesetzt wird. Nicht eingebaute

Nukleotide werden entfernt, indem die DNA gefällt und in 100 µl TE-Puffer gelöst wird.

Methoden 49

Auffüllreaktion: Annealing Mix 0,3 µl

10x Klenow Puffer 1 µl

dATG (2,5 mM) 0,5 µl

α32P-dCTP (10 µCi/µl) 1 µl

ddH2O 7,2 µl

Der Ansatz wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

3.13.2 Bindungsreaktion und nicht-denaturierende Gelelektrophorese

Es werden pro Reaktion 10 µl EMSA-binding buffer mit 0,2 µg BSA vorgelegt. 1 µl des

radioaktiv markierten Oligonukleotids und evtl. kompetitive DNA (100 ng ssDNA, poly dI-

dC, nicht-radioaktives Oligonukleotid) werden mit dem entsprechenden Protein (2-4 µl ivt-

bzw. MBP- oder GST-Protein) vermischt und mit EMSA-binding buffer auf ein

Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur

inkubiert. Die nachfolgende Gelelektrophorese erfolgt unter nicht-denaturierenden

Bedingungen in einem Tris-Glycin-Gel bei 4 °C für 2-4 Stunden. Das Gel wird bei 80 °C

getrocknet und ein Röntgenfilm aufgelegt.

Tris-Glycin-Gel: ddH2O 50,6 ml

10x Tris-Glycin-Puffer 7,2 ml

Acrylamid:Bisacrylamid (29:1) 12,4 ml

Glycerin (99 %) 1,8 ml

APS (10 %) 540 µl

TEMED 84 µl

3.14 Zellkulturtechniken 3.14.1 Kultivierung und Lagerung

Die humanen HEK293T Zellen werden in DMEM-Medium mit GlutaMAX-I (GibcoBRL),

10 % fötalem Kälberserum (FCS), 10.000 U/ml Penicillin und 10.000 U/ml Streptomycin

bei 37 °C in 5 %iger CO2 Atmosphäre kultiviert und etwa jeden dritten Tag 1:10 geteilt.

Um die Zellen längerfristig lagern zu können, müssen sie tiefgefroren und in flüssigem

Stickstoff aufbewahrt werden. Dazu werden etwa 107 Zellen in 1 ml Einfriermedium

langsam auf –196 °C abgekühlt

Methoden 50

Das Auftauen der tiefgefrorenen Zellen geschieht schnell bei 37 °C. Danach wird die

Lösung sofort mit 10 ml Medium versetzt und die Zellen bei 600 rpm 5 Minuten

abzentrifugiert. Die Zellen werden in frischem Medium resuspendiert und in

Zellkulturschalen ausgesät.

3.14.2 Transfektion mittels Calciumphosphat-Präzipitation

Die Aufnahme von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen kann mit Hilfe von

Calciumphosphat geschehen. Dazu wird eine Stunde vor Beginn der Transfektion das

Medium einer zu 50 % dicht bewachsener Schale (∅ 10 cm) abgesaugt und durch 7 ml

frisches Medium ersetzt. Zur Transfektion werden 6 µg Plasmid-DNA in 175 µl Wasser

mit dem gleichen Volumen 0,5 M CaCl/HEPES versetzt und kräftig vermischt. Die

Präzipitatlösung wird mit 350 µl 2x HBS (pH 7,05) vermischt und eine Minute bei

Raumtempertatur inkubiert, bevor sie vorsichtig auf die Zellen getropft wird. Nach

12 Stunden wird das Medium ausgetauscht.

3.15 Isolierung, Färbung, Einbettung und Schnitte von Mausgewebe 3.15.1 Präparation von Mausgewebe

Mäuse wurden durch CO2-Inhalation und zervikale Dislokation getötet, die

entsprechenden Organe oder Embryonen präpariert und in PBS gewaschen.

3.15.2 lacZ-Färbung

Die entnommenen Organe werden in 0,1 M Na-Phophat Puffer gewaschen und für 1 bis

4 Stunden in lacZ-Fixierpuffer auf Eis fixiert. Danach werden sie dreimal 15 Minuten in

lacZ-Waschpuffer geschüttelt und über Nacht in lacZ-Färbelösung bei 37 °C

lichtgeschützt inkubiert. Die gefärbten Präparate werden mit PBS-Puffer gewaschen und

über Nacht in 4 % PFA fixiert. Anschließend können sie in lacZ-Waschpuffer gelagert

werden.

3.15.3 Einbetten und Schneiden von Mausgewebe in Paraffin

Die gefärbten Gewebe werden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, zweimal

10 Minuten in PBS und 10 Minuten in 0,9 % NaCl gewaschen. Anschließend werden sie

in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, zweimal 100 %

Methoden 51

Methanol für je 2 Stunden), in Isopropanol:Chloroform (1:1) geschüttelt und in Chloroform

überführt. Zum Einbetten werden sie in Chloroform:Paraffin inkubiert bis das Chloroform

verdampft ist und nach dreimaligem Wechseln des Paraffins in Blöcke eingebettet.

Die Schnitte (3-10 µm) werden mit einem Mikrotom angefertigt, im 37 °C Wasserbad auf

Polylysin-beschichtete Objektträger aufgezogen und bei 42 °C getrocknet.

Die lacZ-gefärbten Schnitte können zusätzlich noch Hämalaun/Eosin gefärbt werden.

3.16 RNA in situ Hybridisierung ganzer Embryonen

Mit dieser Technik kann die räumliche und zeitliche Expression von Genen bestimmt

werden. Die zellulär transkribierte mRNA wird mit einer spezifischen Digoxygenin-UTP-

markierten antisense-RNA nachgewiesen. Gebundene markierte RNA wird

immunhistochemisch mit Hilfe eines anti-Digoxygenin Antikörpers sichtbar gemacht.

3.16.1 Herstellung der Digoxygenin-markierten RNA-Sonde

Die entsprechende cDNA wird in Vektoren mit T3-, T7- oder SP6-Promoter kloniert und

der Vektor am 5‘-Terminus linearisiert. Der Reaktionsansatz wird Phenol/Chloroform

gereinigt. Für die in vitro Transkription wird folgender Ansatz gewählt:

Linearisierte Plasmid-DNA 1-2 µg

10x Transkriptionspuffer 2 µl

Digoxygenin-labeling Mix 2 µl

RNase-Inhibitorenmix 0,8 µl

RNA-Polymerase 1,2 µl

DEPC-H2O ad 20 µl

Der Ansatz wird zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Nachdem die RNA-Probe durch

Gelelektrophorese überprüft wurde, wird die RNA gefällt, in Ethanol gewaschen und in

100 µl DEPC-H2O gelöst. Die Lösung wird mit Hybridisierungslösung 1:10 verdünnt und

bei –20 °C gelagert.

3.16.2 Hybridisierung (Henrique et al., 1995)

Methoden 52

Die Embryonen werden in 4 % PFA fixiert und anschließend in PBT gewaschen. Die

Entwässerung erfolgt in einer aufsteigenden Methanolreihe (25 %, 50 %, 75 %, 100 %)

für je 15 Minuten, danach werden sie über Nacht in 100 % Methanol bei -20 °C gelagert.

Nach Rehydrierung in absteigender Methanolreihe, werden die Embryonen in PBT

gewaschen und eine Stunde mit 6 % H2O2 gebleicht. Das H2O2 wird ausgewaschen und

eine Proteinase K (10 µg/ml) Behandlung erfolgt unterschiedlich lange, je nach

Entwicklungsstadium:

<E9,5 1 min

E10,5 3 min

E12,5 5 min

E13,5 7 min

>E13,5 10 min

Danach wird dreimal mit PBT, dreimal mit RIPA und nochmals mit PBT gewaschen,

bevor die Embryonen 20 Minuten mit 4 % PFA/0,2 % Glutaraldehyd fixiert werden.

Danach werden sie dreimal in PBT, 10 Minuten in Hybridisierungslösung/PBT (1:1) und

10 Minuten in Hybridisierungslösung gewaschen. Die Prähybridisierung in

Hybridisierungspuffer mit tRNA erfolgt bei 70 °C für mindestens eine Stunde. Die

markierte RNA-Sonde wird bei 80 °C denaturiert und in 1:100 Verdünnung mit den

Embryonen bei 70 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wird mehrmals mit 70 °C

warmer Hybridisierungslösung gewaschen. Nach Schütteln in NTE, wird einzelsträngige

RNA durch einstündige RNase A (20 µg/µl) und RNase T1 (100 U/µl) Behandlung

degradiert. Die Embryonen werden in NTE, dann in 70 °C warmer Hybridisierungslösung

und Hybridisierungslösung/TBST (1:1) gewaschen, bevor sie mit TBST und MABT

behandelt werden. Nach Vorinkubation mit 20 % Schafserum und 1 % Blocking Reagenz

(Boehringer) wird der anti-Digoxygenin Antikörper in einer 1:2000 Verdünnung zugesetzt

und mindestens drei Stunden inkubiert. Ungebundene Antikörper werden zwei Tage lang

mit MABT abgewaschen. Zum Färben werden die Embryonen zunächst mit NTMT und

NTMT/2 mM Levamisol gewaschen. Das AP-Substrat BM Purple (Boehringer) wird mit

1 % Tween-20 und 2 mM Levamisol versetzt und mit den Embryonen inkubiert. Nach der

Färbung wird nochmal mit PBT gewaschen und mit 4 % PFA nachfixiert und vor dem

Fotographieren mit 50 % Glycerin/PBS geklärt. Anschließend können die gefärbten

Embryonen in Paraffin eingebettet und geschnitten werden.

Die Hybridisierungen auf Paraffinschnitte wurden von Nina Schumacher durchgeführt

(Leimeister et al., 1999b).

Ergebnisse 53

4 Ergebnisse

Im Folgenden werden die Ergebnisse der Hey-Proteininteraktionsstudien beschrieben.

Anschließend wird auf die DNA-Bindung von Hey-Transkriptionsfaktoren und ihren

Interaktionspartnern eingegangen, gefolgt von den Ergebnissen der Phänotypisierung

von Hey2-Knockoutmäusen.

4.1 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Peptiden Die hairy-verwandten Proteine zeichnen sich dadurch aus, dass sie mit ihrem

carboxyterminalen WRPW-Motiv den Corepressor Groucho/TLE1 binden und damit die

Transkription ihrer Zielgene reprimieren. Die Hey-Proteine besitzen einen leicht

veränderten, aber evolutionär konservierten Carboxyterminus, mit dem sie vermutlich

auch Proteine binden können. Daher sollten zunächst die Interaktionen des Hey1-

Carboxyterminus aufgedeckt werden. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten nach neuen

Interaktionen zu suchen, wobei die bekannteste sicherlich das Yeast Two-Hybrid

Verfahren ist. Zunächst wurde jedoch eine neuartige Methode zur Detektion unbekannter

Proteinbindungen erprobt.

Das Prinzip dieses Tests besteht darin, einen Proteinexpressionsfilter mit einem

markierten Protein bzw. Peptid zu inkubieren und anschließend die gebundene Probe

anhand einer Farbreaktion nachzuweisen. Im nächsten Schritt werden dann die

entsprechenden cDNA-Klone, die das Protein auf dieser Filterstelle kodiert haben,

analysiert (s. Abb. 6).

FilterFilterprotein

Hey1-Peptid

BiotinStreptavidin

AP

AP

AP

Abb. 6: Prinzip des Screeningverfahrens. Links: AP-gekoppeltes Hey1-Peptid bindet an ein Membran fixiertes Protein. Rechts: Biotin-gekoppeltes Hey1-Peptid, mit AP-Streptavidin komplexiert, interagiert mit einem Filterprotein.

Ergebnisse 54

Es wurde ein „high-density-grid“-Proteinexpressionsfilter (hEX1) vom Ressourcen-

Zentrum (RZPD) in Berlin bezogen, der ursprünglich für die Untersuchung von

Antikörpern konzipiert wurde (Bussow et al., 1998). Als Testpeptid diente im ersten

Versuch ein carboxyterminales Hey1-Fragment, das an seinem Aminoterminus mit

alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelt war. Ein entsprechendes Expressionsplasmid

wurde in HEK293T Zellen transfiziert, die das Fusionsprotein in das Medium sezernieren.

Die Filtermembran wurde mit dem durch Zentrifugalfiltration aufkonzentrierten Medium

(3 U AP-Aktivität) inkubiert und gewaschen. Die Detektion erfolgte durch Zugabe des AP-

Substrates BM-Purple (Boehringer), womit nach einstündiger Färbung 48 eindeutige

Signale zu erkennen waren (s. Abb. 7). Die entsprechenden cDNA-Klone waren teilweise

identisch, da manche Klone mehrfach auf den Filter aufgebracht waren. Dies war bereits

ein ermutigendes Ergebnis, da ein mehrfach aufgetragener Klon auch an allen Stellen

nachweisbar sein sollte. Insgesamt wurden 39 Klone vom RZPD bezogen und durch

Plasmidreinigung und Sequenzierung des Plasmidinserts analysiert.

Abb. 7: Ausschnitt des Proteinexpressions-filters. Der Filter wurde mit einem AP-markiertem Hey1-C-terminalen Peptid inkubiert und gebundene Peptide durch AP-Substratfärbung sichtbar gemacht. Deutlich sind zwei Signale zu erkennen (Pfeil-spitzen). Die Filterproteine sind jeweils doppelt in einem bestimmten Muster um den zentral gelegenen Orientierungspunkt angeordnet.

Weiterhin wurden mit den cDNA-Klonen eigene Proteinexpressionsfilter hergestellt, um

die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse überprüfen zu können. Die Wiederholung des

Experiments zeigte eine gleichmäßige Färbung aller Proben. Zusätzlich wurden, als

Negativkontrolle, die Proteinfilter ohne das markierte Peptid nach gleichem Protokoll

behandelt, wobei sich keine Signale zeigten.

Die Auswertung ergab, dass viele der gefundenen Proteine wahrscheinlich keine

physiologisch relevanten Bindungen mit Hey1 eingehen können, da sie in

unterschiedlichen Zellkompartimenten lokalisiert sind wie z.B. Klon1A4: Fc-IgG Rezeptor.

Einige Proteine wurden mehrfach auf dem Filter detektiert (Kreatinkinase B, Clathrin,

NAPA) und zusätzlich wurden bisher unbekannte Sequenzen isoliert. Eine tatsächliche

physiologische Bindung der Hey-Proteine an Strukturproteine wie Clathrin wäre durchaus

vorstellbar, z.B. während des Transports vom Cytoplasma in den Zellkern. Da aber in

Ergebnisse 55

erster Linie nach Transkriptions-Regulatoren wie Groucho/TLE gesucht wurde, sind diese

möglichen Interaktionen nicht weiter analysiert worden. Lediglich die Interaktion mit dem

Klon 2A3, der für den Transkriptionsfaktor CREB2 kodiert, wurde näher untersucht. Eine

Bindung an den Hey1-Carboxyterminus konnte im GST-Pulldown Assay jedoch nicht

verifiziert werden. Auch an ein WRPW-Motiv im Hey1-Kontext konnte das CREB2-

Fragment nicht binden.

Da mit dem initialen Screening kein interessanter Bindungspartner gefunden werden

konnte, musste der Assay abgewandelt werden. Es wurde nun ein carboxyterminales

Hey1-Fragment (aa 283-299) in vitro synthetisiert, das an seinem Aminoterminus mit

Biotin markiert war (Prof. Dr. Dieter Palm, Würzburg). 1 nmol dieses Peptids wurde für

das Screening mit AP-gekoppeltem Streptavidin im Überschuss versetzt, wobei sich

Biotin-Streptavidin-Komplexe bilden konnten, während ungebundene Peptide durch

Zentrifugalfiltration entfernt wurden.

Anschließend wurde der hEX1-Proteinexpressionsfilter mit diesem in vitro synthetisierten

und markiertem Peptid inkubiert und die Detektion erfolgte wie zuvor. Zusätzlich zu den

alten Signalen, konnten 14 weitere Signale detektiert werden (s. Tab. 1). Diese Klone

wurden bestellt und teilweise sequenziert, wobei sich zeigte, dass erneut unbekannte

oder physiologisch eher unbedeutsame Protein gefunden worden waren.

Um den Assay weiter überprüfen zu können, wurden alle bisher bezogenen Klone auf

PVDF-Membranen gespottet und Proteinexpressionsfilter nach dem Protokol von Büssow

hergestellt. Diese Filter wurden dann mit dem biotinylierten Peptid, bzw. als

Negativkontrolle, ohne das Peptid inkubiert, gewaschen und erst dann mit alkalischer

Phosphatase, gekoppelt an Streptavidin, versetzt. Nach Zugabe des AP-Substrates

färbten sich alle Kolonien innerhalb weniger Minuten stark an. Auch bei der

Negativkontrolle (ohne Hey1-Peptid) konnte die starke Färbung gesehen werden.

Möglicherweise ist diese Reaktion auf biotinylierte bakterielle Proteine zurückzuführen,

die mit dem freien Streptavidin Komplexe bilden. Es ist bisher bekannt, dass die BCCP-

Untereinheit der bakteriellen Acetyl-CoA-Carboxylase biotinyliert wird (Chapman-Smith

and Cronan, 1999). Dies zeigt, dass es mit diesem Versuchsaufbau schwierig ist,

tatsächliche Interaktionsproteine des eingesetzten Peptids zu erfassen, da

ungebundenes Streptavidin immer starke Komplexe mit den biotinylierten Proteinen

ausbilden wird.

Klon GenBank 1A1 Beta Tubulin AF070561 1A2 Ribosomales Protein L7 X52967

Ergebnisse 56

1A3 Chr.19 Klon LLNLR-272C5 1A4 Fc-IgG Rezeptor U12255 1A5 KIAA0689 AB014589 1A6 Kreatinkinase B L47647 1B1 Kreatinkinase B L47647 1B4 AAMP M95627 1B6 Transkriptionsfaktor CR53 3' UTR AF017433 1C6 Bithoraxoid like Protein AF165516 1D2 NS1 bind. Protein AJ012449 2A1 Chr.6 Cosmid F0811 2A2 Clathrin Leichtkette M20471 2A3 CREB2 M86842 2A4 Clathrin Leichtkette M20471 2A5 NAPA U39412 2A6 unbekannt 2B2 G-Protein bindendes Protein M16538 2B4 Calsenilin AF120102 2B6 Clathrin Leichtkette M20471 2C1 Clathrin Leichtkette M20471 2C3 NAPA U39412 3A2 Chaperon für Superoxid Dismutase AF002210 3A4 PTD014 AF092135 3A6 KIAA0362 AB002360 3B1 Chr.17 clone RPC875H18 3B2 Chr. 17q13.3 3B3 BC-2 AF042384 3B4 FLJ11052 AK001914 3B5 Chr.17 clone RPC875H18 Tab. 1: Liste der sequenzierten Klone aus dem Expressionsfilter Screening.

Insgesamt erschien diese Methode zum Auffinden neuer Protein-Proteininteraktionen

noch nicht ausgereift. Daher wurde das etablierte Yeast Two-Hybrid Verfahren

herangezogen, um neue Interaktionspartner zu finden

4.2 Yeast Two-Hybrid Library Screening 4.2.1 Klonierung der Vektoren

Das Yeast Two-Hybrid System ist eine weit verbreitete Methode, neue

Proteininteraktionen zu entdecken. Das System wurde nun für die Hey-Proteine

aufgebaut und evaluiert.

Zunächst wurden die „bait“- und „prey“-Konstrukte mit den üblichen Techniken kloniert

(Ausubel et al., 2001; Sambrook et al., 1989). Als Vektoren dienten pGBKT7 und

pGADT7 (Clontech). Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung aller Vektoren und der damit

Ergebnisse 57

kodierten Proteine, die entweder für das Screening oder später für die direkten

Interaktionstests benutzt wurden.

Vektor kodiertes Protein Amino-säuren

Klonierung

GBK-HLH Hey1-HLH ohne basic 62-105 PCR clk11/clk13 EcoRI-BamHI GBK-bHLH Hey1-bHLH 39-121 PCR clikBE/clikSal BamHI-SalI GBK-bHLHOr Hey1-bHLH-Or 50-200 D15 MscI in GBK NdeI GBK-HLHOr Hey1-HLH-Or ohne basic 62-169 PCR clk11/clk14 EcoRI-BamHI GBK-heyA Hey1-bHLH-Or 38-175 PCR clk7/clk8 EcoRI-BamHI GBK-Or Hey1-Orange lang 108-169 PstI Fragment aus GBK-bHLHOr GBK-Or-s Hey1-Orange kurz 122-169 PCR clk12/clk14 EcoRI-BamHI GBK-heyB Hey1-C-Terminus 173-299 PCR clk9/clk10 EcoRI-BamHI GBK-heyC Hey1-basic-Stop 38-299 PCR clk7/clk10 EcoRI-BamHI GBK-YRPW Hey1-C-Terminus 266-299 PCR Eco-yrpw/clk4 EcoRI-NsiI GBK-sWRPW Hey1-WRPW statt YRPW 287-299 GEX-WRPW PCR

sWRPW/Kgreverse DraI-SalI GBK-sWRPY Hey1-WRPY statt YRPW 287-299 GEX-WRPY PCR

sWRPY/Kgreverse DraI-SalI GBK-blik Hey2 ohne C-Terminus 1-269 pBS-mhey2-ATG-Eco EcoRV-PstI

in GBK SmaI-PstI GBK-c-hairy1 c-hairy1-bHLH-Or 1-163 Subklonierung aus GAD-c-hairy1

EcoRI-XhoI GAD-HLH Hey1-HLH ohne basic 62-105 PCR clk11/clk13 EcoRI-BamHI GAD-HLHOr Hey1-HLH-Or ohne basic 62-169 PCR clk11/clk14 EcoRI-BamHI GAD-heyA Hey1-bHLH-Or 38-175 PCR clk7/clk8 EcoRI-BamHI GAD-Or-s Hey1-Orange kurz 122-169 PCR clk12/clk14 EcoRI-BamHI GAD-heyB Hey1-C-Terminus 173-299 PCR clk9/clk10 EcoRI-BamHI GAD-blik Hey2 ohne C-Terminus 1-172 Subklonierung aus GBK-blik NcoI GAD-c-hairy1 c-hairy1-bHLH-Or 1-163 GEX-chairy bHO ClaI, Klenow fill

in, SacI GAD-E2.2bHLH E2.2-bHLH 457-544 PCR ITF1B/ITF1S BamHI-SalI GAD-E2.5bHLH E2.5-bHLH 512-600 PCR ITF2B/ITF2S BamHI-SalI GAD-E12bHLH E12-bHLH 48-146 PCR E12B/E12S BamHI-SalI

GAD-MyoD MyoD-bHLH 74-162 PCR MyoB/MyoS BamHI-SalI Tab. 2: Liste der klonierten Vektoren für die Yeast Two-Hybrid Interaktionstests. Zusätzlich sind die kodierten Proteinfragmente sowie die Klonierungsstrategie aufgeführt.

Alle Konstrukte wurden durch Testverdau oder PCR-Reaktionen überprüft und

sequenziert. Die Proteinexpression in Hefezellen wurde durch Proteinextraktion und

Ergebnisse 58

Western-Blotting kontrolliert, womit alle rekombinanten Proteine in der erwarteten Größe

nachgewiesen werden konnten (s.Abb. 8).

Abb. 8: Western Blot Analyse von rekombinanten Fusionsproteinen. AH109-Hefezellen wurden mit den Vektoren GBK-HLH, -HLHOr, -YRPW, bzw. dem leeren pGBKT7 Plasmid transformiert. Die jeweiligen Proteinlysate wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen geblottet. Rekombinante Fusionsproteine konnten durch einen anti-c-myc Antikörper nachgewiesen werden. Die Detektion erfolgte mit dem ECL-System (Amersham). Links: Ein Gel wurde nach der Elektrophorese Coomassie gefärbt. Rechts: Western Blot. Der leere GBK-Vektor kodiert die GAL4-DBD mit c-myc Epitop in der erwarteten Größe. Die übrigen Vektoren kodieren GAL4-DBD-Hey1-Fragmente.

Anschließend wurden die transformierten Hefeklone auf verschiedenen

Selektivnährböden ausplattiert, um ihren Phänotyp zu testen und schließlich wurden alle

Konstrukte mit den entsprechenden Kontrollvektoren (pGBKT7, GBK-p53, GBK-LaminC,

bzw. pGADT7, GAD-T-Antigen) cotransformiert, um sogenannte „self activators“ von

Anfang an auszuschließen.

Lediglich das Konstrukt GBK-YRPW (Hey1-C-Terminus) zeigte eine schwache

Aktivierung der Reportergene, die allerdings durch den Zusatz von 10 mM 3-AT, einem

Inhibitor der Histidinsynthese, unterdrückt werden konnte. Die übrigen Vektoren erfüllten

alle Testkriterien und konnten für Yeast Two-Hybrid Analysen eingesetzt werden.

4.2.2 Screening mit dem Hey1-Carboxyterminus Nachdem das Screening eines Proteinexpressionsfilter mit carboxyterminalen Hey1-

Fragmenten keine entscheidenden Ergebnisse geliefert hatte, wurde nun das Yeast Two-

Hybrid System eingesetzt, um einen Interaktionspartner des Hey1-Carboxyterminus zu

finden. Es wurden zwei Screening Ansätze mit unterschiedlich langen carboxyterminalen

Hey1-Fragmenten durchgeführt.

Ergebnisse 59

4.2.2.1 Hey1 aa 266-299 (GBK-YRPW) Screening

Mit dem carboxyterminalen Hey1-Fragment (aa 266-299), das der Vektor GBK-YRPW

kodiert, wurde eine murine embryonale (E11) Genbank (Clontech) nach

Interaktionspartnern durchsucht. Da Hey1 im embryonalen Stadium E11 in zahlreichen

Geweben hoch exprimiert ist, sollten mit dieser Bank potentielle Interaktionspartner

gefunden werden.

Das Screening wurde mit der Mating-Methode durchgeführt. AH109-Zellen, die mit GBK-

YRPW transformiert waren, wurden zusammen mit der Genbank, die bereits in Y187

Zellen transformiert war, inkubiert, damit sich diploide Zellen bilden können, welche beide

Plasmide besitzen. Diploide Zellen wachsen auf SD/-Leu/-Trp Platten und wenn beide

Testproteine miteinander interagieren, können sie auch auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp

Agarplatten wachsen. Die Zellen wurden in diesem Versuch direkt auf diesen

hochstringenten Nährböden ausplattiert.

Ab dem fünften Tag nach Ausplattieren wurden die großen Kolonien gepickt und auf

frische Platten ausgestrichen. Insgesamt konnten 159 Kolonien isoliert werden, von

denen 145 Klone erneut wuchsen. Diese Klone wurden auf die Expression des lacZ-

Gens mit Hilfe des filter-lift β-Galactosidase Assays untersucht. Von den 145

untersuchten Klonen waren 137 lacZ-positiv. Von diesen Klonen wurden die Plasmide

isoliert und in E. coli DH5α Bakterien transformiert. Um nur die pACT-Plasmide und nicht

die pGBK-Plasmide zu isolieren, wurden die Hefen in SD/-Leu Medium und die Bakterien

in LB+Ampicillin Medium kultiviert, wobei jeweils nur Selektionsdruck auf das pACT-

Plasmid einwirkte. Die Inserts der gewonnenen pACT-Plasmide wurden sequenziert und

mit bekannten Sequenzen in den Datenbanken verglichen. Dabei zeigte sich schnell,

dass viele Klone gleiche Inserts besitzen. Um nicht alle Plasmide sequenzieren zu

müssen, wurden mehrfach vorkommende Plasmide aussortiert.

Hierzu wurden Hybridisierungsfilter mit den entsprechenden PCR-Produkten der Insert-

DNA (Primer: act2forw, act2rev) hergestellt und mit radioaktiv markierter Insert-DNA

hybridisiert (EcoRI-XhoI geschnittene PCR-Produkte). Dabei konnten mehrfach

vorkommende identische bzw. überlappende Klone identifiziert werden. Auf den

Autoradiographiefilmen zeigten jedoch oft alle Filterproben Signale. Dies lag

wahrscheinlich daran, dass die Hybridisierungssonden nicht vollständig durch

Restriktionsverdau von den kurzen „linker“-Sequenzen getrennt wurden. Um dieses

Problem zu umgehen, wurden Bakterienkoloniefilter hergestellt und mit EcoRI-XhoI

geschnittenen Plasmidinserts hybridisiert. Die Ergebnisse hierbei waren meist wesentlich

Ergebnisse 60

deutlicher als bei den PCR-Produkt-Filtern. Abbildung 9 zeigt ein typisches

Autoradiogramm mit dem acht identische bzw. überlappende cDNA-Klone gefunden

wurden, die für das BRE-Protein kodieren.

Folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Sequenzierungen:

Klon Insertlänge/

nt

Mehrfach

Isolierung

Y 1 SDR2 1100 3x3 eIF-5a 1100 4x4 FLJ10330 2000 2x5 eEF-2 1100 4x6 unbekannt 8 unbekannt 9 BRE 1100 8x

10 Cytosin-5-Methyl Transferase 700 1x16 unbekannt 700 2x17 PTB 3' UTR 130 5x18 Hsp 70 40021 54TMp 1100 4x23 unbekannt 1100 2x25 unbekannt 110033 unbekannt 80044 snapin 1200 5x50 Splicing factor SC35 1200 3x58 HRS (SPp40) 65059 Calreticulin 1900 3x76 Math4A 3' end 1200 4x78 p311 70097 COX6a 80099 unbekannt 600 3x

100 fascin 500105 unbekannt 900

Abb. 9: Autoradiographie.Koloniehybridisierung mit einer radioaktiv markierten DNA-Probe (EcoRI-XhoI Plasmidinsert Y9: BRE). Die Hybridisierung zeigt sieben weitere Klone mit überlappenden Inserts.

Ergebnisse 61

108 unbekannt 400 7x114 unbekannt 1900117 U2 snRNP 1800118 Topoisomerase 1000119 Ubiquitin konjung. Enzym 110120 h19 hypothetical 3' ORF 850 2x123 unbekannt 500142 unbekannt 1400150 FOG2 1800 1x154 KIAA0250 600155 mitochondriale tRNA 12S 1700157 HMG-I(Y) 3' UTR 600

Tab. 3: Sequenzierungsergebnisse der im GBK-YRPW Yeast Two-Hybrid Screening isolierten Klone.

Die interessantesten Klone wurden weiter analysiert, um mögliche Proteininteraktion

verifizieren zu können. Zuerst wurde jeweils das isolierte pACT-Plasmid in den

Hefestamm Y187 transformiert und ein Matingtest mit AH109-GBK-YRPW durchgeführt.

Erneut musste ein stabiles Wachstum auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten und eine β-

Galaktosidaseaktivität nachweisbar sein. Parallel wurde durch Matingtests mit den

Kontrollplasmiden pGBK, pGBK-p53 und pGBK-LaminC festgestellt, ob es sich um eine

spezifische Interaktion handelt.

Im Folgenden werden einige der untersuchten Klone vorgestellt.

Y32 (BRE):

BRE (brain and reproductive organ expressed gene) wurde bisher nur als humanes Gen

publiziert, dessen zelluläre Expression durch UV-Lichtbestrahlung, Behandlung mit

Retinolsäure oder 4-Nitroquinolin-1-oxid stark reprimiert wird. Das BRE-Protein bindet an

die juxtamembranöse Domäne des TNFα-Rezeptors (Gu et al., 1998).

Hier wurden acht Klone des murinen Homologen gefunden, das bisher noch nicht

publiziert war. Die Interaktion mit den Kontrollplasmiden war negativ, mit pGBK-YRPW

positiv. Daraufhin musste die Hey1-BRE Bindung durch einen biochemischen in vitro

Test bestätigt werden. Im GST-Pulldown Assay konnte die Interaktion allerdings nicht

verifiziert werden, da neben einer schwachen GST-Hey1-YRPW Bande auch eine

schwache Bande bei der Negativ-Kontrollreaktion mit freiem GST zu sehen war (s.

Abb. 10). Daher konnte eine Hey1-Interaktion mit BRE nicht bewiesen werden.

Ergebnisse 62

Abb. 10: GST-Pulldown Assay zur Analyse der BRE-Bindung an den Hey1-C-Terminus. Neben dem natürlichen YRPW-Motiv, wurden auch Proteine mit WRPW, WRPY und ARPA im Hey1-Kontext eingesetzt. Als Negativkontrolle diente freies GST-Protein. 5 µl 35S-ivt-BRE-Protein wurden mit den jeweiligen GST-Proteinen und Glutathion-Sepharose inkubiert. Die an die Sepharose gebundenen GST-Proteine, sowie die an diese gebundenen ivt-Proteine wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und mit Fluorographie nachgewiesen. Es zeigt sich keine spezifische Bindung von BRE an den Hey1-Carboxyterminus bzw. an die verschiedenen xRPx-Motive. Li. Spur: 1 µl 35S-ivt-BRE-Protein (20 % der in der Reaktion einge-setzten Menge).

Y50 (splicing factor SC35)

Es zeigte sich, dass der Klon Y50, der den Splicing Faktor SC35 kodiert, beim Matingtest

mit dem leeren pGBK-Vektor bereits die Reportergene aktivieren kann und somit zu den

typischen falsch-positiven Klonen gerechnet werden muss. Zudem wurde auch im GST-

Pulldown gezeigt, dass SC35 nicht an den Hey1-C-Terminus bindet.

Y150 (FOG2)

FOG2 (friend of GATA) ist ein Protein, das acht Zinkfinger besitzt und die Funktion der

GATA-Transkriptionsfaktoren moduliert. Die Expression in der adulten Maus ist

weitgehend auf Herz, neuronales Gewebe und Gonaden beschränkt, während die

Expression in der Embryonalentwicklung auch in anderen Organen wie Lunge, Niere,

Darm und Urogenitalleiste beobachtet wird (Tevosian et al., 1999).

Die Sequenzanalyse zeigte die FOG2-cDNA, die aber am 5‘-Ende von einer Sequenz

flankiert wurde, welche keiner bekannten Sequenz zugeordnet werden konnte. Entweder

Ergebnisse 63

handelt es sich bei Y150 um ein Plasmid mit zwei Inserts oder die 5‘-Sequenz ist ein

Intron, das nicht gespleißt wurde. Da eine Hey1/FOG2 Bindung sehr interessant wäre,

wurde die eigentliche FOG2-cDNA Sequenz in den pGADT7-Vektor subkloniert, um

sicherzugehen, dass nur das FOG2-Protein translatiert wird. Die Interaktion wurde dann

erneut getestet, wobei jedoch weder im Yeast Two-Hybrid noch im GST-Pulldown eine

Interaktion nachweisbar war.

Y76 (Math4A)

Das bHLH-Protein Math4A ist ein murines atonal-Homolog, das in neuronalen

Vorläuferzellen exprimiert wird und sowohl an das achaete-scute-Homolog Mash1 als

auch an das ubiquitär exprimierte bHLH-Protein E12 bindet. Es steuert, zusammen mit

anderen Proteinen wie dem atonal-Protein in Drosophila, die frühe Entwicklung der

Vorläuferzellen zu neuronalen Zellen (Gradwohl et al., 1996).

Der von Gérald Gradwohl zur Verfügung gestellte Vektor pASV3-Math4A-full lenght

wurde getestet und im Gegensatz zum Klon Y76, der nur für die 19 carboxyterminalen,

prolinreichen Aminosäuren von Math4A kodiert, konnte keine Interaktion im Yeast Two-

Hybrid System und beim GST-Pulldown beobachtet werden. Die unspezifische Bindung

von Y76 könnte auf die Proline zurückzuführen sein, da diese an vielen Protein-Protein

Interaktionen beteiligt sind (Kay et al., 2000).

Zusammenfassung:

Auch mit diesem Yeast Two-Hybrid Assay konnte kein geeigneter neuer

Interaktionspartner gefunden werden, da die meisten der gefundenen Klone entweder

unspezifisch binden oder aber physiologisch nicht relevant erscheinen. Einige der

Sequenzen konnten keiner bekannten Sequenz zugeordnet werden. Jedoch wurde auf

eine sehr aufwendige nähere Untersuchung verzichtet, da es schien, als ob in erster Linie

unspezifische Bindungsproteine isoliert wurden.

Als nächstes wurde das Screening mit einem neuen „bait“-Konstrukt wiederholt, das ein

längeres Hey1-C-terminales Fragment kodiert.

4.2.2.2 Hey1 aa 173-299 (GBK-heyB) Screening

Dieses Screening wurde mit der gleichen Genbank und der gleichen Methode wie der

vorausgegangene Versuch mit GBK-YRPW (Hey1 aa 266-299) durchgeführt. Als „bait“

diente diesmal das GBK-heyB Konstrukt, welches das carboxyterminale Hey1-Fragment

Ergebnisse 64

(aa 173-299) kodiert. Damit sollten weniger unspezifische Interaktionspartner gefunden

werden, als mit dem zuvor eingesetzten kürzen Hey1-Fragment.

Es wuchsen weit über hundert Kolonien auf den Selektionsplatten. Von diesen wurden 70

isoliert, neu ausgestrichen und ihre lacZ-Aktivität bestimmt. Alle Klone wuchsen erneut

und zeigten eine positive lacZ-Reaktion. Die Plasmide wurden isoliert und teilweise

sequenziert und es zeigte sich erneut, dass keine interessanten Kandidaten gefunden

wurden (s. Tab. 4). Folglich wurde die weitere Analyse gestoppt. GST-Pulldown Analysen

von zwei der gefundenen Klone (B28: RNA-Polymerase Modulator 6 und B29: RNA

binding Protein) ergaben ein negatives Ergebnis.

Es musste festgestellt werden, dass das C-terminale Hey1-Fragment schlecht für Yeast

Two-Hybrid Library Screens geeignet ist, da mit ihm eine sehr große Anzahl falsch

positiver Klone isoliert wurde.

Klon B 21 unbekannt

23 BAC clone 24 unbekannt 25 COPII / m SEC66 26 MRS1 27 a1 Kollagen 28 RNA Polymerase modulator 6 29 RNA binding Protein

Tab. 4: Sequenzierungsergebnisse einiger im GBK-heyB Yeast Two-Hybrid Screening isolierten Klone.

4.2.3 Screening mit verschiedenen Hey1-bHLH-Orange-Domänen

Helix-Loop-Helix Domänen bilden in der Regel Dimere, um ihre Funktion als

Transkriptionsregulatoren, z.B. durch DNA-Bindung, zu erfüllen. Mit folgenden Analysen

wurde versucht, Interaktionspartner der Hey1-bHLH zu isolieren.

4.2.3.1 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-bHLHOr, Hey1 aa 50-200)

Das Screening wurde nach der Mating-Methode mit einer murinen embryonalen (E11)

cDNA-Genbank durchgeführt. Als „bait“ diente ein Hey1-bHLH-Orange-Fragment (Hey1

Ergebnisse 65

aa 50-200) und die Hefezellen wurden direkt auf die hochstringenten SD/-Ade/-His/-Leu/-

Trp Agarplatten ausplattiert.

Alle Kolonien wuchsen sehr langsam und erreichten bei Weitem nicht die übliche Größe.

Am neunten Tag nach dem Ausplattieren wurden trotzdem alle Kolonien gepickt und auf

frische SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Agarplatten gestrichen. Insgesamt wurden 130 kleine

Kolonien isoliert, von denen aber nur zehn weiterwuchsen, während die Restlichen

keinerlei Wachstum mehr zeigten. Diese zehn Klone wurden sequenziert und folgende

Tabelle zeigt das Ergebnis:

Klon

HO 22 Brachyury T2 5' UTR 24 hnRNP 3' UTR 31 alpha Tubulin 33 Cytochrom b5 47 unbekannt 49 hnRNP 3'UTR 55 epsilon Globin 70 Histon H3.3A 82 Preprodipeptidyl Peptidase

127 ribosomales Protein S9

Tab. 5: Ergebnis der Klonsequenzierung des GBK-Hey1-HLH-Or Screening.

Es konnte kein relevantes Protein (z.B. ein HLH-Protein) gefunden werden. Über die

Ursache, warum die Hefen so schlecht bzw. überhaupt nicht wuchsen, kann nur

spekuliert werden. Denkbar wäre, dass eine mögliche Hey1-Heterodimerisierung einen

negativen Effekt auf die Hefezellen ausübt.

4.2.3.2 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-heyA, Hey1 aa 38-175)

Da das GBK-bHLHOr-Screening keine weiter verwertbaren Ergebnisse lieferte, wurde

erneut ein Versuch durchgeführt, allerdings mit dem GBK-heyA „bait“ (Hey1-bHLH-

Orange; aa 38-175) und der replica-plate-Methode. Dabei wurden die Hefezellen zuerst

auf SD/-Leu/-Trp Platten, die nur die diploiden Zellen selektionieren, ausgestrichen.

Nachdem die Kolonien gewachsen waren, wurden sie dann auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp

Platten umplattiert. Damit können auch schwächere Protein-Protein Interaktionen

selektioniert werden, da die Hefen ausreichend Zeit haben, die Interaktionsproteine in

ausreichender Menge zu produzieren.

Diesmal wuchsen sehr viele Klone, davon wurden 276 gepickt und frisch ausgestrichen.

Alle Klone wuchsen erneut und zeigten lacZ-Aktivität. Es erschien bereits zu diesem

Ergebnisse 66

Zeitpunkt wahrscheinlich, dass in erster Linie unspezifische Interktionen selektioniert

wurden. Daher wurde nur eine Auswahl dieser Klone sequenziert, unter denen erneut

keine HLH-Proteine zu finden waren (s. Tab. 6).

Um nicht unnötig viel Zeit und Material mit der weiteren Analyse der restlichen Klone zu

verschwenden, wurde das Screening mit einer neuen cDNA-Bank nach der

Cotransformationsmethode wiederholt.

Klon

A 1 FK506 bind. p63 2 RNA bind. Protein CPI 3 Fibrillin 5 CGI-128 6 mitochondriales Genom 8 unbekannt 9 UNC 119

10 UNC 119 11 Fibrillin 12 Heterogenes nukleäres Riboprotein H 13 Hsp 40 15 unbekannt 16 SEC 61B 17 CGI-128 21 CGI-128 23 FK506 bind. p25 32 unbekannt 34 EGF-Rezeptor

Tab. 6: Sequenzierte Klone des GBK-HLH-Or Screenings.

4.2.3.3 Screening einer embryonalen (E17) cDNA-Bank mit GBK-heyA

Nachdem das Screening der embryonalen E11 Bank (Clontech) mit GBK-HLHOr und

GBK-heyA nicht zur Isolierung eines Hey1-Interaktionsproteins führte, wurde eine murine

embryonale E17 cDNA-Bank von Clontech bezogen.

Zunächst wurde der Titer der cDNA-Genbank mit 2x108 cfu/ml bestimmt. Danach wurde

die Bank in E. coli amplifiziert und die Plasmid-DNA isoliert. Zum Screening wurden ca.

1x107 AH109-Hefezellen mit dem GBK-heyA-Vektor und anschließend mit der Plasmid-

DNA der Genbank transformiert. Etwa zwei Drittel der Zellen wurden direkt auf

hochstringenten SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten ausplattiert, der Rest auf SD/-Leu/-Trp

zum anschließenden „replica-plating“ auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten.

Ergebnisse 67

Von den direkt auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp ausplattierten Klonen wuchsen zwei Kolonien

und von den umplattierten Klonen 98. 20 dieser Klone wurden sequenziert (s. Tab. 7).

Wie in dem vorangegangenen Screening konnten wieder nur Proteine entdeckt werden,

die physiologisch höchstwahrscheinlich keine relevante Bindung mit Hey1 eingehen

können.

Insgesamt kann somit festgestellt werden, dass auch für die Hey1-bHLH-Domäne mit

Yeast Two-Hybrid Library-Screening kein geeignetes Interaktionsprotein gefunden

werden konnte.

Klon CA 1 NF-kappaB p65 21 S6 Protein Kinase 3'UTR

7 Laminin-Rezeptor 23 CD81 8 Transposon 24 GPI 9 R kappaB 25 unbekannt

10 unbekannt 26 MEL=RAS related 11 unbekannt 28 MHCII 12 MUP1.5a 40 Serin Protease Inhibitor 1-1 13 G-Protein beta Untereinheit 41 unbekannt 14 Pyruvat Kinase 42 unbekannt 18 Parotis sekretiertes Protein 43 Haptoglobin 19 Serumalbumin

Tab. 7: Ergebnis der GBK-heyA Screening. Die Klone CA1 und CA7 wuchsen direkt auf SD/-SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten. Die Übrigen wuchsen nach Umplattieren von SD/-Leu/-Trp auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp.

4.3 Test der Interaktion von Hey1 mit TLE1

Das carboxyterminale WRPW-Motiv der Hes-Proteine dient als Bindungsstelle des

Groucho/TLE1-Proteins. Daher wurde vermutet, dass das ähnliche Y(R/Q)PW-Motiv von

Hey1 und Hey2 ebenfalls TLE1 rekrutiert.

In GST-Pulldown Assays konnte bereits einmal gezeigt werden, dass das

carboxyterminale Ende von Hey1 nicht mit TLE1 interagiert (B. Klamt, unveröffentlicht).

Wurde das Hey1-Motiv YRPW allerdings durch WRPW ersetzt, konnte TLE1 effizient

gebunden werden. Dagegen konnte durch Austausch mit dem Runt-WRPY-Motiv keine

Bindung an TLE1 beobachtet werden. Diese Experimente wurden zunächst wiederholt

und im Anschluß daran wurde eine mögliche Hey1-TLE1- Bindung im Yeast Two-Hybrid

Assay überprüft.

Ergebnisse 68

Die GST-Pulldown Versuche ergaben, dass TLE1 sehr gut an ein WRPW-Motiv im Hey1-

Kontext bindet, während keine Bindung an ein WRPY- oder ARPA-Motiv erfolgt (s.

Abb. 11). Die Pulldown Assays zeigten eine sehr schwache Bande Hey1-YRPW-TLE1,

die in den Versuchen von Barbara Klamt nicht gesehen wurden.

Abb. 11: GST-Pulldown Analyse der TLE1-Hey1 Interaktion. GST-Hey1-C-Terminus Fusionsproteine (KPYRPWGTEIGAF) bzw. Mutanten mit verändertem YRPW-Motiv (WRPW, WRPY, ARPA) werden mit radioktiv-markiertem ivt-TLE1-Protein und Gluta-thion-Sepharose inkubiert. An GST-Hey1 gebundenes TLE1 wird mit Autoradio-graphie detektiert. Zum Vergleich sind in der linken Spur 20 % der in der Bindereaktion eingesetzten TLE1-Menge aufgetragen. Es zeigt sich eine starke Bindung von TLE1 an das WRPW-Motiv im Hey1-Kontext. Dagegen wird die WRPY sowie die ARPA Sequenz nicht gebunden. Eine sehr schwache TLE1-Bande kann in der GST-YRPW Spur beobachtet werden.

Um eine mögliche Hey1/TLE1-Interaktion weiter zu analysieren, wurde der Yeast Two-

Hybrid Assay eingesetzt.

Dafür wurde zuerst ein TLE1-Fragment (aa 33-553) in den pGADT7-Vektor kloniert.

Anschließend konnte in zahlreichen Versuchen keine Bindung von TLE1 (aa 33-553) an

C-terminale Hey1-Fragmente nachgewiesen werden, weder in Mating- noch in

Cotransformationsassays.

Insgesamt konnte somit gezeigt werden, dass Hey1, im Gegensatz zu den übrigen hairy-

verwandten Proteinen, in vivo nicht an TLE1 binden kann und sich damit weiter von

diesen abgrenzen lässt.

Ergebnisse 69

4.4 Hey-Homo- und Heterodimerisierung mit weiteren bHLH-Proteinen 4.4.1 Hey-Homodimerisierung

Nachdem das Screening von Genbanken nicht zur Isolierung von Hey1-

Interaktionsproteinen führte, wurde nun versucht mit direkten Yeast Two-Hybrid Analysen

Interaktionspartner zu finden. Zunächst wurde getestet, ob Hey1 und Hey2 Homodimere

ausbilden und anschließend wurde überprüft, ob Hey1 mit Hey2 interagieren kann.

GST-Pulldown und Yeast Two-Hybrid Analysen zeigten eindeutig, dass Hey1 und Hey2

Homodimere formen können. Um die entscheidenden Domänen für die

Homodimerisierung zu finden, wurden verschieden lange Hey1-Fragmente kloniert und

ihre Bindungseigenschaften getestet. Die Tests zeigten folgende Ergebnisse:

Die HLH-Domäne ist für die Dimerisation entscheidend (s. Abb. 12). Die Bindung ist nicht

von der basischen Domäne abhängig, da auch die Helix-Loop-Helix Domänen ohne die

basiche Domäne in gleicher Stärke miteinander interagieren. Interessanterweise konnte

beobachtet werden, dass durch die Orange-Domäne die Homodimerisierung deutlich

verstärkt wird. Eine bHLH-Interaktion ohne Orange-Domäne konnte bei Yeast Two-Hybrid

Analysen nur dann beobachtet werden, wenn die Hefen zuerst auf SD/-Leu/-Trp Platten

ausgestrichen wurden und nachfolgend auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp umplattiert wurden.

Wurden jedoch Hey-Proteinfragmente eingesetzt, die neben der bHLH-Domäne auch die

Orange-Domäne besitzen (bHLH-Or), dann konnten die Hefezellen, wenn auch nur

schlecht, direkt auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten wachsen. Quantitative lacZ-

Aktivitätsassays bestätigten ebenfalls, dass die Orange-Domäne die bHLH-Interaktion

deutlich verstärkt (s. Tab. 8). Die Interaktion bHLH/bHLH-Or war genauso schwach wie

die Interaktion bHLH/bHLH. Folglich mussten beide Interaktionspartner die Orange-

Domäne besitzen, um eine starke Bindung auszubilden. Die isolierte Hey1-Orange-

Domäne konnte im Yeast Two-Hybrid Assay nicht an die Hey1-bHLH binden, aber mit

sich selbst interagieren. Ebenso war eine Interaktion der isolierten Hey1-Orange-Domäne

mit Hey1-bHLH-Or, Hey2-bHLH-Or und c-hairy1-bHLH-Or zu beobachten. Dies legt die

Vermutung nahe, dass die Orange-Domänen selbst miteinander interagieren und damit

eine zweite Bindungsdomäne neben der Helix-Loop-Helix ausbilden.

Zusätzlich zur Hey1- und Hey2-Homodimerisierung konnte auch die Hey1/Hey2-

Heterodimerisierung nachgewiesen werden. Auch hier zeigte sich die verstärkende

Wirkung der Orange-Domäne.

Ergebnisse 70

b HLH Orange

schwach

stark

schwach

schwach

schwach

Interaktion

keine

Abb. 12: Hey-Dimerisierung. Schematische Darstellung der bei der Hey1/2 Homo- und Heterodimerisierung beteiligten Domänen und ihre Auswirkung auf die Interaktionsstärke. Die Orange-Domäne dient als Verstärker der HLH-Bindung. Interaktionsstärken wurden anhand von lacZ-Aktivitätstests und dem Wachstum der Hefezellen auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten abgeschätzt.

Die Hey1/2-Homo- und Heterodimerisierungsanalysen zeigten erstmals, dass die Hey-

Orange-Domäne Proteininteraktionen verstärken kann. Diese Funktion war bisher noch

nicht beschrieben worden.

Im Folgenden wurde die Orange-Domäne genauer untersucht. Ein Alignment hairy-

verwandter Proteine verschiedener Spezies zeigt die hohe Konservierung von

Aminosäuren im Bereich der Orange-Domäne und unterstreicht die Bedeutung dieser

Domäne als funktionell wichtigen Proteinbestandteil (s. Abb. 13).

Ergebnisse 71

Eine Strukturanalyse des Hey1-Proteins am PSA Server (http://bmerc-www.bu.edu/psa/)

(Atchley et al., 2000) zeigte, dass die Orange-Domäne strukturell von zwei Helices

geprägt wird, die durch eine nichthelikale Region voneinander getrennt sind (s. Abb. 14).

Der Vergleich mit dem Protein-Alignment verdeutlicht, dass vor allem in den helikalen

Bereichen die größte Homologie zwischen den hairy-verwandten Proteinen besteht.

---------Helix 3---------- ------Helix 4----- Abb. 13: Vergleich der Orange-Domänen verschiedener hairy/E(spl) Proteine. In den helikalen Abschnitten ist eine starke Homologie auch zwischen den verschiedenen Spezies zu erkennen. Das Alignment wurde mit dem ClustalX Programm erstellt. Abk.: r: Ratte, c: Huhn, d: Drosophila, h: Mensch, m: Maus, zf: Zebrafisch.

Abb. 14: Strukturvorhersage von Hey1. Das PSA-Programm berechnet für jede Aminosäure des Hey1-Proteins die Wahrscheinlichkeit (0-1) in einer Helix angeordnet zu sein. Neben dem typischen bHLH-Muster sind auch im Bereich der Orange-Domäne zwei helikalen Strukturen zu erkennen.

Ergebnisse 72

4.4.2 Hey-Protein Interaktion mit c-hairy1

Nachdem mit Yeast Two-Hybrid Assays die Hey1/2-Homo- und Heterodimerisierung

bewiesen worden war, wurde nun mit dem gleichen Test gezielt nach weiteren bHLH-

Interaktionsproteinen gesucht. Erster Kandidat dafür war das hairy1-Protein des Huhns

(c-hairy1), das große Homologie zum murinen Hes1-Protein aufweist.

Entscheidend für diese Auswahl war die Beobachtung von Cornelia Leimeister, dass das

dynamische und oszillierende Expressionsmuster von c-Hey2 während der

Somitogenese in Hühnerembryonen dem von c-hairy1 gleicht (Leimeister et al., 2000a).

Dies führte zur Hypothese, dass beide Proteine miteinander interagieren könnten. Um

dies zu testen, wurden GST-Pulldown Assays und Yeast Two-Hybrid Assays mit murinem

Hey1 bzw. Hey2 und c-hairy1 durchgeführt, da die Hühnchengene c-Hey1 und c-Hey2 zu

diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig kloniert waren. In GST-Pulldown Assays konnten

eindeutig die Interaktionen Hey1/c-hairy1 und Hey2/c-hairy1 gezeigt werden (s. Abb. 15).

Auch im Yeast Two-Hybrid Assay war eine starke Interaktion der Hey1- bzw. Hey2-bHLH-

Orange mit der entsprechenden c-hairy1-Domäne zu beobachten. Dies konnte durch

quantitative lacZ-Aktivitätstests mit ONPG als Substrat bestätigt werden. Hey1- bzw.

Hey2-bHLH ohne Orange-Domäne zeigte eine weitaus schwächere Bindung. Sie war nur

dann zu sehen, wenn die Hefen erst auf SD/-Leu/-Trp wuchsen und dann auf SD/-Ade/-

His/-Leu/-Trp umplattiert wurden. Dies unterstützte erneut die Hypothese, dass die

Orange-Domäne Protein-Protein Interaktionen deutlich verstärkt. Ein weiterer

interessanter Befund ist, dass c-hairy1 starke Homodimere bildet, während Hey1 und

Hey2 nur relativ schwach homodimerisieren (s. Tab. 8). Die Heterodimerisierung Hey/c-

hairy1 ist deutlich stärker ausgeprägt als die Hey-Homodimerisierung, daher scheinen

Hey-Proteine in vivo bevorzugt Heterodimere auszubilden.

Alle Tests wurden sowohl mit der Cotransformations-, als auch mit der Matingmethode

durchgeführt, wobei beide Verfahren übereinstimmende Ergebnisse produzierten.

4.4.3 Hey1/2- und c-hairy1-Protein Interaktionen mit Klasse A E-Proteinen und MyoD

Klasse A E-Proteine sind ubiquitär exprimierte bHLH-Proteine, die sich durch ihre

Fähigkeit auszeichnen, an die E-Box DNA-Sequenz CANNTG zu binden. Die Hes-

Proteine binden an Klasse A E-Proteine, um dann als Transkriptionsrepressoren zu

wirken. (Oellers et al., 1994; Ohsako et al., 1994; Van Doren et al., 1994). MyoD ist ein

Klasse B bHLH-Protein, das zusammen mit myf5, MRF4 und myogenin die Bildung von

Muskelzellen aus undifferenzierten Zellen oder Fibroblasten steuert (Ordahl and Williams,

Ergebnisse 73

1998). Da es Überlappungen der MyoD-Expression mit denen der Hey-Gene während

der Somitogenese gibt, wurde auch MyoD für Interaktionstests herangezogen.

Mit Yeast Two-Hybrid Analysen wurde die Hey1- und Hey2-Interaktion mit E12, E2-2, E2-

5 und MyoD überprüft. Weiterhin wurde die Bindung von c-hairy1 an die zuvor genannten

Proteine getestet.

Dabei wurde festgestellt dass, Hey1, Hey2 und c-hairy1 mit der bHLH-Domäne von

MyoD, E2-2 (Genbank #M30313) und E2-5 (Genbank #M30314) interagieren können.

Eine Dimerisierung mit dem sehr ähnlichen E12-Protein konnte jedoch nicht beobachtet

werden. Alle Interaktionen wurden wie in den vorangegangenen Tests ausführlich

überprüft, um sicherzustellen, dass alle genannten Interaktionen spezifisch sind.

GAL4 AD

GAL4 DBD

Hey1 bHLH

Hey1 bHLH-

Or

Hey1 C-

Terminus

Hey2 bHLH-Or

c-hairy1 bHLH-Or

E12 bHLH

E2-2 bHLH

E2-5 bHLH

T- Antigen

Hey1-bHLH

+ + - + + - + + -

Hey1-bHLH-Or

+ + - + +++ (7,80)

- ++ (0,50)

+ -

Hey1-C-Terminus

- - - - - - - - -

Hey2-bHLH-Or

+ ++ (0,60)

- ++ (0,72)

+++ (8,15)

- ++ (2,75)

+ -

c-hairy1-bHLH-Or

+ +++ (7,22)

- +++ (7,70)

+++ (2,18)

- ++ (0,61)

+ -

p53 - - - - - - - - +++ (58,20)

Tab. 8: Übersicht der Hey1, Hey2 und c-hairy1 Interaktionen in Yeast Two-Hybrid Assays. Die Interaktionsstärke ist definiert als +++ (direktes Wachstum auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten), ++/+ (primäre Selektion auf SD/-Leu/-Trp Platten notwendig, anschließend Wachstum auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten). In Klammern ist die lacZ-Aktivität (in U) bei Flüssigtests mit ONPG als Substrat angegeben. Als Negativkontrollen dienten die Interaktionen mit p53, Hey1-C-Terminus bzw. T-Antigen. Als Positivkontrolle wurde die sehr starke Interaktion p53/T-Antigen herangezogen.

Die HLH-Domäne war jeweils für die Bindung an E2-2, E2-5 und MyoD ausreichend, es

konnte jedoch eine stärkere Interaktion beobachtet werden, wenn HLH-Orange als

Interaktionspartner gewählt wurde. Wie die Orange-Domäne diese Interaktionen verstärkt

ist unklar, da die Bindungspartner selbst keine derartige Domäne besitzen, die mit der

Orange-Domäne direkt interagieren könnte. Möglicherweise stabilisiert daher die Orange-

Domäne das bHLH-Dimer in einer bisher unbekannten Weise.

Ergebnisse 74

Mit GST-Pulldown Assays wurden die oben genannten Interaktionen überprüft und

bestätigt (s. Abb. 15). Allerdings konnten nur mit dem in vivo Verfahren die

unterschiedlichen Bindungsstärken eindeutig detektiert werden.

20 % Input GST-Hey2 GST-c-hairy1

c-ha

iry1

m-H

ey2

E2-5

m-H

ey1

c-ha

iry1

m-H

ey2

E2-5

m-H

ey1

c-ha

iry1

m-H

ey2

E2-5

m-H

ey1

Abb. 15: GST-Pulldown Assay zum Nachweis der Interaktionen von Hey1, Hey2, c-hairy1 und E2-5. c-hairy1, mHey1, mHey2 und E2-5 wurden in vitro translatiert und mit 35S markiert. GST-hHey2 bzw. GST-c-hairy1 wurden mit den ivt-Proteinen und Glutathion-Sepharose inkubiert. An GST-Proteine gebundene ivt-Proteine wurden aufgereinigt, aufgetrennt und mit Fluorographie nachgewiesen. 20 % der in der Bindungsreaktion eingesetzten ivt-Protein Menge wurde zur Kontrolle aufgetragen (links). Als Negativkontrolle diente freies GST-Protein, woran keine Bindung erfolgte (nicht gezeigt).

4.5 DNA-Bindung von Hey1/2, c-hairy1 und E-Proteinen

Viele bHLH-Proteine können als Dimere spezifische DNA-Sequenzen binden. hairy

bindet bevorzugt an N-Box-Sequenzen (CACGCG), während die optimale Bindungsstelle

Ergebnisse 75

für Enhancer-of-split-Proteine eine E-Box (CACGTG) darstellt, wobei flankierende

Nukleotide die Bindungsstärke beeinflussen. Für E(spl) wurde folgende Sequenz als

optimale Bindungsstelle postuliert: TGG CACGTG CCA (Jennings et al., 1999). Binding

site selection Analysen ergaben, dass Hey1 die gleiche Sequenz optimal bindet (Fischer

et al., 2002). Mit Electrophoric Mobility Shift Assays (EMSA) wurde nun versucht, das

Resultat der Bindungsselektion für Hey1 zu bestätigen, als auch die Bindung weiterer

bHLH-Proteine an diese DNA-Sequenz zu überprüfen. Weiterhin wurde getestet, wie sich

verschiedene Hey-Heterodimere bei der DNA-Bindung verhalten.

Als Zielsequenz wurde folgendes Oligonukleotid (E-Hey) gewählt, das zentral die E-Box

Sequenz CACGTG enthält:

AGCTTGATA TGG CACGTG CCA GTCTGGATCE-Box

Die EMSA-Versuche belegten eindeutig, dass Hey1 und Hey2 (bHLH-Orange) diese

Sequenz spezifisch binden. Durch Zugabe von nicht-radioaktivem Oligo wurde das Signal

dosisabhängig geschwächt, was die Spezifität der Bindung beweist. Die verwandte MCK-

Enhancer Sequenz CACCTG konnte die Bindung überraschenderweise nicht

kompetieren (s. Abb. 17). Dies zeigt, dass Hey-Transkriptionsfaktoren ganz spezifisch nur

eine Subgruppe von E-Box Elementen binden. Auch poly dI-dC konnte die Bindung

kompetieren, jedoch nicht so stark wie nicht-markierter Oligo. Es wurden sowohl in vitro

translatierte als auch GST- bzw. MBP-Hey-Fusionsproteine eingesetzt. Die

Fusionsproteine wurden zuvor wie in 3.9.3 beschrieben aufgereinigt und analysiert (s.

Abb. 16). Alle diese Proteine konnten die DNA-Sequenz in gleicher Stärke binden.

Abb. 16: Proteinaufreinigung von MBP-E2-2.MBP-E2-2 wurde in E. coli BL21 exprimiert. Nach der Zellernte wurde das Bakterienlysat mit Amylose-Resin versetzt und ungebundene Proteine abgewaschen. Gebundenes MBP-Protein wurde durch Zugabe von Maltose eluiert und fraktioniert aufgefangen. Aliquots der Fraktionen 1-5 wurden mit SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die Coomassie-Färbung zeigt eine saubere MBP-E2-2 Proteinbande. Zur Konzentrationsabschätzung wurden definierte Mengen BSA eingesetzt (links). PM: Größenstandard

Ergebnisse 76

Abb. 17: DNA-Bindung von Hey1 und Hey2. Links: Radioaktiv (32P) markierte Oligo-DNA, welche die Hey-Zielsequenz CACGTG (E-Hey) enthält, wurde mit MBP-Hey2-Protein versetzt. Die anschließende native Gelelektrophorese zeigt, dass die DNA in einem hochmolekularem Komplex läuft, da sie an das Protein gebunden ist. Ungebundene DNA, die im Überschuss zugesetzt wurde, läuft bis in das untere Drittel des Gels. Die Kompetierung der Bindung ist in den Spuren 2-4 gezeigt. 1: kein Kompetitor; 2: +100 ng ssDNS; 3: +100 ng poly dIdC; 4: +100 ng kalte Oligo-DNA; 0: kein Hey2-Protein zugegeben als Negativkontrolle. Rechts: GST-Hey1 bzw. GST-Hey2 binden die optimale Hey-Zielsequenz (linke Spur). 50-facher Überschuss nicht-markierter E-Hey Oligo-DNA kompetiert diese Bindung, während ein 50-facher Überschuss der verwandten MCK-Enhancer E-Box Sequenz CACCTG keine Kompetition zeigt.

Im nächsten Schritt wurde die Bindung der inzwischen bekannten Hey-

Interaktionspartner c-hairy1, E2-2 und E2-5 an die Hey-Zielsequenz überprüft. Die

genannten Proteine konnten als Homodimere ebenfalls an diese Zielsequenz binden.

Um nun die Bindungseigenschaften verschiedener Hey-Heterodimere testen zu können,

wurden Kombinationen zwischen den ivt-Proteinen und den GST- bzw. MBP-

Fusionsproteinen eingesetzt. Der deutliche Größenunterschied der Fusionsproteine im

Vergleich zu den ivt-Proteinen ermöglichte es, die Signale nach der Elektrophorese dem

jeweiligen Protein eindeutig zuzuordnen.

Ergebnisse 77

Dabei konnten alle diese Proteine die Hey-Zielsequenz als Homodimer binden, allerdings

war niemals die Bildung eines Heterodimers beobachtet worden. Dabei hätte man eine

Bande zwischen den beiden Banden der jeweiligen ivt- und MBP/GST-Homodimere

sehen müssen. Weitere Kontrollexperimente zeigten, dass auch keine Dimere zwischen

einem ivt-Protein und dem gleichen MBP- oder GST-Fusionsprotein ausgebildet werden,

z.B. ivt-Hey2/MPB-Hey2 (s. Abb. 18). Anscheinend ist die Ausbildung eines solchen

Heterodimers unter diesen Versuchsbedingungen nicht möglich. Abschließend kann

festgehalten werden, dass Hey1/2, c-hairy1, E2-2 und E2-5 spezifisch an die E-Box DNA-

Sequenz CAC GTG binden können und damit wahrscheinlich die Transkription

bestimmter Gene in vivo steuern.

Abb. 18: EMSA zur Analyse der DNA-Bindung von Hey, c-hairy1 und E2-2 an die Hey-Zielsequenz. Bei allen Versuchen wurde die Kompetition der Protein/DNA-Bindung durch Zugabe von 100 ng ssDNA (Spur 2), 100 ng poly dIdC (Spur 3) bzw. 100 ng kaltes E-Hey Oligonukleotid (Spur 4) getestet. Alle Interaktionen waren durch Zugabe nicht-radioaktiver E-Hey DNA (Spur 4) deutlich kompetierbar. In Spur 0 wurde jeweils kein Protein eingesetzt. Abk.: H1: Hey1; H2: Hey2; cH: c-hairy1. Links: MBP-Hey2 und ivt-c-hairy1 wurden mit Hey-tar DNA inkubiert. Beide Proteine binden als Homodimer an die DNA. Ein Hey2/c-hairy1-Heterodimer kann nicht beobachtet werden. Mitte: Test der Dimerisierung zwischen ivt-Hey2 und MBP-Hey2. Beide binden als Homodimer an Hey-tar, nicht jedoch als Heterodimer. Rechts: MBP-E2-2 und ivt-Hey1 binden an die Zielsequenz. Auch hier sind keine Heterodimere zu beobachten.

Ergebnisse 78

4.6 Genexpressions- und Funktionsanlysen an Hey2-Knockoutmäusen Im folgenden Teil dieser Arbeit werden die Ergebnisse der Untersuchungen an Hey2-

Knockoutmäusen beschrieben. Bei diesen Mäusen wurden entscheidende Abschnitte

des Hey2-Gen (Exons 2 mit 3 und Intron 3) durch das lacZ-Gen ersetzt (s. Abb. 19).

Homozygote Mäuse, die kein funktionelles Hey2-Gen mehr besitzen, sterben meist in

den ersten Tagen nach der Geburt (ca. 80 % der Homozygoten), während heterozygote

Tiere normal erscheinen und fertil sind (Gessler et al., 2002). Es stellte sich zunächst die

Frage, an welchen Defekten die homozygoten Mäuse sterben.

1 5432

54lacZ pA

Hey2-Gen

ersetzt durch lacZ1 lacZ

Abb. 19: Genomische Struktur des Knockoutallels. Oben: Genomische Struktur des Hey2-Gen mit fünf Exons und Promoterregion (Pfeil). Unten: Genomische Struktur des Knockout-Allels. Hier wurden die Exons 2 und 3 durch das

lacZ-Gen mit Stopcodon und poly-Adenylierungssequenz ersetzt.

4.6.1 Obduktion von Hey2-Knockoutmäusen

Hey2-Knockoutmäuse wurden in den Stadien P1-P7 (Tag 1-7 postnatal) obduziert und

mit heterozygoten und Wildtypmäusen des gleichen Wurfs verglichen. Dabei zeigte sich,

dass die homozygoten Mäuse zumeist kleiner und leichter waren als die entsprechenden

Kontrolltiere. Die Obduktionen ergaben einen sehr interessanten Befund. Alle

homozygoten Hey2-Knockoutmäuse besaßen ein stark vergrößertes und deformiertes

Herz. Abb. 20 zeigt den thorakalen Situs von Knockout- und Wildtypmäusen im Stadium

P3.

Die Untersuchung der präparierten Herzen und Gewebeschnitte zeigten einen massiv

vergrößerten linken Ventrikel (s. Abb. 21). Der rechte Ventrikel war bei den meisten

Tieren ebenfalls vergrößert. Die Hypertrophie führt höchstwahrscheinlich zu einer

terminalen Herzinsuffizienz, was die Hauptursache der frühen Letalität darstellen dürfte

(s.a. Diskussion). Überraschenderweise tritt diese Herzdeformierung erst kurz nach der

Geburt auf. Die Herzen der Embryonen sind makroskopisch nicht auffällig verändert. Dies

impliziert, dass die postnatale Kreislaufumstellungen (Belüftung der Lunge, Verschluss

des Ductus Botalli und des Foramen ovale) zu einer akuten Dekompensation des

insuffizienten Myokards führt. Bemerkenswert ist, dass diejenigen Mäuse, die diese

Ergebnisse 79

kritische Periode überleben, keine weiteren Symptome mehr aufweisen. Sie erreichen

zeitverzögert normale Körpergröße und Gewicht. Auch das Herzgewicht-Körpergewicht

Verhältnis normalisiert sich, wobei das Herz seine charakteristische, deformierte Form

allerdings beibehält.

Weitere histologische Untersuchungen wurden daraufhin von Pathologen in Würzburg

und Erlangen vorgenommen, auf deren Resultate in der Diskussion eingegangen wird.

Die übrigen Organe erschienen makroskopisch unauffällig und wurden zunächst nicht

eingehender untersucht, da der kardiale Phänotyp im Vordergrund stand. Die

heterozygoten Tiere erschienen normal und zeigten keinen auffälligen Unterschied zu

Wildtypmäusen.

Abb. 20: Thoraxsitus im Stadium P3. Die vordere Thoraxwand sowie Teile des Thymus wurden ent-fernt. Oben: Wildtyp. Normaler Situs Unten: Hey2-/--Maus. Das Herz ist biventrikulär massiv vergrößert, während die Vorhöfe unauffällig erscheinen. Die Herz-kranzgefäße verlaufen wie die großen Arterien normal. Die Lungen sind nach dorsal ver-drängt.

Ergebnisse 80

WTKO

4.6.2 lacZ-Expression in Herz und Gefäßen von Hey2-Knockoutmäusen

Abb. 21: Detailansicht Herz postnatal. Rechts: Wildtyp. Links: Hey2-Knockout. Deutlich zu erkennen ist die Herzhypertrophie bei erhaltenem Lumen. Hier wurde eine Hybridisierung mit ANF (atrialer natriuretischer Faktor) vorgenommen. ANF ist deutlich überexprimiert in Hey2-/- Herzen (Nina Schumacher).

Die Expression des lacZ-Gen in Herz und Blutgefäßen wurde an hetero- und

homozygoten Hey2-Knockoutmäusen untersucht, bei denen Abschnitte von Hey2 durch

das lacZ-Gen ersetzt worden waren (s. Abb. 22-24). Da die flankierenden Regionen

erhalten blieben, sollte die lacZ-Expression der von Hey2 entsprechen. Die

Genexpression kann mit Hilfe einer lacZ-Färbung mit dem Farbstoff BM-Purple

(Boehringer) durch Blaufärbung nachgewiesen werden. Im Stadium P5 war folgende

lacZ-Expression zu beobachten:

Epi-, Endo- und Myokard zeigen keine lacZ-Expression, lediglich die Koronargefäße

waren blau gefärbt, während Aorten- und Pulmonalklappen unregelmäßig gefärbt waren.

Alle großen Arterien (Aorta, A. brachiocephalica, A. carotis, A. subclavia, Truncus

pulmonalis, Aa. pulmonales) sowie deren Äste zeigten eine starke lacZ-Expression v.a. in

Endothel und Media (s. Abb. 24). Die Residualstruktur des Ductus arteriosus Botalli, das

Lig. arteriosum, exprimierte ebenfalls lacZ. Diese Ergebnisse der Gefäßuntersuchungen

stehen in Einklang mit den bereits publizierten embryonalen Hey2-Expressionsmustern

(Leimeister et al., 1999b). Überraschenderweise war aber bei den postnatal untersuchten

Mäusen keine lacZ-Expression in den Ventrikeln nachzuweisen, während Embryonen im

Stadium E17.5 Hey2 noch in den Ventrikeln exprimieren. Es zeigte sich, dass die Hey2-

Expression im Ventrikel perinatal beendet wird. Die gleiche Beobachtung wurde später

von M. Chin auch an Ratten gemacht (Chin et al., 2000).

Ergebnisse 81

Abb. 22: lacZ-Expression in Herz, großen Gefäßen und Lungenhilus. Herz und herznahe Arterien einer adulten heterozygoten Hey2-Maus wurden unter dem Mikroskop präpariert, eine Stunde fixiert und über Nacht mit lacZ-Färbelösung versetzt. Alle Arterien exprimieren lacZ und sind daher blau gefärbt. Das Myokard zeigt keine Färbung, während die Herzkranz-gefäße lacZ exprimieren.

Abb. 23: lacZ-Färbung eines Hey2+/--Mausembryo (E11.5). Deutliche lacZ-Expression in Ventrikeln(V), der dorsalen Aorta (Ao), den Spinalganglien (SG), der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (MHG), dem Ohrvesikel (OV), den Kiemenbögen sowie den Extremitäten (Ex). Das lacZ-Expressionsmuster stimmt mit der Hey2-Expression im Wildtyp überein. Ex OV MHG

Ao V SG

Abb. 24: Paraffinschnitt eines lacZ-gefärbten Herz und Gefäß Präparats. Im Stadium P5 sind Aorta (Ao) und A. pulmonalis (PA) blaugefärbt. Pulmonal- (PuK) und Aortenklappe (AK)zeigen ein unregelmäßiges Expressions-muster, während das Myokard postnatal kein lacZ bzw. Hey2 mehr exprimiert. Epikardial ist eine Koronararterie (Ko)angeschnitten. LV, RV: linker, rechter Ventrikel.

Ao

PA

PuK

AK

RV Ko LV

Ergebnisse 82

4.6.3 Arteriographie von Hey2-Knockoutmäusen Wie bereits erwähnt, entwickeln die Hey2-Knockoutmäuse einen massiv vergrößerten

linken Ventrikel. Eine mögliche Ursache für die Hypertrophie könnte eine Stenose der

linksventrikulären Ausstrombahn oder eine Aortenstenose sein. Diese Vermutung wurde

durch eine Publikation der Arbeitsgruppe von Mark Fishman bekräftigt, die zeigten, dass

eine Mutation des Hey2-Gen im Zebrafisch (gridlock) zu einer Aortenstenose führt (Zhong

et al., 2000).

Daraufhin wurden in Zusammenarbeit mit Armin Helisch am Max Planck Institut für

Physiologische und Klinische Forschung in Bad Nauheim Arteriographien durchgeführt,

um eine mögliche Arterienstenose bei Hey2-Knockoutmäusen aufzudecken. Es wurden

sowohl neugeborene (P3) als auch adulte Mäuse (WT, +/-, -/-) untersucht. Die

Knockoutmäuse fielen sofort durch ihr vergrößertes und deformiertes Herz auf. Nach

Punktion des linken Ventrikels und Eröffnung des rechten Vofhofs wurde das Blut

vollständig mit Fixierlösung aus dem Gefäßsystem gespült. Anschließend konnte

Kontrastmittel in das arterielle System injiziert werden. Die Arteriographie zeigte ein

regelrechtes Arteriensystem in allen untersuchten Tieren. Aplasien, Kaliber-

schwankungen, Stenosen oder Kollateralkreisläufe wie in der gridlock-Mutante konnten

nicht entdeckt werden (s. Abb. 25).

Daher kann die Herzhypertrophie nicht durch eine Aortenstenose verursacht werden,

sondern durch eine postnatal schlagartig einsetzende Kardiomyopathie. Die

Beobachtung der überlebenden Knockoutmäuse hat gezeigt, dass die Kardiomyopathie

überraschenderweise nicht progredient verläuft, sondern vielmehr nach der kritischen

Phase peri- und postnatal sistiert. Die Mäuse entwickeln sich schließlich verzögert zu

normal erscheinenden adulten Tieren. Da die Hypertrophie nicht zunimmt, gleicht sich

auch der Herzgewicht/Körpergewicht-Quotient wieder den Normalwerten an. Allerdings

bleibt das Herz der Nullmutanten lebenslang verformt.

Ergebnisse 83

Abb. 25: Angiographie einer vier Wochen alten Hey2-Knockoutmaus. Kontrastmittel wurde in den linken Ventrikel injiziert und damit in den systemischen Kreislauf gepumpt. a) Das Röntgenbild zeigt die

Arterienperfusion im gesamten Körper.

b) Vergrößerter Ausschnitt: Herz, Aortenbogen mit abgehenden Ästen, thorakale Aorta und Interkostal-arterien. Der Gefäßverlauf ist regelrecht und es lassen sich keine Stenosen, Kaliberschwankungen oder Kollateralkreisläufe erkennen. Das Herz ist deutlich verformt.

4.6.4 Elektrokardiogramm (EKG)

Die hohe Letalität der Hey2-Knockouttiere in den ersten Tagen nach der Geburt könnte

auch durch Defekte im Reizleitungssystem des Herzen bedingt sein.

Um dies aufzuklären wurden 3-Kanal-Elektrokardiogramme an anästhesierten Wildtyp-,

Hey2+/-- oder Hey2-/--Mäusen in den Stadien P1-P5 abgeleitet. Die Tiere wurden mit Hilfe

einer Inhalationsnarkose sediert und analgesiert bevor die EKG-Elektroden angebracht

werden konnten. Es zeigten sich keine Unterschiede in Bezug auf Herzfrequenz (390-

510/min), Erregungsentstehung und –ausbreitung zwischen den verschiedenen

Genotypen (s. Abb.26). Weitere Differenzierungen wie Lagetyp oder Hypertrophiezeichen

können mit dieser Technik nicht erfasst werden. Da immer nur einige Minuten lang das

EKG abgeleitet wurde, kann natürlich nicht ausgeschlossen werden, dass die

Knockoutmäuse dennoch paroxysmale Störungen aufweisen. Dies wäre nur durch

kontinuierliche EKG-Überwachung nachweisbar. Allerdings fehlten dafür die benötigten

Geräte.

Diese Versuche wurden in Kooperation mit Prof. Dr. Lutz Hein am Institut für

Pharmakologie, Universität Würzburg, durchgeführt.

Ergebnisse 84

Abb. 26: EKG-Analyse. Vergleich von EKG- Aufzeichnungen anästhesierter (2,2 % Isofluran/O2) Wildtypmäuse mit Hey2-Hetero- und Homozygoten des gleichen Wurfs. Schreibgeschwindigkeit: 25 mm/sec. Die Herzfrequenz der verglichenen Mäuse ist ähnlich. Es lässt sich keine auffällige Rhythmusstörung feststellen.

Ergebnisse 85

4.6.5 Expression von Hey1 und HeyL in Hey2-Knockout Embryonen

Das Hey2-Gen wird in zahlreichen Geweben exprimiert. Eine homozygote Deletion führt

jedoch nur zu einem ausgeprägten kardialen Phänotyp während die übrigen Organe,

nach aktuellem Wissensstand, normal erscheinen. Möglicherweise kann die ausgefallene

Hey2-Funktion von den nahe verwandten Hey1- und HeyL-Genen teilweise kompensiert

werden. Zudem wäre ebenfalls denkbar, dass Hey1 bzw. HeyL in manchen Geweben der

Hey2-Knockoutmäuse ektop exprimiert werden.

Um eine ektope Expression auszuschließen, wurde die Expression von Hey1 und HeyL

in Hey2+/-- und Hey2-/--Embryonen durch RNA in situ Hybridisierungen mit der in

Wildtypembryonen verglichen (s. Abb. 27,28). Dabei wird die entsprechende zelluläre

mRNA durch eine Digoxygenin-UTP markierte antisense RNA-Sonde spezifisch

gebunden. Die gebundene RNA-Sonde wird immunhistochemisch mit einem

Digoxygenin-Antikörper nachgewiesen.

Die whole mount RNA in situ Hybridisierungen in den embryonalen Stadien E9.5, E10.5

und E11.5 zeigten die gleichen Expressionsmuster sowohl von Hey1, als auch von HeyL

in Wildtyp-, Hey2+/- und Hey2-/- Embryonen. Das suggeriert, dass die Hey2-Funktion

zumindest in den Geweben, in denen die Hey-Gene nicht coexprimiert werden, wie z.B.

den Herzventrikeln, nicht kompensiert wird. Genauere Analysen an Paraffinschnitten

ergaben das gleiche Ergebnis.

In Zellen, in denen die Hey2 mit Hey1 oder HeyL coexprimiert werden, könnte natürlich

die Hey2-Funktion von den anderen Hey-Genen übernommen werden. Dies lässt sich

durch in situ Hybridisierungen nicht klären, hier werden Studien an Hey1/Hey2- und

HeyL/Hey2-Knockoutmäusen Aufschluss ergeben.

Ergebnisse 86

ST KS

OV

NG

Ex Mes At

Tel

SN

Abb. 27: Hey1-RNA in situ Hybridisierung von WT und Hey2-KO Embryonen. Das Hey1-Expressionsmuster der Hey2-/--Embryonen (rechts) unterscheidet sich nicht vom Wildtyp (links) in den Stadien E9.5, 10.5 und 11.5. Hey1 wird in Herzvorhof (At), Septum transversum (ST), Somiten, Arterien (nicht gezeigt), Ohrvesikel (OV), Kiemenspalten (KS), Extremitätenknospen (Ex), Spinalnerven (SN), Telencephalon (Tel), Mesencephalon (Mes) und Nasengruben (NG) exprimiert.

Ergebnisse 87

So

KB

TG

Tel

SG

Abb. 28: HeyL-RNA in situ Hybridisierung von WT und Hey2-KO Embryonen. Expressionsmuster von HeyL in Hey2-Knockoutembryonen (E9.5, 10.5 und 11.5) (rechts) im Vergleich zum Wildtyp (links). HeyL-Expression wird in folgenden Geweben beobachtet: Telencephalon (Tel), Trigeminalganglion (TG), Spinalganglien (SG), Kiemenbögen (KB), Arterien (nicht gezeigt) und Somiten (So).

Diskussion 88

5 Diskussion

Der Notch-Signalweg ist ein entscheidender Regulator der embryonalen und adulten

Zelldifferenzierung, wobei seine einzelnen Komponenten unterschiedliche Funktionen in

verschiedenen Geweben besitzen. Die kürzlich identifizierten Hey-Gene stellen eine neue

Gruppe von Notch-regulierten Transkriptionsfaktoren dar. Ihre biochemische

Charakterisierung sowie die Analyse von Hey-Knockoutmäusen werden im Folgenden

diskutiert.

Screening von Proteinexpressionsfiltern

Bei der Suche nach Interaktionsproteinen des Hey1-Carboxyterminus wurde zunächst

eine neue Screening-Technik eingesetzt. Es wurden Proteinexpressionsfilter mit Hey1-

Peptiden inkubiert, die mit Biotin bzw. alkalischer Phosphatase (AP) markiert waren. Das

AP-gekoppelte Peptid wurde aus HEK-293T-Zellen gewonnen, während das Biotin-

markierte Peptid in vitro synthetisiert (Prof. Dr. Dieter Palm, Würzburg) und anschließend

mit Streptavidin-AP gekoppelt wurde. An die Filterproteine gebundene Peptide konnten

daher mit einer von alkalischer Phosphatase katalysierter Farbreaktion nachgewiesen

werden.

Das Screening ergab eindeutige Signale, da alle Klone in einem bestimmten Muster

zweifach auf die Membran gespottet waren und die beobachteten Signale diesem Muster

entsprachen. Manche Klone konnten mehrfach isoliert werden. Die Analyse der

gefundenen Proteine erbrachte jedoch nicht das erwünschte Ergebnis, da keine

physiologisch relevanten Interaktionspartner entdeckt werden konnten. Eines der

isolierten Proteine (CREB2) wurde mit GST-Pulldown Assays auf eine Interaktion mit

Hey1 überprüft, dabei zeigte sich jedoch keine Bindung.

Obwohl die Ergebnisse reproduzierbar waren, kann nicht abschließend beurteilt werden,

ob dieses Screeningverfahren eine Alternative zu den üblichen Proteininteraktion-

Detektionsverfahren darstellt. Zur weiteren Evaluation müsste zunächst mit einem

Protein, dessen Interaktionspartner bekannt sind, ein solcher Filter gescreent werden und

das Ergebnis mit den Literaturdaten verglichen werden.

Ein Nachteil des Filters besteht sicher darin, dass die menschlichen Proteine in Bakterien

translatiert werden. Dabei ergeben sich zahlreiche Probleme. Nicht jede humane mRNA

kann in Bakterien translatiert werden und daher können manche Interaktionen gar nicht

erst detektiert werden. Die synthetisierten Proteine können nicht posttranslational

prozessiert werden, wie dies in Eukaryonten üblich ist. Weiterhin kann sowohl bei der

Diskussion 89

harschen Lyse der Bakterien mit 0,5 M NaOH, als auch bei der Fixation an die Membran

die Proteinkonformation gestört werden. Zu beachten ist auch, dass das Peptid nicht

richtig gefaltet sein kann. Falsch gefaltete Proteine können oft nicht mehr an die

eigentlichen Interaktionsproteine binden, während sie u.U. unspezifisch mit anderen

Proteinen interagieren. Zudem kann eine mögliche Interaktion auch durch die gekoppelte

alkalische Phosphatase beeinträchtigt werden.

Nachdem mit diesem Verfahren keine neuen Hey1-Interaktionspartner gefunden worden

waren und eine weitere Analyse und Optimierung zu aufwendig erschien, wurde das

etablierte Yeast Two-Hybrid Verfahren eingesetzt.

Yeast Two-Hybrid Screening

Der Yeast Two-Hybrid Assay ist inzwischen ein Standardverfahren zum Auffinden neuer

Proteininteraktionen aus cDNA-Banken und hat bereits zur Entdeckung vieler hundert

neuer Interaktionen geführt. In immer größer werdenden Screening-Verfahren wird

versucht, das Proteom niedriger Organismen auf sämtliche Interaktionen hin zu

untersuchen (von Mering et al., 2002). Die Methode hat allerdings einen großen Nachteil,

denn sie führt immer wieder zur Isolierung falsch-positiver Klone. Die Gründe dafür sind

zahlreich, jedoch können nicht alle Fälle befriedigend erklärt werden. So kommt es dazu,

dass sich manche Proteine hervorragend für dieses Verfahren eignen, während andere,

sog. „self activators“, die direkt die Reportergene aktivieren, völlig ungeeignet sind. Es ist

z.Z. nicht voraussagbar, ob ein Protein geeignet ist oder nicht (Vidal and Legrain, 1999).

Das Yeast Two-Hybrid Verfahren wurde im Verlauf der Arbeit zunächst für Hey1 und

Hey2 etabliert. Dazu wurden verschiedene Domänen von Hey1 und Hey2 in die

entsprechenden „bait“- und „prey“-Vektoren kloniert und Hefezellen damit transformiert.

Alle transformierten Hefezellen wurden auf ihre Wachstumsfähigkeit auf entsprechenden

Selektionsmedien getestet, um mögliche „self activators“, die zu vielen falsch-positiven

Ergebnissen führen würden, zu erkennen. Lediglich das Konstrukt GBK-YRPW (Hey1, aa

266-299) konnte die Reportergene schwach aktivieren. Alle anderen Konstrukte

verhielten sich erwartungsgemäß. Im nächsten Schritt wurden Cotransformationsassys

mit Kontrollplasmiden (pGAD-T7, pGAD-T-Ag, pGBK-T7, pGBK-p53, pGBK-Lam)

durchgeführt, wobei sich außer bei dem bereits erwähnten Konstrukt GBK-YRPW keine

Auffälligkeiten ergaben. Schließlich konnte gezeigt werden, dass alle klonierten

Genfragmente auch in Hefezellen translatiert werden. Nachdem diese Tests

abgeschlossen waren, konnte mit dem eigentlichen Screening begonnen werden.

Diskussion 90

Suche nach Interaktionsproteinen der Hey1-bHLH Domäne Es wurden drei Screening-Ansätze durchgeführt, um interagierende Proteine der Hey1-

bHLH Domäne aus embryonalen Genbanken zu isolieren. Als „bait“ dienten dabei Hey1-

bHLH-Orange Fragmente, da vermutet wurde, dass auch die Orange-Domäne Einfluss

auf die Bindung haben könnte.

Im ersten Versuch wurde eine murine embryonale (E11) cDNA-Bank für das Screening

verwendet und die transformierten Zellen direkt auf hochstringente Selektionsplatten

ausgestrichen. Dabei wurden nur zehn Klone isoliert, die auffallend langsam und nicht zu

der gewohnten Koloniegröße heranwuchsen. Deren weitere Analyse ergab, dass keiner

ein relevantes Hey-Interaktionsprotein darstellt. Möglicherweise waren die Hey-

Interaktionen nicht stark genug, dass die Hefezellen direkt auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp

Platten überleben konnten. Daher wurden in den nächsten Versuchen die Zellen erst auf

SD/-Leu/-Trp Platten, die nur Zellen selektieren, die sowohl „bait“- als auch „prey“-

Plasmide besitzen, ausplattiert. Danach wurden die Kolonien auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp

Platten transferiert, auf denen lediglich die Zellen, mit interagierenden „bait-prey“

Proteinen wachsen können. Wie die Ergebnisse der direkten Interaktionsanalysen später

zeigten, war dieses Vorgehen richtig, denn nur so können die Bindungen an Hey1, Hey2,

E2-2 und E2-5 detektiert werden. Lediglich die Interaktion mit Hes1 (c-hairy1) wäre direkt

auf hochstringenten Platten nachweisbar gewesen. Allerdings war dabei zu beobachten,

dass mehrere hundert Klone wuchsen, die zum größten Teil auch das Reportergen lacZ

transkribierten. Im dritten Versuch wurde schließlich eine neue cDNA-Genbank (Maus

E17) und das Cotransformationsverfahren statt des Matingverfahrens gewählt. Es

wuchsen jedoch erneut mehrere hundert Klone, von denen stichprobenhaft einige

Dutzend sequenziert wurden. Es waren v.a. physiologisch irrelevante Proteine isoliert

worden und keines konnte alle Interaktionstests, einschließlich GST-Pulldown, erfolgreich

bestehen, so dass auch diese schließlich verworfen wurden. Es ist denkbar, dass unter

der großen Anzahl der isolierten Klone tatsächlich die richtig-positiven, wie Hey1, Hey2,

E2-2, E2-5, ARNT oder e/dHAND dabei waren, jedoch war die Sequenzierung und

Verifizierung aller zu aufwendig und kostspielig.

Wesentlich erfolgreicher waren dagegen die gezielten direkten Yeast Two-Hybrid

Interaktionstests. Zunächst wurden die Homodimerisierungen von Hey1 und Hey2 sowie

die Hey1/Hey2-Heterodimerisierung getestet. Dabei zeigte sich, dass beide Proteine

bHLH-Homodimere ausbilden können. Die basische DNA-bindende Domäne hatte dabei

keinen Einfluss auf die Stärke der Proteinbindung. Interessanterweise sind diese

Diskussion 91

Interaktionen deutlich stärker, wenn beide Bindungspartner die Orange-Domäne

besitzen. Dieses Verhalten wurde auch bei den im Folgenden diskutierten Hey-

Interaktionen mit c-hairy1 und in geringerem Maße mit E2-2, E2-5 und MyoD beobachtet.

Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Orange-Domäne Protein-Protein

Interaktionen verstärken kann. Zuvor war lediglich bekannt, dass die Orange Domäne

Einfluss auf die Spezifität verschiedener bHLH-Orange Proteine ausübt und dass durch

sie die Repressorfunktion des ARNT2/Hey1-Dimers als auch die von Hes1 entscheidend

mitbestimmt werden (Castella et al., 2000; Chin et al., 2000; Dawson et al., 1995).

Weiterhin wurde die Interaktion mit den E-Proteinen E12, E2-2 und E2-5 sowie mit dem

muskelspezifischen bHLH-Protein MyoD untersucht. Es zeigte sich, dass Hey1 und Hey2

mit E2-2 bzw. E2-5 Heterodimere ausbilden können, während sie mit dem sehr ähnlichen

E12-Protein nicht interagieren. Dieses Ergebnis zeigt, wie spezifisch die Hey-Proteine nur

an bestimmte bHLH-Proteine binden und es unterstreicht die Spezifität des Yeast Two-

Hybrid Verfahrens. Die Hey/MyoD Interaktion wurde inzwischen auch von M. Chin's

Gruppe bestätigt (Sun et al., 2001). Die Frage ist nun, welche der beschriebenen Dimere

in einem bestimmten Zelltyp tatsächlich ausgebildet werden und was diese bewirken.

Durch die alternative Wahl ihrer Bindungspartner können etliche bHLH-Faktoren

unterschiedliche Gene regulieren. Einige, wie z.B. SCL/tal1, können sogar unter

verschiedenen Bedingungen entweder als Repressoren oder als Aktivatoren agieren

(Huang et al., 2000).

Im Verlauf dieser Arbeit waren die Huhngene c-Hey1 und c-Hey2 näher analysiert

worden. Interessanterweise zeigt c-Hey2 ein rhythmisches Expressionsmuster im

Präsomitischen Mesoderm (PSM), exakt übereinstimmend mit dem von c-hairy1 und

lunatic Fringe (lfrg), einem Regulator von Notch. Die c-Hey2-RNA-Expression beginnt am

kaudalen Pol des PSM und wandert dann nach rostral, während die Expression in den

kaudalen Abschnitten wieder verschwindet. Am Zyklusende wird c-Hey2 im posterioren

Abschnitt des neu gebildeten Somiten zusammen mit c-hairy1 und c-Hey1 coexprimiert

und am kaudalen Pol des PSM beginnt von neuem ein c-Hey2 Expressionszyklus.

Dieses oszillierende Expressionsmuster wiederholt sich während der Bildung jedes

Somiten ca. alle 90 Minuten (Leimeister et al., 2000a). Die Coexpression von c-hairy1

und c-Hey2 während der Somitogenese legte die Vermutung nahe, dass beide in einer

ähnlichen Weise reguliert werden. Es stellte sich die Frage, ob c-hairy1 und c-Hey2,

agonistische, antagonistische oder redundante Funktionen während der Somitogenese

ausüben. Ein Aspekt zur Klärung dieser Frage war, eine mögliche Interaktion dieser

verwandten Proteine festzustellen.

Diskussion 92

Es konnte eine starke Interaktion von c-hairy1 mit Hey1 bzw. Hey2 nachgewiesen

werden. Die Bildung von Heterodimeren in vivo war deutlich stärker als die, der

entsprechenden Homodimere, was zusammen mit den Expressionsstudien impliziert,

dass das Hey2/c-hairy1-Heterodimer die Form ist, die im PSM bevorzugt gebildet wird. In

welcher Weise die Hey-Gene dabei an der Somitogenese mitwirken, muss noch weiter

erforscht werden. Hey1-, Hey2- und HeyL-Knockoutmäuse zeigen keinen auffälligen

Somitogenesedefekt, jedoch ist es denkbar, dass die Hey-Gene im PSM redundant sind.

Möglicherweise können auch andere Gene die Hey-Funktion während der Somitogenese

kompensieren, z.B. Hes1, das ebenfalls oszillierend im murinen PSM exprimiert wird

(Jouve et al., 2000). Diese Fragen können in Zukunft an Mäusen untersucht werden, bei

denen mehrere Allele der Hey-Gene deletiert sind. Hier ist noch anzumerken, dass eine

Hey1-Überexpression im Zebrafischembryo zu gravierenden Somitogenesestörungen,

u.a. mit fehlender anterior-posterior Polarität der Somiten, führt (Christoph Winkler, in

Vorbereitung). Interessanterweise wurde vor kurzem gezeigt, dass Hes1 sogar in

Zellkulturlinien ein oszillierendes Expressionsmuster zeigt. Sowohl Hes1 RNA als auch

Protein werden in regelmäßigen Zyklen auf- und wieder abgebaut (Hirata et al., 2002). Es

wird aufschlussreich sein, ein solches Verhalten auch bei Hey2 zu analysieren.

Suche nach Interaktionsproteinen des Hey1-Carboxyterminus

Hey-Proteine zeichnen sich durch einen charakteristischen C-Terminus mit einem

YRPW-Motiv aus. Die Beobachtungen, dass andere Proteine mit einem WRPW-, WRPY-

oder FRPW-Motiv den Corepressor Groucho/TLE binden, legte die Vermutung nahe,

dass auch die Hey-Proteine mit TLE interagieren könnten.

GST-Pulldown und Yeast Two-Hybrid Tests zeigten jedoch, dass Hey-Proteine nicht mit

TLE1 interagieren können. Wurde allerdings das YRPW-Motiv im Hey1-Protein durch die

optimale TLE1-Bindungssequenz WRPW ersetzt, dann konnte eine Interaktion mit TLE1

beobachtet werden. Dies zeigt, dass das Hey1-Protein durch den Austausch einer

Aminosäure (Tyrosin statt Tryptophan) die Fähigkeit verloren hat, den Corepressor TLE1

zu binden.

Es stellte sich die Frage, ob die Hey-Proteine mit anderen Corepressoren interagieren.

Dafür wurden zwei Yeast Two-Hybrid Screeningverfahren mit unterschiedlich langen

Hey1-C-Termini durchgeführt. Als Genbank diente wiederum eine embryonale (E11)

murine cDNA-Bank. In beiden Ansätzen wurden viele hundert Kolonien isoliert. Zunächst

wurden durch DNA-Hybridisierungen überlappende oder identische Klone identifiziert, um

die Zahl der DNA-Sequenzierungen zu reduzieren. Die Auswertung der anschließend

Diskussion 93

sequenzierten Plasmide ergab, dass nur wenige Klone überhaupt als relevante

Interaktionspartner in Frage kommen. Die interessanten Kandidaten (FOG2, Math4a,

SC35, BRE, Polymerase Modulator 6) wurden mit direkten Yeast Two-Hybrid Assays und

schließlich mit dem GST-Pulldown Versuch weiter getestet, jedoch konnte letztlich keine

Proteininteraktion mit Hey1 verifiziert werden.

Es schien, dass bei den Yeast Two-Hybrid Screening Verfahren die Hey1-

Carboxytermini-Konstrukte leicht die Reportergene aktivieren konnten, da eine sehr

große Anzahl falsch-positiver Klone isoliert wurde. Bei den direkten Interaktionstests war

dieses Verhalten allerdings nicht zu beobachten. Insgesamt kann gefolgert werden, dass

sich der Hey1-C-Terminus nicht gut für das Screening von Genbanken eignet. Da auch

andere Arbeitsgruppen das gleiche Problem beobachteten (Randy Johnson, pers.

Mitteilung), bleibt die Frage nach interagierenden Proteinen des Hey-Carboxyterminus

nach wie vor offen. Iso et al. (2001b) publizierten kürzlich Daten, wonach der C-Terminus

keine Repressorfunktion erfüllt. Vielmehr beruhe diese Fähigkeit auf der Interaktion der

bHLH-Domäne mit dem mSin3a Corepressorkomplex. Möglicherweise ist daher der

Carboxyterminus nicht so entscheidend für die Hey-Funktion wie zunächst angenommen.

Jedoch legt die hohe Konservierung dieser Domäne in vielen Spezies eindeutig die

Vermutung nahe, dass das YRPW-Motiv oder das ebenso konservierte TE(I/V)GAF-Motiv

eine wichtige Rolle spielen müssen. Interessanterweise kann das Drosophila hairy-

Protein gleich drei verschiedene Corepressoren rekrutieren. Die Interaktion des WRPW-

Motivs mit Groucho führt zur Rekrutierung der Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 (Chen et

al., 1999), während die basische Domäne direkt die HDAC Sir2 binden kann. Durch

Heterochromatin-„Silencing“ wird dadurch die Transkription von Targetgenen reprimiert

(Rosenberg and Parkhurst, 2002). Ein solches Model wäre auch für Hey gut vorstellbar.

Hey-Protein-DNA Interaktionen

Viele bHLH-Transkriptionsfaktoren zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, spezifische

DNA-Sequenzen zu binden. Auch für die Hey-Proteine konnte in Binding site selection

Analysen eine spezifische E-Box Bindungsstelle gefunden werden. Diese ist identisch mit

der E(spl)-Zielsequenz 5‘-TGG CACGTG CCA-3‘ (Fischer et al., 2002).

In Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) konnte nun bestätigt werden, dass Hey-

Proteine diese Sequenz spezifisch binden können. Auch c-hairy1, E2-2 und E2-5 konnten

als Homodimere an diese DNA-Sequenz binden. Im EMSA gelang es allerdings nicht,

Heterodimere zu beobachten. Warum dies nicht möglich ist, bleibt ungeklärt. Eine

Vermutung ist, dass sich die bereits bei der separaten Proteinsynthese gebildeten

Diskussion 94

Homodimere unter den Versuchsbedingungen nicht mehr trennen. Möglicherweise

nehmen aber auch in vitro translatierte und bakteriell produzierte MBP- bzw. GST-

Fusionsproteine unterschiedliche Konformationen an, die eine Bindung aneinander

erschweren. Iso et al. (2001b) konnten inzwischen in einem ähnlichen Versuchsaufbau

die Heterodimerisierung von ivt-Hey1/ivt-Hes1 nachweisen. Dabei war zu beobachten,

dass das Heterodimer stärker als die jeweiligen Homodimere gebildet wird.

Interessanterweise konnten Sun et al. (2001) in diesem Zusammenhang zeigen, dass

CHF2 (Hey1) die Bindung von MyoD/E47 an DNA verhindert und dass das Hey1/E47

Heterodimer nicht an DNA binden kann. Diese interessanten Daten legen die Vermutung

nahe, dass Hey-Transkriptionsfaktoren auch reprimierend wirken können, indem sie die

DNA-Bindung von aktivierenden Regulatoren wie MyoD verhindern. Ein solches

Verhalten kennt man v.a. von den Id-Proteinen, die keine basische Domäne neben ihrer

HLH-Domänen besitzen (Benezra et al., 1990), aber auch von Hes6 (Bae et al., 2000).

Hes1 wurde ursprünglich auch als ein Repressor der MyoD/E47 DNA-Interaktion

publiziert, obwohl das Protein zudem an eine N-Box binden kann (Sasai et al., 1992). Der

bHLH-Transkriptionsfaktor SCL/tal1 zeichnet sich ebenfalls durch solche Eigenschaften

aus (Goldfarb and Lewandowska, 1995).

Zur weiteren Klärung der DNA-Bindung müssen Reporterassays in Zellkulturen etabliert

werden, um die Transkriptionsregulation durch Hey-Proteine weiter zu erforschen. Der

entscheidende Schritt zum Verständnis der Hey-Transkriptionsfaktoren wird schließlich

die Erforschung der regulierten Gene sein. Diese Untersuchungen, u.a. mit Microarrays,

haben bereits begonnen und es wurde inzwischen beobachtet, dass die Expression von

ANF (atrial natriuretic factor) und CARP (cardiac ankyrin repeat protein) in Hey2-/--Herzen

hochreguliert ist. Die beiden Gene werden allerdings typischerweise in hypertrophierten

Herzen hochreguliert und sind daher wohl keine direkten Zielgene von Hey2.

Analyse von Hey2-Knockoutmäusen

Eine der z.Z. aussagekräftigsten Methoden zur Erforschung der Funktion eines Gens in

vivo ist seine gezielte Ausschaltung im Mausgenom und die anschließende

Untersuchung des Phänotyps.

Durch „gene targeting“ wurden entscheidende Abschnitte des Hey2-Gens (Exons 2-3) in

Mäusen deletiert und durch lacZ ersetzt (Gessler et al., 2002). Heterozygote Mutanten

erscheinen morphologisch und verhaltensmäßig unauffällig und sind fertil, während

ca. 80% der Homozygoten wenige Tage nach der Geburt sterben. Die homozygoten

Neugeboren fallen bereits in den ersten Lebenstagen auf, da sie kleiner als die

Diskussion 95

Heterozygoten und Wildtypmäuse des gleichen Wurfs sind. Um herauszufinden, warum

die Mäuse nicht überleben können, wurden sie obduziert, die lacZ-Expression in

verschiedenen Organen überprüft und anschließend Analysen an Herz und Arterien

durchgeführt.

Die lacZ-Expression der rekombinanten Mäuse wurde mit der von Hey2 im Wildtyp

verglichen, um zu zeigen, dass das lacZ-Gen an der richtigen genomischen Stelle

integriert wurde und nun durch den Hey2-Promoter gesteuert wird. Es zeigte sich, dass

die lacZ-Expression in den untersuchten Organen, insbesondere dem Herzen und den

großen Arterien, der von Hey2 in Wildtypmäusen entspricht.

Die Untersuchung der homozygoten Mäuse in den Stadien P1-P5 zeigte, dass diese eine

massiv vergrößertes Herz besitzen. Die Hypertrophie führt wahrscheinlich zur terminalen

Herzinsuffizienz. Die Hypertrophie des linken Ventrikels kann durch verschiedene

Ätiologien bedingt sein. Möglicherweise führt die Hey2-Deletion während der

Herzentwicklung zur Bildung insuffizienter Myozyten wie bei bestimmten Formen der

Kardiomyopathie (Seidman and Seidman, 2001). Da der rechte Ventrikel weniger

vergrößert ist, könnte es dort zu einer Kompensation der Hey2-Funktion kommen, was

durchaus denkbar ist, da manche Gene asymmetrisch nur auf einer Herzseite exprimiert

werden, wie z.B. die Hey2-Interaktionspartner eHAND und dHAND. Allerdings ist es

wahrscheinlicher, dass die geringere Affektion des rechten Ventrikels durch seine

verminderte Druckbelastung im Lungenkreislauf bedingt wird.

Eine weitere Ursache der Linksherzhypertrophie könnte eine Arterienfehlbildung, z.B.

eine Aortenisthmusstenose, darstellen. Die Zebrafisch gridlock-Mutation, bei der ein

verlängertes Hey2-Protein zu einer Aortenfehlbildung mit konsekutiver Stenose führt,

implizierte eine Aortenisthmusstenose als wahrscheinlichste Ursache der Hypertrophie

(Zhong et al., 2000). Daher wurden die großen Arterien in Zusammenarbeit mit Armin

Helisch am Max Planck Institut für klinische Physiologie in Bad Nauheim untersucht.

Angiographien von neugeborenen und adulten Knockoutmäusen zeigten jedoch, dass die

großen Blutgefäße normal angelegt und funktionsfähig waren. Es konnten keinerlei

Unterschiede zum Wildtyp festgestellt werden. Damit konnte in einem der ersten Fälle

gezeigt werden, dass der Ausfall eines Gens in Zebrafisch bzw. Maus zu

unterschiedlichen Krankheitsbildern führen kann. Dies wird unterstrichen durch die

weiteren Beobachtungen von Mark Fishman’s und Brant Weinstein's Gruppen, dass

gridlock entscheidend für die arterielle vs. venöse Differenzierung ist und eine totale

Blockade von gridlock die Entwicklung von Arterien in Zebrafischen verhindert (Lawson et

al., 2001; Zhong et al., 2001). In der Maus führt eine homozygote Deletion aber nicht zu

einer Arterienaplasie oder –fehlbildung, sondern vielmehr zu einer Kardiomyopathie in

Kombination mit verschiedenen Herzfehlern (s.u.).

Diskussion 96

Es stellte sich nun die Frage, was die Kardiomyopathie auslöst. Hierzu wurde die Hey2-

Expression während der Embryogenese und der postnatalen Periode untersucht.

Während der embryonalen Entwicklung ist Hey2 in Ventrikeln und Arterien exprimiert,

während Hey1 in den Herzvorhöfen transkribiert wird. Die lacZ-Expressionsstudien

zeigten, dass im Embryonalstadium E17.5 noch eine deutliche Hey2- bzw. lacZ-

Expression in den Ventrikeln zu beobachten war, während postnatal die Expression im

Myokard verschwunden war. Diese Ergebnisse sind konform mit den Beobachtungen von

Chin et al. (2000), die ein Verschwinden der Hey2-Expression in Ratten zum Zeitpunkt

um die Geburt beschrieben haben.

Danach wurde untersucht, ob Hey1 oder HeyL die ausgefallene Funktion von Hey2

teilweise kompensieren können, indem sie möglicherweise ektop, z.B. im Herzventrikel

der Hey2-Knockoutmaus, exprimiert werden. Die Hey1- und HeyL-Expression wurde

durch RNA in situ Hybridisierung in Hey2-Knockoutmäusen (E9.5, 10.5, 11.5 und 14.5)

mit der in Heterozygoten und Wildtypmäusen verglichen wurde. Dabei zeigte sich, dass

die Expression von Hey1 und HeyL in allen untersuchten Embryonen gleich war. Somit

kann gefolgert werden, dass zumindest in Geweben in denen die Hey-Gene nicht

coexprimiert sind, die Hey2-Funktion nicht durch ein anderes Hey-Gen übernommen

wird.

Überraschenderweise ist das Herz der Hey2-/- Mäuse bis zur Geburt normal geformt. Erst

perinatal kommt es innerhalb kürzester Zeit zu diesem massiven Umbau des Myokards.

Eine strukturelle Myokardfehlbildung könnte bereits während der Embryonalentwicklung

latent vorhanden sein, aber erst mit der postnatalen Kreislaufumstellung und den

schlagartig einsetzenden hämodynamischen Veränderungen zur Hypertrophie führen.

Die histologischen Untersuchungen zeigten aktivierte, unstrukturierte Kardiomyozyten mit

teils atypischen Mitosefiguren sowie eine leichte Fibrose (Kerstin Amann, Erlangen).

Erstaunlicherweise ist die Kardiomyopathie nicht progredient. Die überlebenden Mäuse

entwickeln sich schließlich wie die Wildtyptiere und haben als Adulte lediglich ein

verformtes Herz, während sich der Herz-Körpergewicht Quotient normalisiert hat.

Radiologische Untersuchungen der Herzfunktion mit Hilfe der Magnetresonanz

Tomographie (Frank Wiesmann, Würzburg) ergaben eine signifikante Reduzierung der

linksventrikulären Ejektionsfraktion, wobei das absolute Schlagvolumen höher war, als

das der Kontrolltiere. Dies zeigt, dass die deutlich verminderte Kontraktionskraft der

Kardiomyozyten (Nikola Golenhofen, Würzburg) durch Hypertrophie und Hyperplasie des

Herzens teilweise kompensiert werden kann. Es wird nun interessant sein zu

beobachten, wie diese Mäuse auf kardiale Überbelastung reagieren.

Diskussion 97

Weiterhin wurden die neugeborenen Mäuse auf Herzrhythmusstörungen untersucht, die

bei einer massiven Hypertrophie häufig auftreten. EKG-Analysen zeigten keine

Rhythmus- oder Überleitungsstörungen oder sonstige Auffälligkeiten. Jedoch sollte

versucht werden, die Tiere über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, um mögliche

paroxsysmalen Störungen zu erkennen, was mit der eingesetzten Technik leider nicht

möglich war.

Es ist anzumerken, dass nach Abschluss dieser Phänotypisierung M.T. Chin in seinem

Hey2-Knockoutmodell Herzseptumdefekte beobachten konnte (pers. Mitteilung).

Daraufhin wurden die hier beschriebenen Mäuse erneut untersucht. In den inzwischen

höheren „Backcross“-Generationen konnten Vorhof- und Ventrikelseptumdefekte (ASD

und VSD) sowie z.T. Trikuspidalatresien (TA), Pulmonalstenosen (PS) oder die

Fallot’sche Tetralogie (VSD, PS, reitende Aorta und rechtsventrikuläre Hypertrophie)

beobachtet werden. Diese typischen Herzfehler waren in den ersten „Backcross“-

Generationen eindeutig nicht vorhanden. Anscheinend wirkt sich also der genetische

Hintergrund auf die Ausprägungsstärke der Hey2-Deletionen aus. Eine weitere

Arbeitsgruppe hat inzwischen die gleichen Herzfehlbildungen in einem ähnlichen Hey2-

Knockout beschrieben (Donovan et al., 2002; Gessler et al., 2002).

Die vorgestellten Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Hey-Transkriptionsfaktoren

mit weiteren bHLH-Faktoren interagieren und an spezifische DNA-Sequenzen binden, um

dadurch bestimmte Zielgene zu kontrollieren. Hey2 ist ein entscheidender Faktor für die

murine Herzentwicklung und diese am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse legen nun

die Vermutung nahe, dass das menschliche Hey2-Gen ein Kandidat sowohl für

Entstehung von Kardiomyopathien, als auch für zahlreiche kongenitale Herzfehler ist. Die

Suche nach Hey2-Mutationen bei Patienten mit Vorhof- bzw, Ventrikelseptumdefekten

und Fallot’sche Tetralogie hat inzwischen begonnnen.

Zusammenfassung 98

6 Zusammenfassung

Die Entwicklung eines vielzelligen Organismus aus einer befruchteten Eizelle ist nur

durch komplexe zelluläre Regulationsmechanismen möglich. Dabei spielt der Notch-

Signaltransduktionsweg eine zentrale Rolle während der Determination von

Zellschicksalen und der Zelldifferenzierung. Die primären Zielgene der Notch-

Signalkaskaskade bei Vertebraten sind die Hes- sowie die kürzlich identifizierten Hey-

Gene. Die Hey-(hairy and E(spl) related with YRPW motif)-Gene kodieren drei

hairy/E(spl)/Hes-verwandte basische Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren, die durch

eine Orange-Domäne und einen charakteristischen Carboxyterminus gekennzeichnet

sind. Während der Embryonalentwicklung werden die Hey-Gene dynamisch in

zahlreichen Geweben exprimiert.

Ziel dieser Arbeit war es, neue Hey-Interaktionsproteine aus embryonalen Genbanken zu

isolieren, die Bindung an weitere bHLH-Transkriptionsfaktoren zu überprüfen und ihre

DNA-Bindung zu analysieren. Um die physiologische Hey2-Funktion zu ergründen,

wurden Hey2-Knockoutmäuse untersucht.

In einem ersten Versuch wurde eine neue Screeningmethode erprobt, bei der

Proteinexpressionsfilter mit markierten Hey1-Peptiden nach interagierenden Proteinen

durchsucht wurden. Hierbei sind 53 Proteine isoliert worden, jedoch konnte nach

eingehenderen Untersuchungen kein relevanter Bindungsspartner beschrieben werden.

Für weitere Analysen unter mehr physiologischen Bedingungen wurde das Yeast Two-

Hybrid Verfahren für Hey1 und Hey2 etabliert. Das Screening von murinen embryonalen

cDNA-Genbanken mit verschiedenen Hey1-Fragmenten führte zur Isolation von

mehreren hundert Klonen. Die interessantesten Kandidaten wurden weiteren

biochemischen Tests unterzogen, wobei jedoch keine neuen Interaktionspartner

verifiziert werden konnten.

Mit gezielten direkten Yeast Two-Hybrid und GST-Pulldown Assays für vermutete

Kandidaten konnte jedoch die Interaktion von Hey1 bzw. Hey2 mit den bHLH-Proteinen

E2-2, E2-5, MyoD und c-hairy1 nachgewiesen werden. Außerdem wurde festgestellt,

dass Hey1 und Hey2 Homodimere und Hey1/Hey2-Heterodimere bilden. Die stärkste

Interaktion wurde mit dem in der Somitogenese rhythmisch exprimierten c-hairy1-Protein

beobachtet. Da Hey2 und c-hairy1 im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten

coexprimiert werden und starke Heterodimere ausbilden, erscheint es wahrscheinlich,

Zusammenfassung 99

dass beide Proteine gemeinsam die Transkription nachgeschalteter Gene steuern. Diese

Interaktionsstudien zeigten außerdem erstmals, dass die Orange-Domäne entscheidend

an der Bildung der Dimere beteiligt ist, da durch sie die Dimerisierung in vivo deutlich

verstärkt wurde. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Hey1 und Hey2, im Gegensatz

zu den übrigen hairy-Proteinen, nicht mit dem Corepressor Groucho/TLE1 interagieren.

Electrophoretic Mobility Shift Assays ergaben, dass die Hey1- und Hey2-Proteine an eine

E(spl)-spezifische E-Box DNA-Sequenz (CACGTG) binden. Auch die interagierenden

bHLH-Proteine c-hairy1, E2-2 und E2-5 binden als Homodimere an diese DNA-Sequenz.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Hey2-Genfunktion an Hey2-Knockoutmäusen

untersucht. Etwa 80 % der homozygoten Mäuse starben wenige Tage nach der Geburt.

Sie zeigten eine massive Hypertrophie der Herzventrikel, die wahrscheinlich die

Todesursache darstellt. Die lacZ-Expression der untersuchten Organe entsprach der

Hey2-Expression im Wildtyp. Es fiel dabei auf, dass es postnatal zu einer

Herunterregulation der Hey2-Transkription kommt.

Mit Elektrokardiogrammen wurden keine Reizleitungsstörungen bei neugeborenen Hey2-

Knockoutmäusen festgestellt. Interessanterweise konnte mit Arteriographien

ausgeschlossen werden, dass die Ventrikelhypertophie Folge einer Aortenstenose wie

bei der gridlock (zf-Hey2)-Mutante im Zebrafisch ist. Vielmehr führt eine homozygote

Hey2-Deletion zu einer Kardiomyopathie in Kombination mit verschiedenene Herzfehlern.

Untersuchungen der Hey1- und HeyL-Expression in Hey2-Knockoutembryonen mittels

RNA in situ Hybridisierungen zeigten keine Veränderungen im Vergleich mit dem Wildtyp.

Daraus kann gefolgert werden, dass Hey1 und HeyL zumindest dort, wo sie nicht mit

Hey2 coexprimiert sind, die Hey2-Funktionen nicht kompensieren können. Weitere

Erkenntnisse über die Funktionen der Hey-Gene werden sicherlich die Studien an den

Doppelknockoutmäusen ergeben.

Die bisherigen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Hey-Gene essentiell für die murine

Herzentwicklung sind. Weitere Untersuchungen müssen nun zeigen, welche Rolle diese

Gene bei der Entstehung von kongenitalen Herzfehlern des Menschen spielen.

Literaturverzeichnis 100

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Abkürzungsverzeichnis 109

8 Abkürzungsverzeichnis aa Aminosäuren

Abb. Abbildung

AD aktivierende Domäne

AK Antikörper

AP alkalische Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

ATP Adenosintriphosphat

bHLH Basic Helix-Loop-Helix

BLAST basic local alignment search tool

bp Basenpaare

BSA bovines Serumalbumin

Ci Curie

CIP alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

cm Zentimeter

dATP/CTP/GTP/TTP/UTP 2‘-Desoxy-Adenosin/Cytosin/Guanosin/

Thymidin/Uracil-5‘-Phosphat

ddH2O bidestilliertes Wasser

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DBD DNA bindende Domäne

dNTP 2‘-Desoxy-Nukleotide-5‘-Phosphat

DTT 1,4-Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethlendiamintetraacetat

EST expressed sequence tag

FCS fötales Kälberserum

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2ethansulfonsäure

IPTG Isopropyl-1-thio-D-galaktosid

kb Kilobasenpaar

kD Kilodalton

M molar

min Minuten

mJ Millijoule

ml Milliliter

Abkürzungsverzeichnis 110

mM millimolar

mmol Millimol

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

ng Nanogramm

OD260 Optische Dichte bei 260 nm

Or Orange-Domäne

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

PMSF Phenylmethylsulfonsäurefluorid

RNase Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SDS Sodiumdodecylsulfat

sec Sekunde

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-Puffer

TBS Tris buffered saline

TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethyl-Ethylendiamin

Tris Tris(hydoxymethyl)-aminomethan

U Unit

UTR Untranslated region

UV Ultraviolett

Vol. Volumen

w Gewicht

WT Wildtyp

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde zwischen April 1999 und Oktober 2002 am Institut für

Physiologische Chemie I der Universität Würzburg unter Anleitung von Prof. Dr. Manfred

Gessler angefertigt.

Ich möchte mich bei allen bedanken, die an der Entstehung dieser Arbeit mitgewirkt

haben:

Ganz besonders danke ich Herrn Prof. Dr. Manfred Gessler für sein großes Interesse an

dieser Arbeit und die jederzeit äußerst freundliche und hilfsbereite Unterstützung.

Weiterhin bin ich ihm sehr dankbar für seine Förderung meiner Praktika und USA-

Aufenthalte.

Herrn Prof. Dr. Lutz Hein bin ich dankbar für die freundliche Übernahme des Koreferats

dieser Arbeit und seine große Hilfe bei der Ableitung von EKG’s an Mäusen.

Mein Dank gilt allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Gessler für die sehr gute

Zusammenarbeit und das angenehme Arbeitsklima.

Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei meinen Eltern, die mir meine Ausbildung

ermöglichten und mich jederzeit ermutigt und unterstützt haben.

Weiterhin möchte ich mich bei den Betreuern meiner Praktika bedanken, die ebenfalls

diese Arbeit beeinflussten, indem sie mir neue Techniken lehrten und mir viel Wissen

weitergaben. Insbesondere möchte ich hier erwähnen:

Frau Dr. Beate Gawin, die mein Interesse für Molekularbiologie geweckt hat.

Frau Dr. Petra Rüger, die mir bei Roche Diagnostics die Prinzipien der Proteinbiochemie

näher brachte.

Herrn Prof. Dr. David Helfet vom Hospital for Special Surgery, New York USA, der mich

immerzu ermunterte, meine klinische Ausbildung nicht zu vernachlässigen.

Herrn Prof. Dr. Stuart Orkin und Herrn Dr. Thorsten Schlaeger, Harvard Medical School,

die mir während meiner Zeit in Boston das faszinierende Feld der Stammzellen Biologie

und der Blutentwicklung erschlossen.

Lebenslauf

Name: Andreas Fischer Geburtsdatum: 09.03.1976 Geburtsort: Miltenberg Schulbildung: 1983 - 1986 Grundschule Schneeberg 1986 - 1995 Karl-Ernst-Gymnasium Amorbach; Abschluss: Abitur Wehrdienst: 1995 - 1996 in Feldkirchen und Niederstetten Hochschulausbildung: 1996 - 2002 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians Universität

Würzburg 19.03.1998 Ärztliche Vorprüfung 23.03.1999 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 05.09.2001 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Praktisches Jahr: Harvard University Medical School, Boston, MA, USA Humangenetisches Institut der Universität Würzburg

22.10.2002 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung seit 01.04.1999 Promotion unter der Anleitung von Herrn Prof. Dr. med. Manfred

Gessler am Institut für Pysiologische Chemie I, Theodor Boveri Institut für Biowissenschaften der Universität Würzburg.

Würzburg, 15.11.2002

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