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Aus dem Institut für Physiologische Chemie I der Universität Würzburg
Vorstand: Professor Dr. rer. nat. Manfred Schartl
Biochemische Charakterisierung der basischen Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren Hey1 und Hey2 sowie Untersuchung ihrer
Rolle während der Herz- und Gefäßentwicklung
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
vorgelegt von
Andreas Fischer
aus Schneeberg
Würzburg, im November 2002
Referent: Professor Dr. med. Manfred Gessler
Koreferent: Professor Dr. med. Lutz Hein
Dekan: Professor Dr. med. Stefan Silbernagl
Tag der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2003
Der Promovend ist Arzt
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung................................................................................................................... 1 1.1 Der Notch-Signaltransduktionsweg ................................................................1 1.2 hairy- und Enhancer-of-split-verwandte Gene ...............................................5 1.3 Die Hey-Gene als neue Familie der hairy- und E(spl)-verwandten Gene.....7 1.4 Das Yeast Two-Hybrid System ......................................................................10 1.5 Zielsetzung ......................................................................................................12
2 Material ..................................................................................................................... 14 2.1 Plasmid-Vektoren............................................................................................14 2.2 Bakterien, Hefen und Zellinien ......................................................................15 2.3 Mausstämme ...................................................................................................16 2.4 Oligonukleotide...............................................................................................16 2.5 Medien, Puffer und Lösungen .......................................................................18 2.6 Enzyme und Kits .............................................................................................28 2.7 Genbanken und Proteinexpressionsfilter.....................................................28 2.8 Chemikalien und Hilfsmittel ...........................................................................29 2.9 Antikörper........................................................................................................29 2.10 Software...........................................................................................................30
3 Methoden ................................................................................................................. 31 3.1 DNA-Präparationen und Aufreinigung..........................................................31
3.1.1 Gewinnung von Plasmid-DNA nach der „Rapid-boiling“-Methode ............................... 31 3.1.2 Nucleobond-Minipräparation .............................................................................................. 31 3.1.3 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Bakterienkulturen ............................................. 31 3.1.4 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Hefekulturen ..................................................... 31 3.1.5 Isolierung von Hefeplasmiden nach der „Rapid-isolation“-Methode ............................ 32 3.1.6 Präparation von Träger-DNA für Hefetransformationen ................................................ 32 3.1.7 cDNA-Synthese.................................................................................................................... 32 3.1.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .............................................................. 33
3.2 Gelelektrophoresen ........................................................................................33 3.2.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese...................................................................................... 33 3.2.2 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese................................................ 33
3.3 DNA-Klonierungstechniken ...........................................................................34 3.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen ........................................................... 34 3.3.2 Ligation von DNA ................................................................................................................. 34
3.4 Transformation von kompetenten Bakterienzellen......................................35 3.4.1 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach Hanahan) ....... 35 3.4.2 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach Inoue) ............. 35 3.4.3 Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen .............................. 36
3.5 DNA-Sequenzierung .......................................................................................36 3.6 Amplifikation einer Plasmid-cDNA Bank ......................................................36
3.7 PCR-Methoden ................................................................................................36 3.7.1 Analytische PCR .................................................................................................................. 36 3.7.2 Präparative PCR .................................................................................................................. 37 3.7.3 Genotypisierung ................................................................................................................... 38
3.8 Radioaktive Markierung von DNA und Filterhybridisierungen...................38 3.8.1 Herstellen von Bakterienkolonie-Filtern............................................................................ 38 3.8.2 Herstellen von PCR-Produkt-Filtern.................................................................................. 38 3.8.3 Radioaktive Markierung von DNA ..................................................................................... 39 3.8.4 Filterhybridisierung .............................................................................................................. 39
3.9 Herstellung, Reinigung, Analyse von Proteinen..........................................39 3.9.1 In vitro Translation ............................................................................................................... 39 3.9.2 Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen ................................................. 40 3.9.3 Expression und Reinigung von MBP-Fusionsproteinen................................................. 40 3.9.4 Proteinexpression und Extraktion in Hefezellen.............................................................. 40 3.9.5 Herstellen und Aufreinigung eines AP-Fusionsproteins................................................. 41 3.9.6 In vitro Proteinsynthese, Reinigung und Nachweis ........................................................ 42 3.9.7 Western-Blot Analyse.......................................................................................................... 42
3.10 GST-Pulldown Assay......................................................................................43 3.11 Das Yeast Two-Hybrid System ......................................................................44
3.11.1 Herstellung kompetenter Hefezellen nach der Lithium-Acetat-Methode ................ 44 3.11.2 Transformation Lithium-Acetat-kompetenter-Hefezellen........................................... 44 3.11.3 Yeast Two-Hybrid Analyse nach der Mating-Methode .............................................. 44 3.11.4 Screening einer cDNA-Genbank mit der Mating-Methode........................................ 45 3.11.5 Screening einer cDNA-Genbank mit der Cotransformations-Methode ................... 45 3.11.6 Filter lift β-Galaktosidase Assay ................................................................................... 45 3.11.7 Quantitativer β-Galaktosidase Assay mit ONPG........................................................ 46
3.12 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Proteinen..........47 3.12.1 Herstellen von Proteinexpressionsfiltern ..................................................................... 47 3.12.2 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit AP-Fusionsproteinen......................... 47 3.12.3 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit einem Biotin-markierten Peptid ....... 48
3.13 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)...............................................48 3.13.1 Präparation der DNA-Sonden ....................................................................................... 48 3.13.2 Bindungsreaktion und nicht-denaturierende Gelelektrophorese.............................. 49
3.14 Zellkulturtechniken .........................................................................................49 3.14.1 Kultivierung und Lagerung ............................................................................................. 49 3.14.2 Transfektion mittels Calciumphosphat-Präzipitation .................................................. 50
3.15 Isolierung, Färbung, Einbettung und Schnitte von Mausgewebe ..............50 3.15.1 Präparation von Mausgewebe ...................................................................................... 50 3.15.2 lacZ-Färbung.................................................................................................................... 50 3.15.3 Einbetten und Schneiden von Mausgewebe in Paraffin............................................ 50
3.16 RNA in situ Hybridisierung ganzer Embryonen...........................................51 3.16.1 Herstellung der Digoxygenin-markierten RNA-Sonde ............................................... 51 3.16.2 Hybridisierung (Henrique et al., 1995) ......................................................................... 51
4 Ergebnisse............................................................................................................... 53 4.1 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Peptiden ...........53 4.2 Yeast Two-Hybrid Library Screening ............................................................56
4.2.1 Klonierung der Vektoren ..................................................................................................... 56 4.2.2 Screening mit dem Hey1-Carboxyterminus ..................................................................... 58
4.2.2.1 Hey1 aa 266-299 (GBK-YRPW) Screening............................................................ 59 4.2.2.2 Hey1 aa 173-299 (GBK-heyB) Screening .............................................................. 63
4.2.3 Screening mit verschiedenen Hey1-bHLH-Orange-Domänen ...................................... 64 4.2.3.1 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-bHLHOr, Hey1 aa 50-200) ............... 64
4.2.3.2 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-heyA, Hey1 aa 38-175) ..................... 65 4.2.3.3 Screening einer embryonalen (E17) cDNA-Bank mit GBK-heyA........................ 66
4.3 Test der Interaktion von Hey1 mit TLE1........................................................67 4.4 Hey-Homo- und Heterodimerisierung mit weiteren bHLH-Proteinen.........69
4.4.1 Hey-Homodimerisierung ..................................................................................................... 69 4.4.2 Hey-Protein Interaktion mit c-hairy1.................................................................................. 72 4.4.3 Hey1/2- und c-hairy1-Protein Interaktionen mit Klasse A E-Proteinen und MyoD..... 72
4.5 DNA-Bindung von Hey1/2, c-hairy1 und E-Proteinen..................................74 4.6 Genexpressions- und Funktionsanlysen an Hey2-Knockoutmäusen........78
4.6.1 Obduktion von Hey2-Knockoutmäusen ............................................................................ 78 4.6.2 lacZ-Expression in Herz und Gefäßen von Hey2-Knockoutmäusen............................ 80 4.6.3 Arteriographie von Hey2-Knockoutmäusen ..................................................................... 82 4.6.4 Elektrokardiogramm (EKG) ................................................................................................ 83 4.6.5 Expression von Hey1 und HeyL in Hey2-Knockout Embryonen................................... 85
5 Diskussion............................................................................................................... 88 6 Zusammenfassung................................................................................................ 98 7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 100 8 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 109
Danksagung Lebenslauf
Einleitung 1
1 Einleitung
Die Entwicklung eines vielzelligen Organismus aus einer einzigen befruchteten Eizelle ist
eines der faszinierendsten und spannendsten Kapitel der Medizin und Biologie. Obwohl
durch genetische und molekularbiologische Untersuchungen in den letzten Jahrzehnten
viele einzelne Mechanismen der Entwicklungsgeschichte aufgedeckt wurden, ist es nach
wie vor ein großes Rätsel, wie aus wenigen Stammzellen komplexe Organe wie Gehirn,
Herz oder Niere entstehen können.
Multiple Regulationsmechanismen steuern die Differenzierung von Vorläuferzellen zu
adulten ausgereiften Zellen. Dabei müssen zellspezifische Gene zum richtigen Zeitpunkt
an- bzw. abgeschalten werden. Dies wird in erster Linie durch Transkriptionsfaktoren
gesteuert, die ihrerseits durch komplizierte Signalkaskaden reguliert werden. Nur im
exakten Zusammenspiel von zahlreichen aktivierenden und hemmenden Faktoren
werden so zum richtigen Zeitpunkt die richtigen Gene transkribiert und translatiert.
Darüber hinaus müssen die einzelnen Zellen miteinander kommunizieren und sich
gegenseitig beeinflussen. Dies erfolgt über größere Distanzen z.B. mit Hilfe von
sezernierten Botenstoffen, während benachbarte Zellen direkt über Ligand-Rezeptor
Interaktionen Signale übermitteln können. Eines der wichtigsten dieser Regulations-
systeme, das die gesamte Differenzierung ab den frühesten Embryonalstadien steuert, ist
der Notch-Signaltransduktionsweg.
1.1 Der Notch-Signaltransduktionsweg
Die Notch-Signalkaskade spielt eine fundamentale Rolle während der
Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden, Fischen und Säugetieren. Durch die
Aktivierung von Notch können molekulare Unterschiede zwischen benachbarten Zellen
etabliert und somit unterschiedliche Zelldifferenzierungen und Gewebegrenzen
determiniert werden. Notch beeinflusst im komplexen Zusammenspiel mit zahlreichen
weiteren Faktoren die zelluläre Differenzierung, Proliferation und Apoptose in allen
Entwicklungsstadien und stellt somit einen zentralen Regulator der Entwicklungsbiologie
dar. In der Fruchtfliege Drosophila melanogaster gibt es wohl kaum ein Gewebe, dessen
Entwicklung nicht durch Notch beeinflusst wird (Hartenstein et al., 1992). So verwundert
es auch nicht, dass Mutationen von Notch-Genen zu zahlreichen Fehlbildungen und
Krankheiten in verschiedenen Spezies führen können.
Das Notch-Gen war eines der ersten Gene, das in Drosophila beschrieben wurde. Bereits
1919 zeigte O.L. Moohr, dass eine heterozygote Notch-Mutation Kerben (engl.: notches)
Einleitung 2
an den Flügelrändern verursacht (Moohr, 1919). Knapp 20 Jahre später entdeckte
D.F. Poulson, dass eine homozygote Notch-Mutation zu einem letalen „neurogenen“
Phänotyp führt, bei dem sich neuroektodermale Zellen nicht wie gewöhnlich zu
Epidermiszellen entwickeln, sondern überschüssiges Nervengewebe bilden (Poulson,
1937).
Notch kodiert einen Transmembranrezeptor, mit einer großen extrazellulären Domäne,
die durch 36 EGF-(epidermal growth factor)-ähnlichen „repeats“ und drei cysteinreichen
Notch/LIN12-Domänen charakterisiert wird. Als Liganden des Notch-Rezeptors agieren
die Transmembranproteine Delta und Serrate (Jagged bei Vertebraten, LAG-2 in
C. elegans). Die Bindung eines Liganden an den Notch-Rezeptor führt zur
proteolytischen Abspaltung seiner intrazellulären Domäne. An dieser komplizierten
Spaltung sind u.a. die Preseniline beteiligt, welche mit der erblichen Form der Alzheimer
Erkrankung assoziiert sind (Haass and De Strooper, 1999). Die aktivierte intrazelluläre
Notch-Domäne wird in den Zellkern importiert und bindet das Supressor-of-hairless
Protein (Su(H), bzw. CBF1/RBP-Jκ bei Säugetieren), das dadurch seine
Repressorfunktion verliert. Dies ermöglicht die Transkription von Enhancer-of-split
(E(spl))-Transkriptionsfaktoren, die dann weitere Zielgene regulieren (Artavanis-Tsakonas
et al., 1999). E(spl)-Transkriptionsfaktoren rekrutieren den Corepressor Groucho und
blockieren die Transkription proneuraler Gene, wie die des achaete-scute Komplexes,
was die Inhibition einer neuronalen Zelldifferenzierung zur Folge hat (s. Abb. 1). Die
Expression des Notch-Liganden Delta wird ebenfalls herunterreguliert und damit eine
Aktivierung von Notch in benachbarten Zellen verhindert. Der gesamte Prozess wird als
„laterale Inhibition“ beschrieben (Fisher and Caudy, 1998; Oellers et al., 1994). Neben
der „lateralen Inhibition“ wurden inzwischen noch weitere Mechanismen der Notch-
Kaskade beschrieben (Gaiano and Fishell, 2002).
Der Notch-Signalweg wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst, die bisher nur zum Teil
bekannt sind. Erwähnt werden soll hier nur das Fringe-Protein (lunatic, radical und manic
Fringe bei Vertebraten), ein negativer Regulator des Notch-Liganden Serrate. Fringe
besitzt eine Glykosyltransferase-Aktivität und verhindert durch N-
Acetylglukosaminylierung der Notch-EGF-„repeats“ eine Serrate-Notch Interaktion
(Bruckner et al., 2000; Moloney et al., 2000).
Einleitung 3
Abb. 1: Schema der Notch-Signalkaskade. Delta (Dl) interagiert mit Notch (N). Durch die Aktivierung kommt es zur Abspaltung der intrazellulären Notch-Domäne, die Supressor of Hairless (Su(H)) bindet und die Transkription von Enhancer-of-split (E(spl)) bewirkt. Durch Interaktion mit Groucho (G) reprimiert E(spl) die Transkription von Achaete-Scute (Ac-Sc). Weitere Faktoren des Signalweges sind gezeigt: Der Ligand Serrate (Ser) und sein Regulator Fringe (Fng), die Notch-spaltenden Enzyme Kuzbanian (Kuz), Presenilin und Furin, sowie die intrazellulär interagierenden Proteine Deltex (Dx), Disheveled (Dsh), Disabled (Dab) und Numb. Abbildung aus (Artavanis-Tsakonas et al., 1999).
Während in Drosophila nur ein Notch-Rezeptor, ein Delta- und ein Serrate-Protein
beschrieben wurden, gibt es bei der Maus vier bekannte Notch-Proteine sowie die Notch-
Liganden Delta-like(Dll)1,3,4 und Jagged-(=Serrate)1,2. Diese werden z.T.
unterschiedlich exprimiert, was die Erforschung ihrer jeweiligen Funktion noch erheblich
kompliziert. Trotzdem ist es teilweise gelungen, die Funktion einiger dieser Gene näher
zu ergründen. Bestimmte Mutationen von Notch oder seinen Liganden konnten sogar als
Ursache menschlicher Erkrankungen aufgedeckt werden.
So verursachen Mutationen in den extrazellulären EGF-„repeats“ des Notch3-Rezeptors
das autosomal dominant vererbte CADASIL-Syndrom (Cerebral autosomal dominant
arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy; OMIM 125310). Es ist
gekennzeichnet durch Arterienfehlbildungen, die zu subkortikalen Infarkten,
Leukenzephalopathie und zunehmender Demenz führen (Joutel et al., 1996).
Einleitung 4
Eine homozygote Notch1-Deletion bei Mäusen bewirkt eine frühe embryonale Letalität im
Stadium E9.5 (9,5 Tage post coitum) mit Somitogenese- und Neurogenesestörungen
sowie Hämorrhagien (Conlon et al., 1995; de la Pompa et al., 1997; Krebs et al., 2000;
Swiatek et al., 1994). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine hypomorphe Notch2-
Mutation zu glomerulären Schäden und myokardialer Hypoplasie führt (McCright et al.,
2001), während Notch4-Knockoutmäuse überraschenderweise einen normalen Phänotyp
zeigen, was auf eine gewisse Redundanz der Notch-Gene schließen lässt. Doppelt
homozygote Notch1/Notch4-Knockoutembryonen sterben allerdings in einem früheren
Stadium mit deutlich schwereren Defekten als Notch1-/--Mutanten. Der entscheidende
Defekt liegt hierbei in der Unfähigkeit der Doppelmutanten, größere Blutgefäße aus den
bereits angelegten primitiven Kapillarnetzwerken zu bilden (Krebs et al., 2000). Die
Expression eines aktivierten Notch4-Proteins unter Kontrolle des Flk1-Promoters im
Endothel führt ebenfalls zu einer stark reduzierten Gefäßbildung bzw. zu
Gefäßmissbildungen (Uyttendaele et al., 2001).
Die genannten Mutationsexperimente zeigen, dass Notch-Proteine insbesondere bei
Vaskulo- und Angiogenese eine zentrale Rolle spielen. Daneben sind weitere
Funktionen, in der Somitogenese, der Zelldifferenzierung von hämatopoetischen
Vorläuferzellen und in der Zellzykluskontrolle beschrieben worden (Robson MacDonald et
al., 2001). Da die Notch-Proteine an der Zelldifferenzierung beteiligt sind, liegt die
Vermutung nahe, dass sie auch in der Krebsentstehung involviert sein könnten.
Tatsächlich wurden das menschliche Notch1-(TAN1) und das murine Notch4-(int3) Gen
ursprünglich als Onkogene identifiziert. In einer geringen Anzahl von humanen T-Zell
Leukämien (T-ALL) kommt es durch eine chromosomale Translokation (7;9)(q34;q34.3)
zur Überexpression der intrazellulären Notch1-Domäne unter der Kontrolle des T-Zell
Rezeptor-β Promoters. Bei viral bedingten Brusttumoren der Maus wurde die Integration
des MMT-Virus in das Notch4-Gen beobachtet, was zur Überexpression der
intrazellulären Notch4-Domäne führt (Ellisen et al., 1991; Robbins et al., 1992).
Auch Mutationen der Notch-Liganden führen zu interessanten Phänotypen. Ein
Funktionsverlust des humanen Notch-Liganden Jagged1 ist verantwortlich für das
autosomal dominant vererbte Alagille-Syndrom (OMIM 118450) (Li et al., 1997; Oda et
al., 1997). Es ist gekennzeichnet durch Gallengangsanomalien und Herzfehler, wie
Pulmonalarterienstenose, Hypoplasie der pulmonalen Strombahn, Fallot-Tetralogie und
Septumdefekte. Weiterhin können faziale, vertebrale, renale und ophtalmologische
Anomalien assoziiert sein (Alagille et al., 1987). Inzwischen konnte auch eine familiäre
Form der Fallot-Tetralogie, einem kongenitalem Herzfehlbildungssyndrom mit
Ventrikelseptumdefekt, Pulmonalstenose und Dextroposition der Aorta auf eine Jagged1-
Einleitung 5
Mutation zurückgeführt werden (Eldadah et al., 2001). Jagged1-/- Mäuse sterben in utero
an der Folge schwerer Gefäßdefekte (Loomes et al., 1999; Xue et al., 1999). Jagged2-
Mutanten zeigen hingegen kraniofaziale Abnormalitäten sowie Thymus- und
Extremitätenfehlbildungen (Jiang et al., 1998).
Ein weiteres menschliches Fehlbildungssyndrom ist mit dem Delta-like3 (Dll3)-Liganden
assoziiert. Homozygote Dll3-Mutationen verursachen das Syndrom der spondylocostalen
Dysostosis (OMIM 277300), das auf Störungen der Somitenentwicklung beruht und der
pudgy-Mausmutante entspricht (Bulman et al., 2000; Kusumi et al., 1998). Dll1-
Knockoutmäuse weisen ebenfalls schwere Somitogenesestörungen auf, wobei keine
kranio-kaudale Differenzierung und Epithelialisierung der gebildeten Somiten erfolgt. Sie
sterben etwa im Stadium E12 an schweren Blutungen (Hrabe de Angelis et al., 1997).
1.2 hairy- und Enhancer-of-split-verwandte Gene Die Enhancer-of-split-Gene stellen die primären Zielgene des Notch-
Signaltransduktionsweges in Drosophila dar und sind, wie bereits erwähnt, verantwortlich
für den Prozess der „lateralen Inhibition“. E(spl)-Gene zeigen eine große Homologie zum
hairy-Gen, das allerdings unabhängig vom Delta-Notch Weg reguliert wird. hairy und
E(spl) kodieren basische Helix-Loop-Helix (bHLH) Transkriptionsfaktoren, die v.a. als
Repressoren agieren. Neben den Drosophila-Genen wurden inzwischen homologe
hairy/E(spl)-Gene in zahlreichen anderen Spezies gefunden.
hairy reguliert als Transkriptionsrepressor wichtige Entwicklungsprozesse in Drosophila.
Während der Neurogenese reprimiert hairy proneurale Gene wie Daughterless oder die
des achaete-scute Komplexes und inhibiert damit eine vorzeitige oder verstärkte
Differenzierung von Neuroektoderm (Botas et al., 1982; Campos-Ortega, 1993; Ish-
Horowicz et al., 1985; Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980). Eine Mutation führt zur
Ausbildung von ektopen Sinneshaaren, denen hairy seinen Namen zu verdanken hat
(Rushlow et al., 1989). Als „pair-rule gene“ steuert hairy weiterhin die Segmentation des
Körpers in frühen Embryonalstadien durch Repression von fushi tarazu (Fisher and
Caudy, 1998; Ish-Horowicz et al., 1985).
Über die Funktion der hairy- und E(spl)-Verwandten in Vertebraten ist dagegen noch
relativ wenig bekannt. Bisher sind die homologen Gene Hes1 bis Hes7 in Mensch und
Maus kloniert worden. Die Hey-Gene bilden eine neue Gruppe der hairy-verwandten
Gene, ihre Beschreibung erfolgt im nächsten Abschnitt.
Einleitung 6
Hes1, Hes5 und Hes7 werden wie E(spl) vom Notch-Signalweg gesteuert, während die
Expression von Hes2, Hes3 und Hes6, wie die von hairy, Notch-unabhängig zu sein
scheint (Bessho et al., 2001a; Koyano-Nakagawa et al., 2000; Nishimura et al., 1998).
Hes1-/--Mäuse sterben während der embryonalen Entwicklung mit schweren
Neurulationsdefekten, die auf die Überexpression des proneuralen Mash1-Gens
zurückgeführt werden. Die fehlende Repression durch Hes1 führt dabei zur vorzeitigen
neuronalen Differenzierung (Ishibashi et al., 1995). Diese Mäuse fallen außerdem durch
eine Hypoplasie der Bauchspeicheldrüse auf, da eine zu frühe Differenzierung endokriner
Zellen zur Depletion epithelialer Vorläuferzellen führt. Auch im Magen-Darm Trakt wird
eine Hyperplasie endokriner Zellen beobachtet (Jensen et al., 2000). Dies ist ein
deutlicher Hinweis für die Bedeutung von Hes1 als reprimierender Regulator in der
Differenzierung endokriner Zellen. Eine Aufgabe von Hes5 besteht darin, die
Differenzierung retinaler Stammzellen in Richtung Müller-Glia zu steuern (Hojo et al.,
2000), was auch für Hey2 postuliert wurde (Satow et al., 2001).
Im Genom des Huhns wurden zwei hairy/E(spl)-Homologe gefunden, die als c-hairy1 und
c-hairy2 publiziert wurden. Die Untersuchung der c-hairy1-Expression während der
Somitogenese führte zu einer sehr interessanten Beobachtung. Während der Bildung
eines Somiten aus dem präsomitischen Mesoderm (PSM), wandert die c-hairy1-
Expression vom kaudalen zum kranialen Abschnitt des PSM. Dieses rhythmische
Expressionsmuster wiederholt sich bei der Bildung aller Somiten in etwa 90 minütigen
Zyklen. Die c-hairy1-mRNA-Expression wird dabei nicht durch das umgebende Gewebe
gesteuert oder durch ein Signal von benachbarten Zellen von kaudal nach rostral geleitet,
was Explantations- und Durchtrennungsversuche bewiesen. Sie ist ebenso unabhängig
von Zellbewegungen oder der de novo Proteinbiosynthese (Palmeirim et al., 1997). Die
autonome, zyklische c-hairy1-Expression stellt damit ein Erklärungsmodell für die so
exakt ablaufende Somitogenese dar, die wie durch ein „molekulares Uhrwerk“ gesteuert
wird (Cooke and Zeeman, 1976). Ein ähnliches Verhalten wie c-hairy1 zeigt auch das
verwandte c-hairy2-Gen, sowie die murinen Gene Hes1, Hes7 und lunatic fringe (Aulehla
and Johnson, 1999; Bessho et al., 2001b; Jouve et al., 2000). Kürzlich wurde von zwei
Arbeitsgruppen ein Abschnitt im lunatic fringe-Promoter identifiziert, der für das „cycling“
des Gens verantwortlich ist. Interessanterweise wird auch dieses Element durch Notch
gesteuert (Cole et al., 2002; Morales et al., 2002).
Einleitung 7
1.3 Die Hey-Gene als neue Familie der hairy- und E(spl)-verwandten Gene
Bei der Suche nach Genen, die die Differenzierung von metanephrogenem Mesenchym
während der Nierenentwicklung der Maus steuern, wurde mit dem „Differential Display
PCR“-Verfahren ein unbekanntes Gen (Hey1: hairy and Enhancer of split related with
YRPW motif) entdeckt, das große Homologie zu den Hes-Genen aufwies (Leimeister et
al., 1999a; Leimeister et al., 1999b). Anschließende Datenbanksuchen führten zur
Identifikation von zwei weiteren verwandten Genen (Hey2, HeyL) und den
entsprechenden Genen des Menschen. Die chromosomale Kartierung ergab, dass Hey1
auf Chromosom 8q21, Hey2 auf 6q21 und HeyL auf 1q34.3 lokalisiert sind. Alle Gene
besitzen eine ähnliche Struktur mit fünf Exons (Steidl et al., 2000).
Promoterstudien belegten, dass die Hey-Gene Zielgene des Notch-Signalweges sind
(Maier and Gessler, 2000). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des
Notch-Weges durch seine Liganden zu einer RBP-Jκ-abhänigigen Expression von Hey1,
Hey2 und HeyL führt (Iso et al., 2002; Iso et al., 2001a; Lin et al., 2000).
Während der Embryonal- und Fetalentwicklung der Maus werden alle Hey-Gene
dynamisch exprimiert, wobei ihr Expressionsmuster teilweise überlappend und teilweise
komplementär ist. In neu entstehenden Somiten werden sie in der posterioren Hälfte
coexprimiert, während Hey1 und Hey2 bei der Herzentwicklung ein komplementäres
Expressionsmuster aufweisen. Dabei ist Hey1 in den atrialen und Hey2 in den
ventrikulären Abschnitten exprimiert, während HeyL nicht detektiert werden kann. Eine
Hey1-Expression wird v.a. in den Kiemenbögen, der kraniofazialen Region, der dorsalen
Aorta und Teilen des zentralen Nervensystems beobachtet. Hey2 wird in Arterien, den
Kiemenbögen, der kraniofazialen Region und Teilen des zentralen und peripheren
Nervensystem exprimiert, während HeyL in Arterien, im Telencephalon, den
Spinalganglien und in den Kiemenbögen exprimiert wird (Leimeister et al., 1999b;
Leimeister et al., 2000b).
Die Analyse der vorhergesagten Hey-Proteinstruktur zeigte, dass diese Gene nicht
weitere Mitglieder Hes-Familie darstellen, sondern sich von diesen abgrenzen. Die Hey-
Gene kodieren ebenfalls basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren, die neben der
bHLH-Domäne eine sogenannte Orange-Domäne (Helices 3 und 4) besitzen. Hey-
Proteine besitzen allerdings einen Glycinrest in der basischen Domäne anstelle eines
charakteristischen Prolins. Am Caboxyterminus besitzen alle hairy/E(spl)/Hes-Proteine
ein WRPW-Motiv (Trp-Arg-Pro-Trp). Dieses nur vier Aminosäuren lange Peptid ist
entscheidend für die Proteininteraktion mit dem Corepressor Groucho/TLE1 (Fisher et al.,
1996). Bei den Hey-Proteinen findet sich dagegen nicht das klassische WRPW-Motiv,
Einleitung 8
sondern ein YRPW, bzw. YQPW im murinen Hey2, und ein noch weiter abgewandeltes
YHSW im HeyL (Hey like) Protein (s. Abb. 2). Zusätzlich besitzen sie carboxyterminal
sechs konservierte Aminosäuren TE(I/V)GAF, die allerdings im evolutionär älteren
Drosophila Hey-Protein nicht gefunden werden. Die Analyse der phylogenetischen
Verwandtschaft verschiedener hairy/E(spl)/Hey-Proteine mit dem ClustalX Programm (s.
Abb. 3) ergab eindeutig, dass Hey-Proteine eine eigenständige Subklasse der hairy-
verwandten Transkriptionsfaktoren bilden (Leimeister et al., 1999b).
Hey1Orangebasic HLH YRPW
Abb. 2: Schematische Darstellung der wichtigsten Domänen des Hey1-Protein.
Abb. 3: Phylogenetische Verwandtschaft der hairy/E(spl)-verwandten Proteine verschiedener Spezies. h: Mensch, m: Maus, d: Drosophila, c: Huhn, zf: Zebrafisch. Der Baum wurde mit dem ClustalX Programm konstruiert und zeigt die Eigenständigkeit der Hey-Gene innerhalb der hairy/E(spl)/Hes-Familie.
Basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren bilden in der Regel Dimere über nicht-
kovalente Interaktionen im Bereich der Helices aus. Mit ihrer basischen Domäne (12-14
Aminosäuren) können sie dann spezifisch an DNA-Sequenzen in Promoterregionen
regulierter Gene binden, um deren Transkription zu steuern (s. Abb 4).
Einleitung 9
Abb. 4: Modell der Interaktion zweier bHLH-Faktoren. Die Proteine binden über die Helices aneinander. Die DNA-Bindung erfolgt durch basische Aminosäuren (Gilbert, 1997).
Die DNA-Bindung erfolgt an spezifischen
Erkennungssequenzen, wobei viele bHLH-
Proteine an sogenannte E-Box Sequenzen
(CANNTG) binden (Murre et al., 1989). hairy, E(spl)- und Hes-Proteine binden dagegen
die N-Box Sequenz CACGCG (Akazawa et al., 1992; Ohsako et al., 1994; Van Doren et
al., 1994). Jedoch wurde später für E(spl) die E-Box Sequenz CACGTG als ideale
Bindungsstelle postuliert (Jennings et al., 1999).
E(spl)-Proteine bilden Homo- und Heterodimere mit jeweils unterschiedlicher Affinität.
Eine Gruppe interagiert mit den proneuronalen Proteinen achaete, scute, asense und
atonal, eine andere mit dem E-Protein Daughterless und einige mit beiden. hairy
interagiert hingegen mit den zuvor genannten Proteinen nicht (Alifragis et al., 1997).
Hes1 und Hes3 bilden Heterodimere mit E47 (Sasai et al., 1992). Für Hey1 und Hey2
wurden im Verlauf dieser Arbeit von anderen Gruppen ebenfalls Interaktionsproteine
beschrieben. Sie können mit dem bHLH-PAS-Protein ARNT/HIF-1b Dimere bilden und
dadurch als Transkriptionsrepressoren wirken (Chin et al., 2000). Kürzlich wurde gezeigt,
dass Hey1 und Hey2 mit Hes1 interagieren und interessanterweise mit ihrer bHLH-
Domäne auch den Corepressorkomplex mSin3a rekrutieren können (Iso et al., 2001b).
Zudem können alle Hey-Proteine mit den bHLH-Faktoren eHAND und dHAND Dimere
bilden (Firulli et al., 2000).
Die Orange-Domäne ist ein Charakteristikum der hairy/E(spl)-bHLH-Faktoren. Sie bedingt
spezifische Funktionen verschiedener Mitglieder der hairy/E(spl)-Familie, wie z.B. die
Suppression von scute durch hairy (Dawson et al., 1995; Giebel and Campos-Ortega,
1997). Die Inhibition der Differenzierung und Proliferation von PC12-Zellen durch Hes1
wird ebenfalls durch die Orange-Domäne moduliert (Castella et al., 2000) und auch die
Repressoraktivität von ARNT/Hey2-Dimeren wird durch die Hey2-Orange-Domäne
beeinflusst (Chin et al., 2000).
Einleitung 10
Das charakteristische WRPW-Motiv der hairy/E(spl)/Hes-Proteine stellt eine
Transkriptionsrepressor-Domäne dar, da es den Corepressor Groucho bzw. die
homologen TLE-Proteine bindet. (Fisher et al., 1996; Grbavec and Stifani, 1996; Paroush
et al., 1994). Das ähnliche VWRPY-Motiv der runt-Proteinfamilie, zu der das humane
akute myeloische Leukämie-Gen 1 (AML1) gehört, interagiert ebenfalls mit Groucho und
seinen Homologen (Aronson et al., 1997; Imai et al., 1998). Schließlich ist auch eine
FRPW-Sequenz im aminoterminalen Abschnitt des Drosophila huckebein-Protein fähig
zur Interaktion mit Groucho (Goldstein et al., 1999). Die genannten Interaktionen deuten
darauf hin, dass Hey-Proteine mit ihrem YRPW-Motiv ebenfalls TLE-Proteine rekrutieren
könnten. Einen Hinweis für die Bedeutung des Hey2-Carboxyterminus liefert die Analyse
der gridlock-Mutation im Zebrafisch, die durch eine Punktmutation im Stopcodon des
Zebrafisch Hey2-(gridlock)-Gens verursacht wird. Dabei wird ein um 44 Aminosäuren
verlängertes Hey2-Protein translatiert. Diese Mutation führt zu einer gravierenden
Gefäßmissbildung am Zusammenfluss der beiden lateralen dorsalen Aorten, die der
Aortenisthmusstenose des Menschen ähnlich ist (Weinstein et al., 1995; Zhong et al.,
2000). Möglicherweise kann das verlängerte gridlock-Protein einen carboxyterminalen
Interaktionspartner nicht mehr binden und verliert dadurch seine Aktivität.
Wichtig für das Verständnis der Hey-Proteine ist daher die Erforschung ihrer
Interaktionspartner. Mit diesem Wissen können dann die DNA-Bindungseigenschaften
evaluiert werden und die Suche nach regulierten Genen begonnen werden. Der
entscheidende Schritt zum Verständnis der Funktion eines Genes liegt oft in der gezielten
Ausschaltung im Mausgenom und der anschließenden Analyse des Phänotyps, weshalb
diese Untersuchungen nach der biochemischen Charakterisierung angeschlossen
wurden.
Während dieser Arbeit wurden die Hey-Gene auch von anderen Arbeitsgruppen kloniert
und unter folgenden Namen publiziert: Hesr (hairy and E(spl) related) (Kokubo et al.,
1999), HRT (hairy related transcription factor) (Nakagawa et al., 1999), CHF
(cardiovascular helix-loop-helix factor) (Chin et al., 2000) und Herp (Hes related
repressor) (Iso et al., 2001a).
1.4 Das Yeast Two-Hybrid System
Das Yeast Two-Hybrid System ist eine der wichtigsten Techniken, die im Rahmen dieser
Arbeit zur Identifikation von Protein-Protein Wechselwirkungen eingesetzt wurde. Daher
soll das System hier kurz beschrieben werden.
Einleitung 11
Die Yeast Two-Hybrid Methode wurde 1989 erstmals von Fields und Song beschrieben,
die damit die Proteininteraktion SNF1-SNF4 nachwiesen (Fields and Song, 1989). Sie
basiert auf den Beobachtungen, dass die beiden isolierten Domänen des GAL4-
Transkriptionsfaktors, die GAL4-DNA bindende-Domäne (DBD) und die GAL4-
transkriptionsaktivierende Domäne (AD) nicht miteinander interagieren und damit auch
nicht mehr die Transkription von Genen bewirken können, wenn sie in einer Hefezelle
coexprimiert werden. Werden die beiden Domänen allerdings in enge räumliche Nähe
gebracht, wird die GAL4-Transkriptionsaktivität wiederhergestellt und die entsprechend
kontrollierten Gene transkribiert (Brent and Ptashne, 1985; Ma and Ptashne, 1987). Um
zwei Proteine auf mögliche Interaktion hin zu testen, wird daher das erste Protein („bait“,
Köder) an die DNA-bindende Domäne und das zweite („prey“, Beute) an die aktivierende
Domäne fusioniert. Binden die beiden Testproteine aneinander, wird die GAL4-
Transkriptionsaktivität wiederhergestellt, binden sie nicht, werden die Reportergene nicht
transkribiert (Abb. 5). Mit dem Yeast Two-Hybrid System können nicht nur Interaktionen
weniger Proteine analysiert werden (Chien et al., 1991; Gyuris et al., 1993), sondern es
ist auch möglich, neue Interaktionsproteine aus einer komplexen Genbank zu isolieren
(Bendixen et al., 1994).
DNA binding site Reporter gene
GAL4-DBD
bait
prey
GAL4-Activation Domain
Abb. 5: Prinzip des Yeast Two-Hybrid Assays. Zwei interagierende Proteine („bait“ und „prey“) sind die an die DNA-bindende Domäne (DBD) bzw. die aktivierende Domäne des GAL4-Transkriptionsfaktors gekoppelt. Durch die Interaktion zwischen den Testproteinen wird die Aktivität des GAL4-Transkriptionsfaktors wiederhergestellt und die Reportergene transkribiert.
Es wurden mehrere Yeast Two-Hybrid Systeme mit unterschiedlichen DBD (GAL4,
LexA), AD (GAL4, VP16, B42), Reportergenen (LEU2, HIS3, ADE2, TRP1, URA3, CYH2,
lacZ) und Hefestämmen entwickelt, die alle auf dem ursprünglichem Prinzip beruhen.
Inzwischen gibt es Variationen des Two-Hybrid Systems, mit denen auch Mutationen
Einleitung 12
eines Testproteins (reverse Two-Hybrid), Protein-DNA Bindungen (One-Hybrid) und
Protein-DNA Bindungen (Three-Hybrid) untersucht werden können (Vidal et al., 1996;
Vidal and Legrain, 1999). Es gibt ebenfalls Bemühungen ein Two-Hybrid System in
E. coli Bakterien zu etablieren, das die aufwendigen Hefetransformationen und Plasmid-
präparationen aus Hefezellen überflüssig macht (Hu et al., 2000).
Die Sensitivität des Yeast Two-Hybrid Assays ist hoch und es können auch schwache
Interaktionen (KD=10-6) nachgewiesen werden (Estojak et al., 1995). Ein Nachteil des
Verfahrens ist jedoch der große Anteil falsch-positiver Ergebnisse. Dies kann zu einem
grossen Teil auf Proteine („self activators“) zurückgeführt werden, welche die
Transkription der Reportergene direkt aktivieren, indem sie an bestimmte
Promoterregionen binden oder durch Interaktion mit endogenen Hefeproteinen die
Transkription der Reportergene starten. Der Anteil der „self activators“ aus einer Genbank
kann bis zu drei Größenordnungen höher sein als der wirklicher Interaktionsproteine
(Walhout and Vidal, 1999).
Im Rahmen der Proteomforschung wird versucht mit Hilfe von Yeast Two-Hybrid
Verfahren sämtliche Protein-Wechselwirkungen in einer Zelle zu finden, was einen
wichtigen Schritt zum Verständnis der hochkomplexen Vorgänge in einer Zelle darstellt.
Zudem dient die Technologie der Suche nach neuen Arzneimitteln und der Analyse von
Arzneimittelwirkungen (Colas and Brent, 1998).
1.5 Zielsetzung
Die Hey-Gene gehören zur Familie der hairy- und E(spl)-verwandten Gene. Ihre
dynamische Expression während der murinen Embryonalentwicklung, ihre Regulation im
Notch-Signaltransduktionsweg und ihre hohe Konservierung zwischen verschiedenen
Spezies deuten auf entscheidende entwicklungsbiologische Funktionen hin.
Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionen der Hey-Proteine mit anderen Proteinen zu
analysieren, neue Interaktionspartner zu identifizieren, die Protein-DNA-Bindung zu
untersuchen und die Hey2-Genfunktion anhand von Knockout-Mausmodellen weiter zu
erforschen.
Es sollte ein neues Screening-Verfahren zum Auffinden unbekannter Proteininteraktionen
auf Proteinexpressionsfiltern getestet werden. Weiterhin sollte der Yeast Two-Hybrid
Assay für Hey1 und Hey2 etabliert werden, um mit direkten Tests Protein-Protein
Bindungen in vivo nachzuweisen und embryonale Genbanken nach neuen Hey-
Bindungspartnern zu durchsuchen. Daraus isolierte Klone waren zu sequenzieren und
Einleitung 13
mit Hilfe vom Gen-Datenbanken zu analysieren. Mögliche Interaktionen mussten mit
GST-Pulldown Assays verifiziert werden.
Die Bindung von Hey1, Hey2 und weiteren bHLH-Proteinen an eine DNA-Zielsequenz
sollte mit Electrophoretic Mobility Shift Assays untersucht werden.
Zur weiteren Aufklärung der Funktion des Hey2-Gens sollten Hey2-Knockoutmäuse
phänotypisiert werden. Die lacZ-Expression dieser Mäuse war mit der von Hey2 im
Wildtyp in verschiedenen Entwicklungsstadien zu vergleichen. Da die frühe postnatale
Letalität der Homozygoten durch eine Herz- oder Gefäßerkrankung verursacht zu sein
schien, wurden sowohl klinische, als auch makro- und histopathologische
Untersuchungen des Herz- und Kreislaufsystems vorgenommen. Um eine mögliche
Redundanz der Hey-Gene festzustellen, waren Genexpressionsstudien von Hey1 und
HeyL mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierung an Hey2-Knockoutmäusen durchzuführen.
Material 14
2 Material 2.1 Plasmid-Vektoren
pBluescript II KS (+/-)
GenBank® X52327 bzw. X52329; Stratagene, La Jolla, CA, USA
pGBKT7
Expressionsvektor für Fusionsproteine,
kodiert die GAL4-DNA-bindende Domäne, c-
myc-Epitop und "„bait“"-Protein. Als Shuttle-
Vektor kann pGBKT7 sowohl in E. coli
(Selektionsmarker Kanamycin) als auch in
Hefezellen (Nutritionsmarker Tryptophan)
autonom repliziert werden. Clontech, Palo
Alto, CA, USA
pGADT7
Mit Hilfe dieses Vektors lassen sich
Fusionsproteine (GAL4-Aktivierungsdomäne-HA-
Epitop-„prey“-Protein) in Bakterien und Hefezellen
(Nutritionsmarker Leucin) herstellen. Der Vektor
besitzt wie pGBKT7 eine T7-Promotersequenz für
die in vitro Translation des „prey“-Proteins.
Clontech, Palo Alto, CA, USA
pACT2
Dieser Vektor hat die gleiche Funktion wie pGADT7, jedoch besitzt er keine T7-
Promotersequenz. Der Vektor liegt im Gegensatz zu pGADT7 nur in wenigen Kopien in
E. coli vor (low copy plasmid). Die im Yeast Two-Hybrid Screen verwendeten Genbanken
waren in diesen Vektor kloniert. GenBank® U29899; Clontech, Palo Alto, CA, USA
pGEX-Vektoren
Vektoren zur Produktion von Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteinen,
Pharmacia-Biotech, Freiburg.
Material 15
pMBP-Vektoren
Vektoren zur Produktion von Maltose-bindenden Fusionsproteinen, New England
Biolabs, Frankfurt.
pcDNA3-TLE1
TLE1-cDNA im pcDNA3-Vektor kloniert. Stefano Stifani, Montreal, Quebec, Kanada
pBS-MATH4A
Math4A-cDNA im Bluescript®-Vektor. Gèrald Gradwohl, IGBMC, Illkirch, Frankreich
pASV3-E12bHLH
pASV3 ist ein Yeast Two-Hybrid „prey“-Vektor. Hier wurde die bHLH-Domäne von E12
kloniert. Gèrald Gradwohl, IGBMC, Illkirch, Frankreich
pASV3-MASH1bHLH
pASV3 kodiert bHLH-Domäne von Mash1. Gèrald Gradwohl, IGBMC, Illkirch, Frankreich
pDC 952
Der Vektor kodiert eine Arginin t-RNA, um bei prokaryotischer Proteinexpression den
Einbau dieser Aminosäure zu verbessern.
2.2 Bakterien, Hefen und Zellinien
Bakterienstämme
E. coli DH5α (Hanahan, 1983)
E. coli BL21 (DE3)
Novagen, Bad Soden
E. coli BL21 (DE3) pLysS
BL21 (DE3) mit dem Plasmid pLysS transformiert, das für T7-Lysozym kodiert, einem
Inhibitor der T7-RNA-Polymerase. Dadurch werden Proteine, die unter Kontrolle des T7-
Promoters liegen, erst nach IPTG-Induktion exprimiert. Novagen, Bad Soden
Material 16
Hefestämme
S. cerevisiae AH109
MATa (James et al., 1996). Transformationsmarker: trp1, leu2; Reportergene: ADE2,
HIS3, lacZ; Clontech
S. cerevisiae Y187
MATα (Harper et al., 1993). Transformationsmarker: trp1, leu2; Reportergen: lacZ;
Clontech
Eukaryotische Zellinien
HEK 293T
Immortalisierte Linie humaner embryonaler Nierenzellen (ATCC CRL1573), welche das
große SV40-T-Antigen exprimieren.
2.3 Mausstämme
CD-1 (ICR)BR, Auszucht-Maus Charles River, Deutschland
C57 BL/6, Inzucht-Mausstamm Charles River, Deutschland
Dll1-Knockout Mäuse Martin Hrabe de Angelis, GSF, München
Hey2-Knockout Mäuse Manfred Gessler, Würzburg
2.4 Oligonukleotide
Oligonukleotide wurden mit Hilfe des Programms Primer 3 (http://www-
genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) konstruiert und von MWG Biotech
(Ebersberg) synthetisiert.
Name Sequenz 5‘→3‘ act2forw CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GC act2rev ATG CAC AGT TGA AGT GAA CTT clikBE CGC GGA TCC GAA TTC CCA TGT CCC CAA CGA clikSal CGA CGT CGA CTA GTC CAT AGC CAG GGC G
Material 17
clk4 CGC TGA GGC AAA CGG AAT clk7EcoRI CGC GAA TTC TCC ATG TCC CCA ACG ACA clk8BamHI CGC GGA TCC GAG GCC ACC GTG AGC GCC clk9EcoRI GCG GAA TTC GGT GGC CTC GGA CAC ATT clk10BamHI GCG GGA TCC AAG CTT TCC CCT CCC TTG clk11-EcoRI GCG GAA TTC CGA GAC CGA ATC AAT AAC AG clk12-EcoRI GCG GAA TTC TAT CGG AGT TTG GGG TTT C clk13-Bam CGC GGA TCC GTG CAG CAT TTT CAG GTG clk14-Bam CGC GGA TCC GCT CGC GGC TTC CCG CTG clkOr forw GCG GAA TTC AAA ATG CTG CAC ACT clkOr rev CGC CTG CAG CTA AGC GCC GCT CGC GGC E12B CGC GGA TCC AGG ACG ACC TTC TCC CC E12S CGA CGT CGA CTA TGG GTC CCC GAC CAC Eco-yrpw CGG CGA ATT CTT TTC CTT CAG CTC CTT CCA FOGforw GCG GGA TCC GCC TTT ACC CTG GAG CA gbkforward GTT GAC TGT ATC GCC GGA AT gbkreverse ACC CCT CAA GAC CCG TTT AG Hey2ko-test3‘ TCG GTG AAT TGG ACC TCA TCA CTG AGC Hey2ko-test5‘ GCT GTC TCA AGG CCT CAA CAG CAT TG Hey-tar-1a AGCTTGATATGGCACGTGCCAGTCTG Hey-tar-1b GATCCAGACTGGCACGTGCCATATCA ITF1B CGC GGA TCC GGG CCC GGA CCA G ITF1S CGA CGT CGA CTA GGC TGC TTT GGG ATT C ITF2B CGC GGA TCC AGC AGA AGG CAG AGC G ITF2S CGA CGT CGA CTA CTC CGA GGA CAC CTT C KGreverse CCG TCA TCA TCA CCG AAA CGC GCG M13 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC MyoB CGC GGA TCC GCT TGC TGT GGG CCT G MyoS CGA CGT CGA CTA CGG TCC AGG TGC GTA sWRPW GCT TTA AAG CCG TGG CGT CCG TGG GGT ACT sWRPY GCT TTA AAG CCG TAT CGT CCG TAC GGT ACT sYRPW GCT TTA AAG CCG TAT CGT CCG TGG GGT ACT T7pACT CGG GAT CCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG ACA GAC CAC CAT GGC TTA CCC
Hinweis: clik, blik und flik sind die ursprünglichen Labornamen von Hey1, Hey2 und
HeyL.
Material 18
2.5 Medien, Puffer und Lösungen Medien
LB-Medium
Bacto-Pepton 10 g/l
Bacto-Hefeextrakt 5 g/l
Natriumchlorid 5 g/l
SD-Medium
Yeast nitrogen base 6,7 g/l
Glukose 20 g/l
10x Aminosäurenmix 100 ml/l
10x Aminosäurenmix für SD-Medium:
L-Adeninhemisulfat 200 mg/l
L-Arginin/HCl 200 mg/l
L-Histidin/HCl-monohydrat 200 mg/l
L-Isoleucin 300 mg/l
L-Leucin 1000 mg/l
L-Lysin/HCl 300 mg/l
L-Methionin 200 mg/l
L-Phenylalanin 500 mg/l
L-Threonin 2000 mg/l
L-Tryptophan 200 mg/l
L-Tyrosin 300 mg/l
L-Uracil 200 mg/l
L-Valin 1500 mg/l
SOB-Medium
Bacto-Pepton 20 g/l
Bacto-Hefeextrakt 5 g/l
Kaliumchlorid 0,2 g/l
Natriumchlorid 0,6 g/l
pH 7,6 mit KOH einstellen. Unmittelbar vor Gebrauch 20 ml/l MgSO4 (1 M) zugeben.
Material 19
YPDA-Medium
Bacto-Pepton 20 g/l
Bacto-Hefeextrakt 10 g/l
Glukose 20 g/l
Adeninhemisulfat (0,2 %) 15 ml/l
2x YT-Medium
Bacto-Pepton 16 g/l
Bacto-Hefeextrakt 10 g/l
Natriumchlorid 5 g/l
Antibiotika
Ampicillin 100 mg/l
Chloramphenicol 12,5 mg/l
Kanamycin 30 mg/l
Agar
Zur Herstellung von Agarplatten werden 11 g/l Bacto-Agar zugesetzt.
Puffer und Lösungen
2x AP-Substrat-Puffer (Screening von Proteinexpressionsfiltern)
para-Nitrophenylphosphat 0,67 % (w/v) 6,67 g/l
Magnesiumchlorid (1 M) 1 mM 1 ml/l
Diethanolamin (pH 9,8, 2 M) ad 1 l
Bead-binding-buffer (GST-Pulldown)
Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,1 M) 50 mM 500 ml/l
Kaliumchlorid 150 mM 11,2 g/l
Magnesiumchlorid (1 M) 1 mM 1 ml/l
Glycerin (87 % v/v) 10 % (v/v) 115 ml/l
Triton X-100 1 % (v/v) 10 ml/l
CaCl/HEPES-Puffer (pH 7,0)
HEPES 100 mM 23,8 g/l
Calciumchlorid, Dihydrat 0,5 M 73,5 g/l
Material 20
Coating-Puffer (pH 9,6) für ELISA
Natriumcarbonat 15 mM 2,67 g/l
Natriumhydrogencarbonat 35 mM 2,94 g/l
Natriumazid 0,02 % (w/v) 0,2 g/l
Coomassie-Lösung
Coomassie Brillant Blue 3 mM 2,5 g/l
Methanol 50 % (v/v) 500 ml/l
Essigsäure 12,5 % (v/v) 125 ml/l
10x Cosmid-Einfrierpuffer
di-Kaliumhydrogenphosphat 360 mM 82,2 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat 132 mM 17,9 g/l
tri-Natriumcitrat, Dihydrat 17 mM 4,90 g/l
Magnesiumsulfat 4 mM 0,98 g/l
Ammoniumsulfat 68 mM 8,98 g/l
Glycerin 44 % (v/v) 440 ml/l
Denaturierungspuffer (Filterhybridisierung)
Natriumchlorid 1,5 M 87,7 g/l
Natriumhydroxid 0,5 M 20,0 g/l
DEPC-H2O
Diethylpyrocarbonat (DEPC) 0,01 % (v/v) 100 µl/l
DEPC wird zugeben und über Nacht stehen gelassen, bevor die Lösung autoklaviert
wird.
DnD-Lösung (kompetente Zellen)
DTT 1 M 154,3 g/l
DMSO 90 % (v/v) 900 ml/l
Kaliumacetat (pH7,5, 1 M) 10 mM 10 ml/l
Entfärber I (Coomassie Färbung)
Methanol 45 % (v/v) 450 ml/l
Essigsäure 10 % (v/v) 100 ml/l
Material 21
Entfärber II (Coomassie Färbung)
Methanol 5 % (v/v) 50 ml/l
Essigsäure 5 % (v/v) 50 ml/l
EMSA-binding buffer
Tris/HCl (pH 7,9, 1 M) 20 mM 20 ml/l
HEPES (pH 7,9, 1 M) 20 mM 20 ml/l
Kaliumchlorid 100 mM 7,46 g/l
Magnesiumchlorid (1 M) 1 mM 1 ml/l
EDTA (0,5 M) 1 mM 2 ml/l
DTT (1 M) 1 mM 1 ml/l
Glycerin (87 %) 12 % (v/v) 1138 ml/l
Gelladepuffer (DNA-Agarosegel)
Bromphenolblau 3,6 mM 2,5 g/l
EDTA (0,5 M) 10 mM 20 ml/l
Ficoll 15 % (w/v) 15,0 g/l
Glycinpuffer (pH10,4)
Glycin 100 mM 7,5 g/l
Zinkchlorid 1 mM 136 µg/l
Magnesiumchlorid (1 M) 1 mM 1 ml/l
2x HBS-Puffer (pH 7,05)
HEPES 50 mM 11,9 g/l
Natriumchlorid 280 mM 16,4 g/l
di-Natriumhydrogenphosphat, Dihydrat 1,5 mM 267 mg/l
Hybridisierungslösung 5 % (Church)
EDTA (0,5 M) 2 mM 42 ml/l
SDS (20 % w/v) 5 % (w/v) 250 ml/l
di-Natriumhydrogenphosphat (1 M) 0,5 M 500 ml/l
Hybridisierungspuffer (RNA in situ Hybridisierung)
Formamid (deionisiert) 50 % (v/v) 500 ml/l
20x SSC (pH 5) 1,3 x 65 ml/l
EDTA (0,5 M) 5 mM 10 ml/l
Material 22
CHAPS 0,5 % (v/v) 5 ml/l
Heparin 0,1 % (w/v) 100 mg/l
Tween-20 0,2 % (v/v) 2 ml/l
Hefe tRNA 0,1 % (w/v) 100 mg/l
Kaliumphosphatpuffer 0,1 M (pH 7,4)
Kaliumhydrogenphosphat (1 M) 80 mM 80 ml/l
Kaliumdihydrogenphosphat (1 M) 20 mM 20 ml/l
Lachssperma-DNA
10 mg/ml Lachssperma-DNA werden in TE-Puffer gelöst, durch Ultraschallbehandlung
auf eine durchschnittliche Fragmentlänge von 500 bp zerkleinert und anschließend bei
-20 °C aufbewahrt.
lacZ-Färbelösung
Kaliumferrocyanid (0,4 M) 0,8 mM 2 ml/l
Kaliumferricyanid (0,4 M) 0,8 mM 2 ml/l
X-Gal (40 mg/ml in DMSO) 1 g/l 25 ml/l
lacZ-Fixierpuffer
EDTA (0,5 M) 0,5 mM 1 ml/l
Magnesiumchlorid (1 M) 2 mM 2 ml/l
Glutaraldehyd (25 %) 0,2 % (v/v) 8 ml/l
ad 1 l 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer
lacZ-Waschpuffer
Magnesiumchlorid (1 M) 1,5 mM 1,5 ml/l
Desoxycholsäure (1 %) 0,01 % (v/v) 10 ml/l
NP-40 (2 %) 0,02 % (v/v) 20 ml/l
ad 1 l 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer
Lysis Puffer (Mausorgane für DNA-Extraktion)
Natriumchlorid (5 M) 100 mM 20 ml/l
Na-larosylsacrosyin (10 %) 0,5 % (v/v) 50 ml/l
MABT
Maleinsäure (1 M) 100 mM 100 ml/l
Material 23
Natriumchlorid 150 mM 8,77 g/l
Tween-20 1 % (v/v) 10 ml/l
Natriumphosphatpuffer
di-Natriumhydrogenphosphat 1 M 89,0 g/l
ortho-Phosphorsäure (85 % v/v) 4 ml/l
Neutralisationspuffer (pH 7,5) für Filterhybridisierung
Tris 0,5 M 60,6 g/l
Natriumchlorid 0,5 M 29,2 g/l
Salzsäure, konzentriert ca. 50 ml/l
NTE (RNase Puffer)
Natriumchlorid 0,5 M 2,9 g/l
Tris/HCl (pH 7,0, 1 M) 10 mM 10 ml/l
EDTA (0,5 M) 5 mM 10 ml/l
NTMT
Natriumchlorid 100 mM 0,58 g/l
Tris/HCl (pH9,5, 1 M) 100 mM 100 ml/l
Magnesiumchlorid (1 M) 50 mM 50 ml/l
Tween-20 0,1 % (v/v) 1 ml/l
Oligo labeling (OLB-) Mix (2 ml)
Hexanukleotide (50 OD-Einheiten) ca. 50x 33 µg
Magnesiumchlorid (1 M) 100 mM 200 µl
DTT (1 M) 10 mM 20 µl
BSA (25 mg/ml) 125 mg/l 100 µl
dATP, dGTP, dTTP (je 0,1 M) 0,5 mM je 10 µl
Tris/HCl (pH 7,6, 1 M) 250 mM 500 µl
ddH2O ad 2 ml
10x PBS (pH 7,2)
Natriumchlorid 1,4 M 80 g/l
Kaliumchlorid 27 mM 2 g/l
di-Natriumhydrogenphosphat, Dihydrat 80 mM 14,4 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat 18 mM 2,4 g/l
Material 24
10x PCR-Puffer
Tris 0,1 M 12,1 g/l
Kaliumchlorid 0,5 M 37,3 g/l
Magnesiumchlorid, Hexahydrat 66 mM 13,4 g/l
Triton X-100 (10 % v/v) 0,2 % (v/v) 20 ml/l
BSA (25 mg/ml) 2,0 g/l 135 ml/l
PEG/LiAc-Lösung (Hefetransformation)
Polyethylenglykol 3.350 (50 % w/v) 40 % (w/v) 800 ml/l
10x TE-Puffer (pH 7,5) 10 % (v/v) 100 ml/l
Lithiumacetat (pH 7,5, 1 M) 10 % (v/v) 100 ml/l
RIPA
SDS (20 % w/v) 0,1 % (w/v) 5 ml/l
Natriumchlorid (5 M) 150 mM 30 ml/l
NP-40 1 % (v/v) 10 ml/l
Deoxycholat 0,5 % (w/v) 5 g/l
EDTA (0,5 M) 5 mM 10 ml/l
Tris/HCl (pH 8,0, 1 M) 50 mM 50 ml/l
Säulenpuffer (MBP-Proteine)
Tris/HCl (pH 7,4, 1 M) 20 mM 20 ml/l
Natriumchlorid (5 M) 200 mM 40 ml/l
EDTA (0,5 M) 1 mM 2 ml/l
DTT (1 M) 1 mM 1 ml/l
10x SDS-Laufpuffer (pH 8,3) für PAGE
Tris 25 mM 3,02 g/l
Glycin 2,5 M 188 g/l
SDS (20 % w/v) 1 % (w/v) 50 ml/l
2x SDS-Probenpuffer (PAGE)
Tris/HCl (pH 6,8, 1 M) 100 mM 100 ml/l
SDS (20 % w/v) 4 % (w/v) 200 ml/l
Bromphenolblau 3 mM 2 g/l
Glycerin 22,9 % (v/v) 229 ml/l
DTT (1 M) 200 mM 200 ml/l
Material 25
Spheroblast-Puffer (Hefe DNA-Extraktion)
Sorbitol 1,2 M 218,6 g/l
Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 1 M) 100 mM 100 ml/l
Yeast lytic Enzym (70T) 2,5 g/l
20x SSC
Natriumchlorid 3 M 175 g/l
tri-Natriumcitrat, Dihydrat 0,3 M 88,2 g/l
STET (“DNA boiling-prep”)
Saccharose 8 % (w/v) 80 g/l
Triton X-100 5 % (v/v) 50 ml/l
EDTA (0,5 M) 50 mM 100 ml/l
Tris/HCl (pH 8,0, 1 M) 50 mM 50 ml/l
Striplösung (Filterhybridisierung)
EDTA (0,1 M) 0,1 mM 1 ml/l
Tris/HCl (pH 8,0, 1 M) 1 mM 1 ml/l
SDS (20 % w/v) 0,1 % (w/v) 5 ml/l
50x TAE-Puffer
Tris 2 M 242 g/l
EDTA 50 mM 18,6 g/l
Essigsäure 60 ml
TB-Puffer (pH 7,6)
PIPES 10 mM 3,2 g/l
Calciumchlorid 15 mM 1,7 g/l
Kaliumchlorid 250 mM 18,6 g/l
Manganchlorid, Dihydrat 55 mM 8,9 g/l
TBS-Puffer
Natriumchlorid 150 mM 8,76 g/l
Tris/HCl (pH7,5, 1 M) 10 mM 10 ml/l
TBS-T
Tween-20 in TBS 0,1 % (v/v) 1 ml/l
Material 26
TBST-T
Triton X-100 in TBS-T 0,5 % (v/v) 5 ml/l
TE-Puffer
Tris/HCl (pH 7,6; 1 M) 10 mM 10 ml/l
EDTA (0,5 M) 1 mM 2 ml/l
TE/LiAc-Lösung (Hefetransformation)
10x TE-Puffer (pH 7,5) 10 % (v/v) 100 ml/l
Lithiumacetat (pH 7,5, 1 M) 10 % (v/v) 100 ml/l
TFB (pH 6,3) (kompetente Zellen)
Kaliumchlorid 100 mM 7,5 g/l
Mangan(II)chlorid, Tetrahydrat 45 mM 8,9 g/l
Calciumchlorid, Dihydrat 10 mM 1,5 g/l
Hexamin Cobalt(III)chlorid 3 mM 0,8 g/l
MES 10 mM 1,9 g/l
Transferpuffer (Semi-dry Blot)
Tris 25 mM 3,0 g/l
Glycin 150 mM 11,25 g/l
Methanol 10 % (v/v) 100 ml/l
10x Tris-Glycin-Puffer pH(8,3) für EMSA
Tris 250 mM 30,28 g/l
Glycin 1,9 M 142,7 g/l
EDTA (0,5 M) 10 mM 20 ml/l
Yeast-breaking-Puffer (Hefe DNA-Präparation)
Natriumchlorid 100 mM 5,84 g/l
Tris/HCl (pH 8,0, 1 M) 10 mM 10 ml/l
SDS 1 % (w/v) 10 g/l
EDTA (0,5 M) 1 mM 20 ml/l
Triton X-100 2 % (v/v) 20 ml/l
Material 27
Yeast-cracking-Puffer (Hefe Protein-Extraktion)
Stocklösung:
Harnstoff 8 M 480 g/l
SDS 5 % (w/v) 50 g/l
Tris/HCl (pH 6,8, 1 M) 40 mM 40 ml/l
EDTA (0,5 M) 100 mM 0,2 ml/l
Bromphenolblau 0,6 mM 0,4 g/l
Kurz vor dem Gebrauch ansetzen:
Stocklösung 1 ml
β-Mercaptoethanol 10 µl
PMSF (0,1 M in Isopropanol) 50 µl
Proteaseninhibitorenmix 70 µl
Proteaseninhibitorenmix (1 ml):
Leupeptin 0,03 mM 14,3 µg
Benzamidine 145 mM 17,5 mg
Aprotinin 37 % (w/v) 0,37 mg
Waschlösung (Filterhybridisierung)
Natriumphosphatpuffer (1 M) 40 mM 40 ml/l
SDS (20 % w/v) 1 % (w/v) 50 ml/l
Z-Puffer (pH 7,0) (Hefe β-Galaktosidase Assay)
di-Natriumhydrogenphosphat, Dihydrat 60 mM 10,7 g/l
Natriumdihydrogenphosphat, Dihydrat 40 mM 7,8 g/l
Kaliumchlorid 10 mM 0,75 g/l
Magnesiumsulfat 1 mM 246 µg/l
Z-Puffer/X-gal-Lösung (Hefe β-Galaktosidase Assay)
Z-Puffer 100 ml
β-Mercaptoethanol 270 µl
X-Gal (40 mg/ml in DMSO) 835 µl
Material 28
2.6 Enzyme und Kits
Alkalische Phosphatase (CIP) MBI Fermentas, St.Leon-Rot
DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
ECL-Chemilumineszenskit Amersham, Braunschweig
Lysozym Serva, Heidelberg
Pfu-Polymerase Stratagene, La Jolla, USA
Restriktionsendonukleasen Eurogentec, Seraing, Belgien
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
NEB, Frankfurt
RNase A Roth, Karlsruhe
T4-DNA-Ligase MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Taq-DNA-Polymerase GibcoBRL, Eggenstein
TNT Transcription/Translation Kit Promega, Madison, USA
Yeast Lytic Enzym (Arthrobacter luteus) ICN, Meckenheim
Gelextraktions-Kit Qiagen, Hilden
Macherey & Nagel, Düren
Clontech, Palo Alto, CA, USA
Plasmid-DNA Extraktions-Kit Qiagen, Hilden
Macherey&Nagel, Düren
Clontech, Palo Alto, CA, USA
Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
2.7 Genbanken und Proteinexpressionsfilter
Prätransformierte MATCHMAKER cDNA-Genbank (Clontech)
Die mRNA stammte aus embryonalem murinen Gewebe (Tag 11 Embryo) und wurde in
λACT2 kloniert. Nach Umwandlung in eine pACT2-Genbank und Amplifizierung in E. coli
wurde die Plasmid-DNA isoliert und damit der Hefestamm Y187 transformiert.
Maus 17. Tag Embryo MATCHMAKER cDNA-Genbank (Clontech)
Die cDNA ist im Vektor pACT2 kloniert. Für Yeast Two-Hybrid Screens musste die Bank
amplifiziert und Plasmid-DNA isoliert werden.
Material 29
Proteinexpressionsfilter hEX1 (RZPD, Berlin)
Die zur Herstellung verwendete mRNA wurde aus humanem embryonalem
Gehirngewebe isoliert (14,8 und 15,8 Wochen p.mens.). Die Proteine sind an ein His-tag
gekoppelt und auf PVDF-Membranen immobilisiert (Bussow et al., 1998).
2.8 Chemikalien und Hilfsmittel Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien zum Ansetzen von Puffern, Medien und
Reaktionslösungen wurden von Roth, Karlsruhe, Sigma, Deisenhofen oder Merck,
Darmstadt bezogen.
Agarose GibcoBRL, Eggenstein
Biozym, Oldendorf
α32P-dCTP (3000 Ci/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig
Aminosäurenmischungen BIO101, Vista, CA, USA
Clontech, Palo Alto, CA, USA
Bacto-Agar, -Trypton, -Hefeextrakt GiboBRL, Eggenstein
BM-Purple (AP-Substrat) Boehringer, Mannheim
Cellulosenitrat-Membran Schleicher & Schuell, Dassel
Centrifugal-Filter-Tubes Eppendorf, Hamburg
CHAPS Boehringer, Mannheim
Glasperlen Labor Schubert & Weiss, München
L-(35S)-Methionin Amersham-Phamacia, Freiburg
Nylonmembranen (Hybond-NX) Amersham-Pharmacia, Braunschweig
Proteinmarker, gefärbt New England Biolabs, Schwalbach
PVDF-Membranen (Hybond-PVDF) Amersham-Pharmacia, Braunschweig
Yeast nitrogen base Difco, Heidelberg
2.9 Antikörper
AK anti-c-myc Christoph Winkler, Würzburg
AK anti-HA Christoph Winkler, Würzburg
AK anti-HA, Peroxidase gekoppelt Boehringer, Mannheim
AK goat-anti-mouse Amersham, Braunschweig
Material 30
2.10 Software
Bildverarbeitung Adobe-Photoshop
Graphik Micrografx Designer9, Paint Shop Pro
Textverarbeitung Microsoft Office 97, Office XP
Literaturverwaltung EndNote V5
DNA-Analysen Wisconsin Package V10 Genetics Computer
Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA
Blast, NCBI, Bethesda, USA
ClustalX, Genedoc
Proteinanalysen EMBL (http://www.embl-heidelberg.de)
BMERC`S Protein Structure Analyses (PSA)
(http://bmerc-www.bu.edu/psa/) ExPAsy (http://www.expasy.org)
Methoden 31
3 Methoden 3.1 DNA-Präparationen und Aufreinigung 3.1.1 Gewinnung von Plasmid-DNA nach der „Rapid-boiling“-Methode
Die „Rapid-boiling“-Methode (Evans and Wahl, 1987) wird genutzt für die schnelle
Isolierung von Plasmid-DNA, die anschließend für Restriktions- und PCR-Analysen
verwendet werden kann. 1,5 ml Bakterienlösung einer Übernachtkultur werden
30 Sekunden zentrifugiert, das Pellet in 300 µl STET-Lösung mit 250 µg Lysozym
aufgenommen, resuspendiert und für 90 Sekunden ins kochende Wasserbad gestellt.
Nach kurzem Abkühlen werden die Zellreste durch 10 minütige Zentrifugation
sedimentiert und entfernt. Zur Fällung der Plasmid-DNA wird der Überstand mit 300 µl
Isopropanol versetzt und 10 Minuten zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird mit Ethanol
gewaschen, luftgetrocknet, in 20 µl TE-Puffer aufgenommen und 15 Minuten im 68 °C
Wasserbad gelöst. Die ebenfalls isolierte RNA kann durch Zugabe von
1µl RNase (10 mg/ml) degradiert werden.
3.1.2 Nucleobond-Minipräparation
Um sehr saubere Plasmid-DNA für Klonierungen und Sequenzierungen zu gewinnen,
wird der Nucleobond Kit von Macherey & Nagel (Düren) verwendet.
3.1.3 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Bakterienkulturen
Werden geringere Mengen an reiner Plasmid-DNA benötigt, wird die GFXTM Micro
Präparation von Amersham-Pharmacia-Biotech (Freiburg) angewandt
3.1.4 GFXTM Micro Plasmid Präparation aus Hefekulturen Durch entsprechende Vorbehandlung kann mit dem GFXTM Micro Plasmid Prep Kit auch
Plasmid-DNA aus Hefezellen isoliert werden. Dazu werden 2 ml einer Hefekultur
abzentrifugiert, die Zellen in 500 µl Spheroplast-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei
37 °C inkubiert, um Zellwände aufzubrechen. Aus dieser Lösung kann nun so wie aus
Bakterienkulturen Plasmid-DNA isoliert werden.
Methoden 32
3.1.5 Isolierung von Hefeplasmiden nach der „Rapid-isolation“-Methode
Diese Variante der „smash and grab“-Methode (Hoffman and Winston, 1987) erlaubt die
sehr schnelle Präparation von Plasmid-DNA aus Hefezellen, die für PCR-Reaktionen und
Transformationen eingesetzt werden kann.
Es werden 1,5 ml Zellen einer Übernachtkultur sedimentiert und in 200 µl Yeast-breaking-
Puffer resuspendiert. Dann werden 200 µl Glasperlen (0,25-0,4 mm) und 200 µl
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 (v/v/v) hinzupipettiert und kräftig 2 Minuten
gemischt. Zur Phasentrennung wird 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Phase wird mit
1 Vol. Chloroform gereinigt und in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
2 µl dieser Lösung können nun zur Transformation von kompetenten E. coli DH5α
verwendet werden. Die Transformationseffektivität ist höher, wenn die DNA gefällt wird.
3.1.6 Präparation von Träger-DNA für Hefetransformationen
Für die Transformation von Hefezellen ist die Verwendung von hochwertiger Träger-DNA
essentiell, da die Transformationsrate durch die Qualität der Träger-DNA entscheidend
beeinflusst wird (Schiestl and Gietz, 1989).
Zur Herstellung von Träger-DNA (sheared salmon sperm DNA, sssDNA) wird getrocknete
DNA (Sigma) in TE-Puffer (pH 7,5) in einer Konzentration von 10 mg/ml eingewogen und
12 bis 16 Stunden bei 4 °C durch Rühren gelöst. Die visköse Lösung wird dreimal für
etwa 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt, um DNA mit einer durchschnittlichen Größe
von 7 kb bei einer Größenspanne von 2 bis 15 kb zu erhalten. Nach jeder
Ultraschallbehandlung wird ein kleines Aliquot elektrophoretisch aufgetrennt und das
Ausmaß der DNA-Fragmentierung begutachtet. Wenn die gewünschte Größe erreicht ist,
wird die DNA-Lösung mit der Phenol/Chloroform Methode extrahiert und anschließend
gefällt. Die sssDNA wird in TE-Puffer in einer Konzentration von 5 bis 10 mg/ml gelöst
und durch 20 minütiges Kochen denaturiert.
3.1.7 cDNA-Synthese
Zur Synthese von cDNA aus RNA wurde der SUPERSCRIPT-Kit von Gibco BRL
verwendet. Hierzu werden 2 µg RNA mit 0,5 µg oligo dT-Primer vermischt, bei 70 °C
denaturiert und nach Zugabe von Puffer und dNTPs 50 Minuten bei 42 °C inkubiert. Die
Synthese des DNA-Stranges wird durch reverse Transkriptase katalysiert. Anschließend
wird die RNA durch Zugabe von RNase H degradiert.
Methoden 33
3.1.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentrationen von DNA- bzw. RNA-Lösungen werden im UV-Spektrometer bei
einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Dabei werden folgende Werte verwendet:
DNA (doppelsträngig) 1,0 OD260 entspricht 50 µg/ml
RNA 1,0 OD260 entspricht 40 µg/ml
3.2 Gelelektrophoresen 3.2.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese wird zur Trennung, Identifizierung, Isolierung und
Reinigung von DNA-Fragmenten eingesetzt.
Es werden in Abhängigkeit der erwarteten Größe der DNA-Fragmente 0,8-3 %ige Gele in
1x TAE-Puffer gegossen, die zum Sichtbarmachen der DNA 0,5 µg/ml Ethidiumbromid
enthalten. Die DNA-Proben werden mit 1-3 µl Gelladepuffer vermischt und in die
Geltaschen geladen. Zusätzlich wird ein Größenstandard aufgetragen. Die Auftrennung
erfolgt im elektrischen Feld bei einer Spannung von 60-110 V. Danach wird das Gel unter
UV-Lichtbestrahlung (254 nm) fotografiert.
Einzelne DNA-Banden können aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten werden und
mit dem Nucleotrap® Kit von Macherey & Nagel (Düren) aufgereinigt werden, um
sie für weitere Klonierungsexperimente einzusetzen. Für Hybridisierungsproben
wird LMP (low melting point)-Agarose verwendet.
3.2.2 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli
dient der Reinigung und Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Dazu
werden ein 5-16 %iges Trenn- und darauf ein 5% iges Sammelgel gegossen. Die
Proteinproben werden mit denaturierendem 2x SDS-Probenpuffer vermischt und 5 min im
Wasserbad gekocht, bevor sie in die Taschen des Sammelgels geladen werden. Die
Auftrennung im elektrischen Feld erfolgt bei einer Spannung von 100-120 V.
Nach der Elektrophorese können Proteinbanden durch Coomassie-Färbung sichtbar
gemacht werden. Dazu wird das Gel 10 Minuten in Coomassie-Lösung inkubiert, danach
10 Minuten in Entfärber I und mehrere Stunden in Entfärber II geschwenkt. Nach dem
Entfärben wird das Gel für zwei Stunden bei 60 °C getrocknet.
Methoden 34
Trenngel
Tris/HCl (pH 8,8) 375 mM
Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) 8-16 % (w/v)
SDS 0,1 % (w/v)
Ammoniumpersulfat 0,1 % (w/v)
TEMED 0,05 % (v/v)
Sammelgel
Tris/HCl (pH 6,8) 250 mM
Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) 5 % (w/v)
SDS 0,1 % (w/v)
Ammoniumpersulfat 0,1 % (w/v)
TEMED 0,1 % (v/v)
3.3 DNA-Klonierungstechniken 3.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
In einen Reaktionsansatz werden 0,5-3 µg DNA und 1-5 U/µg DNA des entsprechenden
Restriktionsenzyms eingesetzt. Puffer, Temperatur und Inkubationsdauer werden
entsprechend den Herstellerangaben gewählt.
Für manche Klonierungsexperimente ist es notwendig, kohäsive Enden in glatte Enden
umzuwandeln. Dies kann durch Auffüllen der Überhänge mit Hilfe des Klenow-Fragments
der DNA-Polymerase I geschehen. Dazu werden nach dem Verdau 0,2 mM dNTPs und
1 U Klenow-Polymerase hinzupipettiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Zur Enzyminaktivierung wird die Lösung 10 Minuten auf 75 °C erhitzt.
3.3.2 Ligation von DNA
Nachdem der Vektor mit Restriktionsenzymen geschnitten worden ist, können die Enden
des linearisierten Vektors mit alkalischer Phosphatase (calf intestinal alkaline
phosphatase, CIP) dephosphoryliert werden, um eine Selbstligation zu vermeiden. Dabei
wird zum Restriktionsansatz 1 U CIP pipettiert und 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die
Isolierung der DNA von den verwendeten Enzymen erfolgt durch Auftrennung im
Agarosegel.
Methoden 35
Das Insert wird kompatibel zu den Vektorenden geschnitten und entsprechend gereinigt.
Um die Verknüpfung der Phosphodiesterbindung zwischen den aneinandergelagerten
Vektor- und Insertenden zu katalysieren, wird T4-DNA-Ligase verwendet. Das im
Ligationsansatz eingesetzte molare Verhältnis von Vektor zu Insert beträgt 1:3 bis 1:10.
Insgesamt werden in einem 10 µl Ansatz 100-200 ng DNA, 5 U T4-DNA-Ligase und 1 µl
10x Ligasepuffer, der den Cofaktor ATP enthält, eingesetzt und 3 bis 5 Stunden bei
Raumtemperatur bzw. über Nacht bei 16 °C inkubiert
3.4 Transformation von kompetenten Bakterienzellen 3.4.1 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach
Hanahan)
Diese Methode dient zur Herstellung ultra-kompetenter Bakterien, die allerdings nicht
länger als einen Tag gelagert werden können.
Es werden 50 ml SOB-Medium mit 2 ml einer Übernachtkultur E. coli DH5α Zellen
beimpft und 2 bis 3 Stunden bei 37 °C geschüttelt, bis eine optische Dichte OD600
zwischen 0,4 und 0,7 erreicht ist. Die Zellen werden bei 3500 rpm für 5 Minuten
abzentrifugiert und in 4 ml TFB-Lösung gewaschen. Danach werden sie erneut
abzentrifugiert und vorsichtig in 2 ml TFB resuspendiert. Man lässt die Bakterien für
30 Minuten im Eisbad stehen, gibt 70 µl DnD-Lösung hinzu und inkubiert die Zellen
15 Minuten auf Eis, bevor man sie erneut mit 70 µl DnD-Lösung versetzt. Nach
20 Minuten sind die Zellen kompetent und können für Transformationen verwendet
werden.
3.4.2 Herstellung von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen (nach Inoue) Der Vorteil dieser Methode (Inoue et al., 1990) im Vergleich zu der von Hanahan besteht
darin, dass diese Zellen für Monate bei –80 °C gelagert werden können.
Es werden 250 ml SOB-Medium mit E. coli DH5α Zellen beimpft und bei
Raumtemperatur, ideal bei 18 °C, über Nacht geschüttelt bis die Kultur eine OD600 von
0,6 erreicht hat. Dann werden die Bakterien für 10 Minuten auf Eis gestellt, anschließend
pelletiert und in 80 ml eiskaltem TB-Puffer gewaschen. Nach 10 minütiger Inkubation im
Eisbad werden die Bakterien wie zuvor abzentrifugiert und in 20 ml TB-Puffer gelöst. Man
gibt 1,4 ml DMSO zu und lässt die Bakteriensuspension erneut für 10 Minuten im Eisbad
stehen. Danach werden die kompetenten Bakterien aliquotiert, sofort auf Trockeneis oder
in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei –80 °C gelagert.
Methoden 36
3.4.3 Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Bakterienzellen
Es werden 10 bis 20 ng Plasmid-DNA mit 50 µl kompetenten Zellen vorsichtig vermischt
und 30 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend werden die Zellen einem Hitzeschock von
42 °C für 45 Sekunden ausgesetzt und sofort 2 Minuten auf Eis gekühlt. Nach Zugabe
von 250 µl LB-Medium werden die Bakterien 30 bis 60 Minuten bei 37 °C inkubiert, auf
LB-Agarplatten mit Selektionsantibiotikum ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C
inkubiert.
3.5 DNA-Sequenzierung
DNA-Sequenzen wurden mit dem ALF oder ALFexpress Sequencer von Kathrin Maier
und Barbara Klamt bestimmt.
Die Sequenzen wurden anschließend mit Hilfe der GCG V10 Software analysiert und mit
bekannten Sequenzen aus Datenbanken (GenBank, EMBL) verglichen.
3.6 Amplifikation einer Plasmid-cDNA Bank
Zunächst wird der Titer der Bank bestimmt. 50 und 100 µl von 1:103 und 1:106
Verdünnungen werden ausplattiert und die Kolonien gezählt. Daraus kann der Titer
(Kolonien/ml) bestimmt werden.
Zur Amplifikation werden etwa 6*106 Kolonien ausplattiert, 40.000 bis 60.000 Kolonien
pro 150 mm Platte. Nachdem die Platten konfluent bewachsen sind, werden die Kolonien
mit einem Glasspatel in LB Medium resuspendiert. Die sehr dichte Kultur wird mit
zusätzlichem LB-Selektionsmedium verdünnt und noch einmal drei Stunden bei 30 °C
geschüttelt. Es ist dabei wichtig, die Kultur nicht bei 37 °C zu inkubieren, um eine Lyse
durch in der Bank noch erhaltene Lambdaphagen zu verhindern. Aus der Kultur (ca. 3 l)
wird Plasmid-DNA nach Standardtechniken gewonnen.
3.7 PCR-Methoden 3.7.1 Analytische PCR
Zur Amplifizierung geringer Mengen DNA dient die Polymerase-Ketten-Reaktion
(polymerase chain reaction, PCR). Dabei wird ein DNA-Fragment, das von zwei Primern
Methoden 37
flankiert wird, durch eine hitzestabile DNA-Polymerase vervielfältigt. Als DNA-Matrize
können gereinigte DNA, aber auch Zellen, Bakterien-, Hefekulturen oder andere DNA-
haltige Flüssigkeiten verwendet werden.
Ein typischer Ansatz sieht folgendermaßen aus:
Plasmid-DNA 10-100 ng
10x PCR-Puffer 2 µl
dNTPs (25mM) 0,2 µl
Primer 1 (10 pmol/µl) 1 µl
Primer 2 (10 pmol/µl) 1 µl
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) 0,2 µl
ddH2O ad 20 µl
Die Reaktion wird auf Eis pipettiert und anschließend in den auf 94 °C vorgeheizten PCR-
Cycler gestellt, um unspezifische Primer-Bindungen zu vermeiden. Werden Hefezellen
als DNA-Matrize eingesetzt, werden diese 10 Minuten mit Spheroplast-Puffer bei 37 °C
vorbehandelt.
Programm: Schritt 1 5 min 94 °C
Schritt 2 30 sec 94 °C
Schritt 3 30 sec Primer-Annealingtemperatur
Schritt 4 30 sec –2 min 72 °C
Schritt 5 20-40x Schritte 2-4 wiederholen
Schritt 6 5 min 72 °C
Schritt 7 4 °C
3.7.2 Präparative PCR
Die PCR kann eingesetzt werden, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das
anschließend in einen Vektor ligiert wird. Wenn in einem zu klonierenden DNA-Fragment
nicht die passenden Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, werden Primer konstruiert,
die an ihrem 5‘-Terminus die entsprechenden Schnittstellen, flankiert von meist drei
Nukleotiden, besitzen.
Bei präparativen PCR-Reaktionen wird neben der Taq-DNA-Polymerase auch eine DNA-
Polymerase mit der Fähigkeit zum Korrekturlesen wie Pwo- oder Pfu-DNA-Polymerase
eingesetzt.
Methoden 38
Für die in vitro-Translation müssen vor der zu translatierenden Region eine
Promotersequenz (z.B. T3, T7 oder Sp6) und ein Startcodon liegen. Die im Yeast Two-
Hybrid Screening verwendete Genbank ist im Vektor pACT2 kloniert, der eine solche
Promotersequenz nicht besitzt. Um die isolierten Plasmide dennoch für in vitro-
Translationen einsetzen zu können, wird das Plasmidinsert mit Hilfe von zwei
flankierenden Primern amplifiziert. Der 5‘-Primer (T7-pACT2) wurde in Anlehnung an den
Protein Truncation Test (Roest et al., 1993) so konstruiert, dass er eine T7-Promoter- und
die Kozak-Translations-Initiationssequenz besitzt.
3.7.3 Genotypisierung
Zur Genotypisierung von Mäusen muss zunächst genomische DNA isoliert werden. Dazu
wird ein kleines Gewebestück in 100 µl Lysis Puffer zerkleinert. Nach 15 Minuten Kochen
werden 100 µl 20 %iges Chelex-100 hinzupipettiert, 15 Minuten bei RT inkubiert und
anschließend erneut 15 Minuten gekocht. Nach Abzentrifugieren kann der Überstand für
PCR-Reaktionen verwendet werden. Durch spezifische Primer werden das Wildtyp- und
Knockout-Allel amplifiziert und elektrophoretisch unterschieden.
3.8 Radioaktive Markierung von DNA und Filterhybridisierungen 3.8.1 Herstellen von Bakterienkolonie-Filtern
Eine Mikrotiterplatte wird mit Bakterienkolonien beimpft und über Nacht bei 37 °C
inkubiert. Die Bakterien werden dann auf eine befeuchtete, ungeladene Nylonmembran
gestempelt, die anschließend vorsichtig auf eine Agarplatte gelegt und 12 bis 14 Stunden
bei 30 °C inkubiert wird. Die bewachsene Nylonmembran wird markiert und 10 Minuten in
Denaturierungspuffer, 10 Minuten in Neutralisationspuffer und 10 Minuten in 50 mM
Natriumphosphatpuffer getränkt. Um die DNA an die Membran zu fixieren wird die
getrocknete Membran mit UV-Licht (245 nm; 50mJ) bestrahlt (GS Gene linker, Biorad)
und 30 Minuten bei 80 °C gebacken. Die Mikrotiterplatte kann bei –80 °C tiefgefroren und
gelagert werden, wenn das Kulturmedium mit 10 % Cosmideinfrierpuffer versetzt wird.
3.8.2 Herstellen von PCR-Produkt-Filtern
Die PCR-Reaktion wird in einem 50 µl Ansatz durchgeführt und 5 bis 10 µl des Produkts
zur Kontrolle auf ein Agarosegel aufgetragen. Mit einem dicken Stempel werden dann
Methoden 39
einige Mikroliter der PCR-Lösung auf eine ungeladene Nylonmembran übertragen.
Anschließend wird die Nylonmembran wie unter 3.8.1 beschrieben weiterbehandelt.
3.8.3 Radioaktive Markierung von DNA
Hierzu wird die „random priming“-Methode (Feinberg and Vogelstein, 1983) verwendet.
200 ng der DNA-Sonde werden in 35 µl TE-Puffer 10 Minuten gekocht. Nachdem die
Lösung abgekühlt ist, werden 5 µl Oligo-labeling-Mix (OLB-Mix), 1 U DNA-Polymerase I
(Klenow-Fragment) und 0,5 µl α32P-dCTP (3000 Ci/mol; 10 µCi/µl) zugegeben und die
Lösung für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
3.8.4 Filterhybridisierung
Zunächst wird die Nylonmembran zur Absättigung unspezifischer Bindungen mit 10 ml
Hybridisierungslösung (Church) und 50 µg/ml denaturierter Lachssperma-DNA
30 Minuten bei 68 °C inkubiert. Die radioaktiv markierte DNA-Sonde wird mit 50 µl
denaturierter Lachssperma-DNA (10 mg/ml) versetzt, 10 Minuten aufgekocht und zu den
vorhybridisierten Filtern gegeben. Die Hybridisierung erfolgt bei 68 °C über Nacht.
Um nichtgebundene DNA zu entfernen, wird die Membran 10 Minuten bei
Raumtemperatur und 2x 10 Minuten bei 68 °C gewaschen und danach zur
Autoradiographie für 12 bis 48 Stunden in Röntgenkassetten bei –80 °C exponiert. Die
Filter können mehrmals verwendet werden, wenn die DNA-Sonde durch 30 minütiges
Waschen in Strip-Lösung bei 80 °C entfernt wird.
3.9 Herstellung, Reinigung, Analyse von Proteinen 3.9.1 In vitro Translation
Zur in vitro Translation wurde der TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit
von Promega (Madison, USA) verwendet. Die Reaktionslösung wird auf Eis angesetzt
und anschließend 90 Minuten bei 30 °C inkubiert.
50 µl Reaktionsansatz:
TNT Quick Master Mix 40 µl
(35S)-Methionin 2 µl
Plasmid-DNA (0,5 µg/µl) 2 µl
Methoden 40
3.9.2 Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen
E. coli Zellen werden mit einem pGEX-Vektor transformiert, der die cDNA für das zu
translatierende Protein enthält. Die Bakterien werden in 10 ml LB-Selektionsmedium über
Nacht kultiviert und am nächsten Tag 1:10 verdünnt. Nach einer Stunde wird die
Proteinexpression durch Zugabe von 0,1 mM IPTG induziert. Die Bakterienkulturen
werden im 27 °C Inkubator 5 Stunden geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Das
Pellet wird in 500 µl kalten PBS-Puffer gelöst und mit 0,5 mM des Proteaseninhibitors
PMSF versetzt. Dann wird die Suspension mit Ultraschall behandelt und das Detergenz
Triton X-100 zu einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Zellreste werden
abzentrifugiert und der Überstand bei –20 °C gelagert. Für GST-Pulldown Analysen
wurde dieses ungereinigte Proteinlysat eingesetzt. Jedoch war eine Aufreinigung für den
Einsatz in Electrophoretic Mobility Shift Assays nötig. Dabei wird das Proteinlysat einer
1 Liter Bakterienkultur mit 1 ml PBS-gewaschener Glutathion-Sepharose versetzt und
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sepharose wird dreimal mit PBS
gewaschen und der Überstand komplett entfernt. Danach wird das GST-Protein mit 6x
500 µl Elutionspuffer (5 mM reduziertes Glutathion, pH 8) von der Sepharose eluiert.
10 µl jeder Fraktion werden auf einem SDS-Gel analysiert und das restliche Eluat mit
20 % Gycerin versetzt, aliquotiert und bei -70 °C gelagert.
3.9.3 Expression und Reinigung von MBP-Fusionsproteinen
Die Expression in E. coli entspricht dem Vorgehen bei GST-Fusionsproteinen. Lediglich
das LB-Medium wird mit 2 g/l Glukose angereichert, um die Synthese von Maltase zu
verhindern. Das Lysat wird mit Säulenpuffer auf 50 ml verdünnt und mit gewaschenem
Amylose-Resin 15 Minuten inkubiert. Nach Zentrifugation wird das Resin dreimal mit
Säulenpuffer gewaschen und anschließend auf eine Säule (Biorad #731-1550) geladen.
Die Elution (6x 500 µl) erfolgt mit 10 mM Maltose. Die Proteine werden mit 20 % Glycerin
vermischt und bei –70 °C gelagert.
3.9.4 Proteinexpression und Extraktion in Hefezellen
Zur Proteinextraktion aus Hefezellen, z.B. für Western-Blot Analysen, müssen im
Gegensatz zu E. coli, die Zellwände durch chemische und physikalische Methoden
aufgebrochen werden und die vielen endogenen Proteasen der Hefezellen inhibiert
werden. Dazu wurde die Harnstoff/SDS-Methode gewählt (Printen and Sprague, 1994).
Methoden 41
Eine 5 ml Übernachtkultur in SD-Selektionsmedium wird in 50 ml YPDA-Medium
überführt und bei 30 °C geschüttelt bis eine OD600 von 0,6 erreicht ist. Danach wird die
Hefekultur in Zentrifugenbecher überführt, die zur Hälfte mit eiskaltem Wasser gefüllt
sind, und 5 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das
Pellet in 50 ml eiskaltem Wasser resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wird das
Pellet in flüssigem Stickstoff gefroren.
Man erwärmt nun den Yeast-cracking-Puffer, dem kurz zuvor der Proteaseinhibitorenmix
zugefügt wurde, auf 60 °C und gibt 440 µl auf die gefrorenen Hefezellen. Die
Zellsuspension wird dann in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und 1 Vol Glasperlen
(Durchmesser 0,25 bis 0,5 mm) dazugegeben. Nach kräftigem, mindestens einminütigem
Durchmischen werden Glasperlen, Zelltrümmer und nicht aufgebrochene Zellen durch
5 minütiges Zentrifugieren sedimentiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß
überführt. Die Proben werden, falls sie nicht sofort weiterverarbeitet werden, bei –70 °C
gelagert.
3.9.5 Herstellen und Aufreinigung eines AP-Fusionsproteins
Die Herstellung des mit alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelten carboxyterminalen
Hey-Proteins erfolgt in HEK293T Zellen, die mit dem Vektor pcAP4-WRPW bzw. mit
pcAP4-YRPW transient transfiziert werden. Die Zellen sezernieren das Fusionsprotein in
den Zellüberstand. Das Medium wird nach 48 Stunden geerntet und 10 Minuten auf
65 °C erwärmt, um endogene alkalische Phosphatasen zu inaktivieren. Anschließend
werden 10 mM HEPES, pH 7,0 und 0,05 % NaN3 zugesetzt und das Medium bei 4 °C
gelagert. Da das Fusionsprotein in geringer Konzentration vorliegt, wird es durch
Zentrifugalfiltration (Centrifugal Filter Tubes, Eppendorf) aufkonzentriert. Nachdem das
gesamte Medium filtriert wurde, wird der aufkonzentrierte Überstand mehrfach mit HBS-
Puffer gewaschen. Schließlich wird der Überstand in 1 bis 2 ml HBS aufgenommen und
die Konzentration des AP-Fusionsprotein bestimmt.
Zur Konzentrationsbestimmung kann die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase
verwendet werden, welche direkt proportional zur molaren Stoffmenge der Proteine ist.
Dazu werden 10 µl der Proteinlösung mit 390 µl HBS und 400 µl 2x AP-Substrat-Puffer
versetzt, bei Raumtemperatur inkubiert und nach 2, 4, 6, 8 und 10 Minuten die optische
Dichte (OD405) im Photometer bestimmt. Zur Berechnung der Enzymaktivität wird eine
Eichgerade erstellt. Hierfür wird in HBS verdünnte alkalische Kälberdarmphosphatase
(CIP) mit bekannter Aktivität verwendet und die OD405 zwischen 0,01 und 0,2 U CIP
gemessen.
Methoden 42
3.9.6 In vitro Proteinsynthese, Reinigung und Nachweis
Von Prof. Dr. Dieter Palm, Würzburg, wurde ein carboxyterminales Proteinfragment des
Hey1-Proteins in vitro synthetisiert, das an seinem Aminoterminus mit einem
Biotinmolekül markiert ist.
Biotin-S G S G K P Y R P W G T E I G A F
Nach der Synthese wurde das Peptid chromatographisch (high liquid pressure
chromatography, HPLC) aufgereinigt und massenspektroskopisch untersucht. Die
einzelnen Fraktionen der HPLC-Analyse wurden außerdem mit einer abgewandelten
ELISA-Methode nach Konzentration und Biotinylierung analysiert.
Dabei werden in einer Mikrotiterplatte 100 ng Peptid jeder HPLC-Fraktion, gelöst in
100 µl Coating-Puffer, vorgelegt und serielle Verdünnungsreihen hergestellt. Die
Adsorption der Peptide an die Plastikoberfläche der Mikrotiterplatte erfolgt über Nacht bei
4 °C. Die Platte wird ausgeklopft und mit TBS-T gründlich gespült, bevor unspezifische
Bindungsstellen mit 3 % BSA in TBS-T abgesättigt werden. Anschließend pipettiert man
5 µg an Streptavidin gekoppelte alkalische Phosphatase in jede Tasche und inkubiert
eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem ungebundenes Enzym durch Waschen mit
TBS-T entfernt wurde, werden 100 µl Substratlösung (100 µg para-Nitrophenylphosphat
in 100 µl Glycin-Puffer) hinzugefügt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die
umgesetzte Substratmenge ist direkt proportional zur eingesetzten Biotinmenge und kann
qualitativ im Plattenphotometer bei 405 nm Wellenlänge bestimmt werden.
3.9.7 Western-Blot Analyse
Der Western-Blot kann eingesetzt werden, um ein Protein aus einem Zellextrakt
detektieren zu können. Dazu werden die Proteine in einer SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend mit dem Semi-dry Blot Verfahren
(Biometra) auf eine Nitrocellulose- bzw. PVDF-Membran transferiert. Der Transfer erfolgt
bei 5 mA/cm² für 30 Minuten im Kühlraum.
Die Membran wird anschließend 1 Stunde bzw. über Nacht bei 4 °C in Block-Puffer
(5 % Trockenmilch in PBS) zur Absättigung unspezifischer Bindungen inkubiert. Danach
wird die Membran 1x 15 Minuten und 2x 5 Minuten in PBS-Puffer gewaschen und eine
Stunde mit dem Erstantikörper (1:500 bis 1:10.000 in Blockpuffer) inkubiert.
Ungebundene Antikörper werden mit PBS-Puffer abgewaschen und die Membran eine
Stunde mit Peroxidase gekoppeltem Zweitantikörper (1:500 bis 1:10.000 in Blockpuffer)
Methoden 43
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 5x 5 Minuten mit PBS-Puffer
gewaschen. Antigen-Antikörper-Komplexe können mit dem ECL-Detektionsreagenz
(Amersham) nach Angaben des Herstellers nachgewiesen werden.
Wird ein mit alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelter Zweitantikörper eingesetzt, so
sollte die Membran mit TBS-Puffer gewaschen und vor der Detektion mit NTMT (pH 9.5)
behandelt werden, da phosphathaltige Puffer die AP hemmen.
3.10 GST-Pulldown Assay
Mit dem GST-Pulldown Assay können Protein-Protein-Interaktionen in vitro
nachgewiesen werden.
Dazu wird ein Protein in vitro translatiert und mit (35S)-Methionin radioaktiv markiert. Das
zweite Test-Protein wird als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und extrahiert. Auf
eine Reinigung des Zellüberstandes wird bewusst verzichtet, da die übrigen bakteriellen
Proteine unspezifische Bindungen absättigen können. Man mischt 5 bis 7,5 µl des in vitro
translatierten (ivt) Proteins mit 1 bis 5 µg des GST-Fusionsproteinextrakts in 300 µl bead-
binding-buffer (bbb) mit 1 mM PMSF und inkubiert das Gemisch für 15 Minuten auf Eis.
Danach werden unlösliche Bestandteile abzentrifugiert und der Überstand mit 30 µl
Gluthation-Sepharose für 2 Stunden bei 4 °C auf dem Vertikalroller inkubiert.
Dabei kommt es zur Bindung des GST-Fusionsproteins an die Gluthation-Sepharose.
Wenn das ivt-Protein an das Testprotein bindet, wird es dadurch beim anschließenden
Waschen an der Sepharose festgehalten, ansonsten wird es mit dem Überstand
verworfen.
Die Sepharose wird pelletiert, dreimal mit je 1 ml bbb gewaschen und nachdem der
Überstand vollständig abgezogen wurde, mit 17,5 µl 2x SDS-Probenpuffer 5 Minuten
aufgekocht. Der Überstand wird auf einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel
aufgetrennt. Daneben wird ein Proteingrößenmarker und 20 % der in der Pulldown
Reaktion eingesetzten Menge ivt-Protein geladen. Das Gel wird mit Coomassie gefärbt
und dann für 30 Minuten in Amplify (Amersham) geschwenkt, um die Signalintensität der
radioaktiven Proteine zu verstärken. NachTrocknung wird das Gel zur Fluorographie 12
bis 48 Stunden bei –80 °C auf einem Röntgenfilm exponiert.
Methoden 44
3.11 Das Yeast Two-Hybrid System 3.11.1 Herstellung kompetenter Hefezellen nach der Lithium-Acetat-Methode
Es werden einige große Hefekolonien in 50 ml YPDA- bzw. SD-Medium kräftig vermischt
und bei 30 °C 12 bis 16 Stunden geschüttelt. Anschließend werden 300 ml YPDA-
Medium mit 30 bis 50 ml der Übernachtkultur versetzt, um eine OD600 von 0,2 bis 0,3 zu
erreichen. Diese Lösung wird für weitere 3 Stunden bei 30 °C inkubiert und die OD600
sollte dann bei 0,4 bis 0,6 liegen. Die Zellen werden abzentrifugiert, in 50 ml ddH2O
gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wird in 1,5 ml frisch angesetzter
1x TE/LiAc-Lösung resuspendiert. Daraufhin sind die Zellen kompetent für
Transformationen. Die kompetenten Zellen können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert
werden, die Transformationseffektivität nimmt dabei aber drastisch ab.
3.11.2 Transformation Lithium-Acetat-kompetenter-Hefezellen
In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß werden 100 µg denaturierte Träger-DNA (sssDNA) mit
0,2 bis 1,0 µg Plasmid-DNA vermischt und 100 µl kompetente Zellen hinzugefügt. Nach
kräftigem Durchmischen wird 600 µl PEG/LiAc-Lösung zugegeben und wieder kräftig
gemischt. Die Zellen werden 30 Minuten bei 30 °C geschüttelt und dann vorsichtig mit
70 µl DMSO versetzt. Der Hitzeschock erfolgt bei 42 °C für 15 Minuten. Nach
zweiminütigem Abkühlen auf Eis werden die Zellen sedimentiert, in 500 µl TE-Puffer
resuspendiert und 100 µl davon ausplattiert.
3.11.3 Yeast Two-Hybrid Analyse nach der Mating-Methode
Zum Test der Proteininteraktion müssen beide Expressionsvektoren in einer Hefezelle
lokalisiert sein. Dazu kann neben der simultanen oder sequentiellen Cotransformation
auch die Mating-Methode angewendet werden. Dabei verschmelzen zwei haploide
Hefezellen mit entgegengesetztem Konjugationstyp a und α zu einer diploiden Zelle
durch sexuelle Konjugation.
Je eine Kolonie der beiden Hefestämme wird in 500 µl YPDA-Medium in einem 1,5 ml
Reaktionsgefäß resuspendiert und 20 bis 24 Stunden auf einem Schüttler (200 rpm) bei
30 °C inkubiert. 100 µl davon werden auf Selektionsagarplatten ausgestrichen.
Man setzt einen MATa-Hefestamm (AH109) ein, der bereits mit einem pGBKT7-Plasmid
transformiert ist, das die Synthese von Tryptophan ermöglicht und einen MATα-
Hefestamm (Y187), der mit einem pGADT7-Plasmid transformiert ist, welches das
Wachstum auf Leucin-freien Nährböden ermöglicht. Diploide Zellen können somit auf
Methoden 45
Tryptophan- und Leucin-freien Nährböden (SD/-Leu/-Trp) wachsen. Falls die beiden
Testproteine miteinander interagieren, wachsen die diploiden Zellen auch auf Nährböden,
die kein Histidin und Adenin enthalten (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp). Zusätzlich wird auch das
lacZ-Gen exprimiert.
3.11.4 Screening einer cDNA-Genbank mit der Mating-Methode
Hierzu wurde eine im Vektor pACT2 klonierte murine cDNA-Genbank von Clontech
bezogen, die bereits in den Hefestamm Y187 transformiert war.
Eine große Kolonie des Hefestamms AH109, der das entsprechende pGBKT7-Plasmid
für das Testprotein trägt, wird in 50 ml SD/-Trp Medium resuspendiert und bei 30 °C 16
bis 24 Stunden auf dem Schüttler inkubiert bis die OD600 der Kultur größer als 0,8 ist. Die
Hefezellen werden bei 3000 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert, in 5 ml YPDA-Medium
resuspendiert und zusammen mit einem frisch aufgetauten 1 ml Aliqot der Genbank in
45 ml YPDA-Medium überführt. Die Suspension wird in einem 2 L-Erlenmeyerkolben
24 Stunden bei 30 °C langsam geschüttelt (40 rpm). Am nächsten Tag werden die Zellen
abzentrifugiert in 10 ml YPDA resuspendiert und ausplattiert. Man streicht etwa 200 µl
pro SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Agarplatte (∅ 15 cm) mit Hilfe von Glasperlen (∅ 0,5 mm)
aus. Alternativ können die Zellen erst auf SD/-Leu/-Trp ausplattiert und nach einigen
Tagen dann auf hochstringente SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp umplattiert werden, um den
Zellen Zeit zu geben, ausreichende Mengen der Interaktionsproteine zu synthetisieren.
3.11.5 Screening einer cDNA-Genbank mit der Cotransformations-Methode
Es wird eine 150 ml Übernachtkultur des mit dem „bait“-Plasmid transformierten Stamms
AH109 in SD/-Trp angeimpft. Am nächsten Tag wird die Kultur in 1 L YPDA verdünnt und
noch einmal drei Stunden geschüttelt. Nach Abzentrifugieren und Waschen, werden die
Zellen in 8 ml TE/LiAc Lösung aufgenommen und mit 100-300 µg cDNA der Genbank
versetzt. Das weitere Vorgehen entspricht der einfachen Hefetransformation.
3.11.6 Filter lift β-Galaktosidase Assay
Die Interaktion von Protein-Protein-Bindungen im Yeast Two-Hybrid System zeigt sich
u.a. in der Transkription des lacZ-Gens, das im Hefestamm Y187 unter der Kontrolle des
GAL1-Promoters, im Stamm AH109 unter Kontrolle des MEL1-Promoters liegt. Die
Enzymaktivität des Genprodukts β-Galaktosidase kann qualitativ und quantitativ bestimmt
werden.
Methoden 46
Der „colony-lift filter“-Test eignet sich für die schnelle Überprüfung der lacZ-Aktivität einer
großen Anzahl von Kolonien. Die Sensitivität des Testes ist hoch, der Nachteil besteht in
der schlechten Quantifizierbarkeit der Ergebnisse.
Ein Stück Cellulosepapier wird auf eine frisch bewachsene SD-Selektionsagarplatte
gelegt, vorsichtig angedrückt und markiert. Der Filter wird nun in flüssigen Stickstoff
getaucht und wieder aufgetaut, um die Zellwände aufzubrechen. Danach wird dieser
Filter auf einen zweiten Filter gelegt, der mit Z-Puffer/X-Gal-Lösung getränkt wurde. Die
Filter werden bei 30 °C inkubiert und die Blaufärbung der Kolonien dokumentiert.
3.11.7 Quantitativer β-Galaktosidase Assay mit ONPG
Zur Quantifizierung der Interaktionsstärke zweier Proteine wird der lacZ-Aktivitätstest mit
o-Nitrophenyl β-D-Galaktopyranosid (ONPG) als Substrat durchgeführt. Dazu werden
transformierte Y187-Zellen über Nacht in SD/-Leu/-Trp Medium kultiviert. 1 ml der Kultur
wird in 4 ml YPDA überführt und etwa drei Stunden weiter geschüttelt. Anschließend wird
die OD600 bestimmt, welche im Bereich 0,4-0,8 liegen sollte. 1,5 ml werden abzentrifugiert
und in 300 µl Z-Puffer resuspendiert. 100 µl dieser Suspension werden in ein neues
Reaktionsgefäß überführt, in flüssigen Stickstoff getaucht und wieder im 37 °C Bad
aufgetaut. Dieser Schritt muss zweimal wiederholt werden, um die Zellen komplett
aufzubrechen. Anschließend werden sie mit 700 µl Z-Puffer und 160 µl ONPG (4 mg/ml)
versetzt. Die Zeit wird ab der Zugabe von ONPG gemessen. Nachdem sich eine
Gelbfärbung zeigt, spätestens jedoch nach vier Stunden, wird die Reaktion durch Zugabe
von 400 µl 1 M NaCO3 gestoppt, die Suspension 10 Minuten lang zentrifugiert und die
OD420 des Überstandes gemessen.
Die β-Galaktosidase Aktivität wird mit folgender Formel bestimmt:
β-Galaktosidase/Units=2000*OD420 / (t(min)*OD600)
Eine Unit ist definiert als die Menge β-Galaktosidase, die 1 µmol ONPG in einer Minute
zu o-Nitrophenol und D-Galaktose hydrolysiert (Miller, 1972).
Methoden 47
3.12 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Proteinen
Zum Auffinden neuer Protein-Protein-Bindungen des carboxyterminalen Hey1-Motivs
wurde ein Screening von Proteinexpressionsfiltern durchgeführt. Dabei wurden ein mit
alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertes und ein in vitro synthetisiertes, mit Biotin
markiertes, Peptid verwendet.
3.12.1 Herstellen von Proteinexpressionsfiltern
Die Herstellung von Proteinexpressionsfiltern erfolgte nach der Methode von Konrad
Büssow (Bussow et al., 1998).
Eine Mikrotiterplatte wird mit E. coli, die das jeweilige Expressionsplasmid tragen, beimpft
und über Nacht bei 37 °C inkubiert. PVDF-Membranen (Hybond-N+, Amersham) werden
in Methanol befeuchtet, in autoklaviertem ddH2O und anschließend in 2x YT-Medium
gewaschen. Die noch feuchte PVDF-Membran wird mit den Bakterienkulturen
bestempelt, auf eine 2x YT-Agarplatte gelegt und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Zur
Induktion der Proteinexpression wird die Membran auf eine frische Agarplatte gelegt, die
1 mM IPTG enthält und für weitere 3 Stunden bei 37 °C inkubiert.
Anschließend werden die Kolonien in Denaturierungspuffer 10 Minuten lysiert, zweimal
5 Minuten mit Neutralisationspuffer und schließlich 15 Minuten mit 2x SSC behandelt.
Nach dem Trocknen kann die Membran bei Raumtemperatur gelagert werden.
3.12.2 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit AP-Fusionsproteinen
Zunächst wird der Proteinexpressionsfilter vorbereitet. Dazu wird die Membran mit
Ethanol angefeuchtet und in TBST-T-Lösung gewaschen. Anhaftende Bakterienkolonien
werden vorsichtig abgewischt. Die Lösung wird zweimal gewechselt und danach wird
noch einmal 10 Minuten in TBS-Puffer gewaschen. Falls die Membran schon einmal
benutzt war, wird sie gründlich in TBS-T gewaschen und die Waschlösung viermal
gewechselt.
Anschließend werden ungesättigte Bindungsstellen auf dem Filter durch einstündige
Inkubation in Block-Puffer (3 % Trockenmilch in TBS) gesättigt und das AP-
Fusionsprotein (2-3 U/Membran) in Block-Puffer 12 bis 16 Stunden bei 4 °C inkubiert.
Ungebundene Proteine müssen durch gründliches Waschen der Membran mit TBST-T
entfernt werden. Um die gebundenen AP-Fusionsproteine nachweisen zu können, wird
als Substrat der alkalischen Phosphatase der präzipitierende Farbstoff BM-Purple
Methoden 48
(Boehringer, Mannheim) eingesetzt. Dazu wäscht man die Membran kurz in NTMT
(pH 9,5), um das pH-Optimum der alkalischen Phosphatase einzustellen und inkubiert
dann mit BM-Purple bei Raumtemperatur, bis die gebundenen Proteine durch
Blaufärbung sichtbar werden.
3.12.3 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit einem Biotin-markierten Peptid
1 nmol des in vitro synthetisierten und mit Biotin markierten Peptid wird mit 10 µg
Steptavidin, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, versetzt und 20 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert, wobei sich stabile Biotin-Streptavidin-Komplexe bilden.
Überschüssige Streptavidinbindungen werden anschließend durch Zugabe von 12 µg
Biotin abgesättigt. Ungebundene Peptide werden durch Ultrazentrifugation (Centrifugal
Filter Tubes, Eppendorf) bei 7000 rpm abzentrifugiert und der Überstand in 1 ml TBS
aufgenommen. Mit dieser Lösung wird dann, analog zum Vorgehen mit AP-
Fusionsproteinen, das Proteinexpressionsfilter-Screening durchgeführt.
3.13 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Mit diesem Assay ist es möglich Protein-DNA Interaktionen nachzuweisen. Dazu wird
DNA radioaktiv markiert und mit Proteinen und evtl. kompetitiven DNA-Sequenzen
inkubiert. Bei der anschließenden Gelelektrophorese werden Protein-DNA-Komplexe
stärker im Gel zurückgehalten als ungebundene DNA.
3.13.1 Präparation der DNA-Sonden
Zunächst werden die beiden komplementären Oligonukleotide aneinandergelagert. Sie
sind so konstruiert, dass das doppelstängige Oligonukleotid freie 5‘-Enden aufweist.
Annealing: Plusstrang-Oligo (100 pmol/µl) 1,5 µl
Minusstrang-Oligo (100 pmol/µl) 1,5 µl
ddH2O 2 µl
Der Ansatz wird 5 Minuten auf 95 °C im Cycler erhitzt und langsam abgekühlt. Danach
werden die freien Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Die DNA kann dabei
radioaktiv markiert werden, indem α32P-dCTP eingesetzt wird. Nicht eingebaute
Nukleotide werden entfernt, indem die DNA gefällt und in 100 µl TE-Puffer gelöst wird.
Methoden 49
Auffüllreaktion: Annealing Mix 0,3 µl
10x Klenow Puffer 1 µl
dATG (2,5 mM) 0,5 µl
α32P-dCTP (10 µCi/µl) 1 µl
ddH2O 7,2 µl
Der Ansatz wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
3.13.2 Bindungsreaktion und nicht-denaturierende Gelelektrophorese
Es werden pro Reaktion 10 µl EMSA-binding buffer mit 0,2 µg BSA vorgelegt. 1 µl des
radioaktiv markierten Oligonukleotids und evtl. kompetitive DNA (100 ng ssDNA, poly dI-
dC, nicht-radioaktives Oligonukleotid) werden mit dem entsprechenden Protein (2-4 µl ivt-
bzw. MBP- oder GST-Protein) vermischt und mit EMSA-binding buffer auf ein
Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Die nachfolgende Gelelektrophorese erfolgt unter nicht-denaturierenden
Bedingungen in einem Tris-Glycin-Gel bei 4 °C für 2-4 Stunden. Das Gel wird bei 80 °C
getrocknet und ein Röntgenfilm aufgelegt.
Tris-Glycin-Gel: ddH2O 50,6 ml
10x Tris-Glycin-Puffer 7,2 ml
Acrylamid:Bisacrylamid (29:1) 12,4 ml
Glycerin (99 %) 1,8 ml
APS (10 %) 540 µl
TEMED 84 µl
3.14 Zellkulturtechniken 3.14.1 Kultivierung und Lagerung
Die humanen HEK293T Zellen werden in DMEM-Medium mit GlutaMAX-I (GibcoBRL),
10 % fötalem Kälberserum (FCS), 10.000 U/ml Penicillin und 10.000 U/ml Streptomycin
bei 37 °C in 5 %iger CO2 Atmosphäre kultiviert und etwa jeden dritten Tag 1:10 geteilt.
Um die Zellen längerfristig lagern zu können, müssen sie tiefgefroren und in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt werden. Dazu werden etwa 107 Zellen in 1 ml Einfriermedium
langsam auf –196 °C abgekühlt
Methoden 50
Das Auftauen der tiefgefrorenen Zellen geschieht schnell bei 37 °C. Danach wird die
Lösung sofort mit 10 ml Medium versetzt und die Zellen bei 600 rpm 5 Minuten
abzentrifugiert. Die Zellen werden in frischem Medium resuspendiert und in
Zellkulturschalen ausgesät.
3.14.2 Transfektion mittels Calciumphosphat-Präzipitation
Die Aufnahme von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen kann mit Hilfe von
Calciumphosphat geschehen. Dazu wird eine Stunde vor Beginn der Transfektion das
Medium einer zu 50 % dicht bewachsener Schale (∅ 10 cm) abgesaugt und durch 7 ml
frisches Medium ersetzt. Zur Transfektion werden 6 µg Plasmid-DNA in 175 µl Wasser
mit dem gleichen Volumen 0,5 M CaCl/HEPES versetzt und kräftig vermischt. Die
Präzipitatlösung wird mit 350 µl 2x HBS (pH 7,05) vermischt und eine Minute bei
Raumtempertatur inkubiert, bevor sie vorsichtig auf die Zellen getropft wird. Nach
12 Stunden wird das Medium ausgetauscht.
3.15 Isolierung, Färbung, Einbettung und Schnitte von Mausgewebe 3.15.1 Präparation von Mausgewebe
Mäuse wurden durch CO2-Inhalation und zervikale Dislokation getötet, die
entsprechenden Organe oder Embryonen präpariert und in PBS gewaschen.
3.15.2 lacZ-Färbung
Die entnommenen Organe werden in 0,1 M Na-Phophat Puffer gewaschen und für 1 bis
4 Stunden in lacZ-Fixierpuffer auf Eis fixiert. Danach werden sie dreimal 15 Minuten in
lacZ-Waschpuffer geschüttelt und über Nacht in lacZ-Färbelösung bei 37 °C
lichtgeschützt inkubiert. Die gefärbten Präparate werden mit PBS-Puffer gewaschen und
über Nacht in 4 % PFA fixiert. Anschließend können sie in lacZ-Waschpuffer gelagert
werden.
3.15.3 Einbetten und Schneiden von Mausgewebe in Paraffin
Die gefärbten Gewebe werden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, zweimal
10 Minuten in PBS und 10 Minuten in 0,9 % NaCl gewaschen. Anschließend werden sie
in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, zweimal 100 %
Methoden 51
Methanol für je 2 Stunden), in Isopropanol:Chloroform (1:1) geschüttelt und in Chloroform
überführt. Zum Einbetten werden sie in Chloroform:Paraffin inkubiert bis das Chloroform
verdampft ist und nach dreimaligem Wechseln des Paraffins in Blöcke eingebettet.
Die Schnitte (3-10 µm) werden mit einem Mikrotom angefertigt, im 37 °C Wasserbad auf
Polylysin-beschichtete Objektträger aufgezogen und bei 42 °C getrocknet.
Die lacZ-gefärbten Schnitte können zusätzlich noch Hämalaun/Eosin gefärbt werden.
3.16 RNA in situ Hybridisierung ganzer Embryonen
Mit dieser Technik kann die räumliche und zeitliche Expression von Genen bestimmt
werden. Die zellulär transkribierte mRNA wird mit einer spezifischen Digoxygenin-UTP-
markierten antisense-RNA nachgewiesen. Gebundene markierte RNA wird
immunhistochemisch mit Hilfe eines anti-Digoxygenin Antikörpers sichtbar gemacht.
3.16.1 Herstellung der Digoxygenin-markierten RNA-Sonde
Die entsprechende cDNA wird in Vektoren mit T3-, T7- oder SP6-Promoter kloniert und
der Vektor am 5‘-Terminus linearisiert. Der Reaktionsansatz wird Phenol/Chloroform
gereinigt. Für die in vitro Transkription wird folgender Ansatz gewählt:
Linearisierte Plasmid-DNA 1-2 µg
10x Transkriptionspuffer 2 µl
Digoxygenin-labeling Mix 2 µl
RNase-Inhibitorenmix 0,8 µl
RNA-Polymerase 1,2 µl
DEPC-H2O ad 20 µl
Der Ansatz wird zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Nachdem die RNA-Probe durch
Gelelektrophorese überprüft wurde, wird die RNA gefällt, in Ethanol gewaschen und in
100 µl DEPC-H2O gelöst. Die Lösung wird mit Hybridisierungslösung 1:10 verdünnt und
bei –20 °C gelagert.
3.16.2 Hybridisierung (Henrique et al., 1995)
Methoden 52
Die Embryonen werden in 4 % PFA fixiert und anschließend in PBT gewaschen. Die
Entwässerung erfolgt in einer aufsteigenden Methanolreihe (25 %, 50 %, 75 %, 100 %)
für je 15 Minuten, danach werden sie über Nacht in 100 % Methanol bei -20 °C gelagert.
Nach Rehydrierung in absteigender Methanolreihe, werden die Embryonen in PBT
gewaschen und eine Stunde mit 6 % H2O2 gebleicht. Das H2O2 wird ausgewaschen und
eine Proteinase K (10 µg/ml) Behandlung erfolgt unterschiedlich lange, je nach
Entwicklungsstadium:
<E9,5 1 min
E10,5 3 min
E12,5 5 min
E13,5 7 min
>E13,5 10 min
Danach wird dreimal mit PBT, dreimal mit RIPA und nochmals mit PBT gewaschen,
bevor die Embryonen 20 Minuten mit 4 % PFA/0,2 % Glutaraldehyd fixiert werden.
Danach werden sie dreimal in PBT, 10 Minuten in Hybridisierungslösung/PBT (1:1) und
10 Minuten in Hybridisierungslösung gewaschen. Die Prähybridisierung in
Hybridisierungspuffer mit tRNA erfolgt bei 70 °C für mindestens eine Stunde. Die
markierte RNA-Sonde wird bei 80 °C denaturiert und in 1:100 Verdünnung mit den
Embryonen bei 70 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wird mehrmals mit 70 °C
warmer Hybridisierungslösung gewaschen. Nach Schütteln in NTE, wird einzelsträngige
RNA durch einstündige RNase A (20 µg/µl) und RNase T1 (100 U/µl) Behandlung
degradiert. Die Embryonen werden in NTE, dann in 70 °C warmer Hybridisierungslösung
und Hybridisierungslösung/TBST (1:1) gewaschen, bevor sie mit TBST und MABT
behandelt werden. Nach Vorinkubation mit 20 % Schafserum und 1 % Blocking Reagenz
(Boehringer) wird der anti-Digoxygenin Antikörper in einer 1:2000 Verdünnung zugesetzt
und mindestens drei Stunden inkubiert. Ungebundene Antikörper werden zwei Tage lang
mit MABT abgewaschen. Zum Färben werden die Embryonen zunächst mit NTMT und
NTMT/2 mM Levamisol gewaschen. Das AP-Substrat BM Purple (Boehringer) wird mit
1 % Tween-20 und 2 mM Levamisol versetzt und mit den Embryonen inkubiert. Nach der
Färbung wird nochmal mit PBT gewaschen und mit 4 % PFA nachfixiert und vor dem
Fotographieren mit 50 % Glycerin/PBS geklärt. Anschließend können die gefärbten
Embryonen in Paraffin eingebettet und geschnitten werden.
Die Hybridisierungen auf Paraffinschnitte wurden von Nina Schumacher durchgeführt
(Leimeister et al., 1999b).
Ergebnisse 53
4 Ergebnisse
Im Folgenden werden die Ergebnisse der Hey-Proteininteraktionsstudien beschrieben.
Anschließend wird auf die DNA-Bindung von Hey-Transkriptionsfaktoren und ihren
Interaktionspartnern eingegangen, gefolgt von den Ergebnissen der Phänotypisierung
von Hey2-Knockoutmäusen.
4.1 Screening von Proteinexpressionsfiltern mit markierten Peptiden Die hairy-verwandten Proteine zeichnen sich dadurch aus, dass sie mit ihrem
carboxyterminalen WRPW-Motiv den Corepressor Groucho/TLE1 binden und damit die
Transkription ihrer Zielgene reprimieren. Die Hey-Proteine besitzen einen leicht
veränderten, aber evolutionär konservierten Carboxyterminus, mit dem sie vermutlich
auch Proteine binden können. Daher sollten zunächst die Interaktionen des Hey1-
Carboxyterminus aufgedeckt werden. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten nach neuen
Interaktionen zu suchen, wobei die bekannteste sicherlich das Yeast Two-Hybrid
Verfahren ist. Zunächst wurde jedoch eine neuartige Methode zur Detektion unbekannter
Proteinbindungen erprobt.
Das Prinzip dieses Tests besteht darin, einen Proteinexpressionsfilter mit einem
markierten Protein bzw. Peptid zu inkubieren und anschließend die gebundene Probe
anhand einer Farbreaktion nachzuweisen. Im nächsten Schritt werden dann die
entsprechenden cDNA-Klone, die das Protein auf dieser Filterstelle kodiert haben,
analysiert (s. Abb. 6).
FilterFilterprotein
Hey1-Peptid
BiotinStreptavidin
AP
AP
AP
Abb. 6: Prinzip des Screeningverfahrens. Links: AP-gekoppeltes Hey1-Peptid bindet an ein Membran fixiertes Protein. Rechts: Biotin-gekoppeltes Hey1-Peptid, mit AP-Streptavidin komplexiert, interagiert mit einem Filterprotein.
Ergebnisse 54
Es wurde ein „high-density-grid“-Proteinexpressionsfilter (hEX1) vom Ressourcen-
Zentrum (RZPD) in Berlin bezogen, der ursprünglich für die Untersuchung von
Antikörpern konzipiert wurde (Bussow et al., 1998). Als Testpeptid diente im ersten
Versuch ein carboxyterminales Hey1-Fragment, das an seinem Aminoterminus mit
alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelt war. Ein entsprechendes Expressionsplasmid
wurde in HEK293T Zellen transfiziert, die das Fusionsprotein in das Medium sezernieren.
Die Filtermembran wurde mit dem durch Zentrifugalfiltration aufkonzentrierten Medium
(3 U AP-Aktivität) inkubiert und gewaschen. Die Detektion erfolgte durch Zugabe des AP-
Substrates BM-Purple (Boehringer), womit nach einstündiger Färbung 48 eindeutige
Signale zu erkennen waren (s. Abb. 7). Die entsprechenden cDNA-Klone waren teilweise
identisch, da manche Klone mehrfach auf den Filter aufgebracht waren. Dies war bereits
ein ermutigendes Ergebnis, da ein mehrfach aufgetragener Klon auch an allen Stellen
nachweisbar sein sollte. Insgesamt wurden 39 Klone vom RZPD bezogen und durch
Plasmidreinigung und Sequenzierung des Plasmidinserts analysiert.
Abb. 7: Ausschnitt des Proteinexpressions-filters. Der Filter wurde mit einem AP-markiertem Hey1-C-terminalen Peptid inkubiert und gebundene Peptide durch AP-Substratfärbung sichtbar gemacht. Deutlich sind zwei Signale zu erkennen (Pfeil-spitzen). Die Filterproteine sind jeweils doppelt in einem bestimmten Muster um den zentral gelegenen Orientierungspunkt angeordnet.
Weiterhin wurden mit den cDNA-Klonen eigene Proteinexpressionsfilter hergestellt, um
die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse überprüfen zu können. Die Wiederholung des
Experiments zeigte eine gleichmäßige Färbung aller Proben. Zusätzlich wurden, als
Negativkontrolle, die Proteinfilter ohne das markierte Peptid nach gleichem Protokoll
behandelt, wobei sich keine Signale zeigten.
Die Auswertung ergab, dass viele der gefundenen Proteine wahrscheinlich keine
physiologisch relevanten Bindungen mit Hey1 eingehen können, da sie in
unterschiedlichen Zellkompartimenten lokalisiert sind wie z.B. Klon1A4: Fc-IgG Rezeptor.
Einige Proteine wurden mehrfach auf dem Filter detektiert (Kreatinkinase B, Clathrin,
NAPA) und zusätzlich wurden bisher unbekannte Sequenzen isoliert. Eine tatsächliche
physiologische Bindung der Hey-Proteine an Strukturproteine wie Clathrin wäre durchaus
vorstellbar, z.B. während des Transports vom Cytoplasma in den Zellkern. Da aber in
Ergebnisse 55
erster Linie nach Transkriptions-Regulatoren wie Groucho/TLE gesucht wurde, sind diese
möglichen Interaktionen nicht weiter analysiert worden. Lediglich die Interaktion mit dem
Klon 2A3, der für den Transkriptionsfaktor CREB2 kodiert, wurde näher untersucht. Eine
Bindung an den Hey1-Carboxyterminus konnte im GST-Pulldown Assay jedoch nicht
verifiziert werden. Auch an ein WRPW-Motiv im Hey1-Kontext konnte das CREB2-
Fragment nicht binden.
Da mit dem initialen Screening kein interessanter Bindungspartner gefunden werden
konnte, musste der Assay abgewandelt werden. Es wurde nun ein carboxyterminales
Hey1-Fragment (aa 283-299) in vitro synthetisiert, das an seinem Aminoterminus mit
Biotin markiert war (Prof. Dr. Dieter Palm, Würzburg). 1 nmol dieses Peptids wurde für
das Screening mit AP-gekoppeltem Streptavidin im Überschuss versetzt, wobei sich
Biotin-Streptavidin-Komplexe bilden konnten, während ungebundene Peptide durch
Zentrifugalfiltration entfernt wurden.
Anschließend wurde der hEX1-Proteinexpressionsfilter mit diesem in vitro synthetisierten
und markiertem Peptid inkubiert und die Detektion erfolgte wie zuvor. Zusätzlich zu den
alten Signalen, konnten 14 weitere Signale detektiert werden (s. Tab. 1). Diese Klone
wurden bestellt und teilweise sequenziert, wobei sich zeigte, dass erneut unbekannte
oder physiologisch eher unbedeutsame Protein gefunden worden waren.
Um den Assay weiter überprüfen zu können, wurden alle bisher bezogenen Klone auf
PVDF-Membranen gespottet und Proteinexpressionsfilter nach dem Protokol von Büssow
hergestellt. Diese Filter wurden dann mit dem biotinylierten Peptid, bzw. als
Negativkontrolle, ohne das Peptid inkubiert, gewaschen und erst dann mit alkalischer
Phosphatase, gekoppelt an Streptavidin, versetzt. Nach Zugabe des AP-Substrates
färbten sich alle Kolonien innerhalb weniger Minuten stark an. Auch bei der
Negativkontrolle (ohne Hey1-Peptid) konnte die starke Färbung gesehen werden.
Möglicherweise ist diese Reaktion auf biotinylierte bakterielle Proteine zurückzuführen,
die mit dem freien Streptavidin Komplexe bilden. Es ist bisher bekannt, dass die BCCP-
Untereinheit der bakteriellen Acetyl-CoA-Carboxylase biotinyliert wird (Chapman-Smith
and Cronan, 1999). Dies zeigt, dass es mit diesem Versuchsaufbau schwierig ist,
tatsächliche Interaktionsproteine des eingesetzten Peptids zu erfassen, da
ungebundenes Streptavidin immer starke Komplexe mit den biotinylierten Proteinen
ausbilden wird.
Klon GenBank 1A1 Beta Tubulin AF070561 1A2 Ribosomales Protein L7 X52967
Ergebnisse 56
1A3 Chr.19 Klon LLNLR-272C5 1A4 Fc-IgG Rezeptor U12255 1A5 KIAA0689 AB014589 1A6 Kreatinkinase B L47647 1B1 Kreatinkinase B L47647 1B4 AAMP M95627 1B6 Transkriptionsfaktor CR53 3' UTR AF017433 1C6 Bithoraxoid like Protein AF165516 1D2 NS1 bind. Protein AJ012449 2A1 Chr.6 Cosmid F0811 2A2 Clathrin Leichtkette M20471 2A3 CREB2 M86842 2A4 Clathrin Leichtkette M20471 2A5 NAPA U39412 2A6 unbekannt 2B2 G-Protein bindendes Protein M16538 2B4 Calsenilin AF120102 2B6 Clathrin Leichtkette M20471 2C1 Clathrin Leichtkette M20471 2C3 NAPA U39412 3A2 Chaperon für Superoxid Dismutase AF002210 3A4 PTD014 AF092135 3A6 KIAA0362 AB002360 3B1 Chr.17 clone RPC875H18 3B2 Chr. 17q13.3 3B3 BC-2 AF042384 3B4 FLJ11052 AK001914 3B5 Chr.17 clone RPC875H18 Tab. 1: Liste der sequenzierten Klone aus dem Expressionsfilter Screening.
Insgesamt erschien diese Methode zum Auffinden neuer Protein-Proteininteraktionen
noch nicht ausgereift. Daher wurde das etablierte Yeast Two-Hybrid Verfahren
herangezogen, um neue Interaktionspartner zu finden
4.2 Yeast Two-Hybrid Library Screening 4.2.1 Klonierung der Vektoren
Das Yeast Two-Hybrid System ist eine weit verbreitete Methode, neue
Proteininteraktionen zu entdecken. Das System wurde nun für die Hey-Proteine
aufgebaut und evaluiert.
Zunächst wurden die „bait“- und „prey“-Konstrukte mit den üblichen Techniken kloniert
(Ausubel et al., 2001; Sambrook et al., 1989). Als Vektoren dienten pGBKT7 und
pGADT7 (Clontech). Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung aller Vektoren und der damit
Ergebnisse 57
kodierten Proteine, die entweder für das Screening oder später für die direkten
Interaktionstests benutzt wurden.
Vektor kodiertes Protein Amino-säuren
Klonierung
GBK-HLH Hey1-HLH ohne basic 62-105 PCR clk11/clk13 EcoRI-BamHI GBK-bHLH Hey1-bHLH 39-121 PCR clikBE/clikSal BamHI-SalI GBK-bHLHOr Hey1-bHLH-Or 50-200 D15 MscI in GBK NdeI GBK-HLHOr Hey1-HLH-Or ohne basic 62-169 PCR clk11/clk14 EcoRI-BamHI GBK-heyA Hey1-bHLH-Or 38-175 PCR clk7/clk8 EcoRI-BamHI GBK-Or Hey1-Orange lang 108-169 PstI Fragment aus GBK-bHLHOr GBK-Or-s Hey1-Orange kurz 122-169 PCR clk12/clk14 EcoRI-BamHI GBK-heyB Hey1-C-Terminus 173-299 PCR clk9/clk10 EcoRI-BamHI GBK-heyC Hey1-basic-Stop 38-299 PCR clk7/clk10 EcoRI-BamHI GBK-YRPW Hey1-C-Terminus 266-299 PCR Eco-yrpw/clk4 EcoRI-NsiI GBK-sWRPW Hey1-WRPW statt YRPW 287-299 GEX-WRPW PCR
sWRPW/Kgreverse DraI-SalI GBK-sWRPY Hey1-WRPY statt YRPW 287-299 GEX-WRPY PCR
sWRPY/Kgreverse DraI-SalI GBK-blik Hey2 ohne C-Terminus 1-269 pBS-mhey2-ATG-Eco EcoRV-PstI
in GBK SmaI-PstI GBK-c-hairy1 c-hairy1-bHLH-Or 1-163 Subklonierung aus GAD-c-hairy1
EcoRI-XhoI GAD-HLH Hey1-HLH ohne basic 62-105 PCR clk11/clk13 EcoRI-BamHI GAD-HLHOr Hey1-HLH-Or ohne basic 62-169 PCR clk11/clk14 EcoRI-BamHI GAD-heyA Hey1-bHLH-Or 38-175 PCR clk7/clk8 EcoRI-BamHI GAD-Or-s Hey1-Orange kurz 122-169 PCR clk12/clk14 EcoRI-BamHI GAD-heyB Hey1-C-Terminus 173-299 PCR clk9/clk10 EcoRI-BamHI GAD-blik Hey2 ohne C-Terminus 1-172 Subklonierung aus GBK-blik NcoI GAD-c-hairy1 c-hairy1-bHLH-Or 1-163 GEX-chairy bHO ClaI, Klenow fill
in, SacI GAD-E2.2bHLH E2.2-bHLH 457-544 PCR ITF1B/ITF1S BamHI-SalI GAD-E2.5bHLH E2.5-bHLH 512-600 PCR ITF2B/ITF2S BamHI-SalI GAD-E12bHLH E12-bHLH 48-146 PCR E12B/E12S BamHI-SalI
GAD-MyoD MyoD-bHLH 74-162 PCR MyoB/MyoS BamHI-SalI Tab. 2: Liste der klonierten Vektoren für die Yeast Two-Hybrid Interaktionstests. Zusätzlich sind die kodierten Proteinfragmente sowie die Klonierungsstrategie aufgeführt.
Alle Konstrukte wurden durch Testverdau oder PCR-Reaktionen überprüft und
sequenziert. Die Proteinexpression in Hefezellen wurde durch Proteinextraktion und
Ergebnisse 58
Western-Blotting kontrolliert, womit alle rekombinanten Proteine in der erwarteten Größe
nachgewiesen werden konnten (s.Abb. 8).
Abb. 8: Western Blot Analyse von rekombinanten Fusionsproteinen. AH109-Hefezellen wurden mit den Vektoren GBK-HLH, -HLHOr, -YRPW, bzw. dem leeren pGBKT7 Plasmid transformiert. Die jeweiligen Proteinlysate wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen geblottet. Rekombinante Fusionsproteine konnten durch einen anti-c-myc Antikörper nachgewiesen werden. Die Detektion erfolgte mit dem ECL-System (Amersham). Links: Ein Gel wurde nach der Elektrophorese Coomassie gefärbt. Rechts: Western Blot. Der leere GBK-Vektor kodiert die GAL4-DBD mit c-myc Epitop in der erwarteten Größe. Die übrigen Vektoren kodieren GAL4-DBD-Hey1-Fragmente.
Anschließend wurden die transformierten Hefeklone auf verschiedenen
Selektivnährböden ausplattiert, um ihren Phänotyp zu testen und schließlich wurden alle
Konstrukte mit den entsprechenden Kontrollvektoren (pGBKT7, GBK-p53, GBK-LaminC,
bzw. pGADT7, GAD-T-Antigen) cotransformiert, um sogenannte „self activators“ von
Anfang an auszuschließen.
Lediglich das Konstrukt GBK-YRPW (Hey1-C-Terminus) zeigte eine schwache
Aktivierung der Reportergene, die allerdings durch den Zusatz von 10 mM 3-AT, einem
Inhibitor der Histidinsynthese, unterdrückt werden konnte. Die übrigen Vektoren erfüllten
alle Testkriterien und konnten für Yeast Two-Hybrid Analysen eingesetzt werden.
4.2.2 Screening mit dem Hey1-Carboxyterminus Nachdem das Screening eines Proteinexpressionsfilter mit carboxyterminalen Hey1-
Fragmenten keine entscheidenden Ergebnisse geliefert hatte, wurde nun das Yeast Two-
Hybrid System eingesetzt, um einen Interaktionspartner des Hey1-Carboxyterminus zu
finden. Es wurden zwei Screening Ansätze mit unterschiedlich langen carboxyterminalen
Hey1-Fragmenten durchgeführt.
Ergebnisse 59
4.2.2.1 Hey1 aa 266-299 (GBK-YRPW) Screening
Mit dem carboxyterminalen Hey1-Fragment (aa 266-299), das der Vektor GBK-YRPW
kodiert, wurde eine murine embryonale (E11) Genbank (Clontech) nach
Interaktionspartnern durchsucht. Da Hey1 im embryonalen Stadium E11 in zahlreichen
Geweben hoch exprimiert ist, sollten mit dieser Bank potentielle Interaktionspartner
gefunden werden.
Das Screening wurde mit der Mating-Methode durchgeführt. AH109-Zellen, die mit GBK-
YRPW transformiert waren, wurden zusammen mit der Genbank, die bereits in Y187
Zellen transformiert war, inkubiert, damit sich diploide Zellen bilden können, welche beide
Plasmide besitzen. Diploide Zellen wachsen auf SD/-Leu/-Trp Platten und wenn beide
Testproteine miteinander interagieren, können sie auch auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
Agarplatten wachsen. Die Zellen wurden in diesem Versuch direkt auf diesen
hochstringenten Nährböden ausplattiert.
Ab dem fünften Tag nach Ausplattieren wurden die großen Kolonien gepickt und auf
frische Platten ausgestrichen. Insgesamt konnten 159 Kolonien isoliert werden, von
denen 145 Klone erneut wuchsen. Diese Klone wurden auf die Expression des lacZ-
Gens mit Hilfe des filter-lift β-Galactosidase Assays untersucht. Von den 145
untersuchten Klonen waren 137 lacZ-positiv. Von diesen Klonen wurden die Plasmide
isoliert und in E. coli DH5α Bakterien transformiert. Um nur die pACT-Plasmide und nicht
die pGBK-Plasmide zu isolieren, wurden die Hefen in SD/-Leu Medium und die Bakterien
in LB+Ampicillin Medium kultiviert, wobei jeweils nur Selektionsdruck auf das pACT-
Plasmid einwirkte. Die Inserts der gewonnenen pACT-Plasmide wurden sequenziert und
mit bekannten Sequenzen in den Datenbanken verglichen. Dabei zeigte sich schnell,
dass viele Klone gleiche Inserts besitzen. Um nicht alle Plasmide sequenzieren zu
müssen, wurden mehrfach vorkommende Plasmide aussortiert.
Hierzu wurden Hybridisierungsfilter mit den entsprechenden PCR-Produkten der Insert-
DNA (Primer: act2forw, act2rev) hergestellt und mit radioaktiv markierter Insert-DNA
hybridisiert (EcoRI-XhoI geschnittene PCR-Produkte). Dabei konnten mehrfach
vorkommende identische bzw. überlappende Klone identifiziert werden. Auf den
Autoradiographiefilmen zeigten jedoch oft alle Filterproben Signale. Dies lag
wahrscheinlich daran, dass die Hybridisierungssonden nicht vollständig durch
Restriktionsverdau von den kurzen „linker“-Sequenzen getrennt wurden. Um dieses
Problem zu umgehen, wurden Bakterienkoloniefilter hergestellt und mit EcoRI-XhoI
geschnittenen Plasmidinserts hybridisiert. Die Ergebnisse hierbei waren meist wesentlich
Ergebnisse 60
deutlicher als bei den PCR-Produkt-Filtern. Abbildung 9 zeigt ein typisches
Autoradiogramm mit dem acht identische bzw. überlappende cDNA-Klone gefunden
wurden, die für das BRE-Protein kodieren.
Folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Sequenzierungen:
Klon Insertlänge/
nt
Mehrfach
Isolierung
Y 1 SDR2 1100 3x3 eIF-5a 1100 4x4 FLJ10330 2000 2x5 eEF-2 1100 4x6 unbekannt 8 unbekannt 9 BRE 1100 8x
10 Cytosin-5-Methyl Transferase 700 1x16 unbekannt 700 2x17 PTB 3' UTR 130 5x18 Hsp 70 40021 54TMp 1100 4x23 unbekannt 1100 2x25 unbekannt 110033 unbekannt 80044 snapin 1200 5x50 Splicing factor SC35 1200 3x58 HRS (SPp40) 65059 Calreticulin 1900 3x76 Math4A 3' end 1200 4x78 p311 70097 COX6a 80099 unbekannt 600 3x
100 fascin 500105 unbekannt 900
Abb. 9: Autoradiographie.Koloniehybridisierung mit einer radioaktiv markierten DNA-Probe (EcoRI-XhoI Plasmidinsert Y9: BRE). Die Hybridisierung zeigt sieben weitere Klone mit überlappenden Inserts.
Ergebnisse 61
108 unbekannt 400 7x114 unbekannt 1900117 U2 snRNP 1800118 Topoisomerase 1000119 Ubiquitin konjung. Enzym 110120 h19 hypothetical 3' ORF 850 2x123 unbekannt 500142 unbekannt 1400150 FOG2 1800 1x154 KIAA0250 600155 mitochondriale tRNA 12S 1700157 HMG-I(Y) 3' UTR 600
Tab. 3: Sequenzierungsergebnisse der im GBK-YRPW Yeast Two-Hybrid Screening isolierten Klone.
Die interessantesten Klone wurden weiter analysiert, um mögliche Proteininteraktion
verifizieren zu können. Zuerst wurde jeweils das isolierte pACT-Plasmid in den
Hefestamm Y187 transformiert und ein Matingtest mit AH109-GBK-YRPW durchgeführt.
Erneut musste ein stabiles Wachstum auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten und eine β-
Galaktosidaseaktivität nachweisbar sein. Parallel wurde durch Matingtests mit den
Kontrollplasmiden pGBK, pGBK-p53 und pGBK-LaminC festgestellt, ob es sich um eine
spezifische Interaktion handelt.
Im Folgenden werden einige der untersuchten Klone vorgestellt.
Y32 (BRE):
BRE (brain and reproductive organ expressed gene) wurde bisher nur als humanes Gen
publiziert, dessen zelluläre Expression durch UV-Lichtbestrahlung, Behandlung mit
Retinolsäure oder 4-Nitroquinolin-1-oxid stark reprimiert wird. Das BRE-Protein bindet an
die juxtamembranöse Domäne des TNFα-Rezeptors (Gu et al., 1998).
Hier wurden acht Klone des murinen Homologen gefunden, das bisher noch nicht
publiziert war. Die Interaktion mit den Kontrollplasmiden war negativ, mit pGBK-YRPW
positiv. Daraufhin musste die Hey1-BRE Bindung durch einen biochemischen in vitro
Test bestätigt werden. Im GST-Pulldown Assay konnte die Interaktion allerdings nicht
verifiziert werden, da neben einer schwachen GST-Hey1-YRPW Bande auch eine
schwache Bande bei der Negativ-Kontrollreaktion mit freiem GST zu sehen war (s.
Abb. 10). Daher konnte eine Hey1-Interaktion mit BRE nicht bewiesen werden.
Ergebnisse 62
Abb. 10: GST-Pulldown Assay zur Analyse der BRE-Bindung an den Hey1-C-Terminus. Neben dem natürlichen YRPW-Motiv, wurden auch Proteine mit WRPW, WRPY und ARPA im Hey1-Kontext eingesetzt. Als Negativkontrolle diente freies GST-Protein. 5 µl 35S-ivt-BRE-Protein wurden mit den jeweiligen GST-Proteinen und Glutathion-Sepharose inkubiert. Die an die Sepharose gebundenen GST-Proteine, sowie die an diese gebundenen ivt-Proteine wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und mit Fluorographie nachgewiesen. Es zeigt sich keine spezifische Bindung von BRE an den Hey1-Carboxyterminus bzw. an die verschiedenen xRPx-Motive. Li. Spur: 1 µl 35S-ivt-BRE-Protein (20 % der in der Reaktion einge-setzten Menge).
Y50 (splicing factor SC35)
Es zeigte sich, dass der Klon Y50, der den Splicing Faktor SC35 kodiert, beim Matingtest
mit dem leeren pGBK-Vektor bereits die Reportergene aktivieren kann und somit zu den
typischen falsch-positiven Klonen gerechnet werden muss. Zudem wurde auch im GST-
Pulldown gezeigt, dass SC35 nicht an den Hey1-C-Terminus bindet.
Y150 (FOG2)
FOG2 (friend of GATA) ist ein Protein, das acht Zinkfinger besitzt und die Funktion der
GATA-Transkriptionsfaktoren moduliert. Die Expression in der adulten Maus ist
weitgehend auf Herz, neuronales Gewebe und Gonaden beschränkt, während die
Expression in der Embryonalentwicklung auch in anderen Organen wie Lunge, Niere,
Darm und Urogenitalleiste beobachtet wird (Tevosian et al., 1999).
Die Sequenzanalyse zeigte die FOG2-cDNA, die aber am 5‘-Ende von einer Sequenz
flankiert wurde, welche keiner bekannten Sequenz zugeordnet werden konnte. Entweder
Ergebnisse 63
handelt es sich bei Y150 um ein Plasmid mit zwei Inserts oder die 5‘-Sequenz ist ein
Intron, das nicht gespleißt wurde. Da eine Hey1/FOG2 Bindung sehr interessant wäre,
wurde die eigentliche FOG2-cDNA Sequenz in den pGADT7-Vektor subkloniert, um
sicherzugehen, dass nur das FOG2-Protein translatiert wird. Die Interaktion wurde dann
erneut getestet, wobei jedoch weder im Yeast Two-Hybrid noch im GST-Pulldown eine
Interaktion nachweisbar war.
Y76 (Math4A)
Das bHLH-Protein Math4A ist ein murines atonal-Homolog, das in neuronalen
Vorläuferzellen exprimiert wird und sowohl an das achaete-scute-Homolog Mash1 als
auch an das ubiquitär exprimierte bHLH-Protein E12 bindet. Es steuert, zusammen mit
anderen Proteinen wie dem atonal-Protein in Drosophila, die frühe Entwicklung der
Vorläuferzellen zu neuronalen Zellen (Gradwohl et al., 1996).
Der von Gérald Gradwohl zur Verfügung gestellte Vektor pASV3-Math4A-full lenght
wurde getestet und im Gegensatz zum Klon Y76, der nur für die 19 carboxyterminalen,
prolinreichen Aminosäuren von Math4A kodiert, konnte keine Interaktion im Yeast Two-
Hybrid System und beim GST-Pulldown beobachtet werden. Die unspezifische Bindung
von Y76 könnte auf die Proline zurückzuführen sein, da diese an vielen Protein-Protein
Interaktionen beteiligt sind (Kay et al., 2000).
Zusammenfassung:
Auch mit diesem Yeast Two-Hybrid Assay konnte kein geeigneter neuer
Interaktionspartner gefunden werden, da die meisten der gefundenen Klone entweder
unspezifisch binden oder aber physiologisch nicht relevant erscheinen. Einige der
Sequenzen konnten keiner bekannten Sequenz zugeordnet werden. Jedoch wurde auf
eine sehr aufwendige nähere Untersuchung verzichtet, da es schien, als ob in erster Linie
unspezifische Bindungsproteine isoliert wurden.
Als nächstes wurde das Screening mit einem neuen „bait“-Konstrukt wiederholt, das ein
längeres Hey1-C-terminales Fragment kodiert.
4.2.2.2 Hey1 aa 173-299 (GBK-heyB) Screening
Dieses Screening wurde mit der gleichen Genbank und der gleichen Methode wie der
vorausgegangene Versuch mit GBK-YRPW (Hey1 aa 266-299) durchgeführt. Als „bait“
diente diesmal das GBK-heyB Konstrukt, welches das carboxyterminale Hey1-Fragment
Ergebnisse 64
(aa 173-299) kodiert. Damit sollten weniger unspezifische Interaktionspartner gefunden
werden, als mit dem zuvor eingesetzten kürzen Hey1-Fragment.
Es wuchsen weit über hundert Kolonien auf den Selektionsplatten. Von diesen wurden 70
isoliert, neu ausgestrichen und ihre lacZ-Aktivität bestimmt. Alle Klone wuchsen erneut
und zeigten eine positive lacZ-Reaktion. Die Plasmide wurden isoliert und teilweise
sequenziert und es zeigte sich erneut, dass keine interessanten Kandidaten gefunden
wurden (s. Tab. 4). Folglich wurde die weitere Analyse gestoppt. GST-Pulldown Analysen
von zwei der gefundenen Klone (B28: RNA-Polymerase Modulator 6 und B29: RNA
binding Protein) ergaben ein negatives Ergebnis.
Es musste festgestellt werden, dass das C-terminale Hey1-Fragment schlecht für Yeast
Two-Hybrid Library Screens geeignet ist, da mit ihm eine sehr große Anzahl falsch
positiver Klone isoliert wurde.
Klon B 21 unbekannt
23 BAC clone 24 unbekannt 25 COPII / m SEC66 26 MRS1 27 a1 Kollagen 28 RNA Polymerase modulator 6 29 RNA binding Protein
Tab. 4: Sequenzierungsergebnisse einiger im GBK-heyB Yeast Two-Hybrid Screening isolierten Klone.
4.2.3 Screening mit verschiedenen Hey1-bHLH-Orange-Domänen
Helix-Loop-Helix Domänen bilden in der Regel Dimere, um ihre Funktion als
Transkriptionsregulatoren, z.B. durch DNA-Bindung, zu erfüllen. Mit folgenden Analysen
wurde versucht, Interaktionspartner der Hey1-bHLH zu isolieren.
4.2.3.1 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-bHLHOr, Hey1 aa 50-200)
Das Screening wurde nach der Mating-Methode mit einer murinen embryonalen (E11)
cDNA-Genbank durchgeführt. Als „bait“ diente ein Hey1-bHLH-Orange-Fragment (Hey1
Ergebnisse 65
aa 50-200) und die Hefezellen wurden direkt auf die hochstringenten SD/-Ade/-His/-Leu/-
Trp Agarplatten ausplattiert.
Alle Kolonien wuchsen sehr langsam und erreichten bei Weitem nicht die übliche Größe.
Am neunten Tag nach dem Ausplattieren wurden trotzdem alle Kolonien gepickt und auf
frische SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Agarplatten gestrichen. Insgesamt wurden 130 kleine
Kolonien isoliert, von denen aber nur zehn weiterwuchsen, während die Restlichen
keinerlei Wachstum mehr zeigten. Diese zehn Klone wurden sequenziert und folgende
Tabelle zeigt das Ergebnis:
Klon
HO 22 Brachyury T2 5' UTR 24 hnRNP 3' UTR 31 alpha Tubulin 33 Cytochrom b5 47 unbekannt 49 hnRNP 3'UTR 55 epsilon Globin 70 Histon H3.3A 82 Preprodipeptidyl Peptidase
127 ribosomales Protein S9
Tab. 5: Ergebnis der Klonsequenzierung des GBK-Hey1-HLH-Or Screening.
Es konnte kein relevantes Protein (z.B. ein HLH-Protein) gefunden werden. Über die
Ursache, warum die Hefen so schlecht bzw. überhaupt nicht wuchsen, kann nur
spekuliert werden. Denkbar wäre, dass eine mögliche Hey1-Heterodimerisierung einen
negativen Effekt auf die Hefezellen ausübt.
4.2.3.2 Screening mit Hey1-bHLH-Orange (GBK-heyA, Hey1 aa 38-175)
Da das GBK-bHLHOr-Screening keine weiter verwertbaren Ergebnisse lieferte, wurde
erneut ein Versuch durchgeführt, allerdings mit dem GBK-heyA „bait“ (Hey1-bHLH-
Orange; aa 38-175) und der replica-plate-Methode. Dabei wurden die Hefezellen zuerst
auf SD/-Leu/-Trp Platten, die nur die diploiden Zellen selektionieren, ausgestrichen.
Nachdem die Kolonien gewachsen waren, wurden sie dann auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
Platten umplattiert. Damit können auch schwächere Protein-Protein Interaktionen
selektioniert werden, da die Hefen ausreichend Zeit haben, die Interaktionsproteine in
ausreichender Menge zu produzieren.
Diesmal wuchsen sehr viele Klone, davon wurden 276 gepickt und frisch ausgestrichen.
Alle Klone wuchsen erneut und zeigten lacZ-Aktivität. Es erschien bereits zu diesem
Ergebnisse 66
Zeitpunkt wahrscheinlich, dass in erster Linie unspezifische Interktionen selektioniert
wurden. Daher wurde nur eine Auswahl dieser Klone sequenziert, unter denen erneut
keine HLH-Proteine zu finden waren (s. Tab. 6).
Um nicht unnötig viel Zeit und Material mit der weiteren Analyse der restlichen Klone zu
verschwenden, wurde das Screening mit einer neuen cDNA-Bank nach der
Cotransformationsmethode wiederholt.
Klon
A 1 FK506 bind. p63 2 RNA bind. Protein CPI 3 Fibrillin 5 CGI-128 6 mitochondriales Genom 8 unbekannt 9 UNC 119
10 UNC 119 11 Fibrillin 12 Heterogenes nukleäres Riboprotein H 13 Hsp 40 15 unbekannt 16 SEC 61B 17 CGI-128 21 CGI-128 23 FK506 bind. p25 32 unbekannt 34 EGF-Rezeptor
Tab. 6: Sequenzierte Klone des GBK-HLH-Or Screenings.
4.2.3.3 Screening einer embryonalen (E17) cDNA-Bank mit GBK-heyA
Nachdem das Screening der embryonalen E11 Bank (Clontech) mit GBK-HLHOr und
GBK-heyA nicht zur Isolierung eines Hey1-Interaktionsproteins führte, wurde eine murine
embryonale E17 cDNA-Bank von Clontech bezogen.
Zunächst wurde der Titer der cDNA-Genbank mit 2x108 cfu/ml bestimmt. Danach wurde
die Bank in E. coli amplifiziert und die Plasmid-DNA isoliert. Zum Screening wurden ca.
1x107 AH109-Hefezellen mit dem GBK-heyA-Vektor und anschließend mit der Plasmid-
DNA der Genbank transformiert. Etwa zwei Drittel der Zellen wurden direkt auf
hochstringenten SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten ausplattiert, der Rest auf SD/-Leu/-Trp
zum anschließenden „replica-plating“ auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten.
Ergebnisse 67
Von den direkt auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp ausplattierten Klonen wuchsen zwei Kolonien
und von den umplattierten Klonen 98. 20 dieser Klone wurden sequenziert (s. Tab. 7).
Wie in dem vorangegangenen Screening konnten wieder nur Proteine entdeckt werden,
die physiologisch höchstwahrscheinlich keine relevante Bindung mit Hey1 eingehen
können.
Insgesamt kann somit festgestellt werden, dass auch für die Hey1-bHLH-Domäne mit
Yeast Two-Hybrid Library-Screening kein geeignetes Interaktionsprotein gefunden
werden konnte.
Klon CA 1 NF-kappaB p65 21 S6 Protein Kinase 3'UTR
7 Laminin-Rezeptor 23 CD81 8 Transposon 24 GPI 9 R kappaB 25 unbekannt
10 unbekannt 26 MEL=RAS related 11 unbekannt 28 MHCII 12 MUP1.5a 40 Serin Protease Inhibitor 1-1 13 G-Protein beta Untereinheit 41 unbekannt 14 Pyruvat Kinase 42 unbekannt 18 Parotis sekretiertes Protein 43 Haptoglobin 19 Serumalbumin
Tab. 7: Ergebnis der GBK-heyA Screening. Die Klone CA1 und CA7 wuchsen direkt auf SD/-SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten. Die Übrigen wuchsen nach Umplattieren von SD/-Leu/-Trp auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp.
4.3 Test der Interaktion von Hey1 mit TLE1
Das carboxyterminale WRPW-Motiv der Hes-Proteine dient als Bindungsstelle des
Groucho/TLE1-Proteins. Daher wurde vermutet, dass das ähnliche Y(R/Q)PW-Motiv von
Hey1 und Hey2 ebenfalls TLE1 rekrutiert.
In GST-Pulldown Assays konnte bereits einmal gezeigt werden, dass das
carboxyterminale Ende von Hey1 nicht mit TLE1 interagiert (B. Klamt, unveröffentlicht).
Wurde das Hey1-Motiv YRPW allerdings durch WRPW ersetzt, konnte TLE1 effizient
gebunden werden. Dagegen konnte durch Austausch mit dem Runt-WRPY-Motiv keine
Bindung an TLE1 beobachtet werden. Diese Experimente wurden zunächst wiederholt
und im Anschluß daran wurde eine mögliche Hey1-TLE1- Bindung im Yeast Two-Hybrid
Assay überprüft.
Ergebnisse 68
Die GST-Pulldown Versuche ergaben, dass TLE1 sehr gut an ein WRPW-Motiv im Hey1-
Kontext bindet, während keine Bindung an ein WRPY- oder ARPA-Motiv erfolgt (s.
Abb. 11). Die Pulldown Assays zeigten eine sehr schwache Bande Hey1-YRPW-TLE1,
die in den Versuchen von Barbara Klamt nicht gesehen wurden.
Abb. 11: GST-Pulldown Analyse der TLE1-Hey1 Interaktion. GST-Hey1-C-Terminus Fusionsproteine (KPYRPWGTEIGAF) bzw. Mutanten mit verändertem YRPW-Motiv (WRPW, WRPY, ARPA) werden mit radioktiv-markiertem ivt-TLE1-Protein und Gluta-thion-Sepharose inkubiert. An GST-Hey1 gebundenes TLE1 wird mit Autoradio-graphie detektiert. Zum Vergleich sind in der linken Spur 20 % der in der Bindereaktion eingesetzten TLE1-Menge aufgetragen. Es zeigt sich eine starke Bindung von TLE1 an das WRPW-Motiv im Hey1-Kontext. Dagegen wird die WRPY sowie die ARPA Sequenz nicht gebunden. Eine sehr schwache TLE1-Bande kann in der GST-YRPW Spur beobachtet werden.
Um eine mögliche Hey1/TLE1-Interaktion weiter zu analysieren, wurde der Yeast Two-
Hybrid Assay eingesetzt.
Dafür wurde zuerst ein TLE1-Fragment (aa 33-553) in den pGADT7-Vektor kloniert.
Anschließend konnte in zahlreichen Versuchen keine Bindung von TLE1 (aa 33-553) an
C-terminale Hey1-Fragmente nachgewiesen werden, weder in Mating- noch in
Cotransformationsassays.
Insgesamt konnte somit gezeigt werden, dass Hey1, im Gegensatz zu den übrigen hairy-
verwandten Proteinen, in vivo nicht an TLE1 binden kann und sich damit weiter von
diesen abgrenzen lässt.
Ergebnisse 69
4.4 Hey-Homo- und Heterodimerisierung mit weiteren bHLH-Proteinen 4.4.1 Hey-Homodimerisierung
Nachdem das Screening von Genbanken nicht zur Isolierung von Hey1-
Interaktionsproteinen führte, wurde nun versucht mit direkten Yeast Two-Hybrid Analysen
Interaktionspartner zu finden. Zunächst wurde getestet, ob Hey1 und Hey2 Homodimere
ausbilden und anschließend wurde überprüft, ob Hey1 mit Hey2 interagieren kann.
GST-Pulldown und Yeast Two-Hybrid Analysen zeigten eindeutig, dass Hey1 und Hey2
Homodimere formen können. Um die entscheidenden Domänen für die
Homodimerisierung zu finden, wurden verschieden lange Hey1-Fragmente kloniert und
ihre Bindungseigenschaften getestet. Die Tests zeigten folgende Ergebnisse:
Die HLH-Domäne ist für die Dimerisation entscheidend (s. Abb. 12). Die Bindung ist nicht
von der basischen Domäne abhängig, da auch die Helix-Loop-Helix Domänen ohne die
basiche Domäne in gleicher Stärke miteinander interagieren. Interessanterweise konnte
beobachtet werden, dass durch die Orange-Domäne die Homodimerisierung deutlich
verstärkt wird. Eine bHLH-Interaktion ohne Orange-Domäne konnte bei Yeast Two-Hybrid
Analysen nur dann beobachtet werden, wenn die Hefen zuerst auf SD/-Leu/-Trp Platten
ausgestrichen wurden und nachfolgend auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp umplattiert wurden.
Wurden jedoch Hey-Proteinfragmente eingesetzt, die neben der bHLH-Domäne auch die
Orange-Domäne besitzen (bHLH-Or), dann konnten die Hefezellen, wenn auch nur
schlecht, direkt auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten wachsen. Quantitative lacZ-
Aktivitätsassays bestätigten ebenfalls, dass die Orange-Domäne die bHLH-Interaktion
deutlich verstärkt (s. Tab. 8). Die Interaktion bHLH/bHLH-Or war genauso schwach wie
die Interaktion bHLH/bHLH. Folglich mussten beide Interaktionspartner die Orange-
Domäne besitzen, um eine starke Bindung auszubilden. Die isolierte Hey1-Orange-
Domäne konnte im Yeast Two-Hybrid Assay nicht an die Hey1-bHLH binden, aber mit
sich selbst interagieren. Ebenso war eine Interaktion der isolierten Hey1-Orange-Domäne
mit Hey1-bHLH-Or, Hey2-bHLH-Or und c-hairy1-bHLH-Or zu beobachten. Dies legt die
Vermutung nahe, dass die Orange-Domänen selbst miteinander interagieren und damit
eine zweite Bindungsdomäne neben der Helix-Loop-Helix ausbilden.
Zusätzlich zur Hey1- und Hey2-Homodimerisierung konnte auch die Hey1/Hey2-
Heterodimerisierung nachgewiesen werden. Auch hier zeigte sich die verstärkende
Wirkung der Orange-Domäne.
Ergebnisse 70
b HLH Orange
schwach
stark
schwach
schwach
schwach
Interaktion
keine
Abb. 12: Hey-Dimerisierung. Schematische Darstellung der bei der Hey1/2 Homo- und Heterodimerisierung beteiligten Domänen und ihre Auswirkung auf die Interaktionsstärke. Die Orange-Domäne dient als Verstärker der HLH-Bindung. Interaktionsstärken wurden anhand von lacZ-Aktivitätstests und dem Wachstum der Hefezellen auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten abgeschätzt.
Die Hey1/2-Homo- und Heterodimerisierungsanalysen zeigten erstmals, dass die Hey-
Orange-Domäne Proteininteraktionen verstärken kann. Diese Funktion war bisher noch
nicht beschrieben worden.
Im Folgenden wurde die Orange-Domäne genauer untersucht. Ein Alignment hairy-
verwandter Proteine verschiedener Spezies zeigt die hohe Konservierung von
Aminosäuren im Bereich der Orange-Domäne und unterstreicht die Bedeutung dieser
Domäne als funktionell wichtigen Proteinbestandteil (s. Abb. 13).
Ergebnisse 71
Eine Strukturanalyse des Hey1-Proteins am PSA Server (http://bmerc-www.bu.edu/psa/)
(Atchley et al., 2000) zeigte, dass die Orange-Domäne strukturell von zwei Helices
geprägt wird, die durch eine nichthelikale Region voneinander getrennt sind (s. Abb. 14).
Der Vergleich mit dem Protein-Alignment verdeutlicht, dass vor allem in den helikalen
Bereichen die größte Homologie zwischen den hairy-verwandten Proteinen besteht.
---------Helix 3---------- ------Helix 4----- Abb. 13: Vergleich der Orange-Domänen verschiedener hairy/E(spl) Proteine. In den helikalen Abschnitten ist eine starke Homologie auch zwischen den verschiedenen Spezies zu erkennen. Das Alignment wurde mit dem ClustalX Programm erstellt. Abk.: r: Ratte, c: Huhn, d: Drosophila, h: Mensch, m: Maus, zf: Zebrafisch.
Abb. 14: Strukturvorhersage von Hey1. Das PSA-Programm berechnet für jede Aminosäure des Hey1-Proteins die Wahrscheinlichkeit (0-1) in einer Helix angeordnet zu sein. Neben dem typischen bHLH-Muster sind auch im Bereich der Orange-Domäne zwei helikalen Strukturen zu erkennen.
Ergebnisse 72
4.4.2 Hey-Protein Interaktion mit c-hairy1
Nachdem mit Yeast Two-Hybrid Assays die Hey1/2-Homo- und Heterodimerisierung
bewiesen worden war, wurde nun mit dem gleichen Test gezielt nach weiteren bHLH-
Interaktionsproteinen gesucht. Erster Kandidat dafür war das hairy1-Protein des Huhns
(c-hairy1), das große Homologie zum murinen Hes1-Protein aufweist.
Entscheidend für diese Auswahl war die Beobachtung von Cornelia Leimeister, dass das
dynamische und oszillierende Expressionsmuster von c-Hey2 während der
Somitogenese in Hühnerembryonen dem von c-hairy1 gleicht (Leimeister et al., 2000a).
Dies führte zur Hypothese, dass beide Proteine miteinander interagieren könnten. Um
dies zu testen, wurden GST-Pulldown Assays und Yeast Two-Hybrid Assays mit murinem
Hey1 bzw. Hey2 und c-hairy1 durchgeführt, da die Hühnchengene c-Hey1 und c-Hey2 zu
diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig kloniert waren. In GST-Pulldown Assays konnten
eindeutig die Interaktionen Hey1/c-hairy1 und Hey2/c-hairy1 gezeigt werden (s. Abb. 15).
Auch im Yeast Two-Hybrid Assay war eine starke Interaktion der Hey1- bzw. Hey2-bHLH-
Orange mit der entsprechenden c-hairy1-Domäne zu beobachten. Dies konnte durch
quantitative lacZ-Aktivitätstests mit ONPG als Substrat bestätigt werden. Hey1- bzw.
Hey2-bHLH ohne Orange-Domäne zeigte eine weitaus schwächere Bindung. Sie war nur
dann zu sehen, wenn die Hefen erst auf SD/-Leu/-Trp wuchsen und dann auf SD/-Ade/-
His/-Leu/-Trp umplattiert wurden. Dies unterstützte erneut die Hypothese, dass die
Orange-Domäne Protein-Protein Interaktionen deutlich verstärkt. Ein weiterer
interessanter Befund ist, dass c-hairy1 starke Homodimere bildet, während Hey1 und
Hey2 nur relativ schwach homodimerisieren (s. Tab. 8). Die Heterodimerisierung Hey/c-
hairy1 ist deutlich stärker ausgeprägt als die Hey-Homodimerisierung, daher scheinen
Hey-Proteine in vivo bevorzugt Heterodimere auszubilden.
Alle Tests wurden sowohl mit der Cotransformations-, als auch mit der Matingmethode
durchgeführt, wobei beide Verfahren übereinstimmende Ergebnisse produzierten.
4.4.3 Hey1/2- und c-hairy1-Protein Interaktionen mit Klasse A E-Proteinen und MyoD
Klasse A E-Proteine sind ubiquitär exprimierte bHLH-Proteine, die sich durch ihre
Fähigkeit auszeichnen, an die E-Box DNA-Sequenz CANNTG zu binden. Die Hes-
Proteine binden an Klasse A E-Proteine, um dann als Transkriptionsrepressoren zu
wirken. (Oellers et al., 1994; Ohsako et al., 1994; Van Doren et al., 1994). MyoD ist ein
Klasse B bHLH-Protein, das zusammen mit myf5, MRF4 und myogenin die Bildung von
Muskelzellen aus undifferenzierten Zellen oder Fibroblasten steuert (Ordahl and Williams,
Ergebnisse 73
1998). Da es Überlappungen der MyoD-Expression mit denen der Hey-Gene während
der Somitogenese gibt, wurde auch MyoD für Interaktionstests herangezogen.
Mit Yeast Two-Hybrid Analysen wurde die Hey1- und Hey2-Interaktion mit E12, E2-2, E2-
5 und MyoD überprüft. Weiterhin wurde die Bindung von c-hairy1 an die zuvor genannten
Proteine getestet.
Dabei wurde festgestellt dass, Hey1, Hey2 und c-hairy1 mit der bHLH-Domäne von
MyoD, E2-2 (Genbank #M30313) und E2-5 (Genbank #M30314) interagieren können.
Eine Dimerisierung mit dem sehr ähnlichen E12-Protein konnte jedoch nicht beobachtet
werden. Alle Interaktionen wurden wie in den vorangegangenen Tests ausführlich
überprüft, um sicherzustellen, dass alle genannten Interaktionen spezifisch sind.
GAL4 AD
GAL4 DBD
Hey1 bHLH
Hey1 bHLH-
Or
Hey1 C-
Terminus
Hey2 bHLH-Or
c-hairy1 bHLH-Or
E12 bHLH
E2-2 bHLH
E2-5 bHLH
T- Antigen
Hey1-bHLH
+ + - + + - + + -
Hey1-bHLH-Or
+ + - + +++ (7,80)
- ++ (0,50)
+ -
Hey1-C-Terminus
- - - - - - - - -
Hey2-bHLH-Or
+ ++ (0,60)
- ++ (0,72)
+++ (8,15)
- ++ (2,75)
+ -
c-hairy1-bHLH-Or
+ +++ (7,22)
- +++ (7,70)
+++ (2,18)
- ++ (0,61)
+ -
p53 - - - - - - - - +++ (58,20)
Tab. 8: Übersicht der Hey1, Hey2 und c-hairy1 Interaktionen in Yeast Two-Hybrid Assays. Die Interaktionsstärke ist definiert als +++ (direktes Wachstum auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten), ++/+ (primäre Selektion auf SD/-Leu/-Trp Platten notwendig, anschließend Wachstum auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Platten). In Klammern ist die lacZ-Aktivität (in U) bei Flüssigtests mit ONPG als Substrat angegeben. Als Negativkontrollen dienten die Interaktionen mit p53, Hey1-C-Terminus bzw. T-Antigen. Als Positivkontrolle wurde die sehr starke Interaktion p53/T-Antigen herangezogen.
Die HLH-Domäne war jeweils für die Bindung an E2-2, E2-5 und MyoD ausreichend, es
konnte jedoch eine stärkere Interaktion beobachtet werden, wenn HLH-Orange als
Interaktionspartner gewählt wurde. Wie die Orange-Domäne diese Interaktionen verstärkt
ist unklar, da die Bindungspartner selbst keine derartige Domäne besitzen, die mit der
Orange-Domäne direkt interagieren könnte. Möglicherweise stabilisiert daher die Orange-
Domäne das bHLH-Dimer in einer bisher unbekannten Weise.
Ergebnisse 74
Mit GST-Pulldown Assays wurden die oben genannten Interaktionen überprüft und
bestätigt (s. Abb. 15). Allerdings konnten nur mit dem in vivo Verfahren die
unterschiedlichen Bindungsstärken eindeutig detektiert werden.
20 % Input GST-Hey2 GST-c-hairy1
c-ha
iry1
m-H
ey2
E2-5
m-H
ey1
c-ha
iry1
m-H
ey2
E2-5
m-H
ey1
c-ha
iry1
m-H
ey2
E2-5
m-H
ey1
Abb. 15: GST-Pulldown Assay zum Nachweis der Interaktionen von Hey1, Hey2, c-hairy1 und E2-5. c-hairy1, mHey1, mHey2 und E2-5 wurden in vitro translatiert und mit 35S markiert. GST-hHey2 bzw. GST-c-hairy1 wurden mit den ivt-Proteinen und Glutathion-Sepharose inkubiert. An GST-Proteine gebundene ivt-Proteine wurden aufgereinigt, aufgetrennt und mit Fluorographie nachgewiesen. 20 % der in der Bindungsreaktion eingesetzten ivt-Protein Menge wurde zur Kontrolle aufgetragen (links). Als Negativkontrolle diente freies GST-Protein, woran keine Bindung erfolgte (nicht gezeigt).
4.5 DNA-Bindung von Hey1/2, c-hairy1 und E-Proteinen
Viele bHLH-Proteine können als Dimere spezifische DNA-Sequenzen binden. hairy
bindet bevorzugt an N-Box-Sequenzen (CACGCG), während die optimale Bindungsstelle
Ergebnisse 75
für Enhancer-of-split-Proteine eine E-Box (CACGTG) darstellt, wobei flankierende
Nukleotide die Bindungsstärke beeinflussen. Für E(spl) wurde folgende Sequenz als
optimale Bindungsstelle postuliert: TGG CACGTG CCA (Jennings et al., 1999). Binding
site selection Analysen ergaben, dass Hey1 die gleiche Sequenz optimal bindet (Fischer
et al., 2002). Mit Electrophoric Mobility Shift Assays (EMSA) wurde nun versucht, das
Resultat der Bindungsselektion für Hey1 zu bestätigen, als auch die Bindung weiterer
bHLH-Proteine an diese DNA-Sequenz zu überprüfen. Weiterhin wurde getestet, wie sich
verschiedene Hey-Heterodimere bei der DNA-Bindung verhalten.
Als Zielsequenz wurde folgendes Oligonukleotid (E-Hey) gewählt, das zentral die E-Box
Sequenz CACGTG enthält:
AGCTTGATA TGG CACGTG CCA GTCTGGATCE-Box
Die EMSA-Versuche belegten eindeutig, dass Hey1 und Hey2 (bHLH-Orange) diese
Sequenz spezifisch binden. Durch Zugabe von nicht-radioaktivem Oligo wurde das Signal
dosisabhängig geschwächt, was die Spezifität der Bindung beweist. Die verwandte MCK-
Enhancer Sequenz CACCTG konnte die Bindung überraschenderweise nicht
kompetieren (s. Abb. 17). Dies zeigt, dass Hey-Transkriptionsfaktoren ganz spezifisch nur
eine Subgruppe von E-Box Elementen binden. Auch poly dI-dC konnte die Bindung
kompetieren, jedoch nicht so stark wie nicht-markierter Oligo. Es wurden sowohl in vitro
translatierte als auch GST- bzw. MBP-Hey-Fusionsproteine eingesetzt. Die
Fusionsproteine wurden zuvor wie in 3.9.3 beschrieben aufgereinigt und analysiert (s.
Abb. 16). Alle diese Proteine konnten die DNA-Sequenz in gleicher Stärke binden.
Abb. 16: Proteinaufreinigung von MBP-E2-2.MBP-E2-2 wurde in E. coli BL21 exprimiert. Nach der Zellernte wurde das Bakterienlysat mit Amylose-Resin versetzt und ungebundene Proteine abgewaschen. Gebundenes MBP-Protein wurde durch Zugabe von Maltose eluiert und fraktioniert aufgefangen. Aliquots der Fraktionen 1-5 wurden mit SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die Coomassie-Färbung zeigt eine saubere MBP-E2-2 Proteinbande. Zur Konzentrationsabschätzung wurden definierte Mengen BSA eingesetzt (links). PM: Größenstandard
Ergebnisse 76
Abb. 17: DNA-Bindung von Hey1 und Hey2. Links: Radioaktiv (32P) markierte Oligo-DNA, welche die Hey-Zielsequenz CACGTG (E-Hey) enthält, wurde mit MBP-Hey2-Protein versetzt. Die anschließende native Gelelektrophorese zeigt, dass die DNA in einem hochmolekularem Komplex läuft, da sie an das Protein gebunden ist. Ungebundene DNA, die im Überschuss zugesetzt wurde, läuft bis in das untere Drittel des Gels. Die Kompetierung der Bindung ist in den Spuren 2-4 gezeigt. 1: kein Kompetitor; 2: +100 ng ssDNS; 3: +100 ng poly dIdC; 4: +100 ng kalte Oligo-DNA; 0: kein Hey2-Protein zugegeben als Negativkontrolle. Rechts: GST-Hey1 bzw. GST-Hey2 binden die optimale Hey-Zielsequenz (linke Spur). 50-facher Überschuss nicht-markierter E-Hey Oligo-DNA kompetiert diese Bindung, während ein 50-facher Überschuss der verwandten MCK-Enhancer E-Box Sequenz CACCTG keine Kompetition zeigt.
Im nächsten Schritt wurde die Bindung der inzwischen bekannten Hey-
Interaktionspartner c-hairy1, E2-2 und E2-5 an die Hey-Zielsequenz überprüft. Die
genannten Proteine konnten als Homodimere ebenfalls an diese Zielsequenz binden.
Um nun die Bindungseigenschaften verschiedener Hey-Heterodimere testen zu können,
wurden Kombinationen zwischen den ivt-Proteinen und den GST- bzw. MBP-
Fusionsproteinen eingesetzt. Der deutliche Größenunterschied der Fusionsproteine im
Vergleich zu den ivt-Proteinen ermöglichte es, die Signale nach der Elektrophorese dem
jeweiligen Protein eindeutig zuzuordnen.
Ergebnisse 77
Dabei konnten alle diese Proteine die Hey-Zielsequenz als Homodimer binden, allerdings
war niemals die Bildung eines Heterodimers beobachtet worden. Dabei hätte man eine
Bande zwischen den beiden Banden der jeweiligen ivt- und MBP/GST-Homodimere
sehen müssen. Weitere Kontrollexperimente zeigten, dass auch keine Dimere zwischen
einem ivt-Protein und dem gleichen MBP- oder GST-Fusionsprotein ausgebildet werden,
z.B. ivt-Hey2/MPB-Hey2 (s. Abb. 18). Anscheinend ist die Ausbildung eines solchen
Heterodimers unter diesen Versuchsbedingungen nicht möglich. Abschließend kann
festgehalten werden, dass Hey1/2, c-hairy1, E2-2 und E2-5 spezifisch an die E-Box DNA-
Sequenz CAC GTG binden können und damit wahrscheinlich die Transkription
bestimmter Gene in vivo steuern.
Abb. 18: EMSA zur Analyse der DNA-Bindung von Hey, c-hairy1 und E2-2 an die Hey-Zielsequenz. Bei allen Versuchen wurde die Kompetition der Protein/DNA-Bindung durch Zugabe von 100 ng ssDNA (Spur 2), 100 ng poly dIdC (Spur 3) bzw. 100 ng kaltes E-Hey Oligonukleotid (Spur 4) getestet. Alle Interaktionen waren durch Zugabe nicht-radioaktiver E-Hey DNA (Spur 4) deutlich kompetierbar. In Spur 0 wurde jeweils kein Protein eingesetzt. Abk.: H1: Hey1; H2: Hey2; cH: c-hairy1. Links: MBP-Hey2 und ivt-c-hairy1 wurden mit Hey-tar DNA inkubiert. Beide Proteine binden als Homodimer an die DNA. Ein Hey2/c-hairy1-Heterodimer kann nicht beobachtet werden. Mitte: Test der Dimerisierung zwischen ivt-Hey2 und MBP-Hey2. Beide binden als Homodimer an Hey-tar, nicht jedoch als Heterodimer. Rechts: MBP-E2-2 und ivt-Hey1 binden an die Zielsequenz. Auch hier sind keine Heterodimere zu beobachten.
Ergebnisse 78
4.6 Genexpressions- und Funktionsanlysen an Hey2-Knockoutmäusen Im folgenden Teil dieser Arbeit werden die Ergebnisse der Untersuchungen an Hey2-
Knockoutmäusen beschrieben. Bei diesen Mäusen wurden entscheidende Abschnitte
des Hey2-Gen (Exons 2 mit 3 und Intron 3) durch das lacZ-Gen ersetzt (s. Abb. 19).
Homozygote Mäuse, die kein funktionelles Hey2-Gen mehr besitzen, sterben meist in
den ersten Tagen nach der Geburt (ca. 80 % der Homozygoten), während heterozygote
Tiere normal erscheinen und fertil sind (Gessler et al., 2002). Es stellte sich zunächst die
Frage, an welchen Defekten die homozygoten Mäuse sterben.
1 5432
54lacZ pA
Hey2-Gen
ersetzt durch lacZ1 lacZ
Abb. 19: Genomische Struktur des Knockoutallels. Oben: Genomische Struktur des Hey2-Gen mit fünf Exons und Promoterregion (Pfeil). Unten: Genomische Struktur des Knockout-Allels. Hier wurden die Exons 2 und 3 durch das
lacZ-Gen mit Stopcodon und poly-Adenylierungssequenz ersetzt.
4.6.1 Obduktion von Hey2-Knockoutmäusen
Hey2-Knockoutmäuse wurden in den Stadien P1-P7 (Tag 1-7 postnatal) obduziert und
mit heterozygoten und Wildtypmäusen des gleichen Wurfs verglichen. Dabei zeigte sich,
dass die homozygoten Mäuse zumeist kleiner und leichter waren als die entsprechenden
Kontrolltiere. Die Obduktionen ergaben einen sehr interessanten Befund. Alle
homozygoten Hey2-Knockoutmäuse besaßen ein stark vergrößertes und deformiertes
Herz. Abb. 20 zeigt den thorakalen Situs von Knockout- und Wildtypmäusen im Stadium
P3.
Die Untersuchung der präparierten Herzen und Gewebeschnitte zeigten einen massiv
vergrößerten linken Ventrikel (s. Abb. 21). Der rechte Ventrikel war bei den meisten
Tieren ebenfalls vergrößert. Die Hypertrophie führt höchstwahrscheinlich zu einer
terminalen Herzinsuffizienz, was die Hauptursache der frühen Letalität darstellen dürfte
(s.a. Diskussion). Überraschenderweise tritt diese Herzdeformierung erst kurz nach der
Geburt auf. Die Herzen der Embryonen sind makroskopisch nicht auffällig verändert. Dies
impliziert, dass die postnatale Kreislaufumstellungen (Belüftung der Lunge, Verschluss
des Ductus Botalli und des Foramen ovale) zu einer akuten Dekompensation des
insuffizienten Myokards führt. Bemerkenswert ist, dass diejenigen Mäuse, die diese
Ergebnisse 79
kritische Periode überleben, keine weiteren Symptome mehr aufweisen. Sie erreichen
zeitverzögert normale Körpergröße und Gewicht. Auch das Herzgewicht-Körpergewicht
Verhältnis normalisiert sich, wobei das Herz seine charakteristische, deformierte Form
allerdings beibehält.
Weitere histologische Untersuchungen wurden daraufhin von Pathologen in Würzburg
und Erlangen vorgenommen, auf deren Resultate in der Diskussion eingegangen wird.
Die übrigen Organe erschienen makroskopisch unauffällig und wurden zunächst nicht
eingehender untersucht, da der kardiale Phänotyp im Vordergrund stand. Die
heterozygoten Tiere erschienen normal und zeigten keinen auffälligen Unterschied zu
Wildtypmäusen.
Abb. 20: Thoraxsitus im Stadium P3. Die vordere Thoraxwand sowie Teile des Thymus wurden ent-fernt. Oben: Wildtyp. Normaler Situs Unten: Hey2-/--Maus. Das Herz ist biventrikulär massiv vergrößert, während die Vorhöfe unauffällig erscheinen. Die Herz-kranzgefäße verlaufen wie die großen Arterien normal. Die Lungen sind nach dorsal ver-drängt.
Ergebnisse 80
WTKO
4.6.2 lacZ-Expression in Herz und Gefäßen von Hey2-Knockoutmäusen
Abb. 21: Detailansicht Herz postnatal. Rechts: Wildtyp. Links: Hey2-Knockout. Deutlich zu erkennen ist die Herzhypertrophie bei erhaltenem Lumen. Hier wurde eine Hybridisierung mit ANF (atrialer natriuretischer Faktor) vorgenommen. ANF ist deutlich überexprimiert in Hey2-/- Herzen (Nina Schumacher).
Die Expression des lacZ-Gen in Herz und Blutgefäßen wurde an hetero- und
homozygoten Hey2-Knockoutmäusen untersucht, bei denen Abschnitte von Hey2 durch
das lacZ-Gen ersetzt worden waren (s. Abb. 22-24). Da die flankierenden Regionen
erhalten blieben, sollte die lacZ-Expression der von Hey2 entsprechen. Die
Genexpression kann mit Hilfe einer lacZ-Färbung mit dem Farbstoff BM-Purple
(Boehringer) durch Blaufärbung nachgewiesen werden. Im Stadium P5 war folgende
lacZ-Expression zu beobachten:
Epi-, Endo- und Myokard zeigen keine lacZ-Expression, lediglich die Koronargefäße
waren blau gefärbt, während Aorten- und Pulmonalklappen unregelmäßig gefärbt waren.
Alle großen Arterien (Aorta, A. brachiocephalica, A. carotis, A. subclavia, Truncus
pulmonalis, Aa. pulmonales) sowie deren Äste zeigten eine starke lacZ-Expression v.a. in
Endothel und Media (s. Abb. 24). Die Residualstruktur des Ductus arteriosus Botalli, das
Lig. arteriosum, exprimierte ebenfalls lacZ. Diese Ergebnisse der Gefäßuntersuchungen
stehen in Einklang mit den bereits publizierten embryonalen Hey2-Expressionsmustern
(Leimeister et al., 1999b). Überraschenderweise war aber bei den postnatal untersuchten
Mäusen keine lacZ-Expression in den Ventrikeln nachzuweisen, während Embryonen im
Stadium E17.5 Hey2 noch in den Ventrikeln exprimieren. Es zeigte sich, dass die Hey2-
Expression im Ventrikel perinatal beendet wird. Die gleiche Beobachtung wurde später
von M. Chin auch an Ratten gemacht (Chin et al., 2000).
Ergebnisse 81
Abb. 22: lacZ-Expression in Herz, großen Gefäßen und Lungenhilus. Herz und herznahe Arterien einer adulten heterozygoten Hey2-Maus wurden unter dem Mikroskop präpariert, eine Stunde fixiert und über Nacht mit lacZ-Färbelösung versetzt. Alle Arterien exprimieren lacZ und sind daher blau gefärbt. Das Myokard zeigt keine Färbung, während die Herzkranz-gefäße lacZ exprimieren.
Abb. 23: lacZ-Färbung eines Hey2+/--Mausembryo (E11.5). Deutliche lacZ-Expression in Ventrikeln(V), der dorsalen Aorta (Ao), den Spinalganglien (SG), der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (MHG), dem Ohrvesikel (OV), den Kiemenbögen sowie den Extremitäten (Ex). Das lacZ-Expressionsmuster stimmt mit der Hey2-Expression im Wildtyp überein. Ex OV MHG
Ao V SG
Abb. 24: Paraffinschnitt eines lacZ-gefärbten Herz und Gefäß Präparats. Im Stadium P5 sind Aorta (Ao) und A. pulmonalis (PA) blaugefärbt. Pulmonal- (PuK) und Aortenklappe (AK)zeigen ein unregelmäßiges Expressions-muster, während das Myokard postnatal kein lacZ bzw. Hey2 mehr exprimiert. Epikardial ist eine Koronararterie (Ko)angeschnitten. LV, RV: linker, rechter Ventrikel.
Ao
PA
PuK
AK
RV Ko LV
Ergebnisse 82
4.6.3 Arteriographie von Hey2-Knockoutmäusen Wie bereits erwähnt, entwickeln die Hey2-Knockoutmäuse einen massiv vergrößerten
linken Ventrikel. Eine mögliche Ursache für die Hypertrophie könnte eine Stenose der
linksventrikulären Ausstrombahn oder eine Aortenstenose sein. Diese Vermutung wurde
durch eine Publikation der Arbeitsgruppe von Mark Fishman bekräftigt, die zeigten, dass
eine Mutation des Hey2-Gen im Zebrafisch (gridlock) zu einer Aortenstenose führt (Zhong
et al., 2000).
Daraufhin wurden in Zusammenarbeit mit Armin Helisch am Max Planck Institut für
Physiologische und Klinische Forschung in Bad Nauheim Arteriographien durchgeführt,
um eine mögliche Arterienstenose bei Hey2-Knockoutmäusen aufzudecken. Es wurden
sowohl neugeborene (P3) als auch adulte Mäuse (WT, +/-, -/-) untersucht. Die
Knockoutmäuse fielen sofort durch ihr vergrößertes und deformiertes Herz auf. Nach
Punktion des linken Ventrikels und Eröffnung des rechten Vofhofs wurde das Blut
vollständig mit Fixierlösung aus dem Gefäßsystem gespült. Anschließend konnte
Kontrastmittel in das arterielle System injiziert werden. Die Arteriographie zeigte ein
regelrechtes Arteriensystem in allen untersuchten Tieren. Aplasien, Kaliber-
schwankungen, Stenosen oder Kollateralkreisläufe wie in der gridlock-Mutante konnten
nicht entdeckt werden (s. Abb. 25).
Daher kann die Herzhypertrophie nicht durch eine Aortenstenose verursacht werden,
sondern durch eine postnatal schlagartig einsetzende Kardiomyopathie. Die
Beobachtung der überlebenden Knockoutmäuse hat gezeigt, dass die Kardiomyopathie
überraschenderweise nicht progredient verläuft, sondern vielmehr nach der kritischen
Phase peri- und postnatal sistiert. Die Mäuse entwickeln sich schließlich verzögert zu
normal erscheinenden adulten Tieren. Da die Hypertrophie nicht zunimmt, gleicht sich
auch der Herzgewicht/Körpergewicht-Quotient wieder den Normalwerten an. Allerdings
bleibt das Herz der Nullmutanten lebenslang verformt.
Ergebnisse 83
Abb. 25: Angiographie einer vier Wochen alten Hey2-Knockoutmaus. Kontrastmittel wurde in den linken Ventrikel injiziert und damit in den systemischen Kreislauf gepumpt. a) Das Röntgenbild zeigt die
Arterienperfusion im gesamten Körper.
b) Vergrößerter Ausschnitt: Herz, Aortenbogen mit abgehenden Ästen, thorakale Aorta und Interkostal-arterien. Der Gefäßverlauf ist regelrecht und es lassen sich keine Stenosen, Kaliberschwankungen oder Kollateralkreisläufe erkennen. Das Herz ist deutlich verformt.
4.6.4 Elektrokardiogramm (EKG)
Die hohe Letalität der Hey2-Knockouttiere in den ersten Tagen nach der Geburt könnte
auch durch Defekte im Reizleitungssystem des Herzen bedingt sein.
Um dies aufzuklären wurden 3-Kanal-Elektrokardiogramme an anästhesierten Wildtyp-,
Hey2+/-- oder Hey2-/--Mäusen in den Stadien P1-P5 abgeleitet. Die Tiere wurden mit Hilfe
einer Inhalationsnarkose sediert und analgesiert bevor die EKG-Elektroden angebracht
werden konnten. Es zeigten sich keine Unterschiede in Bezug auf Herzfrequenz (390-
510/min), Erregungsentstehung und –ausbreitung zwischen den verschiedenen
Genotypen (s. Abb.26). Weitere Differenzierungen wie Lagetyp oder Hypertrophiezeichen
können mit dieser Technik nicht erfasst werden. Da immer nur einige Minuten lang das
EKG abgeleitet wurde, kann natürlich nicht ausgeschlossen werden, dass die
Knockoutmäuse dennoch paroxysmale Störungen aufweisen. Dies wäre nur durch
kontinuierliche EKG-Überwachung nachweisbar. Allerdings fehlten dafür die benötigten
Geräte.
Diese Versuche wurden in Kooperation mit Prof. Dr. Lutz Hein am Institut für
Pharmakologie, Universität Würzburg, durchgeführt.
Ergebnisse 84
Abb. 26: EKG-Analyse. Vergleich von EKG- Aufzeichnungen anästhesierter (2,2 % Isofluran/O2) Wildtypmäuse mit Hey2-Hetero- und Homozygoten des gleichen Wurfs. Schreibgeschwindigkeit: 25 mm/sec. Die Herzfrequenz der verglichenen Mäuse ist ähnlich. Es lässt sich keine auffällige Rhythmusstörung feststellen.
Ergebnisse 85
4.6.5 Expression von Hey1 und HeyL in Hey2-Knockout Embryonen
Das Hey2-Gen wird in zahlreichen Geweben exprimiert. Eine homozygote Deletion führt
jedoch nur zu einem ausgeprägten kardialen Phänotyp während die übrigen Organe,
nach aktuellem Wissensstand, normal erscheinen. Möglicherweise kann die ausgefallene
Hey2-Funktion von den nahe verwandten Hey1- und HeyL-Genen teilweise kompensiert
werden. Zudem wäre ebenfalls denkbar, dass Hey1 bzw. HeyL in manchen Geweben der
Hey2-Knockoutmäuse ektop exprimiert werden.
Um eine ektope Expression auszuschließen, wurde die Expression von Hey1 und HeyL
in Hey2+/-- und Hey2-/--Embryonen durch RNA in situ Hybridisierungen mit der in
Wildtypembryonen verglichen (s. Abb. 27,28). Dabei wird die entsprechende zelluläre
mRNA durch eine Digoxygenin-UTP markierte antisense RNA-Sonde spezifisch
gebunden. Die gebundene RNA-Sonde wird immunhistochemisch mit einem
Digoxygenin-Antikörper nachgewiesen.
Die whole mount RNA in situ Hybridisierungen in den embryonalen Stadien E9.5, E10.5
und E11.5 zeigten die gleichen Expressionsmuster sowohl von Hey1, als auch von HeyL
in Wildtyp-, Hey2+/- und Hey2-/- Embryonen. Das suggeriert, dass die Hey2-Funktion
zumindest in den Geweben, in denen die Hey-Gene nicht coexprimiert werden, wie z.B.
den Herzventrikeln, nicht kompensiert wird. Genauere Analysen an Paraffinschnitten
ergaben das gleiche Ergebnis.
In Zellen, in denen die Hey2 mit Hey1 oder HeyL coexprimiert werden, könnte natürlich
die Hey2-Funktion von den anderen Hey-Genen übernommen werden. Dies lässt sich
durch in situ Hybridisierungen nicht klären, hier werden Studien an Hey1/Hey2- und
HeyL/Hey2-Knockoutmäusen Aufschluss ergeben.
Ergebnisse 86
ST KS
OV
NG
Ex Mes At
Tel
SN
Abb. 27: Hey1-RNA in situ Hybridisierung von WT und Hey2-KO Embryonen. Das Hey1-Expressionsmuster der Hey2-/--Embryonen (rechts) unterscheidet sich nicht vom Wildtyp (links) in den Stadien E9.5, 10.5 und 11.5. Hey1 wird in Herzvorhof (At), Septum transversum (ST), Somiten, Arterien (nicht gezeigt), Ohrvesikel (OV), Kiemenspalten (KS), Extremitätenknospen (Ex), Spinalnerven (SN), Telencephalon (Tel), Mesencephalon (Mes) und Nasengruben (NG) exprimiert.
Ergebnisse 87
So
KB
TG
Tel
SG
Abb. 28: HeyL-RNA in situ Hybridisierung von WT und Hey2-KO Embryonen. Expressionsmuster von HeyL in Hey2-Knockoutembryonen (E9.5, 10.5 und 11.5) (rechts) im Vergleich zum Wildtyp (links). HeyL-Expression wird in folgenden Geweben beobachtet: Telencephalon (Tel), Trigeminalganglion (TG), Spinalganglien (SG), Kiemenbögen (KB), Arterien (nicht gezeigt) und Somiten (So).
Diskussion 88
5 Diskussion
Der Notch-Signalweg ist ein entscheidender Regulator der embryonalen und adulten
Zelldifferenzierung, wobei seine einzelnen Komponenten unterschiedliche Funktionen in
verschiedenen Geweben besitzen. Die kürzlich identifizierten Hey-Gene stellen eine neue
Gruppe von Notch-regulierten Transkriptionsfaktoren dar. Ihre biochemische
Charakterisierung sowie die Analyse von Hey-Knockoutmäusen werden im Folgenden
diskutiert.
Screening von Proteinexpressionsfiltern
Bei der Suche nach Interaktionsproteinen des Hey1-Carboxyterminus wurde zunächst
eine neue Screening-Technik eingesetzt. Es wurden Proteinexpressionsfilter mit Hey1-
Peptiden inkubiert, die mit Biotin bzw. alkalischer Phosphatase (AP) markiert waren. Das
AP-gekoppelte Peptid wurde aus HEK-293T-Zellen gewonnen, während das Biotin-
markierte Peptid in vitro synthetisiert (Prof. Dr. Dieter Palm, Würzburg) und anschließend
mit Streptavidin-AP gekoppelt wurde. An die Filterproteine gebundene Peptide konnten
daher mit einer von alkalischer Phosphatase katalysierter Farbreaktion nachgewiesen
werden.
Das Screening ergab eindeutige Signale, da alle Klone in einem bestimmten Muster
zweifach auf die Membran gespottet waren und die beobachteten Signale diesem Muster
entsprachen. Manche Klone konnten mehrfach isoliert werden. Die Analyse der
gefundenen Proteine erbrachte jedoch nicht das erwünschte Ergebnis, da keine
physiologisch relevanten Interaktionspartner entdeckt werden konnten. Eines der
isolierten Proteine (CREB2) wurde mit GST-Pulldown Assays auf eine Interaktion mit
Hey1 überprüft, dabei zeigte sich jedoch keine Bindung.
Obwohl die Ergebnisse reproduzierbar waren, kann nicht abschließend beurteilt werden,
ob dieses Screeningverfahren eine Alternative zu den üblichen Proteininteraktion-
Detektionsverfahren darstellt. Zur weiteren Evaluation müsste zunächst mit einem
Protein, dessen Interaktionspartner bekannt sind, ein solcher Filter gescreent werden und
das Ergebnis mit den Literaturdaten verglichen werden.
Ein Nachteil des Filters besteht sicher darin, dass die menschlichen Proteine in Bakterien
translatiert werden. Dabei ergeben sich zahlreiche Probleme. Nicht jede humane mRNA
kann in Bakterien translatiert werden und daher können manche Interaktionen gar nicht
erst detektiert werden. Die synthetisierten Proteine können nicht posttranslational
prozessiert werden, wie dies in Eukaryonten üblich ist. Weiterhin kann sowohl bei der
Diskussion 89
harschen Lyse der Bakterien mit 0,5 M NaOH, als auch bei der Fixation an die Membran
die Proteinkonformation gestört werden. Zu beachten ist auch, dass das Peptid nicht
richtig gefaltet sein kann. Falsch gefaltete Proteine können oft nicht mehr an die
eigentlichen Interaktionsproteine binden, während sie u.U. unspezifisch mit anderen
Proteinen interagieren. Zudem kann eine mögliche Interaktion auch durch die gekoppelte
alkalische Phosphatase beeinträchtigt werden.
Nachdem mit diesem Verfahren keine neuen Hey1-Interaktionspartner gefunden worden
waren und eine weitere Analyse und Optimierung zu aufwendig erschien, wurde das
etablierte Yeast Two-Hybrid Verfahren eingesetzt.
Yeast Two-Hybrid Screening
Der Yeast Two-Hybrid Assay ist inzwischen ein Standardverfahren zum Auffinden neuer
Proteininteraktionen aus cDNA-Banken und hat bereits zur Entdeckung vieler hundert
neuer Interaktionen geführt. In immer größer werdenden Screening-Verfahren wird
versucht, das Proteom niedriger Organismen auf sämtliche Interaktionen hin zu
untersuchen (von Mering et al., 2002). Die Methode hat allerdings einen großen Nachteil,
denn sie führt immer wieder zur Isolierung falsch-positiver Klone. Die Gründe dafür sind
zahlreich, jedoch können nicht alle Fälle befriedigend erklärt werden. So kommt es dazu,
dass sich manche Proteine hervorragend für dieses Verfahren eignen, während andere,
sog. „self activators“, die direkt die Reportergene aktivieren, völlig ungeeignet sind. Es ist
z.Z. nicht voraussagbar, ob ein Protein geeignet ist oder nicht (Vidal and Legrain, 1999).
Das Yeast Two-Hybrid Verfahren wurde im Verlauf der Arbeit zunächst für Hey1 und
Hey2 etabliert. Dazu wurden verschiedene Domänen von Hey1 und Hey2 in die
entsprechenden „bait“- und „prey“-Vektoren kloniert und Hefezellen damit transformiert.
Alle transformierten Hefezellen wurden auf ihre Wachstumsfähigkeit auf entsprechenden
Selektionsmedien getestet, um mögliche „self activators“, die zu vielen falsch-positiven
Ergebnissen führen würden, zu erkennen. Lediglich das Konstrukt GBK-YRPW (Hey1, aa
266-299) konnte die Reportergene schwach aktivieren. Alle anderen Konstrukte
verhielten sich erwartungsgemäß. Im nächsten Schritt wurden Cotransformationsassys
mit Kontrollplasmiden (pGAD-T7, pGAD-T-Ag, pGBK-T7, pGBK-p53, pGBK-Lam)
durchgeführt, wobei sich außer bei dem bereits erwähnten Konstrukt GBK-YRPW keine
Auffälligkeiten ergaben. Schließlich konnte gezeigt werden, dass alle klonierten
Genfragmente auch in Hefezellen translatiert werden. Nachdem diese Tests
abgeschlossen waren, konnte mit dem eigentlichen Screening begonnen werden.
Diskussion 90
Suche nach Interaktionsproteinen der Hey1-bHLH Domäne Es wurden drei Screening-Ansätze durchgeführt, um interagierende Proteine der Hey1-
bHLH Domäne aus embryonalen Genbanken zu isolieren. Als „bait“ dienten dabei Hey1-
bHLH-Orange Fragmente, da vermutet wurde, dass auch die Orange-Domäne Einfluss
auf die Bindung haben könnte.
Im ersten Versuch wurde eine murine embryonale (E11) cDNA-Bank für das Screening
verwendet und die transformierten Zellen direkt auf hochstringente Selektionsplatten
ausgestrichen. Dabei wurden nur zehn Klone isoliert, die auffallend langsam und nicht zu
der gewohnten Koloniegröße heranwuchsen. Deren weitere Analyse ergab, dass keiner
ein relevantes Hey-Interaktionsprotein darstellt. Möglicherweise waren die Hey-
Interaktionen nicht stark genug, dass die Hefezellen direkt auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
Platten überleben konnten. Daher wurden in den nächsten Versuchen die Zellen erst auf
SD/-Leu/-Trp Platten, die nur Zellen selektieren, die sowohl „bait“- als auch „prey“-
Plasmide besitzen, ausplattiert. Danach wurden die Kolonien auf SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
Platten transferiert, auf denen lediglich die Zellen, mit interagierenden „bait-prey“
Proteinen wachsen können. Wie die Ergebnisse der direkten Interaktionsanalysen später
zeigten, war dieses Vorgehen richtig, denn nur so können die Bindungen an Hey1, Hey2,
E2-2 und E2-5 detektiert werden. Lediglich die Interaktion mit Hes1 (c-hairy1) wäre direkt
auf hochstringenten Platten nachweisbar gewesen. Allerdings war dabei zu beobachten,
dass mehrere hundert Klone wuchsen, die zum größten Teil auch das Reportergen lacZ
transkribierten. Im dritten Versuch wurde schließlich eine neue cDNA-Genbank (Maus
E17) und das Cotransformationsverfahren statt des Matingverfahrens gewählt. Es
wuchsen jedoch erneut mehrere hundert Klone, von denen stichprobenhaft einige
Dutzend sequenziert wurden. Es waren v.a. physiologisch irrelevante Proteine isoliert
worden und keines konnte alle Interaktionstests, einschließlich GST-Pulldown, erfolgreich
bestehen, so dass auch diese schließlich verworfen wurden. Es ist denkbar, dass unter
der großen Anzahl der isolierten Klone tatsächlich die richtig-positiven, wie Hey1, Hey2,
E2-2, E2-5, ARNT oder e/dHAND dabei waren, jedoch war die Sequenzierung und
Verifizierung aller zu aufwendig und kostspielig.
Wesentlich erfolgreicher waren dagegen die gezielten direkten Yeast Two-Hybrid
Interaktionstests. Zunächst wurden die Homodimerisierungen von Hey1 und Hey2 sowie
die Hey1/Hey2-Heterodimerisierung getestet. Dabei zeigte sich, dass beide Proteine
bHLH-Homodimere ausbilden können. Die basische DNA-bindende Domäne hatte dabei
keinen Einfluss auf die Stärke der Proteinbindung. Interessanterweise sind diese
Diskussion 91
Interaktionen deutlich stärker, wenn beide Bindungspartner die Orange-Domäne
besitzen. Dieses Verhalten wurde auch bei den im Folgenden diskutierten Hey-
Interaktionen mit c-hairy1 und in geringerem Maße mit E2-2, E2-5 und MyoD beobachtet.
Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Orange-Domäne Protein-Protein
Interaktionen verstärken kann. Zuvor war lediglich bekannt, dass die Orange Domäne
Einfluss auf die Spezifität verschiedener bHLH-Orange Proteine ausübt und dass durch
sie die Repressorfunktion des ARNT2/Hey1-Dimers als auch die von Hes1 entscheidend
mitbestimmt werden (Castella et al., 2000; Chin et al., 2000; Dawson et al., 1995).
Weiterhin wurde die Interaktion mit den E-Proteinen E12, E2-2 und E2-5 sowie mit dem
muskelspezifischen bHLH-Protein MyoD untersucht. Es zeigte sich, dass Hey1 und Hey2
mit E2-2 bzw. E2-5 Heterodimere ausbilden können, während sie mit dem sehr ähnlichen
E12-Protein nicht interagieren. Dieses Ergebnis zeigt, wie spezifisch die Hey-Proteine nur
an bestimmte bHLH-Proteine binden und es unterstreicht die Spezifität des Yeast Two-
Hybrid Verfahrens. Die Hey/MyoD Interaktion wurde inzwischen auch von M. Chin's
Gruppe bestätigt (Sun et al., 2001). Die Frage ist nun, welche der beschriebenen Dimere
in einem bestimmten Zelltyp tatsächlich ausgebildet werden und was diese bewirken.
Durch die alternative Wahl ihrer Bindungspartner können etliche bHLH-Faktoren
unterschiedliche Gene regulieren. Einige, wie z.B. SCL/tal1, können sogar unter
verschiedenen Bedingungen entweder als Repressoren oder als Aktivatoren agieren
(Huang et al., 2000).
Im Verlauf dieser Arbeit waren die Huhngene c-Hey1 und c-Hey2 näher analysiert
worden. Interessanterweise zeigt c-Hey2 ein rhythmisches Expressionsmuster im
Präsomitischen Mesoderm (PSM), exakt übereinstimmend mit dem von c-hairy1 und
lunatic Fringe (lfrg), einem Regulator von Notch. Die c-Hey2-RNA-Expression beginnt am
kaudalen Pol des PSM und wandert dann nach rostral, während die Expression in den
kaudalen Abschnitten wieder verschwindet. Am Zyklusende wird c-Hey2 im posterioren
Abschnitt des neu gebildeten Somiten zusammen mit c-hairy1 und c-Hey1 coexprimiert
und am kaudalen Pol des PSM beginnt von neuem ein c-Hey2 Expressionszyklus.
Dieses oszillierende Expressionsmuster wiederholt sich während der Bildung jedes
Somiten ca. alle 90 Minuten (Leimeister et al., 2000a). Die Coexpression von c-hairy1
und c-Hey2 während der Somitogenese legte die Vermutung nahe, dass beide in einer
ähnlichen Weise reguliert werden. Es stellte sich die Frage, ob c-hairy1 und c-Hey2,
agonistische, antagonistische oder redundante Funktionen während der Somitogenese
ausüben. Ein Aspekt zur Klärung dieser Frage war, eine mögliche Interaktion dieser
verwandten Proteine festzustellen.
Diskussion 92
Es konnte eine starke Interaktion von c-hairy1 mit Hey1 bzw. Hey2 nachgewiesen
werden. Die Bildung von Heterodimeren in vivo war deutlich stärker als die, der
entsprechenden Homodimere, was zusammen mit den Expressionsstudien impliziert,
dass das Hey2/c-hairy1-Heterodimer die Form ist, die im PSM bevorzugt gebildet wird. In
welcher Weise die Hey-Gene dabei an der Somitogenese mitwirken, muss noch weiter
erforscht werden. Hey1-, Hey2- und HeyL-Knockoutmäuse zeigen keinen auffälligen
Somitogenesedefekt, jedoch ist es denkbar, dass die Hey-Gene im PSM redundant sind.
Möglicherweise können auch andere Gene die Hey-Funktion während der Somitogenese
kompensieren, z.B. Hes1, das ebenfalls oszillierend im murinen PSM exprimiert wird
(Jouve et al., 2000). Diese Fragen können in Zukunft an Mäusen untersucht werden, bei
denen mehrere Allele der Hey-Gene deletiert sind. Hier ist noch anzumerken, dass eine
Hey1-Überexpression im Zebrafischembryo zu gravierenden Somitogenesestörungen,
u.a. mit fehlender anterior-posterior Polarität der Somiten, führt (Christoph Winkler, in
Vorbereitung). Interessanterweise wurde vor kurzem gezeigt, dass Hes1 sogar in
Zellkulturlinien ein oszillierendes Expressionsmuster zeigt. Sowohl Hes1 RNA als auch
Protein werden in regelmäßigen Zyklen auf- und wieder abgebaut (Hirata et al., 2002). Es
wird aufschlussreich sein, ein solches Verhalten auch bei Hey2 zu analysieren.
Suche nach Interaktionsproteinen des Hey1-Carboxyterminus
Hey-Proteine zeichnen sich durch einen charakteristischen C-Terminus mit einem
YRPW-Motiv aus. Die Beobachtungen, dass andere Proteine mit einem WRPW-, WRPY-
oder FRPW-Motiv den Corepressor Groucho/TLE binden, legte die Vermutung nahe,
dass auch die Hey-Proteine mit TLE interagieren könnten.
GST-Pulldown und Yeast Two-Hybrid Tests zeigten jedoch, dass Hey-Proteine nicht mit
TLE1 interagieren können. Wurde allerdings das YRPW-Motiv im Hey1-Protein durch die
optimale TLE1-Bindungssequenz WRPW ersetzt, dann konnte eine Interaktion mit TLE1
beobachtet werden. Dies zeigt, dass das Hey1-Protein durch den Austausch einer
Aminosäure (Tyrosin statt Tryptophan) die Fähigkeit verloren hat, den Corepressor TLE1
zu binden.
Es stellte sich die Frage, ob die Hey-Proteine mit anderen Corepressoren interagieren.
Dafür wurden zwei Yeast Two-Hybrid Screeningverfahren mit unterschiedlich langen
Hey1-C-Termini durchgeführt. Als Genbank diente wiederum eine embryonale (E11)
murine cDNA-Bank. In beiden Ansätzen wurden viele hundert Kolonien isoliert. Zunächst
wurden durch DNA-Hybridisierungen überlappende oder identische Klone identifiziert, um
die Zahl der DNA-Sequenzierungen zu reduzieren. Die Auswertung der anschließend
Diskussion 93
sequenzierten Plasmide ergab, dass nur wenige Klone überhaupt als relevante
Interaktionspartner in Frage kommen. Die interessanten Kandidaten (FOG2, Math4a,
SC35, BRE, Polymerase Modulator 6) wurden mit direkten Yeast Two-Hybrid Assays und
schließlich mit dem GST-Pulldown Versuch weiter getestet, jedoch konnte letztlich keine
Proteininteraktion mit Hey1 verifiziert werden.
Es schien, dass bei den Yeast Two-Hybrid Screening Verfahren die Hey1-
Carboxytermini-Konstrukte leicht die Reportergene aktivieren konnten, da eine sehr
große Anzahl falsch-positiver Klone isoliert wurde. Bei den direkten Interaktionstests war
dieses Verhalten allerdings nicht zu beobachten. Insgesamt kann gefolgert werden, dass
sich der Hey1-C-Terminus nicht gut für das Screening von Genbanken eignet. Da auch
andere Arbeitsgruppen das gleiche Problem beobachteten (Randy Johnson, pers.
Mitteilung), bleibt die Frage nach interagierenden Proteinen des Hey-Carboxyterminus
nach wie vor offen. Iso et al. (2001b) publizierten kürzlich Daten, wonach der C-Terminus
keine Repressorfunktion erfüllt. Vielmehr beruhe diese Fähigkeit auf der Interaktion der
bHLH-Domäne mit dem mSin3a Corepressorkomplex. Möglicherweise ist daher der
Carboxyterminus nicht so entscheidend für die Hey-Funktion wie zunächst angenommen.
Jedoch legt die hohe Konservierung dieser Domäne in vielen Spezies eindeutig die
Vermutung nahe, dass das YRPW-Motiv oder das ebenso konservierte TE(I/V)GAF-Motiv
eine wichtige Rolle spielen müssen. Interessanterweise kann das Drosophila hairy-
Protein gleich drei verschiedene Corepressoren rekrutieren. Die Interaktion des WRPW-
Motivs mit Groucho führt zur Rekrutierung der Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 (Chen et
al., 1999), während die basische Domäne direkt die HDAC Sir2 binden kann. Durch
Heterochromatin-„Silencing“ wird dadurch die Transkription von Targetgenen reprimiert
(Rosenberg and Parkhurst, 2002). Ein solches Model wäre auch für Hey gut vorstellbar.
Hey-Protein-DNA Interaktionen
Viele bHLH-Transkriptionsfaktoren zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, spezifische
DNA-Sequenzen zu binden. Auch für die Hey-Proteine konnte in Binding site selection
Analysen eine spezifische E-Box Bindungsstelle gefunden werden. Diese ist identisch mit
der E(spl)-Zielsequenz 5‘-TGG CACGTG CCA-3‘ (Fischer et al., 2002).
In Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) konnte nun bestätigt werden, dass Hey-
Proteine diese Sequenz spezifisch binden können. Auch c-hairy1, E2-2 und E2-5 konnten
als Homodimere an diese DNA-Sequenz binden. Im EMSA gelang es allerdings nicht,
Heterodimere zu beobachten. Warum dies nicht möglich ist, bleibt ungeklärt. Eine
Vermutung ist, dass sich die bereits bei der separaten Proteinsynthese gebildeten
Diskussion 94
Homodimere unter den Versuchsbedingungen nicht mehr trennen. Möglicherweise
nehmen aber auch in vitro translatierte und bakteriell produzierte MBP- bzw. GST-
Fusionsproteine unterschiedliche Konformationen an, die eine Bindung aneinander
erschweren. Iso et al. (2001b) konnten inzwischen in einem ähnlichen Versuchsaufbau
die Heterodimerisierung von ivt-Hey1/ivt-Hes1 nachweisen. Dabei war zu beobachten,
dass das Heterodimer stärker als die jeweiligen Homodimere gebildet wird.
Interessanterweise konnten Sun et al. (2001) in diesem Zusammenhang zeigen, dass
CHF2 (Hey1) die Bindung von MyoD/E47 an DNA verhindert und dass das Hey1/E47
Heterodimer nicht an DNA binden kann. Diese interessanten Daten legen die Vermutung
nahe, dass Hey-Transkriptionsfaktoren auch reprimierend wirken können, indem sie die
DNA-Bindung von aktivierenden Regulatoren wie MyoD verhindern. Ein solches
Verhalten kennt man v.a. von den Id-Proteinen, die keine basische Domäne neben ihrer
HLH-Domänen besitzen (Benezra et al., 1990), aber auch von Hes6 (Bae et al., 2000).
Hes1 wurde ursprünglich auch als ein Repressor der MyoD/E47 DNA-Interaktion
publiziert, obwohl das Protein zudem an eine N-Box binden kann (Sasai et al., 1992). Der
bHLH-Transkriptionsfaktor SCL/tal1 zeichnet sich ebenfalls durch solche Eigenschaften
aus (Goldfarb and Lewandowska, 1995).
Zur weiteren Klärung der DNA-Bindung müssen Reporterassays in Zellkulturen etabliert
werden, um die Transkriptionsregulation durch Hey-Proteine weiter zu erforschen. Der
entscheidende Schritt zum Verständnis der Hey-Transkriptionsfaktoren wird schließlich
die Erforschung der regulierten Gene sein. Diese Untersuchungen, u.a. mit Microarrays,
haben bereits begonnen und es wurde inzwischen beobachtet, dass die Expression von
ANF (atrial natriuretic factor) und CARP (cardiac ankyrin repeat protein) in Hey2-/--Herzen
hochreguliert ist. Die beiden Gene werden allerdings typischerweise in hypertrophierten
Herzen hochreguliert und sind daher wohl keine direkten Zielgene von Hey2.
Analyse von Hey2-Knockoutmäusen
Eine der z.Z. aussagekräftigsten Methoden zur Erforschung der Funktion eines Gens in
vivo ist seine gezielte Ausschaltung im Mausgenom und die anschließende
Untersuchung des Phänotyps.
Durch „gene targeting“ wurden entscheidende Abschnitte des Hey2-Gens (Exons 2-3) in
Mäusen deletiert und durch lacZ ersetzt (Gessler et al., 2002). Heterozygote Mutanten
erscheinen morphologisch und verhaltensmäßig unauffällig und sind fertil, während
ca. 80% der Homozygoten wenige Tage nach der Geburt sterben. Die homozygoten
Neugeboren fallen bereits in den ersten Lebenstagen auf, da sie kleiner als die
Diskussion 95
Heterozygoten und Wildtypmäuse des gleichen Wurfs sind. Um herauszufinden, warum
die Mäuse nicht überleben können, wurden sie obduziert, die lacZ-Expression in
verschiedenen Organen überprüft und anschließend Analysen an Herz und Arterien
durchgeführt.
Die lacZ-Expression der rekombinanten Mäuse wurde mit der von Hey2 im Wildtyp
verglichen, um zu zeigen, dass das lacZ-Gen an der richtigen genomischen Stelle
integriert wurde und nun durch den Hey2-Promoter gesteuert wird. Es zeigte sich, dass
die lacZ-Expression in den untersuchten Organen, insbesondere dem Herzen und den
großen Arterien, der von Hey2 in Wildtypmäusen entspricht.
Die Untersuchung der homozygoten Mäuse in den Stadien P1-P5 zeigte, dass diese eine
massiv vergrößertes Herz besitzen. Die Hypertrophie führt wahrscheinlich zur terminalen
Herzinsuffizienz. Die Hypertrophie des linken Ventrikels kann durch verschiedene
Ätiologien bedingt sein. Möglicherweise führt die Hey2-Deletion während der
Herzentwicklung zur Bildung insuffizienter Myozyten wie bei bestimmten Formen der
Kardiomyopathie (Seidman and Seidman, 2001). Da der rechte Ventrikel weniger
vergrößert ist, könnte es dort zu einer Kompensation der Hey2-Funktion kommen, was
durchaus denkbar ist, da manche Gene asymmetrisch nur auf einer Herzseite exprimiert
werden, wie z.B. die Hey2-Interaktionspartner eHAND und dHAND. Allerdings ist es
wahrscheinlicher, dass die geringere Affektion des rechten Ventrikels durch seine
verminderte Druckbelastung im Lungenkreislauf bedingt wird.
Eine weitere Ursache der Linksherzhypertrophie könnte eine Arterienfehlbildung, z.B.
eine Aortenisthmusstenose, darstellen. Die Zebrafisch gridlock-Mutation, bei der ein
verlängertes Hey2-Protein zu einer Aortenfehlbildung mit konsekutiver Stenose führt,
implizierte eine Aortenisthmusstenose als wahrscheinlichste Ursache der Hypertrophie
(Zhong et al., 2000). Daher wurden die großen Arterien in Zusammenarbeit mit Armin
Helisch am Max Planck Institut für klinische Physiologie in Bad Nauheim untersucht.
Angiographien von neugeborenen und adulten Knockoutmäusen zeigten jedoch, dass die
großen Blutgefäße normal angelegt und funktionsfähig waren. Es konnten keinerlei
Unterschiede zum Wildtyp festgestellt werden. Damit konnte in einem der ersten Fälle
gezeigt werden, dass der Ausfall eines Gens in Zebrafisch bzw. Maus zu
unterschiedlichen Krankheitsbildern führen kann. Dies wird unterstrichen durch die
weiteren Beobachtungen von Mark Fishman’s und Brant Weinstein's Gruppen, dass
gridlock entscheidend für die arterielle vs. venöse Differenzierung ist und eine totale
Blockade von gridlock die Entwicklung von Arterien in Zebrafischen verhindert (Lawson et
al., 2001; Zhong et al., 2001). In der Maus führt eine homozygote Deletion aber nicht zu
einer Arterienaplasie oder –fehlbildung, sondern vielmehr zu einer Kardiomyopathie in
Kombination mit verschiedenen Herzfehlern (s.u.).
Diskussion 96
Es stellte sich nun die Frage, was die Kardiomyopathie auslöst. Hierzu wurde die Hey2-
Expression während der Embryogenese und der postnatalen Periode untersucht.
Während der embryonalen Entwicklung ist Hey2 in Ventrikeln und Arterien exprimiert,
während Hey1 in den Herzvorhöfen transkribiert wird. Die lacZ-Expressionsstudien
zeigten, dass im Embryonalstadium E17.5 noch eine deutliche Hey2- bzw. lacZ-
Expression in den Ventrikeln zu beobachten war, während postnatal die Expression im
Myokard verschwunden war. Diese Ergebnisse sind konform mit den Beobachtungen von
Chin et al. (2000), die ein Verschwinden der Hey2-Expression in Ratten zum Zeitpunkt
um die Geburt beschrieben haben.
Danach wurde untersucht, ob Hey1 oder HeyL die ausgefallene Funktion von Hey2
teilweise kompensieren können, indem sie möglicherweise ektop, z.B. im Herzventrikel
der Hey2-Knockoutmaus, exprimiert werden. Die Hey1- und HeyL-Expression wurde
durch RNA in situ Hybridisierung in Hey2-Knockoutmäusen (E9.5, 10.5, 11.5 und 14.5)
mit der in Heterozygoten und Wildtypmäusen verglichen wurde. Dabei zeigte sich, dass
die Expression von Hey1 und HeyL in allen untersuchten Embryonen gleich war. Somit
kann gefolgert werden, dass zumindest in Geweben in denen die Hey-Gene nicht
coexprimiert sind, die Hey2-Funktion nicht durch ein anderes Hey-Gen übernommen
wird.
Überraschenderweise ist das Herz der Hey2-/- Mäuse bis zur Geburt normal geformt. Erst
perinatal kommt es innerhalb kürzester Zeit zu diesem massiven Umbau des Myokards.
Eine strukturelle Myokardfehlbildung könnte bereits während der Embryonalentwicklung
latent vorhanden sein, aber erst mit der postnatalen Kreislaufumstellung und den
schlagartig einsetzenden hämodynamischen Veränderungen zur Hypertrophie führen.
Die histologischen Untersuchungen zeigten aktivierte, unstrukturierte Kardiomyozyten mit
teils atypischen Mitosefiguren sowie eine leichte Fibrose (Kerstin Amann, Erlangen).
Erstaunlicherweise ist die Kardiomyopathie nicht progredient. Die überlebenden Mäuse
entwickeln sich schließlich wie die Wildtyptiere und haben als Adulte lediglich ein
verformtes Herz, während sich der Herz-Körpergewicht Quotient normalisiert hat.
Radiologische Untersuchungen der Herzfunktion mit Hilfe der Magnetresonanz
Tomographie (Frank Wiesmann, Würzburg) ergaben eine signifikante Reduzierung der
linksventrikulären Ejektionsfraktion, wobei das absolute Schlagvolumen höher war, als
das der Kontrolltiere. Dies zeigt, dass die deutlich verminderte Kontraktionskraft der
Kardiomyozyten (Nikola Golenhofen, Würzburg) durch Hypertrophie und Hyperplasie des
Herzens teilweise kompensiert werden kann. Es wird nun interessant sein zu
beobachten, wie diese Mäuse auf kardiale Überbelastung reagieren.
Diskussion 97
Weiterhin wurden die neugeborenen Mäuse auf Herzrhythmusstörungen untersucht, die
bei einer massiven Hypertrophie häufig auftreten. EKG-Analysen zeigten keine
Rhythmus- oder Überleitungsstörungen oder sonstige Auffälligkeiten. Jedoch sollte
versucht werden, die Tiere über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, um mögliche
paroxsysmalen Störungen zu erkennen, was mit der eingesetzten Technik leider nicht
möglich war.
Es ist anzumerken, dass nach Abschluss dieser Phänotypisierung M.T. Chin in seinem
Hey2-Knockoutmodell Herzseptumdefekte beobachten konnte (pers. Mitteilung).
Daraufhin wurden die hier beschriebenen Mäuse erneut untersucht. In den inzwischen
höheren „Backcross“-Generationen konnten Vorhof- und Ventrikelseptumdefekte (ASD
und VSD) sowie z.T. Trikuspidalatresien (TA), Pulmonalstenosen (PS) oder die
Fallot’sche Tetralogie (VSD, PS, reitende Aorta und rechtsventrikuläre Hypertrophie)
beobachtet werden. Diese typischen Herzfehler waren in den ersten „Backcross“-
Generationen eindeutig nicht vorhanden. Anscheinend wirkt sich also der genetische
Hintergrund auf die Ausprägungsstärke der Hey2-Deletionen aus. Eine weitere
Arbeitsgruppe hat inzwischen die gleichen Herzfehlbildungen in einem ähnlichen Hey2-
Knockout beschrieben (Donovan et al., 2002; Gessler et al., 2002).
Die vorgestellten Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Hey-Transkriptionsfaktoren
mit weiteren bHLH-Faktoren interagieren und an spezifische DNA-Sequenzen binden, um
dadurch bestimmte Zielgene zu kontrollieren. Hey2 ist ein entscheidender Faktor für die
murine Herzentwicklung und diese am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse legen nun
die Vermutung nahe, dass das menschliche Hey2-Gen ein Kandidat sowohl für
Entstehung von Kardiomyopathien, als auch für zahlreiche kongenitale Herzfehler ist. Die
Suche nach Hey2-Mutationen bei Patienten mit Vorhof- bzw, Ventrikelseptumdefekten
und Fallot’sche Tetralogie hat inzwischen begonnnen.
Zusammenfassung 98
6 Zusammenfassung
Die Entwicklung eines vielzelligen Organismus aus einer befruchteten Eizelle ist nur
durch komplexe zelluläre Regulationsmechanismen möglich. Dabei spielt der Notch-
Signaltransduktionsweg eine zentrale Rolle während der Determination von
Zellschicksalen und der Zelldifferenzierung. Die primären Zielgene der Notch-
Signalkaskaskade bei Vertebraten sind die Hes- sowie die kürzlich identifizierten Hey-
Gene. Die Hey-(hairy and E(spl) related with YRPW motif)-Gene kodieren drei
hairy/E(spl)/Hes-verwandte basische Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren, die durch
eine Orange-Domäne und einen charakteristischen Carboxyterminus gekennzeichnet
sind. Während der Embryonalentwicklung werden die Hey-Gene dynamisch in
zahlreichen Geweben exprimiert.
Ziel dieser Arbeit war es, neue Hey-Interaktionsproteine aus embryonalen Genbanken zu
isolieren, die Bindung an weitere bHLH-Transkriptionsfaktoren zu überprüfen und ihre
DNA-Bindung zu analysieren. Um die physiologische Hey2-Funktion zu ergründen,
wurden Hey2-Knockoutmäuse untersucht.
In einem ersten Versuch wurde eine neue Screeningmethode erprobt, bei der
Proteinexpressionsfilter mit markierten Hey1-Peptiden nach interagierenden Proteinen
durchsucht wurden. Hierbei sind 53 Proteine isoliert worden, jedoch konnte nach
eingehenderen Untersuchungen kein relevanter Bindungsspartner beschrieben werden.
Für weitere Analysen unter mehr physiologischen Bedingungen wurde das Yeast Two-
Hybrid Verfahren für Hey1 und Hey2 etabliert. Das Screening von murinen embryonalen
cDNA-Genbanken mit verschiedenen Hey1-Fragmenten führte zur Isolation von
mehreren hundert Klonen. Die interessantesten Kandidaten wurden weiteren
biochemischen Tests unterzogen, wobei jedoch keine neuen Interaktionspartner
verifiziert werden konnten.
Mit gezielten direkten Yeast Two-Hybrid und GST-Pulldown Assays für vermutete
Kandidaten konnte jedoch die Interaktion von Hey1 bzw. Hey2 mit den bHLH-Proteinen
E2-2, E2-5, MyoD und c-hairy1 nachgewiesen werden. Außerdem wurde festgestellt,
dass Hey1 und Hey2 Homodimere und Hey1/Hey2-Heterodimere bilden. Die stärkste
Interaktion wurde mit dem in der Somitogenese rhythmisch exprimierten c-hairy1-Protein
beobachtet. Da Hey2 und c-hairy1 im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten
coexprimiert werden und starke Heterodimere ausbilden, erscheint es wahrscheinlich,
Zusammenfassung 99
dass beide Proteine gemeinsam die Transkription nachgeschalteter Gene steuern. Diese
Interaktionsstudien zeigten außerdem erstmals, dass die Orange-Domäne entscheidend
an der Bildung der Dimere beteiligt ist, da durch sie die Dimerisierung in vivo deutlich
verstärkt wurde. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Hey1 und Hey2, im Gegensatz
zu den übrigen hairy-Proteinen, nicht mit dem Corepressor Groucho/TLE1 interagieren.
Electrophoretic Mobility Shift Assays ergaben, dass die Hey1- und Hey2-Proteine an eine
E(spl)-spezifische E-Box DNA-Sequenz (CACGTG) binden. Auch die interagierenden
bHLH-Proteine c-hairy1, E2-2 und E2-5 binden als Homodimere an diese DNA-Sequenz.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Hey2-Genfunktion an Hey2-Knockoutmäusen
untersucht. Etwa 80 % der homozygoten Mäuse starben wenige Tage nach der Geburt.
Sie zeigten eine massive Hypertrophie der Herzventrikel, die wahrscheinlich die
Todesursache darstellt. Die lacZ-Expression der untersuchten Organe entsprach der
Hey2-Expression im Wildtyp. Es fiel dabei auf, dass es postnatal zu einer
Herunterregulation der Hey2-Transkription kommt.
Mit Elektrokardiogrammen wurden keine Reizleitungsstörungen bei neugeborenen Hey2-
Knockoutmäusen festgestellt. Interessanterweise konnte mit Arteriographien
ausgeschlossen werden, dass die Ventrikelhypertophie Folge einer Aortenstenose wie
bei der gridlock (zf-Hey2)-Mutante im Zebrafisch ist. Vielmehr führt eine homozygote
Hey2-Deletion zu einer Kardiomyopathie in Kombination mit verschiedenene Herzfehlern.
Untersuchungen der Hey1- und HeyL-Expression in Hey2-Knockoutembryonen mittels
RNA in situ Hybridisierungen zeigten keine Veränderungen im Vergleich mit dem Wildtyp.
Daraus kann gefolgert werden, dass Hey1 und HeyL zumindest dort, wo sie nicht mit
Hey2 coexprimiert sind, die Hey2-Funktionen nicht kompensieren können. Weitere
Erkenntnisse über die Funktionen der Hey-Gene werden sicherlich die Studien an den
Doppelknockoutmäusen ergeben.
Die bisherigen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Hey-Gene essentiell für die murine
Herzentwicklung sind. Weitere Untersuchungen müssen nun zeigen, welche Rolle diese
Gene bei der Entstehung von kongenitalen Herzfehlern des Menschen spielen.
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Abkürzungsverzeichnis 109
8 Abkürzungsverzeichnis aa Aminosäuren
Abb. Abbildung
AD aktivierende Domäne
AK Antikörper
AP alkalische Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat
ATP Adenosintriphosphat
bHLH Basic Helix-Loop-Helix
BLAST basic local alignment search tool
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
Ci Curie
CIP alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
cm Zentimeter
dATP/CTP/GTP/TTP/UTP 2‘-Desoxy-Adenosin/Cytosin/Guanosin/
Thymidin/Uracil-5‘-Phosphat
ddH2O bidestilliertes Wasser
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
DBD DNA bindende Domäne
dNTP 2‘-Desoxy-Nukleotide-5‘-Phosphat
DTT 1,4-Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethlendiamintetraacetat
EST expressed sequence tag
FCS fötales Kälberserum
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2ethansulfonsäure
IPTG Isopropyl-1-thio-D-galaktosid
kb Kilobasenpaar
kD Kilodalton
M molar
min Minuten
mJ Millijoule
ml Milliliter
Abkürzungsverzeichnis 110
mM millimolar
mmol Millimol
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
ng Nanogramm
OD260 Optische Dichte bei 260 nm
Or Orange-Domäne
PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction
PMSF Phenylmethylsulfonsäurefluorid
RNase Ribonuklease
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SDS Sodiumdodecylsulfat
sec Sekunde
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-Puffer
TBS Tris buffered saline
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethyl-Ethylendiamin
Tris Tris(hydoxymethyl)-aminomethan
U Unit
UTR Untranslated region
UV Ultraviolett
Vol. Volumen
w Gewicht
WT Wildtyp
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde zwischen April 1999 und Oktober 2002 am Institut für
Physiologische Chemie I der Universität Würzburg unter Anleitung von Prof. Dr. Manfred
Gessler angefertigt.
Ich möchte mich bei allen bedanken, die an der Entstehung dieser Arbeit mitgewirkt
haben:
Ganz besonders danke ich Herrn Prof. Dr. Manfred Gessler für sein großes Interesse an
dieser Arbeit und die jederzeit äußerst freundliche und hilfsbereite Unterstützung.
Weiterhin bin ich ihm sehr dankbar für seine Förderung meiner Praktika und USA-
Aufenthalte.
Herrn Prof. Dr. Lutz Hein bin ich dankbar für die freundliche Übernahme des Koreferats
dieser Arbeit und seine große Hilfe bei der Ableitung von EKG’s an Mäusen.
Mein Dank gilt allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Gessler für die sehr gute
Zusammenarbeit und das angenehme Arbeitsklima.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei meinen Eltern, die mir meine Ausbildung
ermöglichten und mich jederzeit ermutigt und unterstützt haben.
Weiterhin möchte ich mich bei den Betreuern meiner Praktika bedanken, die ebenfalls
diese Arbeit beeinflussten, indem sie mir neue Techniken lehrten und mir viel Wissen
weitergaben. Insbesondere möchte ich hier erwähnen:
Frau Dr. Beate Gawin, die mein Interesse für Molekularbiologie geweckt hat.
Frau Dr. Petra Rüger, die mir bei Roche Diagnostics die Prinzipien der Proteinbiochemie
näher brachte.
Herrn Prof. Dr. David Helfet vom Hospital for Special Surgery, New York USA, der mich
immerzu ermunterte, meine klinische Ausbildung nicht zu vernachlässigen.
Herrn Prof. Dr. Stuart Orkin und Herrn Dr. Thorsten Schlaeger, Harvard Medical School,
die mir während meiner Zeit in Boston das faszinierende Feld der Stammzellen Biologie
und der Blutentwicklung erschlossen.
Lebenslauf
Name: Andreas Fischer Geburtsdatum: 09.03.1976 Geburtsort: Miltenberg Schulbildung: 1983 - 1986 Grundschule Schneeberg 1986 - 1995 Karl-Ernst-Gymnasium Amorbach; Abschluss: Abitur Wehrdienst: 1995 - 1996 in Feldkirchen und Niederstetten Hochschulausbildung: 1996 - 2002 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians Universität
Würzburg 19.03.1998 Ärztliche Vorprüfung 23.03.1999 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 05.09.2001 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr: Harvard University Medical School, Boston, MA, USA Humangenetisches Institut der Universität Würzburg
22.10.2002 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung seit 01.04.1999 Promotion unter der Anleitung von Herrn Prof. Dr. med. Manfred
Gessler am Institut für Pysiologische Chemie I, Theodor Boveri Institut für Biowissenschaften der Universität Würzburg.
Würzburg, 15.11.2002