1072

非放 射 性標 識 プ ロー ブ とPolymerase Chain Reaction法 を

用 い たHBVウ イル スの検 出

II.ASOプ ロー ブ法 とPCR直 接 シー クエ ンス法 に よ る

コア遺 伝 子変 異 の同定

兵庫医科大学病院中央臨床検査部

山下 啓子 香 川 昌平 松 岡 瑛

東洋紡績株式会社総合研究所

宝 田 裕

(平成8年6月28日 受付)

(平成8年7月23日 受理)

Key words: hepatitis B virus, core gene, mutation, ASO probe method,

PCR, direct sequencing

要 旨

慢 性B型 肝 炎 の患者 で はB型 肝 炎 ウイル ス(HBV)の プ レコア/コ ア遺 伝子 に変 異 が認 め られ る.コ

ア遺 伝子 は,HBe抗 原 の合成 と分 泌 に関与 す るプ レ コア遺 伝 子 の上流 に位 置 して い る.こ れ まで の研 究

か ら,コ ア遺 伝子 産物 が細 胞 障害性Tリ ンパ球 の標 的 とされ る ことか ら,HBVキ ャ リアの臨床 経過 は

感染 して い るHBV変 異 株 に よって影 響 を受 けて い るこ とが示 唆 され て きた.本 研究 で,著 者 らは プ レコ

ア領 域 の28番 目の コ ドンにお け る翻 訳停 止 コ ドンの有 無 の条件 下で の コア遺伝 子 変異 につ い て,ASOプ

ロー ブ法 とPCR-直 接 シー クエ ンス法 を用 い て検 討 した.

コア領 域 にお い て,HBe抗 体 陽性例 で はコ ドン31～49と コ ドン87～97等 に多数 の変異 を高頻度 で認 め

た.そ の変異 はプ レコア領 域 での停 止 コ ドンの有無 にかか わ らず,L311,S49T,S87G/N,K96N及 び

118F/1等 の ア ミノ酸置換 を伴 って いた.一 方,HBe抗 原陽性 例 で は,コ ア領域 で の変異 は少 数 で あった.

さ らに,著 者 らは非放 射性 プロー ブ を用 い る こ とによ って,コ ドン87,96及 び97の 変 異 を同定 した が,

その結 果 はPCR一 直 接 シー クエ ンス法 によ る結 果 とよ く一 致 して いた.ASOプ ロー ブ法 は多数検 体 で の

コア遺 伝子 変異 を検 出す る上 で有 用で あ る.

序 文

B型 肝炎 ウイルス(HBV)キ ャリアの多 くは新

生児期に感染するが,免 疫寛容状態 にあるために

肝細胞障害 はみ られない.肝 細胞障害は免疫機構

の発達する成長期か ら始 まり,細胞障害性Tリ ン

パ球(CTL)に よるHBVの 排除と同時に肝細胞

の破壊が進展する.CTLの 標的抗原 はHBe・HBc

蛋白に散在する10個 以下のペプチ ドでHLAク ラ

ス1に よって肝細胞表面に提示され,CTLに より

攻撃 される1).そ れ以後,宿 主の免疫応答プレッ

シャーを受けてe抗 原を分泌できない変異株が出

現する.変 異株では主 としてpre-C領 域 における

コ ドン28の トリプ トファン(TCG)が 終止コ ドン

(TAG)に 変異 し,e抗 原の産生 ・分泌が停止す

る2).e抗 原からe抗 体へのセロコンバージョンが

生ずると,肝 炎は治癒すると考えられてきた.し

かし,な かには重症化する症例 もあ り3)4),肝炎の

別刷請求先:(〒663)西 宮市武庫川町1番1号

兵庫医科大学病院中央臨床検査部

山下 啓子

感染症学雑誌 第70巻 第10号

HBVウ イルスの検 出のコア遺伝子変異 1073

病 態 を理 解 す る上 で 変 異HBe・HBc抗 原 の 解 明

は 重 要 で あ る.

pre-C変 異 株 で はC遺 伝 子 変 異 の頻 度 が 高 い こ

とに加 え て,そ の 変 異 はpre-C変 異 に 先 立 っ て生

じ る こ と,あ る い は肝 炎 進 展 の原 因 と も な っ て い

る こ とが 示 唆 され て い る5)6).C遺 伝 子 の 変 異 部 位

と肝 炎 の 病 型 をあ わ せ 考 えた 結 果,コ ドン84～99

と48～60に 変 異 を 有 す るType 1群 と2群 に

HBVは 大 別 され る こ とが 示 さ れ た5).本 研 究 に お

い て,著 者 ら はPCR直 接 シー ク エ ンス 法 とASO

プ ロー ブ 法 を 用 い てC遺 伝 子 の 変 異 に つ い て 検

討 を加 えた.

材 料 と方 法

1.HBVマ ー カ ー の 測 定 とDNAの 調 製

HBs抗 原 はRPHA法(リ バ ー ス セ ル(R),山 之

内)とEIA法(エ ル ジ アHBs-Ag(R),国 際 試 薬),

HBe抗 原 はEIA法(エ ル ジ アHBe・Ag(R),国 際 試

薬),HBe抗 体 はEIA法(エ ル ジ アHBe-Ab(R),

国 際 試 薬)で 測 定 した.本 実 験 で は,既 報 に準 じ

て7)8)ASOプ ロ ー ブ法 に よ っ てHBs抗 原 の サ ブ

タ イ プ(adr/w及 びayr/w)並 び にpre-Cで の コ

ド ン28,29の 塩 基 配 列 が 解 明 され て い るHBVを

C遺 伝 子 変 異 の 検 索 対 象 と した.被 検 血 清 を滅 菌

精 製 水 で10倍 希 釈,95℃,/5分 間 加 熱 後,12,000×

g,10分 間遠 心 す る こ と に よ りHBV-DNAを 調 製

し,PCRに 供 した.

2.PCR(polymerase chain reaction)反 応

C遺 伝 子 のDNA増 幅 は,Ehataら5)の 方 法 に 準

じ てnestedPCRで 実 施 した.PCR直 接 シ ー ク エ

ン シ ン グ の 鋳 型 とな る 一 本 鎖DNAを 得 る 目 的

で,2ndPCRで の ア ン チ セ ンス ・プ ライ マ ー の5'

末 端 に はMMTリ ン カ ー を用 い て ア ミ ン基 を 結

Fig. 1 Detection of HBV mutants of the core gene (codon 77-100) by PCR and

ASO probes

Primers for 1st PCR

PP,: 5'-TAGGAGGCTGTAGGCATAA-3', PR,: 5'-ACCTTATGAGTCCAAG-

GGAT-3'

Primers for 2nd PCR

PF2: 5'-ATGGACATTGACCCGTATAA-3', PR2: 5'-YCCAAATACTCAAGA-

ACAGTT-3'

Probes

a (S87): 5'-ZGTAGTCAGCTATGTC-3', b (G87): 5'-ZGACATAGCCGACT-

AC-3', c (N87): 5'-ZGACATAGTTGACTAC-3, d (K96, 197): 5'-ZGCCTAAA-

AATCAGAC-3', e (K96, F97): 5'-ZGTCTGAATTTTAGGC-3', f (K96, L97):

5'-ZGTCTGAATTTTAGGC-3', g (N96, I97): 5'-ZGTCTGATATTTAGGC-3, h

(N96, F97): 5'-ZGTCAGAAATTTAGGC-3', i (N96, L97): 5'-ZGTCTGAGAT-

TTAGGC-3', Y: biotin, Z: alkaline phosphatase conjugated to amine linker

a

b

c

d

e

f

g

h

i

平成8年10月20日

1074 山下 啓子 他

合 した 後,ビ オ チ ン基 を導 入 し た.PCR反 応 は

95℃ で,5分 間 処 理 後,TthDNAポ リメ ラ ー ゼ(4

units)を 添 加 し,プ ラ イ マ ー のTm値 に応 じて 設

定 した 温 度 で30秒 の ア ニ ー リ ン グ,お よび72℃ で

1分30秒 の 酵 素 反 応 を1サ イ クル と して30回 行 っ

た.PCR産 物 を2%ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 後,

エ チ ジ ウム ブ ロ マ イ ド(EtBr)で 染 色 した .

3.ア レル 特 異 的 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド(ASO)プ

ロ ー ブ 法

オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の51末 端 にMMTリ ン

カ ー を用 い て ア ミ ン基 を導 入 後,E-リ ン ク ・オ リ

ゴ ヌ ク レオ チ ドラベ リ ング ・キ ッ トを用 い て ア ル

カ リ ホ ス フ ァタ ー ゼ(Alp)を 標 識 した.ア ガ ロ ー

ス ゲ ル 電 気 泳 動 後,ナ イ ロ ン膜 に転 写 したDNA

を 通 常(Tm-5)℃ でAlp標 識 プ ロ ー ブ とハ イ ブ

リ ダ イ ズ した 後,NBT/BCIP基 質 を 用 い て 染 色

した.

4.PCR直 接 シー ク エ ンス 法

PCR産 物 とス トレ プ トア ビ ジ ン結 合 磁 性 ビー

ズ を混 和 後,磁 石 で磁 性 ビー ズ を収 集 した.0.3N

NaOHを 添 加 し,シ ー クエ ン ス反 応 の 鋳 型 と な る

一 本 鎖DNAを 調 製 した.Sequenase Kit Version

2.0の 方 法 に 従 っ て ジ デ オ キ シ 法 に よ る シ ー クエ

ン シ ン グ を行 っ た.6%ア ク リル ア ミ ドゲ ル で 電

気 泳 動 後,ゲ ル を乾 燥 し,X線 フ ィル ム に一 夜 露

光 した。

成 績

1.ASOプ ロ ー ブ法 に よ る変 異 配 列 の 検 出

nested PCRに よ っ て 増 幅 し たC遺 伝 子 の

DNA断 片 は,EtBr染 色 に よ っ て358bpの 位 置 に

鮮 明 な 一 本 の バ ン ド と し て 検 出 さ れ た.ASOプ

ロ ー ブ は 文 献 記 載 の 塩 基 配 列6)7),ま た 著 者 ら が

PCR直 接 シ ー ク エ ン ス 法 で 解 析 し た 塩 基 配 列 に

基 づ い て 作 成 した.C遺 伝 子 の コ ドン87に はAGC

(S),GGC (G),AAC (N)の3つ の 異 な る塩 基

配 列 が認 め られ るが,a,b及 びc3種 の プ ロ ー ブ

に よっ て 塩 基 配 列 を検 出 で きた .ま た 隣 接 す る コ

ドン96,97で はAAA (K)とATC(1)をdプ ロ ー

ブ,AAA (K)とTTC (F)をeプ ロ ー ブ,AAA

(K)とCTC(L)をfプ ロ ー ブ,AAT(N)とATC

Fig. 2 Nucleotide sequences around the 87th, 96th and 97th codon determined by

PCR and dideoxy method

Sequencing primers for analysis of the codon 27-74 (a) and the codon 76•`100

(b)

(a) 5'-GAGTTACTCTCTTTTTTGCC-3',(b) 5'-TGAGTTGATGAATCTGG-

CCA-3'

感染症学雑誌 第70巻 第10号

HBVウ イルスの検出のコア遺伝子変異 1075

(1)をgプ ロー ブ,AAT(N)とTTC(F)をh

プ ロ ー ブ,AAT(N)とCTC(L)をiプ ロー ブ

等6種 の プ ロ ー ブ に よっ て 塩 基 配 列 を 検 出 で き

た.ま たASOプ ロ ー ブ 法 に よ っ てHBVが 単 一

株 か 混 在 株 で あ る か を特 定 で き る(Fig.1).

2.PCR直 接 シー ク エ ン ス 法 に よ るC遺 伝 子

の 塩 基 配 列 の 同定

PCR直 接 シ ー クエ ン ス 法 に よ っ て 明 ら か に さ

れ たC遺 伝 子 の 一 部 塩 基 配 列,と くに ア ミノ酸 置

換 を高 頻 度 で 認 め た コ ドン87,96及 び97の 結 果 を

例 示 した(Fig.2).Table1に は,e抗 原,e抗 体,

pre-C変 異 及 びHBs抗 原 サ ブ タ イ プ 等 で 分 類 し

たHBVの コ ドン77～100で の ア ミ ノ酸 配 列 を示

した.e抗 原 陽 性 のpre-C野 生 株1～12で は,M93

Tあ る い は197Lの 変 異 を 有 す る2株 を 除 き,す

べ て 野 生 株(50%)で あ った.一 方,13～18は2

～3置 換 の変 異 株(38 .9%)で あ っ た.e抗 体 陽 性

のpre-C野 生株19～35で は,V91A,G94V,197L/

Fい ず れ か の変 異 を有 す る3株 を除 き,す べ て野

生 株(32.4%)で あ った.36～55はS87G/N,K96

N,197F/Lの2～5置 換 の 変 異 株(59.5%)で あ っ

た.e抗 体 陽 性 のpre-C変 異 株55～70は 野 生 株

(34.5%)あ るい は一 置 換 の 変 異 株 で あ った.し か

し,71～84はS87G/N,K96N,197F/Lの2～3

置 換 の変 異株(51.7%)で あ っ た.ま た,検 討 し

た84株 で は,野 生 株 が36.9%,一 置 換 株 が10.7%,

二 置 換 株 が17.8%,三 置 換 以 上 の 株 が34.5%で

あ っ た.コ ドン87,96お よ び97部 位 で の ア ミノ 酸

Table 1 Nucleotide sequences for the core gene (codon 77-100) among 84 strains of HBV. The deduced aminoacids residues different from the prototype are shown by single letters. Dashes indicate the identity of the

prototype. Brackets indicate the presence of each amino acid residues in sequences

平成8年10月20日

1076 山下 啓子 他

Table 2 Nucleotide sequences for the core gene (codon 27-97) among 36 strains of HBV. The underlined

amino acids residues indicate the coexsitence of prototype sequence

X : stop codon

置 換 率 は44.0,33.3,52.3%の 高 値 を示 した.

e抗 原 陽 性 のpre-C野 生 株 で は,コ ド ン27～69

で の ア ミ ノ酸 置 換 数 は1以 下 で あ った .e抗 体 陽

性 のpre-C野 生 株 で は,コ ド ン87,96,97の 三 置

換 が あ る と き,L311とS49Tの 二 置 換 を認 め た.

e抗 体 陽 性 のpre-C変 異 株 で は,コ ド ン87,96,97

の 三 置 換 が あ る とき,L311とS49Tの 二 置 換 を認

め た(Table2).

考 察

本研究 において,著 者 らはPCR直 接 シークエ

ンス法を用いてC遺 伝子の一部塩基配列(コ ドン

27～100)を 解析 した.ま た,ASOプ ローブ法 を用

いて変異が生 じ易いといわれるコ ドン87,96及 び

97の 塩基配列 にっいて検討 した.そ の結果,同 定

したア ミノ酸配列 は両法で よく一致する ことか

ら,多 数検体 を処理で きるASO法 は変異検出 に

感染症学雑誌 第70巻 第10号

HBVウ イルスの検出のコア遺伝子変異 1077

有 用 で あ る こ とが わ か っ た.ASO法 に よ る変 異 検

出 の 特 異 性 は一 塩 基 置 換 を特 定 で き る ほ ど鋭 敏 な

もの で あ っ た4C遺 伝 子 の コ ドン27～100で の 変 異

は多 彩 で あ るが,L311,S49T,S87G/N,K96N及

び197F/Lの5つ の ア ミノ 酸 置 換 に集 約 さ れ た.

しか も この 部 位 で の ア ミノ酸 置 換 の 頻 度 はpre-C

領 域 に お け る終 止 コ ドン の有 無 と は無 関 係 で あ っ

た.ア ミ ノ酸 五 置 換 を 示 した 症 例 につ い てpre-C

変 異 の 有 無 と肝 炎 病 型 を比 較 し た と こ ろ,pre-C

野 生 株 で は9症 例 の う ち2例 が肝 硬 変 で あ るの に

対 し て,pre-C変 異 株 で は5症 例 の うち4症 例 が

肝 硬 変 ・肝 細 胞 癌 に進 行 して い た.こ の よ う に,

pre-C変 異 が 存 在 す る と きC遺 伝 子 変 異 の 蓄 積 が

肝 炎 を よ り重 症 化 させ て い た こ とは注 目す べ き こ

と と考 え る.HBs抗 原 サ ブ タ イ プ とpre-C変 異 に

っ い て は,e抗 原 あ る い はe抗 体 陽 性 のpre-C野

生 株 で は,adrが88.9,89.2%,adwが11.8,10.8%

と両 群 に類 似 した 数 値 が 認 め られ た.一 方,e抗 体

陽 性 のpre-C変 異 株 で は,adrが72.4%,adwが

24-1%と 野 生 株 に比 し てadwが 高 値 で あ った.肝

炎 重 症 化 例 に お い て,adrで は コ ドン84～99に,一

方adwで は コ ドン48～60に 高 頻 度 の変 異 が 認 め

られ て い る が5)9),著 者 らの 成 績 で は この よ うな偏

りは認 め られ な か っ た.

Ehataら5)はType1群 で はC遺 伝 子 の コ ド ン

84～101で の変 異 率 が54%以 上 に達 す る こ と を 示

して い る.B型 肝 炎 患 者 の増 悪 期 で はS49T,S74

G,S87G,197Lの 置 換 例10),ま た肝 炎 重 症 例 で は

S74N,E83D, S87N, V91T, 197Fの 置 換 例11)が

報 告 され て い る.上 述 した 諸 家 の成 績 で は コ ドン

31,49,96の 変 異 頻 度 は きわ め て低 く,著 者 らの

結 果 とは乖 離 し て い た.

ウ イ ル ス は 宿 主 の 免 疫 応 答 プ レ ッ シ ャー を 受

け,CTLの 標 的 とな る抗 原 基 をた えず 変 異 し続 け

る.C遺 伝 子 の 変 異 が コ ドン77～97の 部 位 に 集 中

し て い る こ とか ら,こ の 部 位 がCTLの 標 的抗 原

に な る もの と推 測 され て い る5)9).コ ドン87,96,

97に お い て 高 頻 度 の ア ミノ酸 置 換(33.3～52.3%)

を認 め た 著 者 らの 成 績 は,標 的 抗 原 部 位 に関 す る

諸 家 の 見 解 を裏 付 け る もの で あ る.こ れ ら の変 異

がCTLの 新 た な標 的 とな り肝 炎 を進 展 さ せ る可

能性 もあるが12),一方,変 異がさらに高度に蓄積す

る と肝炎 は終息 に向か うこ とが指摘 され てい

る13).このように,C遺 伝子の変異はpre-C変 異 と

共に肝炎の発症 ・進展2予 後 と密接に関わってお

り,pre-C/C遺 伝子変異の検出は臨床上有意義な

もの と考える.

文 献

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平成8年10月20日

1078 山下 啓子 他

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膵1993; 27: 539-543.

Detection of Hepatitis B Virus by Using Polymerase Chain Reaction and

Nonradioactive DNA ProbesII. Identification of Mutations in the Core Gene by PCR-direct

Sequencing and ASO Probe Method

Keiko YAMASHITA, Shohei KAGAWA & Akira MATSUOKA

Clinical Laboratory, Hyogo College of MedicineYutaka TAKARADA

Toyobo Co. Ltd. Research Center

Mutants of hepatitis B virus (HBV) in the pre-core/core gene exist in patients chronicallyinfected with HBV. The core gene of HBV DNA is preceded by the pre-core region which takes

a role of synthesis and secretion of HBe antigen (HBeAg). Previous studies have suggested that

products of the core gene could be immunological targests of cytoxic T lymphocytes as well asthose of variant pre-core genes and subsequently, that the clinical courses of HBV carriers might

be influenced due to infected HBV variants. In this study, we therefore examined mutations inthe core gene of HBV DNA on strains with or without a translational stop codon at the 28th

codon of the pre-core region, using allele-specific oligonucleotide (ASO) probes and PCR-direct

sequencing. The analysis of nucleotide sequences (codon 27-100) of HBV DNA in anti-HBe

positive sera showed that there were two hypervariable segments of codon 31-49 and codon87-97, where amino acid substitutions of L31I, S49T, S87G/N , K96N and I87F/1 frequentlyoccurred regardless of the presence or absence of the mutation in the pre-core region . Meanwhile,less mutations were detected in the core gene of HBV DNA in HBeAg positive sera . Further-more, we could identify the mutations at codon 87, 96 and 97 by using nonradioactive probes in

a good coincidence with results by PCR-direct sequencing. The ASO probe method is useful fordetection of mutations in the core gene in many specimens .

感染症学雑誌 第70巻 第10号