GERSTEL Aktuell Applikation

Kaum ein Labor, das nicht unter Zeit- und Kostendruck steht. Lösungen, ihn zu reduzieren, gleichzeitig Effi zienz, Präzision und Sicherheit zu steigern, sind stets willkom-men. „Ziel erreicht“, melden Applikateure der britischen Bespak Europe Ltd. und Anatune Ltd. für die GC/MS-Ana-lyse von Fettsäuren. Ihr Lösungsansatz: Automatisierung der Probenvorbereitung, einschließlich Standardaddition, Zugabe eines internen Standards und Derivatisierung, bis hin zur diskriminierungsfreien Injektion in das Chromato-graphie-System.

FAMEs just-in-timebestimmen

Effi ziente Derivatisierung von Fettsäuren

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J e komplexer die Analytik, desto höher die Anforderungen, die ein Laborro-boter erfüllen muss. Maximale Flexi-

bilität bietet jenes Gerät, das die Funktion von zwei Robotern für das Handling � üssi-ger Proben in sich vereint. So die MPS-Prep-Station von GERSTEL, die von John Col-well, Bespak Europe Ltd., sowie Ray Per-kins, Keith Summerhill und Jonathan Ang-ove von der Anatune Ltd. in England zur Analyse von Fettsäuren eingesetzt wird – überaus erfolgreich, wie die vier GC/MS-Pro� s im Fachmagazin Chromatography To-day (Vol. 1, Issue 4, Sept./Oct. 2008, p. 17-19) berichten.

Triglyceride spalten und freie Fettsäuren derivatisierenTierische und p� anzliche Fette spielen als Bestandteil unserer Ernährung sowie als Schmier- und Gleitmittel eine wichtige Rolle. Analytik hat die Aufgabe, nicht nur den Reinheitsgrad von Fett und Öl zu un-tersuchen, sondern auch zu Deklarations-zwecken Fettgehalt und -zusammensetzung von Lebensmitteln zu bestimmen.

Fette und fette Öle sind Ester des drei-wertigen Alkohols Glycerin (Propan-1,2,3-triol) mit drei meist verschiedenen, über-wiegend geradzahligen und unverzweigten aliphatischen Monocarbonsäuren, den Fett-säuren, durch die Fette sich charakterisie-ren lassen. Verbindungen dieser Art wer-den Triglyceride beziehungsweise Triacyl-glycerine genannt.

Die Triglyceride der Fettsäuren lassen sich gaschromatographisch nicht analysie-ren. Dafür bedarf es der Spaltung und Deri-vatisierung: Die Esterbindungen werden auf-gebrochen und die freien Fettsäuren in korrespondierende Fettsäuremethylester (FAMEs; das Akronym leitet sich ab von Fatty Acid Methyl Esters) überführt. Im Ge-gensatz zu den jeweiligen Fettsäuren sind FAMEs unpolar und moderat � üchtig und eignen sich für die GC-Analyse.

Der Schritt der Fettsäurenderivatisie-rung ist für gewöhnlich arbeitsintensiv; eine Automatisierung der Probenvorbereitung, wie sie Colwell, Perkins, Summerhill und Angove unternommen haben, drängt sich geradezu auf. Die Wissenscha� ler haben die vielfach beschriebene manuelle Derivatisie-rung mit Bortri� uorid und Methanol ad-aptiert (Journal of Liquid Research, 1965. 5: p. 600-608) und auf die MPS-PrepStation übertragen; die Vergleichbarkeit war ge-währleistet, schreiben die Autoren.

Zunächst wurden die Fettproben in 10-mL-Vials mittels Accelerated Solvent Extraction (ASE) extrahiert und mit deu-terierten Fettsäuren versetzt. Die resultie-renden Extrakte wurden bis zur Trockene eingedamp� und schließlich alle weiteren Schritte automatisiert auf der MPS-PrepSta-tion durchgeführt. Die Quanti� zierung er-folgte mit 1-Bromtetradecan als internem Standard (IS).

Die technischen DetailsEntscheidend für die e� ziente Automatisie-rung der Fettsäurenderivatisierung ist, dass

sich alle erforderlichen Arbeitsschritte auf dem Autosampler durchführen lassen. Die MPS-PrepStation verfügt über zwei überei-nander gelagerte Achsen (Schienen), an de-nen sich jeweils ein Roboterarm entlangbe-wegt, der in alle drei Raumrichtungen agie-ren kann. „Während die obere Schiene der MPS-PrepStation etwa das gesamte Spek-trum der Flüssigaufgabe abdeckt, inklusi-ve Standardaddition, Zugabe eines inter-nen Standards und Derivatisierung, kann die zweite Schiene eine abweichende Mög-lichkeit der Probenanreicherung und Pro-benaufgabe bieten – etwa Headspace (HS),

MPS-PrepStation, wie sie von Colwell, Perkins, Summerhill und Angove zur Darstellung von Fettsäuremethylestern (Derivatisierung) eingesetzt wurde.

Analysenbedingungen

Probeneingang: Automatisierte Säulenkühlung im Ofeneinzug-Modus (Ofentemperatur: 3 °C)

Injektionsvolumen: 1 µL (10-µL-Spritze)

Trennsäule: Phenomenex Zebron ZB1, 30 m x 240 µm (0,1 µm Film)

Vorsäule: Approx 1 m x 0,53 µm Innendurchmesser, deaktiviert

Trägergas: Helium (1mL/min), konstanter Fluss, Vakuum-kompensiert

T-Programm: 40 °C (1 min) – 10 °C/min – 300 °C (5 min)

Detektionsmodus: Selected Ion Monitoring (SIM)

Interface-Temperatur: 280 °C (Detektorübergang)

MSD-Einstellung: Standard Auto Tune (STUNE)

MSD-Lösemittelverzögerung: 5 min

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SolidPhaseMicroExtraction (SPME) oder automatisiert SPE“, erklärt Ray Perkins. Die MPS-PrepStation ermöglicht es, selbst komplexe Analysen e� zient, komfortabel, zeitlich verschachtelt und just in time durch-zuführen, was insbesondere dann interes-sant ist, wenn es sich um sensible, leicht zer-störbare Proben handelt und ein Verlust an Substanz im derivatisierten Zustand zu be-fürchten ist.

Die MPS-PrepStation von Colwell, Per-kins, Summerhill und Angove war mit einer 1-mL- sowie einer 10-µL-Spritze ausgestat-tet sowie mit zwei beheizbaren Agitatoren und einer Lösemittelstation, die Platz für vier Lösemittelbehälter bietet. Zwei enthiel-ten Wasser der Qualitätsstufe HPLC-Grade, einer war mit Aceton gefüllt.

Der in Hexan gelöste interne Standard sowie das Derivatisierungsreagens (BF3 in Methanol) wurden in je einem 100-mL-Vial bevorratet. Kontrolliert und gesteuert wur-de die Probenvorbereitung mittels GERS-TEL-MAESTRO-Software. Die anschlie-ßende Analyse erfolgte auf einer Kombi-nation GC 6890 und MSD 5973 von Agi-

Aceton ist in jedem Verhältnis mit Was-ser und den meisten organischen Löse-mitteln mischbar. Daher eignet sich Ace-ton zur Konditionierung von Spritzen, um beim Wechseln von wässrigen zu öligen Phasen und umgekehrt Benetzungspro-blemen vorzubeugen, so wie es Colwell, Perkins, Summerhill und Angove im Zu-ge ihrer Probenvorbereitung gemacht ha-ben.

lent Technologies. „Unsere Gerätekon� gu-ration erlaubt es“, schreiben die Wissen-scha� ler, „Probenvorbereitung, Probenauf-gabe und Analyse nahtlos ineinander über-gehen zu lassen oder wahlweise jeden ein-zelnen Schritt unabhängig voneinander, das heißt die GC/MS-Analyse separat, durch-zuführen.“

Colwell, Perkins, Summerhill und Ang-ove überführten die 10-mL-Vials mit den eingedamp� en Extrakten von Hand auf die MPS-PrepStation. Alle weiteren Schritte verliefen voll automatisiert: 1 mL der BF3/Methanol-Mischung wurde mit der 1-mL-Spritze dem Vorratsbehälter entnommen und zudosiert. Die Vials wurden zum ers-ten Agitator überführt und für die Dauer

von 5 min bei 70 °C geschüttelt, dann wie-der im Probentray positioniert. Die 1-mL-Spritze kam erneut zum Einsatz, um 1 mL des internen Standards (1-Bromtetradecan in Hexan) in die Probe zu dosieren.

Gestoppt wurde die Derivatisierungsre-aktion durch Zugabe von 3 mL HPLC-Was-ser. Die Extraktion der Fettsäuremethyles-ter erfolgte für die Dauer von 35 min. bei Raumtemperatur durch Schütteln im zwei-ten Agitator. Nach einer Standzeit von 1 min im Probentray hatte sich die organi-sche Phase, in der sich die FAMEs ange-reichert haben, von der wässrigen getrennt; mit der 10-µL-Spritze wurde je 1 µL der or-ganischen Phase entnommen und direkt in das GC/MS-System injiziert.

Tabelle 1 Durch GC/MS ermittelte Peakfl ächen ausgewählter Fettsäuremethylester einschließlich der deuterierten Standards nach manueller Derivatisierung.

Tabelle 2Durch GC/MS ermittelte Peakfl ächen ausgewählter Fettsäuremethylester einschließlich deuterierter Standards nach automatisierter Derivatisierung mittels GERSTEL-MPS-PrepStation.

Tabelle 3Vergleich der Durchschnittswerte der mittels GC/MS ermittelten Peakfl ächen nach manueller und automatisierter Derivatisierung der Probenextrakte.

Aceton

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Hoher Probendurchsatz, präzise und sichere Ergebnisse„Da die Probenvorbereitung deutlich mehr Zeit in Anspruch nimmt als der GC-Lauf “, erklärt Ray Perkins, „bedeutet der Einsatz der MPS-PrepStation puren Zeitgewinn, verbunden mit einer signi� kanten Steige-rung der Produktivität.“

Die Ursache ist in der intelligenten So� -waresteuerung zu � nden, die über den Mo-dus „PrepAhead“ verfügt und durch die der Anwender in der Lage ist, beide Schritte – Probenvorbereitung und Analyse – zeitlich zu verschachteln; die Vorbereitung der Pro-ben kann so tief verschachtelt werden, dass sich unmittelbar ein GC-Lauf an den nächs-ten anschließt.

Die So� ware erlaube es sogar, die Schrit-te der Probenvorbereitung exakt zu planen. Nur so lasse sich die Kapazität des gesamten Analysesystems voll und ganz ausschöpfen. Dank des Schedulers, der in der So� ware in-tegriert ist, hat der Anwender den Ablauf-plan konkret vor Augen – auf dem Bild-schirm seines Rechners. „Die Proben wer-den alle gleich behandelt und in der denkbar kürzesten Zeit abgearbeitet“, schreiben Col-well, Perkins, Summerhill und Angove.

Hohe Wiederfi ndung, präzise Ergebnisse, sichere AnalyseIhre Arbeit habe gezeigt, schildern die Wis-senschaftler, dass sich die bewährte manu-elle Vorgehensweise bei der Derivatisierung von freien Fettsäuren in Fettsäuremethyl-ester erfolgreich automatisieren lasse. Ein

Fettsäuremethylester (FAME) werden durch Umestern von Fetten oder Ölen (Trigly-ceriden) mit Methanol hergestellt. Diese Reaktion wird sauer oder basisch katalysiert. Dabei wird der dreiwertige Alkohol Glycerin gegen Methanol ausgetauscht. Es ent-stehen Glycerin und FAME als Reaktionsprodukte, wobei bei Einsatz von natürlichen Fetten stets ein Gemisch aus verschiede-nen Fettsäuremethylestern erhalten wird, da natürliche Triglyceride mehrere verschiede-ne Fettsäurereste enthalten können. In der Technik wird das Gleichgewicht der Umeste-rungsreaktion, durch das Entfernen des Gly-cerins oder durch einen Überschuss des Al-kohols (Methanol), auf die Seite der Produk-te, also auf die Seite der Fettsäuremethyles-ter, verschoben.

Schon gewusst? Biodiesel ist ein dem Die-selkraftstoff vergleichbarer pfl anzlicher Kraft-stoff. Im Gegensatz zum konventionellen Die-selkraftstoff wird er nicht aus Rohöl, sondern aus Pfl anzenölen oder tierischen Fetten gewon-nen, meistens aus Raps (Rapsdiesel). Biodie-sel wird deshalb als erneuerbarer Energieträ-ger bezeichnet; chemisch handelt es sich um Fettsäuremethylester (FAME).

GC/MS-Chromatogramm (SIM-Mode) einer Probe, der deuterierte Fettsäu-ren zugesetzt wurden. Die Probenvorbereitung erfolgte automatisiert mit der MPS-PrepStation. Peaks in der Reihen-folge ihrer Elution von links: Methylmyristat (deuteriert), Methylmyri-stat, 1-Bromtetradecan (interner Standard), Methylpalmitat (deute-riert), Methylpalmitat, Methylstearat (deuteriert), Methylstearat.

Vergleich der manuellen, von erfahrener Hand durchgeführten Derivatisierung mit den Ergebnissen der auf der MPS-PrepSta-tion realisierten automatisierten Prozedur bezeuge die Güte, die Sensitivität und Prä-zision der automatisierten Vorgehensweise: „Die Automatisierung brachte wie erwartet eine bessere Wiederfi ndung sowie eine ge-

ringere Standardabweichung in allen Fäl-len“, konstatieren die Wissenschaftler und merken an, dass ein Teil der ohnehin gerin-gen Schwankungsbreite in den Daten der avisierten endogenen Methylester sowieso mit der individuellen ASE jeder einzelnen Probe, die im Vorfeld der Derivatisierung erfolgte, zusammenhinge.

Biodiesel

Fettsäuremethylester (FAME)

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