Effekte von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern...

Effekte von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern

auf Zellen im Monolayer

Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität Rostock

vorgelegt von

Anna Steuer

aus Greifswald

Rostock, den 26.01.2016

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Schreibmaschinentext

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urn:nbn:de:gbv:28-diss2016-0095-9

1. Gutachter: Prof. Dr. Juergen F. Kolb

INP Greifswald / Institut für Physik, Universität Rostock

2. Gutachter: Prof. Dr. Georg Müller

Karlsruher Institut für Technologie (KIT)

Tag der Verteidigung: 08.06.2016

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... IV

1 Einleitung .......................................................................................................................... 1

1.1 Gepulste elektrische Felder und ihre biologischen Anwendungen ........................... 1

1.1.1 Historische Entwicklung und Parameterbereiche ......................................... 1

1.1.2 Elektrische Eigenschaften von Zellmembranen und ihr Verhalten in

elektrischen Feldern .................................................................................... 3

1.1.3 Biologische Effekte von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern ..... 8

1.2 Zell-Zell-Kommunikation über Gap Junctions ......................................................... 9

1.2.1 Aufbau, Eigenschaften und Funktionen von Gap Junctions ......................... 9

1.2.2 Lebenszyklus und Regulation der Gap Junctions ....................................... 11

1.2.3 Zell-Zell-Kommunikation, Connexine und Krankheiten ........................... 13

1.3 Zusammenhang von Zellelastizität, Malignität und Invasivität ............................. 15

1.4 Zielstellung .............................................................................................................. 17

2 Material und Methoden ................................................................................................... 20

2.1 Zellkultur ................................................................................................................. 20

2.2 Erzeugung von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern ............................. 21

2.3 Behandlung von Zellen mit nsPEFs ....................................................................... 22

2.4 Bestimmung der Zellvitalität ................................................................................... 23

2.5 Nachweis von Elektroporation ................................................................................ 24

2.6 Nachweis der Zell-Zell-Kommunikation mittels Fluoreszenzfarbstoff-Transfer As-

say ........................................................................................................................... 24

2.7 Nachweis von Cx43, F-Aktin und ZO-1 mittels Immunfluoreszenz ...................... 25

2.8 Analyse der Genexpression ..................................................................................... 26

2.8.1 Isolierung der RNA ..................................................................................... 26

2.8.2 Transkription der cDNA ............................................................................. 27

2.8.3 Quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) .................... 27

2.9 Proteinanalyse ......................................................................................................... 28

2.9.1 Bestimmung der Proteinkonzentrationen ................................................... 28

2.9.2 Western Blot ............................................................................................... 28

Inhaltsverzeichnis

II

2.10 Statistik .................................................................................................................. 29

2.11 Rasterkraftmikroskopie ......................................................................................... 29

2.11.1 Aufbau und Funktionsweise ..................................................................... 29

2.11.2 Kraft-Abstand-Kurven und Bestimmung der Elastizitätsmoduln ............. 31

2.12 Scratch Assay ........................................................................................................ 34

2.13 Soft Agar Colony Formation Assay ...................................................................... 35

3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 36

3.1 Erzeugung eines 100 ns-Pulses ............................................................................... 36

3.2 Simulation der elektrischen Feldstärkeverteilung ................................................... 37

3.3 Zellvitalität und Elektroporation ............................................................................. 38

3.4 Effekte von nsPEFs auf die Zell-Zell-Kommunikation .......................................... 41

3.4.1 Effekte auf die Zell-Zell-Kommunikation von WB-F344 .......................... 42

3.4.2 Änderung der Zell-Zell-Kommunikation in Abhängigkeit von der Feld-

stärke .......................................................................................................... 44

3.4.3 Effekte auf die Zell-Zell-Kommunikation von WB-ras ............................. 46

3.4.4 Vergleich von Behandlungen der Zellen mit 20 und 100 Pulsen ............... 47

3.5 Immunfluoreszenzfärbungen von Cx43, F-Aktin und ZO-1 ................................... 48

3.6 Analyse der Cx43-Genexpression ........................................................................... 51

3.7 Analyse der MAP-Kinase-Aktivierung und der Proteinexpression von Cx43 ....... 53

3.7.1 Erk1/2 ......................................................................................................... 53

3.7.2 p38 .............................................................................................................. 55

3.7.3 Cx43 ............................................................................................................ 55

3.8 Effekte von nsPEFs auf die Elastizität von Zellen .................................................. 57

3.8.1 Zeitliche Entwicklung der Elastizitätsmoduln ............................................ 59

3.8.2 Vergleich der Elastizität über dem Zellkern und dem Zellrand ................. 64

3.8.3 Zusammenhang von Elastizität und Zytoskelett ......................................... 66

3.9 Einfluss von nsPEF auf Kanzerogenese und Invasivität von Zellen ....................... 67

3.9.1 Migration und Proliferation ........................................................................ 68

3.9.2 Maligne Transformation ............................................................................. 70

4 Diskussion ....................................................................................................................... 71

4.1 Vergleich idealer und realer Hochspannungspuls ................................................... 71

4.2 Zellvitalität .............................................................................................................. 72

Inhaltsverzeichnis

III

4.3 Zell-Zell-Kommunikation ....................................................................................... 74

4.3.1 Verteilung von Cx43 in den Zellen ............................................................ 75

4.3.2 Gen- und Proteinexpression von Cx43 ....................................................... 76

4.3.3 Direkte Effekte von nsPEFs auf die Zell-Zell-Kommunikation ................. 78

4.3.4 Indirekte Effekte von nsPEFs auf die Zell-Zell-Kommunikation .............. 79

4.4 Zellelastizität, Transformation und Metastasierungspotential ................................ 82

4.5 Bedeutung für medizinische Anwendungsmöglichkeiten ....................................... 86

5. Zusammenfassung.......................................................................................................... 88

6. Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 91

IV

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AFM Ratserkraftmikroskopie (engl. atomic force microscopy)

BSA Rinder-Serum-Albumin

bzw. beziehungsweise

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CK1 Casein-Kinase 1

Cl- Chlorid

CO2 Kohlendioxid

Cx43 Connexin43

Da Dalton

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

d.h. das heißt

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate

dNTP’s Desoxyribonukleosidtriphosphate

DPBS Dulbecco‘s Phosphate Buffered Salt Solution

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EP Elektroporation

ER Endoplasmatisches Retikulum

Erk1/2 extracellular signal regulated kinases

FCS fötales Kälberserum

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FWHM Halbwertsbreite (engl. full width at half maximum)

GJ Gap Junction

GTP Guanosin Triphosphat

h Stunde

HBSS Hank´s balanced salt solution

HRP Meerrettichperoxidase (engl. horseradish peroxidase)

K+ Kalium

Ktrl. Kontrolle

LY Lucifer Yellow

MAP-Kinase mitogen-aktivierte Proteinkinase

MEM Minimum Essential Medium

µs Mikrosekunden

Abkürzungsverzeichnis

V

min Minute

mRNA messenger Ribonukleinsäure

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

Na+ Natrium

NADP Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

ns Nanosekunden

nsPEF Nanosekunden gepulste elektrische Felder (engl. nanosecond pulsed electric field)

PBS Phosphate buffered saline

PDGF platelet-derived growth factor

PFA Paraformaldehyd

PI Propidiumiodid

PKA Proteinkinase A

PKC Proteinkinase C

PVDF Polyvinylidenfluorid

qPCR Quantitative Real-Time Polymerasekettenreaktion

RNA Ribonukleinsäure

RNasin Ribonuklease Inhibitor

RPL13A 60S ribosomal protein L13a

rpm Umdrehungen pro Minute (engl. rounds per minute)

s. siehe

SD Standardabweichung (engl. standard deviation)

SDS Natriumdodecylsulfat

TGN trans-Golgi-Netzwerk

TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate

TR Texas Red

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

TBST Gemisch aus Tris und Tween 20

U/ml Einheiten (engl. units) pro Milliliter

unbeh. unbehandelt

UV Ultraviolett

YM Youngscher Modul

z.B. zum Beispiel

ZO-1 Zonula Occludens 1

ZZK Zell-Zell-Kommunikation

1

1 Einleitung

1.1 Gepulste elektrische Felder und ihre biologischen Anwendungen

1.1.1 Historische Entwicklung und Parameterbereiche

Die Effekte von elektrischen Feldern auf biologische Materie wurden bereits im 18. und

19. Jahrhundert beschrieben. 1754 berichtete J.A. Nollet erstmals von der Bildung roter

Flecken auf der Haut von Tieren und Menschen, nachdem sie mit elektrischen Funken be-

handelt wurden [1]. Heute scheint es wahrscheinlich, dass diese Flecken nicht nur durch

thermische Schäden, sondern auch durch die irreversible Bildung von Poren in der Zell-

membran der Kapillaren aufgrund der transient einwirkenden elektrischen Felder verur-

sacht wurden.

Im 20. Jahrhundert wurden die ersten systematischen Untersuchungen von gepulsten elek-

trischen Feldern an Nerven durchgeführt. B. Frankenhaeuser und L. Widén konstatierten

1956 die veränderte Leitfähigkeit von Nerven, nachdem sie diese mit Pulsen mit einer

Dauer im Millisekunden-Bereich stimuliert hatten [2]. Diese Beobachtungen wurden kurze

Zeit später durch Studien von R. Stämpfli bestätigt, der diese Effekte mit dem Zusammen-

bruch des Membranpotentials unter dem Einfluss der gepulsten elektrischen Felder er-

klärte. Zudem beschrieb er, dass die beobachteten Effekte unter bestimmten Umständen

reversibel sein können [3]. 1972 wies E. Neumann zusammen mit K. Rosenheck die rever-

sible Bildung von Poren in Zellmembranen nach, nachdem Zellen mit elektrischen Pulsen

behandelt wurden [4]. Zehn Jahre später nutzte Neumann diesen Effekt zum Einbringen

von Fremdgenen in Zellen und bezeichnete die Porenbildung in Zellmembranen aufgrund

gepulster elektrischer Felder erstmals als Elektroporation [5].

Heute weiß man, dass mit der Wahl von Feldstärke und Pulslänge gezielt bestimmte Effekte

ausgelöst werden können, wie in Abb. 1.1 dargestellt. Die strichpunktierte Linie zeigt, bei

welcher Pulslänge welche Feldstärke nötig ist, um das kritische Transmembranpotential

von ungefähr 1 V zu erreichen, ab dem sich Poren in der Zellmembran ausbilden, wobei

der tatsächliche Schwellwert vom Zelltyp abhängt. Die gestrichelte Linie grenzt den Be-

reich ab, in dem biologische Effekte überwiegend auf thermische Effekte zurückzuführen

sind (im Beispiel für einen durch die Pulse verursachten Temperaturanstieg von 10 K).

1 Einleitung

2

Abb. 1.1* Anwendungsmöglichkeiten von gepulsten elektrischen Feldern an Zellen und Geweben.

Die strichpunktierte Linie zeigt an, welche Parameter zum Erreichen der kritischen Spannung Vkr

nötig sind, um verschiedene Effekte hervorzurufen, wie z.B. Porenbildung in der Membran oder

intrazelluläre Mechanismen. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze an, ab der thermische Effekte

beginnen eine dominante Rolle zu spielen. *nach [6]

Neben dem Einbringen von Fremd-Genen in eukaryotische Zellen mit dem Ziel der rekom-

binanten Expression in diesen Zellen [7, 8], werden Millisekunden gepulste elektrische

Felder auch zur Behandlung von Tumoren angewendet. Die Elektrochemotherapie, deren

Wirksamkeit und Effektivität bereits in mehreren klinischen Studien getestet wurde, macht

sich das Prinzip der reversiblen Elektroporation zu Nutze [9]. Die in der Krebstherapie

verwendeten Zytostatika sind Moleküle, die aufgrund ihrer Größe und Hydrophilie kaum

membrangängig sind. Mit Hilfe der Elektroporation werden Poren erzeugt, durch die die

Medikamente ins Zellinnere diffundieren können. Dadurch wird die Wirksamkeit der

Chemotherapeutika trotz geringerer Dosierung um ein Vielfaches gesteigert und Neben-

wirkungen werden gleichzeitig stark vermindert [10, 11].

Im Vergleich dazu können Pulse mit einer Länge im Bereich von Mikrosekunden zur bak-

teriellen Dekontamination von Lebensmitteln und Abwässern und zur Vermeidung von

Biofouling angewendet werden [12-15].

1 Einleitung

3

Bei der Behandlung von Zellen mit Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern (engl.

nanosecond pulsed electric fields; nsPEFs) wird im Unterschied zur Anwendung von län-

geren Pulsen eine vollständige Aufladung der äußeren Plasmamembran verhindert.

Dadurch können nsPEFs die Zelle durchdringen und wirken sich hauptsächlich auf intra-

zelluläre Membranen aus [16, 17]. Die Wechselwirkung mit subzellulären Strukturen kann

verschiedene Effekte innerhalb der Zelle hervorrufen, wie z.B. die Induktion der Apoptose

oder die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern [6]. Die Effekte von Pulsen

mit einer Dauer im Nanosekunden-Bereich auf Zellen sind auch Thema der vorliegenden

Arbeit. Dabei lag der Fokus auf der Kommunikation zwischen Zellen, da diese über intra-

zelluläre Mechanismen, wie sie durch nsPEFs ausgelöst werden können, reguliert wird.

1.1.2 Elektrische Eigenschaften von Zellmembranen und ihr Verhalten in

elektrischen Feldern

Sowohl im Inneren von Zellen als auch im Extrazellularraum befinden sich in unterschied-

lichen Konzentrationen Ladungsträger wie Natrium (Na+)-, Kalium (K+)-, und Chlorid

(Cl-)-Ionen, die durch die Zellmembran voneinander getrennt sind. Die unterschiedlichen

Ionenkonzentrationen und die damit verbundene ungleiche Verteilung der Ladungsträger

auf beiden Seiten der Plasmamembran führen zu einem elektrochemischen Gradienten, der

ein Potentialgefälle über der Plasmamembran bewirkt. Das resultierende Ruhepotential be-

trägt in Säugerzellen ca. -60 mV. Wird die Zellmembran um etwa 20 mV auf -40 mV de-

polarisiert und somit ein bestimmter Schwellenwert überschritten, öffnen sich spannungs-

gesteuerte Na+-Kanäle und im Fall von erregbaren Zellen wird ein Aktionspotential ausge-

löst. Das Membranpotential verschiebt sich durch den Einstrom der Na+-Ionen zu einem

Wert von ca. +40 mV, bevor die Membran schließlich wieder zu ihrem Ruhepotential zu-

rückkehrt. Generell kann jede Membran depolarisiert werden, aber nur in erregbaren Zel-

len, wie Nerven- und Muskelzellen, wird ein Aktionspotential ausgelöst [18]. In nicht er-

regbaren Zellen, wie z.B. Astrocyten, Oligodendrocyten, Lymphocyten und Makrophagen,

kehrt das Membranpotential ohne Aktionspotential zum Ruhewert zurück.

Im Gegensatz dazu können durch von außen angelegte elektrische Felder weit höhere Po-

tentialunterschiede als die physiologischen Unterschiede von einigen mV erzeugt werden.

Wird eine Zelle einem elektrischen Feld ausgesetzt, akkumulieren die Ionen entlang der

Membran und führen so zu einem Anstieg des Membranpotentials. Ab einem Wert von

ungefähr 1 V beginnen sich Poren in der Membran zu bilden [19, 20], es kommt zur Elek-

1 Einleitung

4

troporation (Abb. 1.2) [5]. Die Ladungsträger, die normalerweise durch die Membran von-

einander getrennt sind, können nun durch diese hindurch diffundieren und die Transmem-

branspannung sinkt wieder. Je nach Wahl der Pulsparameter kann die Porenbildung rever-

sibel oder irreversibel sein, d.h., dass sich entweder die Zellmembran regeneriert und sich

die Poren wieder schließen oder aber die Zelle abstirbt [21, 22].

Abb. 1.2 Schematische Darstellung der Elektroporation: Wird eine Zelle einem elektrischen Feld

ausgesetzt, akkumulieren die Ladungsträger entlang der Membran und die Transmembranspannung

steigt an. Erreicht sie einen Wert von 1 V, bilden sich Poren in der Membran. Die Ladungsträger

auf beiden Seiten der Zellmembran können diese nun passieren, wodurch die Transmembranspan-

nung wieder sinkt.

Abb. 1.3* Doppelschalenmodell einer Zelle und Ersatzschaltbild einer Zelle zwischen zwei Elek-

troden. Die Plasma- und Kernmembran werden mit den Kapazitäten Cm bzw. Cn beschrieben, das

Zytoplasma bzw. Nukleoplasma durch die Widerstände R2, R3 und R4. R1, R5 und C0 hängen von

den elektrischen Eigenschaften des Mediums ab. *nach [17]

Vereinfacht kann die Membranaufladung auch in elektrischen Schaltbildern beschrieben

werden. Dabei kann eine Zelle mit einer konzentrisch angeordneten Organelle (z.B. Nu-

1 Einleitung

5

kleus) als Kugelkondensator angesehen werden (Abb. 1.3). Das Zytoplasma sowie das

Nukleoplasma sind mäßig leitfähig, die Membranen hingegen haben nur eine geringe Leit-

fähigkeit. Somit kann die Zelle als Leiter betrachtet werden, der von einer verlustbehafte-

ten, isolierenden Hülle umgeben ist [17].

Unter diesen Annahmen kann die Änderung der Transmembranspannung der Plasma-

membran in folgende Gleichung gefasst werden:

|𝛥𝑉𝑚| = 1,5 ∙ 𝐸 ∙𝐷

2∙ (1 − 𝑒

−𝑡

𝜏𝑐) (1.1)

dabei steht E für das elektrische Feld, D für den Durchmesser der Zelle und t für die Zeit,

die die Zelle dem elektrischen Feld ausgesetzt ist. Die Ladezeitkonstante τc kann wiederum

beschrieben werden durch:

𝜏𝑐 = (𝜌𝑐 + 0,5 ∙ 𝜌𝑎) ∙ 𝑐𝑚 ∙𝐷

2 (1.2)

mit der Leitfähigkeit des Zytosol ρc, der Leitfähigkeit der Zellsuspension ρa und der spezi-

fischen Membrankapazität cm. Die Werte hängen stark von der Zytosol- und Membranbe-

schaffenheit (z.B. Cholesterol-Anteil) ab und sind somit je nach Zelltyp unterschiedlich.

Typische Werte für die Leitfähigkeit des Zytosols liegen im Bereich von 1

70 S/cm, die spe-

zifische Membrankapazität beträgt ungefähr 1 µF/cm2 [23, 24]. Genau genommen müssten

auch die kapazitiven Anteile des Zytosols und die Leitfähigkeit der Membran berücksich-

tigt werden, diese werden hier aber vernachlässigt. Die Gleichungen 1.1 und 1.2 zeigen die

Abhängigkeit der Änderung der Transmembranspannung vom Durchmesser der Zelle.

Folglich erreichen größere Zellen bei gegebener Feldstärke die kritische Transmembran-

spannung schneller als Zellen mit einem kleineren Durchmesser bzw. sind höhere Feldstär-

ken nötig, um die Porenbildung in kleineren Strukturen zu bewirken. Die Abhängigkeit der

Ladezeitkonstante zeigt zudem, dass sich kleinere Strukturen, wie z.B. Zellorganellen,

schneller aufladen als die äußere Zellmembran.

Unter der Annahme, dass die Organelle rund ist und sich konzentrisch in der Zelle befindet,

kann die Potentialänderung über der Organellenmembran wie folgt beschrieben werden:

|𝛥𝑉𝑜(𝑡)| = (1,5)2 ∙ 𝐸 ∙𝑑

2∙ 𝑒

−𝑡

𝜏𝑐 ∙𝜏𝑐

𝜏𝑐−𝜏𝑜∙ 𝑒

𝑡𝜏𝑐

−𝑡

𝜏𝑜 (1.3)

1 Einleitung

6

mit dem Durchmesser der Organelle d und der Ladezeitkonstante der Organelle τo. Die La-

dezeitkonstante für Organellen ist analog zu der für Zellen.

Lädt sich gleichzeitig die äußere Membran der Zelle auf, bildet sich in der Zelle ein dem

äußeren Feld entgegengerichtetes elektrisches Feld aus, das die subzellulären Strukturen

vom äußeren Feld abschirmt. Sollen vorwiegend die intrazellulären Strukturen wie Nuk-

leus, Mitochondrien oder das endoplasmatische Retikulum beeinflusst werden, muss die

Pulslänge des angelegten elektrischen Feldes also kürzer sein als die Dauer, die die äußere

Membran braucht, um sich aufzuladen. In diesem Zusammenhang spielt auch die Anstiegs-

zeit des elektrischen Pulses eine wichtige Rolle. Idealerweise müsste der angelegte Puls

eine unendlich kurze Anstiegszeit haben oder zumindest eine sehr viel kürzere als typische

Ladezeitkonstanten, also möglichst rechteckig sein.

Die durch die einfachen elektrischen Modelle gewonnenen Ergebnisse lassen sich durch

detaillierte Computersimulationen bestätigen und weiter spezifizieren [25]. Dazu wurde

eine Zelle mit Kern, Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum mit den jeweiligen

charakteristischen elektrischen Eigenschaften in einem elektrischen Feld mit der dazu ge-

hörenden Feldverteilung simuliert (Abb. 1.4). Die in weiß dargestellten Membranab-

schnitte veranschaulichen Membranabschnitte, für die eine Änderung von 1 V erreicht

wurde.

Abb. 1.4*: Simulation der Feldverteilung bei einer Zelle im elektrischen Feld. Im Fall von „kon-

ventioneller“ Elektroporation (110 µs, 1,1 kV/cm) geht das elektrische Feld um die Zelle herum

(a), während es bei Supra-Elektroporation (60 ns, 60 kV/cm) durch die Zelle hindurchgeht (b).

*aus [25]

Für den Fall der konventionellen Elektroporation wurde ein Feld mit einer Pulslänge von

110 µs und einer Feldstärke von 1,1 kV/cm angenommen (Abb. 1.4a). Dabei geht das elek-

trische Feld gegen Ende des angelegten Pulses um die Zelle herum und nur die äußere, den

1 Einleitung

7

Polen zugewandte Membran, lädt sich auf 1 V auf, während die Organellen im Zellinneren

unberührt bleiben. Für den Fall der Supra-Elektroporation (Abb. 1.4b) wurde ein 60 ns-

Puls und eine Feldstärke von 60 kV/cm angenommen. Im Gegensatz zur konventionellen

Elektroporation durchdringt hier das elektrische Feld gegen Ende des angelegten Pulses die

Zelle noch vollständig. Durch die hohe Feldstärke laden sich sowohl die komplette äußere

Membran als auch die Membranen der subzellulären Strukturen auf 1 V auf.

Der Prozess der Elektroporation besteht aus drei Phasen: dem Aufladen der Membran, der

Bildung der ersten Pore und schließlich der Entwicklung weiterer Poren. Die zeitliche Ab-

hängigkeit der Porendichte N kann mit folgender Gleichung nach Smoluchowski beschrie-

ben werden:

𝑑𝑁

𝑑𝑡= 𝛼𝑒

(𝑉𝑚𝑉𝑒𝑝

)2

(1 −𝑁

𝑁0𝑒

−𝑞(𝑉𝑚𝑉𝑒𝑝

)2

) (1.4)

wobei N0 die Porendichte für den Fall ist, dass keine Transmembranspannung anliegt

(Vm = 0 mV). q und α sind Konstanten. Vep ist ebenfalls eine Konstante, die analog einer

Zeit- oder Längenkonstanten die charakteristische Transmembranspannung beschreibt, die

zu einer e-fachen Erhöhung der Porenbildungs-Rate führt [26].

Die durch Elektroporationspulse (Pulslänge µs-ms) erzeugten Poren unterscheiden sich in

Anzahl, Dichte und Größe von denen, die durch nsPEFs entstanden sind. Zudem hängen

sie von der Höhe der applizierten Feldstärke ab. Generell werden alle Membranen, also

sowohl die äußere als auch die der Organellen, innerhalb von wenigen zehn Nanosekunden

gleichmäßig poriert [25, 27]. Poren, die durch kurze Pulse entstanden sind, sind zahlreicher,

mit einem Radius von wenigen Nanometern aber auch wesentlich kleiner als durch Elek-

troporationspulse erzeugte Poren (Porendurchmesser bis zu 120 nm [28]) [29-31]. Die Bil-

dung unterschiedlicher Porengrößen hat zur Folge, dass sich auch die Ionen, die durch die

Poren in der Membran diffundieren können, unterscheiden. Da Ionen eine wichtige Rolle

in der Regulation zellulärer Prozesse spielen, wie z.B. bei der Reizleitung in Nerven oder

der Osmoregulation der Zelle, können nsPEFs somit andere Effekte nach sich ziehen als

klassische Elektroporationspulse.

1 Einleitung

8

1.1.3 Biologische Effekte von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern

Als Folge der unterschiedlichen Aufladevorgänge bzw. Porenbildungsdynamik unterschei-

den sich Nanosekunden gepulste elektrische Felder in ihrer biologischen Wirkung auf Zel-

len von Pulsen mit einer Dauer im Mikro- bis Millisekunden-Bereich, die zur Elektropora-

tion verwendet werden. Zahlreiche Publikationen beschreiben die Induktion der Apoptose

nach der Behandlung mit nsPEFs, die sowohl über den extrinsischen Weg, also durch Stress

auf die äußere Zellmembran, als auch den intrinsischen Weg, also durch die Freisetzung

pro-apoptotischer Faktoren, eingeleitet werden kann [17, 32, 33]. Weiterhin konnte eine

Wirkung von nsPEFs auf den Zellkern und die DNA gezeigt werden, die sich in der Porie-

rung der Kernmembran und der Induktion von DNA-Schäden äußert [34-37]. Aufgrund

dieser Effekte wurden elektrische Pulse in den letzten Jahren als neue medikamentenfreie

Behandlungsmöglichkeit von Krebs, vor allem von Melanomen, untersucht. In Tierversu-

chen konnte gezeigt werden, dass nsPEFs, auch ohne die Verwendung von Chemothera-

peutika, Tumore schrumpfen und sogar zu ihrer vollständigen Rückbildung führen können

[38-41]. Weiterhin konnte die den Tumor versorgende Blutzufuhr nachhaltig gestört wer-

den. Zum einen können nsPEFs die Blutzufuhr unterbrechen und zum anderen die Bildung

neuer Blutgefäße verhindern [42]. NsPEFs als Krebstherapie haben gegenüber herkömm-

lichen Behandlungen wie Chemotherapie und Bestrahlung unter anderem den Vorteil, dass

durch den schnellen Zelltod die Wahrscheinlichkeit für Resistenzen und Rezidive der Tu-

more verringert wird und die Nebenwirkungen abgeschwächt werden [40, 43].

Ein weiterer, ausführlich beschriebener Effekt von nsPEFs auf Zellen ist die Freisetzung

von Calcium aus intrazellulären Speichern wie dem endoplasmatischen Retikulum auf-

grund der Poration der Organellenmembranen [44-47]. Basierend auf diesem Effekt bieten

nsPEFs eine mögliche medizinische Anwendung im Bereich der Wundheilung zur Stillung

von Blutungen. Dabei werden Thrombozyten mit elektrischen Pulsen behandelt, was zum

Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und dies wiederum zur Aggregation der

Thrombozyten führen kann [48]. Der Vorteil gegenüber bovinem Thrombin, das sonst zur

künstlichen Stimulierung der Thrombozytenaggregation, z.B. während Operationen, ge-

nutzt wird, ist, dass allergische Reaktionen vermieden werden können.

Des Weiteren können nsPEFs den kompletten Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts in-

nerhalb weniger Minuten bewirken, vermutlich indem sie zur Depolymerisierung der Ak-

tin-Filamente führen. Dieser Effekt kann ebenfalls reversibel sein [34].

1 Einleitung

9

Neben diesen direkten Effekten können neben der Induktion der Apoptose auch weitere

intrazelluläre Signalwege in Gang gesetzt werden. Ein Beispiel ist die Aktivierung ver-

schiedener mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAP-Kinasen), die wiederum andere in-

trazelluläre Prozesse nach sich ziehen können. Als Auslöser für die Aktivierung werden

durch die elektrischen Pulse verursachte strukturelle Änderungen in der Plasmamembran

vermutet [49].

Viele der beschriebenen Effekte können einen Einfluss auf die Zell-Zell-Kommunikation

haben, die wichtig für die Aufrechterhaltung der Homöostase in Geweben ist.

1.2 Zell-Zell-Kommunikation über Gap Junctions

Zellen in einem Gewebeverband unterscheiden sich von einzelnen, isolierten Zellen durch

ihre Verbindung zu benachbarten Zellen und ihre Fähigkeit mit diesen zu kommunizieren.

In einem Gewebeverband sind die Zytoplasmen von angrenzenden Zellen über Kanäle, so

genannte Gap Junctions (GJs), miteinander verbunden, die den direkten Austausch ver-

schiedener Ionen und Moleküle durch Diffusion ermöglichen. Die Zell-Zell-Kommunika-

tion (ZZK) reguliert das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung. Zudem ist die ZZK

auch an der Regulation der Apoptose (kontrollierter Zelltod) beteiligt, vermutlich durch die

Verbreitung eines „Todessignals“ in Form von Ca2+-Ionen. Gleichzeitig korreliert die Ex-

pression der GJ-Proteine, unabhängig von der ZZK, invers mit der Apoptose. So wurde

gezeigt, dass die chemisch induzierte Inhibierung der ZZK zu einer dosis-abhängigen He-

runterregulierung der Apoptoserate führte [50, 51].

Während der Apoptose werden Substanzen freigesetzt, die zur Beseitigung der toten Zelle

und zu einer Immunantwort führen. Wird die tote Zelle nicht entfernt, kann es zur Nekrose,

Entzündungsreaktion oder einer Autoimmunantwort kommen. Der kontrollierte Zelltod

und damit verbunden auch die GJ-vermittelte ZZK sind essentiell für die Homöostase mul-

tizellulärer Organismen [52-54]. GJs kommen in fast allen Zelltypen vor. Ausnahmen bil-

den nur wenige terminal differenzierte Zellen, wie z.B. Skelettmuskel- und Blutzellen [55].

1.2.1 Aufbau, Eigenschaften und Funktionen von Gap Junctions

Gap Junctions sind hydrophile, mit Wasser gefüllte Poren mit einem Porendurchmesser

von 1 bis 1,5 nm, die eine direkte Verbindung zwischen angrenzenden Zellen unter Aus-

schluss des extrazellulären Raumes bilden. Dabei überbrücken sie einen Abstand von ca.

2 nm zwischen den benachbarten Plasmamembranen, der ansonsten normalerweise 20 bis

1 Einleitung

10

30 nm beträgt [56]. GJs können einzeln auftreten oder sich zu Plaques mit mehr als 104 Ka-

nälen pro µm2 ansammeln [57]. Jeder Kanal wird aus zwei Halbkanälen, den so genannten

Connexonen, aufgebaut, die sich jeweils in der Plasmamembran zweier benachbarter Zel-

len gegenüberliegen. Jedes Connexon besteht wiederum aus sechs hexagonal angeordneten

Untereinheiten, den Connexinen (Abb. 1.5) [58, 59].

Connexine sind Transmembranproteine mit vier Transmembrandomänen (M1-M4), zwei

extrazellulären (E1, E2) und einer zytoplasmatischen (CL) Schleife und einem zytoplasma-

tischen N- und C-Terminus. Während die Transmembrandomänen und die extrazellulären

Schleifen hochkonservierte Regionen darstellen, können die zytoplasmatischen Anteile

stark variieren. Diese Sequenzvariabilität führt zu unterschiedlichen Molekulargewichten

der Connexine, nach dem die Connexine, zusammen mit der Abkürzung Cx, benannt sind.

So werden beispielsweise Connexine mit einem Molekulargewicht von 43 kDa mit Cx43

bezeichnet [60]. Bislang sind 21 verschiedene Connexintypen im Menschen und 20 in der

Maus bekannt.

Je nach Zell- und Gewebeart werden unterschiedliche Connexine exprimiert. Zudem kön-

nen GJs aus verschiedenen Connexintypen zusammengesetzt sein. Die meisten Zellen ex-

primieren mindestens zwei verschiedene Arten von Connexinen [60, 61].

Abb. 1.5*: Schematischer Aufbau von Gap Junctions. M1-M4: Transmembrandomänen; E1 und

E2: extrazelluläre Schleifen; CL: zytoplasmatische Schleife.

*Quelle: http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=File:Gap_junction5.jpg

1 Einleitung

11

Die unterschiedlichen Connexin-Kombinationen resultieren in einer unterschiedlichen

Leitfähigkeit, Permeabilität und Selektivität der GJs, die dadurch vielfältige Funktionen

innerhalb biologischer Prozesse ermöglichen [62, 63]. Die elektrische Einzelkanalleitfä-

higkeit kann, je nach Zusammensetzung der GJs und dem Phosphorylierungsstatus der

Connexine, zwischen 20 und 300 pS betragen [64-67]. Die Permeabilität der GJs für be-

stimmte Moleküle hängt von der Molekülgröße und ihrer Ladung ab. Aufgrund des Poren-

durchmessers können nur Moleküle mit einer Größe von bis zu 1 kDa den Kanal passieren.

Kationen haben wegen der elektrostatischen Wechselwirkung mit den porenbildenden Pro-

teinen eine höhere Durchlässigkeit als Anionen [68-70].

GJs haben verschiedene Aufgaben. Sie erlauben den Austausch niedermolekularer Meta-

bolite und Signalmoleküle zwischen Zellen in einem Gewebeverband. Dazu gehören Ami-

nosäuren, Zucker, Nukleotide und sekundäre Botenstoffe wie cAMP und Calcium [71-73].

Bereits während den frühen Entwicklungsstadien eines Embryos werden Connexine expri-

miert, die funktionale GJs ausbilden und eine wichtige Rolle für die Entwicklung des Em-

bryos spielen [74-77]. Durch die Zusammensetzung von GJs aus inkompatiblen Connexi-

nen können Kommunikationsbarrieren aufgebaut werden, die die Bildung von getrennten

Kommunikations- und Entwicklungsbereichen ermöglichen [78]. Eine weitere Aufgabe

von GJs ist die Versorgung von Zellen mit Nährstoffen, die nicht über den Blutkreislauf

versorgt werden können, wie z.B. die Zellen der Augenlinse [79] und die Schichten der

Schwann’schen Zelle [80]. Zudem können GJs elektrische Reize in neuronalen sowie nicht

neuronalen Geweben weiterleiten. Beispiele hierfür sind die Erregungsleitung im Herzen

[81], die Kontraktion der Uterusmuskulatur während der Geburt [82, 83] und die Koordi-

nation der Darmperistaltik [84].

1.2.2 Lebenszyklus und Regulation der Gap Junctions

Connexine werden im endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert. Anschließend

durchlaufen sie den Golgi-Apparat, wo sie phosphoryliert1 werden, bevor sie in Vesikeln

zur Plasmamembran transportiert werden. Die Connexine werden typabhängig im ER oder

im trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zu Connexonen zusammengesetzt und in geschlossenem

Zustand zufällig verteilt in die Membran eingebaut, wo sie an bereits existierenden oder

neu geformten GJs akkumulieren. Zum Ausbilden neuer GJs docken zwei Connexone

1 Phosphorylierung = das reversible Anhängen einer Phosphatgruppe an ein Protein: eine der wichtigsten

Regulationsmöglichkeiten von biologischen Prozessen in der Zelle, z.B. durch Konformationsänderungen

des Proteins, so dass es zwei funktionell verschiedene Formen des Proteins gibt (aktiviert oder inaktiviert)

1 Einleitung

12

durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den extrazellulären Schleifen aneinan-

der. Voraussetzung ist die Zelladhäsion, vor allem über Cadherine. In der Plasmamembran

werden die Connexine weiter phosphoryliert [85].

GJs haben je nach Zell- und Connexintyp eine relativ kurze Halbwertszeit, die Turnover-

Rate für Cx43 beträgt ca. 1-3 h [86, 87]. Zum Abbau von GJs werden diese zunächst als

annuläre GJs internalisiert, die es erlauben, mehrere hundert Kanäle auf einmal aus der

Plasmamembran zu entfernen. Anschließend werden die GJs über Lysosome, und wahr-

scheinlich auch Ubiquitin-abhängig über Proteasome, abgebaut [85].

Zellen können den Austausch von Molekülen über verschiedene Mechanismen regulieren.

Dazu gehören der Kanaltyp und die damit verbundene Selektivität, aber auch die Anzahl

der GJs in der Plasmamembran und deren funktionaler Zustand. Das Öffnen und Schließen

der GJs wird durch eine Konformationsänderung der Kanalproteine reguliert, wodurch

mehrere Öffnungsgrade möglich sind. Posttranslationale Modifikationen der Connexine,

insbesondere Phosphorylierungen, haben sowohl beim Auf- und Abbau als auch beim Öff-

nen und Schließen der GJs eine regulierende Funktion. Connexine haben zahlreiche Phos-

phorylierungsstellen, die sich vor allem am C-Terminus befinden und durch verschiedene

Stimuli wie Proteinkinasen oder Phosphatasen modifiziert werden können [88-90].

Die Menge der Connexone und somit auch der GJs in der Zellmembran hängt von der Con-

nexinexpression und dem korrekten Transport zur Membran ab. Weiterhin müssen die Con-

nexone richtig in die Membran eingebaut und zu GJs zusammengelagert werden. Abgese-

hen von der Expression werden diese Prozesse über Phosphorylierungen reguliert [90-92].

Zudem wird für den Auf- und Abbau von GJs ein intaktes Zytoskelett benötigt. Dabei wird

die ZZK zum einen direkt durch Interaktionen der GJs mit zytoskelettalen Elementen be-

einflusst und zum anderen indirekt durch Transportmechanismen der GJs entlang des Zy-

toskeletts zur Plasmamembran [93, 94]. Auch an der Lokalisierung von Connexin ist das

Zytoskelett beteiligt. Es wird vermutet, dass das Tight Junction Protein ZO-1 (Zonula Oc-

cludens) Connexin mit Aktin verbindet und zudem am Turnover der GJs beteiligt sein

könnte. Eine funktionelle Beteiligung von ZO-1 an der Bildung von GJs scheint allerdings

eher unwahrscheinlich [95-98].

Ob die Phosphorylierung der Connexine zu einer verminderten oder erhöhten ZZK führt,

hängt vom Zelltyp und der Phosphorylierungsstelle ab. Welche Phosphorylierungsstelle

modifiziert wird ist wiederum von den verantwortlichen Modulatoren abhängig (Abb. 1.6).

Dabei kann eine Phosphorylierungsstelle auch von mehreren Kinasen phosphoryliert wer-

den. Häufig werden MAP-Kinasen aktiviert, die zur Phosphorylierung von Cx43 und zur

1 Einleitung

13

Inhibierung der ZZK führen. Außerdem hängen sowohl der Phosphorylierungsstatus der

Connexine als auch die ZZK stark vom Zellzyklus ab. Die Phosphorylierung nimmt wäh-

rend der S- und M-Phase im Vergleich zur G0/G1-Phase zu, während die ZZK in der M-

Phase drastisch vermindert ist und sich während der G1-Phase allmählich erholt [99].

Abb. 1.6*: Cx43 wird im endoplasmatischen Retikulum (ER) gebildet und im trans-Golgi-Netz-

werk (TGN; Golgi) zu Connexonen zusammengesetzt. Die Halbkanäle werden in Vesikeln zur

Plasmamembran transportiert und dort zufällig verteilt eingebaut. Im Normalfall können Zellen

nach der Ausbildung von GJs miteinander kommunizieren (Doppelpfeile), während Halbkanäle

normalerweise geschlossen sind (abgeknickter Pfeil). Verschiedene Proteinkinasen können die

ZZK stimulieren (grün) oder inhibieren (rot). Proteinkinase A (PKA) stimuliert den Transport der

Connexine zur Membran und Caseinkinase 1 (CK1) fördert ihren Zusammenbau zu GJs. Protein-

kinase C (PKC) wirkt dem Aufbau der GJs entgegen und führt zum Verschließen der Kanäle, wie

auch die Tyrosinkinase SRC und MAP-Kinasen. *nach [88]

Der Öffnungszustand der GJs wird auch über andere Faktoren, unabhängig von der Phos-

phorylierung, reguliert. Sowohl ein Absinken des intrazellulären pH-Wertes als auch ein

Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration bewirken eine Verringerung der Kanal-

Leitfähigkeit [100]. Auch das Membranpotential kann einen Einfluss auf den Öffnungszu-

stand haben. Mit steigender transjunktionaler Spannung, gleich, welcher Polarität, oder mit

fallender Transmembranspannung sinkt die Leitfähigkeit. Weitere Modulatoren sind der

Glukosespiegel, Onkogene, Tumorpromotoren und Wachstumsfaktoren [85, 101-103].

1.2.3 Zell-Zell Kommunikation, Connexine und Krankheiten

Die ZZK ist wichtig für die Regulation von Wachstum, Differenzierung und Entwicklung

von Zellen. Bereits im 8-Zellen-Stadium in der Embryogenese bilden sich bei Vertebraten

1 Einleitung

14

GJs aus und steuern die meiotische Reifung [101]. Treten Mutationen in den Connexin-

Genen auf, kann dies eine Vielzahl von Erkrankungen zur Folge haben. Cx32-Mutationen

werden mit der X-gebundenen Form der erblichen Charcot-Marie-Tooth-Krankheit in Ver-

bindung gebracht [104]. Dabei kommt es zur progressiven Muskelatrophie, verursacht

durch die Degeneration der Myelinscheiden und der Schädigung der peripheren Nerven.

Folglich wird die saltatorische Erregungsleitung gestört, was zur Schwächung und schließ-

lich zum Abbau der Muskulatur führt.

Mutationen können an verschiedenen Stellen in Genen auftreten. So können Mutationen an

einem Connexin sowohl zum Hörverlust als auch zu Hauterkrankungen führen. Connexine

spielen eine wichtige Rolle bei der akustischen Signaltransduktion im Innenohr, indem sie

über die Regulierung von Ionenkanälen das Membranpotential aufrechterhalten. Eine re-

zessive Mutation im Cx26-Gen, einem in der Cochlea weit verbreiteten Connexin, führt

zum nicht-syndromalen Hörverlust, ebenso wie Mutationen von Cx30 und Cx31. Dieselben

Connexine werden auch mit Hauterkrankungen assoziiert. Eine dominante Mutation in

Cx26 kann zur epidermalen Verhornungsstörung führen, bei der die Haut an Handtellern

und Fußsohlen verdickt ist. Mutationen in den Genen von Cx30 und Cx31 können unab-

hängig voneinander die Hautkrankheit Erythrokeratoderma variabilis auslösen, bei der es

zur Bildung von transienten roten Flecken und einer Hyperkeratose kommt. Während

Cx26-assoziierte Hauterkrankungen mit Hörstörungen einhergehen, ist dies bei Cx31-Mu-

tationen nicht zwingend der Fall [105-108].

Mutationen im Cx46-Gen können zu einem angeborenen Katarakt führen, genauso wie eine

Cx50-Mutation, bei der es zusätzlich zu einer Inhibierung des Augenwachstums kommt

[105, 107].

Neben genetisch bedingten Erkrankungen spielt die ZZK auch eine wichtige Rolle bei der

Krebsentstehung, vor allem in der Promotionsphase. Die meisten initiierten Zellen können

weder untereinander, noch mit den gesunden Zellen in ihrer Umgebung kommunizieren,

da sie nur unzureichend Connexine exprimieren oder nicht in der Lage sind diese richtig

zu funktionsfähigen GJs in die Plasmamembran einzubauen. Dadurch entziehen sich die

Tumorzellen der Kontrolle ihrer gesunden Nachbarzellen, da keine Signale, z.B. zur

Wachstumskontrolle, mehr übermittelt werden können. Die Folgen sind eine klonale Ex-

pansion der initiierten Zellen, die Entstehung zusätzlicher Mutationen und schließlich ihre

komplette neoplastische Transformation. Krebszellen können die Fähigkeit zur ZZK wie-

dererlangen, z.B. durch die Transfektion mit Connexinen oder die Behandlung mit

chemopräventiven Wirkstoffen, wie Carotenoiden oder Retinoiden. In der Folge verringert

1 Einleitung

15

sich auch das unkontrollierte Zellwachstum und die Fähigkeit verankerungsunabhängig zu

wachsen [109-113].

Die direkte Kommunikation über GJs ist darüber hinaus auch entscheidend für eine kor-

rekte Wundheilung. Sie reguliert das Gleichgewicht von Zytokinen, Chemokinen und

Wachstumsfaktoren in den Zellen und somit wichtige Funktionen wie Migration, Prolife-

ration und Matrixsynthese. In akuten Wunden wird die Expression von Cx43 innerhalb von

5 h herunterreguliert und Cx43 ist weder in der Wunde noch am Wundrand nachweisbar.

Auch Cx26 und Cx30 sind in dieser Phase nur schwach in der näheren Umgebung der

Wunde exprimiert. Nach 24 - 48 h sind Cx26 und Cx30, im Gegensatz zu Cx43, an den

Wundrändern nachweisbar. Nach 5 - 6 Tagen, wenn sich die Epidermis vollständig rege-

neriert hat, kann Cx26 und Cx30 in allen Hautschichten gefunden werden, während die

Cx43-Expression immer noch unterhalb des Kontrollniveaus liegt. Im Vergleich hierzu ist

die Connexin-Expression in chronischen Wunden, wie z.B. diabetischen Ulcera, stark ver-

ändert. Cx26 und Cx30 sind sowohl in der Wunde als auch an den Wundrändern nachweis-

bar. Die Expression von Cx43 ist signifikant erhöht. Die Isolation der verletzten Zellen von

der gesunden Umgebung scheint also ein entscheidender Schritt in der Wundheilung zu

sein [114-117].

1.3 Zusammenhang von Zellelastizität, Malignität und Invasivität

Ein intaktes Zytoskelett ist nicht nur für die ZZK essentiell, wobei es für den Aufbau von

GJs benötigt wird, sondern bestimmt auch maßgeblich die Elastizität einer Zelle. Das Zy-

toskelett ist eine komplexe Proteinstruktur, bestehend aus Aktin, Mikrotubuli und Interme-

diärfilamenten, die maßgeblich die mechanischen Eigenschaften von Zellen bestimmt und

ihnen ihre mechanische Festigkeit verleiht [18]. Zudem ist es an der Regulation der Zell-

proliferation und Differenzierung beteiligt, indem wachstumsbezogene Signale über das

Zytoskelett zum Kern weitergeleitet werden [118]. In kernhaltigen Zellen bildet das Aktin

eine Art Stützkorsett in Form eines ca. 0,5 µm dicken Kortex, der die Zelle stabilisiert.

Dieser ist intrazellulär über Kopplungsproteine an Rezeptoren in der Plasmamembran ge-

bunden, was den Zellen eine hohe Scherfestigkeit verleiht [119]. Unter dem Aktinkortex,

im Zytoplasma, existiert ein wesentlich weicherer Teil, der vor allem Intermediärfilamente

enthält. Dieser stabilisiert die intrazellulären Kompartimente, hat jedoch keinen signifikan-

ten Einfluss auf die Steifigkeit des Kortex [120].

1 Einleitung

16

Während der Entwicklung von Krebs durchlaufen die Zellen verschiedene Phasen, in denen

sich auch ihre Steifigkeit, die mithilfe des Elastizitätsmoduls (Youngscher Modul) be-

schrieben werden kann, ändert. Über ihre mechanischen Eigenschaften lassen sich somit

Krebszellen von gesunden Zellen unterscheiden. Zahlreiche Publikationen beschreiben,

dass Tumorzellen generell weicher als ihr nicht-tumorigener Gegenpart sind, was vor allem

an einer Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts liegt [118, 121-124]. Vermutlich wird

die Umstrukturierung des Zytoskeletts durch Onkogene induziert, die Bestandteile der Ad-

häsionsplaques phosphorylieren bzw. zur Produktion bestimmter Proteine (z.B. pp60) füh-

ren können, die für die Strukturänderungen verantwortlich sind [118, 122]. So konnte ge-

zeigt werden, dass der Elastizitätsmodul von kanzerogenen humanen Zellen der Blase im

Vergleich zu dem von nicht-kanzerogenen Blasenzellen um etwa eine Größenordnung

niedriger war [121]. Metastasierende Zellen aus Patientenproben von Lunge, Brust und

Pankreas waren über 70 % weicher als gesunde Zellen aus den gleichen Organen, wobei

die Standardabweichung bei den Krebszellen über 5-mal enger ist [125]. Ein sehr ähnliches

Ergebnis lieferten Untersuchungen an Patienten-Effusionszellen. Die metastasierenden

Zellen waren über 80 % weicher als die gesunden Zellen, mit einer mehr als 6-mal engeren

Verteilung der Elastizitätsmoduln [126].

Neben der Unterscheidung zwischen malignen und gesunden Zellen können anhand der

Zellelastizität auch Rückschlüsse auf das Metastasierungspotential von Tumorzellen ge-

schlossen werden. Deshalb wird die Bestimmung der Zellelastizität als neues Diagnose-

werkzeug zur medizinischen Prognose bei Krebsleiden untersucht. Um Metastasieren zu

können, müssen sich einzelne Zellen aus dem Gewebeverband lösen und fortbewegen kön-

nen. Ihre Motilität beruht hauptsächlich auf der Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts

[127, 128]. Am Beispiel von verschiedenen humanen Ovarialzelllinien mit unterschiedli-

chem Metastasierungspotential konnte nachgewiesen werden, dass die Krebszellen mit

dem höchsten Migrations- und Invasionspotential 5-mal weicher waren als die Zellen mit

dem niedrigsten Potential [129].

NsPEFs können den Elastizitätsmodul von Zellen senken. Es stellt sich daher die Frage, ob

somit auch weitere mit dem Aktinskelett verbundene Charakteristika durch nsPEFs beein-

flusst werden. Insbesondere, ob die so behandelten Zellen ein höheres Migrations- und In-

vasionspotential aufweisen.

1 Einleitung

17

1.4 Zielstellung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von nsPEFs auf Zellen in einem Monolayer

untersucht. Bisher sind die grundlegenden Auswirkungen von nsPEFs auf Zellen in einem

Gewebeverband nur wenig erforscht. Die meisten Studien fokussierten sich auf die Unter-

suchung fundamentaler Mechanismen an einzelnen Zellen oder die Durchführung von Ver-

suchen an Tieren, um die Wirksamkeit von Behandlungen zu testen. Zu verstehen, wie

Zellen in einem Verbund auf nsPEFs reagieren, und ein besseres Verständnis der den Ef-

fekten zugrundeliegenden Mechanismen, sind jedoch eine wichtige Voraussetzung für die

Entwicklung neuer biomedizinischer Anwendungen von elektrischen Pulsen.

Es sind viele Effekte von nsPEFs auf einzelne Zellen bekannt, die auch die ZZK beeinflus-

sen können, wie z.B. die Änderung des Membranpotentials, die Freisetzung von intrazel-

lulärem Ca2+ und die Aktivierung von MAP-Kinasen. Deshalb liegt die Vermutung nahe,

dass nsPEFs auch einen Einfluss auf die ZZK haben können. Den Einfluss von nsPEFs auf

die Kommunikation zwischen Zellen in einem Gewebe zu verstehen, könnte dazu beitra-

gen, die Behandlung von Krankheiten, die auf einer gestörten ZZK basieren, zu verbessern.

Somit lag der Fokus der vorliegenden Arbeit auf der Untersuchung der ZZK von tumori-

genen und nicht-tumorigenen Zellen und der Aufklärung der dem Effekt zugrundeliegen-

den Mechanismen.

Im Gegensatz zu den meisten anderen Studien zu Effekten von elektrischen Pulsen auf

Zellen wurden die Versuche für die vorliegende Arbeit an Monolayern durchgeführt. Dabei

sind die Zellen, ähnlich wie in einem Gewebe, miteinander verbunden und kommunizieren.

Als Zelllinie wurden nicht-tumorigene Rattenleberepithelzellen (WB-F344) gewählt, die

dafür bekannt sind, anders als die meisten anderen Zelllinien, auch in vitro über Gap Junc-

tions zu kommunizieren. Zudem stehen Tumorzellen (WB-ras) vom selben Ursprung wie

die normalen Rattenleberepithelzellen zur Verfügung, die die Ergebnisse direkt miteinan-

der vergleichbar machen.

In dieser Studie, in der zum ersten Mal die Effekte von nsPEFs auf die ZZK untersucht

wurden, konnte eine Inhibierung der ZZK nachgewiesen werden. Dabei kommen mehrere

mögliche Mechanismen in Frage, deren Zusammenhänge in Abb. 1.7 dargestellt sind und

aus denen sich die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente ergeben.

1 Einleitung

18

Abb. 1.7 Schematische Übersicht über die möglichen Wirkmechanismen von nsPEFs auf die ZZK

und über die Zusammenhänge von ZZK, Zellelastizität und verschiedenen Krankheiten.

1 Einleitung

19

Die Kommunikation über GJs wurde mittels Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assay analy-

siert. Aufgrund des zeitlichen Verlaufs der Inhibierung der ZZK konnten daraufhin sowohl

die Depolarisation der Plasmamembran als auch die Freisetzung von Calcium aus intrazel-

lulären Speichern als mögliche Ursachen weitestgehend ausgeschlossen werden.

Die Verteilung von Cx43 in der Zelle wurde mit Hilfe von Immunfluoreszenz sichtbar ge-

macht, um zu überprüfen, ob GJs aus der Membran abgebaut worden sind oder sich die

Kanäle nur geschlossen hatten. Anschließend wurde eine Proteinanalyse mittels Western

Blot durchgeführt, die Aufschluss darüber geben sollte, ob MAP-Kinasen aktiviert oder

Cx43 hyperphosphoryliert wurde, da beides zur Internalisierung von GJs führen kann. Zu-

dem können MAP-Kinasen auch die Genexpression beeinflussen, weshalb zusätzlich mit-

tels qPCR der mRNA-Level von Cx43 ermittelt wurde.

MAP-Kinasen können unter anderem durch strukturelle Änderungen der Plasmamembran

aktiviert werden. Diese strukturellen Änderungen können wiederum durch eine Umstruk-

turierung des Zytoskeletts hervorgerufen werden. Zudem verbindet das Tight Junction Pro-

tein ZO-1, das auch für den engen Zusammenhalt von Zellen in einem Verband mitverant-

wortlich ist, Connexin mit Aktin. Deshalb wurden sowohl F-Aktin als auch ZO-1 mittels

Immunfluoreszenz angefärbt, um mögliche Änderungen erkennen zu können.

Neben der Aktivierung von MAP-Kinasen kann sich ein nicht intaktes Zytoskelett auch

direkt auf die ZZK auswirken, da Aktin essentiell am Auf- und Abbau von GJs beteiligt ist.

Zusätzlich ist das Zytoskelett, vor allem das Aktin, auch für die mechanischen Eigenschaf-

ten von Zellen verantwortlich. Die Umstrukturierung oder der Zusammenbruch des Zyto-

skeletts können somit zu einer Erniedrigung der Zellelastizität führen. Die mechanische

Stabilität von Zellen ist insgesamt ein wichtiger Parameter bei der Krebsentstehung und

der Metastasenbildung. Deshalb wurde die Elastizität der Zellen mittels Rasterkraftmikro-

skopie untersucht. Da die Messungen zeigten, dass die Zellen nach der Behandlung mit

nsPEFs weicher wurden, könnte man vermuten, dass das Applizieren von elektrischen Pul-

sen in normalen Zellen tumorigene Eigenschaften, wie die Fähigkeit zum verankerungsun-

abhängigen Wachstum, hervorrufen oder zur Bildung von Metastasen führen könnte. Diese

möglichen Auswirkungen wurden in vitro mittels Soft Agar Colony Formation Assay und

Scratch Assay untersucht.

20

2 Material und Methoden

2.1 Zellkultur

Für die vorliegende Arbeit wurden die Stammzell-ähnlichen Rattenleberepithelzellen

WB-F344 verwendet [130]. Diese stammen phänotypisch von der normalen Leber einer

erwachsenen Fischer-Ratte ab. Sie zeichnen sich durch eine hohe Expression von Cx43 aus

und haben, im Gegensatz zu den meisten anderen Zelllinien, die Eigenschaft auch in vitro

über GJs zu kommunizieren [131-134].

Die WB-F344 Zellen wurden in Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM, 1 g/l Glu-

kose), ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin,

0,1 mg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin, bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Alle

drei bis vier Tage wurden die Zellen passagiert. Zum Ablösen vom Substrat wurden die

Zellen zunächst für 5 min mit PBS/EDTA (5 mM EDTA in PBS) und anschließend für

7 min mit 0,25 %-igem Trypsin inkubiert. Die Zellzählung erfolgte mithilfe einer Trypan-

blau-Färbung (0,2 %, Hofmann-La Roche AG, Basel, CH) unter Verwendung einer Neu-

bauer-Zählkammer.

Weiterhin wurden auch Krebszellen untersucht, um festzustellen, ob diese anders reagieren

als die normalen Zellen. Dazu wurde die Zelllinie WB-ras verwendet. Hierbei handelt es

sich um dieselbe Zelllinie wie die normalen Zellen, die jedoch mit dem Proto-Onkogen ras

transformiert wurden. Damit haben beide Zelllinien denselben Ursprung und die Versuchs-

ergebnisse können direkt miteinander verglichen werden. Die Tumorzellen wurden in so-

genanntem CCD-Medium kultiviert. Das CCD-Medium bezieht sich auf modifiziertes Ea-

gle´s Minimum Essential Medium (MEM), das unter dem Namen „D-Medium“ von C. C.

Chang an der Michigan State University entwickelt und verwendet wurde [135]. Vergli-

chen mit Eagle´s MEM enthält das CCD-Medium Earl´s balanced salt solution, allerdings

mit 1 g/l Natriumhydrogencarbonat und 7,635 g/l Natriumchlorid, 1,5-fach erhöhter Kon-

zentration aller Vitamine und essentieller Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 0,2 mM aller

nicht-essentieller Aminosäuren und 1 mM Natriumpyruvat. Schließlich wurden dem Me-

dium ebenfalls 5 % FCS, 0,1 mg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin zugefügt. Das

Passagieren der Zellen erfolgte genau wie bei den WB-F344 Zellen.

Zur Weiterkultivierung wurden für beide Zelllinien jeweils 1,5 x 106 Zellen in 75 cm2 Zell-

kulturflaschen ausgesät. Für die Behandlung mit nsPEFs wurden die Zellen mit einer

2 Material & Methoden

21

Dichte von 40.000 Zellen pro cm2 Substratfläche in 12-Well Platten oder 35 mm-Petrischa-

len ausgesät und für ca. 48 h bis zur Ausbildung einer konfluenten Zellschicht (Monolayer)

inkubiert.

Sowohl die WB-F344 als auch die WB-ras Zellen wurden von Dr. Pavel Babica (Masaryk

University, Brno, Tschechische Republik) zur Verfügung gestellt, mit Genehmigung von

Dr. James E. Trosko (East Lansing, MI, USA).

2.2 Erzeugung von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern

Zum Erzeugen der Nanosekunden gepulsten elektrischen Felder wird ein Pulsgenerator,

basierend auf dem Prinzip einer Blumlein Wellenleiterschaltung [136], verwendet (Abb.

2.1).

Abb. 2.1 Schematischer Aufbau eines Blumlein-Pulsgenerators. Beim Schließen des Schalters S

wird ein Rechteckpuls erzeugt. Die Pulsdauer wird durch die Kabellänge l und die Feldstärke über

der Probe durch die angelegte Spannung V0 und den Abstand der Elektroden festgelegt. *aus [38]

Dieser besteht im Wesentlichen aus zwei gleich langen Koaxialkabeln, durch deren Länge

die Pulsdauer bestimmt wird [17]. Der Zusammenhang zwischen Pulsdauer t und Kabel-

länge l für die Wellenleitung in einem Koaxialkabel, in dem ein Dielektrikum mit der rela-

tiven Permittivität εr verwendet wird, kann durch folgende Gleichung beschrieben werden:

𝑡 =𝑙 ∙ √𝜀𝑟

𝑐

(2.1)

mit der Vakuumlichtgeschwindigkeit c. Das Kabel wird über eine angeschlossene Span-

nungsquelle aufgeladen, die durch einen hochohmigen Ladewiderstand Rcharge getrennt ist.

Beim Schließen des Schalters S wird der Wellenleiter an einem Ende kurzgeschlossen,

während das andere Ende offen bleibt. Die im Kabel hin- und herlaufenden Wellen überla-

gern sich an der angeschlossenen Last zu einem idealerweise unipolaren Rechteckpuls.


22

Real wird die Anstiegszeit des Pulses dadurch bestimmt, wie schnell der Schalter geschlos-

sen werden kann. Stimmt der Widerstand der Probe Rload mit der Impedanz der Blumlein-

Konfiguration 2Z0 überein, entspricht die Amplitude des Pulses der Amplitude der ange-

legten Spannung V0.

2.3 Behandlung von Zellen mit nsPEFs

Der Versuchsaufbau besteht neben dem Blumlein-Pulsgenerator aus einer Spannungsquelle

(FX20R15, Glassman, High Bridge, NJ), einem Oszilloskop (TDS3054, Tektronix,

Beaverton, OR) und einem Hochspannungstastkopf (P5100A, Tektronix, Beaverton, OR)

(Abb. 2.2). Für die Versuche wurde eine Pulslänge von 100 ns gewählt. Pulse mit dieser

Länge rufen vorwiegend intrazelluläre Effekte hervor und wirken sich kaum auf die äußere

Zellmembran aus. Zudem wurden 100 ns-Pulse bereits in zahlreichen Studien angewendet

[38, 41, 43, 137, 138]. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung subletaler

Effekte, weshalb eine Pulszahl von 20 oder 100 Pulsen mit eher moderaten Feldstärken

zwischen 5 und 35 kV/cm (in 5 kV/cm Schritten) gewählt wurde. Die Monolayer wurden

in Vollmedium und ohne gesonderten Mediumswechsel vor dem Applizieren der Pulse be-

handelt.

Abb. 2.2 Versuchsaufbau mit dem selbstgebauten Blumlein-Pulsgenerator zur Behandlung der

Zell-Monolayer mit gepulsten elektrischen Feldern.


23

Die Elektroden bestanden aus zwei parallelen, rostfreien Stahldrähten mit einem Durch-

messer von 0,8 mm, die in einem Abstand von 5 mm, jeweils von der Mitte der Drähte aus

gemessen, angeordnet waren. Die Elektroden wurden so in einen Plastikzylinder, der genau

in ein einzelnes Well einer 12-Well Platte passte, eingebettet, dass etwa 40 % ihres Durch-

messers (ca. 0,3 mm) über die Auflagefläche überstand. Dadurch wurden die Elektroden

zur Behandlung der Zellen leicht in die Zellen eingedrückt, so dass sich das elektrische

Feld im und über dem Monolayer ausbreiten konnte.

2.4 Bestimmung der Zellvitalität

Um den Parameterbereich zu bestimmen, den die meisten Zellen überleben, wurden die

Zellen nach der Behandlung mit nsPEFs auf ihre Vitalität untersucht. Dazu wurde ein

MTT-Test durchgeführt, bei dem der wasserlösliche Farbstoff 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-

yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) durch NADH und NADPH in ein violettes, was-

serunlösliches Formazan reduziert wird, das mittels eines Spektrophotometers detektiert

werden kann. Die Menge des umgesetzten Farbstoffs entspricht der Glykolyserate der Zel-

len und ist somit ein Maß für ihre Vitalität.

Innerhalb von 10 min nach der Behandlung der Zell-Monolayer mit nsPEFs wurde das

Medium über den Zellen gegen 500 µl frisches Medium mit 50 µl MTT-Lösung (5 mg/ml

MTT in PBS; AppliChem, Darmstadt) ausgetauscht und die Zellen für 2 Std. bei 37 °C

inkubiert. Dann wurde die MTT-Lösung entfernt und die Zellen einmal mit HBSS gewa-

schen. Anschließend wurden die Zellen in einer Zelllyse-Lösung (99,4 ml Dimethylsul-

foxid (DMSO), 0,6 ml Essigsäure (100 %), 10 g Sodiumdodecylsulfat (SDS)) aufgelöst.

Nach einer 5-minütigen Inkubation und weiteren 5 min auf einem Schüttler wurde die Zell-

Lösung bei 550 nm mit einer Referenz-Wellenlänge von 700 nm mit einem Photometer

(Infinite M200 PRO, Tecan, Männedorf, Schweiz) vermessen.

Für die Auswertung wurden die Absorptionswerte der behandelten Flächen ins Verhältnis

zu denen der unbehandelten gesetzt. Dazu wurden die Werte von Wells mit ausschließlich

unbehandelten Zellen als Kontrolle genutzt und unter der Annahme, dass alle Zellen vital

waren, auf 100 % gesetzt. Die Fläche zwischen den Elektroden, d.h. die behandelte Fläche,

betrug 23,5 % vom gesamten Well, die restliche Fläche dementsprechend 76,5 %. So

konnte mit folgender Gleichung aus den Absorptionswerten der behandelten Wells ein Ab-

sorptionswert x nur für die behandelten Zellen berechnet werden:


24

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑝𝑡𝑖𝑜𝑛 (𝑏𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑒𝑙𝑡𝑒𝑠 𝑊𝑒𝑙𝑙) = 0,765 ∙ 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑝𝑡𝑖𝑜𝑛 (𝐾𝑡𝑟𝑙) + 0,235 ∙ 𝑥 (2.2)

Insgesamt wurden 4 unabhängige Experimente durchgeführt, wobei die Werte für jedes

Experiment wiederum in Triplets bestimmt wurden. Für die Auswertung wurden aus den

Triplets Mittelwerte gebildet und mit diesen Mittelwerten wurde der Standardfehler be-

stimmt.

2.5 Nachweis von Elektroporation

Die mögliche Elektroporation der Zellmembran ist bei ausreichender Feldstärke und Puls-

dauer ein charakteristisches Merkmal der Anwendung elektrischer Felder auf Zellen. Die

Bildung von Poren in der Zellmembran wurde über die Aufnahme von Propidiumiodid (PI)

getestet. PI ist ein DNA-interkalierender Farbstoff mit einem Molekulargewicht von 668,4

Da, der für gesunde Zellen nicht membrangängig ist. Ist die Zellmembran jedoch beschä-

digt, wie z.B. bei toten oder elektroporierten Zellen, dringt PI in die Zelle ein und bindet

dort an die DNA. Sobald PI gebunden hat, erhöht sich dessen Fluoreszenz um das 20- bis

30-fache und kann unter dem Mikroskop (Axio Observer D1, Carl Zeiss, Berlin) detektiert

werden.

Zum Nachweis der Elektroporation wurde das Medium auf den Zellen vor und 5, 10 und

15 min nach der Behandlung mit nsPEF gegen mit 1 mM PI versetztem Medium ausge-

tauscht und die Zellen für 10 min inkubiert. Anschließend wurde die Fluoreszenz unter dem

Mikroskop betrachtet und mit einer unbehandelten Kontrolle verglichen.

2.6 Nachweis der Zell-Zell-Kommunikation mittels Fluoreszenzfarbstoff

Transfer-Assay

Um ZZK im Monolayer sichtbar zu machen, wurde ein Fluoreszenzfarbstoff-Transfer As-

say durchgeführt (Abb. 2.3) [139]. Nach der Behandlung mit nsPEFs wurden die Zellen

unterschiedlich lange inkubiert (Abb. 2.3 (1)), bevor das Medium entfernt und durch einen

Farbstoff-Mix, bestehend aus 0,05 % Lucifer Yellow (LY) (L0259, Sigma-Aldrich, Tauf-

kirchen) und 0,1 % Dextran-konjugiertem Texas Red (TR) (D-1828, Invitrogen, Darm-

stadt) in PBS, ersetzt wurde. Mittels einer Rasierklinge wurde ein feiner Schnitt („Kratzer“)

in den Monolayer gesetzt und die Zellen anschließend für 3 min inkubiert (Abb. 2.3 (2)).

In dieser Zeit nehmen die verletzten Zellen entlang des Kratzers den Farbstoff-Mix auf.


25

Sind die Zellen über funktionierende und geöffnete GJs miteinander verbunden, kann das

niedermolekulare LY (457,25 Da) von den beschädigten Zellen in angrenzende Zellen dif-

fundieren, während das an Dextran (10.000 Da) gekoppelte TR nicht GJ-permeabel ist und

in der verletzten Zelle verbleibt (Abb. 2.3 (3)). Nach der Inkubationszeit wurde der Mo-

nolayer 3-mal mit DPBS (Dulbecco‘s Phosphate Buffered Salt Solution with Ca and Mg,

Pan Biotech, Aidenbach) gewaschen, anschließend mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in

PBS fixiert und unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Axio Observer D1, Carl Zeiss, Ber-

lin) fotografiert.

Abb. 2.3 Schematische Darstellung des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assays: Nach der Behand-

lung der Zellen mit nsPEFs (1) wird das Medium gegen eine Fluoreszenzfarbstoff-Mischung, be-

stehend aus dem GJ-permeablen Lucifer Yellow und dem GJ-impermeablen Texas Red, ausge-

tauscht und ein Kratzer in den Monolayer gemacht (2). Die verletzten Zellen entlang des Schnittes

nehmen den Farbstoff auf, der dann über funktionsfähige GJs in benachbarte Zellen diffundieren

kann (3).

Pro Well wurden 3-5 Bilder aufgenommen und beide Fluoreszenzkanäle getrennt mittels

MatLab (The MathWorks, Natick, MA) ausgewertet. Die Aufnahmen wurden zunächst in

Schwarz/Weiß Bilder konvertiert und anschließend der fluoreszierende Anteil in Prozent

für jede Aufnahme ermittelt. Die Fluoreszenz des TR-Kanals ergab einen Mittelwert von

5 % und entspricht der Zahl der Zellen im Beobachtungsfeld, die durch den Kratzer verletzt

wurden und dadurch den Farbstoff-Mix aufgenommen haben. Dieser Basiswert wurde von

dem Fluoreszenzsignal des LY-Kanals abgezogen, um nur den Anteil der über GJs kom-

munizierenden Zellen zu bestimmen.

2.7 Nachweis von Cx43, F-Aktin und ZO-1 mittels Immunfluoreszenz

Die Cx43-Verteilung in den Zellen sowie das Aktin-Zytoskelett wurden mittels Immunflu-

oreszenz sichtbar gemacht. Dazu wurde in jedes Well einer 12-Well Platte ein Deckglas


26

gelegt und Zellen darauf ausgesät. Nachdem sich ein konfluenter Monolayer gebildet hatte,

wurden die Zellen mit nsPEFs behandelt. Nach festgelegten Inkubationszeiten wurden die

Zellen auf den Deckgläsern einmal mit PBS gewaschen, danach für 15 min mit 4 % PFA

fixiert und anschließend für 20 min mit 0,25 % Triton-X-100 in PBS permeabilisiert. Nach

zweimaligem Waschen mit deionisiertem Wasser wurden die Zellen mit dem Cx43-Pri-

märantikörper (Cell Signaling #3512, Frankfurt am Main, 1:75 in 1 % BSA/PBS) und

FITC-Phalloidin (Fluorescein Isothiocyanate Labeled Phalloidin, Sigma-Aldrich, Taufkir-

chen, 1:200, Färbung von F-Aktin) bei 4 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden

die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, bevor sie mit dem Sekundärantikörper anti-rabbit

Alexa Fluor 546 (A-11035, Life Technologies, Darmstadt, 1:1000) und Hoechst 33342

(1:500) in PBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Anschließend wurden die

Zellen noch zweimal mit PBS gewaschen und die Deckgläser danach mit Fluoromount

(Sigma Aldrich, Traunstein) auf Objektträger eingebettet. Bis zur Untersuchung der Zellen

mit einem konfokalen Mikroskop (TCS SP5, Leica, Wetzlar) wurden die Proben bei 4 °C

gelagert.

Auf die gleiche Weise wie das Cx43 wurde auch das Tight Junction Protein ZO-1 detektiert

(rabbit-anti-ZO-1, QA213066, Life Technologies, Darmstadt, 1:100 in 1 % BSA/PBS),

allerdings ohne die gleichzeitige Färbung von F-Aktin und unter Verwendung eines nor-

malen Fluoreszenz-Mikroskops (Axio Observer D1, Carl Zeiss, Berlin).

2.8 Analyse der Genexpression

Für die Analyse der Genexpression von Cx43 wurden Zellen in 12-Well Platten ausgesät

und nach Erreichen eines konfluenten Monolayers jeweils 12 Wells mit dem gleichen Pa-

rametersatz behandelt. Nach festgelegten Inkubationszeiten wurden nur die Zellen aus dem

Bereich zwischen den Elektroden abgeschabt und in eisgekühltem PBS aufgenommen, an-

schließend für 8 min bei 12.000 rpm und 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und

das Pellet bis zur Weiterverwendung bei -20 °C eingefroren.

2.8.1 Isolierung der RNA

Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde der RNA MiniKit (Bio&Sell, Feucht) verwendet.

Die Isolierung wurde entsprechend der Herstellervorschrift durchgeführt und die RNA-

Konzentration mittels eines Spektralphotometers (NanoDrop 2000/2000C, Thermo Scien-

tific Inc., Waltham (MA), USA) bestimmt.


27

2.8.2 Transkription der cDNA

Nach der Isolierung der RNA und Bestimmung der RNA-Konzentration wurde 1 µg RNA

unter Verwendung des Transcriptor First Strand Synthesis Kit (Hofmann-La Roche AG,

Basel, CH) nach Herstellervorschrift in cDNA transkribiert. Für die Polymerase Kettenre-

aktion (PCR) wurden Oligo dT-Primer (1 µl (100 µM)) eingesetzt und mit 1 µg RNA für

10 min bei 65°C inkubiert. Anschließend wurde der Mastermix (2 µl (10 mM) dNTP´s,

0,5 µl (40 U/µl) RNAsin, 4 µl PCR-Puffer (5-fach) und 0,5 µl (20 U/µl) reverser Tran-

skriptase) zum Ansatz zugefügt. Im nächsten Schritt wurde der Ansatz für die Transkription

für 30 min auf 50 °C erhitzt, anschließend die reverse Transkriptase 5 min bei 85 °C inak-

tiviert und die cDNA-Konzentration mithilfe des NanoDrop-Spektralphotometers be-

stimmt.

2.8.3 Quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion

Für die quantitative Real-Time PCR (qPCR) wurde der RealTime ready Catalog assay

GAJ1 bzw. RPL13A (Hofmann-La Roche AG, Basel, CH) verwendet. Im ersten Schritt

wurde ein Mastermix aus 4 µl PCR-Wasser, 10 µl LightCycler 480 Probes Master und je

1 µl (8 pmol) des entsprechenden Primerpaares für Cx43 bzw. RPL13A hergestellt und

jeweils 15 µl Mastermix in einer PCR-96-Well-Platte vorgelegt. Im Anschluss wurden 5 µl

(100 ng) der spezifischen cDNA hinzugegeben. Für die Durchführung der qPCR wurde der

LightCycler 480 (Hofmann-La Roche AG, Basel, CH) mit dem in Tab. 2.1 beschriebenen

Programm verwendet.

Die Auswertung der qPCR Ergebnisse basierte auf den CP–Werten2, die mit der LightCyc-

ler 480 Software berechnet wurden. Die normalisierten Werte wurden nach folgender

Formel bestimmt:

𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡𝑒𝑟 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =

𝐶𝑃 𝑍𝑖𝑒𝑙𝑔𝑒𝑛𝐶𝑃 𝑅𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑧𝑔𝑒𝑛 (𝑅𝑃𝐿13𝐴)

𝐶𝑃 𝑍𝑖𝑒𝑙𝑔𝑒𝑛𝐶𝑃 𝑅𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑧𝑔𝑒𝑛 (𝑅𝑃𝐿13𝐴)

Probe

(2.3)

Kalibrator (Ktrl)

Die Berechnung der prozentualen Veränderungen der mRNA-Expression erfolgte mit fol-

gender Formel:

2 „Crossing Point“ (CP)-Werte: entsprechen der Anzahl der PCR-Zyklen die nötig sind, um ein konstant und

zuvor definiertes Fluoreszenzniveau zu erreichen


28

∆ (𝑚𝑅𝑁𝐴 − 𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛) % = 100 % − (100 % ∙ 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡𝑒𝑟 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 (𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒)

𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡𝑒𝑟 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 (𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑙𝑒) ) (2.4)

Tab. 2.1: Zyklusprogramm qRT-PCR

Programm Analysenmodus Zieltemperatur Zeit (hh:mm:ss)

Prä-Inkubation

(1 Zyklus)

- 95°C 00:10:00

Amplifikation

(45 Zyklen)

- 95°C 00:00:10

- 60°C 00:00:30

Quantifizierung 72°C 00:00:01

Kühlung

(1 Zyklus)

- 40°C 00:00:30

2.9 Proteinanalyse

Für die Proteinanalyse wurden die Proben wie in Abschnitt 2.8 beschrieben vorbereitet.

Das so erhaltene Zell-Pellet wurde in 60 µl Lyse-Puffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA,

1 % SDS) resuspendiert, mit Ultraschall (6 Pulse, Amplitude 50 %, Zyklus 0,6) behandelt

und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Proben für 8 min bei 4 °C und

9000 rpm zentrifugiert, der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur

Weiterverwendung bei -80 °C eingefroren.

2.9.1 Bestimmung der Proteinkonzentrationen

Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen erfolgte in Triplikaten mithilfe des DCTM As-

say (BioRad, Hercules (CA), USA) nach Herstellervorschrift, unter Verwendung einer

BSA-Standardkurve.

2.9.2 Western Blot

Die Proben zur Untersuchung der MAP-Kinase-Aktivität wurden für 5 min auf 95 °C er-

hitzt und die Proben zur Cx43 Bestimmung für 1 h bei 37 °C inkubiert. Jeweils 30 µl Probe

wurden auf CriterionTM TGX Stain-FreeTM Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA) geladen.

Nach der Gelelektrophorese wurden die Gele durch UV-Licht aktiviert und mit dem Image-

Quant LAS 4000 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK) abgebildet.


29

Die PVDF-Membranen (Bio-Rad) wurden für 30 s in Ethanol (96 %) equilibriert, bevor die

separierten Proteine mit dem Trans-Blot Turbo Transfer System auf die Membranen ge-

blottet und mit dem ImageQuant LAS 4000 abgebildet wurden. Die Membranen wurden

für 1 h in TBST mit 5 % Milchpulver geblockt. Nachdem die Membranen mit TBST ge-

waschen wurden, wurden sie über Nacht mit dem primären Antikörper (1:1000 in TBST)

bei 4 °C und anschließend für 1 h bei Raumtemperatur mit dem sekundären HRP-konju-

gierten Antikörper (goat anti-rabbit, 1:10.000 in TBST, Jackson ImmunoResearch, West

Grove, PA) inkubiert. Folgende Primärantikörper wurden verwendet (alle von New Eng-

land Biolabs, Ipswich, MA): Cx43 (#3512), p38 (#8690), p38 phosphoryliert (#4511), Erk

1/2 (#9102), Erk 1/2 phosphoryliert (#4370).

Die Membranen zur Analyse der MAP-Kinasen wurden zweimal verwendet, zunächst zur

Detektion der phosphorylierten und anschließend der unphosphorylierten Form. Dazu wur-

den die Membranen für 25 min bei 70 °C mit einer Stripping-Lösung (62,5 mM Tris, 1 %

SDS, 100 mM ß-mercaptoethanol, pH-Wert 6.7) inkubiert. Da der Cx43-Antikörper auch

die phosphorylierte Form bindet, wurde hier kein zweiter Antikörper benötigt.

Für die Detektion der Zielproteine wurde Amersham ECL Select (GE Healthcare) entspre-

chend der Herstellervorschriften verwendet. Die Chemilumineszenz-Signale wurden mit

dem ImageQuant LAS 4000 detektiert. Die Blots wurden mithilfe der ImageQuant TL Soft-

ware (GE Healthcare) ausgewertet.

2.10 Statistik

Zur Auswertung des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assay sowie der qPCR und Western

Blot Daten wurden mindestens 3 unabhängige Versuche je untersuchter Feldstärke und

Zeitpunkt durchgeführt. Die Signifikanzen wurden mittels one-way ANOVA-Dunnett´s

Test berechnet, mit Signifikanzwerten von p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) und p < 0.001 (***).

2.11 Rasterkraftmikroskopie

2.11.1 Aufbau und Funktionsweise

Die Rasterkraftmikroskopie (AFM, engl. atomic force microscopy) bietet die Möglichkeit

Oberflächen zerstörungsfrei mit atomarer Auflösung abzubilden oder auch die mechani-


30

schen Eigenschaften einer Probe zu bestimmen [140]. Der Aufbau eines Rasterkraftmikro-

skops ist schematisch in Abb. 2.4 gezeigt. Die Probenoberfläche wird von einer sehr feinen

Spitze mit einem Spitzenradius im Nanometer-Bereich gerastert, die sich an der Unterseite

eines Federbalkens (Cantilever) befindet, der wiederum an einer Piezokeramik befestigt ist.

Aufgrund der Oberflächenbeschaffenheit, wie Höhenänderungen bzw. atomaren Wechsel-

wirkungskräften zwischen Probe und Spitze, wird der Cantilever positionsabhängig unter-

schiedlich weit gebogen. Die Änderungen der Auslenkungen werden mithilfe eines Laser-

strahls detektiert, der vom Cantilever reflektiert wird und auf eine segmentierte Photodiode

trifft. Im angeschlossenen Steuercomputer wird aus den Daten ein Bild der Probe rekon-

struiert.

Abb. 2.4 Schematische Darstellung der Funktionsweise eines Rasterkraftmikroskops. Die Cantile-

verspitze rastert mit einer definierten Kraft die Probenoberfläche ab. Die dadurch entstehenden

Verbiegungen des Canitlevers werden mithilfe eines Laserstrahls detektiert, der auf eine segmen-

tierte Photodiode trifft. Die Daten werden über einen Computer zu einem Bild zusammengesetzt.

Das AFM kann zur Bildgebung in verschiedenen Messmodi betrieben werden. Im Kontakt-

modus, der vor allem für die Abbildung von harten Materialien geeignet ist, wird der Can-

tilever mit einer konstanten Kraft auf die Probenoberfläche gedrückt. Höhenänderungen

werden durch die Verbiegung des Cantilevers detektiert und die Kraft anschließend über

den Piezoscanner nachgeregelt. Dieser Messmodus ist für biologische Proben eher unge-

eignet, da die permanent ausgeübte Kraft bei Zellen zu einer irreversiblen Deformation

führen kann. Im tapping-Modus wird der Cantilever zu einer konstanten Schwingung in

seiner Resonanzfrequenz angeregt. In der Nähe der Probe wird die Schwingungsamplitude

gedämpft. Diese Dämpfung wird detektiert und durch die Anpassung des Abstandes zwi-

schen Cantileverspitze und Probe ausgeglichen. So kann die Probenoberfläche fast ohne


31

Reibungskräfte untersucht werden und die Methode ist damit auch für biologische Proben

geeignet [141].

2.11.2 Kraft-Abstands-Kurven und Bestimmung der Elastizitätsmoduln

Neben der Oberflächentopographie können mit dem AFM auch lokal Kräfte gemessen und

so die mechanischen Eigenschaften von Proben untersucht werden [142]. Dazu werden

Kraft-Abstands-Kurven aufgenommen.

Abb. 2.5 Theoretischer Ablauf der Aufzeichnung einer Kraft-Abstands-Kurve: 1) Annäherung des

Cantilevers an die Probe; 2) der Cantilever berührt die Probe (Kontaktpunkt); 3) der Cantilever wird

in die Probe eingedrückt; 4) der Cantilever wird zurückgezogen; 5) die Probe wird gedehnt; 6)

Rückzug des Cantilevers

Während der Annäherung des Cantilevers an die Probe wirkt keine Kraft auf den Cantilever

und er wird somit auch nicht verbogen. Die aufgenommene Kurve zeigt eine Nulllinie

(Abb. 2.5 (1)). Wird der Cantilever, nachdem die AFM-Spitze die Oberfläche berührt hat


32

(Abb. 2.5 (2)), weiter nach unten gedrückt, steigt die auf den Cantilever wirkende Kraft,

was zu einem Verbiegen des Cantilevers und einem Anstieg der Kraft-Abstands-Kurve

führt (Abb. 2.5 (3)). Erreicht die Kraft den Wert der zuvor definierten Maximal-Kraft

(Fmax), wird der Cantilever wieder von der Probe entfernt. Das aufgenommene Kraft-Ab-

stands-Verhalten entspricht auf dem Rückweg bis zum Kontaktpunkt theoretisch dem der

Annäherung (Abb. 2.5 (4)). Wird der Cantilever weiter von der Probe entfernt, kann es zur

Dehnung der Probe kommen, wobei sich der Cantilever in die entgegengesetzte Richtung

biegt. Dies resultiert in einem Negativ-Peak der Kraft-Abstands-Kurve (Abb. 2.5 (5)).

Nachdem sich die Spitze von der Probe gelöst hat, wirkt keine Kraft mehr auf den Cantile-

ver und die Kurve zeigt wieder eine Nulllinie an (Abb. 2.5 (6)).

Bei sehr geringen Abständen zwischen AFM-Spitze und Probenoberfläche kann es zu ato-

maren Wechselwirkungskräften, wie z.B. Coulomb-, van-der-Waals oder elektrostatischen

Kräften, kommen. Dies führt bei der Annäherung des Cantilevers an die Probe zum soge-

nannten „snap-on“-Effekt, d.h. die AFM-Spitze „springt“ an die Probenoberfläche, obwohl

sich der Cantilever noch oberhalb der Probe befindet. Dadurch verbiegt sich der Cantilever

in die „negative“ Richtung, was in der Kraft-Abstands-Kurve in einem Peak unterhalb der

Nulllinie resultiert, ähnlich wie bei der Dehnung der Probe während des Rückzugs des

Cantilevers (Abb. 2.5 (5)).

Abb. 2.6 Vergleich von Kraft-Abstands-Kurven von unterschiedlich harten Proben. Bei einer har-

ten Probe ist die Verbiegung des Cantilevers proportional zur Kraft (rot). Eine weiche Probe hin-

gegen, wie z.B. eine Zelle, zeigt ein elastisches Verhalten, da die AFM-Spitze zunächst in die Probe

eingedrückt wird und die Verbiegung erst mit steigender Kompression der Probe zunimmt (blau).


33

Je nach Elastizität der Probe ergeben sich für die Kraft-Abstands-Kurven unterschiedliche

Verläufe (Abb. 2.6). Trifft der Cantilever auf eine harte Oberfläche, ist die Verbiegung

proportional zur applizierten Kraft und resultiert in einem linearen Anstieg der Kurve (Abb.

2.6, rote Kurve). Weiche Proben hingegen, wie z.B. Zellen, zeigen ein elasto-plastisches

Verhalten [143]. Während der Messung wird die Oberfläche eingedrückt und die Kurve

weist einen nicht-linearen Verlauf auf (Abb. 2.6, blaue Kurve). Bei dünnen Proben, wie

beispielsweise einer adhärierten, ausgebreiteten Zelle, kann zudem die Substratoberfläche

die Messung bei tieferem Eindrücken der AFM-Spitze beeinflussen.

Zum Aufnehmen der Kraft-Abstands-Kurven wurden die Zellen wie in Kap. 2.1 beschrie-

ben kultiviert und in 35 mm-Petrischalen vorbereitet. Vor jeder Messung wurde das Me-

dium auf den Zellen gegen auf 37 °C erwärmtes DMEM (1 g/l Glukose), versetzt mit

25 mM HEPES, ausgetauscht. Anschließend wurden die Schalen unter das AFM (Nano-

wizard 3 BioScience, JPK Instruments, Berlin, Germany) und in den PetriDishHeater (JPK)

bei 37 °C gestellt.

Das AFM wurde für die Messungen im Kontaktmodus betrieben. Es wurden 64 x 64, also

insgesamt 4096 Kraftkurven über eine Fläche von 30 x 30 µm2 aufgenommen. Dazu wurde

der QITM (Quantitative Imaging) Modus von JPK genutzt. Die maximal applizierte Kraft

betrug 4 nN bei einer z-Länge von 3 µm und einer Frequenz von 50 kHz. Es wurden han-

delsübliche Siliziumnitrid-Cantilever (MLCT, Bruker, Camarillo, CA) mit einer nominel-

len Federkonstanten von 0,03 N/m, einem Spitzenradius von 20 nm und einem Frontwinkel

von 15 ° verwendet. Vor jedem Experiment wurde die Federkonstante des Cantilevers mit-

tels Thermal Noise Methode neu bestimmt [144].

Die Berechnung der Elastizitätsmoduln der Zellen basiert auf dem Hertz-Modell, das die

Deformation zweier linear elastischer, kugelförmiger Körper beschreibt, die aufeinander

gepresst werden. Weitere wichtige Annahmen sind, dass es zwischen den beiden Körpern

keine weiteren Wechselwirkungen gibt und ihre Kontaktflächen im Vergleich zu den Kör-

pern klein sind [145]. Dieses Modell wurde von Sneddon auf andere Geometrien übertra-

gen, wodurch es sich auch auf einen Cantilever mit einer vierseitigen Pyramide als Spitze

anwenden lässt [146].

Die Elastizitätsmoduln wurden unter Verwendung der Data Processing Software von JPK

bestimmt [147]. Die materialabhängige Poissonzahl µ, die das elastische Verhalten eines

Körpers beschreibt, wurde mit 0,5 angegeben, obwohl sie über der Zelle variieren kann

[142]. Zudem wurde für die vorliegende Arbeit eine Eindrücktiefe der Cantileverspitze von


34

300 nm gewählt, da zum einen so ein Einfluss der Substratoberfläche auf die Messung ver-

mieden und die Zelle nicht verletzt werden sollte. Zum anderen sollte die allgemeine Elas-

tizität der Zelle ermittelt werden und nicht nur die Elastizität der zytoskelettalen Strukturen

direkt unter der Membran.

Die so bestimmten Werte für die Elastizitätsmoduln wurden mithilfe der OriginPro 8 Soft-

ware (OriginLab Corporation, Northampton, MA) in ein Histogramm aufgetragen und an-

schließend mit einer Gauß-Kurve gefittet. Die Gauß-Kurve beschreibt eine Normalvertei-

lung eines Datensatzes und hat den Vorteil, dass „Ausreißer“ kaum einen Einfluss auf die

Werte haben. Für die weitere Auswertung wurden die den Gauß-Kurven zugehörigen Peak-

Werte ermittelt. Aus den Halbwertsbreiten der Gauß-Kurven (FWHM) wurden mithilfe der

folgenden Formel die Standardabweichungen (SD) berechnet:

𝐹𝑊𝐻𝑀 = 2√2 ln 2 ∙ 𝑆𝐷 ≈ 2,3548 ∙ 𝑆𝐷 (2.5)

Die statistische Auswertung der Ergebnisse wurde mit den Peak-Werten der Gauß-Kurven

sowie den aus den Halbwertsbreiten ermittelten Standardabweichungen vorgenommen.

2.12 Scratch Assay

Der Scratch Assay dient zur Bestimmung der Zellmigration und -proliferation in vitro.

Dazu wurde nach der Behandlung mit nsPEFs mithilfe einer Pipettenspitze ein Kratzer in

den konfluenten Monolayer eingebracht, der eine Breite von ca. 600 µm hatte. Der Kratzer

wurde im rechten Winkel zu den Elektrodenpositionen eingebracht. Direkt im Anschluss

wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, um tote und abgelöste Zellen wegzu-

spülen. Die Zellkulturschalen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h unter einem Mikro-

skop (Axiovert 40 CFL, Zeiss, Oberkochen, Germany) inkubiert. Während dieser Zeit

wurde alle 5 min ein Bild aufgenommen [148].

Die Bilder wurden mithilfe der ZEN Software (blue edition, Carl Zeiss MicroImaging

GmbH) ausgewertet. Dazu wurde bei jeder 30. Aufnahme, was einer Zeitspanne von 2,5 h

entspricht, jeweils an drei unterschiedlichen Stellen die Breite des Kratzers ausgemessen

und gegen die ursprüngliche Breite des Kratzers zu Beginn des Versuchs normiert. Der

prozentuale Anteil des zugewachsenen Spaltes von mit Hochspannungspulsen behandelten

WB-F344 Zellen wurde mit denen von unbehandelten WB-F344 und WB-ras Zellen ver-

glichen.


35

2.13 Soft Agar Colony Formation Assay

Der Soft Agar Colony Formation Assay ist ein semi-quantitativer in vitro Test auf zelluläre

Transformation, die durch Chemikalien oder andere Mechanismen ausgelöst wurde. Nor-

male Zellen brauchen einen festen Untergrund, um sich teilen zu können, während trans-

formierte Zellen auch verankerungsunabhängig in einem viskosen Gel, wie z.B. Agar,

wachsen können. Es wird angenommen, dass der Transformations-Prozess, bei dem sich

die Zellen phänotypisch verändern, stark mit der Karzinogenese in vivo korreliert. Somit

gibt dieser Assay einen ersten Hinweis auf eine mögliche maligne Transformation der Zel-

len [149].

Für den Assay wurde Agarose (GTQ, Carl Roth, Karlsruhe) in Vollmedium erhitzt und

aufgelöst. Je 1 ml 1 %-ige Agarose wurde in die Wells einer 6-Well Platte gefüllt und ab-

kühlen gelassen. Anschließend wurden die Zellen wie in Kap. 2.1 beschrieben abgelöst und

in pulsing-Puffer (2,5 mM KH2PO4, 10 mM K2HPO4, 125 mM Saccarose, 2 mM

MgCl2•6H2O2) resuspendiert. Die Behandlung der Zellen mit nsPEFs erfolgte in Elektro-

porationsküvetten (VWR International GmbH, Darmstadt) mit einem Elektrodenabstand

von 4 mm. Für die Behandlung wurden 800 µl der Zellsuspension in eine Küvette über-

führt, die Küvette in eine selbst konzipierte Halterung gestellt und darin die elektrischen

Pulse appliziert. Direkt im Anschluss wurden 100 µl der Suspension, die ca. 5000 Zellen

enthielten, mit 1 ml 0,33 %-iger Agarose vermischt und auf die bereits vorhandene Agaro-

seschicht in den Wells gegeben. Bei diesem kritischen Schritt musste auf die Temperatur

der Agarose geachtet werden, die zwischen 30 und 40 °C liegen sollte, da die Zellen bei zu

hohen Temperaturen absterben. Bei niedrigen Temperaturen wird die Agarose fest und lässt

sich nicht mehr im Well verteilen. Zum Abschluss folgte noch eine Schicht aus 1 ml

0,5 %-iger Agarose. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle dienten unbehandelte WB-F344

bzw. WB-ras Zellen.

Die Platten wurden im Brutschrank inkubiert und zweimal pro Woche mit 0,5 ml Medium

je Well versorgt. Nach drei Wochen wurden die Zellen bzw. Kolonien mit einer 1:1-Mi-

schung aus Giemsa (Carl Roth) und Methanol gefärbt und unter dem Mikroskop detektiert

[150].

36

3 Ergebnisse

3.1 Erzeugung eines 100 ns-Pulses

Die zur Erzeugung der gepulsten elektrischen Felder nötigen Hochspannungspulse wurden

von einem Wellenleitungspulsgenerator in einer Blumlein-Konfiguration bereitgestellt (s.

Kap. 2.2). Ein mit einem digitalen Speicheroszilloskop aufgenommener typischer über dem

Monolayer angelegter Spannungspuls ist in Abb. 3.1 gezeigt. Die generierten Rechteck-

pulse wiesen eine Länge von 100 ns mit einer relativ kurzen Anstiegszeit von ca. 13 ns auf.

Die Amplitude entsprach in etwa der Ladespannung des Pulsgenerators.

Abb. 3.1 Aufnahme eines mit dem Blumlein-Pulsgenerator erzeugten Rechteckpulses mit einer

Länge von 100 ns und einer Amplitude von 10 kV. Der Puls wurde in Vollmedium appliziert und

mit einem digitalen Speicheroszilloskop aufgezeichnet.

Nimmt man den Spannungsverlauf über einen längeren Zeitraum auf, erkennt man, dass

außer dem gewünschten Puls auch Reflektionen des Pulses auftreten (Abb. 3.2). Das liegt

daran, dass der Widerstand der Probe (ZProbe), in diesem Fall also der des Mediums, etwas

geringer ist als die Impedanz des Blumlein-Pulsgenerators (2ZKabel).

Beim Schließen des Schalters S wird eine Wanderwelle ausgelöst, die sich in Richtung

Probe ausbreitet. Bei einer Änderung der Impedanz entlang der Ausbreitungsrichtung, also

wenn 2ZKabel ≠ ZProbe, wird nur ein Teil der Welle durch die Probe durchgelassen und ein

Teil reflektiert. Entspricht 2ZKabel = ZProbe überlagern sich die Wellen an der Last zu einem

3 Ergebnisse

37

rechteckigen Spannungspuls, dessen Länge durch die Länge der Kabel bestimmt wird. Ne-

ben der Amplitude können die Reflektionen auch die Form des Pulses verändern [151].

Abb. 3.2 Oszillationen der Spannungsamplitude am Ende des mit dem Blumlein-Pulsgenerator er-

zeugten Pulses, der in Vollmedium appliziert wurde.

3.2 Simulation der elektrischen Feldstärkeverteilung

Da die Zellen im Monolayer einem elektrischen Feld ausgesetzt wurden, das zwischen zwei

Drahtelektroden erzeugt wurde, kann nicht davon ausgegangen werden, dass das elektri-

sche Feld im Behandlungsbereich homogen ist und sich aus der angelegten Spannung und

dem Elektrodenabstand berechnen lässt. Zudem lagen die Elektroden auf dem Monolayer

auf bzw. waren in diesen eingedrückt. Um über die Feldverteilung Aufschluss zu erlangen,

insbesondere im Monolayer, wurde das elektrische Feld mit der EStat Software (Field Pre-

cision LLC, Albuquerque, NM) simuliert. Abb. 3.3a zeigt die farbcodierte Simulation der

Feldstärkeverteilung für in wässriger Umgebung applizierte Spannungen. Dazu wurde eine

Spannung von 10 kV bei einem Elektrodenabstand von 5 mm und einer relativen Permitti-

vität von 80 für Wasser bzw. von 2 für das Substrat angenommen.

In Abb. 3.3b ist grafisch der Querschnitt durch die elektrische Feldverteilung auf Höhe der

Substratoberfläche abgebildet. Die Simulation zeigt, dass das elektrische Feld in der Nähe

der Elektroden auf Substrathöhe annähernd verschwindet und die Feldstärke dann in einer

Entfernung von ca. 0,5 mm steil auf einen Wert von ungefähr 24 kV/cm ansteigt. In der

Mitte zwischen den Elektroden, bei einem Abstand von etwa 1,5 mm zu beiden Elektroden,

fällt die Feldstärke wieder um ungefähr 8 % auf einen Wert von ca. 22 kV/cm ab und bleibt

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-400 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Sp

ann

un

g [

kV

]

Zeit [ns]

3 Ergebnisse

38

dort annähernd konstant. Insgesamt ist der Monolayer zwischen den Elektroden damit ei-

nem Feld ausgesetzt, das über die Fläche in der Stärke mit 23 kV/cm beschrieben werden

kann, mit einer Abweichung von ± 1 kV/cm (etwa 4 %).

Abb. 3.3 a) Farbcodierte Simulation der elektrischen Feldstärkeverteilung zwischen zwei zylinder-

förmigen Drahtelektroden (Durchmesser 0,8 mm) für in Wasser applizierte Spannungen, für fol-

gende Parameter: Elektrodenabstand d=5 mm, angelegte Spannung V0=10 kV, rel. Permittivität

Wasser εWasser=80, rel. Permittivität Polystyrol εSubstrat=2. b) Grafische Darstellung der elektrischen

Feldstärkeverteilung entlang der Oberfläche des Substrats, auf der die Zellen adhäriert sind.

3.3 Zellvitalität und Elektroporation

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, subletale Effekte von nsPEFs auf Zellen zu untersu-

chen. Deshalb wurde zu Beginn ein MTT-Test durchgeführt, mit dem das Überleben der

Zellen in Abhängigkeit von den Behandlungsparametern bestimmt und entsprechend der

Parameterraum für die Untersuchungen eingeschränkt wurde. Die violette Farbe repräsen-

tiert die Enzymaktivität und somit vitale Zellen, während die hellen Bereiche im Well auf

einen reduzierten Stoffwechsel und somit auf tote Zellen hinweisen (Abb. 3.4). Nach der

Inkubation der Zellen mit der MTT-Lösung und noch vor der Lyse der Zellen ist vor allem

für höhere Feldstärken klar erkennbar, dass das elektrische Feld nur auf die Zellen zwischen

den Elektroden wirkt (Abb. 3.4c, d). Mit steigender Feldstärke steigt auch der Anteil der

nicht-gefärbten Fläche, also der abgestorbenen Zellen.

Neben der Vitalität der Zellen nach der Behandlung mit nsPEFs wurde auch eine Schein-

behandlung durchgeführt, um ein Absterben der Zellen aufgrund des Einbringens der Elek-

3 Ergebnisse

39

troden in das Well auszuschließen. Dazu wurden die Elektroden wie zum Applizieren der

Pulse auf die Zellen gesetzt, jedoch ohne die Spannungsquelle einzuschalten und für ca.

20 s, also in etwa so lange, wie die Behandlung mit 20 Pulsen dauert, auf den Zellen belas-

sen.

Abb. 3.4 MTT-Test eines unbehandelten WB-F344 Monolayers (a), bzw. nach dem Applizieren

von 20 Pulsen mit 5, 15 und 25 kV/cm (b-d). Die Fotos wurden vor dem Lysieren der Zellen auf-

genommen. Die weißen Pfeile deuten auf die Stellen, wo zuvor die Elektroden positioniert waren.

Die grünen Pfeile grenzen den Bereich zwischen der vorherigen Elektrodenposition und dem Be-

reich ein, ab dem das elektrische Feld einen Effekt auf die Zellen hat.

Bei den Zellen, die mit einer höheren Feldstärke behandelt wurden (Abb. 3.4c, d), ist zwi-

schen der vorherigen Elektrodenposition (weiße Pfeile) und dem Bereich, in dem die Zellen

aufgrund der Behandlung mit nsPEFs abgestorben waren, ein sehr schmaler, violetter Strei-

fen zu erkennen (grüne Pfeile), in dem die Zellen offensichtlich überlebt haben. Das elek-

trische Feld scheint nicht sofort ab dem Punkt, an dem die Elektroden das Substrat berührt

hatten, auf die Zellen gewirkt zu haben, was sehr gut mit der simulierten Feldstärkevertei-

lung übereinstimmt.

Abb. 3.5 zeigt die Ergebnisse des MTT-Tests für WB-F344 und WB-ras Zellen, die mit 20

Pulsen mit einer Länge von 100 ns und Feldstärken zwischen 5 und 35 kV/cm behandelt

wurden. Die beiden Zelllinien weisen eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber nsPEFs

auf. Die Enzymaktivität der normalen Zellen bleibt bis zu einer Feldstärke von 15 kV/cm

weitestgehend konstant und sinkt erst nach einer Behandlung mit 20 kV/cm auf einen Wert

von 88 % im Vergleich zur Kontrolle ab. Für höhere Feldstärken sinkt die Zellvitalität kon-

tinuierlich von 77 % für eine applizierte Feldstärke von 25 kV/cm auf ungefähr 27 % für

35 kV/cm. Im Vergleich dazu schwankten die Werte der tumorigenen Zelllinie WB-ras für

alle applizierten Feldstärken um den Wert der Kontrolle.

Die Ergebnisse dieser Messung sind mit relativ großen Fehlern behaftet. Das liegt zum

einen daran, dass nur die Vitalität der behandelten Zellen, also der Zellen zwischen den

3 Ergebnisse

40

Elektroden, untersucht werden sollte. Für die Messung im Plattenreader wurden aber alle

Zellen im Well lysiert. Zum anderen konnten sich während des Spülens der Zellen teilweise

kleine Bereiche des Monolayers ablösen, die dann mit der Spülflüssigkeit abgesaugt wur-

den und somit die Absorptionswerte beeinflusst haben. Die Ergebnisse des MTT-Tests

zeigten, dass die WB-ras unempfindlicher gegenüber nsPEFs waren, weshalb die mit den

WB-F344 Zellen erzielten Resultate zum Eingrenzen der applizierten Feldstärken herange-

zogen wurden. Da knapp 90 % der WB-F344 Zellen 20 Pulse mit einer Feldstärke von

20 kV/cm überleben, wurden für die folgenden Versuche sowohl für die WB-F344 als auch

für die WB-ras Feldstärken zwischen 10 und 20 kV/cm gewählt.

Abb. 3.5 Enzymaktivität von WB-F344 und WB-ras Zellen, nach der Behandlung mit 20 Pulsen

mit einer Länge von 100 ns und Feldstärken zwischen 5 und 35 kV/cm. Das Diagramm zeigt die

Mittelwerte ± SE, normiert auf die Kontrolle (100 %), n = 4.

Abb. 3.6 Nachweis der Abwesenheit von Elektroporation über die Aufnahme von PI verglichen

mit unbehandelten Zellen (a). Der Farbstoff wurde vor (b) und 5, 10 und 15 min nach dem Appli-

zieren von 20 Pulsen mit einer Feldstärke von 20 kV/cm zugegeben (c-e). In den behandelten Zellen

haben nicht mehr Zellen den rot fluoreszierenden Farbstoff aufgenommen als in der Kontrolle.

Um ausschließen zu können, dass Elektroporation einen Einfluss auf die Ergebnisse zur

ZZK hat, wurde der Farbstoff PI zu den Zellen gegeben und die Farbstoff-Aufnahme der

0

20

40

60

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120

Sch

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b. 5

10

15

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kV/cm

Enzy

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%

WB-F344

WB-ras

3 Ergebnisse

41

Zellen unter dem Mikroskop untersucht. Elektroporation konnte zu keiner der untersuchten

Zeiten (0, 5, 10, 15 min nach nsPEFs) detektiert werden (Abb. 3.6).

3.4 Effekte von nsPEFs auf die Zell-Zell-Kommunikation

Die Kommunikation zwischen den Zellen wurde mittels Fluoreszenzfarbstoff-Transfer As-

say bestimmt. Dazu wurde mit einer Rasierklinge ein Kratzer quer zur Position der Elek-

troden gesetzt (s. Kap. 2.5).

Abb. 3.7 Schematische Darstellung der Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation (linkes Bild).

Unter dem Mikroskop ist die vorherige Position der Elektroden durch die mit Texas Red gefärbten

Zellen erkennbar (rechtes Bild). Die Zellen zeigten nach der Behandlung mit 20 Pulsen mit

20 kV/cm (1) eine deutlich geringere Kommunikationsaktivität als unbehandelte Zellen (2).

Durch das Eindrücken der Elektroden in den Monolayer wurden die Zellen darunter be-

schädigt und nahmen den rot fluoreszierenden Farbstoff Texas Red auf, wodurch die Elek-

trodenpositionen unter dem Mikroskop deutlich als rote Linien erkennbar waren (Abb. 3.7).

So ließen sich behandelte Zellen, die sich zwischen den Elektroden befanden, gut von un-

behandelten unterscheiden.

Die beschädigten Zellen entlang des Kratzers haben sowohl den GJ-permeablen Farbstoff

Lucifer Yellow (LY) (Abb. 3.8a) als auch den GJ-impermeablen Farbstoff Texas Red (TR)

(Abb. 3.8b) aufgenommen. Während TR in den verletzten Zellen geblieben ist, konnte LY

über GJs weiter in die benachbarten Zellen diffundieren, wie in Abb. 3.8 beispielhaft an

einem unbehandelten WB-F344 Monolayer gezeigt.

3 Ergebnisse

42

Abb. 3.8 Aufnahmen des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assay an einem unbehandelten WB-F344

Monolayer mit LY, das GJ-permeabel ist (a), und TR, das GJ-impermeabel ist (b). TR bleibt in den

beschädigten Zellen entlang des Kratzers, während LY über GJs in benachbarte Zellen diffundieren

kann. (c) zeigt die überlagerten Fluoreszenzkanäle.

3.4.1 Effekte auf die Zell-Zell-Kommunikation von WB-F344

Die nicht-tumorigenen Rattenleberepithelzellen WB-F344 wurden in Monolayern mit

20 Pulsen, einer Pulslänge von 100 ns und Feldstärken zwischen 10 und 20 kV/cm behan-

delt. Abbildung 3.9 zeigt die Mikroskopie-Aufnahmen des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer

Assays 15, 30 und 60 min nach dem Applizieren der Pulse.

Es ist ein deutlicher Zeit- und Feldstärke-abhängiger Effekt der nsPEFs auf die ZZK zu

erkennen. In Monolayern, die mit 20 kV/cm behandelt wurden, fluoreszierten nach 15 min

nur einzelne Zellen entlang des Kratzers. Im Vergleich dazu war in Monolayern, die Pulsen

mit einer Amplitude von 10 kV/cm ausgesetzt waren, die ZZK nach 15 min nur geringfügig

herunterreguliert. Nach 30 bzw. 60 min hatte sich die Kommunikation für applizierte Feld-

stärken von 10 bzw. 15 kV/cm so weit erholt, dass nur noch ein geringer Unterschied zwi-

schen behandelten Zellen und Kontrolle erkennbar war. Lediglich in Zellen, die mit 20

kV/cm behandelt wurden, war die ZZK auch noch nach 60 min deutlich herabreguliert.

Für die Auswertung wurde jeweils die fluoreszierende Fläche der Aufnahmen ermittelt und

gegen die fluoreszierende Fläche der Kontrolle normiert (s. Kap. 2.5). Die entsprechenden

Ergebnisse für alle untersuchten Zeitpunkte (5, 15, 30, 60 min und 24 h nach nsPEFs) sind

in Abb. 3.10 gezeigt.

3 Ergebnisse

43

Abb. 3.9 Mikroskopie-Bilder des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assays an WB-F344 Monolay-

ern 15, 30 und 60 min nach der Behandlung mit 20 Pulsen (100 ns) mit Feldstärken von 10, 15 bzw.

20 kV/cm.

Abb. 3.10 Einfluss von nsPEFs auf die ZZK in WB-F344 Monolayern. Die Zellen wurden mit 20

Pulsen (100 ns) mit einer Amplitude von 10, 15 bzw. 20 kV/cm behandelt. Die ZZK ist Zeit- und

Feldstärke-abhängig nach unten reguliert. Dargestellt sind die Mittelwerte prozentual im Vergleich

zur Kontrolle ± SD.

0

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80

100

5 15 30 60 24 h 5 15 30 60 24 h 5 15 30 60 24 h

10 kV/cm 15 kV/cm 20 kV/cm

ZZK

(%

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ntr

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)

**

***

***

* ***

***

***

***

3 Ergebnisse

44

Fünf Minuten nach der Behandlung war die ZZK der Zellen, die Pulsen mit einer Feldstärke

von 10 und 15 kV/cm ausgesetzt waren, nicht signifikant verändert. Im Gegensatz dazu

war die Kommunikation in Monolayern, die mit 20 kV/cm behandelt wurden, bereits um

über 30 % im Vergleich zur Kontrolle herabgesetzt. Die größten Unterschiede konnten

15 min nach der Behandlung detektiert werden. Hier war die ZZK für alle applizierten

Feldstärken signifikant vermindert. Zellen, die Pulsen mit 10 kV/cm ausgesetzt waren, re-

duzierten ihre Kommunikation verglichen mit der Kontrolle fast um die Hälfte. 15 min

nach der Behandlung mit 15 kV/cm kommunizierten die Zellen kaum noch und im Fall von

Behandlungen mit 20 kV/cm war die ZZK komplett inhibiert. Eine halbe Stunde nach dem

Applizieren der Pulse erholte sich die ZZK wieder. Für Feldstärken von 15 und 20 kV/cm

war sie mit ca. 30 bzw. 10 % gegenüber der ursprünglichen Kommunikation aber immer

noch signifikant vermindert. Nach einer Stunde war die Kommunikation in Monolayern,

die mit 10 kV/cm behandelt wurden, fast wieder auf Kontrollniveau. Im Vergleich dazu

war die Kommunikation zwischen Zellen, die Pulsen mit einer Feldstärke von 15 und

20 kV/cm ausgesetzt waren, auch nach 60 min noch signifikant vermindert. Die ZZK be-

trug ca. 70 bzw. 40 % der ursprünglichen Kommunikation. 24 h nach der Behandlung hatte

sich die ZZK für alle untersuchten Feldstärken erholt und entsprach wieder dem Niveau

der Kontrolle.

3.4.2 Änderung der Zell-Zell-Kommunikation in Abhängigkeit von der

Feldstärke

In Abb. 3.11 ist die ZZK noch einmal in Abhängigkeit der applizierten Feldstärke darge-

stellt. In den ersten 5 min nach der nsPEF-Behandlung änderte sich die ZZK linear zur

applizierten Feldstärke. D.h. die Änderung betrug für 15 kV/cm ca. 15 % und für 20 kV/cm

etwa das doppelte, nämlich 30 %. Bei 10 kV/cm trat nach 5 min noch keine Beeinträchti-

gung der ZZK auf. Auch 15 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse zeigte

sich immer noch diese lineare Abhängigkeit von der Feldstärke, zumindest für Feldstärken

von 10 und 15 kV/cm. Für Zellen, die 20 kV/cm ausgesetzt waren, war gar keine ZZK mehr

nachweisbar. Während sich die Zahl an kommunizierenden Zellen im Fall von 10 kV/cm

um ca. 40 % reduzierte, sank sie für 15 kV/cm um etwa das Doppelte (80 %). Ab 30 min

nach der Behandlung mit nsPEFs begann sich die Kommunikation zwischen den Zellen zu

erholen. Die Zellen schienen allerdings, unabhängig von der zuvor applizierten Feldstärke,

dieselbe Regenerationszeit zu haben. So erholte sich die ZZK nach 30 min sowohl im Fall

3 Ergebnisse

45

von 10 als auch 15 kV/cm um rund 25 %. In Zellen, die Pulsen mit 20 kV/cm ausgesetzt

waren, war die ZZK nach 30 min hingegen nur um ca. 10 % gestiegen. Dies könnte daran

liegen, dass die Kommunikation zwischen den Zellen für diese Feldstärke zuvor komplett

inhibiert war und die Zellen somit länger brauchten, um sich zu regenerieren, während im

Fall von 10 und 15 kV/cm nach 15 min noch eine gewisse Restkommunikation erhalten

geblieben war. Nach einer Stunde hatte sich die ZZK weiter erholt. Auch hier war eine

lineare Charakteristik erkennbar. Für die Feldstärken von 15 und 20 kV/cm kommunizier-

ten etwa 35 % mehr Zellen miteinander im Vergleich zum zuvor untersuchten Zeitpunkt

nach 30 min. Dies gilt jedoch nicht für Zellen, die 10 kV/cm ausgesetzt waren, da deren

ZZK bereits nach 60 min wieder annähernd auf dem Niveau der Kontrolle lag. Nach 24 h

erlangten alle Zellen wieder die Fähigkeit entsprechend den unbehandelten Zellen zu kom-

munizieren.

Zusammenfassend lässt sich der Zusammenhang zwischen der Feldstärke der applizierten

Hochspannungspulse und der ZZK folgendermaßen beschreiben: Mit jeder Erhöhung der

Feldstärke um 5 kV/cm veränderte sich die ZZK gleichermaßen, d.h. bei einer Erhöhung

um 5 kV/cm verdoppelte bzw. bei einer Erhöhung um 10 kV/cm verdreifachte sich die

Anzahl der Zellen, die nicht mehr miteinander kommunizierten. Im Hinblick auf die Rege-

nerationszeit der ZZK gab es keine Unterschiede. Die Kommunikation erholte sich über

einen bestimmten Zeitraum für alle Feldstärken in gleichem Maße.

Abb. 3.11 Einfluss von nsPEFs auf die ZZK in WB-F344 Monolayern in Abhängigkeit von der

Feldstärke. Dargestellt sind die Mittelwerte prozentual im Vergleich zur Kontrolle ± SD für jeden

untersuchten Zeitpunkt.

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5 min 15 min 30 min 60 min 24 h

ZZK

(%

Ko

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)

3 Ergebnisse

46

3.4.3 Effekte auf die Zell-Zell-Kommunikation von WB-ras

Zusätzlich zu den normalen Zellen wurde der Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assay auch an

Monolayern der tumorigenen Zelllinie WB-ras durchgeführt, bei der es sich um mit dem

Onkogen ras transformierte WB-F344 Zellen handelt. Eine inhibierte ZZK ist ein Charak-

teristikum von Krebszellen. So sollte untersucht werden, ob tumorigene Zellen in Hinblick

auf die ZZK anders reagieren wie nicht-tumorigene Zellen und die ZZK in den WB-ras

Zellen durch die Behandlung mit nsPEFs evtl. erhöht werden kann.

Abb. 3.12 Mikroskopie-Bilder des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assays an WB-ras Monolay-

ern 5, 15, 30 und 60 min nach der Behandlung mit 20 Pulsen mit einer Länge von 100 ns und einer

Feldstärke von 20 kV/cm im Vergleich zur Kontrolle.

Abbildung 3.12 zeigt die Mikroskopie-Aufnahmen des LY-Kanals von WB-ras Zellen, die

mit 20 Pulsen und einer Länge von 100 ns und einer Feldstärke von 20 kV/cm behandelt

wurden. Zum Vergleich ist ein Bild der Kontrolle aufgeführt. Im Gegensatz zu den nicht-

tumorigenen WB-F344 Zellen kommunizieren auch unbehandelte WB-ras Zellen kaum

miteinander. Während 5 min nach der Behandlung der Zellen mit nsPEFs keine Änderung

der ZZK verglichen mit der Kontrolle zu erkennen ist, ist die Kommunikation zwischen

den Zellen 15 und 30 min nach der Behandlung komplett inhibiert. Nach 1 h ist kein Un-

terschied zur Kontrolle zu sehen. Die ZZK konnte in WB-ras Zellen durch die Behandlung

mit nsPEFs also nicht erhöht bzw. auf das Niveau der WB-F344 Zellen gebracht werden.

3 Ergebnisse

47

Da die tumorigenen WB-ras Zellen kaum eine Änderung der ZZK nach dem Applizieren

der nsPEFs aufwiesen, beschränkten sich die weiteren Versuche auf die Untersuchung der

nicht-tumorigenen Zelllinie WB-F344.

3.4.4 Vergleich von Behandlungen der Zellen mit 20 und 100 Pulsen

Neben den Parametern wie Pulslänge und Feldstärke kann auch die Pulsanzahl einen Ein-

fluss auf die durch gepulste elektrische Felder in Zellen hervorgerufenen Effekte haben.

Deshalb wurden der MTT-Test und der Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assay zusätzlich

nach der Behandlung der Zellen mit 100 Pulsen (100 ns) durchgeführt. In diesem Fall über-

lebten nur etwa 60 % der WB-F344 Zellen eine Feldstärke von 15 kV/cm (Daten nicht ge-

zeigt). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für den Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assay für

die Behandlung mit 100 Pulsen eine Amplitude von 10 kV/cm gewählt, die etwa den sub-

letalen Bedingungen von 20 kV/cm im Fall von 20 Pulsen entsprach. Der Fluoreszenzfarb-

stoff-Transfer Assay wurde 15, 30 und 60 min nach der Behandlung der WB-F344 Zellen

mit 100 Pulsen und einer Feldstärke von 10 kV/cm durchgeführt (Abb. 3.13).

Abb. 3.13 Vergleich der ZZK in WB-F344 Monolayern nach der Behandlung mit 100 Pulsen bzw.

20 Pulsen, die gegen jeweilige Kontrollen normiert wurden.

Der Effekt auf die ZZK nach der Behandlung mit 100 Pulsen ähnelte dem zeitlichen Ver-

lauf der ZZK von Zellen, die 20 Pulsen mit einer Feldstärke von 15 kV/cm ausgesetzt wur-

den. Die Zellen, die 100 Pulsen ausgesetzt worden waren, behielten 15 min nach der Be-

handlung eine Restkommunikation von knapp 10 % im Vergleich zur Kontrolle. Die Kom-

0

20

40

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100

15 30 60

ZZK

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100 Pulse 10 kV/cm

20 Pulse 20 kV/cm

20 Pulse 15 kV/cm

20 Pulse 10 kV/cm

3 Ergebnisse

48

munikation nach der Applikation von 20 Pulsen mit 15 kV/cm betrug noch ca. 4.5 %. Wäh-

rend die ZZK in den Versuchen mit 20 Pulsen und 15 kV/cm zum nächsten untersuchten

Zeitpunkt nach 30 min um ca. 25 % auf etwa 30 % anstieg, erhöhte sich die Kommunika-

tion nach dem Applizieren von 100 Pulsen jedoch nur um weniger als 10 % auf 17 %. Dafür

hatten sich die mit 100 Pulsen behandelten Zellen nach 60 min um weitere 45 % auf über

60 % regeneriert, wohingegen sich die Zellen, die mit 20 Pulsen behandelt worden waren,

nur um weitere 35 % erholt hatten. Mit einer ZZK von über 70 % im Vergleich zur Kon-

trolle kommunizierten die mit 20 Pulsen behandelten Zellen nach 60 min damit allerdings

immer noch mehr als die mit 100 Pulsen behandelten Zellen, trotz der geringeren ZZK zu

Anfang (nach 15 min). Insgesamt erholte sich die Kommunikation zwischen den Zellen

nach der Behandlung mit 100 Pulsen also etwas langsamer verglichen mit 20 Pulsen und

15 kV/cm.

Sowohl das Ausmaß der Inhibierung als auch die Regenerationszeit der ZZK unterscheiden

sich demnach je nach Anzahl der applizierten Hochspannungspulse. Um festzustellen, ob

es diesbezüglich für die Behandlung der Zellen mit 100 Pulsen eine ähnliche Gesetzmäßig-

keit gibt, wie nach der Applikation von 20 Pulsen, müssten weitere Versuche mit 100 Pul-

sen mit unterschiedlichen Feldstärken durchgeführt werden.

Da die Ergebnisse nach der Applikation von 100 Pulsen im Vergleich zu 20 Pulsen hin-

sichtlich der ZZK keine wesentlichen Unterschiede zeigten, wurde dieser Ansatz nicht wei-

ter verfolgt und die folgenden Versuche beschränkten sich auf die Untersuchung der WB-

F344 Zellen, die mit 20 Pulsen mit einer Feldstärke zwischen 10 und 20 kV/cm behandelt

wurden.

3.5 Immunfluoreszenzfärbungen von Cx43, F-Aktin und ZO-1

Wie in Kap. 3.4 gezeigt, führte die Behandlung von Monolayern mit nsPEFs zu einer ver-

minderten Kommunikation über GJs zwischen den Zellen. Um die dem Effekt zugrunde-

liegenden Mechanismen aufzudecken, wurde die Verteilung von Cx43 in WB-F344 Zellen

mittels Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. Da für den Auf- und Abbau von GJs

ein intaktes Zytoskelett notwendig ist, wurde zusätzlich das F-Aktin angefärbt.

Abb. 3.14 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von WB-F344 Monolayern, die mit 20 Pul-

sen mit einer Feldstärke von 20 kV/cm behandelt wurden. In den unbehandelten Zellen sind

deutlich große, helle Punkte zu erkennen, die sich vor allem in der Plasmamembran befin-

3 Ergebnisse

49

den und die Zellen miteinander verbinden. Diese Punkte stellen GJs-Plaques dar. Im Zyto-

plasma konnte kaum Cx43 nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigte die Färbung ein

intaktes Zytoskelett mit normal strukturierten Aktinfasern, die sich gleichmäßig über die

Zelle erstreckten (Abb. 3.14a). 5 min nach dem Applizieren der Pulse hatte sich die Cx43-

Verteilung kaum verändert. Cx43 war weiterhin in die Zellmembran integriert, allerdings

schienen die GJs-Plaques, vergleichen mit der Kontrolle, etwas kleiner zu sein. Im Gegen-

satz dazu konnten jedoch kaum noch intakte Aktinfasern gefunden werden (Abb. 3.14b).

15 min nach dem Anlegen der elektrischen Pulse waren immer noch einzelne GJ-Plaques

in der Membran zu finden, gleichzeitig hatte sich aber auch der Anteil an zytosolischem

Cx43 erhöht. Das Zytoskelett wies weiterhin keine intakten Aktinfasern auf (Abb. 3.14c).

Eine halbe Stunde nach dem Anlegen der elektrischen Felder war fast kein Cx43 mehr in

der Plasmamembran nachweisbar. Die zuvor durch die GJs beschriebenen Zellumrisse wa-

ren nicht mehr erkennbar. Das Fluoreszenzsignal des Cx43 im Zellinneren war ähnlich wie

bereits nach 15 min erhöht, was darauf hinweist, dass die GJs in der Membran abgebaut

und das Connexin ins Zellinnere transportiert wurde. Die Aktinfasern wiesen kaum eine

Änderung zum zuvor untersuchten Zeitpunkt auf (Abb. 3.14d). Eine Stunde nach der Be-

handlung der Zellen mit nsPEFs waren wieder einzelne GJs-Spots in der Plasmamembran

nachweisbar. Zudem waren auch einzelne definierte Punkte im Zellinneren zu erkennen,

die darauf hindeuteten, dass Connexone zurück zur Membran transportiert wurden. Gleich-

zeitig nahm das diffuse Fluoreszenzsignal für Cx43 im Zellinneren ab. Auch das Zytoske-

lett erholte sich wieder, auch wenn die Aktinfasern noch nicht wieder so geordnet waren

wie in der Kontrolle.

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde auch an Zellen durchgeführt, die mit 20 Pulsen mit

einer Feldstärke von 15 kV/cm behandelt wurden. Die Ergebnisse sowohl für Cx43 als auch

für das Aktin-Zytoskelett sind vergleichbar mit denen von Zellen, die 20 kV/cm ausgesetzt

waren, jedoch sind die Veränderungen weniger ausgeprägt. Im Gegensatz zu Zellen, die

mit 20 kV/cm behandelt wurden, war in Zellen, die nur 15 kV/cm ausgesetzt waren, nicht

das komplette Cx43, d.h. nicht alle GJs, aus der Membran abgebaut (Daten nicht gezeigt).

3 Ergebnisse

50

3 Ergebnisse

51

Abb. 3.14 (auf S. 50) Immunfluoreszenzfärbung von Aktin (grün) und Cx43 (rot) in einem unbe-

handelten WB-F344 Monolayer (a) und 5, 15, 30 und 60 min nach dem Applizieren von 20 Pulsen

mit einer Feldstärke von 20 kV/cm (b-e). (blau: Nuklei)

Der Effekt auf die ZZK war 15 min nach der Behandlung mit 20 kV/cm am ausgeprägtes-

ten. Für diese Behandlungsparameter war die Kommunikation komplett inhibiert. Um aus-

zuschließen, dass die Zellen nicht mehr kommunizierten, nur weil sie den Kontakt zu ihren

benachbarten Zellen verloren hatten, wurde 15 min nach der Behandlung der Zellen mit

20 kV/cm das Tight Junction Protein ZO-1 angefärbt (Abb. 3.15). In der Kontrolle waren

die Umrisse der Zellen klar anhand des ZO-1 Proteins zu erkennen und es war kaum ZO-1

im Zellinneren zu finden (Abb. 3.15a). 15 min nach der Behandlung mit 20 Pulsen mit

20 kV/cm waren die durch ZO-1 umschriebenen Zellränder im Vergleich zur Kontrolle

nicht mehr so klar definiert (Abb. 3.15b). Aber insgesamt waren die Zellen im Monolayer

weiterhin dicht gepackt und hatten Kontakt zu angrenzenden Zellen.

Abb. 3.15 Immunfluoreszenzfärbung des Tight Junction Proteins ZO-1 (orange) in einem unbehan-

delten WB-F344 Monolayer (a) und 15 min nach der Behandlung mit 20 Pulsen mit einer

Amplitude von 20 kV/cm (b). (blau: Nuklei)

3.6 Analyse der Cx43-Genexpression

Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die GJs nach der Behandlung der Zellen mit

nsPEFs aus der Membran abgebaut wurden. Um festzustellen, ob der Abbau der GJs mit

einer veränderten Genexpression verbunden und kein direkter Feldeffekt war, wurde der

mRNA-Level von Cx43 mittels qPCR in WB-F344 Zellen untersucht (Abb. 3.16).

Die Genexpression von Cx43 wurde 30 min und 1, 3, 6, 24 und 48 h nach der Behandlung

der Zellen mit 20 Pulsen mit Feldstärken von 10, 15 und 20 kV/cm analysiert. Die mRNA-

3 Ergebnisse

52

Level von Cx43 sind Zeit- und Feldstärke-abhängig verändert, wobei sich die signifikan-

testen Änderungen eine Stunde nach dem Applizieren von Pulsen mit 20 kV/cm zeigten.

Für diese Feldstärke war die Genexpression 30 min nach der Behandlung fast um die Hälfte

vermindert. Nach einer Stunde sank sie noch weiter ab auf einen Wert von etwa 45 % im

Vergleich zur Kontrolle. 3 h nach dem Anlegen der Pulse befand sich der mRNA-Level

fast wieder auf dem Niveau der Kontrolle, fiel nach 6 h aber wieder auf einen Wert von

etwa 70 %. Auch 24 und 48 h nach der Behandlung der Zellen war die Genexpression noch

um etwa 40 % im Vergleich zur Kontrolle vermindert. Die Änderungen der Genexpression

in Zellen, die mit Feldstärken von 10 bzw. 15 kV/cm behandelt wurden, sind ähnlich wie

die für 20 kV/cm, nur weniger ausgeprägt. Nach 30 bis 60 min waren die mRNA-Level auf

Werte zwischen 60 und 70 % im Vergleich zur Kontrolle abgesunken. Nach 3 h stieg die

Genexpression wieder auf 70 bzw. 80 % für Feldstärken von 10 bzw. 15 kV/cm. In Zellen,

die mit 15 kV/cm behandelt wurden, blieb der mRNA-Level 6, 24 und 48 h nach dem Ap-

plizieren der Pulse relativ konstant auf einem Wert von etwa 65 % im Vergleich zur Kon-

trolle, während die Werte für Zellen, die mit 10 kV/cm behandelt wurden, zwischen 66 und

80 % schwankten.

Abb. 3.16 Analyse der mRNA Expression von Cx43 30 min und 1, 3, 6, 24 und 48 h nach der

Behandlung der WB-F344 Zellen mit 20 Pulsen mit 10, 15 bzw. 20 kV/cm. Dargestellt sind die

Mittelwerte prozentual im Vergleich zur Kontrolle ± SD.

3 Ergebnisse

53

3.7 Analyse der MAP-Kinase-Aktivierung und der Proteinexpression von

Cx43

Die ZZK über GJs wird sowohl über die Menge an GJs in der Plasmamembran als auch

deren Öffnungszustand reguliert. Diese Größen wiederum werden durch den Phosphory-

lierungsstatus der Connexine und die Aktivierung von MAP-Kinasen beeinflusst. Deshalb

wurden die Aktivierung von p38 und Erk1/2 und die Phosphorylierung von Cx43 nach der

Behandlung der WB-F344 Zellen mit 20 Pulsen mit Feldstärken von 10, 15 und 20 kV/cm

analysiert. Die Proben zur Untersuchung der MAP-Kinasen wurden 15 und 30 min und 1,

3 und 6 h nach dem Applizieren der Pulse gesammelt.

Die Proteinkonzentrationen der Proben waren mit nur ca. 1 µg/µl relativ gering. Zudem

konnte nicht ausgeschlossen werden, dass Proteine, die für gewöhnlich als Housekeeping-

Proteine genutzt werden, wie z.B. Aktin, ebenfalls durch die Behandlung der Zellen mit

nsPEFs verändert wurden. Deshalb wurden die Werte gegen das Gesamtprotein normali-

siert. Dazu wurde zuerst das Gesamtprotein für jede Spur mit der Analyse Toolbox be-

stimmt. Anschließend wurde das Volumen jeder Bande mit der 1D-Gelanalyse ermittelt.

Die Volumina der Banden wurden gegen das Gesamtprotein normalisiert und diese Werte

gegen die Kontrolle normiert. Daraus ergaben sich die relativen Änderungen der behandel-

ten Proben im Vergleich zur Kontrolle.

3.7.1 Erk1/2

Die Analyse von Erk1/2 zeigte eine signifikante Zeit- und Feldstärke-abhängige Phospho-

rylierung (Abb. 3.17). Zellen, die mit 20 kV/cm behandelt wurden, wiesen nach 15 min

eine fast 9-fach erhöhte Aktivierung von Erk2 im Vergleich zur Kontrolle auf. Das Appli-

zieren von Pulsen mit einer Feldstärke von 10 bzw. 15 kV/cm führte zu einer Erhöhung der

Phosphorylierung von Erk2 auf das 2- bzw. 3-fache. Eine Stunde nach der Behandlung der

Zellen mit 20 kV/cm sank der phosphorylierte Anteil von Erk2 im Vergleich zum Zeitpunkt

nach 15 min ab, war aber immer noch etwa 6-fach erhöht im Vergleich zur Kontrolle. Der

Wert für Erk2 für 15 kV/cm war auf Kontroll-Niveau gesunken. Nach 6 h waren alle Werte

im Bereich der Kontrolle. Im Gegensatz zu Erk2 war für alle applizierten Feldstärken kaum

eine Änderung im Phosphorylierungsmuster von Erk1 detektierbar.

3 Ergebnisse

54

Abb. 3.17 Verhältnis von phosphoryliertem zu unphosphoryliertem Erk1/2 15 min und 1 und 6 h

nach der Behandlung der WB-F344 Zellen mit 20 Pulsen mit 10, 15 bzw. 20 kV/cm. Dargestellt

sind die Mittelwerte der Änderungen im Vergleich zur Kontrolle (gepunktete Linie) ± SD.

3 Ergebnisse

55

3.7.2 p38

Im Gegensatz zu Erk1/2 zeigte die Analyse von p38 eine späte Phosphorylierung, die erst

6 h nach der Behandlung der Zellen mit nsPEFs auftrat. Die Aktivierung von p38 war aber

ebenfalls Feldstärke-abhängig (Abb. 3.18).

Abb. 3.18 Verhältnis von phosphoryliertem zu unphosphoryliertem p38 15 und 30 min und 1, 3

und 6 h nach der Behandlung der WB-F344 Zellen mit 20 Pulsen mit 10, 15 bzw. 20 kV/cm. Dar-

gestellt sind die Mittelwerte der Änderungen im Vergleich zur Kontrolle (gepunktete Linie) ± SD.

Der phosphorylierte Anteil an p38 stieg 6 h nach der Behandlung der Zellen mit 20 kV/cm

auf ungefähr das 5,5-fache im Vergleich zur Kontrolle an. In Zellen, die 10 und 15 kV/cm

ausgesetzt waren, erhöhte sich die Aktivierung von p38 nach 6 h etwa um das 2,5- bzw.

4,5-fache. Zu allen anderen untersuchten Zeitpunkten waren die phosphorylierten Anteile

von p38 im Bereich der Kontrolle bzw. sogar etwas unterhalb des Kontroll-Niveaus.

3.7.3 Cx43

Die Gelelektrophorese zur Detektion von Cx43 zeigte drei getrennte Banden, die die unter-

schiedlichen Phosphorylierungszustände des Connexins widerspiegeln. Dabei steht die P0-

Bande für das unphosphorylierte, die P1-Bande für das phosphorylierte und die P2-Bande

für das hyperphosphorylierte Cx43. Eine Hyperphosphorylierung von Connexin wird mit

der Inhibierung der ZZK assoziiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.19 dargestellt.

3 Ergebnisse

56

Abb. 3.19 Verhältnis von phosphoryliertem zu unphosphoryliertem Cx43 30 min und 6 und 24 h

nach der Behandlung der WB-F344 Zellen mit 20 Pulsen mit 10, 15 bzw. 20 kV/cm. Dargestellt

sind die Mittelwerte der Änderungen im Vergleich zur Kontrolle (gepunktete Linie) ± SD.

Die Behandlung der WB-F344 Zellen mit nsPEFs führte 30 min nach dem Applizieren der

Pulse für alle untersuchten Feldstärken zu einem 2,5- bis 3-fachen Anstieg des hyperphos-

phorylierten Anteils an Cx43 (P2) im Vergleich zur Kontrolle. Gleichzeitig sank der Anteil

an phosphoryliertem (P1) und unphosphoryliertem Cx43 (P0) etwa auf die Hälfte ab. Nach

6 h befanden sich die Werte für alle Phosphorylierungszustände für alle Feldstärken wieder

ungefähr auf Kontroll-Niveau. Lediglich im Fall der mit 10 kV/cm behandelten Zellen war

der Wert für P2 leicht, jedoch nicht signifikant, auf etwa das 2-fache erhöht. 24 h nach der

Behandlung hingegen war der Anteil an hyperphosphoryliertem Cx43 in Zellen, die mit

3 Ergebnisse

57

einer Feldstärke von 10 kV/cm behandelt wurden, signifikant um etwa das 3-fache im Ver-

gleich zur Kontrolle gestiegen. Gleichzeitig war die Menge an unphosphoryliertem Cx43

ungefähr um die Hälfte gesunken. Der phosphorylierte Anteil war nur leicht erhöht. Die

Änderungen in Zellen, die mit 15 und 20 kV/cm behandelt wurden, waren nicht signifikant.

Hier stieg der Wert für P2 auf das 1,5- bis 2-fache, während P1 im Vergleich zur Kontrolle

nur leicht erhöht war und sich P0 im Bereich der Kontrolle befand.

Die Genexpression von Cx43 war nach der Behandlung der Zellen mit nsPEFs signifikant

vermindert, deshalb wurde zusätzlich zum Phosphorylierungsstatus auch die Gesamtmenge

an Cx43 untersucht (Abb. 3.20). Dazu wurden die Werte der P0-, P1- und P2-Bande addiert.

Abb. 3.20 Änderung der Gesamtmenge an Cx43 30 min und 24 h nach der Behandlung der

WB-F344 Zellen mit 20 Pulsen mit 10, 15 und 20 kV/cm. Dargestellt sind die Mittelwerte der Än-

derungen im Vergleich zur Kontrolle (gepunktete Linie) ± SD.

Eine halbe Stunde nach dem Applizieren der Pulse war die Gesamtmenge in Zellen, die mit

15 und 20 kV/cm behandelt wurden, signifikant um mehr als die Hälfte reduziert. In Zellen,

die einer Feldstärke von 10 kV/cm ausgesetzt waren, betrug die Cx43-Expression nach

30 min noch etwa 60 % des Kontrollwertes. 24 h nach der Behandlung der Zellen befand

sich die Gesamtproteinmenge an Cx43 für alle angelegten Feldstärken wieder im Bereich

der Kontrolle.

3.8 Effekte von nsPEFs auf die Elastizität von Zellen

Der Elastizitätsmodul verhält sich proportional zur applizierten Kraft und antiproportional

zum Quadrat der Eindrücktiefe der Spitze des Cantilevers in die Zelle. Folglich bedeuten

3 Ergebnisse

58

niedrige Elastizitätsmoduln von nur wenigen kPa, dass die Struktur eher weich ist, während

hohe Elastizitätsmoduln mit Werten von über 100 kPa auf steifere Strukturen verweisen.

Maligne Zellen sind wesentlich weicher als gesunde (s. Kap. 1.3), zudem hängt die Zell-

elastizität stark vom Zelltyp ab. Da in der vorliegenden Arbeit die mit dem Onkogen ras

transformierten WB-F344 Zellen als Tumorzelllinie zu den normalen WB-F344 Zellen un-

tersucht wurden, sind beide Zelllinien in Bezug auf ihre Elastizität direkt miteinander ver-

gleichbar. Ziel der rasterkraftmikroskopischen Messungen war es herauszufinden, ob Zel-

len, die mit nsPEF behandelt wurden, anschließend eine ähnliche Elastizität aufweisen wie

Tumorzellen und somit eventuell auch die mit einer geringen Elastizität assoziierten Eigen-

schaften hinsichtlich Malignität und Invasivität annehmen. Die AFM-Messungen wurden

nur an Zellen durchgeführt, die mit einer Feldstärke von 20 kV/cm behandelt wurden, da

die zuvor beschriebenen Veränderungen bezüglich ZZK und Umstrukturierung des Aktin-

Zytoskeletts hier am größten waren.

Abb. 3.21 zeigt eine typische AFM-Aufnahme der Topographie und der Elastizitätsmoduln

eines unbehandelten WB-F344 Monolayers bei einer Eindrücktiefe des Cantilevers von

300 nm. In den topographischen Aufnahmen (linkes Bild) stellen sich erhöhte Strukturen

im Vergleich zu flacheren Zellabschnitten heller dar. Im Fall der Elastizitätsmoduln (rech-

tes Bild) sind weichere Bereiche dunkler abgebildet. D.h. je steifer eine Struktur ist, desto

heller erscheint sie im Bild.

Die topographische Darstellung zeigt, dass der Zellkern (grüner Pfeil) gegenüber dem Zell-

rand (gelber Pfeil) erhaben ist. Zudem sind zahlreiche, parallel ausgerichtete Aktinfasern

zu erkennen (rote Pfeile), die sich über die komplette Zelle erstrecken und am Zellrand in

gegenüberliegenden „Polen“ zusammenlaufen (blaue Pfeile). Die beschriebenen Struktu-

ren sind auch über die Verteilung der Elastizitätsmoduln gut erkennbar. Der Bereich über

dem Zellkern (grüner Pfeil) ist deutlich weicher als der Rest der Zelle, ersichtlich an der

dunkleren Darstellung. Da die Aktinfasern, die sich über den Zellkörper erstrecken, steifer

sind als der den Zellkern umgebende Cortex, heben sie sich als helle Linien vom Unter-

grund ab (rote Pfeile). Auch die Zellränder, die wesentlich steifer sind als der restliche

Zellkörper, sind deutlich zu erkennen (gelber Pfeil). Die steifsten Bereiche der Zelle bilden

jedoch die Bereiche, in denen die Aktinfasern am Zellrand zusammenlaufen (blaue Pfeile).

3 Ergebnisse

59

Abb. 3.21 Typische AFM-Aufnahme eines unbehandelten WB-F344 Monolayers. Das linke Bild

zeigt die Oberflächen-Topographie, das rechte die Elastizitätsmoduln der Zellen. Beide Bilder ge-

hen aus derselben Messung hervor, die aus 4096 einzelnen Kraftkurven besteht. Der grüne Pfeil

deutet auf den Zellkern, die blauen und gelben Pfeile zeigen auf den Zellrand. Über die gesamte

Zelle spannen sich parallel ausgerichtete Aktin-Fasern (rote Pfeile).

Die Messungen an den mit nsPEFs behandelten Zellen konnten nicht an exakt denselben

Zellen aufgenommen werden wie die Messungen an den unbehandelten Zellen, da die

Hochspannungspulse mit dem verwendeten Versuchsaufbau nicht unter dem AFM appli-

ziert werden konnten. Somit konnten keine direkten Änderungen der Elastizitätsmoduln im

Vergleich zu den unbehandelten Zellen bestimmt werden. Ein weiteres Problem stellte die

Behandlung der Zellen bei Raumtemperatur dar, wodurch das Medium über den Zellen

abkühlte. Unter dem AFM im PetriDishHeater, der auf 37 °C eingestellt war, erwärmte sich

das Medium wieder. Der sukzessive Temperaturanstieg führte zu einer Drift des Laser-

strahls, wodurch eine Messung erst möglich war, nachdem die Temperatur des Mediums

annähernd konstant blieb, was erst nach etwa 8 min der Fall war. Eine Drift des Laserstrahls

führt zu einer schrägen Baseline der aufgenommenen Kraftkurve. Da bei der Auswertung

eine Baseline-Korrektur vorgenommen wurde, hatten leichte Temperaturänderungen je-

doch kaum einen Einfluss auf das Ergebnis.

3.8.1 Zeitliche Entwicklung der Elastizitätsmoduln

Wie die Immunfluoreszenz-Färbung von Aktin zeigte (Abb. 3.14), führte die Behandlung

der WB-F344 Monolayer zu einer Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts. Das Zytoske-

lett ist maßgeblich für die Stabilität einer Zelle verantwortlich. Um festzustellen, ob sich in

Folge der Behandlung mit nsPEFs auch die Elastizität der Zellen geändert hatte, wurden

die Elastizitätsmoduln der Zellen bestimmt. Dazu wurden Zeitreihen zwischen 8 und

3 Ergebnisse

60

28 min nach dem Applizieren von 20 Pulsen mit einer Feldstärke von 20 kV/cm aufgenom-

men, die den Verlauf der Elastizitätsänderungen zeigen. Es wurde auch eine Zeitreihe eines

unbehandelten Monolayers aufgenommen, um ausschließen zu können, dass sich die Zell-

elastizität aufgrund der mechanischen Beanspruchung durch die Messung oder generell den

Bedingungen des Untersuchungsprotokolls geändert hatte.

3 Ergebnisse

61

Abb. 3.22 AFM-Aufnahmen der Topographie (linke Spalte) und der Elastizitätsmoduln (mittlere

Spalte) eines WB-F344 Monolayers nach der Behandlung mit 20 Pulsen mit einer Feldstärke von

20 kV/cm (a), und zum Vergleich an einem unbehandelten Monolayer (b). Die Aufnahmen wurden

zwischen 8 und 28 min (in 5 min-Abständen) nach dem Applizieren der Pulse gemacht. Die rechte

Spalte zeigt die Verteilung der Elastizitätsmoduln, über die eine Gauß-Funktion gefittet wurde (x-

Achse: YM / xmax: 600 kPa; y-Achse: counts / ymax:250). In den Histogrammen sind zusätzlich die

Peak-Werte der Gauß-Kurven ± SD (berechnet aus den Halbwertsbreiten der Kurven) angegeben.

3 Ergebnisse

62

Abb. 3.22a zeigt ein Beispiel einer mit dem AFM aufgenommenen Zeitreihe der Oberflä-

chen-Topographie (linke Spalte) und der Elastizitätsmoduln (mittlere Spalte) eines mit

nsPEFs (20 Pulse, 20 kV/cm) behandelten WB-F344 Monolayers. Zusätzlich sind die Ver-

teilungen der Elastizitätsmoduln abgebildet, die mit einer Gauß-Funktion gefittet wurden,

zusammen mit den Peak-Werten der Gauß-Fits und der zugehörigen Standardabweichung,

die über die Halbwertsbreiten der Gauß-Glockenkurven berechnet wurden (rechte Spalte).

Zum Vergleich zeigt Abb. 3.22b die Zeitreihe einer AFM-Messung an einem unbehandel-

ten WB-F344 Monolayer.

Die topographischen Aufnahmen des behandelten Monolayers (Abb. 3.22a, linke Spalte)

zeigen eine deutliche Veränderung der Zellen mit der Zeit. Bis 13 min nach der Behandlung

sind wohldefinierte, parallel ausgerichtete Aktinfasern (rote Pfeile) zu erkennen, die sich

über die komplette Zelle spannen. Zwischen 18 und 28 min nach dem Applizieren der

Hochspannungspulse änderte sich die Form der Zelle deutlich, sie wurde wesentlich runder.

Zudem sind kaum noch Aktinfasern zu erkennen, die sich über die gesamte Länge der Zelle

erstrecken. Die Aktinfasern scheinen in Bruchstücke zerfallen zu sein und die „Pole“ der

Zelle (blaue Pfeile) sich aufgelöst zu haben. Diese Veränderungen sind auch in den Abbil-

dungen der Elastizitätsmoduln (Abb. 3.22a, mittlere Spalte) deutlich ersichtlich. 8 min nach

dem Applizieren der Hochspannungspulse sind die Aktinfasern noch weitestgehend intakt

und die Zellstruktur und -form gut erkennbar. Ab 13 min nach der Behandlung der Zellen

mit nsPEFs wird die Verteilung der Elastizitätsmoduln immer diffuser, d.h. es sind kaum

noch Aktinfasern zu erkennen und auch die Zellränder sind nur noch schwer auszumachen.

Zwischen 18 und 28 min nach dem Anlegen der Hochspannungspulse ist anhand der Ab-

bildung der Elastizitätsmoduln keine Zellstruktur mehr ersichtlich. Diese Entwicklung kor-

reliert mit der Verteilung der Elastizitätsmoduln (Abb. 3.22a, rechte Spalte). 8 min nach

Behandlung waren die Zellen in der beschriebenen Beispielmessung mit einem Mittelwert

der Gauß-Kurven-Peaks von knapp 62 kPa eher weich. Bis 18 min nach dem Applizieren

der Hochspannungspulse stieg dieser Wert auf 110 kPa, die Zellen wurden also steifer,

bevor er anschließend wieder auf knapp 80 kPa absank. Auch die Halbwertsbreiten der

Gauß-Fits über die Verteilung der Elastizitätsmoduln änderten sich deutlich. 8 min nach

der nsPEF-Behandlung war die Verteilung mit einer Standardabweichung von knapp 35

kPa eher schmal, während sie zu 18 min hin immer breiter wurde und einen Wert von etwa

55 kPa erreichte. Das Ergebnis der letzten Messungen nach 28 min war mit einer Stan-

dardabweichung von 37 kPa ähnlich dem Ergebnis der ersten Messung.

3 Ergebnisse

63

Im Vergleich zu den behandelten Zellen zeigte die gemessene Zeitreihe der unbehandelten

Zellen kaum eine Veränderung, weder in der Topographie noch in der Entwicklung der

Elastizitätsmoduln. In allen Bildern ist die Zellstruktur mit den wohldefinierten, parallel

ausgerichteten Aktinfasern zu erkennen. Auch die Elastizitätsmoduln (mittlere Spalte) än-

dern sich kaum, lediglich der steife Bereich am linken Zellrand (blauer Pfeil) wird mit der

Zeit etwas größer. Diese Entwicklung ist auch an der Verteilung der Elastizitätsmoduln

(rechte Spalte) erkennbar, deren Durchschnittswert von ca. 85 kPa auf etwa 105 kPa an-

steigt. Im Unterschied zu den mit nsPEFs behandelten Zellen waren die Halbwertsbreiten

der Gauß-Fits über die gesamte Messreihe weitestgehend konstant geblieben, mit Werten

für die Standardabweichung zwischen 47 und 55 kPa.

Abb. 3.23 Zeitlicher Verlauf der Youngschen Moduln von WB-F344 Zellen nach dem Applizieren

von 20 Pulsen mit einer Feldstärke von 20 kV/cm im Vergleich zu unbehandelten WB-F344 und

WB-ras Zellen. Dargestellt sind die Mittelwerte der Gauß-Kurven-Peaks ± SD von sieben gemes-

senen Zeitreihen. (WB-F344 ctrl: n = 14; WB-ras ctrl: n = 5). Die Signifikanzen wurden mithilfe

eines ungepaarten t-Tests ermittelt, mit einer Signifikanz von p < 0,05 (*).

Insgesamt wurde der zeitliche Verlauf der Elastizitätsmoduln an sieben verschiedenen WB-

F344 Monolayern nach dem Applizieren von 20 Pulsen mit einer Feldstärke von 20 kV/cm

aufgenommen. Die Werte für die Kontrollen wurden aus 14 (WB-F344) bzw. 5 (WB-ras)

Messungen bestimmt. Abbildung 3.23 zeigt die aus diesen Messungen resultierenden Mit-

telwerte der Gauß-Kurven-Peaks im Vergleich zu den Werten von unbehandelten WB-

0

20

40

60

80

100

WB-ras

unbeh.

WB-F344

unbeh.

8 13 18 23 28

YM

/ k

Pa


*

3 Ergebnisse

64

F344 und WB-ras Zellen. Die Fehlerbalken entsprechen den Mittelwerten der Standardab-

weichungen, die für jede Messung aus der Halbwertsbreite der Gauß-Kurven-Fits bestimmt

wurden. Für die Auswertung wurden alle Werte von jeweils der kompletten Aufnahme ver-

wendet.

Die unbehandelten WB-F344 Zellen hatten einen mittleren Elastizitätsmodul von etwa

61 kPa. Die Messung der Zellen 8 min nach der Behandlung mit nsPEFs zeigte, dass die

Zellen mit einem mittleren Elastizitätsmodul von knapp 43 kPa im Vergleich signifikant

weicher geworden waren. Bereits 13 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse

lag der Elastizitätsmodul mit 58 kPa nur noch knapp unter dem Wert der Kontrolle. Die

Messungen 18 und 23 min nach der nsPEF-Behandlung der Monolayer zeigten sogar eine

leichte Erhöhung der Elastizitätsmoduln im Vergleich zur Kontrolle, auf einen Wert von

etwa 70 kPa. Dieser Unterschied ist jedoch statistisch nicht signifikant. Bei der letzten Mes-

sung nach 28 min wiesen die Zellen wieder annähernd die gleiche Elastizität wie die unbe-

handelte Kontrolle auf (ca. 61 kPa). Im Vergleich dazu waren die tumorigenen WB-ras

Zellen generell wesentlich weicher. Mit ca. 20 kPa war der mittlere Elastizitätsmodul der

unbehandelten Tumorzellen nur etwa ein Drittel so hoch wie der der unbehandelten WB-

F344 Zellen und nur etwa halb so hoch der der behandelten WB-F344 Zellen 8 min nach

dem Applizieren der Hochspannungspulse.

3.8.2 Vergleich der Elastizität über dem Zellkern und dem Zellrand

Die Elastizitätsmoduln der Zellen variieren stark und hängen unter anderem von der Zell-

dichte im Monolayer ab. Um zu untersuchen, ob die Hochspannungspulse unterschiedliche

Effekte auf verschiedene Bereiche der Zelle haben, wurden die Elastizitätsmoduln separat

über dem Zellkern und dem Zellrand bestimmt. Dazu wurden dieselben Messungen ver-

wendet, die bereits im vorhergehenden Kapitel beschrieben wurden. Es wurden Ausschnitte

von 25 x 25 Kraft-Abstands-Kurven über dem Kern bzw. dem Rand ausgewählt und eben-

falls mittels Gauß-Fits ausgewertet.

Die Ergebnisse der Elastizitätsuntersuchungen an WB-F344 Zellen, die mit 20 Pulsen mit

einer Feldstärke von 20 kV/cm behandelt wurden, sind in Abb. 3.24 gezeigt. Dargestellt ist

der zeitliche Verlauf der Elastizitätsmoduln für Bereiche über dem Zellkern (Abb. 3.24a)

und dem Randbereich von Zellen (Abb. 3.24b) im Vergleich zu den entsprechenden Berei-

chen von unbehandelten WB-F344 und WB-ras Zellen.

3 Ergebnisse

65

Abb. 3.24 Zeitlicher Verlauf der Youngschen Moduln im Bereich über dem Zellkern (a) bzw. dem

Zellrand (b) von WB-F344 Zellen nach dem Applizieren von 20 Pulsen mit einer Feldstärke von

20 kV/cm im Vergleich zu unbehandelten WB-F344 und WB-ras Zellen. Dargestellt sind die Mit-

telwerte der Gauß-Kurven-Peaks ± SD von sieben gemessenen Zeitreihen. (WB-F344 ctrl: n = 14;

WB-ras ctrl: n = 5). Zu beachten sind die deutlich verschiedenen Skalen der y-Achse. Die Signifi-

kanzen wurden mithilfe eines ungepaarten t-Tests ermittelt, mit einer Signifikanz von p < 0,05 (*).

0

20

40

60

80

100

WB-ras

unbeh.

WB-F344

unbeh.

8 13 18 23 28

YM

/ k

Pa


Zellkern

*

a)

0

40

80

120

160

200

240

WB-ras

unbeh.

WB-F344

unbeh.

8 13 18 23 28

YM

/ k

Pa


Zellrandb)

*

*

3 Ergebnisse

66

Der mittlere Elastizitätsmodul von unbehandelten WB-F344 Zellen lag über dem Kern bei

etwa 60 kPa. 8 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse sank die Elastizität

signifikant um knapp die Hälfte auf 36 kPa, und stieg dann bis 23 min nach der Behandlung

stetig auf einen Wert von 64 kPa. 28 min nach der nsPEF-Behandlung näherte sich der

Elastizitätsmodul mit einem Wert von über 57 kPa wieder dem Kontrollniveau. Die Elas-

tizität über dem Zellkern der tumorigenen WB-ras Zellen lag bei 32 kPa und war damit nur

unwesentlich geringer wie die der WB-F344 Zellen 8 min nach dem Applizieren der

nsPEFs. Im Vergleich dazu lagen die Elastizitätsmoduln von unbehandelten WB-F344 Zel-

len in den Bereichen über dem Zellrand bei knapp 150 kPa und die von unbehandelten WB-

ras Zellen bei etwa 120 kPa. 8 min nach der nsPEF-Behandlung sank der mittlere Elastizi-

tätsmodul signifikant um fast die Hälfte auf 80 kPa. Im weiteren Verlauf änderte sich die

Elastizität über dem Rand kaum, war jedoch im Vergleich zur Kontrolle nicht mehr signi-

fikant verändert. 13 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse betrug der Elasti-

zitätsmodul ca. 91 kPa und nach 18 min 92 kPa. 23 min nach der nsPEF-Behandlung lag

der Wert bei knapp über 100 kPa, bevor er anschließend wieder auf 95 kPa absank. Im

Gegensatz zu der Elastizität über dem Zellkern erholte sie sich über dem Zellrand nicht

mehr und lag auch eine halbe Stunde, nachdem die Zellen den elektrischen Pulsen ausge-

setzt waren, deutlich unterhalb des Kontrollwertes.

3.8.3 Zusammenhang von Elastizität und Zytoskelett

Wie im vorhergehenden Kapitel beschrieben, sind tumorigene Zellen deutlich weicher als

nicht-tumorigene Zellen. Da die Elastizität von Zellen maßgeblich durch das Zytoskelett

bestimmt wird, wurde zum Vergleich zu den AFM-Aufnahmen auch das F-Aktin in

WB-F344 und WB-ras Monolayern angefärbt (Abb. 3.25).

In den AFM-Aufnahmen der WB-F344 Zellen sind sowohl in der topographischen

Darstellung als auch in der Abbildung der Elastizitätsmoduln deutlich zahlreiche, parallel

verlaufende Aktinfasern zu erkennen, die sich über die gesamte Zelle erstrecken (rote

Pfeile). Auch die Immunfluoreszenzfärbung des F-Aktin zeigt klar definierte Aktinfasern,

die über die gesamte Zelle gespannt sind. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich sowohl

die AFM-Aufnahmen als auch die Immunfluoreszenzfärbung des WB-ras Monolayers

stark von denen des WB-F344 Monolayers. Die Farbcodierung der AFM-Aufnahmen zeigt,

dass die Tumorzellen im Vergleich zu den normalen Zellen deutlich höher, gleichzeitig

jedoch wesentlich weicher sind. Die Maximalwerte für die WB-F344 Zellen betragen

3 Ergebnisse

67

knapp 960 nm bzw. 600 kPa, während die WB-ras Zellen Werte von 3,45 µm und 344 kPa

erreichen. Im Fall der tumorigenen WB-ras Zellen sind weder in der Topographie noch in

der Abbildung der Elastizitätsmoduln definierte Aktinfasern erkennbar. Dieses Ergebnis

korreliert mit der Immunfluoreszenzfärbung. Die Färbung des F-Aktin in den WB-ras

Zellen zeigt keine klar erkennbaren Aktinfasern, sondern weist vielmehr ein diffuses

Fluoreszenzsignal im Zellinneren auf. Auch die Umrisse der Tumorzellen sind in der

Immunfluoreszenzfärbung nicht so deutlich begrenzt wie im Fall der WB-F344 Zellen

(gelbe Pfeile). Im Vergleich dazu waren die Aktinfasern in WB-F344 Zellen nach der

Behandlung mit nsPEFs in Bruchstücke zerfallen. Die Umstrukturierung war auch 28 min

nach der Behandlung noch zu erkennen (s. Kap. 3.5, Abb. 3.14).

Abb. 3.25 AFM-Aufnahmen der Topographie (linke Spalte) und der Elastizitätsmoduln (mittlere

Spalte) eines unbehandelten WB-F344 Monolayers (obere Reihe) und eines WB-ras Monolayers

(untere Reihe). Zum Vergleich dazu zeigt die rechte Spalte die Immunfluoreszenzfärbung des

Aktinzytoskeletts. Die roten Pfeile weisen auf Aktinfasern, die gelben auf den Zellrand.

3.9 Effekte von nsPEFs auf Kanzerogenese und Invasivität von Zellen

Die Ergebnisse zur Behandlung der Zellen mit nsPEFs zeigen, dass diese sowohl eine In-

hibierung der ZZK als auch eine Verminderung der Zellelastizität zur Folge haben. Beides

wird mit Kanzerogenität und Invasivität assoziiert (s. Kap. 1.2.3 und 1.3). Um zu überprü-

fen, ob mit nsPEFs behandelte Zellen tumorigene Eigenschaften entwickeln, wurde zum

3 Ergebnisse

68

einen ein Scratch Assay durchgeführt, um die Proliferation und die Migrationsgeschwin-

digkeit von mit nsPEFs behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu un-

tersuchen. Zum anderen wurde ein Soft Agar Colony Formation Assay gemacht, der Hin-

weise auf eine maligne Transformation der Zellen gibt.

3.9.1 Migration und Proliferation

Abbildung 3.26 zeigt die Mikroskopie-Aufnahmen eines unbehandelten WB-F344 Mo-

nolayers zu Anfang, also direkt nach dem Setzen des Kratzers, (a) und zum Ende des

Scratch Assays (nach 24 h) (b). Die Doppelpfeile beschreiben die ausgemessenen Spalt-

breiten, die für die in Kap. 2.12 beschriebene Auswertung benötigt wurden, bei der der

Anteil des zugewachsenen Spaltes bestimmt wurde.

Abb. 3.26 Scratch Assay durchgeführt an einem unbehandelten WB-F344 Monolayer. Gezeigt sind

die Mikroskopie-Aufnahmen des Kratzers zu Anfang (a) und nach 24 h des Scratch Assays (b).

Das Ergebnis des Scratch Assays ist in Abb. 3.27 dargestellt. Es wurde das Zuwachsen des

Spaltabstandes von unbehandelten WB-F344 und WB-ras Zellen mit dem von WB-F344

Zellen verglichen, die mit 20 Pulsen und einer Feldstärke von 15 bzw. 20 kV/cm behandelt

worden waren. In den ersten 15 Stunden nach dem Setzen des Kratzers war der Spalt in den

WB-ras Monolayern wesentlich schneller zugewachsen als in den WB-F344 Monolayern.

Zudem war im Fall der WB-F344 Monolayer bis zu diesem Zeitpunkt kaum ein Unter-

schied zwischen behandelten und unbehandelten Zellen festzustellen. 2,5 h nach dem Ap-

plizieren der Hochspannungspulse war der Spalt der behandelten sowie der unbehandelten

Zellen jeweils um ca. 6,5 % zugewachsen, während sich der Spaltabstand zwischen den

Tumorzellen zu diesem Zeitpunkt bereits um über 11 % verkleinert hatte. Nach 5 h war das

Zellwachstum von allen WB-F344 Zellen weiterhin gleich, in allen drei Fällen war der

Spalt um etwa 15 % im Vergleich zum ursprünglichen Kratzer zugewachsen. Im Gegensatz

3 Ergebnisse

69

dazu war der Spalt in den WB-ras Monolayern zu diesem Zeitpunkt bereits um über 23 %

zugewachsen. Dieser Unterschied zwischen den WB-F344 und den WB-ras Zellen blieb

auch 7,5 h nach der nsPEFs-Behandlung bestehen. Der Spalt in den WB-ras Zellen war um

mindestens 5 % mehr zugewachsen als der in den WB-F344 Zellen. Ab 10 h nach Beginn

des Scratch Assays wurde der Wachstumsvorsprung der WB-ras Zellen kleiner und betrug

maximal noch etwa 3 %, ab 12,5 h waren es noch ca. 2 %.

Abb. 3.27 Analyse des Scratch Assays von WB-F344 Zellen, die mit 20 Pulsen mit Feldstärken

von 15 und 20 kV/cm behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten WB-F344 und WB-ras

Zellen. Dargestellt ist der zugewachsene Anteil des Spaltes prozentual im Vergleich zur ursprüng-

lichen Spaltbreite als Mittelwert aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten ± SD.

In den ersten 15 h schloss sich der Spalt in den mit 20 kV/cm behandelten Monolayern nur

unwesentlich schneller im Vergleich zu den mit 15 kV/cm behandelten und den unbehan-

delten WB-F344 Zellen. In der Zeit zwischen 15 h und 24 h nach Beginn des Assays schie-

nen die Proliferation und Migration der WB-ras Zellen zu stagnieren, der Spalt wuchs in

dieser Zeit nur noch um 8 % weiter zu. Im Mittel war der ursprüngliche Kratzer in den WB-

ras Monolayern nur um 60 % zugewachsen. Der Spalt in den WB-F344 Zellen hingegen

wuchs auch in der Zeit zwischen 15 h und 24 h nach Beginn des Assays stetig weiter zu-

sammen, wobei es kaum einen Unterschied machte, ob die Zellen zuvor behandelt worden

waren oder nicht, und gleich mit welcher Feldstärke. Am Ende des Scratch Assays waren

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 24

zugew

achse

ner

Sp

alta

bst

and

/ %

Zeit nach der Behandlung / h

WB-ras

WB-F344 unbehandelt

WB-F344 15 kV/cm

WB-F344 20 kV/cm

3 Ergebnisse

70

die Kratzer in den WB-F344 Monolayern im Mittel um ungefähr 70 % zusammengewach-

sen. Eine Behandlung mit nsPEFs scheint also keinen Einfluss auf die Migration und

Proliferation von WB-F344 Zellen zu haben.

3.9.2 Maligne Transformation

Des Weiteren wurde ein Soft Agar Colony Formation Assay durchgeführt, mit dem unter-

sucht wurde, ob nsPEF-behandelte Zellen in der Lage sind verankerungsunabhängig zu

wachsen, was auf eine maligne Transformation der Zellen hindeuten würde (s. Kap. 2.13).

Abb. 3.28 Mikroskopie-Aufnahmen des Soft Agar Colony Formation Assays von WB-F344 Zellen,

die mit 20 kV/cm behandelt wurden (a), und von unbehandelten WB-F344 (b) und WB-ras Zellen

(c). Die Pfeile in a) und b) zeigen auf einzelne Zellen, während sich in c) deutlich erkennbar Kolo-

nien gebildet haben. (n = 3)

Abbildung 3.28 zeigt die Mikroskopie-Bilder, die drei Wochen nach Beginn des Assays

aufgenommen wurden. Neben WB-F344 Zellen, die mit 20 Pulsen und einer Feldstärke

von 20 kV/cm behandelt worden waren (Abb. 3.28a), sind zum Vergleich unbehandelte

WB-F344 (Abb. 3.28b) und WB-ras Zellen (Abb. 3.28c) abgebildet. Alle Aufnahmen wur-

den mit derselben Vergrößerung aufgenommen. Weder im Fall der behandelten noch der

unbehandelten WB-F344 Zellen waren Kolonien gewachsen. Die Pfeile zeigen auf mit

Giemsa gefärbte Zellen, die zwar im Agar überlebt hatten, jedoch nicht proliferierten. Im

Gegensatz dazu konnten die WB-ras Zellen auch verankerungsunabhängig im Agar wach-

sen und hatten deutlich erkennbar Kolonien gebildet (Pfeile Abb. 3.28c).

Der Soft Agar Colony Formation Assay wurde zusätzlich mit WB-F344 Zellen durchge-

führt, die zuvor mit 20 bzw. 100 Pulsen und Feldstärken von jeweils 10 und 15 kV/cm

behandelt worden waren. Keine der behandelten Gruppen bildete Kolonien aus (Daten

nicht gezeigt).

71

4 Diskussion

4.1 Vergleich idealer und realer Hochspannungspuls

Zur Behandlung der Zellen unter gut definierten Bedingungen, d.h. mit einem konstanten

elektrischen Feld, sollten idealerweise Rechteckpulse mit einer unendlich kurzen Anstiegs-

zeit verwendet werden. Wie die Abbildung eines typischen, mit dem Wellenleitungspuls-

generator generierten Pulses zeigt (Abb. 3.1), entsprach die Dauer des Hochspannungspul-

ses der gewünschten Länge von 100 ns mit einer relativ kurzen Anstiegszeit von etwa 13 ns

und die ausgegebene Spannung kam in etwa der über die Spannungsquelle angelegten

Spannung gleich. Dennoch wich die reale Pulsform von der idealen ab. Es kam aufgrund

von Reflektionen zu zusätzlichen Pulsen, die wie bereits in Kap. 3.1 beschrieben durch eine

nicht exakte Impedanzanpassung der Last an die Pulsgeneratorimpedanz entstehen. In die-

sem Fall war der Lastwiderstand, also der von Zellen und Medium, etwas kleiner als die

Impedanz des Pulsgenerators. Die Anpassung der Last könnte verbessert werden, indem

der Blumlein-Generator mit zwei in parallel betriebenen Kabeln aufgebaut werden würde,

wodurch sich die Impedanz des Pulsgenerators halbieren und sich dem Lastwiderstand an-

nähern würde. Im Fall eines zu hohen Lastwiderstands könnte die Impedanz durch einen

zusätzlichen, zur Last parallel geschalteten Widerstand exakt angepasst werden.

Die Amplituden der zusätzlichen Pulse sind allerdings wesentlich kleiner als die des Haupt-

pulses und zudem in der Amplitude schnell abnehmend (Abb. 3.2). Wie die Ergebnisse zur

Zellvitalität zeigen (Abb. 3.5), ist für diese geringen Spannungen, bzw. für die entsprechen-

den elektrischen Felder, kein wesentlicher oder nachhaltiger Einfluss auf die Zellen zu er-

warten, so dass sich die beobachteten Effekte tatsächlich auf den Hauptpuls zurückführen

lassen. Verstärkungen der biologischen Effekte durch die zusätzlichen Pulse können jedoch

nicht vollständig ausgeschlossen werden.

Die Simulation der elektrischen Feldstärkeverteilung (Abb. 3.3) zeigt, dass das Feld auf-

grund der Elektrodenkonfiguration nicht völlig homogen ist und die Feldstärke zwischen

den Elektroden um ca. 2 kV/cm variiert. Auch der reale Puls hatte nicht die Form eines

perfekten Rechteckpulses. Im Bereich des Amplituden-Plateaus lagen die Schwankungen

bei der höchsten angelegten Spannung von 10 kV bei etwa ± 2 kV. Für die Versuche wurde

die Feldstärke in Schritten von 5 kV/cm geändert. Die Variation der Feldstärke, die durch

4 Diskussion

72

die Elektrodengeometrie bzw. die nicht exakte Impedanzanpassung von Last- und Pulsge-

neratorwiderstand entstanden ist, war also geringer als die gewollte schrittweise Änderung

der Feldstärke in den Versuchen und somit im Hinblick auf die Zellvitalität vernachlässig-

bar.

4.2 Zellvitalität und Elektroporation

Wie die Ergebnisse des MTT-Tests (Abb. 3.5) zeigen, wiesen die tumorigenen WB-ras im

Vergleich zu den WB-F344 Zellen eine geringere Sensitivität gegenüber der Behandlung

mit nsPEFs auf. Dies könnte sich darauf zurückführen lassen, dass die Versuche an den

beiden Zelllinien in unterschiedlich zusammengesetzten Zellkulturmedien durchgeführt

wurden. So konnte bereits in einer Studie gezeigt werden, dass das Überleben und die

Membranintegrität von Zellen neben den Pulsparametern auch von den elektrischen Para-

metern der Zelle und des Mediums sowie der Zusammensetzung des Mediums abhängt.

Dabei spielen vor allem Calcium und Magnesium eine wichtige Rolle, die die Zellmembran

vor einer anhaltenden Schädigung schützen [152-154]. Da für die Zellen keine Elektropo-

ration nachgewiesen werden konnte, ist es eher unwahrscheinlich, dass die den Medien

zugesetzten Inhaltsstoffe einen direkten toxischen Effekt auf die Zellen hatten. Beide Me-

dien enthalten dieselbe Konzentration an Magnesium, jedoch nicht dieselbe Menge an Cal-

cium. Während das Medium für die normalen WB-F344 Zellen 1,8 mM Calcium enthielt,

waren in dem CCD-Medium für die tumorigenen WB-ras Zellen nur 1,36 mM Calcium

enthalten. Zudem waren die Leitfähigkeiten der beiden Zellkulturmedien mit knapp 14 mS

für das normale und 15,6 mS für das CCD-Medium leicht verschieden. Eine höhere Leit-

fähigkeit führt zu einer schnelleren Änderung des Transmembranpotentials und somit ei-

nem schnelleren Erreichen des Elektroporations-Schwellenwertes und letztendlich dem

schnelleren Abtöten der Zellen [152]. Betrachtet man nur die Zellkulturmedien, in denen

die Zellen behandelt wurden, müssten also mehr WB-F344 als WB-ras Zellen die nsPEF-

Behandlung überlebt haben, was jedoch nur für eine Feldstärke bis 20 kV/cm zutraf. Ab

25 kV/cm überlebten wesentlich mehr Tumorzellen als normale Zellen die nsPEF-Behand-

lung. Man könnte vermuten, dass ab dieser Feldstärke eine Art Schwellwert überschritten

wurde, ab dem die Zusammensetzung des Mediums keinen entscheidenden Einfluss mehr

auf die Vitalität der Zellen hatte, und die Ursache für die unterschiedliche Sensitivität der

beiden Zelllinien an den Zellen selbst lag. Bisherige Studien zeigten allerdings immer den

umgekehrten Fall, dass Tumorzellen sensitiver auf nsPEFs reagieren als normale Zellen

4 Diskussion

73

[155, 156]. Die Gründe für die unterschiedliche Ansprechbarkeit der beiden Zelllinien blei-

ben somit im Rahmen dieser Studie zunächst ungeklärt.

Das Überleben der Zellen wurde mittels MTT-Test untersucht, der auf der Messung der

metabolischen Aktivität von Zellen beruht (s. Kap. 2.4). Dabei dient die Menge des durch

Glykolyse umgesetzten Farbstoffs MTT als Maß für die Zellvitalität. Genau genommen

wird also nicht der Anteil der lebenden Zellen, sondern lediglich die Enzymaktivität der

Zellen bestimmt. Diese muss aber nicht zwangsläufig mit dem Anteil der lebenden Zellen

korrelieren. So könnte es sein, dass ein Teil der Zellen abgestorben ist, die überlebenden

Zellen jedoch einen erhöhten Stoffwechsel haben, was zu der Schlussfolgerung führen

würde, dass mehr Zellen die Behandlung überlebt haben als es tatsächlich der Fall war.

Umgekehrt könnten die Hochspannungspulse auch zu einer Verminderung der metaboli-

schen Aktivität geführt haben, was den umgekehrten Schluss nahelegen würde, dass weni-

ger Zellen die Behandlung überlebt haben als es tatsächlich der Fall war. Diese These, dass

nsPEFs die Enzymaktivität beeinflussen können, würde auch mit den Ergebnissen zum

Überleben der Zellen korrelieren. Betrachtet man das Diagramm in Abb. 3.5 zusammen

mit den Fehlerbalken, stieg die Enzymaktivität im Fall der WB-F344 Zellen nach der Be-

handlung der Zellen mit einer Feldstärke von 10 bzw. 15 kV/cm auf über 110 % im Ver-

gleich zur Kontrolle an, im Fall der WB-ras Zellen für eine applizierte Feldstärke von

5 kV/cm sogar auf 120 %. Da nicht plötzlich mehr Zellen im Well vorhanden sein können,

muss sich folglich die metabolische Aktivität der Zellen erhöht haben.

Der sprunghafte Anstieg der Enzymaktivität im Fall der WB-ras Zellen bei 25 kV/cm

könnte darauf zurückzuführen sein, dass sich die Tumorzellen, im Gegensatz zu den

WB-F344 Zellen, viel schneller von der Substratoberfläche ablösten. Bereits das Ablösen

von sehr kleinen Teilen des Monolayers änderte die gemessenen Absorptionswerte signifi-

kant. Deshalb weisen vor allem die Werte für die Enzymaktivität der WB-ras Zellen einen

relativ großen Fehlerbalken auf.

Des Weiteren können elektrochemische Effekte auf die Zellvitalität ausgeschlossen wer-

den. Die Zellen wurden zusammen mit dem MTT-Farbstoff für zwei Stunden inkubiert.

Hätten sich reaktive Spezies gebildet, hätten sich diese während der Inkubation im gesam-

ten Well verteilt und auf alle Zellen ausgewirkt. Die Effekte beschränkten sich jedoch auf

die Zellen zwischen den Elektroden (s. Abb. 3.4).

Die mögliche Bildung von Poren in der Plasmamembran wurde über die Aufnahme von PI

in die Zelle überprüft, das eine Molekülgröße von ca. 660 Da hat. Jedoch kann, gerade bei

einer wie für die vorliegende Arbeit verwendeten Pulslänge im Bereich von Nanosekunden,

4 Diskussion

74

nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Nanoporation, also zur Bildung sehr kleiner Poren

kommt, die zwar kein PI, dafür aber wesentlich kleinere Moleküle wie z.B. Ca2+ (40 Da)

durchlassen [157]. Diese Möglichkeit wurde nicht weiter untersucht, da Nanoporation kei-

nen Einfluss auf die Ergebnisse zur ZZK hat.

4.3 Zell-Zell-Kommunikation

In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss von Nanosekunden gepuls-

ten elektrischen Feldern auf die Gap Junction vermittelte Kommunikation zwischen Zellen

beschrieben. Dass elektrische Felder überhaupt einen Einfluss auf die ZZK haben können,

wurde bereits an prä-osteoplastischen MC3T3-E1 Zellen gezeigt, die extrem niederfre-

quenten elektromagnetischen Feldern ausgesetzt wurden, die eine Inhibierung der ZZK be-

wirkten [158]. Ein anderes Beispiel ist die Behandlung von Brustkrebszellen mit „Energie

regulierbaren steilen Pulsen“, die zu einer Erhöhung der Cx43 Expression führten [159].

In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass die ZZK in WB-F344 Zellen, die

Hochspannungspulsen mit einer Länge von 100 ns und Feldstärken zwischen 10 und

20 kV/cm ausgesetzt waren, Zeit- und Feldstärke-abhängig inhibiert wurde (Abb. 3.10). Da

auch die Pulsanzahl einen Einfluss auf die in Zellen hervorgerufenen Effekte haben kann,

wurden zum Vergleich auch Versuche mit 100 Pulsen (100 ns) und einer Feldstärke von

10 kV/cm hinsichtlich Vitalität und ZZK durchgeführt. Der MTT-Test ergab, dass die

nsPEF-Behandlung mit diesen Parametern ähnlich viele Zellen überlebt hatten wie die Be-

handlung mit 20 Pulsen und 20 kV/cm. Das Ergebnis des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer

Assay bezüglich der ZZK war für 100 Pulse vergleichbar mit dem Applizieren von 20 Pul-

sen und einer Feldstärke von 15 kV/cm. Diese ähnlichen Resultate für unterschiedliche

Pulszahlen bei gleicher Pulslänge können über den Energie-Eintrag in die Zellen erklärt

werden, der mit folgender Formel berechnet werden kann [160]:

∆𝐸 = 𝜎𝐸2𝑁𝜏 (4.1)

mit der Pulslänge τ, der Leitfähigkeit des Mediums σ, der elektrischen Feldstärke E und der

Pulszahl N. Da Pulslänge und Medium für beide Bedingungen gleich sind, unterscheidet

sich der Energie-Eintrag lediglich aufgrund der Feldstärke und der Anzahl der Pulse. Ver-

gleicht man die Anwendung von 100 Pulsen mit einer Feldstärke von 10 kV/cm mit der

4 Diskussion

75

von 20 Pulsen und 20 kV/cm, unterscheidet sich der Energie-Eintrag lediglich um einen

Faktor 0,2, der hinsichtlich biologischer Effekte vermutlich vernachlässigbar ist.

Für den Effekt der Hochspannungspulse auf die ZZK kommen mehrere mögliche durch

nsPEFs induzierte Mechanismen in Frage, wie z.B. eine Änderung des Membranpotentials

oder die Aktivierung von MAP-Kinasen, die nachfolgend diskutiert werden.

4.3.1 Verteilung von Cx43 in den Zellen

In der bereits erwähnten Studie an den prä-osteoplastischen MC3T3-E1 Zellen, die extrem

niederfrequenten elektromagnetischen Feldern von 0-15 G und 2,3279 mV/m bei 60 Hz

ausgesetzt waren, war die ZZK während ihrer Proliferationsphase vermindert. Gleichzeitig

blieb die Menge und Verteilung von Cx43 in den Zellen jedoch unverändert [158]. In der

vorliegenden Arbeit zeigte die Immunfluoreszenzfärbung von Cx43 in den WB-F344 Zel-

len nach der Behandlung mit nsPEFs im Gegensatz dazu eine zeitabhängige Änderung der

Cx43-Verteilung (Abb. 3.14), wobei der Zellzyklus hier allerdings nicht berücksichtigt

wurde. 5 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse mit einer Feldstärke von

20 kV/cm war noch kaum eine Änderung der Cx43-Verteilung zu erkennen, jedoch schie-

nen die GJ-Plaques im Vergleich zur Kontrolle bereits etwas kleiner zu sein. Die Ergeb-

nisse der Färbung 15 und 30 min nach der nsPEF-Behandlung zeigten, dass immer mehr

GJs abgebaut wurden, bis kaum mehr Cx43 in der Plasmamembran detektierbar war. Der

Auf- und Abbau der GJ ist ein dynamischer Prozess, bei dem permanent neue GJs am Rand

der Plaques in die Zellmembran eingebaut werden und die dann immer weiter zur Mitte

wandern, von wo aus sie internalisiert und schließlich abgebaut werden [86, 87, 91]. Das

Kleinerwerden der GJ-Plaques nach 5 min könnte darauf zurückzuführen sein, dass bereits

nach dieser kurzen Zeit GJs abgebaut, aber keine neuen mehr aufgebaut wurden. Zudem

nahm mit der Zeit auch das intrazelluläre Fluoreszenzsignal zu, je weniger GJs in der

Membran nachweisbar waren. Der Abbau der GJs findet in Lysosomen statt. Die in den

Lysosomen entstandenen Bruchstücke werden ins Zytosol abgegeben, wo sie als Bausteine

für neue Moleküle dienen [161]. Im Zytoplasma waren während des Abbaus der GJs punk-

tuelle Spots erkennbar, die den Lysosomen entsprechen könnten, sowie ein diffuses Fluo-

reszenzsignal, das von zum Recycling ins Zytoplasma abgegebenen Cx43 stammen könnte.

Der Abbau der GJs vollzog sich innerhalb von 30 min. Da die Halbwertszeit der GJs nor-

malerweise 1-3 h beträgt, kann der Abbau der GJs aus der Membran jedoch nicht alleine

4 Diskussion

76

über die natürliche Turnover-Rate erklärt werden. Vielmehr müssen die Hochspannungs-

pulse einen weiteren, aktiven Prozess zum Abbau der GJs ausgelöst haben, wie z.B. die

Aktivierung von MAP-Kinasen. 60 min nach dem Applizieren der Pulse war eine Rückkehr

der GJs in die Plasmamembran erkennbar. Die Cx43-Verteilung korrelierte auf den ersten

Blick nicht mit den Ergebnissen zur Untersuchung der ZZK. Demnach kommunizierten die

Zellen 5 min nach der nsPEF-Behandlung mit 20 kV/cm noch zu 70 % im Vergleich zur

Kontrolle, während das Cx43 in der Zellmembran zum gleichen Zeitpunkt jedoch kaum

verändert war (s. Abb. 3.11).

Neben der Menge an GJs in der Membran spielt auch der funktionale Zustand, also ob die

Kanäle geöffnet oder geschlossen sind, eine entscheidende Rolle. So könnte es sein, dass

5 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse zwar noch zahlreiche GJs in der

Membran vorhanden waren, diese jedoch in einem geschlossenen Zustand vorlagen. Ähn-

lich ist die Situation 15 min nach der Behandlung. Obwohl offensichtlich noch GJ in der

Membran nachweisbar waren, war die ZZK zu diesem Zeitpunkt komplett inhibiert. Nach

30 min waren fast keine GJs mehr in der Membran detektierbar, zu diesem Zeitpunkt hatte

die ZZK allerdings bereits wieder begonnen, sich zu regenerieren. In diesem Fall könnte es

sein, dass sich die wenigen vorhandenen GJs wieder öffneten und so den Austausch von

Molekülen erlaubten. Zudem muss die Menge an vorhandenem Connexin nicht zwangs-

läufig mit der ZZK korrelieren [50]. 1 h nachdem die Monolayer den elektrischen Pulsen

ausgesetzt waren, zeigte sich in der Immunfluoreszenzfärbung, dass wieder GJs zurück zur

Membran transportiert wurden. Dies spiegelte sich auch in der ZZK wieder, die sich nach

60 min auf etwa 40 % im Vergleich zur Kontrolle erholt hatte.

4.3.2 Gen- und Proteinexpression von Cx43

Die mit nsPEFs behandelten WB-F344 Zellen wiesen bis zu einer Stunde nach dem Appli-

zieren der 100 ns-Pulse eine signifikante Herunterregulierung des mRNA-Levels von Cx43

auf (Abb. 3.16). 3 h nach der Behandlung stieg die Genexpression für mit 20 kV/cm be-

handelte Zellen noch einmal fast auf Kontroll-Niveau an, bevor sie sich zu allen weiteren

untersuchten Zeitpunkten (6, 24 und 48 h) auf einem annähernd gleichbleibenden Wert un-

terhalb der Kontrolle festsetzte. Der Anstieg nach 3 h könnte auf ein Entgegenregeln der

Zellen zurückzuführen sein, die versucht haben, die veränderte Genexpression zu kompen-

sieren, bevor sich der Wert dauerhaft auf einem Wert unterhalb der Kontrolle festzusetzen

schien.

4 Diskussion

77

Ähnlich wie bei der ZZK schien die schrittweise Erhöhung der Feldstärke eine lineare Än-

derung der Cx43 Genexpression bewirkt zu haben. Die verminderte Cx43 Genexpression

korrelierte mit der Änderung der Gesamtproteinmenge an Cx43, die 30 min nach der Be-

handlung ebenfalls signifikant reduziert war (Abb. 3.20). Im Gegensatz dazu steht eine

Studie, in der Brustkrebszellen 5 min lang mit „Energie regulierbaren steilen Pulsen“ be-

handelt wurden. Die nach 48 h durchgeführten Protein- und Genanalysen zeigten eine Er-

höhung der Cx43 Expression im Vergleich zur Kontrolle [159]. Die Genexpression kann

unter anderem durch die Aktivierung von MAP-Kinasen reguliert werden. Diese können

Serine und Threonine auf bestimmten Genregulatorproteinen phosphorylieren, was deren

Fähigkeit zur Steuerung der Transkription der Zielgene ändert. Dabei hängt das genaue

Ergebnis davon ab, welche anderen Gene in der Zelle aktiv sind und welche Signale die

Zelle noch erhält [18]. Dies würde erklären, warum die Genexpression in unterschiedlichen

Zelltypen unterschiedlich durch denselben Stimulus verändert sein kann.

Normalerweise dauert es mehrere Stunden, bis sich die Genexpression von Zellen ändert.

Nach der Behandlung der WB-F344 Zellen mit nsPEFs änderte sie sich jedoch bereits in-

nerhalb von 30 min. Im Vergleich zu Zellen, die über einen längeren Zeitraum elektrischen

Feldern von wesentlich geringerer Feldstärke ausgesetzt waren, wie es in der Studie mit

den Brustkrebszellen der Fall war [159], könnte man vermuten, dass nsPEFs einen direkten

Effekt auf die Zellen haben, der zu einer sehr schnellen Minderung der Gen- und Protein-

expression von Cx43 führen kann.

Die verminderte Cx43 Expression stimmte mit den Ergebnissen der Immunfluoreszenzfär-

bung überein. Neben dem Abbau der GJs aus der Plasmamembran könnte zusätzlich die

geringere Menge an zur Verfügung stehendem Cx43 den Aufbau von neuen GJs erschwert

haben. Aus demselben Grund könnte man entsprechend der herabgesetzten Genexpression

von Cx43 auch eine verringerte ZZK erwarten. Jedoch müssen Gen- und Proteinexpression

nicht unbedingt miteinander korrelieren [162]. Deshalb war es auch möglich, dass der

mRNA-Level von Cx43 bis 48 h nach der Behandlung der WB-F344 Zellen im Vergleich

zur Kontrolle durchgehend verringert war, während das Cx43 bereits nach einer Stunde

zurück in die Zellmembran wanderte und sich die ZZK spätestens 24 h nach dem Applizie-

ren der Hochspannungspulse wieder auf demselben Niveau wie die Kontrolle befand.

4 Diskussion

78

4.3.3 Direkte Effekte von nsPEFs auf die Zell-Zell-Kommunikation

Es gibt verschiedene Effekte von nsPEFs auf Zellen, die wiederum einen Einfluss auf die

ZZK haben können. Dazu gehören die Änderung des Membranpotentials, die Erhöhung der

intrazellulären Calciumkonzentration und der Zusammenbruch des Zytoskeletts [34, 100,

102].

Depolarisation der Plasmamembran - Eine Studie an Jurkat Zellen, die mit Pulsen mit einer

Länge von 60 ns und Feldstärken von bis zu 100 kV/cm behandelt wurden, zeigte, dass die

Depolarisation der Plasmamembran innerhalb von wenigen Nanosekunden abläuft [163].

Das Schließen der GJs findet innerhalb weniger Zehntelsekunden statt [88]. Die Ergebnisse

des Fluoreszenzfarbstoff-Transfer Assays zeigten jedoch, dass die ZZK 5 min nach der Be-

handlung der Zellen mit nsPEFs verhältnismäßig wenig beeinflusst war. Der ausgepräg-

teste Effekt trat erst 15 min nach dem Applizieren der Pulse auf. Diese Ergebnisse lassen

darauf schließen, dass eine Depolarisation der Zellen als Ursache für den beobachteten Ef-

fekt auf die ZZK ausgeschlossen werden kann, da die Inhibierung der ZZK ansonsten viel

schneller hätte auftreten müssen. Vermutlich waren die verwendeten Pulse mit 100 ns zu

kurz und die gewählte maximale Feldstärke von 20 kV/cm zu gering, um eine Depolarisa-

tion der Plasmamembran hervorzurufen, die ein Schließen der GJs bewirken würde.

Intrazelluläre Calciumkonzentration - Ein weiterer möglicher Mediator ist die Erhöhung

der intrazellulären Calciumkonzentration, die ebenfalls eine Inhibierung der ZZK nach sich

ziehen kann. Versuche an Jurkat Zellen, die Hochspannungspulsen mit einer Dauer von

60 ns und Feldstärken von 25, 50 bzw. 100 kV/cm ausgesetzt wurden, ergaben einen Feld-

stärke-abhängigen Anstieg des intrazellulären Calcium-Levels innerhalb von wenigen Mil-

lisekunden. Dabei war der Calcium-Level in Zellen, die mit 25 kV/cm behandelt wurden,

verhältnismäßig geringfügig erhöht und bereits nach 30 s wieder auf Kontroll-Niveau ab-

gesunken [46]. Ein Schließen der GJs aufgrund einer Erhöhung des zytoplasmatischen Cal-

ciums findet innerhalb etwa einer Minute statt [164-166]. Somit ist die Freisetzung von

Calcium aus intrazellulären Speichern als Ursache der inhibierten ZZK aus denselben

Gründen wie im Fall der Depolarisation der Plasmamembran eher unwahrscheinlich.

Zytoskelett - Für den Auf- und Abbau von GJs wird ein intaktes Zytoskelett benötigt. Am

Beispiel von Linsenepithelzellen konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Aktin-

depolimerisierenden Substanzen zu einer signifikanten Reduktion der ZZK und einer ver-

mehrten Anreicherung von Cx43 im Zytoplasma führte [167]. In einer Studie an HeLa Zel-

len wurde der komplette Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts nach dem Applizieren

4 Diskussion

79

von einem 60 ns-Puls mit 15 kV/cm beschrieben [34]. Wie die Immunfluoreszenzfärbung

in der vorliegenden Arbeit zeigte, führte auch die Behandlung der WB-F344 Zellen mit

nsPEFs zu einer Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts, jedoch nicht zu einem komplet-

ten Zusammenbruch. Die Störung des Aktins könnte zum einen dazu beigetragen haben,

dass keine neuen GJ zur Plasmamembran transportiert werden konnten, zum anderen aber

auch zur Aktivierung von MAP-Kinasen aufgrund von strukturellen Fluktuationen in der

Zelle [168, 169]. Da das Aktin-Zytoskelett nur in Bruchstücke zerfallen und nicht komplett

zusammengebrochen war, war der direkte Effekt auf die ZZK vermutlich eher gering. Falls

überhaupt, hat die Umstrukturierung des Zytoskeletts wahrscheinlich eher indirekt über die

Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden zur Änderung der ZZK beigetragen.

ZO-1 – Neben einem intakten Zytoskelett hängt die Bildung von GJ Kanälen auch von

anderen Junctions, wie z.B. Tight Junctions, ab. Diese verbinden benachbarte Zellen mit-

einander und sorgen für einen engen Zusammenhalt. Zudem ist bekannt, dass Connexine

direkt mit Tight Junction Proteinen wie ZO-1 interagieren und co-lokalisieren [96, 97]. Die

Immunfluoreszenzfärbung von ZO-1 in WB-F344 Zellen nach dem Applizieren von Hoch-

spannungspulsen zeigte keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zu den unbehan-

delten Zellen (Abb. 3.15). Somit ist es eher unwahrscheinlich, dass sich die Zellen aufgrund

der nsPEFs voneinander getrennt haben und die ZZK dadurch unterbrochen wurde. Aller-

dings schienen die Zellränder verglichen mit den unbehandelten Zellen nach dem Appli-

zieren der Pulse nicht mehr so klar definiert zu sein. Dies könnte ebenfalls auf strukturelle

Fluktuationen der Zelle hinweisen, die eventuell zur Auslösung intrazellulärer Signalkaska-

den geführt haben könnten.

4.3.4 Indirekte Effekte von nsPEFs auf die Zell-Zell-Kommunikation

Neben den direkten Effekten auf die ZZK können nsPEF auch Signalkaskaden in Zellen

auslösen, wie z.B. die Aktivierung von MAP-Kinasen. Diese können wiederum zur Hyper-

phosphorylierung von Connexin und zur Internalisierung von GJs führen. Der Zusammen-

hang zwischen der Aktivierung von MAP-Kinasen und deren Auswirkungen auf die ZZK

wurde bereits in mehreren Studien an WB-F344 Zellen gezeigt. Die Behandlung mit dem

Proteinsynthese-Inhibitor Anisomycin beispielsweise aktiviert p38, das eine vermehrte

Phosphorylierung von Cx43 bewirkt. Das wiederum fördert den Abbau von Cx43 und führt

zu einer verminderten ZZK [170]. Auch Wasserstoffperoxid (H2O2) führt zur Hyperphos-

phorylierung von Cx43 und hemmt die ZZK. Als Ursache wird oxidativer Stress vermutet,

4 Diskussion

80

der die Aktivierung von MAP-Kinasen nach sich ziehen kann [171]. Ein Extrakt aus dem

Pilz Phellinus linteus hingegen verhindert die Aktivierung von p38 und Erk1/2 durch H2O2

[172]. TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) aktiviert in Rattenleberzellen die Pro-

teinkinase C (PKC), die wiederum Erk aktiviert. Dies führt zur Hyperphosphorylierung von

Cx43 und zur Internalisierung der GJs. Dabei ist unklar, ob Erk direkt für den durch TPA

verursachten Effekt verantwortlich ist oder andere Signalkaskaden involviert sind. Eine

Hyperphosphorylierung könnte eine Konformationsänderung in Cx43 bewirken, die zum

Schließen der GJs und weiterhin zur Internalisierung der Connexine führen können [173].

Nach der Inkubation von WB-F344 Zellen mit Cannabinoiden konnte innerhalb von 5 min

eine Aktivierung von Erk1/2 gezeigt werden, dabei wurde der Phosphorylierungsstatus von

Cx43 nicht signifikant verändert. Trotzdem wurde die ZZK innerhalb von 10 min reversibel

inhibiert. Cx43 ist kein direktes Substrat für Erk und die Aktivierung von Erk korreliert

nicht zwingend mit einer veränderten Phosphorylierung von Cx43 [174]. Mit H-ras trans-

formierte Rattenleberepithelzellen besitzen überwiegend nur unphosphoryliertes Cx43 und

weisen keine ZZK auf. Untersuchungen zeigten, dass das Onkogen sowohl die Aktivierung

von Erk1/2 als auch von p38 bewirkte, aber wahrscheinlich nur p38, nicht aber Erk1/2, für

die Inhibierung der ZZK verantwortlich ist [175].

Dass nsPEFs MAP-Kinasen aktivieren können, wurde bereits an HeLa Zellen gezeigt, die

mit ähnlichen Pulsparametern behandelt wurden, wie sie in der vorliegenden Arbeit ver-

wendet wurden. Dazu wurden die Zellen in Suspension gebracht und 20 Pulse mit einer

Länge von 80 ns und einer Feldstärke von 20 kV/cm appliziert. Die anschließende Pro-

teinanalyse zeigte eine Aktivierung sowohl von Erk als auch p38 innerhalb von 15 min

[49]. Die Behandlung der WB-F344 Zellen mit nsPEFs in der vorliegenden Studie führte

ebenfalls zu einer signifikanten Aktivierung von Erk innerhalb von 15 min (Abb. 3.17). Im

Gegensatz zu den Ergebnissen der Studie an den HeLa Zellen konnte eine Aktivierung von

p38 jedoch erst 6 h nach dem Applizieren der Pulse nachgewiesen werden (Abb. 3.18).

Dieser Unterschied könnte darauf zurückzuführen sein, dass die durch nsPEFs ausgelösten

Effekte Zelltyp-spezifisch sein könnten, sodass dieselbe Behandlung in verschiedenen Zell-

linien unterschiedliche Effekte hervorrufen kann. Die Aktivierung von Erk nach 15 min

steht im Einklang zur Inhibierung der ZZK, die ebenfalls 15 min nach der Behandlung am

signifikantesten war.

Sowohl die Aktivierung von Erk als auch von p38 können zur Hyperphosphorylierung von

Cx43 führen. Die Proteinanalyse der WB-F344 Zellen zeigte 30 min und 24 h nach dem

Applizieren der Hochspannungspulse eine Hpyerphosphorylierung von Cx43, während das

4 Diskussion

81

Phosphorylierungsmuster 6 h nach der Behandlung im Vergleich zur Kontolle weitestge-

hend unverändert war (Abb. 3.19). Weiterhin können die Aktivierung von MAP-Kinasen

sowie die Hyperphosphorylierung von Cx43 zum Abbau der GJs aus der Plasmamembran

führen [170, 173], was mit den Ergebnissen der Immunfluoreszenzfärbung korreliert (Abb.

3.14). 30 min nachdem die Zellen den nsPEFs ausgesetzt waren, waren kaum mehr GJs in

der Membran nachweisbar, was auch mit der gleichzeitig herabgesetzten ZZK überein-

stimmt. Des Weiteren konnte eine Aktivierung von p38 6 h nach der nsPEF-Behandlung

und eine erneute Hyperphosphorylierung von Cx43 nach 24 h nachgewiesen werden, die

jedoch nicht mit einer inhibierten ZZK einherging. Die frühe Hyperphosphorylierung von

Cx43 innerhalb von 30 min nach der nsPEF-Behandlung könnte durch das aktivierte Erk

hervorgerufen worden sein, während die Hyperphosphorylierung nach 24 h durch p38 her-

beigeführt worden sein könnte. Die Proteinanalyse zeigte, dass hauptsächlich Erk2 aktiviert

wurde, jedoch kaum Erk1. Erk1 und 2 bewirken in der Zelle sehr ähnliche Effekte und

teilen sich dieselben Aktivatoren und Substrate [176]. Trotzdem gibt es Anzeichen für Iso-

form-spezifische Funktionen [177, 178]. So konnte für Erk2 eine positive Rolle in der Kon-

trolle der normalen sowie der Ras-abhängigen Zellproliferation nachgewiesen werden,

während Erk1 eher das Gesamtergebnis der Signalgebung der Zelle beeinflusst, indem es

der Erk2 Aktivität entgegenwirkt [179]. Der funktionelle Unterschied zwischen Erk1 und

2 ist jedoch noch nicht genau geklärt. Die nsPEFs schienen in den WB-F344 Zellen vor

allem Erk2 aktiviert zu haben, das dann für die frühe Phosphorylierung von Cx43 verant-

wortlich war.

Verschiedene Modulatoren können unterschiedliche Phosphorylierungsstellen von Cx43

phosphorylieren, was sich in unterschiedlichen Effekten auswirken kann. So muss, wie be-

reits in anderen Studien gezeigt, eine Änderung der Cx43-Phosphorylierung nicht zwangs-

läufig in einer veränderten ZZK enden [174]. Einige Chemikalien, die die ZZK herabset-

zen, können zusätzlich MAP-Kinasen aktivieren, wobei die inhibierende Wirkung MAP-

Kinase-unabhängig war und über die Aktivierung von Phosphatidylcholin-spezifischer

Phospholipase C oder noch nicht identifizierte Mechanismen ausgelöst wurde [180-183].

Die genauen Ursachen, die nach der Behandlung der Zellen mit nsPEFs zur Inhibierung

der ZZK geführt haben, müssen somit noch weiter untersucht werden, z.B. durch die Ver-

wendung von MAP-Kinase-Inhibitoren.

4 Diskussion

82

4.4 Zellelastizität, Transformation und Metastasierungspotential

Die Elastizität von Zellen hängt vor allem von einem intakten Zytoskelett ab. Während der

Entwicklung von Krebs ändert sich die Steifigkeit einer Zelle, sie wird weicher [121, 123,

124]. Der Hauptgrund hierfür ist die Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts [118, 122].

Diese sorgt auch dafür, dass sich die Motilität der Zellen erhöht, was die Bildung von Me-

tastasen fördert [127, 128]. Wie die Immunfluoreszenzfärbung der WB-F344 Zellen zeigte,

bewirkte die Behandlung der Zellen mit nsPEFs ebenfalls eine Umstrukturierung des Ak-

tin-Zytoskeletts (Abb. 3.14). Dabei korrelieren die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfär-

bung mit den topographischen AFM-Aufnahmen (Abb. 3.22). Beide Methoden zeigen, dass

die Aktinfasern innerhalb weniger Minuten nach der Behandlung ihre geordnete Struktur

verloren hatten und in Bruchstücke zerfallen waren. Das Aktin-Zytoskelett hatte sich auch

30 min nach dem Applizieren der Pulse nicht erholt. Die Elastizitätsmessungen ergaben,

dass die Zellen 8 min nach dem Applizieren der Hochspannungspulse um etwa ein Drittel

weicher waren im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Abb. 3.23). Dieses Ergebnis

könnte vermuten lassen, dass gepulste elektrische Felder möglicherweise krebsähnliche

Charakteristika in Zellen hervorrufen und auch die Motilität von Zellen ändern könnten.

Deshalb wurden ein Scratch Assay und ein Soft Agar Colony Formation Assay durchge-

führt. Im Gegensatz zu Tumorzellen können normale Zellen nicht verankerungsunabhängig

wachsen. Während die tumorigenen WB-ras Zellen Kolonien im Agar ausbildeten, formten

weder die unbehandelten noch die behandelten WB-F344 Zellen Kolonien, gleich welche

Pulsparameter verwendet wurden (Abb. 3.28). Auch der Scratch Assay zeigte keinen sig-

nifikanten Unterschied in der Proliferation und Migration der Zellen (Abb. 3.27). Die Er-

gebnisse implizieren, dass nsPEFs nicht zu krebsartigen Veränderungen zu führen scheinen

und somit weder die Entstehung von Krebs noch die Bildung von Metastasen fördern.

Bezogen auf die verminderte Elastizität könnte es dafür mehrere Gründe geben. Der Elas-

tizitätsmodul war zwar 8 min nach dem Applizieren der elektrischen Pulse signifikant her-

abgesetzt, begann sich jedoch bereits nach 13 min zu erholen. Damit war die Dauer, wäh-

rend der die Zellen weicher waren, relativ gering und wahrscheinlich nicht ausreichend,

um eine Änderung der Motilität zu bewirken. Zudem waren die WB-F344 Zellen, auch als

sie am weichesten waren, immer noch doppelt so steif wie die tumorigenen WB-ras Zellen.

Weiterhin waren in den WB-F344 Zellen auch nach dem Applizieren der Hochspannungs-

pulse noch Aktinfasern erkennbar, auch wenn diese im Vergleich zur Kontrolle nicht mehr

ganz intakt gewesen zu sein schienen (Abb. 3.14 und 3.22). Im Gegensatz dazu waren in

4 Diskussion

83

den WB-ras Zellen kaum Aktinfasern nachweisbar (Abb. 3.25). Die Tumorzellen besitzen

eine andere Zytoskelett-Struktur als gesunde Zellen, ihnen fehlen beispielsweise die Aktin-

Stressfasern [118].

Das Aktin-Zytoskelett hatte auch eine Stunde nach der Behandlung der Zellen mit nsPEFs

nicht wieder dieselbe Struktur wie zuvor, gleichzeitig lag die Elastizität der Zellen jedoch

bereits nach 13 min fast wieder auf Kontroll-Niveau. Dabei spielen die weiteren Kompo-

nenten des Zytoskeletts (Mikrotubuli und Intermediärfilamente) wahrscheinlich eher eine

untergeordnete Rolle, da sie kaum zur Zellelastizität beitragen [120, 184]. Es muss also

noch weitere Faktoren geben, die die Zellelastizität beeinflussen. Möglicherweise führten

strukturelle Änderungen der Plasmamembran oder eine Änderung des osmotischen Drucks

in der Zelle zum Anstieg der Elastizität [185]. Auffällig ist auch, dass die Zellen 18 und

23 min nach dem Applizieren der elektrischen Pulse sogar, wenn auch nicht signifikant,

steifer wurden als die unbehandelten Zellen, bevor sie sich wieder dem Kontroll-Niveau

anglichen. Es wäre möglich, dass die Zelle in einer Art Regelkreis versucht, dem Elastizi-

tätsverlust entgegenzuwirken, wodurch die Zelle erst einmal steifer wird, bevor sie sich

wieder auf Kontroll-Niveau einpendelt.

Auch im Fall der zeitaufgelösten AFM-Messreihe an den unbehandelten WB-F344 Zellen

war eine gewisse Änderung der Elastizitätsmoduln über die Zeit erkennbar (Abb. 3.22b).

Wahrscheinlich bewirkte der Druck durch den Cantilever, ähnlich wie die nsPEF-Behand-

lung, einen mechanischen Stress in den Zellen, dem die Zellen versuchten entgegenzuwir-

ken. Dieser Stress kann zwar zur Änderung der Zellelastizität beigetragen haben, diese je-

doch nicht komplett erklären. So variierten die Elastizitätsmoduln der Zeitreihe der unbe-

handelten Zellen nur um ca. 20 kPa, während sie sich im Fall der behandelten Zellen um

ungefähr 50 kPa änderten. Weiterhin wurden die Adhäsionspunkte in den Elastizitäts-Auf-

nahmen der unbehandelten Zellen mit der Zeit immer größer (Abb. 3.22, mittlere Spalte,

blaue Pfeile), was ebenfalls eventuell auf mechanischen Stress zurückzuführen sein könnte.

Normalerweise lösen sich Zellen unter Stress eher schneller vom Untergrund ab. Mögli-

cherweise reichte die Pause zwischen den einzelnen Messungen, dass die Zellen versuchten

dem entgegenzuwirken und ihre Adhäsionspunkte vergrößerten. Ansonsten waren die Zel-

len unverändert geblieben, weder die Zellform noch die Aktinfasern hatten sich erkennbar

verändert. Im Vergleich dazu schien sich die komplette Struktur der mit nsPEFs behandel-

ten Zellen aufgelöst zu haben (Abb. 3.22a).

Für eine tiefergehende Analyse wurden die Änderungen der Elastizitäten über dem Zell-

kern und dem Rand der Zelle getrennt betrachtet. Dabei ähnelte der zeitliche Verlauf der

4 Diskussion

84

Elastizitätsänderungen über dem Zellkern stark dem der Elastizität der gesamten Aufnahme

(Abb. 3.24). Auch hier war die Zelle 8 min nach der Behandlung mit nsPEFs signifikant

weicher im Vergleich zur Kontrolle und fing bereits nach 13 min an sich zu regenerieren.

Zudem war die Elastizität über dem Zellkern 8 min nach dem Applizieren der Hochspan-

nungspulse annähernd gleich wie die Elastizität über dem Zellkern der tumorigenen WB-

ras Zellen. Im Vergleich zum Bereich über dem Zellkern war die Elastizität über dem Rand

der Zelle zum gleichen Zeitpunkt sogar um ein Drittel geringer als die Elastizität über dem

Randbereich der WB-ras Zellen und auch signifikant verringert im Vergleich zur Kontrolle.

Im Gegensatz zum Bereich über dem Zellkern erholte sich die Elastizität über dem Rand-

bereich der behandelten Zellen nicht. Da der Elastizitätsmodul bei einer Eindrücktiefe des

Cantilevers von 300 nm gemessen wurde und sich das Aktin auch 30 min nach der Behand-

lung noch nicht regeneriert hatte, könnte die Messung durch das Substrat beeinflusst wor-

den sein, weshalb die Elastizität auch bei der Messung nach 28 min kaum einen Anstieg

zeigte. Im Vergleich dazu besitzt der Zellkern selbst bereits eine gewisse Elastizität und ist

in der Lage sich zu deformieren, um sich so Änderungen der Zellform anzupassen [186].

Möglicherweise kann der Effekt der Hochspannungspulse durch eine Adaption des Zell-

kerns schneller kompensiert werden.

Vergleicht man die Elastizitätsmoduln der normalen Zellen 8 min nach der nsPEF-Behand-

lung mit denen der Tumorzellen, so besaßen beide Zellen über dem Zellkern in etwa die-

selbe Elastizität, während die WB-ras im Bereich über dem Zellrand sogar steifer waren.

Betrachtet man die durchschnittliche Elastizität über die gesamte Zelle waren die Tumor-

zellen jedoch erheblich weicher als die behandelten WB-F344 Zellen. Zudem ähnelt der

zeitliche Verlauf der Elastizitätsmoduln der gesamten Zelle dem Verlauf über dem Zell-

kern, jedoch nicht dem über dem Rand. Folglich scheint die Gesamtelastizität der Zellen

hauptsächlich durch die Elastizitäten über dem Nukleus bestimmt zu werden. In zukünfti-

gen Experimenten müssten vor allem im Randbereich die Messungen für geringere Ein-

drücktiefen des Cantilevers (z.B. 100 nm) ausgewertet werden, um einen Einfluss des Sub-

strats ausschließen zu können, da diese Regionen in adhärierten Zellen weniger als 500 nm

hoch sind [186].

Eine Änderung der Elastizität von Zellen nach der Behandlung mit gepulsten elektrischen

Feldern wurde bereits in einigen Publikationen beschrieben. So wurde beispielsweise eine

Studie an einzelnen CHO Zellen durchgeführt, die Elektroporationspulsen (5 ms und

400 V/cm) ausgesetzt wurden. Die Elastizitätsmoduln wurden für eine Eindrücktiefe des

Cantilevers von 50 nm bestimmt. Ähnlich wie im Fall der Nanosekunden Pulse bei den

4 Diskussion

85

WB-F344 Zellen, waren die Elastizitätsmoduln der CHO Zellen 8 min nach der Behand-

lung signifikant herabgesetzt und begannen sich nach 17 min zu erholen. Allerdings ver-

hielt sich das Zytoskelett anders. Die Messungen an den CHO Zellen zeigten bis 15 min

nach dem Applizieren der elektrischen Pulse eine Abwesenheit von Aktinfasern unter der

Membranoberfläche, die nach 23 min begannen sich zu regenerieren. Im Vergleich dazu

waren die Aktinfasern in den WB-F344 Zellen ebenfalls bereits nach 5 min verändert, wo-

bei trotzdem zu jeder Zeit noch Aktinfasern nachweisbar waren, jedoch begann sich das

Aktin-Zytoskelett erst nach 60 min zu erholen. Das heißt, auch im Fall der CHO Zellen

korrelierte der zeitliche Verlauf der Zellelastizität nicht mit den Änderungen des Aktin-

Zytoskeletts. Es wurde vermutet, dass das Weicherwerden der Zellen ein dynamischer Pro-

zess ist und dass neben den direkten Effekten aufgrund der elektrischen Pulse noch weitere

Effekte in der Zelle ausgelöst worden sein müssen, die die Elastizität beeinflusst haben

[187]. Die Ergebnisse dieser Studie lassen sich jedoch nur schwer mit den Resultaten der

vorliegenden Arbeit vergleichen. So wurden beispielsweise unterschiedliche Zelllinien ver-

wendet, die unterschiedlich auf elektrische Pulse reagieren können, und unterschiedliche

Pulsparameter. Im Fall der Elektroporationspulse müssen z.B. auch Änderungen des osmo-

tischen Drucks und folglich ein Anschwellen der Zellen mit in Betracht gezogen werden.

Und schließlich wurden die Elastizitätsmoduln bei unterschiedlichen Eindrücktiefen des

Cantilevers bestimmt, wodurch neben dem Aktin auch die Lipid-Doppelschicht der Mem-

bran einen Einfluss auf die Steifigkeit haben kann. In einer anderen Studie wurden ebenfalls

CHO Zellen behandelt, jedoch mit Nanosekunden Pulsen (50 oder 100 Pulse, 10 ns,

150 kV/cm) anstatt mit Elektroporationspulsen. Die Messungen wurden an erst kurz adhe-

rierten, noch runden Zellen durchgeführt und die Elastizitätsmoduln bei einer Eindrücktiefe

des Cantilevers von 500 nm bestimmt. Die Ergebnisse zeigten eine Verringerung der Zell-

elastizität um 50 % und einen teilweisen Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts [188].

Dieses Ergebnis korreliert mit den Resultaten der vorliegenden Arbeit, trotz der wesentlich

kürzeren Pulse und höheren Feldstärke. In beiden Studien kam es nach dem Applizieren

von Nanosekunden Pulsen zu einer Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts, jedoch

konnte kein kompletter Zusammenbruch nachgewiesen werden.

Die Messdaten wiesen eine relativ große Standardabweichung auf. Dies liegt vor allem

daran, dass die Elastizität an Zellen in einem Monolayer gemessen wurde. Zum einen hängt

die Elastizität stark von der Form der Zellen ab, also ob sie rund oder flach ausgebreitet

sind [186], und somit auch von der Zelldichte. Ein weiterer Aspekt ist, dass die AFM-

Aufnahmen über eine größere Fläche (30 x 30 µm2) und damit auch über mehrere Zellen

4 Diskussion

86

gemacht wurden. Je nachdem an welcher Stelle gemessen wurde, befanden sich so mehr

Anteile vom Zellrand oder auch mehr Anteile vom Zellkern im Bereich der Aufnahme.

Dies erklärt auch, warum bei der getrennten Betrachtung der Elastizitäten von Kern und

Rand die Werte der Elastizitätsmoduln stark variierten. Insgesamt war die mittlere Stan-

dardabweichung jedoch relativ konstant.

4.5 Bedeutung für medizinische Anwendungsmöglichkeiten von

nsPEFs

Seit ein paar Jahren wird die Elektrochemotherapie als ein etabliertes Verfahren in Kliniken

zur palliativen Behandlung von Krebs eingesetzt [10, 189-191]. In den letzten 10 Jahren

wurden auch nsPEFs als neue Therapiemöglichkeit bei Krebs untersucht, da sie gegenüber

der Elektrochemotherapie den Vorteil haben, dass sie auch ohne den Einsatz von Medika-

menten Apoptose induzieren können [16, 192]. Während es bei der Behandlung von Krebs

primär um das Abtöten von Zellen geht, wurden in der vorliegenden Arbeit die Untersu-

chungen zur ZZK in einem subletalen Pulsparameter-Bereich durchgeführt. Gerade bei der

Verwendung von Nadelelektroden könnte es sein, dass Zellen, die sich in einiger Entfer-

nung zu den Elektroden befinden, einem elektrischen Feld ausgesetzt sind, dessen Feld-

stärke je nach Entfernung soweit abgeschwächt ist, dass die Zellen nicht mehr abgetötet

und eventuell andere Effekte, wie z.B. die Inhibierung der ZZK, ausgelöst werden. Eine

gestörte ZZK wird mit der Entstehung von Krebs und der Bildung von Metastasen assozi-

iert. Wie in zahlreichen Studien gezeigt wurde, ist ein Charakteristikum von Tumorzellen,

dass sie weder untereinander noch mit ihren gesunden Nachbarzellen kommunizieren [112,

113]. Die in dieser Arbeit untersuchte Behandlung der WB-F344 führte zu einer Inhibie-

rung der ZZK mit einer gleichzeitigen Herabregulierung der Gen- und Proteinexpression

von Cx43. Während sich die ZZK und die Proteinexpression von Cx43 nach 24 h wieder

komplett regeneriert hatten, war die Genexpression auch noch nach 24 nach unten reguliert,

wenn auch nicht mehr signifikant (Abb. 3.16). Aufgrund dieser Ergebnisse erscheinen

nsPEFs, zumindest im Hinblick auf die ZZK, erst einmal ungeeignet zur Behandlung von

Krebs. Die Untersuchung der mit nsPEFs behandelten Zellen auf maligne Transformation

und ihre Migrationsgeschwindigkeit zeigten jedoch keine Änderungen im Vergleich zur

Kontrolle (Abb. 3.27 und 3.28). Wahrscheinlich ist die Dauer, während der die Effekte auf

die ZZK und die Gen- und Proteinexpression von Cx43 anhalten, zu kurz, um die Zellen

negativ zu beeinflussen. Dabei bleibt offen, ob eine wiederholte Behandlung der Zellen zu

4 Diskussion

87

einer dauerhaft verminderten ZZK und dadurch eventuell zur Entstehung von Krebs führen

könnte. Diese Frage müsste in weiteren Studien erforscht werden.

Weiterhin wären Untersuchungen zur ZZK an anderen Zelllinien als den hier verwendeten

interessant, da verschiedene Zelltypen unterschiedlich auf denselben Stimulus reagieren

können. Zudem sollten auch die Pulsparameter, wie Pulslänge, Feldstärke, Pulsanzahl und

Wiederholungsrate, variiert werden. Die Versuche an den tumorigenen WB-ras Zellen

zeigten zwar eine komplette Inhibierung der ZZK, aber möglicherweise existieren Bedin-

gungen, die zur Wiederherstellung der ZZK führen können und so einen Ansatz zur The-

rapie von Krankheiten liefern, die auf einer gestörten ZZK beruhen.

Während eine verminderte ZZK bei der Behandlung von Krebs eher von Nachteil ist,

könnte sie im Fall der Wundheilung förderlich sein, indem sie verletzte Zellen von ihrer

gesunden Umgebung isoliert, was eine essentielle Voraussetzung für die Wundheilung ist.

Im Gegensatz zu akuten Wunden ist die Cx43-Expression in den Wundrändern von chro-

nischen und diabetischen Wunden signifikant erhöht. Die Behandlung der WB-F344 Zellen

mit nsPEFs wiesen eine Herabregulierung sowohl der ZZK als auch der Gen- und Protein-

expression von Cx43 auf, wobei die Hochspannungspulse vor allem im Hinblick auf die

Genexpression eine langanhaltende Wirkung zeigten. Auch hier wäre es interessant in zu-

künftigen Experimenten herauszufinden, ob eine Mehrfachbehandlung der Zellen die

Cx43-Expression dauerhaft senken könnte. So könnte die regelmäßige Behandlung von

chronischen Wunden mit nsPEFs zur Wundheilung beitragen.

88

5 Zusammenfassung

Zellen in einem Gewebe sind über Kanäle, sogenannte Gap Junctions (GJs), miteinander

verbunden, die eine direkte Kommunikation zwischen benachbarten Zellen ermöglichen.

GJs werden aus Connexinen (Cx) gebildet und erlauben den diffusiven Austausch be-

stimmter Moleküle, wie beispielsweise Aminosäuren oder Botenstoffen. Die Zell-Zell-

Kommunikation kann durch mehrere Faktoren reguliert werden. Neben der Anzahl der GJs

in der Membran ist auch ihr funktionaler Zustand entscheidend. Das Öffnen und Schließen

der Kanäle wird normalerweise hauptsächlich über die Phosphorylierung der Connexine

reguliert, die durch Phosphatasen und Proteinkinasen (z.B. MAP-Kinasen) phosphoryliert

werden. Die ZZK über Gap Junctions ist essentiell zur Aufrechterhaltung der Homöostase

in Geweben. Eine Störung dieses Gleichgewichts kann in unterschiedlichen Krankheiten

resultieren. Bei der Entstehung von Krebs ist die Kommunikation zwischen Tumorzellen

und den sie umgebenden Zellen inhibiert, wodurch sich die entarteten Zellen der Kontrolle

durch gesunde Zellen entziehen. Im Gegensatz dazu ist im Fall von chronischen Wunden

eine Isolation der verletzten Zellen von ihrer gesunden Umgebung ein entscheidender

Schritt im Heilungsprozess.

Nanosekunden gepulste elektrische Felder (nsPEFs) werden seit längerem auf ihre biome-

dizinischen Anwendungsmöglichkeiten untersucht, insbesondere zur Behandlung von

Krebs. Neben der Induktion der Apoptose können sie vor allem intrazelluläre Effekte her-

vorrufen, wie z.B. die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern oder den Zu-

sammenbruch des Aktin-Zytoskeletts. Viele dieser Effekte sind auch potentielle Modula-

toren der ZZK. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob und wie nsPEFs

die Kommunikation zwischen Zellen über GJs beeinflussen können und so eventuell die

Behandlung bestimmter Krankheiten verbessert werden könnte. Die Ergebnisse zeigen,

dass neben einer vorübergehenden Inhibierung der ZZK auch die Gen- und Proteinexpres-

sion von Cx43 verändert, MAP-Kinasen aktiviert und die Zellelastizität herabgesetzt

wurde.

Für die Versuche wurden Rattenleberepithelzellen (WB-F344) in Monolayern 20 Hoch-

spannungspulsen mit einer Dauer von 100 ns und Feldstärken zwischen 10 und 20 kV/cm

ausgesetzt. Knapp 90 % der Zellen überlebten diese Behandlung und es konnte keine Elek-

troporation für den gewählten Parameterbereich nachgewiesen werden. Die Ergebnisse

5 Zusammenfassung

89

zeigten eine Zeit- und Feldstärke-abhängige Inhibierung der ZZK, mit einer kompletten

Inhibierung 15 min nach der Anwendung von 20 kV/cm. 24 h nachdem die Zellen den

nsPEFs ausgesetzt worden waren, hatte sich die ZZK wieder komplett erholt. Die Immun-

fluoreszenzfärbung zeigte eine ebenfalls Zeit- und Feldstärke-abhängige Veränderung der

Verteilung von Cx43 in der Zelle. Eine halbe Stunde nach dem Applizieren der Hochspan-

nungspulse waren fast alle GJs aus der Plasmamembran abgebaut, während gleichzeitig das

intrazelluläre Fluoreszenzsignal zunahm. Nach 1 h begannen die GJs wieder in die Mem-

bran zurückzuwandern.

Die wahrscheinlichste Ursache der veränderten ZZK sowie der veränderten Cx43-Vertei-

lung ist eine Aktivierung von MAP-Kinasen, die in der Proteinanalyse nachgewiesen wer-

den konnte. 15 min nach dem Applizieren der elektrischen Pulse war Erk signifikant akti-

viert, was mit einer Hyperphosphorylierung von Cx43 und der Internalisierung der GJs aus

der Plasmamembran ins Zellinnere 30 min nach der Behandlung einherging. Im Gegensatz

dazu war p38 erst nach 6 h aktiviert und könnte für die Hyperphosphorylierung von Cx43

nach 24 h verantwortlich sein. Auch die Genanalyse wies eine signifikante Herabregulie-

rung des mRNA-Levels von Cx43 bis zu einer Stunde nach dem Applizieren der Hoch-

spannungspulse auf, was mit einer ebenfalls signifikant verminderten Gesamtproteinmenge

von Cx43 nach 30 min korrelierte. Nach 48 h war die Genexpression weiterhin vermindert,

allerdings nicht mehr signifikant. Alle Effekte waren Zeit- und Feldstärke-abhängig und

ihre Ausprägung nahm mit steigender Feldstärke zu.

Sowohl die Immunfluoreszenzfärbung als auch die AFM-Aufnahmen zeigten eine Um-

strukturierung des Aktin-Zytoskeletts nach dem Applizieren von Pulsen mit einer Feld-

stärke von 20 kV/cm. Der zeitliche Verlauf der Elastizitätsmessungen wies nach, dass die

Zellen direkt nach der nsPEF-Behandlung signifikant weicher wurden, sich jedoch schnell

wieder regenerierten. Dabei wurde die Gesamtelastizität über den Zellen hauptsächlich

durch die Elastizität über dem Zellkern bestimmt. Obwohl ein Weicherwerden von Zellen

mit der Malignität assoziiert wird, konnte mittels Soft Agar Formation Assay bzw. Scratch

Assay keine maligne Transformation und auch keine Änderung der Migrationsgeschwin-

digkeit nachgewiesen werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Behandlung von Zellen mit nsPEFs im Hin-

blick auf die ZZK zwar keine weiteren Vorteile bei der Krebstherapie zu haben scheint,

jedoch auch keine unerwünschten Nebenwirkungen wie eine maligne Transformation nach

sich zieht. Dafür wäre eine Anwendung im Bereich der Wundheilung denkbar, bei der eine

5 Zusammenfassung

90

unterdrückte ZZK und die Herabregulierung von Cx43 einen entscheidenden Prozess in der

Wundheilung darstellen.

91

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Effekte von Nanosekunden gepulsten elektrischen Feldern...

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