EGFR-Überexpression als möglicher Parameter zur ... · so waren die Unterschiede bei D0 (p =...

EGFR-Überexpression als möglicher Parameter zur

Einschätzung des malignen Potentials von

Leukoplakien der Mundhöhle

Aus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik

Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. h. c. Friedrich W. Neukam

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med. (doctor medicinae)

vorgelegt von

Moritz Bechtold

aus Mainz

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender der Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h. c. J. Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. Dr. E. Nkenke

Gutachter: PD Dr. Dr. F. Stelzle

Tag der Mündlichen Prüfung: 08. Januar 2015

3

meinen Förderern gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ....................................................................................... 6

1.1 Hintergrund und Ziele ................................................................................ 6

1.2 Material und Methoden ............................................................................. 6

1.3 Ergebnisse ................................................................................................ 7

1.4 Praktische Schlussfolgerung ..................................................................... 8

2 Summary ...................................................................................................... 9

2.1 Background and aims ............................................................................... 9

2.2 Materials and methods .............................................................................. 9

2.3 Results .................................................................................................... 10

2.4 Practical conclusion ................................................................................ 11

3 Einleitung ................................................................................................... 12

4 Zielsetzung ................................................................................................. 17

5 Material und Methode ................................................................................ 18

5.1 Patientenkollektiv .................................................................................... 18

5.2 Histologische Untersuchung ................................................................... 19

5.2.1 HE-Färbung ...................................................................................... 19

5.2.2 Immunhistochemische Grundlagen................................................... 20

5.2.3 Färbevorgang und Färbeprotokoll ..................................................... 21

5.3 Darstellung der IHC Färbungen .............................................................. 24

5.4 Bestimmung der EGFR-Expressionsrate ................................................ 27

5.5 Statistik ................................................................................................... 27

6 Ergebnisse ................................................................................................. 28

6.1 Ergebnisse der HE-Färbungen................................................................ 28

6.1.1 Klinische Kriterien und histologische Charakterisierung der Proben in

Gruppe I ..................................................................................................... 28

5

6.1.2 Histopathologische Bewertung der korrespondierenden Tumorprobe

................................................................................................................... 30

6.1.3 Transformationsrate je nach Dysplasiegrad in Gruppe I ................... 31

6.1.4 Klinische Kriterien und histologische Charakterisierung der Proben in

Gruppe II .................................................................................................... 32

6.1.5 Häufigkeitsverteilung der Dysplasiegrade im gesamten

Patientenkollektiv ....................................................................................... 33

6.2 Ergebnisse der EGFR-Färbungen ........................................................... 34

6.2.1 Übersicht über die Expressionsrate in den Probandengruppen ........ 34

6.2.2 Tabellarische Zusammenfassung der Färbeergebnisse ................... 37

6.2.3 Vergleich der EGFR-Expressionsrate der Leukoplakien in den

einzelnen Probandengruppen .................................................................... 41

6.2.4 Festlegung des cut-off-points der Überexpression von EGFR, Odds

Ratio und Vertrauensintervall ..................................................................... 45

6.2.5 Anzahl der Proben oberhalb des COP .............................................. 49

7 Diskussion .................................................................................................. 51

8 Literaturverzeichnis .................................................................................... 58

9 Erklärung .................................................................................................... 64

10 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................ 65

11 Herstellerverzeichnis ................................................................................ 66

12 Danksagung ............................................................................................. 68

13 Lebenslauf ............................................................................................... 69

6

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Die Leukoplakie der Mundhöhle (LPM) stellt die häufigste potentiell maligne

Mundschleimhautveränderung dar. Der Bewertung ihres Potentials zur

malignen Transformation kommt eine Schlüsselrolle in der Frühdiagnostik von

Kopf-Hals-Karzinomen, insbesondere des Plattenepithelkarzinoms der

Mundhöhle (PECM), zu. In Frühstadien therapiert, weist das PECM eine 5-

Jahres-Überlebensrate von etwa 80 % auf, diese sinkt in den

fortgeschrittenen Stadien auf etwa 30 %. Da die Mehrzahl der Fälle erst in

den höheren Stadien diagnostiziert wird, sind differenzierte Methoden für die

Frühdiagnostik von höchster Wichtigkeit.

Die histopathologische Einstufung des Grades der Dysplasie gehört zur

Routine in der Frühdiagnostik, um benigne Proben von solchen mit

potentieller Malignität zu unterscheiden. Diese Methode ist jedoch subjektiv

und kann häufig keine zuverlässige Aussage darüber treffen, ob das Gewebe

maligne entarten könnte. Daher sucht man heute nach molekularbiologischen

Markern, deren Expression in Zusammenhang mit Veränderungen in

Zellproliferation und Differenzierung steht. Diese Marker können mit der

malignen Entartung eines Gewebes assoziiert sein.

Ziel dieser Studie ist die Prüfung, ob zwischen der Expressionsrate des

Proteins Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) in Leukoplakien der

Mundhöhle und deren zeitnaher maligner Entartung eine Korrelation besteht.

1.2 Material und Methoden

Das historische Kollektiv umfasste 148 Gewebeproben von insgesamt 127

Patienten, diese wurden in drei Gruppen unterteilt.

Gruppe I bildeten 53 prämaligne Leukoplakieproben, die im

Beobachtungszeitraum von 5 Jahren (Follow-Up) ein PECM entwickelten. Bei

21 dieser 53 Patienten wurde der korrespondierende Tumor

immunhistochemisch nachuntersucht.

Gruppe II umfasste 45 Leukoplakien (LP), die im Beobachtungszeitraum von

5 Jahren kein PECM entwickelten.

7

Gruppe III diente als Kontrollgruppe und beinhaltete 29 Proben gesunder

Mundschleimhaut.

Bei den untersuchten Schnitten handelte es sich um formalinfixierte

Paraffinproben. Vorab erfolgte die Bestimmung des Dysplasiegrades anhand

einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE). Um die Expression von EGFR

einzuschätzen, wurde das Protein in weiteren Schnitten immunhistochemisch

nachgewiesen und anschließend geeignete Bereiche der Proben (regions of

interest, ROI) semi-quantitativ mittels Cell-Counting ausgezählt. Für die

Auswertung wurde die Expression in den einzelnen Gruppen und in den

jeweiligen Dysplasiegraden betrachtet und bezüglich signifikanter

Unterschiede bewertet. Hierzu diente der Mann-Whitney-U-Test mit einem

Signifikanzniveau von p ≤ 0,05.

1.3 Ergebnisse

Die Analyse der EGFR-Expression in den einzelnen Gruppen zeigte

signifikante Unterschiede in der Gruppe der entartenden (Gruppe I) und nicht-

entartenden (Gruppe II) Leukoplakien (p = 0,017).

Vergleicht man die einzelnen Dysplasiegrade in Gruppe I und II miteinander,

so waren die Unterschiede bei D0 (p = 0,013) und D1 (p = 0,049) signifikant.

Für die höheren Dysplasiegrade (D2 und D3) zeigten sich keine signifikanten

Zusammenhänge. Für D2 lag der p-Wert bei 0,43. D3 lag in Gruppe II nicht

vor und hatte in Gruppe I die geringste Probenzahl (n = 11).

Beim Vergleich der Kontrollgruppe (Gruppe III) mit den zusammengefassten

D0- und D1-Proben der Gruppe I zeigte sich ein hochsignifikanter

Unterschied (p = 0,003). Dieser war auch noch beim Zusammenfassen der

D0-, D1- und D2-Proben der Gruppe I gegenüber Gruppe III signifikant (p =

0,05).

Fasst man dagegen die D0- und D1-Proben der Gruppe II zusammen, ergibt

sich kein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p = 0,26).

Um zu beurteilen, ob eine prämaligne Läsion als benigne einzustufen ist oder

erhöhtes Potential zur malignen Entartung besitzt, wurde ein Schwellenwert

(cut off point, COP) im Sinne einer kritischen EGFR-Überexpression mithilfe

der ROC-Kurve (receiver operating characteristic) ermittelt. Der COP, ab dem

8

eine maligne Entartung als wahrscheinlich anzusehen ist, liegt nach dem

errechneten Youden-Index bei 44,7 %.

Zudem wurde das Quotenverhältnis (odds ratio, OR) bestimmt. Dieses liegt

bei 4,83. Läsionen, die den COP der EGFR-Expression überschreiten haben

demzufolge eine rund 5-mal höhere Chance zu entarten. Betrachtet man das

95%-Konfidenzintervall der OR, so ist diese bei Überschreiten des COP

mindestens doppelt und maximal 12-fach erhöht gegenüber einer Läsion mit

unterschwelliger Expression.

1.4 Praktische Schlussfolgerung

Die Bestimmung der EGFR-Expression in LPM kann ein wichtiges

zusätzliches diagnostisches Hilfsmittel sein, um Gewebeveränderungen mit

erhöhtem Risiko für eine maligne Entartung - über die Bewertung des

Dysplasiegrades hinaus - sicherer zu identifizieren.

9

2 Summary

2.1 Background and aims

The oral leukoplakia (OLP) represents the most common potential malignant

lesion of the oral mucosa. The evaluation of its malignancy plays a key role in

the early diagnosis of head and neck carcinoma, especially the oral

squamous cell carcinoma (OSCC). While therapy in the early stages

correlates with a high 5-year survival rate about 80 %, the same one

drastically drops in the advanced stages down to 30 %. Given that most of the

cases are diagnosed in an advanced stage, therefore differentiated methods

of evaluation for early diagnosis are urgently needed.

The histopathological assessment of the degree of dysplasia belongs to

today’s clinical routine in early diagnosis in order to distinguish benign

specimens from those with increased malignant potential. But this method

remains to be subjective and cannot reliably predict whether a lesion

progresses to malignancy. Hence, attempts have been made to find

molecular biological markers whose expression comes along with changes in

cell proliferation and differentiation. These can be contributed to the malignant

transformation of the tissue.

The aim of this study was to evaluate if there are correlations between EGFR

expression rate in OLP and their contemporary rate of malignant

transformation.

2.2 Materials and methods

A total of 148 tissue samples based on 127 patients was achieved and split

into three groups.

Group I based upon 53 premalignant specimens that transformed to

malignancy (OSCC) within 5 years of observation. The correspondent tumor

tissues were researched in 21 of the total of 53 patients.

Group II included 45 premalignant lesions that didn’t show malignant

transformation during the 5-year-follow-up period.

Group III served as a control group (negative control) and involved 29 healthy

tissue samples.

10

All tissue samples were collected as paraffin blocks affixed by formalin. First

of all their grade of dysplasia was measured by means of an Hematoxylin and

eosin stain. In order to describe the expression rate of EGFR all samples had

been stained immunohistochemically. Afterwards the labeling index of proper

regions (regions of interest, ROI) of these samples was semi-quantitative

analyzed by cell-counting to measure the expression rate which was realized

for each group and each grade of dysplasia. Correlation between over-

expression and malignant transformation was calculated by Mann-Whitney-U-

Test considering p-values < 0.05 as statistically significant.

2.3 Results

The analysis of EGFR-expression showed significant differences between

Group I (malignant-transforming) and Group II (non-transforming), p = 0.017.

Considering the grade of dysplasia for both groups significance was found in

the lower grades of dysplasia D0 (p = 0.013) and D1 (p = 0.025). There was

no correlation found within the tissue specimens with higher dysplastic grades

(D2 + D3). The p-value calculated for D2 was 0.43. Group II did not contain

specimens of D3. Only a few samples of this grade of dysplasia occurred in

Group I (n = 11).

Comparing the control group (Group III) with the combined samples of D0 and

D1 of Group I revealed a highly significant difference (p = 0.003). This

significance also appeared when combining the samples of D0, D1 and D2 of

Group I (p = 0.05).

In contrast there was no significant difference found between control group

and the summarized tissues of D0 and D1 of Group II (p = 0.26).

To evaluate a premalignant sample being either innocuous or having the

potential to malignant transformation there was calculated an optimal

threshold value (cut-off-point) of critical EGFR-expression rate using the

ROC-curve (receiver operating characteristic). The COP for differentiation

between non-transforming and transforming lesions was 44.7 % referred to

the Youden-index.

In addition we calculated an odds ratio of 4.83, which means lesions with

expression over the COP have a nearly 5 times higher risk of cancer

development. Considering the 95 % confidence interval of the COP lesions

11

above this threshold value has at least a double and at maximal a 12 times

higher risk compared to those below the COP.

2.4 Practical conclusion

Considering the expression of EGFR in oral leukoplakia may be an important

additional tool in cancer risk assessment of OLP. Additionally this analysis

could more reliable identify those premalignant lesions exhibiting no or mild

dysplasia bearing a high risk for malignant progression.

12

3 Einleitung

Kopf-Hals-Karzinome (Head and neck squamous-cell carcinoma, HNSCC)

stehen nach Häufigkeit an sechster Stelle aller Malignome weltweit [29]. Die

WHO gibt die Mortalität mit knapp 60 % an, die 5-Jahres-Überlebensrate wird

auf etwa 50 % geschätzt [47]. Die invasive Therapie für betroffene Patienten

umfasst rekonstruktive Chirurgie, Radiatio, adjuvante Chemotherapie sowie

lebenslängliche Nachuntersuchungen [1].

Bei über 90 % der Malignome der Mundhöhle handelt es sich um

Plattenepithelkarzinome (PECM) [27]. Erfolgen Diagnose und Therapiebeginn

dieser in einem Stadium noch vor der Entartung, kann die

Überlebenswahrscheinlichkeit bis zu 80 % betragen, in späteren Stadien sinkt

diese auf etwa 30 % [32]. Die Prognose ist somit maßgeblich abhängig von

der frühzeitigen Diagnostik und Therapie.

Viele Studien haben gezeigt, dass maligne Neoplasien der Mundhöhle in

einem 2-stufigen Prozess aus einer oralen Vorläuferläsion entstehen [42, 46,

56]. Daher kommt der Untersuchung dieser Läsionen eine Schlüsselrolle in

der Krebsfrühdiagnostik zu. Diese potentiell malignen Läsionen zeigen jedoch

kein einheitliches klinisches Bild. Sie können beispielsweise auch

schmerzlose Hyperkeratosen oder rötliche, unscharf-begrenzte Plaques und

Knoten sein [18].

Die häufigste potentiell maligne Gewebeveränderung des Mundraums stellt

die Leukoplakie (LPM) dar [75]. Die Literatur beschreibt die LPM in 11 bis 67

% der Fälle als Vorläuferläsion des PECM [63]. Die Häufigkeit ihrer malignen

Transformation wird mit < 1 bis 18 % der Fälle über einen

Beobachtungszeitraum von bis zu 11 Jahren angegeben. Die Unterschiede

ergeben sich aufgrund verschiedener Länderdaten [56, 8].

Das klinische Erscheinungsbild der Leukoplakie der Mundhöhle stellt sich als

weißer, nicht-abwischbarer Fleck dar, bei dem es sich um eine Hyperkeratose

der Schleimhaut handelt. Sie präsentieren sich als nicht juckende,

schmerzlose, plane und scharf begrenzte Hautveränderungen, welche nach

WHO-Definition keinem bestimmten Krankheitsbild zugeordnet werden

13

können [50, 75]. Ursachen für ihre Entstehung sind chronisch-andauernde

exogen-irritative Reize auf die Schleimhaut. Zu diesen gehören biologische

Reize durch Virusinfektionen. Des Weiteren chemische Reize durch Rauchen

und Kautabak sowie mechanische Reize infolge schlecht-sitzender

Zahnprothesen, kariöser Zähne oder Potentialdifferenzen zwischen

verschiedenen dentalen Legierungen. Raucher bilden die Patientengruppe

mit dem höchsten Vorkommen an Leukoplakien [8]. Zu den wesentlichen

Risikofaktoren, die zur malignen Transformation beitragen, zählen Rauchen

[38], chronischer Alkoholabusus [44] sowie mangelhafte Mundhygiene.

Weiterhin stellen Humane Papillomaviren (Typ 1, 6, 16) [41] oder Infektionen

mit Candida [57] etwaige Risikofaktoren dar.

Um die Wahrscheinlichkeit für die maligne Entartung einer LPM zu beurteilen,

wird heutzutage ihr histologisches Erscheinungsbild gemäß verschiedener

Dysplasiegrade betrachtet [46]. Die biopsierten, verdächtigen Läsionen

werden einer HE-Färbung unterzogen und anschließend histopathologisch

bezüglich ihres Dysplasiegrades eingestuft [21]. Etwa 13 % aller gefundenen

Leukoplakien weisen bereits eine dysplastische Veränderung auf [8]. Dabei

unterscheidet man eine epitheliale Hyperpalsie (D0) von den

Dysplasiegraden D1 bis D3. Bei D1 betrifft die dysplastische Veränderung

den basalen epithelialen Abschnitt. Bei D2 liegt sie im basalen und mittleren

Abschnitt vor. Bei D3 ist die gesamte Epithelschicht dysplastisch verändert.

Die Wichtigkeit des Dysplasiegrading zeigt sich darin, dass folgender

Zusammenhang heute allgemein anerkannt wird: Mit steigendem

Dysplasiegrad nimmt auch die Entartungswahrscheinlichkeit einer

prämalignen Läsion zu [15, 21, 22, 50, 70, 76]. Viele klinische Studien haben

diesen Zusammenhang bestätigt und zeigen, dass sich die

Entartungswahrscheinlichkeiten wie folgt verteilen: Eine D0 entartet in 0 - 3

%, eine D1 in 0 - 30 %, eine D2 in 0 - 44 % und eine D3 in 20 - 67 % der Fälle

[5, 14, 23, 52]. Da bereits eine D1-Dysplasie ein recht hohes Entartungsrisiko

aufweisen kann, lässt sich schlussfolgern, dass eine zuverlässige

Frühdiagnostik von höchster Relevanz ist. Die Einstufung einer

Vorläuferläsion hinsichtlich ihres Dysplasiegrades kann als wichtigster Schritt

der weiteren klinischen Behandlungsplanung angesehen werden [25].

14

Allerdings ergeben sich bei der Bestimmung des Dysplasiegrades folgende

Probleme: In Hinsicht auf diesen werden die gleichen HE-Färbungen von

verschiedenen Pathologen oftmals unterschiedlich eingestuft [7, 14, 35, 45].

Zudem entartet nicht jede LPM gemäß ihrem Dysplasiegrad. Einige Läsionen

mit hohem Dysplasiegrad entarten nicht oder bilden sich spontan zurück.

Außerdem kann ein PECM auch aus unverändertem Gewebe entstehen [56,

15, 22, 50]. Ein weiteres Defizit ist, dass sich der vorgefundene

Dysplasiegrad nicht mit der Rezidiv-Wahrscheinlichkeit korrelieren lässt. Die

Rezidiv-Wahrscheinlichkeit einer chirurgisch exzidierten oralen Leukoplakie

wird mit 7,7 bis 38,1 % angegeben [39]. Auch die Lokalisation der

vorgefundenen prämalignen Gewebeveränderung hat Einfluss auf deren

Entartungswahrscheinlichkeit. Zunge und Mundboden gelten als Hoch-Risiko-

Zonen für die Entartung [74, 77].

Wegen dieser Probleme sucht man aktuell nach neuen Methoden, welche die

Frühdiagnostik von prämalignen Läsionen verbessern, um zu einer

genaueren Vorhersage über die Wahrscheinlichkeit der malignen

Transformation dieser zu gelangen. Hierbei kommt der Expression von

molekularbiologischen Markern in der Immunhistochemie eine Schlüsselrolle

zu. Gegenwärtig besitzen diese zwar noch keine allgemein anerkannte

Aussagekraft bezüglich des Risikos, das von einer Vorläuferläsion ausgeht,

sie könnten aber dazu beitragen, das maligne Potential einer Vorläuferläsion

zusätzlich zum Dysplasiegrading genauer zu erfassen [10, 56, 62]. Diese

neue Möglichkeit der Präzisierung der Prognose ist gerade bei den niedrig-

dysplastischen Vorläuferläsionen (D0 und D1) von hoher Bedeutung.

Als Biomarker eignen sich vor allem die Tumorassoziierten Antigene (TAA).

Anders als die Tumorspezifischen Antigene, die man nur bei Krebszellen

vorfindet, werden viele TAAs auch von gesunden Zellen exprimiert. Das

Expressionsmuster dieser TAA entspricht bei Krebszellen häufig einer

Überexpression [6]. Die größte Bedeutung kommt den

Differenzierungsantigenen, die gewebespezifisch exprimiert und in malignen

Neoplasien überexprimiert sind, und Proteinen zu, die in den Zellzyklus

15

eingreifen und zu einer erhöhten Proliferation sowie einer verminderten

Apoptose führen [2, 9, 16, 17].

In der vorliegenden Arbeit wurde der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor

(EGFR, ErbB1) in den Mittelpunkt dieser Betrachtung gestellt. Bei diesem

handelt es sich um eine Rezeptortyrosinkinase aus der Familie der ErbB-

Membran-Rezeptoren. EGFR kommt in allen Zellarten vor und stimuliert über

eine Signalkaskade das Zellwachstum, verhindert den apoptotischen Zelltod

und begünstigt die Transformation einer Zelle. Extrazellulär bindet der EGF-

Rezeptor die Liganden epidermal growth factor (EGF) und transforming

growth factor (TGF-α). EGFR wird als Tumorassoziiertes Antigen in vielen

malignen Gewebeproben, die sich aus Plattenepithelien entwickelt haben,

überexprimiert. Seine vermehrte Expression ist beispielsweise in

Lungenkarzinomen, Mamma- und Ovarialkarzinomen, Nieren-, Blasen-,

Prostatakarzinomen sowie Kopf- und Halstumoren nachgewiesen [61]. Seine

Überexpression lässt sich auch als diagnostischer und prognostischer Marker

des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle heranziehen [33, 36, 65]. Bei

einigen Karzinomen wurde bereits eine Korrelation zwischen der EGFR-

Expression und einer schlechteren Prognose gefunden [20]. So findet sich

beispielsweise in den Frühstadien (II + IIIa) des nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinoms (NSCLC) eine Gain-Mutation des EGFR-Gens (Chr.

7p12), die zur Überexpression führt [34]. Auch bei Leukoplakien als

potentielle Präkanzerosen wurde bereits ein Zusammenhang zwischen der

EGFR-Überexpression mit der Proliferationsrate und/oder der epithelialen

Malignität assoziiert. Dabei imponiert vor allem das Stratum germinativum

(Str. basale und Str. spinosum) als Bereich der höchsten Dichte an positiv

gefärbten EGFR-Zellen [67]. Dysplastische prämaligne Läsionen des

Plattenepithelkarzinoms des Kopf- und Halsbereiches zeigen deutlich erhöhte

EGFR-Expressionsraten. Auch in Tumor angrenzendem gesundem Gewebe

wurde eine hochregulierte EGFR-Expression gefunden [66]. Andere Studien

zeigen, dass die Immunfärbungen oraler Vorläuferläsionen unabhängig vom

vorgefundenen Dysplasiegrad stets erhöht ausfallen [55]. Eine erhöhte

Kopienzahl des EGFR-Gens und eine erhöhte EGFR-Expression in oralen

prämalignen Läsionen geht somit stets mit einer höheren malignen

Entartungswahrscheinlichkeit einher [72].

http://flexikon.doccheck.com/de/Apoptose

http://de.wikipedia.org/wiki/Epidermal_Growth_Factor

http://de.wikipedia.org/wiki/Transforming_Growth_Factor

http://de.wikipedia.org/wiki/Transforming_Growth_Factor

16

Demgegenüber stehen jedoch Forschungsarbeiten, die keine Unterschiede in

der immunhistochemischen EGFR-Expression zwischen dysplastischem und

nicht-dysplastischem Epithel oraler Leukoplakien sehen [58]. Auch bei

Rauchern und Nichtrauchern lässt sich das Ausmaß der EGFR-Expression in

oralen Leukoplakien immunhistochemisch nicht voneinander unterscheiden

[58]. Viele Autoren sprechen sich jedoch dafür aus, dass Tabakrauch den

Signalweg der EGFR-Tyrosinkinase aktiviert und somit die Zellproliferation

und -transformation vorantreibt [12, 19, 34].

Vor dem Hintergrund dieser Widersprüche soll in dieser Arbeit geprüft

werden, wie sich die EGFR-Expression sowohl in niedrig- als auch hoch-

dysplastischen Leukoplakien im Vergleich zum Tumor selbst und einer

Kontrollgruppe darstellt. Es soll die Frage geklärt werden, ob auch geringe

Unterschiede im Expressionsmuster von EGFR einen signifikanten

Vorhersagewert bezüglich der Entartungswahrscheinlichkeit besitzen. Eine

sich daraus ergebende präzisere Prognoseabschätzung ist auch für die

anschließende Therapie solcher Vorläuferläsionen von größter Bedeutung.

Leukoplakien mit erhöhtem malignem Potential könnten frühzeitig erkannt

und in einem Stadium therapiert werden, in welchem sie noch nicht entartet

sind. Betroffene Patienten erhalten so die Chance, den invasiven und

beeinträchtigenden chirurgischen Eingriff sowie die adjuvante Chemotherapie

und deren Nebenwirkungen zu vermeiden. Die Erforschung der Antigene

könnte neue Therapiekonzepte ermöglichen, z.B. eine spezifische

Immuntherapie gegen EGFR in oralen Leukoplakien.

17

4 Zielsetzung

Ziel der Studie ist es, zu überprüfen, ob durch den Nachweis einer

Überexpression von EGFR in Leukoplakien der Mundhöhle auf die zeitnahe

Entwicklung eines PECM geschlossen werden kann. Darüber hinaus soll

untersucht werden, ob eine unterschiedlich hohe Expression in den

Patientengruppen als Risikofaktor für die Entartung gewertet werden muss.

So soll die Frage geklärt werden, ob derartige Expressionsanalysen in

Leukoplakien der Mundhöhle einen Beitrag zur Früherkennung von Patienten

liefern können, die ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung eines PECM haben.

Hieraus ergeben sich folgende Arbeitshypothesen:

- Eine Überexpression von EGFR lässt sich wie beim PECM auch in

Leukoplakien der Mundhöhle nachweisen.

- Wenn in einer Leukoplakie der Mundhöhle eine signifikante

Überexpression von EGFR nachgewiesen werden kann, entwickelt sich

im Verlauf ein Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle.

- Wenn in einer Leukoplakie der Mundhöhle keine signifikante

Überexpression von EGFR nachgewiesen wird, entwickelt sich in einem

5-Jahreszeitraum kein Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle.

Bereits maligne transformierte Zellen könnten durch Methoden der

Molekularbiologie und Immunhistologie in den Vorläufern des

Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle nachgewiesen und somit bei

Hochrisikopatienten besser identifiziert werden. Die Methoden können ein

zusätzliches Kriterium für eine chirurgische und/oder adjuvante

Therapieentscheidung bilden und der Entwicklung neuer Therapiekonzepte,

beispielsweise auf Basis der Immuntherapie, neuen Anstoß geben.

18

5 Material und Methode

5.1 Patientenkollektiv

Das Expressionsmuster von EGFR wurde anhand einer Reihe von

formalinfixierten Paraffinproben untersucht. Diese Proben entstammen einem

Patientenkollektiv, welches zwischen 1997 und 2011 rekrutiert wurde. Das

Gewebematerial lag in anonymisierter Form vor, sodass einzelne Proben

nicht auf die Patienten zurückführbar waren. Die Daten wurden retrospektiv

erhoben, Nachuntersuchungen waren nicht notwendig. Einschlusskriterien für

die Patientenauswahl waren Veränderungen der Schleimhaut (Leukoplakien)

der Mundhöhle und des Rachenraums. Es ließen sich drei Patientengruppen

mit folgenden Eigenschaften bilden:

Patienten wurden der Gruppe I zugeordnet, wenn sich aus den

Schleimhautveränderungen innerhalb von 5 Jahren ein Plattenepithel-

karzinom der Mundhöhle bzw. des Oropharynx entwickelte. Gruppe I umfasst

somit die prämalignen Gewebeproben des ersten Untersuchungszeitpunktes,

sowie die korrespondierende entartete Läsion (PECM) zu einem folgenden

Untersuchungszeitpunkt (Follow-Up).

Gruppe II umfasst Proben von Patienten, bei denen zum Zeitpunkt der

Erstuntersuchung im oben genannten Rekrutierungszeitraum eine potentiell

maligne Läsion (Leukoplakien, Hyperplasien) der Mund- oder

Rachenschleimhaut entdeckt wurde. Auch bei diesen Patienten wurde eine

Nachuntersuchung mit Gewebeprobe innerhalb von 5 Jahren nach der

Erstuntersuchung veranlasst. In diesen Follow-Up-Untersuchungen zeigten

sich jedoch keine malignen Entartungen der betroffenen Schleimhautareale.

Die gewonnenen Leukoplakien der Erstuntersuchung konnten somit als nicht-

präkanzerös eingestuft werden. Nur die Gewebeproben der Erstuntersuchung

wurden immunhistochemisch aufbereitet und bezgl. ihrer EGFR-Expression

untersucht, um sie mit den prämalignen Proben der Gruppe I vergleichen und

bewerten zu können.

19

Bei den Gewebeproben der Gruppe III handelt es sich um gesunde

Schleimhautproben der Mund- und Oropharynx-Region, die keine

histologischen Veränderungen zeigten. Die Proben dienen als Kontrollgruppe

(Negativkontrolle). In ihnen wurde die EGFR-Expression ebenfalls

immunhistochemisch bestimmt. Sie dienen dem Zweck, die unterschiedlich

hohe EGFR-Expression von prämalignen bzw. verdächtigen Läsionen und

somit deren prognostische Bedeutung gegenüber gesunder Schleimhaut zu

verdeutlichen.

5.2 Histologische Untersuchung

5.2.1 HE-Färbung

Mit Hilfe dieser Färbemethode wurden die Leukoplakieproben ihrem

jeweiligen Dysplasiegrad zugeordnet. Weiterhin wurde so das Grading für die

PECM-Schnitte ermittelt.

Die in Formalin fixierten Paraffinschnitte der einzelnen Probandengruppen

wurden zunächst entparaffiniert: Die Objektträger wurden dreimal für je 15

Minuten in ein Xylol-Bad (Xylene®, rein = 100 % konzentriert) eingelegt.

Anschließend wurden die Objektträger je 3 min einer Alkoholreihe

absteigender Konzentration zugeführt (insgesamt 7 Propanol-Bäder).

Abschließend wurden die Objektträger kurzzeitig in Aqua dest. (AD)

belassen.

Entparaffinierung Minuten

Xylol 3 x 15‘

100 % Isopropanol 5‘







Aqua dest. 2‘

Tabelle 1: Protokoll zum Entparaffinieren der Schnitte

20

Die Objektträger wurden nun für fünf Minuten in Hämatoxylin (Fa. Sigma)

getaucht und dann kurz in einem HCl-Alkohol-Bad differenziert. Zur

Beseitigung von überschüssigem Farbstoff wurden sie weitere fünf Minuten

unter fließendem Wasser gewässert. Die Proben wurden für 3 Minuten in

einem AD-Bad zwischengelagert, ehe sie für ca. 5 Sekunden in eine Lösung

des Farbstoffs Eosin (Fa. Sigma) eingesenkt wurden.

Anschließend wurden die Objektträger wieder in AD gespült und einer

aufsteigenden Propanolreihe (identisch mit der oben beschriebenen Alkohol-

Reihe) zugeführt, um überschüssiges Eosin auszuwaschen. Nach einer

erneuten Zwischenlagerung in Xylol (für je 5 Minuten) wurden die Proben mit

dem Eindeckmedium Entellan (Fa. Merck) unter Zuhilfenahme eines

Deckgläschens eingedeckt.

5.2.2 Immunhistochemische Grundlagen

Für die Untersuchungen wurde ein indirektes Verfahren, die sogenannte

Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode (Lab-Sa, syn. LSAB IHC), gewählt.

Diese ist auf Abbildung 1 veranschaulicht.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der LSAB-Methode [28]

21

Zunächst wird ein unkonjugierter Primärantikörper auf die zu untersuchenden

Schnitte gegeben, der an EGFR als Antigen bindet. An dessen konstante

Kette bindet ein zweiter biotinylierter Sekundärantikörper (Brücken-

Antikörper). An diesen wiederum binden (Strept-)Avidin-Moleküle. Hierbei

kommt Biotin die Fuktion eines Bindungsvermittlers (Enzymkonjugat) zu. Da

jedes Avidin-/Streptavidin-Molekül über vier Bindungsstellen für Biotin verfügt,

kommt es zu einer Signalamplifikation bzw. Verstärkung des Signals. Die für

die Färbung verantwortliche Chromogen-Lösung basiert hier auf alkalischer

Phosphatase [40].

Der Färbevorgang wurde an allen formalinfixierten Paraffinschnitten der drei

Patientengruppen durchgeführt. Für den Nachweis des EGF-Rezeptors auf

Proteinebene wurde ein geeigneter monoklonaler Primärantikörper (anti-

EGFR) der Firma Dako [26] mit folgenden Eigenschaften verwendet:

Primär-

Antikörper

Firma gewonnen

aus

gerichtet gegen Typus Konzentration

d. Primär-

Antiköpers

EGFR Clone

H11

Dako (An Agilent

Technologies

Company)

Maus Mr 170 kD wild-type EGFR-1,

Mr 145 kD deletion mutant

form of the EGFR-receptor

(EGFRvIII), EGFRvIII-

transfected HC2 20 d2 cell line

monoklonal 1:300

Tabelle 2: Hersteller, Eigenschaften und Konzentration des verwendeten

Primärantikörpers

Der Antikörper erzeugt an den Zell-Oberflächen von Tumor-Zellinien mit

erhöhter EGFR-Expressionsrate (sog. A431-Zellinie) eine vermehrte

Anfärbung, sofern der Rezeptor überexprimiert wird [78]. Diese

Überexpression lässt sich lichtmikroskopisch erfassen und quantifizieren.

5.2.3 Färbevorgang und Färbeprotokoll

Vor der Antikörper-Färbung müssen alle Präparate entparaffiniert bzw.

vorbehandelt werden. Die Schnitte werden dreimal hintereinander für je 15

min in Xylol getaucht. Anschließend werden sie einer absteigenden

Propanolreihe zugeführt. Diese entspricht der oben beschriebenen Propanol-

Reihe bei der HE-Färbung. Zur Rehydrierung wurden die Proben in Aqua

dest. belassen.

22

Der Färbevorgang wurde vollautomatisch unter Zuhilfenahme eines

Autostainers durchgeführt (Dako Diagnostika GmbH, Hamburg), in den die

vorbehandelten Objektträger sowie nötigen Reagenzien eingelegt waren. Zur

Spülung der Proben im Autostainer wurde am Vortag ein geeigneter Dako-

Wash-Puffer (S3006, pH 7.6, ca. 100 µl/Schnitt) hergestellt.

Um sicherzustellen, dass die Färbung korrekt vollzogen wurde, wurde für

jeden Durchlauf neben den eigentlichen Schnitten eine Probe eines PECM

als Positivkontrolle mitgeführt. Ebenso wurde eine Negativkontrolle zum

Ausschluss falsch-positiver Ergebnisse mitgefärbt. Diese wurde zwar mit den

gleichen Reagenzien jedoch nicht mit dem Primär-Antikörper behandelt. Der

genaue Ablauf der vollautomatischen Färbung im Autostainer ist Tabelle 3 zu

entnehmen.

Als Primär-Antikörper kam der oben beschriebene EGFR-Antikörper zum

Einsatz, der mit Antibodydiluent (Dako S2022) im Verhältnis 1:300 verdünnt

wurde. Als Sekundär-Antikörper wurden biotinylierte Ziege-Anti-Maus-

Immunglobuline (Dako REAL Detection System AB2) verwendet. Diese

Reaktion wird mit dem Farbstoff (Chromogen Fast-Red) nachgewiesen.

Dieser wird im Zuge der Färbung im Autostainer mit AP-Substrat-Buffer (Dako

REAL von Fa. Dako, Hamburg) verdünnt, dem zuvor ein Tropfen Levamisol

(auf 10 ml AP-Buffer) zugefügt wurde. Durch Levamisol wird die endogene

Alkalische Phosphatase gehemmt. Chromogen Fast-Red führt aufgrund einer

Hydrolyse des Substrats zu einer rot-braunen Färbung.

An die Hauptfärbung schloss sich unmittelbar die Gegenfärbung mit

Haemalaun (Fa. Dako, Hamburg) an, siehe Tabelle 3. Überschüssige Farbe

wurde unter fließendem Wasser ausgewaschen. Die Schnitte wurden ein

letztes Mal in Aqua dest. belassen, dann getrocknet und mit Aquatex (Fa.

Merck, Darmstadt) eingedeckt.

23

Hauptfärbung im Autostainer

5 min Proteinase K (Dako S3020)

30 min EGFR 1:300 (= Primär-Ak)

verdünnt mit Antibodydiluent (Dako S2022)

15 min Spül-Lösung A (= biotinylierter Sekundär-Ak)

Dako REAL Detection System K5005

15 min Spül-Lösung B (= Streptavidin-AP-Komplex,

basierend auf Alkalischer Phosphatase)

Dako REAL Detection System AP K5005

8 min Chromogen Fast-Red K5005

6 min Chromogen Fast-Red 2 K5005

- 8 min bis 22°

- 5 min bis 22°

Spülung AD

Färbung von Hand

5 min Haemalaun (Dako S3301)

5 min Fließendes Leitungswasser

5 min Eindecken mit Aquatex

Tabelle 3: Färbeprotokolle für die IHC-Färbung mit EGFR-Primärantikörper

24

5.3 Darstellung der IHC Färbungen

Die folgenden Abbildungen 2a bis 2d zeigen Tumorschnitte:

2a (20x Vergrößerung) 2b (20x Vergrößerung)

2c (40x Vergrößerung) 2d (40x Vergrößerung)

Abbildung 2: Beispielbilder für ein PECM nach erfolgter Färbung

25

Die Abbildungen 3a bis 3d zeigen Schnitte von gesunder Mundschleimhaut:

3a (40x Vergrößerung) 3b (40x Vergrößerung)

3c (40x Vergrößerung) 3d (40x Vergrößerung)

Abbildung 3: Beispielbilder aus der Gruppe III (gesunde Schleimhaut)

26

Die nachstehende Abbildung zeigt Schnitte von gefärbten Leukplakien in

allen vorgefundenen Dysplasiegraden von D0 bis D3 und stellt Gruppe I und

Gruppe II gegenüber:

Abbildung 4: Schnitte von gefärbten Leukplakien D0 bis D3 in Gruppe I u. II

27

5.4 Bestimmung der EGFR-Expressionsrate

Zur Semi-Quantifizierung der EGFR-Expressionsrate wurden die gefärbten

Schnitte mithilfe eines Mikroskops mit integrierter Digitalkamera Axio Cam

von Carl Zeiss (Jena) digitalisiert und in Bilddateien (.jpeg oder .tif) überführt.

Es wurden Bilder in 10-, 20- sowie 40-facher Vergrößerung aufgenommen.

Für jedes Präparat wurden 2-4 auszuwertende Präparat-Bereiche, die sog.

region of interests (ROI), festgelegt. In jedem ROI wurden ca. 200-300

epitheliale Zellen ausgezählt und die gezählten Zellen als positiv oder negativ

bezüglich ihrer EGFR-Expression bewertet. Pro Schnitt wurden somit ca. 900

Zellen beachtet. Als Software für dieses Cell-Counting diente ImageJ Version

1.46 (entwickelt bei National Institutes of Health, Bethesda).

Der Quotient aus EGFR-positiven- zu EGFR-negativen-Zellen wurde in

Prozent dokumentiert. Dieser Wert entspricht dem prozentualen Anteil der

EGFR-Expression (expression rate, ER) im vorliegenden Präparat. Die ER (je

Schnitt) stellt den gemittelten Wert der Einzel-Zählungen aus den ROIs dar.

Die Vorteile dieser Auszählungs-Methode sind in der Diskussion dieser Arbeit

erläutert.

5.5 Statistik

Alle Ergebnisse wurden tabellarisch festgehalten, hierbei kam das

Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2010 zum Einsatz (Microsoft Corp.,

Redmond, USA).

Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SPSS 19.0 (IBM,

Armonk, USA) verwendet. Dieses konnte über das Regionale Rechenzentrum

der Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg bezogen werden. Signifikante

Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test für unabhängige

Stichproben berechnet. Als Signifikanzniveau wurde p < 0,05 festgelegt.

28

6 Ergebnisse

6.1 Ergebnisse der HE-Färbungen

Die gefärbten Gewebeschnitte wurden von zwei unabhängigen Pathologen

untersucht. Die vorhandenen Leukoplakien wurden hinsichtlich ihres

Dysplasiegrades beurteilt. Bei den Tumoren wurden deren

Differenzierungsgrad (Grading) und deren Stadieneinteilung (Staging)

bestimmt. Die Ergebnisse wurden tabellarisch festgehalten, um Aussagen

über die prozentualen Verteilungen der genannten Parameter zu treffen.

6.1.1 Klinische Kriterien und histologische Charakterisierung

der Proben in Gruppe I

Die Einschlusskriterien wurden von insgesamt 40 als Leukoplakien

klassifizierten Schnitten erfüllt. Als weitere prämaligne Gewebeproben

wurden 13 fakultative Präkanzerosen aus dem Oropharynx in die Gruppe

miteinbezogen. Somit konnten insgesamt 53 prämaligne, pharyngeale

Leukoplakien immunhistochemisch untersucht werden.

Bei 21 Patienten dieser Gruppe wurde im Rahmen der Nachuntersuchung

(Follow-Up innerhalb von 5 Jahren) eine Gewebeprobe des

korrespondierenden Tumors (PECM) gewonnen.

Von den 53 gefärbten prämalignen Läsionen stammen insgesamt 34 von

männlichen Probanden. Dies entspricht einem Prozentsatz von 64,2 %.

Weitere 19 Proben bzw. 35,8 % wurden bei weiblichen Probanden

diagnostiziert. Das Verhältnis Männer : Frauen lag somit ungefähr bei 2 : 1 .

Betrachtet man das Alter der 53 überprüften Patienten bei der Erstdiagnose

der Leukoplakie, so ergibt sich ein Durchschnittsalter von 61,8 Jahren, wobei

das Durchschnittsalter der männlichen Erkrankten bei 60,2 Jahren, das der

weiblichen Probanden bei 63,3 Jahren liegt.

Die Läsionen manifestierten sich in der Periode zwischen 1997 und 2011.

In dem Kollektiv waren alle Dysplasiegrade - D0, D1, D2 und D3 –

vorhanden.

29

Die prozentuale und numerische Verteilung der Dysplasiegrade in Gruppe I

sind in Abbildung 5 und Tabelle 4 wiedergegeben:

Abbildung 5: Graphische Darstellung der Dysplasiegrad-Verteilung in

Gruppe I in Prozent

Dysplasiegrad Anzahl Prozentanteil

D0 15 28,3 %

D1 14 26,4 %

D2 13 24,5 %

D3 11 20,8 %

Total 53 100 %

Tabelle 4: Numerische und prozentuale Dysplasiegrad-Verteilung für die

Leukoplakien in Gruppe I

30

6.1.2 Histopathologische Bewertung der korrespondierenden

Tumorprobe

Von den 53 maligne entartenden Patientenproben der Gruppe I konnten noch

insgesamt 21 Patienten für eine Follow-Up-Untersuchung gewonnen und

immunhistochemisch untersucht werden. Die meisten dieser

erstdiagnostizierten Tumore waren von kleiner Größe. Bei 15 von diesen

Tumorproben war die Tumorgröße dokumentiert worden. 60 % aller PECM

befanden sich im T1-Stadium, 13,3 % waren T2-, 6,7 % waren jeweils T3-

und T4-gewichtet. In zwei Fällen lag ein Carcinoma in Situ (CIS) vor, dies

entspricht anteilig 13,3 %.

Um den Differenzierungsgrad zu beschreiben, wurde bei 20 Proben das

Grading erfasst. Dabei befanden sich 25 % der untersuchten Proben im G1-

Stadium (differenziert), 45 % waren G2 (mäßig differenziert) und 30 % waren

undifferenziert. Betrachtet man das Tumorstadium, so befanden sich 81,3 %

in einem frühen Stadium (Stadium I – II). 18,8 % befanden sich im

Spätstadium (St. III).

In der nachfolgenden Tabelle 5 sind die Ergebnisse der Tumorproben

zusammengefasst:

Dysplasiegrad der Präkanzerose

EGFR-Expressionsrate der Tumorprobe ERPECM

T N G ST

D0 0,000 4 2b 2 IV

65,620 1 2 2 IV

61,705 1 - 3 I

61,677 1 - 2 IV

53,333 1 2 3 IV

31,646 1 0 1 I

D1 0,000 2 0 3 II

53,219 CIS - 1 I

80,337 1 0 1 I

67,326 2 0 2 II

23,661 1 0 2 I

D2 63,167 1 - 3 II

21,212 - - 2 II

13,259 - - 3 III

31

45,661 3 0 3 III

D3 14,362 - - 1 II

20,588 - - - -

40,098 - - 2 III

64,894 1 - 2 I

44,983 CIS - 1 I

8,673 - - 2 II

Tabelle 5: TNM-Stadien der Follow-Up-Proben

6.1.3 Transformationsrate je nach Dysplasiegrad in Gruppe I

Die Zeitspannen bis zur Transformation der Vorläuferläsionen in ein PECM

(Transformationsrate, DFS-rate) sind in Tabelle 6 dargestellt. Gemittelt über

alle Dysplasiegrade der Gruppe I liegt diese Zeitspanne bei 16,8 Monaten.

Die höhergradigen Dyspalsien D2 und D3 entarten innerhalb eines knappen

Jahres, gemittelt nach 10,5 Monaten. Diese kurze Zeitspanne bis zu ihrer

Entartung spricht für ein erhöhtes malignes Potential.

Niedergradige Dysplasien (D0 + D1) entarten im Mittel nach 23,5 Monaten.

Geb.Datum Entnahme

der Präkanzerose

Alter Follow-Up,

Entnahme der Tumorprobe

Entartungszeitspanne [Monate]

D0: ≈ 60,5 ≈ 17,42 Monate

07.10.1953 25.01.2008 54 17.06.2008 5

16.10.1950 17.07.2007 56 31.07.2007 0,5

15.04.1932 24.09.2007 75 07.11.2008 14

04.11.1936 10.01.2006 69 12.12.2008 35

08.09.1958 10.01.2002 43 06.08.2004 31

21.08.1939 19.12.2006 66 31.07.2008 19

D1: ≈ 57 ≈ 29,6 Monate

13.07.1946 18.04.2002 55 24.04.2002 0

24.06.1958 25.09.2006 48 17.04.2009 31

17.10.1938 03.07.2003 64 11.12.2009 77

31.03.1943 16.06.2004 61 20.09.2007 39

11.07.1944 08.05.2002 57 03.06.2002 1

32

D2: ≈ 54,8 ≈ 11,56 Monate

20.02.1949 06.06.2007 58 14.06.2007 0,25

13.11.1948 11.09.1997 48 08.07.1998 10

09.02.1956 11.11.2008 52 17.02.2009 3

23.11.1935 22.10.1997 61 04.07.2000 33

D3: ≈ 60,5 ≈ 8,54 Monate

28.05.1943 05.10.1998 55 11.12.2001 38

25.03.1930 21.07.2005 75 21.02.2006 7

25.09.1931 09.05.2000 68 01.09.2000 4

04.10.1946 23.06.2008 61 30.06.2008 0,25

06.01.1945 09.05.2006 61 19.06.2006 1

06.06.1962 23.12.2005 43 25.01.2006 1

Tabelle 6: Transformationsraten in Gruppe I, sortiert nach Dysplasiegraden

6.1.4 Klinische Kriterien und histologische Charakterisierung

der Proben in Gruppe II

Für diese Gruppe von prämalignen Geweben (Leukoplakien), die nicht

innerhalb des Beobachtungszeitraumes entarteten und somit als benigne zu

betrachten sind, konnten insgesamt 45 Proben untersucht werden. Die

untersuchten Vorläuferläsionen entstammten alle der Mundschleimhaut.

55,6 % der LP entstammten männlichen Patienten (25 Präkanzerosen). Die

verbliebenen 44,4 % bzw. 20 Gewebeveränderungen wurden bei Frauen

diagnostiziert.

In dieser Gruppe war das Verhältnis Männer zu Frauen nahezu ausgeglichen.

Das Durchschnittsalter der Patienten bei der Primärdiagnose der Läsion in

Gruppe II lag insgesamt bei 49,8 Jahren (Männer im Schnitt 48,3 Jahre,

Frauen 51,4 Jahre).

Im Gegensatz zu den LP der Gruppe I wiesen die Gewebeproben in Gruppe

II keine Dysplasien des Grades 3 auf. Sie beinhalteten nur die

Dysplasiegrade D0 bis D2.

33

Die prozentuale und numerische Verteilung können Abbildung 6 und Tabelle

7 entnommen werden:

Abbildung 6: Graphische Darstellung der Dysplasiegradverteilung in Gruppe

II in Prozent

Dysplasiegrad Anzahl Prozentanteil

D0 22 48,9 %

D1 19 42,2 %

D2 4 8,9 %

Total 45 100 %

Tabelle 7: Numerische und prozentuale Verteilung der Dysplasiegrade in

Gruppe II

6.1.5 Häufigkeitsverteilung der Dysplasiegrade im gesamten

Patientenkollektiv

Wie bereits beschrieben, finden sich in Gruppe II (benigne LP) vor allem

Dysplasien der Stufe D0 und D1. Der Dysplasiegrad D2 ist hier mit 8,9 % aller

Gewebeproben vertreten. Dies stellt einen deutlichen Unterschied zu den

34

prämalignen Läsionen der Gruppe I dar. Dort sind die verschiedenen

Dysplasiegrade nahezu gleichmäßig über das Kollektiv verteilt. Betrachtet

man nur die D2-Dysplasien, so sind diese in Gruppe I etwa 3-mal häufiger

anzutreffen als wie in Gruppe II. Weiterhin wurden D3-Dysplasien nur in

Gruppe I diagnostiziert.

Die genaue Probenzahl/Verteilung der Dysplasiegrade im gesamten

Patientenkollektiv lässt sich folgender Tabelle entnehmen:

Dysplasiegrad D0 D1 D2 D3 Insgesamt

Gruppe I 15 14 13 11 53

Gruppe II 22 19 4 0 45

Insgesamt 37 33 17 11 98

Tabelle 8: Probandenzahl für die jeweiligen Dysplasiegrade in allen

untersuchten Vorläuferläsionen

6.2 Ergebnisse der EGFR-Färbungen

6.2.1 Übersicht über die Expressionsrate in den

Probandengruppen

Die nachstehende Grafik (Abb. 7) veranschaulicht, mit welcher Häufigkeit die

ermittelten Expressionsraten von EGFR in den einzelnen Probandengruppen

(Gruppe 1 bis 3 und Tumorgruppe) vorgefunden wurden. Hierbei wurde nicht

nach Dysplasiegraden unterschieden. Es zeigt sich, dass die Verteilung der

Expression keiner Normalverteilung unterliegt. Daher wurde eine

parameterfreie (verteilungsfreie) Statistik anhand der Färbeergebnisse

durchgeführt. Die Signifikanz des statistischen Zusammenhangs wurde mit

dem Mann-Whitney-U-Test berechnet.

35

Abbildung 7: Häufigkeitsverteilung der Färbeergebnisse in den einzelnen

Gruppen

Im Mittelpunkt der Betrachtung dieser Arbeit steht die Assoziation der

Expression von EGFR mit der Entstehung eines PECM aus einer

präkanzerösen Läsion. Die folgende Übersicht (Abb. 8) veranschaulicht die

Expressionsrate von EGFR in den einzelnen Gruppen, sortiert nach

Dysplasiegraden:

36

Abbildung 8: Box-Whisker-Plots der EGFR-Expressionsraten in den

untersuchten Gruppen und deren Verteilung auf die einzelnen

Dysplasiegrade

Gruppe III ER = Expressionsrate im Kollektiv der gesunden Schleimhäute

Gruppe II ER D0 = Expressionsrate der (nicht-entartenden) D0-Leukoplakien



Gruppe I ER0 D0 = Expressionsrate der (im Follow-Up entartenden) D0-Leukoplakien




Gruppe I ERPECM = Expressionsrate der entarteten Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle

In dieser Abbildung lässt sich anhand der Mediane der Box-Whisker-Plots

ablesen, dass benigne Leukoplakien der Gruppe II (gemittelt) umso höhere

EGFR-Expressionsraten aufweisen, je höher der Dysplasiegrad ist. Dies trifft

37

für die prämalignen Leukoplakien der Gruppe I nicht zu. Die D0-, D1- und D3-

Dysplasien zeigen vergleichbar hohe Expressionsraten, die D2-Dyplasien

jedoch fallen deutlich ab und sogar im Mittel unter den Expressionswert der

D2-Dysplasien der nicht entarteten LP.

Die Gruppe der D2-Dysplasien in den Leukoplakien, die im Follow-Up ein

PECM entwickelten, muss somit als Sonderfall betrachtet werden. Hier

zeigen sich EGFR-Expressionsmuster, die in etwa denen der Gruppe II

(benigne LP) entsprechen (Tab. 9).

Dysplasiegrad D0 D1 D2 D3

Gruppe I 45,68 44,95 28,09 39,65

Gruppe II 27,06 26,12 37,95 -

Tabelle 9: Mittelwerte für die EGFR-Expression in den Gruppen I

(entartende LP) und II (benigne LP)

6.2.2 Tabellarische Zusammenfassung der Färbeergebnisse

In Tabelle 10 sind alle Färbeergebnisse (Expressionsrate in Prozent)

zusammengefasst – diese sind für jede Patientengruppe nach aufsteigendem

Dysplasiegrad geordnet. Außerdem sind die Expressionsraten der

korrespondierenden Tumorproben (Gruppe I PECM, Follow-Up) sowie

Geschlecht und Alter bei Entnahme der ersten Probe festgehalten.

Gruppe Patientenzahl

je Gruppe Dysplasiegrad

männlich/

weiblich

Alter bei

Eingangs-

Untersuchung

Expressions-

rate bei Erst-

Untersuchung

Expressios-

rate der

Tumor-

probe

I 1 D0 m 54 46,714 0,000

I 2 D0 w 56 61,010 65,620

I 3 D0 m 75 47,735 61,705

I 4 D0 m 69 47,931 61,677

I 5 D0 m 43 65,799 53,333

I 6 D0 m 66 47,997 31,646

I 7 D0 w 68 51,622 -

I 8 D0 m 34 59,879 -

I 9 D0 m 56 0,000 -

38

I 10 D0 w 64 0,000 -

I 11 D0 w 64 30,435 -

I 12 D0 m 58 79,311 -

I 13 D0 m 66 50,225 -

I 14 D0 m 68 48,184 -

I 15 D0 w 79 48,357 -

I 16 D1 m 55 61,711 0,000

I 17 D1 m 48 66,698 53,219

I 18 D1 m 64 55,662 80,337

I 19 D1 m 61 54,286 67,326

I 20 D1 w 57 18,719 23,661

I 21 D1 w 45 30,887 -

I 22 D1 w 68 64,105 -

I 23 D1 w 66 50,165 -

I 24 D1 w 70 45,592 -

I 25 D1 w 71 54,818 -

I 26 D1 m 55 100,000 -

I 27 D1 w 70 11,897 -

I 28 D1 w 62 0,000 -

I 29 D1 m 58 14,688 -

I 30 D2 w 58 39,010 63,167

I 31 D2 m 48 26,241 21,212

I 32 D2 m 52 0,000 13,259

I 33 D2 m 61 0,000 45,661

I 34 D2 m 70 57,356 -

I 35 D2 m 64 56,430 -

I 36 D2 w 61 63,754 -

I 37 D2 m 52 0,000 -

I 38 D2 m 60 6,593 -

I 39 D2 m 67 3,801 -

I 40 D2 m 67 13,661 -

I 41 D2 w 59 13,455 -

I 42 D2 w 45 84,857 -

I 43 D3 w 55 100,000 14,362

I 44 D3 w 75 0,000 20,588

I 45 D3 m 68 21,065 40,098

I 46 D3 m 61 33,037 64,894

I 47 D3 m 61 32,932 44,983

I 48 D3 w 43 4,651 8,673

I 49 D3 w 61 63,168 -

I 50 D3 m 58 63,754 -

I 51 D3 m 68 63,848 -

I 52 D3 w 79 43,377 -

I 53 D3 m 61 10,300 -

II 1 D0 w 35 0,000

II 2 D0 m 43 18,310

II 3 D0 m 62 0,000

II 4 D0 m 37 12,230

II 5 D0 m 37 29,157

39

II 6 D0 m 37 2,860

II 7 D0 w 42 8,440

II 8 D0 w 31 7,241

II 9 D0 m 26 30,607

II 10 D0 w 58 57,937

II 11 D0 w 63 43,781

II 12 D0 w 60 38,701

II 13 D0 w 60 19,491

II 14 D0 w 82 42,181

II 15 D0 w 63 0,000

II 16 D0 w 60 0,000

II 17 D0 m 61 39,574

II 18 D0 w 33 50,588

II 19 D0 m 70 24,865

II 20 D0 w 50 65,355

II 21 D0 m 61 41,121

II 22 D0 w 67 62,866

II 23 D1 m 41 0,000

II 24 D1 w 23 0,000

II 25 D1 m 28 46,779

II 26 D1 m 29 41,645

II 27 D1 w 42 26,112

II 28 D1 m 27 0,000

II 29 D1 w 31 7,241

II 30 D1 w 58 57,937

II 31 D1 m 53 0,000

II 32 D1 m 61 0,000

II 33 D1 m 53 70,942

II 34 D1 w 62 18,820

II 35 D1 m 61 39,574

II 36 D1 m 61 6,000

II 37 D1 m 36 36,338

II 38 D1 m 46 0,000

II 39 D1 m 58 64,228

II 40 D1 w 64 41,944

II 41 D1 w 44 38,650

II 42 D2 m 59 55,918

II 43 D2 m 56 25,439

II 44 D2 m 50 39,382

II 45 D2 m 54 31,073

III 1 - - - 36,338

III 2 - - - 43,269

III 3 - - - 38,576

III 4 - - - 38,739

III 5 - - - 33,945

III 6 - - - 0,000

III 7 - - - 0,000

III 8 - - - 38,340

III 9 - - - 46,827

40

III 10 - - - 51,741

III 11 - - - 33,322

III 12 - - - 39,776

III 13 - - - 39,000

III 14 - - - 39,646

III 15 - - - 38,601

III 16 - - - 40,707

III 17 - - - 48,879

III 18 - - - 36,466

III 19 - - - 40,440

III 20 - - - 0,000

III 21 - - - 27,869

III 22 - - - 37,603

III 23 - - - 49,754

III 24 - - - 45,855

III 25 - - - 0,000

III 26 - - - 42,164

III 27 - - - 30,180

III 28 - - - 16,594

III 29 - - - 36,653

Tabelle 10: Gesamt-Übersicht über die Färbeergebnisse

41

6.2.3 Vergleich der EGFR-Expressionsrate der Leukoplakien in

den einzelnen Probandengruppen

Die prämalignen Leukoplakien der Gruppe I sowie die nicht-prämalignen

(benignen) Leukoplakien der Gruppe II bilden den Kernpunkt dieser

statistischen Betrachtung.

Im Box-Whisker-Plot lässt sich das Ergebnis der Färbemethode aus beiden

Gruppen anschaulich vergleichen (Abb. 9).

Abbildung 9: Box-Whisker-Plot über die ER von Gruppe II (n = 45) sowie

Gruppe I (n = 53)

Die Expressionsrate von EGFR unterscheidet sich mittels der Farbmethode in

beiden Gruppen signifikant voneinander. Mit dem Mann-Whitney-U-Test

errechnet sich der p-Wert zu p = 0,017. Dies entspricht einem

hochsignifikanten Zusammenhang.

42

Man kann daraus schließen, dass EGFR in prämalignen Läsionen

(Leukoplakien) signifikant höher exprimiert wird, sofern sich aus diesen

Präkanzerosen ein PECM entwickelt.

Die folgenden Abbildungen (Abb. 10 – 13) zeigen die Expressionsraten

anhand der Färbung aus den verschiedenen Gruppen und in den jeweiligen

Dysplasiegraden:

Abbildung 10: Box-Whisker-Plots der EGFR-Expressionsraten in den

untersuchten Gruppen

Gruppe II ER = Expressionsrate in Gruppe II

Gruppe II ER° = Expressionsrate der (prämalignen) Leukoplakien

Gruppe I ER PECM = Expressionsrate der PECM

Gruppe III ER = Expressionsrate in gesunder Schleimhaut

Die Expressionsraten der PECM unterscheiden sich nicht signifikant von der

Gruppe gesunder Schleimhäute. Vergleicht man „Gruppe III ER“ mit „Gruppe

43

I ER PECM“ (Abb. 10) kommt man im Mann-Whitney-U-Test auf einen p-Wert

von p = 0,22.

Bei der Berechnung der Signifikanz mittels Mann-Whitney-U-Test zwischen

„Gruppe III ER“ und „Gruppe II ER“ (Abbildung 10) ergibt sich ein p-Wert von

p = 0,30.

Nur die D0- und D1-Leukoplakien der Gruppe I (= prämaligne Leukoplakien)

zeigen signifikant höhere Expressionen als die D0- und D1-Leukoplakien der

Gruppe II (= nicht-entartende LP):

Abbildung 11: Box-Whisker-Plots der EGFR-Expressionsraten von D0-

Leukoplakien

Gruppe I ER° D0 = prämaligne D0-Leukoplakien

Gruppe II ER D0 = nicht-entartende D0-Leukplakien

44


Leukoplakien



Für eine weitere statistische Betrachtung wurden die D0- und D1-Proben von

Gruppe I zu einer neuen Subgruppe zusammengefasst und deren EGFR-

Expression mit der Kontrollgruppe (Gr. III) verglichen. Der p-Wert berechnet

sich zu p = 0,003. Dies entspricht einem hochsignifikanten Zusammenhang.

Auch bei Hinzunahme der D2-Proben aus Gr. I in diese Subgruppe, bleibt der

p-Wert gering signifikant gegenüber der Kontrollgruppe (p = 0,048).

Für die zusammengefassten D0- und D1-Proben der Gruppe II gilt dieser

Zusammenhang nicht. Gegenüber der Kontrollgruppe ergibt sich kein

signifikanter Unterschied in der EGFR-Expression, der p-Wert liegt bei p =

0,26.

Bei den höheren Dysplasiegraden zeigten sich keine signifikanten

Unterschiede in der EGFR-Expression. Für die D2-Dysplasien von Gr. I und II

liegt der p-Wert bei 0,43 (Abb. 13). Da in Gruppe II keine D3-Proben

45

vorliegen, kann dieser Dysplasiegrad nicht mit Gr. I verglichen werden. In

Gruppe I kommt D3 auf die geringste Probenzahl (n = 11).


Leukoplakien



6.2.4 Festlegung des cut-off-points der Überexpression von

EGFR, Odds Ratio und Vertrauensintervall

Um zu beurteilen, ab welchem Prozentwert die Expression von EGFR als

kritisch zu bewerten ist, also ab welcher Expression eine Präkanzerose mit

erhöhter Wahrscheinlichkeit in ein PECM übergeht, muss ein cut-off-point

(COP) der ER festgelegt werden. Oberhalb von diesem soll der

Zusammenhang „höhere Expression und höheres Malignitätsrisiko“ als

gesichert gelten. Diesen COP kann man in der ROC-Kurve ablesen (receiver

operating characteristic). Rechnerisch ergibt sich der COP aus dem höchsten

Youden-Index.

46

Die Expressionsrate stellt somit das Testergebnis aus einem klinischen Test

dar und soll das maligne Potential abschätzen. Liegt ein Patient mit seiner

EGFR-Expressionsrate oberhalb des COP, soll er mit möglichst hoher

Wahrscheinlichkeit auch ein PECM entwickeln.

Die Ordinate und Abszisse der ROC-Kurve erklären sich wie folgt:

Die Sensitivität (Ordinate) stellt die Richtig-Positiv-Rate dar (Angabe in

Prozent). Sie ist der Anteil an Patienten, die im Follow-Up ein PECM

entwickelten, mit Expressionsraten oberhalb des COP im Verhältnis zu allen

Patienten, die im Follow-Up ein PECM entwickelten.

Auf der Abszisse wird die Falsch-Positiv-Rate abgetragen (= 1-Spezifität). Sie

ist der Anteil an Patienten, die im Follow-Up kein PECM entwickelten, mit

Expressionsraten oberhalb des COP im Verhältnis zu allen Patienten, die im

Follow-Up kein PECM entwickelten.

Jede Expressionsrate wurde als cut-off-point festgelegt, die daraus

resultierenden Wertepaare für Sensitivität und 1-Spezifität ergeben die in

Abb. 14 dargestellte ROC-Kurve:

Abbildung 14: ROC-Kurve für alle möglichen cut-off-Punkte innerhalb des

Messbereichs der Expression

47

Die Berechnung der Area under the curve (AUC) ergab einen Wert von 64 %.

Dies ist für einen klinischen Test als zu gering aussagekräftig anzusehen.

Der optimale cut-off-point ist der Messwert, bei dem der Youden-Index seinen

Maximalwert erreicht. Bei diesem Wert ist die Sensitivität (Richtig-Positiv-

Rate) also möglichst hoch, und die Falsch-Positiv-Rate möglichst gering. Der

Youden-Index errechnet sich zu { Sensitivität – (1-Spezifität) }. Die größte

Differenz ergibt sich bei einem cut-off-point von 44,68650 %, wie in Tab. 11

dargestellt.

Positiv, wenn größer oder

gleich Sensitivität 1 - Spezifität Youden-Index

43,57900 ,547 ,222 0,325

44,68650 ,547 ,200 0,347

46,15300 ,528 ,200 0,328

Tabelle 11: Koordinaten der ROC-Kurve, Variable für Testergebnis: ER (%)

Mit Hilfe des cut-off-points lassen sich die Präkanzerosen aus Gruppe I und II

in einer Vierfelder-Tafel zusammenfassen (Tab. 12):

Maligne Entartung (im

Follow-Up)

Gesamt Nein Ja

Expressionsrate < 44,7 %

Expressionsrate > 44,7 %

36 24 60

9 29 38

Gesamt 45 53 98

Tabelle 12: Vierfelder-Tafel

Anhand der Kreuztabelle lassen sich nun die Odds Ratio und das 95%-

Konfidenzintervall bestimmen.

Die Odds Ratio (Quotenverhältnis) gibt die Chance an, dass ein Ereignis bei

einem bestehenden Risikofaktor eintritt, in diesem Falle die Entwicklung eines

48

PECM. Als Risikofaktor ist das Überschreiten des COP (44,7 % ER)

anzusehen.

OR = (29 x 36) / (9 x 24) = 4,8333 ≈ 5

Die Chance ein PECM zu entwickeln ist somit unter Patienten, deren

Präkanzerosen den cut-off-point von 44,7 % überschreiten, knapp 5-mal

höher als wie bei den Patienten, die diesen Wert der Expression nicht

überschreiten.

Das 95%-Konfidenzintervall dieser Odds Ratio errechnet sich wie folgt:

(1) Obere Grenze des 95%-Konfidenzintervalls:

Obere95%KIGrenze = e { lnOR + 1,96 * √[(1/29)+(1/36)+(1/9)+(1/24)] }

= e { 1,57 + 1,96 * 0,46 }

= e { 2,48 }

= 11,99 ≈ 12

Der Wert 1,96 ist der Standardnormalverteilung für ein 95%-

Konfidenzintervall entnommen. Er kann als Näherung auf 2 gerundet

werden.

(2) Untere Grenze des 95%-Konfidenzintervalls:

Untere95%KIGrenze = e { lnOR - 1,96 * √[(1/29)+(1/36)+(1/9)+(1/24)] }

= e { 1,57 - 1,96 * 0,46 }

= e { 0,67 }

= 1,95 ≈ 2

Somit ergibt sich das Quotenverhältnis zu OR(CI95%) = 4,83 (2; 12).

49

Bei Betrachtung des Konfidenzintervalls ist die Chance mindestens 2-fach

und maximal 12-fach erhöht gegenüber denjenigen Patienten, die den COP

nicht überschreiten.

6.2.5 Anzahl der Proben oberhalb des COP

Dass gerade D0- und D1-Dysplasien besonderer Beachtung verdienen, zeigt

sich darin, dass diese Dysplasiegrade im Vergleich zu D2 und D3 innerhalb

der Gruppe deutlich häufiger oberhalb des cut-off-points liegen. In Gruppe I

machen D0 und D1 zusammen etwa 72 % der den COP-überschreitenden

Proben aus. In Gruppe II kommen D0 und D1 zusammen auf etwa 89 %.

Insgesamt sind Proben, die den COP überschreiten, in Gruppe I deutlich

häufiger anzutreffen als in Gruppe II. In Gr. I liegen knapp 55 % aller

rekrutierten Patienten über diesem, in Gr. II dagegen nur 20 % (Tab. 13).

50

Häufigkeitsverteilung der Proben oberhalb des COP (= 44,6865 %)

> COP %-Gesamt

Gruppe I ER0 (n=53) 29 29/53 = 54,72 %

Gruppe I ER0 D0 12 12/29 = 41,38 %

Gruppe I ER0 D1 9 9/29 = 31,03 %

Gruppe I ER0 D2 4 4/29 = 13,79 %

Gruppe I ER0 D3 4 4/29 = 13,79 %

Gruppe I ERPECM (n=21) 11 11/21 = 52,38 %

Gruppe II ER (n=45) 9 9/45 = 20 %

Gruppe II ER0 D0 4 4/9 = 44,44 %

Gruppe II ER0 D1 4 4/9 = 44,44 %

Gruppe II ER0 D2 1 1/9 = 11,11 %

Gruppe III ER (n=29) 5 5/29 = 17,24 %

Tabelle 13: Die Tabelle zeigt die Häufigkeitsverteilung der Proben oberhalb

des COP in den Gruppen insgesamt und sortiert nach Dysplasiegraden

Gruppe I ER0 = Prämaligne Leuokoplakien

Gruppe I ERPECM = Follow-Up-Proben des korrespondierenden Tumors

Gruppe II ER = Nicht-prämaligne Leukoplakien

Gruppe III ER = Proben gesunder Mundschleimhaut

51

7 Diskussion

Die Ergebnisse bestätigen die Arbeitshypothesen: LPM zeigen genau wie die

Tumorproben eine Überexpression von EGFR. Unsere Studie zeigte keine

signifikanten Unterschiede in der EGFR-Expression beim Vergleich der

PECM-Schnitte mit gesunder Mundschleimhaut. Jedoch finden sich die

meisten Proben, die den cut-off-point überschreiten, in der Tumorgruppe

sowie in der Gruppe der prämalignen Leukoplakien. In letzterer liegt die

EGFR-Expression der Proben etwa 3-mal so häufig oberhalb des COP wie in

der Gruppe der nicht-entartenden LP. Der Mann-Whitney-U-Test bestätigt,

dass zwischen der ER der entartenden und nicht-entartenden LP ein

hochsignifikanter Unterschied vorliegt. Außerdem weisen prämaligne LP

gegenüber der Kontrollgruppe eine signifikant höhere EGFR-Expression auf.

Das Überschreiten des COP kann demnach als Risikofaktor für die

Entwicklung eines PECM in diesen Leukoplakien angesehen werden. Nicht-

prämaligne LP zeigen Expressionsraten vergleichbar der Kontrollgruppe und

besitzen kein erhöhtes malignes Potential.

Stellt man die einzelnen Dysplasiegrade von Gruppe I und II gegenüber,

treten die Unterschiede in der ER insbesondere bei den niedrig-

dysplastischen D0- und D1-Proben hervor. Gut drei Viertel der Proben, die

den COP überschreiten, sind diesen Dysplasiegraden zuzuordnen. Fasst

man D0 und D1 zu einer Subgruppe zusammen und vergleicht die ER mit der

Kontrollgruppe, zeigt sich für die entartenden LP der Gruppe I ein

hochsignifikanter Unterschied. Auch unter Hinzunahme von D2 in diese

Subgruppe bleibt der Unterschied signifikant. Die nicht-entartenden LP zeigen

keine erhöhten ER verglichen mit Gruppe III.

Von den höhergradigen D2- und D3-Dysplasien standen weniger Proben zur

Verfügung, rund ein Viertel von diesen liegt über dem COP. Bei diesen

Dysplasiegraden zeigten sich im Vergleich von Gruppe I und II keine

signifikanten Unterschiede der EGFR-Expression.

Zahlreiche weitere Studien haben sich mit der epithelialen Expression von

EGFR befasst [58, 70, 74]. Die Autoren kamen zu dem Ergebnis, dass die

52

EGFR-Expression in potentiell prämalignen Läsionen wie Leukoplakien und

submukösen Fibrosen der Mundschleimhaut ebenso erhöht ist wie im PECM.

EGFR kann somit durchaus als Marker der Entartungswahrscheinlichkeit von

LPM herangezogen werden. Jedoch zeigen diese Studien Schwächen bei der

Auswahl und Rekrutierung der Patienten, wodurch die Ergebnisse an

Aussagekraft verlieren. Auch fehlen diesen Studien beispielsweise Follow-

Up-Untersuchungen, um zu prüfen, ob die vorgefundenen LP überhaupt

maligne entarten, in ihrem Stadium verharren oder ausheilen. Infolgedessen

sind die Ergebnisse widersprüchlich. Während die einen Autoren einen

linearen Zusammenhang zwischen dem epithelialen Dysplasiegrad der LP

und dem Intensitätslevel der EGFR-Färbung vorfinden [70], kommen andere

zu dem Ergebnis, dass die Positivität der EGFR-Färbung weder mit dem

Dysplasiegrad der LP, noch mit dem Raucherstatus der Patienten oder der

Überexpression anderer molekularbiologischer Wachstumsmarker (z.B. Ki-

67) assoziiert werden kann [58]. In einer weiteren groß angelegten Studie

über die EGFR-Expression in LPM wurden die Gewebeproben

histopathologisch gemäß ihrem Dysplasiegrad vorsortiert. Bei dieser Arbeit

wurde auch eine Follow-Up-Untersuchung durchgeführt und die Leukoplakien

in entartende und nicht-entartende Gruppen sortiert. Dabei wurden die

Proben der Genanalyse zugeführt, bei denen sich EGFR stark positiv

anfärben ließ. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass eine erhöhte EGFR-

Genkopienzahl in keiner Korrelation mit dem epithelialen Dysplasiegrad steht,

und führen an, dass die Probenzahl für diesen Zusammenhang zu gering

war. Jedoch erhöht diese die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines

Tumors über einen Beobachtungszeitraum von 10 Jahren [72].

Durch den langen Rekrutierungszeitraum unserer Studie kam ein adäquat

großes Patientenkollektiv zusammen. Zudem wurde durch eine Follow-Up-

Untersuchung (nach spätestens 5 Jahren) erfasst, welche Leukoplakien

maligne transformierten. Die Gewebeproben wurden den Dysplasiegraden

nach WHO-Kriterien zugeordnet und zwischen den im Beobachtungszeitraum

entartenden und nicht-entartenden Leukoplakien eine strikte Trennung

vollzogen. Wie oben beschrieben führt unsere Arbeit zu dem Ergebnis, dass

sich die EGFR-Expressionsraten in den beiden Leukoplakiegruppen (Gruppe

53

I = entartende, Gruppe II = nicht-entartende) signifikant voneinander

unterscheiden. Dieser Unterschied tritt am stärksten hervor bei den

niedergradigen Dyspalsiestufen D0 und D1. Obwohl beim Vorliegen dieser

Läsionen keine invasive klinische Konsequenz, sondern lediglich

Kontrolluntersuchungen in regelmäßigen Abständen indiziert sind, kann mit

Hilfe der EGFR-Expression ihr Gefahrenpotential einer malignen Entartung

präziser erfasst werden. Anhand unserer Daten kann diese Aussage für die

Dysplasiegrade D2 und D3 nicht getroffen werden, da das Kollektiv zu wenige

Patienten umfasste.

Aufgrund des gefundenen signifikanten Zusammenhangs in den mehr

Patienten umfassenden D0- und D1-Gruppen, sollten ähnlich hohe Fallzahlen

auch in den D2- und D3-Gruppen angestrebt werden. Dies könnte im

Rahmen einer neuen Studie geschehen. Eine der größten Studien, die sich

mit der Entartung von LPM befasste, wurde bereits 2006 von Amagasa et al.

durchgeführt. Die Autoren kamen zu dem Ergebnis, dass der von der

Vorläuferläsion erreichte Grad der Dysplasie keinen signifikanten Einfluss auf

deren Entartungsrate hat [3]. Die Begründung hierfür liegt möglicherweise

darin, dass die gefundenen Leukoplakien, die nach erfolgter Biopsie dem D2-

oder D3-Grad zugeordnet wurden und somit als hochriskant einzustufen

waren, chirurgisch vollständig mit ausreichendem Sicherheitsabstand

exzidiert wurden. An Stellen exzidierter oraler Vorläuferläsionen kommt es

nur selten zur malignen Entartung [3, 19, 68].

Wie bereits erwähnt, kommt es auch in der Beurteilung des Vorhandenseins

und des Ausprägungsgrades von Dysplasien selbst zwischen erfahrenen

Pathologen zu deutlichen Abweichungen und somit Fehleinschätzungen [37,

71]. Dieser Problematik wurde in unserer Studie damit begegnet, dass alle

Proben durch 2 unabhängige Pathologen untersucht wurden. Um die

abweichenden Einschätzungen durch verschiedene Untersucher möglichst

gering zu halten, ist ein eindeutiges Klassifikationssystem von höchster

Wichtigkeit. Der Begriff der „Dysplasie“ ist in der Literatur nicht einheitlich

definiert. Er beschreibt einerseits den Verlust der Epithelschichtung in

Verbindung mit dem Vorhandensein zellulärer Atypien wie

54

Kernpolymorphismus, Nukleolenvergrößerung, hyperchromatischen Kernen

und Mitose-Atypien. Dabei wird nicht unterschieden, ob es sich um eine

prämaligne Läsion oder einen invasiv wachsenden, die Basalmembran

überschreitenden Tumor handelt. Des Weiteren dient er der Beschreibung

von ossären Systemerkrankungen (u.a. der Fibrösen Dysplasie) [51]. Daher

wurde 2005 parallel zur Dysplasiegrad-Einteilung der WHO auch das Konzept

der Squamösen Intraepithelialen Neoplasie (SIN) vorgestellt [31]. Dieses

System beschreibt präzise intra-epitheliale Neubildungen, wobei die

Basalmembran noch vorhanden sein muss. Das SIN-Grading umfasst drei

Grade (SIN-I, SIN-II, SIN-III), wobei die niedergradigen SIN-I und SIN-II mit

den Dysplasiegraden D1 und D2 übereinstimmen. Als entscheidende

Abweichung (vom Dysplasiegrading) ist der Grad SIN-III anzusehen, da

dieser die D3-Dysplasien sowie die Ausbildung eines CIS (Carcinoma in Situ)

zu einer Risikogruppe zusammenfasst. Im Falle eines SIN-III wird die

Entartungswahrscheinlichkeit mit 90 % angegeben, weshalb eine Entfernung

der Läsion als unmittelbare klinische Konsequenz indiziert ist. Bei den

niedergradigen SIN-I und SIN-II sind regelmäßige Kontrollen in Intervallen

von 3 bis 6 Monaten angezeigt. Eine Epithelhyperplasie (entsprechend D0)

benötigt keine weiteren Kontrollen [15], für diese bietet das SIN-Grading

keine Empfehlung für die klinische Nachsorge an. Jedoch können auch D0-

Vorläuferläsionen maligne transformieren [3, 56, 71]. Die Ergebnisse unserer

Studie legen daher eine zusätzliche molekularbiologische Analyse dieser

niedergradigen Vorläuferläsionen nahe, da deren malignes Potential

unterschiedlich hoch sein kann.

Auch die experimentelle Methode, mit der die ER eines epithelialen Proteins

erfasst wird, ist nicht einheitlich festgelegt. Viele Arbeitsgruppen verwenden

Computerprogramme zur Bildanalyse der mittels Mikroskop digitalisierten

Schnitte. Diese Methode bezeichnet man als automated semi-quantitative

analysis und ist beispielsweise mit dem Programm ImageJ durchführbar.

Dabei werden die Zellen in den ROIs automatisch erkannt und als positiv

oder negativ gezählt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die positiven und

negativen Zellen manuell unter dem Mikroskop auszuzählen, um die

Expressionsraten im Epithel zu quantifizieren [68, 72]. Die Auswertungen

55

dieser Methoden können sich selbst bei ähnlichen Patientenkollektiven

unterscheiden und somit zu anderen Ergebnissen führen [60, 70].

In unserem Falle wurde die Bildanalyse-Software imageJ zur Hilfe

genommen. Die Vorteile sind darin zu sehen, dass der Untersucher einzelne

Zellen jederzeit markieren oder die Markierung wieder aufheben kann,

während das Bildprogramm automatisch jeweils die positiven und negativen

Zell-Markierungen zusammenzählt [30]. Dadurch werden keine Zellen für die

Zählung übersehen. Außerdem kann der Betrachter zwischen ungünstig

angeschnittenen Zellen sowie Überlappungen einzelner Zellkerne gut

differenzieren und Zählfehler somit minimieren. Da die Zellen während des

Markierungsprozesses schon zusammengezählt werden, bedeutet dies eine

enorme Zeitersparnis. Änderungen bei den Markierungen sind auch nach

abgeschlossener Zählung jederzeit möglich. Die benötigten Bildprogramme

(z.B. ImageJ) sind im Internet frei verfügbar, einziger Nachteil ist der enorme

Zeitaufwand für die Auszählung der Präparate.

Manche Autoren beurteilen die Intensität bzw. Positivität ihrer

Immunfärbungen nach Augenmaß [11]. Dieses Vorgehen wird jedoch von

anderen Autoren strikt abgelehnt, da es zu hoher Subjektivität unterliegt [55].

Auch bei unserer Studie wurde zunächst die Intensität der Färbung frei

beurteilt und so die Positivität der Schnitte festgelegt. Die Methode wurde

aber zugunsten der (semi-) quantitativen Analyse fallengelassen, um

reproduzierbare, einsehbare Bilddaten zu erhalten.

Grundsätzlich sollte überlegt werden, ob die molekularbiologische

Untersuchung von EGFR und somit die Einteilung der Patienten in eine

Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppe nicht nur zur Prognoseabschätzung,

sondern auch für neue Therapieansätze wertvoll ist. Aktuell gibt es kein

einheitliches Therapieschema, mit dem eine signifikante Reduktion des

malignen Entartungspotentials einer LPM erreicht werden kann [24].

Höhergradige Dysplasien werden standardmäßig chirurgisch oder

laserchirurgisch exzidiert (Vaporisation). Ein generelles Problem stellt die

hohe Rezidivrate dar, die mit etwa 30 % angegeben wird [43]. Daher sollten

die bestehenden Therapieschemata um weitere sinnvolle Schritte im

gesamten Behandlungskonzept erweitert werden.

56

Dies konnte erfolgreich bei der Behandlung des HER2/neu-

überexprimierenden Mammakarzinoms mithilfe monoklonaler Antikörper

(Trastuzumab/Herceptin®) umgesetzt werden. Diese Krebsimmuntherapie

wird kombiniert mit den bestehenden Behandlungsmethoden aus adjuvanter

Chemotherapie, Bestrahlung und antihormoneller Therapie [59]. Trastuzumab

ist gerichtet gegen den EGFR-verwandten ErbB2-Rezeptor, der als

Wachstumsfaktor auf der Oberfläche von Krebszellen exprimiert wird. Die

Blockade des Rezeptors kann Rückfälle um 50 % reduzieren und somit zur

Heilung beitragen, unabhängig davon ob bereits Fernmetastasen bestehen.

Dieser Zusammenhang wurde in vielen Studien bestätigt [48, 49, 53, 69]. Die

Überexpression des HER2/neu-Gens ist bei etwa 30 % der

Mammakarzinome auszumachen. Bei diesen ist die Prognose verschlechtert

[4, 73].

Interessant ist die Betrachtung des HER2/neu-Status in

Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle. 11 bis 53 % der PECM weisen eine

Überexpression auf. In diesen Fällen ist die Proliferationsrate der Zellen und

ihr angiogenetisches Potential erhöht sowie die Zelladhäsion vermindert [64].

Einen solchen immuntherapeutischen Ansatz gibt es bereits für den

epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor: Der monoklonale Antikörper

Cetuximab (Handelsname Erbitux) kommt bei der Behandlung des EGFR-

überexprimierenden metastasierenden Kolorektalkarzinoms zum Einsatz, mit

der Einschränkung, dass dieses kein mutiertes K-Ras-Gen enthalten darf.

Seit September 2008 ist er auch für die Therapie von lokal fortgeschrittenen

Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses (SCCHN) in Verbindung mit

einer Strahlentherapie zugelassen. Zu den Nebenwirkungen zählen

Hautreaktionen und Mukositis [13]. Weitere Zulassungen sind beantragt, zum

Beispiel für die Erstlinientherapie des metastasierten nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinoms.

Der Erfolg dieser neuen Behandlungsmöglichkeit muss in weiteren Studien

untersucht werden. Die Immuntherapie könnte sich als alternatives

Behandlungskonzept mit möglicherweise geringeren Nebenwirkungsraten

und höherem Therapieansprechen beim PECM etablieren [54].

http://de.wikipedia.org/wiki/Kopf-Hals-Tumor

57

Unsere Studie zeigte, dass die Überexpression von EGFR in LPM als

Parameter der Malignitätswahrscheinlichkeit herangezogen werden kann. In

den entartenden- und nicht-entartenden LP zeigen sich signifikant

unterschiedliche Expressionsraten, für die sich ein cut-off-point als

Schwellenwert für die Malignität definieren lässt. Die Bestimmung der EGFR-

Expressionsrate könnte somit einen wichtigen Beitrag leisten, um die

histopathologische Untersuchung von Vorläuferläsionen weiter zu

objektivieren und zu präzisieren. Die Verbesserung der Einschätzung von

präkanzerösen Läsionen ist für die Früherkennung maligner Prozesse von

entscheidender Bedeutung, und kann bei frühzeitigem Therapiebeginn die

Überlebenszeit der Betroffenen erhöhen. Außerdem bieten sich über die

Ermittlung des Rezeptorstatus neue immuntherapeutische Ansätze, deren

Erfolg in künftigen Studien zu prüfen ist.

58

8 Literaturverzeichnis

1. Aarstad HJ, Aarstad AK, Heimdal JH, Olofsson J: Mood, anxiety and sense of humor in head and neck cancer patients in relation to disease stage, prognosis and quality of life. Acta Otolaryngol 2005 May;125(5):557-65.

2. Agarwal S, Mathur M, Shukla NK, Ralhan R: Expression of cyclin dependent

kinase inhibitor p21waf1/cip1 in premalignant and malignant oral lesions: relationship with p53 status. Oral Oncology 1998;34:353-60.

3. Amagasa T, Yamashiro M, Ishikawa H: Oral leukoplakia related to malignant

transformation. Oral Science International 2006 Nov;45–55.

4. Benz CC, Scott GK, Sarup JC, Johnson RM, Tripathy D, Coronado E, Shepard HM, Osborne CK: Estrogen-dependent, tamoxifen-resistant tumorigenic growth of MCF-7 cells transfected with HER2/neu. Breast Cancer Res Treat 1992;24(2):85-95.

5. Blackwell KE, Fu YS, Calcaterra TC: Laryngeal dysplasia. A

clinicopathologic study. Cancer 1995 Jan 15;75(2):457-63.

6. Bolli M, Kocher T, Adamina M, Guller U, Dalquen P: Tissue microarray evaluation of Melanoma antigen E (MAGE) tumor-associated antigen expression: potential indications for specific immunotherapy and prognostic relevance in squamous cell lung carcinoma. Ann Surg 2002 Dec;236(6):785-93.

7. Bosman FT: Dysplasia classification: pathology in disgrace? J Pathol

2001;194:143-144.

8. Brzak BL, Mravak-Stipetić M, Canjuga I, Baricević M, Balicević D, Sikora M, Filipović-Zore I: The frequency and malignant transformation rate of oral lichen planus and leukoplakia--a retrospective study. Coll Antropol 2012 Sep;36(3):773-7.

9. Chang F, Syrjanen S, Syrjanen K: Implications of the p53 tumoursuppressor

gene in clinical oncology. J Clin Oncol 1995;13:1009-1022.

10. Cowan CG, Gregg TA, Napier SS, McKenna SM, Kee F: Potentially malignant oral lesions in Northern Ireland: A 20-year population-based perspective of maligant transformation. Oral Dis 2001;7:(1)18-24.

11. Diniz-Freitas M, García-Caballero T, Antúnez-López J, Gándara-Rey JM,

García-García A: Pharmacodiagnostic evaluation of EGFR expression in oral squamous cell carcinoma. Oral Dis 2007 May;13(3):285-90.

12. Du B, Leung H, Khan KM, Miller CG, Subbaramaiah K, Falcone DJ,

Dannenberg AJ: Tobacco smoke induces urokinase-type plasminogen

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Aarstad%20HJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16092551

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Aarstad%20AK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16092551

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Heimdal%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16092551

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Olofsson%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16092551

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mood%2C+anxiety+and+sense+of+humor+in+head+and+neck+cancer+patients+in+relation+to+disease+stage%2C+prognosis+and+quality

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1348864306800017



http://www.sciencedirect.com/science/journal/13488643

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Benz%20CC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Scott%20GK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sarup%20JC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Johnson%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tripathy%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Coronado%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shepard%20HM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Osborne%20CK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8095168

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8095168



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bolli%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454517

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kocher%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454517

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Adamina%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454517

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guller%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454517

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dalquen%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454517


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brzak%20BL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mravak-Stipeti%C4%87%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Canjuga%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Baricevi%C4%87%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Balicevi%C4%87%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sikora%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Filipovi%C4%87-Zore%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23213931


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cowan%20CG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11354915

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gregg%20TA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11354915

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Napier%20SS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11354915

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McKenna%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11354915

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kee%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11354915

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Diniz-Freitas%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17448210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Garc%C3%ADa-Caballero%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17448210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ant%C3%BAnez-L%C3%B3pez%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17448210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=G%C3%A1ndara-Rey%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17448210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Garc%C3%ADa-Garc%C3%ADa%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17448210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pharmacodiagnostic+evaluation+of+EGFR+expression+in+oral+squamous+cell+carcinoma.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Du%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leung%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khan%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miller%20CG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Subbaramaiah%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Falcone%20DJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dannenberg%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17875740

59

activator and cell invasiveness: evidence for an epidermal growth factor receptor dependent mechanism. Cancer Res 2007 Sep 15;67(18):8966-72.

13. European Medicines Agency / Science Medicines Health Erbitux: EPAR-

Summary for the public 2012 Feb.

14. Fleskens S, Slootweg P: Grading systems in head and neck dysplasia: their prognostic value, weaknesses and utility. Head & Neck Oncol 2009;1:11.

15. Gale N, Pilch BZ, Sidransky D, Westra W, Califano J: Tumours of the

hypopharynx, larynx and trachea (Epithelial precursor lesions). World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and genetics of head and neck tumours. International Agency for Research on Cancer (IARC) Press (Lyon) 2005;140-143.

16. Girod SC, Krueger G, Pape HD: p53 and Ki 67 expression in preneoplastic

and neoplastic lesions of the oral mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg 1993;22:285-8.

17. Girod SC, Pape HD, Krueger GR: p53 and PCNA expression in

carcinogenesis of the oropharyngeal mucosa. Eur J Cancer B Oral Oncol 1994;30B:419-23.

18. Grundmann E (1994): Einführung in die allgemein Pathologie 9. Auflage,

Gustav Fischer Verlag, Stuttgart.

19. Gümüş ZH, Du B, Kacker A, Boyle JO, Bocker JM, Mukherjee P, Subbaramaiah K, Dannenberg AJ, Weinstein H: Effects of tobacco smoke on gene expression and cellular pathways in a cellular model of oral leukoplakia. Cancer Prev Res (Phila) 2008 Jul;1(2):100-11.

20. Harris AL, Nicholson S, Sainsbury R, Wright C, Farndon J: Epidermal growth

factor receptor and other oncogenes as prognostic markers. J Natl Cancer Inst Monogr 1992;(11):181-7.

21. Helliwell TR: 'Risky' epithelium in the larynx - a practical diagnosis?

Histopathology 1999 Mar;34(3):262-5.

22. Hellquist H, Lundgren J, Olofsson J: Hyperplasia, keratosis, dysplasiaand carcinoma in situ of the vocal cords - a follow-up study. Clin Otolaryngol Allied Sci 1982 Feb;7(1):11-27.

23. Hirade Y, Aso M, Kurita S, Hirano M, Shin T: Epithelial hyperplasia of the

larynx. A 10-year review of 88 patients. Auris Nasus Larynx 1983 Oct;73-81.

24. Holmstrup P, Vedtofte P, Reibel J, Stoltze K: Long-term treatment outcome of oral premalignant lesions. Oral Oncol 2006;42:(5)461-74.

25. Holmstrup P, Vedtofte P, Reibel J, Stoltze K: Oral premalignant lesions: is a

biopsy reliable? J Oral Pathol Med 2007;36:262-6.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=G%C3%BCm%C3%BC%C5%9F%20ZH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Du%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kacker%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Boyle%20JO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bocker%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mukherjee%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Subbaramaiah%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dannenberg%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Weinstein%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19138943


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Harris%20AL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1627426

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nicholson%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1627426

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sainsbury%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1627426

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wright%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1627426

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Farndon%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1627426






60

26. http://www.dako.com/de/download.pdf?objectid=105473003. 2013-06-13, 19 Uhr.

27. http://www.klinikum.uni-heidelberg.de/Boesartige-Tumoren-der-

Mundhoehle.7419.0.html. 2013-03-22, 21 Uhr. 28. http://www.pathologie-online.de/methoden/immunhistologie. 2013-03-24, 19

Uhr.

29. Hunter KD, Parkinson EK, Harrison PR: Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer 2005 Feb;5(2):127-35.

30. Ide M, Jimbo M, Yamamoto M, Kubo O: Tumor cell counting using an image

analysis program for MIB-1 immunohistochemistry. Neurol Med Chir (Tokyo) 1997 Feb;37(2):158-62.

31. Intraepitheliale Plattenepithelneoplasie (WHO 2005). HNO 2009;57:181-8.

32. Jemal A, Tiwari RC, Murray T, Ghafoor A, Samuels A, Ward E, Feuer EJ,

Thun MJ, American Cancer Society: Cancer statistics, 2004. CA Cancer J Clin 2004 Jan-Feb;54(1):8-29.

33. Kalyankrishna S, Grandis JR: Epidermal growth factor receptor biology in

head and neck cancer. J Clin Oncol 2006 Jun 10;24(17):2666-72.

34. Kang JU, Koo SH, Kwon KC, Park JW, Jung SS: Gain of the EGFR gene located on 7p12 is a frequent and early event in squamous cell carcinoma of the lung. Cancer Genet Cytogenet 2008 Jul;184(1):31-7.

35. Karabulut A, Reibel J, Therkildsen MH, Praetorius F, Nielsen HW,

Dabelsteen E: Observer variability in the histologic assessment of oral premalignant lesions. J Oral Pathol Med 1995;24:198–200.

36. Kong A, Leboucher P, Leek R, Calleja V, Winter S, Harris A, Parker PJ,

Larijani B: Prognostic value of an activation state marker for epidermal growth factor receptor in tissue microarrays of head and neck cancer. Cancer Res 2006 Mar 1;66(5):2834-43.

37. Kujan O, Khattab A, Oliver RJ, Roberts SA, Thakker N, Sloan P: Why oral

histopathology suffers inter-observer variability on grading oral epithelial dysplasia: An attempt to understand the sources of variation. Oral Oncol 2007 Mar;43(3):224-31.

38. Kumar P, Augustine J, Urs AB, Arora S, Gupta S, Mohanty VR: Serum lipid

profile in oral cancer and leukoplakia: correlation with tobacco abuse and histological grading. J Cancer Res Ther 2012 Jul-Sep;8(3):384-8.

39. Kuribayashi Y, Tsushima F, Sato M, Morita K, Omura K: Recurrence

patterns of oral leukoplakia after curative surgical resection: important factors that predict the risk of recurrence and malignancy. J Oral Pathol Med 2012 Oct;41(9):682-8.

http://www.dako.com/de/download.pdf?objectid=105473003

http://www.klinikum.uni-heidelberg.de/Boesartige-Tumoren-der-Mundhoehle.7419.0.html

http://www.klinikum.uni-heidelberg.de/Boesartige-Tumoren-der-Mundhoehle.7419.0.html

http://www.pathologie-online.de/methoden/immunhistologie/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hunter%20KD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15685196

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parkinson%20EK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15685196

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Harrison%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15685196


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ide%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9059038

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jimbo%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9059038

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yamamoto%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9059038

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kubo%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9059038


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jemal%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tiwari%20RC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Murray%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ghafoor%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Samuels%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ward%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Feuer%20EJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thun%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14974761

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=American%20Cancer%20Society%5BCorporate%20Author%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kalyankrishna%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16763281

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Grandis%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16763281

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kang%20JU%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18558286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Koo%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18558286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kwon%20KC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18558286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Park%20JW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18558286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jung%20SS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18558286


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kong%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leboucher%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leek%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Calleja%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Winter%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Harris%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parker%20PJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Larijani%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16510606


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kujan%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16931119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khattab%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16931119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Oliver%20RJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16931119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Roberts%20SA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16931119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thakker%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16931119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sloan%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16931119


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kumar%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23174719

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Augustine%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23174719

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Urs%20AB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23174719

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Arora%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23174719

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gupta%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23174719

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mohanty%20VR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23174719


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kuribayashi%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22697318

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tsushima%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22697318

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sato%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22697318

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Morita%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22697318

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Omura%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22697318


61

40. Lang G: Histotechnik – Praxislehrbuch für die biomedizinische Analytik.

Springer Verlag, Wien, 2006; S. 258-294.

41. Lee SY, Cho NH, Choi EC, Baek SJ, Kim WS, Shin DH, Kim SH: Relevance of human papilloma virus (HPV) infection to carcinogenesis of oral tongue cancer. Int J Oral Maxillofac Surg 2010 Jul;39(7):678-83.

42. Lian IB, Tseng YT, Su CC, Tsai KY: Progression of precancerous lesions to

oral cancer: Results based on the Taiwan National Health Insurance Database. Oral Oncol 2013 May;49(5):427-30.

43. Lodi G, Porter S: Management of potentially malignant disorders: evidence

and critique. J Oral Pathol Med 2008 Feb;37(2):63-9.

44. Maserejian NN, Joshipura KJ, Rosner BA, Giovannucci E, Zavras AI: Prospective study of alcohol consumption and risk of oral premalignant lesions in men. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006;15:774-81.

45. McLaren KM, Burnett RA, Goodlad JR, Howatson SR, Lang S, Lee FD,

Lessells AM, Ogston S, Robertson AJ, Simpson JG, Smith GD, Tavadia HB, Walker F, Scottish Pathology Consistency Group: Consistency of histopathological reporting of laryngeal dysplasia. The Scottish Pathology Consistency Group. Histopathology 2000;37:460-463.

46. Melrose RJ: Premalignant oral mucosal diseases. J Calif Dent Assoc 2001

Aug;29(8):593-600.

47. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P: Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 2005 Mar-Apr;55(2):74-108.

48. Perez EA, Romond EH, Suman VJ, Jeong JH, Davidson NE, Geyer CE Jr,

Martino S, Mamounas EP, Kaufman PA, Wolmark N: Four-year follow-up of trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer: joint analysis of data from NCCTG N9831 and NSABP B-31. J Clin Oncol 2011 Sep 1;29(25):3366-73.

49. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, Goldhirsch A, Untch M,

Smith I, Gianni L, Baselga J, Bell R, Jackisch C, Cameron D, Dowsett M, Barrios CH, Steger G, Huang CS, Andersson M, Inbar M, Lichinitser M, Láng I, Nitz U, Iwata H, Thomssen C, Lohrisch C, Suter TM, Rüschoff J, Suto T, Greatorex V, Ward C, Straehle C, McFadden E, Dolci MS, Gelber RD: Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005 Oct 20;353(16):1659-72.

50. Pindborg JJ, Reichart PA, Smith CJ, van der Waal I: Histological typing of

cancer and precancer of the oral mucosa. Berlin: Springer 1997;pp21–23.

51. Pindborg JJ, Renstrup G, Poulsen HE, Silverman S Jr: Studies in oral leukoplakias. V. Clinical and histologic signs of malignancy. Acta Odontol Scand 1963;21:407-14.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lee%20SY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cho%20NH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Choi%20EC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Baek%20SJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kim%20WS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shin%20DH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kim%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20413270


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lian%20IB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23273345

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tseng%20YT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23273345

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Su%20CC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23273345

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tsai%20KY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23273345


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lodi%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18197849

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Porter%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18197849


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Maserejian%20NN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16614123

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Joshipura%20KJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16614123

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosner%20BA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16614123

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Giovannucci%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16614123

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zavras%20AI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16614123

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Melrose%20RJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11577670


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parkin%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15761078

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bray%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15761078

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ferlay%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15761078

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pisani%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15761078



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Perez%20EA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Romond%20EH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Suman%20VJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jeong%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davidson%20NE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Geyer%20CE%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Martino%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mamounas%20EP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kaufman%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wolmark%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21768458

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Updated+results+of+the+combined+analysis+of+NCCTG+N9831+and+NSABP+B-31+adjuvant+chemotherapy

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Piccart-Gebhart%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Procter%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leyland-Jones%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Goldhirsch%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Untch%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Smith%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gianni%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Baselga%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bell%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jackisch%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cameron%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dowsett%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Barrios%20CH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Steger%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Huang%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Andersson%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Inbar%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lichinitser%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=L%C3%A1ng%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nitz%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Iwata%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thomssen%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lohrisch%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Suter%20TM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=R%C3%BCschoff%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Suto%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Greatorex%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ward%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Straehle%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McFadden%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dolci%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gelber%20RD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gelber%20RD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236737


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=PINDBORG%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14110648

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=RENSTRUP%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14110648

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=POULSEN%20HE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14110648

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=SILVERMAN%20S%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14110648

62

52. Plch J, Par I, Navratilova I, Blahova M, Zavadil M: Long term follow-up study

of laryngeal precancer. Auris Nasus Larynx 1998;25:407-412.

53. Ranson M, Sliwkowski MX: Perspectives on anti-HER monoclonal antibodies. Oncology 2002;63 Suppl 1:17-24.

54. Rapidis AD, Wolf GT: Immunotherapy of head and neck cancer: current and

future considerations. J Oncol 2009;346345.

55. Rautava J, Jee KJ, Miettinen PJ, Nagy B, Myllykangas S, Odell EW, Soukka T, Morgan PR, Heikinheimo K: ERBB receptors in developing, dysplastic and malignant oral epithelia. Oral Oncol 2008 Mar;44(3):227-35.

56. Reibel J: Prognosis of Oral Pre-malignant Lesions: Significance of Clinical,

Histopathological, and Molecular Biological Characteristics. Crit Rev Oral Biol Med 2003;14(1):47-62.

57. Reichart PA: Identification of risk groups for oral precancer and cancer and

preventive measures. Clin Oral Investig 2001 Dec;5(4):207-13.

58. Ribeiro DC, Gleber-Netto FO, Sousa SF, Bernardes VD, Guimarães-Abreu MH, Aguiar MC: Immunohistochemical expression of EGFR in oral leukoplakia: association with clinicopathological features and cellular proliferation. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2012 Sep;17(5):739–744.

59. Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer CE Jr, Davidson NE,

Tan-Chiu E, Martino S, Paik S, Kaufman PA, Swain SM, Pisansky TM, Fehrenbacher L, Kutteh LA, Vogel VG, Visscher DW, Yothers G, Jenkins RB, Brown AM, Dakhil SR, Mamounas EP, Lingle WL, Klein PM, Ingle JN, Wolmark N: Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005 Oct 20;353(16):1673-84.

60. Rubin Grandis J, Tweardy DJ, Melhem MF: Asynchronous modulation of

transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor protein expression in progression of premalignant lesions to head and neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 1998 Jan;4(1):13-20.

61. Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N: Epidermal growth factor-

related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol 1995 Jul;19(3):183-232.

62. Schaaij-Visser TB, Bremmer JF, Braakhuis BJ, Heck AJ, Slijper M, van der

Waal I, Brakenhoff RH: Evaluation of cornulin, keratin 4, keratin 13 expression and grade of dysplasia for predicting malignant progression of oral leukoplakia. Oral Oncol 2010 Feb;46(2):123-7.

63. Scheifele C, Reichart PA: Oral leukoplakia in manifest squamous epithelial

carcinoma. A clinical prospective study of 101 patients. Mund- Kiefer- und Gesichtschirurgie 11/1998;2(6):326-30

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ranson%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12422051

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sliwkowski%20MX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12422051

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rapidis%20AD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19680453

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wolf%20GT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19680453

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rautava%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jee%20KJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miettinen%20PJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nagy%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Myllykangas%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Odell%20EW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Soukka%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Soukka%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Morgan%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Heikinheimo%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17604679


http://cro.sagepub.com/search?author1=Jesper+Reibel&sortspec=date&submit=Submit



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reichart%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11800432


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ribeiro%20DC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gleber-Netto%20FO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sousa%20SF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bernardes%20VD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guimar%C3%A3es-Abreu%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guimar%C3%A3es-Abreu%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Aguiar%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22322523

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Romond%20EH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Perez%20EA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bryant%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Suman%20VJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Geyer%20CE%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davidson%20NE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tan-Chiu%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Martino%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Paik%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kaufman%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Swain%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pisansky%20TM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fehrenbacher%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kutteh%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vogel%20VG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Visscher%20DW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yothers%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jenkins%20RB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jenkins%20RB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brown%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dakhil%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mamounas%20EP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lingle%20WL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klein%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ingle%20JN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wolmark%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16236738


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rubin%20Grandis%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9516947

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tweardy%20DJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9516947

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Melhem%20MF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9516947

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Asynchronous+modulation+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+protein+expression+in+progression+of+premalignant+lesions+to+head+and+neck+squamous+cell+carcino

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Salomon%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7612182

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brandt%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7612182

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ciardiello%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7612182

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Normanno%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7612182



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schaaij-Visser%20TB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bremmer%20JF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Braakhuis%20BJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Heck%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Slijper%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20der%20Waal%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brakenhoff%20RH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20036603


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Scheifele%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9881003

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reichart%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9881003

http://www.researchgate.net/journal/1432-9417_Mund-Kiefer-und_Gesichtschirurgie


63

64. Scheer M, Prange W, Petmecky K, Schirmacher P, Zöller JE, Kübler AC: Überexpression/Amplifikation des her-2/neu-Protoonkogens in oralen Plattenepithelkarzinomen. Mund- Kiefer- und Gesichtschirurgie 04/2012;7(3):138-145.

65. Sheikh Ali MA, Gunduz M, Nagatsuka H, Gunduz E, Cengiz B, Fukushima

K, Beder LB, Demircan K, Fujii M, Yamanaka N, Shimizu K, Grenman R, Nagai N: Expression and mutation analysis of epidermal growth factor receptor in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Sci 2008 Aug;99(8):1589-94.

66. Shin DM, Ro JY, Hong WK, Hittelman WN: Dysregulation of epidermal

growth factor receptor expression in premalignant lesions during head and neck tumorigenesis. Cancer Res 1994 Jun 15;54(12):3153-9.

67. Shirasuna K, Hayashido Y, Sugiyama M, Yoshioka H, Matsuya T:

Immunohistochemical localization of epidermal growth factor (EGF) and EGF receptor in human oral mucosa and its malignancy. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1991;418(4):349-53.

68. Silverman S Jr, Gorsky M, Lozada F: Oral leukoplakia and malignant

transformation: a follow-up study of 257 patients Cancer 1984;53:563-8.

69. Slamon D, Pegram M: Rationale for trastuzumab (Herceptin) in adjuvant breast cancer trials. Semin Oncol 2001 Feb;28(1 Suppl 3):13-9.

70. Srinivasan M, Jewell SD: Evaluation of TGF-alpha and EGFR expression in

oral leukoplakia and oral submucous fibrosis by quantitative immunohistochemistry. Oncology 2001;61(4):284-92.

71. Tabor MP, Braakhuis BJ, van der Wal JE, van Diest PJ, Leemans CR,

Brakenhoff RH, Kummer JA: Comparative molecular and histological grading of epithelial dysplasia of the oral cavity and the oropharynx. J Pathol 2003 Mar;199(3):354-60.

72. Taoudi Benchekroun M, Saintigny P, Thomas SM, El-Naggar AK,

Papadimitrakopoulou V, Ren H, Lang W, Fan YH, Huang J, Feng L, Lee JJ, Kim ES, Hong WK, Johnson FM, Grandis JR, Mao L: Epidermal growth factor receptor expression and gene copy number in the risk of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila) 2010 Jul;3(7):800-9.

73. Tzahar E, Waterman H, Chen X, Levkowitz G, Karunagaran D, Lavi S,

Ratzkin BJ, Yarden Y: A hierarchical network of interreceptor interactions determines signal transduction by Neu differentiation factor/neuregulin and epidermal growth factor. Mol Cell Biol 1996 Oct;16(10):5276-87.

74. van der Waal I: Potentially malignant disorders of the oral and

oropharyngeal mucosa; terminology, classification and present concepts of management. Oral Oncol 2009 Apr-May;45(4-5):317-23.

http://www.researchgate.net/researcher/38877349_M_Scheer/

http://www.researchgate.net/researcher/9052348_W_Prange/

http://www.researchgate.net/researcher/30672277_K_Petmecky/

http://www.researchgate.net/researcher/48788582_P_Schirmacher/

http://www.researchgate.net/researcher/38907578_J_E_Zoeller/

http://www.researchgate.net/researcher/33292671_A_C_Kuebler/


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sheikh%20Ali%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gunduz%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nagatsuka%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gunduz%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cengiz%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fukushima%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fukushima%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Beder%20LB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Demircan%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fujii%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yamanaka%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shimizu%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Grenman%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nagai%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18754871


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shin%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8205534

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ro%20JY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8205534

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hong%20WK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8205534

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hittelman%20WN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8205534


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shirasuna%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2024456

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hayashido%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2024456

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sugiyama%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2024456

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yoshioka%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2024456

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Matsuya%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2024456



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Silverman%20S%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6537892

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gorsky%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6537892

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lozada%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6537892

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Slamon%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11301370

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pegram%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11301370


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Srinivasan%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11721175

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jewell%20SD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11721175


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tabor%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Braakhuis%20BJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20der%20Wal%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20Diest%20PJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leemans%20CR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brakenhoff%20RH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kummer%20JA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12579537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Comparative+molecular+and+histological+grading+of+epithelial+dysplasia+of+the+oral+cavity+and+the+oropharynx

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Taoudi%20Benchekroun%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Saintigny%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thomas%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=El-Naggar%20AK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Papadimitrakopoulou%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ren%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lang%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fan%20YH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Huang%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Feng%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lee%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kim%20ES%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hong%20WK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Johnson%20FM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Grandis%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mao%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20570883


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tzahar%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Waterman%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Levkowitz%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Karunagaran%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lavi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ratzkin%20BJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yarden%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8816440

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=A+hierarchical+network+of+interreceptor+interactions+determines+signal+transduction+by+Neu+differentiation+factor%2Fneuregulin+and+epidermal+growth+factor.



64

75. Warnakulasuriya S, Johnson NW, van der Waal I: Nomenclature and classification of potentially malignant disorders of the oral mucosa. J Oral Pathol Med 2007 Nov;36(10):575-80.

76. Warnakulasuriya S, Reibel J, Bouquot J, Dabelsteen E: Oral epithelial

dysplasia classification systems: predictive value, utility, weaknesses and scope for improvement. J Oral Pathol Med 2008 Mar;37(3):127-33.

77. Wei Liu, Lin-Jun Shi, Lan Wu, Jin-Qiu Feng, Xi Yang, Jiang Li, Zeng-Tong

Zhou, and Chen-Ping Zhang: Oral Cancer Development in Patients with Leukoplakia – Clinicopathological Factors Affecting Outcome. PLoS One 2012;7(4):34773.

78. Wikstrand CJ, Hale LP, Batra SK, Hill ML, Humphrey PA, Kurpad SN,

McLendon RE, Moscatello D, Pegram CN, Reist CJ, Traweek ST, Wong AJ, Zulatsky MR, Bigner DD: Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Canc Res 1995;55(14):3140-8.

9 Erklärung

Hiermit versichere ich, dass die vorliegende Dissertation eigenständig und nur

unter Zuhilfenahme der angegebenen Literatur von mir erstellt und keiner

anderen Fakultät oder Universität zur Prüfung bereits vorgelegt wurde. Die

Quellen und Hilfsmittel wurden vollständig angegeben. Tabellen und

Abbildungen, die anderen Werken dem Sinn nach oder im Wortlaut entnommen

wurden, sind als Entlehnung gekennzeichnet.

Moritz Bechtold

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Warnakulasuriya%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17944749

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Johnson%20NW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17944749





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20W%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shi%20LJ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20L%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Feng%20JQ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20X%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20J%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20ZT%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20ZT%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20CP%5Bauth%5D

65

10 Abkürzungsverzeichnis

LP Leukoplakie

LPM Leukoplakie der Mundhöhle

PECM Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle

EGF epidermal growth factor

EGFR epidermal growth factor receptor, epidermaler Wachstumsfaktor-

Rezeptor

HE Hämatoxylin-Eosin

ROI region of interest

COP cut-off-point

ROC receiver operating characteristic

TAA Tumorassoziiertes Antigen

TGF-α transforming growth factor

ER expression rate, Expressionsrate

Follow-Up Nachuntersuchung nach Beobachtungszeitraum von 5 Jahren

DFS-rate Transformationsrate

AUC Area under the curve

OR odds ratio, Quotenverhältnis

SIN Squamöse Intraepitheliale Neoplasie

AD Aqua dest.

66

11 Herstellerverzeichnis

Deckgläser

Deckgläser verschiedener Größe

Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG

Saarbrückener Straße 248, 38116 Braunschweig

Objektträger

SuperFrost Ultra Plus®

Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG

Saarbrückener Straße 248, 38116 Braunschweig

Xylol (Isomere), 2-Propanol sowie Ethanol vergällt

Carl Roth GmbH & Co. KG

Schoemperlenstraße 3-5, 76185 Karlsruhe

Hämatoxylin, Eosin

Sigma-Aldrich Chemie GmbH

Kappelweg 1, Industriegebiet Süd, 91625 Schnelldorf

Salzsäure, Entellan® + Aquatex® Eindeckmedium

Firma Merck KGaA

Frankfurter Straße 250, 64293 Darmstadt

Dako Cytomation Autostainer mit Dako REAL Kit

Proteinase K (Dako S3020)

EDTA-Puffer, pH 9,0 (Dako S2367)

Dako-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)

Avidin + Biotin (Dako X0590)

Antibodydiluent (Dako S2022)

Lsg. A, Dako REAL Detection System K5005

Lsg. B, Dako REAL Detection System AP K5005

Chromogen Fast-Red K5005 + Levamisol

67

Dako Hämalaun S3301

Dako Diagnostika Deutschland GmbH

Stresemannstraße 161, 22769 Hamburg

Primärantikörper Dako EGFR Clone H11

Dako Diagnostika Deutschland GmbH

Stresemannstraße 161, 22769 Hamburg

Axioskop, Axiocam

Carl Zeiss Jena GmbH, Unternehmensbereich Mikroskopie

Carl-Zeiss-Promenade 10, 07745 Jena

Microsoft SPSS 19.0, Excel 2010, Word 2010

Microsoft Corporation

One Microsoft Way

Redmond, WA 98052-7399, USA

ImageJ by Wayne Rasband

National Institutes of Health NIH, Bethesda, USA

68

12 Danksagung

Mein herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Dr. med.

dent. Emeka Nkenke, für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die

Bereitstellung dieses hoch interessanten Themas sowie seine fachlich

kompetente Unterstützung bei Fragen der Methode und Statistik. In

besonderem Maße bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent.

Dr. h. c. Friedrich W. Neukam für die Möglichkeit, dieses Dissertationsprojekt an

der Mund-, Kiefer- u. Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg durchführen zu dürfen. Vielen Dank auch an

Herrn PD Dr. med. Dr. med. dent. Florian Stelzle für seinen Beitrag als

Korreferent zur Vollendung dieser Dissertation.

Bei meiner Betreuerin, Fr. Dr. rer. nat. Jutta Ries, möchte ich mich

außerordentlich bedanken für ihre fachliche Unterstützung in allen Belangen

dieser Dissertation sowie ihr besonderes persönliches Engagement.

Herzlichen Dank richte ich auch an Herrn Dr. Lutz Klinghammer der

Medizinischen Klinik 2 des Universitätsklinikums Erlangen für seine Hilfe bei

Fragen der Statistik sowie Einarbeitung in SPSS.

Weiterhin gilt mein Dank Herrn PD Dr. med. Dr. med. dent. Falk Wehrhan und

Herrn Dr. med. dent. Patrick Möbius für ihre Hilfe bei der Literaturrecherche

sowie Erläuterung der Methode für die Auswertung der immunhistochemischen

Schnitte.

Vielen lieben Dank an meine ehemalige Kommilitonin Fr. Dr. med. dent. Patricia

Gorecki für ihre Hilfe bei der Rekrutierung der Patientenproben.

Ich möchte mich ebenfalls für die Hilfsbereitschaft und Einarbeitung durch das

Labor-Team der Mund-, Kiefer- u. Gesichtschirurgischen Klinik bedanken,

namentlich Fr. S. Schönherr, Fr. E. Diebel und Fr. A. Krautheim-Zenk.

Meinen Eltern danke ich herzlich für ihre fortwährende Unterstützung, welche

meinen Lebensweg, mein Studium und diese Dissertation überhaupt erst

ermöglicht hat.

69

13 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Moritz Klaus Bechtold

Wohnort: Otto-Goetze-Str. 3, 91054 Erlangen

Geburtsdatum: 24.09.1986

Geburtsort: Mainz

Eltern:

PD Dr. med. Heinrich Bechtold (Facharzt für Innere Medizin u. Kardiologie)

Andrea Bechtold (Fachärztin für Kinder-/Jugendheilkunde)

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulausbildung

Juni 2006 Abitur am Albert-Schweitzer-Gymnasium Crailsheim

Studium

WS 06/07 bis SS 11 Medizinstudium an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

07/2008 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Physikum)

WS 10/11 Beginn des Doppelstudiums Medizin und

Zahnmedizin an der FAU Erlangen-Nürnberg

01/2011 Beginn der Promotion in der Abteilung für Mund-, Kiefer- u. Gesichtschirurgie an der FAU Erlangen-Nürnberg

WS 11/12 und SS 12 Praktisches Jahr an der FAU Erlangen-Nürnberg

02/2012 Zahnärztliche Vorprüfung (Physikum)

04 bis 07/2013 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung und Abschluss des Medizinstudiums, Approbation als Arzt

Weiterbildung

03/2012 Grundkurs im Strahlenschutz für Ärzte

EGFR-Überexpression als möglicher Parameter zur ... · so waren die Unterschiede bei D0 (p =...

Documents

Transcript of EGFR-Überexpression als möglicher Parameter zur ... · so waren die Unterschiede bei D0 (p =...