Risafah Pertemuan Ilmiah P~elilian dan Pengembangan Teknologi ISOlop dan RadiaSl; 2(XJ()

DETEKSI CEPAT BAKTERI Escherichia coli ENTEROHEMORAGIK(EHEK) DENGAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Dadang Sudrnjat, Maria Lina R, dan F. Suhadi

,.

I ~.~ Teknol~otop dan Radiasi, BATAN, Jakarta

ABSTRAK

DETEKSI CEPAT BAKTERI &cherichia coli ENTEROHEMORAGIK (EHEK) DENGAN.METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION). Telah dilakukan uji Reaksi polimerisasi berantai(PCR) untuk mendeteksi adanya bakteri Escherichia coli enterohemoragik OI57:H7. DNA dari sel bakteridengan metode CTAB-fenol-kloroform clan diendapkan dengan isopropanol. Untuk menguji sensitivitas darireaksi amplifikasi PCR, dibuat seri pengenceran dari larutan DNA E.coli O157:H7 antara I ~ -I pg/~I.Pasangan oligonukleotida primer yang digunakan untuk reaksi amplifikasi adalah shiga like toxin 1- forward(SLTI-F) & shiga like toxin 1- reverse (SLTI-R) yang diperoleh dari gen Shiga-Like-Toxin. Hasil penelitianmenunjukkan bahwa DNA E.coli pada konsentrasi 1 ng/~1 masih bisa dideteksi menggunakan primer SL n-F &SL n -R dengan fragmen DNA pada posisi 140 bp.

ABSTRACT

RAPill DETECTION OF &cherichia coli ENTEROHEMORRAGIC (EHEC) BACTERIA BYPCR (POLYMERASE L'HAIN RE4CTION) METHODs. A Polymerase Chain Reaction (PCR) assays fordetect presence of enterohemmoragic Escherichia coli O157:H7 was calTied out. DNA was extmcted frombacterial cells \\ith CTAB-phenol-chlorotonn and precipitated \\ith isopropallol. To test sensitivity of PCRamplified reaction, serial dilutions of E.coli DNA solution were prepared between I Ilg-l ngllll. A single pairoligonucleotide primer SLll-F & SLn-R derived from Shiga-like-Toxin genes was used in amplificationmethod. The results shows that I ngllll of E.coli DNA could be detected using the primers SL ll-F & SL TI-Rwith the position of 140 bp DNA fragment.

teknik ELISA sangat cepat dan sensitif serta praktispenggunaanya dalam klinik. Cara ini didasarkan padareaksi antara antibodi monoklonal spesifik E. colidengan antigen E.coli O157:H7 (4). Dengan cara inidapat dideteksi 1,5 seUgram. Kelemahan cara ELISAadalah kurang spesifik karena akan terjadi reaksi silangdengan antibodi dari bakteri lain sepeti E.hermanii.Brucella sp dan beberapa bakteri enterik lainnya. Untukitu perlu dikembangkan cara deteksi yang cepat dansensitif antara lain dengan teknik PCR (PolymeraseChain Reaction) berlabel isotop32p. Metode PCR dapatmendeteksi secara tepat gen yang menyandi toksin SL T(.S'higa-Like-Toxin) dari bakteri E.coli O157:H7 yangterdapat dalam makanan, susu rnaupun rases penderita (5.6).

PENDAHULUAN

Tujuan penelitian ini adalall mengembangkan caradeteksi bakteri E. coli patogen (EHEK) dalam sampelmakanan yang terkontaminasi berdasarkan teknik diatas.Pada tal1ap awal akan dilakukan ekstrnksi DNA daribeberapa isolat E.coli enterohemoragik. DNA basilisolasi diencerkan pada beberapa konsentrasi danselanjutnya dilakukan proses amplifikasi DNA denganPCR menggunakan oligonukleotida primer yang spesifik.Deteksi basil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesisgel agarose.

Escherichia coli enterohemoragik (EHEK) adalahsalah satu bakteri usus patogen yang dapat menyebabkandiare hemoragik colitis (HC), hemolitic-uremic syndrome(HUS) (1). Menurut Meng daD Doyle (2), EHEK0157:H7 menyebabkan diare berdarall dan HUS.

Mengingat masih rendahnya tingkat sanitasilingkungan di negara berkembang, penyakit diare yangdisebabkan oleh bakteri E.coli patogen menjadi masalahpenting apabila terjadi wabah. Makanan yangterkontaminasi bakteri E.coli khususnya EHEKmenyebabkan diare yang disertai pendaraltan, karenatoksin SL T (Shiga like toxin) yang dihasilkannya.Penyakit ini biasanya dikaitkan dengan daging sapi daDsusu yang terkontaminasi. Infeksi ini dapat dicegahdengan mengidentifikasi sumbernya antara lain nlakananyang terkontaminasi (2).

Selama ini ada beberapa metode konvensionalyang digunakan untuk menentukan adanya E.coli 0157:7enterohemoragik dari sampel lnakanan antara lainmetode biakan (kultur), uji biokimiawi, daD uji serologis(2). Cara-cara tersebut mempunyai kelelnahan danketerbatasan, selain memerlukan waktu lama juga tidakspesifik. Cara biakan yaitu dengan mengisolasi bakteridalam media selektif seperti yang dikembangkan olehDoyle daD Schoeni (3). Metode ini tidak sensitif kerenasampel harus mengandung !03 -104 sel/graln, selain itujuga memerlukan waktu lama dan lnahal karena harusdilakukan uji tallap selanjutnya meliputi uji biokilnia,serologis, daD verotoksisitas. Metode serologis dengan

BAHAN DAN METODE

Bahan. Isolat bakteri E.co/i EHEK yang digunakandalam penelitian ini adalah strain E.coli OI57:H7 basil

75

Risalah Pertemuan Ilmiah Pene!J1ian dan Pengembangan r eknologi IsOIOp dan Radiasi, l{xx}

dengan menggunakan 1% (b/v) agarose yang dilarutkandengan larutan biller 0,09 M Tris-Borate-0,2mM EDT A(TBE). Sejumlah 20 ~l larutan DNA dimasukkankedalam sumuran yang terdapat dalam lempeng agarose.Sebagai gel loading bufer dipakai larutan yang terdiridaTi 50% gliserol daD 0.025% brornfenolblue. MarkerDNA yang digunakan adalall 4> 174 Hae III (BRL).Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan teganganlistrik 100 volt selama 60 memt. Selanjutnya lempengagar diwamai dengan ethidium bromide. Pengambilangambar dilakukan dengan kamera Polaroid MP-4,dibawah penyinaran sinar ultraviolet diatasTransilluminator.

BASIL DAN PEMBAHASAN

Konsentrasi DNA E.coli EHEK basil isolasi dari7 isolat dapat di1ibat pacta Tabel 1.Hasil rata-rata dari 3 kali percobaan isolasi DNA,mempunyai konsentrasi berkisar antara 577 ,00 ~glml -1039,5 ~glInl denganrasio A26o/A28o = 1,76 -1,83.

Nilai perbandingan basil pembacaan pacta panjanggelombang A2rd A28o adalah untuk mengetahui tingkatkemurnian DNA. Menurut Maniatis (9) nilai rasio yangpaling baik antara 1,8 -2,0. Secara umum tingkatkemurnian DNA E. coli EHEK basil isolasi dalarnpenelitian ini cukup baik. Hasil ini juga sesuai darigambaran pola elektrogran1 genornik DNA E.coliEHEK pacta basil analisis dengan elektroforesis gelagarose yang memperlibatkan 1 pita DNA (Gambar 1).

Pacta percobaan deteksi DNA E.coli EHEKdengan reaksi PCR digunakan konsentrasi DNA dariImsil pengenceran sebesar 10 ngl~ dengan bantuanpasangan primer SLTI-F dan SLTI-R, menunjukkanreaksi positif untuk semua isolat yang diuji yaitu isolat719, 741, 743, 745, HCW 157 , HCI, dan strain 0157:H7 Adelaide dengan produk amplifIkasi terletakpacta posisi 140 bp pacta lempeng elektroforesis gelagarose (Gambar 2). Pita DNA produk PCR pacta isolat719 kurang terlibat nyata, sedangkan padac isolat 741,745, dan strain O157:H7 Adelaide pita DNA terlilmtjelas. Hasil amplifikasi DNA E.coli EHEK dengankonsentrasi 1 nglul dengan menggunakan pasanganprimer SL TIR dan SL TIF, masih memberikan basilposit if, untuk 6 isolat yang diuji, kecuali untuk isolat719 sudah tidak menunjukkan adanya amplifikasi DNA(tidak terdeteksi). Hasil percobaan yang dilakukan olehGarmon et at. (8) menggunakan pasangan primer yangsarna untuk amplifikasi DNA E.coli 0157:H7 yangdiisolasi dari daging sapi menunjukkan basil positifdengan fragmen PCR terletak pacta posisi 600 bp pactalempeng elektroforesis agarose. Perbedaan posisi produkPCR dengan penelitian ini kemungkinan disebabkanadanya perbedaan lokasi sekwens sasaran dalam genShiga Toxin untuk primer SL TI.

Posisi fragmen DNA produk PCR pada penelitianini sesuai dengan percobaan penelitian yang dilakukanPolard dkk (10) menggunakan primer yang diperolehdari gen SLTI yaitu pacta posisi 140 bp. Sensitivitas daripercobaan tersebut adalah 20 pgl~l. Sensitivitas padapenelitian ini lebih rendah yaitu sekitar 1 ngl~l.

isolasi dari daging ayam yaitu isolat dengan no kode 719,741, 743, 745, HCW, dan HC1-lyang diperolch dariBalitvet, Bogor. Sebagai pembanding digunakan strainstandar E. coli 0157:H7 Adelaidc. Isolat-isolat tcrscbutditwnbullkan dalmn media Mac.Coltkey Agar (DIFCO).Untuk keperluan isolasi DNA, bakteri ditwnbultkandalam media Luria-Bertani (LB) dan diinkubasi pactasuhu 37° C selmna 211ari.

lsolasi DNA. Isolasi DNA bakteri E.coliO:157:H7 dilakukan dengan menggunakan metodeAusubel (6). Kultur bakteri yang telah tumbuh dalammedia LB selama 2 hari , diambil sebanyak 15 mi. Pallensel dilakukan dengan cara sentrifugasi pacta 7000 rpmselama 10 menit. Pelet sel disuspensikan dalmn 5,6 mllarut:w bufer 0,0 I M Tris -EDT A pH 8 (TE), tambahkanlarutanlO% sodium dodec;:vl sulfate (SDS) scbanyak 300f.l.1, clan 30 f.l.llarutan proteinase K (20 mg/ml). Campurandiinkubasi selama 1 jam pada SullU 37°C dalam inkubatorgoyang. Tamballkall I mllarutan NaCI 5 M kocok secarasempuma. Kemudian ditambal1kaIl 800 I1llarutan CT AB,selanjutnya campuran diinkubasi selama 20 menit padasuhu 65°C. Ekstraksi DNA dilakukan denganmenambahkan volume SalTh1 larutan kloroform/isoamilalkohol (24: I). C1mpuran disentrifugasi selama10 mcnit pacta 10.000 rpm smnpai terbentuk 2 rase.Pindahkan rase air kedalmll tabung barn kemudiantmllbaltkan volwne sarna larutan fenol/klorofonn/iso-al1ul alkohol dan disentrifugasi kcmbali selama 15 menitpacta 10.000 rpm. Fase atas yang terbcntuk dipindaltkandalam tabung barn kemudian ditmnbal1kc1ll 0,6 VOIWllClarutan isopropanol dingin Imtuk mengendapkan DNA.Endapan DNA dipisal1kaIl dengml cara sentrifugasi pacta12.000 rpm selalna 15 menit, kemudian dicuci denganlarutan 70% etllc1llo1 dingin. Pelet DNA murnidikeringkan dalmll desikator vakwn untuk selanjutnyadilarutkan dalmll larutan bufer TE. Konsentrasi DNAdiukur dengan alat spektrofotometer pacta panjanggelombang 260 Oln daD 280 Oln. Konsentrasi DNA hasilisolasi kemudian dibuat pengenceran dengan larutan TEsampc1i I pg/ml untltk pcngujian amplifikasi DNA.

Ampliflkasi DNA. Amplifikasi DNA denganteknik PCR dari E.coli EHEK menggunakml metodeGarmon et at. (7). Rcaksi PCR dikerjakc1ll dcngan totalvolwne campuran yang mengandung 2 ug DNA target(10 111); 10 InM tris-HCI (pH 8,3); 50 InM KCI; 2 InMMgCI2, lnasing-masing 0,2 111M dATP, dCfP, dGTP,dTTP., daD 2,5 Unit cnzim Taq DNA polimerase (PerkinElmer Cetus). Primer yang digunakan adalah pasanganoligonukleotida SLTI-F (5'-ACACTGGATGATCfCA-GTGG-3') clan SLTI-R (5'CTGAATCCCCCTCCAT-TATG-3') yang diperoleh daTi sekucns spesifik EHEKsebanyak 2 InM. Pennukaan campuran reaksi dilapisidengan mineral oil. Reaksi PCR dilakukan dengan alatDNA Themlal Cycler (Perkin Elmer) menggunakan 40siklus, yang tiap siklus terdiri dari : (I) Dcnaturasi padasuhu 94°C selarna I OlCnit, (2) Annealing pacta suhu 60°Cselama I menit, (3) Extension pada SullU 72°C sclalna 2menit. Sesudall amplifikasi campuran disentrifugasi12.0000 rpm.

Analisis Amplifikasi DNA. Hasil mnplifikasiDNA E.coli EHEK dianalisis mcnggunakanelektroforesis gel agarose. Lempeng gel agarose dibuat

76

Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Teknologi lsalop dan Radias~ ,,(XX)

4. PADHYE, N.V., and DOYLE, M.P., Rapidprocedure for detecting enterohemomgicE.\'cherichia coli 0157:H7 in food. Appl.Environ.Microbiol ~ (1991) 2693-2698.

5. BRIAN, M.J., FROSOLONO, M., MURA Y, H.E.,MIRANDA, A., LOPEZ, E.L., GOMEZ, HF.,and CLEARLY, T.G., Polymerase chainreaction for diagnosis of enterohemoragicEscherichia coli infection and hemolytic uremicsyndrome. J. Clin. Microbio/. JQ (1992) 1801-1806.

Perbedaan sensirivitas PCR ini kemungkinan jugadisebabkan oleh perbedaan banyaknya kopi sekwensDNA spesifik yang terdapat secara alami dalam DNAisolat bakteri. Selain itu sensitivitas PCR jugadipengarulli oleh adanya kontanlinan dalam proses isolasiDNA sam pel, dan juga kondisi reaksi PCR sepertibanyaknya siklus yang digunakan (9).

Penggunaan pasangan primer SL TI-F dan SL TI-Rmempunyai prospek hila digunakan dalmn deteksi diniE.coli O157:H7 enterohemoragik untllk galur lokal(Indonesia) karena mempunyai spesifisitas yang cukuptinggi.

6. BEGUM., STROCBINE, N.A., SOWERS, E.G., andJACKSON., M.P., Evaluation of technique foridentification of shiga like toxin producingEscherichia coli by using polymerase chainreaction and digoxigenin-labelIed probes. J. Clin.Microbiol.ll (1993) 3153-3156.

KESIMPULAN

7. AUSUBEL, F.M., R.BRENT, R.E. KINGSTON,0,0. MOORE, J.G. SEOMAN, J.A., and K.STRUHL. Current protocols in molecularbiology, p.2.4.1.-2.4.2. John Wiley & Sons,Inc., New York (1987).

I. Amplifikasi DNA dari 7 isolat E.coli O157:H7dengan teknik PCR, semua isolat menunjukkan reaksipositif dengan menggunakc'lD pasangan primer SL TI-F daD SL T I-R dengan produk PCR terletak padaposisi 140 bp. Sensitifitas dari pasangan primer iniadalah dapat mengamplifikasi DNA E.coli O157:H7dengan konsentrasi 1 ngiul.

2. Waktu deteksi lebih cepat hila dibandingkan denganmetode konvensional yaitu 13 jam.

8. GANNON, P.J., KING, R.K., KIM, J.Y, andGOLSTEYN THOMAS, E.J. Rapid andsensitive method for detection of shiga-liketoxin-producing Esherichia coli in ground beefusing tIle polymerase chain reaction. Appliedand Enviromental Microbiology ~ (1992)3809-3815.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih yangsebesar-besamya kepada Ny. Suheni Sulaeman, Ny.Almaida, daD Sdri. Rika Heryani yang telah banyakmembantu dalam penelitian ini.

9.

MANIATIS, T., FRITSCH, E.F., and SAMBROOK,J., Molecular cloning, Laboratory Manual Book,3A, 2 nd edition. Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1989).

DAFT AR PUST AKA

DOYLE, M.P., E.~cherichia coli O157:H7 and itssignificance in foods. Int. J. Food. Microbiol. n(1991)289-302. 10. POLLARD, D.R., JOHNSON, W.M., LIOR, H.,

TYLER, S.D., and ROZEE, K.R..Differentiation of shiga toxin and vero cytotoxintype 1 genes by polymerase chain reaction.Journal of Infectious Diseases 162 (1990) 1195-1199

2. MENG, J., DOYLE, M.P., ZHAO, T., and ZHAO,S., Detection and control of Escherichia coli0157:H7 in foods. Trend in Food .Science &Technology:! (1994) 179-184.

DOYLE, M.P., and SCHOEN!, J.L., Isolation ofEscherichia coli O157:H7 from retail freshmeats and poultry. Appl. Environ.Microbiol. .21(1987) 2394-2396.

77

Risa/ah Pel1emuan //miah Penelitian dan Pengembangan Tetn%gi /sotop dan RadiaSl; 2{){)()

Tabcl Hasil allalisis konsentrasi dan nilai kemumian .DNA isolatE.coli EHEK O157:H7

;~ $

1

t "* 6 1~~Kb

2Jx J :J,;()

Pola elektrogram genomik DNA E.coli EHEKdeng.m elektroforesis gel agarose.(1). DNA Marker A Hind III, (2). Isolat 719, (3).Isolat 741, (4) Isolat 743, (5). Isolat 745, (6) IsolatHCW 157, (7) Isolat HCI-I, (8) Isolat Adelaide 157.

Gambar

78

Risalah Peltemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan [elrnologi Isolop dan RadlaS/; ",(XX)

M 1 2 3 .. 5 M 1 6 7 8

1353,,-1078._.871--

.603 --310281~

bp 271-234'-194 --

140 118 -

1)1'

140

79

M~~,¥jg~.L :M: Marker DNA <I> 17-1 IJ~le ill (BRL)1 : Koilirol negntif2: IF:ol:JI 7193 : .If;oll1( 7~ 14 : Isola! 71135 : 1801~11 7.156 : rsol~,t fJCW 1.57

7:180111IT1(:.'I-18 : Isol~lt AdeJ(ljde 157

Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian don Pengembangan leknologi lsotop dan RadiaSl; cfX)()

M 1 2 3 .. 5

bp

GWllbw' 3. AJnl)JifiknfJi JJNJ\ igoJnt bJ1l<.tl~l'i E. coli EI-IEK Ol~7:r17 cJl"I)~1lI1 kollsrrlll'nsi1 ngimJ mrllggllllru<!1/1 pnsmlgml pi-imer SLTI-F clan Sl:rl-lt p~lcJ:ll;'l('kh(1r(11"('si~

gel RgnrORe._Y~_r~Jg~- :M: Mru'kcr DNA 4I17~ Tille ill (ilRL'1 : Kollb'ol negatif2: Tsolnt719

3 : IAolllt 7~ I" : If;ol:lt 743.5 : IRolnt 74.5

6 : IRo!~lt JJ(;W 1.S77 : IRoiltl ..fC J -J

8 : Isolrlt Adelaide 1.'57

DISKUSI

BASRIL SUDRADJA T ISKANDAR

Dari beberapa metode yang disebutkan terdahulu(kultur. ELISA dan PCR). mana yang paling ekonomis ?

DADANG

1. Untuk mendeteksi DNA E. coli pada konsentrasirendall 1 mg/ml, apakah ada cara lain yang lebihsederhana dan murall ?

2. Kalau ada, apa perbedaan dengan yang diteliti(metode PCR) ?

Metode PCR yang lebih ekonomis. dibandingkandengan metode konvensiorull (kurslls. ELISA) k.1rerulselain cepat. sensitip dan spesefik.

DADANG

1. Tidak ada, hanya dengan metode PCR yang dapatmendeteksi adanya E. coli, dengan menguji DNAyang pada konsentrnsi dibawah 1 mg.

2. Tidak ada.

80