Ein Praxisbericht Ellen Scherbaum -...

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Varian-Seminar Juni 2005

Einsatz der HPLC-MS(-MS) in der Pestizidanalytik

Ellen Scherbaum

Ein Praxisbericht

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Gliederung

Ziele des CVUA StuttgartGerätetechnik LC-MS(-MS)Applikationen ValidierungMatrix-EffekteErgebnisse aus der Lebensmittelüberwachung

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Ziele

So einfach wie möglich, so viel wie möglich, so gut wie nötig

Möglichst viele Stoffe mit einer einfachen Multimethode erfassenEinen Extrakt sowohl für die GC- als auch für die LC-BestimmungenMatrix-orientiertes StoffspektrumMatrixeinflüsse bei der Chromatographie berücksichtigen (Standard-Addition bei HMÜ)

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QuEChERS

Anastassiades et al.EPRW 4, Rom 2002

10 g gefrorene Probe einwiegen

Intensiv schütteln 1 minIntensiv schütteln 1 min

Schütteln, ZentrifugierenSchütteln, Zentrifugieren

Zugabe der ISTD-Lösung

Schütteln, ZentrifugierenSchütteln, Zentrifugieren

Take Aliquot and Add to MgSO 4 & SPE Sorbent

Zugabe von 10 mL Acetonitrile

Zugabe von 4 g MgSO 4 / 1 g NaCl / 1 g Na3Citrat / 0.5 g Na 2HCitrat (pH 5-5.5)

10 µL 5% HCOOH in ACN / mL Extrakt zugeben(um basenempfindliche Stoffe zu schützen)

Optional: Zugabe von “Analyte Protectants”Multimethoden

mittels GC-MS, LC-MS

Optional: Säuren mittels LC-MS

Sehr großes Stoffspektrum

Extrakt direkt für GC- und LC-MS

geeignet

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GC oder LC-MS?

API Electrospray

Molekulargew

icht

Analyt-Polarität

1000

100,000

10,000

unpolar stark polar

APCI

GC/MS

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LC-MS/MS - Schematischer Aufbau

Ionen-Produktion - Quelle

Fragmentierung

Ionen-Selektion – Q3

Ionen-Detektion


Ionen-Transport - ins MS

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LC-MS - Schematischer Aufbau

Ionen-Produktion - Quelle

Fragmentierung

Ionen-Selektion – Q

Ionen-Detektion


Ionen-Transport - ins MS

HP 1998

Nebulizer

+ + ++

+++ + + ++ +

+

QuadrupoleLensesFragmentation zone (CID)

Capillary Octopole

3 Torr 1 x 10 -5 Torr

HP 1998

Nebulizer

+ + ++

+++ + + ++ +

++ + +

+++

+ + + ++ ++

++ ++ ++++

++++++ ++ ++ ++++ ++

++

QuadrupoleLensesFragmentation zone (CID)

Capillary Octopole

3 Torr 1 x 10 -5 Torr

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API, Elektrospray-Technik, ESI

TaylorCone

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ESI

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ESI

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ESI

Rayleigh Limit erreicht

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ESI

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Solution Chemistry

PositiverModus

Negativer Modus

R1 R1| |

:N - R2 + HA +HN - R2 + A-

| |R3 R3

Base Säure Analytion

O O|| ||

R-C-OH + :B R-C-O - + H:B+

Säure Base Analytion

Elektrospray: Analytionen müssen in Lösung vorliegen!

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Solution Chemistry

� Positive IonendetektionpH-Wert erniedrigen durch Zusatz

von� Ammoniumacetat, -formiat

2-20 mmol, pH 4-5� Essigsäure, Ameisensäure

0,1-1 %, pH 2-4

� Negative IonendetektionpH-Wert erhöhen durch Zusatz

von� Ammoniak 0,1-1 %

++

++

+++

+ + + + + + + + + + + + +

+

+

-5,000 V

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ESI – Quasi Molekülionen und Addukte

Positive Ionendetektion[M+H]+

[M+Na]+, [M+K] +

[M+NH4]+

Negative Ionendetektion[M-H] -

[M+HCOO] -, [M+CH3COO]-

++

++

+++

+ + + + + + + + + + + + +

+

+

-5,000 V

Schonendste Ionisierungsart in der LC-MS

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APCI, APPI-Quellen

APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization

Corona Nadel, Ionisierung über Lösungsmittel-moleküle

Nach BfR nur für 5 % der Substanzen höhere Empfindlichkeit

APPI: Atmospheric Pressure Photo Ionization

UV-Lampe

geeignet für sehr unpolare Substanzenwie PAKs

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LC-MS – Detektion der Fragmente

M n [M]+

1

[M]2

+

Fragmentor-Voltage

QuadrupolKapillare

Fragmentieruns-zone 439

467

684.65Fragmentorspannung = 175 V

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LC-MS/MS – Multiple Reaction Monitoring

Q1 Kollisionszelle Q3

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LC-MS(/MS) – Wieviele Massen oder Übergänge?

Geräte sind in ihrer Leistungsfähigkeit begrenzt (z.B. 100 Übergänge)

Je nach Fragestellung gibt es 2 Ansätze:

Möglichst viele Stoffe in einem Lauf: 1 Übergang pro Stoff, Zeitfenster

Große Sicherheit, wenig Nachuntersuchungen: mind. 2-3 Übergänge pro Stoff, dafür mehrere Läufe (Methoden)

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LC-MS(/MS) – Wieviele Massen oder Übergänge?

M+H=318

Phosmet

160

77

M+H=318

Azinphos-methyl

160

77

Ein Übergang ist für einen Befund nicht ausreichend!!

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LC-MS(/MS) – Probe in Acetonitril?

Für die meisten Stoffe ist eine direkte Injektion des Acetonitril-Extraktes möglich.

Lediglich einige polare Verbindungen ergeben eine unbefriedigende Peakform. In diesen Fällen versetzen wir den Extraktim Autosampler des HPLC automatisch mit Fließmittel A und spritzen die doppelte Menge ein.

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LC-MS(/MS) – Welche Massen und Übergänge?

Es gibt zahllose Publikationen mit vorgeschlagenen Übergängen und Geräteparametern.

• www.bfr.bund.de/cd/5831: 304 Pestizide, jeweils mit 2 Übergängen einschließlich Geräteparameter zum download

•www.pesticides-online.comWirkstoff-Datenblätter für mehrere Hundert Pestizide einschließlich vorgeschlagener Massenund Übergänge

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LC-MS(/MS) – Welche Massen und Übergänge?

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Routine-Applikationen

N-MethylcarbamateBenzoylharnstoff-InsektizideDiacylhydrazineOrganozinn-VerbindungenPolare PhosphorsäureesterChlormequat/MepiquatBasische FungizideNeonicotinoideMacrocyclenPhenylharnstoff-HerbizideTriazineTriazolePhenoxyalkancarbonsäuren

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Säulen / mobile Phasen

Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µm

0,01 % Essigsäure in Wasser/Acetonitril

LC-MS/MSESI neg.

Herbizide1Phenoxys





Aqua C18 150x2 mm; 3µ; 125 A;

5 mmol NH4Formiat in Wasser/Methanol

LC-MS/MSESI pos.

Herbizide2

5 mmol NH4Acetat in Wasser /Acetonitril

LC-MSESI neg.

Benzoyl-Harnstoffe

10 mmol NH4Formiat in Wasser /Methanol pH 4

LC-MSESI pos.

Neonics und QSM

10 mmol NH4Formiat in Wasser /Acetonitril pH 4

LC-MS/MSESI pos.

Macrocylen


LC-MS/MSESI pos.

Triazole

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Säulen / mobile Phasen

LC-MS/MSESI pos.

LC-MS/MSESI pos.

LC-MSESI pos.

LC-MS/MSESI pos.

LC-MSESI pos.


5 mmol NH4Acetat in Wasser/Acetonitril

NMC

MonoChrom MS 5 µ 25 mmol NH4Acetat0,1 % Essigsäure, Acetonitril

ChlormequatMepiquat

Zorbax XDB C1850 x 2,1 mm 3,5 µ

5 mmol NH4Formiat in Wasser/Methanol, 1 % Ameisensäure

Organozinns

Gemini C18150 x 2,0 mm 5 µ

5 mmol NH4Acetat in Wasser/Methanol

Basische Fungizide

Aqua C18150 x 2 mm 3 µ


Polare

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Nachweisgrenzen

BG mg/kgNG mg/kgStoffe

0,003-0,006

0,002-0,004

0,003

0,008-0,01

0,002-0,004

0,004-0,008

0,001-0,005Polare

0,005-0,01 Neonicotinoide

0,001-0,01 Basische Fungizide

0,003-0,007 Macrocyclen*

0,005 Acephat/Methamidophos

0,013-0,02 Organozinn-Verbindungen

0,003-0,007 Diacylhydrazine

0,008-0,014 Benzoylharnstoff-Insektizide

0,002-0,01 N-Methylcarbamate

*außer Milbemectin

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Beispiel-Chromatogramm

Paprika 2 g/ml Benzoyl-Harnstoff-Pestizide 0,1 ppm

min4 5 6 7 8 9

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Flufenoxuronm/z 487

IS PCPm/z 265

Diflubenzuronm/z 309

Teflubenzuronm/z 379

Lufenuronm/z 509

Triflumuronm/z 357

Hexaflumuronm/z 459

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Validierung

EU-PT 4-6

Pestizid EU PT 4-6

Anwendung Dotiert mg/kg

CVUA S mg/kg

Median mg/kg

Carbofuran 0,14 0,15 0,13 Imazalil 0,94 0,76 0,69 Imidacloprid ja 0,15 + A 0,2 0,16 Methamidophos ja 0,11 0,09 Acephat ja 0,10 0,12 Diazinon 0,12 0,12 0,11 λ-Cyhalothrin ja 0,14 + A 0,19 0,19 Malathion ja 0,10 + A 0,07 0,07 Mevinphos 0,20 0,16 0,17 Omethoat 0,05 0,04 0,04 Oxydemeton-me 0,20 0,17 0,17 Parathion 0,26 0,26 0,22 Phosmet 0,20 0,20 0,17 Propyzamid ja 0,34 + A 0,45 0,39 Tolclofos-methyl 0,51 0,48 0,43 Azoxystrobin 0,23 0,23 Dimethoat 0,13 0,13 Imazalil 0,16 0,17 Imidacloprid 0,23 0,23 Oxydemeton-me 0,24 0,20 Thiabendazol 0,33 0,31

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Matrixeffekte

zeitlich konstantzeitlich nicht konstant

stark abhängig von chromat. Trennung

chromat. Trennung ohne Einfluss

MatrixabhängigMatrixabhängig

vom Analyt abhängigvom Analyt abhängig

in der Regel Signalsuppression

in der Regel Signalerhöhung

nach der Säulev.a. im Injektor

LC-MS (ESI)GC-MSD (Quadrupol)

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Matrixeffekte - Beispiel

0

50

100

150

200

250

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

2 g/ml

1 g/ml

0,5 g/ml

0,25 g/ml

0,125 g/ml

ohne Matrix

TPP Konzentration [µg/ml]

Fläche

Matrix

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Matrixeffekte - Abhilfe

•Verdünnen

•Injektionsvolumen reduzieren

Bedingung: empfindliche Geräte

Matrixeffekte werden nur reduziert!

Man braucht wie immergut ausgebildeteaufmerksame Mitarbeiter!

Matrix-Kalibrierung!

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BfR: Reduzierung der

Matrix-Effekte 50 %

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Flächenverhältnis Analyt/ISTD

zugegebene Menge an Analyt (Aufstockung)||||x ||||

||||x ||||: absolute Menge an Analyt im Probenextrakt vor der Dotierung (y=0)

y-Achsenabschnitt׀x׀ =

Steigung der Geraden

Wenn es drauf ankommt: Standardaddition

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2004 –Rückstands-Befunde

2277 (42 %)

861 (41 %)

1416 (43 %)

Befunde LC

54253148Gesamt1485 Proben

2110(3,3/Probe)

1249Gemüse641 Proben

3315(3,9/Probe)

1899Obst844 Proben

Befunde GesamtBefunde GC

Matrix

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2004 - Höchstmengenüberschreitungen

269(68 %)

150 (68 %)

119 (67 %)

HMÜs LC

397128Gesamt1485 Proben

22070Gemüse641 Proben

17758Obst844 Proben

HMÜs Gesamt

HMÜs GC

Matrix

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LC-Befunde - Entwicklung

269 (68 %)

56 (35 %)

davon LC-Substanzen

NMC, Basische, CCC, Ozinn, Ozide, BUs,

Azole, Polare, Ureas, Triazine etc.

3972004

Basische, Ozinn, BUs, Methamidophos

1582000

Erfasste LC-Stoffklassen

Stoffe über Höchstmenge

Jahr

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Befunde - 2005

> Höchst-menge

KulturenBefundeStoffgruppe

4 HMÜsSolanaceen, Kernobst

15 malBenzoyl-Harnstoffe

10 HMÜsSolanaceen, Zucchini, argent. Äpfel

22 malSpinosad

31 HMÜsSalate, Solanaceen, Tafeltrauben

146 malNeonicotinoide

670 Proben

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Befunde - 2005

> Höchst-menge

KulturenBefundeStoffgruppe

3 HMÜsviele verschiedene185 malTriazole

1 mal nicht zugelassen

Kräuter, Salate, Karotten, Sellerie

44 malPhenyl-Harnstoffe

1 HMÜSpargel, Sellerie10 malTriazine

3 HMÜs(Oxamyl)

viele verschiedene46 malCarbamate

670 Proben

www.pesticides-online.com

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...herzlichen Dank

dem pestis-team am cvua stuttgart

und Ihnen für die Aufmerksamkeit.

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