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Eine Methode zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivitiit der ,,freien Aminos/iuren" in Gewebeextrakten yon S/iugetieren

H ~ T W I G M6LLER, ~]:KOLAUS SErL:~ und GOTTFRIED WERNER

Max-Planck-Institut fiir Hirnforschung, Arbeitsgruppe Neurochemie Frankfurt/Main-Niederrad

Eingegangen am 25. Mai 1968

A Method/or the Determination o/the Speci/ic Radioactivity o] "Free Amino.Acids" in Tissue Extracts o/Mammals. Some experiences are given with a measuring device for the determination of the specific radioactivity of 14C-labelled brain amino-acids. The apparatus consists of an automatic amino-acid analyzer combined with a flow cell filled with anthracene. The reproducibility of the method is ~= 5 ~ to -4- 1 ~ m.e. in the range of 1 • 10 -a vCi to 5 • 10 -3 ~Ci. A quantitative determination of 3 • 10 -~ ~Ci/ml eluant is still possible.

Die Bes t immung der spezifischen I~adioakt iv i t s yon a l l - oder 14C- mark i e r t en Aminosi~uren in H y d r o l y s a t e n oder Gewebeex t r ak t en k a n n kont inu ier l ich und mi t nur einer Ana lysenprobe erfolgen, wenn der aus der Ionenaus tauschers~ule eines au toma t i s chen Aminos~urenana lysa to r s aus t re t ende Puf fe rs t rom durch eine MeBzelle gele i te t wird, die m i t e inem festen, im Puffer nnlSsliehen Szint i l la tor geffillt i s t [1- -4] . W i t benu t z t en die in Abb. 1 sehemat iseh darges te l l te MeSanordnung zur Ana lyse der Aminos~uren in Pe reh lo r s~ure -Ex t r ak t en yon Mi~use- gehirnen.

Abb. 1. Schematische Darstellung der Apparatur zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivit~t yon l~C-markierten Aminos~uren

Bestimmung der spezifisehen Radioaktivit~ der ,,freien Aminos~uren" 127

Die Apparatur besteht aus einem Aminos~urenanalysator ,,Unichrom" der Fa. Beck- man Instruments GmbI-I (S~ule: 650 mm L~nge, 9 mm lich~e Weite, I-Iarzffillung : Beckman Custom l~esearch t~esin PA-28) und einem unmittelbar an den S~ulen~us- flul3 angeschlossenen P~ckard-Flow-Detector, Modell 3041. Die MeBzelle befindet sich in dem Detektor zwischen zwei rauscharmen Photomultipliern und is~ dicht mit AnthracenkristMlen (Fluor.-Max. 4450 A) gepaekt. ])as effektive Volumen der Zelle betr~gt 1 ml, die MeBzeit bei einer Puffergeschwindigkeit yon 50 ml/h demnach etwa 1 rain. Eine Kfihlung der Durchflui~einrichtung ist entbehrlich. Die Mei~zelle ist fiber ein Mehrweg-Verbindungsstiick an die S~ulen des Aminos~urenanalysators ange- schlossen. Mit Hilfe des Tri-Carb-Szintillationsspektrometers, Model13021 (Packard), und eincs Linienschreibers (Elektronik 16, Honeywell) wird die Radioaktivitgt im Pufferstrom kontinuierlich registriert. Die Trennung der Aminos~uren erfolgt zu- n~chst mit Citrat-Puffer pH 3,20, N~-Ionenkonzentration 0,20 N, nach dem Auf- treten des Al~nins im Eluat mit Citrat-Puffer pI-I 4,80, ~-Ionenkonzentration 0,38 N. ~Iit diesem Puffersystem lassen sich die sauren und neutralen Aminos~uren sowie die y-Aminobutters~ure auf einer Austauschers~ule innerhalb yon 4,5 h auf- trennen. Im Anschlul] an die Radioaktivit~tsmessung werden die im Puffers~rom befindlichen Aminos~uren mit )~inhydrin zur l~eaktion gebracht und ihre Konzen- tr~tionen in iiblicher Weise photometrisch bestimmt. In der Anthraeen-MeBzelle tritt eine Vermischung des Eluates, die sich in einer Verbreiterung der Absorp~ions- banden der tCeaktionsprodukte aus den Aminos~uren und Ninhydrin ~ul]ern wiirde, nicht ein.

Ergebnisse Aus Abb. 2 geht hervor, dal~ der Kohlenstoff yon intraperi toneal injizier- ter [u-14C]-D-Glucose im Gehirn der M~use in die Aminos/~uren Alanin, y-Aminobutters~ure, Asparagins~ure, Glutamin, Glutamins~ure und Serin sowie in einige Keto- und I-Iydroxys~uren eingebaut wird. Eine []berlagerung der radioakt iven Aminosguren im Chromatogramm mit anderen im Gehirnextrakt vorkommenden radioakt iven Substanzen t r i t t nicht ein. Lediglich Taurin, d~s nicht radioakt iv markier t wird, wird gemeinsam mit der Milchsi~ure eluiert.

Die Radioaktivit /~tsbestimmung erfolgt bei 1~C mit einer Z~hlausbeute yon 55o/o. Der Unte rgrund yon 20 I p m bleibt auch bei mona~elanger Benutzung der Mel~anordnung konstant .

Die Reproduzierbarkei t der Methode ergibt sich aus der Tabelle. Die Radioakt ivi tg tsmessungen erfolgten im Bereich bis 2 �9 104 Ipm. Ffir die Analysen wurden Probenmengen entsprechend 100 mg Gehirngewebe verwende~; daraus ergibt sich ftir die Bes t immung der Radioakt iv i t~t in der GrSl~enordnung 1 . 1 0 -a ~Ci ein mitt lerer Feh|er yon ~ 50/0, bei 2 . 1 0 -3 ~Ci ein mitt lerer Fehler yon ~ 2~ und bei 5" 10 -2 ~Ci ein solcher yon • 1~ yore Mittelwert. Eine quant i ta t ive Bes t immung der Radio- akt ivi t~t im Bereich yon 3 �9 10 -4 ~tCi/ml Elua t ist bei einer DurchfluB- geschwindigkeit yon 50 ml/h noch m5glich.

Die Vorteile des Verfahrens gegenfiber papier- oder d/innschichGchroma- tographischen Methoden liegen einmal in der gro~en Empfindlichkeit und

128 H. M6L~ER et al. : Bestimmtmg der spezifischen Radioaktiviti~t

t lpm 8000

6 000

I: III a

~u3 ,=o o

2'5 5'0 �9 i 5 100 125 1~0 175 200 mt Etuat~ Abb.2. Kombiniertes Chromutogramm der Konzentrations- und Radio~ktivit~ts- messung der Aminos~uren im Perchlors~ure-Extrakt eines )5~usegehirns. (Die Radioaktivit~t der Glut~mins~ure wurde mit um die Hi~lfte reduzierter Empfind- ]ichkeit gemessen)

Tabelle. Konzentration der /reien Aminosduren sowie ihre Radioalctivit6t im Gehirn einer Maus nach i.p. In]e#tion yon 20 ItCi [u-14C] markierter D-Glucose (Mittelwerte aus 6 Bestimmungen)

Konzentr~tion Radioaktivit~t spezif, relat, spezif. der AS der AS [FCi/g Aktivit~t Aktivit~t [l~Mol/g Gehirn- Gehirn- [~Ci/~zMol] (bezogen aus feuchtgew, feuchtgew, y-Abu ~ 1,00) =~ ~ v.M.W.] =~ ~ v. M.W.]

Alanin 0,52 ~= 3,5 7-Aminobutter-

s~ure 2,09 =[= 1,4 Asparagins~ure 3,42 • 2,0 Glut~min 5,86 • 1,3 Glutamins~ure 10,41 ~: 1,4 Serin 0,88 ~: 4,6 Glycin 1,03 ~: 2,1 P-~th~nolamin 2,08 q- 3,3 Taurin 10,40 :E 1,9

0,015 ~: 4,6 0,0288 0,78

0,078 :j: 2,6 0,0374 1,00 0,150 ~: 1,5 0,0439 1,09 0,174 :j:: 1,7 0,0297 0,80 0,549 :~ 1,0 0,0525 1,40 0,006 ~ 5,4 0,0068 0,17

B. I{OLB U. E. WIEI)EKING: Radio-gas-chromatographisehe Analyse 129

der guten Reproduzierbarkeit, zum anderen kSnnen Konzentration und Radioaktivit/it der Aminos/~uren in derselben Analysenprobe bestimmt werden.

Zusammenfassung

Es werden Erfahrungen mit der Kombination yon automatischem Amino- s~urenanalysator und Szintillations-DurchfluSzelle zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivit/~t 14C-markierter Aminos/iuren im Gehirn mit- geteilt. Die Erfassungsgrenze betr/~gt 3 �9 10 -4 ~Ci/ml Eluat, die Reprodu- zierbarkeit 5--1~ vom Mittelwert im Mel~bereich yon 1 . 1 0 -a bis 5 �9 10 -2 ~Ci.

Literatur 1. ELwY~, D. tL : Atomlight 87, 5 (1964). 2. PI]~z, K. A.: Anal. Biochem. 4, 444 (1962); vg]. diese Z. 199, 392 (1964). 3. SC~O~i~T.L]:R, J., u. H.-J. STA~: diese Z. 211, 274 (1963). 4. S c m ~ , E., and R. LO~BA~nT: Anal. Biochem. 8, 68 (1962); vgl. diese Z. 148,

126 (1963). 5. S ~ E R , N., H. MSLLEa u. G. WER:~ER: Z. Physiol. Chem. 848, 657 (1967).

Dipl.-Chem. It. M S ~ R Max-Planek-Institut fiir Hirnforschung Arbeitsgruppe Neuroehemie 6000 Frankfurt a.M.-hIiederrad, Deutschordenstralle 46

Radio-gas-ehromatographische Analyse von Fetts~iuremethylestern und Steroiden

B. KOLB und E. WIED~KI~G

Bodenseewerk Perkin-Elmer & Co. G.m.b.H., ~berlingen

Eingegangen am 14. Mai 1968

Radio Gas.Chromatographic Analysis o/ Fatty Acid Methy ,Esters and Steroids. A description is given of comparative investigations in radio gas-chromatography with a proportional flow-through counter tube after cracking either by hydrogenation or by oxidation of laC and 3H labelled substances previously separated by gas chroma- tography. When hydrogenation was used, counting yields of !00~ were found for both the laC and the 3H labelled compounds. The determination of specific activities of 14C labelled fatty acid methyl esters showed good agreement of the results obtained by hydrogenation and by oxidation. Some examples are given for analysis of ~H labelled steroids after hydrogenation and of 14C labelled steroids after oxidation. In addition, the application possibilities of support-coated open tubular columns in radio-gas chromatography are discussed.

9 Z. Anal. Chem., Bd. 243