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Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe

Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Marek Zygmunt

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Einflüsse eines Folsäure und Vitamin-B6-Mangels auf die Morphologie der Plazenta

und den diaplazentaren Aminosäuretransport der trächtigen Ratte

Inaugural – Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2010

vorgelegt von:

Benjamin Johannes Desaga

geb. am: 10. Oktober 1982

in Hamburg

Dekan: Prof. Dr. med. Claus-Dieter Heidecke

1. Gutachter: Prof. Dr. med. M. Zygmunt

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. C. Pfarrer

Ort, Raum: Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe, Ferdinand-Sauerbruch-Straße, Greifswald, N0.03

Tag der Disputation: Di. 30. August 2011

2

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung und Zielstellung 5

2. Literaturübersicht

2.1 Folsäure 7

2.2 Vitamin B6 13

2.3 Aufbau und Entwicklung der Plazenta der Ratte 18

2.4 Diaplazentare Transportmechanismen 28

2.5 Methylierungszyklus 31

2.6 Zusammensetzung der Amnionflüssigkeit 34

3. Material und Methoden

3.1 Material 35

3.2 Methoden 36

4. Ergebnisse

4.1 Vitamin B6, Folsäure, Homocystein, ALAT, ASAT im maternalen Plasma 45

4.2 Proteinogene Aminosäuren mit apolaren Seitenketten 49

4.3 Proteinogene Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten 55

4.4 Proteinogene Aminosäuren mit sauren Seitenketten 60

4.5 Proteinogene Aminosäuren mit basischen Seitenketten 62

4.6 Nicht proteinogene Aminosäuren 65

4.7 Histomorphologische Untersuchung der Plazenten 71

4.8 Immunhistochemische Untersuchung der Plazenten 76

4.9 Resorptionen 80

5. Diskussion

5.1 Blut- und Amnionparameter 81

5.2 Histomorphologische und Immunhistochemische Untersuchungen der Plazenten 88

6. Literaturupdate und Ausblick 92

7. Zusammenfassung 94

8. Abkürzungsverzeichnis 97

9. Schrifttum 98

3

Seite

Eidesstattliche Erklärung 117

Danksagung 118

Anhang 119

4

1. Einleitung und Zielstellung

Lippen-Kiefer-Gaumen-Segel-Spalten (LKGS) und Neuralrohrdefekte (ND) gehören mit zu den

häufigsten Fehlbildungen des Menschen mit einer regional unterschiedlichen Inzidenz von 1:500

bis 1:1500 (Hillig, 1991; Källen, 1989; Kerrigan et al., 2000; Rösch et al., 1998; Tönz et al.,

1996). Das Ursachengefüge dieser Fehlbildungen ist sehr vielschichtig. Neben genetischen

Faktoren als auch Umwelteinflüssen, spielen Toxine, aber auch Mangelernährungen bzw.

Vitaminunterversorungen eine nicht unerhebliche Rolle. Bezüglich der Vitaminmangelernährung

kommt den wasserlöslichen B-Vitaminen Folsäure, Vitamin B6 und B12 eine entscheidende Rolle

zu. Sie haben insbesondere am Aminosäurestoffwechsel, an der Proteinsynthese als auch an der

Zellteilung entscheidenden Anteil.

Bisherige empirische Untersuchungen geben jedoch nur unvollständig Auskunft über den Bedarf

und die Wirkung dieser Vitamine in der perikonzeptionellen Phase als auch in der

Schwangerschaft selbst. Problematisch ist der Umstand, dass ND und LKGS in der 4. bzw. 7.-9.

Embryonalwoche entstehen, die Schwangerschaft selbst im Allgemeinen aber erst nach Eintritt

dieser Fehlbildungen diagnostiziert wird. Eine Prävention über die orale Gabe dieser Vitamine

kommt dann meist zu spät, ebenso die klinisch-chemische Diagnostik bezüglich der biologischen

Verfügbarkeit dieser Vitamine im Blut der Mutter. Neben den persönlichen Problemen für die

Betroffenen als auch für deren Angehörige sind die Kosten für das Gesundheitssystem zu

berücksichtigen. Somit verursachen z.B. die nach Koletzko und Kries (1995) veranschlagten

Kosten für das deutsche Gesundheitssystem zur Behandlung von Neuralrohrdefekten jährlich

Belastungen in Höhe von ca. 130 Mio. DM. Schon aus dieser Sicht hat die Gesellschaft ein großes

Interesse an der Prävention dieser Fehlbildungen. Ein Vitamin B6-Magel kann während der

Schwangerschaft u.a. zu Entwicklungsstörungen des Gehirns mit retardierter physischer

Entwicklung führen (Gerster, 1996). Durch einen Mangel an Folsäure oder Vitamin B6 steigt der

Homocysteinspiegel im Blutplasma deutlich an. Aus den medizinischen Fachbereichen der

Kardiologie, Neurologie und Gynäkologie ist bekannt, dass ein erhöhter Homocysteinspiegel zu

strukturellen Veränderungen an Gefäßendothelien und damit zu Herzinfarkten, Apoplex, Aborten

und Fehlbildungen führen kann (Blacher et al., 1996; Ambrosi et al., 1996; Montalescot et al.,

1997; Eskes, 1997, 2001; Goddijn-Wessel et al., 1996).

Nach bisherigen internationalen Untersuchungen aus Ungarn, den USA, Norwegen u.a. Ländern

konnte z.B. bei perikonzeptioneller Folsäuresubstitution eine Senkung von Fehlbildungen

insbesondere bei den ND erreicht werden (Czeizel et al., 1994, 1998, 2004). Zur Reduktion von

LKGS bei Folsäuresubstitution finden sich in der Literatur erstaunlicherweise widersprüchliche

5

Ergebnisse, obwohl ein Vitaminmangel allgemein als Risikofaktor angesehen wird (Wilcox, 2007;

Hartridge et al., 1999; Hayes 1996; Czeizel et al., 2004; Czeizel, 2004 ).

Es wird vermutet, dass insbesondere aufgrund der Erfahrungen aus der Kardiologie und

Neurologie der durch Vitamin B-Mangel und dem mit ihm assoziierte erhöhte Homocysteinspiegel

sich auf die Struktur und die Transportmechanismen der Plazenta und damit auf die

Lebensfähigkeit der Feten auswirkt oder Aborte bzw. Entwicklung von Fehlbildungen auslöst.

Daher gilt es in der vorliegenden Arbeit an dem Tiermodell Ratte mit einer Plazenta hämochorialis

zu prüfen, ob und inwieweit ein mit dem Beginn der Trächtigkeit induzierter Folsäure- bzw.

Vitamin B6-Mangel mittels Vitaminrestriktion Einfluß auf die Strukturen und Reifung der

Plazenta haben. Neben den morphologischen Strukturen der Plazenta sollen auch Blutwerte der

Mütter und Amnionflüssigkeitswerte der Feten bezüglich des diaplazentaren

Aminosäuretransportes als auch des Methylierungszyklus untersucht werden. Somit sollen

morphologische Strukturen bzw. Veränderungen durch physiologische Parameter untermauert

werden und einen Beitrag leisten, die Entwicklung, Reifung und Struktur der Plazenta besser zu

verstehen. Nicht zuletzt werden hiermit allgemeine Aussagen zur Rolle der genannten B-Vitamine

bezüglich der Prävention und Induktion von Fehlbildungen erwartet.

6

2. Literaturübersicht

2.1 Folsäure

Folsäure besteht aus einem Pteridinkern, p-Aminobenzoesäure und L-Glutamat. Natürlich

vorkommendes Folat unterscheidet sich in der Anzahl der Glutamylreste, die mit dem Pteridin-p-

aminobenzoesäurekomplex verbunden sind (Löffler und Petrides, 1998). Ihr chemischer Name ist

Pteroylglutamat (Butterworth und Bendich, 1996). Sie gehört zur Gruppe der wasserlöslichen

Vitamine (Trivialname Vitamin B11). Die künstlich hergestellte Folsäure ist im Gegensatz zum

natürlich vorkommenden Folat wesentlich hitzebeständiger und erreicht eine höhere biologische

Verfügbarkeit.

Abb. 2.1.1: Folsäure, künstlich hergestellt als Beispiel für ein Monoglutamat. chemischer Name:Pteroyl-L-monoglutaminsäure

Abb. 2.1.2: Folat als Hexaglutamat, Beispiel für natürlich Vorkommendes Polyglutamat. chemischer Name:L-Glutaminsäure, N-(N-(N-(N-(N-(N-(4-(((2-amino-1,4-dihydro-4-oxo-6-pteridinyl)methyl)amino)benzoyl)-L-gamma-glutamyl)-L-gamma-glutamyl)-L-gamma-glutamyl)-L-gamma-glutamyl)-L-gamma-glutamyl)

Folat ist reichlich in Leber, Hefe, Eiern, Bohnen, Apfelsinen und grünem Blattgemüse enthalten.

Häufig enthalten folatreiche Lebensmitteln auch Vitamin C, welches als Antioxidans wirkt und

einen schnellen Folatabbau verhindert (Butterworth und Bendich, 1996).

Folsäure wird vor ihrer aktiven Resorption durch die Mukosazellen des

Duodenums oder des oberen Jejunums hydrolysiert. In den Mukosazellen erfolgt anschließend die

7

Reduktion zu 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure und eine Methylierung zu 5-Methyltetrahydrofolsäure,

welche in die Blutbahn überführt wird (Buddecke, 1994). Nach Bässler (1997) finden sich im

Portalvenenblut reichlich noch nicht methylierte Tetrahydrofolate, so das die Methylierung dieser

erst in der Leber erfolgt. Zudem wird die Leber auch als Hauptspeicherorgan angesehen. Der

Transport im Serum erfolgt überwiegend durch Bindung an Albumin, α-Makroglobuline und

Transferrin. Waxman und Schreiber (1973) konnten ein Folsäure bindendes Protein (FABP)

nachweisen, dem sie eine wichtige Funktion bei der Folatspeicherung und Aufnahme in die Zellen

zuschrieben.

Die hohe biologische Verfügbarkeit von Folsäure im Gegensatz zu Folat ist durch die

Glutamatreste bedingt. Während Folsäure als ein Monoglutamat fast vollständig (>90%) resorbiert

wird, liegt die Verfügbarkeit von Folat als ein Polyglutamat (5-7 Glutamareste) bei lediglich 50

Prozent (DGE, ÖGE, SGE, SVE, 2000).

Nach Butterworth et al. (1969) ist zu beachten, dass etwa die Hälfe einer oral zugeführten Menge

Folsäure von 4,41mg innerhalb von 24 Stunden renal ausgeschieden wird. Im direkten Vergleich

zeigte sich, dass Mono- und Triglutamate zu 50-60% im Urin ausgeschieden wurden,

Heptaglutamate jedoch lediglich zu 8,7% oder weniger.

Aus diesem Grund wurde von der D.A.CH. Liga Homocystein der Begriff des Folatäquivalents

eingeführt (Stanger et al., 2003). 1mg Folatäquivalent entsprechen 1mg Nahrungsfolat und 0,5mg

Folsäure. Der Bedarf eines Erwachsenen liegt bei 400µg/d Folatäquivalent (DGE, ÖGE, SGE,

SVE, 2000).

Nach Beitz et al. (2002) erreichen 90% aller in Deutschland lebenden Männer, und fast 100% aller

Frauen durch ihre tägliche Kost, ohne Supplimentierung durch Vitamin-Präparate nicht die

empfohlene Tagesdosis Folsäure von 400µg/d.

Zur Diagnose einer Folsäurehypovitaminose, ist die Bestimmung der Folsäurekonzentration

sowohl im Blutplasma als auch im Vollblut notwenig. Dabei ist die Folsäurekonzentration des

Plasmas aussagekräftig hinsichtlich der kurzfristigen Folsäureaufnahme. Ein langfristigeres

Vitamindefizit schlägt sich schließlich auch in einer niedrigeren Konzentration im

Erythrozytenkonzentrat nieder. Hier sinken die Folsäurewerte erst 16-18 Wochen nach Beginn

einer folsäurearmen Kost. Nach Krumdieck et al. (1978) besitzt die Folsäure beim Menschen eine

Halbwertszeit von etwa 100 Tagen. Er beobachtete jedoch auch eine zweite Halbwertszeit von

etwa 31,5 Stunden für neu aufgenommene Folsäure. Es wird vermutet, dass ein nicht

unbeträchtlicher Teil der Folsäure während der Erythropoese in den Zellen gebunden wird und die

8

http://www.google.de/search?hl=de&sa=X&oi=spell&resnum=0&ct=result&cd=1&q=Erythropoese&spell=1

Folsäurekonzentration in den Erythrozyten während ihrer Lebensdauer von etwa 120 Tagen

konstant bleibt (Butterworth und Bendich, 1996).

Hierdurch erklärt sich die lange Halbwertszeit in den Erythrozyten, im Gegensatz zu der kurzen

Halbwertszeit im Plasma.

Die Resorption von Folsäure im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wesentliche Rolle bei

der Folsäurehomöostase (Sikka und McMartin, 1998). Durch die Resorption werden nur wenige

Mikrogramm folatwirksamer Verbindungen renal ausgeschieden (Stahl und Heseker, 2007). Nach

Krumdieck et al. (1978) spielt eine enterale Ausscheidung von Folsäure bzw. ihren Derivaten in

den Faeces eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Folsäure. Da Folsäure jedoch auch

von Mikroorganismen in der Darmflora gebildet wird, ist in der Praxis schwer zwischen enteral

ausgeschiedener und in der Darmflora gebildeter Folsäure zu unterscheiden (Institute of Medicine,

1998). Die im Stuhl ausgeschiedene Menge an Folat beträgt insgesamt etwa 200 µg /d (Stahl und

Heseker, 2007). Bekannt ist, dass täglich etwa 10 bis 90µg Folsäure im enterohepatischen

Kreislauf rückresorbiert und bei normaler Folataufnahme etwa 1-12 mg in Form verschiedener

folatwirksamer Verbindungen renal ausgeschieden werden (Koletzko und Pietrzik, 2004).

Der intrazelluläre Wirkmechanismus der Tetrahydrofolsäure besteht in der Übertragung von C1-

Resten, wie z.B. Methyl-, Formyl-, Formiat- und Hydroxymethylresten, wobei die C1-Reste durch

entsprechende Dehydrogenase- bzw. Isomerasereaktionen ineinander überführt werden können.

C1-Donatoren stellen vor allem die Aminosäuren Serin, S-Adenosylmethionin, Thymin sowie der

Alkohol Cholin dar, wobei die Tetrahydrofolsäure zu N5,10-Methylentetrahydrofolsäure

methyliert wird. Die C1 Reste liefern dann z.B. den Kohlenstoff für die Positionen 2 und 8 der

Purinringe, stellen die Methylgruppen von Thymin und Hydroxymethylcytosin dar, bilden den ß-

Kohlenstoff des Serins bei der Umwandlung von Glycin in Serin und stellen die Methylgruppe bei

der Methylierung von Homocystein zu Methionin (Löffler und Petrides, 1998).

Aufgrund der essentiellen Rolle von Folsäure bei der Synthese von Purinen, als auch ihre

Funktion bei der Methylierung von Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) zu

Desoxythyminmonophosphat (dTMP) im Rahmen der Thyminsynthese, kommt ihr eine große

Bedeutung bei der DNS-Replikation und somit bei der Zellteilung zu. Das bedeutet, dass sich ein

Folsäuremangel zunächst in Geweben mit hoher Zellteilungsrate manifestiert. Neben den

Entwicklungsstörungen von Feten, ist daher die megaloblastische Anämie eine typische

Erkrankung bei anhaltendem Folsäuremangel.

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Durch die Remethylierung des Homocysteins zu Methionin wird der Homocysteinspiegel gesenkt.

In diesem Zusammenhang spielt auch das Vitamin B12 eine essentielle Rolle, da es in Form des

Methylcobalamin als Cofaktor zur Remethylierung benötigt wird (Löffler und Petrides, 1998).

Nach Clarke et al. (1998) führte eine tägliche Zufuhr von mindestens 0,5 mg Folsäure zu einer

Reduktion des Homocysteinspiegels um durchschnittlich 25%.

Durch zusätzliche Gabe von 0,5 mg Vitamin B12 konnte das Homocystein um durchschnittlich

weitere 7% gesenkt werden. Somit kann der Homocysteinspiegel im Blut u.a. als Indikator für die

Folsäureversorgung herangezogen werden.

Die Hyperhomocysteinämie wurde in den letzten Jahren für eine Reihe von Erkrankungen und

embryonalen Entwicklungsstörungen verantwortlich gemacht.

Nach Boushey et al. (1995) führt eine Erhöhung des Homocysteinspiegels um 5mmol/l bei

Männern zu einer Risikosteigerung für kardiovaskuläre Erkrankungen um 60%, bei Frauen um

80%. Die American Heart Association empfiehlt die Behandlung der Hyperhomocysteinämie ab

mehr als 10 µmol/l mit Folsäure und Vitamin B6 (Deris, 2001).

Die HOPE-2 Studie (Lonn et al., 2006) zeigte, dass die Behandlung mit Folsäure, Vitamin B6 und

B12 über durchschnittlich 5 Jahre bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ II oder vaskulären

Erkrankungen, den Homocysteinspiegel um 2,4 µmol/l senken konnte, während er in der

Kontrollgruppe um 0,8 µmol/l stieg. Eine Reduktion tödlicher Herzinfarkte oder Schlaganfälle

durch die Behandlung war jedoch nicht vorhanden.

Zu ähnlichen Ergebnissen kam die NORVIT Studie, (Bønaa et al., 2006) in der der

Homocysteinspiegel bei Myokardinfarktpatienten mittels Vitamin B12- und Folsäureapplikation

um 27% gesenkt werden konnte (0,8 mg Folsäure /d, 0,4 mg Vitamin B12 /d), ein Einfluss auf die

Häufigkeit erneuter kardiovaskulärer Ereignisse konnte jedoch auch hier nicht nachgewiesen

werden.

Auch bei Patienten die lediglich mit Vitamin B6 (40 mg/d) behandelt wurden, konnte kein

signifikanter Zusammenhang zwischen der Behandlung und einer Reduktion erneuter

kardiovaskulärer Ereignisse festgestellt werden. Bei Myokardinfarkt-Patienten, welche mit

Vitamin B6, B12 und Folsäure behandelt wurden (0,8 mg Folsäure /d, 0,4 mg Vitamin B12 /d, 40

mg Vitamin B6 /d), wurde sogar eine Tendenz zu einem erhöhten Risiko einen Reinfarkt zu

erleiden festgestellt.

Die Homocysteinurie Typ I ist durch eine Mutation des Gens für die Cystathion β-Synthase (CBS)

(GA919, TC833) gekennzeichnet (Dilley et al., 2001). Es handelt nach Malinow et al. (1999)

um eine autosomal rezessive Erbkrankheit mit einer Inzidenz von etwa 1: 200.000.

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Das Krankheitsbild der Homocysteinurie Typ II ist durch eine leichte Hyperhomocysteinämie

gekennzeichnet, der eine Mutation des Enzyms Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR)

(CT677) zugrunde liegt.

Während bei der Homocysteinurie Typ I ein Zusammenhang zwischen Hyperhomocysteinämie,

Myokardinfarkten, Schlaganfällen und Lungenembolien schon im frühen Alter gesehen werden

kann (Malinow et al., 1999), ist dies bei der Homocysteinurie Typ II nicht der Fall (Dilley et al.,

2001).

Ein kompetitiver Hemmstoff der Dihydrofolatreduktase ist u.a. der Folsäureantagonist

Methotrexat (Lantarel®). Nach Transport in die Zelle durch Folsäure-Transporter wird Methotrexat

durch die Polylglutamase zu Polyglutamaten glutaminoyliert. Der Wirkmechanismus besteht in

einer höheren Affinität zur Dihydrofolatreduktase als Folsäure sie besitzen. Hierdurch wird die

Übertragung von C1-Resten u.a. auf Nukleinsäurebausteine sowie die Purinsynthese gehemmt.

Methotrexat wird als Zytostatikum eingesetzt und wirkt teratogen (Mutschler et al., 2006). Quinn

et al. (2004) konnten im Liquor cerebrospinalis bei intrathekal appliziertem Methotrexat einen

verringerten Folsäure- und S-Adenosylmethioninspiegel, begleitet von gestiegenen Homocystein-

und Adenosinwerten feststellen. Vezmar et al. (2003) vermuten in diesem Zusammenhang, dass

eine Erhöhung von Homocystein, S-Adenosylmethionin bzw. S-Adenosylhomocystein in der

Entwicklung subakuter und chronischer Neurotoxizität eine entscheidende Rolle spielen.

Der Folsäurehypovitaminose bzw. dem daraus resultierenden erhöhten Homocysteinspiegel von

Schwangeren werden Entwicklungsstörungen in der Embryogenese wie Neuralrohrdefekte,

Lippen-Kiefer-Gaumen-Segelspalten, Herz-, Extremitäten- und Harnwegsfehlbildungen sowie

Pylorusstenosen und Plazentaablösungen zugeschrieben (Koletzko und Pietrzik, 2004; Hall und

Solehdin, 1998).

Smithells et al. (1976) und Hall (1972) kamen zu dem Ergebnis, dass es keinen Zusammenhang

zwischen der Häufigkeit von Neuralrohrdefekten und dem Serumfolatspiegel gibt. Jedoch konnten

Smithells et al. (1976) einen Zusammenhang zwischen Neuralrohrdefekten, einem erniedrigen

Vitamin C Spiegel im Serum bei gleichzeitig verringerter Folsäurekonzentration in den

Erythrozyten feststellen.

Weiterhin wiesen Essien und Wannberg (1993) an Axd mutierten Mäusen nach, dass nicht eine

Folsäure- oder Vitamin B12-Hypovitaminose, sondern ein erhöhter Homocysteinspiegel für die

Entwicklung von Neuralrohrdefekten verantwortlich ist. Zhao et al. (2001) wiesen den

Zusammenhang zwischen Homocystein und Fehlbildungen an Ratten nach. Li et al. (1998)

konnten denselben Zusammenhang an Hühnerembryonen nachweisen.

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Wannberg+SL%22%5BAuthor%5D

Aubard et al. (2000) vermuten die Hyperhomocysteinämie als Ursache für maternale Thrombosen,

Präeklampsie bzw. Eklampsie und Plazentaablösungen, während Eskes (2000; 2001) neben

Plazentaablösungen darin auch die Ursache für Aborte und Neuralrohrdefekte sieht.

Unabhängig davon, ob der Folsäuremangel oder die Hyperhomocysteinämie für die Bildung von

Neuralrohrdefekten verantwortlich ist, konnte bei schwangeren Patientinnen, welche bereits ein

Kind mit Neuralrohrdefekt gebaren bei einer täglichen perikonzeptionellen

Folsäuresupplimentierung von 4 mg eine Reduktion dieser Fehlbildungen um 72% erreicht

werden (MRC Vitamin Study Research Group, 1991).

Aus diesem Grund wird Schwangeren eine perikonzeptionelle Substitution von Folsäure, Vitamin

B6 und B12 empfohlen. Hierbei erstreckt sich der perikonzeptionelle Zeitraum vornehmlich über

den Zeitraum von 2-3 Monaten vor der Konzeption bis mindestens dem Ende des ersten

Trimenon. Die DGE (2000) und Suter (2002) geben den täglichen Bedarf von Schwangeren mit

600 µg Folsäure, 1,9 mg Vitamin B6 und 3,5 µg Vitamin B12 an. Der Umkehrschluss hieraus, also

ein Vitaminprofil der schwangeren Frau zur Beurteilung des Risikos Kinder mit Neuralrohrdefekt

zu gebären ist jedoch nicht zulässig (Eskes, 1998).

Nach da Costa und Rothenberg (1996) besitzt die Rattenplazenta nahezu keine ungesättigten

Folsäurerezeptoren. Das folsäurebindende Protein in der Rattenplazenta besitzt seine höchste

Affinität für Folsäure, gefolgt von N5-Methyltetrahydrofolsäure und mit großem Abstand zu N5-

Formyltetrahydrofolsäure. Nach Henderson et al. (1995) findet der Folsäuretransport in der

menschlichen Plazenta bidirektional statt und ist nicht sättigbar. Die high-affinity membrane-

associated placental folate receptors (PFRs) besitzen eine hohe Affinität für 5-

Methylentetrahydrofolat. Der Transport kann in zwei Schritte eingeteilt werden, zum einen der

aktive Transport aus dem maternalen Blut in die Trophoblastenzelle, gegen einen

Konzentrationsgradienten der schnell geschieht und anschließend einen passiven langsameren

Transport aus der Zelle, dem Konzentrationsgradienten folgend in das fetale Blut. Das intervillöse

Blut der menschlichen Plazenta hat eine etwa dreifach höhere Konzentration an Folaten als das

maternale Blut.

Nach Baker et al. (1981) ist der Transfer von Vitamin B6, B12 und Folat zum Fetus und in die

Plazenta bei Schwangeren Frauen mit entsprechenden Hypovitaminosen verringert.

Piedrahita et al. (1999) wiesen nach, dass das Transportprotein Folbp1 der Maus eine

entscheidende Rolle in der Folathomöostase während der Entwicklung des Fetus spielt. Die Feten

entsprechender knockout-Mäuse entwickelten schwerwiegende Fehlbildungen und starben in

12

utero. Das Protein entspricht dem menschlichen FOLR1, bei dessen Defekt Fehlbildungen

vermutet werden.

Die fetale und plazentare Folsäureaufnahme ist nach Will et al. (1985) bei erhöhter maternaler

Aufnahme von Hydantoin deutlich reduziert. Es wird daher vermutet, dass die Fehlbildungen beim

„fetalen Hydantoin Syndrom“ auf einen fetalen Folsäuremangel zurückzuführen sind.

Nach Fisher et al. (1985) ist die Aktivität von plazentaren Folsäurerezeptoren bei chronischer

Ethanolexposition bei Ratten signifikant verringert. Die Plazenten sind größer, die Feten kleiner

als in der Kontrollgruppe.

2.2 Vitamin B6

Unter Vitamin B6 oder Pyridoxin werden die Wirkstoffe Pyridoxol (Alkohol), Pyridoxamin

(Amin) und Pyridoxal (Aldehyd) zusammengefasst, wobei alle Substanzen im Stoffwechsel

ineinander überführt werden können (Bässler, 1997). Die aktive Form des Vitamins ist das

Pyridoxal-5-phosphat, das durch eine ATP abhängige Phosphorylierung unter Mitwirkung der

Pyridoxalkinase gebildet wird (Löffler und Petrides, 1998).

Abb. 2.2.1: Strukturformal von Pyridoxin (I; R= -CH2OH), Pyridoxal (I; R=-CHO), Pyridoxamin (I; R=-CH2NH2), 4-Pyridoxinsäure (III), 4-Pyridoxolacton (IV), Pyridoxin 5-Phosphat (II; R= -CH2OH), Pyridoxal 5-Phosphat (II; R=-CHO) und Pyridoxamin 5-Phosphat (II; E=-CH2NH2). Nach Kälin Aebi, 2006.

13

Das Vitamin B6 gehört zur Gruppe der wasserlöslichen Vitamine und kommt sowohl in Fleisch,

vor allem in Leber, als auch in pflanzlicher Nahrung, wie z.B. Kartoffeln, Getreide,

Hülsenfrüchten und Gemüse reichlich vor. Auch Milchprodukte und einige Fischarten enthalten

Vitamin B6. Nach Reynolds (1988) ist die Bioverfügbarkeit von Vitamin B6 in Fleischprodukten

sehr hoch und kann 100% erreichen, während die Bioverfügbarkeit aus Pflanzenprodukten

aufgrund der hier häufig zu findenden Pyridoxin-Glykoside und der teilweise schwer spaltbaren

Polysaccharide der Zellwand zum Teil lediglich zwischen 20 und 25% liegt.

Die Resorption erfolgt vor allem im oberen Jejunum und in geringerem Umfang auch im Ileum.

Die o.g. Phosphorylierung von Pyridoxin zu Pyridoxal-5-phosphat findet vor allem in den

resorbierenden Mukosazellen statt. Im Plasma wird es überwiegend an Albumin gebunden

transportiert. Da es die Zellmembranen jedoch nicht passieren kann, muß es vor der Zellaufnahme

durch die hydrolisierende Eigenschaft der alkalische Phosphatase permeabel gemacht werden.

Die Erythrozytenkonzentration von Vitamin B6 ist 4-5 mal höher, als die im Plasma.

Die biologische Halbwertszeit von Vitamin B6 beträgt 10 Tage (Bässler, 1997).

Pyridoxin ist ein wichtiges Coenzym im Aminosäurestoffwechsel und katalysiert

Transaminierungen, Dexarboxylierungen, Eleminierungen und Aldolspaltungen (Löffler und

Petrides, 1998).

Des Weiteren spielt es eine wichtige Rolle im Rahmen der Glukoneogenese, der Niacin-

biosynthese aus Tryptophan, dem Fettstoffwechsel (vor allem im Sphingolipidstoffwechsel), der

Neurotransmittersynthese von Serotonin, Dopamin, Noradrenalin und γ-Aminobuttersäure, sowie

der Taurin-, Myelin- und Hämsynthese.

Weiterhin wird Vitamin B6 im Immunsystem und bei der Modulation von Hormoneffekten

benötigt. Vitamin B6 kann an Steroidhormonrezeptoren gebunden werden und somit die

Genexpressionen beeinflussen. Es ist Kofaktor von insgesamt über 100 Enzymen (Suter, 2002).

Der tägliche Bedarf des Menschen beträgt 1,5 bis 2 mg pro 100g aufgenommenem Protein

(Löffler und Petrides, 1998). Nach Suter (2002) wird Männern im Alter von 19 bis 65 Jahren eine

Zufuhr von 1,5 mg/d, Frauen von 1,2 mg/d und Schwangeren ab dem 4. Schwangerschafts Monat

sowie Stillenden 1,9mg/d Vitamin B6 empfohlen.

Nach Succari et al. (1987) besteht ein direkter Zusammenhang zwischen den Aktivitäten der

Alanin-Aminotransferase (ALAT), der Aspartat-Aminotransferase (ASAT) im Serum und einer

Pyridoxal-5-phosphat Substitution. Dies lässt sich dadurch begründen, dass die Apoenzyme

ALAT und ASAT mit ihrem Coenzym Vitamin B6 noch nicht gesättigt sind.

14

http://de.wikipedia.org/wiki/Gamma-Aminobutters%C3%A4ure

Die ALAT spielt eine wichtige Rolle im Stickstoffstoffwechsel, da sie Aminogruppen und

Ammoniak im Alanin fixiert und diese in die Leber transportiert werden, wo der Stickstoff z.B. als

Harnstoff gebunden und anschließend renal ausgeschieden wird.

Die ASAT wird zur Bereitstellung von Aminogruppen z.B. bei Synthesen von Purinen,

Pyrimidinen und Aminozuckern benötigt.

Auch spielt Vitamin B6 bei der Hyperhomocysteinämie und ihren unter 2.1 genannten Folgen eine

Rolle, da es als Coenzym beim Abbau von Homocystein zu Cystein beteiligt ist. Die SH- Gruppe

des Homocysteins wird hierbei auf Serin übertragen. Das entstehende Homoserin kann weiter zu

Proprionyl-CoA abgebaut werden. Dieses dient u.a. als Energielieferant im Zitratzyklus (Löffler

und Petrides, 1998).

Nach Gerster (1996) spielt Pyridoxin eine entscheidende Rolle bei der Biosynthese der

Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure und Dopamin. Bei neugeborenen Ratten, deren Mütter eine

schwere Vitamin B6-Hypovitaminose aufwiesen, wurden erniedrigte Konzentrationen dieser

Neurotransmitter, weniger verzweigte Dendriten und eine verringerte Zahl myelinisierter Axone

und Synapsen nachgewiesen. Die Tiere zeigten ein auffälliges Verhalten, wie z.B. epilepsieartige

Krampfanfälle, in der Regel überlebten die Jungen nicht. Hier kommt der bei Ratten bekannte

selektive Kannibalismus zum Tragen, d.h. das Muttertier frisst fehlgebildete Neugeborene auf, um

den Genpool „sauber“ zu halten.

Beim Menschen konnte ein geringeres Geburtsgewicht, sowie ein retradiertes reaktives und

unreifes adaptives Verhalten beobachtet werden.

Alton-Mackey und Walker (1973) konnten bei Ratten mit einer Vitamin B6-Hypovitaminose

während der Trächtigkeit ebenfalls ein geringeres Geburtsgewicht, eine langsamere physische

Entwicklung sowie Beeinträchtigungen der neuromotorischen Entwicklung der Jungen feststellen.

Guilarte (1993) zufolge, kommt es bei einem Vitamin B6-Defizit während der Schwangerschaft

bzw. der Stillzeit außerdem zu Veränderungen in der Funktion von N-methyl-D-Aspartat-

rezeptoren, einem Subtyp von glutamatergen Neurotransmitterrezeptoren, welche eine wichtige

Rolle beim Lernen und Erinnern spielen.

Marathe und Thomas (1987) konnten zeigen, dass es bei der Behandlung von trächtigen Ratten

mit Pyridoxinhydrochlorid zu mehr Implantationen, Corpora lutea und lebend geborenen Jungen

kam. Bei hohen Dosen wurde jedoch ein geringeres Geburtsgewicht der Jungen beobachtet.

Vergleiche zwischen den Vitamingehalten von Uterus, Plazenta und fetalem Gewebe nach

intraperitonealer Injektion von Vitamin B6 bei trächtigen Tieren zeigten zunächst einen

Konzentrationsanstieg im Uterus, anschließend einen Vitamin B6-Abfall, begleitet von einem

15

http://de.wikipedia.org/wiki/Gamma-Aminobutters%C3%A4ure

Anstieg in der Plazenta, sowie ein Anstieg der Konzentration im Feten. Interessant ist, dass das

Vitamin B6 drei und zehn Minuten nach Injektion im Uterus und der Plazenta, vorwiegend als

Pyridoxol und Pyridoxol-5-phosphat nachgewiesen wurde, 30 Minuten nach Injektion jedoch in

Form von Pyridoxal-5-phosphat. Es kann also davon ausgegangen werden, dass dies die Form ist,

welche zum Fetus transportiert wird. (unbekannter Autor, 1972).

Nach Contractor und Shane (1971) wird Pyridoxalphosphat sowohl beim Menschen als auch beim

Nagetier (Ratte) aktiv zum Feten transportiert. Schenker et al. (1992) vermuten jedoch, dass es

sich um einen passiven Transport handelt.

Lyon et al. (1962) konnten bei Mäusen mit induzierter Vitamin B6-Hypovitaminose einen

verminderten Pyridoxal-5-phosphatspiegel im Hirngewebe nachweisen, die Konzentration von

Pyridoxamin-5-phosphat war unverändert. In Mäusen kommen überwiegend die Formen

Pyridoxal-5-phosphat sowie Pyridoxamin-5-phosphat vor.

Untersuchungen von Cleary et al. (1975) zufolge, sollten Schwangere mit mindestens 2 mg

Vitamin B6 pro Tag supplimentiert werden, um einen natürlichen Pyridoxinspiegel aufrecht zu

erhalten. Ob dies auch für den Fetus gilt, kann lediglich vermutet werden. Baker et al. (1981)

konnten zeigen, dass es bei Vitamin B6-, B12- und Folsäurehypovitaminosen zu einem

verringerten Transfer dieser Vitamine zum Feten kommt. Bei oraler Gabe dieser Vitamine konnte

ein fetaler Konzentrationsanstieg lediglich für Folsäure, jedoch nicht für Vitamin B6

nachgewiesen werden. Es wird vermutet, dass es zunächst zu einer Sättigung plazentarer

Rezeptoren kommen muss, bevor das Vitamin zum Fetus gelangt.

Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Kirchgessner et al. (1985), sie ermittelten bei trächtigen Ratten,

welche ein Futter mit einem Vitamin B6-Gehalt von nur 1mg/kg erhielten, eine signifikant

verringerte Vitamin B6-Konzentration im Fetus, der Plazenta und der Amnionflüssigkeit. Bei

einem Futter mit 6mg Vitamin B6/kg, konnte jedoch eine ausreichende Vitaminversorgung des

Fetus, sowie eine Gewebesättigung der Reproduktions Organe nachgewiesen werden.

Wang und Trumbo (1992) konnten zeigen, dass ein verringerter Plasmaspiegel von

Pyridoxalphosphat während der Trächtigkeit von Ratten weder mit einer verringerten enternalen

Resorption noch mit einem erhöhten fetalem Bedarf zusammenhängt. Mittels von H3 Pyridoxin

konnte nachgewiesen werden, dass sich weniger als drei Prozent des oral aufgenommenen Vitamin

B6 im fetalen Gewebe oder im Uterusgewebe befinden. Es konnte jedoch eine Umverteilung von

Pyridoxalphosphat aus dem Plasma in die Erytrozyten ermittelt werden. So wurde ein Abfall der

Vitamin B6-Plasmakonzentration um 50%, bei einem gleichzeitigen Anstieg der Aktivität der

erythrozytären Aspartat-Aminotransferase (EAST) um 50% festgestellt, ohne dass eine exogene

Stimulation durch Pyrodoxalphosphat stattgefunden hatte.

16

Roth-Maier et al. (1996) zeigten, dass es bei Ratten mit einem hohen Versorgungsstatus von

Vitamin B6 während der Gravidität, am 14. Tag der Laktation zu Aktivitätszunahmen der ASAT

um 56% im Plasma, um 44% in den Erythrozyten und um 43% in der Leber kommt. Die

Aktivitätszunahmen beschreiben die Differenz der Enzymaktivität zwischen den Tieren mit der

geringsten Vitamin B6-Zulage (0,6mg/kg Futter) und der höchsten Zulage (180mg/kg Futter). Das

Futter wurde ad libitum angeboten. Eine Erhöhung der Vitamin B6-Zufuhr erst zu Beginn der

Laktation nach Mangelernährung während der Gravidität führte zu einer überdurchschnittlichen

Erhöhung der Enzymaktivität, da der Organismus bestrebt ist, das während der Gravidität

entstandene Defizit auszugleichen. Eine Unterversorgung während der Laktation konnte durch

bedarfsgerechte Versorgung während der Trächtigkeit ausgeglichen werden.

Bei der ALAT konnten keine Aktivitätsänderungen festgestellt werden, dieses Ergebnis kann

durch eine höhere Coenzymabsättigung erklärt werden.

Nach einem unbekanntem Autor (1972) werden bei trächtigen Ratten innerhalb von 24 Stunden

43% von injiziertem C14-markiertem Pyridoxol im Urin ausgeschieden. Hiervon waren allerdings

nur noch 16% in Form von Pyridoxol vorhanden, weitere 12% in Form von Pyridoxinsäure

Lactone und weitere 8% als Pyridoxinsäure. Übrige Formen wurden in geringer Menge renal

ausgeschieden. Im Blut wurde vorwiegend Pyridoxol und Pyridoxal nachgewiesen.

Nach Schenker et al. (1992) findet der plazentare Pyridoxaltransport in der menschlichen Plazenta

bidirektional statt. Die Transportrate von maternal nach fetal ist jedoch signifikant höher als

umgekehrt. Pyridoxine und Pyridoxal scheinen eine ähnliche Clearance zu besitzen, der Transport

von Pyridoxal 5-Phosphat ist jedoch deutlich geringer. Die Transporter sind nicht gesättigt und es

findet kein Transport gegen einen Konzentrationsgradienten statt. Die plazentare Konzentration

von Pyridoxal ist sowohl höher als die des fetalen, als auch des maternalen Blutes. Diese

Ergebnisse deuten auf einen passiven diaplazentaren Transport hin. Die erhöhte Konzentration von

Pyridoxal in der Plazenta deutet darauf hin, dass das Vitamin hier gebunden wird.

Im Gegensatz hierzu beschreiben Contractor und Shane (1971) einen aktiven diaplazentaren

Transport von Pyridoxal 5-Phosphat sowohl beim Menschen als auch bei der Ratte.

Nach Furth-Walker et al. (1989) sinkt der Plasma Pyridoxal 5-Phosphat Spiegel bei trächtigen

Mäusen um 50%, die Konzentration in den Erythrozyten steigt jedoch um den Faktor 2,9, so dass

im Vollblut ein Anstieg um den Faktor 1,6 zu beobachten ist.

Nach Leibman et al. (1990) besitzt die Plazenta trächtiger Mäuse eine hohe Aktivität alkalischer

Phosphatase. Es wird vermutet, dass die alkalische Phosphatase als Ektoenzym wirkt und eine

17

wichtige Rolle bei der Regulation des Pyridoxal-5-Phosphat-Plasmaspiegels spielt, da die

plasmatische alkalische Phosphatase ihre Aktivität während der Trächtigkeit um 50% verringert.

2.3 Aufbau und Entwicklung der Plazenta der Ratte

Zur Klärung der vorliegenden Fragestellung eignet sich die Ratte als Versuchstier aus mehreren

Gründen. Zwar gibt es nach Carter (2007) kein perfektes Tiermodell für die menschliche

Plazentation, die Ratte kommt diesem jedoch recht nahe.

Da sowohl Mensch als auch Ratte Omnivora (Allesfresser) sowie Monogaster (sie besitzen

lediglich einen einhöhligen Magen) sind, kann von einem ähnlichen Verdauungstrakt und

ähnlichen Enzymmustern ausgegangen werden.

Weitere Vorteile dieses Tiermodells sind eine hohe Reproduktionsrate, ein kurzes

Reproduktionsintervall sowie die geringe Größe der Tiere, wodurch die Haltung unkompliziert ist

(Carter, 2007).

Wie der Mensch, besitzt auch die Ratte eine Plazenta discoidalis, d.h. eine runde bis leicht ovale

makroskopische Gestalt, sowie eine Plazenta hämochorialis, so dass das mütterliche Blut direkt an

das Chorionepithel reicht, da sich maternales Gefäßepithel zurückgebildet hat (Franke, 1969). Der

Durchmesser der Rattenplazenta variiert zwischen 10 und 14 mm am 19. Tag der Trächtigkeit, bei

einer Dicke von 4-5 mm. Es bestehen jedoch beträchtliche Größenschwankungen – auch innerhalb

eines Muttertieres.

Im Gegensatz zur Ratte, die eine Plazenta hämotrichorialis ausbildet, entwickelt der Mensch eine

Plazenta hämomonochorialis. Das heißt, die Schranke zwischen maternalem und fetalem Blut

besteht bei der Ratte aus bis zu drei trophoblastischen Zellschichten, beim Menschen lediglich aus

einer. Ein weiterer Unterschied ist der bei der Ratte gut ausgebildete Spongiotrophoblast, der beim

Menschen fehlt.

Im Gegensatz zur menschlichen Zottenplazenta, entwickelt die Ratte eine Labyrinthplazenta

(Carter, 2007; Ramsey, 1982).

Dieser histomorphologische Unterschied, sowie das Vorhandensein des Spongiotrophoblasten

haben jedoch keine Auswirkungen auf den diaplazentaren Transport.

18

Der morphologische Aufbau der Rattenplazenta ist zwischen dem 18. und 20. Tag am deutlichsten

zu erkennen. Von maternal nach fetal sind folgende Schichten zu unterscheiden:

- Decidua basalis oder subchoriale Decidua mit einer

Zona Spongiosa und

Zona Compacta

- Riesenzellenscheide (giant cells)

- Trophospongium oder Spongiotrophoblast (junctional zone, Durchdringungszone)

- Labyrinth

Lediglich die Decidua basilaris ist maternalen Ursprungs. Die Unterteilung in Zona spongiosa und

Zona compacta beruht auf die unterschiedlich stark ausgebildete Interzellularsubstanz. Die

Feinstruktur der Zellorganellen in beiden Zonen stimmt überein, es bestehen lediglich quantitative

Unterschiede (Franke, 1969). Schiebler und Knoop (1959) beschreiben das Vorkommen von

Glykogenzellen in der Decidua basalis.

Nach Franke (1969) kann es bei Deciduazellen, die an die Riesenzellschicht grenzen, zu einer

Reihe feinstruktureller Veränderungen wie einer Faltung der Kernmembran, einer Vakuolisierung

des Zytoplasmas, Auftreten von Lipideinschlüssen und gequollenen Mitochondrien kommen.

Die in der Entwicklung noch geschlossene Riesenzellenscheide ist gegen Ende der Tragzeit (etwa

ab dem 18. Tag) lückenhaft, so dass kleinere Deziduazellen in die Riesenzellschicht eindringen

können und zum Teil bis zum Spongiotrophoblasten reichen. Aber auch bei jüngeren Plazenten

sind Riesenzellen zu finden, die in die Dezidua dringen. Mehrkernige Riesenzellen können durch

Verschmelzung mehrerer Deziduazellen entstehen. Dieses Gebiet, in dem fetales und maternales

Gewebe aneinander treffen ist in jüngeren Plazenten deutlicher getrennt. Erst später vermischen

sich fetale und maternale Zellen (Schiebler und Knoop, 1959).

Schiebler und Knoop (1959) berichten in der Trennlinie dieser Schichten in nicht durchmischten

Regionen von zum Teil mächtig ausgebildeter basalmembranartiger Interzellulärsubstanz.

Diese Beobachtung konnte von Franke (1969) jedoch nur partiell bestätigt werden.

Granulated cells sind natürliche Killerzellen, deren Funktion noch nicht abschließend geklärt ist

und die durch Desmosomen miteinander verbunden sind (Croy und Kiso, 1993; Franke, 1969).

Welsh und Enders (1993) vermuten, dass den granulierten Zellen eine entscheidende Rolle bei der

Induktion der Apoptose von Uterusepithelzellen zukommt und sie somit eine wichtige Funktion

bei der Implantation der Blastozyste haben.

19

Die Schicht des Trophospongiums besteht aus drei Zelltypen:

1. den Spongiotrophoblasten

2. den Glykogenzellen, deren Glykogengehalt ab dem 19. Tag rasch abnimmt und den

3. Riesenzellen (Franke, 1969; Jollie, 1964; Schiebler und Knoop (1959).

Nach Jollie (1964) entwickeln sich die trophoblastischen Riesenzellen wahrscheinlich durch

Wachstum und/oder Fusion aus Spongiotrophoblasten.

Schiebler und Knoop (1959) konnten zwei verschiedene Typen von Riesenzellen nachweisen, die

sich in Form und Größe der Kerne unterscheiden.

Jollie (1965) vermutet, dass die Spongiotrophoblasten das Hormon Luteotropin produzieren.

Hierfür spricht unter anderem das gut entwickelte Endoplasmatische Retikulum, sowie das

reichliche Vorkommen von Glykogen, wenn man beachtet, dass es sich bei Luteotropin um ein

Glykoprotein handelt. Auch die verminderte Produktion von Luteotropin gegen Ende der

Gravidität korrespondiert mit der Involution des Spongiotrophoblasten.

Laut Jollie (1964) sind in den Spongiotrophoblasten zwischen dem 8. und 18. Tag auffällig viele

Mitosen zu beobachten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich hieraus sowohl die

Glykogenzellen als auch das Labyrinth differenzieren.

Dean et al. (1962) schreiben den Riesenzellen des Trophospongiums endokrine Funktionen zu.

Die Zellen produzieren Steroidhormone, wobei der Höhepunkt der Produktion zwischen dem 13.

und dem 15. Tag der Trächtigkeit liegt, danach sinkt die Hormonproduktion.

Auch die Synthese des Luteotropins scheint außer in den Spongiotrophoblasten auch in den

Riesenzellen des Trophospongiums stattzufinden.

Nach Davies und Glasser (1968) besteht das Labyrinth der Rattenplazenta aus drei Schichten

(1. Wand des maternalen Sinus, 2. und 3. Synzytiotrophoblast), welche die Plazentaschranke

(Jollie, 1965) bilden. Andere Autoren, wie Metz et al. (1976), benennen fünf Schichten. Dies liegt

daran, dass hier der perivaskuläre Raum sowie das fetale Kapillarendothel als eigene Schicht

benannt werden.

20

Die Wand des maternalen Sinus, welche als erste Schicht bezeichnet wird, ist die dünnste aller drei

Schichten und wird vom basophilen Trophoblastenepithel gebildet, die über die gesamte

Gravidität mitotische Aktivität zeigt und sich zum Ende der Schwangerschaft teilweise oder

komplett in Riesenzellen umwandeln kann.

Die zweite und dickste Schicht weist kein basophiles Zytoplasma auf und enthält kleinere

Zellkerne (Thliveris, 1976; Davies und Glasser, 1968). Nach Takata et al. (1997) und Metz et al.

(1976) handelt es sich bei der zweiten und dritten Schicht um ein Synzytium, den sog.

Synzytiotrophoblasten. Die zweite und dritte Schicht sind durch Gap junctions verbunden. Es wird

vermutet, daß sie die Funktion eines „Siebes“ haben und den diaplazentaren Transport limitieren

(Metz et al. 1976).

Die dritte Schicht ist durch eine aus dem Trophoblasten stammende Basalmembran vom fetalen

Mesenchym getrennt. Auch hier ist das Zytoplasma nicht basophil und die Zellen weisen kleinere

Kerne als in der ersten Schicht auf (Davies und Glasser, 1968).

Nach Thliveris (1976) und Takata et al. (1997) folgt der dritten Schicht das durch eine

Basallamina von ihr getrennte fenestrierte fetale Gefäßendothel, dessen Zellen durch tight

junctions miteinander verbunden sind (Metz et al. 1976).

Im Gegensatz zu den Zellen der ersten und zweiten Schicht, die durch zahlreiche Desmosomen

lose miteinander verbunden sind, sind die Zellen aus Schicht zwei und drei innig miteinander

Abb. 2.3.1: elektronenmikroskopische Aufnahme des Trophoblasten im Labyrinth der Rattenplazenta (Plazentaschranke) an Tag 14 der Trächtigkeit, 14.000 x Vergrößerung. Nach Jollie, 1964. FCB: fetale Blut Kapillare, e: Endothelzelle der fetalen Kapillare, MBS: maternaler Blut Sinus, I,II,III: trophoblastische Zellschichten

21

verbunden und weisen keine Desmosomen auf. Da es sich bei dem Trophoblastenepithel der ersten

Schicht um ein fenestriertes Epithel handelt, haben die Zellen der angrenzenden zweiten Schicht

die Möglichkeit sich in die maternalen Sinus vorzustülpen (Davies und Glasser, 1968).

Nach Bridgman (1948 b) sind maternale Sinus und fetale Gefäße gegen Ende der Trächtigkeit

lediglich durch ein fetales Gefäßendothel getrennt. Dieser Ansicht schließt sich Jollie (1964)

jedoch nicht an. Nach ihm besteht die Plazentaschranke während der gesamten Trächtigkeit aus

vier zytoplasmatischen Schichten. Da jedoch gegen Ende der Tragzeit sowohl das fetale

Gefäßendothel fenestriert ist, als auch die erste Trophoblastenschicht besteht die Plazentaschranke

lediglich noch aus dem Trophoblasten II und der dritten Zellschicht.

Der Trophoblast II nach Jollie (1964) entspricht dem Synzytiotrophoblasten der Schicht Zwei nach

Takata et al. (1997) und Metz et al. (1976).

Beschriebene Erleichterungen des diaplazentaren Stofftransports gegen Ende der Gravidität

können durch diese Veränderungen der Plazentaschranke erklärt werden.

Die ersten Uterusdrüsenzellen (granulated metrial gland cells) sind noch vor ihrem Erscheinen im

mesometrialen Triangel im Ektoplazentakonus und in der Dezidua basilaris zu finden. Aus dem

Ektoplazentakonus kommt es zur Migration der Zellen in Richtung des mesometrialen Triangels,

indem sie eine perivaskuläre Lage einnehmen (Dixon und Bulmer, 1971). Nach Peel (1989) sind

die Zellen ab der dritten Woche p.c. in großer Zahl in den Uterusdrüsen anzutreffen. Die Zellen

werden aufgrund ihrer Glykoprotein und hydrolytische Enzyme enthaltenden Granula auch als

granulierte Uterusdrüsenzellen bezeichnet. Einige dieser Zellen sind reich an Glykogen.

Dallenbach-Hellweg et al. (1965) konnten in den granulierten Zellen der Uterusdrüsen das

Peptidhormon Relaxin nachweisen. Die Hauptfunktion des Relaxins besteht in der Aufhebung von

Fasern von zusammenhaltendem Gewebe, vor allem von Kollagen.

Nach Peel (1989) werden gegen Ende der Trächtigkeit einige Zellen in den maternalen Sinus des

Labyrinths nachgewiesen. Es wird vermutet, dass es zu Interaktion zwischen diesen Zellen und

den Trophoblastenzellen der ersten Schicht kommt, welche im Zusammenhang mit der

Degeneration der Trophoblastenzellen und der Uterusdrüsenzellen steht. Peel und Adam (1991)

vermuten, dass die granulierten Uterusdrüsenzellen zur Gruppe der Killerzellen gehören. Sie

konnten eine zytotoxische Aktivität der Zellen gegenüber co-kultivierten Trophoblastenzellen

nachweisen.

22

Noch vor Beginn der Implantation kommt es im Endometrium zur sog. Deziduareaktion.

Als Deziduareaktion wird ein durch Östrogen und Progesteron induzierter Prozess bezeichnet,

welcher die maternalen Stromazellen in helle glykogenreiche Zellen umwandelt.

Diese Reaktion kann ab dem vierten Tag der Trächtigkeit zunächst in der Umgebung maternaler

Gefäße beobachtet werden (de Rijk et al., 2002). Weiterhin konnten Mulholland et al. (1992)

zeigen, dass am Implantationspol des Uterus Kollagen des Typs VI weitgehend verschwunden ist,

und die Expression des Intermediätfilaments Desmin in denselben Zellen zugenommen hat. Bei

der Rückentwicklung der Deziduazellen, konnte eine Umkehr dieses Prozesses nachgewiesen

werden. Diese Ergebnisse lassen Mulholland et al. (1992) vermuten, dass es zu einer weiteren

funktionellen Differenzierung dieser Zellen als Antwort auf die Implantation der Blastozyste

kommt.

Nach Enders und Schlafke (1967) beginnt der Prozess der Implantation der Blastozyste am Abend

des fünften Tages nach Bedeckung, durch Anheftung der Blastozyste am Endometrium, nahe der

antimesometrialen Seite des Uterus, wobei der Embryoblast mesometrial orientiert ist.

In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass die Implantation zwar antimesometrial, die

Entwicklung der definitiven Plazenta jedoch mesometrial stattfindet. Für den „Wechsel“ der Seite

des Embryos kommt es zu einem vorübergehenden Schluss des Uteruslumen (Ramsey, 1982).

Ab dem sechsten Tag besteht das Stroma um die implantierte Blastozyste aus Deziduazellen mit

leicht basophilem Zytoplasma, großen, runden Nuklei mit verschieden vielen Nukleoli. Die Zellen

zeichnen sich durch PAS-positive Granula aus. Ab dem achten Tag findet eine Umwandlung der

Deziduazellen von große in kleine Zellen statt, ab dem 14. Tag der Trächtigkeit sind nur noch

kleine Deziduazellen anzutreffen.

Zwischen dem sechsten und dem zehnten Tag sind Mitosen der Deziduazellen zu beobachten,

wobei die höchste Aktivität am Tag acht zu finden ist (Enders und Schlafke, 1967).

Vor der myometrialen Deziduareaktion, die vom 10. bis zum 20. Tag andauert und auf der

plazentaren Seite des Uterus stattfindet, kommt es zwischen dem 10. und 12. Tag zu myometrialen

Ödemen, die jedoch wieder vollständig verschwinden (de Rijk et al., 2002).

Vor Bildung der definitiven, mesometerial liegenden chorioallantoischen Plazenta, die sich ab dem

10. Tag bildet, ist eine antimesometrial liegende Dottersackplazenta vorhanden. Am neunten Tag

jedoch kommt es zu autophagischen Vorgängen an der Dottersackplazenta welche anschließend

degeneriert (Kaloglu et al., 2003).

23

Nach Bridgman (1948a) sind ab dem sechsten Trächtigkeitstag große supranukleäre proteinhaltige

Granula im viszeralen Entoderm zu finden, welches die „innere“ Membran des Dottersacks

darstellt. Diese Granula sind am neunten Tag nicht mehr nachweisbar, eventuell haben sie sich in

die Dottersackhöhle herausgestoßen. Es formen sich jedoch neue kleinere Granula, die sich bis

zum 15. Tag erneut vergrößert haben. Außerdem ist reichlich Glykogen in den Dottersackzellen

anzutreffen.

Einen Tag später rupturiert die Reichertssche Membran und Fett welches im Uterusepithel nahe

der Fruchtblase nachweisbar war, verschwindet. Glykogen und proteinhaltige Granula sind jedoch

bis zum 20. Tag weiterhin anzutreffen.

Den Granula wies Litwer (1928) bei Mäusen sekretorische Funktionen zu, während Wislocki et al.

(1946) sie als Produkte von Absorption und Phagozytose deuteten. Hierfür spricht nach Wislocki

et al. (1946) der Nachweis von Eisen im Dottersack, welches aus phagozytierten maternalen

Erythrozyten stammen könnte.

Die Reichertsche Membran besteht aus Kollagen und wird nach Mutmaßungen von Wislocki et al.

(1946) durch Riesenzellen gebildet. Merker und Villegas (1970) konnten zeigen, dass die

Reichertsche Membran vom parietalen Dottersackentoderm gebildet wird, dessen Zellen ihr

aufliegen. Maternales Plasma kann direkt das viszerale Dottersackentoderm erreichen. Die

Membran stellt die einzige kontinuierliche Schicht zwischen maternalem Blut und Träger dar. Die

von Wislocki et al. (1946) angenommene phagozytotische Aktivität des viszeralen

Dottersackentoderm wird von Merker und Villegas (1970) bestätigt, die Granula als

Abb. 2.3.2: Blutfluss in der Dottersackplazenta nach Merker und Villegas, 1970. A Archamnionhöhle; DG Deziduagefäße; vD viszerales Dottersackentoderm; pD parietales Dottersackentoderm; EPK Ektoplazentakonus; PS periembryonaler Sinus

24

Phagolysosomen charakterisiert. Maternales Plasma kann somit aufgenommen, abgebaut und dem

Keimling zur Verfügung gestellt werden. Das maternale Blut erreicht das viszerale Entoderm über

einen periembryonalen Randsinus, der nach innen durch die Reichertsche Membran und die

Zellen des parietalen Blattes des Dottersackentoderms, nach außen durch Trophoblasten- und

Deziduazellen abgegrenzt wird. Der Randsinus endet als Blindsack, d.h. eingeströmtes Blut kann

den Sinus nicht mehr verlassen.

Die Reichertsche Membran hat somit die Funktion eines Ultrafilters, so dass maternale Blutzellen

nicht in den Dottersack gelangen können. Die chorioallantoische Plazenta zeichnet sich durch ihre

Entstehung aus der Chorionschicht und allantoischem Mesenchym aus.

Abb. 2.3.3: Entstehung der chorioallantoische Plazenta: AH Amnionhöhle; AM allantoisches Mesenchym; vDE viszerales Dottersackentoderm; pDE parietales Dottersackentoderm; EC Exocoelom; EH Ektoplazentahöhle; EK Ektoplazentakonus; L Lakune; MS maternale Sinus; OES obere Ektodermalschicht; UES untere Ektodermalschicht; ZM extraembryonales Mesoderm; in Anlehnung an Pijneborg und Vercruysse, 2006.

25

Zur besseren Übersicht, kann die Entwicklung der chorioallantoischen Plazenta in drei Stadien

eingeteilt werden (Pijnenborg und Vercruysse, 2006):

- Zeitraum der anfänglichen Entwicklung der Ektoplazenta (Tag 8-10)

- Zeitraum der ektoplazentalen Entwicklung (Tag 11-17)

- Endgültige Reifung der Ektoplazenta (Tag 18-21)

Die Entwicklung der Plazenta beginnt am achten Tag (Pijnenborg und Vercruysse, 2006) bzw. laut

Franke (1969) am sechsten Tag, mit der Differenzierung eines solidzelligen Trophoblastenzapfens,

der sich in Träger (Franke, 1969) oder Ektoplazentarkonus (Pijnenborg und Vercruysse, 2006)

unterteilt. Aus dem Träger bzw. dem Ektoplazentakonus entwickelt sich die spätere Plazenta.

Da sich der Träger aus dem Trophoblasten entwickelt, ist er ektodermaler Herkunft (de Rijk et al.,

2002; Pijnenborg und Vercruysse, 2006).

Der Träger stellt die Verbindung zwischen Embryoblasten und Dezidua her. Durch aktive

Vordringungsprozesse des Trägers gegen die Deziduazellen werden maternale Kapillaren eröffnet.

Etwa am neunten Tag bildet sich im Träger ein Lakunensystem, in das maternale Blut strömt.

Pijnenborg und Vercruysse, 2006 sprechen in diesem Zusammenhang von einer

Implantationskammer, in welche sich das maternale Blut ergießt. Dieser Bereich, in dem fetales

Gewebe (der Träger) und die maternalen Deciduazellen aneinander treffen, wird als

Durchdringungszone bezeichnet. In dieser Zone entwickeln sich ab dem fünften Tag Riesenzellen

aus Trophoblastenzellen, die durch ihre ausgeprägte Phagozytoseaktivität eine wichtige Rolle bei

der Implantation spielen (Franke, 1969). Gleichzeitig entwickelt sich die Blastozyste durch das

Wachstum des Mesoderms weiter und unterteilt sich in Ektoplazentarhöhle, Extraembryonales

Coelom (Exocoelom) und Amnionhöhle. Die Ektoplazentarhöhle ist nun durch eine obere

Ektoplazentarschicht vom Träger abgegrenzt, nach unten ist sie ebenfalls durch eine dünnere

untere Ektoplazentarschicht (echtes Chorion), vom Exozoelom abgegrenzt.

Zwischen dem neunten und zehnten Tag kommt es durch starkes Wachstum des allantoischen

Mesenchyms zur Verlegung der Ektoplazentarhöhle. Obere und untere Ektoplazentarschicht liegen

nun direkt aufeinander und bilden die Chorionschicht. Der Kontakt zwischen allantoischem

Mesenchym und Chorion findet bei ca. 80% der Embryonen mittig statt, nur bei etwa 20% wächst

das Mesenchym seitlich an das Chorion (Ellington, 1987). Zwischen den beiden Blättern der

Lamina sind jedoch Lakunen zu erkennen, die sich mit maternalem Blut anfüllen (Pijnenborg und

Vercruysse, 2006). Die Chorionschicht, die auf ihrer antimesenterialen Seite von allantoischem

Mesoderm überzogen ist, hat sich eventuell nicht nur aus den Epithelzellen der Ektoplazentahöhle

entwickelt, sondern es besteht auch die Möglichkeit, dass sich einige Zellen aus dem Träger in der

Lamina befinden. Aus der Lamina die am 10. Tag in ihrer Mitte lediglich aus einer Schicht von 4-

26

8 kleinen Zellenreihen besteht, entwickelt sich später das Labyrinth, wobei es für möglich

gehalten wird, dass in der späteren Entwicklung das Wachstum des Labyrinthes mit Zellen aus der

Durchdringungszone stattfindet (Peel und Bulmer, 1977; Jollie, 1964).

Der Dottersack umgibt jetzt mit einer viszeralen und einer parientalen Schicht alle drei Kammern

bzw. Höhlen und lässt lediglich zwischen der Ektoplazentahöhle und dem Träger einen Spalt

(Pijnenborg und Vercruysse, 2006).

Parallel zu der Plazentaentwicklung kommt es zu einer massiven Verdickung des endometrialen

Stromas, wodurch das gesamte Uteruslumen verschwindet, das Schleimhautepithel löst sich bei

diesem Prozess auf. Am achten Tag bildet sich auf der antimesometrialen Seite ein neues

Uteruslumen.

Im zweiten Stadium der Plazentaentwicklung, besteht bereits die grundlegende Architektur der

späteren Plazenta.

Zwischen dem 11. und 17. Tag sind fetale Gefäße im allantoischen Mesenchym zu finden, welches

mit der unteren Ektoplazentaschicht verschmilzt. In dem sich jetzt entwickelnden Labyrinth sind

bereits maternale Sinus und fetale Gefäße anzutreffen. Auch im Trophospongium sind maternale

Lakunen erkennbar. Der Träger ist nun verschwunden, lediglich in den lateralen Plazentazonen

sind noch übrig gebliebene Träger-Zellen zu erkennen.

Zwischen dem 15. und 17. Tag ist zunächst das Einwachsen von meist zwei afferenten maternalen

Gefäßen aus der Dezidua in Richtung des Labyrinth zu beobachten. Auch dringt der

Spongiotrophoblast nun aktiv in die maternale Dezidua ein.

Zwischen dem 18. und 21. Tag, kommt es zur Resorption von vorher gebildeten Strukturen. Der

Spongiotrophoblast hat sich nun jedoch soweit vergrößert, dass er scheinbar den Raum der

Dezidua basilaris einnimmt, welche resorbiert wird.

Die zum Ende der Trächtigkeit immer weniger werdenden Überreste der Dezidua basilaris werden

nach der Geburt mit ausgestoßen. Des weiteren ist eine „Verwischung“ der Grenze zwischen

Trophospongium und Labyrinth zu erkennen. Die Zellkerne der äußeren Bereiche des

Spongiotrophoblasten vergrößern sich gegen Ende der Trächtigkeit.

Große fetale Gefäße in der Plazenta sind nun von einer mesodermalen Hülle umgeben, der größere

Höhlen folgen, die seitlich durch Entoderm begrenzt werden (Pijnenborg und Vercruysse, 2006).

Zu Beginn der Plazentaentwicklung, besteht fast die gesamte Plazenta aus maternalen

Deziduazellen, lediglich basophile- und Riesenzellen sind fetalen Ursprungs. Obwohl es auch zu

einer Proliferation dieser Zellen kommt, die ihren Höhepunkt am 14. Tag (basophile Zellen) bzw.

am 17. Tag (Riesenzellen) haben, ändert sich erst durch das schnelle Wachstum des Labyrinths das

27

Überwiegen fetaler Zellen. Ab dem 15. Tag stellt das Labyrinth den größten Teil der Plazenta dar,

entwickelt sich jedoch bis zum 22. Tag weiter und dominiert dann die gesamte Plazenta (Durst-

Zivkovic, 1978).

2.4 Diaplazentare Transportmechanismen

Kyuma (1984) vermutet, dass der diaplazentare Aminosäuretransfer zur fetalen Seite mittels

stereospezifischer Transportproteine oder erleichterter Diffusion stattfindet. Die Ergebnisse seiner

Arbeit lassen ihn weiterhin vermuten, dass nicht die maternale, sondern überwiegend die fetale

Konzentration freier Aminosäuren im Plasma den diaplazentaren Transport regulieren.

Nach Battaglia und Regnault (2001) kann der Transport von Aminosäuren im Trophoblasten in

drei Schritte unterteilt werden: erstens die Aufnahme der Aminosäure aus dem maternalen Blut

über die apikale Oberfläche der Trophoblastenzelle, zweitens den Transport durch das Zytoplasma

der Zelle und drittens den Transport aus der Zellen hinaus und durch die Basalmembran in die

fetale Kapillare. Transportproteine werden jeweils beim Transport über Plasmamembranen, also

bei Schritt Eins und Drei benötigt. Hierbei ist zu beachten, dass die an der apikalen Zellmembran

vorhandenen Transportproteine nicht immer denen an der basalen Trophoblastenzellmembran

entsprechen. Die Transportproteine können Na+-abhängig bzw. Na+-unabhängig sein, zum anderen

können sie bezüglich ihres Substrates in die Gruppen A, ASC, L, y+, β und Glycin eingeteilt

werden, wobei einzelne Gruppen mehrere Systeme enthalten können.

28

Abb. 2.4.1: Schematische Abbildung ausgewählter Na+-abhängiger () und Na+-unabhängiger (○) Aminosäuretransport Systeme des Trophoblasten der Plazenta des Menschen und der Ratte. apikale Membran= maternal, basale Membran= fetal, MeAIB: Methylaminoisobuttersäure, AIB: α-Aminoisobuttersäure, BCH: 2-Aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carbonsäure. In Anlehnung an Regnault et al. (2005).

Nach Schneider und Dancis (1974) geschieht die Aufnahme saurer Aminosäuren (Glutamat und

Aspartat), sowie Serin recht schnell und es stellt sich ein großer Konzentrationsgradient zwischen

Extrazellular- und Intrazellularraum ein. Die Abgabe der Aminosäuren ist offensichtlich langsamer

als die Aufnahme. Im Gegensatz hierzu ist die Aufnahme basischer Aminosäuren (Lysin und

Arginin) weniger schnell und die Akkumulation im Gewebe erreicht schnell ein Plateau. Dies

deutet auf einen effizienten Abtransport der Aminosäuren hin. Neutrale Aminosäuren wie Glycin,

Alanin und Prolin zeigen ein ähnliches Aufnahmeverhalten wie die basischen Aminosäuren.

Leucin zeigt eine schnelle Abgabe aus dem Plazentagewebe, so dass der Konzentrationsgradient

intrazellulär : extrazellulär typischerweise unter Eins blieb.

Nach Battaglia und Regnault (2001) ist die Plazenta nicht nur in der Lage freie Aminosäuren des

maternalen Plasmas zu resorbieren und unter Umständen zu metabolisieren, sondern sie ist auch in

der Lage, maternale Proteine abzubauen und dessen Aminosäuren zum Feten hin zu transportieren.

29

Auch besitzt die Plazenta die Möglichkeit, Aminosäuren zu deren Ketosäuren zu desaminieren

und in den fetalen Kreislauf zu transportieren. Die Ketosäuren können dort entweder zu ihren

entsprechenden Aminosäuren transaminiert werden, oder sie werden weiter decarboxyliert. Dies

ist bei Leucin und wahrscheinlich auch bei Isoleucin und Valin der Fall (Loy et al., 1990). Der

Stofftransport in der Plazenta ist nicht unidirektional, es kann u.a. bei Leucin zu einem

fetomaternalen Transfer kommen (Ross et al., 1996).

Nach Cetin (2001) werden Aminosäuren aktiv zum Feten transportiert und liegen hier in höherer

Konzentration vor, als im maternalen Plasma. Die meisten Aminosäuren können in der Plazenta

metabolisiert werden, und bei manchen nicht essentiellen Aminosäuren konnte deren Synthese in

der Plazenta nachgewiesen werden. Der Transfer von essentiellen Aminosäuren ist signifikant

höher, als der nicht essentieller Aminosäuren.

Kedenburg und Mülling (1975) halten es für möglich, dass bei der Ratte ähnlich wie beim

Kaninchen in der die Amnionhöhle umgebende Dottersackwand aktive Transportproteine für

Aminosäuren lokalisiert sind. Hierdurch könne die im Vergleich zum Menschen hohe

Aminosäurekonzentration in der Amnionflüssigkeit zu erklären sein.

Nach Lines und Waisman (1971) ist die Konzentration von Aminosäuren im fetalen Blut um den

Faktor 1,5 bis 2,4 höher, als im maternalen Blut. Andere Autoren wie Beckman et al. (1997)

berichten jedoch zum Teil von größeren Konzentrationsunterschieden.

Paolini et al. (2001) konnten beim Schaf nachweisen, dass die Regulation von Transportsystemen

essentieller Aminosäuren von der Genexpression entsprechender Transportproteine und der

maternalen sowie fetalen Plasmakonzentration der entsprechenden Aminosäure abhängt.

Der beträchtliche Bedarf des Feten an Glycin als Beispiel für eine nicht essentielle Aminosäure

wird in der menschlichen und der Rattenplazenta nach Bennett und Jackson (1998) allerdings

lediglich durch die folatabhängige Umwandlung von Serin zu Glycin durch die

Serinhydroxymethyltransferase gedeckt. Die Plazenta besitzt nicht die Möglichkeit Alanin mit

Hilfe der Glyoxylataminotransferase in Glycin umzuwandeln.

Nach Malandro et al. (1996) kommt es bei Ratten nach einer Reduktion der maternalen Aufnahme

von Casein (20% Casein vs. 5% Casein im Futter) zwar nicht zu einer verringerten maternalen

Plasmaaminosäurekonzentration, jedoch war das fetomaternale Aminosäureverhältnis im Plasma

reduziert. Aufgrund dieser Ergebnisse liegt es nahe, dass der Nährstofftransfer zum Fetus reduziert

ist. Es kam vor allem zu einer Reduktion der Aktivitäten des Na+-abhängigen neutralen

Aminosäure Transporters A, während der Transport des Systems ASC unbeeinflusst blieb. Auch

die Aktivität des Na+-abhängigen anionischen Aminosäure Transporters EAAC1 war reduziert,

30

während Na+-unabhängige Transportsysteme kaum betroffen waren. Es wird vermutet, dass eine

verringerte Synthese der Transportsysteme für die Aktivitätsreduktion der Systeme EAAC1 und

CAT1 verantwortlich sind.

Nach Verabreichung eines Futters mit einem erhöhten Glukoseanteil (24% anstatt 12%) wurde in

der Amnionflüssigkeit eine um 364% erhöhte Methioninkonzentration sowie ein signifikanter

Anstieg des Phenylalanins und ein konstanter Abfall von Taurin zwischen dem 18. und dem 21.

Trächtigkeitstag beobachtet. Dabei korrelierten diese Werte auch mit dem ansteigendem

Fetalgewicht bzw. mit vortlaufender Trächtigkeit. Auch bei den Aminosäuren Cystein, Lysin und

Tyrosin konnte ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten Konzentration in der

Amnionflüssigkeit und einem Anstieg des fetalen Gewichtes beobachtet werden (Gurekian und

Koski, 2005).

2.5 Methylierungszyklus

Der Methylierungszyklus (siehe Abb.2.5.1) stellt einen wichtigen Stoffwechselweg zur Regulation

der Homocysteinkonzentration im Blut dar. Damit steht er ebenfalls im Mittelpunkt des Interesses

bei der Betrachtung der Hyperhomocysteinämie und den Erkrankungen die hierdurch gefördert

werden.

Laut Goddijn-Wessel et al. (1996) ist bei Frauen mit einer Hyperhomocysteinämie das Risiko für

Plazentaablösungen oder Plazentainfarkte deutlich erhöht. Die maternalen Konzentrationen von

Vitamin B6, B12 und der Serumfolatspiegel waren bei den Frauen mit Hyperhomocysteinämie

verringert. Die Folsäurekonzentration im Erythrozytenkonzentrat ist bei Frauen mit und ohne

Hyperhomocysteinämie vergleichbar gewesen.

31

Nach Zhao et al. (2001, 2002) beeinträchtigt Homocystein die Entwicklung der viszeralen

Dottersackwand, sowie die Ausbildung von Blutgefäßen. Die Beeinträchtigungen zeigten sich in

geschrumpften Oberflächen, mangelhaften Blutinseln und signifikant niedrigerem Durchmesser

des Dottersacks. Funktionell beeinträchtigt Homocystein den Transport in der viszeralen

Dottersackwand, speziell die Endozytose. Es wird vermutet, dass der verringerte Stofftransport

direkt mit der teratogenen Wirkung des Homocysteins korreliert.

Di Simone et al. (2004) wiesen bei menschlichen Trophoblastenzellen, welche einer

Homocysteinkonzentration von 20 µmol/l ausgesetzt waren, Apoptose und Einschränkungen der

Zellfunktion nach. Nach vorheriger Behandlung der Zellen mit Folsäure (20 nmol/l) konnte eine

Einschränkung dieser hervorgerufenen Effekte beobachtet werden.

Im weiteren Verlauf der Trächtigkeit, spielen die Enzyme Methioninsynthase- welches die

Reaktion Homocystein zu Methionin katalysiert, Cystathionin-β-Synthase und S-Adenosyl-

Homocysteinhydrolase- welches die Reaktion S-adenosylhomocystein zu Homocystein katalysiert

eine wichtige Rolle bei der Senkung des fetalen Homocysteinspiegels. Aerts et al. (1995) konnten

die Methioninsynthase im fetalen Gewebe zwischen dem 10 und 20 Trächtigkeitstag nachweisen.

Die höchste Enzymaktivität wiesen sie am 12. Tag nach. In der Plazenta war die Aktivität der

Abb. 2.5.1: Vereinfachtes Schema des Methionin-Homocystein Metabolismusin: 1: Cystathionin β-Synthase, 2: 5-Methyltetrahydrofolat Homocystein Methyltransferase, 3: 5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktase, SAM: S-Adenosylmethionin, SAH: S-Adenosylhomocystein, THF: Tetrahydrofolat, 5-m-THF: 5-Methyltetrahydrofolat, 5,10-m-THF: 5,10-Methylentetrahydrofolat. In Anlehnung an Goddijn-Wessel et al., 1996.

32

Methioninsynthase während der gesamten Trächtigkeit geringer und unterlag keinen signifikanten

Schwankungen.

Die Cystathionin-β-Synthase war in plazentarem Gewebe, und ab dem 18. Trächtigkeitstag im

fetalen Gewebe nachweisbar. In der fetalen Leber kommt es seit dem 14. Trächtigkeitstag zu

einem konstanten Anstieg der Enzymaktivität, hingegen nimmt hier die Aktivität der

Methioninsynthase leicht ab. Während die Aktivität der Cystathionin-β-Synthase in der fetalen

Leber ab dem 14. Tag zunimmt, nimmt sie zwischen dem 10. und 18. Tag in der Plazenta ab, bis

sie kaum mehr nachzuweisen ist.

Die S-Adenosylhomocysteinhydrolase konnte zwischen dem 9,5 und 11,5 Tag in dezidualem

Gewebe, der parietalen und viszeralen Dottersackwand, dem Ektoplazentakonus sowie im

embryonalen Gewebe mit unterschiedlicher Aktivität nachgewiesen werden.

Diese Ergebnisse zeigen, dass der Methylierungszyklus bereits während der Neurulation in

fetalem Gewebe aktiv ist.

Nach Steegers-Theunissen et al. (1995) ist im Durchschnitt bei Frauen, die Kinder mit

Neuralrohrdefekt gebären, die Homocysteinkonzentration in der Amnionflüssigkeit signifikant

höher, als bei Frauen, die gesunde Kinder gebären. Die Homocysteinkonzentration im maternalen

Blut sowie die Konzentrationen von Folat, Vitamin B6 sowie Vitamin B12 zeigten in der

Amnionflüssigkeit und im maternalen Blut keinen signifikanten Unterschied zwischen den Frauen

welche gesunde und welche Kinder mit Neuralrohrdefekt gebaren. Die durchschnittliche

Konzentration von Homocystein und Vitamin B6 waren in beiden Gruppen in der

Amnionflüssigkeit signifikant geringer als im maternalen Blut, während Vitamin B12 in der

Amnionflüssigkeit in einer höheren Konzentration vorlag als im maternalen Blut.

Des weiteren berichten Steegers-Theunissen et al. (1997) von vergleichsweise hohen

Methioninkonzentrationen und geringen Homocysteinkonzentrationen in der Amnionflüssigkeit

im Gegensatz zum maternalen Blut zwischen der 8. und 12. Schwangerschaftswoche bei Frauen.

Aufgrund dieser Ergebnisse vermuten sie einen Methionin Metabolismus auf fetaler Seite.

Wendstrom et al. (2000) berichten das sowohl eine Mutation des fetalen Gens für die 5,10-m-THF

als auch eine erhöhte amniale Homocysteinkonzentration mit Neuralrohrdefekten assoziiert sind,

wobei keine Assoziation zwischen der Mutation und der erhöhten amnialen

Homocysteinkonzentration besteht.

33

Abb. 2.5.2: ausgewählte Abbauwege des Methionins. In Anlehnung an Caltrider und Niss, 1966.

2.6 Zusammensetzung der Amnionflüssigkeit

Wie in Abb. 2.6.1 zu erkennen ist, gibt es mehrere Wege, die die Zusammensetzung der

Amnionflüssigkeit modulieren bzw. beeinflussen können. Hierbei kann zunächst zwischen einem

passiven und einem aktiven Transport unterschieden werden. Zu den passiven

Abb. 2.6.1: Die Zusammensetzung der Amnionflüssigkeit beeinflussende Faktoren. In Anlehnung an Weingärtner et al. 2007.

34

Transportmechanismen zählen die Diffusion von Stoffen aus dem mütterlichen Blut und aus der

Nabelschnurvene. In der Plazenta sind zum einen aktive Transportmechanismen vorhanden,

welche in der Plazentaschranke lokalisiert sind, zum anderen kommt es auch hier zur passiven

Diffusion von Stoffen in die Amnionflüssigkeit.

Des weiteren gelangen fetaler Urin sowie abgeschliffene Epithelzellen in die Amnionflüssigkeit.

Auch kann es zu Diffusion von Stoffen durch fetale Schleimhäute kommen.

Ist die Konzentration freier Aminosäuren in der Amnionflüssigkeit höher als im maternalen

Plasma, ist davon auszugehen das die Plazenta mit ihren aktiven Transportmechanismen der Weg

ist, auf welchem die Aminosäuren in nennenswertem Umfang in die Amnionflüsigkeit gelangen

konnten. Die Aminosäuren können nach dem aktiven diaplazentaren Transport entweder über die

Plazenta oder über die Nabelschnurvene in die Amnionflüssigkeit diffundiert sein. Möglicherweise

sind bei der Ratte auch in der die Amnionhöhle umgebenden Dottersackwand aktive

Transportproteine für Aminosäuren lokalisiert (Kedenburg und Mülling, 1975).

3. Material und Methoden

3.1 Material

Der Tierversuch wurde in Mecklenburg-Vorpommern unter der Genehmigungsnummer

LLALLF M-V/TSD/7221.3-2.1-032/08 durchgeführt.

Für die Untersuchungen wurden weibliche Ratten des Zuchtstammes LEW1.W verwandt. Die

Böcke des Zuchtstammes kamen lediglich zur Bedeckung der weiblichen Tiere zum Einsatz. Die

weiblichen Tiere waren ausschließlich erstgebährend, um sicher zu stellen, dass die Zahl der

Implantationen und Resorptionen ausschließlich auf die aktuelle Trächtigkeit zurückzuführen ist.

Da es sich bei den Tieren um Individuen aus einer Inzucht handelt, kann von relativ homogenen

Stoffwechselparametern ausgegangen werden.

Die Ratten wurden in K3-Käfigen zu je drei Tieren gehalten. Die Bedeckung erfolgte über Nacht

im Verhältnis Bock : Weibchen von 1:2. Die Böcke wurden nach erfolgter Bedeckung wieder

separiert. Am Morgen nach der Bedeckung wurden Vaginalabstriche genommen, Weibchen mit

Spermien im Abstrich wurden als gedeckt angenommen. Der erste Tag nach der Bedeckung wurde

als Tag Null definiert. Für die weitere Arbeit wurden die gedeckten Tiere in die Gruppen K

(Kontrollgruppe n=16), B (induzierter Vitamin B6-Mangel n=16) und F (induzierter

35

Folsäuremangel n=15) unterteilt. Die Fütterungen der Gruppen B und F erfolgte ab Tag Null durch

das jeweilige Mangelfutter.

Für die Gruppe B kam das Experimentalfuttermittel „ssniff EFR/M, 10mm, Pyridoxin-arm,

S0752-S010, Batch No.: 1567414“ der Firma ssniff Spezialdiäten GmbH, 59494 Soest,

Deutschland zum Einsatz. Die Zusammensetzung bestand aus 20,8% Rohprotein, 4,2% Rohfett,

5% Rohfaser, 5,6% Rohasche, 46,8% Stärke, 10,8% Zucker sowie pro kg 15.000 IE Vitamin A,

1.500 IE Vitamin D3, 150mg Vitamin E, 20mg Vitamin K3, 30mg Vitamin C und 14mg Kupfer.

Die Fütterung der Gruppe F erfolgte mit dem Experimentalfuttermittel „sniff EFR/M, 10mm,

Folsäure-arm, S0752-S020, Batch No.: 1577414“ der Firma ssniff Spezialdiäten GmbH, 59494

Soest, Deutschland. Die Zusammensetzung entspricht der des Pyridoxin-armen Futtermittels,

jedoch ohne Folsäure.

Die Fütterung der Gruppe K erfolgte mit dem Aufzuchtfuttermittel „ssniff R-Z, extrudiert, V1326-

000 Reg.nr.: nl 96093“ der Firma ssniff Spezialkiäten GmbH, 59494 Soest, Deutschland.

Die Zusammensetzung bestand aus 21% Rohprotein, 3,8% Rohfett, 4,4% Rohfaser und 6,7%

Rohasche, sowie 15.000 IE/kg Vitamin A, 1.000 IE/Kg Vitamin D3, 100 mg/kg Vitamin E und 12

mg/kg Kupfer.

Die Futteraufnahme und Tränkung der Tiere erfolgte ad libitum, es wurde ein Lichtregime mit

einem Rhythmus von 12 Stunden hell und 12 Stunden dunkel eingesetzt (6-18 Uhr hell, 18-6 Uhr

dunkel). Die Temperatur betrug 22 °C +/- 1 °C, die Luftfeuchtigkeit ca. 50-52%. Der Streuwechsel

erfolgte zweimal wöchentlich, es wurde das Produkt Lingocel der Firma J. Rettenmaier & Söhne

GmbH + Co. KG in 73494 Rosenberg, Deutschland verwendet.

3.2 Methoden

Für die Probenentnahme wurden die Versuchstiere anästhesiert. Die Anästhesie erfolgte mit 10%

Ketamin (Wirkstoff: Ketaminhydrochlorid), 2% Rompun (Wirkstoff: Xylazinhydrochlorid) und

Aqua dest. im Verhältnis 1:1:1 durch intraperitoneale Injektion von 0,1ml je 100g Körpergewicht.

Die Eröffnung der Bauchdecke und des Thorax zur Entblutung der Muttertiere durch intrakardiale

Punktion des rechten Ventrikels mittels einer heparinisierten Spritze erfolgte während der

Tiefennarkose. Anschließend wurde das Vollblut bei 3.000 rpm 4 Minuten zentrifugiert. Das

Plasma wurde mit einer Pipette abgenommen, Plasma und Erythrozytenkonzentrat anschließend

bei -22 °C bis zur weiteren Bearbeitung eingefroren und gelagert.

36

Die Entnahme von Zwei Plazenten, der Amnionflüssigkeit und des maternalen Blutes erfolgte an

Tag 14, 16 und 20 der Trächtigkeitsperiode. Den Tieren wurden jeweils um 10 Uhr des

Entnahmetages 50 µg BrdU (5-Bromodeoxyuridin) pro 1 g Körpergewicht intraperitoneal

appliziert.

Bei BrdU handelt es sich um ein Thymidin-Basenanalogon, welches nach Einbau in die DNS

während der zellulären Synthesephase des Zellzyklus mit Hilfe von entsprechenden monoklonalen

Antikörpern nachgewiesen werden kann. Mit diesem von Gratzner (1982) entwickelten Verfahren,

besteht die Möglichkeit, Zellproliferationsereignisse zu quantifizieren. Die Probenentnahme fand

nach der BrdU Inkorporation jeweils um 16 Uhr, ca. 6h nach BrdU-Applikation statt.

Des Weiteren erfolgte die Punktion der Amnionhöhlen mehrerer Feten zur Gewinnung von

Amnionflüssigkeit als Sammelprobe eines Muttertieres. Die Amnionflüssigkeit wurde ebenfalls

abzentrifugiert und der Überstand bei -22 °C tiefgefroren.

Die Eröffnung des Uterus erfolgte paraplazentar, jedoch nicht antimesenterial, so dass ehemalige

Implantationsstellen nicht beschädigt wurden. Die Anzahl der Resorptionen wurden zunächst

makroskopisch ermittelt und die Feten wurden ausgezählt, es fand kein Vergleich zwischen den

Feten statt. Zum Nachweis aller Implantationsorte wurden die bei -22 °C tiefgefrorenen Uterie

zunächst bei Zimmertemperatur aufgetaut. Danach erfolgte eine 10 minütige Inkubation der Uteri

in einer 10%igen Ammoniumsulfidlösung, nach kurzem Spülen in Aqua dest. erfolgte eine 10

minütige Inkubation in einer Lösung aus 1%iger Salzsäure und einer 20%igen Kaliumferrocyanid-

Lösung zu gleichen Teilen. Nach erneutem spülen der Uteri in Aqua dest. erfolgte die

stereomikroskopische Auszählung aller Implantationsorte, welche sich bei dieser Methode nach

Salewski (1964) blauschwarz färben.

Jeweils eine Plazenta wurde entweder in einer 4% gepufferten Formaldehydlösung oder in einer

von Langeron modifizieren Bouin-Lösung über mindestens 24 Stunden fixiert, die Auswahl der

Plazenten zum Fixierungsverfahren geschah willkürlich (Romeis, 1968).

4% gepuffertes Formalin: 12 ml 37% Formaldehyd

88 ml PBS

Bouin-Lösung: 1 Teil 40%iges Formol

3 Teile destilliertes Wasser

Pikrinsäure im Überschuss

Zu dieser Lösung wurde unmittelbar vor Gebrauch Eisessig im Verhältnis 1:20 gegeben.

Pro Muttertier wurde eine Plazenta Formol- und eine Bouin fixiert. Die Bouin fixierten Plazenten

wurden mittels HE, PAS und PBA Färbemethode behandelt. Dies gilt ebenfalls für die Formol

fixierten Plazenten, hier erfolgte z.T. zusätzlich eine vorherige Diastaseinkubation.

37

Die fixierten Plazenten wurden zunächst in einer aufsteigenden Alkoholreihe nach folgendem

Protokoll entwässert, anschließend bei 60°C in Paraffin eingebettet und an einer Ausgießstation

ausgeblockt. Zum Erkalten des Blocks wurde dieser auf eine gekühlte Platte gestellt.

Reagenz Zeit (in min)

70% EtOH 30

80% EtOH 30

96% EtOH 30

96% EtOH 45

100% EtOH 30

100% EtOH 30

100% EtOH 45

Xylol 30

Xylol 45

Paraffin 30

Paraffin 30

Die 4µm dicken Paraffinschnitte wurden mittels eines Rotationsmikrotoms der Firma Leica

(Modell RM2255) hergestellt und zum Strecken auf ein 40°C heißes Wasserbad gelegt.

Anschließend wurden sie auf SuperFrost® Plus Objektträger der Firma R. Langenbrinck gezogen

und auf einer 40°C temperierten Wärmeplatte über mind. 30 min adheriert und getrocknet. Die

Lagerung der Paraffinblöcke erfolgte im Kühlschrank bei etwa 7°C, die Lagerung der

Paraffinschnitte bei Raumtemperatur.

Es folge für die histologische Beurteilung der Schnitte die Färbung der mit Formalin und Bouin

fixierten Präparate mit Hämatoxylin-Eosin (HE) nach Romeis (1968). Nach der Entparaffinierung

der Schnitte in zweimal 5 min Xylol, erfolgte die Rehydrierung der Präparate in zweimal 5 min

100% EtOH, 5 min 96% EtOH, 3 min 70% EtOH, 3 min 50% EtOH und mind. 3 min in

destilliertem Wasser. Anschließend wurden die Schnitte 3-5 Minuten in ein Hämalaun-Bad

überführt und nach gründlichem Waschen mit Wasser (10-15 min) für 5-15 min in einer 0,1%igen

wässrigen Eosinlösung gefärbt. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Schnitte in

80%igem EtOH differenziert, dehydriert und über Xylol als Zwischenmedium in Permanent

Mounting Medium eingedeckt.

Zum Nachweis von Polysacchariden, neutralen Mukopolysacchariden, Muko- und

Glykoproteinen, Glykolipiden sowie ungesättigten Fetten und Phospholipiden wurden sowohl die

mit Formalin als auch die mit Bouinlösung fixierten Präparate mittels Periodic-acid-Schiff-

38

reaction (PAS, PJS) nach McManus gefärbt (Romeis, 1968). Anschließend erfolgte eine

qualitative Auswertung der Schnitte. Hierzu erfolgte eine Rehydrierung der Schnitte nach

demselben Protokoll wie bei der HE-Färbung. Anschließend wurden die Präparate 5 min in eine

0,5%ige wässrige Perjodsäurelösung gestellt und danach mit Wasser gespült. Hiernach wurden sie

für 15 min in Fuchsinschwefliger Säure inkubiert und daraufhin in 3 Portionen SO2-Wasser

dreimal 2 min gewaschen. Nach erneutem Waschen in Wasser wurden die Zellkerne mit Hämalaun

für 20-30 Sekunden gegengefärbt und die Schnitte anschließend erneut gewaschen. Nach einer

Färbung des Zellplasmas mit Lichtgrün folgte die Dehydrierung der Schnitte in einer

aufsteigenden Alkoholreihe und das Eindecken der Präparate mittels eines Permanent Mounting

Mediums über Xylol.

Zur besseren Farbdifferenzierung der Glykoproteine und Mukopolysaccharide, vor allem von

Basallaminae in den fetalen Kapillaren wurden weitere, in Bouinlösung sowie Formalin fixierte

Schnitte nach der Perjodsäure-Bisulfit-Aldehydthionin-Färbemethode (PBA) (Specht, 1970)

gefärbt, bei welcher Substanzen mit einer α-D-Glykolgruppe blau erscheinen. Zum Ausschluss

von Glykogenanfärbung besteht die Möglichkeit einer zweistündigen Inkubation der Schnitte in

1%iger wässriger Diastaselösung.

Hierzu erfolgte die Deparaffinierung und Rehydrierung nach demselben Protokoll wie bei der HE-

Färbung und die Weiterbehandlung wie folgt:

1. Inkubation der entparaffinierten Schnitte in 1% wässriger Perjodsäure für 7 min

2. Spülen der Schnitte in destilliertem Wasser

3. Inkubation der Präparate in 10% wässriger Na-Pyrosulfitlösung für etwa 14 Stunden

4. 3x kurz in destilliertem Wasser spülen

5. Einstellen der Schnitte für 1-2 min in 70% EtOH

6. Färben mit Aldehydthionin für etwa 1,5 Stunden.

7. Spülen in 70% EtOH

8. Mehrfaches spülen mit destilliertem Wasser

9. Färben in Kernechtrubinlösung für 8 min

10. Spülen in destilliertem Wasser

11. Für etwa 5 min in 5%iger wässriger Phosphorwolframsäure differenzieren

12. Spülen in destilliertem Wasser

13. Entwässern, kurz in 96% EtOH, dann 3x in 100% EtOH, eindecken mittels eines permanenten

Mounting Mediums über Xylol.

39

Zusammensetzung Aldehydthionin:

0,5g Thionin (Firma Merck Nr. 1.15929.0025)

91,5 ml 70% EtOH

7,5 ml Paraldehyd (Firma Merck Nr. 8.18255.0100)

1,0 ml rauchende Salzsäure

Die Lösung ruhte für mind. 6 Tage in einer dunklen Flasche und wurde anschließend filtriert, ohne

den Bodensatz aufzuwirbeln.

Zusammensetzung Kernechtrubinlösung:

0,1g Kernechtrubin (Firma Niepötter)

100 ml destilliertes Wasser

1,0 ml Eisessig

Zusätzlich wurden Laminin, als Hauptbestandteil fetaler Blutgefäße in der Plazenta, aktivierte

Caspase-3 als Marker für apoptotische Vorgänge sowie Ki-67 als Proliferationsmarker

immunhistochemisch nachgewiesen. Der Nachweis von Laminin und Ki-67 erfolgte an jeweils 3

Plazenten pro Gruppe und Zeitpunkt, der Nachweis von Caspase-3 erfolgte an 4 Plazenten zu den

Zeitpunkten 16 und 20.

Der Nachweis des Glykoproteins Laminin erfolgte mittels Anti-Laminin Antikörper der Firma

Sigma (Nr. L 9393), die Protease Caspase-3 wurde mittels Anti-ACTIVE® Caspase-3 Antikörper

der Firma Promega (Catalog #G7481) nachgewiesen.

Das Protein Ki-67 wurde mithilfe des monoklonales Maus Anti-Ratte Ki-67 Antigen Antikörpers

der Firma DakoCytomation (Nr. M7248) nachgewiesen.

Der Nachweis der entsprechenden Antigene erfolgte mittels modifizierter ABC-Methode (avidin-

biotin conjugate method), wobei folgender unlösliche Komplex gebildet wird (Hsu et al., 1981).

40

Abb. 3.2.1: schematische Darstellung der ABC-Methode. A: Avidin; Ag: Antigen; B: Biotin; Px: Peroxidase; sA: Sekundärantikörper; *: entsprechender Primärantikörper. In Anlehnung an Taylor et al., 2006.

Anstelle des Avidins welches bei der ABC-Methode an den biotinylierten Sekundärantikörper

bindet, wurde Strepdavidin verwendet. Hierbei handelt es sich um ein tetrameres, nicht

glykolysiertes Avidin-Analogon, dessen Aminosäuresequenz zu etwa 33% homolog (Haugland

und You, 1998) ist und welches eine sehr hohe Affinität zu Biotin besitzt. Jedes Molekül

Streptavidin vermag wie Avidin vier Moleküle Biotin zu binden. Ein Vorteil von Streptavidin

besteht darin, dass sein isoelektrischer Punkt annähernd im neutralen pH Bereich liegt, während

der isoelektrische Punkt von Avidin bei etwa pH 10 liegt. Hierdurch können elektrostatische

Bindungen vermieden werden, welche ein hohes Hintergrundsignal verursachen können.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Streptavidin keine Carbonhydrate enthält, welche

unspezifisch and Lektin ähnlichen Substanzen zu binden vermögen und dadurch ebenfalls

Hintergrundsignale erzeugen können.

Des Weiteren ermöglicht die hohe Affinität von Streptavidin zu Biotin die lange Lagerung

gebrauchsfertiger Lösung (Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex) und vereinfacht somit die

Anwendung.

Die Farbentwicklung erfolgt indem der Peroxidase H2O2 als Substrat angeboten wird, welches

reduziert wird. Die frei werdenden Protonen oxidieren nun DAB (3,3´-Diaminobenzidin), welches

daraufhin Polymerisiert.

41

Hierbei entsteht ein brauner, lichtstabiler, in Alkohol und Xylol unlöslicher Komplex, der eine

Dehydrierung und ein Eindecken der Präparate in Harz erlaubt (Taylor et al., 2006).

Um einen besseren Kontrast zur anschließenden Gegenfärbung zu erzielen, wurde der Lösung

Nickel beigemischt, hierdurch entsteht ein grau-schwarzer Farbkomplex.

Im Folgenden werden die einzelnen Arbeitsschritte beschrieben.

Die Deparaffinierung und Rehydrierung erfolgte nach demselben Protokoll wie bei den HE

gefärbten Präparaten.

Anschließend erfolgte:

1. die Blockierung der endogenen Peroxidase mittels 3% H2O2 in Leitungswasser für 10 min,

danach wurden die Schnitte in PBS (Aqua dest., 0,14M NaCl, 0,0027M KCl, 0,01M Phosphat bei

PH 7,4) gewaschen.

2. eine Antigendemaskierung:

- die Präparate auf denen mit dem Ki-67-Antikörper gearbeitet wurde wurden hierzu für 30 min in

einen 100°C heißen 0,01M Citratpuffer gestellt.

- die Präparate auf denen mit dem Anti-ACTIVE® Caspase-3 Antikörper gearbeitet wurde wurden

für 10 min in 0,2% Triton in PBS inkubiert.

3. Blockierung von unspezifischen Bindungsstellen der Antikörper, hierzu wurden die Schnitte

inkubiert mit:

- 2,5% Pferdeserum mit 4 Tropfen Avidin-Blockierung (blocking Kit der Firma Vector

Laboratories Inc. (SP-2001)) pro ml Serum für 10 min, waschen in PBS

- 2,5% Pferdeserum mit 4 Tropfen Biotin-Blockierung (blocking Kit der Firma Vector Laboratories

Inc. (SP-2001)) pro ml Serum für 10 min, 2x waschen in PBS

4. Inkubation mit dem Primärantikörper für eine Stunde in einer feuchten Kammer mit den

Verdünnungen:

- Laminin: 1:30

- Caspase-3: 1:100

- Ki-67: 1:25, jeweils in 2,5% Pferdeserum

5. 2x 5 min waschen in PBS

6. Inkubation mit dem Sekundärantikörper des Färbe-Kits der Firma Vector Laboratories Inc.

(SP-2001) für 45 min in einer feuchten Kammer


42

8. Inkubation mit dem Streptavidin-Peroxidase-Komplex (universal quick Kit der Firma Vector

Laboratories Inc. (SP-2001))


10. Substratentwicklung mittels eines DAB-Kit (3,3´-Diaminobenzidin) der Firma Vector

Laboratories Inc. (SK-4100), die Zusammensetzung der Lösung besteht aus besteht aus:

- 5 ml Aqua dest.

- 2 Tropfen Puffer

- 4 Tropfen DAB

- 2 Tropfen H2O2

- 2 Tropfen Nickel-Lösung

11. Es erfolgte die Farbentwicklung, welche je nach Intensität nach 1-10 min in Leitungswasser

gestoppt wurde.

12. 5 min waschen in Leitungswasser

13. Gegenfärbung mit Nuclear fast red der Firma Vector Laboratories Inc. (H-3403) für 5 min

14. waschen in Leitungswasser während 10 min

15. Dehydrieren der Schnitte

- 3 mal kurz in 80% EtOH

- 3 mal kurz in 96% EtOH

- 3 min in 100% EtOH

- 5 min in 100% EtOH

- 2 mal 5 min in Xylol

Es erfolgte das Eindecken der Präparate mittels eines Xylol löslichen Permanent Mounting

Mediums.

43

Die Aminosäureanalytik im Blutplasma und der Amnionflüssigkeit (Bestimmung von Taurin,

Asparaginsäure, Hydroxyprolin, Threonin, Serin, Aspartat, Glutaminsäure, Glutamin, Prolin,

Glycin, Alanin, Citrullin, Butyrat, Valin, Cystein, Methionin, Cystathionin, Isoleucin, Leucin,

Tyrosin, Phenylalanin, Ornithin, Lysin, Histidin und Arginin) erfolgte mittels

Ionenaustauschchromatographie und anschließender Detektion der Aminosäuren mittels

Ninhydrin. Das Homocystein und Vitamin B6 in Form von Pyridoxal-Phosphat wurden mittels

HPLC (high pressure liquid chromatograph) bestimmt. Die Folsäure wurde mittels

Chemilumineszenz ermittelt. Die Enzymaktivität von ALAT und ASAT wurden mit der von der

International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) empfohlenen Methode nach Warburg

bestimmt. Die Bestimmung von Folsäure, Vitamin B6, Homocystein, ALAT und ASAT erfolgte

durch das Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universität Rostock. Die

Aminosäureanalytik wurde durch das Institut für Mikrobiologie Abteilung für Genetik und

Biochemie der Ernst-Moritz-Arndt Universität Greifswald durchgeführt.

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm SPSS Statistics. Zunächst

wurde eine deskriptive Statistik erstellt, wobei Mittelwerte und Standartabweichungen (jeweils

pro Gruppe und Zeitpunkt) berechnet wurden. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen

wurde mit Hilfe eines Post-Hoc-Tests errechnet.

44

http://www.google.de/search?hl=de&sa=X&oi=spell&resnum=0&ct=result&cd=1&q=high+pressure+liquid+chromatograph&spell=1

http://www.google.de/search?hl=de&sa=X&oi=spell&resnum=0&ct=result&cd=1&q=high+pressure+liquid+chromatograph&spell=1

4. Ergebnisse

4.1 Vitamin B6, Folsäure, Homocystein, ALAT, ASAT im maternalen Plasma

4.2 Proteinogene Aminosäuren mit apolaren Seitenketten

4.3 Proteinogene Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten

4.4 Proteinogene Aminosäuren mit sauren Seitenketten

4.5 Proteinogene Aminosäuren mit basischen Seitenketten

4.6 Nicht proteinogene Aminosäuren

4.7 Histomorphologische Untersuchung der Plazenten

4.8 Immunhistochemische Untersuchung der Plazenten

4.9 Resorptionen

Zur besseren Übersicht wird die Kontrollgruppe im Folgenden als „Gruppe K“ bezeichnet, die

Gruppe mit Vitamin-B6-Restriktion als „Gruppe B“ und die Gruppe mit Folsäure-Restriktion als

„Gruppe F“. Wenn nicht anders beschrieben, beziehen sich die Angaben auf die

Blutplasmakonzentrationen der Tiere. Die Irrtumswahrscheinlichkeit signifikanter Unterschiede

beträgt p≤ 0,05, auf abweichende Irrtumswahrscheinlichkeiten wird im Text hingewiesen.

4.1 Vitamin B6, Folsäure, Homocystein, ALAT, ASAT

im maternalen Plasma

Vitamin B6

In der Gruppe K blieb die maternale Vitamin-B6-Konzentration zwischen dem 14. und dem 20.

Tag weitestgehend konstant. In der Gruppe B ist bereits am 14. Trächtigkeitstag eine signifikant

verringerte Vitamin-B6-Konzentration im Vergleich zu Gruppe K und F zu beobachten, welche bis

zum 20. Trächtigkeitstag wesentlich niedriger ist als in der Gruppe K und sich von der Gruppe K

signifikant unterschied.

45

Vitamin B6

0

50

100

150

200

250

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

Abb. 4.1.1: Maternale Vitamin-B6-Konzentration im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

In der Gruppe F ist im Vergleich zu Gruppe K ab dem 16. Trächtigkeitstag ein Abfall der Vitamin-

B6-Konzentration zu beobachten, die Konzentration am 20. Tag unterscheidet sich jedoch nicht

signifikant von Gruppe K.

Zwischen dem 14. und 16. Trächtigkeitstag ist die Vitaminkonzentration in Gruppe B signifikant

geringer als in Gruppe F, am 20. Trächtigkeitstag nähern sich die Konzentrationen durch den

starken Vitamin-B6-Abfall in Gruppe F an, so dass sich für dem 20. Tag kein signifikanter

Unterschied darstellt.

Folsäure im Blutplasma

Die Folsäurekonzentration im Plasma der Gruppe K ist über die gesamte Trächtigkeit weitgehend

konstant, lediglich zwischen dem 16. und 20. Tag kommt es zu einem leichten Abfall der

Konzentration. Zwischen dem 14. und 20. Trächtigkeitstag sind keine signifikanten Unterschiede

zwischen den Gruppen K und B bezüglich der Folsäurekonzentration zu beobachten. Der

beschriebene Konzentrationsabfall in Gruppe K ist in Gruppe B jedoch nicht zu beobachten.

Abb. 4.1.2: Maternale Folsäurekonzentration des Plasmas im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Folsäure

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

46

Die Tiere der Gruppe F weisen zu jedem Zeitpunkt der Messung eine signifikant verringerte

Folsäurekonzentration als die der Gruppen K und B auf. Zwischen dem 14. und 16. Trächtigkeitstag

ist kein weiterer Abfall der Konzentration zu beobachten. Am 20. Tag ist es in Gruppe F zu einem

weiteren Abfall der Folsäurekonzentration gekommen.

erythrozytäre Folsäure

Die Folsäurekonzentration im Erythrozytenkonzentrat ist in allen Gruppen weitgehend konstant,

mit Ausnahme der Gruppe F, die am 16. Trächtigkeitstag eine signifikant geringere erythrozytäre

Folsäurekonzentrationen gegenüber der Gruppe B aufweist.

Abb. 4.1.3: Maternale erythrozytäre Folsäurekonzentration im zeitlichen Verlauf.

Der erythrozytäre Folsäuregehalt in Gruppe F ist im gesamten Versuchszeitraum gegenüber den

Gruppen B und F leicht verringert, es konnten jedoch keine weiteren signifikanten Unterschiede

errechnet werden.

Homocystein

Die Homocysteinkonzentration in Gruppe K sinkt zwischen dem 14. und 16. Trächtigkeitstag und

erreicht am 16. Tag einen Tiefpunkt. Bis zum 20. Trächtigkeitstag erfolgt ein mäßiger Anstieg.

Die Homocysteinkonzentration der Gruppe B ist im Vergleich zu Gruppe K am 14. und 16.

Trächtigkeitstag signifikant erhöht und unterscheidet sich am 20. Tag mit einer Signifikanz von

p≤0,06. In Gruppe F ist die Homocysteinkonzentration am 14. und 16. Trächtigkeitstag

47

Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

erythrozytäre Folsäure

0

100

200

300

400

500

600

700

800

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

im Vergleich zu Gruppe K signifikant erhöht, am 20. Tag können keine signifikanten Unterschiede

für Gruppe F errechnet werden. Zwischen dem 16. und dem 20. Tag kommt es in den Gruppen B

und F zu einem Abfall der Homocysteinkonzentration.

ALAT

Zwischen dem 14. und 16. Trächigkeitstag kommt es zu einer Zunahme der Aktivität des Enzyms

Alanin-Aminotransferase (ALAT) in Gruppe K.

Die Enzymaktivität in Gruppe B ist in Laufe der Trächtigkeit weitestgehend konstant. Die

Aktivität der ALAT in Gruppe B ist im Vergleich zu Gruppe K über den gesamten

Trächtigkeitsverlauf signifikant verringert.

Abb.: 4.1.5: Aktivität der Alanin-Aminotransferase im maternalen Serum im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Auch in Gruppe F bleibt die Enzymaktivität der ALAT über den gesamten Trächtigkeitszeitraum

weitgehend konstant. Am 20. Trächtigkeitstag ist die Enzymaktivität in Gruppe F gegenüber

Gruppe K signifikant verringert.

ALAT

0

10

20

30

40

50

60

70

14 16 18 20

Tag

U

K

B

F

Abb.: 4.1.4: Maternale Homocysteinkonzentration im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Homocystein

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

48

Im Vergleich zu Gruppe B ist die Enzymaktivität in Gruppe F an den Tagen 14 und 20 der

Trächtigkeit signifikant erhöht.

ASAT

Die Aktivität des Enzyms Aspartat-Aminotransferase (ASAT) steigt in Gruppe K zwischen dem

14. Trächtigkeitstag und 16. Trächtigkeitstag an. Die Enzymaktivität in Gruppe B ist zwischen

dem 14. und 20. Trächtigkeitstag relativ konstant. Am 16. Trächtigkeitstag ist die Aktivität der

Gruppe B gegenüber der Gruppe K signifikant verringert.

Zwischen dem 14. und 20. Trächtigkeit sinkt die Enzymaktivität in Gruppe F leicht ab und zeigt

im Vergleich zu Gruppe K am 20. Trächtigkeitstag eine signifikant verringerte Enzymaktivität.

Am 14. und 16. Tag ist die Aktivität der ASAT in Gruppe B gegenüber der Aktivität in Gruppe F

signifikant erniedrigt.

4.2 Proteinogene Aminosäure mit apolaren Seitenketten

Zur Bestimmung des diaplazentaren Aminosäuretransports, wurden die entsprechenden

Konzentrationen im maternalen Plasmas mit denen der Amnionflüssigkeit verglichen. Hierzu

wurde der Quotient aus der Aminosäurekonzentration der Amnionflüssigkeit und der des

maternalen Blutplasmas bestimmt. Wird dieser Quotient gegen die Zeit aufgetragen, ergibt sich

ein Graph, der den diaplazentaren Aminosäuretransport im Verlauf der Trächtigkeit widerspiegelt.

Sowohl die Werte des maternalen Blutplasmas, die der Amnionflüssigkeit als auch ihre Quotienten

sind im Anhang zu finden.

Abb. 4.1.6: Aktivität der Aspartat-Aminotransferase im maternalen Plasma. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

ASAT

0

20

40

60

80

100

120

140

14 16 18 20

Tag

U

K

B

F

49

Glycin

Der Graph der Aminosäurekonzentration im maternalen Plasma zeigt in Gruppe K vom 14. bis

zum 16. Tag einen Abfall und anschließend eine Gerade. In Gruppe B ist ein leicht

parabelförmiger Verlauf des Graphen mit Scheitelpunkt am 16. Trächtigkeitstag zu beobachten, in

Gruppe F kommt es nach dem 16. Tag zu einem stärkerem Konzentrationsabfall. Am 14. Tag ist

die Konzentration der Aminosäure in der Gruppe F im Vergleich zu den Gruppen K und B

signifikant verringert. Am 16. Tag ist die Konzentration in Gruppe B im Vergleich zu Gruppe K

signifikant reduziert. Am 20. Tag ist die Konzentration der Gruppe F im Vergleich zu Gruppe B

signifikant reduziert. Mit einer Signifikanz von p≤0,06 trifft dies ebenfalls im Vergleich mit der

Gruppe K zu.

Sowohl der Graph der Aminosäurekonzentration in der Amnionflüssigkeit, als auch jener, der den

fetomaternalen Aminosäurequotienten darstellt, haben einen parabelförmigen Verlauf, mit

Scheitelpunkt am 16. Tag.

Die Konzentrationen in der Amnionflüssigkeit zeigen lediglich am 16. Tag eine signifikant erhöhte

Konzentration in Gruppe B im Vergleich zu Gruppe F.

Am 14. Tag zeigt die Gruppe F gegenüber Gruppe K einen signifikant höheren fetomaternalen

Aminosäurequotient für Glycin. Am 16. Tag lässt sich in der Gruppe B im Vergleich zu den

Gruppe K und F ein signifikant höherer Glycinquotient errechnen. Am 20. kann in der Gruppe F

ein signifikant erhöhter fetomaternale Glycinquotient gegenüber den Gruppen K und B errechnet

werden.

Abb. 4.2.1: GlycM: Glycinkonzentration im maternalen Plasma im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.2: GlycAm: Valinkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

50

GlycM

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

GlycAm

0

100

200

300

400

500

600

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

Alanin

Am 14. Tag ist die Alaninkonzentration im maternalen Plasma in Gruppe B gegenüber Gruppe K

signifikant reduziert. Am 16. Tag ist die Konzentration der Gruppe F signifikant höher als in den

Gruppen K und B.

In der Amnionflüssigkeit konnte lediglich am 20. Tag eine signifikante Erhöhung der Alanin-

konzentration mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 für Gruppe F gegenüber Gruppe K

errechnet werden.

Ebenfalls mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 konnte am 14. Tag in Gruppe B

gegenüber Gruppe K ein erhöhter fetomaternale Alaninquotient ermittelt werden. Am 16. Tag ist

der Quotient der Gruppe B gegenüber Gruppe F signifikant erhöht.

Abb. 4.2.4: AlaM: Alaninkonzentration im maternalen Plasma im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.5: AlaAm: Alaninkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.3: GlycQ: fetomaternaler Glycinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

GlycQ

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

14 16 18 20

Tag

K

B

F

51

AlaM

0

100

200

300

400

500

600

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

AlaAm

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

Valin

Bei der Aminosäure Valin ist im maternalen Plasma der Gruppe F am 14. Tag eine signifikant

höhere Konzentration zu messen, als in den Gruppe K und B. Am 16. Tag ist die Konzentration in

der Gruppe F immer noch signifikant höher als in Gruppe K.

In der Gruppe B ist die Valinkonzentration in der Amnionflüssigkeit am 16. Tag signifikant höher

als in Gruppe K. Am 20. Tag ist die Konzentration in Gruppe F gegenüber der in Gruppe K

signifikant erhöht.

Am 14. und 16. Tag ist der fetomaternale Quotient in Gruppe B signifikant größer als in Gruppe F.

Die Graphen aller Quotienten zeigen einen parabelförmigen Verlauf, mit Scheitelpunkt am 16.

Tag.

Abb. 4.2.7: ValM: Valinkonzentration im maternalen Plasma im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.8: ValAm: Valinkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.6: AlaQ: fetomaternale Alaninquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

AlaQ

0

1

2

3

4

5

6

14 16 18 20

Tag

K

B

F

52

ValM

0

50

100

150

200

250

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

ValAm

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

Leucin

Während sich bei der Konzentration der Aminosäure Leucin im maternalen Plasma und in der

Amnionflüssigkeit keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen feststellen lassen, ist

der fetomaternale Quotient am 16. Tag in Gruppe F signifikant geringer als in Gruppe B. Es

können keine signifikanten Unterschiede zur Gruppe K errechnet werden.

Isoleucin

Ähnliches ist bei der Aminosäure Isoleucin zu beobachten. Auch hier sind im maternalen Plasma

und der Amnionflüssigkeit keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu erkennen.

Am 16. Tag ist der Quotient der Gruppe F gegenüber den Gruppen K und B signifikant geringer.

Methionin

Die Methioninkonzentration im maternalen Plasma aller Gruppen zeigt einen relativ homogenen

Verlauf. Am 14. und 16. Trächtigkeitstag kann im Plasma der Gruppe F eine signifikant höhere

Konzentration als in Gruppe K nachgewiesen werden. Am 20. Trächtigkeitstag sind keine

Unterschiede zwischen den Gruppen K, B und F nachweisbar.

Abb. 4.2.9: ValQ: fetomaternaler Valinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

ValQ

0

1

2

3

4

5

6

7

8

14 16 18 20

Tag

K

B

F

53

Abb. 4.2.10: MethM: Methioninkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.11: MethAm: Methioninkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.12: MethQ: fetomaternaler Quotient der Methioninkonzentration im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Auch in der Amnionflüssigkeit sind keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu

beobachten, der Graph ist parabelförmig mit Scheitelpunkt am 16. Tag.

Der fetomaternale Aminosäurequotient ist lediglich am 16. Trächtigkeitstag in Gruppe F

signifikant kleiner als in den Gruppen K und B. Auch hier stellt sich der Graph parabelförmig dar

und besitzt seinen Scheitelpunkt am 16. Trächtigkeitstag.

Prolin

Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 ist die Prolinkonzentration im maternalen Plasma

am 14. Tag in der Gruppe B signifikant geringer als in der Gruppe F. Die Werte der Gruppe K

liegen zwischen denen der Gruppen B und F.

Am 16. Tag ist die Prolinkonzentration in der Amnionflüssigkeit in Gruppe B signifikant höher als

in Gruppe F. Am 20. Tag sind die Konzentrationen in der Amnionflüssigkeit in den Gruppen B und

MethM

0

10

20

30

40

50

60

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

MethAm

0

50

100

150

200

250

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

MethQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

14 16 18 20

Tag

K

B

F

54

F signifikant höher als in Gruppe K, Gruppe F weist gegenüber Gruppe B ebenfalls eine

signifikant höhere Prolinkonzentration auf.

Der fetomaternale Quotient ist am 14. Tag in Gruppe B signifikant höher als in Gruppe F. Am 20.

Tag ist der Quotient der Gruppe F signifikant höher als der in Gruppe K.

Abb. 4.2.13: ProlM: Maternale Prolinkonzentration im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.2.14: ProlAm: Prolinkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

4.3 Proteinogene Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten

Cystein

Die Konzentration der Aminosäure Cystein im maternalen Blutplasma steigt in der Gruppe K im

Verlauf der Trächtigkeit leicht an, in Gruppe B ist eine weitgehend konstante Konzentration zu

beobachten, während sich der Graph in Gruppe F negativ parabelförmig mit Scheitelpunkt am 16.

Abb. 4.2.15: ProlQ: fetomaternaler Quotient der Prolinkonzentration im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

ProlQ

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

14 16 18 20

Tag

K

B

F

ProlM

0

50

100

150

200

250

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

ProlAm

0

200

400

600

800

1000

1200

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

55

Tag darstellt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen sind über den gesamten

Trächtigkeitszeitraum, abgesehen von der Gruppe F, welche am 16. Tag eine signifikant höhere

Konzentration aufweist als Gruppe B, nicht zu beobachten. In Gruppe F ist am 16. Tag eine

überproportional hohe Konzentration von Cystein zu beobachten.

In der Amnionflüssigkeit aller Gruppen ist vom 14. bis zum 20. Tag kein signifikanter Unterschied

der Cysteinwerte zu beobachten. Die Cysteinkonzentration steigt in allen Gruppen zwischen dem

14. und 20. Tag signifikant an.

Aufgrund der geringen maternalen und der hohen fetalen Cysteinkonzentrationen ab dem 20. Tag,

steigt der fetomaternale Quotient ab dem 16. Tag in allen Gruppen signifikant an.

Abb. 4.3.1: CystM: Maternale Cysteinkonzentration im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.3.2: CystAm: Konzentration von Cystein in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.3.3: CystQ: Fetomaternaler Quotienten der Cysteinkonzentration im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

CystM

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

14 16 18 20

Tag

µm

ol/l

K

B

F

CystAm

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

14 16 18 20

Tag

µm

ol/l

K

B

F

CystQ

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

14 16 18 20

Tag

K

B

F

56

Tyrosin

Bei der Aminosäure Tyrosin zeigen sich über den gesamten Trächtigkeitszeitraum in der

Kontrollgruppe niedrigere maternale Plasmakonzentrationen als in den Gruppen B und F. Im

Gegensatz zu diesen Gruppen in denen die Tyrosinkonzentration zwischen dem 16. und 20. Tag

weitgehend konstant bleiben, fällt die Tyrosinkonzentration im maternalen Plasma in Gruppe K

über zwischen dem 16. und 20. Tag weiter ab. In der Gruppe B sind die Werte gegenüber der

Gruppe K an den Tagen 14 und 20 signifikant erhöht, in der Gruppe F sind signifikant erhöhte

Werte gegenüber Gruppe K an den Tagen 14 und 16 zu beobachten. Signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen B und F bestehen nicht.

Sowohl der Graph der Amnionflüssigkeit als auch der des fetomaternalen Quotienten stellen sich

parabelförmig mit Scheitelpunkt am 16. Tag dar, wobei der rechte Schenkel der Quotientenkurve

am 20. Tag höher ist als am 14. Tag.

Die Tyrosinkonzentration in der Amnionflüssigkeit der Gruppe B ist an den Tagen 14, 16 und 20

gegenüber der Gruppe K signifikant erhöht, an Tag 14 ist ebenfalls eine signifikante Erhöhung

gegenüber Gruppe F zu beobachten. Am 20. Tag ist in Gruppe F eine signifikant höhere

Aminosäurekonzentration zu ermitteln, als in Gruppe K.

Am 16. Tag ist der Aminosäurequotient der Gruppe F signifikant geringer als in Gruppe B.

Weitere Unterschiede konnten nicht errechnet werden.

Abb. 4.3.4: TyrM: Tyrosinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.3.5: TyrAm: Tyrosinkonzentration in der Amnionflüssigkeit in Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

57

TyrM

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

14 16 18 20

Tag

µm

ol/l

K

B

F

TyrAm

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

Abb. 4.3.6: TyrQ: fetomaternaler Tyrosinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Serin

Die Aminosäure Serin ist am 16. Tag im maternalen Plasma der Gruppe F gegenüber den Gruppen

K und B signifikant erhöht. Abgesehen von diesem Unterschied zeigen die Graphen einen recht

homogenen Verlauf.

Die Graphen der Amnionflüssigkeit zeigen einen parabelförmigen Verlauf mit Scheitelpunkt am

16. Tag. Während in der Amnionflüssigkeit keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden

können, ist der Quotienten der Gruppe F des 16. Tages gegenüber der Gruppen K und B

signifikant reduziert.

Abb. 4.3.7: SerM: Serinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.3.8: SerAm: Serinkonzentration in der Amnionflüssigkeit in Verlauf der TrächtigkeitStandartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang.

58

TyrQ

0123456789

14 16 18 20

Tag

K

B

F

SerM

0

50

100

150

200

250

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

SerAm

0

100

200

300

400

500

600

700

14 16 18 20

Tag

µm

ol/l K

B

F

Abb. 4.3.9: SerQ: fetomaternaler Serinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Threonin

Die Konzentration der Aminosäure Threonin im maternalen Plasma aller drei Gruppen stellt sich

zwischen dem 14. und 20. Trächtigkeitstag als recht konstant dar, so dass die Graphen annähernd

waagerecht verlaufen. Der Graph der Gruppe K zeigt hierbei eine niedrigere Plasmakonzentration

an, als die Graphen der Gruppe B und F. Diese Unterschiede sind zwischen den 14. und 20. Tag

signifikant.

Die Graphen der Threoninkonzentration in der Amnionflüssigkeit sowie die der fetomaternalen

Quotienten zeigen einen parabelförmigen Verlauf mit Scheitelpunkt am 16. Tag. Sowohl die

Konzentration in der Amnionflüssigkeit als auch die Quotienten sind am 20. Tag größer als am 14.

Tag.

Zwischen dem 14. und 20. Tag ist die Threoninkonzentration in der Amnionflüssigkeit in den

Gruppen B und F signifikant höher als in Gruppe K. Am 16. Tag ist die Threoninkonzentration in

Gruppe B signifikant höher als in Gruppe F.

Am 14. Tag sind die Quotienten der Gruppen B und F signifikant kleiner als der Quotient der

Gruppe K. Am 16. Tag ist der fetomaternale Threoninquotient in Gruppe F signifikant kleiner als

in Gruppe K.

59

SerQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

14 16 18 20

Tag

K

B

F

Abb. 4.3.10: ThreoM: Threoninkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.3.11: ThreoAm: Threoninkonzentration in der Amnionflüssigkeit im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.3.12: ThreoQ: Fetomaternaler Threoninquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

4.4 Proteinogene Aminosäuren mit sauren Seitenketten

Asparaginsäure

Am 16. Tag ist im maternalen Plasma der Tiere der Gruppe F eine gegenüber den Gruppen K und

B signifikante Erhöhung der Asparaginsäurekonzentration zu messen. In der Amnionflüssigkeit

lassen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen nachweisen.

Glutaminsäure

Die Glutaminsäurekonzentration im maternalen Plasma der Gruppe K ist während der gesamten

Tragzeit annähern konstant geblieben, während die Graphen der Gruppen B und F ein Maximum

am 16. Tag zeigen und sich an diesem Tag alle Gruppen signifikant von einander unterscheiden.

Dabei zeigt die Gruppe F den höchsten und die Gruppe K den niedrigsten Wert.

ThreoQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

14 16 18 20

Tag

K

B

F

60

ThreoM

0

50

100

150

200

250

300

350

400

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

ThreoAm

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

14 16 18 20

Tag

µm

ol/l K

B

F

Die Glutaminsäurekonzentration in der Amnionflüssigkeit nimmt vom 14. bis zum 20. Tag in allen

Gruppen deutlich ab. Besonders ausgeprägt ist dies in den Gruppen B und F zu beobachten, in

denen die Konzentration am 14. Tag über den in Gruppe K liegt. Es können jedoch über den

gesamten Trächtigkeitszeitraum keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen errechnet

werden.

Die Graphen der Aminosäurequotienten erinnern an jene der fetalen Glutaminsäurekonzentration,

zeigen im Gegensatz zu diesen jedoch signifikante Unterschiede. So ist der Aminosäurequotient

der Gruppe F gegenüber der Gruppe K am 16. Tag signifikant verringert. Mit einer

Irrtumswahrscheinlichkeit vom p≤0,06 ist der Aminosäurequotient der Gruppe F signifikant

geringer als der Quotient in Gruppe B.

Nachdem die Werte – vor allem zwischen dem 14. und 16. Tag deutlich fallen, und am 16. Tag in

den Gruppen K und B um 1 sind, während der Quotient in Gruppe F deutlich kleiner 1 ist, sind am

20. Tag alle Quotienten kleiner 1.

Abb. 4.4.1: GlutsM: Glutaminsäurekonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.4.2: GlutsAm: Glutaminsäurekonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.4.3: GlutsQ: Fetomaternaler Glutaminsäurequotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

GlutsM

0

50

100

150

200

250

300

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

GlutsAm

0

100

200

300

400

500

600

700

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

GlutsQ

0

1

2

3

4

5

6

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

61

4.5 Proteinogene Aminosäuren mit basischen Seitenketten

Lysin

Die Lysinkonzentration aller Gruppen sowohl im maternalen Blutplasma als auch in der

Amnionflüssigkeit bleiben annähernd konstant. Am 14. und 16. Tag zeigen sich in den Gruppen B

und F signifikant höhere maternale Plasmakonzentrationen als in der Gruppe K.

In der Amnionflüssigkeit können signifikant höhere Konzentrationen in den Gruppen B und F im

Vergleich zu Gruppe K an den Tagen 16 und 20 nachgewiesen werden. Am 14. Tag kann in

Gruppe B ein signifikant höhere Wert als in Gruppe K errechnet werden, in der Gruppe F kann an

diesem Tag mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 ebenfalls ein erhöhter Wert gegenüber

Gruppe K ermittelt werden.

Am 14. Tag ist der fetomaternale Lysinquotient in Gruppe F signifikant kleiner als in Gruppe B.

Abb. 4.5.1: LysM: Lysinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.5.2: LysAm: Lysinkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.5.3: LysQ: Fetomaternaler Lysinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

LysM

0

100

200

300

400

500

600

700

800

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

LysAm

0

500

1000

1500

2000

14 16 18 20

Tag

µmol

/l

K

B

F

LysQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

62

Arginin

Nachdem die Graphen des maternalen Blutplasmas der verschiedenen Gruppen anfänglich

unterschiedliche Verlaufsrichtungen zeigen, nähern sie sich am 16. Tag, und zeigen am 20. Tag

kaum noch Unterschiede. Am 14. Tag ist die Argininkonzentration im maternalen Blutplasma der

Gruppe B signifikant geringer als in der Gruppe K. In der Gruppe F ist die Plasmakonzentration

am 16. Tag signifikant höher als in den Gruppen K und B.

Abb. 4.5.4: ArgM: Argininkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.5.5: ArgAm: Argininkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.5.6: ArgQ: Fetomaternaler Argininquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

In der Amnionflüsigkeit der Gruppen B und F können am 14. Tag signifikant geringere

Konzentrationen ermittlet werden, als in Gruppe K.

Während die Graphen der Argininkonzentration in der Amnionflüssigkeit sowie die des

fetomaternalen Argininquotienten zwischen dem 14. und 16. Tag unterschiedliche

Verlaufsrichtungen zeigen, steigen alle ab dem 16. Tag an.

ArgM

0

20

40

60

80

100

120

140

160

14 16 18 20

Tag

µmol

/l

K

F

B

ArgAm

0

50

100

150

200

250

300

350

400

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

ArgQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

14 16 18 20

Tag

K

B

F

63

Am 16. Tag kann gegenüber der Gruppe K in Gruppe F ein signifikant verringerter fetomaternaler

Argininquotient errechnet werden.

Histidin

Die Konzentration der Aminosäure Histidin im maternalen Plasma zeigt lediglich am 16. Tag eine

signifikante Reduktion der Konzentration in Gruppe B gegenüber Gruppe F. Die Konzentration

der Gruppe K liegt zwischen denen der Gruppe B und F, zeigt jedoch zu diesen keine signifikanten

Unterschiede.

In der Amnionflüssigkeit ist die Konzentration am 14. Tag in Gruppe F signifikant geringer als in

den Gruppen K und B.

Der fetomaternale Quotient der Gruppe F ist am 14. und 16. Tag signifikant geringer als die der

Gruppen K und B. Sowohl die Graphen der Amnionflüssigkeit als auch die der fetomaternalen

Quotienten zeigen einen parabelförmigen Verlauf mit Scheitelpunkt am 16. Trächtigkeitstag.

Abb. 4.5.7: HisM: Histidinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.5.8: HisAm: Histidinkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.5.9: HisQ: Fetomaternaler Histidinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

HisM

0

10

20

30

40

50

60

70

14 16 18 20

Tag

µmo

l/l

K

B

F

HisAm

0

100

200

300

400

500

600

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

HisQ

0

2

4

6

8

10

14 16 18 20

Tag

K

B

F

64

4.6 Nicht proteinogene Aminosäuren

Butyrat

Bei der Aminosäure Butyrat ist im zeitlichen Verlauf in allen Gruppen ein deutlicher Anstieg der

Konzentration sowohl im maternalen Plasma als auch in der Amnionflüssigkeit nachzuweisen. Am

14. und 20. Trächtigkeitstag sind die Butyratkonzentrationen des maternalen Plasmas der Gruppen

B und F gegenüber Gruppe K signifikant erhöht.

In der Amnionflüssigkeit kann am 20. Trächtigkeitstag in den Gruppen B und F ebenfalls eine

signifikant höhere Konzentration im Vergleich zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Bereits

am 14. Trächtigkeitstag kann dies in der Gruppe B beobachtet werden.

Im zeitlichen Verlauf zeigen die Konzentrationsquotienten einen leichten parabelförmigen Verlauf

mit Scheitelpunkt am 16. Trächtigkeitstag.

Abb. 4.6.1: ButyM: Butyratkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang.

Abb. 4.6.2: ButyAm: Butyratkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.6.3: ButyQ: Fetomaternaler Butyratquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

65

ButyM

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

ButyAm

0

10

20

30

40

50

60

70

14 16 18 20

Tag

µmol

/l

K

B

F

ButyQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

14 16 18 20

Tag

K

B

F

Ornithin

Während es im maternalen Plasma der Gruppe K zu einem sukzessiven Anstieg der

Ornithinkonzentration vom 14. zum 20. Tag kommt, zeigen die Graphen der Gruppen B und F

einen waagerechten Verlauf. Ab dem 16. Trächtigkeitstag kann im maternalen Plasma in den

Gruppen B und F eine signifikant geringere Ornithinkonzentration nachgewiesen werden, als in

Gruppe K.

In der Amnionflüssigkeit kann an den Tagen 14 und 16 in der Gruppe F eine signifikant geringere

Ornithinkonzentration als in der Gruppe K bestimmt werden. An Tag 16 ist die Konzentration in

Gruppe B ebenfalls signifikant verringert. Zwischen dem 14. und dem 16. Trächtigkeitstag nimmt

der fetomaternale Ornithinquotient in allen Gruppen deutlich ab wird jedoch nicht kleiner 2.

Am 20. Trächtigkeitstag ist in den Gruppen B und F ein signifikant erhöhter Ornithinquotient

gegen Gruppe K zu errechnen.

Abb. 4.6.4: OrnM: Ornithinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.6.5: OrnAm: Ornithinkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf.Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

66

OrnM

0

10

20

30

40

50

60

14 16 18 20

Tag

µmo

l/l

K

B

F

OrnAm

0

50

100

150

200

250

300

350

14 16 18 20

Tag

µmo

l/l

K

B

F

Abb. 4.6.6: OrnQ: Fetomaternaler Ornithinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Cystathionin

In Gruppe B kommt es zwischen dem 14. und 16. Tag zu einem deutlichen Anstieg der

Cystathioninkonzentration im maternalen Plasma, im weiteren Verlauf bleibt die Konzentration

konstant. Die Graphen der Gruppen K und F liegen ab dem 16. Tag deutlich unter dem der Gruppe

B und nähern sich zum 20. Tag einander an. Zwischen dem 14. und dem 20. Trächtigkeitstag kann

im maternalen Plasma der Gruppe B eine signifikant höhere Cystathioninkonzentration ermittelt

werden als in der Gruppe K. Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 kann am 20.

Trächtigkeitstag ebenfalls eine Erhöhung der Aminosäurekonzentration in Gruppe B gegenüber

Gruppe F nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze für Cystathionin liegt bei 0,5 µmol/l, die

Cystathioninkonzentration der Gruppe K sowohl im maternalen Blutplasma als auch in der

Amnionflüssigkeit liegt an den Tagen 14 und 16 lagen unterhalb der Nachweisgrenze und wurden

daher für die statistische Auswertung mit 0,5 µmol/l berücksichtig.

Die Graphen der Gruppen B und F zeigen sowohl bei der Aminosäurekonzentration in der

Amnionflüssigkeit als auch bei den fetomaternalen Quotienten einen parabelförmigen Verlauf mit

Scheitelpunkt am 16. Tag. Der Graph der Gruppe K steigt nach waagerechtem Verlauf zwischen

dem 14. und 16. Tag zwischen dem 16. und 20. Tag linear an.

Am 16. Trächtigkeitstag kann in Gruppe B ein signifikant verringerter fetomaternaler

Aminosäurequotient gegenüber Gruppe K errechnet werden. Die Aminosäurekonzentrationen der

Amnionflüssigkeit zeigen keine signifikanten Unterschiede.

67

OrnQ

01

23

45

67

89

14 16 18 20

Tag

K

B

F

Abb. 4.6.7: CystaM: Cystathioninkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Glutamin

Während die Glutaminkonzentration im maternalen Plasma der Gruppen K und B zwischen dem

14. und 16. Tag weitestgehend konstant bleibt, kommt es in Gruppe F zunächst zu einem leichten

Abfall, später zu einem Anstieg der Konzentration. Die Plasmakonzentration der Aminosäure

Glutamin ist am 16. Tag in der Gruppe F signifikant geringer als in den Gruppen K und B. Am 20.

Tag ist sie in der Gruppe B signifikant höher als in den Gruppen K und F.

Abb. 4.6.9: CystaQ: Fetomaternaler Cystathioninquotient im zeitlichen VerlaufStandartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang.

CystaQ

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

14 16 18 20

Tag

K

B

F

68

CystaM

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

14 16 18 20

Tag

µmol

/l

K

B

F

Abb. 4.6.8: CystaAm: Cystathioninkonzentration in der Amnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

CystaAm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

14 16 18 20

Tag

µmo

l/l

K

B

F

Abb. 4.6.10: GluM: Glutaminkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.6.11: GluAm: Glutaminkonzentration in derAmnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 4.6.12: GluQ: Fetomaternaler Glutaminquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Die Graphen der Amnionflüssigkeit sowie des fetomaternalen Quotienten zeigen einen

parabelförmigen Verlauf, mit Scheitelpunkt am 16. Tag.

In der Amnionflüssigkeit sind abgesehen vom 16. Tag, an welchem die Konzentration in der

Gruppe B signifikant höher ist als in den Gruppen K und F keine weiteren signifikanten

Unterschiede zwischen den Gruppen zu messen.

Der fetomaternale Glutaminquotient ist am 16. Tag in Gruppe F signifikant höher als in Gruppe K.

Phenylalanin

Im maternalen Plasma der Tiere aller Gruppen zeigen sich keine signifikanten Unterschiede.

Am 14. Tag ist die Phenylalaninkonzentration in der Amnionflüssigkeit in Gruppe F signifikant

höher als in Gruppe B. Die Werte der Gruppe K liegen zwischen denen der Gruppen B und F, ohne

jedoch signifikant abzuweichen.

69

GluM

0

100

200

300

400

500

600

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

GluAm

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

GluQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

14 16 18 20

Tag

µmo

l/l

K

B

F

Es konnten keine signifikant voneinander abweichenden fetomaternalen Phenylalaninquotienten

errechnet werden.

Taurin

Die Taurinkonzentration im maternalen Plasma und der Amnionflüssigkeit sowie die

fetomaternalen Quotieten zeigen keinerlei signifikante Unterschiede.

Hydroxyprolin

Auch bei der Aminosäure Hydroxyprolin können weder im maternalen Plasma, noch in der

Amnionflüssigkeit, noch bei den fetomatrnalen Quotienten signifikante Unterschiede ermittelt

werden.

Asparagin

Der fetomaternale Asparaginquotient der Gruppe F ist am 16. Tag gegenüber Gruppe K signifikant

reduziert, am 20. Tag ist er gegenüber den Gruppen K und B signifikant erhöht. Bei den

maternalen Plasma- und den Amnionflüssigkeitskonzentrationen zeigen sich keine signifikante

Unterschiede.

Citrullin

Im maternalen Blutplasma sind zwischen den Gruppen über den gesamten Messzeitraum keine

signifikanten Unterschiede zu errechnen.

Am 20. Trächtigkeitstag kommt es in der Amnionflüssigkeit der Gruppen B und F zu einer

signifikanten Erhöhung der Citrullinkonzentration gegenüber Gruppe K.

Entsprechend ist der fetomaternale Citrullinquotient in den Gruppen B und F am 20. Tag größer 1,

in Gruppe K hingegen kleiner 1. Der fetomaternale Quotient am 20. Tag der Gruppe B ist

signifikant größer als in Gruppe K, mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 ist auch der

fetomaternale Quotient der Gruppe F signifikant größer als in Gruppe K.

70

Abb. 4.6.13: CitrM: Citrullinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

4.7 Histomorphologische Untersuchung der Plazenten

Bei der histomorphologischen Untersuchung der Plazenten können Unterschiede zwischen den

einzelnen Gruppen nachgewiesen werden.

In zwei Plazenten des 20. Trächtigkeitstages der Gruppe B können bereits in der HE-Färbung

großflächige Nekrosen im Labyrinth festgestellt werden, die sich zum Teil bis in den

Spongiotrophoblasten erstrecken.

In der PBA-Färbung können neben den Basallaminae der Endothelien auch weitere Einlagerungen

von Mukopolysaccariden um die fetalen Gefäße nachgewiesen werden (Abb. 4.7.1). Da diese sich

jedoch durch zweistündige Diastase-Inkubation vor der Färbung weitgehend eliminieren lassen

(Abb. 4.7.2) und immunhistochemisch mit Hilfe des Anti-Laminin-Antikörpers nicht

Abb. 4.6.14: CitrAm: Citrullinkonzentration in derAmnionflüssigkeit im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

CitrAm

010

20

30

40506070

8090

100

14 16 18 20

Tag

µmo

l/l

K

B

F

Abb. 4.6.15: CitrQ: Fetomaternaler Citrullinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

CitrQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

14 16 18 20

Tag

K

B

F

71

CitrM

0

10

20

30

40

50

60

70

80

14 16 18 20

Tag

µmol

/l

K

B

F

nachgewiesen werden können, muss davon ausgegangen werden, dass es sich nicht um

Bestandteile der fetalen Basallamina handelt, sondern um intrazelluläre Glykogeneinschlüsse. Bei

diesen bereits von Schiebler und Knoop (1959) beschriebenen Glykogengranula im

Synzytiotrophoblasten ist zu ergänzen, dass die Glykogeneinschlüsse praktisch nur um fetale

Gefäße und nicht um maternale Sinus zu finden sind.

Abb. 4.7.1: K16/2F PBA L4:Fetales Gefäß mit deutlichen PBA positiven Strukturen neben der Basallamina des fetalen Kapilarendothels. Plazenta aus der Gruppe K, Tag 16 der Trächtigkeit.

Abb. 4.7.2: K16/2F PBA-D L5:Deutliche Reduktion der PBA positiven perivaskulären Strukturen nach zweistündiger Diastase-Inkubation. Plazenta aus der Gruppe K, Tag 16 der Trächtigkeit.

Abb. 4.7.3: B16/8F PBA L5: Fetales Gefäß mit deutlichen PBA positiven Strukturen neben der Basallamina des Endothels. Plazenta aus der Gruppe B, Tag 16 der Trächtigkeit.

72

Unter Berücksichtigung der Gefäßgröße erscheint der Eindruck, dass diese Mukopolysaccaride bei

den Plazenten der Tiere der Gruppe B vermehrt auftreten (Abb. 4.7.3).

Des weiteren können bei Plazenten des 16. sowie des 20. Trächtigkeitstages von Tieren der

Gruppe B sowohl in der PBA- als auch in der PAS-Färbung kräftige PBA- bzw. PAS-positive

Strukturen um größere fetale Gefäße (Abb. 4.7.5) gezeigt werden, welche vor allem in Bouin-

fixiertem Gewebe gut hervortreten. Diese Strukturen können sowohl in längs (Abb. 4.7.6) als auch

in quer (Abb. 4.7.5) angeschnittenen Gefäßen dargestellt werden. Ähnliche, jedoch deutlich

aufgelockerte Strukturen sind auch in Gruppe K zu finden (Abb. 4.7.4).

Abb. 4.7.4: K16/2B PBA L4: Größeres fetales Gefäß (quer) im Labyrinth der Rattenplazenta mit diffusen PBA positiven Strukturen um das Gefäß. Gruppe B, 16. Tag der Trächtigkeit.

Abb. 4.7.5: B16/1B PBA L2: Größeres fetales Gefäß (quer) im Labyrinth der Rattenplazenta, mit deutlichen PBA positiven Strukturen um das Gefäß. Gruppe B, 16. Tag der Trächtigkeit.

Abb. 4.7.6: B16/1B PBA L7: Größeres fetales Gefäß (längs) im Labyrinth der Rattenplazenta mit deutlichen PBA positiven Strukturen um das Gefäß. Gruppe B, 16. Tag der Trächtigkeit.

73

Mit der PBA-Färbetechnik konnte besonders an Bouin-fixiertem Gewebe basalmembranartige

Interzellulärsubstanz dargestellt werden.

Des weiteren finden sich sowohl im Spongiotrophoblasten als auch im apikalen Labyrinth,

Gruppen von Zellen mit PBA- bzw. PAS positivem Zytoplasma (Abb. 4.7.7). Da sich das

Zytoplasma nach zweistündiger Diastase-Inkubation der Schnitte nicht mehr PBA- bzw. PAS

positiv darstellt, muß davon ausgegangen werden, dass es sich um glykogenhaltige Zellen handelt.

In Hinblick auf den Glykogengehalt dieser Zellen können zwischen den Gruppen keine

Unterschiede festgestellt werden. Es finden sich jedoch bereits innerhalb der Gruppen große

Unterschiede zwischen dem Glykogengehalt und der Anzahl der Glykogenzellen in den Plazenten.

Zum Teil wurden Zellgruppen von über 30 Glykogenzellen im Labyrinth gezählt (Abb.: 4.7.7).

Die Anzahl der Glykogenzellen – vor allem im Spongiotrophoblasten- nimmt im Laufe der

Trächtigkeit deutlich ab.

Abb.4.7.7: B20/7F PBA L1: Gruppe von Glykogenzellen im apikalen Labyrinth. Gruppe B, 20. Tag der Trächtigkeit.

74

Bereits am 14. Tag sind Riesenzellen mit PBA positiven Zytoplasmaeinschlüssen zu beobachten,

wobei es scheint, dass hier die Plazenten der Gruppen B mehr PBA positive Riesenzellen

aufweisen.

Abb. 4.7.8: K16/2F PBA: Zwei Riesenzellen mit deutlich glykogenhaltigem Zytoplasma. Gruppe K, 16. Tag der Trächtigkeit.

Die Basalmembran des Amnionepithels scheint in Gruppe B (Abb. 4.7.10) gegenüber Gruppe K

(Abb. 4.7.9) verdickt zu sein. Dieser Unterschied fällt vor allem am 16. und 20. Tag auf.

In Gruppe B scheint Gegenüber Gruppe K eine vermehrte granulozytäre Infiltration vorhanden zu

sein. Diese ist am 14. Tag in der basalen Plazenta – in der Dezidua zu sehen und steigt im weiteren

Verlauf der Trächtigkeit Richtung apikal. Am 20. Tag ist in Gruppe B eine deutliche Infiltration

neutrophiler Granulozyten am Übergang des Spongiotrophoblasten zum Labyrinth zu sehen

Abb. 4.7.10: B20/7F PAS L1: Basalmembran des Amnionepithels am 20. Tag in Gruppe B.

Abb. 4.7.9: K20/8F PAS L1: Basalmembran des Amnionepithels am 20. Tag in Gruppe K.

75

(Abb. 4.7.12). In Gruppe K ist diese Infiltration in einem wesentlich geringeren Umfang zu

beobachten (Abb. 4.7.11).

4.8 Immunhistochemische Untersuchung der Plazenten

Bei den immunhistochemischen Untersuchungen mit dem Ki-67 Antikörper als Marker für

Zellproliferation kann bei den Plazenten der Gruppe K des 14. und 16. Trächtigkeitstages im

basalen Labyrinth eine rege Proliferation der Trophoblastenzellen festgestellt werden.

Abb. 4.8.1: arithmetisches mittel der Ki-67 positiven Trophoblastenzellen am 16. Tag in einem Gesichtsfeld. Es wurden mind. 9 Gesichtsfelder (20x Vergrößerung) pro Gruppe ausgezählt.

Ki-67 positive Zellen 16. Tag

K; 26

B; 12,2

F; 7,4

0

5

10

15

20

25

30

Gruppe

An

zah

l K

i-67

po

s. Z

elle

n

K

B

F

Abb. 4.7.11: K20/6F PAS L1: Granulozyten am Übergang des Spongiotrophoblasen zum Labyrinth am 20. Tag in Gruppe K.

Abb. 4.7.12: B20/1F PAS L1: Granulozyten am Übergang des Spongiotrophoblasten zum Labyrinth am 20. Tag in Gruppe B.

76

In den Gruppe B sowie F ist im Labyrinth der Plazenten eine deutlich geringere Zellproliferation

zu beobachten als in der Gruppe K.

Zur semiquantitative Erfassung, wurden die Ki-67 positiven Zellen pro Gesichtsfelder ausgezählt

und miteinander verglichen (siehe Abb. 4.8.4). Hierzu wurden jeweils Drei Gesichtsfelder pro

Plazenta von Drei Plazenten pro Gruppe zu einem Zeitpunkt (Tag 16) ausgezählt. Ein Großteil der

fetalen kernhaltigen Erythrozyten weisen Ki-67 positive Zellkerne auf (Abb.4.8.3), welche bei der

Auszählung von den Ki-67 positiven Zellen des Labyrinths berücksichtigt wurden.

Abb. 4.8.2: K16/7F Ki-67 L8: Ki-67 positiver Zellkern einer Trophoblastenzelle des Labyrinths

Abb. 4.8.3: K16/7F Ki-67 L6: Fetaler Ki-67 positiver Retikulozyt im Labyrinth

Bei der immunhistochemischen Untersuchung mit dem Anti-aktive Caspase-3-Antikörper als

Apoptosemarker ist eine deutliche Caspase-3 Aktivität in den Amnionepithelzellen aller Gruppen

ab dem 16. Trächtigkeitstag zu beobachten (Abb. 4.8.5). Quantitative Unterschiede zwischen den

Abb. 4.8.4: K16/3F Ki-67 L1: Ki-67 positive Zellkerne des maternales Labyrinths, sowie der fetalen Retikulozyten. Plazenta aus Gruppe K, Tag 16.

77

Gruppen konnten nicht erkannt werden. Der Zellbesatz der Basalmembran ist am 20. Tag deutlich

reduziert, z.T. finden sich Zelltrümmer auf der Basalmembran (Abb. 4.8.6).

Auch im Labyrinth der Plazenten können mit Hilfe des Anti-aktive Caspase-3-Antikörpers

apoptotische Zellen nachgewiesen werden (Abb.4.8.7). Eine Zuordnung der Zellen zu einer

Schicht der Plazentaschranke ist lichtmikroskopisch nicht möglich. Aufgrund der ohnehin seltenen

apoptotischen Ereignisse im Labyrinth (z.T. Caspase-3 freie Schnitte) entfällt ein Vergleich

zwischen den Gruppen. In der Zusammenfassung der Gruppen, ergibt sich folgende Anzahl von

apoptotischen Ereignissen.

Abb. 4.8.5: K16/1F Cas3 L1: Nachweis von aktiver Caspase-3 im Zytoplasma der Amnionepithelzellen. Gruppe K, Tag 16.

Abb. 4.8.7: K20/6F Cas3 L1: Nachweis von aktiver Caspase-3 im Zytoplasma einer Zelle des Labyrinths. Gruppe K, Tag 20.

Abb. 4.8.6: K20/5F Laminin L1: deutlich reduzierter Zellbesatz und Zelltrümmer auf der Basalmembran des Amnionepithels. Gruppe K, Tag 20.

78

K16 B16 F164 14 2K20 B20 F206 2 6

Es wurden jeweils 2 Schnitte von 4 Plazenten pro Gruppe ausgezählt wurden. Die Anzahl

apoptotischer Ereignisse schwankt auch innerhalb der Gruppen stark. Da hierbei wahrscheinlich

methodische Mängel zugrunde liegen (s.S. 89) fand der Nachweis von aktiver Caspase-3 lediglich

an den Tagen 16. und 20 statt.

Die immunhistochemische Untersuchung mit dem Anti-Laminin-Antikörper erfolgte zusätzlich

zur Differenzierung der Ergebnisse der PAS- und PBA-Färbung.

Unterschiede zwischen den Gruppen konnten hierbei jedoch nicht erkannt werden.

Tabelle 4.8.1: Anzahl Caspase-3 positiver Zellen in den Gruppen K, B und F

79

4.9 Resorptionen

Obwohl sowohl die Anzahl der Resorptionen als auch die Anzahl der ausgetragenen Früchte –

auch innerhalb einer Gruppe deutlichen Schwankungen unterliegt, können signifikante

Unterschiede zwischen den Gruppen errechnet werden. In Gruppe K konnten durchschnittlich

83,58% (N=22) aller implantierten Früchte ausgetragen werden. In Gruppe B war dies in lediglich

62,36% (N=19) der Fall, in Gruppe F bei 86,81% (N= 18). Somit ist die Anzahl der Resorptionen

in Gruppe B signifikant höher als in den Gruppen K und F. Im Umkerhrschluß bedeutet dies, dass

die Tiere der Gruppe B signifikant weniger Früchte austragen als die Tiere der Gruppen K und F,

obwohl im Mittel gleichviel Implantationen stattgefunden haben.

Abb. 4.9.1: Implantationsnachweis nach Salewski (1964) an einem Uterus

80

5. Diskussion

5.1 Blut- und Amnionparameter

In Anlehnung an Roth-Maier et al. (1996) erfolgte die Bestimmung der Transaminasen ALAT und

ASAT im Serum der Muttertiere um den indirekten Vitamin-B6-Status der Tiere beurteilen zu

können.

In Übereinstimmung mit O´Kane und Gunsalus (1947) welche Pyridoxalphosphat als Coenzym

der ASAT nachwiesen und mit Ono et al. (1995) die in vivo bei Hämodialysepatienten zeigen

konnten, dass eine Reduktion der Aktivität der plasmatischen ALAT und ASAT mit einem

reduziertem Pyridoxal-5-Phosphat Plasmaspiegel zusammenhängen, sind in der vorliegenden

Arbeit die Aktivitäten der maternalen plasmatischen ASAT und ALAT in Gruppe B z.T. signifikant

reduziert.

Da sich die Arbeit von Roth-Maier et al. (1996) mit der laktierenden Ratte auseinander setzt und

somit ein anderes Zeitfenster beleuchtet wird, ist ein Vergleich der Aktivität der Enzyme nicht

möglich. Die von Roth-Maier et al. (1996) beschriebene nicht vorhandene Reduktion der

Enzymaktivität der ALAT im Gegensatz zur ASAT kann nicht bestätigt werden. Roth-Maier et al.

halten dieses Ergebnis durch eine höhere Coenzymabsättigung der ALAT im Gegensatz zur ASAT

für möglich. In den vorliegenden Ergebnissen ist jedoch die Aktivität der ALAT in Gruppe B

stärker reduziert als die der ASAT.

Jung et al. (1978) konnten durch Supplimentierung von Pyridoxal-5-Phosphat beim Menschen

eine Zunahme der ASAT-Aktivität um 37% und der ALAT-Aktivität um 15,2% im Serum zeigen.

Hieraus könnte eine höhere Affinität der ASAT für Pyridoxal-5-Phosphat gefolgert werden,

welches Roth-Maier et al. (1996) widerspricht und die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse

erklären könnte.

Die Aktivität der ALAT ist in Gruppe B ab dem 14. Tag gegenüber Gruppe K signifikant reduziert.

Dies ist ebenfalls dadurch zu erklären, dass Vitamin-B6 ein Coenzym der ALAT ist.

Die ALAT spielt eine wichtige Rolle bei der Ausscheidung von Stickstoff und somit für den

gesamten Aminosäurehaushalt. Differenzen der Aminosäurekonzentrationen sowohl im

maternalen Plasma als auch in der Amnionflüssigkeit könnten somit z.T. durch eine reduzierte

Aktivität der ALAT in den Gruppen B und F erklärt werden. Wobei darauf aufmerksam gemacht

werden muss, dass es noch eine Reihe weiterer Vitamin-B6 abhängige Aminotransferasen gibt.

81

Für die ASAT welche ebenfalls Vitamin-B6 als Coenzym benötigt, konnte am 16. Trächtigkeitstag

eine signifikant verringerte Enzymaktivität in Gruppe B nachgewiesen werden. Am 20. Tag ist

dies für Gruppe F der Fall. Da die Aktivität des Enzyms in Gruppe B jedoch an allen Tagen z.T.

deutlich unter der Aktivität in Gruppe K liegt, kann geschlussfolgert werden, dass sich in einem

zahlenmäßig größeren Tierversuch noch mehr signifikante Unterschiede zeigen würden. Da die

ASAT durch Bereitstellung von Aminogruppen eine wichtige Rolle bei der Synthese von Purinen,

Pyrimidinen und Aminozuckern spielt, hängt sie unmittelbar mit der Zellproliferation zusammen,

und spielt somit u.a. in der Entwicklung von fetalen und plazentaren Gewebe eine wichtige Rolle.

Im Gegensatz zu Lakshmi et al. (2001) welche beim Menschen lediglich bei einem

Folsäuremangel einen höheren Homocysteinspiegel nachweisen konnten, während Ihnen dies bei

einer Vitamin B6 Hypovitaminose nicht gelang, kann in den vorliegenden Ergebnissen am 14. und

16. Tag sowohl in Gruppe F als auch in Gruppe B ein gegenüber Gruppe K signifikant erhöhter

Homocysteinspiegel nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen das

Dierkes et al. (1998) lediglich bei einer Folsäure Supplimentierung, nicht jedoch bei einer Vitamin

B6 Supplimentierung eine Reduktion des Homocysteinspiegels beobachten konnten.

In der Gruppe B ist der erhöhte Homocysteinspiegel durch die Repremierung der Cystathionin β-

Synthase (CBS) zu erklären, welche Pyridoxal-5-Phosphat abhängig ist und den Abbau von

Homocystein zu Cystathionin katalysiert welches ebenfalls Pyridoxal-5-Phosphat abhängig weiter

zu Cystein abgebaut wird. Obwohl die CBS Vitamin-B6 abhängig ist, finden sich in Gruppe B

erstaunlicherweise signifikant erhöhte Cystathioninspiegel gegenüber Gruppe K an den Tagen 14,

16 und 20. Eine mögliche Erklärung für den erhöhten Cystathioninspiegel in Gruppe B könnte

eine Repremierung des ebenfalls pyridoxalphosphatabhängigen Enzyms Cystathionin-γ-Lyase

sein, welches die Reaktion von Cystathionin zu Cystein und α-Kerobutyrat katalysiert (Goddijn-

Wessel et al., 1996). In diesem Fall wirkt sich der Vitamin-B6-Mangel stärker auf die Aktivität der

Cystathionin-γ-Lyase aus, als auf die Aktivität der CBS.

Die Tatsache dass kaum erhöhte Cysteinkonzentrationen gemessen werden können, ist

möglicherweise auch mit den vielen Stoffwechselreaktionen zu erklären, welche Cystein als

Substrat verwenden und es z.B. zu Pyruvat abbauen, zu Taurin decarboxylieren oder zu

Mercaptopyruvat transaminieren. Teilweise dienen diese Reaktionen zur Verbesserung der

Ausscheidungsfähigkeit des Cysteins (Löffler und Petrides, 1998). Bezüglich der

Taurinkonzentration des maternalen Plasmas lassen sich sich keine signifikanten Unterschiede

zwischen den Gruppen K und B feststellen. Diese Ergebnisse untermauern nicht die Vermutung,

dass die Decarboxylierung von Cystein zu Taurin bei Vitamin-B6 Restriktion gesteigert ist.

82

Da neben Homocystein auch Serin Substrat für die CBS ist, hätte in Gruppe B mit einer erhöhten

Serinkonzentration gerechnet werden können, da ein Serinverbrauchender Stoffwechselweg

gehemmt wird. Es lassen sich jedoch zwischen Gruppe K und B keine signifikanten Unterschiede

bezüglich der Serinkonzentrationen im maternalen Plasma oder in der Amnionflüssigkeit

nachweisen.

In Anlehnung an Goddijn-Wessel et al. (1996) ist der erhöhte Homocysteinspiegel in Gruppe F

durch Reduktion der Aktivitäten der Enzyme 5-Methyltetrahydrofolat-Homocystein-

Methyltransferase und 5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktase zu erklären, deren Substrate

Folsäurederivate sind und welche eine zentrale Rolle bei der Remethylierung von Homocystein zu

Methionin spielen. An den Tagen 14 und 16 ist in Gruppe F gegenüber Gruppe K eine signifikante

Erhöhung der Vitamin-B6 Konzentration im maternalen Plasma zu messen. Hier kann gemutmaßt

werden, ob dies Teil einer Kompensationsreaktion ist. Zwischen dem 16. und 20. Tag kommt es in

Gruppe F jedoch zu einem deutlichen Abfall der Vitamin-B6-Konzentration sodass die

Konzentration unter der in Gruppe K liegt. Dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant.

Der Methioninspiegel der Gruppe B im maternalen Plasma hat sich im Gegensatz zu Gruppe F

nicht erhöht. Es hätte vermutet werden können, dass die Remethylierung des Homocysteins durch

das Enzym 5-Methyltetrahydrofolat-Homocystein-Methyltransferase aufgrund eines erhöhten

Substratangebots und der vorhandenen Kofaktoren in Gruppe B gesteigert würde.

Weiterhin verwundert der signifikant erhöhte Methioninspiegel im maternalen Plasma der Gruppe

F an den Tagen 14. und 16. der Trächtigkeit. Da durch die Vitaminrestriktion die Remethylierung

von Homocystein zu Methionin reduziert wird, wäre eher mit einem verringerten

Methioninspiegel zu rechnen gewesen. Die Hemmung dieser Remethylierung in Gruppe F bei

welcher die Folsäure notwendige Methylgruppen überträgt erklärt die erhöhte Konzentration von

Homocystein im maternalen Plasma.

Der Abbau von Homocystein zu Cystathionin und Cystein ist nicht beeinträchtigt, es lassen sich

jedoch bei dieses Parametern im maternalen Plasma keine signifikanten Unterschiede zwischen

den Gruppen K und F finden. Dies hätte im Rahmen einer kompensatorischen Reaktion zur

Senkung des Homocysteinspiegels erwartet werden können. Da die Homocystein abbauenden

Stoffwechselwege nicht beeinträchtigt sind und keine höhere Konzentration von Cystathionin und

Cystein in Gruppe F nachweisbar sind, kann vermutet werden, dass der Organismus in der Lage ist

den erhöhten Anfall von Homocystein Abbauprodukten weiter zu verstoffwechseln. Die

Serinkonzentration im maternalen Plasma der Gruppe F ist gegenüber den Gruppen K und B

83

jedoch am 16. Tag signifikant erhöht. Dies verwundert, da Serin beim Abbau von Homocystein

verbraucht wird.

Das Enzym Serin/Threonin-Hydroxymethyltransferase ist ebenfalls Pyridoxalphosphat abhängig.

Es katalysiert die Reaktion von Serin/Threonin und THF zu Glycin und N5,N10-Methylen-THF.

Dies könnte die signifikant erhöhten Serinwerte im maternalen Plasma der Gruppe F am 16. Tag

erklären. Auch die an allen Tagen in den Gruppen B und F signifikant erhöhte

Threoninkonzentration im maternalen Plasma sowie die an den Tagen 14, 16 und 20 erhöhte

Threoninkonzentration in der Amnionflüssigkeit könnte hierdurch erklärt werden.

Wirtschafter (1958b) konnte zeigen, dass die totale Konzentration freier Aminosäuren in der

Amnionflüssigkeit zum Zeitpunkt der Geburt beim Menschen geringer ist, als die im maternalen

Plasma. Für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Aminosäuren konnte dies am 20.

Trächtigkeitstag (gesamte Tragzeit 22 Tage) lediglich für Glutaminsäure und Asparaginsäure

festgestellt werden. Diese Unterschiede könnten durch die Vermutung von Kedenburg und

Mülling (1975) erklärt werden, dass sich bei der Ratte auch in der die Amnionhöhle umgebenden

Dottersackwand aktive Transportproteine für Aminosäuren befinden und sich daher in der

Amnionflüssigkeit der Ratte eine insgesamt höhere Aminosäurekonzentration findet als beim

Menschen.

Ein unregelmäßiges Auftreten der Aminosäuren Arginin, Ornithin, Glutamin, Tyrosin und

Asparaginsäure im maternalen Serum oder der Amnionflüssigkeit, wie von Wirtschafter (1958b)

beim Menschen beobachtet, konnte in der vorliegenden Arbeit nicht gefunden werden. Lediglich

die maternale Cystein- und Cystathioninkonzentration sowie die fetale Cysteinkonzentration

liegen in dieser Arbeit unterhalb der Nachweisgrenze von 0,5µmol/l.

Wirtschafter (1958a) konnte in einem Versuch mit trächtigen Ratten des Long-Evans Stammes

Ornithin zwar in der Amnionflüssigkeit, nicht jedoch im maternalen Serum nachweisen. In der

vorliegenden Arbeit ist Ornithin jedoch in allen Gruppen über den gesamten Zeitraum sowohl in

der Amnionflüssigkeit als auch im maternalen Serum nachzuweisen. Am 13. Tag ist es

Wirtschafter (1958b) nicht gelungen Asparaginsäure in der Amnionflüssigkeit nachzuweisen.

Am 14. Trächtigkeitstag beträgt die Asparaginsäurekonzentration der Amnionflüssigkeit der

Gruppe K in der vorliegenden Arbeit 50,4 µmol/l.

Obwohl die maternale Plasmakonzentration von Serin in Gruppe F am 16. Tag signifikant erhöht

ist, zeigen sich keine signifikanten Unterschiede der Serinkonzentration in der Amnionflüssigkeit.

84

Jedoch ist der fetomaternale Serinquotienten der Gruppe F gegenüber den Gruppen K und B am

16. Tag signifikant reduziert. Dies könnte auf eine kompensatorische Funktion der Plazenta

hindeuten. Die Serinkonzentration wird unabhängig von der maternalen Konzentration in der

Amnionflüssigkeit konstant gehalten, indem der diaplazentare Serintransport reduziert wird. Da es

sich in allen Gruppen um einen aktiven Transport handelt, kann es also zu einer Repression eines

Transportproteins gekommen sein.

Abb. 5.1.1: SerM: Serinkonzentration im maternalen Plasma im Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Abb. 5.1.2: SerAm: Serinkonzentration in der Amnionflüssigkeit in Verlauf der Trächtigkeit. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

Am 16. und 20. Tag ist im maternalen Plasma der Gruppen B eine signifikant reduzierte

Ornithinkonzentration zu messen. Am 16. Tag ist dies auch in der Amnionflüssigkeit der Fall. Da

Pyridoxalphosphat Coenzym bei der Decarboxylierung von Ornithin zu Putrescin und CO2 ist,

wäre an und für sich mit einer erhöhten Ornithinkonzentration in Gruppe B zu rechnen gewesen.

SerQ

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

14 16 18 20

Tag

K

B

F

Abb. 5.1.3: SerQ: fetomaternaler Serinquotient im zeitlichen Verlauf. Standartabweichungen siehe Tab. 10.1 im Datenanhang

85

SerM

0

50

100

150

200

250

14 16 18 20

Tag

µm

ol/

l K

B

F

SerAm

0

100

200

300

400

500

600

700

14 16 18 20

Tag

µm

ol/l

K

B

F

Die Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Methionin, Prolin, Tyrosin, Serin, Threonin, Histidin,

Butyrat, Cystathionin sowie Glutamin zeigen im zeitlichen Verlauf in der Amnionflüssigkeit einen

parabelförmigen Verlauf mit Scheitelpunkt am 16. Trächtigkeitstag. Die Ausprägung zwischen den

Gruppen ist variabel z.T. zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen. Hierbei

bleibt die maternale Plasmakonzentration weitestgehend konstant, z.T. kommt es zum Abfall der

maternalen Plasmakonzentrationen d.h. es kommt zur Induktion von Transportprozessen ab dem

16. Trächtigkeitstag. Aufgrund der weitestgehend konstant bleibenden maternalen

Aminosäurekonzentration zeigen die entsprechenden fetomaternalen Quotienten ebenfalls einen

parabelförmigen Verlauf.

Die Threoninkonzentration im maternalen Plasma der Gruppen B und F sind gegenüber der

Gruppe K im gesamten Messzeitraum signifikant erhöht. Obwohl dies auch für die

Amnionflüssigkeit gilt, ist der fetomaternale Threoninquotient am 14. Tag in den Gruppen B und F

gegenüber Gruppe K signifikant reduziert. Am 16. Tag ist dies noch in Gruppe F der Fall. Auch in

diesem Fall kann also über eine kompensatorische Reduktion des Threonintransportes diskutiert

werden, der allerdings – im Gegenteil zum Serin- nicht ausreicht die maternalen

Aminosäuredifferenzen zwischen den Gruppen in der Amnionflüssigkeit auszugleichen.

Obwohl sich bei der Aminosäure Citrullin keine signifikanten Unterschiede im maternalen Plasma

zwischen den Gruppen messen lassen, ist die Citrullinkonzentratiom in der Amnionflüssigkeit am

20. Tag in den Gruppen B und F gegenüber Gruppe K signifikant erhöht. Dies spiegelt sich auch

in den fetomaternalen Quotienten wieder, welche am 20. Tag in Gruppe B signifikant und in

Gruppe F mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,06 größer sind als in Gruppe K.

Bei der Aminosäure Butyrat ist am 20. Tag sowohl im maternalen Plasma als auch in der

Amnionflüssigkeit der Gruppen B und F eine signifikant höhere Konzentration zu messen, als in

Gruppe K.

Ähnliches ist bei der Aminosäure Prolin am 20. Tag zu Beobachten. Obwohl es im maternalen

Plasma zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede gibt, ist die Prolinkonzentration

in der Amnionflüssigkeit am 20. Tag in den Gruppen B und F gegenüber Gruppe K signifikant

erhöht. Jedoch ist lediglich zwischen den Gruppen K und F am 20. Tag ein signifikant erhöhter

fetomaternale Aminosäurequotient in Gruppe F zu errechnen.

Bei der Aminosäure Citrullin scheint es also in den Gruppen B und F zum Ende der Trächtigkeit

zur Induktion aktiver Transportprozesse zu kommen, welche in Gruppe K nicht beobachtet werden

kann. Bei Prolin kommt es zu einer höheren Konzentration in der Amnionflüssigkeit, ohne das es

zu einer Zunahme der maternalen Aminosäurekonzentration gekommen ist, während bei Butyrat

86

eine Zunahme der maternalen Konzentration zu messen ist. Mechanismen die eine konstante

Aminosäurekonzentration auf fetaler Seite schaffen scheinen bei diesen Aminosäuren also nicht

vorhanden zu sein.

Bei der Aminosäure Butyrat scheint ein nicht gesättigter maternofetale Aminosäuretransport

vorzuliegen, da sowohl die maternale als auch die fetale Aminosäurekonzentration in den Gruppen

B und F signifikant gestiegen ist, ohne das es zu einem signifikanten Unterschied bei den

fetomaternalen Quotienten gekommen ist.

Bei der Aminosäure Lysin scheint dieser Effekt sogar noch ausgeprägter vorhanden zu sein. Hier

sind bereits am 14. und 16. Tag in den Gruppen B und F gegenüber Gruppe K signifikant erhöhte

Aminosäurekonzentrationen im maternalen Plasma und der Amnionflüssigkeit zu messen

(Irrtumswahrscheinlichkeit an Tag 14 in der Amnionflüssigkeit zwischen Gruppe K und F

p≤0,06). Während diese Unterschiede in der Amnionflüssigkeit auch am 20. Tag noch signifikant

sind, ist im maternalen Plasma lediglich in Gruppe B eine mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von

p≤0,06 eine signifikant erhöhte Aminosäurekonzentration zu messen. Auch an dieser Stelle kann

gemutmaßt werden, dass sich in einem zahlenmäßig größeren Tierversuch am 20. Tag im

maternalen Plasma weiterhin signifikante Unterschiede hätten finden lassen.

Auch bei der Aminosäure Tyrosin scheint es keinen Kompensationsmechanismus zu geben der die

fetale Aminosäurekonzentration konstant hält. Am 14. Tag ist im maternalen Plasma in den

Gruppen B und F eine signifikant erhöhte Aminosäurekonzentration gegenüber Gruppe K zu

messen, am 16. Tag ist dies nur für Gruppe F, am 20. Tag nur für Gruppe B der Fall. Am 14. und

16. Tag ist in Gruppe B eine signifikant erhöhte Tyrosinkonzentration in der Amnionflüssigkeit zu

messen, am 20. Tag ist dies für die Gruppe B und F der Fall. Zwischen der Gruppe K und den

Gruppen B und F gibt es jedoch keine signifikanten Unterschiede bei den fetomaternalen

Aminosäurequotienten, also keine Veränderung der Transportdynamik zwischen den Gruppen.

Ein umgekehrter Effekt ist bei der Aminosäure Ornithin zu beobachten. Hier kommt es an Tag 16

zu einer signifikant reduzierten Konzentration in den Gruppen B und F sowohl im maternalen

Plasma als auch in der Amnionflüssigkeit. Am 20. Tag ist der Unterschied lediglich im maternalen

Plasma nachzuweisen. Hier zeigen sich in den Gruppen B und F gegenüber Gruppe K signifikant

erhöhte fetomaternale Ornithinquotienten. Es scheint also ab den 16. Tag zu einer Induktion des

fetomaternalen Aminosäuretransports in den Gruppen B und F gekommen zu sein, welcher die

reduzierte maternale Aminosäurekonzentration auf fetaler Seite weitestgehend ausgleicht.

87

Bei den Aminosäuren Cystein kommt es ab dem 16. Trächtigkeitstag zu einem starken Anstieg des

maternofetalen Aminosäuretransports in allen Gruppen. Der fetomaternale Aminosäurequotient

der Glutaminsäure ist hingegen ab dem 16. Tag kleiner 1. Bei den Aminosäure Lysin konnte keine

Dynamik des maternofetalen Transfers beobachtet werden.

Der von vielen Autoren (u.a. Battaglia und Regnault (2001) sowie Kedenburg und Mülling (1975))

beschriebene aktive diaplazentare Aminosäuretransport kann somit bestätigt werden. Aufgrund

fehlender bisheriger Arbeiten konnten jedoch keine Vergleichsdaten welche die Dynamik des

Transports beschreiben gefunden werden. Kedenburg und Mülling (1975) stellten fest, dass die

Aminosäurekonzentration in der menschlichen Amnionflüssigkeit gegen Ende der

Schwangerschaft geringer sei als im maternalen Plasma, während dies bei der Ratte umgekehrt

sei. Ein Vergleich der Dynamik des diaplazentaren Aminosäuretransportes ist daher nicht oder nur

sehr eingeschränkt möglich.

Die Vermutung von Kyuma (1984), dass der diaplazentare Aminosäuretransport überwiegend von

der fetalen Plasmakonzentration freier Aminosäuren abhängig ist und nicht von der maternalen

kann für einige Aminosäuren indirekt bestätigt werden. Bei den Aminosäuren Serin und Threonin

sind vermutlich kompensatorische Änderungen in der Transportdynamik zwischen den Gruppen

zu erkennen, durch welche Schwankungen im maternalen Plasma in der Amnionflüssigkeit

ausgeglichen werden, oder dies zumindest versucht wird. Es wird also versucht die amniale

Aminosäurekonzentration konstant zu halten. Daher liegt es nahe, dass die Regulation des

Transports von fetaler Seite aus stattfindet.

Nach Bennett und Jackson (1998) wird der fetale Bedarf an Glycin lediglich durch die

folatabhängige Umwandlung von Serin zu Glycin in der Plazenta gedeckt. In der vorliegenden

Arbeit kann jedoch in Gruppe F keine signifikante Reduktion der Glycinkonzentration in der

Amnionflüssigkeit gemessen werden, wie es zu erwarten gewesen wäre.

5.2 Histomorphologische und Immunhistochemische Untersuchungen

der Plazenten

Im Gegensatz zu Schiebler und Knoop (1959) welche Glykogen in den Riesenzellen lediglich in

Spuren nachweisen konnten, finden sich in fast allen Plazenten des 16. Trächtigkeitstages einzelne

z.T. aber auch mehrere Riesenzellen mit deutlichem PBA positivem, nicht diastaseresistentem

Zytoplasma.

88

Nach Schiebler und Knoop (1959) finden sich Glykogenzellen im Labyrinth in 5er oder 6er

Gruppen, wobei es auch zu Unter- sowie Überschreitungen dieser Zahl kommen kann. Entgegen

diesen Ergebnissen konnten im apikalen Labyrinth Zellgruppen von bis zu 30 glykogenhaltigen

Zellen gefunden werden.

Diese Beobachtungen sind jedoch nicht auf eine Vitaminrestriktion zurückzuführen, da sie in allen

Gruppen gemacht werden. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte der unterschiedlicher

Zuchtstamm sein. Während Schiebler und Knoop (1959) mit Wistar-Ratten arbeiteten, wurden für

die vorliegende Arbeit Ratten des Zuchtstammes LEW.1W verwand.

Glykogenzellen innerhalb des Spongiotrophoblasten konnten in Übereinstimmung mit De Rijk

(2002) gefunden werden.

In Übereinstimmung mit De Rijk (2002) wurden Gruppen von Glykogenzellen ab dem 12. Tag im

Spongiotrophoblasten gefunden, welche sich im weiteren Verlauf der Trächtigkeit reduzierten. Die

Anzahl der Glykogenzellen ändert sich jedoch nicht nur im laufe der Trächtigkeit wie von De Rijk

(2002) beschrieben, sondern stellt sich zwischen den verschiedenen Tieren auch zum selben

Trächtigkeitstag als äußerst variabel dar. Das von De Rijk (2002) beschriebene kolloidale PAS-

positive Material welches den Platz der verlorenen Glykogenzellen einnimmt, konnte weder bei

Bouin noch bei Formalin fixierten Präparaten dargestellt werden. Auch mittels der PBA

Färbemethode konnte kein entsprechendes Material gefunden werden.

In einigen Plazenten zeigten sich jedoch nicht PAS bzw. PBA positive kolloidale Strukturen, der

Großteil des Platzes an welchem wahrscheinlich vormals Glykogenzellen zu finden waren, ist

jedoch leer.

Die von Schiebler und Knoop (1959) beschriebene basalmembranartige Interzellulärsubstanz des

Spongiotrophoblasten kann mit Hilfe der PBA-Färbetechnik, besonders gut an Bouin-fixiertem

Gewebe dargestellt werden.

Die in Gruppe B vermehrt zu beobachtenden Glykogeneinlagerungen um fetale Gefäße des

Labyrinths sind möglicherweise durch die Pyridoxalphosphat Abhängigkeit des Enzyms

Glykogenphosphorylase zu erklären, da die Glykogenphosphorlylase das für die Glykogenolyse

Geschwindigkeitsbestimmende Enzym ist (Löffer und Petrides, 1998, Livanova et al. 2002). Es

hat somit einen katabolen Charakter. Wird die Enzymaktivität durch Entzug eines Koenzyms

reduziert, könnte dies einen anabolen Effekt bewirken, indem es zu einer Reduktion der

Glykogenolyse kommt. Die Reduktion des Glykogenabbaus äußert sich im folgenden in einer

höheren Glykogenkonzentration im Labyrinth der Plazenta.

89

Die verringerte Anzahl Ki-67 positiver Zellen im Labyrinth der Plazenten der Gruppe F ist auf

eine verringerte Zellproliferation zurückzuführen. Als Überträger von 1-Kohlenstoffresten stellt

N10-Formyltetrahydrofolat die Kohlenstoffatome 2 und 8 des Purinkerns und ist somit unmittelbar

an der Bereitstellung der DNS-Basen Adenin und Guanin beteiligt. Auch bei der Bereitstellung der

Pyrimidinbase Thymin spielt die Folsäure eine wichtige Rolle. Bei der durch das Enzym

Thymidylatsynthase katalysierten Reaktion von Desoxyuridinmonophosphat zu

Desoxythymidinmonophosphat stellt N5,N10-Methylentetrahydrofolat einen Methylrest. Bei jeder

Verminderung des Folsäureangebots kommt es daher zu einer Störung der Thyminnucleotid-

Biosynthese und damit der DNS-Replikation. Eine Störung der DNS-Replikation wiederum

beeinträchtigt die Zellproliferation.

Die verringerte Zellproliferation in Gruppe B könnte, wie bereits erwähnt, mit einer verringerten

Aktivität der ASAT zu erklären sein, welche eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation spielt.

Um eine semiquantitative Auswertung der Zellproliferation zu ermöglichen wurde die in 4.8

beschriebenen Auszählung Ki-67 positiver Zellen vorgenommen. Zur Vermeidung von

Verwechslungen zwischen Ki-67 positiven Trophoblastenzellen und fetalen Erythrozyten kann für

nachfolgende Arbeiten angeregt werden, andere Proliferationsmarker zu verwenden.

Der Nachweis apoptotischer Vorgänge mittels des Anti-ACTIVE® Caspase-3 Antikörper

stellte sich als problematisch dar. So sind die 14 Ereignisse in Gruppe B16 allein auf eine

Plazenta zurückzuführen. Hierbei liegt der Verdacht nahe, dass Methodische Fehler zugrunde

liegen.

Ziel der Arbeit mit dem Anti-Laminin Antikörpers ist der Nachweis von α-Laminin als Bestandteil

der Basallamina (Abb. 4.8.8) des fetalen Gefäßendothels. Hierdurch können Aussagen über die

Entwicklung des Gefäßsystemes der Plazenta getroffen werden. In diesem Zusammenhang sei

jedoch darauf hingewiesen, dass ein Vergleich der Basalmembranstärke des fetalen

Gefäßendothels lichtmikroskopisch aufgrund der ohnehin sehr dünnen Basalmembran nicht

möglich ist. Es besteht lediglich die Möglichkeit die Entwicklung des fetalen Gefäßsystems

aufgrund der Peroxidasereaktion abzuschätzen.

Als problematisch bei der Probengewinnung stellte sich die Deckung der Versuchstiere heraus.

Bei etwa 30 Tieren welche täglich gedeckt wurden, dauerte die Gewinnung des Probematerials

etwa 3 Monate. Diese Zeitspanne hätte lediglich durch eine größere Anzahl der zu bedeckenden

Tiere reduziert werden können.

90

Obwohl die Ratte als Versuchstier eine Reihe von bereits erwähnten Vorteilen aufweist (s.S.16),

können die Ergebnisse nicht bedingungslos auf den Menschen übertragen werden. Kedenburg und

Mülling (1975) vermuten, dass sich aktive Aminosäuretransportsysteme bei der Ratte nicht nur in

der Plazenta, sondern auch in der die Amnionhöhle umgebenden Dottersackwand befinden.

Des weiteren stellte sich die Menge der gewonnen Amnionflüssigkeit z.T. als zu gering heraus.

Während das Probevolumen der Amnionflüssigkeit ab dem 14. Tag für die Aminosäureanalytik

ausreichend war, war dies am 12. Trächtigkeitstag teilweise nur durch eine Sammelprobe mehrerer

Tiere erreicht worden. Daher konnten die Ergebnisse der am 12. Tag gewonnenen Proben nicht in

die vorliegende Arbeit mit einbezogen werden. Auch kann vermutet werden, dass in einem

größeren Tierversuch weitere signifikante Unterschiede bezüglich der Aminosäurekonzentrationen

zu finden gewesen wären, da einige Ergebnisse mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit zwischen

p=0,05 und p=0,06 auftraten.

Die Bestimmung von Homocystein in der Amnionflüssigkeit wäre gerade vor dem Hintergrund

der Verstoffwechselung von Homocystein in der Plazenta interessant gewesen da vermutet wird,

dass überwiegend eine Remethylierung des Homocysteins zu Methionin stattfindet, und der

Abbau zu Cystein lediglich in einem deutlich geringerem Umfang stattfindet (Solanky et al.

2010). Dies würde bedeuten, dass der plazentare Homocysteinstoffwechsel überwiegend Folsäure

abhängig und nicht Vitamin-B6 abhängig ist. Inwieweit der plazentare Homocysteinsoffwechsel

Auswirkungen auf die Homocysteinkonzentration in der Amnionflüssigkeit hat, und ob im Falle

einer Folsäurerestriktion der Abbau zu Cystein induziert wird um dem Homocysteinspiegel

möglichst niedrig zu halten, wären interessante Fragen für die Zukunft.

Auch für während der Arbeit neu aufgetretene Fragestellung war das Probevolumen zu gering.

So wäre die Bestimmung von Xanturensäure in der Amnionflüssigkeit interessant gewesen, da

diese einen Komplex mit Insulin bildet und dessen biologische Verfügbarkeit deutlich herabsetzt

(Kotake et al. 1968). Xanturensäure fällt bei einem Vitamin-B6-Mangel vermehrt an, und es ist

aufgefallen das einige Feten der Gruppe B deutlich makrosom waren, welches auf einen

Schwangerschaftsdiabetes hinweisen könnte.

Des weiteren wurden Gefrierpräparate der Plazenten angefertigt um Untersuchungen

durchzuführen, welche an den Formalin bzw. Bouin fixierten Präparaten nicht möglich sind. Zu

nennen ist hier beispielsweise der Nachweis von Lipiden mittels einer Sudan-Färbung. Dieses

wäre zwar grundsätzlich möglich gewesen, jedoch stellte sich der Erhalt des Gewebes als schlecht

heraus. Als Grund hierfür wird die Probengewinnung vermutet, bei welcher die Plazenten auf

Trockeneis gelegt wurden. Mitunter hätte eine vorherige Fixierung in flüssigem Stickstoff hier

Abhilfe schaffen können.

91

In der Diskussion der Ergebnisse stellte sich die vorhandene Literatur insbesondere bezüglich der

Aminosäureanalytik in der Amnionflüssigkeit als äußerst spärlich heraus, welches die Einordnung

der eigenen Ergebnisse erschwerte.

6. Literaturupdate und Ausblick

Die praktische Durchführung der Arbeit erfolgte im Jahr 2007. Im folgenden soll auf

zwischenzeitliche Entwicklungen in der Literatur eingegangen werden.

Franke et al. (2009) konnten einen genetischen Polymorphismus nachweisen, welcher mit einem

geringeren Risiko für Spina bifida assoziiert ist. Grund hierfür ist ein erhöhter Vitamin-B12

Spiegel und ein wahrscheinlich hieraus resultierender erhöhter Folsäurespiegel in den

Erythrozyten. Das entsprechende Gen CUBN kodiert ein Intrinsic-Faktor-Cobalamin Rezeptor.

Um das Zusammenspiel der über 15 Transportproteine für Aminosäuren in der Plazenta besser

abschätzen zu können, entwickelten Sengers et al. (2010) ein mathematisches Modell, welches die

Zusammenarbeit der Transportproteine als System berechnet.

Solanky et al. (2010) konnten nachweisen, das die mRNA welche die Enzyme Methionin-

Synthase und 5,10-Methylentetrahydrofolatreduktase kodiert in der menschlichen Plazenta

zwischen dem ersten Trimenon und dem Ende der Schwangerschaft in ähnlicher Menge

exprimiert werden wie in der Leber. Die mRNA für die Cystathionin-beta-Synthase ist im

Vergleich zur Leber in einer deutlich geringeren Menge zu finden. Dies deutet daraufhin, das

Homocystein in der Plazenta überwiegend mit Hilfe von 5,10-Methylentetrahydrofolat zu

Methionin remethyliert wird, und nicht zu Cystein abgebaut wird. Diese Ergebnisse weisen auf die

Wichtigkeit der perikonzeptionellen Folsäuresubstitution hin.

Der diaplazentare Homocysteintransport findet mit hilfe der Transportsysteme L, A und y(+)L

statt, wie Tsitsiou et al. 2009 zeigen konnten.

Jansson (2009) stellt in einem Review fest, dass mehrere Arbeiten einen beeinträchtigten

diaplazentaren Aminosäuretransport bei einem erhöhten maternalen Homocysteinspiegel zeigen.

Einige Arbeiten zeigen diesen Effekt vorwiegend bei essentiellen Aminosäuren. Vermutet wird

hier u.a. eine kompetitive Hemmung der Transportproteine durch Homocystein.

Weitere Fragen die sich aus dieser Arbeit ergeben haben sind der bereits erwähnte

Homocysteinstoffwechsel in der Plazenta, insbesondere in der Gruppe F. Wenn überwiegend eine

Remethylierung von Homocystein zu Methionin erfolgt, stellt sich die Frage, in welchem Maße

92

die Feten der Gruppe F im Vergleich zu Gruppe B bzw. auch K einer erhöhten

Homocysteinkonzentration ausgesetzt sind. Welche Rolle spielt also der plazentare

Homocysteinstoffwechsel für dessen Konzentration in der Amnionflüssigkeit?

Auch die Vermutung dass ein Vitamin-B6 Mangel durch Bindung des Insulins an Xanthurensäure

während der Trächtigkeit, eine Glukosetolleranzstörung hervorruft gilt es zu untersuchen. Hierbei

wäre nicht nur die Glukosekonzentration im maternalen Plasma sowie der Amnionflüssigkeit

interessant, sondern auch die Menge an Xanthurensäure um dem Pathomechanismus

nachvollziehen zu können.

Okada et al. (1991) konnten an Ratten zeigen, dass bei einem Vitamin-B6 Mangel im M.

Gastrocnemius und im Herz die Aktivität der Glykogenphosphorylase signifikant reduziert ist.

Auch konnte in diesen Geweben vermehrt Glykogen nachgewiesen werden. In der Leber konnten

diese Veränderungen jedoch nicht beobachtet werden. Folglich kann vermutet werden das es bei

einem Vitamin-B6 Mangel auch in der Plazenta zu einer Hemmung der Glykogenphosphorylase

kommt, welche für das Vermehrte Auftreten PBA positiver Strukturen verantwortlich ist. Zum

Nachweis wären jedoch organspezifische Enzymaktivitätsbestimmungen notwendig.

Welche Rolle der Vitaminmangel der trächtigen Ratte auf den Stoffwechsel der Neugeborenen hat

ist ebenfalls weiterhin unklar.

Auch die Frage ob es einen kausalen Zusammenhang zwischen den gemessenen Unterschieden

der Aminosäurekonzentration in der Amnionflüssigkeit und der Pathogenese der bekannten

Fehlbildungen gibt, gilt es noch zu klären, da dies zum gegenwärtigen Zeitpunkt zwar

wahrscheinlich scheint, jedoch nicht sicher nachgewiesen werden konnte. Dies gilt auch für die

Frage, inwieweit die morphologischen Veränderungen an der Plazenta für die veränderten

Aminosäurekonzentrationen verantwortlich sind.

Auch die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen für den diaplazentaren

Aminosäuretransport, insbesondere wenn es zu scheinbar kompensatorischen Änderungen in der

Transportkinetik kommt, sind noch nicht hinreichend bekannt.

93

7. Zusammenfassung

Ziel der Arbeit war es, den diaplazentaren Aminosäuretransport trächtiger LEW.1A-Ratten

während eines induzierten Folsäure- oder Vitamin-B6-Mangel zu quantifizieren, sowie

histomorphologische Reaktionen der Plazenten zu erfassen.

Von beiden Vitaminen ist bekannt, dass am Menschen peri- bzw. postkonzeptionelle

Hypovitaminosen zu schweren Fehlbildungen wie z.B. Reifungsstörungen des ZNS und zu

Spaltenbildungen im Mund-Kiefer-Gesichtsbereich führen können.

Zu diesem Zweck wurden die Ratten in die Gruppen K= Kontrolle, B= induzierter Vitamin-B6-

Mangel und F= induzierter Folsäuremangel eingeteilt. Die Tiere wurden ab dem Tag der

Konzeption mit entsprechendem vitaminfreien Futter versorgt. Die Probenentnahme fand an den

Tagen 14, 16 und 20 der Trächtigkeit statt, es wurden Blut und Amnionflüssigkeit sowie Plazenten

entnommen.

Neben den Vitaminspiegeln des maternalen Plasmas welche, den Vitaminstatus der Tiere

anzeigen, wurden auch indirekte Parameter wie der Homocysteinspiegel, die Aktivität der Vitamin

B6-abhängigen Enzyme ASAT und ALAT im Plasma erfasst, um eine Aussage über den

funktionellen Vitaminstatus der Tiere geben zu können. In Gruppe B ist zwischen dem 14. und 20.

Tag im maternalen Plasma eine signifikant reduzierte Vitamin-B6-Konzentration gegenüber

Gruppe K gemessen worden. Im Gegensatz hierzu ist in Gruppe F am 14. und 16. Tag eine

signifikant höhere Vitamin-B6-Konzentration gemessen worden als in Gruppe K. In Gruppe F ist

zwischen dem 14. und 20. Tag eine signifikant reduziert Folsäurekonzentration in maternalen

Plasma gemessen worden. Die Homocysteinkonzentration in den Gruppen B und F ist an den

Tagen 14 und 16 gegenüber Gruppe K signifikant erhöht. Nachdem es am 14. Tag lediglich in

Gruppe B zu einer signifikanten Reduktion der Enzymaktivität der ALAT kommt, ist diese an den

Tagen 16 und 20 sowohl in Gruppe B als auch in Gruppe F zu messen. Die Aktivität der ASAT am

16. Tag ist in Gruppe B gegenüber den anderen Gruppen signifikant reduziert, am 20. Tag ist die

Aktivität in Gruppe F gegenüber Gruppe K signifikant reduziert.

Des weiteren wurden die Aminosäurekonzentrationen sowohl im maternalen Plasma als auch in

der Amnionflüssigkeit bestimmt und ein feto-maternaler Aminosäure-Quotient errechnet, welcher

Auskunft über den aktiven diaplazentaren Transport gibt. Dabei zeigte sich, dass der aktive

Aminosäuretransport während der Trächtigkeit einer zeitlichen Dynamik unterliegt.

94

Zur Interpretation der diaplazentaren Transportprozesse ist dieser entwickelte Quotienten nützlich.

Hiermit konnte gezeigt werden, dass der Graph der Quotienten während der Trächtigkeit einen

parabelförmigen Verlauf nimmt.

Demnach greift ein Vitamin B6-Mangel massiv in den Aminosäure Stoffwechsel und damit auch

in den diaplazentaren Transport ein. Es zeigen sich im Verlaufe der Trächtigkeit höhere

Quotienten der Gruppe B bezüglich der Aminosäuren Glycin, Citrullin und Ornithin im Vergleich

zur Gruppe K. Andererseits fiel der Quotient für die Aminosäuren Threonin und Cystathionin in

der Gruppe B signifikant im Vergleich zur Gruppe K.

Ein Folsäuremangel bewirkt bezüglich des diaplazentaren Transportes im Vergleich zur Gruppe

K folgende Ergebnisse: Der Quotient für die Aminosäuren Asparaginsäure, Glutamin, Glycin und

Ornithin nimmt im Laufe der Trächtigkeit signifikant zu. Dagegen sind die Quotienten der Gruppe

F für die Aminosäuren Threonin, Serin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Prolin, Butyrat,

Methionin, Isoleuzin, Histidin und Arginin im Vergleich zur Gruppe K signifikant erniedrigt.

Schlußfolgernd kann eine Dynamik der maternalen sowie der amnialen

Aminosäurekonzentrationen sowie deren Quotienten beschrieben werden. Zur Einordnung dieser

Ergebnisse ist zu konstatieren, dass sowohl ein Folsäure- als auch Vitamin B6-Mangel zu

massiven Störungen des diaplazentaren Aminosäuretransportes führen.

Auch bei den histomorphologischen Untersuchungen der Plazenten können Unterschiede

beschrieben werden. So sind bei den Bouin fixierten Präparaten in der PBA Färbung in der

Gruppe B dichtere PBA positive Strukturen um größere fetale Gefäße zu finden als in Gruppe K.

Auch sind in Formalin fixierten Präparaten in Gruppe B vermehrt Glykogeneinlagerungen um

kleine fetale Gefäße im Labyrinth zu finden. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Vitamin-B6

Abhängigkeit des Enzyms Glykogenphosphorylase, welches eine wichtige Rolle bei der

Glykogenolyse spielt.

Möglicherweise stellen die in der Gruppe B übermäßigen Glykogeneinlagerungen um die fetalen

Gefäßwände des Labyrinths und die Verstärkungen der Basallamina des Amnionepithels eine

Diffusionsbarriere dar. Des weiteren sind in allen Gruppen größere Ansammlungen von

Glykogenzellen im apikalen Labyrinth zu finden als in der Literatur beschrieben, womöglich sind

diese Unterschiede tierstammspezifisch begründet.

Diese morphologischen Veränderungen haben vermutlich einen funktionellen Einfluß auf die

Versorgung der Feten und erklären 20% mehr Resorptionen der Früchte in der Gruppe B

gegenüber den Gruppen K und F. Zudem zeigt sich zwischen Spongiotrophoblast und Labyrinth

der Gruppe B eine stärkere granulozytäre Infiltration als in den übrigen Gruppen.

95

Der Vitamin B6-Mangel an der trächtigen Ratte induziert stärkere negative Einflüsse auf die

Plazento- und Fetogenese als ein Folsäuremangel. Einige Feten der Gruppe B zeigten starke

Übergewichtigkeit. Dies deutet auf einen Schwangerschaftsdiabetes hin, welcher durch die

Bindung des Insulins an Xanthurensäure induziert sein könnte. Hierzu sind weitere

Untersuchungen nötig.

Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Bedeutung der perikonzeptionellen Folsäure- und

Vitamin B6-Substitution.

Mit dem Nachweis veränderter Aminosäurekonzentrationen in der Amnionflüssigkeit bei Vitamin-

B6- oder Folsäuremangel während der Trächtigkeit konnte ein weiterer zu berücksichtigender

Baustein in der Pathogenese von ZNS Reifungsstörungen sowie Spaltenbildungen erbracht

werden.

Die scheinbar kompensatorische Reaktion der Plazenta auf veränderte maternale

Aminosäurekonzentrationen bzw. einen beeinträchtigten Aminosäurestoffwechsel, welche bei

einigen Aminosäuren zu beobachten ist, mag einen Impuls für weiterführende Arbeiten geben.

96

8. Abkürzungsverzeichnis:

ALAT: Alanin-Aminotransferase = GPT: Glutamat-Pyruvat-Transaminase

ASAT: Aspartat-Aminotransferase = GOT: Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

BrdU: 5-Bromodeoxyuridin

CBS: Cystathion β-Synthase

DAB: 3,3´-Diaminobenzidin

dTMP: Desoxythyminmonophosphat

dUMP: Desoxyuridinmonophosphat

EAST: erythrozytäre Aspartat-Aminotransferase

EtOH: Ethylalkohol

FABP: Folsäure bindendes Protein

HE: Hämatoxylin-Eosin

LKGS: Lippen-Kiefer-Gaumen-Segel-Spalte

MTHFR: Methylentetrahydrofolatreduktase

ND: Neuralrohrdefekt

PAS: Periodic-acid-Schiff-reaction

PBA: Perjodsäure-Bisulfit-Aldehydthionin

PFRs: high-affinity membrane-associated placental folate receptors

PBS: Phosphate Buffer Solution

THF: Tetrahydrofolsäure

97

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, daß ich die vorliegende Dissertation selbständig verfaßt und keine anderen als

die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.

Ich erkläre, daß ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und daß eine

Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Datum Unterschrift

117

Danksagung

In erster Linie danke ich Herrn Univ.-Prof. Dr. M. Zygmunt für die Durchsicht der Arbeit sowie

für seine konstruktive Kritik.

Gleich an zweiter Stelle möchte ich Herrn Dr. Jens Weingärtner aus dem Institut für Anatomie und

Zellbiologie nennen. Ihm danke ich insbesondere für seine gute fachliche Betreuung, für hilfreiche

Hinweise und eine unkomplizierte Zusammenarbeit.

Nicht zuletzt möchte ich mich auch bei Frau Dr. K. Lotz bedanken, welche mir wertvolle

Hinweise bei der Aufbereitung der histologischen Präparate gab.

Auch bei Frau M. Bansemir, Mitarbeiterin des Instituts für Anatomie und Zellbiologie bedanke ich

mich für Ihre Hilfe bei der Aufarbeitung der histologischen Präparate.

Für die statistische Auswertung der gewonnenen Daten danke ich Herrn PD Dr. G. Kundt aus dem

Institut für Medizinische Informatik und Biometrie der Universität Rostock.

118

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