Einfluss bariatrischer Chirurgie auf das Metabolom des Urins fileOrt, Raum: Klinik und Poliklinik...

Aus dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin

(Direktor Univ.- Prof. Dr. med. M. Nauck)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Einfluss bariatrischer Chirurgie auf das Metabolom des Urins

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2012

vorgelegt von

Arne Jungnickel

geb. am 17.11.1983

in Halle/Saale

________________________________________________________________________________________ 2

Dekan: Prof. Dr. med. dent. R. Biffar

1. Gutachter: Prof. Dr. med. H. Wallaschofski

2. Gutachter: Prof. Dr. med. W. Gronwald (Regensburg)

Ort, Raum: Klinik und Poliklinik für Innere Medizin A, Ferdinand-Sauerbruch- Straße, 17475 Greifswald, Seminarraum O0.65

Tag der Disputation: Dienstag, 25. Juni 2013

________________________________________________________________________________________ 3

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG 5

1.1. Adipositas und bariatrische Chirurgie 5

1.2. Metabolomik 11

2. METHODEN 13

2.1. Patientenkollektiv 13

2.2. Bestimmung der Metabolitenprofile mittels NMR-Spektrometrie von Urin 15

2.3. Statistische Methoden 16

3. ERGEBNISSE 21

3.1. Deskriptive Statistik 21

3.2. Metabolomik 25

4. DISKUSSION 33

4.1. Deskriptive Statistik 33

4.2. Metabolomik 33

4.3. Stärken und Limitationen der Studie 39

5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 42

6. LITERATURVERZEICHNIS 44

7. ANHANG 50

7.1. Eidesstattliche Erklärung 50

7.2. Danksagung 51

________________________________________________________________________________________ 4

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

BMI Body-Mass-Index

BPD Biliopankreatische Diversion

DModX Distance to the Model

FID Aufnahme des zeitabhängigen Signals in der Empfängerspule (Free Induction Decay)

GDM Genetisch determinierter Metabotyp

GIP Gastric Inhibitory Peptide

GLP-1 Glucagon-like-peptide-1

HOMA-IR Homeostatic model assessment of insulin resistance

NMR Kerspinresonanzspektroskop (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)

OPLS Orthogonal partial least squares

OPLS-DA Orthogonal partial least squares discriminant analysis

PC Hauptkomponente (Principal component)

PCA Hauptkomponentenanalyse (Principal component analysis)

PLS Partial least squares

PLS-DA Partial least squares discriminant analysis

ppm Parts per million

RD Relaxationsverzögerung (Relaxation delay)

TSP Natriumtrimethylsilylpropionat

VIP-Plot Variable importance in the projection-Plot

WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization)

________________________________________________________________________________________ 5

1. Einleitung

1.1. Adipositas und bariatrische Chirurgie

Adipositas ist eine chronische Erkrankung multifaktorieller Genese. In der Verantwortung

finden sich genetische Faktoren genauso wie Gewohnheiten in der Nahrungsaufnahme

und körperlichen Aktivität sowie soziale und kulturelle Faktoren (1). In Deutschland zeigen

Studien, dass 6,3 % der drei- bis 17-jährigen (2) und 12,9 % der über- 18-jährigen von

einer Adipositas betroffen sind (3). Weltweit gehen Schätzungen von rund 500 Millionen

Betroffenen aus, wobei die Tendenz über die letzten drei Jahrzehnte als steigend

beobachtet worden ist (4). Frauen sind von dieser Epidemie häufiger betroffen als

Männer. Abbildung 1 zeigt die geschätzte Prävalenz der Adipositas Grad I bei Frauen

weltweit im Jahr 2010.

Abbildung 1: Geschätzte Prävalenz Adipositas Grad I (BMI ≥ 30 Kg/m²), Frauen, Alter 15+, 2010 Quelle: WHO Global Infobase: International Comparisons

Eine Einteilung der Schwere der Erkrankung geschieht nach der

Weltgesundheitsorganisation (engl. World Health Organization [WHO]) anhand des Body-

Mass-Index (BMI) in Kg/m² entsprechend Tabelle 1.

________________________________________________________________________________________ 6

Tabelle 1: Einteilung der Adipositas nach Body-Mass-Index (BMI). *: Adipositas Grad III wird in der Literatur auch bezeichnet mit Adipositas permagna oder morbide Adipositas. Tabelle nach: WHO, 2000. Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a WHO Consultation. In WHO Technical Report Series.

Kategorie nach WHO BMI in Kg/m2

Normalgewicht 18,5 – 24,9

Übergewicht 25 – 29,9

Adipositas Grad I 30 – 34,9

Adipositas Grad II 35 – 39,9

Adipositas Grad III* ≥40

Auf Grund sozialer Stigmata und persönlicher Unzufriedenheit sind Adipöse psychisch

und emotional belastet (3). Weiterhin wird eine Zunahme der Prävalenz für Krankheiten

wie Bluthochdruck, kardiovaskuläre Erkrankungen, Lipidstoffwechselstörungen,

Insulinresistenz und Typ 2 Diabetes mellitus, Gallenblasenerkrankungen, Schilddrüsen-

und Nebenschilddrüsenfehlfunktion, Schlaganfall, obstruktives Schlafapnoe-Syndrom,

Steatosis hepatis und degenerative Gelenkerkrankungen beobachtet (1,5–7). Darüber

hinaus wird eine Assoziation zu Malignomen beschrieben. So wird in einem Artikel von

Calle und Kollegen (8) Adipositas für 14 % der männlichen und 20 % der weiblichen

Krebstoten in einem Zeitraum von 25 Jahren in den USA verantwortlich gemacht.

Insgesamt kann in den genannten Adipositas-bedingten Morbiditäten eine Ursache für die

verminderte Lebenserwartung in Personen mit Adipositas gesehen werden (9).

Neben den persönlichen Folgen stellt die Adipositas ein großes

gesundheitsökonomisches Problem dar. Erkrankungen assoziiert mit Übergewicht und

Adipositas verursachten im Jahr 2002 geschätzte direkte Kosten in Höhe von 4 854

Millionen EUR und stellten damit 2,1 % der Gesamtausgaben im Gesundheitswesen der

Bundesrepublik Deutschland dar. Indirekte Kosten, verbunden z.B. mit

Produktivitätsausfall durch Invalidität oder Tod, beliefen sich auf geschätzte 5 019

Millionen EUR (3).

Behandlungsversuche der morbiden Adipositas sowie des Übergewichtes beinhalten den

Versuch einer Herbeiführung von Verhaltensänderungen – gesteigerte körperliche

Aktivität, Reduzierung der täglich aufgenommenen Kalorien zusätzlich zu einer generellen

Umstellung des Diätplans – erreicht durch psychosoziale/psychotherapeutische

________________________________________________________________________________________ 7

Interventionen, Ernährungsberatung und Physiotherapie (10). Zusätzlich gibt es die

Option der Therapie mit Medikamenten wie Orlistat und - im Prinzip als Ultima ratio - die

irreversible Möglichkeit der bariatrischen Chirurgie.

Da bisherige Studien zeigen konnten, dass die bariatrische Chirurgie aktuell die

effektivste Methode ist, einen zügigen, langanhaltenden und vor allem relevanten

Gewichtsverlust herbeizuführen, hat sie sich in vielen Zentren als bevorzugte Therapie zur

Behandlung morbider Adipositas durchgesetzt (10–12). Dabei sind bariatrische

Maßnahmen kosteneffektiv gegenüber der konservativen Behandlung oder keiner

Behandlung (13). Bei Komorbidität mit z.B. Diabetes mellitus ist Kosteneffektivität in

mehreren Studien international deutlich belegt worden (14–16), so auch namentlich für

Deutschland (17).

Aktuelle Leitlinien legitimieren alle Patienten zur bariatrischen Chirurgie, welche in nicht-

chirurgischen Modalitäten keinen Behandlungserfolg erzielen konnten, von Adipositas

Grad III betroffen sind oder mindestens Adipositas Grad II und eine schwere,

„adipositasassoziierte Folge-/Begleiterkrankung aufweisen“ (6).

Analog zur Zunahme des Anteils übergewichtiger und adipöser Menschen an der

Gesamtbevölkerung nimmt die Nachfrage nach bariatrischer Chirurgie in Deutschland,

wie auch global, exponentiell zu (6,18). So wurden im Jahr 2008 weltweit nahezu 350 000

bariatrische Eingriffe vorgenommen (10). Dabei sind die am häufigsten durchgeführten

Verfahren das variable Magenband mit einem Anteil von 42 %, der Roux-en-Y

Magenbypass mit einem Anteil von 39 % und die Bildung eines Schlauchmagens mit

einem Anteil von 5 % (19). Standardmäßig werden diese Verfahren heute laparoskopisch

durchgeführt (6).

Die in der bariatrischen Chirurgie benutzten Operationsmethoden lassen sich nach den

Hauptmechanismen ihrer Wirkung grob einteilen in restriktive und malabsorptive

Verfahren sowie Mischformen aus Beidem. Den primär restriktiven Verfahren ist gemein,

dass durch eine starke Verkleinerung des Magens die Nahrungszufuhr limitiert werden

soll und sich gleichzeitig ein Sättigungsgefühl früher einstellt. Zu den heute üblichen

primär restriktiven Verfahren gehören der Magenballon, das variable Magenband und die

Bildung eines Schlauchmagens. Zu den Verfahren mit überwiegend malabsorptiver

Komponente gehören die „Biliopankreatische Diversion nach Scopinaro“ und der distale

________________________________________________________________________________________ 8

Magenbypass. Beide Verfahren stellen Außenseiter dar und zählen nicht zu den aktuell

gängigen Verfahren (6). Mechanismus der malabsorptiven Verfahren ist eine späte

Vermischung der Verdauungssäfte aus Galle und Pankreas mit der aufgenommenen

Nahrung. Dadurch kommt es zu einer späteren und reduzierten Aufnahme von

Energieträgern aus der Nahrung, vor allem von Fett (18).

Zu den gängigen Kombinationsverfahren gehören der bereits erwähnte Roux-en-Y

Magenbypass und die biliopankreatische Diversion mit/ohne Duodenalswitch. Die

Kombinationsverfahren sollen die Vorteile der restriktiven Maßnahmen mit denen der

malabsorptiven vereinen, sind aber in der Durchführung schwieriger und auch

komplikationsbelasteter als die rein restriktiven Verfahren (10,18).

Die Fähigkeit, zu einem Gewichtsverlust zu führen, ist bei den erwähnten Verfahren

unterschiedlich. In einem systematischen Review von Padwal und Kollegen (10) konnten

folgende Werte anhand von 2 600 Patienten ermittelt werden: Im Vergleich zur

konservativen Behandlung wurde bei der biliopankreatischen Diversion ein Verlust um

11,2 Kg/m2, der Schlauchmagenbildung um 10,1 Kg/m2, dem Roux-en-Y Magenbypass

um 9,0 Kg/m2 und dem adjustierbaren Magenband um 2,4 Kg/m2 innerhalb eines Jahres

nach Operation beobachtet. Konservative Behandlung schloss Diäten und Diäten in

Verbindung mit Sportprogrammen ein.

Hormonelle Beeinflussung spielt bei allen Verfahren eine Rolle. So verändert die

Schlauchmagenbildung durch ihren hohen Anteil an reseziertem Magengewebe die

Wirkung des Hormons Ghrelin. Dies wird vor allem darauf zurückgeführt, dass bei der

Entfernung von ca. 4/5 des Magens auch 80 % der Ghrelinrezeptoren verloren gehen

(18). Ghrelin wird für eine Vermittlung von Hungergefühl im Zentralnervensystem

verantwortlich gemacht (20). Wird, wie bei den Kombinationsverfahren und den

überwiegend malabsorptiven Verfahren, die Nahrungspassage durch große Teile des

Magens sowie Duodenums ausgeschaltet, hat dies u.a. einen Einfluss auf das Glukagon-

like-peptide-1 (GLP-1) und das Gastric-inhibitory-peptide (GIP). Diese befinden sich

ebenfalls in der Diskussion um ihren Anteil an der Genese der Adipositas und des

Diabetes mellitus. GLP-1 und GIP sind verantwortlich für ca. 50 % der postprandialen

Insulinsekretion (21,22). Die hormonellen Veränderungen werden auch als Ursache

diskutiert, warum die bariatrische Chirurgie einen frühzeitigen positiven Einfluss auf den

________________________________________________________________________________________ 9

Verlauf metabolischer Folgeerkrankungen wie Typ 2 Diabetes mellitus und Hypertonie

nimmt.

So benötigten in einer Studie von Kiong und Kollegen (23) über 50 % der Patienten

innerhalb von vier Wochen nach dem Roux-en-Y Magenbypass keine antidiabetische

Medikation mehr. Diese Veränderung trat auf, bevor sich signifikanter Gewichtsverlust

einstellte. Darüber hinaus wurde eine signifikante Verringerung der Insulinresistenz 15

Tage nach Biliopankreatischer Division nach Scopinaro beobachtet (24). Nach

Magenbypassoperation kommt es postprandial zu einem Anstieg der Inkretine, namentlich

GLP-1 und GIP. Diese Veränderungen wurden nicht nach einem allein durch Diät

erreichten äquivalenten Gewichtsverlust gesehen (25). Außerdem gleicht sich der

Inkretin-vermittelte Effekt auf die Insulinausschüttung - bei Typ 2 Diabetes mellitus-

Patienten abgeschwächt - dem schlanker Kontrollen innerhalb eines Monats nach

Magenbypass-Operation an (26). Weiterhin wird von einer Senkung der Hypertonie und

systemischer Entzündungsmarker (wie das C-reaktive Protein) innerhalb der ersten vier

Wochen nach adjustierbarem Magenband, Roux-en-Y Magenbypass und

Schlauchmagenbildung berichtet (27,28). Für Roux-en-Y Magenbypass wurde bereits

nach einer Woche post-operativ eine Verringerung der diastolischen und systolischen

Blutdruckwerte beobachtet, ohne dass es in diesem Zeitraum zu signifikantem

Gewichtsverlust gekommen war (29). Ferner wurde in Nagetiermodellen des Roux-en-Y

Magenbypasses ein anhaltender Gewichtsverlust und eine verringerte

Nahrungsaufnahme beobachtet, obwohl die Tiere bei einer hochkalorischen Diät gehalten

wurden (30). Auch für durch Schlauchmagenbildung operierte Nagetiere konnte ein

anhaltender Gewichtsverlust in Verbindung mit reduzierter Nahrungsaufnahme

beobachtet werden. Selbst als sich die Nahrungsaufnahme der nicht-operierter Kontroll-

Tiere anglich, nahmen die operierten Tiere nicht an Gewicht zu (31). Dies legt nahe, dass

bariatrische Chirurgie auch das Verhalten bei der Nahrungsaufnahme beeinflusst. So

konnte gezeigt werden, dass Patienten postoperativ weniger hungrig und früher satt sind

(32), dass sie eine veränderte Geschmackswahrnehmung haben (33,34) und eine

reduzierte Präferenz für Nahrung mit hoher Energiedichte aufweisen (35). Der Einfluss auf

Appetit und Sättigungsgefühl konnte in einer prospektiven, doppelblinden Studie von

Karamanakos und Kollegen für den Roux-en-Y Magenbypass und die

Schlauchmagenbildung dokumentiert werden (36).

________________________________________________________________________________________ 10

Die Patienten in dieser Arbeit wurden entweder mit der Bildung eines Schlauchmagens

oder dem Roux-en-Y Magenbypass operativ behandelt.

Dabei wird die Schlauchmagenbildung standardmäßig laparoskopisch durchgeführt. Das

gastrokolische Band (Ligamentum gastrocolicum) wird magennah durchtrennt. Das große

Netz (Omentum majus) wird nicht entfernt. Über den Mund wird eine 32 - 44

French/Charr-Magensonde in den Magen eingeführt und kleinkurvaturseitig platziert.

Diese dient als Kalibrierung und Leitstruktur. Danach wird ab Beginn des netzfreien

Anteils der großen Kurvatur begonnen, mit dem Klammernahtgerät in Richtung His-Winkel

zu resezieren. Antrum und Pylorus werden erhalten, große Kurvatur und Fundus werden

entfernt. Der resezierte Magenanteil sollte ein Volumen von mindestens 500 ml

aufweisen. Der verbleibende Schlauchmagen sollte nur noch ein Füllungsvolumen von

100-150 ml aufweisen (6,18). Abbildung 2, links illustriert dies schematisch.

Abbildung 2. Links: Bildung eines Schlauchmagens. Antrum und Pylorus werden erhalten, große Kurvatur und Fundus werden entfernt. Rechts: Roux-en-Y Magenbypass. Jejunum wird direkt an den Magenpouch anastomosiert, der Rest-Magen verbleibt in Situ. Hier Seit-zu-Seit-Anastomose zwischen alimentärer und biliopankreatischer Schlinge. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. med. Th. Hüttl (37).

Der Roux-en-Y Magenbypass wird ebenfalls standardmäßig laparoskopisch durchgeführt.

Dazu wird der Magen unterhalb des Ösophagus mit dem Klammernahtgerät durchtrennt.

Dabei wird kleinkurvaturseitig ein Stück Magenanteil mit Volumen von ~30 ml

(Magenpouch) belassen. Der größere, von der Nahrungspassage ausgeschlossene

________________________________________________________________________________________ 11

Magenrest, verbleibt an ursprünglicher Stelle. Die Rekonstruktion der Nahrungspassage

erfolgt nach Roux-en-Y. Dazu wird der Dünndarm distal des Treitz-Bandes (Ligamentum

suspensorium doudeni) durchtrennt und der aborale Schenkel mit Hilfe des

Klammernahtgerätes an den Magen-Pouch anastomosiert. Anschließend wird eine End-

zu-Seit oder Seit-zu-Seit Anastomose zwischen alimentärer und biliopankreatischer

Schlinge geschaffen, um ein Zusammentreffen der Gallen- und Pankreassekrete mit der

Nahrung zu ermöglichen. Die Länge der biliopankreatischen Schlinge beträgt in der Regel

50 bis 100 cm und die der alimentären Schlinge 100 bis 250 cm (6,18). Abbildung 2,

rechts zeigt eine schematische Übersicht.

Insgesamt muss erwähnt werden, dass die vollständigen Mechanismen, die zu den

beeindruckenden Ergebnissen der o.g. Maßnahmen führen, noch Gegenstand der

Forschung sind. Der Gewichtsverlust allein kann diese Veränderungen nicht erklären.

1.2. Metabolomik

Der Begriff Metabolomik umfasst die Identifikation und Quantifizierung aller

Stoffwechselprodukte (Metabolite) einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder eines

gesamten Organismus unter verschiedenen Bedingungen zu einem bestimmten

Zeitpunkt. Das Metabolom bezeichnet die Gesamtheit aller Metabolite einer Probe. Es ist

dynamisch und repräsentiert das Antwortverhalten auf einen, die jeweilige Entität

betreffenden, Stimulus (38). Es ist wie ein Fingerabdruck z.B. einer Zelle in einer

bestimmten Situation und kann genutzt werden, um Veränderungen zu klassifizieren, um

sie in anderen Zellverbänden zu detektieren oder um nachzuweisen, dass bestimmte

Einflüsse bestehen oder nicht mehr bestehen.

Bestimmt wird das Metabolom aus Körperflüssigkeiten wie Plasma und Urin oder aus

Extrakten von Zellverbänden und Organen.

Zur Messung nach Auftrennung werden massenspektrometrische Verfahren oder das

Kernspinresonanzspektroskop (engl. nuclear magnetic resonance [NMR] spectroscopy)

verwendet.

In einer Studie konnte gezeigt werden, dass ein spezifischer adipöser, aus dem Urin

gemessener Metabotyp existiert. In dieser Arbeit wurden 15 männliche Patienten mit

________________________________________________________________________________________ 12

einem BMI ≥ 40 mit zehn altersgematchten normalgewichtigen männlichen Kontrollen

verglichen. Zur Messung wurde ein Kernspinresonanzspektroskop verwendet. Anhand

vierer Metabolite (Hippursäure, Trigonellin [N-Methylnicotinat], 2-Hydroxyisobutyrat und

Xanthin) konnte deutlich zwischen der adipösen und der schlanken Kontrollgruppe

unterschieden werden. Weiterhin unterzogen sich zwei adipöse Patienten einem

bariatrischen Eingriff, dem Roux-en-Y Magenbypass und der Biliopankreatischen

Diversion. Mit dem einsetzenden Gewichtsverlust glich sich der Metabotyp dem der

schlanken Kontrollgruppe an (39). Meines Wissens ist die Arbeit von Calvani et al. aktuell

die einzige, welche die Auswirkungen der bariatrischen Chirurgie auf das Metabolom

untersucht.

Da restriktive und malabsorptive Mechanismen nicht ausschließlich für den Erfolg der

bariatrischen Chirurgie verantwortlich sind, soll mit einem Metabolomik-Ansatz untersucht

werden, ob frühzeitige (bis 13 Tage nach Operation) Veränderungen im Urin feststellbar

sind. In einer aktuellen Publikation unserer Arbeitsgruppe (40) konnte gezeigt werden,

dass genetische Polymorphismen, die stoffwechselregulierende Gene betreffen und die

für Enzyme und Transportproteine codieren, zu einem spezifischen und differenzierbaren

metabolischen Phänotyp führen, welcher im Urin gemessen werden konnte. Dies wurde

als „genetisch determinierter Metabotyp“ (GDM) bezeichnet. Es ist vorstellbar, dass ein

GDM für Adipositas existiert, der durch eine erfolgreiche bariatrische Chirurgie

beeinflussbar ist.

Die Untersuchung einer frühen postoperativen Wirkung der bariatrischen Chirurgie auf

das Metabolom des Urins geschieht auch mit dem Ziel, in Zukunft Metabolite identifizieren

zu können, welche zu diesem erwarteten Unterschied assoziiert sind. Damit könnten

Stoffwechselwege aufgedeckt werden, die den bisher fehlenden Anteil am Gelingen der

bariatrischen Chirurgie erklären. Letzten Endes könnte dies zur Entwicklung weniger

invasiver chirurgischer Eingriffe oder sogar spezifischer und individueller

Pharmakotherapie der morbiden Adipositas und ihrer metabolischen Begleiterkrankungen

führen. Die Frage, ob bariatrische Chirurgie bereits nach einem kurzen Zeitraum einen

Einfluss auf das Urin-Metabolom hat, ist der erste Schritt auf diesem Weg.

________________________________________________________________________________________ 13

2. Methoden

2.1. Patientenkollektiv

Aus den chirurgischen und internistischen Akten des städtischen Krankenhauses Dresden

Neustadt wurden die Metadaten von 53 Patienten entnommen, welche sich im Zeitraum

von 2009 bis einschließlich 2010 dort einer bariatrischen Operation unterzogen hatten.

Die Patienten hatten ihre Einwilligung zur Nutzung ihrer Daten zu Forschungszwecken zu

Beginn der Therapie gegeben. Die Patienten gaben Blut und Urin ab, nah vor der

Operation, zeitnah nach der Operation sowie in einem Zeitraum von 70 bis 120 Tagen,

150 bis 240 Tagen und 326 bis 410 Tagen nach der Operation. Zusätzlich wurden zu

diesen Untersuchungszeitpunkten anthropometrische Daten erhoben. Die Urinproben

wurden im Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universität

Greifswald analysiert.

Das Patientenkollektiv besteht aus 40 weiblichen Patienten mit einem Durchschnittsalter

zum Operationszeitpunkt von 45 Jahren (± 10 Jahre) und 13 männlichen Patienten im

Alter von 51 Jahren (± 8 Jahre), insgesamt 53 Patienten mit durchschnittlichem Alter von

47 Jahren (± 10 Jahre) zum Zeitpunkt der Operation.

Die Patienten wurden nach zwei verschieden Methoden operiert. 41 Patienten - 30

Frauen und elf Männer - bekamen laparoskopisch einen Schlauchmagen angelegt. Bei

zwölf Patienten - zehn Frauen und zwei Männern - wurde laparoskopisch ein Roux-en-Y

Magenbypass angelegt. Die Entscheidung zur Art der Operation erfolgte nach vorheriger

Aufklärung und Empfehlung durch den Patienten. Siehe hierzu Abbildung 3.

________________________________________________________________________________________ 14

Abbildung 3: Diagramm des Patientenkollektivs mit durchschnittlichem Alter ± Standardabweichung

Das durchschnittliche Gewicht der Patientinnen (w) vor der Operation beträgt 138,38 Kg

(± 25,42 Kg), der BMI 49,79 Kg/m² (±8,66 Kg/m²). Das durchschnittliche Gewicht der

Patienten (m) beträgt 156,65 Kg (± 26,47), der BMI 49,45 Kg/m² (± 7,54 Kg/m²), ebenfalls

vor der Operation. Hierzu gibt Tabelle 2 einen Überblick.

Tabelle 2: Gewicht und Body-Mass-Index (BMI) der Patienten vor Operation

Kilogramm BMI in Kg/m²

Gesamt 142,95 ± 26,65 49,71 ± 8,32

Frauen 138,38 ± 25,42 49,79 ± 8,66

Männer 156,65 ± 26,47 49,45 ± 7,54

Aus dem Patientenkollektiv von 53 Patienten mit anthropometrischen Daten und

Urinproben wurden anthropometrische Daten von 51 Patienten für die Erstellung der

deskriptiven Statistik verwendet. Die Daten von zwei Patienten wurden wegen

Unvollständigkeit von der Analyse ausgeschlossen. Urinproben von 50 Patienten wurden

für den Vergleich des Metabolomik-Ansatzes präoperativ versus postoperativ verwendet.

Die Urinproben von drei Patienten konnten wegen Unvollständigkeit - entweder Fehlen

der präoperativen Probe oder der postoperativen Probe - nicht untersucht werden und

wurden von der Analyse ausgeschlossen.

53 Patienten47 ± 10 Jahre53 Patienten47 ± 10 Jahre

13 Männer51 ± 8 Jahre13 Männer

51 ± 8 Jahre

N = 10Roux-en-Y

Magenbypass

N = 10Roux-en-Y

Magenbypass

N = 30Schlauch-

magen

N = 30Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

40 Frauen45 ± 10 Jahre40 Frauen

45 ± 10 Jahre

53 Patienten47 ± 10 Jahre53 Patienten47 ± 10 Jahre

13 Männer51 ± 8 Jahre13 Männer

51 ± 8 Jahre

N = 10Roux-en-Y

Magenbypass

N = 10Roux-en-Y

Magenbypass

N = 30Schlauch-

magen

N = 30Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

40 Frauen45 ± 10 Jahre40 Frauen

45 ± 10 Jahre

________________________________________________________________________________________ 15

2.2. Bestimmung der Metabolitenprofile mittels NMR-Spektrometrie von

Urin

Präparation von Urinproben für NMR-Analyse

Die Urinproben wurden nach Entnahme auf -80°C gefroren und in diesem Zustand bis zur

Analyse belassen. Für die spektroskopische Analyse wurden 450 µl Urin mit 50 µl

Phosphatpuffer versehen, um den Urin pH-Wert bei 7,0 (+/- 0,35) zu stabilisieren. Dieser

Puffer besteht aus 0,1 % Natriumtrimethylsilylpropionat (TSP), Kaliumdihydrogenphosphat

(KH2PO4), 1,5 M und Natriumazid (NaN3) 3mM aufgelöst in Deuteriumoxid (D2O).

Die Probenverarbeitung und -messung muss in hohem Maß reproduzierbar sein, um die

spektroskopischen Daten statistisch auswerten zu können. Um dies zu erreichen, wurde

die Qualität der NMR-Spektren kontrolliert. Anhand der Überprüfung von Linienbreite und

Signal-Rausch Verhältnis des TSP-Signals, der Bestimmung des Mittleren Fehlers der

Kreatininkonzentration und der Phasenkorrektur ausgesuchter Signale wurde die Qualität

der NMR-Spektren beurteilt.

1H-NMR spektroskopische Analyse von Urinproben

Die Urinspektren werden an einem NMR-Spektrometer AVANCE-II 400 (Bruker BioSpin

GmbH, Rheinstetten, Deutschland) aufgezeichnet. Das NMR-Gerät verfügt über einen

supraleitenden Magneten mit einer Feldstärke von 9,4 Tesla, was einer

Resonanzfrequenz im 1H-NMR-Spektrum von 400 MHz entspricht.

Die Proben werden über einen Liquidhandler (Gilson) der NMR-Durchflusszelle zugeführt

(Flow-Injection-NMR). Die Urinproben werden bei einer Temperatur von 300 K (26,85°C)

unter Berücksichtigung einer standardisierten 1D 1H-NMR Pulssequenz mit

Unterdrückung des Wassersignals (NOESYPRESAT) [RD − P(90o) − 4µs − P(90o) − tm −

P(90o) – Aufnahme des zeitabhängigen Signals in der Empfängerspule (Free Induction

Decay)] gemessen. Der 90° Puls beträgt 9,4 µs.

________________________________________________________________________________________ 16

Die Relaxationsverzögerung (RD), Mischdauer tm und Akquisitionszeit werden

entsprechend auf 4 s, 100 ms und 3,96 s eingestellt. Daraus resultiert eine Zyklusdauer

von ca. 8 s.

Nach Aufzeichnung von vier Dummy-scans werden jeweils 32 FID-scans in eine

Spektrengröße (td) von 32k Datenpunkten bei einer Spektrenbreite (sw) von 20,689 ppm

akkumuliert

Vor der Fourier-Transformation wurde auf den FIDs eine exponentielle Multiplikation von

lb = 0,3 Hz angewandt. Alle Spektren wurden mit dem Programm TOPSPIN2.1 (Bruker

Biospin) prozessiert und anschließend zur statistischen Analyse in MATLAB transferiert.

2.3. Statistische Methoden

Deskriptive Statistik

Abbildung 4: Diagramm der anthropometrischen Daten von Patienten eingeflossen in deskriptive Statistik

Analog Abbildung 4 flossen aus dem Patientenkollektiv die Daten von 51 Patienten in die

deskriptive Statistik ein. Ausgewertet und dargestellt wurden Daten bezüglich des

Gewichtsverlaufs in Kilogramm, des Verlaufs des Body-Mass-Index, des Verlaufs der

51 Patienten51 Patienten

13 Männer13 Männer

N = 9Roux-en-Y

Magenbypass

N = 9Roux-en-Y

Magenbypass

N = 29Schlauch-

magen

N = 29Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

38 Frauen38 Frauen


Ausschluss:N = 2; unvollständiger

Datensatz


Datensatz


13 Männer13 Männer

N = 9Roux-en-Y

Magenbypass

N = 9Roux-en-Y

Magenbypass

N = 29Schlauch-

magen

N = 29Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 11Schlauch-

magen

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

N = 2Roux-en-Y

Magenbypass

38 Frauen38 Frauen



Datensatz


Datensatz

________________________________________________________________________________________ 17

Gewichtsabnahme und des Übergewichtsverlustes in Prozent jeweils über den

Beobachtungszeitraum. Übergewichtsverlust in Prozent wurde berechnet als

[100×(Körpergewicht vor der Operation – aktuelles Körpergewicht)/Übergewicht].

Übergewicht wurde berechnet als Differenz zwischen Körpergewicht vor der Operation

und einem Körpergewicht korrespondierend zu einem BMI von 25 Kg/m² des jeweiligen

Patienten.

Darstellung und Auswertung erfolgte mit Microsoft Excel 2007. Die Daten sind dargestellt

als Mittelwert ± Standardabweichung.

Metabolomik

Die Rohspektren wurden in das Programm MATLAB (Mathworks, Natich, MA, USA)

eingelesen und es erfolgte die Skalierung auf TSP (-0,2 – 0,2 ppm) und Kreatinin (3,03 –

3,07 ppm). Danach wurden die NMR Spektren im ppm Bereich von 0,5 – 9,5 auf 250

Buckets reduziert, welches einer Bucketweite von 0,036 ppm entspricht. Jedes Bucket

erhält den Wert des absoluten Integrals des Spektrumbereiches, welches es repräsentiert.

Für die Analysen wurden die Buckets (112 - 128), welche das Wassersignal enthalten,

ausgeschlossen, insgesamt sind somit 233 Buckets in die Analysen eingeflossen. Die

anschließenden multivariaten Auswertungen erfolgten mit dem Programm SIMCA-P+ 12.0

(Umetrics AB, Umeå, Schweden).

Multivariate Analysen wurden genutzt, um präoperative Spektren und postoperative

Spektren innerhalb der ersten 13 Tage nach der Operation zu vergleichen. In Abbildung 5

ist ein genereller Workflow für die Analysen mit SIMCA-P+ dargestellt.

Die X Matrix setzt sich zusammen aus den Buckets sowie Geschlecht und Alter der

Probanden zum Zeitpunkt der bariatrischen Operation. Die Daten wurden Pareto-skaliert

(Skalierungsgewicht für Spalte k = 1/ √Standardabweichung von k). Pareto-Skalierung

repräsentiert einen Mittelweg zwischen keiner Skalierung und Skalierung auf die Varianz

und ist geeignet für spektroskopische Daten.

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA - principal component analysis) wurde genutzt, um

einen Überblick über die Daten zu erlangen. Die PCA ist eine statistische Methode, die

________________________________________________________________________________________ 18

Abbildung 5. Auswertungs-Workflow für Metabolomikdaten in Anlehnung an Eriksson et al (41).

der Dimensionenreduktion von komplexen Datensätzen dient (42). Bei der Modellbildung

werden aus den Originalvariablen (X Matrix) neue Variablen ermittelt, die orthogonal

zueinander und damit unkorreliert sind. Diese Variablen werden als Hauptkomponenten

(PC - principal component) bezeichnet und stellen linear Kombinationen der

Daten aufbereiten- Auswahl der X Variablen: Alter, Geschlecht, 233 Buckets

- Skalierung der X Variablen: Pareto scaling: Gewicht = 1/sqrt(STD)

- Auswahl der Beobachtungen und Definition der Y Variable:

Prä-OP vs. Post-OP(1-13T))

Datengenerierung- Erstellung und Einlesen der 250 Buckets

Datenübersicht- Deskriptive Statistik der Rohdaten: Histogramm (Verteilung), Scatterplot- PCA (principal component analysis)

Evaluation des Modells- Modelübersicht: R2/Q2 Plot, X/Y Plot

- Ausreißerdetektierung: t1/t2 Plot, Distance to Model X-Block Contribution (DmodX) plot, Hotelling's T2Range plot

- Residuen: DmodX Plot, Residual Normal Probability Plot

- Score Plot

- Variablen Plots: Loading, PLS Regressionskoeffizienten, VIP

- Validierung durch PLS Permutation

Berechnung des Modells- PCA- PLS-DA (partial least squares - discriminant analysis) mit Crossvalidierung- OPLS-DA (orthogonal PLS-DA) mit Crossvalidierung

Annahme des Modells ?

Validierung des Modells- Anwendung des Modells auf neue Daten- Prädiktion Plot- Klassifizierungstabelle

JA

NEIN

Daten aufbereiten- Auswahl der X Variablen: Alter, Geschlecht, 233 Buckets

- Skalierung der X Variablen: Pareto scaling: Gewicht = 1/sqrt(STD)

- Auswahl der Beobachtungen und Definition der Y Variable:

Prä-OP vs. Post-OP(1-13T))

Datengenerierung- Erstellung und Einlesen der 250 Buckets

Datenübersicht- Deskriptive Statistik der Rohdaten: Histogramm (Verteilung), Scatterplot- PCA (principal component analysis)

Evaluation des Modells- Modelübersicht: R2/Q2 Plot, X/Y Plot

- Ausreißerdetektierung: t1/t2 Plot, Distance to Model X-Block Contribution (DmodX) plot, Hotelling's T2Range plot

- Residuen: DmodX Plot, Residual Normal Probability Plot

- Score Plot

- Variablen Plots: Loading, PLS Regressionskoeffizienten, VIP

- Validierung durch PLS Permutation

Berechnung des Modells- PCA- PLS-DA (partial least squares - discriminant analysis) mit Crossvalidierung- OPLS-DA (orthogonal PLS-DA) mit Crossvalidierung

Annahme des Modells ?

Validierung des Modells- Anwendung des Modells auf neue Daten- Prädiktion Plot- Klassifizierungstabelle

JA

NEIN

________________________________________________________________________________________ 19

Originalvariablen dar. Im Verlauf der PCA erhält jeder Datenpunkt neue Koordinaten,

welche Scores T genannt werden.

X = TPT → T = XP (Matrixschreibweise)

P - Loadingmatrix.

Die Loadings P geben an, welche Variablen die PCs beeinflussen und wie die Variablen

korreliert sind. In der Regel erklären wenige erste PCs den größten Teil der Variation in

der X Matrix, so dass höhere PCs ohne Verlust an Information für die nachfolgenden

Analysen weggelassen werden können (= Dimensionenreduktion).

Eine Erweiterung der PCA stellt die PLS (PLS - partial least squares - discriminant

analysis) und orthogonal PLS-DA (OPLS) dar. Beide Methoden werden dazu eingesetzt,

um die Abhängige Y aus X vorherzusagen und können auch zur Diskriminanzanalyse

genutzt werden (PLS-DA, OPLS-DA). Während bei der PCA in die Berechnung der PCs

nur die Information aus der X Matrix einfließen, wird bei der PLS auch die Information aus

der Y Matrix (Abhängigen) verwendet. Die Scores für beide Matrizen

X = TPT → T = XP

Y = UQT → U = YQ

P, Q - Loadingmatrizen,

werden so gewählt, dass sie maximal miteinander korrelieren. Bei der Interpretation des

PLS Modells werden zusätzlich zu den Loadings sogenannte Weights (deutsch:

Gewichte)

W = r(X,U)

C = r(Y,T),

welche die Korrelation zwischen X und U(Y) oder Y und T(X) angeben, herangezogen.

Dadurch, dass das PLS Verfahren jedoch unidirektional ist, können die ermittelten PCs

auch Variationen in X erfassen, die unkorreliert zu Y sind. OPLS stellt eine Erweiterung

der generellen PLS dar, welche die X Variation in zwei Teile aufteilt. Der 1. Teil ist linear

assoziiert mit Y und stellt den prädiktiven Teil des Modells dar. Der 2. Teil modelliert die X

Variation, welche unabhängig von Y ist.

________________________________________________________________________________________ 20

PLS-DA/OPLS-DA Modelle wurden anhand von 70 Spektren ermittelt. Die

Prädiktionsleistung der Modelle wurde mittels 3-facher Crossvalidierung geschätzt. Die

verbliebenen Spektren wurden zur Validierung der Modelle genutzt.

________________________________________________________________________________________ 21

3. Ergebnisse

3.1. Deskriptive Statistik

Gewichtsverlauf in Kilogramm

Vor der Operation betrug das durchschnittliche Gewicht 143,44 ± 26,68 Kg. Nach der

Operation zeigt sich eine kontinuierliche Senkung auf durchschnittlich 96,93 ± 17,93 Kg.

Männer hatten, im Vergleich zu Frauen, wie erwartet, ein höheres Ausgangsgewicht.

Abbildung 6 illustriert die absoluten Gewichtsverläufe für männliche sowie weibliche

Patienten und die Gesamtheit.

Abbildung 6: Gewichtsverlauf in Kilogramm Körpergewicht, dargestellt als Mittelwert. Blau: Gewichtsverlauf Männer, Rot: Gewichtsverlauf Frauen, Grün: Gewichtsverlauf Gesamtheit. N gibt die Anzahl an Patienten an, welche zum jeweiligen Datenpunkt untersucht wurden.

N=13

N=12

N=8

N=10N=9

N=38N=34

N=13N=26

N=18

N=51

N=46

N=21

N=36N=27

80

100

120

140

160

180

prä Op post OP1-13

post OP70-120

post OP150-240

post OP326-410

Tage

Kg

Männer Frauen Gesamt

________________________________________________________________________________________ 22

Gewichtsverlauf Prozentual

Prozentual stellt sich der Gewichtsverlust ebenfalls kontinuierlich dar. Dargestellt wird dies

in Abbildung 7. Nach 326 bis 410 Tagen wiegen die Patienten durchschnittlich 68,88 ±

6,11 Prozent ihres Ursprungsgewichts. Das entspricht einer Gewichtsabnahme von 31,12

± 6,11 Prozent innerhalb eines Jahres. Hierbei ist zu erkennen, dass Männer und Frauen

im gleichen Maße abnehmen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde in Abbildung 7 auf

die Kennzeichnung der Gruppenstärke verzichtet. Diese kann jedoch aus Tabelle 3

entnommen werden.

Abbildung 7: Gewichtsverlauf in Prozent, dargestellt als Mittelwert. Blau: Gewichtsverlauf Männer, Rot: Gewichtsverlauf Frauen, Grün: Gewichtsverlauf Gesamtheit.

Tabelle 3: Anzahl der Probandendatensätze zum jeweiligen Zeitraum

Zeitraum Anzahl Frauen Anzahl Männer Anzahl Gesamt

Prä OP 38 13 51

Post OP 1-13 Tage 34 12 46

Post OP 70-120 Tage 13 8 21

Post OP 150-240 Tage 26 10 36

Post OP 326-410 Tage 18 9 27

65

70

75

80

85

90

95

100

prä Op post OP1-13

post OP70-120

post OP150-240

post OP326-410

Tage

Proz

ent


________________________________________________________________________________________ 23

Verlauf Body-Mass-Index

Der BMI betrug vor der Operation durchschnittlich 49,78 ± 8,39 Kg/m² für die gesamte

Patientengruppe. Er fällt über die bereits erwähnten Zeiträume hinweg auf einen

durchschnittlichen Wert von 33,36 ± 5,54 Kg/m² ab. Das entspricht einer

durchschnittlichen Abnahme von 16,42 ± 5,54 Kg/m² innerhalb eines Jahres. Abbildung 8

illustriert dies.

Abbildung 8: Verlauf des BMI in Kg/m², Daten dargestellt als Mittelwert. Blau: BMI-Verlauf Männer, Rot: BMI-Verlauf Frauen, Grün: BMI-Verlauf Gesamt. Übergewichtsverlust in Prozent

Abbildung 9 stellt den Verlust des Übergewichtes der einzelnen Gruppen über die Zeit

dar. Nach einem Zeitraum von 326-410 Tagen nach der Operation zeigt sich, dass die

Patienten durchschnittlich 67,22 ± 16,74 Prozent ihres Übergewichts verloren haben.

Auch hier ist kein Unterschied zwischen Männern und Frauen zu sehen.

Tabelle 4 fasst die Verläufe der genannten vier Rubriken als Zahlenwerte zusammen.

30

35

40

45

50

55

prä Op post OP1-13

post OP70-120

post OP150-240

post OP326-410

Tage

Kg/

m²


________________________________________________________________________________________ 24

Abbildung 9: Verlorenes Übergewicht über die Zeit in Prozent. Daten dargestellt als Mittelwert. Blau: Verlauf Männer, Rot: Verlauf Frauen, Grün: Verlauf Gesamt

Tabelle 4: Verlauf von Gewicht in Kilogramm, Körpergewicht in Prozent, Verlauf des Body-Mass-Index (BMI) und Entwicklung des Übergewichtsverlustes (% EWL: % Excess-Weight-Loss = Übergewichtsverlust) während des Beobachtungszeitraumes. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung.

prä OP post OP [Tage]

1-13 70-120 150-240 326 - 410

Kg Männer 156,65 ± 26,47 144,11 ± 19,79 127,68 ± 30,75 110,40 ± 19,55 103,56 ± 16,12

Frauen 138,92 ± 25,54 134,51 ± 25,62 111,25 ± 23,82 104,72 ± 19,92 93,66 ± 18,3

Gesamt 143,44 ± 26,68 137,02 ± 24,39 117,51 ± 27,17 106,29 ± 19,71 96,96 ± 17,93

Kg % Männer 100 94,89 ± 1,11 79,33 ± 7,33 72,32 ± 6,26 69,91 ± 7,85

Frauen 100 96,03 ± 1,67 82,24 ± 4,35 74,00 ± 5,66 68,37 ± 5,22

Gesamt 100 95,73 ± 1,61 81,13 ± 5,68 73,53 ± 5,79 68,88 ± 6,11

BMI Männer 49,45 ± 7,54 45,79 ± 6,06 40,28 ± 8,38 35,44 ± 5,79 33,00 ± 4,86

Frauen 49,89 ± 8,75 48,40 ± 8,71 40,47 ± 6,92 36,85 ± 6,51 33,54 ± 5,98

Gesamt 49,78 ± 8,39 47,72 ± 8,12 40,40 ± 7,3 36,46 ± 6,27 33,36 ± 5,54

% EWL

Männer 0 11,05 ± 2,64 42,87 ± 17,05 59,93 ± 18,85 66,78 ± 18,91

Frauen 0 8,31 ± 3,58 38,51 ± 14,18 54,39 ± 14,09 67,44 ± 16,13

Gesamt 0 9,02 ± 3,55 40,17 ± 15,07 55,93 ± 15,47 67,22 ± 16,47

0

10

20

30

40

50

60

70

80prä OP post OP

1-13Tpost OP 70-120T

post OP 150-240T

post OP 326-410T

Proz

ent Ü

berg

ewic

htsv

erlu

st

Tage


________________________________________________________________________________________ 25

3.2. Metabolomik

Fragestellung : Vergleich von prä-operativen Spektren und post-operativen

Spektren innerhalb der ersten 13 Tage nach der Operation

Basierend auf allen 100 Spektren wurde initial eine PCA berechnet, um einen Überblick

über die Daten zu erlangen und Ausreißer zu identifizieren. Das PCA Modell benötigt 7

PCs, um 95 % der Varianz in X zu erklären (R2X = 0,951) und besitzt eine

Vorhersagbarkeit von 83 % (Q2X = 0,828) (Abbildung 10, links). Bereits mit Hilfe des

ersten PCA Modells erhalten wir eine gute Separation zwischen prä- und post-operativen

Proben (Abbildung 10, rechts).

Distance to the model (DModX) und Hotellings T2 Diagramme wurden genutzt, um

Ausreißer zu identifizieren (Abbildung 11). Die DmodX einer Beobachtung ist proportional

zu seiner Residuen-Standardabweichung. Werte oberhalb des zweifachen kritischen

Wertes werden als Ausreißer definiert. Hotellings T2 stellt eine multivariate Variante des

Student’s T-Test dar. Werte oberhalb des 99 % Bereiches werden als Ausreißer

identifiziert. Basierend auf beiden Maßen wurden insgesamt 10 Spektren von den

weiteren Analysen ausgeschlossen.

Die verbliebenen 90 Spektren wurden zur multivariaten Analyse verwendet, um den

Abbildung 10. Links: PCA Modelübersicht. R2: erklärter Anteil der Varianz in der X Matrix; Q2: erklärter Anteil der Varianz in der X Matrix vorhergesagt durch das Modell nach 3-facher Crossvalidierung. Rechts: PCA T1/T4 Score-Plot für prä- und post-operative Proben. Die Ellipse präsentiert den Hotellings T2 Bereich zum Signifikanzniveau 0,05.

-3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]Comp No.

R2X(cum) Q2(cum)

-200

-100

0

100

200

300

400

0 500 1000 1500

t[4]

t[1]

Prä-OP Post-OP(1-13T)

-3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]Comp No.

R2X(cum) Q2(cum)

-200

-100

0

100

200

300

400

0 500 1000 1500

t[4]

t[1]


________________________________________________________________________________________ 26

Abbildung 11. Oben: Distance to the model (DModX) Plot. Werte oberhalb des 2-fachen kritischen Wertes (─) sind Ausreißer. Unten: Hotellings T2 Plot.

Zusammenhang zwischen dem Metabolitenprofil und dem operativen Status zu erfassen.

70 Spektren wurden dabei zur Berechnung der Modelle und 20 Spektren zur Evaluation

der ermittelten Modelle genutzt.

Abbildung 12. Links: PLS-DA Modelübersicht. R2: erklärter Anteil der Varianz in der Y Matrix; Q2: erklärter Anteil der Varianz in der Y Matrix vorhergesagt durch das Modell nach 3-facher Crossvalidierung. Rechts: PLS-DA T1/T2 Score-Plot für prä- und post-operative Proben. Die Ellipse präsentiert den Hotellings T2 Bereich zum Signifikanzniveau 0,05. Die Richtung der Separierung zwischen beiden Klassen ist durch den grünen Pfeil gekennzeichnet.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0D

Mod

X[7]

(Nor

m) 2x D-Crit(0,05)

0

20

40

60

80

100

T2R

ange

[1 -

7]

Spektrum

T2Crit(95%)T2Crit(99%)

D-Crit(0,05)

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

8990

11

1218

19 20

30

78100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0D

Mod

X[7]

(Nor

m) 2x D-Crit(0,05)

0

20

40

60

80

100

T2R

ange

[1 -

7]

Spektrum

T2Crit(95%)T2Crit(99%)

D-Crit(0,05)

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

8990

11

1218

19 20

30

78100


-400

-200

0

200

400

600

-600 -400 -200 0 200

t[2]

t[1]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0R2Y(cum) Q2(cum)

[1] [2] [3] [4]Comp No.


-400

-200

0

200

400

600

-600 -400 -200 0 200

t[2]

t[1]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0R2Y(cum) Q2(cum)

[1] [2] [3] [4]Comp No.

________________________________________________________________________________________ 27

Abbildung 13. PLS-DA Weight Plot für die 1 und 2 Komponente. Die Richtung der Separierung zwischen beiden Klassen aus Abbildung 12 ist durch den grünen Pfeil gekennzeichnet.

Das PLS-DA Modell enthält 4 signifikante PCs und erklärt 91 % (R2X = 0,914) der Varianz

in X und 81 % (R2Y = 0,813) in Y. Die Vorhersagbarkeit von Y liegt bei 69 % (Q2Y =

0,687) (Abbildung 12). Wie zu erwarten, wird die Separation zwischen prä- und post-

operativen Spektren hauptsächlich durch die Komponente 1 und 2 getragen (Abbildung

12, rechts). Im zugehörigen Weight Plot (Abbildung 13) wird sichtbar, dass mehrere

Buckets (z.B. b20, b49, b50) sich in Richtung der Separierung der beiden Klassen

befinden und diese somit maßgeblich zur Separierung beitragen. Um weiterhin

abzuklären, welche Spektrumbereiche entscheidend für die Separierung sind, wurden der

VIP (Variable Importance in the Projection) Plot und Koeffizienten Plot genutzt (Abbildung

14).

w*c[1]

-0,6

-0,4

-0,2

-0,0

0,2

0,4

-0,45 -0,40 -0,35 -0,30 -0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10

w*c

[2]

b20

alter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17

b18b19

b21b22b23b24b25b26b27

b28b29b30b31b32b33b34b35

b36b37b38b39b40 b41b42b43b44 b45

b46b47

b48

b49b50

b51

b52b53

b54

b55 b56b57

b58

b59b60

b61b62

b63b64b65b66b67

b68b69

b70

b71

b72b73

b74

b75

b76b77

b78

b79

b80b81

b82

b83 b84b85b86b87

b88b89

b90b91b92

b93b94b95b96

b97

b98b99

b100

b101

b102b103

b104b105b106b107b108b109

b110b111b129b130b131

b132b133

b134b135b136b137b138b139b140b141b142b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163b164b165b166b167b168b169b170b171b172b173

b174b175b176b177b178b179b180b181b182b183b184

b185b186b187b188b189

b190b191

b192

b193

b194b195

b196b197

b198

b199

b200b201b202b203

b204b205

b206b207b208b209b210b211b212

b213b214b215b216b217b218

b219b220b221b222b223b224

b225b226b227b228b229b230b232

b233b234b235b236b238b239

b240b241b242b243b244b245b246b247b248b249b250

w*c[1]

-0,6

-0,4

-0,2

-0,0

0,2

0,4

-0,45 -0,40 -0,35 -0,30 -0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10

w*c

[2]

b20

alter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17

b18b19

b21b22b23b24b25b26b27

b28b29b30b31b32b33b34b35

b36b37b38b39b40 b41b42b43b44 b45

b46b47

b48

b49b50

b51

b52b53

b54

b55 b56b57

b58

b59b60

b61b62

b63b64b65b66b67

b68b69

b70

b71

b72b73

b74

b75

b76b77

b78

b79

b80b81

b82

b83 b84b85b86b87

b88b89

b90b91b92

b93b94b95b96

b97

b98b99

b100

b101

b102b103

b104b105b106b107b108b109

b110b111b129b130b131

b132b133

b134b135b136b137b138b139b140b141b142b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163b164b165b166b167b168b169b170b171b172b173

b174b175b176b177b178b179b180b181b182b183b184

b185b186b187b188b189

b190b191

b192

b193

b194b195

b196b197

b198

b199

b200b201b202b203

b204b205

b206b207b208b209b210b211b212

b213b214b215b216b217b218

b219b220b221b222b223b224

b225b226b227b228b229b230b232

b233b234b235b236b238b239

b240b241b242b243b244b245b246b247b248b249b250

________________________________________________________________________________________ 28

Abbildung 14. Oben: PLS-DA VIP (Variable Importance in the Projection) Plot. Unten: PLS-DA Koeffizienten Plot.

Der VIP Plot fasst die Bedeutung der Buckets hinsichtlich ihrer Fähigkeit X und Y zu

erklären zusammen. VIP Werte > 1 deuten auf bedeutende Buckets hin, während Buckets

mit VIP Werten < 0,5 in der Regel als unbedeutend erachtet werden können. Der Bereich

zwischen 0,5 und 1 wird als Graubereich angesehen. Der Koeffizienten Plot beschreibt

präziser als der Weight Plot, welche Buckets zur Vorhersage der Klasse beitragen. Unter

Berücksichtigung aller drei Angaben (Weights, VIP, Koeffizienten) wurden mehrere ppm-

Bereiche sichtbar, welche für die Separierung wichtig sind (Abbildung 14, grau hinterlegt).

-0,003

-0,002

-0,001

0,000

0,001

Coe

ffCS[

2]

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

b1 b10

b20

b30

b40

b50

b60

b70

b80

b90

b100

b110b130

b140

b150

b160

b170

b180

b190

b200

b210

b220

b230

b240

b250VI

P[4]

Buckets

-0,003

-0,002

-0,001

0,000

0,001

Coe

ffCS[

2]

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

b1 b10

b20

b30

b40

b50

b60

b70

b80

b90

b100

b110b130

b140

b150

b160

b170

b180

b190

b200

b210

b220

b230

b240

b250VI

P[4]

Buckets

________________________________________________________________________________________ 29

Abbildung 15. Oben: OPLS-DA T1/T2 Score-Plot für prä- und post-operative Proben. Die Ellipse präsentiert den Hotellings T2 Bereich zum Signifikanzniveau 0,05. Unten: zugehöriger S-Plot.

Das entsprechende OPLS-DA Modell liefert vergleichbare Ergebnisse. Das OPLS-DA

Modell enthält eine prädiktive und vier orthogonale Komponenten. Die kumulierte erklärte

Varianz beträgt 92 % (R2X = 0,922) in X und 85 % (R2Y = 0,852) in Y. Die

Vorhersagbarkeit liegt bei 69 % (Q2Y = 0,690). Der zum OPLS Modell zugehörige S-Plot

(Abbildung 15) stellt eine Möglichkeit der Visualisierung der Ergebnisse dar. Der S-Plot

gibt sowohl die Magnitude, d.h. die Stärke der Assoziation, als auch die Reliabilität an.

Weisen Buckets eine niedrige Magnitude auf, deutet dies auf Rauschen und somit auf

eine falsche Assoziation hin.

Die PLS-DA sowie OPLS-DA Modelle identifizieren ähnliche Buckets, die zur Separierung

der beiden Gruppen notwendig sind. Die ppm-Bereiche sind in Tabelle 5 dargestellt.

Prä-OP

Post-OP(1-13T)

to[2

]

t[1]

100

200

300

400

500

600

-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,40,5

-0,15 -0,10 -0,05 -0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

p(co

rr)[1

]

w*c[1]

SEX((1) MäSEX((2) Fralter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10

b11b12b13b14

b15b16b17

b18b19

b20

b21

b22b23b24

b25b26b27b28

b29b30b31

b32b33b34b35

b36b37b38b39

b40

b41b42b43b44

b45

b46

b47

b48 b49b50b51

b52 b53b54

b55

b56

b57b58

b59b60

b61b62

b63

b64

b65

b66b67

b68

b69

b70b71

b72

b73

b74

b75

b76b77

b78

b79

b80

b81

b82

b83b84

b85b86

b87b88b89

b90b91b92

b93b94b95

b96

b97

b98b99

b100

b101

b102b103

b104b105b106b107b108

b109

b110

b111b129b130b131

b132

b133

b134b135

b136b137b138b139b140

b141b142

b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163

b164b165b166

b167

b168b169

b170

b171b172

b173

b174b175b176

b177

b178b179

b180b181

b182

b183

b184

b185

b186

b187b188b189

b190b191

b192

b193

b194

b195

b196b197

b198

b199

b200

b201b202

b203

b204b205

b206

b207b208

b209b210

b211b212

b213

b214b215b216

b217

b218

b219b220

b221

b222

b223 b225

b226b227b228b229

b230

b231

b232 b233

b234b235

b236

b237

b238b239

b240

b241

b242b243

b244b245b246b247b248b249

b250

b224

MAGNITUDE

RELIAB

ILITÄTPrä-OP

Post-OP(1-13T)

to[2

]

t[1]

100

200

300

400

500

600

-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200to

[2]

t[1]

100

200

300

400

500

600

-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,40,5

-0,15 -0,10 -0,05 -0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

p(co

rr)[1

]

w*c[1]

SEX((1) MäSEX((2) Fralter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10

b11b12b13b14

b15b16b17

b18b19

b20

b21

b22b23b24

b25b26b27b28

b29b30b31

b32b33b34b35

b36b37b38b39

b40

b41b42b43b44

b45

b46

b47

b48 b49b50b51

b52 b53b54

b55

b56

b57b58

b59b60

b61b62

b63

b64

b65

b66b67

b68

b69

b70b71

b72

b73

b74

b75

b76b77

b78

b79

b80

b81

b82

b83b84

b85b86

b87b88b89

b90b91b92

b93b94b95

b96

b97

b98b99

b100

b101

b102b103

b104b105b106b107b108

b109

b110

b111b129b130b131

b132

b133

b134b135

b136b137b138b139b140

b141b142

b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163

b164b165b166

b167

b168b169

b170

b171b172

b173

b174b175b176

b177

b178b179

b180b181

b182

b183

b184

b185

b186

b187b188b189

b190b191

b192

b193

b194

b195

b196b197

b198

b199

b200

b201b202

b203

b204b205

b206

b207b208

b209b210

b211b212

b213

b214b215b216

b217

b218

b219b220

b221

b222

b223 b225

b226b227b228b229

b230

b231

b232 b233

b234b235

b236

b237

b238b239

b240

b241

b242b243

b244b245b246b247b248b249

b250

b224

MAGNITUDE

RELIAB

ILITÄT

________________________________________________________________________________________ 30

Tabelle 5. Identifizierte Buckets und die entsprechenden ppm-Bereiche.

Bucket ppm-Bereich

b18 – b21 1,112 – 1,256

b48 – b54 2,192 – 2,444

b76 – b79 3,200 – 3,344

b84 – b89 3,488 – 3,704

b97 – b102 3,956 – 4,172

b192/b193 7,376 – 7,448

b198/b199 7,592 – 7,664

b204/b205 7,808 – 7,880

Die Prädiktionsleistung beider Modelle ist gleich. Wie in Abbildung 16 sichtbar, wurde von

den 20 Spektren, welche zur Evaluation der Modelle genutzt wurden, ein Spektrum

Abbildung 16. Vorhergesagte Klassenzugehörigkeit für Spektren im Evaluationsdatensatz basierend auf PLS-DA (links) und OPLS-DA (rechts). Als Grenzwert zur Klassifizierung wurde 0,5 verwendet. Spektrum 83 (eingekreist) wurde in beiden Modellen falsch vorhergesagt.

falsch klassifiziert. Insgesamt wurden somit 95 % der Spektren richtig zugeordnet

(Fisher-Exakt-Test: p = 0,00006).

Bei näherer Betrachtung der Originalspektren werden die Unterschiede deutlich.

Abbildung 17 zeigt die mittleren NMR-Spektren für präoperative und postoperative Proben

und geht näher auf die entscheidenden ppm-Bereiche ein. In den Bereichen 1,20-1,24,

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99

OPL

S-D

A: Y

Pred

PS[1

]

Spektrum

PLS-

DA:

YPr

edPS

[4]


0,0

0,5

1,0

1,5

77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99

Spektrum

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99

OPL

S-D

A: Y

Pred

PS[1

]

Spektrum

PLS-

DA:

YPr

edPS

[4]


0,0

0,5

1,0

1,5

77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99

Spektrum

________________________________________________________________________________________ 31

2,1-2,5, 3,2-3,6, 4,1-4,2, 7,40-7,45 und 7,6-7,7 zeigt sich eine Hochregulation, während in

den Bereichen 7,5-7,6 und 7,8-7,9 eine Herunterregulation zu verzeichnen ist.

________________________________________________________________________________________ 32

Abbildung 17. Mittlere NMR-Spektren für prä-operative (schwarz) und post-operative (rot) Urinproben (unten). PPM-Bereiche, die sich zwischen beiden Gruppen unterscheiden (A – E), wurden zusätzlich einzeln abgebildet (Mittelwert plus 95 % Konfidenzintervall, oben).

ppm

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5

1.161.181.201.221.241.262.102.202.302.402.503.23.33.43.53.64.114.154.197.47.57.67.77.87.9

A

A

B C D E

B C D E

ppm

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5

1.161.181.201.221.241.26 1.161.181.201.221.241.26 1.161.181.201.221.241.262.102.202.302.402.50 2.102.202.302.402.50 2.102.202.302.402.503.23.33.43.53.6 3.23.33.43.53.64.114.154.19 4.114.154.19 4.114.154.197.47.57.67.77.87.9 7.47.57.67.77.87.9

A

A

B C D E

B C D E

________________________________________________________________________________________ 33

4. Diskussion

4.1. Deskriptive Statistik

Nach bariatrischer Chirurgie verlieren Männer und Frauen kontinuierlich an Gewicht. Ein

Gewichtverlust von 43,57 ± 10,94 Kg und eine damit einhergehende Reduktion des BMIs

von 15,09 ± 3,65 Kg/m² innerhalb eines Jahres entspricht den bereits publizierten

Ergebnissen (10,43) und den Erwartungen aktueller Leitlinien (6). Anhand des Verlaufs

des prozentualen Gewichtsverlustes ist erkennbar, dass keine geschlechts-spezifischen

Unterschiede in der Gewichtsentwicklung bestehen. Dies ist die erste Studie, die zeigen

konnte, dass es keine Geschlechtsunterschiede hinsichtlich der Entwicklung nach

bariatrischer Chirurgie gibt.

Der in Studien zur bariatrischen Chirurgie zur Beschreibung der Effektivität oft genutzte

Übergewichtsverlust fällt in dieser Arbeit mit 67,22 ± 16,74 Prozent Übergewichtsverlust

nach ca. einem Jahr ebenfalls im Rahmen publizierter Ergebnisse aus (18,36,43).

Insgesamt sind die Beobachtungen zum Gewichtsverlauf eine weitere Dokumentation der

Wirksamkeit bariatrischer Chirurgie im Zeitraum eines Jahres.

4.2. Metabolomik

In der vorliegenden Arbeit konnten anhand multivariater Analysen Änderungen im

Metabolitenprofil vor und nach bariatrischer Operation nachgewiesen werden. Bei

genauer Betrachtung der 1H-NMR Urin-Spektren fällt nach dem bariatrischem Eingriff eine

Hochregulation in den ppm-Bereichen 1,20-1,24; 2,1-2,5; 3,2-3,6; 4,1-4,2; 7,40-7,45 und

7,6-7,7 sowie eine Herabregulation in den ppm-Bereichen 7,5-7,6 und 7,8-7,9 ppm auf.

Mit Ausnahme der hier vorgestellten Ergebnisse untersuchte bisher nur eine Studie (39)

die Auswirkung von bariatrischer Chirurgie auf ein im Urin bestimmtes Metabolom. Diese

Arbeit beschäftigte sich hauptsächlich mit den Unterschieden in Urin-Spektren zwischen

adipösen Personen (mittlerer BMI = 49,58 ± 8,3 Kg/m²; N=15) und schlanken

Kontrollpersonen (mittlerer BMI = 24,63 ± 1,9 Kg/m²; N=10). Dabei wurden vier Metabolite

identifiziert (Hippursäure, Trigonellin, 2-Hydroxyisobutyrat und Xanthin), welche

hauptsächlich zur Unterscheidung der zwei Gruppen beitrugen. Von diesen Metaboliten

________________________________________________________________________________________ 34

leistete Hippursäure den deutlichsten Beitrag zur Unterscheidung. Die Gruppe der

Patienten und der Kontrollen unterscheiden sich in der Arbeit von Calvani und Kollegen

allerdings nicht nur im BMI deutlich, sondern auch in Bezug auf ihre Insulinresistenz

(mittlerer HOMA-IR-Score [Homeostatic model assessment of insulin resistance] Adipöse:

12,92 ± 11,49; Kontrollen: 1,24 ± 0,39). Die gefundenen Unterschiede im Metabolom

könnten somit sowohl auf die Insulinresistenz als auch auf die Anthropometrie zurück zu

führen sein. Die Hypothese, dass die Insulinresistenz einen Teil der gefundenen

Ergebnisse bedingt, wird durch Studien bestärkt, welche teilweise die von Calvani et al.

gefundenen Metabolite (namentlich Hippursäure und Trigonellin) mit einem Diabetes

mellitus-Status in Tiermodellen und Menschen assoziiert haben (39,44).

Hippursäure ist ein Metabolit der Benzoesäure. Diese kann von einer Reihe Darmflora-

assoziierter Bakterien aus aromatischen Verbindungen hergestellt werden (45,46). In den

Mitochondrien wird Benzoesäure mit Glycin konjugiert und als Hippursäure mit dem Urin

ausgeschieden. Dabei ist Hippursäure ein normaler Bestandteil des Urins (47).

Physiologisch treten erhöhte Urin-Werte im Rahmen einer vermehrten Aufnahme von

phenolquellenhaltiger Nahrung, wie z.B. Tee, Wein und Fruchtsaft, auf (48). Niedrige

Hippursäure-Werte im Urin konnten dahingegen mit einem adipösen Phänotyp im

Nagetiermodel assoziiert werden (49). Darüber hinaus wurden niedrige Hippursäure-

spiegel im Urin von Typ 2 Diabetes mellitus Nagetiermodellen (50) sowie bei Typ 2

Diabetes mellitus-Patienten gefunden (44). Ebenso wird von einer inversen Assoziation

zwischen Hippursäure und Blutdruck beim Menschen berichtet (51).

Zusätzlich zur Diskrimination zwischen schlanken Kontrollen und adipösen Personen

wurden in der Arbeit von Calvani und Kollegen zwei Patienten bariatrischer Chirurgie

zugeführt. Ein Patient bekam einen Roux-en-Y Magenbypass, der andere Patient

unterzog sich einer Biliopankreatischen Diversion. Von diesen zwei Patienten wurden

Urinproben vor der Operation, 30 Tage sowie 90 Tage nach der Operation gewonnen und

mittels 1H-NMR spektroskopisch untersucht. Bei den Spektren von beiden Patienten ist im

Verlauf der Nachbeobachtungsperiode eine deutliche Hochregulation im ppm-Bereich von

Hippursäure (7,5-7,88 ppm) zu sehen. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte dieser

ppm-Bereich identifiziert werden. Allerdings findet sich in dieser Arbeit im Kontrast zu

Calvani und Kollegen post-operativ eine Herabregulation in diesem Bereich. Mehrere

________________________________________________________________________________________ 35

Gründe können für diesen Unterschied verantwortlich sein: die Gewinnung der post-

operativen Urinprobe erfolgte in der Arbeit von Calvani und Kollegen (39) wesentlich

später als in der gegenwärtigen Arbeit. Es ist nicht auszuschließen, dass zu einem

Abnahmezeitpunkt 30 Tage nach Operation oder später auch in dem hier untersuchten

Patientenkollektiv eine Hochregulation zu finden wäre. Zukünftige Studien und

Untersuchungen werden benötigt, um dies zu klären. Neben dem Abnahmezeitpunkt kann

auch die Fallzahl ein entscheidender Grund für diesen Unterschied sein. Während Calvani

und Kollegen (39) nur zwei Patienten untersuchten, fand die vorliegende Untersuchung an

insgesamt 45 Patienten statt.

Wie oben erwähnt, war es Calvani und Kollegen gelungen, neben Hippursäure weitere

Metabolite zu identifizieren, die sich signifikant zwischen adipösen und schlanken

Personen unterschieden, sowie sich nach der Operation im Spektrum nachweisbar

veränderten. Bei diesen Metaboliten handelte es sich zusätzlich um Trigonellin, 2-

Hydroxyisobuthyrat und Xanthin. Im Vergleich dazu sind in dieser Arbeit keine auffälligen

Änderungen in diesen Metaboliten entsprechenden ppm-Bereichen sichtbar. Unsere

Ergebnisse lassen auf weitere Metabolite schließen, die Veränderungen durch die

bariatrische Operation unterworfen sind.

Die Patienten in dieser Arbeit wurden im Zeitraum von 2009 bis 2010 nacheinander

operiert. Sie alle unterscheiden sich in Bezug auf ihr Geschlecht und Alter, ihre

Komorbidität mit entsprechender Medikation, ihren sozialen Hintergrund sowie

persönliche Nahrungsgewohnheiten. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass eine

Lebensstiländerung wie die Umstellung der Ernährung zu einer Änderung der mikrobiellen

Besiedlung des Darmes führt und dass sich diese auf das Metabolom des Menschen

auswirkt (52). Siehe hierzu z.B. auch „Metabolischer Effekt von Zartbitter-Schokolade auf

Energie, mikrobielle Besiedlung des Darmes sowie Stress-assoziierten Stoffwechsel in

frei-lebenden Probanden“ von Martin und Kollegen (53). Darüber hinaus wird vermutet,

dass die Darmflora eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Adipositas spielt. So ist sie

über verschiedene Mechanismen wie Energieaufnahme oder Fettspeicherung an der

Regulation des Stoffwechsels beteiligt (54–56). Es gibt Hinweise, dass

Lipopolysaccharide der Darmbakterien über das Endocannabinoidsystem die Physiologie

des Fettgewebes beeinflussen (57). Neben Umweltfaktoren beeinflussen auch genetische

________________________________________________________________________________________ 36

Merkmale des Wirts die Fülle und Diversität der mikrobiellen Besiedlung des Darmes

(58,59).

Die Gemeinsamkeit aller Patienten ist das Übergewicht und die Tatsache der

bariatrischen Operation. Dazu wurden zwei verschiedene Methoden, der Roux-en-Y

Magenbypass als gemischt malabsorptives und restriktives Verfahren und die

Schlauchmagenbildung als Vertreter der rein restriktiven Verfahren, angewendet. Die

Analysen ergaben, dass Alter und Geschlecht keine zusätzliche Information zur

Unterscheidung von prä- und post-operativen Proben liefert. Aufgrund der Fallzahlen war

es leider nicht möglich, beide Operationsmethoden hinsichtlich einer unterschiedlichen

Entwicklung des Metabolitenprofils zu untersuchen. Untersuchungen weisen jedoch

darauf hin, dass die Fähigkeit der beiden genannten Verfahren zum Gewichtsverlust zu

führen, auf unterschiedlichen Mechanismen beruht (36,60). Die Schlauchmagenbildung

führt im Vergleich zum Roux-en-Y Magenbypass zur stärkeren Senkung der Nüchtern-

Ghrelin-Spiegel als auch postprandialer Ghrelin-Spiegel (36,61), sowohl nach drei (61),

als auch zwölf Monaten (36). Ghrelin ist ein peripheres appetitanregendes

gastrointestinales Hormon, welches hauptsächlich aus Zellen des Magens sezerniert wird

(62). Die Verabreichung von Ghrelin stimuliert die Nahrungsaufnahme sowohl bei

Nagetieren als auch beim Menschen über eine vermehrte hypothalamische Expression

des appetitanregenden Neuropeptids Y (63,64). Ghrelin wird eine Rolle bei der Initiation

der Nahrungsaufnahme zugeschrieben, da beobachtet worden ist, dass Ghrelin-Spiegel

preprandial kontinuierlich ansteigen und postprandial proportional zur Kalorienaufnahme

sinken (65). Interessanterweise ist Adipositas verbunden mit niedrigen Ghrelin-Spiegeln

(66) und zusätzlich mit einer schwachen postprandialen Ghrelin-Suppression (60). Nach

Diät-induziertem Gewichtsverlust steigen Ghrelin-Spiegel, während sie nach

Gewichtsverlust erreicht durch Magenbypass sinken (67). Der Effekt des Roux-en-Y

Magenbypasses könnte in einer Verhinderung des Ghrelinanstiegs nach Bypass-Chirurgie

bestehen (36). Allerdings existieren widersprüchliche Berichte bzgl. des Einflusses des

Magenbypasses auf den Ghrelinspiegel (36).

Sowohl Schlauchmagenbildung als auch Roux-en-Y Magenbypass führen post-operativ

zu einer deutlichen Steigerung der Ausschüttung des Hormons Peptid YY, sowohl basal

als auch postprandial (36,61). Peptid YY wird postprandial aus intestinalen endokrinen L-

________________________________________________________________________________________ 37

Zellen im distalen Darm freigesetzt und inhibiert am Nucleus arcuatus im

Zentralnervensystem die Freisetzung des Neuropeptids Y (68). Beim Menschen induziert

eine intravenöse Infusion des Peptids YY ein Gefühl der Sättigung, reduziert die

Nahrungsaufnahme (68,69) und inhibiert die gastrointestinale Motilität sowie die

Sekretionsleistung des Pankreas (70,71). Studien konnten einen niedrigeren Peptid YY-

Spiegel bei morbid-adipösen im Vergleich zu schlanken Kontrollen beobachten (69,72).

Zusätzlich ist bei morbid-adipösen der physiologische Anstieg der Peptid YY-

Konzentration als Antwort auf eine Mahlzeit abgeschwächt (73).

Mittels einer visuellen Analogskala zur Einschätzung des Appetits konnten Karamanakos

und Kollegen post-operativ eine Senkung des Appetits sowohl für die

Schlauchmagenbildung als auch den Roux-en-Y Magenbypass beobachten. Der Verlust

des Appetits war größer für Patienten nach Schlauchmagenbildung. Bei beiden

Untersuchungsgruppen stieg der Appetit über einen Zeitraum von zwölf Monaten wieder

an, blieb aber für Schlauchmagen-Patienten niedriger. Ausgangswerte wurden von beiden

Gruppen nach zwölf Monaten nicht wieder erreicht (36).

Die Eigenschaft, dass die Schlauchmagenbildung zusätzlich zur Erhöhung des Peptid YY-

Spiegels den Ghrelin-Spiegel senkt, wird für die bessere Effektivität im Vergleich zum

Roux-en-Y Magenbypass, einen Gewichtsverlust zu erreichen, sowie den Appetit zu

senken, verantwortlich gemacht (36). Ein hoher Ghrelin-Spiegel vermindert die

anorektische Wirkung des Peptids YY und des Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1) im

Tiermodel (74).

Bei Typ 2 Diabetes mellitus-Patienten konnte nach Roux-en-Y Magenbypass eine

deutliche Verbesserung des Blutzuckerspiegels beobachtet werden (11,12,43). In der

frühen post-operativen Phase können viele Patienten normale Nüchtern-Blutzucker-Werte

erreichen, ohne dass bis dahin ein signifikanter Gewichtsverlust eingetreten ist (23,24,75).

Hierbei wird angenommen, dass hauptsächlich Veränderungen des GLP-1 Spiegels dafür

verantwortlich sind (61). GLP-1 ist ein Hormon, das aus endokrinen L-Zellen des distalen

Darmes in Reaktion auf Nahrungsaufnahme in das Blut freigesetzt wird (76). Die

Hauptwirkung dieses Hormons besteht in einer postprandialen Stimulation der

Insulinsekretion bei zeitgleicher Inhibition der Glukagonsekretion (76). Ferner limitiert es

die gastrointestinale Motilität und Sekretion (76). Zusätzlich scheint GLP-1 eine

________________________________________________________________________________________ 38

regulierende Funktion auf Appetit und Nahrungsaufnahme zu haben, womit einer defekten

postprandialen GLP-1 Antwort ein Anteil an der Genese der Adipositas zugeschrieben

wird (76). In präklinischen wie klinischen Studien konnte beobachtet werden, dass

anhaltende GLP-1 Rezeptor-Aktivierung mit Gewichtsverlust assoziiert ist (77). GLP-1

erhöht im Nagetiermodel die Menge der Langerhans-Inseln durch Stimulation der

pankreatischen β-Zellproliferation und Induktion der Inselzellneogenese (78). Außerdem

begünstigt GLP-1 die Differentiation von exokrinen Zellen oder unreifen Inselzellvorläufern

zu einem differenzierten β-Zell-Phänotyp (78). Peterli und Kollegen konnten in einer

prospektiven, randomisierten Studie zeigen, dass sich sowohl post Roux-en-Y

Magenbypass als auch post Schlauchmagenbildung die GLP-1 Antwort auf eine Test-

Mahlzeit deutlich verbesserte; im Sinne eines erhöhten postprandialen GLP-1 Anstiegs

(61). Patienten mit Roux-en-Y Magenbypass hatten sowohl eine Woche als auch drei

Monate post-operativ höhere durchschnittliche GLP-1 Werte als Patienten mit

Schlauchmagen. Bei beiden war jedoch der Anstieg signifikant. Sowohl der Roux-en-Y

Magenbypass als auch die Schlauchmagenbildung konnten post-operativ den HOMA-IR

Score deutlich senken. Allerdings hatten Patienten mit Roux-en-Y Magenbypass drei

Monate post-operativ einen niedrigeren HOMA-IR Score als Patienten mit

Schlauchmagen. Letztgenanntes wird von den Autoren mit der Beobachtung in

Verbindung gebracht, dass der Roux-en-Y Magenbypass die postprandiale GLP-1

Dynamik stärker beeinflusst als der Schlauchmagen. Warum der Roux-en-Y

Magenbypass die GLP-1 Dynamik mehr beeinflusst als der Schlauchmagen ist noch

Gegenstand der gegenwärtigen Diskussion.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass eher die schlechtere bzw. fehlende Dynamik der

genannten Hormone in Reaktion auf Stimuli charakteristisch für Adipositas ist als die

absoluten Konzentrationen.

Vorstellbar ist, dass die erwähnten, im Serum gemessenen Beobachtungen eine

Auswirkung auf das Metabolom des Urins haben. Jedoch lässt sich zurzeit keine Aussage

bzgl. einer Verbindung der Hormone mit der Erscheinung der Spektren treffen. Eine

Arbeit, die die Auswirkungen bariatrischer Operationen auf das Metabolom des Serums

untersucht, könnte hier vielleicht Signaturen dieser Hormone entdecken.

________________________________________________________________________________________ 39

4.3. Stärken und Limitationen der Studie

Stärken

Die präsentierte Arbeit untersuchte zum ersten Mal an einem großen Patientenkollektiv

die Auswirkungen von bariatrischer Chirurgie auf das Metabolom des Urins.

Alle Patienten wurden aus einem Behandlungszentrum mit Schwerpunkt Adipositas

rekrutiert und vom selben chirurgischen Team operiert. So ist eine gleichbleibende Art

und Qualität der Operation gewährleistet. Damit wird eine Fehlermöglichkeit, die sich z.B.

aus verschieden großen Resektatstücken bei der Schlauchmagenbildung oder der Größe

des Pouches bei dem Roux-en-Y Magenbypass ergibt, stark minimiert. Da der

Rekrutierungszeitraum mit elf Monaten relativ kurz war, wird der Einfluss von Variablen

wie Operateure, Änderungen der Operationsmethode oder Nachsorge auf die

Untersuchungsergebnisse minimiert. Der Roux-en-Y Magenbypass und die

Schlauchmagenbildung sind etablierte und häufige Verfahren. Zudem haben sie eine

ähnliche Wirksamkeit bezogen auf Gewichtsverlust und Komorbidität, obwohl sie sich in

der Operationsmethodik deutlich unterscheiden. Die Schlauchmagenbildung zählt zu den

neueren Verfahren und gewinnt rapide an Bedeutung, da sie vergleichsweise

einfach/leicht zu erlernen und anzuwenden ist und keine Änderung der Architektur des

Magen-Darm Traktes nach sich zieht. Damit sind Untersuchungen wie Gastroskopie,

endoskopische retrograde Cholangiopancreaticographie im weiteren Leben des Patienten

nicht ausgeschlossen. Die Patienten dieser Arbeit haben sich überwiegend der

Schlauchmagenbildung unterzogen, womit auch der Anteil der Beobachtungen

überwiegend auf dieses Procedere zurückzuführen sein wird. Damit wurde in dieser Arbeit

ein an Bedeutung gewinnendes Verfahren mit der innovativen Methode der Metabolomik

untersucht.

Mit der Bestimmung des Metaboloms via 1H-NMR-Spektroskopie aus dem Urin kann

quantitativ das gesamte Metabolom in einem Durchgang gemessen werden. Eine

Messung für die hier vorgestellte Arbeit dauerte ca. 20 Minuten.

________________________________________________________________________________________ 40

Urin ist leicht und vor allen Dingen nicht-invasiv zu gewinnen, was einen Vorteil birgt in

Bezug auf Akzeptanz bei Patienten/Probanden. Bei der Gewinnung von Serum werden

viele kleine Moleküle während des Gerinnungsprozesses freigesetzt, die das Spektrum

beeinflussen können. Bei der Gewinnung von Plasma ist die Natur des verwendeten

Antikoagulans zu bedenken, die ihrerseits das Metabolom beeinflussen kann. Diese

beiden Einschränkungen treffen für Urinproben nicht zu.

Limitationen

Die vorliegende Arbeit stellt keinen Beweis für Veränderungen im Urin-Metabolom speziell

nach einer bariatrischen Operation dar. Die beschriebenen Veränderungen und

Gemeinsamkeiten können auch Ausdruck eines ganz allgemeinen post-operativen Status

nach größeren und invasiveren Eingriffen sein. In so einem Fall wären die Beobachtungen

evtl. Ausdruck von post-operativem Stress. Veränderungen, die sich speziell nach

bariatrischer Operation ergeben, sieht man gegebenenfalls erst nach einem längeren

Zeitraum, wenn der Organismus Zeit hatte, sich an die neue Situation zu adaptieren. Um

diese Thesen zu überprüfen, müsste diese oder eine ähnliche Studie weitergeführt

werden, welche einen längeren Zeitraum sowie mehr Mess-Zeitpunkte beinhaltet. So

könnten eine Dynamik im Sinne einer Änderung der Spektren detektiert werden. Darüber

hinaus können die Veränderungen auch durch den beachtlichen Gewichtsverlust

innerhalb kürzester Zeit (10 % Gewichtsverlust in 13 Tagen) bedingt sein oder durch post-

operative Medikamente wie z.B. Schmerzmittel, Narkotika, Anästhetika und Heparin

beeinflusst werden.

Wie bereits oben diskutiert, wurden die Patienten dieser Arbeit nach zwei Methoden

operiert. Elf Patienten bekamen einen Roux-en-Y Magenbypass und 40 Patienten

unterzogen sich einer Schlauchmagenbildung. Somit sind zwei verschiedene OP-

Methoden unterschiedlich schwer gewichtet. Die daraus resultierende Vermischung

verschiedener Effekte mag eine Identifikation spezieller Unterschiede schwierig machen.

Eine Arbeit mit einem größeren und operationsmethodisch ausgeglichenen

Patientenkollektiv könnte hierzu Aussagen treffen und evtl. Unterschiede im Metabolom

des Urins zwischen den beiden Operationsgruppen zeigen.

________________________________________________________________________________________ 41

Das vorgestellte Patientengut wurde nicht getrennt nach Diabetiker und Nicht-Diabetiker

analysiert. Eine getrennte Untersuchung könnte evtl. Unterschiede im Veränderungsprofil

des Metaboloms aufzeigen. Die Wirkung bariatrischer Chirurgie auf die Verbesserung

eines Diabetes mellitus ist auch nach kurzen post-operativen Zeiträumen dokumentiert

(23,24).

________________________________________________________________________________________ 42

5. Zusammenfassung und Ausblick

Adipositas ist medizinisch und sozioökonomisch ein weltweit an Bedeutung gewinnendes

Problem. Bariatrische Chirurgie hat sich als effektivste Möglichkeit zur Behandlung

morbider Adipositas erwiesen. Dabei ergeben sich deutliche Verbesserungen des

diabetischen Stoffwechsels bereits kurz nach dem Eingriff, bevor ein signifikanter

Gewichtsverlust eingetreten ist. Die Mechanismen, die dazu führen, sind dabei noch nicht

vollständig aufgeklärt. Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe des Metabolomikansatzes

herauszufinden, ob bariatrische Chirurgie einen Einfluss auf das Metabolom des Urins

hat. Dazu wurden Urinproben von 50 Patienten jeweils prä-operativ und bis zu 13 Tage

post-operativ mittels 1H-NMR untersucht und mit Hilfe von multivariaten statistischen

Methoden analysiert. Dabei konnte deutlich zwischen prä- und post-operativen Proben

unterschieden werden. PLS-DA und OPLS-DA Modelle waren in der Lage, 95 % der

Spektren richtig in prä- und post-operativ zu klassifizieren. Zur Unterscheidung trugen in

erster Linie die Buckets b20, b49 und b50 bei. Bei Betrachtung der gemittelten Spektren

fielen eine Heraufregulation in den ppm-Bereichen 1,20-1,24, 2,1-2,5, 3,2-3,6, 4,1-4,2,

7,40-7,45 und 7,6-7,7 sowie eine Herabregulation in den ppm-Bereichen 7,5-7,6 und 7,8-

7,9 jeweils post-operativ auf. Bariatrische Chirurgie verändert somit das Metabolom des

Urins.

Den Variationen im Spektrum liegen Metabolite zu Grunde, deren Identifikation

Rückschlüsse auf Stoffwechselprozesse erlauben. Diese können wiederum

Erklärungsansätze für den Gewichtsverlust und die Stoffwechselbeeinflussung in Folge

einer bariatrischen Chirurgie liefern. Dieses bessere Verständnis der

pathophysiologischen Vorgänge könnte weiterhin zur Entwicklung weniger invasiver

chirurgischer Eingriffe oder spezieller, individueller pharmakologischer Therapien führen,

zielgerichtet auf Gewichtsverlust und Remission des Diabetes mellitus. Weiterhin könnte

Metabolomik bei der Entscheidung über die OP-Methode helfen. Dazu müsste es

gelingen, aus einem großen Patientenkollektiv mit mehreren OP-Methoden im Urin z.B.

einen Prädiktor zu finden, welcher Gewichtsverlust und Resolution von Komorbidität für

einen individuellen Patienten vorhersagt.

Insgesamt befindet sich die Metabolomikforschung noch in den Anfängen. Im Besonderen

gilt dies für die Dokumentation des Einflusses chirurgischer Eingriffe auf das Metabolom

________________________________________________________________________________________ 43

des Urins. Weitere Studien mit einem größeren Patientenkollektiv und alternativen

Fragestellungen könnten hier zu einem Erkenntnisgewinn führen.

________________________________________________________________________________________ 44

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78. Drucker DJ. Glucagon-like peptides: regulators of cell proliferation, differentiation, and apoptosis. Mol. Endocrinol. 2003;17(2):161-171.

________________________________________________________________________________________ 50

7. Anhang

7.1. Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine

anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen

Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass

eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Greifswald, den 25. Juni 2013 ___________________________________

Arne Jungnickel

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7.2. Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. med. H. Wallaschofski für die Überlassung des Themas und die

Unterstützung bei der Bearbeitung.

Frau PD Dr. rer. med. N. Friedrich danke ich für die Erstellung der Biostatistik und Ihre

hilfreichen Korrekturen und Anregungen zur Fertigstellung der Arbeit.

Ich danke Frau Dr. rer. med. K. Budde für die NMR-Spektroskopie der Urinproben und

Ihre Erläuterungen zum Verständnis dieser Methode.

Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. med. T. Lohmann, Chefarzt der Medizinischen Klinik

Industriestraße des städtischen Krankenhauses Dresden-Neustadt, für die klinische

Zusammenarbeit bei der Erstellung der Patientendaten seiner Klinik und die Kooperation

mit dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universitätsmedizin

Greifswald. Insbesondere danke ich dem Stationsarzt Dr. med. T. Wolf für seine

zuvorkommende Unterstützung während der Datensammlung in Dresden.

Meinem Bruder danke ich für wiederholte Logis in Dresden und für seine Excel-Expertise.

Schließlich danke ich meinen Eltern herzlich für die Ermöglichung meines Studiums.

Ihnen widme ich diese Arbeit.

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