Einfluss des Flavonoids Quercetin auf die epitheliale ... Zur Klasse der Flavonoide z¤hlen...

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  • Medizinische Klinik I für Gastroenterologie, Infektiologie und Rheumatologie Charité, Campus Benjamin Franklin, Berlin

    Einfluss des Flavonoids Quercetin auf die epitheliale Barrierefunktion

    der humanen Kolonkarzinom-Zelllinie Caco-2

    Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades "doctor rerum naturalium" (Dr. rer. nat.)

    eingereicht an

    der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Potsdam

    Wissenschaftsdisziplin: Ernährungswissenschaft

    vorgelegt von

    Susanne Schlichter

    Potsdam 2007

  • This work is licensed under the Creative Commons Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 2.0 Germany License. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/de/ or send a letter to Creative Commons, 171 Second Street, Suite 300, San Francisco, California, 94105, USA. Elektronisch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der Universität Potsdam: http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2007/1526/ urn:nbn:de:kobv:517-opus-15269 [http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus- 15269]

  • Inhaltsverzeichnis I

    Inhaltsverzeichnis

    A Einleitung ................................................................................... 1

    1 Flavonoide................................................................................................... 1 1.1 Quercetin und Quercetinglykoside................................................................ 2 1.1.1 Vorkommen................................................................................................ 2 1.1.2 Metabolismus............................................................................................. 4 1.1.3 Biologische Effekte .................................................................................... 6

    2 Epithelien .................................................................................................... 8 2.1 Zellkontakte zwischen Epithelien und Endothelien ....................................... 8 2.2 Tight Junction ............................................................................................. 10 2.2.1 Occludin ................................................................................................... 10 2.2.2 Tricellulin.................................................................................................. 12 2.2.3 Claudin-Familie ........................................................................................ 13 2.2.4 Junctional Adhesion Molecule.................................................................. 16 2.3 Humane intestinale Epithelzelllinie Caco-2 als in vitro-Modell .................... 17

    3 Zielstellung................................................................................................ 18

    B Material und Methoden ........................................................... 19

    1 Geräte ........................................................................................................ 19

    2 Verbrauchsmaterialien ............................................................................. 20

    3 Substanzen und Chemikalien.................................................................. 21

    4 Gebrauchsfertige Kits .............................................................................. 23

    5 Enzyme...................................................................................................... 24

    6 Antisera ..................................................................................................... 24

    7 Primer ........................................................................................................ 25

    8 Biologisches Material............................................................................... 25

    9 Zellbiologische Methoden........................................................................ 26 9.1 Kultivierung von Zellen ............................................................................... 26 9.2 Behandlung der Zellen mit Testsubstanzen................................................ 27 9.3 Beschichtung von Deckgläschen mit Poly-L-Lysin ..................................... 27

  • Inhaltsverzeichnis II

    10 Elektrophysiologische Methoden............................................................ 28 10.1 Manuelle Messung des transepithelialen Widerstands ............................... 28 10.2 Widerstands- und Fluxmessungen mittels Ussing-Technik ........................ 29 10.2.1 Messung von Mannitol-Fluxen ................................................................. 30 10.2.2 Messung von Natriumchlorid-Fluxen........................................................ 31

    11 Biochemische Methoden ......................................................................... 31 11.1 Untersuchung von Substanzen auf Zytotoxizität durch Bestimmung der

    Laktat-Dehydrogenase-Aktivität.................................................................. 31 11.2 Western Blot-Analysen ............................................................................... 32 11.2.1 Membranprotein-Extraktion aus eukaryontischen Zellkulturen................. 32 11.2.2 Proteinextraktion von Gesamtlysat aus eukaryontischen Zellkulturen ..... 33 11.2.3 Proteinbestimmung .................................................................................. 33 11.2.4 Protein-Auftrennung durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ......... 34 11.2.5 Proteintransfer auf PVDF-Membrane....................................................... 36 11.2.6 Immundetektion von Proteinen ................................................................ 37 11.3 Immunfluoreszenz-Färbung von Tight Junction-Proteinen ......................... 38 11.4 Bestimmung der Apoptose-Rate mittels TUNEL-Färbung .......................... 39

    12 Molekularbiologische Methoden ............................................................. 40 12.1 RNA-Isolierung aus eukaryontischen Zellkulturen ...................................... 40 12.2 Polymerase-Kettenreaktion ........................................................................ 41 12.3 Quantitative mRNA-Bestimmung................................................................ 42 12.4 Klonierung des Claudin-4-Promotors.......................................................... 44 12.4.1 Synthese des Claudin-4-Promotors ......................................................... 44 12.4.2 DNA-Agarosegel-Elektrophorese............................................................. 45 12.4.3 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ............................... 46 12.4.4 Aufreinigung über Säulensysteme ........................................................... 46 12.4.5 Ligation des Claudin-4-Promotors in Plasmidvektoren ............................ 47 12.4.6 Enzymatisches Schneiden von Plasmid-DNA.......................................... 50 12.4.7 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente Zellen ......................... 51 12.4.8 Plasmid-Minipräparation aus kompetenten Zellen ................................... 53 12.4.9 Sequenzierung von DNA-Abschnitten...................................................... 54 12.4.10 Plasmid-Midipräparation (endotoxinfrei) .................................................. 55 12.4.11 Glycerolstocks.......................................................................................... 56 12.5 Bestimmung der Aktivität des Claudin-4-Promotors mittels Luciferase-

    Reportergen-Assay..................................................................................... 57

    13 Statistische Auswertung.......................................................................... 59

  • Inhaltsverzeichnis III

    C Ergebnisse ............................................................................... 60

    1 Effekt des Flavonoids Quercetin auf die Barrierefunktion der Caco-2-Zelllinie ......................................................................................... 60

    1.1 Einfluss von Quercetin auf den transepithelialen Widerstand..................... 60 1.2 Zytotoxizität von Quercetin an konfluenten Zellen ...................................... 63 1.3 Effekt von Quercetin auf den transepithelialen Widerstand nach

    täglicher Supplementierung des Flavonoids ............................................... 64 1.4 Einfluss von Quercetin auf den transepithelialen Widerstand in

    Abhängigkeit vom Zugabekompartiment .................................................... 65

    2 Einfluss von Quercetin auf das Expressionsmuster von Tight Junction-Proteinen................................................................................... 66

    2.1 Proteinexpression von Caco-2-Zellen in Kulturschalen .............................. 66 2.2 Proteinexpression von Caco-2-Zellen auf permeablen Zellfiltern ............... 68

    3 Einfluss von Quercetin auf die Lokalisation der Tight Junction- Proteine ..................................................................................................... 69

    4 Einfluss von Quercetin auf die mRNA-Expression von Claudin-4 ...... 77

    5 Klonierung des Claudin-4-Promotors ..................................................... 78 5.1 Zytotoxizität von Quercetin an subkonfluenten Zellen ................................ 78 5.2 Amplifizierung des Claudin-4-Promotors sowie Klonierung in den

    pCR2.1-TOPO-Vektor............................................................................