Einfluss extrazellulärer Enzyme auf die Struktur und die

Eigenschaften von Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa

Vom Fachbereich Chemie

der Universität Duisburg-Essen

(Standort Duisburg)

zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

genehmigte Dissertation

von

Petra Tielen

aus

Mülheim an der Ruhr

Datum der Einreichung: 20.05.2005

Tag der Prüfung: 29.06.2005

Referent: Prof. H.-C. Flemming

Korreferent: Prof. K.-E. Jaeger

Danksagung

DANKSAGUNG Herrn Prof. Dr. Hans-Curt Flemming gebührt mehr als an dieser Stelle übliche Dank. Ich danke ihm für seine Unterstützung und die lehrreichen Jahre, in denen er es mir mit freundschaftlicher Kollegialität ermöglichte meinen eigenen Ideen nachzugehen, mich aber auch veranlasste über meinen eigenen wissenschaftlichen „Tellerrand” zu schauen. Darüber hinaus danke ich ihm für sein Vertrauen, mich mit der Betreuung von Praktikanten und Diplomanden und der Planung, Organisation und Durchführung des mikrobiologischen Praktikums des Studiengangs “Water Sciences” zu betrauen. Herr Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger danke ich für die Übernahme des Korreferates und die zwischenzeitliche Aufnahme in seiner Arbeitsgruppe und seinen Laboratorien. Dr. Jost Wingender danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, für die stete Betreuung, die hilfreichen Anregungen und für so manche förderliche Diskussion. Den Mitarbeitern der Aquatischen Mikrobiologie danke ich für die freundschaftlich kollegiale Arbeitsatmosphäre und für die chemischen Sicht- und Denkweisen, von denen ich viel gelernt habe. Insbesondere bei Dr. Martin Strathmann, Astrid Dannehl und Sabine Dietl möchte ich mich für die produktive Zusammenarbeit bedanken. Darüber hinaus gilt Sabine Dietl mein besonderer Dank für ihre freundschaftliche Unterstützung. Den Mitarbeitern des Institutes für Molekulare Enzymtechnologie möchte ich für die inspirierende Zeit danken. Besonders Dr. Susanne Wilhelm und Dr. Frank Rosenau möchte ich für die produktive Kooperation und die wegweisenden und zum Teil visionären Diskussionen danken. Darüber hinaus gilt Dr. Frank Rosenau mein herzlichster Dank für die bestmögliche Unterstützung die man sich wünschen kann; dafür, dass er mir die nächste Stufe gezeigt hat und vor allem, dass er an mich geglaubt hat. Benedikt Henke danke ich für seine tatkräftige Unterstützung im Rahmen seines Praktikums. Dr. Dirk Wenderoth und Birgit Jung von der Gesellschaft für Biologische Forschung (GBF) in Braunschweig danke ich für die erfreuliche, produktive Kooperation. Der deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die im Rahmen des Projektes “Rolle extrazellulärer Enzyme bei Aufbau, Erhalt und Abbau von Biofilmen” gewährte finanzielle Unterstützung. Mein letzter, aber persönlichster Dank gilt meinen Lieben, ohne die das alles nicht möglich gewesen wäre.

Veröffentlichungen

VERÖFFENTLICHUNGEN Artikel Tielen, P., Strathmann, M., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C., Wingender, J. (2005) Alginate acetylation influnces initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Res. 160; 165 - 176 Konferenzbeiträge Tielen, P., Wingender, J., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C. (2000) Influence of acetyl groups in alginate on the properties of extracellular polymeric substances from Pseudomonas aeruginosa. Poster, IWA Tagung, Extracellular Polymeric Substances, Mülheim a. d. Ruhr, Deutschland Tielen, P., Wingender, J., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C. (2001) Influence of acetyl groups in alginate on the properties of extracellular polymeric substances from Pseudomonas aeruginosa. Poster, Jahrestagung der VAAM, Oldenburg, Deutschland Wingender, J., Tielen, P., Strathmann, M., Flemming, H.-C., Heckmann, S., Rosenau, F., Jaeger, K.-E., (2001) Extracellular enzymes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Poster, Pseudomonas Tagung, Brüssel, Belgien Tielen, P., Strathmann, M., Wingender, J., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C. (2002) Localization and interaction of extracellular enzymes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Poster; IUMS Conference, The World of microbes, Paris, Frankreich Tielen, P., Strathmann, M., Wingender, J., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C. (2002) Localization and interaction of extracellular enzymes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Poster, Jahrestagung der VAAM, Göttingen, Deutschland Tielen, P., Wilms, A., Rode, A., Wilhelm, S., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C. (2003) Overproduction of the extracellular protease elastase Biofilm affects EPS composition and biofilm structure of mucoid Pseudomonas aeruginosa. Poster, ASM Conference, Biofilms 2003, Victoria, British Columbia, Kanada Tielen P., Wilhelm, S., Jaeger K-E., Flemming H.-C., Wingender J. (2005) Extrazellular enzymes affect EPS composition and biofilm structure of Pseudomonas aeruginosa. Poster, Pseudomonas Tagung, Marseille, Frankreich

Inhaltsverzeichnis

i

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ..................................................................................................................................1

1.1 Biofilme als mikrobieller Lebensraum ..................................................................................1

1.2 EPS und extrazelluläre Enzyme.............................................................................................4

1.3 Pseudomonas aeruginosa .....................................................................................................14

1.4 Problemstellung......................................................................................................................29

1.5 Zielsetzung ..............................................................................................................................30

2 MATERIAL .....................................................................................................................................31

2.1 Bakterienstämme ..................................................................................................................31

2.2 Plasmide ................................................................................................................................32

2.3 Oligonukleotide.....................................................................................................................33

2.4 Nährmedien ...........................................................................................................................34 2.4.1 Allgemeine Nährmedien...................................................................................................34

2.4.2 Test-Nährmedien .............................................................................................................35

2.5 Puffer und Lösungen............................................................................................................37

2.6 Polysaccharide......................................................................................................................38

2.7 Proteine und Enzyme............................................................................................................39

2.8 Chemikalien...........................................................................................................................40

2.9 Kommerzielle Reaktions- und Nachweis-Kits ....................................................................42

2.10 Geräte.....................................................................................................................................42

2.11 Computer Software und Datenbanken................................................................................44

Inhaltsverzeichnis

ii

3 METHODEN ...................................................................................................................................45

3.1 Mikrobiologische Methoden...................................................................................................45 3.1.1 Stammhaltung der Bakterien............................................................................................45

3.1.2 Anzucht der Bakterien......................................................................................................45 3.1.2.1 Anzucht von Flüssigkulturen ..................................................................................................46

3.1.2.2 Anzucht von Biofilmen............................................................................................................46

3.1.3 Charakterisierung der Bakterien mit dem api 20NE-System............................................48

3.1.4 Isolierung von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) ..........................................49

3.1.5 Bestimmung der Trockenmasse ......................................................................................49

3.1.6 Bestimmung der Adhärenz an n-Hexadekan ...................................................................49

3.1.7 Bestimmung von Signalmolekülen in zellfreien EPS-Lösungen.......................................50

3.1.8 Bestimmung von Beweglichkeiten ...................................................................................50

3.2 Molekularbiologische Methoden ...........................................................................................51 3.2.1 Isolierung von DNA ..........................................................................................................51

3.2.1.1 Mini-Präparation von Plasmid-DNA .......................................................................................51

3.2.1.2 Midi-Präparation von Plasmid-DNA .......................................................................................51

3.2.1.3 Isolierung von chromosomaler DANN aus P. aeruginosa .....................................................52

3.2.2 Phenol-Chloroform-Extraktion..........................................................................................52

3.2.3 Präzipitation von DNA......................................................................................................52 3.2.3.1 Ethanolfällung.........................................................................................................................52

3.2.3.2 Isopropanolfällung..................................................................................................................53

3.2.4 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................................53 3.2.4.1 Konzentrationsbestimmung von DNA ....................................................................................53

3.2.4.2 Elution von DANN aus Agarosegelen ....................................................................................53

3.2.5 In vitro-Rekombination von DNA......................................................................................54 3.2.5.1 Hydrolytische Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen ....................................54

3.2.5.2 Synthese von glatten DNA-Enden („blund ends“)..................................................................54

3.2.5.3 Ligation von Vektor- und Fragment-DNA...............................................................................54

3.2.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA..............................................................55 3.2.6.1 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen .........................................................55

3.2.6.2 Transformation von E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA .............................................................55

3.2.7 Übertragung von Plasmiden durch Konjugation...............................................................55

3.2.8 Polymerasekettenreaktion................................................................................................56

3.2.9 Pulsfeld-Gelelektrophorese..............................................................................................56 3.2.9.1 Einbettung von bakterieller genomischer DNA in Agarose-Blöcke........................................56

3.2.9.2 Kompletter Einfachverdau der eingebetteten genomischen DNA .........................................57

3.2.9.3 Contour Clamped Homogenous Electric Field-Electrophoresis ............................................57

Inhaltsverzeichnis

iii

3.3 Biochemisch-präparative Methoden .....................................................................................58 3.3.1 Reinigung von bakteriellen Alginaten...............................................................................58

3.3.2 Reinigung von kommerziellen Polysacchariden...............................................................58

3.3.3 Chemische Deacetylierung von bakteriellen Alginaten ....................................................59

3.3.4 Isolierung von Lipopolysacchariden .................................................................................59

3.4 Chemisch-analytische Methoden ..........................................................................................60 3.4.1 Bestimmung von Proteinen ..............................................................................................60

3.4.2 Bestimmung von Kohlenhydraten ....................................................................................60

3.4.3 Bestimmung von Uronsäuren...........................................................................................61 3.4.3.1 Biphenyl-Methode ..................................................................................................................61

3.4.3.2 Sulfamat-Biphenyl-Methode...................................................................................................61

3.4.4 Bestimmung von Acetylgruppen ......................................................................................62

3.4.5 Bestimmung von 2-Keto-3-desoxyoctonat (KDO) ............................................................62

3.4.6 Bestimmung von Pigmenten ............................................................................................63

3.5 Methoden zur Enzymaktivitätsbestimmung .........................................................................63 3.5.1 API-ZYM-System .............................................................................................................63

3.5.2 Bestimmung von Enzymaktivitäten mit Substratagarplatten ............................................64 3.5.2.1 Protease .................................................................................................................................64

3.5.2.2 Esterase .................................................................................................................................64

3.5.2.3 Lipase.....................................................................................................................................64

3.5.3 Photometrische Methoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten .................................65 3.5.3.1 Protease .................................................................................................................................65

3.5.3.2 Esterase .................................................................................................................................65

3.5.3.3 Lipase.....................................................................................................................................66

3.5.3.4 Phospholipase C ....................................................................................................................66

3.5.3.5 alkalische Phosphatase .........................................................................................................67

3.5.4 Fluorimetrische Methoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten..................................67 3.5.4.1 alkalische Phosphatase .........................................................................................................67

3.5.5 Visualisierung von Enzymaktivitäten in situ .....................................................................68 3.5.5.1 Phosphatase ..........................................................................................................................68

3.5.5.2 Esterase .................................................................................................................................69

3.5.5.3 Lipase.....................................................................................................................................69

3.6 Physikalisch-analytische Methoden......................................................................................70 3.6.1 Viskosimetrie....................................................................................................................70

3.6.2 Filmrheometrie .................................................................................................................70

Inhaltsverzeichnis

iv

3.7 Gelelektrophorese von Proteinen..........................................................................................71 3.7.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese..................................................71

3.7.2 Gelelektrophorese zur Bestimmung von Protease-Aktivitäten.........................................72

3.8 Chromatographische Methoden............................................................................................73 3.8.1 Analytische Gelsiebchromatographie von zellfreien EPS-Lösungen ...............................73

3.8.2 Gelsiebchromatographie von Lipasen an Sephacryl S-500 HR.......................................74

3.8.3 Adsorptionschromatographie von Lipasen an Glas .........................................................75

3.9 Bestimmung von Enzym-Polysaccharid Wechselwirkungen .............................................76 3.9.1 Mikrotiterplatten-Bindungs-Test .......................................................................................76

3.9.2 Thermische Behandlung von Lipasen..............................................................................76

4 ERGEBNISSE ................................................................................................................................78

4.1 Physiologische Charakterisierung des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81 .............78 4.1.1 Wuchseigenschaften in Modellbiofilmen ..........................................................................78

4.1.2 EPS-Zusammensetzung ..................................................................................................80

4.1.3 Extrazelluläre Enzymaktivitäten .......................................................................................81

4.2 Lokalisation von extrazellulären Enzymen im Biofilm ........................................................84

4.3 Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Enzymen und EPS-Bestandteilen .............86 4.3.1 Gelsiebchromatographie von EPS ...................................................................................86

4.3.2 Bindung von Lipasen an Sephacryl S-500 HR.................................................................90

4.3.3 Immobilisierung von Lipasen an Glas ..............................................................................93

4.3.4 Bindung von Lipasen an Polysaccharide .........................................................................97

4.3.5 Thermische Stabilität von Lipasen in Gegenwart von Polysacchariden...........................99

4.4 Erzeugung und Charakterisierung von Enzym-Überexpressions-Stämmen und Enzym- dezifizienten Mutanten von P. aeruginosa SG81 ..................................................................102 4.4.1 Genotypische Charakterisierung des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81...............102

4.4.2 Konstruktion und Charakterisierung von P. aeruginosa Enzym-Defekt und –

Überexpressions-Stämmen..............................................................................................103

4.5 Physiologische Charakterisierung der verwendeten P. aeruginosa-Stämme...................111 4.5.1 Reaktionen im api 20NE-System .....................................................................................111

4.5.2 Wuchseigenschaften in mAPM-Flüssigmedien................................................................113

4.5.3 Quantitative Untersuchung von 24 h-Agarbiofilmen.........................................................117

Inhaltsverzeichnis

v

4.5.4 Hydrophobizität der Zelloberflächen ................................................................................119

4.5.5 Beweglichkeiten ...............................................................................................................120

4.5.6 EPS-Zusammensetzung ..................................................................................................123

4.5.7 Extrazelluläre Enzymaktivitäten .......................................................................................127 4.5.7.1 Photometrischer Nachweis extrazellulärer Enzymaktivitäten ................................................127

4.5.7.2 In situ Nachweis von Lipase-Aktivitäten im Biofilm................................................................129

4.5.7.3 Nachweis von Protease-Aktivitäten mit Zymogramgelen ......................................................130

4.6 Physikalische Eigenschaften der Biofilme und ihrer EPS ..................................................132 4.6.1 Adhärenz von EPS-Bestandteilen an n-Hexadekan ........................................................132

4.6.2 Viskosität der EPS ...........................................................................................................134

4.6.3 Rheologische Eigensschaften der Biofilme......................................................................135

4.7 Biofilmbildung der Mutanten und Überexpressionsstämme..............................................137

4.7.1 Biofilmbildung in Mikrotiterplatten ....................................................................................137

4.7.2 Biofilmbildung auf Glas unter statischen Bedingungen....................................................138

4.7.3 Biofilmbildung auf Glas unter kontinuierlichen Bedingungen ...........................................140

4.8 Regulation von extrazellulären Enzymen im Biofilm...........................................................145

5 DISKUSSION..................................................................................................................................147

5.1 P. aeruginosa als Modell- Biofilmorganismus .....................................................................148

5.2 Anzucht von Biofilmen ...........................................................................................................149

5.3 Vorkommen und Lokalisation extrazellulärer Enzyme im Biofilm......................................154

5.4 Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Enzymen und der EPS-Matrix....................156

5.5 Physiologische Funktion extrazellulärer Enzyme im Biofilm .............................................164

5.5.1 Lipase LipA ......................................................................................................................164

5.5.2 Lipase LipC ......................................................................................................................167

5.5.3 Esterase EstA ..................................................................................................................171

5.5.4 Elastase LasB ..................................................................................................................175

6 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................................................188

7 FAZIT ............................................................................................................................................190

8 AUSSICHTEN.................................................................................................................................191

9 LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................................193

Abkürzungen

vi

ABKÜRZUNGEN

A Absorption A. deion. deionisiertes Wasser A. dest. destilliertes Wasser AHL Acyl-Homoserinlacton Amp Ampicillin Apmr Ampicillin-Resistenz APM „Alginate Promoting“ Medium ATP Adenosintriphosphat BHL N-Butanoyl-L-Homoserinlacton bp Basenpaar/e BSA bovine serum albumine (Rinderserumalbumin) BUGTM Biolog Universal Growth Ca-PIA Pseudomonas-Isolierungs-Agar mit 0,1 M CaCl2

CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy (konfokale Laser-Raster-Mikroskopie) Cm Chloramphenicol Cmr Chloramphenicol-Resistenz CF Cystische Fibrose, Mukoviszidose DNA Deoxyribonuclein acid (Deoxyribonukeinsäure) DTT Dithiothreit DMSO N,N-Dimethylsulfoxid dNTP Desoxynucleosidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELF Enzyme-labelled-fluorescence EPS extrazelluläre polymere Substanzen EU Enzymeinheit (enzyme unit) FDA Fluoresceindiacatat FT-IR-Spektroskopie FourierTransform Infrarot Spektroskopie Gm Gentamycin Gmr Gentamycin-Resistenz GSP "general secretory pathway" HHL N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton KBE koloniebildende Einheit kbp Kilo Basenpaare kDa Kilo Dalton Km Kanamycin Kmr Kanamycin-Resistenz konz. konzentriert KÜ Kulturüberstand LB-Medium Luria-Broth-Medium LPS Lipopolysaccharid mPIA modifizierter Pseudomonas-Isolierungs-Agar NB Nährbouillon NBA Nährbouillon-Alginat

Abkürzungen

vii

n.b. nicht bestimmt n.n. nicht nachweisbar NCBI National Center for Biotechnology Information O.D. optische Dichte OdDHL N-(3-Oxododekanoyl)-L-Homoserinlacton OM äußere Membran orf "open reading frame" (offener Leserahmen) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PFGE Pulsfeldgelelektrophorese PIA Pseudomonas-Isolierungs-Agar pNP para-Nitrophenol pNPC para-Nitrophenyl-Caproat pNPP para-Nitrophenyl-Palmitat pNPPh para-Nitrophenyl-Phosphat PO4

3- -PIA Pseudomonas-Isolierungs-Agar mit 7 mM PO43-

QS Quorum Sensing RFLP Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus RT Raumtemperatur rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Sm Streptomycin Smr/Spr Streptomycin-/Spectinomycin-Resistenz Sp Spectinomycin T Temperatur TBA Thiobarbitursäure TBE Tris-Borsäure-EDTA-Puffer Tc Tetracyclin Tcr Tetracyclin-Resistenz TE Tris-EDTA-Puffer TMF Transformationspuffer Tris-HCl Tris(hydroymethyl)-aminomethanhydrochlorid ÜK Übernachtkultur Upm Umdrehungen pro Minute v/v Volumen pro Volumen (volume per volume) w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume)

1 Einleitung

1

1 EINLEITUNG 1.1 Die mikrobielle Lebensgemeinschaft Biofilm Unter dem Begriff „Biofilm“ versteht man Aggregate von Mikroorganismen, wie Flocken, Schlämme, oder Filme an Phasengrenzflächen bis hin zu mikrobiellen Matten (Costerton et al., 1987; Flemming 1991; Costerton et al., 1995; Flemming und Wingender, 2001; Donlan und Costerton, 2002). Als Phasengrenze kann sowohl die zwischen einer festen organischen oder anorganischen Oberfläche (Substratum) und einer flüssigen, oder gasförmigen Phase als Aufwuchsfläche für Biofilme genutzt werden. Es werden aber auch Grenzflächen zwischen wässrigen und gasförmigen Phasen, z. B. in Form von sogenannten Kahmhäuten besiedelt. Auch die Zelloberflächen von anderen Mikroorganismen können als Besiedlungsfläche genutzt werden, was letztlich zur Ausbildung von frei schwebenden mikrobiellen Flocken führt (Wingender und Flemming, 1999; Wingender und Flemming, 2003a). Schon 1933 wurde die Assoziation von Bakterien an Oberflächen beschrieben (Henrici, 1933). 1987 postulierten Costerton et al., dass bis zu 99 % aller Mikroorganismen der Erde sessil in Form von Biofilmen leben. Dabei kommen Biofilme ubiquitär in der Umwelt vor, denn es gibt praktisch keine Grenzfläche, die nicht von Mikroorganismen besiedelt werden kann. Sie können demnach überall gefunden werden; im Boden, im Wasser, in Sedimenten, in technischen Systemen und auf Pflanzen und Tieren. Je nach Blickwinkel ist dies nützlich z. B. bei der Abwasser-Reinigung, oder schädlich z. B. bei Infektionen, von denen vermutet wird, dass bis zu 65 % als Biofilmphänomene anzusehen sind (Costerton et al., 1999; Potera, 1999). Prinzipiell setzen sich Biofilme aus mehreren Komponenten zusammen. Der Hauptbestandteil von bis zu 98 % ist Wasser, welches zusammen mit extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) eine schleimige Matrix bildet, in die prokaryotische sowie eukaryotische Mikroorganismen eingebettet sind (Donlan und Costerton, 2002). Darüber hinaus können exogene partikuläre organische und anorganische Materialien und gelöste Stoffe eingelagert sein (Flemming, 1991; Wingender und Flemming, 1999; Donlan und Costerton, 2002). Wurde bis dahin die Physiologie von Mikroorganismen lediglich an planktonischen Zellen in Flüssigkulturen untersucht, kam es in den letzten Jahren zu einer enormen Intensivierung der Erforschung der sessilen Lebensweise. Entscheidend war hierbei vor allem die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie und entsprechender Färbemethoden, die die zerstörungsfreie in situ- Betrachtung von Biofilmen in ihrer hydratisierten Form zulassen (Lawrence et al, 1991). Auch moderne Methoden, wie Proteom-Analysen über 2-dimensionale Gelelektrophorese („Proteomics“; Sauer et al., 2002; Vilain et al., 2004; Pysz et al., 2004) und Transkriptom-Analysen unter Verwendung von Gesamt- oder Teilgenom DNA-Mikroarrays („Transcriptomics“; Whiteley et al., 2001; Wagner et al., 2003; Arevalo-Ferro et al., 2003) werden zunehmend eingesetzt. Zudem macht man sich vermehrt Reportergenfusionen und Defekt-Mutanten zu Nutze, um die physiologischen und regulatorischen Prozesse während der Biofilmentwicklung auf molekularer Ebene zu entschlüsseln. Dabei wurde häufig das Gram-negative und fakultativ humanpathogene Bakterium Pseudomonas aeruginosa untersucht, das aufgrund seiner enormen physiologischen Vielseitigkeit einerseits und der Fülle an verfügbaren Daten andererseits, derzeit als einer der populärsten Modellorganismen zur Erforschung der Biofilmbildung gilt (z. B. Davies und Geesey, 1995; Übersichten in Toutain et al., 2004; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Die daraus gewonnenen Erkenntnisse, führten zu einer neuen Definition von Biofilmen die besagt, dass ein

1 Einleitung

2

Biofilm eine mikrobielle, sessile Lebensgemeinschaft darstellt, bei der die Zellen charakteristischer Weise irreversibel angeheftet an ein Substratum, eine Grenzfläche, oder an einander, eingebettet in einer selbstgebildeten Matrix aus EPS vorliegen, wobei sie einen veränderten Phänotyp in Bezug auf die Wuchsraten und die Genexpression aufweisen (Flemming und Wingender, 2001; Donlan und Costerton, 2002; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Angelehnt an die Parameter einer klassischen Wuchskurve von Mikroorganismen in Flüssigkulturen, verläuft die Bildung von Biofilmen prinzipiell in vier Phasen: 1. die Induktionsphase, in der die Primäradhäsion an Oberflächen stattfindet, 2. die logarithmische Wachstumsphase, 3. die Plateau-Phase, in der sich Zuwachs und Ablösung von Zellen im Wesentlichen ausgleichen und 4. die Ablösungsphase (Flemming, 1991, Wingender und Flemming, 1999; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Die Primäradhäsion kann, abhängig von der Zellzahl im Medium, innerhalb einer Stunde zu einer schnellen Oberflächenbelegung führen. Dabei heften sich die Mikroorganismen zunächst reversibel an. Erst nach längerer Aufenthaltszeit an der Oberfläche folgt eine irreversible Anheftung der Zellen (ZoBell, 1943; Marshall et al, 1971; Flemming und Wingender, 2001; Sauer et al., 2002; Toutain et al., 2004). Dieser Anheftungsprozess wird maßgeblich von der Oberflächenbeschaffenheit der Zellen und des Substratums beeinflusst. So wurde beschrieben, dass die Anheftungsrate bei steigender Rauhigkeit einer Oberfläche zunimmt (Bruinsma, 2001, 2003; Picioreneau et al., 2000) und dass Zellen eher an hydrophobe, unpolare Oberflächen, wie Plastik adhärieren als an hydrophile, wie z. B. Glas oder Stahl (Fletcher, 1988; Marshall et al., 1989). Generell spielen Kräfte wie hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen, van der Waals´sche Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen eine entscheidende Rolle (Flemming, 1991; Flemming et al., 1999; Flemming und Wingender, 2001). Weitere abiotische Faktoren mit Einfluss auf diesen Prozess sind die herrschenden Strömungsbedingungen und die daraus resultierenden Scherkräfte, wie auch die Ionenstärke und pH-Werte des Mediums (DeBeer et al., 1994; Busalmen und de Sanchez, 2001; Rasmussen und Ostgaard, 2003). Auch biotische Faktoren, wie die Zelloberflächen-exponierten Flagellen und Pili können eine Rolle beim Anheftungsprozess spielen (O´Toole und Kolter, 1998; Pratt und Kolter, 1998; Sauer et al., 2002; Klausen et al., 2003a). Die zweite Phase ist gekennzeichnet durch den Beginn logarithmischen Wachstums und einer umfassenden Adaptation des Stoffwechsels auf die sessile Lebensweise (Whiteley et al., 2001; Sauer et al., 2002; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). In dieser Phase werden biofilmspezifische Gene induziert, es kommt zur Bildung von Mikrokolonien und die Synthese von EPS wird eingeleitet (Davies und Geesey, 1995; Costerton et al., 1995; 1999; Sauer et al., 2002). Zusätzlich heften sich immer noch weitere planktonische Mikroorganismen an die Oberfläche an. Beides zusammen führt zu einer Akkumulation von Zellen und somit zur Bildung eines Biofilms. In dieser Phase entstehen auch Mikrokonsortien, also Mischkolonien verschiedener Spezies (Flemming, 1991). Allerdings erfolgt kein unbegrenztes Dickenwachstum der Biofilme. Es kommt zu einer sogenannten Plateau-Phase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellzahl netto konstant bleibt, da sich ein Gleichgewicht zwischen Wachstum und Ablösung von Zellen einstellt (Flemming, 1991), wobei für die Ablösung verschiedene Mechanismen in Frage kommen. So wurde z. B. die passive, strömungsbedingte Ablösung von größeren Aggregaten („sloughing off“; Wingender und Flemming, 1999; Stoodley et al., 2002), aber auch von Einzelzellen („Erosion“; Tolker-Nielsen et al., 2000; Purevdorj-Gage und Stoodley, 2004) beschrieben. Auch

1 Einleitung

3

das aktive Verlassen des Biofilms durch bewegliche Schwärmerzellen konnte beobachtet werden (Szewzyk und Schink, 1988, Wingender und Flemming, 1999). Ein entscheidender Unterschied zwischen der planktonischen Lebensweise und dem Leben in Biofilmen liegt im Organisierungsgrad der Mikroorganismen, sowohl in räumlicher als auch in physiologischer Hinsicht. Voraussetzung hierfür ist die Ausbildung einer definierten dreidimensionalen Struktur. Die Mechanismen, die letztendlich zu der Architektur eines reifen Biofilms führen, stehen derzeit ebenso im Focus des Interesses, wie das Verständnis der physiologischen Vorteile, die die sessile Lebensweise den Mikroorganismen bietet. Eine momentan gängige Strukturvorstellung eines reifen Biofilms ist das so genannte „Mushroom Model“ (Abbildung 1), pilzförmige Makrokolonien in denen die Zellen eingebettet in einer EPS-Matrix vorliegen und dazwischen wassergefüllte Kanäle, die den Nährstoff- und Sauerstofftransport und den Abtransport von Stoffwechselprodukten gewährleisten (Lawrence et al., 1991; Costerton et al., 1994; DeBeer et al., 1994). Heute weiß man aber, dass die Architektur eines Biofilms von vielen Faktoren abhängt, wie z. B. dem Nährstoffangebot, den Strömungsbedingungen, der Oberflächenbeschaffenheit des Substratums und nicht zuletzt von dem Mikroorganismus selbst. So wurden filamentöse Auswüchse, so genannte „Streamer“ vermehrt bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten beobachtet (Stoodley et al., 1998; 1999). Es sind aber auch homogenere, flächendeckende Bewüchse beschrieben worden (Marshall und Blainey, 1991; Nivens et al., 2001; Heydorn et al., 2002; Tolker-Nielsen und Molin, 2004).

Wasserphase

Zellen in EPS-Matrix Streamer

Kanal

Abbildung 1: Modellvorstellung der Biofilmstruktur (nach Costerton et al., 1994) Wie die Struktur des Biofilms auch geartet sein mag, diese immobilisierte Lebensform bietet den Mikroorganismen eine Reihe von Vorteilen (Übersicht in Flemming und Wingender, 2003a). So genießen sie einen erhöhten Schutz vor Austrocknung (Ophir und Gutnick, 1994; Wingender und Flemming, 1999) und Phagozyten (Donlan und Costerton, 2002) oder Protozoen (Matz et al., 2004). Außerdem konnte ein gewisser Schutz vor Bioziden, wie Desinfektionsmitteln oder Antibiotika nachgewiesen werden (Le Chevallier et al., 1988; Morton et al, 1998; Grobe et al., 2001; Schulte et al., 2003). Durch die Möglichkeit Nährstoffe zu akkumulieren, können auch oligotrophe Habitate besiedelt werden (Flemming, 1991; Wingender und Flemming, 1999; Decho, 1990; Wolfaardt et al., 1999). Des Weiteren bietet eine definierte Struktur auch Mikroorganismen verschiedener Spezies die Möglichkeit, längere Zeit in einer stabilen Anordnung zu bleiben und sich in synergistischen Mikrokonsortien zusammenzufinden. Dies erlaubt eine erhöhte Effizienz des Gentransfers innerhalb der Biofilmpopulation (Angles et al., 1993; Lisle und Rose, 1995; Roberts et al., 2001; Wuertz, 2002) und kann die Erschließung

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schwer abbaubarer Substrate durch Kombination komplexer Stoffwechselwege zur Folge haben (Haack und McFeters, 1982; Lappin et al., 1985; Flemming et al., 1999; Nielsen et al., 2000). Eine mittlerweile weit verbreitete Ansicht ist, dass Biofilme eine Art multizelluläre Organisationsform von Mikroorganismen darstellen, die auf Grund von interzellulärer „Kommunikation“ zu Interaktionen befähigt sind (Costerton et al., 1987; 1994; Shapiro, 1998; Crespi, 2001; Jacob et al., 2004; Hentzer et al., 2004; Parsek und Greenberg, 2005). Der Informationsaustausch über Zelldichten zwischen den Mikroorganismen erfolgt dabei über niedermolekulare Signalmoleküle („Autoinducer“, wobei in Gram-negativen Bakterien verbreitet N-Acyl-L-Homoserin-Lactone (AHL), in Gram-positiven Bakterien hingegen Peptide (Sturme et al., 2002) genutzt werden. Sie werden von den Mikroorganismen selbst produziert, mittels Diffusion in die Umgebung freigesetzt und fungieren ab einer Schwellenkonzentration als Effektormoleküle in genregulierenden Systemen, die in Abhängigkeit von der Zelldichte wirken („Quorum sensing“; Whitehead et al., 2001, Hentzer et al., 2004). Die zentrale Rolle für die Ausbildung räumlich strukturierter Biofilme und die Etablierung von physiologischen Nischen zum Vorteil der Mikroorganismen innerhalb dieser Struktur spielen die EPS. Wesentlich dabei sind zum einen die Zusammensetzung und zum anderen die Eigenschaften der EPS (Wingender und Flemming, 1999; Wolfaardt et al., 1999; Flemming und Wingender, 2003b) 1.2 EPS und extrazelluläre Enzyme • EPS Die EPS bilden eine stark hydratisierte Matrix, in die die Organismen eingebettet sind und stellen somit sozusagen die Schlüsselmoleküle für die Organisation des Biofilms dar (Allison, 2003). Sie können an der Anheftung von Mikroorganismen an Oberflächen (Adhäsion) beteiligt sein, viel wichtiger sind sie aber für den Zusammenhalt (Kohäsion) der Biofilmorganismen und für die Entwicklung, Differenzierung und die drei-dimensionale Struktur von Biofilmen (Wingender und Flemming, 1999; Wingender et al., 1999a; Wolfaardt et al., 1999; Flemming und Wingender, 2003). Die EPS bestehen hauptsächlich aus Polysacchariden (z. B. Costerton et al, 1981; Sutherland, 1984) und Proteinen, von denen zumindest ein Teil Enzym-Aktivitäten zeigt (Frølund et al., 1996; Nielsen et al., 1997; Wingender und Jaeger, 2002), aber auch aus anderen Makromolekülen wie (Phospho)lipiden, Nukleinsäuren, Glycoproteinen und Glycolipiden (Gehrke et al., 1998; Sand und Gerke, 1999; Whitchurch et al., 2002; Wingender et al., 1999a; Flemming und Wingender, 2002). Sie können entweder aktiv von den Zellen ausgeschieden werden oder passiv z. B. durch die Lyse von Zellen freigesetzt werden (Flemming, 1991; Wingender und Flemming, 1999; Wingender et al., 1999a). Darüber hinaus können in Biofilmen aus der Umwelt neben den Biopolymeren auch andere polymere Moleküle wie z. B. Huminstoffe von außen eingetragen und in der Biofilmmatrix akkumuliert werden (Nielsen et al., 1997). Die Zusammensetzung der EPS wird vor allem von der Populationszusammensetzung des Biofilms bestimmt. Sie kann aber auch abhängig von den Umweltbedingungen, insbesondere der Nährstoffzusammensetzung (Ombaka et al., 1983; Tait et al, 1986; Sutherland, 2001; Scheen,

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2003), und dem Biofilmalter, stark variieren (Wingender et al., 1999a). So konnte z. B. in Abwasserbiofilmen und Belebtschlammflocken DNA als Haupkomponente der EPS nachgewiesen werden (Palmgren und Nielsen, 1996; Nielsen und Jahn, 1999). In Reinkulturen von Thiobacillus ferrooxidans dagegen wurden Lipide als Hauptbestandteil der EPS gefunden (Gehrke et al., 1998). Auch Phospholipide konnten als EPS-Bestandteil identifiziert werden (Goodwin und Forster,1985; Gehrke et al., 1998; 2001). Polysaccharide, die regelmäßig in Biofilmen gefunden werden konnten, stellen bislang die am besten untersuchte Komponente der EPS dar (Sutherland, 1999a; Sutherland, 2001; Flemming und Wingender, 2002). Es kommen sowohl Homopolysaccharide, die nur aus neutralen Bausteinen bestehen vor, wie z. B. Mutan, Curdlan, Dextran, Cellulose, als auch welche die aus anionischen Monomeren, wie Uronsäuren bestehen, wie z. B. Alginate. Es wurden aber auch Heteropolymere gefunden, die aus alternierenden, neutralen und anionischen Monomerbausteinen zusammengesetzt sind, darunter Hyaluronsäuren und Xanthan (Tait et al, 1986). Generell weisen Polysaccharide eine immense Strukturvielfalt auf, die durch verschiedene Substituenten wie N- oder O-gebundene Acetylgruppen, Pyruvat und Succinat noch gesteigert wird (Sutherland, 1999a; Sutherland, 2001). Da Polysaccharide zur Bildung hoch hydratisierter Netzwerke neigen, wird ihnen vorwiegend eine Strukturfunktion im Biofilm zugeschrieben. Dabei vermitteln nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Polymerketten direkt oder indirekt über zweiwertige Kationen (z. B. Ca2+ oder Mg2+) die mechanische Stabilität von Biofilmen (Mayer et al., 1999; Körstgens et al., 2001a; b; Flemming und Wingender, 2002). Möglicherweise besitzen auch Proteine ergänzend eine strukturgebende Funktion innerhalb des Biofilms. Higgins und Novak (1997) beschrieben Lektin-artige Proteine, die durch Verbrückung von Polysacchariden an der Ausbildung einer drei-dimensionalen EPS-Matrix beteiligt sein könnten. Die eigentlich relevante physiologische Funktion extrazellulärer Proteine wird aber in der katalytischen Wirkung von Enzymen gesehen (Hoffman und Decho, 1999; Wingender et al, 1999a; b; Wingender und Jaeger, 2002). • extrazelluläre Enzyme In der extrazellulären Matrix von Biofilmen konnten verschiedene Enzymaktiviäten nachgewiesen werden. Die meisten gehören zur Klasse der Hydrolasen (EC 3), wie Proteasen und Peptidasen, Lipasen, Esterasen, Glycosidasen, Phosphatasen und Polysaccharidasen. Es konnten aber auch Lyasen (EC 4) und Oxidoreduktasen (EC 1) nachgewiesen werden. Die Untersuchungen beschränkten sich allerdings hauptsächlich auf Abwasserbiofilme, Belebtschlammflocken oder Biofilme in Flusssedimenten (Übersicht in Wingender und Jaeger, 2002). Relativ wenig ist bisher bekannt über die Synthese und Sekretion von extrazellulären Enzymen in Reinkulturbiofilmen im Labor oder in Biofilmen, die bei Infektionen des Menschen eine Rolle spielen. Die Hauptfunktion extrazellulärer Enzyme wird in der Hydrolyse von Makromolekülen, wie Polysacchariden, Proteinen und Lipiden zu niedermolekularen Substanzen gesehen (Hoffman und Decho, 1999). Die Abbauprodukte können anschließend über die Zellmembran ins Zellinnere transportiert und von den Zellen als Nährstoff- und Energiequelle verstoffwechselt werden (Azam und Cho, 1987). Dazu kommt die Funktion einiger extrazellulärer Enzyme aus pathogenen Mikroorganismen bei Infektionsgeschehen besiedeltes Wirtsgewebe anzugreifen und abbauen zu können und so

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eine Rolle bei der Etablierung oder Aufrechterhaltung von Infektionen zu spielen. Daher werden viele extrazelluläre Enzyme auch als Virulenzfaktoren eingestuft (Übersicht in van Delden, 2004). Von großem Interesse ist derzeit die Frage, ob Mikroorganismen über die Synthese extrazellulärer Enzyme und den Abbau bzw. die Modifikation eigener polymerer EPS-Komponenten Einfluss auf die physikochemischen und physiologischen Eigenschaften der Biofilme nehmen können und inwieweit diese Funktion relevant für die Ausbildung, den Erhalt, bzw. den Abbau einer Biofilmstruktur sein kann (Sutherland, 1999b). Es wurden z. B. Enzyme beschrieben, die an der extrazellulären Biosynthese und der Modifikation von Exopolysacchariden beteiligt sind. In Leuconostoc mesenteroides und in Staphylococcus mutants existieren extrazelluläre Glycosyltransferasen, die die Exopolysaccharide Dextran bzw. Levan aus den Monomereinheiten Glucose und Fructose polymerisieren. Ertesvåg und Valla (1998) beschrieben eine extrazelluläre C-5-Epimerase in Azotobacter vinelandii, die die Konvertierung von Mannuronat zu Guluronat innerhalb des sekretierten, Kapsel-bildenden Polysaccharides Alginat katalysiert. Andererseits wurde das Vorkommen von extrazellulären Polysaccharid-abbauenden Enzymen, wie Polysaccharidasen und Lyasen beschrieben, die an dem partiellen Abbau von Exopolysacchariden beteiligt sind (Sutherland 1999b). Xun et al. (1990) beschrieben eine extrazelluläre Polysaccharidase aus Methanosarcina mazei, die hydrolytisch das Exopolymer Methanochondroitin zu Oligosacchariden abbaut, was zur Auflösung von Zellaggregaten und zur Freisetzung von Einzelzellen führte. In Pseudomonas aeruginosa führte die gesteigerte Expression einer endogenen Alginat-Lyase zur Depolymerisierung des Exopolysaccharides Alginat und zur erhöhten Ablösung von Zellen aus dem Biofilm (Boyd und Chakrabarty, 1994). Ähnliches konnte bei einer extrazellulären Lyase von P. fluorescens beobachtet werden (Allison et al., 1998). Da viele Polysaccharide Substituenten, wie z. B. Acetylgruppen tragen, erfordert der komplette Abbau dieser Polymere allerdings häufig eine synergistische Wirkung von deactetylierenden und depolymerisierenden Enzymen (Margolles-Clark et al., 1996). So ist z. B. für O-acetylierte Alginate bekannt, dass die Acetylgruppen dem Polysaccharid einen gewissen Schutz vor dem Abbau durch Alginat-Lyasen bieten (Skjår-Bræk et al. 1985, Lange et al., 1989; Tielen, 1999). Polysaccharid-deacetylierende Enzyme können als Acetylesterasen (EC 3.1.1.6) zusammengefasst werden (Williamson et al., 1998). Es konnte bisher eine Vielzahl mikrobieller Enzyme mit entsprechender Aktivität nachgewiesen werden, wobei die deacetylierende Wirkung größtenteils an pflanzlichen Polysacchariden, wie Xylan oder Pectinen, nicht aber an mikrobiellen Polysacchariden untersucht wurde (z. B. Tenkanen, 1998; Cui, et al., 1999; Übersicht in Tielen, 1999). Es gibt Hinweise darauf, dass Polysaccharid-Deacetylasen ähnliche Mechanismen der Katalyse aufweisen wie bereits gut charakterisierte Serin-Esterasen, Lipasen und Serin-Proteasen (Williamson et al., 1998). Sekretierte Enzyme werden nach ihrer endgültigen Lokalisation in Ektoenzyme oder extrazelluläre Enzyme eingruppiert (Hoffman und Decho, 1999). Der Begriff Ektoenzyme wurde für Enzyme geprägt, die mit der produzierenden Zelle assoziiert verbleiben, wie periplasmatische Enzyme, oder Enzyme der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Der Begriff extrazelluläre Enzyme dagegen wird für Enzyme genutzt, die den Kontakt zur produzierenden Zelle verloren haben und frei im umgebenden Medium, bzw. der EPS-Matrix, oder adsorbiert an biotische oder abiotische Oberflächen vorliegen (Chróst, 1991; Wingender und Jaeger, 2002). Auch möglich ist die Bindung von sekretierten Enzymen an Zelloberflächenstrukturen wie Lipopolysaccharide (LPS), als integraler Bestandteil der äußeren

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Membran Gram-negativer Bakterien, wie es für die Lipase LipA von P. aeruginosa beschrieben wurde (Stuer et al., 1986; Jaeger et al., 1996). Zellgebundene Enzyme können aber auch zu freien Enzymen werden. Beispiele dafür sind die alkalische Phosphatase (Wetzel, 1991) und die ß-Lactamase von Bacillus licheniformis (Priest, 1992), die Amylase von Bacillus stearothermophilis (Egelseer et al., 1995) oder Lipase LipA aus P. aeruginosa (Jaeger et al, 1996). Unabhängig von ihrer endgültigen Lokalisation im Biofilm, können extrazelluläre Enzyme verschiedenen Ursprung haben. Sie können entweder aktiv von den Zellen ausgeschieden, oder durch Zelllyse freigesetzt werden. Außerdem können sie aus dem umgebenen Medium von der Biofilmmatrix eingefangen werden (Wingender et al., 1999b; Wingender und Jaeger, 2002). Zur Analyse von Enzymaktivitäten werden meistens Moleküle verwendet, bei denen ein Substratmonomer über Ester-, Glycosid- oder Amidbindungen an ein chromogenes oder fluorigenes Molekül gekoppelt ist. Diese künstlichen Enzymsubstrate sind allerdings nur analog zu den natürlich vorkommenden Molekülen und ihre Umsetzung gibt nicht mehr als einen Hinweis auf die eigentlich physiologisch relevante Enzymaktivität. Es werden also nur Modellreaktionen betrachtet, die nicht in letzter Konsequenz Rückschlüsse auf die Spaltung der natürlichen Substrate zulassen, vor allem da Enzyme meist mehr als nur ein Substrat spalten können (Wingender und Jaeger, 2002). Untersuchungen zur Synthese, Sekretion und Funktion von extrazellulären Enzymen wurden bisher fast ausschließlich in Flüssigkulturen gemacht. Es wird geschätzt, dass bei Bakterien mehr als 30 % des Genoms für extracytoplasmatische Proteine (Proteine der Cytoplasmamembran, Ektoproteinen und extrazelluläre Proteine), inklusive Enzyme codieren (Economou, 1998; 2000). Da die Proteinbiosynthese im Cytoplasma stattfindet, erfordert die Proteinsekretion bei Gram-negativen Bakterien die Überwindung von zwei Membranen, der Cytoplasmamembran und der äußeren Membran. • Aufbau der Zellhülle von Gram-negativen Bakterien Die Zellhülle von Gram-negativen Bakterien ist aus einer, inneren, cytoplasmatischen Membran, einem sich anschließenden periplasmatischen Raum und einer asymmetrischen äußeren Membran aufgebaut (Abbildung 2; Hancock, 1991). Die Cytoplasmamembran besteht aus einer Phospholipiddoppelschicht mit zahlreichen integralen und peripheren Proteinen. Sie stellt eine Diffusionsbarriere dar, die zusätzlich zu den Atmungskettenkomponenten und der H+-ATPase, spezifische hoch- und niederaffine Aufnahmesysteme für hydrophile Substanzen besitzt. Weiterhin ist die Cytoplasmamembran an der Biosynthese und am Export von Proteinen und dem Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Membran beteiligt (Hancock, 1991; Poxton, 1993). Zwischen der Cytoplasmamembran und der äußeren Membran befindet sich der gelartige, periplasmatische Raum, in dem neben der Peptidoglykanschicht zahlreiche periplasmatische Enzyme (z. B. ß-Lactamasen, Phosphatasen) lokalisiert sind (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; 1997). Zudem befinden sich im Periplasma Bindeproteine, die unter anderem den Transport von Aminosäuren und Oligosacchariden in das Innere der Zelle vermitteln. Die Peptidoglykanschicht gewährleistet die osmotische Stabilität und die Zellform (Hancock, 1991; Poxton, 1993).

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Die stark asymmetrische äußere Membran besteht nach Innen aus Phospholipiden und außen aus LPS. Außerdem sind zahlreiche Proteine (äußere Membranproteine) sowohl ein- als auch aufgelagert. Die äußere Membran hat zahlreiche Funktionen. Sie kann als Diffusionsbarriere gegenüber hydrophilen und hydrophoben Substanzen wirken und unter anderem in Abhängigkeit von Molekulargewicht und Art der Substanz mittels Porinen selektiv Substanzen aufnehmen. Zudem wir der Verlust periplasmatischer Komponenten durch die äußere Membran verhindert und die Resistenz gegenüber Komplement-vermittelter Zelllysis während einer Infektion gewährleistet (Übersicht Raetz und Whitfield, 2002).

Abbildung 2: Schematischer Aufbau der Zellhülle von Gram-negativen Bakterien (OM, äußere Membran; PG, Peptidoglykan; PP, Periplasma; PG, Peptidoglycan; CM, cytoplasmatische Membran; LPS, Lipopolysaccharid) modifiziert nach Hancock (1991). Das LPS von Gram-negativen Bakterien ist anionisch und über zweiwertige Kationen, insbesondere Mg2+ komplexiert. Es besteht aus der Lipid A-Region, der Kernregion und der O-spezifischen Seitenkette (Abbildung 3; Übersicht Lam et al., 2004). Die Lipid A-Region besteht aus einem Glucosamindisaccharid, dessen Hydroxylgruppen mit seltenen Fettsäuren verestert sind (Kropinski et al., 1985; Hancock, 1991; Poxton, 1993). Sie bildet den hydrophoben Membrananker und ist verantwortlich für die endotoxische Aktivität der LPS (Lam et al., 2004). Die Basisstruktur vom Lipid A ist grundsätzlich hoch konserviert innerhalb der Gram-negativen Bakterien. Allerdings konnten geringe Variationen in der Anzahl und der Länge der Acylreste beobachtet werden (Lam et al., 2004). Frühere Studien zeigten, dass sowohl die Glucosamin-Disaccharide wie auch die korrekte Anzahl und Länge der Acylreste wichtig sind für die biologische Aktivität der Lipid A-Region (Raetz und Whitfield, 2002; Geurtsen et al., 2004). Die Kernregion ist kovalent mit der Lipid A-Region verbunden und besteht aus einem Oligosaccharid, dem 2-Keto-3-desoxyoctonat (KDO) und zwei bis drei Heptosemolekülen. Der äußere Teil der Kernregion besteht unter anderem aus D-Glukose, D-Galactosamin, L-Rhamnose und L-Alanin. Im Gegensatz zu anderen Bakterienarten ist sowohl die Kern- als auch die Lipid A-Region von P. aeruginosa stark mit Phosphatgruppen substituiert (Hancock, 1991; Poxton, 1993). Nach außen hin folgt auf die Kernregion die O-spezifische Seitenkette, die in ihrer Zusammensetzung stark variabel ist. Sie kann aus sich bis zu 50mal wiederholenden

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Oligosacchariden bestehen, die reich an N-acetylierten Aminozuckern und Uronsäuren sind (Kropinski et al., 1985). Wie Wilkinson (1983) zeigte, enthalten sie jedoch auch neutrale Zucker, wie z. B. L-Rhamnose und D-Glukose. Das LPS von P. aeruginosa besitzt im Gegensatz zu enterobakteriellem LPS nur in etwa 8 % der Fälle O-spezifische Seitenketten (Rivera et al., 1988). Das LPS ohne O-spezifische Seitenkette wird auch als rauhes LPS („rough“ LPS; R-LPS), das LPS mit O-spezifischer Seitenkette als glattes LPS („smooth“-LPS; S-LPS) bezeichnet (Knirel et al., 2001). Rivera et al. (1988) zeigten weiterhin, dass innerhalb des S-LPS wiederum zwei verschiedene Arten von LPS gefunden werden können („A-Banden“ LPS und „B-Banden“ LPS). Das „B-Banden“ LPS, welches das höhere Molekulargewicht zeigt, ist serotypspezifisch und stellt das typische LPS des Bakteriums dar. Es besitzt lange Polysaccharidketten, die reich an Aminozuckern und Uronsäuren sind und wenig Rhamnose enthalten (Rivera uns McGroarty, 1989). Dagegen erweist sich das A-Banden LPS mit seinem geringern Molekulargewicht als Rhamnose-reich und Aminozucker-arm und wird daher auch als Liporhamnan bezeichnet. Zudem besitzt es keine Lipid A-Region (Rivera und McGroarty, 1989). Die verschiedenen LPS-Arten können in einem P. aeruginosa-Stamm gleichzeitig vorkommen (Rivera und McGroarty, 1989; Lam et al., 1992). Dabei ist die Zusammensetzung der LPS abhängig von der Wuchsphase und von der Bebrütungstemperatur (Cadieux et al., 1983). Die O-spezifischen Seitenketten stellen das eigentliche Antigen dar, welches vom Wirt während einer akuten Infektion mit P. aeruginosa erkannt wird (Cryz et al., 1984; Tang et al., 1996). Interessanterweise konnte bei chronischen Lungeninfektionen, insbesondere in der Lunge von CF-Patienten beobachtet werden, dass die LPS-Struktur von S-LPS zu R-LPS konvertiert (Hancock et al., 1983), was als einer der Hauptgründe dafür angesehen wurde, dass P. aeruginosa in der Lunge über einen längeren Zeitraum überleben kann, ohne vom Immunsystem des Wirts eliminiert zu werden (Hancock et al., 1983; Knirel et al., 2001).

Abbildung 3: Schematische Struktur eines Lipopolysaccharids (aus Brock,1997) • Proteinsekretion in Gram-negativen Bakterien Bisher sind sechs verschiedene Sekretionswege in Gram-negativen Bakterien bekannt (Kadurugamuwa und Beveridge, 1997; Filloux et al., 1998; Koster et al., 2000; Sandkvist, 2001). Typ I-Sekretion Die Typ I-Sekretion, auch als ABC-Transport bezeichnet, ist eine Ein-Schritt-Sekretion bei der die Proteine ohne die Ausbildung eines periplasmatisches Intermediats über die innere und äußere Membran direkt ins Außenmedium transportiert werden (Higgins, 1992; Pugsley, 1993). Der Sekretionsapparat besteht aus dem namensgebenden, ABC-Protein („ATP-binding cassette“) in der inneren Membran, einem Membranfusionsprotein im Periplasma und einem Poren-bildenden Protein, das in der äußeren Membran lokalisiert ist (Higgins, 1992; Binet at al.,

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1997). Für diesen Mechanismus wird ein nicht abspaltbares, carboxylterminales Signal im Substratprotein benötigt (Binet et al., 1997). Viele der über den ABC-Transport sekretierten Proteine besitzen Glycin-reiche Bereiche, die eine Rolle in der Bindung von Ca2+-Ionen und für die Faltung der Proteine spielen (Baumann et al., 1993). Als Beispiel für diesen Sekretionsweg gilt das am besten untersuchte und charakterisierte Sekretionssystem des α-Hämolysins von Escherichia coli (Holland et al., 1990; Kenny et al., 1991). Bei P. aeruginosa wurde der Typ I-Sekretionsmechanismus bisher für die alkalische Protease (Guzzo et al., 1991; Baumann et al., 1993) und das Häm-bindende Protein HasAp (Létoffé et al., 1998; Stover et al., 2000) beschrieben. Typ II-Sekretion Die Typ II-Sekretion, auch „main terminal branch“ des „general secretory pathway“ genannt, ist eine Zwei-Schritt-Sekretion bei der im ersten Schritt eine N-terminale Peptidsequenz die Translokation über die innere Membran in den periplasmatischen Raum vermittelt. Im Periplasma wird diese Signalsequenz abgespalten, das Protein gefaltet und anschließenden Modifikationen unterzogen, wie die Bildung von Disulfidbrücken, oder dem Zusammenbau von Untereineinheiten, bevor es im zweiten Schritt mittels des Typ II-Apparats (Sekreton) über die äußere Membran ins extrazelluläre Medium transportiert wird (Pugsley, 1993; Filloux et al., 1998; Koster et al., 2000; Sandkvist, 2001). 1) Transport über die innere Membran Der größte Teil der sekretierten Proteine wird mit Hilfe des Sec-Apparates über den sogenannten GEP („general export pathway“) über die innere Membran transportiert (Pugsley, 1993; Manting und Driessen, 2000; Palmer und Berks, 2003). Das Exportsignal stellt dabei eine meist 20 – 45 Aminosäuren lange, N-terminale Erkennungssequenz mit einer hoch konservierten Peptid-Schnittstelle dar (Watson, 1984; von Heinje, 1990; Pugsley, 1993). Die so gekennzeichneten Proteine werden im Cytoplasma an das Chaperon SecB gebunden, wodurch eine ungefaltete, sekretionskompetente Form gewährleistet und die Bindung an die cytoplasmatische ATPase SecA vermittelt wird. Der dabei entstehende SecA-Präproteinkomplex bindet an die Membranproteine SecY/E/G und bildet damit das eigentliche Translokon, welches durch SecD/F stabilisiert wird und unter ATP-Verbrauch und Abspaltung der Signalsequenz das Substratprotein in das Periplasma transloziert (Hanada, 1994; Doung und Wickner, 1998; Driessen et al., 1998; Manting und Driessen, 2000; Palmer und Berks, 2003). Alternativ zum GEP existiert ein Sec-unabhängiger Weg, die Tat-Sekretion („twin-arginine-translocation“). Dabei werden gefaltete Proteine im Komplex mit ihren Cofaktoren, wie z. B. Ca2+ oder Fe2+ über die Cytoplasmamembran transportiert. Diese Sekretion ist in E. coli ein spezieller Mechanismus für nur wenige Proteine. In P. aeruginosa konnte dieser Transportmechanismus für die Phospholipasen Plc-H und Plc-N nachgewiesen werden (Weiner et al., 1998; Berks et al., 2000; Voulhoux et al., 2001). 2) Translokation über die äußere Membran In einem zweiten, unabhängigen Schritt erfolgt die Translokation über die äußere Membran. Sie wird zusammen mit dem Sec-abhängigen Transport über die Cytoplasmamembran als GSP („general secretory pathway“) bezeichnet und kommt in vielen Gram-negativen Bakterien, inklusive P. aeruginosa vor (Pugsley, 1993; Pugsley et al., 1997; Russel, 1998; Filloux et al., 1998). Der aufwendige Sekretionsapparat des GSP besteht aus mindestens 12 verschiedenen

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Genprodukten, den Xcp-Proteinen (Tommassen et al., 1992; Filloux et al., 1998; Koster et al., 2000). Er weist Homologien zum Typ IV-Pilus-Apparat auf, welcher Typ IV-Piline an die Zelloberfläche von P. aeruginosa exportiert (Balley et al., 1992; Nunn, 1999). Beide Apparate benötigen die bifunktionale Prepilinpepdidase PilD/XcpA (Strom et al., 1991), die sowohl für den Aufbau der Pili, als auch für einen funktionsfähigen Xcp-Apparat notwendig ist. Sie prozessiert und methyliert die sogenannten Pseudopiline XcpT/U/V/W (Bally et al., 1992). Diese bauen einen Pseudopilus auf der das zu sekretierende Protein durch eine Pore in der äußeren Membran, die aus einem Oligomer aus 12 XcpQ Untereinheiten besteht und eine zentrale Öffnung von 95 Å besitzt (Bitter et al., 1998; Brok et al, 1999) geschoben wird (Filloux et al., 1998). Dieser Prozess wird wahrscheinlich durch XcpR, eine ATPase in der inneren Membran energetisiert (Turner et al., 1993). Die Faltung der zu sekretierenden Proteine erfolgt zuvor im Periplasma (Pugsley, 1992; Braun et al., 1996). Beteiligt an diesem Vorgang sind spezifische Faltunghelfer, wie das Propeptid der Elastase (LasB), welches als intramolekulares Chaperon fungiert (Braun et al., 1996 und 1998; Kessler et al., 1998) oder die Lipase-spezifische Foldase LipH, die die Lipase LipA faltet (Jaeger et al., 1994 und 1996; Schneidinger, 1997; Rosenau und Jaeger, 2000; Rosenau et al., 2004). Ein weiterer beteiligter Faktor ist das Dsb-System, welches Disulfidbrücken knüpft und somit eine große Bedeutung für die Ausbildung periplasmatischer Intermediate bzw. die korrekte Proteinfaltung hat (Pusley, 1992; Missiakas und Raina, 1997). Beteiligt sind dabei DsbA, eine Thio-Disulfid-Oxidoreduktase, die Disulfidbrücken in Substratproteinen knüpft und DsbC, eine Disulfid-Isomerase. DcbC korrigiert DsbA-bedingte Fehler bei der Bildung von Disulfidbrücken in Proteinen mit mehr als zwei Cysteinen (Raina und Missiakas, 1997; Urban et al., 2001). Typ III-Sekretion Der Typ III-Sekretionsmechanismus, oder „contact side-dependent pathway“, ist ein Ein-Schritt-Mechanismus, der vor allem für pathogene Bakterien wie Yersinia sp. (Cornelis und Wolf-Watz, 1997), Shigella sp. (Parsot und Sansonetti, 1996), Salmonalla sp. (Galan, 1996) und auch P. aeruginosa (Yahr et al., 1996) beschrieben wurde. Diese Sekretion steht immer mit der Virulenz dieser Bakterien in Verbindung, da die Substratproteine, meist Virulenzfaktoren, nicht nur sekretiert, sondern direkt ins Cytosol von eukaryontischen Wirtszellen injiziert werden (Lee, 1997). Folglich wird eine dritte Membran (Cytoplasmamembran der Wirtszelle) überquert, wobei die Induktion der Sekretion erst bei Kontakt mit Wirtszellen erfolgt (Cornelis und Wolf-Watz, 1997; Lee, 1997). Dieser komplexe Sekretionsapparat besteht aus etwa 20 Proteinen, wobei die meisten davon in der inneren Membran lokalisiert sind, sodass dieser Sekretionsweg unabhängig von der Sec-Translokase funktioniert (Hueck, 1998). Darüber hinaus existiert in der äußeren Membran eine zum Typ II Sekretionsapparat analoge Proteinpore, die wahrscheinlich als Multimer des zur Familie der Sekretine gehörenden Proteins PscC gebildet wird (Cornelis und Wolf-Watz, 1997; Frank, 1997). Die bakteriellen Proteine werden ohne Abspaltung einer Signalsequenz und ohne die Bildung eines periplasmatischen Intermediats sekretiert (Cornelis und Wolf-Watz, 1997). Die Informationen zur Sekretion werden am aminoterminalen Teil der Proteine vermutet (Yahr et al., 1996; Hauser et al., 1998). Bei P. aeruginosa wird der Typ III-Sekretionskomplex durch die psc-Gene („Pseudomonas secretion“) codiert (Frithz-Lindsten et al., 1997) und sekretiert z. B. Exoenzym S, Exoenzym T und Exoenzym Y (Yahr et al., 1996; Finck-Barbançon, 1997; Yahr et al., 1997; Hauser et al., 1998; Yahr et al., 1998).

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Typ IV Sekretion Typ IV-Sekretionssysteme vermitteln den direkten Zell-zu-Zell-Transfer von Virulenzfaktoren zwischen Bakterien oder zwischen Bakterien und eukaryotischen Zellen und wurden in vielen pathogenen, Gram-negativen Bakterien, wie Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori und Legionella pneumophila gefunden (Burns, 1999; Baron et al., 2002; Burns, 2003). Als Transfersysteme für Makromoleküle, wie Proteine aus vielen Untereinheiten, DNA oder Protein-DNA-Komplexe wurde die T-DNA-Transfermaschinerie von A. tumefaciens zur Übertragung von Plasmid-DNA von Bakterienzelle zu Bakterienzelle bisher am intensivsten studiert (z. B. Zambryski, 1988; Lai und Kado, 2000; Yeo und Waksman, 2004). Allerdings zeigen die Komponenten aller bisher bekannten Typ IV-Sekretionssysteme signifikante Homologien zu dem Konjugationssystem von A. tumefaciens (Yeo und Waksman, 2004). Sie bestehen prinzipiell aus etwa 10 Proteinen, wobei eine Gruppe im Periplasma und/oder in den Membranen lokalisiert ist und eine Art von Pore bilden. Eine zweite Gruppe von Proteinen bildet eine Pilus-ähnliche Struktur aus, die sich über die innere Membran, den periplasmatischen Raum und die äußere Membran zieht und den Kontakt zum Außenmedium bzw. zur Wirtszelle vermittelt. Außerdem sind drei cytoplasmatische und innere Membran assoziierte ATPasen beschrieben, die möglicherweise den Prozess des Pilus-Zusammenbaus energetisieren (Zambryski, 1988; Yeo und Waksman, 2004). Typ Va-Sekretion Die Typ Va-Sekretion oder Autotransportersekretion wurde als Nebenweg des GSP („general secretory pathway“) beschrieben, da der Transport über die innere Membran über den Sec-Apparat erfolgt und keine zusätzlichen Proteine für die Sekretion über die äußere Membran benötigt werden (Filloux et al., 1998; Henderson et al., 1998 und 2000; Henderson und Nataro, 2001). Nach der Translokation über die innere Membran wird das N-terminale Signalpeptid abgespalten und es entsteht ein periplasmatisches Intermediat, welches den Transport über die äußere Membran über die carboxyterminale Domäne, ohne weitere Faktoren selbstständig vermittelt. Dabei bildet der C-terminale Teil (β-Domäne) eine integrale Membranstruktur aus antiparallen β-Faltblättern, die starke Ähnlichkeit zu Porinen aufweist. Der aminoterminale Teil des Proteins (α-Domäne) wird durch diese Pore an die Zelloberfläche transloziert (Pohlner et al., 1987; Klauser et al., 1993; Jose et al., 1995). Anschließend kann die N-terminale Domäne, die die eigentliche Funktion des Proteins übernimmt, durch Proteasen oder Autoproteolyse abgespalten und freigesetzt werden, oder sie bleibt an der Oberfläche assoziiert (Pohler et al., 1987; Steinhauer et al., 1999; O´Toole et al., 1994). Die zur Autotransporterfamilie zählenden Proteine sind häufig Virulenzfaktoren und wurden in vielen pathogenen Bakterien, inklusive P. aeruginosa gefunden (Loveless und Saier, 1997; Henderson et al., 1998; Wilhelm et al., 1999; Henderson und Nataro, 2001; Newman und Stathopoulos, 2004). Typ Vb-Sekretion Die Typ Vb-Sekretion, auch TPS-Sekretion („two-partner secretion“) genannt, ist eine zweite Form der Autotransportersekretion, über die besonders große Exoproteine von bis zu 500 kDa sekretiert werden (Locht et al., 2001; Desvaux et al., 2004; Jacob-Dubuisson et al., 2004; Newman und Stathopoulos, 2004). Das System besteht aus zwei Proteinen; dem zu transportierenden Protein TpsA und dem spezifischen Transporterprotein TpsB, das eine Pore in der äußeren Membran bildet (Yen et al., 2002). TspA wird zunächst in einer ungefalteten Form via Sec-Translokase über die innere Membran transportiert und durch das Periplasma direkt an TpsB weitergeleitet (Jacob-Dubuisson et al., 2004). Dabei vermittelt eine hoch

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konservierte N-terminale Signalsequenz („secretion domain“) im TpsA die Erkennung durch das spezifische Transporterprotein (Clantin et al., 2004). Erst nach der Translokation über die äußere Membran wird das Protein an die Zelloberfläche zu seiner nativen Form gefalten und ans extrazelluläre Medium abgeben (Jacob-Dubuisson et al., 2004). Die TPS-Sekretion wurde vor allem für Adhäsine, Cytolysine und Enzyme bei vielen Gram-negativen, pathogenen Bakterien, inklusive P. aeruginosa beschrieben (Clantin et al., 2004; Jacob-Dubuisson et al., 2004). Membranvesikel Ein unspezifischer Sekretionsmechanismus für Makromoleküle, wie Enzyme und DNA ist die Bildung von Membranvesikeln, die besonders intensiv bei P. aeruginosa (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; Übersicht in Kadurugamuwa und Beveridge, 1997), aber auch in anderen Gram-negativen Bakterien untersucht wurde (Kahn et al., 1983; Dorward et al., 1989; Li et al., 1998; Kadurugamuwa und Beveridge, 1999). Dabei wird die äußere Membran abgeschnürt und Inhalte des periplasmatischen Raums eingeschlossen, die als enzymhaltige, LPS-reiche Vesikel an das extrazelluläre Medium abgegeben werden (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995). In Membranvesikeln von P. aeruginosa konnte eine Vielzahl hydrolytischer Enzyme nachgewiesen werden, wie z. B. die Aktivitäten von Proteasen, Phospholipase C, alkalischer Phosphatasen, β-Lactamasen und Peptidoglycan-Hydrolasen (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; Coifu et al., 2000). Einige dieser Enzyme, wie die alkalische Phosphatase oder Peptidoglycan-Hydrolasen gelten als periplasmatische Markerenzyme bei vielen Gram-negativen Bakterien, inklusive P. aeruginosa (Ingram et al., 1973; Poole und Hancock, 1983; Lazdunski et al., 1990; Tan und Worobec, 1993). Zudem konnten periplasmatische Enzym-Vorstufen, wie die Pro-Elastase und das Vorkommen von DNA nachgewiesen werden (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; Renelli et al., 2004). DNA konnte auch in Membranabschnürungen von anderen Gram-negativen Bakterien, wie Neisseria gonorrhoeae (Dorward et al., 1989) und Haemophilus (Kahn et al., 1983) gefunden werden.

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1.3 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa ist ein ubiquitär verbreitetes, Gram-negatives, nicht sporenbildendes, über polare Geißeln und Typ IV Pili bewegliches Stäbchen (Evans und Linker, 1973; Mattick, 2002). Es gehört zur Familie der Pseudomonadaceae und wird der rRNA-Homologie-Gruppe I (Palleroni, 1972) innerhalb der γ-Gruppe der Proteobakterien zugeordnet (Krieg und Garrity, 2001). Erst kürzlich wurde das 6,26 Mb große Genom von P. aeruginosa PAO1 komplett sequenziert (Stover et al., 2000). P. aeruginosa ist ein Bakterium mit einem fakultativ aeroben Stoffwechsel; unter anaeroben Bedingungen kann es Nitrat als terminalen Elektronenakzeptor nutzen (Denitrifikation; Schlegel, 1992). Mit einem Wachstumoptimum von 37 °C stellt P. aeruginosa ein mesophiles Bakterium dar, dass nicht in der Lage ist, im sauren Milieu (pH-Wert < 4,5) zu wachsen. Dieses hinsichtlich der Nährstoffansprüche sehr anspruchslose, chemoorganotrophe Bakterium ist in der Lage zahlreiche oligotrophe aquatische und terrestrische Standorte in der Umwelt zu besiedeln. Darüber hinaus ist P. aeruginosa auch in wasserführenden technischen Systemen zu finden (Grobe et al., 1995). So kann sich P. aeruginosa innerhalb kürzester Zeit in Toiletten, Geruchsverschlüssen und Ausgüssen vermehren und dort ein Reservoir für Kontaminationen des gesamten technischen Wassersystems bilden (Döring, 1991). Dadurch ist P. aeruginosa besonders im Krankenhausbereich zu einem hygienischen Problem geworden, da er als Erreger infektiöser Hospitalismuserkrankungen gilt (Martinez-Martinez et al., 1991). In einigen Fällen konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Infektion von Patienten mit P. aeruginosa und dem Vorkommen des Bakteriums in den benutzten wasserführenden Systemen nachgewiesen werden (Schubert, 1990). Aufgrund seiner opportunistischen Pathogenität sind besonders vorgeschädigte Personen wie z. B. Patienten mit der autosomal rezessiven Erbkrankheit Cystische Fibrose (CF) oder Patienten mit Verbrennungen (Bodey et al., 1983) gefährdet. Etwa 80 - 90% der CF-Patienten sind von chronischen pulmonalen Infektionen mit P. aeruginosa betroffen (Pier, 1998). Bei Isolaten von CF-Patienten handelt es sich meistens um P. aeruginosa-Stämme mit einem schleimigen (mucoiden) Phänotyp (Doggett et al., 1977; Lam et al., 1980; Govan, 1990). Dieser bezieht sich auf einen von sechs verschiedenen Kolonietypen (klassisch, Coliformen-ähnlich, rauh, runzelig, mucoid, winzig) von P. aeruginosa (Phillips, 1969). Mucoide Stämme von P. aeruginosa zeichnen sich durch eine Überproduktion des extrazellulären Polysaccharids Alginat aus, was sich makroskopisch anhand eines wässrig, schleimigen Aussehens nach Übernachtkultur auf der Oberfläche von Standard-Agarnährmedien erkennen lässt (Phillips, 1969; Govan, 1990). Sonnenschein berichtete schon 1927 von schleimigen Formen von P. aeruginosa aus einem eitrigen Abszess. Erste mucoide Isolate aus der Lunge von CF-Patienten wurden 1966 von Doggett et al. beschrieben. Weiterhin findet man mucoide Stämme von P. aeruginosa in geringerer Häufigkeit bei Menschen mit anderen chronischen Lungenkrankheiten oder Harnwegsinfektionen (Evans und Linker, 1973; McAvoy et al., 1989). Generell sind aber nur 1 % der klinischen Isolate von anderen Infektionen mucoid (Doggett et al., 1977; Lam et al., 1980; Govan, 1990; Jain und Ohman, 2004). Lange Zeit wurde angenommen, dass mucoide P. aeruginosa-Stämme nur bei Infektionen vorkommen. Inzwischen wurden mucoide Stämme aber ebenfalls aus technischen Wassersystemen isoliert (Grobe et al., 1995). Die Pathogenität von P. aeruginosa wird maßgeblich durch die Produktion von zahlreichen zellgebundenen und extrazellulären Virulenzfaktoren bestimmt (Döring et al., 1987, van Delden, 2004). Als extrazelluläre Virulenzfaktoren können neben einer Vielzahl von extrazellulären Enzymen (z. B. verschiedene Proteasen, Lipase, Phospholipasen, Exotoxin A, Exotoxin S) auch

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wasser- und chloroformlösliche Pigmente, Glycolipide und das extrazelluläre Polysaccharid Alginat von mucoiden P. aeruginosa-Stämmen (Rehm und Valla, 1997, van Delden, 2004) angesehen werden. Aufgrund seiner enormen physiologischen Vielseitigkeit einerseits und der Fülle an verfügbaren Daten andererseits, gilt P. aeruginosa derzeit als populärster Modellorganismus zur Erforschung der Biofilmbildung. • Alginat Das Exopolysaccharid Alginat wird als einer der Pathogenitätsfaktoren von mucoiden P. aeruginosa-Stämmen angesehen (Übersicht in: Govan und Deretic, 1996). Zum einen fördert Alginat die Anheftung der Zellen an Lungenepithel (Marcus und Baker, 1985; Ramphal et al., 1987, Marty et al., 1998), zum anderen erhöht es die Resistenz der Bakterien gegenüber Immunabwehrmechanismen (Schwarzmann und Boring III, 1971; May et al., 1993; Pier et al., 2001, 2004) und bietet den Bakterien zuverlässigen Schutz vor einer Reihe von Antibiotika, insbesondere Aminoglycosiden (Pedersen, 1992; Rehm und Winkler, 1996). Interessanterweise geht mit dem Übergang von nicht-mucoiden zum mucoiden Phänotyp eine Variation anderer Virulenzfaktoren einher, wie z. B. die Abnahme der Protease-, Exotoxin A-, Exoenzyme S-, Phospholipase C- Produktion (Ohman und Chakrabarty; 1982; Luzar und Montie; 1985; Mohr et al., 1990; Woods et al., 1991) und die Konvertierung vom glatten zum rauhen LPS (Hancock et al., 1983). Alginate wurden zuerst als Zellwandbestandteile von Braunalgen (Phaeophyceae) gefunden. Aber auch bei einigen Bakterien-Arten konnte die Produktion von Alginaten als Exopolysaccharide nachgewiesen werden, wie z. B. bei dem Bodenbakterium Azotobacter vinelandii, oder bei P. aeruginosa (Linker und Jones; 1966; Evans und Linker, 1973; Rehm und Winkler, 1996). Ferner konnte mittels Gensonden gegen die drei Alginat-Biosynthesegene algA, algC und algD und eines der Regulatorgene (algR1) von P. aeruginosa gezeigt werden, dass Alginat-homologe Sequenzen in Pseudomonas syringae pv. glycinea, Pseudomonas viridiflava, Pseudomonas corrugata und anderen Mitgliedern der rRNA-Homologie-Gruppe Ι vorhanden sind (Fett et al., 1992, Gacesa, 1998). Alginat oder Alginat-ähnliche Polysaccharide scheinen somit weit verbreitete Polysaccharide von Bakterien zu sein. Bei Alginaten handelt es sich um Exopolysaccharide mit einem relativ hohen Molekulargewicht (ca. 2 x 104 - 7 x 106; Evans und Linker, 1973; Grobe, 1996; Tielen, 1999). Sie bestehen aus den Uronsäureresten β-D-Mannuronat und seinem C-5-Epimer α-L-Guluronat, welche 1,4-glycosidisch verbunden sind (Abbildung 4; Evans und Linker, 1973; Chitnis und Ohman, 1990). Innerhalb des Alginatmoleküls sind die Monomere in Blockstrukturen angeordnet; es können sowohl homopolymere Regionen, die aus Poly-β-D-Mannuronat (M-Blöcke) oder Poly-α-L-Guluronat (G-Blöcke) bestehen, als auch heteropolymere Regionen (MG-Blöcke) vorkommen. In den Heteropolymerbereichen kommen die Uronsäurereste statistisch verteilt vor (Skjåk-Bræk et al., 1986, Schürks et al., 2002). Im Gegensatz zu Algenalginaten oder Alginaten von A. vinelandii ist für das Alginat von P. aeruginosa das Fehlen von G-Blöcken charakteristisch (Sherbrock-Cox et al., 1984; Skjåk-Bræk et al., 1986, Chitnis und Ohman, 1990; Schürks et al., 2002). Ferner ist für Bakterienalginate im Gegensatz zu Algenalginaten eine partielle O-Acetylierung am C2- und/oder am C3-Atom des β-D-Mannuronats charakteristisch (Skjåk-Bræk et al., 1986). Das Ausmaß der O-Acetylierung des Alginates von

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P. aeruginosa kann dabei abhängig vom jeweiligen Bakterienstamm, dem Nährmedium (C-Quelle; Marty et al., 1992) und der Wachtumsphase sein (Evans und Linker, 1973; Skjåk-Bræk et al., 1986). Die Acetylgruppen besitzen einen großen Einfluss auf die physikochemischen Eigenschaften des Alginates. Es konnte gezeigte werden, dass die Viskosität von Alginaten mit steigendem Acetylgruppengehalt zunimmt (Skjåk-Bræk et al.; 1989; Lee et al., 1996). Weiterhin verringert sich mit steigendem Acetylierungsgrad die Bindungsfähigkeit von divalenten Kationen (Skjåk-Bræk et al., 1989; Geddie und Sutherland, 1994; Lee et al., 1996, Lattner et al., 2003) und die Wasserbindungs-Kapazität wird erhöht (Skjåk-Bræk et al., 1989). Acetylierte Alginate sind zudem resistenter gegenüber dem Abbau durch viele Alginat-Lyasen (Skjåk-Bræk et al.,1985; Lange et al., 1989). Außerdem schützen sie die Mannuronsäurereste vor der Epimerisierung zu α-L-Guluronat durch Mannuronan C-5-Epimerasen während des Alginat-Synthese-Prozesses und bestimmen somit das Mannuronat/Guluronat-Verhältnis im Alginatmolekül (Franklin und Ohman, 1993; Rehm und Valla, 1996; Franklin et al., 1994; Gacesa, 1998). Bei Untersuchungen am Alginat von P. aeruginosa wurde festgestellt, dass die Acetylgruppen eine große Rolle bei den Resistenzeigenschaften der Bakterien gegenüber Desinfektionsmitteln wie z. B. Chlor (Chlorzehrung) spielen (Grobe, 1996; Grobe et al., 2001). Auch scheinen sie für die Virulenzeigenschaften der Bakterien eine gewisse Funktion zu übernehmen (Rehm und Winkler, 1996). Neuere Ergebnisse zeigten, dass Acetylierungs-defekte Mutanten eine verringerte Anheftungs- und Biofilmbildungs-Fähigkeit besitzen (Nivens et al., 2001; Tielen et al., 2005) Insgesamt werden die physikochemischen Eigenschaften der Alginate durch ihr Molekulargewicht, ihr Mannuronat/Guluronat-Verhältnis, die Verteilung der Blöcke im Molekül und ihren Acetylierungsgrad bestimmt (Gacesa und Russell, 1990). Darüber hinaus beeinflusst Alginat als Strukturpolymer die Biofilmstruktur und die mechanische Stabilität von Biofilmen von P. aeruginosa (Hentzer et al., 2001; Körstgens et al., 2001)

Abbildung 4: Ausschnitt aus einem Alginatmolekül. (A) Monomerbausteine des Alginats (B) Monomer-Anordnung innerhalb des Alginatmoleküls; M, Mannuronat und G, Guluronat (aus Chitnis und Ohman, 1990)

ß-D-Mannuronat -L-Guluronatα

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Die an der Alginat-Biosynthese bei P. aeruginosa beteiligten Gene sind weitestgehend identifiziert und charakterisiert (May und Chakrabarty, 1994; Rehm und Valla, 1997; Gacesa, 1998, Franklin und Ohman, 1993). Die ersten vier Enzymreaktionen der Biosynthese finden im Cytoplasma unter Beteiligung der Genprodukte AlgA, AlgC und AlgD statt, wobei Fructose-6-phosphat über Mannose-6-phosphat, Mannose-1-phosphat und GDP-Mannose in die aktivierte Vorstufe des Alginats GDP-Mannuronsäure umgewandelt wird (Gacesa, 1998). Die Polymerisierung von GDP-Mannuronsäure zu Alginat ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. Wahrscheinlich verläuft sie mit Hilfe des Proteins Alg8, welches Strukturanalogien zu ß-Glycosyl-Tansferasen zeigt (Abbildung 5; Saxena et al., 1995; Rehm und Winkler, 1996). Während des Ausschleusungsprozesses des wachsenden Polymannuronates finden im periplasmatischen Raum Modifikationen wie die Transacetylierung einiger Mannuronatreste durch AlgF, AlgI, AlgJ (Shinabarger et al., 1993; Franklin und Ohman, 1993, 1996, 2002), die teilweise Epimerisierung der Mannuronatreste zu Guluronat durch die Epimerase AlgG (Chitnis und Ohman, 1990; Franklin et al., 1994; Jain et al., 2003) und die partielle Depolymerisierung durch die Alginat-Lyase AlgL (Schiller et al., 1993) statt, wodurch die Länge des nativen Alginatmoleküls kontrolliert wird (May und Chakrabarty, 1994). Der Transport des reifen Alginats über die äußere Membran wird durch das 54 kDa große, Anionen-spezifische Porenprotein AlgE vermittelt, welches nur in mucoiden nicht aber in nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stämmen gefunden wurde (Grabert et al., 1990; Chu et al., 1991; Rehm et al., 1994).

Abbildung 5: Modellvorstellung zur Polymerisierung, der Modifizierung und dem Export von Alginat aus Zellen von mucoiden Stämmen von P. aeruginosa (Jain und Ohman, 2004). O.M., äußere Membran; I.M., innere Membran.

GDP-Mannuronat

Periplasma Alginat Modifikation und Sekretion(AlgK, AlgG, AlgL, AlgX, Alg44)

Acetyl-Donor (?)

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• Extrazelluläre Enyme von P. aeruginosa P. aeruginosa sekretiert zahlreiche extrazelluläre Enzyme über fünf verschiedene Sekretionswege (Typ I, Typ II, Typ IV, Typ V und Membranvesikel). In Tabelle 1 sind die wichtigsten zusammengestellt. Viele dieser extrazellulären Enzyme sind als Virulenzfaktoren anzusehen und spielen für die Pathogenität von P. aeruginosa eine wichtige Rolle (Übersicht in van Delden, 2004). Exotoxin A (toxA) wird von den meisten klinischen P. aeruginosa-Isolaten produziert (Plotkowski et al. 2002). Dieses 68 kDa-Protein wird über den Typ II Sekretionsapparat sekretiert und gelangt über eine Rezeptor-vermittelte Endocytose ins Cytoplasma von eukaryotischen Wirtszellen. Durch die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität dieses Enzyms wird die Proteinbiosynthese der Wirtszelle inhibiert, was letztlich zum Zelltod führt (Wick et al., 1990). Ähnliche Funktionen innerhalb des Infektionsgeschehens besitzen die Exoenzyme S (exoS) und T (exoT; Liu, 1974; Frithz-Lindsten et al., 1997; van Delden, 2004). Diese werden allerdings bei Kontakt der P. aeruginosa Zelle zur Wirtszelle über den Typ III Sekretionsmechanismus direkt ins Cytoplasma der Wirtszelle transportiert (Yahr et al., 1996; Barbieri und Sun, 2004). Ebenfalls über den Typ III Sekretionsweg werden die Exoenzyme U (exoU) und Y (exoY) transloziert (Yahr et al. 1998). ExoU auch PepA genannt, besitzt Lipase- wie auch Phospholipase-Aktivität (Sato und Frank, 2004) und wird von den meisten Isolaten von Bindehautentzündungen exprimiert (Finck-Barbancon et al., 1997). Im Gegensatz dazu konnte exoU nur in 40 % der Stämme die von akuten Lungenentzündungen isoliert wurden und sogar nur in 10 % der CF-Isolate gefunden werden (van Delden, 2004). Die Rolle von ExoY für die Pathogenität von P. aeruginosa ist bisher noch nicht geklärt (van Delden, 2004). Die Adenylatcyclase-Aktivität dieses Enzyms führt dazu, dass es innerhalb der eukaryotischen Zelle zur Akkumulation von cAMP kommt (Yahr et al., 1998). Zusätzlich sekretiert P. aeruginosa noch eine Vielzahl anderer hydrolytisch wirkender Enzyme, wie Lipasen (LipA, LipC), Phospholipasen (PlcH, PlcN, PlcB, PlcA), Proteasen und Phosphatasen (Tabelle 1). P. aeruginosa sekretiert insgesamt vier Phospholipasen C (EC 3.1.4.3). Die PlcH (hitzelabiles Hämolysin, 78 kDa), die Phoshatidylcholin und Sphingomyelin spaltet, PlcN (nicht hämolytische Phospholipase C, 73 kDa), die Phoshatidylcholin spaltet, die PlcB die neben Phoshatidylcholin und Sphingomyelin auch Phoshatidylethanolamin als Substrat erkennen kann, und die kürzlich entdeckte PlcA, die ebenfalls Phoshatidylcholin sowie Phoshatidylethanolamin verwertet. Diese Phospholipasen werden soweit heute bekannt über den Typ II Sekretionsapparat ins extrazelluläre Medium transportiert, konnten aber auch in Membranvesikeln gefunden werden (Ostroff et al., 1990; Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; Barker et al., 2004). Einige dieser Phospholipasen spielen eine wichtige Rolle als Virulenzfaktoren (Vasil, 1993). Für die nicht-hämolytische Phopholipase C konnte keine pathogene Aktivität nachgewiesen werden. Dagegen bewirkte im Tierversuch die Gabe von gereinigtem Hämolysin schwere Organschäden und konnte die Ausschüttung von diversen Enzündungsfaktoren induzieren (König et al., 1996). Zusätzlich zu den Phospholipasen sekretiert P. aeruginosa zwei Lipasen über den Typ II Mechanismus; die 29 kDa Lipase A und die 32 kDa große Lipase C (Stuer et al., 1986; Martinez et al., 1999). Bei beiden Enzymen handelt es sich nach der von Arpigny und Jaeger (1999) vorgeschlagenen Nomenklatur um Lipasen (E.C. 3.1.1.3) der Familie I.1. Anhand der 3D-Struktur von LipA (Nardini et al., 2000) wurde gezeigt, dass Lipasen dieses Typs eine das aktive Zentrum bedeckende α-helikale Deckelstruktur besitzen. Diese Deckelstruktur („Lid“) gilt als die molekulare Erklärung für die sogenannte Interphasenaktivierung von Lipasen, also die

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Aktivierung des Enzyms durch Substratemulsionen (Jaeger et al., 1994). Anders als prototypisch Interphasen-aktivierbare Lipasen weist LipA aus P .aeruginosa diese Eigenschaft jedoch nicht auf. Als molekulare Ursache hierfür wurde postuliert, dass die Deckelstruktur bei diesem Enzym permanent geöffnet vorliegt, wahrscheinlich durch die Assoziation des Proteins mit lipidischen Substanzen der äußeren Membran (Stuer et al., 1986; Liebeton, 1999). Typische Substrate für diese Lipasen sind Triacylglycerole mit langkettigen Substituenten (Jaeger et al., 1993), es wird aber angenommen, dass sie als natürliches Substrat auch Diacylglycerole verwerten können (Barker et al., 2004). LipA zeigte synergistische Effekte bezüglich der Virulenz mit der Phospholipase C (Jaeger et al., 1991; Jaeger, 1994; König et al., 1994; 1996). Zusammen sind die Enzyme in der Lage Dipalmitoylphoshatidylcholin abzubauen, das als hauptsächliches Oberflächenlipid von Lungenepithelzellen gilt. Erst kürzlich wurde ein äußere Membran-gebundenes Enzym mit Carboxylesterhydrolase-Aktivität (EC 3.1.1.1) beschrieben, die bevorzugt Ester kurzkettiger Fettsäuren hydrolysiert (Wilhelm et al., 1999). Diese EstA benannte Esterase besitzt eine molekulare Masse von 67 kDa und transloziert sich selbst über Autotransportersekretion, wobei die enzymatisch aktive N-terminale Domäne nach ihrer Sekretion auf der Zelloberfläche exponiert verbleibt (Wilhelm et al., 1999). Proteasen können in hohen Konzentrationen im Sputum von CF-Patienten nachgewiesen werden (Pollack, 2000), wobei P. aeruginosa fünf verschiedene Proteasen sekretiert. Die alkalische Protease ist eine Metalloprotease, deren spezifisches Substrat noch nicht klar identifiziert ist (Gambello et al., 1993). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sie fähig ist Komponenten des Komplementsystems, Interferon γ (IFN-γ) und den Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) zu spalten (van Delden, 2004) und somit Einfluss auf das Infektionsgeschehen nimmt. Alkalische Protease-defiziente Stämme zeigten sich weniger virulent (Hirakata et al., 1995; Pollack, 2000). Die beiden Zink-Metalloproteasen Elastase A (LasA) und Elastase B (LasB) können neben einer Reihe von Proteinen auch Elastin hydrolytisch spalten (van Delden, 2004). Elastin stellt einen deutlichen Teil des Lungengewebes dar und ist verantwortlich für die Expansions- und Kontraktions-Kapazität der Lunge. Bei einer Lungeninfektion mit P. aeruginosa bauen die beiden Enzyme synergistisch Elastin ab (Galloway, 1991), was sie zu den Hauptvirulenzfaktoren während einer akuten Infektion macht (Bever und Iglewski, 1988; van Delden, 2004). Beide Enzyme konnten in dem Sputum von CF-Patienten nachgewiesen werden (Jaffar-Bandjee et al., 1995). LasB ist eine hoch effiziente Protease mit einer proteolytischen Aktivität, die 10fach höher ist als die der alkalischen Protease von P. aeruginosa (Galloway, 1991). Sie spaltet nicht nur Elastin, sondern zerstört auch andere Gewebekomponenten und inteferiert mit dem Immunsystem des Witrsorganismus während einer Infektion (van Delden, 2004). LasB-defiziente Stämme von P. aeruginosa zeigten sich in Tier-Infektions-Modellen entsprechend weit weniger virulent (Tamura et al., 1992; Tang et al., 1996). Die Protease IV ist eine Serinprotease mit einer molekularen Masse von 26 kDa, die Lysin-haltige Peptide von der Carboxylseite her spaltet (Engel et al., 1998). Auch diese Protease ist in der Lage eine Vielzahl an Komponenten das humanen Immunsystems und Gewebebestandteile zu zerstören. In Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass die Protease IV eine deutliche Rolle in der Virulenz von P. aeruginosa während Bindehautinfektionen spielt (O´Callaghan et al., 1996; Engel et al., 1997). Die Expression einiger extrazellulärer Enzyme von P. aeruginosa, wie Las A, LasB, AprA und LipA ist über „Quorum sensing“ reguliert (Pesci et al., 1997; Whiteley et al., 1999).

Tabelle 1: Extrazelluläre Enzyme von P. aeruginosa. (?) noch nicht bekannt Enzym-Klasse EC-Nr. Enzym Gen Molmasse Sekretionsweg Referenz

(kDa) IM OM Sec Typ II ADP-

Ribosyltransferase 2.4.2.5 Exotoxin A

Exoenzym S Exoenzym T

toxA

exoS

exoT

68

49

53

Typ III Typ III

Callahan 3rd, 1974; Iglewski et al., 1977; Lory et al., 1983 Iglewski et al., 1978; Yahr et al., 1996; Fritz-Lindsten, 1997; Goehring et al., 1999 Liu et al., 1997; Barbieri und Sun, 2004

Adenylatcyclase 4.6.1.1 Exoenzym Y exoY 42 Typ III Yahr et al., 1996; Yahr et al., 1998 Phospholipase A 3.1.1.4 Exoenzym U exoU 74 Typ III Fink-Barbancon et al., 1997; Sato und Frank,

2004 Phospholipase C 3.1.4.3

PLC-H (hitzelabiles Hämolysin) PLC-N (nicht hämolytisch) PLC-B PLC-A

plcH

plcN

plcB

plcA

78

73

35

47

TAT TAT Sec Sec

Typ II, MV Typ II, MV Typ II, MV ?

Ostroff und Vasil, 1987; Ostroff et al., 1990 Ostroff und Vasil, 1987; Ostroff et al., 1990 Barker et al., 2004 Vasil, 2005

Carboxylesterasen 3.1.1.1 Esterase A estA 67 Sec Typ Va Wilhelm et al., 1999 Triacylglycerol Lipasen

3.1.1.3 Lipase A Lipase C

lipA

lipC

29

32

Sec ?

Typ II Typ II

Stuer et al., 1986; Rosenau und Jaeger, 2002 Martinez et al., 1999

Proteasen 3.4.24 alkalische Protease aprA 54 Typ I Cryz und Iglewski, 1980; Guzzo et al., 1991

Elastase A (staphyolytische Protease) Elastase B (Zn-Metalloprotease) Elastase D (staphyolytische Protease) Protease IV (Serinprotease)

lasA

lasB

?

PA4175

24

33

23

26

Sec Sec Sec Sec

Typ II Typ II Typ II Typ II

Kessler et al., 1993 Bever und Iglewski, 1988; Braun et al., 1996 Park und Galloway, 1995 Engel et al., 1998; Caballero et al., 2001

alkalische Phosphatase

3.1.3.1

H-AP (schwere Phosphatase) L-AP (leichte Phosphatase)

phoA

lapA

51

40

? Sec

MV Typ II

Day und Ingram, 1973; Tan und Worobec, 1993 Tan und Worobec, 1993; Ball et al., 2002

Chitinase 3.2.1.14 Endochitinase chiC 30 ? ? Wang und Chang, 1997; Folders et al., 2001

1 Einleitung

21

• „Quorum sensing“ in P. aeruginosa Unter dem Begriff "Quorum sensing" (QS) werden bakterielle Zell-Zell Kommunikationssysteme, die die Expression bestimmter Gene in Abhängigkeit von der Zelldichte regulieren, zusammengefaßt (Übersichten in: Parsek und Greenberg, 2000; Fuqua et al., 2001; Whitehead et al., 2001). Diese Systeme funktionieren mittels niedermolekularer, diffusionsfähiger Signalmoleküle. Typisch für derartige Systeme ist, dass sich bestimmte bakterielle Eigenschaften nur dann ausprägen, wenn eine entsprechende Anzahl von Bakterien vorliegt. Die kleinste Populationseinheit, die zu einer koordinierten Aktion befähigt ist, stellt per Definition das sog. „Quorum“ dar (Swift et al., 1996), also einen Schwellenwert der Zelldichte, bei dessen Erreichen die QS-Regulation einsetzt. Die Zelldichte wird dabei über die Konzentration der Signalmoleküle (Autoinduktoren) wahrgenommen und die Genexpression entsprechend koordiniert (Pesci et al., 1997). Bei den von Gram-negativen Bakterien eingesetzten Signalmolekülen handelt es sich häufig um eine Gruppe verschiedener N-Acyl-L-Homoserinlactone (AHL), die sich durch die Länge der N-Acyl-Seitengruppe sowie durch Modifikationen der C-3-Position (3-Oxo- oder 3-Hydroxygruppe) unterscheiden. Durch ihren amphiphilen Charakter können sie einerseits frei durch die Membranen diffundieren, andererseits wurden aber auch aktive Transportprozesse beschrieben (Pearson et al, 1999). In der Regel liegen die AHL aber intra- und extrazellulär in gleicher Konzentration vor. Prinzipiell setzen sich QS-Systeme aus einem Regulatorprotein (R-Protein), das über die Bindung eines spefizischen Autoinduktors die Genexpression koordiniert und einer AHL-Synthase (I-Protein), die die entsprechenden Autoinduktoren synthetisiert, zusammen. P. aeruginosa besitzt zwei solcher QS-Regulationsysteme, das LasRI- und das RhlRI-System (Abbildung 6; Pesci und Iglewski, 1999, Wingender und Jaeger, 2002). Abbildung 6: „Quorum sensing“ Regulation der Genexpression bei P. aeruginosa (Wingender und Jaeger, 2002). (+) positive Reglation, (-) negative Regulation. Gene die für extrazelluläre Enzyme kodieren sind in rot abgebildet. (Genbezeichnungen: apr = alkalische Protease, azu = Azurin, cyaA = Cyanid, katA = Katalase, lasA, lasB = Elastasen, lipA = Lipase A, plc = Phospholipase C, rhlAB = Rhamnosyltransferase I, rpoS = Stationärphasen-Sigmafaktor, sodA, sodB = Superoxidismutasen, toxA = Exotoxin A, xcpR, xcpP = Proteine des Typ II-Sekretions-Systems)

aprplckatAlasAlasBsodAtoxAxcpR,xcpP

azuAlginatgenekatATwitching Motility

LasR

LasR

3-oxo-C12-HSL

lasI

LasI

C4-HSLRhlR

RhlRrpoSChitinasecyaAlasBlipAPyocyaninrhlABsodBxcpR, xcpP

rhlI

RhlI

rhlR

+

+++

+

+

-

ONH

O

HOO

ONH

O

HO

aprplckatAlasAlasBsodAtoxAxcpR,xcpP

azuAlginatgenekatATwitching Motility

LasR

LasR

3-oxo-C12-HSL

lasI

LasI

C4-HSLRhlR

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rhlI

RhlI

rhlR

+

+++

+

+

-

ONH

O

HOO

ONH

O

HO

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Das LasRI-System besteht aus der Synthase LasI, die die Synthese von N-(3-oxododecanoyl) L-Homoserinlacton (3-oxo-C12-HSL) katalysiert, welches an das Regulatorprotein LasR bindet. Der Komplex aus LasR und 3-oxo-C12-HSL reguliert die Expression der extrazellulären Enzymgene lasA, lasB, aprA und toxA und dem Gen für die eigene Synthetase lasI, was zu einer positiven „Feedback“-Regulation führt. Das RhlRI-System besteht aus der Synthase RhlI, die den Autoinduktor N-Butanoyl-L-Homoserinlacton (C4-HSL) synthetisiert, das von dem Regulatorprotein RhlR gebunden wird. Der RhlR-C4-HSL-Komplex reguliert die Expression der Rhamnolipid-Biosynthese-Gene rhlA und rhlB, die Gene der extrazellulären Enzyme lasB und aprA, den Stationärphasen Sigmafaktor RpoS und die Sekundärmetaboliten Pyocyanin und Cyanid und wiederum die eigene Sythetase RhlI. Interessanterweise werden einige Gene die für extrazelluläre Enzyme und die Gene xcpP und xcpR, die für Proteine des TypII-Sekretoms kodieren von beiden Systemen reguliert. Darüber hinaus arbeiten die beiden Systeme nicht unabhängig voneinander. Es wurde beschrieben, dass LasR die Expression von rhlR positiv reguliert, wodurch das QS-System von P. aeruginosa eine hirarchisch aufgebaute Regulationskaskarde darstellt, bei dem das LasRI-System dominiert (Pesci et al., 1997) Zelldichteabhängige Genregulationen spielen besonders in Biofilmen eine große Rolle (Übersicht in Hentzer et al., 2004). Kürzlich wurde beschrieben, dass im Sputum von CF-Patienten eine charakteristische Konzentration der Signalmoleküle 3-oxo-C12-HSL und C4-HSL nachweisbar ist. Ähnliche relative Mengen konnten in auf Agar angezüchteten Modellbiofilmen, nicht aber in Flüssigkulturen von P. aeruginosa nachgewiesen werden, woraus vermutet wurde, dass P. aeruginosa die Lunge von CF-Patienten in Form von Biofilmen besiedelt (Singh et al., 2000). In Durchflusszellexperimenten konnte der Einfluss von QS auf die Biofilmdifferenzierung und -struktur von P. aeruginosa beobachtet werden (Davies et al.,1998; De Kievit et al., 2001). • Biofilmbildung bei P. aeruginosa P. aeruginosa ist in der Lage sowohl biotische als auch abiotische Oberflächen in Form von Biofilmen zu besiedeln (O´Toole und Kolter, 1998; Hogan und Kolter, 2002). In den letzten Jahren wurde die Erforschung der Biofilmbildung- und entwicklung von Pseudomonaden inklusive P. aeruginosa intensiviert (Übersichten in Toutain at al., 2004; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Dabei wurden zum einen mikroskopische Methoden zur in situ Beobachtung des Verhaltens der Bakterien während der Biofilmbildung und zur Aufklärung von Biofilmstrukturen verwendet. Zum anderen wurden molekularbiologische Methoden zur Untersuchung des genetischen und physiologischen Hintergrunds von Biofilmphänomenen eingesetzt. Bis heute sind die genauen Mechanismen der einzelnen Entwicklungsstadien allerdings nicht bis ins Letzte verstanden, da die Biofilmbildung einen dynamischen Prozess darstellt, der als hochregulierte Antwort auf diverse Umweltreize abläuft und zum Teil Art- bzw. sogar Stammspezifisch zu sein scheint. Einige der bisher bekannten Faktoren die Einfluss auf die Biofilmbildung von P. aeruginosa besitzen, sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Prinzipiell gelangte man zu der Annahme, dass die Biofilmentwicklung (Anheftung, Wachstum und Differenzierung, Loslösung und erneute Anheftung) Teil des natürlichen Lebenszyklus bei Pseudomonaden und wahrscheinlich auch bei anderen Biofilm-bildenden Mikroorganismen darstellt (Abbildung 7; Stoodley et al., 2002).

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Abbildung 7: Schematische Darstellung der Phasen während der Biofilmbildung bei P. aeruginosa. 1) Primäre Anheftung von planktonischen Zellen an eine Oberfläche 2) Bildung von Mikrokolonien 3) Bildung von Makrokolonien 4) Erhalt des reifen Biofilms 5) Ablösung von Zellen aus dem Biofilm und erneute Anheftung (aus Stoodley et al., 2002) 1) Induktionsphase oder Primäradhäsion Neben abiotischen Faktoren, wie z. B. die Ionenstärke, pH-Wert des Mediums, oder die Hydrophobizität des Substratums, spielen die polar angeordneten Flagellen eine besondere Rolle bei der primären Anheftung der Zellen an Oberflächen (O´Toole und Kolter; 1998; Sauer et al., 2002; Klausen et al., 2003). Diese Bewegungsorganellen erlauben einerseits dem Bakterium sich durch gerichtete Schwimmbewegungen der Oberfläche zu nähern (O´Toole und Kolter; 1998) und andererseits als adhäsive Zelloberflächenstruktur den ersten Kontakt aufzunehmen (Sauer et al., 2002). Durch die polare Anordnung der Flagellen kommt es zunächst zu einer apikalen Ausrichtung der angehefteten Zellen. In diesem Stadium ist die Adhäsion noch reversibel. Erst die anschließende Anheftung der Zellen über die gesamte Zelloberfläche in Längsrichtung führt zu einer irreversiblen Adhäsion (Sauer et al., 2002). Allerdings scheinen die Flagellen nicht zwingend nötig für die Anheftung an Oberflächen. Zwar zeigten sich Flagellen-defiziente Mutanten von P. aeruginosa unfähig in Glucose-haltigen Medien Biofilme zu bilden. Klausen et al. (2003) fanden aber heraus, dass Flagellen-defiziente Mutanten in Citrat-haltigem Medium durchaus fähig waren, Biofilme zu bilden. Sie schienen sich dann allerdings direkt mit der gesamten Zelloberfläche anzuheften (Sauer et al., 2002). Neben den Flagellen spielen noch andere biotische Faktoren eine Rolle bei der primären Anheftung, wie z. B. Typ IV-Piline (Ramphal et al., 1984; 1987; Deziel et al., 2001), fimbriale Adhäsine (Vallet et al., 2001; 2004) und äußere Membranproteine (Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Typ IV-Pili wurden als einer der Hauptfaktoren für die Adhärenz von P. aeruginosa an Gewebe beschrieben und somit als wichtiger Virulenzfaktor (Übersicht in Hahn, 1997). Es konnte z. B. gezeigt werden, dass Typ IV-Pili maßgeblich an der Anheftung an Lungenepithelzellen (Ramphal et al., 1987; Zoutman et al., 1991) und Bindehautgeweben beteiligt sind (Wu et al., 1995). Generell ist die Zelloberflächen-Hydrophobizität maßgeblich für die Anheftungseffizienz verantwortlich. Diese kann vor allem durch die die Struktur der LPS (Rocchetta et al., 1999), aber auch durch das Vorhandensein von EPS an der Zelloberfläche beeinflusst werden (Martinez-Martinez et al., 1991, Gómez-Suárez et al., 2002, Toutain et al., 2004). So wurde z. B. extrazelluläre DNA als adhäsive Substanz bei nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stämmen

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beschrieben (Whitchurch et al., 2002), welche anscheinend auch in der nachfolgende Phase der Mikrokoloniebildung als Zell-Zell-„Klebstoff“ fungiert. Bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa wurde der Einfluss des extrazellulären Polysaccharids Alginat auf die Anheftungseffizienz nachgewiesen (Gómez-Suárez et al., 2002). Gacesa (1998) berichtete, dass mucoide Stämme 10 - 1000 mal besser an Lungenepithelien anheften können, als nicht-mucoide Stämme. Dabei kommt den O-Acetylgruppen im Alginat eine besondere Bedeutung zu. O-Acetylierungs-defekte Mutanten zeigten im Gegensatz zum Ausgangsstamm mit acetyliertem Alginat eine verlangsamte Primär-Adhäsion an Stahloberflächen (Tielen, 1999) und waren nicht in der Lage Mikrokolonien auszubilden (Nivens et al., 2001; Tielen et al., 2005). 2) Die logarithmische Wachstumsphase oder Reifung des Biofilms Die Reifung des Biofilms beginnt mit der Bildung von kleineren Zellaggregaten oder Mikrokolonien. Dabei scheinen die aus Pilinen aufgebauten Typ IV-Pili eine bedeutende Rolle zu spielen. Typ IV-Pili sind am gleichen Zellpol wie die Flagellen lokalisiert und vermitteln die Bewegung der Zellen über Oberflächen, die sogenannte „Twitching Motility“ (Mattick, 2002). Es wurde vermutet, dass sich die adhärierten Zellen mittels Twitching Motility zueinander hinbewegen und dass die Typ IV-Pili darüber hinaus als Adhäsine zwischen den Zellen fungieren (O´Toole und Kolter, 1998). Experimente unter statischen Bedingungen in Glukose-haltigem Medium zeigten z. B., dass Twitching-defiziente Mutanten von P. aeruginosa nicht in der Lage waren, auf abiotischen Oberflächen Mikrokolonien auszubilden, sondern in einer einlagigen Schicht gleichmäßig verteilt vorlagen (O´Toole und Kolter, 1998; Klausen et al., 2003b). In Citrat-haltigem Medium waren diese Stämme allerdings sehrwohl in der Lage Mikrokolonien auszubilden (O´Toole und Kolter, 1998; Klausen et al., 2003a; b). Diese entstanden dort allerdings durch klonales Wachstum der adhärieren Zellen (Klausen et al., 2003a; b). Darüber hinaus zeigten zeitaufgelöste CLSM Untersuchungen an Mischkulturen aus unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Typ IV-Pili-defekten und Wildtyp-Stämmen in Fließzellen, dass die initialen Mikrokolonien von den unbeweglichen Zellen gebildet werden, während sich die Twitching-aktiven Zellen über das Substratum aus den Mikrokolonien weg bewegten (Klausen et al., 2003a; Heydorn et al., 2003). Chiang und Burrows (2003) zeigten, dass hyperpilierte, unbewegliche Mutanten von P. aeruginosa große, eng gepackte Makrokolonien ausbildeten, was die Vermutung zuließ, dass weniger die Bewegung, sondern die Adhäsinfunktion der Typ IV-Pili notwendig für die Ausbildung eines strukturierten Biofilms sind. Für den Zusammenhalt der Zellen innerhalb dieser Mikrokolonien wurde neben den Typ IV- Pilinen auch EPS postuliert. Whitchurch et al. (2002) zeigten, dass die exogene Zugabe von DNA-Endonuklease I die Mikrokolonien von nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stämmen auflösen konnte, was die Beteiligung extrazellulärer DNA als kohäsive Sustanz zwischen den Zellen bestätigen würde (Whitchurch et al., 2002). Dabei spielen anscheinend wiederum die Typ IV-Pili eine Rolle. Hyperpilierte Mutanten mit einem Defekt im pilU-Gen, das für ein DNA-Bindeprotein kodiert, zeigten sich unfähig, Biofilme unter fließenden Bedingungen auszubilden (Comolli et al., 1999). In mucoiden Stämmen konnte mittels algC::lacZ Reportergenfusionen in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass die Expression des Strukturgens algC, dessen Genprodukt maßgeblich an der Alginat-Biosynthese beteiligt ist, schon nach 15-minütiger Anheftung der Zellen an Teflon oder Glas hochreguliert wird, was die Annahme zuließ, dass extrazelluläre Polymere wie Alginat schon an der frühen Phase der Biofilmbildung beteiligt sein können (Davies et al., 1993; Davies und Geesey, 1995).

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Darüber hinaus wurde über das Screening von Transposon-Mutanten der Einfluss von verschiedenen Regulations- und Signaltransduktionssystemen auf diese frühe Entwicklungsphase von Biofilmen nachgewiesen, wie z. B. der Catabolitrepressor Crc, der Virulenzfaktor Regulator Vfr und das globale Zwei-Komponenten-Regulations-System GacAS. Das crc-Gen („catabolit repression control“) kodiert für ein Regulationsprotein, dass eine Rolle im Kohlenhydrat-Metabolismus über den Tricarboxylsäure Zyklus spielt (Wolff et al., 1991). Crc-Mutanten konnten sich zwar an Oberflächen anheften, waren aber nicht in der Lage Mikrokolonien auszubilden (O´Toole et al., 2000), wahrscheinlich, da sie eine reduzierte Typ IV-Pili Synthese zeigten und entsprechend Twitching-defizient waren (O´Toole et al., 2000). Der Virulenzfaktor Regulator (Vfr) bildet unter Glukose-Mangelbedingungen einen Komplex mit cAMP und reguliert darüber die Expression von Genen, die in der Verwertung von Kohlenstoffquellen involviert sind und zudem das LasRI Quorum sensing System von P. aeruginosa und so direkt oder indirekt die Synthese von Typ IV-Pili beeinflusst, woraus wiederum die Unfähigkeit Mikrokolonien auszubilden, folgte (Albus et al., 1997; Beatson et al., 2002). Parkins et al. (2001) zeigten, dass das in Gram-negativen Bakterien, inklusive P. aeruginosa hochkonserviert vorkommende GacAS System Einfluss auf die Biofilmbildung besitzt. Zwei-Komponenten-Regulations-Systeme werden von Bakterien genutzt, um Umweltreize über eine Membran-assoziierte Sensor-Histidinkinase (GacS) wahrzunehmen und auf ein Regulatorprotein (GacA) zu übertragen, welches dann entsprechend die Genexpression verändern kann (Parkins et al., 2001; Willis et al., 2001) GacA wie auch GacS Mutanten zeigten sich defizient, Mikrokolonien auszubilden (Parkins et al., 2001). In P. aeruginosa reguliert GacAS zelluläre Prozesse wie die Alginatsynthese, oder die Produktion von Quorum sensing Molekülen (Willis et al., 2001). Über solche Signaltransduktions-Systeme sind die Zellen in der Lage Umweltbedingungen, wie das Vorhandensein von verwertbaren Kohlenstoffquellen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Der Einfluss solcher Systeme auf die frühe Entwicklungsphase von Biofilmen macht deutlich, dass die Biofilmbildung maßgeblich von den Nährstoffbedingungen beeinflusst wird. Durch Wachstum der Zellen und vermehrte EPS-Produktion im weiteren Verlauf der Biofilmreifung entstehen letztlich Makrokolonien und somit ein reifer Biofilm (Toutain et al., 2004). Die Struktur dieses Biofilms wird maßgeblich von der C-Quelle beeinflusst (Klausen et al., 2003b), aber auch von der Art der EPS (Boyd und Chakrabarty, 1995; Wingender und Flemming, 1999). Bei mucoiden Stämmen wurde gezeigt, dass das extrazelluläre Polysacchrarid Alginat an der Ausbildung von dreidimensionalen, heterogenen Biofilmen beteiligt ist (Davies, 1999; Hentzer, 2001). Dabei spielen wiederum die O-Acetylgruppen im Alginat eine Rolle. O-Acetylierung-defekte Mutanten von mucoiden P. aeruginosa zeigten keine strukturierten Biofilme, sondern homogene, flächendeckende Bewüchse (Nivens et al., 2001; Tielen et al., 2005). Prinzipiell ist Alginat allerdings nicht essentiell für die Biofilmbildung. So spielt Alginat in nicht-mucoiden Stämmen von P. aeruginosa keine Rolle bei der Biofilmbildung (Wozniak et sl., 2003). Kürzlich wurden aber verschiedene Gene identifiziert, die für Proteine kodieren, die an der Biosynthese anderer extrazelluläre Polysaccharide beteiligt sind, welche Einfluss auf die Stabilität von Biofilmen zeigen. In den P. aeruginosa-Stämmen PAK14 sowie PAO1 konnten operonische pel-Genkluster identifiziert werden, die zur Ausbildung eines extrazellulären, glucosereichen Polymers nötig sind, welches anscheinend Einfluss auf die Stabilität von Kahmhäuten („pellicle“; Friedman und Kolter, 2004b; Vasseur et al., 2005). Ausserdem konnte ein pls-Genkluster identifiziert werden, der anscheinend zur Produktion eines mannosereichen Polysaccharids kodiert, welches Einfluss auf die Anheftung und die

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nachfolgende Biofilmentwicklung zeigt (Jackson et al., 2004; Friedman und Kolter, 2004a; Matusukawa und Greenberg, 2004). An der Ausbildung eines reifen Biofilms mit einer ausgeprägten Struktur und Organisation können zudem auch höhere Regulations-Systeme, wie z. B. das Quorum sensing (QS) beteiligt sein. Der Einfluss des QS auf die Biofilmstruktur wurde zuerst von Davies et al. (1998) gezeigt. In diesen Experimenten bildeten lasI-defiziente Mutanten flache, undiffferenzierte Biofilme. Untersuchungen von anderen Gruppen zeigten allerdings keine oder nur sehr geringe Unterschiede in der Struktur von Biofilmen von QS-defizienten und Wildtyp-Stämmen (Heydorn et al., 2002; Purevdorj et al., 2002). Beatson et al. (2002) zeigte, dass QS-Mutanten eine gesteigterte Neigung zu Sekundärmutationen besitzen, sodass die Ergebnisse von Davies et al. (1998) eher darauf zurück zu führen sind (Hentzer et al., 2004). Mit neu konstruierten QS-Mutanten konnte nachgewiesen werden, dass zumindest rhlI/lasI Doppelmutanten einen Einfluss auf die Biofilmstruktur von 10 Tage alten Durchflusszell-Biofilmen hatten, was sich in einem dünneren Biofilm mit weniger Biomasse äußerte. Einfachmutanten zeigten allerdings nur einen sehr geringen Einfluss (Hentzer et al., 2004). Die genauen Mechanismen, die eine Regulation durch QS mit sich bringt sind bisher noch nicht verstanden. Eindeutig konnte aber der Einfluss von QS-regulierten Substanzen, wie z. B. das Rhamnolipid (Pearson et al., 1997) nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass diese oberflächenaktiven, amphiphilen Moleküle zur Aubildung von Kanälen zwischen den Makrokolonien führen (Davey at al., 2003). In diesen Kanälen hefteten sich zudem kaum noch planktonische Zellen an. Dagegen zeigten Mutanten mit einen Defekt im rhlA-Gen, das für die Rhamnolipidsynthase kodiert, keine Kanalbildung, woraus geschlossen wurde, dass Rhamnolipide zum einen den Zell-Zell-Kontakt blockieren und zum anderen die Adhäsion von Zellen zum Substratum beeinträchtigen. (Davey et al., 2003). Der Einfluss von anderen QS-regulierten Molekülen wie z. B. der Elastase B wurde bisher noch nicht untersucht. 3) Plateauphase oder Erhalt des Biofilms Reife Biofilme zeichnen sich durch eine definierte Architektur und einen hohen Organisationsgrad aus. Proteom-Analysen mittels 2-dimensionaler-Gelelektrophorese zeigten, dass Biofilmbakterien im Vergleich zu planktonischen Zellen ein stark verändertes Proteinmuster aufwiesen. Mehr als 50 % des Proteoms von Biofilmbakterien zeigte eine 6-fache, oder noch höhere Veränderung im Expressionslevel (Sauer et al., 2002). Dagegen zeigten Transkriptom-Analysen von planktonischen Zellen und solchen aus reifen Biofilmen mit DNA-Mikroarrays, dass nur etwa 1 % aller Gene in ihren Expressionslevel verändert waren, wobei im Biofilm etwa 0,5 % der Gene hochreguliert und etwa 0,5 % runterreguliert erschienen (Whiteley et al., 2001, Schuster et al., 2003) Am höchsten aktiviert zeigten sich Gene von temperenten Bakteriophagen und Gene die an der Resistenz der Bakterien gegen Antibiotika beteiligt sind (Whiteley et al., 2001). Die Unterschiede in der Expression von Genen lassen auf einen spezifischen Biofilm-Phänotyp schließen, der vermutlich der Grund für die veränderten Resistenzeigenschaften gegenüber antimikrobiellen Agenzien, wie z.B. Antibiotika oder Desinfektionsmitteln darstellen. Ausschlaggebend ist dabei anscheinend unter anderem die hohe Zellzahl, die in einem Biofilm erreicht werden kann. So konnte der Einfluss des alternativen Sigmafaktors RpoS auf diese Phase der Biofilmentwicklung bei P. aeruginosa nachgewiesen werden. RpoS spielt eine große Rolle bei der Stressantwort und der Regulation von Virulenzfaktoren des Bakteriums (Jorgensen et al. 1999). Die Expression von rpoS steigt in

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planktonischen Kulturen beim Eintritt in die stationäre Phase, also bei Erreichen einer hohen Zellzahl, an (Whiteley et al, 2000). Auch im Biofilm konnte eine gesteigerte Expression von rpoS erst in der späteren Phase nachgewiesen werden (Xu et al., 2001; Heydorn et al., 2002), woraus geschlossen wurde, dass dieser Faktor zur Kontrolle des Wachstums innerhalb des Biofilms zuständig ist, um die Größe von Makrokolonien zu kontrollieren (Toutain et al., 2004). 4) Auflösung des Biofilms Prinzipiell findet die Ablösung von Biofilmen statt, wenn die wirkenden externen Kräfte größer sind als die Kräfte innerhalb der Matrix, die den Biofilm zusammenhalten (Stoodley et al., 2002; Toutain et al., 2004). Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Ablösung von Biofilmzellen durch eine Vielzahl an physikalischen Faktoren, wie hydrodynamische Bedingungen und die Viskosität des Mediums, aber auch durch pH-Wert und Ionenstärke des Mediums beeinflusst werden können. Einflüsse solcher Art wurden intensiv untersucht (Picioreanu et al., 2001; Übersicht Purevdorj-Gage und Stoodley, 2004). Von großen Interesse ist zur Zeit der Einfluss biologischer Faktoren, die möglicherweise in der Lage sind die physiko-chemischen Eigenschaften der Biofilme zu beeinflussen, um somit die intern herrschenden Kräfte zu verändern. Ein Beispiel dafür wäre das bereits in früheren Biofilmentwicklungsphasen involvierte Biotensid „Rhamnolipid“. Davey et al. (2003) zeigte, dass die exogene Gabe von Rhamnolipiden zur Auflösung von frisch gebildeten Kahmhäuten von P. aeruginosa führte. Neuere Ergebnisse zeigen, dass die Expression der Rhamnolipidsynthase in reifen Biofilmen verstärkt wird (Davey et al. 2004). Zudem wird das Rhamnolipid vermehrt von Zellen produziert die sich an der Unterseite des Biofilms, also direkt an der Aufwuchsfläche befinden, wodurch der Biofilm letztlich abgelöst wird (Lequette und Greenberg, 2004). Auch Enzyme, die die EPS-Matrix modulieren können, werden als Möglichkeit zur aktiven Veränderung der Biofilmeigenschaften durch die Bakterien diskutiert (Sutherland, 1999b; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Es wurde beschrieben, dass die vermehrte Produktion der Polysaccharid depolymerisierenden Alginat-Lyase bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa eine gesteigerte Ablösung von Biofilmzellen zur Folge hat (Boyd und Chakrabarty, 1994). Ähnliche Effekte konnten auch bei anderen Bakterienarten beobachtet werden (Lee et al., 1996; Allison et al., 1998; Baty et al., 2001). Webb et al. (2003) beschrieben den Einfluss von temperenten Bakteriophagen auf den Auflösungsprozess von P. aeruginosa Biofilmen. In Durchflusszellexperimenten konnte gezeigte werden, dass es innerhalb der Makrokolonien zur Lyse von Zellen kam, was zur Ausbildung von Löchern in der Mitte der Makrokolonien führte. Der Zelltod dieser Subpopulation konnte auf den filamentösen Pf1-Typ Phage zurückgeführt werden, der in reifen Biofilmen induziert wird. Die gesteigerte Produktion von Phagen in reifen Biofilmen wurde durch Transkriptomanalysen (Whiteley et al., 2001) wie auch Proteomanalysen bestätigt (Sauer et al., 2002).

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Tabelle 2: Zusammenfassung der in der Biofilmentwicklung von P. aeruginosa involvierten Faktoren (erweitert nach Toutain et al., 2004)

Biofilmentwicklung Faktoren Referenzen Primäre Anheftung

Nährstoffangebot Rauhigkeit des Substratums Hydrophobizität des Substratums/ Zelloberfläche Elektrochemische Eigenschaften des Mediums Flagellen und Schwimmbewegung extrazelluläre DNA, Proteine, Polysaccharide

Costerton et al., 1995; Rashid et al., 2000 Bruinsma et al., 2001; 2003; Picioreanu et al., 2000 Fletcher et al., 1988; Marshall et al., 1989; Markin und Beveridge, 1996; DeFlaun et al., 1999 Busalmen und deSanchez, 2001; McWhiter et al, 2002 O´Toole und Kolter, 1998; Sauer et al., 2002; Klausen et al., 2003; Allison et al., 1998; Gómez-Suárez et al., 2002; Whitchurch et al., 2002

Bildung von Mikrokolonien

Typ IV-Pili und Twitching Motility Katabolitrepressor (Crc) Virulenzfaktor Regulator (Vfr) Zwei-Komponenten-System (GacAS) Phasenvariation

O´Toole und Kolter, 1998; Deziel et al., 2001; Chiang und Burrows, 2003; Heydorn et al., 2002; Klausen et al., 2003 O´Toole et al., 2000 Albus et al., 1997; Beatson et al., 2002 Parkins et al., 2001; Willis et al., 2001; Henderson et al., 1999; Haussler et al., 2003

Bildung von Makrokolonien

Exopolysaccharid Produktion Quorum sensing Regulationssysteme (z. B. SadARS)

Davies et al., 1993; Davies und Geesey, 1995; Hentzer et al., 2001 Davies et al., 1998; DeKievit et al., 2001 Toutain et al., 2004; Kuchma et al., 2005

Erhalt des reifen Biofilms

Rhamnolipide Quorum sensing und PQS Stressantwort (RpoS)

Davey et al., 2003 Beatson et al., 2002; Hentzer et al., 2004; Calfee et al., 2001 Whiteley et al., 2000; Xu et al., 2001

Ablösung (Detachment)

Nährstoffzusammensetzung Enzyme (z.B. Lyasen) Rhamnolipide Prophagen Hydrodynamische Bedingungen

Sauer et al., 2004; Hunt et al., 2004 Sutherland, 1999b; Gacesa et al., 1998 Davey et al., 2003; 2004 Webb et al., 2003; 2004 Picioreanu, 2001; Stoodley et al., 2002; Purevdorj-Gage und Stoodley, 2004

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1.4 Problemstellung Im Biofilm liegen die Zellen der Mikroorganismen charakteristischerweise eingebettet in einer wasserhaltigen Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) vor. Es wird angenommen, dass die EPS überwiegend aus Polysacchariden und Proteinen bestehen (z. B. Wingender et al., 1999a; Sutherland, 1999a). Den Polysacchariden wie auch den Proteinen (z. B. lectinartige Proteine; Higgins und Novak, 1997, Sutherland, 2001) werden im Allgemeinen Strukturfunktionen im Biofilm zugeschrieben. Da jedoch Enzymaktivitäten im Biofilm regelmäßig nachzuweisen sind, ist davon auszugehen, dass es sich zumindest bei einem Teil der extrazellulär vorhandenen Proteine um Enzyme handelt. Die Hauptfunktion von extrazellulären Enzymen wird im Abbau von Makromolekülen, wie Polypeptiden, Lipiden oder Polysacchariden zu niedermolekularen Verbindungen gesehen, die in dieser Form von den Zellen aufgenommen werden und anschließend verstoffwechselt werden können. Die Untersuchungen zur Expression, Sekretion und der physiologischen Funktion extrazellulärer Enzyme wurden bisher aber fast ausschließlich in vitro in Flüssigkulturen gemacht. Zudem werden Enzymaktivitäten im Allgemeinen anhand der Verwertung von synthetischen Modellsubstanzen untersucht. Die natürlichen Substrate der Enzyme sind meist nicht bekannt. Daher ist zurzeit nur sehr wenig darüber bekannt, inwieweit Enzyme von Biofilmzellen produziert und sekretiert werden und welche Funktion extrazelluläre Enzymaktivitäten innerhalb der Biofilmmatrix übernehmen. Vorstellbar wären z. B. Modifikationen der EPS durch enzymatische Aktivitäten. Ein bislang beschriebenes Beispiel ist die Depolymerisation von Polysacchariden durch extrazelluläre Polysaccharidasen (Sutherland, 1999b). Unklar ist aber, ob Mikroorganismen die Möglichkeit besitzen, ihre direkte Umgebung im Biofilm durch Modifikation aktiv zu gestalten und durch Reaktionen extrazellulärer Enzyme, wie z. B. den partiellen Abbau von EPS-Komponenten, die rheologischen Eigenschaften des Biofilms zu modulieren. Hierzu wäre die Perzeption von physikochemischen Eigenschaften der Biofilmmatrix in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen zu postulieren. Über solche Mechanismen existieren aber derzeit keinerlei Informationen. Untersuchungen zur Genregulation extrazellulärer Enzyme im Biofilm könnten hierzu aber weiterführende Erkenntnisse ermöglichen und erste Hinweise auf die Existenz solcher Regulationsmechanismen erbringen. Ebenso unklar ist in diesem Zusammenhang die Lokalisation von extrazellulären Enzymen innerhalb des Biofilms. Beschrieben wurde die Möglichkeit der Wechselwirkung zwischen Enzymen und Polysacchariden (Wingender 1990; Wingender et al., 1999b). Solche Interaktionen würden zum einen den Vorteil bieten, dass die katalytische Wirkung durch die Immobilisierung der Enzyme in räumlicher Nähe der Zelle ablaufen würde, zum anderen könnten die Enzymmoleküle möglicherweise gleichzeitig als Vernetzungspunkte zwischen Polysacchariden fungieren und somit als zusätzliche strukturgebende Komponente dienen. Bisher ist aber nicht bekannt, ob es auch natürlicherweise innerhalb der Biofilmmatrix zu Interaktionen zwischen Enzymen und EPS-Bestandteilen kommt. Als Modellorganismus wurde das Gram-negative Bakterium P. aeruginosa gewählt, da es ein ubiquitär vorkommender, fakultativ pathogener und somit hygienerelevanter Keim ist. Diese Bakterienart wird in der Biofilm-Forschung häufig verwendet, da sie an wässrigen Habitaten regelmäßig aus Biofilmen isoliert werden kann und somit ein typisches Biofilmbakterium darstellt. Außerdem ist P. aeruginosa physiologisch, biochemisch und molekulargenetisch bereits eingehend charakterisiert und produziert eine Vielzahl verschiedener extrazellulärer Enzyme. Bei extrazellulären Enzymen des humanpathogenen Keims wurde allerdings bisher verstärkt die Verwertung von Komponenten des Wirtsgewebes oder Immunsystems untersucht,

1 Einleitung

30

um den Einfluss der Enzyme auf die Virulenz von P. aeruginosa nachzuweisen. Bisher völlig ungeklärt blieb der Einfluss von extrazellulären Enzymen auf die Entwicklung, d. h. auf den Aufbau, den Erhalt und den Abbau von Biofilmen. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich das mucoide Umweltisolat P. aeruginosa SG81 verwendet, das sich durch eine Überproduktion des extrazellulären Polysaccharids Alginat auszeichnet. Alginate stellen bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa eine Hauptkomponente der EPS dar und werden als maßgeblich für die Stabilität von Biofilmen dieser Bakterien angesehen (Davies, 1999; Körstgens et al., 2001b). 1. 5 Zielsetzung In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von extrazellulären Enzymen auf die Biofilmentwicklung und –struktur, wie auch auf die Eigenschaften von Biofilmen untersucht werden. Die Schwerpunkte wurden dabei wie folgt gesetzt:

• Nachweis von extrazellulären Enzym-Aktivitäten im Biofilm. Als Beispiele sollten Hydrolasen dienen, deren Biosynthese und Sekretion in planktonischen Kulturen von P. aeruginosa umfassend charakterisiert sind. Hierbei handelt es sich um eine Esterase, Lipasen, Phospholipasen C, Phosphatasen, Proteasen. Bei diesen Untersuchungen sollte als Hauptparameter das Biofilmalter dienen, die Produktion der Enzyme also in den verschiedenen Phasen der Biofilmentwicklung quantitativ verfolgt werden.

• Da ein entscheidendes Charakteristikum eines Biofilms die räumliche Struktur ist, die

entweder eine physiologische Differenzierung der Mikroorganismen nach sich zieht oder sogar bedingt, erschien eine räumliche Verteilung innerhalb der Biofilmmatrix auch für sekretierte Enzyme vorstellbar. Daher sollte anhand von mikroskopischen Untersuchungen in Kombination mit fluorigenen Modellsubstraten die Lokalisation extrazellulärer Enzyme im Biofilm untersucht werden.

• Parallel dazu sollte mit in vitro Experimenten der Nachweis von Wechselwirkungen

zwischen extrazellulären Enzymen und anderen EPS-Molekülen, wie Polysaccharide und Lipopolysaccharide geführt werden.

• Durch die Verwendung von Enzym-Defekt-Mutanten und Enzym-Überexpressions-

Stämmen, abgeleitet von mucoiden Stamm P. aeruginosa SG81, sollte der Einfluss von extrazellulären Enzymen auf die Biofilmentwicklung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden, wobei das Interesse auf folgenden Punkten lag

o Aufbau, Erhalt, und Abbau von Biofilmen o Biofilmstruktur o biochemische und physiko-chemische Charakterisierung der EPS

• Zudem sollten mittels Reportergen-Fusionen Untersuchungen zur transkriptionellen

Regulation von Strukturgenen extrazellulärer Enzyme während der Biofilmentwicklung durchgeführt werden, um einen Hinweis auf mögliche Regulationsmechanismen zu erhalten.

2 Material

31

2 MATERIAL 2.1 Bakterienstämme Tabelle 3: Genotypen bzw. Phänotypen der verwendeten Bakterienstämme. Die Bezeichnungen der Genotypen entsprechen der allgemeinen Nomenklatur für E. coli (Bachmann, 1983) und für P. aeruginosa (Holloway und Matsumoto, 1984)

Stamm Genotyp/Phänotyp Referenz

Escherichia coli DH5α

Φ80∆lacZ∆M15 rec A1 endA1 gryA96 thi-1 hsdR17 (rK

- mK+) supE44 relA1 deoR

∆(lacZYA-argF) U196

Hanahan et al., 1983

Escherichia coli JM109

F´ traD36 lacIq ∆(lacZ)M15 proA+B+/e14-

(McrA-) ∆(lac-proAB) thi gyrA96 (Na1r) endA1 hsdR17 (rK

- mK+) relA1 supE44

recA1

Yanisch-Perron et al., 1985

Escherichia coli S17-1

thi pro hsdR-M- mit chromosomal integriertem [RP4-2 Tc::Mu:Kmr::Tn7, Tra+ Trir Strr]

Simon et al., 1983

Agrobacterium tumefaciens NTL4

traI-lacZ Fusion, Gmr (pZLR4) Reporter-Stamm für N-Acyl-L-Homoserinlactone

Fuqua und Winans, 1996

Pseudomonas aeruginosa PAO1

nicht-mucoider Wildtyp Holloway et al., 1979

Pseudomonas aeruginosa SG81

mucoides Umweltisolat aus einem Biofilm eines technischen Wassersystems (Fleischzerlegebetrieb, Duisburg)

Grobe et al., 1994

Pseudomonas aeruginosa SG81R1

spontane nicht-mucoide Revertante, abgeleitet vom Stamm SG81

Grobe et al., 1994

Pseudomonas aeruginosa FRD1

mucoides Isolat aus dem Sputum eines CF-Patienten

Ohman und Chakrabarty, 1981

Pseudomonas aeruginosa FRD1153

mucoid, abgeleitet vom Stamm FRD1 Mutation im algJ3-Gen; Defekt in der O-Acetylierung von Alginat

Franklin und Ohman, 1993, 1996

Pseudomonas aeruginosa SG81∆LAH

∆(2/3 lipA 1/5 lipH)::Ω-Gmr

Deletion in den Genen lipA und lipH

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81∆LAH(pBBL7)

∆(2/3 lipA 1/5 lipH)::Ω-Gmr

pBBL7 Deletion in den Genen lipA und lipH, komplementiert in trans mit pBBL7

diese Arbeit

2 Material

32

Tabelle 3 (Fortsetzung): Genotypen bzw. Phänotypen der verwendeten Bakterienstämme.

Stamm Genotyp/Phänotyp Referenz

Pseudomonas aeruginosa SG81MCS

pBB1MCS Leervektorkontrolle

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81LCH

pBBLCH Überexpression lipC und lipH

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81LAH

pBBL7 Überexpression lipA

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81EA

pBBLX+ Überexpression estA

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81pMMB

pMMB67EH Leervektorkontrolle

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81lasB

pSAK5 Überexpression lasB

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81 PlipA::gfp

pSWgfp::PlipA

gfp-Reporterfusion mit Promotor von lipA

diese Arbeit

Pseudomonas aeruginosa SG81 PestA::gfp

pSWgfp::PestA

gfp-Reporterfusion mit Promotor von estA

diese Arbeit

2.2 Plasmide Tabelle 4: Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Vektoren.

Vektoren für E. coli Genetische Eigenschaften Referenz

pME3087 ColE1, oriT, mob, tetA, tetR Voisard et al., 1994 pSUP202 ColE1, mob, Ampr, Cmr, Tcr Simon et al., 1983 pRK2013 ColE1, Tra [RKs]+, Kmr Figurski und Helinski,

1979 pWKR202 pACYC177-Derivat, Gmr, Kmr Klipp, Ruhr-Universität

Bochum, Deutschland pBSL142 pBluescript-Derivat, MCS, Gmr, Ampr Alexeyev, 1995

Vektoren mit weitem Wirtsbereich

Genetische Eigenschaften Referenz

pBBR1MCS lacZα, Plac, Pt7, Cmr, mob Kovach et al., 1994 pMMB67EH IncQ, lacIq, Ptac, rrnB, Ampr, mob Fürste et al., 1986 pSWgfp

7,0 kbp, Ampr, ori1600, oriT, promotorloses gfp-Reportergen

Wilhelm, IMET, Jülich Deutschland

2 Material

33

Tabelle 4 (Fortsetzung): Übersicht der in dieser Arbeit rekombinanten Plasmide.

rekombinante Plasmide Genetische Eigenschaften Referenz

pSUP202estA∆Mlu ca. 2,8 kbp XhoI-Fragment mit ∆estA (ca. 0,8 kbp MluI-Deletion) über SalI in pSUP202

Wilhelm et al., 1999

pSUP202estA∆Mlu::Gmr ca. 2,6 kbp BamHI-Fragment aus pWKR202 (Gmr) über BglII in pSUP202estA∆Mlu

diese Arbeit

pSUP202lipC::Gmr ca. 1,2 kbp BamHI/HindIII-Fragment mit ∆lipC in pSUP202 2,6 kbp SalI-Fragment (Gmr) aus pWRK202 in pSUP202lipC

Friedrich, 2001

pME∆AH11 ca. 2,06 kbp KpnI/XbaI-Fragment mit ∆(2/3 lipA 1/5 lipH) in pME3087

Schneidinger, 1997

pME∆AH::Ω-Gmr ca. 1,6 kbp SmaI-Fragment aus pBSL142 (Ω-Gmr) über StyI in pME∆AH11

diese Arbeit

pBBLCH pBBLCAH ∆lipA (BamHI/PpuMI-Deletion) lipC/lipH Plac (PT7) kontrolliert

Heckmann, 2001

pBBL7 ca. 2,8 kbp XmnI/SmaI-Fragment mit lipAH-Operon in pBBR1MCS Plac kontrolliert

Düfel, 1995

pBBX+ ca. 3,3 kbp XhoI-Fragment mit estA in pBBR1MCS Plac kontrolliert

Wilhelm et al., 1997

pSAK5 ca. 2,7 kbp EcoRI/HindIII-Fragment mit lasB in pMMB67HE Ptac kontrolliert

Kamath et al., 1998

pSWgfp::PlipA

ca. 1,0 kbp Fragment mit Promotor von lipA gfp PlipA kontrolliert

Wilhelm, IMET, Jülich, Deutschland

pSWgfp::PestA

ca. 1,0 kbp Fragment mit Promotor von estA gfp PestA kontrolliert

Wilhelm, IMET, Jülich, Deutschland

2.3 Oligonukleotide Die synthetischen Oligonukleotide wurden von der Fa. Interactiva Biotechnologie (Ulm) in HPLC-gereinigter, lyophilisierter Form bezogen. Sie wurden in dem vom Hersteller angegebenen Volumen A. dest. aufgenommen, so dass sie in einer Konzentration von 100 pmol/µl vorlagen. Tabelle 5: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide („Primer“). Bezeichnung Nukleotidsequenz (5´ 3´) Tm

(°C) Länge (bp)

LipCup 5´-GTA ATG GCG TGC GCC GGG AGC CCA-3´ 60,2 24 LipCdwn 5´-CGC GAA CAG GAG GTG ATA TCC AGG-3´ 58,4 24 Gmup 5´-GCA GCC GCG TAG TGA GAT CTA TAT CTA TG-3´ 65,7 29 Gmdwn 5´-GCC GGA GAC TGC GAG ATC ATA GAT ATA G-3´ 63,9 28 EstAup 5´-AAT GAT CAG AAT GGC GCT CAA GC-3´ 59,2 23 EstAdwn 5´-TTT CAG AAG TCC AGG CTC AGC GC-3´ 61,6 23 LipAup 5´-GAA TTC ACA TAT GAA GAA GAA GTC TC-3´ 49,7 26 LipAdwn 5´-GCT AAG GAT CCT CTT CAC GCG AGG GGG CTT-3´ 72,6 31

2 Material

34

2.4 Nährmedien 2.4.1 Allgemeine Nährmedien modifiziertes „Alginate-Promoting“ Medium (mAPM, nach Ohman und Chakrabarty, 1981) Lösung 1: 21,81 g Natrium-D-Gluconat (Sigma) ad 100 ml A. deion. (Endkonzentration: 100 mM) Lösung 2: 10,11 g Kaliumnitrat (Sigma) ad 100 ml A. deion. (Endkonzentration: 100 mM) Lösung 3: 2,46 g MgSO4 x 7 H2O ad 50 ml A. deion. (Endkonzentration: 10 mM) Lösung 4: 1,03 g NaH2PO4 x H2O und 2,93 g K2HPO4 ad 750 ml A. deion. (Endkonzentrationen: 7,5 mM und 16,8 mM) Die Lösungen wurden getrennt voneinander autoklaviert. Zur Herstellung von 100 ml APM wurden 10 ml Lösung 1, 10 ml Lösung 2, 5 ml Lösung 3 und 75 ml Lösung 4 zusammen gegeben. Der pH-Wert des Mediums betrug 7,05. Für die Anzucht von Biofilmen unter kontinuierlichen Bedingungen in Durchflusszellen (3.1.2.2) wurde die Lösungen 1 bis 3 1:10 verdünnt eingesetzt, das Puffersystem (Lösung 4) blieb unverändert. LB-Medium 10 g Trypton (Difco), 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt (Merck) ad 1 l A. deion. Der pH-Wert des Mediums betrug 7,0. LB-Agar 10 g Trypton (Difco), 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt (Merck), 15 g Bacto-Agar (Difco) ad 1 l A. deion. Der pH-Wert des Agrarnährmediums betrug 7,0. Nähr-Agar (NB-Agar) 8 g Nährbouillon (Difco), 5 g NaCl, 15 g Bacto-Agar (Difco) ad 1 l A. deion. Der pH-Wert des Agarnährmediums betrug 7,0. Pseudomonas-Isolierungs-Agar (PIA) 20 g Bacto-Pepton, 1,4 g MgCl2 x 6 H2O, 10 g K2SO4, 13,6 g Bacto-Agar, 0,025 g Irgasan DP 300, 25,2 g Glycerin (Merck) 45 g des Fertiggranulates (Difco) wurden in 980 ml A. deion. gelöst und mit 25,2 g Glycerin (Merck) versetzt. Der pH-Wert des Agarnährmediums betrug 7,0. Pseudomonas-Isolierungs-Agar mit 0,1 M CaCl2 (Ca-PIA) 45 g des PIA Fertiggranulates (Difco) wurden mit 25,2 g Glycerin (Merck) versetzt und in 880 ml A. deion. gelöst. 4,7 g CaCl2 x 2 H2O (Merck) wurden in 100 ml A. deion gelöst. Beide Komponenten wurden getrennt voneinander autoklaviert und nach Abkühlung auf 50 °C zusammen gegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0,1 M Ca2+- im Agarnährmedium erreicht wurde. Der pH-Wert des Agarnährmediums betrug 7,0.

2 Material

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Pseudomonas-Isolierungs-Agar mit 7 mM PO43- (PO4-PIA)

Zu 45 g des Fertiggranulates (Difco) wurden 1,25 g Na2HPO4 x 2 H2O (Merck) gegeben (Endkonzentration 7 mM PO4

3-). Die Komponenten wurden in 980 ml A. deion. gelöst und mit 25,2 g Glycerin (Merck) versetzt. Der pH-Wert des Agarnährmediums betrug 7,0. Alle Nährmedien wurden für 20 min bei 121 °C und 200 kPa autoklaviert. Die sterilisierten Agar-Medien wurden zu je 25 ml in sterile Plastikpetrischalen gegossen und bis zum Gebrauch (maximal 4 Wochen) bei 4 °C aufbewahrt. Für Agarplatten die zur Anzucht von konfluenten Bakterienrasen genutzt wurden, wurden Petrischalen mit Nocken im Deckel verwendet, um eine optimale Belüftung der Kultur während der Bebrütung zu gewährleisten. Um auf plasmid- oder genomkodierte Resistenzen zu selektionieren, wurden den Medien die entsprechenden Antibiotika in den in Tabelle 13 angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Die thermolabilen Antibiotika wurden zuvor mittels Membranfilter (Celluloseacetat, Porendurchmesser 0,2 µm) sterilfiltriert und dem autoklavierten Medium nach Abkühlung auf 60 °C zugesetzt. 2.4.2 Test-Nährmedien • Substratagarplatten zur Bestimmung von Enzymaktivitäten FDA-Agar (Küpper et al., 1999) Lösung 1: NB-Agar, pH 7,0 mit 5 g Aktivkohle (Sigma) Lösung 2: 41,64 mg Fluoresceindiacetat (FDA, Serva) wurden in 5 ml Aceton gelöst Zu 1 l autoklavierter und auf 50 °C abgekühlter Lösung 1 wurden unter Rühren 5 ml Lösung 2 (20 mM FDA) gegeben und das Medium anschließend zu 20 ml in Petrischalen gegossen und bis zur Verwendung, aber nicht länger als zwei Wochen, bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt. Rhodamin B Agar (Kouker und Jaeger, 1987) Lösung 1: NB-Agar, pH 7,0 Lösung 2: gereinigtes Olivenöl (Sigma), sterilfiltriert Lösung 3: Rhodamin B-Lösung (Sigma; 1 mg/ml A. dest), sterilfiltriert 7,5 ml Lösung und 2,5 ml Lösung 3 wurden zu 245 ml autoklavierten und auf 60 °C abgekühlten NB-Agar gegeben (Triolein-Endkonzentration: 0,25 mM). Anschließend wurde das Gemisch 1 min mit dem Ultra-Turrax homogenisiert. Nach 10 min Inkubation bei 60 °C wurde das Test-Nährmedium zu 20 ml in Petrischalen gegossen bis zur Verwendung, aber nicht länger als 2 Wochen, bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt. Magermilch-Agar Lösung 1: NB-Agar, pH 7,0 Lösung 2: 10 % (w/v) Magermilchpulver (Difco) in A. deion. Die beiden Lösungen wurden getrennt voneinander autoklaviert und nach Abkühlen auf 60 °C unter leichtem Rühren zu gleichen Teilen zusammen gegeben. Das Test-Nährmedium wurde zu 20 ml in Petrischalen gegossen und bis zur Verwendung, aber nicht länger als 2 Wochen, bei 4 °C aufbewahrt.

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• Medien zur Bestimmung von Beweglichkeiten M9-Medium (Sambrock et al., 1989): Lösung 1: 40 g D-Glucose (Merck) ad 1 l A. deion. Lösung 2: 20 g MgSO4 x 7 H2O ad 1 l A. deion. Lösung 3: 2 g CaCl2 x 2 H2O ad 1 l A. deion. Lösung 4: 70 g Na2HPO4 x 2 H2O; 30 g KH2PO4; 5 g NaCl; 10 g NH4Cl ad 1 l A. deion. Lösung 5: 2 % (w/v) Bacto-Agar (Difco) in A. deion. Lösung 6: 5 % (w/v) Natriumglutamat Die Lösungen wurden getrennt voneinander autoklaviert und nach dem Abkühlen auf 60 °C im Wasserbad in folgenden Volumina (Tabelle 6) zusammen gegeben und abschließend zu 20 ml in Petrischalen gegossen. Die semisoliden Agarplatten wurden jeweils frisch angesetzt. Tabelle 6: Pipettierschema für die Herstellung von 450 ml Beweglichkeits-Testmedium. Lösung Nr. Schwärmagar

(0,5 % Agar) Schwimmagar (0,3% Agar)

1 45,0 ml 45,0 ml 2 4,5 ml 4,5 ml 3 4,5 ml 4,5 ml 4 45 ml (ohne NH4Cl) 45,0 ml (mit NH4Cl) 5 112,5 ml 67,5 ml 6 4,5 ml - A. deion. 234,0 ml 283,5 ml

• Medium zur Anzucht des Signalmolekül-Indikators Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens-Glucose-Minimal-Salz-Medium (ATG-Medium) Lösung 1: 2,0 g NH4Cl, 0,6 g MgSO4 x 7 H2O, 0,3 g KCl, 20 mg CaCl2, 5 mg FeSO4 x 7 H2O ad. 100 ml A. dest. Lösung 2: 6,0 g K2HPO4, 2,3 g NaH2PO4 ad. 100 ml A. dest. Lösung 3: 10 % (w/v) D-Glucose (Merck) in A. dest. Lösung 4: 2 % (w/v) Bacto-Agar (Difco) in A. dest. Lösung 5: 2 % (w/v) X-Gal in DMSO Alle Komponenten wurden getrennt voneinander autoklaviert. Zur Herstellung von 100 ml ATG-Medium wurden nach dem Abkühlen auf 60 °C 5 ml Lösung 1 mit 5 ml Lösung 2 und 2 ml Lösung 3 zusammengegeben und anschließend mit 88 ml sterilem A. dest. versetzt.Zur Herstellung von ABG-Agarplatten wurden 25 ml eines 4-fach angesetzten ABG-Mediums mit 75 ml 2 %iger Agar-Lösung zusammen gegeben und zu 10 ml in Petrischalen gegossen. Für die Vorkulturen wurden die Medien mit 30 µg/ml Gentamycin versetzt.

2 Material

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2.5 Puffer und Lösungen Tabelle 7: Übersicht über die in der Arbeit verwendeten Puffer und Lösungen.

Bezeichnung pH-Wert Zusammensetzung Menge auf 1 l

ES-Lösung 7,5 – 8,0 500 mM Na2-EDTA 0,5 % (w/v) N-Lauroylsarkosin

186,1 g5,0 g

0,14 M Kochsalzlösung NaCl 8,18 g

Mg2+-Mix 500 mM MgCl2 x 6 H2O

500 mM Mg2SO4 x 7 H2O 101,7 g123,2 g

1 mM Natrium-Acetat-Puffer 4,5 Natrium-Acetat 82,03 mg

50 mM Natrium-Phosphat-Puffer

7,0 7,5

NaH2PO4 x 2 H2O 7,8 g

mit 1 mM Na2-EDTA 7,0 + Na2-EDTA 0,372 g

10 mM Phosphat-Puffer 7,0 KH2PO4

Na2HPO4 x 2 H2O 0,31 g 1,37 g

mit 0,2 M NaCl 7,0 + NaCl 11,7 g

PUM-Puffer 7,1 K2HPO4 x 3 H2O KH2PO4 Harnstoff MgSO4 x 6 H2O

22,2 g7,26 g

1,8 g0,2 g

SE-Puffer 7,5 – 8,0 75 mM NaCl 25 mM Na2-EDTA

4,38 g9,31 g

0,05 M Sørensen-Phosphat-Puffer

8,0 Lösung 1: Na2HPO4 x 2 H2O. Lösung 2: KH2PO4

8,9 g6,8 g

Kurz vor Gebrauch werden 94,5 ml der Lösung 1 und 5,5 ml der Lösung 2 zusammen gegeben

10 mM Tris-HCl-Puffer 8,0 Tris 1,21 g

mit 2 mM MgCl2 8,0 + MgCl2 x 6 H2O 0,407 g

30 mM Tris-HCl-Puffer mit 3 mM MgCl2 7,5 Tris MgCl2 x 6 H2O

3,64 g0,61 g

50 mM Tris-HCl-Puffer

7,0 7,5

Tris 6,06 g

mit 2 mM MgCl2 7,5 + MgCl2 x 6 H2O 0,407 g

100 mM Tris-HCl-Puffer 7,5 10,0

Tris 12,11 g

10 mM MgCl2 10,0 + MgCl2 x 6 H2O 2,03 g

250 mM Tris-HCl-Puffer 7,2 Tris 30,3 g

1 M Tris-HCl-Puffer

7,5 8,0

Tris 121,14 g

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Tabelle 7 (Fortsetzung): Übersicht über die in der Arbeit verwendeten Puffer und Lösungen.

Bezeichnung pH-Wert Zusammensetzung Menge auf 1 l

TBE-Puffer 8,3 90 mM Tris 90 mM Borsäure 2,5 mM Na2-EDTA

10,9 g5,56 g0,93 g

Es wurde eine 20-fache Stammlösung hergestellt und bei Bedarf entsprechend mit A. dest. verdünnt.

TE-Puffer 7,5 – 8,0 10 mM Tris 1 mM Na2-EDTA

1,21 g0,372 g

Transformationspuffer (TMF) 100 mM CaCl2 50 mM RbCl2 40 mM MnCl2

11,1 g6,05 g5,03 g

Die pH-Werte der Puffer wurden mit 1,0 M HCl oder 0,5 M NaOH auf den jeweiligen Wert eingestellt. Alle Puffer wurden 20 min bei 121°C autoklaviert und maximal 1 Monat bei 4 °C aufbewahrt. 2.6 Polysaccharide Tabelle 9: verwendete Polysaccharide und Lipopolysacharide Name Herkunft Bezugsquelle Best.-Nr.

Algenalginat Manucol LHF

Braunalgen, Natrium-Salz NutraSweet Kelco Company

-

Bakterienalginate gereinigt aus P. aeruginosa SG81, FRD1 und FRD1153

- -

Dextran Leuconostoc mesenteroides, mittlere Molekularmasse 5 - 40 x 106

Da Sigma D-5501

Blue Dextran 2000 Leuconostoc mesenteroides, 2 x 106 Da Sigma D-5751 Dextran Leuconostoc mesenteroides, 2,0 x 106 Da Sigma D-5376 Dextran Leuconostoc mesenteroides, 2,5 x 105 Da Pharmacia T250 Dextran Leuconostoc mesenteroides, 1,1 x 105 Da Pharmacia T110 Dextran Leuconostoc mesenteroides, 4,0 x 104 Da Pharmacia T40 Dextran Leuconostoc mesenteroides, 2,0 x 104 Da Pharmacia T20 Dextran Leuconostoc mesenteroides, 1,05 x 104 Da Sigma D-9260 Hyaluronsäure Streptococcus zooepidemicus Sigma H-9390 Levan Erwinia herbicola Fluka 62085 Lipopolysaccharid P. aeruginosa, Serotyp 10 Sigma L-9143 Lipopolysaccharid gereinigt aus P. aeruginosa SG81 - - Xanthan Xanthomonas campestris Sigma G-1253

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2.7 Proteine und Enzyme Tabelle 8: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Proteine und Enzyme. Name Herkunft Bezugsquelle Best.-Nr.

Benzonase, Reinheitsgrad 1 (rekombinant)

Serratia marcescens Merck 101694

Desoxyribonuklease I Rinderpankreas Sigma D-5025 Elastase B 33 kDa; aus P. aeruginosa CalBiochem 324676 Esterase Schweinepankreas Sigma E-3019 Esterase (EstA) teilgereinigt aus P. aeruginosa

PAO1estA+ zur Verfügung gestellt von Prof. Jaeger, IMET Jülich

Lipase Pseudomonas sp. Sigma L-9518 Lipase (LipA) gereinigt aus P. aeruginosa

PAO1lipA+ zur Verfügung gestellt von Prof. Jaeger, IMET Jülich

Lysozym Hühnereiweiss Sigma L 7651 Pronase E Streptomyces griseus Sigma P-6911 Proteinase K Tritirachium album Sigma

Gibco BRL P-6556 25530-015

Restriktionsendonukleasen - BglII - BamHI - EcoR1 - HindIII - SmaI - Spe I - StyI - XhoI

Bacillus globigii Bacillus amyloliquefaciens Escherichia coli Haemophilus influenzae Rd Serratia marcescens Sb Sphaerotilus sp. Escherichia coli mit pST27 Xanthomonas holcicola

New England Biolabs

R0144L R0136L R0101L R0104L R0141L R0133L R0500L R0146L

Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, 96-99% Albumin Sigma A-4503 Rinderserumalbumin (BSA) molecular biology grade Fermantas B14 Ribonuklease A Rinderpankreas Sigma R-4875 Taq-Polymerase Thermus aquaticus Fermentas EP0282 T4-DNA-Ligase T4-infected Escherichia coli Fermentas EL0011 T4-DNA-Polymerase Escherichia coli Fermentas LP0061

Die zugehörigen Enzym-Reaktionspuffer wurden von den Firmen Fermentas, Quiagen oder New England Biolabs bezogen.

2 Material

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2.8 Chemikalien Tabelle 10: Substrate und Farbstoffe für die Mikroskopie und die Bestimmung von Enzym-Aktivitäten Substanzname Summenformel Mol.-

Gew. Bezugsquelle Best.-Nr.

Sulfanilamide Azocasein - - Sigma A-2765 ELF-Acetat C16H10Cl2N2O3 349,2 Molecular Probes E-6580 ELF-97-Palmitat C30H38Cl2N2O3 545,5 Molecular Probes E-6583 ELF-97-Phosphat C14H7Cl2N2O5P 431,1 Molecular Probes E-6588 Fluoresceindiacetat, 5x krist. C24H16O7 416,4 Serva 21575 Elastin-Kongorot - - Sigma E-0502 4-Methylumbelliferyl-Acetat (MUF-Acetat)

C12H10O4 218,2 Sigma M-0883

4-Methylumbelliferyl-Palmitat (MUF-Palmitat)

C26H38O4 414,6 Sigma M-7259

4-Methylumbelliferyl-Phosphat (MUF-Phosphat)

C10H9O6P 256,2 Sigma M-8883

p-Nitropenylacetat C8H7NO4 181,1 Sigma N-8130 p-Nitropenylpalmitat C22H35NO4 377,5 Sigma N-2752 p-Nitrophenylphosphat C6H4NO6PNa2 x 6H2O 371,1 Serva 30770 p-Nitrophenylphosphorylcholin C11H17N2O6P 304,2 Sigma N-5879 Rhodamin B C28H31ClN2O3 479,0 Sigma R-6626 SYTO 9 - - Molecular Probes S-34854 SYTO 62 - - Molecular Probes S-11344

Tabelle 11: Allgemeine Chemikalien und Antibiotika. Substanzname Mol.-Gew. Bezugsquelle Best.-Nr.

Acetylcholinchlorid 181,7 Sigma A-6625 Adenosin-5´-triphosphat-Dinatriumsalz (ATP) 551,1 Gibco BRL 18330-019 Agarose - Gibco BRL 15510-027 Agarose Low Melting Agarose - Gibco BRL 15517-022 Aktivkohle - Sigma C-4386 Ampicillin krist. 403,7 Serva 13397 Bromphenolblau, Natriumsalz 692,0 Serva 15375.01 Carbenicillin, Disodium salt 422,4 Sigma C-1389 Chloramphenicol 323,1 Sigma C-0378 Chloroform p.A. 119,38 Fluka 25690 Dimethylsulfoxid (DMSO) 78,13 Aldrich 47,230-1 DNA-Molekulargewichtsstandard 1 kb ladder Gibco BRL 15615-024 dNTP-Mix (10 mM) - Gibco BRL 18427-013 Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz-Dihydrat (Na2-EDTA)

372,24 Merck 108418

Eisen-(III)-chlorid-Hexadyrat 270,32 Merck 103943 Essigsäureanhydrid, z. A. 102,09 Merck 100042

2 Material

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Tabelle 11 (Fortsetzung): Allgemeine Chemikalien und Antibiotika. Substanzname Mol.-Gew. Bezugsquelle Best.-Nr.

Ethidiumbromid (500 µg/ml) 394,3 Sigma E-1385 Fluorescein-Natrium 376,28 Merck 103992 Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz - Sigma F-9252 Gentamycin Sulfat 674 U/mg Sigma G-1264 D-Gluconic Acid, Sodium salt 218,1 Sigma G-9005 L-Glutamic Acid, Monosodium salt 169,1 Sigma G-1626 Glycerin p.A. 92,1 Fluka 49770 Gum arabic - Sigma G-9752 Harnstoff 60,06 Fluka 51456 n-Hexadekan 226,45 Merck 8.20633 3-Hydroxybiphenyl 170,2 Sigma H-6527 Irgasan DP-300 - Ciba-Geigy James Reagenz - bioMérieux 70540 Kaliumnitrat 101,11 Merck 1.05063.0500 Kanamycin-Sulfat 600,6 Sigma K-4000 Kristallviolett 407,99 Merck 15940 Lambda Ladder PFG Marker - New England Biolabs NO340S N-Lauroylsarkosin, Sodium salt 293,4 Sigma L-5777 2-Mercaptoethanol 78,13 Sigma M-7154 4-Methylumbelliferone 176,2 Sigma M-1381 di-Natriumtetraborat-Decahydrat z.A. 381,37 Fluka 72000 di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat z.A. 177,99 Merck 106580 Natriumdodecylsulfat (SDS) 288,38 Merck 113760 Natriumazid, z.A. 65,01 Merck 106688 Natrium-Desoxycholat 414,57 Merck 106504 Natrium(meta)arsenit 129,91 Fluka 71287 p-Nitrophenol 139,1 Sigma 104-8 Olivenöl - Sigma O-1500 Perjodsäure 227,9 Sigma P-0430 Phenol, z. A. 94,11 Fluka 77610 Pefabloc2 SC (AEBSF) 100 mM 1 ml Boehringer Mannheim 1429868 2-Propanol 60,10 Baker 8067 Protein-Molekulargewichtsstandard Mark 12 Invitrogen LC5677 Prestained SDS Molecular Weight Marker MWM-105A Sigma SDS-7B Sulfamaminsäure 97,09 Sigma S-6771 Tetracyclin - Sigma T-7660 Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, z.A. 121,14 Merck 108382 2-Thiobarbitursäure (TBA) 144,15 Fluka 88481 Triton X-100 - Sigma T-8787

Die hier nicht erwähnten Chemikalien wurden von den Firmen Merck, Riedel-de Haen, Serva und Sigma im höchstmöglichen Reinheitsgrad bezogen.

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2.9 Kommerzielle Reaktions- und Nachweis-Kits Bei der Verwendung von Reaktions- und Nachweis-Kits wurde jeweils nach dem vom Hersteller mitgelieferten Protokoll verfahren. Tabelle 12: Verwendete Reaktions- und Nachweis-Kits Kommerzielles Kit Bezugsquelle Best.-Nr.

api20 NE bioMérieux 20 050 API ZYM System bioMérieux 25 200 DNeasy Tissue Kit Qiagen 69504 HMW Gel Filtration Calibration Kit Amersham Pharmacia Biotech

UK Limited 17-0441-01

Nucleo Spin Extrakt 2 in 1Kit Macherey-Nagel 740952.250 HiSpeed Plasmid Midi Kit Qiagen 12643 Protein Assay Lowry Sigma P-5656 Simply BlueTM Safe Stain (Coomassie G-250) Invitrogen LC 6060 SilverStain Express Invitrogen LC 6100

2.10 Geräte Elektrophoreseapparatur Fa. Cosmo Bio, LTD, Typ i-Mupid

Filmrheometer Universität Duisburg-Essen, Eigenbau (Körstgens et al., 2001) mit Analysenwaage Typ BP221S, Fa. Sartorius

Fluorimeter Fa. Kontron, Typ SFM 25

Fluoreszenzmikroskop Fa. Leica, Typ Laborlux S mit Filtersystem A (Anregungsfilter BP 340 – 380, Teilerspiegel RKP 400, Sperrfilter LP 430)

FT-IR-Spektrometer Fa. Bruker, Typ IFS 88

Gefriertrocknungsanlage Fa. Christ, Typ Alpha 1-2

Geldokumentations-System Fa. Bio-Rad, Densitometer Typ GS-710, Computerprogramm Quantity One V.4.1.0, Bio-Rad

Inkubationsrundschüttler Fa. New Brunswick Scientific Co. Inc., Typ Innova 4230

Inkubations-Roller Ruhr-Universität Bochum, Eigenbau

Kapillar-Viskosimeter Fa. Schott, Mikro-KPG-Ubbelohde-Viskosimeter, Kapillare Ι, Typ 53610

Konfokales Laser-Scanning Mikroskop Fa. Zeiss, inverses Mikroskop Axiovert 100 M BP mit Laser-Scanning Modul LSM 510

2 Material

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Kühlbrutschrank Fa. Memmert, Typ GTR0214

Kühlzentrifuge Fa. Kendro, Typ Sorvall RC26 Plus, Rotoren: SS34/GSA/GS3

Mikrotiterplatten-Lesegerät Fa. Dynex Tech., Typ MRX-TC Revelation

PCR-Automat Fa. Eppendorf, Typ Mastercycler Gradient

Phasenkontrastmikroskop Fa. Leica, Typ Laborlux S

pH-Meter Fa. WTW, Typ Multi Cal pH540 GLP

Pulsfeldgelelektrophorese-Apperatur Fa. Bio-Rad, Typ CHEFTM Mapper XA Chiller System

Rotations-Vakuumkonzentrator Fa. Christ, Typ RVC 2-25 mit Kühlfalle Typ CT 02-50

Rundschüttelwasserbad Fa. New Brunswick Scientific Co. Inc., Typ G76

Rundschüttler Fa. New Brunswick Scientific Co. Inc.,Typ G10

Säulenchromatographie-Apperatur Fa. Amersham Bioscience, Fraktionssammler Typ FRAC-100 und Pumpe Typ P-1

Schütteltisch Fa. Biometra, Typ Rocking Platform

und Fa. Heidolpf, Typ Duomax 1030

Schüttelwasserbad Fa. Köttermann, Typ GFL

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese- Fa. Biometra Elektrophoreskammer, Apperatur Typ G42 für Minigele und Power Supply Fa. Biometra, Typ Power Pack P25

Thermostat Fa. Haake, Typ DC-1 mit Kühlbad Typ K20

Thermoblock Fa. Techne, Typ Ori-Block DB-1

Thermomixer Fa. Eppendorf, Typ comfort

Tisch-Zentrifuge Fa. Eppendorf, Typ 5415 und

Fa. Heraeus, Typ Biofuge fresco

Ultraschall-Desintegrator Fa. Branson, Typ Sonifier 250

Ultra-Turrax T25 Fa. Janke und Kunkel, IKA Labortechnik

Ultrazentrifuge Fa. Beckmann, Typ. U8 – 70, Rotor: Ti70

UV/VIS-Photometer Fa. Shimadzui, Typ UV-1202

Videodokumentationssystem Fa. MWG-Biotech, TypGelPrint 2000i mit Thermoprinter, Typ UP-D860E, Fa. Sony und TV Zoom lens Typ S6X11-II, Fa. Rainbow

Die im Labor üblichen Geräte wurden hier nicht aufgeführt.

2 Material

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2.11 Computer Software und Datenbanken Die Auswertung der api 20 NE-Teststreifen (bioMérieux) zur Identifizierug von Pseudomonaden erfolgte mit dem Programm apiLAB Plus (Datenbank-Version: V 6.0 api 20NE) Die Erstellung von Klonierungsstrategien erfolgte unter Verwendung der Programme “Clone Manager for Windows 4.1” (Scientific und Educational Software) und “Plasmid Map Enhancer for Windows95, Version 3.0” (Scientific und Educational Software). Zur Durchführung von Homologievergleichen wurde das DNASTARTM-Programmpaket (Lasergene) verwendet. Für Sequenz- und Datenbankrecherchen im Internet wurden folgende Adressen verwendet: “National Center for Biotechnological Information” (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov “Pseudomonas Genome Projekt: http://www.pseudomonas.com

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3 METHODEN 3.1 Mikrobiologische Methoden 3.1.1 Stammhaltung der Bakterien Die Stammhaltung der verwendeten Bakterienstämme erfolgte mit Gefrierkulturen bei -80 °C. Dazu wurden LB-Kulturen in Gegenwart der entsprechenden Antibiotika (Tabelle 13) mindenstens 24 h bei 37 °C bebrütet. Je 1,3 ml dieser Kulturen wurden mit 0,1 ml DMSO vermischt und in Kryoröhrchen (Fa. Nalge Company) bei -80 °C maximal 1 Jahr gelagert. Arbeitsgefrierkulturen wurden entsprechend hergestellt und bei -20 °C gelagert und maximal dreimal aufgetaut. Zusätzlich zu den Gefrierkulturen wurden die in dieser Arbeit verwendeten P. aeruginosa-Stämme auf PIA mit der entsprechenden Konzentration an Antibiotika (Tabelle 13) gehalten. Dazu wurden je 50 µl LB-Übernachtkultur als Einzelkolonieausstrich auf dem Agar-Nährmedium inokuliert und für 24 h bei 36 °C bebrütet. Diese Arbeitsplatten wurden maximal eine Woche bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Anschließend wurden frische Arbeitsplatten hergestellt. 3.1.2 Anzucht der Bakterien Um auf plasmid- oder genomkodierte Resistenzen zu selektionieren, wurden die Medien bei einer Temperatur von ≤ 60 °C mit den entsprechenden Konzentrationen an Antibiotika (Tabelle 13) versetzt. Die thermolabilen Antibiotika wurden zuvor mittels Membranfilter (Celluloseacetat, Porendurchmesser 0,2 µm) sterilfiltriert. Tabelle 13: Endkonzentration der in dieser Arbeit verwendeten Antibiotika

Konzentration für P. aeruginosa (µg/ml) Antibiotikum Konzentration für E.coli (µg/ml) im Flüssigmedium im Agar

Ampicillin (Amp) 100 - - Carbenicillin (Cb) - 600 600 Chloramphenicol (Cm) 50 200 300 Gentamycin (Gm) 10 20 30 Kanamycin (Km) 50 - - Tetracyclin (Tc) 25 50 75

Für die molekularbiologischen Arbeiten wurden die E. coli und P. aeruginosa-Stämme bei 37 °C in LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika kultiviert. Kulturvolumina bis 5 ml wurden in Reagenzgläsern im Brutroller und in größeren Volumina in Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen: max.1/5 – 1/10 des Gefäßvolumens) bei 37 °C und 180 Upm im Schüttelwasserbad inkubiert. Übernachtkulturen wurden unter entsprechendem Selektionsdruck für mindestens 16 h inkubiert. Sie wurden entweder mit einer Einzelkolonie oder mit 1/100 Volumen aus einer Gefrierkultur inokuliert. Für die physiologischen und biochemischen Charakterisierungen der von P. aeruginosa SG81 abgeleiteten Enzymdefekt-Mutanten bzw. Enzym-Überexpressionsstämme wurden die Bakterienstämme, wenn nicht anders angegeben bei 36 °C in dem jeweiligen verwendeten Medium angezüchtet. Vorkulturen wurden immer mit der entsprechenden Konzentration an Antibiotika, Hauptkulturen ohne Antibiotika angezüchtet.

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3.1.2.1 Anzucht von Flüssigkulturen Vorkulturen Je 25 ml LB-Medium mit entsprechender Konzentration an Antibiotika (Tabelle 13) wurde mit 1/100 Volumen aus einer Gefrierkultur (Arbeitsgefrierkultur bei –20 °C) inokuliert und über Nacht bei 36 °C und 180 Upm bebrütet (= Vorkultur Nr.1). Die Zellzahl wurde mittels einer Thoma-Zählkammer im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Ausgehend von der Vorkultur Nr.1 wurden 25 ml LB-Medium bzw. mAPM (Medium entsprechend der Hauptkultur) mit entsprechender Konzentration an Antibiotika (Tabelle 13) auf eine Zellzahl von 1 x 106/ml Kultur angeimpft und bei 36 °C und 180 Upm für 24 h bebrütet (= Vorkultur Nr.2). Hauptkulturen Ausgehend von der Vorkultur Nr.2 wurden 25 ml mAPM bzw. LB-Medium in 100 ml Erlenmeyerkolben auf eine Zellzahl von 1 x 106/ml Kultur (Thoma-Zählkammer) angeimpft und bei 36 °C und 180 Upm bebrütet. Die Kulturen der verschiedenen P. aeruginosa-Stämme wurden zeitversetzt angeimpft, so dass eine kontinuierliche Beobachtung des Wuchsverhaltens möglich war. Zu jeder Stunde wurden 700 µl der Kulturen steril entnommen und die Zelldichte der Kulturen durch Trübungsmessung in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 580 nm gegen das entsprechende Medium bestimmt. Ab einer O.D.580 = 0,5 wurden die Kulturen zuvor 1:10 in steriler NaCl-Lösung verdünnt. Eine optische Dichte (O.D.580) von 1,0 entspricht einer Zellzahl von etwa 5 x 108 Zellen pro ml Kultur. Pro Stamm wurden jeweils zwei Kulturen parallel angezüchet und die Ergebnisse gemittelt (Doppelbestimmung). Zur Bestimmung der Wuchsrate wurde die Steigung der Wuchskurve in der logarithmischen Phase bestimmt (µ = ∆O.D.580/h). Zur Gewinnung von EPS-haltigen Überständen wurden die beiden entnommenen Kulturproben der Parallelbestimmung in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß vereinigt und 15 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde photometrisch auf Lipase- (3.5.3.3) und Protease-Aktivitäten (3.5.3.1) hin untersucht. Anschließend wurde der Überstand über Nacht gegen 2 x 5 l A. deion. dialysiert und der Uronsäure-Gehalt (3.4.3.1) in den Proben bestimmt. 3.1.2.2 Anzucht von Biofilmen Vorkulturen Ausgehend von den Vorkulturen Nr.1 (siehe oben) wurden Einzelkolonieausstriche auf PIA mit den entsprechenden Konzentrationen an Antibiotika (Tabelle 13) hergestellt und für 24 h bei 36 °C bebrütet. Anzucht von Agar-Biofilmen und Membranfilter-Biofilmen (MFB) Einige mucoide Einzelkolonien von der PIA-Vorkultur wurden in steriler NaCl-Lösung suspendiert und mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer auf eine Zellzahl von etwa 1 x 108 Zellen/ml eingestellt. Jeweils 100 µl dieser Suspension wurden auf eine PIA-Platte (Petrischalen mit

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Nocken) ausplattiert und für bis zu 7 Tage bei 36 °C bebrütet, um einen konfluenten Bakterienrasen zu erhalten. Für die Visualisierung von Enzymaktivitäten in situ und für einige biochemische Untersuchungen wurden Modellbiofilme der verschiedenen P. aeruginosa-Stämme auf der Oberfläche von Polycarbonat-Membranfiltern angezüchtet (Wingender et al., 2001). Dazu wurden einige mucoide Einzelkolonien von einer PIA-Vorkultur in steriler NaCl-Lösung suspendiert und auf eine Zellzahl von etwa 1 x 108 Zellen/ml eingestellt. Jeweils 100 µl dieser Suspension wurde auf die Oberfläche von schwarzen Polycarbonat-Membranfiltern (Millipore, Isopore HTBP; Durchmesser 2,5 cm, Porengröße 0,4 µm) vakuumfiltriert, anschließend je drei Filter auf eine PIA-Platte gelegt und bei 36 °C bis zu 7 Tage bebrütet. Zur Stabilisierung der Biofilme für nachfolgende in situ Färbungen wurde dem Agar-Nährmedim in einigen Fällen 0,1 M CaCl2 zugesetzt (Ca-PIA). Zur Zellfärbung wurde der Fluoreszenzfarbstoff SYTO 9 (Molecular Probes) verwendet. Es wurde eine Arbeitslösung mit 1,5 µl SYTO 9 in 1 ml 0,14 M NaCl-Lösung hergestellt und maximal 1 h im Dunkeln aufbewahrt. Zur Färbung wurden 100 µl dieser Arbeitslösung auf den Biofilm gegeben und 15 min im Dunkeln inkubiert. Der Biofilm wurde anschließend unter Verwendung der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM; Anregungswellenlänge: 488 nm, Detektionsfilter: BP 505-530 oder LP 505) untersucht. Anzucht und Quantifizierung von Mikrotiterplatten-Biofilmen Einige mucoide Einzelkolonien von PIA-Vorkulturen wurden in mAPM suspendiert und die Suspensionen mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer auf eine Zellzahl von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt. 100 µl dieser Suspensionen wurden in je eine Vertiefung einer sterilen Mikrotiterplatte (Polystyrol, 96 Kavitäten pro Platte; Fa. Nalgene Nunc) pipettiert und die Platte unter leichtem Schütteln bei 36 °C für 24 h bebrütet. Pro P. aeruginosa-Stamm wurde jeweils eine Achtfachbestimmung durchgeführt. Nach der Bebrütung wurden die planktonischen Kulturen aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte entfernt und in einer neuen Mikrotiterplatte 1:10 in steriler 0,14 M NaCl-Lösung verdünnt und die optische Dichte im Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 580 nm bestimmt. Zur Quantifizierung der Biofilmbildung wurden die angehefteten Zellen, nach Entfernung der Zellsuspension, in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit 25 µl 1% (w/v) Kristallviolett-Lösung gefärbt. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurde überschüssige Kristallviolett-Lösung durch dreimaliges Waschen mit je 200 µl A. deion. entfernt und das an die Biofilmzellen gebundene Kristallviolett in je 200 µl abs. Ethanol gelöst. Nach weiteren 10 min bei Raumtemperatur wurde diese Lösung in einer neuen Mikrotiterplatte 1:10 in abs. Ethanol verdünnt und die Absorption als Maß für die Biofilmbildung bei 580 nm im Mikrotiterplatten-Lesegerät bestimmt. Anzucht von Biofilmen auf Glas unter Batch-Kulturbedingungen Zur Anzucht von Biofilmen auf Glas unter Batch-Kulturbedingungen wurden einige mucoide Einzelkolonien von PIA-Vorkulturen in mAPM suspendiert und die Suspensionen mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer auf eine Zellzahl von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt. Je 25 ml dieser Suspensionen wurden zusammen mit einem zuvor mit Aceton entfetteten und autoklavierten Glasobjektträger (76 mm x 26 mm, Fa. Marienfeld, „Superior“) in eine sterile Petrischale gegeben. Die Bebrütung erfolgte bei 36 °C unter leichtem Schütteln auf einem Schütteltisch mit

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Inkubationshaube. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Objektträger unter sterilen Bedingungen vorsichtig aus den Petrischalen entnommen und die angehefteten Zellen, ohne vorheriges Spülen des Objektträgers mit dem Fluoreszenzfarbstoff SYTO 9 (Molecular Probes) gefärbt. Dazu wurden 1,5 µl SYTO 9-Stammlösung in 1 ml 0,14 M NaCl-Lösung verdünnt und je 100 µl dieser Arbeitslösung auf einen Objektträger gegeben. Nach 15 min im Dunkeln wurde der Biofilm mit dem CLSM; Anregungswellenlänge: 488 nm, Detektionsfilter: BP 505-530 oder LP 505) betrachtet. Zusätzlich wurde die Zellzahl in den Suspensionen mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer bestimmt. Anzucht von Biofilmen auf Glas unter kontinuierlichen Kulturbedingungen Zur Anzucht von Biofilmen auf Glas unter kontunuierlichen Bedingungen wurden Zwei-Kanal-Durchflusszellen aus V10A-Stahl verwendet, wobei jeder Kanal die Ausmaße 3 mm x 8 mm x 54 mm besaß. Als Substratum wurden Deckgläschen aus Borosilikat-Glas (24 mm x 60 mm; Dicke 0,17 mm; Fa. Marienfeld, „Superior“) mit Additiv-freiem Silikon an der Unter- und Oberseite der Durchflusszellen befestigt. Für die Zu- und Abläufe wurden Tygon-Schläuche (Innendurchmesser: 3,17 mm) verwendet. Nach dem Autoklavieren der Durchflusszellen inklusive Schläuche für 15 min bei 121 °C wurden die Biofilmbildungs-Experimente mit mAPM (2.4.1) bei 30 °C durchgeführt. Mit Hilfe einer Mehrkanal Peristaltik Pumpe (Fa. Ismatec, IPC-N) wurde eine Durchflussgeschwindigkeit 20 ml/h (8,33 cm/h) eingestellt, was bei den Ausmaßen der Durchflusszellen einer Reynoldszahl von 1 entsprach. Zur Inokulation der Durchflusszellen wurden für jeden Kanal 5 ml mAPM mit frischem Bakterienmaterial von einer PIA-Vorkultur so angeimpft, dass eine Zellzahl von 1 x 107/ml entstand. Nach Einbringen dieser Suspensionen in die Durchflusszelle und einer Standzeit von 1 h wurde der Fluss wieder angestellt und die Biofilmentwicklung mit dem CLSM im Phasenkontrast-Modus verfolgt. Nach 24 h, 48 h und 72 h wurden pro Stamm jeweils zwei Kanäle (Doppelbestimmung) mit dem Fuoreszenzfarbstoff SYTO 9 (Molecular Probes) gefärbt. Dazu wurden 15 µl SYTO 9-Stammlösung in 10 ml mAPM verdünnt und pro Kanal je 5 ml dieser Arbeits-Lösung injiziert. Nach 15-minütiger Inkubation wurde die Biofilmstruktur mit dem CLSM (Anregungswellenlänge: 488 nm, Detektionsfilter: BP 505-530 oder LP 505) dokumentiert. 3.1.3 Charakterisierung der Bakterien mit dem api 20NE-System Zur biochemischen und physiologischen Teilcharakterisierung wurden die in dieser Arbeit verwendeten P. aeruginosa-Stämme in das kommerziell erhältliche Identifizierungssystem api 20NE (bioMérieux) eingesetzt. Ausgehend von Einzelkolonieausstrichen auf PIA wurden die Teststreifen nach Herstellerangaben beimpft und 24 h bzw. 48 h bei 36 °C bebrütet. Die Auswertung erfolgte nach Angaben des Herstellers mittels einer Ablesetabelle. Zusätzlich wurde die Cytochromoxidase-Reaktion mittels eines kommerziellen Oxidase-Tests (Bactident-Oxidase, Merck) ermittelt. Dazu wurde ein wenig frisches Bakterienmaterial, das zuvor auf PIA (24 h, 36 °C) angezüchtet worden war, auf dem Teststreifen verteilt. Eine Blaufärbung des Teststreifens innerhalb 1 min wurde als positive Cytochromoxidase-Reaktion gewertet. Die Identifizierung der untersuchten Stämme erfolgte durch die Auswertung der ermittelten Reaktionsprofile mit Hilfe der Software apiLAB Plus (Datenbank-Version: V 6.0 api 20NE)

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3.1.4 Isolierung von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) Die Isolierung von EPS erfolgte nach Wingender et al. (2001). Der konfluente Bewuchs von Agar-Platten bzw. Membranfiltern wurde vorsichtig mit einem Metallspatel abgeschabt, gewogen, in steriler 0,14 M NaCl-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 1:16 (w/v) suspendiert und unter Rühren (Magnetrührer, 1300 Upm) bei Raumtemperatur für 30 min homogenisiert. Die Suspensionen wurden 2 h bei 40000 x g (10 °C) zentrifugiert und die dabei erhaltenen Überstände mittels Membranfilter (Celluloseacetat, Porengröße 0,20 µm, Fa. Sarstedt) sterilfiltriert. Die Filtrate (zellfreie EPS-Lösungen) wurden entweder sofort verwendet, oder portionsweise eingefroren und bei -20 °C gelagert. Für die Bestimmung der Adhärenz von Zellen und EPS-Bestandteilen an n-Hexadekan (3.1.9) wurde PUM-Puffer, pH 7,5 anstelle von 0,14 M NaCl-Lösung verwendet. 3.1.5 Bestimmung der Trockenmasse Die Bestimmung der Trockenmasse von Biofilmen erfolgte nach DIN EN 12880. Dazu wurden je zwei konfluent bewachsene PIA-Platten nach 3.1.2.2 hergestellt. Der Bewuchs von diesen zwei Platten wurde mit einem Metallspatel abgenommen und in eine Abdampfschale eingewogen, die zuvor im Wärmeschrank bei 105 °C ± 2 °C getrocknet und nach Erkalten im Exsikkator auf Raumtemperatur auf 1 mg genau ausgewogen (m1) wurde. Das Biofilm-Feuchtgewicht (m2) wurde bestimmt und die Bakterienmasse über Nacht bei 105 °C ± 2 °C getrocknet. Nach Erkalten im Vakuum-Exsikkator wurde die Schale mit dem Rückstand erneut gewogen (m3). Die Trockenmasse (m3 – m1) wurde als konstant angesehen, wenn ihr Gewicht nach einer weiteren 30 min Trocknung von dem vorhergehenden Wert nicht mehr als 2 mg abwich. Die Trocknungen über 30 min wurden bis zur Gewichtskonstanz wiederholt. 3.1.6 Bestimmung der Adhärenz an n-Hexadekan Die Bestimmung der Adhärenz von Zellen bzw. Bestandteilen der EPS an das hydrophobe Lösungsmittel n-Hexadekan wurde modifiziert nach Rosenberg et al. (1980) durchgeführt. Dazu wurden von den verschiedenen P. aeruginosa-Stämmen zellfreie EPS-Lösungen im PUM-Puffer, pH 7,5 wie unter 3.1.4 beschrieben hergestellt. Das dabei erhaltene Zellpellet wurde in PUM-Puffer resuspendiert und erneut für 1 h bei 40000 x g zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen wiederum in PUM-Puffer suspendiert . Die Suspension wurde mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer auf eine Zellzahl von ca. 5 x 108 Zellen /ml eingestellt, was einer Absorption bei 580 nm von ungefähr 1,0 entsprach. Die Bakteriensuspensionen, die EPS-haltigen Überstände und das verwendete n-Hexadekan wurden vor Versuchsbeginn im Wasserbad auf 25 °C vortemperiert. Je 1,2 ml der Bakteriensuspensionen bzw. der zellfreien EPS-Lösungen wurden mit verschiedenen Volumina (0 - 200 µl) n-Hexadekan versetzt und jeweils 2 min auf einem Reagenzglasschüttler stark gemischt. Nach 15-minütiger Standzeit bei Raumtemperatur wurde die untere wässrige Phase vorsichtig entnommen und deren Absorption bei 580 nm bestimmt.

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3.1.7 Bestimmung von Signalmolekülen in zellfreien EPS-Lösungen Zur Bestimmung der Konzentration an Signalmolekülen wurden zellfreie EPS-Lösungen wie unter 3.1.4 beschrieben hergestellt und in einen Biosensor-Test mit Agrobacterium tumefaciens als Indikatorbakterium eingesetzt. Dazu wurde A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) über Nacht bei 30 °C und 180 Upm in ATG-Medium mit 30 µg/ml Gentamycin (2.4.2) angezüchtet. Auf ATG-Agarplatten wurden je 5 ml eines Indikator-Soft-Agars gegeben. Zur Testung wurden Löcher mit einem Durchmesser von 0,5 cm in den Agar gestanzt. Pro Loch wurden 100 µl zellfreie EPS-Lösung gegeben und für 24 h bei 30 °C bebrütet. AHL-Aktivität konnte anhand von blauen Höfen um die Probenlöcher erkannt werden. Indikator-Soft-Agar 1,75 ml 2 % Agar-Lösung 1,5 ml ATG-Medium 1,75 ml Übernacht-Kultur des Indikatorbakteriums 10 µl 2 % X-Gal in DMSO 3.1.8 Bestimmung von Beweglichkeiten Schwimmen: Es wurden Weichagarplatten mit M9-Minimalmedium und 0,3 % Agar hergestellt (2.4.2) und in der Mitte mit einer frischen Einzelkolonie von einer PIA-Vorkultur punktförmig beimpft. Die Schwimmagarplatten wurden 24 h bei 36 °C bebrütet. Bei Schwimmbewegungs-positiven Keimen konnte eine trübe Zone um die entstandene Kolonie beobachtet werden. Schwärmen: Für Schwärmagarplatten wurde M9-Minimlamedium ohne NH4Cl in der Lösung 4 verwendet (2.4.2). Als einzige Stickstoffquelle wurde stattdessen die Aminosäure Glutamat in einer Endkonzentration von 0,05 % (w/v) zugesetzt. Die Agarkonzentration betrug 0,5 % (w/v). Die Schwärmagarplatten wurden in der Mitte punktförmig mit einer Einzelkolonie von einer PIA-Vorkultur beimpft und 48 h bei 36 °C inkubiert. Bei Schwärmbewegungs-positiven Keimen konnte eine trübe Zone um die entstandene Kolonie beobachtet werden. „Twitching Motility“ Es wurden je 15 ml LB-Agar zu etwa 3 mm dicken LB-Platten gegossen. Mittels eines sterilen Zahnstochers wurde eine Einzelkolonie von einer PIA-Vorkultur durch den Agar bis auf den Petrischalenboden gestochen und für 24 h bei 36 °C bebrütet. Nach weiteren 48 h bei Raumtemperatur konnte bei „Twitching Motility“ positiven Keimen eine trübe Zone um die entstandene Kolonie beobachtet werden. Zusätzlich konnte bei Betrachtung der Kolonieränder bei 100-facher Vergrößerung im Phasenkontrastmikroskop „Twitching Motility“ typische, fransenartige Ausstülpungen erkannt werden.

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3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolierung von DNA 3.2.1.1 Mini-Präparation von Plasmid-DNA (modifiziert nach Birnboim und Doly, 1979) • Lösung I (pH 8,0): 50 mM Tris-HCl 10 mM Na2-EDTA • Lösung II: 200 mM NaOH 1 % (w/v) SDS • Lösung III (pH 4,8) 3,0 M Kaliumacetat 1,8 M Natriumformiat Bakterienzellen aus 2 ml einer unter Selektionsdruck angezogenen Übernachtkultur (3.1.2) wurden durch Zentrifugation (3 min, 10.000 x g, Raumtemperatur) sedimentiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt und die Bakterien anschließend in 300 µl Lösung I resuspendiert. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 300 µl Lösung II zu den Ansätzen gegeben und vorsichtig gemischt. Nach Zugabe von 300 µl Lösung III wurden die Ansätze intensiv gemischt und 10 min auf Eis inkubiert. Die durch den Zellaufschluss freigewordenen Protein-SDS-Komplexe, gefällte chromosomale DNA, sowie Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (15 min, 13000 x g, Raumtemperatur) sedimentiert. Der Plasmid-DNA enthaltende Überstand wurde nochmals 10 min auf Eis inkubiert und anschließend 15 min bei 13000 x g zentrifugiert, um die restlichen Proteine zu entfernen. Der dabei erhaltene Überstand wurde mit dem 0,7-fachen Volumen Isopropanol versetzt, um die Plasmid-DNA zu fällen und zentrifugiert (15 min, 13000 x g, Raumtemperatur). Der Überstand wurde vollständig entfernt und die sedimentierte Plasmid-DNA mit 400 µl kaltem absoluten Ethanol versetzt, um die restliche Salze zu entfernen. Anschließend wurde der Ansatz nochmals 5 min bei 13000 x g zentrifugiert. Die Plasmid-DNA wurde luftgetrocknet und in 30 µl A. dest. oder 0,1 x TE-Puffer (2.5) aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert. 3.2.1.2 Midi-Präparation von Plasmid-DNA Die Isolation größerer Mengen Plasmid-DNA erfolgte mit dem “HiSpeed Plasmid Midi Kit” der Fa. Qiagen. Dazu wurden 150 ml LB-Übernachtkultur (3.1.2) für 15 min bei 6000 x g (4 C) zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt und die sedimentierten Zellen in 6 ml des mitgelieferten Puffers P1 resuspendiert. Die anschließende Reinigung der Plasmid-DNA wurde nach Angaben des Herstellers unter Verwendung der mitgelieferten Puffer durchgeführt. Präzipitiert und entsalzt wurde die Plasmid-DNA abschließend durch eine Isopropanol-Fällung (3.2.3.2).

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3.2.1.3 Isolierung chromosomaler DNA aus P. aeruginosa (Gamper et al., 1992) Bakterienzellen aus 1,5 ml Übernachtkultur (3.1.2) wurden durch Zentrifugation für 3 min bei 13000 x g (Raumtemparatur) sedimentiert und der Überstand wurde vollständig entfernt. Die Zellen wurden mit 1 ml TE-Puffer (2.5) gewaschen und anschließend in 300 µl TE-Puffer resuspendiert. Zur Lyse der Zellen wurden die Ansätze mit 100 µl Proteinase K (2,5 mg/ml) und 50 µl 10% (w/v) SDS versetzt und 1 h bei 37 °C inkubiert. Die dabei freigesetzte bakterielle, chromosomale DNA wurde durch wiederholtes Aufziehen mittels einer Spritze mit Kanüle mechanisch geschert. Anschließend wurde die DNA-haltige Lösung einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen, um die Proteine zu entfernen (3.2.2). Abschließend wurde die DNA mit Ethanol aus der Lösung gefällt (3.2.3.1), luftgetrocknet, in 150 µl TE-Puffer (2.5) aufgenommen und bei –20 °C gelagert. Alternativ wurde die chromosomale DNA mit dem “DNeasy Tissue Kit” der Fa. Qiagen nach Angaben des Herstellers und unter Verwendung der mitgelieferten Puffer isoliert. 3.2.2 Phenol-Chloroform-Extraktion • Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (pH 8,0) 50 % (v/v) Phenol (TE-Puffer-gesättigt) 48 % (v/v) Chloroform 2 % (v/v) Isoamylalkohol • Chloroform-Isoamylalkohol 96 % (v/v) Chloroform 4 % (v/v) Isoamylalkohol Zur Denaturierung und Entfernung von Proteinen wurden DNA-haltige Lösungen mit dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol versetzt, intensiv gemischt und anschließend bei Raumtemperatur zentrifugiert (2 min, 13000 x g). Die denaturierten Proteine lagerten sich dabei in der Interphase zwischen der oberen wässigen Phase und der unteren phenolhaltigen Phase ab. Die obere Phase wurde vorsichtig abgenommen, in ein frisches Eppendorf-reaktionsgefäß überführt und erneut mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol versetzt, gemischt und zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis sich keine Protein-Interphase mehr bildete. Anschließend wurde die DNA-haltige obere Phase abgenommen, mit dem gleichen Volumen Chloroform-Isoamylalkohol versetzt, gemischt und für 2 min bei 13000 x g zentrifugiert (Raumtemperatur). Die von Phenolresten gereinigte, nukleinsäurehaltige Oberphase wurde abgenommen und die enthaltene DNA durch Ethanolfällung (3.2.3.1) präzipitiert. 3.2.3 Präzipitation von DNA 3.2.3.1 Ethanolfällung Wässrige DNA-Lösungen wurden mit 0,1 Volumen 3 M Kaliumacetat-Lösung und 2,5 Volumen absolutem Ethanol (-20 °C kalt) vermischt und 10 min bei –80 °C oder über Nacht bei –20 °C

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gelagert. Die als Kaliumsalz präzipitierte DNA wurde durch Zentrifugation für 15 min bei 13000 x g (Raumtemperatur) sedimentiert und überschüssige Salze durch Waschen mit 500 µl 70 % (v/v) Ethanol entfernt. Der Überstand wurde nach erneuter Zentrifugation (5 min, 13000 x g, Raumtemperatur) vollständig entfernt. Anschließend wurde die DNA luftgetrocknet und in 0,1 x TE-Puffer (2.5) oder A. dest. aufgenommen. 3.2.3.2 Isopropanolfällung Wenn durch Mini-Präparation (3.2.1.1) gewonnene Plasmid-DNA für Testrestriktionen mit Restriktionsendonukleasen (3.2.5.1) eingesetzt werden sollte, wurde auf die Phenol-Chloroform-Extraktion (3.2.2) verzichtet und statt der Ethanolfällung eine Isopropanolfällung durchgeführt. Dazu wurden DNA-haltige wässrige Lösungen mit 0,7 Volumen Isopropanol versetzt, intensiv gemischt und die präzipitierte DNA durch Zentrifugation für 30 min bei 13000 x g (Raumtemperatur) sedimentiert. Anschließend wurde die DNA mit 400 µl eiskaltem 70 % (v/v) Ethanol gewaschen und nach einem weiteren Zentrifugationsschritt für 5 min bei 13000 x g (Raumtemperatur) luftgetrocknet und in 0,1 x TE-Puffer (2.5) oder in A. dest. aufgenommen. 3.2.4 Agarose-Gelelektrophorese von DNA • DNA-Molekulargewichtsstandard (“1 kb Ladder”, Gibco BRL): 12,216; 11,198; 10,180; 9,162; 8,144; 7,126; 6,108; 5,090; 4,072; 3,054; 2,036; 1,634; 1,018; 0,512; 0,369; 0,344; 0,298; 0,220; 0,201; 0,154; 0,134; 0,075 kb • DNA-Probenpuffer (5 x): 100 mM Na2-EDTA 43 % (v/v) Glycerol 0,05 % (w/v) Bromphenolblau Die Agarose-Gelelektrophorese wurde zur Analyse von DNA-Restriktionen, PCR-Reaktionen, zur Mengen- und Größenabschätzung linearisierter DNA sowie für die präparative Isolierung von DNA-Fragmenten eingesetzt. Für die Gel-Matrix wurden je nach Größe der zu trennenden DNA-Moleküle Agarosekonzentrationen zwischen 0,4 und 1,2 % (w/v) in 0,5 x TBE-Puffer (2.5) verwendet. Bei präparativen Gelen wurde zum UV-Schutz der DNA zusätzlich 10 mM Guanosin zugesetzt. Zur Anfärbung der DNA wurden pro ml aufgekochter Agarose-Lösung 0,5 µg Ethidiumbromid zugegeben. Vor dem Auftragen auf das Agarosegel wurden die DNA-Proben mit 1/5 Volumen DNA-Probenpuffer (5 x) versetzt. Als Molekulargewichtsstandard diente der “1 kb Ladder” (Gibco BRL). Die Elektrophorese erfolgte in horizontalen Gelkammern bei einer auf 60 mA limitierten Stromstärke und einer Spannung zwischen 8 und 12 V/cm Elektodenabstand. Als Laufpuffer wurde 0,5 x TBE-Puffer (2.5) eingesetzt, bei präparativen Gelen mit einem Zusatz von 1 mM Guanosin. Die Dokumentation der DNA-Banden in den Agarosegelen erfolgte unter UV-Licht (λ = 245 nm) mit einer Videodokumentationsanlage. Konzentrationsbestimmung von DNA Die Mengenabschätzung von DNA erfolgte in Agarosegelen (3.2.4) anhand der 1,6 kb-Bande des DNA-Molekulargewichtsstandards (“1 kb Ladder”, Gibco BRL). Nach Herstellerangaben enthält diese Bande 10 % der insgesamt eingesetzten Marker-DNA. Bei einer aufgetragenen DNA-Gesamtmenge von 333 ng entfallen somit 33 ng auf die 1,6 kb-Bande.

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Elution von DNA aus Agarosegelen Zur Klonierung bestimmter DNA-Fragmente wurden diese nach ihrer elektrophoretischen Auftrennung aus den Agarosegelen eluiert. Die Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit Hilfe des “Nucleo Spin Extract 2 in 1 Kit” (Macherey-Nagel) nach Angaben des Herstellers und unter Verwendung der mitgelieferten Puffer. 3.2.5 In vitro-Rekombination von DNA 3.2.5.1 Hydrolytische Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen Zur gezielten hydrolytischen Spaltung von Phosphodiesterbindungen innerhalb spezifischer Basensequenzen von Plasmid-DNA wurden ausschließlich Restriktionsendonukleasen des Typs II (DNA-Bindungsstelle ist identisch mit der Schnittstelle) eingesetzt. Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten, wurde pro µg DNA 5 – 10 U der entsprechenden Endonuklease eingesetzt und der Restriktionsansatz 1 bis 2 h bei 37 °C inkubiert (Ausnahme: SmaI bei 30 °C). Für optimale Reaktionsbedingungen (Salzgehalt, pH-Wert) wurden die vom Hersteller der Enzyme mitgelieferten Puffer verwendet. Vor Ligationen und Auffüllreaktionen wurden die Restriktionsendonukleasen durch 20 min Inkubation bei 65 °C inaktiviert. Zur Inaktivierung von Hitze-stabilen Restriktionsendonukleasen wurden die Ansätze nach der Hitzebehandlung für 10 min bei –20 °C eingefroren, wieder aufgetaut und anschließend erneut für 20 min bei 65 °C inkubiert. 3.2.5.2 Synthese von glatten DNA-Enden Um zwei nicht-kompatible DNA-Fragmente zu ligieren, wurde mit Hilfe der T4-DNA-Polymerase 5´-Phosphat-überhängende Enden zu glatten DNA-Enden („blunt ends“) aufgefüllt. Dazu wurden die Reaktionsansätze mit ca. 500 ng hydrolytisch gespaltener Plasmid-DNA, 0,1 mM dNTP-Mix und 0,5 U T4-DNA-Polymerase in T4-DNA-Polymerase-Puffer hergestellt und mit A. dest. auf ein Volumen von 20 µl gebracht. Nach Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur wurde die T4-DNA-Polymerase durch 10 min Erhitzen bei 70 °C inaktiviert. 3.2.5.3 Ligation von Vektor- und Fragment-DNA Die verwendete T4-DNA-Ligase katalysiert in einer ATP-abhängigen Reaktion die Verknüpfung von 3´-OH- und 5´-Phosphat-Enden doppelstängiger DNA-Moleküle. Dabei können die Phosphodiester-Bindungen sowohl zwischen zwei kompatiblen kohäsiven Enden (“sticky ends”) als auch zwischen glatten Enden (“blunt ends”) gebildet werden. Für die Ligation eines DNA-Fragmentes mit Vektor-DNA wurden diese in einem molaren Verhältnis von 3:1 eingesetzt. Die DNA wurde vorher für 10 min auf 60 °C erhitzt, um Religationen zu vermeiden. Die Ligation wurde in einem Reaktionsvolumen von 10 – 20 µl mit 1 U T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP (Endkonzentration) und 0,5 mM β-Mercaptoethanol (Endkonzentration) durchgeführt. Die Reaktion erfolgte im vom Hersteller mitgelieferten T4-DNA-Ligase-Puffer für 2 h bei Raumtemperatur. Für nachfolgende Transformationen wurden die Ligationsansätze im Volumenverhältnis 1:4 mit TMF (2.5) verdünnt.

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3.2.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA (modifiziert nach Hanahan, 1983) 3.2.6.1 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen 20 ml LB-Medium wurden mit 0,4 ml Mg2+-Mix (2.5) versetzt und mit 0,2 ml einer E. coli Übernachtkultur beimpft. Die Kultur wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben bei 37 °C und 200 Upm bis zur logarithmischen Wuchsphase (O.D.580 = 0,5 – 0,8) bebrütet. Pro Transformationsansatz wurden die Zellen von 4 ml Kultur durch Zentrifugation (3 min, 8000 x g, 4 °C) sedimentiert, anschließend in 2 ml eiskaltem TMF (2.5) suspensiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (3 min, 8000 x g, 4 °C) wurde das Zellsediment in 0,2 ml TMF (2.5) aufgenommen. Die kompetenten Zellen wurden bis zur weiteren Verwendung entweder auf Eis gelagert oder nach Zugabe von 20 % (v/v) Glycerol (Endkonzentration) bei –80 °C eingefroren. 3.2.6.2 Transformation von E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA Zur Transformation wurden 0,2 ml transformationskompetente Zellen (3.2.6.1) entweder mit 20 µl bzw. 40 µl der in TMF (2.5) verdünnten Ligationsansätze (3.2.5.3) oder mit etwa 0,1 µg präparierter Plasmid-DNA (3.2.1.1) vermischt und mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend folgte ein Hitzeschock für 3 min bei 42 °C. Nach Zugabe von 0,7 ml LB-Medium wurde der Transformationsansatz zur phänischen Expression für 3 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz zentrifugiert (2 min, 8000 x g, Raumtemperatur), der Überstand dekantiert, das Zellpellet in der Restflüssigkeit resuspendiert und auf Selektivagarplatten mit dem entsprechenden Antibiotika ausplattiert. Gleichbehandelte Bakterienansätze, denen keine DNA zugesezt wurde, dienten als Negativkontrolle. 3.2.7 Übertragung von Plasmiden durch Konjugation Zur Einbringung von Plasmid-DNA in P. aeruginosa SG81 wurde die Methode des “biparentalen matings” angewendet. Als Donor wurde der E. coli-Stamm S17-1 verwendet, bei dem die Tansfergene (tra-Gene) chromosomal intergiert vorliegen (Simon et al., 1993). Die Anzucht der zu konjugierenden Stämme erfolgte für E. coli in LB-Medium mit der entsprechenden Konzentration an Antibiotika und für P. aeruginosa in LB-Medium ohne Antibiotika bei 37 °C und 200 Upm über Nacht. Um die Restriktions- und Modifikationssysteme des Rezipientenstamms vor der Konjugation zu inaktivieren wurde die P. aeruginosa-Kultur für 10 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden 5 ml Flüssigkultur des Rezipientenstamms und 4 ml des Donorstamms in einem Reagenzglas vermischt und für 10 min bei 8000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellsediment in der Restflüssigkeit durch starkes Mischen resuspendiert und mit einer Pipette auf eine gut getrocknete LB-Platte gegeben. Der Konjugationsansatz wurde 4 h bei 37 °C bebrütet, danach mit einer Impföse von der Agarplatte genommen und in 1 ml steriler 0,14 M NaCl-Lösung resuspendiert. Jeweils 0,1 ml des Bakteriengemmisches wurden unverdünnt und in den Verdünnungen 10-1; 10-3 und 10-4 auf LB-Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und 24 h bei 37 °C bebrütet. Zur Kontraselektion von E. coli wurde 25 µg/ml Irgasan (Endkonzentration) eingesetzt.

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3.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR; modifiziert nach Saiki et al., 1988) Die PCR wurde zur Überprüfung einiger Genomsequenz-Abschnitte von P. aeruginosa SG81 und der durch Konjugation aus diesem Stamm entstandenen Enzymdefekt-Mutanten angewendet. Ein PCR-Ansatz von 50 µl enthielt die in Tabelle 14 angegebenen Reaktionskomponenten: Tabelle 14: Konzentrationen der Reaktionskomponenten bei PCR-Reaktion mit der Taq-DNA-Polymerase

Reaktionskomponente Konzentration Oligonukleotid I (2.3) 20 pmol Oligonukleotid II (2.3) 20 pmol Taq-Polymerase-Puffer 1 x Taq-Puffer dNTP-Mix 0,2 mM Taq-DNA-Polymerase 2,5 U MgCl2 1,5 mM Matrizen-DNA 10 ng

Die PCR-Reaktion wurde in dem PCR-Automaten “Mastercycler Gradient” der Fa. Eppendorf mit folgendem Programm durchgeführt:

Temperatur (°C) Dauer (min) vollständige Denaturierung 98 4 Denaturierung 95 1 Hybridisierung 55- 65 0,5 Elongation 72 4 finale Elongation 72 7

3.2.9 Pulsfeld-Gelelektophorese 3.2.9.1 Einbettung von bakterieller genomischer DNA in Agarose-Blöcke 20 ml LB-Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben wurden aus einer LB-Übernacht-Vorkultur mit einer OD580 von ca. 0,2 angeimpft und für etwa 2 h bei 30 °C und 180 Upm bis zu einer OD580 von ca. 0,6 - 0,8 bebrütet (mittlere bis späte logarithmische Wachstumsphase). Die Zellen wurden bei 3500 x g für 15 min abzentrifugiert, das Pellet im gleichen Volumen SE-Puffer (2.5) resuspendiert und nochmals bei 3500 x g für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 8-10 % des ursprünglichen Volumens SE-Puffer aufgenommen. Diese Suspension wurde anschließend soweit mit SE-Puffer verdünnt, bis eine Transmission bei 578 nm von 0,8 - 30 % erreicht war. 100 µl dieser Bakteriensuspension wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß vorgelegt und bei 50 °C mit 100 µl 2 % (w/v) LMP-Agarose (Gibco BRL, 55174 UA) in SE-Puffer vermischt. 220 µl dieser Agarose-Zell-Mischung wurden in je eine Gießmulde mit den Ausmaßen von 20 x 9 x 1,2 mm einer Gießform (Bio-Rad, 170-3706) pipettiert und bei 4 °C in 10 - 15 min geliert. Nach dem Verfestigen wurden die Agarose-Blöcke in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und mit 780 µl ES-Lösung (2.5) und 20 µl 20 mg/ml frisch angesetzter Proteinase K-Lösung versetzt. Die Reaktionsansätze wurden 1 - 2 Tage bei 50 °C inkubiert. Anschließend wurde der Puffer entfernt und durch 800 µl 1 mM

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Pefabloc2 SC (Boehringer Mannheim) in TE-Puffer (2.5) ersetzt. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C wurden die Ansätze auf Raumtemperatur abgekühlt, der Puffer abgenommen und verworfen. Zur Entfernung des Pefabloc2 SC wurden die Agarose-Blöcke drei- bis fünfmal für je 30 min in TE-Puffer äquilibriert. Anschließend wurden die Agarose-Blöcke bei 4 °C in TE-Puffer gelagert. Die DNA in den Agarose-Blöcken war mindestens 6 Monate haltbar. 3.2.9.2 Kompletter Einfachverdau der eingebetteten genomischen DNA Die bakterielle DNA innerhalb der Agarose-Blöcke wurde bei einem kompletten Einfachverdau mit Hilfe der im P. aeruginosa-Genom selten schneidenden Restriktionsendonuklease SpeI vollständig fragmentiert. Für den Verdau der DNA mit SpeI wurden die Agarose-Blöcke in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und dreimal für 30 min auf Eis mit mindestens 300 µl (bzw. 240 µl für einen halben Agarose-Block) eines geeigneten Restriktionspuffers äquilibiert. Zur DNA-Hydrolyse wurden Sie in 300 µl Restriktionspuffer mit 20 U des Restriktionsenzyms SpeI und BSA versetzt. Der Ansatz wurde gemischt und 2-3 h auf Eis präinkubiert und anschließned für 3-20 h bei 30 °C inkubiert. Die Verdauungsreaktionen wurden nach 16-20 h Inkubation dadurch abgestoppt, dass der Restriktionspuffer abgenommen und TE-Puffer (2.5) zur Probe gegeben wurde. Die DNA im Agarose-Blöckchen wurde entweder direkt aufs Gel geladen oder in TE-Puffer (2.5) bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. 3.2.9.3 “Contour Clamped Homogeneous Electric Field-Electrophoresis” (CHEF) Der Restriktionslängenpolymorphismus der Genome der verschiedenen P. aeruginosa-Stämme wurde mittels CHEF (Chu et al., 1986) in einem CHEFTM Mapper XA Chiller System (200/240 VAC, Bio-Rad 170-3673) durchgeführt. Die Gele wurden aus 1,1 % (w/v) Agarose (DNA Typing Grade, Gibco BRL) in 100 ml 0,5 x TBE (2.5) bereitet. Die flüssige Agarose wurde in einen Gießstand (Bio-Rad 170-3689) mit den Maßen 14 x 13 cm gegossen und ein 30-zähniger Probenkamm etwa 1 cm vom oberen Rand des Gels entfernt, eingesetzt. Nach dem Gelieren der Agarose, wurde der Probenkamm entfernt und die entstandenen Geltaschen mit 0,5 x TBE (2.5) gefüllt. Die Taschen wurden mit je einem halben bzw. einem viertel DNA-haltigen Agarose-Blöcken (siehe oben) beladen und anschließend mit flüssiger Agarose versiegelt. Als Marker für die Molekülgrößenbestimmung wurde der Lambda Ladder PFG Marker (New England Biolabs NO340S) verwendet. Das mit den Proben versehene Gel wurde in die Elektrophoresekammer eingebracht, die mit 1,5 L 0,5 x TBE befüllt war. Nach dem Abkühlen von Puffer und Gel auf 14 °C wurde der Lauf im „two-state Modus“ über 21 h mit einem Winkel von 120° gestartet. Die Spannung betrug dabei 5,6 V/cm mit einer Puls „switch-time“ von 5 bis 30 s. Anschließend wurden die Banden im Gel in einer 0,5 % (w/v) Ethidiumbromid-Lösung gefärbt und mit einer Videodukumentationsanlage dokumentiert.

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3.3 Biochemisch-präparative Methoden 3.3.1 Reinigung von bakteriellen Alginaten (modifziert nach Wingender, 1984) Zur Reinigung von bakteriellen Alginaten aus P. aeruginosa erfolgte wurden 10 PIA-Platten wie unter 3.1.2.2 konfluent beimpft und für 24 h bei 36 °C bebrütet. Der konfluente Bakterienwuchs wurde vorsichtig mit einem Metallspatel abgenommen, 1:16 (w/v) in steriler 0,14 M NaCl-Lösung suspendiert und unter Rühren (Magnetrührer, 1300 Upm) bei Raumtemperatur für 30 min homogenisiert. Die Suspension wurde für 2 h bei 40000 x g (10 °C) zentrifugiert und der dabei erhaltene Überstand sterilfiltriert (Celluloseacetat-Membranfilter, Porengröße 0,2 µm). Die so erhaltene zellfreie EPS-haltige Lösung wurde unter leichtem Rühren im Eisbad mit dem dreifachen Volumen an eiskaltem, vergällten Ethanol versetzt und 30 min im Eisbad inkubiert. Das entstandene Präzipitat wurde über eine Nutsche (Schott, Nutsche Nr.3) abfiltriert und auf der Nutsche zweimal mit eiskaltem vergälltem Ethanol und abschließend einmal mit eiskaltem absolutem Ethanol gewaschen. Das Präzipitat wurde fünf Tage im Vakuum-Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Das getrocknete Rohexopolysaccharid wurde in einer Konzentration von 2,5 mg/ml in sterilem 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, mit 2 mM MgCl2 gelöst. Nach Zugabe von 5 U/ml Benzonase (Endkonzentration; Merck) wurde der Ansatz 4 h bei 36 °C inkubiert. Nach Zugabe von frisch hergestellter, sterilfiltrierter Proteinse K-Lösung (Sigma, gelöst in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, mit 2 mM MgCl2; Endkonzentration: 5 µg/ml), wurde der Ansatz weitere 24 h bei 36 °C inkubiert und anschließend für 30 min bei 20000 x g (10 °C) zentrifugiert. Der dabei erhaltene Überstand wurde zunächst 1 h und anschließend über Nacht gegen 5 l A. deion. dialysiert (Visking Dialyseschlauch, Serva; Molekulargewichts-Ausschlußgrenze: 12000 - 14000) und abschließend lyophilisiert. 3.3.2 Reinigung von kommerziellen Polysacchariden • Algenalginat und Dextran Zur Reinigung des kommerziellen Natriumalginats aus Braunalgen (Manucol LHF, Kelco-AIL) und des Dextrans aus Leuconostoc mesenteroides (mittleres Molekulargewicht 5 – 40 x 106; Sigma) wurden je 2 g der Polysaccharide in 100 ml A. deion. gelöst und die Ansätze 30 min bei 40000 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden nochmals 30 min bei 40000 x g zentrifugiert. Die dabei erhaltenen Überstände wurden zunächst 1 h und anschließend über Nacht gegen 5 l A. deion. dialysiert (Visking Dialyseschlauch, Serva; Molekulargewichts-Ausschlußgrenze: 12000 - 14000) und abschließend lyophilisiert. • Levan, Xanthan und Hyaluronsäure Zur Reinigung der kommerziellen Polysaccharide Levan aus Erwinia herbicola (Fluka), Xanthan aus Xanthomonas camperis (Sigma) und Hyaluronsäure aus Streptococcus zooepidemicus (Sigma) wurden die Rohexopolysaccharide zu 2,5 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 2 mM MgCl2 gelöst und nach Zugabe von 5 U/ml Benzonase (Endkonzentration; Merck) 4 h bei 36 °C inkubiert. Nach Zugabe von frisch hergestellter, sterilfiltrierter Proteinase K-Lösung (Sigma, gelöst in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5; Endkonzentration 5 µg/ml)wurde weitere 24 h

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bei 36 °C inkubiert und anschließend für 30 min bei 20000 x g (10 °C) zentrifugiert. Der dabei erhaltene Überstand wurde zunächst 1 h und anschließend über Nacht gegen 5 l A. deion. dialysiert (Visking Dialyseschlauch, Serva; Molekulargewichts-Ausschlußgrenze: 12000 - 14000) und abschließend lyophilisiert. 3.3.3 Chemische Deacetylierung von bakteriellen Alginaten (nach Evans und Linker, 1973) Zur chemischen Deacetylierung von gereinigten Bakterienalginaten aus P. aeruginosa (3.3.1) wurden je 25 mg gereinigtes Alginat in 5 ml A. deion. gelöst und mit 2,5 ml 0,3 M NaOH versetzt. Der Ansatz wurde für 1 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 0,5 M HCl auf einen pH von 8,0 eingestellt. Dann wurde der Ansatz zunächst 1 h und anschließend über Nacht gegen 5 l A. deion. dialysiert (Visking Dialyseschlauch, Serva; Molekulargewichts-Ausschlußgrenze: 12000 - 14000) und abschließend lyophilisiert. 3.3.4 Isolierung von Lipopolysacchariden (modifiziert nach Darveau und Hancock, 1983) Zur Isolierung von Lipopolysacchariden aus der äußeren Membran von P. aeruginosa SG81 wurden 40 PIA-Platten wie unter 3.1.2.2 konfluent beimpft und für 24 h bei 36 °C bebrütet. Der konfluente Bakterienwuchs wurde mittels eines Spatels abgenommen und in 200 ml sterilem A. deion. mit Hilfe eines Magnetrührers (30 min, 1300 Upm) suspendiert. Die Bakteriensuspension wurde 2 h bei 40000 x g zentrifugiert, das Sediment in 50 ml A. deion. aufgenommen und lyophilisiert. Zur Lipopolyaccharid-Isolierung wurden 500 mg gefriergetrocknete Bakterien in 15 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 mit 2 mM MgCl2 100 µg/ml Desoxyribonuklease I (Endkonzentration) und 25 µg/ml Ribonuklease A (Endkonzentration) suspendiert und durch Beschallung für 12 x 30 s bei 90 Watt aufgeschlossen. Die Absorption bei 580 nm nahm während der Beschallungsdauer auf weniger als 10 % des Ausgangswertes ab. Anschlißend wurden 200 µg/ml Desoxyribonuklease I (Endkonzentration) und 50 µg/ml Ribonuklease A (Endkonzentration) zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei 36 °C wurde der Suspension 5 ml 0,5 M Na4EDTA in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 2,5 ml 20 % (w/v) SDS in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 und 2,5 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 zugesetzt und vermischt. Danach wurde der Ansatz 30 min bei 50000 x g (20 °C) zentrifugiert. Zum Überstand wurden 200 µg/ml Proteinase K (Endkonzentration) gegeben und der Ansatz über Nacht bei 36 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Der Ansatz wurde mit 50 ml 0,375 M MgCl2 in eiskaltem 95 % absolutem Ethanol versetzt, auf 0 °C abgekühlt und 15 min bei 12000 x g (4 °C) zentrifugiert. Das dabei erhaltene Sediment wurde in 25 ml 2 % (w/v) SDS-Lösung mit 0,1 M Na4-EDTA in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 gelöst und durch Ultraschallbehandlung, wie bereits beschrieben, weiterbehandelt. Anschließend wurde der Ansatz 30 min bei 85 °C erhitzt, nach Abkühlen wurden 25 µg/ml Proteinase K (Endkonzentration) zugegeben und über Nacht bei 36 °C unter leichtem Schütteln bebrütet. Danach wurden 50 ml 0,375 M MgCl2 in 95 % abs. Ethanol bei 0 °C zugegeben und der Ansatz 15 min bei 12000 x g (4 °C) zentrifugiert. Das dabei erhaltene Sediment wurde in 15 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 aufgenommen und durch Ultraschall, wie bereits beschrieben, behandelt. Der Ansatz wurde danach 10 min bei 4000 x g zentrifugiert und der Überstand anschließend 2 h bei 200000 x g (15 °C) zentrifugiert. Das Sediment wurde in 5 ml A. deion. aufgenommen und lyophilisiert.

3 Methoden

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3.4 Chemisch-analytische Methoden 3.4.1 Bestimmung von Proteinen Proteine wurden mit einer modifizierten Lowry-Methode (Lowry et al., 1951; Frølund et al., 1996) unter Verwendung eines komerziell erhältlichen Protein-Test-Kits (Sigma) bestimmt. Die Arbeitsreagenzien wurden entsprechend der Herstellerangaben angesetzt: • modifiziertes Lowry-Reagenz: alkalische Kupfertartrat-Lösung mit 78,8 mM Natriumdodecylsulfat Der Inhalt der Flasche des modifizierten Lowry-Reagenzes (Sigma, L-1013) wurde mit 40 ml A. deion. versetzt und bis zur Lösung geschüttelt. • Phenolreagenz: 4,5 ml Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz (Sigma, F-9252) wurden kurz vor Gebrauch mit 22,5 ml A. deion. gemischt und bis zur Verwendung im Dunkeln aufbewahrt. • Standard: 0 - 60 µg Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V; Sigma) in 1 ml 1 % (w/v) SDS 0,5 ml Probe wurden mit 0,5 ml des Lowry-Reagenzes versetzt und auf einem Reagenzglasschüttler gemischt. Nach 20 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,25 ml Phenolreagenz dazu gegeben, der Ansatz nochmals gemischt und nach weiteren 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 750 nm gegen A. deion. gemessen. Der Leerwert enthielt A. deion. bzw. den entsprechenden Puffer der Probelösung anstelle der Probe. Jede Probe wurde dreifach angesetzt. 3.4.2 Bestimmung von Kohlenhydraten Die Bestimmung von neutralen Kohlenhydraten in zellfreien EPS-Lösungen erfolgte mit einem Phenol-Schwefelsäure-Test nach Dubois et al. (1956). • Lösung 1 (5 % (w/v) Phenol): 5 g Phenol wurden in 100 ml A. deion. gelöst • Lösung 2: konz. H2SO4 • Standard: 0 - 200 µg gereinigtes Bakterienalginat von P. aeruginosa SG81 in 1 ml 0,14 M NaCl-Lösung

0,5 ml Probe wurde mit 0,5 ml Lösung 1 versetzt und durchmischt. Nach Zugabe von 2,5 ml Lösung 2 wurde der Ansatz nochmals kräftig durchmischt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur und weiteren 15 min bei 30 °C im Wasserbad, wurde die Absorption bei 480 nm (für saure Polysaccharide: z.B. Alginat) gegen A. deion. gemessen. Der Leerwert enthielt A. deion. bzw. den entsprechenden Puffer der Probelösung anstelle der Probe. Jede Probe wurde dreifach angesetzt.

3 Methoden

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3.4.3 Bestimmung von Uronsäuren 3.4.3.1 Biphenyl-Methode Die Bestimmung von Uronsäuren in gelchromatographischen Fraktionen erfolgte mit einem Hydroxybiphenyl-Test nach Blumenkrantz und Asboe-Hansen (1973). • Lösung 1 (0,0125 M Tetraborat): 0,9535 g di-Natriumtetraborat-Decahydrat wurden in 200 ml konz. H2SO4 gelöst • Lösung 2 (0,15 % (w/v) 3-Hydroxybiphenyl): 15 mg 3-Hydroxybiphenyl wurden in 10 ml 0,5 % (w/v) NaOH gelöst • Standard: 0- 200 µg gereinigtes Bakterienalginat von P. aeruginosa SG81 in 1 ml 0,14 M NaCl-Lösung Zu 0,2 ml Probe im Eisbad wurden 1,2 ml Lösung 1 gegeben. Nach 10 min im Eisbad wurde der Ansatz gemischt und für 5 min bei 100 °C in Wasserbad erhitzt. Nach Abkühlen für 5 min im Eisbad wurden 20 µl Lösung 2 hinzugegeben und der Ansatz wiederum gemischt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 520 nm gegen A. deion. gemessen. Der Leerwert enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl anstelle der Probe. Jede Probe wurde dreifach angesetzt. 3.4.3.2 Sulfamat-Biphenyl-Methode Die Bestimmung von Uronsäuren in EPS-haltigem Material zur biochemischen Charakterisierung der verwendeten P. aeruginosa-Stämme erfolgte mit einem Sulfamat-Hydroxybiphenyl-Test (modifiziert nach Filisetti-Cozzi und Carpita, 1991). • Lösung 1 (4 M Sulfamat): 19.42 g Sulfaminsäure wurden in 20 ml A. deion. unter Rührens durch tropfenweise Zugabe von gesättigter KOH-Lösung in Lösung gebracht. Nach dem Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur wurde der pH-Wert auf 1,6 eingestellt und die Lösung auf 50 ml mit A. deion. aufgefüllt. • Lösung 2 (0,075 M Tetraborat): 5,721 g di-Natriumtetraborat-Decahydrat wurden in 200 ml konz. H2SO4 gelöst • Lösung 3 (0,15 % (w/v) 3-Hydroxybiphenyl): 15 mg 3-Hydroxybiphenyl wurden in 10 ml 0,5 % (w/v) NaOH gelöst • Standard: 0 - 200 µg gereinigtes Bakterienalginat von P. aeruginosa SG81 in 1 ml 0,14 M NaCl-Lösung Zu 0,4 ml Probe wurden 40 µl Lösung 1 gegeben. Der Ansatz wurde auf einem Reagenzglasschüttler gut gemischt und anschließend mit 2,4 ml Lösung 2 versetzt, wiederum gemischt und für 20 min bei 98 °C im Wasserbad erhitzt. Nach Abkühlen für 5 min im Eisbad

3 Methoden

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wurden 80 µl Lösung 3 hinzugegeben und die Ansätze errneut gemischt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 525 nm gegen A. deion. gemessen. Der Leerwert enthielt A. deion. bzw. den entsprechenden Puffer der Probe anstelle der Probe. Jede Probe wurde dreifach angesetzt. 3.4.4 Bestimmung von Acetylgruppen Die Bestimmung des Acetylgruppengehaltes an Alginaten bzw. in zellfreien EPS-Lösungen erfolgte mit einer photometrischen Methode nach Hestrin (1949) • Lösung 1 (1 M alkalisches Hydroxylamin): Ein Volumen 2 M Hydroxylamin in A. deion. wurde kurz vor Gebrauch mit einem Volumen 3,5 M NaOH zusammengegeben • Lösung 2: 37 % HCl wurde im Volumenverhältnis 1:3 (v/v) mit A. deion. verdünnt • Lösung 3 (0,37 M Eisen-(III)-chlorid): 10,0 g FeCl3 x 6 H2O wurden in 100 ml 0,1 M HCl gelöst • Standard: 0 - 5 mM Acetylcholinchlorid (Sigma) in 1 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5 0,5 ml Alginatlösungen (2 mg/ml in 1 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5) bzw. zellfreie EPS-Lösungen wurden mit 1 ml Lösung 1 vermischt. Nach 1 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde 0,5 ml der Lösung 2 dazu gegeben. Nach kurzem Durchmischen wurde 0,5 ml der Lösung 3 zugesetzt, nochmals kurz gemischt und sofort die Absorption bei 540 nm gegen A. deion. gemessen. Der Leerwert enthielt 1 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5 anstelle der Probe. Jede Probe wurde dreifach angesetzt. 3.4.5 Bestimmung von 2-Keto-3-desoxyoctonat (KDO) Die Bestimmung von KDO als Markersubstanz für Lipopolysaccharide wurde mit einer Methode nach Karkhanis et al. (1978) durchgeführt. • Lösung 1: 1 M H2SO4 • Lösung 2 (0,04 M Perjodsäure): 0,912 g H5IO6 wurden in 100 ml 0,0625 M H2SO4 gelöst • Lösung 3 (2,6 % (w/v) Natrium-Arsenit): 2,6 g NaAsO2 wurden in 100 ml 0,5 M HCl gelöst • Lösung 4 (0,6 % (w/v) Thiobarbitursäure): 0,6 g 2-Thiobarbitursäure (TBA) wurden 100 ml A. deion. gelöst • Lösung 5: DMSO • Standard: 0 – 10 µg KDO (Sigma) in 1 ml 0,1 M H2SO4

3 Methoden

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Die Proben wurden zunächst 9:10 (v/v) mit 1 M H2SO4 verdünnt und 30 min bei 100 °C im Wasserbad hydrolisiert. Je 2 ml der so erhaltenen Probelösungen wurden für 6 min bei 16000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. In einer Dreifachbestimmung wurden nun jeweils 0,5 ml des Überstandes bzw. des Standards mit 0,25 ml Lösung 2 versetzt. Nach 20 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,25 ml Lösung 3 zugegeben und bis zur Entfärbung der Ansätze gewartet (ca. 2 min). Anschließend wurden 0,5 ml Lösung 4 zugegeben. Nach kurzem Durchmischen wurden die Ansätze 150 min bei 100 °C im Wasserbad erhitzt. Zu den heissen Ansätzen wurde 1 ml DMSO gegeben und nach Abkühlen auf Raumtemperatur die Absorption bei 548 nm gegen einen Leerwert, der anstelle der Probe A. deion. enthielt bestimmt. Bei einigen Proben trat während der Farbreaktion eine Trübung auf. Diese Proben wurden vor der photometrischen Messung nochmals für 6 min bei 16000 x g zentrifugiert. 3.4.6 Bestimmung von Pigmenten Zur Bestimmung der von P. aeruginosa gebildeten Pigmente Pyocyanin und Pyoverdin in zellfreien EPS-Lösungen (3.1.4) wurden das Pyocyanin zunächst durch eine Chloroform-Extraktion isoliert. Dazu wurden 4 ml zellfreie EPS-Lösung in einem Reagenzglas mit 1 ml Chloroform versetzt und 2 min stark vermischt. Nach 15-minütiger Standzeit bei Raumtemperatur wurde die obere chloroformhaltige Phase vorsichtig abgenommen und die untere wässrige Phase nochmals mit 1 ml Chloroform versetzt und wie oben beschrieben behandelt. Diese Prozedur wurde viermal wiederholt. Das hydrophobe Pyocyanin wurde dabei in der organischen Phase angereichert und konnte mittels Absorptionsmessung bei 695 nm gegen Chloroform bestimmt werden. Das hydrophile Pyoverdin verblieb in der wässrigen Phase und wurde fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlänge von 400 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm bestimmt. 3.5 Methoden zur Enzymaktivitätsbestimmung 3.5.1 API-ZYM-System Zum semiquantitativen Nachweis von Enzymaktivitäten wurden zellfreie EPS-Lösungen (3.1.4) der verschiedenden P. aeruginosa-Stämme in das kommerzielle Nachweissystem API-ZYM (bioMérieux) eingesetzt. Die Mikroröhrchen des Teststreifens wurden jeweils mit 65 µl zellfreier EPS-Lösung beimpft. Nach einer Inkubation für 20 h bei 36 °C wurde in jedes Mikroröhrchen je ein Tropfen der Reagenzien ZYM A und ZYM B zugegeben. Nach 5 min wurde die Menge des umgesetzten Substrats mit Hilfe einer Farbtabelle entsprechend der Herstellerangaben ermittelt. • ZYM A: 25 g tri-Hydroxymethylaminomethan, 11 ml 37 % HCl, 10 g Laurylsulfat ad 100 ml A. dest. • ZYM B: 0,35 g Fast Blue BB ad 100 ml 2-Methoxyethanol

3 Methoden

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3.5.2 Bestimmung von Enzymaktivitäten mit Substratagarplatten 3.5.2.1 Protease Der Nachweis von Protease-Aktivitäten in flüssigen Proben erfolgte auf Skim-Milk-Agar (2.4.1). Zur Testung wurden Löcher mit einem Durchmesser von 0,5 cm in den Agar gestanzt. Pro Loch wurden 100 µl Probe gegeben und die Platten für 24 h bei 30 °C bebrütet. Das dem Agar zugesetzte Magermilchpulver enthält Casein, das von Proteasen als Substrat erkannt und abgebaut wird. Protease-Aktivität konnte als klarer Hof um die Probenlöcher erkannt werden. 3.5.2.2 Esterase (Küpper et al., 1999) Der Nachweis von Esterase-Aktivitäten in flüssigen Proben erfolgte auf FDA-Agar (2.4.1). Fluoresceindiacetat (FDA) wird bevorzugt durch Esterasen hydrolytisch gespalten. Das frei werdende Fluorescein emittiert bei Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) Licht im sichtbaren Bereich (gelb/grün). Zur Testung wurden Löcher mit einem Durchmesser von 0,5 cm in den Agar gestanzt. Pro Loch wurden 100 µl Probe gegeben und die Platten für 24 h bei 30 °C bebrütet. Esterase-Aktivität wurde als fluoreszierender Hof um die Probenlöcher bei Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) detektiert. 3.5.2.3 Lipase (Kouker und Jaeger, 1987) Zur Selektion von Lipase-negativen Mutanten von P. aeruginosa und zum Nachweis von Lipase-Aktivitäten in flüssigen Proben wurde Rhodamin B-Agar (2.4.1) verwendet. Das im Rhodamin B-Agar enthaltene Triolein wird durch hydrolytische Aktivität von Lipasen gespalten. Die entstehenden Fettsäuren komplexieren mit Rhodamin B und emittieren dann Licht im sichtbaren Bereich (rot/orange) bei Bestrahlung mit UV-Licht (350 nm). Zur Testung von flüssigen Proben wurden Löcher mit einem Durchmesser von 0,5 cm in den Agar gestanzt. Pro Loch wurden 100 µl Probe gegeben und die Platten für 24 h bis zu 48 h bei 30 °C bebrütet. Lipase-Aktivität konnte als fluoreszierender Hof um die Probenlöcher bei Bestrahlung mit UV-Licht (350 nm) erkannt werden. Zur Selektion von Lipase-negativen Mutanten von P. aeruginosa wurden Einzelkolonien mittels eines sterilen Zahnstochers auf dem Rhodamin B-Agar inokuliert und für 24 h bis 48 h bei 36 °C bebrütet. Lipase-Aktivität konnte Probenlöcher bei Bestrahlung mit UV-Licht (350 nm) als fluoreszierender Hof um die gewachsenen Kolonien erkannt werden.

3 Methoden

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3.5.3 Photometrische Methoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten 3.5.3.1 Protease Die Aktivität von Proteasen (EC 3.4) in flüssigen Proben erfolgte photometrisch anhand der enzymatischen Hydrolyse von Azocasein mit einer modifizierten Methode nach Prestidge et al. (1971). • Substrat: 2% (w/v) Azocasein 1 g Azocasein (Na-Salz, Serva) in 50 ml A. deion. gelöst 0,15 ml enzymhaltige Probelösung wurde mit 0,05 ml 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 und 0,05 ml A. deion. in einem Reagenzglas gemischt und der Ansatz 5 min auf 30 °C im Wasserbad vortemperiert. Nach Zugabe von 0,25 ml 2% (w/v) Azocaseinlösung wurde der Ansatz genau 20 min bei 30 °C im Wasserbad inkubiert und anschließend mit 1 ml eiskalter 7 % (v/v) Perchlorsäure versetzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Der Ansatz wurde in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und 4 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde in Reagenzgläser gegeben und mit 0,15 ml 10 M NaOH versetzt. Die Absorption wurde bei 430 nm gegen einen Leerwert, der anstelle von enzymhaltiger Lösung 0,14 M NaCl-Lösung enthielt, gemessen. Jede Probe wurde doppelt angesetzt. Eine Enzymeinheit (EU) extrazellulärer Protease wurde als diejenige Aktivität in 1 ml definiert, welche innerhalb von 60 min eine ∆A430 = 1,0 verursachte (Obermesser et al., 1981). 3.5.3.2 Esterase Die Aktivität von Esterasen (Carboxylesterhydrolasen EC 3.1.1.1) in flüssigen Proben wurde photometrisch anhand der enzymatischen Hydrolyse von Fluoresceindiacetat nach Küpper et al. (1999) bestimmt. • Substrat: 20 mM Fluoresceindiacetat (FDA) 20,8 mg FDA (Serva) wurden in 2,5 ml Aceton gelöst. Dazu wurden 9 ml enzymhaltige Probelösung, mit 1 ml 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 versetzt. Nach Zugabe von 10 µl 20 mM FDA-Lösung wurden die Ansätze für 60 min bei 30 °C im Schüttelwasserbad inkubiert. Alle 10 min wurde 1 ml der Probe entnommen und die Absorption bei 490 nm gegen 0,1 M Tris-HCl-Puffer gemessen. Als Blindwert wurde ein Ansatz, der anstelle enzymhaltiger Lösung 0,14 M NaCl-Lösung enthielt auf die gleiche Weise behandelt, um die spontane Hydrolyse von FDA zu berücksichtigen. Jede Probe wurde doppelt angesetzt. Eine Kalibrationsgerade wurde im Konzentrationsbereich von 0 µM bis 100 µM Fluorescein (Na-Salz; Merck) in 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 aufgenommen. Eine Absorptionszunahme bei 490 nm von 0,591 entsprach dabei 10 µM Fluorescein; d.h. eine Absorptionszunahme von 1,0 bei 490 nm in 60 min entsprach unter den beschriebenen Testbedingungen einer Esterase-Aktivität von 0,282 nmol/min x ml Probe.

3 Methoden

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3.5.3.3 Lipase Die Aktivität von Lipasen (Triacylglycerolacylhydrolasen EC 3.1.1.3) in flüssigen Proben wurde mit emulgiertem p-Nitrophenylpalmitat als Substrat photometrisch nach Winkler und Stuckmann (1979) bestimmt. Die Methode basiert auf der enzymkatalytischen, hydrolytischen Spaltung von pNPP; das dabei entstehende p-Nitrophenol weist eine Gelbfärbung auf und kann bei 410 nm photometrisch bestimmt werden. • Substrat: 0,8 mM p-Nitrophenylpalmitat (pNPP) Substratemulsion: In einem 100 ml-Erlenmeyerkolben wurden 30 mg pNPP (Serva) unter leichtem Erwärmen in 10 ml Isopropanol gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur wurde sie unter schwachem Rühren zu 90 ml 0,05 M Sørensen-Phosphat-Puffer, pH 8,0, in dem zuvor 207 mg Na-Desoxycholat und 100 mg Gummi arabicum gelöst wurden, zugegeben. Die milchige Substratemulsion wurde lichtgeschützt gelagert und innerhalb von einer Stunde verbraucht. 2,4 ml Substratemulsion wurden 3 min bei 37 °C vorgewärmt und anschließend mit 0,2 ml enzymhaltiger Lösung versetzt. Nach kurzer Durchmischung der Ansätze auf einem Reagenzglasschüttler wurde die Absorption bei 410 nm einmal sofort und ein weiteres Mal nach 15 min Inkubation bei 37 °C im Dunkeln bestimmt. Als Blindwert wurde ein Ansatz, der anstelle enzymhaltiger Lösung 0,14 M NaCl-Lösung enthielt auf die gleiche Weise behandelt, um die Autohydrolyse von pNPP zu berücksichtigen. Jede Probe wurde doppelt angesetzt. Zur Abschätzung von Lipase-Aktivitäten in gelchromatographischen Fraktionen und zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen Polysacchariden und Lipasen, erfolgte die Lipase-Aktivitäts-Bestimmung im Mikrotiterplatten-Maßstab. Dazu wurden je 20 µl enzymhaltige Probe in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 240 µl vortemperierter Substratemulsion gestartet. Die Absorptionszunahme bei 405 nm wurde im auf 37 °C temperierten Mikrotiterplatten-Lesegerät einmal sofort und dann alle 15 min bis hin zu 1 h bestimmt. Jede Probe wurde vierfach bestimmt. Eine Kalibrationsgerade wurde im Konzentrationsbereich von 0 µM bis 100 µM p-Nitrophenol in der beschriebenen Pufferemulsion aufgenommen. Eine Absorptionszunahme bei 410 nm von 0,179 entsprach dabei 10 µM p-Nitrophenol; d.h. eine Absorptionszunahme von 1,0 bei 410 nm in 15 min entsprach unter den beschriebenen Testbedingungen einer Lipase-Aktivität von 48,3 nmol/min x ml Probe. 3.5.3.4 Phospholipase C Die Aktivität von Phospholipase C (Phosphatidylcholin Cholinphosphohydrolase EC 3.1.4.3) in flüssigen Proben wurde photometrisch mit p-Nitrophenylphosphorylcholin als Substrat nach Kurioka und Matsuda (1976) bestimmt. Das bei der enzymatischen Spaltung von pNPPC freiwerdende p-Nitrophenol weist eine Gelbfärbung auf und kann photometrisch bei 410 nm bestimmt werden. • Substrat: 10 mM p-Nitrophenylphosphorylcholin (pNPPC)

3 Methoden

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Substratlösung: Zur Herstellung von 10 ml pNPPC-Substratlösung wurden 6 g D(-)-Sorbit (Sgma) in 4 g 250 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,2 gelöst. Nach Zugabe von 0,01 ml einer 1 M ZnCl2-Lösung wurde der Ansatz gemischt, anschließend wurde 30,42 mg pNPPC (Sigma) zugegeben und nochmals gemischt. 0,9 ml pNPPC-Substratlösung wurden 5 min bei 37 °C vortemperiert und anschließend mit 0,1 ml Probelösung versetzt. Nach kurzem Durchmischen der Ansätze auf einem Reagenzglasschüttler wurde die Absorption bei 410 nm einmal sofort und nach 15-minütiger und 30-minütiger Inkubation bei 37 °C bestimmt. Als Blindwert wurde ein Ansatz, der anstelle enzymhaltiger Lösung 0,14 M NaCl-Lösung enthielt auf die gleiche Weise behandelt, um die Autohydrolyse von pNPPC zu berücksichtigen. Jede Probe wurde doppelt bestimmt. Eine Kalibrationsgerade wurde im Konzentrationsbereich von 0 µM bis 40 µM p-Nitrophenol (Sigma) in 250 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,2 mit D(-)-Sorbit aufgenommen. Eine Absorptionszunahme bei 410 nm von 0,796 entsprach dabei 10 µM p-Nitrophenol; d.h. eine Absorptionszunahme von 1,0 bei 410 nm in 30 min entsprach unter den beschriebenen Testbedingungen einer Phospholipase C-Aktivität von 4,19 µmol/min x ml Probe. 3.5.3.5 alkalische Phosphatase Die Aktivität von alkalischer Phosphatase (alkalische Phosphomonoesterase EC 3.1.3.1) in flüssigen Proben wurde mit p-Nirophenylphosphat als Substrat photometrisch mit einer nach Neu und Heppel (1965) modifizierten Methode bestimmt. Die Methode basiert auf der enzymkatalytischen, hydrolytischen Spaltung von p-Nirophenylphosphat im alkalischen Milieu; das dabei entstehende p-Nitrophenol weist eine Gelbfärbung auf und kann bei 410 nm photometrisch bestimmt werden. • Substrat: 1 mM p-Nitrophenylphosphat 3,7 mg p-Nitrophenylphosphat (Serva) wurden in 10 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 10,0 mit 10 mM MgCl2 gelöst 50 µl Probelösung wurden mit 950 µl frisch hergestelltem Substratpuffer vermischt und die Absorption bei 410 nm sofort nach Vermischung und ein weiteres Mal nach 30 min bestimmt. Als Blindwert wurde ein Ansatz, der anstelle enzymhaltiger Lösung 0,14 M NaCl-Lösung enthielt auf die gleiche Weise behandelt, um die Autohydrolyse von p-Nitrophenylphosphat zu berücksichtigen. Jede Probe wurde doppelt bestimmt. Eine Kalibrationsgerade wurde im Konzentrationsbereich von 0 µM bis 40 µM p-Nitrophenol (Sigma) in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 10 mit 10 mM MgCl2 aufgenommen. Eine Absorptionszunahme bei 410 nm von 0,143 entsprach dabei 10 µM p-Nitrophenol; d.h. eine Absorptionszunahme von 1,0 bei 410 nm in 30 min entsprach unter den beschriebenen Testbedingungen einer Phosphatase-Aktivität von 55,9 nmol/min x ml Probe.

3 Methoden

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3.5.4 Fluorimetrische Methoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten 3.5.4.1 alkalische Phosphatase Zur Bestimmung der Phosphatase-Aktivität in gelchromatographischen Fraktionen wurde eine fluorimetrische Methode mit 4-Methylumbelliferyl-Phosphat (MUF-Phosphat, Sigma) als Substrat verwendet. Die Methode basiert auf der enzymkatalytischen, hydrolytischen Spaltung von MUF-Phosphat; das dabei entstehende 4-Methylumbelliferon emitiert bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm Licht im sichtbaren Bereich, welches fluorimetrisch bei 450 nm bestimmt werden kann. • Substrat: 40 mM MUF-Phosphat 10,25 mg MUF-Phosphat (Sigma) wurden in 1 ml DMSO gelöst 100 µl enzymhaltige Probelösung wurden mit 890 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 10,0 mit 10 mM MgCl2 vermischt. Nach Zugabe von 10 µl Substratlösung und guter Durchmischung wurde die Fluoreszenz bei 450 nm gemessen (Anregung von 360 nm) einmal sofort und ein weiteres Mal nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur bestimmt. Als Blindwert wurde ein Ansatz, der anstelle enzymhaltiger Lösung 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 10,0 mit 0,2 M NaCl enthielt auf die gleiche Weise behandelt, um die Autohydrolyse von MUF-Phosphat zu berücksichtigen. Jede Probe wurde doppelt angesetzt. Eine Kalibrationsgerade wurde im Konzentrationsbereich von 0 µM bis 25 µM 4-Methylumbelliferon (MUF, Sigma) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 10,0 mit 10 mM MgCl2 aufgenommen. Eine Fluoreszenzzunahme bei 450 nm von 67,3 relativen Fluoreszenzeinheiten (Anregung: 360 nm) entsprach dabei 10 µM MUF; d.h. eine Fluoreszenzzunahme von 100 relativen Fluoreszenzeinheiten bei 450 nm in 30 min entsprach unter den beschriebenen Testbedingungen einer Phosphatase-Aktivität von 5,2 µmol/min x ml Probe. 3.5.5 Visualisierung von Enzymaktivitäten in situ Die in situ-Visualisierung von Enzymaktivitäten (Phosphatase, EC 3.1.3.1; Lipase EC 3.1.1.3; Esterase EC 3.1.1.1) in Biofilmen erfolgte durch die Applikation von ELF-97-Substraten (ELF: Enzyme labelled fluorescence; Molecular Probes). Die löslichen Enzymsubstrate werden bei entsprechend vorhandener Enzymaktivität gespalten, wobei direkt am Reaktionsort der wasserunlösliche ELF-97-Alkohol zu fluoreszierenden Kristallen präzipitiert (Singer et al., 1994; Haugland, 1995). 3.5.5.1 Phosphatase

• Substrat: 5 mM ELF-97 Phosphat (Molecular Probes) in A. deion.

Phosphatase + H2O - Na2PO4

ELF-97-Phosphat ELF-97-Alkohol

3 Methoden

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Die Substratlösung wurde kurz vor Gebrauch 1:20 in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 10,0 mit 10 mM MgCl2 verdünnt und diese Gebrauchslösung bis zur Verwendung im Dunkeln gelagert (maximal 1 h). Je 50 µl der Gebrauchslösung wurden auf einem Membranfilter-Biofilm gegeben, so dass er komplett überschichtet wurde Nach 30 min Inkubation bei 30 °C im Dunkeln wurde die Phosphatase-Aktivität im Biofilm mit einem Fluoreszenzmikroskop (Filtersatz A; Anregung: BP 340-380 nm, Farbteiler: 400 nm, Sperrfilter: LP 425 nm), bzw. mit dem CLSM (Anregungswellenlänge: 351 nm, Detektionsfilter: BP 505-550 oder LP 505) betrachtet. 3.5.5.2 Esterase

• Substrat: 5 mM ELF-97 Acetat (Molecular Probes) in DMSO Die Substratlösung wurde kurz vor Gebrauch 1:20 in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 verdünnt und diese Gebrauchslösung bis zur Verwendung im Dunkeln gelagert (maximal 1 h). Je 50 µl der Gebrauchslösung wurden auf einem Membranfilter-Biofilm gegeben, so dass er komplett überschichtet wurde. Nach einer Inkubation von bis zu 3 h bei 30 °C im Dunkeln wurde die Esterase-Aktivität im Biofilm mit einem Fluoreszenzmikroskop (Filtersatz A; Anregung: BP 340-380 nm, Farbteiler: 400 nm, Sperrfilter: LP 425 nm), bzw. mit dem CLSM (Anregungswellenlänge: 351 nm, Detektionsfilter: BP 505-550 oder LP 505) betrachtet. 3.5.5.3 Lipase

• Substrat: 5 mM ELF-97 Palmitat (Molecular Probes) in Isopropanol • Puffer: 0,207 g Natrium-Desoxycholat und 0,1 g Gummi arabicum wurden

in 90 ml Sørensen-Phosphat-Puffer, pH 8,0 gelöst Das Substrat wurde mit der entsprechenden Menge Isopropanol versetzt und unter leichtem Erwärmen gelöst. Anschließend wurde das Substrat 1:10 mit dem Puffer vermischt. Die entstandene milchige Substratemulsion wurde lichtgeschützt gelagert und innerhalb einer Stunde verbraucht. Je 50 µl der Substratemulsion wurden auf einem Membranfilter-Biofilm

Lipase + H2O - Palmitat

ELF-97-Palmitat ELF-97-Alkohol

Esterase + H2O - Acetat

ELF-97-Acetat ELF-97-Alkohol

3 Methoden

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gegeben, so dass er vollständig überschichtet wurde und bis zu 3 h bei 30 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Lipase-Aktivität im Fluoreszenzmikroskop (Filtersatz A; Anregung: BP 340-380 nm, Farbteiler: 400 nm, Sperrfilter: LP 425 nm), bzw. mit dem CLSM (Anregungswellenlänge: 351 nm, Detektionsfilter: BP 505-550 oder LP 505) betrachtet. 3.6 Physikalisch-analytische Methoden 3.6.1 Viskosimetrie Die Viskosität von EPS-haltigen Kulturüberständen wurde mit Hilfe eines Kapillarviskosimeters (Mikro-KPG-Ubbelohde-Viskosimeter, Kapillare Ι, Schott) im Vergleich zum verwendeten Lösungsmittel (0,14 M NaCl-Lösung) bei 25 °C ± 0,1 °C bestimmt. Die Proben wurden im Viskosimeter 15 min bei 25 °C ± 0,1 °C vortemperiert und anschließend die Durchflusszeiten bestimmt. Es wurden fünf Messwerte pro Probe ermittelt. Die spezifische und die reduzierte Viskosität wurde mit Hilfe der Durchflusszeiten berechnet: spezifische Viskosität reduzierte Viskosität

η =spez

t - tt

p l

l

η =η

redspez

c

ηspez: spezifische Viskosität ηred : reduzierte Viskosität tl : Durchlaufzeit des Lösungsmittels (s) c : Uronsäure-Konzentration (g/100 ml) tp : Durchlaufzeit der Probe (s) 3.6.2 Filmrheometrie Die Untersuchung der mechanischen Stabilität von Biofilmen erfolgte mit einer von Körstgens et al. (2001) entwickelten Apparatur zur uniaxialen Kompressionsmessung. Dazu wurden Membranfilter-Biofilme der zu untersuchenden P. aeruginosa-Stämme abweichend zu 3.1.2.2 auf der Oberfläche von Cellulosemischester-Membranfiltern (Pall Gelham Sciences, GN-6 Metrical Membranfilter; Porengröße 0,45 µm), die auf eine PIA-Platten-Oberfläche gelegt wurden, für 24 h bei 36 °C angezüchtet. Nach der Inkubation wurden mit einem sterilen Skalpell Stücke mit einer Fläche von etwa 0,3 x 0,3 cm aus dem Membranfilter-Biofilm ausgeschnitten und in die Apparatur eingebracht. Zur Deformation des Biofilms wurde ein Stempel aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 0,25 cm (A) kurz über dem Biofilm plaziert und mit einer linearen Geschwindigkeit von 1 µm s-1 bis zu 25 % der Ausgangsdicke (D0) des Biofilms herunter gefahren. Die zur Kompression des Biofilms benötigte Kraft (f) wurde mit einer Analysenwaage (Sartorius, BP 210S), die an einen PC gekoppelt war, aufgenommen. Von jedem zu untersuchenden Biofilm wurden 12 Stücke ausgeschnitten und vermessen. Zur Auswertung wurden die gemessenen Größen Kraft [N] und Abstand [µm] gegeneinander aufgetragen; aus der Steigung der Kurven im linearen Bereich erhält man Kraft/Dickendifferenz. Daraus konnte das apparente Elastizitätsmodul (E-Modul) als Maß für die mechanische Stabilität der Biofilme nach folgenden Gleichungen berechnet werden:

3 Methoden

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wobei: und σ : Spannung f : Kraft ∆d : Dickendifferenz ε : Dehnung A : Fläche D0 : Ausgangsdicke des Biofilms 3.7 Gelelektrophorese von Proteinen 3.7.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE nach Laemmli, 1970) Die Auftrennung von Proteinproben erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in einem diskontinuierlichen Gelsystem, wie von Laemmli (1970) beschrieben. Gele und Reagenzien wurden von der Fa. Invitrogen bezogen und nach Herstellerangaben verwendet. Es wurden 45 µl Probe mit dem gleichen Volumen an Probenpuffer vermischt. Nach Zugabe von 10 µl Reduzierungs-Reagenz wurden die Ansätze nochmals gemischt und vor dem Auftragen auf das Gel für 5 min bei 85 °C inkubiert. Von diesen denaturierten Proben wurden jeweils 12,5 µl bzw. 25 µl auf das Gel aufgetragen. Der gelelektrophoretische Lauf erfolgte in einer vertikalen Gelapparatur (Biometra, Typ G42 für Minigele) für etwa 1,5 h unter konstanter Spannung von 125 V. • SDS-Probenpuffer (Invitrogen, LC2676)

enthält Tris, Glycerin, SDS und Bromphenolblau (pH 6,8) • Elektrophoresepuffer (Invitrogen, LC2675)

enthält Tris, Glycin und SDS (pH 8,3) Dieses Pufferkonzentrat wurde kurz vor Gebrauch 1:10 mit A. deion. verdünnt.

• DTT-Reduzierungs-Reagenz (Invitrogen, NP0004) enthält Dithiothreit • Gelkassetten 4-20 % Tris Glycin (Invitrogen, EC6005)

Dicke: 1,0 mm; Trenngel: 4 % • Markerproteine (Mark 12, Wide Range Protein Standard; Invitrogen, LC5677)

Myosin 200,0 kDa β-Galactosidase 116,25 kDa Phosphorylase B 97,4 kDa Serumalbumin 66,3 kDa Glutamat-Dehydrogenase 55,4 kDa Lactat-Dehydrogenase 36,5 kDa Carboanhydrase 31,0 kDa Trypsin-Inhibitor 21,5 kDa Lysozym 14,5 kDa

σ

ε

Eapp =

σ = f

A

∆d

D0

ε =

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Aprotinin 6,0 kDa Insulin, B-Kette 3,5 kDa Insulin, A-Kette 2,5 kDa

Silberfärbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen Die Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen erfolgte nach der Elektrophorese mit dem kommerziellen Färbe-Kit „SilverXpress Silver Staining Kit“ (LC6100) der Fa. Invitrogen nach Herstellerangaben. Zur Dokumentation wurden die Gele mit einem Densitometer (Bio-Rad, Typ GS-710) eingescannt. • SilverXpress Silver Staining Kit

o Sensibilisierungsreagenz: enthält Glutaraldehyd o Färbelösung A: enthält Silbernitrat o Färbelösung B: enthält Ammoniumhdryid und Natriumhydroxid o Entwickler: enthält Formaldahyd und Zitronensäure o Stopper: enthält Zitronensäure

3.7.2 Gelelektrophorese zur Bestimmung von Protease-Aktivitäten Zum Nachweis von Protease-Aktivitäten wurden kommerziell erhältliche Casein-Blue-Zymogramgele der Fa. Invitrogen mit den zugehörigen Puffern nach Herstellerangaben verwendet. Das in den diskontinuierlichen Acrylamidgelen enthaltene, mit Bromphenolblau vorgefärbte Casein dient als Substrat für Proteasen (Sensibilität: 1,5 x 10-3 U Trypsin/Bande); entsprechende Aktivitäten können nach der Elektrophorese und anschließender Renaturierung der Proteine und einem Entwicklungsschritt als klare Bande im blauen Gel erkannt werden. Die Gelelektrophorese wurde wie unter 3.7.1 beschrieben durchgeführt. Die Probenvorbereitung verlief abweichend, ohne Reduzierungs-Reagenz für 10 min bei Raumtemperatur. • Gelkassetten 4 – 16 % Zymogram Casein-Blue Gel (Invitrogen, EC5415)

Dicke: 1,0 mm; Trenngel: 4 % • Renaturierungs Puffer (Invitrogen, LC2670) enthält 25 % (w/v) Triton X-100 Dieses Pufferkonzentrat wurde kurz vor Gebrauch 1:10 in A. deion. verdünnt. • Developing Puffer (Invitrogen, LC2671) enthält Tris, NaCl, CaCl2, Brij 35 Dieses Pufferkonzentrat wurde kurz vor Gebrauch 1:10 in A. deion. verdünnt. • Markerproteine (Prestained SDS Molecular Weight Standard Mixture; Sigma, SDS-7B)

α-Macroglobulin 180,0 kDa β-Galactosidase 116,0 kDa Fructose-6-Phosphatkinase 84,0 kDa Pyruvatkinase 58,0 kDa Fumarase 48,5 kDa Lactat-Dehydrogenase 36,5 kDa Triosephosphat-Isomerase 26,6 kDa

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Färbung mit Coomassie Brilliantblau Zur Färbung von Casein-Blue Zymogramgelen nach der Elektrophorese wurde das kommerzielle Färbe-Kit „SimplyBlueTM SafeStain“ (Invitrogen, LC6060) nach Herstellerangaben verwendet. Zur Dokumentation wurden die Gele mit einem Densitometer (Bio-Rad, Typ GS-710) eingescannt. • SimplyBlueTM SafeStain

enthält Coomassie G-250

3.8 Chromatographische Methoden 3.8.1 Analytische Gelsiebchromatographie von zellfreien EPS-Lösungen Vorgequollenes Sephacryl S-500 High Resolution (Pharmacia) wurde dreimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl gewaschen. Anschließend wurde das Gel/Puffer-Volumenverhältnis auf ca. 3:1 eingestellt, das Gel mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe entgast und mittels eines Packreservoirs in eine Chromatographiesäule geschichtet. Die Packung erfolgte für 2 h bei einer Flußrate von 50 ml/h und anschließend für 1 h bei einer Flussrate von 70 ml/h. Es wurden folgende Versuchsbedingungen verwendet: Säulendurchmesser: 1,6 cm Gelbetthöhe: 92 cm Gelbettvolumen: 185 ml Flussrate: 15 ml/h Elutionsmittel: 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl Fraktionsvolumen: 2,0 ml Anzahl der Fraktionen: 124 Probenvolumen: 5 ml Dextrane zur Kalibrierung: Dextran 5 – 40 x 106 Da Sigma D-5501 Dextran 2,0 x 106 Da Sigma D-5376 Dextran 2,5 x 105 Da Pharmacia T250 Dextran 1,1 x 105 Da Pharmacia T110 Dextran 4,0 x 104 Da Pharmacia T40 Dextran 2,0 x 104 Da Pharmacia T20 Dextran 1,05 x 104 Da Sigma D-9260 Proteine zur Kalibrierung (HMW Gel Filtration Calibration Kit; Amersham Pharmacia Biotech UK Limeted, 17-0441-01): Thyroglobulin 669 kDa Ferritin 440 kDa Katalase 232 kDa Aldolase 158 kDa

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Die Säule wurde mit ca. dem 3-fachen Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl bei einer Flussrate von 15 ml/h äquilibriert. Das Ausschlussvolumen der Säule wurde mit einem hochmolekularen Dextran (Sigma, technisch; mittleres Molekulargewicht: 5 – 40 x 106) ermittelt. Dazu wurde 2 ml Dextran-Lösung in 0,14 M NaCl-Lösung (2,5 mg/ml) aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl eluiert. In den aufgefangenen Fraktionen wurde die Kohlenhydratkonzentration (3.4.2) bestimmt. Anschließend wurde die Säule mit ca. 555 ml Eluenten gewaschen. Kalibriert wurde die Säule mit verschiedenen hochmolekularen Dextranen (2,5 mg/ml in 0, 14 M NaCl-Lösung) und verschiedenen Proteinen (5 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl). Es wurden jeweils 2,0 ml der Lösungen auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Lösung, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl eluiert und in den Fraktionen der Kohlenhydratgehalt (3.4.2) bzw. die Proteinkonzentration (3.4.1) bestimmt. Zwischen den einzelnen Läufen wurde die Säule jeweils mit 3-fachem Säulenvolumen an Eluenten gewaschen. Zur Bestimmung der Elutionsprofile von EPS-haltigen, sterilfiltrierten Kulturüberständen von Agar-Biofilmen auf PIA (3.1.2.2) wurde je 5 ml EPS-haltiger Überstand (3.1.4) aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,2 M NaCl eluiert. In den aufgefangenen Fraktionen wurden dann jeweils photometrisch die Kohlenhydratkonzentration (3.4.2), die Uronsäurekonzentration mit dem Biphenyl-Test (3.4.3.1) und die Proteinkonzentration über die Absorption bei 280 nm bestimmt. Zusätzlich wurden Lipase-, Esterase- und Protease-Aktivitäten mittels Substratagarplatten (3.5.2) und Phosphatase-Aktivitäten fluorimetrisch mit MUF-Phosphat als Substrat (3.5.4.1) bestimmt. 3.8.2 Gelsiebchromatographie von Lipasen an Sephacryl S-500HR Vorgequollenes Sephacryl S-500 High Resolution (Pharmacia) wurde dreimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 gewaschen. Das Gel/Puffer-Volumenverhältnis wurde auf ca. 3:1 eingestellt, das Gel mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe entgast und mittels eines Packreservoirs in eine Chromatographiesäule geschichtet und für 2 h bei einer Flußrate von 20 ml/h und anschließend für1 h bei einer Flußrate von 30 ml/h gepackt. Es wurden folgende Versuchsbedingungen verwendet: Säulendurchmesser : 1,0 cm Gelbetthöhe : 37 cm Gelbettvolumen: 29,1 ml Flussrate: 20 ml/h Äquilibrierungspuffer: 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 Elutionsmittel: 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5

1% (v/v) Triton X-100 in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 Fraktionsvolumen: 1,0 ml Anzahl der Fraktionen: 75 Probenvolumen: 1,0 ml Die Säule wurde mit ca. 3-fachem Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 äquilibriert. Das Ausschlußvolumen der Säule wurde mit einem hochmolekularen Dextran (Sigma, technisch; mittleres Molekulargewicht: 5 x 106 – 40 x 106) ermittelt. Dazu wurde 1 ml Dextran-

3 Methoden

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Lösung (2 mg/ml) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. In den aufgefangenen Fraktionen wurde die Kohlenhydratkonzentration (3.4.2) bestimmt. Anschließend wurde die Säule mit ca. 90 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen. Für die Versuche wurden Kulturüberstände von LB-Flüssigkulturen (3.1.2.1) und gereinigte Lipase A aus P. aeruginosa PAO1 verwendet. 0,5 ml Lipase in A. deion. (0,36 µg/ml) bzw. LB-Kulturüberstände wurden mit 0,5 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bzw. mit verschiedenen Polysacchariden in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 (2 mg/ml) in Plastikröhrchen vermischt und 30 in bei 30 °C im Wasserbad vorinkubiert. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurden je 1,0 ml dieser Lösungen auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bzw. mit 1 % (v/v) Triton X-100 in demselben Puffer eluiert. In allen aufgefangenen Fraktionen wurde die Lipase-Aktivität im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und der Kohlenhydratgehalt (3.4.2) bestimmt. In einigen Versuchen mit Lipopolysaccharid wurde anstelle des Kohlenhydratgehaltes der KDO-Gehalt bestimmt (3.4.5). 3.8.3 Adsorptionschromatographie von Lipasen an Glas Glasperlen (mittlerer Durchmesser 0,25 – 0,30 mm, Braun Biotech International) wurden mehrmals mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 gewaschen, entgast und in eine Chromatographiesäule gepackt. Es wurden folgende Versuchsbedingungen verwendet: Säulendurchmesser: 1,0 cm Höhe der Glasperlenschicht:: 7,0 cm Säulenvoumen: 5,5 ml Flussrate: 24 ml/h Äquilibrierungspuffer: 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 Elutionsmittel: 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5

1% (v/v) Triton X-100 in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 Fraktionsvolumen: 0,5 ml Anzahl der Fraktionen: 48 Probenvolumen: 0,2 mL Die Glasperlen wurden mit ca. 3-fachem Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 äquilibriert. Das Ausschlussvolumen wurde mit Dextran Blue 2000 (Pharmacia, mittleres Molekulargewicht: 2,0 x 106 Da) bestimmt. Dazu wurde 0,2 ml Dextran-Lösung (2 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. In den aufgefangenen Fraktionen wurde die Kohlenhydratkonzentration (3.4.2) bestimmt. Anschließend wurde die Säule mit ca 20 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen. Für die Versuche wurden Kulturüberstände von LB-Flüssigkulturen (3.1.2.1) und gereinigte Lipase A aus P. aeruginosa PAO1 verwendet. 0,25 ml Lipase in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 (3,6 µg/ml) bzw. LB-Kulturüberstände wurden mit 0,25 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bzw. mit verschiedenen Polysacchariden (2 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) in Plastikröhrchen vermischt und 30 in bei 30 °C im Wasserbad vorinkubiert. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurden je 0,2 ml dieser Lösungen auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer; pH 7,5 bzw. mit 1 % (v/v) Triton X-100 in demselben Puffer eluiert. In allen aufgefangenen Fraktionen wurde die Lipase-Aktivität im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und

3 Methoden

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der Kohlenhydratgehalt (3.4.2) bestimmt. In einigen Versuchen mit Lipopolysaccharid wurde anstelle des Kohlenhydratgehaltes der KDO-Gehalt bestimmt (3.4.5). Nachdem Triton X-100 als Elutionsmittel verwendet wurde, wurde eine neue Säule mit frischen Glasperlen verwendet. 3.9 Bestimmung von Lipase-Polysaccharid-Wechselwirkungen 3.9.1 Mikrotiterplatten-Bindungstest Die Bindung von Lipasen an Alginat und andere Polysaccharide wurde mit einem Mikrotiterplatten-Bindungs-Assay (MTBA) untersucht. Die verwendeten Polysaccharide wurden zuvor nach 3.3.2 gereinigt und vor dem Einsetzen in den Test 15 min bei 90 °C inkubiert, um mögliche noch vorhandene Enzyme zu inaktivieren. Nach der Hitzebehandlung wurden die Polysaccharide auf Eis abgekühlt und abschließend wieder auf Raumtemperatur gebracht. • verwendete Kohlenhydrate: gereinigtes Algenalginat (Manucol LHF) gereinigtes Alginat von P. aeruginosa SG81 gereinigtes Dextran gereinigtes Xanthan gereinigte Hyaluronsäure gereinigtes Levan Lipopolysaccharid (LPS, Serotyp 10) Es wurden je 100 µl verschieden konzentrierter Polysaccharid-Lösungen (0 µg/ml bis 5 mg/ml in 0,14 M NaCl-Lösung) in die Vertiefungen von sterilen Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten (Polystyrol, Nalgene Nunc) gefüllt und über Nacht bei 36 °C inkubiert. Es wurden mindestens Vierfach-Bestimmungen durchgeführt. Die so immobilisierten Polysaccharide wurden einmal mit 200 µl A.deion. gewaschen, um überschüssiges NaCl zu entfernen. Anschließend wurden je 20 µl einer aus P. aeruginosa PAO1 gereinigten Lipase A (0,36 µg/ml in A. dest.) zugegeben. Nach Inkubation für 30 min bei 30 °C wurde zweimal mit je 100 µl A. deion. gewaschen, um nicht gebundene Lipase zu entfernen. Um sicher zu stellen, dass es sich um reine Bindungsphänomene und nicht um Interhasen-Aktivierung der Lipase handelt, wurde in einigen Experimenten auf diese Waschschritte verzichtet. Die gebundene Lipase wurde indirekt über Aktivitätsmessung in der Mikrotiterplatte quantifiziert. Dazu wurden je 20 µl A. deion. in die Vertiefungen pipettiert und die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 240 µl Substratemulsion gestartet (3.5.3.3). Die enzymatische Spaltung des Substrates pNPP wurde im Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 37 °C über einen Zeitraum von bis zu 60 min bei einer Absorptionswellenlänge von 405 nm verfolgt.

3 Methoden

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3.9.2 Thermische Behandlung von Lipasen Die Stabilisierung von Lipasen durch Wechselwirkungen mit Polysacchariden wurde anhand des Schutzes durch Polysacchride vor Inaktivierung der Lipase durch Hitze untersucht. Die verwendeten Polysaccharide wurden zuvor nach 3.3.2 gereinigt und vor dem Einsetzen in den Test 15 min bei 90 °C inkubiert, um mögliche noch vorhandene Enzyme zu inaktivieren. Nach der Hitzebehandlung wurden die Polysaccharide auf Eis abgekühlt und abschließend wieder auf Raumtemperatur gebracht. • verwendete Kohlenhydrate: gereinigtes Algenalginat (Manucol LHF) gereinigtes Alginat von P. aeruginosa SG81 gereinigtes Alginat von P. aeruginosa SG81, deacetyliert gereinigtes Alginat von P. aeruginosa FRD1 gereinigtes Alginat von P. aeruginosa FRD1153 gereinigtes Dextran gereinigtes Xanthan Es wurde ein Volumen gereinigte Lipase A aus P. aeruginosa PAO1 (36 ng/ml in A. deion.) mit einem Volumen Kohlenhydrat-Lösung (2 mg/mL in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) in Plastikröhrchen vermischt und 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend wurden die Ansätze für verschiedene Zeiten (bis 60 min) im Wasserbad bei verschiedenen Temperaturen (37°C; 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Ansätze auf Eis gestellt und die Lipase-Aktivität mit pNPP als Substrat im Mikrotiterplatten-Maßstab bestimmt (3.5.3.3). Als Kontrolle dienten Ansätze, die 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 anstatt einer Kohlenhydrat-Lösung enthielten. Die Versuche wurden mindestens dreimal durchgeführt.

4 Ergebnisse

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4. ERGEBNISSE Die Mehrzahl aller Mikroorganismen lebt sessil in Form von Biofilmen. In den letzten 100 Jahren Forschung wurde die Physiologie von Mikroorganismen allerdings fast ausschließlich in Flüssigkulturen untersucht. Erst in den letzten Jahren wurde Bedeutung von Biofilmen für technische Systeme und in Bezug auf die Pathogenität von Bakterien bei Infektionsgeschehen erkannt. Die physiologischen Abläufe innerhalb des Biofilms sind allerdings bisher noch nicht bis ins Letzte verstanden. P. aeruginosa ist ein typischer Biofilmkeim, der eine Vielzahl extrazellulärer Enzyme produziert (z. B. Bhatti und Ingram, 1982; Poole und Hancock, 1983; Huang et al., 1995; Jaeger et al., 1996; Martinez et al., 1999; Wilhelm et al., 1999). Ungeklärt blieb bisher, ob P. aeruginosa diese extrazellulären Enzyme auch im Biofilm produziert, wo diese Enzyme innerhalb der EPS-Matrix lokalisiert sind und ob sie möglicherweise Wechselwirkungen mit anderen EPS-Bestandteilen eingehen. Auch nicht geklärt ist, ob extrazelluläre Enzyme eine Rolle bei der Entwicklung von Biofilmen und der Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur spielen und ob sie die Zusammensetzung und die Eigenschaften der EPS modifizieren können. Diese Fragen sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel von verschiedenen extrazellulären und äußere Membran gebundenen lipolytischen Enzymen (LipA, LipC und EstA) und einer extrazellulären Protease (LasB) untersucht werden. Ausgangspunkt der Untersuchungen war das mucoide Umweltisolat P. aeruginosa SG81, welches sich durch eine Überproduktion von Alginat auszeichnet (Grobe et al., 1994). Angelehnt an die herrschenden Bedingungen bei Infektionen, welche im Allgemeinen als Biofilmbildung an der Grenzfläche zwischen fester und gasförmiger Phase angesehen werden können, wurden Modellbiofilme in Form konfluenten Bewuchses auf Agaroberflächen (Agar-Biofilme) bzw. auf der Oberfläche von Polycarbonat-Membranfiltern, die auf Agar-Nährmedien gelegt wurden (Membranfilter-Biofilme), etabliert (Wingender et al., 2001; Steinberger et al., 2002; Strathmann 2003). Um zu überprüfen, ob sich diese Biofilme für die geplanten Untersuchungen eignen, wurden zunächst die Eigenschaften des Ausgangsstamms P. aeruginosa SG81 unter diesen Anzuchtbedingungen untersucht. 4.1. Physiologische Charakterisierung des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81 4.1.1 Wuchseigenschaften in Modellbiofilmen Um einen Überblick über die Wuchseigenschaften von P. aeruginosa SG81 in dem gewählten Biofilmmodell zu erhalten, wurden zum einen Agar-Biofilme in Form konfluenter Bakterienrasen auf PIA und zum anderen Membranfilter-Biofilme (3.1.2.2) bis zu 7 Tage bei 36 °C angezüchtet. Zur Bebrütung der Membranfilter-Biofilme wurden je drei Membranfilter der Größe 4,9 cm2 auf die Agar-Oberfläche (PIA) einer Petrischale mit einer Fläche von 57,0 cm2 gelegt. Zur Quantifizierung der Biofilme wurde das Feuchtgewicht des Schleims, die Trockenmasse und die Zellzahl im Biofilm bestimmt. Zur Bestimmung der Zellzahl wurde der Bewuchs von den Aufwuchsflächen abgekratzt und 1:16 (w/v) in steriler NaCl-Lösung suspendiert. Anschließend wurde die Zellzahl dieser Biofilmsuspensionen mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Die Trockenmasse wurde nach DIN EN 12880 bestimmt (3.1.5) und repräsentiert den organischen und anorganischen Anteil der Biofilme. Der daraus ermittelte Trockengewichtsanteil gibt den prozentualen Anteil der Trockenmasse von der Feuchtmasse wieder und lässt letztlich Rückschlüsse auf den Wassergehalt des Biofilms zu.

4 Ergebnisse

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Wie in Abbildung 8a-d zu erkennen, zeigten die Agar-Biofilme über den Bebrütungszeitraum von 24 h zu 168 h einen linearen Anstieg aller ermittelten Parameter. Die Population wuchs in den ersten 24 h auf eine Zellzahl von 1,75 x 109 Zellen/cm2 an. Bei weiterer Bebrütung bis 168 h stieg die Zellzahl nochmal auf etwa den doppelten Wert von 3,73 x 109 Zellen/cm2 an (Abbildung 8a). Auch die Feuchtmasse verdoppelte sich von 30 mg/cm2 bei 24 h auf 60 mg/cm2 bei 168 h (Abbildung 8b). Die Trockenmasse stieg sogar um das 3,7fache an (Abbildung 8c), während der Trockengewichtsanteil nur um das 1,3fache anstieg (Abbildung 8d). Dies bedeutet, dass über den Bebrütungszeitraum von 168 h der Wassergehalt im Biofilm realtiv konstant bleibt, während die Biomasse steigt. Bei den Membranfilter-Biofilmen konnte ein etwas anderer Kurvenverlauf beobachtet werden. Dort stieg die Zellzahl schon in den ersten 48 h auf einen Maximalwert von 6,5 x 109 Zellen/cm2 an, der dann bei weiterer Bebrütung des Biofilms relativ konstant blieb (Abbildung 8a). Auch die Feuchtmasse der Membranfilter-Biofilme zeigte schon nach 48-stündiger Bebrütung einen maximalen Wert von 80 mg/cm2 (Abbildung 8b), was zum einen auf ein schnelleres, zum anderen auf ein vermehrtes Wachstum der Zellen auf den Membranfiltern schließen lässt. Die Trockenmasse dagegen einen stetigen Anstieg von 2,3 mg/cm2 bei 24 h auf 7,3 mg/cm2 bei 168 h (Abbildung 8c). Der Trockengewichtsanteil erwies bei den beiden Kultivierungsmethoden identisch, was auf einen vergleichbaren Wassergehalt der Biofilme schließen lässt. Generell zeigten die Membranfilter-Biofilme im Vergleich zu den Agar-Biofilmen über die gesamte Bebrütungsdauer von 168 h, sowohl höhere Zellzahlen, wie auch höhere Feucht- und Trockenmassen pro cm2 Aufwuchsfläche.

Abbildung 8: Entwicklung von Biofilmen von P. aeruginosa SG81 in Abhängigkeit von der Kultivierungsmethode. Die Anzucht erfolgte auf Polycarbonat-Membranfiltern ( ) bzw. direkt auf der Oberfläche von PIA-Nährmedien (•) bei 36 °C für 24 h bis 168 h. a) Zellzahl b) Feuchtgewicht c) Trockenmasse d) Trockengewichtsanteil. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Untersuchungen. Die Trockenmasse wurde jeweils nur einmal bestimmt und zur Ermittlung des Trockengewichtsanteils auf die Feuchtmasse bezogen. (Die in dieser Abbildung zusammengestellten Daten resultieren aus einer Zusammenarbeit mit Dr. M. Strathmann).

0102030405060708090

100

0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit (h)

Feu

chtm

asse

(mg/

cm2 )

012345678

0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit (h)

Tro

cken

mas

se (

mg/

cm2)

0123456789

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4 Ergebnisse

80

4.1.2 EPS-Zusammensetzung Bei beiden Anzuchtbedingungen konnten für biochemische Analysen ausreichende Mengen an Biomasse gewonnen werden. Zur EPS-Isolierung wurde diese Biomasse 1:16 (w/v) in 0,14 M NaCl-Lösung suspendiert und die Zellen mittels Zentrifugation und Membranfiltration der Überstände (Celluloseacetat, Porendurchmesser 0,2 µm, Fa. Sarstedt) entfernt (3.1.4). Die zellfreien EPS-Lösungen wurden mit verschiedenen photometrischen Tests auf ihre biochemische Zusammensetzung hin untersucht (3.4.1 – 3.4.3). Die Ergebnisse sind in Abbildung 9 dargestellt. Es zeigte sich, dass die EPS von P. aeruginosa SG81 neben Kohlenhydraten, die zum größten Teil aus Uronsäuren (Alginat) bestanden, deutliche Mengen an Proteinen aufwiesen. Der Proteingehalt in den zellfreien EPS-Lösungen der Agar-Biofilmen betrug nach 24 h 556 µg/ml und stieg bei längerer Bebrütungsdauer nur noch schwach auf 636 µg/ml an (Abbildung 9a). Bei der Anzucht auf Membranfiltern betrug der maximale extrazelluläre Proteingehalt nach 24 h 524 µg/ml und blieb bei weiterer Bebrütung konstant. Der zeitliche Verlauf der Konzentration extrazellulärer Kohlenhydrate in den zellfreien EPS-Lösungen war bei beiden Kultivierungsmethoden gleich (Abbildung 9c). Die Konzentration stieg von etwa 1400 µg/ml bei 24 h auf 1800 µg/ml bei 168 h Bebrütung an. Die Kohlenhydrate bestanden zum größten Teil aus Uronsäuren. Bei beiden Kultivierungsverfahren betrug der Uronsäure-Anteil innerhalb der Kohlenhydratfraktion nach 24 h etwa 80 %. Dieser stieg bei 48-stündiger Bebrütung sogar noch weiter auf etwa 93 %, um bei längerer Bebrütungszeit wieder abzufallen auf 65 % bei Agarbiofilmen bzw. sogar nur 45 % bei Membranfilter-Biofilme. Dies weist darauf hin, dass in späteren Wachstumsphasen neben dem Alginat noch anderes extrazelluläres, uronsäurefreies, Kohlenhydrat-haltiges Material von P. aeruginosa SG81 gebildet wird. Der Uronsäuregehalt in den EPS-haltigen Filtraten zeigte bei den beiden Kultivierungsmethoden einen unterschiedlichen Verlauf (Abbildung 9e). Bei Membranfilter-Biofilmen sank die extrazelluläre Uronsäurekonzentration mit steigender Bebrütungsdauer von 1098 µg/ml auf 788 µg/ml relativ linear ab. Bei den direkt auf Agaroberflächen angezüchteten Biofilmen sank die Uronsäurekonzentration zwar auch zunächst von 1133 mg/ml auf 841 µg/ml ab, stieg aber im Folgenden wieder auf 1262 µg/ml an. Bezogen auf die Zellzahl ergab sich ein etwas anderes Bild (Abbildung 9b,d,f). Da die auf Membranfiltern angezüchteten Biofilme eine höhere Zellzahl aufwiesen als die Agar-Biofilme (Abbildung 9a), erwies sich die EPS-Produktion bei Membranfilter-Biofilmen geringer als bei Agar-Biofilmen. Der Verlauf der Kurven war allerdings bei beiden Kultivierungsmethoden relativ identisch. Auffällig war, dass Unterschiede zwischen den beiden Kultivierungsmethoden, sowohl in der Zellzahl, als auch bei der gesamten Biomasse und der EPS-Produktion, bei 24 h alten Biofilmen am geringsten waren.

4 Ergebnisse

81

Abbildung 9: Zusammensetzung der EPS von P. aeruginosa SG81-Biofilmen über die Zeit in Abhängigkeit von der Kultivierungsmethode. Die Anzucht erfolgte auf Polycarbonat-Membranfiltern ( ) bzw. direkt auf der Oberfläche von PIA-Nährmedien (•) bei 36 °C für 24 h bis 168 h. a, b) Proteinkonzentration, c, d) Kohlenhydratkonzentration, e, f) Uronsäurekonzentration. a, c, e) bezogen auf ml zellfreie EPS-Lösung, b, d, f) bezogen auf die Zellzahl in den Biofilmsuspensionen. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Untersuchungen. (Die in dieser Abbildung zusammengefassten Daten entstammen einer Zusammenarbeit mit Dr. M. Strathmann.) 4.1.3 Extrazelluläre Enzymaktivitäten In den untersuchten zellfreien EPS-Lösungen konnten Kohlenhydrate, die zum größten Teil aus Alginat bestanden und ein signifikanter Anteil an Proteinen nachgewiesen werden (4.1.2). Zu untersuchen galt, ob es sich zumindest bei einem Teil der Proteine um extrazelluläre Enzyme handelt. Es wurden Protease-Aktivitäten mit Azocasein als Substrat (3.5.3.1), die Aktivität alkalischer Phosphatase mit para-Nitrophenylphosphat (pNP-Phosphat; 3.5.3.5), die Lipase-Aktivität mit para-Nitrophenylpalmitat (pNPP; 3.5.3.3), die Phospholipase C-Aktivität mit para-Nitrophenylphosphorylcholin (pNPPC; 3.5.3.4) und die Aktivität von Esterasen mit Fluoresceindiacetat als Substrat (FDA; 3.5.3.2) photometrisch in den zellfreien EPS-Lösungen bestimmt.

0

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0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit (h)

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4 Ergebnisse

82

Es zeigte sich, dass die zellfreien EPS-Lösungen von Biofilmen beider Kultivierungsmethoden nachweisbare Aktivitäten extrazellulärer Enzyme aufwiesen (Abbildung 10a-e). Sowohl bei den auf Agar, als auch bei den auf Membranfiltern angezüchteten Biofilmen konnte nach 24-stündiger Bebrütungszeit eine spezifische Protease-Aktivität von etwa 12 EU/mg Protein in den zellfreien EPS-Lösungen nachgewiesen werden (Abbildung 10a). In den zellfreien EPS-Lösungen von Agar-Biofilmen stieg diese bei weiterer Bebrütung bis zu 168 h auf 25 EU/mg Protein an. Die Membranfilter-Biofilme zeigten sogar einen stärkeren Anstieg der extrazellulären Protease-Aktivität auf 40 EU/mg Protein. Insgesamt wiesen die auf Agar angezüchteten Biofilme im Vergleich zu den Membranfiltern-Biofilmen nach 48 h Bebrütung nur etwa 70 % der extrazellulären, spezifischen Protease-Aktivitäten auf. Die nachweisbare, extrazelluläre, spezifische Phosphatase-Aktivität (Abbildung 10b) sank bei den Membranfilter-Biofilmen relativ linear von 0,73 nkat/mg Protein bei 24 h auf 0,40 nkat/mg Protein bei 168 h ab. Auch bei den Agar-Biofilmen sank die spezifische Phosphatase-Aktivität über die Bebrütungszeit von 0,52 nkat/mg Protein auf 0,20 nkat/mg Protein ab. Generell konnten in den zellfreien EPS-Lösungen von Agar-Biofilmen nur 50 % der Phosphatase-Aktivitäten in Relation zu den extrazellulären Aktivitäten von Membranfilter-Biofilmen nachgewiesen werden. Die extrazelluläre, spezifische Lipase-Aktivität (Abbildung 10c) stieg bei den Agar-Biofilmen auf 0,19 nkat/mg Protein bei 48-stündiger Bebrütung an, um bei weiterer Bebrütung bis zu 168 h auf 0,09 nkat/mg Protein abzufallen. Bei den Membranfilter-Biofilmen dagegen stieg die Lipase-Aktivität zunächst von 0,20 nkat/mg Protein bei 24 h auf 0,24 nkat/mg Protein an. Demnach war die extrazelluläre, spezifische Lipase-Aktivität der Agar-Biofilme bei 168 h um 65 % niedriger als bei den Membranfilter-Biofilmen. Die spezifische Aktivität von Phospholipasen C in den zellfreien EPS-Lösungen von Membranfilter-Biofilmen stieg über die Bebrütungsdauer von 168 h auf 3,3 nkat/mg Protein (Abbildung 10d). Der Anstieg der Phospholipase C-Aktivität in den EPS-haltigen Filtraten von Agar-Biofilmen war deutlich geringer. Sie sank sogar zunächst von 2,0 nkat/mg Protein auf 0,9 nkat/mg Protein ab um anschließend nur noch auf 1,6 nkat/mg Protein anzusteigen. Die Phospholipase C-Aktivität war demnach bei den beiden Kultivierungmethoden nur bei 24 h vergleichbar. Bei längerer Bebrütung konnte in den Agar-Biofilmen nur etwa 50 % der Aktivität im Vergleich zu den Membranfilter-Biofilmen nachgewiesen werden. Im Fall der spezifischen Esterase-Aktivität zeigten die Biofilme beider Kultivierungsmethoden bis 72 h den selben Verlauf (Abbildung 10e). Die spezifische Aktivität in den zellfreien EPS-Lösungen stieg von etwa 0,0015 nkat/mg Protein bei 24 h auf 0,003 nkat/mg Protein bei 72 h an. Bei den Membranfilter-Biofilmen konnte anschließend ein nochmaliger Anstieg auf 0,006 nkat/mg Protein beobachtet werden, während die spezififsche Esterase-Aktivität von Agar-Biofilmen konstant blieb. Demnach konnte nach 168 h nur etwa die Hälfte an extrazellulärer Esterase in den Agar-Biofilmen im Vergleich zu den Membranfilter-Biofilmen nachgewiesen werden. Prinzipiell konnte man beobachten, dass die extrazellulären, spezifischen Enzymaktivitäten in Agar-Biofilmen, besonders bei längeren Bebrütungszeiten, deutlich geringer waren als bei Membranfilter-Biofilmen. Der tendenzielle Verlauf der einzelnen Enzym-Aktivitäten über die Bebrütungsdauer war unterschiedlich. Die spezifischen Aktivitäten von Proteasen und lipolytischen Enzymen, wie Lipase, Esterase und Phospholipase C stiegen an. Einzige Ausnahme war die Lipase-Aktivität in Agar-Biofilmen, welche zwar zunächst anstieg, dann aber abfiel. Die spezifische Phosphatase-Aktivität fiel bei beiden Kultivierungsmethoden ab.

4 Ergebnisse

83

Abbildung 10: Extrazelluläre Enzymaktivitäten von P. aeruginosa SG81-Biofilmen über die Zeit in Abhängigkeit von der Kultivierungsmethode. Die Anzucht erfolgte auf Polycarbonat-Membranfiltern ( ) bzw. direkt auf der Oberfläche von PIA-Nährmedien (•) bei 36 °C für 24 h bis 168 h. a) Protease-Aktivität b) Phosphatase-Aktivität c) Lipase-Aktivität d) Phospholipase C-Aktivität e) Esterase-Aktivität. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei unabhängigen Untersuchungen. (Die in dieser Abbildung zusammengestellten Daten entstanden in Zusammenarbeit mit Dr. M. Strathmann.)

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4 Ergebnisse

84

4.2 Lokalisation von extrazellulären Enzymen im Biofilm Mittels photometrischer Substrat-Verwertungs-Tests wurden Enzym-Aktivitäten von Proteasen, alkalischer Phosphatase, Lipasen, Phospholipase C und Esterasen in den EPS von im Biofilm gewachsenem P. aeruginosa SG81 nachgewiesen (4.1.3). Mit fluorigenen Enzym-Substraten sollte nun die Lokalisation dieser Enzyme innerhalb der Biofilmmatrix untersucht werden. Die in situ-Visualisierung erfolgte für die Aktivitäten von alkalischer Phosphatase, Lipase und Esterase durch die Applikation von ELF-97-Substraten (Molecular Probes) auf Membranfilter-Biofilme und anschließender Dokumentation der Enzymaktivitäten mit der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM). Die löslichen Enzym-Substrate ELF-97-Phosphat, ELF-97-Palmitat und ELF-97-Acetat werden bei entsprechender Enzymaktivität gespalten, wobei direkt am Reaktionsort der wasserunlösliche ELF-97-Alkohol zu fluoreszierenden Kristallen präzipitiert (Singer et al., 1994, Haugland, 1995). Für die Untersuchungen wurden Membranfilter-Biofilme nach 3.1.2.2 für 24 h, 48 h und 72 h bei 36 °C angezüchtet. Sie bieten den Vorteil, dass sie zerstörungsfrei von dem Agarnährmedium abgenommen, mit den Enzym-Substraten versetzt in das Mikroskop eingebracht und betrachtet werden können. Die Verwendung der Substrate und die Inkubation erfolgte wie unter 3.5.5 beschrieben. Zusätzlich erfolgte eine Färbung der Zellen mit SYTO 9 (3.1.2.2), um zwischen zellgebundenen und interzellulären Enzymaktivitäten unterscheiden zu können. Die Phosphatase-Aktivität (Abbildung 11a-c) konnte direkt an den Zellen und in relativer Nähe zu den Zellen in globulären Strukturen beobachtet werden. Wie zuvor photometrisch in den zellfreien EPS-Lösungen nachgewiesen, nahm die Phosphatase-Aktivität im Laufe des Biofilmwachstums drastisch ab, so dass nach 72 h Bebrütungszeit in situ kaum noch Phosphatase-Aktivität beobachtet werden konnte. Im Gegensatz dazu nahm die Lipase-Aktivität mit steigendem Biofilmalter zu (Abbildung 11d-f). Die mit dem ELF-97-Palmitat visualisierten Aktivitäten konnten sowohl direkt an den Zellen, als auch zunehmend interzellulär in heterogen verteilten Bereichen unterschiedlicher Größe rund um die Zellen beobachtet werden. Auch die mit dem ELF-97-Acetat visualisierten Esterase-Aktivitäten (Abbildung 11g-i) nahmen mit steigendem Biofilmalter zu. Nach 24-stündiger Bebrütungszeit konnten Esterase-Aktivitäten vornehmlich an den Zellen beobachtet werden, wobei allerdings nur ein Teil der gesamten Population angefärbt wurde. Mit zunehmendem Biofilmalter konnten vermehrt auch extrazelluläre Bereiche mit Esterase-Aktivität erkannt werden. Diese Bereiche besaßen eine wolkenartige Struktur und konnten nicht mehr mit einzelnen Zellen oder Zellklustern in Verbindung gebracht werden. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Lokalisation der extrazellulären Enzymen innerhalb der Biofilmmatrix für jedes untersuchte Enzym unterschiedlich und teilweise sehr heterogen war. Darüber hinaus erwies sich die Intensität der durch Enzymaktivitäten entstandenen Fluoreszenz über das Biofilmalter ansteigend im Fall der Phosphatase und sinkend bei Lipase- und Esterase-Aktivitäten, was den Ergebnissen der Untersuchungen an zellfreien EPS-Lösungen mit photometrischen Enzym-Aktivitäts-Tests entsprach.

4 Ergebnisse

85

Abbildung 11: Visualisierung von Enzymaktivitäten in Membranfilter-Biofilmen von P. aeruginosa SG81 mittels ELF-Substraten (rot) für alkalische Phosphatase (a-c), Lipase (d-f) und Esterase (g-i) und Zellfärbung mit SYTO 9 (grün), Überlagerung = gelb. Die Anzucht der Biofilme erfolgte bei 36 °C für (a, d, g) 24 h, (b, e, h) 48 h und (c, f, i) 72 h auf PIA. CLSM-Aufnahme (optischer Schnitt in der vertikalen Mitte des Biofilms), Vergrößerung 1000fach, Maßbalken: 20 µm. Die Dokumentation erfolgte für die ELF-Substrate durch Anregung im UV-Bereich bei 351 nm und einer Detektionswellenlänge von 505 - 550 nm und in einem gesonderten Kanal für SYTO 9 mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 505 - 530 nm. In der Abbildung sind beide Kanäle übereinander gelegt dargestellt.

a

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cb

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h

20 µm

4 Ergebnisse

86

4.3 Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Enzymen und anderen EPS- Bestandteilen 4.3.1 Gelsiebchromatographie von EPS In Kapitel 4.1.2 und 4.1.3 wurde gezeigt, dass zellfreie EPS-Lösungen von auf PIA gewachenen Biofilmen vom mucoiden Stamm P. aeruginosa SG81 Kohlenhydrate enthalten, die zum größten Teil aus Uronsäuren (Alginat) bestehen. Es konnten aber auch ein deutlicher Anteil an Proteinen in den EPS nachgewiesen werden, von dem zumindest ein Teil Enzymaktivitäten zeigte. Um eine genauere Aussage über die molekulare Zusammensetzung und ihrer Größenverteilungen zu erhalten, wurden zellfreie EPS-Lösungen des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81 nach 3.1.4 in 0,14 M NaCl-Lösung hergestellt und über Gelsiebchromatographie an Sephacryl S-500 HR untersucht. In den ersten 29 Fraktionen konnten weder Kohlenhydrate noch Proteine nachgewiesen werden. Daher wurden diese Fraktionen bei den wiederholenden Experimenten verworfen und entsprechend nur in den Fraktionen 30 bis 125 jeweils die Konzentrationen an Kohlenhydraten, Uronsäuren, Proteinen (Abbildung 12a) und die Aktivitäten von Phosphatasen, Proteasen, Lipasen und Esterasen bestimmt (Abbildung 12b). Zuvor wurde die Chromatographie-Säule mit verschiedenen Dextranen und Proteinen kalibiert. Die Elutionsmaxima der Dextrane sind in Abbildung 12a und 13a, die Elutionsmaxima der Proteine in Abbildung 12b und 13b markiert. Das Ausschlussvolumen V0 wurde mit einem hochmolekularen Dextran mit einer mittleren Molmasse von 5 – 40 x 106 Da bestimmt und konnte bei Fraktion 40 detektiert werden. Das Elutionsprofil der EPS von P. aeruginosa SG81 zeigte, dass eine vollständige Trennung von Proteinen und Kohlenhydraten nicht möglich war (Abbildung 12a); es erfolgte eine Koelution von Kohlenhydraten und Proteinen in einem weiten Bereich von Fraktion 54 – 106. Sowohl die Kohlenhydrate, inklusive Uronsäuren, als auch die Proteine zeigten eine große Heterogenität in Bezug auf ihre Molekülgrößen, was sich an den sehr breiten Peaks erkennen ließ. Zusätzlich zeigte der Kohlenhydrat- und der Uronsäure-Peak bei höheren Elutionsvolumen eine sehr langsame Konzentrationsabnahme. Die insgesamt 2,5 mg Kohlenhydrate, die von der Säule eluierten, bestanden zum größten Teil aus Uronsäuren (2,2 mg). Bei höheren Elutionsvolumen, im Bereich von Fraktion 62 bis 106 konnten allerdings auch Kohlenhydrate detektiert werden, die nicht aus Uronsäuren bestanden. Die Uronsäuren eluierten direkt nach dem Ausschlussvolumen mit einem Peakmaximum bei Fraktion 47, was verglichen mit den Elutionsmaxima der Kalibrierdextrane einem Molmasse von über 2 Mio. Da entsprach. Die Proteine eluierten in zwei breiten Peakbereichen. Der erste, größere Peak eluierte im Bereich von Fraktion 54 bis 102 mit Maximum bei 86 und ein kleinerer im Bereich von Fraktion 102 bis 125 mit einem Maximum bei 111. Erst der zweite Protein-Peak war relativ frei von Kohlenhydraten. Enzymaktivitäten konnten auch ausserhalb der Proteinpeaks nachgewiesen werden (Abbildung 12b). So wurden Phosphatase-Aktivitäten in einem symmetrischen Peak im hochmolekularen Bereich von Fraktion 42 bis 77 mit einem Maximum bei Fraktion 61 detektiert. Lipase-Aktivitäten konnten über den gesamten Elutionsbereich, ohne eindeutige Elutionspeaks nachgewiesen werden. Esterase-Aktivitäten eluierten in einem undeutlichen Peak zwischen Fraktion 64 und 95 mit einem Maximum bei etwa 77. Protease-Aktivitäten eluierten in drei Peaks, ein kleiner vor dem Ausschlussvolumen mit einem Maximum bei Fraktion 35, ein großer, breiter Peak im Bereich von Fraktion 47 bis 86 mit einem Maximum bei Fraktion 71 und ein weiterer kleiner Peak mit einem Maximum bei etwa Fraktion 97.

4 Ergebnisse

87

Abbildung 12: Gelfiltration von EPS aus P. aeruginosa SG81 an Sephacryl S-500 HR. Es wurden 5 ml zellfreie EPS-Lösungen von Agar-Biofilmen (PIA, 24 h, 36 °C) aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 mit 0,2 M NaCl eluiert. In allen Fraktionen (2 ml) wurde photometrisch der Kohlenhydrat-(3.4.2) und der Uronsäuregehalt (3.4.3.1), der Proteingehalt über die Absorption bei 280 nm, fluorimetrisch die Phosphatase-Aktivitäten (3.5.4) und mittels Substratagarplatten Lipase-, Esterase-, und Protease-Aktivitäten (3.5.2) bestimmt. Dargestellt ist das Elutionsprofil eines repräsentativen Säulenlaufes von fünf unabhängigen Experimenten.

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4 Ergebnisse

88

Die Gelfiltration von EPS-Lösungen des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81 zeigte, dass Enzymaktivitäten auch außerhalb der Protein-Peaks, im hochmolekularen Bereich eluierten, oder dass, wie im Fall der Lipase, gar keine eindeutigen Elutionspeaks beobachtet werden konnten. In der Literatur wurde beschrieben, dass Proteine Wechselwirkungen mit Polysacchariden eingehen können (z. B. Wingender, 1990; Kemmling et al, 2004). Diese Wechselwirkungen würden unter Umständen eine gemeinsame Elution von Proteinen und Polysacchariden zur Folge haben. Es galt nun zu untersuchen, ob die Elution von Enzymen im hochmolekularen Bereich, möglicherweise durch Wechselwirkungen mit dem hochmolekularen Alginat, als Hauptbestandteil der EPS bei mucoiden P. aeruginosa-Stämmen, verursacht worden sein könnten. Dazu wurden zellfreie EPS-Lösungen der nicht-mucoiden Revertante SG81R1 entsprechend der vorausgegangenen Untersuchungen durch Gelsieb-chromatographie an Sephacryl S-500 HR untersucht. Die Zusammensetzung dieser EPS ist in Tabelle 19 (4.5.6) dargestellt. Wie zu erwarten, zeigte der nicht-mucoide Stamm SG81R1 nur sehr geringe Mengen an Alginat (Abbildung 13a). Insgesamt eluierten etwa 0,16 mg Uronsäuren von der Säule, was in etwa 7,3 % der beim mucoiden Stamm SG81 nachweisbaren Uronsäuremenge entspricht. Es konnte ein kleiner Kohlenhydrat-Peak im hochmolekularen Bereich von Fraktion 31 bis 44 mit einem Maximum bei Fraktion 35 detektiert werden, der ausschließlich aus Uronsäuren zu bestehen schien (Abbildung 13a). Interessanterweise eluierte dieser Peak 5 Fraktionen vor dem entsprechenden Peak der EPS von SG81 (Abbildung 12a), was auf größere Alginatmoleküle beim Stamm SG81R1 hinweist. Ein weiterer minimaler Uronsäure-Peak konnte im mittleren Molekulargewichtsbereich von Fraktion 78 bis 91 mit einem undeutlichen Maximum bei Fraktion 85 beobachtet werden (Abbildung 13a). In diesem Bereich konnte auch ein deutlicher Kohlenhydrat Peak erkannt werden. Dieser erstreckte sich über den Bereich der Fraktionen 53 bis 102. Mit 1,3 mg eluierten beim Stamm SG81R1 etwa die Hälfte an Kohlenhydraten in Relation zu SG81 von der Säule. Kohlenhydrate und Proteine koeluieren im mittleren Molekulargewichtsbereich von Fraktion 73 bis 99, wobei der Kohlenhydrat-Peak ein undeutliches Maximum bei Fraktion 84 und der Protein Peak ein Maximum bei Fraktion 80 zeigte. Phosphatase-Aktivitäten konnten auch beim nicht-mucoiden Stamm SG81R1 im hochmolekularen Bereich nachgewiesen werden (Abbildung 13b). Im Vergleich zu dem Elutionsprofil vom SG81 eluierte die Phosphatase sogar 11 Fraktionen früher. Wechselwirkungen der Phosphatase mit dem sauren Polysaccharid Alginat konnten hier allerdings ausgeschlossen werden, da in weiten Bereichen des Phosphatase-Peaks keine Uronsäuren nachweisbar waren (Abbildung 13a). Esterase-Aktivitäten konnten in einem deutlichen Peak im Bereich von 73 bis 104 nachgewiesen werden. Damit eluierten sie im Vergleich zu den Esterasen beim Stamm SG81 (Abbildung 12b), um 9 Fraktionen später. Im Gegensatz zum Stamm SG81, bei dem Protease-Aktivitäten in drei Peaks detektiert werden konnten (Abbildung 12b), eluierte sie hier in nur einem relativ schmalen, symmetrischen Peak im Bereich von Fraktion 75 bis 97 mit einem Maximum etwa bei Fraktion 83 (Abbildung 13b). Auch die Lipase-Aktivitäten konnten beim Stamm SG81R1 im Bereich von Fraktion 75 bis 100 detektiert werden (Abbildung 13b). Allerdings konnten auch beim Stamm SG81R1 geringere Lipase-Aktivitäten vor und nach dem eigentlichen Lipase-Peak beobachtet werden, was möglicherweise auf Wechselwirkungen mit anderen EPS-Bestandteilen und/oder mit dem Säulenmaterial zurückzuführen ist. Die eindeutigen Unterschiede im Elutionsprofil von Protease- und Lipase-Aktivitäten aus den EPS er beiden Stämme laasen die Vermutung von Wechselwirkungen zwischen den Enzymen und dem Polysaccharid Alginat zu.

4 Ergebnisse

89

Abbildung 13: Gelfiltration von EPS aus P. aeruginosa SG81R1 an Sephacryl S-500 HR. Es wurden 5 ml zellfreie EPS-Lösungen von Agar-Biofilmen (PIA, 24 h, 36 °C) aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 mit 0,2 M NaCl eluiert. In allen Fraktionen (2 ml) wurde photometrisch der Kohlenhydrat-(3.4.2) und der Uronsäuregehalt (3.4.3.1), der Proteingehalt über die Absorption bei 280 nm, fluorimetrisch die Phosphatase-Aktivitäten (3.5.4) und mittels Substratagarplatten Lipase-, Esterase-, und Protease-Aktivitäten (3.5.2) bestimmt. Dargestellt ist das Elutionsprofil eines repräsentativen Säulenlaufes von zwei unabhängigen Experimenten.

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110.

000

10.0

0020

.000 Dextran-Standards (Da)

0

10

20

30

40

50

60

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Fraktionsnummer

rela

tive

Fluo

resz

enz

0

10

20

30

40

50

60

70

Phosphatase

Protease

Lipase

Esterase Hofdurchm

esser (mm

)

V0 440

669

148

232 Protein-Standards (kDa)

a

b

4 Ergebnisse

90

4.3.2 Bindung von Lipasen an Sephacryl S-500 HR Die Gelfiltration von EPS-haltigen Filtraten von P.aeruginosa SG81 zeigte, dass Lipase-Aktivitäten nicht in einem deutlichen Peak eluierten, sondern über den gesamten Fraktionsbereich zu detektieren waren Abbildung 12b; 4.3.1). Unklar blieb, ob dieses Phänomen durch Wechselwirkungen zwischen den Lipasemolekülen und dem hydrophilen, nicht-geladenen Säulenmaterial Sephacryl S-500 HR oder durch Wechselwirkungen mit EPS-Bestandteilen zustande kam. Um dieses Phänomen genauer zu untersuchen, wurden analytische Sephacryl S-500 HR-Chromatographiesäulen (Gelbettvolumen 29 ml) verwendet. Es wurde gereinigte Lipase A aus einem lipA-Überexpression-Stamm abgeleitet von P. aeruginosa PAO1 in An- und Abwesenheit von Alginat bzw. LPS auf die Säule aufgetragen und anschließend mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Nach einem Säulenvolumen (= Fraktion Nr. 30) wurde dem Elutionspuffer 1 % (w/v) des nicht-ionischen Detergenzes Triton X-100 zugesetzt, um mögliche an das Säulenmaterial gebundene Lipasemoleküle von der Säule zu eluieren. Das Ausschlussvolumen V0 wurde mit einem hochmolekularen Dextran mit einem durchschnittlichen Molmasse von 5 – 40 x 106 Da bestimmt und konnte bei Fraktion 13 detektiert werden. Zur Kalibrierung der Säule, wurden die Elutionsprofile verschiedener Proteine (High Molecular Weight Gel Filtration Kit und Low Molecular Weight Gel Filtration Kit; Fa. Amersham Pharmacia Biotech) detektiert. Das 669 kDa große Thyroglobulin eluierte bei Fraktion 11, die 232 kDa große Katalase bei Fraktion 21 und Albumin, mit einer Molmasse von 67 kDa bei Fraktion 25. Es wurde zunächst ein Elutionsprofil der gereinigten Lipase A in Abwesenheit von Alginat aufgenommen. Im Gegensatz zur Gelsieb-Chromatographie von EPS-Lösungen von P. aeruginosa SG81 (Abbildung 12b), konnte die gereinigte Lipase hier in distinken Aktivitäts-Peaks eluiert werden (Abbildung 14A). Allerdings zeigte sich, dass die Lipase heterogen in mehreren Peaks von der Säule eluierte (Abbildung 14A, Nr.1 – Nr.4). Es konnten zwei Lipase-Peaks beobachtet werden, die ohne Zugabe von Triton X-100 von der Säule eluierten. Der erste Peak kam mit dem Ausschlussvolumen V0 mit einem Maximum bei Fraktion 14. Diese Lipase-Moleküle schienen keine Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial einzugehen. Der zweite, etwas breitere Peak Nr.2 eluierte direkt dahinter mit einem Maximum bei Fraktion 19. Beide Peaks eluierten im hochmolekularen Bereich, was nicht dem erwarteten Elutionsprofil des gereinigten Proteins mit einer Molmasse von etwa 29 kDa (Stuer et al., 1986) entsprach. Insgesamt konnte in diesen beiden Peaks eine Lipase-Aktivität von ∆A405 = 12,0 nachgewiesen werden, was etwa der Hälfte der aufgetragenen Lipase-Aktivität entsprach. Weitere Lipase-Aktivitäten ließen sich nur mit Triton X-100 von der Säule eluieren, was auf eine starke Wechselwirkung zwischen den Lipasen und dem Säulenmaterial schließen ließ. Auch hier konnten zwei Peaks beobachtet werden. Ein sehr kleiner Peak (Nr. 3) eluierte mit einem Maximum bei Fraktion 46 und ein großer Peak (Nr. 4) mit einem Maximum bei Fraktion 58 und einer Gesamt-Lipase-Aktivität von ∆A405 von 10,25. Die Zugabe von Triton X-100 zum Elutionspuffer erfolgte nach einem Säulenvolumen, ab Fraktion 30. Demnach konnte Peak 3 dem Ausschlussvolumen des zweiten Säulenvolumens zugeordnet werden, Peak 4 eluierte im mittleren Bereich des des zweiten Säulenvolumens.

4 Ergebnisse

91

Abbildung 14: Gelfiltration von gereinigter Lipase A an Sephacryl S-500 HR in (A) Abwesenheit und (B) Anwesenheit von Bakterienalginat. Es wurde 0,5 ml Lipase A-Lösung (0,36 µg/ml; gereinigt aus P. aeruginosa PAO1lipA+) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit (A) 0,5 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bzw. (B) 0,5 ml Alginat-Lösung (2,0 mg/ml; gereinigt aus P. aeruginosa SG81) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 für 30 min bei 30 °C vorinkubiert, anschließend auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Ab Fraktion Nr. 30 wurde 1 % (w/v) Triton X-100 in demselben Puffer zugegeben. In allen Fraktionen (1 ml) wurde die Lipase-Aktivität mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und die Kohlenhydrat-Konzentration (3.4.2) bestimmt. Die Ergebnisse sind in angegeben als Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten. Um mögliche Wechselwirkungen zwischen LipA und bakteriellen Alginaten zu untersuchen, gereinigte Lipase in Anwesenheit von Baketerienalginat auf die Säule gegeben und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Das Elutionsprofil ist in Abbildung 14B dargestellt. Das hochmolekulare Alginat eluierte in einem 17 Fraktionen breiten Peak mit einem Maximum bei Fraktion 20, direkt nach dem Ausschlussvolumen V0 von der Säule. Es konnten im Gegensatz zu dem Elutionsprofil von gereinigter Lipase in Abwesenheit von Alginat (Abbildung 14A) nur zwei deutliche Lipase-Aktivitäts-Peaks beobachtet werden (Abbildung 14B). Der erste heterogene Peak erstreckte sich von Fraktion 12 bis 29 mit zwei Maxima bei Fraktion 18 bzw.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80Fraktionsnummer

Lipa

se-A

ktiv

ität (

∆A

405)

Triton X-100V0

-10

0

10

20

30

40

50

60

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80

0 10 20 30 40 50 60 70

Fraktionsnummer

Koh

lenh

ydra

t-Kon

zent

ratio

n (µ

g/m

L)

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5AlginatLipase Lipase-A

ktivität ( ∆A405 )

Triton X-100V0

B

A

4 Ergebnisse

92

23 und konnte somit im selben Bereich wie der Alginat-Peak detektiert werden (Abbildung 14B). Die Gesamt-Lipase-Aktivität dieses Peaks lag mit ∆A405 = 15 um etwa 25 % höher als die der zwei ersten Peaks des Lipase-Elutions-Profil in Abwesenheit von Alginat (Abbildung 14A). Nach Zugabe von Triton X-100 zum Elutionspuffer konnte der in Abwesenheit von Alginat zu beobachtende Peaks Nr. 3 gar nicht detektiert werden. Der Peak Nr. 4 eluierte zwar im selben Elutionsbereich, war allerdings um 4 Fraktionen schmaler und zeigte mit einem Maximum von ∆A405 = 1,25 und einer Gesamt-Aktivität von ∆A405 = 3,6 eine um 70% verringerte Lipase-Aktivität in Relation zum Peak Nr.4 Abwesenheit des Alginates. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zumindest ein Teil der Lipase-Moleküle Wechselwirkungen mit dem Bakterienalginat einzugehen scheinen, um dann zusammen mit dem Alginat im hochmolekularen Bereich zu eluieren. Eine weitere Wechselwirkung die untersucht werden sollte, war die von Lipasen mit LPS. Dazu wurde eine Lösung gereinigter Lipase A 1:1 (v/v) mit einer 2 mg/ml LPS-Lösung (Serotyp 10 aus P. aeruginosa, Sigma) zusammen gegeben und für 30 min bei 30 °C vorinkubiert, anschließend auf die Säule gegeben und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. In unterschiedlichen Experimenten wurde die LPS-Konzentration in den Fraktionen zum einen über den Kohlenhydratgehalt (Abbildung 15A) und zum anderen über die KDO-Konzentration (Abbildung 15B) bestimmt. Wie in Abbildung 15A zu sehen, konnte der Kohlenhydrat-Anteil des LPS in einen distinken Peak mit einem Maximum bei Fraktion 25 detektiert werden. Zusätzlichen konnte ein sehr kleiner Peak mit einem Maximum bei Fraktion 18 beobachtet werden. KDO-Anteil des LPS (Abbildung 15B) konnte an der selben Stelle detektiert werden, wie der zuvor gemessene kleine Kohlenhydrat-Peak (Abbildung 15A). Für die Lipase zeigte sich, dass sie fast vollständig in dem Bereich des KDO-Peaks eluierte. Die in dem Lipase-Elutionsprofil in Abwesenheit von Kohlenhydraten (Abbildung 14A) zu beobachtenden Peaks Nr. 1 und 2, verschmolzen bei Zugabe von LPS zu einem Peak (Abbildung 15), der zudem etwa 7 Fraktionen schmaler war, als die beiden Peaks zusammen und mit einer relativen Lipase-Aktivität von insgesamt ∆A405 = 18,5 um etwa 50 % höher lag. Mit einem Maximum bei Fraktion 15 lag der Peak allerdings immer noch direkt hinter dem Ausschlussvolumen V0. Durch die Zugabe von Triton X-100 konnten kaum noch Lipasen von der Säule eluiert werden (Abbildung 15). Peak Nr. 3 fehlte völlig, Peak Nr. 4 eluierte 5 Fraktionen früher und entsprach mit ∆A405Gesamt = 1,3 nur 1/8 der im Lipase-Elutionsprofil (Abbildung 14A) nachweisbaren Lipase-Aktivität. Das kaum noch Lipasen mit Triton X-100 von der Säule eluiert werden konnten, wies darauf hin, dass die Lipasen, die zuvor Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial eingegangen waren, nun anscheinend zusammen mit den LPS-Molekülen eluierten, woraus sich schließen ließ, dass die Lipase A anscheinend eine höhere Affinität zum LPS als zu Sephacryl S-500 HR besitzt.

4 Ergebnisse

93

Abbildung 15: Gelfiltration von gereinigter Lipase A in Gegenwart von LPS an Sephacryl S-500 HR. Es wurde 0,5 ml LPS-Lösung (2,0 mg/ml; aus P. aeruginosa; Serotyp 10; Sigma) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 mit 0,5 ml Lipase A-Lösung (0,36 µg/ml aus P. aeruginosa PAO1lipA+) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 für 30 min bei 30 °C vorinkubiert, anschließend auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Ab Fraktion Nr. 30 wurde 1 % (w/v) Triton X-100 zugegeben. In allen Fraktionen (1 ml) wurde die Lipase-Aktivität mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und (A) die Kohlenhydrat-Konzentration (3.4.2) bzw. (B) die KDO-Konzentration (3.4.5) bestimmt. Ergebnisse sind dargestellt als repräsentativer Säulenlauf von drei unabhängigen Experimenten. 4.3.3 Bindung von Lipasen an Glas Die Chromatographie von Lipasen an Sephacryl S-500 HR zeigte, dass Lipase-Moleküle anscheinend eine geringe Wechselwirkung mit Bakterienalginat und eine starke Wechselwirkung mit dem KDO-haltigen Teil von Lipopolysacchariden (= Kern-Region des LPS) eingehen. Eine weitere Möglichkeit Wechselwirkungen zwischen Lipase-Molekülen und EPS-Bestandteilen zu untersuchen, besteht über die Bindung von Lipasen an Glas, die von Wingender (1990) beschrieben wurde. Es wurde gezeigt, dass angereicherte Exolipase aus Kulturüberständen von P. aeruginosa B104 mit unbehandelten Glasperlen interagiert. Diese Interaktion konnte durch das nicht-ionische Detergenz Triton X-100 unterbunden und mit

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Fraktionsnummer

KD

O-K

onze

ntra

tion

(µg/

mL)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Lipase-Aktivität ( ∆A

405 )

LPSLipase

Triton X-100V0

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 10 20 30 40 50 60 70Fraktionsnummer

Koh

lenh

ydra

t-Kon

zent

ratio

n (µ

g/m

L)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5LPSLipase Lipase-A

ktivität ( ∆A405 )

Triton X-100V0

B

A

4 Ergebnisse

94

Algenalginat zumindest verringert werden (Wingender et al., 1987). Diese Befunde wurden genutzt, um die Affinität von gereinigter Lipase A aus P. aeruginosa PAO1 mit Bakterienalginat und LPS aus P. aeruginosa SG81 genauer zu untersuchen. Dazu wurden Glasperlen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,25 – 0,3 mm (Braun Biotech International, 8541604) dreimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 gewaschen und mit einer Gelbetthöhe von 7 cm in eine Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von 1 cm gepackt. Das Ausschlussvolumen V0 dieser Glasperlen-Adsorptionssäule wurde mit 0,2 ml Dextran Blue-Lösung (2 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) bestimmt und konnte bei Fraktion 6 detektiert werden. Abbildung 16: Adsorptions-Chromatographie von gereinigter Lipase A an Glas in (A) Abwesenheit und (B) Anwesenheit von Bakterienalginat. Es wurde 0,1 ml Lipase A-Lösung in A. deion. (0,36 µg/ml; aus P. aeruginosa PAO1lipA+) wurde (A) mit 0,1 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bzw. (B) mit 0,1 ml Alginat-Lösung (2 mg/ml) aus P. aeruginosa SG81 in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 vermischt, für 30 min bei 30 °C vorinkubiert und anschließend auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Ab Fraktion Nr. 15 wurde dem Elutionspuffer 1 % (w/v) Triton X-100 zugegeben. In allen Fraktionen (0,5 ml) wurde die ( ) Lipase-Aktivität mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und in (B) zusätzlich die (•) Kohlenhydrat-Konzentration (3.4.2) bestimmt. Die Ergebnisse sind in angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei Säulenläufen. In Abbildung 16A ist das Elutionsprofil der Lipase A in Abwesenheit von Alginat dargestellt. Die Lipase-Aktivität konnte in zwei Peaks von der Säule eluiert werden (Abbildung 16A, Nr.1 + 2). Der erste Peak eluierte distinkt mit dem Ausschlussvolumen mit einem Maximum bei Fraktion 6.

-0,1

0

0,1

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0,3

0,4

0,5

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0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Fraktionsnummer

Lipa

se-A

ktiv

ität (

∆A

405 )

Triton X-100V0

-20

0

20

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100

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0 10 20 30 40 50

Fraktionsnummer

Koh

lenh

ydra

t-K

onze

ntra

tion

(µg/

mL)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Alginat

Lipase Lipase-Aktivität ( ∆A

405 )

Triton X-100V0

A

1

2

B

4 Ergebnisse

95

Der zweite Peak konnte nach Zugabe von Triton X-100 zum Elutionspuffer detektiert werden. Er eluierte über 9 Fraktionen mit einem Maximum bei Fraktion 27. In Gegenwart von Bakterienalginat änderte sich das Elutionsverhalten der Lipase nicht (Abbildung 16B). Der Lipase-Aktivitäts-Peak Nr.1 eluierte im gleichen Fraktionsbereich wie in Abwesenheit von Alginat. Allerdings war dieser Peak um 3 Fraktionen breiter und das Maximum um 2 Fraktionen nach hinten verschoben, was auf eine mögliche Interaktion zwischen den Lipase-Molekülen und dem sauren Polysaccharid Alginat schließen ließ, welches im selben Fraktionsbereich eluiert. Sowohl das gereinigte Alginat von P. aeruginosa SG81, wie auch der erste Lipase-Aktivitätspeak eluierten demnach mit dem Ausschlussvolumen. Der zweite Lipase-Aktivitäts-Peak mit einem Maximum bei Fraktion 27 eluierte entsprechend dem in Abwesenheit von Alginat nachweisbaren Peak. In Anwesenheit von Alginat konnte ein leicht verbreiterter und verschobener Lipase-Aktivitäts-Peak nachgewiesen werden Abbildung 16B), was auf eine mögliche Wechselwirkung zwischen Alginat und zumindest einem Tiel der Lipase-Moleküle schließen ließ. Um die Stärke der Affinität von Lipasen zu Bakterienalginat zu überprüfen, wurde eine Säule gefahren, bei der dem Elutionspuffer anstatt Triton X-100 eine 2 mg/ml Alginat-Lösung zugesetzt wurde. Wie in Abbildung 17 zu sehen, konnten mit Alginat die an das Glas gebundenen Lipase-Moleküle nicht von der Säule eluiert werden. Der Peak Nr. 2 blieb aus, was bedeutet, dass die Affinität von Lipasen zu Glas stärker ist, als die zu Alginat-Molekülen. Abbildung 17: Glasperlen-Adsorptions-Chromatographie von gereinigter Lipase A. Es wurde (A) 0,2 ml Lipase A-Lösung (0,18 µg/ml; aus P. aeruginosa PAO1lipA+) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Bei Fraktion Nr. 15 wurde 0,1 mL einer 2 mg/mL Alginat-Lösung in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 zugegeben. In allen Fraktionen (0,5 ml) wurde die ( ) Lipase-Aktivität mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und die (•) Kohlenhydrat-Konzentration (3.4.2) bestimmt. Die Ergebnisse sind in angegeben als repräsentatives Säulenlauf von zwei unabhängigen Experimenten. Anders sah es aus, wenn anstelle von Triton X-100 eine 2,5 mg/ml LPS-Lösung aus P. aeruginosa SG81 auf die Säule gegeben wurde (Abbildung 18). Es konnte ein deutlicher Lipase-Aktivitäts-Peak im Bereich des Kohlenhydrat-Peaks mit einem Maximum bei Fraktion 19 erkannt werden. Durch die anschließende Zugabe von Triton X-100 zum Elutionspuffer konnte

0

20

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0 10 20 30 40 50 60Fraktionsnummer

Koh

lenh

ydra

t-Kon

zent

ratio

n (µ

g/m

L)

-0,1

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Lipase-Aktivität (

A405 )

V0 Alginat

4 Ergebnisse

96

keine weitere Lipase von der Säule eluiert werden, was darauf schließen ließ, dass durch das LPS sämtliche an das Glas gebundene Lipasen eluiert werden konnten. Die Affinität von Lipasen an LPS scheint stärker zu sein, als die zu Glas. Wie auch schon die Chromatographie- Versuche von Lipasen an Sephacryl S-500 HR vermuten ließen, zeigen die Lipase A-Moleküle eine deutliche Wechselwirkung mit LPS-Bestandteilen. Abbildung 18: Adsorptions-Chromatographie von gereinigter Lipase A an Glas. Es wurde 0,2 ml Lipase A-Lösung (0,18 µg/ml; aus P. aeruginosa PAO1lipA+) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Bei Fraktion Nr. 15 wurde 0,1 mL einer 2,5 mg/mL LPS-Lösung (isoliert aus P. aeruginosa SG81 nach 3.3.4) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, ab Fraktion Nr. 35 wurde 1 % (w/v) Triton X-100 zugegeben. In allen Fraktionen (0,5 ml) wurde die ( ) Lipase-Aktivität mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und die (•) Kohlenhydrat-Konzentration (3.4.2) bestimmt. Die Ergebnisse sind in angegeben als repräsentatives Säulenlauf von drei unabhängigen Experimenten. Als weiteres Experiment wurden Lipase-haltige Kulturüberstände des Wildtyps P. aeruginosa PAO1 und des mucoiden LipA-Überproduktions-Stamms SG81LAH2 auf die Gaslperlen-Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert (Abbildung 19). Nach einem Säulenvolumen (5,5 ml) wurde dem Elutionspuffer 1 % (w/v) Triton X-100 zugesetzt. Der Kulturüberstand von P. aeruginosa PAO1 zeigte nur einen Lipase-Aktivitäts-Peak (Abbildung 19A). Dieser eluierte vor dem Ausschlussvolumen mit einem Maximum von ∆A405 = 0,7 bei Fraktion 5. Durch Zugabe von Triton X-100 zum Elutionspuffer konnte keine weitere Lipase von der Glasperlen-Säule eluiert werden, was darauf schließen ließ, dass im Kulturüberstand des nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stamms PAO1 keine Lipase-Moleküle mit einer Affinität zu Glas vorhanden waren. Bei dem Kulturüberstand der Lipase A-Überexpression SG81LAH2 konnten zwei Peaks beobachtet werden (Abbildung 19B). Wie schon bei den Experimenten mit gereinigter Lipase A in Anwesenheit von Alginat (Abbildung 19B) eluierte Peak Nr.1 eine Fraktion nach dem Ausschlussvolumen, mit einem Maximum bei Fraktion 7 im gleichen Bereich wie der Alginat-Peak. Er besaß eine maximale Lipase-Aktivität von ∆A405 = 2,6. Ein zweiter kleinerer Lipase-Peak mit einer maximalen Lipase-Aktivität von ∆A405 = 0,9 bei Fraktion 24, konnte nach der Zugabe von Triton X-100 zum Elutionspuffer detektiert werden. Insgesamt konnte im Kulturüberstand des Lipase-Überproduktions-Stamms SG81LAH2 eine 5-fach höhere Lipase-Aktivität als im Überstand des Wildtyps PAO1 nachgewiesen werden.

-20

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0 10 20 30 40 50 60

Fraktionsnummer

Koh

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ydra

t-Kon

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n (µ

g/m

L)

-0,05

0,05

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Lipase-Aktivität (

A405 )

V0 LPS Triton X-100

4 Ergebnisse

97

Abbildung 19: Adsorptions-Chromatographie an Glas von Lipase-haltigen Kulturüberständen (LB, 24 h, 36 °C, 180 rpm) von A) P. aeruginosa PAO1 und B) P. aeruginosa SG81LAH2. Es wurden je 0,2 ml 24 h-LB-Überständen auf die Säule aufgetragen und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 eluiert. Ab Fraktion Nr. 15 wurde dem Elutionspuffer 1 % (w/v) Triton X-100 zugegeben. In allen Fraktionen (0,5 ml) wurde die Lipase-Aktivität mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) und der Kohlenhydratgehalt (3.4.2) bestimmt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von zwei unabhängigen Säulenläufen. 4.3.4 Bindung von Lipasen an Polysaccharide Die Chromatographie von gereinigter Lipase A in An- und Abwesenheit von Alginat bzw. LPS an Sephacryl S-500 HR und an Glasoberflächen zeigte, dass Lipasen Interaktionen zu Polysacchariden eingehen können. Um die Bindung von Lipasen an Polysaccharide genauer zu untersuchen, wurde ein Mikrotiterplatten-Bindungstest etabliert (3.9.1). Dazu wurden verschiedene Polysaccharide zunächst nach 3.3.2.1 bzw. 3.3.2.2 gereinigt, da sie zum Teil Verunreinigungen mit Proteinen oder niedermolekularen Substanzen aufwiesen. Zudem wurden sie für 15 min bei 90 °C erhitzt, um mögliche noch gebundene Enzyme mit lipolytischer Aktivität zu inaktivieren. Anschließend wurden die gereinigten Polysaccharide in 0,14 M NaCl-Lösung gelöst und in Konzentrationen von bis zu 5 mg/ml in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten aus Polystyrol gegeben und über Eintrocknung bei 36 °C über Nacht immobilisiert. Strathmann et al. (2002) zeigten über die Messung des Kohlenhydratgehaltes die gleichmäßige Bindung von in

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 10 20 30 40 50

Fraktionsnummer

Lipa

se-A

ktiv

ität (

∆A

405)

V0 Triton X-100

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200

250

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350

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0 10 20 30 40 50Fraktionsnummer

Koh

lenh

ydra

t-Kon

zent

ratio

n (µ

g/m

L)

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3AlginatLipase

Triton X-100V0

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4 Ergebnisse

98

0,14 M NaCl-Lösung gelöstem Dextran und Bakterienalginat im Konzentrationsbereich von 0,01 bis 1000 µg/ml an das Polystyrol von Mikrotiterplatten. Durch einen Waschschritt mit je 200 µl A. deion. wurde überschüssiges NaCl entfernt und anschließend 20 µl gereinigte Lipase A-Lösung in einer Konzentration von 72 ng/ml in A. deion. zugeben. Nach Inkubation für 30 min bei 30 °C wurden nicht gebundene Lipase-Moleküle durch zweimaliges Waschen mit je 100 µl A. deion. entfernt und die Menge der gebundenen Lipase-Moleküle indirekt über einen photometrischen Aktivitäts-Nachweis mit pNPP bestimmt. Da für Lipasen des Typ I, zu der auch die Lipase A von P. aeruginosa zählt, eine Grenzflächenaktivierung beschrieben wurde (Jaeger et al., 1993; 1994; Arpigny und Jaeger, 1999), wurde in einem Vorversuch auf diese Waschschritte verzichtet, um sicherzustellen, dass es sich bei den zu beobachtenden Lipase-Aktivitäts-Steigerungen um ein Bindungs- und nicht um ein Aktivierungphänomen handelte. Es konnte unabhängig von der Konzentration der Polysaccharide, in allen Kavitäten die gleiche Lipase-Aktivität von etwa ∆A405 = 0,8 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer Kontrollversuch war die Bindung von Lipasen an Polystyrol. Es zeigte sich, dass die Lipase nur in einem geringen Maße an das Polystyrol der Mikrotiterplatte bindet. Es konnte eine Aktivität ∆A405 von maximal 0,07 in den Kavitäten nachgewiesen werden (ohne Abbildung). Wie in Abbildung 20 zu erkennen, konnte eine sehr deutliche Bindung von LipaseA-Molekülen an das Alginat aus P. aeruginosa SG81 nachgewiesen werden. Je höher die eingesetzte Alginat-Konzentration, desto höher war auch die messbare Lipase-Aktivität. Bei einer Polysaccharid-Konzentration von 5 mg/ml konnte eine fast 14fach höhere Lipase-Aktivität detektiert werden. Allerdings zeigte das gereinigte Alginat aus P. aeruginosa SG81, als einziges der verwendeten Polysaccharide, auch ohne die Zugabe von gereinigter Lipase, mit steigender Konzentration eine steigende Lipase-Aktivität. Daraus ließ sich erkennen, dass die extrazelluläre Lipase von P. aeruginosa SG81 bei der Reinigungsprozedur des Alginats weder durch Proteinase K-Behandlung noch durch die Wärmebehandlung für 15 min bei 90 °C vollständig inaktiviert werden konnte, was auf eine Stabilisierung der Lipase-Moleküle durch das Alginat hinweist. Die nachweisbare Lipase-Aktivität im Alginat betrug maximal ∆A405 = 0,4 bei 5 mg/ml Alginat. Die in der Abbildung 20 dargestellten Werte wurden mit diesen Werten korrigiert. Beim Algenalginat und dem neutralen Polysaccharid Dextran dagegen konnte keine Affinität zu Lipase-Molekülen nachgewiesen werden. Die Lipase-Aktivität erwies sich sogar geringer als die zuvor ermittelte Aktivität bei Bindung von Lipase-Molekülen an die Polystyroloberfläche der Mikrotiterplatten, was auf eine Maskierung des Polystyrols durch diese Polymere hinweist. Auch bei der Hyaluronsäure konnte keine Bindung von Lipasen beobachtet werden. Die Lipase-Aktivitäten erwiesen sich über den gesamten Konzentrationsbereich als konstant bei ∆A405 von ca. 0,07, was der Lipase-Aktivität in Abwesenheti von Polysacchariden entsprach. Xanthan zeigte erst im höheren Konzentrationsbereich ab 3 mg/ml eine Bindung von Lipasen, was sich durch eine sprunghafte Erhöhung der Lipase-Aktivität auf das 5,7fache bemerkbar machte. Das neutrale Polysaccharid Levan zeigte eine geringe Bindung von Lipasen. Die Lipase-Aktivität stieg um das 3,6-fache bei 0,5 mg/ml Levan. Allerdings konnte die Aktivität durch höhere Konzentrationen des Polysaccharids nicht gesteigert werden.

4 Ergebnisse

99

Abbildung 20: Mikrotiterplatten-Bindungs-Test. Bindung von gereinigter Lipase A aus P. aeruginosa PAO1 an Polysaccharide. Polysaccharide wurden in verschiedenen Konzentrationen in 0,14 M NaCl-Lösung gelöst und über Nacht bei 30 °C in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach Zugabe von Lipase A (72 ng/ml in A. deion.) und Inkubation für 30 min bei 30 °C wurde die nicht-gebundene Lipase durch zwei Waschschritt mit je 100 µl A. deion. entfernt und die gebundene Lipase über Aktivitäts-Nachweis mit pNPP als Substrat in der Mikrotiterplatte (3.5.3.3) bestimmt. Für das gereinigte Alginat aus P. aeruginosa SG81 ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus fünf Versuchen, für die restlichen Polysaccharide der Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei Versuchen dargestellt. 4.3.5 Thermische Stabilität von Lipasen in Gegenwart von Polysacchariden Es konnte gezeigt werden, dass Lipase A-Moleküle Wechselwirkungen mit dem P. aeruginosa-eigenen extrazellulären Polysaccharid Alginat eingehen. Im Folgenden sollte als weiterer Hinweis für diese Enzym/Polysaccharid-Wechselwirkungen die Stabilität der Lipase bei thermischer Behandlung in An- und Abwesenheit von Polysacchriden untersucht werden. Ein Hinweis ergab sich aus der Beobachtung, dass sich die extrazelluläre Lipase durch die 15-minütige Inkubation bei 90 °C im Rahmen der Alginat-Reinigungsprozedur nicht vollständig inaktivieren ließ. Um zu überprüfen, ob dieses Phänomen wirklich durch die Interaktion von Lipasen und dem Polysaccharid Alginat vermittelt wird, wurde die gereinigte Lipase A in An- und Abwesenheit verschiedener Polysaccharide für 20 min bei verschiedenen Temperaturen inkubiert und die Inaktivierung der Lipase über Aktivitäts-Nachweis verfolgt. Dabei wurden verschiedene bakterielle Alginate verwendet. Zum einen die nativen Bakterienalginate der P. aeruginosa-Stämme SG81 und FRD1 und zum anderen modifizierte bakterielle Alginate (chemisch deacetyliertes Alginat von P. aeruginosa SG81 und Alginat von der O-Acetylierungs-defekten Mutante P. aeruginosa FRD1153), um weitere Hinweise auf die Art der Wechselwirkungen zwischen den Molekülen zu erhalten. Zusätzlich wurden aber auch Polysaccharide verwendet, die im Mikrotiterplatten-Bindungs-Test keine Affinität zu Lipasen zeigten.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4 5 6

Kohlenhydrat-Konzentration (mg/ml)

Lipa

se-A

ktiv

ität (

∆A

405)

SG81 Alginat

Algenalginat

Dextran

Xanthan

Hyaluronsäure

Levan

4 Ergebnisse

100

Abbildung 21: Schutz vor thermischer Inaktivierung von gereinigter Lipase A durch Polysaccharide in Abhängigkeit der Temperatur. 0,5 ml einer 36 ng/ml Lipase A-Lösung in A. deion. (gereinigt aus P. aeruginosa PAO1lipA+) wurde mit 0,5 ml einer 2 mg/ml Polysaccharid-Lösung in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 zusammen gegeben und 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 20 min bei verschiedenen Temperaturen. Die Lipase-Aktivität wurde mit dem pNPP-Test im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) bestimmt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen. Es konnte ein gewisser Schutz der Lipase durch Wechselwirkungen die Anwesenheit von Kohlenhydraten im Bereich von bis 70°C beobachtet werden (Abbildung 21). Bei höheren Temperaturen dagegen konnte kein Einfluss von Polysacchariden auf die thermische Inaktivierung mehr nachgewiesen werden. Die größte Wirkung besaßen die Polysaccharide im Bereich von 50 – 70 °C, allerdings zeigte die Lipase bei 50 °C auch in Abwesenheit von Polysacchariden nur eine geringe Inaktivierung von etwa 25 % innerhalb von 20 min. Auch das Algenalginat zeigte im Bereich von bis zu 60 °C eine sehr starke Schutzwirkung. Bei steigender Temperatur fiel die Schutzwirkung allerdings rasch ab. Bei 70 °C zeigten die Acetylgruppen-freien bakteriellen Alginate die höchste Schutzwirkung von allen getesteten Kohlenhydraten, gefolgt von den nativen Bakterienalginaten und dem neutralen Dextran. Xanthan und das Algenalginat zeigten bei dieser Temperatur keine Schutzwirkung mehr. Da die meisten Polysacchariden eine gewisse Schutzwirkung bei der gewählten Inkubationszeit von 20 min zeigten, wurde die Inaktivierung der Lipase in An- und Abwesenheit von Polysacchariden bei auswählten Temperaturen (37 °C, 70 °C und 80 °C) über einen Zeitraum von 60 min verfolgt. Dabei wurde in Abständen von 10 min ein Aliquot entnommen und auf die Lipase-Aktivität hin untersucht. Es zeigte sich, dass die Lipase bei 37 °C auch ohne zusätzliche Stabilisierung durch Polysaccharide über 60 min stabil blieb (ohne Abbildung). Bei der Inkubation der gereinigten LipaseA in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 konnte kein Aktivitäts-Verlust innerhalb von 60 min beobachtet werden. Gegenteiliges konnte bei einer Temperatur von 80 °C beobachtet werden (ohne Abbildung). Dort konnte schon nach 10-minütiger Inkubation keine Lipase-Aktivität mehr nachgewiesen werden, unabhängig davon ob Polysaccharide anwesend waren oder nicht.

-20

0

20

40

60

80

100

120

37 50 60 70 80 90

Temperatur (°C)

Lipa

se-A

ktiv

ität (

%)

FRD1 Alginat

FRD1153 Alginat

SG81 Alginat

SG81 Alginat deac.

Algenalginat

Dextran

Xanthan

Kontrolle (Tris-Puffer)

4 Ergebnisse

101

Die zeitliche Dynamik der Inaktivierung von Lipase A bei 70 °C ist in Abbildung 22 dargestellt und zeigt, dass die Lipase in Abwesenheit von Polysacchariden einer schnellen Aktivitäts-Abnahme unterliegt und nach 40-minütiger Inkubation nicht mehr nachweisbar war. Auch bei Anwesenheit von Polysacchariden konnte der hauptsächliche Aktivitäts-Verlust innerhalb der ersten 10 min beobachtet werden. Den stärksten Schutz boten die nicht-acetylierten Bakterienalginate, wie das chemisch deacetylierte Alginat aus P. aeruginosa SG81 und das gereinigte Alginat der mucoiden O-Acetylierungs-defekten P. aeruginosa-Mutante FRD1153. Dort konnte auch nach 60-minütiger Inkubation noch 40 % der eingesetzten Lipase-Aktivität detektiert werden. Im mittleren Bereich lagen die nativen Bakterienalginate der mucoiden P. aeruginosa-Stämme SG81 und FRD1. Hier konnten nach 60 min immerhin noch 20 bzw. sogar 30 % der anfänglichen Lipase-Aktivität gemessen werden. Interessanterweise besaß das neutrale Polysaccharid Dextran eine ähnlich starke Schutzwirkung wie die Alginate, obwohl es im Mikrotiterplatten-Bindungs-Test keine Bindung von Lipasen zeigte. Auch das Algenalginat und Xanthan zeigten zumindest in den Konzentrationen, die in diesem Test eingesetzt wurden, keine Bindung von Lipase-Molekülen. Erwartungsgemäß konnte hier prinzipiell auch kein Schutz der Lipase vor der Inaktivierung duch Hitze beobachtet werden. In Anwesenheit von Xanthan wurde die Lipase innerhalb der ersten 20 min sogar um etwa 10 % schneller inaktiviert als in Abwesenheit des Polymers. Erst bei längerer Inkubationsdauer ab etwa 20-30 min konnte eine minimale Schutzwirkung von etwa 5 % nachgewiesen werden. Das Algenalginat zeigte dementsprechend nur bei niedrigeren Temperaturen Schutz vor Inaktivierung der Lipasen.

Abbildung 22: Schutz vor thermischen Inaktivierung von gereinigter Lipase A durch Polysacchride in Abhängigkeit der Zeit. 0,5 ml einer 36 ng/ml Lipase-Lösung in A. deion. (gereinigt aus P. aeruginosa PAO1) wurde mit 0,5 ml einer 2 mg/ml Polysaccharid-Lösung in 100 mM Tris-Hcl-Puffer, pH 8,0 zusammen gegeben und 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 70 °C über 60 min. Alle 10 min wurde die Lipase-Aktivität mittels des pNPP-Tests im Mikrotiterplatten-Maßstab (3.5.3.3) bestimmt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichung aus vier unabhängigen Versuchen.

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70

Zeit (min)

Lipa

se-A

ktiv

ität (

%)

SG81 Alginat

SG81 Alginat deac.

FRD1 Alginat

FRD1153 Alginat

Xanthan

Algenalginat

Dextran

Kontrolle (Tris-Puffer)

4 Ergebnisse

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4.4 Erzeugung und Charakterisierung von Enzym-Überexpressions-Stämmen und Enzym-defizienten Mutanten von P. aeruginosa SG81 4.4.1 Genotypische Charakterisierung des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81 Es konnte gezeigt werden, dass der mucoide Stamm P. aeruginosa SG81 eine Vielzahl an Enzymen produziert und diese in die extrazelluläre Biofilmmatrix sekretiert (4.1.3). Um den Einfluss von extrazellulären Enzymen auf die Struktur und die Eigenschaften von Biofilmen genauer untersuchen zu können, sollten verschiedene Enzymdefekt-Mutanten und Enzym-Überexpressionsstämme vom mucoiden P. aeruginosa SG81 konstruiert werden. Ausgehend von der Genomsequenz des Wildtyps PAO1, welche vollständig bekannt ist (Stover et al., 2000), wurden die Gene der lipolytischen Enzyme LipA, LipC und EstA und des proteolytischen Enzyms LasB kloniert und in Subklonierungsschritten für die Konstruktion von Mutagenese- bzw. Expressionsvektoren verwendet. Da der Stamm SG81 bisher genetisch nicht untersucht ist, sollte zunächst überprüft werden, ob die Gene der oben erwähnten Enzyme auch im Genom von P. aeruginosa SG81 vorliegen und folglich genetische Veränderungen mit den auf der DNA-Sequenz von P. aeruginosa PAO1 basierenden Mutagenesekonstrukten in den Stamm SG81 eingefügt werden können. Um erste Aussagen über die genetischen Eigenschaften dieses Stammes zu erhalten, wurde eine Analyse der Genomstruktur auf der Basis des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) im Vergleich zum Wildtyp PAO1 durchgeführt. Zusätzlich wurde die vom SG81 abgeleitete nicht-mucoide Revertante SG81R1 und zwei weitere mucoide Isolate aus dem Sputum eines CF-Patienten (P. aeruginosa FRD1 und die daraus abgeleitete Mutante FRD1153 mit einem Defekt in der O-Acetylierung des Alginates; Ohman und Chakrabarty, 1993, 1996) in die Analyse eingesetzt. Für den Verdau der genomischen DNA wurde die Restriktionsendonuklease SpeI verwendet, die eine spezifische Erkennung der Sequenz ACTAGT aufweist und für das P. aeruginosa-Genom als selten-schneidendes Enzym beschrieben wurde (Römling et al., 1994). Die entstandenen Fragmente wurden über Pulsfeld-Gelelektrophorese aufgetrennt und nach Färbung der DNA-Banden mit Ethidiumbromid fotographisch dokumentiert. Die Restriktionsfragment-Muster sind in Abbildung 23 dargestellt. Alle untersuchten P. aeruginosa-Stämme besaßen ein Fragmentmuster, das veröffentlichten Mustern von P. aeruginosa-Stämmen entsprach (Römling et al., 1994). Die Bandenanzahl von 21 bzw. 20 Banden beim Stamm SG81R1 entsprach der für das P. aeruginosa-Genom zu erwartenden Restriktionsfragmenten. Zwischen den Stämmen konnte eine gewisse Variabilität im Bandenmuster beobachtet werden. Der P. aeruginosa-Stamm FRD1 und die davon abgeleitete O-acetylierungsdefekte Mutante FRD1153 (Ohman und Chakrabarty, 1993, 1996) zeigten identische Fragmentmuster. Der Stamm SG81 glich seiner nicht-mucoiden Revertante SG81R1 im oberen (> 50 kb) und im unteren Molekulargewichtsbereich (< 2,32 kb), während bei mittleren Fragmentgrößen deutliche Unterschiede auftraten. Interessanterweise schien die Variabilität des Bandenmusters vom Stamm SG81 zu seiner Revertante SG81R1 ähnlich hoch zu sein, wie zu dem Wildtyp PAO1. Allerdings konnten hier über den gesamten Molekulargewichtsbereich Unterschiede, aber auch identische Banden erkannt werden.

4 Ergebnisse

103

Abbildung 23: Pulsfeld-gelelektrophoretische Analyse des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus der Genome verschiedener P. aeruginosa-Stämme. Die isolierte genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SpeI verdaut und die entstandenen Fragmente in einem 1,1 % (w/v) Agarosegel aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde bei 14 °C in 0,5 x TBE-Puffer im Zweischritt-Modus über 21 h mit einem Winkel von 120°. Die Spannung betrug dabei 5,6 V/cm mit einer Puls-„switch-time“ von 5 bis 30 s. Als DNA-Molekulargewichts-Standard wurde ein Lambda-Ladder-PFG-Marker verwendet. Zur besseren Übersicht wurden die Banden der Abbildung farblich markiert. 4.4.2 Konstruktion und Charakterisierung von P. aeruginosa Enzym-Defekt- und –Überproduktions-Stämmen Wie die RFLP-Analyse ergab, bestehen zwischen den Genomen von P. aeruginosa SG81 und PAO1 deutliche Unterschiede. Um sicher zu stellen, dass SG81 die Zielgene zur Inaktivierung durch Insertionsmutagenese ebenso besitzt wie PAO1, sollte deren Existenz zunächst mittels PCR-Analyse nachgewiesen werden. Dazu wurde die genomische DNA von P. aeruginosa SG81 isoliert und mit geeigneten Primern (Tabelle 5), ausgehend von der Gensequenz von P. aeruginosa PAO1 PCR-amplifiziert. Wie im Referenzstamm PAO1 (Daten nicht gezeigt), konnten auf diese Weise für alle gewählten Enzymgene PCR-Produkte mit der entsprechenden

194,0 kb

6,55 kb

9,42 kb

23,1 kb

48,5 kb 97,0 kb145,5 kb

2,03 kb

2,32 kb

4,36 kb

SG

81

MPAO

1

FRD

1153

FRD

1

SG81

R1

4 Ergebnisse

104

Größe erhalten werden, d. h. für das estA-Gen ein ca. 2,0 kbp, für das lipC-Gen ein ca. 1,0 kbp und für das lipA-Gen ein ca. 1,1 kbp großes Fragment (Abbildung 24).

Abbildung 24: Gelelektrophoretische Analyse von PCR-Produkten von genomischer DNA aus P. aeruginosa SG81 in 0.8 % (w/v) Agarose-Gelen. A) lipA B) lipC C) estA. Es wurden die Primerpaare LipAup/LipAdwn für lipA, LipCup/LipCdwn für lipC und EstAup/EstAdwn für estA entsprechend der Gensequenz in P. aeruginosa PAO1 verwendet. Als Marker wurde der DNA-Molekulargewichtsstandard „1 kb-ladder“ verwendet. Zur Inaktivierung von Genen werden üblicherweise in kodierende Sequenzen selektierbare Markergene wie z. B. Antibiotikaresistenzen mit molekularbiologischen Methoden inseriert und diese dann durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert („allelic exchange“). Zur Komplementation solcher Mutationen bzw. zur Überexpression von Genen werden diese in geeigneten Plasmiden in den entsprechenden Wirtsstamm eingebracht. In den nachfolgenden Versuchen wurde zum Einbringen von Plasmiden in P. aeruginosa-Stämme der konjugative Transfer über den Helferstamm E. coli S17-1, der die Transfergene zur Mobilisierung von Plasmiden aus dem E. coli Plasmid RK2 in trans zur Verfügung stellt, genutzt (Simon et al., 1986). Zur Auswahl der erhaltenen Klone, die für die weiteren Untersuchungen verwendet werden sollten, wurden die verschiedenen Klone auf ihre genotypischen und phänotypischen Eigenschaften hin untersucht. Zur phänotypischen Charakterisierung wurden die Klone in LB-Medium über 24 h bei 37°C und 180 Upm angezüchtet. Die Zelldichte der Kulturen wurde mittels Trübungsmessung bei 580 nm bestimmt. Anschließend wurden die Zellen für 15 min bei 13000 x g sedimentiert. Die zellfreien Kulturüberstände wurden auf die entsprechende Enzymaktivität hin untersucht. Die sedimentierten Zellen wurden aufgeschlossen, die Plasmid-DNA isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen. Deletion von Strukturgenen extrazellulärer Enzyme Zur Deletion des Lipasegens lipA wurde der Vektor pME3087 verwendet. Er besitzt einen E. coli-Replikationsursprung und ist somit ein Suizidvektor für P. aeruginosa, d. h., dass das Plasmid in diesem Bakterium nicht autonom repliziert wird. Hieraus folgt, dass eine eingefügte

B CA

1 kb

7 kb6 kb5 kb4 kb

3 kb

2 kb

1,6 kb

1,1 kb 1,6 kb

4 kb

3 kb

2 kb

8 kb7 kb6 kb

5 kb

~ 2,0 kb

1,0 kb

0,512 kb

6 kb

4 kb3 kb

2 kb1,6 kb

1 kb

4 Ergebnisse

105

genetische Veränderung erst nach homologer Rekombination in das Pseudomonas-Genom (doppeltes Crossover) stabil ist. Ausgehend von diesem Vektor konstruierte Schneidinger (1997) den Mutagenesevektor pME∆AH11. Mit diesem Vektor war es möglich, eine ortsgerichtete Mutation im lipA-Gen durch partielle Deletion des Strukturgens einzufügen. Es wurde gezeigt, dass die Lipase A-Aktivität nur in Verbindung mit der Deletion des Gens der zugehörigen Foldase LipH (lipH) vollständig inaktiviert werden konnte. Um eine zusätzliche Selektionsmöglichkeit der zu erfolgenden homologen Rekombination ins P. aeruginosa SG81 Genom zu erhalten, wurde eine Ω-Gentamycin-Resistenzkassette (ca. 1,6 kbp großes SmaI-Fragment aus pBSL142) in die StyI-Schnittstelle im Bereich des Inserts in das Plasmid pME∆AH11 eingefügt (Abbildung 25). Das dabei entstandene Plasmid pME∆AH::Ω-Gmr wurde zur Deletions-Insertions-Mutagenese von lipA und lipH in P. aeruginosa SG81 verwendet. Nach konjugativem Transfer und erfolgter Rekombination konnten mehrere lipA-negative Klone über die eingebaute Gentamycin-Resistenz und den Verlust der Lipase-Aktivitäten in zellfreien Überständen von 24 h LB-Kulturen selektiert werden. Alle Klone zeigten bei etwa gleicher Zelldichte eine drastische Abnahme der Lipase-Aktivität in Relation zum Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81, allerdings auch eine verbleibende geringe Restaktivität von etwa 8,0 % (ohne Abbildung). Für die folgenden Untersuchungen wurde der lipA-Deletions-Stamm P. aeruginosa SG81∆LAH1 ausgewählt. Die genetische Veränderung wurde mit dem Vektor pBBL7 (siehe unten) in trans komplementiert.

Abbildung 25: Konstruktion des Deletions-Insertions-Mutagenese-Vektors pME∆AH::Ω-Gmr durch Klonierung der 2,6 kbp Ω-Gentamycin-Resistenzkassette aus pBSL142 in den Deletions-Mutagenese-Vektor pME∆AH11.

KpnI

Ω−Gm

pBSL142(4,7 kb)

Amp

SmaI

SmaI

pME AH11∆(8,9 kb)

mob

Tc

XbaI

StyI

REP

lipA/H Sty∆ I

pME AH11::Gmr∆

(10,6 kb)

Ω−Gm

mob

Tc

XbaI

KpnI( I/ I)Sty Sma

REP

( I/ I)Sty Sma

4 Ergebnisse

106

Zur Deletion des Esterase A-Gens (estA) und des Lipase C-Gens (lipC) wurde der Vektor pSUP202 verwendet. Auch dieser Vektor besitzt einen E. coli-Replikationsursprung und kann somit genetische Veränderungen in P. aeruginosa durch homologe Rekombination chromosomal integrieren. Dieser Vektor wird speziell für die ortsgerichtete Transposon-Mutagenese in vielen Gram-negativen Organismen eingesetzt (Simon et al., 1983). Wilhelm (2001) konstruierte den auf pSUP202 basierenden Deletions-Mutagenese-Vektor pSUP202estA∆Mlu und war damit in der Lage estA-Deletions-Mutanten in P. aeruginosa PAO1 zu erzeugen, die mit PCR-Analyse verifiziert wurde. Prinzipiell sollte es also möglich sein, mit diesem Vektor das estA-Gen auch in P. aeruginosa SG81 zu mutagenisieren. Um entstehende Mutanten besser selektionieren zu können, wurde eine zusätzliche Gentamycin-Resistenzkassette (ca. 2,6 kbp großes BamHI-Fragment aus pWKR202) in die BglII-Schnittstelle innerhalb des estA-Gens eingefügt (Abbildung 26) und der entstandene 12 kbp große Deletions-Insertions-Mutagenesevektor pSUP202estA∆Mlu::Gmr über konjugativen Transfer in P. aeruginosa SG81 gebracht. Trotz mehrmaliger Versuche konnte mit diesem Plasmid keine Deletion des estA-Gens erreicht werden. Es konnten zwar Gentamycin-resistente Transkonjuganden erhalten werden, diese zeigten allerdings bei PCR-Analysen das vollständige estA-Gen, was darauf hinweist, dass zwar das erste, nicht aber das zweite Cross-over stattgefunden hatte.

Abbildung 26: Konstruktion des Deletions-Insertions-Mutagenese-Vektors pSUP202estA∆Mlu::Gmr durch Klonierung der 1,6 kbp Gentamycin-Resistenzkassette aus pWKR202 in den Deletions-Mutagenese-Vektor pSUP202estA∆Mlu (Wilhelm, 2001).

pSUP202estA Mlu::Gmr∆

(12 kb)

Gm

mob

Cm

SalI

SalI

( II/ HI)Bgl Bam

( II/ HI)Bgl Bam

( II/ HI)Bgl Bam

REP

pSUP202estA Mlu∆(9,4 kb)

mob

Cm

SalI

SalI

BglII

REP

Gm

BamHI

BamHI

Cm

Km

pWKR202(8,3 kb)

estA I∆Mlu

estA I∆Mlu

estA I∆Mlu

4 Ergebnisse

107

Mit dem ebenfalls auf dem Vektor pSUP202 basierenden Insertions-Mutagenesevektor pSUP202lipC::Gmr konnten lipC-Mutanten in P. aeruginosa PAO1 erzeugt werden (Friedrich, 2001). Der Versuch mit diesem 11,3 kbp großen Vektor Mutationen in P. aeruginosa SG81 einzufügen schlug aber reproduzierbar fehl. Auch hier konnten Gentamycin-resistente Transkonjuganden erhalten werden, die bei PCR-Analysen allerdings das vollständige lipC-Gen zeigten. Daraus läßt sich schließen, dass auch hier zwar das erste, nicht aber das zweite Cross-over stattgefunden hatte. Überexpression von extrazellulären Enzymen Der Ausgangsvektor pBBR1MCS, der für die Überexpression der lipolytischen Enzyme verwendet wurde, besitzt einen weiten Wirtsbereich und ist geeignet, genetische Veränderungen in P. aeruginosa einzubringen und dort episomal zur Expression zu bringen (Kovach et al., 1994). Der Vektor verfügt über eine multiple cloning site (MCS), in die über verschiedene Restriktionsenzyme eine Insertion eingefügt werden kann. Die Enzym-Strukturgene lipA, lipC und estA von P. aeruginosa PAO1 wurden so in den Vektor kloniert, dass sie unter der Kontrolle des konstitutiven lacZ-Promotors (PLac) standen (Schneidinger, 1997; Heckmann, 2001; Wilhelm et al., 1999). Da die Gene vieler extrazellulärer Enzyme „Quorum sensing“-reguliert sind, also erst ab einer späteren Wuchsphase exprimiert werden, führt eine konstitutive Ablesung der Gene zu einer vermehrten Expression der Enzyme. Zudem ist PLac im Gegensatz zu den meisten Enzympromotoren ein äußerst starker Promotor (etwa 100-fach, Rosenau, 1995), so dass es zu einer Überexpression der entsprechenden Enzymgene kommt. Die entstandenen Überexpressions-Stämme vom P. aeruginosa SG81 wurden über die auf dem Vektor vorhandene Chloramphenicol-Resistenz selektiert. Um pleiotrope Effekte durch das Einbringen des Vektors ausschließen zu können, wurde zunächst die Wirkung des Ausgangsvektors pBBR1MCS in P. aeruginosa SG81 untersucht. Die zehn ausgewählten Klone (SG81MCS) besaßen alle das entsprechende Restriktionsmuster des Leervektors. Die Zelldichten der Kulturen und die Lipase-Aktivitäten in den zellfreien Kulturüberständen entsprachen in etwa dem des Ausgangstamms P. aeruginosa SG81 (ohne Abbildung). Für die folgenden Untersuchungen wurde der Klon SG81MCS1 ausgewählt, der als Leervektorkontrolle zusätzlich zum Ausgangsstamm SG81 mit untersucht wurde. Zur Überexpression der beiden Lipasen LipA und LipC wurden die Plasmide pBBL7 (lipA/H) und pBBLCH (lipC/H) verwendet, in denen das jeweilige Lipase-Strukturgen zusammen mit dem Strukturgen der Lipase-spezifschen Foldase LipH als Operon im Vektor pBBR1MCS vorliegt (Schneidinger, 1997; Heckmann 2001). Je sechs Exkonjuganden (SG81LAH) wurden in Gegenwart von Chloramphenicol in LB-Medium angezüchtet und die Lipase-Aktivität in zellfreien Kulturüberständen überprüft. Es zeigte sich, dass durch das Einbringen des Vektors pBBL7 die extrazelluläre Lipase-Aktivität bezogen auf die Zelldichte bei der Mehrzahl der Klone in Relation zum Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81 bis zu 320fach gesteigert werden konnte (Abbildung 27). Bei gleichem Restriktionsmuster der Plasmide, zeigte SG81LAH2 (Klon2) sogar eine 680fache Steigerung der Lipase-Aktivität. Um den Einfluss dieser zusätzlichen Aktivitäts-Steigerung genauer zu untersuchen, wurde nachfolgend mit SG81LAH3 (Klon3), der die Mehrzahl der Klone repräsentiert und SG81LAH2 (Klon2) gearbeitet. Durch das Einbringen des Vektors pBBLCH konnte die extrazelluläre Lipase-Aktivität in Relation zum Ausgangsstamm bei zehn getesteten Klonen (SG81LCH) um das etwa 2,1-fache gesteigert werden (ohne Abbildung). Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde der lipC-

4 Ergebnisse

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ÜberexpressionsKlon SG81LCH1 gewählt, da er in etwa die gleiche Zelldichte wie der Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81 besaß.

Abbildung 27: Relative

Lipase-Aktivität von P. aeruginosa SG81LAH-Klonen in zellfreien Überständen von LB-Kulturen (24 h, 37 °C). Die Lipase-Aktivität (Balken) wurde mit dem pNPP-Test (3.5.3.3) bestimmt, die Zelldichte der Kulturen (Punkte) über Trübungsmessung bei 580 nm. P. aeruginosa SG81 wurde als Referenz-Stamm verwendet. Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von zwei Untersuchungen. Schwarz markiert sind die Klone, die für die weiterführenden Arbeiten ausgewählt wurden. Zur Überexpression der Esterase A wurde der Vektor pBBx+ (Wilhelm et al., 1997) basierend auf pBBR1MCS verwendet. Bei der phänotypischen Charakterisierung der von P. aeruginosa SG81 abgeleiteten Konjuganden (SG81EA) konnten zwei unterschiedliche Fraktionen an Klonen beobachtet werden (Abbildung 28). Obwohl die Restriktions-Bandenmuster der Plasmide aller Klone gleich waren und die entsprechenden Fragmente zeigten, wurden Unterschiede in der Zelldichte und der Esterase-Aktivität in zellfreien Kulturüberständen mit FDA als Substrat deutlich. Die Klone Nr. 1; 5 und 6 besaßen ähnliche Zelldichten wie der Ausgangsstamm SG81 und die Leervektorkontrolle SG81MCS und eine etwa 6fach höhere Esterase-Aktivität im zellfreien Kulturüberstand. Die Klone Nr. 3; 8 und 18 besaßen eine etwas niedrigere Zelldichte, dafür aber eine etwa dem 9-fachen gesteigerte extrazelluläre Esterase-Aktivität. Zusätzlich konnten Unterschiede in der Pigmentierung der Kulturen beobachtet werden. Die Kulturen der Klone mit der höheren Zelldichte waren pigmentlos, die der Klone mit der gesteigerten Esterase-Aktivität hatten die gleiche dunkelgrüne Farbe wie die der Leervektorkontrolle SG81MCS, erschienen dafür aber zähflüssiger als der Ausgangsstamm und die der Leervektorkontrolle. Da die Unterschiede zwischen den beiden Klon-Typen sehr auffällig waren, wurde für die nachfolgenden Untersuchungen aus jeder Fraktion je ein Klon verwendet (SG81EA1 und SG81EA18).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

SG81 Klon1 Klon2 Klon3 Klon4 Klon5 Klon6

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Lipa

se-A

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A41

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/O.D

.580

nm

]

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m]

4 Ergebnisse

109

Abbildung 28: Relative Lipase-Aktivität von P. aeruginosa SG81EA-Klonen in zellfreien Überständen von LB-Kulturen. Die Esterase-Aktivität (Balken) wurde mit dem FDA-Test (3.5.3.2) bestimmt, die Zelldichte der Kulturen (Punkte) über Trübungsmessung bei 580 nm. Die P. aeruginosa-Stämme SG81 und SG81MCS wurden als Referenz-Stämme verwendet. Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von zwei Untersuchungen. Schwarz markiert sind die Klone, die für die weiterführenden Arbeiten ausgewählt wurden. Zur Überexpression des proteolytischen Enzyms Elastase B (LasB) wurde das Plasmid pSAK5 (Kamath et al., 1998) verwendet, das auf dem Vektor pMMB67EH (Bagdasarian und Bagdasarian, 1994) basiert und in dem das lasB-Gen unter transkriptioneller Kontrolle des tac-Promotors steht. Der tac-Promotor ist ein starker Promoter der mit IPTG induziert werden kann, was zu einer zusätzlich Aktivierung führt. Im uninduzierten Zustand wird der Promotor durch den ebenfalls auf dem Vektor kodierten Lac-Repressor reprimiert, was in einer geringen Basalexpression resultiert. Für die Selektion der entstehenden Stämme stand eine auf dem Vektor kodierte Carbenicillin-Resistenz zur Verfügung. Zunächst wurde die Auswirkung des Leervektors in P. aeruginosa SG81 überprüft (ohne Abbildung). Es konnten keine Änderung in Bezug auf die Zelldichte der Kulturen (LB, 24 h, 37 °C) beobachtet werden, allerdings zeigten die mit dem Vektor transkonjugierten Stämme teilweise eine etwas verringerte Protease-Aktivität als der Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81. Für folgende Untersuchungen wurde der Klon Nr.1 (SG81MMB1) gewählt, da er in den untersuchten Eigenschaften (Zelldichte und Protease-Aktivität) dem Ausgangsstamm am ähnlichsten war. Dieser Klon wurde als Leervektorkontrolle zusätzlich zum Ausgangsstamm SG81 mit untersucht. Das lasB-Expressionsplasmid pSAK5 wurde über konjugativen Transfer in P. aeruginosa SG81 gebracht. Sechs ausgewählte lasB-Überexpressions-Klone (SG81LasB) wurden, ohne Zugabe von ITPG auf ihre Protease-Aktivität hin untersucht (Abbildung 29). Zudem wurde das Restriktionsmuster überprüft. Das Restriktions-Bandenmuster der Plasmide aller Klone zeigten die entsprechenden Fragmente. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde der SG81LasB1 (Klon1) gewählt, der zwar eine niedrigere Zelldichte, dafür aber eine 20fach höhere Protease-Aktivität in Relation zum Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81 besaß. Zusätzlich wurde der SG81LasB3 (Klon3) ausgewählt, der eine um ca. 7,5fach erhöhte Protease-Aktivität zeigte, dafür aber eine erhöhte Zelldichte in den Kulturen aufwies und sich somit wie Mehrzahl der Klone verhielt.

0

10

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SG81 SG81MCS Klon1 Klon3 Klon5 Klon6 Klon8 Klon18

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m]

4 Ergebnisse

110

Abbildung 29: Relative Protease-Aktivität von nicht induzierten P. aeruginosa SG81LasB-Klonen in zellfreien Überständen von LB-Kulturen (24 h, 37 °C). Die Protease-Aktivität (Balken) wurde mit dem Azocasein-Test (3.5.3.1) bestimmt, die Zelldichte der Kulturen (Punkte) über Trübungsmessung bei 580 nm. Die P. aeruginosa SG81 wurde als Referenz-Stamm verwendet. Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von zwei Untersuchungen. Schwarz markiert sind die Klone, die für die weiterführenden Arbeiten ausgewählt wurden. Reporter-Enzympromotor-Fusionsstämme Um die transkriptionelle Regulation ausgewählter extrazellulärer Enzyme im Biofilm untersuchen zu können, wurden Gfp-Reporter-Enzympromotor-Fusionen im Plasmid pSWgfp konstruiert. Dabei wurde das gfp-Gen (grünfluoreszierendes Protein) aus der Qualle Aequorea victoria unter die Kontrolle der entsprechenden Enzympromotoren gestellt. Es wurde gfpmut3* verwendet, eine Variante des nativen Gfp, welches bei Anregung ein verlagertes Emissionsspektrum aufweist und sich somit deutlich von dem Eigenfluoreszenzspektrum von P. aeruginosa unterscheidet. Zudem fluoresziert Gfpmut3* 20-fach stärker als das native Gfp (Anderson et al., 1998). Mit geeigenten Primern wurden mittels PCR DNA-Fragmente aus dem PAO1 Genom amplifiziert, die ca. 1000 bp stromaufwärts des Startkodons gelegenen Bereiche beinhalteten. So wurden die Promotorbereiche von lipA und estA erhalten und diese jeweils in pSWgfp kloniert (S. Wilhelm, unveröffentlicht). Diese Reportergenfusionen wurden über konjugativen Transfer in P. aeruginosa SG81 eingebracht. Die Selektionierung der Exkonjuganden erfolgte über die auf dem Plasmid kodierte Carbenicillin-Resistenz und über die Detektion der Fluoreszenz der Kolonien bei Anregung mit UV-Licht. Es wurden je zwei Klone ausgewählt und in den folgenden Versuchen parallel untersucht.

0

200

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1000

SG81 Klon1 Klon3 Klon4 Klon5 Klon7 Klon10

rel.

Pro

teas

e-A

ktiv

ität/Z

elld

icht

e [ ∆

A43

0 nm

/O.D

.580

nm

]

012345678910

Zelld

icht

e [O

.D.5

80 n

m]

4 Ergebnisse

111

4.5 Physiologische Charakterisierung der verwendeten P. aeruginosa-Stämme 4.5.1 Reaktionen im api 20NE-Testsystem Für eine erste Beurteilung der physiologischen und biochemischen Eigenschaften der ausgewählten molekularbiologisch konstruierten Enzym-Überexpressions-Stämme im Vergleich zum mucoiden Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81, seiner nicht-mucoiden Revertante SG81R1 und dem Wildtyp P. aeruginosa PAO1 wurden die Stämme in das kommerzielle Identifizierungssystem api 20NE (bioMérieux, 3.1.3) eingesetzt. Dieses speziell für Nicht-Enterobacteriaceen entwickelte Testsystem besteht aus acht konventionellen und 12 Assimilations-Reaktionen. Die Reaktionsprofile sind in Tabelle 15 zusammengestellt. Die Reaktionsprofile aller getesteten Stämme entsprachen gemäß dem analytischen Profilindex des Herstellers einer ausgezeichneten Identifizierung als P. aeruginosa. Fast alle Stämme verhielten sich in den 21 Reaktionen identisch. Es konnten keine Unterschiede zwischen mucoiden und nicht-mucoiden Stämmen in Bezug auf die untersuchten Reaktionen beobachtet werden. Die einzigen Unterschiede zeigten die LasB-Überproduktionsstämme P. aeruginosa SG81Las1 und SG81Las3 und einer der beiden Esterase-Überexpressionstämme SG81EA1. Bei diesen drei Stämmen fand eine vermehrte Harnstoff Verwertung stand, was auf eine erhöhte Urease-Aktivität dieser Stämme schließen ließ.

4 Ergebnisse

Tabelle 15: Reaktionsprofile der in dieser Arbeit verwendeten P. aeruginosa-Stämme im api 20NE-Testsystem. Die Ablesung der Reaktionen erfolgte nach einer Bebrütung bei 30 °C für 48 h; (+) positive Reaktionen; (-) negative Reaktionen; (+/-) schwache, nicht eindeutige Reaktionen. Test Substrat Nachweis Reaktion P. aeruginosa-Stamm SG81 SG81

R1

PAO1 SG81

MCS1

SG81

LAH2

SG81

LAH3

SG81

LCH1

SG81

EA1

SG81

EA18

SG81

MMB1

SG81

Las1

SG81

Las3

NO3 Kaliumnitrat Nitratreduktion + + + + + + + + + + + +

TRP Tryptophan Indolnachweis - - - - - - - - - - - -

GLU Glucose Fermentation - - - - - - - - - - - -

ADH Arginin Argininhydrolase + + + + + + + + + + + +

URE Harnstoff Urease +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- + +/- +/- + +

ESC Äsculin β-Glucosidase - - - - - - - - - - - -

GEL Gelatine + Tusche Protease + + + + + + + + + + + +

PNPG p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

β-Galactosidase - - - - - - - - - - - -

GLU Glucose Assimilation + + + + + + + + + + + +

ARA Arabinose Assimilation - - - - - - - - - - - -

MNE Mannose Assimilation - - - - - - - - - - - -

MAN Mannit Assimilation + + + + + + + + + + + +

NAG N-Acetylglusosamin Assimilation + + + + + + + + + + + +

MAL Maltose Assimilation - - - - - - - - - - - -

GNT Gluconat Assimilation + + + + + + + + + + + +

CAP Caprat Assimilation + + + + + + + + + + + +

ADI Adipat Assimilation + + + + + + + + + + + +

MLT Malat Assimilation + + + + + + + + + + + +

CIT Citrat Assimilation + + + + + + + + + + + +

PAC Phenylacetat Assimilation - - - - - - - - - - - -

Ox NaDi Cytochromoxidase + + + + + + + + + + + +

4 Ergebnisse

113

4.5.2 Wuchseigenschaften in mAPM-Flüssigmedien Um die Wuchseigenschaften des mucoiden Ausgangsstamms SG81 und der davon abgeleiteten Enzym-Überexpressions- und Deletions-Stämme zu vergleichen, wurden sie als mAPM-Flüssigkultur bei 36 °C über 48 h angezüchtet und die Trübung der Kulturen bei 580 nm als Maß für die Zelldichte bestimmt. Zusätzlich wurde die extrazelluläre Lipase-Aktivität und bei einigen ausgewählten Stämmen die Uronsäure-Konzentration in den zellfreien Kulturüberständen bestimmt. Der zeitliche Verlauf des Wachstums, der extrazellulären Enzymaktivitäten und der Uronsäure-Konzentrationen sind in Abbildung 30 dargestellt. Zudem sind die aus dem logarithmischen Teil der Wuchskurven resultierenden Wuchsraten und die maximalen Zelldichten der Kulturen in Tabelle 16 zusammengefasst. Die LasB-Überexpressionen SG81Las1 und SG81Las3 zeigten einen identischen Kurvenverlauf, daher wurde nur der Stamm SG81Las1 in Abbildung 30 dargestellt. Entsprechendes galt für die beiden lipA-Überexpressions-Stämme, von denen nur der Stamm SG81LAH2 in Abbildung 30 dargestellt ist. Alle Stämme zeigten ab etwa 13 h ein exponentielles Wachstum und gingen ab 18 h in die stationäre Phase über. Einzige Ausnahme bildete der lipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1, welcher mit einer 70 % geringeren Wuchsrate erst ab etwa 22 h in die stationäre Phase überging. Besonders auffällig war dieser Stamm darüber hinaus durch die Bildung von Zellaggregaten, die in Form von kleinen Flocken in den Flüssigkulturen zu beobachten waren. Nach 20-24 h befanden sich alle Stämme in der Plateauphase, außer den LasB-Überproduzenten, die einen weiteren leichten Zelldichten-Anstieg bis 36 h zeigten. Zusammen mit der um 1,4 bzw. 1,6fach gesteigerten Wuchsrate erreichten diese Stämme eine entsprechend erhöhte maximale Zelldichte (Tabelle 16). Ansonsten besaßen die Stämme alle eine ähnliche maximale Zelldichte von etwa O.D.580 = 1,5, obwohl der lipA-Defekt- sowie der lipA-Überexpressions-Stamm, wie auch die estA-Überexpression SG81EA18 eine um etwa 40% verringerte Wuchsrate im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MCS zeigten. Allerdings erreichten diese Stämme ihre maximale Zelldichte erst nach 36 h und nicht schon nach 24 h wie der Ausgangsstamm SG81. Die Leervektorkontrolle SG81MCS verhielt sich in ihren Wuchseigenschaften wie der Ausgangsstamm SG81. Nach spätestens 36 h gingen die Stämme in eine Absterbephase über, was an den sinkenden Zelldichten zu erkennen war (Abbildung 30). Interessanterweise war der Rückgang in der Zelldichte umso drastischer, je höher die maximale Zelldichte des entsprechenden Stamms gewesen war. Betrachtete man die extrazellulären Lipase-Aktivitäten über die Wuchsdauer, so konnte man bei allen Stämmen einen deutlichen Lipase-Aktivitäts-Peak vor der logarithmischen Phase im Bereich von 7 h – 16 h beobachten (Abbildung 30). Beim lipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1 war dieser Peak mit einer maximalen Lipase-Aktivität von etwa 0,4 nmol/min x ml doppelt so hoch wie bei den anderen Stämmen. Sogar bei dem lipA-Defekt-Stamm SG81∆LAH1 konnte dieser Peak mit einem Maximum von 0,2 nmol/min x ml erkannt werden. Dort fiel die lipolytische Aktivität allerdings nach 16 h auf eine sehr geringe Restaktivität ab. Gegensätzlich verhielt sich der lipA-Überexpressions-Stamm SG81LAH, bei dem die hauptsächliche Lipase-Aktivität erst nach diesem Zeitpunkt ab 17 h auf etwa 7,0 nmol/min x ml anstieg, was im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 einer 10fach gesteigerten Aktivität entsprach. Auch dieser zweite Lipase-Aktivitäts-Peak in der logarithmischen Wuchsphase konnte mit einer durchschnittlichen Maximal-Aktivität von 0,7 nmol/min x ml bei 20 h – 24 h bei allen Stämmen, außer dem lipA-Defekt-Stamm SG81∆LAH1 beobachtet werden. Interessanterweise fiel diese lipolytische Aktivität bei fast allen Stämmen nach 36 h bzw. 48 h

4 Ergebnisse

114

ab und war weiterhin nicht mehr nachzuweisen. Bei den beiden estA-Überexpressions-Stämmen, besonders beim Stamm SG81EA18 konnte allerdings nach 20-stündiger Wuchsdauer eine zusätzliche Aktivitätssteigerung auf 3,0 nmol/min x ml festgestellt werden, die bei längerer Bebrütung nicht komplett abfiel und auch noch nach 48 h mit einer Aktivität von 1,25 nmol/min x ml detektiert werden konnte. Beim zweiten EstA-Überproduktions-Stamm SG81EA1 war der Verlauf der lipolytischen Aktivitäten prinzipiell der gleiche, nur mit geringeren Werten. Auch die beiden lasB-Überexpressions-Stämme zeigten keinen kompletten Abfall der Aktivität und so konnte bei 48 h noch eine Aktivität von 0,1 nmol/min x ml nachgewiesen werden, allerdings war bei diesen Stämmen die Maximal-Aktivität mit ca. 0,4 nmol/min x ml um 40 % geringer als im Ausgangssstamm SG81. Der Vergleich der verschiedenen lipolytischen Enzym-Defekt- und –Überexpressionsstämme ließ vermuten, dass die in dieser Arbeit untersuchten Enzyme LipA, LipC und EstA zu unterschiedlichen Zeiten des Bakterienwachstums ins extrazelluläre Medium sekretiert werden. Scheinbar wird die Lipase LipC zu einer frühen Wuchsphase bei 7-16 h, die Lipase LipA in der exponentiellen Wuchsphase, ab 16 h mit einem Maximum bei durchschnittlich 22 h und einem anschließendem Rückgang der Aktivität nach 32 h, die Esterase EstA hingegen erst zum Beginn der stationären Wuchsphase ab 20 h sekretiert. Die Konzentration an Uronsäuren wurde in dialysierten, zellfreien Kulturüberständen für die lasB-Überexpressions-Stämme im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 bestimmt (Abbildung 30). Es konnte beobachtet werden, dass die extrazelluläre Uronsäure-Konzentration des Stamms SG81 einen ähnlichen Verlauf wie die Wuchskurven zeigten, was bedeutet, dass die Uronsäure-Produktion vermehrt in der exponentiellen Wuchsphase stattfand. Die maximale Uronsäure-Konzentration von 1,8 mg/ml beim Stamm SG81 erwies sich 9fach höher als die der beiden LasB-Überproduzenten. Tabelle 16: Wuchsraten und maximale Zelldichten der verwendeten P. aeruginosa-Stämme in mAPM. 25 ml mAPM wurden mit 1 x 106 Zellen/ml ausgehend von einer mAPM-Vorkultur unter entsprechendem Selektionsdruck beimpft und über 48 h bei 36 °C und 180 Upm bebrütet. Die Zelldichte der Kulturen wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 580 nm über die Zeit verfolgt. P. aeruginosa-

Stamm

Wuchsrate µ

(∆O.D.580/h)

Zeitpunkt der

max. Zelldichte (h)

maximale Zelldichte

(O.D. 580)

SG81 0,424 24 1,45

SG81MCS4 0,414 24 1,40

SG81LCH1 0,115 24 1,51

SG81LAH2 0,277 36 1,48

SG81LAH3 0,285 36 1,49

SG81EA1 0,478 20 1,42

SG81EA18 0,281 36 1,37

SG81∆LAH1 0,249 36 1,50

SG81MMB1 0,380 24 1,42

SG81Las1 0,594 36 2,08

SG81Las3 0,665 36 2,16

4 Ergebnisse

115

Abbildung 30: Wuchskurven in APM. 25 ml APM wurden mit 1 x 106 Zellen/ml ausgehend von einer APM-Vorkultur unter entsprechendem Selektionsdruck beimpft und über 48 h bei 36 °C und 180 Upm bebrütet. Die Zelldichte der Kulturen wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 580 nm über die Zeit verfolgt. In EPS-haltigen zellfreien Kulturüberständen wurde die Lipase-Aktivität (3.5.3.3) und in einigen Fällen die Uronsäure-Konzentration (3.4.3.1) photometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichungen von zwei unabhängigen Untersuchungen.

-0,20

0,20,40,60,8

1

1,21,41,61,8

22,2

0 10 20 30 40 50 60Zeit (h)

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0

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1,6SG81

Uronsäuren

Lipase

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)

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1,6SG81MCS1

Lipase

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l)optis

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0,2

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1,4

1,6SG81DLAH1

Lipase

Lipase-Aktivität (nm

ol/min x m

l)

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che

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(580

nm

)

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0 10 20 30 40 50 60

Zeit (h)

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14

16SG81LAH2

Lipase

Lipase-Aktivität (nm

ol/min x m

l)

optis

che

Dic

hte

(580

nm

)

4 Ergebnisse

116

Abbildung 30 (Fortsetzung): Wuchskurven in APM. 25 ml APM wurden mit 1 x 106 Zellen/ml ausgehend von einer APM-Vorkultur unter entsprechendem Selektionsdruck beimpft und über 48 h bei 36 °C und 180 Upm bebrütet. Die Zelldichte der Kulturen wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 580 nm über die Zeit verfolgt. In EPS-haltigen zellfreien Kulturüberständen wurde die Lipase-Aktivität und in einigen Fällen die Uronsäure-Konzentration (3.4.3.1) photometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichungen von zwei unabhängigen Untersuchungen.

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1,6SG81LCH1

Lipase

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0

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1,6SG81EA1

Lipase

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5

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7SG81EA18

Lipase

Lipase-Aktivität (nm

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l)

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che

Dic

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(580

nm

)

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0,20,40,60,8

11,21,41,61,8

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0 10 20 30 40 50 60Zeit (h)

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0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6SG81Las1

Uronsäuren

Lipase

Lipase-Aktivität (nm

ol/min x m

L)

optis

che

Dic

hte

(580

nm

)

U

rons

äure

-Kon

zent

ratio

n (m

g/m

l)

4 Ergebnisse

117

In den Wuchskurven Experimenten konnte beim Ausgangsstamm SG81 und den meisten Enzym-Überexpressions-Stämmen nach 32-stündiger Bebrütung eine Inaktivierung der Lipase-Aktivität beobachtet werden. Sogar bei dem lipA-Überexpressions-Stamm SG81LAH, der eine fast 10fache Lipase-Aktivität als der Ausgangsstamm SG81 zeigte, ging diese nach 36 h Bebrütung komplett zurück (Abbildung 30). Eine mögliche Erklärung dafür wäre der proteolytische Abbau der extrazellulären Lipasen. Um einen Überblick über die zu den verschiedenen Bebrütungszeiten aktiven Proteasen zu erhalten, wurden gelelektrophoretische Analysen mit Casein als Protease-Substrat von zellfreien Kulturüberständen von mAPM-Flüssigkulturen durchgeführt (Abbildung 31). Es konnte eine deutliche Bande bei einem Molekulargewicht von etwa 50 kDa erkannt werden, deren Stärke mit der Bebrütungszeit deutlich zunahm. In der Literatur wurde beschrieben, dass diese Bande der alkalischen Protease von P. aeruginosa zuzuordnen ist (Caballero et al., 2001)

Abbildung 31: Gelelektrophoretische Analyse von Protease-Aktivitäten mit Zymogrammgelen. Es wurden jeweils 25 µl zellfreie Kulturüberstände von unterschiedlich lange bebrüteten APM-Kulturen (36 °C, 180 Upm) aufgetragen. Spuren 2-5: Kulturüberstände von P. aeruginosa SG81, Spuren 6-9: Kulturüberstände von P. aeruginosa SG81LAH2, Spuren 1 und 10: Marker (Prestained Protein-Molekulargewichts-Marker, Sigma) 4.5.3 Quantitative Untersuchung von 24 h-Agarbiofilmen Untersuchungen am Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81 an Agar-Biofilmen und Membranfilter-Biofilmen auf PIA zeigten, dass sich beide Anzuchtverfahren als Biofilmmodell nutzen lassen (4.1). Zum einen konnten für die biochemische Analyse der EPS-Komponenten ausreichende Mengen extrazellulären Materials gewonnen werden. Zum anderen konnte bei den Experimenten zur zeitlichen Dynamik dieser Biofilme gezeigt werden, dass sich 24 h-Biofilme anscheinend in der spät logarithmischen, bzw. früh stationären Wuchsphase befanden. Da fast alle extrazellulären Substanzen, wie auch extrazelluläre Enzyme, vermehrt in dieser Wuchsphase exprimiert und sekretiert werden, sind 24 h-Biofilme für die biochemischen Untersuchungen zur EPS-Zusammensetzung, inklusive der Aktivitäts-Bestimmungen extrazellulärer Enzyme geeignet. Bei der physiologischen Charakterisierung der Enzym-Defekt- und Überexpressions-Stämme von P. aeruginosa wurden dementsprechend nur Agar-Biofilme auf PIA untersucht, die für 24 h bei 36 °C angezüchtet wurden. Zunächst wurden die Biofilme

26,6 kDa36,5 kDa

58,0 kDa

84,0 kDa116 kDa

180 kDa

48,5 kDa

36 h24 h0 h48 h36 h24 h0 h 48 hM M

8765432 91 10

4 Ergebnisse

118

an Hand der Feuchtgewichts des Schleims (Biomasse), der Zellzahl und des Trockengewichtanteils (3.1.5) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 zusammengefasst. Tabelle 17: Eigenschaften von 24 h Agar-Biofilmen der verwendeten P. aeruginosa-Stämme. Die Anzucht der Biofilme erfolgte als konfluenter Bakterienrasen auf der Oberfläche von Agarnährmedien (PIA, 24 h, 36 °C). Der Biofilm wurde von den Agarnährmedien abgekratzt, das Feuchtgewicht bestimmt und anschließend 1:16 (w/v) in 0,14 M NaCl-Lösung suspendiert. Die Zellzahlen wurden in diesen Biofilmsuspensionen mit Hilfe einer Thoma-Kammer im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von vier unabhängigen Untersuchungen. Der Trockengewichtsanteil wurde nur einmal bestimmt. n. b., nicht bestimmt P. aeruginosa-

Stamm

Zellzahl/cm2

(x 109)

Zellzahl/g

Feuchtgewicht (x 1010)

Feuchtgewicht

(mg/cm2)

Trockengewichts

-anteil (%)

SG81 1,4 ± 0,3 5,8 ± 1,8 25,6 ± 1,9 6,1

SG81R1 1,4 ± 0,5 56,0 ± 28,5 2,5 ± 0,2 n. b.

SG81MCS1 1,6 ± 0,3 5,20 ± 0,6 28,2 ± 4,4 5,9

SG81∆LAH1 1,2 ± 0,1 3,8 ± 0,3 32,8 ± 3,0 5,5

SG81LAH2 1,4 ± 0,2 4,4 ± 0,7 31,4 ± 2,5 6,0

SG81LAH3 1,5 ± 0,6 4,6 ± 0,8 31,9 ± 6,8 n. b.

SG81LCH1 1,6 ± 1,7 5,7 ± 2,2 27,9 ± 7,9 5,3

SG81EA1 1,5 ± 0,6 5,7 ± 1,7 26,0 ± 3,7 5,4

SG81EA18 1,9 ± 0,2 5,3 ± 2,4 36,3 ± 8,1 5,6

SG81MMB1 1,5 ± 0,1 5,9 ± 0,4 26,3 ± 1,4 n. b.

SG81Las1 1,5 ± 0,8 4,9 ± 2,0 30,2 ± 4,2 n. b.

SG81Las3 1,4 ± 0,3 4,4 ± 1,4 32,3 ± 1,9 5,9

Im Vergleich zum mucoiden Ausgangsstamm SG81 wies die nicht-mucoide Revertante SG81R1 ein 10fach verringertes Feuchtgewicht pro cm2 Aufwuchsfläche auf. Bei gleicher Zellzahl von 1,4 x 109 Zellen/cm2 in Relation zum Stamm SG81 entsprach das einer 10fach erhöhten Zellzahl pro g Biomasse. Die beiden Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 zeigten keine Unterschiede zum Ausgangsstamm SG81 in Bezug auf das Feuchtgewicht und die Zellzahlen des Biofilms. Die beiden lipA-Überexpresssions-Stämme SG81LAH2 und SG81LAH3 zeigten untereinander keine Unterschiede. Allerdings wiesen sie im Vergleich zum Ausgangsstamm ein um 25 % erhöhtes Feuchtgewicht auf und eine entsprechend verringerte Zellzahl pro g Biofilm, obwohl die Zellzahl/cm2 gleich war.Auch der lipA-Deletions-Stamm SG81∆LAH1 besaß ein um 30 % erhöhtes Feuchtgewicht und eine um 35 % verringerte Zellzahl pro g Feuchtgewicht und auch eine leicht verringerte Zellzahl pro cm2 Aufwuchsfläche. Sowohl der lipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1, sowie eine der beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA1 wiesen im Vergleich zum Ausgangsstamm und ihrer Leervektorkontrolle SG81MCS1 keine Unterschiede auf. Dagegen zeigte der zweite estA-Überexpressions-Stamm SG81EA18 ein um 40 % gesteigertes Feuchtgewicht pro cm2 in Relation zum Ausgangssatmm SG81, bei vergleichbarer Zellzahl. Auch die lasB-Überexpressions-Stämme wiesen eine 20 % erhöhtes Feuchtgewicht pro cm2 und eine um ca. 20 % geringere Zellzahl pro g Feuchtgewicht auf im Vergleich mit dem Ausgangsstamm SG81 und ihrer Leervektorkontrolle SG81MMB1.

4 Ergebnisse

119

Das Feuchtgewicht des Biofilms setzt sich unter diesen Anzuchtbedingungen prinzipiell aus dem Gewicht der Zellen, dem des extrazellulären Materials und dem des eingelagerten Wassers zusammen. Unterschiede im Feuchtgewicht können demnach entweder durch eine erhöhte Zellzahl, erhöhte EPS-Produktion, oder durch einen erhöhten Wasseranteil im Biofilm zustande kommen. Bei der Betrachtung des Trockengewichtanteils, stellte sich heraus, dass einige Stämme (SG81∆LAH1, SG81LCH1, SG81EA1 und SG81EA18) einen verringerten Trockengewichtsanteil aufwiesen, was auf einen erhöhten Wassergehalt schließen ließ. Interessanterweise zeigen fast alle Stämme mit erhöhtem Feuchtgewicht eine verringerte Zellzahl. 4.5.4 Hydrophobizität der Zelloberflächen Für P. aeruginosa wurde gezeigt, dass das Anheften an biotische und abiotische Oberflächen, als primäre Phase der Biofilmbildung, vor allem in wässrigen Systemen, unter anderem durch die hydrophoben Eigenschaften der Zelloberflächen beeinflusst wird (siehe Einleitung). Rosenberg et al. (1980) entwickelten ein Zwei-Phasen-Testsystem, um die Hydrophobizität von Zelloberflächen durch die Bindung der Zellen an das hydrophobe, organische Lösemittel n-Hexadekan quantitativ bestimmen zu können. Um einen Hinweis auf die Zelloberflächenhydrophobizität der Enzym-Defekt-Mutanten und Überexpressions-Stämme zu erhalten, wurde die Adhärenz der Zellen an n-Hexadekan untersucht. Dazu wurden die verschiedenen P. aeruginosa-Stämme als Biofilm auf PIA bei 36 °C für 24 h angezüchtet und eine Zellsuspension in PUM-Puffer, pH 7,5 hergestellt. Um EPS-Bestandteile von den Zelloberflächen zu entfernen wurden die Zellen 1 x mit PUM-Puffer gewaschenen und erneut in PUM-Puffer resuspendiert und die Zellzahl der Suspensionen mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer auf 5 x 108 Zellen/ml eingestellt. Dies entsprach bei 580 nm einer optischen Dichte von ungefähr 0,9. Anschließend wurden je 1,2 ml dieser Suspensionen mit verschiedenen Volumina an n-Hexadekan vermischt und nach einer Phasentrennungszeit von 15 min die untere wässrige Phase entnommen und bei 580 nm im Photometer vermessen (3.1.6). Es konnte bei keinem der untersuchten Stämme eine Bindung der Zellen an n-Hexadekan beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Demnach ist die Zellenoberflächen insgesamt als hydrophil anzusehen.

4 Ergebnisse

120

4.5.5 Beweglichkeiten Ein weiterer Faktor, der die Anheftung von Zellen und damit die Biofilmbildung von P. aeruginosa an Oberflächen beeinflusst, sind die Bewegungsorganellen wie Flagellen und Typ IV-Pili. Dabei befähigt die Flagelle die Zelle zu Schwimmbewegungen, die ihnen das Erreichen einer Oberfläche ermöglicht und das Anheften vermittelt (O´Toole und Kolter, 1998). Typ IV-Pili erlauben die Bewegung entlang einer Oberfläche („Twitching Motility“; Mattick, 2002). Eine dritte Bewegungsform, die erst kürzlich für P. aeruginosa beschrieben wurde, ist das Schwärmen, welche sich aus der Flagellen-abhängigen Schwimmbewegung und der Typ IV-Pili vermittelten Twiching Motility zusammensetzt (Köhler et al., 2000). Das Schwimmverhalten wurde mittels M9-Agarplatten mit einer Agarkonzentration von 0,3 % (w/v) untersucht. Die Bewegung der Zellen im weichen Agar vom Punkt der Inokulation fort führte zur Ausbildung von trüben Zonen (Abbildung 32 a + c). Die Twitching Motility wurde mit Hilfe von 3 mm dicken LB-Agarplatten untersucht. Es wurden Einzelkolonien durch den Agar bis zum Petrischalengrund gestochen. Nach 24 h bei 36 °C bildeten sich auf der Agaroberfläche Kolonien. Nach weiteren 48 h bei Raumtemperatur kam es durch die Bewegung der Zellen entlang des Petrischalenbodens zu einer trüben Zone um die entstandenen Kolonien. Ein weiterer Hinweis auf Twitching Motility sind gefranste Kolonieränder, die im Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet werden konnten (Abbildung 33). Weichagarplatten mit einer Agarkonzentration von 0,5 % (w/v) wurden zur Untersuchung des Schwärmverhaltens verwendet. Das Ausschwärmen der Zellen vom Inokulationspunkt führt bei nicht-mucoiden Stämmen von P. aeruginosa zu einem typischen, dendristischen Muster (Köhler et al., 2000; Abbildung 34b), welches bei mucoiden Stämmen fehlte; hier kam es nur zur Ausbildung von trüben Zonen um den Inokulationspunkt (Abbildung 34a). Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 zusammengefasst. Tabelle 18: Beweglichkeiten der verwendeten P. aeruginosa-Stämme. Es wurden vier unabhängige Experimente mittels Agarplatten-Tests (3.1.8) durchgeführt. (-) keine Bewegung, (+/-) schwache Bewegung, (+) mäßige Bewegung, (++) starke Bewegung, (+++) sehr starke Bewegung, n.n. = nicht nachgewiesen. P. aeruginosa- Schwimmen Twitching Motility Schwärmen

Stamm Bewegung Mustertyp

(Abb. 32)

trübe Zone gefranzte

Kolonieränder

Mustertyp

(Abb. 33)

Bewegung Mustertyp

(Abb. 34)

SG81 + a +/- +/- a + a

SG81R1 ++ b n.n. n.n. n.n. ++ b

SG81MCS4 + a +/- +/- a + a

SG81∆LAH1 + a - + c + a

SG81LAH2 + a + +/- a + a

SG81LAH3 + a + +/- a + a

SG81LCH1 + a - - b + a

SG81EA1 ++ c - - b +++ c

SG81EA18 + a - - b +++ d

SG81MMB1 + a - +/- a + a

SG81Las1 ++ d ++ ++ d + e

SG81Las3 ++ d ++ ++ d + e

4 Ergebnisse

121

Der Ausgangsstamm SG81 und die beiden Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 zeigten eine mäßige Schwimmbewegung (Tabelle 18; Abbildung 32a). Der nicht-mucoide Stamm SG81R1 dagegen wies eine deutlich vermehrte Schwimmfähigkeit und als einziger Stamm die Ausbildung eines deutlichen Musters innerhalb des semisoliden Agars auf (Abbildung 32b). Sowohl die Deletion, als auch die Überexpression von lipA zeigte keinen Einfluss auf die Schwimmbewegung. Auch beim lipC-Überexpression-Stamm SG81LCH1 und einem der beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA18 konnte kein Unterschied in der Schwimmbeweglichkeit im Verglcih zum Ausgangsstamm SG81 beobachtet werden (Tabelle 18). Dagegen wiesen die beiden lasB-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 und der estA-Überexpressions-Stamm SG81EA1 vermehrtes Schwimmen im Vergleich mit dem Ausgangsstamm SG81 auf, was sich bei SG81EA1 an dem größeren Durchmesser der trüben Zone (Abbildung 32c) und für die LasB-Überproduzenten zusätzlich durch unregelmäßige Muster im Agar (Abbildung 32d) erkennen ließ. Abbildung 32: Schwimmbewegung der P. aeruginosa-Stämme a) SG81 b) SG81R1 c) SG81EA1 und d) SG81Las1 in M9-Minimalagar mit einer Agarkonzentration von 0,3 %. Dargestellt sind repräsentative Schwimmagarplatten, die mit einer Einzelkolonie beimpft und für 24 h bei 36 °C inkubiert wurden. Der Ausgangsstamm SG81 dient dabei als Beispiel für alle Stämme mit mäßiger Schwimmbewegung. Die Fähigkeit zur Twitching Motility erwies sich zwischen den verschiedenen Stämmen als sehr unterschiedlich. Der Ausgangsstamm SG81 und die beiden Leerverktorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 zeigten nur eine sehr schwache Typ IV-Pili vermittelte Beweglichkeit. Es konnten nur an Teilbereichen der Kolonien trübe Zonen beobachtet werden (ohne Abbildung). Auch die Ausstülpungen an den Kolonierändern waren nur schwach ausgeprägt (Abbildung 33a). Der lipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1 und die beiden Esterase-Überproduzenten SG81EA1 und SG81EA18 zeigten keine Bewegung über die Oberfläche. Bei den drei Stämmen zeigten sich weder trübe Zonen noch Ausstülpungen an den Kolonierändern (Abbildung 33b). Die beiden LipA-Überproduktions-Stämme SG81LAH2 und SG81LAH3 wiesen im Vergleich zum Ausgangsstamm eine leicht erhöhte Beweglichkeit auf. Zwar konnten hier keine gefransten Kolonieränder beobachtet werden, dafür aber deutlichere trübe Zonen um die Kolonien. Im Gegensatz dazu konnte bei der lipA-Defekt-Mutante SG81∆LAH keine trübe Zone, aber dafür verstärkt gefranste Kolonieränder beobchtet werden (Abbildung 33c). Sehr deutlich verstärkte Twitching motility zeigten die beiden Elastase B-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3. Es konnten sowohl deutliche trübe Zonen um die gesamte Kolonie, als auch stark gefranste Kolonieränder beobachtet werden (Abbildung 33d).

a) c) b) d)

4 Ergebnisse

122

Abbildung 33: Twitching Motility der P. aeruginosa-Stämme a) SG81 b) SG81EA1 c) SG81∆LAH1 und d) SG81Las1 in LB-Agar, welcher mit einer Einzelkolonie beimpft und für 24 h bei 36 °C und weitere 48 h bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Dargestellt sind Kolonieränder bei 100facher Vergrößerung im Phasenkontrast. Der Ausgangsstamm SG81 dient dabei als Beispiel für alle Stämme mit schwacher Twitching Motility, SG81EA1 dient als beispielhafte Darstellung für fehlende Twitching Motility. Die nicht-mucoide Revertante SG81R1 zeigte im Schwärmagar-Plattentest ein deutliches, dendritisches Muster (Abbildung 34b). Bei den mucoiden Stämmen dagegen konnte man fast ausschließlich trübe Zonen, ohne Muster um den Inokulationspunkt beobachten (Abbildung 34a). Eine Ausnahme bot der Esterase A-Überexpressionsstamm SG81EA1, der als einziger mucoide Stamm ein deuliches Muster zeigte. Zudem war die Besiedlung der Agaroberfläche nach 48 h Bebrütung fast flächendeckend (Abbildung 34c). Der zweite estA-Überexpressions-Stamm SG81EA18 zeigte zwar kein Muster, dafür aber eine etwa doppelt so große trübe Zone um den Inokulationspunkt in Relation zum Ausgangsstamm SG81, was auf ein verstärktes Schwärmverhalten schließen ließ. Die beiden lasB-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 zeigten bei gleichem Durchmesser der trüben Zone im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 einen Ansatz von einem Muster. Alle anderen Stämme, einschließlich der Leervektorkontrollen verhielten sich in Bezug auf ihr Schwärmverhalten wie der Ausgangsstamm SG81 (Abbildung 34a). Abbildung 34: Schwärmverhalten der P. aeruginosa-Stämme a) SG81 b) SG81R1 c) SG81EA1 d) SG81EA18 und e) SG81Las1 in M9-Minimalagar mit einer Agarkonzentration von 0,5 % (w/v) und Glutamat als einzige Stickstoffquelle. Dargestellt sind repräsentative Schwärmagarplatten, die mit einer Einzelkolonie beimpft und für 48 h bei 36 °C inkubiert wurden. Der Ausgangsstamm SG81 dient dabei als Beispiel für alle Stämme mit mäßigen Schwärmverhalten.

a) d)c) b)

a) d) c) b) e)

4 Ergebnisse

123

4.5.6 EPS-Zusammensetzung Für P. aeruginosa wurde gezeigt, dass die EPS-Zusammensetzung einen Einfluss auf die Anheftung von Zellen an biotische und abiotische Oberflächen, die Biofilmdifferenzierung und die Biofilmstruktur besitzt. Bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa spielt vor allem das extrazelluläre Polysaccharid Alginat eine wesentliche Rolle bei diesen Vorgängen. Daher galt es zu untersuchen, ob die molekularbiologisch eingebrachten genetischen Veränderungen möglicherweise Veränderungen in der EPS-Zusammensetzung der im Agar-Biofilm gewachsenen Enzym-Defekt-Mutanten und Enzym-Überexpressions-Stämme nach sich zieht. Zusätzlich zu der biochemischen Analyse von Protein- (3.4.1), Kohlenhydrat- (3.4.2) und Uronsäuegehalt (3.4.3.2) wurde der Acetylgruppengehalt nach einer Methode von Hestrin et al. (1949) in den zellfreien EPS-Lösungen bestimmt, da die über Esterbindungen kovalent ans Alginat gebundenen Acetylgruppen eine zusätzliche Rolle bei allen Stadien der Biofilmbildung spielen (Franklin & Ohman, 1993; 1996; Körstgens et al., 2001; Tielen et al., 2005) und vor allem lipolytische Enzyme theoretisch in der Lage sind, solche Esterbindungen zu spalten. Zunächst muss festgehalten werden, dass die teilweise sehr hohen Standabweichungen durch die Mittlung der vier unabhängigen Experimente zustande kamen. Innerhalb der Experimente waren im Wesentlichen immer dieselben Unterschiede zwischen den einzelnen Stämmen erkennbar, sodass von tatsächlichen physiologischen Effekten durch das Einbringen der genetischen Veränderungen ausgegangen werden kann. Bezogen auf das Volumen (ml) EPS-Lösung konnte zwischen den Stämmen kein signifikanter Unterschied in der Proteinkonzentration erkannt werden (Abbildung 35a); der Proteingehalt in den EPS-Lösungen belief sich auf etwa 550 µg/ml. Nur der nicht-mucoide Stamm SG81R1 besaß mit 650 µg/ml einen um 20 % erhöhten Proteinanteil in den zellfreien EPS-Lösungen. Auch die Kohlenhydratkonzentration war mit etwa 1000 µg/ml EPS-Lösung bei fast allen Stämmen identisch (Abbildung 35b). Nur die nicht-mucoide Revertante SG81R1 zeigte einen um 25 % verringerten Kohlenhydratgehalt. Bei einem der beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA18 konnte eine um 30 % erhöhte Kohlenhydratkonzentration gegenüber dem Stamm SG81 nachgewiesen werden. Die Kohlenhydrate bestanden bei den meisten mucoiden Stämmen fast ausschließlich aus Uronsäuren (Abbildung 35c). Beim nicht-mucoiden Stamm SG81R1 konnten nur 7 % des Gesamtkohlenhydrates als Uronsäuren identifiziert werden. Der estA-Überexpressions-Stamm SG81EA18 zeigte einen 77 %igen Anteil Uronsäuren am Gesamtkohlenhydratgehalt. Bei den beiden LasB-Überproduktions-Stämmen konnten etwa 83 % der Kohlenhydrate als Uronsäuren nachgewiesen werden. Bei gleichem Kohlenhydratgehalt waren die Uronsäurekonzentrationen bei den beiden Stämmen auch um etwa 30 % niedriger als beim Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MMB1. Auch die beiden EstA-Überproduktions-Stämme SG81EA1 und SG81EA18 zeigten eine um 20 % bzw. 15 % verringerte Uronsäurekonzentration in Relation zum Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MCS. Allerdings kam diese Abweichung, genauso wie der um 22 % verringerte Uronsäuregehalt bei dem LipA-Überexpressions-Stamm SG81LAH und die um 26 % verringerte Konzentration bei der LipA-Defekt-Mutante SG81∆LAH, durch eine verringerte Zellzahl im 24 h Biofilm zustande (Tabelle 19).

4 Ergebnisse

124

Abbildung 35: EPS-Zusammensetzung in 24 h-Agar-Biofilmen (PIA, 36 °C) der verwendeten P. aeruginosa-Stämme. Die Ergebnisse sind dargstellt als Konzentration der a) Proteine (3.4.1), b) Kohlenhydrate (3.4.2) und c) Uronsäuren (3.4.3.2) in µg/ml zellfreier EPS-Lösung (dunkle Balken) bzw. als µg/109 Zellen (helle Balken). Es sind arithmetrische Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten ± Standardabweichungen dargestellt.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

SG81

SG81R1

SG81MCS1

SG81LC

H1

SG81LA

H2

SG81DLA

H1

SG81EA1

SG81EA18

SG81MMB1

SG81La

s1

SG81La

s3

Pro

tein

-Kon

zent

ratio

n (µ

g/m

L bz

w. µ

g/10

9 Zel

len)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

SG81

SG81R1

SG81MCS1

SG81LC

H1

SG81LA

H2

SG81DLA

H1

SG81EA1

SG81EA18

SG81MMB1

SG81La

s1

SG81La

s3

Koh

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n(µ

g/m

L bz

w. µ

g/10

9 Zel

len)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

SG81

SG81R1

SG81MCS1

SG81LC

H1

SG81LA

H2

SG81DLA

H1

SG81EA1

SG81EA18

SG81MMB1

SG81La

s1

SG81La

s3

Uro

nsäu

re-K

onze

ntra

tion

(µg/

mL

bzw

. µg/

109 Z

elle

n)

b)

a)

c)

4 Ergebnisse

125

Bezogen auf die Zellzahl in den Biofilmsuspensionen ergab sich ein etwas anderes Bild der EPS-Zusammensetzung (Abbildung 35; Tabelle 19). Dort zeigte sich, dass die beiden EstA-Überproduktions-Stämme und die lipA-Überexpression eine vergleichbare Uronsäurekonzentration in Relation zum Ausgangsstamm SG81 aufwiesen. Die lipA-Defekt-Mutante zeigte sogar eine um 20 % erhöhte Uronsäureproduktion. Nur die beiden LasB-Überproduktions-Stämme besaßen auch auf die Zellzahl bezogen eine um 36 % bzw. 18 % verringerte Uronsäurekonzentration. Der nicht-mucoide Stamm SG81R1 zeigte bei der auf die Zellzahl bezogene EPS-Zusammensetzung besonders deutliche Unterschiede. Da dieser Stamm in Relation zum mucoiden Stamm SG81 eine etwa 10fach höhere Zellzahl/ml aufwies, ergab sich bei gleicher extrazellulärer Masse pro ml eine entsprechend 10fach verringerte EPS-Produktion. Die beiden Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 wiesen eine mit dem Ausgangsstamm vergleichbare EPS-Zusammensetzung auf. Auch die lipC-Überexpression SG81LCH und einer der beiden EsteraseA-Überproduktions-Stämme SG81EA1 verhielten sich bezüglich der EPS-Zusammensetzung in Agar-Biofilmen identisch zum Ausgangsstamm SG81. Beim zweiten EstA-Überproduzenten SG81EA18 dagegen konnte man eine 30 % erhöhte Proteinkonzentration und eine 45 % erhöhte Kohlenhydratkonzentration, allerdings keine erhöhte Uronsäurekonzentration nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass dieser Stamm zusätzlich zum Alginat wahrscheinlich noch ein anderes extrazelluläres Polysaccharid produziert. Der LipaseA-Überexpressions-Stamm SG81LAH2 zeigte eine um 34 % erhöhte Proteinkonzentration, was sich allerdings nicht als statistisch abgesichert erwies. Der lipA-Defekt-Stamm zeigte trotz geringerer Zellzahl einen um 30 % erhöhten extrazellulären Kohlenhydratgehalt und einen um 64 % erhöhten Proteingehalt, was zu einer insgesamt 43 %igen Steigerung des gesamten extrazellulären Materials führte. Die beiden LasB-Überexpressions-Stämme besaßen bei vergleichbarer Zellzahl eine um 34 % bzw. 57 % erhöhte Proteinkonzentration und eine um 50 % bzw. 30 % erhöhte Kohlenhydrat-Konzentration im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81, was insgesamt zu einer 40 %igen Erhöhung des gesamten extrazellulären Materials führte. Trotz erhöhtem Kohlenhydratgehalt erwies sich die Uronsäurekonzentration um 36 % bzw. 22 % verringert, was darauf hinweist, dass die LasB-Überproduzenten zusätzlich zum Alginat noch ein anderes extrazelluläres Polysaccharid besitzen, welches etwa 50 % bzw. 26 % bei SG81Las3 vom Gesamtkohlenhydratgehalt ausmacht. Auch konnte bei den beiden LasB-Überproduktions-Stämmen, trotz verringertem Uronsäuregehalt ein um 35 % erhöhter Acetylgruppengehalt nachgewiesen werden. Der Acetylgruppengehalt erwies sich beim LipaseC-Überexpressionsstamm SG81LCH1 in Relation zum Ausgangsstammm SG81 um 32 % erhöht, was sich bei statistischer Betrachtung allerdings als nicht signifikant herausstellte. Alle anderen Stämme zeigten einen zum Ausgangsstamm vergleichbaren Acetylgruppengehalt.

4 Ergebnisse

126

Tabelle 19: EPS-Zusammensetzung von 24 h-Agar-Biofilmen (PIA, 36 °C) der verwendeten P. aeruginosa-Stämme. Die Ergebnisse sind angegeben als Konzentration der a) Proteine (3.4.1), b) Kohlenhydrate (3.4.2) und c) Uronsäuren (3.4.3.2) in µg pro 109 Zellen von 4 unabhängigen Untersuchungen, außer SG81R1 und SG81∆LAH = zwei Untersuchungen. Der Acetylgruppengehalt (3.4.4) wurde in zwei unabhängigen Experimenten bestimmt und auf die Uronsäurekonzentration in den Zellfreien EPS-Lösungenn bezogen. n.b., nicht bestimmt. P. aeruginosa-

Stamm

Proteine (µg/109 Zellen)

Kohlenhydrate (µg/109 Zellen)

Uronsäuren (µg/109 Zellen)

Acetylgruppen (mM/mg Alginat)

SG81 161,2 ± 52,2 296,6 ± 100,9 346,41 ± 94.8 0,97 ± 0,21

SG81R1 22,77 ± 2,3 21,01 ± 2,26 1,49 ± 0,21 n.b.

SG81MSC1 174,4 ± 23,5 304,3 ± 60,7 373,50 ± 58,4 1,05 ± 0,14

SG81LCH1 136,0 ± 9,7 315,1 ± 101,5 351,80 ± 84,1 1,28 ± 0,15

SG81LAH2 216,4 ± 51,6 338,4 ± 107,5 395,27 ± 74,2 1,16 ± 0,21

SG81∆LAH1 264,6 ± 64,6 388,9 ± 98,4 419,09 ± 55,9 n.b.

SG81EA1 182,3 ± 30,3 273,4 ± 89,8 364,11 ± 85,0 1,06 ± 0,13

SG81EA18 210,3 ± 14,2 428,6 ± 105,8 309,72 ± 51,4 1,16 ± 0,01

SG81MMB1 180,3 ± 8,6 282,6 ± 24,2 299,54 ± 34,7 n.b.

SG81las1 216,1 ± 95,3 442,9 ± 109,6 221,40 ± 42,2 1,30 ± 0,07

SG81las3 252,4 ± 87,6 384,6 ± 110,3 285,59 ± 28,2 1,31 ± 0,08

Weitere extrazelluläre Komponenten von P. aeruginosa sind niedermolekulare Pigmente, wie Pyocyanin und Pyoverdin. Der blaue, redox-aktive Sekundärmetabolit Pyocyanin (Phenazin-1-Carboxylsäure) spielt bei Infektionsgeschehen eine große Rolle und wird als Virulenzfaktor von P. aeruginosa angesehen. Das gelb-grün fluoreszierende Siderophor Pyoverdin, wird von vielen P. aeruginosa-Stämmen unter Eisenmangelbedingungen gebildet. Neuere Erkenntnisse haben gezeigt, dass auch Pyoverdin in das Signalgeschehen während einer Infektion eingreift und somit die Virulenz von P. aeruginosa beeinflusst (Lamont et al., 2002). Sowohl bei Flüssigkulturen als auch bei der Anzucht von Biofilmen auf Agaroberflächen konnten Unterschiede in der Farbe von einigen Stämmen beobachtet werden. Die Kulturen der LasB-Überproduzenten SG81Las1 und SG81Las3, sowie einer der beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA1 waren farblos, die Kultur des zweiten EstA-Überproduktions-Stamms SG81EA18 hingegen stärker blau-grün gefärbt. Zur Quantifizierung wurde das Pyocyanin mit Chloroform aus den EPS-Lösungen der verschiedenen Enzym-Defekt- und Enzym-Überexpressions-Stämme extrahiert und die Absorption dieser Lösung bei 695 nm bestimmt. Das hydrophile Pyoverdin verblieb in der wässrigen EPS-Lösung und konnte fluorimetrisch detektiert werden (Abbildung 36). Es zeigte sich, dass die Konzentration an extrazellulärem Pyocyanin durch das Einbringen des Leervektors pBBR1MCS nicht signifikant beeinflusst wurde. Die auf diesem Vektor basierenden

4 Ergebnisse

127

Lipase-Überexpressionen SG81LCH1 und SG81LAH2 und einer der beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA18 zeigten entsprechendes. Der Stamm SG81EA1 hingegen wies eine um 50 % verringerte Absorption im Vergleich zum Ausgangsstamm auf. Auch die LasB-Überproduktion SG81Las1 zeigte erwartungsgemäß eine um 55 % niedrigere Pyocyanin-spezifische Absorption, wohingegen die Leervektorkontrolle eine zum Ausgangsstamm vergleichbare Absorption aufwies. Die lipA-Deletion hatte keinen Einfluss auf die Pyocyanin-Konzentration. Die extrazelluläre Pyoverdin-Konzentration war bei allen Stämmen, außer den EstA-Überproduzenten SG81EA1 und dem LasB-Überproduzenten SG81Las1 vergleichbar. Dabei wies der Stamm SG81EA1 eine 30 %ige Steigerung, der Stamm SG81Las1 eine um 60 % verringerte Pyoverdin-spezifische Fluoreszenz der EPS-Lösungen auf.

Abbildung 36: Pigmente in zellfreien EPS-Lösungen von 24 h-PIA Biofilmen der verwendeten P. aeruginosa-Stämme. Pyocyanin wurde durch viermalige Extraktion mit Chloroform aus den zellfreien EPS-Lösungen der verschiedenen Enzym-Defekt- bzw. Überexpressions-Stämme isoliert und die Absorption bei 695 nm im Photometer bestimmt. Das hydrophile Pyoverdin verblieb in der wässrigen Phase und konnte fluorimetrisch mit einer Anregungswellenlänge von 400 nm bei einer Emissionswellenlänge von 460 nm detektiert werden (3.4.6). Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichungen von zwei unabhängigen Untersuchungen.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

SG81

SG81MCS1

SG81LCH1

SG81DLAH1

SG81LAH2

SG81EA1

SG81EA18

SG81MMB1

SG81Las1

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Flu

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zenz

(E

m46

0)

Abs

orpt

ion

(A69

5 (x

200

))

Pyocyanin

Pyoverdin

4 Ergebnisse

128

4.5.7 Extrazelluläre Enzymaktivitäten 4.5.7.1 Photometrischer Nachweis extrazellulärer Enzymaktivitäten Die extrazellulären Enzymaktivitäten wurden in den zellfreien EPS-Lösungen mit photometrischen Substrat-Verwertungs-Tests ermittelt. Es galt vor allem zu untersuchen, wie sich die molekularbiologisch eingebrachten genetischen Veränderungen in Bezug auf die extrazellulären Enzymaktivitäten bei den im Biofilm angezüchteten P. aeruginosa-Stämmen auswirkten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 dargestellt. Tabelle 20: Photometrische Bestimmung von Enzymaktivitäten in zellfreien EPS-Lösungen von Agar-Biofilmen (PIA, 24 h, 36 °C) der verwendeten P. aeruginosa-Stämme. Es wurde Fluoresceindiacetat als Esterase-Substrat (3.5.3.2), para-Nitrophenylpalmitat als Lipase-Substrat (3.5.3.3), Azocasein als Protease-Substrat (3.5.3.1) und para-Nitrophenylphosphat als alkalisches Phosphatase-Substrat (3.5.3.5) eingesetzt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte aus vier unabhängigen Versuchen ± Standardabweichungen angegeben. n.n., nicht nachweisbar

P. aeruginosa-Stamm

Protease-Aktivität

(EU/mg Protein)

Lipase-Aktivität

(nmol/min x mg Protein)

Esterase-Aktivität

(nmol/min x mg Protein)

Phosphatase-Aktivität

(nmol/min x mg Protein)

SG81 11,40 ± 0,08 0,51 ± 0,03 0,048 ± 0,002 42,10 ± 1,07

SG81R1 11,64 ± 0,55 8,33 ± 0,55 0,167 ± 0,011 46,15 ± 0,49

SG81MCS1 9,20 ± 0,10 0,55 ± 0,07 0,049 ± 0,004 37,87 ± 0,50

SG81LCH1 9,72 ± 0,23 1,35 ± 0,12 0,050 ± 0,003 39,05 ± 0,89

SG81LAH2 9,78 ± 0,09 226,72 ± 22,70 0,065 ± 0,005 39,78 ± 1,31

SG81LAH3 9,76 ± 0,01 234,64 ± 21,30 0,079 ± 0,004 37,62 ± 0,47

SG81∆LAH1 9,54 ± 0,33 n.n. 0,051 ± 0,003 32,35 ± 0,14

SG81EA1 5,59 ± 0,16 3,48 ± 0,26 0,209 ± 0,005 25,45 ± 0,72

SG81EA18 8,47 ± 0,01 0,71 ± 0,07 0,109 ± 0,002 32,45 ± 0,03

SG81MMB1 9,07 ± 0,06 0,58 ± 0,01 0,060 ± 0,0005 38,64 ± 0,17

SG81Las1 87,84 ± 0,10 0,79 ± 0,04 0,118 ± 0,004 19,33 ± 1,33

SG81Las3 75,23 ± 1,58 0,89 ± 0,12 0,098 ± 0,004 11,69 ± 0,25

Der nicht-mucoide Stamm SG81R1 zeigte bei etwa gleichem Proteingehalt der EPS (Abbildung 35) eine 16,3fach gesteigerte spezifische Lipase-Aktivität und eine 3,5fach gesteigerte Esterase-Aktivität verglichen mit dem mucoiden Stamm SG81 (Tabelle 20). Protease- und Phosphatase-Aktivitäten hingegen waren bei beiden Stämmen nahezu identisch. Die Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 zeigten keine Unterschiede in Bezug auf die extrazellulären spezifischen Enzymaktivitäten im Vergleih zum Ausgangsstamm SG81. Die Protease-Aktivitäten in den zellfreien EPS-Lösungen waren zwischen den meisten Stämmen vergleichbar. Nur bei den beiden LasB-Überproduktions-Stämmen SG81Las1 und

4 Ergebnisse

129

SG81Las3 konnte eine etwa 8fach höhere spezifische Protease-Aktivität in Relation zum Ausgangsstamm SG81 nachgewiesen werden. Auffällig war, dass einer der Esterase-Überproduzenten SG81EA1 eine um ca 50 % niedrigere Protease-Aktivität in Relation zum Ausgangsstamm SG81 aufwies, während der zweite Stamm SG81EA18 nur eine Senkung um 25 % zeigte. Die spezifische Lipase-Aktivität konnte mit dem Einbringen des Plasmids pBBL7 (SG81LAH2 und SG81LAH3) um das ca. 450fache gesteigert werden. Bei der LipA-Defekt-Mutante SG81∆LAH1 dagegen konnte erwartungsgemäß gar keine extrazelluläre Lipase-Aktivität mehr nachgewiesen werden. Der lipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1 wies eine 2,6fache extrazelluläre Lipase-Aktivität im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 auf. Dagegen zeigte einer der beiden EstA-Überproduzenten SG81EA1 eine um das 6fache gesteigerte Hydrolyse des Lipase-Substrates. Auch die beiden lasB-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 zeigten im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 eine leicht um ca. 40 bzw. 54 % gesteigerte Lipase-Aktivität. Die spezifische Esterase-Aktivität konnte durch die Überexpression von estA extrazellulär um das 4,6fache beim Stamm SG81EA1 bzw. nur um das 2,3fache beim Stamm SG81EA18 gesteigert werden. Die beiden LasB-Überproduktionsstämme zeigten eine etwa 2,5fach gesteigerte Spaltung dieses Substrates. Auch bei den beiden LipA-Überproduktions-Stämmen SG81LAH2 und SG81LAH3 konnte eine um 35 bzw. 64 % erhöhte Substratspaltung beobachtet werden. Obwohl keine direkte molekularbiologische Veränderung in Bezug auf die alkalische Phosphatase-Aktivität vorgenommen worden ist, zeigte sich eine verringerte Aktivität der beiden LasB-Überproduktions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3. In Relation zu der Leervektorkontrolle SG81MMB1 wies der Klon SG81Las1 nur noch 60 %, der Klon SG81Las3 sogar nur noch 36 % der Phosphatase-Aktivität auf. Auch bei einem der EstA-Überproduktions-Stämmen SG81EA1 konnte eine um etwa 30 % verringerte alkalische Phosphatase-Aktivität beobachtet werden, beim Klon SG81EA18 war diese nur um etwa 15 % reduziert. Alle anderen Stämme wiesen eine zum Ausgangsstamm SG81 vergleichbare Phosphatase-Aktivität auf. 4.5.7.2 In situ Nachweis von Lipase-Aktivitäten im Biofilm Die Verwendung von ELF-97- Palmitat in Kombination mit der CLSM als eine Methode zur in situ Visualisierung von Lipase-Aktivitäten, zeigten beim Ausgangsstamm SG81 eine heterogene Verteilung von Lipase-Aktivitäten in Membranfilter-Biofilmen (4.2; Abbildung 11). Im Folgenden wurde ELF-97-Palmitat verwendet, um die lipA-Defekt- und Überexpressions-Stämme in situ zu untersuchen. Dazu wurden die Stämme als Membranfilter-Biofilm auf PIA+Ca2+ für 24 h bei 36 °C angezüchtet und nach 3.5.5.3 mit dem Substrat behandelt. Ca2+ wurde zur Stabilisierung der Biofilme ins Medium gegeben. Beim Wachstum der Biofilme kommt es zu Ca2+-Alginat-Komplexen, die dem Biofilm gelartige Eigenschaften und somit eine höhere mechanische Stabilität verleihen (Körstgens et al., 2001b), wodurch die Behandlung mit dem Enzymsubstrat und die anschließende Betrachtung im CLSM erleichtert wird. Es zeigte sich, wie bei den vorhergegangenen Untersuchungen, dass die Lipase-Aktivität des Ausgangsstamms SG81 innerhalb des Biofilms heterogen verteilt vorlag (Abbildung 37). Sie konnte zum Teil an den Zellen, aber auch in unmittelbarer Nähe der Zellen und in den Interzellulärräumen beobachtet werden. Beim LipA-Überproduktions-Stamm SG81LAH2 konnte

4 Ergebnisse

130

eine deutlich vermehrte Lipase-Aktivität beobachtet werden. Alle Zellen innerhalb des Biofilms zeigten deutliche Fluoreszenz und auch extrazellulär konnte eine vermehrte Spaltung des Substrates detektiert werden. Bei der lipA-Defekt-Mutante dagegen konnte kaum noch Lipase-Aktivität wahrgenommen werden. Sie beschränkte sich auf einige wenige Zellen innerhalb des Biofilms, die auch nur ein sehr schwaches Signal gaben. Interzellulär konnte gar keine Lipase-Aktivität beobachtet werden. Durch das Einbringen des Plasmides pBBL7 in den Stamm SG81∆LAH konnte der Defekt komplementiert und so der Ausgangszustand wieder hergestellt werden.

Abbildung 37: Visualisierung der Lipase-Aktivitäten in Membranfilter-Biofilmen (PIA+Ca2+, 24 h, 36 °C) mit ELF-97-Palmitat als Substrat. Untersucht wurde der Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81, der lipA-Überexpressions-Stamm SG81LAH2, die lipA-Defekt-Mutante SG81∆LAH1 und deren epichromosomale Komplementation SG81∆LAH1(pBBL7). CLSM-Aufnahme (optischer Schnitt aus der vertikalen Mitte des Biofilms) bei 400facher Vergrößerung. Die Zellfärbung erfolgte mit SYTO 9 (grün); rot, Lipase-Aktivität; gelb, Überlagerung.

SG81

SG81∆LAH1

SG81LAH2

SG81∆LAH1(pBBL7)

4 Ergebnisse

131

4.5.7.3 Nachweis von Protease-Aktivitäten mit Zymogrammgelen Zur qualitativen Analyse von Protease-Aktivitäten in zellfreien EPS-Lösungen der Enzym-Defekt-Mutante und der Enzym-Überexpressions-Stämme wurden „Caseinblue-Gele“ (Invitrogen) verwendet. Das in den Gelen duch Coomassieblau angefärbte Casein kann von Proteasen als Substrat verwertet werden; wenn entsprechende Enzymaktivitäten vorhanden sind, führt die Substratspaltung zu klaren Banden innerhalb des ansonsten blauen Gels. Es konnten bei fast allen Stämmen zwei klare Banden im Gel erkannt werden, eine bei einem Molekularmasse von etwa 50 kDa und die zweite bei etwa 150 kDa (Abbildung 38). Die gereinigte Elastase (CalBiochem.) bandierte im hochmolekularen Bereich bei 150 kDa (Abbildung 38, Spur 10). Der Stamm SG81Las1 zeigte nur die Bande bei 150 kDa, die deutlich intensiver war als bei den anderen Stämmen (Abbildung 38, Spur 9). Auch beim Auftrag von 25 µl zellfreien EPS-Lösung konnte keine Bande bei 50 kDa beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Aus der Literatur ist bekannt, dass in diesem Gelsystem, die alkalische Protease von P. aeruginosa bei etwa 56 kDa bandiert, die Elastase B bei etwa 160 kDa detektiert werden (Caballero et al., 2001). Diese Angaben stimmen also näherungsweise mit den hier erhaltenen Beobachtungen überein.

Abbildung 38: Gelelektrophoretische Analyse von Protease-Aktivitäten mit Caseinblue-Zymogram-Gelen in zellfreien EPS-Lösungen von Agar-Biofilmen (PIA, 24 h, 36 °C) der verschiedenen Enzym-Defekt- und Enzym-Überexpressions-Stämme von P. aeruginosa SG81. Es wurden je 25 µl, bzw. 5 µl bei dem LasB-Überproduktions-Stamm SG81Las1, der EPS aufgetragen und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Als Referenz für Elastase-Aktivitäten wurde in Spur 10 die kommerziell erhältliche, gereinigte Elastase aus P. aeruginosa (Calbiochem) in einer Konzentration von 10 µg/ml aufgetragen. Als Marker (M) wurde der „Prestained Protein-Molekulargewichts-Marker“ (Sigma) verwendet.

LCH1

26,6 kDa

36,5 kDa

58,0 kDa

84,0 kDa

116,0 kDa

180,0 kDa

48,5 kDa

8765 4 3 2 91 10 12 11

MEA18EA1 LAH2 MCS1SG81 Las1 M Elastase M ∆ LAH

4 Ergebnisse

132

4.6 Physikalische Eigenschaften von Agar-Biofilmen und deren EPS 4.6.1 Adhärenz von EPS-Bestandteilen an n-Hexadekan Die Anheftung von Mikroorganismen an biotische und abiotische Oberflächen wird durch verschiedene Kräfte, wie z. B. hydrophobe, elektrostatische oder van der Waals´sche Wechselwirkungen, oder durch Wasserstoffbrückenbindungen vermittelt (Flemming, 1991). Dabei spielen zum einen die physikalischen Eigenschaften der Oberflächen, zum anderen die Eigenschaften der Zelloberflächen eine wesentliche Rolle. Zusätzlich können an den Zellen gebundene EPS-Bestandteile die physikalischen Eigenschaften der Zelloberflächen maskieren und somit die Adhärenz der Zellen nachhaltig beeinflussen. Bei der Untersuchung der Hydrophobizität der Zelloberflächen der mucoiden Enzym-Defekt- und -Überexpressions-Stämme von P. aeruginosa SG81 mittels eines Zweiphasen-Tests (Rosenberg et al., 1980) konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Stämmen nachgewiesen werden (4.5.4). Bei diesem Test gilt die Verteilung der Zellen im Zweiphasen-System Wasser/n-Hexadekan als Maß für die Hydrophobizität der Zelloberflächen. Da die Anheftung gerade bei mucoiden Stämmen nicht alleine durch die Zelloberflächen, sondern auch durch EPS-Bestandteile an den Zellen vermittelt wird, wurde die Hydrophobizität der EPS mit demselben Testsystem untersucht. Dazu wurden zellfreie EPS-Lösungen nach 3.1.4 gewonnen und mit verschiedenen Volumina (0 – 200 µl) des hydrophoben, organischen Lösungsmittels n-Hexadekan vermischt. Nach der definierten Phasentrennungszeit von 15 min stellte sich heraus, dass bei allen Stämmen bei steigender n-Hexadekan-Konzentration keine eindeutige Phasentrennung erreicht werden konnte, was an einer Trübung der zuvor klaren EPS-Lösung zu erkennen war. Die getrübte EPS-Lösung besaß ein Absorptionsmaximum bei 580 nm (Daten nicht gezeigt). Zwischen den verschiedenen Stämmen konnten deutliche Unterschiede in der Trübungszunahme beobachtet werden (Abbildung 39). Der Ausgangsstamm SG81 und die Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 zeigten bei Zugabe von 100 µl n-Hexadekan eine Trübungserhöhung von etwa 250 % im Vergleich zu der unbehandelten EPS-Lösung. Durch höhere Volumina an Hexadekan ließ sich die Trübung nicht weiter steigern. Bei den beiden Lipase-Überproduktions-Stämmen SG81LCH1 und SG81LAH2 konnte eine um 0,3fach geringere Trübungszunahme im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 beobachten werden. Hier stieg die optische Dichte der zellfreien EPS-Lösungen durch die Zugabe von n-Hexadekan nur auf 175 % bzw. auf 160 % an (Abbildung 39). Auch einer der beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA18 wies ein um 20 % geringere maximale Trübung in Relation zum Stamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MCS1 auf. Die EPS-Lösungen des zweiten EstA-Überproduzenten SG81EA1 dagegen zeigten eine 9fache Steigerung der Trübung durch die Zugabe des hydrophoben Lösungsmittels, wobei hier schon etwa 25 µl ausreichten, um den Maximalwert zu erreichen. Damit zeigte dieser Stamm eine 3,6fach höhere Trübung als die Vergleichsstämme. Auch der lipA-Defekt-Stamm SG81∆LAH1 zeigte eine um das 5,5fache gesteigerte Trübung durch n-Hexadekan-Zugabe, was in Relation zum Ausgangsstamm SG81 einer 2,2fachen Adhärenz von n-Hexadekan an die EPS entsprach. Die auffälligste Trübunszunahme zeigten die beiden LasB-Überproduktionsstämme. Hier konnte schon durch die Zugabe von 25 µl eine 30fache Steigerung der optischen Dichte beobachtet werden, was im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 eine 10-mal höhere Trübung der EPS-Lösung darstellt.

4 Ergebnisse

133

Abbildung 39: Adhärenz von EPS-Bestandteilen an n-Hexadekan. Es wurden jeweils 1,2 ml zellfreie EPS-Lösungen von auf PIA gewachsenen Biofilmen (24 h, 36 °C) der verschiedenen P. aeruginosa-Stämme mit verschiedenen Volumina n-Hexadekan vermischt und nach einer Phasentrennungszeit von 15 min die optische Dichte der wässrigen Phase bei 580 nm bestimmt (3.1.6). Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten.

0

100

200

300

400

500

600

0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

optis

che

Dic

hte

O.D

.58

0 (%

)

SG81

0

100

200

300

400

500

600

0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

optis

che

Dic

hte

O.D

.58

0 (%

)

SG81MCS4

0

100

200

300

400

500

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0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

optis

che

Dic

hte

O.D

.58

0 (%

)

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0

100

200

300

400

500

600

0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

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che

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hte

O.D

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0 (%

)

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0

100

200

300

400

500

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0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

optis

che

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hte

O.D

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0 (%

)

SG81DLAH1

0

300

600

900

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0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

optis

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hte

O.D

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)

SG81EA1

0

100

200

300

400

500

600

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optis

che

Dic

hte

O.D

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0 (%

)

SG81EA18

4 Ergebnisse

134

Abbildung 39 (Fortsetzung): Adhärenz von EPS-Bestandteilen an n-Hexadekan. Es wurden jeweils 1,2 ml zellfreie EPS-Lösungen von auf PIA gewachsenen Biofilmen (24 h, 36 °C) der verschiedenen P. aeruginosa-Stämme mit verschiedenen Volumina n-Hexadekan vermischt und nach einer Phasentrennungszeit von 15 min die optische Dichte der wässrigen Phase bei 580 nm bestimmt (3.1.6). Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten. Die Ergebnisse dieses Experiments lassen die Vermutung zu, dass in den EPS-Lösungen der verschiedenen Stämme hydrophobe Bestandteile in unterschiedlich hohen Konzentrationen vorhanden sind, die eine Affinität zu dem hydrophoben n-Hexadekan aufweisen. 4.6.2 Rheologische Eigenschaften der EPS Bei der Anzucht von Flüssigkulturen und Agar-Biofilmen für die verschiedenen durchgeführten Experimente, konnte bei einigen Stämmen der Eindruck einer zäheren Konsistenz gewonnen werden. So erschienen die Flüssigkulturen und Biofilmsuspensionen des estA-Überexpressions-Stamms SG81EA18, im Gegensatz zum Stamm SG81EA1 und allen anderen Stämmen stärker viskos. Auch die daraus gewonnenen zellfreien EPS-Lösungen erschienen zähflüssiger als bei den anderen Stämmen. Da die Viskosität der EPS möglicherweise einen Einfluss auf die mechanische Stabilität der Biofilme und somit auf die Biofilmstruktur haben könnte, sollte dieser Beobachtung genauer nachgegangen werden. Dazu wurde die spezifische Viskosität von zellfreien EPS-Lösungen mit einem Kapillarviskosimeter (Mikro KPG-Ubbelohde-Viskosimeter, Kapillare I, Schott) im Vergleich zu 0,14 M NaCl-Lösung bei 25 °C ± 0,1 °C gemessen. Die spezifische Viskosität der EPS-Lösungen vom estA-Überexpressions-Stamms SG81EA18 erwies nur leicht um das 1,2fache erhöht (Daten nicht gezeigt). Alle anderen Stämme besaßen eine zum Ausgangsstamm vergleichbare spezifische Viskosität. Da davon auszugehen ist, dass bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa das langkettige Polysaccharid Alginat maßgeblich an der Viskosität der EPS-Lösungen beteiligt ist, wurden die spezifischen Viskositäten auf den Uronsäuregehalt (Alginat) der verwendeten EPS-Lösungen (4.5.6; Tabelle 19) bezogen, um die reduzierte Viskosität zu ermitteln (Abbildung 40). Es zeigte sich, dass der EstA-Überproduktions-Stamm SG81EA18 eine um das 1,8fache erhöhte reduzierte Viskosität aufwies. Es stellte sich heraus, dass auch die LasB-Überproduzenten SG81Las1 und SG81Las3 eine um 40 % erhöhte reduzierte Viskosität bezogen auf den Uronsäuregehalt aufwiesen. Alle anderen Stämme zeigten eine zum Ausgangsstamm SG81 vergleichbare reduzierte Viskosität.

0

100

200

300

400

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0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

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0 (%

)SG81MMB1

0500

100015002000250030003500

0 50 100 150 200 250Volumen n-Hexadekan (µl)

optis

che

Dic

hte

O.D

.58

0 (%

)

SG81LasB

4 Ergebnisse

135

Abbildung 40: Reduzierte Viskosität der EPS von Agar-Biofilmen (PIA, 24 h, 36 °C) von P. aeruginosa SG81 und von ihm abgeleiteten Enzym-Überexpressions-Stämmen bezogen auf die Uronsäurekonzentration in den EPS (4.5.6). Die Ergebnisse sind angegeben als arithmetrische Mittelwerte ± Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten. 4.6.3 Rheologische Eigenschaften der Biofilme Bei der Gewinnung von Agar-Biofilmen auf PIA konnte beobachtet werden, dass die lasB-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 einen zäheren Schleim ausbildeten als der Ausgangsstamm SG81 und die Leervektorkontrolle SG81MMB1. Die Biofilme der beiden LasB-Überproduzenten ließen sich nur schwer suspendieren, was sich durch makroskopisch sichtbare Schleimaggregate äußerte. Um dieses Phänomen genauer zu untersuchen, wurde die mechanische Stabilität der Biofilme mit einem dafür konstruierten Filmrheometer (Körstgens et al., 2001a) analysiert. Für die rheologischen Untersuchungen wurden Membran-Biofilme der verschiedenen P. aeruginosa-Stämme auf der Oberfläche von Cellulosemischestern (Pall Gelham Science; Porengröße 0,45 µm) angezüchtet. Nach der Bebrütung auf PIA für 24 h bei 36 °C wurden Quadrate mit einer Größe von etwa 3 x 3 mm aus den mit Biofilmen bewachsenen Membranen ausgeschnitten. Die Biofilme wurden mit einem Stempel (Durchmesser 2,5 mm) bei einer Geschwindigkeit von 1 µm/s uniaxial komprimiert und die zur Kompression des Biofilms benötigte Kraft gemessen. Aus den erhaltenen Kraft-Abstands-Kurven (Abbildung 41) wurden die Dicke der Biofilme und der apparente Elastizitätsmodul (E-Modul) berechnet (3.6.3). Bei der in Abbildung 41 dargestellten Auftragung der zur Kompression der Biofilme benötigten Kraft gegen den Abstand des Stempels von der Biofilmaufwuchsfläche, konnte beim Biofilm dem lasB-Überexpressions-Stamm SG81Las1 insgesamt ein viskoelastisches Verhalten beobachtet werden. Direkt nach dem Auftreffen des Stempels auf den Biofilm bei einem Abstand von etwa 530 µm konnte zunächst ein linearer Bereich zwischen -0,001 N und 0,004 N erkannt werden, was auf einen Gelcharakter der Biofilms hinweist. Dieser lineare Bereich endete mit dem Auftreten einer Fließgrenze bei etwa 0,004 N, was auf viskoses Verhalten des Biofilms bei höherer Krafteinwirkung schließen ließ. Die Leervektorkontrolle SG81MMB1 zeigte hingegen ein deutlich niedrigviskoses Verhalten.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

SG81

SG81MCS1

SG81LCH1

SG81LAH2

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1

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4 Ergebnisse

136

Abbildung 41: Kompressionstest von 24 h Membran-Biofilmen (PIA, 36 °C) von P. aeruginosa SG81Las1 und dem Ausgangsstamm SG81. Beispielhafte Darstellung einer repräsentativen Kraft-Abstands-Kurve. Es wurden insgesamt zwei unabhängige Experimente mit jeweils 12 parallelen Messungen durchgeführt. Die aus den Messdaten ermittelten Biofilmdicken und apparenten E-Module sind in Abbildung 42 dargestellt. Es zeigte sich, dass der Stamm SG81Las1 bei ähnlicher Biofilmdicke von etwa 500 µm im Vergleich zu Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MMB1 einen um das 3,2fach gesteigerten apparenten E-Modul aufwies und somit eine deutlich gesteigerte mechanische Stabilität.

Abbildung 42: Biofilmdicke und E-Modul von Membran-Biofilmen (PIA, 24 h, 36 °C) der P. aeruginosa-Stämme SG81, SG81MMB1 und SG81Las1. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Untersuchungen mit jeweils zwölf parallelen Messungen.

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0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

-700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0

Abstand [µm]

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]SG81SG81Las1

0

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4000

5000

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SG81 SG81MMB1 SG81Las1

Ela

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Biofilmdicke Elastizitätsmodul

4 Ergebnisse

137

4.7 Biofilmbildung der Mutanten und Überexpressionsstämme Nachdem der Einfluss von extrazellulären Enzymen auf die Zusammensetzung und die Eigenschaften der EPS analysiert wurde, sollte nun der Einfluss dieser Enzyme auf die Biofilmbildung und –struktur an der Grenzfläche fest/flüssig unter statischen und kontinuierlichen Bedingungen untersucht werden. Für die folgenden Biofilmuntersuchungen wurde das mAPM (Ohman und Chakrabarty, 1981) verwendet. Dieses Minimalmedium wurde als geeignetes Medium beschrieben, die Alginat-Produktion von mucoiden P. aeruginosa-Stämmen in Batch-Flüssigkulturen zu steigern. 4.7.1 Biofilmbildung in Mikrotiterplatten Um Hinweise darauf zu erhalten, ob die Überexpression extrazellulärer Enzyme die Biofilmbildung vom mucoiden P. aeruginosa-Stamm SG81 beeinflusst, wurde zunächst ein einfaches Verfahren zur Quantifizierung von Biofilmen verwendet. Dazu wurden die verschiedenen Enzym-Überexpressions-Stämme für 24 h in Mikrotiterplatten angezüchtet. Anschließend wurden die planktonischen Zellen entfernt und die angehefteten Zellen mit Kristallviolett angefärbt. Die gebundene Farbstoffmenge wurde photometrisch bei 570 nm quantifiziert und gilt als indirektes Maß für die Menge an angehefteten Zellen (3.1.2.2).

Abbildung 43: Quantifizierung der Biofilmbildung in Mikrotiterplatten. Die erfolgte Anzucht in APM für 24 h bei 36°C unter leichtem Schütteln. Angeimpft wurde mit 1 x 106 Zellen pro ml ausgehend von Einzelkolonien von PIA-Vorkulturen. Die angehefteten Zellen wurden mit Kristallviolett angefärbt und nach Herauslösen des Farbstoffs mit Ethanol die Absorption bei 570 nm bestimmt. Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten mit je acht Parallelmessungen pro Stamm. Aus Abbildung 43 geht hervor, dass die Leervektorkontrolle SG81MCS1 und die meisten der davon abgeleiteten Überexpressions-Stämme keine signifikanten Unterschiede zum Ausgangsstamm SG81 aufwiesen. Nur beim Lipase A-Überexpressions-Stamm SG81LAH2 konnte geringfügig weniger Biofilmmasse (76 % in Relation zum Ausgangsstamm SG81) beobachtet werden. Dieser Stamm zeigte schon in den APM-Flüssigkulturen ein etwas langsameres Wachstum, was sich in einer geringeren Wuchsrate und einem späteren Erreichen

0

1

2

3

4

5

6

SG81

SG81MCS1

SG81LC

H1

SG81LA

H2

SG81EA1

SG81EA18

SG81las

1

SG81las

3

Abs

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ion

bei 5

70 n

m

4 Ergebnisse

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der maximalen Zelldichte äußerte (4.5.2). Auch einer der beiden Esterase-Überexpressions-Stämme SG81EA1 zeigte in Relation zum Ausgangsstamm SG81 nur 76 % an Biofilmmasse. Dagegen zeigte der andere Esterase-Überexpressions-Stamm SG81EA18 keinen Unterschied in der Biofilmmenge im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MCS1. Die beiden Elastase B-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 hefteten sich um einen Faktor von 1,3 stärker an die Mikrotiterplatte an als der Ausgangsstamm SG81. 4.7.2 Biofilmbildung auf Glas unter statischen Kulturbedingungen Die Quantifizierung der Biofilmbildung in Mikrotiterplatten als einfaches Biofilmmodell zeigte, dass einige der Enzym-Überexpressions-Stämme vom P. aeruginosa SG81 eine veränderte Fähigkeit der Biofilmbildung an Polystyrol aufwiesen. Um die Biofilmbildung der verschiedenen Stämme auch qualitativ untersuchen zu können, wurden zunächst Biofilme auf Glas unter Batch-Kulturbedingungen angezüchtet, um sie anschließend mikroskopisch betrachten zu können. Dazu wurden zuvor mit Aceton entfettete, sterile Glasobjektträger in Petrischalen gegeben und mit 15 ml APM überschichtet. Das Medium wurde mit 1 x 106 Zellen/ml angeimpft und für 24 h bei 30 °C, unter leichtem Schütteln bebrütet. Anschließend wurden die Objektträger vorsichtig herausgenommen und dreimal mit je 1 ml steriler NaCl-Lösung gewaschen, damit alle nicht richtig angehefteten Zellen abgespült wurden. Anschließend erfolgte eine Zellfärbung mit dem DNA-Bindefluoreszenzfarbstoff SYTO 9 Färbung und die Betrachtung der Biofilme im konfokalen Laser-Scanning Mikroskop. Die mikroskopischen Bilder sind Abbildung 44 dargestellt. Prinzipiell zeigten fast alle Stämme nach 24 h Bebrütung eine nur sehr geringe Biofilmbildung. Es konnten meist nur einlagige Zellschichten auf den Glasoberflächen beobachtet werden, wobei die Zellen relativ regelmäßig verteilt vorlagen. Ausnahmen bildete der lipC- Überexpressions-Stamm SG81LCH1 und der lasB-Überexpressions-Stamm SG81LasB. Bei SG81LCH1 konnte eine deutlich höhere Flächenbelegung und die Bildung von kleineren Zellaggregaten mit etwa 5-10 Zellen pro Aggregat beobachtet werden. Die Bildung solcher kleinen Zellaggregate konnte beim Stamm SG81LCH1 auch schon in Flüssig-Schüttelkulturen beobachtet werden (4.5.2). SG81LasB, der auch in Mikrotiterplatten-Test eine vermehrte Biofilmbildung zeigte, bildete auf der Glasoberfläche makroskopisch sichtbare große Aggregate. Mikroskopisch erwiesen sich diese Aggregate als mehrlagig mit weit über 100 Zellen. Die Zellen in diesen Klustern erschienen sehr darüber hinaus stark aggregiert.

4 Ergebnisse

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Abbildung 44: Biofilmbildung von Enzym-Defekt- und Überexpressions-Stämmen auf Glasoberflächen unter statischen Kulturbedingungen. Die Anzucht erfolgte für 24 h bei 30 °C in APM unter leichtem Schütteln auf Glasobjektträgern. Die Biofilmzellen wurden nach dreimaligem Waschen der Objektträger mit je 1 ml NaCl-Lösung mit Syto 9 gefärbt und die Biofilmstruktur mit dem CLSM bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 505 nm dokumentiert. Abgebildet sind repräsentative Bilder von zwei unabhängigen Experimenten. Vergrößerung: 400fach; Maßbalken: 50 µm.

SG81LasB

SG81EA1

SG81LAH2

SG81MMB1

SG8LCH1

SG81 LAH1∆

SG81MCS4SG81

4 Ergebnisse

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4.7.4 Biofilmbildung auf Glas unter kontinuierlichen Bedingungen Um den Einfluss extrazellulärer Enzyme auf die Entwicklung und die Struktur von Biofilmen zu untersuchen, wurden die konstruierten Enzym-Deletions und –Überexpressions-Stämme unter kontinuierlichen Bedingungen auf Glas bei 30 °C über 72 h in mAPM angezüchet. Die Nährstoffbestandteile im mAPM wurden dafür 1:10 verdünnt eingesetzt, während das Puffersystem mit 7,5 mM NaH2PO4 und 16,8 mM K2HPO4 entsprechend dem von Ohman und Chakrabarty (1981) beschriebenen Medium belassen wurde. Das Nährmedium wurde mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/h zudosiert, was einer Reynoldszahl von 1,0 entsprach und somit zu laminaren Bedingungen innerhalb der Kammern der Durchflusszellen führte. Nach Animpfen der Kammer mit 1 x 107 Zellen/ml wurde der Durchfluss für 1 h unterbrochen, damit die Zellen an die Glasoberflächen anheften konnten. Anschließend wurde die Medienzufuhr wieder angestellt und die Entwicklung der Biofilme über 72 h mittels der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie verfolgt und alle 24 h dokumentiert. Dazu wurden die 24 h Biofilme zunächst im Durchlichtmodus, ohne zusätzliche Zellfärbung betrachtet. Im Folgenden, bei steigendem Bewuchs der Oberflächen, wurden die Zellen zur besseren Detektierbarkeit mit SYTO9 gefärbt und die Biofilme bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 505 nm dokumentiert. Die bei steigender Wuchsdauer zunehmend mehrlagigen Biofilme wurden in mehreren Scans in vertikaler Richtung (Z-Schnitte) aufgenommen und nachträglich mit dem CLSM-zugehörigen Bildverarbeitungsprogramm zu einem 3-dimensionalen Bild zusammengefügt. Nach 24 h zeigte sich bei fast allen Stämmen ein prinzipiell ähnliches Bild. Beispielhaft wurde in Abbildung 45a der Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81 dargestellt. Es konnte eine einlagige Zellschicht beobachtet werden. Die Zellen lagen heterogen verteilt in Form von Aggregaten oder Mikrokolonien von bis zu ca. 50 Zellen auf der Glasoberfläche vor. Einzige Ausnahme bildeten die ElastaseB-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 (Abbildung 45b). Hier konnten nur vergleichsweise wenig Zellen auf der Oberfläche erkannt werden. Diese Zellen waren verhältnismäßig groß und vermehrt in Zellketten angeordnet, welche relativ gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt vorlagen. Die Bildung von Mirkokolonien konnte hier nur vereinzelt beobachtet werden. Abbildung 45: 24 h-Biofilme von P. aeruginosa a) SG81 und b) SG81Las1. Die Anzucht erfolgte unter kontinuierlichen Bedingungen in mAPM bei 30 °C. Dargestellt sind repräsentative CLSM-Aufnahmen von zwei unabhängigen Experimenten im Durchlichtmodus bei 400facher Vergrößerung.

b)

a)

4 Ergebnisse

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Nach 48-stündiger Bebrütungsdauer zeigten einigen Stämme deutliche Unterschiede in der Biofilmstruktur im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 (Abbildung 46). Bei den meisten Stämmen konnte die Ausbildung von größeren, mehrlagigen Makrokolonien beobachtet werden, wohingegen andere Stämme nur kleine, einlagige Mikrokolonien zeigten. Sowohl der Ausgangsstamm wie auch die Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 wiesen einen heterogenen, mehrlagigen Biofilm auf. Es konnte deutlich die Bildung von mehr oder weniger großen Makrokolonien auf der Glasoberfläche erkannt werden. Auch der lipA-Überexpressions-Stamm SG81LAH2 bildete nach 48 h einen fast flächendeckenden, mehrlagigen, heterogenen Bewuchs aus. Der lipA-Defekt-Stamm SG81∆LAH1 wies dagegen nur wenige Makrokolonien auf. Zwischen diesen Makrokolonien lagen die Zellen vermehrt einzeln auf der Oberfläche vor. Auch die beiden estA-Überexpressions-Stämme SG81EA1 und SG81EA18 (in Abbildung 46 nur SG81EA1 dargestellt) zeigten im Vergleich zum Ausgangsstamm nur geringen Bewuchs. Es konnten nur einige Mikrokolonien beobachtet werden, die tendenziell einlagig waren. Die Zellen innerhalb dieser Mikrokolonien wiesen einen gewissen Abstand zueinander auf, wodurch die Aggregate weniger dicht gepackt erschienen. Ganz in Gegensatz zum LipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1. Es konnten nur wenige Makrokolonien auf der Aufwuchsfläche erkannt werden, diese wirkten aber extrem kompakt und wiesen darüber hinaus eine relativ regelmäßig runde Form auf. Zwischen diesen Makrokolonien konnten weite Oberflächenbereiche beobachtet werden, die frei von Zellen waren. Die LasB-Überexpressions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 (in Abbildung 46 nur SG81Las1 dargestellt) zeigten nach 48 h einen deutlich geringeren Bewuchs in Relation zum Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkonrolle SG81MMB1. Die Zellen lagen vermehrt einzeln oder in sehr kleinen Aggregaten vor. Die wenigen Mikrokolonien, die zu beobachten waren, waren einlagig und wie bei den Esterase-Überproduktions-Stämmen weniger dicht gepackt. Noch auffälliger waren die Unterschiede der lasB-Überexpression bei einer größeren Vergrößerung (Abbildung 47a). So konnte bei einer 400fachen und zusätzlich 4fach digitalen Vergrößerung das Vorkommen von Zellketten mit bis zu 10 Zellen beobachtet werden. Außerdem konnten extrem große Zellen, von bis zu 10 µm Länge und SYTO 9 gefärbte Bereiche, undefinierter Form erkannt werden, die auf die mögliche Lyse von Bakterienzellen hinweisen. Ein ähnliches Bild konnte bei LipaseA-Defekt-Mutante SG81∆AH1 beobachtet werden (Abbildung 47b). Auch hier waren in einigen Bereichen der Oberfläche Zellketten, von bis zu 25 Zellen zu erkennen und stark fluoreszierende Bereiche, die nicht auf das Vorhandensein von Zellen zurückzuführen waren.

4 Ergebnisse

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Abbildung 46: Biofilmstruktur von Enzym-Überexpressions- und Deletions-Stämmen abgeleitet von P. aeruginosa SG81 auf Glas unter kontinuierlichen Bedingungen in mAPM bei 30°C. CLSM Aufnahmen von SYTO 9 gefärbten 48 h-Biofilmen bei 200facher Vergrößerung, optische Schnitte in der vertikalen Biofilmmitte. Dargestellt sind repräsentative Aufnahmen von zwei unabhänfigen Experimenten.

SG81LCH1

SG81MCS1

SG81LAH2

SG81Las1

SG81

SG81EA1

SG81MMB1

SG81 LAH1∆

4 Ergebnisse

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Abbildung 47: 48 h-Biofilme von P. aeruginosa a) SG81Las1 und b) SG81∆LAH1. Die Anzucht erfolgte unter kontinuierlichen Bedingungen in mAPM bei 30 °C. Dargestellt sind CLSM-Aufnahmen von SYTO 9 gefärbten Zellen bei 400facher Vergrößerung plus 4facher digitaler Vergrößerung bei SG81Las1 bzw. 2facher digitaler Vergrößerung bei SG81∆LAH1. Maßbalken: 20 µm Nach 72 h waren die Unterschiede in der Biofilmstruktur zwischen den Stämmen noch stärker ausgeprägt (Abbildung 48). P. aeruginosa SG81 und die beiden Leervektorkontrollen SG81MCS1 und SG81MMB1 wiesen nach 72 h einen noch dichteren, mehrlagigen, heterogenen Biofilm auf. Deutlich konnten große, unregelmäßig geformte Makrokolonien erkannt werden, die teilweise zu einem flächendeckenden Bewuchs von etwa 25 µm Dicke zusammenwuchsen. Der LipA-Deletions-Stamm SG81∆LAH1 zeigte einen deutlich geringeren Bewuchs. Die Makrokolonien waren kleiner als bei dem Ausgangsstamm SG81. Darüber hinaus waren weite Bereiche der Aufwuchsfläche von Einzelzellen belegt. Die LipA-Überexpression SG81LAH2 hingegen zeigte, wie auch schon nach 48 h, keine signifikanten Unterschiede zum Ausgangsstamm und der Leervektorkontrolle SG81MCS1. Bei der LipC-Überexpression SG81LCH1 konnten auch nach 72 h Bebrütung relativ kleine, runde Mikrokolonien beobachtet werden. Die Zellen innerhalb dieser Makrokolonien waren stärker aggregiert als beim Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MCS1. Außerdem waren sie mit durchschnittlich 37 µm deutlich höher als bei den anderen Stämmen. Der Raum zwischen den Kolonien war relativ frei von Bewuchs. Ein völlig anderes Bild lieferte die EstA-Überexpression. Wo nach 48 h noch Mikrokolonien beobachtet werden konnten, konnte nach 72 h nur noch eine einlagige Schicht von Zellen beobachtet werden, die regelmäßig über die Glasoberfläche verteilt vorlagen. Dementsprechend war die Dicke des Bewuchses mit 12 µm sehr gering. Auch die LasB-Überexpression zeigte eine einlagige Zellschicht und somit eine maximale Biofilmdicke von 14 µm. Hier lagen die Zellen allerdings nicht gleichmäßig verteilt, sondern teilweise einzeln und teilweise in kleinen Aggregaten vor. Damit zeigte der LasB-Überproduzent nach 72 h ein ähnliches Bild wie schon nach 48-stündiger Bebrütung.

a) b)

4 Ergebnisse

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Abbildung 48. Biofilmstruktur von Enzym-Überexpressions- und Deletions-Stämmen abgeleitet von P. aeruginosa SG81 auf Glas unter kontinuierlichen Bedingungen in mAPM bei 30°C. CLSM Aufnahme von SYTO 9 gefärbten 72 h-Biofilmen bei 200facher Vergrößerung, optische Schnitte in der vertikalen Biofilmmitte mit Seitenansichten.

4 Ergebnisse

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4.8 Transkriptionelle Regulation extrazellulärer Enzyme im Biofilm Eine Möglichkeit der Regulation von Enzymen besteht auf der Ebene der Transkriptions-Aktivität. Um die transkriptionelle Aktivität von extrazellulären Enzymen während der Biofilmentwicklung zu untersuchen, wurden Gfp-Reportergenfusionen der Enzyme LipA und EstA konstruiert, bei denen das gfpmut3*-Gen unter der Kontrolle der entsprechenden Enzympromotoren steht, sodass die Stärke der Fluoreszenz des gebildeten Gfp ein Maß für die Transkriptionslevel der entsprechenden Enzyme darstellt. Die Fusionsplasmide wurden in den Stamm P. aeruginosa SG81 gebracht und die entstandenen Reporterstämme SG81gfp::PlipA

bzw. SG81gpf::PestA unter kontinuierlichen Bedingungen in mAPM bei 30 °C für bis zu 72 h in Durchflusszellen angezüchtet. Alle 24 h wurden die Biofilme im CLSM betrachtet, wobei die Zellen im Durchlichtmodus und die Fluoreszenz des Gfp bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 505 nm dokumentiert wurden. In Abbildung 49 sind 72 h Biofilme der beiden Fusionsstämme SG81gfp::PlipA

und SG81gpf::PestA dargestellt. Es zeigte sich, dass bei den gfpmut3*-Fusionen mit dem Promotorbereich von lipA schon nach 24 h eine deutliches Gfp-Signal zu detektieren war (Daten nicht gezeigt), welches sich bei weiterer Bebrütung nur noch marginal verstärkte. Alle Zellen innerhalb des Biofilms, sowohl in den Makrokolonien, als auch einzeln vorliegende Zellen zwischen den Makrokolonien zeigten deutliche Fluoreszenz (Abbildung 49a). Ein völlig anderes Bild bot dagegen die gfpmut3*-Fusionen mit dem Promotorbereich von estA (Abbildung 49b). Dort konnte erst nach 72 h ein deutliches Gfp-Signal detektiert werden, zudem zeigten hier nur wenige Zellen die grün leuchtende Fluoreszenz. Interessanterweise waren diese Zellen hauptsächlich an den Außenrändern von Makrokolonien zu beobachten. Da die Biofilme in den Durchflusszellen ohne Selektionsdruck angezüchtet wurden, musste geklärt werden, ob dieses Phänomen tatsächlich durch eine heterogen verteilte Transkriptionsaktivität von estA, oder möglicherweise durch den Verlust des Fusionsplasmides zustande gekommen war. Dazu wurde zum Zeitpunkt 72 h eine Probe aus dem Auslauf der Durchflusszellen entnommen und parallel auf LB-Agar ohne und mit 600 µg/ml Carbenicillin ausplattiert. Auf dem Antibiotika-haltigen Medium erwies sich die Anzahl an KBE etwa halb so hoch wie auf Antibiotika-freien Medium (Daten nicht gezeigt). Daraus lässt sich schließen, dass nach 72 h Bebrütung zumindest 50 % der Gesamtpopulation das Fusionsplasmid mit der darauf kodierten Carbenicillin-Resistenz trägt.

4 Ergebnisse

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Abbildung 49. Transkriptions-Aktivitäten der Enzymgene a) lipA und b) estA in 72 h Biofilmen. Die Anzucht erfolgte unter kontinuierlichen Bedingungen in mAPM bei 30 °C in Durchflusszellen. Dargestellt sind repräsentative CLSM-Aufnahmen von zwei unabhängigen Experimenten bei 400facher Vergrößerung. Links oben: Gfp-Signal bei 505 nm; rechts oben: Biofilmzellen im Durchlicht; unten: Überlagerung der Bilder.

a) b)

5 Diskussion

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5 DISKUSSION Die Mehrzahl aller Mikroorganismen der Erde lebt in Biofilmen wie Flocken oder Schleimen, eingebettet in einer stark hydratisierten, gelartigen Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) (Donlan und Costerton, 2002). Die EPS bestehen hauptsächlich aus Polysacchariden und Proteinen (Nielsen et al., 1997; Sutherland 1984; Wingender et al., 1999a), es wurden aber auch Lipide und Nukleinsäuren nachgewiesen (z. B. Gehrke et al., 1998; Whitchurch et al., 2002). Den Polysacchariden wird hauptsächlich strukturgebende Funktion und die Vermittlung der mechanischen Stabilität von Biofilmen zugeschrieben (Flemming und Wingender, 2002). Auch für Proteine wird eine Strukturfunktion vermutet, wobei sie als mögliche Vernetzungspunkte zwischen den Polysacchariden diskutiert werden (Higgins und Novak, 1997). Die vorwiegende Funktion von extrazellulären Proteinen wird allerdings in der katalytischen Wirkung von Enzymen gesehen (Hoffman und Decho, 1999; Wingender und Jaeger, 2002). Über die physiologische Rolle mikrobieller, extrazellulärer Enzyme innerhalb des Biofilms ist allerdings derzeit nur sehr wenig bekannt. Prinzipiell wird sie im enzymatischen Abbau von Makromolekülen zu niedermolekularen Substanzen, welche von der mikrobiellen Zelle aufgenommen und verstoffwechselt werden können, gesehen (Hoffman und Decho, 1999). Bisher wurden Untersuchungen zu extrazellulären Enzymaktivitäten allerdings fast ausschließlich an planktonischen Zellen in Flüssigkulturen durchgeführt. Es wurde zwar gezeigt, dass extrazelluläre Enzyme in Biofilmen vorkommen; darunter verschiedene Hydrolasen, Lyasen und Oxidoreduktasen die in Abwasserbiofilmen, Belebtschlammflocken und Biofilmen in Flusssedimenten nachgewiesen werden konnten (Übersicht in Wingender und Jaeger, 2002). Kaum untersucht ist jedoch ein möglicher Einfluss sekretierter Enzyme auf die molekularen Vorgänge innerhalb der Reifung und Entwicklung von Biofilmen. Zur Zeit von großem Interesse ist die Frage, ob extrazelluläre Enzyme durch Modifikationen oder Abbau von EPS Einfluss auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Biofilm-Matrix nehmen und somit für die Zellen im Biofilm die Möglichkeit bieten sich z. B. aktiv aus ihrer schleimigen Umgebung zu befreien und so neue Habitate zu erreichen (z. B. Xun et al., 1990; Boyd und Chakrabarty, 1994; Übersicht in Sutherland, 1999b). Das Hauptinteresse an extrazellulären Enzymen von P. aeruginosa liegt momentan wohl aber in ihrer Funktion als Virulenzfaktoren bei einem Infektionsgeschehen. Dabei wurde die Rolle der Enzyme fast ausschließlich als Mediatoren gegen Wirtsgewebe beschrieben (Übersicht in van Delden, 2004). Nicht untersucht ist der Einfluss dieser Enzyme auf die Biofilmentwicklung, obwohl mindestens 65 % aller Infektionen als Biofilmphänomen angesehen werden (Potera, 1999). Darüber hinaus sind einige der von P. aeruginosa produzierten Enzyme, wie Esterase und Lipasen im Focus biotechnologischen Interesses (Jaeger et al., 1999; Jaeger und Rosenau, 2002). Zur Zeit laufen intensive Untersuchungen zur Optimierung der Expressionslevel, der Substratspezifität und zur Steigerung der katalytischen Aktivität von Enzymen. Dabei werden vermehrt molekularbiologische Methoden, wie die zielgerichtete Mutation von Enzymstrukturgenen durch z. B. „directed evolution“-Verfahren eingesetzt (Liebeton et al., 2000; Jaeger und Reetz, 2000; Jaeger und Rosenau, 2002). In dieser Arbeit sollte zunächst die Bildung extrazellulärer Enzyme im Reinkultur-Biofilm des Modellorganismus P. aeruginosa nachgewiesen und im Weiteren die Lokalisation dieser Enzyme aufgeklärt werden. Ferner sollten mögliche Wechselwirkungen zwischen Enzymen und anderen EPS-Bestandteilen am Beispiel der extrazellulären Lipase LipA aus P. aeruginosa untersucht werden.

5 Diskussion

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Mit Enzym-Defekt-Mutanten und Enzym-Überexpressions-Stämmen galt es die physiologische Funktion von extrazellulären Enzymen für die Biofilmbildung und die Eigenschaften von Biofilmen zu klären. Dafür wurden verschiedene lipolytische Enzyme, wie die extrazellulären Lipasen LipA und LipC, sowie die äußere Membran-gebundene Esterase EstA und die Elastase LasB als hauptextrazelluläre Protease von P. aeruginosa betrachtet. Zudem sollte mittels Gfp-Enzympromotor-Fusionen die transkriptionelle Aktivität einiger ausgewählter Enzyme während der Biofilmbildung näher bestimmt werden. 5.1 P. aeruginosa als Modell-Biofilmorganismus In dieser Arbeit wurden Reinkultur-Biofilme von P. aeruginosa SG81 und von ihm abgeleiteten Enzym-Defekt-Mutanten und Überexpressions-Stämme verwendet. Reinkulturen bieten den Vorteil, dass physiologische Vorgänge die bei der Entwicklung eines Phänotyps eine Rolle spielen, ohne Interferenzen mit anderen Spezies untersucht werden können. P. aeruginosa ist ein physiologisch und biochemisch sehr gut charakterisiertes Bakterium, welches in der Biofilmforschung häufig Anwendung findet (Übersichten in Toutain et al., 2004; Tolker-Nielsen und Molin, 2004). Dabei wird vor allem mit dem nicht-mucoiden Wildtyp PAO1 und von ihm abgeleiteten Mutanten gearbeitet (z. B. Beatson et al., 2002; Heydorn et al., 2002; Sauer et al., 2002; Klausen et al., 2003). Seit 2000 ist das Genom von P. aeruginosa PAO1 vollständig sequenziert und die erhaltenen Daten soweit möglich mit bekannten Genen korreliert (Stover et al., 2000). Die Ergebnisse sind in einer Datenbank unter www. Pseudomonas.com frei zugänglich, was molekularbiologische Arbeiten an diesem Bakterium immens erleichtert. P. aeruginosa ist ein ubiquitär in der Umwelt und in technischen Systemen vorkommendes Gram-negatives Bakterium mit einer enormen physiologischen Vielseitigkeit. Aufgrund seiner opportunistischen Humanpathogenität und der Sekretion zahlreicher Virulenzfaktoren ist es von großem medizinischen Interesse (z. B. Döring, 1991; Übersicht in van Delden, 2004). Von hygienischem Interesse wurde es durch den Nachweis eines Zusammenhangs zwischen dem Vorkommen von P. aeruginosa in wasserführenden Systemen und dem Auftreten von Infektionen im klinischen Bereich, wodurch der Organismus zum Erreger von Hospitalismuserkrankungen erklärt wurde (Schubert, 1990; Martinez-Martinez et al., 1991). Er kann sich innerhalb kürzester Zeit in technischen Wassersystemen vermehren und von dort aus ein Reservoir für Kontaminationen bilden (Döring, 1991). Dabei ist P. aeruginosa ein typischer Biofilmkeim. Man konnte ihn von unterschiedlichen Standorten, wie Wandungen von Trinkwasserleitungen, oder Abflüssen und auch aus den Aufbereitungsanlagen von Schwimmbädern aus Biofilmen isolieren (Döring et al., 1991; Botzenhart und Hahn, 1989; Grobe, 1996). Auch auf mit P. aeruginosa infiziertem Lungengewebe konnten mit mikroskopischen Methoden Biofilme in Form von Mikrokolonien nachgewiesen werden (Lam et al., 1980). Als opportunistischer Krankheitserreger gefährdet er vornehmlich immunsupprimierte Patienten oder anders vorgeschädigte Personen, wie z. B. Krebs- und AIDS-Patienten, Brandwundenopfer oder Patienten mit der rezessiv, autosomal vererbbaren Cystischen Fibrose (CF; Bodey et al., 1983; Clarke, 1990; Pier, 1998). 80 – 90 % der CF-Patienten sind von chronischen Lungeninfektionen mit P. aeruginosa betroffen (Pier 1998). Bei Isolaten aus der CF-Lunge handelt es sich meistens um Stämme mit einem mucoiden Phänotyp, die sich in der Überproduktion des extrazellulären Polysaccharids Alginat ausweisen (Phillips, 1969; Doggett

5 Diskussion

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et al., 1977; Lam et al., 1980; Govan, 1990). Auch bei Harnwegsinfektionen und Mittelohrentzündungen konnten in geringerer Häufigkeit mucoide Stämme von P. aeruginosa gefunden werden (McAvoy et al., 1989). Lange Zeit war man der Ansicht, dass der mucoide Phänotyp nur bei chronischen Infektionen zu finden sei. Mittlerweile konnten mucoide Stämme aber auch aus der Umwelt, sowie aus technischen Wassersystemen isoliert werden (Grobe et al., 1994), wobei postuliert wurde, dass viele Umweltisolate von P. aeruginosa mucoid sind, diese aber aus Ermangelung geeigneter Kultivierungsverfahren nicht als solche erkannt wurden (Grobe et al., 1994; Gacesa, 1998). Ungeklärt bleibt aber bis heute, ob die Konvertierung von nicht-mucoiden zum mucoiden Phänotyp bei Infektionsgeschehen und in der Umwelt nach denselben Mechanismen verläuft und welche Bedingungen diesen Prozess letztlich auslösen. Neuere Untersuchungen zeigten, dass das extrazelluläre Alginat eine große Rolle für die Ausbildung einer dreidimensionalen, heterogenen Biofilmstruktur von mucoiden Stämmen von P. aeruginosa spielt (Davies, 1999; Hentzer et al., 2001; Nivens et al., 2001; Tielen et al., 2005). Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit vorrangig der mucoide Stamm P. aeruginosa SG81 benutzt, der ursprünglich aus einem technischen Wassersystem isoliert wurde (Grobe et al., 1994). Im Vergleich dazu kamen vom Stamm SG81 abgeleitete Enzym-Defekt-Mutanten und Enzym-Überexpressionsstämme und in einigen Fällen die isogene, nicht-mucoide Revertante SG81R1 (Grobe et al., 1994) zum Einsatz. 5.2 Anzucht von Biofilmen Die Anzucht von Biofilmen erfolgte je nach Fragestellung unter verschiedenen Bedingungen. Zum einen wurden Biofilme an der Phasengrenze fest/gasförmig auf der Oberfläche von Membranfiltern, die auf eine Agaroberfläche gelegt wurden, bzw. direkt auf der Agaroberfläche in Form von konfluenten Bakterienrasen angezüchtet (3.1.2.2). Zum anderen wurden Biofilme an der Phasengrenze fest/flüssig unter statischen und kontinuierlichen Bedingungen mit unterschiedlichen Oberflächen wie Glas oder Polystyrol im Fall von Mikrotiterplatten-Biofilmen in dem synthetischen „Alginate Promoting“ Medium (APM, Ohman und Chakrabarty, 1981) angezüchtet (3.1.2.2). • Agar-Biofilme und Membranfilter-Biofilme Auf Agaroberflächen angezüchtete Biofilme wurden in der Literatur als „ungesättigte Biofilme“ beschrieben (Wingender et al., 2001; Steinberger et al., 2002). Unter „ungesättigt“ ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass die Biofilme nicht in einem Wasser überstautem System gewachsen sind und dass die Nährstoffversorgung durch die Diffusion von Nährstoffen aus dem Anzuchtmedium erfolgt (Steinberger et al., 2002). Diese Art von Anzucht wurde bereits für Biofilme von Klebsiella pneumoniae (Huang et al., 1998), P. putida (Holden et al., 1997; Auerbach et al., 2000) und P. aeruginosa (Wingender et al., 2001; Steinberger et al., 2002) beschrieben. Sie bieten den Vorteil, dass ausreichende Mengen an Biomasse gewonnen werden können, um biochemische Analysen in Bezug auf die EPS-Zusammensetzung durchzuführen (z. B. Wingender et al., 2001). Außerdem entsprechen diese Biofilme wohl am ehesten den Bedingungen, die bei Infektionen der Lunge von Cystische Fibrose Patienten vorherrschen, die auch als Biofilm an der Grenzfläche Substratum/Luft angesehen werden können (Lam et al. 1980; Doig et al., 1987; Lyczak et al., 2002). Auch in der Natur sind

5 Diskussion

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ungesättigte Biofilme von Bedeutung. Sie können z. B. in der Bodenmatrix (Robertson und Firestone, 1992) auf Wurzeln (Foster et al., 1983) und auf der Oberfläche von Blättern (Morris et al., 1997) gefunden werden. Die Bezeichnung „gesättigter Biofilm“ wäre aber wohl treffender, da sich sekretierte Substanzen unter diesen Bedingungen anreichern, in dem limitierten Volumen des Lösungsmittels Wasser akkumulieren und somit unter Umständen hohe Konzentrationen erreichen können. Im Fall von amphiphilen Molekülen, wie z. B. LPS oder Rhamnolipiden, die in den Agar-Biofilmen von P. aeruginosa SG81 extrazellulär nachgewiesen werden konnten (Wilms et al., in Vorbereitung; Rode, 2004), könnten die Konzentration die kritische Micellbildungs-Schwellenkonzentration erreichen, was letztlich Einfluss auf physiologische und physikalische Eigenschaften der Biofilme, wie die Struktur und die mechanische Stabilität besitzen könnte (Wingender et al., 1999a; Gehrke et al., 1998). Auch könnte es zur Ausbildung von hydrophoben, abgegrenzten Bereichen in einer hydrophilen Umgebung kommen. Hydrophobe Bereiche in Biofilmen konnten mit Nilrot (Lamont et al., 1987; Wolfaardt et al., 1994; 1998) und mit hydrophoben, fluoreszierenden Mikro-Kugeln nachgewiesen werden (Zita und Hermansson, 1997). Die Akkumulation von EPS und auch von Stoffwechselprodukten kann letztlich für sämtliche statischen Kulturbedingungen angenommen werden. Zudem muss ab einem gewissen Zeitpunkt mit Nährstoffmangelbedingungen gerechnet werden. Die eigenen Untersuchungen zeigten, dass bei konfluenten Bakterienrasen schon nach 24 h eine Stagnation bzw. sogar ein Rückgang in der Zellzahl beobachtet werden konnte, während das bei Membranfilter-Biofilmen, die etwa 75 % weniger Fläche auf einer Agarplatte einnehmen und somit mehr Nährstoff/cm2

Biofilm zur Verfügung steht, erst nach 48-stündiger Bebrütung der Fall war (4.1.1). Interessanterweise stieg die Konzentration extrazellulärer Kohlenhydrate trotz konstanter Zellzahl bei längerer Bebrütung weiter an (4.1.2), was sich auch in einer steigenden Feuchtmasse und einem steigenden Trockenrückstand der Biofilme ausdrückte (4.1.1). Da Kohlenhydrate hauptsächlich aus Kohlenstoff bestehen, kann davon ausgegangen werden, dass die Kohlenstoff-Quelle (C-Quelle) nicht den limitierenden Faktor im Medium darstellt. Zudem wurde in der Literatur beschrieben, dass Stickstoff oder Phosphat zu den limitierenden Faktoren während des Biofilmwachstum gezählt werden (Ombaka et al., 1983; Tait et al., 1986; Sutherland, 2001; Scheen, 2003) und die Bedingungen bei chronischen Infektionen widerspiegelt (Terry et al., 1991). Bei dem Vergleich von 24 h Biofilmen der Enzym-Defekt-Mutanten und -Überexpressions-Stämme konnte beobachtet werden, dass Stämme, die eine verringerte Zellzahl zeigten, eine erhöhte Biofilm-Feuchtmasse aufwiesen (4.5.1), was auf eine vermehrte Produktion extrazellulären Materials, insbesondere Kohlenhydrate zurück geführt werden konnte (4.5.5). Das deutet darauf hin, dass die zur Verfügung stehende Energie entweder zur Bildung neuer Zellen, oder von EPS genutzt werden kann. Die vermehrte Produktion extrazellulärer Polysaccharide unter Nährstoffmangelbedingungen wurde für P. aeruginosa in der Literatur beschrieben (Wrangstadh et al., 1990; Schlictman et al., 1994) Der zur Anzucht von Agar-Biofilmen und Membranfilter-Biofilmen verwendete Pseudomonas Isolierungs Agar (PIA) enthält standardisiert 25 µg/ml Irgasan DP 300 (5-Chlor-2(2,4-dichlorphenoxyphenol)). Diese auch Triclosan genannte Substanz, hemmt die in natürlicher Umgebung mit P. aeruginosa assoziiert vorkommenden Mikroorganismen (Begleitflora; Curry und Butera, 1971). Daher wurde dieses Medium besonders im klinischen Bereich häufig als Isolierungsmedium für P. aeruginosa verwendet (Pugashetti et al., 1982; Govan et al., 1983; Kelly et al., 1983; Grobe, 1996). Zudem erleichtert der Einsatz eines solchen Hemmstoffes das Arbeiten mit Reinkulturen von P. aeruginosa. Allerdings wird auch P. aeruginosa bis zu 90 % im Wachstum behindert (Marold et al., 1981; Grobe, 1995). In der vorliegenden Arbeit wurde

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vornehmlich mit mucoiden Stämmen von P. aeruginosa gearbeitet. Der mucoide Phänotyp ist im Labor mehr oder weniger instabil (Çetin et al., 1965). Die schleimbildenden Bakterien revertieren mit großer Häufigkeit zu einem nicht-mucoiden Phänotyp (Govan, 1990). Es wurde beschrieben, dass Triclosan den mucoiden Phänotyp stabilisiert (Pugashetti et al., 1982; Govan et al., 1983), was einen weiteren Vorteil dieses Mediums darstellt. Neuere Erkenntnisse besagen, dass Triclosan eine inhibitorische Wirkung auf das Quorum Sensing-System von Gram-negativen Bakterien besitzt (Zang et al., 2003), worauf die Hemmung des Wachstums von P. aeruginosa und seiner Begleitflora beruhen mag. Dabei wirkt Triclosan als Strukturanalogon zu den Signalmolekülen und wirkt dadurch inhibierend auf die Autoinduktion des LasIR und RhlIR-Systems (Zang et al., 2003). Mit chemischen Nachweismethoden konnte in Biofilmen eine 45fache Konzentration an 3-oxo-C12-HSL im Vergleich zu planktonischen Kulturen nachgewiesen werden (Hentzer et al., 2004). Untersuchungen zur Konzentration an 3-oxo-C12-HSL in den auf PIA angezüchteten Biofilmen von P. aeruginosa SG81 zeigten, dass sich die Aktivität des Signalmoleküls in den EPS aus Flüssigkulturen identisch zu der von Agar-Biofilmen (Abbildung 50), was auf einen Einfluss von Triclosan auf das Quorum Sensing-System von P. aeruginosa bei der Anzucht auf PIA hinweist. Um den Einfluss von extrazellulären Enzymen, von denen einige über das Quorum Sensing-System reguliert werden (Pesci et al., 1997; Whiteley et al., 1999), auf die Biofilmentwicklung zu untersuchen, wurden entsprechend andere Anzuchtbedingungen gewählt. Abbildung 50: Bestimmung der 3-oxo-C12-HSL-Aktivität in 50 µl zellfreien EPS-Lösungen von P. aeruginosa SG81 von a) Agar-Biofilmen (PIA, 36 °C, 24 h) und b) Flüssigkulturen (LB, 36 °C, 24 h), mit dem Biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4, Fuqua und Winans, 1996). Die eingesetzten Kulturen, aus denen die EPS durch Zentrifugation und anschließender Sterilfiltration der Überstände gewonnen wurden besaßen eine vergleichbare Zellzahl/ml. Repräsentative Darstellung von zwei unabhängigen Experimenten. • Mikrotiterplatten-Biofilme Zur Quantifizierung der Biofilmbildung wurde ein einfaches Verfahren in Mikrotiterplatten aus Polystyrol verwendet (3.1.2.2). Dieses System wurde in der Literatur schon vielfach beschrieben. Es wurde unter anderem für die Biofilmanzucht von Staphylococcus epidermidis (Pitts et al., 2003), Listeria monocytogenes (Molz und Martin, 2005) und P. aeruginosa (z. B. O´Toole und Kolter, 1998; Davey et al., 2003; Webb et al., 2004) genutzt. 1999 wurde diese Anzuchtmethode als „Standard 96-Well Technologie“ zur Testung der Wirksamkeit für Antibiotika beschrieben (Ceri et al., 1999). Durch die hohe Anzahl an Kavitäten innerhalb einer Mikrotiterplatte ist es ein sehr nützliches System für die Analyse der Biofilmbildung von z. B. Genbanken, oder der Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Nährstoffen (Molin et al., 2004; Molz und Martin, 2005). In Kombination mit automatisierenden Maschinen, wie z. B. Pipettierrobotern, bietet es die Möglichkeit des „Screenings“ auf Biofilmbildungsfähigkeiten im Hochdurchsatz-Verfahren (Molin et al., 2004). Ebenso bietet es die Möglichkeit, eine große

a) b)a) b)

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Anzahl an Parallelbestimmungen durchzuführen, die für statistische Analysen nötig sind. Allerdings erhält man durch dieses System nur Hinweise auf die Fähigkeit der Mikroorganismen, sich unter den gewählten Bedingungen an Oberflächen anzuheften. Man erhält keine Aussage über die Biofilmentwicklung, oder die Biofilmstruktur. Daher wurden in dieser Arbeit auch Anzuchtsysteme verwendet, die eine qualitative Aussage über die Biofilmbildung zulassen. • Biofilmbildung unter statischen Bedingungen Zur Untersuchung der Biofilmstruktur unter statischen und auch unter kontinuierlichen Bedingungen an Glasoberflächen wurde das von Ohman und Chakrabarty (1981) beschriebene „Alginate Promoting“ Medium verwendet. Dieses synthetische Medium wurde als geeignetes Medium beschrieben, die Alginat-Produktion von mucoiden Stämmen von P. aeruginosa zu steigern und den mucoiden Phänotyp zu stabilisieren (Ohman und Chakrabarty, 1981). Der mucoide Phänotyp ist besonders nach längerer statischer Bebrütung in Flüssigkulturen instabil und die Revertierung zum nicht-mucoiden Phänotyp konnte häufig beobachtet werden (Govan et al., 1979; Pugashetti et al, 1982; Ombaka et al, 1983; Govan, 1990). Das Medium wurde in modifizierter Form eingesetzt (mAPM; 2.4.1). Als Stickstoff-Quelle wurde anstatt 100 mM Glutamat, 100 mM Kaliumnitrat verwendet. Dies geschah u. a. deswegen, da KNO3 keine zusätzliche C-Quelle bietet und somit die Möglichkeit einer Variation der einzelnen Nährstoffkomponenten in zukünftigen Experimenten gewährleistet ist. Besonders das C:N:P-Verhältnis des Mediums scheint großen Einfluss auf das Biofilmwachstum und die Bildung von EPS zu besitzen (Wrangstadh et al, 1990; Schlictman et al., 1994; Scheen, 2003; Lawrence et al., 2004). Untersuchungen an nicht-mucoiden Stämmen von P. aeruginosa zeigten, dass das Medium einen großen Einfluss auf die Biofilmstruktur besitzt. So konnten mit Glucose als C-Quelle heterogene Biofilme beobachtet werden, in denen Mikro- und Makrokolonien vorhanden waren. Mit Citrat als C-Quelle dagegen zeigten die Stämme einen eher homogenen, flachen Biofilm (Klausen et al., 2003a; b), was darauf hinweist, dass die Art der Kohlenstoffquelle die Architektur (z. B. „Mushroom“-Struktur) des reifen Biofilms maßgeblich beeinflusst. Für mucoide Stämme wurde ein solcher Einfluss bisher allerdings nicht beschrieben. Dort konnten unabhängig von der Nährstoffzusammensetzung immer heterogene Biofilme mit Mikrokoloniebildung erkannt werden (z. B. Nivens et al., 2001; Tolker-Nielsen und Molin, 2004; Tielen et al., 2005). Da festgestellt wurde, dass im Biofilm anaerobe Bereiche entstehen können (Flemming und Wingender, 2001), sollte durch die Verwendung von Kaliumnitrat anstelle von Glutamat als Stickstoffquelle P. aeruginosa die Möglichkeit gegeben werden, wenn nötig, Energie über Nitratatmung zu erhalten und somit trotz Sauerstoffmangels zu Biofilmen heranzuwachsen. Die Untersuchungen mit Gfp-Reporterfusionen (lipA) in Durchflusszellen zeigten allerdings, dass zumindest nach 72 h bei allen Zellen ein deutliches Gfp-Signal auch in den tieferen Schichten der Makrokolonien nachweisbar war. Da die Reifung des Gfp, bzw. die Ausbildung des fluorigenen Chromophors, Sauerstoff-abhängig ist (Zimmer, 2002), weist dieser Befund darauf hin, dass unter den hier verwendeten Bedingungen zu diesem Zeitpunkt kein Sauerstoffmangel herrschte. Die Verwendung von abiotischen Oberflächen als Substratum für Biofilmbildungsexperimente wurde in der Literatur häufig beschrieben, wobei neben Glas auch verschiedene Plastikarten oder Stahl zum Einsatz kam (z. B. Davies et al., 1993; Davies und Geesey, 1995; Tielen et al.,

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2005). Die Kultivierung unter statischen Bedingungen bietet dabei in erster Linie den Vorteil eines geringen apparativen Aufwands, der die Untersuchung grosser Probenmengen erlaubt. Von Vorteil ist dies z. B. bei der Anlyse von Einflüssen physikalischer Oberflächeneigenschaften des Substratums, wie die Hydrophobizität, oder Polarität auf die mikrobielle Biofilmbildung. Wie schon für die statische Anzucht von Biofilmen auf Agarnährmedien erörtert, können jedoch unter diesen Bedingungen ab einem gewissen Zeitpunkt Nährstoffmangelbedingungen auftreten, was großen Einfluss auf die Biofilmstruktur hat. Singh et al. (2002) beschrieben z. B. dass durch Eisenmangel die Fähigkeit zur Twitching Motility stimuliert wird. Generell wird vermutet, dass die Konvertierung von unbeweglichen zu beweglichen Zellen durch Nährstoffmangel bedingt wird (Tolker-Nielsen und Molin, 2004; Sauer et al., 2004). Auch die EPS-Zusammensetzung ist maßgeblich von der Nährstoffzusammensetzung beeinflusst (Wrangstadh et al., 1990; Schlictman et al., 1994; Ombaka et al., 1983; Sutherland, 2001). Beides besitzt bekannter Weise einen Einfluss auf die Biofilmstruktur (Wingender et al., 1999a; Klausen et al., 2003a; b; Allison, 2003). • Biofilmbildung unter kontinuierlichen Bedingungen Die Anzucht von Biofilmen unter kontinuierlichen Bedingungen wird häufig in der Literatur beschrieben (z. B. Rioufol et al., 1999; Schulte, 2003; Molin et al., 2004). Sie erlauben die Anzucht von Biofilmen an der Grenzfläche Substratum/Wasser und spiegeln somit die Bedingungen an aquatischen Standorten wieder. Dabei kommen je nach Fragestellung verschiedene Arten von Reaktoren zum Einsatz. Sie sind prinzipiell geeignet um sowohl Reinkulturen als auch Mischkulturen anzuzüchten und somit die physiologischen Effekte verschiedener Bedingungen auf die Biofilmentwicklung nachzustellen. Ein wichtiger Parameter sind u. a. hydrodynamische Bedingungen, die in entsprechenden Systemen anhand der Durchflussgeschwindigkeit des Mediums variiert werden können und einen maßgeblichen Einfluss auf die dreidimensionale Biofilmstruktur haben (Stoodley et al., 2002; Purevdorj-Gage und Stoodley, 2004). In den hier gemachten Experimenten wurde eine Reynoldszahl von 1 eingestellt, was bei den Dimensionen der Durchflusszelle einer laminaren Strömung entsprach. Laminare Strömungen kommen auch in z. B. Trinkwasser-führenden Systemen vor. Ein weiterer Vorteil solcher Systeme ist die Möglichkeit einer kontinuierlichen Nährstoffzufuhr, was wohl die Situation in den meisten Habitaten der Umwelt mit fließenden Bedingungen und dem daraus resultierenden Stofftransport widerspiegelt. Durchflusszellen sind sicherlich das kleinste System, das entwickelt wurde (Wolfaardt et al., 1994). Da das Substratum üblicherweise aus Glas besteht, ist eine direkte mikroskopische Betrachtung der Biofilmbildung möglich (Molin et al., 2004). Bei der Nutzung von molekularbiologischen Methoden, wie dem Einsatz von Gfp-Reporterfusionen oder von chromosomal integrierten Reporterkassetten unter Verwendung der CLSM, ist eine zeitaufgelöste Verfolgung der Biofilmentwicklung möglich (z. B. Lawrence et al., 1991; Heydorn et al., 2002; Webb et al., 2004). Damit kann ein vierdimensionales Bild der Biofilmentwicklung erhalten werden (Purevdorj-Gage und Stoodley, 2004). Durchflusszellen wurden vor allem bei der Erforschung der Biofilmentwicklung von P. aeruginosa verwendet (z. B. Huang et al., 1998; Xu et al., 1998; Heydorn et al., 2002; Klausen et al., 2003a; b; Webb et al., 2003; 2004).

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5.3 Vorkommen und Lokalisation von extrazellulären Enzymen im Biofilm Durch die Verwendung der fluorigenen ELF®-97-Enzymsubstrate konnte die Akitivität von Esterasen, Lipasen und alkalischen Phosphatasen innerhalb der Biofilmmatrix in situ visualisiert werden (4.2). Dabei stellte sich heraus, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität vermehrt in der Nähe der Zellen, Esterase- und Lipase-Aktivitäten aber bei längerer Bebrütungszeit auch zunehmend im Interzellularraum zu beobachten waren. Zudem nahm die alkalische Phosphatase-Aktivität bei steigender Bebrütungszeit ab, während die Aktivitäten der lipolytischen Enzyme zunahmen. Diese Beobachtung korrelierte mit den Ergebnissen der photometrischen Enzym-Aktivitäts-Messungen in den zellfreien EPS-Lösungen dieser Biofilme (4.1.3). Auch dort konnte bei älteren Membranfilter-Biofilmen eine Abnahme der alkalischen Phosphatase-Aktivität und eine Zunahme von Esterase- und Lipase-Aktivitäten nachgewiesen werden. Die Expression von Phosphatasen wird über die Verfügbarkeit von anorganischem Phosphat induziert, sodass bei Phosphat-Mangelbedingungen vermehrt Phosphatasen produziert werden (Tan und Worobec, 1993; Huang et al., 1998; Van Ommen Kloeke und Geesey, 1999). Es kann demnach davon ausgegangen werden, dass das Anzuchtmedium PIA ein Phosphat-armes Medium darstellt und entsprechend von einer hohen Phosphatase-Aktivität auszugehen war. Durch den Zusatz von 7 mM Phosphat zum PIA-Medium konnten sowohl mit ELF®-97-Phosphat in 24 h Membranfilter-Biofilmen, wie auch mit para-Nitrophenyl-Phosphat in zellfreien EPS-Lösungen dieser Biofilme keine alkalische Phosphatase-Aktivitäten mehr nachgewiesen werden (Strathmann, 2003). Die Abnahme der Phosphatase-Aktivität bei längerer Bebrütungsdauer auf PIA würde demnach bedeuten, dass die Zellen ausreichend mit Phosphat versorgt sind, welches dann aber auf anderem Wege zur Verfügung gestellt werden müsste. Eine Möglichkeit hierfür wäre der Abbau von Phosphat-haltigen Zellbestandteilen, wie z. B. Phospholipiden. Bei der Lyse von Zellen werden u. a. Membranbestandteile frei, die zu großen Teilen aus Phospholipiden bestehen (Hancock, 1991; Poxton, 1993). Diese können durch verschiedene lipolytische Enzyme, wie Phospholipasen und Lipasen komplett in ihre niedermolekularen Bestandteile abgebaut werden und diese so der Zelle wieder als Nährstoff zur Verfügung gestellt werden. Dabei spalten die Phospholipasen C und D zunächst den Phosphatrest vom Phospholipid ab und Lipasen anschließend die Fettsäurereste von entstehendem Diacylglycerol (Sohlenkamp et al., 2003). Die Verwendung des durch die Spaltung von Phosphatidylcholinen durch Phospholipase C freiwerdenden Phosphatrestes wurde für mucoide Stämme von P. aeruginosa beschrieben. (Krieg et al., 1988). Dass dieser Mechanismus in den statisch angezüchteten Membranfilter-Biofilmen von Relevanz sein kann, wird von der Beobachtung unterstützt, dass genau diese Enzyme bei längerer Bebrütungszeit eine Aktiviätssteigerung zeigen (gezeigt für Phospholipase C, Lipase, Esterase; 4.1.3). Außerdem konnte eine geringe Abnahme der Zellzahl zwischen 48 h und 72 h beobachtet werden, was auf die Lyse von Zellen hinweist (4.1.1). Darüber hinaus enthält das PIA-Medium keine Bestandteile, die von lipolytischen Enzymen als Substrat genutzt werden könnten, sodass eine vermehrte Produktion dieser Enzyme zu einem späteren Zeitpunkt auf das Vorhandensein von spaltbaren Molekülen, wahrscheinlich freigesetzt durch Zelllyse, schließen lässt.

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Die zunächst nicht fluoreszierenden, löslichen ELF®-97-Enzymsubstrate werden von entsprechenden Enzymen gespalten, wobei der unlösliche ELF®-97-Alkohol als fluoreszierende Kristalle direkt am Reaktionsort präzipitiert (Singer et al., 1994; Haugland, 1995). Das ELF®-97-Phosphat wurde zum Nachweis von Phosphatase-Aktivitäten in Belebtschlammflocken (Van Ommen Kloeke und Geesey, 1999) und in Fließzell-Biofilmen von P. aeruginosa (Huang et al., 1998; Xu et al., 1998) verwendet. Die Verwendung der zur Visualisierung von lipolytischen Enzymen geeigneten Substrate ELF®-97-Palmitat und ELF®-97-Acetat wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. Es ist nicht auszuschließen, dass diese Substrate auch von anderen Enzymen, wie z.B. von unspezifischen Proteasen gespalten werden können, da sich Esterbindungen und Peptidbindungen chemisch sehr ähnlich sind. Durch die Verwendung des Protease-Substrats Azocasein konnte bei längerer Bebrütung photometrisch ein Aktivitätsanstieg dieser Enzyme in zellfreien EPS-Lösungen nachgewiesen werden (4.1.3). Prinzipiell sind Lipasen und Esterasen hochspezifisch in Bezug auf ihr Substrat, häufig sogar Enantio-selektiv (Jaeger et al., 1999; Jaeger und Reetz, 2000). Letztlich gehören aber beide Enzyme zur Klasse der Carboxylesterhydrolasen, wobei sich die Substrate in Bezug auf die Länge der Fettsäurenreste unterscheiden. Dabei bevorzugen Esterasen Substrate mit kurzkettigen Fettsäuren (bis etwa C4), Lipasen langkettige Substrate (>C10; Jaeger et al., 1999). Eigene Ergebnisse zeigten, dass die Esterase Est A allerdings auch in der Lage ist, langkettigere Substrate wie para-Nitrophenyl-Palmitat zu verwerten (4.5.2 und 4.5.7.1). Da die physiologischen Substrate noch nicht eindeutig bekannt sind, kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Lipase LipA das kurzkettigere ELF®-97-Acetat spaltet und somit die intensiven interzellulären Enzymaktivitäten besonders im 72 h Biofilm von Lipase-Aktivitäten verursacht wurden. Zumal mit Fluoresceindiaceat als Esterase-Substrat photometrisch nur eine sehr geringe Esterase-Aktivität ermittelt werden konnte, was für ein äußere Membran gebundenes Enzym auch zu erwarten wäre. Dagegen deckt sich die zu beobachtende zellgebundene Esterase-Aktivität an nur wenigen Zellen innerhalb des Biofilms (4.2) mit den Befunden in Durchflusszellen, bei denen sich die Aktivität des estA-Promotors mittles gfp-Reporterfusionen auch nur in wenigen Zellen innerhalb des Biofilms beobachten ließ (4.8).

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5.4 Wechselwirkungen von extrazellulären Enzymen mit der EPS-Matrix Die Untersuchungen zur Lokalisation von Enzymen im Biofilm zeigten, dass Lipase-Aktivitäten an den Zellen, aber auch im interzellulären Raum als wolkenartige Strukturen zu beobachten waren (4.2). Interessanterweise erwiesen sich diese Strukturen bei Zugabe von Calcium zum Anzuchtmedium geordneter und in größerer Nähe zu den Zellen (4.5.7.2). Es wurde beschrieben, dass das divalente Kation Ca2+ mit Alginat-Molekülen komplexiert und somit dem extrazellulären Polysaccharid gelartige Eigenschaften verleiht, was zu einer höheren mechanischen Stabilität von Biofilmen von P. aeruginosa führt (Körstgens et al., 2001a; b; Lattner et al., 2003). Es kann also vermutet werden, dass das Alginat unmittelbar nach seiner Sekretion direkt an der Zelloberfläche Wechselwirkungen mit Ca2+-Ionen eingeht und geliert. Ähnliche Strukturen wie bei der Verwendung des Lipase-Substrates ELF®-97-Palmitat konnten bei der Applikation des zuckerbindenen Proteins Concanavalin A (ConA) aus Canavalia ensiformis (Abbildung 51) beobachtet werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass dieses α-Mannose- und α-Glucose-spezifische Lektin an Gluluronat-reiche Alginatfraktionen mit einem geringen Acetylgruppengehalt bindet (Strathmann et al., 2002). Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass die Lipase von P. aeruginosa möglicherweise mit dem wirtseigenem extrazellulären Polysaccharid Alginat assoziiert vorliegt. Abbildung 51: TRITC-ConA Bindung (rot) an Membranfilter-Biofilme von P. aeruginosa SG81; Zellfärbung (grün) mit SYTO 9. Die Anzucht erfolgte bei 36 °C für 24 h auf Ca2+-PIA. CLSM-Aufnahme (optischer Schnitt) bei 400facher Vergrößerung (aus Strathmann et al., 2002). Bei der Gelsiebfiltration von zellfreien EPS-Lösungen des mucoiden Stamms P. aeruginosa SG81 an Sephacryl S-500 HR konnte beobachtet werden, dass i) die Aktivitäten von Lipasen nicht in einem eindeutigen Peak, sondern undefiniert über den gesamten Fraktionsbereich eluierten, ii) Protease-Aktivitäten in drei Peaks eluierten, wobei ein Peak sogar vor dem Ausschlussvolumen der Säule detektiert werden konnte, iii) Esterase-Aktivitäten zwar im Bereich des Gesamt-Proteinpeaks, aber in einem sehr breiten, undistinkten Peak eluierten und iv) Phosphatase-Aktivitäten in einem symmetrischen Peak im hochmolekularen Bereich, außerhalb des Proteinpeaks nachgewiesen werden konnten (4.3.1). Sephacryl als ungeladenes, hydrophiles Säulenmaterial wird häufig zur Trennung und Reinigung von Proteinen anhand ihrer Molekülgröße verwendet („Gelsiebchromatographie“; Übersicht in Saxena et al., 2003). Dabei eluieren Proteine typischerweise in relativ distinkten, symmetrischen Peaks. Ein solches Elutionsverhalten konnte auch bei den in dieser Arbeit

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verwendeten Kalibrierungsproteinen beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Für das undefinierte Elutionsverhalten der extrazellulären Enzyme bei der chromatographischen Auftrennung von EPS an Sephacryl S-500 HR gibt es verschiedene Erklärungsmöglichkeiten. i) Die Enzyme liegen innerhalb der EPS-Matrix nicht nur als Monomere, sondern auch in Form von Homo- oder Heteromultimeren vor. Die Aggregation von Enzymmolekülen wurde z. B. für eine Lipase von P. fluorescens beschrieben (Fernández-Lorente, 2003). Weitere Erklärungsmöglichkeiten wären ii) die Interaktion der Enzyme mit dem Säulenmaterial und iii) die Assoziation von Enzymen mit anderen EPS-Bestandteilen, was letztlich zu einer Koelution von Proteinen mit diesen Polymeren führen könnte. Die nicht-kovalente Bindung von Proteinen mit enzymatischer Aktivität an verschiedene Polymere wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (Lookene et al., 1996; Sardar und Gupta, 1998; Sharma und Gupta, 2001; Shah und Russel, 2004; Kemmling et al., 2004). Darunter wurde auch die Affinität der extrazellulären Lipase von P. aeruginosa zu verschiedenen Polysacchariden gezeigt, wobei besonders uronsäurehaltige Polysaccharide, wie Hyaluronsäure und Algenalginat Effekte aufwiesen (Schulte et al., 1982; Wingender und Winkler, 1984). Entsprechend könnte eine Wechselwirkung von LipA zu dem eigenen uronsäurehaltigem Alginat vermutet werden. Allerdings eluierten Lipase-Aktivitäten nicht nur in dem hochmolekularen Bereich des Polysaccharids (4.1.3), sodass bei der Lipase noch von anderen Wechselwirkungen ausgegangen werden muss. Die extrazelluläre Phosphatase-Aktivität des mucoiden Stamms SG81 dagegen eluierte zusammen mit dem Uronsäurepeak. Zur Untersuchung einer möglichen Wechselwirkung zwischen Phosphatasemolekülen und dem extrazellulären Polysaccharid wurde die Gelfiltration mit zellfreien EPS-Lösungen der nicht-mucoiden Revertante wiederholt (4.1.3). Auch hierbei eluierte die Phosphatase im hochmolekularen Bereich, sogar noch 11 Fraktionen früher als beim mucoiden Stamm. Dass eine Wechselwirkung des Enzyms zum Alginat zu diesem Elutionsverhalten führte, konnte somit also ausgeschlossen werden, da die Revertante SG81R1 nur marginale Mengen Alginat produziert und entsprechend weite Bereiche des Phosphatase-Aktivitäts-Peaks uronsäurefrei waren. Neue Erkenntnisse besagen, dass P. aeruginosa zwei alkalische Phosphatasen produziert; eine leichte Phosphatase (L-AP) mit 40 kDa und eine schwere Phosphatase (H-AP) mit 51 kDa. Nur die L-AP wird via Typ II Sekretion ins extrazelluläre Medium transportiert. Die H-AP ist ein periplasmatisches Enzym, welches nur auf alternativem Wege in den extrazellulären Raum transportiert wird (Tan und Worobec, 1993; Ball et al., 2002). Da in den hier durchgeführten Experimenten nicht zwischen beiden Phosphatasen differenziert wurde, ist davon auszugehen, dass jeweils die Aktivitäten beider Enzyme nachgewiesen wurden. Bereits 1973 beschrieben Ingram et al. die Assoziation von alkalischer Phosphatase-Aktivität mit Lipopolysacchariden. Weiterführend wiesen Kadurugamuwa und Beveridge (1995) nach, dass P. aeruginosa Abschnürungen der äußeren Membran in Form von Membranvesikel in das extrazelluläre Medium abgibt. Diese LPS-haltigen Vesikel schließen Bereiche des bakteriellen Periplasmas einschließlich verschiedener Enzyme ein, u. a. wurde auch alkalische Phophatase nachgewiesen (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995). Interessanterweise wurden fluoreszensmikroskopisch mit dem Lipid-bindenden Farbstoff DID (1,1´-Dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethyl-indodicarbocyanin-5,5´-disulfonsäure) und rasterelektronenmikroskopisch in der extrazellulären Matrix von Biofilmen von P. aeruginosa SG81 globuläre Strukturen von ca. 100 nm Durchmesser nachgewiesen (Strathmann, 2003). Diese Größe entspricht den von Kadurugamuwa und Beveridge beschriebenen Membranvesikeln (1995; 1997). Diese Befunde legen die Vermutung nahe, dass das beobachtete Chromatographieverhalten der alkalischen

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Phosphatase-Aktivität auf ihre Assoziation bzw. Lokalisation in Membranvesikeln zurückzuführen ist. Die exakte Lokalisierung der Phosphatase in diesen Strukturen, wie auch der zweifelsfreie Nachweis, dass es sich hierbei um Membranvesikel handelt, sollte Ziel von nachfolgenden Studien sein. Die anderen getesteten Enzyme (Protease, Esterase, Lipase) des nicht-mucoiden Stamms SG81R1 eluierten im Gegensatzt zu denen vom mucoiden Stamm SG81 in deutlicheren Peaks, innerhalb des Proteinpeaks. Dies deutet darauf hin, dass im mucoiden Hintergrund Wechselwirkugen zwischen den Enzymen und dem Polysaccharid Alginat auftreten, die durch die Gelsiebfiltration an Sephacryl S-500 HR nicht aufgehoben werden können und es so zu einer Koelution von Proteinen und Alginat kommt. Solche Wechselwirkungen wären beim Stamm SG81R1 nicht möglich, da er nur äußerst geringe Mengen Alginat produziert. Allerdings wären neben Wechselwirkungen zum anionischen Polysaccharid Alginat auch Wechelwirkungen mit anderen EPS-Bestandteilen, wie z. B. die erst kürzlich nachgewiesenen extrazellulären Mannose- und Glukose-reichen Kohlenhydrate von nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stämmen (Jackson et al., 2004; Matusukawa und Greenberg, 2004; Friedman und Kolter, 2004 a; b; Vasseur et al., 2005) oder LPS denkbar. LPS konnte über einen KDO-Nachweistest in den EPS von mucoiden Stämmen von P. aeruginosa, inklusive des Stamms SG81 in einer Konzentration von etwa 4,2 % pro mg Biofilm-Trockenmasse nachgewiesen werden (Wilms et al., in Vorbereitung). Die Assoziation von LPS-Molekülen und LipA von P. aeruginosa wurde bereits in der Literatur beschrieben (Stuer et al., 1986). Zum Nachweis solcher potentiellen Interaktionen und zur Untersuchung des physiko-chemischen Charakters dieser Bindungen, wurden in dieser Arbeit mehrere Trennungsverfahren, wie auch Bindungstests eingesetzt. Hierbei stand als Beispiel die Lipase A im Vordergrund, da ihr Aktivitäts-Elutionsprofil in den beschriebenen Chromatographieversuchen mit Sephacryl als Säulenmaterial mit den EPS aus dem mucoiden Stamm am undeutlichsten war. Als Trennungsmethoden kam zum einen die analytische Gelfiltration an Sephacryl S-500 HR mit einem Gelbettvolumen von 28 ml zum Einsatz. Als weitere Methode zur Trennung von Lipasen von anderen EPS-Komponenten wurde mit der Adsorptionschromatographie an Glas beschrieben (Wingender et al., 1987), wobei die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Glas und Lipase-Molekülen genutzt wurde. Die Chromatographie-Versuche wurden mit gereinigter Lipase LipA (zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. K.-E. Jäger) durchgeführt. Es wurde jeweils i) als Kontrolle die gereinigte Lipase alleine, ii) in Gegenwart von Alginat und iii) in Gegenwart von LPS eingesetzt. Bei der Gelfiltration von gereinigter Lipase A konnten vier Peaks beobachtet werden (4.3.2); dabei eluierten zwei Lipase-Aktivitäts-Peaks ohne Zugabe von Triton X-100, die beiden anderen erst nach Zugabe von 1 % (w/v) Triton X-100 von der Säule. Dies ist nur zu erklären, wenn ein Teil der Lipase-Moleküle Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial eingeht. Da diese Wechselwirkung mit einem nicht-ionischen Detergenz aufgehoben werden konnte, deutet dieser Befund darauf hin, dass es sich hierbei um direkte oder indirekte hydrophobe Wechselwirkungen handelte. Wurde der Lipase P. aeruginosa-Alginat zugesetzt, reduzierte sich die Zahl der Peaks mit Lipaseaktivität auf zwei, von denen diesmal nur einer Triton X-100-abhängig war und zudem deutlich kleiner war als zuvor. Das weist darauf hin, dass zumindest ein Teil der Lipasemoleküle Wechselwirkungen mit dem Alginat eingingen und somit die Interaktion der Lipase mit dem Säulenmaterial verhindert wurde. Der ohne Detergenzzugabe erhaltene Peak wie darüber hinaus eine deutlich höhere Lipaseaktivität auf, als in dem

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Kontrollversuch mit Lipase alleine. Wurde die Lipase vor der Chromatographie anstelle von Alginat mit LPS inkubiert, eluierte die überwiegende Menge an Lipaseaktivität in einem Peak. Durch die Zugabe von Triton X-100 konnte nahezu keine weitere Lipaseaktivität eluiert werden, was darauf hindeutet, dass LPS-Moleküle die Interaktion der Lipase mit dem Säulenmaterial Sephacryl inhibieren können. Das Auftreten verschiedener Peaks in diesen Versuchen deutet darauf hin, dass das Lipaseprotein in der vorliegenden Präparation nicht homogen vorlag, sondern in vier verschiedenen Zuständen, die aber alle Lipaseaktivität aufwiesen. Hierfür gibt es im wesentlichen zwei Erklärungsmöglichkeiten: i) die Lipasemoleküle selbst könnten in Di- oder Multimerform vorgelegen haben, oder ii) die Lipase lag in einer bereits von Stuer et al. (1986) beschriebenen Assoziation mit LPS-Molekülen vor. Bei vielen Experimenten wurde die Aggregation von Lipasen verschiedenen Ursprungs beobachtet (Osborne et al., 1985; Stuer et al. 1986; Sugihara et al., 1991; 1992; Jaeger et al., 1992; Lesuisse et al., 1993; Schmidt-Dannert et al., 1994; Rúa et al., 1997; Berryman et al., 1998; Graupner et al., 1999; Palomo et al., 2003). Zudem zeigten Röntgen-Strukturanalysen, dass Lipasen häufig als Dimere kristallisierten, wobei sich die das aktive Zentrum umgebenen hydrophoben Bereiche dieser amphiphilen Moleküle, zusammen lagern (Ghosh et al., 1995; Uppenberg et al., 1995; Pernas et al., 2001). Interessanterweise existierten jeweils zwei Peaks. Im Vergleich zu den Elutionsprofilen der Kalibrierungsproteine waren die Moleküle im ersten Peak etwa doppelt so groß wie in dem folgenden Peak, was auf eine Dimerisierung hindeutet. Ein weiterer Hinweis auf eine Dimerisierung einer Population von Lipase-Molekülen ist die geringe Größe von Peak Nr.3 im Elutionsprofil der Lipase in Abwesenheit von Polysacchariden, da beschrieben wurde, dass die Komplexbildung von Lipasen über hydrophobe Wechselwirkungen erfolgt und durch Detergenzien wie Triton X-100 wieder in die Einzelmoleküle aufgelöst werden kann (Palomo et al., 2003). Darüber hinaus wurde beschrieben, dass die Bildung von Dimeren in wässrigen Lösungen auch durch die Immobilisierung der Lipasen an geeignete Materialien unterbunden werden kann (Palomo et al., 2003). In Abbildung 14B ist Peak Nr.3, durch die Gegenwart von Alginat komplett verschwunden und auch Peak Nr. 1 ist nicht mehr als distinkter Peak zu erkennen, sondern nach hinten verschoben, wodurch der Peak Nr. 2 an Fläche zunimmt und demnach wahrscheinlich nur noch Monomere vorliegen. Demnach käme dem Alginat unter diesen Bedingungen eine Aggregations-verhindernde Wirkung zu, die nur mit Interaktionen zwischen dem Polysaccharid und der Lipase zu erklären ist, die wahrscheinlich zu einer Separation der Lipasemoleküle führten. Einen klaren Hinweis auf eine Assoziation der Lipase mit LPS-Molekülen und die daraus resultierende Beeinflussung von hydrophoben Bindungseigenschaften des Proteins ergab die Adsorptionschromatographie an Glasoberflächen. In diesen Experimenten mit gereinigter Lipase traten ebenfalls unterschiedliche Zustände der Lipase auf. Hier waren zwei Peaks zu beobachten, von denen einer erst nach Zugabe von Triton X-100 zu beobachten war. Hier bewirkte die Vorinkubation mit Alginat jedoch keinen Unterschied im Elutionsverhalten, was darauf hinweist, dass Alginat die Interaktion zwischen Enzym und Glas nicht inhibierte. Auch konnte die Interaktion durch nachträgliche Gabe von Alginat nicht aufgehoben werden. Wurde anstelle des Alginats LPS nachträglich zugegeben, konnte die Lipaseaktivität jedoch von der Säule eluiert werden. Die Interaktionen zwischen Lipase und Glas bei dieser Methode wurden als hydrophobe Wechselwirkungen beschrieben, da festgestellt wurde, dass sich die diese Wechselwirkung nur mit Detergenzien, nicht aber mit steigenden Konzentrationen an NaCl

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inhibieren konnte (Wingender et al., 1987). Dies zugrunde gelegt, bedeutet das, dass aufgrund der beobachteten Einflüsse des LPS auf die Elution der Lipase als relevanter Molekülteil nur der hydrophobe Lipid A-Anteil infrage kommt. Da Alginat weder die Bindung der Lipase an Glas inhibieren konnte, noch aufheben konnte, ist dies indirekt ein Hinweis darauf, dass Interaktionen zwischen Lipase und Alginat nicht hydrophober Natur sein können. Umgekehrt bedeutet das Auftreten von zwei Peaks bei der Chromatographie der Lipase alleine, von denen einer Detergenz-unabhängig eluierte, dass diese Population an Lipasemolekülen nicht in der Lage war, hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Glas einzugehen. Eine wahrscheinliche Erklärung hierfür ist eine Assoziation mit LPS-Molekülen, die auch bei der hier verwendeten Lipasepräparation auftritt (F. Rosenau und K.-E. Jäger, persönliche Mitteilung), die einem Kulturüberstand eines von P. aeruginosa PAO1 abgeleiteten lipA-Überexpressionstamms entstammt, der die Lipase etwa 10000fach überproduziert (Rosenau und Jaeger, 2004). Interessanterweise wies die Lipase in Versuchen mit Kulturüberständen aus P. aeruginosa PAO1, also ohne Überproduktion in Adsorptionschromatographieversuchen nur eine einzige Zustandsform auf, die Detergenz-unabhängig eluierte. Bei moderater Überexpression unter Verwendung des Stamms SG81LAH traten jedoch beide Peaks auf. Dies kann als Hinweis gewertet werden, dass abhängig von der Menge der exprimierten Lipase die von den Zellen produzierte LPS-Menge nicht ausreicht, um eine vollständige Absättigung der Lipase zu erreichen. Dies könnte zum Auftreten von verschiedenen Lipasepopulationen führen, die sich im Assoziationsgrad mit LPS und somit in ihrer Bindefähigkeit zu hydrophoben Flächen unterscheiden. Als weitere Möglichkeit für die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Enzymen und Polysachariden wurde ein Bindetest entwickelt, der aufgrund seines Mikrotiterplatten-Formates entsprechende Untersuchungen im Hoch-Durchsatz-Verfahren erlaubt (3.9.1). In diesem Test wird der Befund genutzt, dass Polysaccharide wie Dextran und Alginat in Gegenwart von 0,14 M NaCl in einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 1,0 mg/ml durch Eintrocknung gleichmässig an das Polystyrolmaterial von Mikrotiterplatten adsorbiert werden können (Strathmann et al., 2002). Die Bindung von Enzymen an die immobilisierten Polysaccharide kann in dem hier entwickelten Bindungstest durch photometrische Messung der Enzymaktivität innerhalb der Mikrotiterplatte quantifiziert werden. Dieses System wurde benutzt, um die Wechselwirkungen zwischen der Lipase aus P aeruginosa und einer Auswahl verschiedener Polysaccharide näher zu charakterisieren. Hierzu wurde neben dem bakteriellen Alginat, das chemisch gesehen ein acetyliertes, negativ geladenes Heteropolymer aus Mannuronat und Guluronat darstellt, ein Alginat aus Braunalgen gegenübergestellt, das sich durch das Fehlen von Acetylgruppen und durch eine andere Monomer-Sequenz von den bakteriellen Alginaten unterscheidet (Skår-Bræk et al., 1986; Schürks et al., 2002). Zusätzlich wurden weitere bakterielle Polysacharide verwendet, wie z. B. das extrazelluläre Polysaccharid Xanthan aus der P. aeruginosa nah verwandten Art Xanthomonas campestris. Xanthan ist ein Heteropolysaccharid aus Glucose, Mannose und Glucuronsäure, das mit Acetat und Pyruvat substituiert vorliegt. Demnach besitzt es sowohl saure als auch neutrale Eigenschaften. Außerdem wurde Hyaluronsäure aus dem Gram-positiven Bakterium Streptococcus zooepidemicus als alternierendes Kopolymer aus Glucuronsäure und N-Acetyl-glucosamin genutzt. Neben den sauren Polysacchariden wurden zwei neutrale Polysaccharide verwendet: Dextran aus Leuconostoc mesenteroides, welches aus poly-α-D-Glucose besteht und Levan aus Erwinia herbicola als Polymer aus β-D-Fructose.

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Die Bindung von Lipase an Alginat aus P. aeruginosa SG81 erfolgt in deutlicher Abhängigkeit von der eingesetzten Alginatkonzentration, wohingegen das Algenalginat nicht in der Lage war, Lipase zu binden. Eine schwache Bindung war zwischen Xanthan und Lipase nachweisbar, das wie auch Alginat Gluconatreste als Monomerbausteine aufweist. Die Bindefähigkeit war allerdings nur sehr gering, was sich daraus ableiten lässt, dass Lipasebindung erst bei sehr hohen Polysaccharid-Konzentrationen erfolgte. Ähnliches war bei Verwendung von Levan der Fall. Alle anderen getesteten Polysaccharide waren nicht in der Lage, Lipase zu binden. Auffällig war, dass Algenalginat keine Bindung mit der gereinigten Lipase aufwies, obwohl eine solche Bindung von Algenalginat an Exolipase aus Kulturüberständen von nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stämmen beschrieben wurde (Wingender et al., 1984; 1987; 1990). Die Ursache für diese unterschiedlichen Befunde sind derzeit nicht klar, jedoch bieten sich zwei Erklärungsansätze. Zum einen könnten die in den hier durchgeführten Salzkonzentrationen eine Wechselwirkung des Algenalginats mit der Lipase negativ beeinflusst haben. Wingender (1990) berichtete, dass eine Kopräzipitation von Lipasen und Algenalginat bei einer alkoholischen Fällung durch Zugabe von NaCl verhindert wurde. Zum anderen liegt ein wichtiger Unterschied in der Präparation der Lipase. Während die Bindung an Algenalginat mit Kulturüberstandslipase von Wildtypstämmen nachgewiesen wurde, entstammte die hier benutzte Lipase einer Überexpressionskultur und zeigte, wie bereits erörtert, ein anderes Adsorptionsverhalten an Glas, was wahrscheinlich auf eine reduzierte Assoziation mit LPS-Molekülen zurückzuführen ist. Es wurde postuliert, dass die Bindung der Exolipase an Alginat über mit dem Protein assoziierte LPS-Moleküle erfolgen soll (Wingender et al., 1987). Dies vorausgesetzt, könnte ein unterschiedliches Maß der LPS-Assoziation das hier beobachtete Fehlen der Interaktion zwischen Lipase und Algenalginat erklären. Die Interaktion mit Polysacchariden kann zu einer Stabilisierung von Proteinen beitragen (z. B. Sharma und Gupta., 2001; Kemmling et al., 2004), was auch im Zusammenhang mit der Lipase aus P. aeruginosa gezeigt wurde (Wingender et al., 1987). Dieser Zusammenhang wurde genutzt, um die bereits beschriebenen Interaktionen der verschiedenen Polysaccharide mit der Lipase zu untersuchen, indem die Thermostabilität des Enzyms in Abhängigkeit zum jeweiligen Polymer verglichen wurde. Die Befunde deckten sich dabei im Wesentlichen mit den Daten aus den Bindetests in Mikrotiterplatten. Generell konnte eine Erhöhung der Thermostabilität nur in einem Temperaturbereich zwischen 50-70 °C beobachtet werden, unterhalb dieser Temperaturen erwies sich die Lipase durchweg als stabil. Die Zugabe von Algenalginat und Dextran zeigte keinen Einfluss auf die Stabilität der Lipase unter diesen Bedingungen, während das acetylierte Alginat aus P. aeruginosa SG81 und Xanthan eine Stabilisierung bewirkten, was in Übereinstimung mit den Ergebnissen des bereits beschriebenen Bindetest in Mikrotiterplatten ist. Interessanterweise zeigte der Vergleich zwischen acetyliertem Alginat aus dem mucoiden Stamm P. aeruginosa FRD1 und dem nicht-actetylierten Alginat aus P. aeruginosa FRD1153, dass das nicht-acetylierte Alginat eine gesteigerte Schutzwirkung hatte. Dies kann als Indiz interpretiert werden, dass die Bindfähigkeit des Alginats für Proteinliganden durch den Gehalt an Acetylgruppen moduliert wird, wobei Acetylierung anscheinend eine Herabsetzung der Bindungsfähigkeit bewirkt. Parallel zu dieser Arbeit durchgeführte Berechnungen mit „Molecular Modelling“-Verfahren zu Wechselwirkungen zwischen LipA und Alginat ergaben interessante Befunde. Es wurde gezeigt, dass das negativ geladene Alginat im Vakuum, sowie in wässriger Umgebung, elektrostatische Wechselwirkungen zu den Seitenketten Oberflächen-exponierter, positiv

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geladener Aminosäuren wie Histidin (His) und Arginin (Arg) im hydrophilen Teil der Lipase eingehen kann (Abbildung 52). Da die durchgeführten Berechnungen eine Energieminimierungssimulation darstellen, scheint dieser gebundene Zustand der Lipase dem niedrigsten Energiezustand zu entsprechen und somit in Gegenwart von Alginat bevorzugt zu sein (Tielen et al., in Vorbereitung). Da die Lipase mehrere positiv geladene Aminosäuren auf der Moleküloberfläche exponiert, werden entsprechend viele Wechselwirkungen mit dem Alginatmolekül eingegangen. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass es durch diese Wechselwirkung zu Konformationsänderungen im Lipasemolekül kam, die sich bis in den Bereich des aktiven Zentrums erstreckten (ohne Abbildung). Eine konformationsänderung von Peptiden durch die elektrostatische Wechselwirkung mit Alginat wurde auch schon in der Literatur berichtet (Chang et al., 2005).

Abbildung 52: Modell der Interaktion zwischen positiv geladenen Aminosäuren aus LipA und Alginat-Molekülen nach Energieminimierungssimulation (aus Tielen et al., in Vorbereitung). In der linken Abbildungshälfte ist die Struktur der Lipase LipA aus P. aeruginosa in Gegenwart eines im aktiven Zentrum des Enzyms gebundenen Inhibitormoleküls dargestellt. Hervorgehoben in Grün ist das in der Lipase gebundene Ca2+-Ion (Nardini et al., 2000). Seitenketten positiv geladener Aminosäurereste sind in Blau dargestellt. Rechts: Ausschnitt aus einem Alginatmolekül in „Ball and Stick Representation“. Mit diesen unterschiedlichen Methoden konnte gezeigt werden, dass Wechselwirkungen zwischen Lipase-Molekülen und Polysacchariden, insbesondere dem P. aeruginosa-eigenen extrazellulären, anionischen Polysaccharid Alginat, aber auch zwischen Lipase-Molekülen und LPS-Molekülen vorkommen. Als physikalische Grundlage für diese Bindungen kommen sowohl hydrophobe Wechselwirkungen, als auch ionische Wechselwirkungen in betracht. Inder Literatur wurde sowohl die Bindung von LipA an LPS (Stuer et al., 1986), als auch die Bindung von diversen Lipasen, inklusive der extrazellulären Lipase von P. aeruginosa an Algenalginat beschrieben (Winkler und Stuckmann, 1979; Schulte et al., 1982; Rauschen und Winkler, 1982;Wingender und Winkler, 1984; Wingender et al., 1987; Wingender, 1990).

positiv geladene Aminosäuren (Arg, His)

aktives

Zentrum

positiv geladene Aminosäuren (Arg, His)

aktives

Zentrum

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Es ergaben sich Hinweise darauf, dass die Bindung von LPS an die Lipase auf hydrophobe Wechselwirkungen zurückzuführen sind, während ionische Wechselwirkungen die Ursache für die Alginatbindung des Enzyms sind. Die Bindung von Alginat aus P. aeruginosa erwies als besonders effizient und verlieh der Lipase eine gesteigerte Thermostabilität. Im Gegensatz hierzu hatten die getesteten heterologen Polysaccharide diesen Effekt nicht. Interessant ist zudem, dass die Schutzwirkung des homologen Alginats weiter gesteigert war, wenn es in nicht-acetylierter Form vorlag. Die Ergebnisse der „Molecular Modelling“-Berechnungen legen den Schluss nahe, dass die Interaktion zwischen Lipase und Alginat spezifisch über ionische Wechselwirkungen erfolgt. Diese Spezifität kann erklären, warum andere Polysaccharide trotz ähnlicher Eigenschaften (Monomerbausteine, Ladungen) nicht an die Lipase binden können. Ferner deutet dies aber auch auf eine „Koevolution“ von Alginat und Enzymen wie der Liapse aus einem Organismus hin und wirft gleichzeitig die Frage nach den physiologischen Konsequenzen der Polysaccharid/ Protein-Wechselwirkung auf. Die beschriebene Stabilisierung des Proteins bei niedrigem pH-Wert (Wingender et al., 1987), die Thermostabilistät und die Stabilität des Enzyms z. B. bei der in dieser Arbeit verwendeten Alkoholfällung zur Reinigung des Alginats (Daten nicht gezeigt; Wingender et al., 1987) weisen auf eine Schutzfunktion unter harschen Umweltbedingungen hin. Daneben bietet die Interaktion mit dem Alginat die Möglichkeit, das Enzym in räumlicher Nähe der Zelle zu immobilisieren, sodass die durch die Lipase-Aktivität bereitgestellten Nährstoffkomponenten der Zelle unmittelbar zur Verfügung stehen. Zudem lassen die Hinweise auf die Verhinderung oder Auflösung von Aggregaten durch Alginat die Vermutung zu, dass eine solche Immobilisierung auch in vivo im Biofilm zu einer räumlichen Separation von Monomeren der Lipase führen kann. Inwieweit das und die Interaktion mit dem Polysaccharid selbst enzymatische Eigenschaften der Lipase wie die Aktivität oder Substratspezifität beinflussen kann, sollte in weiterführenden Studien untersucht werden.

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5.5 Physiologische Funktionen extrazellulärer Enzyme im Biofilm Jedes der in dieser Arbeit betrachteten Enzyme wurde u. a. als Virulenzfaktor von P. aeruginosa diskutiert (Tamura et al., 1992; König et al., 1994; 1996; Tang et al., 1996; Martinez et al., 1999; Wilhelm et al., 1999; van Delden, 2004), wobei eine generelle Funktion im Infektionsgeschehen wahrscheinlich in der Zerstörung von Wirtsgeweben und einer Auslösung von Immunantworten zu sehen ist. Für die bakterielle Zelle werden durch die Aktivität von extrazellulären Enzymen zum einen Nährstoffe zur Verfügung gestellt (Azam und Cho, 1987; Hoffman und Decho, 1999), zum anderen auch biotische Oberflächen enzymatisch so verändert, dass eine vermehrte Anheftung von P. aeruginosa erleichtert wird (z. B. Jaffar-Bandjee et al., 1995; Kernacki et al., 1995). Die genauen Mechanismen für Letzteres sind allerdings bisher noch nicht völlig verstanden. Völlig ungeklärt ist bislang die Frage eines möglichen Effekts extrazellulärer Enzym-Aktivitäten auf den mikrobiellen Biofilm und die daraus gegebenenfalls folgenden Auswirkungen auf einen Infektionsprozess. Denkbar wären u. a. extrazelluläre Modifikationen an den verschiedenen EPS-Bestandteilen. Da die EPS die Stabilität der Biofilme vermitteln, könnten Modifikationen, die die rheologischen Eigenschaften der EPS verändern folglich erhebliche Auswirkungen auf die gesamte Biofilmgemeinschaft besitzen. Es wurde z. B. für P. fluorescens die extrazelluläre Modifikation der eigenen Cellulose durch eine Lyase beschrieben (Allison et al., 1998). Aber auch der gezielte Abbau von extrazellulären Proteinen kann angenommen werden. Für Myxococcus xanthus wurde gezeigt, dass die Prozessierung von extrazellulären Proteinen zur posttranslationalen Regulation, Teil des natürlichen Differenzierungsprozess ist (Kearns et al., 2002). Daneben kann für extrazelluläre Proteine auch eine strukturgebende Funktion innerhalb des Biofilms angenommen werden, wie für Lektin-artige, zuckerbindende Proteine vermutet wird (Higgins und Novak, 1997). Auch der extrazelluläre Abbau von Lipiden, welchen Ursprungs auch immer, könnte innerhalb des Biofilms zu physiologischen Effekten führen. So wurden Lipide als Signal für Gram-negative Bakterien, inklusive P. aeruginosa diskutiert (Barker et al., 2004). Klar bewiesen ist derzeit, dass Gradienten aus Lipiden und Lipid-Bestandteilen als Chemoattraktantien die zielgerichte Bewegung von Bakterien bewirken können (Kearns et al., 2001; Barker et al., 2004). 5.5.1 Lipase LipA Die Lipase A (LipA) gilt als die mengenmässig dominierende von P. aeruginosa sekretierte Lipase (Stuer et al., 1986). Sie ist ein globuläres 29 kDa großes Protein das via Sec-abhängiger und Typ II-Sekretion ins extrazelluläre Medium transportiert wird (Filloux et al., 1998). Extrazellulär scheint sie assoziiert mit lipidartigen Substanzen wie LPS-Molekülen vorzuliegen, was als Grund dafür gesehen wird, dass dieses zur Lipase-Familie I.1 zählende Enzym keine lipasetypische Interphasen-Aktivierung zeigte (Stuer et al., 1986; Jaeger et al., 1993; Liebeton, 1999; Jaeger und Arpigny, 1999), obwohl anhand der Röntgenstrukturanalyse die molekulare Voraussetzung hierfür, nämlich die Existenz einer Deckelstruktur, im Protein vorhanden ist (Nardini et al., 2000). Liebeton wies nach, dass LipA sehr wohl eine Interphasen-Aktivierung zeigt, wenn es in dem Gram-positiven, also nicht LPS-produzierenden, Bakterium Streptomyces coelicolor exprimiert wird (Liebeton, 1999). Dies wurde als Indiz interpretiert, dass die Assoziation mit LPS möglicherweise unter physiologischen Bedingungen das Vorhandensein

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einer aktivierenden Interphase simuliert und LipA somit permanent in geöffnetem Zustand vorliegt (Liebeton, 1999). Schneidinger (1997) konstruierte das Expressionsplasmid pBBL7, in dem das lipA-Strukturgen und das Gen der Lipase-spezifischen Foldase lipH, in operonischer Struktur, unter der Kontrolle des konstitutiven lac-Promotors steht. Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von lipA nur mit der gleichzeitigen Überexpression von lipH möglich ist, da das Chaperon essentiell für die im Periplasma erfolgende korrekte Faltung von LipA zu ihrer enzymatisch aktiven und sekretionskompetenten Form ist (Rosenau et al., 2004). Durch das Einbringen des Plasmids pBBL7 in den mucoiden Stamm SG81 konnte die extrazelluläre Lipase-Aktivität in LB-Kulturüberständen beim Stamm SG81LAH2 um das 680fache, beim Stamm SG81LAH3 nur um das 320fache gesteigert werden (4.4.2). Diese hohe Aktivitätssteigerung deckt sich mit dem qualitativen Befund, dass unter Verwendung des Lipase-Substrates ELF-97-Palmitat in Kombination mit der CLSM eine stark gesteigerte extrazelluläre Lipase-Aktivität in situ beobachtet werden konnte (4.5.7.2). Bei der Anzucht der beiden Überexpressions-Stämme als Biofilm auf der Oberfläche von Agarnährmedien zeigten allerdings beide Stämme eine identische 450fache Aktivitätssteigerung (4.5.7.1). Auch bei den folgenden physiologischen, biochemischen und physiko-chemischen Charakterisierungen konnte kein Unterschied zwischen den beiden Klonen beobachtet werden. Daher wurde im Ergebniskapitel bei vielen Untersuchungen exemplarisch nur noch der Stamm SG81LAH2 aufgeführt. Die lipA-Überexpressions-Stämme zeigten keine deutlichen Unterschiede im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MCS1. Sowohl die getesteten physiologischen Eigenschaften, wie auch die biochemische Zusammensetzung und die physiko-chemischen Eigenschaften der EPS, wie Viskosität und Hydrophobizität entsprachen denen des Ausgangsstamms SG81. Eine allgemeine Strategie zur Charakterisierung der physiologischen Funktion einzelner Leserahmen umfasst eine Kombination aus Überexpression und Inaktivierung des entsprechenden Strukturgens jeweils mit anschließender Analyse der resultierenden Phänotypen. Daher wurde das lipA-Gen mit einem Derivat des Mutagenesevektor pME∆AH11 (Schneidinger, 1997) deletiert. Hierzu wurde eine Ω-Gentamycin-Resistenzkassette in die im Plasmid enthaltene DNA des Lipaseoperons eingefügt, um eine zusätzliche Selektionsmöglichkeit des durch homologe Rekombination ins Genom von P. aeruginosa SG81 integrierten Deletions-Insertions-Vektors zu erhalten. Durch das Einbringen des entstandenen Plasmids pME∆AH::Ω-Gmr in den Stamm SG81 konnten Gentamycin-resistente, LipA-negative Mutanten erzeugt werden, die eine geringe extrazelluläre Lipase-Restaktivität von 8 % im Vergleich zum Ausgangsstamm zeigten (4.4.2). Eine geringe Restaktivität konnte auch bei lipA-Defekt-Mutanten von P. aeruginosa PAO1 beobachtet werden. Sie wurde auf andere lipolytische Enzyme wie LipC und EstA zurückgeführt (Schneidinger, 1997). Im Gegensatz zu der Überexpression von lipA zeigte die lipA-Deletion einen deutlichen Effekt auf die Biofilmstruktur. So konnte unter kontinuierlichen Bedingungen in Durchflusszellen nach 48 h in Relation zum Ausgangsstamm ein deutlich geringerer Bewuchs auf dem Glassubstratum beobachtet werden. Auffällig war darüber hinaus das Vorkommen von Zellketten von bis zu 25 Zellen, die unregelmäßig über die Aufwuchsfläche verteilt vorlagen (4.7.3). Diese Zellfilamente können als Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen der Expression von LipA und der Fähigkeit zur vollständigen Zellteilung gewertet werden.

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Ein weiteres zu beobachtendes Phänomen war die erhöhte Hydrophobizität der EPS von lipA-Deletions-Mutanten, was auf das vermehrte Vorkommen von hydrophoben oder amphiphilen Substanzen schließen lässt. Substanzen die hauptsächlich hierfür in Frage kommen, sind Komponenten der äußeren Membran, wie z. B. Micellen aus Phospholipiden und LPS. Für P. aeruginosa wurde die spontane Freisetzung von LPS-Molekülen aus der äußeren Membran beschrieben (Cadieux et al., 1983). Zudem wurde das Abschnüren von Membranvesikeln aus der äußeren Membran von P. aeruginosa in Flüssigkulturen (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; 1997) wie auch in Biofilmen (Beveridge, 1997) beschrieben Diese können als enzymbepackte LPS-haltige Partikel innerhalb der extrazellulären Matrix angesehen werden (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; 1997; Berverdig, 1997). P. aeruginosa besitzt eine Reihe von Phospholipasen, die wahrscheinlich kooperativ mit den hier beschriebenen Lipasen für die vollständige Umsetzung extrazellulärer (Phospho-) Lipide verantwortlich sind (Vasil et al., 1992). Freie Fettsäuren werden für die Biosynthese von LPS und Phospholipiden der inneren und äußeren Membran während der Zellteilung benötigt (Lam, 2004). Die beobachtete Akkumulation von hydrophoben Verbindungen in den EPS kann demnach auf eine verminderte Nutzung dieser extrazellulären Ressourcen durch das Nichtvorhandensein von LipA zurückzuführen sein, die im Umkehrschluss in einer verminderten Bereitstellung von Fettsäuren resultiert. Es kann demnach postuliert werden, dass LipA essentiell ist für die Bereitstellung von Fettsäuren und somit eine wichtige physiologische Rolle für das Wachstum von P. aeruginosa spielt. Ein weiterer Hinweis auf die essentielle Bedeutung von LipA auf Zellteilungsprozesse, ist der Befund, dass die lipA-Deletions-Mutante in Flüssigkulturen eine stark verminderte Wuchsrate und eine daraus resultierenden späteren Zeitpunkt des Erreichens der maximalen Zelldicht in Relation zum Ausgangsstamm SG81 zeigte (4.5.2). Gfp-Fusionen mit dem Promotorbereich von lipA wurden konstruiert (Wilhelm et al., in Vorbereitung) und in den mucoiden Stamm SG81 eingebracht. Bei der Anzucht der Reporterfusions-Stämme in Durchflusszellen konnte schon nach 24 h ein deutliches Gfp-Signal, als Maß der transkriptionellen Aktivität des lipA-Gens beobachtet werden, das sich bei längerer Wuchszeit nur noch marginal verstärkte (4.8). Die Expression des lipA-Gens erfolgt komplex reguliert und unterliegt zum Teil einem noch nicht im Detail verstandenem Einfluss durch das Quorum Sensing (Rosenau und Jaeger, 1999; Heurlier et al., 2004), also bei Zelldichten, die wahrscheinlich eine Verknappung von Nährstoffen bedingen. Die Transkription von lipA in dieser frühen Biofilmentwicklungsphase deckt sich mit der Beobachtung in mAPM-Flüssigkulturen, bei denen die extrazellulären Lipase-Aktivität in der früh-logarithmischen Wuchsphase detektiert werden konnte (4.5.2). Daraus lässt sich schließen, dass sich die Zellen in den bei 24 h auf dem Glassubstratum zu beobachtenden Mikrokolonien ebenfalls in der früh-logarithmischen Wuchsphase befinden. Das deckt sich mit der gängigen Ansicht, dass Mikrokolonien durch klonales Wachstum der Zellen entstehen (z. B. Klausen et al. 2003a; Heydorn et al., 2003; Chiang und Burrows, 2003). Bemerkenswerterweise zeigten alle Zellen im Biofilm Transkriptionsaktivität des lipA-Gens, sowohl die einzeln vorliegenden Zellen, wie auch die Zellen in den Mikro- bzw. Makrokolonien (4.8). Das kann als Indiz dafür gewertet werden, dass LipA unter diesen Bedingungen ein für P. aeruginosa wichtiges Enzym ist und stimmt mit den Erkenntnissen überein, dass LipA die hauptextrazelluläre Lipase von P. aeruginosa darstellt (Stuer et al., 1986; Jaeger et al., 1991)

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und anscheinend eine bedeutende Rolle bei den physiologischen Prozessen während der Zellteilung spielt. Interessanter Weise konnte bei der Anzucht der LipA-Überproduzenten, wie auch bei der Leervektorkontrolle und dem Ausgangsstamm in mAPM-Schüttelkulturen nach 36 h eine drastische Abnahme der extrazellulären Lipase-Aktivität beobachtet werden (4.5.2). Auch beim nicht-mucoiden Wildtyp PAO1 konnte diese Beobachtung gemacht werden (Schneidinger, 1997). Darüber hinaus ergaben Western Blot-Analysen der Kulturüberstände von P. aeruginosa PAO1 mit polyklonalen Antikörpern gegen LipA, dass das Protein nicht mehr nachweisbar war, folglich also proteolytisch abgebaut worden sein musste (Schneidinger, 1997). P. aeruginosa sollte demnach eine Möglichkeit besitzen, das Protein extrazellulär abzubauen. In vitro- Untersuchungen zum Abbau von LipA ergaben, dass die Elastase als mengenmässig dominierende Protease von P. aeruginosa nicht in der Lage war, LipA abzubauen (Daten nicht gezeigt). Dies bestätigten auch Proteom-Analysen, nach denen es keinen Zusammenhang zwischen der Expression von LasB und dem Vorhandensein von LipA im extrazellulären Medium gibt (Nouwens et al., 2003). Zymogramgel-Analysen von Flüssigkulturen in unterschiedlichen Wuchsphasen zeigten eine vermehrte Aktivität der alkalischen Protease bei steigender Bebrütungsdauer (4.5.2). Da die Akkumulation von alkalischer Protease parallel zum Verlust der Lipaseaktivität verlief, kann dies ein Hinweis darauf sein, dass die Lipase ein Substrat dieser Protease sein könnte. Die physiologische Bedeutung einer proteolytischen Inaktivierung der Lipase bleibt derzeit aber ebenso unklar wie der exakte Mechanismus. Bei einer zu postulierenden Modulation extrazellulärer Enzymaktivitäten durch andere Enzyme muss es sich aber um einen komplex gesteuerten Prozess handeln, dessen Aufklärung Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein wird. 5.5.2 Lipase LipC Martinez et al. (1999) beschrieben LipC als weitere extrazelluläre Lipase neben LipA in P. aeruginosa. Die Nukleotidsequenz des vorhergesagten Leserahmens zeigte starke Homologien zu der bereits bekannten Lipase LipA. Die abgeleitete Aminosäuresequenze von lipC weist demzufolge eine Identität von ca. 51 % zu LipA auf (Martinez et al., 1999). Deutliche Unterschiede liegen jedoch im Bereich der Signalsequenz, die mit bioinformatischen Methoden jedoch eindeutig als Signalpeptid für eine Sec-abhängige Translokation des Enzyms identifiziert werden konnte (F. Rosenau, persönliche Mitteilung). Zur Aktivierung des Enzyms im Periplasma ist ebenso wie für LipA das lipasespezifische Chaperon LipH notwendig (Martinez et al., 1999; Rosenau et al., 2004). Die abschließende Sekretion von LipC über die äußere Membran soll Typ II-abhängig, also vermittelt durch den Xcp-Apparat, erfolgen (Martinez et al., 1999). Durch das Einbringen das Plasmids pBBLCH (Heckmann, 2001) in den mucoiden P. aeruginosa-Stamm SG81 konnte die extrazelluläre Lipase-Aktivität im Biofilm lediglich um das 2,6fache gesteigert werden. Diese im Vergleich zu LipA geringere Steigerung der Lipaseaktivität im Kulturüberstand deckt sich mit dem Befund, dass LipC im nicht-mucoiden Wildtyp ebenfalls nur sehr schwach exprimiert wird (Martinez et al., 1999) und auch unter Verwendung des Plasmids pBBLCH dort nur eine schwache Überexpression möglich ist

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(Heckmann, 2001). Die anderen getesteten extrazellulären Enzymaktivitäten (Protease, Esterase, Phosphatase) des lipC-Überexpressions-Stamms SG81LCH1 blieben unverändert (4.5.6.1). Auch die EPS-Zusammensetzung wurde durch die veränderte Enzymmenge nicht beeinflusst. So entsprachen die extrazellulären Protein-, Kohlenhydrat- und Uronsäuregehalte denen des Ausgangstamms SG81 (4.5.5). Es konnte allerdings im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 eine leicht verringerte Trockenmasse des 24 h-Agarbiofilms detektiert werden (4.5.2), was bei gleicher Zellzahl und gleicher EPS-Zusammensetzung auf einen erhöhten Wassergehalt des Biofilms schließen lässt. Darüber hinaus konnte ein um 32 % erhöhter Acetylgruppengehalt in den EPS vom lipC-Überexpressions-Stamm SG81LCH1 festgestellt werden (4.5.5). Lipasen (E.C.3.1.1.3) sind Triacylglycerol-Acylhydrolasen, spalten also bevorzugt Glycerolester langkettiger Fettsäuren. In nicht wässrigen Medien katalysieren diese Enzyme jedoch auch die gegenläufige Reaktion, also Esterbildungs- bzw. Transesterifizierungsreaktionen (Jaeger et al., 1999). Unter den bekannten Lipasen wurden auch Enzyme mit transacetylierender Aktivität gefunden (Tekanen, 1998; Übersicht in Tielen, 1999). Da über das Substratspektrum und die physiologische Funktion der Lipase LipC bisher nur äußerst wenig bekannt ist, ist es durchaus denkbar, dass LipC unter physiologischen Bedingungen eine transacetylierende Funktion besitzen könnte und somit Acetylgruppen von einem bisher unbekannten Molekül auf Alginatmoleküle übertragen und somit Einfluss auf den Acetylierungsgrad des Alginats nehmen könnte. In der Literatur wurde beschrieben, dass die Acetylgruppen am Alginat maßgeblich an der Wasserbindungsfähigkeit des Polysaccharids beteiligt sind, was an chemisch acetylierten Algenalginaten mit verschiedenen Acetylgruppengehalten nachgewiesen werden konnte (Skjår-Bræk et al., 1986). Die Viskosität ist eine weitere physikochemische Eigenschaft des Alginats, die durch den Acetylgruppengehalt beeinflusst wird (Skjår-Bræk et al., 1989; Lee et al., 1996, Tielen et al., 2005). Die Zunahme der Viskosität der EPS-Lösung von SG81LCH1 war jedoch mit ca. 20 % nur moderat (4.6.2). Dies deckt sich mit der Tatsache, dass der Unterschied im Acetylgruppengehalt mit 32 % ebenfalls nur gering war. Deutliche Unterschiede in der Viskosität wurden nur beobachtet, wenn der Acetylgrupppengehalt drastisch verändert war. So führte beispielsweise bei Alginaten von P. aeruginosa eine Verringerung des Acetylgruppengehaltes von 91 % zu einer um 74 % verringerten spezifischen Viskosität (Tielen, 1999). Für die enzymatische Modifikation von Alginat mit Acetylgruppen kommen im Prinzip zwei mögliche Lokalisationen in Frage. Der primäre Ort hierfür ist das bakterielle Periplasma, in dem die Modifikation bereits während der Synthese und gleichzeitigen Ausschleusung des Polysaccharids durch die äußere Membran durch die Aktivität der Proteine AlgF/AlgJ/AlgI erfolgt (Franklin und Ohman, 1993, 1996; 2002). Daneben ist aber auch bekannt, dass bereits sekretierte Polysaccharide im extrazellulären Medium nachträglich durch bisher wenig charakterisierte Enzyme modifiziert werden können (Ertesvåg und Valla, 1998; Wingender und Jaeger, 2002). LipC weist starke Homologien zu der zweiten Lipase LipA auf, was darauf schließen lässt, dass es sich bei dem Protein ebenfalls um ein über für den Xcp-Sekretionsapparat sekretiertes Enzym handelt, was experimentell auch zum Teil bestätigt wurde (Martinez et al, 1999). Es existieren aber auch Hinweise darauf, dass erhebliche Anteile des Enzyms in P. aeruginosa PAO1 sowohl gebunden an die Zelloberfläche verbleiben, ebenso wie in der Periplasmafraktion der Zellen (S. Heckmann, persönliche Mitteilung). Hierbei scheint eine Abhängigkeit zu der Signalsequenz zu bestehen, da bei Überexpression der Anteil frei im Kulturüberstand nachweisbaren Enzyms nur unter Verwendung der LipA-Signalsequenz deutlich gesteigert werden konnte (S. Heckmann, F. Rosenau, persönliche Mitteilung). Dies deckt sich mit dem

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hier gefundenen geringen Maß an LipC-Überproduktion, das in etwa mit dem der äußeren Membran-assoziierten Esterase EstA vergleichbar war. Demgegenüber wurde unter Verwendung des gleichen Expressionsplasmids bei der Lipase LipA, bei der es sich zweifelsfrei um ein rein extrazellulär lokalisiertes Enzym handelt, eine im Vergleich zum Ausgangsstamm ca. 450fache Überproduktion erreicht. Einen deutlicheren Einfluss der Überexpression von lipC konnte bei der Untersuchung zur Biofilmentwicklung an der Phasengrenze fest/flüssig beobachtet werden (4.7.3). Dort konnten nach 48-stündiger Bebrütung relativ runde Mikrokolonien erkannt werden, in denen die Zellen sehr eng beieinander lagen, was auf eine verstärkte Aggregation der Zellen hindeutet. Die Oberfläche zwischen diesen Mikrokolonien war bis auf wenige einzelne Zellen relativ frei von Bewuchs. Zudem waren die Makrokolonien nach 72 h mit 37 µm deutlich höher als beim Ausgangsstamm, der nur einen durchschnittlich 25 µm dicken Biofilm aufwies (4.7.3). Demgegenüber zeigten 24 h Biofilme prinzipiell keinen Unterschied zu dem des Ausgangsstamms SG81, was darauf schließen lässt, dass die primäre Anheftung nicht durch die verstärkte Expression von lipC beeinflusst war und somit nicht als Erklärung für die Mikrokoloniebildung in späteren Phasen dienen kann. Ein entscheidender Mechanismus zur Ausbildung von Mikrokolonien bei der Biofilmbildung von P. aeruginosa wird in dem klonalen Wachstum von angehefteten Zellen gesehen (Klausen et al., 2003 a; b; Heydorn et al., 2003; Chiang und Burrows, 2003). Eine Voraussetzung hierfür scheint eine verringerte Beweglichkeit der Zellen zu sein, da gerade nicht bewegliche Stämme das Ausbilden solcher eng gepackten Mikrokolonien zeigten (Chiang und Burrows, 2003). Es wurde vermutet, dass die Typ IV-Pili abhängige zelluläre Beweglichkeit für eine gleichmäßige Oberflächenbelegung nötig ist (Tolker-Nielsen et al., 2000, Klausen et al. 2003a und 2003b) und die Piline zudem als Adhäsine zwischen den Zellen fungieren (Chiang und Burrows, 2003). Experimente in der eigenen Arbeit zeigten, dass bei der Überexpression von lipC die Typ IV- Pili-vermittelte Beweglichkeit deutlich reduziert war (4.5.4). Daher kann vermutet werden, das die Ausbildung dieser eng gepackten Mikrokolonien und die geringe Oberflächenbelegung zwischen diesen Mikrokolonien ursächlich auf die verringerte Twitching Motility zurück geführt werden kann. Ein Zusammenhang zwischen Pilusbiogenese bzw. Funktion und lipC–Expression wurde bereits von Martinez et al. (1999) beschrieben. Danach existiert ein wahrscheinlich indirekter Einfluss der Typ IV-Pili-Biosynthesegene pilX und pilY1 auf die Expression von lipC (Martinez et al., 1999). So zeigte eine Transposon-Mutagenese, dass die Insertion von Tn5 in den Genen pilX und pilY1 zu einer gesteigerten lipC-Expression führte. Die Expression von lipC in nicht-pilierten (PAK∆pilA), oder hyperpilierten Stämmen (PAKpilT) erwies sich allerdings als unbeeinflusst. Auch andere Pili-Synthesegene (pilY2, pilE, pilS) hatte keinen Einfluss auf die Expression von lipC (Martinez et al., 1999). PilX wurde als Protein der inneren Membran beschrieben, mit der postulierten Funktion, über seinen N-terminalen Bereich die Pilin-Untereinheiten bei der Pili-Biosythese zu assemblieren (Alm et al., 1996). PilY1 dagegen zeigt zum einen Eigenschaften eines äußeren Membran Proteins, zum anderen zeigt es Sequenzhomologien zu PilC2 aus Neisseria gonorrhoeae, welches dort eine Untereinheit des Pilus darstellt (Rudel et al., 1995; Alm et al., 1996). Der Mechanismus der physiologischen Zusammenhänge zwischen lipC-Expression und der Typ IV-Pili Biogenese/Funktion ist derzeit aber nicht verstanden. Es wurde allerdings postuliert, dass PilX und PilY1 vermutlich nicht direkt an der Repression des lipC-Promotors beteiligt sind, sondern eher an der Generierung eines

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extrazelluläre Signals beteiligt sind, oder den „Funktionsstatus“ des Pilus angeben (Martinez et al., 1999). Das Strukturgen der Lipase LipC liegt im Genom von P. aeruginosa in unmittelbarer Nähe eines Gens, dessen Produkt Homologien zu den Fettsäuren-Dehydrogenasen FadH aus E. coli und Mycobacterium tuberculosis zeigt und dort an der β-Oxidation von ungesättigten Fettsäuren beteiligt ist (Martinez et al., 1999; Stover et al., 1999). Hieraus wurde geschlossen, dass LipC eine spezifische, bisher allerdings noch nicht erfasste Rolle in der Verwertung von extrazellulären Lipiden, die bei Infektionsgeschehen von dem Wirtsorganismus freigesetzt werden, besitzen könnte. Neben einer potentiell virulenzassoziierten Funktion wurde überdies eine mögliche Funktion für die Physiologie von P. aeruginosa nicht ausgeschlossen (Martinez et al., 1999). So konnte in dem nicht-mucoiden Stamm P. aeruginosa PAO1 ein Zusammenhang zwischen LipC-Produktion und Zelloberflächenhydrophobizität nachgewiesen werden (Heckmann et al., in Vorbereitung). Dies deutet auf einen Einfluss von LipC auf die Eigenschaften der äußeren Membran hin. Eine entscheidende regulatorische Rolle bei der Anpassung der äußeren Membran an Umweltbedingungen in Gram-negativen Bakterien spielt das Zwei-Komponenten Regulationssystem bestehend aus der Sensorkinase PhoP und dem Regulatorprotein PhoP, das auch in P. aeruginosa existiert (Macfarlane et al., 1999). In Salmonella spec. umfasst die PhoP/PhoQ-abhängige Regulation ca. 40 Gene, die als Antwort auf Änderungen von Konzentrationen divalenter Kationen wie Ca2+ oder Mg2+ entweder spezifisch aktiviert oder reprimiert werden (Soncini et al., 1996; Guo et al., 1997). Dabei hat es z. B. Einfluss auf den Anbau von Aminoarabinose und Palmitat an den Lipid A-Teil der LPS unter Magnesium-Mangelbedingungen (Trent et al., 2001). Diese Modifikation des Lipid A im LPS, wird durch die periplasmatische Lipase PagL vermittelt. Homologe von PagL wurden mittlerweile für viele Gram-negative Bakterien beschrieben (Kawasaki et al., 2004; Geurtsen et al., 2004). Auch für P. aeruginosa wurde er Umbau der Lipd A-Region unter Mg2+-Mangelbedingungen beschrieben, obwohl derzeit ist noch kein PagL-homologes Protein aus P. aeruginosa bekannt ist (Geurtsen et al., 2004). Interessanterweise konnte in lipC-Defekt-Mutanten des Stammes P. aeruginosa PAO1 mit zweidimensionaler Gelelektrophorese und anschließender Massenspektrometrie eine ca. 100fache Steigerung in der Expression von PhoP nachgewiesen werden (S. Heckmann, persönliche Mitteilung). Zwar ist der Zusammenhang zwischen lipC- und phoP-Expression derzeit nicht verstanden, doch deutet dieser Befund auf eine möglicherweise übergeordnete Funktion von LipC auf die Physiologie von P. aeruginosa hin. Legt man die wahrscheinliche Annahme zugrunde, dass P. aeruginosa neben LipA und LipC keine weiteren Lipasen in den extrazellulären Raum sekretiert, kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der nachweisbaren extrazellulären Lipase-Aktivität der lipA-Defekt-Mutante SG81∆LAH1 um die Aktivität von LipC handelt. Bei der Anzucht des Stamms SG81∆LAH1 in APM-Flüssigmedium konnte diese Lipase-Aktivität in der frühen logarithmischen Phase, vor der eigentlichen Zellteilungs-Phase detektiert werden. Die Aktivität war mit 0,2 nmol/min x ml sehr gering, was der in der Literatur beschriebenen geringen Expression von lipC entsprechen würde (Martinez et al., 1999). Die frühe Expression in Kombination mit der geringen Menge produzierten Enzyms deutet daher zusätzlich auf eine spezielle Funktion von LipC hin, die wahrscheinlich in sehr frühen Phasen der Zelldifferenzierung und somit auch der Biofilmentwicklung zum Tragen kommen.

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Bemerkenswert ist zudem, dass mit der angewendeten Standardmethode zur chromosomalen Inaktivierung von Genen in P. aeruginosa („allelic exchange mutagenesis“) keine lipC-Deletion zu erreichen war. Das über konjugativen Transfer eingebrachte Plasmid pSUP202lipC::Gmr konnte zwar über homologe Bereiche ins Chromosom von P. aeruginosa SG81 integriert werden („single crossover“), wodurch Gentamycin-resistente Transkonjuganden entstanden, jedoch konnten reproduzierbar nur Klone isoliert werden, bei denen das nachfolgende zweite Rekombinationsereignis den Ausgangszustand wiederhergestellt hatte und nicht in einer Inaktivierung des lipC-Gens resultierte. Eine plausible Erklärung hierfür ist, dass die Deletion von lipC zu einem lethalen Effekt führt und somit bei dem zweiten Rekombinationsereignis ein Selektionsdruck auf Erhalt des Wildtypzustands besteht. In nicht-mucoiden Stämmen konnten allerdings mit derselben Methode und unter Verwendung derselben Mutagenesekonstrukte lipC-Mutanten erzeugt werden (Friedrich, 2000). Dies legt die Vermutung nahe, dass die Funktion von LipC im mucoiden Hintergrund eine deutlich wichtigere Rolle spielt, als im nicht-mucoiden Stamm P. aeruginosa PAO1. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression von lipC streng reguliert ist und dass Veränderungen im Expressionslevel dieses Enzyms durch molekularbiologische Techniken großen Einfluss auf die Physiologie der Zellen in Bezug auf die Beweglichkeit und die Biofilmentwicklung nach sich ziehen. Dabei scheint ein ausgeglichenes Verhältnis von LipC Vorraussetzung für die korrekte physiologische Funktion zu sein. Schon sehr geringe Veränderungen in der LipC-Produktion scheinen große Auswirkungen zu besitzen. 5.5.3 Esterase EstA Die Esterase EstA wurde als Enzym der äußeren Membran beschrieben, das zur Familie der Autotransporterproteine zählt und aus zwei Domänen aufgebaut ist. Die enzymatische Aktivität ist in der aminoterminalen Domäne lokalisiert, während die carboxyterminale Domäne („Translokator“) eine Pore in der äußeren Membran darstellt, über die die enzymatisch aktive Domäne sekretiert wird (Wilhelm et al., 1999). Durch das Einbringen des Expressionsplasmids pBBX+, bei dem das Strukturgen estA unter der Kontrolle des konstitutiven lac-Promotors steht, konnte die extrazelluläre Esterase-Aktivität nur um das 2,6fache bzw. 4,6fache gesteigert werden (4.4.2). Dahingegen wurde mit dem gleichen Expressionssystem eine ca. 450fache Steigerung in der lipA-Expression erreicht. Im nicht-mucoiden P. aeruginosa PAO1 konnte durch das Einbringen von pBBX+ eine 10fache Aktivitäts-Steigerung beobachtet werden. Allerdings zeigte sich, dass 95 % dieser Aktivität an der äußeren Membran lokalisiert war und nur etwa 2 – 3 % im extrazelluläre Medium (Wilhelm et al., 1999). Bei der physiologischen und biochemischen Charakterisierung der gewonnenen estA-Überexpressions-Stämme fiel auf, dass es zwei unterschiedliche Typen an Klonen gab, die beide das gleiche Restriktionsbandenmuster des eingebrachten Plasmids pBBX+ zeigten. Der eine Typ, zu dem der untersuchte Stamm SG81EA1 zählte, wies bei gleicher Zellzahl/cm2 Biofilm eine 4fach gesteigerte Esterase-Aktivität im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 auf. Zudem konnte eine 6fach gesteigerte Lipase-Aktivität, eine 50 % verringerte Protease-Aktivität

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und eine 30 % verringerte Phosphatase-Aktivität beobachtet werden (4.5.7.1). Obwohl keine Unterschiede in der EPS-Zusammensetzung in Bezug auf Kohlenhydrat- Uronsäure- und Proteingehalt in Relation zum Ausgangsstammm SG81 nachgewiesen werden konnte (4.5.6), zeigte die EPS des Stamms SG81EA1 eine zur EPS des Ausgangsstamms 3,6fach gesteigerte Hydrophobizität (4.6.1). Der andere Klon-Typ, zu dem der Stamm SG81EA18 zählte, wies in mAPM-Flüssigkulturen eine auf etwa die Hälfte verringerte Wuchsrate (4.5.2) auf, allerdings eine zum Ausgangsstamm SG81 vergleichbare Zellzahl bei der Anzucht auf Agarnährmedien (4.5.3). Er zeigte nur eine 2fach gesteigerte Esterase-Aktivität, keine gesteigerte Lipase-Aktivität, eine nur 25 % verringerte Protease-Aktivität und eine 15 % verringerte Phosphatase-Aktivität (4.5.7.1). Das bei der Anzucht auf Agarnährmedien zu beobachtende erhöhte Feuchtgewicht (4.5.3) konnte auf eine um 45 % erhöhte Konzentration an extrazellulären Kohlenhydraten und einen um 30 % erhöhten Proteingehalt in den EPS zurückgeführt werden (4.5.6). Die EPS zeigten keine erhöhte Hydrophobizität (4.6.1), dafür aber eine 1,8fach gesteigerte reduzierte Viskosität (4.6.1). Trotz dieser Unterschiede zwischen den beiden Stämmen zeigten beide eine verringerte Twitching Motilily und ein verstärktes Schwärmverhalten (4.5.5). Auch die Biofilmentwicklung unter statischen und kontinuierlichen Bedingungen an der Phasengrenze fest/flüssig war bei beiden Stämmen identisch (4.7). So zeigte sich bei der Anzucht von Biofilmen auf Glas unter kontinuierlichen Bedingungen als Charakteristikum der EstA-Überproduzenten eine frühe Auflösung des Biofilms (4.7.3), anfängliche Mikrokoloniebildung bis 48 h verlief ähnlich wie die des Ausgangsstamms SG81, obwohl die Zellen innerhalb dieser Mikrokolonien einen größeren relativen Abstand zueinander aufwiesen (4.7.3). Nach 72 h Bebrütung konnte bei den estA-Überexpressions-Stämmen nur noch eine einlagige Schicht gleichmäßig über die Oberfläche verteilter Einzelzellen beobachtet werden, während der Ausgangsstamm und die Leervektorkontrolle einen mehrlagigen Biofilm mit dreidimensionaler, heterogener Struktur aufwiesen (4.7.3). In Analysen der EPS fiel auf, dass der EstA-überproduzierende Stamm SG81EA1 neben einer erhöhten Hydrophobizität der EPS eine deutlich erhöhte Konzentration an Rhamnolipiden aufwies (A. Rode, unveröffentlicht). Ein bisher nicht verstandener Zusammenhang zwischen Rhamnolipid-Produktion und EstA wurde auch im nicht-mucoiden Stamm P. aeruginosa PAO1 beobachtet, in dem die Inaktivierung des estA-Gens eine Rhamnolipiddefizienz hervorrief, während die Überexpression von estA-eine Rhamnolipidüberproduktion bewirkte (Gdynia et al., in Vorbereitung). Verändert waren auch die zellulären Beweglichkeiten bei Überproduktion von EstA (4.5.5), was ebenfalls in dem nicht-mucoiden Stamm P. aeruginosa PAO1 zu beobachten war (Gdynia et al., in Vorbereitung). Bei der Biofilmentwicklung von P. aeruginosa konnte ein Einfluss sowohl von Rhamnolipiden (Davey et al., 2003; 2004), als auch der Fähigkeit der Zellen zur Beweglichkeit gezeigt werden (O´Toole und Kolter, 1998; Klausen et al., 2003a; b). Rhamnolipide gelten dabei als Faktoren, die die Ablösung von Zellen aus dem Biofilm begünstigen und so u. a. die Entstehung von Kanälen zwischen den Makrokolonien in einem Biofilm bewirken (Davey et al., 2003; 2004). Darüber hinaus wurde beschrieben, dass Rhamnolipide Vorraussetzung für die Schwärmbewegung von nicht-mucoiden P. aeruginosa Zellen sind (Köhler et al., 2000), was mit den hier gefundenen erhöhten Schwärmbeweglichkeit und erhöhter extrazellulärer Rhamnolipid-Konzentration der EstA-Überproduzenten übereinstimmt. Bei der Auflösung von Biofilmen wurde zusätzlich eine verstärkte Beweglichkeit derjenigen Zellen beobachtet, die den Biofilm verließen (Klausen et al., 2003b). Die beobachtete Kombination von erhöhter

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Rhamnolipid-Produktion und Beweglichkeit unter Überproduktion von EstA, kann demnach als Erklärung für die frühe Auflösung des Biofilms unter den hier untersuchten Bedingungen angenommen werden. Um den zeitlichen Verlauf der estA-Expression während der Biofilmbildung zu analysieren, wurden Gfp-Reporterfusionen (Wilhelm et al., in Vorbereitung) mit dem Promotorbereich des estA-Strukturgens verwendet. Die Expression von estA konnte erst in der späten Biofilmwuchsphase detektiert werden. Zudem wurde sie nur von wenigen Zellen innerhalb des Biofilms exprimiert. Interessanterweise waren diese Zellen vornehmlich an den äußeren Rändern von Makrokolonien lokalisiert (4.8). Die Beobachtung der späten Expression von estA deckt sich mit der Messung von Carboxylesterase-Aktivitäten mit dem kurzkettigen Fluoresceindiacetat als Substrat in den EPS von mAPM-Flüssigkulturen. Auch dort konnte Esterase-Aktivität erst in der späten exponentiellen Wuchsphase nachgewiesen werden (4.5.2). Entsprechendes wurde in der Literatur mit p-Nitrophenylcaproat als Substrat beschrieben (Wilhelm, 2001). Die Expression von estA in späten Phasen der Biofilmentwicklung untermauert den Schluss, dass dem Protein wahrscheinlich eine Funktion bei der Auflösung des Biofilms zukommt. Die physiologischen Bedingungen, unter denen die enzymatisch aktive Domäne von EstA in das Kulturmedium freigesetzt wird sind derzeit nicht bekannt. Möglich ist eine Freisetzung der N-terminalen Domäne durch Prozessierung von EstA auf der Zelloberfläche, wie sie z. B. bei Autotransporterproteinen in Neisseria beschrieben wurde (NalP, van Ulsen et al., 2003). Ebenfalls denkbar ist, dass das Volllängenprotein unprozessiert als Bestandteil von Membranvesikeln freigesetzt wird, die von P. aeruginosa von der äußeren Membran abgeschnürt werden (Kadurugugamuwa et al., 1995; Wilhelm et al., 1999). Jedoch verbleibt der Hauptteil des Proteins, wie bereits erörtert, zellgebunden (Wilhelm et al., 1999). Auffällig ist, dass die Überproduktion von EstA in funktioneller Form durch molekularbiologische Techniken Limitierungen unterliegt, was auf eine strenge Regulation und eine wichtige physiologische Rolle von EstA hinweist. Die Lokalisation des Proteins, wie auch die Beobachtung, dass bei niedrigen Konzentrationen an divalenten Kationen, z. B. hervorgerufen durch die Zugabe von EDTA, eine erhöhte Freisetzung von EstA ins extrazelluläre Medium bewirken (Wilhelm et al., 1999) lassen jedoch eine Funktion vermuten, die wahrscheinlich in Zusammenhang mit Funktionen oder der Struktur der äußeren Membran stehen. EstA wurde als Carboxylesterhydrolase beschrieben, die in der Lage ist Estersubstrate mit kurzkettigen Fettsäuren (< C10) zu hydrolisieren (Wilhelm et al., 1999). Das natürliche Substrat und somit auch die physiologische Funktion von EstA wurde bisher allerdings nicht geklärt. Derzeit wird aber untersucht, ob EstA neben der bekannten Esteraseaktivität Phospholipaseaktivität besitzt, da die enzymatisch aktive Domäne hohe Sequenzhomologien zu verschiedenen pro- und eukaryontischen Phospholipasen aufweist (S. Wilhelm, persönliche Mitteilung). Weiterhin wird vermutet, dass EstA an Modifikationsreaktionen des Lipid A-Anteils des LPS beteiligt sein könnte (S. Wilhelm, persönliche Mitteilung). Wie auch im Fall der Lipase LipC, war es das Ziel, den Einfluss von EstA auf die Biofilmbildung u. a. anhand einer Defektmutante des Stamms P. aeruginosa SG81 zu untersuchen. Dies war in besonderem Maße interessant, da bei ähnlichen Untersuchungen basierend auf dem nicht-mucoiden Stamm P. aeruginosa PAO1 eine deutlich geänderte Biofilmbildung nachgewiesen wurde (Gdynia et al., in Vorbereitung). Interessanterweise war wie im Fall von LipC eine Deletions-/Insertionsmutante reproduzierbar nicht herstellbar. Vielmehr konnten nach der Mutagenese mit dem Plasmid pSUP202lipC::Gmr zwar die erfolgreiche Integration des

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Plasmids anhand der eingeführten Antibiotikaresistenzen nachgewiesen werden, ebenso war ein zweites Rekombinationsereignis anhand des Verlustes der vektorkodierten Resistenz nachweisbar, jedoch waren alle isolierten Klone stets zur Ausgangssituation rekombiniert. Da unter Verwendung des identischen Mutagenesekonstrukts und derselben Methode wiederholt Mutanten von nicht-mucoiden Stämmen von P. aeruginosa hergestellt wurden (Wilhelm, 2001; Gdynia et al, unveröffentlicht), ist mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass der genetische Hintergrund des mucoiden Stamms Grund für diese Befunde ist. Dies lässt die Vermutung zu, dass EstA im mucoiden Hintergrund eine essentielle Funktion zukommt, deren Inaktivierung einen lethalen Effekt bewirkt. Eine plausible Erklärung wäre in diesem Zusammenhang eine Funktion von EstA, die zur Aufrechterhaltung der Membranzusammensetzung bzw. Stabilität beiträgt. Die Integrität der äußeren Membran hängt maßgeblich von ihren physiko-chemischen Eigenschaften ab. Lam et al. (1992) zeigten, dass die Stabilität der äußeren Membran maßgeblich durch nicht-kovalente, elektrostatische Bindungen von zweiwertigen Kationen, wie Mg2+ und Ca2+ an die negativ geladenen O-spezifischen Seitenketten des B-Band LPS vermittelt wird. Die Zugabe von Kationen-chelierenden Substanzen, wie EDTA führte zu einer Destabilisierung der äußeren Membran und zu einer erhöhten Freisetzung von LPS-Molekülen. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass kurzkettiges LPS instabiler ist, als LPS mit langen O-Seitenketten, was auf den Mangel an Kationen-Bindestellen zurückgeführt wurde (Lam et al., 1992). Ein weiterer Faktor für die Stabilität der äußeren Membran ist die Zusammensetzung des Lipid A-Anteils, der in unterschiedlichem Maße acyliert sein kann, wobei der Acylierungsgrad u. a. die Fluidität der Membran beeinflusst (Lam et al., 2004; Geurtsen et al., 2004). Es existieren also im Wesentlichen zwei Möglichkeiten, die äußere Membran durch Modifikationen in ihrer Stabilität zu beeinflussen: i) an der Außenseite durch Vernetzung mittels divalenter Kationen und ii) an der Innenseite durch reversible Acylierung oder Deacylierung des Lipid A-Anteils. Klinische Isolate von P. aeruginosa aus chronischen Lungeninfekten, wie z. B. bei CF-Patienten zeigten eine Konvertierung vom S-LPS, mit O-spezifischen Seitenketten hin zum R-LPS, ohne Seitenketten (Hancock et al., 1983; Knirel et al., 2001). Entsprechend kann bei diesen Stämmen eine zusätzliche Stabilisierung der äußeren Membran über Bindung von divalenten Kationen an die negativen Ladungen der O-spezifischen Seitenkette ausgeschlossen werden, woraus vermutet werden kann, dass solche Stämme möglicherweise eine instabilere Membran aufweisen. Arbeiten aus der eigenen Arbeitsgruppe zeigten, dass auch das mucoide Umweltisolat SG81 hauptsächlich das rauhe R-LPS produziert (Wilms et al., in Vorbereitung). Durch die Verwendung des LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits (Molecular Probes) lässt sich der Anteil membrangeschädigter Zellen an einer Gesamtpopulation nachweisen. Dieser Test funktioniert über zwei verschiedene DNA-bindende Farbstoffe. Der grün fluoreszierende Farbstoff SYTO 9 ist ein 10 Da Molekül mit leichter Membrangängigkeit, das rot fluoreszierende Propidiumiodid mit einer molekularen Masse von 668 Da kann dagegen laut Herstellerangaben nur in Zellen eindringen, die eine erhöhte Membranpermeabilität bzw. eine gestörte Membranintegrität aufweisen. Durch Untersuchungen dieser Art wurde gezeigt, dass der mucoide Stamm SG81 eine deutlich erhöhte Membranpermeabilität im Vergleich zu seiner nicht-mucoiden Revertante aufwies (Schulte, 2003). Auch für ein anderes isogenes mucoides/nicht-mucoides Stammpaar wurde diese Beobachtung gemacht (Küppers, 1999). Dieses Phänomen wurde mit dem Vorkommen eines zusätzlichen Porenproteins in der äußeren Membran von mucoiden P. aeruginosa-Stämmen erklärt (Schulte, 2003). Das von algE kodierte Porenprotein ist in der äußeren Membran mucoider Stämme lokalisiert und vermittelt die Sekretion des extrazellulären

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Polysaccharids Alginat (Grabert et al., 1990; Rehm et al., 1992). Darüber hinaus wurde eine Veränderung in der Permeabilität der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien mit einer veränderten LPS-Zusammensetzung in Verbindung gebrach, die wiederum großen Einfluss auf die Stabilität der äußeren Membran besitzt (Hancock, 1984). Es kann also angenommen werden, dass die Konvertierung vom S-LPS zum R-LPS bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa mit einer erhöhten Membraninstablität einhergeht. Unter diesen Bedingungen könnten Acylierungsreaktionen am Lipid A-Anteil, die in verschiedenen Gram-negativen Bakterien einschließlich P. aeruginosa beschrieben wurden (Guo et al., 1998; Geurtsen et al., 2004) eine essentielle Bedeutung haben. Eine Schlüsselreaktion hierbei ist die Palmitoylierung des Lipid A durch Transacylierung, die z. B. in Salmonella spec. von der Esterase PagP katalysiert wird, die in der äußeren Membran lokalisiert ist (Bishop et al., 2000). Diese führt zu einer Erhöhung der Membranstabilität, was sich aus einer damit einhergehenden Steigerung der Resistenz gegenüber kationischen antimikrobiellen Peptiden schließen lässt (Guo et al., 1998). pagP-Mutanten von Legionella pneumophila zeigten sich defizient, unter Mg2+-Mangel die stationäre Phase zu überleben wobei sie ein generell vermindertes Wachstum unter diesen Bedingungen und erhöhte Sterberaten in der stationären Phase aufwiesen (Robey et al., 2001). Dies wird durch die Tatsache erklärt, dass die Expression von pagP in Salmonella spec. und E. coli der Kontrolle des PhoP/PhoQ-Zweikomponentensystems unterliegt, welches auf die Konzentration von divalenten Kationen wie Mg2+ reagiert (MacFarlane et al., 1999). Gene mit Homologie zu pagP wurden in einer Reihe von Gram-negativen Bakterien identifiziert (Basu et al., 1999; Bishob et al., 2000; Robey et al., 2001; Geurtsen et al., 2004), jedoch besitzt P. aeruginosa kein entsprechendes Gen (Daten nicht gezeigt), obwohl die entsprechende Modifikation des Lipid A experimentell nachgewiesen wurde (Geurtsen et al., 2004), was den Schluss zulässt, dass eine nicht-homologe Esterase der äußeren Membran, wie z. B. EstA, diese Reaktion katalysiert. 5.5.4 Elastase LasB Die Elastase B (LasB) wurde als die mengenmässig dominierende extrazelluläre Protease von P. aeruginosa beschrieben (van Delden, 2004), wobei die proteolytische Aktivität dieses sehr effektiven Enzyms als etwa 10fach höher, als die der alkalischen Protease von P. aeruginosa nachgewiesen werden konnte (Galloway, 1991). In vitro wurde gezeigt, dass sie eine immense Vielfalt an Substraten erkennen und hydrolytisch spalten kann. Als physiologische Funktion von LasB wurde bisher der Abbau von Immunsystem-Komponenten und Gewebe-Bestandteilen, wie z. B. Elastin gesehen (van Delden, 2004), was dieses Enzym als einen der bedeutendsten Virulenzfaktoren von P. aeruginosa qualifiziert (Bever und Iglewski, 1988; van Delden, 2004). Die weitaus meisten klinischen P. aeruginosa-Isolate produzieren Elastase (Jaffar-Bandjee et al., 1995; Azghani et al., 2000), allerdings scheint die Produktion von Elastasen nicht essentiell für einen Infektionsprozess zu sein, da auch P. aeruginosa-Stämme aus Mittelohrinfekten isoliert werden konnten, die keine Elastase-Aktivität zeigten (Petersmann et al., 2001; Hobden, 2002). Die genauen physiologischen Mechanismen, wie LasB in den Infektionsprozess eingreift, sind bisher nicht bekannt (van Delden, 2004). Auch ist ungeklärt, ob LasB neben dem Einfluss auf Infektionsgeschehen noch andere physiologische Funktionen für P. aeruginosa besitzt. Durch das Einbringen des Expressions-Plasmids pSAK5 (Kamath et al., 1998), bei dem das Elastase B-Gen lasB unter der Kontrolle des konstitutiven tac-Promotors steht, konnte die

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extrazelluläre Protease-Aktivität des mucoiden Stamm P. aeruginosa SG81 um das 8fache auf eine relative Protease-Aktivität von 80 EU/mg Protein gesteigert werden (4.5.7.1). Auffällig war, dass die LasB-Überproduktions-Stämme SG81Las1 und SG81Las3 unter statischen Anzuchtmethoden erhöhte Zellzahlen zeigten, sowohl in planktonischen Kulturen als auch im Biofilm. So besaßen die getesteten lasB-Überexpressionen in mAPM-Flüssigkulturen eine 1,5fach gesteigerte Wuchsrate und eine entsprechend erhöhte maximale Zelldichte (4.5.2). In Mikrotiterplatten war die Biofilmmasse im Vergleich zum Ausgangsstamm 1,3fach höher (4.7.1). Ebenso war die Zellzahl in Biofilmen erhöht, die unter statischen Bedingungen im mAPM mit Glas als Aufwuchsoberfläche kultiviert wurden. Daneben waren auch die Strukturen der Biofilme deutlich unterschiedlich. Hierbei wiesen die LasB-Überproduzenten sowohl im Vergleich zum Ausgangsstamm erhebliche Unterschiede auf, wie auch in Abhängigkeit der Kultivierungsmethode. Im Gegensatz zu einer geringen Oberflächenbelegung unter kontinuierlichen Bedingungen in Durchflusszellen (4.7.3), zeigten die LasB-Überproduzenten unter statischen Bedingungen mit denselben Nährstoffkomponenten eine stark gesteigerte Biofilmbildung (4.7.2). So konnte im Vergleich mit dem Ausgangsstamm SG81 und der Leervektorkontrolle SG81MMB1, die nach 24 h Bebrütung eine gleichmäßige Verteilung von Einzelzellen auf dem Glassubstratum aufwiesen, bei den lasB-Überexpressions-Stämmen SG81Las1 und SG81Las3 sehr große, unregelmäßig geformte Zellkluster beobachtet werden (4.7.2). Zudem zeigten die entsprechenden Analysen der EPS von Agar-Biofilmen eine veränderte Zusammensetzung. Die extrazelluläre Uronsäure-Konzentration war bei unverändertem Gesamtkohlenhydrat-Gehalt um 40 % verringert (4.5.6), wohingegen die Konzentration an extrazellulärem LPS und Rhamnolipiden deutlich gesteigert war (Wilms et al., in Vorbereitung). Ein weiteres auffälliges Merkmal der EPS unter diesen Bedingungen war eine um den Faktor 8,5 gesteigerte Hydrophobizität (4.6.1). Auch die rheologischen Eigenschaften der EPS waren bei LasB-Überproduktion unter diesen statischen Bedingungen verändert, da die reduzierte Viskosität bezogen auf den Uronsäuregehalt der EPS um 40 % erhöht war (4.6.2). Bemerkenswerterweise zeigten die LasB-Überproduzenten in den EPS auch ein verändertes Enzymaktivitäts-Profil. Zusätzlich zu der erhöhten Protease-Aktivität konnte eine 2fach gesteigerte Esterase-Aktivität und eine um 40 bzw. 64 % verringerte Phosphatase-Aktivität nachgewiesen werden (4.5.7.1). Darüber hinaus konnte mit Zymogram-Analysen keine extrazelluläre alkalische Protease-Aktivität nachgewiesen werden (4.5.7.3). Es wurden auch Unterschiede in den zellulären Beweglichkeiten nachgewiesen. So war sowohl die Typ IV-Pili abhängige Twitching Motility, als auch das Flagellen-vermittelte Schwimmen in verstärktem Maße vorhanden, während das Schwärmen im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 unverändert war (4.5.5). Die Expression von lasB selbst stellt sich in P. aeruginosa als hoch komplex reguliert dar und wird maßgeblich über die beiden Quorum Sensing-Systeme, LasRI, wie auch RhlRI, kontrolliert (Pearson et al., 1997). Zudem wurde beschrieben, dass auch noch andere Regulationsmechanismen direkt oder indirekt Einfluss auf die Expression von lasB besitzen, wie z. B. der alternative Sigmafaktors RpoN (Heurlier et al., 2003; Thompson et al., 2003), der Quorum Sensing-Antagonist DksA (Branny et al., 2001; Jude et al., 2003 ) und das Zweikomponentensystem AlgQ/R (Mohr et al., 1990; Ledgham et al., 2003). Darüber hinaus scheint auch das hierarchisch oberhalb der Quorum Sensing-Regulationssysteme agierende PQS-System in die Regulation von lasB integriert zu sein (Pesci et al., 1999; Calfee et al., 2001). Der Einfluss von derart aufwendig regulierten Zielgenen, wie das der Elastase, auf komplexe physiologische Vorgänge wie z. B. die Biofilmbildung ist bisher jedoch gar nicht untersucht. Dabei können verschiedene Möglichkeiten in Betracht kommen. Zum einen ein

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direkter Einfluss des extrazellulär aktiven Enzyms, wobei bei einem proteolytischen Enzym z. B. der Abbau von extrazellulären Strukturproteinen denkbar wäre. Zum anderen Sekundäreffekte, möglicherweise regulatorischer Art, wie Veränderungen im Enzymstatus in Bezug auf andere Enzyme, Veränderungen in der Beweglichkeit der Zellen und vieles mehr. Es können demnach neben Effekten, die auf der reinen Enzymaktivität basieren auch Einflüsse durch oder auf Regelkreisläufe postuliert werden. • Einfluss auf die Anheftung Bei den LasB-Überproduzenten konnte unter kontinuierlichen Bedingungen im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 schon nach 24 h eine stark verminderte Oberflächenbelegung auf dem Glassubstratum beobachtet werden. Daraus lässt sich vermuten, dass die erhöhte LasB Produktion eine Rolle bei der primären Anheftung der Zellen und somit bei der frühen Phase der Biofilmbildung spielt. Hazlet et al., 1992 beschrieben den Einfluss von LasB auf die Anheftungseigenschaften von P. aeruginosa an Bindehautzellen. Dabei konnte die exogene Zugabe von gereinigter Elastase die Adhärenz von P. aeruginosa an Bindehautzellen steigern (Hazlett et al., 1992). Andere Arbeiten zeigten, dass nur durch die kombinierte Gabe von gereinigter Elastase und alkalischer Protease aus P. aeruginosa die Anheftung der Zellen an Bindehautgewebe erhöht werden konnte, wobei die Applikation von Elastase-Antikörpern keinen Einfluss, die Applikation von polyklonalen Antikörpern gegen die alkalische Protease dagegen die Bindung der Zellen deutlich verringerte (Gupta et al., 1996). Zudem wurde mit Zymogram-Analysen nachgewiesen, dass vor allem hochvirulente Stämme von P. aeruginosa hohe Aktivitäten an sekretierter alkalischer Protease aufwiesen (Gupta, et al., 1996). Hirakata et al. (1995) berichteten, dass Elastase-defiziente Mutanten von P. aeruginosa genauso virulent waren wie der Ausgangsstamm, während sich alkalische Protease-Mutanten weit weniger virulent zeigten. Aus den Ergebnissen wurde geschlossen, dass die alkalische Protease eher als die Elastase von P. aeruginosa einen Einfluss auf die Anheftungseffizient besitzt (Gupta, et al., 1996). Diese Erkenntnis deckt sich mit dem Befund, dass die LasB-Überproduzenten keine extrazelluläre alkalische Protease aufwiesen (4.5.7.3) und möglicherweise aus diesem Grund eine geringer Anheftungseffizienz zeigten (4.7.3). Die genauen Mechanismen die zur Veränderung der Anheftungseffizienz durch die alkalische Protease führen sind bisher jedoch nicht bekannt. Neuere Erkenntnisse besagen, dass P. aeruginosa eher an zerstörtes als an intaktes Gewebe anheftet (Yamaguchi und Yamada, 1991), sodass der Einfluss von Proteasen auf den Anheftungsprozess wohl darin liegt, dass sie Oberflächenmoleküle des Wirtsgewebes abbauen und so die Oberflächeneigenschaften des Gewebes verändern und dadurch eine Anheftung der Zellen ermöglichen. Ähnliche Mechanismen könnten auch bei experimentellen Biofilm-Anzuchtbedingungen eine Rolle spielen. In wässrigen Systemen werden Oberflächen innerhalb von Sekunden von Makromolekülen, wie Proteinen oder Kohlenhydraten und hydrophoben Molekülen aus dem umgebenen Medium belegt (Marshall, 1992; Schneider und Leis, 2002). Dieser sogenannte „Conditioning Film“ maskiert die Oberfläche des Substratums und verändert maßgeblich seine physikalischen Oberflächeneigenschaften (Schneider und Leis, 2002), welche wiederum großen Einfluss auf das Anheftungsgeschehen besitzen (Marshall et al., 1989; Pringle und Fletcher, 1986; DeFlaun et al., 1999). Der „Conditioning Film“ kann als Nährstoff von den Mikroorganismen genutzt werden (Marshall und Blainey, 1991) und ist die eigentliche Oberflächenstruktur, die von den Mikroorganismen während der Anheftung erkannt wird

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(Pringle und Fletcher, 1986). Eine Veränderung der physikalischen Eigenschaften der Oberfläche durch proteolytischen Abbau von Peptiden des „Conditioning Films“ mit Auswirkungen auf die Anheftungseigenschaften der Bakterien kann demnach auch in den Biofilmfilmbildungs-Experimenten unter Laborbedingungen vermutet werden. Bei den Durchflusszell-Experimenten wurde allerdings mAPM als Anzuchtmedium verwendet. Dieses Minimalmedium enthält keine Peptide, die als Substrat von Proteasen genutzt werden könnten (2.4.1). Folglich sind unter diesen Bedingungen zelleigene Oberflächenproteine oder extrazelluläre Proteine die einzigen Strukturen, die durch proteolytische Aktivität verändert werden könnten, um so Einfluss auf die Anheftungseigenschaften von P. aeruginosa zu nehmen. Es wurde gezeigt, dass bei P. aeruginosa Zelloberflächenproteine eine wichtige Rolle beim Anheftungsprozess an biotische und abiotische Oberflächen spielen (Smit et al., 1992; Dörr et al., 1998; O´Toole und Kolter, 1998). Espinosa-Urgel und Mitarbeiter zeigten, dass die Gabe von Proteinase K zu Anheftungsexperimenten, die Anheftung von Pseudomonas putida an abiotische Oberflächen signifikant beeinträchtigte (Espinosa-Urgel et al., 2000). Außerdem fanden sie durch das Screening von Transposon-Mutanten verschiedene Anheftungs-defiziente Stämme, die Defekte in Oberflächen- bzw. äußere Membran-Proteinen aufwiesen (Espinosa-Urgel et al., 2000). Für Vibrio proteolytica konnte nachgewiesen werden, dass extrazelluläre Proteine genutzt werden, um an hydrophobe Oberflächen anzuheften, während die Anheftung an hydrophile Oberflächen von extrazellulären Polysacchariden vermittelt wird (Flemming und Wingender, 2002). Um Veränderungen im Proteinstatus von Oberflächenproteinen und extrazellulären Proteinen zu erreichen, können neben transkriptionellen Regulationen auch posttranslationale Regulationen durch proteolytischen Abbau dieser Proteine vermutet werden. Zumal bekannt ist, dass die posttranslationale Regulation deutlich schneller ist, als die Regulation auf transkriptioneller Ebene (Klauck et al., 2005) und somit eine Adaptation der Zellen auf Umweltbedingungen bzw. die Anpassung an ein neues Substratum deutlich effizienter vonstatten gehen kann. Bisher wurde die Funktion der Proteolyse von zelleigenen Proteinen lediglich in der Beseitigung von defekten Proteinen und zum Auffüllen des zellulären Aminosäurepools gesehen. Klauck et al. (2005) beschrieben allerdings die intrazelluläre Proteolyse als Regulationsprinzip in E. coli. Es wurde gezeigt, dass der proteolytische Abbau von regulatorischen Proteinen, wie z. B. Stress-Sigmafaktoren, der bisher nur für eukaryotischen Organismen bekannt war, auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle bei der Steuerung zellulärer Vorgänge spielt (Gottesman, 2003; Jenal und Hengge-Aronis, 2003). Die Wichtigkeit der gezielten Proteolyse anderer, nicht-regulatorischer Proteine wird deutlich bei der Überlegung, dass bestimmte Proteine und besonders Enzyme unter gewissen Umweltbedingungen oder in bestimmten Wuchsphasen nicht mehr gebraucht bzw. sogar schädlich für den Organismus sein können und somit beseitigt werden müssen. Daher wird der proteolytische Abbau von zelleigenen Proteinen als generelles Regulationsprinzip in Prokaryoten angenommen (Klauck et al., 2005). Dass solche proteolytischen Regulations-Mechanismen auch extrazellulär eine Rolle spielen wurde für Eukaryoten gezeigt. Für humane Matrix-Metalloproteasen, von denen bisher etwa 20 verschiedene bekannt sind, konnte der Einfluss auf diverse Prozesse, wie Embryogenese, Wundheilung, Gewebeumbau und Entzündungsantworten über den gezielten Abbau von Matrix-Proteinen nachgewiesen werden (Vu und Werb, 2000; Kearns et al., 2002). Als Substrat für diese Metalloproteasen gelten dabei Gewebekomponenten, wie z. B. Elastin oder Collagen, aber auch andere Metalloproteasen (Klauck et al., 2005). Dabei entstehen komplexe „Prozessierungs-Kaskaden“ bei denen die Aktivität von speziellen Proteasen über den Abbau

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durch andere Proteasen reguliert wird. Auch für P. aeruginosa ist eine solche Kaskade beschrieben worden. Folders et al. (2000) zeigten die proteolytische Prozessierung des extrazellulären Chitinbindeproteins CbpD durch die Elastase B. Dabei wird aus dem CbpD-Protein zunächst die sogenannte staphylolytische Protease LasD freigesetzt, die ihrerseits zum Abbau des Propeptids der Elastase LasA notwendig ist (Park und Galloway, 1998; Kessler et al., 1998; Traidej et al., 2003). Da das Propeptid von LasA eine inhibierende Wirkung besitzt, wird LasA erst nach dieser Proteolyse aktiv (Kessler und Safrin, 1988a; b) Interessant ist hierbei, dass das unprozessierte CbpD zwar eine Chitin-Bindefunktion besitzt, aber zunächst keinerlei Protease-Aktivität aufweist (Folders et al., 2000). Darüber hinaus weisen Proteom-Analysen extrazellulärer Proteine aus P. aeruginosa darauf hin, dass der extrazellulären Proteolyse wahrscheinlich eine noch weitaus größere Bedeutung zukommt, da zwischen den Vorhersagen über wahrscheinlich extrazelluläre Proteine und den in diesen Analysen gefundenen Zahlen deutliche Diskrepanzen bestehen. So waren anhand des Genoms ca. 100 extrazelluläre Proteine erwartet worden (Economou, 1998), wohingegen experimentell mehr als 300 nachgewiesen wurden (Sauer et al., 2000). Ein weiteres Indiz hierfür ist das Vorhandensein von Proteinen in verschiedenen molekularen Massen und somit Prozessierungszuständen (Nouwens et al., 2003). Außerdem ergaben Proteom-Analysen extrazellulärer Proteine aus Biofilmzellen im Vergleich zu denen aus planktonischen Zellen einen Unterschied von etwa 50 % des Gesamtproteoms (Sauer et al., 2002), während Transkriptom-Analysen dagegen nur in 1 % der Gene einen Unterschied im Transkriptionslevel zeigten (Whiteley et al., 2001), was auf wiederum auf eine posttranskriptionelle Regulation hinweist. Die physiologischen Konsequenzen hieraus sind derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Es lässt sich aber vermuten, dass eine Vielzahl von Prozessen in dieser Art und weise postsekretorisch beeinflusst werden können. • Einfluss auf die EPS-Zusammensetzung und die Biofilmstruktur In den EPS der LasB-Überproduzenten konnte ein zu den EPS des Ausgangsstamms und der Leervektorkontrolle ca. 40 % verringerter Uronsäuregehalt nachgewiesen (4.5.6). Noch deutlicher war dieses Phänomen in Flüssigkulturen, in denen die LasB-Überproduzenten eine 9fach verringerte Uronsäure-Konzentration zeigten (4.5.2). In mucoiden Stämmen konnte mittels algC::lacZ Reportergenfusionen in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass die Expression des Strukturgens algC, dessen Genprodukt maßgeblich an der Alginat-Biosynthese beteiligt ist, schon nach 15-minütiger Anheftung der Zellen an Teflon oder Glas hochreguliert wird, was die Annahme zuließ, dass extrazelluläre Polymere wie Alginat schon an der frühen Phase der Biofilmbildung beteiligt sein können (Davies et al., 1993; Davies und Geesey, 1995). Darüber hinaus berichtete Gacesa (1998), dass mucoide Stämme 10 - 1000 mal besser an Lungenepithelien anheften können, als nicht-mucoide Stämme. Auch für die Biofilmstruktur spielt das Alginat bei mucoiden Stämmen eine bedeutende Rolle. So wurde geziegt, dass das extrazelluläre Polysacchrarid Alginat an der Ausbildung einer dreidimensionalen, heterogenen Struktur der Biofilme beteiligt ist (Davies, 1999; Hentzer et al., 2001). Die geringe Uronsäure-Konzentration der LasB-Überproduzenten könnte demnach ursächlich für die geringe Oberflächenbelegung des Glassubstratums unter kontinuierlichen Bedingungen verantwortlich sein. Eine Erklärungsmöglichkeit für die geringe Alginat-Konzentraion der LasB-Überproduzenten bieten Mohr et al. (1990). Sie beschrieben einen Zusammenhang zwischen der Expression von

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LasB und der Alginat-Synthese. So wurde gezeigt, dass die Gene von LasB und der von algD kodierten GDP-Mannose-Dehydrogenenase, was eines der Schlüsselenzyme bei der Alginat-Synthese darstellt (May und Chakrabarty, 1994) einen inversen Aktivitätslevel aufweisen (Mohr et al., 1990). Entsprechend konnte keine lasB mRNA detektiert werden, wenn der Promotor von algD aktiv war. Zudem wurde festgestellt, dass der Promotor des lasB-Gens in nicht-mucoiden Zellen aktiv und in mucoiden aber Zellen inaktiv ist, während der algD-Promotor umgekehrt in mucoiden Zellen aktiv und in nicht-mucoiden Zellen inaktiv ist (Mohr et al., 1990; Storey et al., 1997). Demnach kann ein negativer Einfluss auf die Alginat-Synthese durch eine molekularbiologisch eingebrachten Überexpression von lasB angenommen werden. Schon 1987 wurde beschrieben, dass die transkriptionelle Regulation von algD über AlgR vermittelt wird (Deretic et al., 1987). AlgR ist ein globaler Transkriptionsregulator in P. aeruginosa (Deteric et al., 1989; Ledgham et al., 2003) der zusammen mit der Sensorkinase AlgQ ein Zwei-Komponenten-Regulations-System bildet, dass auf Umweltreize reagiert (Deretic und Konyecsni, 1989). Es konnte klar gezeigt werden, dass AlgR neben der Regulation von algD, die Expression der Quorum Sensing-Gene lasR und rhlR negativ moduliert und darüber die Synthese der Elastase B und anderen sekretierten Virulenzfaktoren reguliert. Zudem wird durch AlgR die Synthese von Siderophoren hochreguliert und die Synthese von Rhamnolipiden und extrazellulären Proteasen runterreguliert (Ledgham et al., 2003). Für den Fall der Überexpression von lasB könnte eine Rückkopplung auf das AlgR/Q-Regulations-System postuliert werden. Hinweise darauf geben die Beobachtungen, dass bei den LasB-Überproduktions-Stämmen neben der verringerten Alginat-Konzentration auch die Menge an Siderophoren (Pyoverdin und Pyoverdin, 4.5.5) verringert ist, während der Gehalt an extrazellulärem Rhamnolipid deutlich erhöht ist (A. Rode, unveröffentlicht). Diese zu beobachtenden Effekte entsprechen genau dem negativen regulatorischen Einfluss von AlgR. Allerdings konnte bei den LasB-Überproduzenten kein Einfluss auf das Quorum Sensing-System nachgewiesen werden (siehe Abbildung 53). Einen gegenteiligen Effekten zeigten Kamath et al. (1998) mit dem Befund, dass eine Überexpression von lasB in mucoiden, wie auch in nicht-mucoiden Stämmen von P. aeruginosa zu einer Steigerung der extrazellulären Alginat-Konzentration führte, wohingegen die Deletion von lasB in mucoiden Stämmen zum Verlust der Alginat-Produktion und somit zu einer Konvertierung zum nicht-mucoiden Phänotyp führte. Sie postulierten, dass dieser Effekt durch die Spaltung der Nukleosid-Diphosphat-Kinase (Ndk) durch die Elastase B zustande kommt. Die Ndk ist ein 16 kDa großes, cytoplasmatisches Enzym, das über eine Phosphotransferreaktion Nukleosid-Triphosphate (NTPs) generiert. NTPs sind die Vorstufen von RNA bzw. DNA und somit essentiell für die Vermehrung der Mikroorganismen (Ray und Mathews, 1992; Chakrabarty, 1998). Darüber hinaus sind ATP und GTP in den Energiemetabolismus der Zellen involviert und spielen eine essentielle Rolle bei der Protein- und Polysaccharid-Synthese. Kamath et al. (1998) wiesen nach, dass die Ndk durch LasB prozessiert werden kann. Das daraus resultierende 12 kDa Protein ist mit der Cytoplasmamembran assoziiert und generiert nunmehr nur noch GTPs. GTP spielt eine wichtige Rolle in den ersten Schritten der Alginat-Synthese, bei denen Mannose-6-Phosphat über Mannose-1-Phosphat zu GDP-Mannose umgewandelt wird, welches letztlich als Vorstufe der Alginat-Monomere genutzt wird (May und Chakrabarty, 1994). Es wurde postuliert, dass das Mehrangebot an GTPs die Ursache für die vermehrte Alginat-Produktion in lasB-Überexpressions-Stämmen sei (Kamath et al., 1998; Chakrabarty, 1998). Zur Spaltung eines

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cytoplasmatischen Proteins müsste allerdings eine intrazelluläre Aktivität der Elastase B voraus gesetzt werden. Von verschiedenen Arbeitsgruppen wurde aber eindeutig gezeigt, dass die Elastase B erst im Periplasma gefalten wird (Braun et al., 1996) und das sie darüber hinaus erst nach der Sekretion über die äußere Membran aktiv wird (Kessler und Safrin 1988a; b; McIver et al., 1995; Kessler et al., 1998; Braun et al., 1996; 1998). LasB wird als Pre-Pro-Enzym im Cytoplasma synthetisiert (Kessler und Safrin, 1988a; b). Das Prepeptid fungiert als Signalsequenz für den Transport des Proteins über die innere Membran und wird im Periplasma abgespalten (Kessler und Safrin, 1988a). Das 18 kDa große Propeptid fungiert als intramolekulares Chaperon, dass die Elastase im Periplasma faltet und vor proteolytischem Abbau schützt (Braun et al., 1996). Zudem wurde gezeigt, dass das Propeptid essentiell ist für die Translokation der Elastase über die äußere Membran via Typ II-Sekretion (McIver et al., 1995). Es wird zusammen mit der gefalteten Elastase sekretiert und erst extrazellular proteolytisch abgebaut, wodurch die reife, aktive Elastase frei wird (McIver et al., 1995; Kessler et al., 1998; Braun et al., 1998). Im Periplasma hält das Propeptid die Elastase über eine nicht-kovalente Bindung in einer enzymatisch inaktiven Form (Kessler und Safrin 1988a; b; Kessler et al., 1994; Braun et al., 1996). Somit kann eine intrazelluläre Aktivität der Elastase B wohl ausgeschlossen und vermutet werden, dass die beschriebenen Effekte nicht durch die Spaltung der Ndk durch LasB, sondern durch andere Phänomene zustande kamen. Trotz verringerten Uronsäuregehalts konnte in den EPS-haltigen Lösungen der LasB-Überproduzenten eine Gesamtkohlenhydrat-Konzentration nachgewiesen werden, die mit der Konzentration in den EPS des Ausgangsstamms SG81 vergleichbar war (4.5.6). Bezogen auf die Zellzahl im Biofilm erwies sich der Gesamtkohlenhydratgehalt der EPS der LasB-Überproduzenten sogar um etwa 50 % erhöht. Das deutet darauf hin, dass neben dem uronsäurehaltigen Alginat, welches mengenmäßig die Hauptkomponente der extrazellulären Polysaccharide von mucoiden P. aeruginosa-Stämmen ausmacht (Wingender et al., 2001), noch ein anderes uronsäurefreies Kohlenhydrat in den EPS der lasB-Überexpressions-Stämmen vorhanden war. Für nicht-mucoide Stämme von P. aeruginosa wurden erst kürzlich ein glucosereiches und ein mannosereiches Polysaccharid (Friedmann und Kolter, 2004a; b; Jackson et al., 2004; Matusukawa und Greenberg, 2004) nachgewiesen, die beide Einfluss auf die Stabilität von Biofilmen zeigten. Arbeiten aus der eigenen Arbeitsgruppe zeigten, dass auch der mucoiden Stamm SG81 neben dem negativ geladenem Alginat zusätzlich ein neutrales, extrazelluläres Kohlenhydrat produziert (A. Rode, 2004). Der Zweiphasen-Test mit n-Hexadekan wurde entwickelt, um die Hydrophobizität von Zelloberflächen in einem einfachen, schnellen Verfahren zu untersuchen (Rosenberg et al., 1980). Dabei gilt die Verteilung der Zellen in den beiden Phasen (Wasser/org. Lösungsmittel) als Maß für die Hydrophobizität der Zelloberflächen. Bei der Behandlung von zellfreien EPS-Lösungen mit n-Hexadekan konnte keine komplette Phasentrennung mehr erreicht werden, was in einer Trübung der EPS-Lösung mit einem Maximum bei 580 nm resultierte (4.6.1) und auf Wechselwirkungen zwischen dem hydrophoben n-Hexadekan und EPS-Bestandteilen schließen lässt. Dabei zeigten die zellfreien EPS-Lösungen der LasB-Überproduzenten eine signifikant höhere Trübung (300fach) im Vergleich zu den EPS des Ausgangsstamm und der Leervektorkontrolle (4.6.1), sodass davon ausgegangen werden kann, dass in den EPS der lasB-Überexpessions-Stämme signifikant mehr hydrophobe Komponenten vorhanden sind, die Wechselwirkungen mit dem hydrophoben Lösemittel n-Hexadekan eingehen. Denkbare Moleküle mit hydrophobem Charakter wären z. B. Rhamnolipide oder LPS.

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In den EPS der LasB-Überproduzenten konnte mittels Dünnschicht-Chromatographie deutlich mehr Mono- und Di-Rhamnolipid nachgewiesen werden (A. Rode, unveröffentlicht). Zudem ergaben gelelektrophoretische Analysen einen deutlich erhöhten Anteil an LPS in den EPS der LasB-Überproduzenten im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81 (Wilms et al., in Vorbereitung). Solche amphiphilen Moleküle können Auswirkungen auf die Biofilmentwicklung und –struktur besitzen. Davey et al., 2003 beschrieben z. B. den Einfluss von Rhamnolipiden auf die Biofilmdifferenzierung von P. aeruginosa in Durchflusszellen. Die Produktion von endogenem Rhamnolipid konnte mit der Bildung von Kanälen zwischen den Makrokolonien von reifen Biofilmen in Zusammenhang gebracht werden. Interessanterweise hefteten sich in den entstandenen Freiräumen keine weiteren Zellen aus der planktonischen Phase an. Darüber hinaus führte die exogene Zugabe von Rhamnolipiden zur Auflösung von Kahmhäuten, die als Biofilm an der Grenzfläche Wasser/Luft angesehen werden können (Davey et al., 2003). Es wurde postuliert, dass durch dieses amphiphile, oberflächenaktive Molekül der Kontakt zwischen den Zellen und zwischen den Zellen und dem Substratum blockiert wird, wodurch letztlich der Biofilm aufgelöst wird, was eine weitere Funktion von Rhamnolipiden als Biodetergenz darstellt (Davey et al., 2003). Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass die Produktion von Rhamnolipiden mit der Funktion als Biodetergenz zur natürlichen Regulation des Biofilmwachstums dient, insbesondere zur Regulation der Biofilmdicke und zur Ausbildung von dreidimensionalen Strukturen innerhalb des Differenzierungsprozesses (Davey et al., 2004). Interessanterweise konnten bei den Durchflusszell-Experimenten nach 48stündiger Bebrütung große Ähnlichkeiten im Oberflächenbewuchs der LasB-Überproduzenten und der estA-Überexpressions-Stämme beobachtet werden (4.7.3). Ein übereinstimmendes Merkmal war der geringe, einlagige Bewuchs, ein weiteres der relative Abstand zwischen den Zellen innerhalb der zu beobachtenden Mikrokolonien. Wie bei der LasB-Überproduktion war auch in den EPS der EstA-Überproduzenten die Rhamnolipid-Konzentration (sowohl Mono- als auch Di-Rhamnolipid) deutlich erhöht. Daraus ergibt sich ein weiterer Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen der Rhamnolipid-Produktion und der geringen Oberflächenbelegung. Mit Gfp-Reporterfusionen wurde festgestellt, dass die Expression des Rhamnolipid-Biosynthesegens rhlA in der späten Biofilmentwicklungsphase vornehmlich in Zellen an der Unterseite des Biofilms stattfindet, was die Ablösung dieser Biofilmzellen vom Substratum zur Folge hatte (Davey et al., 2004). Die zeitlich späte Expression deckt sich mit der bekannten Regulation von rhlA durch das Quorum Sensing-System (Pearson et al., 1997). Unter den regulatorischen Bedingungen im Wildtyphintergrund gäbe es demnach keine Erklärung für die frühe Auflösung von LasB-Biofilmen in Durchflusszellen. Da auch lasB über Quorum Sensing reguliert wird (Pearson et al., 1997) könnte eine Feedback-Rückkopplung durch die lasB Überexpression über das Quorum Sensing auf die Rhamnolipid-Produktion vermutet werden. Analysen der Signalmolekülkonzentration unter Verwendung von A. tumefaciens NTL4 (pZLR4; Fuqua und Winans, 1996) als Bioindikator, mit dem hauptsächlich 3-oxo-C12-HSL nachgewiesen werden können, zeigten allerdings keine Unterschiede zwischen dem Ausgangsstamm SG81 und den lasB-Überexpressions-Stämmen in Bezug auf die Aktivität des Signalstoffes in zellfreien EPS-Lösungen von Agarbiofilmen (Abbildung 53). Die lasB-Überexpression in trans zieht demnach keine Rückkopplung auf das LasRI-Regulationssystem nach sich. Der A. tumefaciens-basierte Test gibt vorwiegend Auskunft über die Konzentration an 3-oxo-C12-HSL, als spezifisches Signalmolekül des LasRI-Systems, nicht aber über die Konzentration von C4-HSL, des spezifischen Signalmolekül des für die Regulation der

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Rhamnolipidproduktion verantwortlichen RhlRI-Systems. Zwar kann ein Einfluss der LasB-Überproduktion auf dieses System derzeit nicht zweifelsfrei ausgeschlossen werden, doch ist dieser aufgrund der hierarchischen Struktur des Quorum Sensing-Systems bei unveränderter Konzentration der LasRI-Signalmoleküle als unwahrscheinlich anzusehen. Derzeit ist allerdings fraglich, ob die Regulation der Rhamnolipidbiosynthese ausschliesslich über das Quorum Sensing-System erfolgt. So konnte z. B. im Fall des rhlR-Gens gezeigt werden, dass eine Quorum Sensing-unabhängige Regulation existiert (Soberon-Chavez, 2004). Zusammengefasst legen die Befunde den Schluss nahe, dass die beschriebenen Phänomene auf andere Regulationsmechanismen oder einen direkten Effekt der Enzymaktivität zurückzuführen sind. Abbildung 53: 3-oxo-C12-HSL-Aktivität in 50 µl zellfreien EPS-Lösungen von 24 h Agar-Biofilmen (PIA, 36 °C) von a) SG81 und b) SG81Las1. Als Bioindikator für 3-oxo-C12-HSL wurde A. tumefaciens NTL4 (pZLR4; Fuqua und Winans, 1996) verwendet. Eine weitere zelleigene Substanz mit amphiphilen Charakter ist das LPS, welches in den zellfreien EPS-Lösungen der LasB-Überproduzenten in signifikant erhöhten Mengen nachgewiesen werden konnte (Wilms et al., in Vorbereitung). Die Freisetzung von Bestandteilen der äußeren Membran ins extrazelluläre Medium wurde in der Literatur beschrieben, wobei sowohl passive (Cadieux et al., 1983; Weber-Frick und Schmidt-Lorenz, 1988), wie auch aktive Freisetzungsmechanismen, z. B. in Form von Membranvesikeln (Kadurugamuwa und Beveridge, 1997) diskutiert wurden. Die spontane Freisetzung von LPS kann bei vielen Gram-negativen Bakterien beobachtet werden, wobei die freigesetzten LPS-Moleküle die gleiche Struktur aufwiesen wie das Membran-assoziierte (Cadieux et al., 1983). Die Freisetzung scheint hierbei verstärkt in der späten exponentiellen Wuchsphase zu erfolgen (Cadieux et al., 1983; Weber-Frick und Schmidt-Lorenz, 1988), also zeitgleich mit der Rhamnolipidsynthese (Pearson et al., 1997). Ein direkterer Hinweis auf eine Kopplung bzw. Abhängigkeit von LPS-Freisetzung und Rhamnolipid ergibt sich aus dem Befund, dass die Applikation geringer Mengen an Rhamnolipid (0-10 mM), die kleiner als die kritische Micellbildungs-Konzentration ist, zu einer erhöhten Freisetzung von LPS führte (Al-Tahhan et al, 2000). Die in den Durchflusszellexperimenten beobachtete Unfähigkeit der Zellen zur Biofilmbildung unter LasB-Überproduktion lässt sich demnach zumindest teilweise mit der erhöhten Rhamnolipid-Konzentration erklären. Es kann derzeit nicht ausgeschlossen werden, dass die damit einhergehende Freisetzung des ebenfalls amphiphilen Moleküls LPS zusätzlich einen Effekt auf dieses Phänomen besitzt. Die Aufklärung einer solchen gegebenenfalls existierenden Ursächlichkeit sollte ein Ziel weiterführender Studien sein.

a) b)a) b)

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• Einfluss auf die mechanische Stabilität von Biofilmen Interessanterweise war das Verhalten der LasB-Überproduktions-Stämme unter statischen Bedingungen trotz Verwendung desselben Mediums gegenteilig zu dem unter kontinuierlichen Bedingungen. Hier wiesen die LasB-Überproduzenten eine gesteigerte Tendenz zur Biofilmbildung auf. Es traten Mikrokolonien außergewöhnlicher Größe auf, wohingegen der Ausgangsstamm lediglich eine einlagige Schicht aus gleichmäßig die Oberfläche belegenden Einzelzellen ausbildete (4.7.2). Darüber hinaus wiesen die auf Agaroberflächen angezüchteten Biofilme der LasB-Überproduzenten ein 3,3fach gesteigertes E-Modul, also eine erhöhte mechanische Stabilität auf (4.6.3). Bisher wurde angenommen, dass die mechanische Stabilität von Biofilmen mucoider Stämme von P. aeruginosa, maßgeblich von dem extrazellulären Polysaccharid Alginat verursacht wird (Körstgens et al., 2001b). Auch bei anderen Biofilmen wurden die Polysaccharide als struktur- und stabilitätsgebende Komponente angesehen (Wingender et al., 1999a; Sutherland, 1999a). Allerdings zeigten die LasB-Überproduzenten eine um 40 % verringerte Uronsäure-Konzentration im Vergleich zum Ausgangsstamm SG81, sodass davon auszugehen ist, dass das Alginat nicht die Ursache für die zu beobachtende erhöhte Stabilität der Biofilme der LasB-Überproduzenten darstellt. Neben den Polysacchariden, können auch z. B. Lipide die rheologischen Eigenschaften und somit die mechanische Stabilität von Biofilmen beeinflussen (Wingender et al., 1999a). Die Funktion von Rhamnolipiden als Biodetergenz unter wässrigen, kontinuierlichen Bedingungen wurde beschrieben (Davey et al., 2003; 2004). Ähnliche Funktionen können für die amphiphilen LPS-Moleküle angenommen werden. Ungeklärt ist aber bisher, welchen Einfluss solche Moleküle unter statischen Bedingungen besitzen. Hermann et al. (1997) beobachteten, dass die exogene Gabe von Rhamnolipiden zu Batch-Kulturen von P. aeruginosa zur Aggregation der Zellen führte. Denkbar ist, dass durch den fehlenden Abtransport von Metaboliten und der daraus resultierende Akkumulation für Substanzen wie Rhamnolipide und LPS unter diesen Bedingungen Konzentrationen erreicht werden, die oberhalb der Micellenbildungs-Schwellenkonzentration liegen. Solche Micellen innerhalb der EPS-Matrix könnten, über bisher nicht charakterisierte Interaktionen mit EPS-Bestandteilen, ihrerseits Ursache für eine zusätzliche Vernetzung und somit eine Erhöhung der mechanischen Stabilität sein. Ein Indiz für solche Phänomene bietet der Befund, dass in Biofilmen abgegrenzte hydrophobe Bereiche in der hydrophilen Matrix nachgewiesen werden konnten (Lamont et al., 1987; Wolfaardt et al, 1994, 1998; Zita & Hermansson, 1997). Eine weitere Erklärung für die erhöhte Stabilität wäre die bei den LasB-Überproduzenten nachweisbare Konzentration an extrazellulären Proteinen, die 34 % bzw. 50 % über der des Ausgangsstamms SG81 lag (4.5.6). Auch für Proteine wird eine strukturgebende Funktion innerhalb der Biofilmmatrix diskutiert (Wingender et al., 1999a). Higgins und Novak (1997) Stellten ein Modell auf, bei dem Lektin-artige, zuckerbindende Proteine die Vernetzung von Polysacchariden in Belebtschlammflocken vermitteln. Das deckt sich mit den Befunden, dass LipA sowohl Interaktionen zum wirtseigenen Alginat, wie auch zum LPS eingehen kann (4.3; Stuer et al., 1986), was möglicherweise zu Vernetzungen innerhalb der EPS-Matrix und somit zu einer erhöhten mechanischen Stabilität führen könnte. Solchen Proteinen wie der Lipase könnte somit neben ihrer enzymatischen Aktivität eine zweite, zusätzliche Funktion als strukturgebendes Element innerhalb der Biofilmatrix zukommen. Allerdings wies Strathmann (2003) nach, dass die Behandlung von Biofilmen des mucoiden Stamms SG81 mit Proteinase K keinen Einfluss auf die Struktur des Biofilms besaß, was

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anhand der mit dem Lektin ConA visualisierten Alginatverteilung innerhalb der Matrix nachgewiesen wurde. Speziell im Fall der Lipase LipA kann aber davon ausgegangen werden, dass sie Proteinase K-resistent ist, da die Lipaseaktivität während der Alginatreinigung trotz entsprechender Behandlung nicht inaktiviert wurde (Daten nicht gezeigt), was möglicherweise auch für andere extrazelluläre Proteine von P. aeruginosa gilt. • Einfluss auf die Biofilmauflösung Die LasB-Überproduzenten zeigten eine gesteigerte Beweglichkeit, wobei sowohl die Typ IV-Pili-vermittelte Twitching Motility, wie auch die Flagellen-vermittelte Schwimmbewegung betroffen waren (4.5.5). Die erhöhte Beweglichkeit deckt sich mit dem Befund, dass die Schwärmbewegung, die als Mischform aus beiden gilt, mit der Rhamnolipidsynthese in Verbindung gebracht wird (Köhler et al., 2000). Unklar ist allerdings bisher, ob die gesteigerte Beweglichkeit durch eine erhöhte Anzahl an Bewegungsorganellen, oder ihre erhöhte Funktionalität zustande kommt. Eine Erklärungsmöglichkeit bei mucoiden Stämmen von P. aeruginosa wäre z. B. die Veränderung in den physiko-chemischen Eigenschaften der EPS, die zu einer erhöhten Beweglichkeit der Zellen innerhalb der schleimigen Matrix aus Alginat führen könnten. So konnte gezeigt werden, dass die LasB-Überproduzenten eine verminderte Uronsäure-Konzentration besaßen und damit einhergehend eine um 30 % geringere spezifische Viskosität der EPS (4.6.2). Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung physiko-chemischer EPS-Eigenschaften resultiert aus der Beobachtung, dass die nicht-mucoide Revertante SG81R1 im Vergleich zum mucoiden Stamm SG81 eine stark gesteigerte Beweglichkeit aufwies (4.5.5). Sowohl für die Typ IV-Pili, als auch für die Flagellen von P. aeruginosa wurde neben ihrer Funktion zelluläre Beweglichkeit zu vermitteln, ein Einfluss auf die Anheftung an biotische und abiotische Oberflächen beschrieben (Mattick, 2002). Für beide wurde gezeigt, dass sie als Zelloberflächenstrukturen einen großen Einfluss auf die Adhäsionseigenschaften der Zellen besitzen. Eine Hauptfunktion von Typ IV-Pili scheint hierbei als Adhäsin die Anheftung von nicht-mucoiden P. aeruginosa-Stämmen an Lungenepithelzellen der Maus, der Ratte und des Menschen zu vermitteln (Ramphal et al., 1984; Zoutman et al., 1991). Auch die primäre Adhäsion an Bindehautgewebe wird maßgeblich durch die Piline vermittelt (Wu et al., 1995). Aufgrund dieser Eigenschaften wurden die Typ IV-Pili als einer der bedeutendsten Virulenzfaktoren von P. aeruginosa beschrieben (Hahn, 1997). Auch bei der Anheftung von P. aeruginosa an abiotische Oberflächen, wie Glas, spielen Typ IV-Pili als Adhäsine eine Rolle (Chiang und Burrows, 2003). Zusätzlich zu ihrer Funktion als Adhäsin spielen die Typ IV-Pili aufgrund der von ihnen vermittelten Beweglichkeit in verschiedenen Phasen der Biofilmentwicklung eine Rolle (O’Toole und Kolter, 1998; Deziel et al., 2001; Klausen et al., 2003a; b). Neben der gut charakterisierten Funktion der Twitching Motility für eine gleichmäßige Oberflächenbelegung in frühen Entwicklungsphasen ist derzeit die Frage von großem Interesse, inwieweit zelluläre Beweglichkeit bei der Dispersion von Biofilmen von Bedeutung ist. So beschrieben Klausen et al. (2003) die erhöhte Beweglichkeit von Zellen im Zentrum von Makrokolonien in späten Entwicklungsphasen mit der daraus resultierenden Freisetzung von Zellen, was letztlich zur Auflösung räumlich klar umgrenzter Biofilmareale führte. Interessanterweise existiert zudem eine Verknüpfung zwischen dem Vorhandensein von Bewegungsorganellen und dem Zelltod in Biofilmen von P. aeruginosa. Webb et al. (2003) beobachteten den Zelltod innerhalb von Makrokolonien von P. aeruginosa Biofilmen, die unter

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kontinuierlichen Bedingungen in Durchflusszellen angezüchtet wurden. Jedoch zeigten pilA fliM Doppelmutanten, die weder Typ IV-Pili noch Flagellen ausbilden keinen Zelltod (Webb et al., 2003). Es wurde daher postuliert, dass der zu beobachtende Zelltod durch Phagen-bedingte Zelllyse verursacht wurde. So konnte in späten, nicht aber in frühen Biofilmentwicklungsphasen der temperente, filamentöse Pf1-Phage im Ausfluss der Durchflusszellen nachgewiesen werden und zeigten, dass dieser Phage den Wildtyp nicht aber die pilA fliM Doppelmutante reinfizieren konnte (Webb et al., 2003). Es ist bekannt, dass sowohl Typ IV-Pili, als auch Flagellen die generellen Rezeptoren für Bakteriophagen darstellen (Brunschwig und Darzins, 1992). Die zu beobachtende Zelllyse der lasB-Überexpressions-Stämme in den Biofilm-Experimenten unter kontinuierlichen Bedingungen (4.7.3), könnte demnach die Folge einer vermehrten Freisetzung und Reinfizierung durch einen Prophagen sein. Ein Hinweis darauf, dass auch im Genom von P. aeruginosa SG81 ein temperenter Phage vorliegt, ist die Beobachtung von Plaque-ähnlichen Zonen innerhalb des Bewuchses auf M9-Minimalmedium-Agarplatten (Daten nicht gezeigt), das für die Analyse von Beweglichkeiten verwendet wurde. Zusammenfassend kann die zu beobachtende geringe Oberflächenbelegung der LasB-überproduzierenden Stämme in Durchflusszellen durch die erhöhte Beweglichkeit erklärt werden. Hierbei ist zwischen den Möglichkeiten zu differenzieren, dass die Beweglichkeit direkt, oder ein aus ihr resultierender „programmierter“ Zelltod dieses Phänomen bedingen. Ein Hinweis darauf liefert die Beobachtung, dass in Durchflusszell-Experimenten mit dem DNA-bindenden Farbstoff SYTO 9 unregelmäßig geformte Bereiche angefärbt wurden, die räumlich nicht mit intakten Zellen in Verbindung gebracht werden konnten (4.7.3) und daher möglicherweise auf das Vorhandensein von extrazellulärer DNA aus lysierten Zellen zurückzuführen sind. Neben DNA werden bei der Lyse von Zellen Membranbestandteile frei, was als plausible Erklärung für den erhöhten Gehalt an LPS-Molekülen in den EPS der LasB-Überproduzenten anzusehen ist. D´Argenio (2002) berichteten von einem Zusammenhang zwischen der Lyse von Zellen und einem erhöhten Level des Pseudomonas Quinolon Signals (PQS). Es wurde postuliert, dass diese Autolyse durch die Aktivierung von endogenen, temperenten Phagen über das PQS induziert wird. Das PQS ist ein Sekundärmetabolit, das als 2-Heptyl-3-Hydroxy-4-Quinolon identifiziert wurde und in P. aeruginosa als Zell-Zell-Kommunikations-Signal fungiert (Pesci et al., 1999; Calfee et al., 2001). Dieses zu den AHL sehr unterschiedliche Molekül ist trotzdem Teil der Quorum Sensing-Signalkaskade (McKnight et al., 2000). So wird die Produktion von PQS durch das LasRI-System positiv reguliert und kann seinerseits das RhlRI-System aktivieren (Pesci et al., 1999; McKnight et al., 2000). Es wurde gezeigt, dass über PQS die Expression vieler Virulenzfaktoren, inklusive der der Elastase B kontrolliert wird (Pesci et al., 1999; McKnight et al., 2000; Cao et al., 2001; Gallagher et al., 2002; Diggle et al., 2003; Calfee et al., 2005). Das hydrophobe PQS diffundiert durch die Zellmembranen ins umgebende Medium und wird scheinbar durch Rhamnolipide in der hydrophilen extrazellulären Matrix in Lösung gehalten (Calfee et al., 2005). Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine höhere Konzentration an Rhamnolipiden zu einer erhöhten Aufnahme des PQS führt und somit zu einer erhöhten Aktivität des PQS innerhalb der Zellen, was letztlich zu einer Steigerung der Virulenzfaktor-Synthese über positive Regulation führt (Calfee et al., 2005). Inhibierung des PQS-Systems durch analoge Substanzen führte zu einer signifikant verringerten Elastase B-Produktion (Calfee et a., 2001). Möglicherweise könnte auch der umgekehrte Weg angenommen werden, d. h. dass eine erhöhte Produktion an Virulenzfaktoren, in diesem Fall der Elastase B über eine bisher nicht nachgewiesene Rückkopplung zu einer erhöhten

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Produktion des Sekundärmetaboliten PQS und darüber zu einer erhöhten Konzentration an Rhamnolipiden führt, wie es für die LasB-Überproduzenten nachgewiesen werden konnte (A. Rode, unveröffentlicht). Bemerkenswert ist zudem das Vorkommen vergrößerter Zellen in 24 h alten Biofilmen der LasB-Überproduzenten unter kontinuierlichen Bedingungen, die größtenteils in Zellketten von bis zu 10 Zellen vorlagen (4.7.3). Dies weist auf einen Zellteilungsdefekt der lasB-Überproduktionsstämme hin. Die Ausbildung von Zellfilamenten wurde bei einer Vielzahl von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien als Folge von klassischen Stressfaktoren wie z. B. Temperaturanstieg, Antibiotikabehandlung, oder UV-Strahlung (Bhatti, 1976). Im Detail ist dies wahrscheinlich auf die Inhibierung von physiologischen Aktivitäten, wie z. B. Veränderungen in der Permeabilität der Zellwände, die Inhibierung der DNA-Synthese (Otsuji et al. 1974) oder die Inaktivierung von Enzymaktivitäten zurückzuführen (Kamiryn und Strominge, 1974). So wurden finale Prozesse der Zellteilung bei P. aeruginosa mit der Aktivität der periplasmatischen alkalischen Phosphatase in Zusammenhang gebracht (Bhatti et al., 1976). Hierbei wurde festgestellt, dass eine verringerte Phosphatase-Aktivität zu der Ausbildung von Zellfilamenten führte. Zwar sind die genauen Mechanismen auf molekularer Ebene nicht aufgeklärt, doch deckt sich dies mit dem Befund, dass die LasB-Überproduzenten eine verringerte Phosphatase-Aktivität aufwiesen (4.5.7.1).

6 Zusammenfassung

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6 ZUSAMMENFASSUNG Bisher wurde die hauptsächliche Funktion extrazellulärer Enzyme von Mikroorganismen in dem katalytischen Abbau von Makromolekülen wie Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden gesehen. Zudem wurden die Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bisher fast ausschließlich an planktonischen Zellen in Flüssigkulturen durchgeführt, obwohl der Großteil aller auf der Erde lebenden Mirkoorganismen in einer sessilen Lebensform wie Flocken oder Biofilmen lebt. Biofilme sind an Grenzflächen existierende mikrobielle Lebensgemeinschaften, in der die Zellen in einer selbstgebildeten, gelartigen Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) eingebettet sind. Bei den EPS handelt es sich zum größten Teil um Polysaccharide und Proteine, wobei die Funktion der Polysaccharide als strukturgebende Komponente innerhalb des Biofilmes beschrieben wurde. Die Funktion der extrazellulären Proteine für den Biofilm ist bisher weites gehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss extrazellulärer Enzyme auf die Biofilmbildung und -struktur und die Eigenschaften der Biofilme und ihrer EPS untersucht. Die Untersuchungen wurden an dem opportunistischen Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa durchgeführt, einem Modellorganismus in der Biofilmforschung, der bis zum heutigen Stand eines der molekularbiologisch und biochemisch am besten untersuchten Bakterien darstellt und sich durch eine immense physiologische Vielseitigkeit auszeichnet. Speziell wurde der mucoide Umweltstamm P. aeruginosa SG81 verwendet, der sich durch eine Überproduktion des extrazellulären Polysaccharids Alginat auszeichnet. Bei dem bakteriellen Alginat handelt es sich um ein Heteropolymer aus den Uronsäuren α-L-Guluronat und β-D Mannuronat, wobei letzteres mit Acetylgruppen am C2 und/oder C3 substituiert vorliegt. Alginat wird von den meisten Isolaten aus chronischen Lungeninfektionen von Patienten mit der Erbkrankheit Cystische Fibrose produziert, wobei 80 – 90 % dieser Patienten von Infektionen mit P. aeruginosa betroffen sind, welche als Biofilme auf dem Lungengewebe angesehen werden können. Biofilme wurden auf Agaroberflächen bis zu 168 h angezüchtet und neben der EPS-Zusammensetzung, wie Protein- Kohlenhydrat- und Uronsäuregehalt, Enzymaktivitäten mit photometrischen Aktivitätstests nachgewiesen. Mit fluorigenen Enzymsubstraten wurde für ausgewählte Enzyme die Lokalisation innerhalb der Biofilmmatrix nachgewiesen. Außerdem wurde eine mögliche Wechselwirkung zwischen extrazellulären Enzymen und anderen EPS-Bestandteilen am Beispiel der extrazellulären Lipase LipA aus P. aeruginosa und dem extrazellulären Polysaccharid Alginat untersucht. Zur Untersuchung des Einflusses extrazellulärer Enzyme auf die Entwicklung von Biofilmen wurden Enzym-Defektmutanten und Enzym-Überexpressionsstämme konstruiert. Beispielhaft wurden die extrazellulären lipolytischen Enzyme Lipase LipA und Lipase LipC, die äußere Membran-gebundene Esterase EstA und die proteolytische Elastase LasB verwendet. Biofilme wurden bis zu 72 h unter kontinuierlichen Bedingungen in Durchflusszellen angezüchtet und die Biofilmbildung mit der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie verfolgt. Außerdem wurden Enzympromotor-Reportergen-Fusionen konstruiert, um die transkriptionelle Regulation der Enzymgene unter Biofilmbedingungen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass der mucoide P. aeruginosa-Stamm SG81 im Biofilm verschiedene Enzyme produziert und diese in die extrazelluläre Matrix sekretiert. Bei der Anzucht von Biofilmen auf Agaroberflächen über 168 h konnte für die lipolytischen Enzyme, Lipase, Phospholipase C und Esterase eine Aktivitätssteigerung, für die alkalische Phosphatase eine Aktivitätsminderung über die Zeit beobachtet werden. Die Lokalisation der Enzyme innerhalb des Biofilms zeigte sich heterogen und für jedes Enzym charakteristisch. So konnten

6 Zusammenfassung

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alkalische Phosphatase-Aktivitäten nur in Zellnähe nachgewiesen werden, Lipase-Aktivitäten konnten sowohl zellgebunden als auch extrazellulär in wolkenartigen Strukturen beobachtet werden, Esterase-Aktivitäten konnten nur bei einem Teil der Gesamtpopulation zellgebunden beobachtet werden und mit zunehmendem Biofilmalter vermehrt im Interzellularraum. Für die extrazelluläre Lipase LipA von P. aeruginosa konnte eine Wechselwirkung mit verschiedenen extrazellulären Polymeren, wie Alginat und Lipopolysacchariden (insbes. dem Lipid A-Anteil) nachgewiesen werden, welche im Fall von Alginat zu einer Stabilisierung des Enzyms in Bezug auf die Inaktivierung durch Hitze beitrug. Alle untersuchten Enzyme zeigten einen Einfluss auf die Biofilmstruktur. Im Vergleich zum Ausgangsstamm P. aeruginosa SG81, der nach 72 h einen heterogenen, relativ flächendeckenden, mehrlagigen Biofilm ausbildete, zeigte die LipC-Überexpression einen weniger dichten Biofilm mit einigen kleinen, aber dafür stark aggregierten und höheren Mikrokolonien. Die Esterase-Überproduktion bewirkte, dass sich der anfänglich normal entwickelte Biofilm nach 72 h auflöste und sich nur noch eine gleichmäßig verteilte Schicht aus Einzelzellen auf der Aufwuchsfläche beobachten ließ. Die Elastase B-Überexpression bewirkte, dass sich gar kein Biofilm ausbilden konnte und nach 72 h nur vereinzelt kleine Zellaggregate zu bebachten waren. Die Überexpression der Lipase A hatte keinen erkennbaren Einfluss auf die Biofilmstruktur, dafür zeigte die LipA-Deletionsmutante eine geringere Biofilmbildung aus. Für die Elastase B konnte zusätzlich ein Einfluss auf die rheologischen Eigenschaften des Biofilms nachgewiesen werden. Mit Gfp-Enzympromotor-Fusionen konnte für die LipA eine kontinuierliche Transkription über die gesamte Biofilmentwicklung nachgewiesen werden, während die estA Expression deutlich verzögert und nur in wenigen Zellen des Biofilms erfolgte. Fraglich bleibt allerdings bis zu diesem Punkt, ob die Enzymaktivitäten direkt zu den zu beobachtenden Unterschieden in der Biofilmstruktur führen, oder ob indirekte Effekte, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der EPS, z. B. der Rhamnolipid-, der LPS, oder der Uronsäure-Konzentration diese Unterschiede herbeiführen. Auch denkbar wäre der Einfluss von extrazellulären Enzymen auf höher gestellte Regulationsmechanismen.

7 Fazit

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7 FAZIT In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass P. aeruginosa im Biofilm extrazelluläre Enzyme produziert und diese in die extrazelluläre Matrix sekretiert, wobei die betrachteten Enzyme zueinander stark unterschiedliche Verteilungen aufwiesen und teilweise sehr heterogen verteilt in der Biofilmmatrix vorlagen. Während für die alkalische Phosphatase eher eine Zell-assoziierte Aktivität beobachtet werden konnte, trat für Lipasen und Esterasen auch vermehrte Aktivität in den Interzellularräumen auf. Für die extrazelluläre Lipase LipA von P. aeruginosa konnte klar gezeigt werden, dass das Protein molekulare Wechselwirkungen sowohl mit LPS-Molekülen, wie auch dem von P. aeruginosa selbst produzierten extrazellulären Polysaccharid Alginat eingeht. Zudem konnten Hinweise darauf erhalten werden, dass die Interaktionen zwischen LipA und LPS wahrscheinlich hydrophoben Charakter besitzen, die Interaktionen zwischen LipA und Alginat dagegen über elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt werden. Durch „Molecular modelling“-Techniken wurden Argininreste als wahrscheinliche Interaktionsstellen zwischen dem Protein und dem Polysaccharid identifiziert. Potentielle Konformationsänderungen des Proteins als Folge der Interaktion mit solchen Polymeren können biotechnologisch relevante Enzymeigenschaften wie z. B. Prozess-Stabilität oder Enantioselektivität verändern und damit von erheblichem industriellem Interesse sein. Mögliche Konsequenzen dieser in vivo-Immobilisierung potentieller Virulenzfaktoren in der Biofilmmatrix auf die Physiologie des pathogenen Bakteriums sind daneben auch von erheblichem medizinischen Interesse. Erstmalig wurde zudem ein Einfluss von extrazellulären Enzymen auf die Biofilmentwicklung und daraus resultiernd auf die Biofilmstruktur nachgewiesen. Zudem hatte die Elastase LasB auch einen Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Biofilms. Es wurde gezeigt, dass die Produktion extrazellulärer Enzyme während der Entwicklung des Biofilms auf verschiedenen Ebenen reguliert werden, sowohl auf transkriptioneller Ebene, wie für die Esterase EstA über gfp-Reportergen-Fusionen gezeigt, als auch auf posttranslationaler Ebene der nativen Proteine nach der Sekretion in die Biofilmmatrix. Die physiologischen Mechanismen hinter diesen Phänomenen, sind aber bisher nur unvollständig geklärt und sollten daher Gegenstand nachfolgender Untersuchungen sein. Dabei können Enzymaktivitäts-assoziiierte Phänomene genauso postuliert werden, wie übergeordnete Regulierungsmechanismen. Da bei vielen der von P. aeruginosa ausgelösten Infektionen davon ausgegangen werden kann, dass Biofilmphänomene dabei eine wichtige Rolle spielen, eröffnet die detailierte Charakterisierung der physiologischen Prozesse während der Biofilmentwicklung Möglichkeiten für ein tieferes Verständnis der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen während des Infektionsgeschehens.

8 Ausblick

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8 AUSBLICK In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass extrazelluläre Enzyme einen Einfluss auf die Biofilmentwicklung und die daraus resultierende Architektur und die Eigenschaften von Biofilmen besitzen. Unklar ist allerdings, welche molekularen Mechanismen bei den beobachteten Phänomenen zu grunde liegen. Auch nur ansatzweise geklärt, ist die Regulation dieser physiologischen Prozesse während der Biofilmreifung. Diese komplexe Problematik erfordert eine differenzierte Herangehensweise unter verschiedenen Gesichtspunkten, wobei die Frage nach den extrazellulären Signalen im Vordergrund stehen sollte, also welche Umweltbedingung über welchen Regulationsmechanismus zu welchem Phänotyp führt. Mögliche Ansatzpunkte hierfür wären: 1) Die Aufklärung der Wirkmechanismen extrazellulärer Enzyme inklusive der Erkennung der natürlichen Substrate in Bezug auf die physiologische Bedeutung während der Biofilmentwicklung. Untersuchungen zu der Lipase LipC (S. Heckmann und F. Rosenau, unveröffentlicht) und der Esterase Est A (A. Gdynia und S. Wilhelm, in Vorbereitung) laufen zur Zeit im IMET im Forschungszentrum Jülich. 2) Da es Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der Aktivität von extrazellulären Enzymen, der Biofilmstruktur und der Freisetzung von amphiphilen Molekülen wie LPS und Rhamnolipiden gibt, sollte eingehender auf die Struktur der äußeren Membran und der LPS- bzw. Phospholipid-Zusammensetzung eingegangen werden, wobei besonderer Augenmerk auf die Fettsäure- bzw. Lipid-Analytik gelegt werden sollte. 3) Die Aufklärung der regulatorischen Mechanismen und dadurch bedingte Phänomene, wobei die erweiterte Erforschung der transkriptionellen Regulation im Vordergrund stehen sollte. Dabei sollten verschiedene Methoden zum Einsatz kommen:

• verschiedene Reportergenfusionen, z. B. mit einem instabilen Gfp zur „online“-Verfolgung der Expression ausgewählter Enzymgene während der Biofilmentwicklung

• DNA-Mikroarray-Technik zur Transkriptom-Analyse. Im Vordergrund sollten hierbei Gene für extrazelluläre Proteine und solche stehen, die für Biosynthesewege extrazellulärer Komponenten kodieren. Ein entsprechender DNA-Chip wird derzeit in Zusammenarbeit mit dem IMET und der Universität Nottingham entworfen.

• Quantitative Real-Time-PCR-Analysen von ausgewählten Genen zur Quantifizierung der transkriptionellen Aktivität

Parallel dazu sollte die posttranslationale Regulation über Proteom-Analysen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese verfolgt werden. Untersuchungen laufen zur Zeit in der eigenen Arbeitsgruppe (S. Broekman, unveröffentlicht) 4) Intensivere Untersuchungen zur Lokalisation von extrazellulären Enzymen innerhalb der Biofilmmatrix, würde eine Weiterentwicklung der „Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer“- (FRET) Methodik bieten. Dabei wird ein Protein direkt bei der Synthese an ein fluoreszierendes

8 Ausblick

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Reporterprotein gekoppelt (Translationsfusionen). Beide Moleküle werden gemeinsam sekretiert und können in Kombination mit der CLSM verfolgt werden. Da sowohl die Ergebnisse dieser Arbeit, als auch die in der Literatur beschrieben Befunde vermehrt darauf hinweisen, dass innerhalb des Biofilms ein hoher Organisationsgrad mit einer daraus folgenden Aufgabenverteilung zwischen den einzelnen Zellen besteht, sollte in nachfolgenden Experimenten genauer auf dieses Phänomen eingegangen werden. Unterschieden werden sollte nicht nur zwischen den einzelnen Wuchsphasen, sondern auch zwischen den räumlichen Kompartimenten innerhalb eines Biofilms, wie z. B. dem Zentrum von Mikrokolonien oder deren Rändern. Hierzu sollten Methoden der biochemischen und molekularbiologischen Einzelzellanalytik in Kombination mit Mikromanipulationstechniken zum Einsatz kommen.

9 Literaturverzeichnis

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-LEBENSLAUF-

Petra Anna Maria Tielen

Talstrasse 120, 45475 Mülheim a. d. Ruhr

PERSÖNLICHE DATEN

• Geburtsdatum: 28.04.1972

• Geburtsort: Mülheim a. d. Ruhr

• Staatsangehörigkeit: deutsch

• Familienstand: ledig

SCHULBILDUNG

• 1978-1984 Grundschule, Mülheim a. d. Ruhr

• 1982-1991 Gymnasium, Mülheim a. d. Ruhr; Abschluss: Abitur

BERUFSAUSBILDUNG

• 1991-1993 Höhere Berufsfachschule für Technik, Olsberg;

Abschluss: staatlich geprüfte Biologisch technische Assistentin

• 1993-1999 Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum;

Abschluss: Diplom-Biologin

• seit Sept. 1999 Promoventin im Fachbereich Chemie, Biofilm Centre, Abteilung

Aquatische Mikrobiologie an der Universität Duisburg-Essen

BERUFLICHER WERDEGANG

• Feb. 1997-Aug. 1997 wissenschaftl. Hilfskraft im IWW-Zentrum Wasser, Abteilung

Mikrobiologie, Mülheim a. d. Ruhr

• Juli 1998-Juli 1999 wissenschaftl. Hilfskraft im Biofilm Centre, Abteilung

Aquatische Mikrobiologie an der Universität Duisburg-Essen

• seit Sept. 1999 wissenschaftl. Mitarbeiterin im Biofilm Centre, Abteilung

Aquatische Mikrobiologie an der Universität Duisburg-Essen

PRAKTIKA

• Feb. 1993-März 1993 IWW-Zentrum Wasser, Abteilung Mikrobiologie, Mülheim a. d. Ruhr

• Okt. 1996-Nov. 1996 IWW-Zentrum Wasser, Abteilung Mikrobiologie, Mülheim a. d. Ruhr

SONSTIGES

• Feb. 2003 Fortbildung für Projektleiter nach §15 Abs.2 Satz 1 Nr. 3 GenTSV