Einfluß von Ammonium und Sulfat auf die Glutathion-Produktion in Suspensionskulturen von Nicotiana...

Botanisches Institut der Universitat zu Koln, Bundesrepublik Deutschland

EinfluB von Ammonium und Sulfat auf die GlutathionProduktion in Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum

Influences of Ammonium and Sulfate. on the Production of Glutathione in Suspension Cultures of Nicotiana tabacum

HEINZ RENNENBERG und LUDWIG BERGMANN

Mit 4 Abbildungen

Eingegangen am 8. Oktober 1978 . Angenommen am 1. November 1978

Summary Release and accumulation of glutathione in the medium of suspension cultures of Nicotiana

tabacum var. SAMSUN grown photoheterotrophically in a modified MURASHIGE-SKOOG medium are controlled by the mineral nutrition of the cells.

In batch cultures the glutathione accumulation is limited by the sulfur supply of the medium, the sulfate concentration in a range from 0.3 mM to 1.73 mM influencing the duration of accumulation but not the rate of GSH release into the medium. After the sulfate supply of the medium has been exhausted, the GSH level in the medium declines. The increase in cell protein during this period indicates that GSH is taken up by the cells and used as sulfur source.

Besides high concentrations of sulfate the surplus production of glutathione is depending on the supply of the tabacco cells with ammonium. In cultures grown with 60 mM nitrate as sole nitrogen source up to 7 micromoles glutathione per liter are found in the medium in contrast to 700 micromoles accumulated in the medium of cultures supplied with 20 mM ammonium and 40 mM nitrate. There is no difference in the glutathione content of cells grown with ammonium-nitrate and with nitrate alone, and the addition of ammonia to nitrate grown cells results in a fast increase of glutathione in the medium.

The present data support the idea that glutathione can function as storage and transport form of cysteine. They also pose the question how the glutathione synthesis is regulated in cells assimilating ammonium-nitrate.

Key words: Glutathione, Suspension cultures, Sulfate nutrition, Ammonium nutrition.

Einleitung

Photoheterotroph in M + S Medium kultivierte Zellsuspensionen von Nicotiana tabacum var. SAMSUN geben wahrend der logarithmischen Wachstumsphase bis zu 99 % des von den Zellen synthetisierten Glutathions in das Kulturmedium ab (BERGMANN und RENNENBERG, 1978). Das im Medium angehaufte GSH kann in der an-

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schlieBenden Wachstumsphase nahezu vollstandig von den Zellen aufgenommen und metabolisiert werden, was auf eine mogliche Funktion des Glutathions als Cysteinoder N -Speicher hindeutet, wie sie flir tierische Zellen (HIGASHI et al., 1977) und Bakterien (CHENG et al., 1973) diskutiert wird. Eine Glutathionanhaufung solhe danach besonders dann zu beobachten sein, wenn die physiologischen Bedingungen in den Zellen zu einem verstarkten Anfall von Aminosauren, insbesondere Cystein flihren. Wir haben daher in der vorliegenden Arbeit geprlift, wieweit die beobachtete GSH-Produktion von dem Sulfat- und N-Angebot in dem M + S Medium abhangt, und ob sie durch eine Veranderung des flir Pflanzen wichtigen C : N-Verhahnisses beeinfluBt wird.

Material und Methoden

Wie in der vorangehenden Arbeit (BERGMANN und RENNENBERG, 1978) wurden die Versuche mit Zellsuspensionen des Klons SC I von Nicotiana tabacum var. SAM SUN durchgefuhrt. Die Kulturen wurden bei 25 DC und 3000 Lux in einem modifizierten M + S Medium gezogen, das die bei LOGEMANN und BERGMANN (1974) angegebene Zusammensetzung hatte. Die Medien mit verschiedenem Sulfatgehalt wurden durch Variation des MgS04-Gehaltes und Zugabe der entsprechenden Mengen MgCl2 hergestellt, die Nitrat-Nahrlosungen durch Ersatz des NH(NOa durch NaNOs.

Die Messung des GSH- und GSSG-Gehaltes in den konditionierten Medien und die Aminosaurebestimmungen erfolgten wie bei BERGMANN und RENNENBERG (1978) beschrieben.

Der Ammoniumgehalt der Nahrlosungen wurde mit einer Ammoniakelektrode Modell 95-10 der Firma Orion Research Inc., Cambridge, Mass. nach BANWART et al. (1972) und COLEMANN (1972) gemessen. Die Bestimmungen des Sulfatgehaltes im Medium erfolgte nach Fallung mit BaCl2 in einer 0,03 Ufo Gelatinelosung turbidometrisch bei 436 nm. Die Trockengewichts- und Proteinbestimmungen wurden wie an anderer Stelle angegeben durchgefiihrt (BERGMANN et aI., 1978).

Ergebnisse

Werden grline Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum var. SAMSUN photoheterotroph in M + S Medien mit verschiedenen Sulfatkonzentrationen kultiviert, so zeigt sich eine deutliche Abhangigkeit der im Medium angehauften Glutathionmenge von dem Sulfatgehalt des Mediums. Wie die in Abb. 1 und 2 wiedergegebenen Versuche zeigen, nimmt die wahrend der Kultur im Medium angehaufte Glutathionmenge im Bereich von 0,4 his 1,73 mM Sulfat proportional zu dem Sulfatangebot zu. Hierbei beeinflufh die Sulfatkonzentration nicht die Rate, sondern nur die Zeit-

Fig. 1: Effect of sulfate nutrItion on glutathione accumulation in the medium and growth of photoheterotrophical suspension cultures of Nicotiana tabacum. The cultures were supplied with sulfate in the following concentrations 1.73 mM 1; 0.98 mM 2; 0.6 mM 3. After exhaustion of the sulfate supply in 2 22.5 micromole sulfate per culture were added at time indicated. The values of the GSH concentrations shown 0-0-0 during the first 10 (12) days of culture are means of the data from 3 (2) different sulfate concentrations. The values of the GSSG concentrations. • • are means of the corresponding data from 3 (2) different sulfate concentrations. Dry weight 0-0-0; Protein e • e·

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Glutathion-Produktion in Tabak-Suspensionskulturen 135

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dauer der Glutathionanhaufung (Abb. 1). Wahrend unter Normalbedingungen (1,73 mM Sulfat) der Glutathiongehalt im Medium bis zum 18. Kulturtag ansteigt, nimmt der Glutathiongehalt in den mit 0,98 mM Sulfat kultivierten Zellsuspensionen bis zum 14. Tag zu und steigt in den mit 0.6 mM Sulfat kultivierten Suspensionen nur bis zum 10. Tag an. Zu diesen Zeitpunkten ist in den Kulturen kein oder weniger als 1,5 X 10-8 Mol S04/ml Medium nachweisbar, so daB man annehrnen darf, daB die Glutathionproduktion hier durch Sulfatmangel begrenzt wird. Mit dieser Annahme steht in Einklang, daB der Glutathion-Gehalt steil ansteigt, wenn den Zellen zu einem Zeitpunkt, in dem der GSH-Gehalt im Medium bereits fa lIt, erneut Sulfat angeboten wird. Obwohl sich hierbei der GSH-Gehalt des Mediums wie in dem in Abb. 1 wiedergegebenen Versuch in 48 h mehr als verdoppelt, laBt die Zunahme des GSSG-Gehaltes im Medium keine Veranderung gegeniiber den Kontrollen ohne zusatzliches Sui fat erkennen. Diese Beobachtung bestatigt den an anderer Stelle (BERGMANN und RENNENBERG, 1978) diskutierten Befund, daB Glutathion in der reduzierten Form von den Zellen in das Medium abgegeben wird.

Wie Abb. 1 Ferner erkennen laBt, hat die Sulfatkonzentration in dem untersuchten Bereich keinen EinfluB auf die Wachstumsrate, sondern begrenzt nur die Wachstumsdauer. Hierbei ist auffallig, daB Wachstumsstillstand und Erschopfung des Sulfatvorrates zeitlich nicht zusammenfallen, sondern daB die Zellmasse auch nach dem Verbrauch des Sulfatvorrates im Medium noch weiter zunimmt. Dies ist besonders deutlich bei den mit 18 und 29,4,liMol Sulfat angezogenen Kulturen; die mit 29,4,liMol Sulfat kultivierten Suspensionen zeigen praktisch keinen Unterschied im Wachs tum gegeniiber den mit 52,liMol Sulfat angezogenen Normalkulturen, obwohl nach dem 14. Kulturtag kein Sulfat im Medium nachweisbar ist. Auch bei den mit 18 ,liMol Sulfat kultivierten Zellsuspensionen tritt der Wachstumsstillstand erst 96 h nach Verbrauch des Sulfats im Medium ein. Setzt man die Zunahme des Zellproteins in der Wachstumsperiode nach Erschopfung des Sulfatvorrates in Beziehung zu der im gleichen Zeitraum erfolgten Glutathionabnahme im Medium (Tab. 1), so zeigt sich, daB der Glutathion-Schwefel fiir die gemessene Proteinzunahme ausreichen wiirde. Dieser Befund stiitzt die Annahme, daB das von den Zellen in das Medium abgegebene Glutathion als mobiler Cysteinspeicher fungieren kann.

Table 1: Comparison of protein and GSH - decrease in the medium of tabacco suspension cultures after exhaustion of the sulfate supply in the medium. Condition of culture as in Fig. 1.

Culture mM Sulfate

0.60 0.98 1.73

Increase in Protein-N micromole N / Culture

51.4 216.2

96.1

". GSH = GSH Decrease - GSSG Increase

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Time

96 120 96

Decrease in GSH"· micromole / Culture

2.3 7.6 3.3

N:S

22.4 28.4 29.1


Werden die in den Kulturen bei verschiedenen Sulfatangeboten erreichten optimalen Glutathionmengen im Medium gegen die Sulfatkonzentrationen des Mediums aufgetragen, so erhalt man die in Abb. 2 wiedergegebene Abhangigkeit. Aus ihr geht hervor, dag in dem Bereich zwischen 0,4 und 1,73 mM die Menge des in das Medium abgegebenen GSH linear mit dem Sulfatangebot steigt, dag unterhalb einer Konzentration von 0,3 mM SuI fat kein GSH im Medium angehauft wird, und da~ eine Erhohung der Sulfatkonzentration tiber 1,73 mM nicht zu einer we iter en Zunahme des GSH-Gehaltes im Medium flihrt. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, da~ im Bereich hoherer Sulfatkonzentrationen die GSH-Produktion der Zellen durch einen weiteren Faktor begrenzt werden mug, Dieser Faktor ist in der N-Ernahrung der Zellen zu suchen. Bestimmt man neben der Sulfatabnahme gleichzeitig die Abnahme der Ammoniumionen im Kulturmedium, so zeigt sich, da~ in den Normalkulturen auch das im Medium angebotene Ammonium zum gleichen Zeitpunkt nahezu vollsdndig von den Zellen aufgenommen worden ist wie das SuI fat (Abb.3). Da, wie im folgenden gezeigt wird, die Versorgung mit Ammonium eine Voraussetzung flir die beobachtete Glutathionabgabe ist, kann sich die Erhohung des Sulfatangebotes im Grundmedium nicht auf die Glutathionproduktion auswirken .

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Fig. 2: Dependence of glutathione accumulation in the medium of tobacco suspension cultures on sulfate supply. Cells were grown on media supplied with different sulfate concentrations and the highest glutathione level reached plotted against the sulfur concentration of the medium.

2. Stickstoff

Die von uns untersuchten Tabak-Kulturen benotigen ftir eine optimale Aminosaure- und Proteinsynthese neben Nitrat reduzierten Stickstoff, der in dem anorganischen M + S-Grundmedium als Ammonium geboten wird (BERGMANN, GROSSE und

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Fig. 3: Effect of ammonium nutrition on glutathione accumulation in the medium and growth of photoheterotrophic suspension cultures of Nicotiana tabacum. The cultures were supplied with 10 mM and 20 mM ammonium and 50 mM respectively 40 mM nitrate

A. Glutathione: 0--0--0 10 mM NH/; .--e-e 20 mM NH/. - B. Protein: 0-0-0 10 mM NH/; 11-11-. 20 nm NH/. Dry weight: 0-0-0 10 mM NH/; ••• 20mMNH/.

KOTH, 1976). Wie die folgenden Versuche belegen, ist auch die Glutathionproduktion der Zellen von einem Ammoniumangebot abhangig.

Werden die Tabakzellen in einem M + S-Medium kultiviert, in dem der Ammoniumgehalt urn die Halfte auf 10 mMolar reduziert und durch eine aquimolare Nitratmenge ersetzt ist, so erreicht die Glutathionanhaufung im Medium nur etwa die Halfte des Wertes der Kontrollen. Wie aus dem in Abb. 3 wiedergegebenen Versuch hervorgeht, kommt die Glutathionanhaufung nach dem Verbrauch des Ammoniumvorrates am 16. Tag zum Stillstand. Wie der weitere Anstieg des Glutathiongehaltes im Medium der Kontrollen anzeigt, ist zu diesem Zeitpunkt noch ausreichend SuI fat im Medium vorhanden, so daB die Glutathionproduktion in den Kulturen von dem Ammonium begrenzt werden muB.

Wie aus Abb. 3 hervorgeht, hat die Herabsetzung des Ammoniumangebotes auf das Wachstum der Kulturen keinen so ausgepragten EinfluB. Zwar nimmt der Proteingehalt in den Kulturen mit reduziertem Ammoniumangebot etwas langsamer zu,

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erreicht aber mit 79,4 mg Protein pro Kultur noch 80 % des Wertes der Kontrolle. Hierbei werden nach dem Verbrauch des Ammoniums im Medium noch ca. 100,uMole N im Protein festgelegt. Diesem Wert steht eine Abnahme des Glutathions im Medium von 4,5,umol gegeniiber; somit miissen die Tabakzellen das im Medium verfiigbare Nitrat fiir die Proteinsynthese verwenden, konnen jedoch unter dies en Bedingungen kein iiberschiissiges Glutathion bilden und in das Medium abgeben.

Dieser Befund wird durch Kulturen bestatigt, die in einem M + S Medium wachsen, das Nitrat als einzige N-Quelle enthalt. Wahrend sich im Medium der AmmonNitrat-Kulturen bis zu 700,uMol Glutathion im Liter anhaufen, finden sich im Medium der Nitratkulturen maximal nur 7,uMolll. Wie Abb. 4 zeigt, fiihrt die Zugabe von Ammoniumionen in diesen Kulturen zu einem raschen Anstieg des Glutathiongehaltes im Medium, der die Fahigkeit der Zellen zu einer vermehrten Glutathionsynthese und -abgabe demonstriert. Die Daten von Abb. 4 zeigen Ferner den gegeniiber den Ammon-Nitrat-Kulturen verringerten Proteingehalt der Nitratkulturen, der eine Folge des verminderten Angebotes an reduziertem Stickstoff ist, der sich auch in dem unterschiedlichen Gehalt der Zellen an lOs lichen Aminosauren spiegelt (Tab. 2). Dieser Unterschied ist besonders ausgepragt bei den Saureamiden und

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Fig. 4: Glutathione accumulation and growth of suspension cultures of Nicotiana tabacum grown photoheterotrophically with 60 mM nitrate. 0----0 Glutathione, dry weight, and protein content with 60 mM Nitrate . • -e Glutathione, dry weight, and protein content after addition 20 mM ammonium at the time indicated.

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Table 2: Free amino acid and amide composition of tobacco cells grown photoheterotrophically as suspension cultures with ammonium (20 mM) and nitrate (40 mM), and with nitrate (60 mM) as sole nitrogen source. Cultures were analysed 10 days after inoculation with 1.7 mg dry weight130 ml culture medium.

NH4N03 N03-

,uM/g DW ,uM/g DW

ASP 6.6± 0.51 2.0±0.24 THR 5.6± 0.59 8.1 ± 0.95 SER 14.1 ± 1.72 12.9 ± 1.68 ASN 19.6± 1.66 GLU 15.3± 1.52 10.9 ± 0.80 GLN 303.5 ± 23.71 6.7±0.75 GLY 2.3 ± 0.24 1.9±0.14 ALA 26.3± 2.88 9.8 ±0.32 VAL 1.6± 0.23 CYS MET + ILE + LEU 1.5± 0.19 + TYR .+ PHE + + y-ABA 30.5± 2.92 2.9±0.07 LYS 4.7± 0.58 HIS + + ARG 9.6± 0.26

Table 3: Effect of different glucose (saccharose) concentrations on growth and glutathione accumulation in photoheterotrophically grown suspension cultures of Nicotiana tabacum var. SAMSUN. Cultures were inoculated with 1.7 mg dry weight and analysed after 10 days of growth.

Glucose DW (%) (mg/30 ml)

0.1 22.8± 0.7 0.5 82.5 ± 2.4 1 83.7± 3.8 2 44.8 ± 6.4 3 30.3± 4.5 4 22.3± 1.1 5 15.21 0.9

Sacch. DW (010) (mg/30 ml)

0.1 26.0± 0.4 0.5 85.8 ± 7.5 1 96.8± 10.9 2 83.7± 2.3 5 44.9 ± 2.9

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Glutathione (mg/I)

12.2±2.5 64.7±8.9 67.0±9.1 16.8 ± 3.0 10.1±2.2 6.8 ± 1.2 4.7 ± 1.8

Glutathione (mg/I)

10.0 ± 1.3 47.3 ±4.1 63.0 ± 9.2 60.5 ±7.1 15.8±1.5

mgGSH /gDW

16.0 23.5 24.0 11.2 10.0 9.1 9.3

11.5 16.5 19.5 21.7 10.5


clem ebenfalls N-reichen Arginin; er ist jecloch nicht auf diese Speicherformen beschrankt, sondern auch bei der Mehrzahl der ubrigen Aminosauren klar zu erkennen, und zeigt, dag sich die Nitratkulturen gegenuber den Ammon-Nitrat-Kulturen in einem Stickstoffdefizit befindcn. Eine Veranderung des c: N Verhaltnisses in der Ernahrung der Zellkulturen, die fUr die Produktion von Metaboliten des Sekundarstoffwechsels von Bedeutung sein kann (ZENK et ai., 1977), hat auf die Glutathionproduktion erwartungsgemag keinen oder nur einen geringen EinfluK Werden photoheterotrophe Tabakkulturen bei gleichem N-Angebot mit unterschiedlichen Konzentrationen an Saccharose oder Glukose kultiviert, so fallt die Glutathionanhaufung bei hoheren und niedrigeren Zuckerkonzentrationen gegeniiber den Kontrollen etwas starker ab als das Wachs tum der Zellen (Tab. 3). Die hieraus resultierende Verschiebung der Relation Glutathion pro Zellmasse ist gering und deutet eher auf einen Zusammenhang zwischen dem Wachstum und der Glutathionabgabe hin als auf einen Einflug des C : N-Verhaltnisses auf die Glutathionproduktion.

Diskussion 1. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dag die Anhaufung von Glutathion im Medi

um der photoheterotrophen Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum an eine ausreichende Versorgung der Zellen mit Ammonium gebunden ist und durch die im Medium zur Verfugung stehende Sulfatmenge begrenzt wird. Sowohl in Kulturen mit einem geringen Sulfatangebot im Medium wie in Kulturen, die als einzige NQueUe Nitrat erhalten, wird kein oder nur eine sehr geringe Menge Glutathion in das Medium abgegeben, obwohl der Glutathionpegel in den Zellen keine Veranderung gegenuber den mit Ammonnitrat kultivierten Zellen zeigt. Werden die Zellen dagegen mit Ammonnitrat und Sulfatkonzentrationen oberhalb 0.4 mM kultiviert, so kommt es zu einer Erhohung der Glutathionsynthese und einer betrachtlichen Glutathionanhaufung im Medium. Im Gegensatz zu Zellsuspensionen von Nicotiana tabacum var. XANTHI, bei denen HART und FILNER (1969) eine Hemmung der Sulfataufnahme durch Glutathion beobachtet haben, bleibt in den mit der 10fachen Sulfatkonzentration kultivierten SAMsuN-Zellsuspensionen die Sulfataufnahme wiihrend des Anstiegs der Glutathion-Konzentration im Medium praktisch konstant, so dag die Voraussetzung fiir eine weitere Zunahme der Glutathionanhaufung im Medium gegeben ist.

Das im Medium angehaufte Glutathion nimmt von dem Zeitpunkt wieder ab, zu dem der Sulfatvorrat des Mediums oder sein Ammoniumgehalt erschopft sind. Hierbei zeigt die Wachstumsrate der Kulturen wahrend der GSH-Abnahme an, dag das Glutathion von den Zellen als S-Quelle und sehr wahrscheinlich auch als Lieferant fur reduzierten Stickstoff benutzt wird. Dieser Befund und die Abhangigkeit der Glutathionanhaufung im Medium von einem luxurierenden N- und S-Stoffwechsel weisen auf eine Speicher- und Transportfunktion hin. Diese Annahme steht in Einklang mit Ergebnissen von SMITH (1974), der nachgewiesen hat, dag der intracellulare Glutathiongehalt von Tabakzellen eine deutliche Abhangigkeit von der Sulfat-

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versorgung zeigt und nach dem Verbrauch der endogenen Sulfatreserven steil abfallt, wahrend der Cysteinspiegel in den Zellen nur geringen Schwankungen unterliegt, was ebenfalls eine Rolle des Glutathions als Cysteinspeicher anzeigt.

2. Die im Vergleich zu den Nitratkulturen urn zwei Zehnerpotenzen hohere Glutathionproduktion in den Ammonnitratkulturen wirft die Frage nach der Verkniipfung des N- und S-Stoffwechsels und der Regulation der Glutathionsynthese in den photoheterotrophen Zellen auf. Wie an anderer Stelle gezeigt und wie auch Abb. 4 belegt (BERGMANN et al., 1976), ist das als Proteinzunahme gemessene Wachstum der Nitratkulturen unter unseren Kulturbedingungen urn knapp l/S niedriger als das Wachs tum der Ammon-Nitrat-Kulturen und wird offensichtlich durch die Kapazitat der Zellen zur Reduktion des Nitratstickstoffs begrenzt. Man konnte daher annehmen, daB in den Nitratkulturen die Sulfatreduktion durch die zur Verfiigung stehenden Reduktionsaquivalente begrenzt und die Glutathionsynthese iiber das Cysteinangebot limitiert wird, wahrend in den Ammon-Nitrat-Kulturen das Angebot an reduziertem Stickstoff eine erhohte Sulfatreduktion ermoglicht. Da jedoch auch die mit Ammonnitrat ernahrten Zellen in erheblichem Urn fang Nitrat verarbeiten, wie die Differenz zwischen dem aufgenommenen Ammon-N und der Zunahme des Proteinstickstoffs und der loslichen Aminosauren in den Kulturen zeigt (BERGMANN et aI., 1976), verliert diese Annahme an Wahrscheinlichkeit.

Die vorliegenden Daten deuten vielmehr darauf hin, daB die Glutathionsynthese in den photoheterotrophen Tabakzellen entweder direkt durch den Ammoniumspiegel in den Zellen, oder iiber die von der N-Ernahrung abhangigen Verschlebungen im Aminosaurestoffwechsel geregelt wird. Ob der Ansatzpunkt hierbei in der Glutathionsynthese selbst liegt und diese bei Ammonernahrung «entkoppelt» wird, so daB es zu einem verstarkten Cysteinverbrauch und damit zu einer Erhohung der Sulfatreduktion kommt, oder ob er im Bereich der von REUVENY und FILNER (1977) aufgedeckten Regulation der Sufatreduktion iiber den EinfluB der N-Ernahrung auf die A TP-Sulfurylase zu suchen ist, miissen weitere Untersuchungen zeigen.

Literatur BANWART, W. L., M. A. TABATABAI, and J. M. BREMMER: Cornrn. in Soil Sci. and Plant Anal.

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