Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die ... · 2.2.3 Toxikokinetik Cadmium ist...

Einfluss von Cadmiumverbindungen auf

die Struktur und die Funktion

des Tumorsuppressorproteins p53

vorgelegt von

Diplom-Lebensmittelchemikerin

Christina Thuy

aus Speyer

Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin (TU)

zur Erlangung des akademischen Grades

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN

-Dr. rer. nat.-

genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. L.Kroh

Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. A. Hartwig

Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. M. Metzler

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 23.06.06

Berlin 2006 D 83

Inhalt

I

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ......................................................................................... 1

2 Einleitung ....................................................................................................... 3

2.1 Thematische Einführung ......................................................................................... 3

2.2 Cadmium................................................................................................................... 4

2.2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften................................................. 4

2.2.2 Vorkommen und Verwendung ....................................................................... 4

2.2.3 Toxikokinetik ................................................................................................. 5

2.2.4 Kanzerogenität................................................................................................ 6 2.2.4.1 Direkte genotoxische Effekte................................................................................. 6 2.2.4.2 Indirekte genotoxische Effekte .............................................................................. 7

2.3 DNA-Reparatursyteme ............................................................................................ 8

2.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur........................................................................... 9

2.3.2 Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden................... 11

2.4 Das Tumorsuppressorprotein p53 ........................................................................ 13

2.4.1 Eigenschaften des p53 Proteins .................................................................... 13

2.4.2 Regulation und Modulation des p53 Proteins .............................................. 14

2.4.3 Struktur des p53 Proteins.............................................................................. 15

2.4.4 Auswirkungen von Mutationen in p53 ......................................................... 17

2.4.5 Rolle von p53 in der NER ............................................................................ 17

2.4.6 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle..................................................... 19

3 Fragestellung................................................................................................ 21

4 Material und Methoden .............................................................................. 22

4.1 Zellkultur ................................................................................................................ 22

4.1.1 Zellen............................................................................................................ 22

4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit ............................................................................. 22

4.2 Behandlung der Zellen........................................................................................... 23

Inhalt

II

4.2.1 Inkubation..................................................................................................... 23

4.2.2 UVC-Bestrahlung ......................................................................................... 23

4.3 Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer....................................................... 24

4.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip..................................................................... 24

4.3.2 Fluoreszenzfärbung ...................................................................................... 25

4.3.3 Zellzyklusmessung ....................................................................................... 26

4.4 Bestimmung des p53 Proteingehaltes ................................................................... 27

4.4.1 Zelllyse ......................................................................................................... 27

4.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford............................................................... 27

4.4.3 Elektrophorese und Westernblot .................................................................. 27

4.4.4 Detektion durch Chemilumineszenz............................................................. 28

4.4.5 Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53 ..................... 28 4.4.5.1 Zelllyse und Vorklärung ...................................................................................... 28 4.4.5.2 Immunopräzipitation............................................................................................ 29

4.5 Bestimmung der relativen Genexpression ........................................................... 30

4.5.1 Probenvorbereitung ...................................................................................... 30 4.5.1.1 RNA-Isolierung.................................................................................................... 30 4.5.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung........................................................ 31 4.5.1.3 RNA Gelelektrophorese....................................................................................... 31 4.5.1.4 cDNA-Synthese ................................................................................................... 31

4.5.2 Quantitative Real Time PCR........................................................................ 32 4.5.2.1 Prinzip .................................................................................................................. 32 4.5.2.2 Geräteaufbau ........................................................................................................ 36 4.5.2.3 Effizienzbestimmung ........................................................................................... 36 4.5.2.4 PCR-Protokoll...................................................................................................... 38 4.5.2.5 Schmelzkurvenanalyse......................................................................................... 39 4.5.2.6 Relative Quantifizierung ...................................................................................... 40

5 Ergebnisse und Diskussion ......................................................................... 42

5.1 Messungen mit der Real Time PCR ..................................................................... 42

5.1.1 Schmelzkurvenanalyse ................................................................................. 42

5.1.2 Effizienzbestimmung.................................................................................... 44

5.2 UVC-Bestrahlung ................................................................................................... 45

5.2.1 Koloniebildung ............................................................................................. 45

5.2.2 Induktion von p53......................................................................................... 46

Inhalt

III

5.2.3 Genexpression von p21, p48 und XPC......................................................... 48 5.2.3.1 p21 ....................................................................................................................... 48 5.2.3.2 p48 ....................................................................................................................... 49 5.2.3.3 XPC...................................................................................................................... 50

5.2.4 Zellzyklusphasenverteilung.......................................................................... 51

5.3 Cadmium................................................................................................................. 53

5.3.1 Koloniebildung ............................................................................................. 53

5.3.2 Induktion von p53......................................................................................... 55

5.3.3 Immunpräzipitation ...................................................................................... 56


5.4 Kombinationsuntersuchungen .............................................................................. 63

5.4.1 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität..................... 63

5.4.2 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion................... 64


5.4.4 Zellzyklusphasenverteilung.......................................................................... 69

6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick .......................................... 71

7 Literatur ....................................................................................................... 80

A Anhang.......................................................................................................... 89

A.1 Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................... 89

A.2 Liste der verwendeten Chemikalien ..................................................................... 91

A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-materialen .............................. 93

A.4 Verwendete Lösungen und Puffer ........................................................................ 95

A.4.1 Zellkultur ...................................................................................................... 95

A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot................................................................................................... 96

Inhalt

IV

A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese............................................................ 98

A.5 Primersequenzen .................................................................................................... 99

A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation ........................................ 99

A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse................................................................... 100

A.8 Dosis-Abstands-Kurve ......................................................................................... 100

A.9 cDNA-Verdünnungreihen ................................................................................... 101

Publikationsliste............................................................................................... 103

Lebenslauf ........................................................................................................ 107

Danksagung...................................................................................................... 108

Zusammenfassung

1

1 Zusammenfassung

Cadmiumverbindungen sind sowohl beim Mensch als auch im Tierversuch kanzerogen und

tragen aufgrund ihrer weiten Verbreitung in der Umwelt und am Arbeitsplatz erheblich zum

Krebsrisiko durch Schadstoffe bei. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nach

wie vor ungeklärt, zumal ihre Mutagenität nur schwach ausgeprägt ist. Diskutiert werden u.a.

die Induktion von oxidativem Stress sowie der Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse der

Zelle.

Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität spielt das Tumorsuppressorprotein p53

eine große Rolle. Durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor reguliert es die Expression

einer Vielzahl von Genen, die in verschiedenen Prozessen zum Schutz der Zelle involviert

sind, wie z.B. der Apoptose, der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur. Für diese

Eigenschaft ist eine gefaltete Proteindomäne essenziell, die durch die Koordination von einem

Zink-Ion durch drei Cystein- und einem Histidinrest stabilisiert wird.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von löslichem CdCl2 und partikulärem CdO

auf die Struktur und damit auch auf die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53

untersucht. Beide Verbindungen verursachten eine Umfaltung der Wildtyp-Form des

Tumorsuppressorproteins p53 in die ungefaltete „mutante“ Form. Dies hatte auch eine

Hemmung von nachgeschalteten Signalwegen wie die Transkription der DNA-Reparaturgene

p48 und XPC zur Folge. Um den Einfluss der Verbindungen auf die p53-Stabilisierung

infolge der Wirkung DNA-schädigender Agenzien zu untersuchen, wurden Untersuchungen

in Kombination mit UVC-Strahlung durchgeführt. Während UVC-Strahlung zu einer

Induktion der Wildtyp-Form führte, zeigten beide Cadmiumverbindungen in Kombinations-

versuchen eine Hemmung der UVC-induzierten p53-Stabilisierung, wenn auch bei CdCl2

stärker ausgeprägt als bei CdO. Gleichzeitig resultierte eine Co-Inkubation in einer

verstärkten Bildung der „mutanten“ Konformation. Im Einklang damit zeigten beide

Verbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene p48 und

XPC. Da diese Proteine eine große Rolle bei der Reparatur von sperrigen DNA-Addukten,

wie sie z.B. durch UV-Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK)

entstehen, spielen, könnte eine Beeinträchtigung der Expression in einer Beeinflussung von

DNA-Reparaturprozessen resultieren.

Zusammenfassung

2

Um zu untersuchen, ob Cadmiumverbindungen auch andere Kontrollmechanismen stören,

wurde der Einfluss auf die Zellzykluskontrolle in Kombination mit UVC-Strahlung

untersucht. Während UVC-Strahlung 10 Stunden nach der Bestrahlung mit 5 J/m2 zu einem

S-Phasenarrest führte, zeigte eine Vorinkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen

und anschließender Bestrahlung eine Zellzyklusphasenverteilung, die nahezu der von

unbestrahlten Zellen entspricht. Dagegen resultierte eine alleinige Behandlung mit den

jeweiligen Cadmiumverbindungen in einem leichten G1-Phasenarrest. Die Genexpression von

p21, einem Protein, dem sowohl im G1-Phasenarrest als auch im S-Phasenarrest eine Rolle

zugesprochen wird, wurde sowohl durch die jeweiligen Cadmiumverbindungen als auch

durch UVC-Strahlung erhöht, während die UVC-induzierte p21-Expression infolge einer Co-

Inkubation mit Cadmium und UVC-Strahlung inhibiert wurde.

Da p53 als Transkriptionsfaktor eine Vielzahl von Genen reguliert, die in verschiedenen

Prozessen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität eine Rolle spielen, könnte eine

Beeinflussung seiner Struktur und damit auch seiner Funktion einen Mechanismus darstellen,

der zur krebserzeugenden Wirkung von Cadmiumverbindungen beiträgt

Einleitung

3

2 Einleitung

2.1 Thematische Einführung

Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu

Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial

nur schwach ausgeprägt ist.

Vor allem in der Metallindustrie sind Arbeiter chronisch gegenüber hohen Dosen partikulärer

und löslicher Cadmiumverbindungen exponiert. Allerdings haben Cadmiumverbindungen

aufgrund ihrer Persistenz in biologischen Systemen, sowie ihrer Akkumulation in

verschiedenen Geweben des Menschen auch für beruflich nicht exponierte Personen eine

große Bedeutung.

Für das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Metall Cadmium konnte in früheren Studien

gezeigt werden, dass es die genotoxische Wirkung von DNA-schädigenden Agenzien erhöht.

So verstärkt Cadmium(II) die durch B[a]P (Benzo[a]pyren) verursachte Zelltransformation

syrischer Hamsterembryonalzellen (Rivedal und Sanner, 1981) und erhöht in V79 Zellen die

durch UVC-Strahlung induzierte Mutationsrate (Hartwig und Beyersmann, 1989). Es

scheinen sich also vielmehr indirekte genotoxische Eigenschaften hinter dem kanzerogenen

Potenzial zu verbergen als eine direkte DNA-Schädigung, in dem es z.B. in zelluläre

Reparaturmechanismen eingreift (Hartwig et al., 1998).

Zellen unterliegen einer permanenten Schädigung durch endogene und exogene

Einwirkungen. Zur Beseitigung von auftretenden DNA-Schäden, bevor sie durch unkorrekte

Replikation und als Folge davon zur Manifestierung von Mutationen führen, hat die Zelle

verschiedene Mechanismen entwickelt. Die wichtigsten Reparaturprozesse sind die NER

(Nukleotidexzisionsreparatur), die BER (Basenexzisionsreparatur) und die MMR

(Mismatchreparatur). Die NER beseitigt helixverzerrende DNA-Addukte, die z.B. durch UV-

Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) gebildet werden,

während über die BER Basenmodifikationen wie sie z.B. durch reaktive Sauerstoffspezies

entstehen, repariert werden. Die MMR beseitigt Basenfehlpaarungen, die als Folge von

Replikationsfehlern auftreten. Eine Reparatur der DNA-Schäden ist häufig mit einer

Arretierung des Zellzyklus verbunden, um die notwenige Zeit zur Reparatur der Schäden zu

gewährleisten. Ist das Ausmaß der Schädigung zu groß, wird der programmierte Zelltod, die

Einleitung

4

Apoptose, eingeleitet. Ein zentrales Protein, welches diese drei Mechanismen koordiniert, ist

das Tumorsuppressorprotein p53. Das Protein p53 besitzt ein Zink-bindendes Proteinmotiv, in

dem ein Zink-Ion von drei Cysteinresten und einem Histidinrest koordiniert wird. Ergebnisse

der letzten Jahre haben gezeigt, dass „Zinkfingerstrukturen“ empfindliche Angriffspunkte für

toxische Metallverbindungen sind. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat

inzwischen ergeben, dass ca. 3 % aller Gene für Proteine mit Zinkfingerstrukturen kodieren

(Maret, 2003). Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar nicht zu den Zinkfingerproteinen

gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und Mann, 2001), könnte aber

dennoch durch Wechselwirkung von Metall-Ionen mit der Zink-bindenden Domäne in seiner

Funktion beeinträchtigt werden.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl partikulärer

als auch löslicher Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die damit verbundene Funktion

des Tumorsuppressorproteins p53. Damit soll ein möglicher Einfluss auf DNA-

Reparaturprozesse sowie auf die Zellzykluskontrolle aufgeklärt werden.

2.2 Cadmium

2.2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften

Das Element Cadmium ist ein Metall der 2. Nebengruppe des Periodensystems mit einem

Atomgewicht von 112,41 und der Ordnungszahl 48. Es sind acht natürlich vorkommende

Isoptope bekannt (114Cd, 112Cd, 111Cd, 110Cd, 113Cd, 116Cd, 106Cd und 108Cd). Es handelt sich

um ein silberweißes, glänzendes, sehr weiches und plastisch verformbares Metall. In seinen

Verbindungen hat es die Oxidationsstufe +2. Lösliche Verbindungen sind z.B.

Cadmiumchlorid, Cadmiumsulfat und Cadmiumacetat, wasserunlösliche z.B. Cadmiumsulfid,

Cadmiumcarbonat und Cadmiumoxid (Riedel, 1999).

2.2.2 Vorkommen und Verwendung

Cadmium wurde 1817 von F. Strohmeyer als Metall in Zinkcarbonat entdeckt (griech.:

cadmeia = Zinkerz (Galmei)). In der Erdrinde ist das Metall nur in sehr geringen Mengen

vertreten. Reine Cadmiumminerale sind der Greenockit (hexagonales CdS), Hawleyit

(kubisches CdS), Ovatit (CdCO3), Monteponit (CdO) und der Cadmoselit (CdSe). Cadmium

Einleitung

5

ist in Zinkmineralen wie der Zinkblende zu 0,1 bis 0,5 % und im Zinkspat bis zu 5 %

enthalten (Riedel, 1999).

Das Metall gelangt über Emission aus Industrieanlagen, vor allem Zinkhütten, Eisen- und

Stahlwerken, Müllverbrennungsanlagen und Braunkohlekraftwerken sowie durch

Verbrennung fossiler Brennstoffe und Einsatz von Phosphatdüngemitteln in der

Landwirtschaft in die Umwelt. Industriell wird Cadmium zur Herstellung von Nickel-

Cadmium-Batterien eingesetzt. Des Weiteren findet es für Korrosionsschutzüberzüge von

Metallen sowie als Stabilisator in der Kunststoffindustrie Verwendung (zusammengefasst in

Stöppler, 1991; Pinot et al., 2000).

2.2.3 Toxikokinetik

Cadmium ist ein toxisches, biologisch nicht essenzielles Schwermetall. Für einen beruflich

nicht exponierten Menschen ist die Hauptaufnahmequelle die Nahrung, hier vorwiegend

pflanzliche Lebensmittel und Innereien, einen geringen Anteil liefert das Trinkwasser (10 %).

Die durchschnittliche tägliche Aufnahme über Nahrung und Trinkwasser beträgt zwischen 10

und 30 µg, während die inhalative Aufnahme mit 0,02 µg bei Gehalten der Außenluft von 1

bis 5 ng/m3 nur unwesentlich zur Gesamtbelastung beiträgt. Einen großen Beitrag zur

täglichen Cadmiumaufnahme leistet allerdings Tabak, so dass Raucher erhöhte

Cadmiumgehalte im Körper aufweisen. Eine Zigarette enthält etwa 1-2 µg Cadmium. Davon

werden etwa 10 % inhaliert und hiervon wiederum 50 % resorbiert, so dass das Rauchen von

einer Schachtel Zigaretten pro Tag in einer zusätzlichen Aufnahme von etwa 1-2 µg resultiert.

Somit ist der Eintrag höher als über die Nahrung, da aus dem Gastrointestinaltrakt nur etwa

5 % des aufgenommenen Cadmiums resorbiert werden. Nach Aufnahme in den Körper

akkumuliert es an Metallothionein gebunden, vor allem in der Niere und der Leber und weist

Halbwertszeiten von bis zu 30 Jahren auf. Die totale Körperbelastung eines beruflich nicht

exponierten 50 Jahre alten Menschen beträgt etwa 15 mg (Oberdörster, 1989; Stöppler, 1991).

Die einzelnen Beiträge der Organe sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Einleitung

6

Tabelle 1: Cadmiumgehalte im Körper (zusammengefasst in IARC, 1993, 1997).

Gewebe bzw. Körperflüssigkeiten Gehalt

Niere 15-50 mg/kg Nassgewicht

Leber 1-3 mg/kg Nassgewicht

Lunge ca. 1,3 mg/kg Trockengewicht

Urin 0,4 - 4 µg/l

Blut 0,2 - 4 µg/l

2.2.4 Kanzerogenität

Cadmium wurde von der IARC (International Agency for Research on Cancer) als

kanzerogen für den Menschen eingestuft (IARC, 1993, 1997). Epidemiologische Studien

zeigen eine deutliche Korrelation zwischen Cadmiumexposition und einem erhöhten

Auftreten von Tumoren vor allem der Lunge, aber auch der Prostata, der Niere und des

Magens. Auch im Versuchstier zeigt sich die kanzerogene Wirkung aller untersuchten

Cadmiumverbindungen (CdCl2, CdSO4, CdS, CdO). Das kanzerogene Potenzial kann

allerdings nur teilweise durch seine direkte genotoxische Eigenschaft erklärt werden, da es

sich als nicht mutagen in bakteriellen Testsystemen und als nur schwach mutagen in

verhältnismäßig hohen Konzentrationen in Säugerzellen erwiesen hat (Hartwig et al., 1998).

2.2.4.1 Direkte genotoxische Effekte

Cadmium induziert Chromosomenabberationen (Ochi und Ohsawa, 1985) und DNA-

Strangbrüche (Ochi und Ohsawa, 1983; Snyder, 1988; Dally und Hartwig, 1997) in

kultivierten Zellen. Als ein möglicher Mechanismus für die genotoxische Wirkung wird die

Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären

Verteidigungsmechanismen diskutiert. Eine vermehrte Bildung von ROS wurde in

verschiedenen Zelllinien gezeigt (Yang et al., 1997; Szuster-Ciesielska et al., 2000; Filipic

und Hei, 2004). Ochi et al. (1987) untersuchten in V79-Zellen den Einfluss von CdCl2 auf die

Aktivität von Enzymen, die an der Metabolisierung von ROS direkt oder indirekt beteiligt

sind, wie z.B. Superoxiddismutase, Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase

(Glutathiondisulfid-Reduktase). Die Funktionsweise dieser Enzyme ist in Abbildung 1

dargestellt. Es konnte allerdings keine Beeinflussung der untersuchten Enzymaktivitäten

Einleitung

7

festgestellt werden, wohingegen der Gehalt an GSH signifikant abnahm. Als Gründe dafür

wurden verschiedene Punkte diskutiert. Einerseits könnte Cadmium in die Synthese des GSH

eingreifen, indem wichtige Enzyme für dessen Synthese (γ-Glutamyl-Cystein-Synthase,

Glutathionsynthase) beeinflusst werden. Andererseits könnte durch Induktion von Cystein-

reichem Metallothionein, welches durch Schwermetalle wie Cadmium induziert wird, die

Verfügbarkeit von Cystein in der Zelle deutlich gesenkt werden, wodurch weniger GSH

synthetisiert werden kann. Einen Zusammenhang zwischen GSH-Gehalt und

Cadmiumzytotoxizität zeigten auch die Ergebnisse von Kang et al. (1989) sowie von Kang

und Enger (1990), bei denen von einer Korrelation zwischen wachstumsbedingtem GSH-

Gehalt bzw. GSH-Depletion durch Hemmung der γ-Glutamyl-Cystein-Synthase mittels

Buthionin Sulfoximin (BSO) und Cadmiumzytotoxizität berichtet wurde. Des Weiteren zeigte

eine Studie an einer cadmiumresistenten A549 Subpopulation, dass die im Gegensatz zur

sensitiven A549 Subpopulation erhöhte Resistenz auf einen etwa 2-fach höheren GSH-Gehalt

zurückzuführen ist (Hatcher et al., 1995).

Abbildung 1: Metabolismus von ROS (Marquardt und Schäfer, 1997).

2.2.4.2 Indirekte genotoxische Effekte

Größere Relevanz wird allerdings den indirekten genotoxischen Effekten zugeschrieben, da

Cadmium die Mutagenität von anderen DNA-schädigenden Agenzien verstärkt. So

beobachteten Rivedal und Sanner (1981) eine Komutagenität von Cadmium(II) mit B[a]P in

syrischen Hamsterembryonalzellen und Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten von

einer Erhöhung der, durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate in V79 Zellen.

Nocentini (1987) zeigte bereits sehr früh eine Beeinflussung der DNA-Replikation und

Reparatur UV-geschädigter DNA in menschlichen Zellen. Snyder et al. (1989) sowie

Hartmann und Hartwig (1998) zeigten eine Hemmung der Schadenserkennung nach UV-

Einleitung

8

Bestrahlung in HeLa S3 Zellen. Dieser Befund sowie die Ergebnisse von Fatur et al. (2003)

die eine Hemmung der Exzision UV-induzierter CPDs in chinesischen Hamsterzellen zeigten,

weisen darauf hin, dass die komutagene Wirkung von Cadmium auf eine Störung zellulärer

Reparaturmechanismen zurückzuführen ist

Auf molekularer Ebene zeigten Asmuss et al. (2000), dass bei Verwendung von gereinigtem

XPA, einem Protein, das an der NER beteiligt ist, dessen Bindung an ein UVC-geschädigtes

Oligonukleotid durch CdCl2 vollständig gehemmt wird. Dieser Effekt wird durch eine

equimolare Konzentration an Zink aufgehoben, was auf eine Verdrängung von Zink in der

DNA-bindenden Zinkfingerdomäne des XPA-Proteins schließen lässt. Untersuchungen an

einem synthetisierten Peptid, das die Zinkfingerstruktur des humanen XPA-Proteins

repräsentiert, konnten eine quantitative Substitution von Zn(II) durch Cd(II) zeigen. Darüber

hinaus erwiesen sich die Cadmium-gebundenen Thiole durch die hohe Bindungskonstante

von Cd(II) als oxidationsunempfindlich gegen H2O2 (Kopera et al., 2004).

Eine Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden hat zur Folge, dass die Schäden infolge

stattfindender DNA-Replikation zu Mutationen führen können. Besonders kritisch sind

Mutationen in Onkogenen, die zu einem unkontrollierten Wachstum der Zelle führen können,

sowie Mutationen in Tumorsuppressorgenen, deren Genprodukte u.a. an der

Zellzykluskontrolle beteiligt sind.

2.3 DNA-Reparatursyteme

Die DNA unterliegt einer permanenten Schädigung sowohl durch endogene

Stoffwechselprozesse und durch exogene Quellen wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung

als auch durch eine Reihe von chemischen Kanzerogenen. Das entstehende Schadensspektrum

reicht von oxidativen Basenschäden bis zu DNA-Einzel- und DNA-Doppelstrangbrüchen,

DNA-Alkylierungsschäden und DNA-Addukten.

Um die Integrität des Genoms zu gewährleisten, hat die Zelle verschiedene DNA-

Reparaturmechanismen entwickelt, bevor die Schäden infolge einer fehlerhaften Replikation

zu Mutationen führen können. Die so genannte MMR (Mismatchreparatur) ist für die

Reparatur von Basenfehlpaarungen, wie sie durch Replikationsfehler entstehen,

verantwortlich. Für oxidative Basenmodifikationen, die durch reaktive Sauerstoffspezies

gebildet werden, ist die BER (Basenexzisionsreparatur) spezifisch. Für Umweltmutagene ist

das bedeutendste Reparatursystem die NER (Nukleotidexzisionsreparatur). Sie erkennt und

Einleitung

9

repariert großräumige DNA-Addukte, die zu einer Verzerrung der Helixstruktur der DNA

führen. Hierzu zählen z.B. UV-induzierte Schäden, sowie Benzo[a]pyren- und Aflatoxin-

induzierte DNA-Addukte.

2.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur

Da in der vorliegenden Arbeit als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt

wurde, wird im Folgenden näher auf den Mechanismus der NER eingegangen.

Es kann grundsätzlich zwischen sechs Schritten unterschieden werden:

• Schadenserkennung

• Entwindung der Doppelhelix am DNA-Schaden

• Einzelstrang-Inzision an beiden Seiten des Schadens

• Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen Oligonukleotids

• DNA-Neusynthese des zuvor ausgeschnittenen Oligonukleotids

• Ligation

Für die NER ist ein koordiniertes Zusammenwirken von mindestens 30 verschiedenen

Proteinen erforderlich. Mutationen in NER-Genen verursachen die seltene Erbkrankheit

Xeroderma pigmentosum, bei der die Patienten extrem lichtempfindlich und anfällig für die

Entstehung von Hautkrebs sind. Es existieren acht Komplementationsgruppen (XPA bis XPG

und XPV), die auf jeweils verschiedene Gendefekte von an der NER beteiligten Proteinen

zurückzuführen sind und letztendlich in allen Fällen (mit Ausnahme von XPV) zu einer

Beeinträchtigung der Inzision führen.

Je nachdem in welchem Bereich der DNA sich der Schaden ereignet, kann die NER in zwei

Untergruppen eingeteilt werden. Schäden, die sich im transkribierten Strang aktiv

transkribierter Gene ereignen, werden über die TCR (transkriptionsgekoppelte Reparatur)

repariert, während Schäden im restlichen Genom über die GGR (globale genomische

Reparatur) beseitigt werden. Diese beiden Prozesse unterscheiden sich nur im ersten Schritt

der NER. Nach der Schadenserkennung verlaufen die beiden Wege analog. In der TCR

scheint die RNA Polymerase II das eigentliche Schadenserkennnungssignal für die

Rekrutierung der NER-Proteine darzustellen. Nach erfolgter Schadenserkennung kommt es in

Folge einer Konformationsänderung der DNA zur Anlagerung von NER-Proteinen. In der

GGR ist ein Protein-Komplex bestehend aus XPC und hHR23B für die Schadenserkennung

Einleitung

10

zuständig. Volker et al. (2001) konnten durch die Anwendung einer lokalen UV-Bestrahlung

und dem Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern die Reihenfolge der Anlagerung der

NER-Proteine zeigen (Abbildung 2). Nach Anlagerung des XPC-Genproduktes im Komplex

mit hHR23B bindet der Transkriptionsfaktor TFIIH. Dieser besteht aus mehreren

Untereinheiten und beinhaltet als größte Untereinheiten die beiden Helikasen XPB und XPD

(Egly, 2001). Im Anschluss an die lokale Entwindung der DNA kommt es zur Anlagerung der

3´-Nuklease XPG, von XPA, RPA und letztendlich zur Rekrutierung des 5´-Nuklease-

Komplexes bestehend aus ERCC1 und XPF. Während die Anlagerung der Helikase XPG

unabhängig von XPA erfolgt, kann der Komplex aus ERCC1 und XPF erst nach erfolgter

Bindung des XPA erfolgen. Dennoch ist die Aktivität des Enzyms XPG abhängig von XPA.

Abbildung 2: Modell für den Aufbau des menschlichen NER-Exzisions-Komplexes. (Volker et al., 2001).

Nach erfolgter Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen

Oligonukleotids wird die entstandene Lücke durch eine DNA-Neusynthese durch die

Polymerasen δ und ε mit Hilfe von PCNA, RPA und RFC aufgefüllt. Die Ligation durch die

Ligase I schließt letztendlich den Reparaturprozess ab (zusammengefasst in Friedberg, 2001).

TFIIH

XPG XPA-RPA

ERCC1-XPF

XPC-hHR23B

Einleitung

11

2.3.2 Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden

UV-Strahlung kann in drei Wellenlängenbereiche eingeteilt werden. UVA umfasst die

Wellenlängen von 400 bis 320 nm, UVB die von 320 bis 290 nm und UVC schließt den

Bereich zwischen 290 und 100 nm ein. Als umweltrelevante, DNA-schädigende UV-

Strahlung spielen nur UVA und UVB eine Rolle, da Wellenlängen kleiner 320 nm fast

vollständig von der Ozonschicht absorbiert werden. Dabei handelt es sich bei den durch

UVA-Strahlung induzierten Schäden hautsächlich um oxidative Basenschäden, während

UVB-Strahlung, analog zu UVC-Strahlung, DNA-Photoprodukte induziert. Da allerdings das

Absorptionsmaximum der Basen innerhalb der DNA bei 260 nm liegt und somit durch

Bestrahlung mit UVC eine effiziente photochemische Reaktion stattfindet, wird in den

meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. UVB- und UVC-Strahlung führen

hauptsächlich durch eine [2+2]-Cycloaddition benachbarter Pyrimidine zur Bildung von zwei

Produkten, zum einen von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPD), die mit ca. 75 % den

Hauptteil der Photoprodukte einnehmen und zum anderen von (6-4)-Photoprodukten

(Abbildung 3) (van Steeg und Kraemer, 1999).

Abbildung 3: Entstehung von DNA-Schäden nach UVC-Bestrahlung.

Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer

(6-4)-Photoprodukt

UVC-Strahlung

Einleitung

12

Nach heutigem Kenntnisstand wird zusätzlich zum XPC einem weiteren Protein, dem DDB-

Komplex bestehend aus dem XPE-Genprodukt p48 (DDB2) und p127 (DDB1) eine Rolle im

ersten Schritt der Schadenserkennung zugeschrieben. Dieser Komplex scheint vor allem bei

der Schadenserkennung von CPDs von Bedeutung zu sein, indem er die Anlagerung von XPC

an CPDs vermittelt (Fitch et al., 2003b; Wang et al., 2004). XPC erkennt eine spezifische

DNA-Struktur, die aufgrund einer Störung der Basenpaarung infolge des DNA-Adduktes

einzelsträngige Bereiche innerhalb der DNA-Doppelhelix beinhaltet. (6-4)-Photoprodukte

führen zu einer stärkeren Helixverzerrung als CPDs und können somit vermutlich direkt

durch XPC erkannt werden. CPDs werden nicht komplett von XPC erkannt und benötigen

zunächst die Bindung des DDB-Komplexes (Sugasawa et al., 2002). Ein weiterer Grund für

die unterschiedliche Schadenserkennung der beiden Photoprodukte besteht in der Tatsache,

dass sich (6-4)-Photoprodukte weniger häufig in Nukleosomen gebundener DNA ereignen als

CPDs (Fitch et al., 2003a; Thoma, 1999). Für die Reparatur im Kontext mit Chromatin ist

zunächst ein DNA-Remodeling von Nöten, um die Zugänglichkeit der DNA für die NER-

Proteine zu gewährleisten. Hwang et al. (1998) erkannten ein Tryptophan-Asparaginsäure-

Motiv (WD-Motiv) im p48 Protein, das eine Ähnlichkeit zu den WD-Motiven in Proteinen

besitzt, die in der Re-Organisation von Chromatin involviert sind. So z.B. in einer

Untereinheit des „chromatin assembly factors“ CAF-1, dessen Bezug zur Reparatur von UV-

induzierten Schäden bereits von Gaillard et al. (1996) gezeigt wurde. Des Weiteren konnte

eine Interaktion zwischen DDB und der CBP/p300 Histon-Acetyl-Transferase gezeigt

werden, die als Folge einer Acetylierung von Histonen zur Relaxation des Chromatins führt

(Datta et al., 2001; Moser et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002). Im Anschluss an die

Anlagerung des DDB-Komplexes an die DNA kommt es zu einer Ubiquitinierung von DDB2.

Dies hat den proteasomalen Abbau von DDB2 zur Folge, wodurch dann XPC an das DNA-

Addukt binden kann (Chen et al., 2001; Matsuda et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002;

Sugasawa et al., 2005).

Abbildung 4: Model für die Schadenserkennung von UV-induzierten Photoprodukten (Adimoolam und Ford, 2003; Ford, 2005).

6-4PP CPD

DDB2

DDB1

XPC hHR23

Ubiquitin DDB2

XPC hHR23

Einleitung

13

2.4 Das Tumorsuppressorprotein p53

2.4.1 Eigenschaften des p53 Proteins

Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität hat das Tumorsuppressorprotein p53 eine

große Bedeutung. Seine tumorsuppressive Eigenschaft zeigt sich schon allein durch die

Tatsache, dass das Gen, welches für p53 kodiert, in ca. 50 % aller menschlichen Tumoren

mutiert ist. Die meisten Mutationen ereignen sich in Bereichen des Gens, die für die DNA-

Bindungsdomäne des Proteins kodieren. Dabei handelt es sich oftmals um Punktmutationen

(Martin et al., 2002). p53 ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 53 kDa. Seine

Sequenz lässt sich in eine N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine DNA-

Bindungsdomäne und eine C-terminale regulatorische Region einteilen. Die C-terminale

Domäne beinhaltet drei funktionelle Motive, zum einen drei Kernlokalisierungssignale und

ein Kernexportsignale, die die subzelluläre Lokalisation regulieren sowie eine

Oligomerisierungsdomäne (Abbildung 5) (Stewart und Pietenpol, 2001; Michael und Oren,

2003).

Abbildung 5: verschiedene Domänen des p53 Proteins (Michael und Oren, 2003).

NLS: Kernlokalisierungssignal; NES: Kernexportsignal. Die Eigenschaft, als Tumorsuppressorprotein zu fungieren, lässt sich auf seine Funktion als

Transkriptionsfaktor zurückführen. Wie Cho et al. (1994) sowie Clore et al. (1994) zeigten,

bindet p53 in seiner aktiven Form als Tetramer bestehend aus vier identischen Untereinheiten

an DNA, die vier Wiederholungen der Pentamersequenz 5´-Pu-Pu-Pu-C-A/T-3´ enthält und

steuert so die Expression einer Vielzahl von Genen. Reguliert werden u.a. Gene, die in die

Zellzykluskontrolle, in die Apoptose aber auch direkt in die DNA-Reparatur involviert sind.

Einleitung

14

2.4.2 Regulation und Modulation des p53 Proteins

In normalen ungestressten Zellen unterliegt das Protein einem ständigen Ubiquitin-

vermittelten mdm2 abhängigen Abbau und wird somit auf einem niedrigen Level in der Zelle

gehalten (Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten). Das Protein mdm2 bindet hierzu an die

Transaktivierungsdomäne im N-teminalen Bereich des p53 Proteins (siehe Abbildung 5) und

überträgt dann als E3-Ligase Ubiquitinreste auf p53, wodurch der Abbau durch das 26S-

Proteasom eingeleitet wird (Abbildung 6).

Abbildung 6: Ubiquitin-vermittelter Proteinabbau (Ciechanover, 1998).

(A) Konjugation von Ubiquitin an das zu degradierende Protein. (B) Abbau des Proteins durch das 26S-Proteasom. (1) Aktivierung von Ubiquitin durch E1. (2) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E1 auf ein Mitglied der E2-Familie. (3) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E2 auf eine substratspezifische E3-Ligase. (4) Ausbildung einer mit dem Substrat kovalent verknüpften Polyubiquitin-Seitenkette. (5) Bindung des polyubiquitinierten Substrats an den Ubiquitin-Rezeptor in der 19S-Unterheinheit des 26S-Proteasoms und proteolytische Spaltung des Substrats zu kurzen Peptiden durch die 20S-Untereinheit. (6) Recycling von Ubiquitin durch Isopeptidasen.

A B

Einleitung

15

Infolge von DNA-Schäden kommt es zu verschiedenen Modifikationen, wie Acetylierung und

Phosphorylierung am Protein. Phosphorylierungen haben zur Folge, dass die Bindung von

mdm2 verhindert wird und somit kein Abbau des Proteins mehr stattfinden kann. Dies führt

somit zu seiner Stabilisierung und Erhöhung der Halbwertszeit. Acetylierungen erhöhen die

Sequenz-spezifische DNA-Bindung an so genannte p53 responsive Elemente in der

Promotorregion bzw. in intronischen Segmenten seiner Zielgene und führen somit zu deren

Transkription (zusammengefasst in Hainaut und Hollstein, 2000; Stewart und Pietenpol,

2001).

2.4.3 Struktur des p53 Proteins

Die Bindung von p53 an spezifische DNA Sequenzen wird durch seine

konformationsspezifische Struktur in der zentralen Bindungsdomäne (Aminosäuren 102-292)

vermittelt. Die Struktur besitzt ein Sandwich von 2 ß-Faltblättern, bestehend aus 4 bzw. 5 ß-

Strängen, des Weiteren ein Loop-β-Faltbatt-Helix-Motiv, das mit der großen Furche der DNA

interagiert sowie ein Loop-Helix-Motiv (L2/L3), das mit der kleinen Furche der DNA

interagiert. Das Motiv L2/L3 wird durch die Koordinierung eines Zink-Ions mittels dreier

Cysteine (Cys176, Cys238, Cys242) und eines Histidins (His179) stabilisiert (Abbildung 7

und Abbildung 8).

Im Gegensatz zu so genannten Zinkfingerproteinen, in denen sich durch die Koordination

eines Zink-Ions eine fingerähnliche Struktur ausbildet, die sich in die große Furche der DNA

einlagert, ist im p53 die Zink-bindende Domäne nicht direkt an der DNA-Bindung beteiligt.

Der Hauptkontakt zwischen DNA und p53 wird stattdessen über Arg248 innerhalb des L3-

Loop vermittelt und erfolgt über die kleine Furche der DNA. Das Vorhandensein des Zink-

Ions ist aber dennoch essenziell für seine Struktur und Funktion als Transkriptionsfaktor. Eine

Behandlung mit Metallchelatoren führt zu einer Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur,

wodurch es durch Auffaltung des Proteins zum Verlust der Tertiärstruktur und damit auch zu

einem Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit kommt (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et

al., 1998; Meplan et al., 2000). Ebenso führte eine Oxidation der Cysteine mittels Diamid zu

einer Konformationsänderung und damit zu einer Hemmung der DNA-Bindung (Hainaut und

Milner, 1993a). Darüber hinaus resultierte eine Substitution der Zink-bindenden Cysteine

gegen Lysin in einer verminderten DNA-Bindung von p53 (Rainwater et al., 1995).

Einleitung

16

Abbildung 7: Topologisches Diagramm der Sekundärstruktur von p53 (Cho et al., 1994).

Abbildung 8: DNA-Bindungsdomäne von p53 (modifiziert nach Wang et al., 2001).

Zink-Ion

Einleitung

17

2.4.4 Auswirkungen von Mutationen in p53

Als Folge von Mutationen im Gen, das für das p53 Protein codiert, kann es zu einem

Funktionsverlust als Tumorsuppressorprotein kommen. Die meisten Mutationen führen zu

einer Beeinträchtigung der sequenzspezifischen Transaktivierungs-Aktivität, wodurch die

Expression von Genen, die z.B. in der Zellzykluskontrolle und der Apoptose involviert sind,

beeinträchtigt wird. Dennoch zeigten verschiedene Studien, dass bestimmte Arten von

Mutationen, so genannte gain-of-function-Mutante zu einem Funktionsgewinn des Proteins

führen, die dem Protein eine onkogene Eigenschaft verleihen. Eine der zusätzlichen

Funktionen ist die Hochregulierung von Genen, die für die Steuerung der Zellproliferation

zuständig sind (z.B. c-myc, c-fos, PCNA, EGFR). Ein weiterer Mechanismus, durch den

Mutationen in p53 heterozygoten Zellen zur Tumorprogression beitragen könnten, ist die

dominant-negative Inhibierung der Wildtyp-Form durch mutantes p53. Die infolge einer

Aktivierung von wildtyp p53 erfolgten Tetramerisierung und somit die sequenzspezifische

DNA-Bindung kann durch die Bildung von Hetero-Oligomeren aus Wildtyp- und „mutanter“

Form inhibiert werden (Chan et al., 2004; Sigal und Rotter, 2000; van Oijen und Slootweg,

2000).

2.4.5 Rolle von p53 in der NER

Erste Hinweise darauf, dass p53 eine Rolle in der NER spielt, kommen von Beobachtungen

von Wang et al. (1995) die zeigten, dass p53 mit den Helikasen XPB und XPD wechselwirkt.

Allerdings zeigen in vitro Versuche keine Notwendigkeit von p53 für den Ablauf der NER, so

dass p53 eine Rolle in der NER im Kontext mit Chromatin zu spielen scheint. Des Weiteren

zeigten Versuche an Hautfibroblasten, die homozygote Mutationen des p53-Gens tragen, dass

p53 für die globale genomische Reparatur von UV-induzierten CPDs benötigt wird, während

die transkriptionsgekoppelte Reparatur unbeeinflusst ist (Ford und Hanawalt, 1995). Die

Reparatur wurde mit Hilfe der T4-Endonuklease, die spezifisch CPDs erkennt, gemessen.

Ford und Hanawalt (1997) konnten mittels eines Immunoassays mit spezifischen Antikörpern

gegen CPDs und auch gegen (6-4)-Photoprodukte zeigen, dass der Effekt von p53 auf die

Reparatur von (6-4)-Photoprodukte, die sich im Gegensatz zu CPDs weniger häufig in

Nukleosomen gebundener DNA ereignen, geringer ist als auf CPDs. Hwang et al. (1999)

sowie Adimoolam und Ford (2002) konnten zeigen, dass p53 als Transkriptionsfaktor die

Einleitung

18

NER-Proteine p48 und XPC induziert und somit eine indirekte Rolle in der NER einnimmt.

Für eine Anlagerung des Schadenserkennungsprotein XPC an CPDs ist p53 essenziell. Dies

ist vermutlich auf die Induktion von p48 infolge von DNA-Schäden zurückzuführen (Wang et

al., 2003). Die Beteiligung von p48 in der NER und seine Rolle beim DNA-Remodeling

wurde schon in Kapitel �2.3.2 vorgestellt. Allerdings zeigen Arbeiten von Rubbi und Milner

(2003), dass XPE-Zellen eine normale UV-induzierte Chromatin-Relaxation aufweisen, so

dass die p53 vermittelte Relaxation unabhängig von p48 ist. Ebenso wie p48 ist auch p53 in

der Lage, die Histon-Acetyltransferase p300 an Chromatin zu rekrutieren und so eine Histon

Acetylierung auszulösen. Es scheint von Bedeutung zu sein, zwischen Chromatin-Relaxation,

für die p48 entbehrlich ist und Chromatin-Remodeling, das durch p48 eingeleitet wird, zu

unterscheiden (Allison und Milner, 2004).

Abbildung 9: Auslösung der Transkription von DDB2 und XPC durch Bindung von p53 an p53 responsive Elemente (p53RE) (modifiziert nach Adimoolam und Ford, 2003).

DDB2 p53RE

p53

XPC p53RE

p53

p53

Einleitung

19

2.4.6 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle

Eine Zelle durchläuft von einer Teilung bis zur nächsten vier Phasen im Zellzyklus

(Abbildung 10).

Abbildung 10: Übersicht über die einzelnen Phasen des Zellzyklus (Eisenbrand und Metzler, 1994).

Nach der Zellteilung (M-Phase) geht die Zelle in die so genannte G1-Phase über. Hier wird

die Zellmasse verdoppelt und Nukleotide für die nächste Phase, die S-Phase (Synthesephase)

synthetisiert. In der S-Phase wird die DNA repliziert bis dann nach einer zweiten Ruhephase

(G2-Phase) die Zellteilung stattfindet und so an deren Ende zwei identische Zellen vorliegen.

In einer typischen, sich teilenden eukaryotischen Zelle verbleibt die Zelle etwa 12 Stunden in

der G1-Phase, sechs bis acht Stunden in der S-Phase, bis sie dann nach einer Ruhephase (G2-

Phase) von ca. drei bis sechs Stunden in die etwa 30 Minuten anhaltende Mitose übergeht.

Die exakte Länge der einzelnen Phasen variiert allerdings zwischen Zelltyp und

Wachstumsbedingungen (Shackelford et al., 1999).

Um zu gewährleisten, dass sich auftretende DNA-Schäden durch fehlerhafte Replikation nicht

in Mutationen manifestieren, besitzt eine Zelle mehrere Kontrollpunkte im Zellzyklus. Die

Zelle kann hier den Zellzyklus vorübergehend arretieren, um Zeit zur Reparatur der Schäden

zu gewährleisten. An der Kontrolle des Zellzyklus ist ein komplexes, interargierendes

Netzwerk verschiedener regulatorischer Faktoren involviert. Im Zentrum der Regulation

stehen zunächst einmal die CDKs (cyclin dependent kinase) mit ihren regulatorischen

Untereinheiten, den Cyclinen. Die Assoziation der Cycline mit den CDKs bildet den ersten

Schritt ihrer Aktivierung. Im zweiten Schritt muss der Cyclin-CDK-Komplex durch eine

Einleitung

20

CAK (CDK activating kinase) phosphoryliert werden. Ein wichtiges Substrat, welches durch

CDKs phosphoryliert wird, ist das Tumorsuppressorprotein pRB, das Produkt des

Retinoblastom-Gens. Dieses Protein hat eine wichtige Funktion im G1-Kontrollpunkt. Der

G1-Kontrollpunkt, auch Restriktionspunkt genannt, ist der am besten untersuchte

Kontrollpunkt. Die Rolle von p53 wird hier gut verstanden. p53 wird infolge von auftretenden

DNA-Schäden phosphoryliert und kann dann als Transkriptionsfaktor die Expression des

CDK-Inhibitors p21 induzieren. In normalen menschlichen Fibroblasten liegt p21 in einem

quartären Komplex zusammen mit Cyclin, CDK und PCNA vor. Durch Bindung eines

weiteren p21 Proteins, infolge einer verstärkten Expression, wird die Phosphorylierung und

somit die Aktivierung des Cyclin-CDK-Komplexes durch die CAK verhindert (Gartel et al.,

1996). Dies hat zur Folge, dass pRB nicht mehr phosphoryliert werden kann. In der

hypophosphorylierten Form bindet pRB den Transkriptionsfaktor E2F. Erst durch die

Phosphoryierung des pRB durch die Cyclin-CDK-Komplexe wird seine Affinität zum E2F

reduziert und so der Trankriptionsfaktor freigesetzt. Dieser induziert die Transkription

wichtiger Gene, deren Produkte für den Fortgang durch die S-Phase essenziell sind (Bartek

und Lukas, 2001) so z.B. Dihydrofolatreduktase, DNA-Polymerase α, Cyclin A und E,

Thymidinkinase, sowie E2F selbst (zusammengefasst in Pucci und Giordano, 1999).

Die Induktion von p21 kann allerdings auch in einem S-Phasenarrest resultieren. Durch seine

Bindung an PCNA, eine Untereinheit, die von der Polymerase δ benötigt wird, verhindert p21

den Elongationschritt der DNA-Replikation (Waga und Stillman, 1998). Da allerdings PCNA

allgemein ein für die DNA-Synthese essenzieller Faktor ist, und somit auch für eine DNA-

Neusynthese infolge stattfindender Reparatur benötigt wird, wurde die Hemmung von PCNA

durch p21 zunächst kontrovers diskutiert. Während Li et al. (1994) keinen inhibierenden

Effekt von p21 auf die DNA-Reparatur feststellen konnten, zeigten Studien von Cooper et al.

(1999), sowie von Pan et al. (1995) eine Hemmung der Reparatur. Allerdings zeigte sich hier,

dass die NER im Gegensatz zu der in der S-Phase stattfindenden DNA-Replikation, weniger

sensitiv gegenüber einer Hemmung durch p21 ist.

Wie bereits Rhind und Russell (2000) darstellten scheint die Reihenfolge, dass zunächst die

Replikation gestoppt bis anschließend durch die Reparatur der Schäden der Zellzyklus

fortgesetzt wird, ein veraltetetes Modell zu sein. Vielmehr scheint der S-Phasenkontrollpunkt

eine Modifikation der DNA-Replikation zur Folge zu haben, indem eine

rekombinationsabhängige Reparatur aktiviert wird. Infolge von UV-Schäden kann es auch zur

sogenannten PPR (post-replication repair) durch eine spezielle Polymerase η, dem

Genprodukt von XPV kommen.

Fragestellung

21

3 Fragestellung

Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu

Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial

nur schwach ausgeprägt ist. Empfindliche Zielstrukturen für Metallverbindungen sind Zink-

bindende Domänen in so genannten Zinkfingerproteinen. Drei Prozent der Gene codieren für

Zinkfingerstrukturen. Das Strukturelement ist häufig in Transkriptionsfaktoren beinhaltet. Ein

wichtiger Transkriptionsfaktor mit einer Zink-bindenden Struktur ist das Tumorsuppressor-

protein p53. Das Protein ist in einer Vielzahl von Mechanismen zum Schutz der Zelle

beteiligt, so z.B. in der Zellzykluskontrolle, in der Apoptose, aber auch in der DNA-

Reparatur.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl löslicher als

auch partikulärer Cadmiumverbindung auf die Struktur und die damit verbundene Funktion

des Tumorsuppressorproteins p53. Ein möglicher Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse sowie

auf die Zellzykluskontrolle soll aufgeklärt werden. Da Cadmium in der Umwelt meist in

partikulärer Form als CdO vorkommt ist die Abklärung der Frage, ob das Wirkspektrum von

löslichem CdCl2 dem des partikulären CdO entspricht von zentraler Bedeutung für die

Risikobewertung von umweltrelevanten Cadmiumverbindungen. Ausgehend von einer

Hemmung der Reparatur UV-induzierter und BPDE-induzierter DNA-Schäden, soll in

Kombinationsuntersuchungen die Genexpression zweier Zielgene von p53, p48 und XPC,

untersucht werden. Die Genprodukte sind in die Schadenserkennung der

Nukleotidexzisionsreparatur involviert. Hierzu muss zunächst die Real Time RT-PCR-

Methode etabliert werden, mit der die Amplifikation eines Oligonukleotids in Echtzeit

verfolgt werden kann und quantitative Aussagen getroffen werden können. Ein weiterer

wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die

Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, muss der Zellzyklus vorübergehend

angehalten werden bis die Schäden repariert sind, damit sie sich nicht infolge stattfindender

DNA-Replikation in Mutationen manifestieren können. Das Genprodukt von p21 besitzt hier

eine große Bedeutung und wird ebenfalls über p53 reguliert. Somit soll des Weiteren die

Genexpression von p21 untersucht werden. Versuche zur Zellzyklusphasenverteilung am

Durchflusszytometer in Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung sollen letztendlich

zeigen, ob Cadmiumverbindungen in die Zellzykluskontrolle eingreifen.

Material und Methoden

22

4 Material und Methoden

Eine Auflistung von allen eingesetzten Chemikalien und Lösungen, deren Konzentrationen

sowie eine Liste der verwendeten Geräte ist im Anhang zu finden.

4.1 Zellkultur

Medien, Puffer, Lösungen und alle verwendeten Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur

wurden sterilfiltriert oder autoklaviert bzw. hitzesterilisiert.

4.1.1 Zellen

In der vorliegenden Arbeit wurde die humane Zelllinie A549 (Lungenadenokarzinomzellen)

eingesetzt. Die Zellen werden in einem Einfriermedium bestehend aus 90 % FKS (fötales

Kälberserum) und 10 % DMSO bei -196°C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Kultiviert

werden sie in DMEM-Medium mit 10 % FKS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml

Streptomycin bei 37°C, 5 % CO2-Atmosphäre und 100 % Luftfeuchtigkeit. Die Zellen

wachsen als Monolayer mit einer Generationszeit von etwa 24 Stunden. Bei etwas 70 %

Konfluenz werden die Zellen abtrypsiniert, in neue Schalen ausgesät und mit frischem

Medium versetzt. Die Zellen werden mittels PCR auf Kontamination mit Mykoplasmen

getestet.

4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit

Mit Hilfe der Koloniebildungsfähigkeit von Zellen kann die Zytotoxizität der zu

untersuchenden Verbindung ermittelt werden. Hierfür wird die Zellzahl nach Ablauf der

Inkubationszeit bestimmt, eine definierte Anzahl von Zellen weitergesetzt und diese unter

normalen Wachstumsbedingungen mehrere Tage kultiviert. Anhand der, im Vergleich zu

unbehandelten Zellen, Anzahl gebildeter Kolonien lässt sich feststellen ob und in welchen

Konzentrationen das getestete Agens zu Langzeitschäden, die die Reproduktionsfähigkeit der

Zellen beeinflussen, führt.


23

Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit werden jeweils 1 x 106 Zellen in eine

Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut. Nach einem

Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Verbindung,

indem die entsprechende Menge an jeweiliger Stammlösung in das Kulturmedium zupipettiert

wird. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird das Medium abgenommen und die Schalen

werden mit je 5 ml Medium gewaschen. Die Zellen werden abtrypsiniert, die Zellzahl wird

bestimmt und jeweils 300 Zellen werden in eine Zellkulturschale (60 x 15 mm) mit 5 ml

frischem Kulturmedium überführt. Nach etwa 7 Tagen im Brutschrank sind die Kolonien mit

bloßem Auge sichtbar. Das Medium wird abgenommen, die Zellen werden mit PBS

gewaschen und mit 2-3 ml 100 %igem Ethanol fixiert. Durch eine Blaufärbung der Kolonien

mit Giemsa-Farbstoff können die Kolonien ausgezählt werden.

4.2 Behandlung der Zellen

4.2.1 Inkubation

Für die Inkubation mit dem wasserlöslichen CdCl2 wird eine Stammlösung (10 mM) in

bidestillierten Wasser angesetzt, sterilfiltriert und bei 4°C gelagert. Je nach gewünschter

Endkonzentration im Kulturmedium wird nach Bestimmung des Kulturmediumvolumens die

entsprechende Menge der Stammlösung zupipettiert.

Die Stammsuspension des schlecht löslichen, partikulären CdO wird unmittelbar vor

Versuchsbeginn hergestellt. Hierfür werden die Partikel für 30 min bei 110°C sterilisiert und

anschließend die Stammsuspension (0,5 mg/ml) in bidestilliertem autoklaviertem Wasser

hergestellt. Um die Teilchen nahezu vollständig und fein verteilt in Suspension zu bekommen,

wird die Suspension 15 min im Ultraschallbad behandelt und im Anschluss 5 min auf dem

Vibrationsmischer geschüttelt.

4.2.2 UVC-Bestrahlung

Für die Kombinationsuntersuchungen wird als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung

(254 nm) verwendet. Vor der Bestrahlung der Probe wird mit einem Dosimeter eine Dosis-

Abstands-Kurve aufgenommen, aus der dann die Bestrahlungsparameter (Entfernung der

Lampe zur Zellkulturschale, Zeit der Bestrahlung) entnommen werden.


24

Zur Bestrahlung der Zellen wird nach Beendigung der Vorinkubation bzw. nach Ablauf der

Anwachsphase das Kulturmedium abgenommen und gesammelt. Um Reste des Mediums zu

entfernen wird die Zellkulturschale mit PBS gespült. Zur Bestrahlung werden die Schalen

ohne Deckel unter die UVC-Lampe gestellt und für 5 sec im Abstand von 30 cm bestrahlt

(entsprechend einer Dosis von 5 J/m2). Im Anschluss werden die Zellen mit dem jeweiligen

Ursprungsmedium versetzt und im Brutschrank gelagert.

4.3 Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer

In der vorliegenden Arbeit wird die Verteilung der Zellen im Zellzyklus mit einem

Durchflusszytometer bestimmt. Daher wird im Folgenden auf den Aufbau und das

Messprinzip eingegangen.

Ein Durchflusszytometer ist ein optisches Messsystem, mit dem Fluoreszenz- und

Streulichtsignale von Zellen, die sich in Suspension befinden, analysiert werden können.

4.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip

Die sich in Suspension befindlichen Zellen werden durch einen Flüssigkeitsstrom in einer

konisch zulaufenden Kapillare fokussiert (Abbildung 11). Die Abstände der Zellen

voneinander vergrößern sich dadurch auf dem Weg durch die Kapillare, so dass gewährleistet

ist, dass die Zellen nacheinander die Messstelle durchlaufen.

Abbildung 11: Aufbau der Messküvette eines Durchflusszytometers und Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung (Dickinson, 2000).


25

Passiert eine Zelle die Messstelle, wird sie von einem Laser bestrahlt, wodurch es zu

mehreren Effekten kommt. Zum einen wird das Licht gestreut, wobei es je nach Zellgröße

nach vorne (Vorwärtsstreulicht), und je nach Oberflächenbeschaffenheit zur Seite

(Seitwärtsstreulicht) gestreut wird. Zum anderen kommt es durch eine vorangehende Färbung

von Zellbestandteilen wie z.B. der DNA mittels eines fluoreszierenden Farbstoffes zu einem

Fluoreszenzsignal. Die Intensitäten der auftretenden Emissionen werden mit Hilfe eines

optischen Detektionssystems quantifiziert (Abbildung 12) (Schmitz und Rothe, 1994).

Abbildung 12: Aufbau des optischen Systems eines Durchflusszytometers (Schmitz und Rothe, 1994).

4.3.2 Fluoreszenzfärbung

Für die Zellzyklusmessungen wird der DNA-Gehalt einer Zelle mittels DAPI (4’, 6’-

Diamidino-2-phenylindol), einem spezifischen DNA-Farbstoff, bestimmt. Hierfür werden die

Zellen nach Ablauf der Inkubationszeit abtrypsiniert, gezählt und 1 x 106 Zellen in ein 15 ml

Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 1200 rpm wird der Überstand

entfernt und das Zellpellet in 1 ml PBS aufgenommen. Durch Zugabe von 3 ml 100 %igem

Ethanol (-20°C) unter Schütteln auf dem Vibrationsmischer werden die Zellen fixiert und bis

zur Fluoreszenzfärbung bei -20°C aufbewahrt.

Am Tag vor der Messung wird erneut bei 1200 rpm abzentrifugiert, der Überstand

abgenommen und das Zellpellet in 1 ml DAPI-Fertiglösung durch mischen suspendiert. Bis

zur Messung am Durchflusszytometer werden die Proben bei 4°C aufbewahrt.


26

4.3.3 Zellzyklusmessung

Die Intensität des erhaltenen Fluoreszenzsignals ist abhängig vom DNA-Gehalt der Zelle.

Dieser ist wiederum abhängig davon, in welcher Phase des Zellzyklus sich die Zelle befindet.

Während der G1-Phase besitzt die Zelle einen einfachen DNA-Gehalt. Im Verlauf der S-

Phase kommt es auf Grund der Replikation der DNA zu einem Anstieg des DNA-Gehalts, bis

am Ende der doppelte Gehalt vorliegt. Die Zelle besitzt also während der G2- und M-Phase

einen doppelten DNA-Gehalt, bis sie sich teilt und somit am Ende der M-Phase zwei Zellen

mit jeweils einfachem DNA-Gehalt entstehen (Abbildung 13).

Abbildung 13: Änderung des DNA-Gehalts während des Zellzyklusses (Dickinson, 2000). Für die Auswertung der durchflusszyotometrischen Analyse werden die Intensitätssignale

jeder Zelle, die dem DNA-Gehalt proportional sind, aufsummiert, wodurch eine

Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Mittels eines Algorithmus ermittelt die Software

schließlich die einzelnen Flächen des Histogramms, die den jeweiligen Phasen des

Zellzyklusses entsprechen (Abbildung 14).

Abbildung 14: DNA-Histogramm einer Zellzyklusmessung (Dickinson, 2000).


27

4.4 Bestimmung des p53 Proteingehaltes

Zur Bestimmung des p53 Proteingehaltes werden die Proteine aus den Zellen isoliert. Nach

Ermittlung der Proteinkonzentration nach Bradford (Bradford, 1976) wird ein Aliquot des

Zellextraktes denaturiert, auf ein SDS-Polyacrylamidgel (12 %) aufgetragen und die Proteine

bei einer Spannung von 100 V aufgetrennt. Im Anschluss erfolgt der Transfer der Proteine auf

eine PVDF-Membran. Auf jedem Gel wird ein Molekulargewichtsmarker mitgeführt der

gleichzeitig auch als Kontrolle des erfolgten Proteintransfers nach dem Westernblot dient.

4.4.1 Zelllyse

Zur Zelllyse werden 5 Millionen Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und bei

1200 rpm 3 min abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 100 µl RIPA-Puffer versetzt, in ein

Eppendorfreaktionsgefäß überführt und im Ultraschall sonifiziert (5 x pulse). Nach

Abzentrifugieren der Zelltrümmer (15.000 rpm, 15 min) kann der Proteingehalt im Überstand

bestimmt werden.

4.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford

Zur Proteinbestimmung nach Bradford werden jeweils 2 µl Proteinextrakt mit 98 µl Wasser

in einer 24-Mikrotiterlochplatte vermischt (Dreifachbestimmung) und dazu 900 µl

Bradfordlösung (Bio-Rad Reagenz) gegeben. Fünf Minuten nach Reagenzzugabe wird die

Absorption bei 595 nm in einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpektraFluor) bestimmt.

Durch die Bindung des in der Bradfordlösung enthaltenen Farbstoffs Coomasie Brillantblau

G 250 an Proteine verschiebt sich in saurer Lösung die Absorption von 465 nm nach 595 nm.

Zur Berechnung der Proteinkonzentration wird auf jeder Lochplatte eine Kalibriergerade mit

Rinderserumalbumin im Bereich von 1- 15 µg/ml mitgeführt.

4.4.3 Elektrophorese und Westernblot

20 µg Gesamtprotein wird mit 5 µl Lämmli-Ladepuffer (4x) versetzt, mit H2O auf 20 µl

aufgefüllt und bei 95°C für 5 min denaturiert. Im Anschluss werden die Proben auf ein

denaturierendes Popyacylamidgel (5 %iges Sammelgel, 12 %iges Trenngel) aufgetragen. Die


28

Elektrophorese erfolgt bei 80 V im Sammelgel und zur Trennung der Proteine im Trenngel

bei 100 V. Als Molekulargewichtsmarker wird auf jedem Gel ein Rainbow-

Molekulargewichtsmarker mitgeführt, anhand dessen Farben die 53 kD-Bande des p53-

Proteins zugeordnet werden kann. Zur Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran

werden die Proteine nach erfolgter Trennung in einer Semidry-Blot-Apparatur bei 0,8 A/cm2

Membran für 1 h auf eine PVDF-Membran geblottet.

4.4.4 Detektion durch Chemilumineszenz

Um aktive Bindungsstellen der Membran zu blockieren, wird die Membran nach dem

Westernblot für 30 min in Magermilchpulver (5 % in PBS) geschwenkt. Anschließend wird

die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur (oder bei 4°C über Nacht) mit dem Anti-

p53-Antikörper DO-7 (Mausserum) inkubiert. Hierzu wird die Membran mit einer Lösung

bestehend aus 3 µl des Antikörpers und 3 ml Blockierlösung luftblasenfrei eingeschweißt. Im

Anschluss erfolgt nach jeweils dreiminütigem, viermaligem Waschen der Membran in PBS

(0,3 % Tween 20) die Inkubation mit dem an Peroxidase gekoppelten Anti-Maus IgG-

Antikörper. Dazu werden 1,2 µl des Antikörpers in 3 ml Blockierlösung gegeben und dies

zusammen mit der Memran eingeschweißt. Nach Ablauf von einer Stunde erfolgt nach vier

Waschschritten mit PBS (0,3 % Tween 20) für jeweils drei Minuten die Detektion mittels

Chemilumineszenz. Hierzu wird die Membran für eine Minute mit etwa 1 ml der ECL-

Lösung von Amersham (1:1 Mischung) inkubiert und im Anschluss die Reaktion der

Peroxidase mit dem Substrat anhand der Chemilumineszenz detektiert.

4.4.5 Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53

Um zwischen Wildtyp- und „mutanter“-Konformation von p53 unterscheiden zu können,

wird eine Immunopräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt.

4.4.5.1 Zelllyse und Vorklärung

Die Zellen werden mit 500 µl Immunpräzipitationspuffer (4°C) lysiert, mittels Zellschaber

von der Zellkulturschale abgelöst und in 2,2 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Alle

nachfolgenden Arbeiten werden auf Eis durchgeführt. Die Zelltrümmer werden bei 15.000 g

für 5 min abzentrifugiert und der Überstand in neue Reaktionsgefäße überführt. Um

unspezifische Bindungsreaktionen zu minimieren werden die Proben vorgeklärt. Hierzu wird


29

pro Ansatz 1 µg Pab 416 zugegeben, ein Antikörper gegen das nicht in Lösung befindliche

SV40T-Antigen. Um das gebildete Präzipitat aus der Lösung zu entfernen, wird 20 µl Protein

A/G-Agarose-Lösung zugegeben und nach 45 min im Rotator bei 10.000 g für 1 min

abzentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und der Proteingehalt nach Bradford (siehe

Kapitel �4.4.2) bestimmt.

4.4.5.2 Immunopräzipitation

Abbildung 15: Schematische Darstellung einer Immunpräzipitation.

Für die Unterscheidung zwischen Wildtyp- und „mutanter“-p53-Konformation wird der

Zellextrakt nach Proteinbestimmung durch Verdünnung mit Immunpräzipitationspuffer auf

gleiche Proteinmenge und Volumina eingestellt. Jede Probe wird auf verschiedene Ansätze

aufgeteilt und anschließend die Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen

Antikörpern durchgeführt. Hiezu werden die entsprechenden Ansätze jeweils mit 1 µg

monoklonalem Antikörper (PAb 1620 = Wildtyp, PAb 240 = „mutante“ Konformation) und

15 µl Protein A/G-Agarose-Lösung versetzt. Nach 18 h im Rotor wird das gebildete Präzipitat

bei 10.000 g für 1 min abzentrifugiert (Abbildung 15). Das Pellet wird dreimal mit eiskaltem

Immunpräzipitationspuffer und zuletzt einmal mit eiskaltem PBS gewaschen. Der Rückstand

bestehend aus einem p53-Protein-anti-p53-Antikörper und Protein A/G-Agarose-Komplex

wird mit Lämmli-Ladepuffer versetzt und für 10 min bei 95 °C aufgekocht, wodurch der

Antikörper denaturiert, das p53-Protein in Lösung geht und nach erfolgter Elektrophorese

mittels Westernblot und Chemilumineszensdetektion quantifiziert wird. Hierzu wird wie unter

Kapitel �4.4.3 beschrieben vorgegangen. Da der für die Immunpräzipitation verwendete,

konformationsspezifische Antikörper aus der Maus stammt, wird als anti-p53-Antikörper für

den Westernblot ein Antikörper einer anderen Spezies (CM1 (Kaninchenserum)) eingesetzt,

da sonst ein gegen Maus IgG gerichteter sekundärer Antikörper, zusätzlich die schwere Kette

Zugabe von Antikörper

Zugabe von Protein A/G gekoppelt an Agarose

Zentrifugation Überstand

Pellet


30

des denaturierten, zur konformationsspezifischen Fällung verwendeten Antikörpers erkennen

würde und dies in einer Bande in Höhe des p53-Proteins resultieren würde. Als sekundärer

Antikörper wird somit ein mit Peroxidase gekoppelter anti-Kaninchen IgG-Antikörper

eingesetzt.

4.5 Bestimmung der relativen Genexpression

Um Unterschiede im Expressionslevel bestimmter Gene nach Inkubation mit einer

Testverbindung zu untersuchen wird eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wird die Gesamt-

RNA aus den Zellen isoliert, in cDNA umgeschrieben und die Expression des zu

untersuchenden Gens mittels spezifischen Primern mit Hilfe der PCR untersucht.

4.5.1 Probenvorbereitung

4.5.1.1 RNA-Isolierung

Die Isolation der RNA erfolgt mittels Säulenisolationskit von BD Bioscience. Das Prinzip

beruht auf einem Silikat-Filter, der Nukleinsäuren bindet und somit die RNA von Proteinen

und Zellbestandteilen abtrennt. Nach DNase-Verdau und verschiedenen Waschschritten kann

die RNA von der Säule eluiert werden.

Es werden jeweils 1 x 106 Zellen in eine Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml

Kulturmedium ausgestreut. Nach einem Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation

mit der zu untersuchenden Verbindung. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Zellen

abtrypsiniert, die Zellzahl bestimmt und 2 x 106 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen

überführt, bei 1200 rpm abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Zellpellet wird

in 1 ml PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und erneut bei

1200 rpm abzentrifugiert. Nach Abnehmen des Überstandes wird das Pellet mit 350 µl

Lysepuffer (R1-Puffer) und 3,5 µl Mercaptoethanol versetzt und durch fünfmaliges Aufziehen

durch eine Kanüle (∅ 0,4 mm) geschert. Im Anschluss wird das gleiche Volumen 70 %iges

Ethanol zugegeben, gemischt, die gesamte Lösung auf ein Reaktionsgefäß mit Filtereinsatz

überführt und bei 9000 g für 30 sec abzentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die

Säule mit 350 µl MDB-Puffer (membrane desalting buffer) versetzt. Nach Abzentrifugieren

bei 11 000 rpm für 1 min wird der Durchlauf erneut verworfen und ein DNase-Verdau auf der

Säule durchgeführt. Hierzu werden 95 µl DNase Reaktionsgemisch (10 µl DNase + 90 µl


31

DNase Reaktionspuffer) 15 min bei Raumtemperatur auf die Säule gegeben. Daraufhin

werden zum Abstoppen 200 µl RA2-Puffer auf den Filter gegeben und 30 sec bei 9.000 rpm

zentrifugiert. Die Säule wird im Anschluss auf ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und

mit 600 µl RA3-Puffer gewaschen. Nach Zentrifugieren für 30 sec bei 9.000 rpm wird der

Durchlauf verworfen und die Säule ein zweites Mal mit RA3-Puffer (250 µl) gewaschen.

Nach Zentrifugation für 2 min bei 13.000 rpm wird die RNA durch zweimaliges

zentrifugieren mit je 50 µl RNase freiem Wasser bei 13.000 rpm von der Säule eluiert. Die

Lagerung erfolgt bei -80°C.

4.5.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung

Zur Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA wird zunächst eine 1:50 Verdünnung

hergestellt. Hierfür werden 98 µl Wasser mit 2 µl der RNA-Lösung versetzt und im Anschluss

die Extinktion der verdünnten Lösung bei 260 nm bestimmt.

1 OD260nm = 40 µg RNA

4.5.1.3 RNA Gelelektrophorese

Zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA wird eine denaturierende RNA

Gelelektrophorese durchgeführt.

Hierzu wird ein 1,2 %iges formaldehydhaltiges Agarosegel hergestellt. Es werden 1,2 g

Agarose mit 83 µl Wasser und 5 ml 20 x MOPS-Puffer aufgekocht und nach Abkühlung auf

ca. 65°C mit 12 ml Formaldehydlösung (37 %) versetzt.

1 µg der isolierten Gesamt-RNA wird mit FDP (Formamid-Denaturierungs-Puffer) auf 15 µl

Gesamtvolumen gebracht und 10 min bei 65°C auf dem Heizblock denaturiert, so dass die

RNA einzelsträngig vorliegt. Nach Zugabe von ca. 1,5 µl Lämmli-Ladepuffer erfolgt die

Eletrophorese mit MOPS (1x) bei 60 V für ca. 2 h. Zur Detektion wird das Gel bei 520 nm

abfotografiert.

4.5.1.4 cDNA-Synthese

Die Synthese der cDNA erfolgt mittels cDNA-Synthesekit von Bio-Rad, welches auf einer

modifizierten MMLV reversen Transkriptase mit RNAse H+-Aktivität sowie einem Gemisch

aus Oligo(dT)- und random hexamer Primern basiert (Abbildung 16).


32

Abbildung 16: Schema der cDNA-Synthese.

Der Reaktionsansatz wird bei 4°C im Eisblock nach folgendem Pipettierschema pipettiert:

15 – x µl RNase freies Wasser x µl (entsprechend 1 µg) RNA-Probe 4 µl 5 x iScript Reaktiongemisch 1 µl iScript Reverse Transkriptase

Dieser Ansatz wird bei 25°C für 5 min inkubiert, damit sich die Primer an die einzelsträngige

RNA anlagern. Im Anschluss erfolgt bei 42°C die reverse Transkrition für 30 min. Durch eine

Erhitzung auf 85°C für 5 min wird die Reaktion letztendlich beendet und die synthetisierte

cDNA kann für die PCR eingesetzt werden.

4.5.2 Quantitative Real Time PCR

4.5.2.1 Prinzip

Die PCR (Polymerase Chain Reaction) wurde 1985 von K. B. Mullis entwickelt und dient zur

in vitro Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Das Reaktionsprinzip ist die enzymatische

Amplifizierung eines DNA-Abschnittes zwischen zwei Oligonukleotidprimern, die

gegenläufig an komplementären DNA-Strängen gebunden sind und den zu amplifizierenden

DNA-Abschnitt begrenzen. Die Reaktion basiert auf einer zyklischen Wiederholung von drei

Schritten: Denaturierung, Annealing und Elongation (Abbildung 17).

5´------------------------aaaaa-3´ mRNA Oligo-dT 5´------------------------aaaaa-3´ ttttt-5´ Reverse Transkriptase 5´------------------------aaaaa-3´ cDNA 3´------------------------ttttt-5´


33

Abbildung 17: Schema einer Polymerasekettenkeaktion (PCR).

Während der Denaturierungsphase wird der DNA-Doppelstrang aufgrund der Aufspaltung der

Wasserstoffbrücken durch hohe Temperatur zwischen den gegenüberliegenden Basenpaaren

aufgetrennt, so dass sich im nächsten Schritt, der Annealingsphase, die Primer an

komplementäre Sequenzen anlagern können. Im letzten Schritt kommt es bei 72°C, dem

Temperaturoptimum der Polymerase, zur Elongation d.h. zur Auffüllung der Stränge mit

Nukleotiden. In jedem Zyklus kommt es so zu einer Verdopplung der eingesetzten DNA-

Menge. Diese exponentielle Zunahme lässt sich mit folgender Gleichung beschreiben:

5´--------tgcaccaccaactgcttagc--------3´ 3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´

Denaturierung

5´--------tgcaccaccaactgcttagc--------3´

+

3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´

Annealing

5´---------tgcaccaccaactgcttagc--------3´ cgaatcg-5´

+

5´-tgcacca x 3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´

Elongation

5´--------tgcaccaccaactgcttagc--------3´ 3´--------acgtggtggttgacgaatcg-5´ X

+

X 5´-tgcaccaccaactgcttagc--------3´ 3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´


34

N = N0 x (1 + E)n

Aufgrund einer Konkurrenzreaktion zwischen Strang-Reannealing und Primer-Annealing bei

höheren Zyklenzahlen, sowie aufgrund einer Inaktivierung der Polymerase durch thermische

Belastung sowie durch Akkumulation von Pyrophosphat, das sich während der Reaktion

bildet, kommt es bei fortlaufender Reaktion zu einer Plateaubildung (Köhler, 1995; Mülhardt,

2003). Für eine Quantifizierung ist es entscheidend, den Zyklenbereich festzulegen, in dem

ein linearer Zusammenhang zwischen Ampifikatbildung und Zyklenzahl besteht. Der Vorteil

der Real Time PCR gegenüber der herkömmlichen PCR ist die Möglichkeit, den gesamten

Amplifikationsvorgang online zu verfolgen (Abbildung 18).

Abbildung 18: Vergleich densitometrische Auswertung konventioneller PCR (A) mit online-Auswertung bei der Real Time PCR (B).

Hierzu wurden in den letzten Jahren verschiedene Methoden entwickelt, die auf dem Einsatz

unterschiedlicher Fluorophore beruhen. Gemessen wird dabei die direkt oder indirekt mit der

DNA-Amplifikation verbundene Fluoreszenz, während bei der konventionellen PCR die

Proben nach einer definierten Zyklenzahl densitometrisch nach erfolgter Elektrophorese

vermessen werden (Bustin, 2000). In der hier vorliegenden Arbeit wird die DNA-

Amplifikation durch den Einsatz des Fluoreszensfarbstoff SYBR Green ermittelt. Hierbei

handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der unspezifisch in doppelsträngige DNA

A

B

N0 – Anfangsmenge der DNA

N – Menge an Amplifikat nach n Zyklen

n – Anzahl der Zyklen

E – Effizienz der PCR


35

interkaliert und somit mit fortschreitender Zyklenzahl zu einem Fluoreszenzanstieg führt

(Abbildung 19).

Abbildung 19: Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR Green während der Elongation durch die DNA-Polymerase.

Für den Probenansatz werden pro Reaktionsgefäß

12,5 µl SYBR Green Supermix 10,5 µl Wasser 0,5 µl forward Primer 0,5 µl reverse Primer 1 µl cDNA

eingesetzt. Um Pipettierfehler zu minimieren, wird für jede zu untersuchende cDNA-Probe

ein Mastermix angesetzt, der Supermix, cDNA und Wasser enthält. Dieser wird dann auf die

verschiedenen Ansätze verteilt (Gen X, Housekeeping Gen) und im Anschluss werden die

Primerpaare zugegeben.


36

4.5.2.2 Geräteaufbau

Der Aufbau des optischen Systems iCycler von Bio-Rad ist in Abbildung 20 dargestellt. Die

Proben werden mit Hilfe des Anregungsfilters mit einer Wellenlänge von 494 nm bestrahlt

und das emittierte Fluoreszenzlicht bei 521 nm wird am Detektor erfasst.

Abbildung 20: Aufbau des iCycler von Bio-Rad.

4.5.2.3 Effizienzbestimmung

Für optimierte Reaktionsbedingungen erhält man je nach zu untersuchendem Gen in der

Regel Effizienzen der PCR im Bereich von 0,78 bis 0,97 (Köhler, 1995). Die Effizienz der

Reaktion hängt u.a. von der Amplifikationslänge (kurze Amplifikate liefern größere

Effizienzen), von evtl. im Amplikon enthaltenen Sekundärstrukturen und vom G/C-Gehalt des

Amplikons ab. Geringere Effizienzen weisen auf eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch

Effizienzen größer 2, also größer 100 % sind bei der Verwendung von SYBR Green möglich.

Dies weist daraufhin, dass zusätzlich zu dem spezifischen zu untersuchenden Gen ein

weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird. Daher ist es notwendig zunächst die

Effizienzen zu bestimmen und evtl. die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur,

Annealingzeit, eingesetzte Primer) zu optimieren. Bei der Wahl der Primerpaare ist es wichtig

verschiedene Eigenschaften zu gewährleisten. Zum einen sollten sie eine Länge von 15 bis 20

Basen und einen G/C-Gehalt zwischen 50 und 60 %. besitzen. Um die Bildung von Primer-

Dimeren zu verhindern ist zum anderen darauf zu achten, dass forward und reverse Primer

keine 3´ komplementären Strukturen aufweisen. Eine zusätzliche Amplifizierung von

eventuell in der Probe enthaltenen DNA-Verunreinigung sollte durch Verwendung von

Intron-überspannenden Primern verhindert werden (Gassen, 1994; Köhler, 1995).

1 Wolfram-Lampe 2a/2b Filterrad mit 5 Positionen für Anregungs(2a)-

bzw. Emissions(2b)-Filter 3 Verstärker der Lichtintensität 4 Probenplatte 5 CCD (charge-coupled device)-Detektor


37

Die Effizienz lässt sich durch verschiedene Methoden bestimmen (Pfaffl, 1994):

• anhand einer Verdünnungsreihe

• anhand des absoluten Fluoreszenzanstiegs

• anhand mathematischer Algorithmen

In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Effizienz anhand einer Verdünnungsreihe

bestimmt. Daher wird im Folgenden näher darauf eingegangen.

Abbildung 21: Real Time PCR-Analyse einer hergestellten cDNA-Verdünnungsreihe (A)

mit daraus resultierender Auswertung (B).

A

B


38

Zunächst wird aus den zu untersuchenden cDNA-Proben eine Mischprobe hergestellt, in dem

die verschiedenen cDNA-Proben zu gleichen Teilen miteinander versetzt werden. Nach

Herstellung einer Verdünnungsreihe wird nach abgeschlossener PCR (Abbildung 21 A) die

eingesetzte cDNA-Menge in einer logarithmischen Funktion gegen den so genannten Ct-Wert

(Thresholdcycle) dargestellt (Abbildung 21 B). Die Ct-Werte entsprechen der Anzahl der

Zyklen die nötig sind, um ein konstant festgelegtes Fluoreszensniveau zu erreichen. Bei

diesem Wert befindet sich in allen Reaktionsgefäßen die gleiche Menge an neu synthetisierter

DNA. Daher ist die Zahl der Zyklen, die für die amplifikationsbedingte Fluoreszenzzunahme

zum Erreichen des Ct-Wertes erforderlich sind, invers proportional zu der Menge an

ursprünglich eingesetzter DNA. Die Effizienz (E) errechnet sich aus der Steigung (m) der

erhaltenen Geraden nach folgender Gleichung:

1101

−=−

mE (Ginzinger, 2002)

4.5.2.4 PCR-Protokoll

Die Real Time PCR-Analyse erfolgt über die iCycler Real-Time PCR Detection Software von

Bio-Rad. Das angewendete Analysenprogramm ist in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: PCR-Analysenprotokoll.

Cycle (Anzahl) Step Prozess Temperatur (°C) Zeit (min)

Cycle 1 (1x)

Step 1

Aktivierung der Polymerase

95

01:30

Cycle 2 (37x) Datengewinnung und Echtzeitanalyse

Step 1 Step 2 Step 3

Denaturierung Primer-Anlagerung Elongation

95 60 72

00:30 00:30 00:30

Cycle 3 (1x) Step 1

Denaturierung

95

01:00

Cycle 4 (1x) Step 1 Zusammenlagerung 60 01:00 Cycle 5 (70x) Datengewinnung und Echtzeitanalyse

Step 1

langsame Denaturierung

60

Steigerung der Temperatur nach

Zyklus 2 um 0,5ºC/10 sec

00:10

Cycle 6 (1x) Step 1

Ende

4

∞


39

4.5.2.5 Schmelzkurvenanalyse

Da es sich bei SYBR Green um eine unspezifische Interkalation handelt, wird bei dem

Fluoreszenzanstieg auch die Amplifikation unspezifischer Produkte wie z.B. die Bildung von

Primer-Dimeren oder die Bildung unspezifischer PCR-Produkte aufgrund unspezifischer

Primer-Bindung an die DNA erfasst. Daher muss nach abgeschlossener PCR die Spezifität

überprüft werden und evtl. müssen die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur,

Annealingzeit, eingesetzte Primer) optimiert werden.

Abbildung 22: Schmelzkurve (A) mit erhaltener Ableitungsfunktion (B).

Die mit SYBR Green markierten PCR-Produkte werden durch Erhöhung der Temperatur kontinuierlich bis zu ihrem definierten Schmelzpunkt denaturiert. Dies führt zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Ableitungsfunktion der relativen Fluoreszenzänderung über die Temperatur (-dRFU/dT) weist am Schmelzpunkt ein Maximum auf.

Eine Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produkten kann weitgehend

über eine Schmelzkurvenanalyse erfolgen (Abbildung 22). Hierbei werden die PCR-Produkte

nach abgeschlossener PCR kontinuierlich über einen bestimmten Temperaturbereich

A B

A

B


40

aufgeheizt. Währenddessen kommt es zu einer Denaturierung der Doppelstränge, wobei die

Denaturierungstemperatur u.a. von der Länge des PCR-Produktes abhängt. Am Schmelzpunkt

des Amplifikats kommt es zu einer schlagartigen Abnahme des Fluoreszenzsignals was sich

in der Ableitungsfunktion der Fluoreszenz gegenüber der Temperatur als Peakmaximum

detektieren lässt.

4.5.2.6 Relative Quantifizierung

Als Maß für die Quantifizierung werden die Ct-Werte herangezogen. Im Falle einer

100 %igen Effizienz der Reaktion verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge während der

exponentiellen Phase der PCR mit jedem Zyklus. Eine Probe, die zu Reaktionsbeginn doppelt

so viele DNA-Moleküle wie die Vergleichsprobe enthält, benötigt somit einen Zyklus

weniger, um den gleichen Ct-Wert zu erreichen. Anhand der unterschiedlichen Ct-Werte der

beiden Proben lässt sich also der relative Unterschied des Nukleinsäure-Gehaltes zwischen

den Proben berechnen (Walker, 2002).

Aufgrund von Schwankungen während der cDNA-Synthese und um Pipettierfehler beim

Einsatz der RNA-Menge für die cDNA-Synthese zu vermeiden, wird zusätzlich zu dem zu

untersuchenden Gen ein weiteres, so genanntes Housekeeping-Gen untersucht (Abbildung 23

und Abbildung 24). Hierbei handelt es sich um ein Gen, bei dem davon ausgegangen wird,

dass es unabhängig von äußeren Einflüssen d.h. unabhängig von der Behandlung der Zellen,

exprimiert wird. In der hier vorliegenden Arbeit wurde als Housekeeping-Gen GAPDH

(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase), einem Enzym, das in der Glykolyse beteiligt

ist, verwendet. Die für das zu untersuchende Gen erhaltenen Ct-Werte werden somit im

Endeffekt auf die für das Housekeeping-Gen erhaltenen Ct-Werte normalisiert. Mit der in

Kapitel �4.5.2.1 gezeigten Gleichung für den exponentiellen Reaktionsverlauf lässt sich somit

die relative Expression (R) der behandelten Probe in Bezug auf die unbehandelte Kontrolle

darstellen (Livak und Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001):

)()1(

)()1(,,

,,

GAPDHBehandeltGAPDHKontrolleGAPDH

XGenBehandeltXGenKontrolleXGen

CtCtE

CtCtER −+

−+=


41

Abbildung 23: relative Quantifizierung

Abbildung 24: Fließdiagramm

�Ct Gen X �Ct GAPDH

Threshold

Kontrolle, GAPDH

Kontrolle

Kontrolle, Gen X

Behandelt, GAPDH

Behandelt

Behandelt, Gen X

Zellen

RNA

cDNA

PCR

Ergebnisse und Diskussion

42

5 Ergebnisse und Diskussion

Im Vordergrund dieser Arbeit stand zunächst die Etablierung der Real Time RT-PCR-

Methode. Daher wird zuerst auf die Validierung der Messmethode eingegangen, bevor im

Anschluss die Effekte des für die Untersuchungen zur NER eingesetzten schädigenden Agens

UVC-Strahlung gezeigt werden. Um später auf die Wirkung von Cadmiumverbindungen in

Kombination mit UVC einzugehen, werden zuvor die Ergebnisse der jeweiligen Verbindung

aus den unterschiedlichen Teilbereichen der Fragestellung vorgestellt.

5.1 Messungen mit der Real Time PCR

Um die Eignung der Methode für die Analyse der Genexpression nachzuweisen, wurden für

jedes zu untersuchende Gen die Spezifität des Primers mittels Schmelzkurvenanalyse und die

Linearität mit Hilfe einer cDNA-Verdünungsreihe untersucht.

5.1.1 Schmelzkurvenanalyse

Zur Untersuchung der Spezifität der eingesetzten Primer, wurde nach abgeschlossener PCR-

Reaktion eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt.

Bei den eingesetzten Primerpaaren wurde darauf geachtet, dass keine komplementären

Strukturen enthalten sind, die zu einer Primer-Dimer-Bildung führen, und so in einer Primer-

Amplifizierung resultieren könnten. Dies würde sich in einem zusätzlichen Schmelzpunkt bei

niedrigeren Temperaturen zeigen. Analog hierzu würde auch die Amplifikation unspezifischer

Produkte in der Schmelzkurvenanalyse zu zusätzlichen Peaks führen. Eine Vervielfältigung

von DNA-Verunreinigungen in der Probe würde sich in einem zusätzlichen Peak oberhalb des

spezifischen mRNA-Peaks zeigen, da DNA aufgrund der enthaltenen Introns zu längeren

PCR-Produkten führt und somit höhere Temperaturen zur Denaturierung nötig sind. Um eine

Vervielfältigung von DNA zu vermeiden, wurden die RNA-Proben zum einen einem DNAse-

Verdau unterzogen, zum anderen wurden möglichst Intron-übergreifende Primer eingesetzt.

Alle zu untersuchenden Gene wiesen nur einen Schmelzpunkt auf, was auf die Spezifität der

eingesetzten Primer schließen lässt (Abbildung 25). Wie in Tabelle 3 zu erkennen ist,

korrelierte die Länge des Amplifikats mit der Höhe des Schmelzpunktes. So denaturierte p21


43

mit der geringsten Länge von 90 Basenpaaren bereits bei 84,5°C, während XPC mit einer

Länge von 112 Basenpaaren einen Schmelzpunkt von 87°C hatte. Die Schmelztemperatur

hängt allerdings nicht nur von der Länge, sondern zusätzlich auch vom G/C-Gehalt des

Amplifikats ab. Zwischen G/C kommt es zur Ausbildung von drei Wasserstoffbrücken im

Gegensatz zu zwei, die zwischen A/T gebildet werden. Hohe G/C-Anteile benötigen somit

höhere Temperaturen zur Denaturierung als A/T-Bereiche.

Abbildung 25: Schmelzkurvenanalyse der Amplifikate von GAPDH (A), XPC (B), p21 (C), p48 (D).

Die mit SYBR Green markierten PCR-Produkte wurden durch Erhöhung der Temperatur kontinuierlich bis zu ihrem definierten Schmelzpunkt denaturiert. Dies führt zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Ableitungsfunktion der relativen Fluoreszenzänderung über die Temperatur (-dRFU/dT) weist am Schmelzpunkt ein Maximum auf.

Tabelle 3: Eigenschaften der amplifizierten Templates.

Gen Amplifikatlänge (bp) Schmelztemperatur (°C)

GAPDH 90 84,5

p48 103 85

XPC 112 87

p21 97 86,5

B A

D C


44

5.1.2 Effizienzbestimmung

Zur Überprüfung der Linearität und Sensitivität wurde die Amplifikation der cDNA mittels

einer seriellen cDNA-Verdünnung gemessen. Die ermittelten Effizienzen für die untersuchten

Gene sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4: Effizienzbestimmung mittels cDNA-Verdünnungreihe.

Gen Effizienz (%)

GAPDH 93,6

p48 101,0

XPC 92,9

p21 83,7

In der Literatur werden für optimierte Reaktionsbedingungen je nach zu untersuchendem Gen

in der Regel Effizienzen im Bereich von 78 bis 97 % angegeben (Köhler, 1995). Die Effizienz

der Reaktion hängt u.a. von der Amplifikationslänge, evtl. im Amplikon enthaltenen

Sekundärstrukturen und vom GC-Gehalt des Amplikons ab. Geringere Effizienzen weisen auf

eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch Effizienzen größer 1, also größer 100 % sind bei

der Verwendung von SYBR Green möglich. Dies weist daraufhin, dass zusätzlich zu dem

spezifischen zu untersuchenden Gen ein weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird.

Sowohl die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalyse als auch die erhaltenden Effizienzen

verdeutlichen, dass die zugrunde liegenden PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur,

Annealingzeit, eingesetzte Primer) geeignet sind für das verwendete Testsystem.


45

5.2 UVC-Bestrahlung

Zur Untersuchung der über die NER vermittelten Beseitigung sperriger DNA-Addukte wird

als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt. Da das Absorptionsmaximum der

DNA bei 260 nm liegt und somit die photochemische Reaktion durch UVC-Strahlung sehr

effizient ist, wird in den meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. Durch UVC-Strahlung

wird ein gut definiertes Schadensspektrum erhalten, so kommt es vorwiegend zur Bildung

von CPDs und (6-4)-Photoprodukten (Ravanat et al., 2001).

Im Folgenden werden die Einflüsse von UVC-Strahlung auf die Koloniebildungsfähigkeit, die

Zellzyklusphasenverteilung, den p53-Gehalt und die Genexpression von durch p53 regulierten

Genen (p48, XPC, p21) gezeigt.

5.2.1 Koloniebildung

Zur Abschätzung der Bestrahlungsdosis, die zum einen eine genügend große Zahl an Schäden

verursacht, zum anderen aber das Überleben eines großen Anteils der Zellen sicherstellt,

wurde die Zytotoxizität der UVC-Strahlung anhand der Koloniebildungsfähigkeit in einem

Dosisbereich von 0 bis 20 J/m2 ermittelt.

Abbildung 26: Koloniebildungsfähigkeit von A549 Zellen nach UVC-Bestrahlung.

Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.


46

UVC-Bestrahlung führte zu einer rapiden Abnahme der Koloniebildungsfähigkeit mit

zunehmender UVC-Dosis. Während eine Bestrahlung mit 5 J/m2 noch in einer

Koloniebildungsfähigkeit über 70 % im Vergleich zu unbestrahlten Kontrollzellen resultierte,

war die Anzahl der Kolonien nach einer Behandlung mit 7,5 J/m2 nur noch bei etwa 50 %

(Abbildung 26). Für die nachfolgenden Versuche wurde eine UVC-Dosis von 5 J/m2

eingesetzt.

5.2.2 Induktion von p53

Das Protein p53 besitzt in ungestressten Zellen aufgrund eines ständigen Ubiquitin-

vermittelten mdm2-abhängigen Abbaus eine geringe Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten.

Infolge von DNA-Schäden wird die Bindung von mdm2 an p53 durch Phosphorylierung in

der N-teminalen Transaktivierungsdomäne des p53 verhindert und somit der Abbau von p53

reduziert (zusammengefasst in Alarcon-Vargas und Ronai, 2002; Giaccia und Kastan, 1998).

UVC-Strahlung generiert DNA-Addukte (CPDs und (6-4)-Photoprodukte). Zur Untersuchung

der zeitabhängigen Induktion des p53-Gehaltes in Folge der UVC-Bestrahlung, wurde der

p53-Protein-Gehalt zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer UVC-Bestrahlung durch eine

Westernblot-Analyse mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen p53 bei einer Dosis von

5 J/m2 bestimmt. Es zeigte sich eine starke Induktion des p53-Protein-Gehalts mit einem

Maximalgehalt drei Stunden nach der Bestrahlung. Daraufhin führte die Bestrahlung zu einer

Abnahme an p53, bis nach etwa 24 Stunden wieder annähernd das Niveau unbestrahlter

Zellen erreicht wurde (Abbildung 27).

Abbildung 27: Westernblot nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde ein Westernblot mit anti-p53-Antikörper DO-7 aus dem Zelllysat durchgeführt. Dargestellt ist ein Westernblot. Insgesamt wurden drei unabhängige Versuche durchgeführt, die alle das gleiche Ergebnis aufwiesen.

0 1 3 6 10 12 18 24 Zeit nach UVC-Bestrahlung (h)


47

Von einer Induktion von p53 in Folge von UVC-Stahlung berichteten ebenfalls

Untersuchungen von Ford und Hanawalt (1997) in menschlichen Fibroblasten. Allerdings

zeigten diese Zellen bei einer Bestrahlungsdosis von 20 J/m2 eine etwas verzögerte Induktion

mit einem Maximum zwischen 12 und 24 h. Dies könnte auf die in der Studie verwendete

primäre Zelllinie und somit längeren Generationszeit im Vergleich zu der in der hier

vorliegenden Arbeit verwendeten A549 Zellen zurückzuführen sein. Ebenfalls konnten

Studien von Hwang et al. (1999) sowie von Adimoolam und Ford (2002) und Adimoolam et

al. (2001) eine Induktion von p53 durch UV-Strahlung nachweisen.

Der genaue Mechanismus für die Auslösung der Phosphorylierung und damit der Aktivierung

von p53 infolge von UVC- induzierter Schäden ist nicht bekannt. Dagegen gut untersucht ist

die Aktivierung infolge von �-Strahlung. Hier scheint der so genannten ATM (Ataxia

Telangiectasia mutated)-Kinase eine große Bedeutung zuzukommen. �-Strahlung führt zur

Bildung von Strangbrüchen, die eine Aktivierung der ATM und somit eine Phosphorylierung

von p53 zur Folge haben. Während AT-Zellen, in denen das Gen, das für ATM codiert,

mutiert ist, eine verzögerte Phosphorylierung von p53 infolge von �-Strahlung aufweisen, ist

die Aktivierung von p53 durch UV-Strahlung unbeeinflusst. Bei durch UV-Strahlung

induzierten Schäden spielt die so genannte ATR (Ataxia Telengiectasia Related)-Kinase eine

Rolle (zusammengefasst in Abraham, 2001; Caspari, 2000; Tibbetts et al., 1999). Der genaue

Auslöser für die p53-Phosphorylierung durch ATR ist allerdings nicht bekannt. Kaufmann

und Paules (1996) sowie Nelson und Kastan (1994) vermuten die Bildung von DNA-

Strangbrüchen, die kurzfristig während der Reparatur der durch UV-Strahlung induzierten

Photoprodukte gebildet werden. Allerdings führt eine Bestrahlung von XPA defizienten

Zellen ebenfalls zu einer p53-Akkumulation und dies bei geringeren UV-Dosen als für

normale Zellen zur Aktivierung nötig sind. In diesen Zellen ist allerdings die

Schadenserkennung und folglich auch die Inzision der DNA verhindert, so dass keine

intermediär gebildeten Strangbrüche infolge einer stattfindenden Reparatur entstehen können.

Dem gegenüber zeigen XPC defiziente Zellen, in denen nur die globale genomische Reparatur

beeinflusst ist, nicht aber die transkriptionsgekoppelte Reparatur, keine verstärkte p53

Aktivierung im Vergleich zu normalen Zellen. Diese Ergebnisse sowie die Beobachtung, dass

eine Blockierung der Transkription durch den RNA Polymerase Inhibitor α-Amanitin

ebenfalls zu einer p53 Akkumulation führt, lassen die Vermutung zu, dass DNA-Schäden in

aktiv transkribierten Genen der Auslöser der Aktivierung von p53 sein könnten (Yamaizumi

und Sugano, 1994; Ljungman und Zhang, 1996; Dumaz et al., 1997).


48

5.2.3 Genexpression von p21, p48 und XPC

p53 ist als Transkriptionsfaktor an der Expression einer Vielzahl von Genen involviert. Zur

Untersuchung der Auswirkung des erhöhten Proteingehaltes infolge der UVC-Bestrahlung auf

die Expression seiner Zielgene, wurde die Genexpression verschiedener, durch p53 regulierter

Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht.

5.2.3.1 p21

Für p21, ein Gen dessen Produkt in der Zellzykluskontrolle eine Rolle spielt, ist die p53-

abhängige Induktion in Folge von DNA-Schäden schon lange bekannt. Es zeigte sich ein

zeitabhängiger Verlauf des p21 mRNA-Gehaltes in Folge einer UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Abbildung 28: Relative Genexpression von p21 nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zu unbehandelten Kontrollzellen aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

Zunächst führte die Bestrahlung zu einer Induktion der Genexpression relativ zur auf 1

normierten Kontrolle. Zwischen drei und zehn Stunden nach der Bestrahlung wurden

Maximalwerte von vier- bis fünffach erhöhten mRNA Gehalten im Vergleich zur

unbehandelten Kontrolle erreicht. Ab 12 Stunden fand ein Rückgang der Genexpression statt


49

und erreichte nach etwa 18 Stunden einen noch etwa doppelten Wert im Vergleich zur

unbestrahlten Kontrolle, der bis hin zu 24 Stunden erhalten blieb (Abbildung 28).

5.2.3.2 p48

Zur Untersuchung der Kinetik der Induktion von p48 in den in der vorliegenden Arbeit

verwendeten menschlichen Lungenkrebszellen wurde die Genexpression mittels Real Time

RT-PCR ermittelt.

Die UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 verursachte eine zeitabhängige Steigerung der

Genexpression von p48 mit einer Verdopplung der mRNA-Menge im Vergleich zu

unbestrahlten Zellen nach etwa 10 bis 12 Stunden. Ab etwa 18 Stunden nach der Bestrahlung

näherte sich die Genexpression bis hin zu 24 Stunden dem Ausgangwert von unbehandelten

Kontrollzellen (Abbildung 29).

Abbildung 29: Relative Genexpression von p48 nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zu unbehandelten Kontrollzellen aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

Analog hierzu zeigten auch die Ergebnisse von Hwang et al. (1999) eine zeitabhängige

Induktion der mRNA von p48 durch UV-Strahlung in menschlichen Lungenfibroblasten. Hier

wurde von einer etwa zweifachen Induktion der Genexpression 16 Stunden nach der


50

Bestrahlung im Vergleich zu unbestrahlten Zellen berichtet. Somit entsprechen die

Absolutwerte der maximalen Induktion der in dieser Arbeit ermittelten relativen

Genexpression. Die im Vergleich zu den hier gezeigten Ergebnissen verzögerte Induktion von

p48, könnte auf der in der Studie eingesetzten primären Ziellinie und somit längeren

Generationszeit zurückzuführen sein.

5.2.3.3 XPC

Ein weiteres Gen, dessen Expression durch p53 reguliert wird, ist das XPC. Eine UVC-

Bestrahlung mit 5 J/m2 führte zunächst zu einer gesteigerten Expression, die etwa sechs

Stunden nach der Bestrahlung einen Maximalwert erreichte und im Vergleich zur

unbestrahlten Zellen einen doppelt so hohen mRNA-Gehalt aufwies. Die mRNA-Menge

nahm daraufhin nach etwa 12 Stunden ab, blieb allerdings bis hin zu 24 Stunden nach der

Bestrahlung auf im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle erhöhten Werten (Abbildung 30).

Abbildung 30: Relative Genexpression von XPC nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

Die Ergebnisse sind im Einklang mit Versuchen von Adimoolam und Ford (2002), in denen

eine Zeit- und p53-abhängige Induktion von XPC infolge einer UVC-Bestrahlung gezeigt

wurde.


51

5.2.4 Zellzyklusphasenverteilung

Ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die

Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, werden so genannte Kontrollpunkte aktiviert,

um einen Übergang der Zelle in die nächste Phase des Zellzyklus zu verhindern.

Um zu untersuchen, ob die durch UVC-Strahlung induzierten Photoprodukte zu einer

Aktivierung von Kontrollpunkten führen, wurde die Zellzyklusphasenverteilung von A549

Zellen nach einer Bestrahlung mit 5 J/m2 ermittelt. Hierzu wurden die Zellen zu

verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung fixiert, die DNA mit dem

Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbt und schließlich die vom DNA-Gehalt abhängige

Fluoreszenz am Durchlusszytometer bestimmt.

Problematisch ist allerdings die Anzahl der ausgestreuten Zellen pro Zellkulturschale. Bei zu

großer Konfluenz kommt es aufgrund der Kontaktinhibition zu einem Wachstumsstopp, der

sich in einem zunehmenden Anteil der G1-Phase bemerkbar macht (Tabelle 5). Um allerdings

zum Zeitpunkt des Bestrahlens gleiche Bedingungen und damit gleiche Konfluenz zu

gewährleisten, muss die ausgestreute Zellzahl möglichst gering gewählt werden, um im

gesamten Messbereich keine Konfluenz der Schale zu erhalten.

Tabelle 5: Einfluss der Konfluenz auf die Zellzyklusphasenverteilung in A549 Zellen.

Anzahl Zellen (105)

G1 S G2

4 55,7 29,3 15,0

10 61,3 24,5 14,2

15 70,8 18,6 10,6

20 75,9 13,7 10,4

In Abbildung 31 ist der Anteil der Zellen in den jeweiligen Phasen des Zellzyklus gegen die

Zeit nach der UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 aufgetragen. Es ist deutlich zu erkennen, dass die

Bestrahlung nach etwa sechs Stunden zu einer Zunahme des Anteils der Zellen in der S-Phase

führte, während im gleichen Maße der G1-Phasenanteil abnahm. Der maximale Anteil der

Zellen in der S-Phase zeigte sich im Bereich von zehn bis zwölf Stunden. In den darauf

folgenden Stunden näherten sich die Anteile der Zellen in den jeweiligen Phasen denen der


52

unbehandelten Kontrollzellen. Die nach etwa 12 Stunden erfolgte Aufhebung des S-

Phasenarrests könnte auf eine Reparatur der DNA-Schäden zurückgeführt werden.

Abbildung 31: Zellzyklusphasenverteilung nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde die Zellzyklusphasenverteilung am Durchflusszytometer ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen ± SD.

Verschiedene Arbeiten in menschlichen Zellen zeigen, dass die Reparatur von 6-4-PP sehr

schnell und effizient erfolgt, mit einer nahezu vollständigen Reparatur nach drei Stunden,

wohingegen die Reparatur von CPDs selbst nach 24 Stunden nur 50 bis 80 % beträgt. (Ford

und Hanawalt, 1997; Hwang et al., 1999; Riou et al., 2004). Während der DNA-Replikation

in der S-Phase des Zellzyklus führen die verbleibenden Schäden zu einer Aktivierung des S-

Phasenkontrollpunktes. Der erfolgte S-Phasenarrest und somit die Inhibierung der DNA-

Synthese-Rate äußert sich sowohl auf der Ebene der Kettenverlängerung als auch auf Ebene

der Replikon-Initiation der DNA-Synthese. Die replikativen DNA-Polymerasen ε und δ sind

nicht in der Lage, an Photoprodukten vorbei zu replizieren, so dass eine „translesion

synthesis“ durch eine spezielle Polymerase η eingeleitet werden muss. Des Weiteren spielen

auch Prozesse eine Rolle, in denen die Proteinkinase ATR, sowie die von ATR domnstream

regulierte Kinase Chk1 (checkpoint kinase) involviert sind und zur Phosphorylierung von p53

führen (Heffernan et al., 2002). p53 kann dann Gene induzieren, deren Genprodukte den

Fortgang des Zellzyklus kontrollieren.

G1

S

G/M


53

5.3 Cadmium

Im folgenden Teil dieser Arbeit werden vergleichende Untersuchungen zum Einfluss von

löslichem CdCl2 und partikulärem CdO auf die Zytotoxizität und die Induktion des

Tumorsuppressorproteins p53 vorgestellt. Im Anschluss werden die Effekte der eingesetzten

Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die Funktion des p53-Proteins näher betrachtet.

Die Größenverteilung und das Agglomerationsverhalten der CdO-Partikel wurden mit dem

Rasterelektronenmikroskop (LEO 1530) am Institut für Werkstoffe der Elektrotechnik der

Universität Karlsruhe untersucht. Die Aufnahmen zeigen, dass die eingesetzten Partikel

kleiner sind als 1 µm (Abbildung 32) und somit phagozytiert werden können.

Abbildung 32: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der verwendeten CdO-Partikel.

5.3.1 Koloniebildung

Zur Abschätzung der Zytotoxizität von CdCl2 und CdO wurden A549 Zellen auf die beiden

Endpunkte Zellzahl und Koloniebildungsfähigkeit nach einer 24 Stunden-Inkubation mit der

jeweiligen Cadmiumverbindung untersucht.

Werden die Ergebnisse von löslichem CdCl2 und unlöslichem CdO miteinander verglichen, so

zeigten 75 µM CdCl2 und 1,5 µg CdO ähnliche zytotoxische Eigenschaften, mit einer

Reduktion der Koloniebildungsfähigkeit auf etwa 50 % in Bezug zur unbehandelten

Kontrolle. Während bei CdO im untersuchten Konzentrationsbereich die Zellzahl annähernd

im gleichen Maße reduziert wurde wie die Koloniebildungsfähigkeit, war bei CdCl2 die

Koloniebildung der sensitivere Endpunkt im Vergleich zur Zellzahl. Während eine Inkubation

1 µm 10 µm


54

mit 100 µM CdCl2 die Zellzahl um 30 % erniedrigte, war die Koloniebildung bereits um 80 %

des Ausgangswertes reduziert (Abbildung 33).

Abbildung 33: Koloniebildungsfähigkeit und Zellzahl von A549 Zellen nach 24 h Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).

Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD.

A

Koloniebildungsfähigkeit

Zellzahl

B

Koloniebildungsfähigkeit

Zellzahl


55

5.3.2 Induktion von p53

Das Protein p53 unterliegt aufgrund einer Ubiquitin vermittelten Degradation einem ständigen

Auf- und Abbau in der Zelle. Die kurze Halbwertszeit von etwa 20 Minuten in ungestressten

Zellen wird durch eine Stabilisierung infolge von DNA-Schäden erhöht.

Ein möglicher Einfluss einer 24-Stunden-Inkubation mit CdCl2 und CdO auf den p53-

Proteingehalt wurde mittels Westernblot-Analyse untersucht.

Abbildung 34: Westernblot nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).

Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde ein Westernblot mit anti-p53-Antikörper DO-7 aus dem Zelllysat durchgeführt. Dargestellt ist ein Westernblot. Insgesamt wurden drei unabhängige Versuche durchgeführt, die alle das gleiche Ergebnis auswiesen.

Sowohl CdCl2 als auch CdO resultierte in einer konzentrationsabhängigen Zunahme der

Bandenintensität in A549 Zellen. Eine Inkubation mit CdCl2 zeigte bereits ab 10 µM eine

deutliche Steigerung des p53-Proteingehaltes. Ab etwa 50 µM wurde eine Art Plateau erreicht

und die Expression zeigte bis hin zu 75 µM einen maximalen Wert. Ebenso verstärkte CdO

bereits bei geringen Konzentrationen von etwa 0,2 µg/cm2 Wachstumsfläche der Zellen die

Expression von p53, die bis hin zu 1,5 µg/cm2 stetig anstieg (Abbildung 34).

Ein Mechanismus der zu einem gesteigerten p53-Proteingehalt führen könnte, wäre eine

Induktion von oxidativen DNA-Schäden als Folge einer verstärkten Bildung von reaktiven

Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären Verteidigungsmechanismen

0 0 10 25 50 60 75 CdCl2 [µM]

0 0 0,1 0,2 0,5 1 1,5 CdO [µg/cm²]

A

B


56

(Stohs und Bagchi, 1995; Valko et al., 2005). Eine vermehrte Bildung von ROS, vermutlich

in erster Linie Superoxidradikalanion und Wasserstoffperoxid wurde durch CdCl2 in

kultivierten menschlichen Lungenfibroblasten und Makrophagen nachgewiesen (Hassoun und

Stohs, 1996; Yang et al., 1997). Dally und Hartwig (1997) konnten in Hela-Zellen eine

Induktion von DNA-Strangbrüchen durch CdCl2 nachweisen. Als ein weiterer Mechanismus

zur Entstehung oxidativer DNA-Schäden wird neben der ROS-vermittelten Induktion, eine

Hemmung der Reparatur von endogen-induzierten oxidativen DNA-Schäden diskutiert. So

konnten Dally und Hartwig (1997) eine verminderte Reparatur von lichtinduzierten Fpg-

sensitiven Stellen durch CdCl2 in HeLa-Zellen zeigen. Die beobachtete Hemmung der

Basenexzisionsreparatur könnte auf einer Hemmung der Schadenserkennung durch spezielle

Glykosylasen zurückzuführen sein. So zeigen neue Studien eine Herunterregulierung der

Expression der menschlichen Ogg1 (8-Oxoguanin-Glykosylase) durch Cadmium (Potts et al.,

2003; Youn et al., 2005). SP1, der Transkriptionsfaktor für Ogg1, besitzt einen Zinkfinger, so

dass die Hemmung der Ogg1-Expression auf eine Beeinträchtigung des Zinkfingers

zurückzuführen sein könnte (Youn et al., 2005).

5.3.3 Immunpräzipitation

Zur Untersuchung der Struktur von p53 wird eine Immunpräzipitation mit

konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt. Die Struktur von p53 wird durch die

Komplexierung eines Zink-Ions aufrechterhalten. Wird das Zink-Ion durch Metallchelatoren

oder durch Oxidation der Zink-bindenden Cysteine aus dem Proteinmotiv entfernt, kommt es

zu einer Konformationsänderung. Zwischen den beiden p53-Formen, der gefalteten Wildtyp-

Form und der ungefalteten „mutanten“ Form, wurde mit konformationsspezifischen

Antikörpern unterschieden. Der Antikörper PAb 1620 ist gegen ein konformationsabhängiges

Epitop in der DNA-Bindungsdomäne gerichtet, das empfindlich gegenüber Denaturierung ist

und somit die Wildtyp-Konformation erkennt. Im Gegensatz dazu bindet der Antikörper

PAb 240 an ein Aminosäuremotiv, das in der Wildtyp-Form verborgen ist und erst bei der

„mutanten“-Form durch Umfaltung des Proteins zum Vorschein kommt (Milner, 1995). Die

Bezeichnung „mutante“ Form resultiert aus der Tatsache, dass Mutationen, die zu einer

Inaktivierung von p53 als Tumorsuppressorprotein führen einen gemeinsamen Effekt auf die

Konformation des Proteins haben und das Protein folglich keine Reaktion mit dem Antikörper

PAb 1620 zeigt, stattdessen aber eine Bindung des Antikörpers PAb 240 (Gannon et al.,

1990).


57

Abbildung 35: Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern gegen wildtyp- und „mutante“ Konformation von p53 nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).

A549 Zellen wurden 24 h mit CdCl2 inkubiert und anschließend wurde eine Immunpräzipitation vom p53 aus dem Zellysat mit entsprechenden Antikörpern gegen die Wildtyp- (PAb 1620) bzw. „mutante“ Konformation (PAb 240) durchgeführt. Immunopräzipitiertes p53 wurde im Anschluss durch Westernbot-Analyse mit dem anti-p53-Antikörper CM-1 detektiert. Dargestellt ist ein Ergebnis von drei Versuchen.

Die Effekte von CdCl2 und CdO auf die Konformation des p53 Proteins werden in Abbildung

35 gezeigt. Dargestellt sind jeweils nur die spezifischen Banden der resultierten Blots.

Generell wiesen die Blots unspezifische Banden auf, die allerdings auch dann auftraten, wenn

an Stelle des Zelllysats nur Immunpräzipitationspuffer für die Immunpräzipitation verwendet

wurde. Diese Artefakte lassen sich vermutlich auf die Verwendung von Protein A/G

zurückführen. IgGs binden unabhängig von der Antigenspezifität durch den FC-Teil an

Proteine A/G, somit kann der sekundäre Antikörper sowohl spezifisch an p53 als auch

unspezifisch an Protein A/G binden.

Beide Verbindungen zeigten eine deutliche konzentrationsabhängige Induktion der

ungefalteten „mutanten“-Form des Proteins, während die gefaltete Wildtyp-Form nahezu

unverändert war. CdCl2 führte bereits bei einer Konzentration von 10 µM zu einer schwachen

Bildung der „mutanten“ Konformation. Eine starke Bildung der „mutanten“ Konformation

war ab Konzentrationen von 50 µM bis hin zu 75 µM zu sehen. Ebenso resultierte die

Wildtyp-Konformation

„mutante“ Konformation

Wildtyp-Konformation


0 10 25 50 75 75 0 10 25 50 75 75 CdCl2 [µM]

0 0,2 0,5 0,75 1 0 0,2 0,5 0,75 1 CdO [µg/cm²]

A

B


58

Behandlung mit CdO schon bei 0,2 µg/cm2 Wachstumsfläche in einer Denaturierung von p53,

die konzentrationsabhängig bis hin zu 1 µg/cm2 verstärkt wurde.

Die mittels Westernblot in Kapitel �5.3.2 gezeigte Induktion von p53 infolge der Inkubation

mit der jeweiligen Cadmiumverbindung scheint also vielmehr auf einer Umwandlung in die

„mutante“ Form als auf einer Induktion der Wildtyp-Form zu beruhen. Die „mutante“ Form

besitzt eine mit 5 bis 10 Stunden deutlich längere Halbwertszeit als die Wildtyp-Form mit

maximal 20 Minuten (Soussi, 2000). Dadurch führt eine Umwandlung in die „mutante“ Form

zu einer Akkumulation von p53.

Ob Cadmium allerdings dennoch in der Lage ist, p53-Wildtyp zu induzieren (infolge

eventuell gebildeter oxidativer DNA-Schäden) und diese Wildtyp-Form dann direkt in die

„mutante“ Form umgewandelt wird, bedarf noch weiterer Klärung.

Während frühere Studien für das lösliche CdCl2 bereits eine Umwandlung der Wildtyp-Form

in die „mutante“ Form zeigen konnten (Hainaut und Milner, 1993b; Meplan et al., 1999),

wurde in der hier vorliegenden Arbeit erstmalig eine Konformationsänderung für das

unlösliche partikuläre CdO nachgewiesen.


Um zu untersuchen inwieweit die Cadmium-vermittelte Strukturveränderung von p53 einen

Einfluss auf die Expression seiner Zielgene hat, wurde die Genexpression verschiedener,

durch p53 regulierter Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht.

5.3.4.1 p21

In Abbildung 36 ist die Genexpression von p21 in Abhängigkeit von der inkubierten

Cadmiumkonzentration gezeigt. Die Ergebnisse sind jeweils relativ zu der auf 1 normierten

Kontrolle dargestellt. Mit steigender Konzentration führte die Inkubation zu einer Zunahme

der Genexpression. Die Induktion durch CdCl2 war bereit ab 10 µM deutlich zu erkennen. Die

Werte stiegen bis hin zu 50 µM linear an, bis sich ab etwa 50 µM eine Art Plateau einstellte,

nach dem mit steigender Konzentration keine weitere Erhöhung erzielt werden konnte. Im

Gegensatz dazu resultierte die Behandlung mit CdO in einer allmählichen Induktion der

Genexpression, die insgesamt schwächer ausgeprägt war als bei CdCl2.


59

Abbildung 36: Relative Genexpression von p21 nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B)

Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

A

B


60

5.3.4.2 p48

Versuche zum Einfluss der jeweiligen Cadmiumverbindungen auf den basalen mRNA Gehalt

von p48 zeigten eine Hemmung der Genexpression mit steigender Cadmiumkonzentration

(Abbildung 37).

Abbildung 37: Relative Genexpression von p48 nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).

Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

B

A


61

CdCl2 reduzierte konzentrationsabhängig den mRNA Gehalt in A549 Zellen ab 50 µM und

erreichte bei 75 µM nur noch etwa 50 % des Ausgangswertes. Eine Inkubation mit CdO

resultierte ebenfalls in einer Abnahme der Genexpression, wenn auch nicht so stark

ausgeprägt wie bei CdCl2.

5.3.4.3 XPC

In Abbildung 38 ist der Einfluss von CdCl2 und CdO auf die basale Genexpression von XPC

dargestellt. Die Kontrolle wurde auf 1 normiert und alle gezeigten Werte relativ zur

unbehandelten Kontrolle errechnet.

Abbildung 38: Relative Genexpression von XPC nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B). Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

A

B


62

Sowohl CdCl2 als auch CdO zeigten im untersuchten Konzentrationsbereich einen nur

schwach ausgeprägten Effekt auf die relative Genexpression von XPC. In wieweit sich

allerdings selbst kleinste Änderungen im mRNA Gehalt auf den für die Wirkung in der Zelle

ausschlaggebende Proteinmenge auswirkt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet

werden.


63

5.4 Kombinationsuntersuchungen

5.4.1 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität

Der Effekt der jeweiligen Cadmiumverbindung auf die UVC-induzierte Zytotoxizität wurde

anhand der Koloniebildungsfähigkeit nach 24 h Vorinkubation mit CdCl2 bzw. CdO im

Anschluss an eine Bestrahlung mit einer nicht zytotoxischen Dosis von 5 J/m2 UVC-

Strahlung konzentrationsabhängig untersucht.

Abbildung 39: Einfluss von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte Zytotoxizität.

Die jeweiligen Werte bei den entsprechenden Cadmiumkonzentrationen sind normiert auf unbehandelte Zellen für alleinige Cadmium-Inkubation bzw. auf UVC behandelte Zellen für UVC + Cadmium. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmung +SD.

CdCl2

UVC 5J/m2 + CdCl2

CdCl2

UVC 5J/m2 + CdCl2

A

B


64

Beide Verbindungen zeigten keine deutliche Verstärkung der zytotoxischen Eigenschaft von

UVC-Strahlung (Abbildung 39). Eine mögliche durch Cadmium verursachte

Reparaturhemmung UVC-induzierter Schäden muss allerdings nicht zwangsläufig in einem

Replikationsstopp und somit in einer Abnahme der Überlebensrate resultieren. Nicht

reparierte DNA-Addukte können über so genannte TLS (translesion synthesis) durch die

Polymerase η entfernt werden.

5.4.2 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion

Wie in Kapitel �5.2.2 gezeigt werden konnte, führte eine UVC-Behandlung zu einer Zunahme

des p53 Gehalts mit einem Maximalwert drei Stunden nach der Bestrahlung. Der Effekt von

Cadmium auf den basalen Level von p53 wurde in Kapitel �5.3.3 beschrieben. Beide

untersuchten Verbindungen führten zu einer Denaturierung der Wildtyp-Form von p53 und

induzierten dadurch die Bildung der „mutanten“ Konformation. Zur Untersuchung des

Einflusses von Cadmium auf das durch UVC-Strahlung induzierte p53 Protein, wurden

Kombinationsuntersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden A549 Zellen 24 Stunden mit der

jeweiligen Cadmiumverbindungen vorinkubiert, anschließend mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und

im Anschluss nach drei Stunden Nachinkubation mit Cadmium die Konformation des

resultierenden p53 Proteins mittels Immunpräzipitation bestimmt.

In Abbildung 40 sind zunächst die Effekte einer alleinigen Behandlung mit UVC bzw. mit der

jeweiligen Cadmiumverbindung dargestellt. Des Weiteren ist der Einfluss einer Co-

Inkubation auf die p53 Konformation gezeigt. Es konnte zunächst beobachtet werden, dass es

sich bei der in Abschnitt �5.3.2 gezeigten Induktion von p53 infolge der UVC-Bestrahlung um

eine Zunahme des Gehalts der Wildtyp-Form handelte und nicht um eine Stabilisierung

aufgrund einer Bildung der „mutanten“ Konformation. Die Kombinationsversuche zeigten,

dass beide Verbindungen zu einer Abnahme der Wildtyp-Konformation im Vergleich zu

UVC behandelten Zellen führten. Hierbei war der Effekt bei CdCl2 stärker ausgeprägt als bei

CdO. Allerdings führte eine Co-Inkubation sowohl mit CdCl2 als auch mit CdO zu einer

Zunahme der „mutanten“ Konformation, die eine längere Halbwertszeit besitzt. Ob dennoch

eine UV-induzierte p53 Induktion stattfindet, gebildetes p53 dann allerdings durch die

jeweilige Cadmiumverbindung sofort in die „mutante“ Form überführt wird, oder ob eventuell

sogar die Induktion der Wildtyp-Konformation gehemmt wird, indem Cadmium in die

Signalkaskade eingreift, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden.


65

Abbildung 40: Einfluss von 60 µM CdCl2 (A) und 1,0 µg/cm2 CdO (B) auf die UVC- induzierte p53 Induktion.

A549 Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach 3 Stunden Nachinkubation wurde eine Immunpräzipitation aus dem Zellysat mit entsprechenden Antikörpern gegen die Wildtyp- (PAb 1620) bzw. „mutante“ Konformation (PAb 240) durchgeführt. Immunopräzipitiertes p53 wurde im Anschluss durch Westernbot-Analyse mit dem anti-p53-Antikörper CM-1 detektiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei Versuchen.


Der Einfluss der Cadmiumverbindungen auf die UVC-induzierte Genexpression der p53

Zielgene p21, p48 und XPC wurde nach 24 Stunden Vorinkubation untersucht. Da für die drei

betrachteten Gene die Induktion infolge der UVC Bestrahlung zwischen 6 und 10 Stunden

nach der Bestrahlung maximal ist, wurde für die Kombinationsuntersuchungen die

Genexpression 10 Stunden nach der UVC Behandlung mittels Real Time RT PCR untersucht.

5.4.3.1 p21

In Abbildung 41 ist der Einfluss von Cadmium auf die durch UVC-Strahlung induzierte p21

Genexpression dargestellt. Zunächst ist erneut der in Kapitel �5.2.3.1 beschriebene Effekt einer

alleinigen UVC-Bestrahlung 10 Stunden nach der Behandlung gezeigt. Die Bestrahlung

resultierte in einer etwa fünffachen Zunahme der Genexpression im Vergleich zur

unbestrahlten Kontrolle. Eine Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung erreichte

Ko CdCl2 UV

wildtyp-Konformation „mutante“ Konformation

UV CdCl2 +

UV

CdCl2 +

UV

Ko CdCl2 UV UV CdCl2 +

UV

CdCl2 +

UV

Ko CdO UV

wildtyp-Konformation


UV CdO +

UV

CdO +

UV

Ko CdO UV UV CdO +

UV

CdO +

UV

A

B


66

dagegen nur mRNA-Gehalte von etwa doppeltem Gehalt bei 60 und 75 µM CdCl2 (Abbildung

41 A) bzw. dreifachen bei 1,0 und 1,5 µg/cm2 CdO (Abbildung 41 B).

Abbildung 41: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte p21 Genexpression.

Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

A

B


67

5.4.3.2 p48

Die UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 verursachte eine zeitabhängige Steigerung der

Genexpression von p48 mit einer mehr als doppelten mRNA-Menge im Vergleich zu

unbestrahlten Zellen nach etwa 10 bis 12 Stunden (Kapitel �5.2.3.2).

Abbildung 42: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte p48 Genexpression.

Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

A

B


68

Inwieweit dieser Effekt durch eine Vorinkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung

beeinflusst wird, ist in Abbildung 42 dargestellt. Sowohl CdCl2 als auch CdO führten zu einer

konzentrationsabhängigen Abnahme der durch alleinige UVC-Bestrahlung nach 10 Stunden

induzierten mRNA-Menge.

5.4.3.3 XPC

Eine UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 führte wie in Kapitel �5.2.3.3 gezeigt zu einer

zeitabhängigen Induktion der XPC Genexpression mit einer maximalen Induktion 12 Stunden

nach der Bestrahlung.

Abbildung 43: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte XPC Genexpression.

Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.

A

B


69

10 Stunden nach der Bestrahlung wies die Genexpression noch den 2fachen Wert der

unbehandelten Kontrolle auf. Wie in Abbildung 43 zu sehen, führte sowohl CdCl2 als auch

CdO zu einer Abnahme der durch alleinige UVC-Bestrahlung nach 10 Stunden induzierten

mRNA-Menge.

Eine Beeinflussung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene von p53 durch

Cadmiumverbindungen konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden. Die

verminderte Induktion ist möglicherweise auf verschiedene Mechanismen zurückzuführen.

Zum einen könnte die Induktion des Transkriptionsfaktors p53 dennoch stattfinden, die

induzierte Wildtyp-Form aber direkt durch Cadmium in die „mutante“ Form umgewandelt

werden und somit nicht mehr die Transkription der Zielgene einleiten. Zum anderen wäre eine

Beeinflussung der Wildtyp-Form durch die „mutante“ Form denkbar. p53 bindet in seiner

aktiven Form als Tetramer an bestimmte Bereiche seiner Zielgene und löst in diesem Zustand

deren Transkription aus. Durch eine Bildung von gemischten Tetramere aus Wildtyp- und

„mutanter“Form könnte es somit ebenfalls zu einer Inhibierung der Funktion des

Transkriptionsfaktors kommen. Denkbar wäre auch eine verminderte Induktion von p53

aufgrund von Störungen der Signalkaskade und somit einer Störung der Stabilisierung des

p53 Proteins.

5.4.4 Zellzyklusphasenverteilung

In Tabelle 6 ist sowohl der Effekt von CdCl2 als auch die Auswirkung von CdO in

Kombination mit UVC auf die Zellzyklusphasenverteilung in A549 Zellen dargestellt. CdCl2

führt zu einer leichten Zunahme des Anteils der Zellen in der G1-Phase (von 63,9 % G1-

Phase in unbehandelten Zellen auf 70,4 % nach einer Inkubation mit 75 µM CdCl2). Wie

bereits in Kapitel �5.2.4 gezeigt, führt eine Bestrahlung mit 5 J/m2 UVC zu einer

Akkumulation der Zellen in der S-Phase 10 Stunden nach Bestrahlung (von 25,6 % S-Phase

in unbehandelten Zellen auf 46,1 % nach UVC-Bestrahlung). Dieser durch UVC-Strahlung

verursachte S-Phasenarrest wird durch die Vorinkubation mit CdCl2 nahezu vollständig

aufgehoben. So befinden sich 10 Stunden nach der Bestrahlung bei einer vorherigen

Inkubation mit 75 µM CdCl2 für 24 Stunden nur noch 28,8 % der Zellen in der S-Phase. Die

Verteilung entspricht damit nahezu der von unbehandelten Zellen. Ein ähnliches Resultat

zeigte auch die Behandlung mit CdO. Auch hier führte CdO zu einer leichten Steigerung des

Anteils der Zellen in der G1-Phase (von 66,9 % G1-Phase in unbehandelten Zellen auf 70,7 %


70

nach einer Inkubation mit 1,5 µg/cm2), während eine Vorinkubation mit CdO den durch

UVC-Strahlung hervorgerufenen S-Phasenarrest aufhob (von 24,1 % S-Phase in bestrahlten

Zellen auf 22,1 % nach vorheriger Inkubation mit 1,5 µg/cm2 CdO).

Tabelle 6: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die Zellzyklusphasenverteilung 10 Stunden nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.

Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Zellen in der jeweiligen Zellzyklusphase ± SD.

0 µM CdCl2 60 µM CdCl2 75 µM CdCl2 Phase - UV + UV - UV + UV - UV + UV

G1 63,9 ± 3,2 44,7 ± 2,0 69,2 ± 2,3 58,8 ± 3,6 70,4 ± 2,5 65,6 ± 2,5

S 25,6 ± 2,1 46,1 ± 3,9 22,0 ± 1,7 35,2 ± 2,8 22,3 ± 1,2 28,8 ± 1,2

G2/M 10,4 ± 1,8 99,2 ± 5,1 98,4 ± 1,1 95,9 ± 1,2 97,4 ± 1,8 95,6 ± 1,8

0 µg/cm2 CdO 1,0 µg/cm2 CdO 1,5 µg/cm2 CdO Phase - UV + UV - UV + UV - UV + UV

G1 66,9 ± 3,2 48,1 ± 1,4 69,1 ± 2,1 57,5 ± 1,4 70,7 ± 5,3 62,1 ± 5,8

S 24,1 ± 1,6 46,9 ± 1,2 22,6 ± 1,0 37,9 ± 2,4 22,1 ± 3,2 33,7 ± 5,5

G2/M 99,0 ± 1,8 95,0 ± 0,4 98,4 ± 1,3 94,6 ± 1,0 97,2 ± 2,1 94,2 ± 0,4

A

B

Zusammenfassende Diskussion und Ausblick

71

6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick

UVC-Strahlung führt zu helixverzerrenden DNA-Addukten, die über eine Zellzyklusphasen-

unabhängige NER entfernt werden. Um ein größeres Zeitfenster für die Reparatur zu

gewährleisten, existieren verschiedene Kontrollpunkte im Zellzyklus. Diese verzögern z.B.

beim G1-Phasen-Kontrollpunkt den Übergang von der G1-Phase zur S-Phase. Die Regulation

des G1-Phasen-Kontrollpunktes wird u.a. über das Protein p21 gesteuert, indem es an Cyclin-

CDK-Komplexe bindet und diese so in ihrer Aktivität inhibiert. CDKs (Cyclin dependent

kinase) sind für die Progression im Zellzyklus unentbehrlich und eine Inhibierung resultiert

folglich in einem Stillstand des Zellzyklus. Dennoch unerkannte Schäden oder Schäden die

sich erst in der darauf folgenden S-Phase ereignen, führen während der Replikation zu einem

Stopp der Polymerase an dem DNA-Addukt, was eine Verlangsamung der Replikation zur

Folge hat und somit in einem S-Phasenarrest resultiert. Über den Mechanismus des S-

Phasenarrestes ist wenig bekannt. Denkbar wäre, dass p21 auch hier eine Rolle spielt. Es ist

bekannt, dass p21 an PCNA bindet (Waga und Stillman, 1998). Dies hat eine Unterdrückung

der Aktivität der Polymerase δ zur Folge und führt somit zu einer Hemmung der Replikation

(S-Phasenarrest). Neben den normalen für die DNA-Replikation verantwortlichen

Polymerasen, existieren noch weitere Polymerasen, die für die Replikation von DNA-

Addukten verantwortlich sind. Die Polymerase κ repliziert beispielsweise BPDE-induzierte

DNA-Addukte und ist somit auch für den Fortgang des Zellzyklusses nach dem durch BPDE

induzierten S-Phasenarrestes verantwortlich (Bi et al., 2005), während die Polymerase η den

„Bypass“ von UV-induzierten Photoprodukten übernimmt (Goodman, 2002; Kannouche et

al., 2001; Kannouche und Stary, 2003). Mutationen des verantwortlichen Gens XPV führen

zu der UV-sensitiven Erbkrankheit Xeroderma Pigmentosum-V (XPV) (Friedberg, 2001;

Tuteja und Tuteja, 2001).

Die infolge der UVC-Bestrahlung resultierende Steigerung der Genexpression von p21 in

A549 Zellen korreliert zeitlich sehr gut mit dem gesteigerten Proteingehalt von p53. Die

Expression von p48 und XPC, deren Genprodukte in der Schadenserkennung der NER

involviert sind, werden ebenfalls durch p53 reguliert. Adimoolam und Ford (2002) und Tan

und Chu (2002) konnten p53 responsive Elemente in den jeweiligen Genen identifizieren. Die

Versuche zeigen einen zeitabhängigen Anstieg infolge von UVC-Strahlung, allerdings ist die

maximale Induktion zu späteren Zeitpunkten verschoben als die p53-Induktion. Eine


72

gesteigerte Expression findet allerdings bereits drei Stunden nach der Bestrahlung statt und

spiegelt sich somit in der Zeitachse der p53-Induktion wider. Warum allerdings die maximale

Zunahme zu späteren Zeitpunkten verschoben ist, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht

beantwortet werden. Denkbar ist eine Zwischenschaltung weiterer regulierender

Mechanismen, die letztendlich zur Einleitung der Transkription von p48 und XPC führen.

Kinetikversuche zur Bindung von p53 an die jeweiligen responsiven Elemente der Zielgene

könnten Aufschluss über die Ereignisse zwischen maximaler p53-Protein-Induktion und

maximaler Induktion seiner Zielgene geben.

UVC-Strahlung führt 10 Stunden nach der Bestrahlung zu einer Ansammlung von Zellen in

der S-Phase des Zellzyklusses, was auf einen stattfindenden S-Phasenarrest durch gestörte

DNA-Replikation von zuvor nicht reparierten DNA-Schäden hinweist. Zeitlich korreliert die

gesteigerte p21-Expression gut mit dem erhaltenen S-Phasenarrest, so dass hier evtl. ein

Zusammenhang bestehen könnte. Ob die drei Stunden nach der Bestrahlung bereits erhöhte

p21 Expression zuvor in einen G1-Arrest resultiert, dieser allerdings durch eine schnelle

Reparatur wieder aufgehoben wird und somit in dem zwischen 3 und 6 Stunden nicht

gemessenen Zeitfenster unerfasst bleibt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet

werden. Schäden, die sich im Chromatin ereignen und somit nicht erkannt wurden, führen erst

während der Replikation zu einem Stillstand des Zellzyklusses und resultieren in einem S-

Phasenarrest bis die Schäden repariert sind. Die gesteigerte Expression der DNA-

Reparaturgene p48 und XPC 10 Stunden nach der Bestrahlung unterstützt die These, dass der

resultierende S-Phasenarrest eingeleitet wird, um Zeit zur Reparatur zu gewährleisten. Die

Abnahme der Expression der Reparaturgene sowie der Rückgang der Expression von p21

korrelieren zeitlich sehr gut mit der Aufhebung und somit Fortgang des Zellzyklusses, was

auf eine erfolgte Reparatur schließen lässt.

Ergebnisse der letzten Jahre haben gezeigt, dass so genannte „Zinkfingerstrukturen“, in denen

ein Zink-Ion an jeweils festgelegte Cystein- und/oder Histidinreste bindet, um die Struktur

einer kleinen, autonom gefalteten Proteindomäne zu stabilisieren, empfindliche

Angriffspunkte für toxische Metallverbindungen sind (Abbildung 44). Cadmium(II) besitzt

aufgrund seiner Größe, seiner kleinen positiven Ladungsdichte und seiner ungepaarten

Elektronen eine leichten Polarisierbarkeit und somit die Eigenschaft eines weichen Ions. Es

fungiert als Elektronenpaarakzeptor (Lewis-Säure) und kann nach der Lewis-Säure-Base-

Theorie mit einer weichen Base reagieren. Als weiche Base können in Proteinen der


73

Stickstoff aus Imidazolen (z.B. Histidin) und der Schwefel aus Thiolen (z.B. Cystein)

fungieren (Glusker, 1991). Cd(II) könnte somit in der Lage sein, Zink aus der Zink-bindenden

Domäne von Zinkfingerproteinen zu verdrängen, zumal es durch seine analoge

Elektronenkonfiguration eine ähnliche chemische Reaktivität aufweist.

Abbildung 44: Mögliche Wechselwirkung von Metallverbindungen mit Zink-bindenden Strukturen (Hartwig, 2001).

Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar trotz seiner Zink-bindenden Domäne nicht zu

den Zinkfingerproteinen gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und

Mann, 2001), dennoch ist die Komplexierung eines Zink-Ions durch 3 Cysteinreste und einem

Histidinrest essenziell für die Aufrechterhaltung der Struktur der DNA-bindenden Domäne

und somit auch für seine Funktion als Transkriptionsfaktor. Wie bereits Versuche mit

Metallchelatoren (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et al., 1998) und Oxidationen der

Cysteine mit Diamid (Hainaut und Milner, 1993a) zeigen konnten, kommt es durch eine

Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur von p53 zu einer Auffaltung des Proteins was

einen Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit zur Folge hat. Die Fähigkeit von löslichen

Cadmiumverbindungen, die Konformation von p53 zu beeinflussen und somit zur Bildung der

„mutanten“ Konformation zu führen, zeigen bereits frühere Studien mit CdSO4 und CdCl2

(Hainaut und Milner, 1993b; Meplan et al., 1999). Dass allerdings partikuläres CdO ebenfalls


74

in der Lage ist, eine Konformationsänderung von p53 Wildtyp hervorzurufen wurde in dieser

Arbeit erstmalig untersucht. Des Weiteren zeigten bisher keine Studien, dass

Cadmiumverbindungen einen Einfluss auf die basale Expression der p53-Zielgene p48 und

XPC haben und folglich in die DNA-Reparatur eingreifen könnten.

Eine Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung reduziert die Genexpression von p48

und XPC. Dies könnte auf die Bildung der „mutanten“ Form infolge einer Bindung von

Cadmium-Ionen an p53 im Austausch von Zink zurückzuführen sein. So zeigt sowohl CdCl2

als auch CdO eine konzentrationsabhängige Bildung der „mutanten“ Form von p53. Aufgrund

der längeren Halbwertszeit von 5 bis 10 Stunden der „mutanten“ Form im Vergleich zu

maximal 20 Minuten der Wildtyp-Form (Soussi, 2000), beruht der durch Westernblot-

Analyse gezeigte gesteigerte Gesamtgehalt von p53 infolge der Cadmium-Inkubation

vermutlich auf der Bildung und Akkumulation der stabilen „mutanten“ Konformation und

nicht auf einer Stabilisierung der Wildtyp-Form. Da die Bindung von p53 an die DNA seiner

Zielgene als Tetramer erfolgt und so deren Expression ausgelöst wird, kann die Entstehung

der „mutanten“, nicht zur DNA-Bindung fähigen Form, dazu führen, dass gemischte

Heterotetramere aus Wildtyp- und „mutanter“-Form gebildet werden, die dann nicht mehr als

Transkriptionsfaktor wirken können (dominant negativer Effekt) (Kern et al., 1992; Cadwell

und Zambetti, 2001). Dies wäre eine Erklärung dafür, dass trotz eines annähernd konstanten

p53-Wildtyp-Gehaltes eine Beeinflussung nachgeschalteter Mechanismen stattfindet.

Oxidative DNA-Schäden infolge einer durch Cadmium indirekt verursachten Zunahme an

ROS könnten zu einer Stabilisierung von p53 führen. Andererseits könnte oxidativer Stress

ebenfalls durch Oxidation von Cysteinen in der DNA-Bindungsdomäne zu einer Inaktivierung

von p53 führen. So zeigen Arbeiten in menschlichen Zellen, exponiert mit NO, H2O2 und

Glutathion-depletierenden Agenzien eine durch Umfaltung verminderte DNA-

Bindungsfähigkeit (Calmels et al., 1997; Parks et al., 1997; Russo et al., 1995). Allerdings

unterliegt der Redoxstatus der p53 Wildtyp-Form in der Zelle einer Regulation über

Thioredoxin bzw. Thioredoxin-Reduktase und Ref-1 (Redoxfaktor 1) und ist somit gut

kontrolliert (Hainaut und Mann, 2001). Daher scheint es wahrscheinlicher, dass die

Umfaltung auf den Austausch des Zink-Ions in der DNA-bindenden Domäne von p53

zurückzuführen ist. Cadmium besitzt einen größeren Atomradius als Zink (Cd: 0,97 Å;

Zn: 0,74 Å) und könnte somit die Tertiärstruktur von p53 beeinflussen. Denkbar wäre auch

eine Beeinflussung der Zink-Bindung in p53 durch Methallothioneine (MT).


75

Methallothioneine sind niedermolekulare Proteine, die aufgrund ihres hohen Cysteinanteils

eine hohe Affinität zu essenziellen Metall-Ionen wie Zn(II), aber auch zu toxischen Metall-

Ionen wie Cd(II) besitzen und somit deren intrazelluläre Verfügbarkeit regulieren. So zeigte

eine Co-Transfektion von p53 und MT in p53 defizienten Zellen, dass die Überexpression von

MT relativ zur p53-Expression zu einer Hemmung der Transaktivierung von p53 führt. Diese

Beobachtungen lassen vermuten, dass MT als ein Regulator der Zink-Bindung von p53

fungiert. Bei hohen Gehalten an MT wirkt es als Chelator und führt somit zur Herauslösung

von Zn(II) aus p53 und damit zu dessen Inaktivierung (Hainaut und Mann, 2001). Da Cd(II)

die MT-Expression induziert, könnte sich dies direkt negativ auf p53 auswirken.

Eine dennoch durch die jeweilige Cadmiumverbindung erfolge Induktion von p21 könnte auf

p53-unabhängigen Mechanismen beruhen. So zeigen zum einen Ergebnisse von Russo et al.

(1995) eine p53 unabhängige Aktivierung der p21 Expression infolge von oxidativem Stress,

zum anderen berichten Haapajarvi et al. (1999) von einer gesteigerte p21 Expression infolge

einer UVC-Bestrahlung durch den Transkriptionsfaktor SP1. Der durch alleinige Cadmium-

Inkubation hervorgerufene G1-Arrest könnte durch p21 hervorgerufen werden.

Noch deutlicher sind die Effekte einer vermehrten Bildung der „mutanten“ Form von p53

infolge einer Inkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen bei

Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung. Während UVC alleine zu einer Induktion

der Zielgene p48, XPC und p21 führt, hat die Vorinkubation mit den jeweiligen

Cadmiumverbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Expression zur Folge. Die

Effekte von CdCl2 sind hierbei etwas stärker als die von CdO. Dies lässt sich möglicherweise

auf den ebenfalls bei CdCl2 stärkeren Effekt auf die Hemmung der p53-Wildtyp-Induktion

durch UVC-Strahlung zurückführen. Während CdCl2 die Induktion von p53 vollständig

hemmt und p53 in die „mutante“ Konformation umgewandelt wird, führt eine Vorinkubation

mit CdO noch zu einer leichten Erhöhung des UVC-induzierten p53-wildtyp-Gehalts. Ob die

jeweiligen Cadmiumverbindungen allerdings schon in die Signalkaskade zur Stabilisierung

von p53 eingreifen und somit die Induktion durch UVC verhindert wird, oder ob die

Induktion zunächst stattfindet, induziertes p53 dann allerdings durch Cadmium in die

„mutante“ Form umgewandelt wird, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden.

Die Kombinationsversuche zur Koloniebildungsfähigkeit zeigen keine deutliche Verstärkung

der UVC-induzierten Zytotoxizität. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit Versuchen von


76

Tang et al. (2000) in Hamsterzellen, die aufgrund von Methylierungen des DDB2-Gens eine

verminderte p48 Expression aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass die Transfektion von

Hamsterzellen mit menschlichen p48 keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit infolge

einer UV-Bestrahlung hat. Allerdings zeigten diese Versuche, dass die Mutationsrate im

nicht-transkribierten Strang in p48 transfizierten Zellen deutlich geringer ist. Der Effekt von

p48 auf die UV-induzierte Mutationsrate ist bei nicht-TT-CPDs größer als bei TT-CPDs.

Dieser Befund könnte auf die Fähigkeit der Polymerase η, Photoprodukte zu replizieren,

zurückzuführen sein. Diese hat die Eigenschaft Adenin gegenüber Photoprodukte einzubauen,

so dass TT-CPDs effizient und mit großer Genauigkeit über „translesion synthesis“ (TLS)

repariert werden können, während nicht-TT-CPDs durch falschen Einbau einer Adenin-Base

zu Mutationen führen können. Vorhandene Addukte resultieren somit nicht zwangsläufig in

einem Stopp der DNA-Polymerase, so dass die Überlebensrate unbeeinflusst bleibt. Eine

Reparaturhemmung infolge eines geringeren p48 und oder XPC-Gehalts kann also

möglicherweise zur fehlerbehafteten post-replicativen Reparatur führen, zumal die

Polymerase η ebenfalls einen Zinkfinger aufweist und somit möglicherweise auch durch

Cadmium gehemmt werden könnte. Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten bereits von

einer Erhöhung der durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate durch Cadmium in

chinesischen Hamsterzellen. Ob die Behandlung mit Cadmium allerdings in Kombination mit

UVC-Strahlung die Mutationsrate in den in dieser Arbeit eingesetzten humanen

Lungenadenokarzinomzelllinie erhöht, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden

und müsste mit in einem Mutationstest näher untersucht werden.

Des Weiteren führt eine Co-Behandlung mit den eingesetzten Cadmiumverbindungen zu einer

Hemmung des durch UVC-Behandlung resultierenden S-Phasenarrests, was möglicherweise

auf einer Hemmung der UVC-induzierten p21-Expression zurückgeführt werden könnte.

Allgemein muss berücksichtigt werden, dass es bei den hier vorgestellten Ergebnissen nur um

die Expression der betrachteten Gene auf mRNA-Ebene handelt. Ob und in wieweit sich die

erhaltenden Ergebnisse auf die Proteingehalte auswirken, müsste in weiteren Versuchen

überprüft werden.

Bei der Allgemeinbevölkerung liegen die Cadmiumkonzentrationen in der Lunge bei etwa

1,3 mg/kg Trockengewicht (Kollmeier et al., 1990). Mit dem in Kollmeier (1985)

angegebenen Umrechnungsfaktor von Trockengewicht auf Nassgewicht für Lungengeweben

ergeben sich Gehalte von ca. 0,3 mg/kg Nassgewicht in der Lunge. Ausgehend von einer

100 %igen Löslichkeit der Partikel in 9 ml Zellkulturmedium bei einer Schalengröße von


77

60 cm2 Wachstumsfläche, würde der eingesetzte Konzentrationsbereich von 0,1 bis

1,5 µg/cm2 etwa im Bereich von 0,6 bis 10 µg Cadmium/ml liegen und somit etwa dem von

10 µM bis 75 µM eingesetzten Bereich von löslichem CdCl2 entsprechen (1,1 bis 8,4 µg/ml).

Dadurch wird deutlich, dass die eingesetzten Konzentrationen durchaus im physiologisch

relevanten Bereich liegen, zumal die Gehalte bei Arbeitern der metallverarbeitenden Industrie

um ein vielfaches höher liegen können und in Geweben wie der Niere und der Leber, in denen

es zu einer Akkumulation des Metalls sogar Gehalte von bis zu 3 mg/kg bzw. 50 mg/kg

Nassgewicht erreicht werden. Die Interpretation der Ergebnisse mit partikulären CdO ist

allerdings schwierig, da CdO nahezu unlöslich in wässrigen Lösungen ist und die Partikel

über Phagozytose in die Zelle gelangen. Während bei löslichen Verbindungen von einer

homogenen Aufnahme über die Zellpopulation ausgegangen werden kann, werden in

Versuchen mit unlöslichen partikulären Substanzen die Effekte als Summenparameter

gemessen. Die Ergebnisse repräsentieren somit einen Mittelwert der Effekte von Zellen, die

Partikel durch Phagozytose aufgenommen haben und Zellen, die nicht phagozytiert haben.

Daher können die lokal auftretenden Effekte durch CdO weitaus stärker sein als die

vorgestellten Mittelwerte.

Die hohen Konzentrationen in der Niere resultieren aus der Induktion von MT durch

Cadmium. Die Bindung von Cadmium an MT resultiert in Halbwertszeiten von bis zu

30 Jahren. Durch die Eigenschaft, toxische Metall-Ionen zu binden, wird von einer

detoxifizierenden Wirkung ausgegangen. Ob allerdings das Abfangen tatsächlich mit einer

Aufhebung des toxischen Potenzials einhergeht, ist wenig untersucht. Ergebnisse unserer

Arbeitsgruppe zeigen, dass Methallothionein, das 3,23 Mol Cd(II), 1,41 Mol Cu(II) und

0,77 Mol Zn(II) enthält, sowohl eine konzentrationsabhängige Zunahme von Einzelstrang-

brüchen in PM2-DNA verursacht, als auch die Aktivität des Fpg-Proteins im PM2-Assay

hemmen kann (Hoffmann, 2000). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass trotz der Bindung

an Methallothioneine, Metall-Ionen ihre toxische Eigenschaft ausüben können.

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sowohl lösliches CdCl2 als auch partikuläres CdO in der

Lage sind, die Struktur des Tumorsuppressorproteins p53 zu beeinflussen. Beide

Verbindungen führen zu einer Induktion der „mutanten“ Konformation. Als mögliche Folge

könnten Signaltransduktionswege gestört werden, die zu einem veränderten

Expressionsmuster von z.B. für die Reparatur und die Zellzykluskontrolle entscheidenden

Proteine p21, p48 und XPC führen (Abbildung 44). Vor dem Hintergrund, dass frühere

Studien eine Hemmung der Schadenserkennung UV-induzierter DNA-Addukte in Folge eine


78

Cadmiumbehandlung zeigen (Hartmann und Hartwig, 1998), scheint dieses Resultat eine

mögliche Erklärung für die Cadmium-vermittelte Kanzerogenese zu liefern.

Abbildung 45: Schematische Darstellung des möglichen Mechanismus der durch Cadmium-vermittelten Kanzerogenese.


79

Da auch Studien zur Reparatur von BPDE eine Beteiligung von p53 zeigen konnten und vor

allem Arbeiter der metallverarbeitenden Industrie aber auch die Allgemeinbevölkerung u.a.

durch Zigaretten oder Flugasche einer Mischexposition von oftmals partikulären

Metallverbindungen und zahlreichen mutagenen Agenzien wie UV-Strahlung, PAKs oder

Aflatoxinen ausgesetzt sind, kann diesem Protein eine entscheidende Funktion in der

Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität zugeschrieben werden (Lloyd und Hanawalt,

2000; Wani et al., 2002; Lloyd und Hanawalt, 2002).

Literatur

80

7 Literatur

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Wani, M. A., El-Mahdy, M. A., Hamada, F. M., Wani, G., Zhu, Q., Wang, Q. E. and Wani, A. A. (2002). Efficient repair of bulky anti-BPDE DNA adducts from non-transcribed DNA strand requires functional p53 but not p21(waf1/cip1) and pRb. Mutat Res 505(1-2): 13-25.

Yamaizumi, M. and Sugano, T. (1994). U.v.-induced nuclear accumulation of p53 is evoked through DNA damage of actively transcribed genes independent of the cell cycle. Oncogene 9(10): 2775-84.

Yang, C. F., Shen, H. M., Shen, Y., Zhuang, Z. X. and Ong, C. N. (1997). Cadmium-induced oxidative cellular damage in human fetal lung fibroblasts (MRC-5 cells). Environ Health Perspect 105(7): 712-6.

Youn, C. K., Kim, S. H., Lee do, Y., Song, S. H., Chang, I. Y., Hyun, J. W., Chung, M. H. and You, H. J. (2005). Cadmium down-regulates human OGG1 through suppression of Sp1 activity. J Biol Chem 280(26): 25185-95.

Anhang

89

A Anhang

A.1 Abkürzungsverzeichnis

A549 - Menschliche Lungenadenokarzinomzelllinie

B[a]P - Benzo[a]pyren

BER - Basenexzisionsreparatur

Bp - Basenpaare

BSA - Rinderserumalbumin

BSO - Buthionin Sulfoximin

CAK - CDK activating kinase

CdCl2 - Cadmiumchorid

CDK - Cyclin dependent kinase

cDNA - komplementäre DNA

CdO - Cadmiumoxid

cm - Zentimeter

CPD - Cyclopyrimidindimere

Ct - Thresholdycle

Cys - Cystein

DDB - damage DNA binding Protein

DMEM - Dulbecos Modified Eagle Medium

DMSO - Dimethylsulfoxid

DNA - Desoxyribonukleinsäure

E - Effizienz

EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure

FDP - Formamid-Denaturieungspuffer

Fpg - Formamidopyrimidin-DNA Glycosylase

FKS - Fötales Kälberserum

GAPDH - Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

GGR - Globale Genomische Reparatur

GSH - Glutathion

GSSG - Glutathiondisulfid

Anhang

90

h - Stunde

HeLa S3 - menschliche Cervixkarzinomzelllinie

His - Histidin

IARC - International Agency for Research on Cancer

Ig - Immunglobulin

J - Joule

kD - Kilodalton

mdm2 - murine double minute 2

MMR - Mismatchreparatur

MOPS - Morpholinopropansulfonsäure

mRNA - messenger Ribonukleinsäure

NER - Nukleotidexisionsreparatur

OGG - 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase

Oligo(dT) - Oligodesoxythymidin

PAK - Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe

PCR - Polymerase Chain Reaction

PBS - Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCNA - proliferating cell nuclear antigen

PMSF - Phenylmethansulfonylfluorid

PVDF - Polyvinylidenfluorid

Ref1 - Redoxfaktor 1

RFU - relative Fluoreszenzunit

RPA - Replikationsprotein A

ROS - reaktive Sauerstoffspezies

rRNA - ribosomale RNA

RT-PCR - reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

SD - Standardabweichung

SDS - Natriumdodecylsulfat

Taq-Polymerase - Thermus aquaticus Polymerase

Tris - Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan

UV - Ultraviolettes Licht

V79 - Lungenfibroblasten des chinesischen Hamsters

XP - Xeroderma Pigmentosum

Anhang

91

A.2 Liste der verwendeten Chemikalien

Bezeichnung: Hersteller:

Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung 37,5:1 (40 %) Merck, Darmstadt

Agarose Sigma, Deisenhofen

Ammoniumperoxodisulfat Merck, Darmstadt

Anti-Kaninchen-Antikörper-HRP Santa Cruz, Santa Cruz (USA)

Anti-Maus-Antikörper-HRP Santa Cruz, Santa Cruz (USA)

Anti-p53-Antikörper (Maus) Dako, Glostrup (Dänemark)

Anti-p53-Antikörper (Kaninchen) Novocastra, Newcastle (UK)

Anti-p53-Antikörper (PAb 1620) Oncogene, San Diego (USA)

Anti-p53-Antikörper (PAb 421) Oncogene, San Diego (USA)

Aprotinin Sigma, Deisenhofen

β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

Bradford-Lsg Bio-Rad, München

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

BSA (� 96 %) Sigma, Deisenhofen

CdCl2 (99,99 + %) Aldrich, Steinsheim

CdO (99,99 + %) Aldrich, Steinsheim

DAPI/SR-Lösung Partec, Münster

DMEM Sigma, Deisenhofen

DMSO p.a. Sigma, Deisenhofen

EDTA p.a. Merck, Darmstadt

ECL-Detektionslösung Amersham, Freiburg

Ethanol p.a. Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid p.a. Merck, Darmstadt

First Strand cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, München

Formaldehyd Merck, Darmstadt

Formamid Merck, Darmstadt

FKS Sigma, Deisenhofen

Glycerol Merck, Darmstadt

Anhang

92

Guanidin-Isothiocyanat Merck, Darmstadt

Isopropanol Sigma, Deisenhofen

iQ SYBR

Green Supermix (2x) Bio-Rad, München

KCl Merck, Darmstadt

Leupeptin Merck, Darmstadt

Magermilchpulver Merck, Darmstadt

Methanol Riedel-de Haen, Seelze

Molekulargewichtsmarker RPN 800 Amersham, Freiburg

MOPS Sigma, Deisenhofen

NaCl p.a. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 p.a. Merck, Darmstadt

NaH2PO4 p.a. Merck, Darmstadt

NaOH p.a. Merck, Darmstadt

PCR-Primer MwG Biotech, Ebersberg

Penicillin/Streptomycin 5000IU/ml Sigma, Deisenhofen

Pepstatin A Sigma, Deisenhofen

Protein G PLUS/Protein A – Agarose –Lösung Oncogene, San Diego (USA)

SDS (10 % in Wasser) Merck, Darmstadt

TEMED Serva, Heidelberg

Tris Sigma, Deisenhofen

Triton X-100 Pierce, Rockford (USA)

Trypsin (10x) Sigma, Deisenhofen

Anhang

93

A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-materialen

Bezeichnung: Hersteller:

Auflichtmikroskop Axiovert 25 Zeiss, Oberkochen

Bildauswerteprogramm (Aida Image Analyzer) Raytest, Straubenhardt

Biophotometer Eppendorf, Köln

Bottle Top Filter (0,2 µm) Nalgene, Hamburg

Brutschrank Hera cell Heraeus, Hanau

Digitalwaage Sartorius, Göttingen

Durchflusszytometer PAS Partec, Münster

Elektrophoresekammer Hoefer, Wiesloch

Geldokumentationssystem Fuji LAS 3000 Raytest, Straubenhardt

H2O Aufbereitungsanlage Ultra Clear SG, Barsbüttel

iCycler (96 x 0,2 ml Modul) Bio-Rad, München

iCycler iQ Optical System Software (3.1) Bio-Rad, München

Kolbenhubpipetten Eppendorf, Hamburg

Kryoröhrchen Greiner, Frickenhausen

Kühlschrank Liebherr, Ochsenhausen

Kulturschalen Biochrom, Trasadingen (Schweiz)

Küvetten (UVetten) Eppendorf, Köln

Magnetrührer Heidolph, Schwabach

24-Mikrotiterlochplatten Sarstedt, Nümbrecht

Mikrotiterplattenlesegerät Tecan, Crailsheim

Mykoplasmendetektionskit Minerva Biolabs, Berlin

Netzgerät Bio-Rad, München

Neubauer-Zählkammer Marienfeld, Lauda-Königshofen

PCR-Reaktionsgefäße Bio-Rad, München

PCR-Reaktionsgefäße (8er Streifen) Sarstedt, Nümbrecht

PCR-Reaktionsgefäße (96 Lochplatte) Sarstedt, Nümbrecht

pH-Meter pH 320 WTW, Weilheim

Anhang

94

Pipettenspitzen Eppendorf, Köln

Pipettierhilfe Pipetus Hirschmann, Eberstadt

Ready-To-Go-PCR-Kit Amersham, Freiburg

Reaktionsgefäße, 1,5/2 ml Eppendorf, Köln

Rotator Neolab, Heidelberg

Spritzen Braun, Melsungen

Sterilbank Hera safe Heraeus, Hanau

Stickstoffbehälter MVE, Burnsville (USA)

Thermocycler MJ Research, USA

Tiefkühlschrank GFL, Burgwedel

Ultraschall-Sonifier 250 Branson, Hannover

UV-Lampe Bioblock Scientific, Illkirch Cedex (F)

UV-Radiometer PRC Krochmann, Berlin

Vakuum-Zentrifuge Heto, DK

Vortex Genie 2 Scientific Industries, USA

Wasserbad Julabo, Seelbach

Zellzähler Casy-1 Schärfe System, Reutlingen

Zellzyklusanalysensoftware FloMax Partec, Münster

Zentrifuge Biofuge pico Heraeus, Hanau

Zentrifuge Eppendorf, Köln

Zentrifugenröhrchen (15, 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht

Anhang

95

A.4 Verwendete Lösungen und Puffer

Alle Lösungen werden mit über Austascherkanülen aufgereinigtem destilliertem Wasser

angesetzt. Die Medien und Lösungen für die Zellkultur werden sterilfilriert.

A.4.1 Zellkultur

A549 Kulturmedium

DMEM

10 % FKS

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

PBS, pH 7,4

100 mM NaCl

7 mM Na2HPO4

4,5 mM KCl

3 mM KH2PO4

PBS-EDTA, pH 7,4

100 mM NaCl

7 mM Na2HPO4

4,5 mM KCl

3 mM KH2PO4

3 mM EDTA

Trypsin-Lösung

0,25 % Trypsin in PBS-EDTA

Anhang

96

A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot

RIPA-Zelllysepuffer

10 mM Tris, pH 7,6

150 mM NaCl

1mM EDTA

1 % Triton X-100

1 % Na-Desoxycholat

0,1 % SDS

1 mM PMSF

Blockierlösung

5 % Magermilchpulver in PBS

Bradfordlösung

1:5 - Verdünnung Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz mit H2Obidest

BSA-Stammlösung

100 µg/ml in H2O

Lämmli-Laufpuffer (1x)

192 mM Glycin

25 mM Tris

0,1 % SDS

Lämmli-Ladepuffer (4x)

320 mM Tris

8 % SDS

32 % Glycerin

8 % Mercaptolethanol

0,04 % Bromphenolblau

Anhang

97

Trenngelpuffer

1,5 M Tris pH 8,8

Sammelgelpuffer

1 M Tris pH 6,8

Transferpuffer

192 mM Glycin

20 mM Tris

0,01 % SDS

10 % Methanol

Trenngel

12 % Acrylamid

375 µM Tris

0,1 % SDS

ca. 0,1 % APS

ca. 1:1000 TEMED

Sammelgel

5 % Acrylamid

125 µM Tris

0,1 % SDS

ca. 0,1 % APS

ca. 1:1000 TEMED

Immunpräzipitationspuffer

10 mM Tris pH 7,6

140 mM NaCl

0,5 % NP40

0,5 mM PMSF (Stammlösung: 18 mg/ml in Isopropanol)

0,5 µg/ml Leupeptin (Stammlösung: 0,2 mg/ml in H2O)

2 µg/ml Aprotinin (Stammlösung: 0,3 mg/ml in 50 mM Tris pH 7)

0,7 µg/ml Pepstatin A (Stammlösung: 1,05 mg/ml in DMSO)

Anhang

98

Waschpuffer

PBS mit 0,3 % Tween 20

A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese

MOPS pH 7,0 (20x)

400 mM MOPS

100 mM Na-Acetat

10 mM EDTA

Ethidiumbromid-Lösung

10 mg/ml in H2O

FDP (Formamid-Denaturierungspuffer)

54 µl H2O

35 µl Formalin (37 %)

10 µl MOPS (20x)

100 µl Formamid (rekristallisiert)

1 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml)

Agarosegel

1,2 g Agarose

83 ml H2O

5 ml MOPS (20x)

12 ml Formaldehyd (37 %)

RNA-Laufpuffer

1x MOPS

Anhang

99

A.5 Primersequenzen

GAPDH reverse: 5´- GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG -3´ GAPDH forward: 5´- CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG -3´ p48 reverse: 5´- GCT GGC TTT CCC TCT AAC CTG -3´ p48 forward: 5´- CCT GAA CCC ATG CTG TGA TTG -3´ XPC reverse: 5´- GGC CAC GCG GTG TAG AT -3´ XPC forward: 5´- CGT GGA CGG GAA GGT GC -3´ p21 reverse: 5´- GTA CCA CCC AGC GGA CAA GT -3´ p21 forward: 5´- CCT CAT CCC GTG TTC TCC TTT -3´

A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation

Die qualitative Kontrolle der RNA-Isolation erfolge über eine denaturierende RNA-

Gelelektrophorese. Da die ribosomale RNA (rRNA) den größten Anteil an der Gesamt-RNA

einnimmt und eine definierte Größe besitzt, weisen die zwei scharfe Banden der 28 S rRNA

und der 18 S rRNA auf eine gute Integrität und geringe Denaturierung hin.

Abbildung 46: RNA-Gel zur Kontrolle der Integrität der isolierten RNA.

1 µl des RNA-Isolates wird pro Tasche aufgetragen und das Gel zwei Stunden bei 60 V und maximaler Amperezahl laufen gelassen. Zur Dokumentation wird das Gel bei 520 nm abfotografiert.

28 S rRNA

18 S rRNA

Anhang

100

A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse

Beispielhaft sind im Folgenden zwei Histogramme dargestellt, die die

Zellzyklusphasenverteilung 10 Stunden nach einer UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2

(Abbildung 47 B) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abbildung 47 A) zeigen.

Abbildung 47: Histogramme der Zellzyklusanalyse von Ko (A) und UVC (10 h, 5 J/m2) (B).

A.8 Dosis-Abstands-Kurve

Um bei den Versuchen mit dem DNA-schädigenden Agens UVC-Strahlung eine konstante

Dosis von 5 J/m2 einsetzen zu können, wurden im Vorfeld die geeigneten Parameter wie

Bestrahlungsabstand und Bestrahlungszeit festgelegt. Mit der in Abbildung 48 angegebenen

Leistung der Strahlungsquelle bei definiertem Abstand wird mit folgender Gleichung die

Bestrahlungszeit bei einem Abstand von 30 cm auf 5 sec bei festgelegt.

Watt = Joule/Sekunde

A B

Anhang

101

Abbildung 48: Aufnahme der Strahlungsintensität in Abhängigkeit von dem Abstand zur Strahlenquelle mittels UV-Radiometer.

A.9 cDNA-Verdünnungreihen

Die Verdünnungreihen wurde aus den entsprechenden cDNA-Proben hergestellt und dann

jeweils 1 µl der jeweiligen cDNA-Verdünnung in die PCR eingesetzt.

Abbildung 49: cDNA-Verdünnungsreihen mit den verwendeten Primern für GAPDH (A), p48 (B), XPC (C) und p21 (D).

A B

C D

Anhang

102

Im Fall von GAPDH (A), XPC (C) und p21 (D) wurden als Verdünnungsschritte zwischen

den aufeinander folgenden Proben 1:2, 1:5 und 1:2 eingesetzt. Eine Verdünnung um den

Faktor 2 resultiert theoretisch bei einer Verdopplung der DNA-Menge mit jedem Zyklus in

einer Verschiebung des Ct-Wertes um einen Zyklus, eine Verdünnung um den Faktor 5 um

2,3 Zyklen. Im Fall von p48 (B) liegt zwischen den einzelnen Verdünnungen ein

Verdünnungsfaktor von 10 und sollte somit in einer Verschiebung der Ct-Werte um jeweils

3,32 Zyklen resultieren.

103

Publikationsliste

Vorträge auf Fachtagungen GDCH Regionalverband 07. – 08.03.2005, Hamburg

Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und Funktion des

Tumorsuppressorproteins p53.

22. GUM Tagung, 21. - 24. 02. 2006, Darmstadt



Posterbeiträge auf Fachtagungen DGPT Mainz 2001

Interference of arsenic(III), cadmium(II), and nickel(II) with cell cycle progression and

control in A549 human lung cells.

I. Ehleben, C. Thuy, U. Herzer, A.Hartwig

43. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für experimentelle und klinische

Pharmakologie und Toxikologie 12. - 14.03.2002, Mainz

Interference of As(III), Cd(II),Co(II) and Ni(II) with cell cycle progression and control in

A549 human lung cells.

I. Ehleben, U. Herzer, D.Kostelac, C. Thuy, A. Hartwig

31. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 07. - 11. 09. 2002, Frankfurt

Einfluss von Cd(II) auf die Zellzykluskontrolle in menschlichen Lungenkrebszellen.

C. Thuy, I. Ehleben, A. Hartwig

32nd Annual Meeting of the EEMS, 03. - 03.09.2002, Waraw, Poland

Modulation of cell cycle control and gene expression by arsenic(III), cadmium(II), cobalt(II)

and nickel(II).

I. Ehleben, U. Herzer, C. Thuy, D. Kostelac, A. Hartwig

104

7. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 17. - 20.09.2002

Effects of arsenic(III), cadmium(II), cobalt(II) and nickel(II) on cell cycle control in human

lung carcinoma cells.

C. Thuy, I. Ehleben, D. Kostelac, A. Hartwig

33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 13. - 15. 09. 2004 Bonn

Arsenit und seine dreiwertigen methylierten Metabolite MMA(III) und DMA(III) reduzieren

die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in kultivierten menschlichen Zellen.

I. Walter, A. Pelzer, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig

33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 13. - 15. 09. 2004 Bonn

Einfluss von Cd(II) auf die Genexpression des an der Nukleotid-Exzisions-Reparatur

beteiligten Proteins p48 in menschlichen Lungenkrebszellen.

C. Thuy, A. Hartwig

8. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 28.09. - 01.10. 2004 Ulm

Impact of arsenic compounds on the poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells.

I. Walter, A. Pelzer, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig

8. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 28.09. - 01.10. 2004 Ulm

Modulation of p48 gene expression by CdO in cultured human lung cells.

C. Thuy, A. Hartwig

21. GUM Tagung, 05. - 08. 10. 2004 Würzburg

Modulation der Genexpression des Reparaturproteins p48 durch CD(II) in menschlichen

Lungenkrebszellen.

C. Thuy, A. Hartwig

21. GUM Tagung, 05. – 08. 10. 2004, Würzburg

Inhibierung der DNA-Reparatur, p53-Konformationsänderung und Induktion oxidativer

DNA-Schäden durch lösliche und partikuläre Cadmiumverbindungen.

T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig

105

35th Annual Meeting of the EEMS, 03. - 07. 07. 2005, Kos, Greece

Biomethylated arsenicals interfere with poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells.

I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig

22. GUM Tagung, 21. - 24. 02. 2006, Darmstadt

Hemmung von PARP-1 durch dreiwertige Arsenverbindungen.

I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, G.L. Dianov, A. Hartwig

Lebensmittelchemische Gesellschaft, Regionalverband Nord-Ost und Süd-Ost, Arbeitstagung

2006, 23. - 24. 03. 2006, Berlin

Dreiwertige Arsenverbindungen hemmen das DNA-Reparaturprotein PARP-1.

I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig

Veröffentlichungen

Publikationen in Fachzeitschriften Submitted for publication:

Impact of arsenite and its methylated metabolites on PARP-1 activity, PARP-1 gene

expression and poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells.

I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, J.L. Parsons, G.L. Dianov, A. Hartwig

Submitted for publication:

Genotoxicity of soluble and particulate cadmium compounds: oxidative DNA damage,

nucleotide excision repair and p53.

C. Thuy, T. Schwerdtle, A. Hartwig

Abstracts Lebensmittelchemie, 59 (5), 132. (2005)



C. Thuy, T. Schwerdtle, A. Hartwig

106

Buchbeitrag Schriftenreihe der GMS als Buch, wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, in

press. (2006)

Zinkfinger-Proteine als empfindliche Angriffspunkte für toxische Metall-Ionen und essentielle

Spurenelemente.

T. Schwerdtle, H. Blessing, G. Jahnke, C. Thuy, A. Hartwig

107

Lebenslauf

Name Christina Thuy

Persönliche Daten Geburtsdatum: 03.01.1977 in Speyer

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulbildung

1983 – 1987 Zeppelin-Grundschule in Speyer

1987 – 1996 Edith-Stein-Gymnasium in Speyer

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Studium

10/96 – 05/97 Studium der Diplomchemie an der Universität Karlsruhe

05/97 – Ende 2001 Studium der Lebensmittelchemie an der Universität Karlsruhe

29.09.1999 Vorprüfung der Staatsprüfung für Lebensmittelchemiker

2001 Wissenschaftliche Abschlussarbeit am Institut für Lebensmittelchemie

und Toxikologie der Universität Karlsruhe:

Thema: Einfluss von Cd(II) auf die Zellzykluskontrolle

Abschluss: Diplom-Lebensmittelchemikerin/

Zweiter Prüfungsabschnitt der Staatsprüfung für

Lebensmittelchemiker

Dissertation

05/02 – 07/04 Promotion am Institut für Lebensmittelchemie und Toxikologie der

Universität Karlsruhe (Prof. Dr. A. Hartwig)

Thema: Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und

die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53

Seit 08/04 Fortsetzung der Promotion am Institut für Lebensmitteltechnologie und

Lebensmittelchemie der TU Berlin (Prof. Dr. A. Hartwig)

108

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Andrea Hartwig für die Überlassung des

interessanten Arbeitsthemas, ihre fachlich kompetente und stets freundliche Unterstützung

und die großzügig gewährten Freiräume bei der Durchführung während der gesamten

Promotion. Danken möchte ich ihr außerdem für ihren Wechsel nach Berlin. Dadurch wurde

ich um einiges reicher an Erfahrung.

Herrn Prof. Dr. Manfred Metzler vom Institut für Angewandte Biowissenschaften der

Universität Karlsruhe danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.

Tanja Schwerdtle danke ich für ihre stete Hilfsbereitschaft und praktischer Unterstützung bei

meiner Arbeit.

Den Kollegen Gunnar Jahnke und Ingo Walter danke ich für den Zusammenhalt, vor allem

während der schweren Phase unseres gemeinsamen Umzuges aus dem Institut in Karlsruhe

nach Berlin.

Bei meiner Schreibtischnachbarin Caroline Hall möchte ich mich für ihre Freundschaft, ihren

Humor und ihre Unterstützung in allen Bereichen bedanken.

Jens Mäder und Thorsten Fiedler aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Lothar W. Kroh danke

ich für die Kaffeepausen und die Einführung in das Berliner Leben sowie für die

kulinarischen Streifzüge durch die norddeutsche Küche.

Allen anderen Kollegen aus dem Arbeitskreis danke ich für die überaus offene und kollegiale

Arbeitsatmosphäre während meiner Promotion.

Meinem Freund Drazen Kostelac möchte ich für sein Verständnis und den Zusammenhalt

trotz der räumlichen Trennung vor allem in der Endphase meiner Arbeit danken.

Bei meinen Eltern und Großeltern möchte ich mich dafür bedanken, dass sie mir den Weg zu

dieser Arbeit ermöglicht haben.

Der deutschen Nationalmannschaft danke ich für eine tolle WM 2006 in Deutschland und das

Erreichen des 3. Platzes.

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