Einfluss von Entzündungen auf das bovine Corpus luteum · Tierärztliche Hochschule Hannover...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss von Entzündungen auf das bovine Corpus lut eum

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Klaas-Dietrich Strüve

Rinteln

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein

Klinik für Reproduktionsmedizin

Zürich

Priv.-Doz. Dr. Kathrin Herzog

Klinik für Rinder

Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Harald Sieme

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2013

Meinen Eltern in Dankbarkeit

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG ................................................................................................. 11

2. LITERATURÜBERSICHT……………………………… ................................... 13

2.1 Entzündungen des Uterus und Fertilität......... ........................................... 13 2.1.1 Metritis und Endometritis............................................................................ 13 2.1.2 Bakterielle Kontamination und olfaktorische Befunde des Lochialsekretes 14 2.1.3 Bedeutung histologischer Untersuchungen des Uterus auf die Fruchtbarkeit .............................................................................................. 15 2.1.4 Einfluss von Entzündungen auf die Fruchtbarkeitskennzahlen .................. 16

2.2 Einfluss von Entzündungen auf die ovarielle Akt ivität............................. 17 2.2.1 Einfluss einer Metritis auf die Ovaraktivität................................................. 17 2.2.2 Einfluss weiterer Entzündungen auf die Ovaraktivität ................................ 17 2.2.3 Einfluss von Endotoxinen auf die Ovaraktivität im Zyklus .......................... 18 2.2.4 Einfluss von Endotoxinen auf die Ovaraktivität während der Gravidität ..... 20 2.2.5 Einfluss nicht-entzündlicher Erkrankungen auf das Corpus luteum ........... 21

2.3 Persistierende Corpora lutea................... ................................................... 22 2.3.1 Definition und Auftreten.............................................................................. 22 2.3.2 Entstehung von persistierenden Corpora lutea .......................................... 23

2.4 Bestimmung der lutealen Aktivität .............. ............................................... 24 2.4.1 Hormonelle und sonographische Untersuchungen von Corpora lutea ....... 24 2.4.2 Luteale Genexpressionsanalyse ................................................................ 25

3. MATERIAL UND METHODEN ........................... ........................................... 27

3.1 Metritis-Studie................................ .............................................................. 27 3.1.1 Tiere ........................................................................................................... 27 3.1.2 Experimentelles Design............................................................................. 27

3.1.2.1 Gruppeneinteilung............................................................................... 27 3.1.2.2 Überwachung der Zyklusaktivität ........................................................ 28 3.1.2.3 Untersuchungen zyklischer Corpora lutea .......................................... 29 3.1.2.4 Untersuchungen persistierender Corpora lutea................................... 29 3.1.2.5 Endometriumsbiopsien und Fruchtbarkeitsparameter......................... 30

3.1.3 Manuelle transrektale Untersuchung.......................................................... 32 3.1.4 Sonographische Untersuchungen und Auswertungen ............................... 32 3.1.5 Blutprobenentnahme und Bestimmung von Progesteron und Prostaglandin E.......................................................................................... 33 3.1.6 Corpus luteum Biopsien ............................................................................. 34

INHALTSVERZEICHNIS

3.1.7 RNA Extraktion und Synthese der komplementären DNA der Corpus luteum Biopsien.......................................................................................... 35 3.1.8 Real-Time RT-PCR .................................................................................... 36 3.1.9 Endometriumsbiopsien............................................................................... 37 3.1.10 Statistische Methoden................................................................................ 38

3.2 LPS-Studie..................................... ............................................................... 39 3.2.1 Tiere ........................................................................................................... 39 3.2.2 Experimentelles Design.............................................................................. 39 3.2.3 Ultrasonographische Untersuchungen ....................................................... 40 3.2.4 Blutprobenentnahme und Bestimmung von Progesteron, PGFM sowie Prostaglandin E................................................................................ 42 3.2.5 Corpus luteum Biopsien ............................................................................. 43 3.2.6 RNA Extraktion und Synthese der komplementären DNA der Corpus luteum Biopsien.......................................................................................... 43 3.2.7 Real-Time RT-PCR .................................................................................... 43 3.2.8 Immunhistochemie ..................................................................................... 44 3.2.9 Statistische Methoden................................................................................ 45

4. CHAPTER 1: THE EFFECT OF METRITIS ON LUTEAL FUNC TION IN DAIRY COWS ............................................................................................... 46

4.1 Abstract ....................................... ................................................................. 46

4.2 Introduction.................................. ................................................................ 47

4.3 Materials and Methods .......................... ...................................................... 49 4.3.1 Cows .......................................................................................................... 49 4.3.2 Experimental design.................................................................................. 49

4.3.2.1 Group allocation .................................................................................. 49 4.3.2.2 Observation of cyclicity ....................................................................... 50 4.3.2.3 Cyclic corpus luteum........................................................................... 50 4.3.2.4 Persistent corpus luteum..................................................................... 51 4.3.2.5 Endometrial biopsy and fertility procedures ........................................ 51

4.3.3 Ultrasonography......................................................................................... 52 4.3.4 Measurement of progesterone and prostaglandin E................................... 53 4.3.5 Procedure of luteal biopsy.......................................................................... 54 4.3.6 Luteal RNA extraction and cDNA production ............................................. 54 4.3.7 Real-time RT-PCR ..................................................................................... 55 4.3.8 Procedure of endometrial biopsy................................................................ 56 4.3.9 Statistical analysis ...................................................................................... 57

4.4 Results........................................ .................................................................. 58 4.4.1 Groups ....................................................................................................... 58 4.4.2 Cyclic corpus luteum .................................................................................. 58 4.4.3 Persistent corpus luteum............................................................................ 59 4.4.4 Endometrial biopsy and fertility procedures................................................ 59

INHALTSVERZEICHNIS

4.5 Discussion..................................... ............................................................... 60

4.6 Tables and figures ............................. .......................................................... 64

5. CHAPTER 2:ESCHERICHIA COLI LIPOPOLYSACCHARIDE ADMINISTRATION TRANSIENTLY SUPPRESSES LUTEAL FUNCT ION AND STRUCTURE IN DIOESTROUS COWS............................................... 71

6. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION........................ ......................................... 81

7. ZUSAMMENFASSUNG................................. ................................................ 89

8. SUMMARY .................................................................................................... 92

9. LITERATURVERZEICHNIS ............................ .............................................. 95

10. TABELLENVERZEICHNIS............................ .............................................. 108

11. ABBILDUNGSVERZEICHNIS.......................... ........................................... 109

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS


AI artificial insemination

bp Basenpaar (base pair)

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

B-Mode brightness mode

ca. circa

cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)

CL Corpus luteum

CLs Corpora lutea

cm Zentimeter (centimeter)

cm² Quadratzentimeter (square centimeter)

COX-2 Cyclooxygenase-2

Cum. Survival Cumulative Survival

∆Cq normalisierte mRNA Werte (normalized mRNA values)

d day

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

DNase Desoxyribonuklease (desoxyribonuclease)

EDTA Ethylendiamintetraacetat (ethylenediaminetetraacetic acid)

EIA Enzymimmunoassay

et al. und andere

E. coli Escherichia coli

GAPDH Glycerolaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

(glycerolaldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)

GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon (gonadotropin-releasing

hormone)

h Stunde (hour)

H.E.-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung

HRP Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)


IgG Immunglobulin G

i.m. intramuskulär (intramuscular)

i.v. intravenös (intravenous)

kg Kilogramm (kilogram)

LH Luteinisierungshormon (luteinizing hormone)

LPS Lipopolysaccharide

MAD Median der absoluten Abweichungen (mean absolute

deviation)

mg Milligramm (milligram)

MHz Megahertz (megahertz)

min Minute (minute)

ml Milliliter (milliliter)

mm Millimeter (millimeter)

mM mmol/l

mRNA Boten-RNA

MW Mittelwert

µg Mikrogramm (microgram)

µl Mikroliter (micoliter)

µm Mikrometer (micrometer)

n Anzahl (number)

ng Nanogramm (nanogram)

nm Nanometer (nanometer)

p oder P Irrtumswahrscheinlichkeit (probability)

P4 Progesteron (progesterone)

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

pg Pikogramm (picogram)

PG Prostaglandin (prostaglandin)

PGE Prostaglandin E (prostaglandin E)

PGEM Prostaglandin E Metaboliten

PGFM 13,14-dihydro-15-keto-Prostaglandin F2α


PGF2α Prostaglandin F 2α (prostaglandin F2α)

PGH2b Prostaglandin H 2b (prostaglandin H 2b)

pH negativer dekadischer Logarithmus der Hydroniumionen

Konzentration

pp post partum

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

RNase Ribonukleasen (ribonuclease)

RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction

s.c. subkutan

SD Standardabweichung (standard deviation)

sek Sekunde (second)

SEM Standardfehler (standard error of the mean)

StAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein (steroidogenic

acute regulatory protein)

T. pyogenes Trueperella pyogenes

UK United Kingdom

WI Wisconsin

3ß-HSD 3ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3ß-hydroxysteroid-

dehydrogenase)

x g Erdbeschleunigung (gravitational acceleration)

°C Grad Celsius (degree Celsius)

Ø Durchmesser (diameter)

% Prozent (percent)

EINLEITUNG

11

1. EINLEITUNG

Entzündungen führen zu einer herabgesetzten Fruchtbarkeit bei Milchkühen. Kühe,

die nach einer Insemination an einer klinischen Mastitis erkrankten, mussten für eine

erfolgreiche Trächtigkeit im Vergleich zu gesunden Kühen nahezu doppelt so häufig

besamt werden (BARKER et al. 1998). In einer Reihe von Studien wurde nachge-

wiesen, dass eine Endometritis die Reproduktionsleistung von Milchkühen ebenfalls

verschlechtert (BORSBERRY u. DOBSON 1989; LEBLANC et al. 2002). Es ist

bekannt, dass Entzündungen, die nicht im ovariellen Gewebe lokalisiert sind, den-

noch Einfluss auf die Physiologie des Ovars ausüben. Bei einem hohen pathogenen

Keimgehalt des Uterus waren die ersten dominanten Follikel post partum (pp) kleiner

und produzierten weniger Östradiol (SHELDON et al. 2002; WILLIAMS et al. 2007).

Auch experimentelle, durch Endotoxine verursachte Entzündungen beeinflussen die

Ovaraktivität. Sowohl durch die systemische Gabe von Endotoxinen an Kühe im

Proöstrus (SUZUKI et al. 2001; LAVON et al. 2008) als auch durch experimentell

induzierte Mastitiden (HOCKETT et al. 2005) wurden Ovulationen verzögert oder

sogar unterdrückt. Neben der Follikulogenese beeinträchtigen Entzündungen auch

die luteale Aktivität. Wies der Uterus in den ersten Wochen pp einen hohen Gehalt

an pathogenen Keimen auf, war das Corpus luteum (CL) des ersten Zyklus kleiner

und produzierte weniger Progesteron (P4; WILLIAMS et al. (2007)). Durch die

intravenöse Gabe von Endotoxinen an nicht tragende Kühe im Diöstrus wurde nach

einem kurzfristigen Anstieg der Plasma P4 Konzentration eine ca. 16-stündige Phase

einer deutlich herabgesetzten P4 Konzentration beobachtet (GILBERT et al. 1990).

GIRI et al. (1990) applizierten graviden Kühen Endotoxine und verursachten dadurch

bei sechs von zehn Tieren einen Abort. Die Autoren vermuten, dass die Endotoxine

über einen erhöhten Prostaglandin (PG) F2α Spiegel die Luteolyse induzierten, die

zum Abbruch der Trächtigkeit führte.

Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von Entzündungen auf das CL in zwei

verschiedenen Studien zu untersuchen. In der ersten Feldstudie wurde ein möglicher

EINLEITUNG

12

Langzeiteffekt von Entzündungen auf das CL bestimmt (Metritis-Studie). Dafür

wurden die Größe und Genexpression von CLs sowie die periphere P4 Kon-

zentration von Tieren mit und ohne klinischer Metritis vom ersten bis zum vierten

Zyklus pp untersucht. In der zweiten experimentellen Studie wurde der kurzzeitige

Effekt von Lipopolysacchariden (LPS) auf die luteale Aktivität von nicht-laktierenden

Kühen im Diöstrus anhand der lutealen Größe, Durchblutung und Genexpression

sowie der peripheren P4- und Prostaglandin Konzentration analysiert (LPS-Studie).

Durch diese Untersuchungen sollte geprüft werden, welche Mechanismen durch

entzündliche Erkrankungen im CL induziert werden und ob diese eine Erklärung für

die schlechte Fertilität bei entzündlich erkrankten Milchkühen sein könnten.

LITERATURÜBERSICHT

13

2. LITERATURÜBERSICHT

Die Infertilität gilt als Hauptgrund für die Remontierung von Kühen in Milchbetrieben

und ist somit für einen erheblichen wirtschaftlichen Schaden verantwortlich

(BRICKELL u. WATHES 2011). Jede fünfte Merzung einer Milchkuh ist auf

mangelnde Fruchtbarkeitsergebnisse zurückzuführen (BASCOM u. YOUNG 1998).

Systemische als auch lokale Entzündungen besitzen bei Milchkühen einen negativen

Effekt auf die Fruchtbarkeit (BARKER et al. 1998; GILBERT et al. 2005). Auch das

CL wird durch Entzündungen wie z. B. eine Metritis in seiner Morphologie und

Physiologie beeinflusst (WILLIAMS et al. 2007). Deshalb wurde in der vorliegenden

Dissertation der Einfluss von Entzündungen auf das CL in zwei verschiedenen

Versuchsansätzen untersucht.

2.1 Entzündungen des Uterus und Fertilität

2.1.1 Metritis und Endometritis

Da in der Vergangenheit keine einheitliche Definition einer Metritis oder Endometritis

in der Literatur existierte, nutzten SHELDON et al. (2009) Aspekte verschiedener

Studien, um puerperale Entzündungen des Uterus einheitlich anhand klinischer

Befunde zu klassifizieren. Aufgrund histologischer Untersuchungen wurde eine

Metritis demnach auf den Zeitraum vom Partus bis Tag 21 pp beschränkt. Klinisch

war sie durch einen vergrößerten Uterus mit übel riechendem, wässrigem, rötlich-

braunem Lochialsekret gekennzeichnet. Ferner wurde die Metritis in drei Grade

unterteilt, wobei die oben beschriebenen Befunde den ersten Grad dieser

Erkrankung charakterisierten. Traten zusätzlich systemische Entzündungssymptome

wie Fieber auf, lag der zweite Grad vor. Tiere mit einer Metritis Grad III zeigten eine

Toxämie, die sich in einer hochgradigen Störung des Allgemeinbefindens äußerte

und bis zum toxischen Schock führen konnte. Klinisch pathologische Befunde, die

LITERATURÜBERSICHT

14

nach Tag 21 pp auftraten, definierten SHELDON et al. (2009) als eine klinische

Endometritis. Je nach Menge der purulenten Beimengungen im Vaginalschleim

wurde ebenfalls zwischen drei Graden der Endometritis unterschieden. Bei Vorliegen

eines klaren oder durchscheinenden vaginalen Ausflusses galt die Kuh als gesund.

Enthielt der Vaginalschleim einzelne weiße oder cremefarbene Eiterflocken, lag eine

Endometritis ersten Grades vor. War deutlich mehr weißes oder cremefarbenes

Exsudat beigemischt, dessen Anteil 50% aber nicht überstieg, wurde eine

Endometritis zweiten Grades diagnostiziert. Ein Vaginalschleim, der über 50% aus

weißem, gelbem oder mitunter blutfarbenem Exsudat bestand, wurde einer

Endometritis dritten Grades zugeordnet.

2.1.2 Bakterielle Kontamination und olfaktorische Befunde des Lochialsekretes

Die olfaktorische Beurteilung des Lochialsekretes gibt Hinweise auf die

Keimzusammensetzung und die Schwere einer Entzündung im Uterus.

HUSZENICZA et al. (1999) wiesen am Tag 10 pp bei 78 Kühen mit übelriechendem

Lochialausfluss erhöhte Konzentrationen an Trueperella pyogenes (T. pyogenes),

Escherichia coli (E. coli) und gramnegativen Anaerobiern in Uterustupferproben nach.

Dabei korrelierte das Vorliegen von T. pyogenes mit dem Auftreten von

gramnegativen Anaerobiern. Die Autoren vermuteten eine synergistische Wirkung

beider Keime. Es zeigte sich, dass T. pyogenes länger als andere Bakterien im

Uterus nachzuweisen war und dieses mit einer herabgesetzten Konzeptionsrate

assoziiert war. Auch in der Studie von BONNETT et al. (1993) führte bei 91

untersuchten Kühen eine Infektion mit diesem Keim zu einer verschlechterten

Fruchtbarkeit. WILLIAMS et al. (2005) zeigten anhand der Auswertung von 328

Tupferproben, dass übelriechendes Lochialsekret mit einem erhöhten Plasmaspiegel

an Akute-Phase-Proteinen einherging. Wie in anderen Studien korrelierten

Geruchsabweichungen des Lochialsekrets mit dem Auftreten von T. pyogenes, E.

coli, nicht-hämolysierenden Streptokokken und Mannheimia haemolytica.

LITERATURÜBERSICHT

15

2.1.3 Bedeutung histologischer Untersuchungen des Uterus auf die Fruchtbarkeit

Entzündlich bedingte postpartale Störungen der Uterusinvolution lassen sich auch

über das Puerperium hinaus histologisch nachweisen. In der Studie von THEUS et al.

(1979) wurden Schlachtuteri von Milchkühen unter besonderer Berücksichtigung des

Vorberichts untersucht. In der Gruppe der Tiere, die vorberichtlich eine klinische

Endometritis hatten, die wiederum am Tag der Schlachtung klinisch ausgeheilt war,

wurden dennoch bei sechs von elf Tieren umfangreiche histologische

Veränderungen des Endometriums festgestellt. Im Gegensatz dazu wies keines der

fünf Tiere mit einer physiologischen Uterusinvolution ausgeprägte histologische

Veränderungen auf.

BONNETT et al. (1993) untersuchten im Puerperium histologisch Endometriums-

biopsien von 97 Milchkühen im Hinblick auf die Fertilität. Bei vermehrt nach-

gewiesenen Entzündungszellen wie neutrophilen Granulozyten und Makrophagen

wurde eine Endometritis diagnostiziert. Es zeigte sich, dass Kühe mit guten

Fruchtbarkeitsergebnissen weniger entzündliche Veränderungen im Stratum

compactum aufwiesen (Tag 26 pp) als Kühe mit einer schlechten Fruchtbarkeit. Als

Kühe mit guter Fruchtbarkeit wurden Tiere definiert, die bis zum Tag 119 pp

erfolgreich besamt wurden (n = 31). Im Gegensatz hierzu wurde Tieren eine

schlechte Fruchtbarkeit attestiert, die nicht innerhalb von 175 Tagen nach der

Abkalbung konzipierten oder aufgrund wiederholten Umbullens gemerzt wurden.

Vergleichbare Ergebnisse ergab eine Studie, in der histologisch Endometriums-

biopsien von 15 fertilen mit 135 wegen Infertilität gemerzten Kühen verglichen

wurden (RODENBUSCH 2011). Dabei traten bei infertilen Rindern häufiger mittel-

und hochgradige Endometritiden auf. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass 64%

der infertilen Tiere mit histologisch nachgewiesener Endometritis klinisch unauffällig

und demnach subklinisch erkrankt waren.

LITERATURÜBERSICHT

16

2.1.4 Einfluss von Entzündungen auf die Fruchtbarkeitskennzahlen

Der negative Einfluss intra- und extrauteriner Entzündungen auf die Fertilität von

Milchkühen ist seit Jahrzehnten bekannt und Forschungsgegenstand zahlreicher

Studien. Eine Vielzahl von Arbeiten zeigte bereits, dass Metritiden bzw.

Endometritiden die Fruchtbarkeit bei Rindern herabsetzen (BORSBERRY u.

DOBSON 1989). Tiere mit klinischer Endometritis (Tag 20 bis 33 pp) wurden im

Vergleich zu Tieren ohne Endometritis fast doppelt so häufig wegen Unfruchtbarkeit

gemerzt (LEBLANC et al. 2002). Bei einer physiologischen Uterusinvolution lag der

Anteil der Kühe, die 300 Tage nach der Abkalbung wieder tragend waren, bei 89%.

Für Tiere mit einer postpartalen Endometritis verringerte sich der entsprechende

Anteil auf 69% (GILBERT et al. 2005). Darüber hinaus war der Erstbesamungserfolg

bei Kühen mit einer Endometritis um 15% niedriger als bei Kühen ohne Puerperal-

störung (KIM u. KANG 2003). Auch extrauterine Entzündungen wirkten sich negativ

auf Fruchtbarkeitskennzahlen von Kühen aus. So verlängerte sich die Rastzeit um 13

(BARKER et al. 1998) bzw. neun Tage (SCHRICK et al. 2001), falls Kühe vor der

ersten Besamung pp an einer klinischen Mastitis erkrankten. Trat diese Erkrankung

bei Kühen nach der ersten postpartalen Besamung auf, waren nahezu doppelt so

viele Besamungen für eine Trächtigkeit nötig als bei gesunden Kühen (BARKER et al.

1998).

LITERATURÜBERSICHT

17

2.2 Einfluss von Entzündungen auf die ovarielle Akt ivität

2.2.1 Einfluss einer Metritis auf die Ovaraktivität

Uterine Entzündungen beeinflussen die Ovaraktivität bei Rindern. Kühe mit einer

erhöhten Anzahl an pathogenen Keimen im Lochialsekret entwickelten bis zum Tag

26 pp kleinere Corpora lutea (CLs) als Tiere mit einem geringeren Keimgehalt

(WILLIAMS et al. 2007). Analog zu der erniedrigten lutealen Größe war die periphere

P4 Konzentration herabgesetzt. Die durch die intrauterine Entzündung bedingten

Toxine wurden dabei für den hemmenden Effekt auf die Lutealzellen verantwortlich

gemacht. Der Effekt blieb jedoch nicht nur auf die Zellen des CL beschränkt, sondern

wirkte sich auch negativ auf die Follikulogenese aus. So war bei Vorliegen eines

erhöhten intrauterinen Gehalts an Pathogenen der erste postpartale dominante

Follikel kleiner und produzierte weniger Östradiol (SHELDON et al. 2002; WILLIAMS

et al. 2007). Bereits in einer älteren Arbeit gab es Hinweise darauf, dass Tiere mit

einer Retentio secundinarum im Vergleich zu gesunden Tieren in den ersten beiden

Wochen des Puerperiums weniger Follikel anbildeten (PETER u. BOSU 1988).

2.2.2 Einfluss weiterer Entzündungen auf die Ovaraktivität

Neben der Metritis bzw. Endometritis wurde in einigen Arbeiten auch der Einfluss

weiterer entzündlicher Reaktionen auf die ovarielle Aktivität untersucht. Nach einer

experimentellen Infektion mit dem Bovinen Virus Diarrhoe-Virus erniedrigte sich bei

den infizierten Kühen die Plasma Östradiol Konzentration, wenngleich sich die

peripheren Plasmakonzentrationen von P4 und PGF2α im Vergleich zu denen

gesunder Tiere nicht unterschieden (FRAY et al. 1999). Auch klinische Mastitiden

zeigten keinen Effekt auf die Plasma P4 Konzentration bei Kühen (LAVON et al.

2010). Allerdings ereignete sich die Mastitis in der letztgenannten Studie bereits

20 ± 7 Tage vor der Blutprobenentnahme.

LITERATURÜBERSICHT

18

2.2.3 Einfluss von Endotoxinen auf die Ovaraktivität im Zyklus

Beim Rind wurden in der Vergangenheit exogene Endotoxine eingesetzt, um

Entzündungen unter definierten Bedingungen zu simulieren. Als Endotoxinquelle

dienten dabei häufig LPS, Zellwandbestandteile von E. coli Bakterien. LPS wurden

Kühen in verschiedenen Versuchsansätzen im Diöstrus sowohl intravenös als auch

intrauterin appliziert (GILBERT et al. 1990). Nach intravenöser Endotoxingabe wurde

vier Stunden nach der Applikation ein signifikanter Anstieg der 13,14-dihydro-15-

keto-Prostagladin F2α (Metaboliten von Prostaglandin F2α; PGFM) beobachtet. Dieser

hatte jedoch keinen Einfluss auf die Zykluslänge (GILBERT et al. 1990). Auch die P4

Konzentration stieg zunächst vier Stunden nach Endotoxingabe stark an. Danach

sank sie 12 bis 28 Stunden nach der LPS Applikation deutlich ab, um zwei Tage

nach der LPS Gabe wieder das Ausgangsniveau zu erreichen.

Intrauterin verabreichte E. coli Endotoxine (5 µg/kg) hatten weder einen Effekt auf die

Zykluslänge noch auf die PGFM- und P4-Konzentration (GILBERT et al. 1990).

Allerdings führte die intrauterine Applikation einer vermehrungsfähigen E. coli Kultur-

lösung (ca. 109 koloniebildende Einheiten/ml) bei drei Viertel der Versuchstiere zu

einer Zyklusverkürzung.

Mehrere Studien belegen einen negativen Einfluss von Endotoxinen auf

physiologische Vorgänge während des Östrus bei Kühen. Wurde LPS während des

Östrus intramammär (n = 8) oder intravenös (n = 13) verabreicht, verlängerte sich

unabhängig von der Applikationsart bei einem Drittel der behandelten Kühe der

Zeitraum von Östrus bis zur Ovulation auf ca. 75 Stunden oder es kam sogar zu

einer Unterdrückung der Ovulation (LAVON et al. 2008). Die restlichen zwei Drittel

der mit LPS behandelten Kühe und Kühe einer Kontrollgruppe (n = 12) ovulierten ca.

30 Stunden nach Einsetzen des Östrus. LAVON et al. (2008) vermuten, dass die

beobachtete Verminderung bzw. Verzögerung des präovulatorischen LH-Peaks nach

der Endotoxingabe für die gestörte Ovulation verantwortlich war. Ähnliche Ergeb-

nisse erhielten SUZUKI et al. (2001), die mittels PGF2α den Östrus bei Kühen

LITERATURÜBERSICHT

19

induzierten und den brünstigen Kühen 42 Stunden später intravenös LPS injizierten.

Der Zeitraum von der PGF2α Gabe bis zur Ovulation verlängerte sich auf 8,0 ± 1,3

Tage bei den LPS Tieren. Die Kontrolltiere ovulierten 4,2 ± 0,2 Tage nach der

Prostaglandininjektion. Die LH Pulsfrequenz war in den ersten sechs Stunden nach

der Endotoxinapplikation erniedrigt und fünf der sechs mit LPS behandelten Tiere

entwickelten keinen präovulatorischen LH-Peak. Auch die Östradiol Konzentration

war 24 Stunden nach der LPS Gabe im Gegensatz zur Kontrollgruppe herabgesetzt.

Fast identische Ergebnisse lieferte die Studie von HOCKETT et al. (2005), in der

eine Entzündung bei diöstrischen Kühen durch die experimentelle Infektion des

Euters mit Streptokokkus uberis hervorgerufen wurde. Eine PGF2α Applikation

erfolgte vier Tage später, um einen Östrus zu induzieren. Nach der Behandlung von

19 Kühen mit dem pathogenen Erreger, entwickelten 12 Tiere eine klinische Mastitis,

von denen acht Kühe in der Folge weder Brunstverhalten ausprägten noch ovulierten.

Jene acht Tiere zeigten im Vergleich zu den anderen experimentell infizierten Tieren

und einer Kontrollgruppe eine erniedrigte Frequenz der LH-Pulse, eine

Abschwächung des präovulatorischen LH-Peaks sowie eine Verminderung des

Östradiol-Spiegels.

Wie in der Studie von WILLIAMS et al. (2001) belegt, vermindern systemisch

applizierte Endotoxine bei Schafen die Ansprechbarkeit der Hypophyse gegenüber

dem Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH). In dieser Studie führte die Behand-

lung mit LPS zu veränderten LH Konzentrationen im Plasma, obwohl die GnRH

Konzentrationen im Portalgefäß der Hypophyse annähernd unverändert waren.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der stimulierende Einfluss von exogenem

GnRH auf die Hypophyse unter dem Einfluss von LPS gehemmt wurde. Schafe ohne

Endotoxinbehandlung wiesen deutlich höhere LH Konzentrationen nach GnRH Gabe

auf als Schafe mit einer Endotoxinexposition.

LITERATURÜBERSICHT

20

2.2.4 Einfluss von Endotoxinen auf die Ovaraktivität während der Gravidität

In verschiedenen Trächtigkeitsphasen verabreichten GIRI et al. (1990) Kühen über

einen Zeitraum von sechs Stunden intravenös LPS in zwei verschiedenen Konzen-

trationen (1,0 und 2,5 µg pro kg Körpergewicht). Zwei der drei Kühe, denen die

höhere Endotoxindosis infundiert wurde, abortierten. Vier von sieben Kühen, denen

die geringere LPS Konzentration verabreicht wurde, abortierten und zwei abortierten

nicht. Ein Tier verendete. Da der Anteil an abortierenden Kühen (drei von vier) im

ersten Drittel der Trächtigkeit im Gegensatz zu den späteren Trächtigkeitsphasen am

höchsten war, vermuteten die Autoren, dass die Tiere zu diesem Zeitpunkt

besonders anfällig waren. Darüber hinaus führten GIRI et al. (1990) endokrino-

logische Untersuchungen durch. Die Plasma P4 Konzentration änderte sich bei den

Tieren während der sechsstündigen Infusion mit 1,0 µg LPS nicht. Aber 36 Stunden

nach Infusionsbeginn war sie, verglichen mit der Ausgangskonzentration, bis zum

Ende der Studie (120 Stunden) erniedrigt. Im Gegensatz hierzu stieg die P4

Konzentration nach der LPS Gabe in der Dosierung von 2,5 µg LPS pro kg

Körpergewicht ähnlich wie bei GILBERT et al. (1990) innerhalb der ersten Stunde auf

nahezu das Doppelte der Ausgangskonzentration an. Wie bei der geringeren

Endotoxindosis war sie aber nach 18 Stunden bis zum Ende der Studie niedriger als

die Ausgangskonzentration. Weiterhin verursachten die Endotoxine eine Erhöhung

des PGF2α Spiegels, die sich über einen Zeitraum von 12 (1,0 µg LPS pro kg

Körpergewicht) bzw. 48 Stunden (2,5 µg LPS pro kg Körpergewicht) erstreckte.

Dieser PGF2α Anstieg sollte gemäß GIRI et al. (1990) durch die Aktivierung uteriner

Muskelkontraktionen und die Induktion der Luteolyse für die Aborte verantwortlich

sein.

LITERATURÜBERSICHT

21

2.2.5 Einfluss nicht-entzündlicher Erkrankungen auf das Corpus luteum

Neben Entzündungen können auch metabolische Prozesse das CL und seine P4

Syntheseleistung beeinflussen. Milchkühe mit einem schweren Energiedefizit in den

ersten neun Tagen des Puerperiums wiesen auch noch im zweiten und dritten Zyklus

pp geringere Milch P4 Konzentrationen auf als Tiere ohne diese Stoffwechsel-

belastung (VILLA-GODOY et al. 1988; STAPLES et al. 1990). Die Autoren ver-

muteten, dass eine negative Energiebilanz zu einer herabgesetzten Entwicklung

und/oder Syntheseleistung des CL führte. Die Höhe der peripheren P4 Konzentration

wird nicht nur von der lutealen Syntheseleistung, sondern auch vom Katabolismus

dieses Hormons beeinflusst (WILTBANK et al. 2006). In einer Studie, in der Kühen

exogenes P4 zugefügt wurde, während die Synthese von endogenem P4 mittels

eines GnRH Antagonisten unterdrückt wurde, wurde sogar von einer negativen

Korrelation zwischen der Futteraufnahme und der Plasma P4 Konzentration berichtet

(RABIEE et al. 2001). Wurden auf diese Weise behandelte Kühe ad libitum gefüttert,

wiesen sie signifikant niedrigere Plasma P4 Konzentrationen auf als Kühe, die

restriktiv gefüttert wurden (1,08 versus 1,71 ng/ml). In Fütterungsversuchen wurde

weiterhin gezeigt, dass die Leberdurchblutung bei Milchkühen zwei Stunden nach

der Fütterung maximal anstieg. Dabei korrelierte die hepatogene Durchblutung mit

der Stoffwechselrate von Steroidhormonen, die drei Stunden nach Futteraufnahme

ihr Maximum erreichte (SANGSRITAVONG et al. 2002).

LITERATURÜBERSICHT

22

2.3 Persistierende Corpora lutea

2.3.1 Definition und Auftreten

Obwohl das Persistieren von CLs bereits seit Jahrzehnten als Reproduktions-

erkrankung anerkannt ist, existiert noch keine einheitliche Definition für diese

Erkrankung. Einige Autoren verbinden persistierende CLs fest mit dem Auftreten

einer Pyometra (MELAMPY u. ANDERSON 1968; MANNS et al. 1985; FARIN et al.

1989; DAVIDSON et al. 1996; MWAANGA u. JANOWSKI 2000). Definitionsgemäß

liegt eine Pyometra vor, wenn der Uterus bei verschlossener Zervix hochgradig mit

eitrigem Sekret gefüllt ist und gleichzeitig am Ende der physiologischen Zykluslänge

die Luteolyse ausbleibt (MWAANGA u. JANOWSKI 2000; SHELDON et al. 2006). In

anderen Quellen wurde ein persistierendes CL über regelmäßige Bestimmungen der

P4 Konzentration in Milch oder Blut diagnostiziert. In einigen Quellen wurde dabei für

persistierende CL das Synonym „verlängerte Lutealphasen“ verwendet (LAMMING u.

DARWASH 1998; OPSOMER et al. 2000). Lag der Milchprogesterongehalt über

einen Zeitraum von 19 bzw. 20 Tagen über 3 ng/ml, galt dies als Beweis für das

Vorliegen eines persistierenden CLs (LAMMING u. DARWASH 1998; TAYLOR et al.

2003; PETERSSON et al. 2007; POLLOTT u. COFFEY 2008; GARMO 2009).

Wieder andere Autoren definierten ein persistierendes CL als luteale Struktur, die bei

einer Plasma P4 Konzentration oberhalb von 1 ng/ml über einen Zeitraum von 30

Tagen sonographisch nachweisbar war (HAUGHIAN et al. 2002; GUMEN et al.

2005).

Die Angaben über die Prävalenz von persistierenden CL schwanken in der Literatur

zwischen 11 und 35% (FONSECA et al. 1983; LAMMING u. DARWASH 1998;

OPSOMER et al. 2000; ZULU et al. 2002; TAYLOR et al. 2003; GUMEN et al. 2005;

POLLOTT u. COFFEY 2008). In mehreren Studien wurde eine gestörte Uterus-

involution als begünstigender Faktor bei der Entstehung von persistierenden CLs

nachgewiesen (OPSOMER et al. 2000; TAYLOR et al. 2003). Bei OPSOMER et al.

(2000) war neben einer Metritis, einer Retentio secundinarum sowie einem

LITERATURÜBERSICHT

23

veränderten vaginalen Ausfluss auch ein kurzes Intervall von der Kalbung bis zur

ersten Ovulation mit persistierenden CLs assoziiert.

2.3.2 Entstehung von persistierenden Corpora lutea

Zur Einleitung einer Luteolyse spielt PGF2α eine zentrale Rolle. Bleibt die Bildung von

Interferon τ durch einen Embryo am Ende des Zyklus aus, kann das vom Endo-

metrium sezernierte PGF2α die luteolytische Kaskade am CL induzieren (ASSELIN et

al. 1997).

Mehrere Autoren beobachteten, dass Metritiden bzw. Endometritiden mit einem

erhöhten Vorkommen an persistierenden CLs assoziiert sind (OPSOMER et al. 2000;

TAYLOR et al. 2003). Es wurde vermutet, dass das Endometrium aufgrund der

Entzündung nicht mehr in der Lage ist, PGF2α im physiologisch pulsatilen Muster

freizusetzen (MWAANGA u. JANOWSKI 2000). Neben PGF2α deuten andere

Arbeiten auf eine Beteiligung des luteotroph wirkenden PGE bei der Entstehung von

persistierenden CLs hin (REYNOLDS et al. 1983; HERATH et al. 2009). So konnte

nachgewiesen werden, dass bei einer Pyometra PGE in der uterinen Flüssigkeit

erhöht ist (MANNS et al. 1985; DAVIDSON et al. 1996). Intrauterin verabreichtes

PGE führte bei Rindern im Diöstrus sogar zu einer Zyklusverlängerung

(THIBODEAUX et al. 1992).

LITERATURÜBERSICHT

24

2.4 Bestimmung der lutealen Aktivität

2.4.1 Hormonelle und sonographische Untersuchungen von Corpora lutea

Für die Beurteilung der lutealen Aktivität werden verschiedene Parameter heran-

gezogen. Dabei gilt die Analyse der Plasma P4 Konzentration als Goldstandard, um

die luteale Funktion zu quantifizieren (BATTOCCHIO et al. 1999). Eine P4

Konzentration im Plasma von über 4 ng/ml spricht für das Vorliegen eines

Blütegelbkörpers (BATTOCCHIO et al. 1999; VERONESI et al. 2002). Liegt die P4

Konzentration zwischen 1 und 4 ng/ml wird von einem Anbildungsgelbkörper und bei

Konzentrationen unter 1 ng/ml von einem CL in Regression ausgegangen. Neben

der Hormonbestimmung können die Größe und Durchblutung eines CL mittels

Sonographie bestimmt werden, um dessen Funktionszustand einschätzen zu können.

In der Regressionsphase nimmt die Konzentration des P4 deutlich schneller ab als

die über B-Mode Sonographie erfasste luteale Größe (RIBADU et al. 1994; HERZOG

et al. 2010). Aus diesem Grund stößt die diagnostische Fähigkeit ein CL in der

Regressionsphase anhand der B-Mode Sonographie korrekt zu identifizieren an ihre

Grenzen. Durch die Messung der lutealen Durchblutung wurde der physiologische

Status eines CL genauer widergespiegelt (MATSUI u. MIYAMOTO 2009; HERZOG

et al. 2010). HERZOG et al. (2010) stellten über den gesamten Zyklus eine

Korrelation zwischen der Plasma P4 Konzentration und der Perfusion des CL dar.

Insbesondere während der Regressionsphase war die Korrelation hoch, da der

schnelle P4 Abfall mit einer deutlichen Reduktion der lutealen Durchblutung

einherging. Untersuchungen, in denen der Beginn der spontanen Luteolyse (Tag 17

und 18 des Zyklus) intensiv beobachtet wurde, zeigten einen kurzfristigen Anstieg

der lutealen Durchblutung, bevor es zum Abfall der lutealen Perfusion kam

(MIYAMOTO et al. 2005). Dieser temporäre Anstieg der lutealen Durchblutung, der

vermutlich durch den Einfluss von PGF2α hervorgerufen wurde, stellte eine Trigger-

Funktion zur Induktion der Luteolyse dar. Auch während der durch PGF2α induzierten

Luteolyse war dieser Blutflussanstieg zu Beginn der Luteolyse über zwei Stunden

nachweisbar, bevor die Durchblutung konsekutiv abnahm (ACOSTA et al. 2002).

LITERATURÜBERSICHT

25

2.4.2 Luteale Genexpressionsanalyse

Die Untersuchung der Genexpression des lutealen Gewebes gibt Informationen über

physiologische und pathologische Vorgänge des CL. Die P4 Produktion der Luteal-

zellen wird hauptsächlich von drei Enzymen gesteuert. Das Steroidogenic Acute

Regulatory Protein (StAR) transportiert Cholesterol von der äußeren zur inneren

Mitochondrienmembran. Dort wird das Cholesterol durch Cytochrom P450 in

Pregnenolon umgewandelt, welches anschließend durch die 3ß-Hydroxysteroid-

Dehydrogenase (3ß-HSD) in Progesteron umgesetzt wird (REKAWIECKI et al. 2005).

In Studien, die die Genexpression während verschiedener Zyklusstadien unter-

suchten, war die luteale mRNA Konzentration an StAR bei Pferden über den

gesamten Zyklus konstant. Nur gegen Ende des Zyklus wurde eine tendenzielle

Abnahme der Genexpression von StAR beobachtet (SLOUGH et al. 2011). Bei

Schafen wurden bezüglich der Konzentration der mRNA des Cytochrom P450

zwischen Tag drei bis neun ein Anstieg und nach Tag 15 des Zyklus ein Abfall

festgestellt (JUENGEL et al. 1994). Dieser Verlauf entspricht dem Beginn und dem

Ende der lutealen P4 Sekretion. Bei Schafen wurde 3ß-HSD im Gewebe von CLs

über den gesamten Zyklus auf einem konstanten Level exprimiert (JUENGEL et al.

1994). Im Gegensatz dazu wiesen SLOUGH et al. (2011) bei Pferden ein Absinken

der 3ß-HSD zwischen Tag 12 und 14 des Zyklus nach.

Auch mittels in vitro-Versuche wurde bewiesen, dass diese drei Enzyme für die P4

Synthese eine zentrale Rolle spielen. Die Zugabe von LH und PGE2 zum Nähr-

medium boviner Lutealzellen erhöhte neben der Genexpression von StAR, Cyto-

chrom P450 und 3ß-HSD auch die Sekretion von P4 (REKAWIECKI et al. 2005).

In mehreren Studien wurde der Einfluss von PGF2α auf die luteale Genexpression

analysiert. Bei Pferden und Rindern führte die Applikation des luteolytisch wirkenden

Hormons neben dem Abfall des peripheren P4 Spiegels zu einer Abnahme der

mRNA Konzentration von StAR- und LH-Rezeptoren im lutealen Gewebe (TSAI et al.

LITERATURÜBERSICHT

26

2001; BEG et al. 2005; DIAZ u. WILTBANK 2005). Auch 3ß-HSD wurde nach

Verabreichung von PGF2α vermindert exprimiert, obwohl diese Reaktion nicht

zwangsläufig mit einer reduzierten P4 Konzentration assoziiert war (JUENGEL et al.

1998; DIAZ u. WILTBANK 2005).

Die Luteolyse wird bei einer Vielzahl von Säugetieren durch intrauterin sezerniertes

PGF2α eingeleitet (TSAI u. WILTBANK 1998; DIAZ et al. 2000). Die Gabe von

exogenem PGF2α führte bei mehreren Spezies zu einer deutlichen Erhöhung der

lutealen Genexpression der Cyclooxygenase-2 (TSAI u. WILTBANK 1998; DIAZ et al.

2000; NARAYANSINGH et al. 2002; BEG et al. 2005). Dieses Enzym ist für die

Umwandlung der Arachidonsäure in PGH2b verantwortlich und katalysiert somit den

ersten Schritt der Prostaglandinsynthese (DIAZ et al. 2000). In vitro produzierten

ovine Lutealzellen mit erhöhtem mRNA Gehalt der Cyclooxygenase-2 (COX-2)

vermehrt PGF2α (TSAI u. WILTBANK 1997). Weiterhin wurde vermutet, dass die

luteolytische Wirkung von uterinem PGF2α auf einer Aktivierung der intralutealen

PGF2α Synthese beruhte (TSAI u. WILTBANK 1997; BEG et al. 2005).

Ein anderes luteolytisches Enzym ist die Caspase-3, da es eine entscheidende Rolle

bei der Apoptose eukaryotischer Zellen spielt (RUEDA et al. 1999). Untersuchungen

mit Knockout-Mäusen belegten die Rolle dieses Enzyms bei der Luteolyse

(CARAMBULA et al. 2002). Die Ovarien von Mäusen, bei denen die Caspase-3

„ausgeknockt“ wurde, wiesen am Tag 7 des Zyklus noch viele CLs auf, während

Mäuse vom Wildtyp zu diesem Zeitpunkt gemäß ihrer physiologischen Zykluslänge

nur noch Rückstände an lutealem Gewebe besaßen. Nach hormoneller Induktion der

Luteolyse durch PGF2α konnte bei Schafen ebenfalls eine verstärkte Expression des

genannten Gens nachgewiesen werden (RUEDA et al. 1999).

MATERIAL UND METHODEN

27

3. MATERIAL UND METHODEN

3.1 Metritis-Studie

3.1.1 Tiere

Im Rahmen dieser Studie wurden 47 primi- und pluripare, laktierende Kühe der

Rasse Deutsche Holstein auf dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover untersucht. Die Tiere wurden mit einer Total-

Misch-Ration mit leistungsbezogener Zuteilung an Kraftfutter gefüttert. Die Kühe

waren 38 ± 12 Monate (Median ± MAD) alt, wogen 616 ± 66 kg (Mittelwert ±

Standardabweichung) und hatten eine 305-Tageleistung an Milch von 9085 ± 1657

kg (Mittelwert ± Standardabweichung). Das Tierversuchsvorhaben wurde vom

Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

(Aktenzeichen: 33.9-42502 – 04-09/1782) genehmigt.

3.1.2 Experimentelles Design

3.1.2.1 Gruppeneinteilung

Anhand der Ergebnisse klinischer Untersuchungen des Reproduktionstraktes wurden

die Kühe in eine gesunde (G) und in eine Metritis-Gruppe (M) eingeteilt (Figure 1).

Dafür wurde die Größe des Uterus subjektiv nach einem definierten Bewertungs-

system (G I bis G VI; ROSENBERGER et al. (1990)) erfasst. Dabei wurden die Tiere

von Tag 4 bis 21 pp dreimal pro Woche (Montag, Mittwoch, Freitag) manuell,

transrektal palpiert und die Körpertemperatur wurde erfasst. Eine verzögerte uterine

Involution wurde diagnostiziert, wenn ein Tier am Tag 21 pp noch eine Uterusgröße

vom Grad G III (Uterus unter der Hand zu versammeln, Hörner drei- bis

vierfingerstark) oder größer aufwies. Trat bei der transrektalen Palpation des Uterus

Lochialsekret aus, wurde es auf Geruchsabweichungen geprüft. Zusätzlich wurden


28

an den Tagen 4, 8 und 11 pp vaginoskopische Untersuchungen mit einem Röhren-

spekulum durchgeführt, um das aus der Zervix austretende Sekret olfaktorisch zu

beurteilen. Alle Untersuchungen wurden von derselben Person durchgeführt.

In Anlehnung an SHELDON et al. (2009) wurden alle Kühe, die eine verzögerte

uterine Involution zeigten und bei mindestens einer Untersuchung Lochialsekret mit

Geruchsabweichungen aufwiesen, der Gruppe M zugeordnet. Die übrigen Kühe

bildeten die Gruppe G. Metritis-Kühe, die Fieber entwickelten (Körpertemperatur >

39,5°C) wurden einmalig mit Flunixin Meglumin (2,2 mg/kg, i.v.; Finadyne®, MSD

Intervet, Deutschland) und für drei Tage mit Ceftiofur (2,2 mg/kg, i.m.; Excenel RTU®,

Pfizer Animal Health, Deutschand) behandelt.

3.1.2.2 Überwachung der Zyklusaktivität

Die Tiere wurden während der ersten vier postpartalen Zyklen untersucht. Um den

Zeitpunkt der ersten Ovulation nach der Abkalbung zu bestimmen, wurden die Ova-

rien der Kühe ab dem Tag 11 pp dreimal in der Woche (Montag, Mittwoch, Freitag)

sonographisch im B-Mode untersucht. Von einer Ovulation wurde ausgegangen,

wenn ein bei der vorangegangenen Untersuchung darstellbarer dominanter Follikel

nicht mehr nachweisbar war. War zu diesem Zeitpunkt das sich anbildende CL

sonographisch darstellbar (Ø > 7 mm), wurde von einer zwei Tage zurückliegenden

Ovulation ausgegangen (Tag 3 des Zyklus; Tag 1 = Ovulation). War noch kein CL

darstellbar, wurde der vorherige Tag als Ovulationszeitpunkt festgelegt (Tag 2 des

Zyklus). Zusätzlich wurden die Ovarien 5 ± 1 und 11 ± 2 Tage nach dem festgelegten

Tag der Ovulation in sonographischen Nachkontrollen auf das Vorhandensein eines

CL geprüft. Die nachfolgenden Ovulationen wurden grundsätzlich nach gleichem

Untersuchungsschema wie oben beschrieben erfasst. Zur Bestimmung des Zeitpunk-

tes der zweiten Ovulation wurde im Diöstrus ab Tag 14 des ersten Zyklus pp und bei

den nachfolgenden Ovulationen ab Tag 18 des vorherigen Zyklus mit den sonogra-

phischen Untersuchungen begonnen.


29

3.1.2.3 Untersuchungen zyklischer Corpora lutea

Die Größen zyklischer CLs wurden im ersten, zweiten und vierten postpartalen

Diöstrus einmalig zwischen den Tagen 9 und 13 des Zyklus sonographisch erfasst

(Figure 1). Gleichzeitig wurde den Tieren eine Blutprobe entnommen. Im ersten

Zyklus wurden 23 Tiere (Gruppe G: n = 11, Gruppe M: n = 12), im zweiten 41 Tiere

(Gruppe G: n = 23, Gruppe M: n = 18) und im vierten 18 Tiere (Gruppe G: n = 11,

Gruppe M: n = 7) untersucht. Ein Teil der Kühe wurde im ersten und zweiten post-

partalen Zyklus untersucht, während die Untersuchungen bei dem zweiten Teil der

Kühe im zweiten und vierten postpartalen Diöstrus erfolgten. Deshalb umfassen die

Untersuchungen während des zweiten Zyklus die größte Tierzahl. Darüber hinaus

wurden im zweiten und vierten Diöstrus von insgesamt 16 Tieren (Gruppe G: n = 9,

Gruppe M: n = 7) einmalig zwischen den Tagen 9 und 13 des Zyklus transvaginal CL

Biopsien entnommen. Für die Untersuchungen der zyklischen CLs wurden nur Tiere

herangezogen, die innerhalb der ersten 42 Tage pp ovuliert hatten.

3.1.2.4 Untersuchungen persistierender Corpora lutea

Zeigte ein CL am Ende der physiologischen Zykluslänge keine Anzeichen einer

Luteolyse, wurden einmalig zwischen den Tagen 29 und 33 des Zyklus sono-

graphisch die CL Größe bestimmt, eine transvaginale CL Biopsie durchgeführt sowie

eine Blutprobe zur Bestimmung der P4 Konzentration entnommen. Zur Bestätigung

eines persistierenden CL musste die P4 Konzentration im Serum ≥ 1,0 ng/ml

betragen. Daraufhin wurde die Luteolyse mit einem synthetischen PGF2α (0,5 mg,

Cloprostenol, i.m., Estrumate®, Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) eingeleitet.

Der Zeitpunkt der darauf folgenden Ovulation wurde nach demselben Unter-

suchungsschema wie bei spontanen Ovulationen bestimmt. An den Tagen 9 bis 13

des folgenden Diöstrus wurde wieder die CL Größe erfasst, eine Biopsie sowie eine

Blutprobe entnommen (Figure 1).


30

3.1.2.5 Endometriumsbiopsien und Fruchtbarkeitsparameter

Um die klinische Einteilung der Kühe in eine gesunde und eine an Metritis erkrankte

Gruppe histologisch zu überprüfen, wurden bei allen Kühen während des zweiten

und dritten postpartalen Östrus Endometriumsbiopsien entnommen. Die Biopsie-

entnahme erfolgte, wenn sich bei Vorliegen eines Rückbildungsgelbkörpers

(Ø < 10 mm) ein dominanter Follikel (Ø ≥ 10 mm) angebildet hatte.

Ab dem vierten Östrus wurde mit der künstlichen Besamung begonnen. Es wurden

ausschließlich Tiere besamt, bei denen der Duldungsreflex durch das Personal des

Lehr- und Forschungsgutes beobachtet worden war. Sonographische Trächtigkeits-

untersuchungen wurden 29 ± 1 und 40 ± 3 Tage nach einer künstlichen Besamung

durchgeführt, wobei der Nachweis einer embryonalen Herzaktion als positiver

Trächtigkeitsnachweis gewertet wurde. Die Rast- und Güstzeiten sowie Besamungs-

und Trächtigkeitsindizes der Gruppen G und M wurden erfasst.


31

Figure 1 : Zeitlicher Ablauf und Übersicht der durchgeführten Untersuchungen

Untersuchungen persistierender CLs

1. Zyklus Diöstrus a,*

Gruppeneinteilung (Metritis, Gesund)

Tag 4 bis 21 postpartum: (dreimal pro Woche) ● manuelle transrektale uterine Untersuchung mit Beurteilung

der Uterusinvolution am Tag 21 postpartum ● Beurteilung des uterinen Ausflusses während der manuellen

transrektalen uterinen Untersuchungen Tag 4, 8, 11 postpartum: ● vaginoskopische Untersuchung

Untersuchungen zyklischer CLs

● Messung der CL Größe ● Blutprobenentnahme

2. Zyklus Östrus Diöstrus a,*

● Endometriumsbiopsie

● Messung der CL Größe ● Blutprobenentnahme ● CL Biopsie

3. Zyklus Östrus Diöstrus *

● Endometriumsbiopsie

4. Zyklus Diöstrus a,* ● Messung der CL Größe ● Blutprobenentnahme ● CL Biopsie

im Falle eines persistierenden CL b: (keine Luteolyse am Ende des Zyklus)

● Messung der CL Größe ● Blutprobenentnahme ● CL Biopsie ● Applikation von Cloprostenol

● Messung der CL Größe ● Blutprobenentnahme ● CL Biopsie

folgender Diöstrus a

Fußnoten: a einmalig zwischen Tag 9 und 13 des Zyklus b einmalig zwischen Tag 29 und 33 des Zyklus * im Fall eines persistierenden CL � Untersuchungen persistierender CLs

Partus


32

3.1.3 Manuelle transrektale Untersuchung

Um die Uterusinvolution zu beurteilen, wurden im Zeitraum vom Tag 4 bis 21 pp

regelmäßig manuelle transrektale Palpationen vorgenommen. Dabei wurde die

Uterusgröße subjektiv in sechs Grade eingeteilt (ROSENBERGER et al. 1990).

G I Gebärmutter unter der Hand zu versammeln; Hörner etwa fingerstark

G ll Gebärmutter unter der Hand zu versammeln; Hörner etwa zweifingerstark

G lll Gebärmutter unter der Hand zu versammeln; Hörner etwa drei- bis

vierfingerstark

G lV Gebärmutter mit der Hand abzugrenzen; große Kurvatur des

männerarmstarken bis etwa brotlaibgroßen Organs erreichbar

G V Gebärmutter fast mit der Hand abzugrenzen; große Kurvatur lässt sich nicht

mehr vollständig abtasten

G Vl Gebärmutter nicht mit der Hand abzugrenzen; große Kurvatur eindeutig

außerhalb der Reichweite der rektal untersuchenden Hand

3.1.4 Sonographische Untersuchungen und Auswertungen

Die transrektalen sonographischen Untersuchungen im B-Mode zur Bestimmung des

Ovulationszeitpunktes wurden mit einem portablen Ultraschallgerät (HS-101V,

Honda Electronics CO., Tokio, Japan), ausgestattet mit einer 5,0 MHz Linear-Sonde,

durchgeführt und fanden an im Fressgitter fixierten Kühen statt. Zur Messung der

lutealen Größe CL wurde das Ultraschallgerät LOGIQ Book XP (General Electrics

Medical Systems, Solingen, Deutschland), ausgestattet mit einer 10 MHz Linear-

Sonde, verwendet. Für diese Untersuchungen sowie für die Entnahmen von Endo-

metriums- bzw. CL-Biopsien wurden die Kühe in einem Untersuchungsstand außer-

halb des Stalles geführt. Von jedem untersuchten CL wurden drei Bilder mit maxi-

maler Querschnittsfläche gespeichert. Anschließend wurden off-line die maximalen

Längen zweier senkrecht zueinander stehenden Achsen (a, b) in der lutealen


33

Querschnittsfläche mit dem Programm PixelFlux® (Version 1.0; Chameleon Software,

Leipzig, Deutschland) ausgemessen. Die Form des CL wurde wie bei der Studie von

LÜTTGENAU et al. (2011) der geometrischen Figur eines verlängerten Rotations-

ellipsoids gleichgesetzt und das Volumen des lutealen Gewebes nach folgender

Formel berechnet:

Der größere Durchmesser a entspricht der Rotationsachse, während der kleine

Durchmesser b die Transversalachse darstellt. Zur Volumenermittlung eines CL mit

Hohlraum wurde das Volumen des Hohlraums nach gleichem Verfahren errechnet

und vom Gesamtvolumen subtrahiert. Lag eine Doppelovulation vor, wurden die bei-

den Volumina addiert. Dieses Verfahren basiert auf den Ergebnissen von MANN et al.

(2007), die zeigten, dass sich das Gesamtgewicht des lutealen Gewebes nach

Einzelovulationen nicht von Doppelovulationen unterscheidet. Da pro Untersuchung

drei Bilder abgespeichert wurden, diente der Mittelwert der drei bestimmten lutealen

Volumina als Grundlage der statistischen Auswertung.

3.1.5 Blutprobenentnahme und Bestimmung von Progesteron und Prostaglandin E

Zur Bestimmung der P4- und PGE-Konzentrationen wurden Blutproben aus der Vena

jugularis (Serum- und EDTA-Röhrchen, Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)

entnommen, auf Eis zwischengelagert und innerhalb von 90 min bei 3000 x g über

15 min bei 4°C zentrifugiert. Serum und Plasma wurd en bei -20°C bis zur P4- und

PGE-Bestimmung gelagert. Die P4 Konzentration wurde in allen genommenen Blut-

proben anhand eines Radioimmunoassays (Progesterone Coat-a-Count, TKPG1,

Siemens Medical Diagnostics, CA, USA) bestimmt. Der Intra-Assay Variations-

koeffizient lag bei 4,0% und der Inter-Assay Variationskoeffizient bei 7,6%.

PGE wurde einmalig von Tieren der Gruppen G und M während des ersten

postpartalen Diöstrus (Tage 9 bis 13 des Zyklus) und von Tieren mit persistierenden

luteales Volumen = 4

3

a

2

b

2

2 x x x π


34

CLs (Tage 29 bis 33 des Zyklus) bestimmt. Dabei wurde ein kommerziell erhältlicher

Enzymimmunoassay (EIA; Prostaglandin E2 EIA Kit, Biotrend Chemikalien GmbH,

Köln, Deutschland) verwendet. Die Plasmaproben wurden mit Hilfe einer Festphasen

Extraktion (C18 Sep-Pak Light Columns, Waters GmbH Eschborn, Deutschland)

extrahiert. Die C18 Sep-Pak Light Säulen wurden zuerst mit Methanol (Sigma

Aldrich) und destilliertem Wasser vorbehandelt, um anschließend 1 ml Plasma und

0,2 ml Methanol hinzuzufügen. Als Elutionsmedium wurde Methylformiat (2 ml)

verwendet. Das Eluat wurde in dem Eppendorf Konzentrator 5301 getrocknet und mit

einem Extraktionspuffer (Prostaglandin E2 EIA Kit, Biotrend Chemikalien GmbH,

Köln, Deutschland) wieder in Lösung gebracht. Die EIA Bestimmung der Prosta-

glandin E2 Konzentration wurde nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Bei

wiederholten Analysen von bovinen Plasmaproben ergab sich ein Intra-Assay

Variationskoeffizient von 9,9%. Der untere Messbereich lag bei 0,2 ng/ml. Die vom

Hersteller angegebenen Kreuzreaktionen betrugen für Prostaglandin E2 A1, A2, B1, B2,

E1 100%, für 6-Keto-Prostaglandin E1 85,5%, für Prostaglandin E3, F1α 17.7% und für

13,14-Dihydro-15-Keto-Prostaglandin F2α 2,0%. Alle anderen Kreuzreaktionen betru-

gen < 0,3%.

3.1.6 Corpus luteum Biopsien

CL Biopsien wurden im Diöstrus des zweiten und vierten postpartalen Diöstrus

durchgeführt. Zur Schmerzausschaltung und um rektale Kontraktionen zu unter-

drücken, wurde eine Epiduralanästhesie (80 mg Procain Hydrochlorid, Procasel 2%®;

Selectavet, Weyarn-Holzolling, Deutschland) gesetzt. Es wurde ein von RNAse

befreites (RNAse-ExidusPlusTM, AppliChem, Darmstadt, Deutschland), halbauto-

matisches Biopsiekanülensystem (TEMNO EvolutionTM, Firma Walter Veterinär-

Instrumente e.K., Baruth/Mark, Deutschland) verwendet, das in einem Biopsie-

nadelträger (Typ Hannover, ONNEN-LÜBBEN (2009); Figure 3) gelagert wurde. Um

die Biopsieentnahme unter sonographischer Kontrolle durchzuführen, wurde der

Biopsienadelträger ebenfalls mit einer 7,5 MHz Konvex-Sonde bestückt, die mit dem


35

LOGIQ Book XP verbunden wurde. Der Biopsienadelträger wurde transvaginal unter

dem Scheidendach platziert, das CL manuell transrektal in unmittelbarer Nähe

positioniert und im Ultraschallbild auf den maximalen lutealen Durchmesser

eingestellt. Nach Durchstoßen der Scheidenwand wurde eine luteale Gewebeprobe

(Größe ca. 15 x 1 x 1 mm) gewonnen. Die Biopsieproben wurden in DNase- und

RNase-freie Kryoröhrchen (Fa. Brand, Wertheim, Deutschland) überführt, in

flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C bis zur Genexpressionsanalyse

gelagert. Die Methode der transvaginalen Punktion des CL ermöglichte die

Entnahme von lutealem Gewebe, ohne die CL Funktion nachfolgend zu beeinflussen

(TSAI et al. 2001).

3.1.7 RNA Extraktion und Synthese der komplementären DNA der Corpus luteum

Biopsien

Die luteale mRNA Expression wurde hinsichtlich StAR, Cytochrom P450 und 3ß-

HSD untersucht. Die genannten Proteine gelten als wichtige Faktoren der zellulären

Progesteronproduktion (JUENGEL et al. 1994; TSAI et al. 2001; REKAWIECKI et al.

2005; SLOUGH et al. 2011).

Zur Analyse wurde die Gesamt-RNA mit dem TRIzol Reagenz (CHOMCZYNSKI u.

SACCHI 1987) nach der Methode von WATANABE et al. (2006) extrahiert. Der

Gehalt an lutealer Gesamt-RNA wurde mittels Ultraviolettspektroskopie (Optische

Dichte, 260 nm) gemessen. Die RNA Konzentration wurde mit einem Biotech

Photometer (WPA, Cambridge, UK) unter Verwendung von Wellenlängen von 260

nm und 280 nm bestimmt. Die extrahierte Gesamt-RNA wurde in RNA Lagerungs-

lösung (Ambion, Texas, USA) bei -80°C bis zur Besti mmung der komplementären

DNA (cDNA) zwischengelagert. Hierfür wurden die RNA Proben mit dem RQ1

RNase-freien DNase Kit (Promega. Co., Madison, WI, USA) behandelt. Dabei

wurden 2 µl der RNA-Lösung (1 µg/µl) für 30 min bei 37°C mit 1 µl RQ1 RNAse-

freiem DNase 10x Reaktionspuffer und 2 µl (1 µg/µl) RNase-freier DNase inkubiert.

Anschließend wurden 1 µl RQ1 DNase Stop Lösung (20 mM EGTA) hinzugefügt, um


36

die Reaktion zu unterbrechen. Es folgte eine weitere Inkubation bei 65°C. Mit der

SuperScriptTM II Revers Transcriptase (Invitrogen Corp., Carlsbad, Californien, USA)

wurde eine Einzelstrangsynthese der cDNA durchgeführt, die bei -30°C gelagert

wurde.

3.1.8 Real-Time RT-PCR

Eine Quantifizierung der mRNA Expression wurde für die drei zu untersuchenden

Enzyme StAR, Cytochrom P450 und 3ß-HSD sowie für die beiden housekeeping

Gene ß-Aktin und Glycerolaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) durchge-

führt. Die Konzentrationen der mRNA wurden mit einer Real-Time PCR unter Einsatz

eines LightCyclers (Roche Diagnostics Co.) und eines kommerziellen Kits

(LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I: Roche Diagnotics Co.)

quantifiziert. Basierend auf bovinen DNA-Sequenzen wurden die Primer mit dem

Primer3-Programm ausgewählt. Die Amplifikation begann mit einer fünfzehn-

minütigen Aktivierungsphase bei 95°C, dem 40 Vervie lfältigungszyklen folgten. Jeder

Zyklus bestand aus 15 sek Denaturierung bei 94°C, 3 0 sek Annealing bei 58°C und

20 sek Extension bei 72°C. Anhand der Vermehrung de s DNA-Fragments (150~250

bp) mit der Zielsequenz der Real-Time PCR wurde das Zielgen quantifiziert. Die

Primer der Real-Time PCR waren StAR (Akzessionsnummer MN174189) vorwärts

5´-GTGGATTTTGCCAATCACCT-3´ und rückwärts 5´-TTATTGAAAACGTGCCAC-

CA-3´; Cytochrom P450 (K02130) vorwärts 5´-CTGCAAATGGTCCCACTTCT-3´ und

rückwärts 5´-CACCTGGTTGGGTCAAACTT-3´; 3β-HSD (X17614) vorwärts 5´-TCC-

ACACCAGCACCATAGAA-3´ und rückwärts 5´-AAGGTGCCACCATTTTTCAG-3´;

GAPDH (U85042; U94889) vorwärts 5´-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3´ und

rückwärts 5´-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3´; ß-Aktin (K00622) vorwärts 5´-

CCAAGGCCAACCGTGAGAAAAT-3´ und rückwärts 5´-CCACATTCCGTGAGGATC-

TTCA-3´. Die PCR Produkte wurden einer Elektrophorese unterzogen. Die Zielban-

den wurden herausgeschnitten und mit einem DNA Purifikationskit (SUPRECTM-01,

TaKaRa Bio. Inc., Otsu, Japan) aufgereinigt. Pro PCR-Durchgang wurden drei bis


37

fünf schrittweise verdünnte DNA Standards verwendet. Die Quantifizierung der

mRNA Expression wurde mit dem Lighter Cycler Programm (Version 3.5, Roche)

durchgeführt. Bevor die Primer für die Analyse verwendet wurden, wurden sie mit

lutealen Gewebsproben getestet, um die Amplifikation der spezifischen Banden zu

überprüfen. Ferner wurden die amplifizierten Produkte geklont und sequenziert, um

ihre Identität zu bestätigen. Mit Einbeziehung von β-Aktin und GAPDH als interne

Standards wurden die quantifizierten mRNA Werte normalisiert (∆Cq) und mit der 2-

∆∆CT-Methode nach LIVAK u. SCHMITTGEN (2001) berechnet.

3.1.9 Endometriumsbiopsien

Die Endometriumsbiopsien wurden mit der Biopsiezange nach Kevorkian (Fa.

Hauptner Herberholz GmbH & Co. KG, Solingen, Deutschland) entnommen. Die

Biopsiezange wurde dazu unter transrektaler, manueller Kontrolle durch die Zervix in

den Uterus vorgeschoben, um aus beiden Uterushörnern ca. 2 cm kranial der Bifur-

kation jeweils eine Biopsie zu entnehmen. Die frisch entnommenen Proben wurden

in neutral gepuffertem Formalin nach Lillie zwischengelagert. Es wurden 3-4 µm

dicke Schnitte angefertigt, die mit einer H.E.-Färbung behandelt wurden, um sie

lichtmikroskopisch auf Hinweise einer Endometritis zu untersuchen. Wie von

RODENBUSCH (2011) beschrieben, wurde ein entzündlicher Prozess, der über die

physiologische zyklische Selbstreinigung hinausging, als Endometritis definiert. Da-

bei wurde das Vorhandensein von maximal 20 neutrophilen Granulozyten bzw. bis zu

15 mononukleären Zellen (Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen) pro Gesichts-

feld bei 400-facher Vergrößerung im Bereich des luminalen Epithels und Stratum

compactum als physiologisch angesehen. Wurden in einer oder beiden Biopsien am

selben Entnahmezeitpunkt übermäßig viele entzündliche Prozesse festgestellt,

wurde von einer Endometritis ausgegangen.


38

3.1.10 Statistische Methoden

Die statistische Auswertung wurde mit SigmaStat 2.03 (Systat Software GmbH,

Erkrath, Deutschland) durchgeführt. Stetige Parameter wurden mit dem Kolmogorov-

Smirnov-Test auf Normalverteilung geprüft. Bei normalverteilten Daten wurden

Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) angegeben. Unterschiede wurden

hierbei für unabhängige Stichproben mit dem t-Test und für verbundene Stichproben

mit dem gepaarten t-Test überprüft. Lag keine Normalverteilung vor, wurde der

Median und die mittlere Abweichung vom Median (MAD) angegeben. Gepaarte

Gruppen wurden mit dem Wilcoxon Signed-Ranked-Test und ungepaarte Gruppen

mit dem Ranksum-Test nach Wilcoxon verglichen. Die Güstzeit von Kühen der

Gruppen G und M wurden mit Kaplan Meier Kurven dargestellt und mit einem

Mantel-Cox Test verglichen. Bei qualitativen Merkmalen wie dem Auftreten von histo-

pathologischen Befunden und persistierenden CLs wurden die Gruppen mit dem Chi-

Quadrat-Test bzw. der Fisher’s-Exact-Test verglichen. Unterschiede mit Irrtums-

wahrscheinlichkeiten von p < 0,05 galten als statistisch signifikant und von 0,05 ≤ p ≤

0,10 als statistische Tendenz.


39

3.2 LPS-Studie

3.2.1 Tiere

Die Untersuchungen fanden im Zeitraum von März bis September 2010 in der Klinik

für Rinder der Stiftung Tierärztlich Hochschule Hannover statt. Das Tierversuchs-

vorhaben wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und

Lebensmittelsicherheit (Aktenzeichen: 33.9-42502 – 04-09/1782) genehmigt. In der

Studie wurden sieben klinisch gesunde, nicht-laktierende Kühe der Rasse Deutsche

Holstein untersucht. Das Alter der primi- und pluriparen Kühe betrug 5,1 ± 0,8 Jahre

(MW ± Standardfehler; Spannweite 2,4 - 8,2). Die letzte Abkalbung der Kühe ereig-

nete sich mindestens vier Monate vor Studienbeginn. Die Aufstallung erfolgte in

Einzelboxen bei einer ad libidum Fütterung mit Heu und Wasser.

3.2.2 Experimentelles Design

Zu Beginn der Studie erfolgte eine Zyklussynchronisation mit einem Ovsynch

Protokoll (PURSLEY et al. 1995). Dafür wurde ein GnRH Analogon (10 µg Buserelin,

s.c., Receptal®, MSD Tiergesundheit, Unterschließheim, Deutschland) verabreicht.

Nach sieben Tagen erfolgte eine Applikation mit einem PGF2α Analogon (657,5 µg

Cloprostenol-Natriumsalz, im, Estrumate®, MSD Tiergesundheit, Unterschleißheim,

Deutschland), dem 48 Stunden später eine weitere Behandlung mit dem GnRH

Analogon folgte. Anschließend wurden 12, 24 und 36 Stunden nach der letzten

GnRH Applikation transrektal sonographische Untersuchungen der Ovarien durch-

geführt, um den Ovulationszeitpunkt zu bestimmen. War ein bei der vorherigen

Untersuchung sichtbarer dominanter Follikel nicht mehr sonographisch darstellbar,

galt der Tag der aktuellen Untersuchung als Ovulationstag und wurde als Tag 1 des

Zyklus definiert. Am Tag 9 des Zyklus wurde ein Venenverweilkatheter (Jugularis-

Teflonkatheter, AD 2,4 mm, Länge 20 cm; Firma Walter Veterinär-Instrumente e.K.,

Baruth/Mark, Deutschland) in eine Vena jugularis gelegt. Der Katheter diente der


40

Entnahme der Blutproben. Jedes der sieben Studientiere durchlief zunächst einen

Kontrollversuch, bei dem am Tag 10 des hormonell eingeleiteten Zyklus 10 ml einer

0,9 %igen Kochsalzlösung (Isotonische Natriumchlorid-Lösung, B. Braun Melsungen

AG, Melsungen, Deutschland) als intravenöser Bolus (Applikationdauer 1 min) über

den Verweilkatheter verabreicht wurde. Die Tiere wurden daraufhin bis Tag 10 des

nachfolgenden Zyklus untersucht, an dem der Venenverweilkatheter wieder entfernt

wurde. Es folgte eine Ruhephase von mindestens 21 Tagen, an denen die Kühe

nicht behandelt wurden.

Der folgende LPS Versuch begann mit demselben Ovsynch Protokoll und unter-

schied sich von dem Kontrollversuch nur darin, dass am Tag 10 des eingeleiteten

Zyklus statt der physiologischen Kochsalzlösung 10 ml einer LPS-Lösung (0,5 µg/kg

Körpergewicht E. coli, O55:B5; L2880, Sigma-Aldrich) und sterilem Wasser (Aqua ad

iniectabilia, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) als intravenöser Bo-

lus verabreicht wurde. Der Versuch endete für die Kuh mit dem Tag 10 des nach-

folgenden Zyklus.

3.2.3 Ultrasonographische Untersuchungen

Sämtliche ultrasonographischen Untersuchungen wurden von derselben Person mit

dem LOGIQ Book XP (General Electrics Medical Systems, Solingen, Deutschland)

mit einer 10 MHz Linear-Sonde durchgeführt. Die transrektale Bestimmung der Quer-

schnittsfläche der CLs erfolgte im B-Mode. Die luteale Größenmessung fand eine

Stunde vor und zwölf Stunden nach der Applikation der Kochsalz- bzw. der LPS-

Lösung (Tag 10 des synchronisierten Zyklus) statt. Anschließend wurden täglich B-

Mode Untersuchungen der Ovarien bis zur nächsten Ovulation durchgeführt. War

dabei ein in der vorherigen Untersuchung darstellbarer dominanter Follikel nicht

mehr darstellbar, galt der Tag der aktuellen Untersuchung als Tag 1 des nachfol-

genden Zyklus. An den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 des nachfolgenden Zyklus erfolgten

weitere B-Mode Untersuchungen des CL. In der B-Mode Untersuchung wurden von

jedem CL drei Bilder mit maximaler lutealer Querschnittsfläche abgespeichert. Die


41

lutealen Querschnittsflächen der drei Bilder wurden off-line ausgemessen (PixelFlux®,

Version 1.0; Chameleon Software, Leipzig, Deutschland). Lag ein CL mit Hohlraum

vor, wurde für jedes Bild ebenfalls die Querschnittsfläche des Hohlraums

ausgemessen und für die Bestimmung der lutealen Querschnittsfläche von der

Gesamtfläche abgezogen (KASTELIC et al. 1990). Der Mittelwert der drei bestimm-

ten CL-Flächen wurde berechnet und diente als Grundlage der statistischen

Auswertung.

Für die Evaluierung des lutealen Blutflusses wurden sonographische Untersuchun-

gen im Power Mode durchgeführt. Am Tag 10 des synchronisierten Zyklus wurde der

luteale Blutfluss eine Stunde vor und 3, 6 und 12 Stunden nach der der Applikation

der Kochsalz- bzw. der LPS-Lösung gemessen. An drei folgenden Tagen (Tage 11

bis 13 des Zyklus) wurden weitere Blutflussbestimmungen durchgeführt. Dafür wurde

der Schallkopf im B-Mode auf die maximale Querschnittsfläche des CL eingestellt

und nach Einschalten des Power Mode wurden drei Bilder mit maximaler Zahl an

Farbpixeln abgespeichert. Der luteale Blutfluss wurde semiquantitativ durch die

Messung der farbigen Pixel mit dem Programm PixelFlux bestimmt. Der Mittelwert

der drei Bilder, die pro CL ausgewertet wurden, wurde für die weiteren statistischen

Analysen des Blutflusses genutzt.


42

3.2.4 Blutprobenentnahme und Bestimmung von Progesteron, PGFM sowie

Prostaglandin E

Die Blutproben wurden aus der Vena jugularis via Venenverweilkatheter entnommen

und in Calcium-EDTA-Röhrchen (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland) auf-

gefangen. Am Tag 10 des synchronisierten Zyklus wurden eine und eine halbe Stun-

de vor der Applikation der Kochsalz- bzw. LPS-Lösung Blutproben für die Bestim-

mung von P4, PGFM und PGE entnommen. Der Mittelwert der beiden Proben diente

der Ermittlung eines Basallevels, bevor die Behandlung erfolgte. Anschließend

wurden 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 9 und 12 Stunden nach der Applikation weitere

Blutprobenentnahmen durchgeführt. Im Verlauf des restlichen Zyklus wurden täglich

und im nachfolgenden Zyklus an den Tagen 2, 4, 6, 8, 10 des Zyklus Blutproben ge-

wonnen. Sämtliche Proben wurden innerhalb von 30 min nach der Blutproben-

entnahme zentrifugiert (3000 x g; 15 min bei 4°C). Der Überstand wurde in ein

Eppendorf-Gefäß (Reagiergefäß 2 ml, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland),

abpipettiert und bei -20°C gelagert.

Die Plasmakonzentration des P4 wurde mit einem kommerziellen Chemilumineszenz

Immunoassay (Immulite, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) be-

stimmt. Der untere Messbereich betrug 0,5 ng/ml. Der Intra- und Inter-Assay Varia-

tionskoeffizient lag unter 10%.

Der Gehalt an PGFM im Blutplasma wurde mit einem kompetitivem Enzym Immuno-

assay (MISHRA et al. 2003) gemessen. Die PGFM-HRP Konjugate und das

Antiserum stammen aus dem Wissenschaftszentrum Weihenstephan (Physiology

Weihenstephan, Technische Universität München, Freising, Deutschland), während

das PGFM, das für die Erstellung der Standardkurven diente, von Sigma-Aldrich

geliefert wurde. Das Antiserum wies Kreuzreaktionen von 5% für PGEM und <1% für

PGE2 sowie PGF2α auf (GUVEN u. OZSAR 1993). Der untere Messbereich für PGFM

lag bei 25 pg/ml. Der Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizient betrug 3,5 und

11,4%.


43

Das Verfahren der Bestimmung von PGE im Blutplasma ist in Kapitel 3.1.5

Blutprobenentnahme und Bestimmung von Progesteron und Prostaglandin E

beschrieben.

3.2.5 Corpus luteum Biopsien

CL Biopsien wurden am Tag 10 des synchronisierten Zyklus zwölf Stunden nach der

Applikation der Kochsalz- bzw. LPS-Lösung sowie am Tag 10 des nachfolgenden

Zyklus durchgeführt. Das Verfahren der Biopsieentnahme erfolgte wie in Kapitel

3.1.6 Corpus luteum Biopsien beschrieben. Da in diesem Versuch neben Genex-

pressionsanalysen auch immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt

wurden, wurden bei jeder Probenentnahme zwei luteale Biopsien gewonnen. Die

erste Biopsie diente der Quantifizierung der mRNA verschiedener Enzyme, während

die zweite Biopsie für die histologische Auswertung in Formalin fixiert und in Paraffin

eingebettet wurde.

3.2.6 RNA Extraktion und Synthese der komplementären DNA der Corpus luteum

Biopsien

Die angewandten Verfahren bis zur Einzelstrangsynthese der komplementären DNA

der lutealen Biopsien erfolgten wie in Kapitel 3.1.7 RNA Extraktion und Synthese der

komplementären DNA der Corpus luteum Biopsien beschrieben.

3.2.7 Real-Time RT-PCR

Eine Quantifizierung der mRNA-Expression wurde für die zu untersuchenden Enzy-

me Caspase-3, StAR und COX-2 sowie für das housekeeping Gen β-Aktin durch-


44

geführt. Die angewandten Verfahren werden in Kapitel 3.1.8 Real-Time RT-PCR

beschrieben. Die genutzten Primer der Real-Time PCR waren Caspase-3

(Akzessionsnummer NM001077840) vorwärts 5´-AAGCCATGGTGAAGAAGGAA-3´

und rückwärts 5´-CCTCAGCACCACTGTCTGTC-3´; StAR (MN174189) vorwärts 5´-

GTGGATTTTGCCAATCACCT-3´ und rückwärts 5´-TTATTGAAAACGTGCCACCA-

3´; COX-2 (AF031698) vorwärts 5’-TCCTGAAACCCACTCCCAACA-3´ und rückwärts

5´-TGGGCAGTCATCAGGCACAG-3´; β-Aktin (K00622) vorwärts 5´-CCAAGGCCAA-

CCGTGAGAAAAT-3´ und rückwärts 5´-CCACATTCCGTGAGGATCTTCA-3´. Mit

Einbeziehung von β-Aktin als interner Standard wurden die quantifizierten mRNA

Werte normalisiert (∆Cq) und mit der 2-∆∆CT-Methode nach LIVAK u. SCHMITTGEN

(2001) berechnet.

3.2.8 Immunhistochemie

Die lutealen Gewebsschnitte (4 µm) wurden auf salinisierten Glasobjektträgern

(Histobond Superior; Paul Marienfeld Laboratory Glassware, Laud-Königshofen,

Deutschland) aufgezogen und bei 37°C für 24 Stunden getrocknet. Es folgte eine

Entparaffination mit Xylol und eine Rehydratation in verschiedenen Ethanolkon-

zentrationen. Über eine dreißigminütige Inkubation in 80 %igem Ethanol (enthielt 2%

Wasserstoffperoxid), dem drei Spülvorgänge (3 x 5 min) in PBS (pH 7,2) folgten,

wurde die Aktivität der endogenen Peroxidase blockiert. Mit einer Vorbehandlung der

COX-2 bzw. Caspase-3 Gewebsschnitte mit einem EDTA-Puffer (pH 9,0, 96°C,

10 min) bzw. Citratpuffer (pH 6,0, 96°C, 15 min) wu rden Antikörperbindungsstellen

wiederhergestellt. Es folgte eine Inkubation in 20% inaktiviertem, normalem Pferde-

(StAR) oder Ziegen- (Caspase-3 und COX-2) Serum (in PBS) für 20 min bei Raum-

temperatur, um unspezifischen Bindungen mit Proteinen vorzubeugen. Die Proben

wurden anschließend mit primären Antikörpern (in PBS plus 1,5% BSA) gegen die

Caspase-3 (1:50; ab4051, Abcam, Cambridge, UK), gegen COX-2 (1:20; Clone

SP21, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland) und gegen StAR (1:50; N-

16, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland) bei 4°C für 20 min in einer


45

feuchten Kammer inkubiert. Die Caspase-3 sowie COX-2 wurde mit dem DAKO

Envision+ System/rabbit, HRP (DAKO, Hamburg Deutschland) gemäß der

Herstellerangaben behandelt. StAR wurde mit dem SuperVision2 two-step Polymer

System (DCS, Hamburg, Deutschland) nach Angaben des Herstellers visualisiert.

Diaminobenzidin diente dabei als Chromogen. Die Gewebsschnitte wurden

anschließend für 10 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen und wurden

mit Delafields Hämatoxylin gegengefärbt. Abschließend wurden sie in einer Reihe

von Ethanolkonzentrationen sowie Xylol dehydriert und mit Eukitt (Sigma-Aldrich)

eingedeckt.

Negativkontrollen wurden mit einer Inkubation ohne primären Antikörpern oder durch

den Einsatz von Isotypenkontrollen (Serum-IgG von Hasen oder Ziegen; Sigma-

Aldrich) anstelle der primären Antikörpern durchgeführt. Da beide Kontrollen keine

Anfärbungen aufwiesen, sind Antigen-unabhängige Effekte auszuschließen. Positiv-

kontrollen erfolgten mit Gewebsschnitten von boviner Plazenta oder bovinem

Endometrium. Alle Schnitte jeder Kuh wurden angefärbt und qualitativ ausgewertet.

Aufgrund der geringen Größe der Gewebsschnitte und der Anzahl an Studientieren

konnten keine quantitativen Analysen durchgeführt werden.

3.2.9 Statistische Methoden

Die Zykluslänge von Kontroll- und LPS-Tieren wurden mit einem gepaarten t-Test

verglichen. Der Blutfluss und die Querschnittsfläche der CLs sowie die Plasma-

konzentrationen an P4, PGFM und PGE wurden mit dem Shapiro-Wilk Test auf

Normalverteilung geprüft. Alle genannten Parameter waren normalverteilt. Deshalb

wurde für jeden Endpunkt ein Mixed Model ANOVA-Test durchgeführt, um den Effekt

der Gruppe (Kontrolle versus LPS), der Zeit und Gruppen-Zeit Interaktionen zu

bestimmen. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit einem LSD Test

berechnet. Die Daten wurden mit dem Statistikprogramm SAS® (SAS Institute Cary,

NC, USA) ausgewertet. Stetige Parameter wurden mit MW ± Standardfehler ange-

geben und die Signifikanzschwelle lag bei p < 0,05.

CHAPTER 1

46

4. CHAPTER 1: THE EFFECT OF METRITIS ON LUTEAL FUNC TION IN

DAIRY COWS

4.1 Abstract

Forty-seven lactating Holstein-Friesian cows were used to investigate the effect of

metritis on luteal function during the first four postpartum estrous cycles. Cows with

abnormal uterine enlargement and malodorous lochia were classified as having

metritis (group M, n = 18) and all others were considered healthy (group H, n = 29).

Luteal size was measured once between days 9 and 13 of the first (group H, n = 11;

group M, n = 12), second (group H, n = 23; group M, n = 18) and fourth (group H,

n = 11; group M, n = 7) postpartum luteal phases. Serum progesterone (P4) con-

centration was measured at the same time. Sixteen cows (group H, n = 9; group M, n

= 7) underwent transvaginal luteal biopsy for gene expression analysis of steroido-

genic regulatory proteins (steroidogenic acute regulatory protein, cytochrome P450,

3ß-hydroxysteroid-dehydrogenase) during the second and fourth cycles. Cows with

persistence of the corpus luteum (CL) underwent determination of luteal size, luteal

biopsy and serum P4 measurement once between days 29 and 33, followed by

prostaglandin treatment to induce luteolysis. The same procedures were repeated

once between days 9 and 13 of the induced cycle. The cows in group M had smaller

first-cycle CLs than the cows in group H (P = 0.04), but P4 concentrations did not

differ between groups (P = 0.50). Luteal size, P4 concentration and gene expression

did not differ (P > 0.11) between the two groups during the second and fourth cycles.

Compared with healthy cows (3/29, 10%), there was a trend (P = 0.07) toward a

higher prevalence of persistent CLs in cows with metritis (6/18, 33%). Persistent CLs

were limited to the first cycle. Persistent CLs and the induced cyclic CLs did not differ

with regard to the variables investigated (P > 0.20). In conclusion, postpartum metritis

has adverse effects on luteal size and persistence, which seems to be limited to the

first postpartum cycle.

CHAPTER 1

47

4.2 Introduction

Disturbed uterine involution has a significant adverse effect on reproductive

performance in dairy cows (BONNETT et al. 1993; SHELDON et al. 2000; GILBERT

et al. 2005). Compared with healthy cows, days open was increased by 36 days in

cows with endometritis (KIM u. KANG 2003), and twice as many affected cows were

culled because of poor fertility (LEBLANC et al. 2002). Interestingly, for many years

there has never been a consistent definition of endometritis and metritis (LEBLANC

et al. 2002). SHELDON et al. (2009) characterized metritis by the presence of an

enlarged uterus and a watery reddish-brown fluid to viscous off-white purulent uterine

discharge, which often has a fetid odor. Whereas metritis occurs within 21 days,

clinical endometritis is defined in cattle as the presence of a purulent uterine

discharge detectable in the vagina 21 days or more postpartum (SHELDON et al.

2009).

Uterine infections affect ovarian activity. In cows with severe bacterial uterine conta-

mination the first postpartum dominant follicle was smaller and secreted less estra-

diol compared with healthy cows (SHELDON et al. 2002; WILLIAMS et al. 2007).

These cows also had smaller CLs and lower plasma progesterone (P4) concen-

trations than healthy cows (WILLIAMS et al. 2007).

Several authors have proven an association between disturbed uterine involution and

the occurrence of persistent CL in dairy cows (OPSOMER et al. 2000; TAYLOR et al.

2003). Furthermore, persistent CLs have been determined as one of the most

frequent abnormal ovarian activity in dairy cows (OPSOMER et al. 2000; TAYLOR et

al. 2003). The impact of persistent CLs on bovine fertility is largely unknown. While

TAYLOR et al. (2003) found no difference in reproductive competence between cows

with persistence of the CL and normal cyclic cows, another study showed that

persistent CLs resulted in a higher level of late embryo to early foetal mortality

(LAMMING u. DARWASH 1998). It is generally accepted that if the CL fails to lyse

and maintains its function beyond the physiological length of the estrous cycle, it is

defined as a persistent CL. However, a uniform length of the luteal phase for

CHAPTER 1

48

diagnosing a persistent CL does not exist as yet in literature. Based on serial P4

measurements in blood or milk, prevalence of 11 to 35% for persistent CL has been

calculated (FONSECA et al. 1983; LAMMING u. DARWASH 1998; OPSOMER et al.

2000; ZULU et al. 2002; TAYLOR et al. 2003; GUMEN et al. 2005; POLLOTT u.

COFFEY 2008). Although the pathogenesis of a formation of a persistent CL is not

clearly understood, some studies give evidence that the luteotropic prostaglandin

(PG) E might be involved (AKINLOSOTU et al. 1986; THIBODEAUX et al. 1992).

Intrauterine infusion of PGE prolongs the luteal phase in cattle (GIMENEZ u.

HENRICKS 1983; REYNOLDS et al. 1983), and induction of luteolysis was blocked

when PGF2α and PGE were given to sheep simultaneously (HENDERSON et al.

1977).

Luteal function can be evaluated by determining the gene expression of three

specific proteins, which basically regulate the transformation of cholesterol to

progesterone (REKAWIECKI et al. 2005). The steroidogenic acute regulatory protein

(StAR) transports cholesterol from the outer to the inner mitochondrial membrane

(DIAZ u. WILTBANK 2005). There the cytochrome P450 catalyzes the conversion of

cholesterol to pregnenolone, which is transformed to progesterone by the 3ß-

hydroxysteroid-dehydrogenase (3ß-HSD; REKAWIECKI et al. (2005)). In the ovine

CL the average concentration of mRNA for cytochrome P450 increased from day 3 to

day 9 (day 0 = estrus) and decreased significantly by day 15 (JUENGEL et al. 1994).

The induction of luteolysis with the consecutive decrease of the plasma progesterone

caused a significant reduction of the bovine gene expression of StAR and 3ß-HSD

(TSAI et al. 2001).

The primary goal of this study was to examine whether the adverse effect of metritis

on luteal function is limited to the first postpartum cycle (WILLIAMS et al. 2007) or

whether subsequent cycles are also affected. A secondary aim was to prove whether

metritis induces the occurrence of persistent CL. Furthermore, normal cyclic and

persistent CLs were compared with regard to size, P4 secretion and various gene

expressions.

CHAPTER 1

49

4.3 Materials and Methods

4.3.1 Cows

Forty-seven primiparous and pluriparous lactating Holstein-Friesian cows from the

research farm of the University of Veterinary Medicine Hannover, Germany, were

used. Cows were milked twice a day. The cows were fed a total mixed ration, and

concentrate was supplemented according to production. The study was conducted in

accordance with the guidelines of the Animal Research Act (research permit number

33.9 – 42502 – 04-09/1782) of the Lower Saxony Federal State Office for Consumer

Protection and Food Safety, Oldenburg, Germany.

4.3.2 Experimental design

4.3.2.1 Group allocation

Based on the results of the clinical examination of the reproductive tract, the cows

were classified as healthy (group H) or as having metritis (group M; Figure 2). Uterine

size was assessed subjectively according to a defined score system

(ROSENBERGER et al. 1979). Transrectal palpation was carried out on days 4, 8

and 11 (±1 day) postpartum and then three times a week until day 21. On day 21

postpartum cows with a uterus which could be gathered up with the hand and horns

were the thickness of three or four fingers (ROSENBERGER et al. 1979) or worse

were assumed to have a delayed uterine involution. When uterine discharge was

released from the vulva during transrectal examination it was noted and its odor

assessed. Furthermore, vaginoscopy was carried out using a tube speculum on days

4, 8 and 11, and the odor of the lochia was assessed. All examinations were carried

out by the same person (K.S.).

Based on SHELDON et al. (2009), cows with a uterine enlargement and discharge

having an offensive odor at any point of the examination were assigned to group M,

CHAPTER 1

50

and all other cows to group H. Metritis-cows which had fever (body temperature >

39.5°C) were treated daily for 3 days with ceftiofur (2.2 mg/kg, i.

m.; Excenel RTU®, Pfizer Animal Health, Germany) and on the day of diagnosis with

a single dose of flunixin meglumine (2.2 mg/kg, i.v.; Finadyne®, MSD Intervet,

Germany).

4.3.2.2 Observation of cyclicity

Cows were monitored by ultrasonography three times a week (Monday, Wednesday,

Friday) for the first ovulation starting on day 11 postpartum. Ovulation was diagnosed

when a dominant follicle, which had been seen at the previous examination, was no

longer visible. A CL with a diameter of more than 7 mm was deemed to be the result

of ovulation two days previously (day of ovulation = day 1), and the cycle stage was

designated as day 3. When the dominant follicle was no longer present, and a CL

was not visible or was smaller than 7 mm, the previous day was considered the day

of ovulation. On days 5 ± 1 and 11 ± 2 of cycle the presence of a CL was verified so-

nographically. The following three ovulations were diagnosed accordingly; to determi-

ne the occurrence of the second ovulation monitoring (three times per week) started

on day 14, and for detection of the third and fourth postpartum ovulations, monitoring

(three times per week) started on day 18 of the previous cycle.

4.3.2.3 Cyclic corpus luteum

Luteal size was measured sonographically once between days 9 and 13 of the first,

second and fourth cycles, and blood samples were collected at the same time for

measuring the serum P4 (Figure 2). In the first, second and fourth cycles, the CL of

23 (group H, n = 11; group M, n = 12), 41 (group H, n = 23; group M, n = 18) and 18

cows (group H, n = 11; group M, n = 7) was measured, respectively. One fraction of

cows was investigated during the first and second cycles, while another fraction of

CHAPTER 1

51

cows was examined during the second and fourth cycles. For that reason, the

number of individuals in the second cycle included most of the animals. During the

second and fourth cycles, 16 cows (group H, n = 9; group M, n = 7) underwent

transvaginal biopsy of the CL once between days 9 and 13. Cows which did not

ovulate within the first 42 days postpartum were excluded from analysis regarding

cyclic CLs.

4.3.2.4 Persistent corpus luteum

Cows with a CL with no sign of luteolysis at the end of a cycle underwent sono-

graphic luteal examination and transvaginal luteal biopsy once between days 29 and

33 of the estrous cycle as well as blood collection. The existence of a persistent CL

was confirmed by a serum P4 concentration of ≥ 1.0 ng/ml. After sonographic exa-

mination of the persistent CL the cows were treated with cloprostenol (0.5 mg, i.m.,

Estrumate®, Intervet, Unterschleißheim, Germany) to induce luteolysis and the sub-

sequent ovulation was diagnosed as described for spontaneous ovulations. In the

following induced cycle these cows underwent another luteal biopsy as well as so-

nographic luteal examination and blood collection once between days 9 and 13 of the

induced cycle (Figure 2).

4.3.2.5 Endometrial biopsy and fertility procedures

To verify whether the clinically based diagnosis of metritis leads to endometritis,

transvaginal endometrial biopsies were taken during the second and third postpartum

estrus (Figure 2). Biopsies were taken when a dominant follicle (Ø ≥ 10 mm) and only

a small CL (Ø < 10 mm) were apparent during transrectal sonographic examination.

Artificial insemination was started in the fourth postpartum estrus. Only cows

observed in standing heat were bred. Two pregnancy examinations were carried out

CHAPTER 1

52

using sonography on days 29 ± 1 and 40 ± 3 after breeding. An embryonic heart beat

was used to confirm pregnancy. Days to first service and days open as well as in-

semination (total number of inseminations in all cows per number of pregnant cows)

and pregnancy indices (number of inseminations per achieved pregnancy) were cal-

culated for cows in the two groups. Cows not ovulating within the first 42 days post-

partum were excluded from analysis regarding endometrial biopsies and fertility

procedures.

4.3.3 Ultrasonography

A portable ultrasound machine (HS-101V, Honda Electronics CO., Tokio, Japan) with

a 5 MHz linear-array transducer was used to monitor cows for ovulation and another

machine (LOGIQ Book XP, General Electric Medical System, Solingen, Germany)

equipped with a 10 MHz linear-array transducer was used to measure luteal size.

According to LÜTTGENAU et al. (2011), a CL was assumed to have the shape of a

prolate spheroid. For each detectable CL, maximum longitudinal and cross-sectional

images were frozen and recorded three times. The maximum height and width of the

cross-sectional area of the CL were measured (PixelFlux®, Version 1.0; Chameleon

Software, Leipzig, Germany) and taken as the major and minor diameters of the

spheroid, respectively. The volume of the CL was calculated as follows:

with a = major diameter (rotational axis) and b = minor diameter (transverse axis). If a

CL had a cavity, the volume of the cavity was determined accordingly and subtracted

from the previously calculated luteal volume. The difference between the total volume

of the CL and the volume of its cavity was defined as the volume of luteal tissue. In

double ovulations, the volumes were added, based on a previous study showing that

the weight of a CL resulting from a single ovulation does not differ from the combined

luteal weight resulting from a double ovulation (MANN et al. 2007).

volume = 4

3

a

2

b

2

2 x x x π

CHAPTER 1

53

4.3.4 Measurement of progesterone and prostaglandin E

Blood samples from a jugular vein were collected (serum- and EDTA-tubes, Sarstedt,

Nümbrecht, Germany) and placed on ice. Serum and plasma were separated by cen-

trifugation (3 000 x g, 15 min) and frozen at -20 °C. Serum P4 concentration was de-

termined using a commercial coat-a-count radioimmunoassay according to the

manufacturer’s instructions (Progesterone Coat-a-Count, TKPG1, Siemens Medical

Diagnostics, CA, USA). For PGE analysis, cows of both groups were sampled once

during the first postpartum luteal phase (between days 9 and 13) and cows with a

persistent CL were tested between days 29 and 33 after the first ovulation. PGE

plasma concentration was determined using a commercial PGE2 enzyme immuno-

assay (Prostaglandin E2 EIA Kit, Biotrend Chemikalien GmbH, Cologne, Germany).

Plasma samples first underwent solid phase extraction (C18 Sep-Pak Light Columns,

Waters GmbH Eschborn, Germany). In brief, C18 Sep-Pak Light Columns were

pretreated with methanol (Sigma Aldrich) and distilled water and 1 ml plasma diluted

with 0.2 ml methanol was added to the column. Elution medium was methyl formate

(2 ml) and the eluate was dried in the Eppendorf Concentrator 5301 and resus-

pended in an extraction buffer. The prostaglandin E2 EIA was carried out according

to the manufacturer’s instructions. The intra-assay correlation coefficient was

calculated by repeated measurements of bovine plasma samples. The minimal

detectable concentration was 0.2 ng/ml. The intra-assay correlation coefficient was

9.9 %. The described cross-reactivities were 100% for prostaglandin E2, A1, A2, B1,

B2, E1, 85.5% for 6-keto-prostaglandin E1, 17.7% for prostaglandin E3, F1α, and 2.0%

for 13,14-dihydro-15-keto-prostaglandin F2α. All other cross reactivities were <0.3%.

CHAPTER 1

54

4.3.5 Procedure of luteal biopsy

Luteal biopsy was carried out under epidural anesthesia using 80 mg procaine

hydrochloride (Procasel 2%®, Selectavet, Weyarn-Holzolling, Germany). An RNase-

freed (RNase-ExitusPlus™; AppliChem, Darmstadt, Germany) semi-automatic high-

speed biopsy needle (TEMNO Evolution™; Fa. Walter, Baruth/Mark, Germany) was

inserted into the CL along its longitudinal axis to collect a sample measuring appro-

ximately 15 x 1 x 1 mm. A second sample was collected in the same way. For visual

guidance, a portable ultrasound machine (LOGIQ Book XP; General Electric Medical

System, Solingen, Germany) with a 7.5-MHz convex transducer was used. Two hard

plastic forms, each with two parallel flutings, were used to create a bearing system

(type Hannover, ONNEN-LÜBBEN et al. (2009)) for the biopsy needle and the ultra-

sound transducer (Figure 3). In the upper fluting a guide tube for the semi-automatic

high-speed biopsy needle was inserted. The convex transducer was put into the lo-

wer fluting. After bolting the two hard plastic forms together, the bearing system was

inserted into the vagina, and the CL was placed in front of the vaginal fornix by trans-

rectal manipulation. Tissue samples were immediately placed in a sterile DNase- and

RNase-free cryo tube (Fa. Brand, Wertheim, Germany), frozen in liquid nitrogen and

stored at –80 °C until hormone determination and ge ne expression analysis had

been completed. This method allowed repeated biopsy sampling from a single CL

without impairing its subsequent function, as described earlier (TSAI et al. 2001).

4.3.6 Luteal RNA extraction and cDNA production

The levels of mRNA for StAR, cytochrome P450 and 3ß-HSD were quantified. These

substances are important factors for luteal steroidogenesis (JUENGEL et al. 1994;

TSAI et al. 2001; REKAWIECKI et al. 2005; SLOUGH et al. 2011). Total RNA was

extracted from luteal biopsy samples following the protocol of CHOMCYNSKI u.

SACCHI (1987), using TRIzol reagent as described previously (WATANABE et al.

2006). The yield of extracted total luteal RNA for each sample was determined by

CHAPTER 1

55

ultraviolet spectroscopy (optical density, 260 nm). The RNA concentration was

measured using the Bio-Tech Photometer (WPA, Cambridge, UK) at 260 nm and 280

nm absorbance. The extracted total RNA was stored in RNA storage solution

(Ambion, Texas, USA) at -80 °C until being used for cDNA production. RNA samples

were treated with DNase using the RQ1 RNase-Free DNase kit (Promega. Co.,

Madison, WI, USA). RNA (2 µl of 1 µg/µl) was incubated for 30 min at 37 °C with 1µl

of RQ1 RNase-Free DNase 10x Reaction Buffer and 2 µl of 1 µg/µl RNase-Free

DNase. Then, 1 µl of RQ1 DNase Stop Solution (20 mM EGTA) was added to ter-

minate the reaction, and incubated again for 10 min at 65 °C. First strand cDNA

synthesis was conducted according to a commercial protocol described in

SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA).

The synthesized cDNA was stored at -30 °C.

4.3.7 Real-time RT-PCR

Levels of mRNA for two housekeeping genes, glycerolaldehyde-3-phosphate-

dehydrogenase (GAPDH) and ß-actin, as well as for StAR, cytochrome P450 and 3ß-

HSD were quantified by real-time PCR with a LightCycler (Roche Diagnostics Co.)

using a commercial kit (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I: Roche

Diagnostics Co.). The primers were designed using Primer-3, based on bovine

sequences. The primers used to amplify specific fragments referring to selected

regulated genes are shown (Table 1). The amplification program consisted of 15 min

activation at 95 °C followed by 40 cycles of PCR st eps (15 sec denaturation at 94 °C,

30 sec annealing at 58 °C and a 20 sec extension at 72 °C). For the quantification of

the target genes, a series of standards were constructed by amplifying a fragment of

DNA (150~250 bp) containing the target sequence for real-time PCR. The PCR pro-

ducts were subjected to electrophoresis, and the target band cut out and purified

using a DNA purification kit (SUPRECTM-01, TaKaRa Bio. Inc., Otsu, Japan). The

quantification of mRNA expression was performed using Light Cycler Software (Ver-

sion 3.5; Roche). Primer sets were tested in luteal tissue samples to confirm am-

CHAPTER 1

56

plification of single bands, amplified products were cloned and sequenced to confirm

their identity, before using primers for analyzing the samples. The values determined

for the target genes were normalized against the housekeeping genes GAPDH and

ß-actin (∆Cq). To avoid negative digits while allowing an estimation of a relative

comparison between two genes, data were presented as means ± SD subtracted

from the arbitrary value 20 (∆Cq). Thus, a high ∆Cq proportionally resembled high

transcript abundance (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001).

4.3.8 Procedure of endometrial biopsy

The biopsy instrument, designed by Kevorkian (Fa. Hauptner Herberholz GmbH &

Co. KG, Solingen, Germany), was used to collect endometrial tissue samples from

both uterine horns approximately 2 cm cranial to the bifurcation. The instrument was

introduced into the uterus analogous to an AI pipette. Tissue samples were fixed in

10% neutral formalin buffered according to Lillie and embedded in paraffin. Sections

3 to 4 µm thick were stained with hematoxylin and eosin and examined microsco-

pically for signs of inflammation including the occurrence of lymphocytes, plasma

cells, macrophages and neutrophils. Endometritis was defined as an inflammatory

cell infiltration of the endometrium which exceeded the normal cellular infiltration

associated with repair of the endometrium. Up to 20 neutrophils in the luminal epi-

thelium and 15 mononuclear cells (lymphocytes, plasma cells, macrophages) in the

stratum compactum per high-power (x400) field are considered normal.

CHAPTER 1

57

4.3.9 Statistical analysis

The program SigmaStat 2.03 (Systat Software GmbH, Erkrath, Germany) was used

for statistical analysis. Continuous variables were analyzed for normal distribution

using the Kolmogorov-Smirnov test. Normally-distributed data are given as mean ±

SD. Differences between independent and dependent samples were analyzed using

a Student’s t-test and a paired t-test, respectively. Data not normally distributed are

presented as the median and mean absolute deviation (MAD). Differences between

paired and unpaired samples were analyzed using the Wilcoxon signed ranks test

and Mann-Whitney rank sum test, respectively. Days open of groups H and M were

plotted by Kaplan Meier curves, and curves were compared by a Mantel-Cox test.

Categorical data such as histopathological findings or occurrence of a persistent CL

were analyzed using a chi-square test or Fisher’s exact test. A P-value ≤ 0.05 was

considered significant and a value 0.05 < P < 0.10 was considered as a trend toward

significance.

CHAPTER 1

58

4.4 Results

4.4.1 Groups

Based on the examinations up to day 21 postpartum, 29 cows were healthy

(group H) and 18 had metritis (group M). Three metritis-cows had fever between

days 5 and 10, and were treated using the mentioned protocol. The two groups did

not differ with regard to the interval from calving to first ovulation (group H, n = 29,

19 ± 7 days [median ± MAD]; group M, n = 18, 16 ± 3 days [median ± MAD];

P = 0.22). Six of 29 (21%) in group H did not ovulate within 42 days of parturition and

none (0%) in group M (P = 0.07). No difference was found in age (P = 0.83), weight

(P = 0.37) and 305-day milk yield (P = 0.93) between cows of both groups. Cows of

groups H and M were 38 ± 12 [median ± MAD] months old, weighed 616 ± 66 kg and

had a milk yield of 9085 ± 1657 kg.

4.4.2 Cyclic corpus luteum

In the first cycle the luteal volume in cows of group M was smaller than that in cows

of group H (P = 0.04; Table 2). In the twelve cows of group M the first-cycle CL was

smaller compared to their second-cycle CL (5.8 ± 2.9 versus 7.9 ± 1.9 cm3; P = 0.05,

data not shown in Table 2).

Between cows of groups H and M there were no differences in P4 concentrations of

all three analyzed cycles (P ≥ 0.35; Table 2). In the first, second and fourth post-

partum cycles the time of assessment of luteal size and P4 concentration did not

differ between the two groups (P ≥ 0.34). Assessments were carried out on days

27 ± 6 (group H) and 28 ± 5 (group M) in the first cycle, on days 54 ± 13 (group H)

and 56 ± 9 (group M) in the second cycle and on days 102 ± 11 (group H) and 101 ±

7 (group M) in the fourth cycle, respectively.

In healthy cows there were differences in gene expression for cytochrome P450 and

3ß-HSD between the second and fourth cycles (Table 3, both P = 0.02).

CHAPTER 1

59

4.4.3 Persistent corpus luteum

Of the nine cows with a persistent CL, six belonged to group M and three to group H

(6/18: 33% versus 3/29: 10%; P = 0.07). All persistent CLs occurred in the first luteal

phase. The single treatment with prostaglandin induced luteolysis in all cases of a

persistent CL. No difference was found between luteal sizes, P4 concentrations and

gene expressions of persistent CLs and the CLs which formed after induced luteo-

lysis of the former (P ≥ 0.20; Table 4). There was no difference between the PGE

concentrations of cows with a persistent CL (blood sample taken after CL biopsy)

and cows in both groups (H and M) with a normal cyclic CL (blood sample taken

once between days 9 and 13) during the first postpartum cycle (3.0 ± 1.5 ng/ml

versus 3.45 ± 1.54 ng/ml; P = 0.43).

4.4.4 Endometrial biopsy and fertility procedures

In group M (n = 18) there was a trend toward more cows with histological signs of

endometritis than in group H (n = 23) during the second estrus (67% versus 35%;

P = 0.06). In the third estrus there were significantly more cows showing signs of

endometritis in group M compared to group H (56% versus 16%; P = 0.02).

Nineteen (48%), 16 (40%) and five (13%) cows (n = 40) were bred artificially for the

first time at the fourth, fifth and sixth postpartum estrus, respectively (one cow was

not re-bred). Two cows each from both groups were excluded from breeding after

five unsuccessful inseminations. Days to first insemination (group H, 101 ± 18 days;

group M 100 ± 17 days; P = 0.90) and days open (Figure 4; P = 0.52) did not differ

between the two groups. The insemination and pregnancy indices did not differ

between groups H (2.2 and 1.7) and M (2.9 and 2.3) either (P ≥ 0.25). All cows which

were diagnosed as pregnant at the first sonographic examination (day 29 ± 1 after

breeding) maintained their pregnancy until the next examination (day 40 ± 3 after

breeding).

CHAPTER 1

60

4.5 Discussion

In cows with metritis the CLs of the first postpartum estrous cycle were smaller than

those of the second cycle, and they were also smaller than the first-cycle CLs of

healthy cows. This was in agreement with observations made by WILLIAMS et al.

(2007) that the occurrence of large numbers of pathogenic bacteria in the uterine

lumen is associated with smaller first postpartum CLs. BRINSFIELD u. HAWK (1967)

showed that intrauterine infusion of E. coli during the previous estrous period caused

a reduction in the luteal weight in cows. The pathogenesis of luteal impairment

through metritis remains unclear. Metritis causes increased PGF2α plasma concen-

trations (THOMPSON et al. 1987; DEL VECCHIO et al. 1994; MATEUS et al. 2003),

which possibly disturb luteal development. Other inflammatory mediators such as

tumor necrosis factor-α which may be released during metritis are cytotoxic to bovine

luteal cells (PETROFF et al. 2001). Furthermore, endotoxin inhibits the responsive-

ness of the pituitary to GnRH (WILLIAMS et al. 2001), which in turn could affect

ovulation and luteal development.

In addition to smaller CLs in the first postpartum estrous cycle, bacterial contamina-

tion of the postpartum uterus has also been shown to be associated with lower

plasma P4 concentrations (WILLIAMS et al. 2007). This effect was not seen in the

present study. Possible reasons for this discrepancy include the use of clinical criteria

(SHELDON et al. 2009) rather than uterine culture results (WILLIAMS et al. 2007) for

classification of the cows in the present study, as well as the time of P4

measurement. Whereas the lower plasma P4 concentrations in cows with high num-

bers of uterine pathogens were measured between days 21 and 26 postpartum

(WILLIAMS et al. 2007), many of our cows were sampled later because

determination of P4 concentration of the first postpartum cycle was carried out on

days 27 ± 6 (group H) and 28 ± 5 (group M) postpartum, respectively. Uterine

involution (OKANO u. TOMIZUKA 1987) and elimination of bacteria from the uterine

lumen (HUSSAIN et al. 1990) progress continuously in the postpartum period, which

was also the reason why cows which remained anovulatory beyond day 42

CHAPTER 1

61

postpartum were eliminated from luteal and hormonal analysis.

In addition to the evaluation of the uterine discharge, cows were classified as healthy

or having a metritis based on the involution of the uterus. Although the transrectal

palpation of the uterus is subjective (OKANO u. TOMIZUKA 1987), and thresholds

for uterine enlargement do not exist in literature, it has been demonstrated that an in-

fection of the uterus delays the postpartum involution of the uterus (MATEUS et al.

2002; SHELDON et al. 2003). In the present study the validity of the applied group

allocation was confirmed by the histological examinations of endometrium biopsies

because cows in group M had a higher prevalence of endometritis in the second and

third postpartum estrus compared to cows in group H.

The results of gene expression of enzymes involved in progesterone synthesis were

surprising due to differences between the 2nd and 4th cycles in cows of group H

(Table 3). Expression of cytochrome P450, which converts cholesterol to pregne-

nolone (TUCKEY u. STEVENSON 1984), was reduced and expression of 3ß-HSD,

which converts pregnenolone to progesterone (REKAWIECKI et al. 2005), was in-

creased in the 2nd cycle compared with the 4th cycle. We have no clear explanation

for this difference, but this could be a kind of complementary mechanism by which

the CL maintains a stable amount of P4 synthesis and secretion. This idea is suppor-

ted by the result that peripheral P4 concentration and expression of StAR did not

differ significantly between the 2nd and 4th cycles, in agreement with the regulatory

function of the StAR protein on peripheral P4 concentration documented in pigs

(DIAZ u. WILTBANK 2005).

There was a trend toward an increased prevalence of persistent CLs in cows with

metritis, in agreement with previous reports stating that disturbed uterine involution

may be associated with this condition (OPSOMER et al. 2000; TAYLOR et al. 2003).

The prevalence of persistent CLs calculated in the present study was 19%, which

was similarly reported elsewhere (LAMMING u. DARWASH 1998; OPSOMER et al.

2000; TAYLOR et al. 2003; GUMEN et al. 2005; POLLOTT u. COFFEY 2008).

However, in contrast to our study, persistent CLs were not always limited to the first

postpartum cycle (LAMMING u. DARWASH 1998; TAYLOR et al. 2003; POLLOTT u.

COFFEY 2008). In those studies, the presence of luteal tissue was monitored indi-

CHAPTER 1

62

rectly using serial P4 measurements in blood or milk, rather than directly depicting

luteal tissue using sonography. It is therefore possible that in the cited studies at

least some persistent CLs were mistaken for luteinized ovarian cysts, which can

cause prolonged elevation of peripheral P4 concentration (KESLER et al. 1980;

CARROLL et al. 1990).

There were no differences between cyclic and persistent CLs with regard to size,

peripheral P4 concentration and gene expression for StAR, cytochrome P450 and

3ß-HSD, suggesting that the function of a persistent CL is not reduced compared

with that of a cyclic CL. However, the cellular mechanisms involved in luteolytic dis-

turbance remain elusive.

In addition to abnormal uterine PGF2α secretion (MATEUS et al. 2003) inflammatory-

mediated secretion of PGE, which is luteotropic (REYNOLDS et al. 1983), might be

responsible for prolonged luteal function. However, cows with persistent CLs did not

have elevated peripheral PGE concentration in our study, and therefore a prolonged

peripheral increase in PGE is not a likely mechanism of luteal persistence. On the

other hand, endometritis causes an increase in PGE concentration in uterine fluid of

cows (MATEUS et al. 2003), and endometrial epithelial cells exposed to endotoxin

undergo an endocrine switch from luteolytic PGF2α to luteotropic PGE (HERATH et al.

2009). Increased PGE concentrations in uterine fluid cause luteal persistence in

cows (THIBODEAUX et al. 1992), suggesting that in cows with metritis this prosta-

glandin plays a local role in the pathogenesis of persistent CL.

To our surprise, resumption of ovarian activity was not delayed in cows with metritis,

whereas 21% of the healthy cows had the first postpartum ovulation after 42 days.

Reduced feed intake and a negative energy balance are main factors leading to the

delay of postpartum ovarian activity (STAPLES et al. 1990; ZAIN et al. 1995). Our

observations suggest that the cases of a metritis seen in our cows were not severe

enough to have any significant effect on metabolic activity.

In summary, in the present study an adverse effect of metritis on luteal activity was

only apparent in the first postpartum estrous cycle at which time metritis was asso-

ciated with smaller luteal size and a trend toward increased prevalence of luteal

persistence. An adverse effect of metritis on the studied variables was not apparent

CHAPTER 1

63

after the first postpartum cycle. Therefore, a long-term effect on luteal function is not

a likely cause of reduced fertility in dairy cows with metritis.

CHAPTER 1

64

4.6 Tables and figures

Table 1: Sequences and accession numbers of the PCR primers for assayed

steroidogenic acute regulatory protein (StAR), cytochrome P450, 3ß-hydroxysteroid-

dehydrogenase (3ß-HSD), ß-actin and glycerolaldehyde-3-phosphate-dehydrogena-

se (GAPDH).

Gene

Primer sequencea

Accession number

StAR

For: 5-GTG GAT TTT GCC AAT CAC CT-3

MN174189

Rev: 5-TTA TTG AAA ACG TGC CAC CA-3

For: 5-CTG CAA ATG GTC CCA CTT CT-3 K02130 Cytochrome P450

Rev: 5-CAC CTG GTT GGG TCA AAC TT-3

3ß-HSD For: 5-TCC ACA CCA GCA CCA TAG AA-3 X17614

Rev: 5-AAG GTG CCA CCA TTT TTC AG-3

GAPDH For: 5-CTC TCA AGG GCA TTC TAG GC-3 NM001034034

Rev: 5-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3

ß-actin For: 5-CCA AGG CCA ACC GTG AGA AAA T-3 K00622

Rev: 5-CCA CAT TCC GTG AGG ATC TTC A-3

a For: forward primer ; Rev: reverse primer

CHAPTER 1

65

Table 2: Luteal size (mean ± SD) and serum progesterone (P4) concentration

(mean ± SD) in healthy cows (group H) and cows with metritis (group M) with a cyclic

corpus luteum in the first, second and fourth cycles (number of cows).

Luteal size [cm³]

P4 concentration [ng/ml]

Cycle

Group H

Group M

Group H

Group M

first

8.67 ± 3.36*

(11)

5.81 ± 2.86*

(12)

4.22 ± 1.44

(11)

3.75 ± 1.81

(12)

second 8.19 ± 2.69

(23)

7.91 ± 2.46

(18)

5.08 ± 1.18

(23)

4.67 ± 1.59

(18)

fourth 9.08 ± 2.49

(11)

7.41 ± 2.78

(7)

5.08 ± 2.14

(11)

4.47 ± 1.22

(7)

* P< 0.05 within rows

66

Table 3: Expression of mRNA (∆Cq; mean ± SD) for steroidogenic acute regulatory proteins (StAR), cytochrome P450 and

3ß-hydroxysteroid-dehydrogenase (3ß-HSD) of luteal tissue in healthy cows (group H) and cows with metritis (group M)

during the second and fourth cycles postpartum (number of cows).

StAR

Cytochrome P450

3ß-HSD

Cycle

Group H

Group M

Group H

Group M

Group H

Group M

second

1.11 ± 0.42

(9)

0.98 ± 0.30

(7)

1.04 ± 0.60*

(9)

1.21 ± 0.57

(7)

1.37 ± 0.72*

(9)

1.27 ± 0.79

(7)

fourth 0.88 ± 0.29

(9)

1.17 ± 0.39

(7)

1.46 ± 0.64*

(9)

1.11 ± 0.55

(7)

0.68 ± 0.25*

(9)

0.74 ± 0.51

(7)

* P< 0.05 within columns

CH

AP

TE

R 1

66

67

Table 4: Luteal size (mean ± SD) and serum progesterone (P4) concentration (mean ± SD) as well as mRNA expression

(∆Cq; mean ± SD) for steroidogenic acute regulatory proteins (StAR), cytochrome P450 and 3ß-hydroxysteroid-

dehydrogenase (3ß-HSD) of persistent CLs and cyclic CLs which formed after induced luteolysis of the former (number of

cows).

Luteal size [cm³]

P4 concentration [ng/ml]

StAR

Cytochrome P450

3ß-HSD

Persistent CLs

6.11 ± 1.47

(9)

5.12 ± 1.65

(9)

0.87 ± 0.47

(9)

1.49 ± 0.63

(9)

1.89 ± 1.12

(9)

Cyclic CLs 7.02 ± 2.34

(9)

5.23 ± 1.42

(9)

1.03 ± 0.40

(9)

1.12 ± 0.35

(9)

1.32 ± 0.73

(9)

CH

AP

TE

R 1

67

CHAPTER 1

68

Figure 2: Time schedule of examinations.

Experimental design persistent CL (Time schedule of examinations)

1st cycle diestrus a,*

Parturition Group allocation (metritis, healthy)

days 4 to 21 after parturition: (three times a week) ● transrectal uterine palpation with

assessment of uterine involution until day 21 after parturition

● examination of uterine discharge released from the vulva during transrectal examination

days 4, 8, 11 after paturition: ● vaginoscopy

Experimental design cyclic CL (Time schedule of examinations)

● determination of luteal size ● blood sample

2nd cycle estrus diestrus a,*

● endometrial biopsy

● determination of luteal size ● blood sample ● luteal biopsy

3rd cycle estrus diestrus *

● endometrial biopsy

4thcycle diestrus a,* ● determination of luteal size ● blood sample ● luteal biopsy

in case of a persistent CL b: (no signs of luteolysis at the end of cycle)

● determination of luteal size ● blood sample ● luteal biopsy ● application of cloprostenol

● determination of luteal size ● blood sample ● luteal biopsy

following diestrus a (of the induced cycle)

Footnotes: a once between day 9 and 13 of cycle b once between day 29 and 33 of cycle * in case of a persistent CL � Experimental design persistent CL

CHAPTER 1

69

Figure 3: Bearing system for biopsy needle and ultrasound transducer used during

luteal biopsy sampling.

CHAPTER 1

70

Days open [d]

0 50 100 150 200 250 300

Cum

. Sur

viva

l

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Figure 4: Kaplan Meier curves for days open [d] of healthy cows (■; group H; n = 22)

and cows with metritis (▲; group M; n = 18).

group H

group M

P = 0.52

71

RREESPEARRCH ODUCTION

Escherichia coli lipopolysaccharide administration transiently suppresses luteal structure and function in diestrous cows

K Herzog, K Stru ve, J P Kastelic1, M Piechotta, S E Ulbrich2, C Pfarrer3, K Shirasuna4, T Shimizu4, A Miyamoto4 and H Bollwein5

Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Bischofsholer Damm 15, D30173 Hannover, Germany, 1Agriculture and Agri-Food Canada, Lethbridge Research Centre, Lethbridge, Alberta, Canada, 2Physiology- Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany, 3Institute of Anatomy, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany, 4Graduate School of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Obihiro, Japan and 5Clinic of Reproductive Medicine, University of Zurich, Zurich, Switzerland

Correspondence should be addressed to K Herzog; Email: [email protected]

K Herzog and K Stru ve contributed equally to this work

Abstract

The objective was to characterize the effects of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) endotoxin (given i.v.) on luteal structure and function. Seven nonlactating German Holstein cows, 5.1±0.8 years old (mean±S.E.M.), were given 10 ml saline on day 10 (ovulation=

day 1) of a control estrous cycle. On day 10 of a subsequent cycle, they were given 0.5 mg/kg LPS. Luteal size decreased (from 5.2 to 3.8 cm2, P≤ 0.05) within 24 h after LPS treatment and remained smaller throughout the remainder of the cycle. Luteal blood flow decreased by 34% (P≤ 0.05) within 3 h after LPS and remained lower for 72 h. Plasma progesterone (P4) concentrations increased

(P≤ 0.05) within the first 3 h after LPS but subsequently declined. Following LPS treatment, plasma prostaglandin (PG) F metabolites concentrations were approximately tenfold higher in LPS-treated compared with control cows (9.2 vs 0.8 ng/ml, P≤ 0.05) within 30 min, whereas plasma PGE concentrations were nearly double (P≤ 0.05) at 1 h after LPS. At 12 h after treatment, levels of mRNA encoding Caspase-3 in biopsies of the corpus luteum (CL) were increased (P≤ 0.05), whereas those encoding StAR were decreased (P≤ 0.05) in cattle given LPS vs saline. The CASP3 protein was localized in the cytoplasm and/or nuclei of luteal cells, whereas StAR was detected in the cytosol of luteal cells. In the estrous cycle following treatment with either saline or LPS, there were no significant differences between groups on luteal size, plasma P4 concentrations, or gene expression. In conclusion, LPS treatment of diestrus cows transiently suppressed

both the structure and function of the CL. Reproduction (2012) 144 467–476 ISSN 1470–1626 (paper) 1741–7899 (online) DOI: 10.1530/REP-12-0138

Introduction

Inflammation in cattle is associated with low fertility, attributed to endotoxin-induced production of prostaglandin F2α (PGF2α), and regression of the corpus luteum (CL; Moore et al. 1991, Hockett et al. 2000, Sheldon et al. 2009). For example, cows with severe bacterial metritis had smaller CL, which produced less progesterone (P4; Williams et al. 2007). Following i.v. administration of Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS) in pro-estrus cows, ovulation was delayed 4 days, and the interval from ovulation to CL formation and to increased peripheral P4 concentrations was both prolonged (Suzuki et al. 2001, Lavon et al. 2008). I.v. administration of endotoxin on days 7–9 of the estrous cycle in cows caused rapid increases in serum concentrations of P4 and PGF metabolites

(13,14-dihydro-15-keto-PGF2α; PGFM), followed by a transient decrease in P4 concentrations, although the duration of the estrous cycle was not significantly altered (Gilbert et al. 1990). In that study, a high dose of LPS (5 mg/kg) was used; in some cows, it caused severe cyanosis, fever, ptyalism, diarrhea for 24 h, and recumbency for up to 5 days. However, in another study (Lavon et al. 2008), 0.5 mg/kg LPS given i.v. affected ovarian function and caused systemic responses that were not life threatening. It was noteworthy that LPS was given i.v. in this study, as the objective was to determine the systemic effects of LPS, not the effects of LPS derived from a specific location (e.g. uterus or mammary gland).

P4 is primarily synthesized in the CL, but small amounts are also synthesized in the adrenal cortex.

CHAPTER 2: Reproduction (2012) 144 467-476; Page 467

www.reproduction-online.org

72

Lute

al s

ize

(cm

2 )

b

Cholesterol, the precursor of P4, must be transported to the inner mitochondrial membrane; the StAR protein (StAR) is involved in this rate-limiting step of steroidogenesis (Stocco & Clark 1996). The CL also produces PG, particularly during the early stages of the estrous cycle and during luteolysis. The rate-limiting step in PG production is conversion of arachidonic acid to PGG2 by cyclooxygenase-2 (PTGS2 (COX2)), the inducible, highly regulated form of cyclooxygenase (Wiltbank & Ottobre 2003, Slough et al. 2011). During luteolysis, activation of Caspase-3 has a pivotal role in selective destruction of key structural and functional cellular proteins (Casciola-Rosen et al. 1996, Thornberry & Lazebnik 1998). Furthermore, PGE might contribute to maintenance of luteal function until 21 days post-estrus, perhaps even causing a prolonged luteal phase in postpartum cows (Gimenez & Henricks 1983, Opsomer et al. 2000, Sheldon et al. 2009).

There are apparently no reports characterizing, at the subcellular level, the relationship between endotoxin exposure and luteal function in cows. However, an ultrasound-guided biopsy of the CL would be a noninvasive means of investigating the effects of endotoxin exposure on luteal tissue. Therefore, the objectives of this study were to characterize the in vivo effects of endotoxin on luteal function and structure (order consistent with title) and in particular mRNA levels for Caspase-3, StAR, and PTGS2, and their respective proteins, in the CL of cyclic, nonlactating cows.

Results

Clinical response and interovulatory interval

None of the cows had any systemic reactions after administration of saline solution. In contrast, following LPS treatment, all cows had tachycardia and tachyp- noea, combined with an expiratory grunt (starting ~15 min after treatment), followed by muscle tremors. Furthermore, all cows had ptyalism and cyanosis, starting 1 h after treatment and persisting for 8–12 h. Three cows had an immediate febrile response, with peak temperatures (39.5–40.4 °C) between 3 and 12 h after treatment. Three cows developed diarrhea within the first 12 h after administration (it persisted for 8 h). In some cows, feed intake did not resume until 6 h after treatment, whereas water intake was suspended until ~8 h after administration. However, it was noteworthy that all but one cow appeared clinically normal by 24 h after LPS treatment. In the remaining cow, clinical signs had abated by 48 h after treatment.

The mean cycle length of the control cycle was 21.0 ±0.9 days (mean±S.E.M.), whereas it was 25.0 ± 2.5 days (P=0.138) for the cycle following LPS treatment. The minimum and maximum lengths of the cycles were 18 and 24 days in control cows and were

19 and 38 days in LPS-treated cows, with two cows in the latter group having a prolonged cycle (28 and 38 days respectively).

Luteal area and luteal blood flow

All cows had single ovulations. Following treatment with saline or LPS, five of seven cows had a CL with a cavity, whereas no cavity was present in the CL of the other two cows.

For luteal area, there was a group by time interaction (P≤ 0.001), but no effect of group or time (P=0.115 and 0.083 respectively). Luteal area decreased in LPS-treated cows (from 5.2 to 3.8 cm2, P≤ 0.05) within 24 h after treatment and remained at that size until 216 h after treatment (Fig. 1). In control cows, luteal area decreased from 4.6 cm2 at the start of treatment to 3.4 cm2 at 216 h after treatment. Between 24 and 72 h after LPS administration, luteal area was smaller in LPS-treated cows compared with control cows (P≤ 0.05). However, starting 5 days after treatment, luteal area was not significantly different between groups. Similarly, luteal area was not significantly different between groups in the following estrous cycle after treatment with either saline or LPS (Fig. 2A).

For luteal blood flow (LBF), there were effects of group, time, and a group by time interaction (P=0.002, 0.019, and ≤ 0.0001 respectively; Fig. 3A). There was no significant difference in LBF between groups -1.0 h before treatment. However, at 3 h after treatment, LBF had decreased by 34% in LPS-treated cows (P≤ 0.05). Between 24 and 72 h after LPS treatment, LBF rebounded and reached nearly baseline values again (P<0.05). In control cows, LBF remained nearly

6

a

5

4 * * *

3

2

0 –1 12 24 48 72 120 168 216

Interval relative to treatment (h)

Figure 1 Mean±S.E.M. luteal size in cows given saline (open triangle) or E. coli lipopolysaccharide (LPS; filled triangle) on day 10 of the estrous cycle. *Values differed between saline- and LPS-treated cows (P≤ 0.05). a,bWithin LPS-treated cows, values without a common superscript differed (P≤ 0.05).



73

Pro

gest

eron

e (n

g/m

l) Lu

teal

siz

e (c

m2 )

constant during the investigation period (P>0.05). Until 48 h, LBF was lower in LPS-treated vs control cows (P≤ 0.05).

Plasma P4 concentrations, PGFM, and PGE concentrations

For plasma P4 concentrations, there were effects of time and group by time (P≤ 0.0001 and ≤ 0.0001 respectively; Fig. 3B), but no effect of group (P=0.5083). Plasma P4 concentrations were stimulated by endotoxin; within the first 30 min after administration, they increased dramatically (from 4.8 to 8.6 ng/ml, P≤ 0.05). Thereafter, plasma P4 concentrations decreased until 9–24 h when the concentrations reached their nadir (~1.9 ng/ml, P≤ 0.05). Furthermore, 5 days (120 h) after LPS treatment, plasma P4 concentrations had recovered (3.8ng/ml). Plasma P4 concentrations were higher

(P≤ 0.05) in LPS-treated than in control cows within the first 3 h after treatment. Plasma P4 concentrations did not differ (P>0.05) between groups from 4 to 6 h after LPS treatment, whereas between 9 and 72 h after treatment, plasma P4 concentrations were lower in LPS-treated compared with control cows (P≤ 0.05). However, at 5 days (120 h) after treatment, there were no differences in plasma P4 concentrations between groups anymore (P>0.05), nor were there differences in plasma P4 concentrations between groups in the estrous cycle after treatment with either saline or LPS (P>0.05; Fig. 2B).

For PGFM, there were effects of group and time, and a group by time interaction (P=0.0042, ≤ 0.0001, and ≤ 0.0001 respectively; Fig. 4A). At 30 min after LPS administration, plasma PGFM concentrations were approximately tenfold higher in LPS-treated compared with saline-treated cows (9.2 vs 0.8 ng/ml, P≤ 0.05). These concentrations remained elevated in LPS-treated cows at 4 h after exposure (2.8 vs 0.6 ng/ml, P≤ 0.05), but there was no significant difference between groups

A 6

5

4

3 c

2

b

1 a

0

from 6 h to the end of the investigations. Plasma PGE concentrations were nearly twice as high

in LPS-treated vs control cows at 1 h after treatment (3.61 c vs 1.98 ng/ml respectively, P≤ 0.05; Fig. 4B). At 4 h after

c treatment, there was no significant difference between groups (P>0.05), whereas 24 h after treatment, PGE

concentrations were lower in saline-treated than in LPS- treated cows (P≤ 0.05). There was no significant difference between groups 24 h before the next ovulation (P>0.05). However, it was noteworthy that the two LPS-treated cows with prolonged cycles had the highest PGE concentrations 24 h before the next ovulation (3.3 and 8.6 ng/ml respectively).

1 3 5 7 9

Interval after ovulation [days]

B 6

5 d

d

4

3

2 c

1

b

0 a

1 3 5 7 9

Interval after ovulation [days]

Figure 2 Mean±S.E.M. luteal size (panel A) and plasma progesterone concentration (panel B) in cows in the estrous cycle after treatment with saline (open triangle) or E. coli lipopolysaccharide (LPS; filled triangle). a,b,c,dWithin LPS-treated cows, values without a common superscript differed (P≤ 0.05).

Gene expression and immunohistochemistry

The mRNA encoding Caspase-3 was more than twice as high in LPS-treated cows vs control cows at 12 h after treatment (P≤ 0.05; Fig. 5), with no significant difference in the following cycle. Luteal mRNA expression of StAR was lower in LPS- than in saline-treated cows 12 h after treatment (P≤ 0.05; Fig. 5), with no significant difference between groups on day 10 of the estrous cycle after treatment with either saline or LPS (P>0.05; Fig. 5). There was no difference in mRNA encoding PTGS2 in LPS- or saline-treated cows 12 h after challenge (P>0.05; Fig. 5).

CASP3 was predominantly present in the cytoplasm of luteal cells in control cows (Fig. 6). In LPS-treated cows, there was a strong nuclear reaction of CASP3 after LPS exposure (12 h). Endothelial cells were stained infre- quently, whereas PTGS2 immunoreaction was detected in connective tissue cells (also endothelial cells) and to a much lower extent in luteal cells after LPS treatment (Fig. 6). Luteal cells were strongly positive for StAR protein (Fig. 6). Unfortunately, the small size and number



74

Lute

al b

lood

flow

(cm

2 ) P

roge

ster

one

(ng/

ml)

PG

E (

ng/m

l) P

GF

M (

ng/m

l)

*

A 1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.0

a

*

* *

b * * *

b

Although the diestrous CL is the most highly perfused organ (per unit of tissue) in the body (Wiltbank et al. 1988), it was noteworthy that LBF decreased sharply within the first 3 h after LPS administration in this study. When there is a serious systemic problem (e.g.

a septicemia), blood flow is diverted from the periphery to the core (Evtushenko et al. 1985, Richardson et al. 1996); this may have accounted for the precipitous decline in luteal perfusion in this study. Furthermore, in these cows, blood samples taken 30 min after LPS treatment were dark blue, and cows had clinical symptoms of increased vascular permeability (i.e.

B 10

8

–1 3 6 9 12 24 48 72


*

b

* *

injected or ruptured episcleral vessels), attributed to damage to capillary endothelia, and release of compounds that were vasoactive and initiated the coagulation cascade.

6

a

4 a *

2 c * *

0

A 12

* 10

b

8

* * 6

c *

4 –10.5 2 3 4 6 9 12 24 48 72


Figure 3 Mean±S.E.M. luteal blood flow (panel A) and plasma progesterone concentration (panel B) in cows given saline (open triangle) or E. coli lipopolysaccharide (LPS; filled triangle) on day 10 of the estrous cycle. *Values differed between saline- and LPS-treated cows (P≤ 0.05). a,bWithin LPS-treated cows, values without a common superscript differed (P≤ 0.05).

of biopsies per cow precluded quantification of the immunoreaction and thus formal statistical comparisons between groups.

Discussion

To our knowledge, this is the first detailed assessment regarding the effects of LPS on luteal function and structure in cows. There was temporary suppression of CL function and structure after i.v. administration of LPS endotoxin in diestrus, nonlactating cows. Luteal size, LBF, and P4 all decreased within 24 h after LPS treatment. Similarly, in a previous study, when LPS was given 42 h after PGF (which was intended to induce luteal regression and ovulation), CL formation was delayed compared to control cows (Suzuki et al. 2001). Furthermore, as CL diameter was smaller during the first postpartum cycle in cows with many vs fewer uterine pathogens, it was concluded that metritis had deleterious effects on ovarian function and that it contributed to infertility (Williams et al. 2007).

* d

2

a a 0

–10.5 2 3 4 6 9 12 24


B 4 *

b

3

* *

c

2 a*

0 –1 12 4 12 24 Before next

ovulation


Figure 4 Mean±S.E.M. plasma concentrations of prostaglandin F metabolites (PGFM; panel A) and prostaglandin E (PGE; panel B) in cows given saline (open triangle) or E. coli lipopolysaccharide (LPS; filled triangle) on day 10 of the estrous cycle. *Values differed between saline- and LPS-treated cows (P≤ 0.05). a,b,c,dWithin LPS-treated cows, values without a common superscript differed (P≤ 0.05).



75

b

b

Arb

itrar

y un

its (

Cox

-2/ß

-act

in)

Arb

itrar

y un

its (

StA

R/ß

-act

in)

Arb

itrar

y un

its (

Cas

pase

3/ß-

actin

)

Decreased LBF may have been associated with partial luteolysis. In that regard, after induction of luteolysis with PGF, LBF initially increased (30 min after PGF treatment), but it subsequently (within 4 h) decreased

(Acosta & Miyamoto 2004). For animal welfare reasons (i.e. systemic effects of LPS on the cows), transrectal sonographic examinations were not conducted immediately after LPS administration.

Decreased plasma P4 concentrations occurred concurrent with reduced LBF; in that regard, plasma P4

0.07

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.00

mRNA Caspase-3

a

b

b

b

concentrations decreased to minimal values between 9 and 24 h after LPS treatment, consistent with the close correlation between LBF and P4 (Herzog et al. 2010). However, there was an initial, transient increase in plasma P4 concentrations (within the first 30 min after LPS treatment). Similarly, in a previous study (Gilbert et al. 1990), plasma P4 concentrations were markedly increased within 4 h after LPS infusion; the prolonged increase in P4 concentrations was attributed to the high dose of LPS (tenfold that used in this study). It is well established that P4 concentrations increase following LPS treatment (Peter et al. 1989, Battaglia et al. 1997,

LPS Cont LPS Cont Takeuchi et al. 1997). This increase was attributed to

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.00

12 h after infusion Day 10 of the following cycle

mRNA StAR

b b

a,b

a

adrenal origin, as similar rises were induced by endotoxin in ovariectomized heifers (Kujjo et al. 1995) and ewes (Battaglia et al. 1997). Suzuki et al. (2001) suggested that LPS caused suppression of the reproductive axis at the level of the hypothalamus, anterior pituitary, or both, associated with central activation of the neuroendocrine stress axis, resulting in temporary increases in both P4 and cortisol. In this study, plasma P4

was lower in LPS-treated cows compared with control cows at 9 h after treatment. Similarly, systemic P4

concentrations were decreased over several days in cows given an intrauterine infusion of LPS (Williams et al. 2008). In this study, 72 h after LPS treatment, there was some recovery in plasma P4 concentrations, whereas 5 days after treatment, plasma P4 concen-

LPS Cont LPS Cont trations were not significantly different from those in

0.0018

0.0016

0.0014

0.0012

0.0010

0.0008

0.0006

0.0004

0.0002

0.0000


mRNA Cox-2

saline-treated cows Furthermore, average cycle length was not significantly altered after LPS treatment in the current study, in agreement with a previous report (Gilbert et al. 1990). The profound increase in PGFM concentrations within 30 min after LPS administration obviously did not induce complete luteal regression, presumably due to an insufficient release of PGF2α. In addition, we inferred that PGE contributed to luteal cell recovery, as it regulates luteal lifespan and generally has effects opposite to those of PGF2α. In that regard, intrauterine infusion of PGE delayed the decline in P4

concentrations and prolonged the estrous cycle in cattle (Akinlosotu et al. 1986), and it counteracted the effects of PGF2α in gilts treated with indomethacin (Akinlosotu

LPS Cont LPS Cont et al. 1988). Interestingly, in the two cows with a


Figure 5 Mean±S.E.M. levels of mRNA for specific enzymes at 12 h after infusion and on day 10 of the following estrous cycle in cows given saline (Cont; gray bars) or E. coli lipopolysaccharide (LPS; black bars). a, bWithin a sampling period (i.e. 12 h or day 10), values differed between saline- and LPS-treated cows (P≤ 0.05).

prolonged estrous cycle, PGE concentrations were maximal at the next ovulation, consistent with the well-known luteotrophic effect of PGE. In previous studies, chronic intrauterine infusion of PGE in the uterine horn ipsilateral to the CL-containing ovary prevented spontaneous luteolysis (Magness et al. 1981, Weems et al. 1992, 2006) or premature luteolysis induced by PGF2α



.

76

A B

CASPASE-3 (Cont) CASPASE-3 (LPS)

C D

COX-2 (LPS) StAR (LPS) X500

Figure 6 Immunolocalization of CASP3 (CASPASE- 3), PTGS2, and StAR in biopsies of corpora lutea of cows given saline or E. coli lipopolysaccharide (original magnification: X500). (A) CASP3 (CAS- PASE-3) immunostaining was present in cytoplasm in cows given saline- (Cont; green arrows). (B) LPS- treated cows had predominantly nuclear staining 12 h after E. coli lipopolysaccharide administration (LPS; black arrows). (C) PTGS2 was localized in stroma cells between luteal cells in LPS-treated cows. (D) StAR antibody strongly stained the cytoplasm of luteal cells in LPS-treated cows.

(Reynolds et al. 1981, Weems et al. 1985). Furthermore, PGE (given i.m.) increased P4 concentrations for 72 h in cows (Kimball & Lauderdale 1975).

The mRNA encoding Caspase-3 increased consider- ably 12 h after LPS administration. Caspase-3 has been described primarily in CL of other species in relation to induced luteolysis (Rueda et al. 1999, Carambula et al. 2002) but has apparently not been described in physiological luteolysis. In this study, there was an increase in Caspase-3, but LPS only caused a temporary suppression of CL function and morphology, without complete luteolysis. Interestingly, localization of CASP3 in either the cytoplasm or nucleus, in the absence of apparent nuclear degeneration, has been associated with several non-apoptotic functions in other tissues (Wagner et al. 2011). Functions proposed are partici- pation in cellular proliferation and cell cycle regulation, as well as differentiation of numerous cell types (Schwerk & Schulze-Osthoff 2003). Therefore, we inferred that the shift of CASP3 after LPS treatment to the nuclei of the cells was not only an expression of luteolysis but also of luteal cell regeneration. The mRNA encoding StAR decreased 12 h after LPS administration, concurrent with reduced plasma P4

concentrations in these cows. Although the effects of LPS treatment on StAR have apparently not been reported, values for mRNA encoding StAR were positively correlated with serum P4 concentrations on days 5 and 14 in mares (Slough et al. 2011). As StAR activity is the rate-limiting role in steroidogenesis (Stocco & Clark 1996), we inferred that the decreased StAR activity was the cause rather than the conse- quence of reduced plasma P4 concentrations. In contrast to its effect on StAR, LPS had no significant

effect on the mRNA encoding PTGS2. In previous studies in cattle, luteal PTGS2 mRNA expression was highest in the early luteal phase (Kobayashi et al. 2002), with increasing values in mature bovine CL after induction of luteolysis by PG (Tsai & Wiltbank 1997, 1998, Diaz et al. 2000, Narayansingh et al. 2002, Shirasuna et al. 2004).

In this study, a single bolus of LPS did not significantly affect luteal functions in the following estrous cycle, suggesting that this LPS treatment had no effect on ovarian follicular development. Cattle with metritis, particularly cases associated with E. coli infection, have reduced ovarian follicle growth and function and are less likely to ovulate (Peter et al. 1989, Sheldon et al. 2002, Williams et al. 2007). Perhaps follicle growth and development is differentially influenced by acute vs chronic LPS exposure.

The dosage of 0.5 mg/kg LPS was based on the previous reports (Nugent et al. 2002, Lavon et al. 2008). The amount used was sufficient to provoke inflammatory symptoms without risking the long-term health or even life of animals. Furthermore, by taking CL biopsies during diestrus of the LPS cycle as well as during the following estrous cycle on the corresponding day, effects of LPS treatment, and no residual effects of treatment on the subsequent CL, were demonstrated.

In conclusion, giving 0.5 mg/kg LPS to clinically healthy, cyclic cows provoked a temporary depression in luteal function and morphology but had no effect on CL development in the following cycle. Whether this extent of luteal depression has any influence on fertility or even an existing early pregnancy is the topic of current studies.



77

Materials and Methods

Cows

This study was conducted (between March and September 2010) in the Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany. The experimental protocol was reviewed and approved and the research was conducted in accordance with German legislation on animal welfare (Lower Saxony Federal State Office for Consumer Protection and Food Safety, 33.9-42502 – 04-09/1782). Seven nonlactating German Holstein cows, clinically healthy and with no apparent reproductive abnormalities, were used. These cows were 5.1±0.8 years old (mean±S.E.M.; range, 2.4–8.2), primiparous or pluriparous, and were at least 4 months postpartum. They were tethered in stalls and given ad libitum access to hay and water.

Study design

Ovulation was synchronized with an Ovsynch protocol (Pursley et al. 1995). A GNRH analog (10 mg buserelin, Receptal, Intervet, Unterschleißheim, Germany) was given s.c. Seven days later, a PGF2α analog (657.5 mg cloprostenol- natriumsalz, Estrumate, Essex, Munich, Germany) was given i.m., followed by 10 mg of the GNRH analog given s.c. 48 h later. Transrectal ultrasonographic examinations were performed 12, 24, and 36 h after the last GNRH treatment to detect ovulation (defined as day 1 of the estrous cycle). On day 9, a polyethylene catheter was inserted into a jugular vein. Each cow first underwent a control treatment: 10 ml of 0.9% saline was administered (over a 1-min interval) via the catheter on day 10 of the estrous cycle. In the following cycle, transrectal ultrasonography (to examine the ovaries) was done every other day until day 10. Then, the Ovsynch protocol was repeated and the next ovulation confirmed. On day 10 of that cycle, the LPS trial was conducted. An LPS solution (0.5 mg/kg body weight E. coli, O55:B5; L2880, Sigma–Aldrich) in 10 ml sterile water (B Braun, Melsungen) was given i.v. (over an interval of ~1 min). After administration of either saline or LPS solutions, the catheter was flushed with 25 ml of 0.9% saline solution. In the cycle following the LPS trial, cows were investigated, as described previously for the saline trial, until day 10.

Ultrasonography and determination of LBF

Transrectal B-mode ultrasonographic examinations were done at -1, 12, 24, 48, 72, and 216 h relative to treatment (saline or LPS); following ovulation, similar examinations were done every second day until day 9 of the following estrous cycle. All these examinations were conducted by the same operator, using a Logiq Book XP ultrasound scanner (General Electrics Medical Systems, Jiangsu, People’s Republic of China), equipped with a 10.0 MHz linear-array transducer (General Electrics Yokogawa Medical Systems, Tokyo, Japan). Three cross-sectional images with maximal areas of the respective CL were recorded (using B-mode sonography). Luteal areas were measured offline (PixelFlux, version 1.0, Chameleon Software, Leipzig, Germany). The cross-sectional area of the CL was

determined from each image. If the CL had a cavity, the cross- sectional area of the cavity was measured and subtracted from the total area (Kastelic et al. 1990). The mean of the cross- sectional areas of the three images was calculated and used for statistical analyses.

Power-flow Doppler was used for color blood flow mapping of the CL in various transverse sections. Investigations were done at -1, 3, 6, 9, 12, 24, 48, and 72 h in relation to administration of saline or LPS. Fixed, preinstalled Doppler system controls were used to preclude variations in recording. Three power-flow images were recorded at the maximum blood flow cross section; care was taken to locate the entire CL within the Doppler sample box to avoid flash artifacts and to evaluate maximal blood flow within the CL. PixelFlux was used to quantify (off-line) the area of color pixels within the CL, which was considered a semiquantitative measure of LBF. For further processing, the mean of the three single images was calculated. Image acquisition and processing were done as described (Jordan et al. 2009, Herzog et al. 2010).

Blood samples and determination of plasma P4, PGF metabolites, and PGE concentrations

At 1.0 and 0.5 h before administration of saline or LPS, blood samples were collected to characterize concentrations of P4, PGFM, and PGE; the mean of these two samples was used as a pretreatment base concentration for that day. In addition, blood samples were collected (via the catheter) at 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 24, 48, 72, and 120 h after treatment, as well as every other day until day 9 of the following estrous cycle. For all these samples, plasma was separated by centrifugation (3000 g, 15 min at 4 °C) within 30 min after collection, and samples were stored at -20 °C pending analysis.

Plasma P4 concentrations were determined with a commercial chemiluminescence immunoassay (Immulite, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA). The lower detection limit was 0.5 ng/ml, and the intra- and interassay coefficients of variation (CVs) was <10%. Plasma PGFM concentrations were determined with a competitive enzyme immunoassay (Mishra et al. 2003). The PGFM–HRP conjugate and antiserum were supplied by Prof. Meyer (Physiology Weihenstephan, Technische Universitaet Muenchen, Freising, Germany), whereas the PGFM used for the standard curve was purchased from Sigma. The antiserum had minimal cross-reactions with any of the related PGs, PGE2, PGEM, PGA2, PGAM, and PGF2α

(<0.01%, Guven & Ozsar 1993). The lowest detection limit for PGFM was 25 pg/ml. The intra- and interassay CVs were 3.5 and 11.4% respectively.

Plasma PGE concentrations were determined using a commercial PGE2 enzyme immunoassay (Prostaglandin E2 EIA Kit, Biotrend Chemikalien GmbH, Koln, Germany). Before analysis, plasma samples were subjected to solid-phase extraction (C18 Sep-Pak Light Columns, Waters GmbH, Eschborn, Germany). In brief, C18 Sep-Pak Light Columns were pretreated with methanol (Sigma–Aldrich) and distilled water; thereafter, 1 ml plasma (diluted in 0.2 ml methanol) was added to the column. The elution medium was methyl formate (2 ml). The eluate was dried in an Eppendorf concentrator (Model 5301) and resuspended in extraction buffer (Prostaglandin E2



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enzyme immuno assay (EIA) Kit, Biotrend Chemikalien GmbH). The following EIA for PGE2 was performed according to the manufacturer’s instructions. The minimal detectable concentration was 0.2 ng/ml and the intra- and interassay CVs were 9.9 and 17.4% respectively. The described cross-reactivities were 100% for PGs E2, A1, A2, B1, B2, and E1; 85.5% for 6-keto-PGE1; 17.7% for PGE3 and F1a; and 2.0% for 13,14-dihydro-15-keto- PGF2α (all other cross-reactivities were <0.3%).

CL biopsy

CL biopsies were done on experimental day 10 of the saline cycle and the LPS cycle respectively (12 h after treatment). Additionally, after each trial, biopsy samples were collected on day 10 of the following estrous cycle. To reduce rectal contractions during the biopsy procedure, cows were given caudal epidural anesthesia (80 mg procaine hydrochloride; Procasel 2%, Selectavet, Weyarn-Holzolling, Germany). Two samples (each ~15x1x1 mm) were obtained from the maximum diameter of the CL, using an RNase-free (RNase- ExitusPlus; AppliChem, Darmstadt, Germany) semiautomatic high-speed biopsy needle (TEMNO Evolution; Fa. Walter, Baruth/Mark, Germany). For these biopsies, the same ultrasound scanner described earlier was used (it was equipped with a 7.5 MHz convex transducer). The biopsy needle and the ultrasound transducer were guided transvaginally using a bearing system (type Hannover) and the CL was placed immediately anterior to the vaginal fornix by transrectal manipulation. At least two tissue samples per cow were recovered. One tissue sample was immediately placed in a sterile DNase- and RNase-free cryo tube (Fa. Brand, Wertheim, Germany), frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 °C until expression analysis was done, whereas the second sample was formalin fixed and routinely embedded in paraffin. This method allowed repeated biopsy sampling from a single CL without impairing its subsequent function, as described (Tsai et al. 2001).

RNA extraction

Total RNA was extracted from CL biopsy samples using TRIzol reagent (Chomczynski & Sacchi 1987) as described by Watanabe et al. (2006). The yield of extracted total luteal RNA for each sample was determined by u.v. spectroscopy (optical density, 260 nm). The RNA concentration was determined with a Bio-Tech Photometer (WPA, Cambridge, UK) at 260 and 280 nm absorbance. Extracted total RNA was stored in RNA storage solution (Ambion, Austin, TX, USA) at -80 °C until used for cDNA production.

cDNA production

The RNA samples were treated with DNase using the RQ1 RNase–Free DNase kit (Promega Co.). Then, RNA (2 ml of 1 mg/ml) was incubated for 30 min at 37 8C with 1 ml RQ1 RNase–Free DNase 10x Reaction Buffer and 2ml of 1 mg/ml RNase–Free DNase. The reaction was terminated with the addition of 1 ml RQ1 DNase Stop Solution (20 mM EGTA), and the resulting mixture was incubated again for 10 min

at 65 °C. First-strand cDNA synthesis was conducted according to a commercial protocol SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Corp.). The synthesized cDNA was stored at -30 °C.

Real-time RT-PCR

The levels of mRNA for Caspase-3, StAR, PTGS2, and ß-actin were quantified by real-time PCR with a LightCycler (Roche Diagnostics Co.) using a commercial kit (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I: Roche Diagnostics Co.). The primers were designed using Primer-3, based on bovine sequences. The amplification program consisted of 15-min activation at 95 °C followed by 40 cycles of PCR steps (15-s denaturation at 94 °C, 30-s annealing at 58 °C, and a 20-s extension at 72 °C). For quantification of target genes, a series of standards were constructed by amplifying a fragment of DNA (~150–250 bp) that contained the target sequence for real-time PCR. The primers used for real-time PCR were Caspase-3 (NM001077840) forward, 5´-AAGCCATGGTGAA- GAAGGAA-3´ and reverse, 5´-CCTCAGCACCACTGTCTGTC- 3´; StAR (accession no. MN174189) forward, 5´-GTGG- ATTTTGCCAATCACCT-3´and reverse, 5´-TTATTGAAAACGT- GCCACCA-3´; PTGS2 (AF031698) forward, 5´-TCCTG- AAACCCACTCCCAACA-3´ and reverse, 5´-TGGGCAGTCAT- CAGGCACAG-3´; ß-actin (K00622) forward, 5´-CCAAGGC- CAACCGTGAGAAAAT-3´ and reverse, 5´-CCACATTCC- GTGAGGATCTTCA-3´.

The PCR products were subjected to electrophoresis, and the target band cut out and purified using a DNA purification kit (SUPRECTM-01; Takara Bio, Inc., Otsu, Japan). Three to five stepwise-diluted DNA standards were included in every PCR run. The quantification of mRNA expression was done using Light Cycler Software (version 3.5; Roche). Primer sets were tested in luteal tissue samples to confirm amplification of single bands. Before use of primers for analyzing samples, amplified products were cloned and sequenced to confirm their identity. Values were normalized using ß-actin as an internal standard.

Immunohistochemistry

Sections of the luteal biopsies (4 mm thick) were mounted on saline-treated glass slides (Histobond Superior; Paul Marienfeld Laboratory Glassware, Laud-Ko nigshofen, Germany) and dried at 37 °C for 24 h. After deparaffinization in xylene and rehydration in a series of graded ethanols, endogenous peroxidase activity was blocked by incubation in 80% ethanol (containing 2% hydrogen peroxide) for 30 min followed by three rinsing steps (3x5min) in PBS (pH 7.2). Pretreatment with EDTA buffer (pH 9.0, 96 °C, 10 min) or citrate buffer (pH 6.0, 96 °C, 15 min) was performed for cox-2 or caspase-3 respectively to recover antibody-binding sites. This was followed by incubation in 20% normal horse (StAR) or goat (caspase-3 and cox-2) serum (in PBS) for 20 min at room temperature to avoid nonspecific protein binding. Then, sections were incubated with primary antibodies (in PBS plus 1.5% BSA) against caspase-3 (1:50; ab4051, Abcam, Cambridge, UK), cox-2 (1:20; Clone SP21, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany), and StAR (1:50; N-16, Santa



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Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany) at 4 °C for 20 h in a moist chamber. Caspase-3 and cox-2 were detected with the DAKO EnvisionC System/rabbit, HRP (DAKO, Hamburg, Germany) according to the manufacturer’s protocol, whereas StAR was visualized with the SuperVision2 two-step polymer system (DCS, Hamburg, Germany) according to the manufacturer’s instructions. Diaminobenzidine served as chromogen. Then, sections were washed in running tap water for 10 min and counterstained with Delafield’s hematoxylin. Finally, they were dehydrated in a series of graded ethanol solutions, cleared in xylene, and mounted with Eukitt (Sigma–Aldrich).

Negative controls were produced by incubation without primary antibodies or their replacement by an isotype control (rabbit or goat IgG from serum; both were from Sigma–Aldrich) in lieu of primary antibodies. Either type of processing failed to produce a signal, thereby excluding antigen-independent staining. Positive controls were done with sections of bovine placenta or endometrium. All slides from each cow were stained and evaluated qualitatively, as the size and number of sections did not enable quantification.

Statistical analyses

A paired Student’s t-test was used to determine the length of the estrous cycle in control vs LPS-treated cycles. Furthermore, data for LBF, luteal area, and plasma concentrations of P4, PGFM, and PGF, were subjected to a Shapiro–Wilk test. None of these end points differed significantly from a normal distribution. Therefore, for each end point, Mixed Models ANOVA was used to determine the effects of group (LPS vs control), time, and the group by time interaction. An LSD test was used to locate differences among groups. All analyses were conducted with the Statistical Analysis System (SAS Institute, Cary, NC, USA) and P<0.05 was considered significant. Continuous data were presented as mean±S.E.M.

Declaration of interest

The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of the research reported.

Funding

This research did not receive any specific grant from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sector.

Acknowledgements

The authors thank Randy Wilde for statistical support.

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Received 15 April 2012 First decision 30 May 2012 Accepted 6 July 2012



ÜBERGREIFENDE DISKUSSION

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6. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Entzündungen auf das CL in zwei

verschiedenen Studien analysiert. In der ersten Studie wurden Milchkühe mit und

ohne klinischer Metritis vom ersten bis zum vierten postpartalen Zyklus untersucht,

um den Langzeiteffekt einer Entzündung in Form einer Metritis auf das CL zu

bestimmen. Die zweite Studie diente der Erforschung des Kurzzeiteffekts einer

Entzündung auf das CL. Hier wurde die luteale Reaktion auf eine einmalige intra-

venöse Applikation von Endotoxinen untersucht. Die Ergebnisse der Studien zeigen,

dass Entzündungen einen Einfluss auf die Morphologie und Physiologie von CLs

besitzen.

In beiden Studien führten Entzündungsprozesse zu einer Größenreduktion der CLs.

In der ersten Studie wiesen laktierende Kühe mit einer Metritis kleinere CLs als

gesunde Kühe im ersten Zyklus pp auf. Dieser Zusammenhang wurde bereits für

Kühe mit einem erhöhten Gehalt an pathogenen Uteruskeimen im Vergleich zu

Kühen mit einem geringen Keimgehalt zwischen den Tagen 21 und 26 pp beobachtet

(WILLIAMS et al. 2007). Im zweiten und vierten postpartalen Zyklus war dieser

Unterschied zwischen Tieren mit und ohne Metritis in der eigenen Studie nicht mehr

existent. In der LPS-Studie konnte bereits 24 Stunden nach LPS Applikation sono-

graphisch eine Verkleinerung der CLs nachgewiesen werden. Im Vergleich zur

Kontrollgruppe bestand die reduzierte Größe bis zum dritten Tag nach der Endo-

toxingabe. Anschließend lag bis zum Diöstrus des darauf folgenden Zyklus kein

Unterschied mehr in der lutealen Größe zwischen den beiden Gruppen vor. Als

Ursache für die reduzierte luteale Größe als Folge einer Metritis bzw. einer LPS-

Exposition sind verschiedene Mechanismen denkbar. Für die Größenreduktion kön-

nten die luteolytischen Eigenschaften des PGF2α verantwortlich sein. Bei Vorliegen

einer uterinen Infektion wurden erhöhte Blutplasmaspiegel an PGFM beobachtet

(THOMPSON et al. 1987; DEL VECCHIO et al. 1994; MATEUS et al. 2003). Auch in

der eigenen Endotoxinstudie führte die Applikation von LPS zu einer vierstündigen,


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stark angestiegenen Konzentration an PGFM im Blutplasma. Da extraluteales PGF2α

als Trigger für die Luteolyse gilt (MIYAMOTO et al. 2005), könnte dieser Stimulus bei

einem Teil der lutealen Zellen apoptotische Prozesse induziert haben, was die

verminderte Größe verursacht haben könnte. Neben PGFM sind jedoch noch weitere

Entzündungsmediatoren wie das Interferon γ und der Tumornekrosefaktor α bekannt,

die sich zytotoxisch auf Lutealzellen auswirken (FAIRCHILD u. PATE 1991;

PETROFF et al. 2001). Zusätzlich sind Endotoxine in der Lage, die Ansprechbarkeit

der Hypophyse auf das GnRH zu beeinflussen (WILLIAMS et al. 2001), was die

Entwicklung eines CL ebenfalls beeinträchtigen könnte.

Obwohl in beiden Studien ein Effekt auf die luteale Größe nachweisbar war, konnte

nur in der LPS-Studie ein Einfluss auf die P4 Konzentration beobachtet werden. In

der Metritis-Studie wiesen Tiere mit einer Metritis im ersten postpartalen Zyklus im

Vergleich zu gesunden Tieren trotz der reduzierten lutealen Größe keine vermin-

derten P4 Werte auf. Im Gegensatz dazu berichteten WILLIAMS et al. (2007) über

niedrigere P4 Konzentrationen sowie CL Größen bei Kühen mit einem erhöhten

Gehalt an pathogenen Keimen im Uterus im Vergleich zu Kühen mit einem niedrigen

Keimgehalt. Eine mögliche Ursache für die verschiedenen Ergebnisse der beiden

Studien könnte in den unterschiedlichen Gruppeneinteilungen begründet sein.

Während in der eigenen Studie die Tiere anhand der Befunde klinischer Untersuch-

ungen einteilt wurden (SHELDON et al. 2009), basierte die Einteilung von WILLIAMS

et al. (2007) auf bakteriellen Untersuchungen von uterinen Tupferproben. Des

Weiteren bestimmten WILLIAMS et al. (2007) die periphere P4 Konzentration

zwischen den Tagen 21 und 26 pp. In der eigenen Studie wurden Kühe der

gesunden Gruppe 27 ± 6 Tage und Kühe der Metritisgruppe 28 ± 5 Tage pp beprobt.

Folglich wurde eine Vielzahl der Tiere der eigenen Studie später als Tag 26 pp

untersucht. Im Puerperium stellen die uterine Involution und die Elimination von

Bakterien aus dem Uteruslumen kontinuierliche Prozesse dar (OKANO u.

TOMIZUKA 1987; HUSSAIN et al. 1990). Möglicherweise waren Metritis-Kühe, die

zu einem späteren Zeitpunkt als Tag 26 pp beprobt wurden, einer geringeren Menge

an Noxen ausgesetzt und wiesen deshalb höhere P4 Werte auf. Bezüglich des


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entzündlichen Einflusses auf die P4 Konzentration bestätigen Untersuchungs-

ergebnisse von LAVON et al. (2010) die eigenen Ergebnisse der Metritis-Studie. Eine

klinische Mastitis bei Milchkühen zeigte keinen Einfluss auf die P4 Konzentration im

Plasma, die 20 ± 7 Tage nach der Mastitis-Diagnose bestimmt wurde (LAVON et al.

2010). In diesem Zusammenhang wurde ebenfalls der Einfluss viraler Erkrankungen

auf die Zyklusaktivität des Rindes analysiert. So zeigte sich, dass eine kontrollierte

Infektion mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus trotz ausgeprägter Leukozytopenie

keinen Effekt auf den Plasma P4 Spiegel hatte (FRAY et al. 1999). In der LPS-Studie

wurde ein negativer Effekt von LPS auf die P4 Konzentration sichtbar. Nach

systemischer Verabreichung der Endotoxine war die Plasma P4 Konzentration

bereits nach neun Stunden im Vergleich zu Kontrolltieren erniedrigt. Erst nach drei

Tagen erreichte die P4 Konzentration wieder das Niveau der Kontrolltiere. Dieses

Phänomen lässt sich unter anderem durch die luteolytisch bedingte Reduktion der

lutealen Größe erklären. Durch die Apoptose einiger Luteinzellen wurde die se-

kretorische Kapazität analog zur lutealen Größe temporär eingeschränkt. Der Ein-

fluss der Endotoxine auf die luteale Aktivität blieb jedoch auf den aktuellen Zyklus be-

schränkt. Im anschließenden Zyklus unterschieden sich die P4 Konzentrationen der

beiden Gruppen nicht mehr. Es scheint demnach nicht jede Entzündung mit

niedrigen P4 Werten einherzugehen. Welche Entzündungsprozesse zu einer

herabgesetzten peripheren P4 Konzentration führen, ist weitestgehend unbekannt.

Es bleibt zu vermuten, dass insbesondere schwerwiegende systemische

Entzündungsreaktionen zu einer verminderten lutealen Syntheseleistung führen

können.

In der eigenen LPS-Studie lag bis 48 Stunden nach der Endotoxin Applikation eine

reduzierte luteale Perfusion im Vergleich zur Kontrollgruppe vor. Analog dazu war die

periphere P4 Konzentration neun bis 48 Stunden nach der Endotoxin Exposition

ebenfalls im Vergleich zu Kontrollgruppe vermindert. Der Zusammenhang zwischen

lutealer Perfusion und Sekretion wurde bereits für den Zyklus des Rindes

beschrieben. Insbesondere während der Luteolyse in der Regressionsphase bestand

eine hohe Korrelation zwischen beiden Parametern (HERZOG et al. 2010). Zwölf


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Stunden nach der LPS Gabe war die Genexpression des StAR Enzyms bei LPS

behandelten Kühen niedriger als bei den Kontrolltieren. Dieses Enzym wurde als

limitierender Faktor der P4 Synthese charakterisiert (DIAZ u. WILTBANK 2005).

Diese Resultate weisen darauf hin, dass die verminderte periphere P4 Konzentration

eher auf einer reduzierten lutealen Syntheseleistung als auf einer erhöhten Meta-

bolisierung des Steroidhormons beruht.

Sowohl in der Metritis- als auch in der LPS-Studie konnten keine Langzeiteffekte auf

die CL Größe sowie periphere P4 Konzentration beobachtet werden. Dieses Resultat

wird durch die Genexpressionsanalysen der beiden eigenen Studien bestätigt.

Weder im zweiten oder vierten postpartalen Zyklus bei Metritis-Tieren (Metritis-

Studie) noch im Folgezyklus nach der LPS-Exposition (LPS-Studie) konnten

Änderungen der mRNA Konzentrationen von StAR, Cytochrom P450 und 3ß-HSD

(Metritis-Studie) bzw. StAR (LPS-Studie) im Vergleich zu den Kontrolltieren

beobachtet werden.

Zusätzlich zur Analyse der Genexpression wurden die Proteine Caspase-3, StAR

und COX-2 in der LPS-Studie direkt mittels Immunhistochemie nachgewiesen. Da

das StAR Protein im Zytoplasma von Lutealzellen und das COX-2 Protein in Stroma-

zellen anfärbbar waren, sind die gemessenen Gehalte an mRNA nachgewiesener-

maßen auch mit einer tatsächlichen Synthese derselbigen Proteine einhergegangen.

Auch konnte durch den beobachteten Shift des Caspase-3 Proteins vom Zytoplasma

in den Zellkern der Lutealzellen ein Effekt der LPS- gegenüber der Kochsalzinfusion

festgestellt werden. Eine Quantifizierung der Immunreaktionen und damit eine sta-

tistische Auswertung war jedoch aufgrund der zu geringen Größe der gewonnenen

CL Biopsien nicht durchführbar. Für derartige Analysen wären andere Verfahren der

CL Biopsieentnahme nötig.

In einer Studie von BARKER et al. (1998) verursachten klinische Mastitiden, die sich

innerhalb von 60 Tagen nach einer künstlichen Besamung manifestierten, eine Ver-

schlechterung des Trächtigkeitsindexes. Die Autoren vermuteten, dass die entzün-


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dungsbedingte Induktion einer vollständigen Luteolyse zum Abbruch der Trächtigkeit

führte. Die Ergebnisse des eigenen Endotoxinversuchs geben Hinweise auf eine

andere Pathogenese als mögliche Ursache für die herabgesetzte Fertilität bei

Vorliegen einer klinischen Mastitis. Die LPS Applikation führte in der eigenen Studie

zu einer Reduzierung der peripheren P4 Konzentration, die über mehrere Tage

andauerte, ohne eine vollständige Luteolyse auszulösen. Progesteron gilt als

wichtigstes Hormon für die Aufrechterhaltung einer Gravidität. Es ist bekannt, dass

hohe P4 Konzentrationen in den ersten sieben Tagen nach der Besamung für eine

erfolgreiche Etablierung der Gravidität entscheidend sind (LARSON et al. 1997;

MANN u. LAMMING 2001). Eine temporäre Absenkung der P4 Konzentration könnte

zu einer Störung der fetalen Entwicklung und anschließend zu einem Trächtig-

keitsabbruch führen. In der Arbeit von GIRI et al. (1990) konnte durch eine

intravenöse Verabreichung von Endotoxin bei graviden Kühen eine mehrtägige

Senkung der P4 Konzentration sowie das Auftreten von Aborten nachgewiesen

werden. Allerdings wurden in dieser Studie keine sonographischen Untersuchungen

durchgeführt. Es blieb damit unklar, ob die LPS Infusion zu einer vollständigen Luteo-

lyse mit konsekutivem Abort führte oder ob lediglich – wie in der eigenen LPS Studie

beobachtet – eine temporäre Absenkung der P4 Konzentration zu den Aborten führte.

Um diese Vorgänge besser zu verstehen, sind deshalb noch weitere Untersu-

chungen nötig, die explizit den Einfluss von Entzündungen auf das CL und den

Embryo von graviden Tieren analysieren.

Entzündungen sind in der Lage, die Zykluslänge zu beeinflussen. KANEKO u.

KAWAKAMI (2009) sowie GILBERT et al. (1990) induzierten durch eine experi-

mentelle Infektion des Uterus mit pathogenen Keimen eine Luteolyse. In der Studie

von KANEKO u. KAWAKAMI (2009) fiel bei Kühen mit einer Zyklusverkürzung ein

starker PGFM Anstieg nach der Behandlung auf. Dabei war für eine Luteolyse nicht

die absolute Menge an PGFM ausschlaggebend, sondern der Faktor, um wie viel

sich die PGFM Konzentration nach Exposition mit der Noxe erhöhte (KANEKO u.

KAWAKAMI 2009). Im Gegensatz hierzu führte die Endotoxin Applikation in der eige-

nen LPS-Studie zu keiner Zyklusverkürzung, obwohl die PGFM Konzentration eine


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halbe Stunde nach der Behandlung auf das Zehnfache angestiegen war. Da

KANEKO u. KAWAKAMI (2009) bereits bei sechsfachen Konzentrationserhöhungen

eine Luteolyse beobachteten, wird eine Zyklusverkürzung wahrscheinlich nicht allein

durch PGFM Konzentrationsveränderungen im Blutplasma verursacht. Auch Metritis-

Kühe der eigenen Studie sowie Kühe, die experimentell mit dem Bovinen

Virusdiarrhoe Virus infiziert wurden (FRAY et al. 1999), zeigten keine verkürzten

Lutealphasen. Neben einer Verkürzung des Zyklus können Entzündungen auch

verlängerte Lutealphasen zur Folge haben. So fielen in der eigenen Studie mehr

verlängerte Lutealphasen bei Kühen mit Metritis im Vergleich zu gesunden Kühen im

ersten Zyklus pp auf. Dieses Phänomen wurde ebenfalls von anderen Arbeits-

gruppen beschrieben (OPSOMER et al. 2000; TAYLOR et al. 2003). In der eigenen

LPS-Studie traten bei zwei mit Endotoxin behandelten Tieren verlängerte

Lutealphasen auf, die über die physiologische Zykluslänge von 17 bis 24 Tagen

hinausgingen (ULBERG et al. 1951; HASLER et al. 1980). Aufgrund der geringen

Tierzahl war dieser Effekt auf die Zykluslänge im Vergleich zu den Kontrolltieren

nicht signifikant. Die Ergebnisse der verschiedenen Arbeiten demonstrieren, dass

Entzündungen die Zykluslänge von Rindern verändern können. Leichtere, vorwie-

gend lokale Entzündungen sind scheinbar nicht in der Lage, eine vollständige

Luteolyse zu induzieren. Weiterhin zeigen mehrere Studien, dass puerperale Störun-

gen der Uterusinvolution vermehrt mit verlängerten Lutealphasen assoziiert sind. Es

ist allerdings weitestgehend unbekannt, durch welche Faktoren eine Entzündung zu

einer Luteolyse oder zu einer verlängerten Lutealphase führt.

In der Literatur existiert keine einheitliche Definition für persistierende CLs. Für einige

Autoren (LAMMING u. DARWASH 1998; TAYLOR et al. 2003; PETERSSON et al.

2007; POLLOTT u. COFFEY 2008; GARMO 2009) war die regelmäßige Bestimmung

des P4 Wertes in Milch oder Blut entscheidend. Lag hierbei der Milchprogesteron-

gehalt über einen Zeitraum von 19 bzw. 20 Tagen (Probenentnahme zwei- bis

dreimal pro Woche) über 3 ng/ml, galt dies als Kriterium für das Vorliegen eines

persistierenden CL. Da während eines physiologischen 21-Tage Zyklus über den

Zeitraum von sieben Tagen kein aktives CL (Milchprogesterongehalt < 3 ng/ml)


87

vorhanden ist, würden nach dieser Definition Tiere mit einer Zykluslänge von 26 bzw.

27 Tagen ein persistierendes CL aufweisen (LAMMING u. DARWASH 1998). In

weiteren Studien wurde ein persistierendes CL als luteale Struktur definiert, die bei

einer P4 Konzentration im Plasma oberhalb von 1 ng/ml über einen Zeitraum von 30

Tagen sonographisch nachweisbar war (HAUGHIAN et al. 2002; GUMEN et al.

2005). In der eigenen Metritis-Studie wurden die Ovarien dreimal in der Woche

sonographisch untersucht. Größe, Lokalisation des CL sowie Anzeichen einer

Luteolyse wurden skizziert. Damit wurde sichergestellt, dass alle Ovulationen erkannt

wurden. Bestand eine luteale Struktur länger als 29 Tage, wurde durch die P4

Bestimmung im Plasma ein persistierendes CL diagnostiziert, sofern die P4 Kon-

zentration ≥ 1 ng/ml betrug. Hiermit basiert die in der eigenen Studie verwendete

Definition für ein persistierendes CL auf den Studien von HAUGHIAN et al. (2002)

und GUMEN et al. (2005).

Im Zusammenhang mit verlängerten Lutealphasen wird dem PGE eine zentrale Rolle

zugesprochen (HERATH et al. 2009). Die PGE Konzentrationen im Plasma waren

bei Tieren mit verlängerten Zyklen in beiden durchgeführten Studien mit

unterschiedlichen Ergebnissen verbunden. In der Metritis-Studie trat bei neun Tieren

ein persistierendes CL auf. Allerdings unterschieden sich die PGE Konzentrationen

dieser Tiere nicht von den normal zyklischen Tieren. In der Endotoxin-Studie wiesen

die beiden Tiere mit den längsten Ovulationsintervallen (28 und 38 Tage) am Ende

des Zyklus numerisch die höchsten PGE Konzentrationen im Vergleich zu allen

anderen Tieren auf. Die Ergebnisse der beiden Studien lassen vermuten, dass

verlängerte Lutealphasen nicht allein durch erhöhte Plasma PGE Konzentrationen

verursacht werden. Allerdings konnten verschiedene Arbeitsgruppen durch die

Substitution von PGE den Zyklus bei Kühen über die physiologische Zyklusdauer

verlängern (GIMENEZ u. HENRICKS 1983; REYNOLDS et al. 1983). Derzeit sind die

exakten Mechanismen dieser Zyklusstörung noch nicht hinreichend geklärt.


88

Schlussfolgerungen

Die Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Entzündungen die Morphologie und

Funktion eines CL beeinflussen können. Effekte von Entzündungsreaktionen auf

luteales Gewebe konnten in Form von Größe, Durchblutung und Genexpression des

CL sowie in der peripheren P4 Konzentration nachgewiesen werden. Zusätzlich

wurde bei einer klinischen Metritis ein tendenziell vermehrtes Vorkommen an

persistierenden CLs im ersten Zyklus nach der Abkalbung beobachtet. In beiden

durchgeführten Studien konnten aber lediglich temporäre Beeinträchtigungen der

lutealen Aktivität nachgewiesen werden. Bereits im zweiten Zyklus pp unterschieden

sich Metritis- und Kontrolltiere in den untersuchten Parametern nicht mehr

voneinander. Auch in der LPS-Studie konnte kein Endotoxin Effekt im Folgezyklus

beobachtet werden. Folglich geben die Ergebnisse beider Studien keinen Hinweis

darauf, dass Entzündungen aufgrund eines negativen Langzeiteffekts auf die luteale

Aktivität für Fertilitätsstörungen bei Milchkühen verantwortlich sind.

ZUSAMMENFASSUNG

89

7. ZUSAMMENFASSUNG


Einfluss von Entzündungen auf das bovine Corpus lut eum

Ziel der Dissertation war es, die Auswirkungen von Entzündungen auf das Corpus

luteum (CL) zu untersuchen. Dafür wurden zwei verschiedene Studien durchgeführt.

Über den Zeitraum vom ersten bis zum vierten postpartalen Zyklus wurde in einer

Feldstudie die Auswirkung einer Metritis auf das CL bei laktierenden Kühen analy-

siert (Metritis-Studie). Damit sollte ein möglicher Langzeiteffekt einer Entzündung auf

die luteale Aktivität bestimmt werden. Weiterhin wurden Kühen in einer experimen-

tellen Studie Lipopolysaccharide (LPS) als intravenöser Bolus verabreicht, um den

unmittelbaren Einfluss einer standardisierten Entzündungsreaktion auf die luteale

Aktivität zu untersuchen (LPS-Studie).

In der Metritis-Studie wurden 47 laktierende Kühe der Rasse Deutsche Holstein vom

Partus bis zum vierten postpartalen Zyklus untersucht. Tiere, die postpartal einen

abnorm vergrößerten Uterus mit Geruchsabweichungen des Lochialsekrets aufwie-

sen, wurden der Metritis-Gruppe (Gruppe M; n = 18) zugeordnet. Alle anderen Tiere

bildeten die gesunde Gruppe (Gruppe G; n = 29). Im ersten (Gruppe G: n = 11, Grup-

pe M: n = 12), zweiten (Gruppe G: n = 23, Gruppe M: n = 18) und vierten (Gruppe G:

n = 11, Gruppe M: n = 7) postpartalen Zyklus wurde einmalig im Diöstrus (Tag 9-13;

Tag 1 = Ovulation) die CL Größe sonographisch erfasst und eine Blutprobe zur Pro-

gesteron (P4) Bestimmung im Serum gewonnen. Von neun bzw. sieben Tieren der

Gruppen G bzw. M wurden im zweiten und vierten postpartalen Diöstrus transvaginal

CL Biopsien zur Genexpressionsanalyse von Regulationsproteinen der P4 Synthese

(Steroidogenic Acute Regulatory Protein, Cytochrom P450, 3ß-Hydroxysteroid-

Dehydrogenase) entnommen. Trat ein persistierendes CL (Zykluslänge > 28 Tage)

auf, wurde einmalig zwischen den Tagen 29 und 33 die luteale Größe erfasst, P4 im

Serum bestimmt und eine CL Biopsie durchgeführt. Im Anschluss daran wurde ein

ZUSAMMENFASSUNG

90

PGF2α Analogon injiziert, um die Luteolyse einzuleiten. Im darauf folgenden Zyklus

wurden während des Diöstrus (Tag 9 bis 13) nochmals dieselben Parameter erfasst.

Die Tiere der Gruppe M wiesen im ersten postpartalen Diöstrus kleinere CLs als die

Tiere der Gruppe G auf (p = 0,04). Die P4 Konzentrationen unterschieden sich nicht

(p = 0,50) zwischen den Tieren beider Gruppen. Im zweiten und vierten Zyklus pp

waren zwischen den Gruppen G und M keine Unterschiede (p > 0,11) in der lutealen

Größe, P4 Konzentration oder Genexpression festzustellen. Im Vergleich zu gesun-

den Tieren (3/29, 10%) entwickelten Tiere mit einer Metritis (6/18, 33%) tendenziell

häufiger (p = 0,07) persistierende CLs, die aber nur im ersten postpartalen Zyklus

auftraten. Persistierende CLs unterschieden sich in keinem der untersuchten Para-

meter von normal zyklischen CLs des Folgezyklus (p > 0,20).

In der LPS-Studie wurden sieben nicht-laktierenden Kühen der Rasse Deutsche

Holstein im Alter von 5,1 ± 0,8 Jahren (MW ± Standardfehler) am Tag 10 des Zyklus

(Ovulation = Tag 1) intravenös 10 ml einer Kochsalzlösung verabreicht (Kontroll-

gruppe). Anschießend wurden die Kühe bis Tag 10 des folgenden Zyklus untersucht.

Es folgte eine Ruhephase von mindestens 21 Tagen, an denen sie nicht behandelt

wurden. An Tag 10 eines der folgenden Zyklen wurde der Versuch wiederholt.

Allerdings wurde dabei statt der Kochsalzlösung eine LPS-Lösung (0,5 µg/kg)

appliziert (LPS-Gruppe). Die Größen der CLs reduzierten sich innerhalb von 24

Stunden nach der LPS Behandlung von 5,2 auf 3,8 cm² (p ≤ 0,05) und waren bei der

LPS-Gruppe für die folgenden drei Tage (Tage 1-3 nach der Behandlung) kleiner als

bei der Kontrollgruppe. Anschließend unterschieden sich die Größen der CLs beider

Gruppen nicht mehr. Der luteale Blutfluss verminderte sich drei Stunden nach der

LPS Applikation um ein Drittel (p ≤ 0,05) und blieb für 72 Stunden reduziert. Die P4

Konzentration im Plasma erhöhte sich (p ≤ 0,05) innerhalb von drei Stunden nach

LPS Gabe, nahm anschließend ab und war in der LPS-Gruppe im Vergleich zur

Kontrollgruppe für den Zeitraum von 9 bis 72 Stunden nach der Behandlung

erniedrigt. Die Kühe wiesen 30 Minuten nach der LPS Behandlung zehnmal höhere

Plasma Konzentrationen an Prostaglandin (PG) F Metaboliten auf als nach der Infu-

sion der Kochsalzlösung (9,2 versus 0,8 ng/ml, p ≤ 0,05). Die Plasma PGE Konzen-

ZUSAMMENFASSUNG

91

tration der LPS-Gruppe war bezogen auf die Kontrollgruppe eine Stunde nach der

Behandlung ebenfalls auf annähernd das Doppelte angestiegen (3,61 versus

1,98 ng/ml, p ≤ 0,05). In den lutealen Biopsien war der Gehalt an Caspase-3

kodierender mRNA zwölf Stunden nach der Behandlung mit LPS im Gegensatz zur

Behandlung mit der Kochsalzlösung erhöht (p ≤ 0,05), während der Gehalt an

Steroidogenic Acute Regulatory Protein (StAR) kodierender mRNA vermindert war

(p ≤ 0,05). Im Gegensatz zur Kontrollgruppe, bei der das Caspase-3 Protein

immunhistochemisch im Zytoplasma der Lutealzellen nachzuweisen war, führte die

Exposition mit LPS zu einer Anhäufung des Caspase-3 Proteins im Zellkern der

Lutealzellen. Im Zyklus, der sich der Behandlung mit der Kochsalz- bzw. LPS-Lösung

anschloss, konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Behandlungsgruppen

bezüglich der CL Größe, Plasma P4 Konzentration sowie der Genexpression

festgestellt werden.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Dissertation, dass akute Entzün-

dungen in der Lage sind, die luteale Aktivität zu beeinträchtigen. Im ersten postpar-

talen Zyklus wiesen Kühe mit einer Metritis kleinere CLs als gesunde Tiere auf und

nach einer LPS Applikation konnte eine Reduktion der lutealen Größe und Durchblu-

tung sowie eine Beeinflussung der Genexpression nachgewiesen werden. Allerdings

war sowohl in der Metritis-Studie ab dem zweiten postpartalen Zyklus als auch in der

LPS-Studie im Zyklus nach der Behandlung in sämtlichen untersuchten Parametern

kein Unterschied zwischen den Metritis/LPS-Kühen und Kontrollkühen mehr

festzustellen. Damit scheinen Entzündungen die luteale Aktivität nur temporär

einzuschränken, ohne einen Langzeiteffekt auf das CL auszuüben.

SUMMARY

92

8. SUMMARY


Inflammatory effects on the bovine corpus luteum

The objective of this work was to characterize the influence of inflammations on the

corpus luteum (CL). Therefore, two different studies were conducted. In the first in-

vestigation the impact of metritis on the CL was investigated over the period from the

first to the fourth postpartum cycle (metritis-study). With this study a potential long

term effect of an inflammation on luteal activity was analysed. In another study cows

were treated with lipopolysaccharide (LPS) by an intravenous bolus injection to exa-

mine potential immediate effects of a standardized inflammation on luteal activity

(LPS-study).

In the metritis-study forty-seven lactating German Holstein cows were examined

during the first four postpartum estrous cycles. Cows with abnormal uterine enlarge-

ment and malodorous lochia were classified as having metritis (group M, n = 18) and

all others were considered healthy (group H, n = 29). Luteal size was measured once

between days 9 and 13 of the first (group H, n = 11; group M, n = 12), second

(group H, n = 23; group M, n = 18) and fourth (group H, n = 11; group M, n = 7)

postpartum luteal phases. Serum progesterone (P4) concentration was measured at

the same time. Sixteen cows (group H, n = 9; group M, n = 7) underwent transvaginal

luteal biopsy for gene expression analysis of steroidogenic regulatory proteins

(steroidogenic acute regulatory protein, cytochrome P450, 3ß-hydroxysteroid-dehy-

drogenase) during the second and fourth cycles. Cows with persistence of the CL

underwent determination of luteal size, luteal biopsy and serum P4 measurement

once between days 29 and 33, followed by prostaglandin treatment to induce luteo-

lysis. The same procedures were repeated once between days 9 and 13 of the indu-

ced cycle. Cows in group M had smaller first-cycle CLs than cows in group H (P =

0.04), but P4 concentrations did not differ between groups (P = 0.50). Luteal size, P4

SUMMARY

93

concentration and gene expression did not differ (P > 0.11) between the two groups

during the second and fourth cycles. Compared with healthy cows (3/29, 10%), there

was a trend (P = 0.07) toward a higher prevalence of persistent CLs in cows with

metritis (6/18, 33%). Persistent CLs were limited to the first cycle. Persistent CLs and

the induced cyclic CLs did not differ with regard to the variables investigated

(P > 0.20).

In the LPS-study seven non-lactating German Holstein cows, 5.1 ± 0.8 years old

(mean ± SEM), were given 10 ml saline intravenously on day 10 (ovulation = day 1)

of a control estrous cycle. Cows were subsequently examined until day 10 of the

following cycle. Afterwards a resting period of at least 21 days without any treatments

was arranged. On day 10 of a subsequent cycle the same experimental protocol was

conducted but 0.5 µg/kg LPS instead of saline was given. Within 24 h after LPS treat-

ment luteal size decreased from 5.2 to 3.8 cm² (P ≤ 0.05). For a period of three days

(day 1-3 after treatment) LPS-treated cows had smaller CLs than the control cows

(P ≤ 0.05) but afterwards there was no difference in luteal sizes between both

treatments. At 3 h after LPS luteal blood flow was reduced by one third (P ≤ 0.05)

and remained lower for 72 h. Plasma P4 concentrations increased (P ≤ 0.05) within

3 h after LPS but subsequently declined and were lower in the LPS cycle than in the

control cycle between 9 to 72 h after treatment. Within 30 min after LPS treatment

prostaglandin F metabolites concentrations in LPS-treated cows were approximately

tenfold higher than in control cows (9.2 versus 0.8 ng/ml, P ≤ 0.05). Plasma prosta-

glandin E concentrations were nearly twice as high in cows given LPS versus saline

at 1 h after treatment (3.61 versus 1.98 ng/ml, P ≤ 0.05). Amounts of mRNA encoding

Caspase-3 in luteal biopsies were increased (P ≤ 0.05) within 12 h, whereas those

encoding the steroidogenic acute regulatory protein decreased (P ≤ 0.05) in LPS-

treated compared to control cows. Using immunolocalization the Caspase-3 protein

was predominantly found in the cytoplasm of luteal cells in control cows, whereas the

exposure to LPS resulted in a strong nuclear reaction of Caspase-3. In the estrous

cycle following treatment luteal sizes, plasma P4 concentrations and gene

expressions did not differ between LPS-treated and control cows.

SUMMARY

94

In conclusion, the results of this work show that an acute inflammation has the ability

to impact luteal function. In the first postpartum cycle cows with metritis had smaller

CLs in comparison to healthy cows. Furthermore, the LPS treatment resulted in a

transient regression in luteal size and blood flow and in alterations of gene

expression of luteal tissue. However, after the first postpartum estrous cycle in the

metritis-study and after the treatment-cycle in the LPS-study no differences occurred

in analyzed parameters between metritis/LPS cows and control cows. Therefore,

inflammations are able to impair luteal activity transiently, but do not seem to have a

long term effect on luteal function.

LITERATURVERZEICHNIS

95

9. LITERATURVERZEICHNIS

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TABELLENVERZEICHNIS

108

10. TABELLENVERZEICHNIS

Table 1: Sequences and accession numbers of the PCR primers for

assayed StAR, cytochrome P450, 3ß-HSD, ß-actin and

GAPDH………………………………………………………..………

64

Table 2: Luteal size (mean ± SD) and serum P4 concentration

(mean ± SD) in healthy cows and cows with metritis with a

cyclic corpus luteum in the first, second and fourth cycles………

65

Table 3: mRNA expression (∆Cq; mean ± SD) in healthy cows and cows

with metritis for StAR, cytochrome P450 and 3ß-HSD of luteal

tissue during the second and fourth cycles postpartum………….

66

Table 4: Luteal size (mean ± SD) and serum P4 concentration (mean ±

SD) as well as mRNA expression (∆Cq; mean ± SD) for StAR,

cytochrome P450 and 3ß-HSD of persistent CLs and cyclic CLs

which formed after induced luteolysis of the former………………

67

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

109

11. ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Figure 1: Zeitlicher Ablauf und Übersicht der durchgeführten

Untersuchungen………………………………………………………

31

Figure 2: Time schedule of examinations…………………………………….. 68

Figure 3: Bearing system for biopsy needle and ultrasound transducer

used during luteal biopsy sampling…………………………………

69

Figure 4: Kaplan Meier curves for days open [d] of healthy cows (■; group

H; n = 22) and cows with metritis (▲; group M; n = 18)………….

70

110

Teile dieser Arbeit wurden wie folgt veröffentlicht :

Vorträge:

44. Jahrestagung „Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“ gleichzeitig

36. Veterinär-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung

(vom 16. bis 18. Februar 2011 in Hannover)

3. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe Deutsche buiatrische Gesellschaft

(vom 11. bis 12. November 2011 in Berlin)

K. Strüve, K. Herzog, M. Piechotta, A. Miyamoto, H. Bollwein

„Effekte systemisch verabreichter Endotoxine auf den Progesteronspiegel, die Größe

des Corpus luteum und die Zykluslänge beim Rind“

Artikel:

K. Herzog, K. Strüve, J. P. Kastelic, M. Piechotta, S. E. Ulbrich, C. Pfarrer,

K. Shirasuna, T. Shimizu, A. Miyamoto, H. Bollwein

“Escherichia coli lipopolysaccharide administration transiently suppresses luteal

function and structure in dioestrous cows”

Reproduction (2012) 144 467-476

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Danksagung

Mein erster Dank gilt Prof. Dr. Heinrich Bollwein für die Überlassung des

interessanten Themas und die hervorragende Unterstützung bei der Anfertigung

dieser Dissertation. Insbesondere möchte ich mich für die immer zuverlässige

Betreuung und schnellen Hilfestellungen bei Problemen bedanken.

Ein besonderer Dank geht an den unermüdlichen Einsatz und die ausgezeichnete

Betreuung durch Dr. Kathrin Herzog . Vielen Dank für die praktische Hilfe bei der

Durchführung der Studien, die Hilfestellungen beim Verfassen der Arbeit und die

freundschaftliche Zusammenarbeit. „Super, Kathrin!“

Ich bedanke mich an dieser Stelle ganz herzlich für die Unterstützung meiner

Kollegen der Klinik für Rinder, die mir jederzeit in Rat und Tat zur Seite standen.

Vielen Dank für die hilfreichen Tipps bei der Auswertung, Statistik und Formatierung

sowie für die harmonische Zusammenarbeit in der Klinik.

Ein großes Dankeschön geht an meine Mitdoktoranden . Vielen Dank für die

gemeinsame Zeit im Doktorandenzimmer, in der Mensa und auf dem Center Court

sowie für die gemeinsamen Freizeitaktivitäten. Ich danke Anne und Merle für die

hervorragende Zusammenarbeit in Ruthe und natürlich für die Süßigkeiten, die mich

so manches Mal über ein Hungerloch retteten.

Ich danke Herrn Dr. Christian Sürie, sowie Herrn Hartmut Mohwinkel vom Lehr- und

Forschungsgut Ruthe für die Bereitstellung der Studientiere. Ein großes

Dankeschön gilt Jens-Oliver Minx, Anne Stallbaum, Carsten Lemke und Simon

Albrecht für die gute Zusammenarbeit bei der Durchführung der Studie.

Dem Endokrinologischen Labor und Dr. Marion Piechotta gilt mein Dank für die

zuverlässige Bestimmung von Progesteron sowie der Entzündungsmediatoren PGF2α

und PGE.

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Ich bedanke mich bei Prof. Akio Miyamoto und seinen Mitarbeitern (Obihiro

University, Japan) für die molekularbiologischen Untersuchungen der lutealen

Biopsien und für die Hilfe bei der Interpretation der Ergebnisse.

Ein Dankeschön gebührt Prof. Dr. Christiane Pfarrer und den Mitarbeitern des

Anatomischen Instituts für die histologische Auswertung der endometrialen und

lutealen Biopsien.

Ein ganz besonderer Dank geht an Evi , die mir mit ihrer positiven Einstellung über

jeden Tiefpunkt geholfen hat. Vielen lieben Dank für das Verständnis für meine Arbeit

und vor allem für die hervorragende Planung der gemeinsamen Zeit außerhalb der

Klinik!

Abschließend möchte ich mich ganz herzlich bei meiner Familie bedanken, die mich

zu jeder Phase des Studiums und der Promotion unterstützt hat und dadurch diese

Arbeit erst möglich machte. Vielen Dank für alles!

Einfluss von Entzündungen auf das bovine Corpus luteum · Tierärztliche Hochschule Hannover...

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