Aus der Medizinischen Klinik I mit Poliklinik

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Markus F. Neurath

Einfluss von Somatostatinanaloga auf die

Proliferation von Tumorzellen des

Gastrointestinaltraktes unter besonderer

Berücksichtigung von neuroendokrinen

Tumoren

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Katrin Trummer

aus

Nürnberg

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Priv.-Doz. Dr. I. A. Harsch Korreferent: Prof. Dr. M. F. Neurath Tag der mündlichen Prüfung: 07. Juli 2010

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung 1

1.1 Hintergrund und Ziele 1

1.2 Methoden 1

1.3 Ergebnisse 1

1.4 Schlussfolgerungen 2

2 Abstract 3

2.1 Background 3

2.2 Methods 3

2.3 Results 3

2.4 Conclusions 4

3 Hintergrund 5

3.1 Neuroendokrine Tumoren 5

3.1.1 Inzidenz und Einteilung 5

3.1.2 Symptome 6

3.1.3 Therapieoptionen bei neuroendokrinen Tumoren 7

3.2 Somatostatin 10

3.2.1 Entdeckung des natürlichen Somatostatins 10

3.2.2 Funktion von Somatostatin 11

3.2.3 Somatostatin- Rezeptoren 11

3.2.4 Probleme bei der klinischen Anwendung 13

3.3 Somatostatinanaloga 14

3.3.1 Octreotid 14

3.3.2 Pasireotid 17

3.3.3 Vorteile von Pasireotid verglichen mit Octreotid 20

3.4 Zielsetzung der Arbeit 22

4 Material und Methoden 23

4.1 Zellkultur 23

4.1.1 Zelllinien 23

4.1.2 Kultivierung der Zelllinien 26

4.1.3 Vorbereitung der Zellen für das Experiment 28

4.2 Somatostatinanaloga 30

4.3 Versuchsaufbau 30

4.4 Versuchsauswertung 32

4.4.1 Casy-1 Zellzählmethode 32

4.4.2 BRDU Proliferation Assay 35

4.5 Statistik 36

5 Ergebnisse 37

5.1 Allgemeine methodische Aspekte 37

5.2 Vorbereitende Versuche 38

5.2.1 Versuche mit Octreotid 38

5.2.2 Versuche mit Pasireotid 43

5.3 Hauptversuche 48

5.3.1 Antiproliferative Effekte bei HCT Zellen 48

5.3.2 Antiproliferative Effekte bei HepG2 Zellen 54

5.3.3 Antiproliferative Effekte bei BON-1 Zellen 61

5.4 Zusammenfassung der Ergebnisse 68

5.4.1 Zusammenfassung der antiproliferativen Effekte bei HCT Zellen 68

5.4.2 Zusammenfassung der antiproliferativen Effekte bei HepG2 Zellen 80

5.4.3 Zusammenfassung der antiproliferativen Effekte bei BON-1 Zellen 89

5.4.4 Vergleich des antiproliferativen Effektes von Octreotid und Pasireotid bei den drei Zelllinien in vitro 99

6 Diskussion 104

6.1 Fehlerbetrachtung 104

6.1.1 Wachstumsverhalten der Zellen 104

6.1.2 Umweltbedingungen 105

6.1.3 Pipettierfehler 105

6.1.4 Fehler bei der Auswertung 105

6.2 Methodenvergleich 106

6.3 Wirkunterschiede bezüglich der verschiedenen Konzentrationen von Octreotid und Pasireotid 108

6.4 Klinischer Einsatz der Somatostatinanaloga 109

6.4.1 Klinischer Einsatz von Octreotid 109

6.4.2 Klinischer Einsatz von Pasireotid 112

7 Ausblick 114

Literaturverzeichnis 115

Abbildungsverzeichnis 125

Tabellenverzeichnis 133

Abkürzungsverzeichnis 135

Danksagung 136

Lebenslauf 137

1

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Antiproliferative Effekte von Octreotid auf verschiedene gastrointestinale Tu-

morzelllinien wurden bereits in zahlreichen Studien nachgewiesen. Pasireotid ist

ein neues Somatostatinanalogon mit hoher Affinität zu allen humanen

Somatostatinrezeptoren (SSTR), ausgenommen Typ 4. Verglichen mit

Octreotid, das hauptsächlich an SSTR-2 und geringfügig an SSTR-5 bindet, ist

die Affinität am SSTR-1 etwa 20 bis 30fach, am SSTR-3 5fach und am SSTR-5

40fach erhöht. Ziel der Studie war es, eine aufgrund des Bindungsprofils im

Vergleich zu Octreotid möglicherweise stärkere antiproliferative Wirkung von

Pasireotid auf humane kolorektale Tumorzellen (HCT), humane hepatozelluläre

Tumorzellen (HepG2) und neuroendokrine pankreatische Tumorzellen (BON-1)

nachzuweisen.

1.2 Methoden

HCT Zellen und HepG2 Zellen wurden in RPMI- Medium mit Zusatz von 10%

fötalem Kälberserum gehalten. Zur Kultivierung der BON-1 Zellen wurden Dul-

becco’s MEM und HAM’s F12 Medium zu gleichen Anteilen mit 5% fötalem Käl-

berserum verwendet. Vor Versuchsbeginn wurden die Zellen für 24 Stunden in

Medium mit nur 1% FKS gegeben. Anschließend wurden Pasireotid und

Octreotid jeweils in Konzentrationen von 10-7 M bis 10-11 M appliziert. Die Aus-

wertung erfolgte meist nach 48 Stunden durch automatische Zellzählung mit

Hilfe eines Casy-1 Zellzählgerätes sowie durch Bestimmung des Einbaus eines

markierten Nukleotids in die DNA der Tumorzellen mit BRDU- Elisa.

1.3 Ergebnisse

Bei den HCT Zellen zeigten sich mit beiden Methoden signifikante Unterschie-

de. Die Proliferationshemmung durch Pasireotid, verglichen mit Octreotid, war

bei Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode 1,55fach und bei Auswertung

mit dem BRDU- Elisa 1,36fach stärker.

2

Bei den HepG2 Zellen war die Proliferationshemmung durch Pasireotid bei Ein-

satz des BRDU- Elisa um den Faktor 1,43 stärker; mit dem Casy-1 Zellzählge-

rätes konnte kein signifikantes Ergebnis erzielt werden (Faktor 1,07).

Bei den BON-1 Zellen erwies sich Pasireotid, unter Berücksichtigung der Er-

gebnisse mit der Casy-1 Zellzählmethode, als 1,6fach stärker inhibitorisch wirk-

sam. Jedoch lies sich dieses Ergebnis mit dem BRDU- Elisa nicht bestätigen.

1.4 Schlussfolgerungen

Wir konnten einen antiproliferativen Effekt von Pasireotid auf alle untersuchten

Tumorzellen nachweisen. Bei den HCT Zellen war der Unterschied am deut-

lichsten ausgeprägt; jedoch bestand auch bei den HepG2- und BON-1 Zellen

die Tendenz zur stärkeren Proliferationshemmung bei Einsatz von Pasireotid.

Pasireotid ist mindestens so stark wirksam wie Octreotid und es zeigt eine Ten-

denz zur stärkeren Inhibition der Zellproliferation. In ersten klinischen Studien

zeigte sich eine Überlegenheit in der antisekretorischen Wirkung von Pasireotid

im Vergleich zu Octreotid, wobei Pasireotid bei Patienten getestet wurde, die

auf eine Octreotid- Therapie nicht mehr angesprochen haben. Sowohl diese

Ergebnisse als auch die in vitro Ergebnisse berechtigen zu der Hoffnung, dass

Pasireotid in Zukunft eine effektive Therapiealternative bei Patienten mit neuro-

endokrinen Tumoren des Gastrointestinaltraktes werden könnte, die von

Octreotid aufgrund von Primär- oder Sekundärversagen der Therapie nicht pro-

fitieren. Eine Analyse des Somatostatinrezeptorstatus wäre möglicherweise hilf-

reich bei der Präselektion von Patienten für eine Pasireotid- Therapie.

3

2 Abstract

2.1 Background

Antiproliferative effects of octreotide have been demonstrated in different gas-

trointestinal tumor cell lines. Pasireotide is a novel high affinity ligand for all hu-

man somatostatin receptor (SSTR) subtypes except for SSTR-4. Compared to

octreotide, that binds preferentially to SSTR-2 and to a lesser extent to SSTR-5,

the affinity to SSTR-1 is 20 to 30fold, to SSTR-3 5fold and to SSTR-5 40fold

higher. The aim of the study was to investigate the antiproliferative action of

pasireotide in comparison to octreotide on human colorectal carcinoma cells

(HCT), human hepatocellular carcinoma cells (HepG2) and neuroendocrine

pancreatic carcinoma cells (BON-1).

2.2 Methods

HCT cells and HepG2 cells were cultured in RPMI medium with 10% fetal bo-

vine serum (FBS). BON-1 cells were cultured in equal amounts of DMEM and

HAM’s medium with 5% FBS. The cells were starved in medium with 1% FBS

for 24 hours. Concentrations of 10-7 M to 10-11 M of pasireotide and octreotide

were used. Cell proliferation was determined by cell- counting with the CASY-1

analyser system and by BRDU incorporation assay (BRDU- Elisa).

2.3 Results

In HCT cells similar results were obtained by the different methods. The effect of

pasireotide was 1,55 times stronger than the effect of octreotide using the

CASY-1 analyser system and 1,36 times stronger using BRDU- Elisa.

HepG2 cells were inhibited by pasireotide 1,43 times stronger when measured

with BRDU- Elisa, but not significantly stronger with the Casy-1 cell counter

(1,07 times) .

In BON-1 cells pasireotide was 1,6 times stronger at inhibiting the cell prolifera-

tion using the Casy-1 cell counter, while by BRDU- Elisa this effect could not be

observed.

4

2.4 Conclusions

In summary we could demonstrate an antiproliferative effect of pasireotide on all

gastrointestinal tumor cells investigated. In HCT cells the inhibition of cell prolif-

eration by pasireotide was significantly stronger than by octreotide. In HepG2-

and BON-1 cells pasireotide showed a tendency for stronger inhibition.

Pasireotide is at least as efficient as octreotide and there is a tendency for an

even stronger inhibition of cell proliferation. This has also been shown in first

clinical studies, where pasireotide was applied to patients who were not respon-

sive to octreotide anymore. The in vitro and first in vivo results make pasireotide

a promising drug in the clinical application to neuroendocrine tumor patients

who do not benefit from octreotide. Analysis of somatostatin receptor subtypes

might be helpful for preselection of patients for pasireotide treatment.

5

3 Hintergrund

3.1 Neuroendokrine Tumoren

3.1.1 Inzidenz und Einteilung

Neuroendokrine Tumoren sind seltene, in der Regel langsam wachsende, Tu-

moren, die vom disseminierten endokrinen Zellsystem ausgehen. Der Anteil

neuroendokriner Tumoren des Gastrointestinaltraktes und des Pankreas an al-

len malignen Tumoren beträgt etwa 2%. Die Häufigkeit ihres Auftretens korre-

liert mit der Dichte neuroendokriner Zellen an der jeweiligen Lokalisation. Im

Gastrointestinaltrakt treten neuroendokrine Tumore mit einem Anteil von etwa

42% am häufigsten im Dünndarm auf, gefolgt von Rektum und Magen mit Antei-

len von 27% und 8,7% [49].

Traditionell werden die neuroendokrinen Tumoren des Gastrointestinaltraktes in

Vorderdarmtumoren mit Sitz in der Lunge, dem Thymus, der gastralen Mucosa

oder dem oberen Duodenum oder Pankreas, Mitteldarmtumoren ausgehend

von distalem Duodenum, Jejunum, Ileum, Caecum oder proximalem Kolon und

Enddarmtumoren, die im distalen Kolon oder Rektum lokalisiert sind, unterteilt.

Diese Einteilung wurde offiziell durch die WHO- Klassifikation mit den fünf Sub-

typen hoch differenzierter endokriner Tumor, hoch differenziertes endokrines

Karzinom, niedrig differenziertes endokrines Karzinom, gemischt exokrines und

endokrines Karzinom und tumorähnliche Läsion ersetzt. Hierbei werden

Histomorphologie, Tumorgröße, lokale Invasivität und Metastasierung berück-

sichtigt. Hochdifferenzierte Tumoren haben eine solide trabekuläre oder

glanduläre Struktur, monomorphe Tumorzellen mit nur wenigen Zellatypien und

eine niedrige Proliferationsrate. Diese wird als Anteil Ki67- positiver Zellen an-

gegeben und beträgt weniger als 2%. Für niedrig differenzierte Karzinoide sind

Nekrosen und Zellatypien, sowie eine Proliferationsrate von über 20% Ki67-

positiver Zellen charakteristisch.

Dennoch ist auch die alte Einteilung noch in Gebrauch. Der häufigste Typ, die

sogenannten „Karzinoide“ des Mitteldarms, weist eine 5- Jahres Überlebensrate

6

von durchschnittlich 60,8% auf. Insgesamt hat die Inzidenz, insbesondere von

Karzinoiden des Magens und Rektums, in den letzten 30 Jahren zugenommen,

was aber auch durch die verbesserte Diagnostik bedingt sein kann [49].

3.1.2 Symptome

Charakteristisch ist die Produktion von Hormonen und bioaktiven Substanzen.

Daher können typische Krankheitsbilder entstehen, die durch die exzessive und

unkontrollierte Hormonfreisetzung zustande kommen.

Das Karzinoid- Syndrom ist das häufigste klinische Syndrom bei funktionell ak-

tiven neuroendokrinen Tumoren des Gastrointestinaltraktes. Zugrunde liegt ein

hepatisch metastasierter Tumor, meist vom Jejunum oder Ileum, seltener von

der Appendix, dem Bronchialsystem, Ovar, Magen oder anderen Lokalisationen

ausgehend, da das exzessiv produzierte Serotonin dann nicht mehr hepatisch

abgebaut werden kann. Es wurden eine Vielzahl von Hormonen bzw. Mediato-

ren beim Karzinoid-Syndrom identifiziert, deren Bedeutung für die Leitsympto-

me der Erkrankung nur teilweise geklärt ist, wie z.B. Serotonin, Histamin,

vasoaktive Kinine, Prostaglandine und Chromogranin A. Die Leitsymptome sind

Diarrhoe, kolikartige Bauchschmerzen, anfallsartige Rötung vor allem des Ge-

sichts und Oberkörpers, Zeichen der Rechtsherzinsuffizienz,

Bronchokonstriktion und Pellagra- ähnliche Hautveränderungen.

Für das im Pankreas lokalisierte Insulinom ist die als Whipple-Trias bekannte

Konstellation charakteristisch , bestehend aus hypoglykämischen Symptomen

wie Schwächegefühl, Heißhunger, Schwitzen, Unruhe, Tremor und Krämpfen,

dem gleichzeitigem Nachweis einer Hypoglykämie und die Besserung der

Symptome durch Glukoseaufnahme. Bei Auftreten eines, im Pankreas oder

Duodenum gelegenen, Gastrinomes kommt es durch die unkontrollierte

Gastrinfreisetzung zu Oberbauchbeschwerden, peptischen Ulcera, wässrigen

Diarrhoen und zur Refluxkrankheit. Das Vipom mit Primärtumorsitz meist im

Pankreas führt zu massiven wässrigen Diarrhoen. Hauptsymptome des eben-

falls im Pankreas lokalisierten Glucagonomes sind Diabetes mellitus, Hautver-

änderungen wie das nekrolytische migratorische Erythem und Gewichtsverlust.

7

Oft gestaltet sich die klinische Diagnostik jedoch schwierig, da nur diskrete

Symptome wie etwa Bauchschmerzen oder intermittierende Diarrhoe auftreten.

Über die Hälfte der neuroendokrinen Tumoren sind funktionell nicht aktiv und

machen sich klinisch nur durch ihr verdrängendes Tumorwachstum, nicht aber

durch Hormonfreisetzung bemerkbar [76].

3.1.3 Therapieoptionen bei neuroendokrinen Tumoren

Bei der Therapie metastasierter neuroendokriner Tumore wurde lange Zeit Zu-

rückhaltung gezeigt. Die Wahl der Therapieform hing von der pathologischen

Differenzierung, dem Stadium bei der Diagnosestellung und dem Vorhanden-

sein von Symptomen durch Hormonproduktion ab. Die, in der Regel sehr lang-

sam wachsenden, Tumore wurden oft nur beobachtet und nur bei progressivem

Wachstum aggressiv behandelt [11].

In letzter Zeit änderte sich dieses Konzept. Die frühzeitige Behandlungsindika-

tion bei therapie- naiven Patienten mit histologisch gesicherter Diagnose eines

lokal inoperablen oder eines metastasierten gut- differenzierten neuroendokri-

nen Karzinoms mit Primärsitz im unteren Dünndarm wurde im Rahmen der

PROMID- Studie geprüft; hier wurde die antiproliferative Wirkung von Octreotid

gegenüber Placebo getestet. Dabei war die Zeit bis zur Tumorprogression unter

Octreotid- Therapie mehr als verdoppelt. Das Risiko einer Tumorprogression

war in der Verumgruppe gegenüber der Placebogruppe um 67 % reduziert. Der

Effekt zeigte sich sowohl bei Patienten mit hormonell aktiven als auch mit inak-

tiven Tumoren und war bei Patienten mit niedriger hepatischer Tumorlast be-

sonders ausgeprägt. Daraus lässt sich schließen, dass die Ergebnisse für die

Patienten durch einen frühen Therapiebeginn verbessert werden können [61].

3.1.3.1 Chirurgische Therapie

Im Falle der lokalisierten Erkrankung ist die Operation als die einzige kurative

Behandlungsmöglichkeit immer noch Methode der Wahl. Die Rolle der Chirurgie

im metastasierten Stadium wird kontrovers diskutiert; mögliche Indikationen sind

beispielsweise die Resektion eines Primärtumors im Dünndarmbereich, auch

8

bei Vorliegen einer Metastasierung, zur Verhinderung eines Ileus oder die Ent-

fernung größerer Metastasen in Leber und Bauchraum im Sinne eines

"Tumordebulking", insbesondere bei funktionell aktiven Tumoren. Auch der Ver-

such einer Lebertransplantation wurde bei Patienten ohne extrahepatische Me-

tastasen durchgeführt, wobei allerdings keine ermutigenden Langzeitergebnisse

erzielt werden konnten [49] und daher diese Therapieoption den wenigen Pati-

enten vorbehalten bleiben sollte, deren Symptome mit allen anderen antiprolife-

rativen Therapiestrategien nicht verbessert werden konnten.

3.1.3.2 Embolisation

Bei einer großen Anzahl der Patienten sind bei Diagnosestellung bereits Le-

bermetastasen vorhanden. Durch eine Reduktion der Tumormasse in der Leber

kann Lebensqualität gewonnen und die Überlebenszeit verlängert werden. Da-

bei kann die Embolisation von Lebermetastasen, auch als Chemoembolisation

mit Zytostatika, eingesetzt werden. Eine Verminderung der Hormonfreisetzung

und der Symptome kann in 65 bis 80% der Fälle erreicht werden, jedoch erfor-

dert diese Therapie häufige Wiederholungen, um Langzeiterfolge zu erreichen

[49].

3.1.3.3 Radiotherapie

Radiotherapeutische Ansätze waren bisher nur von begrenztem Erfolg. Der

Einsatz ist hauptsächlich auf die Therapie zerebraler Metastasen und die

Schmerztherapie bei Knochenmetastasen beschränkt.

3.1.3.4 Medikamentöse Therapie

Bei der Mehrzahl der Patienten wird eine medikamentöse Therapie im Krank-

heitsverlauf notwendig, da die meisten Tumore sich zum Diagnosezeitpunkt

bereits im fortgeschrittenen Stadium befinden und damit inoperabel sind. Zu

den eingesetzten Substanzen zählen Zytostatika, Interferon- Alpha und

Somatostatinanaloga.

Die Chemotherapie stellt nur bei einem geringen Anteil von Patienten einen ef-

fektiven Therapieansatz dar, da bestimmte Kriterien erfüllt sein müssen. Bei

9

stark proliferierenden Zellen, insbesondere bei pankreatischen Tumoren, kann

die zytostatische Therapie oft mit Erfolg eingesetzt werden. Der Proliferations-

index sollte bei über 10 bis 15% Ki67 positiver Zellen liegen. Das klassische

Karzinoid des Mitteldarms weist jedoch einen niedrigen Proliferationsindex von

meist unter 2% auf, so dass die Patienten nicht von der Therapie profitieren

[49]. Bei neuroendokrinen Tumoren des Pankreas konnten Ansprechraten zwi-

schen 45% mit 5-FU und Streptozotocin und 65% mit Doxorubicin und

Streptozotocin erzielt werden. Bei schlecht differenzierten neuroendokrinen Tu-

moren wird eine Kombination von Etoposid und Cisplatin eingesetzt.

Interferone wirken antiproliferativ durch Induktion nukleärer Enzyme. Im Rah-

men verschiedener Studien wurde eine Halbierung der Tumormarker in etwa

der Hälfte der Fälle und eine signifikante Tumorzellreduktion bei 10% bis 12%

der Patienten erreicht. Bei 35% der Patienten kam es zu keiner weiteren Pro-

gression der Tumorerkrankung [49]. Eine sehr häufige Nebenwirkung sind grip-

peähnliche Symptome; ausserdem treten oft chronische Müdigkeit und in Ein-

zelfällen Depressionen auf. Zudem leiden etwa 15% der behandelten Patienten

unter Autoimmunreaktionen.

Antiangiogenetische Therapieansätze erscheinen bei den, meist gut

vaskularisierten, neuroendokrinen Tumoren naheliegend. Erste Daten liegen zu

Bevacizumab, einem neutralisierenden Antikörper des Wachstumsfaktors VEGF

(Vascular Endothelial Growth Factor) vor. Auch der mTor Inhibitor Rad001, weist

ebenso wie Thallidomid unter anderem einen antiangiogenetischen Effekt auf

und wird in Studien bezüglich seiner Wirksamkeit bei neuroendokrinen Pankre-

astumoren überprüft. Erste positive Daten liegen auch für den ebenfalls

antiangiogenetisch wirksamen Tyrosinkinaseinhibitor Sunitinib vor.

Bei 80% bis 90% der neuroendokrinen Tumoren wurden

Somatostatinrezeptoren mit hoher Affinität identifiziert.

10

3.2 Somatostatin

3.2.1 Entdeckung des natürlichen Somatostatins

Somatostatin wurde zufällig im Rahmen von Studien über das Wachstumshor-

mon im Hypothalamus von Ratten entdeckt. Kruhlich kam bei der Gelfiltration

des hypothalamischen Extraktes von Ratten und Schafen auf einer Säule

Sephadex G-25 zu einer überraschenden Erkenntnis. Dabei entstanden zwei

Zonen, welche die Sekretion von Wachstumshormon nach der Inkubation mit

Extrakt aus den Hypophysen- Vorderlappen männlicher Ratten in unterschiedli-

cher Weise beeinflussten. Eine davon steigerte die Freisetzung von Wachs-

tumshormon um ein Vielfaches, während die zweite im Vergleich mit den, nicht

mit hypophysärem Extrakt inkubierten, Kontrollen, diese auf etwa die Hälfte re-

duzierte. Daraus entstand die Hypothese eines GH- freisetzenden und eines

GH- inhibierenden Faktors im Hypothalamus von Schafen und Ratten [28].

Brazeau führte Experimente durch, um den Wachstumshormon- freisetzenden

Faktor nachzuweisen. Auch er beobachtete eine regelmäßig auftretende Hem-

mung der GH- Sekretion der hypophysären Zellen bei der Zugabe von

hypothalamischem Extrakt zu den hypophysären Zellen von Ratten. Es gelang

ihm, das dafür verantwortliche Peptid zu isolieren. Er bezeichnete dieses als

Growth Hormon- Release- inhibiting Factor. Anhand von in vitro Assays identifi-

zierte er dessen Struktur [5].

Dabei handelt es sich um ein zyklisches Tetradecapeptid, welches im Blut in

zwei verschiedenen biologisch aktiven Formen zirkuliert. Diese wurden nach

der Anzahl der vorhandenen Aminosäuren als Somatostatin-14 und

Somatostatin-28 bezeichnet. Die physiologisch aktivere Form ist das

Somatostatin-14. Somatostatin-28 ist ein Prohormon von Somatostatin-14, das

selbst aber auch physiologisch aktiv ist. Beide entstehen durch Proteolyse aus

größeren Vorläufer- Molekülen, dem Präpro- Somatostatin und dem Pro-

Somatostatin [67]. Neben der Regulation der GH- Sekretion wurden viele weite-

re Effekte entdeckt.

11

3.2.2 Funktion von Somatostatin

Beim Menschen werden Somatostatin-14 und -28 durch zwei unterschiedliche

Gene kodiert [52]. Zielzellen sind sowohl endokrine und exokrine Gewebe als

auch neuronale Zellen und Immunzellen.

Im Gastrointestinaltrakt inhibiert Somatostatin die Sekretion und Wirkung zahl-

reicher Peptidhormone. Dadurch werden Funktionen wie Motilität, Säureproduk-

tion, Enzymfreisetzung aus dem Pankreas und die Gallesekretion gehemmt.

Auch die Freisetzung pankreatischer und gastrointestinaler Hormone wie Insu-

lin, Glucagon, Gastrin, Sekretin und VIP (vasoactive intestinal polypeptide)

nimmt unter dem Einfluss von Somatostatin ab [56].

Als Neurohormon inhibiert Somatostatin die hypophysäre GH- Freisetzung und

beeinflusst dadurch indirekt auch die IGF-I (Insulin like Growth Factor 1)- Frei-

setzung der Leber und anderer peripherer Organe wie Herz und Niere [66]. Im

ZNS fungiert Somatostatin als Regulator der neocorticalen, striatalen, limbi-

schen und hypothalamischen Neurone [13].

Ausserdem konnte im Rahmen von Studien auch eine inhibitorische Wirkung

auf die Zellproliferation in gesundem und entartetem Gewebe nachgewiesen

werden. Das Wachstum verschiedener endokriner Tumoren wie beispielsweise

Wachstumshormon- sezernierender Adenome, Gastrinome, Insulinome,

Glucagonome und Vipome wird durch Somatostatin supprimiert [56].

Somatostatin beeinflusst somit Sekretion, Neurotransmission und Zellprolifera-

tion. Dabei wirken die beiden Formen von Somatostatin zum Teil unterschied-

lich. Somatostatin-28 ist beispielsweise der stärkere Neuromodulator und Inhibi-

tor der Insulinsekretion, hat aber auf andere Prozesse, wie etwa die

gastrointestinale Motilität, keinen Einfluss [6].

3.2.3 Somatostatin- Rezeptoren

Somatostatin-14 und -28 agieren durch Bindung an G- Protein gekoppelte

Membranrezeptoren. Die ersten beiden Somatostatinrezeptoren wurden von

Yamada et al. aus menschlicher Inselzell- RNA geklont [77]. Inzwischen sind

12

fünf Somatostatin- Rezeptor Subtypen auf Zelloberflächen identifiziert und aus

verschiedenen Geweben geklont worden. Sie werden als SSTR 1-5 bezeichnet

[21]. Diese Subtypen sind in ihrer Aminosäuresequenz zu 42% bis 60% iden-

tisch und gehören zu einer Rezeptorfamilie mit sieben transmembranösen Do-

mänen. Die Gene liegen auf unterschiedlichen Chromosomen, was für ver-

schiedene Funktionen an unterschiedlichen Organen spricht [52]. Im Laufe der

Forschung konnten die Funktionen einiger Rezeptoren klar definiert werden, zu

anderen gibt es jedoch nur Vermutungen. Für SSTR-2 und SSTR-5 wird eine

Beteiligung an der Regulation der GH Freisetzung und für SSTR-5 eine Mitwir-

kung an der Regulation der Insulin- und wahrscheinlich auch Glucagonsekretion

angenommen. SSTR-3 und in geringerem Umfang auch SSTR-2 können

Apoptose induzieren. Die Inhibition der Zellproliferation erfolgt über eine Aktivie-

rung von SSTR-1, SSTR-2 und SSTR-5. SSTR-1 ist vermutlich an der

Angiogenese beteiligt. Die Funktion von SSTR-4 ist weitgehend unbekannt [41].

Durch Bindung von Somatostatin an den zugehörigen Rezeptor werden „se-

cond messenger Systeme“ aktiviert. Dies führt zu einer Hemmung der

Adenylatzyklase, Aktivierung von Calciumkanälen und Stimulation der

Phosphotyrosin- Phosphatase oder MAP- (Mitogen activated Protein) Kinase.

Die inhibitorischen Effekte von Somatostatin auf die Adenylatzyklase- Aktivität

und den Calciumeinstrom führen zur Hemmung von Hormonsekretionsprozes-

sen. Die Aktivierung der Phosphotyrosin- Phosphatase oder MAP- Kinase spielt

möglicherweise eine Rolle bei der Regulation der Zellproliferation [38, 18, 53].

Endokrine Tumoren exprimieren Somatostatinrezeptoren in großer Dichte. Bei-

spiele dafür sind Hypophysenadenome, endokrine Pankreastumoren, Karzinoi-

de, Paragangliome, Phäochromozytome, medulläre Schilddrüsenkarzinome,

Mammakarzinome und Lungentumoren. Darüberhinaus finden sich SSTR in

malignen Lymphomen [58, 74, 59]. Das Vorkommen von Somatostatinrezeptor-

Subtypen bei verschiedenen Tumoren konnte mittels in situ- Hybridisierung,

RNA- Proteinase- Assays und RT-PCR [29] nachgewiesen werden. Die Mehr-

heit Somatostatinrezeptor- positiver Tumoren exprimiert unterschiedliche

Somatostatinrezeptoren gleichzeitig, wobei eine große Variationsbreite zwi-

13

schen verschiedenen Tumorarten und auch innerhalb einer Tumorart festge-

stellt wurde [25, 20]. Auch bei endokrinen Pankreastumoren und Tumoren des

Verdauungstraktes ist die Somatostatinrezeptor- Expression vielfältig, jedoch

besteht hier eine Dominanz der Typ 2 Rezeptoren mit einer Expression bei über

80% der Tumore [59, 57, 51, 9]. Insulinome dagegen exprimieren nur in 50 %

der Fälle Somatostatinrezeptoren Typ 2.

Somatostatin-14 und Somatostatin-28 binden an alle der fünf Rezeptor Subty-

pen mit hoher Affinität, wobei SSTR-4 eine etwas stärkere Affinität für

Somatostatin-14 und SSTR-5 eine 10 -15mal stärkere Affinität für Somatostatin-

28 aufweist [52].

3.2.4 Probleme bei der klinischen Anwendung

Bedingt durch das breite Wirkungsspektrum wurde eine Behandlung mit

Somatostatin zunächst für eine gute Therapieform zahlreicher Erkrankungen

gehalten. Durch die inhibitorische Wirkung auf die Sekretion biologischer

Peptidhormone wie die Wachstumshormonsekretion und durch die

Rezeptorexpression bei zahlreichen Tumoren wurde durch die Anwendung von

Somatostatin ein therapeutischer Fortschritt bei der Behandlung der Akromega-

lie sowie zahlreicher endokriner Tumoren erwartet. Wegen der Inhibition der

pankreatischen Enzymsekretion wurde die Anwendung bei Patienten mit Pan-

kreatitis in Erwägung gezogen [53].

Jedoch blieb das therapeutische Potential von Somatostatin lange Zeit unge-

nutzt. Bedingt durch eine schnelle proteolytische Degradation durch

Aminopeptidasen und Endopeptidasen im Plasma beträgt die Halbwertszeit von

Somatostatin weniger als drei Minuten. Dies beschränkt die Anwendungsmög-

lichkeiten auf die intravenöse Gabe. Zusätzliche Probleme bereitet der Re-

bound- Effekt bezüglich der Hormonsekretion bei Absetzen der Therapie. Die

Eignung von Somatostatin zur Behandlung spezifischer Erkrankungen wird au-

ßerdem durch potentielle Nebenwirkungen bei sehr breitem Wirkspektrum auf

verschiedene Organe begrenzt.

14

Dadurch nahmen die initiale Begeisterung und das große Interesse an

Somatostatin zunächst ab [40]. Etwas später wurden Initiativen zur Entwicklung

hochpotenter Somatostatin- Analoga mit verbesserter Stabilität und verlängerter

Wirkungsdauer ergriffen.

3.3 Somatostatinanaloga

3.3.1 Octreotid

1974, zwei Jahre nach der Entdeckung von Somatostatin, begann die Firma

Sandoz in Basel ein Programm zur Entwicklung langwirksamer Somatostatin-

analoga. Schritt für Schritt wurde der zentrale Anteil des Somatostatinmoleküls

verändert. Bauer et al [4] gelang schließlich die Synthese eines Somatostatin-

Analogons ohne die meisten der Nachteile des natürlichen Peptides, die den

klinischen Einsatz verhinderten. Dabei wurde, die für die Wirkung essentielle,

Aminosäuresequenz Phe7-Trp8-Lys9-Thr10 des natürlichen Somatostatins be-

lassen und am N- und C- terminalen Ende metabolisch stabilisiert. Um ein zykli-

sches Peptid zu erhalten, wurden die Phenylalanin- Reste an Position 6 und 11

durch 2 Cystein- Reste ersetzt. Die Strukturformel des ersten Analogons

Octreotid ist H-[D]-Phe-Cys-Phe-[D]-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol) [1].

Abbildung 1: Vergleich der Aminosäuresequenz von Somatostatin 14 (oben)

und Octreotid (unten)

15

Andere zyklische Analoga mit ähnlicher Affinität und Spezifität sind beispiels-

weise Lanreotid und Vapreotid.

Während die Leber zur Elimination von Somatostatin neben dem Metabolismus

durch unterschiedliche Peptidasen der Blutzirkulation ein wichtiges Organ dar-

stellt, ist die hepatische Clearance von Octreotid deutlich niedriger. Ursächlich

dafür scheint sowohl eine höhere Stabilität bezüglich der Proteolyse in der Blut-

bahn als auch eine herabgesetzte Permeabilität zu sein. Die Clearance von

Octreotid korreliert mit dem Körpergewicht. Beim Menschen beträgt sie etwa

200 ml/min. Da ein großer bioverfügbarer Dosisanteil von Octreotid extrarenal

ausgeschieden wird, ist bei eingeschränkter Nierenfunktion keine

Dosisanpassung notwendig [43].

Bedingt durch die hochgradige Resistenz gegen enzymatische Degradation

konnte die Plasmahalbwertszeit bei subkutaner Gabe auf zwei Stunden verlän-

gert werden. Kutz et al. [31] untersuchten die Wirkung subkutaner Injektionen

von 50 µg, 100 µg, 200 µg und 400 µg Octreotid bei gesunden Probanden. Die

Plasmakonzentrationen nahmen monophasisch ab und die Plasmahalbwerts-

zeiten lagen zwischen 88 und 102 Minuten. Für 200 µg Octreotid lag die Halb-

wertzeit bei 98 ± 37 Minuten. Nach subkutaner Injektion wurde bei allen Dosie-

rungen innerhalb von 30 Minuten die maximale Serumkonzentration erreicht.

Die Bioverfügbarkeit unterschied sich nicht signifikant bei den verschiedenen

Konzentrationen. Die biologische Wirkungsdauer lag bei 6 bis 8 Stunden; der

Plasmaspiegel betrug 10,6 ± 3,3 ng/ml. Aufgrund der 6 bis 8-stündigen Wirk-

dauer ist beim klinischen Einsatz eine dreimal tägliche Gabe subkutan möglich.

Neben subkutanen Darreichungsformen gibt es seit einiger Zeit auch Depotprä-

parate wie z.B. das Octreotid-LAR, das nur alle 4 Wochen intramuskulär gege-

ben werden muss.

Außerdem konnte im Rahmen von in vivo- Studien eine potentere Wirkung von

Octreotid im Vergleich zu natürlichem Somatostatin nachgewiesen werden. Die

Inhibition der GH- Sekretion ist etwa 45fach stärker ausgeprägt; auch Glucagon

und Insulin werden 11fach bzw. 3fach stärker inhibiert [4].

16

Die Probleme der Octreotidbehandlung zeigten sich im Rahmen erster klini-

scher Studien. Bei den meisten Patienten kam es zur Desensibilisierung und

zum Wiederanstieg der Hormonsekretion. Die Mechanismen der Desensibilisie-

rung und die Gründe für die variable Wirkungsdauer der Octreotid- Therapie

sind vielfältig. Man unterscheidet dabei Primär- und Sekundärversagen.

Eine Erklärungsmöglichkeit für Primärversagen ist die beschränkte

Rezeptoraffinität von Octreotid. Tumore können die Somatostatinrezeptoren 1

bis 5 exprimieren. Octapeptid- Analoga wie Octreotid zeigen eine Bindungslü-

cke am SSTR-4. Starke Affinität besteht nachweislich nur für den SSTR-2 und

geringfügige für den SSTR-5 [53, 7].

Der Einsatz von Octapeptid- Analoga bei Tumorerkrankungen basiert auf der

Tatsache, dass endokrine Pankreastumore und gastrointestinale Tumore in

über 80% der Fälle den Somatostatinrezeptor Typ 2 exprimieren. Öberg et al

geben die Häufigkeit der Expression der Somatostatinrezeptoren 1 bis 5 bei

gastrointestinalen neuroendokrinen Tumoren mit 68%, 86%, 46%, 93% und

57% an [50].

Allerdings besteht oft eine große Variabilität der Rezeptorexpression bei ver-

schiedenen Tumorarten und sogar zwischen Primärtumor und dessen Metasta-

sen. Der Erfolg der Octreotid- Therapie korreliert stark mit dem Nachweis der

Somatostatin- Rezeptoren in der Octreotid- Szintigraphie [27]. Tumore, welche

die Somatostatinrezeptoren 2 und 5 mit hoher Affinität für Octreotid nicht

exprimieren, sollten nicht mit Octreotid behandelt werden.

Noch häufiger als Primärversagen wurde allerdings das Auftreten von Resisten-

zen innerhalb von Wochen bis Monaten im Behandlungsverlauf beschrieben.

Potentielle Gründe für Tachyphylaxie und Therapieresistenz im Rahmen eines

Sekundärversagens der Octreotid- Therapie sind Rezeptor- Downregulation

durch Abnahme der Anzahl und Affinität von Somatostatinrezeptoren oder De-

sensibilisierung durch eine Abkopplung des Rezeptors vom G- Protein und da-

mit der second messenger Aktivierung. Außerdem können Rezeptorart und -

Anzahl bei Metastasen stark vom Rezeptorstatus des Primärtumors abweichen

[46]. Weiterhin besteht die Möglichkeit von Mutationen in den

17

Somatostatinrezeptor- codierenden Genen, was zum Fehlen funktionierender

Rezeptorproteine führen kann. Zusätzlich kann Tachyphylaxie bezüglich indirek-

ter wachstumshemmender Mechanismen, wie der GH- oder Gastrin- Inhibition

auftreten [17, 39].

Im Anschluss an erste Studien folgten kaum Versuche der Verbesserung, bei-

spielsweise durch bessere Dosisanpassung, Therapiepausen als Maßnahme

zur Reduktion der Tachyphylaxie oder die Gabe als Dauerinfusion, was in eini-

gen problematischen Fällen bereits Erfolg gezeigt hatte.

Um die gesamte Breite der Tumore mit dem gewünschten Erfolg behandeln zu

können, wurden gezielt langwirksame Somatostatinanaloga mit breitem Bin-

dungsspektrum entwickelt.

3.3.2 Pasireotid

Im Jahr 2002 wurde von der Firma Novartis Pasireotid, damals unter dem Na-

men SOM-230, als universeller Ligand an allen Somatostatinrezeptoren mit

langer Halbwertszeit entwickelt [7]. Um Informationen über die, für die univer-

selle Rezeptorbindung wichtigen, Strukturen zu gewinnen wurden Ala- substitu-

ierte Somatostatin-14 Analoga synthetisiert und das Bindungsverhalten an die

fünf Somatostatinrezeptor- Typen untersucht. Durch die Substitution einzelner

Aminosäuren durch Ala konnten Typ8 und Lys9 sowie die angrenzenden Regio-

nen mit Lys4, Phe6, Phe7 und Phe11 als die für das universelle Bindungsprofil

von Somatostatin-14 verantwortlichen Strukturen identifiziert werden. Zur Ent-

wicklung kleiner, stabiler Somatostatinanaloga mit einem ähnlichen Bindungs-

profil wurden Strukturelemente von Somatostatin-14 zu einem größenmäßig

reduzierten, stabilen Cyclohexapeptid zusammengefügt. Durch Einfügen von

Lysin, Phenylglycin, O-Benzyl-Tyrosin und D-Tryptophan entstand Pasireotid.

Dieses besteht insgesamt aus sechs modifizierten und nicht modifizierten Ami-

nosäuren anstatt der 14 Aminosäuren in Somatostatin-14.

18

Abbildung 2: Strukturformel von Somatostatin-14

Abbildung 3: Strukturformel von Octreotid. Die Aminosäuresequenz Phe7-Trp8-

Lys9-Thr10 des natürlichen Somatostatins wurde belassen und

am N- und C- terminalen Ende metabolisch stabilisiert. Um ein

zyklisches Peptid zu erhalten wurden die Phenylalanin- Reste an

Position 6 und 11 durch 2 Cystein- Reste ersetzt.

19

Abbildung 4: Strukturformel von Pasireotid. Strukturelemente von Somatostatin-

14 wurden zu einem größenmäßig reduzierten, stabilen

Cyclohexapeptid zusammengefügt. Durch Einfügen von Lysin,

Phenylglycin, O-Benzyl-Tyrosin und D-Tryptophan entstand

Pasireotid.

Unter Einsatz von Zellmembranen mit transferrierten Somatostatinrezeptoren

führte die Arbeitsgruppe von Bruns [7] Rezeptorbindungsstudien durch. Nach

dem Einfügen von Strukturelementen aus Somatostatin-14 in das

Cyclohexapeptid zeigte sich ein, dem natürlichen Peptid ähnliches, Profil mit

hoher Affinität zu allen humanen Somatostatinrezeptoren außer Typ 4. Vergli-

chen mit Octreotid ist die Affinität am ersten Somatostatinrezeptor 30fach, am

SSTR-3 5fach und am SSTR-5 fast 40fach erhöht. Letztere ist sogar doppelt so

stark ausgeprägt wie bei Somatostatin-14 selbst.

Tabelle 1: Bindungsaffinitäten der Somatostatinanaloga an die fünf Subtypen

der Somatostatinrezeptoren nach Schmid, Schoeffter (2004) [65].

IC50 Wert (nM) SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5

Somatostatin-14 0,93±0,12 0,15±0,02 0,56±0,17 1,50±0,40 0,29±0,04

Octreotid 280±80 0,38±0,08 7,10±1,40 >1000 6,30±1,00

Pasireotid 9,30±0,10 1,00±0,10 1,50±0,30 >1000 0,16±0,01

Octreotid/Pasireotid 30 0,4 5 - 39

Chromosomale

Lokalisation

14 17 22 20 16

20

3.3.3 Vorteile von Pasireotid verglichen mit Octreotid

Als nächstes wurde getestet, ob sich die Vorteile im Bindungsverhalten, vergli-

chen mit Octreotid, auch bezüglich der inhibitorischen Wirkung bemerkbar ma-

chen.

In vitro wurde die Inhibition der Freisetzung von Wachstumshormon durch

Pasireotid unter Einsatz kultivierter Hypophysenzellen von Ratten bestimmt.

Dabei erwies sich die Inhibition durch Pasireotid als 3 bis 4fach stärker vergli-

chen mit Octreotid. Dies kann durch in Studien festgestellte Beobachtungen,

dass SSTR-5 eine entscheidende Rolle in der Wachstumshormonregulation

spielt, begründet werden [68].

Die Arbeitsgruppe um Bruns [7] untersuchte das pharmakokinetische Profil von

Pasireotid bei Ratten nach einer einzelnen subkutanen Bolusinjektion. Die

Plasmakonzentration von Pasireotid wurde bestimmt und mit der von Octreotid

verglichen.

Abbildung 5: Plasmakonzentration von Pasireotid verglichen mit Octreotid im

Zeitverlauf, bestimmt nach einer subkutanen Bolusinjektion von

1mg/kg Körpergewicht des Somatostatinanalogons bei Ratten [7].

21

Die langsame systemische Clearance von Pasireotid weist auf eine nur geringe

hepatische Metabolisation hin. Die Verteilungshalbwertszeit von Pasireotid be-

trägt 0,74 Stunden verglichen mit 0,22 Stunden bei Octreotid. Für die Eliminati-

onshalbwertszeit wurden 23 Stunden für Pasireotid im Vergleich zu 2 Stunden

für Octreotid bestimmt. Die klinische Anwendung von Pasireotid wird aufgrund

des pharmakokinetischen Profiles durch eine tägliche Einmalgabe, anstelle ei-

ner dreimaligen subkutanen Applikation wie bei Octreotid, vereinfacht.

Die 3fach längere Verteilungshalbwertszeit und die 11fach längere Eliminati-

onshalbwertszeit erklären die längere Wirkungsdauer von Pasireotid bei in vitro

und in vivo Studien. Dabei wurde die Freisetzung von Wachstumshormon,

Glukagon und Insulin bei Ratten, Hunden und Affen gemessen. Bezüglich der

Sekretion von Wachstumshormon war Pasireotid eine Stunde nach Applikation

geringfügig schwächer wirksam als Octreotid, jedoch wurde nach 6stündiger

Wirkdauer ein über 4fach stärkerer inhibitorischer Effekt festgestellt. Die Insu-

linsekretion wurde durch Pasireotid 15fach stärker, die Glucagonsekretion ge-

ringer inhibiert. In einer weiteren in vivo- Studie konnten die IGF-I Werte im

Plasma durch Pasireotid unter kontinuierlicher Gabe per Infusion um 75% ver-

glichen mit 28% durch Octreotid reduziert werden. Die Wirkung von Pasireotid

konnte über einen verlängerten Zeitraum von bis zu 120 Tagen beobachtet

werden.

Im Gegensatz zu den Beobachtungen beim klinischen Einsatz von Octreotid trat

im Tierversuch mit Pasireotid keine Desensibilisierung auf. Nach 18wöchiger

hochdosierter kontinuierlicher Infusion war der Effekt unverändert nachweisbar

[7]. Eine mögliche Erklärung dafür ist das unterschiedliche Bindungsverhalten

zwischen den Somatostatinanaloga. Pasireotid bindet mit 40fach höherer Affini-

tät an den Somatostatinrezeptor Typ 5; Octreotid dagegen bindet stärker an den

Somatostatinrezeptor Typ 2. Während der Somatostatinrezeptor Typ 2 nach der

Bindung des Liganden schnell internalisiert wird, wird der Somatostatinrezeptor

Typ 5 nach der Internalisierung schnell wieder recycelt und gelangt von intrazel-

lulär zurück an die Zellmembran [70].

22

Auch zeigten sich im Tierversuch keine schwerwiegenden unerwünschten Wir-

kungen. Die Befürchtung einer diabetogenen Nebenwirkung, bedingt durch die

starke Inhibition der Insulinsekretion, wurde im Tierversuch nicht bestätigt. Nach

18wöchiger Anwendung mit einer kontinuierlichen Infusionsrate von 10 µg/kg/h

waren die Glukosewerte im Plasma nicht signifikant verändert [7].

3.4 Zielsetzung der Arbeit

Die genannten Aspekte, wie etwa die erhöhte Affinität von Pasireotid an den

Somatostatinrezeptoren 1,3 und 5, die längere Wirkungsdauer und die fehlende

Desensibilisierung stellen vielversprechende Vorteile im Vergleich zu den bisher

eingesetzten Somatostatinanaloga dar. Jedoch fehlen Erkenntnisse zur antipro-

liferativen Wirkung.

Unter Therapie mit Octreotid subkutan in einer Tagesdosis von 200-450 µg kam

es nur in ca. 8 % der Fälle zu einer Tumorregression (Zusammenfassung zahl-

reicher Studien, [49]). Daher erscheint es attraktiv, das neue Analogon

Pasireotid hinsichtlich antiproliferativer Effekte sowohl bei endokrinen als auch

bei exokrinen Zellen zu untersuchen.

Ziel der Arbeit ist es, im Rahmen einer in vitro Studie die Wirkung von Octreotid

und Pasireotid auf die Proliferation von drei verschiedenen Tumorzelllinien zu

vergleichen und zu prüfen, ob für Pasireotid aufgrund der genannten Bindungs-

eigenschaften tatsächlich eine stärkere inhibitorische Wirkung nachgewiesen

werden kann.

23

4 Material und Methoden

4.1 Zellkultur

4.1.1 Zelllinien

Die Versuche wurden an drei verschiedenen humanen Zelllinien ausgeführt.

Dabei handelt es sich um kolorektale Karzinomzellen (HCT Zellen),

hepatozelluläre Karzinomzellen (HepG2 Zellen) und neuroendokrine

pankreatische Karzinomzellen (BON-1 Zellen). Die Zelllinien wurden in flüssi-

gem Stickstoff bei -190°C gelagert.

Die HCT Zellen befinden sich seit 1998 im Institut. Es handelt sich um schwach

differenzierte und stark proliferierende kolorektale Adenokarzinom- Zelllinien

humanen Ursprungs. Diese exprimieren die Somatostatinrezeptoren 2,3 und 5

[71]. Die Zellen sind relativ pflegeleicht. Einmal sind die Angehraten sehr hoch,

was das Auftauen und den Einsatz eingefrorener Zellen erleichtert. Durch einla-

giges und dichtes Wachstum wird das Auszählen der Zellen vereinfacht. Außer-

dem kann die Inkubationszeit, bedingt durch die kurze Verdopplungszeit der

Zellen, relativ kurz gehalten werden und die Auswertung rasch erfolgen.

Abbildung 6: HCT Zellen in der Vergrößerung 1:10

24

Diese Vorteile weisen auch die HepG2 Zellen auf, die ebenfalls seit 1998 im

Besitz des Institutes sind. Bei HepG2 Zellen handelt es sich um Zellen eines

hochdifferenzierten Hepatoblastoms, die 1979 aus dem Leberbiopsat eines

15jährigen männlichen Kaukasiers gewonnen wurden. Zunächst wurden diese

Zellen von bestrahlten, in Kultur gehaltenen, Mäusezellen mitversorgt. Nach

etlichen Passagen wurde eine proliferierende, von anderen Kulturen unabhän-

gige, Zelllinie gewonnen.

Für die HepG2 Zellen ist ein festes Anwachsen auf dem Flaschenboden charak-

teristisch. Diese starke Adhärenz verhindert ein Ablösen der Zellen beim Aus-

tausch der Nährlösung, muss jedoch auch bei der Applikation von Trypsin auf

die Tumorzellen berücksichtigt werden. Hier ist eine längere Einwirkzeit des

Trypsins erforderlich.

Lichtmikroskopisch zeigen sich relativ gleichförmige, kleine, dunkle epitheliale

Zellen. Elektronenmikroskopisch erscheinen die Tumorzellen als reife Zelllinie

mit gut definierten subzellulären Organellen. Tight junctions grenzen die Gal-

lengänge ab und das zahlreiche Vorkommen der Mikrovilli weist auf die Fähig-

keit zur aktiven Sekretion hin [24].

Bei HepG2 Zellen wurde die Expression der Somatostatinrezeptoren 2, 3, 4 und

5 nachgewiesen, wobei es Abweichungen zwischen den Ergebnissen verschie-

dener Arbeitsgruppen gibt.

Tabelle 2: Nachweis unterschiedlicher Somatostatinrezeptor- Expressions-

muster in HepG2 Zellen durch verschiedene Arbeitsgruppen [48,

42, 55]

Publikation Jahr Nachweismethode SSTR-Subtypen

Notas et al 2004 RT-PCR

Immunzytochemie

2,3,5

Liu et al 2004 RT-PCR 2,3,4

Raderer et al 2000 Northern blot 2,3,4

25

Abbildung 7: HepG2 Zellen in der Vergrößerung 1:10

Die BON-1 Zellen wurden 2004 von Prof. B. Wiedenmann aus Berlin übernom-

men. Es handelt sich um eine ubiquitär verbreitete Zelllinie, die 1986 aus einer

Lymphknoten- Metastase des pankreatischen Karzinoids eines 28jährigen

Mannes isoliert wurden. Ein Teil des Lymphknotens wurde in Salzlösung gewa-

schen und zerkleinert. Die Tumorfragmente wurden in einer Mischung aus Dul-

becco’s modified Eagle medium (DMEM) und F-12 K- Medium mit 10% fötalem

Kälberserum gehalten. Nach Entfernung aller Fibroblasten wurden die BON-1

Zellen eingefroren [16].

Die BON-1 Zellen sind langsam wachsende Zellen mit einer Verdopplungszeit

von etwa 60 Stunden. Die Angehraten sind relativ niedrig.

Mikroskopisch zeigen die BON-1 Zellen eine polygonale Form und pflaster-

steinartiges Wachstum. Einige Zellen haben lange, zytoplasmatischen Fortsät-

zen ähnelnde, Dendriten, wie es für neuroendokrine Zellen charakteristisch ist.

Beim Arbeiten mit dieser Zelllinie ist große Sorgfalt erforderlich, da sich die Zel-

len durch ihre Wachstumsform in Clustern sehr leicht vom Flaschenboden ablö-

sen.

Elektronenmikroskopisch bestehen Tumore, die von BON-1 Zellen ausgehen,

aus vielen polygonalen Zellen, die größtenteils membrangebundene,

26

zytoplasmatische, sekretorische Granula beinhalten. Viele Zellen enthalten

Tonofilamente, wie sie für die epitheliale und endokrine Differenzierung typisch

sind.

Die Expression von Somatostatin- Rezeptoren auf BON-1 Zellen wurde

immunhistochemisch unter Einsatz polyklonaler Antikörper für SSTR 2-5 und

einem monoklonalen Antikörper für SSTR-1 untersucht. BON-1 Zellen zeigen

eine Anfärbung der Zellmembran vor allem für SSTR-2 und geringer für SSTR-4

und 5.

Abbildung 8: BON-1 Zellen, Vergrößerung 1:10

4.1.2 Kultivierung der Zelllinien

Alle Zelllinien wurden in sterilen Einmalkulturflaschen der Fa. Nunc (Roskilde)

gehalten. Auf der hydrophil beschichteten Wachstumsfläche wuchsen sie als

Monolayer in 10 ml Nährlösung. Die Inkubatorbedingungen wurden bei 37°C,

5% CO2 und 95% bis 100% Luftfeuchtigkeit konstant gehalten. Für die Kultivie-

rung der HCT Zellen und HepG2 Zellen wurde RPMI-1640 Medium mit Zusät-

zen verwendet. RPMI-1640 ist ein Zellkulturmedium für humane und tierische

Zelltypen. Die Formulierung wurde Mitte der 1960er Jahre von G. E. Moore und

Kollegen am Roswell Park Memorial Institute, daher RPMI, entwickelt. Wie die

meisten Zellkulturmedien benutzt RPMI-1640 ein Hydrogencarbonat-

Puffersystem und basiert auf einer Lösung von Glukose, Salzen, Aminosäuren

27

und Vitaminen. Als Indikator für den pH-Wert ist weiterhin noch Phenolrot zuge-

setzt. Zur Kultivierung der Tumorzelllinien muss das Medium um weitere Kom-

ponenten ergänzt werden. Zu 500 ml RPMI-1640 Medium wurden 50 ml fötales

Kälberserum sowie, um Kontaminationen zu vermeiden, 5 ml Pen-Strep (Kom-

bination der Antibiotika Benzylpenicillin- Procain und Dihydrostreptomycin) und

2,5 ml Gentamycin pipettiert. Die Nährlösung für die BON-1 Zellen bestand aus

Dulbecco’s MEM und HAM’s F12 Medium zu gleichen Anteilen mit 5% fötalem

Kälberserum. Das auf Mykoplasmen getestete fötale Kälberserum wurde für 30

Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert und, wie auch das Pen-Strep und Gentamycin,

bis zur Anwendung bei –20°C gelagert. Die einzelnen Nährlösungskomponen-

ten wurden vor ihrer Verwendung im Wasserbad auf 37°C erwärmt. Das fertige

Medium wurde bis zum Gebrauch kühl aufbewahrt.

Der Einsatz erfolgte unter sterilen Bedingungen an einer Werkbank der Firma

Heraeus Instruments (Düsseldorf). Das Kulturmedium, in dem die Zellen gehal-

ten wurden, musste in zweitägigen Abständen erneuert werden. Dabei wurde

die verbrauchte Nährlösung abpipettiert und durch 10ml neuen Mediums er-

setzt. Alle Kulturmedien und Zusätze wurden von der Firma Biochrom AG, Ber-

lin, bezogen.

Die Zellen wurden je nach Zelldichte alle 4 bis 7 Tage passagiert. Um eine aus-

reichende Nährstoffversorgung und Teilungsrate zu gewährleisten, wurde eine

Konfluenz der Zellen bis zu maximal 80% zugelassen.

Dazu wurde das Kulturmedium aus der bewachsenen Gewebekulturflasche

vorsichtig abpipettiert. Um die verbleibende Nährlösung zu entfernen, wurden

die Zellen anschließend mehrmals mit einer PBS Lösung (PBS- Dulbecco,

Biochrom AG, Berlin) gespült. Der Überstand wurde nach jedem Spülvorgang

verworfen. Danach wurden etwa 5 ml auf 37°C erwärmten Trypsins appliziert,

um den Zellrasen vom Flaschenboden abzulösen. Dieser Vorgang wurde mik-

roskopisch (Fa. Olympus GmbH, Hamburg) kontrolliert. Nach Lösung der adhä-

renten Zellen wurden 6 ml Medium zur Neutralisation des Trypsins zugegeben.

Anschließend wurde die Suspension aus Zellen und Medium für fünf Minuten

bei 1000 Umdrehungen pro Minute und 24°C zentrifugiert (Laborzentrifuge der

28

Fa. Heraeus Instruments, Düsseldorf). Das so erhaltene Zellpellet wurde durch

kräftiges Aufklopfen gelöst, mit etwas Medium verdünnt und die Zellen je nach

Zelldichte auf drei bis zehn bereits mit Nährlösung gefüllte Kulturflaschen ver-

teilt, die zur Aufbewahrung schnellstmöglich in den Brutschrank gelegt wurden.

4.1.3 Vorbereitung der Zellen für das Experiment

Das Aussäen der Zellen für einen Versuch mit definierter Zellzahl erfolgte je-

weils 48 Stunden vor Zugabe der Somatostatinanaloga. Die ersten 24 Stunden

wurden benötigt, um eine ausreichende Adhärenz der Zellen am Flaschenbo-

den zu gewährleisten; weitere 24 Stunden waren für die Inkubation mit Starving

Medium vorgesehen.

Beim Aussäen wurde der Zellrasen wiederum mit Trypsin gelöst, der Vorgang

mit Nährmedium gestoppt und die Zellsuspension, wie oben beschrieben, zent-

rifugiert. Das gelöste Zellpellet wurde mit 2 bis 5 ml Medium verdünnt und zur

gleichmäßigen Verteilung der Zellen mit Hilfe einer Pipette gemischt. Zur Be-

stimmung der Zelldichte wurden 10µl in eine Neubauer- Zählkammer (Fa.

Schubert und Weiss- OMNILAB GmbH&Co, München) pipettiert. Alle vier Quad-

ranten wurden ausgezählt.

Die Zellen mussten bis zur gewünschten Konzentration von 104 Zellen/ml mit

Medium verdünnt werden. Die benötigte Menge Zellsuspension und Medium

zur Verdünnung bis hin zur gewünschten Konzentration für eine bestimmte An-

zahl von Versuchen wurde mit folgender Formel berechnet:

C1 x V1 = C2 x V2

C1= Konzentration der Zellsuspension (ergibt sich aus der Zellzahl in allen vier

Quadranten der Zählkammer: 4 x 104/ml)

V1= Gesuchte Variable (benötigtes Volumen der Zellsuspension in ml)

C2= Gewünschte Endkonzentration der Zellsuspension (104 Zellen /ml)

V2= Benötigtes Aussaatvolumen, das aus Medium und Zellsuspension ange-

setzt wird in ml (in Abhängigkeit von der Anzahl der Versuche)

29

Die errechnete Menge an Zellsuspension wurde mit der entsprechenden Menge

Medium verdünnt. Wenn beispielsweise für V1 der Wert 0,5 ml berechnet wurde

und insgesamt 30 ml benötigt wurden (V2), mussten 0,5 ml Zellsuspension zu

29,5 ml Medium pipettiert werden.

Die HCT Zellen, HepG2 Zellen und BON-1 Zellen wurden in Loch- Platten (be-

schichtete Loch- Platten mit Deckel, Becton Dickinson Labware, NJ, USA) aus-

gesät. Die Art der Loch- Platten wurde in Abhängigkeit von der Methode der

Auswertung gewählt.

Für die Versuche mit dem automatischen Zellzählgerät Casy-1 Cell Counter und

Analyser System (Schärfe System, Reutlingen) wurden 24- Loch- Platten ein-

gesetzt. Da die gewünschte Konzentration 5000 Zellen/Loch betrug, wurden je

0,5 ml der verdünnte Zellsuspension in ein Loch pipettiert.

Für die Experimente mit dem BRDU Proliferation Assay (Roche Diagnostics

GmbH, Mannheim) wurden 96- Loch- Platten verwendet. Die festgelegte Kon-

zentration betrug hier 1000 Zellen pro Loch. Daher wurde jeweils 0,1 ml Zell-

suspension in ein Loch pipettiert.

Zunächst wurden die Zellen für 24 Stunden bei 37° in 50 ml/l CO2 inkubiert. Am

Folgetag wurden die Zellen mit Starving Medium behandelt, um die Zellprolife-

ration zu stoppen und somit die Zellen in der gleichen Phase des Zellzyklus zu

synchronisieren. Das Nährmedium mit 10% fötalem Kälberserum wurde dazu

abpipettiert und die Zellen mit PBS gewaschen. Anschließend wurden bei den

24- Loch- Platten je 0,5 ml und bei den 96- Loch- Platten je 0,1 ml des neuen

Mediums pro Loch zugegeben. Dieses wurde analog der, für die jeweilige Zellli-

nie verwendeten, Nährlösung hergestellt; allerdings wurde anstelle von 10% nur

1% fötales Kälberserum zugegeben.

Anschließend wurden die Zellen erneut unter oben genannten Bedingungen

inkubiert.

30

4.2 Somatostatinanaloga

Die Somatostatinanaloga wurden von der Fa. Novartis (Nürnberg) bezogen. Die

Lagerung erfolgte bei -20°C. Octreotid und Pasireotid wurden in einer Konzent-

ration von 10-3 M angesetzt und aliquotiert.

Vor Versuchsbeginn mussten die benötigten Konzentrationen von 10-7 M bis 10-

11 M durch Verdünnung mit Medium jeweils neu hergestellt werden. Zunächst

wurden 10 µl des jeweiligen Somatostatinanalogons in 1 ml Medium pipettiert,

um eine Konzentration von 10-5 M zu erhalten. Anschließend wurden 50 µl die-

ser Mischung mit 4,95 ml Medium bis zur Konzentration 10-7 M verdünnt. Davon

wurden 0,5 ml mit 4,95 ml Medium gemischt, um die Konzentration 10-8 M zu

erhalten. Analog wurden Somatostatinanaloga der Konzentrationen 10-9 M bis

10-11 M hergestellt.

4.3 Versuchsaufbau

Nach 24stündiger Inkubation mit Starving Medium erfolgte die Zugabe der

Somatostatinanaloga. Nach Abgießen des Starving Mediums wurden Octreotid

und Pasireotid in den verschiedenen Konzentrationen mit einer Multipette (Fa.

Eppendorf, Hamburg) auf die entsprechenden Reihen der Platten verteilt.

Die 24- Loch- Platten wurden in sechs Gruppen von je vier Löchern unterteilt.

Dabei wurde in die Löcher der Kontrollgruppe Medium mit 1% fötalem Kälberse-

rum ohne Zusatz von Somatostatinanaloga pipettiert. Neben der Kontrollgruppe

wurden fünf Gruppen angeordnet, bei denen Octreotid oder Pasireotid zugege-

ben wurde. Dazu wurden die hergestellten Somatostatinanaloga in von links

nach rechts abnehmender Konzentration appliziert. Die Abbildung Nr. 9 zeigt

diese Einteilung.

31

Abbildung 9: Einteilung der 24- Loch- Platten in sechs Gruppen von je 4 Lö-

chern, gezeigt anhand eines Versuchsansatzes mit HCT- Zellen

der Passage 15.

Die 96- Loch- Platten waren in 5 Gruppen von je 12 Löchern eingeteilt. Neben

der Kontrollgruppe waren vier Gruppen mit von links nach rechts abnehmender

Konzentration der Somatostatinanaloga angeordnet. Dies ist in der Abbildung

Nr. 10 gezeigt.

32

Abbildung 10: Einteilung der 96- Loch- Platten in fünf Gruppen von je 12 Lö-

chern, gezeigt anhand eines Versuchsansatzes mit HCT- Zellen

der Passage 15.

Nach Applikation der Somatostatinanaloga wurden die Platten im Brutschrank

aufbewahrt. Aufgrund der achtstündigen Halbwertszeit von Octreotid mussten

die Experimente innerhalb der nächsten 48 Stunden dreimal täglich wiederholt

werden. Zur gleichen Behandlung aller Ansätze wurde die Wiederholung an

allen Platten, eingeschlossen der Versuche mit Pasireotid, durchgeführt.

4.4 Versuchsauswertung

4.4.1 Casy-1 Zellzählmethode

48 Stunden nach der erstmaligen Applikation der Somatostatinanaloga wurde

der Teil der Zellen, der für die Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

(Schärfe System, Reutlingen) bestimmt war, mit Trypsin aus den Löchern ge-

löst. Das vollständige Ablösen der Zellen wurde mikroskopisch kontrolliert. An-

33

schließend wurden die Zellen jedes Loches in ein Casy-1 Probenröhrchen zu

10 ml Casyton Lösung (Casyton Verdünnungslösung für Zellkulturen, Schärfe

System, Reutlingen) pipettiert und beides miteinander vermischt.

Vor Beginn der Messungen wurde sichergestellt, dass die Vorratsflasche des

Casy-1 Zellzählgerätes aufgefüllt und die Abfallflasche entleert war. Das zum

Casy-1 Zellzählgerät gehörende LCD- Display zeigt im Menümodus Mess- und

Ausgabeparameter an. Vor dem Start wurden Auswertungsparameter wie

Messkapillare und Messvolumen definiert, um diese für alle Versuche konstant

zu halten. Auch die Skalierung der x- und y- Achse der graphischen Darstellung

der Messergebnisse wurde vorher festgelegt. Diese Einstellungen konnten als

Setup gespeichert werden und für alle nachfolgenden Versuche wieder aufgeru-

fen werden.

Nach Abschluss der Vorbereitungen wurden die Probenröhrchen auf dem Pro-

bensockel so platziert, dass die Messkapillare in die Casyton- Lösung mit den

Zellen eintauchen konnte. Das Probenvolumen wurde mit konstantem Unter-

druck über die Messkapillare angesaugt. Im auf der Abbildung 11 erkennbaren

Sichtfenster sind drei Leuchtdioden angeordnet, die den Füllstand des Steigroh-

res anzeigen. Am unteren Ende des Kapillarkörpers ist ein Rubin mit einer Prä-

zisionsmesspore eingegossen. Nach dreimaliger Messung wird das Ergebnis

auf dem LCD- Display angezeigt.

Das Display dient im Messmodus der Darstellung der Größenverteilung und der

Anzeige der Messergebnisse. Zunächst wird die graphische Darstellung der

Messergebnisse angezeigt. Dabei kann die Auswertung der Größenverteilung

durch zwei positionierbare Cursorpaare festgelegt werden. Diese können so

eingestellt werden, dass vitale Zellen, nicht jedoch Zelldebris bei der Auszäh-

lung berücksichtigt werden. Durch Umschaltung von der graphischen zur nume-

rischen Anzeige können anschließend die Messergebnisse eingesehen werden.

Diese werden vom Gerät absolut als counts (Zellzahl) und als counts/ml

(Zellzahl/ml) angegeben. Unter „total volume“ kann das Gesamtvolumen der

gezählten Partikel im Cursorbereich abgelesen werden.

Diese Messwerte werden folgendermaßen berechnet:

34

Counts = ∑=

CR

CLi

iN

Counts/ml = olungenMeßwiederhMeßvolumen

sfaktorVerdünnung

×

×1000

Total Volume = ∑=

×

CR

CLi

ii NV )( mit Vi = 3

4003

4

× sgrenzeSkalierungiπ

CR: Größenkanal des rechten Cursors

i: Nummer eines Größenkanals (1...200)

CL: Größenkanal des linken Cursors

Ni: Anzahl counts im i-ten Größenkanal

Vi: Volumen eines Partikels im i-ten Größenkanal

Abbildung 11: CASY® 1 Zellzählgerät Model TT. Im Sichtfenster sind drei

Leuchtdioden angeordnet, die den Füllstand des Steigrohres anzeigen. Am un-

teren Ende des Kapillarkörpers ist ein Rubin mit einer Präzisionsmesspore ein-

gegossen. Nach dreimaliger Messung wird das Ergebnis auf dem LCD- Display

angezeigt.

35

Abbildung 12: Graphische Darstellung der Messergebnisse auf dem Display.

Die Auswertung der Größenverteilung kann durch zwei

positionierbare Cursorpaare festgelegt werden.

4.4.2 BRDU Proliferation Assay

Die Auswertung der übrigen Experimente erfolgte mit dem BRDU Proliferation

Assay. Dieser beruht auf dem Einbau des Pyrimidinanalogons 5-Brom-2‘-

desoxyuridin (BrdU) während der Inkubation der Zellen mit BrdU unter Zellkul-

turbedingungen. Nach Fixieren und Lysieren der Zellen wird das eingebaute

BrdU über einen Peroxidase-gekoppelten anti-BrdU-Antikörper detektiert und

quantifiziert. Entstehende Farbstoffe und damit die Absorption sind nach Abzug

des Leerwertes proportional zur Zahl der proliferierenden (während der Inkuba-

tion mit BRDU „markierten“) Zellen in der jeweiligen Mikrokultur.

Wir gingen nach der Anleitung des entsprechenden Kits der Roche Diagnostics

GmbH in Mannheim vor. Am Abend vor dem Auswertungstag wurden pro Loch

10 µl einer Lösung mit brommarkiertem Desoxyuridin (5-Bromo-2‘-

Desoxyuridin) zugegeben, was zu einer BrdU-Endkonzentration von 10 µmol/l

führte. In der über Nacht folgenden Reinkubationszeit vollzog sich der Einbau

des Pyrimidinanalogons BrdU in die DNA proliferierender Zellen. Am nächsten

Morgen wurde das Kulturmedium entfernt. Nach der Denaturierung der Zellen

durch ein mitgeliefertes Schnellfixans erfolgte die Zugabe von hochspezifischen

BrdU-Antikörpern in 100 µl Lösung. Nach weiteren 90 Minuten wurden drei

Waschgänge durchgeführt und durch Zugabe einer mitgelieferten Substratlö-

36

sung eine Reaktion zur Detektion der Immunkomplexe ausgelöst. Diese Reakti-

on wurde nach etwa 20 bis 30 Minuten, erkennbar an der Entwicklung eines

kräftigen Farbtones, mit 25 µl H2SO4 (1 mol/l) gestoppt und unmittelbar an-

schließend die Absorption in einem Multiwell- Spektrophotometer (Fa. Dynex

Technologie, Denkendorf, Gerät mrx II) bei einer Wellenlänge von 450 nm ge-

messen.

4.5 Statistik

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte in dem Programm Microsoft Excel.

Bei jedem Experiment waren die Versuche in Gruppen mit jeweils gleichen Ver-

suchsansätzen unterteilt. Somit wurde innerhalb eines Experiments jeder Ver-

suchsansatz zwischen mindestens 4mal bei Versuchen mit der Casy-1 Zell-

zählmethode und höchstens 12mal bei Versuchen mit BRDU- Elisa ausgeführt.

Aus den Ergebnissen gleicher Ansätze wurden Mittelwert und Standardabwei-

chung ermittelt.

Außerdem wurde die Stärke der Tumorzellinhibition durch die jeweilige Kon-

zentration von Octreotid bzw. Pasireotid durch Vergleich mit den unbehandelten

Zellen der Kontrollgruppe berechnet.

Dabei wurde die folgende Formel verwendet:

Inhibition = 1- (Mittelwert Zellzahl)/ Mittelwert Zellzahl der Negativkontrolle

Die Berechnung des Signifikanzniveaus erfolgte anhand des Student´schen t-

Testes. Mit dem t-Test kann die Signifikanz beim Vergleich stetiger Zielgrößen

geprüft werden, indem die Gleichheit bzw. Verschiedenheit zweier Stichproben

anhand der Differenz ihrer Erwartungswerte gemessen wird. Erwartungswerte

entsprechen Mittelwerten von fiktiven unendlichen Grundgesamtheiten. Die Mit-

telwerte aus Stichproben sind Schätzwerte für die entsprechenden Erwar-

tungswerte. Vor Durchführung eines Signifikanztests muss festgelegt werden,

bei welchem Irrtumsniveau die Nullhypothese abgelehnt werden soll. In unserer

Studie haben wir im Studienprotokoll für das Signifikanzniveau α den allgemein

üblichen Wert von 0,05 (bzw. 5%) festgelegt.

37

5 Ergebnisse

5.1 Allgemeine methodische Aspekte

Die Graphiken wurden nach einem einheitlichen Schema erstellt. Auf der x-

Achse sind die Konzentrationen der applizierten Somatostatinanaloga darge-

stellt. Die Zellen der Negativkontrolle wurden nur in Starving Medium ohne Zu-

satz von Somatostatinanaloga gehalten. Daneben sind die mit Pasireotid bzw.

Octreotid behandelten Zellgruppen dargestellt, wobei die Konzentration der

Somatostatinanaloga von links nach rechts abnimmt.

Auf der y- Achse sind die Messergebnisse jeweils als Mittelwerte aller gleichen

Versuchsansätze dargestellt. Die nicht inhibierten Zellen der Negativkontrolle

liefern dabei einen Referenzwert.

Als Ergebnis der Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode ist das Gesamt-

volumen der gezählten Partikel im Cursorbereich dargestellt. Dieses wird vom

Casy-1 Zellzählgerät automatisch nach folgender Formel berechnet:

Total Volume = ∑=

×

CR

CLi

ii NV )( mit Vi = 3

4003

4

× sgrenzeSkalierungiπ

CR: Größenkanal des rechten Cursors

i: Nummer eines Größenkanals (1...200)

CL: Größenkanal des linken Cursors

Vi: Volumen eines Partikels im i-ten Größenkanal

Ni: Anzahl counts im i-ten Größenkanal

Bei Auswertung mit BRDU- Elisa ist auf der y- Achse die Absorption im Multi-

well- Spektrophotometer dargestellt, die proportional zur proliferativen Aktivität

der Zellen ist.

Bei den dargestellten Graphiken sind die im Student’schen T- Test signifikanten

Ergebnisse mit zwei Sternen gekennzeichnet.

38

5.2 Vorbereitende Versuche

Vor Beginn der Experimente wurden Vorversuche mit verschiedenen Einwirkzei-

ten der Somatostatinanaloga durchgeführt, um die für eine möglichst starke In-

hibition durch Octreotid und Pasireotid optimale Einwirkzeit herauszufinden. Wir

wählten hierfür die Zeitspannen 24, 48 und 72 Stunden aus. Die Vorversuche

wurden mit der Casy-1 Zellzählmethode ausgewertet.

Im Folgenden sind vorbereitende Versuche mit HCT Zellen, HepG2 Zellen und

BON-1 Zellen dargestellt.

5.2.1 Versuche mit Octreotid

5.2.1.1 Vorbereitende Versuche mit HCT Zellen

Bei 24-stündigem Einwirken von Octreotid auf HCT Zellen zeigte nur ein Vor-

versuch eine signifikante Proliferationshemmung. In der gezeigten Graphik la-

gen die Inhibitionen durch 10-7 bzw. 10-9 molares Octreotid bei 24% bzw. 35%

mit p-Werten von 0,036 und 0,054. Bei einem weiteren Versuch war die Inhibi-

tion durch Octreotid aller applizierten Konzentrationen nicht signifikant.

Abbildung 13: Zellüberleben von HCT Zellen bei 24stündiger Einwirkzeit von

Octreotid.

39

Bei zwei Versuchen mit einer Einwirkzeit von 72 Stunden wurde die Proliferation

der HCT Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-9 M bzw. 10-10 M mit

15,2% bzw. 16,5% am stärksten gehemmt. Diese Inhibitionen waren mit p-

Werten von 0,014 und 0,039 signifikant.

Abbildung 14: Zellüberleben von HCT Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit von

Octreotid.

5.2.1.2 Vorbereitende Versuche mit HepG2 Zellen

Bei den HepG2 Zellen wurde in 3 Versuchen mit 24stündiger Einwirkzeit eine

Tumorzellinhibition von maximal 20% bis 35% durch Octreotid der Konzentrati-

on 10-7 M bis 10-9 M nachgewiesen. In der gezeigten Graphik war diese bei ei-

nem p-Wert von 0,0014 signifikant; in den weiteren Versuchen wurden mit p-

Werten von 0,081 und 0,46 bei den maximal inhibitorisch wirkenden Konzentra-

tionen von Octreotid keine signifikanten Ergebnisse erzielt.

40

Abbildung 15: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei ≤ 24stündiger Einwirkzeit

von Octreotid.

Bei einem der Versuche mit 72stündiger Einwirkzeit wurde die stärkste Inhibiti-

on wie bei den meisten Versuchen mit 48stündiger Einwirkzeit durch Octreotid

der Konzentration 10-9 M erreicht. Die Inhibition betrug 26,9% bei einem p-Wert

von 0,026. Bei einem weiteren Versuch lag die maximale Inhibition bei 34,8%

durch Octreotid der Konzentration 10-10 M mit einem p-Wert von 0,039.

41

Abbildung 16: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit von

Octreotid.

5.2.1.3 Vorbereitende Versuche mit BON-1 Zellen

Bei zwei Versuchen mit 24stündiger Einwirkzeit wurde die maximale Proliferati-

onshemmung der BON-1 Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-10 M er-

reicht. Bei dem als Graphik dargestellten Versuchsansatz betrug diese 21,5%

bei einem p-Wert von 0,0024. Ein weiterer Versuch lieferte mit einer 39%igen

Inhibition durch 10-10 molares Octreotid bei einem p-Wert von 0,071 kein signifi-

kantes Ergebnis.

42

Abbildung 17: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei ≤ 24stündiger Einwirkzeit

von Octreotid.

Bei zwei Versuchen mit 72stündiger Einwirkzeit zeigte sich die maximale

Hemmwirkung durch Octreotid der Konzentration 10-8 M und 10-9 M mit 22%

und 26,5% Inhibition. Diese Ergebnisse waren mit p-Werten <0,001 signifikant.

43

Abbildung 18: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit von

Octreotid.

5.2.2 Versuche mit Pasireotid

5.2.2.1 Vorbereitende Versuche mit HCT Zellen

Bei 24stündiger Einwirkzeit von Pasireotid auf HCT Zellen trat bei zwei Versu-

chen keine signifikante Tumorzellinhibition auf. Bei den maximalen Inhibitionen

von 10% bzw. 18% durch Pasireotid der Konzentration 10-8 M bzw. 10-10 M la-

gen die p- Werte bei 0,13 und 0,20.

44

Abbildung 19: Zellüberleben von HCT Zellen bei 24stündiger Einwirkzeit von

Pasireotid.

Bei zwei Versuchen mit 72stündiger Einwirkzeit wurden die stärksten Inhibitio-

nen durch Pasireotid der Konzentration 10-9 M bzw. 10-10 M erzielt. Diese lagen

bei 24,7% und 21,2% und waren mit p-Werten von 0,003 und <0,001 signifikant.

Abbildung 20: Zellüberleben von HCT Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit von

Pasireotid.

45

5.2.2.2 Vorbereitende Versuche mit HepG2 Zellen

Bei drei Versuchen mit einer Einwirkzeit von höchstens 24 Stunden lag die ma-

ximale Inhibition der HepG2 Zellen zwischen 15% und 44% durch Pasireotid

der Konzentration 10-8 M bzw. 10-9 M. Die p-Werte lagen bei 0,050 in der ge-

zeigten Graphik und 0,042 bzw. 0,0063 in den weiteren Versuchen.

Abbildung 21: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei ≤ 24stündiger Einwirkzeit

von Pasireotid.

Nach einer Einwirkzeit von 72 Stunden wurden die HepG2 Zellen durch 10-9

molares Pasireotid mit 26,9% am stärksten in ihrer Proliferation gehemmt. Die-

se Inhibition war mit einem p-Wert von 0,026 signifikant. Bei einem weiteren

Versuch lag die stärkste und mit einem p-Wert von 0,0026 ebenfalls signifikante

Inhibition bei 38,9% und wurde durch Pasireotid der Konzentration 10-10 M er-

zielt.

46

Abbildung 22: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit von

Pasireotid.

5.2.2.3 Vorbereitende Versuche mit BON-1 Zellen

Bei den Vorversuchen mit BON-1 Zellen zeigte sich nach weniger als

24stündiger Einwirkzeit eine signifikante Tumorzellinhibition durch Pasireotid in

allen Konzentrationen. Am stärksten war diese in der gezeigten Graphik durch

Pasireotid der Konzentration 10-9 M mit einer Inhibition von 24,6% und einem p-

Wert von < 0,001. In einem weiteren Experiment wurde die stärkste Proliferati-

onshemmung von 59% durch 10-8 molares Pasireotid erreicht und war mit ei-

nem p-Wert von 0,0016 ebenfalls signifikant.

47

Abbildung 23: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei ≤ 24stündiger Einwirkzeit

von Pasireotid.

Bei einer verlängerten Einwirkzeit von 72 Stunden zeigten sich in 3 Vorversu-

chen Inhibitionen zwischen 35,2% und 46,3% durch Pasireotid der Konzentrati-

on 10-8 M bzw. 10-9 M. Die Tumorzellinhibition war immer signifikant (p- Werte:

0,00046 in der gezeigten Graphik und < 0,001 in den weiteren Versuchen).

Abbildung 24: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit von

Pasireotid.

48

Nachdem sich gezeigt hatte, dass bei den Versuchen mit 48stündiger Einwirk-

zeit im Durchschnitt eine deutlichere Tumorzellinhibition der HCT Zellen und

HepG2 Zellen festgestellt wurde als bei den Versuchen mit einer Einwirkzeit von

nur 24 Stunden und diese Effekte durch eine Verlängerung auf 72 Stunden im

Allgemeinen nicht verstärkt werden konnten, führten wir die folgenden Versuche

mit einer Einwirkzeit von 48 Stunden durch. Eine Ausnahme bildeten die Expe-

rimente mit den BON-1 Zellen. Hier wurden signifikante Ergebnisse mit 24, 48

und 72stündiger Einwirkzeit von Octreotid bzw. Pasireotid erzielt. Wir führten

die Hauptversuche mit 48 und 72 Stunden Einwirkzeit durch.

5.3 Hauptversuche

5.3.1 Antiproliferative Effekte bei HCT Zellen

5.3.1.1 Versuche mit Octreotid

5.3.1.1.1 Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Bei den Versuchen mit HCT Zellen unter Verwendung der Casy-1 Zellzählme-

thode lag die maximale Inhibition durch Octreotid zwischen 10% und 36%. Die

maximalen inhibitorischen Effekte waren über den Konzentrationsbereich 10-7 M

bis 10-10 M verteilt, allerdings wurde die maximale Inhibition schwerpunktmäßig

durch Octreotid der Konzentration 10-8 M und 10-9 M erreicht.

Tabelle 3: Maximale Inhibition der HCT- Zellen durch Octreotid bei Auswer-

tung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p-Wert

1 (14.10.05) 36% bei10-9 M < 0,001

2 (14.10.05) 11% bei 10-10 M 0,21

3 (21.10.05) 22/23% bei 10-9/10-10 M 0,0014

4 (5.11.04) 31% bei 10-7 M 0,066

5 (6.12.04) 10% bei 10-8 M 0,37

49

6 (26.11.04) 34% bei 10-8 M 0,061

7 (8.10.04) 21% bei 10-9 M 0,093

8 (27.10.05) 30% bei 10-9 M 0,0012

Der Mittelwert der maximalen Inhibitionen aus allen Versuchen betrug 24,52%.

In der folgenden Graphik ist exemplarisch ein Versuch mit der Casy-1 Zellzähl-

methode dargestellt:

Abbildung 25: Zellüberleben von HCT Zellen unter Octreotid, ausgewertet mit

der Casy-1 Zellzählmethode.

5.3.1.1.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Bei Auswertung mit BRDU- Elisa lagen die maximalen Inhibitionen zwischen

10% und 38%. Octreotid der Konzentration 10-8 M bzw. 10-9 M hatte den stärks-

ten proliferationshemmenden Effekt auf die HCT Zellen.

50

Tabelle 4: Maximale Inhibition der HCT Zellen durch Octreotid bei Auswer-

tung mit BRDU- Elisa.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert

1 (26.11.04) 18% bei 10-8 M 0,0062

2 (21.10.05) 38% bei 10-8 M < 0,001

3 (14.10.05) 26% bei 10-9 M < 0,001

4 (14.10.05) 18% bei 10-9 M < 0,001

5 (21.10.05) 38% bei 10-9 M < 0,001

6 (21.10.05) 35% bei 10-9 M < 0,001

7 (3.10.05) 26% bei 10-9 M < 0,001

8 (3.10.05) 15% bei 10-9 M < 0,001

9 (3.10.05) 28% bei 10-8 M < 0,001

10 (8.9.05) 14% bei 10-8 M 0,025

11 (8.9.05) 22% bei 10-9 M < 0,001

12 (4.2.05) 10% bei 10-9 M 0,060

13 (28.10.05) 22% bei 10-10 M 0,0037

14 (28.10.05) 23% bei 10-10 M 0,0025

15 (28.10.05) 19% bei 10-10 M 0,0034

16 (28.10.05) 20% bei 10-10 M <0,001

Der Mittelwert aus allen Versuchen lag bei Auswertung mit BRDU- Elisa mit

23,21% im selben Bereich wie mit der Casy-1 Zellzählmethode. Die folgende

Graphik zeigt ein Beispiel aus der Versuchsreihe der Applikation von Octreotid

auf HCT Zellen bei Auswertung mit BRDU- Elisa.

51

Abbildung 26: Zellüberleben von HCT Zellen unter Octreotid, ausgewertet mit

BRDU- Elisa.

5.3.1.2 Versuche mit Pasireotid

5.3.1.2.1 Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Mit Pasireotid wurde eine maximale Inhibition der HCT Zellen zwischen 13%

und 69% erreicht. Diese war durch Pasireotid in einer Konzentration zwischen

10-7 M und 10-9 M am stärksten ausgeprägt. Zusätzlich fiel im Gegensatz zu den

Versuchen mit Octreotid eine plateauartige Wirkung auf. Neben der jeweils am

stärksten inhibitorisch wirkenden Konzentration von Pasireotid setzte sich der

proliferationshemmende Effekt auf den gesamten Bereich zwischen 10-7 M und

10-9 M fort.

Tabelle 5: Maximale Inhibition der HCT Zellen durch Pasireotid bei Auswer-

tung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert

1 (14.10.05) 36% bei 10-7 M < 0,001

2 (14.10.05) 13% bei 10-8 M 0,050

3 (21.10.05) 23% bei 10-9 M < 0,001

52

4 (5.11.04) 60% bei 10-7 M 0,0053

5 (5.11.04) 69% bei 10-7 M 0,0014

6 (6.12.04) 18% bei 10-8 M 0,065

7 (8.10.04) 36% bei 10-9 M 0,015

8 (26.11.04) 50% bei 10-7 M < 0,001

9 (27.10.05) 35% bei 10-7 M < 0,001

Der Mittelwert der maximalen Inhibition durch Pasireotid lag bei Auswertung mit

der Casy-1 Zellzählmethode mit 38,12% in einem höheren Bereich als durch

Octreotid mit 24,52%.

Die Graphik zeigt ein Versuchsergebnis nach Applikation von Pasireotid auf

HCT Zellen und Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Abbildung 27: Zellüberleben von HCT Zellen unter Pasireotid, ausgewertet mit

der Casy-1 Zellzählmethode.

5.3.1.2.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Mit BRDU- Elisa wurden durch Pasireotid maximale Inhibitionen zwischen 14%

und 45% gemessen. Dabei wurde die maximale Inhibition meistens durch

53

Pasireotid der Konzentration 10-9 M erreicht. In einem Experiment wurde durch

10-7 molares Pasireotid eine Inhibition von 85% gemessen.

Tabelle 6: Maximale Inhibition der HCT Zellen durch Pasireotid bei Auswer-

tung mit BRDU- Elisa.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p-Wert

1 (26.11.04) 85% bei 10-7 M < 0,001

2 (21.10.05) 42% bei 10-9 M < 0,001

3 (14.10.05) 31% bei 10-9 M < 0,001

4 (14.10.05) 26% bei 10-9 M < 0,001

5 (21.10.05) 45% bei 10-9 M < 0,001

6 (21.10.05) 45% bei 10-9 M < 0,001

7 (3.10.05) 28% bei 10-9 M < 0,001

8 (3.10.05) 30% bei 10-9 M < 0,001

9 (3.10.05) 38% bei 10-9 M < 0,001

10 (8.9.05) 19% bei 10-9 M 0,014

11 (4.2.05) 14% bei 10-7 M 0,0026

12 (9.12.04) 16% bei 10-8 M 0,0027

13 (28.10.05) 23% bei 10-9 M 0,0032

14 (28.10.05) 24% bei 10-10 M 0,0014

15 (28.10.05) 19% bei 10-9 M 0,0034

16 (28.10.05) 20% bei 10-10 M <0,001

Auch bei Auswertung mit BRDU- Elisa lag der Mittelwert der maximalen Inhibiti-

on bei Einsatz von Pasireotid mit 31,62% deutlich höher als mit Octreotid

54

(23,21%). Die Inhibitionen fielen tendenziell etwas schwächer aus als bei Aus-

wertung mit der Casy-1 Zellzählmethode (Mittelwert 38,12%).

Die nachfolgende Graphik zeigt ein Versuchsergebnis nach Auswertung mit

BRDU- Elisa.

Abbildung 28: Zellüberleben von HCT Zellen unter Pasireotid, ausgewertet mit

BRDU- Elisa.

5.3.2 Antiproliferative Effekte bei HepG2 Zellen

5.3.2.1 Versuche mit Octreotid

5.3.2.1.1 Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Bei den Versuchen mit HepG2 Zellen lag die maximale Proliferationshemmung

durch Octreotid zwischen 16% und 36 %. Meist wurde diese durch 10-8 bzw. 10-

9 molares Octreotid erreicht.

55

Tabelle 7: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Octreotid bei Auswer-

tung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert

1 (14.10.05) 19% bei 10-8 M 0,00018

2 (14.10.05) 16% bei 10-8 M 0,010

3 (21.10.05) 36% bei 10-7 M 0,016

4 (21.5.04) 27% bei 10-9 M 0,25

5 (14.05.04) 34% bei 10-9 M 0,18

6 (07.05.04) 35% bei 10-7 M 0,026

7 (20.11.03) 30% bei 10-8 M 0,0017

8 (1.12.03) 29% bei 10-9 M 0,0074

9 (28.11.04) 20% bei 10-9 M 0,0014

10 (7.5.04) 24% bei 10-8 M 0,081

Der Mittelwert der maximalen Inhibition durch Octreotid betrug 27,25%.

Die folgende Graphik zeigt exemplarisch ein Ergebnis nach Applikation von

Octreotid auf HepG2 Zellen bei Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

56

Abbildung 29: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Octreotid, ausgewertet mit

der Casy-1 Zellzählmethode.

5.3.2.1.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Bei der Auswertung der Versuche an HepG2 Zellen mit BRDU- Elisa lag die

stärkste Inhibition durch Octreotid zwischen 12% und 49%. Die maximale Inhibi-

tion zeigte sich meist durch Octreotid der Konzentration 10-8 M bzw. 10-9 M.

Tabelle 8: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Octreotid bei Auswer-

tung mit BRDU- Elisa.

Versuch Nr. Inhibition p- Wert

1 (3.10.05) 23% bei 10-8 M < 0,001

2 (14.10.05) 12% bei 10-9 M 0,047

3 (21.10.05) 33% bei 10-9 M < 0,001

4 (21.10.05) 49% bei 10-8 M < 0,001

5 (21.10.05) 32 % bei 10-9 M < 0,001

57

6 (3.10.05) 24% bei 10-10 M < 0,001

7 (3.10.05) 12% bei 10-7 M < 0,001

8 (28.10.05) 20% bei 10-9 M < 0,001

9 (28.10.05) 29% bei 10-9 M < 0,001

10 (28.10.05) 15% bei 10-9 M < 0,001

11 (28.10.05) 20% bei 10-8 M < 0,001

Der Mittelwert aus allen Versuchen lag mit 24,76% etwas niedriger als bei Aus-

wertung mit der Casy-1 Zellzählmethode (27,25%).

Exemplarisch ist ein Experiment mit Octreotid, das mit BRDU- Elisa ausgewer-

tet wurde, gezeigt.

Abbildung 30: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Octreotid, ausgewertet mit

BRDU- Elisa.

58

5.3.2.2 Versuche mit Pasireotid

5.3.2.2.1 Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Bei Applikation von Pasireotid auf HepG2 Zellen wirkte Pasireotid der Konzent-

ration 10-9 M mit 15% bis 44% Inhibition am stärksten proliferationshemmend.

Tabelle 9: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Pasireotid bei Aus-

wertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert

1 (14.10.05) 21% bei 10-8 M < 0,001

2 (14.10.05) 20/19% bei 10-8 M /10-9 M < 0,001/< 0,001

3 (21.10.05) 41% bei 10-9 M < 0,001

4 (21.05.04) 30% bei 10-9 M 0,21

5 (14.05.04) 31% bei 10-9 M 0,21

6 (07.05.04) 29% bei 10-8 M 0,042

7 (20.11.03) 35% bei 10-9 M < 0,001

8 (1.12.03) 27% bei 10-9 M 0,0026

9 (28.11.04) 15% bei 10-9 M 0,050

10 (7.5.04) 44% bei 10-8 M 0,0062

Mit Pasireotid wurde eine mittlere Inhibition von 29,27% erreicht. Diese war im

Vergleich zu Octreotid im Durchschnitt etwas stärker (27,25%).

Die folgende Graphik zeigt ein Beispiel für die Inhibition der HepG2 Zellen

durch Pasireotid. Die Auswertung erfolgte anhand der Casy-1 Zellzählmethode.

59

Abbildung 31: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Pasireotid, ausgewertet

mit der Casy-1 Zellzählmethode

5.3.2.2.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Bei Auswertung mit BRDU- Elisa wurden durch Pasireotid Inhibitionen im Be-

reich von 16% bis 54% festgestellt. Meistens war die Proliferationshemmung

durch 10-8 bzw. 10-9 molares Pasireotid am stärksten.

Tabelle 10: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Pasireotid bei Aus-

wertung mit BRDU- Elisa.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert

1 (14.10.05) 16% bei 10-10 M < 0,001

2 (3.10.05) 49% bei 10-8 M < 0,001

3 (14.10.05) 18% bei 10-10 M 0,0053

4 (21.10.05) 36% bei 10-8 M < 0,001

5 (21.10.05) 54% bei 10-8 M < 0,001

6 (21.10.05) 43% bei 10-8 M < 0,001

7 (3.10.05) 43% bei 10-7 M < 0,001

60

8 (3.10.05) 34% bei 10-8 M < 0,001

9 (28.10.05) 40% bei 10-9 M < 0,001

10 (28.10.05) 34% bei 10-9 M < 0,001

11 (28.10.05) 28% bei 10-9 M < 0,001

12 (28.10.05) 30% bei 10-9 M < 0,001

Der Mittelwert der maximalen Inhibition lag mit 35,31% deutlich höher als bei

den Versuchen mit Octreotid (24,76%). Im Vergleich zur Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode (29,27%) war die Inhibition bei Einsatz von BRDU-

Elisa geringfügig stärker.

Exemplarisch ist eine Graphik nach Auswertung mit BRDU- Elisa dargestellt.

Abbildung 32: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Pasireotid, ausgewertet

mit BRDU- Elisa.

61

5.3.3 Antiproliferative Effekte bei BON-1 Zellen

5.3.3.1 mit Octreotid

5.3.3.1.1 1. Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Die maximale Inhibition der BON-1 Zellen zwischen 18% und 41% wurde mit

Octreotid meist in der Konzentration 10-8 M festgestellt.

Tabelle 11: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Octreotid bei Aus-

wertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Werte Einwirkzeit

1 (29.9.04) 24% bei 10-8 M < 0,001 48 h

2 (3.11.04) 25% bei 10-10 M 0,059 72 h

3 (9.11.04) 18% bei 10-8 M 0,0073 48 h

4 (19.11.04) 41% bei 10-10 M 0,026 48 h

5 (10.8.05) 27% bei 10-9 M 0,0015 48 h

6 (9.11.04) 39% bei 10-10 M 0,071 18 h

7 (29.7.05) 27% bei 10-8 M 0,0034 72h

8 (23.1.07) 22% bei 10-10 M 0,0025 24 h

Der Mittelwert der maximalen Proliferationshemmung von BON-1 Zellen durch

Octreotid betrug 27,92% bei Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

In der folgenden Graphik ist ein Beispiel nach Auswertung mit der Casy-1 Zell-

zählmethode dargestellt.

62

Abbildung 33: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Octreotid, ausgewertet mit

der Casy-1 Zellzählmethode.

5.3.3.1.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Bei den Experimenten, die mit BRDU- Elisa ausgewertet wurden, lag die maxi-

male Inhibition zwischen 23% und 57%. Diese wurde hauptsächlich durch

Octreotid der Konzentration 10-8 M bzw. 10-9 M erreicht.

Tabelle 12: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Octreotid bei Aus-

wertung mit BRDU- Elisa.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert Einwirkzeit

1 (22.8.05) 55% bei 10-10 M < 0,001 48 h

2 (9.11.04) 56% bei 10-8 M < 0,001 48 h

3 (19.11.04) 53% bei 10-9 M < 0,001 48 h

4 (28.9.04) 23% bei 10-8 M 0,0013 24 h

63

5 (3.11.04) 57% bei 10-8 M < 0,001 72 h

6 (11.8.05) 47% bei 10-10 M < 0,001 72 h

Nach Auswertung mit BRDU- Elisa lag der Mittelwert der maximalen Inhibition

bei 48,63%.

Exemplarisch ist eine Graphik dargestellt.

Abbildung 34: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Octreotid, ausgewertet mit

BRDU- Elisa.

5.3.3.2 mit Pasireotid

5.3.3.2.1 Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Die maximale Tumorzellinhibition durch Pasireotid reichte von 35% bis 59% und

wurde meist durch 10-8 molares Pasireotid erreicht.

64

Tabelle 13: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Pasireotid bei Aus-

wertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert Einwirkzeit

1 (29.9.04) 56% bei 10-8 M < 0,001 48 h

2 (3.11.04) 45% bei 10-8 M < 0,001 48 h

3 (29.7.05) 46% bei 10-8 M < 0,001 72 h

4 (10.8.05) 35% bei 10-9 M < 0,001 72 h

5 (9.11.04) 59% bei 10-8 M 0,0016 24 h

6 (23.1.07) 25% bei 10-9 M < 0,001 24 h

Der Mittelwert der maximalen Inhibition der BON-1 Zellen durch Pasireotid lag

nach Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode bei 44,78%.

Ein Experiment nach 48stündigem Einwirken von Pasireotid ist als Beispiel dar-

gestellt.

Abbildung 35: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid, ausgewertet

mit der Casy-1 Zellzählmethode.

65

5.3.3.2.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Bei den Experimenten, die mit BRDU- Elisa ausgewertet wurden, ergab sich

durch Pasireotid eine Proliferationshemmung der BON-1 Zellen zwischen 27%

und 73%. Die Konzentration von Pasireotid, bei der die maximale Inhibition ge-

funden wurde, schwankte zwischen 10-7 M und 10-10 M.

Tabelle 14: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Pasireotid bei Aus-

wertung mit BRDU- Elisa.

Versuch Nr. Maximale Inhibition p- Wert Einwirkzeit

1 (22.8.05) 73% bei 10-9 M < 0,001 48 h

2 (9.11.04) 62% bei 10-8 M < 0,001 48 h

3 (19.11.04) 56% bei 10-8 M < 0,001 48 h

4 (28.9.04) 27% bei 10-7 M < 0,001 24 h

5 (3.11.04) 53% bei 10-7 M/

52% bei 10-9 M

< 0,001/< 0,001 72 h

6 (11.8.05) 41% bei 10-10 M < 0,001 72 h

7 (10.8.05) 38% bei 10-10 M < 0,001 48 h

Nach Auswertung mit BRDU- Elisa lag die durchschnittliche maximale Inhibition

mit 50,05% in einem ähnlichen Bereich wie nach Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode.

Die folgende Graphik zeigt ein Beispiel für die Inhibition der BON-1 Zellen durch

Pasireotid nach Auswertung mit BRDU- Elisa.

66

Abbildung 36: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid, ausgewertet

mit BRDU- Elisa.

5.3.3.3 Vergleich zwischen Pasireotid und Octreotid

Um die inhibitorische Wirkung von Pasireotid und Octreotid direkt vergleichen

zu können wurden die Ergebnisse beider Ansätze in einer Graphik dargestellt.

67

Abbildung 37: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid und Octreotid

im direkten Vergleich, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmetho-

de.

Abbildung 38: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid und Octreotid

im direkten Vergleich, ausgewertet mit BRDU- Elisa.

68

Im direkten Vergleich zeigte sich mit beiden Methoden eine deutlich stärkere

Inhibition der BON-1 Zellen durch Pasireotid. Am deutlichsten ist der Unter-

schied bei den Konzentrationen 10-8 M und 10-9 M der Somatostatinanaloga

ausgeprägt. Bei den niedrigeren Konzentrationen nähern sich die

inhibitorischen Wirkungen von Octreotid und Pasireotid etwas an.

5.4 Zusammenfassung der Ergebnisse

5.4.1 Zusammenfassung der antiproliferativen Effekte bei

HCT Zellen

5.4.1.1 Octreotid

5.4.1.1.1 Auswertung mit der Casy- 1 Zellzählmethode

Um zu sehen, in welcher Konzentration Octreotid bei HCT Zellen am stärksten

proliferationshemmend wirkt, ist die durchschnittliche Inhibition für die verschie-

denen Konzentrationen von Octreotid graphisch dargestellt. Die Standardab-

weichung zeigt die Streubreite zwischen den Ergebnissen der einzelnen Expe-

rimente.

69

Abbildung 39: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HCT

Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus allen An-

sätzen.

Beim Vergleich der Mittelwerte zeigt sich, dass die stärkste Proliferationshem-

mung von HCT Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-9 M zu

erreichen ist. Aufgrund der geringeren Streubreite der Ergebnisse bei Octreotid

in der Konzentration 10-9 M ist in der folgenden Graphik die maximale Inhibition

von HCT Zellen durch 10-9 M Octreotid in den verschiedenen Versuchsansätzen

dargestellt.

70

Abbildung 40: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-9 molares Octreotid

in den verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zell-

zählmethode.

Hier zeigt sich, dass die Proliferation von HCT Zellen durch Octreotid bei Aus-

wertung mit der Casy-1 Zellzählmethode durchschnittlich 20% gehemmt wurde,

wobei die Stärke der Inhibition zwischen den verschiedenen Ansätzen variiert.

Da nicht bei allen Ansätzen die stärkste Inhibition durch 10-9 molares Octreotid

gefunden wurde, ist in der nächsten Graphik die jeweils stärkste Inhibition bei

den verschiedenen Versuchen aufgetragen. Bei welcher Konzentration von

Octreotid diese beobachtet wurde, ist jeweils oberhalb der Säulen angegeben.

71

Abbildung 41: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Octreotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Wenn die jeweils stärksten Inhibitionen berücksichtigt werden, liegt die mittlere

Inhibition von HCT Zellen durch Octreotid bei fast 25%.

5.4.1.1.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Auch für die Experimente, die mit dem BRDU Proliferation Assay ausgewertet

wurden, wurden die mittlere Inhibition und die Standardabweichung für jede

Konzentration von Octreotid berechnet und graphisch dargestellt.

72

Abbildung 42: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HCT

Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen.

Auch bei Auswertung der Ergebnisse mit BRDU- Elisa gelingt die stärkste Inhi-

bition der HCT Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-9 M.

73

Abbildung 43: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-9 molares Octreotid

in den verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa.

Die Darstellung der Inhibition durch Octreotid der Konzentration 10-9 M in den

verschiedenen Versuchsansätzen ergibt auch bei Auswertung mit BRDU-Elisa

eine mittlere Inhibition von etwa 20%.

74

Abbildung 44: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Octreotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit BRDU-Elisa.

Bei Berücksichtigung der maximalen Inhibition unabhängig von der Konzentra-

tion von Octreotid liegt die durchschnittliche Inhibition bei 23 % und die Streu-

breite der Ergebnisse nimmt etwas ab.

5.4.1.2 Pasireotid

5.4.1.2.1 Auswertung mit der Casy- 1 Zellzählmethode

Die folgende Graphik zeigt die mittlere Inhibition und Standardabweichung bei

Applikation von Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-11 M auf HCT- Zellen.

75

Abbildung 45: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HCT

Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus allen An-

sätzen.

Die maximale Inhibition wird durch Pasireotid im Konzentrationsbereich 10-7 M

bis 10-8 M erreicht. Aufgrund der geringeren Streubreite wurden die Ergebnisse

der verschiedenen Versuchsansätze mit 10-8 molarem Pasireotid herausgegrif-

fen und in der nächsten Graphik dargestellt.

76

Abbildung 46: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-8 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode.

Die Inhibition der HCT- Zellen durch Pasireotid in der am effektivsten wirkenden

Konzentration ist bei einem Mittelwert um 25% stärker ausgeprägt als mit

Octreotid.

77

Abbildung 47: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Pasireotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Bei Verwendung der stärksten Inhibition unabhängig von der Konzentration von

Pasireotid nähert sich die durchschnittliche Proliferationshemmung an 40% an.

5.4.1.2.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Die Abbildung 51 zeigt die durchschnittliche Proliferationshemmung der HCT

Zellen durch Pasireotid der verschiedenen Konzentrationen bei Auswertung mit

BRDU- Elisa.

78

Abbildung 48: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HCT

Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen.

Bei Auswertung mit der BRDU- Elisa Methode wurden die HCT Zellen durch

10-9 molares Octreotid am stärksten inhibiert.

79

Abbildung 49: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit BRDU-

Elisa.

Auch mit BRDU- Elisa liegt die mittlere Inhibition bei 25%.

80

Abbildung 50: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Pasireotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa.

Bei Berücksichtigung der jeweils stärksten Inhibition liegt die durchschnittliche

Proliferationshemmung bei über 30%.

5.4.2 Zusammenfassung der antiproliferativen Effekte bei

HepG2 Zellen

5.4.2.1 Octreotid

5.4.2.1.1 Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

Die mittlere Proliferationshemmung der HepG2 Zellen durch Octreotid der je-

weils angegebenen Konzentration ist für die mit der Casy-1 Zellzählmethode

ausgewerteten Experimente in der nächsten Graphik dargestellt.

81

Abbildung 51: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HepG2

Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus allen An-

sätzen.

Bei Betrachtung der Proliferationshemmung von HepG2 Zellen durch Octreotid

fällt auf, dass diese durch 10-9 molares Octreotid am stärksten ausgeprägt ist.

82

Abbildung 52: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode.

Bei der Darstellung aller Ergebnisse mit 10-9 molarem Octreotid zeigt sich eine

mittlere Inhibition von etwa 20%.

Abbildung 53: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Octreotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

83

Bei Darstellung der jeweils stärksten Inhibitionen bei jedem Versuchsansatz

unabhängig von der Konzentration liegt die durchschnittliche Inhibition bei etwa

27% und die Streubreite der Ergebnisse nimmt ab.

5.4.2.1.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Auch für die mit BRDU- Elisa ausgewerteten Experimente wurden für jede Kon-

zentration von Octreotid die mittlere Inhibition und die Standardabweichung be-

rechnet.

Abbildung 54: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HepG2

Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen.

Auch bei Auswertung mit BRDU- Elisa wirkt Octreotid in der Konzentration 10-9

M am stärksten inhibitorisch.

84

Abbildung 55: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit BRDU-

Elisa.

Die durchschnittliche Inhibition durch Octreotid in dieser Konzentration liegt

wiederum bei etwa 20%.

Abbildung 56: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Octreotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa.

85

Auch hier liegt die mittlere Proliferationshemmung bei Berücksichtigung der je-

weils stärksten Inhibition jedes Versuchsansatzes bei etwa 25%.

5.4.2.2 Pasireotid

5.4.2.2.1 Auswertung mit der Casy- 1 Zellzählmethode

Zum Vergleich ist die mittlere Inhibition mit Standardabweichung durch

Pasireotid der verschiedenen Konzentrationen dargestellt.

Abbildung 57: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HepG2

Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus allen An-

sätzen.

Bei Einsatz von Pasireotid ist die Proliferationshemmung der HepG2 Zellen

ebenfalls bei Anwendung des Somatostatinanalogons in der Konzentration 10-9

M am stärksten.

86

Abbildung 58: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode.

Die durchschnittliche Inhibition bei allen Versuchsansätzen liegt hier bei etwa

25%.

Abbildung 59: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Pasireotid der je-

weils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den ver-

schiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmetho-

de.

87

Bei Verwendung der maximalen Inhibitionen unabhängig von der Konzentration

liegt die durchschnittliche Inhibition bei geringerer Streubreite bei fast 30%.

5.4.2.2.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Die Abbildung 63 zeigt die mittlere Inhibition durch Pasireotid in den verschie-

denen Konzentrationen bei Auswertung mit BRDU- Elisa.

Abbildung 60: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von HepG2

Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen.

Bei Auswertung mit BRDU- Elisa wird die maximale Inhibition ebenfalls durch

Pasireotid der Konzentration 10-9 M erreicht.

88

Abbildung 61: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit BRDU-

Elisa.

Im Durchschnitt liegt die maximale Proliferationshemmung der HepG2 Zellen

durch Pasireotid bei knapp über 30%.

Abbildung 62: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Pasireotid der je-

weils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den ver-

schiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa.

89

Um die Streubreite der Ergebnisse zu verringern wurden auch hier die jeweils

maximalen Inhibitionen unabhängig von der Konzentration von Pasireotid dar-

gestellt. Die mittlere Inhibition liegt dabei um 35%.

5.4.3 Zusammenfassung der antiproliferativen Effekte bei

BON-1 Zellen

5.4.3.1 Octreotid

5.4.3.1.1 Auswertung mit der Casy- 1 Zellzählmethode

Die Abbildung 66 zeigt die mittlere Inhibition der BON-1 Zellen durch Octreotid

der Konzentration 10-7 M bis 10-11 M.

Abbildung 63: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von BON-1

Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-11 M, aus-

gewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus allen An-

sätzen.

Octreotid inhibiert die Proliferation von BON-1 Zellen in der Konzentration 10-8

M bis 10-10 M am stärksten. Aufgrund der geringeren Streubreite sind im Fol-

genden alle Ergebnisse mit 10-9 molarem Octreotid dargestellt.

90

Abbildung 64: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode.

Durch 10-9 molares Octreotid konnte eine Proliferationshemmung von etwa 20%

erreicht werden. Die Inhibition bei Berücksichtigung der jeweils am stärksten

wirksamen Konzentration in allen Versuchen ist in der nächsten Graphik darge-

stellt.

91

Abbildung 65: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Octreotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode.

Bei Darstellung der jeweils maximalen Inhibitionen in allen Versuchsansätzen

liegt die mittlere Inhibition bei etwa 28%.

5.4.3.1.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

Die nächste Abbildung zeigt die durchschnittliche Proliferationshemmung der

BON-1 Zellen durch Octreotid bei Auswertung mit BRDU- Elisa.

92

Abbildung 66: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von BON-1

Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10 M, aus-

gewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen.

Bei Auswertung mit BRDU- Elisa wird die Proliferation der BON-1 Zellen durch

10-8 molares Octreotid am stärksten inhibiert.

93

Abbildung 67: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-8 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit BRDU-

Elisa.

Bei Berücksichtigung aller Experimente, die mit BRDU- Elisa ausgewertet wur-

den, liegt die mittlere Inhibition durch 10-8 molares Octreotid bei etwa 38%.

Abbildung 68: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Octreotid der jeweils

oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den verschie-

denen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa.

Bei Berücksichtigung der jeweils maximalen Inhibition unabhängig von der Kon-

zentration ist die Streubreite der Ergebnisse abgesehen von dem Versuchser-

gebnis Nr. 4 gering. Die mittlere Proliferationshemmung liegt bei 48,63%.

5.4.3.2 Pasireotid

5.4.3.2.1 Auswertung mit der Casy- 1 Zellzählmethode

Zum Vergleich ist die mittlere Proliferationshemmung der BON-1 Zellen durch

Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-11 M dargestellt.

94

Abbildung 69: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von BON-1

Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-11 M, aus-

gewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus allen An-

sätzen.

Die BON-1 Zellen wurden durch 10-8 und 10-11 molares Pasireotid am stärksten

in ihrer Proliferation inhibiert, wobei die Standardabweichung der Ergebnisse

mit 10-8 molarem Pasireotid wesentlich geringer ist.

95

Abbildung 70: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-8 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode.

Durch 10-8 molares Pasireotid wurden die BON-1 Zellen durchschnittlich über

40% in ihrer Proliferation gehemmt. Zusätzlich ist in der folgenden Graphik die

maximale Inhibition jedes Versuchsansatzes dargestellt. Die jeweilige Konzent-

ration von Pasireotid ist wieder oberhalb der Säulen angegeben.

96

Abbildung 71: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Pasireotid der je-

weils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den ver-

schiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmetho-

de.

Unter Berücksichtigung der jeweils stärksten Inhibition liegt die durchschnittliche

Proliferationshemmung der BON-1 Zellen durch Pasireotid bei etwa 45%.

5.4.3.2.2 Auswertung mit BRDU- Elisa

In der Abbildung 72 ist die durchschnittliche Inhibition der BON-1 Zellen durch

Pasireotid bei Auswertung der Experimente mit BRDU- Elisa dargestellt.

97

Abbildung 72: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von BON-1

Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-11 M, aus-

gewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen.

Auch bei Auswertung mit BRDU- Elisa ist Pasireotid bei BON-1 Zellen in der

Konzentration 10-9 M am stärksten inhibitorisch wirksam.

98

Abbildung 73: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit BRDU-

Elisa.

Die mittlere Proliferationshemmung der BON-1 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid liegt bei Auswertung mit BRDU- Elisa bei etwa 40%.

99

Abbildung 74: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Pasireotid der je-

weils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den ver-

schiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa.

Bei Darstellung der jeweils stärksten Inhibitionen liegt diese bei 50%.

5.4.4 Vergleich des antiproliferativen Effektes von Octreotid

und Pasireotid bei den drei Zelllinien in vitro

Die folgende Tabelle fasst die Versuchsergebnisse mit Pasireotid verglichen mit

Octreotid zusammen.

100

Tabelle 15: Inhibition durch Pasireotid verglichen mit der Inhibition durch

Octreotid; die berücksichtigte Konzentration der

Somatostatinanaloga ist jeweils angegeben.

Zellart Methode der

Auswertung

Mittelwert Inhi-

bition (%) durch

Pasireotid

(Konzentration)

Mittelwert Inhi-

bition (%) durch

Octreotid (Kon-

zentration)

Inhibition

Pasireotid/

Inhibition

Octreotid

HCT Casy 25,70 (10-8 M) 20,37 (10-9 M) 1,26

BRDU 25,82 (10-9 M) 19,66 (10-9 M) 1,31

HepG2 Casy 25,58 (10-9 M) 20,83 (10-9 M) 1,23

BRDU 32,68 (10-9 M) 19,21 (10-9 M) 1,70

BON-1 Casy 41,07 (10-8 M) 19,91 (10-9 M) 2,06

BRDU 39,34 (10-9 M) 37,91 (10-8 M) 1,04

Die HCT- Zellen wurden bei Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode durch

Pasireotid um den Faktor 1,26 stärker inhibiert als durch Octreotid, bei Auswer-

tung mit BRDU- Elisa um den Faktor 1,31. Insgesamt ergibt sich somit bei HCT-

Zellen eine durchschnittlich 1,29fach stärkere Inhibition bei Einsatz von

Pasireotid.

Die HepG2 Zellen wurden bei Verwendung der automatischen Zellzählung mit

dem Casy-1 Zellzählgerät durch Pasireotid 1,23mal so stark in ihrer Proliferati-

on inhibiert wie durch Octreotid. Bei Auswertung mit BRDU- Elisa ergab sich

eine 1,7fach stärkere Inhibition. Insgesamt war die Proliferationshemmung

durch Pasireotid 1,47mal so effektiv wie durch Octreotid.

Die BON-1 Zellen wurden bei Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

durch Pasireotid mehr als doppelt so stark in ihrer Proliferation gehemmt wie

durch Octreotid. Dies bestätigte sich bei Auswertung der Experimente mit

101

BRDU- Elisa nicht. Hier war die Proliferationshemmung kaum stärker als mit

Octreotid. Im Durchschnitt war Pasireotid 1,55fach stärker inhibitorisch wirksam.

In der folgenden Graphik sind alle Ergebnisse mit den Somatostatinanaloga in

der Konzentration 10-9 M dargestellt, da Octreotid und Pasireotid in der Mehr-

zahl der Versuche in dieser Konzentration am stärksten inhibitorisch wirksam

waren.

Abbildung 75: Vergleich der Proliferationshemmung durch Pasireotid und

Octreotid der Konzentration 10-9 M bei BON-1 Zellen, HCT Zellen

und HepG2 Zellen unter Einsatz der Casy-1 Zellzählmethode und

BRDU- Elisa.

Bei allen Versuchen wurde durch Pasireotid eine im Vergleich stärkere Prolife-

rationshemmung erzielt. Aufgrund der Streubreite der Ergebnisse ist diese nicht

immer signifikant; die Tendenz zur stärkeren Inhibition ist jedoch unabhängig

von der Zellart und unabhängig von der Methode der Auswertung immer vor-

handen.

Um die Ergebnisse der Versuchsreihen, bei denen die Somatostatinanaloga in

einer anderen Konzentration stärker wirksam waren, gleichwertig zu berück-

sichtigen, sind in der folgenden Tabelle die jeweils stärksten Proliferationshem-

102

mungen unabhängig von der Konzentration des Somatostatinanalogons darge-

stellt.

Tabelle 16: Inhibition durch Pasireotid verglichen mit der Inhibition durch

Octreotid; berücksichtigt werden die jeweils stärksten Inhibitionen

unabhängig von der Konzentration der Somatostatinanaloga.

Zellart Methode der

Auswertung

Mittelwert Inhi-

bition durch

Pasireotid (%)

Mittelwert Inhi-

bition durch

Octreotid (%)

Inhibition

Pasireotid/

Inhibition

Octreotid

HCT Casy 38,12 24,52 1,55

BRDU 31,62 23,21 1,36

HepG2 Casy 29,27 27,25 1,07

BRDU 35,31 24,76 1,43

BON-1 Casy 44,78 27,92 1,60

BRDU 50,05 48,63 1,03

Auch hier zeigt sich eine durchweg stärkere Inhibition durch Pasireotid. Am

deutlichsten ist diese bei den HCT Zellen. Bei Auswertung mit der Casy-1 Zell-

zählmethode ist die Inhibition durch Pasireotid 1,55fach und bei Auswertung mit

BRDU- Elisa 1,36fach stärker. Insgesamt ergibt sich eine 1,46fach stärkere In-

hibition durch Pasireotid.

Bei den HepG2- Zellen ist die Proliferationshemmung durch Pasireotid bei Ein-

satz des Casy-1 Zellzählgerätes um den Faktor 1,07 und bei Auswertung mit

BRDU- Elisa um den Faktor 1,43 stärker. Durchschnittlich zeigt sich eine

1,25fach stärkere Proliferationshemmung bei Einsatz von Pasireotid verglichen

mit Octreotid.

103

Bei den BON-1 Zellen ergibt die Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode

das deutlichere Ergebnis. Hier erweist sich Pasireotid als 1,6fach stärker

inhibitorisch wirksam. Bei Auswertung mit BRDU- Elisa zeigt sich bei einer

1,03fach stärkeren Wirkung von Pasireotid kein signifikanter Unterschied. Ins-

gesamt war durch Pasireotid eine 1,32fach effektivere Tumorzellinhibition mög-

lich.

Die folgende Graphik veranschaulicht diese Ergebnisse:

Abbildung 76: Vergleich der Proliferationshemmung durch Pasireotid und

Octreotid bei BON-1 Zellen, HCT Zellen und HepG2 Zellen unter

Einsatz der Casy-1 Zellzählmethode und BRDU- Elisa.

104

6 Diskussion

6.1 Fehlerbetrachtung

Um mögliche Fehlerquellen zu erkennen und zu vermeiden mussten zahlreiche

Faktoren aus verschiedenen Bereichen beachtet werden.

6.1.1 Wachstumsverhalten der Zellen

Zellen in Zellkulturen reagieren in den einzelnen Phasen der Wachstumskurve

verschieden auf wachstumshemmende Substanzen. Um zu erreichen, dass

sich die meisten Zellen vor Versuchsbeginn in der gleichen Phase des Zellzyk-

lus befanden, wurden die Zellen einen Tag vor Versuchsbeginn mit Hilfe von

Starving Medium synchronisiert. Durch das Passagieren der Zellen 2 bis 3 Tage

vor Versuchsbeginn konnte erreicht werden, dass sich diese größtenteils in der

logarithmischen Wachstumsphase befanden.

Bei zu dichtem Aussäen der Zellen und auch durch das Passagieren können

sich deren Eigenschaften zum Beispiel bezüglich der Rezeptorexpression ver-

ändern. Deshalb wurde die Zelldichte täglich überprüft und zu dichte Zellrasen

auf mehrere Kulturflaschen verteilt. Um große Unterschiede in der Passagezahl

zu vermeiden wurden regelmäßig Zellen eingefroren. So konnten immer wieder

Zellen mittlerer Passagezeit aufgetaut und eingesetzt werden.

Trotz aller Maßnahmen kann unterschiedliches Verhalten der Zellen in ver-

schiedenen Platten und damit bei evtl. unterschiedlichen Umweltbedingungen

nicht hundertprozentig ausgeschlossen werden. Um wirklich identische Ver-

suchsbedingungen im direkten Vergleich zwischen Pasireotid und Octreotid

herzustellen, wurden zur Kontrolle auch Versuche mit den beiden Substanzen

in einem Ansatz durchgeführt.

Eine weitere Fehlerquelle besteht in der ungleichen Verteilung der Zellzahl auf

die verschiedenen Löcher innerhalb einer Platte. Um dies zu vermeiden achte-

ten wir darauf, das abzentrifugierte Zellpallett ausreichend zu lösen, gut mit

Medium zu vermischen und diesen Vorgang bei der Verteilung auf die Platten

ständig zu wiederholen.

105

6.1.2 Umweltbedingungen

Um möglichst konstante Umweltbedingungen zu erhalten achteten wir darauf,

alle Produkte jeweils von denselben Firmen zu beziehen.

Bei abweichenden Ergebnissen versuchten wir mögliche Fehlerquellen zu eru-

ieren. Beispielsweise zeigten sich die inhibitorischen Effekte von Pasireotid und

Octreotid auf die Tumorzellen nach Verwendung schon länger gelagerter

Somatostatinanaloga nicht mehr in dem Ausmaß, wie bei den vorherigen Ver-

suchen dokumentiert. Dieses Problem war nach dem Austausch der Substan-

zen wieder behoben.

Ein weiterer zu beachtender Umweltfaktor sind die Brutschrankverhältnisse, die

bei 37°C, 5% CO2 und feuchtigkeitsgesättigter Luft konstant gehalten wurden.

Die Zeit außerhalb des Brutschranks war auf das nötigste beschränkt.

6.1.3 Pipettierfehler

Beim Aussähen der Zellen und bei der Durchführung der Experimente mussten

Pipettierfehler vermieden werden.

Beim Ausimpfen führen diese zu einer ungleichen Verteilung der Zellen und

damit zu unterschiedlichen Zellzahlen in den verschiedenen Löchern.

Wenn bei den Versuchen nicht exakt pipettiert wird, werden vom Soll abwei-

chende Konzentrationen von Octreotid und Pasireotid auf die Zellen appliziert.

Durch Verwendung einer Eppendorf Pipette mit einstellbarem zu pipettierendem

Volumen z.B. 0,1 ml bei Verteilung der Zellen auf die 96- Loch- Platten und 0,5

ml bei Verteilung auf die 24- Loch- Platten wurde versucht, das Risiko für Fehler

dieser Art zu minimieren.

6.1.4 Fehler bei der Auswertung

Bei der Zellzählung mit der Casy-1 Zellzählmethode können Messfehler auftre-

ten.

Zum einen zählt das Gerät auch Verunreinigungen mit. Wichtig sind das gründ-

liche Reinigen und Spülen des Gerätes vor Versuchsbeginn, um noch vorhan-

106

dene Zellen aus dem Gerät zu entfernen und die Wiederholung des Reini-

gungsvorganges zwischen den Messungen, vor allem beim Wechsel zwischen

Proben mit verschiedenen Konzentrationen von Pasireotid bzw. Octreotid.

Außerdem besteht das Problem der Aggregation von Zellen und dadurch der

Unterbewertung der Zellkonzentration im Ansatz. Diese Gefahr wird vom Her-

steller durch eine integrierte Aggregationskorrektur des Casy Models TT ver-

mindert. Der Aggregationsgrad der Zellen wird ermittelt und bei der Berechnung

der Zellkonzentration automatisch berücksichtigt. Als zusätzliche manuelle

Maßnahme wendeten wir das Schütteln der einzelnen Proberöhrchen jeweils

vor Beginn der Messung an.

Bei der Auswertung der Versuche mit BRDU- Elisa können fehlerhafte Messun-

gen bei unzureichendem Einwirken der Substratlösung durch vorzeitige Applika-

tion des H2SO4 auftreten. Daher warteten wir die Entwicklung eines tiefblauen

Farbtones vor Beginn der Messung ab, notierten die Zeitdauer und hielten die

Einwirkzeit bei allen Ansätzen konstant.

6.2 Methodenvergleich

Der BrdU- Assay misst den Einbau eines markierten Nukleotids in die DNA der

Tumorzelllinien. Die Auswertung erfolgt über zahlreiche nachgeschaltete Reak-

tionen. Die entstehenden Farbstoffe und damit die Absorption sind nach Abzug

des Leerwertes proportional zur Zahl der proliferierenden Tumorzellen.

Bei der Casy-1 Zellzählmethode werden die Tumorzellen aus jedem Loch in ein

Casy-1 Probenröhrchen zu 10 ml Casyton- Lösung pipettiert. Über eine Präzisi-

onsmesspore erfolgt die automatische Zählung der Tumorzellen jedes Proben-

röhrchens. Nach dreimaliger Messung wird das Ergebnis auf dem LCD- Display

angezeigt.

107

Tabelle 17: Vergleich der Methoden.

Vergleichspunkt Casy-1 Zellzählmethode BRDU- Elisa

Gemessener Parameter Automatische Zählung

der Tumorzellen

Messung der Absorption

entstehender Farbstoffe;

diese ist proportional zur

Zahl der proliferierenden

Tumorzellen

Fehlerquellen - Aggregation von Zellen

- Mitzählen von Verun-

reinigungen

Vorzeitige Messung vor

ausreichendem Einwir-

ken der Substratlösung

Um zu überprüfen, ob mit den beiden Methoden der Auswertung ähnliche Er-

gebnisse erzielt wurden, sind diese in der folgenden Tabelle und Graphik im

direkten Vergleich gegenübergestellt.

Tabelle 18: Vergleich der Ergebnisse mit den verschiedenen Methoden der

Auswertung. Dabei wurden die jeweils stärksten Inhibitionen un-

abhängig von der Konzentration der Somatostatinanaloga berück-

sichtigt.

Zellart Methode Mittelwert der ma-

ximalen Inhibition

durch Pasireotid

Mittelwert der maxi-

malen Inhibition

durch Octreotid

HCT Zellen Casy-1 Zell-

zählmethode

38,12% 24,52%

HCT Zellen BRDU- Elisa 31,62% 23,21%

HepG2 Zellen Casy-1 Zell-

zählmethode

29,27% 27,25%

HepG2 Zellen BRDU- Elisa 35,31% 24,76%

108

BON-1 Zellen Casy-1 Zell-

zählmethode

48,80% 29,17%

BON-1 Zellen BRDU- Elisa 50,05% 48,63%

Abbildung 77: Methodenvergleich: Auswertung mit der Casy- 1 Zellzählmethode

versus Auswertung mit BRDU- Elisa

Mit beiden Methoden wurden verschiedene Parameter gemessen. Dennoch

wurden bei der Auswertung mit BRDU- Elisa und dem Casy-1 Zellzählgerät

ähnliche Ergebnisse erzielt. Bei den Versuchen mit BON-1 Zellen und Prolifera-

tionshemmung durch Octreotid zeigte die Auswertung mit BRDU- Elisa eine

etwa 20% stärkere Inhibition. Bei allen anderen Versuchen lagen die Ergebnis-

se mit den beiden Methoden sehr eng beieinander, wobei zum Teil die Casy-1

Zellzählmethode und teilweise die Auswertung mit BRDU- Elisa quantitativ et-

was deutlichere Ergebnisse lieferte.

6.3 Wirkunterschiede bezüglich der verschiedenen

Konzentrationen von Octreotid und Pasireotid

Die Somatostatinanaloga waren in den durchgeführten Versuchen bei Applikati-

on auf die HepG2 Zellen in der Konzentration 10-9 M am wirksamsten, bei den

109

anderen Tumorzelllinien in den Konzentrationen 10-8 M und 10-9 M. Die 10-8 M

und 10-9 molaren Somatostatinanloga schienen zur Absättigung der von den

Tumorzellen exprimierten Somatostatinrezeptoren zu führen, so dass durch hö-

her konzentrierte Somatostatinanaloga keine besseren Effekte mehr erzielt

werden konnten. Geringere Konzentrationen führten in den durchgeführten Ver-

suchen zu einer weniger starken Proliferationshemmung, z.B. durch eine nicht

ausreichende Absättigung der Rezeptoren.

6.4 Klinischer Einsatz der Somatostatinanaloga

6.4.1 Klinischer Einsatz von Octreotid

Octreotid wurde in den meisten Ländern zur Verbesserung der Symptomatik

durch Hormonhypersekretion bei Patienten mit Karzinoiden und endokrinen

Pankreastumoren sowie bei Akromegalie zugelassen.

Insgesamt wurden in den letzten dreißig Jahren viele Studien zur Wirkung und

Verträglichkeit von Octreotid bei gastrointestinalen Tumoren durchgeführt. Die-

se sind in der Tabelle Nr.1 zusammengestellt (nach Delaunoit et al, 2005, [11]).

Der Therapieerfolg wurde radiologisch, nach der Wirkung auf die Hormonsekre-

tion oder nach beiden Kriterien beurteilt. Dabei entspricht das objektive Anspre-

chen auf die Therapie einem Rückgang der Tumormasse in der Bildgebung

(OR, „objective response“) oder einem Tumorstillstand (SD, „stable disease“).

Biochemische Wirkung (BR, „biochemical response“) ist definiert als eine Ab-

nahme der Tumormarker um mindestens 50% und symptomatisches Anspre-

chen (SR, „symptomatic response“) als Verbesserung der Symptome bedingt

durch die Hypersekretion von Hormonen bzw. bei nicht Hormon- sezernieren-

den Tumoren als Verbesserung der Symptome bedingt durch die Tumorlast.

110

Tabelle 19: Zusammenfassung der in den letzten dreißig Jahren durchgeführ-

ten Studien mit Octreotid bei Patienten mit

gastroenteropankreatischen Tumoren.

Referenz Patien-

tenzahl

Substanz Dosierung OR

(%)

SD

(%)

BR

(%)

SR

(%)

Arnold et al,

1996, [3]

52 Octreotid 200 µg 3

x/d

0 36,5 74 -

Maton et al,

1989, [44]

107 Octreotid Verschie-

dene

7,5 39 79,4 67,3

Kvols et al,

1987, [32]

22 Octreotid 150-500

µg 3x/d

- - 68,2 100

Ruszniewski

et al, 1993,

[63]

4 Octreotid 200 µg

2x/d

- - 75 100

Eriksson et

al, 1990, [14]

14 Octreotid 100 µg 2-

3x/d

28,6 21,4 28,6 -

Eriksson et

al, 1993, [15]

19 Octreotid 100 µg

2x/d

- 31,6 31,6 -

Di Bartolomeo

et al, 1996,

[12]

58 Octreotid 500-1000

µg 3x/d

3 46,5 77 73

Saltz et al,

1994, [64]

34 Octreotid 250 µg

3x/d

0 50 71

BR+

SR

-

Ricci et al,

2000, [60]

15 LAR-

Octreotid

20 mg/ Mo 7 40 41 82

Shojamanesh 15 LAR- 20-30 6 47 - -

111

et al, 2002,

[69]

Octreotid mg/Mo

Tomassetti et

al, 1999, [72]

16 LAR-

Octreotid

20 mg/Mo 0 87,5 81 100

Rubin et al,

1989, [62]

26 vs

22/20/25

Octreotid

vs LAR-

Octreotid

300-900

µg/d vs

10/20/30

mg/Mo

- - - 58 vs

67/71

/62

Zusammenfassend konnte durch den Einsatz von Octreotid subkutan in einer

Dosis zwischen 200 µg und 3000 µg pro Tag zu 60% eine Linderung der Symp-

tome, zu 70% eine Reduktion der Tumormarker um mehr als 50% und zu 8%

eine signifikante Verringerung der Tumormasse erreicht werden. Auch von einer

kleinen Anzahl Patienten mit partieller Tumorregression und einigen wenigen

Patienten mit kompletter Tumorregression wurde berichtet. Bei einem großen

Anteil der Patienten konnte der Krankheitsverlauf stabilisiert werden [49].

Die Therapie mit Octreotid hat sich als relativ nebenwirkungsarm erwiesen.

Häufig auftretende unerwünschte Effekte sind Übelkeit, abdominelle Krämpfe,

Diarrhoe und Fettstühle, wahrscheinlich bedingt durch eine vorübergehende

Inhibition der exokrinen Pankreassekretion. Sie beginnen einige Stunden nach

der ersten subkutanen Injektion, sind dosisabhängig und innerhalb der ersten

Behandlungswochen spontan rückläufig. Grund dafür ist wahrscheinlich eine

lokale Adaptation im Gastrointestinaltrakt und im exokrinen Pankreas. Auch ei-

ne Verschlechterung der Glukosetoleranz durch eine vorübergehende Inhibition

der Insulinsekretion wurde beobachtet. Die einzige länger anhaltende Neben-

wirkung ist die Entwicklung von Gallensteinen, verursacht durch eine Hemmung

der Gallenblasenkontraktion und Entleerung sowie der Cholecystokinin Sekreti-

on und durch die gesteigerte intestinale und biliäre Produktion von

Desoxycholsäure [41].

112

Die schnelle Adaptation an die Octreotid- Therapie erweist sich als Vorteil be-

züglich der geringen Nebenwirkungsrate, jedoch als begrenzend auf den The-

rapieerfolg. Im Rahmen einer Studie mit 57 Karzinoid- Patienten wurde die

Octreotid- Therapie bei 23 Patienten nach einer Zeitdauer zwischen einer Wo-

che und 12,5 Monaten wegen Erfolglosigkeit beendet, während die Symptome

der anderen Patienten für einen Zeitraum von bis zu 2,5 Jahren gebessert wer-

den konnten. Die durchschnittliche Wirkungsdauer von Octreotid in diesem Pa-

tientenkollektiv betrug nur ein Jahr [45].

6.4.2 Klinischer Einsatz von Pasireotid

In vitro konnte eine stärkere Proliferationshemmung aller verwendeten Tumor-

zelllinien durch Pasireotid im Vergleich zu Octreotid gezeigt werden. Pasireotid

ist bisher nur im Rahmen von Studien für den klinischen Gebrauch zugelassen.

Im September 2004 wurde die Wirkung von Pasireotid in einer multizentrischen

Phase II Studie bei 21 Patienten mit metastasiertem Karzinoid im Alter zwischen

40 und 76 Jahren erprobt, deren Symptome mit Octreotid nicht gelindert werden

konnten. Die Patienten erhielten Pasireotid subkutan zunächst in der Tagesdo-

sis 300 µg. Eine Steigerung der Dosis um 150 µg bis zur Maximaldosis von

1200 µg pro Tag bzw. bis zur Symptomfreiheit wurde in dreitägigen Abständen

durchgeführt. Dabei wurde bezüglich der Symptome bei 7 der Patienten durch

Pasireotid in einer Dosis zwischen 600 µg und 900 µg täglich eine partielle Re-

mission erreicht. Einer dieser Patienten entwickelte anschließend sogar eine

komplette Remission [34].

Im September 2005 wurde die Studie mit 44 Patienten eines Durchschnittsalters

von 61 Jahren fortgesetzt [35]. Dabei konnte bei 9 der Patienten bezüglich der

Symptome durch die Therapie mit 600 µg bis 1200 µg Pasireotid subkutan eine

partielle Remission verzeichnet werden. Bei 2 der Patienten wurde ein vollstän-

diges Ansprechen durch eine Dosis zwischen 600 µg und 900 µg subkutan er-

reicht. Bezüglich der Tumorgröße, die bei 11 der Patienten nach 6 Monaten

überprüft wurde, lag bei 9 der Patienten eine Stabilisierung und bei 2 der Pati-

enten eine Progression der Erkrankung vor.

113

Zusätzlich wurde im Rahmen dieser zweiten Studie eine Untersuchung über

den Einfluss der Therapie mit Pasireotid auf die Lebensqualität der Patienten

durchgeführt. Dabei zeigte sich bei den Patienten, die klinisch auf die Therapie

angesprochen hatten, eine Verbesserung des körperlichen und psychischen

Wohlbefindens und im umgekehrten Fall eine Verschlechterung [36].

Zusammenfassend wurde festgestellt, dass durch Pasireotid in einer Dosis zwi-

schen 600 µg und 1200 µg bei 25% der Patienten ohne eine Wirkung unter

Octreotid- Therapie eine effektive Linderung der anfallsartigen Rötung und der

Diarrhoe möglich war. Bei diesen Patienten wurde eine deutliche Verbesserung

der Lebensqualität erreicht.

Die unerwünschten Wirkungen von Pasireotid waren nicht häufiger oder ausge-

prägter als unter Octreotid- Therapie; genannt wurden Bauchschmerzen, Übel-

keit, Leistungsminderung, Gewichtsverlust und in 24% der Fälle eine Ver-

schlechterung der Glucosetoleranz.

114

7 Ausblick

Bisher ist Pasireotid nur im Rahmen von Studien für den klinischen Gebrauch

zugelassen.

In Zukunft muss im Rahmen klinischer Studien weiter evaluiert werden, ob sich

die positiven in- vitro- Ergebnisse bestätigen und Pasireotid als first- line- drug

in der Therapie metastasierter neuroendokriner Tumoren eingesetzt werden

sollte.

Von Novartis ist eine Zulassungsstudie bei Patienten mit metastasierenden Kar-

zinoid- Tumoren geplant, die trotz medikamentöser Behandlung an Durchfall

und Gesichtsrötung leiden. Ziel dieser Studie ist es festzustellen, ob eine Be-

handlung mit der Prüfsubstanz SOM230 LAR (Pasireotid) oder mit dem han-

delsüblichen Medikament Sandostatin® LAR® (Octreotid) diese Symptome

besser lindert und welche Substanz besser verträglich ist. Sollte ein Patient, der

Pasireotid erhält, von der Behandlung profitieren, so darf er nach Ablauf der

ersten Studienphase diese Behandlung so lange im Rahmen der Studie erhal-

ten, bis SOM 230 LAR kommerziell erhältlich ist.

115

Literaturverzeichnis

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125

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Vergleich der Aminosäuresequenz von Somatostatin 14

(oben) und Octreotid (unten) ............................................................ 14

Abbildung 2: Strukturformel von Somatostatin-14 ............................................. 18

Abbildung 3: Strukturformel von Octreotid. Die Aminosäuresequenz Phe7-

Trp8-Lys9-Thr10 des natürlichen Somatostatins wurde belassen

und am N- und C- terminalen Ende metabolisch stabilisiert. Um

ein zyklisches Peptid zu erhalten wurden die Phenylalanin-

Reste an Position 6 und 11 durch 2 Cystein- Reste ersetzt. ............ 18

Abbildung 4: Strukturformel von Pasireotid. Strukturelemente von

Somatostatin-14 wurden zu einem größenmäßig reduzierten,

stabilen Cyclohexapeptid zusammengefügt. Durch Einfügen

von Lysin, Phenylglycin, O-Benzyl-Tyrosin und D-Tryptophan

entstand Pasireotid. ......................................................................... 19

Abbildung 5: Plasmakonzentration von Pasireotid verglichen mit Octreotid

im Zeitverlauf, bestimmt nach einer subkutanen Bolusinjektion

von 1mg/kg Körpergewicht des Somatostatinanalogons bei

Ratten. [Bruns, 2002] ....................................................................... 20

Abbildung 6: HCT Zellen in der Vergrößerung 1:10 .......................................... 23

Abbildung 7: HepG2 Zellen in der Vergrößerung 1:10 ...................................... 25

Abbildung 8: BON-1 Zellen, Vergrößerung 1:10................................................ 26

Abbildung 9: Einteilung der 24- Loch- Platten in sechs Gruppen von je 4

Löchern, gezeigt anhand eines Versuchsansatzes mit HCT-

Zellen der Passage 15. .................................................................... 31

Abbildung 10: Einteilung der 96- Loch- Platten in fünf Gruppen von je 12

Löchern, gezeigt anhand eines Versuchsansatzes mit HCT-

Zellen der Passage 15. .................................................................... 32

126

Abbildung 11: CASY® 1 Zellzählgerät Model TT. Im Sichtfenster sind drei

Leuchtdioden angeordnet, die den Füllstand des Steigrohres

anzeigen. Am unteren Ende des Kapillarkörpers ist ein Rubin

mit einer Präzisionsmesspore eingegossen. Nach dreimaliger

Messung wird das Ergebnis auf dem LCD- Display angezeigt. ........ 34

Abbildung 12: Graphische Darstellung der Messergebnisse auf dem

Display. Die Auswertung der Größenverteilung kann durch zwei

positionierbare Cursorpaare festgelegt werden................................ 35

Abbildung 13: Zellüberleben von HCT Zellen bei 24stündiger Einwirkzeit

von Octreotid. ................................................................................... 38

Abbildung 14: Zellüberleben von HCT Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit

von Octreotid. ................................................................................... 39

Abbildung 15: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei ≤ 24stündiger

Einwirkzeit von Octreotid. ................................................................. 40

Abbildung 16: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit

von Octreotid. ................................................................................... 41

Abbildung 17: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei ≤ 24stündiger

Einwirkzeit von Octreotid. ................................................................. 42

Abbildung 18: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit

von Octreotid. ................................................................................... 43

Abbildung 19: Zellüberleben von HCT Zellen bei 24stündiger Einwirkzeit

von Pasireotid. ................................................................................. 44

Abbildung 20: Zellüberleben von HCT Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit

von Pasireotid. ................................................................................. 44

Abbildung 21: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei ≤ 24stündiger

Einwirkzeit von Pasireotid. ............................................................... 45

Abbildung 22: Zellüberleben von HepG2 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit

von Pasireotid. ................................................................................. 46

127

Abbildung 23: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei ≤ 24stündiger

Einwirkzeit von Pasireotid. ............................................................... 47

Abbildung 24: Zellüberleben von BON-1 Zellen bei 72stündiger Einwirkzeit

von Pasireotid. ................................................................................. 47

Abbildung 25: Zellüberleben von HCT Zellen unter Octreotid, ausgewertet

mit der Casy-1 Zellzählmethode. ..................................................... 49

Abbildung 26: Zellüberleben von HCT Zellen unter Octreotid, ausgewertet

mit BRDU- Elisa. .............................................................................. 51

Abbildung 27: Zellüberleben von HCT Zellen unter Pasireotid, ausgewertet

mit der Casy-1 Zellzählmethode. ..................................................... 52

Abbildung 28: Zellüberleben von HCT Zellen unter Pasireotid, ausgewertet

mit BRDU- Elisa. .............................................................................. 54

Abbildung 29: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Octreotid,

ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode. ................................. 56

Abbildung 30: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Octreotid,

ausgewertet mit BRDU- Elisa. .......................................................... 57

Abbildung 31: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Pasireotid,

ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode .................................. 59

Abbildung 32: Zellüberleben von HepG2 Zellen unter Pasireotid,

ausgewertet mit BRDU- Elisa. .......................................................... 60

Abbildung 33: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Octreotid,

ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode. ................................. 62

Abbildung 34: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Octreotid,

ausgewertet mit BRDU- Elisa. .......................................................... 63

Abbildung 35: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid,

ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode. ................................. 64

128

Abbildung 36: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid,

ausgewertet mit BRDU- Elisa. .......................................................... 66

Abbildung 37: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid und

Octreotid im direkten Vergleich, ausgewertet mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 67

Abbildung 38: Zellüberleben von BON-1 Zellen unter Pasireotid und

Octreotid im direkten Vergleich, ausgewertet mit BRDU- Elisa. ....... 67

Abbildung 39: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HCT Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10

M, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus

allen Ansätzen. ................................................................................. 69

Abbildung 40: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode. ................................................................. 70

Abbildung 41: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Octreotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 71

Abbildung 42: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HCT Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10

M, ausgewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen. .... 72

Abbildung 43: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit

BRDU- Elisa. .................................................................................... 73

Abbildung 44: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Octreotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU-Elisa. ................... 74

Abbildung 45: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HCT Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10

129

M, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus

allen Ansätzen. ................................................................................. 75

Abbildung 46: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-8 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode. ................................................................. 76

Abbildung 47: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Pasireotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 77

Abbildung 48: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HCT Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10

M, ausgewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen. .... 78

Abbildung 49: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit

BRDU- Elisa. .................................................................................... 79

Abbildung 50: Maximale Inhibition von HCT Zellen durch Pasireotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa. .................. 80

Abbildung 51: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HepG2 Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-

10 M, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet

aus allen Ansätzen. .......................................................................... 81

Abbildung 52: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode. ................................................................. 82

Abbildung 53: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Octreotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 82

130

Abbildung 54: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HepG2 Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-

10 M, ausgewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen

Ansätzen. ......................................................................................... 83

Abbildung 55: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit

BRDU- Elisa. .................................................................................... 84

Abbildung 56: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Octreotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa. .................. 84

Abbildung 57: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HepG2 Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-

10 M, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet

aus allen Ansätzen. .......................................................................... 85

Abbildung 58: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode. ................................................................. 86

Abbildung 59: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Pasireotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 86

Abbildung 60: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

HepG2 Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-

10 M, ausgewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen

Ansätzen. ......................................................................................... 87

Abbildung 61: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit

BRDU- Elisa. .................................................................................... 88

131

Abbildung 62: Maximale Inhibition von HepG2 Zellen durch Pasireotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa. .................. 88

Abbildung 63: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

BON-1 Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-11

M, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet aus

allen Ansätzen. ................................................................................. 89

Abbildung 64: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-9 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode. ................................................................. 90

Abbildung 65: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Octreotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 91

Abbildung 66: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

BON-1 Zellen durch Octreotid der Konzentration 10-7 M bis 10-10

M, ausgewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen Ansätzen. .... 92

Abbildung 67: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-8 molares

Octreotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit

BRDU- Elisa. .................................................................................... 93

Abbildung 68: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Octreotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa. .................. 93

Abbildung 69: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

BON-1 Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-

11 M, ausgewertet mit der Casy-1 Zellzählmethode, berechnet

aus allen Ansätzen. .......................................................................... 94

132

Abbildung 70: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-8 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit der

Casy-1 Zellzählmethode. ................................................................. 95

Abbildung 71: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Pasireotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit der Casy-1

Zellzählmethode. .............................................................................. 96

Abbildung 72: Mittelwerte und Standardabweichungen der Inhibition von

BON-1 Zellen durch Pasireotid der Konzentration 10-7 M bis 10-

11 M, ausgewertet mit BRDU- Elisa, berechnet aus allen

Ansätzen. ......................................................................................... 97

Abbildung 73: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch 10-9 molares

Pasireotid in den verschiedenen Ansätzen, Auswertung mit

BRDU- Elisa. .................................................................................... 98

Abbildung 74: Maximale Inhibition von BON-1 Zellen durch Pasireotid der

jeweils oberhalb der Säule angegebenen Konzentration in den

verschiedenen Ansätzen; Auswertung mit BRDU- Elisa. .................. 99

Abbildung 75: Vergleich der Proliferationshemmung durch Pasireotid und

Octreotid der Konzentration 10-9 M bei BON-1 Zellen, HCT

Zellen und HepG2 Zellen unter Einsatz der Casy-1

Zellzählmethode und BRDU- Elisa. ................................................ 101

Abbildung 76: Vergleich der Proliferationshemmung durch Pasireotid und

Octreotid bei BON-1 Zellen, HCT Zellen und HepG2 Zellen

unter Einsatz der Casy-1 Zellzählmethode und BRDU- Elisa. ....... 103

Abbildung 77: Methodenvergleich: Auswertung mit der Casy- 1

Zellzählmethode versus Auswertung mit BRDU- Elisa ................... 108

133

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Bindungsaffinitäten der Somatostatinanaloga an die fünf

Subtypen der Somatostatinrezeptoren nach [Schmid, 2004]. .......... 19

Tabelle 2: Nachweis unterschiedlicher Somatostatinrezeptor-

Expressionsmuster in HepG2 Zellen durch verschiedene

Arbeitsgruppen [Notas, 2004; Liu, 2004; Raderer, 2000] ................. 24

Tabelle 3: Maximale Inhibition der HCT- Zellen durch Octreotid bei

Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode. .................................. 48

Tabelle 4: Maximale Inhibition der HCT Zellen durch Octreotid bei

Auswertung mit BRDU- Elisa. .......................................................... 50

Tabelle 5: Maximale Inhibition der HCT Zellen durch Pasireotid bei

Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode. .................................. 51

Tabelle 6: Maximale Inhibition der HCT Zellen durch Pasireotid bei

Auswertung mit BRDU- Elisa. .......................................................... 53

Tabelle 7: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Octreotid bei

Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode. .................................. 55

Tabelle 8: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Octreotid bei

Auswertung mit BRDU- Elisa. .......................................................... 56

Tabelle 9: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Pasireotid bei

Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode. .................................. 58

Tabelle 10: Maximale Inhibition der HepG2 Zellen durch Pasireotid bei

Auswertung mit BRDU- Elisa. .......................................................... 59

Tabelle 11: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Octreotid bei

Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode. .................................. 61

Tabelle 12: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Octreotid bei

Auswertung mit BRDU- Elisa. .......................................................... 62

134

Tabelle 13: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Pasireotid bei

Auswertung mit der Casy-1 Zellzählmethode. .................................. 64

Tabelle 14: Maximale Inhibition der BON-1 Zellen durch Pasireotid bei

Auswertung mit BRDU- Elisa. .......................................................... 65

Tabelle 15: Inhibition durch Pasireotid verglichen mit der Inhibition durch

Octreotid; die berücksichtigte Konzentration der

Somatostatinanaloga ist jeweils angegeben. ................................. 100

Tabelle 16: Inhibition durch Pasireotid verglichen mit der Inhibition durch

Octreotid; berücksichtigt werden die jeweils stärksten

Inhibitionen unabhängig von der Konzentration der

Somatostatinanaloga. .................................................................... 102

Tabelle 17: Vergleich der Methoden. ............................................................... 107

Tabelle 18: Vergleich der Ergebnisse mit den verschiedenen Methoden der

Auswertung. Dabei wurden die jeweils stärksten Inhibitionen

unabhängig von der Konzentration der Somatostatinanaloga

berücksichtigt. ................................................................................ 107

Tabelle 19: Zusammenfassung der in den letzten dreißig Jahren

durchgeführten Studien mit Octreotid bei Patienten mit

gastroenteropankreatischen Tumoren. ........................................... 110

135

Abkürzungsverzeichnis

BON-1 Zellen Neuroendokrine pankreatische Tumorzellen

BRDU- Elisa 5-bromo-2-deoxyuridin Elisa

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium

FKS Fötales Kälberserum

GH Growth hormon = Wachstumshormon

HCT Zellen Humane kolorektale Tumorzellen

HepG2 Zellen Humane hepatozelluläre Tumorzellen

IGF-I Insulin- like growth factor I

IR- Octreotid Intermediate release Octreotide = Mittellang wirk-

sames Octreotid

LAR- Octreotid Long- acting release Octreotide = Langwirksames

Octreotid

PBS- Lösung Phosphatgepufferte Normalsalzlösung

MAP Kinase Mitogen activated Protein Kinase

RT- PCR Reverse Transkriptase- Polymerase- Kettenreakti-

on

SSTR Somatostatinrezeptor(en)

VIP Vasoactive intestinal polypeptide

136

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Dr. Detlef Schuppan danke ich für die Überlassung des interes-

santen Themas und für die hervorragenden Arbeitsbedingungen.

Meiner ursprünglichen Betreuerin Frau PD Dr. Marianne Pavel danke ich für die

Anleitung zum wissenschaftlichen Arbeiten und für die Bereitwilligkeit, im Rah-

men einiger Treffen die einzelnen Abschnitte der Arbeit zu diskutieren.

Mein herzlichster Dank gilt Herrn PD Dr. Harsch. Durch seine freundliche Be-

reitschaft, die weitere Betreuung meiner Arbeit zu übernehmen und die Korrek-

tur rasch und zielführend durchzuführen, hat er mir den Abschluss meiner Dok-

torarbeit ermöglicht.

Großen Dank möchte ich auch Frau Hübner vom Promotionsbüro aussprechen,

die mich nach dem Weggang von Herrn Prof. Dr. Dr. Schuppan und Frau PD Dr.

Pavel tatkräftig unterstützt hat, um die Doktorarbeit fortführen zu können.

Ich bin außerordentlich dankbar für die experimentelle Anleitung im Labor durch

Frau Gerda Hassler, sowie für ihre ständige Bereitschaft zur Unterstützung bei

allen Problemen und Fragen. Weiterhin danke ich allen Mitarbeitern des Labors

für das gute Arbeitsklima, für den Gedankenaustausch und die Beantwortung

von Fragen zur Laborarbeit. Außerdem möchte ich mich bei den Mitarbeitern

des Labors der Medizinischen Abteilung II für die Überlassung des Casy-1 Zell-

zählgerätes zur Auswertung der Experimente bedanken.

Ich danke meiner Familie und meinen Freunden für die Motivation und Unter-

stützung, ganz besonders meinem Vater Günther Trummer und Tobias Boll für

die Hilfe bei technischen Problemen und die Durchsicht der Arbeit.

137

Lebenslauf

Zur Person

Name

Geburtsdatum/-ort

Staatsangehörigkeit

Familienstand

Vater

Mutter

Bruder

Katrin Sabine Trummer

29. Mai 1981 in Nürnberg

deutsch

ledig

Günther F. Trummer, Dipl. Ingenieur

Helene B. Trummer (geb. Wölfel),

Sozialpädagogin

Stefan N. Trummer, Dipl. Ingenieur

Schulausbildung

1987–1991

1991–2000

1996–1997

Abschluss

Grundschule Baiersdorf

Christian- Ernst- Gymnasium Erlangen

Northfield- Mount- Herman School, Northfield,

MA, USA

Allgemeine Hochschulreife

Studium

2000–2006

Studium der Medizin an der Friedrich- Alexan-

der- Universität Erlangen- Nürnberg

Staatsexamina 2003, 2005 und 2006

138

Berufstätigkeit

Seit 03/2007

Assistenzärztin am Klinikum Kempten, Abtei-

lung Onkologie und Hämatologie