Einzelmolekülspektroskopie an lebenden Zellen

EinzelmolekülspektroskopieEinzelmolekülspektroskopiean lebenden Zellenan lebenden Zellen

EinzelmolekülspektroskopieEinzelmolekülspektroskopiean lebenden Zellenan lebenden Zellen

Vortrag für das physikalische Hauptseminarvon Ulrich Stopper, Januar 2004

Vorteile der Untersuchung einzelner Moleküle:

• Quantitativer Einblick in biologische Prozesse

• Arbeit mit niedrigen Stoffkonzentrationen

natürliche Vorgänge in der Zelle werden nicht gestört

Schwierigkeiten bei der Untersuchung einzelner Moleküle:

• empfindliche Detektoren

• hohe Zeitauflösung

• Photobleichen

Photobleichen:Bei langer Laserbestrahlung, Übergang des Fluorophors in einen Zustand,der keine optische Relaxation erlaubt.

Drei Beispiele :

1.) Untersuchung der Endozytose

2.) Erforschung chemotaktischer Zellen

3.) Verfolgung der viralen Infektion

1.) Untersuchung endozytoser Prozesse in lebenden Zellen mit der Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Analyse

(Bacia et al., MPI für biophysikalische Chemie in Göttingen, 2002)

1. Untersuchung der Endozytose Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS):

Messung des Fluoreszenzsignals:

t

F

einzelne Fluorophore diffundieren durch den Laserfokus

Anwendung der Autokorrelation (i = j) :

τ

GF

1

0

Diffusionszeit der Partikelji

jiFij

FF

tFtFG

)()()(

... : zeitliches Mittelτ : zeitliche Verschiebung

Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS):

Messung zweier Fluoreszenzsignale, von spektral unterscheidbaren Molekülen.Anwendung der Kreuzkorrelation (i j). Anstieg von Gij

F(0), wenn zwei unterschiedliche Moleküle aneinander gebunden sind.

Experimenteller Aufbau für die FCCS:

Zellprobe

Objektiv

Laseranregung488nm & 631nm(einige μW)

Fokus

Hauptstrahlteiler

Sekundärstrahlteiler

Detektor 1

Detektor 2

lateraler 1/e²-Radius des Beobachtungsvolumens:~0,18μm für grün, 0,25μm für rot

gr

grFrg

FF

tFtFG

)()()(

Fr

Fg

1. Untersuchung der Endozytose

Experiment :

Bakterielles Cholera-Toxin (CTX) wurde mit Cy2- und Cy5- Farbstoffmolekülen an unterschiedlichen Untereinheiten des Moleküls markiert :

Markiert mit Cy5:

B5-Einheit(verantwortlich für die Bindung an die Zelloberfläche durch Wechselwirkung mit GM1-Gangliosid)

Markiert mit Cy2:

A-Einheit(enzymatisch aktiv)

an eine Zellmembran gebundenes CTX


CTX nutzt vermutlich einen Pfad durch das Endoplasma und den Golgi-Apparat aus, den es rückwärts durchläuft, um zum endoplasmatischen Retikulum zu gelangen.

Golgi-Apparat

endoplasmat.Retikulum

Sekretproduktion durch das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat (Exozytose)

Aufnahme des Choleratoxins in die Zelle (Endozytose)


Wie markiert man ein Biomolekül mit zwei verschiedenen Farbstoffen ?

- Cy2-Färbung würde sich nicht nur an A-Einheit, sondern auch an B-Einheit binden Experiment wäre nicht durchführbarAlso: B-Einheit muss abgeschirmt werden

- Cy5 lagert sich ausschließlich an B-Einheit an.

Einsatz von Antikörper gegen die B-Einheit

- Einfärben der A-Einheit

- Entfernen der Antikörper


Beobachtung des doppelt markierten CTX mit FCCS, gleichzeitig LSM-Imaging:

- die ersten Sekunden: Keine Kreuzkorrelation (KK) und keine Autokorrelation (AK), LSM: Starkes Photobleichen CTX ist unbeweglich

Anbindung an die Membran

LSM-Bild der Zelle in den ersten SekundenPfeil: Photobleichen durch Korrelations-Messung

- Kurz darauf: Nach anfänglichem Photobleichen, Anstieg von AK und KK

Erste Vesikel kapseln sich ab und diffundieren durch den Fokus

Zellmembran und Membran-nahe Vesikel mit CTX


- 15 Min. später: Starke KK in den meisten intrazellulären Messungen

B- und A-Einheit sind immer noch an einander gebunden, diffundieren durch das Plasma

- einige Minuten danach: Abnahme der KK und der AK, LSM bestätigt Photobleichen Immobilität

Vesikel werden vom Golgi-Apparat aufgenommen

A- und B-Einheit werden erst im Golgi von einander getrennt !

LSM-Aufnahme des Zytoplasmas nach 15 Minuten AK Cy2 AK Cy5 KK

gemessen an der markierten Stelle im linken Bild

- Kurz darauf: leicht erhöhte AK, immernoch keine KK

A und B wieder beweglich, aber keine gemeinsame Bewegung

LSM-Aufnahme des Golgi keine KK im Golgi


Diffusionszeiten im Zellplasma können aus Fits an die Korrelationskurven bestimmt werden: τDiff= 20ms Diffusionskonstante D 6·10-9 cm2/s (langsame Diffusion)Stokes-Einstein-Gleichung:

hR

kTD

6 η 5 : Viskosität

Rh : hydrodynamischer Radius

Durchmesser der diffundierenden Partikel: 2Rh 150nm bestätigt Einschluß in Vesikel


Weiterer Beweis für Vesikelbildung:

Anwendung einer Mischung aus unterschiedlich einfach-markiertem CTX (CTX-Cy2 & CTX-Cy5) auf eine Zelle.

Starke KK im Zellplasma, obwohl jedes einzelne Molekül nur einfach markiert ist! Mehrere CTX-Moleküle führen korrelierte Bewegungen aus.

Bindung in Vesikel AK- und KK-Kurven für unterschiedliche Mischungen

Zusammenfassung der Ergebnisse der Korrelations-Analyse von CTX:

- FCCS kann verwendet werden, um herauszufinden, ob unterschiedliche Moleküle gebundene Bewegungen ausführen.

- A- und B-Einheiten des CTX-Moleküls werden erst nach Erreichen des Golgi-Apparats voneinander getrennt.

- Mehrere CTX-Moleküle werden in einzelne Vesikel zusammengeschlossen, die im Plasma diffundieren.


2.) Einzelmolekül-Analyse von chemotaktischen Prozessen mit der Totalreflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie

(Ueda et al., Universität Osaka, 2001)

TIRFM (Total internal reflection fluorescence microscopy) :

dünnes Medium

dichtes Medium

evaneszentes elektromagnetisches Feld

Intensität

Eindringtiefe(einige hundert nm)

Totalreflexion

Photonen tunneln in das Fluorophor

Vorteil: sehr geringe Hintergrundfluoreszenz

2. Erforschung chemotaktischer Zellen

Objektiv

Dictyostelium-Zellen reagieren chemotaktisch auf cAMP

Chemotaxie spielt wichtige Rolle bei:- Immunsystem- Ausbildung neuronaler Netze- Morphogenese

der Schleimpilz Dictyostelium discoideum

wichtiger Botenstoff, der aus ATP gebildet wird und zur Steuerung von Zellfunktionen dient.

zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP):


Zellmembran

Aktivierung

GDP

GDP

G-Protein

GTP

Rezeptor

cAMP

G-Protein

GTP

Enzym

Umbau des Zellskeletts

Die chemotaktische Reaktion wird durch Rezeptoren an der Zelloberfläche und durch G-Protein-abhängige Signalübermittlung ermöglicht:


Experiment:

Echtzeit-Abbildung von einfach fluorophorisch markierten cAMP-Molekülen, die an die Oberfläche einer Dictyostelium-Zelle gebunden sind. TIFRM-Bild der

Dictyostelium-Zelle vor Abwaschen von un-

gebundenem Cy3-cAMP

Gleich nach Zugabe des cAMP beginnt dieses, sich an die Membran zu binden und sich lateral zu bewegen.

einzelne, fluoreszierende Cy3-cAMP-Moleküle


Verfolgung einzelner Fluoreszenzpunkte über mehrere Minuten:

Diffusion einzelner cAMP-Rezeptor-Komplexeletztes Bild: Trajektorien

laterale Beweglichkeit mit D = (2,7 ± 1,1) · 10-10 cm2/s

meistens sehr lineare Bewegungen mit gelegentlichen Zwischenstopps evtl. Wechselwirkung mit Zellskelett

REM-Aufnahme eines Zellskeletts


Zellen bewegen sich linear in Richtung des Gradienten.

Erzeugung eines cAMP-Konzentrationsgradienten

cAMP-Konzentrationsgradient wird mit einer Mikropipette erzeugt.


Verfolgung der cAMP-Rezeptor-Komplexpositionen:

Pfeil: Konzentrationsgradient

Die meisten Cy3-Punkte blieben nur einige Sekunden lang an der Membran haften:

Pun

kte,

die

sei

t t=

0 an

de

r M

embr

an h

afte

n Dissoziationsratenunterschied zwischen vorderer und hinterer Hälfte

schnellercAMP-Austausch

langsamercAMP-Austausch

Konzentrationsgradient undBewegungsrichtung

vordere Hälfte:12% mehr Rezeptoren als auf der hinteren Hälfte

Aber: Kein Unterschied im Diffusionskoeffizienten

Es befinden sich auf der Membran im Mittel mehr Rezeptoren an der nach vorne gerichteten Zellhälfte:


Zwei mögliche Ursachen für schnelleren cAMP-Austausch:

- Rezeptor-Phosphorylierungoder

- besondere Wechselwirkung zwischen G-Protein und Rezeptor

Phosphorylierung:Chemische Reaktion (Anhängen einer Phosphatgruppe), die die Rezeptoraffinität um das 3- bis 6-Fache verringert.

Wichtige Entdeckung: Dissoziationsratenunterschied zwischen der einen und der anderen Seite der Zelle existiert auch dann, wenn kein Konzentrations-Gradient vorhanden ist ! zellinterne Polarisation legt die Zellvorderseite fest !

selbes Experiment diesmal mit zwei verschiedenen Dictyostelium-Mutationen:

1. Mutation: phosphorylierte Rezeptoren keine Veränderung Phosphorylierung ist nicht die Ursache

2. Mutation: „defektes“ G-Protein keine Dissoziationsunterschiede mehr ! Wahrscheinlich ist G-Protein-Rezeptor-Wechselwirkung die Ursache.


Beobachtung der Auswirkungen bei Zugabe von GTP und GDP:

- GTP verursacht Zunahme der cAMP- Dissoziationsrate- GDP hat keinen Effekt

G-Protein beeinflusst das Liganden-Bindungsverhalten.

Überprüfen, ob Rezeptor - G-Protein - Wechselwirkung vorliegt:

cAMP-Austauschgeschwindigkeit ohne (-) und mit (+) Zugabe von GTP.

dunkel-/hellgrau/weiß: Zusammensetzung des Fits aus einer schwach/mittel/stark abklingenden Komponente

unveränderteZelle

1. Mutation

2. Mutation(2 Varianten)


Fragen, die noch zu beantworten sind:

Ist die Polarisation des Dissoziationsverhaltens eine spezielle Eigenschaft der Membran oder des Zellskeletts?

Kann sich die Polarisation, also die Auszeichnung der Vorderseite zeitlich verändern?

3.) Echt-Zeit-Aufzeichnung des Infektionsvorgangs eines Adeno-assoziierten Virus mit Single Virus Tracing

(Bräuchle et al., LMU München, 2001)

Viren werden mit nur ein oder zwei Cy5-Molekülen markiert, um den natürlichen Vorgang nicht zu beeinflussen.

sehr hohe Detektorempfindlichkeit notwendig

Beobachtung mit der Weitfeldmikroskopie

Detaillierte Kenntnisse über virale Infektionsprozesse sind von großer Bedeutung für antivirale Medizin und Gen-Therapie.

Adeno-assoziierter Virus

3. Single Virus Tracing

Adeno-assoziierter Virus (AAV):kleiner Virus, der den Adenovirus zur Ausbreitungbenötigt. Verursacht keine Krankheit beim Menschen interessant für Gen-Therapie

Außerhalb der Zelle:normale Diffusion mit D = 7,5 μm2/s


Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit nTouch Kontakten

Fits

In der Nähe der Zellmembran:- Beschleunigung in Richtung Zellwand- Wiederholte Berührungsereignisse, unterbrochen von kurzer Diffusion in Zellnähe

Im Durchschnitt 4,4 Berührungen

mittlere Berührungszeit: 62msmittlere Kontaktdauer: 3,2s (erster ... letzter Kontakt)

Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit der mittleren Berührungszeit t

Fit

Eindringen in die Zelle:mittlere, zum Eindringen benötigte, Kontaktzeit: 1,2s

Eindringeffizienz: 13%Membran ist eine wichtigeBarriere gegen Viren.

Trajektorien mit Penetration:


Im Zellplasma:

47% normale Diffusion (<r2> ~ t)

D = 0,6 μm2/s

D = 1,3 μm2/s

zwei verschiedene Komponenten:- freies Virus- Virus in Endosom (Stokes-Einstein: 2R 50 nm)

Jedes Endosom enthielt stets nur ein AAV.


45% anomale Diffusion (<r2> ~ Dt α)

0,3μm2/s < D < 1,5μm2/s0,5 < α < 0,9

Behinderung der Diffusion durch feste Bestandteile des Plasmas

MSD-Plots von Partikel im Plasma:

normale Diffusion, freies AAV

normale Diffusion

anomale Diffusionendosomal

8% gerichtete Bewegung! (<r2> = 4Dt + (vt)2)

Behandlung mit Nocodazol gerichtete Bewegung verschwindet Mikrotubuli-Transport durch Ausnutzen von Motorproteinen wie Kinesin oder Dynein.

Nocodazol:wird zum Depolymerisieren vonMikrotubuli verwendet.

1,8μm/s < v < 3,7μm/s

Im Zellkern:

57% normale Diffusion

0,4μm2/s < D < 1,3μm2/s<D> = 0,85μm2/s

17% anomale Diffusion

0,25μm2/s < D < 0,9μm2/s0,6 < α < 0,9


26% gerichtete Bewegung!

Einige Virusmoleküle bewegen sich nacheinander auf dem selben Pfad. Alle Pfade waren regional gleich orientiert.

0,2μm/s < v < 2,8μm/s

Behandlung mit Nocodazol gerichtete Bewegung im Zellkern verschwindet Aktiver Transport in der Kernregion, obwohl dort bisher keine Mikrotubuli und Motorproteine nachgewiesen werden konnten!

Unterschiedliche Bewegungsarten und -Phasen:

I.) Beschleunigung in Richtung Zellwand (1), mehrere aufeinanderfolgende Virus- Membran-Kontakte (2) und schnelle Endozytose (3)

II.) freie und anomale Diffusion des Endosoms mit dem Virus im Plasma und im Kern (3, 4)

III.) gerichtete Bewegung durch Ausnutzung von Motorproteinen im Plasma und in Röhrchenstrukturen des Kerns (4)

15 Minuten nach jeder Behandlung waren 50% der Zellen von mindestens einem Virusmolekül befallen!

Die wichtigsten Ergebnisse des Single Virus Tracing:


Quellen:

[1] Bacia et al. (2002): Probing the Endocytic Pathway in Live Cells Using Dual-Color Fluorescence Cross-Corelation Analysis. Biophysical Journal 83(2) 1184-1193.

[2] Ueda et al. (2001): Single-Molecule Analysis of Chemotactic Signaling in Dictyostelium Cells. Science Vol 294 864-867.

[3] Bräuchle et al. (2001): Real-Time Single-Molecule Imaging of the Infection Pathway of an Adeno-Associated Virus. Science Vol 294 1929-1932.

Bildmaterial:

Folien-Nr. Bildbeschreibung Quelle

6 Zelle im Querschnitt www.art4science.de/bsp_right.html

7 CTX-Molekül www.cvm.uiuc.edu/courses/vp331/ToxinsGposBact/

7 CTB-Einheit bio.winona.msus.edu/berg/308s01/ Lec-note/10-new.htm

8 Modell der Exozytose www.schoolwork.de/cytologie/golgiapparat.php

8 Endozytose von CTX research.chem.psu.edu/brpgroup/ Nonnaturalreceptors.html

10-12 Alle Bilder [1]

16 Dictyostelium-Pilz www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/d27_10/27_10.htm

16 cAMP-Strukturformel www.uni-frankfurt.de/fb14/fsbc/lexikon/c/camp.html

18-23 Alles außer den folgenden [2]

19 REM-Aufnahme des Zellskeletts 35.9.122.184/images/07-TourOfTheCell/

20 Chemotaxie-Video http://www.physik.uni-stuttgart.de/SMG/altleiningen/talks/

25 Adeno-assoziierter Virus www.cup.uni-muenchen.de/schnupper/Inhalte.html

26-30 Alles außer den folgenden [3]

26,27,29 SVT-Videos www.single-virus-tracing.com

28 Nocodazol-Strkturformel w-chemdb.nies.go.jp/noyaku/1615.htm

28 Kinesin ung.nbi.dk/biofysik/biofysik.htm

Einzelmolekülspektroskopie an lebenden Zellen

Documents

Transcript of Einzelmolekülspektroskopie an lebenden Zellen