Elektrophorese

Sommersemester 2012

Gliederung

1. Was ist Elektrophorese? Allgemeine Informationen

1. Anwendung

2. Physikalische Grundlagen

3. Arten der Elektrophorese

1. Trägerelektrophorese

1. Grundlagen

2. Probleme Trägerelektrophorese

3. Weiterentwicklungen und Beispiele

2. Trägerfreie Elektrophorese – Kapillarelektrophorese

1. Physikalische Grundlagen

2. Bestandteile und Durchführung

3. Weiterentwicklungen und Beispiele

4. Übungsaufgabe

5. Literatur

1. Was ist eigentlich Elektrophorese?

Definition:

Wanderung von Ionen und kolloidalen Teilchen wie Makromolekülen,

Viren und Zellen im elektrischen Feld unter Erzielung einer

Auftrennung nach Größe und Ladungsdichte

Analsyenmethode zur Trennung und Bestimmung (und

Quantifizierung) von Molekülen

Einteilung der Elektrophorese Arten: • Trägerelektrophorese = Zonenelektrophorese

z.B. Gelelektrophorese

• Trägerfreie Elektrophorese = Grenzflächenelektrophorese

z.B. Kapillarelektrophorese

1.1 Anwendung

Molekularbiologie und Biologie:

Isolierung und Aufreinung von Makromolekülen

- DNA, RNA, Proteine (z.B. Immunglobuline)

(“Genetischer Fingerabdruck”)

(Pharmazeutische/LMC) Analytik:

Überprüfung Reinheit und Gehalt von:

- Immunseren für den Menschen

- Kontrolle von Insulin/Heparin

- Nachweis von Kuhmilch in Ziegenkäse

- Ist der Döner wirklich aus Lammfleisch?

Kapillarelektrophorese häufig zur Kontrolle

Gehalt und Reinheit von Arzneistoffen und

Pflanzenextrakten

2. Physikalische Grundlagen der Elektrophorese

Gesetz von Kohlrausch:

“Geladene Teilchen wandern in Lösung unter dem

Einfluss eines elektrischen Feldes mit unterschiedlicher

Geschwindigkeit”

Gründe für diese Verhalten:

• Ladungsdichte der Moleküle: Beschleunigung v ↑

• Größe der Teilchen : Reibungswiderstand v ↓

2. Physikalische Grundlagen der Elektrophorese

Wenn Fep = FR Keine Beschleunigung mehr

Geschwindigkeit ist konstant.

Fep : Beschleunigungskraft

FR : Reibungskraft

E: Feldstärke

zi : Ladungszahl des Teilchen

eo : Elektrische Elementarladung

Vep: elektrophoretische

Wanderungsgeschwindigkeit

μep : Elektrophoretische Mobilität

ri: Radius der Teilchen

η: Viskosität des Mediums

Einfluss von Beschleunigungs-

und Reibungskraft auf geladene

Teilchen

Fep= zi* eo* E und

FR= 6π* r*η*vep

2. Physikalische Grundlagen der Elektrophorese

Die Wanderungsgeschwindigkeit ist demzufolge abhängig von:

– Der Ladung des Moleküls

– Der Größe des Moleküls

– Den Eigenschaften des Mediums

– Der Solvatisierung bzw. Bildung der Ionenhülle

– Der Viskosität des Mediums

– pH-Wert der Umgebung und Isoelektrischer Punkt bei Proteinen

3.1 Trägerelektrophorese

Prinzip:

Die Analyse wird auf einen Träger (z.B. Gel, Papier…)

aufgetragen. Dieses ist mit Pufferlösung getränkt.

Beim Anlegen der Spannung trennen sich die Teilchen

gemäß Ladung und Größe (siehe Punkt 2.)

Träger

Zusätzliche Einflüsse:

- Sogströme,

-verdunsten Puffer

- Elektroosmose

-Adsorption Analyten

an Träger

Anionen - Kationen +

3.1.1 Praktische Durchführung Trägerelektrophorese Träger vorbereiten (Gel gießen oder quellen lassen, Papier tränken…)

- Celluloseacetat

- Agarosegele

- Stärkegele

- Polyacrylamidgele

- Papierstreifen

Kammern mit Puffer füllen Puffer (richtet sich nach pka der Analyten)

- TBE ( Tris-Borat-EDTA) Puffer

- TAE ( Tris-Acetat-EDTA) Puffer

- TTE (Tris-Taurin-EDTA) Puffer

Analyt auftragen

Definierte Spannung Anlegen und Gel über bestimmten Zeitraum laufen lassen (Dauer : 30min – 2h)

Anschließend Entwicklung des Trägers zur Detektion des Analyten (diese sind meist farblos!)

DNA mit Ethidiumbromid

Proteine mit Silbernitrat, Coomassie-Brilliant-Blue oder Antikörpern

3.1.1 Praktische Durchführung Trägerelektrophorese

Beispiel: DNA Trennung mit Agarosegelelektrophorese

(DNA ist negativ geladen, Trennung ausschließlich

nach Größe Richtung Anode)

- 1% Agarose in TBE-Puffer lösen (kochen)

- Gel gießen und gleich Ethidiumbromid zugeben

- Gel aushärten lassen, in Kammer legen (gefüllt mit TBE Puffer) und

Analyt auftragen + Standard

- 45min bei 120 V Gel laufen lassen

3.1.1 Praktische Durchführung Trägerelektrophorese

Beispiel:

Serumelektrophorese

(Cellulose-Acetat-Gel)

Trennung und Analytik der

Serum Immunglobuline

(ohne Gerinnungsfaktoren

und feste Bestandteile)

Alpha-Fraktion erhöht

Hinweis auf Entzündung,

Nierenerkrankungen

3.1.2 Probleme der Trägerelektrophorese

• Häufig lange Analysendauer (>30min)

• Analyten meist farblos: – Proteine anfärben mit Silber oder Coomassie Brilliant, Nachweis

mit farbstoffmarkierten Antikörper (Westernblot)

– DNA und RNA anfärben mit Ethidiumbromid

• Quantitative Bestimmung ist stark fehlerbehaftet (schlechte Reproduzierbarkeit)

• Papier und Gel kann austrocken

• Viel Energie geht als Wärme verloren – Konvektion der Analyten ( breite Banden)

– Proteine können bei hohen Temperaturen denaturieren Kühlung

Was passiert wenn ein Analyt doppelt so schwer ist wie

ein anderer, dafür aber die doppelte Ladung trägt???

Keine Trennung möglich

3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese

- Isoelektrische Fokossierung Trennung von Proteinen anhand des IEP (isoelektrischer

Punkt nach außen ungeledan) durch einen pH Gradienten

(anschließend klassische Gelelektrophorese 2D System)

- Isotachophorese Verschiedene Zonen mit unterschieldichen Feldstärken

schärfere Banden der Analyten (z.B. für Wasseranalysen)

- Disk-Elektrophorese Verwendung von diskontinuierlichen Puffer- und

Gelsystemen (Sammelgel/Trenngel ”Stacking”) schärfere Banden der Analyten

3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese

SDS-PAGE (Sodiumdecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese)

“DAS” Trennverfahren für Proteine.

SDS ist ein Tensid (z.B. auch in Shampoo)

Trennung nur anhand von Molekülgröße, da die

Moleküle alle von Tensid Molekülen umhüllt und somit alle

negative geladen sind Wanderung Richtung Anode, je

größer das Molekül desto langsamer ist es

Protein wird von

C oder D

denaturiert, SDS

wird absorbiert

et voilà

3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese

3.1.3 Weiterentwicklungen der Trägerelektrophorese

Entwicklung des

Gels mit

Coomassie

Brilliant Blue,

dann auswerten.

3.2 Trägerfreie Elektrophorese = Grenzflächenelektrophorese

Kapillarelektrophorese (CE)

Ähnliche Anwendungsgebiete wie die HPLC, jedoch

unterschiedliches Trennprinzip:

HPLC CE

Transport der Analyten Druck

Pumpen pressen

Fließmittel durch HPLC

Säulen

Elektrische Spannung

Ionen (v.a. Leitelektrolyt)

wandern im elektrischen

Feld

Trennung der Analyten Unterschiedlich starke

WW mit Säule und FM

der zu trennenden

Substanzen

Adsorbtions-

chromatographie

Unterschiedliche

Wanderungsgeschwindig-

keit der zu trennenden

Substanzen im

elektrischen Feld

Elektrophorese

3.2 Kapillarelektrophorese - Aufbau

Injektion

Der Elektrosmotische Fluss (EOF)

Elektroosmose ist die Bewegung einer Elektrolytlösung

relative zu einer geladenen Oberfläche durch Anlegen

eines elektrischen Feldes

3.2.1 Kapillarelektrophorese – Physikalische Grundlagen

d= 50-250 µm

Fluss zur

Kathode bei

Silica-Säulen

μeff= effektive Mobilität (eines Analyten)

μeff = μeof +μep μeof= elektroosmotische Mobilität (der Pufferlösung)

μep= elektrophoretische Mobilität (eines Analyten)

Der EOF überlagert die elektrophoretische Mobilität der Analyten

wenn μeof groß genug ist, können Ionen unabhängig von ihrer Ladung zu einem der Pole bewegt werden, im Fall

von Quarzkapillaren zur Kathode.

μeof ~1/u u : Ionenstärke

μeof ~ ω ω: Ladungsdichte an der Wandoberfläche

Höhere Pufferkonzentration (u ↑) : EOF

Höherer pH- Wert : Mehr SiOH- Gruppen

deprotoniert (ω ↑) : EOF↑

3.2.1 Kapillarelektrophorese – Physikalische Grundlagen

HPLC

Strömung wird durch

Druckdifferenz verursacht.

Es kommt zu Reibung an der

Kapillarwand: parabolisches

Strömungsprofil

CE

Strömung wird durch EOF

verursacht:

Die Antriebskraft entsteht an

der Wand es kommt zu

Einem Gleichgewicht mit der

Reibung :

Flaches Strömungsprofil

Sehr schmale Peaks

Hohe Empfindlichkeit

A: HPLC

B: CE

3.2.1 Kapillarelektrophorese – Strömunsprofile

Kapillare :

• Kieselglas

• Länge 30-100cm

• Innendurchmesser 25 - 100μm

Hochspannungsquelle:

Spannung : bis zu 30 kV !

Anforderungen an Puffer:

• Selektive für zu trennende Ionen (unterschiedliche Ladungen der Analyten)

• Hohe Pufferkapazität keine pH Änderungen während der Analyse

• Geringe Absorption bei Detektionswellenlänge (hohe Empfindlichkeit)

• Geringe Mobilität des Gegenions

• Konzentration : EOF groß genug für schnelle Analysenzeiten ohne Bandenverbreiterung durch thermische Effekte

Injektionssysteme: (meist werden nur wenige nl injiziert!)

• Hydrodynamische Injektion (Druck, Sog)

• Elektrokinetische Injektion (Spannung, wichtig: IS!)

Detektion (ähnlich HPLC) :

• UV-Vis

• Flouresenzdetektor

• Massenspektroskopie (wegen sehr kleinen Flussraten von nl/min zusätzlicher Flow notwendig)

3.2.2 Bestandteile und Durchführung CE

3.2.3 Weiterentwicklungen der CE

Kapillarzonenelektrophorese (CZE):

Klassische Verfahren

mizellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC):

Zur Trennung ungeladener Analyten. Es werden dem

Puffer Tenside zugegeben, die Mizellen mit einem

hydrophoben Kern bilden (quasistationäre Phase).

Die Analyten gehen gemäß ihrer Polarität unterschiedlich

starke WW mit mobiler Phase und Mizellen ein.

Zusätzlich chromatographisches Trennprinzip

Kapillargelelektrophorese (CGE):

Kapillare mit Polyacrylamidgel gefüllt zusätzlichen Siebeffekt (vgl. SDS-

PAGE) bei Trennung von sehr großen Molekülen.

Beispiel: Vergleich CZE und und MEKC zur Trennung von

apolaren Analyten mit sehr ähnlichem Ladungs/Masse

Verhältnis.

3.2.3 Weiterentwicklungen der CE

4. Übungsaufgabe SDS PAGE

Protokoll:

-Beschreibung des

Verfahrens

(Gelelektrophorese

SDS),

Grundlagen

Elektrophorese

- Einkleben und

beschriften der

Elektropherograms

- Gefundenes

Protein (Molmasse)

5. Literatur

• Rücker, G , Neugebauer M , : Willems , G.G. :

Instrumentelle Pharmazeutische Analytik, Wissenschaftl.

Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart,2001

• F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg): Bioanalytik, Spektrum

Akademischer Verlag, 1998

• www.kapillarelektrophorese.de

• www.pharmchem.tu-bs.de/waetzig-cep.html

• Vorlesungsskript 8. Semester Pharmazie Uni Würzburg

2007