Elpho 1 WS08 H.Schlichting 1Elektrophoretische Analytik

Elektrophorese von Proteinen I

H.Schlichting

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 2Elektrophorese dient zur Analyse von Proteinen

Proteine• bestehen aus 50 – 5000 Aminosäuren (20 Typen)• haben Molekulargewicht 5 – 500 kDa• sind ausgestreckt 20 – 1000 nm lang• sind zunächst ungeladen, jedoch mit inhomogener Ladungsverteilung

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 3Übersicht

Bewegung von Ionen (Proteine) im freien ElektrolytenLeitfähigkeitHydrathülle

Bewegung von Ionen (Proteine) in GelenOgston ModellReptation Modell

Elektrophoretische TechnikGelbildungIonenbeweglichkeit

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 4Bewegung eines positiven Ions im freien Elektrolyten

fc

+

EqFe ⋅=

Elektrostatische Kraft

vFfr ⋅=

Reibungs-Kraft

Gleichgewicht

fre FF =

Er

frFr

eFr

vr

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 5Definition der Beweglichkeit

Durch Kraft verursachte Bewegung eines Körpersin einem Medium mit Reibung,

die durch die Bewegung verursacht wird:

Kräfte-Gleichgewichtfre FF =

Da Kräfte-Gleichgewicht herrscht, ist die Bewegung gleichförmig,also nicht beschleunigt, solange die Feldstärke konstant bleibt.Die Geschwindigkeit ist konstant.

Ev=:µBeweglichkeit

Ev ⋅= µKonstante Geschwindigkeit

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 6Bewegungskräfte durch viskose Reibung

Die Proteine bewegen sich in einer "zähen" Flüssigkeit. Diese verursacht Reibungskräfte, ähnlich derviskosen, laminaren Reibung in einer Flüssigkeit.

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 7Bewegung in Flüssigkeiten: Das Stokessche Gesetz

Reibungskraft auf eine makroskopische ungeladene Kugelbei laminarer Bewegung in einer freien Flüssigkeit

vηπrFfr ⋅⋅= 6

ηDynamische Viskosität

Stokessches Gesetz

frFr

vr

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 8Die Viskosität einer Flüssigkeit

ηDynamische Viskosität

Die Viskosität ist die Eigenschaft eines Gases oder Flüssigkeitdie dessen Zähigkeit beschreibt.

Hohe Viskosität -> zähflüssigNiedrige Viskosität -> dünnflüssig

Einheit Pa s (Pascal Sekunde) = N s / m2

Luft 17,2 µPas

Wasser 1,002 mPas (25C)

Ethanol 1,2 mPas

Olivenöl 80,8 mPas

Glycerin 1480 mPas

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 9Stokessches Modell der Beweglichkeit im freien Elektrolyten

Stokessches Modell der Bewegung eines Ions im Elektrolyten:Das Ion verhält sich wie eine Kugel die an andere Atome in der Flüssigkeitstößt und dadurch abgebremst wird.Elektrische Kräfte spielen für die Reibung keine Rolle.

vηπrEq ⋅⋅=⋅ 6fre FF =

Ev=µ

ηπrq

⋅=

6

3

34 rm ⋅= πρKugelförmiges Ion

mq ∝Homogene Ladungsverteilung

Weitere Annahmen:

31

mr ∝

Resultierende Beweglichkeit

32

m∝µResultierende Beweglichkeit

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 10Resultate des Stokesschen Modells

32

m∝µBeweglichkeit des Ions im freien Elektrolyten

Ergebnis des Modells:Die Beweglichkeit nimmt zu mit steigender Masse.Bei konstanter Feldstärke bewegen sich schwere Ionen schneller als leichte !

Das steht im krassen Widerspruch zum Experiment,in Realität ist der Massen-Exponent

null (freier Elektrolyt) oder negativ (Gel)

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 11Stab-Modell für Ionen-Bewegung im freien Elektrolyten

Stab-Modell:Protein als langestreckter biegsamer StabMasse proportional zur LängeLadung proportional zur Länge (auf chemischem Weg)

->Reibungskraft proportional zur Länge (laminare Reibung prop. Fläche)Elektrische Kraft proportional zur Länge

->Beweglichkeit unabhängig von Länge also auch von Masse

EqLFe ⋅⋅∝ 0fre FF = η⋅⋅∝ 2rLFfr

0m∝µResultierende Beweglichkeit

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 12Bewegungskräfte durch Wechselwirkung mit Ionen

Die Proteine bewegen sich in einer Träger-Flüssigkeit,zusammen mit anderen teil-dissoziierenten Molekülen,die über Ladung und Reibung gegenseitig wechselwirken.

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 13Leitfähigkeit eines Elektrolyten

Die gesamte Leitfähigkeit eines Elektrolyten setzt sich aus der Leitfähigkeitdurch Anionen und Kationen zusammen.

+− += σσσSpezifische Leitfähigkeit

( )+++−−− +⋅⋅= zczcF µµασSpezifische Leitfähigkeit

lmolcKonzentration der Ionen (Molarität) Einheit

FFaraday KonstantemolAs

Einheit

αDissoziationskonstante

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 14Leitfähigkeit eines Elektrolyten

Grundsätzliche Idee der Leitfähigkeit:Jedes in die Lösung eingebrachte Molekül dissoziiertJedes der Anionen und Kationen trägt mit seiner konstanten Beweglichkeitzur Leitfähigkeit bei.

Realität:Nicht jedes Molekül dissoziiertDie Beweglichkeit hängt von den anderen Ionen ab

=>Modelle für die Leitfähigkeit unter unterschiedlichen Bedingungen

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 15Reaktionsgleichgewicht

+− +↔+ OHAOHHA 32Reaktionsgleichung schwache Säure HA(z.B. HCl, gilt aber auch für Elektrolyt NaCl)

Reaktionsgleichgewicht allgemeinonRückreakti

nHinreaktio

VVK =

Reaktionsgeschwindigkeit v ~ Konzentration der Ausgangsprodukte

[ ][ ][ ][ ]OHHA

OHAK2

3+−

=Dissoziationsgleichgewicht

[ ]Xchemische Schreibweise für Konzentration

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 16Das Ostwaldsche Verdünnungsgesetz

[ ]c

A−

=αDefinition Dissoziationsgrad

cAusgangskonzentration der Säure

αα−

=1

2cDissoziationsgleichgewicht [ ][ ][ ][ ]OHHA

OHAK2

3+−

=

[ ] cA α=− [ ] cOH α=+3 [ ] 12 =OH[ ] cHA )1( α−=

−

+⋅= 141

2

21

c

c

Kc

cKαAllgemein

1<<αfür kleine Dissoziationsgrade

Ostwaldsches Verdünnungsgesetzc

Kc=α

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 17Resultierende reale Leitfähigkeiten von Elektrolyten

Schwache Elektrolyte, verdünntOstwaldsches Verdünnungsgesetz c

Kc=α

( )+++−−− +⋅⋅= zczcF µµασSpezifische Leitfähigkeit

( ) c⋅+∝ +− µµσKonzentrationsabhängige LeitfähigkeitSchwacher verdünnter Elektrolyte

Starke Elektrolyte, verdünnt 1=α

( ) c⋅+∝ +− µµσKonzentrationsabhängige LeitfähigkeitStarker verdünnter Elektrolyte

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 18Molare Leitfähigkeiten von Elektrolyten

c∝σSchwache verdünnte Elektrolyte Nicht alle Ionen sind dissoziert

c∝σStarke verdünnte Elektrolyte Alle Ionen sind dissoziert

cσ=Λ :Molare Leitfähigkeit

0lim:

→∞ Λ=Λc

Die Grenzleitfähigkeit:Leitfähigkeit im Linitunendlicher Verdünnung

∞Λ=ΛStarke verdünnte Elektrolyte

−

+⋅⋅Λ=Λ ∞ 141

2

21

c

c

Kc

cK

Schwache Elektrolyte

c1⋅Λ=Λ ∞Schwache verdünnte Elektrolyte

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 19Reale Elektrolyte

schwacher Elektrolyt

starker Elektrolyt

Mol

are

Leitf

ähig

keit Λ

Konzentration c

schwacher Elektrolyt

starker Elektrolyt

Leitf

ähig

keit σ

schwacher Elektrolyt

starker Elektrolyt

Konzentration c

Die Grenzleitfähigkeit schwacher Elektrolyte ist oft größer als die starker

Auch starke Elektrolyte dissoziieren bei hohen Konzentrationen nicht vollständig

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 20Kohlrausch's Gesetz

1 KCl 2 LaCl3

3 CaCl2 4 Na2SO4

5 LiCl 6 MgSO4

∞Λ=ΛMolare LeitfähigkeitStarker verdünnter Elektrolyte

Kohlrausch's Gesetz(empirisch)Molare LeitfähigkeitStarker Elektrolyte

cK 1−Λ=Λ ∞

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 21Das Debye-Hückel-Modell

Bestätigung des Kohlrausch-Gesetzes durch das Debye-Hückel-Onsager-Modell

Erklärung der verbleibenden Konzentrationsabhängigkeitaus Hydrathülle

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 22Hydrathülle, Solvatisierung

HHO

H2O-Dipol

+Zentral-Ion

Hydrathülle

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 23Bewegungskräfte im Debye-Hückel-Modell

Konsequenzen der Hydrathülle:Das Debye-Hückel-Onsager-Modell bestätigt Kohlrausch's Gesetz

cK 1−Λ=Λ ∞

Molare Leitfähigkeit

relFRelaxations-Kraft

retFRetardations-Kraft

Der effektive Teilchenradius ist erheblich größer als das einfache IonBei Bewegung entstehen Relaxationskräfte aufgrund derVerformung der Hydrathülle

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 24Visualisierung der Reibungskräfte auf Ionen im freien Elektrolyten

( )BvqFrr×⋅=Lorentz-Kraft⇔Reibungskraft

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 25Bewegungskräfte in / durch Trennmatrix

Bisher alle Überlegungen im freien Elektrolyten

Bei der Elektrophorese bewegen sich die Proteine in

einer porösen Matrix die mit Elekrolyt 'gefüllt' ist

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 26Bewegungskräfte auf ein Ion in einer Trennmatrix

+

Er

vr

frFr

eFr

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 27Bewegungskräfte auf ein langestrecktes Ion in einer Trennmatrix

Unterschiedliche Regime die von der Masse des Ions (Proteins) abhängen

0m∝µ

1−∝ mµ

Rg= a

−∝

2

expa

Rgµ

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 28Das Ogston Modell

Das Ogston Modell, Bewegung kleiner Ionen in einer MatrixIon als harte KugelBewegung in Hohlräumen die die Kugel unterschiedlich weit ausfüllt

Resultierende Beweglichkeit:

−∝

2

expaRµ

Radius RaMaschenweite

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 29Das Reptation Modell

Das Reptation Modell, Bewegung mittlerer und großer Ionen in einer MatrixIon als Knäul das sich durch Höhlräume schlängelt und dabei teilweise entwirrtBewegung in Röhre

Resultierende Beweglichkeit:

1−∝ mµ

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 30Ionen unterschiedlicher Massen im Reptation-Modell

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 31Modell - Tatsächliche Reptation

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 32Auftrennung von Proteinen mittels Elektrophorese

PorigesHydro-Gel

GrößenMark

Protein-

proben

Protein-

proben

Protein-Probe

5 kDa

200 kDa

Färbung

Massentrennungdurch Laufzeit"Bremseffekt" er

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 33Manuelle Elektrophorese

Separation time: 1 - 2 hSeparation by Molecular Weight

Assembly of Equipment

Detection by StainingSDS-PAGE, 14 Steps

Total time: 2 - 4 h

Total time: 8 -12 h

Detection via AntibodiesWesternBlot, 27 Steps

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 34Typische Apparaturen der Gel-Elektrophorese

Vertikale Elpho Horizontale Elpho

Röhrchen Elpho Kapillar Elpho

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 35Typischer Elpho-Run in Vertikaler Kammer

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 36Hydrogel als Trennmatrix: Polyacrylamid

5%-Gel Porengröße 5,3nm20%-Gel Porengröße 3,3nm

90 % Wasser10 % (Acrylamid + Bis-Acrylamid)

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 37Bildung des Netzwerks durch radikalische Reaktion

Chemische Polymerisation• Reaktionsstart durch thermische Radikalbildung aus

Ammoniumperoxodisulfat (NH4)2S2O8 (Initiator)

• Übertragung der Radikale auf TEMED (Katalysator) und von dort auf Acrylamid-Momomere Bildung von Polymerketten + Querverknüpfungen

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 38Bildung des Netzwerks durch radikalische Reaktion

Photo-Polymerisation• UV-Bestrahlung eines photosensitiven Initiators (UVA-UVC)

• Radikalbildung durch:

• Spaltung des Initiators in 2 radikalische Moleküle (Benzoin-Derivate)

• H-Abstraktion (Quinone, Benzophenone)

• charge transfer (Riboflavin) Rib • + TEMED • Acrylamid • PAA

• Übertragung der Radikale auf Acrylamid Polymerisation

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 39Geltypen als Trennmatrix

3 - 6 nm einstellbar150nm - 500nm(Konz:1% - 0.2%)

Porengröße

Proteine, Peptide, DNAfür Moleküle >10nm øDNA, Proteine>500kDa

Anwendung

2 Doppel-Helices lateral, verknüpft an den EndenZwischenräume gefüllt mit crosslinked Polymeren

Netzwerk aus crosslinked Polymeren(AA : BA = 19 bis 40 : 1)

2 Doppel-Helices lateral, verknüpft an den Enden

Struktur

Acrylamid/Bisacrylamid + Agarose

Acrylamid/BisacrylamidPolysaccharid(aus Rotalgen)

Bestand-teile

CompositePolyAcrylamidAgarose

T= (a+b)*100/V

C=b*100/(a+b)

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 40Verhalten ungeladener Teilchen in Flüssigkeit: Diffusion

sm2

1xcDj

∆∆⋅−=1. Fick'sches Gesetz

sm2

DDiffusionskonstante

H+ in Wasser 9,3 10-9 m2s-1

Dextrose in Wasser 1,3 10-9 m2s-1

Protein in Wasser 0,02 10-9 m2s-1

Diffusions-Länge 1mm30 s3 min5 h

Diffusion durch Membran cPj ∆⋅−=

Permeabilität P sm

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 41Diffusion

Zusammenhang zwischen Diffusionskonstante und Beweglichkeit eines Ions

Einstein RelationzFRTD ⋅= µ

Stokes-Einstein Relationr

kTDπη6

=

Hergeleitet für:Ion ist eine Kugel mit Radius rKräfte durch Reibung in der Flüssigkeit mit Viskosität η

2. Fick'sches Gesetz2

2

zcD

tc

∂∂⋅=

∂∂

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 42Beispiele Diffusion

⋅

Φ−=tD

zCtzC NN 2

12

),(0

Dtz

NN e

tDctzC 4

0 2

),(−

⋅⋅=

π

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 43Diffusion Osmose

Was ist Unterschied zwischen Diffusion und Osmose ?

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 44Schwierigkeiten: Bandenverbreiterung - Sensitivität

Probe typisches Volumen 5 µl = 5 mm3

TrennRichtung Gel-Matrix

Die Konzentration der Proben ist vorgegeben.Damit man eine ausreichende Sensitivität erzielt,benötigt man eine bestimmte Stoffmenge.Je geringer die Konzentration desto breiter wird die Probe im Gel 'verschmiert'.Lösung:Ankonzentrierung der Probe durch StackerGel

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 45Ionen im freien Elektrolyten: unterschiedliche Konzentrationen

ii c~σLeitfähigkeit

Konzentration ic

1c 2c

Ir

iiE

σ1~Feldstärke da nur 1 Strompfad

Geschwindigkeiti

i cv µ~ Ev ⋅= µda

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 46Ionen im freien Elektrolyten: Konzentrations-Grenze

21 cc <

cKonzentration

c~σ σLeitfähigkeit

σ1~E

EFeldstärke

vGeschwindigkeit

cv µ~

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 47Ionen im freien Elektrolyten: Wandernde Konzentrations-Grenze

An einem Konzentrations-Anstieg desElektrolyten 'stauen' sich die Ionen.

21 cc <0=t

1tt =

1

2

2

1

cc

vv =

Elpho 1 WS08 H.Schlichting 48Probe im freien Träger-Elektrolyten: Stacking

Verwendung eines Konzentrations-Anstieg desTräger-Elektrolyten um die Probe anzukonzentrieren.

21 cc <0=t 0=t

1tt =

1

2

2

1

cc

vv =Wenn Trägerobe µµ <Pr