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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

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1. Auflage 2012

© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gießen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-0

Verlag: DVG Service GmbH

Friedrichstraße 17

35392 Gießen

0641/24466

[email protected]

www.dvg.net

91-5

Tierärztliche Hochschule Hannover

Morphologische Untersuchungen an den Atemwegen von

Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) unter besonderer

Berücksichtigung von Clara-Zellen

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Victoria Seidel

Iwanowo (Russland)

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Deutsches Primatenzentrum, Göttingen

Abteilung Infektionspathologie

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Tierärztliche Hochschule Hannover,

Deutsches Primatenzentrum, Göttingen

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Gasse

Tierärztliche Hochschule Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2012

Meinem Vater, meiner Mutter

und meinem Mann Andreas

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ................................................................................................... 7

2 LITERATURÜBERSICHT ............................................................................. 8

2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ................................................................................ 8

2.2 Einsatz von Weißbüschelaffen in der biomedizinischen Forschung ................................... 10

2.3 Anatomie der Lunge ............................................................................................................... 12

2.3.1 Makroskopie ............................................................................................................................. 12

2.3.1.1 Lappung .................................................................................................................................... 13

2.3.1.2 Bronchialbaum .......................................................................................................................... 15

2.3.2 Lunge bei Weißbüschelaffen .................................................................................................... 17

2.4 Nicht-zilierte Zellen des pulmonalen Respirationsepithels ................................................. 19

2.4.1 Flimmerepithel .......................................................................................................................... 19

2.4.2 Nicht-zilierte Zellen des Flimmerepithels ................................................................................. 20

2.4.2.1 Clara-Zellen .............................................................................................................................. 20

2.4.2.2 Becherzellen.............................................................................................................................. 22

2.4.2.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen ............................................................................................ 22

2.4.2.4 Basalzellen ................................................................................................................................ 24

2.4.3 Alveolarepithel .......................................................................................................................... 25

2.4.3.1 Pneumozyten Typ I ................................................................................................................... 26

2.4.3.2 Pneumozyten Typ II .................................................................................................................. 27

2.4.4 Pulmonale Surfactant-Proteine ................................................................................................. 28

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN .................................................................. 30

3.1 Material und Methoden .......................................................................................................... 30

3.1.1 Tiere und Probenmaterial .......................................................................................................... 30

3.1.2 Haltungsbedingungen ............................................................................................................... 30

3.1.3 Probenentnahme ........................................................................................................................ 31

3.1.4 Korrosionstechnik ..................................................................................................................... 33

3.1.5 Computertomographie und Datenauswertung mit MeVisLab .................................................. 33

3.1.6 Zuordnung und Nomenklatur der Bronchialbäume .................................................................. 34

3.1.7 Lichtmikroskopie ...................................................................................................................... 35

3.1.7.1 Histologie und Immunhistochemie ........................................................................................... 35

3.1.8 Elektronenmikroskopie ............................................................................................................. 38

3.1.8.1 Transmissionselektronenmikroskopie ....................................................................................... 38

3.1.8.2 Rasterelektronenmikroskopie.................................................................................................... 39

3.1.9 Datenauswertung und statistische Berechnungen ..................................................................... 39

3.2 Ergebnisse ................................................................................................................................ 42

3.2.1 Makroskopie ............................................................................................................................. 42

3.2.1.1 Bronchialbaum .......................................................................................................................... 44

3.2.2 Histologie und Immunhistochemie ........................................................................................... 59

3.2.2.1 Trachea ..................................................................................................................................... 59

3.2.2.2 Hauptbronchus .......................................................................................................................... 59

3.2.2.3 Lobar- und Segmentbronchus ................................................................................................... 60

3.2.2.4 Bronchiolus ............................................................................................................................... 61

3.2.2.5 Nicht-zilierte Zellen der intrapulmonalen Atemwege ............................................................... 62

3.2.2.6 Alveolarepithel .......................................................................................................................... 69

3.2.2.7 Alveolarmakrophagen ............................................................................................................... 71

3.2.3 Verteilung der nicht-zilierten Zellen in den intrapulmonalen luftführenden Wegen ................ 74

3.2.3.1 Statistische Auswertung der nicht-zilierten Zellen ................................................................... 74

3.2.3.2 Prozentuale Verteilung der nicht-zilierten Zellen im Vergleich zu zilierten und

undifferenzierten Zellen ............................................................................................................ 79

3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Clara-Zellen ............................................ 83

4 DISKUSSION .................................................................................................. 90

5 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................. 105

6 SUMMARY ................................................................................................... 108

7 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................... 111

8 ANHANG ...................................................................................................... 127

Einleitung 7

1 EINLEITUNG

Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) als nicht-menschlicher Primat ist ein weit

verbreitetes Tiermodell für verschiedene humane Erkrankungen. Im Vergleich zu anderen

Primaten haben diese Neuweltaffen dank ihrer kleinen Größe, ihrer Anpassungsfähigkeit an

Gefangenschaftshaltung, ihrer reproduktiven Besonderheiten und ihrer Kosteneffizienz viele

Vorteile als Versuchstiermodell.

Hintergrund der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines Tiermodells in nicht-

menschlichen Primaten für chronische Atemwegserkrankungen des Menschen, insbesondere

Asthma und Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).

Bei Asthma und COPD des Menschen spielen die nicht-zilierten Zellen des respiratorischen

Epithels bekanntermaßen eine wichtige Rolle. Um Veränderungen dieser Zellpopulation im

Tiermodell beurteilen zu können, sind umfassende Kenntnisse zur normalen Verteilung und

Morphologie dieser Epithelzellen sowie allgemeiner Lungenbesonderheiten bei

Weißbüschelaffen unerlässlich. Da es aber in der Literatur kaum Informationen zu den

morphologischen Verhältnissen im Respirationstrakt bei Weißbüschelaffen gibt, ist es das

Ziel dieser Arbeit, umfangreiche Informationen und Daten zur Lungenmorphologie,

Bronchialbaumstruktur, Verteilung und Morphologie von Clara-Zellen, Becherzellen und

neuroendokrinen Zellen im Atmungstrakt von Weißbüschelaffen unterschiedlichen Alters zu

gewinnen bzw. generieren, um Referenzdaten im Vorfeld tierexperimenteller Arbeiten zur

Verfügung zu haben und um Aussagen über die anatomischen Ähnlichkeiten und

Unterschiede zu anderen Tiermodellen und dem Menschen machen zu können.

8 Literaturübersicht

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)

Callithrix (C.) jacchus, auch als Pinselohraffe, Marmoset oder Weißbüschelaffe bezeichnet,

ist ein tagaktiver, baumbewohnender Primat aus der Gruppe der Neuweltaffen. Nach

aktueller Klassifikation von RYLANDS und MITTERMEIER (2009) sind die Krallenaffen

eine eigenständige Familie (Callitrichidae) innerhalb der Gruppe der Breitnasenaffen

(Platyrrhini), die aus 7 Gattungen besteht: Atlantische Marmosetten (Callithrix),

Zwergseidenäffchen (Cebuella), Zwergmarmosetten (Callibella), Amazonas-Marmosetten

(Mico), Tamarine (Saguinus), Löwenaffen (Leontopithecus) und Springtamarine (Callimico)

(RYLANDS u. MITTERMEIER 2009). Bei der Gattung Callithrix gibt es keine weiteren

Untergattungen. Der Name „Marmosetten“ wurde zum ersten Mal von WOLTERS und

IMMELMANN (1988) eingeführt, die darunter die Gattungen Callithrix und Cebuella

zusammenfassten (WOLTERS u. IMMELMANN 1988). Inzwischen werden die Gattungen

Callithrix, Mico und Callibella als Marmosetten bezeichnet und die Gattungen Saguinus und

Callimico als Tamarine (GEISSMANN 2003; RYLANDS u. MITTERMEIER 2009).

Gemeinsames anatomisches Merkmal der Gattungen Callithrix, Cebuella und Mico ist, dass

alle Zähne im Vordergebiss etwa gleich hoch sind, wobei die Incisivi vergrößert und die

Canini verkürzt sind (GEISSMANN 2003).

Laut der taxonomischen Revision von GROVES (2005) und RYLANDS u. MITTERMEIER

(2009) besteht die Gattung Callithrix aus 6 Arten (GROVES 2005; RYLANDS u.

MITTERMEIER 2009):

C. jacchus - Weißbüschelaffe

C. penicillata - Schwarzpinselaffe

C. kuhli - Bahia-Seidenaffe

C. geoffroyi - Weißgesichtsseidenaffe

C. aurita - Weißohrseidenaffe

C. flaviceps - Gelbkopfbüschelaffe

Literaturübersicht 9

Weißbüschelaffen weisen eine vorwiegend graubraune Fellfärbung auf. Das Rücken- und

Schwanzfell ist in hellgrauen Tönen transversal gestreift (SCHRÖPEL 2010). Im Alter von

etwa drei Monaten beginnen sich die typischen Gesichtszeichnungen dieser Tierart, weiße

Ohrbüschel, auszubilden (SCHRÖPEL 2010). STEVENSON und RYLANDS (1988) geben

für den adulten Weißbüschelaffen Kopf-Rumpf-Längen von ca. 25 cm und Schwanzlängen

von 28 cm an. Das Gewicht wildlebender Tiere beträgt 317,9 +/- 34,1 g für Männchen und

322,0 +/- 40,4 g für Weibchen. In Laborhaltung wurden mit 347,6 +/- 30,5 g (Männchen)

und 359,7 +/- 50,4 g (Weibchen) etwas höhere Werte ermittelt (ARAUJO et al. 2000).

Im Alter von 9 bis 13 Monaten werden die männlichen Weißbüschelaffen geschlechtsreif,

weibliche Tiere allerdings erst nach ca. 20 Monaten (EISENBERG 1977). Laut HEARN

(1983) beträgt die Ovarialzyklusdauer 28,6 +/- 1,0 Tage (HEARN 1994). Nach einer

Tragzeit von 141-146 Tagen gebären Weißbüschelaffen in bis zu 65 % der Fälle Zwillinge,

die Blut- und Stammzellchimären sind (HEARN 1983, 1994; A. KÖNIG 1995;

GEISSMANN 2003; SCHRÖPEL 2010).

Die Weißbüschelaffen sind vor allem im Nordosten Brasiliens und bis zum Rio Sao

Francisco bzw. südwestlich bis zum Rio Grande verbreitet. In diesem Gebiet herrscht ein

gemischtes Klima, und es sind verschiedene Vegetationsformen vorhanden, die eine hohe

Anpassungsfähigkeit der Tiere verlangen. Die Luftfeuchtigkeit im atlantischen Küstenwald

ist mit 77 - 99 % (auch in der Trockenzeit) sehr hoch. Niederschläge kommen außerhalb der

Regenzeit (Juni bis Juli) eher selten vor. Die Temperaturschwankung in diesem Gebiet

beträgt zwischen 21 und 31° C. Die Tiere sind häufig im Sekundärwald anzutreffen, der

zusammen mit Zuckerrohr- und Cashewnuss-Plantagen reichlich vorhanden ist

(SCHRÖPEL 2010). Je nach Literaturquelle liegt die Lebenserwartung der

Weißbüschelaffen in freier Wildbahn zwischen 10 und 16 Jahren. In Laborhaltung reicht sie

bis zu 18 Jahren (NOWAK 1999). Im Deutschen Primatenzentrum (DPZ), das seit 30 Jahren

über eine große Weißbüschelaffenkolonie verfügt, leben einzelne Tiere, die schon mehr als

20 Jahre alt sind.


2.2 Einsatz von Weißbüschelaffen in der biomedizinischen

Forschung

Weißbüschelaffen werden in den letzten Jahren zunehmend als Tiermodell in der

biomedizinischen Forschung eingesetzt (SASAKI et al. 2009). Während sie zunächst

hautsächlich im Bereich der Infektionsforschung, der Reproduktionsbiologie, der

Neurowissenschaften sowie der Verhaltensforschung eingesetzt wurden, finden sie heute

zunehmend Verwendung in der Arzneientwicklung sowie für die Sicherheitsbewertung von

Substanzen in toxikologischen Studien (MANSFIELD 2003).

In der Infektionsforschung zeigen die Weißbüschelaffen eine hohe Empfänglichkeit für

einige wichtige humane Infektionserreger, u.a. Yersinia pseudotuberculosis, Herpesviren

und Toxoplasma gondii. Außerdem werden sie auch zur Erforschung von

Alterserkrankungen wie der Alzheimer Krankheit und altersbedingter Gehörabnahme

(TARDIF et al. 2010) sowie für Atemwegserkrankungen wie dem Schweren Akuten

Respiratorischen Syndrom (SARS) eingesetzt (GREENOUGH et al. 2005). Weitere

biomedizinische Einsatzgebiete sind Onkologie, Virologie (ADAMS et al. 2008),

Pharmakologie (CHELLMAN et al. 2009), Teratologie, Endokrinologie, Osteologie,

Autoimmunerkrankungen und Transplantationsimmunologie. Zusammenfassend sind in der

Tabelle 1 Krankheitsmodelle und Forschungsbereiche aufgeführt, in denen

Weißbüschelaffen als Tiermodell eingesetzt werden.

Aufgrund ihrer geringen Größe können diese nicht-menschlichen Primaten auch in kleineren

Käfigen artgerecht in Gruppen gehalten werden. Die Größe erleichtert zudem das Handling

der Tiere. Dazu kommen ökonomische Vorteile: da in der Arzneimittelentwicklung das

Verbrauchsmaterial nach Gewicht des Tieres berechnet wird, sind Weißbüschelaffen im

Vergleich zu Rhesusaffen (etwa 5 - 10 kg) 10 - 15 mal kostengünstiger (ORSI et al. 2010).

Durch die frühe Geschlechtsreife und die gute und konstante Reproduktion in Laborhaltung

ergeben sich darüber hinaus Vorteile bezüglich zeitlicher Aspekte, da im Vergleich zu

anderen Affenspezies in kürzerer Zeit reproduzierbare Datensätze erhoben werden können.


Tabelle 1: Einsatz der Weißbüschelaffen für Krankheitsmodelle und Forschungsbereiche.

(MANSFIELD 2003; ORSI et al. 2010).

Neurowissenschaften Multiple Sklerose

Parkinson-Krankheit

Chorea Huntington (Huntington-

Krankheit)

Schlaganfall

Alzheimer-Krankheit

Absence-Epilepsie

Alterung

Rückenmarksverletzung

Immunologie Thymusepithelium

Interleukin 2und 4

Amyloid A (AA) Amyloidose

Induzierte thrombozytopenische Purpura

Infektionskrankheiten Hepatitis

Östliche Pferdeenzephalomyelitis

Schweres Akutes Respiratorisches

Syndrom (SARS)

Viruspersistenz

HIV

Masern

Milzbrand

Pocken

Hämorrhagisches Fieber

Filariose

Malaria

Urogenitale Infektionen

Legionellose

Prionkrankheiten

Andere Reproduktive Biologie und

Immunokontrazeption

Knochenerkrankungen

Humane Physiologie

Verhaltenswissenschaften


2.3 Anatomie der Lunge

2.3.1 Makroskopie

Bei Menschen und Haus- und Labortieren unterscheidet man zwei im Brustraum liegende

Lungen, eine rechte (Pulmo dexter) und eine linke (Pulmo sinister). Sie gliedern sich in

Lappen, Segmente, Läppchen und Azini (LARSEN u. ZIEGENFUSS 2009).

Man differenziert drei äußere Lungenflächen, die von einem einschichtigen flachen Epithel

(Serosa bzw. Pleura) überzogen sind: Facies diaphragmatica, Facies mediastinalis und

Facies costalis (jeweils angrenzend an das Zwerchfell, das Mediastinum und die Rippen)

(MOLL u. MOLL 2005; H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Auf diesen Flächen sind zwei

Kanten zu finden: bei menschlichen Lungen zwischen Facies mediastinalis und Facies

costalis der Margo anterior und beim Übergang zwischen Facies costalis und Facies

diaphragmatica der Margo inferior (MOLL u. MOLL 2005). Bei Haustierlungen nennt man

den stumpfen dorsalen Rand der Lunge Margo dorsalis oder obtusus und den gegenüber

stehenden scharfen Rand Margo acutus (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).

Die rechte und linke Lunge befindet sich jeweils in einer Cavitas pleuralis (in dieser Arbeit

wird aufgrund der starken Ähnlichkeit von Weißbüschelaffen und Menschen sowie der

Motivation dieser Arbeit an einigen Stellen die Human-Nomenklatur benutzt, die Cavitas

pleuralis hieße in der Veterinärnomenklatur Cavum pleurae). Sie werden von einer Pleura

pulmonalis (Pleura visceralis) überzogen, die durch einen schmalen Spalt von der Pleura

parietalis getrennt wird. Im Pleuralspalt befindet sich ein Flüssigkeitsfilm, der die

Verschiebung der Lungen gegenüber der Brustwand ermöglicht (LARSEN u.

ZIEGENFUSS 2009). Die Pleura parietalis ist äußerst schmerzempfindlich, da sie viele

Nerven enthält. Im Gegensatz dazu hat die Pleura visceralis keine sehr ausgeprägte

Innervation (WALDEYER 2003).


2.3.1.1 Lappung

Die Lungenlappung bei Säugetieren ist artspezifisch unterschiedlich ausgebildet. Als Basis

für die Bezeichnung der einzelnen Lungenlappen dient die Aufzweigung des

Bronchialbaums (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Bei Menschen besteht die rechte Lunge

aus drei Lappen (LARSEN u. ZIEGENFUSS 2009):

- Oberlappen (Lobus superior);

- Mittellappen (Lobus medius);

- Unterlappen (Lobus inferior).

Die linke Lunge hingegen besteht nur aus zwei Lappen:

- Oberlappen (Lobus superior);

- Unterlappen (Lobus inferior).

In der Tabelle 2 wird zusammenfassend die Lappung der Lunge bei Menschen, Labor- und

Haustieren dargestellt.

Die Lungenlappen sind bei Menschen (und größeren Säugetieren wie Rindern und Pferden)

mit interlobäre bindegewebige Septen verbunden. Bei Rhesusaffen sind die Septen nur

schwach entwickelt, und bei Mäusen und Ratten fast gar nicht vorhanden (PLOPPER 1996).


Tabelle 2: Lungenlappung bei Menschen, Labor- und Haustieren (ELLENBERGER u.

BAUM 1943; MERCER et al. 1987; TYLER et al. 1988; WEIBEL 1989; HARKEMA et al.

1991; MCBRIDE 1992).

Linke Lunge Rechte Lunge

Mensch Lobus superior

Lobus inferior

Lobus superior

Lobus medius

Lobus inferior

Rhesusaffe Lobus cranialis

Lobus caudalis

Lobus cranialis

Lobus medius

Lobus caudalis

Lobus accessorius

Ratte Lobus cranialis

Lobus caudalis

Lobus cranialis

Lobus medius

Lobus caudalis

Lobus accessorius

Maus Lobus cranialis

Lobus caudalis

Lobus cranialis

Lobus medius

Lobus caudalis

Lobus accessorius

Schwein Lobus cranialis

(zweigeteilt)

Lobus caudalis

Lobus cranialis

Lobus medius

Lobus caudalis

Lobus accessorius

Pferd Lobus cranialis

Lobus caudalis

Lobus cranialis

Lobus caudalis

Lobus accessorius


2.3.1.2 Bronchialbaum

Erste Erkenntnisse über den Bronchialbaum der Säugetiere, inklusive des Menschen,

wurden im Jahr 1880 von AEBY (1880) veröffentlicht.

Die Luftröhre (Trachea) ist eine flexible Röhre, die den Kehlkopf mit den Hauptbronchien

verbindet. Bei menschlichen Erwachsenen ist sie 10 bis 12 cm lang und hat einen

Durchmesser zwischen 1,2 und 1,5 cm (MOLL u. MOLL 2005). Die Trachea wird von

hyalinen Knorpelspangen stabilisiert, die je nach Tierart unterschiedliche Form und Anzahl

haben können (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Die Trachea des Menschen, des Hundes, und

des Pferds besitzt C-förmige Knorpelspangen (MOLL u. MOLL 2005; H. KÖNIG u.

LIEBICH 2008). Beim Schwein hat sie die Form eines fast verschlossenen Ringes mit

überlappenden Enden, und beim Rind sind die Enden der Spangen nach dorsal aufgebogen

(H. KÖNIG u. LIEBICH 2008). Die dorsalen Enden der Knorpelspangen werden von

transversal verlaufender glatter Muskulatur (Musculus trachealis) verschlossen (DRAKE et

al. 2007). Bei den meisten Säugetieren teilt sich die Trachea an dem keilförmigen

Knorpelstück Carina tracheae über die Bifurcatio tracheae in zwei Hauptbronchien

(Bronchi principales), die weiter zur linken und rechten Lunge führen. Bei Wiederkäuer und

Schwein entlässt die Trachea auf der rechten Seite vor ihrer Bifurcatio tracheae einen

Bronchus trachealis. Er ist für die Belüftung des Lobus cranialis verantwortlich (H.

KÖNIG u. LIEBICH 2008). Im weiteren Verlauf verzweigt sich jeder Hauptbronchus in

Lappenbronchien (Bronchi lobares). Je nach Säugetierart können die Abzweigungen

innerhalb der Lappenbronchien jedoch unterschiedlich sein (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008).

Die Verzweigung der Bronchien beim Mensch erfolgt dichotomisch (LARSEN u.

ZIEGENFUSS 2009). Das Aufzweigungsprinzip bei nicht-menschlichen Primaten ist relativ

einzigartig: es kann dichotomisch und trichotomisch sein. Die Bronchialsegmente

verzweigen sich dabei unter einem Winkel von etwa 45° (PLOPPER 2005). Beim Menschen

teilt sich der rechte Hauptbronchus in drei Lappenbronchien (Bronchi lobares superior,

medius und inferior) auf. Der linke Hauptbronchus teilt sich in zwei Lappenbronchien

(Bronchi lobares superior und inferior) auf (MOLL u. MOLL 2005). Danach verzweigen


sich die Lappenbronchien in Segmentbronchien (Bronchi segmentales), die zu einzelnen

bronchopulmonalen Lungensegmenten innerhalb eines Lappens führen. Unter einem

bronchopulmonalen Segment versteht man eine selbstständige funktionstüchtige

Atmungseinheit, die einen Segmentbronchus und eine zugehörige pulmonale Arterie besitzt

(DRAKE et al. 2007). Auf der rechten Seite befinden sich beim Menschen 10

Segmentbronchien:

Bronchus lobaris superior mit 3 Segmentbronchien (1.-3. Lungensegment);

Bronchus lobaris medius mit 3 Segmentbronchien (4.-5. Lungensegment);

Bronchus lobaris inferior mit 5 Segmentbronchien (6.-10. Lungensegment);

Auf der linken Seite sind nur 9 Segmentbronchien vorhanden:

Bronchus lobaris superior mit 5 Segmentbronchien (1.-5. Lungensegment);

Bronchus lobaris inferior mit 4 Segmentbronchien (6.-10. Lungensegment, der 7.

Bronchus fehlt);

Den Segmentbronchien schließen sich mehrere Generationen von Bronchi intrasegmentales

an: mittlere, kleine und kleinste. Die Bronchi lobares, Bronchi segmentales und die anderen

kleineren Bronchien besitzen Knorpelspangen, die unregelmäßig ringförmig in der Wand

angeordnet sind (WALDEYER 2003). Weiterhin gehen die Bronchi subsegmentales in

Bronchioli veri über. In der Humanliteratur spricht man von Bronchiolen, wenn sie weniger

als 1 mm im Durchmesser sind und keine Knorpelplatten haben. Nach mehreren

Verzweigungen gehen die Bronchioli veri in Bronchioli terminales über (DRAKE et al.

2007) und teilen sich schließlich in die Bronchioli respiratorii auf. Bronchioli respiratorii

sind Bronchiolen, in deren alveolären Aussackungen der Gasaustausch stattfindet. Die

Letzteren teilen sich noch 3 mal und zweigen sich in Ductuli alveolares auf. Von den

Ductuli alveolares gehen die Alveolen ab, die sich traubenartig um einen Ductulus

alveolaris herum gruppieren. Gruppen von Alveolen werden als Sacculi alveolares

bezeichnet (MOLL u. MOLL 2005) (Abbildung 1).


Abbildung 1: Schematische Darstellung des Bronchialbaums (H. KÖNIG u. LIEBICH

2008).

Für die großen Menschenaffen (Schimpansen (NAKAKUKI 1992), Orang-Utans

(NAKAKUKI u. EHARA 1991) und Gorillas (NAKAKUKI 1991)) liegen ausführliche

Daten über den Bronchialbaum vor. Es konnte gezeigt werden, dass die Verzweigung des

Bronchialbaums des Menschen und der Menschenaffen weitgehend übereinstimmt

(NAKAKUKI 1992).

2.3.2 Lunge bei Weißbüschelaffen

Erste Beschreibungen der anatomischen Charakteristika der Lunge von Weißbüschelaffen

finden sich in den wissenschaftlichen Arbeiten von FORBES (1880), WELDON (1884) und

BEDDARD (1901). Eine makroskopische und histologische Beschreibung der


Lungenmorphologie bei Callithrix jacchus erfolgte erstmalig von SURRIBAS u.

LAWZEWITSCH (1987) und von FOERSTER (1988).

Die etwa 3 cm lange Trachea teilt sich in zwei Hauptbronchien (SURRIBAS u.

LAWZEWITSCH 1987). Die Lunge von einem adulten Weißbüschelaffen hat, gemessen

von der oberen Kante des oberen Lappens bis zur unteren Kante des unteren Lappens, eine

Ausdehnung von etwa 3,5 cm und ist, wie bei allen luftatmenden Lebewesen, von Pleura

überzogen (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987). Die Lunge ist unterteilt in sechs

Lappen: zwei auf der linken Seite und vier auf der rechten Seite. Die beiden oberen Lappen

(Lobus cranialis sinister und Lobus cranialis dexter) haben eher eine ovale Form. An seiner

Spitze hat der obere linke Lappen (Lobus cranialis sinister) sehr häufig eine Einkerbung.

Die beiden unteren Lappen (Lobus caudalis sinister und Lobus caudalis dexter) sind die

größten. Kranial des Herzens und kaudal des Zwerchfells liegt der mittlere Lappen (Lobus

medius), der eine langgezogene, spitz auslaufende Gestalt aufweist. Der infrakardiale

Lappen (Lobus accessorius) befindet sich auf der rechten Seite und ist im Vergleich zu den

anderen Lappen beweglicher (FOERSTER 1988).

Eine Übersicht über die pränatale Entwicklung sowie die Morphologie der Lunge in der

neonatalen Periode bei Weißbüschelaffen gibt die Arbeit von FOERSTER (1988). In dieser

Arbeit wurden mit Hilfe von Lupen-, Licht- und Elektronenmikroskopie die einzelnen

Phasen der Lungenentwicklung identifiziert und mit denen anderer nicht-menschlicher

Primaten bzw. des Menschen verglichen. Die Lungenentwicklung bei Weißbüschelaffen

stimmt weitgehend mit der anderer Primaten überein.


2.4 Nicht-zilierte Zellen des pulmonalen Respirationsepithels

2.4.1 Flimmerepithel

Die Trachea, Hauptbronchien und intrapulmonalen Atemwege sind von einem

respiratorischen Flimmerepithel (Abbildung 2) ausgekleidet. Die Höhe des Flimmerepithels

nimmt entlang des Bronchialbaums in distale Richtung der Alveolen kontinuierlich ab. In

der Trachea, den Hauptbronchien und den Bronchien befindet sich ein mehrreihiges

hochprismatisches Epithel, wohingegen die Bronchiolen von einem einschichtigen

isoprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet sind (LIEBICH 2009). Die größte

Zellpopulation des respiratorischen Epithels stellen zilierte Zellen dar (SHAH et al. 2009).

Diese besitzen am apikalen Zellpol Zilien, die koordiniert Bewegungen in Richtung des

Pharynx ausführen und damit eine wichtige Rolle bei der mukoziliären Clearance spielen

(WELSCH 2006). Die Oberfläche des respiratorischen Flimmerepithels wird von einem

seromukösen Sekretfilm überzogen, der von Becherzellen und Bronchialdrüsen produziert

wird und zur Reinigung der Atemwege von Pathogenen und Fremdpartikeln (z. B. Staub)

dient. Der Schleimfilm wird in zwei Phasen unterteilt: eine Sol- und Gelphase (LARSEN u.

ZIEGENFUSS 2009). Für die mukoziliäre Clearance ist die Anzahl, Struktur, Aktivität und

koordinierte Bewegung der Zilien sowie eine ausreichende Sekretproduktion der nicht-

zilierten Zellen relevant. Beim Menschen setzt eine optimale Funktion der mukoziliären

Clearance eine Körpertemperatur von 37 °C und eine intrapulmonale absolute Feuchtigkeit

von 44 mg/l entsprechend einer relativen Feuchtigkeit von 100 % voraus (OCZENSKI et al.

2008).

Eine erste Beschreibung zur Histologie des Flimmerepithels im Respirationstrakt von

Weißbüschelaffen lieferten SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987). Das einschichtige

iso- bis hochprismatische Epithel kleidet die Nasen-, Trachea- und stellenweise die

Bronchialbereiche aus. Das bronchioläre Epithel zeichnet sich durch einreihiges kubisches

Epithel aus (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).


2.4.2 Nicht-zilierte Zellen des Flimmerepithels

2.4.2.1 Clara-Zellen

Clara-Zellen (Abbildung 2) sind nicht-zilierte, sekretorisch aktive Zellen, die erstmals von

KÖLLIKER (1881) und später von CLARA (1937) in den terminalen Bronchiolen bei

Kaninchen und Mensch beschrieben wurden. Clara-Zellen erfüllen verschiedene wichtige

Funktionen im respiratorischen Epithel der Lunge. Sie sind involviert in die Regulation von

Entzündungsprozessen und in die Regeneration des Bronchialepithels. Weiterhin können sie

bei Schädigungen des respiratorischen Epithels als Vorläuferzellen für andere zilierte und

nicht-zilierte Zellen dienen (REYNOLDS u. MALKINSON 2009). Ihre Hauptfunktion liegt

in der Synthese und Sekretion verschiedener Substanzen. Sie sezernieren hauptsächlich das

Clara-Zell-Protein, das auch als Clara Cell Secretory Protein (CCSP) bekannt ist. Spezies-

und organabhängig kann man dieses Protein auch unter anderen Namen finden: CC10,

CC16, Uteroglobulin oder Blastokinin (COPPENS et al. 2007).

Durch die Bildung der Surfactant-Proteine A, B und D, die für die unspezifische

Immunabwehr erforderlich sind, tragen die Clara-Zellen zum pulmonalen Surfactant-System

bei (PLOPPER 1996; REYNOLDS u. MALKINSON 2009). Surfactant-Proteine setzen die

Oberflächenspannung herab und ermöglichen die Zilienbewegung unter dem Schleim. Eine

wesentliche detoxifizierende Wirkung für die gesamte Lunge wird den Clara-Zellen

aufgrund verschiedener intrazytoplasmatischer Enzymsysteme, insbesondere einer

Zytochrom-P-450 (CYP) und einer Flavin-enthaltenden Monooxygenase (FMO),

zugeschrieben (DROMMER et al. 1987; DEVEREUX et al. 1989). Bei Rhesusaffen sind

diese jedoch nur in geringem Maße nachweisbar (PLOPPER 1996). Bei den meisten anderen

Labortieren ist eine Zytochrom-P-450-Expression, insbesondere von CYP2B und CYP4B,

nachweisbar. Weiterhin spielen die Clara-Zellen eine wichtige immunmodulierende Rolle,

weil sie Glykosaminoglykane, Lysozym und sekretorisches Immunglobulin A (IgA)

sezernieren können (SINGH u. KATYAL 2000).


Hinsichtlich ihrer Morphologie weisen Clara-Zellen große, spezies-abhängige Unterschiede

auf. Insbesondere ihre Granula, die Menge von Glykogen, das raue endoplasmatische

Retikulum (RER) und das glatte endoplasmatische Retikulum (GER) unterliegen

tierartspezifischen Variationen (PLOPPER et al. 1980a; PLOPPER et al. 1980c; PLOPPER

1983, 1996; REYNOLDS u. MALKINSON 2009).

Man glaubte viele Jahre, dass sich Clara-Zellen nur in den terminalen Bronchiolen befinden.

PLOPPER et al. (1983) konnten jedoch nachweisen, dass die Clara-Zellen bei einigen

Tierarten nicht nur in den Bronchiolen, sondern auch in der Trachea und den

Hauptbronchien vorkommen, wie z. B. bei Rhesusaffe, Maus, Hamster und Kaninchen

(PLOPPER et al. 1983; MARIASSY 1992; COPPENS et al. 2007). Im Gegensatz zu diesen

Tieren sind die Clara-Zellen in der menschlichen Lunge erst ab Höhe der terminalen

Bronchiolen zu finden (BOERS et al. 1999). Immunhistochemisch können Clara-Zellen mit

Antikörpern gegen CCSP dargestellt werden (SINGH u. KATYAL 1997; COPPENS et al.

2007).

Ultrastrukturell weisen Clara-Zellen die für sie typischen elektronendichten Granula auf. Bei

der Katze fehlen diese vollständig (PLOPPER et al. 1980c). Die Mitochondrien können in

der Größe sehr variabel sein. Die größten von ihnen sind zugleich in großen Mengen z.B.

bei Maus und Meerschweinchen zu finden. Die Glykogenspeicherung im Zytoplasma ist

besonders ausgeprägt bei Ratten, Rindern und Kaninchen (PLOPPER u. HYDE 1992; EL-

GAWAD u. WESTFALL 2000). Von einem besonders großen Nukleus wird häufig bei

menschlichen Clara-Zellen berichtet (SMITH et al. 1979). Mit Hilfe der

Elektronenmikroskopie ist der Sekretionsmodus der Clara-Zellen darstellbar: ein apokriner

Typ der Sekretion liegt vor, wenn die Zellen ihre Sekretionsgranula unter Verlust ihres

Zytoplasmas in sogenannten „apical caps“ abschnüren; bei dem merokrinen Typ trennen

sich die Granula ohne Verlust des Zytoplasmas von der Zelle. Beide Sekretionsmodi wurden

bei den Clara-Zellen des Pferdes beobachtet (DROMMER et al. 1987). In der vorhandenen

wissenschaftlichen Literatur liegen bis jetzt keine morphologischen Daten zu Clara-Zellen

bei Weißbüschelaffen vor.


2.4.2.2 Becherzellen

Becherzellen sind nicht-zilientragende, becherförmige, schleimproduzierende Zellen, die im

respiratorischen und intestinalen Epithel sowie in den Konjunktiven des Auges vorkommen.

Sie produzieren hauptsächlich Muzine, die sich unter Wasseraufnahme zu Mukus (Schleim)

umbilden. Becherzellen geben ihre Sekrete auf der Zelloberfläche auf apokrinem und

merokrinem Sekretionsweg ab. Chronische Atemwegserkrankungen, wie z. B. Asthma,

COPD und zystische Fibrose, führen zu einer Hyperplasie und Hypertrophie der

Becherzellen. In der Folge verändert sich aufgrund einer Hypersekretion von Muzinen das

Volumen und die Zusammensetzung des Mukus (ROGERS 2003). Histologisch können

Becherzellen mit der PAS-Reaktion oder immunhistochemisch mit muzinbindenden

Antikörpern wie z. B. MUC5AC nachgewiesen werden.

Ultrastrukturell zeigen Becherzellen eine becherförmige Morphologie und liegen zwischen

den zilientragenden Zellen. In den apikalen Bereichen des Zytoplasmas sind die

charakteristischen elektronendurchlässigen, muzin-enthaltenden Granula zu finden. Im

basalen Bereich befinden sich das raue endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, der

Nukleus und weitere Organellen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).

Bis jetzt ist sehr wenig bekannt über die Becherzellen von Weißbüschelaffen. SURRIBAS

und LAWZEWITSCH (1987) erwähnt in seiner Arbeit nur kurz, dass sie in der Trachea in

geringer Anzahl vorhanden sind.

2.4.2.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen

Seit der ersten Erwähnung von FEYRTER (1938) haben die pulmonalen neuroendokrinen

Zellen (PNEZ) (Abbildung 2) großes wissenschaftliches Interesse hervorgerufen

(FEYRTER 1938; PAN et al. 2004). Sie kommen in geringer Anzahl bei den meisten

Säugetieren, Reptilien, Amphibien, Vögeln und sogar in den Kiemen von Fischen vor

(SORHAUG 2007). Disseminiert im respiratorischen Epithel treten sie einzeln oder in Form

korpuskulärer Zellaggregate, sogenannter „neuroepithelial bodies“, auf (CUTZ 1982). Es ist


bekannt, dass beim Menschen pulmonale neuroendokrine Zellen von dem respiratorischen

Epithel der Nasenhöhle bis zu den bronchioalveolären Regionen vorkommen (SORHAUG

2007). Sie sind meistens nahe an der Basalmembran lokalisiert (HARKEMA et al. 1991).

Neuroepithelial bodies (NEBs) befinden sich eher im Bifurkationsbereich und an den

Übergangsstellen zwischen den Bronchiolen und Alveolen (SORHAUG 2007).

Viele funktionelle und morphologische Eigenschaften teilen die pulmonalen

neuroendokrinen Zellen mit anderen neuroendokrinen Zellen, die z.B. im

Gastrointestinaltrakt vorkommen. Sie synthetisieren und geben bioaktive Peptide und Amine

ab, die über das Blut (endokrin) auf Zielzellen wirken können. NEBs können als

Sauerstoffsensoren dienen. Sie haben engen Kontakt mit Nervenfasern, und die

Sekretprodukte der NEBs können daher als Neurotransmitter agieren (SORHAUG 2007).

Laut SOROKIN et al. (1993) und HOYT et al. (1993) spielen PNEZ eine regulatorische

Rolle in der Lungenentwicklung. Während der pulmonalen Organogenese reifen die PNEZ

als erster Zelltyp aus. Es wird vermutet, dass die von PNEZ produzierten Peptide einen

parakrinen stimulierenden Effekt auf ihre Nachbarzellen haben und damit für die Ausreifung

der Lungen verantwortlich sind (SORHAUG 2007).

Die von den PNEZ bzw. NEBs produzierten Peptide sollen weiterhin die

Entzündungsreaktion bei Erkrankungen wie Asthma und COPD modulieren (SORHAUG

2007). Außerdem werden den PNEZ bzw. NEBs weitere Funktionen wie die Regulation der

pulmonalen Blutbahn und des bronchialen Tonus zugeschrieben (SORHAUG 2007).

Ausgereifte PNEZ haben eine konische oder spindelförmige Struktur, die mit ihrer basalen

Oberfläche an die Basallamina grenzt. Die dünnen apikalen Teile der Zellen dehnen sich in

Richtung des Lumens aus (JOHNSON 1991).

Mit verschiedenen histologischen Techniken, wie z. B. Versilberungen, kann eine prägnante

Argyrophilie der Granula nachgewiesen werden (GRIMELIUS 2004). Dann zeigen die

neuroendokrine Zellen ihre charakteristischen argyrophilen, endokrinen Granula

(DIAUGUSTINE u. SONSTEGARD 1984). Immunhistochemisch kann diese

Zellpopulation mit den üblichen neuroendokrinen Markern, wie z.B. Neuronspezifische


Enolase (NSE) oder Chromogranin A, gut dargestellt werden (WHARTON et al. 1981).

Weitere immunhistochemische Marker für pulmonale neuroendokrine Zellen bzw.

neuroepithelial bodies sind Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und gastrin releasing

peptide (GRP, bombesin) (SCHEUERMANN 1997).

Ultrastrukturell sind für die neuroendokrinen Zellen zahlreiche runde und ovoide

intrazytoplasmatische neurosekretorische Granula charakteristisch, deren Durchmesser

zwischen 70 und 150 nm beträgt. Sie enthalten Peptide und Serotonin (CUTZ et al. 1993).

Die Granula besitzen ein elektronendichtes Zentrum, das von der äußeren Grenzmembran

durch einen klaren, elektronentransparenten Halo getrennt ist.

Neuroendokrine Zellen in der Lunge wurden bei nicht-menschlichen Primaten unter

anderem bei Geoffroy-Klammeraffen (Ateles geoffroyi) beschrieben (LAUWERYNS et al.

1972), aber bis heute liegen keine Veröffentlichungen über die Morphologie oder Verteilung

der pulmonalen neuroendokrinen Zellen bei Weißbüschelaffen vor.

2.4.2.4 Basalzellen

Basalzellen sind kleine, abgeflachte Zellen, die auf der Basallamina ruhen, aber mit ihren

apikalen Zellgrenzen nicht an das Lumen heranreichen (HARKEMA et al. 1991). Mit dieser

zentralen Position haben sie direkten Kontakt mit den Epithelzellen, den Nervenfasern, der

Basalmembran sowie den mesenchymalen Zellen. Auf diese Weise spielen sie eine wichtige

Rolle in der sogenannten „epithelial-mesenchymal trophic unit“ im Bronchialepithel

(EVANS et al. 2001). Sie kommen im gesamten respiratorischen Epithel vor und erfüllen in

der ersten Linie eine regenerative Funktion durch Ersatz von abgestorbenen oder

beschädigten Epithelzellen. Man vermutet, dass sie sich als Reservezellen in eine Clara-

Zelle, Becherzelle oder sogar eine zilierte Epithelzelle differenzieren können (ROCK et al.

2009). Es wird auch berichtet, dass sie zusätzlich eine Funktion in neurogenen

Entzündungen, anderen Entzündungsreaktionen, bei der mukoziliären Clearance und bei

Antioxidationsprozessen im Gewebe haben können (EVANS et al. 2001).


Morphologisch weisen die Basalzellen keine charakteristischen Organellen wie die anderen

nicht-zilierten Zellen auf. Sie besitzen wenig Zytoplasma und einen kleinen Nukleus. Das

Zytoplasma ist gefüllt mit Intermediärfilamenten. Zahlreiche Desmosomen verbinden die

Basalzellen mit umliegenden Epithelzellen (HARKEMA et al. 1991). Immunhistochemische

Untersuchungen der Basalzellen von BOERS et al. (1998) zeigten eine positive Reaktion mit

Hilfe des Antikeratin-Antikörpers 34βE12 als Marker für Basalzellen (BOERS et al. 1998).

Während die Verteilung der Basalzellen innerhalb des Bronchialbaumes bei Rhesusaffen

bereits von HARKEMA et. al. (1991) untersucht wurde, gibt es bis heute bei den als

Versuchstiermodell interessanteren Weißbüschelaffen noch keine Untersuchungen zu den

Basalzellen im Respirationsepithel.

Abbildung 2: Schematische Darstellung verschiedener Zelltypen im Bronchialepithel

(WALDEYER 2003).

2.4.3 Alveolarepithel

Als Alveolarepithel bezeichnet man das einschichtige flache Epithel, mit dem die Innenseite

der Alveolen ausgekleidet ist. In den Alveolen als strukturelle Einheiten des


Respirationstraktes findet der Gasaustausch zwischen Blut und alveolären Luftraum statt.

Das Alveolarepithel setzt sich aus zwei Zelltypen zusammen: Pneumozyten Typ I und

Pneumozyten Typ II. Die Alveolen haben die Form kleiner Bläschen, die weintraubenförmig

einen Alveolargang (Ductulus alveolaris) bilden, der seinerseits das Ende der Bronchiolen

ist. Die einzelne Alveole weist eine runde bis polygonale Form auf, wobei ihr Durchmesser

stark davon abhängt, in welcher Phase der Ein- oder Ausatmung sie sich befindet (WELSCH

2006). Angrenzende Alveolen sind voneinander durch dünne Alveolarsepten getrennt, in

denen sich feinste Poren, die sogenannten Kohn‘schen Poren, befinden. Sie ermöglichen

eine kollaterale, alveoläre Ventilation, Umtausch des Surfactants und auch Durchtritt für

pulmonale Makrophagen (BLÜMCKE 1983). Außerdem enthalten Alveolarsepten viele

Kapillaren und sind reich an Elastin (HEINZELLER 2001).

Untersuchungen von BARBIER und BACHOFEN (2000) zeigen, dass die Alveolarsepten

bei Weißbüschelaffen von auffällig vielen Kohn‘schen Poren unterbrochen werden. Sie

stellen sich in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen besonders gut dar. Des

Weiteren sind die Alveolen bei Weibüschelaffen ungewöhnlich stark kapillarisiert

(BARBIER u. BACHOFEN 2000).

2.4.3.1 Pneumozyten Typ I

Etwa 95 % der inneren Alveolaroberfläche wird von Pneumozyten vom Typ I ausgekleidet

(LIEBICH 2009). Ihre Hauptfunktion ist der Gasaustausch. Pneumozyten Typ I bilden die

Blut-Luft-Schranke, deren Hauptkomponenten, außer den Pneumozyten Typ I, die noch

darunter liegende Basalmembran und das Kapillarendothel sind. Durch die Blut-Luft-

Schranke findet die Aufnahme von Sauerstoff in das Blut und die Abgabe von

Kohlenstoffdioxid in die Atemwege statt (WELSCH 2006).

Pneumozyten vom Typ I sind etwa 50 µm breite und ca. 0,1 – 0,2 µm hohe, stark

abgeflachte Zellen, die über tight junctions mit den Pneumozyten vom Typ II verbunden

sind (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008). Immunhistochemisch lassen sich die Typ I

Pneumozyten mit dem Epithelzellmarker Caveolin-1 darstellen (NEWMAN et al. 1999).


Auf ultrastrukturellem Niveau besitzen Typ I Pneumozyten einen zentral liegenden Nukleus,

Mitochondrien, eine minimale Menge von rauem endoplasmatischen Retikulum und eine

moderate Menge von endozytotischen Vesikeln, Mikrotubuli, Mikrofilamenten und andere

Organellen (PLOPPER 1996; WELSCH 2006).

SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) beschreiben die Typ I Pneumozyten bei

Weißbüschelaffen als Zellen mit wenig Zytoplasma und einem prominenten Nukleus, die

nur minimal in das Alveolarlumen hineinragen (SURRIBAS u. LAWZEWITSCH 1987).

2.4.3.2 Pneumozyten Typ II

Etwa 5% der inneren Alveolaroberfläche bedecken Pneumozyten Typ II, die ebenso viele

wichtige Funktionen erfüllen: Produktion von pulmonalen Surfactant-Proteinen und

Synthese von Fibronektin, Kollagen Typ IV und Proteoglykanen. Ebenso können sie

Arachnidonsäure metabolisieren, um Eikosanoide (z. B. Prostaglandin) zu bilden.

Untersuchungen der letzten Jahre weisen darauf hin, dass die Pneumozyten Typ II sich in

Pneumozyten Typ I differenzieren können und somit als Reservezellen anzusehen sind

(BISHOP 2004). Darüber hinaus exprimieren Pneumozyten Typ II den

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) I-Rezeptor und fungieren als Antigen-

präsentierende Zellen (OSBORN u. LOWENSTINE 1998).

Pneumozyten Typ II haben eine kubische bis polygonale Form, sind bis zu 10 – 15 µm im

Durchmesser groß und liegen meist in den Nischen der Alveolen. Das erklärt die Tatsache,

dass ihre Gesamtzahl innerhalb einer Alveole größer ist als die der Pneumozyten Typ I (40

% Pneumozyten Typ I und 60 % vom Typ II), denn die Pneumozyten vom Typ II sind

wesentlich flächenmäßig kleiner als die vom Typ I (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).

Ultrastrukturell besitzen Pneumozyten vom Typ II einen großen, basal liegenden, runden

Kern mit einem prominenten Nukleolus. Außerdem haben sie viele Mitochondrien,

Ribosomen, wenige Lysosomen, raues endoplasmatisches Retikulum, Mikrovesikel und

einen Golgi-Apparat und Mikrovilli (PLOPPER 1996). Eine Besonderheit der Typ II

Pneumozyten sind zahlreiche osmophile ‚lamellar inclusion bodies‘ (TOMASHEFSKI u.


FARVER 2008), die die wesentlichen Surfactant-Proteine A, B, C und D (SP-A, SP-B, SP-

C, SP-D) enthalten. Dank dieser Surfactant-Proteine lassen sich Typ II Pneumozyten mit

Antikörpern gegen Surfactant-Proteine immuhistochemisch detektieren (SCHMIEDL et al.

2005).

Pneumozyten vom Typ II sind bei Weißbüschelaffen laut SURRIBAS und

LAWZEWITSCH (1987) kubisch bis oval, ihre Zellgrenzen sind „schaumig“ und die Zellen

wölben sich deutlich in Richtung des Alveolarlumens vor.

2.4.4 Pulmonale Surfactant-Proteine

Als „grenzflächenaktive Substanz“ spielt der Surfactant mehrere wichtige Rollen in der

Stabilität und normalen Funktion einer Alveole (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008).

Surfactant setzt sich aus verschiedenen Phospholipiden, insbesondere Dipalmitoyl-Lecithin,

und Glykoproteinen, Plasmaproteinen und speziellen Surfactant-Proteinen (SP-A, SP-B, SP-

C, SP-D) zusammen (TOMASHEFSKI u. FARVER 2008). Während SP-A und SP-D eine

immunologische Funktion zugeordnet wird, spielen SP-B und SP-C eine eher

biophysikalische Rolle. Für die Erkennung von Kohlenhydraten haben hydrophile

Surfactant-Proteine A und D spezielle Domänen, mit deren Hilfe sie mit den

Oberflächenantigenen von Bakterien und Viren interagieren können und sie damit für

Makrophagen phagozytierbar machen. SP-B und SP-C gehören zu den hydrophoben

Membranproteinen, die für die Beschleunigung der Ausbreitung des Surfactantfilms auf der

Alveolaroberfläche verantwortlich sind (GRIESE 1992, 1999).

Bei der Entfaltung einer Alveole werden die Phospholipide zusammengedrückt. Dabei

arrangieren sich die hydrophoben und die hydrophilen Enden jeweils auf einer Seite der

Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht. Dadurch reduziert sich die Oberflächenspannung, und der

Kollaps der Alveole wird verhindert. Bei der Inflation einer Alveole wird diese Anordnung

zerstört. Durch den sich damit ergebenden Anstieg der Oberflächenspannung wird die

elastische Rückstellkraft der Alveole beim Ausatmen unterstützt. Die alveoläre Clearance


wird durch die ständige Sekretion des Surfactants in den Alveolen und seinem Fluss zu den

Bronchiolen unterstützt.

Die Surfactant-Proteine werden hauptsächlich von den Pneumozyten Typ II und den Clara-

Zellen produziert. Ein Teil des Surfactants wird von den Makrophagen phagozytiert

(WELSCH 2006).

Eine mengenmäßig nicht ausreichende Surfactantproduktion kann bei Menschen,

insbesondere bei Neugeborenen zu schweren Erkrankungen wie dem „Neonatal Respiratory

Distress Syndrome“ (NRDS) führen (WELSCH 2006).

30 Eigene Untersuchungen

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN

3.1 Material und Methoden

3.1.1 Tiere und Probenmaterial

In der vorliegenden Arbeit wurden Gewebeproben des Respirationstrakts von 37 klinisch

gesunden Weißbüschelaffen verwendet (s. Anhang, Tabelle 15). Das Probenmaterial stammt

aus dem Sektionsgut des Deutschen Primatenzentrums (DPZ) aus dem Zeitraum von 2009

bis 2011. Die Tiere wurden aufgrund ungünstiger Prognose bei einer nicht den

Respirationstrakt betreffenden Erkrankung, aus tierschutzrelevanten Gründen oder im

Rahmen anderer genehmigter tierexperimenteller Arbeiten euthanasiert. Die verwendeten

Tiere wurden anhand klinischer Angaben, nachfolgender Sektionsergebnisse und

pathohistologischer Untersuchungen als lungengesund eingestuft.

Aufgrund ihrer Altersstruktur wurden die Tiere in 3 Gruppen eingeteilt:

erste Gruppe - Neugeborene (1 bis 2 Tage)

zweite Gruppe - juvenile Tiere (ab 5 bis 18 Monaten)

dritte Gruppe - adulte Tiere (ab 18 Monaten und älter)

3.1.2 Haltungsbedingungen

Die Weißbüschelaffenkolonie des DPZ wird in einem modernen Haltungssystem unter

Berücksichtigung der Mindestanforderungen zur Haltung von Versuchstieren gehalten. Die

Tiere wohnen paarweise, als Familiengruppe mit oder ohne Nachwuchs. Im Alter von etwa

3 bis 5 Monaten werden die Jungtiere von ihren Elterntieren getrennt.

Jede Tiereinheit besitzt eine eigene Futterküche und einen Raum für die tierärztliche

Versorgung. Die Tiere werden in Zuchtvolieren mit einer Größe von 1 m2 Grundfläche und

250 cm Höhe gehalten, wobei mehrere derartige Volieren verbunden werden können. Die

Ausstattung jedes Käfigs schließt verschiedene Kletteräste, Baumzweige sowie wechselndes

Eigene Untersuchungen 31

Spielzeug wie z. B. Pappkartons, Seile, Ketten, Kunststoffkontainer etc. ein. Pro Käfig

stehen den Tieren je nach Gruppengröße 1 bis 2 Holzschlafhäuschen zur Verfügung. Die

Raumtemperatur beträgt 24 bis 26 °C. Die relative Luftfeuchtigkeit liegt zwischen 60 und 70

%. Die Raumluft wird etwa 8 Mal pro Stunde ausgetauscht. Der Hell/Dunkelzyklus beträgt

12 Stunden.

Im Alter von ca. 3 Monaten werden alle Jungtiere gegen Bordetella bronchiseptica

(Bestandsspezifischer Impfstoff gegen Bordetella-Infektionen bei Affen, IDT, Roßlau,

Deutschland), Yersinia pseudotuberculosis (Pseudovac, Fa. IBSS Biomed, Krakow, Polen)

und Rotlauf (Porcilis ery, Fa. Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) geimpft und mit

einem individuellen Mikrochip markiert.

Im Futtermenü der Kolonie von Weißbüschelaffen sind enthalten:

Morgens: Quarkbrei mit Obstanteil, frisches Obst und Gummi arabicum

Mittags: Obst, Gemüse, Reis, Nudeln, Hühnerfleisch

Einmal pro Woche: Mehlwürmer, Heuschrecken

Die Fütterung erfolgt 2 mal am Tag (außer am Sonntag, dann nur einmal). Täglich

bekommen die Tiere Krallenaffenpellets (Fa. Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest,

Deutschland) sowie Wasser ad libitum.

3.1.3 Probenentnahme

Die Tiere wurden unmittelbar vor der Sektion euthanasiert. Hierzu wurden sie zunächst mit

Göttinger Mischung II (GM II, 0,1 ml/kg Körpergewicht i.m.), in tiefe Narkose gelegt.

Göttinger Mischung (10 ml) setzt sich zusammen aus 5 ml Ketamin (100 mg/ml), 1 ml

Xylazin (10 % ig), 0,1 ml Atropin (1 % ig) und 3,9 ml Aqua ad injectionem. Die Euthanasie

erfolgte mittels intrakardialer Injektion von 150 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital-

Natrium (Narcoren, Fa. Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland). Nach der Eröffnung

des Thorax wurde die Lage des Respirationstraktes untersucht. Anschließend wurde der

gesamte Respirationstrakt in toto entnommen und makroskopisch hinsichtlich Größe,

Gewicht und Lappung beurteilt. Die weitere Probenentnahme erfolgte entsprechend dem

Entnahmeschema in Abbildung 3. Für histologische und immunhistochemische

Untersuchungen wurden die vier rechtsseitigen Lungenlappen in 4% igem Formalin fixiert.


Für die elektronenmikroskopische Aufarbeitung wurden die zwei linksseitigen Lappen in 2,5

% igem, frisch angesetztem Glutaraldehyd (GA) verbracht (Protokolle s. Anhang). Hierzu

wurden Gewebeproben aus Bronchien, Bronchiolen und alveolären Bereichen in 2,5 mm3

große Stücke geschnitten und im Kühlschrank bei 4 °C mindestens 24 Stunden und maximal

eine Woche gelagert. Bei einer Reihe von Tieren (G 8233, G 8307, G 8111, G 8001, G

8003, G 8375, G 8217, G 8218, G 8247) wurden zusätzlich Trachea und Hauptbronchus für

histologische und elektronenmikroskopischen Untersuchungen asserviert. Bei diesen Tieren

handelte es sich ausschließlich um adulte Tiere.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Lungen von Weißbüschelaffen und

Probeentnahme. Beschriftung der Lappen: I – Lobus cranialis dexter; II – Lobus medius

dexter; III – Lobus caudalis dexter; IV – Lobus accessorius dexter; V – Lobus cranialis

sinister; VI – Lobus caudalis sinister.


3.1.4 Korrosionstechnik

Mithilfe der sogenannten Ausgusstechnik wurde die Bronchialbaumstruktur der Lunge von

Weißbüschelaffen dargestellt. Es wurden drei Ausgusspräparate der Lungen hergestellt,

jeweils von einem Neonaten (K 2163), von einem Jungtier (K 2097/2) und von einem

adulten Tier (K 2157) (s. Anhang, Tabelle 15). Dabei wurde der Kunststoff

(Methylmetacrylat) Technovit 7143 (Fa. Kulzer&Co GmbH, Bad Homburg, Deutschland)

verwendet.

Zunächst wurden die Lungen inklusive der Trachea von bindegewebigen Anteilen und

Mediastinum abpräpariert und in eine Warmwasserwanne gelegt. Die Luft wurde zusammen

mit der bronchoalveolären Flüssigkeit mittels einer 2 ml-Spritze vorsichtig aus der Lunge

herausgezogen. Daraufhin wurde das Technovit 7143 mit einer 2 ml-Einmalspritze und einer

Kanüle mit Mandrin, die über die Trachea fast bis zur Bifurkation vorgeschoben wurde,

unter mäßigem Druck von Hand in die Lunge injiziert. Für die Lunge eines adulten Tieres

wurden ca. 1,5 ml verwendet. Bei juvenilen Tieren betrug die Menge lediglich ca. 1,1 ml

und bei neugeborenen Tieren ca. 0,8 ml. Die Injektionsdauer betrug 5 bis 10 Sekunden.

Nach der Füllung der Lungen wurde die Kanüle vorsichtig herausgezogen und die Trachea

mit einem Faden zugebunden. Die gefüllte Lunge wurde für den Polymerisationseffekt in

der Warmwasserwanne für 3 Stunden gelagert. Nach der Polymerisation des Kunststoffs

wurden die Lungen mit 40 %igem Kaliumhydroxid (KOH) korrodiert. Um eine bessere,

schnellere und effektivere Korrosion zu erreichen, wurden die Lungen für 24 Stunden in

KOH in den Wärmeschrank bei 50 °C verbracht. Anschließend wurde das Ausgusspräparat

mit Wasser gespült, lackiert und auf einer Halterung fixiert.

3.1.5 Computertomographie und Datenauswertung mit MeVisLab

Die bildgebende Analyse und Ausmessung des Bronchialsystems erfolgte mit Hilfe von

Mikro Computer Tomograph (CT) Scans der Ausgusspräparate mit anschließender

Datenauswertung, die mit speziellen MeVisLab-basierten Bildanalyseverfahren vom

Fraunhofer Institut MEVIS in Bremen durchgeführt wurde.


Mit Hilfe des MeVisLab wurden die Durchmesser der Ausgüsse der Trachea und des

Bronchialbaums ermittelt. Dabei wurden folgende digitale Bildverarbeitungsmethoden

verwendet: Erstellung von 2D-Histogrammen, Skelettierung und Rendering. Ausgehend von

den 2D-Histogrammen der Grauwerte relativ zur Kantenstärke (3D Gradient aus Sobel-

Filter) konnten die optimalen Schwellenwerte per Scan gefunden werden, um die Daten zu

binarisieren. Lücken und kleine Defekte wurden durch Constraint Connection Cost

Operationen gefüllt bzw. bereinigt. Danach wurde die Halterung von dem Ausgusspräparat

entfernt. Eine euklidische Distanztransformation wurde auf die binäre Baummaske

angewendet, um einen Schätzwert für den lokalen Lumenradius zu erhalten. Mit

Skelettierung erhält man die Mittellinien und die Voronoi-Markierung, so dass anschließend

die Radiusinformation vom Skelett auf den vollen Durchmesser der Zweige des

Bronchialbaums übertragen werden konnte. Ebenso wurde der Abstand von der Carina zu

den Voxeln des Skeletts verwendet, um Abbildungen zu erstellen, in denen alle Baumvoxel

dargestellt sind. Eine 3D-Visualisierung der Abbildungen wurde sowohl für Entfernung als

auch für den Durchmesser erstellt. Der Farbkodex pro Parameter blieb für beide Scans

gleich. Anschließend wurde eine virtuelle Unterteilung in Subtrees durchgeführt, indem

Grenzwerte festgelegt wurden, um den zentralen Teil des Bronchialbaums entweder

innerhalb einer von Hand eingestellten Entfernung zur Bifurkation oder über einen günstig

eingestellten Grenzdurchmesser zu entfernen. Bildlich gesehen ergibt der

Durchmesseransatz eine Teilung des Bronchialbaums in anatomisch ähnlichere Teile als der

Entfernungsansatz. Der resultierende Satz nicht zusammenhängender Subtrees wurde mittels

Connected Component Analysis markiert, um die Subtrees in kontrastierende zufällig

ausgewählten Farben zu kolorieren. Um die Übersichtlichkeit zu erhöhen, wurden einige

Teile der Bäume nur als erweitertes Skelett und nicht als komplette Bronchialbaummaske

dargestellt.

3.1.6 Zuordnung und Nomenklatur der Bronchialbäume

Die Bronchialbäume der Weißbüschelaffen wurden mit den bekannten Bronchialbäumen

von Haussäugetieren, Labornagern und dem Menschen verglichen. Aufgrund der großen


Ähnlichkeiten wurde die beim Menschen etablierte Nomenklatur angewandt (MOLL u.

MOLL 2005).

3.1.7 Lichtmikroskopie

3.1.7.1 Histologie und Immunhistochemie

Nach der Entnahme wurden die Gewebeproben aus dem Respirationstrakt für 24 Stunden in

4 %igem, neutral gepuffertem Formalin fixiert. Anschließend wurden durch die

Lungenlappen Nummer I und III (Abbildung 3) 2 Querschnitte angelegt, so dass 3

Lokalisationen (bronchusnah: A, mittig: B, bronchusfern: C) entstanden, die zusammen in

eine Einbettkassette gelegt wurden. Bei einer Reihe von adulten Tieren (G 8233, G 8307, G

8111, G 8001, G 8003, G 8375, G 8217, G 8218, G 8247) wurden zusätzlich Trachea und

Hauptbronchus entnommen. Der mittlere Teil der Trachea und der gesamte Hauptbronchus

wurden transversal geschnitten und in die Einbettkassette gelegt. Die automatische

Paraffineinbettung erfolgte im Excelsior ES (Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich,

Deutschland) nach laborüblichem Protokoll (s. Anhang). Das Ausgießen der Paraffinblöcke

erfolgte mit Hilfe der Ausgießstation EC 350-1 (Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich,

Deutschland). Beim Ausgießen wurden die Lokalisationen A, B und C in eine

standardisierte Reihenfolge gebracht und in Stahlblechformen gelegt. Nach dem Aushärten

wurden die Paraffinblöcke aus den Stahlblechformen herausgenommen und zur Aushärtung

auf Eis gestellt.

Danach wurden Paraffinschnitte für histologische und immunhistochemische Färbungen

hergestellt. Dafür wurden ca. 3 μm dicke Schnitte am Schlittenmikrotom HM 400 (Fa.

ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland) angefertigt. Danach wurden die Schnitte

mit einem in Eiswasser angefeuchteten Streifen Durchschlagpapier vom Paraffinblock

gelöst. Zum Strecken und Beseitigen von Falten wurden sie in ein Warmwasserbad (40 °C)

überführt. Anschließend wurden die Schnitte für die histologischen Färbungen auf

Standardobjektträger (Menzel-Gläser, Fa. Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig,

Deutschland) und für die Immunhistochemie auf Superfrost Plus Objektträger (Menzel-

Gläser, Fa. Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland) aufgezogen. Zum


Trocknen wurden sie 24 Stunden im Wärmeschrank bei 37 °C gelagert und anschließend bei

Raumtemperatur aufbewahrt.

Nach dem im Anhang aufgeführten Protokoll wurden die angefertigten Schnitte für die

histologischen Untersuchungen mit Hilfe des Färbeautomaten Varistain Gemini (Fa. Thermo

Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) mit der Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung

gefärbt.

Für die Darstellung der muzinbildenden Becherzellen wurde die Periodic-Acid-Schiff

(PAS)-Reaktion, die ebenfalls mit dem Färbeautomat Varistain Gemini (Fa. Thermo Fisher

Scientific, Dreieich, Deutschland) erfolgte, als Nachweis für neutrale Mukopolysaccharide

und die Alcian Blau-Färbung (per Hand, s. Anhang) für saure Mukopolysaccharide

durchgeführt.

Die immunhistochemischen Färbungen erfolgten im automatisierten Immunfärbeautomat

Discovery XT (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland, Protokolle s. Anhang). Die

verwendeten Primär-Antikörper sind in Tabelle 3 aufgelistet. Mit der indirekten SABC

(Streptavidin-Biotin-Komplex)-Methode und DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Chromogen

wurden in 4 %igem, neutral gepuffertem Formalin fixierte Paraffinschnitte gefärbt. Als

Sekundärantikörper wurde der Universal Secondary Antibody (Fa. Roche, Mannheim,

Deutschland) verwendet. Für die negative Kontrolle diente Antibody Diluent Roche (Fa.

Roche, Mannheim, Deutschland).

Die Auswertung der histologischen und immunhistochemischen Schnittpräparate erfolgte an

dem Lichtmikroskop Axioplan 2 Imaging mit der Kamera AxioCam HRc (Fa. Zeiss,

Oberkochen, Deutschland). Dabei wurde die Verteilung und Morphologie der nicht-zilierten

Zellen evaluiert und das Lungengewebe grundsätzlich morphologisch beurteilt.


Tabelle 3: Verwendete Antikörper für die immunhistochemischen Färbungen.

Zielzelle/-

Protein

Antikörper Firma/Bestell-

nummer

Verdünnung Positiv-

Kontrolle*

Clara-Zellen Clara Cell Protein Human

Rabbit

Polyclonal Antibody

BioVender

RD 181022220

1:2000 Lunge C.j.

Neuroendokrine

Zellen

Monoclonal Mouse Anti-

Human Neuron-Specific

Enolase (NSE)

Dako M 0873 1:400 Nebenniere C.j.

Becherzellen Mucin 5AC Antibody

(45M1) (MUC5AC)

Novus Biologicals

NB120-3649

1:50 Trachea M.m.

Surfactant B Mouse Monoclonal

Surfactant Protein B

(Precursor) Ab-1

Lab Vision

MS-704-B0

1:10 Lunge C.j.

Surfactant C Rabbit Polyclonal

Prosurfactant Protein C

Abcam ab 28744 1:400 Lunge C.j.

Makrophagen MAC387

Monoclonal Mouse Anti-

Human

Myeloid/Histiocyte

Dako M 0747 1:100 Lunge C.j.

*C.j. – Callithrix jacchus;

M.m. – Macaca mulatta.


3.1.8 Elektronenmikroskopie

3.1.8.1 Transmissionselektronenmikroskopie

Um die Zellen des respiratorischen Epithels auf ultrastrukturellem Niveau zu untersuchen,

wurden zusätzlich transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt.

Das in 2,5 %igem Glutaraldehyd fixierte Gewebe wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei 4

°C im Kühlschrank aufbewahrt und anschließend in einem Epongemisch nach LUFT (1961,

s. Anhang) im Lynx Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) nach

laborüblichlichem Protokoll (s. Anhang) für die Transmissionselektronenmikroskopie

(TEM) eingebettet.

Die Gewebeproben wurden gerichtet eingebettet, so dass beim Schneiden der eingebetteten

Blöcke die untersuchten Lokalisationen, nämlich Bronchus, Bronchiolus und alveoläre

Bereiche erreicht werden konnten. Anschließend erfolgte die Polymerisation des

Epoxidharzes über 24 Stunden bei 60 °C im Wärmeschrank. Die ausgehärteten

Kunststoffblöcke wurden mit Hilfe einer Fräse (Reichert Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim,

Deutschland) auf die Größe des eingebetteten Gewebes zugetrimmt. Am Ultramikrotom

Reichert, Ultracut S (Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) wurden unter Verwendung eines

Diamantenmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) 0,5 µm dicke Semidünnschnitte

angefertigt. Die Schnitte wurden auf Objektträger aufgezogen, bei 60 °C getrocknet und

anschließend mit Methylenblau nach RICHARDSON et al. (1960) gefärbt. Die

lichtmikroskopische Untersuchung von Semidünnschnitten half, die relevanten Bereiche der

Bronchen und Bronchiolen mit nicht-zilierten Zellen zu identifizieren. Die ausgewählten

Bereiche wurden für die Anfertigung von Ultradünnschnitten zeichnerisch dargestellt, und

der Block wurde per Hand auf den gewünschten Bereich zugetrimmt. Nachfolgend wurden

am Ultramikrotom (Reichert, Ultracut S der Fa. Leica, Bensheim, Deutschland) 60 nm

dünne Ultradünnschnitte mit Hilfe eines Diamantenmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz)

angefertigt. Diese wurden auf Kupfer-Lochblenden (single slot 1 x 2, Fa. Plano, Wetzlar,

Deutschland) aufgefangen und mit Uranylazetat und Bleizitrat per Hand kontrastiert.


Die transmissionselektronenmikroskopische Darstellung der nicht-zilierten Zellen erfolgte

am Elektronenmikroskop EM 10 C (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Die

morphologische Befunde wurden fotographisch mit Hilfe einer integrierten Digitalkamera

Slow-scan CCD-Camera for TEM (Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) zusammen mit dem

Bildverarbeitungsprogramm iTEM 5.0 (Fa. Olympus Soft Imaging Solutions GmbH,

Münster, Deutschland) dokumentiert.

3.1.8.2 Rasterelektronenmikroskopie

Von einzelnen Tieren (G 8109 (adult), K 2114 (juvenil) und K 2091 (neonatal)) wurden

darüber hinaus rastelektronenmikroskopische Untersuchungen von dem Lungenlappen V

(Abbildung 3) durchgeführt. Bei der Probenentnahme wurde der Lungenlappen gründlich

mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und in 2,5 %igem Glutaraldehyd sagittal

geschnitten. Die so gewonnenen Gewebeproben wurden bis zur weiteren Verarbeitung in 2,5

%igem Glutaraldehyd bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. Die weitere Probenverarbeitung

erfolgte nach laborüblichem Protokoll (s. Anhang). Die Trocknung erfolgte im Critical Point

Dryer (Modell CPA E 3100, Fa. Polaron, Watford, England). Anschließend wurden die

Gewebestücke mit einem Spezialklebstoff (Leit C, Fa. Plano, Marburg, Deutschland) auf

Aluminiumpräparatehaltern aufgeklebt und im Sputter Coater SCD 040 (Fa. Balzers,

Wiesbaden, Deutschland) mit einer dünnen Goldschicht überzogen. Die Auswertung der

Oberflächenstruktur des Bronchial- und Bronchiolarepithels erfolgte mit Hilfe des

Rasterelektronenmikroskops FEI Quanta 400 F (Hillsboro, Oregon, USA) bei einer

Beschleunigungsspannung von 5-10 kV. Die bildgebende Fotodokumentation wurde mit

dem Bildbearbeitungsprogramm Adobe Photoshop CS (Version 8.0.1., Fa. Adobe Systems

Incorporated, USA) durchgeführt.

3.1.9 Datenauswertung und statistische Berechnungen

Grundsätzlich wurden alle untersuchten Tiere (n = 37) in drei Altersgruppen eingeteilt:

adulte Tiere, juvenile und neugeborene Tiere. Bei allen Tieren der Studie wurden 8 Schnitte

aus den Lungenlappen I und III (Abbildung 3) angefertigt. Für die statistischen


Untersuchungen wurden insgesamt 20 Tiere verwendet (für genauere Angaben zu den

Tieren s. Anhang, Tabelle 15). Die 8 Schnitte pro Lungenlappen wurden hintereinander nach

folgendem Schema geschnitten und histologisch bzw. immunhistochemisch gefärbt:

Schnitt Nr. 1 Haematoxylin und Eosin-Färbung (HE)

Schnitt Nr. 2 PAS-Reaktion

Schnitt Nr. 3 MUC5AC

Schnitt Nr. 4 CCSP

Schnitt Nr. 5 NSE

Schnitt Nr. 6 Surfactant B

Schnitt Nr. 7 Surfactant C

Schnitt Nr. 8 MAC 387

Schnitt Nr. 1 diente der allgemeinen histologischen Beurteilung des Lungengewebes mittels

HE-Färbung. Dabei wurde vor allem geprüft, ob die Lungen gesund waren, und welche

anatomischen Besonderheiten in den Lungen von Weißbüschelaffen gegenüber anderen

Tieren vorhanden sind. Mit dem Schnitt Nr. 2, an dem die PAS-Reaktion durchgeführt

wurde, wurden hauptsachlich die Muzine enthaltenden Becherzellen hinsichtlich Existenz,

Färbeverhalten und Verbreitung evaluiert. Schnitte Nr. 6 (Surfactant B) und 7 (Surfactant C)

wurden hergestellt, um Surfactant-Proteine in Clara-Zellen nachzuweisen. Außerdem

wurden Pneumozyten Typ II mit Hilfe von Surfactant-Protein B deskriptiv beschrieben.

Mittels Schnitt Nr. 8 (MAC 387) konnten Alveolarmakrophagen im Alveolarlumen und auf

der Oberfläche des Alveolarseptum nachgewiesen und allgemein beschrieben werden.

Außerdem wurde die Verteilung bei unterschiedlichen Altersgruppen deskriptiv ermittelt.

Für statistische Untersuchungen wurden bei 20 Tieren (s. Anhang, Tabelle 15) nur die

Schnitte 3, 4 und 5 ausgewählt und miteinander verglichen, um die Verteilung der nicht-

zilierten Zellen (Clara-Zellen, Becherzellen und pulmonale neuroendokrine Zellen) je nach

Lokalisation (Bronchus oder Bronchiolus) und Altersgruppe zu bestimmen. Dabei wurde die

Verteilung der Zellen auf signifikante Unterschiede zwischen den Altersgruppen und

Lokalisationen geprüft. Hierfür wurden in jedem Schnitt Nr. 3, 4 und 5 fünf Strecken pro

immunhistochemischer Färbung (CCSP Human für Clara-Zellen, MUC5AC für


Becherzellen, NSE für pulmonale neuroendokrine Zellen und neuroepithelial bodies), pro

Tier und pro Lokalisation (Bronchi und Bronchioli veri) von Hand ausgezählt. Um die

Vergleichbarkeit zwischen den Strecken bzw. Zählungen herzustellen, wurden die Strecken

auf eine Länge von exakt 100 Zellen standardisiert.

Für die Datenerfassung und Berechnung von Mittelwerten wurde die Software Microsoft

Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, USA) verwendet. Die statistische

Auswertung und die Erstellung der Grafiken erfolgten mit Hilfe des Statistikprogramms

Statistica (Statsoft, Tulsa, USA). Für die primären Endpunkte (Anzahl der CCSP-positiven

Clara-Zellen, MUC5AC-positiven Becherzellen und NSE-positiven pulmonalen

neuroendokrinen Zellen) wurde ein Repeated-Measure Analysis of Variance (ANOVA) Test

modelliert. Bei diesem Test handelt es sich um eine Varianzanalyse, bei der überprüft wird,

ob die Varianzen innerhalb einer Gruppe von Werten größer oder kleiner sind als die

Varianzen zwischen den einzelnen Gruppen. Es wurden die Haupteffekte Altersgruppierung

und Lokalisation und eine Wechselwirkung zwischen den beiden Faktoren modelliert. Das

Signifikanzniveau wurde in allen globalen Tests mit α = 5 % festgelegt, das heißt, dass ein

Unterschied statistisch signifikant war, sobald für die Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05

galt. Für die Paarvergleiche wurden als weiterführende Auswertung T-Tests und eine

Adjustierung mit der Bonferroni-Methode durchgeführt. Bei diesen Tests handelt es sich um

Verfahren, die die Hypothese des signifikanten Unterschieds in der Gruppe weiter

untersuchen. Eine Adjustierung mit der Bonferroni-Methode ist ab einer gewissen Größe der

Gruppe notwendig, um konservativ zu bleiben, d. h. um die Signifikanzen richtig zu

erkennen. Die Grafiken zu den Analysen zeigen Mittelwerte und Konfidenzintervalle

(Standardabweichungen).


3.2 Ergebnisse

3.2.1 Makroskopie

Die paarig angelegten Lungen von Weißbüschelaffen, Pulmo dexter und Pulmo sinister,

lagen im Thorax und füllten dessen ganzen Raum aus. Die Lungen lagen im Brustkorb auf

Höhe der 3. bis 10. Rippe (Weißbüschelaffen haben insgesamt 12 Rippen). Der Lungenhilus

befand sich auf Höhe des 5. Brustwirbels. Die beiden Lungen waren umgeben von der

rechten und linken Pleurahöhle, Cavitas pleuralis, auf beiden Seiten des Mediastinums. Die

Oberfläche der Lungen wurde von der Pleura visceralis bedeckt. Die Pleura war mit dem

Mediastinum am unteren Ende des Hilus durch das kurze Ligamentum pulmonale

verbunden. In diesem Bereich schlug die Pleura visceralis in die Pleura parietalis um.

Größe und Gewicht der Lunge von Weißbüschelaffen waren ziemlich gering. Die hier

aufgeführten Zahlen basieren auf den in dieser Arbeit untersuchten Proben und haben in

erster Linie illustrativen Charakter. Für neugeborene Tiere betrugen das Längenmaß etwa

1,5 - 1,7 cm und die Breite etwa 1,7 - 2,0 cm; für juvenile Tiere betrugen das Längenmaß

etwa 2,0 - 2,4 cm die Breite etwa 2,5 - 3,0 cm und für adulte betrugen das Längenmaß etwa

3,5 - 7,0 cm und die Breite etwa 4,0 - 8,0 cm. Eine adulte Weißbüschelaffenlunge wog

insgesamt (Pulmo dexter und Pulmo sinister ohne Trachea und ohne Hauptbronchus) etwa

2,1 bis 2,6 g. Das entsprach ca. 4,5 % des Körpergewichts. Das Gewicht der Lunge bei

juvenilen Tieren lag bei etwa 1,8 bis 2,1 g und bei neugeborenen Tieren bei etwa 1,1 bis 1,7

g.

Man konnte drei Außenflächen unterscheiden:

- Die Facies costalis hatte eine besonders glatte Oberfläche und eine kuppelartige

Form.

- Die Facies mediastinalis grenzte von ihrer medialen Seite an das Mediastinum und

ihrer dorsalen Seite an die Wirbelsäule. Außerdem hatte diese Oberfläche Kontakt

mit Herz (im Herzbeutel), Vena cava superior und inferior, Vena azygos und

Ösophagus.

- Die Facies diaphragmatica grenzte an das Zwerchfell.


Abbildung 4: Lunge von einem adulten Weißbüschelaffen nach Befüllung mit Agarose.

Ansicht von ventral. Die rechte Lunge besteht aus vier Lungenlappen: I – Lobus cranialis

dexter; II – Lobus medius dexter; III – Lobus caudalis dexter; IV – Lobus accessorius dexter

und die linke Lunge aus zwei: V –Lobus cranialis sinister; VI – Lobus caudalis sinister. Auf

beiden kranialen Lappen sind Einkerbungen (Pfeile) vorhanden.

Die Lungen des Weißbüschelaffen bestanden aus sechs eigenständigen Lungenlappen: vier

auf der rechten Lunge und zwei auf der linken Lunge (Abbildung 4 und Tabelle 4).

Tabelle 4: Lappung der Lunge bei Weißbüschelaffen.

Linke Lunge

Pulmo sinister

Rechte Lunge

Pulmo dexter

Lobus cranialis Lobus cranialis

Lobus caudalis Lobus medius

Lobus caudalis

Lobus accessorius


Zwischen den Lappen waren intralobäre Septen vorhanden.

Die linke Lunge bestand aus zwei Lappen (Abbildung 4): der Lobus cranialis wies eine

flache und ovale Form auf. Deutlich unterhalb des Apex pulmonalis war eine Einkerbung

mit einer Tiefe von einigen Millimetern vorhanden. Der Lobus caudalis hatte eine

dreieckige Form. Auf der medialen Oberfläche des Lobus caudalis befand sich die Impressio

cardiaca.

Die rechte Lunge bestand aus vier Lappen (Abbildung 4): der Lobus cranialis hatte eine

ovale, flache Form mit Einkerbung mit einer Tiefe von einigen Millimetern an der Spitze

(ähnlich dem gleichnamigen Flügel auf der linken Seite). Der Lobus medius hatte eine in

lateraler Richtung spitz zulaufende Gestalt. Außerdem wies der Lobus medius drei Kanten,

eine gewölbte dorsale Seite und zwei flachere mediale Seiten auf. Der Lobus caudalis war

der größte Lappen der rechten Lunge. Er war etwa schildförmig bis dreieckig mit einer

markanten Einbuchtung auf dem Margo acutus. Der Lobus accessorius war der kleinste

Lungenlappen der Lunge. Er lag nah am Herzen und ähnelte in seiner Form auch dem

Herzen selbst, da er oval und spitz zulaufend war.

3.2.1.1 Bronchialbaum

Die Morphologie des Bronchialbaums wurde bei je einer Weißbüschelaffenlunge aus allen

drei Altersgruppen makroskopisch untersucht. Als Grundlage dienten Ausgusspräparate der

Weißbüschelaffenlungen unterschiedlicher Altersstufen (Anhang, Tabelle 15). Die in

Abbildung 5 dargestellten Ausgusspräparate veranschaulichen die altersabhängige Form und

volumenmäßige Ausdehnung der Trachea, Hauptbronchien und Segmentbronchien.


Abbildung 5: Ausgusspräparate von der Lunge (Bronchialbäume) von drei

Weißbüschelaffen unterschiedlicher Altersstufen (von links nach rechts: adultes (K 2157),

juveniles (K 2097/2), neugeborenes (K 2163) Tier). Ansicht von dorsal.

Die Morphologie des Bronchialbaumes war bei allen Altersgruppen grundsätzlich ähnlich

und durch eine dichotomische Aufzweigung gekennzeichnet. Die knorpelgestützte Trachea

teilte sich in zwei Hauptbronchien: Bronchus principalis dexter und Bronchus principalis

sinister. Aus dem Bronchus principalis dexter entsprang kurz hinter der Bifurkation der

Trachea in einem Winkel von etwa 90° in lateraler Richtung der Bronchus lobaris cranialis

dexter, der mit seinen Segmentbronchien den Lobus cranialis belüftet. Er teilte sich sogleich

in drei Segmentbronchien: in den nach dorsal orientierten Bronchus segmentalis apicalis (B

I), in den nach lateral orientierten Bronchus segmentalis posterior (B II) und in den nach

ventral orientierten Bronchus segmentalis anterior (B III). Aus dem Bronchus principalis

dexter gingen drei weitere Abzweigungen hervor: für den Lobus medius in laterale Richtung

in einem Winkel von 90° der Bronchus lobaris medius dexter mit seinem Bronchus


segmentalis lateralis (B IV) und Bronchus segmentalis medialis (B V); für den Lobus

accessorius in ventromediale Richtung in einem Winkel von 130° der Bronchus lobaris

accessorius und für den Lobus caudalis in ventrale Richtung der Bronchus lobaris caudalis

dexter. Der Bronchus lobaris caudalis dexter als Fortsetzung des Bronchus principalis

dexter teilte sich in vier Segmentbronchien auf: in den nach medial orientierten Bronchus

segmentalis superior (B VI), in den nach ventromedial orientierten Bronchus segmentalis

basalis medialis (B VII), in den nach lateral orientierten Bronchus segmentalis basalis

anterior (B VIII) mit seinen kranialen und kaudalen Ästen, in den nach ventrolateral

orientierten Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) und in den nach ventral

orientierten Bronchus segmentalisbasalis posterior (B X).

Aus dem linken Bronchus principalis sinister entsprang in einem Winkel von 145° der

Bronchus lobaris cranialis sinister, der für die Versorgung des Lobus cranialis

verantwortlich war. Er verzweigte sich in vier Segmentbronchien: in den nach dorsal

orientierten Bronchus segmentalis apicalis (B I), in den nach dorsolateral orientierten

Bronchus segmentalis posterior (B II), in den nach ventrolateral orientierten Bronchus

segmentalis anterior (B III) und in den sich sofort spaltendenden Bronchus segmentalis

lateralis (B IV) und Bronchus segmentalis superior (B V). Als Fortsetzung des Bronchus

principalis sinister verlief der Bronchus lobaris caudalis sinister weiter in ventrale Richtung

und belüftet damit den größten Lappen auf dieser Seite, den Lobus caudalis. Wie auch auf

der rechten Seite besaß er drei kleinere Verästelungen: Bronchus segmentalis superior (B

VI), Bronchus segmentalis basalis medialis (VII), Bronchus segmentalis basalis anterior (B

VIII) und zwei kräftigere Verästelungen in Form des nach ventrolateral orientierten

Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) und des nach ventral orientierten Bronchus

segmentalis basalis posterior (B X).

Anhand der CT-Scans dieser Ausgusspräparate (Abbildung 6 bis Abbildung 11) wurden die

Bronchialbäume vermessen (s. Material und Methoden 3.1.5). Die Ergebnisse zum

Durchmesser der Ausgüsse der einzelnen Bronchien und zu der Distanz von der Bifurkation

nach distal sind zusammenfassend in den bis Tabelle 7 aufgeführt.

Bei adulten Tieren maß beim Ausgusspräparat der Durchmesser der Trachea ca. 1000 bis

1150 µm. Während der rechte Hauptbronchus mit 850 bis 1150 µm einen etwas größeren


Durchmesser hatte, war der linke Hauptbronchus mit nur 600 bis 800 µm Durchmesser

etwas kleiner. Der linke Hautbronchus war etwas kürzer als der rechte. Die Lobarbronchien

hatten Durchmesser von 450 bis 650 µm. Der intraluminale Durchmesser der

Segmentbronchien variierte zwischen 250 und 550 µm. Der Bifurkationsbereich der Trachea

wurde für die Entfernungsangaben als Nullpunkt definiert, d. h. alle im Folgenden

angegebenen Entfernungen beziehen sich auf diesen Punkt, an dem rechter und linker

Hauptbronchus zusammentreffen. Nach 4 mm in distaler Richtung im rechten

Hauptbronchus erreichte man den Bronchus lobaris cranialis dexter, wo schon nach 8 bzw.

9 mm die Segmentbronchien anfingen. Von der Bifurkation 7 mm tief rechts in lateraler-

kaudaler Richtung lagen Bronchus lobaris medius dexter und Bronchus lobaris inferior

dexter. Etwas medialer befand sich in einem Abstand von 8 mm ein Bronchus, der in den

akzessorischen Lungenlappen führte, der Bronchus lobaris accessorius. Ausführliche

Angaben zum intraluminalen Durchmesser jedes einzelnen bronchialen Segments sind

zusammenfassend in der Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5: Durchmesser der Bronchien und deren Distanz von dem Bifurkationsbereich bei

einem adulten Weißbüschelaffen (K 2197), ermittelt an einem Ausgusspräparat.

Durchmesser

(µm)

Distanz von der

Bifurkation (mm)

Trachea 1000-1150 _

Bronchus principalis dexter 850-1150 0

Bronchus lobaris cranialis dexter teilt sich in: 450-650 4

Bronchus segmentalis apicalis (B I) 450 9

Bronchus segmentalis posterior (B II) 400 9

Bronchus segmentalis anterior (B III) 300 8

Bronchus lobaris medius dexter teilt sich in: 400-450 7

Bronchus segmentalis lateralis (B IV) 300 12

Bronchus segmentalis medialis (B V) 250 12

Bronchus lobaris inferior dexter teilt sich in: 650 7

Bronchus segmentalis superior (B VI) 300 8

Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 400 12


Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 450-500 12

Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 450 13

Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 500 13

Bronchus lobaris accessorius 300 8

Bronchus principalis sinister 600-800 0

Bronchus lobaris cranialis sinister teilt sich in: 450-500 8




Bronchus lingularis superior (B IV) 250 11

Bronchus lingularis inferior (B V) 250 11

Bronchus lobaris caudalis sinister teilt sich in: 650-700 8

Bronchus segmentalis superior (B VI) 400-450 11


Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 300 11

Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 500-550 11

Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 400 11


Abbildung 6: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Durchmesser

der Bronchusausgüsse bei einem adulten Weißbüschelaffen (K 2157). Der Stern * steht für

B VII, der sich auf der dorsalen Seite befindet und daher nicht sichtbar ist.


Abbildung 7: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Distanzen

vom Bifurkationsbereich nach distal bei einem adulten Weißbüschelaffen (K 2157). Der

Stern * steht für B VII, der sich auf der dorsalen Seite befindet und daher nicht sichtbar ist.


Bei juvenilen Tieren waren die relativen Maßangaben grundsätzlich ähnlich wie bei adulten

Tieren, jedoch entsprechend kleiner skaliert. Die Trachea hatte im Lumen einen

Durchmesser von 1000 bis 1150 µm. Genauso wie bei den oben beschriebenen adulten

Tieren hatte der rechte Hauptbronchus einen Durchmesser von 800 bis 1050 µm im Lumen,

der linke hingegen nur 650 bis 800 µm. Die Lobarbronchien maßen 350 bis 650 µm in

Durchmesser. Der intraluminale Durchmesser der Segmentbronchien variierte zwischen 250

und 500 µm. Ab dem Bifurkationsbereich teilte sich die Trachea (Ausgangspunkt „0 mm“)

in zwei Hauptbronchien, deren Länge unterschiedlich war. Der linke Hautbronchus war

etwas kürzer als der rechte. Der rechte Hauptbronchus verzweigte sich schon nach 5 mm,

dann erreichte man den ersten Lobarbronchus - Bronchus lobaris cranialis dexter. Wenn

man dem rechten Hauptbronchus noch weiter in lateraler Richtung folgte, fand man ab 8

mm die Verzweigung in drei Lobarbronchien: Bronchus lobaris medius dexter, der weiter in

lateraler Richtung verlief, Bronchus lobaris inferior dexter, der für die Versorgung des

rechten kaudalen Lappens verantwortlich war und Bronchus lobaris accessorius, der den

akzessorischen Lappen versorgte. Mehr Angaben zu den einzelnen Bronchien bei juvenilen

Tieren sind in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6: Durchmesser der Bronchien und deren Distanz von dem Bifurkationsbereich bei

einem juvenilen Weißbüschelaffen (K 2097/2), ermittelt an einem Ausgusspräparat.

Durchmesser

(µm)

Distanz von der

Bifurkation (mm)

Trachea 1000-1150 __




Bronchus segmentalis posterior (B II) 300-350 11



Bronchus segmentalis lateralis (B IV) 300 14


Bronchus lobaris inferior dexter teilt sich in: 550-650 8



Bronchus segmentalis basalis medialis (B VII) 250-300 11



Bronchus segmentalis basalis posterior (B X) 450-500 17

Bronchus lobaris accessorius 350-400 8


Bronchus lobaris cranialis sinister teilt sich in: 500-600 8

Bronchus segmentalis apicalis (B I) 350-400 14



Bronchus lingularis superior (B IV) 300 9

Bronchus lingularis inferior (B V) 250 9




Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII) 250 14

Bronchus segmentalis basalis lateralis (B IX) 300 16



Abbildung 8: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von dorsal mit Durchmesser

der Bronchusausgüsse bei einem juvenilen Weißbüschelaffen (K 2097/2). Der Stern * steht

für B VI, der von der dorsalen Seite nicht sichtbar ist.


Abbildung 9: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von dorsal mit Distanz vom

Bifurkationsbereich nach distal bei einem juvenilen Weißbüschelaffen (K 2097/2). Der Stern

* steht für B VI, der von der dorsalen Seite nicht sichtbar ist.


Bei dem neugeborenen Tier betrug der intraluminale Durchmesser der Trachea 700 bis 800

µm. Der rechte und der linke Hauptbronchus maßen beide 500 bis 650 µm im Durchmesser.

Die Lobarbronchien waren deutlich kleiner als bei den anderen Altersgruppen, und der

intraluminale Durchmesser variierte von 250 bis 500 µm. Die Segmentbronchien zeigten

Durchmesser von 100 bis 300 µm. Nach der Verzweigung der Trachea begannen die zwei

Hauptbronchien. Der linke Hautbronchus war etwas kürzer als der rechte. Der rechte

Hauptbronchus verzweigte sich schon nach 2 mm in die Lobarbronchien, wo in lateraler

Richtung der Bronchus lobaris cranialis dexter begann. Weiter kaudal im rechten

Hauptbronchus entsprang nach 6 mm der Bronchus lobaris medius dexter. Nach weiteren 7

mm erreichte man noch zwei Lobarbronchien: Bronchus lobaris inferior dexter und den

nach medial führenden Bronchus lobaris accessorius. Eine detaillierte Information zu jedem

einzelnen Bronchus beim neugeborenen Tier ist in der Tabelle 7 zu finden.

Tabelle 7: Durchmesser der Bronchien und deren Distanz vom Bifurkationsbereich bei

einem neugeborenen Weißbüschelaffen (K 2163), ermittelt an einem Ausgusspräparat.

Durchmesser

(µm)

Distanz von der

Bifurkation (mm)

Trachea 700-800 __







Bronchus segmentalis lateralis (B IV) 100-150 8


Bronchus lobaris inferior dexter teilt sich in: 500 7







Bronchus lobaris accessorius 250-300 7


Bronchus lobaris cranialis sinister teilt sich in: 350 6




Bronchus lingularis superior (B IV) 150-200 8

Bronchus lingularis inferior (B V) 150-200 8








Abbildung 10: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Durchmesser

der Bronchusausgüsse bei einem neugeborenen Weißbüschelaffen (K 2163). Die Sterne *

stehen für B VII und B VI, die sich auf der dorsalen Seite befinden und daher nicht sichtbar

sind.


Abbildung 11: Ansicht des Bronchialbaums (Ausgusspräparat) von ventral mit Distanz vom

Bifurkationsbereich nach distal bei einem neugeborenen Weißbüschelaffen (K 2163). Die

Sterne * stehen für B VII und B VI, die sich auf der dorsalen Seite befinden und daher nicht

sichtbar sind.


3.2.2 Histologie und Immunhistochemie

Die Ergebnisse der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen zu Trachea

und Hauptbronchus beziehen sich entsprechend der Angaben im Abschnitt Material und

Methoden nur auf adulte Tiere. Die Ergebnisse zu den intrapulmonalen Atemwegen

(Bronchus, Bronchiolus) schließen alle untersuchten Altersgruppen ein.

3.2.2.1 Trachea

Die Trachea war von zwei verschiedenen Epithelformen ausgekleidet. Der größte ventrale

Teil der Trachea, die Pars cartilaginea, bestand aus einem einschichtigen, einreihigen

kubischen Epithel, in dem nicht-zilierte Zellen gegenüber den zilierten Zellen dominierten.

Der dorsale knorpelfreie Teil der Trachea, die Pars membranacea, wurde von einem

einschichtigen, mehrreihigen, hochprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet, in dem die

zilierten Zellen überwogen. Mit immunhistochemischen Färbungen konnten die nicht-

zilierten Zellen in beiden Lokalisationen unterschieden werden. Insbesondere im Bereich der

Pars membranacea lagen eine große Anzahl an Clara-Zellen, eine deutlich geringere Anzahl

an Becherzellen und vereinzelt basal liegende pulmonale neuroendokrine Zellen (PNEZ)

vor. Unter der schmalen Basalmembran, auf deren Oberfläche die zilierten und nicht-

zilierten Zellen ruhten, und die nur unter großer Vergrößerung gut sichtbar war, lag die

Lamina propria mucosae. Sie bestand aus lockerem Bindegewebe mit elastischen Fasern

und glatter Muskulatur, Gefäßen und Nerven. Seromuköse Trachealdrüsen waren in der

Lamina propria mucosae nicht nachweisbar.

3.2.2.2 Hauptbronchus

Die an der Bifurcatio tracheae (Bifurkation) beginnenden zwei Hauptbronchien wiesen ein

einschichtiges, mehrreihiges, hochprismatisches Flimmerepithel auf, das in den basalen

Bereichen durch zahlreiche deutlich runde Basalzellen gekennzeichnet war. Außerdem


zeigten sich verschiedene nicht-zilierte Zellen, die mit Hilfe der immunhistochemischen

Färbungen identifiziert werden konnten: Clara-Zellen, vereinzelt Becherzellen und basal

vereinzelt liegende PNEZ. In der Lamina propria mucosae befanden sich eine Schicht

glatter Muskulatur, elastischer Fasern, Gefäße und Nerven. Seromuköse Bronchialdrüsen

waren nicht nachweisbar.

3.2.2.3 Lobar- und Segmentbronchus

Das Bronchiallumen wurde von einem einschichtigen, mehrreihigen, hochprismatischen

Flimmerepithel ausgekleidet, das einer Basalmembran auflag. Die Höhe des Epithels nahm

nach distal ab. Aber auch in den proximalen Regionen in den Bereichen der

Abzweigungsstellen der Lobar- und Segmentbronchien war das Epithel eher isoprismatisch.

Neben zilierten Zellen, die den überwiegenden Teil der Epithelzellen darstellten, zeigten

sich als nicht-zilierte Zellen hauptsächlich Clara-Zellen, aber auch Becherzellen und

pulmonale neuroendokrine Zellen (sie werden später im Kapitel 3.2.2.5 ausführlicher

beschrieben). Zwei Besonderheiten der Bronchuswand bei Weißbüschelaffen waren das

Fehlen von Bronchialdrüsen und die starke Ausprägung des Knorpelgewebes. Die Lamina

propria mucosae war reich an Bindegewebe, das aus kollagenen und elastischen Fasern,

Nerven, Blut- und Lymphgefäßen bestand. Glatte Muskulatur lag den Knorpelstrukturen

lumenwärts auf und war konzentrisch angeordnet. In dem in Abbildung 12 gezeigten

histologischen Schnitt sind die Besonderheiten des respiratorischen Epithels im Bronchus

dargestellt.


Abbildung 12: Histologischer Aufbau eines Segmentbronchus bei einem adulten

Weißbüschelaffen (G 8272). H&E-Färbung, Scale bar = 100 µm.

3.2.2.4 Bronchiolus

Nach mehrmals sich dichotomisch aufteilenden Bronchien folgten die Bronchiolen mit

Durchmesser von etwa 250 µm im Durchmesser. Die Bronchioli veri waren mit einem

einschichtigen, mehrreihigen, isoprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet. Das

Flimmerepithel bestand aus zilierten Zellen und nicht-zilierten Zellen, hauptsächlich Clara-

Zellen, einzelnen Becherzellen und einzelnen pulmonalen neuroendokrinen Zellen sowie

vereinzelt neuroepithelial bodies (NEBs).

Das einschichtige, mehrreihige, isoprismatische Flimmerepithel nahm zur Peripherie hin an

Höhe ab und ging in Höhe der Bronchioli terminales in ein einschichtiges, einreihiges

flaches bis kubisches Flimmerepithel über, bei dem deutlich weniger zilierte Zellen

nachweisbar waren. In den Bronchioli terminales wurden außer den nicht-zilierten Zellen

nur Clara-Zellen und PNEZ gefunden. Die Lamina propria mucosae war nicht mehr so reich

an Bindegewebe. Drüsenstrukturen fehlten. Dafür waren immer noch einzelne

Knorpelplättchen vorhanden (Abbildung 13). Die glatte Muskelschicht war ebenfalls

sichtbar.


Die Bronchioli respiratorii beim Weißbüschelaffen besaßen ein einschichtiges, einreihiges,

kubisches Epithel ohne Zilien. Unter der schmalen Basalmembran fanden sich elastische

Fasern und glatte Muskelzellen. Knorpelplättchen und Drüsenstrukturen lagen nicht vor.

Abbildung 13: Histologischer Aufbau eines Bronchiolus bei einem adulten

Weißbüschelaffen (G 8272). Auch in den terminalen Bronchiolen finden sich bei dieser

Primatenspezies noch hyaline Knorpelstrukturen. H&E-Färbung, Scale bar = 50 µm.

3.2.2.5 Nicht-zilierte Zellen der intrapulmonalen Atemwege

Histologisch war die Differenzierung der verschiedenen nicht-zilierten Zellen im

standardgefärbten H&E-Schnitt sehr schwierig bzw. nicht möglich. Man konnte allenfalls

apikale Zellabschnitte der nicht-zilierten Zellen als konvexe Vorbuchtungen im Bronchial-

und Bronchiolarlumen sehen, die auf apokrin sezernierende Becher- oder Clara-Zellen

hindeuteten (Abbildung 14).


Abbildung 14: Flimmerepithel eines Segmentbronchus eines juvenilen Weißbüschelaffen (G

2095). Es sind vorgewölbte nicht-zilierte Zellen zu sehen (Pfeile). H&E-Färbung, Scale bar

= 20 µm.

3.2.2.5.1 Clara-Zellen

Die Clara-Zellen waren im intrapulmonalen respiratorischen Epithel aller Altersgruppen im

Vergleich zu den anderen nicht-zilierten Zellen der dominante Zelltyp. Die Anzahl der

Zellen hing stark davon ab, welcher Teil des Bronchialbaums untersucht wurde.

Mithilfe eines Antikörpers gegen das Clara Cell Secretory Protein (CCSP) Human konnten

Clara-Zellen im respiratorischen Epithel markiert werden. Hierbei fiel auf, dass von den

Hauptbronchien bis in die terminalen Bronchiolen bei Weißbüschelaffen aller Altersklassen

in hoher Anzahl Clara-Zellen zu finden waren. Die Immunreaktivität der Zellen zeigte sich

in einem intrazytoplasmatischen, teils deutlich granulierten Signal mit Akzentuierung im

apikalen Zellkompartiment (Abbildung 15). Die meisten Zellen hatten entweder eine leicht

vorgewölbte Oberfläche oder eine apikal kuppelartige Form, was der typischen Clara-

Zellmorphologie entsprach. Aber es wurden auch Zellen gefunden, die sich von den

benachbarten zilierten Zellen nicht sonderlich abhoben.

Mit Hilfe der Antiköper gegen die Surfactant-Proteine B und C konnte eine entsprechende

Surfactant-Proteinexpression in den Clara-Zellen bei Weißbüschelaffen aller Altersgruppen

nachgewiesen werden. Surfactant-Protein B wurde ab Höhe der Segmentbronchien

(Abbildung 15 B) und zunehmend nach distal bis zu den Bronchiolen (Abbildung 16 B)

gefunden. Im Gegensatz dazu wurde Surfactant-Protein C nur vereinzelt ab Höhe der

kleineren Segmentbronchien exprimiert und nahm dann ebenfalls nach distal bis zu den


Bronchiolen zu (Abbildung 16 C). Im Bereich der Bronchioli respiratorii wurden beide

Surfactant-Proteine B und C von nahezu allen Clara-Zellen exprimiert.

Abbildung 15: A: CCSP-positive Zellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus bei einem

adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB. CCSP Human. Scale bar = 20 µm.

B: Surfactant-Protein B-positive Zellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus bei einem

adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, Surfactant B. Scale bar = 20 µm.


Abbildung 16: Clara-Zellen in einem Bronchiolus veri bei einem adulten Weißbüschelaffen

(G 8023). Scale bar = 20 µm. A: CCSP exprimierende Clara-Zellen (Pfeile), IHC, SABC-

DAB, CCSP-Human; B: Surfactant-Protein B exprimierende nicht-zilierte Zellen (Pfeile),

IHC, SABC-DAB, Surfactant B; C: Surfactant-Protein C exprimierende nicht-zilierte Zellen

(Pfeile), IHC, SABC-DAB, Surfactant C.

3.2.2.5.2 Becherzellen

Die Markierung von Becherzellen erfolgte färberisch mit der PAS-Reaktion und mit Alcian

Blau 8 GS sowie immunhistochemisch mit dem mukusbindenden intrazytoplasmatischen

Antikörper MUC5AC. Alle angewendeten Färbungen bei allen Altersgruppen zeigten

positive Signale im gesamten respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege,

wenngleich die Intensität aller Färbungen insgesamt eher schwach war und Details der

Becherzellmorphologie wenig deutlich hervortraten (Abbildung 17 und Abbildung 18).

Grundsätzlich konnten in den proximalen Anteilen des Bronchialbaums mehr Becherzellen

identifiziert werden als in den distalen Bereichen.

Die Färbung mit dem mukusbindenden intrazytoplasmatischen Antikörper MUC5AC zeigte

deutliche positive Signale in Granulaform, die sich disseminiert intrazytoplasmatisch


befanden (Abbildung 17 A), vorwiegend aber im apikalen und seltener im mittleren Bereich

des Zytoplasmas nachweisbar waren.

Die in den Becherzellen enthaltenen sauren Mukopolysaccharide wurden mit Hilfe der

Alcian Blau-Färbung (Abbildung 17 B) dargestellt. Mit dieser Färbung waren Becherzellen

nur vereinzelt zu erkennen. Weiterhin war der Oberflächenfilm des respiratorischen Epithels

diffus Alcian Blau positiv.

Die PAS-Reaktion, mit der saure und neutrale Mukopolysaccharide angefärbt werden

konnten, charakterisierte die Becherzellen als magentafarbige Zellen, deren Farbintensität

sehr ungleichmäßig war. Etwa jede 20ste Zelle eines Segmentbronchus war positiv. Bei

neugeborenen Tieren konnte man zusätzlich zu den markierten Becherzellen in basalen

Epithelbereichen viele PAS-positive rundovale Zellen nachweisen, die nicht die luminale

Oberfläche erreichten.

Abbildung 17: A: MUC5AC positive Becherzellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus

eines adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, MUC5AC, Scale bar = 20

µm. B: Alcian Blau positive Becherzellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus bei einem

adulten Weißbüschelaffen (G 8023). Der Oberflächenfilm ist ebenfalls Alcianblau positiv

(gepunkteter Pfeil). Alcian Blau 8GS, Scale bar = 20 µm.


Abbildung 18: PAS-positive Becherzellen (Pfeile) in einem Segmentbronchus eines adulten

Weißbüschelaffen (G 8282). PAS-Reaktion, Scale bar = 20 µm.

3.2.2.5.3 Pulmonale neuroendokrine Zellen

Die immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen die Neuronspezifische

Enolase (NSE) stellte die pulmonalen neuroendokrinen Zellen (PNEZ) in den Bronchien

sowie in den Bronchiolen bei Weißbüschelaffen aller Altersgruppen dar.

Die PNEZ waren am häufigsten nahe der Basalmembran lokalisiert. Es handelte sich zum

einen um runde bis ovale Einzelzellen und zum anderen um korpuskuläre Zellaggregate,

sogenannte „neuroepithelial bodies“ (NEBs) (Abbildung 19). Auffallend war die

topographische Nähe der positiv markierten PNEZ zu den ebenfalls mit NSE anfärbbaren

peribronchialen und peribronchiolären Nervenfasern (Abbildung 19 und Abbildung 20). Die

NEBs bestanden durchschnittlich aus 2 bis 20 Einzelzellen (Abbildung 21). Die Anzahl der

NEBs nahm besonders in terminalen Bronchiolen zu.

Bei allen untersuchten Präparaten kamen die PNEZ selten in Lobar- und Segmentbronchien

vor. Allerdings stieg die Anzahl von PNEZ im bronchiolären Bereich.


Abbildung 19: Runde, überwiegend basal lokalisierte NSE-positive Zellen (Pfeile). Einzelne

Zelle (rechts) und NEB (links) in einem Segmentbronchus bei einem adulten

Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, NSE, Scale bar = 20 µm.

Abbildung 20: NEB (durchgezogener Pfeil) ist mit einer NSE-positivmarkierten Nervenfaser

(gepunkteter Pfeil) verbunden. Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen (G

8307). IHC, SABC-DAB, NSE, Scale bar = 20 µm.

Abbildung 21: NSE-positive Zellen (gepunkteter Pfeil) und NEB bestehend aus ca. 10

Einzelzellen (durchgezogener Pfeil) in einem Bronchiolus bei einem adulten

Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, NSE, Scale bar = 20 µm.

3.2.2.5.4 Basalzellen

Im respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege auf der schmalen Lamina

propria mucosae waren Basalzellen und andere undifferenzierte Zellen zu finden. Mit

Ausnahme des respiratorischen Epithels in den terminalen Bronchiolen und der Bronchioli

respiratorii, konnten sie in allen Lokalisationen und bei allen Altersgruppen gefunden


werden. Die Zellen wiesen eine runde, ovale oder längliche Form auf. Sie besaßen einen

rund-ovalen Kern und wenig Zytoplasma. Auffallend war, dass die Basalzellen häufig

ziemlich nah an den nicht-zilierten Zellen lagen (Abbildung 22). Bei neugeborenen Tieren

waren sie aufgrund des hohen Glykogengehaltes häufig PAS positiv.

Abbildung 22: In Bereichen, wo die nicht-zilierten Zellen (gepunktete Pfeile) häufiger

vorkamen, lagen auf der Basalmembran Basalzellen (durchgezogene Pfeile).

Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8109). Semidünnschnitt,

Methylenblaufärbung nach RICHARDSON et al. (1960), Scale bar = 20 µm.

3.2.2.6 Alveolarepithel

Das Alveolarepithel der Weißbüschelaffen bestand aus zwei Zelltypen: flachen

Pneumozyten Typ I und polygonalen Pneumozyten Typ II, die beide auf der Basalmembran

ruhten. Bei adulten und juvenilen Tieren stellte sich das Alveolarseptum sehr schmal dar.

Bei neugeborenen Tieren wurde das Alveolarseptum von kubischen Alveolarepithelzellen

bedeckt. Der Durchmesser einer Alveole bei neugeborenen Tieren war etwa halb so groß

wie der bei adulten Tieren. Eine einzelne Alveole war rundlich bis polygonal und maß bei

adulten Tieren etwa 50 bis 100 µm im Durchmesser. Bei adulten und juvenilen Tieren

stellten sich Pneumozyten Typ I histologisch als flache Zellen.

Um die Pneumozyten Typ II identifizieren zu können, wurden immunhistochemische

Färbungen mit Antikörpern gegen die Surfactantproteine B und C verwendet. Mittels der

immunhistochemischen Färbungen konnte gezeigt werden, dass die Pneumozyten Typ II

Surfactant-Proteine B und C im Zytoplasma exprimierten. Die meisten Penumozyten Typ II


lagen in den Nischen der Alveolen. Es waren durchschnittlich etwa 2 bis 3 Zellen pro

Alveole bei adulten Tieren vorhanden (Abbildung 23 und Abbildung 24). Sie waren bis zu

15 µm breit und hoch.

Abbildung 23: Alveolarepithel eines adulten Weißbüschelaffen (G 8023) mit Surfactant-

Protein B-positiven Pneumozyten Typ II (Pfeile). Pro Alveole sind etwa 2 bis 3 Surfactant

B-positive Zellen zu sehen. IHC, SABC-DAB, Surfactant-Protein B, Scale bar = 20 µm.


Abbildung 24: Alveolarepithel eines adulten Weißbüschelaffen (G 8023) mit Surfactant-

Protein C-positiven Pneumozyten Typ II (Pfeile). Es wurden ca. 2 bis 3 positive Zellen pro

Alveole gefunden. IHC, SABC-DAB, Surfactant-Protein C, Scale bar = 20 µm.

3.2.2.7 Alveolarmakrophagen

Bei allen Altersgruppen konnten in den alveolären Bereichen pulmonale

Alveolarmakrophagen gefunden werden. Es handelte sich um Zellen mit einer Größe von bis

zu 15 µm im Durchmesser. Während Pneumozyten Typ I und II auf der Basalmembran

saßen, befanden sich die Alveolarmakrophagen anhaftend an den Pneumozyten lumenwärts

oder direkt im Lumen. Pro Alveole konnte man bei einem gesunden adulten

Weißbüschelaffen zwischen 3 und 5 Alveolarmakrophagen finden. Histologisch zeigten sie

ihre typische Struktur mit viel Zytoplasma und großem Kern. Mit Hilfe von

immunhistochemischen Methoden konnten die Alveolarmakrophagen bei

Weißbüschelaffenlungen dargestellt werden. Dazu diente eine immunhistochemische

Färbung mit dem Antikörper MAC 387. Die Alveolarmakrophagen zeigten sich damit als

runde bis ovale Zellen mit viel Zytoplasma (Abbildung 25). Mittels immunhistochemischer

Färbungen mit den Antikörpern Surfactant-Protein B und C konnte außerdem gezeigt


werden, dass Alveolarmakrophagen Surfactant-Proteine B (Abbildung 26 A) und Surfactant-

Protein C (Abbildung 26 B) enthielten.

Abbildung 25: Alveolarmakrophagen (Pfeile) im alveolären Bereich bei einem adulten

Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, MAC 387, Scale bar = 20 µm.


Abbildung 26: A: Surfactant-Protein B enthaltender Alveolarmakrophage (Pfeil) bei einem

adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, Surfactant B, Scale bar = 20 µm. B:

Intraalveoläre Surfactant-Protein C enthaltender Alveolarmakrophage (Pfeil) bei einem

adulten Weißbüschelaffen (G 8023). IHC, SABC-DAB, Surfactant C, Scale bar = 20 µm.


3.2.3 Verteilung der nicht-zilierten Zellen in den intrapulmonalen luftführenden

Wegen

3.2.3.1 Statistische Auswertung der nicht-zilierten Zellen

Im Anschluss an die histomorphologischen und allgemeinen immunhistochemischen

Untersuchungen wurde die Verteilung der nicht-zilierten Zellen statistisch ausgewertet. Die

statistischen Untersuchungen erfolgten an einer ausgewählten Gruppe von

Weißbüschelaffen (n = 20) aus drei Altersgruppen (neugeboren, juvenil, adult). Bei den

Clara-Zellen wurde mittels Repeated-Measure ANOVA Test ein signifikanter Unterschied

zwischen den Altersgruppen in der Anzahl der Clara-Zellen gefunden (p < 0,01). Ein

Unterschied in der Anzahl der Clara-Zellen in der Lokalisation bzw. in der Wechselwirkung

von Altersgruppen und Lokalisation konnte nicht gezeigt werden (Tabelle 8).

Tabelle 8: Ergebnisse der Repeated-Measure ANOVA Tests hinsichtlich Clara-Zellen

bezüglich der Signifikanz der festgestellten Unterschiede.

Effekt p-Wert Interpretation

Altersgruppe < 0,01 Signifikant

Lokalisation = 0,51 Nicht signifikant

Altersgruppe*Lokalisation = 0,21 Nicht signifikant

Die Auswertung deutet auf keine Wechselwirkung zwischen Lokalisation und Altersgruppe

hin, daher wird keine Auftrennung nach Lokalisation unternommen. Auch die Verteilung

der Clara-Zellen in den beiden Lokalisationen Bronchus und Bronchiolus weist keine

statistisch signifikanten Unterschiede auf. Um die Unterschiede in den Altersgruppen

herauszustellen, wurde ein T-Test mit Adjustierung nach der Bonferroni-Methode

verwendet, der unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Altersgruppen durchgeführt

wurde. Hierbei wurden signifikante Unterschiede zwischen adulten und neugeborenen sowie

zwischen juvenilen und neugeborenen Tieren festgestellt (Tabelle 9). Zwischen adulten und

juvenilen Tieren wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden.


Tabelle 9: Paarvergleich hinsichtlich Clara-Zellen.

Vergleich p-Wert (adjustiert) Interpretation

Adulte-Neugeborene < 0,01 Signifikant

Juvenile-Neugeborene < 0,01 Signifikant

Die Mittelwerte der Zählungen von Clara-Zellen und die entsprechenden

Standardabweichungen sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigten, dass

juvenile und adulte Tiere mehr Clara-Zellen besaßen als neugeborene. Eine graphische

Darstellung dieser Ergebnisse ist in Abbildung 27 zu sehen, die das unterschiedliche

Vorkommen von Clara-Zellen bei neugeborenen, juvenilen und adulten Weißbüschelaffen

veranschaulicht.

Tabelle 10: Mittelwerte und Standardabweichungen zu den Repeated-Measure ANOVA

Tests hinsichtlich Clara-Zellen.

Altersgruppe Mittelwert ± Standardabweichung

Adulte 22,23 ± 4,08

Juvenile 26,98 ± 8,53

Neugeborene 16,45 ± 5,08


Adulte Juvenile Neugeborene

Altersgruppe

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

Anzahl der

Cla

ra-Z

ellen

Abbildung 27: Haupteffekt Altersgruppe der Repeated-Measure ANOVA Tests.

Bei den Becherzellen wurden keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Altersgruppen

und keine Wechselwirkung zwischen Altersgruppe und Lokalisation gefunden (p = 0,91, p =

0,51), wohl aber hinsichtlich der Lokalisation (p < 0,02). So war die Anzahl der

Becherzellen im Bronchus signifikant höher als im Bronchiolus. Da keine Wechselwirkung

zwischen Lokalisation und Altersgruppen gefunden werden konnte, war keine Auftrennung

nach Altersgruppen notwendig. Da nur zwei Lokalisationen untersucht wurden, erübrigte

sich auch ein weiterer Hypothesentest innerhalb der Lokalisationen. Die Ergebnisse des

Repeated-Measure ANOVA Test sind in der Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 12 enthält

die Mittelwerte der Zählungen und die entsprechenden Standardabweichungen. Eine

graphische Darstellung der Zählungen der Becherzellen, nach Lokalisation aufgeschlüsselt,

zeigt Abbildung 28. Die Becherzellen kommen im Bronchus häufiger vor als im

Bronchiolus, sind aber in beiden Lokalisationen recht selten.


Tabelle 11: Ergebnisse der Repeated-Measure ANOVA Tests hinsichtlich Becherzellen.


Altersgruppe 0,91 Nicht signifikant

Lokalisation 0,02 Signifikant

Altersgruppe*Lokalisation 0,51 Nicht signifikant

Tabelle 12: Mittelwerte und Standardabweichungen des Repeated-Measure ANOVA Tests

hinsichtlich Becherzellen.

Lokalisation Mittelwert ± Standardabweichung

Bronchus 3,61 ± 3,71

Bronchiolus 1,16 ± 1,64

Bronchus Bronchiolus0

1

2

3

4

5

6

An

za

hl d

er

Be

ch

erz

elle

n

Abbildung 28: Haupteffekt Lokalisation des Repeated-Measure ANOVA Tests bezüglich

Becherzellen.

Bei den pulmonalen neuroendokrinen Zellen wurden ebenfalls keine signifikanten

Unterschiede zwischen den Altersgruppen und keine Wechselwirkung zwischen Alter und

Lokalisation gefunden (Tabelle 13). Die Unterschiede zwischen den Lokalisationen sind

jedoch signifikant (p < 0,01). So war die Anzahl der PNEZ im Bronchiolus signifikant höher


als im Bronchus. Da keine Wechselwirkung zwischen Lokalisation und Altersgruppen

gefunden werden konnte, war keine Auftrennung nach Altersgruppen notwendig. Auch hier

wurden nur zwei Lokalisationen untersucht, so dass auf eine weitergehende Untersuchung

mittels T-Test verzichtet werden konnte. Die Ergebnisse des Repeated-Measure ANOVA

Tests sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Die Ergebnisse der Zählungen stehen in Tabelle

14 und sind ferner in Abbildung 29 graphisch dargestellt. Es konnte also gezeigt werden,

dass die pulmonalen neuroendokrinen Zellen im Bronchiolus häufiger vorkommen als im

Bronchus.

Tabelle 13: Ergebnisse des Repeated-Measure ANOVA Tests hinsichtlich pulmonaler

neuroendokriner Zellen.


Altersgruppe = 0,61 Nicht signifikant

Lokalisation < 0,01 Signifikant

Altersgruppe*Lokalisation = 0,23 Nicht signifikant

Tabelle 14: Mittelwerte und Standardabweichungen zum Repeated-Measure ANOVA Test

hinsichtlich pulmonaler neuroendokriner Zellen.

Lokalisation Mittelwert ± Standardabweichung

Bronchus 1,06 ± 0,70

Bronchiolus 1,87 ± 1,22


Bronchus Bronchiolus0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

An

za

hl d

er

pulm

ona

len n

eu

roe

nd

okrin

en Z

elle

n

Abbildung 29: Haupteffekt Lokalisation des Repeated-Measure ANOVA Tests bei

pulmonalen neuroendokrinen Zellen.

3.2.3.2 Prozentuale Verteilung der nicht-zilierten Zellen im Vergleich zu zilierten und

undifferenzierten Zellen

Die Verteilung der nicht-zilierten Zellen im respiratorischen Epithel in den intrapulmonalen

Wegen war je nach Lokalisation und Altersgruppe unterschiedlich. Im Bereich des

Bronchus stellten die CCSP-positiven Clara-Zellen die Mehrheit der nicht-zilierten Zellen

dar. Becherzellen und PNEZ bildeten einen geringeren Anteil. Betrachtet man zusätzlich zu

den nicht-zilierten Zellen auch die zilierten Zellen, so waren bei adulten Tieren (Abbildung

30) etwa 25 % aller Zellen Clara-Zellen. Bei juvenilen Tieren betrug ihr Anteil sogar 27 %

(Abbildung 31), also etwas mehr als bei adulten Tieren. Bei neugeborenen Tieren hingegen

machte der Anteil der Clara-Zellen lediglich 16 % (Abbildung 32). Diese Ergebnisse

entsprechen somit den bereits dargestellten Werten der statistischen Auswertungen.

MUC5AC-positive Becherzellen machten bei neugeborenen und adulten 4 % der

Gesamtheit aus, bei juvenilen etwa 3 %. NSE-positive pulmonale neuroendokrine Zellen


waren am wenigsten vorhanden und hatten bei allen Altersgruppen konstant ein Anteil von 1

%.

Abbildung 30: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei adulten Tieren im Bronchus.

Abbildung 31: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei juvenilen Tieren im Bronchus.

Zilierte und

undifferenzierte

Zellen

70%

Clara-Zellen

25%

Becherzellen

4%

Neurendokrine

Zellen

1%

Zilierte und

undifferenzierte

Zellen

69%

Clara-Zellen

27%

Becherzellen

3%

Neurendokrine

Zellen

1%


Abbildung 32: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei neugeborenen Tieren im Bronchus.

Im Bereich des Bronchiolus wurde genauso wie im Bereich des Bronchus festgestellt, dass

die CCSP-positive Clara-Zellenpopulation unter den nicht-zilierten Zellen vorherrschte. Bei

adulten Tieren (Abbildung 33) lag ihr Anteil an allen Zellen mit 17 % etwas niedriger als im

Bereich des Bronchus. Bei den juvenilen Tieren (Abbildung 34) war der Anteil mit 27 %

genauso hoch wie im Bronchus. Neugeborene Tiere (Abbildung 35) wiesen im

bronchiolären Bereich mit einem Anteil von 17 % etwas mehr CCSP-positive Clara-Zellen

auf als im Bereich des Bronchus. MUC5AC-positive Becherzellen waren im bronchiolären

Bereich kaum vorhanden. Adulte und neugeborene Tiere wiesen nur 1 % und juvenile 2 %

Becherzellen auf. Die NSE-positiven pulmonalen neuroendokrinen Zellen waren im

bronchiolären Bereich etwas stärker vertreten als im Bereich des Bronchus. Die Anteile

lagen bei adulten und juvenilen Tieren um 2 % und bei neugeborenen bei 1 %.

Zilierte und

undifferenzierte

Zellen

79%

Clara-Zellen

16%

Becherzellen

4%

Neurendokrine

Zellen

1%


Abbildung 33: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei adulten Tieren im Bronchiolus.

Abbildung 34: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei juvenilen Tieren im Bronchiolus.

Zilierte und

undifferenzierte

Zellen

78%

Clara-Zellen

19%

Becherzellen

1%

Neurendokrine

Zellen

2%

Zilierte und

undifferenzierte

Zellen

69%

Clara-Zellen

27%

Becherzellen

2%

Neurendokrine

Zellen

2%


Abbildung 35: Prozentualer Anteil der Epithelzellen bei neugeborenen Tieren im

Bronchiolus.

3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Clara-Zellen

Da Clara-Zellen einen besonderen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellen und außerdem die

mit Abstand häufigsten nicht-zilierten Epithelzellen in den luftleitenden Wegen waren,

wurden entsprechende ultrastrukturelle Untersuchungen durchgeführt, um diesen Zelltyp

näher zu charakterisieren.

Die Clara-Zellen im Bronchus und im Bronchiolus besaßen einen runden bis ovalen Nukleus

mit einem prominenten Nukleolus (Abbildung 36 und Abbildung 37). Das Zytoplasma der

Clara-Zellen war insgesamt etwas elektronendichter als bei den benachbarten zilierten

Zellen (Abbildung 37). Die charakteristischen Clara-Zellgranula waren meistens im apikalen

Bereich des Zytoplasmas zu finden. Sowohl im Bronchus als auch im Bronchiolus konnte

eine unterschiedliche Anzahl von Granula beobachtet werden. Dabei wurde keine

Abhängigkeit von der Lokalisation festgestellt. Die Anzahl von Clara-Zellgranula in einer

Clara-Zelle schwankte zwischen 2 und 40 Stück. In den Clara-Zellen, deren luminaler

Zellpol gleich hoch wie bei den anderen zilierten Zellen war, befanden sich wenige Granula.

Zilierte und

undifferenzierte

Zellen

81%

Clara-Zellen

17%

Becherzellen

1% Neurendokrine

Zellen

1%


In denjenigen, die die anderen zilierten Zellen überragten, konnten in der Regel viele

Granula nachgewiesen werden. Die Granula hatten unterschiedliche Durchmesser und

unterschiedliche elektronenmikroskopische Dichte. Die kleinsten der Granula maßen 100

nm im Durchmesser, die größten hingegen bis zu 500 nm. Die besonders elektronendichten

Granula waren 250 bis 300 nm groß, rund und lagen im apikalen Zytoplasma. Etwa 1 bis 3

Granula pro Zelle zeigten einen elektronenhellen Hof (Abbildung 38).

Im apikalen Zytoplasma, supra- und perinukleär, befand sich wenig glattes und viel raues

endoplasmatisches Retikulum. Perinukleär war der Golgi-Apparat zu erkennen.

Mitochondrien waren basal und perinukleär lokalisiert. Sie waren etwa 1 bis 1,8 µm groß

und vom Crista-Typ (Abbildung 39). Diffus im Zytoplasma wurden weiterhin

Glykogenpartikel gefunden. In den apikalen Bereichen konnten bei vielen Zellen

pinozytotische Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 50 bis 80 nm gefunden werden.

Außerdem enthielten die Clara-Zellen vereinzelt Lipidgranula, die bis zu 1 µm im

Durchmesser maßen. Diese Lipidgranula waren rund und elektronendurchlässig.

Die meisten Clara-Zellen überragten mit ihrem apikalen Zellpol die Zilien des

Flimmerepithels. Aber es gab auch Clara-Zellen, die nicht über die Ebene der benachbarten

luminalen Zellgrenzen hinausragten. Sowohl im Bronchial- als auch im Bronchiolarepithel

konnten Clara-Zellen mit und ohne luminale Projektion gefunden werden. Die apikale

Zellmembran war entweder mit feinen zytoplasmatischen Protrusionen (Abbildung 40 A)

versehen oder glatt. Außerdem waren auf der Oberfläche einiger Zellen viele Mikroporen zu

erkennen (Abbildung 41). Diese konnten besonders gut mittels

rasterelektronenmikroskopischer Untersuchungen festgestellt werden. Unter Verlust des

apikalen Zytoplasmas schnürten die Clara-Zellen bisweilen die sogenannten apical caps als

Ausdruck apokriner Sekretion ab.


Abbildung 36: Clara-Zellen in einem Hauptbronchus mit runden elektronendichten Granula

im apikalen Zytoplasma, hellen Lipidgranula (Pfeil) und Mikrovilli auf der luminalen

Oberfläche bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8212). TEM, Gerätevergrößerung (GV):

X6300.

Abbildung 37: Clara-Zelle in einem Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen

(G 8238), die mit ihrem apikalen Zellpol die Flimmerzellen überragt. TEM, Multiple image

alignment (MIA), GV: X2500.


Abbildung 38: Sekretorische Clara-Zellengranula im apikalen Zytoplasma einer Clara-Zelle.

Die Granula (G) sind rund, elektronendicht und unterschiedlichen Durchmessers. Im

Zytoplasmasaum befinden sich Glykogen (Sternchen) und pinozytotische Vesikel (weiße

gepunktete Pfeile). Die Oberfläche weist Mikrovilli (schwarzer Pfeil) auf.

Segmentbronchus, adulter Weißbüschelaffe (G 8212). TEM, GV: X10000.


Abbildung 39: Clara-Zelle in einem terminalen Bronchiolus bei einem adulten

Weißbüschelaffen (G 8210). Apikal und perinukleär befinden sich elektronendichte Granula

(durchgezogene Pfeile). Die Zelle besitzt einen ovalen Kern (NU). Das Zytoplasma (ZY) ist

etwas elektronendichter als bei den zilierten Zellen und ist reich an rauem

endoplasmatischem Retikulum (RER). Außerdem sind große Mitochondrien vom Crista-T

yp (MI) und viele pinozytotische Vesikel (gepunktete Pfeile) zu finden. Weiterhin sind auf

der Oberfläche der Clara-Zelle zytoplasmatische Protrusionen (ZP), die in das Lumen (L)

hineinragen, zu sehen. TEM, EV: X6300.


Abbildung 40: Nicht-zilierte Clara-Zellen umgeben von zilierten Zellen im

Rasterelektronenmikroskop (REM). Bemerkenswert ist die unregelmäßige Oberfläche der

Clara-Zellen in einem Segmentbronchus bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8109).

REM, GV: X7800.


Abbildung 41: „Apical cap“ einer Clara-Zelle mit zahlreichen Mikroporen (Pfeile) im

Rasterelektronenmikroskop bei einem adulten Weißbüschelaffen (G 8210). REM, GV:

X24750. *

90 Diskussion

4 DISKUSSION

Asthma und COPD zählen zu den häufigsten chronischen Atemwegserkrankungen des

Menschen in Deutschland und der Welt (AMBROSINO u. PAGGIARO 2012). Das

Bundesministerium für Bildung und Forschung schätzt, dass etwa vier Millionen Deutsche

an einer COPD leiden. Um dieser konstant zunehmenden Problematik der chronischen

Atemwegserkrankungen zu begegnen, werden neue Modelle gesucht und entwickelt

(AMBROSINO u. PAGGIARO 2012). Zu den neusten Tiermodellen in der Forschung über

respiratorische Erkrankungen zählen Weißbüschelaffen. Vor einigen Jahren verfassten

PLOPPER und HYDE (2008) ein Review im Zusammenhang mit der Benutzung des

„epithelial-mesenchymalen trophic unit“ (EMTU)-Konzepts und postulierten, dass nicht-

menschliche Primaten ein geeignetes Modell für das Verständnis der Mechanismen von

Asthma und COPD beim Menschen darstellen. Außerdem evaluierte GREENOUGH et al.

(2005) den Weißbüschelaffen als potenzielles Modell für humane Atemwegserkrankungen

wie zum Beispiel dem Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS). Voraussetzung für die

Etablierung von Weißbüschelaffen als nicht-menschliches Primatenmodell für

respiratorische Erkrankungen des Menschen sind umfassende Kenntnisse zur Morphologie

und Physiologie der Lungen bei dieser Spezies. Ziel der vorliegenden Arbeit war die

Darstellung der Lungen-Anatomie bei Weißbüschelaffen auf makroskopischer,

histologischer und elektronenmikroskopischer Ebene sowie die Verteilung der nicht-

zilierten Zellen in der Lunge bei unterschiedlichen Altersgruppen und, damit einhergehend,

die Charakterisierung artspezifischer Besonderheiten bei dieser nicht-menschlichen

Primatenspezies. Eine detaillierte Beschreibung der nicht-zilierten Zellen im

respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege liefert Referenzdaten für weitere

tierexperimentelle Arbeiten hinsichtlich der Physiologie und Pathologie des

Respirationstrakts. Gegenstand der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit waren

insgesamt 37 Tiere unterschiedlicher Altersstufen, die alle als klinisch gesund gewertet

wurden. Darüber hinaus wurden bei 20 Tieren aus allen Altersgruppen (s. Anhang, Tabelle

15) statistische Untersuchungen zur Verteilung von nicht-zilierten Zellen in der Lunge

durchgeführt.

Diskussion 91

In der vorhandenen Literatur gibt es nur wenige Daten zur topographischen Anatomie der

Lungen bei Weißbüschelaffen. Die hier dargestellten Ergebnisse stellen eine detaillierte

Beschreibung der Lungen und deren anatomischer Besonderheiten dar. Im Vergleich zu

anderen Labortieren ist die Lunge von Weißbüschelaffen hinsichtlich ihrer Größe sehr gut

vergleichbar mit der Lunge einer Ratte (HEBEL 1976). Die erste Beschreibung der Lungen

von Weißbüschelaffen wurde von SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) veröffentlicht,

die die Länge der Lunge von einem adulten Tier, gemessen von der oberen Kante des oberen

Lappens, bis zur unteren Kante des unteren Lappens, mit 3,5 cm beziffern. Die Ergebnisse

der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Länge der Lunge für neugeborene Tiere 1,5 - 1,7

cm, für juvenile Tiere 2,0 - 2,4 cm und für adulte 3,5 - 7,5 cm beträgt. Die beiden Lungen

eines adulten Tieres wiegen zusammen ca. 2,1 bis 2,6 g, was einem relativen Lungengewicht

bei Weißbüschelaffen von etwa 4,5 % entspricht. Beim Menschen ist die Lunge in Relation

zum metabolischen Körpergewicht etwas kleiner als beim Weißbüschelaffen (3,3 vs. 4,5 %)

(MOLL u. MOLL 2005).

Die Lungen von nicht-menschlichen Primaten unterscheiden sich von denen des Menschen

hauptsächlich hinsichtlich der Anzahl der Lungenlappen. Menschen haben drei Lappen auf

der rechten Seite und zwei auf der linken, die jeweils eng mit einander verbunden sind

(PLOPPER 2005). SURRIBAS und LAWZEWITSCH (1987) und FOERSTER (1988)

beschreiben die Lungenlappung bei Weißbüschelaffen, wonach vier Lappen inklusive des

Lobus accessorius auf der rechten Seite und zwei Lappen auf der linken Seite vorhanden

sind. FOERSTER (1988) erwähnt zusätzlich, dass auf dem oberen linken Lappen eine

Einkerbung zu finden ist. In Ergänzung der Ergebnisse von FOERSTER (1988) konnte in

dieser Arbeit festgestellt werden, dass solche Einkerbungen auf beiden kranialen Lappen,

sowohl links als auch rechts, bei Weißbüschelaffen vorhanden sind. Hinweise auf ähnliche

Einkerbungen bei anderen Spezies konnten in der Literatur nicht gefunden werden.

Die sechslappige Aufteilung der Lungen wurde nicht nur bei Weißbüschelaffen

nachgewiesen. Sie trifft auch bei Spezies wie Gorilla (NAKAKUKI 1992), Rhesusaffe

(PLOPPER 2005), Ratte, Maus und Schwein (H. KÖNIG u. LIEBICH 2008) zu.

NAKAKUKI (1991, 1992) beschreibt die Unterschiede bzw. Ähnlichkeiten in der

92 Diskussion

Lungenlappung bei Menschenaffen, und legt dar, dass der sechs-lappige Aufbau bei

Menschenaffen durchaus nicht immer üblich ist. So besteht die rechte Lunge von Orang-

Utans und Schimpansen aus Ober-, Mittel- und Unterlappen, was sich mit der Aufteilung

beim Menschen deckt. Akzessorische Lungenlappen fehlen. Die linke Lunge ist in zwei

Lungenlappen (Mittel- und Unterlappen) unterteilt. Es fehlen bei beiden Spezies die

Oberlappen auf der linken Seite. Außerdem bilden die Lungenlappen von Orang-Utans auf

beiden Seiten jeweils einen Lungenflügel. Im Gegensatz dazu sind die Lungenlappen bei

Schimpansen jeweils durch Lungenfissuren voneinander getrennt, was in den im Rahmen

dieser Arbeit erfolgten Untersuchungen ebenso bei Weißbüschelaffen nachgewiesen wurde.

Bei Gorillas hingegen besteht die rechte Lunge aus vier Lungenlappen (Ober-, Mittel-,

Unter- und Akzessorische Lappen). Die linke Lunge besteht ebenso wie bei Orang-Utans

und Schimpansen aus zwei Lungenlappen: Mittel- und Unterlappen. Alle Lungenlappen bei

Gorillas sind mit Lungenfissuren voneinander getrennt, ebenso wie bei Weißbüschelaffen

(NAKAKUKI 1992).

Nach MARIASSY (1992), MERCER et al. (1987), MCBRIDE (1992), und PLOPPER und

HYDE (1992) ist das Aufzweigungsprinzip bei nicht-menschlichen Primaten dichotomisch

und trichotomisch. Beim Menschen ist es allerdings nur dichotomisch (LARSEN u.

ZIEGENFUSS 2009), und das steht im Gegensatz zu Labornagern wie Maus und Ratte, die

eine monopodiale Verzweigung aufweisen (PLOPPER 2005). Um das Aufzweigungsprinzip

bei Weißbüschelaffen zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit außer der allgemeinen

makroskopischen Beurteilung und Beschreibung der Lunge zusätzlich eine

Korrosionstechnik durchgeführt, um Ausgusspräparate des Bronchialbaums zu erhalten. Mit

Hilfe der so entstandenen Präparate und der an diesen durchgeführten CT-Scans war es

möglich, das Bronchialsystem bei Weißbüschelaffen unterschiedlicher Altersstufen zu

charakterisieren. Diese Methode hat durchaus schon eine gewisse Vorgeschichte in der

Forschung an Weißbüschelaffen. Eine der ersten Plastoidfüllungen der Lunge eines

neugeborenen Weißbüschelaffen wurde von FOERSTER (1988) hergestellt. Er konnte

zeigen, dass das Aufzweigungsprinzip des Bronchialbaumes dichotomisch ist. Auf der Basis

unserer Ausgusspräparate konnte ebenfalls ein dichotomisches Aufzweigungsprinzip des

Bronchialsystems bei Weißbüschelaffen festgestellt und die Ergebnisse von FOERSTER

Diskussion 93

(1988) somit bestätigt werden. Darüber hinaus konnten Kenntnisse des

Bronchialbaumsystems, seines Aufzweigungsprinzips, des Durchmessers jedes einzelnen

Segments und der Distanz von der Bifurkation in distaler Richtung gewonnen werden, die

wichtige Informationen für tierexperimentelle Arbeiten mit Weißbüschelaffen darstellen, u.

a. für bronchoskopische Untersuchungsmethoden.

Daten zum Durchmesser der Bronchien und zu der Distanz vom Bifurkationsbereich sind für

klinische, bildgebende Untersuchungsmethoden, wie Bronchoskopie und Radiographie

relevant. Insbesondere wird die Auswahl der Instrumente erleichtert, wenn luminale

Durchmesser des Bronchialbaums bekannt sind. Ein weiteres wichtiges Hilfsmittel ist die

Nomenklatur des Bronchialsystems, denn sie dient vor allem dazu, pathologische

Veränderungen topographisch genauer einzuordnen. Dies erleichtert die Identifizierung der

präzisen Lokalisation pathologischer Lungenbefunde im Tiermodell. Die erste und bis heute

die einzige Untersuchung der Aufzweigung des Bronchialsystems bei Weißbüschelaffen

wurde von FOERSTER (1988) durchgeführt. Er konnte anhand des Ausgusspräparats eines

neugeborenen Tieres alle beim Menschen bekannten 10 Segmentbronchien finden. Unsere

Untersuchungen bezogen Tiere unterschiedlicher Altersgruppen (neugeboren, juvenil, adult)

ein, was die Überprüfung von Unterschieden zwischen den Altersgruppen ermöglichte. Die

Ausgusspräparate zeigten zum einen die dichotomische Aufteilung der Bronchien, was die

Weißbüschelaffen als gemeinsames Merkmal mit dem Menschen teilen, und zum anderen

auch die im Vergleich zum Menschen fehlenden und zusätzlichen Bronchien bei

Weißbüschelaffen. Der beim Menschen oft fehlende, auf der linken Seite der Lunge

liegende, Segmentbronchus (B VII) Bronchus segmentalis basalis medialis kommt bei

Weißbüschelaffen aller Altersgruppen auf der linken und rechten Seite immer vor. Auf der

linken Seite befinden sich der Bronchus segmentalis superior (B VI), der Bronchus

segmentalis basalis medialis (B VII) und der Bronchus segmentalis basalis anterior (B VIII)

auf der gleichen Höhe. Beim Menschen liegt der Bronchus segmentalis superior (B VI)

immer näher an die Bifurkation. Außerdem besitzen die Weißbüschelaffen einen Bronchus

lobaris accessorius, der den Lobus accessorius belüftet. Dieser Bronchus wurde von

FOERSTER (1988) nicht beschrieben. Er beschreibt auch nicht die anderen Lobarbronchien,

sondern nur die Segmentbronchien. Mit dieser Arbeit wurde damit erstmals ein vollständiger

Überblick über die Topographie des Bronchialbaums der Weißbüschelaffenlunge gegeben.

94 Diskussion

In der vorhandenen Literatur werden keine Angaben zum Durchmesser der Bronchien und

deren Abstand von der Bifurkation bei Weißbüschelaffen gemacht. Um diese Fragestellung

zu klären, benutzten wir eine CT-basierte Methode, die von (SCHMIDT u. KUHNIGK

2010) bei menschlichen Lungen etabliert wurde. Die sich anschließende Datenauswertung

mit Hilfe spezieller MeVisLab-basierter Bildanalyseverfahren (www.mevislab.de;

Fraunhofer MEVIS, Bremen) ergab Werte bezüglich des Durchmessers von Trachea, beider

Hauptbronchien, aller Lobarbronchien und Segmentbronchien. Ebenso wurde die Distanz

von der Bifurkation bis zum Anfang jedes Lobar- und Segmentbronchus bei einem

neugeborenen, juvenilen und adulten Weißbüschelaffen bestimmt. Aus der Untersuchung

von MOURISSOUX et al. (2010) ist bekannt, dass die Durchmesser von Bronchien von

Patienten mit hochgradiger COPD-Diagnose größer sind als von Patienten mit

geringgradiger COPD. Durch die wachsende Beliebtheit von Weißbüschelaffen als

Versuchstiermodell auf dem Gebiet der Lungenforschung können Daten über Größen- und

Längenverhältnisse des Bronchialbaumes im Labortier die Exploration von Ergebnissen auf

den Menschen erleichtern und dazu beitragen, methodische Ansätze in der Anaestesiologie

und Notfallmedizinforschung, z. B. bei der Auswahl von passenden Endotrachealtuben, zu

entwickeln (SCHMIDT u. KUHNIGK 2010).

Abschließend ist zum makroskopischen Teil zu sagen, dass trotz einiger Unterschiede in der

Lappung und Segmentierung des Bronchialbaums die Weißbüschelaffen in vielen anderen

morphologischen Aspekten weitgehende Übereinstimmung mit der menschlichen Lunge

zeigen.

Mit Hilfe histologischer Methoden wurden Trachea, Hauptbronchus und die

intrapulmonalen Atemwege untersucht und deskriptiv beschrieben. Histologisch zeigte sich,

dass die Trachea von zwei verschiedenen Formen von Epithel ausgekleidet ist. Dabei fiel

auf, dass die Pars cartilaginea, der größte ventrale Teil der Trachea, im Gegensatz zur Pars

membranacea, überwiegend von nicht-zilierten Zellen überzogen war. Dies steht im

Gegensatz zu den Beobachtungen bei anderen Tierarten (PLOPPER 2005; LIEBICH 2009),

und beim Menschen (PLOPPER 2005), die in der Trachea eine homogene Verteilung von

ziliertem respiratorischen Epithel aufweisen, und stellt möglicherweise eine

tierartspezifische physiologische Besonderheit bei Weißbüschelaffen dar.

http://www.mevislab.de/

Diskussion 95

Es wurde in der Trachea eine große Anzahl von Clara-Zellen gefunden, insbesondere in der

Pars membranacea. PLOPPER (2005) hat in der Trachea von Rhesusaffen und Menschen

nur sehr wenige Clara-Zellen festgestellt, dafür sehr viele bei Ratten und Mäusen. Laut

HARKEMA et al. (1991) sind bei Kaninchen ebenfalls eine große Anzahl von Clara-Zellen

in der Trachea vorhanden.

Der sehr geringe Anteil an Becherzellen in der Trachea von Weißbüschelaffen entspricht

den von PLOPPER (2005) gemachten Angaben bei Ratte und Maus eher als den

Verhältnissen bei Menschen oder Rhesusaffen.

PNEZ wurden beim Weißbüschelaffen in der Trachea und den Hauptbronchien nur

vereinzelt gefunden, was mit Ergebnissen bei anderen Tierarten übereinstimmt (HARKEMA

et al. 1991). NEBs wurden in der Trachea und den Hauptbronchien nicht gefunden, was

ebenfalls die Ergebnisse in der Literatur bestätigt (LAUWERYNS et al. 1972; CUTZ 1982).

Bei der Wahl eines Versuchstiermodells steht häufig die Frage im Raum, ob die

immunhistochemischen Methoden beim Tier funktionieren und die erwartete

Proteinexpression mit dem gewünschten Ergebnis korreliert werden kann. Heutzutage

existieren nur einige wenige Antikörper, die spezifisch für Weißbüschelaffen entwickelt

wurden. Allerdings funktionieren aufgrund der phylogenetischen Nähe zwischen dem

Weißbüschelaffen und dem Menschen viele poly- und monoklonale Antikörper bei

Weißbüschelaffen genau so gut wie beim Menschen (MANSFIELD 2003). In dieser Arbeit

wurden die Antikörper CCSP, MUC5AC, NSE, MAC387, Surfactant-Protein B, Surfactant-

Protein C und CD3 und CD20 (auch als Doppelmarkierung) verwendet, die teilweise im

eigenen Labor für diese Arbeit zunächst für den Weißbüschelaffen etabliert werden mussten.

Mittels des CCSP-Antikörpers konnte die Clara-Zellpopulation detektiert werden, die im

gesamten respiratorischen Epithel der Lungen nachgewiesen werden konnte. Zu diesem

Zelltyp bei Weißbüschelaffen gibt es bis heute keine veröffentlichten Untersuchungen. Wie

schon von PLOPPER et al. (1980b; 1983) berichtet wurde, weisen die Clara-Zellen bei

unterschiedlichen Tierarten eine variable Morphologie auf. In früheren Publikationen wurde

berichtet, dass die Clara-Zellen bei Menschen ausschließlich in den terminalen Bronchiolen

vorkommen (BOERS et al. 1999; RYERSE et al. 2001). Dagegen bestätigen neuere

Untersuchungen das Vorhandensein von CCSP-positiven Zellen auch in den

96 Diskussion

Hauptbronchien und Trachea. Bei Ratten-Lungen benutzten SINGH et al. (1997) einen

CCSP-Antikörper, um Clara-Zellen in den Bronchien und Bronchiolen zu detektieren. Bei

nicht-menschlichen Primaten, z. B. bei Rhesusaffen, kommen die Clara-Zellen in der

Trachea und in den Haupt-, Lobar- und Segmentbronchien vor (COPPENS et al. 2007).

Diese Verteilung von Clara-Zellen ist bei Weißbüschelaffen und Rhesusaffen sehr ähnlich.

Ein interessanter Aspekt zur Verteilung der CCSP-positiver Zellen bei Rhesusaffen wurde

von COPPENS et al. (2007) veröffentlicht. Die Autoren stellten eine besonders große

Menge der CCSP-Expression an den Verzweigungen der Bronchien fest. Diese konnte bei

Weißbüschelaffen in dieser Arbeit nicht beobachtet werden.

Darüber hinaus zeigten die Untersuchungen von COPPENS et al. (2007), dass CCSP zum

Teil mit Muzinen im Zytoplasma kolokalisiert ist. Zu ähnlichen Ergebnissen kommen auch

BOERS et al. (1999) und SINGH und KATYAL (1997) in Bezug auf den Menschen. Im

Rahmen dieser Arbeit wurden keine Doppelmarkierungen hinsichtlich der Kolokalisation

der Clara-Zellproteine und Muzine durchgeführt, und daher kann nur vermutet werden, dass

bei Weißbüschelaffen die Clara-Zellen auch Muzine enthalten.

Zur Verteilung der Clara-Zellen im humanen gesunden respiratorischen Epithel liegen nur

wenige Untersuchungen vor. BOERS et al. (1999) untersuchten die Clara-Zellen bei

erwachsenen Menschen mittels einer statistischen Methode, die der in der vorliegenden

Arbeit sehr ähnlich ist. BOERS et al. (1999) haben Clara-Zellen in Bronchien, großen

Bronchiolen, terminalen und respiratorischen Bronchiolen bezogen auf die Gesamtzahl der

Epithelzellen in den jeweiligen Lokalisationen gezählt, wobei die Zahl der gezählten

Epithelzellen zwischen 400 und 450 lag. In den hier dargestellten Untersuchungen wurden

die Strecken auf exakt 500 Epithelzellen pro Lokalisation standardisiert. Durch die große

Grundgesamtzahl an Zellen war mit einer zuverlässigen Statistik zu rechnen. Die

prozentualen Mittelwerte der Anteile von Clara-Zellen an der Gesamtzahl der Epithelzellen

im Bronchus wurden von BOERS et al. (1999) mit 0 % angegeben, d. h. innerhalb dieser

Untersuchung wurden gar keine Clara-zellen gefunden. Im Gegensatz dazu zeigten unsere

Ergebnisse durchschnittlich 25 % Clara-Zellen im Bronchus bei Weißbüschelaffen. Diese

Diskrepanz ließe sich dadurch erklären, dass die Clara-Zellen beim Weißbüschelaffen

Diskussion 97

möglicherweise einen Teil der Schleimproduktion übernehmen, um das weitgehende Fehlen

von Becherzellen zu kompensieren.

BOERS et al. (1999) unterschieden im bronchiolären Bereich zwischen großen, terminalen

und respiratorischen Bronchiolen. In dieser Arbeit wurden dagegen nur die Zellen von

großen und terminalen Bronchiolen zusammengefasst gezählt. Daher können die Ergebnisse

von BOERS et al. (1999) auch nur unter Berücksichtig dieser Lokalisation (Bronchiolus)

verglichen werden. Laut BOERS et al. (1999) ergaben die Mittelwerte von Clara-Zellen in

großen Bronchiolen und terminalen Bronchiolen zusammen nur 5,7 %. In dieser Arbeit war

der Anteil mit 19 % wieder wesentlich höher. Hinsichtlich der Verteilung der Clara-Zellen

bei juvenilen Weißbüschelaffen betrug der Anteil im Bronchus und im Bronchiolus 27 %. In

der vorhandenen Literatur gibt es keine weiteren Veröffentlichungen mit gleichartiger

quantitativer Auswertung, um unsere Ergebnisse vergleichen zu können. Neugeborene

Tieren zeigten insgesamt etwas weniger Clara-Zellen als adulte und juvenile Tiere – im

Bronchus nur 16 % und im Bronchiolus nur 17 %. Ein Grund dafür könnte sein, dass die

Clara-Zellen sich erst im Laufe der Entwicklung aus Vorläuferzellen vollständig

differenzieren. Es gibt nur eine Arbeit von XU et al. (1998), die unter anderem auch die

Verteilung und Häufigkeit von Clara-Zellen in menschlichen Föten und Neugeborenen

beschreibt. Leider sind die Ergebnisse kaum vergleichbar, da Föten und Neugeborene in der

vorliegenden Arbeit nicht systematisch unterschieden werden (XU et al. 1998).

Aufgrund der Tatsache, dass Clara-Zellen Surfactant-Proteine sezernieren können, wird

ihnen eine wichtige protektive Rolle zugeordnet (PLOPPER 1996). Unsere Untersuchungen

konnten bestätigen, dass Clara-Zellen Surfactant-Proteine bilden können. Die

immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen das Surfactant-Protein B zeigte,

dass Surfactant-Protein B von Clara-Zellen vom Bronchus bis in die distalen Bronchiolen

sezerniert wird. Dagegen trat eine Surfactant-Protein C-Expression durch Clara-Zellen in

den Bronchien seltener auf als in bronchiolären Bereichen, wo zahlreiche nicht-zilierte

Zellen Surfactant-Protein C exprimierten. Es ist möglich, dass die Clara-Zellen in distalen

Bereichen lamelläre Körperchen haben, die für die Produktion von Surfactant-Protein C

verantwortlich sind, so wie es beim Menschen vermutet wird (WAUER 2004).

98 Diskussion

Aufgrund der bekannten Funktionen der Clara-Zellen wie die Bildung von CCSP, das

beteiligt ist bei Regeneration, mukoziliärer Clearance und Regulation von

Entzündungsprozessen, sowie die Bildung von Surfactant-Proteinen, spielt die Verteilung

der Clara-Zellen eine große Rolle, wenn man diese funktionellen Mechanismen in der Lunge

genauer lokalisieren bzw. die Lunge als Gesamtsystem verstehen möchte (REYNOLDS u.

MALKINSON 2009). Da bei Weißbüschelaffen die dominierende Clara-Zellpopulation in

den gesunden Lungen im gesamten respiratorischen Epithel von der Trachea bis in die

respiratorischen Bronchiolen vorkommt, ist anzunehmen, dass die Lunge der

Weißbüschelaffen schon in den oberen Atemwegen eine zusätzliche Schutzfunktion besitzt.

Das Vorhandensein von Clara-Zellen im gesamten respiratorischen Epithel ermöglicht eine

flächendeckende Sekretion von CCSP und Surfactant-Proteinen und damit eine

Bereitstellung der damit einhergehenden Schutz- und immunmodulierenden Funktionen. Die

genaue Funktion der Clara-Zelle und deren Einfluss auf die Zusammensetzung des

Oberflächenfilmes im respiratorischen Epithel muss in der Zukunft noch detaillierter

untersucht werden, z. B. durch zytochemische Analysen.

Die am zweithäufigsten auftretende nicht-zilierte Zelle im respiratorischen Epithel bei

Weißbüschelaffen war die Becherzelle. Mit den in dieser Arbeit verwendeten histologischen

und immunhistochemischen Färbungen (PAS-Reaktion, Alcian blau 8 GS und MUC5AC)

konnten bei allen Altersgruppen nur wenige Zellen gefunden werden, die der

Becherzellmorphologie entsprachen. Da die Intensität aller Färbungen insgesamt sehr

schwach war, war eine eindeutige Identifizierung einer Zelle als Becherzelle nur in seltenen

Fällen möglich. Dies bildet einen Gegensatz zu der Situation bei Menschen und anderen

nicht-menschlichen Primaten (z. B. Rhesusaffen), bei denen die Becherzellmorphologie

immer deutlich zu erkennen ist (PLOPPER 1996; ROGERS 2003).

Die Becherzellen im respiratorischen Epithel bei Weißbüschelaffen wurden im Hinblick auf

ihre Verteilung im gesamten Atmungstrakt erstmals von SURRIBAS und LAWZEWITSCH

(1987) beschrieben. Im Vergleich zu einigen anderen Tierarten und dem Menschen sind die

Becherzellen in deutlich geringerer Anzahl nachweisbar, wobei die mit den Färbungen

nachweisbaren Mukopolysaccharide nur in den apikalen Bereichen der Zellen zu beobachten

Diskussion 99

waren. Diese Tatsache konnte in den hier dargestellten Untersuchungen bestätigt werden.

Mit Hilfe der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurde

nachgewiesen, dass die Becherzellen im gesamten respiratorischen Epithel in der Lunge in

geringer Anzahl vorkommen, wobei sie überwiegend in den proximalen Anteilen des

Bronchialbaums anzutreffen sind.

Im Anschluss an diese ersten Untersuchungen konnten wir feststellen, dass MUC5AC der

beste Marker für Muzin enthaltende Becherzellen war. Mittels alternativer histologischer

Färbungen, der PAS-Reaktion und der Alcian blau 8 GS, wurden nur sehr schwache und oft

fragliche positive Signale im respiratorischen Epithel der intrapulmonalen Atemwege bei

Weißbüschelaffen festgestellt. Bei neugeborenen Tieren handelte es sich bei vielen der PAS-

positiven Signale aufgrund der Lokalisation wahrscheinlich um glykogenreiche Basalzellen,

die eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den Altersgruppen unmöglich gemacht

hätten. Daher wurden alle weiteren statistischen Untersuchungen nur unter Berücksichtigung

der MUC5AC positiven Zellen durchgeführt.

Die statistischen Untersuchungen ergaben, dass im Bronchus bei adulten und

neugeborenen Tieren nur 4 % MUC5AC positive Zellen vorhanden sind. Juvenile Tiere

zeigten mit 3 % etwas geringere Werte. Wie erwartet, zeigten sich im bronchiolären Bereich

noch weniger MUC5AC positive Zellen: bei adulten und neugeborenen Tieren waren es nur

1 %, bei den juvenilen Tieren waren sie mit 2 % etwas zahlreicher.

Die geringe Anzahl von Becherzellen bei Weißbüschelaffen könnte man durch das feuchte

Klima ihrer Heimat erklären. Möglicherweise machen die übrigen Funktionen der Clara-

Zellen die Weißbüschelaffen widerstandsfähiger und anpassungsfähiger, besonders in Bezug

auf das Klima. Es wäre interessant zu untersuchen, ob es bei vergleichbaren Spezies aus

diesem Lebensraum eine ähnliche Entwicklung zu beobachten gibt. Allerdings stellt diese

Arbeit die erste Untersuchung dieser Art bei Krallenaffen dar, daher fehlen bislang

Vergleichsdaten.

100 Diskussion

Bei erwachsenen Menschen gibt es im gesunden respiratorischen Epithel bis zu 25 %

Becherzellen (ROGERS 2003). Bei den anderen Altersgruppen wurden keine vergleichbaren

Daten gefunden.

Eine Besonderheit des respiratorischen Epithels im Bronchus bei Weißbüschelaffen ist das

Fehlen der seromukösen Bronchialdrüsen. Bei Menschen, Makaken und Kaninchen

existieren sie in den Bronchien. Bei vielen Tierarten, auch bei Rhesusaffen, übernehmen

Becherzellen in den distalen Bronchien, wo keine seromukösen Bronchialdrüsen

vorkommen, die Mukussekretion (ROGERS 1994). Bei Ratten, Hamstern und Mäusen

hingegen werden distal von der Trachea, wie bei Weißbüschelaffen, keine seromukösen

Bronchialdrüsen gefunden (PLOPPER 1996). Es ist möglich, dass die Rolle der

seromukösen Bronchialdrüsen ebenso wie die der Becherzellen durch die große Anzahl an

Clara-Zellen kompensiert wird mit den bereits diskutierten Folgen und Vorteilen.

Pulmonale neuroendokrine Zellen (PNEZ) sind im respiratorischen Epithel der

intrapulmonalen Atemwege bei Weißbüschelaffen aller Altersgruppen in geringer Anzahl

vertreten und sind die zahlenmäßig kleinste, nicht-zilierte Zellpopulation in diesem Bereich.

Gleiche Verhältnisse liegen bei den meisten Säugetieren, Reptilien, Amphibien, Vögel und

Fischen vor (SORHAUG 2007). Die PNEZ können einzeln sowie in Form von NEBs

vorkommen (CUTZ 1982). Mit Hilfe von immunhistochemischen Methoden konnten bei

Weißbüschelaffen die PNEZ in allen Regionen des Bronchialbaums bei allen Altersgruppen

nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass die von den PNEZ und NEBs produzierten

Peptide die Entzündungsreaktion bei chronischen Lungenerkrankung wie Asthma und

COPD modulieren können (SORHAUG 2007). Deswegen ist das breite Vorhandensein

dieser Zellen ein Indiz dafür, dass Entzündungsreaktionen in allen Bereichen des

Bronchialbaums und bei allen Altersgruppen erkannt und kontrolliert werden können.

Die Morphologie der Zellen war ähnlich wie bei anderen Säugetieren. Die meisten Zellen

waren rund bis oval und lagen basal. NEBs stehen häufig in Kontakt mit Nervenfasern.

Diese Tatsache wurde mit Hilfe des immunhistochemischen Markers NSE nachgewiesen. Es

wurde bislang in der Literatur berichtet, dass NEBs an den Verzweigungsstellen des

Diskussion 101

Bronchialbaums besonders häufig auftreten (SORHAUG 2007). In den hier dargestellten

Untersuchungen konnte das allerdings nicht beobachtet werden, was aber eine einfache

Konsequenz der Seltenheit des Zelltyps im Allgemeinen und der nicht exakt kontrollierbaren

Lokalisation der untersuchten Schnitte ist.

Hinsichtlich der Verteilung der PNEZ im Bronchus konnten bei Weißbüschelaffen aller

Altersgruppen in allen Lokalisationen bis zu 1 % PNEZ gefunden werden. Ausschließlich in

der Neugeborenen-Gruppe konnte man feststellen, dass die PNEZ im Bronchiolus

zunahmen, nämlich mit einem Anteil von bis zu 2 %. Die Ergebnisse von BOERS et al.

(1996), die nur die Lunge von erwachsenen Menschen untersucht haben, zeigen, dass der

Anteil von PNEZ im Bereich von 0,41 bis 0,17 % liegt. Allerdings wurde dabei ein anderer

Antikörper benutzt, nämlich Chromogranin A, bei dem es sich aber ebenfalls um einen

neuroendokrinen Zellmarker handelt. Es kann daher sein, dass aufgrund von leichten

Abweichungen in der Spezifität der Antikörper die Ergebnisse nicht ohne weiteres

vergleichbar sind.

Im Rahmen dieser Studie wurden die Basalzellen nur deskriptiv morphologisch

beschrieben. Sie konnten im ganzen respiratorischen Epithel der Lunge gefunden werden.

Sie hatten Kontakt mit allen anderen Epithelzellen, zilierte und nicht-zilierte Zellen

eingeschlossen. Bei neugeborenen Tieren wurden viele glykogenreiche Basalzellen

gefunden, die sich vermutlich mit fortschreitendem Alter und Wachstum abbauen.

Das Vorhandensein von ausgeprägten Knorpelanteilen in distalen Bereichen des

Bronchialbaums, also auch in den Bronchiolen, wurde bereits von SURRIBAS und

LAWZEWITSCH (1987) und FOERSTER (1988) erwähnt und konnte durch unsere

Untersuchungen bestätigt werden. Bei menschlichen Lungen werden Knorpelstrukturen nur

in Bronchien gefunden. Die Bronchiolen sind knorpelfrei. Es wird vermutet, dass bei

Menschen die Bindegewebssepten wesentlich stärker sind als bei Affen, und letztere daher

Knorpel zur Stützung des Lungengewebes benötigen (MCLAUGHLIN et al. 1961;

FOERSTER 1988).

102 Diskussion

Transmissionselektronenmikroskopisch wurden schwerpunktmäßig Clara-Zellen

untersucht. Es stellten sich nicht alle nicht-zilierte Zellen deutlich dar, insbesondere die

Becherzellen nicht. Es ist bekannt, dass die Clara-Zellen große spezies-abhängige

Unterschiede aufweisen (PLOPPER et al. 1980a). Aufgrund der charakteristischen

sekretorischen Granula konnte die überwiegende Clara-Zellpopulation ultrastrukturell gut

identifiziert werden. Nach PLOPPER et al. (1980a) haben unter den von ihnen untersuchten

Spezies Schafe die meisten Clara-Zellgranula (durchschnittlich 748 Granula pro Zelle),

gefolgt von Pferden (durchschnittlich 477 Granula pro Zelle) und Rindern (durchschnittlich

408 Granula pro Zelle) (PLOPPER et al. 1980c). Bei Labornagern variiert diese Zahl

ebenfalls stark: bei Ratten mit durchschnittlich 427 Granula pro Zelle, Mäusen mit

durchschnittlich 258 Granula pro Zelle und Meerschweinchen mit durchschnittlich 225

Granula pro Zelle (PLOPPER et al. 1980b). Katzen bilden eine Ausnahme, da deren Clara-

Zellen gar keine Granula besitzen (PLOPPER et al. 1980c). Die Ergebnisse dieser Arbeit

zeigen, dass Clara-Zellgranula bei Weißbüschelaffen deutlich weniger zahlreich vorhanden

waren mit Mengen von 2 bis 40 pro Zelle. Bei Menschen werden ebenfalls recht niedrige

Zahlen von 0 bis 17 Granula pro Clara-Zelle genannt (PLOPPER et al. 1980a), so dass hier

eine ähnliche Situation wie bei Weißbüschelaffen vorliegt. Die kleinsten Granula bei

Weißbüschelaffen maßen 100 nm und die größten 500 nm im Durchmesser. Laut PLOPPER

et al. (1980a) sind sie beim Menschen zwischen 110 und 880 nm groß, so dass hier ebenfalls

eine weitgehende Übereinstimmung vorliegt. Vergleichswerte zu anderen Affenspezies

liegen nicht vor.

In dieser Arbeit wurde bei allen Clara-Zellen diffus viel raues und sehr wenig glattes

endoplasmatisches Retikulum gefunden. Ein ähnliches Mengenverhältnis wird beim

Menschen und Rhesusaffen festgestellt (PLOPPER 1983). Einen Gegensatz dazu beschreibt

PLOPPER (1983) bei Maus, Hamster, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein

und Pferd. Hinsichtlich der zellulären Lokalisation wurde bei den hier dargestellten

Untersuchungen das raue und glatte endoplasmatische Retikulum gleichmäßig im

Zytoplasma verteilt gefunden, während PLOPPER (1983) bei Menschen und Rhesusaffen

abweichend davon apikal nur glattes und perinukleär nur raues festgestellt hat.

Diskussion 103

Bei Menschen wird der Golgi-Apparat luminal oder seitlich des Kerns beobachtet

(PLOPPER et al. 1980a). In dieser Arbeit wurde bei Weißbüschelaffen ebenso der Golgi-

Apparat häufig seitlich des Kerns nachgewiesen. Außerdem wurden in den apikalen

Bereichen des Zytoplasma viele pinozytotische Vesikel gefunden. Das diffuse Auftreten von

Glykogen im Zytoplasma steht im Einklang mit Untersuchungen von (PLOPPER 1983) bei

Rindern, Katzen, Hunden und Frettechen, allerdings füllt Glykogen bei diesen Tieren das

meiste Zytoplasma und ist wesentlich zahlreicher vorhanden als bei Weißbüschelaffen. Bei

Rhesusaffen und bei Menschen ist Glykogen ebenfalls nur selten vorhanden (PLOPPER

1983). Die hier beim Weißbüschelaffen gefundenen Mitochondrien waren elektronendicht

und vom Crista-Typ, was dem Typ entspricht, der auch bei Menschen und Rhesusaffen

vorliegt (PLOPPER 1983).

Die Ergebnisse der Rasterelektronenmikroskopie lieferten Informationen über die

kuppelartige luminale Oberfläche der Clara-Zellen. Die Oberfläche der Clara-Zellen wird

sowohl von zytoplasmatischen Protrusionen als auch von Mikrovilli bedeckt, kann aber auch

sehr glatt sein. Bei Menschen besitzen die Clara-Zellen auch Mikrovilli (LUMSDEN et al.

1984).

Den Sekretionsmodus von Clara-Zellen untersuchten PEAO et al. (1993) in der Rattenlunge.

Mit Hilfe von transmissions- und rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen

beschrieben sie die Phasen der Clara-Zell-Sekretion, und zwar den apokrinen und

merokrinen Sekretionsmodus. Sie konnten bestätigen, dass die „apical caps“ keine Artefakte

sind (PEAO et al. 1993). In dieser Studie bei Weißbüschelaffen konnte nur der apokrine

Sekretionsmodus bei den Clara-Zellen beobachtet werden. Eine neue Erkenntnis über die

Clara-Zellen aus rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen ist, dass die luminale

Oberfläche viele Mikroporen enthält. Es ist denkbar, dass die Clara-Zellen durch diese

Mikroporen einen zusätzlichen merokrinen Sekretionsmodus besitzen, indem sie durch die

Mikroporen ihre Sekrete abgeben. Jedenfalls bleibt die Funktion dieser Mikroporen noch

unklar. Zu diesem Aspekt liegen bislang keine Informationen in der Literatur vor.

Abschließend kann gesagt werden, dass die Resultate der licht- und

elektronenmikroskopischen Untersuchungen des respiratorischen Epithels der

intrapulmonalen Atemwege bei Weißbüschelaffen starke Ähnlichkeiten zeigen mit den

104 Diskussion

Gegebenheiten bei anderen Labortieren und dem Menschen. Zusammenzufassend kann man

also feststellen, dass die Struktur des Bronchialbaums ein dichotomes Verzweigungsmuster

hatte und weitgehend mit der des menschlichen Bronchialbaums übereinstimmte. Allerdings

gab es in der Lungenlappung einige morphologische Unterschiede zwischen Menschen und

Weißbüschelaffen. Die Verteilung der nicht-zilierten Zellen in Bezug auf unterschiedliche

Altersstufen wies keine deutlichen Unterschiede auf. Eine tierartliche Besonderheit bei

Weißbüschelaffen war jedoch die Clara-Zellpopulation, die in hoher Anzahl in allen

Bereichen des respiratorischen Epithels der intrapulmonalen Atemwege auftrat. Die

Becherzellpopulation erschien bei allen Altersgruppen in bronchialen Lokalisationen

weniger prominent als bei anderen Tierarten bzw. dem Menschen. Es ist bekannt, dass die

Hyperplasie der Becherzellen bei Asthma und anderen chronischen Atemwegserkrankungen

ein charakteristisches Zeichen bei der Diagnosestellung ist (PLOPPER u. HYDE 2008).

Wenn man Weißbüschelaffen als Versuchstiermodell für diese Krankheiten verwenden

möchte, sollte man berücksichtigen, dass die Verteilung der nicht-zilierten Clara- und

Becherzellen bei gesunden Weißbüschelaffen und Menschen unterschiedlich sein kann.

Aufgrund dessen sind weitere Untersuchungen zur Verteilung der nicht-zilierten Zellen im

pathologisch veränderten Bronchialepithel nötig. Nur die PNEZ stellten sich charakteristisch

hinsichtlich Morphologie und Verteilung bei Weißbüschelaffen aller Altersstufen dar.

Man kann also festhalten, dass es einige Unterschiede sowohl im Allgemeinen als auch im

Detail gibt zwischen den Lungen von Weißbüschelaffen und Menschen. Im Hinblick auf

eine mögliche Verwendung des Weißbüschelaffen als Tiermodell für Lungenerkrankungen

wie Asthma und COPD scheinen die Ähnlichkeiten jedoch zu überwiegen.

Zusammenfassung 105

5 ZUSAMMENFASSUNG

Victoria Seidel (2012)

Morphologische Untersuchungen an den Atemwegen von Weißbüschelaffen (Callithrix

jacchus) unter besonderer Berücksichtigung von Clara-Zellen.

Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden morphologische Untersuchungen an der Lunge

bei Weißbüschelaffen durchgeführt. Es wurden 37 klinisch gesunde Lungen mittels

makroskopischer, histologischer, immunhistochemischer sowie elektronenmikroskopischer

Methoden untersucht. Alle Tiere wurden in eine von 3 Untersuchungsgruppen eingeteilt:

adulte, juvenile und neugeborene Tiere. Aufgrund der Tatsache, dass die nicht-zilierten

Zellen eine wichtige Rolle bei chronischen Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD

spielen, lag der Schwerpunkt dieser Studie auf den nicht-zilierten Zellen in den

intrapulmonalen Atemwegen bei Weißbüschelaffen mit Schwerpunkt bei den Clara-Zellen.

In dieser Arbeit wurde zunächst eine allgemeine makroskopische Beschreibung der Lungen

inklusive Gewicht und Größe bei neugeborenen, juvenilen und adulten Weißbüschelaffen

vorgenommen. Die Lungen von Weißbüschelaffen bestehen aus sechs eigenständigen

Lappen: vier auf der rechten und zwei auf der linken Seite. Bei beiden kranialen

Lungenlappen wurde jeweils eine Einkerbung festgestellt. Die Morphologie des

Bronchialbaumes war bei allen Altersgruppen grundsätzlich ähnlich. Mit Hilfe von

Ausgusspräparaten und nachfolgenden CT-Scans und deren Auswertung mit speziellen

MeVisLab-basierten Bildanalyseverfahren des Fraunhofer Instituts MEVIS in Bremen

konnten die dichotome Verzweigung des Bronchialbaums, die topographischen Verhältnisse

zwischen den einzelnen Bronchien, der Durchmesser der Ausgüsse der Bronchien sowie die

Distanz von der Bifurkation nach distal gezeigt werden. Bei dem Ausgusspräparat von

einem adulten Tier maß der Durchmesser der Trachea ca. 1000 bis 1150 µm, des rechten

Hauptbronchus ca. 850 bis 1150 µm und des linken 600 bis 800 µm, der Durchmesser der

Lobarbronchien von 450 bis 650 µm und der Segmentbronchien zwischen 250 und 550 µm.

Bei dem Ausgusspräparat von einem juvenilen Tier betrug der Durchmesser der Trachea

1000 bis 1150 µm, des rechten Hauptbronchus ca. 800 bis 1050 µm, des linken 650 bis 800

µm, der Lobarbronchien von 350 bis 650 µm und der Segmentbronchien zwischen 250 und

106 Zusammenfassung

500 µm. Bei dem Ausgusspräparat von einem neugeborenen Tier betrug der Durchmesser

der Trachea 700 bis 800 µm, bei rechten und linken Hauptbronchien 500 bis 650 µm, bei

den Lobarbronchien von 250 bis 500 µm und bei den Segmentbronchien zwischen 100 und

300 µm.

Hinsichtlich der Verteilung der nicht-zilierten Zellen konnten die größten Unterschiede in

der dominierenden Clara-Zellpopulation festgestellt werden. Clara-Zellen bei

Weißbüschelaffen kamen im gesamten respiratorischen Epithel der intrapulmonalen

Atemwege vor. Sie sezernierten hauptsächlich CCSP, aber auch die Surfactant-Proteine B

und C. Die mit immunhistochemischen Methoden erzielten Ergebnisse bezüglich CCSP-

positiver Zellen wurden statistisch ausgewertet. Im Bereich des Bronchus erreichten sie von

allen Epithelzellen einen Anteil von 25 % bei adulten Tieren, 27 % bei juvenilen und 16 %

bei neugeborenen Tieren. Im Bereich des Bronchiolus lag der Anteil der Clara-Zellen an der

Gesamtheit von allen Epithelzellen bei adulten Tieren bei 19 %, bei juvenilen bei 27% und

bei neugeborenen bei 17 %. Ultrastrukturell waren der typische apokrine Sekretionstyp

sowie die charakteristischen elektronendichten Granula unterschiedlichen Durchmessers

nachweisbar. Rasterelektronenmikroskopisch konnten auf der Oberfläche Mikrovilli sowie

Mikroporen erkannt werden.

Schleimproduzierende Becherzellen kamen bei Weißbüschelaffen viel seltener als bei

anderen Spezies vor. Außerdem wiesen sie keine deutliche Becherzellmorphologie auf. Mit

Hilfe der histologischen Färbung Alcian Blau konnte nur in einzelnen Becherzellen ein

Nachweis von sauren Mukopolysacchariden erbracht werden. Die PAS-Reaktion stellte

neutrale und saure Mukopolysaccharide in Becherzellen dar. Zusätzlich konnten

Glykogengranula in Basalzellen nachgewiesen werden, besonders bei neugeborenen Tieren.

Die immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen MUC5AC konnte die

Becherzellen am zuverlässigsten darstellen. Statistisch wurde gezeigt, dass MUC5AC-

positive Becherzellen im Bereich des Bronchus bei adulten und neugeborenen 4 % der

gesamten Epithelzellen ausmachten, und bei juvenilen etwa 3 %. Im bronchiolären Bereich

waren kaum MUC5AC-positive Zellen vorhanden. Neuroendokrine Zellen bei

Weißbüschelaffen kamen erst in den Segmentbronchien vor, wo sie bei allen Altersgruppen

konstant einen Anteil von 1 % hatten. Bei adulten und juvenilen Tieren nahm der Anteil der

Zusammenfassung 107

neuroendokrinen Zellen in den Bronchiolen auf 2 % zu, bei neugeborenen blieb der Anteil

bei 1 %. Sie konnten vereinzelt oder als NEBs angetroffen werden. Aufgrund der

beschriebenen PNEZ-Morphologie und ihrer geringen Anzahl ist festzustellen, dass diese

Zellen mit denen anderer Labortiere sowie mit denen in menschlichen Lungen

morphologisch überein stimmen.

Abschließend konnte gezeigt werden, dass Weißbüschelaffen trotz einiger Unterschiede in

der Verteilung und Morphologie der nicht-zilierten Zellen dennoch in vielen anderen

morphologischen Aspekten dem Menschen, bezogen auf die Lunge, sehr ähnlich sind, und

scheinen daher ein geeignetes Tiermodell für chronische Atemwegserkrankungen des

Menschen zu sein.

108 Summary

6 SUMMARY

Victoria Seidel (2012)

Morphological investigations on the airway of common marmosets (Callithrix jacchus)

with special consideration given to Clara cells.

In the present study, morphological examinations were performed on the lungs of common

marmosets. Macroscopical, histological, immunohistochemical and electron microscopic

methods were applied on 37 clinically healthy common marmoset lungs. Animals were

assigned to 3 study groups: adult, juvenile and newborn animals. Due to the fact that non-

ciliated cells play an important role in chronic respiratory diseases such as asthma and

COPD, the current study was focused on the non-ciliated cells in the intrapulmonary airways

in common marmosets.

In this study the lungs of newborn, juvenile and adult marmosets were for the first time

described macroscopically, including their size and weight. The lungs of the common

marmoset consist of six separate lobes: four on the right side and two on the left. The cranial

lobes on either side were found to possess a notch. Morphologically, the bronchial tree was

found to be similar in all age groups. By employing a method of producing corrosion lung

casts and performing subsequent CT scans on them, followed by an analysis with special

software, it was possible to show the dichotomous branching of the bronchial tree, the

topographical relationships between each segment, the intraluminal diameter of the segment

and its distance from the bifurcation in the distal direction. The intraluminal diameter of the

trachea of an adult marmoset measured 1000 to 1150 µm, the right bronchus ca. 850 to 1150

µm and the left bronchus 600 to 800 µm, the lobar bronchi 450 to 650 µm, and the

segmental bronchi from 250 to 500 µm. For a juvenile marmoset, the intraluminal diameter

of the trachea was 1000 to 1150 µm, the right bronchus ca. 800 to 1050 µm and the left

bronchus 650 to 800 µm, the lobar bronchi 350 to 650 µm, and the segmental bronchi from

250 to 500 µm. For a newborn marmoset, the intraluminal diameter of the trachea measured

700 to 800 µm, the right and left bronchi ca. 500 to 650 µm, the lobar bronchi 250 to 500

µm, and the segmental bronchi from 100 to 300 µm.

Summary 109

Regarding the distribution of the non-ciliated cells, major differences were present within

the Clara cell fraction. Clara cells in common marmosets were found throughout the

respiratory epithelium of the intrapulmonary airways, and were the dominant cell fraction.

They secreted primarily CCSP, but also surfactant proteins B and C. The results obtained via

immunohistochemistry regarding CCSP-positive cells were evaluated using statistical

methods. Within the bronchus, CCSP-positive cells accounted for 25 % of all epithelial cells

for adult animals, 27 % for juveniles and 16 % for newborn marmosets. In the bronchioles,

Clara cells accounted for 19 % of all epithelial cells in adult, 27 % in juvenile, and 17 % in

newborn marmosets. Ultrastructurally, Clara cells showed an apocrine type of secretion.

They had characteristic electron-dense granules of different diameters in the apical

cytoplasm. Scanning electron microscopy revealed microvilli and micropores on the luminal

surface.

Mucus-producing goblet cells were found to be much less present in common marmosets

than in other species. They also did not show the typical goblet cell morphology. With the

help of the histological staining agent Alcian blue, it was possible to detect acidic

mucopolysaccharides in individual goblet cells. The PAS reaction displayed neutral and

acidic mucopolysaccharides within goblet cells, but also glycogen particles, especially in

basal cells of newborn animals. The immunohistochemical staining with antibodies against

MUC5AC was the most reliable method for the detection of goblet cells. It was shown that,

statistically, MUC5AC-positive goblet cells make up 4 % of all epithelial cells in the

bronchi of adult and newborn marmosets, and 3 % in juveniles. Hardly any MUC5AC-

positive cells were found in the bronchioles.

Neuroendocrine cells in common marmosets were detected in the segmental bronchi, where

they made up 1 % of the epithelial cells across all age groups. In the bronchioles, the

fraction of neuroendocrine cells increased to 2 % in adult and juvenile marmosets, but

remained 1 % in newborn animals. They were encountered either as isolated individual cells

or as a group (NEBs). Neuroendocrine cells showed many similarities with human und

laboratory animal lungs concerning morphology and distribution.

Finally, it can be concluded that the lungs of the common marmoset, despite some

differences in the distribution and morphology of non-ciliated cells, are very similar to the

110 Summary

human lung in many morphological aspects. Therefore, the common marmoset seems to be

an appropriate animal model for human chronic respiratory diseases.

Literaturverzeichnis 111

7 Literaturverzeichnis

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Anhang 127

8 Anhang

Tabelle 15: Tiermaterial

G-/K- Nr. Geburtsdatum Sektionsdatum Geschlecht

Alter bei

der

Sektion

1 Adult G 8233* 25.05.2003 04.06.2010 männlich 7,03

2 Adult G 8238 29.09.2009 15.06.2010 männlich 0,71

3 Adult G 8375* 04.08.2003 02.02.2011 weiblich 7,50

4 Adult G 8307* 28.12.2003 13.10.2010 männlich 6,80

5 Adult G 8023* 25.01.2001 09.06.2009 weiblich 8,38

6 Adult G 8272* 22.06.2007 12.08.2010 weiblich 3,14

7 Adult G 8111* 27.04.2008 25.11.2009 weiblich 1,58

8 Adult G 8282* 27.05.2003 23.08.2010 männlich 7,25

9 Adult G 8210 30.06.2003 20.04.2010 weiblich 6,81

10 Adult G 8212 06.05.2006 20.04.2010 männlich 3,96

11 Adult G 8216 21.03.2009 20.04.2010 männlich 1,08

12 Adult G 8109 12.01.2002 23.11.2009 weiblich 7,87

13 Adult G 8003 04.08.2002 27.04.2009 männlich 6,73

14 Adult G 8001 22.08.2001 15.04.2009 männlich 7,65

15 Adult G 8217 18.04.2010 15.06.2010 männlich 0,16

16 Adult G 8218 29.09.2009 15.06.2010 männlich 0,71

17 Adult G 8247 06.04.2006 16.06.2010 weiblich 4,20

18 Adult K 2157 ** 01.10.2006 20.10.2010 männlich 4,05

19 Juvenil G 8043* 07.04.2008 15.07.2009 männlich 1,27


21 Juvenil G 8369* 29.09.2010 26.01.2011 weiblich 0,33


23 Juvenil K 2097/1* 10.04.2009 19.08.2009 männlich 0,36

24 Juvenil K 2097/2

** 10.04.2009 19.08.2009 männlich 0,36

25 Juvenil K 2095 12.03.2009 12.08.2009 männlich 0,42

26 Juvenil K 2085* 29.05.2009 22.06.2009 männlich 0,07

27 Neugeboren K 2151* 30.08.2010 30.08.2010 k.A. 0,00

28 Neugeboren K 2156* 15.10.2010 15.10.2010 k.A. 0,00

29 Neugeboren K 2153* 09.09.2010 09.09.2010 k.A. 0,00

30 Neugeboren K 2082* 01.06.2009 02.06.2009 männlich 0,00

31 Neugeboren K 2075* 06.05.2009 06.05.2009 weiblich 0,00

128 Anhang

32 Neugeboren K 2087* 02.07.2009 02.07.2009 k.A. 0,00

33 Neugeboren K 2152* 06.09.2010 06.09.2010 k.A. 0,00

34 Neugeboren K 2084* 15.06.2009 15.06.2009 männlich 0,00

35 Neugeboren K 2091 12.07.2009 13.07.2009 männlich 0,00

36 Neugeboren K 2163 ** 31.01.2011 01.02.2011 weiblich 0,00

37 Neugeboren K 2114 02.09.2009 03.11.2009 weiblich 0,17

„*“: dieses Tier wurde für die Statistik verwendet;

„**“: dieses Tier wurde für die Korrosionstechnik verwendet.

Histologie

1. Lösungen:

a) Phosphatpuffer

Lösung A (0,2 M):

Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat 27,6 g

Aqua bidest. ad 1000 ml

Lösung B (0,2 M):

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 35,6 g

Aqua bidest. ad 1000 ml

Gebrauchslösung (0,1 M, pH 7,4):

Lösung A 100 ml

Lösung B 400 ml

Aqua bidest. 500 ml

b) Fixierlösungen

4%iges neutral gepuffertes Formalin: 35 % ige Formaldehydlösung 114 ml

Aqua dest. 386 ml

Lösung A Phosphatpuffer 100 ml

Lösung B Phosphatpuffer 400 ml

2. Färbungen

a) Hämatoxylin & Eosin-Färbung

1. Entparaffinierung und Rehydratisierung:

Anhang 129

Xylol 1 5 Minuten

Xylol 2 2 Minuten

Xylol 3 2 Minuten

100%iges Ethanol 2 Minuten

96%iges Ethanol 2 Minuten

80%iges Ethanol 1 Minute

70%iges Ethanol 1 Minute

Aqua dest. 1 Minute

2. Zur Kernfärbung:

Hämalaun nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) 3 Minuten

3. Zum Bläuen fließend wässern 10 Minuten

4. Zur Gegenfärbung:

0,1%iges Eosin

(Fa. ThermoFisher Scientific, Dreieich) 5 Minuten

5. Wässern fließend 5 Sekunden

6. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe:

70%iges Ethanol: 1 Minute




100%iges Ethanol: 2 Minuten

Xylol 1: 1 Minute

Xylol 2: 3 Minuten

Xylol 3: 3 Minuten

7. Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg).

b) Periodic Acid Schiff (PAS)-Reaktion:


Xylol 1: 5 Minuten

Xylol 2: 2 Minuten

Xylol 3: 2 Minuten





Aqua dest.: 1 Minute

2. 0,5%ig Perjodsäure: 10 Minuten

3. Fließend Aqua dest.: 10 Minuten

130 Anhang

4. Schiff`s Reagenz (Fa. Merck, Darmstadt) 15 Minuten

5. Aqua dest.: wenige Sekunden

6. Fließend Leitungswasser: 10 Minuten

7. Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer: 30 Sekunden

8. Bläuen in Leitungswasser: 10 Minuten







Xylol 1: 2 Minuten

Xylol 2: 3 Minuten

Xylol 3: 3 Minuten


c) Alcianblau 8 GS:


Xylol 1: 5 Minuten

Xylol 2: 2 Minuten

Xylol 3: 2 Minuten





Aqua dest.: 1 Minute

2. 3% Essigsäure 3 Minuten

3. Alcianblaulösung 30 Minuten

4. Abspülen in 3% Essigsäure kurz

5. Spülen in Aqua dest.: 1 Minute

6. Zur Kernfärbung: Kernechtrot 5 Minuten

7. Spülen in Aqua dest.: 1 Minute







Xylol 1: 2 Minuten

Xylol 2: 3 Minuten

Xylol 3: 3 Minuten


Anhang 131

Immunhistochemie

1. Etiketten drucken und Reagenzienkarussell bestücken.

2. Reaction Buffer, EZ Prep, LCS, RiboWash und CC sowie Abfallbehälter

kontrollieren.

3. Barcode-Etiketten auf die Objektträger kleben, diese ins Discovery XT (Fa. Roche,

Mannheim, Deutschland) auf die Thermoplates legen.

4. Lauf starten, ab jetzt läuft die IHC-Reaktion vollautomatisch im Gerät nach der

SABC-Methode (Streptavidin-Biotin-Komplex) ab.

5. Aufheizen der Objektträger auf 75°C und Entparaffinierung mit Hilfe der EZ Prep

Solution.

6. Antigendemaskierung: bei Surfactant B für 36 Minuten, bei MUC5AC, NSE, Clara

Cell und Prosurfactant C für 20 Minuten, jeweils mit Cell Conditioning 1 (EDTA

Antigen Retrieval Solution pH 8,4).

7. Zur Hemmung der endogenen Peroxidase 4 Minuten Inhibitor (3% H2O2).

8. Bei MAC387: 20 Minuten Protease 3 (0,02 enzyme unit/ml) als enzymatische

Vorbehandlung.

9. 10 Minuten Option 1 (zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen Ziegenserum

1:5 in PBS verdünnt).

10. Primärantikörperinkubation:

Clara Cell Protein Human: 1:2000 für 32 Minuten

Mucin 5AC: 1:50 für 32 Minuten

Surfactant B: 1:10 für 60 Minuten

Prosurfactant C: 1:400 für 32 Minuten

NSE: 1:400 für 32 Minuten

MAC 387: 1:100 für 32 Minuten

11. 8 Minuten Fixative 1 (20 µl Glutaraldehydlösung 25% in 0,9%iger NaCl-Lösung).

12. Bei Surfactant B: Amplificationkit zur Verstärkung des DAB-Signals, 8 Minuten

Amplifier A und 8 Minuten Amplifier B.

13. 24 Minuten Universal Secondary Antibody (Biotinylierter Sekundärantikörper, ein

so genannter Multi-Link-Antikörper, der sowohl Maus- und

Kaninchenimmunglobuline erkennt).

14. Zur Blockierung von endogenem Biotin 4 Minuten Blocker D.

15. 16 Minuten SA-HRP (Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex).

16. 8 Minuten DAB und H2O2 (enzymhistochemische Reaktion, DAB 2 g/l als

Chromogen und 0,04-0,08% H2O2).

17. 4 Minuten Cooper (Kupfersulfat 5 g/l zur Verstärkung des DAB´s).

132 Anhang

18. Zur Gegenfärbung 4 Minuten Hämatoxylin.

19. Zum Bläuen 4 Minuten Bluing Reagent.

20. Allen Inkubationsschritten im Discovery XT-Färbemodul folgen definierte

Waschschritte mit dem Reaction Buffer von Roche (Cat.950-300).

21. Schnitte aus dem Gerät nehmen, in einer Küvette mit Aqua dest. und Spülmittel

schwenken, um das im Discovery XT verwendete Öl zu entfernen und anschließend

in eine Küvette mit Aqua dest. überführen.

22. Aufsteigende Alkoholreihe:

70%-igem und 80%-igem Ethanol jeweils 30 Sekunden

96%-igem und 100%-igem Ethanol jeweils 1 Minute

100%-igem Ethanol für 2 Minuten

Xylol unter dreimaligem Wechsel (je 2 Minute).

23. Eindecken der Objektträger mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg).

Korrosionstechnik

Für den Ausguss aus Kunststoff wurde Technovit 7143 (Methylmetacrylat) von der Fa.

Kulzer & Co GmbH, Bad Homburg verwendet.

1. 10 g von gelbem Technovit-Pulver wurde mit 5 g Technovit-Flüssigkeit gemischt.

2. 2 Minuten wurde alles gerührt bis es eine sämige Konsistenz hatte.

3. Ca. 1,5 ml Injektion von Hand mit gleichmäßigem Druck (adultes Tier; juveniles Tier:

ca. 1,1 ml; neugeborenes Tier: ca. 0,8 ml)

4. Ruhe für die Aushärtungszeit ca. 3 Stunden

5. 24 Stunden Polymerisation. Aufbewahrung in Kaliumhydroxid (KOH) 40 % ig im

Trockenschrank bei 55 °C.

6. Spülen mit fließendem Wasser

7. Ausgusspräparat mit transparatem Lack ansprühen

Transmissionselektronenmikroskopie

a) Eponmischung nach LUFT (1961)

Mischung A:

Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045) 71,3 g

2-Dodecenylsuccinicacidanhydrid (DDSA)

(Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 20755) 115 g

Anhang 133

Vermischen auf dem Magnetrührer 1 Stunde

Mischung B:

Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045) 100 g

Methylacidanhydrid (MNA)

(Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 29452) 89 g

Vermischen auf dem Magnetrührer 1 Stunde

1. Zusammengeben Mischungen A und B (Verhältnis 1:1)

2. Vermischen auf dem Magnetrührer 30 Minuten

3. Eingeben Beschleuniger (DMP) 1,8%

(2,4,6-Tris (dimethylaminomethyl)phenol (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 36975)

4. Vermischen auf dem Magnetrührer 15 Minuten

b) Eponeinbettung

1. Spülen die Proben in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4°C 3 x 30 Minuten

2. Nachfixieren in 1 %-iger Osmiumtetroxidlösung in 0,1 M

Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4°C 2 Stunden

3. Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 4°C 3 x 30 Minuten

4. Dehydrieren in aufsteigender Alkoholreihe bei 4°C:

30 %iges Ethanol 30 Minuten






Isopropanol 30 Minuten

5. Infiltration mit Propylenoxid bei 4°C 2 x 15 Minuten

6. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 2:1 bei 10 °C 1 Stunde

7. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:1 bei 10°C 2 Stunden

134 Anhang

8. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:2 bei 10°C 4 Stunden

9. Infiltration mit reinem Epon bei 20°C über Nacht

10. Infiltration mit reinem Epon bei 20°C 3 Stunden

c) Methylenblaufärbung nach RICHARDSON et al. (1960)

Lösung A:

Azur II für die Lichtmikroskopie

(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 9211) 1 g

in Aqua dest. lösen 100 ml

Lösung B:

Di-Natriumtetraborat p. a.

(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6306) 1 g

Methylenblau für die Lichtmikroskopie 1 g

(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 15943)

in Aqua dest. lösen 100 ml

Lösungen A und B (Verhältnis 1:1) mischen, filtrieren und anschließend die

Semidünnschnitte auf der Wärmebank bei 60°C 1 Minute färben.

Rasterelektronenmikroskopie

1. Spülen in 0,1 M Cacodylatpuffer

(der Cacodylatpuffer wird mehrfach gewechselt) 5 Stunden

2. Eingelegen in 1%-ig Osmiumtetroxid auf Eis 2 Stunden

3. Spülen in 0,1 M (Cacodylatpuffer mehrfach gewechselt) 4x30 Minuten

4. Dehydrieren in aufstegender Alkoholreihe:

30%-iges Ethanol 60 Minuten

50%-iges Ethanol 60 Minuten

70%-iges Ethanol im Kühlschrank aufbewahrt über Nacht

90%-iges Ethanol (1 Mal gewechselt) 60 Minuten

100%-iges Ethanol (2 Mal gewechselt) 2 Tage

5. Einlegen in Isoamylacetat (2 Mal gewechselt) 2 Tage

6. Critical Point-Trocknung (4 Mal CO2 gewechselt)

Göttingen, den 08.04.2012

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Morphologische

Untersuchungen an den Atemwegen von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) unter

besonderer Berücksichtigung von Clara-Zellen“ selbständig verfasst habe. Bei der

Anfertigung wurden folgende Hilfsmittel und Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

Technisch-methodische Einweisung durch technische Assistentinnen der Abteilung

Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen.

Redaktionelle Überarbeitung durch wissenschaftliche Mitarbeiter und dem Leiter der

Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen.

Computertomographie der Ausgusspräparate mit Hilfe von Mitarbeitern des

Universitätsklinikums Göttingen.

Elektronische Datenverarbeitung der CT-Daten von den Ausgusspräparaten mit Hilfe

von MevisLab, insbesondere Herrn Dr. V. Dicken (Fraunhofer MEVIS, Bremen).

Statistische Auswertung mit Hilfe von Mitarbeitern der Abteilung Medizinische

Statistik, Universitätsklinikum Göttingen.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in Anspruch

genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für

Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation

stehen.

Die vorliegende Dissertation wurde in der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen

Primatenzentrums in Göttingen angefertigt und sie wurde bisher nicht für eine Prüfung oder

Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Victoria Seidel

Danksagung

Bedanken möchte ich mich an erster Stelle besonders herzlich bei meinem Doktorvater,

Herrn Prof. Dr. F.-J. Kaup, für die Übergabe eines hochinteressanten Themas und die

uneingeschränkte motivierende Unterstützung bei der Anfertigung der Dissertation. Trotz

seines vollen Terminkalenders war er immer offen und hilfsbereit. Außerdem möchte ich

mich für die Entdeckung der Pathologie als Beruf bedanken, und für das mir

entgegengebrachte Vertrauen die Vorlesungen zu halten.

Frau Dr. K. Mätz-Rensing und Frau Dr. M. Bleyer danke ich herzlich für die

Materialgewinnung. Frau Dr. M. Bleyer und Frau Dr. E. Gruber-Dujardin für die

Ausbildung auf dem Gebiet der tiermedizinischen Pathologie. Frau Dr. M. Bleyer hat die

gewissenhafte, gründliche und zuverlässige Durchsicht meines Manuskripts übernommen.

Ich danke ihr herzlich, denn sie brachte mir sehr viel Geduld entgegen und sorgte mit

wertvollen Ratschlägen für das Gelingen der Arbeit.

Ich danke Frau Dr. C. Schlumbohm für ihre immer guten Ideen und Anregungen im

wissenschaftlichen Bereich. Frau Dr. T. Becker und Frau Dr. A. Schrod möchte ich sehr

danken für ihre professionelle und interessante Einführung in die Welt der Primaten.

Frau I. Roßbach danke ich für ihre immer zuverlässige organisatorische Hilfe.

Besonderen Dank schulde ich Frau N. Schminke und Frau L. Hummel, die mir bei der

Anfertigung aller meiner Proben und Schnitte zur Seite standen. Außerdem bin ich sehr

dankbar für ihre Hilfe bei meiner Einarbeitung in die Histologie, Immunhistochemie und

Elektronenmikroskopie. Sehr herzlich danke ich den Kollegen aus der Sektionshalle, Frau S.

Wienstroth, Frau E. Lischka, Herrn A. Kues und Herrn W. Henkel. Herrn Henkel danke ich

außerdem für seine Unterstützung bei der Anfertigung der zahlreichen Ausgusspräparate

und ihm sowie Frau C. Heckmann für die Hilfe bei der Materialgewinnung. Ebenso bedanke

ich mich bei Frau K. Rohn für die freundliche Unterstützung bei der Durchführung der

rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen.

Außerdem danke ich Herrn Dr. C. Roos und Herrn N. Westphal für die Hilfe bei einigen

Nachweismethoden von Clara-Zellen.

Ebenso möchte ich mich bedanken bei Herrn A. Heutz, Herrn H. Eichenauer und Herrn L.

Washausen für ihre uneingeschränkte Rettungshilfe bei Computerfragen.

Ein ganz besonderer Dank gilt allen Mitdoktoranden, insbesondere Frau K. Lampe aus der

und Frau K. Hoffmann. Herzlichen Dank für ihre Freundschaft und jeden anderen

wertvollen und unterstützenden Beistand. Ich möchte mich bedanken bei Frau J.

Winkelmann und Frau J. König für die Einführung in die Arbeitsgruppe und die große

Freundlichkeit, mit der sie mich aufnahmen. Frau S. Seehase danke ich für ihre Einarbeitung

in das Lungenprojekt und für das Foto, das in dieser Arbeit auf Seite 43 abgebildet wird.

Auch allen nichtgennanten Kollegen danke ich für das schöne Arbeitsklima.

Ich möchte allen Kollegen aus Fraunhofer ITEM und insbesondere Herrn A. Braun und

Herrn S. Knauf für die vielen innovativen Vorschläge im Rahmen unserer Kooperation

danken. Für die Unterstützung bei statistischen Fragen danke ich herzlichst Herrn S.

Schneider. Eine spezielle Erwähnung verdienen Herr Dr. V. Dicken und Herr C. Dullin für

die CT-Auswertung.

Ich möchte einen besonderen Dank an Herrn Prof. Dr. R. Pabst richten für seine wertvollen

Vorschläge und seine uneingeschränkte Unterstützung.

Frau I. Wilke gebührt mein Dank für die Hilfe bei der Bildbearbeitung und ihre freundliche

Unterstützung. Auch möchte ich mich bei meinen Freunden Frau F. Kaup, Frau I. Wilke,

Frau K. Kara, Frau I. Stridde, Herrn A. Shevchenko und Herrn D. Hahn bedanken, die mich

nicht nur tatkräftig unterstützt haben, sondern mich stets aufbauten und für die erforderliche

Abwechslung sorgten.

Ich danke auch herzlich meinen Lehrern aus der Staatlichen Landwirtschaftlichen

Hochschule Iwanowo Frau G. Korneva, Herrn V. Kuvshinov und Frau O. Ganina.

Außerdem danke ich meiner Deutschlehrerin und guten Freundin Frau I. Kuznetsova für ihre

stets konstruktive Kritik, für ihre wertvollen Ratschläge und meine Deutschkenntnisse.

Ich möchte mich auch bei meinen Freundinnen Frau M. Gorodkova, Frau N. Stroyeva, Frau

E. Smirnova, Frau L. Volkova, Frau O. Tarasova und Frau A. Shishkina in der Heimat

bedanken, die mir immer den Rücken gestärkt haben.

Des Weiteren möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die ein Studium und eine

Doktorarbeit niemals möglich geworden wären. Ich möchte mich ebenso bei meinen

Schwiegereltern für ihre Unterstützung bedanken. Und anschließend danke ich meinem

Mann, der mich durch seine Liebe und Güte die ganze Zeit unterstützt und nie an mir

gezweifelt hat. Daher widme ich ihm diese Arbeit.

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