Eliminierung apoptotischer Zellen durch...

Eliminierung apoptotischer Zellen durch professionelle Phagozyten:

Generierung, Freisetzung und Erkennung des monozytären Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin und Bedeutung von Annexin I als Brückenprotein in der phagozytotischen Synapse

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fakultät Naturwissenschaften

Universität Hohenheim

Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft Universität Hohenheim

und

Universitätsklinikum Tübingen Abteilung für Innere Medizin I

Sektion Molekulare Gastroenterologie und Hepatologie

vorgelegt von Michaela Waibel

aus Schwäbisch Gmünd

2007

Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer 1. berichtende Person, 1. Prüfer: Prof. Dr. Lutz Graeve 2. berichtende Person, 2. Prüfer: Prof. Dr. Sebastian Wesselborg 3. Prüfer: Prof. Dr. Tilman Grune Eingereicht am: 14. Mai 2007 Mündliche Prüfung am: 26. September 2007 Die vorliegende Arbeit wurde am 29. Juni 2007 von der Fakultät Naturwissenschaften der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften“ angenommen.

Danksagung

Prof. Dr. Sebastian Wesselborg danke ich für die Ermöglichung der Dissertation und

seine ständige Unterstützung und Diskussionsbereitschaft während der gesamten

Zeit.

Prof. Dr. Lutz Graeve danke ich für seine freundliche und spontane Bereitschaft, die

Doktorarbeit vor der Fakultät Naturwissenschaften der Universität Hohenheim zu

vertreten.

Ganz besonders möchte ich mich bei Dr. Kirsten Lauber bedanken, die mir das

Thema der Doktorarbeit überlassen hat und durch ihre vielen Ideen, ihr Engagement

und die ständige Hilfsbereitschaft wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen

hat.

Für die freundliche Überlassung verschiedener Zelllinien danke ich Prof. Dr. Reiner

U. Jänicke, Prof. Dr. Alan Porter, Prof. Dr. Ralph Hass und Dr. Caius Radu.

Danke an alle aktuellen und ehemaligen Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Wesselborg

für die tolle Zeit im Labor und die fachliche und moralische Unterstützung: Alexandra,

Antje, Björn, Christoph, Dorothee, Gerburg, Hildegard, Joachim, Karin, Kirsten,

Marco, Merle, Sibylle und Szabolcs.

Besonders herzlich möchte ich mich an dieser Stelle bei meinen Eltern, Anneliese

und Franz Waibel, und bei meiner Schwester Sonja bedanken, die mich in jeder

Hinsicht unterstützt haben und die immer für mich da waren.

Anmerkungen

Folgende Teile der vorliegenden Arbeit sind im Rahmen von Gemeinschaftsprojekten

innerhalb der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Wesselborg entstanden: Die in Abbildung

3.15 – 3.18 (Kapitel 3.4) dargestellten Ergebnisse sind dabei von Szabolcs Sörös

während seiner Diplomarbeit erarbeitet worden (Titel: „Untersuchungen zur

Bedeutung von Annexin I in der Apoptose und Eliminierung apoptotischer Zellen“).

Kapitel 3.3 entstand in Zusammenarbeit mit Christoph Peter und Dr. Kirsten Lauber.

Die Versuche zu Abbildung 3.10B (Kapitel 3.4) wurden von Karin Blume

durchgeführt.

1

Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG........................................................................................................ 7 1.1 Apoptose...................................................................................................................................... 7 1.2 Signalwege der Apoptose .......................................................................................................... 8 1.3 Caspasen ................................................................................................................................... 10 1.4 Regulatoren der Apoptose ....................................................................................................... 11 1.5 Eliminierung apoptotischer Zellen .......................................................................................... 12

1.5.1 Anlockung von Phagozyten durch lösliche Attraktionssignale apoptotischer Zellen............... 12 1.5.2 Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten................................................................ 14 1.5.3 Internalisierung apoptotischer Zellen und post-phagozytotische Reaktionen......................... 16

1.6 Annexin I .................................................................................................................................... 18 1.7 Zielsetzung................................................................................................................................. 19 2 MATERIAL UND METHODEN........................................................................... 21 2.1 Reagenzien ................................................................................................................................ 21

2.1.1 Herstellerverzeichnis ............................................................................................................... 21 2.1.2 Antikörper ................................................................................................................................ 23 2.1.3 Plasmidkonstrukte ................................................................................................................... 24 2.1.4 Gereinigte Proteine.................................................................................................................. 25 2.1.5 siRNA-Oligonukleotide............................................................................................................. 26

2.2 Zellbiologische Methoden ........................................................................................................ 27 2.2.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen................................................................................. 27 2.2.2 Kryokonservierung von eukaryontischen Zellen...................................................................... 28 2.2.3 Transfektion von eukaryontischen Zellen................................................................................ 29 2.2.4 Apoptose-Induktion und Produktion von chemotaktisch aktiven Zellkulturüberständen ......... 30 2.2.5 Nekrose-Induktion.................................................................................................................... 32 2.2.6 Phagozytosetest ...................................................................................................................... 32 2.2.7 PLA2-Aktivitätstest ................................................................................................................... 34 2.2.8 Nachweis reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS)................................................................ 35 2.2.9 Zellbiologische Nachweismethoden des Zelltods.................................................................... 35 2.2.10 Transmigrationstest ................................................................................................................. 37

2.3 Biochemische Methoden.......................................................................................................... 38 2.3.1 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford .................................................................. 38 2.3.2 Herstellung von Zelllysaten ..................................................................................................... 39 2.3.3 Aufreinigung von FLAG-Fusionsproteinen .............................................................................. 39 2.3.4 In vitro-Spaltung von Proteinen mit Hilfe gereinigter Caspasen.............................................. 40 2.3.5 Präparation von Membran- und Cytosolfraktionen.................................................................. 41 2.3.6 Präzipitationen ......................................................................................................................... 42 2.3.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese...................................................... 43 2.3.8 Silberfärbung von Proteingelen ............................................................................................... 44 2.3.9 Westernblot.............................................................................................................................. 45 2.3.10 Anti-FLAG-ELISA..................................................................................................................... 46 2.3.11 In vitro-Phospholipase A2–Aktivitätstest .................................................................................. 47 2.3.12 Nachweis von Lysophosphatidylcholin .................................................................................... 48 2.3.13 Nachweis von Lipid-Hydroperoxiden....................................................................................... 50

2.4 Molekularbiologische Methoden ............................................................................................. 51 2.4.1 RNA-Extraktion aus eukaryontischen Zellen........................................................................... 51 2.4.2 Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA-Lösungen.................................................... 52 2.4.3 Reverse Transkription ............................................................................................................. 52 2.4.4 Real-Time PCR........................................................................................................................ 53 2.4.5 Plasmid-DNA Isolierung .......................................................................................................... 56 2.4.6 Anlage einer Bakterien Glycerin-Dauerkultur .......................................................................... 57

2

3 ERGEBNISSE .................................................................................................... 58 3.1 Prozessierung und Aktivierung der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2)

während der Apoptose ............................................................................................................. 58 3.1.1 iPLA2 wird während der Apoptose durch Caspase-3 prozessiert............................................ 58 3.1.2 Prozessierte iPLA2 hat eine höhere Aktivität als das Volllängen-Protein................................ 60

3.2 Produktion und Freisetzung des Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin während der Apoptose.................................................................................................................................... 62

3.2.1 Nachweis von Lysophosphatidylcholin in den Überständen apoptotischer Zellen.................. 62 3.2.2 Aktive iPLA2 ist essentiell für die Generierung des Attraktionssignals, alleine jedoch nicht

hinreichend für dessen Freisetzung ........................................................................................ 62 3.2.3 Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle bei der Generierung des Attraktionssignals in

apoptotischen Zellen................................................................................................................ 66 3.2.4 Die Inhibierung von ABCA-Transportern hemmt die Freisetzung des Attraktionssignals....... 68 3.2.5 Für die Freisetzung des Attraktionssignals aus apoptotischen Zellen ist ABCA1 essentiell,

nicht ABCA7 ............................................................................................................................ 70 3.2.6 Überexpression von iPLA2 und Aktivierung des ABCA1-Transporters führt auch bei vitalen

Zellen zur Freisetzung des Attraktionssignals......................................................................... 73 3.3 Die Migration monozytärer Zellen auf das Attraktionssignal LPC wird durch den G2A-

Rezeptor vermittelt.................................................................................................................... 74 3.3.1 Vergleich der monozytären Zelllinien THP-1 und U937 .......................................................... 74 3.3.2 Für die Migration von THP-1 Zellen auf das Attraktionssignal LPC ist G2A verantwortlich,

nicht GPR4 .............................................................................................................................. 76 3.3.3 G2A-exprimierende U937 Zellen wandern auf apoptotische Überstände und gereinigtes

Lysophosphatidylcholin ........................................................................................................... 78 3.4 Rolle von Annexin I bei der Eliminierung apoptotischer Zellen........................................... 79

3.4.1 Annexin I hat keinen Einfluss auf die Freisetzung apoptotischer Attraktionssignale .............. 80 3.4.2 Annexin I wird von spät-apoptotischen Jurkat Zellen externalisiert, unabhängig vom

verwendeten Stimulus ............................................................................................................. 82 3.4.3 Die Externalisierung ist keine generelle Eigenschaft von Proteinen der Annexin-Familie...... 84 3.4.4 Die Annexin-I-Externalisierung ist Zelltyp-abhängig und geht mit einer Spaltung von Annexin I

einher....................................................................................................................................... 85 3.4.5 Externalisiertes Annexin I bindet Calcium-abhängig an die phosphatidylserinreiche

Oberfläche apoptotischer Zellen.............................................................................................. 87 3.4.6 Der knock down von Annexin I hat keinen Einfluss auf die Phagozytose spät-apoptotischer

Jurkat-Zellen ............................................................................................................................ 89 3.4.7 Die Beschichtung apoptotischer THP-1 Zellen mit Annexin I stimuliert deren Phagozytose .. 91

4 DISKUSSION ..................................................................................................... 93 4.1 Prozessierung und Aktivierung der iPLA2 während der Apoptose...................................... 93 4.2 Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin während

der Apoptose ............................................................................................................................. 95 4.3 Die Migration von Monozyten auf das Attraktionssignal LPC wird durch den G2A-

Rezeptor vermittelt.................................................................................................................. 100 4.4 Rolle von Annexin I bei der Eliminierung apoptotischer Zellen......................................... 102 5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................... 109 6 LITERATUR ..................................................................................................... 111 7 PUBLIKATIONEN ............................................................................................ 122 8 LEBENSLAUF ................................................................................................. 123

3

Abkürzungsverzeichnis A Adenin aa Aminosäure(n) α anti ABC Adenosyl-5´-triphosphat Bindungskassette Anx Annexin APS Ammoniumperoxodisulfat Apaf-1 Apoptotic Protease Activating Factor 1 Apo Apolipoprotein ATP Adenosintriphosphat Bad Bcl-2 Antagonist of Cell Death Bak Bcl-2 Homologous Antagonist/Killer Bax Bcl-2 Associated X Protein BBPC Bis-BODIPY®FL C11-PC Bcl-2 B Cell Lymphoma/Leukemia-2 BEL Bromenollacton Bfl-1 Bcl-2 Homologue Isolated from a Human Fetal Liver BH-Domäne Bcl-2-Homologie-Domäne Bid BH3 Interacting Domain Death Agonist bidest. bidestilliert Bim Bcl-2 Interacting Mediator of Cell Death Blk Bik-Like Killer Protein Bok Bcl-2-Related Ovarian Killer Boo Bcl-2 Homologue of Ovary bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin ß2-GPI ß2-Glykoprotein I C Cytosin C1q Komplementprotein 1q C3b/bi Komplementprotein 3b/bi CARD Caspase Recruitment Domain Casp Caspase Caspase Cystein-Protease mit Aspartat-Spaltspezifität CD Cluster of Differentiation CD95 APO-1, Fas cDNA Komplementäre DNA CED Cell Death Protein C.elegans Caernohabditis elegans CHAPS (3-([3-Cholamidopropyl]-dimethylammonium)-1-propansulfonat CM-H2DCFDA 5-(und-6)-Chloromethyl-2',7'- Dichlorodihydrofluorescein Diacetat cPLA2 cytosolische Phospholipase A2

Da Dalton dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat

4

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat DD Todesdomäne (Death Domain) DED Todeseffektordomäne (Death Effector Domain) DNA Desoxyribonukleinsäure DcR Decoy Receptor DIABLO Direct IAP Binding Protein with low pI DISC Todessignal-Komplex (Death Inducing Signaling Complex) Diva Death Inducer Binding to Bcl-2 and Apaf-1 DMSO Dimethylsulfoxid DNase Desoxyribonukleinsäure-Hydrolase DTT Dithiothreitol E.coli Escherichia coli ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein EGTA Ethylen-bis-(oxyethylennitrilo)-tetraessigsäure EtOH Ethanol Etopo Etoposid FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FADD Fas-Associating Protein with Death Domain (MORT1) Fas Fibroblast Associated Antigen FCS Fötales Kälberserum Fl Fluoreszenzkanal FLICE FADD-Like Ice FLIP FLICE inhibitory protein FPR Formylpeptidrezeptor FPRL FPR-like FU Fluorescence Unit G Guanin g Gramm g Erdbeschleunigung [m/s2] Gas6 growth arrest-specific 6 GFP Green Fluorescent Protein h Stunde(n) HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N2'-Ethansulfonsäure His Histidin His-Tag Hexahistidin-Fusionstag Hrk Harakiri HRP Meerrettich Peroxidase IAP Inhibitor of Apoptosis Protein ICE Interleukin-1β-Converting Enzyme IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin Iono Ionomycin iPLA2 Calcium-unabhängige Phospholipase A2

5

JNK c-Jun-N-terminale Kinase kb Kilobasen kDa Kilodalton l Liter LB-Medium Luria Bertani Medium LOOH Lipid-Hydroperoxid(e) LPC Lysophosphatidylcholin LPR low-density lipoprotein receptor-related protein m Mili (10-3) m Meter M Molarität, molar µ Mikro (10-6) MFG-E8 milk-fat-globule-EGF-factor 8 min Minute(n) Mito Mitomycin C mRNA Messenger RNA n nano Nbk Natural Born Killer NP-40 Nonidet P-40, Nonylphenoxypolyethoxyethanol nt Nukleotid(e) ori Replikationsursprung oxLDL Oxidiertes low-density lipoprotein p50 Protein mit einer Molekularmasse von 50 kDa PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PARP Poly(ADP-Ribose)-Polymerase PBS Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung PC Phosphatidylcholin PCR Polymerase Kettenreaktion PE Phosphatidylethanolamin PHA Phytohämagglutinin A PLA2 Phospholipase A2

PLC Phospholipase C PMA Phorbolmyristylacetat PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PS Phosphatidylserin PSR Phosphatidylserin-Rezeptor PVDF Polyvinylidendifluorid RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RNasin Ribonuklease Inhibitor RPMI Roswell Park Memorial Institut ROS Reaktive Sauerstoffspezies rpm Umdrehungen pro Minute RT Reverse Transkription, Reverse Transkriptase RT Raumtemperatur s Sekunde

6

SDF-1α Stromal-Cell-derived Factor 1-alpha SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SFM Serumfreies Medium siRNA small interfering RNA SM Sphingomyelin Smac Second Mitochondria-Derived Activator of Caspase Stauro Staurosporin T Thymin TBS Tris-gepufferte physiologische Kochsalzlösung TEMED N, N, N´, N´, Tetramethylethylendiamin TGF-ß transforming growth factor ß TNF Tumornekrose-Faktor TRAIL TNF-Related Apoptosis Inducing Factor Tris Tris-(hydroxymethyl)aminoethan Triton X-100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglycol-p-isooctylphenolether TSP-1 Thrombospondin-1 U Enzymeinheit U Uracil UV Ultraviolett V Volt v/v Volumen / Volumen vol Volumeneinheit vt Vektor w/v Gewicht / Volumen zVAD-fmk Benzyloxycarbonyl-Val-Alex-Asp-fluoromethylketon

EINLEITUNG

1 Einleitung

1.1 Apoptose Das ursprünglich aus dem Griechischen stammende Wort „Apoptose“ bezeichnet sinngemäß das

Herabfallen der Blätter im Herbst und wurde von Kerr et al. zum Anlass genommen, um das

Selbstmordprogramm eukaryontischer Zellen zu beschreiben (Kerr et al., 1972). Die Apoptose spielt

eine maßgebliche Rolle bei der embryonalen Entwicklung, bei der Erhaltung der Gewebshomöostase

in adulten Organismen und bei der Eliminierung von Zellen, die z.B. durch Mutationen oder virale

Infektionen geschädigt wurden. Zudem trägt die Apoptose zur Regulation des Immunsystems bei, z.B.

bei der klonalen Deletion autoreaktiver T-Zellen. Dabei ist die Apoptose eine physiologische und

„stille“ Form des Zelltods, bei der einzelne Zellen, Zellverbände oder Organe (z.B. bei der

Metamorphose von Amphibien) ohne eine Belastung des Gesamtorganismus eliminiert werden.

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose und der Nekrose. Charakteristisch für den apoptotischen Zelltod ist das Schrumpfen der Zelle, die Kondensation des Chromatins und die anschließende Fragmentierung des Zellkerns. Es kommt zur Externalisierung von Phosphatidylserin und die Zelle zerfällt schließlich in kleine, membranumschlossene Vesikel, die apoptotischen Körperchen. Diese können von professionellen Phagozyten oder Nachbarzellen internalisiert und abgebaut werden. Während der Nekrose schwillt die Zelle an, es kommt zur Ruptur der Plasmamembran und zellulärer Inhalt kann freigesetzt werden. Ist die Eliminierung apoptotischer Zellen gestört, verlieren diese mit der Zeit ihre Membranintegrität und werden sekundär nekrotisch. Dadurch können nicht-eliminierte apoptotische Zellen, ebenso wie primär nekrotische Zellen, inflammatorische Reaktionen auslösen.

7

EINLEITUNG

Verschiedene morphologische und biochemische Veränderungen charakterisieren die Apoptose: Die

Zellen schrumpfen und lösen sich von den Nachbarzellen ab. Es kommt zur Kondensation des

Chromatins, und die DNA wird durch Endonukleasen zwischen den Nukleosomen gespalten, wodurch

DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 200 Basenpaaren oder ganzzahligen Vielfachen davon

entstehen (Nagata, 2000). Der Verlust der Membranasymmetrie führt unter anderem dazu, dass

Phosphatidylserin, ein in vitalen Zellen ausschließlich auf der cytosolischen Seite der

Plasmamembran lokalisiertes Phospholipid, während der Apoptose zunehmend auf der Zelloberfläche

erscheint (Fadok et al., 1992). Intrazellulär kommt es zur Depolarisierung des

Mitochondienmembranpotentials und zu einem cytosolischen pH-Wert-Abfall (Ly et al., 2003;

Matsuyama et al., 2000; Nilsson et al., 2006). An der Zellmembran werden Ausstülpungen gebildet

(Zeiose, Blebbing) und es werden immer mehr membranumschlossene Partikel abgeschnürt, die

Zellorganellen und Teile des Zellkerns enthalten. Dabei bleibt der Zellinhalt während des gesamten

Prozesses von einer intakten Membran umschlossen und wird, im Gegensatz zur Nekrose, nicht in

umliegendes Gewebe freigesetzt (Fink und Cookson, 2005; Leist und Jaattela, 2001; Strasser et al.,

2000). Apoptotische Zellen und abgeschnürte Zellpartikel, auch apoptotische Körperchen genannt,

werden normalerweise von benachbarten Zellen oder von professionellen Phagozyten erkannt,

internalisiert und abgebaut (Savill und Fadok, 2000). Ist diese Eliminierung gestört, werden die

apoptotischen Zellen sekundär nekrotisch (siehe Abbildung 1.1). Durch den Verlust der

Membranintegrität kann Zellinhalt austreten und die für die Nekrose bekannten inflammatorischen

Reaktionen im Gewebe hervorrufen (Farber, 1994; Wu et al., 2001).

Zunächst lange Zeit nur in Metazoen beobachtet, zeigten Arbeiten von Madeo et al., dass auch

einzellige Organismen wie Saccharomyces cerevisiae durch einen Apoptose-ähnlichen Zelltod

sterben können (Madeo et al., 1997; Madeo et al., 2002).

1.2 Signalwege der Apoptose Die Apoptose ist ebenso wie die Zellproliferation und Zelldifferenzierung einer inter- und intrazellulären

Kommunikation unterworfen und kann über verschiedene Mechanismen induziert und reguliert

werden. Im Folgenden werden die beiden Hauptsignalwege der Apoptose beschrieben: der

extrinsische Todesrezeptor-Signalweg und der intrinsische, mitochondriale Signalweg (siehe

Abbildung 1.2).

Der extrinsische Signalweg wird ausgelöst durch die extrazelluläre Aktivierung der so genannten

Todesrezeptoren. Diese gehören zur TNF-Rezeptor Superfamilie und sind charakterisiert durch

mehrere extrazelluläre, Cystein-reiche Domänen, eine Transmembranregion und eine intrazelluläre

Todesdomäne (DD, death domain), die aus ca. 80 Aminosäuren besteht und keine katalytischen

Eigenschaften besitzt. Als erster Todesrezeptor wurde CD95 (Apo-1/Fas) beschrieben (Itoh et al.,

1991); inzwischen sind insgesamt 6 Mitglieder der Todesrezeptorfamilie identifiziert worden (TNF-R1,

CD95, TRAMP, TRAIL-R1, TRAIL-R2, DR6) (Schulze-Osthoff et al., 1998).

Die zugehörigen Liganden sind homotrimere Proteine der TNF-Familie (CD95L, TNFα, TRAIL,

TWEAK und RANKL), die ihre Rezeptoren durch Oligomerisierung aktivieren (Banner et al., 1993;

Beutler und van Huffel, 1994; Dhein et al., 1992; Eck und Sprang, 1989; Jones et al., 1992; Wiley et

al., 1995). Die Todesliganden werden zumeist als Transmembranproteine synthetisiert, können jedoch

8

EINLEITUNG

durch alternatives Spleißen oder spezifische Metalloproteasen auch in löslicher Form vorkommen

(Suda et al., 1993). Bei dem bis jetzt am besten untersuchten CD95-Rezeptor/Ligand-System führt die

Ligandenbindung zur Trimerisierung des Rezeptors und leitet damit die Bildung des

Todessignalkomplexes (DISC, death inducing signaling complex) ein. Das Adapterprotein FADD (Fas-

associating protein with death domain) kann dabei durch die homophile Interaktion der

Todesdomänen von CD95 und FADD rekrutiert werden. FADD besitzt eine weitere Adapterdomäne,

die so genannte Todeseffektordomäne (DED, death effector domain), über die Pro-Caspase-8, die

ebenfalls eine Todeseffektordomäne besitzt, homophil gebunden werden kann (Boldin et al., 1996;

Kischkel et al., 1995; Medema et al., 1997; Muzio et al., 1996). Durch die lokale Aggregation mehrerer

Caspase-8-Zymogene kommt es zu deren autokatalytischer Aktivierung (Martin et al., 1998; Muzio et

al., 1998); man spricht hierbei vom Modell der „induzierten Proximität“ (Salvesen und Dixit, 1999).

Nach ihrer Aktivierung und Freisetzung aus dem Todesrezeptorkomplex spaltet Caspase-8 als so

genannte Initiator-Caspase durch limitierte Proteolyse v.a. die sogenannten Effektor-Caspasen, wie

Caspase-3, die durch Prozessierung von relevanten Apoptosesubstraten letztlich den programmierten

Tod der Zellen auslösen.

Andere Apoptose-Stimuli, wie z.B. Zytostatika, oder physikalischer Stress wie UV- oder Gamma-

Strahlung, wirken Todesrezeptor-unabhängig und stimulieren den intrinsischen, mitochondrialen

Signalweg der Apoptose. Das ausschlaggebende Ereignis hierbei ist die Freisetzung von Cytochrom c

aus dem Mitochondrium. In vitalen Zellen ist die Mitochondrienaußenmembran undurchlässig für

Cytochrom c, dessen Funktion in der Elektronenübertragung zwischen Komplex III und Komplex IV

der Atmungskette besteht. Durch den Verlust der Mitochondrienmembranintegrität und durch

Beteiligung von pro-apoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie (siehe unten) kann jedoch während der

Apoptose Cytochrom c ins Cytosol gelangen und dort als second-messenger fungieren. Es induziert

die an die Hydrolyse von ATP oder dATP gekoppelte Oligomerisierung des Adapterproteins Apaf-1

(apoptotic protease activating factor 1) (Zou et al., 1997). Durch die homophile Interaktion der CARD-

Domäne (caspase recruitment domain) von Apaf-1 mit der CARD-Region von Pro-Caspase-9 entsteht

ein hochmolekularer Komplex von ca. 700 kDa, das so genannte Apoptosom (Acehan et al., 2002;

Adrain et al., 1999; Cain et al., 2002; Cain et al., 2000; Li et al., 1997; Ott et al., 2002; Saleh et al.,

1999; Shi, 2001; Zou et al., 1999). Das Apoptosom entspricht in seiner Funktion dem

Todesrezeptorkomplex, und das Caspase-9-Zymogen wird, ähnlich wie Pro-Caspase-8 am DISC,

nach dem Prinzip der induzierten Proximität autoproteolytisch prozessiert und damit aktiviert

(Rodriguez und Lazebnik, 1999). Als zweite zentrale Initiator-Caspase löst Caspase-9 über die

Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 ebenfalls die Caspase-Kaskade aus und leitet damit die

Apoptose ein.

Die beiden beschriebenen Signalwege können unabhängig voneinander ablaufen, sind jedoch auch

miteinander verbunden. So kann aktive Caspase-8 das pro-apoptotische Bcl-2-Familienmitglied Bid

(siehe Abschnitt 1.4) proteolytisch aktivieren, das in seiner trunkierten Form ans Mitochondrium

transloziert und dort die Freisetzung von Cytochrom c stimuliert (Li et al., 1998; Luo et al., 1998).

Somit kann der mitochondriale Apoptoseweg zusätzlich als Verstärkungsmechanismus des

Todesrezeptorwegs wirken.

9

EINLEITUNG

Abbildung 1.2: Die Hauptsignalwege der Apoptose Der extrinsische Todesrezeptor-Signalweg verläuft über den Todesrezeptor, der nach Bindung entsprechender Liganden trimerisieren und einen Signalkomplex (DISC, death inducing signaling complex) aus Rezeptor, FADD (Fas-associating protein with death domain) und Pro-Caspase-8 ausbildet. Die Bindung zwischen den einzelnen Proteinen im Komplex erfolgt über Todesdomänen (DD, death domain) bzw. Todeseffektordomänen (DED, death effector domain). Die autoproteolytische Aktivierung von Pro-Caspase-8 löst die Caspase-Kaskade aus, die letztlich zur Apoptose führt. Der intrinsische, mitochondriale Signalweg beginnt mit der Freisetzung von Cytochrom c aus dem Mitochondrium. Ähnlich wie beim DISC kommt es auch bei diesem Signalweg zur Ausbildung eines hochmolekularen Komplexes, dem Apoptosom. Dieses wird unter (d)ATP-Verbrauch aus Cytochrom c, Apaf-1 und Pro-Caspase-9 gebildet, wobei die Proteine über die Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD, caspase recruitment domain) miteinander interagieren. Dadurch wird Pro-Caspase-9 autoproteolytisch aktiviert und die Caspase-Kaskade eingeleitet. Wichtige Regulatoren des mitochondrialen Signalwegs sind Proteine der Bcl-2-Familie, wie Bcl-2, Bax, Puma und Noxa. Diese sind in der Lage, am Mitochondrium die Cytochrom-c-Freisetzung zu hemmen bzw. zu induzieren. Der mitochondriale Signalweg kann unter anderem durch DNA-Schäden induziert werden, z.B. durch UV- oder Gamma-Strahlung. Die beiden Signalwege sind über die Aktivierung des pro-apoptotischen Bcl-2-Proteins Bid verknüpft, das von Caspase-8 gespalten werden kann und in seiner trunkierten Form in der Lage ist, die Cytochrom-c-Freisetzung zu vermitteln. Der Verlauf der Apoptose kann unter anderem durch Proteine der IAP-Familie (inhibitor of apoptosis proteins) reguliert werden, die direkt mit akiven Caspasen interagieren und diese hemmen können. Die IAP-vermittelte Caspasen-Inhibition kann durch das Protein Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of caspases / direct IAP-binding protein with low pl) aufgehoben werden, das, ähnlich wie Cytochrom c, aus Mitochondien freigesetzt werden kann. Abbildung nach Lauber (Dissertation, 2003).

1.3 Caspasen Entscheidend für den Verlauf der Apoptose, der letztendlich in der Desintegration und Eliminierung

von Zellen durch Phagozyten mündet, ist die proteolytische Prozessierung von Proteinen durch

Caspasen (Budihardjo et al., 1999). Caspasen sind Cysteinproteasen, die Proteine spezifisch hinter

Aspartatresten spalten; dieser Eigenschaft verdanken sie auch ihren Namen (Cysteinyl ASPartat-

specific proteASE). Sie werden zunächst als 30 - 55 kDa große Zymogene mit lediglich sehr geringer

enzymatischer Aktivität synthetisiert. Ihre proteolytische Aktivierung erfolgt meist durch andere

Caspasen, im Falle der Initiator-Caspasen durch deren autokatalytische Prozessierung (siehe oben).

Dabei werden die Zymogene in eine große (ca. 20 kDa) und eine kleine Untereinheit (ca. 10 kDa)

10

EINLEITUNG

gespalten und die N-terminale Prodomäne entfernt. In ihrer aktiven Form liegen Caspasen in der

Regel als Heterotetramere vor, bestehend aus je zwei großen und zwei kleinen Untereinheiten. Die

bislang bekannten Mitglieder der humanen Caspase-Familie lassen sich phylogenetisch in zwei

Unterfamilien einteilen, die entweder wichtig für die Zytokinreifung sind (Caspase-1, 4, 5 und 11) oder

die bei der Apoptose von Bedeutung sind. Innerhalb der Apoptose-Caspasen kann zwischen den

Initiator-Caspasen (Caspase-2, 8, 9 und 10) und den Effektor-Caspasen (Caspase-3, 6 und 7)

unterschieden werden. Die Initiator-Caspasen haben aufgrund ihrer N-terminal gelegenen Adapter-

Regionen (CARD- oder DED-Domäne, siehe Abschnitt 1.2) sehr lange Prodomänen, die bei den

Effektor-Caspasen oftmals nur aus wenigen Aminosäuren bestehen. Die Aktivierung der Initiator-

Caspasen geht der Aktivierung der Effektor-Caspasen immer voraus. Vergleichbar mit der

Blutgerinnung oder dem Komplementsystem entsteht so bei der Einleitung der Apoptose durch

proteolytische Auto- und Transaktivierungen eine irreversible Caspase-Kaskade (Fischer et al., 2003;

Slee et al., 1999).

Es sind inzwischen viele Proteine bekannt, die durch Caspasen prozessiert und somit irreversibel in

ihrer Funktion beeinflusst werden (Fischer et al., 2003; Stroh und Schulze-Osthoff, 1998). Bei der

Caspase-vermittelten Prozessierung handelt es sich um eine gezielte, limitierte Proteolyse, durch die

die Zielproteine in der Regel inaktiviert werden. Dazu gehören z.B. Zytoskelett- und Strukturproteine,

Zelladhäsionsproteine oder Proteine, die am Zellzyklus, der DNA-Replikation oder der DNA-Reparatur

beteiligt sind. Die Spaltung von Zielproteinen kann in einigen Fällen jedoch auch zu deren Aktivierung

führen. Dies ist der Fall bei der Spaltung von Caspasen (siehe oben), bei Zytokin-Präkursoren und

vielen Proteinkinasen. In der Summe führt die Spaltung der verschiedenen Proteine durch Caspasen

zum Zellzyklusarrest, zum Verlust von Zell-Zell-Kontakten, zur Markierung von apoptotischen Zellen

für die Phagozytose und zur Desintegration der Zelle.

1.4 Regulatoren der Apoptose Neben der Expression der an den beschriebenen Signalwegen beteiligten Proteine können

verschiedene Regulationsmechanismen Einfluss auf den Verlauf der Apoptose nehmen. Auf

Rezeptorebene geschieht diese Regulation z.B. durch die Expression der TRAIL-Rezeptoren DcR1

und DcR2 (DcR = Decoy Receptor), die zwar TRAIL binden können, jedoch aufgrund einer fehlenden

funktionellen Todesdomäne das Signal nicht weiterleiten und somit zu einer Resistenz gegenüber

TRAIL führen (Degli-Esposti et al., 1997a; Degli-Esposti et al., 1997b; MacFarlane et al., 1997;

Marsters et al., 1997). Eine weitere Möglichkeit, die Bildung eines funktionellen DISC zu verhindern,

sind die so genannten FLIP-Moleküle (FLICE inhibitory protein; FLICE = ursprünglicher Name für

Caspase-8). FLIPs haben Homologie zur Todeseffektordomäne von Caspasen und können durch

Bindung an FADD die Rekrutierung von Caspase-8 und damit deren Aktivierung verhindern (Scaffidi

et al., 1999). So ist ein möglicher Resistenzmechanismus von Tumorzellen gegenüber der CD95-

Ligand/Rezeptor-vermittelten Apoptose die Expression von FLIPs (Troeger et al., 2007).

Eine zentrale Bedeutung als Regulatoren der Apoptose haben die Mitglieder der Bcl-2-Familie. Ihnen

ist der Besitz verschiedener Bcl-2-Homologie-Domänen (BH1-4) gemeinsam, über die Homo- und

Heterodimere gebildet werden können. Zur Bcl-2-Familie gehören die anti-apoptotischen Proteine Bcl-

2, Bcl-xL, Bcl-w, A1/Bfl-1, Boo/Diva und die pro-apoptotischen Mitglieder Bax, Bok/Mtd, Bcl-xs, Bak,

11

EINLEITUNG

Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Blk und Bim (Adams und Cory, 2001; Reed et al., 1998). Außer A1/Bfl-1,

Bid und Bad besitzen alle Mitglieder eine C-terminale Transmembrandomäne, über die sie in der

Kernmembran, dem endoplasmatischen Reticulum oder der äußeren Mitochondrienmembran

verankert sind. Alle Bcl-2-Familienmitglieder regulieren die Apoptose über die mitochondriale

Cytochrom-c-Freisetzung. Pro-apoptotische Mediatoren wie Bax, Puma und Noxa können durch DNA-

Schädigung p53-abhängig induziert werden und nach Translokation ans Mitochondrium die

Cytochrom-c-Freisetzung bewirken (Eskes et al., 1998; Jia et al., 2001; Nakano und Vousden, 2001;

Oda et al., 2000). Auch Bid transloziert nach seiner Caspase-8-vermittelten Spaltung ans

Mitochondrium und fördert dort die Cytochrom-c-Freisetzung (siehe oben). Die anti-apoptotischen

Mitglieder der Bcl-2-Familie wirken im Gegensatz dazu dem Verlust des

Mitochondrienmembranpotentials und der Cytochrom-c-Freisetzung entgegen (Cosulich et al., 1999;

Miyashita und Reed, 1993; Strasser et al., 1995; Yang et al., 1997).

Auch auf Ebene der Caspasen kann der Verlauf der Apoptose reguliert werden. So sind die Proteine

der IAP-Familie (inhibitor of apoptosis proteins) in der Lage, direkt mit Caspasen zu interagieren und

deren Aktivität reversibel zu inhibieren (Deveraux und Reed, 1999). Bis heute sind in Säugern acht

verschiedene IAPs identifiziert worden, die alle anti-apoptotisch wirken (Ambrosini et al., 1997;

Duckett et al., 1996; Liston et al., 1996). IAPs verhindern die Substratbindung von Caspasen durch

Interaktion mit deren akivem Zentrum; innerhalb der Caspase-Familie inhibieren sie ausschließlich die

Caspasen-9, -3 und -7 (Chai et al., 2001; Huang et al., 2001; Riedl et al., 2001). Die IAP-vermittelte

Inhibition der Caspasen kann durch das Protein Smac/DIABLO (second mitochondria-derived

activator of caspases / direct IAP-binding protein with low pl) aufgehoben werden (Du et al., 2000;

Verhagen et al., 2000). Dieses kann, ähnlich wie Cytochrom c, während der Apoptose aus

Mitochondrien freigesetzt werden und die Caspasen aus ihrer Bindung mit IAPs verdrängen (Du et al.,

2000; Ekert et al., 2001; Shi, 2001; Srinivasula et al., 2000; Srinivasula et al., 2001; Wu et al., 2000a).

1.5 Eliminierung apoptotischer Zellen

1.5.1 Anlockung von Phagozyten durch lösliche Attraktionssignale apoptotischer Zellen

Wie bereits in Abschnitt 1.1 erwähnt, werden apoptotische Zellen normalerweise durch benachbarte

Zellen oder Phagozyten eliminiert, bevor sie ihre Membranintegrität verlieren und potentiell

inflammatorischer Zellinhalt austreten kann. Im Gegensatz zum Modellorganismus Caenorhabditis

elegans, in dem sterbende Zellen durch Nachbarzellen phagozytiert werden, gibt es in höheren

Organismen spezialisierte Phagozyten, die diese Aufgabe wahrnehmen. Da diese jedoch zunächst oft

nicht in direkter Nähe der apoptotischen Beute zu finden sind, setzen sterbende Zellen lösliche

Attraktionssignale frei, um Phagozyten anzulocken. Das bis jetzt am besten charakterisierte so

genannte „find-me“-Signal ist Lysophosphatidylcholin (LPC), das die Migration monozytärer Zellen

induziert. LPC wird von den sterbenden Zellen Caspase-3-abhängig durch die iPLA2-(Calcium-

unabhängige Phospholipase A2)-vermittelte Hydrolyse von Phosphatidylcholin generiert und

freigesetzt (siehe Abbildung 1.3). Dabei wird die 86-kDa-Volllängenform der iPLA2 während der

Apoptose Caspase-3-abhängig in ein 26 kDa großes Fragment prozessiert, dem sowohl die N-

12

EINLEITUNG

terminalen Ankyrin-Domänen als auch der C-Terminus fehlen (Lauber et al., 2003). Larsson et al.

zeigten, dass die Ankyrin-Motive inhibitorisch auf die iPLA2-Aktivität wirken können (Larsson et al.,

1998) und Atsumi et al. konnten nachweisen, dass die Caspase-vermittelte Prozessierung von iPLA2

zu einer erhöhten Arachidonsäure-Produktion führt (Atsumi et al., 2000). Die Beobachtung, dass die

Überexpression der trunkierten 26-kDa-iPLA2 in vitalen Zellen nicht zur Freisetzung von LPC führt,

deutet darauf hin, dass wahrscheinlich weitere apoptotische Ereignisse an der Generierung und / oder

der Freisetzung des Attraktionssignals LPC beteiligt sind (Lauber et al., 2003).

Abbildung 1.3: Modell der Caspase-3- und iPLA2-vermittelten Anlockung von Phagozyten. Während der Apoptose wird die Calcium-unabhängige Phospholipase A2 (iPLA2) Caspase-3-abhängig prozessiert. Dabei werden möglicherweise auch mit iPLA2 assoziierte Inhibitoren abgespalten und das Enzym dadurch aktiviert. Aktive iPLA2 hydrolysiert an der Plasmamembran Phosphatidylcholin, wodurch Lysophosphatidylcholin (LPC) und eine freie Fettsäure, meist Arachidonsäure, entstehen. Das Attraktionssignal LPC wird daraufhin von den apoptotischen Zellen freigesetzt und kann über LPC-Rezeptoren auf den Phagozyten deren Migration hin zur apoptotischen Beute stimulieren. Abbildung nach Lauber et al. (Lauber et al., 2004).

Auch über die Rezeptoren, die für die LPC-vermittelte Migration monozytärer Zellen verantwortlich

sind, ist noch wenig bekannt. 2001 wurden die beiden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren G2A und

GPR4 als LPC-Rezeptoren identifiziert (Kabarowski et al., 2001; Zhu et al., 2001), und weitere

Untersuchungen zeigten eine LPC-vermittelte Migration von T-Zellen und Makrophagen durch G2A

(Radu et al., 2004; Yang et al., 2005). Jedoch musste die Veröffentlichung von Kabarowski et al.

aufgrund nicht reproduzierbarer Bindungsdaten zurückgezogen werden (Witte et al., 2005) und es ist

weiterhin unklar, ob und wie LPC mit dem G2A-Rezeptor interagiert. Auch die Arbeit von Zhu et al.

wurde zurückgezogen (2005) und eine Beteiligung von GPR4 an der LPC-vermittelten Migration

seitdem nicht mehr gezeigt.

Neben LPC konnten weitere chemotaktisch aktive Signale apoptotischer Zellen identifiziert werden,

die zur Anlockung von Monozyten und Makrophagen führen. So wurde z.B. für Thrombospondin-1, die

humane Aminoacyl-tRNA-Synthetase und das S19 ribosomale Protein-Dimer eine Rolle bei der

Rekrutierung von Phagozyten nachgewiesen (Horino et al., 1998; Moodley et al., 2003; Wakasugi und

Schimmel, 1999). Ob diese Proteine unabhängig voneinander oder möglicherweise auch in 13

EINLEITUNG

Kooperation mit dem Phospholipid-Attraktionssignal LPC wirken können, ist bislang noch nicht

untersucht.

1.5.2 Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten Nachdem, wie oben beschrieben, in höheren Organismen die Freisetzung löslicher „find-me“-Signale

zur Anlockung von Phagozyten führt, ist es für den weiteren Verlauf der Eliminierung entscheidend,

dass die apoptotische Zelle durch spezialisierte Makrophagen oder durch Nachbarzellen als solche

erkannt und anschließend internalisiert wird. Die Erkennung der apoptotischen Zelle durch

Phagozyten wird durch so genannte „eat-me“-Signale auf der Oberfläche der sterbenden Zelle

vermittelt. Diese Signale werden entweder während der Apoptose externalisiert, wie z.B.

Phosphatidylserin, oder sie entstehen durch Oxidation oder andere Modifikationen von

Oberflächenmolekülen. Das bis heute am besten charakterisierte „eat-me“-Signal ist

Phosphatidylserin (PS), dessen Translokation von der Innenseite der Plasmamembran auf die

Zelloberfläche ein wichtiger Apoptose-Marker ist (Fadok et al., 1992). Für die PS-Externalisierung ist

sowohl die Inaktivierung der Aminophospholipid-Translokase, die PS in vitalen Zellen von außen nach

innen transportiert, als auch die Aktivierung einer Lipid-Scramblase wichtig (Williamson und Schlegel,

2002). In diesem Zusammenhang wurde auch eine Beteiligung des ATP-binding cassette (ABC)-

Transporters ABCA1 gezeigt (Hamon et al., 2000), jedoch ist der genaue

Externalisierungsmechanismus noch unklar. Neben externalisiertem PS gibt es weitere „eat-me“-

Signale wie z.B. Thrombospondin-1-, C1q- und C3b/bi-bindende Stellen und Oberflächenstrukturen,

die oxidiertem LDL (oxLDL) ähnlich sind (siehe Abbildung 1.4).

Die Erkennung der „eat-me“-Signale erfolgt über spezifische Rezeptoren auf den Phagozyten, wobei

die Bindung entweder direkt an das Oberflächenmolekül oder indirekt über Brückenmoleküle erfolgen

kann. Die Bindung verschiedener Rezeptoren an externalisiertes PS ist dabei eher indirekter Natur

und kann durch mehrere Proteine vermittelt werden. Erst kürzlich konnte dabei Annexin I als ein

Brückenmolekül identifiziert werden, dass die Bindung von PS an den PS-Rezeptor ermöglicht und

damit eine wichtige Rolle bei der Phagozytose spielt (Arur et al., 2003; Fan et al., 2004). Die Identität

des PS-Rezeptors ist inzwischen jedoch sehr umstritten und völlig unklar seitdem gezeigt werden

konnte, dass das von Fadok et al. identifizierte und klonierte vermeintliche PS-Rezeptor-Gen (Fadok

et al., 2000) nicht für einen Membranrezeptor, sondern eher für ein nukleäres Protein kodiert (Cikala

et al., 2004; Cui et al., 2004). Da Arur et al. in ihrer Arbeit zur Funktion von Annexin I

Expressionskonstrukte für den PS-Rezeptor verwendet haben, die ausgehend von der Klonierung

durch Fadok et al. hergestellt wurden ist offen, an welchen phagozytären Rezeptor das

Brückenmolekül Annexin I tatsächlich bindet. Weitere Brückenproteine wie MFG-E8 (milk-fat-globule-

EGF-factor 8), Gas6 (growth-arrest-specific 6) und ß2-GPI (ß2-glycoprotein-I) können ebenfalls an PS

binden und dadurch die Interaktion mit den zugehörigen phagozytären Rezeptoren Vitronectin-

Rezeptor, der Rezeptor-Tyrosinkinase Mer und dem ß2-GPI-Rezeptor vermitteln (Balasubramanian et

al., 1997; Borisenko et al., 2004; Hanayama et al., 2002; Ishimoto et al., 2000; Rubartelli et al., 1997;

Scott et al., 2001). Auch die Erkennung der Thrombospondin-1-, C1q- und C3b/bi-bindende Stellen

durch die Rezeptoren CD36/Vitronectin-Rezeptor und die Komplement-Rezeptoren CR3 und CR4

erfolgt indirekt über die Bindung von Thrombospondin-1 und die Komplementfaktoren C1q und C3b/bi

14

EINLEITUNG

(Mevorach et al., 1998; Savill et al., 1992; Takizawa et al., 1996). Für die Bindung an Stellen, die

oxidiertem LDL ähnlich sind, sind so genannte Scavenger-Rezeptoren wie SR-A (class A macrophage

scavenger receptor), LOX-1 (lectin-like oxLDL-receptor 1), CD68 oder CD36 verantwortlich (Erdosova

et al., 2002; Oka et al., 1998; Platt et al., 1996; Ren et al., 1995).

Eine interessante Veröffentlichung von Kim et al. zeigte, dass das Attraktionssignal

Lysophosphatidylcholin auch als membranständiges „eat-me“-Signal vorkommt und über die Bindung

von IgM-Antikörpern zur Rekrutierung der Komplementfaktoren C1q und C3b/bi führen kann (Kim et

al., 2002). Zudem ist LPC bereits seit langem als Hauptbestandteil von oxidierten LDL-Partikeln

bekannt (Quinn et al., 1987; Quinn et al., 1988). Somit spielt LPC neben seiner Funktion als löslichem

„find-me“-Signal auch eine Rolle als „eat-me“-Signal, und es wäre vorstellbar, dass die oben

erwähnten C1q- und C3b/bi-bindenden Stellen sowie die oxLDL-ähnlichen Oberflächenstrukturen aus

LPC bestehen könnten oder LPC zumindest Bestandteil dieser „eat-me“-Signale sein könnte (Lauber

et al., 2004).

Über diese Vielzahl an membranständigen „eat-me“-Signalen und Brückenmolekülen sowie die

verschiedenen phagozytären Rezeptoren kommt es zur Ausbildung der so genannten

phagozytotischen Synapse (siehe Abbildung 1.4). Dabei besteht eine gewisse Redundanz innerhalb

dieses komplexen Systems, und es müssen nicht unbedingt alle Signale vorhanden sein, um eine

effiziente Eliminierung apoptotischer Zellen zu gewährleisten (Hoffmann et al., 2001; Somersan und

Bhardwaj, 2001). In jedem Fall initiiert dieser enge Kontakt zwischen Zielzelle und Phagozyten die

anschließende Internalisierung und den Abbau der sterbenden Zelle.

Abbildung 1.4: Modell der phagozytotischen Synapse. Inzwischen ist eine Reihe von „eat-me“-Signalen, Brückenmolekülen und Rezeptoren identifiziert worden, die im Zusammenspiel die Erkennung und die Bindung apoptotischer Zellen durch Phagozyten ermöglichen. Anschließend kommt es zur Internalisierung und zum Abbau der apoptotischen Zelle durch den Phagozyten. ABCA1 (ABC-Transporter A1), AnxI (Annexin I), β2-GPI (β2-Glycoprotein I), C1q (Komplementprotein 1q), C3b/bi (Komplementprotein 3b/bi), CD14 (Lipopolysaccharid-Rezeptor), CD91 (Calreticulin / Hitzeschockprotein-Rezeptor), CR3 (Komplement-Rezeptor 3), CR4 (Komplement-Rezeptor 4), CRT (Calreticulin / C1q-bindendes Protein), Gas6 (Wachstumsarrest-Faktor 6), ICAM-3 (Zelladhäsionsprotein), LOX1 (Lectin-ähnlicher OxLDL-Partikel-Rezeptor 1), MBL (Mannose bindendes Lectin), MER (Rezeptor-Tyrosin-Kinase), MFG-E8 (Milchfettglobulin-EGF-Faktor 8), OxLDL (oxidiertes „low-density“ Lipoprotein), Prot S (Protein S), PS (Phosphatidylserin), SP-A/D (Kollektin-A/D), SR-A (Scavenger-Rezeptor A), TSP-1 (Thrombospondin-1). Abbildung modifiziert nach Lauber et al. (Lauber et al., 2004).

15

EINLEITUNG

1.5.3 Internalisierung apoptotischer Zellen und post-phagozytotische Reaktionen

Über die Mechanismen, die nach der Erkennung der apoptotischen Zelle zur Internalisierung und zum

Abbau durch den Phagozyten führen, ist bislang wenig bekannt. Vor allem durch Studien von

Hengartner und Horvitz im Modellorganismus C. elegans konnte jedoch ein erster Einblick gewonnen

werden. In diesen Organismen spielen sieben Gene eine essentielle Rolle für die Phagozytose durch

Nachbarzellen, wobei jede Gendeletion die Hemmung einer effizienten Eliminierung apoptotischer

Zellen bewirkt (Gumienny und Hengartner, 2001). Die Genprodukte sind dabei in zwei partiell

redundanten Signalkassetten arrangiert:

1) Der CED-2 - CED-5 - CED-12-Signalweg mit den Säugerhomologen CrkII / DOCK180 / ELMO, der

zur Aktivierung von CED-10 (Rac1) führt (Reddien und Horvitz, 2004). Dadurch kommt es zur Aktin-

Zytoskelett-Reorganisation, durch welche das Umfließen der Zielzelle initiiert wird.

2) Der CED-1 - CED-6 - CED-7-Signalweg. CED-1 ist homolog zum Scavenger-Rezeptor LPR/SREC

von Säugern (Su et al., 2002; Zhou et al., 2001) und wahrscheinlich für die Erkennung der

apoptotischen Zelle wichtig. Die Signalweiterleitung erfolgt dabei über CED-6, ein Adapterprotein mit

Homologie zum Säugerprotein GULP (Liu und Hengartner, 1998; Su et al., 2002). CED-7 ist verwandt

mit dem ABCA1-Transporter (Wu und Horvitz, 1998) und scheint wichtig für die Membrandynamik zu

sein (Hamon et al., 2002). Eine aktuelle Veröffentlichung zeigt jedoch, dass eher ABCA7 das CED-7-

homologe Säugerprotein sein könnte und möglicherweise durch die Formierung spezieller

Membranmikrodomänen die Signalweiterleitung des LPR-Rezeptors ermöglicht (Jehle et al., 2006).

Auch dieser Signalweg führt letztendlich zur Aktivierung von CED-10 (Rac1) und damit zur

Zytoskelett-Reorganisation (Kinchen et al., 2005).

Welche molekularen Ereignisse letztendlich die vollständige Internalisierung und den anschließenden

Abbau der apoptotischen Zelle steuern, ist bis heute noch weitgehend ungeklärt. Die effiziente

Eliminierung apoptotischer Zellen zielt insgesamt darauf ab, sterbende Zellen zu beseitigen ohne

dabei inflammatorische Prozesse auszulösen und den Organismus damit zu belasten. Dies wird durch

eine Vielzahl an Veröffentlichungen belegt, die zeigen, dass die Eliminierung apoptotischer Zellen zu

einer aktiven Unterdrückung von inflammatorischen Prozessen und Immunreaktionen führt. Dabei

kommt es z.B. zur transkriptionellen Hemmung pro-inflammatorischer Mediatoren wie Interleukin-12

(Kim et al., 2004) oder zur Stimulierung der Sekretion anti-inflammatorischer Zytokine wie Interleukin-

10 oder TGF-ß (transforming growth factor ß) (Byrne und Reen, 2002; Fadok et al., 1998; Huynh et

al., 2002; Voll et al., 1997).

Insgesamt kann die Eliminierung apoptotischer Zellen als dreistufiger Prozess gesehen werden, der

über die Anlockung von Phagozyten durch lösliche „find-me“-Signale zur Erkennung und

Internalisierung mit Hilfe verschiedener „eat-me“-Signale und letztendlich zur Degradation der

apoptotischen Zelle und zur aktiven Unterdrückung entzündlicher Reaktionen führt (siehe Abbildung

1.5).

16

EINLEITUNG

Abbildung 1.5: Dreistufiger Prozess der Eliminierung apoptotischer Zellen. (A) Die apoptotische Zelle setzt lösliche Attraktionssignale frei, die zur Anlockung professioneller Phagozyten führen. (B) Durch den engen Kontakt zwischen apoptotischer Zelle und Phagozyt kommt es zur Ausbildung der phagozytotischen Synapse. Die sterbende Zelle präsentiert dabei eine Vielzahl an „eat-me“-Signalen auf ihrer Oberfläche, die vom Phagozyten direkt oder indirekt über Brückenmoleküle erkannt werden können. Anschließend kommt es zur Internalisierung der apoptotischen Beute durch den Phagozyten. (C) Nach der Internalisierung der apoptotischen Zellen werden diese vom Phagozyten abgebaut. Dieser setzt gleichzeitig vermehrt anti-inflammatorische Zytokine, wie IL-10 und TGF-ß, frei und verhindert dadurch entzündliche Prozesse im umgebenden Gewebe. Abbildung modifiziert nach Lauber et al. (Lauber et al., 2004).

Störungen bei der Eliminierung apoptotischer Zellen können in höheren Organismen schwerwiegende

Folgen haben. So können nicht-eliminierte apoptotische Zellen eine Quelle für Autoantigene sein und

durch die Induktion der Produktion von Autoantikörpern systemische Autoimmunreaktionen

hervorrufen (Casciola-Rosen et al., 1994; Rosen und Casciola-Rosen, 1999). In verschiedenen

Tiermodellen wurde gezeigt, dass sowohl Defekte bei der Anlockung von Phagozyten als auch bei der

Erkennung und der Degradation apoptotischer Zellen langfristige Auswirkungen auf das Immunsytem

haben können. So führt im Mausmodell der knockout von C1q, einem der Brückenmoleküle der

phagozytotischen Synapse, zur Anhäufung apoptotischer Körperchen, und die betroffenen Mäuse

entwickeln ein Multiorgan-Autoimmunsyndrom, das dem humanen systemischen Lupus

erythematodes (SLE) ähnlich ist (Botto, 1998; Botto und Walport, 2002). In MFG-E8-knockout-Mäusen

kommt es durch die Anhäufung nicht-eliminierter Immunzellen zu stark vergrößerten lymphatischen

Organen und zur Entwicklung einer durch Autoimmunantikörper hervorgerufenen Glomerulonephritis

(Hanayama et al., 2004). Die Maskierung von Phosphatidylserin mit einer dominant negativen Form

von MFG-E8 führt ebenfalls zu einer gestörten Phagozytose apoptotischer Zellen und zur Produktion

von Autoantikörpern in Mäusen (Asano et al., 2004). Ebenso äußert sich ein Defekt der phagozytären

Rezeptor-Tyrosinkinase Mer in einer Anhäufung apoptotischer Zellen und der Entwicklung eines

Lupus-ähnlichen Autoimmunsyndroms (Scott et al., 2001). Auch der knockout des LPC-Rezeptors

G2A führt dazu, dass die Mäuse ein Multiorgan-Autoimmunsyndrom entwickeln, das viele Parallelen 17

EINLEITUNG

zum humanen SLE aufweist (Le et al., 2001). Eine aktuelle Veröffentlichung belegt, dass auch die

unzureichende Degradation internalisierter apoptotischer Zellüberreste Krankheitsursache sein kann.

So können Mäuse, die keine DNase II exprimieren, die Nuklei internalisierter apoptotischer Zellen

nicht vollständig abbauen und entwickeln eine chronische Polyarthritis, die durch

Autoimmunantikörper, wie z.B. anti-CCP-Antikörper (CCP = cyclic citrullinated peptide) und Antikörper

gegen doppelsträngige DNA, und eine gesteigerte Produktion pro-inflammatorischer Zytokine

gekennzeichnet ist (Kawane et al., 2006).

1.6 Annexin I Annexin I (auch Annexin A1 oder Lipocortin I genannt) gehört zur Proteinfamilie der Annexine und ist

ein mittelgroßes amphipatisches Protein mit einer molekularen Masse von 38 kDa. Beim Menschen

sind 12 Mitglieder der Annexin-Familie bekannt (A1-A13). Diese erfüllen unterschiedlichste Funktionen

und sind z.B. an der Membran-Organisation oder der Regulation des intrazellulären Calcium-Spiegels

beteiligt (Gerke und Moss, 2002). Allen Annexinen ist die Fähigkeit gemeinsam, Calcium und

Phospholipide zu binden. Die Bindung erfolgt über die so genannten Annexin-Boxen, die innerhalb der

Annexin-Familie sehr stark konserviert sind (Liemann und Huber, 1997; Liemann und Lewit-Bentley,

1995). Annexin I besitzt, ebenso wie die anderen Annexine (außer Annexin VI), vier dieser homologen

Domänen (siehe Abbildung 1.6).

Abbildung 1.6: Struktur des humanen Annexin I. (A) Schematische Darstellung von Annexin I. Dargestellt ist das monomere Protein (38 kDa) in der linearen Form. Die hervorgehobenen Bereiche (I-IV) markieren die hochkonservierten Calcium- und Phospholipid-bindenden Motive, die so genannten Annexin-Boxen. Oberhalb und unterhalb der Darstellung sind die Positionen der Annexin-Boxen in der Aminosäure-(As)- bzw. Nukleotidsequenz (Nt) angegeben. (B) 3-D-Darstellung von humanem Annexin I (aa33-346, Pub-Med-Nr. 1AIN). Annexin I besitzt 20 α-Helices und ist dicht gepackt in Form einer gekrümmten Scheibe. Die Calciumbindung über die Annexin-Boxen erfolgt ausschließlich auf der konvexen Seite. Annexin I bindet pro Molekül 6 Calciumatome. Der hydrophobe N-Terminus ist in Abwesenheit von Calcium auf der konkaven Seite ins Proteininnere gerichtet. Bei Bindung von Calcium-Ionen erfährt das Protein eine Konformationsänderung, der N-Terminus wird aus dem Inneren des Proteins verdrängt und wird frei beweglich (dadurch in Röntgenstrukturanalysen nicht abbildbar). Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure

18

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure

EINLEITUNG

Die unterschiedlichen Funktionen der Annexine kommen durch den für jedes Annexin-

Familienmitglied spezifischen N-Terminus zustande. Annexin I besitzt einen etwa 40 Aminosäuren

langen N-Terminus, der durch Phosphorylierungen oder proteolytische Prozessierung modifiziert

werden kann, wodurch z.B. die Calcium-abhängige Bindung an Membranen geschwächt wird (Wang

und Creutz, 1992). Durch seine Eigenschaft, Calcium-abhängig an Phospholipide und dabei bevorzugt

an Phosphatidylserin binden zu können, ist Annexin I in der Lage, Membranen zu vernetzen

(Rosengarth und Luecke, 2003). Deshalb ist Annexin I an verschiedenen zellulären Prozessen wie

z.B. der Zelldifferenzierung und Proliferation, am Membran-Trafficking, an Exo- und

Endozytoseprozessen und der Organisation des Zytoskeletts beteiligt (Gerke und Moss, 2002;

Rescher et al., 2002).

Bekannt ist Annexin I jedoch vor allem als Glucocorticoid-induzierbares Protein mit verschiedenen

anti-inflammatorischen Funktionen: So hemmt Annexin I die cytosolische Phospholipase A2 (cPLA2)

und kann dadurch die Arachidonsäure-Freisetzung und die Synthese pro-inflammatorischer

Mediatoren unterdrücken (Frey et al., 1999; Kim et al., 2001; Solito et al., 1998; Wu et al., 2000b);

über eine Interaktion mit anderen Mitgliedern der PLA2-Familie, wie z.B. der iPLA2, ist dagegen bis

heute nichts bekannt. Zudem verhindert Annexin I auf der Oberfläche von Monozyten und

Neutrophilen deren Extravasion in entzündete Gewebe (Perretti et al., 2002; Solito et al., 2000).

Neuere Arbeiten zeigen, dass Annexin I außerdem eine Rolle während der Apoptose spielt. Annexin I

wird während der Apoptose prozessiert (Debret et al., 2003) und über einen bislang unbekannten

Mechanismus externalisiert (Arur et al., 2003). Dabei scheint sowohl das auf der Oberfläche von

apoptotischen Zellen gebundene als auch das von Phagozyten externalisierte Annexin I eine wichtige

Rolle bei der Eliminierung apoptotischer Zellen zu spielen (Arur et al., 2003; Fan et al., 2004; Maderna

et al., 2005). Wahrscheinlich dient Annexin I in diesem Prozess, ähnlich wie die in Abschnitt 1.5.2

erwähnten Faktoren MFG-E8, Gas6 und β2-GPI, als Brückenmolekül zwischen der Phosphatidylserin-

reichen Oberfläche apoptotischer Zellen und dem Phagozyt (siehe Abbildung 1.4).

1.7 Zielsetzung Die Eliminierung apoptotischer Zellen durch benachbarte Zellen oder professionelle Phagozyten unter Vermeidung der Induktion entzündlicher Reaktionen ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase in mehrzelligen Organismen. Die Freisetzung löslicher Attraktionssignale und die Präsentation von „eat-me“-Signalen auf der Oberfläche apoptotischer Zellen spielen in diesem Prozess eine zentrale Rolle. Dies erscheint umso wichtiger, da die Entstehung von Autoimmunerkrankungen und die ineffiziente Eliminierung apoptotischer Zellen offensichtlich in engem Zusammenhang stehen (Rosen und Casciola-Rosen, 1999). Insbesondere in höheren Organismen, in denen die sterbenden Zellen und die Phagozyten oft nicht direkt nebeneinander lokalisiert sind, kommt der Freisetzung von löslichen „find-me“-Signalen eine besondere Bedeutung zu. Als ein bedeutendes Attraktionssignal konnte Lysophosphatidylcholin (LPC) identifiziert werden, das durch die hydrolytische Spaltung von Phosphatidylcholin mittels der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) entsteht. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die iPLA2 während der Apoptose Caspase-3-abhängig gespalten wird. Die Überexpression des 26 kDa großen Spaltfragments der iPLA2 führte zwar bei apoptotischen Zellen zu einer gesteigerten Attraktion von Phagozyten, von lebenden Zellen wurde jedoch kein Attraktionssignal freigesetzt. Dies legte den Schluß nahe, dass die

19

EINLEITUNG

iPLA2 zwar für die Freisetzung von LPC benötigt wird, dass aber weitere Prozesse während der Apoptose an der Generierung und / oder der Freisetzung des Attraktionssignals LPC beteiligt sind (Lauber et al., 2003). In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb die folgenden Fragen geklärt werden: 1.) Führt die Spaltung der iPLA2 tatsächlich zu deren Aktivierung und wird die iPLA2-Aktivität

möglicherweise durch Inhibitoren, wie z.B. Annexin I, reguliert? 2.) Welche Transportmechanismen führen während der Apoptose zur Freisetzung des

Attraktionssignals LPC? 3.) Über welche Rezeptoren wird auf Seite der Phagozyten die LPC-vermittelte Migration stimuliert? 4.) Welche Rolle spielt Annexin I als Brückenmolekül in der phagozytotischen Synapse?

20

MATERIAL UND METHODEN

2 Material und Methoden

2.1 Reagenzien

2.1.1 Herstellerverzeichnis

Apotheke des Universitätsklinikums Tübingen Mitomycin C

Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA Lysophosphatidylcholin (LPC), Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylserin (PS)

Axxora, Lausanne, Schweiz Anti-PARP-Antikörper

Bachem, Heidelberg Benzoyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketon (zVAD-fmk)

Biomol, Hamburg Anti-CD95-Antikörper (Maus IgM, Klon CH11), anti-Annexin-I-Antikörper

BioRad, München Bradford-Reagenz, Peroxidase-konjugiertes F(ab')2-Fragment Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H+L),

Peroxidase-konjugiertes F(ab')2-Fragment Ziege-anti-Maus-IgG (H+L), Peroxidase-konjugiertes

F(ab')2-Fragment Kaninchen-anti-Ziege-IgG (H+L), Substratlösung (“TMB Peroxidase EIA Substrat

Kit”)

Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden Arachidonyltrifluoromethylketon (AACOCF3), Calcein, Ionomycin, Lipid Peroxidation Assay Kit II

Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA Bromenollacton (BEL), anti-iPLA2-Antikörper, cPLA2-Assay-Kit

Eurogentec, Seraing, Belgien Mastermixe für quantitative real time-PCR (qPCRTM Mastermix Plus, qPCRTM Mastermix Plus for

SYBR® Green I)

Fermentas, St. Leon-Rot Molekulargewichtsmarker (“Page Ruler Prestained Protein Ladder” und “Page Ruler Prestained

Protein Ladder Plus”)

21


GE Healthcare, Freiburg Molekulargewichtsmarker (Full Range Rainbow Marker), Pd(N)6 Random Hexamere zur reversen

Transkription, PVDF-Membranen (HybondP-ECL-Membran), Westernblot-ECL-Detection-Kit

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe Amplex Ultra Red, Bis-BODIPY®FL C11-PC (BBPC), CM-H2DCFDA (5-(und-6)-Chloromethyl-2',7'-

Dichlorodihydrofluorescein Diacetate, Acetylester), HBSS-Medium, HEPES, Penicillin-Streptomycin,

RPMI-1640-Medium, OptiMEM-Medium, Reverse Transcriptase ("SuperscriptTM II RNaseH-"),

LipofectaminTM2000 Transfektionsreagenz, Stealth siRNA (gegen ABCA1, ABCA7, Annexin I und

G2A)

Macherey und Nagel, Düren RNA-Isolierungskit („Nucleo Spin RNA“), Maxi-Plasmid-Reinigungskit ("Nucleobond AX 500" Kit)

Milipore Corporation, Bedford, MA, USA Millex-Sterilfilter mit 0,2-0,8 µm Porengröße

Neuroprobe, Inc., Gaithersburg, MD, USA Doppelkammerplatten für Transmigrationstests (96-well-Format "ChemoTX")

Novus Biological, Littleton, CO, USA Anti-ABCA1-Antikörper

PAA Laboratories, Cölbe Fötales Kälberserum (FCS)

Promega, Mannheim Desoxy-Nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), RnasIn

R&D Systems, Minneapolis, MN, USA SDF-1 α

Roche Molecular Biochemicals, Mannheim Aprotinin, FuGENETM 6 Transfektionsreagenz, Leupeptin, Pepstatin, Staurosporin

Roth, Karlsruhe Acrylamid/Bisacrylamid, Ammoniumperoxodisulfat (APS), Chloroform, Ethylendiamintetraessigsäure

(EDTA), Ethylen-bis-(oxyethylennitrilo)-tetraessigsäure (EGTA), Natriumdodecylsulfat (SDS),

Rinderserumalbumin (BSA), Tetraethylmethylendiamin (TEMED), Triton X-100

Schleicher und Schüll, Dasseln

22


Filtermembranen (Kollodiumhülsen), 0,22µm-, 0,45µm-, 0,8µm Sterilfilter, GB002 Filter-Papier

Sigma, Deisenhofen Ampicillin, anti-FLAG-Antikörper, anti-FLAG M2-Agarose, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dithiothreitol

(DTT), Etoposid, fettsäurefreies Rinderserumalbumin, Glycerin, Glycerol-3-Phosphat-Oxidase,

Glycerophosphorylcholin(GPC)-Phosphodieserase, Kanamycin, Natriumfluorid, Natriumvanadat,

Natriumpyrophosphat, Nonidet P-40, Peroxidase, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Phorbol-12-

Myristyl-13-Acetat (PMA), PKH26 und PKH67 Fluoreszenz Färbekits, Propidiumiodid (PI), α-

Tocopherol, Tween-20

Alle übrigen Reagenzien wurden in reinster Form (p.a.), falls nicht anders vermerkt, von den Firmen

Sigma (Deisenhofen), Merck (Darmstadt) oder Roth (Karlsruhe) bezogen.

2.1.2 Antikörper Tabelle 2.1: Verwendete Antikörper. Name Beschreibung Hersteller

Anti-ABCA1 Polyklonaler Hase-Antikörper, erkennt die Volllängenform

des ABCA1-Transporters (p220)

Immunogen: aa1201-1211, Reaktivität: Mensch, Maus

Novus Biological

Anti-Annexin I Monoklonaler Maus-Antikörper IgG1, Klon 29

Erkennt die Volllängenform des humanen Annexin I (p38)

Immunogen: Volllängenform, Reaktivität: Mensch, Hund

BD Biosciences

Anti-CD95

Maus-Antikörper IgM, Klon CH11

Bindet an den humanen Todesrezeptor CD95 (p43) auf

verschiedenen Zellen und induziert dadurch Apoptose

Immunogen: FS-7, Reaktivität: Mensch

Biozol

Anti-FLAG Monoklonaler Maus-Antikörper, der das FLAG-Tag von

Fusionsproteinen erkennt (Sequenz: DYKDDDDK)

Sigma

Anti-GFP Mischung aus zwei monoklonalen Maus-Antikörpern IgG1,

Klone 7.1 und 13.1, erkennt das GFP des Aequorea victoria

(p27), das als Reportermolekül in heterologen Systemen

überexprimiert wird, erkennt auch das modifizerte EGPF

Roche

Anti-G2A Polyklonaler Ziege-Antikörper, der humanes G2A erkennt

(p42-46), Reaktivität: Maus, Mensch, Ratte

Santa Cruz Biotechnology

Anti-NHE-1 Monoklonaler Maus-Antikörper, erkennt die p92

Volllängenform von humanem NHE-1

Reaktivität: Mensch, Hund, Ratte, Maus

BD Biosciences (Transduction Labs)

Anti-iPLA2 Polyklonaler Hase-Antikörper, der die humane iPLA2 erkennt

Immunogen: aa 557-576, Reaktivität: Mensch, Maus,

Hamster, Ratte, Rind

Cayman Chemical

Anti-PARP Monoklonaler Maus-Antikörper, der die p116-Form und die Axxora

23


Name Beschreibung Hersteller

prozessierte p85-Form von humanem PARP erkennt

(Immunogen: aa 216-375)

Reaktivität: Mensch, Maus, Ratte, Hamster, Affe

2.1.3 Plasmidkonstrukte Die in der vorliegenden Arbeit zur transienten eukaryontischen Expression verschiedener Proteine

verwendeten Plasmidkonstrukte wurden nicht im Rahmen dieser Arbeit hergestellt. Sie standen

bereits als gereinigte Plasmid-DNA-Stocklösungen bzw. in Form von Bakterien Glycerin-

Dauerkulturen (alle in E.coli XL-1 Blue) zur Verfügung. Abbildung 2.1 zeigt den eukaryontischen

Expressionsvektor pEGFP-N1 in seiner zirkulären Form.

Abbildung 2.1: Vektorkarte von pEGFP-N1. KanR/NeoR (Kanamycin-Resistenz), MCS (Klonierungsregion), EGFP (enhanced green-fluorescent protein) PCMV IE (Cytomegalovirus-Promotor), PT7 lac (T7-Promotor, IPTG-induzierbar), lacIq (lac-Repressor), f1 ori, SV40 ori, pUC ori (DNA-Replikationsursprünge), SV40 poly A (Polyadenylierungssignal des Simian Virus 40) HSV TK poly A (Polyadenylierungssignal des Tyrosinkinasegens von Herpes-Simplex-Virus). Quelle: www.clontech.com; Protokoll #PT3027-5

pEGFP-N1[Flag-iPLA2 aa1-806] Die cDNA der calciumunabhängigen Phospholipase A2 wurde aus der humanen Mamma-Karzinom-

Zelllinie MCF7 in die EcoRI/HindIII-Schnittstelle des eukaryontischen Expressionsvektors pEGFP-N1

kloniert, ohne mit dem vektoreigenen EGFP fusioniert zu werden. Die rekombinante iPLA2 trägt ein N-

terminales Flag-Tag.

pEGFP-N1[Flag-iPLA2 aa514-806] Die cDNA der calciumunabhängigen Phospholipase A2 Aminosäureregion 514-806 wurde aus MCF7

Zellen in die HindIII/NotI-Schnittstelle des eukaryontischen Expressionsvektors pEGFP-N1 kloniert,

ohne mit dem vektoreigenen EGFP fusioniert zu werden. Die rekombinante iPLA2 trägt ein C-


24

http://www.clontech.com/


pEGFP-N1[Flag-iPLA2 aa514-733] Die cDNA der calciumunabhängigen Phospholipase A2 Aminosäureregion 514-733 wurde aus MCF7




pEGFP-N1[FLAG-iPLA2 1-512] Die cDNA der calciumunabhängigen Phospholipase A2 Aminosäureregion 1-512 wurde aus MCF7




pEGFP-N1[hAnnexI] Die aus MDA-Zellen amplifizierte cDNA von humanem Annexin I wurde in die BamH1-Schnittstelle

des Expressionsvektors pEGFP-N1 eingesetzt. Für die vorliegende Arbeit standen Plasmidkonstrukte

mit verschiedenen AnxI-Teilfragmenten in gereinigter Form zur Verfügung:

• pEGFP-N1[hAnnexI nt1-138]






Das exprimierte rekombinante Annexin I ist jeweils am C-Terminus mit EGFP fusioniert.

2.1.4 Gereinigte Proteine Die im Folgenden aufgelisteten und in der vorliegenden Arbeit verwendeten gereinigten

rekombinanten Proteine wurden nicht im Rahmen dieser Arbeit aufgereinigt. Alle Stocklösungen

wurden bei –70°C gelagert.

hCaspase-3-His6

Humane rekombinante Caspase-3 wurde aus mit pET23[Casp3] transformierten E.coli BL21(DE3)

affinitätschromatographisch aufgereinigt und stand bereits als enzymatisch aktive Stocklösung in 20

mM Tris-HCl pH 7,6, 500 mM NaCl, 50% Glycerol zur Verfügung. Das Protein war C-terminal mit

einem Hexahistidin-Tag fusioniert.

His6-hAnnexin I Humanes, rekombinantes Annexin I wurde aus mit pET15b[hAnnexI] transformierten E.coli BL21(DE3)

affinitätschromatographisch aufgereinigt. Es wurden drei verschiedene Annexin-I-Fragmente

aufgereinigt, die alle N-terminal mit einem Hexahistidin-Fusions-Tag und einer Thrombin-

Spaltkonsensussequenz fusioniert waren. In Tabelle 2.2 sind die verschiedenen Fusionsproteine

aufgelistet.

25


Tabelle 2.2: Verwendete hAnnexin-I-His6-Fusionsproteine

Name aufgereinigt aus Bemerkungen

hAnnexin-I-His6 (aa1-346) E.coli BL21(DE3)

pET15b[hAnnexI nt1-1038]

Volllängenprotein

in 30 mM Tris-HCl pH 7,9,

500 mM NaCl, 20% Glycerol

hAnnexin-I-His6 (aa1-46) E.coli BL21(DE3)


N-terminales Fragment



hAnnexin-I-(His6 (aa47-346) E.coli BL21(DE3)


Core-Fragment



hAnnexin-I-Cy2TM

Mit Hilfe von immobilisiertem Thrombin (Merck) wurde bei den in Tabelle 2.1 aufgelisteten

rekombinanten humanen Annexin-I-Fragmenten das N-terminale Hexahistidin-Tag enzymatisch

entfernt. Danach wurden die Annexin-I-Fragmente mit dem FluoroLinkTM-Ab Cy2TM Labelling Kit von

Amersham Biosciences Cy2TM-markiert. Der Farbstoff besaß ein Emmisionsmaximum bei 506 nm und

ließ sich im Durchflusszytometer (FACScalibur, BD Biosciences) im FL1-Filter (530 nm) detektieren.

Alle Stocklösungen waren PBS gepuffert und enthielten 0,1% Azid. Sie wurden bei -70°C gelagert.

His6-hLysophospholipase A1 Humane rekombinante Lysophospholipase A1 wurde aus mit pET15b[hLPL-A1] transformierten E.coli

BL21(DE3) affinitätschromatographisch aufgereinigt und stand als Stocklösung in TBS mit 10 %

Glycerin zur Verfügung. Das Protein war N-terminal mit einem Hexahistidin-Tag fusioniert.

2.1.5 siRNA-Oligonukleotide Die im Folgenden aufgelisteten modifizierten short interfering (si)-RNA-Oligonukleotide wurden alle

von Invitrogen Life Technologies bezogen („stealthTM RNAi“), in lyophilisierter Form geliefert und mit

DEPC-behandeltem Wasser Stocklösungen von 100 µM hergestellt. Diese wurden bei –70°C gelagert.

Die Nukelotid-Sequenzen der verwendeten siRNA-Oligonukleotide sind in Tabelle 2.3 aufgelistet.

Tabelle 2.3: Sequenzen der stealthTM RNAi-Oligonukleotide.

Ziel-mRNA (Start-Nukleotid) Sense RNA-Sequenz 5´-3´

ABCA1 (nt3216) GGAGCUGCUGCUGAAAUACCGACAA

ABCA7 (nt426) ACCAACCAAGCAGUCUCCACUGGAA

ABCA7 (nt1676) UCUACUCCGUGACACUGACAGUGAA

Annexin I (nt148) GCCUUGCAUAAGGCCAUAAUGGUUA

26


Annexin I (nt893) GGAUUAUGGUUUCCCGUUCUGAAAU

Annexin I Kontrolle GGAUAGGUUCUCCUGCUGUAUUAAU

G2A (nt280) ACGCUGCCACUCUGGGUCAUCUAUA

G2A (nt550) GAGACCUGCUUUGACAUGCUGCAGA

G2A Kontrolle ACGCCGUCAGUCUGGUACUCCUAUA

GPR4 (nt59) CGCCAUCCCUCUACAUCUUUGUCAU

GPR4 (nt268) UGCAAGCUCUUUGGGUUCAUCUUCU

GPR4 Kontrolle CGCCUCCCUAUACCUUUGUUACCAU

2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen

Material

RPMI-1640 Medium (Invitrogen Life Technologies)

1x PBS-Lösung (Invitrogen Life Technologies) 10 mM Natriumphosphat 150 mM Natriumchlorid pH 7,4

Penicillin-Streptomycin-Lösung (Invitrogen Life Technologies)

10.000 U/mL Penicillin, 10 mg/mL Streptomycin Die Lösung wurde 1%ig eingesetzt.

HEPES-Lösung (Invitrogen Life Technologies) 1 M HEPES Die Lösung wurde 1%ig eingesetzt.

10x Trypsin/EDTA-Lösung (Sigma) 5 g/l Trypsin 2 g/l EDTA 0,9% Natriumchlorid Für den Gebrauch wurde die Lösung 1:10 in PBS (Invitrogen Life Technologies) verdünnt.

Fötales Kälberserum (PAA Laboratories) Vor Gebrauch wurde das Serum für 20 min bei 56°C hitzeinaktiviert.

Durchführung Alle Zelllinien wurden, falls nicht anders vermerkt, in Kulturflaschen (50 - 800 mL) oder

Mikrotiterplatten (6-, 12-, 24-, oder 96-Well-Format) bei 37°C mit 5% CO2 in wasserdampfgesättigter

Atmosphäre gezüchtet. Die Suspensionszelllinien wurden alle 2 - 3 Tage im Verhältnis 1:10 verdünnt

und passagiert. Adhärente Zelllinien wurden 1 - 2mal pro Woche nach Behandlung mit Trypsin/EDTA-

Lösung im Verhältnis 1:10 passagiert.

Die humane Mamma-Karzinom-Zelllinie MCF7, die stabil mit einem Expressionsvektor für humane

Caspase-3 oder mit dem leeren Kontrollvektor transfiziert worden ist, wurde freundlicherweise von

27


Prof. Dr. Reiner U. Jänicke und Prof. Dr. Alan Porter (National University of Singapore, Singapore) zur

Verfügung gestellt.

Die humane Monozyten-Zelllinie U937 wurde freundlicherweise von Prof. Dr. Ralph Hass

(Medizinische Hochschule Hannover) zur Verfügung gestellt.

Die humane Monozyten-Zelllinie U937, die stabil die murine Form des G2A-Rezeptors exprimiert, und

die mit leerem Kontrollvektor transfizierten U937-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Caius Radu

(University of California, Los Angeles) zur Verfügung gestellt.

Eine detaillierte Aufstellung der verwendeten Zelllinien und Kulturmedien zeigt Tabelle 2.4.

Tabelle 2.4: Verwendete Zelllinien. Name Beschreibung Kulturmedium Jurkat (J16) Humane T-Zelllinie (Subklon 16), in

Suspension RPMI 1640, 10% FCS, 100 U/mL Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin, 10 mM HEPES

MCF7vektor Humane Mamma-Karzinom-Zelllinie, Caspase-3 defizient, stabil mit Kontrollvektor transfiziert, adhärent

RPMI 1640, 10% FCS, 100 U/mL Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin, 10 mM HEPES

MCF7casp3 Humane Mamma-Karzinom-Zelllinie, stabil transfiziert mit Caspase-3, adhärent


MDA-MB 231 Humane Mamma-Karzinom-Zelllinie, adhärent


THP-1 Humane Monozyten-Linie, in Suspension RPMI 1640, 10% FCS, 100 U/mL Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin, 10 mM HEPES

U937 Humane Monozyten-Zelllinie, in Suspension

RPMI 1640, 10% FCS, 100U/mL Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin, 10mM HEPES

U937vektor Humane Monozyten-Zelllinie, stabil mit Kontrollvektor transfiziert, in Suspension


U937G2A Humane Monozyten-Zelllinie, stabil transfiziert mit murinem G2A, in Suspension


2.2.2 Kryokonservierung von eukaryontischen Zellen Die Kryokonservierung eukaryontischer Zellen wurde mit DMSO als Gefrierschutzmittel durchgeführt.

DMSO unterdrückt die Ausbildung von Wasserkristallen während des Einfrierens und verhindert damit

die Zerstörung der Zellwand. Die Zellen wurden abzentrifugiert, das Zellsediment in Einfriermedium

(90% FCS, 10% DMSO) resuspendiert (max. 20 - 30 x 106 Zellen/mL) und in 1 mL großen Aliquots auf

Kryoröhrchen verteilt. Danach wurden die Zellen zunächst für ca. 48 h bei -80°C gelagert und

anschließend in Flüssigstickstoff (-196°C) überführt. Aufgrund der toxischen Wirkung von DMSO bei

Raumtemperatur wurden alle Einfrierschritte rasch und auf Eis durchgeführt.

28


Zum Auftauen wurden die Zellen schnell auf 37°C erwärmt, einmal mit 20 mL Zellkulturmedium

gewaschen und in Kultur genommen.

2.2.3 Transfektion von eukaryontischen Zellen Zum Einbringen von Fremd-DNA bzw. RNA in Säugerzellen, die in Zellkultur gehalten werden,

existieren unterschiedliche Methoden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Transfektion entweder in

Form einer Lipofektion mit Hilfe der Lipofektionsagentien FuGENETM6 (Roche) oder

LipofectaminTM2000 (Invitrogen Life Technologies) oder durch Elektroporation mit Hilfe des Gene

Pulser II-Elektoporators (BioRad) durchgeführt.

Der genaue Transfektionsmechanismus ist bei der Lipofektion nicht geklärt, erfolgt aber vermutlich

durch Endozytose der DNA- bzw. RNA-Liposomen-Gemische (eine Mischung aus polykationischen

Lipiden zur Bindung von DNA oder RNA und neutralen Lipiden). Besonders bei adhärenten Zellen

lassen sich hierdurch oftmals Transfektionseffizienzen von über 50% erzielen (Herstellerangaben).

Für Suspensionszellen hat sich die Transfektion durch Elektroporation als geeignete Methode

erwiesen. Hierbei werden die Zellen für kurze Zeit einem elektrischen Feld ausgesetzt, durch das die

Plasmamembran der Zellen permeabel gemacht wird. Dadurch kann in der Suspension befindliche

Fremd-DNA oder RNA aufgenommen werden.

Material

Plasmid-DNA Plasmid-Maxiprep-gereinigt, 0,2 - 2 µg/µl StealthTM RNAi (Invitrogen Life Technologies) 100µM in DEPC-behandeltem H2O FuGENETM6 (Roche) 3 µl pro 1 µg DNA (für 3 x 105 Zellen) LipofectaminTM2000 (Invitrogen Life Technologies)

2,5 - 5µL für 50 - 100pMol siRNA (3 x 105 Zellen)

OptiMEM (Invitrogen Life Technologies) 1x PBS (Invitrogen Life Technologies) 10 mM Natriumphosphat

150 mM Natriumchlorid pH 7,4

Serum-freies Medium (Invitrogen Life Technologies)

Zellkulturmedium (Invitrogen Life Technologies) Supplementiert wie unter 2.2.1 angegeben Durchführung Zur Lipofektion wurden 3 x 105 Zellen pro Vertiefung in 6-well-Platten ausplattiert und über Nacht im

Brutschrank kultiviert.

Zur Vorbereitung des DNA-Liposomen-Gemisches mit FuGENETM6 wurde 1 µg Plasmid-DNA pro

Transfektionsansatz in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß vorgelegt. In einem anderen Reaktionsgefäß

wurden pro Transfektionsansatz 97 µl serumfreies Medium mit 3 µl FuGENETM6-Reagenz versetzt

und für 5 min inkubiert. Dieses Gemisch wurde tropfenweise zur vorgelegten Plasmid-DNA gegeben,

vorsichtig gemischt und für weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurde das

Zellkulturmedium erneuert und abschließend das DNA-Liposomengemsich tropfenweise über die

Kulturzellen verteilt. Nach 12 h Transfektionszeit im Brutschrank wurde das Kulturmedium erneuert

und die Zellen wie angegeben behandelt.

29


Für die Transfektion von Plasmid-DNA mit LipofectaminTM2000 wurde 1 µg Plasmid-DNA pro

Transfektionsansatz in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß vorgelegt und mit 50 µL serumfreiem

Medium gemischt. In einem zweiten Reaktionsgefäß wurden pro Transfektionsansatz 50 µl

serumfreies Medium mit 3 µl LipofectaminTM2000-Reagenz gemischt, für 5 min inkubiert und dann zur

Plasmid-DNA-Lösung gegeben. Nach vorsichtigem Mischen wurde für 20 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Die Zellen wurden mit 2 mL PBS gewaschen, 1400 µL serumfreies Medium zugegeben und

100 µL des DNA-Liposomengemisches tropfenweise über die Kulturzellen verteilt. Nach 5 h

Transfektionszeit im Brutschrank wurde das Kulturmedium erneuert und die Zellen bis zur weiteren

Behandlung kultiviert.

Zur Transfektion von siRNA mit LipofectaminTM2000 wurden 250 µL serumfreies Medium pro

Transfektionsansatz in einem 50mL Falkon-Reaktionsgefäß mit 2,5 oder 5 µL LipofectaminTM2000

versetzt und 5 min inkubiert. In einem anderen Reaktionsgefäß wurden 250 µL serumfreies Medium

mit 0,5 - 1 µL siRNA (50 - 100 pMol) vorgelegt, die LipofectaminTM2000-Suspension langsam

zugegeben, gemischt und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit 2 mL PBS

gewaschen und 500 µL des siRNA-Liposomengemisches zugegeben. Nach 5h Transfektionszeit

wurden die Zellen auf normales Kulturmedium umgestellt und bis zur weiteren Behandlung im

Brutschrank kultiviert.

Zur Elektroporation von Suspensionszellen wurden diese in kaltem OptiMEM gewaschen und damit

auf eine Dichte von 1 x 107 Zellen/mL eingestellt. In jede Elektoporationsküvette (Gene Pulser

Cuvette, 0,4 cm Spaltbreite, BioRad) wurden 10 µL der 100 µM siRNA-Stocklösung vorgelegt, 500 µL

Zellsuspension zugegeben und nach vorsichtigem Mischen 5 min auf Eis inkubiert. Die

Elektroporation wurde mit einer Feldstärke von 800 µF und 250 V durchgeführt, was einer Pulszeit von

20 - 40 Millisekunden entspricht. Danach wurden die Zellen für weitere 10 min auf Eis inkubiert und

anschließend in 10 mL Kulturmedium in eine Kulturflasche überführt. Die Zellen wurden bis zur

weiteren Behandlung im Brutschrank inkubiert.

2.2.4 Apoptose-Induktion und Produktion von chemotaktisch aktiven Zellkulturüberständen

In der vorliegenden Arbeit wurde Apoptose durch verschiedene Stimuli induziert. Die Stocklösungen

der verschiedenen Apoptose-Stimuli und Inhibitoren wurden bei -70°C gelagert.

Material

AACOCF3, cPLA2-Inhibitor (Calbiochem) Stocklösung 10 mM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 20 µM

Anti-CD95-Antikörper Maus IgM, Klon CH11 (Biozol)

Apoptosestimulus, Agonistischer Antikörper Stocklösung 500 µg/mL in PBS Finalkonzentration 100 ng/mL

Bromenolacton, iPLA2-Inhibitor (Cayman Chemical)

Stocklösung 10 mM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 1 - 20 µM

Etoposid, Zytostatikum (Calbiochem) Stocklösung 20 mg/mL in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 25 µg/mL

Glyburid, ABCA-Inhibitor (Merck) Stocklösung 20 mM in DMSO/Ethanol (frisch angesetzt)

30


Finalkonzentration 1 - 100 µM Ionomycin, Calcium-Ionophor (Calbiochem) Stocklösung 2 mM in DMSO/Ethanol

Finalkonzentration 4 µM Mitomycin C, Zytostatikum (Apotheke des Universitätsklinikums Tübingen)

Stocklösung 1 mg/mL in H2O bidest. Finalkonzentration 25 µg/mL

1x PBS-Lösung (Invitrogen Life Technologies) 10 mM Natriumphosphat 150 mM Natriumchlorid pH 7,4

Phorbolester PMA (Calbiochem) Stocklösung 80 µM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 1 - 80 nM

Sephadex-G15 (Amersham Pharmacia) Es wurden PBS-äquilibrierte Säulen mit einem Gelbett von 2 mL verwendet

Staurosporin, Breitband-Kinase-Inhibitor (Sigma) Stocklösung 2,5 mM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 2,5 µM

α-Tocopherol (Vitamin E) (Sigma) Stocklösung 100 mM in Ethanol Finalkonzentration 1 - 100 µM

Zellkulturmedium (Invitrogen Life Technologies) Supplementiert wie unter 2.2.1 angegeben zVAD-fmk, Breitband-Caspase-Inhibitor (Bachem)

Stocklösung 20 mM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 100 µM

Durchführung Im Fall der Zytostatika- oder Staurosporin-vermittelten Apoptose wurden die Stimuli aus

hochkonzentrierten Stocklösungen dem serumfreien Zellkulturmedium zugesetzt und die Zellen für die

angegebenen Zeiten in diesen Medien inkubiert.

Die UV-Bestrahlung von adhärenten Kulturzellen wurde folgendermaßen durchgeführt:

2 x 106 Zellen pro Vertiefung wurden in 6-well-Platten ausplattiert und bis zur Adhärenz im

Brutschrank kultiviert. Zur UV-Bestrahlung wurde das Zellkulturmedium entfernt und durch 2 mL PBS

ersetzt. Die Zellen wurden mit 10 mJ/cm2 im UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)

ohne Kulturplattendeckel bestrahlt. PBS wurde durch 2 mL serumfreies RPMI-1640-Medium ersetzt

und die Zellen für die angegebenen Zeiten im Brutschrank kultiviert. Anschließend wurden die

Zellkulturüberstände in 2mL-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und Zelldebris durch 5-minütige

Zentrifugation bei 10.000 g entfernt. Die zentrifugierten Überstände wurden in frische

Reaktionsgefäße überführt und bis auf weiteres bei -70°C gelagert.

Inhibitoren wurden 30 min vor der Apoptose-Induktion dem Zellkulturmedium zugesetzt und bis zur

Stimulation im Brutschrank inkubiert. Vor der Stimulation wurde das Medium entfernt und die Zellen

mit 2mL Inhibitor- und Stimulus-haltigem serumfreiem Medium für die angegebenen Zeiten im

Brutschrank inkubiert.

In den Experimenten, in denen verschiedene pharmakologische Reagenzien zur Produktion der

chemotaktisch aktiven Überstände eingesetzt worden sind, wurden die zentrifugierten Zellkultur-

überstände zusätzlich über Sephadex-G15-Säulen (Gelbettvolumen 2 mL) filtriert, um die

niedermolekularen Drogen zu entfernen.

Zur Gewinnung von Zellkulturüberständen nach α-Tocopherol-Vorbehandlung wurden die Zellen für

30 h vor UV-Bestrahlung mit unterschiedlichen Mengen an α-Tocopherol im Zellkulturmedium

kultiviert. Vor Apoptose-Induktion wurden die Zellen zusätzlich mit PBS gewaschen.

31


2.2.5 Nekrose-Induktion Zur Produktion nekrotischer Überstände wurden 2 x 106 MCF7casp3 Zellen in 2 mL serumfreiem

Kulturmedium 20 min bei 58°C im Wasserbad inkubiert. Die nekrotischen Zellen wurden durch 10-

minütige Zentrifugation bei 10.000g sedimentiert, die Überstände in ein frisches Reaktionsgefäß

überführt und bei –70°C bis zur weiteren Verwendung zwischengelagert.

2.2.6 Phagozytosetest Für die Untersuchung der Phagozytose wurden in der vorliegenden Arbeit die Zelllinien THP-1 und

U937 verwendet, da sich diese monozytären Suspensionszellen durch PMA-Zugabe zu adhärenten

phagozytierenden Makrophagen ausdifferenzieren lassen. Makrophagen und aptoptotische Zellen

bzw. Kontrollzellen, im Folgenden als Beute bezeichnet, wurden mit unterschiedlichen

Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Phagozytierende Makrophagen, die durch Aufnahme von gefärbter

Beute doppelt gefärbt waren, ließen sich im Durchflusszytometer von einfach gefärbten, nicht

phagozytierenden Makrophagen unterscheiden. Ebenso ließ sich der Anteil an doppelt gefärbten, also

internalisierten Beutezellen ermitteln.

Material

Bovines Serumalbumin (BSA), fettsäurefrei (Sigma)

Stocklösung 1 mg/mL in PBS Finalkonzentration 2 nmol/mL

Fötales Kälberserum (PAA Laboratories) Vor Gebrauch wurde das Serum für 20 min bei 56°C hitzeinaktiviert

Humanes Annexin I, rekombinant AnxI aa1-346, Stocklösung: 200 µg/mL AnxI aa47-346, Stocklösung: 200 µg/mL AnxI aa1-46, Stocklösung: 500 µg/mL Finalkonzentration 2 nmol/mL

PBS-Lösung (Invitrogen Life Technologies) 10 mM Natriumphosphat 150 mM Natriumchlorid pH 7,4

Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Merck) Stocklösung 80 µM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 1 - 10 nM

PKH26 Red Fluorescent Färbekit (Sigma-Aldrich) 2 µM PKH26 für 1x 107 Zellen/mL

PKH67 Green Fluorescent Färbekit (Sigma-Aldrich)

2 µM PKH67 für 1x 107 Zellen/mL

Serumfreies Medium (Invitrogen Life Technologies)

supplementiert wie unter 2.2.1 angegeben, FCS-frei

1x TBS 50 mM Tris-Hydrochlorid 150 mM Natriumchlorid 5 mM Calciumchlorid bzw. 10 mM EDTA pH 7,4

1x Trypsin/EDTA-Lösung (Sigma-Aldrich) 10x Trypsin/EDTA-Lösung wie unter 2.2.1 angegeben verdünnt

32


Zellkulturmedium (Invitrogen Life Technologies) supplementiert wie unter 2.2.1 angegeben

Im Folgenden wird die generelle Versuchsdurchführung geschildert. Je nach Fragestellung gab es

jedoch leichte Abwandlungen in der Durchführung (siehe dort).

Vorbereitung der Makrophagen Etwa 2,5 Tage vor dem Phagozytosetest wurden die mononzytären THP-1 und U937 Zellen mit

grünem PKH67-Fluoreszenzfarbstoff gefärbt. Dabei handelt es sich um einen Farbstoff mit langen

aliphatischen Resten, mit welchen sich das Molekül in die Zellmembran einlagern kann. Die

Zellfärbung ist nicht homogen, es entstehen vielmehr Farbflecken auf der Zelloberfläche. Der Farbstoff

ist nicht toxisch und in Zellen bis zu drei Wochen stabil. Pro Färbeansatz wurden 2 x 107 Zellen mit

serumfreiem Medium gewaschen und in 1 mL Diluent C, einer isoosmotischen wässrigen Lösung

ohne physiologische Salze oder Puffern, resuspendiert. In einem 1,5 mL Reaktionsgefäß wurde 4 µM

PKH-Farbstoff in 1 mL Diluent C angesetzt und zu der vorgelegten Zellsuspension gegeben. Der

Reaktionsansatz wurde 5 min bei RT inkubiert und die Färbereaktion durch Zugabe von 2 mL FCS

abgestoppt. Nach einer weiteren kurzen Inkubation bei RT wurden die gefärbten Zellen dreimal mit

Zellkulturmedium gewaschen und in eine 24-well-Platte mit je 1 x 105 Zellen in 500 µl

Zellkulturmedium pro Kavität ausplattiert. Zur Ausdifferenzierung der THP-1 Makrophagen wurde 1 nM

PMA zugegeben, den U937 Zellen wurde 10 nM PMA zugesetzt. Nach 16 h Inkubation im Brutschrank

wurde das Kulturmedium gewechselt und die Zellen für weitere 2 Tage ohne PMA-Zusatz kultiviert.

Vorbereitung der Beute Jurkat und THP-1 Zellen wurden direkt vor der Apoptose-Induktion nach dem gleichen Protokoll wie

die Makrophagen (siehe oben) mit rotem PKH26-Fluoreszenzfarbstoff gefärbt. Für die Apoptose-

Induktion wurden die gefärbten Zellen in PBS aufgenommen und mit 10 mJ/cm2 UV-Licht (siehe 2.2.4)

bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen für die jeweils angegebene Zeit im Brutschrank in

serumfreiem Medium kultiviert.

Phagozytose und durchflusszytometrische Analyse Der Phagozytosetest wurde in 24-well-Platten durchgeführt. Dazu wurde das Zellkulturmedium auf

den adhärenten THP-1 und U937 Zellen gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Je nach

Fragestellung wurden die Beutezellen vor der Ko-Inkubation mit den Makrophagen zusätzlich mit

EGTA- oder CaCl2-haltigem TBS-Puffer gewaschen bzw. mit aufgereinigtem rekombinantem Annexin I

beladen. Anschließend wurde die Beute im angegebenen Verhältnis zu den Makrophagen gegeben.

Das finale Volumen betrug 500 µl. Die Zellen wurden für die angegebene Zeit bei 37°C im Brutschrank

inkubiert. Danach wurden die Überstände mit der nicht phagozytierten Beute abgenommen, die

adhärenten Makrophagen nach Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung aus der 24-well-Platte gelöst

und mit den jeweiligen Überständen vereinigt. Die Zellen wurden in PBS aufgenommen und im

Durchflusszytometer (FACScalibur, BD Biosciences) analysiert. Makrophagen und Beute ließen sich

anhand ihrer unterschiedlichen Färbung gut unterscheiden. Zur Berechnung des Phagozytose-Index

wurde sowohl der Anteil an Makrophagen bestimmt, der Beute phagozytiert hatte, als auch der

33


Prozentsatz internalisierter, also doppelt gefärbter Beutezellen. Der Phagozytose-Index wurde mit

folgender Formel berechnet:

(Prozent doppelt gefärbte Beutezellen / 100 * Anzahl eingesetzter Beutezellen) Prozent doppelt gefärbte Phagozyten x ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- (Prozent doppelt gefärbte Phagozyten / 100 * Anzahl eingesetzter Phagozyten)

2.2.7 PLA2-Aktivitätstest Phospholipasen A2 hydrolysieren Phospholipide von Zellmembranen und sind damit wesentlich am

Ab- und Umbau von Phospholipiden und der Generierung von Lysophospholipiden beteiligt. Zur

Messung ihrer Aktivität kann die Spaltung fluorogener Substrate genutzt werden, mit denen Zellen

zuvor beladen werden. Die Messung der Aktivität erfolgt durchflusszytometrisch, hierbei wird die

Zunahme der Fluoreszenz über die Zeit ermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde hierzu das PLA2-

Substrat Bis-BODIPY®FL C11-PC (BBPC) verwendet. BBPC ist eine modifizierte Form von

Phosphatidylcholin, die anstelle der Acyl-Seitenketten mit zwei BODIPY-Fluorophoren verestert ist.

Durch die räumliche Nähe der beiden fluorogenen Seitenketten wird im ungespaltenen Molekül eine

starke Eigenfluoreszenz unterdrückt. Wird eine der Seitenketten abgespalten, entstehen zwei

fluoreszierende Produkte, deren Signal im Durchflusszytometer gemessen werden kann.

Material

Bis-BODIPY®FL C11-PC (1,2-bis-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-undecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine) (BBPC), (Molecular Probes Invitrogen)

Stocklösung 1 µg/µL in DMSO Finalkonzentration 20 ng/µL

HBSS (Invitrogen Life Technologies) 1x Trypsin/EDTA-Lösung (Sigma-Aldrich) 10x Trypsin/EDTA-Lösung wie unter 2.2.1

angegeben verdünnt

Durchführung Es wurden 0,5 x 106 MCF7casp3 Zellen pro Kavität in 6-well-Platten ausplattiert und nach Erreichen der

Adhärenz für 26 h mit entsprechender Plasmid-DNA transfiziert (siehe 2.2.3). Das Zellkulturmedium

wurde entfernt und die Zellen durch Inkubation mit Trypsin/EDTA-Lösung aus der Platte gelöst. Es

wurden jeweils 2 x 106 Zellen in 200 µL HBSS aufgenommen, mit 4 µL BBPC versetzt und für 10 min

bei 37°C inkubiert. Nach der Färbung wurden die Zellen in 500 µL HBSS resuspendiert und im

Durchflusszytometer (FACScalibur, BD Biosciences) analysiert. Während der Färbung und der

Messung wurde darauf geachtet die Proben keiner starken Lichtexposition auszusetzen. Zur

Ermittlung der PLA2-Aktivität wurde die Zunahme der grünen Fluoreszenz bei 530 nm über die Zeit

gemessen und danach die Steigung ermittelt.

34


2.2.8 Nachweis reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS) Oxidativer Stress kann von außen auf Zellen einwirken, es entstehen jedoch auch während des

normalen Zellstoffwechsels reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS), die z.B. zur Oxidation von

Fettsäuren führen können. Insbesondere während der Apoptose ist die Zelle großem oxidativem

Stress ausgesetzt, was zu einer erhöhten Rate an oxidierten Lipiden und einem gesteigerten Lipid-

und Phospholipidabbau führt.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Menge reaktiver Sauerstoffverbindungen in vitalen und

apoptotischen Zellen bestimmt. Um die intrazelluläre ROS-Produktion zu messen, wurden die Zellen

mit dem Farbstoff CM-H2DCFDA (5-(und-6)-Chloromethyl-2',7'-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat,

Acetylester) beladen, dessen Fluoreszenz nach seiner Oxidation durch ROS durchflusszytometrisch

nachgewiesen werden konnte.

Material

CM-H2DCFDA (5-(und-6)-Chloromethyl-2',7'- Dichlorodihydrofluoresceindiacetat, Acetylester) (Molecular Probes Invitrogen)

Stocklösung 10 mM in DMSO/Ethanol Finalkonzentration 10 µM

1x PBS (Invitrogen Life Technologies) 10 mM Natriumphosphat 150 mM Natriumchlorid pH 7,4



1x Trypsin/EDTA-Lösung (Sigma-Aldrich) 10x Trypsin/EDTA-Lösung wie unter 2.2.1 angegeben verdünnt


Durchführung Zur Messung intrazellulärer ROS wurden 4 x 105 Zellen pro Kavität einer 6-well-Platte für 20 min mit

serumfreiem Medium + 10 µM CM-H2DCFDA bei 37°C inkubiert und dann wie unter 2.2.4 beschrieben

durch UV-Bestrahlung Apoptose induziert. Die Zellen wurden für 13 h bei 37°C im Brutschrank

inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen, die adhärenten Zellen nach Behandlung mit

Trypsin/EDTA-Lösung aus der 6-well-Platte gelöst und mit den jeweiligen Überständen vereinigt. Die

Zellen wurden in PBS aufgenommen und im Durchflusszytometer (FACScalibur, BD Biosciences) bei

530 nm die grüne Fluoreszenz (Fl1) analysiert.

2.2.9 Zellbiologische Nachweismethoden des Zelltods

2.2.9.1 Zytofluorimetrischer Nachweis von hypodiploiden Nuklei Während der Apoptose wird die zelluläre DNA durch DNasen internukleosomal gespalten. Die

entstehenden DNA-Fragmente können durch die Kernporen den Zellkern verlassen, so dass dieser

sukzessive DNA verliert. Dieses Phänomen kann man als Messparameter der Apoptose heranziehen.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Quantifizierung der Apoptose anhand der hypodiploiden Nuklei

nach der Methode von Nicoletti et al. (Nicoletti et al., 1991). Hierbei werden die Nuklei durch hypotone

Zellyse freigesetzt und die nukleäre DNA mit Propidiumiodid angefärbt. Die Quantifizierung der

35


nukleären DNA-Menge erfolgt durchflusszytometrisch, und alle Zellkerne mit weniger als dem

diploiden DNA-Gehalt (G0/G1-DNA-Gehalt) werden als apoptotisch betrachtet.

Material

Hypotoner Lysepuffer 1% (w/v) Natriumcitrat 0,1% (v/v) Triton X-100 50 µg/mL Propidiumiodid in H2O bidest.

Durchführung Jeweils 3 - 5 x 104 Zellen pro Vertiefung wurden in 96-well-Platten (bzw. 2 x 106 Zellen pro Vertiefung

in 6-well-Platten) für 18 - 24 h mit den angegebenen Apoptose-Stimuli behandelt. Das

Zellkulturmedium wurde entfernt und die Zellen in hypotonem Lysepuffer für 5 min lysiert.

Anschließend wurde die rote Fluoreszenz der Zellkerne bei 585 nm im Durchflusszytometer

(FACScalibur, BD Biosciences) analysiert. Die apoptotischen, hypodiploiden Zellkerne mit reduzierter

roter Fluoreszenz ließen sich im FL2-Histogramm "links" der diploiden G0/G1-Population prozentual

erfassen.

2.2.9.2 Zytofluorimetrischer Nachweis Propidiumiodid-positiver Zellen Der Nachweis der Zellmembranintegrität erfolgte mittels Propidiumiodid-Färbung der Zellen. Tote

Zellen weisen eine permeable Zellmembran auf, durch die Propidiumiodid in die Zelle eindringen und

in die nukleäre DNA interkalieren kann. Die resultierende rote Fluoreszenz lässt sich

durchflusszytometrisch nachweisen. Bei dieser Methode kann nicht zwischen Nekrose und der im

Rahmen der Apoptose spät auftretenden sekundären Nekrose unterschieden werden.

Material

1x Trypsin/EDTA-Lösung (Invitrogen Life Technologies)

Propidiumiodid-Färbelösung 5 µg/mL Propidiumiodid in 1x PBS

Durchführung Jeweils 3 - 5 x 104 Zellen pro Vertiefung wurden in 96-well-Platten (bzw. 2 x 106 Zellen pro Vertiefung

in 6-well-Platten) für die angegebenen Zeiten mit den verschiedenen Apoptose-Stimuli behandelt. Das

Zellkulturmedium wurde entfernt und die Zellen trypsiniert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation

gesammelt (5 min 200 g), in der Propidiumiodid-Färbelösung aufgenommen und für 5 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die rote Fluoreszenz im Durchflusszytometer

(FACScalibur, BD Biosciences) bei 585 nm analysiert. Die Zellen mit gestörter Membranintegrität

ließen sich im FL2-Histogramm als Population mit erhöhter roter Fluoreszenz "rechts" der vitalen

Kontrollpopulation prozentual erfassen.

36


2.2.10 Transmigrationstest Der Transmigrationstest ist eine Nachweismethode zur Bestimmung des chemotaktischen Potentials

verschiedener Substanzen und/oder von Zellkulturüberständen. In einem Doppelkammer-Aufbau wird

die zu testende Substanz in der unteren Kammer vorgelegt und durch einen Filter definierter

Porengröße von den Testzellen abgetrennt. Dabei wird der Porenduchmesser so klein gewählt, dass

die Testzellen nicht passiv "durchfallen" können, sondern sich aktiv hindurchbewegen müssen. Der

Testaufbau ist in Abbildung 2.2 dargestellt.

Abbildung 2.2: Aufbau des Transmigrationstests.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Testzellen mit dem grünen Fluorophor Calcein-AM markiert.

Dies ermöglicht die prozentuale Quantifizierung der transmigrierten Zellen über die Messung der

grünen Fluoreszenz.

Material


Lyophilisiert Finalkonzentration 0,1 % in serumfreiem Medium

ChemoTX-Platten (Neuroprobe, Inc.) 96-well-Format 8 µm Porendurchmesser 300 µl Fassungsvermögen der unteren Kammer

Calcein-AM-Lösung 1 mg/mL Calcein-AM in DMSO/Ethanol

Lyse-Puffer 25 mM Tris-Phosphat 2 mM EDTA 10% (v/v) Glycerin 1% (v/v) Triton X-100 pH 7,8

Lysophosphatidylcholin (LPC) (Avanti Polar Lipids)

10 mg/mL in Chloroform Finalkonzentration 10 µM

SDF-1α (R&D Systems) Rekombinantes humanes SDF-1α Stocklösung 50 µg/mL in PBS Finalkonzentration 200 ng/mL



37


Durchführung 2 x 106 Testzellen (THP-1 oder U937vektor bzw. U937G2A) pro mL wurden mit 1 µg/mL Calcein-AM in

Kulturmedium (RPMI-1640, supplementiert wie unter 2.2.1 angegeben) für 30 min im Brutschrank

gefärbt, einmal in Kulturmedium gewaschen und mit einer Zellkonzentration von 2 x 106 Zellen pro mL

in Kulturmedium resuspendiert. Für den Transmigrationstest wurden 50 µl dieser Zellsuspension pro

Vertiefung (entspricht 1 x 105 Zellen pro Vertiefung) eingesetzt.

300 µl der zu testenden Zellkulturüberstände verschiedener Zelllinien wurden in der unteren Kammer

der ChemoTX-Platten vorgelegt. Der 8µm-Porenfilter wurde befestigt, 50 µl der gefärbten

Zellsuspension vorsichtig aufgebracht und der Testansatz für 120 min bei 37°C im Brutschrank

inkubiert. Anschließend wurde der Filter vorsichtig entfernt, die transmigrierten Zellen durch

Zentrifugation gesammelt (5 min 200 g) und in 100 µl Lysepuffer für 5 min bei Raumtemperatur lysiert.

Die Messung der grünen Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer

Emissionswellenlänge von 508 nm mit Hilfe des Micro Tek FLI-Fluorometers (Bio-Tek Kontron

Instruments) durchgeführt. Um den prozentualen Anteil der transmigrierten Zellen zu ermitteln, wurde

eine Eichgerade von 0 – 50.000 gefärbten, lysierten Zellen verwendet.

Für die Transmigrationstests mit gereinigtem Lysophosphatidylcholin wurde das entsprechende

Volumen der Chloroformlösung in einem Glasröhrchen vorgelegt und das Chloroform unter

Stickstoffbegasung abgezogen. LPC wurden dann in serumfreiem RPMI-1640-Medium mit 0,1 %

fettsäurefreiem BSA rekonstituiert und zur besseren Lösung für 5 min ultrabeschallt. Für die Tests mit

dem Chemokin SDF-1α wurde dieses in serumfreiem Medium mit 0,1 % fettsäurefreiem BSA

verdünnt.

2.3 Biochemische Methoden

2.3.1 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford In der vorliegenden Arbeit wurde die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

durchgeführt (Bradford, 1976). Das Prinzip dieses Tests ist die Anlagerung des Farbstoffs Coomassie

Brilliant Blue G250 an Proteine, die eine Veränderung im Absorptionsverhalten des Farbstoffs bewirkt.

Material

5x Bradford-Lösung (BioRad) Vor Gebrauch wurde die Lösung 1:5 in H2O bidest. verdünnt.

BSA-Eichgerade 50 - 400 µg/mL BSA (Roth) in PBS

Durchführung Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde im Mikromaßstab in 96-well-Platten durchgeführt. 1 -

10 µl der zu untersuchenden Proteinlösung wurden mit 200 µl 1x Bradford Reagenz versetzt. Bei jeder

Messung wurde eine Verdünnungsreihe von BSA (50 µg/mL bis 400 µg/mL) als interner Standard

mitgeführt. Der Abgleich erfolgte gegen einen Reagenzienleerwert. Die Absorptionsmessung wurde im

Micro Tek FLI-Fluorometer (Bio-Tek Kontron Instruments) bei 570 nm durchgeführt. Mit Hilfe der

38


geräteeigenen Software wurden die Daten der BSA-Verdünnungsreihe ausgewertet und die

Proteinkonzentrationen der Proben ermittelt.

2.3.2 Herstellung von Zelllysaten Zum Nachweis zellulärer Protein mittels SDS-PAGE und zur Präzipitation von Proteinen wurden in der

vorliegenden Arbeit Gesamtzelllysate hergestellt. Dabei wurden in einem isotonen Lysepuffer durch

Zusatz von Detergenz zelluläre Strukturen zerstört und durch Zugabe von Proteinase-Inhibitoren der

weitere Abbau von Proteinen gehemmt.

Material

Lysepuffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 150 mM Natriumchlorid 200 µM EDTA 200 µM EGTA 3 µg/mL Pepstatin 3 µg/mL Aprotinin 3 µg/mL Leupeptin 20 µg/mL Calpain-Inhibitor 1 20 µg/mL Calpain-Inhibitor 2 2 mM PMSF 1 % Triton X-100


4x SDS-Auftragspuffer 250 mM Tris-Hydrochlorid 25,8% (v/v) Glycerin 8,2% (w/v) SDS 0,04% (w/v) Bromphenolblau 4% (v/v) β-Mercapto-Ethanol

Durchführung Die entsprechend vorbehandelten Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und mit PBS

gewaschen. Die trockenen Pellets von 0,5 - 2 x 106 Zellen wurden in 100 µL kaltem Lysepuffer

aufgenommen und für 10 min auf Eis lysiert. Durch Zentrifugation wurden nicht-lysierte

Zellbestandteile sedimentiert. Die Lysate wurden entweder zur Präzipitation (siehe 2.3.6) eingesetzt

oder für eine SDS-PAGE vorbereitet. Dazu wurde eine Proteinkonzentrationsbestimmung

durchgeführt, die entsprechenden Mengen Lysat mit 4x SDS-Auftragspuffer versetzt und für 5 min auf

95°C erhitzt. Danach wurden die Proben auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen und einer Westernblot-

Analyse unterzogen.

2.3.3 Aufreinigung von FLAG-Fusionsproteinen In der vorliegenden Arbeit wurde FLAG-iPLA2 aa1-806 aus Zelllysaten aufgereinigt.

Die Methode beruht auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem zu reinigenden Protein und

einem Antikörper, der an einer Gelmatrix immobilisiert wurde. Dadurch ist es möglich aus einer

Proteinmischung, wie z.B. Gesamtzelllysaten, ein einzelnes Protein aufzureinigen. 39


Material

Anti-FLAG-M2-Agarose (Sigma) Elutionspuffer 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,63 IP Lysepuffer 50 mM Tris-HCL, pH 7,6

150 mM NaCl 1% Triton X-100

IP Waschpuffer 50 mM Tris-HCl 150 mM NaCl 10% Glycerin 0,1% Triton X-100

Neutralisationspuffer 1 M Tris-HCl, pH 9,0 1x PBS + 20% Glycerin zur Dialyse Protease-Inhibitoren 3 µg/mL Pepstatin

3 µg/mL Aprotinin 3 µg/mL Leupeptin 2 mM PMSF

Float-A-Lyzer-Dialysierschläuche, 5 mL Volumen (Roth)

Polypropylen-Säulen mit Fritte (BioRad) 10 mL Fassungsvermögen Durchführung Es wurden wie unter 2.2.3 beschrieben Jurkat Zellen durch Elektroporation mit dem pEGFP-N1[FLAG-

iPLA2 aa1-806]-Plasmidkonstrukt transfiziert, die Zellen 24h nach Transfektion geerntet bis zur

weiteren Verwendung trocken bei -70°C gelagert. Alle weiteren Schritte wurden im Kühlraum bei 4°C

durchgeführt. Das Pellet von 1 x 109 transfizierten Jurkat Zellen wurde in 10mL IP Lysepuffer mit

Zusatz von Protease-Inhibitoren für 10 min lysiert und die Zelldebris durch Zentrifugation abgetrennt.

Die Säule wurde mit 1 mL einer 50 %igen anti-FLAG-Agarose-Lösung gepackt und durch Waschen

mit H2O, Elutionspuffer und IP Lysepuffer vorbereitet. Danach wurden 10 mL Zelllysat vorsichtig

aufgetragen und mit niedriger Fließgeschwindigkeit über die Säule laufen gelassen. Zum Abspülen

unspezifisch gebundener Proteine wurde die Säule zuerst mit 40 mL IP Lysepuffer und dann mit 40

mL IP Waschpuffer gewaschen. Eluiert wurde mit 15 x 250 µL Elutionspuffer und jede Fraktion wurde

sofort mit 12 µL Neutralisationspuffer behandelt. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und

über Nacht gegen PBS + 20% Glycerin dialysiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben

bei -70°C gelagert.

2.3.4 In vitro-Spaltung von Proteinen mit Hilfe gereinigter Caspasen Mit Hilfe der gereinigten rekombinanten Caspase-3 (2.1.4) wurde in der vorliegenden Arbeit die

gereinigte iPLA2 aa1-806 (siehe 2.3.3) in vitro prozessiert.

Material

Gereinigte Caspase-3 Stocklösung 1,25 mg/mL Gereinigte iPLA2 aa1-806 500 µL proteinhaltiges, dialysiertes Eluat von 1 x

109 Zellen, Proteinkonzentration unbekannt

40


1x Reaktionspuffer 37,5 mM HEPES 75 mM Natriumchlorid 7,5% (w/v) D(+)-Sucrose 0,075% (w/v) CHAPS 1,5 mM Calciumchlorid 10 mM DTT pH 7,4


zVAD-fmk 20 mM zVAD-fmk (Bachem) in DMSO/Ethanol Durchführung Jeweils 20µL der gereinigten iPLA2 aa1-806 wurden mit je 2 µg der gereinigten Caspase-3 in An- oder

Abwesenheit von 500 µM zVAD-fmk in einem finalen Volumen von 40 µl 1x Reaktionspuffer

unterschiedlich lange bei 37°C auf einem Thermomixer inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe

von 20 µL 4 x SDS-Auftragspuffer gestoppt, für 5 min auf 95°C erhitzt, auf ein SDS-PAGE-Gel

aufgetragen und einer Westernblot-Analyse unterzogen.

2.3.5 Präparation von Membran- und Cytosolfraktionen Zum Nachweis der intrazellulären Lokalisation von Proteinen und der Detektion gering exprimierter

Membranproteine kann man Zellkerne, Cytosol und Membranen getrennt präparieren und einer

Westernblot-Analyse unterziehen. Das Prinzip dieser Präparationsmethode ist eine hypotone Zelllyse

und eine anschließende Abtrennung von Zellkernen und zellulären Membranen aus der cytosolischen

Fraktion durch Zentrifugation.

In der vorliegenden Arbeit wurde diese Technik zur Bestimmung der intrazellulären Lokalisation der

verschiedenen iPLA2-Fragmente und zum Nachweis des ABCA1-Transporters und des G2A-

Rezeptors herangezogen.

Material

PBS 10 mM Natriumphosphat 150 mM Natriumchlorid pH 7,4

1x Puffer A 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5 10 mM Kaliumchlorid 1,5 mM Magnesiumchlorid 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1 mM DTT 10 µg/mL Leupeptin 10 µg/mL Aprotinin 10 µg/mL Pepstatin A 0,1 mM PMSF

41



Durchführung Das trocken bei -70°C gelagerte Pellet von 1 - 1,5 x 107 Zellen, die wie unter 2.2.3 beschrieben mit

verschiedenen iPLA2-Konstrukten oder siRNA transfiziert worden waren, wurde in 1 mL kaltem Puffer

A resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in den Dounce-Homogenisator (Spaltbreite 70 µm)

überführt und auf Eis mit 20 Stößen homogenisiert. Nuklei und Zelldebris wurden für 10 min bei 800 g

sedimentiert, der Überstand in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und die Membranfraktion durch

Zentrifugation bei 50.000 g und 4°C für 2 h vom cytosolischen Überstand abgetrennt. Die cytosolische

Fraktion wurde abgenommen und die sedimentierte Membranfraktion in 100 – 150 µL Lysepuffer +

5% Triton X-100 (siehe 2.3.2) resuspendiert. Nach einer Proteinkonzentrationsbestimmung wurden

die entsprechenden Volumina der Fraktionen mit 4x SDS-Auftragspuffer versetzt und entweder direkt

oder nach 5 minütigem Erhitzen auf 95°C zur SDS-PAGE eingesetzt.

2.3.6 Präzipitationen Präzipitationstechniken mit Hilfe von Sepharose-Matrizes kann man zum Nachweis von Protein-

Protein-Interaktionen verwenden. Entweder setzt man dabei einen der Bindungspartner direkt

immobilisiert ein, oder man verwendet ein Gelmaterial, an das ein für einen der beiden

Bindungspartner spezifischer Antikörper kovalent gebunden ist. In der vorliegenden Arbeit wurde zur

Präzipitation von FLAG-getaggten Proteinen und deren Bindungspartnern ein Gelmaterial benutzt, an

das ein spezifischer anti-FLAG-Antikörper gekoppelt ist.

Material

Anti-FLAG-M2-Agarose (Sigma) Calciumchlorid Stocklösung 1 M in 1xTBS

Finalkonzentration 5 mM EDTA Stocklösung 1 M in 1xTBS

Finalkonzentration 5 mM Elutionspuffer 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,63 Neutralisationspuffer 1 M Tris-HCl, pH 9,0 8x SDS-Auftragspuffer 500 mM Tris-Hydrochlorid

51,6% (v/v) Glycerin 16,4% (w/v) SDS 0,08% (w/v) Bromphenolblau 8% (v/v) β-Mercapto-Ethanol

Silikonisierte Reaktionsgefäße, 1,5 mL Volumen Biozym Waschpuffer 10 mM Tris-Hydrochlorid

150 mM Natriumchlorid 0,1% (v/v) Triton X-100 pH 8,0

42


Durchführung Pro Präzipitationsansatz wurde das wie unter 2.3.2 beschrieben hergestellte Lysat von 5 x 106 Zellen

eingesetzt (500 µL). Um eine mögliche Calcium-Abhängigkeit der Protein-Interaktionen zu überprüfen,

wurde den Lysaten entweder 5 mM Calciumchlorid oder 5 mM EDTA zugesetzt.

Zur Entfernung des Lagerungspuffers wurden 200 µL des Gelmaterials zunächst mit 1 mL

Waschpuffer gewaschen und zur Entfernung möglicher Verunreinigungen mit 1 mL Elutionspuffer

eluiert. Es wurden 50 µL Neutralisationspuffer zugegeben und das Gelmaterial dreimal mit

Waschpuffer gewaschen. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 20 µL anti-FLAG-Agarose zu

500 µL Lysat und wurde für 1,5 h bei 4°C in Kühlraum auf einem Schüttler durchgeführt. Die Gelmatrix

wurde anschließend durch Zentrifugation sedimentiert und sechsmal mit je 1 mL Waschpuffer unter

Zusatz von Calciumchlorid oder EDTA gewaschen. Zur Elution der gebundenen Proteine wurden die

Proben für 2 min mit je 40 µL Elutionspuffer inkubiert, das Gelmaterial sedimentiert und die in ein

frisches Gefäß überführten Eluate mit 4 µL Neutralisationspuffer neutralisiert. Die Elution wurde

gegebenenfalls wiederholt und die Eluate vereinigt. Die Proben wurden mit 20 µL 8x SDS-

Auftragspuffer versetzt und für 5 min bei 95°C inkubiert, bevor sie zur SDS-Gelelektrophorese und

anschließender Westernblot-Analyse bzw. Silberfärbung eingesetzt wurden.

2.3.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur analytischen Auftrennung von Proteingemischen wurde die diskontinuierliche SDS Polyacrylamid

Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli verwendet (Laemmli, 1970). Hierbei werden die

Proteine mit Hilfe von SDS denaturiert und Disulfidbrücken mit β-Mercapto-Ethanol reduziert. Die

Anlagerung des anionischen Detergenz SDS an die Polypeptidkette erfolgt proportional zum

Molekulargewicht des Polypeptids. Da jedes angelagerte SDS-Molekül die Polypeptidkette mit einer

negativen Ladung versieht, ergibt sich für alle Proteine ein nahezu konstantes Ladungs/Masse-

Verhältnis der SDS-Polypeptid-Aggregate, so dass die Wanderungsgeschwindigkeit im Gel allein von

der Größe des Polypeptids abhängig ist. Mit Hilfe von geeigneten Molekulargewichts-Markern ist die

Größe eines Polypeptids auf diese Weise leicht zu bestimmen.

Durch die Verwendung eines diskontinuierlichen Gel- und Puffersystems mit Sammel- und Trenngel

wird das Auflösungsvermögen der SDS-PAGE wesentlich erhöht (Laemmli, 1970).

Material

Acrylamid-Lösung (Roth) 29,2% (w/v) Acrylamid 0,8% (w/v) Bisacrylamid in H2O bidest.

APS-Lösung 10% (w/v) APS in H2O bidest.

TEMED (Roth) Sammelgel-Puffer 0,74% (w/v) SDS

1 M Tris-Hydrochlorid pH 6,8

Trenngel-Puffer 0,384% (w/v) SDS 1,5 M Tris-Hydrochlorid pH 8,8

43


4x SDS-Auftragspuffer 250 mM Tris-Hydrochlorid 25,8% (v/v) Glycerin 8,2% (w/v) SDS (Roth) 0,04% (w/v) Bromphenolblau 4% (v/v) β-Mercapto-Ethanol

1x Elektrodenpuffer 0,1% (w/v) SDS 1,9 M Glycin 250 mM Tris-Hydrochlorid

Durchführung Aus den Stocklösungen wurden die Gelmischungen hergestellt. Sie enthielten:

Komponente Sammelgel Trenngel Acrylamid/Bisacrylamid 5% (w/v) 8 - 15% (w/v) Tris-Hydrochlorid pH 6,8 135 mM - Tris-Hydrochlorid pH 8,8 - 390 mM SDS 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) APS 0,1% (w/v) 0,05% (w/v)

Die Polymerisation wurde durch Zugabe von 0,1% (v/v) TEMED gestartet und die polymerisierende

Lösung sofort verwendet. Das Trenngel wurde unmittelbar nach dem Gießen mit Isopropanol

überschichtet. Nach ca. 60 min wurde der Alkohol durch Spülen mit H2O bidest. entfernt und das

Sammelgel gegossen.

Die zu testenden Proteinlösungen wurden mit 1x SDS-Auftragspuffer versetzt, für 5 min bei 95°C

inkubiert und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in 1x Elektrodenpuffer solange

durchgeführt, bis die Bromphenolblaufront die untere Gelkante erreicht hatte.

2.3.8 Silberfärbung von Proteingelen Die Silberfärbung von SDS-PAGE-Gelen wurde nach Rabilloud et al. durchgeführt (Rabilloud et al.,

1988). Sie zeichnet sich durch eine 100- bis 1000-fach größere Sensitivität im Vergleich zur

Coomassie-Färbung aus (Nachweisgrenze 0,1 - 1 ng Protein pro Bande).

Material

Fixier-Lösung 50% (v/v) Methanol 12% (v/v) Essigsäure 0,0185% (v/v) Formaldehyd

Thiosulfat-Lösung 0,8 mM Natriumthiosulfat in H2O bidest.

Imprägnier-Lösung 0,2% (w/v) Silbernitrat 0,0278% (v/v) Formaldehyd

Entwickler-Lösung 6%(w/v) Natriumcarbonat 16 µM Natriumthiosulfat 0,0185% (v/v) Formaldehyd

Stop-Lösung 50% (v/v) Methanol 12% (v/v) Essigsäure

44


Durchführung Nach der SDS-PAGE wurde das Trenngel für die angegebenen Zeiten mit den verschiedenen

Lösungen in einer Schwenkapparatur inkubiert:

Lösung Zeit Fixier-Lösung 60 min Dreimal mit 50% (v/v) Methanol in H2O bidest. waschen, jeweils 20 min Thiosulfat-Lösung 1 min Dreimal mit H2O bidest. waschen, jeweils 20 s Imprägnier-Lösung 20 min Zweimal mit H2O bidest. waschen, jeweils 30 s Entwickler-Lösung Bis Banden sichtbar wurden Stop-Lösung 10 min 50% (v/v) Methanol in H2O bidest. 2 h

Anschließend wurde das Gel zwischen zwei Cellophanfolien (Roth) getrocknet.

2.3.9 Westernblot Der Westernblot ist eine Mehode zum selektiven Nachweis eines Proteins mit Hilfe von spezifischen

Antikörpern. Dazu müssen die im SDS-PAGE-Gel aufgetrennten Proteine aus dem Gel zunächst auf

eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran transferiert werden. Der Nachweis erfolgt auf der

Membran mit Hilfe von spezifischen Primärantikörpern und einem geeigneten Detektionssystem auf

der Basis eines Enzym-markierten Sekundärantikörpers.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran im Nass-Tank-

Verfahren durchgeführt und das Peroxidase-basierte "Enhanced-Chemiluminescence" (ECL)-

Detektionssystem verwendet.

Material

PVDF-Membran "HybondP-ECL" (Amersham-Pharmacia)

Filter-Papier (GB002; Schleicher und Schüll) Transfer-Apparatur (BioRad) Transfer-Puffer 2,93 g/l Glycin

5,28 g/l Tris Base 20% (v/v) Methanol

5% Milchpulver-Lösung 5% (v/v) fettarmes Milchpulver 10 mM Tris-Hydrochlorid 150 mM Natriumchlorid 0,02% (v/v) Triton X-100 pH 8,0

1x TBS 0,02% (v/v) Triton X-100 10 mM Tris-Hydrochlorid 150 mM Natriumchlorid 0,02% (v/v) Triton X-100 pH 8,0

Primärantikörper-Lösung 0,5 - 2 µg/mL in 1x TBS 0,02% (v/v) Triton X-100

45


Sekundärantikörper-Lösung Sekundärantikörper-Stocklösung, Peroxidase-markiert (BioRad) 1:4000 verdünnt in 5% Milchpulver

Westernblot-ECL-Detection Kit (Amersham-Pharmacia)

Hyperfilm-ECL (Amersham-Pharmacia) Durchführung Der Zusammenbau des Blots erfolgte in kaltem Transfer-Puffer. Hierzu wurde die Transferkassette

geöffnet und ein Transferschwamm auf die anodengerichtete Seite der Kassette gelegt. Darauf

wurden ein Filter-Papier, die PVDF-Membran, das Gel, zwei Lagen Filterpapier und der zweite

Transferschwamm gelegt. Die Kassette wurde geschlossen, in den Transfertank überführt und dieser

mit kaltem Transfer-Puffer aufgefüllt. Der Transfer wurde für 90 - 240 min bei 0,5 A und 4°C

durchgeführt. Im Anschluss wurden die unspezifischen Bindungsstellen der PVDF-Membran durch

einstündige Inkubation mit 5% Milchpulver-Lösung bei Raumtemperatur blockiert und der Blot zweimal

mit 1x TBS 0,02% (v/v) Triton X-100 gewaschen. Die Inkubation mit der entsprechenden

Primärantikörper-Lösung wurde entweder für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C

durchgeführt. Danach wurde die Membran fünfmal für 3 min mit 1x TBS 0,02% (v/v) Triton X-100

gewaschen und für 1 h mit der entsprechenden Sekundärantikörper-Lösung bei Raumtemperatur

inkubiert. Abschließend wurde der Blot weitere 6mal für 10 min mit 1x TBS 0,02% (v/v) Triton X-100

gewaschen. Zur Detektion wurden gleiche Volumina der Detektionsreagenzien A und B (Westernblot-

ECL-Detection-Kit, Amersham-Pharmacia) gemischt, die Membran darin für 1 min inkubiert, in der

Dunkelkammer ECL-Filme (Hyperfilm-ECL, Amersham-Pharmacia) für verschiedene

Expositionszeiten aufgelegt und anschließend entwickelt.

2.3.10 Anti-FLAG-ELISA Mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kann die Menge eines einzelnen

Proteins in einem Proteingemisch (z.B. Zelllysat oder Zellkulturüberstand) mit Hilfe spezifischer

Antikörper ohne weitere vorangehende Reinigungsschritte quantitativ bestimmt werden. Dazu wird

entweder ein für das Protein spezifischer Antikörper auf einer speziell präparierten Oberfläche

immobilisiert, mit Proteingemisch inkubiert und durch einen weiteren spezifischen Antikörper das

gesuchte Protein markiert. Oder die Proteinmischung selbst wird immobilisiert, mit einem spezifischem

Primärantikörper inkubiert und dann mit Sekundärantikörper überschichtet. Die Detektion erfolgt in

beiden Fällen auf dieselbe Weise: durch den Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper wird das

Substrat 3, 3´, 5, 5´, Tetramethylbenzidin umgesetzt, je nach Menge des gebundenen Antikörpers

ändert sich dadurch die Absorption unterschiedlich stark. Eine absolute Quantifizierung kann

vorgenommen werden, indem mit gereinigtem Zielprotein eine Verdünnungsreihe als Standard

mitbestimmt wird. Steht kein gereinigtes Protein zur Verfügung, kann über den Vergleich

unterschiedlicher Proben eine relative Quantifizierung erfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde die

Expression verschiedener Flag-getaggter iPLA2-Konstrukte relativ bestimmt.

46


Material

Blockierungspuffer 1x PBS, pH 7,4 0,5% (v/v) Tween20 1 % (w/v) BSA

10x Carbonat/Bicarbonat-Puffer 500 mM Natriumcarbonat/Bicarbonat, pH 9,6 Maus-anti-FLAG-Antikörper (Sigma) Stocklösung 5 mg/mL

Finalkonzentration 2 µg/mL Stopplösung 0,2 M H2SO4 in H2O bidest. Substratlösung (BioRad) 3, 3´, 5, 5´, Tetramethylbenzidin-Lösung Waschpuffer 1x PBS, pH 7,4

0,5 % (v/v) Tween20 96-well Flachboden Mikrotiterplatte, Maxisorb (Nalgene Nunc International)

Ziege-anti-Maus-IgG-HRP, EIA-Grade (BioRad) 1:5000 in Blockierungspuffer Durchführung Zelllysate von 2 x 106 Zellen wurden wie unter 2.3.11 angegeben hergestellt und die

Proteinkonzentration auf 1µg/µL eingestellt. Aus dieser Lösung wurde eine Verdünnungsreihe der

Proben von 4 – 0,5 ng/µL in 1x Carbonat/Bicarbonat-Puffer hergestellt. Pro Vertiefung wurde 250 µL

Probe in die Platte gegeben und für 16 h bei 4°C immobilisiert (entspricht 1 – 0,125 µg Protein pro

Kavität). Die Näpfe wurden 5mal gewaschen und danach für 1 h bei 37°C mit je 250 µL

Blockierungspuffer inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde 100 µL Primärantikörper (2 µg/mL in

Blockierungspuffer) zugegeben und für weitere 30 min bei 37°C inkubiert, danach die Vertiefungen

gewaschen und mit je 100 µL Sekundärantikörper-Lösung überschichtet. Nach Abspülen der

überschüssigen Antikörperlösung wurden 100 µL Substratlösung zugegeben und für einige Minuten

im Dunkeln inkubiert, bis eine deutliche Farbreaktion sichtbar wurde. Diese wurde mit 100 µL

Stopplösung abgestoppt und im Micro Tek FLI-Fluorometer (Bio-Tek Kontron Instruments) bei 405 nm

(Referenzwellenlänge 570 nm) die Absorption gemessen. Durch den Vergleich unterschiedlicher

Proben wurde eine relative Quantifizierung vorgenommen.

2.3.11 In vitro-Phospholipase A2–Aktivitätstest Zur Messung der hydrolytischen Aktivität verschiedener Formen der Calcium-unabhängigen

Phospholipase A2 in Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit neben der unter 2.2.7 beschriebenen

Messung eine weitere Methode angewendet. Dazu wurde ein cPLA2 Assay Kit (Cayman Chemical) so

modifiziert, dass ausschließlich die Messung der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2-Aktivität

möglich war. Durch die Hydrolyse des PLA2-Substrats Arachidonoyl-Thio-Phosphatidylcholin entseht

eine freie Thiol-Gruppe, die mit dem zugesetzten DTNB-Farbreagenz (5,5´-dithiobis(2-dinitrobenzoic

acid)) unter Freisetzung von 5-Thio-2-Nitrobenzoylsäure reagiert. Durch die Änderung der Absorption

bei 405 nm kann damit in Zelllysaten die PLA2-Aktivität bestimmt werden.

47


Material

cPLA2 Assay Kit (Cayman Chemical) Bromenol Lacton Lösung: 1 mM in DMSO DTNB/EGTA (5, 5´-dithiobis(2-dinitrobenzoic acid)= Ellman´s Reagenz): 25 mM DTNB, 475 mM EGTA in 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 Substratlösung: 1,5 mM Arachidonyl-thio-Phosphatidylcholin in 1x Probenpuffer 96-well-Probenplatte

Lysepuffer 50 mM HEPES, pH 7,4 1 mM EGTA

2x Probenpuffer 160 mM HEPES, pH 7,4 300 mM Natriumchlorid 4 mM EDTA 8 mM Triton X-100 60 % Glycerin 2 mg/mL BSA

Durchführung Jeweils 2 x 106 MCF7casp3 Zellen, wie unter 2.2.3 beschrieben für 30 h mit verschiedenen FLAG-iPLA2-

Konstrukten transfiziert, wurden in 100 µL hypotonem Lysepuffer für 10 min auf Eis lysiert und die

Zelldebris durch Zentrifugation sedimentiert. Die Proben wurden mit 1x Probenpuffer auf eine

Konzentration von 2 µg/µL eingestellt und je Kavität einer 96-well-Probenplatte 10 µL Probe pipettiert.

Die Proben wurden mit 5 µL BEL-Lösung (Finalkonzentration 24 µM) oder 5 µL DMSO gemischt und

für 40 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 200 µL Substratlösung zugegeben, die

Proben vorsichtig gemischt und 60 min im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe von 10 µL DTNB/EGTA-

Lösung wurde für weitere 5 min inkubiert und anschließend im Micro Tek FLI-Fluorometer (Bio-Tek

Kontron Instruments) bei 405 nm die Absorption gemessen. Zur Berechnung der Phospholipase A2-

Aktivität wurden folgende Formeln verwendet:

Absorption405nm (Probe) – Absorption405nm (Kontrolle) Absorption405nm / min = --------------------------------------------------------------------------- 60 min A405nm / min 0,225 mL PLA2-Aktivität (µmol/min/mL) = ------------------ x -------------- x evtl. Verdünnungsfaktor 10,66 mM-1 0,01 mL

Die spezifische Aktivität der Calcium-unabhängigen PLA2 wurde berechnet, indem die Basalaktivität

der mit Inhibitor vorbehandelten Proben von der Gesamtaktivität abgezogen wurde. Zur

Berücksichtigung der unterschiedlich starken Expression der verschiedenen FLAG-iPLA2-Formen

wurde zusätzlich deren relative Expression (siehe 2.3.10) als Multiplikationsfaktor miteinbezogen.

2.3.12 Nachweis von Lysophosphatidylcholin Zum Nachweis von Lysophosphatidylcholin (LPC) in den Überständen apoptotischer Zellen wurde in

der vorliegenden Arbeit ein enzymatisch gekoppelter Test mit vorausgehender Lipidextraktion nach

Bligh-Dyer verwendet (Bligh und Dyer, 1959). Dabei wird LPC in mehreren Schritten enzymatisch

48


abgebaut, wobei H2O2 freigesetzt wird (modifiziert nach Kishimoto et al., 2002). Dadurch kann

Peroxidase-katalysiert der Farbstoff Amplex Ultra Red umgesetzt und dessen Fluoreszenz detektiert

werden.

Material

Amplex Ultra Red (Molecular Probes Invitrogen) 40 mM in DMSO Finalkonzentration 20 µM


Stocklösung 10 % in PBS Finalkonzentration 0,5 %

Chloroform (Merck) Glycerol-3-Phosphat-Oxidase (Sigma) 200 U/mL in H2O

Finalkonzentration 1 U/mL GPC-Phosphodiesterase (Sigma) 20 U/mL in H2O

Finalkonzentration 0,1 U/mL Lysophospholipase A1 Rekombinante humane LPL-A1 (siehe 2.1.4)

4 mg/mL in TBS 10 % Glycerin Finalkonzentration 20 µg/mL

Lysophosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids) 1 mg (1,91 µmol) in Chloroform Standardreihe 0, 250, 500, 750 und 1000 pmol

Methanol (Merck) Natriumchlorid 1 M NaCl Peroxidase (Sigma) 200 U/mL in H2O

Finalkonzentration 1 U/mL 10x Puffer A 1 M Tris-Hydrochlorid pH 8,0

0,1 % Triton X-100 10 mM Calciumchlorid

10x Puffer B 1 M Tris-Hydrochlorid pH 8,0 0,1 % Triton X-100

Durchführung Wie unter 2.2.4 beschrieben wurden die Überstände von je 2 x 106 vitalen oder apoptotischen

MCF7casp3 Zellen gewonnen, jedoch in 1 mL Volumen. Zur Lipidextraktion wurden die Überstände in

Reagenzgläser (160x16 mm) überführt und 0,5 % fettsäurefreies BSA zugegeben. Dann wurden die

Proben mit je 3,75 mL Methanol/Chloroform (4:1) versetzt, mit einem Papierstopfen verschlossen und

für 10 - 15 min auf einem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 1,25 mL

Chloroform zugegeben, für 1 min gemixt, dann 1,25 mL 1 M Natriumchloridlösung zugegeben und

eine weitere Minute unter Schütteln inkubiert. Durch Zentrifugation für 20 min bei 2000g und 4°C

wurden die Proben in die einzelnen Phasen separiert. Die untere organische Phase wurde mit Hilfe

einer Glaspasteurpipette abgenommen, in ein frisches Reagenzglas überführt und unter einem

Stickstoffstrom das Lösungsmittel abgedampft. Der trockene Lipidniederschlag wurde 1x mit 200 µL

Methanol gewaschen und nochmals unter Stickstoff getrocknet.

Zur LPC-Messung wurden die getrockneten Lipide aus den Überständen von 4 x 106 Zellen in 250 µL

1x Puffer A mit Zusatz von 20 µM Amplex Ultra Red, 0,1 U/mL GPC-Phosphodiesterase, 1 U/mL

Glycerol-3-Phosphat-Oxidase und 1 U/mL Peroxidase aufgenommen und in eine 96-well-

Reaktionsplatte überführt. Dann wurde für 10 min im Micro Tek FLI-Fluorometer (Bio-Tek Kontron

49


Instruments) bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 595

nm bei 37°C die Basalreaktion gemessen, um möglicherweise bereits in den Proben enthaltene

Abbauprodukte von LPC abreagieren zu lassen. Die LPC-Messung wurde dann durch Zugabe von 75

µL 1x Puffer B mit 20 µg/mL Lysophospholipase A1 gestartet und die Fluoreszenz über 45 min

gemessen. Zur Quantifizierung wurde eine Standardreihe mit gereinigtem LPC mitbestimmt, die

ebenso wie die Proben einer vorherigen Extraktion unterzogen wurde. Mittels der geräteeigenen

Software (KC4) wurde nach Abzug der basalen Fluoreszenz die Zunahme der Fluoreszenz pro Minute

ermittelt und die in den Proben enthaltene Menge an LPC mit Hilfe der Standardreihe berechnet.

2.3.13 Nachweis von Lipid-Hydroperoxiden Neben der Messung von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) (siehe 2.2.8) kann zur

Untersuchung oxidativer Vorgänge, z.B. des während der Apoptose auftretenden oxidativen Stresses,

auch die Menge an Lipid-Hydroperoxiden bestimmt werden. Diese entsehen durch die Einwirkung von

ROS auf ungesättigte Fettsäuren, die Bestandteil vieler Membranlipide und Phospholipide sind. In der

vorliegenden Arbeit wurde zur Messung von oxidierten Lipiden ein spezieller Kit zum Nachweis von

Lipid-Hydroperoxiden (LPO) verwendet (Lipid Peroxidation Assay Kit II, Calbiochem). Dabei wird

zweiwertiges Eisen direkt durch Lipid-Hydroperoxide oxidiert, das dann mit dem Indikator-Farbstoff

Xylenol Orange zu einem stabilen, farbigen Komplex reagiert, der colorimetrisch nachgewiesen

werden kann.

Material

Lipid Peroxidation Assay Kit II (Calbiochem) Catalase (2 mL in PBS) Farbentwickler (Fe(NH4)2(SO4)2 in H2SO4) Farbreagenz (Xylenol Orange, in Methanol mit butyliertem Hydroxytoluol) PBS, pH 7,0 Reduktionsagens (Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) in deionisiertem H2O)





Durchführung Zur Messung von Lipid-Hydroperoxiden wurden die Zellen nach α-Tocopherol-Vorbehandlung wie

unter 2.2.4 beschrieben behandelt und 6 h nach Apoptose-Induktion geerntet. Die Pellets von 2 x 106

Zellen wurden in 250 µL 4 mM butyliertem Hydroxytoluol in 10 mM Tris-HCl pH 7,6 resuspendiert und

bei Bedarf bei -70°C zwischengelagert. Danach wurden die Proben in den Dounce-Homogenisator

(Spaltbreite 70 µm) überführt und mit 30 Stößen auf Eis homogenisiert. Die Zelldebris wurde durch

Zentrifugation abgetrennt und 90 µL des Zelllysats mit 10 µL Catalase-Lösung in einem 2 mL

Reaktionsgefäß (Eppendorf) gemischt und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert, um H2O2 abzubauen.

Die Proben wurden dann mit 10 µL H2O versetzt, zu den Leerwertproben 10 µL Reduktionsagens 50


(TCEP) gegeben, um die enthaltenen oxidierten Lipide zu reduzieren, und weitere 30 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde jede Probe mit 900 µL Färbelösung

(Farbentwickler/Farbreagenz 1:100) 30 Sekunden lang gemixt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Proben wurden abzentrifugiert (10.000 g, 10 min) und 900 µL der Proben in eine Küvette

transferiert. Die Absorptionsmessung erfolgte bei 560 nm gegen Wasser in einem Einkanal-UV-VIS-

Spektrometer (Beckmann DU-640). Die Absorption der Leerwertprobe wurde von der Absorption der

jeweiligen Probe abgezogen und die Konzentration an Lipid-Hydroperoxiden berechnet (siehe

Angaben LPO assay kit II).

2.4 Molekularbiologische Methoden

2.4.1 RNA-Extraktion aus eukaryontischen Zellen Die theoretische Grundlage dieser Methode ist eine Homogenisierung der Zellen mit Hilfe einer

Guanidinisothiocyanat-Denaturierungslösung, durch die Proteine sehr effektiv denaturiert und im

Probenmaterial enthaltene RNasen inaktiviert werden, gekoppelt mit einer

Anionenaustauschchromatographie. Dabei wird in den Lysaten enthaltene DNA durch DNase-Verdau

entfernt. Abschließend wird die RNA unter Niedrigsalzbedingungen von der Säule eluiert. Zur RNA-

Extraktion wurde in der vorliegenden Arbeit das NucleoSpin RNA II-Kit von Macherey und Nagel

verwendet.

Beim Arbeiten mit RNA ist besondere Sorgfalt erforderlich, da diese chemisch relativ instabil ist und

sehr rasch durch im Probenmaterial enthaltene bzw. in Reagenzien oder der Umgebung befindliche

RNasen abgebaut wird. Deshalb wurde das Probenmaterial unmittelbar nach der entsprechenden

Vorbehandlung trocken bei –70°C gelagert und möglichst innerhalb weniger Tage die RNA-Isolierung

durchgeführt. Für das Ansetzen der Lösungen wurde DEPC-behandeltes H2O bidest. verwendet. Es

wurde immer mit Einweghandschuhen unter Verwendung von RNase-freien Filter-Pipettenspitzen

(Safe Seal-Tops (Biozym)) gearbeitet.

Material („NucleoSpin RNA II“)

DNase I (Macherey&Nagel) 1 Aliquot aufgelöst im angegebenen Volumen RNase-freiem Wasser

DNase Reaktionspuffer (Macherey&Nagel) Ethanol (Merck) 70%ig

96 - 100%ig H2O, RNase-frei (Macherey&Nagel) Lysepuffer RA1 (Macherey&Nagel) 350 µL Lysepuffer RA1

1 % ß-Mercaptoehanol Membran-Entsalzungspuffer, MDB (Macherey&Nagel)

NucleoSpin Sammelgefäße (Macherey&Nagel) NucleoSpin Filter Säulen (Machery&Nagel) NucleoSpin RNA II Säulen (Macherey&Nagel) Waschpuffer RA2 (Macherey&Nagel)

51


Waschpuffer RA3 (Macherey&Nagel) Konzentrierter Waschpuffer RA3 wurde mit der angegebenen Menge 96 - 100 %igem Ethanol verdünnt

Durchführung Das bei –70°C gelagerte Pellet von 1 - 2 x 106 Zellen wurde in 350 µL Lysepuffer RA1 + 1 % ß-

Mercaptoethanol resuspendiert, wodurch neben der Zelllyse auch eine Inaktivierung der enthaltenen

RNasen erfolgte und die weiteren Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt werden konnten. Danach

wurde das Lysat über eine Filtersäule von nicht-lysierten Bestandteilen getrennt, 350 µL 70%iger

Ethanol zugegeben und das so vorbereitete Lysat zur Adsorption der RNA auf die Silikasäule

gegeben. Durch Zentrifugation wurde das restliche Lysat entfernt und die Silikamembran 1x mit 350

µL Entsalzungspuffer gewaschen. Um ebenfalls an die Membran gebundene DNA zu entfernen

wurden 90 µL DNase-Reaktionspuffer mit 10 µL DNase-Lösung gemischt, auf die Säule gegeben und

für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Säule zuerst mit 200 µL Waschpuffer

RA2 und dann 2x mit Waschpuffer RA3 gewaschen (600 µL bzw. 250 µL). Durch Zentrifugation wurde

die Säule getrocknet und die gebundene RNA mit 60 µL RNase-freiem Wasser eluiert. Die

Konzentration der so erhaltenen RNA-Lösung wurde spektrometrisch bestimmt und die Lösung bis auf

weiteres bei -70° gelagert.

2.4.2 Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA-Lösungen Die Nukleinsäurekonzentrationsbestimmung erfolgte spektrophotometrisch. Die Grundlage hierfür ist

das Absorptionsspektrum von DNA und RNA im UV-Bereich. Gemessen werden die Absorptionswerte

bei 260 nm und 280 nm. Der Absorptionswert bei 260 nm dient der Konzentrationsbestimmung nach

dem Lambert-Beerschen Gesetz. Ein Extinktionswert von 1 entspricht einer Doppelstrang-DNA-

Lösung von 50 µg/mL oder einer Einzelstrang-RNA-Lösung von 40 µg/mL. Der Absorptionswert bei

280 nm ermöglicht eine Reinheitsbewertung der DNA-Lösung, da hier Verunreinigungen mit Phenol

oder mit Proteinen bestimmt werden können. Für eine reine DNA-Lösung hat das Absorptions-

verhältnis A260nm : A280nm den Wert 2. Sind aber zusätzlich Phenol oder Proteine in dieser Lösung

vorhanden, steigt die Absorption bei 280 nm, und das Verhältnis A260nm : A280nm wird kleiner als 2. Eine

akzeptable DNA- bzw. RNA-Präparation besitzt ein Verhältnis A260nm : A280nm von 1,6 - 2.

Durchführung Die Konzentrationsbestimmung wurde mit Hilfe eines programmierbaren Einkanal-UV-VIS-

Spektrometer (Beckmann DU-640) in einer Vierfach-Mikroküvette aus Quarzglas (Beckmann

Instruments) durchgeführt. Nach Leerwertmessung und Küvettenabgleich wurden die

Absorptionswerte einer 1:100 Verdünnung der Testlösung in H2O bidest. in einem finalen Volumen

von 200 µl bestimmt. Das Gerät berechnete daraus die entsprechende Nukleinsäurekonzentration und

das Absorptionsverhältnis automatisch.

2.4.3 Reverse Transkription Reverse Transkriptasen sind multifunktionelle Enzyme mit der Kernaktivität einer RNA-abhängigen

DNA-Polymerase, die aus Retroviren (z.B. aus dem Avianen Myeolblastosis Virus, AMV) isoliert 52


wurden. Ihre RNA-abhängige 5'-3'-DNA-Polymerase-Aktivität macht man sich zunutze, um ausgehend

von Oligonukleotid-Primern (Random-Hexameren oder Oligo-dT) zelluläre mRNA für die

anschließende Klonierung oder PCR in komplementäre DNA (cDNA) zu überführen.

Material

SuperScriptTM II RNase H- (Invitrogen Life Technologies)

200 U/µl

5x Reaktionspuffer (Invitrogen Life Technologies) 250 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,3 375 mM Kaliumchlorid 15 mM Magnesiumchlorid

0,1 M Dithiothreitol (Invitrogen Life Technologies) Pd(N)6 Random Hexamere (Amersham) 0,2 µg/µL RNasInTM (Promega) 40 U/µl, Rekombinanter RNase-Inhibitor 10 mM dNTP Je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (alle

Promega) H2O bidest. DEPC-behandelt (Roth)

Durchführung

Tabelle 2.5: Zusammensetzung einer Standard-RT-Reaktion. Denaturierungsansatz (12 µl) Reverse Transkription (20 µl) RNA 1 µg Random Hexamer dNTP H2O

2 µL (0,2 µg/µL) 1 µL (10 mM) auf 12 µL Volumen auffüllen

RNasInTM 1 µL (40 U/µL) 5x Reaktionspuffer 4 µL (1x) DTT 2 µL (100 mM) SuperScriptTM II RNase H- 1 µL (200 U/µL)

Reverse Transkriptionsreaktionen wurden ausgehend von 1 µg Gesamt-RNA in einem

Reaktionsvolumen von 20 µl durchgeführt. 1 µg RNA wurden zunächst mit 400 ng Random Hexamer

und 1 µL 10 mM dNTP´s in einem Volumen von 12 µl auf Eis versetzt und für 5 min bei 65°C

denaturiert, um die Sekundärstruktur der RNA aufzulösen. Die Lösung wurde auf Eis abgekühlt.

Anschließend wurden 4 µl 5x Reaktionspuffer, 2 µL 100 mM DTT und 40 U RNasIn zugegeben und

bei 42°C für 2 min inkubiert, um eine Bindung der Random Hexamer-Primer an die RNA zu

ermöglichen. Nach Abkühlen und der Zugabe von 200 U SuperScriptTM II RNase H- wurden die

Proben zunächst für 10 min bei 25°C inkubiert, dann für 50 min bei 42°C die DNA-Polymerisation

ermöglicht und abschließend die Reverse Transkriptase durch 15-minütige Inkubation bei 72°C

inaktiviert. Alle Inkubationsschritte wurden im Mastercycler Gradient (Eppendorf) durchgeführt. Die so

erhaltene cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert.

2.4.4 Real-Time PCR Die Polymerase-Ketten-Reaktion, abgekürzt PCR (polymerase chain reaction), ist eine Methode zur

exponentiellen, selektiven Amplifikation von DNA-Sequenzen. Das Prinzip der PCR ist die dreiphasige

53


enzymatische Vermehrung eines DNA-Abschnitts zwischen zwei Oligonukleotid-Primern, die

gegenläufig an komplementäre DNA-Stränge gebunden sind.

Die PCR besteht aus drei Hauptschritten, die in ca. 35 Zyklen wiederholt werden:

- Denaturierungsphase: die doppelsträngige Ausgangs-DNA wird durch Erhitzen auf 95°C in die

beiden Einzelstränge zerlegt

- Annealing-Phase: Anlagern der beiden Oligonukleotid-Primer an die komplementären

Sequenzen der jetzt einzelsträngigen Ausgangs-DNA bei 50 - 60°C

- Elongations-Phase: DNA-Polymerase-katalysierte DNA-Synthese bei 68 - 72°C

Die Zunahme der Synthese-Produkte folgt einer exponentiellen Kinetik, die aufgrund von

Substratmangel, Enzymmangel und hemmenden Nebenprodukten ein Sättigungsverhalten zeigt. Der

Einsatz einer thermostabilen DNA-Polymerase, die bei den hohen Reaktionstemperaturen nicht

denaturiert und demnach nicht vor jedem Reaktionszyklus neu zugegeben werden muss, ermöglicht

eine leichte Automatisierung der PCR-Methode.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zu analytischen Zwecken eine quantitative real-time PCR

durchgeführt. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass die Menge an PCR-Produkt für jeden Zyklus

während der gesamten PCR-Reaktion aufgezeichnet und eine relative oder absolute Quantifizierung

vorgenommen werden kann. Die Grundlage dafür ist die während der Reaktion gemessene

Fluoreszenz, deren Zunahme proportional zur Menge an amplifizierter DNA ist. Hierfür existieren

verschiedene Detektionsmethoden; in der vorliegenden Arbeit wurde sowohl mit SYBR® Green-

Farbstoff als auch mit einem TaqMan®-probe-basierten System gearbeitet. Bei der SYBR® Green-

Methode interkaliert der zugegebene SYBR® Green-Farbstoff unspezifisch in doppelsträngige DNA,

wobei der Farbstoff nur in gebundenem Zustand ein Signal emittiert. Bei der TaqMan®-probe-Methode

wird zusätzlich zu den PCR-Primern ein mit zwei Farbstoffen markiertes Oligonukleotid zur Reaktion

gegeben, das spezifisch an den amplifizierten DNA-Abschnitt bindet. Während der DNA-Synthese

wird dieses Oligonukleotid durch die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase gespalten

und damit die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs ermöglicht.

Material

qPCRTM Mastermix Plus for SYBR® Green I (Eurogentec)

SYBR® Green I dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP) HotGoldStar DNA-Polymerase Uracil-N-Glycosylase Magnesiumchlorid (Finalkonzentration 5 mM) Passiver Referenzfarbstoff ROX Stabilisatoren (keine näheren Angaben)

qPCRTM Mastermix Plus (Eurogentec) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP) HotGoldStar DNA-Polymerase Uracil-N-Glycosylase Magnesiumchlorid (Finalkonzentration 5 mM) Passiver Referenzfarbstoff ROX Stabilisatoren (keine näheren Angaben)

Primer (MWG Biotech) Stocklösungen 2 µM Finalkonzentration 200 - 300 nM

54


Probe (MWG Biotech) Stocklösung 2 µM Finalkonzentration 100 nM

H2O, DEPC-behandelt (Roth) Filter-Pipettenspitzen (Biozym) Dünnwandige 0,2mL-Reaktionsgefäße (Biozym) 96-well-PCR-Reaktionsplatten (Greiner Bio One) Abdeckfolie, Ampliseal (Greiner Bio One) Real-time PCR-Gerät (Applied Biosytems) ABI PRISM® SDS 7000

Tabelle 2.5 zeigt die in der Regel eingesetzten Reaktionsparameter eines real-time-qPCR-Ansatzes

(20 µl Reaktionsvolumen).

Tabelle 2.6: Zusammensetzung einer Standard-real-time qPCR-Reaktion. SYBR® Green-PCR TaqMan®-probe-PCR 2x qPCRTM Mastermix Plus for SYBR® Green I

10 µL

-

2x qPCRTM Mastermix Plus

- 10 µL

Primer Je 3 µL sense und antisense Primer, Finalkonzentration 300 nM

Je 2 µL sense und antisense Primer, Finalkonzentration 200 nM

Probe - 1 µL, Finalkonzentration 100 nM H2O 2 µL 3 µL cDNA 2 µL (10 - 40 ng/µL) 2 µL (10 - 40 ng/µL)

Durchführung Für die quantitative real-time PCR wurden, wie in Tabelle 2.5 angegeben, Mastermix, Primer, evtl.

Probe und Wasser auf Eis gemischt. In die 96-well-Reaktionsplatte wurden jeweils 2 µL cDNA (siehe

2.4.3) (20 - 80 ng pro Reaktion) vorgelegt und mit 18 µL des vorbereiteten Mixes auf 20 µL

Reaktionsvolumen aufgefüllt. Eine Probe ohne DNA diente als Negativkontrolle. Die Platte wurde mit

einer speziellen Abdeckfolie (Ampliseal, Greiner Bio One) verschlossen, in das real-time PCR-Gerät

(ABI PRISM® 7000) gestellt und die Reaktion gestartet. Vor der eigentlichen PCR-Reaktion wurden

die Proben für 2 min bei 50°C inkubiert, um mögliche Verunreinigungen der Proben mit anderen PCR-

Produkten durch die Aktivität der Uracil-N-Glykosylase zu beseitigen. Dann wurde zur Aktivierung der

HotGoldStar DNA-Polymerase (modifizierte Taq-Polymerase) und Inaktivierung der Uracil-N-

Glykosylase für 10 min auf 95°C erhitzt. Danach folgten 40 Zyklen mit 15 Sekunden bei 95°C und 1

min bei 60°C, wobei die Annealing- und Elongationsphase in einem Inkubationsschritt

zusammengefasst wurden. Zur Auswertung wurde die geräteeigene Software (ABI Prism 7000 SDS

Software) genutzt. Die Expression des Zielgens wurde mittels der ΔΔ Ct-Methode auf die Expression

eines stabilen Referenzgens normalisiert. Die relative Quantifizierung erfolgte in der Regel durch den

Vergleich unterschiedlich behandelter Proben untereinander oder über eine Standardkurve. Bei einem

Vergleich der Expression unterschiedlicher Zielgene wurde die relative Quantifizierung unter

Berücksichtigung der Amplifikationseffizienz der jeweiligen PCR-Reaktion vorgenommen.

55


2.4.5 Plasmid-DNA Isolierung Die Plasmid-DNA Isolierung wurde nach einem modifizierten Protokoll der alkalischen Lyse gekoppelt

an eine Anionenaustauschchromatographie durchgeführt. Die theoretischen Grundlagen dieser

Extraktionsmethode sind eine alkalische Zellyse (Birnboim und Doly, 1979) mit anschließender SDS-

Hochsalzfällung der genomischen DNA und Bindung der Plasmid-DNA an eine Glasfasermatrix in

Gegenwart von Guanidiniumchlorid. Die Plasmid-Glasfaser-Aggregate werden im Folgenden

gewaschen, und abschließend eluiert man die Plasmid-DNA in wässriger Lösung unter

Niedrigsalzbedingungen. Diese Extraktionsmethode zeichnet sich durch einfache, schnelle

Handhabung und große Reinheit der isolierten Plasmid-DNA aus.

In der vorliegenden Arbeit wurden die unter 2.1.3 beschriebenen Plasmidkonstrukte im Maxi-Maßstab

aus Bakterienkulturen isoliert, um sie zur Transfektion und transienten Überexpression in

eukaryontischen Zellen zu nutzen. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe des "Nucleobond

AX 500" Kits (Macherey und Nagel).

Material ("Nucleo Bond AX 500" Kit)

LB-Medium 10 g/l Bacto Pepton 5 g/l Hefeextrakt 5 g/l Natriumchlorid pH 7,0 60 µg/mL Kanamycin

2000x Kanamycin 60 mg/mL Kanamycin in H2O bidest. Resuspendierungspuffer S1 (Macherey und Nagel)

50 mM Tris-Hydrogenchlorid 10 mM EDTA 100 µg/mL RNase A pH 8,0

Lysepuffer S2 (Macherey und Nagel) 200 mM Natriumhydroxid 1% (w/v) SDS

Neutralisationspuffer S3 (Macherey und Nagel) 2,8 M Kaliumacetat pH 5,1

Äquilibrierungspuffer N2 (Macherey und Nagel) 100 mM Tris-Hydrogenphosphat 15% (v/v) Ethanol 900 mM Kaliumchlorid 0,15% (v/v)Triton X-100 pH 6,3

Waschpuffer N3 (Macherey und Nagel) 100 mM Tris-Hydrogenphosphat 15% (v/v) Ethanol 1150 mM Kaliumchlorid pH 6,3

Elutionspuffer N5 (Macherey und Nagel) 100 mM Tris-Hydrogenphosphat 15% (v/v) Ethanol 1000 mM Kaliumchlorid pH 8,5

Faltenfilter (Macherey und Nagel) Anionenaustauschersäule AX 500 (Macherey und Nagel)

100% Isopropanol 70% (v/v) Ethanol

56


Durchführung Zunächst wurde eine Bakterienvorkultur (5 mL) in LB-Antibiotikum-Medium angelegt und für 8 h im

Schüttelinkubator bei 37°C kultiviert. Die Vorkultur wurde anschließend in 150 mL LB-Antibiotikum-

Medium überführt und über Nacht (12 - 16 h) im Bakterienschüttler bei 37°C inkubiert. Die

Bakterienzellen wurden sedimentiert und mit 12 mL Resuspendierungspuffer S1 in ein Corex-

Zentrifugen-Röhrchen überführt. Es wurden 12 mL Lysepuffer S2 zugegeben, durch Invertieren

vorsichtig gemischt und der Denaturierungsansatz für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach

Zugabe von 12 mL eisgekühltem Neutralisationspuffer S3 wurde wiederum vorsichtig gemischt und

der Fällungsansatz für 5 min auf Eis inkubiert. Die präzipitierte, genomische DNA wurde durch

Filtration durch einen Faltenfilter abgetrennt und der Plasmid-haltige Überstand bis zur

Anionenaustauschchromatographie auf Eis gelagert. Die Anionenaustauschersäule AX500 wurde mit

5 mL Äquilibrierungspuffer N2 äquilibriert und das klare, Plasmid-haltige Bakterienlysat auf die Säule

geladen. Anschließend wurde die Säule zweimal mit je 12 mL Waschpuffer N3 gewaschen und die

Plasmid-DNA mit 11 mL Elutionspuffer N5 eluiert. Die Plasmid-DNA wurde mit 0,7 vol (hier 8 mL)

100% Isopropanol gefällt und sofort für 30 min bei 15.000 g sedimentiert. Das DNA-Sediment wurde

mit 5 mL 70% (v/v) Ethanol gewaschen, erneut für 10 min bei 15.000 g sedimentiert und der

Überstand verworfen. Zur Entfernung des restlichen Ethanols wurde das DNA-Sediment getrocknet

und abschließend in 200 - 500 µl H2O bidest. aufgenommen. Bis zur weiteren Verwendung wurde die

DNA bei -20°C gelagert.

2.4.6 Anlage einer Bakterien Glycerin-Dauerkultur Zur Langzeitlagerung von Bakterienkulturen wurden 2 mL LB-Antibiotikum-Medium mit einer

Einzelkolonie der betreffenden Bakterien inokuliert und über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler

inkubiert. Nach Zugabe von Glycerin (Endkonzentration 55% (v/v)) kann diese Kultur bei -70°C

dauerhaft konserviert werden. Bei Bedarf wurden zur Anzucht 2 mL LB-Antibiotikum-Medium mit 10 µl

der Glycerin-Dauerkultur inokuliert und bei 37°C im Bakterienschüttler kultiviert.

57

ERGEBNISSE

3 Ergebnisse

3.1 Prozessierung und Aktivierung der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) während der Apoptose

3.1.1 iPLA2 wird während der Apoptose durch Caspase-3 prozessiert Die Freisetzung löslicher Attraktionssignale während der Apoptose spielt in höheren Organismen eine

wichtige Rolle, um die effiziente Eliminierung apoptotischer Zellen durch professionelle Phagozyten zu

ermöglichen. Als ein wichtiger chemotaktisch aktiver Lockstoff konnte das Phospholipid

Lysophosphatidylcholin identifiziert werden (Lauber et al., 2003), das durch die Calcium-unabhängige

Phospholipase-A2 (iPLA2)-vermittelte Hydrolyse von Phosphatidylcholin entsteht. Dabei wurde

beobachtet, dass iPLA2 während der Apoptose Caspase-3-abhängig prozessiert und dadurch

vermutlich aktiviert wird. Da jedoch die Expression der prozessierten Form von iPLA2 alleine nicht

ausreicht, um in vitalen Zellen das Attraktionssignal freizusetzen, sollte untersucht werden, ob die

Prozessierung von iPLA2 mit einer Aktivierung einhergeht.

Hinsichtlich dieser Fragestellung sollte zunächst das genaue Prozessierungsmuster von iPLA2 und die

Caspase-3-Abhängigkeit sowohl im Zellkultursystem als auch in vitro (mit Hilfe von gereinigter iPLA2

und gereinigter Caspase-3) näher betrachtet werden. Dazu wurden die in Abbildung 3.1A schematisch

dargestellten, an potentiellen Caspase-Schnittstellen trunkierten, FLAG-getaggten iPLA2-Konstrukte

verwendet. Durch Entfernen der Ankyrin-Motive an der Schnittstelle DLFD513 entsteht das 32 kDa

große Fragment iPLA2 aa514-806, durch eine weitere Trunkierung am C-Terminus (MVVD733) die 26-

kDa-Form iPLA2 aa514-733. Dieses Konstrukt wurde zusätzlich um das Aspartat733 gekürzt, wodurch

iPLA2 aa514-732 (26 kDa) entsteht. Die hier ebenfalls dargestellte iPLA2-Form aa1-512 (Ankyrin-

Motive ohne aktives Zentrum) entsteht durch Trunkierung vor dem aktiven Zentrum an DLFD513 und

wurde für spätere Versuche (siehe Abschnitt 3.2.2) verwendet. Die unterschiedlichen iPLA2-

Konstrukte wurden in Caspase-3-defizienten MCF7vektor Zellen und in mit Caspase-3 retransfizierten

MCF7casp3 Zellen transient überexprimiert, durch UV-Bestrahlung wurde Apoptose induziert und die

iPLA2-Prozessierung im Westernblot analysiert. Obwohl in beiden Zelllinien durch UV-Bestrahlung

Apoptose ausgelöst werden kann (Lauber et al., 2003), konnte nur in den Caspase-3 positiven MCF7

Zellen eine Prozessierung von iPLA2 beobachtet werden. Wie in Abbildung 3.1B gezeigt, wurde in den

Caspase-3-defizienten Zellen zu keinem Zeitpunkt nach Apoptose-Induktion eine Prozessierung der

iPLA2 beobachtet. In MCF7casp3 Zellen dagegen wurde sowohl die 86-kDa-Volllängenform (aa1-806)

als auch das N-terminal trunkierte 32-kDa-Konstrukt (aa514-806) in ein 26 kDa großes Fragment

gespalten, das 8 - 10 Stunden nach UV-Bestrahlung nachweisbar war. Auch die 26-kDa-Form iPLA2

aa514-733 mit C-terminalem FLAG-Tag wurde in MCF7casp3 Zellen weiter prozessiert, wobei dasselbe

Spaltfragment wie bei iPLA2 aa1-806 und aa514-806 entstand; iPLA2 aa514-732 dagegen wurde nicht

gespalten. Die Prozessierung von iPLA2 aa514-733 lässt sich somit vermutlich durch die Abspaltung

des C-terminal zur Prozessierungsstelle (MVVD733) gelegenen Flag-Tags erklären. Diese Vermutung

wird durch die Beobachtung gestützt, dass diese Prozessierung nach Deletion von Asp733 im Fall des

aa514-732-Konstrukts nicht mehr auftritt. Aus Abbildung 3.1B wird auch deutlich, dass die Spaltung

58

ERGEBNISSE

von iPLA2 Caspase-3 abhängig verläuft, es kann jedoch nicht belegt werden, ob Caspase-3 oder

vielleicht eine nachgeschaltete Protease iPLA2 prozessiert.

Abbildung 3.1: iPLA2 wird während der Apoptose durch Caspase-3 in ein 26-kDa-Fragment gespalten (aa514-733). (A) Schematische Darstellung der Struktur und der verwendeten Expressionskonstrukte der humanen iPLA2. Aktives Zentrum, Caspase-Schnittstellen und die Position des Immunisierungspeptids des Westernblot-Antikörpers sind besonders gekennzeichnet. Abbildung modifiziert nach (Lauber et al., 2003). (B) Überexpression des Volllängen-Proteins und verschiedener trunkierter iPLA2-Formen. MCF7casp3 und MCF7vektor Zellen wurden wie unter 2.2.3 beschrieben mit Hilfe des Lipofektionsagenz FuGENETM6 mit der N-terminal FLAG-getaggten Volllängenform von iPLA2 (aa1-806) bzw. mit den trunkierten C-terminal FLAG-getaggten iPLA2-Konstrukten aa514-806, aa514-733 und aa514-732 transfiziert. 16 h nach Transfektion wurden die Zellen mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und für die angegebenen Zeiten inkubiert. Danach wurden die Zellen geerntet, lysiert und das Lysat von 3 x 105 Zellen pro Probe in einem 8 - 15 %igen SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Expression und Prozessierung von iPLA2 wurde im Westernblot mit dem anti-iPLA2-Antikörper nachgewiesen. (C) in vitro-Spaltung von gereinigter iPLA2 durch gereinigte Caspase-3. Die über das FLAG-Tag aufgereinigte iPLA2 von ca. 4 x 107 Zellen (= 20 µL Eluat) (siehe 2.3.3) wurde für die angegebenen Zeiten mit 2 µg gereinigter humaner Caspase-3 in An- bzw. Abwesenheit der Breitband-Caspase-Inhibitors zVAD-fmk (500 µM) inkubiert. Die Proben wurden in einer SDS-PAGE

59

ERGEBNISSE

(8 - 15 %iges Gel) elektrophoretisch aufgetrennt und die Prozessierung der iPLA2 im Westernblot mittels des anti-iPLA2-Antikörpers nachgewiesen. (D) Intrazelluläre Lokalisation von iPLA2. MCF7casp3 Zellen wurden mit Hilfe von FuGENETM6 mit der Volllängen-Form von iPLA2 (aa1-806 N-FLAG) bzw. mit den trunkierten Formen aa514-806 und aa514-733 (beide C-FLAG) transfiziert, wie unter 2.2.3 beschrieben. 24 h nach Transfektion wurde eine Zellfraktionierung durchgeführt (siehe 2.3.5) und die Cytosol- und Membranfraktion von je 0,5 x 106 Zellen nach SDS-PAGE (8 - 15 %iges Gel) im Westernblot mit dem anti-iPLA2-Antikörper analysiert.

Deshalb wurde, wie in Abbildung 3.1C dargestellt, die gereinigte Volllängen-FLAG-iPLA2 mit

gereinigter Caspase-3 in vitro inkubiert. Dabei ließ sich die in Zelllysaten nachgewiesene

Prozessierung zu einem 26 kDa großen Spaltfragment bestätigen. Daraus kann geschlossen werden,

dass das Fragment iPLA2 aa514-733 das finale Produkt der Caspase-3-Prozessierung darstellt.

Ebenso konnte damit gezeigt werden, dass iPLA2 direkt durch Caspase-3 gespalten wird und nicht

durch eine andere Caspase-3-abhängige Protease. Während des Abbaus entstanden weitere

intermediäre Spaltprodukte von 70 kDa (beschrieben von Atsumi et al., 2000), 52 kDa und 32 kDa,

deren Auftreten durch Caspase-3 bedingt war und durch Zugabe des Breitband-Caspase-Inhibitors

zVAD-fmk blockiert werden konnte.

Atsumi et al. vermuteten, dass die Prozessierung der iPLA2 zu einer veränderten Affinität des Enzyms

zu intrazellulären Membranen, und damit zum Substrat Phosphatidylcholin, führen könnte (Atsumi et

al., 2000). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit die Lokalisation der iPLA2 nach deren

Überexpression untersucht. Dabei konnte, wie in Abbildung 3.1D dargestellt, für die drei verwendeten

Konstrukte (iPLA2 aa1-806, aa514-806 und aa514-733) in vitalen Zellen eine relativ gleichmäßige

Verteilung zwischen Cytosol (Cyt) und Membranfraktion (M) nachgewiesen werden.

3.1.2 Prozessierte iPLA2 hat eine höhere Aktivität als das Volllängen-Protein

Im Verlauf der Apoptose werden zahlreiche Proteine durch Caspasen gespalten und dadurch

entweder aktiviert oder inaktiviert. Für iPLA2 konnte bereits gezeigt werden, dass nach

Überexpression der trunkierten 26-kDa-Form (aa514-733) mehr chemotaktisches Potential in den

Überständen apoptotischer Zellen vorhanden ist als nach Expression des Volllängenproteins (Lauber

et al., 2003). Außerdem konnten Atsumi et al. zeigen, dass nach Überexpression eines 70-kDa-

Fragments der iPLA2 (aa184-806) mehr Arachidonsäure freigesetzt wird im Vergleich zur

Volllängenform (Atsumi et al., 2000). Ob jedoch neben der Prozessierung weitere Mechanismen zur

Aktivierung der iPLA2 und zur anschließenden Freisetzung des Attraktionssignals LPC beitragen, war

bislang ungeklärt. Deshalb sollte zuerst untersucht werden, ob die beobachtete Prozessierung der

iPLA2 alleine für deren Aktivierung verantwortlich und ausreichend ist.

Dazu wurde die iPLA2-Aktivität sowohl im Zellsystem als auch in Zelllysaten (in vitro) in nicht-

apoptotischen Zellen bestimmt. MCF7casp3 Zellen wurden mit den iPLA2-Konstrukten aa1-806 (86

kDa), aa514-806 (32 kDa) und aa514-733 (26 kDa) oder dem Leervektor transfiziert. Zur

durchflusszytometrischen Messung wurden die Zellen mit dem fluorogenen PLA2-Substrat Bis-

BODIPY®FL C11-PC (1,2-bis-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-undecanoyl)-

sn-glycero-3-phosphocholine) (BBPC) beladen und anschließend die Zunahme der grünen

Fluoreszenz über 90 min analysiert. Bei einer Spaltung von BBPC durch Phospholipase A2 kam es zu

einem deutlichen Anstieg der grünen Fluoreszenz der Zellen. In Abbildung 3.2A ist die Aktivität der mit

60

ERGEBNISSE

den verschiedenen iPLA2-Formen transfizierten Zellen als Zunahme des Fluoreszenzmittelwertes pro

min dargestellt, wobei die trunkierte 26-kDa-Form (aa514-733) eine deutlich höhere Aktivität aufwies

als die Volllängenform (aa1-806) oder die 32-kDa-iPLA2 (aa514-806). Gegenüber der Vektorkontrolle

führte die Überexpression aller drei iPLA2-Formen zu einer höheren Aktivität. Dargestellt wurde dabei

die Gesamt-PLA2-Aktivität, da bei dieser Messung ohne spezifische Inhibitoren gearbeitet wurde und

somit auch die Aktivität anderer Phospholipasen A2 mitgemessen wurde. Ein Nachteil dieser

durchflusszytometrischen Messung besteht zudem darin, dass die unterschiedlich starke Expression

der verschiedenen iPLA2-Konstrukte (siehe Abbildung 3.1D) nicht berücksichtigt werden kann.

Deshalb wurde zusätzlich ein in vitro-iPLA2-Aktivitätstest angewendet, mit dem durch Verwendung des

iPLA2-Inhibitors Bromenollacton (BEL) die spezifische iPLA2-Aktivität in Zelllysaten bestimmt werden

konnte. Zudem wurde in den jeweiligen Zelllysaten die Expression der iPLA2-Konstrukte mittels eines

anti-FLAG-ELISA relativ quantifiziert (siehe 2.3.10) und darüber die gemessene iPLA2-Aktivität

normiert. Zur Bestimmung der iPLA2-Aktivität wurden die Zelllysate in Calcium-freiem Puffer mit

Substrat in An- oder Abwesenheit von BEL inkubiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass auch die

spezifische Aktivität der 26-kDa-Form von iPLA2 deutlich höher war als die des Volllängenproteins

oder der p32-Form (Abbildung 3.2B).

Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die Prozessierung der Volllängen-iPLA2 durch

Caspase-3 zum 26-kDa-Fragment und damit die Abspaltung der N-terminalen Ankyrin-Motive und des

C-Terminus zu einer starken Aktivitätssteigerung der iPLA2 auch in vitalen Zellen führt.

Abbildung 3.2: iPLA2 aa514-733 zeigt eine deutlich höhere Aktivität als die Volllängen-Form von iPLA2. (A) Durchflusszytometrische Messung der iPLA2-Aktivität. MCF7casp3 Zellen wurden wie unter 2.2.3 beschrieben unter Verwendung des Lipofektionsagens FuGENETM6 mit iPLA2 aa1-806 (N-FLAG) und den trunkierten Formen aa514-806 und aa514-733 (beide C-FLAG) oder dem Leervektor transfiziert. 26 h nach Transfektion wurden pro Ansatz 2 x 106 Zellen in 200 µL HBSS mit 20 ng/µL BBPC beladen und durchflusszytometrisch über 90 min analysiert (siehe 2.2.7). Für die so erhaltenen Kurven wurde die Steigung ermittelt und die Aktivität als Δ mittlere Fluoreszenz/Minute angegeben. (B) In vitro-iPLA2-Aktivitätstest. Wie unter 3.2A wurden MCF7casp3 Zellen mit den unterschiedlichen iPLA2-Formen transfiziert. Nach 30 h wurden die Zellen lysiert, und mit 20 µg Gesamtprotein pro Kavität einer 96-well-Reaktionsplatte wurde der in vitro-iPLA2-Aktivitätstest in An- bzw. Abwesenheit des Inhibitors BEL (24 µM) wie unter 2.3.11 beschrieben durchgeführt. Die daraus

61

ERGEBNISSE

berechnete Aktivität wurde zusätzlich mit der aus denselben Proben ermittelten relativen Expression der iPLA2-FLAG-Formen (anti-FLAG-ELISA, siehe 2.3.10) multipliziert und somit auf diese normiert.

3.2 Produktion und Freisetzung des Attraktionssignals Lyso-phosphatidylcholin während der Apoptose

3.2.1 Nachweis von Lysophosphatidylcholin in den Überständen apoptotischer Zellen

Zur Messung des von apoptotischen Zellen freigesetzten Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin

(LPC), das durch die iPLA2-vermittelte Spaltung von Phosphatidylcholin entsteht (Lauber et al., 2003),

sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein direkter quantitativer Nachweis von LPC erfolgen. Dazu

wurden aus den serumfreien Überständen von vitalen und apoptotischen MCF7casp3 Zellen die Lipide

durch eine Methanol/Chloroform-Extraktion nach Bligh-Dyer (Bligh und Dyer, 1959) extrahiert, unter

Stickstoffatmosphäre getrocknet und mittels eines enzymatischen Tests LPC nachgewiesen

(Kishimoto et al., 2002).

Abbildung 3.3: MCF7casp3 Zellen setzen während der Apoptose Lysophosphatidylcholin frei. Wie unter 2.2.4 beschrieben, wurde in MCF7casp3 Zellen mit 10 mJ/cm2 UV-Bestrahlung Apoptose induziert bzw. die Zellen unbehandelt gelassen (Kontrolle) und je 2 x 106 Zellen in 1 mL serumfreiem Medium für 13 h inkubiert. Danach wurden die Lipide mit Methanol/Chloroform aus den Überständen extrahiert und unter Stickstoff getrocknet. Der LPC-Nachweis erfolgte wie unter 2.3.12 beschrieben durch den enzymatischen Abbau von LPC mit den Lipiden von 4 x 106 Zellen pro Probe. Die Fluoreszenz des dabei umgesetzten Farbstoffs Amplex Ultra Red wurde über 45 min 1x pro Minute gemessen (Anregung: 530 nm, Emission: 595 nm) und daraus die Zunahme der Fluoreszenz/min ermittelt. Die Quantifizierung erfolgte über die lineare Regression einer Standardreihe mit gereinigtem LPC.

Wie in Abbildung 3.3 dargestellt, konnte in den Überständen apoptotischer Zellen etwa die doppelte

Menge LPC nachgewiesen werden im Vergleich zu Überständen vitaler Zellen. Dabei setzten 1 x 106

MCF7casp3 Zellen nach UV-Bestrahlung knapp 50 pmol LPC frei. Dies entspricht bei einem Ansatz von

2 x 106 Zellen pro mL Überstand einer Konzentration von ca. 100 nM. Dieses Ergebnis konnte in

mehreren unabhängigen Versuchsansätzen bestätigt werden.

3.2.2 Aktive iPLA2 ist essentiell für die Generierung des Attraktions-signals, alleine jedoch nicht hinreichend für dessen Freisetzung

Wie in den Abschnitten 3.1.1 und 3.1.2 gezeigt, wird die 86-kDa-Volllängenform von iPLA2 während

der Apoptose durch Caspase-3 zu einem 26 kDa großen Fragment (aa514-733) prozessiert und damit

aktiviert. Im Folgenden sollte geklärt werden, ob die Aktivierung von iPLA2 das ausschlaggebende

Ereignis für die Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin ist. Eine

Beteiligung der Calcium-abhängigen Phospholipase A2 (cPLA2) an diesem Prozess konnte durch

62

ERGEBNISSE

Arbeiten unserer Arbeitsgruppe (Lauber et al., 2003) und anderer Gruppen (Atsumi et al., 2000)

ausgeschlossen werden.

Dazu wurde in MCF7casp3 Zellen in Gegenwart steigender Konzentrationen des iPLA2-Inhibitors

Bromenollacton (BEL) mit verschiedenen Stimuli Apoptose induziert und, wie in Abbildung 3.4A

dargestellt, die Freisetzung apoptotischer Attraktionssignale indirekt über die Migration von THP-1

Monozyten im Transmigrationstest bestimmt. Neben UV-Bestrahlung wurden als Apoptosestimuli das

Chemotherapeutikum Mitomycin C und der Kinaseinhibitor Staurosporin verwendet. Das

chemotaktische Potential war in den Überständen der mit verschiedenen Stimuli behandelten Zellen

ohne Inhibitor zum Teil unterschiedlich und nach Mitomycin-C-Behandlung schwächer als nach UV-

Bestrahlung und Staurosporin-Stimulation. In den Überständen der nicht behandelten Kontrollzellen

konnte wie erwartet kein chemotaktisches Potential nachgewiesen werden. Die Hemmung der iPLA2

durch BEL führte bei allen Apoptose-Stimuli konzentrationsabhängig zu einer verminderten

Freisetzung des Attraktionssignals und damit zu einer geringeren Migration der THP-1 Monozyten. Ab

einer Konzentration von 10 - 15 µM BEL konnte in den Überständen kein chemotaktisches Potential

mehr nachgewiesen werden. Da die Überstände vor den Transmigrationstests zur Entfernung der

eingesetzten niedermolekularen Agenzien (BEL, Staurosporin und Mitomycin C) über Sephadex G15-

Säulen filtriert wurden, konnte ausgeschlossen werden, dass BEL und die eingesetzten Apoptose-

Stimuli selbst inhibitorisch auf die Migrationsfähigkeit der THP-1 Monozyten wirkten.

BEL inhibiert innerhalb der PLA2-Familie spezifisch die Calcium-unabhängigen Phospholipasen, dabei

kann jedoch nicht zwischen verschiedenen iPLA2-Isoformen (iPLA2α – η) unterschieden werden

(Jenkins et al., 2004; Larsson et al., 1998; Mancuso et al., 2000; Tanaka et al., 2000; Tang et al.,

1997). In der vorliegenden Arbeit wurden iPLA2-Expressionskonstrukte verwendet, die ausgehend von

der 86 kDa iPLA2β-Isoform (aa1-806) hergestellt wurden (Larsson et al., 1998). Um zu untersuchen,

ob die beobachtete Prozessierung und Aktivierung von iPLA2β alleine für die LPC-Freisetzung

verantwortlich ist oder ob weitere Calcium-unabhängige Phospholipasen A2 an der Generierung des

Attraktionssignals beteiligt sind, wurde ein weiterer Versuch durchgeführt. Dazu wurden die R- und S-

Enantiomere von BEL verwendet, die spezifisch die Isoformen iPLA2β (S-BEL) bzw. iPLA2γ (R-BEL),

eine 63 kDa große peroxisomal lokalisierte iPLA2, inhibieren (Jenkins et al., 2002; Yan et al., 2005).

Dabei ist in Abbildung 3.4B deutlich zu sehen, dass sich die Freisetzung des Attraktionssignals sowohl

durch das BEL-Racemat sowie durch S-BEL komplett inhibieren ließ. R-BEL hatte keinerlei Einfluss

auf das chemotaktische Potential der Überstände. Damit konnte eindeutig gezeigt werden, dass die

Isoform iPLA2β für die Generierung des Attraktionssignals verantwortlich war, da S-BEL spezifisch

diese Isoform inhibiert. iPLA2γ, die durch R-BEL gehemmt wird, schien dagegen keinerlei Einfluss zu

haben.

Um auszuschließen, dass BEL selbst die Apoptose inhibiert und es dadurch zu einer verminderten

Freisetzung von chemotaktischem Lockstoff kommt, wurde der Einfluss von BEL auf die Spaltung des

Caspase-Substrats Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) untersucht. Es wurde in MCF7casp3 Zellen

durch UV-Bestrahlung bzw. Staurosporin- oder Mitomycin-C-Behandlung Apoptose induziert und in

An- oder Abwesenheit der höchsten in Abbildung 3.4A verwendeten BEL-Konzentration inkubiert. Wie

in Abbildung 3.4C gezeigt, wurden die Zellen nach den angegebenen Zeiten geerntet und einer

Westernblot-Analyse unterzogen. Bei allen verwendeten Apoptose-Stimuli war eine deutliche Spaltung

63

ERGEBNISSE

der 116-kDa-Form von PARP zum 85-kDa-Spaltfragemt zu erkennen, die in den vitalen Kontrollzellen

nicht auftrat. Die Behandlung der Zellen mit BEL und damit die Inhibierung von iPLA2 hatte keinen

erkennbaren Einfluss auf die Caspase-vermittelte Prozessierung von PARP. Die mit einem Sternchen

gekennzeichnete Bande bezeichnet ein unspezifisches Signal des anti-PARP-Antikörpers.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgern, dass aktive iPLA2β essentiell für die Generierung des

Attraktionssignals LPC während der Apoptose ist.

Abbildung 3.4: Die Inhibierung der iPLA2 führt zur Hemmung der LPC-Freisetzung. (A) Apoptoseinduktion durch verschiedene Stimuli und Inhibierung von iPLA2. In MCF7casp3 Zellen (2 x 106 Zellen/Probe) wurde mit unterschiedlichen Stimuli Apoptose induziert (10 mJ/cm2 UV-Licht, 2,5 µM Staurosporin, 25 µg/mL Mitomycin C bzw. unbehandelte Kontrollen) und in 2 mL serumfreiem Medium für 13 h in Anwesenheit steigender Konzentrationen BEL inkubiert. Mit den über Sephadex G15-Säulen filtrierten Überständen wurde wie unter 2.2.10 beschrieben ein Transmigrationstest mit THP-1 Monozyten durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus Triplikaten. (B) Inhibierung verschiedener iPLA2-Isoformen. 2 x 106 MCF7casp3 Zellen wurden mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und in An- oder Abwesenheit von 20 µM BEL (iPLA2-Inhibitor, Racemat), R-BEL (inhibiert iPLA2γ) oder S-BEL (inhibiert iPLA2β) für 13 h inkubiert. Die Transmigration wurde wie unter 3.4A durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte + Standardabweichung aus Triplikaten. (C) BEL hat keinen Einfluss auf die Apoptose. In MCF7casp3 Zellen wurde wie unter 3.4A angegeben mit verschiedenen Stimuli Apoptose induziert und für die angegebenen Zeiten in An- bzw. Abwesenheit von 20 µM BEL inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und pro Probe 100 µg Gesamtprotein über ein SDS-PAGE-Gel (8 - 15 %) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Spaltung des Caspase-Substrats PARP wurde im Westernblot mit einem anti-PARP-Antikörper nachgewiesen.

Im vorangegangenen Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die prozessierte Form von iPLA2

eine deutlich höhere Aktivität als die Volllängenform hat (Abschnitt 3.1.2) und dass aktive iPLA2

essentiell für die Freisetzung des Attraktionssignals LPC ist (Abbildung 3.4). Außerdem konnten

64

ERGEBNISSE

Atsumi et al. belegen, dass nach Überexpression der Volllängen-iPLA2 mehr Arachidonsäure von

vitalen HEK293 Zellen freigesetzt wurde, was durch Expression der trunkierten Form iPLA2 aa184-806

noch gesteigert werden konnte (Atsumi et al., 2000). Aufgrund dessen stellte sich die Frage, ob die

Überexpression der trunkierten, aktiven iPLA2 alleine hinreichend für die Generierung und Freisetzung

von LPC ist. Um dies zu untersuchen, wurden in MCF7casp3 Zellen die iPLA2-Formen aa1-806

(Volllänge), aa1-512 (Ankyrin-Motive ohne aktives Zentrum) und aa514-733 (26-kDa-Spaltfragment)

überexprimiert bzw. die Zellen mit dem Leervektor transfiziert. Die Zellen wurden UV-bestrahlt oder

unbehandelt gelassen und mit den so gewonnenen Überständen wurden Transmigrationstests

durchgeführt. Abbildung 3.5A zeigt, dass die Überexpression aktiver iPLA2 nach UV-Bestrahlung zu

einem deutlich gesteigerten chemotaktischen Potential der Überstände führte und eine höhere

Migrationsrate der eingesetzten THP-1 Monozyten nachgewiesen werden konnte. Die Expression der

N-terminalen Ankyrin-Motive (aa1-512) hatte weder einen hemmenden noch einen fördernden

Einfluss auf das chemotaktische Potential der Überstände. Jedoch führte die Expression aktiver iPLA2

(aa514-733) in vitalen Zellen nicht zu einer Freisetzung von LPC, wie bereits zuvor von Lauber et al.

gezeigt (Lauber et al., 2003). Abbildung 3.5B zeigt die Expression der verschiedenen FLAG-getaggten

iPLA2-Formen im Westernblot, wobei die Volllängenform deutlich stärker exprimiert wurde als die

beiden trunkierten Konstrukte. Die Sternchen bezeichnen unspezifische Signale des anti-FLAG-

Antikörpers.

Abbildung 3.5: Die Überexpression der aktiven iPLA2 alleine führt nicht zur LPC-Freisetzung. (A) Überexpression verschiedener iPLA2-Formen und Transmigration. 3 x 105 MCF7casp3 Zellen pro Kavität einer 6-well-Zellkulturplatte wurden mit Hilfe von FuGENETM6 wie unter 2.2.3 beschrieben mit iPLA2 aa1-806 (N-FLAG) und den trunkierten Formen aa514-733 und aa1-512 (beide C-FLAG) transfiziert. 16 h nach Transfektion wurden die Zellen mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt bzw. unbehandelt gelassen (Kontrolle) und für 13 h in 2 mL serumfreiem Medium inkubiert. Mit den Überständen wurde wie unter 2.2.10 beschrieben ein Transmigrationstest mit THP-1 Monozyten durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte + Standardabweichung aus Triplikaten. (B) Überexpression verschiedener iPLA2-Formen und Westernblot. Wie unter 3.5A wurden MCF7casp3 Zellen mit verschiedenen iPLA2-Konstrukten transfiziert. 16 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und das Lysat von 3 x 105 Zellen pro Probe in einer 8 - 15 %igen SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Die Expression der FLAG-getaggten iPLA2-Formen wurde im Westernblot mit einem anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen.

Fasst man die bisherigen Ergebnisse zusammen, so konnte gezeigt werden, dass iPLA2 während der

Apoptose durch Caspase-3 gespalten und dadurch aktiviert wird. Außerdem ist aktive iPLA2β absolut

65

ERGEBNISSE

notwendig zur Generierung des Attraktionssignals LPC, das von apoptotischen Zellen freigesetzt wird.

Jedoch setzen vitale Zellen, die die trunkierte aktive Form von iPLA2 exprimieren, spontan kein

solches Attraktionssignal frei. Daraus muss gefolgert werden, dass es neben der Spaltung und

Aktivierung von iPLA2 weitere Mechanismen gibt, die für die Produktion und Freisetzung von LPC

während der Apoptose notwendig sind. Im Folgenden sollte deshalb geklärt werden, welche

apoptotischen Ereignisse für die Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals mitverantwortlich

sind.

3.2.3 Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle bei der Generierung des Attraktionssignals in apoptotischen Zellen

Ein in der Literatur häufig beschriebenes und eng mit der Apoptose assoziiertes Phänomen ist

oxidativer Stress. Dieser entsteht während der Apoptose vor allem durch die Unterbrechung des

mitochondrialen Elektronentransports der Atmungskette und den dabei freiwerdenden reaktiven

Sauerstoffverbindungen (ROS) (Kagan et al., 2003). Dadurch kommt es zu einer verstärkten Oxidation

von Phospholipiden, die insbesondere Phosphatidylserin betrifft, jedoch auch für Phosphatidylcholin

nachgewiesen werden konnte (Huber et al., 2002; Kagan et al., 2002). Perez et al. konnten zeigen,

dass nach H2O2-induzierter Apoptose in U937 Zellen der iPLA2-vermittelte Phospholipid-Um- und

Abbau deutlich erhöht ist (Perez et al., 2004). Außerdem beobachteten sie, dass das dabei

entstehende LPC wichtig für die nachfolgende Phagozytose dieser Zellen ist; dies gilt jedoch nicht

nach Apoptose-Induktion mit TNF-α (Perez et al., 2006). Deshalb sollte untersucht werden, ob die

Phospholipidoxidation bei der Generierung des löslichen Attraktionssignals LPC eine Rolle spielt,

wenn nicht durch oxidativen Stress Apoptose induziert wird, sondern, wie in der vorliegenden Arbeit,

durch andere Stimuli, wie z.B. UV-Bestrahlung.

Dazu wurden MCF7casp3 Zellen mit dem Antioxidanz α-Tocopherol (Vitamin E) vorbehandelt, das die

Entgiftung von reaktiven Sauerstoffverbindungen fördert und dadurch Lipide vor Oxidation schützen

kann. Nach 30-stündiger Inkubation der Zellen mit steigenden Mengen α-Tocopherol wurden die

Zellen gewaschen und durch UV-Bestrahlung Apoptose induziert bzw. die Zellen unbehandelt

gelassen. Wie in Abbildung 3.6A dargestellt, führte dies zu einer konzentrationsabhängigen

Veminderung des chemotaktischen Potentials in den Überständen apoptotischer Zellen; mit

Tocopherol-Konzentrationen von 50 und 100 µM wurde die Freisetzung des Attraktionssignals und

damit die Migration von THP-1 Monozyten fast vollständig gehemmt. Mit der höchsten eingesetzten

Tocopherol-Konzentration von 100 µM wurde daraufhin untersucht, inwieweit Vitamin E die Zellen vor

der Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen schützen konnte. Abbildung 3.6B zeigt eine deutlich

verminderte Menge an ROS nach UV-Bestrahlung in den Tocopherol-behandelten gegenüber den

ungeschützten Zellen. Die ROS-Entstehung während der Apoptose konnte jedoch im Vergleich zu den

Kontrollzellen nicht vollständig unterdrückt werden. Dies liegt vermutlich daran, dass α-Tocopherol in

die Zellmembran eingelagert wird und auch nur dort wirken kann; cytosolische ROS sind dadurch

nicht betroffen und können hier nicht reduziert werden.

Um auszuschließen, dass Vitamin E selbst die Apoptose beeinflusst und deshalb weniger LPC

freigesetzt wurde, wurde die Apoptoserate nach Tocopherol-Behandlung anhand der Bestimmung

hypodiploider Nuklei überprüft. Abbildung 3.6C zeigt, dass die Apoptoserate der Vitamin-E-

66

ERGEBNISSE

behandelten Zellen nach UV-Bestrahlung sogar etwas verstärkt war gegenüber den unbehandelten

Zellen. Somit kann das verminderte chemotaktische Potential der Überstände und die geringere ROS-

Entstehung nach Vitamin-E-Behandlung nicht auf eine Inhibierung der Apoptose zurückgeführt

werden.

Abbildung 3.6: Durch α-Tocopherol-Behandlung kann die Lipid-Peroxidation und die Freisetzung von Attraktionssignalen während der Apoptose inhibiert werden. (A) α-Tocopherol und Transmigration. Nach 30 h Inkubation mit steigenden Konzentrationen α-Tocopherol (1 - 100 µM) im Zellkulturmedium wurde in MCF7casp3 Zellen mit 10 mJ/cm2 UV-Bestrahlung Apoptose induziert bzw. die Zellen unbehandelt gelassen (Kontrolle) und in 2 mL serumfreiem Medium für 13 h inkubiert (2 x 106 Zellen/Probe). Mit den Überständen wurde wie unter 2.2.10 beschrieben mit THP-1 Monozyten ein Transmigrationstest durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus Triplikaten. (B) α-Tocopherol und ROS. MCF7casp3 Zellen wurden mit 100 µM α-Tocopherol für 30 h inkubiert und mit dem Farbstoff CM-H2DCFDA (10 µM) beladen. Dann wurden 4 x 105 Zellen pro Probe mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt bzw. unbehandelt gelassen (Kontrolle) und nach 13 h Inkubation im Durchflusszytometer die grüne Fluoreszenz (Fl1) analysiert (siehe 2.2.8). (C) α-Tocopherol und Apoptoserate. MCF7casp3 Zellen wurden für 30 h mit 100 µM α-Tocopherol kultiviert und danach je 2 x 106 Zellen pro Kavität einer 6-well-Platte mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt bzw. unbehandelt gelassen (Kontrolle). 24 h nach Apoptose-Induktion wurde im Durchflusszytometer die Apoptoserate durch Färbung der im Zellkern enthaltenen DNA mit Propidiumiodid und Bestimmung des Anteils hypodiploider Nuclei gemessen (siehe 2.2.9.1). (D) α-Tocopherol und Lipid-Peroxidation. MCF7casp3 Zellen wurden wie unter 3.6C behandelt und 6 h nach UV-Bestrahlung geerntet. In den Zellen (2 x 106 pro Probe) wurde wie unter 2.2.8 beschrieben die Menge an Lipid-Hydroperoxiden spektrometrisch bestimmt. (n.d. = nicht detektierbar)

67

ERGEBNISSE

Um die Auswirkungen von oxidativem Stress an der Zellmembran, also dem Ort der LPC-Entstehung,

besser untersuchen zu können, wurde die Menge an Lipid-Hydroperoxiden (LOOH) in vitalen und UV-

bestrahlten Zellen mit und ohne Tocopherol-Behandlung bestimmt. LOOH entstehen durch die ROS-

vermittelte Peroxidation von Lipiden und Phospholipiden an Zellmembranen. Abbildung 3.6D zeigt,

dass in apoptotischen Zellen mehr Lipid-Hydroperoxide gebildet wurden als in vitalen MCF7casp3

Zellen. Durch Tocopherol-Vorbehandlung konnte in den apoptotischen Zellen die LOOH-Bildung

deutlich vermindert werden, in vitalen Zellen wurde die LOOH-Menge durch Vitamin E sogar bis unter

die Nachweisgrenze reduziert.

Aus diesen Daten kann gefolgert werden, dass der während der Apoptose auftretende oxidative

Stress in Form von ROS zu einer gesteigerten Lipid-Peroxidation und damit vermutlich zu einer

verstärkten Hydrolyse von oxidierten Phospholipiden, wie z.B. Phosphatidylcholin, führen kann.

Dadurch kann offenbar mehr LPC generiert und freigesetzt werden. Somit scheint neben der

Prozessierung und Aktivierung der iPLA2 auch die Lipid-Peroxidation während der Apoptose für die

Generierung des Attraktionssignals LPC eine wichtige Rolle zu spielen.

3.2.4 Die Inhibierung von ABCA-Transportern hemmt die Freisetzung des Attraktionssignals

LPC wird als apoptotisches Attraktionssignal nach der iPLA2-vermittelten hydrolytischen Spaltung von

Phosphatidylcholin externalisiert und freigesetzt (Lauber et al., 2003). Dies konnte in der vorliegenden

Arbeit, wie in den Abschnitten 3.2.1 und 3.2.2 dargestellt, bestätigt werden. Der genaue Mechanismus

der LPC-Externalisierung in apoptotischen Zellen war bislang jedoch unklar und sollte im Rahmen

dieser Arbeit näher untersucht werden.

Die Externalisierung von Phospholipiden während der Apoptose wurde bislang am besten für

Phosphatidylserin als zentralem Marker der Apoptose untersucht, der Mechanismus bis jetzt jedoch

nur unvollständig aufgeklärt. Die PS-Externalisierung wird demnach v.a. durch die Inaktivierung der

Aminophospholipid-Translokase und der Aktivierung einer Lipid-Scramblase ermöglicht (Bevers et al.,

1999; Bratton et al., 1997; Williamson und Schlegel, 2002). Außerdem wurde gezeigt, dass Mitglieder

der ATP-binding cassette transporter (ABC)-Familie, insbesondere ABCA1 und ABCA7, für den Efflux

verschiedener Phospholipide und Cholesterin in vitalen Zellen verantwortlich sind (Abe-Dohmae et al.,

2004; Wang et al., 2003; Wang und Tall, 2003). Alder-Baerens et al. und Hamon et al. beschrieben

zudem, dass speziell ABCA1 an der PS-Externalisierung mitbeteiligt und wichtig für die Phagozytose

apoptotischer Zellen ist (Alder-Baerens et al., 2005; Hamon et al., 2000). Deshalb sollte im Folgenden

untersucht werden, ob ABCA-Transporter auch an der Freisetzung des Attraktionssignals LPC

während der Apoptose beteiligt sind.

Dazu wurde, wie in Abbildung 3.7A dargestellt, in MCF7casp3 Zellen in Gegenwart steigender

Konzentrationen des ABCA-Inhibitors Glyburid Apoptose induziert. Dies führte zu einer

konzentrationsabhängigen Abnahme des chemotaktischen Potentials der Überstände, wodurch

weniger THP-1 Monozyten in diese Überstände migrierten. Das chemotaktische Potential der mit

unterschiedlichen Apoptose-Stimuli ohne Inhibitor behandelten Proben war unterschiedlich und nach

Apoptose-Induktion mit Staurosporin und Mitomycin C geringer als nach UV-Bestrahlung. Es konnte

68

ERGEBNISSE

jedoch bei allen drei Stimuli mit der höchsten eingesetzten Glyburid-Konzentration von 100 µM sehr

deutlich reduziert werden, nach UV-Bestrahlung von über 20 % Transmigration auf etwa 6 %, nach

Mitomycin-C-Behandlung sogar vollständig. Da die Überstände vor den Transmigrationstests zur

Entfernung der niedermolekularen Apoptose-Stimuli und des Inhibitors über Sephadex G15-Säule

filtriert wurden, konnte ausgeschlossen werden, dass Glyburid selbst die Migration der THP-1

Monozyten inhibierte.

Abbildung 3.7: Der ABCA-Inhibitor Glyburid hemmt die Freisetzung des Attraktionssignals aus apoptotischen MCF7casp3 Zellen. (A) Apoptoseinduktion durch verschiedene Stimuli und Inhibierung von ABCA-Transportern. In MCF7casp3 Zellen (2 x 106

Zellen/Probe) wurde mit unterschiedlichen Stimuli Apoptose induziert (10 mJ/cm2 UV-Bestrahlung, 2,5 µM Staurosporin, 25 µg/mL Mitomycin C bzw. unbehandelte Kontrollen) und in 2 mL serumfreiem Medium für 13 h in Anwesenheit steigender Konzentrationen von Glyburid (1 - 100µM) inkubiert. Mit den filtrierten Überständen wurde wie unter 2.2.10 beschrieben ein Transmigrationstest mit THP-1 Monozyten durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus Triplikaten. (B) Apoptoserate nach Glyburidbehandlung. In MCF7casp3 Zellen wurden wie unter 3.7A Apoptose induziert, mit oder ohne 100 µM Glyburid inkubiert und 24 h nach Apoptoseinduktion der Anteil apoptotischer Zellen durch Propodiumiodidfärbung der nukleären DNA durchflusszytometrisch bestimmt. (C) mRNA-Expression von ABCA1 und ABCA7. Aus MCF7casp3 Zellen wurde die Gesamt-RNA isoliert und mit 1 µg RNA die reverse Transkription durchgeführt. Mittels real-time PCR wurde die Expression von ABCA1 und ABCA7 bestimmt und über das interne Standardgen ALAS-1 normiert. Unter Berücksichtigung der Amplifikationseffizienzen wurden die Proben relativ zueinander quantifiziert (siehe 2.4.4). Rechts ist die primäre Amplifikationskurve dargestellt.

69

ERGEBNISSE

Um sicherzustellen, dass Glyburid keinen Einfluss auf die Apoptose hatte und deshalb weniger

Attraktionssignal freigesetzt wurde, wurden die Zellen mit der höchsten Glyburid-Konzentration (100

µM) und den unterschiedlichen Apoptose-Stimuli (bzw. Kontrolle) nach 24 h mittels Propidiumiodid-

Färbung der nukleären DNA analysiert. In Abbildung 3.7B ist deutlich zu sehen, dass Glyburid in

keinem Fall die Apoptose inhibierte, sondern die Apoptoserate sowohl in den vitalen Kontrollzellen als

auch in den apoptotischen Zellen sogar leicht erhöhte.

Diese Ergebnisse machen deutlich, dass ABCA-Transporter bei der Freisetzung des

Attraktionssignals LPC eine wesentliche Rolle zu spielen scheinen. Da der Inhibitor Glyburid sowohl

ABCA1 als auch ABCA7 inhibieren kann, sollte näher definiert werden, ob möglicherweise beide

Transporter an der LPC-Freisetzung beteiligt sind, oder aber nur einer der beiden. In Abbildung 3.7C

ist die relative Expression der ABCA7- und ABCA1-mRNA in MCF7casp3 Zellen dargestellt. Dabei

zeigte sich, dass ABCA7 etwa 40 Mal stärker exprimiert wurde als ABCA1. Dieser deutliche

Unterschied wies darauf hin, dass möglicherweise ABCA7 bei der LPC-Freisetzung eine größere

Rolle spielen könnte als ABCA1. Deshalb wurde im Folgenden zunächst die Beteiligung des ABCA7-

Transporters an der LPC-Freisetzung untersucht.

3.2.5 Für die Freisetzung des Attraktionssignals aus apoptotischen Zellen ist ABCA1 essentiell, nicht ABCA7

Um zu untersuchen, ob die LPC-Freisetzung während der Apoptose von der ABCA7-Expression

abhängig ist, sollte nun die Expression dieses Transporters durch die Behandlung von MCF7casp3

Zellen mit siRNA reduziert werden. Durch Vorversuche wurde der Zeitpunkt ermittelt, an dem die

Expression von ABCA7 in diesen Zellen am stärksten inhibiert war. Abbildung 3.8A zeigt, dass der

knock down von ABCA7 mit den beiden spezifischen siRNA-Oligonukleotiden (nt426 und nt1676) zu

einer deutlichen Reduktion der ABCA7-mRNA im Vergleich zu den mit Kontroll-Oligonukleotid

(Scramble) transfizierten MCF7 Zellen führte. Aufgrund dessen, dass kein ABCA7-Antikörper für eine

Westernblot-Analyse verfügbar war, konnte die ABCA7-Expression leider nicht auf Proteinebene

untersucht werden. Nach dem knock down wurden die Zellen UV-bestrahlt bzw. unbehandelt gelassen

und mit den Überständen Transmigrationstests durchgeführt. Wie in Abbildung 3.8B dargestellt hatte

der knock down von ABCA7 mit beiden funktionellen siRNA-Oligonukleotiden jedoch keinen Einfluss

auf das chemotaktische Potential der Überstände nach UV-Bestrahlung und die eingesetzten THP-1

Monozyten migrierten ebenso stark wie auf die Überstände der mit Kontroll-Oligonukleotid

behandelten Zellen.

Obwohl für ABCA7 ein deutlich höheres mRNA-Niveau beobachtet werden konnte als für ABCA1

(siehe Abbildung 3.7C), scheint ABCA7 für die Freisetzung des Attraktionssignals LPC keine

ausschlaggebende Rolle zu spielen. Deshalb sollte eine mögliche Beteiligung von ABCA1 näher

untersucht werden.

70

ERGEBNISSE

Abbildung 3.8: Durch den knock down von ABCA1 wird die Freisetzung des Attraktionssignals gehemmt. (A) ABCA7 mRNA-Expression nach knock down. MCF7casp3 Zellen wurden mit Hilfe des Lipofektionsagenz LipofectaminTM2000 (5 µL pro Kavität einer 6-well-Platte) mit 100 nM ABCA7 siRNA bzw. Scramble-Oligonukleotid transfiziert (Tag 5 und 2 vor RNA-Isolierung), dann wurden die Zellen geerntet, die Gesamt-RNA isoliert und 1 µg revers transkribiert. Zur Bestimmung der ABCA7 mRNA-Expression wurden pro Probe 80 ng cDNA mittels real-time PCR analysiert. Die Proben wurden intern auf die ALAS-1-mRNA-Expression normiert und die mit Kontroll-Oligonukleotid behandelten Proben gleich 100 % gesetzt. (B) Transmigration nach knock down von ABCA7. MCF7casp3 Zellen wurden wie unter 3.8A mit verschiedenen ABCA7 siRNA-Oligonukleotiden behandelt (Tag 5 und 2 vor Apoptose-Induktion), dann wurden die Zellen frisch ausgesät (2 x 106 Zellen pro Probe) und nach Erreichen der Adhärenz mit 10 mJ/cm2 UV-Bestrahlung Apoptose induziert bzw. nicht behandelt

71

ERGEBNISSE

(Kontrolle). Nach 13 h wurden die serumfreien Zellkulturüberstände geerntet (2 mL) und mit THP-1 Monozyten ein Transmigrationstest durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten. (C) Transmigration nach knock down von ABCA1. MCF7casp3 Zellen wurden mit Hilfe von LipofectaminTM2000 (2,5 bzw. 5µL pro Ansatz) mit 50 bzw. 100 nM ABCA1 siRNA oder Scramble-Oligonukleotid transfiziert (Tag 5 und 2 vor Apoptose-Induktion), dann die Zellen frisch ausgesät (2 x 106 pro Probe) und nach Erreichen der Adhärenz Apoptose induziert (10 mJ/cm2 UV-Bestrahlung oder 2,5 µM Staurosporin) oder die Zellen unbehandelt gelassen (Kontrolle). Nach 13 h wurden die serumfreien Zellkulturüberstände geerntet (2 mL), über Sephadex G15-Säulen filtriert und mit THP-1 Monozyten ein Transmigrationstest durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten. (D) ABCA1-Expression nach knock down. MCF7casp3 Zellen wurden wie unter 3.8C an den Tagen 5 und 2 vor dem Ernten mit 50 und 100 nM ABCA1 siRNA bzw. Scramble-Oligonukleotid transfiziert. Mit den Zellen wurde eine Zellfraktionierung (siehe 2.3.5) durchgeführt, die Membranfraktionen über ein 6 - 10 %iges SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (100 µg Protein pro Probe) und eine Westernblot-Analyse durchgeführt. Die Expression von ABCA1 wurde mit einem anti-ABCA1-Antikörper nachgewiesen, zur Kontrolle wurde anti-NHE-1-Antikörper verwendet. (E) ABCA1 mRNA-Expression nach knock down. Wie unter 3.8C wurden MCF7casp3 Zellen an den Tagen 5 und 2 vor dem Ernten mit 50 und 100 nM ABCA1 siRNA bzw. Scramble-Oligonukleotid transfiziert. Dann wurde die Gesamt-RNA isoliert, 1 µg zur reversen Transkription eingesetzt und mit 80 ng cDNA die mRNA-Expression mittels real-time PCR ermittelt. Die Expression der mit spezifischem ABCA1-siRNA-Oligonukleotid behandelten Zellen wurde relativ zur Expression der Kontrollzellen (= 100%) bestimmt. (F) Apoptoserate nach ABCA1-knock down. MCF7casp3 Zellen wurden wie unter 3.8C behandelt und 24 h nach Apoptose-Induktion geerntet. Der Anteil apoptotischer Zellen wurde nach dem Anfärben der DNA im Zellkern mit Propodiumiodid durchflusszytometrisch über die Bestimmung der hypodiploiden Nuklei ermittelt.

Abbildung 3.8C zeigt, dass der knock down von ABCA1 mit funktionellem siRNA-Oligonukleotid in

MCF7casp3 Zellen die Freisetzung des Attraktionssignals nach Apoptose-Induktion durch UV-

Bestrahlung oder Staurosporin-Stimulation komplett inhibierte. Dagegen hatte die Transfektion mit

nicht-funktionellem Scramble-Oligonukleotid keinen Einfluss auf das chemotaktische Potential der

Überstände dieser Zellen. Dieser Effekt konnte durch die 2-fache Transfektion der Zellen mit 50 oder

100 nM siRNA und einer Inkubationszeit von insgesamt 5 Tagen erreicht werden. In Abbildung 3.8D

und 3.8E ist die Protein- und die mRNA-Expression von ABCA1 zu dem Zeitpunkt dargestellt, an dem

in den Zellen Apoptose induziert wurde. Sowohl mit 50 als auch mit 100 nM ABCA1-siRNA-

Oligonukleotid war in der Westernblot-Analyse eine deutlich reduzierte Expression von ABCA1

gegenüber den Scramble-behandelten Zellen zu beobachten und nur noch eine schwache Bande des

ABCA1-Transporters bei 220 kDa detektierbar. Die Analyse der mRNA-Expression von ABCA1 ergab

eine Reduktion um 20 % (mit 50 nM siRNA) bzw. 60 % (100 nM siRNA) und war somit zu diesem

Zeitpunkt weniger deutlich inhibiert als die Proteinexpression. Als Ladekontrolle wurde im Westernblot

das Membranprotein Natrium-Protonen-Austauscher-1 (NHE-1) nachgewiesen.

Um auszuschließen, dass der knock down von ABCA1 oder die Behandlung mit siRNA-

Oligonukleotiden allgemein zu einer gehemmten Apoptose führen, wurde die Apoptoserate der

entsprechend behandelten Zellen anhand der apoptotischen hypodiploiden Zellkerne bestimmt. Wie in

Abbildung 3.8F dargestellt, hatte die Vorbehandlung der Zellen mit ABCA1-siRNA bzw. Scramble-

Oligonukleotid keinen Einfluss auf die Apoptoserate. Lediglich mit 100 nM Scramble-Oligonukleotid

war die Apoptoserate der Kontrollzellen etwas erhöht, was sich auch in einer leicht gesteigerten

Transmigrationsrate von ca. 7 % widerspiegelte (Abbildung 3.8C).

Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass dem ABCA1-Transporter eine entscheidende

Rolle bei der Freisetzung des Attraktionssignals LPC während der Apoptose zukommt, wogegen die

Expression von ABCA7 wahrscheinlich keinen wesentlichen Einfluss hat.

72

ERGEBNISSE

3.2.6 Überexpression von iPLA2 und Aktivierung des ABCA1-Transporters führt auch bei vitalen Zellen zur Freisetzung des Attraktionssignals

Fasst man die bisherigen Ergebnisse zusammen so konnte gezeigt werden, dass iPLA2 während der

Apoptose durch Caspase-3 prozessiert wird (Abschnitt 3.1.1). Das dabei entstehende 26-kDa-

Fragment iPLA2 aa514-733 zeigt eine deutlich höhere Aktivität als das ungespaltene Volllängenprotein

(Abschnitt 3.1.2). Zusätzlich scheint oxidativer Stress die Hydrolyse des iPLA2-Substrats

Phosphatidylcholin zu fördern und somit die LPC-Generierung zu unterstützen (Abschnitt 3.2.3). Für

die letztendliche Freisetzung von LPC während der Apoptose scheint der ABCA1-Transporter eine

entscheidende Rolle zu spielen (Abschnitt 3.2.5). Um diese Hypothesen weiter zu belegen, wurde nun

versucht, die apoptotische Situation durch Expression aktiver iPLA2 und Aktivierung des ABCA1-

Transporters in vitalen Zellen zu simulieren. Dazu wurde in MCF7casp3 Zellen zuerst die ABCA1-

Expression durch Transfektion von ABCA1-siRNA gehemmt bzw. die Zellen mit Scramble-

Oligonukleotid transfiziert. Nach 4,5 Tagen wurden die Zellen mit iPLA2 aa514-733 transfiziert und

nach 24 h Inkubationszeit mit Ionomycin C in An- oder Abwesenheit des iPLA2-Inhibitors BEL oder des

cPLA2-Inhibitors AACOCF3 stimuliert. Da ABCA1 während der Apoptose durch den Anstieg des

intrazellulären Calcium-Spiegels aktiviert wird, wurde hier zur Aktivierung von ABCA1 in vitalen Zellen

Ionomycin C eingesetzt, ein Calcium-Ionophor, das zum Einstrom von extrazellulärem Calcium und

damit zur Erhöhung der cytosolischen Calcium-Konzentration führt. Wie in Abbildung 3.9 dargestellt,

führte die Stimulation mit Ionomycin bei den mit Scramble-Oligonukleotid behandelten Zellen zur

Freisetzung des Attraktionssigals, nach knock down von ABCA1 hatte die Ionomycin-Behandlung

keinen Effekt. Durch Inhibierung der überexprimierten aktiven iPLA2 aa514-733 und der endogenen

iPLA2 durch BEL konnte die Freisetzung des Attraktionssignals komplett inhibiert werden. Die

Hemmung der endogenen cPLA2 durch AACOCF3 hatte dagegen keinen Effekt.

Abbildung 3.9: Aktive iPLA2 und Aktivierung des ABCA1-Transporters führen zur Freisetzung des Attraktionssignals. Simulation der apoptotischen Situation in vitalen Zellen. MCF7casp3 Zellen wurden mit Hilfe von 5 µL LipofectaminTM2000/Probe mit 100 nM ABCA1 siRNA bzw. Scramble-Oligonukleotid transfiziert (Tag 4,5 und 2 vor der weiteren Behandlung). Die Zellen wurden frisch ausgesät (0,5 x 106 Zellen pro Kavität einer 6-well-Platte) und dann mit iPLA2 aa514-733 (C-FLAG) transfiziert (mit Hilfe von FuGENETM6). Nach 24 h wurden die Zellen in 2 mL serumfreiem Medium mit 4 µM Ionomycin C in An- bzw. Abwesenheit von 20 µM BEL oder 20 µM AACOCF3 stimuliert oder unbehandelt gelassen. Die Überstände wurden nach 1 h geerntet, über Sephadex G15-Säulen filtriert und mit THP-1 Monozyten ein Transmigrationstest durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten.

73

ERGEBNISSE

Somit konnte gezeigt werden, dass die Expression aktiver iPLA2 auch in vitalen Zellen zur

Generierung des Attraktionssignals LPC führt, dessen Freisetzung kann durch Aktivierung des

ABCA1-Transporters mittels Calcium-Influx stimuliert oder durch ABCA1-knock down inhibiert werden.

Endogene cPLA2 scheint unter diesen Bedingungen dagegen keinen wesentlichen Einfluss auf die

LPC-Produktion in vitalen Zellen zu haben.

3.3 Die Migration monozytärer Zellen auf das Attraktionssignal LPC wird durch den G2A-Rezeptor vermittelt

In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der LPC-Produktion und Freisetzung während

der Apoptose genauer untersucht und mit iPLA2 und ABCA1 die beiden zentralen Mediatoren

identifiziert, wie in den Abschnitten 3.1 und 3.2 gezeigt. Im Folgenden sollte untersucht werden,

welche Rezeptoren die Wirkung von LPC als löslichem „find-me“-Signal auf den Phagozyten

vermitteln und deren Migration auslösen.

3.3.1 Vergleich der monozytären Zelllinien THP-1 und U937 Ursprünglich als „Orphan-Rezeptor“ beschrieben, zeigten Kabarowski et al., dass der G-Protein-

gekoppelte Rezeptor G2A unter anderem Lysophosphatidylcholin binden kann und damit ein

transienter Anstieg des Calcium-Spiegels der Zellen und die Aktivierung der Mitogen-Activated Protein

Kinase (MAP-Kinase) ausgelöst wird (Kabarowski et al., 2001). In Folgestudien konnte eine G2A-

vermittelte Migration von T-Zellen und Makrophagen auf LPC nachgewiesen werden (Radu et al.,

2004; Yang et al., 2005). Die 2001 von Kabarowski veröffentlichten Daten mussten zurückgezogen

werden, da die direkte Bindung von LPC an den G2A-Rezeptor nicht reproduziert werden konnte

(Witte et al., 2005), jedoch wurde ausdrücklich betont, dass eine Beteiligung des G2A-Rezeptors an

der LPC-vermittelten Chemotaxis auch in weiteren Untersuchungen nachgewiesen werden konnte.

Somit sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden, ob G2A für die Induktion der Migration von

Phagozyten auf apoptotische Überstände verantwortlich ist.

Dazu wurde zuerst das Migrationsverhalten von THP-1 und U937 Zellen verglichen, wobei U937

Zellen bekanntermaßen ein niedriges G2A-Expressionsniveau haben (Yang et al., 2005). In Abbildung

3.10 ist die Migration von THP-1 und U937 Zellen in Transmigrationstests dargestellt, in denen die

Überstände vitaler, apoptotischer und nekrotischer Zellen bzw. gereinigtes Lysophosphatidylcholin

und Stromal-Cell-derived Factor 1-alpha (SDF-1α) (Cherla und Ganju, 2001) als Migrationsstimuli

eingesetzt wurden. Dabei wurde deutlich, dass nur THP-1 Zellen auf die Überstände apoptotischer

Zellen und gereinigtes LPC wanderten, U937 Zellen zeigten dagegen keine Migration. Um

auszuschließen, dass dies möglicherweise an einem generellen Defekt der Migrationsfähigkeit der

U937 Zellen lag, wurden als Positivkontrollen die Überstände nekrotischer Zellen und gereinigtes

SDF-1α eingesetzt, worauf sowohl THP-1 als auch U937 Zellen wanderten. Dabei konnte bei den

U937 Zellen eine lediglich geringfügig niedrigere Migrationsrate im Vergleich zu THP-1 Zellen

festgestellt werden.

74

ERGEBNISSE

Abbildung 3.10: Monozytäre THP-1 Zellen wandern auf Überstände apoptotischer Zellen und gereinigtes LPC, U937 Zellen nicht. Migration von THP-1 und U937 Zellen auf Überstände vitaler, apoptotischer oder nekrotischer Zellen und gereinigtes LPC oder SDF-1α. 2 x 106 MCF7casp3 Zellen wurden mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt bzw. unbehandelt gelassen (Kontrolle) und 13 h in 2 mL serumfreiem Medium inkubiert (Überstände vitaler bzw. apoptotischer Zellen) oder in 2 mL serumfreiem Medium für 20 min bei 58°C inkubiert (Überstände nekrotischer Zellen). Die so gewonnenen Überstände wurden in Transmigrationstests mit je 1 x 105 THP-1 oder U937 Zellen eingesetzt. Der Anteil migrierter Zellen wurde nach 2 h Inkubationszeit bestimmt (siehe 2.2.10). Gereinigtes LPC und SDF-1α wurden in serumfreiem Medium mit 0,1 % fettsäurefreiem BSA gelöst und in einer Konzentration von 10 µM (LPC) und 200 ng/mL (SDF-1α) für 3 h zur Transmigration eingesetzt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten.

Um das beobachtete Migrationsverhalten von THP-1 und U937 Zellen hinsichtlich der G2A-

Abhängigkeit weiter zu untersuchen, wurde die Expressionsstärke von G2A in beiden Zelllinien

verglichen. Wie in Abbildung 3.11A zu sehen ist, war die Menge an G2A-mRNA in U937 Zellen um 60

% gegenüber THP-1 Zellen reduziert. Noch deutlicher war dieser Unterschied in der Westernblot-

Analyse zu erkennen, bei der in U937 Zellen keine G2A-Bande bei 46 kDa detektierbar war

(Abbildung 3.11B). Die mit Sternchen gekennzeichneten Banden der U937-Probe bezeichnen

unspezifische Signale des G2A-Antikörpers. Als Ladekontrolle diente das Membranprotein Natrium-

Protonen-Austauscher-1 (NHE-1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass G2A ein möglicher

Kandidat für die LPC-vermittelte Anlockung von Phagozyten sein könnte.

Neben G2A könnte auch der G-Protein-gekoppelte Rezeptor GRP4 eine Rolle spielen, da dieser im

Zusammenhang mit der LPC-vermittelte Migration von Swiss 3T3 Zellen (murine Fibroblasten)

beschrieben wurde (Zhu et al., 2001). Diese Veröffentlichung wurde 2005 ohne nähere Erläuterungen

zurückgezogen (2005), jedoch sollte eine mögliche Beteiligung von GPR4 hier nicht außer Acht

gelassen werden. Der Vergleich der mRNA-Expression von G2A und GPR4 zeigte, dass die G2A-

Expression in THP-1 Zellen etwa fünfmal höher war als die Expression von GPR4-mRNA (Abbildung

3.11C). Deshalb wurde zunächst die Rolle von G2A bei der LPC-vermittelten Migration von

Monozyten untersucht.

75

ERGEBNISSE

Abbildung 3.11: Expressionsstärke putativer LPC-Rezeptoren in THP-1 und U937 Zellen. (A) G2A-mRNA-Expression in THP-1 und U937 Zellen. Es wurde aus 2 x 106 THP-1 bzw. U937 Zellen die mRNA isoliert und je 1 µg revers transkribiert. 80 ng der so gewonnenen cDNA wurden zur quantitativen real time-PCR eingesetzt, auf die Expression der ALAS-1 mRNA normalisiert und relativ zur G2A-mRNA-Expression der THP-1 Zellen quantifiziert. (B) G2A-Expression in Membranfraktionen von THP-1 und U937 Zellen. Wie unter 2.3.5 beschrieben, wurde mit 1 x 107 THP-1 und U937 Zellen eine Zellfraktionierung durchgeführt und je 130 µg der so gewonnenen Membranproteine über ein 8 - 15 %iges SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Westernblot-Analyse erfolgte mit einem anti-G2A-Antikörper, als Ladekontrolle wurde die Expression von NHE-1 detektiert. (C) Expression von G2A- und GPR4-mRNA in THP-1 Zellen. Aus 2 x 106 THP-1 Zellen wurde die Gesamt-RNA isoliert, revers transkribiert und 80 µg der cDNA zur quantitativen real time-PCR eingesetzt. Die relative Quantifizierung erfolgte mittels der (1+E)-CT-Methode unter Berücksichtigung der jeweiligen Amplifikationseffizienz. Rechts ist die primäre Amplifikationskurve dargestellt.

3.3.2 Für die Migration von THP-1 Zellen auf das Attraktionssignal LPC ist G2A verantwortlich, nicht GPR4

Um die Abhängigkeit der Lysophosphatidylcholin-vermittelten Migration von Phagozyten von der G2A-

Expression und eine mögliche Beteiligung von GPR4 weiter zu untersuchen, sollte nun die Expression

dieser Rezeptoren durch die Behandlung mit siRNA in THP-1 Zellen reduziert werden. Wie in

Abbildung 3.12A dargestellt, führte der knock down von G2A mit zwei unterschiedlichen G2A-

spezifischen siRNA-Oligonukleotiden (nt280 und nt550) zu einer deutlich reduzierten Migration der

THP-1 Monozyten auf die Überstände apoptotischer Zellen im Vergleich zu den mit Kontroll-

Oligonukleotid behandelten THP-1 Zellen. Mit gereinigtem LPC als Stimulus konnte die Migration der

Monozyten durch die Behandlung mit G2A-siRNA sogar völlig inhibiert werden (Abbildung 3.12B). Um

auszuschließen, dass die Transfektion mit siRNA an sich einen Einfluss auf die Migrationsfähigkeit der

Zellen hatte, wurden als Positivkontrollen Überstände nekrotischer Zellen und gereinigtes SDF-1α

eingesetzt. Wie in Abbildung 3.12A und 3.12B zu sehen ist, wanderten die mit spezifischen G2A-

siRNA-Oligonukleotiden behandelten Zellen ebenso auf die Überstände nekrotischer Zellen und SDF-

1α wie die mit Scramble-Oligonukleotid transfizierten Zellen. Daraus kann geschlossen werden, dass

G2A tatsächlich eine Rolle bei der durch LPC und apoptotische Überstände vermittelten Migration von

Phagozyten spielt.

76

ERGEBNISSE

Abbildung 3.12: Der knock down von G2A in THP-1 Zellen führt zu einer verminderten Migration auf Überstände apoptotischer Zellen und gereinigtes LPC, der knock down von GPR4 scheint keinen Einfluss zu haben.

77

ERGEBNISSE

(A) Migration auf Überstände vitaler, apoptotischer oder nekrotischer Zellen nach G2A-knock down in THP-1 Zellen. Die Überstände von je 2 x 106 MCF7casp3 Zellen wurden wie unter Abbildung 3.10 beschrieben vorbereitet. Der G2A-knock down in THP-1 Zellen erfolgte wie unter 2.2.3 beschrieben durch zweimalige Elektroporation mit zwei G2A-spezifischen siRNA-Oligonukleotiden bzw. einem unspezifischen Kontroll-Oligonukleotid (Scramble). Die Transmigrationstests wurden an Tag 6 nach der ersten Elektroporation durchgeführt und für 2 h inkubiert. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten. (B) Einfluss des G2A-knock down auf die Migration auf gereinigtes LPC und SDF-1. 10 µM LPC oder 200 ng/mL SDF-1α wurden in serumfreiem Medium + 0,1 % fettsäurefreiem BSA zur Transmigration mit THP-1 Zellen nach G2A-knock down (wie unter 3.12A) eingesetzt. Die Transmigrationstests wurden für 3 h inkubiert. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten. (C) G2A-mRNA-Expression nach knock down. Der G2A-knock down in THP-1 Zellen erfolgte wie unter 3.12A durch zweimalige Elektroporation mit zwei G2A-spezifischen siRNA-Oligonukleotiden bzw. einem unspezifischen Scramble-Oligonukleotid. 6 Tage nach der ersten Elektroporation wurde die Gesamt-RNA isoliert, revers transkribiert und 80 ng der cDNA zur quantitativen real time-PCR eingesetzt. Die Proben wurden auf die ALAS-1-mRNA-Expression normalisiert und die G2A-Expression der Scramble-behandelten Zellen als 100 % gesetzt. (D) G2A-Expression in Membranfraktionen nach knock down. 6 Tage nach der ersten Elektoporation mit zwei spezifischen G2A-siRNA-Oligonukleotiden bzw. Scramble-Oligonukleotid wurde mit je 1 x 107 THP-1 Zellen eine Zellfraktionierung durchgeführt (siehe 2.3.5). 100 µg der so gewonnenen Membranproteine wurden in einer SDS-PAGE (8 - 15 %) elektrophoretisch aufgetrennt und im Westernblot mittels anti-G2A-Antikörper analysiert. Als Ladekontrolle diente NHE-1 (E) GPR4-mRNA-Expression nach knock down mit siRNA-Oligonukleotiden. Nach zweimaliger Elektroporation von THP-1 Zellen mit zwei spezifischen GPR4-siRNA-Oligonukleotiden bzw. Scramble-Oligonukleotid wurden die Zellen an Tag 6 nach der ersten Elektroporation geerntet und wie unter 3.12C die mRNA-Expression von GPR4 bestimmt. (F) Einfluss des GPR4-knock down auf die Migration von THP-1 Zellen auf Überstände vitaler, apoptotischer und nekrotischer Zellen. Wie unter 3.12A wurde mit THP-1 Zellen, die 2x mit zwei spezifischen GPR4-siRNA-Oligonukleotiden bzw. Kontroll-Oligonukleotid elektroporiert worden waren, an Tag 6 Transmigrationstests durchgeführt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten.

In Abbildung 3.12C ist die G2A-mRNA-Expression nach dem knock down in THP-1 Zellen dargestellt.

Durch die beiden spezifischen siRNAs konnte eine Reduktion auf etwa 20 % der ursprünglichen

mRNA-Menge erreicht werden. Auch in der Westernblot-Analyse war der Erfolg der siRNA-

Behandlung deutlich zu sehen und die G2A-Bande bei 46 kDa gegenüber der Kontrolle stark reduziert

und nur noch schwach nachweisbar (Abbildung 3.12D). Diese schwache, aber immer noch

detektierbare Expression von G2A könnte auch die reduzierte, jedoch nicht völlig inhibierte Migration

der THP-1 Zellen auf apoptotische Überstände erklären (Abbildung 3.12A). Eine andere Möglichkeit

wäre die Beteiligung weiterer Rezeptoren, wie GPR4, was ebenfalls durch den knock down dieses

Rezeptors in THP-1 Zellen geklärt werden sollte. Wie in Abbildung 3.12E zu sehen, führte der knock

down von GPR4 mit zwei spezischen siRNA-Oligonukleotiden (nt59 und nt268) zwar zu einer starken

Reduktion der GPR4-mRNA (vergleichbar mit dem G2A knock down), aber nicht zu einer reduzierten

Migration dieser THP-1 Zellen gegenüber den mit Kontroll-Oligonukleotid behandelten Zellen

(Abbildung 3.12F). Somit scheint die Expression von G2A wichtig zu sein für die durch apoptotische

Überstände und gereinigtes LPC ausgelöste Migration von Phagozyten. GPR4 dagegen spielt bei

diesem Prozess wahrscheinlich keine wesentliche Rolle.

3.3.3 G2A-exprimierende U937 Zellen wandern auf apoptotische Überstände und gereinigtes Lysophosphatidylcholin

Wie in Abschnitt 3.3.2 dargestellt, scheint die Expression von G2A eine wichtige Rolle bei der

Migration von Phagozyten auf apoptotische Attraktionssignale und gereinigtes Lysophosphatidylcholin

zu spielen. Ob G2A jedoch alleine ausreichend ist, um diese Reaktion in monozytären Zellen

hervorzurufen, ist damit nicht klar. Um diese Frage zu beantworten, wurden U937 Zellen verwendet,

die stabil mit einem retroviralen Expressionskonstrukt für G2A (U937G2A) bzw. dem Leervektor

(U937Vektor) transfiziert worden waren (Yang et al., 2005). Wie in Abbildung 3.13 dargestellt, wanderten

G2A-exprimierende U937G2A Zellen schwach auf apoptotische Überstände und stärker auf gereinigtes 78

ERGEBNISSE

LPC, U937Vektor Zellen dagegen zeigten keine Reaktion. Dass auch diese Zellen generell die Fähigkeit

zur aktiven Migration besitzen, konnte durch die Positivkontrolle in Form von gereinigtem SDF-1α

gezeigt werden, worauf U937Vektor und U937G2A Zellen gleichermaßen wanderten. Damit konnte

bestätigt werden, dass die Expression von G2A in den monozytären Zellen THP-1 und U937 äußerst

wichtig ist für die Migration dieser Zellen auf apoptotische Attraktionssignale sowie gereinigtes

Lysophosphatidylcholin.

Abbildung 3.13: Durch die Expression von G2A wandern U937 Zellen auf Überstände apoptotischer Zellen und gereinigtes LPC. Wie unter Abbildung 3.10 beschrieben, wurden die Überstände von 2 x 106 vitalen oder apoptotischen MCF7casp3 Zellen bzw. 10 µM LPC oder 200 ng/mL SDF-1α in den Transmigrationstests eingesetzt. Diese wurden mit G2A-exprimierenden U937G2A Zellen bzw. mit Leervektor-transfizierten U937Vektor Zellen durchgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten.

3.4 Rolle von Annexin I bei der Eliminierung apoptotischer Zellen Annexin I ist bereits seit langem als Glucocorticoid-induzierbares anti-inflammatorisches Protein

bekannt und kann unter anderem die Extravasion von Monozyten und Neutrophilen in entzündete

Gewebe inhibieren (Perretti et al., 2002; Solito et al., 2000) und wurde von verschiedenen

Arbeitsgruppen als wichtiger Faktor bei der Eliminierung apoptotischer Zellen beschrieben (Arur et al.,

2003; Fan et al., 2004; Maderna et al., 2005). Außerdem wurde Annexin I als Inhibitor der Calcium-

abhängigen Phospholipase A2 (cPLA2) identifiziert (Frey et al., 1999; Kim et al., 2001; Solito et al.,

1998), wodurch die Freisetzung von Arachidonsäure und damit die Synthese von potentiell pro-

inflammatorischen Prostaglandinen und Leukotrienen vermindert wird (Wu et al., 2000b). Aufgrund der

Funktion von Annexin I als cPLA2-Inhibitor und der Tatsache, dass die Calcium-unabhängige PLA2

(iPLA2) als Volllängenprotein eine wesentlich geringere Aktivität zeigte als nach Caspase-3-

Prozessierung (Abschnitt 3.1.2) war es denkbar, dass Annexin I auch mit iPLA2 assoziiert sein könnte

und so möglicherweise deren Aktivität in vitalen und apoptotischen Zellen beeinflusst. Durch die

Prozessierung der iPLA2 während der Apoptose könnte Annexin I abgespalten und somit die

inhibitorische Wirkung aufgehoben werden. Zusätzlich könnte die in der Literatur beschriebene

Annexin-I-Externalisierung zur räumlichen Trennung von iPLA2 und Annexin I führen und auch 79

ERGEBNISSE

dadurch Einfluss auf die Aktivierung von iPLA2 und die Freisetzung des Attraktionssignals LPC haben.

Somit könnte Annexin I sowohl bei der Freisetzung von „find-me“-Signalen als auch bei der

Erkennung von „eat-me“-Signalen eine entscheidende Rolle spielen.

Deshalb sollte im Folgenden untersucht werden, ob Annexin I mit iPLA2 interagiert und die Annexin-I-

Expression einen Einfluss auf die iPLA2-vermittelte Produktion von apoptotischen Attraktionssignalen

hat.

3.4.1 Annexin I hat keinen Einfluss auf die Freisetzung apoptotischer Attraktionssignale

Eine mögliche Interaktion von Annexin I mit iPLA2 sollte durch Ko-Immunpräzipitationen aufgeklärt

werden. Dazu wurden die FLAG-getaggten iPLA2-Formen aa1-806 (86 kDa Volllängenprotein), aa514-

806 (p32) und aa514-733 (p26, finales Caspase-3-Spaltfragment) in MDA-MB 231 Zellen

überexprimiert. Diese Zelllinie wurde verwendet, da sie in Vorversuchen im Vergleich zu anderen

Zellen eine starke endogene Annexin-I-Expression aufwies (Daten nicht gezeigt). Aus den so

vorbereiteten Zellen wurden die iPLA2-Konstrukte über das FLAG-Tag präzipitiert, wobei jeder

Präzipitationsansatz entweder mit 5 mM Calciumchlorid oder 5 mM EGTA durchgeführt wurde, um

eine mögliche Calcium-Abhängigkeit der Bindung zwischen Annexin I und iPLA2 zu zeigen. Die

Westernblot-Analyse der eluierten Proteine mit dem anti-Annexin-I-Antikörper zeigte, dass in keinem

Fall eine Ko-Präzipitation von Annexin I an iPLA2 stattgefunden hatte, obwohl in den eingesetzten

Zelllysaten (Input) große Mengen an Annexin I nachgewiesen werden konnten (Abbildung 3.14A). Die

Präzipitation der FLAG-iPLA2-Konstrukte an anti-FLAG-Agarose war bei allen Proben erfolgreich und

wurde im Westernblot mit anti-FLAG-Antikörper bestätigt (Abbildung 3.14B).

Obwohl eine direkte Interaktion von Annexin I mit iPLA2 hier nicht nachweisbar war, könnte Annexin I

trotzdem eine indirekte regulatorische Wirkung auf die iPLA2 und damit auf die Generierung löslicher

Attraktionssignale während der Apoptose haben. Um dies zu untersuchen, wurde in MCF7casp3 Zellen,

die bekanntermaßen apoptotische Attraktionssignale freisetzen, die Annexin-I-Expression durch

Stimulation mit dem Phorbolester Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) induziert und danach

Apoptose ausgelöst. In Abbildung 3.14C ist die nach PMA-Behandlung deutlich erhöhte Expression

von Annexin I im Vergleich zur relativ niedrigen basalen Annexin-I-Expression dargestellt. Als

Kontrolle wurde iPLA2 detektiert. Diese höhere Annexin-I-Menge hatte jedoch keinen Einfluss auf die

Freisetzung von „find-me“-Signalen nach UV-Bestrahlung (Abbildung 3.14D).

Um einen möglichen Einfluss von Annexin I differenzierter zu betrachten und mögliche Nebeneffekte

der PMA-Behandlung auszuschließen, wurden MCF7casp3 Zellen mit verschiedenen EGFP-getaggten

Annexin-I-Konstrukten transfiziert und danach UV-bestrahlt. Die Expression der unterschiedlichen

Annexin-I-Formen mit und ohne Apoptose-Induktion ist in Abbildung 3.14E dargestellt (Struktur von

Annexin I: siehe Abbildung 1.6). Alle Konstrukte wurden deutlich exprimiert und zum Teil nach

Apoptose-Induktion stark abgebaut. Jedoch hatte keine der überexprimierten Annexin-I-Formen einen

Einfluss auf das chemotaktische Potential der Überstände nach UV-Bestrahlung und somit auf die

Migration der eingesetzten THP-1 Monozyten (Abbildung 3.14F). Lediglich die Expression von AnxI

aa1-47 (N-Terminus ohne Annexin-Boxen) und aa1-111 (N-Terminus und Annexin-Box I) schien in

vitalen Kontrollzellen zu einer mäßigen Freisetzung von chemotaktisch aktivem Attraktionssignal zu

80

ERGEBNISSE

führen. Die Transfektion mit den unterschiedlichen EGFP-AnxI-Konstrukten selbst hatte dabei keinen

Einfluss auf die Apoptose (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 3.14: Die Annexin-I-Expression hat keinen Einfluss auf die Produktion von Attraktionssignalen während der Apoptose (A) Ko-Immunpräzipitation von Annexin I und iPLA2. MDA-MB 231 Zellen wurden mit Hilfe von LipofectaminTM2000 wie unter 2.2.3 beschrieben mit den iPLA2-Konstrukten iPLA2 aa1-806 (N-FLAG), iPLA2 aa514-806 und iPLA2 aa514-733 (beide C-

81

ERGEBNISSE

FLAG) bzw. dem Leervektor transfiziert. Nach 24 h Inkubationszeit wurden jeweils 2 x 106 Zellen in 1 mL Lysepuffer lysiert und je 500 µL Lysat mit 5 mM CaCl2 oder 5 mM EDTA für 1,5 h mit anti-FLAG-Agarose inkubiert. Nach der Elution (siehe 2.3.6) wurden die Proben über ein 6 - 15 %iges SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und im Westernblot mit einem anti-Annexin-I-Antikörper analysiert. (B) Nachweis der präzipitierten FLAG-iPLA2-Konstrukte an anti-FLAG-Agarose. Zur Präzipitationskontrolle wurde aus den Präzipitationen von 3.14A jeweils ein Teil der Eluate über ein weiteres 6 - 15 %iges SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und in einer Westernblot-Analyse mit einem anti-FLAG-Antikörper getestet. (C) Annexin-I-Expression nach PMA-Behandlung. MCF7casp3 Zellen wurden für 18 h mit 80 nM Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) behandelt bzw. ohne PMA kultiviert (Kontrolle). Die Zellen wurden lysiert und 150 µg Protein pro Probe in einer SDS-PAGE (6 - 15 %) aufgetrennt. Die Analyse der Annexin-I-Expression erfolgte im Westernblot mit anti-Annexin-I-Antikörper, zur Kontrolle wurde die iPLA2-Expression mit einem anti-iPLA2-Antikörper bestimmt. (D) Transmigration nach Annexin-I-Induktion durch PMA. Jeweils 1 x 106 MCF7casp3 Zellen wurden für 18 h mit 80 nM PMA stimuliert bzw. unbehandelt gelassen. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und in 2 mL serumfreiem Medium für 13 h inkubiert. Die Kontrollen wurden ebenfalls mit PBS gewaschen und 13 h in serumfreiem Medium inkubiert. Mit den zellfreien Überständen wurde wie unter 2.2.10 beschrieben mit THP-1 Monozyten ein Transmigrationstest durchgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten. (E) Überexpression verschiedener Annexin-I-Konstrukte in MCF7casp3 Zellen. Je 3 x 105 MCF7casp3 Zellen wurden mit Hilfe von FuGENETM6 mit den Annexin-I-Konstrukten aa1-47, aa1-111, aa1-183, aa1-267, aa1-346, aa47-346 (alle C-terminal EGFP-getaggt) oder dem Leervektor transfiziert und für 18 inkubiert. Danach wurde mit 10 mJ/cm2 UV-Bestrahlung Apoptose induziert bzw. die Zellen unbehandelt gelassen und für weitere 13 h inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und über ein 8 - 15 %iges SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Westernblot-Analyse erfolgte mit einem anti-EGFP-Antikörper. (F) Transmigration nach Überexpression verschiedener Annexin-I-Formen. Wie unter 3.14E wurden MCF7casp3 Zellen mit verschiedenen EGFP-Annexin-I-Konstrukten transfiziert und die Zellen nach 18 h mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt bzw. unbehandelt gelassen (Kontrolle) und in 2 mL serumfreiem Medium für weitere 13 h inkubiert. Mit den zellfreien Überständen wurde mit THP-1 Monozyten ein Transmigrationstest durchgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten.

3.4.2 Annexin I wird von spät-apoptotischen Jurkat Zellen externalisiert, unabhängig vom verwendeten Stimulus

Nachdem Annexin I keine Rolle bei der iPLA2-vermittelten Generierung apoptotischer

Attraktionssignale zu spielen scheint, wurde als Nächstes näher auf die Funktion von Annexin I

während der Phagozytose apoptotischer Zellen eingegangen. Dazu sollte zuerst die von Arur et al.

und Fan et al. beobachtete Externalisierung von Annexin I in apoptotischen Jurkat Zellen näher

charakterisiert werden (Arur et al., 2003; Fan et al., 2004).

Dazu wurde in Jurkat Zellen mit dem Breitband-Kinase-Inhibitor Staurosporin Apoptose induziert und

die Annexin-I-Oberflächenexpression durchflusszytometrisch bestimmt. In Abbildung 3.15A sind die

Primärdaten des zeitlichen Verlaufs der Annexin-I-Externalisierung dargestellt. Durch Doppelfärbung

der Zellen mit anti-Annexin-I-Antikörper und Propidiumiodid (PI) wurden sowohl Annexin-I-

exponierende als auch sekundär nekrotische Zellen sichtbar gemacht. Nach 6 Stunden war eine

deutliche Annexin-I-Färbung auf der Oberfläche nicht permeabilisierter Zellen erkennbar, nach 12 h

waren etwa 70 % der Zellen Annexin-I-positiv, wobei über den gesamten zeitlichen Verlauf die

Annexin-I-Oberflächenexpression vor allem in PI-positiven Zellen nachweisbar war. Um zu

kontrollieren, ob der verwendete anti-Annexin-I-Antikörper möglicherweise unspezifisch an

apoptotische Jurkat Zellen bindet, wurde ein IgG1-Isotyp Kontroll-Antikörper verwendet. Wie in

Abbildung 3.15A zu sehen ist, war der Großteil der Zellen nach 12 h Staurosporin-Behandlung zwar

PI-positiv, es erfolgte jedoch keine Bindung des Kontroll-Antikörpers. Abbildung 3.15B zeigt die

Histogramm-Darstellung der Annexin-I- und IgG1-Oberflächenfärbung 12 h nach Apoptose-Induktion,

in 3.15C ist der Anteil Annexin-I-positiver Zellen und IgG1-Isotyp-gefärbter Zellen für vitale und

apoptotische Jurkat Zellen quantitativ dargestellt.

82

ERGEBNISSE

Abbildung 3.15: Annexin-I-Externalisierung in apoptotischen Jurkat Zellen (A) Durchflusszytometrische Messung von Annexin I an der Zelloberfläche von Jurkat-Zellen. 1 x 105 Jurkat-Zellen wurden für die angegebenen Zeiten in 150 µl Zellkulturmedium in An- oder Abwesenheit von 2,5 µM Staurosporin bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem anti-Annexin-I-Antikörper bzw. dem IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper und anti-Maus-Cy2TM-Antikörper sowie Propidiumiodid doppelgefärbt. Dargestellt sind repräsentative Dot-Plots aus Triplikaten, wobei auf der x-Achse die Cy2TM- (Fl1) und auf der y-Achse die Propidiumiodid-Färbung (Fl2) aufgetragen sind. (B) Histogramm-Darstellung der 12 h Werte. Dargestellt sind 12 h Werte von wie in A behandelten Zellen, wobei jeweils die gesamte Zellpopulation erfasst ist.

83

ERGEBNISSE

(C) Quantitativer Vergleich zwischen Annexin-I-Färbung und Isotyp-Kontrolle. Gezeigt ist der prozentuale Anteil Annexin-I- bzw. Isotyp-positiver Zellen nach 12 h Inkubation ± 2,5 µM Staurosporin. Er ist als Mittelwert mit Standardabweichung aus Triplikaten angegeben. (D) Annexin-I-Externalisierung, DNA-Fragmentierung und Phosphatidylserin (PS)-Externalisierung bei Verwendung verschiedener Apoptose-Stimuli. Im linken Schaubild ist der prozentuale Anteil Annexin-I-positiver Zellen als Mittelwert mit Standardabweichung aus Triplikaten dargestellt. 1 x 105 Jurkat-Zellen wurden für 0 - 18 h in 150 µl Zellkulturmedium mit 100 ng/mL αCD95, 2,5 µM Staurosporin oder 25 µg/mL Etoposid inkubiert oder mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und 0 - 18 h lang in serumhaltigem Medium kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-Annexin-I- und anti-Maus-Cy2TM-Antikörper sowie Propidiumiodid doppelgefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Im mittleren und rechten Schaubild ist die Bestimmung der Phosphatidylserin-externalisierenden Zellen nach 6 h Stimulation bzw. der Anteil der hypodiploiden Nuklei nach 24 h als Maß für die Apoptose dargestellt.

Um zu überpüfen, ob die Annexin-I-Externalisierung ein generelles apoptotisches Phänomen und

damit vom Stimulus unabhängig ist, wurden weitere Apoptose-Stimuli getestet. In Abbildung 3.15D ist

links der zeitliche Verlauf der Annexin-I-Exposition in Jurkat Zellen nach Behandlung mit Staurosporin,

anti-CD95-Antikörper, Etoposid oder UV-Bestrahlung bzw. nicht behandelter Zellen gezeigt. Mit allen

verwendeten Stimuli konnte eine deutliche Annexin-I-Externalisierung beobachtet werden. Diese war

mit den verschiedenen Stimuli unterschiedlich stark und auch der zeitliche Verlauf der

Externalisierung war unterschiedlich. Nach Staurosporin-Behandlung war die Annexin-I-

Externalisierung am stärksten und am frühesten detektierbar. Im mittleren Teil der Abbildung ist die

Phosphatidylserin-Externalisierung als wichtiger Apoptose-Marker 6 h nach Apoptose-Induktion

dargestellt. Dabei wurde im Vergleich mit der Annexin-I-Oberflächenfärbung deutlich, dass zu diesem

Zeitpunkt unabhängig vom verwendeten Apoptose-Stimulus etwa 40 - 50 % der Jurkat Zellen

Phosphatidylserin (PS) externalisiert hatten, jedoch nach 6 h lediglich mit Staurosporin eine mäßige

Annexin-I-Externalisierung nachweisbar war. Als weiterer Apoptose-Marker und zur Kontrolle, dass

tatsächlich mit allen verwendeten Stimuli Apoptose ausgelöst werden konnte, wurde die DNA-

Fragmentierung gemessen (rechtes Schaubild), die nach 24 h mit allen Stimuli sehr deutlich war.

Daraus konnte geschlossen werden, dass die Annexin-I-Externalisierung apoptotischer Jurkat Zellen

ein spätes apoptotisches Ereignis ist und vor allem in PI-positiven Zellen stattfindet, zudem scheint

dieser Prozess unabhängig vom verwendeten Apoptose-Stimulus zu sein.

3.4.3 Die Externalisierung ist keine generelle Eigenschaft von Proteinen der Annexin-Familie

Um zu überprüfen, ob die beobachtete Annexin-I-Externalisierung spezifisch ist oder weitere Annexine

betrifft, wurden die Zellen gegen Annexin II und Annexin VII getestet. Zusätzlich wurden die

apoptotischen Jurkat Zellen zur Kontrolle mit anti-Vinculin-Antikörper inkubiert. 12 h nach Apoptose-

Induktion mit anti-CD95-Antikörper oder Etoposid konnte auf etwa 20 % der Zellen eine Oberflächen-

Exposition von Annexin I nachgewiesen werden, mit Staurosporin als Apoptose-Stimulus erfolgte auf

ca. 60 % der Jurkat Zellen eine Annexin-I-Oberflächenfärbung. Annexin II und Annexin VII waren nicht

auf der Oberfläche apoptotischer Jurkat Zellen detektierbar (Abbildung 3.16A). Mit einem anti-

Vinculin-Antikörper erfolgte keine Färbung. Damit konnte ausgeschlossen werden, dass der Annexin-

I-Nachweis durch Eindringen von Antikörpern in die bereits PI-positiven Zellen und damit durch eine

Färbung von intrazellulärem Protein zustande kam.

Um nachzuweisen, dass die hier untersuchten Proteine in Jurkat Zellen exprimiert werden, wurde eine

Westernblot-Analyse durchgeführt. Diese zeigte, dass Annexin I offensichtlich während der Apoptose

prozessiert wurde und neben dem p38 Volllängen-Protein eine deutliche Bande bei ca. 35 kDa

84

ERGEBNISSE

auftauchte (Abbildung 3.16B). Auch Annexin II und Vinculin wurden exprimiert und nach Staurosporin-

Behandlung prozessiert bzw. abgebaut. Für Annexin VII konnte mit dem verwendeten Antikörper zwar

keine Prozessierung während der Apoptose, aber eine deutliche Expression beobachtet werden.

Abbildung 3.16: Die Protein-Externalisierung spät-apoptotischer Jurkat Zellen ist kein generelles Phänomen innerhalb der Annexin-Familie (A) Verschiedene Apoptose-Stimuli induzieren die Annexin-I-Externalisierung, Annexin II und VII werden nicht externalisiert. Jurkat Zellen wurden wie in 3.15D behandelt und nach 12 h Inkubation gegen Annexin I, Annexin II, Annexin VII oder als extrazelluläre Färbekontrolle gegen Vinculin gefärbt und durchflusszytometrisch ausgewertet. Dargestellt ist jeweils der prozentuale Anteil positiver Zellen als Mittelwert mit Standardabweichung aus Triplikaten. (B) Western-Blot-Analyse der Proteinexpression. 1 x 106 Jurkat-Zellen wurden für 12 h in 1,5 mL Zellkulturmedium ± 2,5 µM Staurosporin inkubiert, anschließend lysiert, in einer SDS-PAGE (8 - 15 %) elektrophoretisch aufgetrennt und einer Westernblot-Analyse mit anti-Annexin-I-, anti-Annexin-II-, anti-Annexin-VII- und anti-Vinculin-Antikörper unterzogen.

3.4.4 Die Annexin-I-Externalisierung ist Zelltyp-abhängig und geht mit einer Spaltung von Annexin I einher

Nachdem aus den bisherigen Ergebnissen geschlossen werden konnte, dass die in Jurkat Zellen

beobachtete Externalisierung von Annexin I unabhängig vom Apoptose-Stimulus ist und keine

generelle Eigenschaft von Proteinen der Annexin-Familie, sollten weitere Zelllinien auf dieses

Phänomen hin untersucht werden. In Abbildung 3.17A ist der Anteil der Annexin-I-externalisierenden

Zellen bzw. der mit IgG1-Isotyp Kontroll-Antikörper gefärbten Zellen ohne und mit Apoptose-Induktion

dargestellt. Obwohl in allen Zelllinien erfolgreich Apoptose induziert werden konnte (Abbildung 3.17B),

wurde eine Annexin-I-Externalisierung lediglich in den verwandten T-lymphozytären Zelllinien Molt4

und Jurkat sowie in primären PHA-Blasten (vitale T-Lymphozyten) nachgewiesen. Die Zellen der akut-

myeloischen Leukämie-Zelllinien HL60 und THP-1, sowie HuT78 Zellen (kutane T-

Lymphoblastomlinie) und U937 Zellen (histiozytisches Lymphom) zeigten nach zwölf Stunden

Apoptose-Stimulation keine messbare Annexin-I-Exposition. Die Westernblot-Analyse ergab, dass in

allen Zelllinien, die Annexin I externalisierten, nach Apoptose-Induktion neben der 38-kDa-Volllängen-

Form auch eine 35 kDa große Spaltform von Annexin I nachweisbar war (Abbildung 3.17C). Am

deutlichsten war die Prozessierung in Jurkat Zellen, die auch die stärkste Annexin-I-Oberflächen-

85

ERGEBNISSE

exposition aufwiesen. In Zellen, die kein Annexin I externalisierten, war keine Spaltung detektierbar

(HuT78, HL60, U937 und THP-1), zudem war die Annexin-I-Expression in THP-1 Zellen auffallend

geringer als in allen anderen Zelllinien. Mit einem anti-Vinculin-Antikörper wurde belegt, dass dabei

vergleichbare Mengen an Zelllysat analysiert wurden.

Somit kann davon ausgegangen werden, dass die spät-apoptotische Externalisierung von Annexin I

offensichtlich mit einer Annexin-I-Prozessierung einhergeht, abhängig vom Zelltyp ist und sich auf

wenige der untersuchten Zelllinien beschränkt. Offen bleibt, ob zwischen Spaltung und

Externalisierung ein kausaler Zusammenhang besteht, und falls ja, welches Ereignis das andere

bedingt.

Abbildung 3.17: Annexin-I-Externalisierung und Spaltung in verschiedenen Zelllinien. (A) Annexin-I-Externalisierung nach 12 h Apoptose bei verschiedenen Zellen. 1 x 105 Zellen wurden für 12 h in 150 µl Zellkulturmedium ± 2,5 µM Staurosporin inkubiert, wie unter 3.15A gefärbt und anschließend durchflusszytometrisch ausgewertet. Dargestellt ist der prozentuale Anteil Annexin-I-positiver Zellen als Mittelwert aus Duplikaten. (B) DNA-Fragmentierung bei verschiedenen Zellen nach 24 h Stimulation. Zellen wurden 24 h lang wie in A behandelt. Anschließend wurde der prozentuale Anteil hypodiploider Nuklei durch Färbung der nukleären DNA mit Propidiumiodid als Maß für die Apoptose durchflusszytometrisch bestimmt. (C) Annexin I Prozessierung in verschiedenen Zelllinien. Jeweils 1 x 106 Zellen wurden in 1,5 mL Zellkulturmedium ± 2,5 µM Staurosporin für 24 h stimuliert, PHA-Blasten nur 12 h. Anschließend wurden die Zellen lysiert, in einer SDS-PAGE (8 - 15 %) elektrophoretisch aufgetrennt und einer Western-Blot-Analyse mit anti-Annexin-I- bzw. anti-Vinculin-Antikörper unterzogen.

86

ERGEBNISSE

3.4.5 Externalisiertes Annexin I bindet Calcium-abhängig an die phosphatidylserinreiche Oberfläche apoptotischer Zellen

Bereits Arur et al. und Fan et al. zeigten, dass externalisiertes Annexin I auf apoptotischen Jurkat

Zellen an Phosphatidylserin (PS) bindet (Arur et al., 2003; Fan et al., 2004). Ob dies auch für die hier

beobachtete Oberflächen-Exposition von Annexin I gültig ist und welcher Teil von Annexin I für die

Bindung auf apoptotischen Jurkat Zellen verantwortlich ist, sollte nachfolgend näher untersucht

werden.

Dazu wurde in Jurkat Zellen mit Staurosporin Apoptose induziert und die Zellen vor der Annexin I /

Propidiumiodid-Doppelfärbung mit Calciumchlorid-haltigem Puffer oder EGTA gewaschen. In

Abbildung 3.18A ist deutlich zu sehen, dass auf den EGTA-gewaschenen apoptotischen Zellen im

Gegensatz zu den mit CaCl2 inkubierten Zellen kein Annexin I mehr nachgewiesen werden konnte. In

Abbildung 3.18B ist der prozentuale Anteil Annexin-I-positiver Zellen über die gesamte Population

dargestellt. Um zu untersuchen, welcher Teil von Annexin I für die Calcium-abhängige Bindung

notwendig ist, wurden vitale oder früh-apoptotische Jurkat Zellen, die bereits PS externalisierten

jedoch noch kein endogenes Annexin I, mit gereinigten Cy2TM-markierten Annexin-I-Fragmenten mit

EGTA oder mit Calcium inkubiert. Dazu wurden die Annexin-I-Konstrukte aa1-346 (Volllängenprotein),

aa47-346 (N-terminal trunkiert) und aa1-46 (N-Terminus ohne Calcium- und Phospholipid-bindende

Annexin-Boxen) verwendet (Struktur von Annexin I: siehe Abbildung 1.6). Auf vitalen Kontrollzellen

wurde in keinem Fall eine Bindung von Annexin I nachgewiesen (Abbildung 3.18C). Auf apoptotischen

Zellen wurde in Anwesenheit von CaCl2 sowohl das Volllängen-Protein AnxI aa1-346 als auch der C-

terminale Teil AnxI aa47-346 gebunden, für den N-Terminus (aa1-46) konnte keine Bindung

nachgewiesen werden. In Gegenwart des Calcium-Chelators EGTA dagegen konnte auf

apoptotischen Jurkat Zellen keines der Fragmente gebunden werden.

Der Frage, ob die beobachtete Ca2+-abhängige Bindung von Annexin I auf der Oberfläche

apoptotischer Zellen tatsächlich über Phosphatidylserin erfolgt, wurde mit zwei unterschiedlichen

Ansätzen nachgegangen. Zum einen sollte die Bindung von Annexin I an Phosphatidylserin in vitro

untersucht werden. Dazu wurde rekombinantes Annexin I mit Micellen, die entweder aus

Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylserin bestanden oder nur PC enthielten, mit 5 mM CaCl2

oder 10 mM EGTA zwei Stunden bei 50.000 g und 4°C zentrifugiert. Ohne Phosphatidylserin ließ sich

Annexin I sowohl in Gegenwart von Calcium als auch von EGTA etwa zum gleichen Teil unspezifisch

pelletieren (Abbildung 3.18D), wobei sich der größere Teil des eingesetzten Proteins im Überstand

befand. Die gleiche Proteinverteilung wurde mit Phosphatidylserin-haltigen Micellen und EGTA

beobachtet. Bei Zentrifugation mit Phosphatidylserin und Calcium wurde Annexin I dagegen

quantitativ präzipitiert, und es konnte kein Protein mehr im Überstand nachgewiesen werden. Um zu

zeigen, dass Phosphatidylserin auch im Zellkultursystem für die Calcium-abhängige Bindung von

Annexin I an die Membranoberfläche essentiell ist, wurden vitale Jurkat Zellen mit Ionomycin

behandelt und anschließend mit Cy2TM-markierten rekombinanten Annexin-I-Fragmenten inkubiert.

Das Calcium-Ionophor Ionomycin führt in Jurkat Zellen in dem hier untersuchten Versuchszeitraum zu

einer schnellen und selektiven Phosphatidylserin-Externalisierung, ohne dass dabei sonstige aus der

Apoptose bekannte Oberflächenveränderungen der Membran auftreten. Wie in Abbildung 3.18E

dargestellt, wurde das N-terminale AnxI-Fragment (aa1-47) in Anwesenheit von Calciumchlorid weder

87

ERGEBNISSE

auf vitalen noch auf Ionomycin-stimulierten Zellen gebunden. Das Core-Fragment (AnxI aa47-346)

und das Volllängenprotein wurden an Ionomycin-behandelte Zellen gebunden, während sie an

unbehandelten Kontrollzellen deutlich schlechter gebunden wurden. Mit EGTA ließ sich die Bindung

komplett unterdrücken (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 3.18: Annexin I bindet Calcium-abhängig an (externalisiertes) Phosphatidylserin.

88

ERGEBNISSE

(A) Durchflusszytometrische Messung von externalisiertem Annexin I in An- oder Abwesenheit von Calcium. 1 x 105 Jurkat Zellen wurden für 12 h in 150 µl Zellkulturmedium ± 2,5 µM Staurosporin bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal in TBS + 5 mM CaCl2 oder 10 mM EGTA gewaschen und mit anti-Annexin-I- und anti-Maus-Cy2TM-Antikörper sowie Propidiumiodid doppelgefärbt. Dargestellt sind repräsentative Dot-Plots, wobei auf der x-Achse die Cy2TM (Fl1) und auf der y-Achse die Propidiumiodid-Färbung (Fl2) aufgetragen sind. (B) Quantitative Bestimmung des Anteils Annexin-I-exponierender Zellen. Aus den Quadranten-Darstellungen in A wurde der prozentuale Anteil Annexin-I-positiver Zellen errechnet und ist als Mittelwert mit Standardabweichung aus Triplikaten angegeben. (C) Bindung verschiedener Annexin-I-Fragmente an apoptotische Zellen. 1 x 105 Jurkat-Zellen wurden für 3 h in 150 µl Zellkulturmedium in An- oder Abwesenheit von 2,5 µM Staurosporin in einer 96-well-Platte bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 5 mM CaCl2 oder 10 mM EGTA und 5 µg/mL Cy2TM-markierten rekombinanten Annexin-I-Fragmenten (aa1-46, aa47-346 und aa1-346) sowie Propidiumiodid inkubiert und danach durchflusszytometrisch ausgewertet. Dargestellt sind Histogramme der Propidiumiodid-negativen Zellpopulation. Der Anteil der Cy2TM-gefärbten apoptotischen Population ist jeweils angegeben. (D) Präzipitation von rekombinantem Annexin I mit Phosphatidylserin-Micellen und Nachweis mittels Silberfärbung. Jeweils 1 µg rekombinantes Volllängen-AnxI (aa1-346) wurde in Gegenwart von 5 mM CaCl2 oder 10 mM EGTA mit 100 µg Phosphatidylserin-Micellen (PS) 30 min bei 37°C inkubiert und anschließend 2 h bei 50.000 g und 4°C zentrifugiert. Das dabei entstandene Sediment wurde einmal mit TBS + 5 mM CaCl2 bzw. 10 mM EGTA gewaschen und erneut abzentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt, mit TCA gefällt und zusammen mit dem jeweiligen Pellet und einem nicht zentrifugierten Ansatz (Input) in einer SDS-PAGE (8 - 15 %) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Detektion erfolgte durch Silberfärbung. (E) Bindung von Cy2TM-markiertem rekombinantem Annexin I an die Zelloberfläche von Ionomycin-behandelten Jurkat-Zellen. 1 x 105 vitale Jurkat-Zellen ± 4 µM Ionomycin wurden in Anwesenheit von 5 mM CaCl2 mit 0 - 10 µg/mL Cy2TM-markierten rekombinanten Annexin-I-Fragmenten und Propidiumiodid doppelgefärbt und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. Dargestellt ist der prozentuale Anteil Propidiumiodid negativer und Cy2TM positiver Zellen als Mittelwert aus Duplikaten.

3.4.6 Der knock down von Annexin I hat keinen Einfluss auf die Phagozytose spät-apoptotischer Jurkat-Zellen

Wie bis hierher gezeigt werden konnte, wird Annexin I in apoptotischen Jurkat Zellen prozessiert,

externalisiert und auf der Phosphatidylserin-reichen Oberfläche Calcium-abhängig gebunden. Arur

und Fan zeigten in ihren Veröffentlichungen, dass Annexin I die Phagozytose apoptotischer Zellen

stimuliert (Arur et al., 2003; Fan et al., 2004). Deshalb lag die Vermutung nahe, auch die hier

beobachtete Annexin-I-Externalisierung apoptotischer Jurkat Zellen könnte einen Einfluss auf deren

Eliminierung haben. Um dies zu untersuchen, wurden Jurkat Zellen 14 h nach UV-Bestrahlung

entweder mit Calciumchlorid- oder EGTA-haltigem Puffer gewaschen und mit ausdifferenzierten THP-

1 oder U937 Makrophagen inkubiert. Abbildung 3.19A zeigt, dass das Abwaschen von Annexin I von

der Oberfläche apoptotischer Jurkat Zellen mit EGTA-Puffer zu keinem Zeitpunkt einen Einfluss auf

die Phagozytose durch THP-1 und U937 Zellen hatte. Ein Problem bei dieser Methode könnte jedoch

sein, dass eine Annexin-I-Externalisierung auch während der Ko-Inkubation von Phagozyten und

apoptotischen Beutezellen stattgefunden haben könnte und so bei längerer Inkubationsdauer der

Effekt der EGTA-Vorbehandlung der apoptotischen Zellen reversibel sein könnte. Die von Fan et al.

beobachtete inhibierte Phagozytose durch das Abwaschen von Annexin I wurde nach 30-minütiger

Ko-Inkubation von apoptotischen Zellen und Makrophagen gemessen (Fan et al., 2004). Im

Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Arbeit, wie in Abbildung 3.19A dargestellt, nach 30 bzw.

45 Minuten Phagozytose (THP-1 oder U937 Makrophagen) kein Unterschied nachgewiesen werden,

jedoch war zu diesem Zeitpunkt der Anteil internalisierter Jurkat Zellen und der Phagozytose-Index

sehr gering.

Um dieses Problem zu umgehen und die Annexin-I-Externalisierung während der Apoptose

nachhaltiger reduzieren zu können, wurden Jurkat Zellen vor den Phagozytosetests mit Annexin-I-

spezifischer siRNA transfiziert, um die Annexin-I-Expression und damit auch die Externalisierung zu

inhibieren. 6 Tage nach der 1. Transfektion war das Expressions-Niveau am stärksten reduziert und

89

ERGEBNISSE

die Zellen wurden 14 h nach Apoptose-Induktion an THP-1 bzw. U937 Makrophagen verfüttert. Der

knock down von Annexin I mit zwei spezifischen siRNA-Oligonukleotiden (nt148 und nt893) hatte im

Vergleich zu den mit Kontroll-Oligonukleotid (Scramble) behandelten Jurkat Zellen keinen Einfluss auf

die Phagozytose der Zellen, weder mit THP-1 noch mit U937 Fresszellen (Abbildung 3.19B).

Abbildung 3.19C zeigt die Westernblot-Analyse der Annexin-I-Expression in Jurkat Zellen zum

Zeitpunkt der Apoptose-Induktion. Mit beiden spezifischen siRNA´s konnte die Expression sehr

deutlich reduziert, wenn auch nicht komplett inhibiert werden. Als Ladekontrolle diente Vinculin.

Abbildung 3.19: Abwaschen oder knock down von Annexin I hat keinen Einfluss auf die Phagozytose spät-apoptotischer Jurkat Zellen. (A) Phagozytose von Jurkat Zellen durch THP-1 und U937 Makrophagen nach dem Abwaschen von Annexin I. Monozytäre THP-1 und U937 Zellen wurden 3 Tage vor den Tests mit grünem PKH67 Farbstoff angefärbt. Dann wurden jeweils 100.000 THP-1 oder U937 Zellen in 24-well-Platten mit 1 nM (THP-1) bzw. 10 nM PMA (U937) für 16 h inkubiert, das PMA-Medium abgewaschen und die Zellen zur weiteren Differenzierung für 48 h in Zellkulturmedium inkubiert. Jurkat Zellen wurden mit rotem PKH26 Farbstoff gefärbt, in serumfreiem Medium mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und 14 h inkubiert. Danach wurden die Zellen 2x in TBS mit 10 mM EGTA oder 5 mM CaCl2 gewaschen und je 200.000 Jurkat Zellen in serumfreiem Medium mit den ausdifferenzierten Makrophagen für die angegebenen Zeiten inkubiert. Die Analyse der Phagozytosetests erfolgte durchflusszytometrisch (siehe 2.2.6). Angegeben sind die Mittelwerte aus Dublikaten bzw. Mittelwert ± Standardabweichung aus Triplikaten. (B) Phagozytose nach Annexin-I-knock-down in Jurkat Zellen. Monozytäre THP-1 und U937 Zellen wurden wie unter 3.19A gefärbt und ausdifferenziert. Jurkat Zellen wurden an den Tagen 6 und 3 vor den Tests mit 100 µM AnxI-siRNA elektroporiert (2 spezifische siRNA-Oligonukleotide (nt148 und nt893) bzw. Kontroll-Oligonukleotid (Scramble)). Dann wurden die Zellen mit rotem PKH26 Farbstoff gefärbt, in serumfreiem Medium mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und 14 h inkubiert. Danach wurden die Zellen in serumfreiem Medium in den angegebenen Verhältnissen mit den ausdifferenzierten Makrophagen inkubiert (mit

90

ERGEBNISSE

THP-1 für 2 h, mit U937 für 2,5 h). Die Analyse der Phagozytosetests erfolgte durchflusszytometrisch (siehe 2.2.6). Dargestellt sind Mittelwerte aus Dublikaten bzw. Mittelwert ± Standardabweichung aus Triplikaten. (C) Annexin-I-Expression nach knock down. Jurkat Zellen wurden wie unter 2.2.3 beschrieben zweimal mit zwei AnxI-spezifischen siRNA-Oligonukleotiden (148 bzw. 893) oder Kontroll-Oligonukleotid (Scr) elektroporiert. Nach insgesamt 6 Tagen Inkubationsdauer wurden die Zellen geerntet, lysiert und 7 µg Protein pro Probe in einer SDS-PAGE (12 %) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Westernblot-Analyse erfolgte mit dem anti-Annexin-I-Antikörper, als Ladekontrolle wurde Vinculin detektiert. Dargestellt ist ein repräsentativer Westernblot aus mehreren Versuchen.

3.4.7 Die Beschichtung apoptotischer THP-1 Zellen mit Annexin I stimuliert deren Phagozytose

Wie unter 3.4.6 dargestellt, hatte das Abwaschen von Annexin I und der Annexin-I-knock-down keinen

wesentlichen Einfluss auf die Phagozytose spät-apoptotischer Jurkat Zellen durch verschiedene

Makrophagen. Dies könnte daran liegen, dass Annexin I lediglich eines von mehreren

Brückenmolekülen der phagozytotischen Synapse darstellt (Lauber et al., 2004) und das Fehlen eines

Faktors nicht unbedingt zu einer messbar eingeschränkten Phagozytose apoptotischer Zellen führen

muss. Es könnte jedoch auch daran liegen, dass obwohl der Annexin-I-knock-down sehr effektiv war,

noch eine geringe Annexin-I-Expression nachweisbar war (siehe Abbildung 3.19C) und diese

ausreichend für die Funktion von Annexin I während der Phagozytose sein könnte. Deshalb sollte in

einem weiteren Ansatz untersucht werden, ob eine Annexin-I-Beschichtung von Zellen, die während

der Apoptose kein Annexin I externalisieren, Einfluss auf die Phagozytose dieser Zellen hat.

Dazu wurden als apoptotische Beutezellen THP-1 Monozyten verwendet, die eine sehr geringe

endogene Annexin-I-Expression aufweisen und während der Apoptose kein Annexin I externalisieren

(Abbildung 3.17A und C), jedoch nach Apoptose-Induktion eine deutliche PS-Externalisierung zeigen

(Daten nicht gezeigt). Die THP-1 Zellen wurden dazu mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und nach 12 h

entweder mit gereinigtem rekombinantem Annexin I (aa1-46, aa1-346 und aa47-346), fettsäurefreiem

BSA oder TBS (Kontrolle) inkubiert. Nach der Beladung der Zellen wurden diese in unterschiedlichen

Verhältnissen für 2,5 h mit U937 Makrophagen bzw. für 2 h mit THP-1 Makrophagen inkubiert. Somit

wurden THP-1 Zellen in diesem Ansatz sowohl als apoptotische „Beute“ als auch in ausdifferenzierter

Form als Phagozyten eingesetzt. Abbildung 3.20A zeigt, dass die Phagozytose apoptotischer THP-1

Zellen durch U937 sowohl mit der Volllängenform von Annexin I (aa1-346) als auch mit dem Core-

Fragment (aa47-346) gegenüber der Kontrolle, der Inkubation mit dem N-Terminus (aa1-46) oder BSA

deutlich verstärkt war. Wurden THP-1 Zellen als Phagozyten eingesetzt, war dieser Effekt noch

stärker zu sehen und der Phagozytoseindex nach Beladung mit AnxI aa1-346 und aa47-346 mehr als

doppelt so hoch im Vergleich zur Kontrolle.

91

ERGEBNISSE

Abbildung 3.20: Extern zugegebenes Annexin I verstärkt die Phagozytose von apoptotischen THP-1 Zellen (A) Phagozytose apoptotischer THP-1 Zellen durch U937 Makrophagen nach Beschichtung mit verschiedenen Annexin-I-Formen. Monozytäre U937 Zellen wurden mit grünem PKH67 Farbstoff gefärbt, für 16 h mit 10 nM PMA stimuliert und anschließend für weitere 48 h in Zellkulturmedium ohne PMA inkubiert. THP-1 Zellen wurden mit rotem PKH26 Farbstoff angefärbt, mit 10 mJ/cm2 UV-Licht bestrahlt und für 12 h in serumfreiem Medium inkubiert. Danach wurden die Zellen mit 2 µM gereinigtem humanem AnxI aa1-346 (Volllänge), aa47-346 (N-terminal trunkiert) und aa1-47 (N-Terminus) oder fettsäurefreiem BSA (alles in TBS + 5 mM CaCl2) für 30 min bei 4°C inkubiert oder nur in TBS + 5 mM CaCl2 inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert, in serumfreiem Medium aufgenommen und in verschiedenen Verhältnissen zu den ausdifferenzierten U937 Zellen gegeben und für 2,5 h inkubiert. Die Analyse erfolgte durchflusszytometrisch (siehe 2.2.6). Dargestellt sind Mittelwerte aus Dublikaten. (B) Einfluss von Annexin I auf die Phagozytose apoptotischer THP-1 Zellen durch THP-1 Makrophagen. Monozytäre THP-1 Zellen wurden mit PKH67 grün gefärbt, mit 1 nM PMA für 16 h stimuliert und anschließend für weitere 48 h in Zellkulturmedium differenziert. Die THP-1-Beutezellen wurden wie unter 3.20A gefärbt, UV-bestrahlt, mit verschiedenen gereinigten Annexin-I-Formen (siehe 2.1.4) oder BSA inkubiert und mit THP-1 Makrophagen für 2 h in serumfreiem Medium ko-inkubiert. Die Analyse erfolgte durchflusszytometrisch, dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus Triplikaten.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Annexin I offensichtlich keinen Einfluss auf die iPLA2-

vermittelte Produktion löslicher Attraktionssignale wie Lysophosphatidylcholin während der Apoptose

hat. Vielmehr wird Annexin I in einigen Zelllinien während der Apoptose prozessiert und auf der

Zelloberfläche als Brückenmolekül in der phagozytotischen Synapse präsentiert, wobei die Bindung

Calcium-abhängig an Phosphatidylserin erfolgt. Das Abwaschen oder der knock down von Annexin I

hat keinen Einfluss auf die Phagozytose apoptotischer, Annexin-I-externalisierender Jurkat Zellen.

Dies könnte möglicherweise an der Redundanz der verschiedenen auf apoptotischen Zellen

präsenten „eat-me“-Signalen liegen. Dagegen kann die Phagozytose von Zellen, die während der

Apoptose keine Annexin-I-Exposition zeigen, durch die Beschichtung dieser Zellen mit Annexin I

deutlich verstärkt werden.

92

DISKUSSION

4 Diskussion

4.1 Prozessierung und Aktivierung der iPLA2 während der Apoptose

Neben den bekannten, auf apoptotischen Zellen gebundenen Phagozytose- bzw. „eat-me“-Signalen,

die für eine effiziente Eliminierung sterbender Zellen notwendig sind, war lange Zeit wenig bekannt

über die Signale, die professionelle Phagozyten zu ihren Beutezellen führen. Eine zentrale

Entdeckung war, dass apoptotische Zellen Lysophosphatidylcholin (LPC) freisetzen, das zur

Anlockung und damit zur aktiven Migration von Monozyten führt (Lauber et al., 2003). LPC entsteht

dabei durch die iPLA2-vermittelte Hydrolyse von Phosphatidylcholin (PC), einem Hauptbestandteil der

Plasmamembran. Dabei hat man beobachtet, dass iPLA2 während der Apoptose Caspase-3-abhängig

prozessiert wird und danach mehr LPC freigesetzt wird. Die genauen Mechanismen jedoch, die zur

Generierung und Freisetzung von LPC in apoptotischen Zellen führen, waren bislang unklar.

In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb untersucht werden, ob die beobachtete Spaltung von iPLA2

tatsächlich zu deren Aktivierung führt und ob dies hinreichend für die Generierung und Freisetzung

des Attraktionssignals LPC ist. Zuerst wurde dazu das genaue iPLA2-Prozessierungsmuster in

apoptotischen MCF7casp3 und MCF7vektor Zellen analysiert und festgestellt, dass sowohl die

Volllängenform von iPLA2 (aa1-806) als auch ein intermediäres Konstrukt (iPLA2 aa514-806)

ausschließlich in Caspase-3-exprimierenden Zellen an den Caspase-Schnittstellen DLFD513 und

MVVD733 gespalten werden. Dadurch entsteht ein 26 kDa großes Fragment, das der

Aminosäuresequenz von iPLA2 aa514-733 entspricht (siehe Abschnitt 3.1.1). Dass diese

Prozessierung direkt durch Caspase-3 und nicht durch eine andere Protease geschieht, konnte in vitro

durch den Verdau gereinigter iPLA2 mit gereinigter Caspase-3 gezeigt werden (Abbildung 3.1C). Die

von Atsumi et al. beschriebene Spaltung in ein 70-kDa-Fragment (iPLA2 aa184-806) (Atsumi et al.,

2000) konnte in der vorliegenden Arbeit insofern nachvollzogen werden, als dass bei der

Prozessierung auch ein etwa 70 kDa großes, intermediäres Fragment detektierbar war. Jedoch war

sowohl im Rahmen der Untersuchungen von apoptotischen Zelllysaten als auch bei den in vitro-

Versuchen das 26 kDa große Spaltfragment von iPLA2 als finales Produkt nachweisbar (Abbildung

3.1B und C). Atsumi et al. zeigten außerdem, dass die Prozessierung von iPLA2 nach CD95-

induzierter Apoptose zu einer gesteigerten Arachidonsäurefreisetzung dieser Zellen führt (Atsumi et

al., 2000), während sie in einer früheren Arbeit keine veränderte iPLA2-Aktivität in den entsprechenden

Zelllysaten nachweisen konnten (Atsumi et al., 1998). Deshalb wurde vermutet, die Spaltung von

iPLA2 könnte zu einer veränderten Affinität des Enzyms zu intrazellulären Membranen und damit zum

Substrat PC führen. In der vorliegenden Arbeit zeigte jedoch die Analyse der Lokalisation der

verschiedenen iPLA2-Konstrukte in vitalen Zellen eine gleichmäßige, unveränderte Verteilung aller

iPLA2-Formen zwischen Cytosol- und Membranfraktion und somit auch nach der Prozessierung keine

messbar veränderte Lokalisation des Enzyms zugunsten einer verstärkten Membranbindung

(Abbildung 3.1D).

In ihrer Veröffentlichung konnten Atsumi et al. weiterhin zeigen, dass während der Apoptose sowohl

iPLA2 als auch cPLA2 gespalten werden, wobei cPLA2 im Gegensatz zur iPLA2 durch die

Prozessierung inaktiviert wird (Atsumi et al., 2000). Außerdem konnten sie nach Expression eines 70-

93

DISKUSSION

kDa-iPLA2-Fragments eine gesteigerte Arachidonsäure-Freisetzung nachweisen, jedoch keine erhöhte

iPLA2-Aktivität (siehe oben). Im Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen

werden, dass die Spaltung der Volllängen-iPLA2 in ein 26 kDa großes Fragment zu einer deutlichen

Aktivitätssteigerung des Enzyms führt (siehe Abschnitt 3.1.2). Dies konnte sowohl bei einer

durchflusszytometrischen Messung als auch in Zelllysaten gezeigt werden. Daraus kann gefolgert

werden, dass die Caspase-3-vermittelte Spaltung der iPLA2 tatsächlich auch zu deren Aktivierung

führt.

Es konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass eine zusätzliche Regulierung der iPLA2-

Aktivität, z.B. durch Interaktion mit möglichen Inhibitoren, erfolgt, da iPLA2 nativ als oligomerer

Komplex mit einem Molekulargewicht von 270 - 350 kDa von Larsson et al. und Ackermann et al.

beschrieben wurde. Die Autoren haben die Vermutung formuliert, dass in diesem Komplex neben dem

Volllängenprotein auch alternative Splice-Isoformen von iPLA2, wie die Ankyrin-Motive, gebunden sein

könnten, die inhibitorisch auf die iPLA2-Aktivität wirken (Ackermann et al., 1994; Larsson et al., 1998).

In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch nicht beobachtet werden, dass die Überexpression der N-

terminalen Ankyrin-Motive ohne aktives Zentrum (aa1-512) zu einer verminderten LPC-Freisetzung

während der Apoptose führt. Somit kann die Hypothese von Larsson et al. zumindest für apoptotische

Zellen hier nicht bestätigt werden (siehe Abbildung 3.5). Möglicherweise liegt dieser

Regulationsmechanismus auch nur in vitalen Zellen vor und wird durch die Caspase-3-vermittelte

Prozessierung von iPLA2 aufgehoben.

Andere Arbeitsgruppen zeigten, dass die iPLA2 in vitalen Zellen Calcium-abhängig mit Calmodulin

assoziiert ist und diese Interaktion zu einer verminderten iPLA2-Aktivität führt (Jenkins et al., 2001;

Smani et al., 2004). Durch die Entleerung intrazellulärer Calcium-Speicher kommt es zur Freisetzung

des so genannten Calcium Influx Factors (CIF), der Calmodulin aus der Bindung mit iPLA2 verdrängt

und so zu deren Aktivierung führt. Dabei konnten zwei mögliche Calmodulin-Bindungsdomänen für

iPLA2 identifiziert werden, die zwischen dem aktiven Zentrum (GTST520) und dem C-Terminus liegen.

Durch die Prozessierung der Volllängenform von iPLA2 (aa1-806) zu iPLA2 aa514-733 (26 kDa) wird

lediglich eines der Calmodulin-Bindungsmotive abgespalten und somit wäre eine Assoziation der 26

kDa iPLA2-Form mit Calmodulin denkbar. Da jedoch, wie in Abschnitt 3.1.2 dargestellt, iPLA2 aa514-

733 auch in vitalen Zellen eine deutlich höhere Aktivität aufwies als das Volllängenprotein, scheint

diese mögliche Calmodulin-Bindung keinen wesentlichen inhibitorischen Einfluss auf die Aktivität der

prozessierten iPLA2 zu haben. Trotzdem kann eine regulatorische Funktion von Calmodulin auf die

iPLA2-Aktivität sowohl in vitalen als auch in apoptotischen Zellen an dieser Stelle nicht vollständig

ausgeschlossen werden.

Ein weiterer Faktor, der hemmend auf die iPLA2-Aktivität wirken könnte, ist die potentielle Interaktion

mit dem Phospholipase-A2-Inhibitor Annexin I. In diesem Zusammenhang konnte eine direkte

Interaktion von Annexin I mit der cytosolischen, Calcium-abhängigen Phospholipase A2 (cPLA2) durch

Ko-Immunpräzipitationen nachgewiesen werden, wobei die Bindung über den N-Terminus von cPLA2

erfolgt (Kim et al., 2001). Außerdem konnten die Autoren zeigen, dass die Überexpression von

Annexin I inhibitorisch auf die Gesamt-PLA2-Aktivität wirkt. In einer weiteren Arbeit wurde zusätzlich

belegt, dass der knock down von Annexin I zu einer gesteigerten PLA2-Aktivität führt, jedoch wiesen

die Autoren darauf hin, dass dabei nicht zwischen spezifischer cPLA2- und iPLA2-Aktivität

94

DISKUSSION

unterschieden werden konnte (Solito et al., 1998). Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht

werden, ob Annexin I mit iPLA2 assoziiert ist und möglicherweise Einfluss auf deren Aktivität und

damit auf die Generierung des Attraktionssignals LPC hat. Wie in Abschnitt 3.4.1 beschrieben, konnte

in vitalen MDA-MB 231 Zellen keine Interaktion von Annexin I mit der iPLA2 nachgewiesen werden,

und weder die Induktion der Annexin-I-Expression mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) noch die

Überexpression verschiedener Annexin-I-Konstrukte in MCF7casp3 Zellen führte zu einer verminderten

Freisetzung des Attraktionssignals nach Apoptose-Induktion. Dies lässt darauf schließen, dass

Annexin I in apoptotischen Zellen nicht inhibitorisch auf die iPLA2-Aktivität wirkt und somit keinen

Einfluss auf die LPC-Generierung hat.

4.2 Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin während der Apoptose

Bis hierher konnte gezeigt werden, dass iPLA2 während der Apoptose durch Caspase-3 prozessiert

wird und dadurch ein 26 kDa großes Spaltfragment entsteht (iPLA2 aa514-733), das eine wesentlich

höhere Aktivität aufweist als das Volllängenprotein (aa1-806) oder die 32-kDa-iPLA2 aa514-806. Wie

bereits erwähnt, konnten Atsumi et al. beobachten, dass nach Überexpression der iPLA2 Spaltform

aa184-806 sowohl vitale als auch apoptotische HEK293 Zellen mehr Arachidonsäure freisetzen als

Zellen, die das Volllängenprotein exprimieren (Atsumi et al., 2000). Andere Arbeitsgruppen zeigten,

dass die Überexpression der iPLA2 zu einer verstärkten Generierung von Lysophosphatidylcholin und

Arachidonsäure führt (Perez et al., 2004) und LPC auf der Oberfläche apoptotischer Zellen wichtig ist

für eine effiziente Eliminierung dieser Zellen (Kim et al., 2002; Perez et al., 2006). Dass das durch die

iPLA2-vermittelte Hydrolyse von Phosphatidylcholin entstehende LPC auch als lösliches

Attraktionssignal in die Überstände apoptotischer Zellen freigesetzt wird und zur Anlockung von

Phagozyten führt, zeigten Lauber et al.. LPC wurde dabei durch eine massenspektrometrische

Analyse der Überstände vitaler und apoptotischer Zellen bestimmt (Lauber et al., 2003).

In der vorliegenden Arbeit sollte ergänzend dazu eine direkte Quantifizierung der freigesetzten Menge

an LPC vorgenommen werden. Aus den Zellkulturüberständen von vitalen und apoptotischen

MCF7casp3 Zellen wurden die Lipide extrahiert und mittels eines enzymatischen Tests LPC

nachgewiesen. Apoptotische Zellen setzten demnach im Vergleich mit vitalen Zellen etwa die doppelte

Menge an LPC frei. Bei dem gewählten Ansatz von 2 x 106 Zellen pro mL Überstand entsprach dies

einer Konzentration von 100 nM (siehe Abbildung 3.3). Damit konnte bestätigt werden, dass

apoptotische MCF7casp3 Zellen das Phospholipid-Attraktionssignal LPC freisetzen, wie bereits durch

die massenspektrometrischen Analysen von Lauber et al. gezeigt (Lauber et al., 2003).

Da bei der iPLA2-vermittelten hydrolytischen Spaltung von Phospholipiden neben einer freien

Fettsäure (meist Arachidonsäure) Lysophospholipide entstehen, und iPLA2 wichtig ist für die

Generierung des apoptotischen Attraktionssignals LPC (Lauber et al., 2003), sollte untersucht werden,

ob die in den Abschnitten 3.1.1 und 3.1.2 gezeigte Spaltung und Aktivierung von iPLA2 hinreichend für

die gemessene LPC-Freisetzung ist (siehe Abschnitt 3.2.1). Es zeigte sich, dass die Hemmung von

iPLA2 mit dem spezifischen iPLA2-Inhibitor Bromenollacton (BEL) konzentrationsabhängig zu einem

verminderten chemotaktischen Potential der Überstände apoptotischer Zellen führte, unabhängig vom

95

DISKUSSION

verwendeten Apoptose-Stimulus (siehe Abbildung 3.4). Ab einer Konzentration von 10 - 15 µM BEL

war die Migration der THP-1 Monozyten komplett inhibiert und das chemotaktische Potential der

Überstände apoptotischer Zellen vergleichbar mit dem der Überstände vitaler Zellen. In der

vorliegenden Arbeit wurden zur Untersuchung der Prozessierung und Aktivierung von iPLA2

Expressionskonstrukte verwendet, die ausgehend von der Sequenz der 86 kDa iPLA2β (aa1-806)

hergestellt wurden (Larsson et al., 1998). Durch die Verwendung der R- und S-Enantiomere von BEL,

die spezifisch die Isoformen iPLA2γ (R-BEL) bzw. iPLA2β (S-BEL) inhibieren (Jenkins et al., 2002; Yan

et al., 2005) konnte zudem gezeigt werden, dass tatsächlich aktive iPLA2β essentiell für die

Generierung des Attraktionssignals LPC während der Apoptose ist (Abbildung 3.4B).

Für den hier verwendeten iPLA2-Inhibitor BEL wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen

konzentrationsabhängige pro- und anti-apoptotische Effekte beschrieben. So zeigten Fuentes et al.,

dass mit einer Konzentration von 25 µM BEL in vitalen U937 Zellen bereits nach 2 h die

Prozessierung von Caspasen und des Caspase-Substrats PARP induziert werden kann und die Zellen

nach längerer Inkubationsdauer eine deutliche Phosphatidylserin-Externalisierung und DNA-

Fragmentierung aufweisen (Fuentes et al., 2003). Eine verzögerte PS-Externalisierung durch die

Behandlung apoptotischer peripherer Blut-T-Lymphozyten mit 10 µM BEL belegte dagegen eine

andere Veröffentlichung, jedoch waren hier sowohl die Caspase-3-Aktivität als auch die PARP-

Spaltung unverändert (Kim et al., 2002). In der vorliegenden Arbeit zeigte die Analyse der Spaltung

des Caspase-Substrats Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) in MCF7casp3 Zellen in An- oder

Abwesenheit von 20 µM BEL nach Apoptose-Induktion, dass die Inhibierung von iPLA2 durch BEL

weder einen hemmenden noch einen fördernden Einfluss auf die PARP-Spaltung und damit indirekt

auf die Caspase-Aktivität hatte (Abbildung 3.4C). Dies lässt darauf schließen, dass auch die Caspase-

3-vermittelte Prozessierung von iPLA2 nicht durch BEL beeinflusst wird. Damit kann die nach BEL-

Behandlung beobachtete verminderte Transmigration von THP-1 Monozyten tatsächlich auf eine

verminderte LPC-Freisetzung zurückgeführt werden. Ob andere apoptotische Ereignisse durch die

hier vorgenommene BEL-Behandlung beeinflusst wurden, kann damit jedoch nicht ausgeschlossen

werden.

Nachdem gezeigt werden konnte, dass iPLA2 während der Apoptose durch Caspase-3 prozessiert

und aktiviert wird und aktive iPLA2β essentiell ist für die Generierung des löslichen Attraktionssignals

LPC, stellte sich die Frage, ob die Aktivierung von iPLA2 alleine ausreichend ist für die Produktion und

Freisetzung von LPC. Um dies zu untersuchen, wurden in MCF7casp3 Zellen die Volllängen-Form von

iPLA2 (aa1-806), die trunkierte aktive 26-kDa-Form iPLA2 aa514-733 oder die N-terminalen Ankyrin-

Motive ohne aktives Zentrum (iPLA2 aa1-512) exprimiert. Dabei ließ sich beobachten, dass nach UV-

Bestrahlung das chemotaktische Potential der Überstände dieser Zellen, und damit die Migration von

THP-1 Monozyten, durch die Expression von iPLA2 aa1-806 und noch deutlicher durch iPLA2 aa514-

733 gesteigert werden konnte (siehe Abbildung 3.5A). Dagegen hatte weder die Expression des 86-

kDa-Volllängenproteins noch der aktiven 26-kDa-Form einen Einfluss auf das chemotaktische

Potential von Überständen vitaler Zellen. Die Expression der 56 kDa großen N-terminalen Ankyrin-

Region ohne aktives Zentrum (aa1-512) übte in keinem Fall einen Einfluss auf die Freisetzung von

LPC aus. Dies widerspricht den Beobachtungen von Larsson et al., die eine hemmende Wirkung der

Ankyrin-Motive auf die iPLA2-Aktivität vermuteten (Larsson et al., 1998). Wie bereits in Abschnitt 4.1

96

DISKUSSION

angesprochen, könnte eine mögliche Ursache für diesen Widerspruch in der Spaltung der iPLA2

während der Apoptose liegen, wodurch eine möglichen inhibitorische Wirkung der Ankyrin-Motive

aufgehoben werden könnte.

Die Beobachtung, dass aktive iPLA2β essentiell ist für die LPC-Generierung in apoptotischen Zellen,

die Expression der aktiven 26-kDa-iPLA2 jedoch nur in apoptotischen und nicht in vitalen Zellen zu

einer gesteigerten Freisetzung des Attraktionssignals führt, warf die Frage auf, welche weiteren

apoptotischen Ereignisse neben der Spaltung und Aktivierung von iPLA2 für die LPC-Generierung und

Freisetzung verantwortlich sind.

Ein mit der Apoptose eng assoziiertes Phänomen ist die Entstehung von oxidativem Stress in Form

reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS). Diese entstehen vor allem durch die Unterbrechung der

Atmungskette während des Verlusts des mitochondrialen Membranpotentials und der Freisetzung von

Cytochrom c und können sowohl Proteine, Nukleinsäuren als auch Lipide peroxidieren (Chundra et

al., 2000; Kagan et al., 2003; Raha und Robinson, 2001). Verschiedene Arbeitsgruppen zeigten, dass

während der Apoptose insbesondere die spezifische Oxidation von Phosphatidylserin für dessen

Externalisierung und die Erkennung durch Makrophagen wichtig ist (Kagan et al., 2002; Matsura et al.,

2002). Jedoch wurde auch oxidiertes Phosphatidylcholin auf apoptotischen Membranen

nachgewiesen und belegt, dass es eine wichtige Rolle für die Erkennung apoptotischer Zellen durch

Phagozyten spielt (Chang et al., 1999; Huber et al., 2002; Kagan et al., 2000). Zudem kommt es nach

H2O2-induzierter Apoptose zu einem erhöhten iPLA2-vermittelten Phospholipid-Um- und Abbau und

dabei zu einem erhöhten intrazellulären Spiegel an Lysophosphatidylcholin und zu einer vermehrten

Freisetzung von Arachidonsäure (Balboa und Balsinde, 2002; Perez et al., 2006; Perez et al., 2004).

Ein Grund dafür ist, dass oxidierte Phospholipide, wahrscheinlich aufgrund ihrer veränderten

sterischen Anordnung in der Membran, anfälliger für eine PLA2-vermittelte Hydrolyse zu sein scheinen

als nicht-oxidierte. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob oxidativer Stress

auch bei der Generierung des löslichen Phospholipid-Attraktionssignals LPC eine Rolle spielt. Durch

die Inkubation von MCF7casp3 Zellen mit dem Antioxidanz α-Tocopherol, das zur Entgiftung von ROS

beiträgt und somit Lipide vor Oxidation schützen kann, wurde die Freisetzung apoptotischer

Attraktionssignale fast vollständig inhibiert (siehe Abschnitt 3.2.3). Die α-Tocopherol-behandelten

Zellen zeigten dabei eine deutlich geringere Menge an Lipid-Hydroperoxiden (LOOH) als nicht-

vorbehandelte apoptotische Zellen, die vergleichbar war mit der Menge an LOOH in vitalen

Kontrollzellen. Somit konnte nachgewiesen werden, dass neben der Prozessierung und Aktivierung

von iPLA2 auch die Lipidperoxidation durch ROS während der Apoptose ein bedeutender Faktor ist,

der zur Generierung des Attraktionssignals LPC beiträgt.

Ein weiterer wichtiger Aspekt war die Frage, wie das Attraktionssignal LPC von apoptotischen Zellen

freigesetzt wird. Die Externalisierung von Phosphatidylserin (PS) während der Apoptose als zentralem

„eat-me“-Signal ist bereits seit langem bekannt, jedoch ist der genaue Externalisierungsmechanismus

bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt. Durch den Anstieg des intrazellulären Calcium-Spiegels während

der Apoptose wird die Aminophospholipid-Translokase inaktiviert, die in vitalen Zellen

Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin (PE) nach innen transportiert. Gleichzeitig werden

eine oder mehrere Lipid-Scramblasen oder ATP-abhängige Floppasen aktiviert, die verschiedene

Phospholipide von der cytosolischen auf die extrazelluläre Seite der Plasmamembran transportieren

97

DISKUSSION

(Bevers et al., 1999; Bratton et al., 1997; Williamson und Schlegel, 2002). Die Arbeitsgruppe von

Chimini zeigte, dass für die apoptotische PS-Externalisierung besonders ein Mitglied der ATP-binding

cassette transporter (ABC)-Familie, nämlich der ABCA1-Transporter, verantwortlich ist (Hamon et al.,

2000). Auch vitale Makrophagen präsentieren PS auf ihrer Oberfläche, dabei scheint jedoch eher das

ABC-Familienmitglied ABCA7 für die Externalisierung wichtig zu sein (Jehle et al., 2006). Dies könnte

bedeuten, dass es zu CED-7 in C. elegans möglicherweise zwei homologe Säugerproteine geben

könnte: ABCA7 in Makrophagen und ABCA1 in der Plasmamembran apoptotischer Zellen (siehe

Abschnitt 1.5). Auch in vitalen Zellen kann die verstärkte Expression von ABCA1 zu einer mäßigen bis

starken PS-Externalisierung führen; dies wurde unter anderem in murinen RAW264.7 Zellen, in MDCK

II Zellen (Hunde-Nierenzelllinie) und HeLa-Zellen (humanes Zervixkarzinom) nachgewiesen (Alder-

Baerens et al., 2005; Smith et al., 2002).

Gereinigtes humanes ABCA1 dagegen kann vor allem durch die Inkubation mit den Cholin-

Phospholipiden PC und Sphingomyelin (SM) aktiviert werden, mit PS oder PE ist die gemessene

ATPase-Aktivität wesentlich geringer (Takahashi et al., 2006). Zudem zeigt eine ganze Reihe von

Veröffentlichungen, dass bei der Entstehung von HDL (high density lipoprotein)-Partikeln durch die

Beladung von Apolipoprotein A1 mit Lipiden und Cholesterin die ABCA-Transporter ABCA1 und

ABCA7 vor allem den Efflux von PC und SM regulieren (Abe-Dohmae et al., 2004; Hayashi et al.,

2005; Wang et al., 2003; Wang und Tall, 2003). In der vorliegenden Arbeit wiesen Versuche mit dem

ABCA-Inhibitor Glyburid darauf hin, dass diese Membranproteine auch eine wesentliche Rolle bei der

Freisetzung des Attraktionssignals LPC während der Apoptose spielen (siehe Abschnitt 3.2.4). Der

Vergleich der mRNA-Expression in MCF7casp3 Zellen ergab eine fast 50-fach stärkere Expression von

ABCA7 gegenüber ABCA1, weshalb eine Beteiligung von ABCA7 an der LPC-Freisetzung

wahrscheinlich erschien. Der spezifische knock down von ABCA7 in diesen Zellen hatte jedoch

keinerlei Einfluss auf das chemotaktische Potential der Überstände nach Apoptose-Induktion,

dagegen konnte die Freisetzung des Attraktionssignals durch den knock down von ABCA1 vollständig

inhibiert werden (siehe Abschnitt 3.2.5). Die Analyse der ABCA1 mRNA- und Proteinexpression

ergab, dass sowohl durch die Transfektion mit 50 als auch mit 100 nM spezifischem ABCA1-siRNA-

Oligonukleotid eine deutliche Reduktion der ABCA1-Expression erzielt werden konnte und nur noch

eine geringe Menge ABCA1 exprimiert wurde (Abbildung 3.8D). Weshalb die Freisetzung des

Attraktionssignals trotz dieser zwar deutlich reduzierten aber immer noch detektierbaren Menge an

ABCA1 vollständig gehemmt werden konnte, lässt sich nicht eindeutig sagen. Ein Erklärungsansatz

wäre, dass ABCA1 in der Zellmembran wahrscheinlich erst als oligomerer Komplex seine Funktion als

Lipidtransporter erfüllen kann (Denis et al., 2004) und diese Oligomerisierung nach dem knock down

möglicherweise nicht mehr in ausreichendem Maß stattfinden kann. Insgesamt unterstützen diese

Ergebnisse indirekt die Veröffentlichungen, in denen ABCA1 als Transporter für Cholin-Phospholipide

beschrieben ist (Hayashi et al., 2005; Takahashi et al., 2006). Dass ABCA7 trotz der deutlichen

mRNA-Expression nicht an der LPC-Freisetzung beteiligt ist könnte sich dadurch erklären lassen,

dass ABCA7 zwar in vielen Geweben exprimiert wird, zum Teil jedoch unterschiedliche Funktionen zu

haben scheint und trotz Expression nicht immer an der Zelloberfläche detektiert werden kann (Linsel-

Nitschke et al., 2005). Aufgrund eines fehlenden Westernblot-Antikörpers konnte hier leider nicht

untersucht werden, wie stark die ABCA7-Proteinexpression an der Plasmamembran tatsächlich war.

98

DISKUSSION

Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass der ABCA1-Transporter während der Apoptose

eine zentrale Rolle für die Freisetzung des löslichen Attraktionssignals LPC spielt. ABCA7 scheint

dagegen keinen wesentlichen Einfluss auf den LPC-Efflux von apoptotischen MCF7casp3 Zellen zu

haben.

Um die bis hierher gewonnene Vorstellung der iPLA2-vermittelten LPC-Produktion und der

anschließenden Freisetzung durch ABCA1 weiter zu belegen, wurde im Folgenden versucht, dieses

apoptotische Szenario durch Expression der aktiven 26-kDa-iPLA2 und Aktivierung des ABCA1-

Transporters durch Ionomycin-C-stimulierten Calcium-Influx in vitalen Zellen zu simulieren. Als

Spezifitätskontrolle wurden ABCA1-knock-down–Zellen eingesetzt und die Zellen mit dem iPLA2-

Inhibitor BEL behandelt. Dabei wurde deutlich, dass ausschließlich Zellen, die aktive iPLA2 und

ABCA1 exprimierten auch in der Lage waren, Attraktionssignale freizusetzen (siehe Abschnitt 3.2.6).

Wie groß der Einfluss der Lipidperoxidation in diesem Fall auf die LPC-Generierung ist, kann hier nicht

eindeutig gesagt werden. Abbildung 3.6 zeigt, dass auch in vitalen Zellen Lipid-Hydroperoxide

nachweisbar sind, jedoch keine LPC-Freisetzung stattfindet. Dies spricht dafür, dass möglicherweise

auch in vitalen Zellen durch den ständigen Um- und Abbau oxidierter Phospholipide LPC entsteht,

dass jedoch in vitalen, ruhenden Zellen der ABCA1-Transporter dieses LPC nicht aus der Zelle

transportiert. Während der Apoptose kommt es somit wahrscheinlich sowohl durch die Prozessierung

und Aktivierung der iPLA2 als auch durch die verstärkte Lipid-Peroxidation zu einer deutlich stärkeren

Generierung von LPC, das über den aktivierten ABCA1-Transporter von diesen Zellen freigesetzt

werden kann. Der aus den hier gezeigten Ergebnissen abgeleitete Mechanismus der iPLA2- und

ABCA1-vermittelten Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals LPC ist in Abbildung 4.1

dargestellt.

Abbildung 4.1: Modellvorstellung der Generierung und Freisetzung des löslichen Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin während der Apoptose.

99

DISKUSSION

Während der Apoptose wird die 86 kDa große Volllängenform der iPLA2 durch Caspase-3 prozessiert und dabei die N-terminalen Ankyrin-Motive und der C-Terminus abgespalten. Dadurch entsteht ein 26 kDa großes, aktiviertes iPLA2-Fragment, das zur vermehrten Hydrolyse von Phosphatidylcholin und damit zur Generierung des Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin (LPC) führt. Zusätzlich entstehen während der Apoptose durch die Einwirkung von oxidativem Stress an der Zellmembran oxidierte Phospholipide, die verstärkt durch iPLA2 gespalten werden können und damit zur LPC-Entstehung beitragen. Das an der Innenseite der Plasmamembran generierte LPC wird schließlich über den ATP-binding cassette transporter ABCA1 freigesetzt, der während der Apoptose wahrscheinlich durch den Anstieg des intrazellulären Calcium-Spiegels aktiviert wird.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass iPLA2β während der Apoptose durch Caspase-3

prozessiert und aktiviert wird. Gleichzeitig kommt es an der Zellmembran zu einer erhöhten Lipid-

Peroxidation und damit insgesamt zur verstärkten iPLA2-vermittelten Generierung von

Lysophosphatidylcholin. Durch die Aktivierung des ABCA1-Transporters während der Apoptose kann

LPC als lösliches Attraktionssignal freigesetzt werden. Bei diesem Prozess ist sowohl die Aktivität der

iPLA2 als auch eine ausreichende Expression und Aktivierung von ABCA1 essentiell. Zusätzlich

scheint die Lipidperoxidation eine wichtige Rolle bei der Generierung von LPC zu spielen. Ob und in

welchem Maße andere Faktoren, z.B. mögliche iPLA2-Inhibitoren wie Calmodulin (Jenkins et al., 2001;

Smani et al., 2004), oder apoptotische Ereignisse wie pH-Wert-Änderungen (Waibel et al., 2007),

Einfluss auf die iPLA2-Aktivität und die ABCA1-vermittelte Freisetzung von LPC haben, bleibt an

dieser Stelle offen und bedarf weiterer Untersuchungen.

4.3 Die Migration von Monozyten auf das Attraktionssignal LPC wird durch den G2A-Rezeptor vermittelt

Die von Lauber et al. beschriebende Generierung des monozytären Attraktionssignals LPC (Lauber et

al., 2003) konnte in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der iPLA2-vermittelten Produktion und der

Freisetzung durch den ABCA1-Transporter im Wesentlichen aufgeklärt werden (siehe Abschnitt 4.1

und 4.2). Wie von Kim et al. gezeigt, kann Lysophosphatidylcholin auch als „eat-me“-Signal auf der

Oberfläche apoptotischer Zellen gebunden bleiben und nach der Rekrutierung von

Komplementfaktoren wahrscheinlich über die entsprechenden Komplementrezeptoren von

Phagozyten erkannt werden (Kim et al., 2002). Über die Rezeptoren, die für die Wirkung von

löslichem LPC als „find-me“-Signal auf die Phagozyten verantwortlich sind und deren aktive Migration

auslösen, ist bislang jedoch wenig bekannt. Folglich sollte diese Frage untersucht und die Beteiligung

möglicher phagozytärer LPC-Rezeptoren näher betrachtet werden.

In diesem Zusammenhang konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der G-Protein-

gekoppelte Rezeptor G2A maßgeblich an der durch das Attraktionssignal LPC vermittelten Migration

der monozytären Zelllinien THP-1 und U937 beteiligt ist (siehe 3.3). Diese Ergebnisse sind zum Teil

übereinstimmend mit Arbeiten anderer Gruppen, die jedoch sehr kontrovers diskutiert werden. So

musste die Veröffentlichung, in der LPC als unmittelbarer Ligand des G2A-Rezeptors identifiziert

wurde (Kabarowski et al., 2001) aufgrund nicht-reproduzierbarer Bindungsstudien zurückgezogen

werden (Witte et al., 2005). Jedoch zeigten nachfolgende Arbeiten, dass G2A durchaus an der LPC-

vermittelten Migration von Lymphozyten und Makrophagen beteiligt ist (Radu et al., 2004; Yang et al.,

2005). Zudem kann die von verschiedenen Gruppen für die Mitglieder der OGR1 (orphan G protein-

coupled receptor 1)-Familie (G2A, GPR4, TDAG8 und OGR1) beschriebene Funktion als Protonen-

Sensor (Ishii et al., 2005; Ludwig et al., 2003; Murakami et al., 2004) für G2A inzwischen bezweifelt

100

DISKUSSION

werden, da verschiedene G2A-knockout-Zelllinien keine veränderte cAMP-Produktion nach

extrazellulärer Protonengabe zeigen (Radu et al., 2005). Auch die in den Abschnitten 3.3.1 - 3.3.3

gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass G2A als Mitglied der OGR1-Familie mit der geringsten

Homologie (Radu et al., 2005) eher eine Rolle bei der durch Lysophospholipide, wie LPC, vermittelten

Zellmigration spielt.

Neben LPC als möglichem G2A-Liganden wurde erst vor kurzem beschrieben, dass auch oxidierte

Fettsäuren Liganden des G2A-Rezeptors sind (Obinata et al., 2005). Die Autoren konnten zeigen,

dass es mit einer Reihe oxidierter Fettsäuren in G2A-überexprimierenden Zellen zur intrazellulären

Calcium-Mobilisierung, Abnahme des cAMP-Spiegels und Jun-Kinase(JNK)-Aktivierung kommt. Sie

konnten jedoch keinen Anstieg des Calcium-Spiegels nach LPC-Stimulierung detektieren. Eine ERK-

Phosphorylierung, wie sie für die LPC-vermittelte G2A-Aktivierung beschrieben ist (Yang et al., 2005),

konnten Obinata et al. für oxidierte Fettsäuren dagegen nicht zeigen. Um eine mögliche Beteiligung

oxidierter Fettsäuren an der chemotaktischen Aktivität apoptotischer Zellkulturüberstände zu

untersuchen, wurden mit verschiedenen oxidierten Fettsäuren Transmigrationstests durchgeführt.

Dabei konnte in keinem Fall die Migration von Monozyten stimuliert oder das chemotaktische Potential

der Überstände durch oxidierte Fettsäuren neutralisiert werden (Daten nicht gezeigt). Somit konnte

eine Beteiligung oxidierter Fettsäuren an der G2A-vermittelten Migration von Monozyten

ausgeschlossen werden. Vielmehr könnte dies darauf hindeuten, dass LPC und oxidierte Fettsäuren

in G2A-exprimierenden Zellen unterschiedliche Signalwege stimulieren. Obinata et al. folgerten aus

ihren Versuchen, dass an der G2A-vermittelten Signaltransduktion oxidierter Fettsäuren sowohl die

Gq- als auch die Gi-alpha-Untereinheit assoziierter G-Proteinen beteiligt ist. Dagegen wurde für LPC

eine Gi-unabhängige, G2A-Gq/11/G12/13-vermittelte Migration von Monozyten beschrieben (Yang et al.,

2005). Somit kommt es durch oxidierte Fettsäuren eher zur Calcium-Aktivierung, Abnahme des cAMP-

Spiegels und JNK-Aktivierung (Obinata et al., 2005), wogegen LPC möglicherweise eher über Rho-

Aktivierung und ERK-Phosphorylierung die Migration stimuliert. Da während der Apoptose iPLA2-

vermittelt sowohl LPC als auch oxidierte Fettsäuren entstehen können, wären weitere

Untersuchungen zu möglicherweise kooperativen Effekten beider Agonisten interessant.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass LPC die Migration der monozytären Zelllinien

THP-1 und U937 G2A-abhängig induziert. Eine direkte Bindung von LPC an den G2A-Rezeptor

scheint jedoch eher unwahrscheinlich, da die von Kabarowski et al. 2001 veröffentlichten Daten, die

eine direkte Bindung von LPC an G2A zeigten, zurückgezogen werden mussten (Kabarowski et al.,

2001; Witte et al., 2005). Somit bleibt die Frage, ob LPC nicht eher indirekt über bislang nicht

identifizierte Faktoren an den G2A-Rezeptor binden kann. Betrachtet man die unterschiedlichen „eat-

me“-Signale auf der Oberfläche apoptotischer Zellen wird deutlich, dass Lipidsignale, wie z.B

Phosphatidylserin, zumeist indirekt über Brückenmoleküle an die zugehörigen phagozytären

Rezeptoren binden (Lauber et al., 2004). Für membranständiges LPC konnte gezeigt werden, dass

sowohl eine IgM-abhängige als auch eine IgM-unabhängige Rekrutierung von Komplementfaktoren

erfolgt, die für die Eliminierung der Zellen wichtig ist (Kim et al., 2002). Deshalb ist es durchaus

denkbar, dass auch zur LPC-vermittelten Migration von Monozyten Kofaktoren notwendig sind, die

eine Bindung des Attraktionssignals an den G2A-Rezeptor ermöglichen. Eine alternative Möglichkeit,

wie LPC die G2A-vermittelte Signaltransduktion regulieren kann, wurde von Wang et al. beschrieben.

101

DISKUSSION

Dabei induziert und stabilisiert LPC die G2A-Oberflächenexpression und kann somit eher indirekt die

G2A-vermittelte ERK-Phosphorylierung und Zellmigration stimulieren (Wang et al., 2005).

Die in Abschnitt 3.3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der G2A-Rezeptor äußerst wichtig für die

LPC-vermittelte Migration von Monozyten ist. Jedoch konnte die durch Überstände apoptotischer

Zellen stimulierte Migration von THP-1 Zellen nach dem knock down von G2A nicht vollständig

inhibiert werden. Dies könnte daran liegen, dass der knock down zwar sehr effektiv war, jedoch immer

noch eine geringe Menge G2A detektiert werden konnte. Eine andere Möglichkeit wäre die Beteiligung

weiterer Rezeptoren, die hier jedoch zumindest für GPR4 mit großer Wahrscheinlichkeit

ausgeschlossen werden konnte, da der GPR4-knock-down keinen messbaren Effekt auf die

Migrationsfähigkeit von THP-1 Monozyten hatte. Andere Gruppen zeigten, dass GPR4 durchaus an

LPC- und Lysosphingomyelin-vermittelten Reaktionen beteiligt ist, jedoch nicht im Zusammenhang mit

Zellmigration (Kim et al., 2005; Qiao et al., 2006). Außerdem konnte für GPR4 eine Rolle als

Protonen-Sensor und weniger als LPC-Rezeptor bestätigt werden (Ludwig et al., 2003; Radu et al.,

2005). Eine Beteiligung anderer Rezeptoren wurde in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht und

kann somit nicht ausgeschlossen werden. So ist bekannt, dass Scavenger-Rezeptoren sowohl

oxidiertes LDL als auch LPC binden können und die Assoziation von Komplementfaktoren mit LPC die

Bindung an Komplementrezeptoren vermittelt (Lauber et al., 2004).

Eine andere Erklärung dafür, dass der knock down von G2A nicht zu einer völligen Inhibierung der

durch Überstände apoptotischer Zellen stimulierten Migrationsfähigkeit von THP-1 Zellen führte

(Abbildung 3.12A), wären zusätzliche „find-me“-Signale, die unabhängig von G2A die Zellmigration

stimulieren. Dafür würde auch die Beobachtung sprechen, dass nach dem G2A-knock-down die

Migration auf gereinigtes LPC komplett unterdrückt werden konnte (Abbildung 3.12B). Die Existenz

anderer chemotaktisch aktiver Signale als LPC in den Überständen apoptotischer Zellen kann hier

nicht ausgeschlossen werden. So finden sich in der Literatur einige Hinweise auf andere apoptotische

Attraktionssignale wie das S19 ribosomale Protein, die humane Tyrosyl-tRNA-Synthetase und

Thrombospondin-1, für die ebenfalls eine chemotaktische Aktivität nachgewiesen werden konnte

(Horino et al., 1998; Moodley et al., 2003; Wakasugi und Schimmel, 1999).

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der G2A-Rezeptor maßgeblich verantwortlich ist für die

Migration der monozytären Zelllinien THP-1 und U937 auf das Attraktionssignal LPC. Dass G2A

tatsächlich eine äußerst wichtige Rolle bei der Eliminierung apoptotischer Zellen spielt, konnte zudem

von Le et al. in in vivo-Studien nachgewiesen werden. Dabei entwickeln G2A-knockout-Mäuse ein

Multiorgan-Autoimmunsyndrom, das viele Parallelen zum humanen systemischen Lupus

erythematodes aufweist (Le et al., 2001). Dagegen scheint GPR4 in dem in der vorliegenden Arbeit

untersuchten System keine wesentliche Rolle zu spielen. Ob andere Rezeptoren an der LPC-

vermittelten Migration beteiligt sind oder neben LPC weitere chemotaktisch aktive Signale die

Migration stimulieren kann hier nicht ausgeschlossen werden und bedarf weiterer Untersuchungen.

4.4 Rolle von Annexin I bei der Eliminierung apoptotischer Zellen Für Annexin I, ein 38 kDa großes, Calcium- und Phospholipid-bindendes Protein, sind verschiedene

anti-inflammatorische Funktionen beschrieben worden: So ist die Annexin-I-Expression durch

102

DISKUSSION

Glucocorticoide induzierbar, wodurch unter anderem die Extravasion von Monozyten und Neutrophilen

in entzündete Gewebe inhibiert werden kann (Perretti et al., 2002; Solito et al., 2000). Zudem wurde

Annexin I als Inhibitor der Calcium-abhängigen Phospholipase A2 (cPLA2) identifiziert (Frey et al.,

1999; Kim et al., 2001; Solito et al., 1998), der die Freisetzung von Arachidonsäure und damit die

Synthese von potentiell pro-inflammatorischen Prostaglandinen und Leukotrienen unterdrückt (Wu et

al., 2000b). Verschiedene aktuelle Veröffentlichungen zeigen außerdem, dass Annexin I eine wichtige

Rolle bei der Phagozytose apoptotischer Zellen zu spielen scheint (Arur et al., 2003; Fan et al., 2004;

Maderna et al., 2005). Im Hinblick auf die iPLA2-vermittelte Generierung des Attraktionssignals LPC

wurde in der vorliegenden Arbeit auch ein möglicher inhibitorischer Einfluss von Annexin I untersucht.

Wie bereits in Abschnitt 4.1 besprochen, zeigte sich jedoch, dass Annexin I in diesem Zusammenhang

offensichtlich nicht als iPLA2-Inhibitor wirkt und eine erhöhte Annexin-I-Expression keine

Auswirkungen auf die iPLA2-vermittelte Generierung apoptotischer Attraktionssignale hatte (siehe

Abbildung 3.14). Deshalb wurde im Folgenden die Funktion von Annexin I bei der Eliminierung

apoptotischer Zellen näher untersucht.

Im Verlauf dieser Untersuchungen zeigte sich, dass Annexin I unabhängig vom verwendeten

Apoptose-Stimulus von apoptotischen Zellen externalisiert wurde. Dabei war die beobachtete

Externalisierung Zelltyp-abhängig und ging mit einer Prozessierung von Annexin I einher, die sich in

der Westernblot-Analyse anhand eines um etwa 3 kDa verkürzten Annexin-Fragments darstellen ließ

(siehe Abschnitte 3.4.2 - 3.4.4). In der Literatur wird eine Annexin-I-Oberflächenexposition für

verschiedene Zelllinien beschrieben, dabei sollte jedoch zwischen der Annexin-I-Externalisierung

apoptotischer Zellen und der vitaler Monozyten oder Makrophagen unterschieden werden. Arur et al.

zeigten, dass nach Apoptose-Induktion mit anti-CD95-Antikörper sowohl Jurkat Zellen als auch

primäre Muskelzellen eine deutliche Annexin-I-Oberflächenfärbung aufwiesen und schlossen daraus,

dass die Annexin-I-Externalisierung ein generelles apoptotisches Phänomen sein könnte (Arur et al.,

2003). Dass zwar apoptotische Jurkat Zellen Annexin I externalisieren, dies jedoch nicht grundsätzlich

auf sterbende Zellen zutrifft, zeigte dagegen die Arbeit von Fan et al., in der neben Jurkat Zellen auch

primäre Thymozyten untersucht wurden (Fan et al., 2004). In der hier vorliegenden Arbeit konnte

durch den Vergleich von 7 verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden, dass lediglich die

verwandten T-lymphozytären Zelllinien Jurkat, Molt4 und primäre PHA-Blasten während der Apoptose

eine Annexin-I-Oberflächenexposition aufwiesen, die in den vitalen Zellen nicht nachweisbar war. Für

die restlichen 4 Zelllinien konnte keine Annexin-I-Externalisierung nachgewiesen werden, obwohl die

meisten deutlich Annexin I exprimierten (siehe Abbildung 3.17). Somit kann davon ausgegangen

werden, dass die Annexin-I-Externalisierung apoptotischer Zellen zwar Apoptosestimulus-unabhängig,

jedoch Zelltyp-spezifisch ist.

Abgesehen von dieser Apoptose-abhängigen Annexin-I-Externalisierung ist auch eine Reihe vitaler

Zellen in der Lage, Annexin I konstitutiv oder nach Stimulation zu externalisieren. So zeigen

Monozyten nach Glucocorticoid-Stimulation eine deutliche Annexin-I-Oberflächenexpression, die ihre

Extravasion in entzündete Gewebe inhibiert (Perretti et al., 2002; Solito et al., 2000). Ausdifferenzierte

Makrophagen, wie U937 oder J774 und humane, aus primären Monozyten generierte Makrophagen,

exprimieren Annexin I sogar konstitutiv auf ihrer Oberfläche (Fan et al., 2004; Maderna et al., 2005).

Auf vitalen Makrophagen konnte zudem ein weiteres Mitglied der Annexin-Familie nachgewiesen

103

DISKUSSION

werden, nämlich Annexin II (Fan et al., 2004), während die Annexin-Externalisierung apoptotischer

Zellen innerhalb der Annexin-Familie eher auf Annexin I beschränkt zu sein scheint. Die hier gezeigte

Oberflächenfärbung apoptotischer Jurkat Zellen gegen Annexin II und Annexin VII ergab, dass diese

Annexine nicht externalisiert werden, obwohl sie von Jurkat Zellen exprimiert werden (Abbildung

3.16). Die Arbeit von Arur et al. belegt zudem, dass auch Annexin IV und Annexin VI im Gegensatz zu

Annexin I nicht verstärkt in der Membranfraktion apoptotischer Jurkat Zellen nachweisbar sind (Arur et

al., 2003).

Die Externalisierung von Annexin I in apoptotischen Jurkat Zellen findet zu einem Zeitpunkt statt, an

dem ein großer Anteil der Zellpopulation bereits Propidiumiodid-positiv ist und sich somit in einem

späten Stadium der Apoptose befindet (siehe Abbildung 3.15 und Arur et al., 2003). Da Annexine über

ihre Annexin-Boxen Calcium-abhängig Phospholipide binden können, stellte sich die Frage, wie

Annexin I an die Zelloberfläche gebunden ist. Die Untersuchungen von Fan und Arur et al. zeigten,

dass die Annexin-I-Exposition auf apoptotischen Zellen Calcium-abhängig ist (Fan et al., 2004) und

Annexin I mit Phosphatidylserin ko-lokalisiert ist (Arur et al., 2003). Dies konnte in der vorliegenden

Arbeit bestätigt werden, da eine Annexin-I-Oberflächenfärbung nur in Anwesenheit von Calcium

möglich war (Abbildung 3.18A) und sich Annexin I nur mit Phosphatidylserin-haltigen Micellen

spezifisch präzipitieren ließ; ohne Calcium oder mit Micellen, die nur Phosphatidylcholin enthielten,

war dies nicht möglich (Abbildung 3.18D). Dass Annexin I über die Annexin-Boxen Calcium-abhängig

an PS bindet, bestätigte sich durch weitere Versuche, in denen nur das Volllängenprotein (AnxI aa1-

346) und die N-terminal trunkierte Form (aa47-346) in Anwesenheit von Calcium an die Oberfläche

apoptotischer Jurkat Zellen oder vitaler, transient PS-externalisierender Jurkat Zellen binden konnten.

Der N-Terminus von Annexin I (aa1-46), der vor den Annexin-Boxen trunkiert wurde, konnte hingegen

nicht an die Oberfläche dieser Zellen gebunden werden (Abbildung 3.18C und E). Solito et al.

beschrieben für vitale U937 Zellen zwei mögliche Arten einer Annexin-I-Oberflächenbindung: eine

Bindung mit niedriger Affinität, die durch EGTA inhibierbar ist und eine zweite, hochaffine Bindung, auf

die eine Behandlung mit EGTA keinen Einfluss hat (Solito et al., 2000). Auch auf vitalen Makrophagen

scheint die Bindung von Annexin I und II nicht auf dieselbe Weise zu erfolgen wie auf apoptotischen

Zellen, denn obwohl differenzierte Makrophagen PS auf ihrer Oberfläche präsentieren, ist die

Annexin-I-Bindung Calcium-unabhängig und kann anders als bei apoptotischen Jurkat Zellen nicht

durch Waschen mit EGTA-haltigem Puffer inhibiert werden (Fan et al., 2004). Dies spricht dafür, dass

die Annexin-I-Bindung auf apoptotischen und vitalen Zellen unterschiedlicher Natur ist und während

der Apoptose Calcium-abhängig über die Annexin-Boxen an externalisiertes Phosphatidylserin erfolgt,

wohingegen die Bindung auf vitalen Zellen Calcium-unabhängig ist und möglicherweise über andere

Regionen als die Phospholipid- und Calcium-bindenden Annexin-Boxen stattfindet.

Über den Externalisierungsmechanismus von Annexin I während der Apoptose ist lediglich bekannt,

dass er sowohl Calcium- als auch Caspase-abhängig ist (Arur et al., 2003). Welche Transporter

jedoch für die Translokation von der cytosolischen auf die extrazelluläre Seite der Plasmamembran

verantwortlich sind, ist nicht bekannt. Der klassische sekretorische Externalisierungsweg über das

endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat konnte durch Versuche mit dem Proteinexport-

Inhibitor Bredfeldin A ausgeschlossen werden, da er die Annexin-I-Externalisierung nicht inhibierte

(Daten nicht gezeigt); zudem besitzt Annexin I keine N-terminale Signalsequenz für diesen

104

DISKUSSION

Sekretionsweg. Für vitale TtT/GF-Zellen (Follikulo-Stellat Zelllinie) konnte nachgewiesen werden, dass

für die Glucocorticoid-induzierte Annexin-I-Externalisierung eine Phosphorylierung von Annexin I

benötigt wird (Solito et al., 2006). Weitere Arbeiten zeigten, dass die Externalisierung in diesen Zellen

von der Expression des ABC (ATP-binding cassette transporter)-Transporters ABCA1 abhängig ist

und durch die Inhibition oder den knock down von ABCA1 verhindert werden kann. Durch die

Expression von ABCA1 in Zelllinien, die keine endogene ABCA1-Expression zeigen, kann die

Annexin-I-Externalisierung induziert werden. Zudem konnte eine ABCA1-Expression in vielen

Zelllinien nachgewiesen werden, die nach Glucocorticoid-Stimulation Annexin I externalisieren

(Chapman et al., 2003; Omer et al., 2006). Dies erscheint umso interessanter, da in der vorliegenden

Arbeit gezeigt werden konnte, dass die ausreichende Expression und Aktivität von ABCA1 für die

Freisetzung des Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin während der Apoptose essentiell ist (siehe

Abschnitt 3.2.5). Zudem beschrieben Hamon et al. und Alder-Baerens et al., dass die ABCA1-

Expression verschiedener vitaler Zellen entscheidend für deren Fähigkeit zur PS-Externalisierung ist

(Alder-Baerens et al., 2005; Hamon et al., 2000). Somit war es vorstellbar, dass die apoptotische

Annexin-I-Externalisierung über die Calcium-abhängige Assoziation mit Phospholipiden wie PS

und/oder LPC ablaufen könnte. Jedoch zeigten weitere im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte

Versuche, dass die Inkubation mit dem ABCA-Inhibitor Glyburid keinen hemmenden Effekt auf die

Annexin-I-Externalisierung apoptotischer Jurkat Zellen hatte und lediglich durch Hemmung der

Caspase-Aktivität die Annexin-I-Exposition verhindert werden konnte (Daten nicht gezeigt). Zudem

konnte eine ABCA1-abhängige Annexin-I-Externalisierung bisher nur in vitalen Zellen gezeigt werden

(Omer et al., 2006) und die unterschiedliche Art der Annexin-I-Bindung auf apoptotischen und vitalen

Zellen (siehe oben) könnte zusätzlich für verschiedene Externalisierungswege sprechen. Somit kann

zum jetzigen Zeitpunkt zusammenfassend gesagt werden, dass die Annexin-I-Translokation in

apoptotischen Zellen sowohl Caspase- als auch Calcium-abhängig ist, jedoch zur Aufklärung des

Externalisierungsmechanismus weitere Versuche notwendig sind. Außerdem sollte die in Abschnitt

3.4.4 beobachtete Prozessierung von Annexin I in diesem Zusammenhang näher untersucht werden,

da sie nur in Zellen auftrat, die eine Annexin-I-Oberflächenexposition zeigten.

Nachdem in Übereinstimmung mit den Veröffentlichungen von Arur und Fan et al. eine Calcium-

abhängige Bindung von Annexin I an die Phosphatidylserin-reiche Oberfläche apoptotischer Jurkat

Zellen gezeigt werden konnte, sollte im Weiteren näher auf die Funktion von Annexin I bei der

Phagozytose apoptotischer Zellen eingegangen werden. Hierzu wurden apoptotische Jurkat Zellen mit

EGTA- oder Calciumchlorid-haltigem Puffer gewaschen und in Phagozytosetests mit

ausdifferenzierten THP-1 und U937 Makrophagen eingesetzt. Der Vergleich ergab, dass das

Abwaschen von Annexin I mit EGTA keinen Einfluss auf die Phagozytose dieser Zellen hatte (siehe

Abbildung 3.19A). Dies widerspricht den Ergebnissen von Fan et al., die nach dem Abwaschen von

Annexin I von apoptotischen Jurkat Zellen eine um etwa 50 % reduzierte Phagozytose durch J774

Makrophagen messen konnten (Fan et al., 2004). Ein Grund für diesen Widerspruch könnte sein, dass

nach dem Waschen der apoptotischen Zellen während der Phagozytose-Tests möglicherweise noch

Annexin I externalisiert wurde und deshalb bei längerer Inkubationsdauer der Effekt der EGTA-

Vorbehandlung reversibel sein könnte. Fan et al. beobachteten eine inhibierte Phagozytose durch das

Abwaschen von Annexin I nach 30-minütiger Ko-Inkubation von apoptotischen Zellen und

105

DISKUSSION

Makrophagen, spätere Zeitpunkte sind in dieser Veröffentlichung nicht angegeben. In der

vorliegenden Arbeit war nach 30 bzw. 45 Minuten (THP-1 oder U937 Makrophagen) kein Unterschied

zwischen EGTA-behandelten und nicht behandelten Zellen sichtbar, jedoch war zu diesem Zeitpunkt

die Zahl phagozytierter Jurkat Zellen und der Phagozytose-Index sehr gering. Um die Annexin-I-

Externalisierung während der Apoptose effizienter reduzieren zu können, wurde für weitere Tests in

Jurkat Zellen die Annexin-I-Expression durch die Verwendung spezifischer siRNA-Oligunukleotide

inhibiert. Jedoch konnte auch nach dem knock down von Annexin I keine eingeschränkte

Phagozytose dieser Zellen durch THP-1- und U937-Makrophagen beobachtet werden (Abbildung

3.19B). Die Westernblot-Analyse der siRNA-behandelten Jurkat Zellen zeigte, dass der Annexin-I-

knock-down äußerst effektiv war und nur noch eine sehr geringe Annexin-I-Expression detektierbar

war (siehe Abbildung 3.19C). In der Arbeit von Arur et al. konnte durch den Annexin-I-knock-down die

Anheftung apoptotischer Jurkat Zellen an Endothelzellen um etwa die Hälfte reduziert werden, im

Westernblot war hier kein Annexin-I-Signal mehr nachweisbar (Arur et al., 2003). Somit wäre eine

mögliche Erklärung für die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse, dass trotz des effektiven

knock downs die Restexpression von Annexin I ausreichend sein könnte, um eine Funktion bei der

Phagozytose dieser Zellen zu erfüllen. Ein anderer Erklärungsansatz ergibt sich aus der Tatsache,

dass es neben Annexin I weitere Proteine gibt, die als Brückenmoleküle der phagozytotischen

Synapse die Interaktion von apoptotischer Zelle und Phagozyt vermitteln können. Dabei unterliegen

die verschiedenen „eat-me“-Signale und die zugehörigen Brückenmoleküle einer gewissen

Redundanz (siehe Abschnitt 1.5). Besonders in Hinblick auf die Tatsache, dass spät-apoptotische

Zellen verwendet wurden, könnten möglicherweise Proteine wie z.B. MFG-E8 (Milk-fat-globule-EGF-

factor 8), Gas6 (growth arrest-specific 6), β2-GP1 (β2-glycoprotein-1) oder Protein S, die als PS-

bindende Brückenmoleküle während der Phagozytose beschrieben sind (Übersicht: Lauber et al.,

2004), den Funktionsausfall von Annexin I kompensieren. Ob diese Proteine jedoch in dem hier

verwendeten System eine Rolle spielen, kann an dieser Stelle nicht beantwortet werden und bedarf

weiterer Untersuchungen.

Da apoptotische Jurkat Zellen erst zu einem Zeitpunkt Annexin I externalisieren, an dem sie bereits

PI-positiv sind (siehe oben) und in diesem Szenario möglicherweise bereits eine ganze Reihe weiterer

„eat-me“-Signale eine Rolle spielen, sollte die Funktion von Annexin I während der Phagozytose in

einem anderen Zellsystem untersucht werden. Dazu wurden früh-apoptotische THP-1 Zellen als

Beutezellen verwendet, da diese eine sehr schwache endogene Annexin-I-Expression zeigen und

während der Apoptose kein Annexin I externalisieren (siehe Abbildung 3.17). Die Zellen wurden in

einem frühen Stadium der Apoptose für die Versuche eingesetzt, in dem sie bereits PS

externalisieren, jedoch noch PI-negativ sind. Vor den Phagozytosetests wurden die apoptotischen,

PS-externalisierenden THP-1 Zellen mit verschiedenen humanen, rekombinanten Annexin-I-

Konstrukten oder BSA inkubiert und danach an ausdifferenzierte THP-1- oder U937-Makrophagen

verfüttert. Sowohl die Volllängenform von Annexin I (aa1-346) als auch das N-terminal trunkierte

Konstrukt aa47-346 stimulierten die Phagozytose sehr deutlich, während eine Prä-Inkubation mit dem

N-Terminus (AnxI aa1-46) oder BSA keinen Einfluss auf die Phagozytose apoptotischer THP-1 Zellen

hatte (Abbildung 3.20). Somit kann gesagt werden, dass Annexin I durchaus einen Stimulus für die

Phagozytose apoptotischer Zellen darstellt. Die Relevanz von Annexin I in diesem Prozess könnte

106

DISKUSSION

dabei möglicherweise vom Stadium der Apoptose abhängig sein und davon, ob und welche anderen

PS-bindenden Proteine von den Zellen exprimiert und externalisiert werden. Dass die Annexin-I-

Externalisierung nicht nur auf der Seite der sterbenden Zelle wichtig ist sondern auch für die Funktion

von Makrophagen selbst, zeigen mehrere Veröffentlichungen. Durch die Blockierung von Annexin I

auf verschiedenen Makrophagen kann die Phagozytose apoptotischer Thymozyten, die selbst kein

Annexin I externalisieren, inhibiert werden (Fan et al., 2004). Außerdem zeigen Makrophagen aus

Annexin-I-knockout-Mäusen eine deutlich eingeschränkte Phagozytose-Kapazität und produzieren

nach Stimulation mehr pro-inflammatorische Mediatoren wie Prostaglandin E2, TNFα oder Interleukin-

6 im Vergleich mit Zellen aus Annexin-I+/+-Mäusen (Yona et al., 2004; Yona et al., 2006).

Auch wenn der N-Terminus von Annexin I aufgrund der fehlenden Phospholipid-Bindungsmotive nicht

direkt an die PS-reiche Oberfläche apoptotischer Zellen binden kann und somit keinen Einfluss auf die

Phagozytose apoptotischer THP-1 Zellen hatte (siehe oben), zeigten Maderna et al., dass die Prä-

Inkubation von Makrophagen mit dem N-terminalen Annexin-I-Peptid aa1-26 ebenso wie die Prä-

Inkubation mit Volllängenprotein zu einer verstärkten Phagozytose apoptotischer PMN-Zellen führt

(Maderna et al., 2005). Zudem kann das Annexin-I-Peptid aa1-25 die Migration von Granulozyten und

Monozyten über die Formyl-Peptid-Rezeptoren FPR, FPRL-1 und FPRL-2 stimulieren (Ernst et al.,

2004). Hayhoe et al. zeigten, dass die Inhibierung der transendothelialen Migration

polymorphonukleärer Leukozyten durch das Volllängenprotein und das N-terminale Peptid aa2-26 auf

unterschiedliche Weise abläuft und Volllängen-Annexin-I nur über den FPR-Rezeptor an

Endothelzellen binden kann, während Annexin I aa2-26 sowohl über FPR als auch über FPRL-1/ALX

die ERK-Phosphorylierung dieser Zellen stimuliert (Hayhoe et al., 2006). Im Zusammenhang mit der

transendothelialen Migration wurde zudem beobachtet, dass Annexin I auf der Zelloberfläche an α4β1-

Intergrin binden kann und dadurch die Anheftung an Endothelzellen inhibiert (Solito et al., 2000). Über

den oder die Rezeptoren, die für die Erkennung von auf apoptotischen Zellen gebundenem Annexin I

verantwortlich sind, ist wenig bekannt. Die Arbeit von Arur et al. zeigt, dass die Expression des

Phosphatidylserin-Rezeptors (PSR) und die Bildung von PSR-Clustern in die Phagozytose von

Annexin-I-exprimierenden apoptotischen Zellen involviert ist (Arur et al., 2003). Arur et al.

verwendeten in ihrer Arbeit Expressionskonstrukte für den PS-Rezeptor, die ausgehend von der

Identifizierung und Klonierung des PS-Rezeptors durch die Arbeitsgruppe von Henson hergestellt

wurden (Fadok et al., 2000). Jedoch kann inzwischen bezweifelt werden, dass das von Fadok et al.

identifizierte Gen tatsächlich für einen PS-Rezeptor auf der Zelloberfläche kodiert (Williamson und

Schlegel, 2004). Neuere Arbeiten zeigen, dass das Produkt des psr-Gens vielmehr ein nukleäres

Protein zu sein scheint, das während der Entwicklung und Differenzierung eine wichtige Rolle spielt

(Bose et al., 2004; Cikala et al., 2004; Cui et al., 2004). Deshalb ist die Identität eines möglichen PS-

Rezeptors, der die Wirkung von Annexin I auf Seite der Phagozyten vermittelt, weiterhin unklar. Es ist

durchaus wahrscheinlich, dass eine Reihe von Rezeptoren an den verschiedenen anti-

inflammatorischen Funktionen von Annexin I beteiligt ist. Ebenso wie es bei vitalen und apoptotischen

Zellen unterschiedliche Externalisierungsmechanismen und Bindungsarten für Annexin I zu geben

scheint, ist es vorstellbar, dass für Annexin I als „eat-me“-Signal der phagozytotischen Synapse

andere Rezeptoren eine Rolle spielen als z.B. bei der transendothelialen Migration. Genauso könnte

107

DISKUSSION

die Funktion von Annexin I als Phagozytosestimulus vom Muster der Rezeptorexpression der jeweils

beteiligten Makrophagenpopulation abhängen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Annexin I unabhängig vom verwendeten Apoptose-

Stimulus externalisiert werden kann und Calcium-abhängig über die Annexin-Boxen an ebenfalls

externalisiertes Phosphatidylserin auf der Oberfläche apoptotischer Zellen bindet. Dadurch kann

Annexin I die Eliminierung dieser Zellen durch professionelle Phagozyten stimulieren.

108

ZUSAMMENFASSUNG

5 Zusammenfassung Die effiziente Eliminierung apoptotischer Zellen durch benachbarte Zellen oder professionelle Phagozyten ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase in mehrzelligen Organismen. Dazu werden von den apoptotischen Zellen verschiedene Phagozytose- oder „eat-me“-Signale auf der Oberfläche präsentiert, die für die Erkennung und Internalisierung entscheidend sind. Insbesondere in höheren Organismen sind die sterbenden Zellen und die Phagozyten jedoch oft nicht direkt nebeneinander lokalisiert; deshalb kommt hier der Freisetzung von löslichen Attraktionssignalen eine besondere Bedeutung zu. Als ein solches „find-me“-Signal konnte Lysophosphatidylcholin (LPC) identifiziert werden, das durch die hydrolytische Spaltung von Phosphatidylcholin mittels der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) entsteht. Dabei wird die iPLA2 während der Apoptose Caspase-3-abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung von iPLA2 direkt durch Caspase-3 geschieht und tatsächlich zu deren Aktivierung führt. Die aktive iPLA2 ist dabei essentiell für die Produktion des Phospholipid-„find-me“-Signals LPC in apoptotischen Zellen. Da die Expression der aktiven Form von iPLA2 in vitalen Zellen jedoch nicht zu einer Freisetzung des Attraktionssignals führte, musste angenommen werden, dass weitere apoptotische Ereignisse an der Generierung und dem Export des Attraktionssignals LPC beteiligt sind. Es zeigte sich, dass die Oxidation von Membranlipiden, wie Phosphatidylcholin, durch reaktive Sauerstoffverbindungen während der Apoptose ein zusätzlicher Faktor ist, der zur verstärkten Produktion von LPC beiträgt - vermutlich weil peroxidierte Lipide anfälliger für eine PLA2-vermittelte hydrolytische Spaltung sind als nicht-oxiderte. Weitere Untersuchungen zum genauen Exportmechanismus von LPC ergaben, dass das ABC (ATP-binding cassette transporter)-Familienmitglied ABCA1 essentiell für die Freisetzung des Attraktionssignals während der Apoptose ist. Somit konnten mit der Lipidoxidation und dem ABCA1-vermittelten LPC-Export weitere wichtige Elemente der LPC-Produktion und anschließenden Freisetzung dieses „find-me“-Signals während der Apoptose charakterisiert werden. Ob dieser mehrschrittige Prozess durch weitere Faktoren, wie z.B. mögliche Inhibitoren oder pH-Wert-Änderungen zusätzlich beeinflusst wird, kann an dieser Stelle nicht ausgeschlossen werden und wird sich in zukünftigen Untersuchungen zeigen. Nachdem die Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals LPC näher aufgeklärt werden konnte, stellte sich die Frage, welche Rezeptoren die Wirkung von LPC auf den Phagozyten vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte dabei gezeigt werden, dass der G-Protein-gekoppelte Rezeptor G2A verantwortlich ist für die Migration monozytärer Zellen auf das Attraktionssignal LPC. Eine Beteiligung des GPR4-Rezeptors an diesem Prozess konnte dagegen ausgeschlossen werden. Die molekularen Mechanismen, die letztendlich zur LPC-stimulierten, G2A-vermittelten Migration führen, sind weitgehend unbekannt und müssen durch künftige Untersuchungen aufgeklärt werden. Auch eine Beteiligung anderer Rezeptoren an der LPC-vermittelten Anlockung von Phagozyten kann hier nicht ausgeschlossen werden. Es wäre auch denkbar, dass neben LPC weitere chemotaktisch aktive Signale in diesen Vorgang involviert sind. Betrachtet man die Vielzahl an „eat-me“-Signalen auf der Oberfläche apoptotischer Zellen scheint es durchaus vorstellbar, dass auch mehr als ein „find-me“-Signal an der Anlockung von Phagozyten beteiligt ist. Zudem finden sich einige Hinweise auf chemotaktisch aktive Proteine in der Literatur. Ob diese oder weitere Faktoren im Zusammenhang mit der LPC-vermittelten Chemotaxis monozytärer Zellen stehen, ist bis jetzt jedoch völlig unklar und bedarf weiterer Untersuchungen.

109

ZUSAMMENFASSUNG

Dass apoptotische Zellen verschiedene „eat-me“-Signale auf ihrer Oberfläche präsentieren, ist seit

längerem bekannt. Dabei kann die Interaktion mit spezifischen Rezeptoren auf der Oberfläche von

Phagozyten direkt oder indirekt über Brückenmoleküle stattfinden. Insgesamt führt dieser Kontakt zur

Ausbildung der so genannten phagozytotischen Synapse, die entscheidend für die Erkennung und

Internalisierung der sterbenden Zelle ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in diesem

Zusammenhang die Funktion des Calcium- und Phospholipid-bindenden Proteins Annexin I näher

untersucht. Dabei zeigte sich, dass Annexin I zwar unabhängig vom verwendeten Apoptose-Stimulus

externalisiert wird, diese Externalisierung jedoch kein generelles apoptotisches Phänomen sondern

Zelltyp-abhängig ist. Die Bindung von Annexin I auf der Oberfläche der sterbenden Zelle erfolgt

Calcium-abhängig über die Annexin-Boxen an ebenfalls externalisiertes Phosphatidylserin, das ein

zentrales Phagozytose-Signal darstellt. Dadurch kann Annexin I die Eliminierung dieser Zellen durch

professionelle Phagozyten stimulieren und erfüllt somit die Funktion eines Brückenmoleküls in der

phagozytotischen Synapse. Darüber, wie Annexin I dabei genau an den Phagozyten bindet, kann nur

spekuliert werden. Im Zusammenhang mit weiteren Funktionen von Annexin I sind verschiedene

Rezeptoren beschrieben, mit denen Annexin I interagieren kann, jedoch ist unklar, ob diese auch bei

der Phagozytose eine Rolle spielen. Es wäre auch denkbar, dass Annexin I apoptotische Zellen und

Phagozyten über Phosphatidylserin vernetzt, das nicht nur von sterbenden Zellen sondern auch von

Makrophagen externalisiert wird. Zudem ist eine Oberflächenexposition von Annexin I auch für

Phagozyten beschrieben, wodurch es über eine homophile Interaktion zweier Annexin-I-Moleküle zum

Kontakt zwischen Phagozyt und Beutezelle kommen könnte.

Abschließend sollte betont werden, dass die hier untersuchten Phänomene wichtige Schritte bei der

effizienten Eliminierung apoptotischer Zellen darstellen. Die physiologische Relevanz dieser Vorgänge

liegt darin, dass der apoptotische Zelltod, im Gegensatz zur Nekrose, in allen Schritten einer strengen

Kontrolle unterliegt und ohne schädigende Nebenwirkungen für den Gesamtorganismus abläuft. Ist

dieser komplexe, mehrstufige Prozess gestört, können nicht-eliminierte apoptotische Zellen zur Quelle

für inflammatorische Reaktionen werden. In verschiedenen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass

sowohl Defekte bei der Anlockung von Phagozyten als auch bei der Erkennung und Internalisierung

durch „eat-me“-Signale und der anschließenden Degradation der apoptotischen Zellen Ursache für die

Entwicklung schwerer Autoimmunerkrankungen sein können. Auch die Entstehung des humanen

systemischen Lupus erythematodes und von rheumatoider Arthritis wird inzwischen mit der

unzureichenden Eliminierung apoptotischer Zellen in Zusammenhang gebracht.

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Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. (2004). Clearance of apoptotic cells: getting

rid of the corpses, Mol Cell, 14(3):277-87

Buk, D.M., Waibel, M., Braig, C., Martens, A.S., Heinrich, P.C., Graeve, L. (2004). Polarity and lipid

raft association of the components of the ciliary neurotrophic factor receptor complex in Madin-Darby

canine kidney cells, Journal of Cell Science, 117 (Pt10): 2063-75

( * bezeichnet geteilte Erstautorenschaft)

122

8 Lebenslauf

12. Juni 1978 geboren in Schwäbisch Gmünd (Baden-Württemberg)

1984-1988 Grundschule Bargau

1988-1994 Realschule Heubach

1994-1997 Agnes-von-Hohenstaufen-Schule, Schwäbisch Gmünd

Ernährungswissenschaftliches Gymnasium

Juni 1997 Abiturprüfung

Oktober 1997

bis Juli 2003

Studium der Ernährungswissenschaft, Universität Hohenheim, Stuttgart

Abschluss: Diplom-Ernährungswissenschaftlerin

Oktober 2002

bis Juli 2003

Diplomarbeit an der Universität Hohenheim, Stuttgart, am Institut für

Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft, Fachgebiet Biochemie

der Ernährung, unter der Betreuung von Prof. Dr. Lutz Graeve mit dem

Titel:

„Untersuchungen zur Assoziation von LIF-Rezeptor und IL-6-Rezeptor

(gp80) mit lipid rafts“

Oktober 2003

bis Mai 2007

Dissertation im Labor von Prof. Dr. Sebastian Wesselborg an der

Universitätsklinik Tübingen, Abteilung für Innere Medizin I, Sektion für

Molekulare Gastroenterologie und Hepatologie, unter der Betreuung von

Prof. Dr. Lutz Graeve (Hohenheim) mit dem Titel:

„Eliminierung apoptotischer Zellen durch professionelle Phagozyten:

Generierung, Freisetzung und Erkennung des monozytären

Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin und Bedeutung von Annexin I

als Brückenprotein in der phagozytotischen Synapse“

123

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