Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständen ... · Antibiotika und Chemotherapeutika...

Aus dem Zentrum für LebensmittelwissenschaftenZentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und –technologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständenausgewählter Antibiotika und Chemotherapeutika in

Hühnereiern mittels mikrobiologischemHemmstofftest

INAUGURAL – DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

( Dr. med. vet. )

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Annette Bendixaus Lehrte

Hannover 2003

II

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. S. Wenzel; PD Dr. M. Kühne

1. Gutachter: PD Dr. M. Kühne

2. Gutachter: PD Dr. G. Glünder

Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2003

III

Meiner Familie in Dankbarkeit

V

Inhaltsverzeichnis:

1. Einleitung 1

2. Wissenschaftliches Schrifttum 3

2.1. Antibiotika und Chemotherapeutika zum Einsatz bei Nutzgeflügel 3

2.1.1. ß-Lactam-Antibiotika 3

2.1.1.1. Ampicillin 4

2.1.2. Aminogykosid-Antibiotika 5

2.1.2.1. Dihydrostreptomycin 6

2.1.3. Tetracycline 7

2.1.3.1. Oxytetracyclin 8

2.1.3.2. Doxycyclin 10

2.1.4. Polypeptid-Antibiotika 11

2.1.4.1. Colistin 12

2.1.5. Sulfonamide 13

2.1.5.1. Sulfadimidin 14

2.1.6. Gyrasehemmer 16

2.1.6.1. Enrofloxacin 16

2.2. Rechtliches Umfeld für die Anwendung von Antibiotika und Chemotherapeutika

bei lebensmittelliefernden Tieren 18

2.2.1. Nationales Recht 18

2.2.2. Supranationales Recht 22

2.3. Hühnereier als Lebensmittel 27

2.3.1. Zusammensetzung von Hühnereiern 27

2.3.2. Chemische Zusammensetzung 28

2.3.3. Eibildung 29

2.3.4. Rückstände von Antibiotika und Chemotherapeutika in Hühnereiern 29

2.4. Nachweisverfahren für Antibiotika- und Chemotherapeutikarückständen in Hühner-

eiern 30

2.4.1. Agardiffusionstest 30

2.4.2. Andere mikrobiologische Screeningverfahren 31

VI

2.4.3. Charm-Test 32

2.4.4. ELISA 33

2.4.5. Chromatographische Nachweise 33

2.4.6. Extraktionsverfahren 34

2.5. Zusammenfassende Bewertung des wissenschaftlichen Schrifttums 35

3. Eigene Untersuchungen 37

3.1. Probenmaterial 37

3.2. Laboruntersuchungen 37

3.2.1. Material und Geräte 37

3.3. Methoden 44

3.3.1. Testkeimherstellung 44

3.3.2. Herstellung der Testplättchen 46

3.3.3. Agardiffusionstest 46

3.3.4. Probenvorbereitung für die Festphasenextraktion 49

3.3.5. Festphasenextraktion 51

3.3.6. Einengung der Eluate 52

3.3.7. Bestimmung des Pipettierfehlers 52

4. Ergebnisse 55

4.1. Vorversuche mikrobiologischer Hemmstofftest 55

4.1.1. Ampicillin 55

4.1.2. Dihydrostreptomycin 57

4.1.3. Oxytetracyclin 58

4.1.4. Doxycyclin 59

4.1.5. Colistin 61

4.1.6. Sufadimidin 62

4.1.7. Enrofloxacin 63

4.2. Vorversuche Festphasenextraktion 64





VII

4.2.5. Colistin 76

4.2.6. Sulfadimidin 79


4.3. Aufarbeitung dotierter Proben 85





4.3.5. Colistin 90

4.3.6. Sulfadimidin 91


4.4.1. Zusammenfassung der Einzeluntersuchungen 95

4.4.2. Vergleich der Eichreihen 96

5. Diskussion 101

5.1. Ermittlung geeigneter Nährmedien und Testkeime im mikrobiologischen Hemmstofftest

102

5.2. Ermittlung geeigneter Festphasenextraktionen 103

5.3. Ermittlung geeigneter Extraktionslösungen für die Matrix Hühnerei 105

5.4. Ermittlung der Nachweisgrenzen in dotiertem Vollei 107

5.5. Rechtliche Einordnung der ermittelten Nachweisgrenzen 109

6. Zusammenfassung 111

7. Summary 113

8. Anhang 115

8.1. Verdünnungsreihen 115

8.2. Einzelergebnisse der Vorversuche zum mikrobiologischem Hemmstofftest 120

8.3. Einzelergebnisse der Untersuchung dotierter Volleiproben 132

8.4. Abkürzungen 149

9. Literaturverzeichnis 152

1

1. Einleitung

Der durchschnittliche jährliche Pro-Kopf-Verbrauch an Eiern liegt in Deutschland bei etwa

220 Stück (ZMP, 2003) und steigt stetig an. Dieser hohe Verbrauch begründet sich im hohen

ernährungsphysiologischen Wert und den umfangreichen Verarbeitungsmöglichkeiten für

Eier in der Lebensmittelindustrie, wobei die Eier von Legehennen den weitaus größten

Marktanteil besitzen (FEHLHABER, 1992).

Durch den liberalisierten weltweiten Handel besteht ein großes Angebot an frischen Eiern und

Eiprodukten. Erzeuger von Hühnereiern können wirtschaftlich nur dann konkurrieren, wenn

Preis und Qualität international wettbewerbsfähig sind. Die Wirtschaftlichkeit der Eiprodukti-

on hängt entscheidend vom Umfang der Tierverluste oder krankheitsbedingter Leistungsein-

bußen ab (DVG, 1981).

Aufgrund der hohen Tierdichte innerhalb eines Bestandes gibt es eine Vielzahl an Erkrankun-

gen, die durch infektiöse oder nicht infektiöse Ursachen negative Auswirkungen auf die Le-

getätigkeit und die Qualität der produzierten Eier haben. Deshalb ist das Hauptanliegen der

Tierhalter, die Haltung zu optimieren und die Gesunderhaltung der Tiere zu gewährleisten

(SIEGMANN, 1993).

In der Haltung lebensmittelliefernder Tiere werden große Mengen an Arzneimitteln, insbe-

sondere Mittel mit antibiotischer oder antiparasitärer Wirkung, eingesetzt, um trotz hohem

Infektionsdruck innerhalb einer Herde Tierverluste zu begrenzen. Dieser Arzneimitteleinsatz

birgt das Risiko einer Rückstandsbildung im erzeugten Lebensmittel. Für das Lebensmittel Ei

wird die Situation durch die kumulative Einlagerung der Arzneimittel in die rasch heranrei-

fenden Eifollikel zusätzlich erschwert, da die eingelagerten Arzneimittel nicht rückresorbiert

werden und nach Behandlungsende noch über einen relativ langen Zeitraum im Ei nachweis-

bar bleiben (LÖLIGER, 1978; DVG, 1981; SIEGMANN, 1993).

2

Der Gesetzgeber sieht im nationalen Rückstandskontrollplan eine stichprobenhafte Überprü-

fung aller Lebensmittel vor, wobei bei der Vielzahl der eingesetzten Arzneimittel eine engma-

schige Überwachung mit chemisch-analytischen Verfahren kaum zu realisieren ist.

Ziel dieser Arbeit soll es daher sein, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe es möglich

ist, Eiproben kostengünstig mit geringem Zeitaufwand und hoher Sensitivität auf Rückstände

derjenigen antimikrobiell wirksamen Substanzen zu untersuchen, die bei Legehennen einge-

setzt werden.

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2. Wissenschaftliches Schrifttum

2.1. Antibiotika und Chemotherapeutika zum therapeutischen Einsatz bei Nutzgeflügel

Neben prophylaktischen Maßnahmen stellt die antibakterielle Chemotherapie nach gezielter

Indikationsstellung ein wichtiges Instrument für den behandelnden Tierarzt dar. Die Auswahl

des Medikamentes richtet sich dabei nach der Wirksamkeit und dem toxischen Potential des

Arzneimittels. In der Behandlung von Nutzgeflügel müssen zusätzlich noch die einfache Ap-

plikationsmöglichkeit und die Zulassung dieses Medikamentes für lebensmittelliefernde Tiere

berücksichtigt werden, wobei die rechtlich vorgeschriebenen Wartezeiten für den Tierbesitzer

umsetzbar sein müssen (SIEGMANN, 1993).

Im Bereich der Legehennenhaltung werden verlustreiche Erkrankungen sowohl von gramne-

gativen ( E.coli, Salmonella Spezies, Haemophilus paragallinarum) als auch von grampositi-

ven Bakterien (Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacterium) hervorgerufen. Zur Therapie

dieser Erkrankungen können Substanzen unterschiedlicher Wirkstoffklassen eingesetzt wer-

den. Hierzu zählen ß-Lactam-Antibiotika, Aminoglykoside, Tetracycline, Polypeptid-

Antibiotika, Sulfonamide und Gyrasehemmer.

2.1.1. ß-Lactam-Antibiotika

1929 entdeckte Alexander Flemming die bakterizide Wirkung eines aus Penicillium notatum

gewonnenen Naturstoffes. Die Erforschung dieses Stoffes wurde durch die vielfältigen Ein-

satzmöglichkeiten innerhalb kürzester Zeit vorangetrieben, so dass sich viele Derivate isolie-

ren ließen, denen allen ein einheitliches Grundgerüst zu Grunde liegt. Dieser 6-

Aminopenicillanring (ß-Lactamring) ist bei den Vertretern dieser Antibiotikagruppe in unter-

schiedlicher Weise substituiert. Heute werden die meisten ß-Lactam-Antibiotika halbsynthe-

tisch hergestellt. Die auch heute noch weitverbreitete Anwendung der ß-Lactam-Antibiotika

begründet sich in der großen therapeutischen Breite, der guten Verträglichkeit und der lang-

samen Resistenzentwicklung unter der Therapie. Diesen Vorteilen stehen eine rasche Elimi-

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nierung, die Sensibilisierungsgefahr und die fehlende ß-Lactamase-Stabilität dieser Stoff-

gruppe gegenüber. Eine Weiterentwicklung dieser ursprünglichen Substanzen stellt eine Sta-

bilität gegen das Enzym ß-Lactamase als 7-Aminocephalosporanring dar, welches von einigen

Bakterien als natürlicher Resistenzfaktor gebildet werden kann (SIMON u. STILLE, 1989).

Ein wichtiger Vertreter der ß-Lactam-Antibiotika ist das Ampicillin.

2.1.1.1. Ampicillin

Chemie

Ampicillin stellt den halbsynthetischen Prototyp eines Aminopenicillins dar, bei dem in die

Benzylseitenketten Aminoreste eingeführt wurden. Es ist magensäurestabil, aber nicht ß-

Lactamasefest. In Form der Natriumsalze oder als Trihydrat ist es in verschiedenen Darrei-

chungsformen erhältlich.

Ampicillin verteilt sich in verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten und passiert bio-

logische Schranken wie die Plazentaschranke. Das Verteilungsvolumen ist größer als das der

Benzylpenicilline, aber die Proteinbindung ist geringer. Die Halbwertszeit ist im Vergleich zu

anderen Antibiotika sehr kurz (Hund: 30 Minuten). Wäßrige Lösungen sind sehr instabil

(SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995).

Wirkungsspektrum

Wie bei allen ß-Lactamantibiotika beruht auch bei Ampicillin die bakterizide Wirkung auf

einer Hemmung der Zellwand-Peptidoglykansynthese, wodurch die Bildung des Mureinske-

lettes, welches besonders bei grampositiven Keimen ausgebildet ist, gestört wird. Zusätzlich

entfaltet Ampicillin auch eine Wirkung gegen gramnegative Keime (FORTH et al., 2001).

Pharmakokinetik

Bei Gabe über das Futter wird Ampicillin zu etwa 30 - 50% resorbiert. Nach parenteraler Ap-

plikation werden deutlich höhere Plasmakonzentrationen erreicht. Eine Serumkonzentration

von ca. 5µg/ml gilt als therapeutisch wirksam (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL,

1995).

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Einsatz bei Geflügel (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995)

Vögel: 100 mg/kg alle 4 Stunden i.m., s.c. oder i.v.

Ziertauben, Zierhühner: 200 mg/kg 2x täglich oral

Masthähnchen:200 mg/Tier/Tag mit dem Trinkwasser oder 50 mg/Tier 4x täglich oral

Wartezeit: essbare Gewebe: 6 Tage, Eier: 10 Tage

Zugelassene Arzneimittel für Masthähnchen (ANONYM, 2002)

Ampicillin C20 GKS®, Ampicillin P®, Ampicillin-Trihydrat®, Ampicillin – W®, Ampi-

ciph®, Ampisel-Pulver 10%®, Vetricillin®Oral

Rechtliche Einordnung

Aufgrund einer toxikologischen Risikobewertung ist Ampicillin in der EU-Verordnung

2377/90 in Annex I mit einem Maximalen Rückstandswert (MRL = Maximum Residue Limit)

von 50 µg/kg Muskulatur, Leber, Niere und Fett bei allen zur Lebensmittelerzeugung genutz-

ten Tierarten eingestuft. Für Milch liegt der gesetzlich geregelte MRL bei 4 µg/kg. Für das

Lebensmittel Ei ist bisher kein MRL festgesetzt worden, da auch kein Medikament für den

Einsatz bei Legehennen zugelassen ist.

2.1.2. Aminoglykosid-Antibiotika

Natürliche Aminoglykoside werden von Pilzen der Gattung Streptomyces oder Micromono-

spora produziert. Alle Substanzen dieser Antibiotikagruppe sind basische, stark polare Ver-

bindungen aus zwei oder mehr Aminozuckern, die glykosidisch an ein Aminocylitol (Strepti-

din oder 2-Desoxystreptamin) gebunden sind. Sie sind gut wasserlöslich, wenig lipophil und

sehr stabil im pH-Bereich 2,2 – 10 sowie relativ temperaturstabil.

Der große therapeutische Vorteil dieser Antibiotikagruppe liegt im breiten Wirkungsspek-

trum, der primär bakteriziden Wirkung und dem raschen Wirkungseintritt. Sie zeigen eine

6

synergistische Wirkung in Kombination mit ß-Lactam-Antibiotika (FORTH et al., 2001). Ei-

nen wichtigen Vertreter dieser Wirkstoffgruppe stellt das Streptomycin dar.

2.1.2.1. Dihydrostreptomycin

Chemie

Dihydrostreptomycin wurde durch katalytische Hydrierung des Streptomycins, welches aus

dem Kulturfiltrat von Streptomyces griseus gewonnen wurde, hergestellt. Im sauren Milieu ist

die Wirksamkeit abgeschwächt, im alkalischen dafür gesteigert (SCHADEWINKEL-

SCHERKL u. SCHERKL, 1995).

Wirkungsspektrum

Das Wirkungsspektrum umfaßt vor allem gramnegative Keime wie Enterobacteriaceaen, Pa-

steurellen und Mykoplasmen. Als empfindlich gelten Keime mit einer Minimalen Hemmkon-

zentration (MHK) von bis zu 10 µg/ml. Aminoglykosid-Antibiotika zeigen eine konzentrati-

onsabhängige Bakterizidie.

Aminoglykoside hemmen die Proteinsynthese der Bakterien, indem sie an die 30S-Unterein-

heiten der Ribosomen binden und sie dabei sterisch so verändern, dass Peptide nicht gebildet

werden können. Außerdem haben sie eine Wirkung auf die Zellmembran, welches zu einer

Permeabilitätsstörung führt. Somit zeigen diese Antibiotika eine bakterizide Wirkung sowohl

in der Ruhe- als auch in der Wachstumsphase. Eine Resistenzbildung setzt sehr schnell schon

nach wenigen Kontakten mit Bakterien oder unter der Therapie ein, da sie auf einer one-step-

Mutation beruhen. Kreuzresistenzen kommen nur selten vor. Insgesamt ist die Resistenzlage

ungünstig, da mittlerweile 30-70 % der E.coli-Stämme als resistent zu bezeichnen sind. Mo-

notherapien sind deshalb nicht angezeigt (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL,

1995).

Pharmakokinetik

Nach oraler Applikation werden die Aminoglykosid-Antibiotika kaum resorbiert. Im Blut

werden sie nur in geringem Maße an Plasmaproteine gebunden (FORTH et al., 2001). Die

7

Ausscheidung erfolgt fast ausschließlich auf renalem Wege, wobei die Halbwertszeit etwa bei

2 Stunden liegt (FREY u. LÖSCHER, 2002).


Vögel: 15 mg/kg 2-3x täglich i.m.

Ziertauben, Zierhühner: 50-80 mg/kg oral oder i.m.

Huhn:100 – 200 mg oral über maximal 3 Tage

Wartezeit: orale Therapie: essbare Gewebe: 7 Tage, Eier: 0 Tage

parenterale Therapie: essbare Gewebe: 25 Tage, Eier: 10 Tage

Zugelassene Arzneimittel für Geflügel (ANONYM, 2002)

Busal® (nicht für Legehennen), Langzeitpenicillin + Dihydrostreptomycin®, Mai-Bacter®

Solubile, Vetripen®- Depot N


Aufgrund der noch nicht abgeschlossenen toxikologischen Risikobewertung war Dihy-

drostreptomycin bis 28.08.2002 in Annex III der EU-Verordnung 2377/90 mit einem vorläu-

figen MRL von 1000 µg/kg für Nieren von Rindern, Schafen, Schweinen und Geflügel und

500 µg/kg für Muskulatur, Leber und Fett enthalten. Für Eier wurde bisher noch kein MRL

festgesetzt (EMEA, 2002). Nach neuesten toxikologischen Bewertungen wurden die vorläufi-

gen MRL-Werte im September 2002 als endgültige Werte in Annex I der EU-Verordnung

2377/90 übernommen.

2.1.3. Tetracycline

Natürliche Tetracycline werden aus verschiedenen Streptomycesarten gewonnen. Sie bestehen

aus vier linear kondensierten Sechserringen (Naphthacenkern), wobei sich die verschiedenen

Derivate in den Substituenten an den Ringpositionen 5, 6 und 7 unterscheiden (FREY u.

LÖSCHER, 2002). Tetracycline sind kaum wasserlöslich; als amphotere Substanzen bilden

8

sie Salze mit Säuren und Basen. Mit zwei- und dreiwertigen Kationen bilden sie schwer lösli-

che Chelate, wodurch sich die unterschiedliche Resorptionsquote erklären läßt. Im Organis-

mus werden die Tetracycline in Knochen und Zähnen eingelagert. Bei feuchter Lagerung oder

hohen Temperaturen entstehen durch Dehydrationen nephrotoxische Epi-Anhydro- oder An-

hydrotetracycline. Anhydrotetracycline entstehen auch unter Lichteinwirkung. Diese Stoffe

sollen für die Photosensibilisierung der Haut verantwortlich sein. In gelöster Form sind Te-

tracycline relativ instabil (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995). In der Vete-

rinärmedizin kommen verschiedene Tetracycline (Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Tetracy-

clin, Rolitetracyclin, Doxycyclin, Minocyclin) zur Anwendung, wobei nicht alle Substanzen

zur Therapie bei lebensmittelliefernden Tieren zugelassen sind. Unter Berücksichtigung der

Zulassungsbeschränkungen werden Tetracyclin, Oxytetracyclin und Doxycyclin im Nutzge-

flügelbereich als häufigste Tetracycline eingesetzt.

2.1.3.1. Oxytetracyclin

Chemie

Natürliche Oxytetracycline werden von Streptomyces rimosus gebildet. Durch Bildung des

Hydrochlorides kann die Wasserlöslichkeit verbessert werden.

Die Halbwertszeit richtet sich nach der Applikationsart und der galenischen Zubereitung, so

dass bei den sogenannten Long-acting-Präparaten eine Anwendung in mehrtägigen Intervallen

möglich ist.

Zwischen Oxytetracyclinen und anderen Arzneimitteln gibt es eine Vielzahl von Inkompa-

tibilitäten, welche von Faktoren wie pH-Wert, Konzentration, Temperatur und verwendetem

Lösungsmittel abhängen (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995).

Wirkungsspektrum

Aufgrund der Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese durch Bindung an die 50S-

Untereinheiten der Ribosomen wirken Tetracycline auf schnell wachsende Keime bakte-

riostatisch. Das Wirkungsspektrum liegt gleichwohl im grampositiven als auch im gramnega-

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tiven Bereich, wobei weit verbreitete Resistenzen in dieser Antibiotikagruppe den therapeuti-

schen Einsatz beschränken (FREY u. LÖSCHER, 2002).

Pharmakokinetik

Nach oraler Applikation wird Oxytetracyclin zu etwa 60 % resorbiert und liegt dann zu circa

30 % proteingebunden vor. Es verteilt sich in allen Organen und Körperflüssigkeiten, wobei

eine hohe Affinität zu calciumhaltigen Geweben (Knochen, Zähne) besteht. Während der

Therapie soll der Plasmaspiegel zwischen 0,5 und 2 µg/ml liegen.

Die Eliminierung erfolgt sowohl renal als auch biliär, wobei eine Störung der Darmflora ein-

treten kann, wenn die Substanzen nicht mit Kotbestandteilen schwer lösliche Chelatkomplexe

bilden (FORTH et al., 2001). Die Muttersubstanzen sind sehr instabil gegenüber dem Umge-

bungsmillieu und wandeln sich leicht in ihre 4-Epimere um.


Huhn, Pute: 50 mg/kg 2-3x täglich i.m., s.c.

Ziervögel: 5 – 15 mg/100 ml Trinkwasser oder 1 mg/30 g Futter

Huhn, Taube: maximal 80 mg/kg/Tag oral

Wartezeit: essbare Gewebe und Eier: 21 Tage


OTC 40%ig, Ursocylin® 10% per inj., Ursocylin® Pulver 20


Oxytetracyclin besitzt eine niedrige Gewebstoxizität und es gibt auch keinen Beweis für eine

kanzerogene oder mutagene Wirkung. Aufgrund der chemischen Instabilität dieser Substanz

hat der Gesetzgeber MRL-Werte für die Summe der Muttersubstanz und seiner 4-Epimere

festgesetzt. Für Nieren aller zur Lebensmittelerzeugung genutzten Tierarten liegt der MRL bei

600 µg/kg, für Leber bei 300 µg/kg, für Muskulatur und Milch bei 100 µg/kg und für Eier bei

200 µg/kg.

Oxytetracyclin ist in Annex I der EU-Verordnung 2377/90 mit festgesetzten Höchstmengen

aufgenommen (EMEA, 2002).

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2.1.3.2. Doxycyclin

Chemie

Doxycyclin ist ein halbsynthetisches Tetracyclin, welches gegenüber den klassischen Te-

tracyclinen ein breiteres Wirkungsspektrum besitzt. Außerdem ist die Fettlöslichkeit verbes-

sert. Die Halbwertszeit ist bei Doxycyclin im Vergleich zu anderen Tetracyclinen verlängert.

Die Interaktionen mit den zwei- und dreiwertigen Kationen ist nicht so ausgeprägt wie bei den

natürlichen Tetracyclinen (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995).

Wirkungsspektrum

Doxycyclin hat gegenüber den alten Tetracyclinen ein erweitertes Wirkungsspektrum, da es

auch gegen plasmidtragende, tetracyclin- und penicillinresistente Stämme wirkt. Aufgrund der

hohen, lange anhaltenden Plasmakonzentrationen und der geringen Schädigung der Darmflora

ist Doxycyclin das Tetracyclin der Wahl bei der Behandlung von Vögeln. Außerdem wird es

erfolgreich zur Therapie der Psittakose eingesetzt (SCHADEWINKEL-SCHERKL u.

SCHERKL, 1995).

Pharmakokinetik

Doxycyclin weist gegenüber den älteren Tetracyclinen einige pharmakologische Vorteile wie

längere Halbwertszeit und bessere Penetrationsfähigkeit in Gewebe und Körperflüssigkeiten

aufgrund der verbesserten Fettlöslichkeit auf. Die Resorption nach oraler Gabe ist gut, wobei

sie geringer durch zwei- und dreiwertige Kationen im Futter gestört wird als bei anderen Te-

tracyclinen. Die Ausscheidung erfolgt primär in inaktiver Form über den Kot, weshalb Doxy-

cyclin auch bei nierengeschädigten Patienten sehr gut verwendet werden kann. Die negativen

Auswirkungen auf die Darmflora sind gering (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL,

1995). Bei kurzzeitiger Anwendung zeigt Doxycyclin eine geringe Gewebs-toxizität, keine

Mutagenität und keine Teratogenität. Bei längerer Anwendung hingegen zeigen sich Verände-

rungen der Leber.

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Psittaciden (Psitakosebehandlung): 100 mg/kg i.m. 9x im Abstand von 5 Tagen

Ziertauben, Zierhühner (Ornithosebehandlung): 100 mg/kg in zwei Portionen i.m. alle 6 Tage

Brieftaube: 25 mg/kg 2x täglich oral mit Grit

Vögel: 30 mg/100 ml Trinkwasser

Zugelassene Arzneimittel (ANONYM, 2002)

kein Präparat zur Anwendung bei Nutzgeflügel zugelassen. Doxirobe Gel®, Doxy – acis 100-

Humanpräparat®, Doxyhexal SF®, Doxihexal Tabs®, Ronaxan®, Vibranvenös®


In Verordnung 2377/90 ist Doxycyclin in Annex I aufgenommen. Für Rinder liegt der MRL

für Muskulatur bei 100 µg/kg, für Leber bei 300 µg/kg und für die Niere bei 600 µg/kg.

Doxycyclin darf nicht bei Tieren angewendet werden, von denen Milch für den menschlichen

Verzehr gewonnen wird. Für das Schwein und das Geflügel gelten die gleichen MRL-Werte,

wobei zusätzlich aufgrund der hohen Fettlöslichkeit noch die Haut und das Fettgewebe mit

300 µg/kg reglementiert werden. Doxycyclin darf nicht bei Tieren angewendet werden, deren

Eier für den menschlichen Verzehr gewonnen werden (EMEA, 2002)

2.1.4. Polypeptid-Antibiotika

Zu dieser Antibiotikagruppe gehören Polymyxin B, Colistin, Bacitracin und Tyrothricin, wel-

che alle ein verzweigtes, cyklisches Dekapeptid mit endständigen Amino- und Fettsäuren dar-

stellen (FREY u. LÖSCHER, 2002). Sie zeigen chemisch-physikalische Inkompatibilitäten

mit zweiwertigen Kationen, ungesättigten Fettsäuren, Polyphosphaten, Aminopenicillinen,

Aminoglykosiden und Cephalosporinen. Bei systemischer Verabreichung besteht ein hohes

toxisches Nebenwirkungspotential bei dieser Antibiotikagruppe, weshalb sie nur nach strikter

Indikationsstellung verwendet werden sollten (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL,

1995). Colistin ist für den Geflügelbereich der wichtigste Vertreter dieser Substanzklasse.

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2.1.4.1. Colistin

Chemie

Natürliches Colistin (Polymyxin E) wird von Bacillus colistinus gebildet. In der Veterinärme-

dizin wird es meist als Colistinsulfat verwendet.

Colistin ist aufgrund seiner amphoteren Struktur gut wasserlöslich und oberflächenaktiv. Als

Salz ist es bei sauren pH-Werten sehr stabil, im basischen Milieu jedoch wird es schnell zer-

stört.

Wirkungsspektrum

Die amphotere Struktur des Colistins ermöglicht eine direkte Einlagerung des Antibiotikums

in die bakterielle Zellmembran, wodurch es zu Störungen in der Permeabilität der Zellen

kommt. Von diesen Zellwandschädigungen sind besonders gramnegative Bakterien betroffen,

da diese nur eine sehr dünne Zellwand als Barriereschicht besitzen, so daß das Haupteinsatz-

gebiet des Colistins gegen die Enterobacteriaceae gerichtet ist. Außerdem inaktiviert Colistin

Endotoxine (Escherichia coli) und zeigt eine antimykotische Wirkung auf Candida-Arten

(FREY u. LÖSCHER, 2002).

Pharmakokinetik

Nach oraler Applikation wird Colistin kaum resorbiert. Bei oraler oder lokaler Gabe sind die

starken Nebenwirkungen ( vor allem Neurotoxizität, Nephrotoxizität und Muskelrelaxanz),

die man bei parenteraler Applikation beobachtet, nicht zu erwarten. Mehr als 50% sind an

Gewebe gebunden, so dass der Plasmaspiegel nur eine geringe Aussagekraft besitzt

(SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995). Der therapeutisch wirksame Serum-

spiegel liegt zwischen 3 – 5 µg/ml (FREY u. LÖSCHER, 2002).


Dosierung nach Einheiten (1 I.E.= 0,03 µg Colistin-Base) 2 Mio. I.E./kg Alleinfutter über 5 –

7 Tage

Wartezeit: essbare Gewebe: 2 Tage, Eier: 0 Tage

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Belacol® 2,5, Colipur®, Colistin 2.4 Mega®, Colistin 12%®, Colistin 100®, Colistin C12

GS®, Colistin-S I®, Colistin S solubile®, Colivet® 6%


Die toxikologische Risikobewertung hat für Colistin zur Einstufung in Annex I der EU-

Verordnung 2377/90 mit Festsetzung von MRL-Werten für Fett, Muskulatur und Leber von

150 µg/kg, für Nieren von 200 µg/kg, für Milch 50 µg/kg und 300 µg/kg für Eier geführt

(EMEA, 2002).

2.1.5. Sulfonamide

1935 entdeckte Gerhard Domagk die antibakterielle Wirksamkeit des Azofarbstoffes Prontosil

gegen experimentelle Kokkeninfektionen und schuf damit die wichtigste Wirkstoffgruppe im

Kampf gegen bakterielle Infektionen bis zur Etablierung der Penicilline. Der von ihm ent-

deckte Stoff stellt ein sogenanntes ´pro-drug´ dar, da die aktive Komponente Sulfanilamid erst

im Organismus gebildet wird. Es wurden eine Vielzahl von Derivaten entwickelt, wobei eine

Substitution des Amidstickstoffes mit einem heterocyclischen Rest im allgemeinen eine Stei-

gerung der Wirksamkeit sowie eine Verbesserung anderer Eigenschaften (Löslichkeit, Kine-

tik, Verträglichkeit) bewirkte. Demgegenüber hat eine Substitution der aromatischen Amid-

gruppe einen Verlust der bakteriellen Aktivität zur Folge.

Die therapeutische Zuverlässigkeit der Sulfonamide hat in den letzten Jahrzehnten infolge

zahlreicher resistenter Bakterienstämme erheblich nachgelassen. Die Resistenz richtet sich

meist gegen die gesamte Gruppe der Sulfonamide, zeigt aber kaum Kreuzresistenzen mit an-

deren Substanzgruppen. Die entwickelten Resistenzen werden dabei durch natürliche Selekti-

on, Spontanmutationen, Enzymadaptionen oder durch resistenztragende Plasmide verursacht.

Eine Steigerung der bakteriostatischen Wirkung der Sulfonamide ist durch Kombination mit

anderen bakteriostatischen Antibiotika (z.B. Trimethoprim) möglich, so dass dadurch das

Wirkungsspektrum bei niedrigeren Dosierungen erweitert werden kann (FREY u. LÖSCHER,

2002).

14

2.1.5.1. Sulfadimidin

Chemie

Sulfadimidin hat sein Wirkungsoptimum zwischen pH 5,5 und 7,5. Im sauren Harn besteht

die Gefahr der Auskristallisierung in den Nierentubuli und den harnabführenden Wegen, wel-

che durch ausreichende Flüssigkeitszufuhr während der Therapie reduziert werden kann. Auf-

grund zahlreicher chemisch-physikalischer Inkompatibilitäten mit anderen Arzneimitteln

sollten Mischspritzen vermieden werden. Sulfadimidin ist temperaturempfindlich, so dass es

am besten bei Raumtemperatur gelagert werden sollte (SCHADEWINKEL-SCHERKL u.

SCHERKL, 1995).

Wirkungsspektrum

Sulfadimidin wirkt bakteriostatisch auf grampositive und gramnegative Bakterien, da es

kompetitiv durch Substratkonkurrenz die Dihydropteroinsäuresynthetase hemmt. Durch diese

Hemmung wird die für wachsende und sich vermehrende Mikroorganismen notwendige Fol-

säuresynthese blockiert. In der Ruhephase sind Bakterien nicht auf die Folsäuresynthese an-

gewiesen, so dass Sulfadimidin in diesem Stadium keinerlei Wirkung zeigt, sondern nur auf

proliferative Bakterien wirken. Da Mensch und Tier Folsäure nicht selbst synthetisieren son-

dern diese essentiell mit der Nahrung aufnehmen müssen, bietet sich kein Angriffspunkt im

Wirtsorganismus.

Aufgrund der ungünstigen Resistenzlage sollte vor Therapiebeginn ein Antibiogramm ange-

fertigt werden (FREY u. LÖSCHER, 2002).

Pharmakokinetik

Die Natriumsalze der Sulfonamide werden unabhängig von der Nahrungsaufnahme nach ora-

ler Applikation gut aus dem Darm resorbiert. Das Verteilungsvolumen entspricht etwa dem

des Körperwassers. Sulfadimidin zeigt eine gute Gewebspenetrationsfähigkeit; es passiert die

Plazentaschranke und einige auch die Blut-Hirnschranke. Die Metabolisierung unterliegt gro-

ßen tierartlichen Unterschieden, wobei es sowohl in freier als auch in konjugierter Form

15

hauptsächlich über die Nieren eliminiert wird (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL,

1995).

Die Wirkung des Sulfadimidins tritt erst nach einer konzentrationsabhängigen Latenzzeit ein,

da die bereits von den Bakterien synthetisierte Folsäure erst verbraucht werden muß. Die

größte therapeutische Aktivität besitzt dieses Antibiotikum in der frühen Phase der Infektion,

da die Erreger zu diesem Zeitpunkt eine sehr hohe Teilungsrate haben und der Folsäurebedarf

dementsprechend hoch ist. Außerdem ist das retikuloendotheliale System des Wirtsorga-

nismus in diesem Stadium sehr aktiv, wodurch eine Phagozytose der vorhandenen teilungs-

unfähigen Erreger begünstigt wird. Chronische Infektionen werden durch Sulfadimidin weit-

aus weniger effektiv beeinflußt (FREY u. LÖSCHER, 2002).


Ziervögel: 200 mg/100 ml Trinkwasser über 5 Tage

Tauben, Hühner: 100 mg/kg 1x täglich i.m., s.c. oder oral

Ziertauben, Zierhühner: 50 mg/kg oral oder 0,2%ig im Trinkwasser

Wartezeit: parenteral: essbare Gewebe: 12 Tage, Eier: 10 Tage

oral: essbare Gewebe: 14 Tage, Eier: 10 Tage

Tierartliche Besonderheiten: bei Hühnern im therapeutischen Bereich bereits toxische

Effekte, Minderung der Legeleistung nach Antibiotikaeinsatz bei Legehennen

Zugelassene Sulfadimidine für Geflügel (ANONYM, 2002)

MZ1®-kwl (nicht für Legehennen), S-B (Tetra-Pen-Sulf)®, S-D (Tylosin – Sulfa)®, Sulfa-

dimidin 33% Forte®, Sulfadimidin 50F®, Sulfadimidin50W®, u.a.


Da zu der Gruppe der Sulfonamide eine Vielzahl von ähnlichen Chemotherapeutika gezählt

werden, reglementiert der Gesetzgeber in der EU-Verordnung 2377/90 in Annex I die Summe

aller dieser Stoffe mit 100 µg/kg Muskulatur, Fett, Leber und Niere aller zur Lebensmittelge-

winnung genutzter Tierarten (EMEA, 2002). Für das Lebensmittel Ei ist bisher kein MRL

16

festgelegt worden, da der Einsatz bei Geflügel durch die bereits im therapeutischen Bereich

auftretenden toxischen Nebenwirkungen stark eingeschränkt ist.

2.1.6. Gyrasehemmer (Chinolone)

Die Bezeichnung Gyrasehemmer begründet sich in der Hemmwirkung dieser Antibioti-

kagruppe auf die bakterielle DNA-Gyrase. Nalidixinsäure stellte die Ausgangssubstanz für

diese synthetisch hergestellten Antibiotika dar, wobei allen ein Grundgerüst aus zwei Ringsy-

stemen zugrunde liegt, welches eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem Chinolonring besitzt.

Durch Veränderungen am Chinolongrundgerüst entstanden seit den 60er Jahren eine Vielzahl

von Substanzen, wovon jedoch nur noch einige wenige eine therapeutische Bedeutung

besitzen. Die Hauptbedeutung kommt heute den Fluorchinolonen (Ofloxacin, Ciprofloxacin,

Norfloxacin, Enrofloxacin, Sarafloxacin, Difloxacin) zu, da diese im Vergleich zu den älteren

Gyrasehemmern eine günstigere Pharmakokinetik und ein breiteres Wirkungsspektrum zeigen

(SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995). In der Veterinärmedizin sind En-

rofloxacin, Difloxacin und Sarafloxacin zur Anwendung bei Geflügel zugelassen, wobei die

älteste Substanz Enrofloxacin nicht bei Legehennen angewendet werden darf.

2.1.6.1. Enrofloxacin

Chemie

Chinolone neigen zur Auskristallisation im Harn, weshalb auf ausreichende Flüssig-

keitszufuhr geachtet werden sollte. Enrofloxacin zeigt eine Vielzahl von Wechselwirkungen

mit anderen Arzneimitteln, wobei in Kombination mit Chloramphenicol, Tetracyclinen oder

Makrolid-Antibiotika antagonistische Effekte und in Kombination mit Aminoglykosiden, Ce-

phalosporinen sowie Breitspektrum-Penicillinen synergistische Effekte im Vordergrund ste-

hen. Andere Arzneimittel mit mehrwertigen Kationen (Mg, Al, Ca) vermindern die Resorpti-

on von Enrofloxacin (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995).

17

Wirkungsspektrum

Das Wirkungsspektrum von Enrofloxacin umfaßt viele gramnegative Keime (Enterobacteria-

ceae, Campylobacter spp., Haemophilus spp. und Vibrionen), Brucellen, Chlamydien, Myko-

plasmen und Mykobakterien. Unter den grampositiven Keimen zeigt es nur gegen Sta-

phylokokken eine gute Wirksamkeit. Streptokokken und Anaerobier lassen sich hiermit nicht

wirkungsvoll behandeln. Die antibakterielle Wirkung beruht auf der Hemmung der bakteriel-

len DNA-Gyrase (Topoisomerase), wodurch die DNA-Replikation gestört wird.

Pharmakokinetik

Die Bioverfügbarkeit nach oraler oder parenteraler Applikation ist gleich gut, wobei die Re-

sorption bei gleichzeitiger Nahrungsaufnahme verlangsamt ist. Enrofloxacin verteilt sich im

gesamten Organismus. Die höchsten Arzneimittelkonzentrationen werden in der Leber, der

Galle, den Nieren, der Lunge und im Genitaltrakt erreicht. Therapeutisch sollten Blutspiegel

von 1µg/ml eingehalten werden. Die Eliminierung erfolgt sowohl renal als auch mit den Fae-

ces (SCHADEWINKEL-SCHERKL u. SCHERKL, 1995). In vivo entsteht als Hauptmetabo-

lit das ebenfalls antimikrobiell wirksame Ciprofloxacin (EMEA, 2002).


Tauben: 5 mg/kg 1 – 2x täglich i.m., s.c. oder oral oder 100 – 200 mg/l Trinkwasser über

5Tage

Hühner: 10 mg/kg KGW oral über 3 – 5 Tage oder 50 – 100 mg/l Trinkwasser über 3 – 5Tage

Wartezeit: parenteral: essbare Gewebe: 7 Tage, Eier: 9 Tage

Zugelassenes Enrofloxacin für Hühner und Puten (ANONYM, 2002)

Baytril® 10% orale Lösung (nicht für Legehennen)


Enrofloxacin ist nicht für die Anwendung bei Legehennen zugelassen, weshalb auch kein

MRL für Eier definiert ist. Für Geflügel anderer Nutzung sind MRL-Werte von 100 µg/kg für

Muskulatur, Haut und Fett, 200 µg/kg für Leber und 300 µg/kg für Nieren in Annex I der EU-

Verordnung 2377/90 festgelegt, wobei die Summe aus Enrofloxacin und Ciprofloxacin re-

18

glementiert wird. Für die anderen zur Lebensmittelgewinnung genutzten Tierarten sind die

MRL-Werte vergleichbar.

Für die neueren Chinolone sind je nach toxischem Potential sehr unterschiedliche MRL-Werte

für Geflügel festgelegt. Für Danofloxacin liegen die MRL-Werte zwischen 100µg/kg (Haut

und Fett) und 400µg/kg (Leber, Niere). Für Difloxacin liegen die MRL-Werte deutlich höher

( zwischen 300µg/kg Muskulatur und 1900µg/kg Leber). Sarafloxacin besitzt insgesamt viel

niedrigere MRL-Werte zwischen 10 und 100µg/kg.

2.2. Rechtliches Umfeld für die Anwendung von Antibiotika und Chemotherapeutika bei le-

bensmittelliefernden Tieren

Die Anwendung pharmokologisch wirksamer Stoffe, insbesondere Antibiotika und Chemo-

therapeutika, beim Tier kann zur Entstehung unerwünschter Rückstände in Lebensmitteln

(essbare Gewebe, Eier) führen. Die Rückstände können bei Aufnahme durch den Menschen

unter Umständen nachteilige Einflüsse auf die Gesundheit ausüben. Aus diesem Grund gibt es

national und international Festlegungen von Anwendungsbeschränkungen und – bedingungen

für pharmakologisch wirksame Substanzen bei lebensmittelliefernden Tieren.

2.2.1. Nationales Recht

Arzneimittelgesetz

Das Arzneimittelgesetz (AMG) dient bereits auf der Ebene der Arzneimittelzulassung der

Vermeidung nicht unbedenklicher Rückstände in Lebensmitteln tierischen Ursprungs. Das

Zulassungsverfahren für Arzneimittel beinhaltet neben einer qualitativen chemischen und

galenischen Prüfung eine genaue Definition der Anwendung nach Tierart, Dosierung und Be-

handlungszweck. Soll das Arzneimittel bei lebensmittelliefernden Tieren angewendet werden,

müssen zusätzlich Untersuchungen zur Ermittlung des Rückstandsverhaltens durchgeführt

werden, um ausreichend sichere Wartezeiten festlegen zu können. Die Wartezeit ist die Zeit,

innerhalb der bei bestimmungsgemäßer Anwendung von Arzneimitteln bei Tieren mit Rück-

19

ständen nach Art und Menge gesundheitlich nicht unbedenklicher Stoffe, insbesondere in sol-

chen Mengen, die festgesetzte Höchstmengen überschreiten, in den Lebensmitteln gerechnet

werden muß, einschließlich einer angemessenen Sicherheitsspanne. Für einige Arzneimittel

gibt es zusätzlich in der Verordnung über Stoffe mit pharmakologischer Wirkung weiterge-

hende Anwendungsbeschränkungen hinsichtlich der zu behandelnden Tierart, Alter der Tiere

und des Zweckes der Anwendung.

Tierärztliche Hausapothekenverordnung

Eine zentrale Bedeutung kommt der tierärztlichen Hausapothekenverordnung (TÄHAV) zu,

die wichtige Angaben zur Anwendung der Arzneimittel bei lebensmittelliefernden Tieren

durch den Tierarzt enthält. So sind z.B. bei einer Arzneimittelumwidmung im Falle eines so-

genannten Therapienotstandes die Wartezeiten so zu bemessen, dass die in der EU-

Verordnung 2377/90 festgesetzten Höchstmengen nicht überschritten werden. Sofern es zu

einer Umwidmung eines Arzneimittels hinsichtlich Tierart, Anwendungsgebiet oder Dosis

gekommen ist, darf die festzulegende Wartezeit von 10 Tagen für Eier, 7 Tagen für Milch und

28 Tagen für essbares Gewebe von Säugetieren und Geflügel nicht unterschritten werden.

Zum 1. November 2002 ist die 11. Novelle des AMGs in Kraft getreten, die einige Neurege-

lungen zur Umwidmung von Fertigarzneimitteln beinhaltet, die sich auf die Regelungen der

TÄHAV beziehen. So wurde eine Kaskade der Umwidmungsmöglichkeiten geschaffen. In

Zukunft dürfen Fertigarzneimittel für Lebensmittel liefernde Tiere nur umgewidmet werden,

wenn die Heilung des Tieres ernstlich gefährdet ist und das Arzneimittel für die gleiche Tier-

art zugelassen ist, aber die Zulassung nur für ein anderes Anwendungsgebiet besteht. In die-

sem Falle gelten die vom Hersteller gemachten Angaben hinsichtlich der einzuhaltenden

Wartezeit. Ist der Wirkstoff nicht für diese Tierart aber für andere lebensmittelliefernde Tiere

zugelassen, so darf ein Medikament bei einem Therapienotstand mit den o.g. Mindestwarte-

zeiten umgewidmet werden. Ist auch diese Form der Umwidmung nicht möglich, so kann im

begründeten Ernstfall auch auf Human- oder Heimtierpräparate zurückgegriffen werden, so-

fern der Wirkstoff in der EU-Verordnung 2377/90 in den Anhängen I bis III aufgenommen ist

(BpT, 2002).

20

Futtermittelgesetz

Das Futtermittelgesetz (FMG) dient ebenfalls der Sicherstellung der gesundheitlichen Unbe-

denklichkeit der Nahrungsmittel tierischer Herkunft für den Menschen. Dabei werden uner-

wünschte Stoffe mit genauen Höchstmengenangaben in Anlage 5 der Futtermittelverordnung

definiert und entsprechende Reglementierungen festgelegt. Des Weiteren hat das FMG Bezug

zur Lebensmittelproduktion, wenn es um die Definition von Futterzusatzstoffen für Misch-

futtermittel in Form von Leistungsförderen und Stoffen zur Verhütung bestimmter Krankhei-

ten geht. Für diese Stoffgruppe gelten ähnlich strenge Anforderungen an die Zulassung wie

für die Arzneimittel in Bezug auf Toxizität, Teratogenität, Rückstandsverhalten und Umwelt-

belastung (MEYER et al., 1993). Da es sich bei diesen Stoffen strenggenommen um Arznei-

mittel handelt, erfolgt hier eine sehr enge Verzahnung mit dem AMG.

Fleischhygienegesetz/Geflügelfleischhygienegesetz (FlHG/GFlHG)

Die Reglementierung von Stoffen mit pharmakologischer Wirkung und deren Metaboliten,

die in Lebensmittel übergehen und gesundheitlich bedenklich sein können, zieht sich durch

eine Vielzahl von Paragraphen. Wenn der begründete Verdacht auf ein Rückstandsrisiko be-

steht, können Auflagen für den Lebendtransport gemacht werden und die Schlachterlaubnis

versagt werden. Rückstandsuntersuchungen sollen stichprobenweise (auch ante mortem), bei

Not- und Krankschlachtungen im Rahmen der bakteriologischen Fleischuntersuchung und bei

begründetem Verdacht durchgeführt werden. Bei dem Nachweis von Rückständen oder

Hemmstoffen können einzelne Teile oder Nebenprodukte der Schlachtung untauglich beurteilt

werden. Darüber hinaus können sich weitere Maßnahmen im Erzeugerbetrieb ergeben. Diese

Regelungen werden sowohl im FlHG als auch im GFlHG definiert (SCHNEIDAWIND u.

HABIT, 2002).

Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (LMBG)

Für die rechtliche Einordnung von Rückständen in Lebensmitteln tierischen Ursprungs ist §15

dieses Gesetzes von großer Bedeutung. Hier bezieht sich das LMBG auf Rückstände von

Stoffen mit pharmakologischer Wirkung. Der erste Abschnitt beschreibt Umstände, die zum

Verbot des Inverkehrbringens der Lebensmittel führen, wobei er Bezug auf Verordnung EWG

Nr. 2377/90 und auf das Arzneimittelgesetz (AMG) nimmt. Der Bezug zur Verordnung EWG

21

2377/90 beruht auf der Überschreitung festgelegter Höchstmengen in seinen Anhängen I

(festgelegte Höchstmengen) und III (vorläufige Höchstmengen) und dem Anwendungsverbot

für Stoffe des Anhangs IV für lebenmittelliefernde Tiere. Ein Inverkehrbringungsverbot be-

steht weiterhin, wenn Stoffe mit pharmakologischer Wirkung in Lebensmitteln vorhanden

sind, die nach dem AMG nicht zugelassen oder registriert sind oder sie als Zusatzstoffe für

Futtermittel nach dem Futtermittelgesetz nicht zugelassen sind. Der zweite Abschnitt nimmt

noch einmal Bezug auf die im AMG definierten Wartezeiten und auf deren Einhaltung. Im

dritten Abschnitt werden einige weitere Ermächtigungen des Bundesministeriums definiert,

um den Verbraucher zu schützen.

Nationaler Rückstandskontrollplan

Der nationale Rückstandskontrollplan dient der gezielten Überwachung des vor-

schriftsmäßigen Einsatzes von pharmakologisch wirksamen Stoffen und der Kontrolle des

Nichteinsatzes verbotener Stoffe. Er basiert auf der Richtlinie 96/23 der EWG. Die Proben-

entnahme erfolgt dabei zum einen in Anlehnung an das Fleischhygienerecht bei 2% aller

geschlachteten Kälber und 0,5% aller anderen gewerblich geschlachten Tiere und zum ande-

ren bedingt durch Hinweise auf unzulässige oder vorschriftswidrige Behandlungen von Tie-

ren. Seit 1999 werden Eier nach geltenden EU-Vorschriften ebenfalls routinemäßig im natio-

nalen Rückstandskontrollplan mit einer Probe je 1.000 Tonnen Jahresproduktion auf Rück-

stände untersucht. Für das Jahr 2001 wurden rund 43.800 Tiere auf 473 Stoffe untersucht, so

dass im Rahmen des Rückstandskontrollplanes ca. 335.000 Untersuchungen durchgeführt

wurden. Auf den Bereich der Eier entfielen dabei 762 Proben mit insgesamt 6348 Untersu-

chungen, wovon keine Untersuchung ein positives Rückstandsergebnis aufwies. Im Bereich

der antibakteriellen Stoffe wurden alle 287 Proben in den 1462 Untersuchungen negativ gete-

stet, wobei der Schwerpunkt der Untersuchungen mit über 50% im Bereich der Chinolone und

42% im Bereich der Tetracycline lag. Insgesamt wiesen 0,22% aller untersuchten Erzeugnisse

oder Tierkörper ein positives Rückstandsergebnis auf, wobei 0,49% aller auf antibakteriell

wirksame Stoffe getesteten Proben ein positives Ergebnis lieferten (BVL, 2003).

22

2.2.2. Supranationales Recht

Bei der Anwendung von Arzneimitteln bei lebensmittelliefernden Tieren sind nicht nur natio-

nale Rechtsbestimmungen einzuhalten. Vielmehr erfordert die zunehmende Globalisierung

des Handels eine Harmonisierung relevanter Rechtsbereiche.

Übereinkommen zur Errichtung der Welthandelsorganisation - WTO

Bereits 1995 wurde ein Übereinkommen zur Errichtung der Welthandelsorganisation (World

Trade Organization = WTO) abgeschlossen. Durch dieses Übereinkommen soll ein freier Wa-

renverkehr zwischen den Vertragsstaaten ohne Diskriminierung einzelner Staaten ge-

währleistet werden. Handelsbeschränkende Maßnahmen dürfen im Rahmen dieses Überein-

kommens nur dann stattfinden, wenn Gründe des Verbraucherschutzes in Form von Gesund-

heitsgefährdung oder Täuschungen vorliegen. Europäisches und nationales Recht hat sich

diesen Bestimmungen unterzuordnen. Für alle Mitgliedstaaten verbindliche Standards werden

durch die Codex Alimentarius Kommission (CAK), die eine Unterorganisation der Food and

Agriculture Organization of the United Nations (FAO) und der World Health Organization

(WHO) ist, festgelegt (MEYER, 1998). Die Codex Alimentarius Kommission trifft sich alle

zwei Jahre, wobei Delegierte der Mitgliedstaaten und Vertreter aus Industrie, Verbraucher-

schutzverbänden und der Wissenschaft teilnehmen und beratend tätig werden. Die Kommissi-

on beschäftigt sich mit Fragen der Lebensmittelverarbeitung ( Zusatzstoffe, Kontaminanten,

Rückstände von Tierarzneimitteln und Pestiziden, Lebensmittelhygiene) und Vermarktung

(Lebensmitteletikettierung, Export- und Importkontrollen), um Empfehlungen und verbindli-

che Standards zu entwickeln. Darüber hinaus sollen Nachweismethoden und Probenahmen

auf internationaler Ebene standardisiert werden. Die einzelnen Teilgebiete bilden zu diesem

Zweck 9 Ausschüsse, die sich dann ausschließlich mit einem Teilgebiet befassen. Der Aus-

schuß für Rückstände von Tierarzneimitteln zum Beispiel wird federführend von den USA

geleitet. Des weiteren gibt es noch 16 Handelsausschüsse, welche sich mit einzelnen Lebens-

mittelgruppen befassen; so hat Dänemark zum Beispiel die Leitung des Ausschusses für ver-

arbeitetes Fleisch und Geflügelprodukte inne (Codex Alimentarius Commission, 2002).

Internationale Harmonisierung ist nur zu erreichen, wenn alle Mitgliedstaaten einheitliche

Standards annehmen, wobei es die Aufgabe der Kommission ist, die Standards so

23

festzusetzten, dass alle Mitgliedstaaten in der Lage sind diese umzusetzen (Codex Alimenta-

rius, 2002).

Europäisches Gemeinschaftsrecht

Das europäische Gemeinschaftsrecht hat in jeder Stufe grundsätzlich Vorrang, einschließlich

der Verfassungen der einzelnen Mitgliedstaaten. Dieser Vorrang führt dazu, daß Be-

stimmungen des nationalen Rechtes ungültig werden, sofern sie mit dem Gemeinschaftsrecht

kollidieren (sog. Sperrwirkung). Verordnungen der Europäischen Gemeinschaft besitzen für

alle Staaten unmittelbare Wirksamkeit und sind in allen Teilen verbindlich. Richtlinien müs-

sen innerhalb einer definierten Frist in nationales Recht umgesetzt werden und haben nach

Verstreichen der Frist entsprechende Gültigkeit. Die Umsetzung innerhalb der einzelnen

Staaten erfolgt nach nationalem Recht; so werden in der Bundesrepublik Deutschland die

meisten Lebensmittelrichtlinien vom Bund umgesetzt. Im Hinblick auf Kontaminanten in Le-

bensmitteln tierischen Ursprunges gibt es auf europäischer Ebene eine Vielzahl von Verord-

nungen und Richtlinien. Neben den unmittelbar geltenden Verordnungen wurden auch eine

Vielzahl europäischer Richtlinien mittlerweile in geltendes deutsches Recht umgesetzt; bei

neuen Erkenntnissen werden diese auf nationaler Ebene laufend ergänzt oder geändert

(MEYER, 1998).

Verordnung (EWG) Nr. 315/93

In dieser Verordnung ist auf innergemeinschaftlicher Ebene das Verfahren zur Kontrolle von

Kontaminanten in Lebensmitteln geregelt. Im Einzelnen beschäftigt sich dieses Rechtswerk

mit Rückständen, die den Lebensmitteln nicht absichtlich hinzugefügt wurden, aber im Le-

bensmittel vorhanden sind und die in Höchstmengen begrenzt sind. Diese Höchstmengen

sollen bei neuen Erkenntnissen innerhalb eines Staates durch den ständigen Lebensmit-

telausschuß überprüft und nötigenfalls korrigiert werden.

Verordnung (EWG) Nr. 2377/90

Im Gegensatz zur Rückstands-Höchstmengen-Verordnung, die sich mit Rückständen von

Pflanzenschutz- und Schädlingsbekämpfungsmitteln, Düngemitteln und sonstigen Mitteln in

oder auf Lebensmitteln und Tabakerzeugnissen beschäftigt, regelt diese Verordnung die Fest-

24

setzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in Nahrungsmitteln tierischen Ur-

sprunges. Hauptanliegen dieser Verordnung ist es, den ständigen Bedarf an Arzneimitteln für

landwirtschaftliche Nutztiere zwar zur Steigerung der Tiergesundheit zu gewährleisten, aber

in erster Linie die Gesundheit des Verbrauchers durch Festlegung von Höchstmengen in

Übereinstimmung mit den allgemeinen Grundsätzen der Unbedenklichkeitsprüfung sicher-

zustellen. Die Festlegung der Höchstmengen obliegt dabei dem Ausschuss für Tierarzneimit-

tel der Kommission in Zusammenarbeit mit Ausschüssen zur analytischen und toxikologisch-

pharmakologischen Prüfung der einzelnen Mitgliedstaaten, die in der Bundesrepublik

Deutschland auf der Basis des Arzneimittelgesetzes eingesetzt wurden. Diese Verordnung

besitzt neben den allgemeinen Bestimmungen über Höchstmengen pharmakologisch wirksa-

mer Stoffe noch fünf Anhänge. In Anhang I findet sich ein Verzeichnis der pharmakologisch

wirksamen Stoffe, für die Höchstmengen für Rückstände festgesetzt sind. Dabei wird der

pharmakologisch wirksame Stoff, die Marker-Substanz, die Tierart, das Zielgewebe und der

Maximum Residue Limit (MRL) genau definiert. Der MRL-Wert stellt in Anlehnung an das

Arzneimittelgesetz die maximale zugelassene Höchstmenge eines Stoffes dar, die nach wis-

senschaftlichen Erkenntnissen bei durchschnittlichen Essgewohnheiten keine Gefährdung der

menschlichen Gesundheit bedeutet.

Anhang II beinhaltet die Stoffe, für die keine Höchstmengen für Rückstände gelten, d.h. dass

bei bestimmungsgemäßem Gebrauch keinerlei Gesundheitsgefährdung für den Verbraucher

besteht. Beschränkt werden diese Stoffe nur durch die ausschließliche Anwendungsmöglich-

keit für einzelne Tierarten oder durch einzelne Anwendungsgebiete.

Anhang III definiert die pharmakologisch wirksamen Stoffe, für die vorläufige Höchstmengen

festgesetzt wurden. Der Aufbau des Verzeichnisses entspricht dem des Anhanges I, wobei die

sonstigen Vorschriften genauere Einschränkungen enthalten. Sofern hier für einen Stoff keine

Angaben gemacht wurden, gilt der vorläufige MRL-Wert für fünf Jahre nach Aufnahme in

diesen Anhang. Innerhalb dieser Zeit müssen toxikologische Prüfungen eine Einordnung in

eine der anderen Anhänge ermöglichen. Damit zeigt sich deutlich, daß der Gesetzgeber an

laufender Aktualisierung dieser Verordnung Interesse hat, sofern sich neue wissenschaftliche

Erkenntnisse hinsichtlich eines Gefährdungspotentials der menschlichen Gesundheit ergeben.

25

Bedeuten Rückstände eines pharmakologisch wirksamen Stoffes in jeder Konzentration eine

Gefährdung der Gesundheit des Verbrauchers, so werden diese Substanzen in Anhang IV ein-

geordnet und sind damit für die Anwendung bei lebensmittelliefernden Tieren verboten.

Anhang V enthält verwaltungstechnische Angaben. Er fordert genaue Angaben, die in einem

Antrag zur Festsetzung von Höchstmengen für Rückstände von pharmakologisch wirksamen

Stoffen aufgenommen werden müssen.

Unter Berücksichtigung der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 sind folgende Antibiotika und

antibakterielle Chemotherapeutika zum Einsatz bei Geflügel direkt oder durch Umwidmung

mit Einhaltung der entsprechenden weiteren Rechtsnormen zugelassen (Tabelle 1).

Substanz: Status: MRL Eier: Hinweise:

Amoxicillin Annex I Kein MRL festgelegt 1

Ampicillin Annex I Kein MRL festgelegt 1

Benzylpenicillin Annex I Kein MRL festgelegt 1

Chlortetracyclin Annex I 200µg/kg Ei 1

Cloxacillin Annex I Kein MRL festgelegt 1

Colistin Annex I 300µg/kg Ei 1

Danofloxacin Annex I Kein MRL festgelegt 2

Dicloxacillin Annex I Kein MRL festgelegt 1

Difloxacin Annex I Kein MRL festgelegt 2

Doxycyclin Annex I Kein MRL festgelegt 2

Enrofloxacin Annex I Kein MRL festgelegt Hühner,Puten

Erythromycin Annex I 150µg/kg Ei 1

Florfenicol Annex I Kein MRL festgelegt 2

Flumiquin Annex I Kein MRL festgelegt 2

Kanamycin Annex III (bis1.1.2004)

Kein MRL festgelegt Hühner

Lincomycin Annex I 50µg/kg Ei 1

Neomycin Annex I 500µg/kg Ei 1

Oxacillin Annex I Kein MRL festgelegt 1

Oxolinsäure Annex I 50µg/kg Ei Hühner

26

Substanz: Status: MRL Eier: Hinweise:

Oxytetracyclin Annex I 200µg/kg Ei 1

Sarafloxacin Annex I Kein MRL Hühner

Spectinomycin Annex I Kein MRL 2

Spiramycin Annex I Kein MRL Hühner

Sulfonamidgruppe Annex I Kein MRL festgelegt 1

Tetracyclin Annex I 200µg/kg Ei 1

Thiamphenicol Annex I Kein MRL 2

Tiamulin Annex I 1000µg/kg Ei Hühner,Puten

Tilmicosin Annex I Kein MRL 2

Trimethoprim Annex I 2

Tylosin Annex I 200µg/kg Ei

Legende:

1 = zugelassen für alle zur Lebensmittelerzeugung genutzten Tierarten

2 = Nicht anwenden bei Tieren, von denen Eier für den menschlichen Verzehr gewonnen

werden

Tabelle 1: Liste, der zur Therapie bei Geflügel zugelassenen oder umwidmungsfähigen Anti

biotika

Neben diesen Verordnungen gibt es eine Vielzahl an Richtlinien, die in nationales Recht um-

gesetzt wurden und daher bereits Gültigkeit besitzen.

27

2.3. Hühnereier als Lebensmittel

2.3.1. Zusammensetzung von Hühnereiern

Allgemeines

Dotter und Eiklar dienen den Vogelembryonen bei der extrauterinen Entwicklung als Nähr-

medium. Die Eischale stellt einen wichtigen Schutzmechanismus des Embryos vor allem vor

mechanischen Schäden dar.

Die Zusammensetzung der Eier zeigt je nach Art des Nutzgeflügels, Rasse und Alter erhebli-

che Variationen. Bei den Hühnereiern der heutigen Legehybriden kann man eine durch-

schnittliche Gewichtsverteilung von 30% Dotter, 60% Eiklar und 10% Schale annehmen, wo-

bei das durchschnittliche Eigesamtgewicht zwischen 50 und 75g schwankt. Die einzelnen

Eifraktionen unterscheiden sich in ihren Zusammensetzungen erheblich (TERNES et al.,

1994).

Dotter

Der Dotter entstammt dem Ovar und stellt sowohl die sich teilende Keimscheibe als auch ein

Nährmedium für den sich entwickelnden Embryo dar. Der sich teilende Anteil wird auch als

weißer Dotter mit einem Dottermasseanteil von etwa 3% bezeichnet. Die weiße Dottermasse

hat einen höheren Wasser-, Protein- und Ascheanteil und niedrigeren Lipidanteil als die gelbe

Dottermasse. Die ernährende gelbe Dottermasse liegt in konzentrischen Kreisen um das Bil-

dungszentrum herum und variiert in seiner Zusammensetzung je nach Fütterung des Mutter-

tieres (TERNES et al., 1994).

Eiklar

Das Eiklar ist nicht gleichmäßig strukturiert. Das zähe Eiklar enthält den höchsten Muzinan-

teil, worin sich die hohe Viskosität begründet. Das innere zähe Eiklar geht an den Eipolen in

die Hagelschnüre (Chalazen) über, die gallertige, seilartige Strukturen darstellen. Sie fixieren

die Dotterkugel in der Eimitte und erlauben dieser eine begrenzte Drehbarkeit aber kaum eine

Lageveränderung. Die Zusammensetzung unterscheidet sich kaum von der des zähen Eiklars.

Das dünnflüssige Eiklar unterscheidet sich von den anderen Eiklarfraktionen vor allem in den

28

physikalischen Eigenschaften; aber auch die Zusammensetzung der Proteinanteile, insbeson-

dere Ovomucin, ist verändert (TERNES et al., 1994).

Eischale

Die Eischale stellt den mechanischen Schutz des Eiinhaltes dar, ermöglicht aber auch einen

Gas- und Flüssigkeitsaustausch über die Poren. Die Eischalenmembranen stellen ein organi-

sches Grundgerüst dar und ermöglichen in der Eibildung eine gewisse Elastizität des entste-

henden Eies mit guter Stabilität. Zwischen den Eischalenmembranen entsteht am stumpfen

Eipol die Luftkammer.

Die eigentliche Schale besteht aus einem feinen organischem Fasernetz, in das Calciumkri-

stalle eingelagert werden. Im frischen, unbehandelten Zustand wird die Kalkschale außen

noch von einer Kutikula bedeckt, welche den Eiinhalt vor Austrocknung und Eindringen von

Mikroorganismen schützen soll. Sie besteht aus verschiedenen Proteinen, Polysacchariden

und Lipiden (TERNES et al., 1994).

2.3.2. Chemische Zusammensetzung

Eier stellen aufgrund ihrer vielen essentiellen Nährstoffe ein sehr hochwertiges Lebensmittel

dar und eignen sich auch zu diätetischen Zwecken, da sie einen hohen Nährstoffgehalt im

Vergleich zum kalorischen Wert besitzen. Als Proteinquelle weisen sie eine höhere Qualität

als Fleisch und Fisch auf, da sie einen hohen Gehalt an essentiellen Aminosäuren in einem

günstigen Verhältnis aufweisen. Der Lipidanteil von Eiern, der stark fütterungsabhängig ist,

enthält einen Anteil von 13% ungesättigten Fettsäuren, wobei Linolsäure den Hauptanteil

besitzt. Hühnereier stellen eine gute Vitaminquelle dar, da der Verzehr eines Eies bereits zu

10 % den durchschnittlichen Tagesbedarf an Vitamin A, D, B2, Niacin, Panthoensäure und

Vitamin B12 deckt. Auch die Zusammensetzung von Mineralstoffen und Spurenelementen ist

im Hühnerei aus ernährungsphysiologischer Sicht als sehr günstig zu bewerten.

Technologisch interessant sind die Proteine des Eiklars, da sie die Oberflächenspannung her-

absetzen und somit eine relativ stabile Schaumbildung gewährleisten. Eigelb wird technolo-

gisch vor allem wegen seiner emulgierenden Wirkung eingesetzt (TERNES et al., 1994).

29

2.3.3. Eibildung

Im weiblichen Hühnerembryo sind bereits ab dem 8. Bebrütungstag ca. 12.500 Oogonien an-

gelegt. Von den ursprünglich paarig angelegten Ovarien ist bei Erreichen der Geschlechtsreife

nur noch das linke Ovar vorhanden, so daß nur etwa 2500 Follikelanlagen zur Eiproduktion

zur Verfügung stehen. Je nach Haltung und Rasse beginnen die Hühner etwa im 6. Lebens-

monat mit der Eiablage. Das Heranreifen eines Follikels bis zur Sprungreife dauert etwa 150

Tage. Alle 24 Stunden ovuliert ein reifer Follikel. Die Ovulationsrate kann durch Verände-

rungen des Lichtregimes gesteigert werden, wobei sich auch das Eigewicht verändert. Die

nächste Ovulation erfolgt 30 Minuten nach der Eiablage. Jährlich legt ein Huhn etwa 280 Eier

(HEIDER u. MONREAL, 1992).

Der Eileitertrichter (Infundibulum) nimmt die Dotterkugel vom Eierstock auf und fügt ihm

Chalazen (Hagelschnüre) hinzu. Im weiten Magnum des Eileiters werden die dünnflüssigen

Bestandteile des Eiweißes und die zähe Eiklarschicht sezerniert. In der Eileiterenge (Isthmus)

werden die paarigen Schalenmembranen angelagert. Die Passage durch den Eileiter dauert ca.

4 Stunden. Im sich anschließenden Eihalter verbleibt das Ei für etwa 20 Stunden, in denen in

die Schalenmembran Calciumsalze aus der Schalendrüse eingelagert werden. Die Scheide

verbindet den Geschlechtsapparat mit dem Verdauungstrakt, da sie in die Kloake mündet

(HEIDER u. MONREAL, 1992).

2.3.4. Rückstände von Antibiotika und Chemotherapeutika in Hühnereiern

Eine Reihe von wissenschaftlichen Untersuchungen (DONOGHUE et al., 1996, 2000; KAN

u. PETZ, 2000 ) haben gezeigt, dass aufgrund des sich langsam entwickelnden Eies, dieses

bereits präovulatorisch einen hohen Gehalt an Rückständen und Kontaminanten enthalten

kann. Diese kumulierten Rückstände werden bis zur Eiablage nicht wieder freigesetzt, so dass

das Lebensmittel selbst nach Therapieende weiterhin rückstandshaltig bleibt. Die Verteilung

des Arzneimittels im Eigelb und Eiklar hängt von den physikochemischen Eigenschaften der

eingesetzten Substanz ab. Die fettlöslichen Substanzen werden vorwiegend in dem fetthalti-

gen Eigelb kumuliert. Außerdem hat der Applikationszeitpunkt im Verlauf der Eibildung ei-

nen großen Einfluß auf Kumulation der Rückstände, da das Heranreifen des Eigelbes deutlich

30

länger dauert und das Eiweiß zeitlich später gebildet wird. Stoffe, die fettlöslich sind, werden

sich demzufolge über einen langen Zeitraum im Eigelb ansammeln können. Die zeitliche

Spanne zur Arzneimittelkumulation im Eiweiß ist demgegenüber relativ kurz, so dass sich in

dieser Eifraktion vorwiegend Arzneimittel nachweisen lassen werden, die unmittelbar vor der

Eiablage appliziert wurden oder aufgrund einer langen Halbwertszeit lange im Körper kursie-

ren.

2.4. Nachweisverfahren für Antibiotika- und Chemotherapeutika-Rückständen in Hühnereiern

Aus amtlicher Sicht besteht aus Gründen des gesundheitlichen Verbraucherschutzes ein Be-

darf an Untersuchungsverfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von pharmakologisch

wirksamen Stoffen, für die national oder innerhalb der Europäischen Union für Fleisch oder

andere Lebensmittel tierischer Herkunft Grenzwerte festgesetzt wurden oder die erfahrungs-

gemäß illegal verwendet werden und zu gesundheitlich nicht unbedenklichen Rückstands-

mengen führen. Die Methoden müssen dabei die rechtlich geregelten Markerrückstände, das

Zielgewebe und die betreffende Tierart berücksichtigen. Amtliche Verfahren können als

Screening-, Routine- oder Referenzmethode zugelassen werden (§35 LMBG). Darüber hinaus

besteht im Rahmen der betrieblichen Eigenkontrolle ein intensives Interesse an der Entwick-

lung geeigneter Nachweismethoden.

Die verschiedenen Nachweismethoden unterscheiden sich im Nachweis der einzelnen Stoff-

gruppen in der Ausnutzung einer biologischen Aktivität (mikrobiologische Testsysteme),

Oberflächenstrukturen und chemischen Eigenschaften (ELISA, Chromatographien) oder im

chemischen Nachweis (Massenspektometrie) und werden sehr häufig durch die entsprechende

Probenmatrix und deren notwendige Aufarbeitung limitiert (NOLLET, 1996; BOTSOGLOU

et al., 2001).

2.4.1. Agardiffusionstest

Das Nachweisprinzip dieses klassischen Verfahrens beruht auf der Diffusion eines antibakte-

riell wirksamen Antibiotikarückstandes in einem festen Nährboden mit definierter Keimein-

31

saat und Ausbildung von messbaren Hemmzonen. Der große Vorteil dieser Methode besteht

im geringen labortechnischen Aufwand und der damit verbundenen Möglichkeit der Durch-

führung von Reihenuntersuchungen (KUNDRAT, 1972; BOTSOGLOU et al., 2001). Nach-

teilig macht sich aber die unsichere Substanzidentifizierung und der fehlende Nachweis nicht

mehr aktiver Metabolite bemerkbar. Eine Quantifizierung ist nur bei Vorhandensein von

Reinsubstanzen und genauer Kenntnis des vorhandenen Stoffes möglich.

Als Screening-Verfahren kommt dem mikrobiologischen Hemmstofftest in der Rück-

standsuntersuchung im Fleisch von Schlachttieren, wie er von LEVETZOW 1971 erstmals

vorgestellt wurde, immer noch eine zentrale Rolle zu, so dass diese Methode im sogenannten

Dreiplattentest auch heute noch in der Verwaltungsvorschrift zum Fleischhygienegesetz ver-

ankert ist. Der Vergleich der drei vorgeschriebenen Platten kann nur einen Hinweis auf die

vorhandene Antibiotikaklasse in der Probe geben und muß gegebenenfalls durch andere Me-

thoden verifiziert werden (STUMPF, 1993).

Der mikrobiologische Hemmstofftest ist ohne Aufarbeitung nicht als Nachweismethode für

Antibiotikarückstände in Eiern geeignet, da die Konsistenz des Eies eine Diffusion des Rück-

standes in den Nährboden nahezu unmöglich macht. Aufwendige Aufarbeitungen führen zu

einem grösseren Zeitbedarf pro Bestimmung und bedingen meist eine geringere Wiederfin-

dungsrate, als wenn die Probe direkt eingesetzt werden kann. Außerdem führen die eieigenen

Lysozyme zu falsch positiven Ergebnissen (DICKS, 1973), so dass diese bei der Aufarbeitung

der Proben sicher zerstört werden müssen.

2.4.2. Andere mikrobiologische Screeningverfahren

Gerade im Bereich der Analyse von Milch wurden verschiedene Nachweismethoden für Anti-

biotikarückstände entwickelt. Die Hauptunterschiede der Nachweissysteme liegen in der Pro-

benaufarbeitung, den verwendeten Testkeimen, Bebrütungszeit und -modalitäten und dem

Nachweisindikator. In der EU wurden bestimmte Testverfahren etabliert; so wird zum Bei-

spiel der Brilliantschwarz-Reduktionstest durchgeführt, bei dem eine Kultur von Bacillus ste-

arothermophilus var. calidolactis als Testorganismus verwendet wird und nach 2-3,5 Stunden

das Reduktionsvermögen von Brilliantschwarz überprüft wird (INTERNATIONAL DAIRY

32

FEDERATION, 1991a). Eine qualitative oder quantitative Aussage ist auch hierbei nicht

möglich.

Durch entsprechende Modifikationen in der Aufarbeitung können vergleichbare mikrobiolo-

gische Testsysteme auch für andere Probenmatrizes verwendet werden, wobei die aufwendi-

gen, spezifischen Aufarbeitungen meist der limitierende Faktor sind. Die Firma DSM Food

Specialities bietet als Screeningtest zum Beispiel den sogenannten Premi®Test an, der ver-

schiedene Antibiotikarückstände in Fleisch, Fleischprodukten und Eiern durch das Ausbleiben

einer Säurebildung durch Bacillus stearothermophilus var. calidolactis anzeigt. Der Hersteller

dieses Testsystems räumt aber gleichzeitig ein, dass es Unsicherheiten in der Interpretation

der Ergebnisse geben kann, so dass die Ergebnisse durch andere Verfahren verifiziert werden

müssen (DSM FOOD SPECIALTIES, 2001). Der große Vorteil dieser Methode liegt in der

erheblichen Zeit- und Materialersparnis und der damit verbundenen Kostenreduzierung.

Außerdem ist das Testsystem so empfindlich, dass es eine Vielzahl von Antibiotikarückstän-

den weit unterhalb der festgesetzten MRL-Werte nachweist (STEAD et al., 2002).

2.4.3. Charm-Test

Der Charm I-Test wurde als mikrobiologischer Rezeptortest ursprünglich zur Untersuchung

von Tankmilch auf ß-Lactamantibiotikarückstände entwickelt. 1984/85 wurde der Test um

den Nachweis von Tetracyclinen, Sulfonamiden, Aminoglykosiden, Chloramphenicol und

Makroliden erweitert und fortan als Charm II-Test bezeichnet (HEESCHEN u. SUHREN,

1986). Dieser Test ist damit ein Screeningverfahren für die genannten Substanzen, der eine

Identifizierung innerhalb von 15 Minuten ermöglicht. Mittlerweile kann dieses Verfahren

nach einer entsprechenden Probenaufarbeitung auch für andere Probenmatrizes wie zum Bei-

spiel Hühnereier angewendet werden (CHARM SCIENCES INC., 1993, 1995a, 1995b).

Der Charm II-Test basiert auf einer irreversiblen Bindung zwischen funktionellen Gruppen

der Antibiotika mit entsprechenden Rezeptoren. Es werden kompetitiv wirkende, radioaktiv-

markierte Antibiotika zugesetzt, so dass ein Nachweis über die Strahlungsmessung möglich

ist. Je größer die emitierte Strahlungsmenge, umso geringer der Rückstandsgehalt in der Pro-

be (HEESCHEN u. SUHREN, 1986).

33

Der Vorteil dieses Screeningverfahrens liegt eindeutig im Zeitfaktor, der einfachen Handha-

bung und dem geringen technischen Aufwand. Eine Quantifizierung ist mit dieser Methode

aber nicht möglich, so dass andere Verfahren zur genaueren Bestimmung angeschlossen wer-

den müssen (BOTSOGLOU et al., 2001). Für die Untersuchung von Eiern muß eine entspre-

chende Aufarbeitung der Proben vor den eigentlichen Nachweis gestellt werden, da die zäh-

flüssige Konsistenz des Eies die Untersuchung behindert und eine kompetitive Bindung un-

möglich wird.

2.4.4. ELISA

Für einzelne Antibiotikarückstände sind mittlerweile serologische Nachweissysteme für

Rückstände in Eiern kommerziell erhältlich (KOLOSOVA et al., 2000, FRANEK et al., 1999,

KITAGAWA et al., 1988). Diese Nachweise haben durch den Einsatz monoklonaler Antikör-

per den Vorteil einer hohen Selektivität und Sensitivität. Die Sensitivität liegt meist weit un-

terhalb des gesetzlich geregelten Rahmens. Der Nachteil liegt in der Möglichkeit nur gezielt

einzelne Substanzen bestimmen zu können, so dass man einen konkreten Verdacht eines An-

tibiotikaeinsatzes haben muß. Diese Verfahren sind daher als Screeningverfahren nicht geeig-

net und in der Summe der Nachweise mit hohen Kosten verbunden.

2.4.5. Chromatographische Nachweise

In der analytischen Chemie ist der Nachweis chemischer Strukturen mittels Chromatographi-

en weitverbreitet. Erfolgt die Trennung aufgrund von unterschiedlichen Bindungseigenschaf-

ten an die stationäre Phase durch polare Seitengruppen der zu untersuchenden Substanz, so

spricht man von einer Ionenaustauscherchromatographie. Je nach Einsatz unterschiedlicher

Trägerlösungen als mobile Phase unterscheidet man Flüsigkeits- und Gaschromatographien.

Je nach Kombination der stationären und mobilen Phase können Kationen- und Anionenaus-

tauscher unterschieden werden (SCHWEDT, 1986).

In der chemischen Analyse von Antibiotikarückständen werden sehr häufig Ionenaustauscher-

chromatographien verwendet, da die nachzuweisenden Substanzen in verschiedenen Lö-

sungsmitteln sehr häufig polare Verbindungen darstellen. Eine selektive Auftrennung ist je

34

nach Wahl der stationären und mobilen Phase für viele Stoffe möglich. Den wichtigsten Vor-

teil dieses Nachweises stellt die Möglichkeit dar, auch biologisch inaktive Metabolite von

Antibiotikarückständen nachzuweisen. Außerdem können durch eine Kombination mit sensi-

tiven Detektoren sehr geringe Rückstandsmengen nachgewiesen werden. Nachteilig für den

Routineeinsatz in der Rückstandsüberwachung ist die Vielzahl der erforderlichen

unterschiedlichen Aufarbeitungen und unterschiedlichen Trennverfahren.

Die in der Rückstandsanalytik weitverbreitete High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) stellt eine Weiterentwicklung der klassischen Flüssigkeitschromatographie dar, da

hierbei innerhalb von Minuten eine hochauflösende Auftrennung in einem feinen Strom der

mobilen Phase entsteht. Die hohe Selektivität und Sensitivität ist in den verwendeten Trenn-

säulen begründet. Die für die HPLC genutzten Säulen sind druckstabile, sehr fein gepackte

Säulen mit einem Durchmesser von 2-5 mm. Nach dem Verlassen der Trennsäule wird die

mobile Phase durch einen Detektor geführt, wo die eluierten Substanzen mit Hilfe unter-

schiedlicher, meist optischer, Meßprinzipien erfaßt werden. Aus dem entstandenen Chroma-

togramm kann man die Retentionszeit und die Peakhöhe zur Identifikation der Substanz und

der Konzentration entnehmen. Durch verschiedenste Kombinationen von Probenaufarbeitung,

Trennsäulen und mobilen Phasen kann man eine Vielzahl an Substanzen sehr selektiv und

sensitiv nachweisen (GEERTSMA et al., 1987; NAGATA et al., 1992; STOEV, 2000;

BERGWERFF et al., 1998; GIGOSOS et al., 2000). Nachteilig wirken sich aber die spezifi-

schen Aufreinigungen der Proben aus, da die Retentionszeiten stark vom Lösungsverhalten

der Antibiotikarückstände abhängig sind. Außerdem bestehen große Unterschiede in der Se-

lektivität der Trennsäulen, so dass man nicht auf alle Substanzen untersuchen kann, sondern

bereits einen entsprechenden Verdacht eines bestimmten Rückstandes haben muß. Da die

Anschaffung einer HPLC-Anlage mit erheblichen Kosten verbunden ist, kommt dieses

Nachweisverfahren nur für größere Laboratorien mit entsprechendem Probenaufkommen in

Frage.

2.4.6. Extraktionsverfahren

Die Konsistenz des Volleies bedingt eine aufwendige Probenvorbereitung im Nachweis anti-

bakterieller Substanzen in Hühnereiern, da die obengenannten Nachweissysteme eine homo-

35

gene Verteilung und eine gute Löslichkeit der Rückstände vorraussetzten. Hierbei ist ent-

scheidend, dass die eieigenen Störfaktoren eleminiert werden, ohne dass die gesuchten Sub-

stanzen zerstört oder verändert werden. Die hohen Protein- und Fettgehalte der Hühnereier

stellen die größten Störfaktoren dar, denen es durch geeignete Aufarbeitungen zu begegnen

gilt.

Bei der Durchsicht der Literatur ist auffällig, dass es eine Vielzahl an verschiedenen Aufar-

beitungsmöglichkeiten im Nachweis antibakterieller Substanzen in Hühnereiern gibt, wobei

das Nachweissystem der limitierende Faktor zu sein scheint. Je störanfälliger die Methode ist,

umso selektivier muß die Aufarbeitung sein.

Wie bereits aus dem Bereich der Klinischen Chemie bekannt ist, kann eine wirkungsvolle

Enteiweißung proteinhaltiger Lösungen mit starken Säuren (hochprozentige Salzsäure, Per-

chloresseigsäure) durchgeführt werden. GEERTSMA (1987) hat die Enteiweißung zum Bei-

spiel mit Perchloressigsäure zum Nachweis von Sulphadimidinrückständen in Hühnereiern

angewendet, mußte anschließend jedoch den pH-Wert mit Kalilauge korrigieren, bevor er den

Extrakt in der HPLC einsetzen konnte. Andere Autoren ( FURUSAWA u. MUKAI, 1994)

zogen die Enteiweißung mit einem Acetonitril-Hexan-Gemisch vor, da sie in der HPLC eine

Acetonitril-Mischung als mobile Phase wählten.

Erfolgt der Nachweis im mikrobiologischem Hemmstofftest, so verwenden einige Autoren

weniger starke Chemikalien zur Aufarbeitung. DONOGHUE et al. (1996) zum Beispiel be-

nutzten Kaliumphosphatpuffer zur Enteiweißung, bevor sie den Nachweis von Ampicillin und

Oxytetracyclin mit Bacillus stearothermophilus durchführten.

In der Aufreinigung mittels Festphasenextraktion schlug die ARBEITSGRUPPE FÜR

´PHARMAKOLOGISCH WIRKSAME STOFFE´ (1994) für die Probenvorbereitung eine

Enteiweißung mit Succinatpuffer zum Nachweis von Tetracyclinen vor, da die entstandene

Lösung direkt auf die Testsäulen gegeben werden konnte.

2.5. Zusammenfassende Bewertung des wissenschaftlichen Schrifttums

Es ist eine Vielzahl an Antibiotika und Chemotherapeutika zum Einsatz bei Geflügel zugelas-

sen. Der Arzneimitteleinsatz kann zu einer Rückstandsbildung im Ei führen. Zusätzlich wird

36

die Situation durch die kumulative Einlagerung der Arzneimittel durch die besonderen biolo-

gischen Verhältnisse der Eireifung erschwert. Die Rückstandsanalysen bei Eiern sind relativ

grobmaschig, da im Moment kaum verläßliche Screeningverfahren zur Verfügung stehen.

Es soll daher das Ziel dieser Arbeit sein, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe ein

größerer Prozentsatz der jährlich produzierten Eier sicher auf mikrobielle Substanzen unter-

sucht werden kann. Zu diesem Zweck sollen verschiedene Nährböden und Testkeime auf ihre

Eignung zum Nachweis ausgewählter Antibiotika und Chemotherapeutika in Hühnereiern

untersucht werden. Außerdem sollen Festphasenextraktionsverfahren getestet werden, ob sie

zur Aufreinigung von Hühnereiern für den Nachweis mikrobieller Substanzen geeignet sind.

37

3. Eigene Untersuchungen

Diese Studie sollte dazu dienen, die Kombination aus Festphasenextraktion und mikrobiologi-

schem Hemmstofftest zu ermitteln, die am selektivsten und sensitivsten den Nachweis von

Antibiotika verschiedener Substanzklassen in dotierten Volleiproben ermöglicht. Zu diesem

Zweck gliederte sich die Untersuchung in drei Teile. Im ersten Teil wurden Nährböden mit

unterschiedlichen pH-Werten und verschiedenen Testkeimen auf ihre Eignung zum selektiven

und sensitiven Nachweis der verschiedenen Antibiotika und Chemotherapeutika überprüft.

Im anschließenden Teil wurden drei verschiedene Festphasensäulen auf ihre Spezifität gete-

stet. Der eigentliche Nachweis erfolgte mittels geeignetem Agardiffusionstest.

Anschließend wurden dotierte Eiproben nach Aufarbeitung mit verschiedenen Nachweisme-

thoden untersucht und die minimale Nachweisgrenze ermittelt.

3.1. Probenmaterial

Für die Vorversuche wurden Verdünnungsreihen der Antibiotikasubstanzen in physiologi-

scher Kochsalzlösung (Oxytetracyclin, Doxycyclin, Dihydrostreptomycin) oder in destillier-

tem Wasser (Ampicillin, Colistinsulfat, Enrofloxacin, Sulfadimidin) eingesetzt.

Bei dem in den Hauptversuchen verwendetem Ei handelte es sich um antibiotikafreies, pa-

steurisiertes Vollei der Firma Eipro, Chargennummer 29048 01/645, welches in 40 ml Portio-

nen bis zur Verwendung bei – 18°C eingefroren wurde.

3.2. Laboruntersuchungen

3.2.1. Material und Geräte

3.2.1.1. Reinsubstanzen

Ampicillin (kristallisiert), Chargen-Nr. 13397,

Serva Feinbiochemie, Heidelberg

86,55 % Aktivat von Ampicillinsäure =>11.55 mg/10 ml NaCl-Lsg. = 1000 µg/ml

38

Colistinsulfat, Lot 49H0635

Sigma Chemical Company

19,74 I.E./mg =>1 I.E. = 0,03 µg Base =>0,5922 µg Base/mg

Dihydrostreptomycinsulfat, Lot 69F0543


744 µg Dihydrostreptomycin/mg =>13,44 mg/10 mlNaCl-Lsg. = 1000 µg/ml

Doxycyclinhydrochlorid, Lot 49F0202


847 units/mg

Enrofloxacinhydrochlorid, VP 2674,

PT-Nr.GRK 5022-3

Aktivität: 90,78 % =>11,02 mg/10 ml Bidest. = 1000 µg/ml

Oxytetracyclin, Lot 59F0009


Sulfadimidin-Natrium, Chargen-Nr. BP73

WDT, Hannover

10,83 mg/10 ml Bidest. = 1000 µg/ml

Trimethoprim, Chargen-Nr. 41491

BP, PN 63/81

Herstellung der Trimethoprim-Lösungen

• Stammlösung: 10 mg Trimethoprim/10 ml Ethanol

• Gebrauchslösung (5 µg/ml): 500 µl Stammlösung + 99,5 ml Bidest.

• Die Gebrauchslösung wurde wöchentlich neu angesetzt

3.2.1.2. Nährmedien

Testagar pH 6,0 für den Hemmstofftest

Herstellung: 25 g/l in destilliertem Wasser durch Erhitzen im Dampftopf lösen, pH-

Wert prüfen und einstellen, autoklavieren (15 min. bei 121° C)

Fertignährboden Merck Art. 1010663, Ch.-B. V416463, Lot 942 in der Zusammen-

setzung (g/l):

39

• Pepton aus Casein, tryptisch 3,45

• Pepton aus Fleisch, tryptisch 3,45

• Natriumchlorid 5,10

• Agar-Agar 13,00


Herstellung: 25,8 g/l in destilliertem Wasser durch Erhitzen im Dampftopf lösen, pH-


Fertignährboden Merck Art.-Nr. 15787, Ch.-B.V544187, Lot 445 in der Zusammen-

setzung (g/l):• Pepton: 7,0


• Agar-Agar 13,0

• Tri-Natriumphosphat-12-hydrat 0,8




Fertignährboden Merck Art.-Nr. 10664, Ch.-B.V811864, Lot 635 in der Zusammen-

setzung (g/l):• Pepton aus Casein, tryptisch 3,45

• Pepton aus Fleisch, tryptisch 3,45


• Agar-Agar 13,00

• Tri-Natriumphosphat-12-hydrat 2,40

Iso-Sensitest-Agar für den Hemmstofftest


Wert auf pH 7,4 ± 0,2 einstellen, autoklavieren (15 min. bei 121° C)

Fertignährboden Oxoid, Lot-Nr. 052 42572 in der Zusammensetzung (g/l):• Caseinhydrolysat 11,0

• Agar 8,0

• Pepton 3,0


40

• Glukose 2,0

• Dinatriumhydrogenphosphat 2,0

• Stärke 1,0

• Natriumacetat 1,0

• Magnesiumglycerolphosphat 0,2

• Calciumgluconat 0,1

• L-Cystein-HCl 0,02

• L-Tryptophan 0,02

• Adenin 0,01

• Guanin 0,01

• Xanthin 0,01

• Uracil 0,01

• Pantothenat 0,003

• Nicotinamid 0,003

• Pyridoxin 0,003

• Mangan(II)-chlorid 0,002

• Kobalt(II)-sulfat 0,001

• Kupfer(II)-sulfat 0,001

• Zinksulfat 0,001

• Eisen(II)-sulfat 0,001

• Menadion 0,001

• Cyanobalamin 0,001

• Biotin 0,0003

• Thiamin 0,00004

Seed-Agar zum Anzüchten der Testkeime

Herstellung: 27 g/l in Phosphatpuffer nach Sörensen, durch Erhitzen im Dampftopf lö-

sen, pH-Wert prüfen und einstellen, autoklavieren (15 min. bei 121° C)

Fertignährboden Oxoid in der Zusammensetzung (g/l):• Agar Nr.1, neutral 11,5

• Fleischpepton 6,0

• Caseinpepton 4,0

• Hefeextrakt 3,0

• Fleischextrakt “Lab-Lemco“ 1,5

• Glukose 1,0

41

Brain-Heart-Infusion-Lösung zur Keimanzüchtung

Herstellung: 37g/l in destilliertem Wasser lösen, zu 4,5ml-Portionen in Reagenzgläser

abfüllen und autoklavieren (15 min bei 121° C)

Fertignährboden Oxoid in der Zusammensetzung (g/l):• Kalbshirninfusion 12,5

• Proteose-Pepton 10,0

• Rinderherzinfusion 5,0


• Dinatriumhydrogenphosphat 2,5

• Glukose 2,0

3.2.1.3. Testkeime

• Bacillus subtilis (BGA), Sporensuspension (107 KbE/ml)

Herkunft: BGA, Berlin, Lyophilisat Januar 1983

Abschwemmung: 02.03.2001

• Bacillus stearothermophilus var. calidolactis DSM 6790, Sporensuspension (107 KbE/ml)

Herkunft: DSM, Braunschweig


• Escherichia coli, Stamm 14, Bayer AG, Keimsuspension (107 KbE/ml)

Herkunft: Bayer AG, Leverkusen


3.2.1.4. Festphasensäulen

• Chromabond SA-Säulen:

Macherey-Nagel, Ch.-B. 29.053

500 mg Kationenaustauscher

• Chromabond NH2-Säulen:

Macherey-Nagel, Ch.-B.86.249

500 mg NH2-Austauscher

42

• C18-Säulen:

Macherey-Nagel, Ch.-B.21.072

6ml, 500 mg C18 endcapped

3.2.1.5. Chemikalien

- Natriumchlorid krist.zur Analyse, Firma Merck, Bestell-Nr. 106404

- Glycerin 98 %ig: chemisch rein, DAB 7: Firma Riedel-de-Haën

- Methanol: Firma Roth, Lot-Nr. 72843, Art.-Nr. P717.1

- Ethylacetat: J.T. Baker Chemicals, Lot-Nr. 116117, Bestell-Nr. 3-9260

- Essigsäure 100 %ig: Firma Roth, Ch.-B. 51838593, Art.-Nr. 3738.2

- Ammoniak 25 %ig: Firma Roth, Bestell-Nr. 5460.2

- n-Hexan: J.T. Baker Chemicals, Lot 104093, Bestell-Nr. 3-9262

- Acetonitril: J.T. Baker Chemicals, Lot-Nr.0013830009, Bestell-Nr. 3-8143

- Salzsäure 6 N: Firma Merck, Ch.-B. Z378719513, Bestell-Nr. 113386

- Salzsäure 1 m: Firma Roth, Ch.-B. 15044466, Bestell-Nr. K025.1

- Natronlauge 1 m: Firma Merck, Lot-Nr. 7429838, Bestell-Nr. 109137

- Natronlauge 0,1 m: Firma Merck, Lot-Nr. 2540293, Bestell-Nr. 109959

- Citronensäure: Firma Merck, Ch.-B. 247K17826241, Art.-Nr. 241.100

- di-Natriumhydrogenphosphat: Firma Roth, Ch.-B.23522247, Art.-Nr. P030.2

- destilliertes Wasser: bidestilliert mit Quarz, Bi-Destillierapparat

- Citratpuffer zur Eiaufarbeitung:

310 ml einer 0,1 m Citronensäurelösung (21,0 g/l) mit 190 ml einer 0,2 m di-

Natriumhydrogenphosphatlösung mischen, mit 1m Natronlauge auf pH 4,0 einstellen

- 1 % Essigsäure in Methanol zur Eiaufarbeitung:

1 ml 100 %iger Essigsäure mit 99 ml Methanol versetzen

- 5 % Essigsäure in Methanol zur Säulenkonditionierung:

5 ml 100 %ige Essigsäure mit 95 ml Methanol versetzen

- Ammoniakalische Methanollösung zur Elution der SA-Säule:

25 ml einer 25 % Ammoniaklösung mit 75 ml Methanol mischen

43

- 5 % Essigsäure in Ethylacetat zur Säulenkonditionierung der Kombinationssäule

5ml einer 100 %igen Essigsäure mit 95 ml Ethylacetat mischen

3.2.1.6. Geräte

- Material für die Keimanzüchtung und Abschwemmung:

Rouxflaschen,

Magnetrührer,

Glasperlen,

Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml),

Platinöse,

Pasteurpipetten,

- Material für den Hemmstofftest:

Glasplatten 23,5 x 44 cm,

Kunstoffringe 19 cm Innendurchmesser,

Glaspetrischalen Durchmesser 19 cm,

Erlenmeyerkolben 500 ml,

Reagenzgläser,

Korkbohrer 11 mm Durchmesser,

Finnpipette 200- 1000 µl,

Eppendorfpipette 100 µl,

Feststellbarer Stechzirkel und Lineal,

Wasserfester Filzschreiber,

Wasserbad, Firma Memmert für 56° C,

Brutschränke, Firma Memmert für 30, 37 und 63° C,

pH-Meter: pH 530, Wissenschaftlich- Technische Werkstätten, Weilheim,

Antibiotikatestplättchen: 6 mm Durchmesser, Schleich und Schüll, Dassel,

- Material für die Festphasenextraktion:

Vakuumkammer: J.T. Baker,

44

Wasserstrahlpumpe,

50 ml Plastikspritzen mit Adapter,

graduierte Spitzröhrchen,

Spitzkölbchen für den Rotationsverdampfer,

Rotationsverdampfer: Vaccubrand Membranpumpe, Büchi Rotavapor <R>,

- Material für die Aufarbeitung der Eiproben:

Zentrifugengläser 80 ml, Schott Duran,

Waage: Omnilab OLX-300, max 300 g,

Waage: Sartorius BP 221S, max.220 g,

Metallspatel,

Pipetten, 20 ml Ex, Brand, B-Qualität,

Pipetus-Akku: Hirschmann Laborgeräte,

Ultraschallbad: Bransonic 12, Firma Jürgens,

Kühlzentrifuge: Hermle Z383 K,

Ultraturrax: Micra RT, Stufe B = 17.800 U/min,

3.3. Methoden

3.3.1. Testkeimherstellung

3.3.1.1. Herstellung der Sporensuspensionen

Von den Keimen Bacillus subtilis BGA und Bacillus stearothermophilus var. calidolactis

DSM 6790 wurden Sporensuspensionen hergestellt.

Zuerst wurde ein Reinheitsausstrich aus einer vorhandenen Sporensuspension auf Nähragar

hergestellt. Von dieser Kultur wurde am nächsten Tag eine Einzelkolonie in 6 ml einer Brain-

Heart-Infusion–Bouillon (BHI) geimpft und für 18 Stunden bei 30° C (Bac. subtilis) oder

60°C (Bac. stearothermophilus) bebrütet. In einer sterilen Rouxflasche wurden 200 ml Seed-

Agar für die Anzucht von Bac. subtilis oder 200 ml Plate-Count-Agar für die Anzucht von

Bac. stearothermophilus gegeben. Diese Nährböden wurden nach dem Erstarren mit 200 µl

45

der vorbebrüteten BHI-Bouillon beimpft. Die Kultur mit Bac. stearothermophilus wurde für

48 Stunden bei 60° C bebrütet, die Kultur mit Bac. subtilis wurde bei 30° C für 10 Tage inku-

biert. Nach der Bebrütungszeit wurde der dichte Keimrasen mit steriler physiologischer

Kochsalzlösung unter Verwendung steriler Glasperlen abgeschwemmt. Die so gewonnene

Bakteriensuspension wurde für 30 Minuten bei 4500 rpm zentrifugiert und der Überstand ab-

pipettiert und verworfen. Das Zentrifugat wurde mit einer Pasteurpipette in steriler physiolo-

gischer Kochsalzlösung resuspendiert. Nach zweimaliger Wiederholung der Zentrifugation

und Resuspendierung wurde die Keimsuspension bei 80° C für 10 Minuten zur Abtötung der

vegetativen Keime inkubiert.

Die Keimdichte wurde parallel durch Koch´sches Plattengußverfahren und durch Oberflä-

chenspatelverfahren bestimmt. Durch Hinzugabe von steriler physiologischer Kochsalzlösung

wurde eine Keimdichte von 1-3 x107 Koloniebildende Einheiten/ml (KbE/ml) eingestellt und

diese mit 7,5 % sterilem Glycerin versetzt. Anschließend wurden 1 ml-Portionen in Eppen-

dorf-Reaktionsgefäße steril abgefüllt und diese bis zur Verwendung bei –18°C eingefroren.

3.3.1.2. Anzucht von Escherichia coli

Zuerst wurde ein Reinheitsausstrich aus einer vorhandenen Keimsuspension auf Nähragar

hergestellt. Von dieser Kultur wurde am nächsten Tag eine Einzelkolonie in 6 ml einer Brain-

Heart-Infusion-Bouillon (BHI) geimpft und für 18 Stunden bei 30° C bebrütet. In einer steri-

len Rouxflasche wurden 200ml Standard-II-Agar gegeben. Der erstarrte Nährboden wurde

anschließend mit 200 µl der vorbebrüteten BHI-Bouillon beimpft. Die Kultur wurde für 24

Stunden bei 30° C bebrütet. Nach der Bebrütungszeit wurde der dichte Keimrasen mit steriler

physiologischer Kochsalzlösung unter Verwendung steriler Glasperlen abgeschwemmt. Die

so gewonnene Bakteriensuspension wurde für 30 Minuten bei 4500 rpm zentrifugiert und der

Überstand abpipettiert und verworfen. Das Zentrifugat wurde mit einer Pasteurpipette in ste-

riler physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.

Die Bestimmung der Keimdichte wurde parallel durch Koch´sches Plattengußverfahren und

durch Oberflächenspatelverfahren durchgeführt. Durch Hinzugabe von steriler physiologi-

46

scher Kochsalzlösung wurde eine Keimdichte von 5 x107 KbE/ml eingestellt und diese mit

7,5% sterilem Glycerin versetzt. Anschließend wurden 1 ml-Portionen in Eppendorf-

Reaktionsgefäße steril abgefüllt und diese bis zur Verwendung bei –18° C eingefroren.

3.3.2. Herstellung der Testplättchen

Zur Kontrolle der mikrobiologischen Hemmstoffbestimmung wurden standardisierte Anti-

biotikatestplättchen verwendet. Als Trägersubstanz wurden Celluloseplättchen der Firma

Schleich und Schüll mit einem Durchmesser von 6 mm genutzt, die mit je 10 µl der Antibio-

tikastandardlösung getränkt wurden. Nach Anfertigung von Verdünnungsreihen wurde das

Penicillintestplättchen mit einer absoluten Antibiotikamenge von 0,005 µg dotiert; das Strep-

tomycintestplättchen und das Sulfadimidinplättchen besassen je eine absolute Menge von 0,5

µg Antibiotika.

3.3.3. Agardiffusionstest

Das Nachweisprinzip dieser Methode beruht auf der Diffusion eines antibakteriell wirksamen

Antibiotikarückstandes in einen festen Nährboden mit definierter Keimeinsaat unter Ausbil-

dung messbarer Hemmzonen nach Inkubation.

3.3.3.1. Herstellung der Testplatten

Die verwendeten Testplatten wurden unmittelbar vor dem Probenauftragen hergestellt. Auf

sterile Glasplatten wurden Kunststoffringe mit einem Innendurchmesser von 19 cm aufgelegt.

Bis die Ringe mit den verschiedenen Testagartypen befüllt werden konnten, wurden die Plat-

ten mit sterilen Glasplatten abgedeckt, um eine Kontamination zu verhindern. Für die Kultu-

ren mit Bac. stearothermophilus und mit E. coli wurden Glaspetrischalen von gleichem

Durchmessers verwendet, um einerseits eine Austrocknung im 60° C-Brutschrank zu verhin-

dern und andererseits eine Kontamination des Brutschrankes auszuschließen.

47

- Testplatte mit Bac. subtilis BGA, pH 6,0

Testagar pH 6,0 wurde im Dampftopf verflüssigt und im Wasserbad auf 56° C temperiert.

Im sterilen Erlenmeyerkolben wurden 80 µl der Sporensuspension von Bac. subtilis BGA

(107 KbE/ml) vorgelegt und 60 ml des Agars dazugegeben. Nach Mischen wurde der

keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegossen. Nach dem Erstarren wurden mit

dem Korkbohrer (Ø 11 mm) Löcher in den Nährboden gestanzt, in die später 100 µl der

Probe pipettiert wurden. Zur Kontrolle des Nährbodens wurde ein Penicillintestplättchen

aufgelegt. Nach dem Aufbringen der Proben wurden die Platten bei 30° C für 18 Stunden

bebrütet und die entstandenen Hemmzonen in Millimetern gemessen.

- Testplatte mit Bac. subtilis BGA, pH 8,0



(107 KbE/ml) vorgelegt und 60 ml des Agars dazugegeben. Nach Mischen wurde der

keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegossen. Nach dem Erstarren wurden mit

dem Korkbohrer (Ø 11 mm) Löcher in den Nährboden gestanzt, in die später 100 µl der

Probe pipettiert wurden. Zur Kontrolle des Nährbodens wurde ein Streptomycintestplätt-

chen aufgelegt. Nach dem Aufbringen der Proben wurden die Platten bei 30° C für 18

Stunden bebrütet und die entstandenen Hemmzonen in Millimetern gemessen.

- Testplatte mit Bac. subtilis BGA, pH 7,2 + TMP



(107KbE/ml) vorgelegt und 60 ml des Agars dazugegeben. Anschließend wurden 600 µl

der Trimethoprim-Gebrauchslösung (Konzentration: 5 µg/ml) hinzugefügt. Nach Mischen

wurde der keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegeben. Nach dem Erstarren

wurden mit dem Korkbohrer (Ø 11 mm) Löcher in den Nährboden gestanzt, in die später

100 µl der Probe pipettiert wurden. Zur Überprüfung des Nährbodens wurde ein Sulfona-

48

midtestplättchen aufgelegt. Nach dem Aufbringen der Proben wurden die Platten bei 30°

C für 18 Stunden bebrütet und die entstandenen Hemmzonen in Millimetern gemessen.

- Testplatte mit Bac. stearothermophilus var. calidolactis DSM 6790

Isoagar wurde im Dampftopf verflüssigt und im Wasserbad auf 56° C temperiert. Im ste-

rilen Erlenmeyerkolben wurden 60 µl der Sporensuspension von Bac. stearothermophilus

var. calidolactis DSM 6790 (107 KbE/ml) vorgelegt und 60 ml des Agars dazugegeben.

Nach Homogenisieren wurde der keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegeben.

Nach dem Erstarren wurden mit dem Korkbohrer (Ø 11 mm) Löcher in den Nährboden

gestanzt, in die später 100 µl der Probe pipettiert wurden. Zur Nährbodenkontrolle wurde

ein Penicillintestplättchen aufgelegt. Nach dem Aufbringen der Proben wurden die Platten

bei 60° C für 18 Stunden in einer feuchten Kammer bebrütet und die entstandenen

Hemmzonen in Millimetern gemessen.

- Testplatte mit E. coli Stamm 14 Bayer AG

Standard-Agar pH 7,2 wurde im Dampftopf verflüssigt und im Wasserbad auf 56° C tem-

periert. Im sterilen Erlenmeyerkolben wurden 60 µl der Keimsuspension von E. coli

Stamm 14 Bayer AG (107 KbE/ml) vorgelegt und 60 ml des Agars dazugegeben. An-

schließend wurde 600 µl der Trimethoprim-Gebrauchslösung (Konz. 5 µg/ml) hinzugege-

ben. Nach Mischen wurde der keimhaltige Agar in die vorbereiteten Platten gegeben.

Nach dem Erstarren wurden mit dem Korkbohrer (Ø 11 mm) Löcher in den Nährboden

gestanzt, in die später 100 µl der Probe pipettiert wurden. Zur Kontrolle des Nährbodens

wurde ein Enrofloxacintestplättchen aufgelegt. Nach dem Aufbringen der Proben wurden

die Platten bei 30° C für 18 Stunden bebrütet und die entstandenen Hemmzonen in Milli-

metern gemessen.

3.3.3.2. Erstellen von Verdünnungsreihen

Zur Ermittlung der Konzentration, die gerade noch eine Hemmwirkung (MHK = Minimale

Hemmkonzentration) zeigte, war es notwendig, Verdünnungsreihen der einzelnen Antibioti-

kalösungen herzustellen. Für die Erstellung der Verdünnungsreihen wurde jeweils eine

49

Stammlösung der entsprechenden Substanz mit einer Konzentration von 1000 µg Wirk-

stoff/ml hergestellt und diese mit Ausnahme des Ampicillins bei -18° C für den Zeitraum der

Untersuchung eingefroren. Die Ampicillinstammlösung wurde für jede Versuchsreihe neu

eingewogen, da sie im gelösten Zustand sehr instabil war. Aus diesen Stammlösungen wurden

durch Zugabe von physiologischer Kochsalzlösung (Oxytetracyclin, Doxycyclin, Dihy-

drostreptomycin) oder von destilliertem Wasser (Enrofloxacin, Sulfadimidin, Ampicillin, Co-

listin) je nach Antibiotikum Verdünnungsreihen in Abstufungen von 10er Potenzen in den

hohen Konzentrationen hergestellt. In den Bereichen des MHK-Wertes wurden möglichst

kleine Konzentrationsabstufungen für jeden Versuchsdurchlauf gewählt (siehe Tabellen 8.1.

im Anhang).

3.3.3.3. Auswertung des mikrobiologischen Hemmstofftestes

Nach Ablauf der Bebrütungszeit der Nährböden wurden diese im Durchlicht betrachtet. Mit

einem Stechzirkel wurde der Abstand des entstandenen Hemmhofes vom Rand des gestanzten

Loches bis zum Beginn des Keimwachstums gemessen. Die Ermittlung der Hemmhofgröße

erfolgte in Millimetern. War zwischen Stanzloch und Beginn des Keimwachstums keine

keimfreie Zone entstanden, sondern lediglich eine geringere Keimdichte feststellbar, so wurde

dieses als Aufhellung bezeichnet. Zeigte sich keinerlei sichtbare Hemmwirkung, so wurde die

Hemmzone mit 0 mm bewertet.

3.3.4. Probenvorbereitung für die Festphasenextraktion

Um die Eiproben mittels Festphasenextraktion aufreinigen zu können, war es notwendig, die

Proben von großen korpuskulären Partikeln zu befreien, da die Säulen sonst unmittelbar nach

der Probenaufgabe verstopften. Die hier verwendeten Säulen unterschieden sich jedoch er-

heblich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber diesen Partikeln. Außerdem zeigte die Wieder-

findung große Unterschiede in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode. Aus diesen

Gründen haben sich je nach verwendeter Festphasensäule unterschiedliche Aufarbeitungs-

methoden als geeignet erwiesen.

50

3.3.4.1. Aufarbeitung für die C18-Säule

Bei der hier verwendeten Aufarbeitung handelt es sich um eine Modifikation der Bestim-

mungsmethode der amtlichen Sammlung nach § 35 für Tetracycline in essbaren Geweben von

Tieren, welche vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärme-

dizin herausgegeben wurde ( veröffentlicht im Bundesgesundheitsblatt 10/95).

5 g des Volleies wurden in ein Zentrifugenglas eingewogen und mit der zu untersuchenden

Antibiotikalösung bekannter Konzentration dotiert. Nach Homogenisierung durch Schütteln

wurden 20 ml Citratpuffer hinzugegeben und die Lösung für 5 Minuten ins Ultraschallbad

gestellt. Anschließend wurde das Gemisch bei 5.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert. Der

Überstand wurde in ein neues Zentrifugenglas abgegossen. Mit dem Zentrifugat wurde die

Extraktion mit 20 ml Citratpuffer in gleicher Weise noch einmal wiederholt, wobei nach Zu-

gabe des Puffers mit einem Ultraturrax wieder eine homogene Lösung hergestellt wurde. Die

vereinigten Überstände konnten auf die konditionierte C18-Säule gegeben werden.

3.3.4.2. Aufarbeitung für die SA-Säulen

Es wurden 5 g Vollei in Zentrifugengläser eingewogen und mit der Antibiotikalösung be-

kannter Konzentration dotiert. Nach Homogenisierung durch Schütteln wurden 20 ml einer

1%igen Essigsäurelösung in Methanol dazugegeben und dieses im Ultraschallbad homogeni-

siert. Anschließend wurde für 5 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde

in ein separates Zentrifugenglas abgegossen und die Extraktion des Zentrifugates mit 20 ml

1%iger Essigsäure in Methanol wiederholt. Eine erneute Homogenisierung wurde durch Be-

handlung mit dem Ultraturrax erreicht. Die vereinigten Überstände konnten auf die konditio-

nierte SA-Säule gegeben werden.

3.3.4.3. Aufarbeitung für die kombinierten Säulen

Die Probenaufarbeitung erfolgte identisch zu der Aufarbeitung für die SA-Kartusche mit 1 %

iger Essigsäure in Methanol.

51

3.3.4.4. Aufarbeitung für die C18-Säulen für Dihydrostreptomycin

Bei der hier verwendeten Aufarbeitung handelt es sich um die Applikation Nummer 81 der

Firma Macherey-Nagel zur Aufarbeitung von Serum und Urin zum Antibiotikanachweis. Zur

Vorbereitung der Probe wurde 1 g Vollei mit 1 ml Dihydrostreptomycinlsg. dotiert, mit 1 ml

Acetonitril kräftig gemischt und anschließend 5 Minuten bei 1600 rpm zentrifugiert. Der klare

Überstand wurde dann mit 5 ml destilliertem Wasser vermischt.

3.3.5. Festphasenextraktion

Für die unterschiedlichen Festphasenextraktionen war je nach Art der verwendeten Säulen

eine spezielle Versuchsdurchführung notwendig.

3.3.5.1. Festphasenextraktion mit der C18-Säule

Die C18-Säule wurde erst mit 5 ml Methanol und anschließend mit 5 ml Bidest. konditioniert.

Nachdem das gesamte Probenvolumen über die Säule gelaufen war, wurde mit 2 ml Bidest.

gespült und anschließend 5 Minuten lufttrocken gesaugt. Die Elution erfolgte mit 6 ml

Methanol in graduierte Spitzröhrchen.

3.3.5.2. Festphasenextraktion mit der SA-Säule

Die SA-Säule wurde mit einem Säulenvolumen 5 %iger Essigsäure in Methanol konditioniert,

bevor die Probe aufgegeben wurde. Vor der Elution wurde nacheinander mit 5 ml Methanol,

10 ml Bidest. und erneut 5 ml Methanol gewaschen. Die Elution erfolgte mit 5 ml ammonia-

kalischer Methanollösung in graduierte Spitzröhrchen.

52

3.3.5.3. Festphasenextraktion mit der Kombinationssäule

Bei den kombinierten Säulen wurden als Vorsäule eine NH2-Säule und als eigentliche Trenn-

säule wieder eine SA-Säule verwendet. Beide Säulen wurden erst mit 3 ml n-Hexan konditio-

niert. Die SA-Säule wurde zusätzlich noch mit 6 ml Ethylacetat in Essigsäure (5%) konditio-

niert. Beide Säulen wurden mit einem Adapter zusammengesteckt und die vereinigten Über-

stände aus der Probenaufarbeitung aufgegeben. Nachdem die Probe vollständig durchgelaufen

war, wurde mit 6 ml Methanol gewaschen. Anschließend wurde die NH2-Säule entfernt und

die SA-Säule mit 6 ml Wasser und 12 ml Methanol gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3 ml

ammoniakalischer Methanollösung in graduierte Spitzröhrchen.

3.3.5.4. Festphasenextraktion mit der C18-Säule für Dihydrostreptomycin

Die C18-Säule wurde erst mit 5 ml Acetonitril, dann mit 5 ml dest. Wasser konditioniert.

Nachdem die Probe über die Säule gegeben worden ist, wurde mit 20 ml Wasser, und 5 ml

Acetonitril/Wassergemisch (1:1) gewaschen und die Säule trocken gesaugt. Die Elution er-

folgte mit 1,5 ml Acetonitril/0,05M Phoshatpuffer pH 5,8 (3:2).

3.3.6. Einengung der Eluate

Um das Nachweissystem so empfindlich wie möglich zu gestalten, wurden die gewonnenen

Eluate im Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt und anschließend wieder in 1 ml

Bidest. aufgenommen.

3.3.7. Bestimmung des Pipettierfehlers

Um die Messungenauigkeit bei der Anfertigung der Verdünnungsreihen und der Dotierungs-

lösungen einschätzen zu können, erfolgte eine Überprüfung der verwendeten Finnpipette

(200-1000µl) und der Eppendorfpipette (60-100µl) in verschiedenen Volumina durch Aus-

53

wiegen des pipettierten Volumens. Als Pipettierlösung wurde Wasser verwendet, da hiermit

eine Umrechnung des Volumens in die Masse 1 : 1 erfolgen konnte.

Den errechneten Werten liegen jeweils 20 Einzelbestimmungen zu Grunde.

Sollwert

(µl)

Ø Istwert

(mg)

Standardab-

weichung

Minimum

(mg)

Maximum

(mg)

Max. Abwei-

chung1000 998,5 3,47 981,4 998,8 - 1,9 %

900 897,1 1,52 893,4 899,4 - 0,76%

750 746,3 4,71 745,5 750,9 - 3,12% / + 0,12%

600 600,4 1,01 599,1 602,1 - 0,12% / + 0,50%

300 300,1 0,79 299,0 301,6 - 0,33% / + 0,53%

200 199,7 1,15 195,2 201,1 - 0,35% / + 0,55%

100 99,0 0,44 98,4 99,6 - 2,3%

60 59,3 0,40 57,9 59,9 - 3,5%

Tabelle 2: Zusammengefasste Ergebnisse der Pipettenkontrollen

55

4. Ergebnisse

4.1. Vorversuche mikrobiologischer Hemmstofftest

Ziel dieses Vorversuches war es, die unterschiedliche Eignung der gewählten Nährmedien

und Testorganismen zu ermitteln, um für die verschiedenen Substanzen ein selektives Nach-

weisverfahren zu finden.

4.1.1 Ampicillin

Unmittelbar vor der Herstellung der Verdünnungsreihe der Reinsubstanz von Ampicillin wur-

den Nährböden mit Bac. subtilis pH 6,0, Bac. subtilis 7,2 mit Trimethoprimzusatz, Bac.

subtilis pH 8,0, Bac. staerothermophilus var. calidolactis und E. coli pH 6,0 hergestellt. Zur

Herstellung der Ampicillinstammlösung wurden je Ansatz 5 mg der Reinsubstanz eingewo-

gen und diese in 4330 µl Wasser aufgelöst, um eine Ausgangskonzentration von 1000 µg/ml

zu erhalten. Hieraus wurden Verdünnungsstufen bis zur Endkonzentration von 0,001 µg/ml

hergestellt (8.1.1.). Im Parallelansatz auf allen zu testenden Nährböden wurden 100 µl pro

Verdünnungsstufe in Stanzlöcher von 11 mm Durchmesser gegeben. Die Kulturen von Bac.

subtilis und E. coli wurden bei 30°C für 18 Stunden bebrütet. Die Kultur von Bac.

stearothermophilus wurde bei 60°C für 18 Stunden bebrütet. Die entstandenen Hemmhöfe

wurden mit einem Stechzirkel in mm gemessen.

Jedes Testsystem wurde dreifach geprüft ( siehe 8.2. Tabellen 57-59) und hieraus die Mittel-

werte errechnet (8.2., Tabelle 60). Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 in einfach logarithmi-

scher Darstellung wiedergegeben.

56

y = 0.1647x - 2.4646R2 = 0.8641

y = 0.2309x - 2.3468R2 = 0.7732

y = 0.2769x - 2.3998R2 = 0.821

y = 0.1951x - 3.0675R2 = 0.9773

-3.5

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0

Hemmhof (mm)

Am

pici

llin

(µg/

ml l

og 1

0)

Bac. subtilis pH 6,0Bac. subtilis pH 7,2 + TMPBac. subtilis pH 8,0Bac. stearothermophilusE. coli pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 7,2 + TMPTrend Bac. subtilis pH 8,0Trend Bac. stearothermophilus

Abb.1: Hemmwirkung von Ampicillin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen Nährmedien

Die lineare Darstellung zeigt hierbei die Trendlinie der einzelnen Nährmedien. Um jeden ein-

zelnen Wert genau berechnen zu können, wurde die Funktion der Trendlinie ermittelt. R2 ist

die Angabe des Bestimmtheitsgrades der Trendlinie zu den ermittelten Messwerten.

Bac. stearothermophilus auf Isoagar ist zum Nachweis von Ampicillin mit einer Nachweis-

grenze von 0,002 µg/ml am sensitivsten.

57

4.1.2. Dihydrostreptomycin

Für diese Untersuchung wurde eine Verdünnungsreihe in physiologischer Kochsalzlösung aus

der Stammlösung von 1000 µg/ml hergestellt (8.1.4.) und diese auf die zu testenden Nährme-

dien verbracht. Aus dem dreifachen Ansatz (siehe 8.2., Tabellen 61-63) wurden Mittelwerte

(8.2., Tabelle 64) gebildet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 in einfach logarithmischer

Darstellung wiedergegeben.

y = 0.2534x - 0.3235R2 = 0.5856

y = 0.1503x - 0.6852R2 = 0.9234

y = 0.1565x - 0.6084R2 = 0.8714

y = 0.2525x - 0.2596R2 = 0.4686

y = 0.2487x - 0.2725R2 = 0.4935

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Hemmhof (mm)

Dih

ydro

stre

ptom

ycin

(µg/

ml l

og 1

0)

Bac. subtilis pH 6,0Bac. subtilis pH 7,2 + TMPBac. subtilis pH 8,0Bac. stearothermophilusE coli pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 7,2 + TMPTrend Bac. subtilis pH 8,0Trend Bac. stearothermophilusTrend E. coli pH 6,0

Abb. 2: Hemmwirkung von Dihydrostreptomycin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen

Nährmedien

58

Bac. subtilis ist bei pH 7,2 mit Trimethoprimzusatz und pH 8,0 etwa gleich gut zum Nachweis

von Dihydrostreptomycin geeignet. Die Nachweisgrenze dieser Testsysteme liegt rechnerisch

bei ca. 0,4 µg/ml. Die anderen Testsysteme zeigen eine Nachweisgrenze von circa 1,7 µg/ml.

4.1.3. Oxytetracyclin

Für diese Untersuchung wurde eine Verdünnungsreihe in physiologischer Kochsalzlösung

aus der Stammlösung von 1000 µg/ml hergestellt (8.1.7.) und diese auf die zu testenden

Nährmedien verbracht. Aus dem dreifachen Ansatz (siehe 8.2., Tabellen 65-67) wurden Mit-

telwerte (8.2., Tabelle 68) gebildet, die folgende einfach logarithmische Darstellung ergaben:

Der empfindlichste Testkeim für den Nachweis von Oxytetracyclin war der Bac. subtilis pH

6,0. Die Nachweisgrenze betrug 0,14 µg/ml.

59

y = 0.1143x - 1.0801R2 = 0.9924

y = 0.1642x - 0.8908R2 = 0.9786

y = 0.1735x - 0.6096R2 = 0.8397

y = 0.1332x - 1.0069R2 = 0.9926

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0Hemmhof (mm)

Oxy

tetr

acyc

lin (µ

g/m

l log

10)

Bac. subtilis pH 6,0Bac. subtilis pH 7,2 + TMPBac. subtilis pH 8,0Bac. stearothermophilusE.coli pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 7,2 + TMPTrend Bac. subtilis pH 8,0Trend E. coli pH 6,0

Abb. 3: Hemmwirkung von Oxytetracyclin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen Nährme-

dien

4.1.4. Doxycyclin

Für diese Untersuchung wurde eine Verdünnungsreihe in pysiologischer Kochsalzlösung aus

der Stammlösung von 1000 µg/ml hergestellt (8.1.5.) und diese auf die zu testenden Nährme-

60

dien verbracht. Aus dem dreifachen Ansatz (siehe 8.2., Tabellen 69-71) wurden Mittelwerte

(8.2., Tabelle 72) gebildet, die folgende graphische Darstellung ergaben:

y = 0.158x - 2.1962R2 = 0.9816

y = 0.1756x - 2.0764R2 = 0.9869y = 0.1839x - 1.3491

R2 = 0.7975

y = 0.2589x - 0.9896R2 = 0.4786

y = 0.1514x - 1.0263R2 = 0.5238

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0

Hemmhof (mm)

Dox

ycyc

lin (µ

g/m

l log

10)

Bac. subtilis pH 6,0Bac. subtilis pH 7,2 +TMPBac. subtilis pH 8,0Bac. stearothermophilusE.coli pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 6,0Trend Bac. subtilis pH 7,2 +TMPTrend Bac. subtilis pH 8,0Trend Bac. stearothermophilusTrend E. coli pH 6,0

Abb. 4: Hemmwirkung von Doxycyclin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen Nährmedien

Der Bac. subtilis pH 6,0 hat sich auch zum Nachweis von Doxycyclin als am empfindlichsten

erwiesen. Die Nachweisgrenze lag hierbei bei 0,013 µg/ml.

61

4.1.5. Colistin

Für diese Untersuchung wurde eine Verdünnungsreihe in Bidest. aus der Stammlösung von

1000 µg/ml hergestellt (8.1.3.) und diese auf die zu testenden Nährmedien verbracht. Aus

dem dreifachen Ansatz (siehe 8.2, Tabellen 73-75) wurden Mittelwerte (8.2., Tabelle 76) ge-

bildet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 in einfach logarithmischer Darstellung wiederge-

geben.

y = 0.2986x + 0.2826R2 = 0.6244

y = 0.2498x + 0.2167R2 = 0.8255

y = 0.2099x + 0.1716R2 = 0.9012

y = 0.1641x + 0.1218R2 = 0.9369

y = 0.1313x + 0.0878R2 = 0.9186

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

Hemmhof (mm)

Col

istin

(µg/

ml l

og 1

0)

Bac. subtilis pH 6,0

Bac. subtilis pH 7,2 + TMP


Bac. stearothermophilus

E.coli pH 7,2 + TMP

Trend Bac. subtilis pH 6,0

Trend Bac. subtilis pH 7,2 + TMP


Trend Bac. stearothermophilus

Trend E. coli pH 7,2 +TMP

Abb. 5: Hemmwirkung von Colistin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen Nährmedien

62

Als empfindlichster Testkeim zum Nachweis von Colistin hat sich der E. coli pH 7,2 mit Tri-

methoprimzusatz erwiesen. Die Nachweisgrenze betrug 2,3 µg/ml.

4.1.6. Sulfadimidin



dem dreifachen Ansatz (siehe 8.2., Tabellen 77-79) wurden Mittelwerte (8.2., Tabelle 80)

gebildet, die folgende graphische Darstellung ergaben:

y = 0.08x - 0.2004R2 = 0.96

y = 0.1118x + 0.2549R2 = 0.6971

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0

Hemmhof (mm)

Sulfa

dim

idin

(µg/

ml l

og 1

0)





E.coli pH 7,2 +TMP

Trend Bac. subtilis pH 7,2 +TMP


Abb. 6: Hemmwirkung von Sulfadimidin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen Nährmedien

63

Der empfindlichste Testkeim zum Nachweis von Sulfadimidin war der Bac. subtilis pH 7,2

mit Trimethoprimzusatz. Die Nachweisgrenze lag bei circa 1 µg/ml. Ohne Zusatz von Tri-

methorim war mit Bac. subtilis in den getesten Bereichen kein Nachweis möglich. Die Unter-

suchung mit E. coli verlief ebenso negativ.

4.1.7. Enrofloxacin



dem dreifachen Ansatz (siehe 8.2., Tabellen 81-83) wurden Mittelwerte (8.2., Tabelle 84)

gebildet, die folgende graphische Darstellung ergaben:

64

y = 0.1211x - 1.5808R2 = 0.9312

y = 0.1298x - 1.7786R2 = 0.974

y = 0.1629x - 1.5157R2 = 0.8898

y = 0.6025x - 1.1786R2 = 0.5672

y = 0.1211x - 2.0758R2 = 0.984

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0

Hemmhof (mm)

Enro

floxa

cin

(µg/

ml l

og 1

0)





E.coli pH 7,2 + TMP


Trend Bac. subtilis pH 7,2 +TMP



Trend E. coli pH 7,2 + TMP

Abb. 7: Hemmwirkung von Enrofloxacin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unterschiedlichen Nährmedien

Der empfindlichste Testkeim zum Nachweis von Enrofloxacin war der E. coli pH 7,2 mit

Trimethoprimzusatz. Die Nachweisgrenze lag bei 0,015 µg/ml.

4.2. Vorversuche Festphasenextraktion

Ziel dieses Versuchteils war es, festzustellen, mit welcher der drei ausgewählten Festpha-

senextraktionssäulen die höchste Wiederfindung für die einzelnen Substanzen erreicht werden

kann. Zu diesem Zweck wurden Antibiotikalösungen in Konzentrationen hergestellt, die mit

den eingesetzten Detektionsverfahren sicher nachgewiesen werden können. Berücksichtigung

65

fand hierbei, dass die einzelnen Aufarbeitungen von unterschiedlichen Elutionsmengen aus-

gehen, so dass für die Extraktion mit der C18- Säule ein Ausgangsvolumen von 6 ml, für die

SA-Säule ein Volumen von 5 ml und für die Kombinationssäulen ein Ausgangsvolumen von

3 ml gewählt wurden. Als Nachweissystem wurde der im vorangegangenen Versuch ermit-

telte empfindlichste Testkeim gewählt. Da der mikrobiologische Hemmstofftest im neutralen

pH-Bereich (pH 6,8) durchgeführt wurde, aber der pH-Wert im Eluat z.T. davon abwich,

wurde er vor der Auftragung auf den Nährboden überprüft und gegebenenfalls eingestellt. Um

Aussagen über die Wiederfindung machen zu können, wurde eine Eichreihe der entsprechen-

den Substanz auf dem gleichen Nährboden mitgeführt

4.2.1 Ampicillin

Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine wässrige Ampicillinlösung hergestellt, die eine Kon-

zentration von 0,03 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der Ionenaustauscher-Säulen wurden 6

ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (0,18 µg abs.), 5 ml auf die SA-Säulen (0,15 µg abs.)

und 3 ml auf die Kombinationssäulen (0,09 µg abs.) gegeben. Aus der gleichen Stammlösung

wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.1.) hergestellt. Nach Versuchsdurchführung wie

unter 3.3.5. beschrieben, wurden Eluatmenge und der pH-Wert hiervon bestimmt. Nach pH-

Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von 11 mm Durchmesser in Isoagar, der

mit Bac.stearothermophilus var. calidolactis beimpft wurde, verbracht. Zur Kontrolle und zur

Erstellung einer Vergleichsreihe für quantitative Berechnungen wurden jeweils 100 µl der

Verdünnungsstufen (siehe Anhang 8.1.1) auf dem gleichen Nährboden mitgeführt.

Tabelle 3: Hemmhöfe von Ampcillin-Standardverdünnungen auf Isoagar

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 0.1 10.0VI 0.08 9.5VII 0.06 9.0VIII 0.03 7.5IX 0.02 5.0X 0.01 4.5XI 0.008 4.5XII 0.006 4.0XIII 0.003 2.0XIV 0.002 1.5XV 0.001 0.0

66

Tabelle 4: Ergebnisse der Untersuchung verschiedener Festphasenextraktionssäulen für

Ampicillin (erster Durchgang) auf Isoagar mit Bac. stearothermophilus

Säule Konz. (µg/ml)

Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution

korrigier-ter pH-Wert

Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

Errechnete Konz. (µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 0.03 5.8 8.16 7.42 5.8 + 0.4 4.5 0.008 0.0086 28.5C18 II 0.03 5.8 8.16 7.42 5.8 + 0.4 4.0 0.006 0.0064 21.4SA I 0.03 4.6 12.02 7.37 2.0 +0.9 0.0 <0.001 <0.0014 <4.8SA II 0.03 4.6 12.02 7.37 2.0 + 0.9 0.0 <0.001 <0.0014 <4.8

Kombi I 0.03 3.0 11.96 7.66 2.0 + 0.9 2.0 0.003 0.0044 14.5Kombi II 0.03 3.0 11.96 7.66 2.0 + 0.9 1.5 0.002 0.0029 9.7

Die errechnete Ampicillinkonzentration ergab sich aus dem Vergleich der Hemmhöfe der

eingestellten Eluate und der Eichreihe. Da sich durch die pH-Wert-Einstellung ein Verdün-

nungseffekt ergab, musste die Ampicillinkonzentration entsprechend korrigiert werden, bevor

die Wiederfindungsrate bestimmt werden konnte. Die beste Wiederfindung ergab sich für die

C18-Säulen mit durchschnittlich fast 25%.

Auf Grund der unbefriedigenden Wiederfindungsraten wurde in einem zweiten Versuchs-

durchlauf eine wässrige Ampicillinlösung hergestellt, die eine Konzentration von 0,1 µg/ml

enthielt. Nach Vorbereitung der Ionenaustauschersäulen wurden 6 ml dieser Lösung auf die

C18 Säule (0,6 µg abs.), 5 ml auf die SA-Säule (0,5 µg abs.) und 3 ml auf die Kombinations-

säule (0,1 µg abs.) gegeben. Aus der gleichen Stammlösung wurde parallel eine Verdün-

nungsreihe (8.1.1.) hergestellt. Nach spezifischer Versuchsdurchführung (3.3.5.) wurden die

Eluatmengen und der pH-Wert bestimmt. Nach pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in

Stanzlöcher von 11 mm Durchmesser in Isoagar, der mit Bac. stearothermophilus var. cali-

dolactis beimpft wurde, verbracht. Zum Vergleich wurden parallel jeweils 100 µl verschiede-

ner Konzentrationen der Verdünnungsreihe auf dem gleichen Nährboden untersucht.

67

Tabelle 5: Hemmhöfe von Ampicillin-Standardverdünnungen auf Isoagar mit Bac.

stearothermophilus



Ampicillin (zweiter Durchgang) auf Isoagar mit Bac. stearothermophilus


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution

korrgier-ter pH-Wert

Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

Errechnete Konz.

(µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 0.1 5.9 8.10 7.67 5.9 + 0.4 8.0 0.03 0.028 28.1C18 II 0,1 5.9 8.10 7.52 5.9 + 0.4 7.5 0.02 0.019 18.7SA I 0.1 4.7 11.75 8.02 2.0 + 0.7 2.0 0.001 0.001 1.4SA II 0.1 4.8 11.83 8.21 2.0 + 0.9 3.0 0.002 0.003 2.9

Kombi I 0.1 3.0 11.96 7.66 2.0 + 0.8 5.0 0.005 0.007 7.0Kombi II 0.1 2.9 11.96 7.55 2.0 + 0.9 7.0 0.010 0.015 14.5

Positivkontrolle 0,1 10.0 0.105


Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine Dihydrostreptomycinlösung in physiologischer

Kochsalzlösung hergestellt, die eine Konzentration von 1,0 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung

der Ionenaustauschersäulen wurden 6 ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (6,0 µg abs.), 5 ml

auf die SA-Säulen (5,0 µg abs.) und 3 ml auf die Kombinationssäulen (3,0 µg abs.) gegeben.

Aus der gleichen Stammlösung wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.4.) hergestellt.

68

Nach Versuchsdurchführung wie unter 3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatmengen und der

pH-Wert bestimmt. Nach pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von 11

mm Durchmesser in Standard I-Agar, pH 7,2 + TMP-Zusatz, der mit Bac. subtilis beimpft

wurde, verbracht. Zum Vergleich wurden jeweils 100 µl der Eichreihe auf dem gleichen

Nährboden mitgeführt. Zur Kontrolle der Hemmwirkung des Eluenten und des Methanols

wurden hiervon je 100µl parallel mituntersucht.

Tabelle 7: Hemmhöfe von Dihydrostreptomycin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 5.00 10.5VI 2.50 9.0VII 1.75 8.0VIII 1.00 7.5IX 0.75 7.0X 0.50 5.0XI 0.25 3.0XII 0.10 0.0

Tabelle 8: Ergebnisse der Untersuchung verschiedener Festphasenextraktionssäulen für Dihy-

drostreptomycin (erster Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 1.0 5.7 8.86 6.92 5.7 + 0.4 0.0 <0.1 <0.11 <10C18 II 1.0 5.8 8.86 6.92 5.7 + 0.4 0.0 <0.1 <0.11 <10SA I 1.0 4.7 11.93 7.85 2.0 + 1.0 1.5 0.13 0.19 18.8SA II 1.0 4.7 11.93 7.85 2.0 + 1.1 1.0 0.08 0.13 12.9

Kombi I 1.0 2.8 11.76 7.71 2.0 + 1.0 1.5 0.13 0.19 18.75Kombi II 1.0 2.8 11.76 7.71 2.0 + 1.0 1.5 0.13 0.19 18.75Eluent 0.0

Methanol 0.0

Da selbst bei relativ hohen Konzentrationen von Dihydrostreptomycin die Ergebnisse dieser

Säulentestung unzufriedenstellend waren, wurde nach einer anderen Art der Aufarbeitung

69

gesucht. Die Hersteller der Festphasensäulen (Macherey-Nagel ) schlugen für den Nachweis

dieses Antibiotikums in Serum- und Urinproben eine Aufarbeitung für die C18-Säule mit

Acetonitril vor. Diese Aufarbeitung wurde mit dotiertem Vollei nach entsprechender Ver-

suchsanweisung (3.3.5.4.) durchgeführt und auf dem oben genannten Nährmedium nachge-

wiesen.

Tabelle 9: Hemmhöfe von Dihydrostreptomycin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 5,0 12.0VI 2.50 10.0VII 1.75 8.5VIII 1.00 6.5IX 0.75 5.5X 0.50 2.5XI 0.25 0.0XII 0.10 0.0


Dihydrostreptomycin (zweiter Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 1.0 5.7 8.86 6.92 5.7 + 0.4 0.0 <0.25 <0.27 <26.8C18 II 1.0 5.8 8.86 6.92 5.7 + 0.4 0.0 <0.25 <0.27 <26.8C18

Aceto- nitril

1.0 1.0 5.66 6.7 0.7 + 0.05 0.0 <0.25 <0.25 <25.0

C18 Aceto- nitril

1.0 1.3 5.95 6.86 0.7 + 0.05 0.0 <0.25 <0.25 <25.0

SA I 1.0 4.7 11.93 7.85 2.0 + 1.2 1.5 0.3 0.50 49.5Kombi I 1.0 2.8 11.76 7.71 2.0 + 1.0 1.5 0.3 0.45 45.0Kombi II 1.0 2.8 11.76 7.71 2.0 + 1.0 1.5 0.3 0.45 45.0Aceto- nitril 0.0

70

Die besseren Wiederfindungsraten in dieser Versuchsreihe begründen sich allein in der Um-

rechnung des gemessenen Hemmhofes in die entsprechende Konzentration anhand der

Eichreihe, denn die absoluten Hemmhofgrößen unterscheiden sich nicht von den Ergebnissen

des ersten Durchgangs. Die Aufarbeitung mit Acetonitril zeigte auch nicht die erhoffte Steige-

rung der Wiederfindungsrate.

4.2.3. Oxytetracyclin

Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine Oxytetracyclinlösung in physiologischer Kochsalz-

lösung hergestellt, die eine Konzentration von 0,8 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der Io-

nenaustauschersäulen wurden 6 ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (4,8 µg abs.), 5 ml auf

die SA-Säulen (4,0 µg abs.) und 3 ml auf die Kombinationssäulen (2,4 µg abs.) gegeben. Aus

der gleichen Stammlösung wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.7.) hergestellt.

Nach Versuchsdurchführung wie unter 3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatvolumina und der

pH-Wert hiervon bestimmt. Nach pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher

von 11 mm Durchmesser in Standard I-Agar, pH 6,0, der mit Bac. subtilis beimpft wurde,

verbracht. Zum Vergleich wurden jeweils 100 µl der Eichreihe auf dem gleichen Nährboden

mitgeführt. Als Negativkontrollen wurden je 100 µl des Eluenten und Methanol mitunter-

sucht.

Tabelle 11: Hemmhöfe von Oxytetracyclin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 3.00 8.0VI 1.80 6.5VII 1.00 5.5VIII 0.80 4.0IX 0.60 3.5X 0.50 3.0XI 0.30 0.0XII 0.20 0.0XIII 0.10 0.0

71


Oxytetracyclin (erster Durchgang) auf Standard-I-Agar, pH 6,0


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof (mm)

Errechnete Konz.

(µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin- dung (%)

C18 I 0.8 5.7 8.10 6.97 3.0 + 2.2 4.0 0.80 1.47 183.3C18 II 0.8 5.7 8.10 6.97 3.0 + 2.2 3.0 0.50 0.92 114.6SA I 0.8 5.0 11.98 7.12 2.0 + 1.2 4.0 0.80 1.28 160SA II 0.8 5.0 11.98 7.12 2.0 + 1.2 4.5 0.82 1.31 164

SA ohne 0.8 5.0 11.98 11.98 0.0 <0.3 <0.3 <37.5Kombi I 0.8 2.7 11.90 7.24 1.0 + 0.4 0.0 <0.3 <0.21 <26.3Kombi II 0.8 2.7 11.90 7.24 1.0 + 0.4 0.0 <0.3 <0.21 <26.3Kombi ohne 0.8 2.7 11.90 11.9 0.0 <0.3 <0.3 <37.5

Methanol 2.7 0.0Eluent 0.0

Die Wiederfindungen von über 100 % sprechen für einen Pipettierfehler, so dass ein neuer

Ansatz mit den gleichen Eluaten, aber einer neuen Eichreihe auf neuen Nährböden angesetzt

wurde.

Tabelle 13: Hemmhöfe von Oxytetracyclin-Standardverdünnungen in der Wiederholung


72


Oxytetracyclin in der Wiederholung


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz. (µg/ml

Wiederfin- dung (%)

C18 I 0.8 5.7 8.10 6.97 3.0 + 2.2 4.0 0.31 0.53 66.6C18 II 0.8 5.7 8.10 6.97 3.0 + 2.2 3.0 0.26 0.47 58.9SA I 0.8 5.0 11.98 7.12 2.0 + 1.2 4.0 0.31 0.49 61.3SA II 0.8 5.0 11.98 7.12 2.0 + 1.2 4.0 0.31 0.49 61.3

SA ohne 0.8 5.0 11.98 11.98 0.0 <0.2 <0.2 <25.0Kombi I 0.8 2.7 11.90 7.24 1.0 + 0.4 0.0 <0.2 <0.28 <35.0Kombi II 0.8 2.7 11.90 7.24 1.0 + 0.4 0.0 <0.2 <0.28 <35.0Kombi ohne 0.8 2.7 11.90 11.9 0.0 <0.2 <0.2 <25.0

Methanol 2.7 0.0Eluent 0.0

Auf Grund der dicht beieinanderliegenden Wiederfindungsraten der SA- und der C18-Säule

wurde im zweiten Versuchsdurchlauf eine Oxytetracyclinlösung in physiologischer Koch-

salzlösung hergestellt, die eine Konzentration von 1,0 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der

Ionenaustauschersäulen wurden 6 ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (6,0 µg abs.), 5 ml auf

die SA-Säulen (5,0 µg abs.) und 3 ml auf die Kombinationssäulen (3,0 µg abs.) gegeben. Aus

der gleichen Stammlösung wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.7.) hergestellt. Nach

Versuchsdurchführung wie unter 3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatvolumina und der pH-

Wert hiervon bestimmt. Nach pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von

11 mm Durchmesser in Standard-I-Agar, der mit Bac. subtilis beimpft wurde, verbracht. Zum

Vergleich wurden jeweils 100 µl der Verdünnungsreihen auf dem gleichen Nährboden mitge-

führt.

73

Tabelle 15: Hemmhöfe von Oxytetracyclin-Standardverdünnungen



Oxytetracyclin (zweiter Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin- dung (%)

C18 I 1.0 6.5 10.57 7.32 2.0 + 0.05 3.5 0.44 0.45 45.1SA I 1.0 5.3 11.85 7.90 2.0 + 0.05 2.5 0.25 0.26 25.6SA II 1.0 4.9 12.04 7.22 2.0 + 0.5 3.5 0.44 0.55 55.0

Kombi I 1.0 2.8 11.85 7.87 2.8 + 0.6 2.0 0.20 0.24 24.3Kombi II 1.0 2.8 11.80 7..66 2.8 + 0.6 2.5 0.25 0.30 30.4

4.2.4. Doxycyclin

Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine Doxycyclinlösung in physiologischer Kochsalzlö-

sung hergestellt, die eine Konzentration von 0,1 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der Ionen-

austauschersäulen wurden 6 ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (0,6 µg abs.), 5 ml auf die

SA-Säulen (0,5 µg abs.) und 3 ml auf die Kombinationssäulen (0,3 µg abs.) gegeben. Aus der

gleichen Stammlösung wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.5.) hergestellt. Nach Ver-

suchsdurchführung wie unter 3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatvolumina und der pH-Wert

hiervon bestimmt. Nach pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von 11 mm

Durchmesser in Standard I-Agar, pH 6,0, der mit Bac. subtilis beimpft wurde, verbracht. Zum

74

Vergleich wurden jeweils 100 µl der Eichreihe auf dem gleichen Nährboden mitgeführt. Je

100 µl Methanol und Eluent wurden als Negativkontrolle untersucht.

Tabelle 17: Hemmhöfe von Doxycyclin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)VI 0.60 10.0VII 0.40 9.0VIII 0.30 6.5IX 0.20 5.5X 0.10 4.5XI 0.05 3.5XII 0.01 1.5


Doxycyclin (erster Durchgang):


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

Errechnete Konz.

(µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 0.1 6.3 8.56 6.86 2.0 + 1.0 2.0 0.03 0.05 45.0C18 II 0.1 6.3 8.56 6.86 2.0 + 1.0 1.5 0.01 0.02 15.0SA I 0.1 4.5 12.05 6.89 2.0 + 0.6 4.0 0.09 0.12 117.0SA II 0.1 4.5 12.05 6.89 2.0 + 0.6 4.0 0.09 0.12 117.0

SA ohne 0.1 4.5 12.05 12.05 1.5 0.01 0.01 10.0Kombi I 0.1 4.5 11.82 6.61 1.0 + 0.3 0.0 <0.01 <0.013 <13.0Kombi II 0.1 3.0 11.82 6.61 1.0 + 0.3 0.0 <0.01 <0.013 <13.0Kombi ohne 0.1 3.0 11.82 11.82 0.0 <0.01 <0.01 <10

Methanol 0.0Eluent 0.0

Die Wiederfindungen von über 100 % sprechen für einen Pipettierfehler, so daß ein neuer

Ansatz mit den gleichen Eluaten, aber einer neuen Eichreihe auf neuen Nährböden angesetzt

wurde.

75

Tabelle 19: Hemmhöfe von Doxycyclin-Standardverdünnungen in der Wiederholung

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)VI 0.60 10.0VII 0.40 9.0VIII 0.30 8.5IX 0.20 8.0X 0.10 7.0XI 0.05 3.5XII 0.01 1.5

Tabelle 20: Ergebnisse der Untersuchung verschiedener Festphasenextraktionssäulen

für Doxycyclin in der Wiederholung


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof (mm)

Errechnete Konz.

(µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin- dung (%)

C18 I 0.1 6.3 8.56 6.86 2.0 + 1.0 4.0 0.057 0.086 85.5C18 II 0.1 6.3 8.56 6.86 2.0 + 1.0 3.0 0.043 0.064 64.4SA I 0.1 4.5 12.05 6.89 2.0 + 0.6 5.0 0.071 0.093 92.8SA II 0.1 4.5 12.05 6.89 2.0 + 0.6 4.5 0.064 0.084 83.6

SA ohne 0.1 4.5 12.05 12.05 2.5 0.036 0.036 35.7Kombi I 0.1 4.5 11.82 6.61 1.0 + 0.3 2.5 <0.01 <0.013 <13.0Kombi II 0.1 3.0 11.82 6.61 1.0 + 0.3 0.0 <0.01 <0.013 <13.0Kombi ohne 0.1 3.0 11.82 11.82 0.0 <0.01 <0.01 <10

Methanol 0.0Eluent 0.0

76

Tabelle 21: Hemmhöfe von Doxycyclin-Standardverdünnungen



Doxycyclin (zweiter Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin- dung (%)

C18 I 1.0 6.0 10.57 7.32 2.0 + 1.0 12.0 0.400 0.60 60.0SA I 1.0 5.3 11.78 7.63 2.0 + 0.7 10.0 0.160 0.22 21.6SA II 1.0 5.0 11.71 7.46 2.0 + 0.7 10.5 0.200 0.27 27.0

Kombi I 1.0 3.0 11.69 7.59 1.0 + 0.4 6.0 0.075 0.11 10.5Kombi II 1.0 2.8 11.68 8.16 1.0 + 0.4 7.0 0.088 0.12 12.3Positiv- kontrolle

1.0 13.0

4.2.5. Colistin

Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine wässrige Colistinlösung hergestellt, die eine Kon-

zentration von 7,5 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der Ionenaustauschersäulen wurden 6

ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (45 µg abs.), 5 ml auf die SA-Säulen (37,5 µg abs.) und

3 ml auf die Kombinationssäulen (22,5 µg abs.) gegeben. Aus der gleichen Stammlösung

wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.3.) hergestellt. Nach Versuchsdurchführung wie

unter 3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatvolumina und der pH-Wert hiervon bestimmt. Nach

pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von 11 mm Durchmesser in Isoagar,

der mit Bac. sterothermophilus var calidolactis beimpft wurde, verbracht. Zum Vergleich

wurden jeweils 100 µl der Eichreihe auf dem gleichen Nährboden mitgeführt

77

Tabelle 23: Hemmhöfe von Colistin-Standardverdünnung

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)IV 7.50 4.0V 5.00 3.5VI 3.50 3.0VII 2.50 2.0VIII 2.00 1.0IX 1.80 0.0X 1.30 0.0XI 1.00 0.0


Colistin (erster Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

Errechnete Konz.

(µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin- dung (%)

C18 I 7.5 5.8 8.53 7.4 5.8 + 1.5 0.0 <2.0 <2.52 <33.56C18II 7.5 5.8 8.53 7.4 5.8 + 1.5 0.0 <2.0 <2.52 <33.56SA I 7.5 4.3 11.95 7.04 2.0 + 1.2 7.0 13.13 21.00 280SA II 7.5 4.3 11.95 7.04 2.0 + 1.2 7.0 13.13 21.00 280.0

Kombi I 7.5 2.7 11.77 7.74 2.0 + 1.0 6.0 11.25 16.88 225.0Kombi II 7.5 2.7 11.77 7.74 2.0 + 1.0 6.0 11.25 16.88 225.0

Da die Wiederfindung deutlich über 100 % lag, wurde der Ansatz mit gleicher Konzentration

aber erweiterter Standard-Eichreihe wiederholt.

78

Tabelle 25: Hemmhöfe von Colistin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)III 10.00 5.0IV 7.50 4.5V 5.00 3.5VI 3.50 2.5VII 2.50 2.0VIII 2.00 1.5IX 1.80 0.0X 1.30 0.0XI 1.00 0.0


Colistin (zweiter Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 7.5 5.8 8.41 7.45 5.0 + 1.0 0.0 <2.0 <2.4 <32C18 II 7.5 5.8 8.41 7.45 5.0 + 1.0 0.0 <2.0 <2.4 <32SA I 7.5 4.7 11.43 7.38 2.0 + 1.0 4.0 6.67 10.01 133.4SA II 7.5 4.7 11.43 7.38 2.0 + 1.0 4.0 6.67 10.01 133.4


Methanol 0.0

Zur Bestätigung der Werte wurde ein dritter Ansatz mit identischer Konzentration angesetzt.

79

Tabelle 27: Hemmhöfe von Colistin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)IV 7.50 3.5V 5.00 2.0VI 3.50 1.0VII 2.50 0.0VIII 2.00 0.0IX 1.75 0.0X 1.25 0.0


Colistin (dritter Durchgang)


Eluat- menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution

korrigier- ter pH-Wert

Verdün- nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

errechnete Konz.

(µg/ml)

korrigierte Konz.

(µg/ml)

Wieder- findung

(%)C18 I 7.5 5.8 10.44 7.98 3.0 + 0.3 0.0 < 3.5 < 3.9 < 51.3C18 II 7.5 5.9 10.57 7.71 3.0 + 0.3 0.0 < 3.5 < 3.9 < 51.3SA I 7.5 4.8 11.69 7.93 3.0 + 0.7 4.5 9.64 11.89 158.5Kombi I 7.5 3.1 11.38 7.95 2.0 + 0.3 3.0 6.43 7.39 98.6Kombi II 7.5 3.0 11.41 7.94 2.0 + 0.4 3.0 6.43 7.16 102.9Positiv- kontrolle 7.5 3.5 7.5

4.2.6. Sulfadimidin

Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine wässrige Sulfadimidinlösung hergestellt, die eine

Konzentration von 5,0 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der Ionenaustauschersäulen wurden

6 ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (30 µg abs.), 5 ml auf die SA-Säulen (25 µg abs.) und

3 ml auf die Kombinationssäulen (15 µg abs.) gegeben. Aus der gleichen Stammlösung wurde

parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.9.) hergestellt. Nach Versuchsdurchführung wie unter

3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatvolumina und der pH-Wert hiervon bestimmt. Nach pH-

Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von 11 mm Durchmesser in Standard-I-

80

Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz, der mit Bac. subtilis beimpft wurde, verbracht. Zum Vergleich

wurden jeweils 100 µl der Eichreihe auf dem gleichen Nährboden mitgeführt. Als Negativ-

kontrolle wurden je 100 µl Methanol und Eluent untersucht.

Tabelle 29: Hemmhöfe von Sulfadimidin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 5.00 13.0VI 3.50 12.0VII 2.50 11.5VIII 2.00 10.5IX 1.75 9.0X 1.25 5.0XI 1.00 3.0

Tabelle 30: Ergebnisse der Untersuchung von verschiedenen Festphasenextraktionssäulen für

Sulfadimin (erster Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

ErrechneteKonz. (µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 5.0 5.8 8.42 7.18 5.8 + 0.7 14.0 5.38 6.03 120.6C18 II 5.0 5.8 8.42 7.18 5.8 + 0.7 14.5 5.58 6.25 125.1SA I 5.0 4.8 12.02 7.78 2.0 + 1.0 3.0 1.00 1.50 30.0SA II 5.0 4.8 12.02 7.78 2.0 + 1.0 3.0 1.00 1.50 30.0


Methanol 0.0

Auf Grund der hohen Konzentrationen ergaben sich große Hemmhöfe, die teilweise zu einer

Wiederfindung von über 100 % führten. Im zweiten Durchlauf wurde eine Konzentration von

2,5 µg/ml gewählt, so dass sich absolute Mengen von 15 µg für die C18-Säule, 12,5 µg für

die SA-Säule und 7,5 µg für die Kombinationssäule ergaben.

81




Sulfadimidin (zweiter Durchgang)


Eluat- menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution

korrigier- ter pH-Wert

Verdün- nung (ml)

Hemm- hof (ml)

errechnete Konz.

(µg/ml)

korrigierte Konz

(µg/ml)

Wiederfin- dung (%)

C18 I 2.5 6.0 10.24 7.13 3.0 + 0.3 1.5 0.94 1.03 41.4C18 II 2.5 4.9 11.94 7.89 3.0 + 0.6 2.0 1.25 1.50 60.0SA I 2.5 4.9 12.01 7.89 3.0 + 0.7 3.0 1.50 1.85 74.0Kombi I 2.5 3.0 11.49 7.34 2.0 + 0.3 2.5 1.31 1.51 60.3Kombi II 2.5 2.8 11.77 7.86 2.0 + 0.3 3.0 1.50 1.73 69.0Positiv- kontrolle 2.5 6.0 2.14

Zur Überprüfung der Ergebnisse wurde im dritten Durchlauf noch einmal die Konzentration

von 2,5 µg/ml gewählt.

82




Sulfadimidin (dritter Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 2.5 5.9 2.00 7.22 3.0 + 0.3 0.0 <1.25 <1.38 <55SA I 2.5 5.0 11.90 7.62 3.0 + 0.6 2.0 1.17 1.40 56.2SA II 2.5 5.0 11.98 7.33 3.0 + 0.7 3.0 1.25 1.54 61.7

Kombi I 2.5 2.9 11.32 7.46 2.0 + 0.3 2.0 1.17 1.35 53.8Kombi II 2.5 2.8 11.78 7.32 2.0 + 0.4 2.0 1.17 1.40 56.2Positiv- kontrolle 2.5 6.0 2.00

4.2.7. Enrofloxacin

Im ersten Versuchsdurchlauf wurde eine Enrofloxacinlösung in destilliertem Wasser herge-

stellt, die eine Konzentration von 0,1 µg/ml enthielt. Nach Vorbereitung der Ionenaustau-

schersäulen wurden 6 ml dieser Lösung auf die C18 Säulen (0,6 µg abs.), 5 ml auf die SA-

Säulen (0,5 µg abs.) und 3 ml auf die Kombinationssäulen (0,3 µg abs.) gegeben. Aus der

gleichen Stammlösung wurde parallel eine Verdünnungsreihe (8.1.6.) hergestellt. Nach Ver-

suchsdurchführung wie unter 3.3.5. beschrieben, wurden die Eluatvolumina und der pH-Wert

hiervon bestimmt. Nach pH-Einstellung wurden 100 µl des Eluates in Stanzlöcher von 11 mm

83

Durchmesser in Standard-I-Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz, der mit E. coli beimpft wurde,

verbracht. Zum Vergleich wurden jeweils 100 µl der Verdünnungsreihe auf dem gleichen

Nährboden mitgeführt.

Tabelle 35: Hemmhöfe von Enrofloxacin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)VI 0.60 16.5VII 0.40 16.0VIII 0.20 14.5IX 0.10 13.0X 0.08 10.0XI 0.06 9.0XII 0.04 8.0XIII 0.02 4.0XIV 0.01 0.0


Enrofloxacin (erster Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)

errechnete Konz.

(µg/ml)

Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wiederfin-dung (%)

C18 I 0.1 6.0 8.26 7.30 6.0 + 1.6 0.0 <0.02 <0.025 <25C18 II 0.1 6.0 8.26 7.30 6.0 + 1.6 0.0 <0.02 <0.025 <25SA I 0.1 2.5 11.20 7.12 1.0 + 0.5 10.0 0.08 0.120 120.0SA II 0.1 2.5 11.20 7.12 1.0 + 0.5 10.0 0.08 0.120 120.0

Kombi I 0.1 2.7 11.70 7.15 2.0 + 1.2 0.0 <0.02 <0.032 <32Kombi II 0.1 2.7 11.70 7.15 2.0 + 1.2 0.0 <0.02 <0.032 <32

Um möglichst auch für die C18-Säule und die Kombinationssäule einen Hemmhof zu be-

kommen, wurde die Konzentration auf 0,6 µg/ml erhöht, so dass eine absolute Menge von 3,6

µg für die C18-Säule, 3,0 µg für die SA-Säule und 1,8 µg für die Kombinationssäulen ge-

nommen wurde.

84

Tabelle 37: Hemmhöfe von Enrofloxacin-Standardverdünnungen

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 0.80 16.0VI 0.60 15.0VII 0.40 13.5VIII 0.20 13.0IX 0.10 11.5X 0.08 11.0XI 0.06 8.0XII 0.04 6.0XIII 0.02 2.5XIV 0.01 0.0


Enrofloxacin (zweiter Durchgang)


Eluat-menge

(ml)

pH-Wert nach

Elution


Verdün-nung (ml)

Hemm- hof

(mm)


Korri- gierte Konz.

(µg/ml)

Wieder- findung

(%)

C18 I 0.6 5.9 10.59 7.76 3.0 + 0.3 11.0 0.08 0.088 14.7C18 II 0.6 6.1 10.86 7.04 3.0 + 0.4 11.5 0.10 0.113 18.9SA I 0.6 5.0 11.69 7.72 3.0 + 0.6 15.0 0.60 0.720 120.0

Kombi I 0.6 2.9 11.81 7.60 2.8 + 0.6 9.0 0.07 0.085 14.2Kombi II 0.6 2.8 11.72 7.73 2.0 + 0.4 9.5 0.07 0.084 14.0Positiv- kontrolle 0.6 17.0 0.85

85

4.3. Aufarbeitung dotierter Proben

Nachdem in den Vorversuchen die Nährböden und die Festphasenextraktionen auf ihre

Eignung zum Nachweis verschiedener Antibiotika untersucht worden waren, wurden im

Hauptversuch Antibiotika-freie Volleiproben mit den entsprechenden Substanzen dotiert. Die

Nachweismethode wurde für verschiedene Antibiotikakonzentrationen getestet, um die

Nachweisgrenze der einzelnen Substanzen zu bestimmen. Zur Bestimmung der Wiederfin-

dung wurden Verdünnungsreihen (8.1.) der Substanzen im mikrobiologischen Hemmstofftest

mitgeführt.

Da die dotierten Eiproben auf Grund ihrer Konsistenz nicht direkt auf die Ionenaustauscher-

säulen gegeben werden konnten, wurde eine Aufbereitung zur Enteiweißung der Festpha-

senextraktion vorangestellt. Hierbei wurde die Enteiweißung durch Essigsäure oder

Citratpuffer auf ihre Eignung überprüft.

4.3.1. Ampicillin

Zuerst wurden zweimal 5 g Vollei mit je 1 ml einer Ampicillinlösung mit der Konzentration

von 0,1 µg/ml dotiert und im Ultraschallbad homogenisiert. Die Proben wurden für die Fest-

phasenextraktion nach Methode 3.3.4.1. und 3.3.4.2. vorbereitet. Die vereinigten Überstände

konnten auf die konditionierte Festphasensäule gegeben werden.

Da sich die C18-Säule im Vorversuch als am geeignesten erwiesen hatte, wurde diese zur

Aufreinigung benutzt. Die Durchführung erfolgte analog zu der im Vorversuch angewendeten

Methode (3.3.5.1.).

Zur Überprüfung des Einflusses der Enteiweißungsmittel auf die Aktivität des Ampicillins

wurde zusätzlich eine Ampicillinlösung mit der Konzentration von 0,1 µg/ml in Citratpuffer

und in 1 %iger Essigsäure in Methanol hergestellt, in der vor dem Auftragen auf die Hemm-

stoffplatten der pH-Wert im neutralen Bereich eingestellt wurde.

86

Der Nachweis des Ampicillins wurde auf dem Isoagar mit Bac. stearothermophilus var. cali-

dolactis erbracht. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.1.) mitge-

führt.

Tabelle 39: Hemmhöfe von Ampicillin-Standardverdünnungen


Tabelle 40: Einfluss des Extraktionsmittels auf den Nachweis von Ampicillin in Vollei

Säule (C18) Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)Ei mit Citratpuffer 0.1 13.0Ei mit Essigsäure 0.1 0.0Ampicillin mit Citratpuffer 0.1 13.5Ampicillin mit Essigsäure 0.1 15.5Positivkontrolle I 1.0 19.0Positivkontrolle II 0.1 13.0

Da nach Aufarbeitung des Volleis mit Essigsäure kein Ampicillin im Eluat der C18-Säule

nachgewiesen werden konnte, wurden die folgenden Aufarbeitungen nur noch mit dem

Citratpuffer durchgeführt.

Das Vollei wurde für die weiteren Untersuchungen immer mit 1 ml der entsprechenden Kon-

zentration dotiert. Da aber die Elution mit 6 ml Methanol durchgeführt wurde, kam es zu ei-

nem Verdünnungseffekt, dem dadurch begegnet wurde, dass das Eluat im Rotationsverdamp-

fer eingeengt und ein Endvolumen von 1 ml im mikrobiologischen Hemmstofftest eingesetzt

wurde.

87

Tabelle 41: Ergebnisse der Aufarbeitung von Ampicillin mit der C18-Säule auf Isoagar mit Bac. stearothermophilus var. calidolactis

Konz. (µg/ml) Konz. (µg/kg Ei)

Hemmhof (mm)

Wiederfindung (%) der

Einwaagen

Standardab-weichung

der Hemm- höfe (mm)

Standardab-weichung der Konz. (µg/ml)

0.6 120.0 11.4 84.3 4 1.4 0.020.3 60.0 11.5 92.0 4 0.5 0.0050.06 12.0 5.8 27.7 4 0.3 0.0030.03 6.0 4.8 58.0 3 0.2 0.00030.008 1.6 4.9 97.6 4 0.2 0.00010.006 1.2 4.5 100.0 4 0.0 0.0000.004 0.8 4.6 56.1 4 0.2 0.00040.002 0.4 3.9 47.4 4 0.2 0.00005

Die angegebenen Werte wurden als Mittelwerte der Einzelansätze berechnet. Die Einzelwerte

finden sich im Anhang 8.3., Tabellen 85- 92.


Da die Vorversuche mit den getesteten Aufarbeitungen keine geeigneten Nachweismöglich-

keiten boten (Wiederfindung aller getesteten Säulen < 20 %), wurde auf den Nachweis unter-

schiedlicher Konzentrationen an Dihydrostreptomycin verzichtet.

4.3.3. Oxytetracyclin (OTC)

Zuerst wurden zweimal 5 g Vollei mit je 1 ml einer OTC-Lösung mit der Konzentration von

3,0 µg/ml dotiert und im Ultraschallbad homogenisiert. Die Proben wurden für die Festpha-

senextraktion nach Methode 3.3.4.1. und 3.3.4.2. vorbereitet. Die vereinigten Überstände

konnten auf die konditionierte Festphasensäule gegeben werden.

88

Da sich die C18-Säule im Vorversuch als am geeignesten erwiesen hatte, wurde diese zur

Aufreinigung benutzt. Die Durchführung erfolgte analog zu der im Vorversuch angewendeten

Methode (3.3.5.1.).

Zur Überprüfung des Einflusses der Enteiweißungsmittel auf die Aktivität von OTC wurde

zusätzlich eine OTC-Lösung mit der Konzentration von 3,0 µg/ml in Citratpuffer und in 1

%iger Essigsäure in Methanol hergestellt, in der vor dem Auftragen auf die Hemmstoffplatten

der pH-Wert im neutralen Bereich eingestellt wurde.

Der Nachweis von OTC wurde auf dem Standard-I-Agar mit Bac subtilis erbracht. Zur Be-

stimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.7.) mitgeführt.

Da nach Aufarbeitung des Volleis mit Essigsäure kaum noch OTC nach der C18-Säule nach-

gewiesen werden konnte, wurden die folgenden Aufarbeitungen nur noch mit dem Citratpuf-

fer durchgeführt.

In diesem Versuchdurchlauf wurde das Vollei immer mit 6 ml der entsprechenden Konzen-

tration dotiert, da das Volumen nach der C18-Säule hiermit nahezu identisch war und man

somit direkt die Konzentration pro Milliliter abgelesen konnte. Mit dieser Methode war es

möglich Konzentrationen bis zu 0,3 µg/ml mit einer Wiederfindung von 80 % sicher nachzu-

weisen, so dass man auf diese Weise eine Nachweisgrenze von 360 µg/kg Vollei OTC errei-

chen konnte. Um das Testsystem noch sensitiver zu gestalten, wurde anschließend je 5g Vol-

lei mit nur 1ml der entsprechenden Konzentration dotiert und das Eluat der Festphasenextrak-

tion mit der C18-Säule im Rotationsverdampfer eingeengt.

Tabelle 42: Ergebnisse der Aufarbeitung von OTC mit der C18-Säule nach Einengung


Hemmhof (mm)


Einwaagen

Standardab-weichung



0.8 160.0 5.9 50.0 4 0.2 0.0180.6 120.0 4.8 43.3 12 0.7 0.0570.5 100.0 2.9 55.3 11 0.5 0.0240.3 60.0 1.7 83.3 3 0.2 0.028

Die angegebenen Werte wurden als Mittelwerte der Einzelansätze berechnet. Die Einzelanga-

ben finden sich im Anhang 8.3. Tabelle 93 - 101

89

4.3.4. Doxycyclin

Zuerst wurde 5 g Vollei mit 6 ml einer DC-Lösung mit der Konzentration von 0,1 µg/ml (abs.

0,6 µg) versetzt. Die Proben wurden für die Festphasenextraktion nach Methode 3.3.4.1. und

3.3.4.2. vorbereitet. Die vereinigten Überstände konnten auf die konditionierte Festphasen-

säule gegeben werden. Für die SA-Säule wurden 5 g Vollei mit 5 ml der DC-Lösung mit der

Konzentration von 0,1 µg/ml (abs. 0,5 µg) dotiert und für die Kombinationssäulen wurden 5 g

Vollei mit 3 ml der entsprechenden Konzentration (abs. 0,3 µg) gespikt. Die Probenaufarbei-

tung erfolgte auch für diese Säulen mit Citratpuffer in der oben beschriebenen Weise. Auf

eine Aufarbeitung mit 1 %iger Essigsäure in Methanol wurde für DC verzichtet, da die Auf-

arbeitung des mit OTC dotierten Volleies gezeigt hatte, dass diese Aufarbeitung für den

Nachweis der Tetracycline nicht geeignet war.

Die Festphasenextraktion wurde analog zu der Methode der Vorversuche (3.3.5.) durchge-

führt. Der Nachweis des DCs wurde auf dem Standard-I-Agar, pH 6,0, mit Bac. subtilis er-

bracht. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.5.) mitgeführt.

Das Eluat der C18-Säule erbrachte in diesem ersten Durchlauf eine Hemmwirkung von 8 mm,

welches einer Wiederfindung von 89,2 % entsprach. Das Eluat der SA-Säule blieb ohne

Hemmwirkung. Die Kombinationssäulen verstopften kurz nach der Probenaufgabe, so dass

kein aussagekräftiges Eluat gewonnen werden konnte.

Da auch in den Vorversuchen die C18-Säule im Durchschnitt die beste Wiederfindung besaß,

wurde in den folgenden Versuchen mit Citratpuffer enteiweißt und eine Aufreinigung über die

C18-Säule erreicht. Zur weiteren Verbesserung der Nachweisgrenze wurden die Volleiproben

im folgenden nur mit 1 ml der entsprechenden Konzentration dotiert und das nach der Fest-

phasenextraktion mit der C18-Säule gewonnene Eluat im Rotationsverdampfer auf 1 ml ein-

geengt. Der Nachweis des DCs wurde auf dem Standard-I-Agar, pH 6,0 mit Bac. subtilis er-

bracht. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.5.) mitgeführt.

90

Tabelle 43: Ergebnisse der Aufarbeitung von DC mit der C18-Säule nach Einengung


Hemmhof (mm)


Einwaagen

Standardab-weichung



0.10 20.0 4.3 15.8 8 0.5 0.00230.08 16.0 3.9 33.5 8 0.5 0.00400.06 12.0 2.1 21.3 8 0.6 0.00270.05 10.0 1.9 22.5 4 1.1 0.0068


ben finden sich im Anhang 8.3., Tabelle 101 - 108.

4.3.5. Colistin

Zuerst wurden im Doppelansatz 5 g Vollei mit 1ml einer wässrigen Colistin-Lösung mit der

Konzentration von 10 µg/ml (abs. 10 µg) versetzt und im Ultraschallbad homogenisiert.

Die Proben wurden für die Festphasenextraktion nach Methode 3.3.4.1. und 3.3.4.2. vorbe-

reitet. Die vereinigten Überstände konnten auf die konditionierte Festphasensäule gegeben

werden. Die Extraktion erfolgte analog zu der im Vorversuch angewendeten Methode (3.3.5.).

Um den Einfluss des Enteiweißungsmittels auf das Colistin zu testen, wurden 200 µl der

Konzentration von 100 µg/ml zu 1800 µl 1 %iger Essigsäure in Methanol und 200 µl der glei-

chen Konzentration zu 1800 µl Citratpuffer gegeben. Anschließend wurde der pH-Wert im

neutralen Bereich eingestellt. Der Nachweis erfolgte auf Isoagar mit Bac. stearothermophilus

var. calidolactis. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.3.) mitge-

führt.

Die SA-Säule der Volleiaufarbeitung mit Citratpuffer verstopfte kurz nach der Probenaufga-

be, so dass kein aussagekräftiges Eluat gewonnen werden konnte. Der Ansatz mit der Entei-

weißung des Volleies mittels 1 %iger Essigsäure in Methanol ergab nach Einengung auf 1 ml

im Rotationsverdampfer einen Hemmhof von 6,5 mm Durchmesser, welches einer Wieder-

findung von 100 % entsprach. Die direkte Colistinverdünnung in 1 %iger Essigsäure in

91

Methanol erbrachte nach pH-Werteinstellung einen Hemmhof von 5,0 mm Durchmesser

(Wiederfindung: 83 %) und die Verdünnung in Citratpuffer zeigte einen Hemmhof von 4,5

mm Durchmesser (Wiederfindung: 75 %). Auffällig war bei allen Aufarbeitungsarten eine

deutliche Verstärkung des Wachstums am Rande der Hemmzone, welche durch einen dichte-

ren Bakterienrasen auffiel.

Da die SA-Säule in den Vorversuchen am geeignesten zum Nachweis von Colistin erschien

und eine Aufarbeitung mit Citratpuffer für diese Säule nicht möglich war, da die Säule sofort

verstopfte, wurde für die folgenden Untersuchungen die Aufarbeitung mit 1 %iger Essigsäure

in Methanol gewählt. Es wurde die Versuchsanweisung aus den Vorversuchen (3.3.5.) ver-

wendet. Die Volleiproben wurden mit 1 ml der entsprechenden Antibiotikakonzentration do-

tiert und das Eluat wurde nach der Festphasenextraktion mit der SA-Säule im Rotationsver-

dampfer auf 1 ml eingeengt, um die Nachweisgrenze so sensitiv wie möglich zu gestalten. Im

mikrobiologischen Hemmstofftest wurde Isoagar mit Bac. stearothermophilus var. calidolac-

tis eingesetzt. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.3.) mitgeführt.

Tabelle 44: Ergebnisse der Aufarbeitung von Colistin mit der SA-Säule nach Einengung


Hemmhof (mm)


Einwaagen

Standardab-weichung



7.5 1500 5.0 166.0 4 0.7 1.205.0 1000 2.8 130.9 4 0.3 0.753.5 700 1.3 <86.5 8 1.2 0.56


ben finden sich im Anhang 8.3. Tabelle 109 - 114.

4.3.6. Sulfadimidin

Da im Vorversuch alle Säulen ähnlich gute Ergebnisse zeigten, wurden noch einmal alle

Säulen im Hauptversuch getestet.

92

Hierfür wurden dreimal 5 g Vollei mit 6 ml einer Konzentration von 5 µg/ml (abs.30 µg) für

die C18-Säule, mit 5 ml der gleichen Konzentration (abs. 25 µg) für die SA-Säule und mit 3

ml der gleichen Konzentration (abs.15 µg) für die Kombinationssäulen dotiert. Die Proben

wurden für die Festphasenextraktion nach Methode 3.3.4.1. und 3.3.4.2. vorbereitet. Die ver-

einigten Überstände konnten auf die konditionierte Festphasensäule gegeben werden. Der

Nachweis erfolgte nach pH-Wert-Korrektur auf Standard-I-Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz mit

Bac. subtilis. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.9.) mitgeführt.

Lediglich bei einer SA-Säule konnte eine geringe Hemmzone von 1,5 mm festgestellt werden,

welches einer Konzentration von 0,375 µg/ml und damit einer Wiederfindung von 7,5 % ent-

sprach. Alle anderen Proben wiesen keinen Hemmhof auf. Es lag der Schluß nahe, dass die

Aufarbeitung mit Essigsäure für den Nachweis von Sulfadimidin nicht geeignet war, so dass

im anschließenden Versuch die Aufarbeitung mit Citratpuffer im Vergleich getestet werden

sollte. Da die SA-Säule und die Kombinationssäule jedoch sofort nach Probenaufgabe bei der

Aufarbeitung mit Citratpuffer verstopten, wurde nur noch mit der C18-Säule weitergearbeitet.

Es wurden im Doppelansatz 5 g Vollei mit 1 ml einer Sulfadimidin-Lösung mit der Konzen-

tration von 5 µg/ml (abs. 5 µg) versetzt und im Ultraschallbad homogenisiert. Die Proben

wurden für die Festphasenextraktion nach Methode 3.3.4.1 und 3.3.4.2. vorbereitet

zentrifugiert, anschließend auf die konditionierte C18-Säule gegeben und die Festphasenex-

traktion analog zu den Vorversuchen (3.3.5.1.) durchgeführt.

Anschließend wurden die Eluate im Rotationsverdampfer auf 1ml eingeengt und dann im mi-

krobiologischen Hemmstofftest aus Standard I-Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz mit Bac.

subtilis untersucht.

Um den Einfluss des Enteiweißungsmittels auf das Sulfadimidin zu testen, wurden 750 µl der

Konzentration von 7,5 µg/ml zu 750 µl 1 %iger Essigsäure in Methanol (Konz. 5 µg/ml) und

750 µl der gleichen Konzentration zu 750 µl Citratpuffer (Konz. 5 µg/ml) gegeben. Anschlie-

ßend wurde der pH-Wert im neutralen Bereich eingestellt. Der Nachweis erfolgte auf Stan-

dard-I-Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz mit Bac. subtilis. Zur Bestimmung der Wiederfindung

wurde eine Eichreihe (8.1.9.) mitgeführt.

93

Der Ansatz nach Enteiweißung mit Essigsäure zeigte keine Hemmwirkung nach der C18-

Säule, wenn man den pH-Wert im neutralen Bereich eingestellt hatte. Die Enteiweißung mit

Citratpuffer zeigte nach der C18-Säule eine Hemmzone von 6 mm, welches einer Konzentra-

tion von 1,15 µg/ml und damit einer Wiederfindung von 23 % entsprach. Sowohl die direkte

Verdünnung in 1 %iger Essigsäure in Methanol als auch in Citratpuffer ergab eine Hemmzone

von 8,0 mm, welches einer Konzentration von 1,75 µg/ml und damit einer Wiederfindung von

35 % entsprach.

In den weiteren Untersuchungen wurden die Volleiproben jeweils mit 1 ml der entsprechen-

den Antibiotikakonzentration dotiert und dann mit Citratpuffer aufgearbeitet. Zur weiteren

Aufreinigung wurden C18-Säulen mit der entsprechenden Analysemethode (3.3.5.) verwen-

det. Das Eluat wurde im Rotationsverdampfer auf 1 ml eingeengt, um die Nachweisgrenze so

sensitiv wie möglich zu gestalten. Im mikrobiologischen Hemmstofftest wurde Standard-I-

Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz mit Bac. subtilis eingesetzt. Zur Bestimmung der Wiederfin-

dung wurde eine Eichreihe (8.1.9.) mitgeführt.

Tabelle 45: Ergebnisse der Aufarbeitung von Sulfadimidin mit der C18-Säule nach Einen-

gung


Hemmhof (mm)


Einwaagen

Standardab-weichung



3.50 700 11.0 95.7 4 0.8 0.322.50 500 10.3 60.6 8 1.0 0.262.00 400 9.9 48.5 4 0.5 0.051.75 350 1.5 <90.0 4 2.4 0.621.00 200 0.0 4 0.0 0.0


ben finden sich im Anhang 8.3. Tabelle 115 – 120.

94

4.3.7. Enrofloxacin

Da die Vorversuche mit Abstand die beste Wiederfindung für die SA-Säule gezeigt hatten,

sollte diese zur Festphasenextraktion gewählt werden. Die Aufarbeitungen der Eiproben der

anderen Antibiotika hatte bereits gezeigt, dass bei Verwendung der SA-Säule eine Aufarbei-

tung der Proben mit Citratpuffer nicht geeignet war, da hierbei die Säulen kurz nach der Pro-

benaufgabe verstopften, so dass die mit Enrofloxacin dotierten Proben mit 1 %iger Essigsäure

in Methanol aufgearbeitet wurden. Die mit 1 ml der entsprechenden Antibiotikakonzentration

dotierten Volleiproben (je 5 g) wurden für die Festphasenextraktion nach Methode 3.3.4.2.

vorbereitet. Die vereinigten Überstände wurden auf die konditionierte SA-Säule gegeben und

es wurde wie unter 3.3.5. beschrieben aufgereinigt.

Anschließend wurden die Eluate im Rotationsverdampfer auf 1 ml eingeengt und dann im

mikrobiologischen Hemmstofftest auf Standard I-Agar, pH 7,2 mit TMP-Zusatz mit E. coli

untersucht. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde eine Eichreihe (8.1.6.) mitgeführt

Tabelle 46: Ergebnisse der Aufarbeitung von Enrofloxacin mit der SA-Säule nach Einengung


Hemmhof (mm)


Einwaagen

Standardab-weichung



0.40 80 7.3 26.9 4 0.3 0.00560.20 40 5.5 20.9 3 0.0 0.00000.10 20 2.0 11.1 4 2.1 0.00620.08 16 0.0 <15.2 4 0.0 0.0


ben finden sich im Anhang 8.3. Tabelle 121 - 126.

Da bei der Elution mit amoniakalischer Methanollösung ein hoher pH-Wert im Eluat vorlag

und dieser selbst nach dem Einengen noch alkalisch war, wurde der pH-Werteinfluß auf den

mikrobiologischen Hemmstofftest überprüft. Hierzu wurden in den eingeengten Eluaten die

95

pH-Werte korrigiert und diese noch einmal im Hemmstofftest überprüft. Die Hemmhöfe ver-

änderten sich hierdurch aber nur geringfügig.

4.4.1. Zusammenfassung der Einzeluntersuchungen

In den einzelnen Versuchsdurchführungen zur Testung der Nährböden-Testkeimkom-

binationen konnten unterschiedliche Nachweisgrenzen erreicht werden.

Tabelle 47: Zusammenfassung der Nachweisgrenzen ausgewählter Nährböden- / Test-

keimkombinationen

Ampicillin (µg/ml)

Dihydrostrep- tomycin (µg/ml)

OTC (µg/ml)

DC (µg/ml)

Sulfadi-midin

(µg/ml)

Colistin (µg/ml)

Enro- floxacin (µg/ml)

Bac.subtilis pH 6,0 0.007 1.5 0.1 0.013 >7.5 7.6 0.05

Bac.subtilis pH 7,2 + TMP 0.01 0.4 0.3 0.019 0.9 3 0.03

Bac.subtilis pH 8,0 0.01 0.5 0.6 0.1 >7.5 3.9 0.06

Bac.stearothermophilus 0.002 1.6 >3.0 0.34 3 2.8 1.1

E.coli >0.1 2.7 0.2 0.19 >7.5 2.3 0.015

Um die Wiederfindungsraten der einzelnen Festphasensäulen zu bestimmen, wurden Antibio-

tikakonzentrationen verwendet, die sicher im mikrobiologischen Hemmstofftest nachgewie-

sen werden konnten. Die ermittelten Werte sind Durchschnittswerte der verschiedenen Ver-

suchsansätze. Die Einzelwerte finden sich in den Tabellen in Kapitel 4.2..

96

Tabelle 48: Zusammenfassung der Wiederfindungsraten ausgewählter Festphasenex-

traktionen (%)

Ampicillin Dihydrostrep-tomycin OTC DC Sulfadi-

midin Colistin Enro-floxacin

C18 25 <10 57 70 41 <32 17SA 2 27 51 56 63 142 120

Kombi 11 32 27 11 60 95 14

Unter Berücksichtigung der geeignesten Festphasenextraktionen und sensitivsten Nachweis-

systeme im mikrobiologischem Hemmstofftest ergaben sich deutliche Unterschiede in den

Nachweisgrenzen der einzelnen Antibiotika und Chemotherapeutika in dotierten Volleipro-

ben.

Tabelle 49: Zusammenfassung der Nachweisgrenzen in geeigneter Kombination aus Fest-

phasenextraktion und mikrobiologischem Hemmstofftest

Ampicillin OTC DC Sulfadimidin Colisin Enrofloxacin

Säule C18 C18 C18 C18 SA SA

Nähr-boden Isoagar Standard I-

Agar pH 6,0Standard-I-Agar pH 6,0

Standard-I-Agar pH 7,2

+ TMPIsoagar

Standard-I-Agar pH 7,2 +

TMP

TestkeimBac. stea-ro- ther-mophilus

Bac. subtilis Bac. subtilis Bac. subtilis

Bac.stearo-thermo-philus

E. coli

Nachweis-grenze(µg/kg Ei)

< 0,4 82 13 530 800 30

4.4.2. Vergleich der Eichreihen

Zur Abschätzung der Messungenauigkeit des mikrobiologischen Hemmstofftestes wurde eine

statistische Auswertung der verschiedenen Ansätze der Eichreihen durchgeführt.

97

Tabelle 50: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Ampicillin auf

Isoagar mit Bac. stearothermophilus var. calidolactis

Konz. (µg/ml)

1. Versuch

2. Versuch

3. Versuch

4. Versuch

5. Versuch

6. Versuch

7. Versuch

Mittel- wert

Standard- abweichung

0.100 11.0 9.5 12.0 10.0 10.5 12.0 11.0 10.9 0.870.080 9.5 9.0 10.0 9.5 10.0 10.0 10.5 9.8 0.450.060 8.0 8.5 9.5 8.0 9.5 9.5 10.0 9.0 0.760.030 7.0 8.0 8.5 7.5 8.0 8.5 9.5 8.1 0.740.020 6.0 8.0 8.0 7.0 7.0 8.0 9.0 7.6 0.90.010 5.0 7.0 7.5 4.0 7.0 7.5 8.5 6.6 1.460.008 3.0 6.0 7.0 2.5 5.5 7.0 8.0 5.6 1.940.006 1.5 5.5 6.0 2.0 5.0 6.0 7.0 4.7 1.960.003 0.0 4.5 5.0 0.0 4.0 5.0 6.5 3.6 2.370.002 0.0 1.5 3.0 0.0 2.5 3.0 5.5 2.2 1.790.001 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 4.5 0.6 1.57

Tabelle 51: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Dihydrostrepto-

mycin auf Standard-I-Agar pH 7,2 + Trimethoprimzusatz mit Bac. subtilis

Konz. (µg/ml) 1. Versuch 2. Versuch 3. Versuch 4. Versuch 5. Versuch Mittelwert

Standardab- weichung

5.00 9.0 9.0 10.0 10.5 12.0 10.1 1.112.50 7.0 6.5 9.0 9.0 10.0 8.3 1.331.75 5.5 4.5 8.5 8.0 8.5 7.0 1.671.00 3.5 3.5 7.0 7.5 6.5 5.6 1.740.75 2.0 2.0 5.0 7.0 5.5 4.3 1.990.50 0.0 0.0 3.5 5.0 2.5 2.2 1.960.25 0.0 0.0 0.0 3.0 0.0 0.6 1.200.10 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.00

98

Tabelle 52: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Oxytetracyclin auf

Standard-I-Agar pH 6,0 mit Bac. subtilis

Konz. (µg/ml)

1. Versuch

2. Versuch

3. Versuch

4. Versuch

5. Versuch

6. Versuch

7. Versuch

Mittel- wert

Standard- abweichung

3.00 14.0 12.0 14.0 10.0 11.5 12.5 11.5 12.2 1.331.75 12.0 11.0 11.5 8.5 9.0 10.5 9.5 10.3 1.221.00 10.0 8.5 10.0 8.0 8.5 8.5 7.5 8.7 0.880.80 9.0 8.0 9.5 7.0 7.0 8.0 7.0 7.9 0.940.60 8.0 7.5 7.5 6.5 6.5 7.5 6.5 7.1 0.580.50 7.0 6.5 7.0 6.0 6.0 7.0 4.0 6.2 0.990.30 6.0 4.5 6.0 5.0 3.0 6.5 2.5 4.8 1.440.20 5.0 0.0 3.0 3.0 0.0 3.0 0.0 2.0 1.850.10 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.3 0.70

Tabelle 53: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Doxycyclin auf

Standard-I-Agar pH 6,0 mit Bac. subtilis

Konz. (µg/ml)

1. Versuch

2. Versuch

3. Versuch

4. Versuch

5. Versuch

6. Versuch

7. Versuch

Mittel- wert

Standard- ab-

weichung1.00 13.5 13.0 13.0 15.5 14.0 16.0 12.0 13.9 1.330.80 13.0 12.5 12.5 14.0 12.5 15.0 11.0 12.9 1.180.60 12.0 12.5 12.5 13.5 12.0 14.0 10.0 12.4 1.190.40 11.0 12.0 12.0 12.5 10.5 13.5 9.5 11.6 1.240.30 10.0 11.5 11.5 12.0 10.0 12.5 9.0 10.9 1.180.20 9.5 10.5 10.5 11.5 9.0 12.0 8.5 10.2 1.190.10 9.0 8.0 8.0 9.5 7.0 11.0 8.0 8.6 1.220.05 6.5 4.5 4.5 7.0 5.0 9.0 6.5 6.1 1.510.01 3.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.4 1.05

99

Tabelle 54: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Colistin auf Isoagar

mit Bac. stearothermophilus

Konz. (µg/ml)

1. Versuch

2. Versuch

3. Versuch

4. Versuch

5. Versuch

6. Versuch

7. Versuch

Mittel- wert

Standardab- weichung

5.00 3.5 4.0 4.5 3.0 3.0 3.5 3.5 3.6 0.493.50 2.5 3.5 3.5 2.5 2.5 2.5 3.0 2.9 0.442.50 1.5 2.5 2.0 2.0 0.0 1.5 2.0 1.6 0.742.00 0.0 2.0 1.5 1.5 0.0 0.0 1.0 0.9 0.791.75 0.0 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.3 0.701.25 0.0 1.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.521.00 0.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.35

Tabell 55: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Sulfadimidin auf

Standard-I-Agar pH 7,2 + Trimethoprimzusatz mit Bac. subtilis

Konz. (µg/ml)

1. Versuch

2. Versuch

3. Versuch

4. Versuch

5. Versuch

6. Versuch

7. Versuch

Mittel- wert

Standard- ab-

weichung7.50 12.5 12.5 12.5 16.0 19.0 13.5 14.3 2.435.00 10.0 11.0 11.5 15.0 16.5 12.0 12.7 2.33.50 8.5 9.0 11.0 13.0 15.0 13.5 9.5 11.4 2.332.50 6.0 8.5 10.5 12.5 14.0 9.5 7.0 9.7 2.662.00 5.0 8.0 8.5 12.0 13.5 7.5 5.5 8.6 2.921.75 3.5 6.5 8.0 12.0 12.0 5.0 4.0 7.3 3.291.25 0.0 5.0 6.0 11.5 11.5 4.0 2.0 5.7 4.091.00 0.0 0.0 4.0 10.5 11.0 3.0 0.0 4.1 4.48

100

Tabelle 56: Vergleich der Hemmhöfe (mm) der einzelnen Eichreihen von Enrofloxacin auf

Standard-I-Agar pH 7,2 + Trimethoprimzusatz mit E. coli

Konz. (µg/ml)

1. Versuch

2. Versuch

3. Versuch

4. Versuch

5. Versuch

6. Versuch

7. Versuch

Mittel- wert

Standard- ab-

weichung1.00 16.5 16.5 16.5 16.5 0.000.80 16.0 16.0 16.0 12.0 14.0 16.0 16.0 15.1 1.460.60 15.0 15.0 15.0 11.5 13.0 15.0 15.0 14.2 1.310.40 13.5 13.5 13.0 9.5 12.5 13.0 13.5 12.6 1.330.20 11.0 13.0 11.0 9.0 12.0 11.0 13.0 11.4 1.300.10 10.0 11.5 9.0 5.0 10.0 9.0 11.5 9.4 2.040.08 8.0 11.0 8.5 4.5 9.5 8.5 11.0 8.7 2.050.06 7.5 8.0 6.5 3.0 8.0 6.5 8.0 6.8 1.670.04 6.0 6.0 5.0 0.0 6.5 5.0 6.0 4.9 2.080.02 3.0 2.5 2.0 0.0 4.0 2.0 2.5 2.3 1.130.01 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.00

101

5. Diskussion

Auf Grund des immer stärker werdenden finanziellen Druckes auf den Halter von Legehen-

nen ist der prophylaktische und therapeutische Einsatz von antibakteriell wirksamen Arznei-

mitteln unumgänglich. Diese Behandlungen bedingen aber ein mögliches gesundheitliches

Risiko für den Verbraucher beim Konsum von Hühnereiern. Um dieser Gefahr zu begegnen,

ist eine engmaschige Überprüfung einer großen Anzahl an Eiern notwendig, welche nur mit

praktikablen, sensitiven Methoden umsetzbar ist. Zur Zeit entfallen lediglich 0,4% aller Un-

tersuchungen des nationalen Rückstandskontrollplanes auf antibakterielle Rückstände in

Hühnereiern (BVL, 2003), welches sicherlich einerseits in den hohen Kosten begründet ist

und andererseits durch fehlende rechtliche Reglementierungen bedingt wird. Die in der amtli-

chen Überwachung weit verbreitete HPLC als selektive und sensitive Nachweismethode für

antibakterielle Hemmstoffe in Eiern ist außerdem in der Routineuntersuchung auf der Ebene

der betrieblichen Eigenkontrollen auf Grund hoher Kosten, hohem Zeit- und Materialaufwand

für Untersuchungen in höherer Anzahl wenig praktikabel. Es soll daher das Ziel dieser Arbeit

sein, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe große Eiprobenzahlen sicher auf antibakte-

rielle Hemmstoffe untersucht werden können, ohne dadurch die amtliche oder betriebliche

Überwachung mit erheblichen Mehrkosten zu belasten.

Neben der HPLC wird als klassisches Nachweissystem auf antibakterielle Rückstände der

Agardiffusionstest als sogenannter Dreiplattentest eingesetzt, welcher nur einen geringen

labortechnischen Aufwand erfordert und damit die Möglichkeit zur Durchführung von Rei-

henuntersuchungen (KUNDRAT, 1972; BOTSOGLOU et al., 2001) bietet. Positive Befunde

können nur einen Hinweis auf die vorhandene Antibiotikaklasse in der Probe geben und müs-

sen gegebenenfalls durch andere Methoden verifiziert werden (STUMPF, 1993). Die bereits

von PASTOORS 1988 untersuchte Möglichkeit der qualitativen Eingrenzung antimikrobieller

Rückstände durch den Einsatz verschiedener Testkeime wurde in dieser Arbeit aufgegriffen,

um verschiedene Antibiotikaklassen, welche in der Geflügelpraxis eine Rolle spielen (Ampi-

cillin, Oxytetracyclin, Doxycyclin, Dihydrostreptomycin, Sulfadimidin, Colistin und En-

rofloxacin), sensitiv und selektiv nachzuweisen. Dabei wurden als Testkeime neben Bacillus

102

subtilis BGA auf Nährböden mit drei verschiedenen pH-Werten, Bacillus stearothermophilus

var. calidolactis und ein E.coli-Stamm getestet.

Zusätzlich sollte der mikrobiologische Hemmstofftest mit Festphasenextraktionen gekoppelt

werden, um die Nachweisgrenze so sensitiv wie möglich zu gestalten.

5.1. Ermittlung geeigneter Nährmedien und Testkeime im mikrobiologischen Hemmstofftest

Wie bereits aus dem Dreiplattentest für die amtliche Fleischuntersuchung bekannt ist, war das

Nachweissystem mit Bacillus subtilis pH 7,2 mit Trimethoprimzusatz auch in dieser Arbeit

das Empfindlichste für den Nachweis von Sulfadimidin als Vertreter der Sulfonamide. Die

Kulturen mit Bac. subtilis pH 6,0 und 8,0 und die E. coli-Kultur zeigten keinerlei Hemmhöfe

bei den untersuchten Konzentrationen. Legt man zur Bestimmung des MHK-Wertes den

Grenzbereich der Verwaltungsvorschrift zum Fleischhygienegesetzes von 2,0 mm Hemmhof

an, so wurde im direkten Nachweis des Antibiotikums ein MHK-Wert von 0,9 µg/ml be-

stimmt.

Der gleiche Nährboden zeigte sich außerdem auch für den Nachweis des Dihydrostrep-

tomycins als am empfindlichsten mit einem MHK-Wert von 0,4 µg/ml. Die anderen geteste-

ten Nährböden zeigten allerdings auch unterschiedlich große Hemmhöfe, wobei die Kultur

mit Bac. stearothermophilus var. calidolactis und E. coli deutliche höhere MHK-Werte von

mehr als 1,6 µg/ml ergaben.

Für die getesteten Vertreter der Tetracycline zeigten sich die Kulturen mit Bac.subtilis pH 6,0

am geeignesten. Hierbei konnten für das Oxytetracyclin ein MHK-Wert von 0,1 µg/ml und

für Doxycyclin ein MHK-Wert von 0,01 µg/ml festgestellt werden. Oxytetracyclin zeigte bei

den hier untersuchten Konzentrationen keinerlei Hemmwirkung auf der Kultur mit Bac. stea-

rothermophilus var. calidolactis.

Ampicillin, als Vetreter der Penicilline, erbrachte die niedrigsten MHK-Werte dagegen auf

der Kultur von Bac. stearothermophilus var. calidolactis mit 0,002 µg/ml. Keinerlei Hemm-

wirkung zeigte sich jedoch hierbei auf der Testplatte mit E.coli.

103

Die Substanzen mit der größten Wirksamkeit im gramnegativen Bereich zeigten die niedrig-

sten MHK-Werte erwartungsgemäß auf der Kultur mit E. coli. Enrofloxacin erbrachte dabei

einen Wert von 0,015 µg/ml, Colistin zeigte einen MHK-Wert von 2,3 µg/ml.

Betrachtet man alle gemessenen Hemmhöfe der einzelnen Kulturen, sind deutliche Unter-

schiede der einzelnen getesteten Antibiotika festzustellen, die zumindest für die Reinsubstan-

zen die Möglichkeit des selektiven Screenings, wie sie PASTOORS (1988) vorschlug, er-

möglichen. Auffällig war hierbei, dass die Testplatte mit Bac. subtilis pH 8,0 nie die niedrig-

ste Nachweisgrenze besaß, und dass sich die meisten Testsysteme innerhalb einer Untersu-

chung in großen Bereichen direkt proportional zueinander verhielten.

Der mikrobiologische Hemmstofftest ist ohne Aufarbeitung nicht als Nachweismethode für

Antibiotikarückstände in Eiern geeignet, da die Konsistenz des Eies eine Diffusion in den

Nährboden nahezu unmöglich macht. Aufwändige Aufarbeitungen führen zu einem grösseren

Zeitbedarf pro Bestimmung und bedingen meist eine geringere Wiederfindungsrate, als wenn

die Probe direkt eingesetzt werden kann. Außerdem führen die eieigenen Lysozyme zu falsch

positiven Ergebnissen (DICKS, 1973), so dass diese in der Aufarbeitung der Proben sicher

zerstört werden müssen. Diese Probleme gilt es durch Kombinationen aus verschiedenen

Nachweismethoden zu lösen, da sich der mikrobiologische Hemmstofftest für die gewählten

Antibiotika als leicht durchzuführendes Screeningverfahren als geeignet erwiesen hat.

5.2. Ermittlung geeigneter Festphasenextraktionen

In der Literatur finden sich sehr viele verschiedene Ansätze in der Aufarbeitung tierischer

Proben zum Nachweis antibakterieller Rückstände.

DONOGHUE et al. (1996) gelang es Ampicillin mittels Bac. stearothermophilus in Eiern

nach intramuskulärer Applikation von 400 mg/kg Huhn mit einer Nachweisgrenze von

800µg/kg Ei nach Aufarbeitung mit Kaliumphoshatpuffer nachzuweisen. ROUDAUT (1988)

hingegen schloss an die Aufarbeitung mit Phosphatpuffer noch eine Erhitzung auf 65° C an,

um Dihydrostreptomycin in Hühnereiern mittels Bac. subtilis pH 8,0 in Konzentrationen von

300 µg/kg Ei nachzuweisen.

104

Einen anderen Weg der Aufreinigung von tierischem Material schlug die `ARBEITSGRUPPE

FÜR PHARMAKOLOGISCH WIRKSAME STOFFE´ (1994) im Nachweis von Tetracycli-

nen vor. Sie erreichte durch Festphasenextraktion eine niedrige Nachweisgrenze von 100 µg

OTC/kg Muskulatur. In unserer Studie sollte überprüft werden, ob die Festphasenextraktion

den sensitiven Nachweis von Antibiotika verschiedener Substanzklassen in dotierten Vollei-

proben ermöglicht. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Festphasensäulen auf ihre

Spezifität getestet, wobei sich deutliche Unterschiede in der Wiederfindung der einzelnen

Antibiotika mit den verwendeten Säulen zeigten.

Der selektive Nachweis von Ampicillin gelang mit der größten Wiederfindung von durch-

schnittlich fast 25 % mit der C18-Säule. Die Wiederfindung mit den Kombinationssäulen lag

im Gegensatz dazu bei 11 %. Insgesamt war die Wiederfindung von Ampicillin sehr niedrig,

welches sich aber möglicherweise auch durch die sehr niedrigen Ausgangskonzentrationen

erklären läßt, in denen sich die Messunsicherheit sehr deutlich bemerkbar macht. Wurden

höhere Konzentrationen eingesetzt, so wurden besssere Wiederfindungsraten erzielt.

Auch für Dihydrostreptomycin waren die Wiederfindungsraten niedrig. Sie lagen bei allen

getesteten Säulen weit unter 20 %, wenngleich bereits Ausgangskonzentrationen von 1µg/ml

verwendet wurden. Die zusätzlich getestete Aufarbeitung, die die Firma Macherey-Nagel für

den Nachweis dieser Antibiotikagruppe aus Serum und Urin vorschlug, brachte leider auch

nur eine unzufriedenstellende Wiederfindung von unter 25 %. Die niedrige Wiederfindung

nach der Auftrennung mit einer Ionenaustauschersäule legt den Schluß nahe, dass sich das

Dihydrostreptomycin im gelösten Zustand nicht als geladenes Teilchen aufhält und daher kei-

ne Ionenbindung an die Festphasensäule erfolgt und somit eine Aufreinigung hiermit nicht

möglich ist.

Für die Tetracycline Oxytetracyclin und Doxycyclin zeigten sich die besten Wiederfindungs-

raten zwischen 57 und 70 % wie erwartet mit der C18-Säule. Auch die ARBEITSGRUPPE

`PHARMAKOLOGISCH WIRKSAME STOFFE` (1994) reinigte die Muskulatur- und Nie-

renproben mit der C18-Säule im Nachweis von Tetracyclinen auf. Allerdings erfolgte hierbei

die Detektion mittels HPLC mit einer Nachweisgrenze von 100µl/kg Muskulatur. Die Kom-

binationssäulen waren dagegen sehr niedrig in der Wiederfindung. Erstaunlicherweise war

auch die SA-Säule mit 56 % (DC) und 51 % (OTC) für den Nachweis geeignet. Der relativ

105

hohe Nachweis mit der Kationenaustauschsäule deutet darauf hin, dass die Tetracycline im

gelösten Zustand in physiologischer Kochsalzlösung zu einem hohen Prozentsatz in kationi-

scher Form vorliegen und diese nach der Elution weiterhin als antibakteriell wirksame Sub-

stanzen aktiv sind.

Das Sulfadimidin zeigte für alle Säulen eine nahezu gleich gute Wiederfindung von etwa 60

%, welches durch den amphoteren Charakter dieser Substanz in gelöster Form bedingt ist.

Für die beiden Substanzen mit Wirkungsschwerpunkt im gramnegativen Bereich zeigten sich

deutliche Paralellen in der Festphasenextraktion. So waren für Enrofloxacin und Colistin die

Kationenaustauschersäule mit der höchsten Wiederfindung am geeignetsten. Die C18-Säule

wies für beide Substanzen die niedrigste Wiederfindung auf. Lediglich die Höhe der Wieder-

findung und die nachweisbare Konzentration unterschieden sich bei diesen Antibiotikaklas-

sen. Das ähnliche chemische Verhalten dieser Substanzen deutet auf strukturelle Gemeinsam-

keiten durch starke Kationenbildung hin, wenngleich ihre antibakteriellen Wirksamkeiten

deutliche Unterschiede im Wirkungsprinzip im Organismus zeigen.

Insgesamt ist festzustellen, dass die Kombinationssäulen für keine der getesteten Substanzen

die Geeigneste darstellt. Lediglich für das Colistin und das Sulfadimidin wurden hiermit

Wiederfindungsraten über 50 % ermittelt. Mit Ausnahme der Wirkstoffe gegen gramnegative

Bakterien (Colistin, Enrofloxacin), bei denen die Kationenaustauschersäulen die höchsten

Wiederfindungsraten hatten, zeigte sich die C18-Säule als am selektivsten. Diese Unterschie-

de wurden durch die unterschiedlichen chemischen Stukturen im gelösten Zustand erklärbar.

Im Hauptversuch wurden die in den Vorversuchen ermittelten geeigneten Nachweismethoden

an dotierten Volleiproben nach Aufarbeitung getestet und die minimale Nachweisgrenze

(Grenzwert: 2,0 mm Hemmhof) ermittelt.

5.3. Ermittlung geeigneter Extraktionslösungen für die Matrix Hühnerei

Auf Grund der Inkompatibilität des Volleies mit den Festphasensäulen mußte eine Enteiwei-

ßung der dotierten Proben vorangestellt werden. Hierbei mußte eine Lösung entstehen, die

direkt auf die geeignete Ionenaustauschersäule gegeben werden konnte. Die chemische

106

Struktur des Antibiotikums durfte so wenig geändert werden, dass ein Nachweis der antibak-

teriell wirksamen Substanz weiterhin möglich war.

In der Enteiweißung von Hühnereiern verwenden die einzelnen Autoren verschiedenste Che-

mikalien, wobei das spätere Nachweissystem den Ausschlag in der Auswahl gibt. Wird die

HPLC als Nachweissystem eingesetzt, orientiert sich das Enteiweißungsmittel an der Ver-

träglichkeit mit der mobilen Phase. Soll der mikrobiologische Hemmstofftest eingesetzt wer-

den, so sind die eingesetzten Chemikalien in der Regel weniger aggressiv (BOTSOGLOU u.

FLETOURIS, 1996).

In dieser Arbeit wurden Aufarbeitungsverfahren getestet, welche im Institut bereits zur Pro-

benbearbeitung zum Nachweis einzelner antibakterieller Substanzen erfolgreich eingesetzt

wurden.

Die Enteiweißung mit 1 %iger Essigsäure in Methanol lieferte eine klare Lösung, die über alle

Säulen gegeben werden konnte. Leider zeigten sich aber hiermit chemische Unverträglich-

keiten mit einzelnen Antibiotikalösungen, so dass ein Nachweis außer für Colistin und En-

rofloxacin nach dieser Form der Enteiweißung negativ verlief. Die Enteiweißung mit Citrat-

puffer brachte eine getrübte Lösung, die die SA- und Kombinationssäulen sehr schnell ver-

stopfen ließ. Da aber nur für Enrofloxacin und Colistin diese Art der Säulen am geeignesten

waren, wurde auch nur für diese beiden Substanzen eine Enteiweißung mit 1%iger Essigsäure

in Methanol durchgeführt. Für die C18-Säule zeigte die Enteiweißung mit Citratpuffer gute

Ergebnisse.

Da es ein Anliegen dieser Arbeit war, heraus zu finden, bis zu welcher Konzentration ein si-

cherer Nachweis mit dieser Methode möglich war, wurden Antibiotikalösungen unterschiedli-

cher Konzentrationen zur Dotierung des Volleis verwendet. Um die Nachweisgrenze so nied-

rig wie möglich zu gestalten, wurde vor dem Auftragen auf den mikrobiologischen Hemm-

stofftest das Eluat im Rotationsverdampfer eingeengt.

107

5.4. Ermittlung der Nachweisgrenzen in dotiertem Vollei

Für Ampicillin war es durch Kombination der C18-Säule als Aufreinigunsschritt und dem

Nachweis mit der Kultur von Bacillus stearothermophilus var.calidolactis auf Isoagar mög-

lich, Konzentrationen von unter 0,002 µg/ml sicher nachzuweisen. Berücksichtigte man die

Einwaage von 5 g, so ergab sich eine Nachweisgrenze für Ampicillin von unter 0,4 µg Ampi-

cillin/kg Vollei mit einer durchschnittlichen Wiederfindung von 47 % mit dieser Methode.

Diese Nachweisgrenze entspricht dem von DONOGHUE et al. (1996) ermittelten Wert im

Nachweis von Ampicillin in Hühnereiern mittels mikrobiologischem Hemmstofftest mit Bac.

stearothermophilus nach Aufarbeitung mit Phosphatpuffer. Als in der Flüssigkeitschromato-

praphie ermittelte Nachweisgrenzen geben BOTSOGLOU und FLETOURIS 5 pg/kg Milch

an.

Bei Verwendung der C18-Säule in Kombination mit der Kultur von Bacillus subtilis pH 6,0

war es möglich, die Tetracycline selektiv nachzuweisen. Für Oxytetracyclin ergab sich dabei

rechnerisch eine Nachweisgrenze von 82 µg Oxytetracyclin/kg Vollei, für Doxycyclin 13 µg

Doxycyclin/kg Vollei. DONOGHUE et al. ermittelten im mikrobiologischen Hemmstofftest

mit Bac. cereus eine Nachweisgrenze von 1mg OTC/kg Ei. ZURHELLE (2000) konnte mit-

tels Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit Massenspektometrie eine Nachweis-

grenze von 50 µg/ml ermitteln. SCZESNY (2001) gelang der Nachweis von Tetracyclinen in

Eiern nach einer Dotierung zwischen 200 und 150 µg/kg Ei mittels Kombination aus HPLC

und mikrobiologischem Nachweisverfahren.

Für Sulfadimidin hat sich auf Grund chemischer Unverträglichkeiten der Enteiweißung die

C18-Säule in Kombination mit der Kultur von Bacillus subtilis pH 7,2 mit Trimethoprimzu-

satz als am sensitivsten erwiesen. Die errechnete Nachweisgrenze lag für diese Substanz bei

530 µg Sulfadimidin/kg Vollei bei einer mittleren Wiederfindung von etwa 50 %. In der Lite-

ratur fand sich keine vergleichbare mikrobiologische Untersuchung auf Sulfonamidrückstän-

de. Die dort hauptsächlich angewendete Methode war die HPLC mit einer Nachweisgrenze

von 100 µg/kg Ei (FURUSAWA et al., 1998).

Die Kombination der SA-Säule mit der Kultur von Bacillus stearothermophilus

var.calidolactis auf Isoagar erbrachte für Colistin eine Nachweisgrenze von etwa 800 µg

Colistin/kg Vollei.

108

Kombiniert man die SA-Säule mit der Kultur von E. coli bei pH 7,2 mit Trimethoprimzusatz,

so kann man Enrofloxacin in Konzentrationen von 30 µg Enrofloxacin/kg Vollei sicher

nachweisen. GIGOSOS et al. (2000) konnten mittels HPLC 50 µg/kg Ei sicher nachweisen.

Dihydrostreptomycin wurde im Haupversuch nicht weiteruntersucht, da die Wiederfin-

dungsraten der Säulentestung für alle Säulen unter 20 % lag.

In den Hauptversuchen zeigte sich deutlich, dass ein selektiver Nachweis der einzelnen Sub-

stanzen mit Ausnahme des Dihydrostreptomycins durch entsprechende Kombination aus

Festphasenextraktion und mikrobiologischem Hemmstofftest möglich war. Betrachtet man

die einzelnen Widerfindungsraten, so zeigen sich große Schwankungen in den einzelnen An-

tibiotikakonzentrationen. Diese könnten in der maximalen Bindungskapazität der Festphasen-

säulen bedingt sein, wobei die in den Hauptversuchen gewählten Konzentrationen immer un-

ter den Konzentrationen der Säulentestung der Vorversuche lagen, so dass es sehr unwahr-

scheinlich ist, dass dieses der Grund der Schwankungen war. Außerdem war die Wiederfin-

dung auch nicht zwangsläufig in den hohen Antibiotikakonzentrationen am geringsten. Kri-

tisch anzumerken ist hierbei sicherlich der große rechnerische Einfluß der zur Ermittlung der

Wiederfindung notwendigen Eichgeraden, welche in starkem Maße von der Meßungenauig-

keit abhängt. Die ermittelte Meßungenauigkeit der verwendeten Pipetten (3.3.7.) lag für alle

Volumina deutlich unter den in der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach

§ 35 LMBG (L00.00-54) tolerierten Schwankungen von +/- 5 %. Berücksichtigt werden muß

dabei allerdings, dass sich die Meßungenauigkeit im Extremfall innerhalb einer Verdünnungs-

reihe natürlich summieren kann. Die bestimmten Nachweisgrenzen sollten deshalb auch nicht

als absolute Zahlen verstanden werden, sondern Maßgaben sein, in deren Bereich ein Nach-

weis möglich erscheint und an denen sich die rechtliche Reglementierung von Rückständen

orientieren könnten.

Die einzelnen Versuchsdurchgänge haben gezeigt, dass man durch gezieltes Kombinieren der

verschiedenen Methoden einen Hinweis auf das verwendete Antibiotikum erhalten kann, so

dass diese Methode als Sreeningverfahren Bedeutung erlangen könnte. Vorraussetzung zur

Nutzung dieser Testsysteme wäre das Vorhandensein eines einzelnen Antibiotikums. Die

Nachweisgrenzen der untersuchten Testsysteme unterscheiden sich hierbei erheblich.

109

5.5. Rechtliche Einordnung der ermittelten Nachweisgrenzen

Momentan sind für Rückstände in Eiern in der EU-Verordnung 2377/90 in Annex I MRL-

Werte für Oxytetracyclinrückstände und deren Epimere von 200 µg/kg Ei festgelegt. Mit

dieser Methode war es möglich, Werte von 82 µg/kg Ei nachzuweisen und damit sicher un-

terhalb des rechtlich geregelten Bereiches zu gelangen.

Auf Grundlage unser Arbeit erscheint es durchaus möglich, auch andere Antibiotika selektiv

in Eiern nachzuweisen. Dabei war es möglich, Doxycyclin unterhalb der Bereiche nachzuwei-

sen, in denen die niedrigsten MRL-Werte anderer Matrizes (MRL Muskulatur: 100 µg/kg) in

EU-Verordnung 2377/90 reglementiert werden. Hieraus würde sich für auch das Ei die Mög-

lichkeit der Reglementierung von sehr niedrigen Werten (Nachweisgrenze: 13 µg/kg Ei) er-

geben. Ähnlich stellt sich die Situation für den Nachweis von Ampicillin dar, denn auch hier

war es möglich, mit unserer Methode Rückstände eine Zehnerpotenz sensibler als den nied-

rigsten MRL-Wert ( MRL Milch: 4 µg/kg) der EU-Verordnung 2377/90 nachzuweisen. Für

Enrofloxacin gelang es, den Bereich des niedrigsten MRL-Wertes von Geflügelfleisch (MRL

Muskulatur: 100 µg/kg) zu erreichen.

In der EU-Verordnung 2377/90 sind für Colistin MRL-Werte von 300 µg/kg Ei festgelegt,

welche mit dieser Methode nicht zu erreichen waren (Nachweisgrenze: 800 µg/kg Ei). Auch

Sulfadimidin konnte mit dieser Methode nicht in Bereichen einer rechtlichen Reglementie-

rung anderer Matrices nachgewiesen werden (MRL Muskulatur: 100 µg/kg, Nachweisgrenze:

530 µg/kg Ei).

Wenn man die beschriebenen Kombinationen aus Probenextraktion und Nachweis für eine

große Probenanzahl möglich machen möchte, ist es durchaus von Interesse, die Durchführung

nochmals auf ihre Praktikabilität zu durchleuchten. Ein großer Vorteil dieser Methode liegt

sicherlich im einfachen Handling der Methode und im geringen Materialaufwand. Auf Grund

des Nachweises mittels mikrobiologischen Hemmstofftestes erscheint eine Reihenuntersu-

chung vieler Eiproben möglich. Diese Vorteile bedingen verhältnismäßig geringe Kosten pro

Einzelbestimmung, welches dieses Nachweissystem als Screeningverfahren für die betriebli-

che Eigenkontrolle durchaus interessant erscheinen läßt. Nachteilig wirken sich noch die

weiterabzuklärenden Meßunsicherheiten aus, welche eine Quantifizierung der Ergebnisse

110

unsicher machen. Außerdem wurden bisher lediglich Volleiproben untersucht, welche mit

einer Reinsubstanz dotiert wurden, so dass eine Anwendbarkeit in auf anderem Wege konta-

minierten Proben abzusichern wäre. Eine Identifizierung einer Substanzklasse erscheint mit

der entsprechenden Kombination dieser Methode durchaus möglich, sollte aber für andere

Substanzen gleicher Antibiotikaklassen im Einzelfall noch weiter abgeklärt werden.

111

6. Zusammenfassung

Annette Bendix (2003)

Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständen ausgewählter Antibiotika und

Chemotherapeutika in Hühnereiern mittels mikrobiologischem Hemmstofftest

Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe es möglich ist, Eipro-

ben kostengünstig mit geringem Zeitaufwand und hoher Sensitivität auf antibiotische Rück-

stände zu untersuchen. Die Auswahl der Antibiotika und Chemotherapeutika (Oxytetracyclin,

Doxycyclin, Ampicillin, Sulfadimidin, Dihydrostreptomycin, Colistin, Enrofloxacin) orien-

tierte sich dabei an Einsatzmöglichkeiten in der Geflügelpraxis.

Antibiotikafreie Volleiproben wurden mit verschiedenen Antibiotikakonzentrationen dotiert

und diese nach Enteiweißung mittels Festphasenextraktionen aufgereinigt. Zur Extraktion

wurden eine Kationenaustauschersäule, eine C18-Säule und eine Kombinationssäule verwen-

det. Der Nachweis erfolgte im mikrobiologischen Hemmstofftest, wobei neben den in der

amtlichen Fleischuntersuchung vorgeschriebenen Testsystemen außerdem noch Kulturen von

Bac. stearothermophilus var. calidolactis und E. coli auf ihre Eignung zum Nachweis getestet

wurden.

• Der mikrobiologische Hemmstofftest war geeignet, die untersuchten Substanzen nachzu-

weisen. Werden neben dem klassischen Dreiplattentest mit Bac. subtilis auf Standard-

nährböden zusätzlich Bac. stearothermophilus var. calidolactis und E. coli eingesetzt, so

kann der mikrobiologische Hemmstofftest als sensitives Screening-Verfahren zum Nach-

weis von einzelnen Antibiotikarückständen genutzt werden.

• Eine vorgeschaltete Festphasenextraktion ermöglichte das Aufreinigung des enteiweißten

Volleies, wobei die C18-Säule zur Aufreinigung von Ampicillin, Oxytetracyclin, Doxycy-

clin und Sulfadimidin am geeignesten war. Für Enrofloxacin und Colistin zeigte die Ka-

tionenaustauschersäule die beste Wiederfindung.

112

• Kombinierte man die Festphasenextraktion mit dem erweiterten Hemmstofftest, so war

ein Nachweis der untersuchten Substanzen in Vollei möglich. Die dabei ermittelten

Nachweisgrenzen der einzelnen Substanzen unterscheiden sich hierbei erheblich.

• Für den Nachweis von Ampicillin ließ sich eine Nachweisgrenze von 0,4 µg/kg Ei durch

Kombination der C18-Säule mit einer Kultur von Bac. stearothermophilus var. calidolac-

tis ermitteln. Bei Verwendung der C18-Säule in Kombination mit der Kultur von Bacillus

subtilis pH 6,0 war es möglich, die Tetracycline selektiv nachzuweisen. Für Oxytetracy-

clin ergab sich dabei rechnerisch eine Nachweisgrenze von 82 µg/kg Vollei, für Doxycy-

clin 13 µg/kg Vollei. Für Sulfadimidin hat sich auf Grund chemischer Unverträglichkei-

ten der Enteiweißung die C18-Säule in Kombination mit der Kultur von Bacillus subtilis

pH 7,2 mit Trimethoprimzusatz als am sensitivsten erwiesen. Die errechnete Nachweis-

grenze lag für diese Substanz bei 530 µg/kg Vollei bei einer mittleren Wiederfindung von

etwa 50 %. Die Kombination der SA-Säule mit der Kultur von Bacillus stearothermophi-

lus var. calidolactis auf Isoagar erbrachte für Colistin eine Nachweisgrenze von etwa 800

µg/kg Vollei. Kombiniert man die SA-Säule mit der Kultur von E. coli pH 7,2 mit Tri-

methoprimzusatz, so kann man Enrofloxacin in Konzentrationen von 30 µg/kg Vollei si-

cher nachweisen. Dihydrostreptomycin wurde im Haupversuch nicht weiteruntersucht,

da die Wiederfindungsraten der Säulentestung für alle Säulen unter 20 % lag.

113

7. Summary

Annette Bendix (2003)

Improved microbiological assay for the detection of several antimicrobial substances in eggs

Aim of this thesis was to develop a new method to detect several antibacterial substances in

eggs sensitive by low costs and short time needed. The choose of antibiotics (Oxytetracyclin,

Doxycyclin, Ampicillin, Sulfadimidin, Dihydrostreptomycin, Colistin, Enrofloxacin) orienta-

ted by the use in the therapy of laying hens.

Drug-free egg was endowed with different concentrations of antibiotics and than cleaned-up

after deproteination by solid-phase extractions. For the extraction were used a cationic co-

lumn, a C18-column and a combination of columns. The detection was made by using a

microbiological assay. Besides the detection by the German three-plate test we used micro-

biological assays of Bacillus stearothermophilus var. calidolactis and E. coli.

• The microbiological assay could detect the examined antibacterial substances. Did we

take Bac. stearothermophilus var. calidolactis and E. coli in addition to the German Ba-

cillus subtilis BGA test , the microbiological assay could be used as a sensitive screening

test for the detection of several antibacterial residues.

• The solid-phase extraction allowed the clean-up of the deproteiniziated egg. The C18-

column was suitable for the clean-up of Ampicillin, Oxytetracyclin, Doxycyclin and Sul-

fadimidin. The best recovery showed the cationic-column for the clean-up of Enrofloxacin

and Colistin.

• The combination of solid-phase extraction and the extended microbiological assay made

it possible to detect the examined antibacterial substances in eggs. The detection limits of

the substances were very different.

114

• It was possible to detect Ampicillin up to 0,4 µg/kg egg by using a combination of C18-

column and Bac. stearothermophilus var. calidolactis. By using the C18-column in com-

bination with Bacillus subtilis pH 6,0 it was possible to detect the tetracyclines. Oxyte-

tracyclin showed a detection limit of 82 µg/kg egg; the detection limit of Doxycyclin

was 13 µg/kg egg. For the detection of Sulfadimidin we used the C18-column in combi-

nation with Bacillus subtilis pH 7,2 with the addition of Trimethoprim because of chemi-

cal incompatililties of the deproteination. The calculated detection limit was 530 µg/kg

egg with a recovery of 50 %. The combination of the SA-column with Bacillus stearo-

thermophilus var. calidolactis showed a detection limit of 800 µg/kg egg. By using a

combination of SA-column with E. coli pH 7,2 with addition of Trimethoprim we cde-

tected Enrofloxacin in concentrations of 30 µg/kg egg. Dihydrostreptomycin was not

further examined in the main experiment because the recoveries of the solid-phase extrac-

tiones were below 20 % for all tested columns.

115

8. Anhang:

8.1. Verdünnungsreihen:

8.1.1. Verdünnungsreihe für Ampicillin:

I : 5mg Ampicillin-Reinsubstanz + 4330µl Bidest. = 1000µg/ml

II : 150 µl I + 1350µl Bidest. = 100µg/ml

III : 150µl II + 1350µl Bidest. = 10µg/ml

IV : 150µl III + 1350µl Bidest. = 1,0µg/ml

V : 450µl IV + 4050µl Bidest. = 0,1µg/ml

VI : 1200µl V + 300µl Bidest. = 0,08µg/ml

VII : 900µl V + 600µl Bidest. = 0,06µg/ml

VIII: 500µl V + 1000µl Bidest. = 0,03µg/ml

IX : 300µl V + 1200µl Bidest. = 0,02µg/ml

X : 450µl V + 4050µl Bidest. = 0,01µg/ml

XI : 1200µl X + 300µl Bidest. = 0,008µg/ml

XII : 900µl X + 600µl Bidest. = 0,006µg/ml

XIII : 500µl X + 1000µl Bidest. = 0,003µg/ml

XIV : 300µl X + 1200µl Bidest. = 0,002µg/ml

XV : 150µl X + 1350µl Bidest. = 0,001µg/ml

8.1.2. Verdünnungsreihe für Colistinsulfat:

I : 5mg Colistin-Reinsubstanz + 4539µl Bidest. = 1000µg/ml





VI : 900µl IV + 600µl Bidest. = 0,6µg/ml

VII : 600µl IV + 900µl Bidest. = 0,4µg/ml

VIII: 300µl IV + 1200µl Bidest. = 0,2µg/ml

IX : 500µl IV + 4500µl Bidest. = 0,1µg/ml

X : 1200µl IX + 300µl Bidest. = 0,08µg/ml

116

XI : 900µl IX + 600µl Bidest. = 0,06µg/ml

XII : 600µl IX + 900µl Bidest. = 0,04µg/ml

XIII : 300µl IX + 1200µl Bidest. = 0,02µg/ml

XIV : 150µl IX + 1350µl Bidest. = 0,01µg/ml

8.1.3. Verdünnungsreihe für Colistinsulfat II:

I : 5mg Colistin-Reinsubstanz + 4539µl Bidest. = 1000µg/ml

II : 200µl I + 1800µl Bidest. = 100µg/ml



V : 750µl III + 750µl Bidest. = 5,0µg/ml

VI : 525µl III + 975µl Bidest. = 3,5µg/ml

VII : 375µl III + 1125µl Bidest. = 2,5µg/ml

VIII: 300µl III + 1200µl Bidest. = 2,0µg/ml

IX : 350µl III + 1650µll Bidest. = 1,75µg/ml

X : 200µl III + 1400µl Bidest. = 1,25µg/ml

XI : 150µl III + 1350µl Bidest. = 1,0µg/ml

8.1.4. Verdünnungsreihe für Dihydrostreptomycin:

I : 5mg Dihydrostreptomycin-Reinsubstanz + 3720µl NaCl-Lsg. = 1000µg/ml

II : 200 µl I + 1800µl NaCl-Lsg = 100µg/ml

III : 400µl II + 3600µl NaCl-Lsg. = 10µg/ml

IV :1200µl III + 400µl NaCl-Lsg. = 7,5µg/ml

V : 750µl III + 750µl NaCl-Lsg. = 5µg/ml

VI : 400µl III + 1200µl NaCl-Lsg. = 2,5µg/ml

VII : 350µl III + 1650µl NaCl-Lsg. = 1,75µg/ml

VIII: 450µl III + 4050µl NaCl-Lsg. = 1,0µg/ml

IX : 1200µl VIII + 400µl NaCl-Lsg. = 0,75µg/ml

X : 750µl VIII + 750µl NaCl-Lsg. = 0,5µg/ml

XI : 400µl VIII +1200µl NaCl-Lsg. = 0,25µg/ml

XII : 150µl VIII +1350µl NaCl-Lsg. = 0,1µg/ml

117

8.1.5. Verdünnungsreihe für Doxycyclin:

I : 5mg Doxycyclin-Reinsubstanz + 4235µl NaCl-Lsg. = 1000µg/ml

II : 200 µl I + 1800µl NaCl-Lsg. = 100µg/ml


IV : 750µl III + 750µl NaCl-Lsg. = 5µg/ml

V : 500µl III + 4500µl NaCl-Lsg. = 1,0µg/ml

VI : 1200µl V + 300µl NaCl-Lsg. = 0,8µg/ml

VII : 900µl V + 600µl NaCl-Lsg. = 0,6µg/ml

VIII: 600µl V + 900µl NaCl-Lsg. = 0,4µg/ml

IX : 450µl V + 1050µl NaCl-Lsg. = 0,3µg/ml

X : 300µl V + 1200µl NaCl-Lsg. = 0,2µg/ml

XI : 200µl V + 1800µl NaCl-Lsg. = 0,1µg/ml

XII : 750µl XI + 750µl NaCl-Lsg. = 0,05µg/ml

XIII: 150µl XI + 1350µl NaCl-Lsg. = 0,01µg/ml

8.1.6. Verdünnungsreihe für Enrofloxacin:

I : 5mg Enrofloxacin-Reinsubstanz + 4539µl Bidest. = 1000µg/ml











XII : 600µl IX + 900µl Bidest. = 0,04µg/ml

XIII : 300µl IX + 1200µl Bidest. = 0,02µg/ml

XIV : 150µl IX + 1350µl Bidest. = 0,01µg/ml

118

8.1.7. Verdünnungsreihe für Oxytetracyclin:

I : 5mg OTC-Reinsubstanz + 4525µl NaCl-Lsg. = 1000µg/ml

II : 200 µl I + 1800µl NaCl-Lsg. = 100µg/ml


IV : 750µl III + 750µl NaCl-Lsg. = 5µg/ml

V : 450µl III + 1050µl NaCl-Lsg. = 3µg/ml

VI : 350µl III + 1650µl NaCl-Lsg. = 1,75µg/ml

VII : 500µl III + 4500µl NaCl-Lsg. = 1,0µg/ml

VIII: 1200µl VII + 300µl NaCl-Lsg. = 0,8µg/ml

IX : 900µl VII + 600µl NaCl-Lsg. = 0,6µg/ml

X : 750µl VII + 750µl NaCl-Lsg. = 0,5µg/ml

XI : 450µl VII + 1050µl NaCl-Lsg. = 0,3µg/ml

XII : 300µl VII + 1200µl NaCl-Lsg. = 0,2µg/ml

XIII : 200µl VII + 1800µl NaCl-Lsg. = 0,1µg/ml

8.1.8. Verdünnungsreihe für Sulfadimidin-Na I :

I : 5mg Sulfadimidin + 4618µl Bidest. = 1000µg/ml











8.1.9. Verdünnungsreihe für Sulfadimidin-Na II:

I : 5mg Sulfadimidin + 4618 µl Bidest. = 1000µg/ml

II : 200µl I + 1800µl Bidest. = 100µg/ml


119


V : 750µl III + 750µl Bidest. = 5,0µg/ml

VI : 525µl III + 975µl Bidest. = 3,5µg/ml

VII : 375µl III + 1125µl Bidest. = 2,5µg/ml

VIII: 300µl III + 1200µl Bidest. = 2,0µg/ml

IX : 350µl III + 1650µll Bidest. = 1,75µg/ml

X : 200µl III + 1400µl Bidest. = 1,25µg/ml

XI : 150µl III + 1350µl Bidest. = 1,0µg/ml

120

8.2. Einzelergebnisse der Vorversuche zum mikrobiologischem Hemmstofftest

Tabelle 57: Hemmwirkung von Ampicillin gegenüber verschiedenen Testkeimen in unter-

schiedlichen Nährmedien I

Stufe Konz. (µg/ml)

Hemmhof Bac.subtilis pH

6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)

Hemmhof Bac.stearothermophilus (mm)

Hemmhof E.coli pH 6,0 (mm)

V 0.10 7.0 7.0 6.5 11.0 0.0VI 0.08 6.0 6.5 5.0 9.5 0.0VII 0.06 5.0 5.0 4.0 8.0 0.0VIII 0.03 0.0 2.5 2.0 7.0 0.0IX 0.02 0.0 0.0 0.0 6.0 0.0X 0.01 0.0 0.0 0.0 5.0 0.0XI 0.008 0.0 0.0 0.0 3.0 0.0XII 0.006 0.0 0.0 0.0 1.5 0.0XIII 0.003 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XIV 0.002 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XV 0.001 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Kontr. Pen 8,5 Sulf:10.0 Strep:10 Pen:9.0 Enro:11,5


schiedlichen Nährmedien II



6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)



V 0.10 11.0 6.5 5.5 9.5 0.0VI 0.08 9.0 5.5 4.5 9.0 0.0VII 0.06 8.5 4.0 4.0 8.5 0.0VIII 0.03 8.0 3.0 3.5 8.0 0.0IX 0.02 6.5 1.5 3.0 8.0 0.0X 0.01 3.5 0.0 1.5 7.0 0.0XI 0.008 0.0 0.0 0.0 6.0 0.0XII 0.006 0.0 0.0 0.0 5.5 0.0XIII 0.003 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 4.5 nicht getestetXIV 0.002 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 1.5 nicht getestetXV 0.001 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 0.0 nicht getestet

121


schiedlichen Nährmedien III



6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)


Hemmhof E.coli pH 6,0(mm)

V 0.10 12.0 6.0 5.5 12.0 0.0VI 0.08 9.0 5.0 4.5 10.0 0.0VII 0.06 8.0 4.0 4.0 9.5 0.0VIII 0.03 7.5 3.5 2.5 8.5 0.0IX 0.02 6.0 1.5 1.5 8.0 0.0X 0.01 2.5 0.0 0.0 7.5 0.0XI 0.008 0.0 0.0 0.0 7.0 0.0XII 0.006 0.0 0.0 0.0 6.0 0.0XIII 0.003 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 5.0 nicht getestetXIV 0.002 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 3.0 nicht getestetXV 0.001 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 0.0 nicht getestet

Tabelle 60: Mittelwerte Hemmwirkung von Ampicillin gegenüber verschiedenen Testkeimen

in unterschiedlichen Nährmedien

Konz. (µg/ml)

log 10 Konz.

(µg/ml)


6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)


Hemmhof E.coli pH 6,0 mm

0.10 -1.000 10.0 6.5 5.8 10.8 0.00.08 -1.097 8.0 5.7 4.7 9.5 0.00.06 -1.222 7.2 4.3 4.0 8.7 0.00.03 -1.523 5.2 3.0 2.7 7.8 0.00.02 -1.699 4.2 1.0 1.5 7.3 0.00.01 -2.000 2.0 0.0 0.5 6.5 0.0

0.008 -2.097 0.0 0.0 0.0 5.3 0.00.006 -2.222 0.0 0.0 0.0 4.3 0.00.003 -2.523 0.0 0.0 0.0 3.2 0.00.002 -2.699 0.0 0.0 0.0 1.5 0.00.001 -3.000 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

122

Tabelle 61: Hemmwirkung von Dihydrostreptomycin gegenüber verschiedenen Testkeimen

in unterschiedlichen Nährmedien I


Hemmhof Bac.subtilis pH 6,0

(mm)


+ TMP (mm)


(mm)


Hemmhof E.coli pH 8.0 (mm)

V 5.00 5.0 9.0 8.0 4.0 4.5VI 2.50 3.5 7.0 6.0 2.0 2.0VII 1.75 1.5 5.5 5.0 0.0 0.0VIII 1.00 0.0 3.5 4.0 0.0 0.0IX 0.75 0.0 2.0 2.0 0.0 0.0X 0.50 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XI 0.25 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XII 0.10 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0


in unterschiedlichen Nährmedien II



6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)

Hemmhof (mm)ac.subtilis pH

8,0


Hemmhof E.coli pH 8.0 (mm)

V 5.00 5.0 9.0 9.0 4.5 2.5VI 2.50 2.0 6.5 7.5 2.0 0.0VII 1.75 1.5 4.5 5.0 0.0 0.0VIII 1.00 0.0 3.5 3.5 0.0 0.0IX 0.75 0.0 2.0 2.0 0.0 0.0X 0.50 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XI 0.25 nicht getestet 0.0 0.0 nicht getestet nicht getestetXII 0.10 nicht getestet 0.0 0.0 nicht getestet nicht getestet


in unterschiedlichen Nährmedien III



6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


(mm)



V 5.00 4.0 10.0 8.0 4.0 6.0VI 2.50 0.0 9.0 6.5 0.0 3.0VII 1.75 0.0 8.5 6.0 0.0 0.0VIII 1.00 0.0 7.0 5.0 0.0 0.0IX 0.75 0.0 5.0 2.5 0.0 0.0X 0.50 0.0 3.5 0.0 0.0 0.0XI 0.25 nicht getestet Aufhellung 0.0 nicht getestet nicht getestetXII 0.10 nicht getestet 0.0 0.0 nicht getestet nicht getestet

123

Tabelle 64: Mittelwerte Hemmwirkung von Dihydrostreptomycin gegenüber verschiedenen

Testkeimen in unterschiedlichen Nährmedien

Konz. (µg/ml)

log 10 Konz.

(µg/ml) l


6,0 (mm)


+ TMP (mm)


8,0 (mm)



5.00 0.699 4.7 9.3 8.3 4.2 4.32.50 0.398 1.8 7.5 6.7 1.3 1.71.75 0.243 1.0 6.2 5.3 0.0 0.01.00 0.000 0.0 4.7 4.2 0.0 0.00.75 -0.125 0.0 3.0 2.2 0.0 0.00.50 -0.301 0.0 1.2 0.0 0.0 0.00.25 -0.602 0.0 0.0 0.0 0.0 0.00.10 -1.000 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Tabelle 65: Hemmwirkung von Oxytetracyclin gegenüber verschiedenen Testkeimen




6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)



V 3.00 14.0 9.0 7.0 0.0 12.0VI 1.75 12.0 7.0 4.0 0.0 9.5VII 1.00 10.0 6.5 3.0 0.0 9.0VIII 0.80 9.0 6.0 2.5 0.0 7.0IX 0.60 8.0 5.0 2.0 0.0 6.5X 0.50 7.0 4.0 1.0 0.0 6.0XI 0.30 6.0 2.0 0.0 0.0 4.0XII 0.20 5.0 1.5 0.0 0.0 3.5XIII 0.10 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0

124





6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)








6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)




125

Tabelle 68: Mittelwerte Hemmwirkung von Oxytetracyclin gegenüber verschiedenen


Konz. (µg/ml)

log 10 Konz. (µg/ml)


6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)



3.00 0.477 13.3 8.3 7.0 0.0 10.71.75 0.243 11.5 6.5 4.3 0.0 9.21.00 0.000 9.5 5.7 3.3 0.0 8.20.80 -0.097 8.8 5.2 2.8 0.0 7.00.60 -0.222 7.7 4.2 1.7 0.0 6.00.50 -0.301 6.8 3.5 0.3 0.0 5.30.30 -0.523 5.5 2.0 0.0 0.0 3.50.20 -0.699 2.7 0.5 0.0 0.0 2.20.10 -1.000 0.7 0.0 0.0 0.0 0.0

Tabelle 69: Hemmwirkung von Doxycyclin gegenüber verschiedenen Testkeimen




6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)



IV 1.00 13.5 12.0 9.0 6.0 6.0V 0.80 13.0 11.0 8.5 5.0 5.0VI 0.60 12.0 10.0 7.0 2.5 3.0VII 0.40 11.0 9.5 6.0 0.0 1.5VIII 0.30 10.0 9.0 5.5 0.0 0.0IX 0.20 9.5 8.5 4.5 0.0 0.0X 0.10 9.0 6.0 3.0 0.0 0.0XI 0.05 6.5 4.0 0.0 0.0 0.0XII 0.01 3.0 1.5 0.0 0.0 0.0





6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)




126





6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)




Tabelle 72: Mittelwerte Hemmwirkung von Doxycyclin gegenüber verschiedenen Testkeimen


Konz. (µg/ml)

log 10 Konz. µg/ml)


6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)



1.00 0.000 13.2 12.0 8.3 4.3 7.80.80 -0.097 12.7 11.3 7.3 3.7 6.20.60 -0.222 12.3 10.3 5.8 1.8 4.30.40 -0.398 11.7 9.7 4.7 0.5 1.50.30 -0.523 11.0 8.8 3.5 0.0 0.00.20 -0.699 10.2 7.8 1.5 0.0 0.00.10 -1.000 8.3 6.5 1.0 0.0 0.00.05 -1.301 5.2 3.5 0.0 0.0 0.00.01 -2.000 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0

127

Tabelle 73: Hemmwirkung von Colistin gegenüber verschiedenen Testkeimen in

unterschiedlichen Nährmedien I



6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)


Hemmhof E.coli pH 7.2 + TMP (mm)

IV 7.50 2.5 2.5 2.5 4.5 3.0V 5.00 0.0 2.0 1.5 4.0 2.0VI 3.50 0.0 0.0 0.0 3.5 0.0VII 2.50 0.0 0.0 0.0 2.5 0.0VIII 2.00 0.0 0.0 0.0 2.0 0.0IX 1.75 0.0 0.0 0.0 2.0 0.0X 1.25 0.0 0.0 0.0 1.5 0.0XI 1.00 0.0 0.0 0.0 1.0 0.0

Tabelle 74: Hemmwirkung von Colistin gegenüber verschiedenen Testkeimen




6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


8,0 (mm)


Hemmhof E.coli pH 7.2 + TMP (mm)

IV 7.50 2.0 2.5 4.0 4.0 7.0V 5.00 1.5 2.0 3.0 3.5 6.5VI 3.50 0.0 1.5 2.5 2.5 6.0VII 2.50 0.0 0.0 1.5 1.5 5.0VIII 2.00 0.0 0.0 0.0 0.0 3.0IX 1.75 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0X 1.25 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XI 1.00 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Tabelle 75: Hemmwirkung von Colistin gegenüber verschiedenen Testkeimen




6,0 (mm)


+ TMP (mm)


(mm)


Hemmhof E.coli pH 7,2 + TMP

(mm)IV 7.50 2.0 3.0 4.0 4.5 6.0V 5.00 1.0 2.0 3.0 3.5 5.5VI 3.50 0.0 1.5 1.0 2.5 5.0VII 2.50 0.0 0.0 1.5 2.0 4.0VIII 2.00 0.0 0.0 0.0 1.5 3.0IX 1.75 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0X 1.25 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0XI 1.00 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

128

Tabelle 76: Mittelwerte Hemmwirkung von Colistin gegenüber verschiedenen Testkeimen


Konz. (µg/ml)

log 10 Konz.

(µg/ml)


6,0 (mm)


7,2 + TMP (mm)


(mm)


Hemmhof E.coli pH 7.2 + TMP

(mm)7.50 0.875 2.2 2.7 3.5 4.3 5.35.00 0.699 0.8 2.0 2.5 3.7 4.73.50 0.544 0.0 1.0 1.5 2.8 3.72.50 0.398 0.0 0.0 1.0 1.8 3.02.00 0.301 0.0 0.0 0.0 0.7 2.01.75 0.243 0.0 0.0 0.0 0.0 0.01.25 0.097 0.0 0.0 0.0 0.0 0.01.00 0.000 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Tabelle 77: Hemmwirkung von Sulfadimidin gegenüber verschiedenen Testkeimen


Stufe Konz. (µg/ml)Hemmhof

Bac.subtilis pH 6,0 (mm)


+ TMP (mm)


8,0 (mm)



(mm)IV 7.50 0.0 12.5 0.0 5.0 0.0V 5.00 0.0 10.0 0.0 1.0 0.0VI 3.50 0.0 8.5 0.0 0.0 0.0VII 2.50 0.0 6.0 0.0 0.0 0.0VIII 2.00 0.0 5.0 0.0 0.0 0.0IX 1.75 0.0 3.5 0.0 0.0 0.0X 1.25 0.0 Aufhelleung 0.0 0.0 0.0XI 1.00 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0





(mm)


7,2 + TMP( mm)


8,0 (mm)



(mm)IV 7.50 0.0 12.5 0.0 5.5 0.0V 5.00 0.0 11.0 0.0 2.5 0.0VI 3.50 0.0 9.0 0.0 1.0 0.0VII 2.50 0.0 8.5 0.0 0.0 0.0VIII 2.00 0.0 8.0 0.0 0.0 0.0IX 1.75 nicht getestet 6.5 nicht getestet nicht getestet 0.0X 1.25 nicht getestet 5.0 nicht getestet nicht getestet 0.0XI 1.00 nicht getestet 0.0 nicht getestet nicht getestet 0.0

129





(mm)


+ TMP (mm)


8,0 (mm)

Hemmhof Bac.stearothermophilus mm)

Hemmhof E.coli pH 7,2 + TMP (mm)

IV 7.50 0.0 12.5 0.0 4.5 0.0V 5.00 0.0 11.5 0.0 1.5 0.0VI 3.50 0.0 11.0 0.0 0.0 0.0VII 2.50 0.0 10.5 0.0 0.0 0.0VIII 2.00 0.0 8.5 0.0 0.0 0.0IX 1.75 nicht getstet 8.0 nicht getestet nicht getestet 0.0X 1.25 nicht getstet 6.0 nicht getestet nicht getestet 0.0XI 1.00 nicht getstet 4.5 nicht getestet nicht getestet 0.0

Tabelle 80: Mittelwerte Hemmwirkung von Sulfadimidin gegenüber verschiedenen


Konz. (µg/ml)



6,0 (mm)

Hemmhof Bac.subtilis pH 7,2 +

TMP (mm)


8,0 (mm)



(mm)7.50 0.875 0.0 12.5 0.0 5.0 0.05.00 0.699 0.0 10.8 0.0 4.7 0.03.50 0.544 0.0 9.5 0.0 0.3 0.02.50 0.398 0.0 8.3 0.0 0.0 0.02.00 0.301 0.0 7.2 0.0 0.0 0.01.75 0.243 0.0 6.0 0.0 0.0 0.01.25 0.097 0.0 3.7 0.0 0.0 0.01.00 0.000 0.0 1.5 0.0 0.0 0.0

Tabelle 81: Hemmwirkung von Enrofloxacin gegenüber verschiedenen Testkeimen




(mm)


TMP (mm)


8,0 (mm)



(mm)IV 1.00 13.0 14.0 9.0 0.0 16.5V 0.80 12.5 13.0 8.5 0.0 16.0VI 0.60 11.5 12.0 8.0 0.0 15.0VII 0.40 8.5 10.0 7.0 0.0 13.5VIII 0.20 4.0 8.0 5.0 0.0 11.0IX 0.10 0.0 6.5 3.5 0.0 10.0X 0.08 0.0 3.0 0.0 0.0 8.0XI 0.06 0.0 2.0 0.0 0.0 7.5XII 0.04 0.0 0.0 0.0 0.0 6.0XIII 0.02 0.0 0.0 0.0 0.0 3.0XIV 0.01 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

130





(mm)

Bac.subtilis pH 7,2 + TMP


8,0 (mm)



(mm)IV 1.00 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 3.5 16.5V 0.80 13.0 13.0 9.0 2.5 16.0VI 0.60 12.0 11.0 7.5 2.0 15.0VII 0.40 10.0 10.0 6.5 0.0 13.5VIII 0.20 9.5 9.5 6.0 0.0 13.0IX 0.10 5.0 6.5 3.0 0.0 11.5X 0.08 3.5 5.5 0.0 0.0 11.0XI 0.06 2.0 5.0 0.0 0.0 8.0XII 0.04 0.0 3.0 0.0 0.0 6.0XIII 0.02 0.0 0.0 0.0 0.0 2.5XIV 0.01 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0





(mm)


TMP (mm)


8,0 (mm)



(mm)IV 1.00 nicht getestet nicht getestet nicht getestet 3.0 16.5V 0.80 12.0 13.0 9.0 2.5 16.0VI 0.60 11.0 11.5 8.0 2.0 15.0VII 0.40 10.0 10.0 7.0 0.0 13.0VIII 0.20 9.5 10.0 6.5 0.0 11.0IX 0.10 6.0 7.0 3.0 0.0 9.0X 0.08 4.0 6.0 2.0 0.0 8.5XI 0.06 3.0 5.0 0.0 0.0 6.5XII 0.04 0.0 0.5 0.0 0.0 5.0XIII 0.02 0.0 0.0 0.0 0.0 2.0XIV 0.01 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

131

Tabelle 84: Mittelwerte Hemmwirkung von Enrofloxacin gegenüber verschiedenen


Konz. (µg/ml)



(mm)


TMP (mm)


8,0 (mm)



(mm)1.00 0.000 13.0 14.0 9.0 2.2 16.50.80 -0.097 12.5 13.0 8.8 1.7 16.00.60 -0.222 11.8 11.5 7.8 1.3 15.00.40 -0.398 9.5 10.0 6.8 0.0 13.30.20 -0.699 7.7 9.2 5.8 0.0 11.70.10 -1.000 3.7 6.7 3.2 0.0 10.20.08 -1.097 2.5 4.8 0.6 0.0 9.20.06 -1.222 1.7 4.0 0.0 0.0 7.30.04 -1.398 0.0 1.8 0.0 0.0 5.70.02 -1.699 0.0 0.0 0.0 0.0 2.50.01 -2.000 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

132

8.3. Einzelergebnisse der Untersuchung dotierter Volleiproben

Tabelle 85: Eichreihe der ersten Aufarbeitung mit Ampicillin


Tabelle 86: Ergebnisse der ersten Aufarbeitung mit Ampicillin

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)C18 I 0.6 9.0C18 II 0.6 12.0C18 III 0.6 12.0C18 IV 0.6 12.5C18 V 0.3 12.0C18 VI 0.3 12.0C18 VII 0.3 11.0C18 VIII 0.3 11.0

Einwaage 0.6 13.5Einwaage 0.3 12.5

Tabelle 87: Eichreihe der zweiten Aufarbeitung mit Ampicillin


133

Tabelle 88: Ergebnisse der zweiten Aufarbeitung mit Ampicillin

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)C18 I 0.06 5.5C18 II 0.06 6.0C18 III 0.06 6.0C18 IV 0.06 5.6C18 V 0.03 4.5C18 VI 0.03 5.0 C18VII 0.03 0.0C18 VIII 0.03 5.0


Tabelle 89: Eichreihe der dritten Aufarbeitung mit Ampicillin


Tabelle 90: Ergebnisse der dritten Aufarbeitung mit Ampicillin



134

Tabelle 91: Eichreihe der vierten Aufarbeitung mit Ampicillin


Tabelle 92: Ergebnisse der vierten Aufarbeitung mit Ampicillin



Tabelle 93: Eichreihe der ersten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem Vollei


135

Tabelle 94: Ergebnisse der ersten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem

Vollei



Tabelle 95: Eichreihe der zweiten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem

Vollei


136

Tabelle 96: Ergebnisse der zweiten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem

Vollei



Tabelle 97: Eichreihe der dritten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem

Vollei


137

Tabelle 98: Ergebnisse der dritten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem

Vollei



Tabelle 99: Eichreihe der vierten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem Vollei


Tabelle 100: Ergebnisse der vierten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit OTC dotiertem

Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)C18 I 0.5 2.0C18 II 0.5 2.0C18 III 0.5 2.0C18 IV 0.3 2.0C18 V 0.3 1.5C18 VI 0.3 1.5


138

Tabelle 101: Eichreihe der ersten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem Vollei


Tabelle 102: Ergebnisse der ersten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem

Vollei



Tabelle 103: Eichreihe der zweiten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem

Vollei

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)VI 0.80 14.0VII 0.60 12.5VIII 0.40 12.0IX 0.30 10.5X 0.20 10.0XI 0.10 9.0XII 0.05 7.0XIII 0.03 5.0XIV 0.01 0.0

139

Tabelle 104: Ergebnisse der zweiten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem

Vollei



Tabelle 105: Eichreihe der dritten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem Vollei


Tabelle 106: Ergebnisse der dritten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem

Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)C18 I 0.06 0.0C18 II 0.06 2.0C18 III 0.06 0.0C18 IV 0.06 2.0

Einwaage 0.06 8.0

140

Tabelle 107: Eichreihe der vierten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem

Vollei


Tabelle 108: Ergebnisse der vierten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit DC dotiertem

Vollei



141

Tabelle 109: Eichreihe der ersten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Colistin dotiertem

Vollei

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 5.00 3.0VI 3.50 2.5VII 2.50 2.0VIII 2.00 1.5IX 1.75 0.0X 1.25 0.0XI 1.00 0.0

Tabelle 110: Ergebnisse der ersten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Colistin dotiertem

Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)SA I 7.5 6.0*SA II 7.5 4.0*SA III 7.5 5.0*SA IV 7.5 5.0*SA V 5.0 2.5*SA VI 5.0 2.5*SA VII 5.0 3.0*SA VIII 5.0 3.0*


*= etwa 5mm Zone mit sehr dichtem Keimwachstum am Rand des Hemmhofes

142

Tabelle 111: Eichreihe der zweiten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Colistin dotiertem

Vollei


Tabelle 112: Ergebnisse der zweiten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Colistin dotiertem

Vollei




143

Tabelle 113: Eichreihe der dritten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Colistin dotiertem

Vollei


Tabelle 114: Ergebnisse der dritten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Colistin dotiertem

Vollei




144

Tabelle 115: Eichreihe erste Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit Sulfadimidin dotiertem

Vollei


Tabelle 116: Ergebnisse der ersten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit Sulfadimidin

dotiertem Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)C18 I 3.5 12.0C18 II 3.5 10.0C18 III 3.5 10.5C18 IV 3.5 11.5C18 V 2.5 10.5C18 VI 2.5 7.5C!8 VII 2.5 8.5C18 VIII 2.5 11.0


145

Tabelle 117: Eichreihe der zweiten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit Sulfadimidin

dotiertem Vollei


Tabelle 118: Ergebnisse der zweiten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit Sulfladimidin

dtiertem Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)C18 I 2.5 11.0C18 II 2.5 11.0C18 III 2.5 10.5C18 IV 2.5 12.0C18 V 2.0 10.0C18 VI 2.0 10.5C!8 VII 2.0 9.0C18 VIII 2.0 10.0


Tabelle 119: Eichreihe der dritten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit Sulfadimidin

dotiertem Vollei

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 3.50 13.5VI 2.50 9.5VII 2.00 7.5VIII 1.75 5.0IX 1.25 4.0X 1.00 3.0XI 0.75 2.5XII 0.50 0.0

146

Tabelle 120: Ergebnisse der dritten Aufarbeitung mit Citratpuffer von mit Sulfadimidin

dotiertem Vollei



Tabelle 121: Eichreihe der ersten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Enrofloxacin

dotiertem Vollei


Tabelle 122: Ergebnisse der ersten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Enrofloxacin

dotiertem Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)SA I 0.4 7.0

SA II 0.4 7.5SA III 0.4 7.0SA IV 0.4 7.5SA V 0.2 5.5SA VI 0.2 5.5SA VII 0.2 0.0SA VIII 0.2 5.5


147

Tabelle 123: Eichreihe der zweiten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Enrofloxacin

dotiertem Vollei

Stufe Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)V 0.80 14.0VI 0.60 13.0VII 0.40 12.5VIII 0.20 12.0IX 0.10 10.0X 0.08 9.5XI 0.06 8.0XI 0.04 6.5XIII 0.02 4.0XIV 0.01 0.0

Tabelle 124: Ergebnisse der zweiten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Enrofloxacin

dotiertem Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)SA I 0.2 0.0SA II 0.2 2.0SA III 0.2 2.5SA IV 0.2 3.0SA V 0.1 0.0SA VI 0.1 0.0SA VII 0.1 0.0SA VIII 0.1 0.0


148

Tabelle 125: Eichreihe der dritten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Enrofloxacin

dotiertem Vollei


Tabelle 126: Ergebnisse der dritten Aufarbeitung mit Essigsäure von mit Enrofloxacin

dotiertem Vollei

Ansatz Konz.(µg/ml) Hemmhof (mm)SA I 0.10 0.0SA II 0.10 0.0SA III 0.10 0.0SA IV 0.10 0.0SA V 0.08 0.0SA VI 0.08 0.0SA VII 0.08 0.0SA VIII 0.08 0.0


149

8.4. Verzeichnis der in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen

abs. = absolute Menge

ADI = acceptable daily intake

Al = Aluminium

AMG = Arzneimittelgesetz

Bac. = Bacillus

Bidest. = Aqua bidestillata

BGA = Bundesgesundheitsamt

BGVV = Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und

Veterinärmedizin

BHI = Brain heart infusion

BpT = Bundesverband praktischer Tierärzte

C = Celsius

Ca = Calcium

CAK = Codex Alimentarius Kommission

cm = Zentimeter

DAB = Deutsches Arzneimittelbuch

DC = Doxycyclin

DDT = Dichlordiphenyltrichloräthan

DNA = Desoxyribonukleinsäure

DVG = Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft

E. coli = Escherichia coli

ELISA = enzym-linked immuno sorbent assay

EMEA = European Medical Products Evaluation Agency

Enro. = Enrofloxacin

et al. = et alii

EU = Europäische Union

EWG = Europäische Wirtschaftsgemeinschaft

FAO = Food and Agriculture Organization

FlHG = Fleischhygienegesetz

150

FMG = Futtermittelgesetz

g = Gramm

GFlHG = Geflügelfleischhygienegesetz

HPLC = High Performance Liquid Chromatography

I.E. = Internationale Einheit

i.m. = intramuskulär

i.v. = intravenös

KbE = Koloniebildende Einheit

kg = Kilogramm

KGW = Körpergewicht

Kontr. = Kontrolle

Konz. = Konzentration

LMBG = Lebensmittel- und Bedarfsgegenstände-Gesetz

Log = Logarithmus

Lsg. = Lösung

m = molar

max. = maximal

Mg = Magnesium

mg = Milligramm

MHK = minimale Hemmkonzentration

Min. = Minuten

ml = Milliliter

MRL = maximum residue limit

µg = Mikrogramm

N = normal

NaCl-Lsg. = physiologische Kochsalzlösung

NOEL = no obseved effect level

OTC = Oxytetracyclin

PCB = polychlorierte Biphenyle

Pen. = Penicillin

pg = Pikogramm

151

per inj. = per injectionem

R2 = Bestimmtheitsgrad

rpm = rotation per minute

s.c. = subkutan

Strep. = Streptomycin

Sulf. = Sulfonamid

TÄHAV = Tierärztliche Hausapothekenverordnung

TMP = Trimethoprimlösung

u. = und

u.a. = und andere

var. = Varietät

WHO = World Health Organization

WTO = World Trade Organization

152

9. Literaturverzeichnis

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Gesetze, Verordnungen, Richtlinien:

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in der Fassung der Bekanntmachung vom 11. Dezember 1998

(BGBl. I S. 3586)

zuletzt geändert am 27. August 2002

(BGBl. I S. 3348)

Verordnung über tierärztliche Hausapotheken vom 27. März 1996

(BGBl. I S.554)


(BGBl. I S.2131)

Futtermittelgesetz (FMG)

In der Fassung der Bekanntmachung vom 25. August 2001

(BGBl. I S. 1358)


(BGBl. I S.3116)

Gesetz über den Verkehr mit Lebensmitteln Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und

sonstigen Bedarfsgegenständen (Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz – LMBG)

In der Fassung der Bekanntmachung vom 9.9.1997

(BGBl. I, S. 2296)


(BGBl. I S. 3116)

Fleischhygienegesetz (FlHG)

In der Neufassung vom 8. Juli 1993

(BGBl. I S. 1198)

in der Fassung vom 7. Juli 1997

(BGBl. I S. 3224, 3240)

158

Geflügelfleischhygienegesetz (GFlHG)

In der Fassung vom 22. Dezember 1997

(BGBl. I S. 3224, 3240)

Allgemeine Verwaltungsvorschrift über die Durchführung der amtlichen Überwachung nach

dem Fleischhygienegesetz und Geflügelfleischhygienegesetz

Vom 19. Februar 2002)

(Banz. Nr.44a)

Verordnung über Stoffe mit pharmakologischer Wirkung

In der Fassung der Bekanntmachung vom 25. September 1984

(BGBl. I S.1251)


(BGBl. I S.3098)

Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 des Rates zur Schaffung eines Gemeinschaftsverfahrens für

die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in Nahrungsmitteln tieri-

schen Ursprungs

Vom 26. Juni 1990

Letzte Aktualisierung: Verordnung (EG) Nr. 544/2003 des Rates vom 27. März 2003

Verordnung (EWG) 315/93 des Rates vom 8.Februar 1993 zur Festlegung von gemeinschaft-

lichen Verfahren zur Kontrolle von Kontaminanten in Lebensmitteln

(Abl. Nr.L 37 S.1)

Richtlinie (RL) 96/23 EG über Kontrollmaßnahmen hinsichtlich bestimmter Stoffe und ihrer

Rückstände in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen und zur Aufhebung der Richtlinie

85/358 EWG und 86/469 EWG und der Entscheidung 89/187 EWG und 91/664 EWG

Vom 23. Mai 1996

(EG ABl. Nr. L 125/10-32)

159

Danksagung:

Herrn Prof. Dr. S. Wenzel gilt mein Dank für die Aufnahme in der Zentrumsabteilung und die

freundliche Bereitstellung der erforderlichen finanziellen Mittel.

Für die Überlassung des Dissertationsthemas und die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im

Institut danke ich Herrn PD Dr. M. Kühne ganz herzlich. Seine Beratung und geduldige

Durchsicht haben entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Mein Dank gilt auch der Firma Eipro für die unentgeldliche Überlassung des Probenmaterials.

Ferner möchte ich Frau S. Korff und Frau G. Möller für ihre stete Hilfsbereitschaft und ihren

jederzeit zuteil gewordenen Rat besonders danken. Ebenso danken möchte ich den weiteren

Mitarbeitern des Institutes für die stets freundliche Aufnahme und die angenehme Arbeitsat-

mosphäre.

Dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung gilt mein Dank für

die Beratung hinsichtlich der Verarbeitung der erhobenen Daten.

Ein besonderer Dank gilt meiner Familie für die moralische Unterstüzung und die kritischen

fachlichen Diskussionen, ohne die ich manchmal verzweifelt wäre.

Desweiteren möchte ich mich bei allen meinen Freunden bedanken, die Verständnis aufge-

bracht haben, dass ich im letzten Halben Jahr etwas wenig Zeit für sie hatte.

Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständen ... · Antibiotika und Chemotherapeutika...

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Transcript of Entwicklung einer Methode zum Nachweis von Rückständen ... · Antibiotika und Chemotherapeutika...