Entwicklung einer multiplex PCR · PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium PCR Polymerasekettenreaktion...

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Transcript of Entwicklung einer multiplex PCR · PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium PCR Polymerasekettenreaktion...

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1. Auflage 2006

© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen

Printed in Germany

ISBN 3-938026-83-9

Verlag: DVG Service GmbH

Frankfurter Straße 89

35392 Gießen

0641/24466

[email protected]

www.dvg.net

Aus dem

Institut fur Virologie

der Tierarztlichen Hochschule Hannover

Entwicklung einer real-time multiplex multitube

RT-PCR zur Differentialdiagnostikder Klassischen Schweinepest

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Veterinarmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierarztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Andreas Gavrilenko

aus Anapskaja

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. V. Moennig

1. Gutachter: Prof. Dr. V. Moennig

2. Gutachter: Prof. Dr. B. Schierwater

Tag der mundlichen Prufung: 23.05.2006

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literaturubersicht 3

2.1 Klassische Schweinepest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.1.1 Taxonomie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.1.2 Morphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.1.3 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . . . . . . 4

2.1.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2 Diagnostik der Klassischen Schweinepest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.2.1 Virus- und Antigennachweis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.2.2 Antikorpernachweis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3 Differentialdiagnostik der KSP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3.1 Afrikanische Schweinepest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3.1.1 Das Virus der Afrikanischen Schweinepest . . . . . . . . . 12

2.3.1.1.1 Taxonomie, Morphologie und physikalische Ei-

genschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3.1.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . 12

2.3.1.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3.1.3 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.3.2 Aujeszkysche Krankheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.3.2.1 Suides Herpesvirus Typ 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.3.2.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . . . . . . . . . . 15

2.3.2.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . 15

2.3.2.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.3.2.3 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.3.3 Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom . . . . . . . . 18

2.3.3.1 Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus 18

2.3.3.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . . . . . . . . . . 18

2.3.3.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . 18

2.3.3.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.3.3.3 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.3.4 Porzine Influenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.3.4.1 Das Influenza-A-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.3.4.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . . . . . . . . . . 21

2.3.4.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . 21

2.3.4.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.3.4.3 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.3.5 Porzine Parvovirus - Infektionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.3.5.1 Das Porzine Parvovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.3.5.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . . . . . . . . . . 23

2.3.5.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . 24

2.3.5.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3.5.3 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.3.6 Porzine Circovirus-Infektionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.3.6.1 Das Porzine Circovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.3.6.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . . . . . . . . . . 27

2.3.6.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . . . . 27

2.3.6.2 Klinik und Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.6.3 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.4 Polymerasekettenreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.4.1 Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.4.2 Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion . . . . . . . . . . 32

2.4.3 Real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.4.3.1 Prinzip und Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.4.3.2 SYBRTM-Green real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.4.3.3 TaqMan real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.4.3.4 Primer-probe energy transfer PriProET . . . . . . . . . . 35

2.4.3.5 Quantitative real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.4.3.5.1 Absolute Quantifizierung . . . . . . . . . . . . . . 37

2.4.3.5.2 Relative Quantifizierung . . . . . . . . . . . . . . 37

2.4.4 Design und Optimierung einer PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.4.4.1 Auswahl der nachzuweisenden Genomregionen . . . . . . . 38

2.4.4.2 Primer- und Sondendesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.4.4.3 Ermittlung von DNA-Sekundarstrukturen . . . . . . . . . 39

2.4.4.4 Optimierungsschritte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.4.5 Multiplex real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.4.6 Interne Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.5 Prinzipien der Validierung von Diagnosetests . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.5.1 Allgemein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.5.2 Validierung von PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3 Material und Methoden 47

3.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.1.1 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.1.1.1 PK(15)A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.1.1.2 EFN-R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.1.1.3 MARC-145 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.1.1.4 Rie 255 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.1.2 Untersuchungsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.1.2.1 Virusisolate und klinische Proben . . . . . . . . . . . . . . 48

3.1.2.2 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.1.2.3 Antikorper und weitere Materialien . . . . . . . . . . . . . 52

3.1.2.4 Kits zur Nukleinsaureisolierung . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.2.1 Klassische virologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.2.1.1 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.2.1.1.1 PK(15)A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.2.1.1.2 EFN-R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.2.1.1.3 MARC-145 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.2.1.2 Virustitration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.2.1.3 Peroxidase-Linked-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.2.1.4 Virusvermehrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.2.2 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.2.2.1 Nukleinsaureisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.2.2.1.1 RNA Isolierung aus Zellkultur und Serum . . . . 55

3.2.2.1.2 RNA-Isolierung aus Organmaterial und Blut . . . 55

3.2.2.1.3 DNA-Isolierung aus Zellkultur und Serum . . . . 56

3.2.2.1.4 DNA Isolierung aus Organmaterial und Blut . . . 57

3.2.2.2 Reverse Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.2.2.3 Primer- und Sondendesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.2.2.3.1 Sequenzsuche und Alignment . . . . . . . . . . . 58

3.2.2.3.2 Auswahl von Primern und Sonden . . . . . . . . 59

3.2.2.3.3 Evaluierung von Primern und Sonden . . . . . . . 59

3.2.2.4 Polymerasekettenreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.2.2.4.1 Gel-basierte PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.2.2.4.2 SYBRTM-Green real-time PCR . . . . . . . . . . 61

3.2.2.4.3 TaqMan real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . 63

3.2.2.4.4 Positive und negative Kontrollen . . . . . . . . . 64

3.2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.2.2.6 Reinigung der PCR-Fragmente . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.2.2.7 TA-Klonierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.2.2.8 Kolonie-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.2.2.9 Plasmidpraparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.2.2.10 Restriktionsenzymverdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.2.2.11 Dephosphorylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.2.2.12 Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

3.2.2.13 Bestimmung der Kopienzahl der Plasmide . . . . . . . . . 70

4 Ergebnisse 73

4.1 Ergebnisse der Literaturrecherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.2 Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs . . . . . . . . . . . . . 78

4.2.1 Ergebnisse der Sequenz-, Primer- und Sondensuche . . . . . . . . . 78

4.2.2 Entwicklung der TaqMan PCRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.2.2.1 Gelbasierte PCRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.2.2.2 Sequenzierung der PCR Produkte . . . . . . . . . . . . . . 84

4.2.2.3 Optimierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.2.2.3.1 Primertitration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.2.2.3.2 Sondentitration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

4.2.2.4 Entwicklung interner Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . 90

4.2.2.5 Multiplex real-time PCRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.3 Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.3.1 Sensitivitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.3.2 Spezifitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

4.3.3 Klinische Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

5 Diskussion 105

5.1 Gesamtkonzept . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

5.2 Auswahl der Nachweismethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

5.3 Literaturrecherche und Auswahl der Erreger . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

5.3.1 Auswahl der Genomregionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

5.4 Aufteilung des multitube PCR-Ansatzes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

5.5 Nukleinsaureisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

5.6 Optimierung der PCRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

5.6.1 Optimierung der Reaktionsbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . 114

5.6.2 Optimierung der Primerkonzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.6.3 Optimierung der Sondenkonzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.6.4 Real-time PCR Effizienzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.7 Auswahl der internen Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

5.8 Auswahl der Isolate und Organproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

5.9 Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

5.9.1 Sensitivitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

5.9.2 Spezifitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

5.9.3 Klinische Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

5.10 Schlussfolgerung und Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128

6 Zusammenfassung 131

7 Summary 133

Literaturverzeichnis 135

A Anhang 177

A.1 Verwendete Virusisolate, Organ- und Blutproben, Antikorper . . . . . . . . 177

A.2 Enzyme und kommerzielle Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

A.3 Medien, Puffer, Losungen, Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

A.3.1 Zellkulturmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

A.3.2 Puffer und Losungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183

A.4 Sonstige Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184

A.5 Primer- und Sondensequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184

A.6 Gerate und Verbrauchsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184

A.6.1 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184

A.6.2 Verbrauchsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

A.7 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

A.8 Tabellen und Abbildungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187

Abbildungsverzeichnis 203

Tabellenverzeichnis 205

Abkurzungsverzeichnis

A. bidest. Aqua bidestillata

AK Aujeszkysche Krankheit

AP Alkalische Phosphatase

AS Aminosaure

ASP Afrikanische Schweinepest

ASPV Virus der Afrikanischen Schweinepest

ATP Adenosintriphosphat

ATV adjusted versen-trypsin

BD Border Disease

BDV Border Disease-Virus

BHV-1 Bovines Herpesvirus Typ 1

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

BVD Bovine Virusdiarrhoe

C Reaktionszyklus (in der real-time PCR)

cDNA komplementare DNA

Ct Schwellenwert (cycle threshold)

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium

DNA Desoxyribonukleinsaure

dNTPs Desoxynukleosid-Triphosphate

dpi Tage post infectionem

dRn (∆Rn) baseline-korrigierte, normalisierte Fluoreszenz

dsDNA doppelstrangige DNA

D-SN diagnostische Sensitivitat

D-SP diagnostische Spezifitat

DTT Dithiothreitol

EAV Virus der infektiosen equinen Arteritis

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsaure

ELISA”enzyme-linked immuno sorbent assay“

EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium

EURL EU Referenzlabor (EU Reference Laboratory)

FAT fluorescent antibody test

FKS fetales Kalberserum

G/C Guanin/Cytosin

HA Hamagglutination

HAE hamagglutinierende Einheiten

IK interne Kontrolle

IPTG Isopropyl-thio-galaktosid

KID50 kulturinfektiose Dosis50

kb Kilobasen

KSP Klassische Schweinepest

KSPV Virus der Klassischen Schweinepest

LDV lactate-dehydrogenase elevating-Virus

mAk monoklonaler Antikorper

MES 2(N-Morpholino)ethansulfonsaure

min Minute

M-Protein Membran-Protein

mRNA”messenger RNA“

N/D nicht durchgefuhrt

N-Protein Nukleokapsid-Protein

NTR nichttranslatierte Region

OD optische Dichte

OIE Office International des Epizooties

ORF offener Leserahmen (open reading frame)

PAM porzine alveolare Makrophagen

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlosung

PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PCV-1 Porcines Circovirus Typ 1

PCV-2 Porcines Circovirus Typ 2

PDNS porzines Dermatitis und Nephropathie Syndrom

PFU Plaque-bildende Einheiten (plaque forming units)

p.i. post infectionem, nach Infektion

PK porcine kidney

PMWS postweaning multisystemic wasting syndrome

PPV Porzines Parvovirus

PRDC porcine respiratory disease complex

PRRS Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom

PRRSV Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom Virus

PRRSV-EU PRRSV europaische Stamme

PRRSV-NA PRRSV nordamerikanische Stamme

R native Fluoreszenz

R2 Bestimmheitsmaß, Pearson Correlation Coefficient

Rn Fluoreszenz abgeglichen mit einem Referenzfarbstoff

RNA Ribonukleinsaure

RT Reverse Transkriptase, reverse Transkription

sec Sekunde

SHV-1 Suides Herpesvirus Typ 1

SMEDI stillbirth, mummification, embryonic death, infertility

SPF spezifisch pathogenfrei

TCID zellkulturinfektiose Dosis (tissue culture infectious dose)

TBE Tris-Borat-EDTA

TiHo Tierarztliche Hochschule

Tm Schmelztemperatur

TRIS Tris-Hydroxymethylaminomethan

U Einheit (unit)

u. a. unter anderem

VNT Virusneutralisationstest

WWW World Wide Web (Internet)

1. Einleitung

Die Klassische Schweinepest (KSP) wird durch ein behulltes RNA-Virus aus dem Genus

Pestivirus der Familie Flaviviridae verursacht und gehort weltweit zu den wichtigsten vi-

ralen Erkrankungen der Schweine. Die KSP ist eine anzeigepflichtige Seuche. Ausbruche

der KSP haben in den letzten Jahrzehnten enorme wirtschaftliche Verluste in Europa

verursacht.

Das klinische Bild einer KSPV-Infektion ist sehr variabel und haufig unspezifisch. Daher

kommen viele andere Erkrankungen viraler, bakterieller und nicht-infektioser Genese dif-

ferentialdiagnostisch in Frage. Zu den viralen Differentialdiagnosen gehoren Afrikanische

Schweinepest (ASP), porzine Circovirusinfektionen, porzine Parvovirose, porzine Influ-

enza, Infektionen mit dem porzinen respiratorischen und reproduktiven Syndrom Virus

(PRRSV) und Aujeszkysche Krankheit.

Die Vielzahl moglicher Differentialdiagnosen macht die Diagnose aufgrund des klinischen

Bildes nahezu unmoglich. Daher ist sowohl fur die Uberwachung der Schweinepopulation

als auch zur Detektion eines KSP-Ausbruchs eine moderne und effiziente Labordiagno-

stik von herausragender Bedeutung. Zu den schnellsten und empfindlichsten Methoden

des Virusgenomnachweises gehort die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die technischen

Entwicklungen der letzten Jahre machten es moglich, verschiedene Erreger in einer so ge-

nannten”multiplex“ PCR nachzuweisen und durch die Nutzung fluoreszierender Sonden

”real-time“ schnell und effizient sichtbar zu machen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es eine moderne und schnelle Nachweismethode differen-

tialdiagnostisch relevanter viraler Erreger auf der Grundlage dieser Technik zu entwickeln.

1

2. Literaturubersicht

2.1 Klassische Schweinepest

Die KSP ist eine der wichtigsten Tierseuchen weltweit und ist in die Liste der Erkrankun-

gen eingruppiert, die bei der OIE und der EU anzeigepflichtig sind (Anonym, 2005a).

Auf nationaler Ebene besteht in Deutschland ebenfalls Anzeigepflicht. Das Virus der Klas-

sischen Schweinepest (KSPV) ist weltweit verbreitet, konnte jedoch in einigen Landern

erfolgreich getilgt werden. So sind z. B. Australien, Neuseeland und die USA KSPV frei

(van Oirschot, 1999a; Edwards, 2000). Aktuelle Informationen zum Seuchenstatus

und -geschehen konnen dem OIE Handistatus II 1 entnommen werden. Die erste offizielle

Feststellung der KSP wurde wahrscheinlich in Ohio, USA, im Jahre 1833 gemacht, wie

aus einem Bericht des Bureau of Animal Industry (United States Department of Agri-

culture) aus dem Jahre 1887 hervorgeht (Liess, 1981). Der genaue Ursprung der Seuche

ist unbekannt (van Oirschot, 1999b). Die Erregercharakterisierung als filtrierbares Vi-

rus erfolgte durch de Schweinitz und Dorset (1904). Naturliche Wirte des KSPV

sind ausschließlich Haus- und Wildschweine (Liess, 1981; Laddomada, 2000), es wurde

allerdings auch von subklinischen Infektionen bei anderen Tieren wie Kalbern, Ziegen,

Schafen, Hirschen und Pekaris berichtet (Loan und Storm, 1968).

1http://www.oie.int/hs2/report.asp

3

4 2. Literaturubersicht

2.1.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest

2.1.1.1 Taxonomie

Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) gehort zum Genus Pestivirus (Horzinek,

1973; Westaway et al., 1985) in der Familie Flaviviridae (Wengler, 1991; Pringle,

1999). Zu diesem Genus gehoren daruber hinaus die eng antigenverwandten Viren der Bo-

vinen Virusdiarrhoe (BVDV) und der Border Disease (BDV) der Schafe (Darbyshire,

1960; Horzinek et al., 1967; Enzmann und Rehberg, 1977; Ridpath und Bolin,

1997). Die Familie Flaviviridae umfasst neben dem Genus Pestivirus die Genera Flavi-

virus und Hepacivirus (Rice et al., 1985). Letzterem gehort ausschließlich das humane

Hepatitis-C-Virus an (Bartenschlager und Lohmann, 2000). Angehorige des Genus

Flavivirus sind u. a. das Gelbfiebervirus und das Fruhsommer-Meningoenzephalitis-Virus

des Menschen, das Louping-Ill-Virus, das Wesselsbron-Disease-Virus der Schafe sowie das

Meningoenzephalitis-Virus der Pute (Wengler et al., 1995).

2.1.1.2 Morphologie

Das Virus der KSP ist ein behulltes RNA-Virus von spharischer Gestalt und misst im

Durchmesser zwischen 40 und 60 nm. Drei strukturelle Glykoproteine erscheinen als un-

regelmaßig gestaltete Projektionen an der Oberflache (s. Abbildung 2.1) (Horzinek et al.,

1967; Moormann und Hulst, 1988; Meyers et al., 1989; Moennig und Plagemann,

1992).

2.1.1.3 Genomorganisation und virale Proteine

Das Genom der Pestiviren, dessen Lange ca. 12,5 Kilobasen betragt, liegt als ein ein-

zelstrangiges, lineares RNA-Molekul in der Plusstrangorientierung vor (Moormann und

Hulst, 1988). Dabei kodiert ein einzelner offener Leserahmen (ORF - open reading frame)

fur ein Polyprotein mit einer Lange von etwa 3900 Aminosauren (Collett et al., 1988;

Meyers et al., 1989; Rumenapf et al., 1993). Das Polyprotein wird co- und posttrans-

lationell in vier Struktur- und sieben Nichtstrukturproteine prozessiert (Elbers et al.,

1996; Meyers und Thiel, 1996). Das Genom wird am 3′- und 5′-Ende von nichttrans-

2.1. Klassische Schweinepest 5

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Virus der Klassischen Schweinepest.

latierten Regionen (NTR) flankiert (Moormann und Hulst, 1988; Rumenapf et al.,

1989; Moormann et al., 1990; Deng und Brock, 1992) (s. Abbildung 2.2). Die Lange

der 5′NTR betragt bei Pestiviren 372 bis 385 Basen (Becher et al., 1998), die der 3′NTR

etwa 200 Basen. Die beiden NTRs sind unter den Pestiviren hoch konserviert (Meyers

et al., 1989; Moormann et al., 1990; Hofmann et al., 1994; Becher et al., 1995;

Vilcek et al., 1997). So betragt die Identitat im 5′NTR-Bereich zwischen BDV-Isolaten

und KSPV-Isolaten bis zu 80 %, zwischen BDV-Isolaten und BVDV-1-Isolaten bis 65 %

(Vilcek et al., 1997).

Durch Sequenzvergleiche bestimmter Genomabschnitte lasst sich das Virus der klassi-

schen Schweinepest unter Einbeziehung geographischer und epidemiologischer Daten in

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Pestivirusgenoms. Modifiziert nach

Meyers und Thiel (1996)

6 2. Literaturubersicht

verschiedene genetische Gruppen einteilen (s. Abbildung 2.3) (Lowings et al., 1996;

Greiser-Wilke et al., 1998; Paton et al., 2000b). Basierend auf der Einteilung von

Lowings et al. (1996), wurden drei Gruppen mit jeweils drei bzw. vier Untergruppen

gebildet (Paton et al., 2000b). Die Gruppe 1 mit den Untergruppen 1.1 bis 1.3 beinhal-

tet Isolate aus den 40–60er Jahren, Isolate aus der Ukraine, Kroatien, Mexiko, Thailand

und China aus den 90er Jahren des vergangenen Jahrhunderts, sowie ein Isolat aus dem

Jahr 2004 aus Kolumbien. Die Gruppe 2 mit den Untergruppen 2.1 bis 2.3 beinhaltet

westeuropaische Isolate aus den 1980er und 1990er Jahren, sowie asiatische Isolate aus

den Jahren 1980–2004. Die Gruppe 3 mit den Untergruppen 3.1 bis 3.4 enthalt ein Iso-

lat aus Großbritannien, sowie Isolate aus Thailand, Japan, Korea und Taiwan aus den

1970–1990er Jahre (Lowings et al., 1996; Paton et al., 2000b; Greiser-Wilke et al.,

2005).

2.1.K

lassische

Sch

wein

epest

7

Abbildung 2.3: Genetische Diversitat der KSPV-Isolate. Die Einteilung basiert auf den Sequenzen des E2-gp Gens. Paton et al.

(2000a), vervollstandigt von Greiser-Wilke et al.

8 2. Literaturubersicht

2.1.2 Klinik und Pathologie

Die Erscheinungsformen der KSP sind sehr unterschiedlich, wobei das Alter der Tiere,

die Virusdosis und die Virulenz des Virusstammes sowie Wirtsfaktoren eine Rolle spie-

len (Dahle und Liess, 1995; van Oirschot, 1999b). Es konnen akute, chronische und

pranatale Verlaufsformen unterschieden werden (van Oirschot et al., 1988; Depner

et al., 1997a; Moennig et al., 2003). Junge Tiere zeigen haufig die akute Form der KSP,

die mit hohem Fieber, Anorexie, Konjunktivitis, vergroßerten Lymphknoten, Diarrhoe

und Verstopfung einhergeht. In der Finalphase der Erkrankung kommt es zu petechia-

len und ekchymatosen Blutungen der Haut im Bereich der Ohren, des Schwanzes, am

Bauch und an den Extremitaten (Depner et al., 1997a; Moennig et al., 1993, 2003).

Die Tiere verenden nach acht bis zwanzig Tagen. Die Mortalitat liegt zwischen 20 und

80 %. Die korrespondierenden pathologisch-anatomischen Befunde umfassen stark ver-

großerte Lymphknoten im gesamten Organismus, petechiale und ekchymatose Blutungen

v. a. in den Nieren, der außeren Haut, der Magen-, Blasen- und Gallenblasenwand sowie

Milzrandinfarkte (Trautwein, 1988). Des Weiteren treten durch Sekundarinfektionen

hervorgerufene Veranderungen des Respirationstraktes und eine nichteitrige Enzephalitis

auf (Gruber et al., 1995).

Die chronische Form der KSP endet immer todlich. Die anfanglichen Symptome sind

denen der akuten Form ahnlich. Im weiteren Verlauf werden die Anzeichen immer un-

spezifischer. Die betroffenen Tiere zeigen intermittierendes Fieber, chronische Enteritiden

und Kummern (Moennig et al., 2003). Im pathologisch-anatomischen Bild zeigen chro-

nisch erkrankte Schweine weniger ausgepragte Befunde. Hamorrhagien und Infarkte fehlen

haufig. Zu den typischen Befunden gehoren eine Depletion der lymphatischen Organe so-

wie nekrotische und ulzerative Veranderungen der Darmwand, so genannte”Boutons“

(van Oirschot, 1999b). Außerdem ist eine Hyperplasie der Nebennierenrinde charak-

teristisch (Cheville und Mengeling, 1969; van der Molen und van Oirschot,

1981). Bei tragenden Sauen, die haufig selbst keine Krankheitszeichen zeigen, ruft die

KSPV-Infektion eine Reihe fetaler Veranderungen hervor. Aborte, Totgeburten oder Miß-

bildungen konnen auftreten (Meyer et al., 1980). Persistent infizierte neugeborene Fer-

kel zeigen haufig keine Symptome, scheiden jedoch ihr Leben lang das Virus aus (van

Oirschot und Terpstra, 1977) und sterben letztendlich nach bis zu elf Monaten an

2.2. Diagnostik der Klassischen Schweinepest 9

der so genannten”late-onset“ Form der KSP (Meyer et al., 1981). Das Auftreten und die

Auspragung der klinischen Symptome, vor allem bei der akuten Verlaufsform, sind außerst

variabel, so dass man keines der Krankheitssymptome als pathognomonisch bezeichnen

kann.

2.2 Diagnostik der Klassischen Schweinepest

Die klinische Diagnostik ist v. a. bei alteren Tieren und in Zusammenhang mit moderat

oder schwach virulenten KSPV-Stammen schwierig, daher ist eine rasche und zuverlassige

labordiagnostische Bestatigung außerordentlich wichtig (Paton und Greiser-Wilke,

2003). Fur die labordiagnostische Untersuchung stehen sowohl Methoden zum Virus- und

Antigennachweis als auch serologische Nachweismethoden zur Verfugung. Die Methoden

sind auf Ebene der EU in der Richtlinie 2002/106/EC2 und dem angehangten technischen

Teil weitestgehend verbindlich festgelegt. Auf weltweiter Ebene beinhaltet das Manual of

Diagnostic Tests und Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees) (im

Weiteren Manual of Diagnostic Tests) des OIE in Kapitel 2.1.13 eine Auflistung und

genaue Erlauterung der Methoden3.

2.2.1 Virus- und Antigennachweis

Der Goldstandard des Virusnachweises ist nach wie vor die Virusisolierung aus Leukozyten

oder Organsuspensionen auf KSPV-permissiven Zellen (Moennig, 2000). Da das Virus

keinen zytopathischen Effekt induziert, erfolgt der Nachweis mit spezifischen Antikorpern

(Moennig, 2000), wobei die Abgrenzung zu anderen Pestiviren mit monoklonalen An-

tikorpern vorgenommen werden kann (Cay et al., 1989; Edwards et al., 1991). Ein

schneller Test ist der Nachweis viralen Antigens in Organschnitten mittels fluoreszieren-

der Antikorper (fluorescent antibody test, FAT) (Solorzano et al., 1966; Turner et al.,

1968; Bouma et al., 2001; Anonym, 2004a; Teifke et al., 2005). Der FAT ist weniger sen-

sitiv und bedarf geschulten und erfahrenen Personals (Moennig, 2000). In ahnlicher Wei-

se kann der Nachweis auch mittels Immunperoxidasefarung erfolgen (Anonym, 2004a).

2http://europa.eu.int/eur-lex/pri/en/oj/dat/2002/l_039/l_03920020209en00710088.pdf3http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00036.htm

10 2. Literaturubersicht

Fur Screeningtests großer Probenzahlen wird haufig ein Antigen-ELISA verwendet, der

jedoch im Vergleich zur Virusisolierung weniger sensitiv ist und in der Inkubationszeit, bei

chronisch erkrankten Tieren und bei niedrigen Virustitern zu falsch negativen Ergebnissen

fuhren kann (Kaden et al., 1999). Der Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR ist eine

schnelle und sensitive Nachweismoglichkeit, die in den letzten Jahren an Bedeutung ge-

wonnen hat (Paton et al., 2000a; Moennig, 2000; Paton und Greiser-Wilke, 2003).

In den vergangenen Jahren wurden viele verschiedene PCR-Ansatze entwickelt und teil-

weise fur die Diagnostik validiert (Sandvik et al., 1997; de A. Diaz et al., 1998; Thur

und Hofmann, 1998; McGoldrick et al., 1998, 1999; Paton et al., 2000a; Hofmann,

2003; Risatti et al., 2003; Handel et al., 2004; van Rijn et al., 2004; Gaede et al.,

2005; Hoffmann et al., 2005; Risatti et al., 2005; Ophuis et al., 2006).

2.2.2 Antikorpernachweis

Der Virusneutralisationstest (VNT) gilt als sensitivster und spezifischster Test zur Detek-

tion von Antikorpern gegen das KSPV. Da kreuzreagierende Antikorper gegen ruminante

Pestiviren Probleme in der Diagnostik bereiten konnen, werden i. d. R. differentialdiag-

nostische VNTs parallel durchgefuhrt (Moennig, 2000). Eine schnelle, jedoch weniger

sensitive Methode ist der Antikorper-ELISA, der fur”screening“-Tests eingesetzt werden

kann (Moennig, 2000).

2.3 Differentialdiagnostik der KSP

Aufgrund des vielfaltigen und unspezifischen klinischen und pathologischen Bildes kom-

men mehrere Erkrankungen viraler, bakterieller und nichtinfektioser Genese als Differen-

tialdiagnosen der KSP in Betracht und mussen im Verdachtsfall labordiagnostisch ausge-

schlossen werden.

Zu den Differentialdiagnosen gehort die akute Form der ASP (Kleiboeker, 2002), die

anhand der klinischen und pathologischen Erscheinungen nicht von der KSP zu unterschei-

den ist. Außerdem kommen Rotlauf, PRRSV-Infektionen, Cumarin-Vergiftungen, Purpura

haemorrhagica, das”Postweaning Multisystemic Wasting“ Syndrom (PMWS), das por-

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 11

zine Dermatitis und Nephropathie Syndrom (PDNS), Infektionen mit Salmonellen oder

Pasteurellen sowie jede fieberhafte Erkrankung des Respirations- oder Gastrointestinal-

traktes, die nicht auf Antibiotika reagiert, differentialdiagnostisch in Frage (Anonym,

2004a; Moennig et al., 2003). So konnen beispielsweise SHV-1-, porzine Parvovirus- sowie

Influenza-A Infektionen ahnliche Symptome wie KSP hervorrufen. Desweiteren konnen

auch Salmonellen, Leptospiren, andere Erreger viraler Meningoenzephalitiden und Stre-

potkokken einen ahnlichen Symptomkomplex auslosen (Anonym, 2004a).

Naturlich vorkommende Infektionen von Schweinen mit ruminanten Pestiviren (BVDV,

BDV) zeigen eine weltweite Verbreitung (Liess und Moennig, 1990). In Deutschland

traten u. a. BDV-Infektionen bei Schweinen aus gemischten Bestanden auf, die zu schwer-

wiegenden Problemen in der serologischen Diagnostik fuhrten (Oguzoglu et al., 2001).

Bei Schweinen stellen Infektionen mit ruminanten Pestiviren generell weniger ein Krank-

heitsproblem, als ein diagnostisches Problem bei der serologischen Abrenzung zu Infek-

tionen mit dem KSPV dar (Paton und Done, 1994). In Einzelfallen konnen Infektionen

mit BVDV und BDV auch bei Schweinen zu Fruchtbarkeitsstorungen (Snowdon und

French, 1968) und klinischen Erkrankungen fuhren, die der chronischen bzw.”late-

onset“ Form der KSP ahneln (Terpstra und Wensvoort, 1988; Paton et al., 1994).

Ein Virusnachweis ist selten moglich (Paton et al., 1994).

12 2. Literaturubersicht

2.3.1 Afrikanische Schweinepest

Die ASP wurde erstmals 1921 in Ost-Afrika beschrieben (Montgomery, 1921). Das Vi-

rus der ASP (ASPV) ist das einzige bisher bekannte DNA Arbovirus (Arthropod-borne)

(Brown et al., 1986; Dixon et al., 1995). Das Virus infiziert Vertreter der Familie Suidae,

zu der unter anderem das Hausschwein, das Wildschwein sowie Warzen- und Buschschwei-

ne gehoren. Zusatzlich kann sich das Virus in seinem Vektor, den Zecken des Genus Orni-

thodoros vermehren (Plowright et al., 1974). Die ASP wurde in den meisten Landern

sudlich der Sahara sowie West- und Nordafrikanischen Staaten beobachtet. In Europa ist

die Krankheit nach Seuchenausbruchen in den 60er bis 80er Jahren des vergangenen Jahr-

hunderts getilgt (mit Ausnahme von Sardinien) (Commission Decision 2005/363/EC)4.

Die ASP gehort ebenfalls zu den Erkrankungen, die sowohl national als auch international

anzeigepflichtig sind (Anonym, 2005a).

2.3.1.1 Das Virus der Afrikanischen Schweinepest

2.3.1.1.1 Taxonomie, Morphologie und physikalische Eigenschaften

Das ASPV ist der einzige Vertreter des Genus Asfivirus in der Familie Asfarviridae

(Dixon et al., 2000). Die Viruspartikel des ASPV sind ca. 200 nm groß, behullt und

haben einen ikosaedrischen Aufbau (s. Abbildung 2.4) (Modrow et al., 2003). Anhand

der Restriktionsenzymanalyse der Virus-DNA konnen funf ASPV-Gruppen unterschieden

werden, wobei nur die afrikanischen Stamme eine ausgepragte Diversitat zeigen (Murphy

et al., 1999).

2.3.1.1.2 Genomorganisation und virale Proteine

Das ASP-Virus enthalt eine doppelstrangige DNA mit einer Lange von ca. 170–190 kBp.

Die DNA besitzt kovalent geschlossene Enden mit inversen terminalen Wiederholungen

und Haarnadelschleifen (Murphy et al., 1999). Das Genom kodiert fur uber 200 Proteine,

die noch unzureichend charakterisiert sind (Kleiboeker et al., 1998; Modrow et al.,

2003). Das Hauptkapsidprotein VP72 des ASPV liegt mit einer Ubereinstimmung der

4http://europa.eu.int/eur-lex/lex/LexUriServ/site/en/oj/2005/l_118/l_11820050505en00370038.pdf

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 13

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

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Abbildung 2.4: Schematische Darstellung des ASP-Virus. (Nach Modrow et al. (2003)

Aminosaurensequenzen zwischen ASPV-Stammen aus allen Teilen der Welt von 97,8 % bis

100 % hochkonserviert vor und ist antigenetisch stabil. Es eignet sich daher als molekulare

Basis fur serologische und molekularbiologische Testmethoden (Yu et al., 1996).

2.3.1.2 Klinik und Pathologie

Die Virusubertragung erfolgt durch infizierte Zecken bzw. zwischen Hausschweinen so-

wohl vertikal als auch horizontal (Mebus, 1988; Kleiboeker et al., 1998; Moennig

et al., 2003). Der Krankheitsverlauf kann je nach Virulenz des Erregers von perakut bis

subklinisch variieren, wobei es einen Zusammenhang zwischen klinischer Auspragung der

Symptome und der Adaptation des Virusstammes an das Hausschwein gibt (Moennig

et al., 2003). Die akute Form ist durch hohes Fieber (40,5–42 ◦C), Leukopenie, Thrombo-

14 2. Literaturubersicht

zytopenie, Hyperamie und petechiale Blutungen im Bereich der Ohren, des Schwanzes, an

den Extremitaten sowie am Bauch gekennzeichnet. Gastrointestinale Storungen, Aborte

und respiratorische Symptome treten auf (Mebus, 1988; Anonym, 2005c). Der Tod tritt

nach 4–8 Tagen ein, die Mortalitat erreicht dabei fast 100 %. Bei der Sektion fallen ver-

großerte, hamorrhagische Lymphknoten, Splenomegalie und petechiale Blutungen in den

Nieren, der Harnblase und dem Larynx auf. Die subakute Form ist durch weniger dramati-

sche Symptome charakterisiert. Die Mortalitat betragt 30–70 %. Die chronische Form wird

von Gewichtsverlusten, undulierendem Fieber, respiratorischen Symptomen, Arthritiden

sowie Veranderungen der Haut begleitet. Die Mortalitat ist dabei gering (Mebus, 1988;

Anonym, 2005c).

2.3.1.3 Diagnostik

Da ASP klinisch und pathologisch nicht von der KSP zu unterscheiden ist, kommen fur

beide Erkrankungen gleiche Differentialdiagnosen in Frage (s. Kapitel 2.3). Zur Abgren-

zung und Bestatigung ist daher eine Labordiagnose notwendig. Es existieren Methoden

zum Nachweis des infektiosen Virus, viralen Antigens, viraler DNA und spezifischer An-

tikorper. Die empfohlenen Methoden sind im Manual of Diagnostic Tests und Vaccines

for Terrestrial Animals der OIE in Kapitel 2.1.125 festgehalten. Die zellkulturelle Isolie-

rung kann auf primaren porzinen Monozytenkulturen oder Knochenmarkszellen erfolgen,

wobei die Isolierung durch einen Hamadsorptionstest erweitert wird (Malmquist und

HAY, 1960; Moennig et al., 2003). Eine immer großere Rolle spielt in der Diagnostik

der Nachweis der viralen Nukleinsaure mittels PCR (Steiger et al., 1992; Gonzague

et al., 2002; Aguero et al., 2003; King et al., 2003; Bastos et al., 2003; Aguero et al.,

2004; Basto et al., 2005; Hjertner et al., 2005; Zsak et al., 2005). Ein Antigennach-

weis ist sowohl mittels FAT als auch in Antigen-ELISAs moglich (Moennig et al., 2003;

Pastor et al., 1990). Der serologische Nachweis kann im Antikorper-ELISA (Wardley

et al., 1979) oder mittels eines indirekten Immunfluoreszenztests (Moennig et al., 2003)

erfolgen.

5http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00035.htm

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 15

2.3.2 Aujeszkysche Krankheit

Die Aujeszkysche Krankheit (AK) wurde erstmals 1902 von dem ungarischen Tierarzt

Aujeszky beschrieben (Aujeszky, 1902). Die Erkrankung kann fast alle Saugetiere be-

treffen, verlauft jedoch bei den verschiedenen Spezies unterschiedlich. Das Schwein gilt

als Primarwirt und Reservoir des Virus (Murphy et al., 1999; Teuffert et al., 2005).

Die AK ist weltweit verbreitet und gehort zu den wirtschaftlich bedeutsamsten Virus-

infektionen. Sie spielt noch immer eine wichtige Rolle in den osteuropaischen Landern,

Deutschland dagegen gilt seit 2003 als AK frei. Der letzte Ausbruch wurde in Deutschland

im Jahre 2000 verzeichnet (Teuffert et al., 2005). Wie KSP und ASP befindet sich die

AK auf der Liste der Erkrankungen, die bei der OIE anzeigepflichtig sind. Dem Handi-

status der OIE6 zufolge (Stand am 13.01.2006) trat die AK im Jahr 2004 in mehreren

Landern der EU auf.

2.3.2.1 Suides Herpesvirus Typ 1

2.3.2.1.1 Taxonomie und Morphologie

Der Erreger der AK, das Suide Herpesvirus Typ 1 (SHV-1), gehort dem Genus Varicellovi-

rus der Subfamilie α-Herpesvirinae in der Familie Herpesviridae an (Klupp et al., 2004b),

zu dem auch das Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) und die Equinen Herpesviren Typ 1

und 4 gehoren. Die Virionengroße des SHV-1 betragt 150–170 nm. Im zentralen Kern, wel-

cher von einem ikosaedrischen Kapsid umgeben wird, befindet sich ein ca. 150 kbp langes,

doppelstrangiges DNA (dsDNA) Molekul. Zwischen dem Kapsid und der glykoprotein-

haltigen Lipidmembran befindet sich das aus mindestens 15 Proteinen zusammengesetzte

Tegument (Klupp et al., 2004b).

2.3.2.1.2 Genomorganisation und virale Proteine

Das lineare dsDNA-Genom des SHV-1 kann in ein langes und ein kurzes Segment ge-

gliedert werden, wobei jedes dieser Segmente eine als”Unique Long“- (UL) bzw.

”Unique

Short“(US)- Region bezeichnete, Sequenzfolge besitzt. Diese Regionen werden, wie die des

6http://www.oie.int/hs2/sit_mald_cont.asp?c_mald=21&c_cont=6&annee=2004

16 2. Literaturubersicht

Abbildung 2.5: Schematische Darstellung eines Herpesvirus. Nach Modrow et al. (2003)

Herpes-Simplex-Virus des Menschen, von invertierten Einheiten wiederholter Sequenzen

flankiert (Ben-Porat et al., 1983; Davison und Wilkie, 1983; Klupp et al., 2004a,b).

Es beinhaltet eine Vielzahl von open reading frames (ORF, offener Leserahmen) und ko-

diert fur eine große, bisher noch nicht genau bestimmte Anzahl an Proteinen (Klupp

et al., 2004b). Fur das SHV-1 wurden bisher 12 Glykoproteine identifiziert, die mit gB

bis gN bezeichnet sind (Modrow et al., 2003). Der hohe C/G-Gehalt erschwert eine

Sequenzierung des SHV-1-Genoms, dennoch liegt eine komplette Sequenz des SHV-1 vor

(Klupp et al., 2004a).

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 17

2.3.2.2 Klinik und Pathologie

Das SHV-1 hat ein breites Wirtsspektrum, das Schweine, Rinder, kleine Wiederkauer,

Fleischfresser, Kaninchen und Nager umfasst. Der Krankheitsverlauf ist beim Schwein

altersabhangig. Die Virusubertragung findet aerogen statt. Die Saugferkel erkranken akut

bis perakut. Sie zeigen typische zentralnervose Storungen mit Opisthotonus, Ataxien und

Krampfen. Die Mortalitat ist mit bis zu 100 % sehr hoch. Mit fortschreitendem Alter der

Tiere mildert sich der Krankheitsverlauf. Es kommt jedoch auch hier zu zentralnervosen

Storungen und Fieber. Sekundare Infektionen konnen das Krankheitsbild zusatzlich er-

schweren. Altere Schweine zeigen meistens einen subklinischen Krankheitsverlauf. Es kom-

men Fieber und respiratorische Symptome vor. Bei tragenden Sauen ruft die Infektion

mit SHV-1 Aborte, Mumifikationen oder Resorption der Fruchte hervor (Shope, 1931a;

Fraser und Ramachandran, 1969; McCracken et al., 1973; Schmidt et al., 1987).

In pathologisch-anatomischen Untersuchungen treten haufig leicht gestaute Lymphknoten

mit kleinen Blutungen auf. Petechien in den Nieren werden ebenfalls beobachtet (Frey,

2003). Zu den regelmaßig auftretenden Befunden gehoren auch entzundliche Verande-

rungen des oberen Respirationstraktes und ein Lungenodem. Eine Panenzephalitis ist

vor allem mikroskopisch nachweisbar. Insgesamt auffallig ist, dass die makroskopischen

Veranderungen auch bei jungen Tieren nicht sehr ausgepragt sind (Gustafson, 1970;

Murphy et al., 1999).

2.3.2.3 Diagnostik

Zur Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit stehen sowohl direkte, als auch indirekte

Nachweismethoden zur Verfugung. Auch fur die AK gibt es von der OIE empfohlene Me-

thoden, die im Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Kapitel

2.2.27, schriftlich niedergelegt sind. Die klassische Methode des Virusnachweises stellt die

Virusisolierung dar. Das SHV-1 lasst sich in einer Vielzahl von Zellkulturen unter Aus-

bildung eines deutlichen zytopathischen Effektes anzuchten (Gustafson, 1970). Das Vi-

rusantigen lasst sich außerdem mittels Immunfluoreszenztechniken (Gustafson, 1970),

Immunperoxidasetechniken oder PCR nachweisen (Echeverria et al., 2000; Krumb-

7http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00041.htm

18 2. Literaturubersicht

holz et al., 2003; van Rijn et al., 2004; Cao et al., 2005b; Huang et al., 2005; Yoon

et al., 2005). Als indirekte Methode bieten sich ELISA und Virusneutralisationstests an

(Frey, 2003). Besonders bei der serologischen Unterscheidung zwischen geimpften und

infizierten Tieren wird ein ELISA eingesetzt (van Oirschot et al., 1988; Lange et al.,

2003).

2.3.3 Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom

Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine der zur Zeit welt-

weit bedeutendsten Schweinekrankheiten. Es verursacht in Zucht- und Mastbetrieben ho-

he wirtschaftliche Schaden (Terpstra et al., 1991; Prieto und Castro, 2005). Der

Erreger des PRRS, das PRRS Virus (PRRSV), wurde erstmals 1990 in den Niederlanden

und kurz danach in den USA entdeckt (Wensvoort et al., 1991; Collins et al., 1992).

2.3.3.1 Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus

2.3.3.1.1 Taxonomie und Morphologie

Das PRRSV wird zusammen mit dem Virus der infektiosen equinen Arteritis (EAV),

dem lactate-dehydrogenase elevating-Virus (LDV) der Mause und dem simian hemorrha-

gic fever -Virus (SHFV) in die Familie Arteriviridae, Ordnung Nidovirales eingruppiert

(Meulenberg et al., 1993b; Cavanagh, 1997). Das PRRSV ist behullt, besitzt einen

Durchmesser von 50-65 nm und enthalt ein 25-35 nm großes Nukleokapsid (Benfield

et al., 1992; Wensvoort et al., 1992; Dea et al., 1995).

2.3.3.1.2 Genomorganisation und virale Proteine

Das PRRSV-Genom besteht aus einem ca. 15,1 kB langen, linearen, einzelstrangigen, po-

lyadenylierten RNA-Molekul. Die RNA kodiert fur acht ORFs. Von den ORFs la und lb

werden Replikations- und Transkriptionsproteine kodiert. Die ORFs zwei bis sieben ko-

dieren fur die Strukturproteine (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a;

Murtaugh et al., 1995). Man unterscheidet zwischen europaischen (PRRSV-EU) und

nordamerikanischen PRRSV-Isolaten (PRRSV-NA). Diese rufen im Allgemeinen ahnliche

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 19

Abbildung 2.6: Schematische Darstellung des PRRS-Virus. Nach Modrow et al. (2003)

Symptome hervor, unterscheiden sich jedoch sowohl in antigenetischen und genetischen

Eigenschaften als auch in der Virulenz (Prieto und Castro, 2005). Die Sequenzanalyse

des ORFs funf, der fur das Strukturglykoprotein GP5 kodiert, ergab eine ca. 55 %ige Se-

quenzhomologie zwischen europaischen und amerikanischen Stammen (Murtaugh et al.,

1995). Dies fuhrte zu Unterteilung des PRRSV in zwei verschiedene Genotypen – eu-

ropaische und amerikanische. Die Genomhomologie innerhalb europaischer Stamme liegt

nach unterschiedlichen Angaben zwischen 2–90 % (Murtaugh et al., 1995; Stadejek

et al., 2002), innerhalb amerikanischer bei ca. 90 % (Andreyev et al., 1997; Meng,

2000; Dee et al., 2001; Forsberg et al., 2002).

2.3.3.2 Klinik und Pathologie

Die klinischen Erscheinungen des PRRS sind sehr variabel und abhangig von dem Al-

ter und der Nutzungsrichtung der Tiere. Typischerweise sind es bei Absatzferkeln und

Laufern Fieber, Dyspnoe, Lethargie, Anorexie und Konjunktivitis. In einigen Fallen tre-

20 2. Literaturubersicht

ten Zyanosen an den Ohren und Extremitaten auf. Mastschweine zeigen ebenfalls Fieber

und Pneumonie, mit fortschreitendem Alter der Tiere treten ofter subklinische Infektio-

nen mit dem PRRSV auf (Benfield et al., 1999; Done et al., 1996; Rossow, 1998;

Anonym, 2004a). Bei tragenden Sauen, die milde Allgemeinsymptome zeigen konnen,

kann das PRRSV die Plazenta uberwinden und zu einer intrauterinen Infektion der Ferkel

fuhren. Fruhgeburten, lebensschwache Ferkel und hohe Ferkelverluste sind kennzeichnend

fur diesen Verlauf der Erkrankung (Yoon et al., 1993; Rossow et al., 1994; Mengeling

et al., 1995, 1996a; Wills et al., 1997; Prieto und Castro, 2005).

2.3.3.3 Diagnostik

Der Nachweis des PRRSV mittels Virusisolierung in permissiven Zellkulturen ist zwi-

schen dem ersten und zehnten Tag nach der Infektion (p.i. - post infectionem) moglich,

spater sinkt die Erfolgsquote rapide (Christopher-Hennings et al., 1995, 1998, 2001;

Mengeling et al., 1996b; Prieto et al., 2003). Die Anzucht in Zellkultur ist aller-

dings problematisch, da viele PRRSV-Stamme nicht in permanenten Zelllinien, sondern

nur in porzinen alveolaren Makrophagen (PAM) wachsen (Zhang et al., 1999). Oft ist

der Antikorpernachweis eine Alternative, jedoch kommt es zu einem schnellen Titerabfall

(Lager et al., 1997). Außerdem konnen die Antikorper gegen das Impfvirus das Ergebnis

bei vakzinierten Tieren beeinflussen (Egli et al., 2001). Des Weiteren besteht die Moglich-

keit, die Nukleinsaure des PRRSV nachzuweisen. Es existieren mehrere konventionelle

und real-time PCR-Protokolle, die den Virusnachweis auch bis zum Tag 31 p.i. erlauben.

Einige gestatten zusatzlich eine Differenzierung zwischen europaischen und amerikani-

schen Stammen (Meulenberg et al., 1993a; Mardassi et al., 1994; Christopher-

Hennings et al., 1995, 1998, 2001; Kono et al., 1996; Larochelle und Magar,

1997; Oleksiewicz et al., 1998; Spagnuolo-Weaver et al., 2000; Egli et al., 2001;

Stadejek et al., 2002; van Rijn et al., 2004; Wasilk et al., 2004; Revilla-Fernandez

et al., 2005; Chung et al., 2005; Kleiboeker et al., 2005).

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 21

2.3.4 Porzine Influenza

Die porzine Influenza ist eine akute, fieberhafte, respiratorische Erkrankung. Influenza-

viren wurden in Schweinen erstmals 1918 in den USA beobachtet (Easterday und

Hinshaw, 1992). 1930 gelang es Shope (1931b), das Virus zum ersten Mal aus erkrankten

Tieren zu isolieren. Den porzinen Influenzaviren kommt moglicherweise auch eine Rolle

bei der Entstehung neuer humanpathogener Influenzastamme zu (Truyen, 2003).

2.3.4.1 Das Influenza-A-Virus

2.3.4.1.1 Taxonomie und Morphologie

Das Virus der Spezies porzines Influenzavirus (im Weiteren Influenza-A Virus) gehort

zur Familie Orthomyxoviridae, Genus Influenzavirus-A. Influenza-A-Viren sind behullt

und besitzen ein helikalsymmetrisches Nukleokapsid. Die Virionen sind pleomorph, so

variiert ihre Große von ca. 70-90 nm bis hin zu 3000 nm (Modrow et al., 2003).

2.3.4.1.2 Genomorganisation und virale Proteine

Das Genom der Influenza-A-Viren besteht aus acht unabhangigen einzelstrangigen RNA-

Segmenten, die in negativer Polaritat vorliegen. Sie kodieren fur zehn Hauptstrukturpro-

teine. Die systematische Bezeichnung der Influenzaviren bezieht neben dem Typ auch die

Antigenstruktur der wesentlichen Strukturproteine des Virus, des Hamagglutinins (H) und

der Neuraminidase (N), sowie das Jahr und den Ort der Isolierung mit ein. Daraus ergeben

sich verschiedene H- und N-Typen. Beim Schwein wurden bisher hauptsachlich H1N1 und

H3N2 Influenzaviren gefunden (Olsen et al., 1993; Bikour et al., 1994; Truyen, 2003),

wobei letztere vermutlich auf Infektionen mit humanen Influenzaviren zuruckzufuhren

sind (Truyen, 2003). In den letzten Jahren hat sich die epidemiologische Situation in

Europa dramatisch verandert. H1N1, H3N2 und H1N2 Subtypen kozirkulieren in der eu-

ropaischen Schweinepopulation (Reeth et al., 2004). Klassische H1N1 Subtypen wurden

in den letzten Jahren durch avian-like H1N1 Stamme verdrangt (Pensaert et al., 1981;

Brown et al., 1993).

22 2. Literaturubersicht

Abbildung 2.7: Influenza-A Virus. Schematische Darstellung viraler Proteine. Nach

Modrow et al. (2003).

2.3.4.2 Klinik und Pathologie

Die Influenza-A-Virus-Infektion tritt beim Schwein in zwei klinischen Formen auf. Die

am weitesten verbreitete ist die respiratorische Form. Nach einer kurzen Inkubations-

zeit von ein bis vier Tagen treten die ersten Symptome auf. Charakteristisch sind dabei

hohes Fieber, trockener Husten, Dyspnoe, Hyperamie der Haut, Lymphknotenschwellun-

gen, interstitielle Pneumonie und seroser Nasen- und Augenausfluss (Zimmermann und

Plonait, 2001; Truyen, 2003). Die Krankheitssymptome konnen drei bis sieben Tage

anhalten. Außerdem ist das Influenza-A-Virus zusammen mit dem PRRSV (s. 2.3.3.1),

PCV-2 (s. 2.3.6.1), Mycoplasma hyopneumoniae und anderen bakteriellen Erregern am so

genannten porcine respiratory disease complex (PRDC, s. 2.3.6.2) beteiligt.

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 23

2.3.4.3 Diagnostik

Die endgultige Diagnose wird durch einen Virusnachweis gefuhrt. Das Virus kann auf

verschiedenen Zelllinien angezuchtet werden, die Virusisolierung erfolgt jedoch meist im

embryonierten Huhnerei. Die Uberprufung und Spezifizierung ist uber den Hamagglutina-

tionshemmtest mit spezifischen Antiseren moglich (Truyen, 2003). In Lungenschnitten

lasst sich das Antigen mittels Immunfluoreszenz-, bzw. Immunperoxidasetechnik nach-

weisen (Zimmermann und Plonait, 2001). Fur die serologische Untersuchung von Se-

rumpaaren steht der Hamagglutinationshemmtest zur Verfugung (Long et al., 2004). In

den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl an PCR-Protokolle zum Nachweis der Nu-

kleinsauren des Influenza-A Virus entwickelt (Fouchier et al., 2000; van Elden et al.,

2001; Choi und Chae, 2002; Matsuzaki, 2003; Richt et al., 2004; Stone et al., 2004;

Watzinger et al., 2004; Chen et al., 2005; Hindiyeh et al., 2005; Krafft et al., 2005;

Landolt et al., 2005; Zhang et al., 2005; Payungporn et al., 2006).

2.3.5 Porzine Parvovirus - Infektionen

Intrauterine Infektionen mit dem porzinen Parvovirus (PPV) gelten heute als wichtigs-

te Ursache fur das so genannte SMEDI-Syndrom (stillbirth, mummification, embryo-

nic death, infertility). Betroffen sind vor allem Bestande mit hohem Jungsauenanteil

(Plonait, 2001). Der Erreger wurde 1967 erstmals in England isoliert und ist weltweit

verbreitet. Die Seropravalenz betragt in deutschen Schweinehaltungen ca. 70 bis 80 %

(Truyen, 2003).

2.3.5.1 Das Porzine Parvovirus

2.3.5.1.1 Taxonomie und Morphologie Das PPV gehort zur Familie Parvoviri-

dae, Subfamilie Parvovirinae. Die Familie enthalt eine weitere Subfamilie - Densovirinae

mit den Genera Brevidensovirus, Densovirus und Iteravirus; die Subfamilie Parvovirinae

umfasst die Genera Dependovirus, Erythrovirus und Parvovirus (Murphy et al., 1995).

Die Parvoviren sind kleine, unbehullte, DNA Viren mit einem Virionendurchmesser von

ca. 20 nm (Mayr et al., 1968; Molitor et al., 1983).

24 2. Literaturubersicht

2.3.5.1.2 Genomorganisation und virale Proteine Das Genom des PPVs besteht

aus einer linearen, einzelstrangigen DNA mit negativer Polaritat und ist ca. 5000 Basen

lang (Molitor et al., 1984; Bergeron et al., 1993). Es besitzt zwei große und einen

kleinen ORF. Alle drei ORFs liegen auf dem komplementaren (positiven) Strang und

uberlappen sich gegenseitig (s. Abbildung 2.8). ORF1 kodiert fur Nichtstrukturprotei-

Abbildung 2.8: Schematische Darstellung des Genoms des Porzinen Parvovirus.

ne und fur die ersten zehn Aminosauren des Strukturproteins VP1. ORF2 kodiert fur

die Strukturproteine VP1 und VP2 (Bergeron et al., 1993). Das Genom der Parvovi-

ren ist von einem Kapsid umgeben, das sich aus den Strukturproteinen VP1 und VP2

zusammensetzt. VP2 ist das Hauptstrukturprotein. Das PPV besitzt außerdem die Nicht-

strukturproteine NS1, NS2 und NS3 (s. Abbildung 2.8), deren Funktionen jedoch noch

nicht genau geklart sind (Berns, 1990; Wilson et al., 1991). Die Aminosauresequenz

des VP2 ist vollstandig in der des VP1 enthalten. Beide Kapsidproteine werden uber die

gleiche”messenger“-RNA (mRNA) transkribiert. Wird die mRNA vom ersten Startcodon

aus translatiert, entsteht das VP1-Kapsidprotein; VP2 wird gebildet, wenn vom zweiten

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 25

Startcodon die mRNA translatiert wird. VPl und VP2 sind antigenetisch eng verwandt

(Molitor et al., 1983). Die Proteine werden durch alternatives Spleißen prozessiert, d. h.,

der gleiche Genomabschnitt wird in verschiedenen Leserastern abgelesen. Dabei dienen so-

wohl gespleißte als auch ungespleißte Transkripte als mRNA. Dieser Mechanismus macht

es den Parvoviren moglich, ihre gesamte Erbinformation innerhalb des kleinen Genoms

zu plazieren (Berns, 1990).

2.3.5.2 Klinik und Pathologie

Infektionen mit dem PPV fuhren zu Fruchtbarkeitsstorungen, die durch Umrauschen, Ab-

orte, Totgeburten, Mumifikation, neonatalen Tod und reduzierte neonatale Lebensfahig-

keit gekennzeichnet sind (Cartwright und Huck, 1967; Johnson und Collings,

1969; Morimoto et al., 1972; Narita et al., 1975; Forman et al., 1977). PPV wird

als haufigste Ursache fur Fruchtbarkeitsstorungen beim Schwein angesehen. In der Klinik

gilt es als Hauptursache des”SMEDI“ Syndroms. Die akute Infektion neonataler und adul-

ter Schweine mit dem PPV verlauft in der Regel subklinisch (Mengeling und Cutlip,

1976; Joo et al., 1977). Pathologische Veranderungen nach einer PPV-Infektion sind nur

bei Embryonen und Feten festzustellen.

Der Grad der klinischen Veranderungen hangt von der Virulenz des PPV-Stammes ab.

Avirulente Stamme konnen die Plazentarschranke nicht ubertreten (Mengeling und

Cutlip, 1976). Virulente Stamme sind nur pathogen fur noch nicht immunkompetente

Feten (Mengeling und Cutlip, 1976), nach Erreichen der Immunkompetenz werden

neutralisierende Antikorper gebildet (Bachmann et al., 1975). Hochvirulente Stamme

verursachen Lasionen bzw. fuhren auch nach Erreichen der Immunkompetenz zum Tod

(Kresse et al., 1985). Je nach Immunstatus und Alter der betroffenen Tiere kommt

es zu unterschiedlichen Auspragungen der klinischen Symptome. Die Palette reicht von

Fruchtresorbtion und Umrauschen, uber Aborte mumifizierter Fruchte bis hin zur Ge-

burt lebensschwacher Ferkel (Rodeffer et al., 1975; Cropper et al., 1976; Wrathall

und Mengeling, 1979; Mengeling et al., 1980; Kuiper, 1985). Der haufigste Krank-

heitsbefund ist die Mumifikation (Mengeling, 1975; Mengeling und Cutlip, 1976;

Donaldson-Wood et al., 1977; Cutler et al., 1983). Das PPV wird mit dem PMWS

(s. 2.3.6.2) in Zusammenhang gebracht, dabei zeigte sich, dass eine Koinfektion von neo-

26 2. Literaturubersicht

natalen Ferkeln mit PPV und PCV-2 (s. Kapitel 2.3.6.1) das Krankheitsbild von PMWS

verstarkt. PPV bewirkt dabei eine Immundysfunktion, die den Viruseintritt von PCV-2

in Zellen erleichtert (Ellis et al., 1999; Allan et al., 1999; Kennedy et al., 2000).

2.3.5.3 Diagnostik

Fur die PPV-Diagnostik stehen sowohl direkte als auch indirekte Nachweismethoden zur

Verfugung. Die Methode der Wahl fur den Nachweis von PPV ist die PCR, da mit ihr

auch der Nachweis viraler Nukleinsauren in mumifizierten Feten moglich ist, wenn kein in-

fektioses Virus mehr nachweisbar ist (Truyen, 2003). Es sind bisher mehrere gel-basierte

und real-time PCR-Protokolle publiziert worden (Molitor et al., 1991; Gradil et al.,

1994; Bergeron et al., 1996; Belak et al., 1998; Arnauld et al., 1998; Soares et al.,

1999; Choi und Chae, 2000; Ellis et al., 2000; Kim und Chae, 2001; Lyoo et al.,

2001; Kim und Chae, 2003; Kim et al., 2003b; Prikhod’ko et al., 2003; Huang et al.,

2004; Kim und Chae, 2004; Cao et al., 2005b). Alternativ besteht die Moglichkeit das

PPV in der Zellkultur zu isolieren. Mengeling (1975, 1978) stellte jedoch fest, dass die

Infektiositat progressiv nach den Tod des Fetus abnimmt und die Isolierung in Zellkul-

tur daher haufig erfolglos verlauft. Wegen der hohen Tenazitat ist bei diesen Verfahren

auch das Kontaminationsrisiko sehr hoch (Cartwright et al., 1969). Generell konnen

mit zunehmender Reife der Feten Antikorper auftreten, die den Virusnachweis storen

(Truyen, 2003). Relativ unspezifisch und weniger sensitiv ist der Hamagglutinationstest

bzw. der spezifische Hamagglutinationshemmtest (Jenkins, 1992; Mengeling et al.,

1993; Truyen, 2003). Die Immunfluoreszenztechnik erlaubt den Nachweis von PPV in

Geweben (Joo und Johnson, 1977; Mengeling, 1978), wobei sich v. a. Lungen eignen

(Truyen, 2003). Oraveerakul et al. (1990) haben ein”slot-blot hybridization“ - Pro-

tokoll mit nichtradioaktiven Sonden zum Antigennachweis in Gewebe und in Zellkultur

entwickelt. Zum indirekten Erregernachweis stehen kommerzielle ELISA-Kits zum semi-

quantitativen Nachweis von PPV-Antikorpern zur Verfugung. Da viele Schweine durch

Impfung, subklinische Infektionen oder maternale Antikorper seropositiv sind, ist eine

einmalige serologische Untersuchung nicht aussagekraftig. Daher wird die Untersuchung

von Serumpaaren durchgefuhrt (Truyen, 2003).

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 27

2.3.6 Porzine Circovirus-Infektionen

Das porzine Circovirus (PCV) wurde 1974 von Tischer et al. (1974) als Kontaminan-

te der stabilen porzinen Nierenzelllinie (PK-15) entdeckt. Es existieren zwei Typen des

PCVs. Wahrend das PCV Typ 1 als apathogen beschrieben wird, ist das PCV Typ 2

fur klinisch manifeste Infektionen verantwortlich. Das porzine Circovirus Typ 2 wurde

erstmals 1991 in Kanada als Ausloser klinischer Erkrankungen beschrieben. Seither fand

man ahnliche Bilder nahezu weltweit. Der Erreger ist beteiligt am PMWS, PDNS und

PRDC (Haas, 2003).

2.3.6.1 Das Porzine Circovirus

2.3.6.1.1 Taxonomie und Morphologie

Die porzinen Circovirus Typen 1 und 2 (PCV-1 bzw. PCV-2) gehoren zusammen mit den

Circoviren der Taube (Pigeon circovirus), der Gans (Goose circovirus), des Kanarienvogels

(Canary circovirus), der Ente (Duck circovirus) und dem Psittacine Beak and Feather

Disease Virus dem Genus Circovirus an (Mankertz et al., 2000; Todd et al., 2001a,b;

Ritchie et al., 1989). Das Chicken Anaemia Virus (Todd et al., 1990) ist der alleinige

Vertreter des Genus Gyrovirus (Pringle, 1999). Die beiden Genera sind in der 1993

etablierten Familie Circoviridae untergebracht (Studdert, 1993; Lukert et al., 1995).

Das PCV ist ein unbehulltes Virus mit einem Durchmesser der Viruspartikel von lediglich

17 nm (Tischer et al., 1982). Es ist damit das kleinste bekannte Virus. Das Nukleokapsid

hat ein Molekulargewicht von 36 kDa und besitzt eine ikosaedrische Symmetrie (Tischer

et al., 1982).

2.3.6.1.2 Genomorganisation und virale Proteine

Die Nukleinsaure der porzinen Circoviren liegt in Form einer zirkular geschlossenen, ein-

zelstrangigen DNA mit positiver Strangorientierung vor (Buhk et al., 1985; Tischer

et al., 1987; Meehan et al., 1997). Die Genomlange betragt beim PCV-1 1759 Basen

und beim PCV-2 1768 Basen (Hamel et al., 1998; Morozov et al., 1998). Beide Typen

sind phylogenetisch eng miteinander verwandt, die Nukleotidsequenzhomologie zwischen

ihnen betragt nach unterschiedlichen Aussagen ca. 68 % bis 80 % (Morozov et al., 1998;

28 2. Literaturubersicht

Hamel et al., 1998; Meehan et al., 1998). Die Nukleotidsequenzhomologien von Feld-

isolaten des PCV-2 liegen bei 96 % (Morozov et al., 1998). Porzine Circoviren besitzen

insgesamt elf ORFs innerhalb ihres Genoms (Hamel et al., 1998).

Im Bereich des ORF1 betragt die Homologie zwischen PCV-1 und PCV-2 85 % (Morozov

et al., 1998; Meehan et al., 1998). In den ORFs 5, 6, 9, 10 und 11 besitzen die bei-

den PCV Typen keinerlei Homologie. In den anderen ORFs ist sie unterschiedlich hoch

ausgepragt (Hamel et al., 1998). Der ORF2 besitzt zwischen PCV-1 und PCV-2 eine

hohere Sequenzvariabilitat. Sie liegt in disem Teil des Genoms bei ca. 66 % (Morozov

et al., 1998; Hamel et al., 1998). Wie Ilyina und Koonin (1992) zeigten, kodiert der

ORF1 fur ein replikationsassoziiertes Protein, die ORF2 kodiert fur Hauptkapsidproteine

(Nawagitgul et al., 2000; Meehan et al., 2001).

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Abbildung 2.9: Schematische Darstellung eines PCV-2. Nach Modrow et al. (2003).

2.3. Differentialdiagnostik der KSP 29

2.3.6.2 Klinik und Pathologie

Trotz der weltweiten Verbreitung des PCV-1 (Allan et al., 1998), wird das Virus als

apathogen angesehen (Tischer et al., 1986; Allan et al., 1995; Krakowka et al., 2000).

Weder in PCV-1-positiven Betrieben, noch bei experimentell infizierten Tieren konnten

Krankheitssymptome festgestellt werden (Allan et al., 1995). Die pathogene Rolle des

PCV-2 beim Schwein wird dagegen oft diskutiert (Allan et al., 1998; Meehan et al.,

1998; Kim und Chae, 2001, 2002; Pallares et al., 2002; Chae, 2004). Zur Ausbildung

eines Krankheitskomplexes sind aber weitere Koinfektionen oder Kofaktoren erforderlich

(Allan et al., 2000; Choi und Chae, 2000; Krakowka et al., 2001; Kim und Chae,

2003).

Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)

Das PCV-2 wurde erstmals von Ellis et al. (1998) mit dem PMWS in Zusammenhang

gebracht. Obgleich nachgewiesen wurde, dass das PCV-2 die Hauptursache des PMWS

ist, sind fur eine Ausbildung des Krankheitskomplexes weitere Kofaktoren erforderlich

(Ellis et al., 2004). Betroffen sind sechs bis 15 Wochen alte Schweine, typischerweise

sind es jedoch junge Tiere nach dem Absetzen (post-weaner) (Harding et al., 1998;

Harding, 2004). Die Diagnose PMWS kann nur gestellt werden, wenn die drei folgenden

Kriterien erfullt werden: typische klinische Symptome, Vorhandensein charakteristischer

mikroskopischer Lasionen und Anwesenheit des PCV-2 in den Lasionen (Segales et al.,

2004; Chae, 2004). Die sechs Hauptsymptome des PMWS sind Kummern, Dyspnoe,

vergroßerte Lymphknoten, Diarrhoe, Blasse und Ikterus (Harding, 2004). Bei der Sektion

fallen die nicht kollabierten, braun-marmorierten Lungen und vergroßerte Lymphknoten

auf (Rosell et al., 1999). Die Leber kann sowohl vergroßert, als auch verkleinert sein

und an den Nieren sind multiple helle Punkte verschiedener Große feststellbar (Rosell

et al., 2000; Segales et al., 2004).

Porzines Dermatitis und Nephropathie Syndrom (PDNS)

PDNS wurde erstmals von Smith et al. (1993) in Großbritannien beschrieben. Mittler-

weile kommt die Krankheit weltweit vor (Segales et al., 2004). Das Leitsymptom ist die

30 2. Literaturubersicht

Ausbildung von runden oder unregelmaßig geformten, rot bis violettgefarbten Hautarea-

len. Meistens sind sie an den Extremitaten, am Unterbauch, an den Flanken oder auch

an den Ohren lokalisiert (Harding, 2004). In schweren Fallen kommt es zu Abmagerung,

Anorexie und Fieber. Selten treten Todesfalle auf. Es kommt zu einer nekrotisierenden

Vaskulitis im Bereich der Haut und in den Nieren. Letztere sind dabei vergroßert, blass

und weisen petechiale Blutungen auf (Harding, 2004).

Porcine respiratory disease complex (PRDC)

Der PRDC ist durch Kummern, Husten und Pneumonie charakterisiert (Thacker et al.,

2000). Betroffen sind meistens Schweine im Alter von 16 bis 20 Wochen. Neben PCV-2

sind auch das PRRSV (s. Kapitel 2.3.3), das porzine Influenza Virus (s. Kapitel 2.3.4.1)

und Mycoplasma hyopneumoniae am Geschehen beteiligt (Thacker et al., 2000). Die

klinischen Erscheinungen sind von der Anzahl der beteiligten Erreger abhangig. In den

meisten Fallen ist es schwierig, PRDC von PMWS oder PRRS zu unterscheiden. Die

pathologischen Veranderungen in den Lungen sind mit denen von PRRS, oder bakteriellen

Infektionen (wie Salmonellose) identisch (Harms et al., 2001).

2.3.6.3 Diagnostik

Zum Nachweis des PCV-2 stehen sowohl direkte, als auch indirekte Nachweismethoden zur

Verfugung. Immunhistochemie und in situ Hybridisierung geben neben dem Erregernach-

weis auch eine Auskunft uber das pathologisch-histologische Geschehen im betroffenen

Gewebe (Choi und Chae, 1999, 2000; Kim und Chae, 2001; Kim et al., 2003a; Kim und

Chae, 2004). Ellis et al. (1998) und Choi et al. (2000) gelang der Nachweis von PCV-2

in verschiedenen Organen mittels Immunhistochemie unter Verwendung von mono- und

polyklonalen Antikorpern. In situ Hybridisierung erlaubt sowohl den Nachweis, als auch

Differenzierung zwischen PCV-1 und PCV-2 (Kim und Chae, 2001, 2002). Die PCR

bleibt im Vergleich zu in situ Hybridisierung die sensitivere Methode (Calsamiglia

et al., 2002). Es sind mehrere gel-basierte PCR-Protokolle publiziert (Ouardani et al.,

1999; Kim et al., 2001; Kim und Chae, 2004).

2.4. Polymerasekettenreaktion 31

2.4 Polymerasekettenreaktion

2.4.1 Prinzip

Die Polymerasekettenreaktion (PCR - Polymerase chain reaction), die zum ersten Mal

von Mullis und Faloona (1987) vorgestellt wurde, stellt eine in vitro Technik dar.

Dabei wird ein von zwei spezifischen Oligonukleotiden, den Primern, eingerahmtes DNA-

Fragment in einer enzymatischen, zyklischen Reaktion mehrfach vervielfaltigt. Im ers-

ten Schritt, der Denaturierung bei 92-95 ◦C, entsteht aus einer doppelstrangigen DNA

(dsDNA) einzelstrangige Matrizen-DNA (ssDNA). Danach wird der Reaktionsansatz auf

eine bestimmte Temperatur herunter gekuhlt, die von der Schmelztemperatur der jewei-

ligen Primer abhangig ist. Dabei kommt es zur Anlagerung (Annealing) der Primer an

die komplementaren Sequenzen der Matrizen-DNA. Im nachsten Schritt werden die Pri-

mer von einer DNA-abhangigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-

Triphosphate (dNTPs) und Magnesium-Ionen verlangert (Elongation). Die im ersten Zy-

klus entstandenen Reaktionsprodukte (Amplifikate) dienen in nachfolgenden Zyklen selbst

als Matrize. Die Polymerase verlangert den DNA-Strang solange sie sich nicht von ihm

lost, oder die Reaktion durch eine Temperaturerhohung unterbrochen wird. Damit wird

ein neuer Zyklus eingeleitet. Ublicherweise wird die Reaktion 20-40 mal wiederholt. In der

Theorie verdoppelt sich die Anzahl neu entstandener DNA-Kopien von Zyklus zu Zyklus.

Anders als in der Theorie, liegt in der Praxis der durchschnittliche Multiplikationsfaktor

in der Gesamtreaktion bei ca. 1,6 bis 1,7 je Zyklus (Kainz, 2000). Das spielt in der quan-

titativen PCR (s. 2.4.3.5), bei der die genaue Zahl der Ausgangskopien bestimmt werden

kann, eine entscheidende Rolle.

Die entstandenen DNA-Fragmente lassen sich anschließend durch Auftrennung anhand

der Fragmentgroße in einem Agarose-Gel (3.2.2.5) und anschließender Farbung mit einem

fluoreszierenden Farbstoff, wie z. B. Ethidiumbromid (Kemp et al., 1989) unter UV-

Licht bei 254 nm sichtbar machen (Sambrook et al., 1989). Durch einen parallel aufge-

tragenen Großenmarker lasst sich die Große des DNA-Amplifikats bestimmen (Mullis

und Faloona, 1987). Eine weitere Verifizierung der amplifizierten DNA laßt sich durch

Restriktionsenzymschnittmusteranalyse (Sambrook et al., 1989), Bestimmung der Nu-

kleotidabfolge durch Sequenzierung (Innis et al., 1988) oder Hybridisierung mit einer

32 2. Literaturubersicht

spezifischen Gensonde (Saiki et al., 1985; Sambrook et al., 1989) durchfuhren.

2.4.2 Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion

Einen großen Beitrag zur Erfolgsgeschichte der PCR leistete die Entdeckung der reversen

Transkriptase (RT) oder RNA-abhangigen DNA-Polymerase (Baltimore, 1970; Temin

und Mizutani, 1970). Die reverse Transkriptase ermoglichte in der Kombination mit

der PCR eine neue Untersuchungstechnik, die Reverse Transkription - Polymeraseket-

tenreaktion (RT-PCR). Durch die reverse Transkription lasst sich jede beliebige RNA

als PCR-Vorlage nutzen. Dabei wird die RNA zunachst in eine komplementare DNA

(cDNA) transkribiert, die anschließend in der PCR vervielfaltigt wird. Dadurch konnen

auch RNA-Viren mittels PCR nachgewiesen werden (Gao und Moore, 1996).

2.4.3 Real-time PCR

2.4.3.1 Prinzip und Techniken

Die real-time PCR (auch qPCR - quantitative PCR genannt) stellt eine Weiterentwick-

lung der konventionellen PCR dar. Der wichtigste Unterschied besteht in der Moglichkeit,

die amplifizierte DNA noch wahrend der Reaktion (in Echtzeit - real-time) zu detektie-

ren. Dabei gibt es zwei unterschiedliche Techniken. Bei der einen werden interkalierende

Farbstoffe, die sich in die doppelstrangige DNA einlagern (Higuchi et al., 1992, 1993)

eingesetzt, und bei der anderen sequenzspezifische Oligonukleotide (Sonden), die mit Fluo-

reszenzfarbstoffen markiert sind (Saiki et al., 1985; Sambrook et al., 1989). Mittlerweile

gibt es eine Vielzahl an fluoreszenzfarbstoffmarkierten Sonden auf dem Markt. Eine Uber-

sicht bieten Bente (2003) und Bustin und Nolan (2004a). In der Abbildung 2.10 sind

die Grundbegriffe der real-time PCR erklart. Weitere Informationen sind u.a. bei Bustin

(2000, 2002); Bustin und Nolan (2004c), sowie Bente (2003) zu finden.

2.4. Polymerasekettenreaktion 33

Abbildung 2.10: Schematische Darstellung einer Amplifikationsgrafik: Die gemessene

Fluoreszenz (Ordinate) wird gegen die Zyklenzahl (Abszisse) aufgetragen. In den ersten

Zyklen andern sich die Fluoreszenzwerte nur unwesentlich, hier wird die Basislinie (Ba-

seline) definiert. Aus der Standardabweichung der Fluoreszenz zwischen Zyklus drei und

15 multipliziert mit dem Faktor zehn, wird ein Fluoreszenzwert errechnet, der zur Grund-

fluoreszenz der Proben addiert wird. So ergibt sich der Schwellenwert (Threshold). Der

Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Schwellenwert wird als cycle-threshold

(Ct) bezeichnet. Er markiert einen Anstieg der Fluoreszenz uber den Schwellenwert. R+n ,

R−n - normalisierte Fluoreszenz einer positiven, bzw. negativen Probe. (∆Rn) - baseline-

korrigierte, normalisierte Fluoreszenz. Modifiziert nach Bente (2003).

2.4.3.2 SYBRTM-Green real-time PCR

SYBRTM-Green gehort neben Ethidiumbromid zu den so genannten interkalierenden Farb-

stoffen (Higuchi et al., 1992, 1993). Die Besonderheit dieser Farbstoffe liegt in der Fahig-

keit, unter UV-Licht, interkaliert in doppelstrangiger DNA, sichtbares Licht zu emittieren.

So besitzt SYBRTM-Green eine Anregungswellenlange von 497 nm und eine Emissions-

wellenlange von 520 nm (Higuchi et al., 1992, 1993). Der Vorteil dieser Farbstoffe ist,

dass sie universell einsetzbar sind (Bustin, 2000), andererseits binden sie an jede doppel-

strangige DNA, so dass auch unspezifische PCR-Produkte ein positives Signal emittieren

34 2. Literaturubersicht

(Vandesompele et al., 2002). Aus diesem Grunde wird am Ende einer SYBRTM-Green -

PCR eine Schmelzpunktanalyse durchgefuhrt (Ririe et al., 1997; Vandesompele et al.,

2002). Dabei wird der Reaktionsansatz in 1 ◦C Schritten von ca. 55 ◦C auf ca. 96 ◦C er-

hitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelstrangige

DNA denaturiert, ist durch einen Abfall der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes

gekennzeichnet. So kann fur jedes PCR-Produkt ein spezifischer Schmelzpunkt bestimmt

werden (Ririe et al., 1997).

2.4.3.3 TaqMan real-time PCR

Die so genannte TaqMan real-time PCR wurde erstmals von Holland et al. (1991) be-

Abbildung 2.11: Schematische Darstellung eines TaqMan Assays

2.4. Polymerasekettenreaktion 35

schrieben. Das Prinzip basiert auf der 5′–3′ Exonukleaseaktivitat der Taq-Polymerase.

Dies bedeutet, dass die Polymerase die vor ihr liegende, hybridisierte Sonde wahrend

der DNA-Strangverlangerung hydrolysiert. Nur bestimmte Polymerasen, unter anderem

die Taq-Polymerase, besitzen diese Fahigkeit (Kreuzer et al., 2000). Die Sonde ist ein

Oligonukleotid, das an seinem 5′-Ende ein Farbstoffmolekul und am 3′-Ende einen so ge-

nannten Quencher tragt (s. Kapitel 2.4.4.2). So lange sich die beiden Molekule auf der

Sonde, in unmittelbarer Nahe, befinden, kommt es zu keinem Anstieg der Fluoreszenz. So-

bald aber das Oligonukleotid von der Taq-Polymerase hydrolysiert wird, werden Farbstoff

und Quencher voneinander getrennt. Folglich kommt es zu einem irreversiblen Anstieg der

Fluoreszenz, der von dem real-time PCR-Gerat gemessen wird (Heid et al., 1996).

TaqMan-PCR ist unter den real-time PCR Methoden am weitesten verbreitet (Terry

et al., 2002). Sie ist ausreichend sensitiv um einzelne Mutationen in einer Sequenz zu

detektieren (Livak, 1999). Desweiteren erlaubt die Auswahl an verfugbaren Fluoreszenz-

farbstoffen TaqMan-Sonden fur multiplex PCRs zu verwenden (s. Kapitel 2.4.5).

2.4.3.4 Primer-probe energy transfer PriProET

Eine Weiterentwicklung der real-time PCR stellt das so genannte primer-probe energy

transfer System (PriProET ) dar (Rasmussen et al., 2003). Dieses System kombiniert die

Moglichkeit, das gebildete PCR-Produkt sondenbasiert in Echtzeit zu detektieren mit

der Option, die Hybridisierung der Sonde mittels Schmelzkurvenanalyse zu bestatigen.

Wie ublich werden zunachst zwei Primer fur die Amplifikation des ausgewahlten Ge-

nomfragments eingesetzt, dazu kommt eine produktspezifische Sonde. Wahrend einer der

beiden Primer mit einem Donor -Farbstoff markiert wird, ist die Sonde an einen Repor-

ter -Farbstoff gekoppelt. Die Primer werden in jedem PCR-Zyklus verlangert, so dass

sich die Sonde an den gebildeten DNA-Strang anlagern kann. Dabei findet die Ener-

gieubertragung vom Donor -Farbstoff auf den Reporter -Farbstoff statt. Dadurch, dass die

Fluoreszenz nur in Anwesenheit des spezifischen Produkts erfolgen kann, wird eine direk-

te PCR-Quantifizierung anhand der vom Reporter-Farbstoff abgestrahlten Lichtmenge

ermoglicht (Rasmussen et al., 2003, 2005).

36 2. Literaturubersicht

Abbildung 2.12: Beim primer-probe energy transfer System (PriProET ) werden zusatz-

lich zum Forward -Primer ein mit Fluoreszenzfarbstoff markierter Reverse-Primer und ei-

ne ebenfalls markierte Sonde verwendet. Der Donor -Farbstoff (FAM) ist am 5′-Ende des

Reverse-Primers, der Reporter -Farbstoff (Cy5) am 3′-Ende der Sonde platziert. Wahrend

der Amplifizierung wird der Primer-Strang verlangert, die FAM-markierte Sonde bindet

daran und es findet eine Energieubertragung von FAM zu Cy5 statt. Damit wird eine

Quantifizierung des Produktes moglich, da das von Cy5 ausgestrahlte Licht direkt pro-

portional zur gebildeten Produktmenge ist. Die Verwendung einer Polymerase ohne 5′-

3′-Exonukleaseaktivitat verhindert die Sondenhydrolyse. Aus 5′–3′-Exonukleaseaktivitat

verhindert die Sondenhydrolyse. Aus Rasmussen et al. (2003).

2.4.3.5 Quantitative real-time PCR

Die quantitative real-time PCR wird bei Genexpressionsstudien, bei der Bestimmung der

Viruslast in der Labordiagnostik, oder im Rahmen von Pathogenesestudien eingesetzt

2.4. Polymerasekettenreaktion 37

(Schang und Osorio, 1993; Heid et al., 1996; Bustin, 2000; van Elden et al., 2001;

Bensaude et al., 2004; Ward et al., 2004; Chung et al., 2005). Dabei wird der Ct-

Wert (s. Abbildung 2.10) als Bezugsgroße genutzt, da er sich umgekehrt proportional

zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsaure verhalt (Higuchi et al., 1993).

Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen.

2.4.3.5.1 Absolute Quantifizierung

Die absolute Quantifizierung erlaubt eine relativ prazise Bestimmung der Viruslast, der

Kopienzahl oder der gesamten Nukleinsaurekonzentration. Als Ergebnis bekommt man

einen absoluten Zahlenwert mit einer Einheit (z. B. Kopienzahl, µg DNA). Die absolute

Quantifizierung kann sowohl mit als auch ohne interne Kontrolle erfolgen. Die Quantifizie-

rung ohne interne Kontrolle erfolgt anhand einer externen Standardkurve mit bekannten

Konzentrationen (Bustin, 2000; Pfaffl, 2004). Als interne Kontrolle kann eine exogene

DNA (oder RNA) verwendet werden, mit der jede Probe versetzt wird. Sie wird zusam-

men mit dem Zielgen amplifiziert und erlaubt so, falsch negative Ergebnisse zu erkennen

(Anonym, 2005b).

2.4.3.5.2 Relative Quantifizierung

Bei der relativen Quantifizierung erfolgt eine Quantifizierung der zu detektierenden Nu-

kleinsaure relativ zu einem Housekeeping-Gen. Das Hauptcharakteristikum eines Hou-

sekeeping-Gens ist, dass es moglichst in allen Geweben gleich hoch exprimiert wird. So

werden mit Hilfe externer Standards die absoluten Mengen von Ziel- und Referenzgen aus

dem gleichem Probenmaterial kalkuliert. In weiteren Tests werden die Zielgen Konzentra-

tionen als relative Menge gegenuber dem Referenzgen bestimmt (Bustin, 2000; Pfaffl,

2004; Anonym, 2005b).

38 2. Literaturubersicht

2.4.4 Design und Optimierung einer PCR

2.4.4.1 Auswahl der nachzuweisenden Genomregionen

Zum Nachweis von Viren mittels PCR werden spezifische Genomabschnitte ausgewahlt.

Dabei sollten die Primerbindungsstellen moglichst hoch konserviert sein, d.h. die Genom-

sequenzen durfen keine, bzw. nur wenige Unterschiede zwischen Vertretern einer Erreger-

spezies aufweisen. Bei den viralen Erregern stellen nicht kodierende Genomregionen oder

auch Gene fur Nichtstrukturproteine – also Abschnitte, die geringerem Evolutionsdruck

unterliegen, haufig geeignete Bereiche dar (Belak und Thoren, 2001).

2.4.4.2 Primer- und Sondendesign

Die optimale Produktlange fur die real-time RT-PCR liegt zwischen 80 und 100 bp (Bustin,

2000). Es ist auch moglich eine TaqMan-PCR mit Produktlangen bis 400 bp durchzufuhren

(Bustin und McKay, 1999), doch kurzere Fragmente werden effektiver amplifiziert und

sind toleranter in Bezug auf die Reaktionsbedingungen. Dies ist darauf zuruckzufuhren,

dass die kurzeren Fragmente leichter denaturieren, und so leichter von Primern und Son-

den gebunden werden. Die Amplifikationsrate der Taq-Polymerase betragt zwischen 30-

70 Basen/sec (Jeffreys et al., 1988), und so sind 15 sec ausreichend fur den Amplifika-

tionsschritt (Bustin, 2000).

Beim Primerdesign mussen vor allem folgende Kriterien berucksichtigt werden: die Schmelz-

temperatur (Tm), die Amplifikatgroße und die Lokalisation der TaqMan-Sonde. Die Schmelz-

temperatur ist definiert als diejenige Temperatur, bei der die Helixstruktur (zwischen

Primer und Zielstrang) zur Halfte verloren gegangen ist. Sie ist abhangig von der Basen-

zusammensetzung und wird nach Baldino et al. (1989) wie folgt berechnet:

Tm = 81, 5 + 16, 6(log10[J+]) + 0, 41( %G + C) − (675/n)

J = Konzentration monovalenter Kationen in mol/l

(% G + C) = Anteil der Basen Cytosin und Guanin in Prozent

n = Anzahl der Nukleotide

2.4. Polymerasekettenreaktion 39

Die optimale Primerlange betragt ca. 18-25 Basen (bis 30 b), der G/C-Gehalt sollte zwi-

schen 20 % und 70 % liegen und die Schmelztemperatur eines Primerpaares nicht mehr

als ein bis zwei ◦C von der angestrebten Temperatur (60 ◦C bei TaqMan-PCRs) abwei-

chen (Bustin, 2000). Ublicherweise werden die Primer in Konzentrationen von 50 nM bis

300 nM eingesetzt. Zu hohe Primerkonzentrationen begunstigen die Bildung von Primer-

Dimern und unspezifischen Produkten, zu niedrige Konzentrationen resultieren in herab-

gesetzter Sensitivitat der PCR.

Das Sondendesign unterscheidet sich nicht wesentlich von dem der Primer. Wie Bustin

(2000) beschreibt, sollte die Sonde ca. 30 Basen lang sein und eine um ca. 10 ◦C hohere

Schmelztemperatur als die Primer besitzen.

Die Auswahl der Reporterfarbstoffe ist in erster Linie von den detektierbaren Lichtwel-

lenlangen des real-time PCR-Gerates abhangig. Im Falle einer multiplex real-time PCR

mussen die Emissions- und Anregungsspektren verschiedener Farbstoffe weit genug von-

einander getrennt sein (s. Abbildung 2.13), damit keine Interferenzen bei der Fluores-

zenzmessung entstehen (Bustin und Nolan, 2004a; Bente, 2003). Die verschiedenen

Reporterfarbstoffe benotigen ensprechende Quencher. In der real-time multiplex PCR ha-

ben sich nichtfluoreszierende Quencher8 bewahrt. Die so genannten Black Hole Quencher

(BHQTM-1, BHQTM-2 und BHQTM-3; Biosearch Technologies, Novato, USA) besitzen kei-

ne Eigenfluoreszenz und geben das aufgenommmene Licht als Warme ab (Parkhurst

und Parkhurst, 1995a,b). Die Aufnahmespektren betragen bei BHQTM-1 480-580 nm,

BHQTM-2 550-650 nm und bei BHQTM-3 620-730 nm.

Informationen uber weitere Parameter und Richtlinien, die beim Primer- und Sonden-

design zu beachten sind, sind bei Mulhard (2002); Bustin und Nolan (2004d) und

Bente (2003) zu finden.

2.4.4.3 Ermittlung von DNA-Sekundarstrukturen

Fur eine effiziente Amplifikation der Ziel-DNA spielen Sekundarstrukturen, die die DNA

bei der Anlagerungstemperatur (Annealing) ausbildet, eine wichtige Rolle. Wichtig ist da-

bei, dass das 3′-Ende der Primer an einem moglichst linear vorliegenden Teil der Matrize

8Eine Ubersicht von Quenchern ist bei Bustin und Nolan (2004a) oder im WWW zu finden.

40 2. Literaturubersicht

450 500 750700650600550

Cy2 JOE TAMRA Cy5

FAM HEX ROX Cy7

TET Cy3 Texas Red

Abbildung 2.13: Emissonsspektren verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe

bindet, um eine problemlose Anlagerung der Polymerase zu gewahrleisten (Peters et al.,

2004). Zuker (2003) entwickelte, basierend auf den Erkenntnissen von SantaLucia

(1998) zu DNA-Sekundarstrukturen unter verschiedenen thermodynamischen Bedingun-

gen ein Programm (mFold), welches die Uberprufung der moglichen Sekundarstrukturen

der Matrizen-DNA bei einer gegebenen Temperatur und Reaktionsbedingungen gestattet.

Dieses Programm ist frei zuganglich unter http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold.

2.4.4.4 Optimierungsschritte

Die Optimierungsschritte spielen bei der Entwicklung einer PCR, vor allem einer multi-

plex PCR, eine wichtige Rolle (Nolan, 2004). Der Einsatz von optimierten Primer- und

Sondenkonzentrationen erlaubt eine Reduktion der Konzentration im Ansatz, was wie-

derum die Sensitivitat und Spezifitat erhoht. Nicht zuletzt spielt der finanzielle Faktor

eine wichtige Rolle (Brisson et al., 2004). Die Optimierungsschritte erfordern den Einsatz

geeigneter Ziel-DNA, meistens sind es gereinigte PCR-Produkte oder linearisierte Plasmi-

de mit klonierten Zielsequenzen (s. 3.2.2.7). Nicht linearisierte zirkulare Plasmide stellen

kein geeignetes Ziel dar (Nolan, 2004). Nachdem die Identitat des Amplifikats gesichert

ist (s. 2.4.1), werden die optimalen Primerkonzentrationen mit Hilfe von SYBRTM-Green

real-time PCRs ermittelt (s. 3.2.2.4.2). Dies hat zum Ziel die Primerkonzentrationen zu

2.4. Polymerasekettenreaktion 41

ermitteln, bei denen die Template-DNA (bzw. cDNA) am effektivsten amplifiziert wird

(Nolan, 2004). Anschließend werden die optimalen Konzentrationen fur die Sonde ermit-

telt; je niedriger der Ct-Wert und je hoher der ∆Rn-Wert, umso besser funktioniert die

Sonde (Peters et al., 2004; Nolan, 2004). Doch die Fluoreszenz- und Ct-Werte alleine

geben keine Auskunft uber die Effizienz und die Kinetik der PCR. Die Erstellung einer

Standardkurve kann weitere Informationen uber Effizienz, Sensitivitat und Genauigkeit

der PCR geben (Higuchi et al., 1993; Bustin, 2000). Zur Erstellung der Standardkur-

ve werden die ermittelten Ct-Werte der Standardverdunnung gegen ihre logarithmische

Konzentration (z. B. Kopienzahl) aufgetragen. Die Neigung der Standardkurve korelliert

mit der Effizienz der PCR und wird nach folgender Formel berechnet:

Effizienz = [10(−1/slope)] − 1

slope = Neigung der Standardkurve

Wenn die Effizienz der PCR bei 100 % liegt, betragt die Neigung der Standardkurve -

3,32 (Bustin, 2000; Bustin und Nolan, 2004b). Das Bestimmheitsmaß - R2 (Pearson

Correlation Coefficient), ausgedruckt als eine Zahl zwischen null und eins, gibt Auskunft,

wie nah einzelne Komponenten in einem mehrfach Ansatz dem Mittelwert sind. Anhand

dieser Kriterien werden die einzelnen PCRs beurteilt und ggf. optimiert.

2.4.5 Multiplex real-time PCR

Die multiplex PCR stellt eine material- und zeitsparende Technik zur simultanen Am-

plifikation mehrerer PCR-Ziele in einem Reaktionsansatz dar. Dies spielt v. a. in dia-

gnostischen Tests und wissenschaftlichen Analysen eine Rolle, da die haufig begrenzte

Probenmenge ein limitierender Faktor ist (Bustin, 2000). Die Umsetzung erfolgt durch

den Einsatz eines oder mehrerer Primerpaare mit mehreren, unterschiedlich markierten

Sonden (Edwards und Gibbs, 1994; Mackay et al., 2002). Fur TaqMan-basierte Sys-

teme konnte gezeigt werden, dass bis zu drei bzw. vier PCR-Ziele erfolgreich miteinander

kombiniert werden konnen, ohne die Sensitivitat im Vergleich zu Einzelreaktionen we-

sentlich zu beeintrachtigen (Moody et al., 2000; Grace et al., 2003; van Rijn et al.,

2004). Entscheidend fur eine erfolgreiche Amplifikation ist ein sorgfaltiges Primerdesign.

42 2. Literaturubersicht

Die gewahlten Primer sollten eine maximale Spezifitat besitzen und eine moglichst maxi-

male Amplifikationseffizienz gewahrleisten (Brisson et al., 2004; Peters et al., 2004).

Dabei wird empfohlen, die Primer und Sonden fur das spezielle System neu zu entwerfen

und direkt aufeinander abzustimmen. Es konnte gezeigt werden, dass so entwickelte Pro-

tokolle leistungsfahiger sind (Brisson et al., 2004). Neben den Eigenschaften der Primer

sind auch deren optimale Konzentrationen von Bedeutung (Bej et al., 1990). Die Opti-

mierung der Reaktionskomponenten (dNTPs, MgCl2, Polymerase etc.) erfolgt analog zu

konventionellen PCRs. Besonderes Augenmerk gilt bei der Optimierung einer multiplex

PCR der Minimierung der moglichen Primer- und Sondeninteraktionen (Elnifro et al.,

2000). Real-time multiplex PCR-Protokolle sind in der humanmedizinischen Diagnostik

inzwischen verbreitet (Meng et al., 2001; Candotti et al., 2004; Templeton et al.,

2004). In den vergangenen Jahren wurden auch in der Veterinarmedizin derartige Proto-

kolle entwickelt (van Rijn et al., 2004; Huang et al., 2004; Cao et al., 2005a; Chung

et al., 2005; Belak, 2005; Kleiboeker et al., 2005).

Zu den multiplex real-time PCR-Protokollen, die fur die veterinarmedizinische Diagnostik

konzipiert und publiziert wurden, gehoren unter anderem Testprotokolle, die im Rahmen

eines EU Projektes (Projekt-Nummer QLK2-CT-2000-00486)9 entwickelt wurden, dessen

Ziel die Entwicklung, Standardisierung und Harmonisierung neuer, molekulardiagnosti-

scher Methoden zum Nachweis acht relevanter, porziner Erregern war. Das in so genannte

Workpackages (WP) untergliederte Projekt wurde von sechs europaischen Laboratorien

durchgefuhrt.

Das Konzept schloss das SHV-1, ASPV, KSPV, PRRSV, das Virus der Maul- und Klauen-

seuche (MKS-Virus), PPV, das Virus der Vesikularen Schweinekrankheit (SVDV - swine

vesicular disease virus) sowie Vesikulare Stomatitis Virus (VSV - vesicular stomatitis vi-

rus) ein. Die nachzuweisenden Erreger wurden in diesem Projekt so genannten Clustern

zugeordnet, die die Erreger nach Symptomenkomplexen einteilten. Der respiratorisch-

reproduktive Cluster beinhaltete Molecular Beacon-basierte multiplex-PCRs fur den Nach-

weis von KSPV/ASPV und PRRSV/SHV-1/PPV. Weiterhin wurden so genannte PriPro-

ET (Primer-Probe Energy Transfer system) fur den Nachweis von VSV, SVDV, MKS-

Virus, ASPV, KSPV und PPV etabliert. Mit diesem System wurden Nachweismetho-

den fur Erreger des”hamorrhagischen“ Clusters (ASPV/KSPV) und des

”vesikularen“

9http://www.multiplex-eu.org

2.5. Prinzipien der Validierung von Diagnosetests 43

(ehemalige OIE Liste-A Krankheiten) Clusters (SVDV/VSV/MKS-Virus) in multiplex-

Ansatzen entwickelt.

Neben der Etablierung der einzelnen Protokolle befasste sich das Projekt zudem mit der

Etablierung und Optimierung der Methoden zur Nukleinsaurereinigung und -extraktion

sowie mit der Entwicklung geeigneter Kontrollen.

2.4.6 Interne Kontrollen

Fur die Kontrolle der Nukleinsaureextraktion und Amplifikation empfiehlt es sich, in-

terne Kontrollen einzufuhren (Belak, 2005). Dabei konnen z. B. Housekeeping genes

verwendet werden. Unter Housekeeping genes versteht man eine Reihe konstitutiv expri-

mierter, proteinkodierender Gene, welche von jedem Zelltyp und in jedem Zellstadium

exprimiert werden. Typischerweise sind es Gene des Grundstoffwechsels (Thellin et al.,

1999). Die von diesen Genen kodierten mRNAs werden u. a. auch in Genexpressionsstu-

dien als interne Standards eingesetzt. Haufig verwendete Housekeeping genes sind β-Aktin

und Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), 18S rRNA und β-2 Mikro-

globulin sowie Ubiquitin C (Schmittgen und Zakrajsek, 2000; Vandesompele et al.,

2002). Fur die Verwendung in quantitativen Studien sollte die Auswahl der internen Re-

ferenz individuell nach Prufung verschiedener Housekeeping genes erfolgen, da kein op-

timaler, allgemein gultiger Standard existiert (Bustin, 2002). Bei der Verwendung der

Housekeeping genes als interne Referenz in qualitativen Ansatzen, erfolgt der Einsatz

v. a. aufgrund der kontinuierlichen Expression und Nachweisbarkeit (Thellin et al.,

1999; Vandesompele et al., 2002).

2.5 Prinzipien der Validierung von Diagnosetests

2.5.1 Allgemein

Das Internationale Tierseuchenamt - OIE (Office International des Epizooties) in Paris

gibt (sinngemaß) folgende Definition eines validierten Tests: Die Validierung von Diagno-

setests ist eine Evaluierung eines diagnostischen Tests zur Bestimmung seiner Fahigkeit

44 2. Literaturubersicht

fur einen speziellen Einsatz. Ein validierter Test liefert konsequent Ergebnisse, die es er-

lauben, Tiere als positiv oder negativ einzustufen, und als Schlussfolgerung eine prazise

Aussage uber deren Infektionsstatus gibt. Das von OIE empfohlene Validierungsschema

(Anonym, 2004b) umfasst die folgenden funf Stufen und ist in Abbildung 2.14 dargestellt.

1. Feststellung der Durchfuhrbarkeit und Einsatzfahigkeit der Methode fur die Frage-

stellung

2. Wahl, Optimierung und Standardisierung der Reagenzien, Techniken und Methoden

3. Bestimmung der Testleistung

4. Fortlaufende Beobachtung der Testleistung

5. Fortfuhrung und Ausweitung der Validierung

2.5.2 Validierung von PCR

Der Validierung von PCR-Tests ist ein Kapitel im Manual of Diagnostic Tests and Vacci-

nes for Terrestrial Animals10 gewidmet (Anonym, 2004c), welches eine Spezifikation des

oben genannten Funf-Stufen-Konzepts darstellt.

10 http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00014.htm

2.5. Prinzipien der Validierung von Diagnosetests 45

Abbildung 2.14: Das OIE-Validierungsschema fur diagnostische Tests. D-SN – diagnos-

tische Sensitivitat; D-SP – diagnostische Spezifitat; PV+ PV– predictive value +/– . Nach

Anonym (2004b).

3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Zelllinien

3.1.1.1 PK(15)A

Die permanente epitheloide Zelllinie PK(15)A (porcine kidney (15) Amsterdam) wurde

1974 durch Einzelzellklonierung hergestellt1. Sie ist frei von BVDV, Mykoplasmen, Bak-

terien und Pilzen und wird im europaischen Referenzlabor (EURL) fur KSP als Referenz-

zelllinie fur die KSP-Diagnostik und KSPV-Vermehrung eingesetzt. Im Rahmen dieser

Arbeit diente sie ebenfalls der Vermehrung von KSPV.

3.1.1.2 EFN-R

Die EFN-R-Zellen stellen eine permanente epitheloide Zelllinie aus fetalen Schweinenie-

ren dar. Die Zelllinie ist frei von Mykoplasmen, Bakterien, Pilzen und einer Reihe boviner

und porziner Viren. Sie ist empfanglich fur verschiedene porzine Viren. Im Rahmen die-

ser Arbeit wurde sie zur Vermehrung von porzinem Influenza und porzinem Parvovirus

verwendet.

1Liess, personliche Mitteilung

47

48 3. Material und Methoden

3.1.1.3 MARC-145

Fur die Anzucht von PRRSV wurden die Zelllinie MARC-145 verwendet. Es handelt sich

hierbei um fetale Nierenzellen des Rhesusaffen, genauer um einen Klon der epitheloiden

Zelllinie MA-104. Die Zelllinie ist frei von Mykoplasmen, Bakterien, Pilzen, acht bovinen

und sieben porzinen Viren.

3.1.1.4 Rie 255

Die Anzucht der PPV-Isolate erfolgte auf der permanenten porzinen Hodenzelllinie STE,

die aus der Zellbank des Friedrich-Loeffler-Institutes (Bundesforschungsinstitut fur Tier-

gesundheit) stammte und dort unter der Katalognummer RIE 255 gefuhrt wird. Diese

polymorph-epitheloide Zelllinie ist permissiv fur PPV, SHV-1, verschiedene Enteroviren,

das Virus der transmissiblen Gastroenteritis und KSPV. Der Linienpass bestatigt die

Freiheit von Mykoplasmen und sieben porzinen und acht bovinen Viren.

3.1.2 Untersuchungsmaterial

3.1.2.1 Virusisolate und klinische Proben

Fur die Etablierung und Validierung der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten PCRs wur-

den verschiedene Virusisolate, positives und negatives Probenmaterial sowie bestimmte

Plasmide verwendet. Die Isolate des Suiden Herpesvirus 1 (s. Tabelle 3.1) wurden freund-

licherweise vom Nationalen Referenzlabor fur Aujeszkysche Krankheit, Friedrich-Loeffler-

Institut, Wusterhausen zur Verfugung gestellt. Vier verschiedene Isolate des porzinen

Parvovirus wurden von Prof. U. Truyen, Universitat Leipzig, zur Verfugung gestellt. Im

Einzelnen handelt es sich um PPV–Stamm NADL-2 und drei Stamme mit der Bezeich-

nung”PPV-Nr.2“,

”PPV-Nr.3“ und

”PPV-Nr.4“.

Ein weiteres PPV- sowie ein PRRSV-Isolat, sowie funf Schweineseren in denen PCV-2

nachgewiesen wurde, wurden freundlicherweise von Dr. S. Kenklies, Landesamt fur Ver-

braucherschutz Sachsen-Anhalt zur Verfugung gestellt.

Drei Influenza-A Virusisolate mit der Bezeichnung”H3N2-Schwein“,

”H1N1-Schwein“ und

”KP“ stammten aus der Sammlung des Institutes fur Virologie der Stiftung Tierarztliche

3.1. Material 49

Hochschule Hannover.

Insgesamt zwolf porzine Influenzavirusisolate (s. Tabelle 3.2) wurden freundlicherweise

von der”IDT / Impfstoffwerk Dessau-Tornau GmbH“ zur Verfugung gestellt. Es han-

delte sich um sechs H3N2, vier H1N1 und zwei H1N2-Stamme, die uber embryonier-

te Huhnereier isoliert, und auf MDBK-Zellen kultiviert wurden. Die zellkulturinfektiose

Dosis50 (TCID50) lag bei allen Stammen uber 105,0 TCID50/ml. Die im Rahmen die-

Tabelle 3.1: SHV-1 Isolate.

Isolat-Nr. Orig. Nr. Herkunft

I 1 SA 229 / 92 Cottbus

I 18 AUZ 269 Frankfurt an der Oder

I 37 Vi 1804 / 95 Oldenburg / Stade

I 57 V 50 Stendal

I 311 Vi 736/37 Hannover

I 321 Vi 433 Hannover

I 351 Vi 936 Hannover

I 386 V 7231/95 Arnsberg

I 387 Vi 816 Berlin

I 397 VO / 12 / 14 Berlin

I 410 3386/95 Kassel

I 423 1325/96 Kassel

I 425 1329/96 Kassel

I 427 I1 / 51 Nurnberg

I 450 SP 9871/90 Osterreich

I 517 Frankreich

I 527 Frankreich

I 537 99,6 Frankreich

I 549 V 46302/98 CSR

I 550 1869 Land Brandenburg

I 611 PA 1520 / 2002 Koblenz

I 612 YSW 185 / 03 Land Brandenburg

50 3. Material und Methoden

ser Arbeit fur die Validierung und Etablierung der PCRs eingesetzten klinischen Proben

und Virusisolate verschiedener Pestiviren stammten aus der Sammlung des EURL fur

KSP, Hannover. Die in (s. Tabelle 3.3) dargestellte Probenauswahl wurde im Rahmen der

Spezifitatsprufung eingesetzt. Ein PPV-Isolat sowie PCV-2 positives Untersuchungsmate-

rial wurden freundlicherweise vom Staatlichen Veterinaruntersuchungsamt Arnsberg zur

Verfugung gestellt.

PCV-2 negatives Untersuchungsmaterial aus PCV-2 spezifisch pathogenfreien (SPF) Schwei-

nen wurde freundlicherweise von Frau Dr. B. Thur, IVI, Mittelhausern, Schweiz uberlassen

und als Negativkontrolle zur Etablierung und Validierung der PCR eingesetzt.

Uber 40 klinische Proben stellte freundlicherweise Frau Dr. E. große Beilage, Außenstelle

fur Epidemiologie, Bakum, Tierarztliche Hochschule Hannover zur Verfugung. Es handel-

te sich dabei um Proben aus der Routinediagnostik.

Zwei PRRSV Impfstamme wurden ebenfalls verwendet. Der Impfstoff Porcilis R© PRRS

Tabelle 3.2: Influenza-A – Isolate. Die Subtypen sind jeweils hinter der Stammbezeich-

nung in Klammern aufgefuhrt. Der Hamagglutinationstiter (HA-Titer) wurde von der IDT

GmbH bestimmt.

Lfd. Nr. Stamm Passage HA-Titer/

Influenza-A virus/swine Originalbestimmung

1 Berlin/5780/00 (H3N2) 2 1:512

2 Lohne/1/98 (H3N2) 2 1:256

3 Bakum/3543/98 (H1N1) 2 1:256

4 Belzig/54/01 (H3N2) 2 1:512

5 Lohne/1/97 (H3N2) 2 1:512

6 Belzig/2/01 (H1N1) 3 1:256

7 Bakum/1362/98 (H3N2) 2 1:256

8 Bakum/909/93 (H3N2) 2 1:64/128

9 Bakum/1832/00 (H1N2) 3 1:512/1024

10 Bakum/1833/00 (H1N2) 3 1:16/32

11 Bakum/5/95 (H1N1) 12 1:512

12 Potsdam/1/81 (H1N1) 3 1:1024

3.1. Material 51

Tabelle 3.3: Pestiviren-Isolate. VS = Virussuspension, OM = Organmaterial.

Datenbank Nr. Urspr. Name Jahr Land Wirt Genotyp Material

CSF0104 Diepholz 1/Han 94 1994 DE HS 2.3 VS

CSF0184 V 487/93 1993 DE WS 2.3 VS

CSF0277 V 1240/97 1997 DE HS 2.1 Serum

CSF0309 Kanagawa 1974 JP - Outgroup VS

CSF0573 Parma98 1998 IT HS 2.2 VS

CSF0634 VI 3837/38 1999 DE HS 2.3 OM

CSF0650 Guatemala HC GT HS 1.3 Serum

CSF0695 759/Ru 1999 RU HS 1.1 OM

CSF0902 Alfort 187 1968 FR 1.1 Serum

CSF0905 Brescia IT 1.2 OM

BVDV NADL BVDV 1a VS

BVDV 7443 BVDV 1 VS

5521-DE BVDV 2 VS

BDV Moredun BDV VS

BDV Frijters BDV VS

BDV S137-4 BDV VS

D15/99 Arnsberg Pestivirus VS

basiert auf europaischem Stamm DV des PRRSV (Fa. Intervet, Unterschleißheim), der

Ingelvac PRRS MLV auf amerikanischen Stammen ATCC VR2332 und ATCC VR2385

(Fa. Boehringer Ingelheim, Ingelheim).

3.1.2.2 Plasmide

Die Plasmide”Dixon 2“,

”Dixon 3“,

”Dixon 5“ und

”Dixon 6“ wurden freundlicherweise

von Dr. Donald P. King, Veterinary Laboratories Agency, Weybridge, UK, zur Verfugung

gestellt. Es handelte sich dabei um pGEM R©-T-easy Plasmide mit klonierter Sequenz des

VP72 Proteins des Virus der Afrikanischen Schweinepest mit einer Lange von 537 bp.

52 3. Material und Methoden

3.1.2.3 Antikorper und weitere Materialien

Die im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten diagnostischen Antikorper und weitere Mate-

rialien sind im Anhang A.1 aufgefuhrt.

3.1.2.4 Kits zur Nukleinsaureisolierung

Kits zur Nukleinsaureisolierung und entsprechende Protokolle sind in Kapitel 3.2.2.1 auf-

gefuhrt.

3.2 Methoden

3.2.1 Klassische virologische Methoden

3.2.1.1 Zellkultur

Alle verwendeten Zelllinien wurden bei 37 ◦C und 5 % CO2-Atmosphare in 25 cm2 – Zell-

kulturflaschen (s. Anhang A.6.2) kultiviert und in Intervallen von drei bis vier Tagen

passagiert (falls nicht anders angegeben). Die Methoden und Medien waren fur die jewei-

lige Zelllinie spezifisch.

3.2.1.1.1 PK(15)A

Die Kultivierung der Zellen erfolgte in 75 cm2 Zellkulturflaschen (Greiner) unter Verwen-

dung von Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) Kulturmedium mit 5 % fetalem

Kalberserum (FKS). Es wurden ca. 1,6 × 106 Zellen in acht ml Medium pro 75 cm2 ein-

gesat. Der Zellrasen war nach drei bis vier Tagen konfluent. Zur Zellpassage wurde das

Medium entfernt und der Zellrasen einmal mit adjusted trypsin-versen (ATV) gespult.

Anschließend wurden zwei ml ATV auf die Zellen gegeben und 15 bei 37 ◦C inkubiert.

Sobald sich der Zellrasen vom Untergrund gelost hatte, wurden die Zellen in acht ml

Medium aufgenommen, resuspendiert und zwei ml der Zellsuspension mit 25 ml Medium

weiterpassagiert.

3.2. Methoden 53

3.2.1.1.2 EFN-R

Die Kultivierung der EFN-R Zellen entsprach der der PK(15)A Zellen. Als Erhaltungs-

medium wurde EMEM-Kulturmedium mit Hanks-Salzen und 5 % FKS verwendet.

3.2.1.1.3 MARC-145

Die Kultivierung der MARC-145 Zellen entsprach in weiten Teilen der der PK(15)A Zellen.

Als Erhaltungsmedium wurde EDulb mit 10 % FKS Antibiotikazusatz verwendet.

3.2.1.2 Virustitration

Zur Titerbestimmung einer Virussuspension wurde eine Endpunktverdunnung eingesetzt.

Die zu titrierende Virussuspension wurde im entsprechenden Kulturmedium in log10 Stu-

fen von 10−1– 10−8 verdunnt. Vier Kavitaten einer Mikrotiterplatte wurden mit je 100 µl

der entsprechenden Verdunnungsstufe beschickt. Anschließend wurden jeder Kavitat 50µl

einer auf 300000 Zellen/ml Medium (unter Zusatz von 10 % FKS) eingestellten Zellsuspen-

sion zugesetzt. Die Kultur wurde 72 h in einer feuchten Kammer bei 37 ◦C und 5 % CO2 im

Brutschrank inkubiert. Der Virusnachweis erfolgte mit den unter 3.2.2.4 und 3.2.1.3 be-

schriebenen Methoden. Die Ermittlung des Titers erfolgte nach der Formel von Kaerber

(1931) in 50 % kulturinfektiosen Dosen (KID50) KID50.

logKID50 = L1,0 − Lint(S − 0, 5)

L1,0 Logarithmus der hochsten Verdunnungsstufe mit der Reaktionsrate 1,0

Lint = Logarithmus des Verdunnungsintervalls

S Summe der Reaktionsraten, begonnen bei der letzten Reaktionsrate, die 1,0 betragt

3.2.1.3 Peroxidase-Linked-Assay

24–72 Stunden nach der Infektion (abhangig von eingesetztem Virus) wurde der Zell-

kulturuberstand abgenommen und die Platten nach einmaligem Waschen mit 1/3 PBS

54 3. Material und Methoden

fur drei Stunden bei 80 ◦C in einem Heissluftsterilisator fixiert. Der Zellrasen der hitze-

fixierten Platte wurde nach dem Abkuhlen auf Raumtemperatur mit PBS-Tween (0,1 %

Tween, s. Anhang A.3.1) benetzt und jede Kavitat mit 50 µl der Konjugat-Losung befullt

(die Konjugatverdunnung war virusabhangig). Anschließend erfolgte eine einstundige In-

kubationzeit bei 37 ◦C. Danach wurde das Konjugat wieder abgenommen, die Platte

dreimal mit PBS-Tween und einmal mit A. bidest. gewaschen. Die Kavitaten wurden

nun mit 50 µl frisch angesetzter 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC)-Substrat-Losung (AEC-

Dimethylformamid-Stammlosung, Natriumazetatpuffer pH 6,8 und 3 %iges H2O2, s. An-

hang A.3.1) beschickt. Nach etwa 10–15 min Inkubation war das Zytoplasma der infi-

zierten Zellen aufgrund einer peroxidasevermittelten Reaktion rot gefarbt. Anschließend

wurde das Substrat entfernt und die Kavitaten zweimal mit A. bidest. gewaschen und

aufgefullt. Die Auswertung der Platten erfolgte lichtmikroskopisch. Eine Kavitat galt als

positiv, wenn das Zytoplasma mindestens einer Zelle gefarbt war.

3.2.1.4 Virusvermehrung

Fur Virustitrationen, weitere Tests zur Validierung und Etablierung der PCRs und Be-

vorratung wurden die in dieser Arbeit eingesetzten Viren, soweit es moglich war, in der

entsprechenden Zellkultur (s. Kapitel 3.1.1) vermehrt. Dazu wurden die Zellen in 25 cm2

oder 75 cm2 Zellkulturflaschen ausgesat und 24 Stunden spater im semikonfluenten Zu-

stand mit einem ml Virussuspension inokuliert. Nach einer Adsorbtionszeit von 1 h bei

37 ◦C wurden sieben ml Erhaltungsmedium zugegeben und die Zellkultur fur 72 h bei 37 ◦C

und 5 % CO2 inkubiert. Darauf folgend wurde die infizierte Zellkultur einem Gefrier-Tau-

Zyklus (1 h bei −80 ◦C) unterzogen um intrazellular vorliegende Virionen freizusetzen. Das

Gemisch wurde anschließend 15 min bei 1750× g und 4 ◦C zentrifugiert. Der Uberstand

wurde vorsichtig dekantiert, portioniert und bei −80 ◦C gelagert.

3.2. Methoden 55

3.2.2 Molekularbiologische Methoden

3.2.2.1 Nukleinsaureisolierung

Fur die Nukleinsaureisolierung aus den unterschiedlichen Untersuchungsmaterialien wur-

den verschiedene kommerziell erhaltliche Systeme nach Herstellerangaben eingesetzt.

3.2.2.1.1 RNA Isolierung aus Zellkultur und Serum

Fur die RNA Extraktion aus dem Zellkulturuberstand wurde der High Pure Viral RNA

Kit der Fa. Roche, Mannheim (s. Anhang A.2) verwendet. Der Kit funktioniert nach fol-

gendem Prinzip. Nach der Lyse des eingesetzten Materials mit einem Detergenz wird die

virale RNA freigesetzt. Danach bindet die virale RNA in Anwesenheit chaotroper Sal-

ze selektiv an Glasfasern im Mikrozentrifugen-Rohrchen. Die RNA bleibt wahrend der

folgenden Waschschritten an die Membran gebunden. Schließlich wird die RNA mittels

Elutionspuffer von der Membran gelost.

Im Einzelnen wurden folgende Schritte durchgefuhrt. Die Arbeitslosung wurde herge-

stellt, indem aliquotierte poly(A) carrier RNA mit 2,5 ml Bindepuffer versetzt wurde. An-

schließend wurden 200 µl Zellkulturuberstand mit 400 µl Arbeitslosung gemischt, 10 min

bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und danach auf das Mikrozentrifugen-Rohrchen mit

Glasfasern gegeben. Im Folgenden wurde 15 sec bei 13000× g zentrifugiert, 500 µl Inhi-

bitor Removal Puffer auf die Saule gegeben und erneut eine min bei 8000× g zentrifu-

giert. Danach wurde die Saule zwei Mal mit 450 µl Waschpuffer gewaschen und eine min

bei 8000× g zentrifugiert; schließlich noch Mal 10 sec bei 13000× g zentrifugiert. Der

Durchlauf und das Auffanggefaß wurden verworfen, die Saule in ein 1,5 ml Reaktionsgefaß

uberfuhrt. Die RNA wurde mit 50 µl Elutionspuffer eluiert und das Gefaß eine min bei

13000× g zentrifugiert. Die RNA wurde sofort in ein Eisbad gestellt und in der reversen

Transkription eingesetzt oder bei −80 ◦C eingefroren.

3.2.2.1.2 RNA-Isolierung aus Organmaterial und Blut

Die RNA-Isolierung aus Organ- und zellhaltigem Material erfolgte mit Hilfe des RNeasy R©

Lipid Tissue Kits.

Der Kit basiert auf der Phenol-Chloroform Extraktion mit anschließender Gesamt-RNA-

56 3. Material und Methoden

Isolierung uber Silica-Gel-Membran. Dabei lysiert das QIAzol -Reagenz (ein Phenol-Guanidin-

Isothiocyanat-Gemisch) das Probenmaterial. Nach Zugabe von Chloroform und darauf

folgender Zentrifugation trennt sich die Losung in wassrige und organische Phasen. Die

die RNA befindet sich in der oberen wassrigen Phase, die DNA in der mittleren und

Proteine in der unteren, organischen, oder in der mittleren Phase. Aus der oberen Phase

wird anschließend die RNA uber die Silica-Gel-Saule isoliert, und dabei durch mehrfaches

Waschen von Verunreinigungen befreit. Die Isolierung erfolgte geringgradig modifiziert

nach dem Protokoll des Herstellers, das folgende Schritte vorsah:

Ein etwa erbsengroßes Gewebestuck wurde steril entnommen, zerkleinert und in ein 1,5 ml

Reaktionsgefaß uberfuhrt. Unter Zugabe von 750 µl QIAzol-Reagenz wurde das Gewe-

bestuck mit einem Mikropistill homogenisiert. Nach 5 min Inkubation bei Raumtempe-

ratur wurden 200 µl Chloroform zugegeben und 15 sec geschuttelt. Es folgten drei min

Inkubation bei Raumtemperatur und anschließend 15 min Zentrifugation bei 12000× g

und 4 ◦C. Durch die Zentrifugation trennte sich die Probe in drei Phasen, eine obere

farblose, wassrige, eine mittlere weiße und eine untere rote, organische Phase. Die RNA

befand sich in der oberen Phase.

Die obere Phase (max. 600 µl) wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefaß uberfuhrt, ein Volu-

menaquivalent (600 µl) 70 %iges Ethanol zugegeben und beides vermischt. Darauf folgend

wurden bis zu 700 µl des Gemisches auf die RNeasy Saule gegeben und 15 sec bei 8000× g

zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen. Der Schritt wurde nochmal ein Mal wie-

derholt. Danach wurden 700 µl Puffer RW1 auf die RNeasy-Saule gegeben und 15 sec

bei 8000× g zentrifugiert. Es schloss sich ein zweimaliger Waschschritt mit 500 µl RPE-

Puffer und eine Zentrifugation fur 15 sec bei 8000× g an. Der Durchlauf wurde jeweils

verworfen. Danach wurde die Saule auf ein neues 1,5 ml Reaktionsgefaß gesetzt und 30 µl

RNase-freies Wasser auf die Membran der Saule geben, fur eine min bei Raumtemperatur

inkubiert und anschließend eine min bei 8000× g zentrifugiert. Die eluierte RNA wurde

sofort in ein Eisbad gestellt und entweder direkt in der reversen Transkription eingesetzt

oder bei −80 ◦C eingefroren.

3.2.2.1.3 DNA-Isolierung aus Zellkultur und Serum

Die DNA-Isolierung aus Zellkulturlysat und Serum erfolgte mit Hilfe des QIAamp R© DNA

Mini Kits (A.2). Die Extraktion erfolgte nach Protokoll des Herstellers, das folgende

3.2. Methoden 57

Schritte vorsah:

Die Probe wurde zunachst auf Raumtemperatur gebracht. Danach wurden und 200 µl

der Probe in ein 1,5 ml Reaktionsgefaß mit 20 µl Proteinase K verbracht. Anschließend

wurden 200 µl Puffer AL dazugegeben, gemischt und bei 57 ◦C fur 10 min inkubiert. Die

Probe wurde kurz anzentrifugiert, bevor 200 µl 96 %iges Ethanol dazugegeben und mit der

Probe vermischt wurden. Das Gemisch wurde anschließend auf die QIAamp Saule in einem

Reaktionsgefaß gegeben und bei 6000× g fur eine min zentrifugiert (der Durchlauf und

das Reaktionsgefaß wurden nach jedem folgenden Waschschritt verworfen und die Saule

in ein neues Reaktionsgefaß gesetzt). Danach wurden 500 µl des Puffers AW1 auf die

Saule gegeben und bei 6000× g fur eine min zentrifugiert. Anschließend folgte 500 µl des

Puffers AW2, der wiederum auf die Saule gegeben und bei 13000× g fur 3 min zentrifugiert

wurde. Die Saule wurde auf ein 1,5 ml Reaktionsgefaß gesetzt, 200 µl des Puffers AE

daraufgegeben und fur eine min inkubiert. Anschließend folgte Zentrifugation bei 6000× g

fur eine min. Die eluierte DNA wurde direkt in der PCR eingesetzt oder bei −20 ◦C

eingefroren.

3.2.2.1.4 DNA Isolierung aus Organmaterial und Blut

Fur die DNA-Isolierung wurde der DNeasy R© Tissue Kit verwendet. Dafur wurden ca.

25 µg Gewebe mit einer Skalpellklinge in kleine Stucke geschnitten, in ein 1,5 ml Reak-

tionsgefaß verbracht und mit 180 µl Puffer ATL und 20 µl Proteinase K gemischt. Die

Probe wurde nun bei 55 ◦C bis zu kompletten Lyse des Materials (1-3 h) inkubiert. Nach

kurzem Durchmischen wurden 200 µl Puffer AL zu der Probe dazugegeben, grundlich ge-

mischt und bei 70 ◦C fur 10 min inkubiert; anschließend wurden 200 µl 96 %iges Ethanol

dazupipettiert und nochmals grundlich gemischt. Das Gemisch wurde auf eine DNeasy

mini Saule gegeben und bei bei 6000× g fur eine min zentrifugiert. Der Durchlauf und

das Reaktionsgefaß wurden nach jedem Waschschritt verworfen und die Saule in ein neues

Reaktionsgefaß gesetzt. Danach wurden 500 µl des Puffers AW1 auf die Saule gegeben und

bei 6000× g fur eine min zentrifugiert. Anschließend wurden 500 µl des Puffers AW2 auf

die Saule gegeben und bei 13000× g fur 3 min zentrifugiert. Die Saule wurde in ein neues

1,5 ml Reaktionsgefaß gesetzt, 200 µl des Puffers AE daraufgegeben und fur eine min ste-

hen gelassen. Anschließend wurde sie bei 6000× g fur eine min zentrifugiert. Die eluierte

DNA wurde direkt in der PCR eingesetzt oder bei −20 ◦C eingefroren.

58 3. Material und Methoden

3.2.2.2 Reverse Transkription

Die reverse Transkription erfolgte nach einem laboreigenen Protokoll, welches von K. Fie-

big2 fur den Nachweis von PRRSV in der PCR optimiert wurde. Dafur wurden in einem

0,5 ml Reaktionsgefaß 26 µl des Mastermixes I (bestehend aus 8 µl 5×RT-Puffer, 8 µl

dNTP Mixes 2,5 mM je Nukleotid und 10 µl DEPC Wasser) und 7 µl RNA zusammen-

pippettiert und anschließend bei 80 ◦C fur 5 min inkubiert. Die Mischung wurde danach

sofort wieder in ein Eisbad gestellt. Nach dem Abkuhlen wurde der Mastermix II (beste-

hend aus 3,5 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 2 µl 1:15 Hexameren, 0,5 µl 25 mM MgCl2,

0,5 µl RNase Inhibitor und 1,5 µl Reverse Transkriptase (s. Anhang A.2)) dazupipettiert,

der Ansatz zuruck in den Cycler gestellt und das Programm fortgestzt. Es folgten 5 min

bei 25 ◦C, 1 h bei 55 ◦C, 5 min bei 99 ◦C und schließlich eine Abkuhlung auf 4 ◦C. Das

gesamte Programm ist in der Tabelle 3.4 dargestellt. Die auf diese Weise synthetisierte

cDNA wurde direkt in der PCR eingesetzt oder bei −20 ◦C eingefroren.

Tabelle 3.4: Reverse Transkription, thermisches Profil

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

80 ◦C ∞ 1

80 ◦C 5 min 1

4 ◦C ∞ 1

25 ◦C 5 min 1

55 ◦C 1 h 1

99 ◦C 5 min 1

4 ◦C ∞ 1

3.2.2.3 Primer- und Sondendesign

3.2.2.3.1 Sequenzsuche und Alignment

Bei der Entwicklung der in dieser Arbeit beschriebenen PCRs3 wurden alle frei verfugba-

2K. Fiebig, personliche Mitteilung3Außer PRRSV. Nach Kleiboeker et al. (2005)

3.2. Methoden 59

ren Sequenzen in der Genomdatenbank GenBank 4 gesucht, heruntergeladen und lokal

gespeichert. Anschließend wurden die Sequenzabschnitte mit hoher Konservierung in den

relevanten Genomregionen anhand des mit Hilfe des Programms ClustalW (Thompson

et al. (1994) s. Anhang A.7) erstellten Alignments ermittelt. Das ClustalW wurde aus

dem Bioedit R© Programm (s. Anhang A.7) aufgerufen und bedient, das fur die Arbeit mit

Sequenzen benutzt wurde.

3.2.2.3.2 Auswahl von Primern und Sonden

Die Auswahl von Primern und Sonden erfolgte anhand der Kriterien, die unter 2.4.4.2

beschrieben sind. Bei der computergestutzten Primer- und Sondensuche wurde das Pro-

gramm Beacon Designer 2.13 (s. Anhang A.7) verwendet. Das Programm ermoglichte eine

gezielte Suche nach Primern und TaqMan-Sonden. Es konnten mehrere Sequenzen gleich-

zeitig bearbeitet werden, so dass es fur die Entwicklung von multiplex TaqMan-PCRs

geeignet war. Als Suchkriterien wurden in Tabelle 3.5 dargestellten Werte verwendet.

Da fur Pestiviren kein Primerpaar und TaqMan-Sonde mit Hilfe des Programms gefunden

wurde, wurde die Suche manuell unter Berucksichtigung der Richtlinien (s. Kapitel 2.4.4.2)

durchgefuhrt. Die Ergebnisse der Primer- und Sondensuche sind im Kapitel 4.2.1 zusam-

mengefasst.

3.2.2.3.3 Evaluierung von Primern und Sonden

Ermittlung von unspezifischen Bindungen

Fur die Ermittlung von unspezifischen Bindungen von Primerpaaren, die zu Amplifikation

von unspezifischen Produkten fuhren konnten, wurden das so genannte Basic Local Align-

ment Search Tool (BLAST)5 (Altschul und Koonin, 1998) eingesetzt. Dabei werden

eingegebene Oligonukleotid-Sequenzen mit allen in der BLAST-Datenbank verfugbaren

Sequenzen verglichen, gefundene Homologien ubermittelt und grafisch dargestellt.

4http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/5Im Internet unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast verfugbar

60 3. Material und Methoden

Tabelle 3.5: Einstellungen und Parameter der Primer- und Sondensuche im Beacon De-

signer 2.13

Parameter Wert

Primer Length Range 19-30 bp

TaqMan Length Range 20-34 bp

Primer Target Tm 57 ◦C ± 1 ◦C

TaqMan Target Tm +10 ◦C ± 1 ◦C

Amplicon Length 75-120 bp

Hairpin max. ∆G -6 kcal/mol

Self Dimer max ∆G -9 kcal/mol

Run/Repeat Maximum Length 3 bp

Multiplexing ∆G -9 kcal/mol

Maximum bases between Primer and Taqman 9

Ermittlung von sekundaren Strukturen

Die Ermitllung der DNA-Sekundarstrukturen erfolgte mittels mFold-Programms (s. Ka-

pitel 2.4.4.3). Die Voreinstellungen des Programms wurden wie in Tabelle 3.6 gewahlt:

Tabelle 3.6: Einstellungen und Parameter fur das mFold Programm zur Ermittlung von

DNA-Sekundarstrukturen

Parameter Wert

DNA sequence linear

Folding temperature 60 ◦C

Ionic conditions [Na+] 1,0 M; [Mg++] 0 M

Correction type Oligomer

Percent suboptimality number 5

Upper bound on the number of computed foldings 50

3.2. Methoden 61

3.2.2.4 Polymerasekettenreaktion

3.2.2.4.1 Gel-basierte PCR

Bei der Entwicklung der real-time PCRs wurden verschiedene Tests und Optimierungs-

schritte vorgenommen (s. Kapitel 2.4.4.4). Zur Identifizierung der Produkte und zur Her-

stellung von PCR-Produkten fur die Klonierung wurde die konventionelle, gel-basierte

PCR angewandt. Benutzt wurde dabei der Abgene HotStart Mastermix (s. Anhang A.2).

In einem 0,5 ml PCR-Reaktionsgefaß wurden 45 µl des Mastermixes mit einer Hotstart-

Polymerase, drei µl Template und jeweils ein µl Forward- und Reverse-Primer (Konzentra-

tion variierte je nach Ziel) gemischt, kurz anzentrifugiert und in den PCR-Thermocycler

(s. Anhang A.6.1) verbracht. Anschließend wurde in Tabelle 3.7 dargestelltes Programm

gestartet.

Tabelle 3.7: Abgene HotStart PCR. Thermisches Profil

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

95 ◦C 10 min 1

95 ◦C 1 min ⌉

56 ◦C 1 min 40

72 ◦C 30 sec ⌋

4 ◦C ∞

3.2.2.4.2 SYBRTM-Green real-time PCR

Fur jede PCR wurden die optimalen Primerkonzentrationen mit Hilfe der SYBRTM-Green

real-time PCR ermittelt. Dabei wurde eine Primermatrix verwendet, die die Primerkon-

zentrationen in den Stufen 50, 100, 300, 600 und 900 nM in allen moglichen Kombina-

tionen enthielt. Als Template wurden 104 Plasmidkopien mit entsprechenden klonierten

DNA-Sequenzen eingesetzt. Die Primermatrix ist in Abbildung 3.1 dargestellt.

623.

Material

und

Meth

oden

Abbildung 3.1: Primeroptimierungsmatrix zur Ermittlung der optimalen Primerkonzentrationen mit Hilfe der SYBRTM-Green

real-time PCR.

3.2. Methoden 63

Fur die Durchfuhrung wurde der BrilliantTMSYBRTM-Green QPCR Master Mix verwen-

det (s. Anhang A.2). Fur jede Primerkombination wurden jeweils 26,1 µl Primer-Wasser

Mixes, 3,4 µl DEPC Wasser, 30 µl Mastermix und vier µl Template in je 0,5 ml Reakti-

onsgefaßen zusammen gemischt und jeweils 25 µl in zwei 0,2 ml real-time PCR Reakti-

onsgefaße uberfuhrt, in das real-time PCR-Gerat (Mx 4000, s. Anhang A.6.1) verbracht

und in der Tabelle 3.8 dargestelltes Programm gestartet.

Wahrend des Programms erfolgte eine Schmelzpunktanalyse. Das PCR-Produkt wurde

von 55 ◦C auf 95 ◦C in 1 ◦C Schritten erhitzt und dabei die Fluoreszenz gemessen.

3.2.2.4.3 TaqMan real-time PCR

Die TaqMan real-time PCR wurde in Einfach- oder Multiplex-Ansatzen durchgefuhrt. Als

Mastermix wurde der QuantiTect R© Multiplex PCR Kit (s. Anhang A.2), der alle notigen

Komponenten enthielt, verwendet. Es wurden noch 20×Primer-Sonden Mixe, Template

DNA (bzw. cDNA) und DNase/RNase-freies Wasser zu einem 25 µl Ansatz zusammenge-

mischt (s. dazu Tabelle 3.9), kurz anzentrifugiert und in 0,2 ml Reaktionsgefaße uberfuhrt.

Die Gefaße wurden in das real-time PCR-Gerat (Mx 4000, s. Anhang A.6.1) verbracht

und in der Tabelle 4.2 dargestelltes Programm gestartet. Die Fluoreszenz wurde in der

Annealing-Phase 3×fach gemessen.

Tabelle 3.8: SYBRTM-Green PCR. Thermisches Profil

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

95 ◦C 10 min 1

95 ◦C 1 min ⌉

55 ◦C 1 min 40

72 ◦C 30 sec ⌋

95 ◦C 1 min

55 ◦C ↑ Schmelzpunktanalyse

64 3. Material und Methoden

Tabelle 3.9: TaqMan real-time PCR. Zusammensetzung der PCR-Ansatze

Komponente Menge/1 Ziel Menge/2 Ziele Menge/3 Ziele

2×Mastermix 12,5 µl 12,5 µl 12,5 µl

20×Primer-Sonden Mix 1 1,25 µl 1,25 µl 1,25 µl

20×Primer-Sonden Mix 2 – 1,25 µl 1,25 µl

20×Primer-Sonden Mix 3 – – 1,25 µl

H2O 5,25 µl 4 µl 2,75 µl

Template 6 µl 6 µl 6 µl

Σ 25 µl 25 µl 25 µl

3.2.2.4.4 Positive und negative Kontrollen

Als positive Kontrollen fur alle entwickelten PCRs wurden entweder ensprechende, in

Plasmide klonierten DNA-Sequenzen, oder aus infizierten Zellkulturen nach entsprechen-

der Extraktion gewonnene virale Nukleinsauren verwendet.

Ein nicht-infiziertes, zuvor getestetes Zellkulturlysat wurde nach der RNA-Extraktion fur

die cDNA-Synthese eingesetzt und diente als Negativkontrolle. Nach der DNA-Extraktion

wurde es als Positivkontrolle in der β-Aktin real-time PCR verwendet.

Fur die real-time PCR wurde zusatzlich eine Non Template Control (NTC) verwendet,

bei der anstelle der Matrizen-DNA DEPC Wasser (s. Anhang A.3.2) eingesetzt wurde.

Alle DNA- und cDNA-Losungen wurden bei −20 ◦C, alle RNA-Losungen bei −80 ◦C bis

zur weiteren Verwendung gelagert.

3.2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese

Die analytische Agarose-Gelelektrophorese wurde mit 2 %igen Tris-Borat-EDTA-Gelen

(TBE) durchgefuhrt. Dabei wurde die entsprechende Menge Agarose im Erlenmeyer-

Kolben abgewogen, mit TBE-Puffer aufgegossen und durch Aufkochen in einem Mikro-

wellenherd gelost. Nachdem die Losung auf ca. 50 ◦C heruntergekuhlt war, wurde sie in

eine Gelkammer mit Kamm gegossen. Nach dem Erkalten wurde der Kamm entfernt und

3.2. Methoden 65

das feste Gel samt Gelkammer in eine mit TBE-Puffer gefullte Kammer verbracht. An-

schließend wurden sieben µl der Proben mit drei µl eines Ladepuffers (s. Anhang A.3.2)

versetzt und in die Taschen gefullt; zusatzlich wurden drei µl eines Langenstandards

(s. Anhang A.4) ebenfalls mit 3 µl des Ladepuffers versetzt und aufgetragen. Es wurde

eine Spannung von 120 V fur ca. 90 min angelegt. Das Gel wurde anschließend in ei-

ner 0,2 %igen Ethidiumbromid-Losung ca. 10 min gefarbt und im Wasserbad ca. 20 min

gewassert. Durch UV-Licht eines Transilluminators (s. Anhang A.6.1) wurden die an-

gefarbten Banden bei 254 nm Wellenlange sichtbar gemacht, mit einem Bilderfassungs-

system (s. Anhang A.6.1) erfasst und zur Archivierung ausgedruckt.

3.2.2.6 Reinigung der PCR-Fragmente

Fur die TA-Klonierung wurden die eingesetzten PCR-Fragmente nach Herstellerempfeh-

lung von der Polymerase, Salzen, Primern und nicht verbrauchten Nukleotiden gereinigt.

Dabei wurden kommerziell erhaltliche Kits eingesetzt. Bei der Reinigung wird die DNA an

eine anionische Silica-Gel-Membran unter definierten niedrigen Salz- und pH-Bedingungen

gebunden und nach Waschschritten und Elution durch einen Puffer wieder gelost. Fur die

Reinigung kleiner Fragmente (ab 17 bp Lange) wurde der QIAquick Nucleotide Removal

Kit R© und fur PCR-Fragmente ab 100 bp Große der QIAquick PCR Purification Kit R©

verwendet. Dabei wurde der vollstandige PCR-Ansatz mit 10 Volumenequivalente Bin-

depuffer (PN-Puffer) versetzt, mit der Pipette gemischt und auf die Saule uberfuhrt.

Anschließend wurde das Auffanggefaß mit der Saule eine min bei 8000× g zentrifugiert.

Der Durchlauf wurde verworfen und 750 µl PE-Puffer erneut auf die Saule gegeben. Es

erfolgte ebenfalls eine Zentrifugation fur eine min bei 8000× g. Der Durchlauf wurde er-

neut verworfen und die Saule bei 13000× g fur eine min trocken zentrifugiert. Auf die

Saule wurden nun 55 µl Elutionspuffer pipettiert, die Saule in ein 1,5 ml Reaktionsgefaß

uberfuhrt und bei 10000× g fur eine min zentrifugiert.

Die eluierte DNA wurde entweder direkt in der TA-Klonierung eingesetzt oder bei −20 ◦C

gelagert.

66 3. Material und Methoden

3.2.2.7 TA-Klonierung

Bei der Klonierung der PCR-Produkte wurden der p-GEM R©-T-easy und der TOPO R© TA

Cloning Kit verwendet (s. Anhang A.2). Als Vektoren dienten im Falle des p-GEM R©-T-

easy-Kits das Standardplasmid p-GEM R©-T-easy, und beim TOPO R© TA Cloning Kit das

pCR R©2.1 Standardplasmid. Die Protokolle waren prinzipiell gleich aufgebaut. Im Einzel-

nen wurden beim p-GEM R©-T-easy-Kit folgende Schritte durchgefuhrt:

Als Erstes wurde der Ligationansatz vorbereitet. Dafur wurden funf µl 2× Rapid Ligation

Buffer, ein µl p-GEM R©-T-easy Vector (50ng), drei µl PCR Produkt, ein µl T4 DNA Ligase

in einem 0,5 ml Reaktionsgefaß zusammenpipettiert und eine Stunde bei Raumtemperatur

inkubiert. Anschließend wurden zwei µl des Ligationsansatzes in ein 1,5 ml Reaktionsgefaß

verbracht und 50 µl der JM109 High Efficiency Competent Cells auf Eis zugegeben. Das

Gefaß wurde kurz geschwenkt und 20 min auf Eis inkubiert. Danach folgte die Hitze-

schocktransformation in einem Wasserbad fur 45–50 sec bei 42 ◦C. Die Gefaße wurden

dann sofort wieder fur 2 min aufs Eis verbracht, danach 950 µl des S.O.C. Mediums

zugesetzt und 1,5 h bei 37 ◦C und 200 rpm in einem Brutschrank inkubiert. Anschlie-

ßend wurden 50 und 100 µl der Transformationskultur auf vorbereiteten IPTG/X-Gal

LB-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden anschließend uber Nacht (16–24 h) bei

37 ◦C inkubiert. Die Selektion der Bakterienkolonien erfolgte am nachsten Tag anhand der

blau-weiß Farbung der Kolonien. Die Bakterien, die den Vektor mit der inserierten DNA

aufgenommen hatten, waren weiß gefarbt. Sie wurden in der anschließenden Kolonie-PCR

(s. 3.2.2.8) uberpruft und fur spatere Mini-Praparation (s. 3.2.2.9) in 5 ml LB-Medium

uber Nacht bei 37 ◦C und 200 rpm in einem Brutschrank weiter vermehrt.

Die Klonierung mit dem TOPO R© TA Cloning Kit (s. A.2) beinhaltete folgende Schritte:

Fur die Ligation wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefaß drei µl des PCR-Produkts mit

0,9 µl des pCR R©2.1-TOPO R© Vektors, ein µl Salzlosung und 1,1 µl sterilem Wassers ge-

mischt, funf min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend sofort auf Eis gestellt.

Zwei µl des Reaktionsansatzes wurden zu den chemokompetenten Bakterien (TOP10 aus

dem Kit) pipettiert und fur 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Bakterien fur

30 sec bei 42 ◦C hitzeschocktransformiert und sofort wieder auf Eis gestellt. Nach Zugabe

von 250 µl des S.O.C.-Mediums und einer Inkubation in einem Brutschrank bei 37 ◦C und

200 rpm fur 1 Stunde wurden die Bakterien auf Selektionsagarplatten in den Verdunnun-

3.2. Methoden 67

gen 1:50 und 1:100 ausplattiert und bei 37 ◦C inkubiert. Den Selektionsagarplatten wurden

50 µg/ml Ampicillin als Selektionsantibiotikum und 40 µg/µl X-Gal als Indikator zugege-

ben. Die Selektion der Bakterienkolonien erfolgte am nachsten Tag anhand der blau-weiß

Farbung der Kolonien analog zu dem p-GEMR©-T-easy-Kit. Die Bakterien, die den Vek-

tor mit der inserierten DNA aufgenommen hatten, waren weiß gefarbt. Sie wurden in

der anschließenden Kolonie-PCR (s. 3.2.2.8) uberpruft und fur spatere Mini-Praparation

(s. 3.2.2.9) in 5 ml LB-Medium uber Nacht bei 37 ◦C und 200 rpm in einem Brutschrank

weiter vermehrt.

3.2.2.8 Kolonie-PCR

Die so genannte Kolonie-PCR wurde eingesetzt, um die Bakterienkolonien, die den Vektor

mit der Produktsequenz bei der TA-Klonierung (s. Kapitel 3.2.2.7) aufgenommen hatten,

zu identifizieren. Fur die PCR-Reaktion wurde in der Tabelle 3.10 dargesteller Ansatz

auf Eis vorbereitet. Zu jedem Ansatz wurden die entsprechenden Primer hinzugegeben

Tabelle 3.10: Kolonie-PCR. Zusammensetzung des Mastermixes

Komponente Menge

dNTPs 8 µl

20×Tth-Puffer 5 µl

MgCl2 (25mM) 5 µl

Tth-Polymerase 0,5 µl

Fwd-Primer 1 µl

Rev-Primer 1 µl

DEPC-Wasser 79,5 µl

Σ 100 µl

(in der Konzentration 25 pmol/µl). Der Mastermix wurde anschließend auf 10 PCR-

Reaktionsgefaße verteilt, so dass ein Volumen von 10 µl in jedem Rohrchen vorhanden

war. Von den uber Nacht bei 37 ◦C inkubierten LB-Agarplatten wurden mit einer Pi-

pettenspitze eine einzelne Bakterienkolonie aufgenommen. Das Bakterienmaterial wurde

68 3. Material und Methoden

zuerst mit dem PCR-Ansatz in Verbindung gebracht, so dass es fur die PCR als Matrize

diente, und anschließend mit dem LB-Medium, so dass eine Vorkultivierung stattfinden

konnte. Die PCR-Reaktionsgefaße wurden in den Thermocycler verbracht und in der

Tabelle 3.11 aufgefuhrtes Programm gestartet. Gleichzeitig wurden die Vorkulturen bei

Tabelle 3.11: Kolonie-PCR. Thermische Profil

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

94 ◦C ∞ 1

94 ◦C 1 min 1

94 ◦C 15 sec ⌉

54 ◦C 35 sec 19

72 ◦C 1 min ⌋

72 ◦C 5 min

4 ◦C ∞

37 ◦C und 200 rpm inkubiert. Nach der Kolonie-PCR wurden die PCR-Produkte mittels

Agarose-Gelelektrophorese (s. Kapitel 3.2.2.5) kontrolliert. Von den positiven Vorkultu-

ren wurden 10 µl zur Vermehrung in vorbereitetes LB-Medium mit Ampicillin ubertragen

und uber Nacht bei 37 ◦C und 200 rpm inkubiert.

3.2.2.9 Plasmidpraparation

Als Ausgangsmaterial fur die Plasmidpraparation diente eine entsprechende LB-Medium-

Ubernachtkultur, die mit einer einzelnen Bakterienkolonie oder einer entsprechenden Men-

ge Vorkultur (von der Kolonie-PCR) angeimpft wurde.

Die Plamidisolierung beruht auf dem Prinzip einer modifizierten alkalischen Lyse, gefolgt

von der Bindung der Plasmid-DNA an eine anionische Silica-Gel-Membran unter defi-

nierten niedrigen Salz- und pH-Bedingungen, die nach Waschschritten und Elution durch

einen Puffer wieder gelost wird. Die uber Nacht inkubierten Kulturen wurden 15 min

bei 2000× g zentrifugiert und anschließend mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit R© gerei-

nigt. Nach der Zentrifugation wurde der Uberstand verworfen und das Pellet mit 250 µl

3.2. Methoden 69

P1-Puffer resuspendiert. Daraufhin wurde der Lysispuffer P2 hinzugegeben und durch

Schwenken mit der Zellsuspension gemischt. Mit der Zugabe von 350 µl des Puffers N3

wurden die Zellbestandteile gefallt. Nach 10 minutigem Zentrifugieren bei 10000× g wur-

de der Uberstand auf die QIAprep-Saulen uberfuhrt. Nach einem Zentrifugationsschritt

fur eine min bei 10000× g wurde der Durchfluss verworfen und die Saule mit 750 µl PE-

Puffer gewaschen. Anschließend wurde erneut fur eine min bei 10000× g zentrifugiert. Der

Durchlauf wurde verworfen. Auf die Saule wurden 50 µl EB-Puffer pipettiert und nach

1-minutiger Inkubation fur eine min bei 10000× g zenrtifugiert. Die eluierte Plasmid-

DNA wurde einer Konzentrationsmessung (s. Kapitel 3.2.2.13) und anschließend einem

Restriktionsenzymverdau unterzogen, zur Sequenzierung an die Fa. MWG–Biotech AG,

Ebersberg (s. Anhang 3.2.2.12) geschickt oder bei −20 ◦C gelagert.

3.2.2.10 Restriktionsenzymverdau

Die Linearisierung der Plasmide erforderte den Einsatz von Restriktionsenzymen. Die-

se sollten nur einmal im Vektor schneiden, nicht aber im Insert. Die passenden Enzyme

wurden ausgewahlt, indem die gesamten Sequenzen (Vektor und Insert) einer Restrikti-

onsschnittmusteranalyse unterzogen wurden (s. Anhang A.7). Anschließend wurden die

Reaktionen wie in Tabelle 3.12 dargestellt angesetzt und bei 37 ◦C uber Nacht inkubiert.

3.2.2.11 Dephosphorylierung

Eine Dephosphorylierung (Entfernung der terminalen 5′-Phosphatgruppen) von geschnit-

tener Plasmid-DNA wurde durchgefuhrt, um die nachfolgende Religation zu verhindern.

Direkt nach dem Restriktionsverdau wurde die geschnittene Plasmid-DNA (40µl) mit

vier µl der alkalischen Phosphatase sowie vier µl des entsprechenden Puffers fur 1 h bei

37 ◦C inkubiert und anschließend 15 min bei 65 ◦C gehalten, um das Enzym zu deaktivie-

ren. Danach wurde das Plasmid mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kit (s. 3.2.2.6)

gereinigt.

70 3. Material und Methoden

3.2.2.12 Sequenzierung

Alle Plasmide wurden zur Sequenzierung an die Firma MWG–Biotech AG, Ebersberg ver-

schickt. Dazu wurde ein µg Plasmid-DNA pro 100 zu sequenzierender Basen in ein 1,5 ml

Reaktionsgefaß verbracht und anschließend in einer Vakuumzentrifuge unter Warmezu-

fuhr getrocknet. Die Sequenzierung erfolgte mit Plasmidstandardprimern (T7 und M13).

3.2.2.13 Bestimmung der Kopienzahl der Plasmide

Die Berechnung der Kopienanzahl des Plasmids pro µl erfolgte anhand der DNA-Konzentration,

die wiederum mittels Messung der optischen Dichte (OD) bestimmt wurde. Die Messung

des OD-Wertes erfolgte zweimal bei 260 nm Wellenlange. Die Berechnung der DNA-

Konzentration erfolgte nach folgender Formel:

C[µg/ml] = OD260 × V × F

C = Konzentration der Ausgangslosung

OD260 = Optische Dichte bei 260 nm Wellenlange

Tabelle 3.12: Restriktionsenzymverdau der Plasmide mit klonierten PCR-Produkten

Plasmid DNA- Enzym Enzym- Puffer Puffer- H2O

Menge menge menge

ASPV 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

SHV-1 25µl EcoR V 5µl Reaction2 5µl + 5µl 15µl

Influenza-A 25µl Xmn I 2,5µl NEB2 + BSA 5µl + 2,5µl 15µl

KSPV 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PCV-2 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PPV 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PRRSV-EU 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PRRSV-NA 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

3.2. Methoden 71

V = Verdunnungsfaktor

F = Multiplikationsfaktor (50 fur dsDNA)

Fur die Berechnung der Kopienzahl wurde folgende Formel eingesetzt:

C[Kopien/µl] = NA ×OD260 × F × V × 10−9

L × MW

C = Konzentration der Losung in Plasmidkopien/µl

NA = 6,022×1023 ×mol−1 Avogadro-Konstante

OD260 = Optische Dichte bei 260 nm Wellenlange

V = Verdunnungsfaktor

F = Multiplikationsfaktor (50 fur dsDNA)

MW = Molekulargewicht je Basenpaar (660 g/mol)

L = Lange des Plasmids in Basen

10−9 = Umrechnungsfaktor

Nach der Berechnung der Konzentration wurde die Plasmid-Losung aliquotiert und ent-

weder in der real-time PCR eingesetzt oder bei −20 ◦C bis zur Verwendung gelagert.

4. Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der Literaturrecherche

Sowohl fur den vorlaufigen Entwurf als auch kontinuierlich wahrend der verschiedenen

Entwicklungsphasen der PCR erfolgte eine Literaturrecherche in der Datenbank Medline1.

Zunachst wurden die Erkrankungen ermittelt, die als bedeutsame KSP Differentialdia-

gnosen viraler Genese bekannt waren. Die in der Literatur erwahnten, differentialdiagnos-

tisch relevanten Erkrankungen waren ASPV-, PCV-2-, PPV-, porzine Influenza-A-Virus-,

PRRSV- und SHV-1-Infektionen (van Oirschot, 1999b; Moennig et al., 2003). Die

Detektion dieser Erreger wurde daher fur den vorliegenden Ansatz angestrebt. In einem

weiteren Schritt wurden TaqMan-Protokolle gesucht, die fur die Detektion dieser Viren

entwickelt wurden. Diese Protokolle wurden hinsichtlich der gewahlten Genomabschnitte,

der Fragmentgroßen und der Thermoprofile ausgewertet. Die TaqMan-PCR-Protokolle,

die uber die Datenbank Medline gefunden werden konnten, sind in Tabelle 4.1 unter

Angabe der Referenz dargestellt. Die Tabelle enthalt alle bis dato publizierten Protokol-

le, obgleich fur die unmittelbare Entwicklung des vorliegenden Ansatzes nur die bis 2004

veroffentlichten Arbeiten berucksichtigt wurden. Allein das von Kleiboeker et al. (2005)

fur die Detektion und Differenzierung des PRRSV publizierte Protokoll wurde im weiteren

Verlauf der Entwicklung getestet und in den multiplex-Ansatz integriert. Fur die Detekti-

on des ASPV konnten zwei eigenstandige TaqMan-PCR-Protokolle gefunden werden, die

beide auf der Detektion eines Fragmentes des VP72-Gens beruhten. Fur das von King

et al. (2003) entwickelte Protokoll war eine Produktlange von 250 bp angegeben, diese

Information war der Publikation von Zsak et al. (2005) fur das dortige Protokoll nicht

1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

73

74 4. Ergebnisse

zu entnehmen. Die Thermoprofile dieser Protokolle wichen in einigen Punkten deutlich

voneinander ab. Das Protokoll von King et al. (2003) beinhaltete 35 Zyklen mit einem

Denaturierungsschritt bei 94 ◦C fur 30 sec, einem Annealing-Schritt bei 58 ◦C fur 60 sec

und einer Elongation bei 72 ◦C fur 45 sec. Fur das Protokoll von Zsak et al. (2005) waren

45 Zyklen mit den Schritten 95 ◦C fur 2 sec und 60 ◦C fur 60 sec angegeben.

Die fur die Detektion des SHV-1 entwickelten TaqMan-Protokolle amplifizierten hauptsach-

lich ein Fragment des Genombereichs, der fur das gB-Protein kodiert. Auch hier konnten

zwei Protokolle gefunden werden. Wahrend das von van Rijn et al. (2004) publizierte

Protokoll ausschließlich das gB-Fragment amplifizierte, war in der Publikation von Yoon

et al. (2005) auch die Amplifikation eines Fragments des gE-Gens vorgesehen. Den Publi-

kationen waren die Produktgroßen nicht zu entnehmen. Die Thermoprofile unterschieden

sich sowohl in der Dauer der einzelnen Schritte als auch der Zyklenzahl. Wahrend das Pro-

Tabelle 4.1: Ergebnisse der Literaturrecherche. Berucksichtigt wurden nur real-time

TaqMan-PCRs.

Virus Referenz

ASPV (King et al., 2003; Zsak et al., 2005)

SHV-1 (van Rijn et al., 2004; Yoon et al., 2005)

PCV-2 (Rovira et al., 2002; Brunborg et al., 2004; Olvera

et al., 2004; Chung et al., 2005)

PPV –

KSPV (Hofmann, 2003; Risatti et al., 2003; van Rijn et al.,

2004; Gaede et al., 2005; Hoffmann et al., 2005;

Risatti et al., 2005; Ophuis et al., 2006)

Influenza-A (van Elden et al., 2001; Watzinger et al., 2004; Hin-

diyeh et al., 2005; Krafft et al., 2005; Payungporn

et al., 2006)

PRRSV (Egli et al., 2001; van Rijn et al., 2004; Wasilk et al.,

2004; Revilla-Fernandez et al., 2005; Kleiboeker

et al., 2005)

4.1. Ergebnisse der Literaturrecherche 75

tokoll von van Rijn et al. (2004) 45 Zyklen mit einem Denaturierungsschritt bei 95 ◦C

fur 5 sec, einem Annealing-Schritt bei 60 ◦C fur 5 sec und einer Elongation bei 72 ◦C fur

10 sec vorsah, enthielt das Protokoll von Yoon et al. (2005) 50 Zyklen mit den Schritten

94 ◦C fur 60 sec, 60 ◦C fur 30 sec und 72 ◦C fur 60 sec.

Die TaqMan-Protokolle, die fur die Detektion des PCV-2 in der Literatur zu finden waren,

amplifizierten ausnahmslos ein Fragment aus dem ORF2 des viralen Genoms. Es konnten

vier Protokolle gefunden werden. Die Fragmentgroßen lagen bei 84 bp (Brunborg et al.,

2004), 98 bp (Olvera et al., 2004), 100 bp (Rovira et al., 2002) und 269 bp (Chung

et al., 2005). Die Thermoprofile sahen 45 (Rovira et al., 2002; Brunborg et al., 2004;

Chung et al., 2005) bzw. 40 (Olvera et al., 2004) Zyklen vor. Im Einzelnen waren die

Profile wie folgt: Das Protokoll von Brunborg et al. (2004) sah fur die 45 Zyklen einen

Denaturierungsschritt bei 95 ◦C fur 10 sec vor, der von 30 sec bei 62 ◦C gefolgt wurde.

Ahnliche Bedingungen wurden bei Olvera et al. (2004) verwendet. Die 40 Zyklen wurden

in diesem Fall mit 15 sec bei 95 ◦C und 60 sec bei 60 ◦C durchgefuhrt. Das Thermoprofil

der von Rovira et al. (2002) entwickelten PCR beinhaltete 45 Zyklen mit den Schritten

20 sec bei 95 ◦C, 20 sec bei 68 ◦C und ebenfalls 20 sec bei 70 ◦C. Das von Chung et al.

(2005) publizierte Protokoll weist ein Thermoprofil mit 45 Zyklen bei 95 ◦C fur 7 sec,

57 ◦C fur 10 sec und 72 ◦C fur 10 sec auf.

Fur das PPV konnten bis dato keine publizierten TaqMan-Protokolle gefunden werden.

Die fur die Detektion des KSPV entwickelten und publizierten TaqMan-Protokolle basie-

ren durchweg auf dem Nachweis eines Fragments aus der 5′NTR des viralen Genoms. Es

konnten der Datenbank funf eigenstandige PCR-Protokolle und ein modifiziertes Proto-

koll entnommen werden. Fur zwei der eigenstandigen Protokolle war die Produktgroße

angegeben, die bei 82 bp (Risatti et al., 2003) bzw. 93 bp (Hoffmann et al., 2005)

lag. Das von Ophuis et al. (2006) modifizierte Protokoll beruht auf den von Risatti

et al. (2003) publizierten Primern und Sonden, daher besitzt dieses Fragment ebenfalls

eine Große von 82 bp. Die Produktgroße der anderen Protokolle (Hofmann, 2003; van

Rijn et al., 2004) konnte den Publikationen nicht entnommen werden. Die verwendeten

Thermoprofile variierten in allen Parametern. Fur das von Hofmann (2003) entwickelte

Protokoll wurde ein Thermoprofil mit 50 Zyklen gewahlt, die aus einem Denaturierungs-

schritt bei 95 ◦C fur 30 sec und einer nachfolgenden Amplifikation bei 60 ◦C fur 60 sec

bestanden. Das von Risatti et al. (2003) publizierte Protokoll sah 45 Zyklen mit zwei sec

76 4. Ergebnisse

bei 95 ◦C und 30 sec bei 60 ◦C vor. Der Publikation von van Rijn et al. (2004) konnte

nur entnommen werden, dass 45 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95 ◦C, einem An-

nealing-Schritt mit unbekannten Parametern und einer Elongation bei 72 ◦C angewendet

wurden. Das von Gaede et al. (2005) publizierte Protokoll nutzt fur die speziesspezifische

Differenzierung von Pestiviren verschiedene Primerpaare, die alle im Bereich der 5′NTR

binden. Das Primerpaar A11/A14 von McGoldrick et al. (1998) amplifiziert ein Frag-

ment von 220 bp Große. Das Pesti3/Pesti4 Primerpaar, das von Hyndman et al. (1998)

publiziert wurde, grenzt ein Genomfragment mit 171 bp Große ein. Die panpesti -Primer

324/326, die von Vilcek et al. (1994) publiziert wurden, amplifizieren ein 288 bp großes

Genomfragment. Das thermische Profil bestand aus einem Schritt fur die reverse Tran-

skription bei 50 ◦C fur 30 min, anschließender Denaturierung und Polymerasenaktivierung

bei 95 ◦C fur 15 min, gefolgt von 45 Zyklen Denaturierung bei 94 ◦C fur jeweils 20 sec

und einem Annealing-/Elongation-Schritt bei 60 ◦C fur 1 min. Das von Hoffmann et al.

(2005) beschriebene Protokoll sieht ein Thermoprofil mit 42 Zyklen vor. Diese bestehen

aus einem Denaturierungsschritt fur 15 sec bei 94 ◦C, einem Annealing der Primer fur

30 sec bei 57 ◦C und einer Elongation-Phase fur 30 sec bei 68 ◦C. Ophuis et al. (2006)

modifizierte das von Risatti et al. (2003) entwickelte Protokoll dahingehend, dass das

Thermoprofil bei gleich bleibender Zyklenzahl eine auf 15 sec verlangerte Phase bei 95 ◦C

und eine auf 60 sec verlangerte Phase bei 60 ◦C aufwies.

Fur die Detektion verschiedener Influenza-A-Viren wurde vornehmlich der fur das M-Protein

kodierende Genomabschnitt verwendet. Vier publizierte, neu entwickelte TaqMan-PCR-

Protokolle sowie ein modifiziertes Protokoll wurden hinsichtlich ihrer Parameter vergli-

chen. Mit der Ausnahme eines von Payungporn et al. (2006) entwickelten Protokolls

zur Detektion von Influenza-A-Viren des Subtyps H5N1, das neben dem Genomfragment

des M-Proteins zusatzlich die fur H5 und N1 kodierenden Genomabschnitte detektierte,

basierten die Protokolle ausschließlich auf der Detektion des M-Protein-Genomfragments.

Das von van Elden et al. (2001) entwickelte Protokoll, das auch dem von Hindiyeh

et al. (2005) modifizierten Protokoll zugrunde liegt, beinhaltet zwei Forwardprimer, was

zu unterschiedlichen Amplifikatlangen fuhrt. Die Fragmentlange betrug anhand der Lo-

kalisation der Primer 188 bp bzw. 128 bp. Das Protokoll nach Watzinger et al. (2004)

fuhrt zu einem 132 bp langen PCR-Produkt. Ein 92 bp langes Fragment wird mittels der

von Krafft et al. (2005) entwickelten PCR amplifiziert, das von Payungporn et al.

4.1. Ergebnisse der Literaturrecherche 77

(2006) publizierte PCR-Protokoll detektiert ein 191 bp langes Fragment (M-Protein). Die

von Hindiyeh et al. (2005) und Watzinger et al. (2004) entwickelten bzw. modifizier-

ten Protokolle besaßen ein identisches Thermoprofil mit 50 Zyklen, die aus 15 sec bei

95 ◦C und 60 sec bei 60 ◦C bestanden. Das Protokoll nach van Elden et al. (2001) wich

nur hinsichtlich der Zyklenzahl ab, da es nur 45 Zyklen vorsah. Ein Thermoprofil mit 50

Zyklen sah das Protokoll von Krafft et al. (2005) vor mit 15 sec bei 95 ◦C und 60 sec

bei 55 ◦C. Die von Payungporn et al. (2006) entwickelte PCR sah ein Thermoprofil mit

40 Zyklen vor, die aus einer Denaturierungsphase bei 94 ◦C fur 15 sec, einem Annealing

der Primer fur 30 sec bei 55 ◦C und einer Elongation-Phase fur 40 sec bei 72 ◦C bestanden.

Zur Detektion des PRRSV wurden bis dato funf publizierte TaqMan-Protokolle gefunden.

Sie basieren hauptsachlich auf der Detektion des ORF7 bzw. ORF6, teilweise in Kombi-

nation mit Fragmenten aus der 3′NTR. Das von Egli et al. (2001) publizierte Protokoll

zur Detektion von PRRSV-EU und PRRSV-NA fuhrte zur Amplifikation eines Fragments

aus dem ORF7. Die Lange des Amplifikats betrug 105 bp fur PRRSV-NA und 96 bp fur

PRRSV-EU. Das Thermoprofil sah 40 Zyklen vor, die aus einem Denaturierungsschritt

bei 95 ◦C fur 15 sec und einem Amplifikationsschritt bei 60 ◦C fur 60 sec bestanden. Das

von van Rijn et al. (2004) publizierte Protokoll amplifizierte ein Fragment aus ORF6 und

ORF7. Die Angaben zum Thermoprofil waren unvollstandig und entsprachen denen fur

KSPV. Die von Wasilk et al. (2004) entwickelte PCR beruhte auf einem kommerziellen

System (Tetracore Inc., Gaithersburg) und amplifizierte neben nicht weiter charakterisier-

ten Genomfragmenten ein Fragment aus der 3′NTR. Dieses Protokoll sah fur PRRSV-NA

ein Thermoprofil mit 40 Zyklen vor, die aus 30 sec bei 94 ◦C, 60 sec bei 61 ◦C und 60 sec

bei 72 ◦C bestanden. Das Profil fur PRRSV-EU bestand aus 45 Zyklen. Diese sahen 3 sec

bei 95 ◦C und 30 sec bei 60 ◦C vor. Das von Revilla-Fernandez et al. (2005) publizierte

Protokoll sah die Amplifikation eines Fragmentes aus dem ORF6 vor. Das Thermoprofil

bestand aus 45 Zyklen, die mit 15 sec bei 95 ◦C und 60 sec bei 60 ◦C durchgefuhrt wurden.

Die PCR, die von Kleiboeker et al. (2005) entwickelt wurde, beruhte fur PRRSV-EU

auf der Amplifikation eines 77 bp Fragments aus dem ORF7, fur PRRSV-NA auf der Am-

plifikation eines 114 bp Fragments aus dem ORF7 und der 3′NTR. Das thermische Profil

sah einen initialen Schritt fur die reverse Transkription bei 50 ◦C fur 30 min, gefolgt von

40 PCR Zyklen vor. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungsschritt bei 94 ◦C fur

15 sec und einem Schritt fur Annealing und Elongation bei 60 ◦C fur 15 sec.

78 4. Ergebnisse

Das anhand der Literatur gewahlte und modifizierte Profil ist in Tabelle 4.2 dargestellt.

Nach Anpassung der Zyklenzahl und -dauer wurde es in der weiteren Arbeit eingesetzt.

Die Aktivierung der Polymerase erfolgte, wie vom Hersteller empfohlen, fur 15 Minuten

bei 95 ◦C. Der Denaturierungschritt wurde auf eine Dauer von 15 sec festgelegt. Die Schrit-

te Annealing und Elongation wurden zusammengefuhrt, und erfolgten bei 60 ◦C fur eine

Minute. In der Literatur werden meistens Zyklenzahlen zwischen 40 und 50 verwendet. In

dieser Arbeit wurde ein Wert von 40 ausgewahlt.

Tabelle 4.2: TaqMan-PCR. Thermisches Profil.

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen Schritt

95 ◦C 15 min 1 Aktivierung der Polymerase

95 ◦C 15 sec ⌉ Denaturierung

40

60 ◦C 1 min ⌋ Annealung und Elongation

4.2 Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs

4.2.1 Ergebnisse der Sequenz-, Primer- und Sondensuche

Die Genomregionen der gewahlten Erreger sowie der internen Kontrolle, die fur eine Am-

plifikation in PCR in Frage kamen, wurden anhand der Literatur und eigener Studien

ausgewahlt. Sequenzabschnitte mit moglichst hoher Konservierung und fur die Entwick-

lung verschiedener PCR-Protokolle von anderen Autoren zur Amplifikation verwendete

Regionen wurden zunachst naher untersucht. Im nachsten Schritt wurden alle verfugba-

ren Sequenzen einem ClustalW-Alignment unterzogen und Consensus-Sequenzen erstellt.

Nach einem Vergleich der in der Sequenzdatenbank GenBank 2 verfugbaren Sequenzen

wurde fur das ASPV ein Primerpaar im Bereich des VP72-Gens ausgewahlt, mit dem ein

96 bp langes Genomfragment amplifiziert wurde. Die TaqMan-Sonde hatte eine Lange von

2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/

4.2. Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs 79

25 Basen. Bei der Entwicklung der pestivirenspezifischen Primer und der Sonde wurden

alle verfugbaren KSPV, BVDV und BDV-Sequenzen ausgewertet. Die ausgewahlten Pri-

mer grenzten ein 164 bp langes Fragment im Bereich der 5′NTR ein, in dem die 26 Basen

lange TaqMan-Sonde band. Fur das PPV konnte nach Auswertung der Sequenzen ein

96 bp langer Bereich des VP2-Gens ausgewahlt werden. Die hier hybridisierende TaqMan-

Sonde hatte eine Lange von 29 Basen. Im zirkularen Genom des PCV-2 wurde der ORF2

fur die Primer- und Sondensuche verwendet. Die ausgewahlten Primer amplifizierten ein

Fragment mit einer Große von 136 bp, die TaqMan-Sonde war 25 Basen lang. Im SHV-1

Genom wurde der fur das gB-Protein kodierende Bereich ausgewahlt. Die entwickelten

Primer grenzten ein 96 bp langes Fragment ein, in dem die 29 Basen lange Sonde band.

Fur das Influenza-A-Virus wurde der Bereich des M1-Proteins gewahlt. Das ausgewahlte

Primerpaar amplifizierte ein 96 bp langes Produkt, an das eine 22 Basen lange Sonde band.

Die Primer und Sonden fur die PRRSV spezifischen PCRs wurden aus der Publikation von

Kleiboeker et al. (2005) ubernommen. Ein Primerpaar amplifizierte ein 77 bp langes

Genomfragment des ORF7 europaischer PRRSV-Stamme. Bei den nordamerikanischen

Stammen wurde mit zwei Forward -Primern und einem Reverse-Primer ein 114 bp langes

Amplifikat aus dem Bereich des ORF7 und 3′NTR gebildet. Die zwei stammspezifischen

Sonden hatten jeweils eine Lange von 24 Basen.

Die Primer und Sonden wurden fur jeden Erreger so ausgewahlt, dass die Amplifikationen

mit dem vorgegebenen einheitlichen Thermoprofil ablaufen konnten.

Als interne Kontrolle wurde das β-Aktingen gewahlt. Die Auswahl erfolgte anhand einer

genomischen und der dazugehorigen mRNA-Sequenz. Dabei wurde ein Primerpaar fur die

Amplifikation sowohl genomischer DNA als auch die mRNA gewahlt. Die Produktgroße

fur die genomische DNA betrug 185 bp und fur die mRNA 90 bp (s. Abbildung 4.1). Es

wurden je eine TaqMan-Sonde entwickelt; die DNA-Sonde war 21 bp, die mRNA 23 bp

lang. Weitere Ergebnisse dazu sind in Kapitel 4.2.2.4 aufgefuhrt. Die gewahlten Primer-

und Sondensequenzen sowie die Produktlangen und Genombereiche sind in Tabelle 4.3

zusammengefasst. Alle Primer- und Sondensequenzen sind in 5′-3′ Orientierung angege-

ben.

Die nach Vorgabe der in Kapitel 3.2.2.3.2 beschriebenen Methoden entwickelten Primer

und Sonden wurden einer BLAST-Suche unterzogen (s. Kapitel 3.2.2.3.3). Dabei wurden

sie sowohl einzeln als auch in Kombination mit der entsprechenden TaqMan-Sonde un-

80 4. Ergebnisse

Abbildung 4.1: Ergebnisse der gelbasierten β-Aktin PCR. Mit ausgewahltem Primerpaar

werden je nach Ausgangsmaterial unterschiedliche Produkte amplifiziert. Bei der genomi-

schen DNA betragt die Produktgroße 185 bp, bei cDNA aus β-Aktin mRNA 90 bp. 1 -

Langenstandard, 2 - NTC, 3, 4 - DNA (Organmaterial), 5, 6, 7 - cDNA (Organmaterial

nach RNA-Extraktion und reverser Transkription).

tersucht. Bei der BLAST-Suche wurden keine uber drei bis vier Basen hinausgehenden

Sequenzidentitaten mit anderen bekannten Organismen festgestellt. Anschließend fand ei-

ne computergestutzte Ermittlung sekundarer Strukturen bei der Annealing-Temperatur

von 60 ◦C mittels des mFold-Programms (s. Kapitel 2.4.4.3) statt. Die graphische Darstel-

lung der Genomabschnitte in den Primer und Sonden banden, zeigten fur Pestiviren- sowie

Influenza-A-Primer und -sonden Sekundarstrukturen im relevanten Genomabschnitt. Die

graphische Ausgabe des mFold-Programms fur PCV-2, welches keine Sekundarstrukturen

im Bereich der 3′-Enden aufwies, ist in Abbildung 4.2 dargestellt. Eine mogliche cDNA-

Konformation fur das Pestivirusgenom ist in Abbildung 4.3 dargestellt.

4.2. Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs 81

Abbildung 4.2: Ermittlung von DNA-Sekundarstrukturen am Beispiel von PCV-2. Die

Abbildung zeigt die angenommene DNA-Konformation bei 60 ◦C. Die 3′-Enden der Primer

lagen in Abschnitten ohne sekundare Strukturen.

82 4. Ergebnisse

Abbildung 4.3: Ermittlung von DNA-Sekundarstrukturen des Pestivirusgenoms. Die

Abbildung zeigt eine mogliche cDNA-Konformation bei 60 ◦C.

4.2.E

ntw

icklu

ng

der

multip

lexreal-tim

eTaq

Man

PC

Rs

83

Tabelle 4.3: Ubersicht der fur das Primer- und Sondendesign eingesetzten Genomregionen sowie der verwendeten Primer- und

Sondensequenzen. Die universelle Base Inosin ist in den Sequenzen als I dargestellt, R steht fur A oder G, IK - interne Kontrolle.

Virus Genomregion / Amplifi-

katlange

Forward-Primer (5′-3′) Reverse-Primer (5′-3′) Sonde (5′-3′)

ASPV VP72 / 96 bp GCG ATG ATG ATT ACC TTT

GCT TT

CCA ACT AAT ATA AAA

TTC TCT TGC TCT G

AAG CCA CGG GAG GAA

TAC CAA CCC A

Pestiviren 5′NTR / 164 bp GGI IAG TCG TCA GTI GTT CGA GTG GGC CTC TGC AGC

ACC CTA T

CTC GAG ATG CIA IGT

GGA CGA GGG CA

PPV VP2 / 97 bp CTC TCC TCA ACA ACC TAG

AAT AAT AAC

GTT CCA CAT ATT ACT

GGA TCT CAT TT

TGC GAA TGT TAG TGT

TCC TTT CCA CCA AA

PCV-2 ORF2 / 172 bp TAT GGC GGG AGG AGT AGT

TTA C

CCC TTT GAA TAC TAC

AGA ATA AGA AAG G

AAG GTT GAA TTC TGG

CCC TGC TCC C

SHV-1 gB / 96 bp GTC TGT GAA GCG GTT CGT G CAC AAG TTC AAG GCC

CAC AT

TAC TAC AAG AAC GTC

ATC GTC ACG ACC GT

Influenza-

A-Virus

M1 / 96 bp AGA CCA ATC CTG TCA CCT

CTG

GAC AAA GCG TCT ACG

CTG C

TCC TCG CTC ACT GGG

CAC GGT G

PRRSV-

EU

ORF7 / 77 bp; Kleiboeker

et al. (2005);

GCA CCA CCT CAC CCA GAC CAG TTC CTG CGC CTT

GAT

CCT CTG CTT GCA ATC

GAT CCA GAC

PRRSV-

NA

ORF7 und 3′NTR / 114 bp;

Kleiboeker et al. (2005)

F1-ATG ATG RGC TGG CAT TCT;

F2-ATR ATG RGC TGG CAT TCC

CAC ACG GTC GCC CTA

ATT G

TGT GGT GAA TGG CAC

TGA TTG ACA

IK

(DNA)

β-Aktin / 185 bp GGT GTC CAG AGG CGC TCT T TCG CAC TTC ATG ATC

GAG TTG

CTG GGC ATG GAG TCC

TGC GGC

IK

(RNA)

β-Aktin / 90 bp GGT GTC CAG AGG CGC TCT T TCG CAC TTC ATG ATC

GAG TTG

CCT TCC TGG GCA TGG

AGT CCT GC

84 4. Ergebnisse

4.2.2 Entwicklung der TaqMan PCRs

4.2.2.1 Gelbasierte PCRs

Neu entwickelte Primerpaare wurden zunachst in konventionellen, gelbasierten PCRs ge-

testet, um die korrekte Große des Amplifikats sicherzustellen und unspezifische Bindungen

der Primer zu erkennen. Fur alle PCR-Produkte konnte eine der zu erwartenden Produkt-

große entsprechende Bande im Agarosegel gezeigt werden. Fur Zellkulturuberstande bzw.

zellfreie Materialien wurden keine unspezifischen Banden festgestellt. PCR-Produkte, die

in multiplex real-time Ansatzen unter Verwendung verschiedener Organmaterialien am-

plifiziert wurden, zeigten im Agarosegel neben den spezifischen Banden unterschiedlich

ausgepragte zusatzliche Bandenmuster (nicht dargestellt).

4.2.2.2 Sequenzierung der PCR Produkte

Alle PCR-Produkte wurden in Standardvektoren kloniert und zur Absicherung der Iden-

titat zur Sequenzierung eingeschickt (Fa. MWG–Biotech AG, Ebersberg). Die Sequenzie-

rung (s. Kapitel 3.2.2.12) aller PCR-Produkte ergab korrekte Sequenzen.

4.2.2.3 Optimierung

Im Rahmen der Entwicklung der PCRs wurden die Primer- und Sondenkonzentrationen

optimiert.

4.2.2.3.1 Primertitration

Bei der Optimierung der Primerkonzentrationen sollte der fur die effektive Amplifikation

der DNA (bzw. cDNA) geeignetste Konzentrationsbereich ermittelt werden. Kriterium

war ein moglichst niedriger Ct-Wert bei hohem Fluoreszenzwert. Das passende Werkzeug

zur Ermittlung des optimalen Konzentrationsverhaltnisses stellte die SYBRTM-Green real-

time PCR (s. Kapitel 2.4.3.2) dar. Zu diesem Zwecke wurden in Doppelansatzen Primerti-

trationen (wie unter 3.2.2.4.2 beschrieben) vorbereitet und durchgefuhrt. Abbildungen 4.4

und 4.5 zeigen eine SYBRTM-Green real-time PCR mit dazugehorigen Schmelzkurven. Mit

4.2. Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs 85

den eingesetzten Primerkombinationen wurden unterschiedliche Kurvenverlaufe hinsicht-

lich der Ct - und Fluoreszenzwerte (∆Rn) erzielt (Abbildung 4.4). Da die getesteten PCRs

in multiplex-Ansatzen durchgefuhrt werden sollten, durften zum Vermeiden der gegensei-

tigen Inhibition nicht die hochsten Konzentrationen ausgewahlt werden. Es musste ein

Kompromiss zwischen moglichst niedrigen Ct - Werten und niedrigen Primerkonzentra-

tionen gefunden werden. Die in Abbildung 4.5 auf Seite 87 dargestellten Schmelzkurven

dienten der Kontrolle der Produktspezifitat und der Uberprufung der Bildung unspezi-

fischer Produkte. Bei der NTC mit einer Primerkonzentration von 900 nM kam es im

Amplifikationsgraphen zu einem Anstieg der Fluoreszenz. In der Schmelzkurvenanalyse

zeigte dieses Produkt eine Schmelztemperatur von 72,5 ◦C, das spezifische Produkt dage-

gen 75,5 ◦C.

Fur eine bessere Ubersicht wurden die gewonnenen Daten in MicrosoftR© Excel 2003 (s.

Anhang A.7) exportiert und dort analysiert. Ein Beispiel ist in Abbildungen 4.6 und 4.7

zu sehen. Die rot gestrichelte Linie begrenzt jeweils die Bereiche mit besten Ct - und

Fluoreszenzwerten. Aus diesen Bereichen wurden die niedrigsten Primerkonzentrationen

ausgewahlt. Die ermittelten Optimalwerte sind in Tabelle 4.4 (Seite 90) dargestellt. Im

Anhang A.8 auf Seite 187 sind die weiteren Ergebnisse der Primertitrationen in Tabel-

le A.1 bis A.6 zusammengefasst.

864.

Ergeb

nisse

Abbildung 4.4: Primertitration am Beispiel der ASPV SYBRTM-Green real-time PCR. Die Abbildung zeigt die Amplifikationsgra-

phen die mit verschiedenen Primerkombinationen erzielt wurden. Sie unterscheiden sich in Ct- und Fluoreszenzwerten. Die beiden

negativen Kontrollen (NTC) wurden mit 50 bzw. 900 nM Primern durchgefuhrt (s. Abbildung 3.1). Sie zeigen ebenfalls einen Anstieg

der Fluoreszenz.

4.2.E

ntw

icklu

ng

der

multip

lexreal-tim

eTaq

Man

PC

Rs

87

Abbildung 4.5: Primertitration am Beispiel der ASPV SYBRTM-Green real-time PCR. Die Abbildung zeigt die zur Abbildung 4.4

gehorenden Schmelzkurven. Die Schmelztemperatur des spezifischen Produktes betragt 75,5 ◦C. Es ist eine deutliche Bildung von

unspezifischen Produkten bei NTC mit 900 nM Primern zu sehen. Die Schmelztemperatur betragt 72,5 ◦C.

884.

Ergeb

nisse

Abbildung 4.6: Ergebnisse der Primertitration am Beispiel der ASPV SYBRTM-Green real-time PCR, dargestellt in Microsoft R©

Excel. Fur die getesteten Primerkombinationen wurden Fluoreszenzwerte ermittelt (∆Rn - baseline-korrigierte, normalisierte Fluo-

reszenz) und hier grafisch dargestellt. Die rot gestrichelte Linie begrenzt den Bereich der optimalen Primerkombinationen. Der Pfeil

zeigt auf die gewahlte Primerkombination.

4.2.E

ntw

icklu

ng

der

multip

lexreal-tim

eTaq

Man

PC

Rs

89

Abbildung 4.7: Ergebnisse der Primertitration am Beispiel der ASPV SYBRTM-Green real-time PCR, dargestellt in Microsoft R©

Excel. Fur die getesteten Primerkombinationen wurden Ct-Werte ermittelt und hier grafisch dargestellt. Die rote gestrichelte Linie

begrenzt den Bereich der optimalen Primerkombinationen. Der Pfeil zeigt auf die gewahlte Primerkombination.

90 4. Ergebnisse

4.2.2.3.2 Sondentitration

Hierbei wurden die optimalen Konzentrationen fur die jeweilige TaqMan-Sonde ermittelt.

Ziel waren niedrige Ct- und hohe ∆Rn-Werte. Die optimalen Sondenkonzentrationen sind

ebenfalls in Tabelle 4.4 festgehalten.

Tabelle 4.4: Die experimentell ermittelten optimalen Primer- und Sondenkonzentratio-

nen. Die Primer- und Sondenkonzentrationen fur die PRRSV-PCR wurden aus dem Pro-

tokoll von Kleiboeker et al. (2005) ubernommen.

Virus Fwd-Primer Rev-Primer Sonde

ASPV 300 nM 300 nM 100 nM

SHV-1 100 nM 100 nM 300 nM

PCV-2 100 nM 300 nM 200 nM

PPV 300 nM 300 nM 200 nM

”Panpesti“ 100 nM 100 nM 100 nM

Influenza-A 100 nM 300 nM 200 nM

PRRSV-NA 300 nM 300 nM 200 nM

PRRSV-EU 300 nM 300 nM 200 nM

β-Aktin mRNA 50 nM 50 nM 100 nM

β-Aktin gDNA 50 nM 50 nM 100 nM

4.2.2.4 Entwicklung interner Kontrollen

Als interne Kontrolle wurde das β-Aktingen gewahlt. Basierend auf der in GenBank 3

verfugbaren porzinen genomischen β-Aktinsequenz und unter Einbeziehung einer entspre-

chenden mRNA-Sequenz wurden ein Primerpaar und zwei TaqMan-Sonden entwickelt. Die

erste TaqMan-Sonde wurde konzipiert, um genomische DNA nachzuweisen. Diese Sonde

wurde an der Ubergangsstelle eines Introns zum Exon platziert und besaß eine komplet-

te Identitat zum gewahlten Genomabschnitt. Die zweite Sonde sollte dem Nachweis der

mRNA dienen und besaß die komplementaren Sequenzen zweier benachbarter Introns, so

3http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/

4.2. Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs 91

Abbildung 4.8: β-Aktin Primer- und Sondenlokalisation. Dargestellt sind die Lokalisa-

tionen der Primer (beta-actin-rev-rna, beta-actin-fwd-rna) sowie zweier Sonden. Die Re-

ferenzsequenz ist die genomische β-Aktin-Sequenz des Schweines. Grau hinterlegt ist der

Bereich des Introns. Die Sonde b-actin-dna-tm dient dem Nachweis genomischer DNA und

ist mit der genomischen Sequenz identisch. Die Sonde b-actin-rna-2 ist nur mit der Sequenz

ohne Intron (also ensprechender messenger-RNA) voll identisch, mit der hier dargestellten

genomischen β-Aktin-Sequenz liegt nur eine partielle Identitat vor.

dass bei Vorliegen genomischer DNA eine vollstandige Bindung der Sonde unterbunden

wurde (s. Abbildung 4.8). Um die Spezifitat der Primer und Sonden zu uberprufen, wurden

sie in der TaqMan-PCR mit aus Organmaterial isolierten DNA, bzw. RNA nach reverser

Transkription eingesetzt. Bei der Uberprufung der TaqMan-Sonde zum Nachweis genomi-

scher DNA mit der aus mRNA erstellten cDNA wurden positive Reaktionen verzeichnet

(nicht gezeigt). Eine Differenzierung der Quelle war mit den eingesetzten Methoden nicht

92 4. Ergebnisse

moglich. Nach einem DNase-Verdau verschwanden diese Reaktionen (s. Abbildung 4.9).

Abbildung 4.9: β-Aktin RNA-DNA Diskriminierung. Eingesetzt wurde Nukleinsaure

nach RNA-Isolierung aus Organmaterial mittels RNeasy R© Lipid Tissue Kits, anschließen-

dem DNase-Verdau und reverser Transkription. Die b-actin-rna-2 -Sonde zeigt eine positive

Reaktion, die beta-actin-dna-tm-Sonde dagegen eine negative. Ohne DNase-Verdau zeigte

die beta-actin-dna-tm-Sonde auch ein positives Signal (nicht gezeigt).

4.2.2.5 Multiplex real-time PCRs

Da bei der Entwicklung der real-time multiplex PCR mehr Fragmente gleichzeitig detek-

tiert werden sollten, als das PCR-Gerat erlaubte, mussten sie auf mehrere Reaktionen

aufgeteilt werden (multitube). Bei der Aufteilung der unterschiedlichen Reaktionsansatze

4.2. Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs 93

wurden Kriterien zugrunde gelegt, die den Eigenschaften der Viren und der Seuchensitua-

tion Rechnung tragen sollten. Zum einen erfolgte die Kombination der Erreger anhand

ihres Genoms, d. h., dass RNA-Viren untereinander und DNA-Viren untereinander kom-

biniert wurden, um einen reibungslosen Reaktionsablauf zu gewahrleisten. Zum anderen

wurde eine moglichst geringe Konkurrenz der einzelnen Primer um die Ressourcen an-

gestrebt. Ein weiteres Kriterium war die epidemiologische Situation im Sinne der Wahr-

scheinlichkeit des Auftretens der Erreger.

Die auf Grundlage dieser Kriterien gewahlte Zusammensetzung der einzelnen Ansatze ist

in Tabelle 4.5 dargestellt.

Die Kopplung der erregerspezifischen Sonden erfolgte fur alle Ansatze an die Fluores-

zenzfarbstoffe FAM und HEX, die Sonden fur die internen Kontrollen wurden mit Cy5

markiert. ROX diente in den Reaktionen als Referenzfarbstoff.

Tabelle 4.5: Zusammensetzung einzelner real-time PCR-Ansatze im Gesamtkonzept. Ref.

Dye = Referenzfarbstoff; IK = interne Kontrolle

Farbstoff Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Quencher

FAM ASPV PPV Panpesti PRRSV-EU BHQ-1

HEX SHV-1 PCV-2 Influenza-A PRRSV-NA BHQ-2

Cy5 − IK − IK BHQ-2

ROX Ref. Dye Ref. Dye Ref. Dye Ref. Dye −

Fur eine bessere Einschatzung der Leistung und Kinetik der PCRs wurden Standard-

kurven (s. Kapitel 2.4.4.4) erstellt und analysiert. Alle Standardkurven-PCRs wurden in

Dreifachansatzen sowohl in einzel- als auch in multiplex-PCRs mit Plasmidkonzentratio-

nen von 107 bis 100 Kopien pro Ansatz durchgefuhrt. Zur Auswertung wurden die Stufen

von 106 bis 101 Kopien pro Ansatz herangezogen.

Die multiplex-Ansatze zeigten ausnahmslos eine geringere Effizienz als die entsprechenden

PCRs im Einzelansatz. Im Einzelnen wurde fur die ASPV-spezifische PCR eine Effizienz

von 91,0 % im einzel- und von 82,4 % im multiplex-Ansatz mit SHV-1 ermittelt. Die

SHV-1 spezifische PCR zeigte eine Effizienz von 96,7 % in der einzel-, bzw. von 80,4 % in

der multiplex-PCR mit ASPV.

Fur die PCV-2 und PPV-spezifischen PCRs betrugen die Effizienzen in den jeweiligen

94 4. Ergebnisse

einzel-PCRs 98,8 % (PCV-2) bzw. 99,5 % (PPV). Kombiniert in einer multiplex-PCR be-

trugen die jeweiligen Effizienzen 85,6 % bzw. 90,4 %. Bei der Ermittlung der Effizienzen der

Pestiviren- bzw. Inluenza-A-spezifischen PCRs konnten Einzeleffizienzen von 92,9 % und

98,8 % festgestellt werden. Im multiplex-Ansatz betrugen die Effizienzen 90,8 % (Pestivi-

ren) bzw. 69,9 % (Influenza). Eine zusammengefasste Darstellung der Ergebnisse befindet

sich im Anhang A.8.

4.3 Validierung

4.3.1 Sensitivitat

Gemaß des Validierungsschemas der OIE sollte das Detektionslimit bzw. die analyti-

sche Sensitivitat der PCR in Endpunktverdunnungen anhand der Anzahl nachweisba-

rer Genomaquivalente bzw. infektioser Einheiten (KID50, PFU) bestimmt werden. Wo

moglich, wurden Endpunktverdunnungen auch in Zellkultur nach Art einer Virustitration

getestet. Fur jedes Virus wurde die analytische Sensitivitat des Ansatzes in einzel-PCRs

in Genomaquivalenten bestimmt. Dazu wurden in Standardvektoren einklonierte PCR-

Produkte logarithmisch verdunnt und in einzel- und multiplex TaqMan real-time PCRs

eingesetzt. Die Verdunnungsstufen enthielten 107 bis 100 Kopien pro PCR-Ansatz. Fur

alle einzel-PCRs konnte ausnahmslos ein Detektionslimit von 101 Kopien/Ansatz festge-

stellt werden. Die Ergebnisse sind in Tabellen A.7 bis A.13 im Anhang A.8 dargestellt.

Parallel wurden fur das porzine Influenza-A-Virus, PRRSV, PPV, SHV-1 und KSPV End-

punktverdunnungen einer Virussuspension (Zellkulturuberstand) bekannten Titers ange-

legt und sowohl in Zellkultur in Form einer Virustitration als auch in PCR-Ansatzen

untersucht. Dabei wurde die Sensitivitat des zellkulturellen Systems mit der Nachweis-

grenze der vorliegenden PCR verglichen und der theoretische Virustiter der logarithmi-

schen Verdunnungsreihe der tatsachliche KID50 der entsprechenden Losung zugeordnet.

Zu diesem Zweck wurden die logarithmisch angelegten Verdunnungsstufen in zwei Ali-

quots geteilt. Fur die Virustitrationen wurde ein Aliquot wiederum in logarithmischen

Verdunnungsreihen auf permissive Zellen verimpft. Die Berechnung des Virustiters der

Verdunnungsstufe erfolgte hier in KID50 pro 100µl. Fur den Vergleich der Methoden

4.3. Validierung 95

wurde diese Zahl auf das in der PCR eingesetzte Volumen von 6µl umgerechnet. Das

zweite Aliquot wurde der Nukleinsaureextraktion zugefuhrt und in der PCR eingesetzt.

Die PCRs wurden in Dreifachansatzen sowohl qualitativ (positiv/negativ) als auch quan-

titativ (Genomaquivalente) bewertet. Die Ergebnisse der beiden Untersuchungsmethoden

wurden in Relation zueinander gesetzt. Im Einzelnen waren die Ergebnisse wie folgt: In

der SHV-1 spezifischen PCR konnte eine Virussuspension mit 60,5 KID50/6µl als positiv

getestet werden, was 1,37 Genomaquivalenten entsprach. Die PPV-PCR ergab ein posi-

tives Signal in der Stufe 7 der logarithmischen Verdunnungsreihe, was einer KID50/6µl

von 0,74 bzw. 1,17 Genomaquivalenten entsprach. Die letzte Verdunnungsstufe, die in der

PCR zum Nachweis der Pestiviren als positiv getestet wurde, hatte einen KID50/6µl-Wert

von 0,60 oder 7,18 Genomaquivalenten. In der Influenza-A-spezifischen PCR konnte eine

Virussuspension mit 0,06 KID50 (umgerechnet auf 6µl) als positiv getestet werden, was

192 Genomaquivalenten entsprach. Es konnten außerdem drei weitere Verdunnungsstu-

fen als positiv getestet werden. Die Konzentrationen lagen hier bei 19,5, 2,1 und 0,81

Genomaquivalenten. Zur Bestimmung der analytischen Sensitivitat der beiden PRRSV-

PCRs wurden je ein amerikanischer und europaischer Impfstamm des Virus (PRRSV-EU,

bzw. PRRSV-NA) in Zellkultur vermehrt und titriert. Die PRRSV-EU real-time PCR

wies in der Verdunnungsstufe mit auf 6µl umgerechneten 0,6 KID50 26,4 Genomaquiva-

lente nach, die PRRSV-NA PCR entsprechend bei 0,06 KID50 373 Genomaquivalente. Bei

beiden real-time PCRs konnte jeweils eine weitere Verdunnungsstufe der logarithmischen

Endpunktverdunnungsreihe als positiv detektiert werden. Die PRRSV-NA-PCR ergab

13,5, die PRRSV-EU-PCR 1,07 Genomaquivalente. Beispieldarstellungen befinden sich in

den Abbildungen 4.10 und 4.11. Weitere Versuchsergebnisse befinden sich im Anhang A.8.

4.3.2 Spezifitat

Beim Design der Primer und Sonden wurde eine BLAST-Suche durchgefuhrt, die eine

Interaktion mit anderen Erregern moglichst ausschließen sollte. Diese Suche ergab fur al-

le ausgewahlten Primer und Sonden spezifische Identitaten mit dem jeweiligem Erreger

(Ergebnisse nicht dargestellt).

Des Weiteren wurden Tests mit Virusisolaten und verschiedenen Organmaterialien (s.

Kapitel 3.1.2.1) durchgefuhrt. Bei der Entwicklung und Validierung der pestivirusspezifi-

96 4. Ergebnisse

Abbildung 4.10: Bestimmung der Nachweisgrenze der PPV-PCR mittels Endpunktbe-

stimmung. In diesem Balkendiagramm sind die in logarithmischen Verdunnungsstufen (V1

bis V8) einer Virussuspension bekannten Titers ermittelten Genomaquivalente dargestellt

(Standardabweichungen sind als Balken eingetragen). Zur besseren Darstellbarkeit wur-

den die Werte logarithmiert. Diese Werte wurden mit den in Zellkultur ermittelten und

auf das PCR-Probenvolumen umgerechneten Virustitern korreliert. Die Virustiter sind als

logKID50/6 µl oberhalb der Kennzeichnung der Verdunnungsstufen angegeben.

schen PCR wurden Virussuspensionen und virushaltiges Organmaterial von experimentell

infizierten Tieren untersucht. Es konnten die eingesetzten KSPV-Isolate aus den phylo-

genetischen Gruppen 1.1-1.3, 2.1-2.3 sowie 3.4 positiv getestet werden. Zudem waren

BVDV-1-, BVDV-2-, BDV- sowie eine pestivirushaltige Virussuspension in der real-time

PCR positiv. Lediglich das von einem experimentell mit BDV Gifhorn 10754 infizierten

Schwein stammende Organmaterial war negativ. Die Ergebnisse sind in Tabelle A.7 auf

Seite 194 abgebildet.

Fur das Primer- und Sondendesign der PCV-2-spezifischen PCR wurde die typspezifische

Region des ORF2 gewahlt (s. Kapitel 2.3.6.1). Eine Uberprufung der Kreuzreaktivitat mit

PCV-1 erfolgte mittels PCV-1-Plasmiden (freundlicherweise zur Verfugung gestellt von

Frau Dr. Mankertz, Robert-Koch-Institut, Berlin). Es wurde gezeigt, dass keine Kreuzre-

aktionen vorlagen. Außerdem wurden die als PCV-2-positiv deklarierten Proben korrekt

4.3. Validierung 97

Abbildung 4.11: Bestimmung der Nachweisgrenze der Influenza-A-PCR mittels End-

punktbestimmung. In diesem Balkendiagramm sind die in logarithmischen Verdunnungs-

stufen (V1 bis V8) einer Virussuspension bekannten Titers ermittelten Genomaquivalente

dargestellt (Standardabweichungen sind als Balken abgetragen). Zur besseren Darstellbar-

keit wurden die Werte logarithmiert. Diese Werte wurden mit den in Zellkultur ermittelten

und auf das PCR-Ansatzvolumen umgerechneten Virustitern korreliert. Die Virustiter sind

als logKID50/6 µl oberhalb der Kennzeichnung der Verdunnungsstufen angegeben.

als positiv erkannt, sowie die PCV-2 negativen als solche bestatigt (nicht gezeigt).

Im Rahmen der Spezifitatsprufung wurden zwolf Isolate beim Schwein vorkommender

Subtypen des Influenza-A-Virus (s. Tabelle 3.2) und drei weitere als positiv erkannt (s.

Tabelle A.8).

Die vier Plasmide mit klonierten Sequenzen des VP72-Proteins des ASPV, die im Rahmen

dieser Arbeit zur Verfugung standen, wurden alle in der real-time PCR erkannt (nicht ge-

zeigt).

Uber 20 SHV-1-Isolate, welche aus verschiedenen Regionen Deutschlands sowie aus Frank-

reich, Osterreich und Tschechien stammten, konnten in die Uberprufung einbezogen wer-

den (s. Kapitel tab:SHV1Isolate). In der real-time PCR wurden sie alle positiv getestet

(s. Tabelle A.9).

Die im Kapitel 3.1.2.1 aufgefuhrten PPV-Isolate wurden ebenfalls in der hier entwickel-

98 4. Ergebnisse

ten PCR erkannt. Außerdem wurden zwei von 33 getesteten klinischen Proben (s. Kapi-

tel 4.3.3) als positiv detektiert. Die in das Gesamtkonzept aufgenommene real-time PCR

zur Detektion und Differenzierung von europaischen und nordamerikanischen PRRSV-

Stammen (Kleiboeker et al., 2005) wurde ohne Modifikationen der Primer- bzw. Son-

densequenzen ubernommen. Im Rahmen der Validierung dieser PCRs wurden zwei PRRSV-

Impfstamme (MLV und DV) eingesetzt, beide wurden spezifisch als positiv erkannt. Dabei

bestanden keine Kreuzreaktionen zwischen den beiden PCRs (nicht gezeigt).

4.3.3 Klinische Proben

Zusatzlich zu den oben aufgefuhrten, im Rahmen der Spezifitatsstudien untersuchten

Virusisolaten und Organmaterialien, wurden im Rahmen der weiteren PCR-Validierung

experimentell gewonnene Proben aus dem EURL sowie klinische Proben aus der Routi-

nediagnostik der Außenstelle fur Epidemiologie der TiHo Hannover in Bakum getestet.

Alle Untersuchungen fanden mit der endgultigen Version des multiplex multitube Ansat-

zes statt. Die Auswahl wurde aus dem vorhandenen Probenmaterial zufallig getroffen.

Es wurden insgesamt 17 Proben untersucht, die von Schweinen stammten, die am EURL

experimentell mit verschiedenen KSPV- bzw. BDV-Stammen infiziert und anschließend

mit den Routinemethoden des EURL zum Virus- und Antikorpernachweis untersucht

worden waren. Die Tiere dieser Versuchsvorhaben stammten aus dem Lehr- und For-

schungsgut Ruthe und waren im Vorfeld der Versuche ausschließlich auf Pestivirenfreiheit

untersucht worden. Ein Teil des Probenmaterials stammte von diesen Probennahmen vor

der Infektion und war somit vorberichtlich KSPV, BDV und BVDV negativ. Eine Probe

mit der Bezeichnung ZA4 stammte aus einem KSPV-Ausbruch in Sudafrika im Jahr 2005.

In dieser Probe wurde vorberichtlich KSPV mittels PCR und Virusisolierung nachgewie-

sen. In Tabelle 4.6 sind die Ergebnisse der Untersuchungen der oben aufgefuhrten Proben

zusammenfasst. Alle vorberichtlich KSPV-positiven Tiere konnten in der multiplex PCR

erkannt werden, wobei das Probenmaterial eines mit CSF0309 (Stamm Kanagawa) infi-

zierten Schweins nicht eindeutig beurteilt werden konnte, da es sowohl schwach positive

Ergebnisse mit hohen Ct-Werten als auch negative Resultate ergab. Alle Proben, die vor

der Infektion entnommen worden waren, konnten korrekt als negativ bestatigt werden.

4.3. Validierung 99

Die Detektion des BDV-Stamms Gifhorn 10754 in der Probe eines vorberichtlich positiven

Schweins gelang nicht. In Organmaterialien von drei Tieren konnte PCV-2 nachgewiesen

werden. Die Tests fur alle anderen Viren verliefen negativ.

Die 33 Proben aus der Außenstelle fur Epidemiologie waren im Vorfeld auf verschiede-

ne porzine Viren und andere Pathogene untersucht worden. Erwartungsgemaß wurden

hier weder ASPV, SHV-1 noch Pestiviren festgestellt (s. Tabelle 4.7). 21 von 33 Proben

(64 %) wurden in der PCV-2-spezifischen PCR positiv getestet. Im Vergleich mit den Er-

gebnissen der Untersuchungen der Außenstelle fur Epidemiologie, die fur 16 der Proben

vorlagen, zeigte sich, dass es acht Abweichungen von den dort erhobenen Befunden gab.

Die Abweichungen betrafen v. a. dort als fraglich befundete Proben. Funf dieser fraglichen

Proben wurden in der hier verwendeten PCR als positiv detektiert, zwei als negativ. Eine

Probe wurde in Bakum negativ, mit der hier entwickelten PCR jedoch positiv getestet.

Die PPV-spezifische PCR detektierte zwei der 33 Proben als positiv (6 %), ein Vergleich

mit Ergebnissen anderer Untersuchungsstellen war in diesem Fall nicht moglich. Neun

von 33 Proben (27 %) wurden mit der entwickelten Influenza-A-spezifischen PCR positiv

getestet. Ein Vergleich mit den Ergebnissen der Außenstelle fur Epidemiologie war fur

drei Proben moglich. Es zeigte sich eine Abweichung insofern, dass eine dort als positiv

getestete Probe im vorliegenden Ansatz negativ war. Die im Rahmen der vorliegenden

Arbeit verwendeten PRRSV-spezifischen PCRs ergaben drei (9 %) positive Ergebnisse

fur PRRSV-EU und vier positive Ergebnisse fur PRRSV-NA (12 %). Der Vergleich mit

Befunden aus Bakum war fur zwei PRRSV-EU-Befunde und einen PRRSV-NA-Befund

moglich. Fur PRRSV-EU ergaben sich keine Abweichungen, die PRRSV-NA-Befunde wi-

chen voneinander ab. Wahrend die Probe in Bakum als positiv befunden wurde, zeigte

sie in der vorliegenden PCR ein negatives Ergebnis.

Die oben genannten Ergebnisse schließen Proben mit ein, deren Ergebnisse fur mehr als

ein Virus positiv ausfielen. Insgesamt wurden mit der hier entwickelten PCR 12 Proben

(36 %) doppelt positiv und eine Probe (3 %) dreifach positiv getestet. Die dreifach positi-

ve Proben gab positive Ergebnisse fur PCV-2, Influenza-A-Virus und PRRSV-NA. Diese

Probe war auch in Bakum auf PCV-2 und Influenza-A-Virus positiv getestet worden,

ein Ergebnis fur PRRSV-NA lag fur einen Vergleich nicht vor. Bei den doppelt positiven

Proben ergaben vier Proben (12 %) positive Ergebnisse fur PCV-2 und Influenza-A-Virus,

zwei Proben (6 %) positive Ergebnisse fur PCV-2 und PRRSV-NA, zwei Proben (6 %) po-

100 4. Ergebnisse

sitive Ergebnisse fur PCV-2 und PPV, drei Proben (9 %) positive Ergebnisse fur PCV-2

und PRRSV-EU und eine Probe die Ergebniskombination PRRSV-NA und Influenza-A-

Virus.

Ein Vergleich mit den Ergebnissen aus Bakum war fur die doppelt positiven Proben nur

teilweise moglich, da nicht alle Erreger, die mit der vorliegenden PCR detektiert wurden,

auch dort in die Tests einbezogen wurden. Im Detail wurde eine vorberichtlich PCV-

2 fragliche Probe in der multiplex-PCR PCV-2 und Influenza-A-Virus positiv getestet.

Eine andere, vorberichtlich PCV-2 und Influenza-A-Virus positive Probe wurde mit der

vorliegenden PCR als PCV-2 und PRRSV-NA positiv, jedoch Influenza-A-Virus negativ

detektiert. Eine weitere, vorberichtlich PCV-2 positive Probe wurde hier zusatzlich PPV

positiv getestet. Das Ergebnis einer PCV-2 und Influenza-A-Virus positiven Probe konnte

bestatigt werden. Fur eine PCV-2 und Influenza-A-Virus positive Probe lag aus Bakum

ausschließlich ein PRRSV-EU negatives Ergebnis vor, das mit der hier verwendeten PCR

bestatigt werden konnte. Eine vorberichtlich PCV-2 fragliche Probe wurden im vorliegen-

den Ansatz PCV-2 und PRRSV-EU positiv detektiert. In einer weiteren PCV-2 positiven

Probe konnte neben diesem Erreger auch PRRSV-NA gefunden werden.

4.3.V

alidieru

ng

101

Tabelle 4.6: Ergebnisse der Untersuchung KSPV-positiver sowie -negativer Proben. Die Proben stammten von Schweinen aus dem

Lehr- und Forschungsgut Ruthe, die im Rahmen verschiedener Tierversuche am EURL eingesetzt wurden. Die mit 0 dpi (Tage post

infectionem) gekennzeichneten Proben sind als vorberichtlich pestivirennegativ anzusehen. Unter Isolat sind jeweils die eingesetzten

Pestiviren-Isolate aufgefuhrt.

Probe Nr.: Isolat ASPV SHV-1 PCV-2 PPV Pestiviren Influenza-A PRRSV-EU PRRSV-NA

ZA4 CSF0849 − − + − + − − −

287 CSF0849 − − − − + − − −

284 CSF0849 − − + − + − − −

282 CSF0905 − − + − + − − −

272 CSF0634 − − − − + − − −

270 CSF0647 − − − − + − − −

266 CSF0309 − − − − − − − −

237 CSF0695 − − − − + − − −

217 CSF0634 − − − − + − − −

217 (0 dpi) negativ − − − − − − − −

216 (0 dpi) negativ − − − − − − − −

209 CSF0905 − − − − + − − −

208 CSF0905 − − − − + − − −

100 (0 dpi) negativ − − − − − − − −

99 (0 dpi) negativ − − − − − − − −

80 (0 dpi) negativ − − − − − − − −

219 BDV-Gifhorn − − − − − − − −

1024.

Ergeb

nisse

Tabelle 4.7: Ergebnisse der Untersuchung klinischer Proben. Die Proben stammten aus der Routinediagnostik der Außenstelle

fur Epidemiologie, Bakum. Die mit der real-time multiplex multitube PCR erzielten Ergebnisse sind unter A, die Ergebnisse der

Voruntersuchungen unter B angegeben. Die nicht abgedeckten Erreger sind als N/D (nicht durchgefuhrt) gekennzeichnet. Ein”?“

steht fur ein vorberichtlich als”fraglich“ bezeichnetes Ergebnis.

Probe Nr.: ASPV SHV-1 PCV-2 PPV Pestiviren Influenza-A PRRSV-EU PRRSV-NA

A B A B A B A B A B A B A B A B

1 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − − − − − −

2 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D + N/D − − − −

3 − N/D − N/D − ? − N/D − N/D − − − − − −

4 − N/D − N/D + + − N/D − N/D + + − − + −

5 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − + − − + −

6 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − − − − − −

7 − N/D − N/D − − − N/D − N/D − − − − − −

8 − N/D − N/D − − − N/D − N/D − − − − − −

9 − N/D − N/D − − − N/D − N/D − − − − − −

10 − N/D − N/D − ? − N/D − N/D − − − − − −

11 − N/D − N/D − − − N/D − N/D + − − − − +

12 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − − + − −

13 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − − − − −

14 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − − − − − −

15 − N/D − N/D − ? − N/D − N/D + − − − − −

Fortsetzung auf der nachsten Seite

4.3.V

alidieru

ng

103

Tabelle 4.7: (Fortsetzung)

Probe Nr.: ASPV SHV-1 PCV-2 PPV Pestiviren Influenza-A PRRSV-EU PRRSV-NA

A B A B A B A B A B A B A B A B

16 − N/D − N/D + + + N/D − N/D − N/D − N/D − N/D

17 − N/D − N/D + + − N/D − N/D + + − − − −

18 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D − − − − − −

19 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − − − − −

20 − N/D − N/D + N/D + N/D − N/D − − − N/D − N/D

21 − N/D − N/D + N/D − N/D − N/D + − − N/D − N/D

22 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D

23 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D

24 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D + − − N/D + N/D

25 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D

26 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D

27 − N/D − N/D − + − N/D − N/D + − − − − −

28 − N/D − N/D + − − N/D − N/D + − − + − −

29 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D − − + − − −

30 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D − − − − + −

31 − N/D − N/D − + − N/D − N/D − − − − − −

32 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − + N/D − N/D

33 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − + − − −

5. Diskussion

5.1 Gesamtkonzept

Die KSP gehort zu den wichtigsten viralen Erkrankungen der Hausschweine weltweit

und besitzt eine hohe wirtschaftliche Bedeutung (Edwards, 2000). Die soziookonomi-

schen Folgen eines großen KSP-Ausbruchs wie z. B. 1997 in den Niederlanden zeigen, von

welch herausragender Bedeutung eine fruhe, schnelle und verlassliche Diagnose fur die

Eindammung und Bekampfung des Seuchengeschehens ist (Murray und McCutcheon,

1999; Elbers et al., 2004). Eine moderne und effiziente Labordiagnostik ist daher so-

wohl fur die Uberwachung der Schweinepopulation in”Friedenszeiten“ als auch fur die

fruhe Erkennung eines Ausbruchs essentiell (Moennig, 2000). Da die klinischen Sym-

ptome und pathologisch-anatomischen Befunde einer KSPV-Infektion sehr variabel und

haufig unspezifisch sind (Depner et al., 1997b; Moennig, 1992; Elbers et al., 2002),

kommen viele andere Erkrankungen unterschiedlicher Genese als Differentialdiagnosen in

Betracht. Zu den viralen Differentialdiagnosen gehoren ASPV-, PCV-2-, PPV-, porzine

Influenza-Virus-, PRRSV- sowie SHV-1-Infektionen (van Oirschot, 1999b; Moennig

et al., 2003). Ein nicht unerhebliches Problem fur die fruhe Erkennung eines Ausbruchs

ist die psychologische Hemmschwelle fur Landwirte und Tierarzte, einen KSP-Verdacht

zu außern, da sofort weitreichende Konsequenzen fur den betroffenen Betrieb die Folge

sind. Eine Nachweismethode, die schnell und sicher eine mogliche KSPV-Infektion erfasst

und die wichtigsten viralen Differentialdiagnosen abklart, konnte ein wichtiges Binde-

glied darstellen. Zu den schnellsten Methoden des Virusgenomnachweises gehort die PCR

(Belak, 2005). Die technischen Entwicklungen der letzten Jahre eroffnen die Moglichkeit,

Genomfragmente mehrerer Pathogene gleichzeitig in einer multiplex PCR nachzuweisen.

105

106 5. Diskussion

Multiplex Ansatze konnen in der Differentialdiagnostik wichtiger Erreger eine zeitsparen-

de Alternative darstellen, die auch den personellen Aufwand minimieren, da viele Schrit-

te automatisierbar sind (Elnifro et al., 2000). In der Humanmedizin finden derartige

Ansatze z. B. fur die Detektion durch Blutkonserven ubertragbarer Erkrankungen An-

wendung (Candotti et al., 2004).

Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Umsetzbarkeit dieses Konzeptes fur die

KSP-Differentialdiagnostik zu uberprufen und eine moderne und schnelle Nachweisme-

thode differentialdiagnostisch relevanter viraler Pathogene in Abgrenzung zu KSPV bzw.

Pestiviren zu entwickeln. Die technische Umsetzung sollte als multiplex multitube real-

time RT-PCR erfolgen, die neben einem Pestivirusnachweis die oben bereits erwahnten

viralen Erreger (ASPV, PCV-2, Influenza-A-Virus, PRRSV-EU, PRRSV-US, SHV-1) ein-

schloss.

5.2 Auswahl der Nachweismethode

Fur die Umsetzung eines multiplex PCR-Ansatzes stehen generell sowohl die konven-

tionelle, gel-basierte als auch die real-time PCR zur Verfugung. Real-time PCRs bie-

ten im Vergleich zur gel-basierten PCR eine erheblich hohere Sensitivitat und Spezifitat

(Bustin, 2002). Ein weiterer Vorteil ist die Zeitersparnis durch Wegfall der Gelelektropho-

rese (Higuchi et al., 1993). Um eine moglichst rasche Diagnose bzw. Differentialdiagnose

zu gewahrleisten, wurde daher fur diese Arbeit der real-time PCR der Vorzug gegeben.

Die Anzahl der in Frage kommenden differentialdiagnostisch relevanten Erreger machten

einen multitube Ansatz notwendig, da die Moglichkeiten der Farbstoffdetektion gerates-

pezifischen Limitierungen unterlag. Es standen vier Kanale zur Erfassung der Fluoreszenz

zu Verfugung. Da ein Referenzfarbstoff sowie eine interne Kontrolle in jedem Lauf mit-

gefuhrt werden sollten, waren nur zwei Kanale verfugbar. Aus diesem Grund wurden zwei

Erreger in einem Ansatz mit den entsprechenden Referenzen und Kontrollen kombiniert.

Im vorliegenden Fall war die Limitierung der Anzahl der Nachweise pro Ansatz durchaus

ein Vorteil, da durch gezielte Kombination der Viren einerseits der Verlust von Sensiti-

vitat minimiert, und andererseits den Eigenschaften der Viren Rechnung getragen werden

konnte. Die Verwendung eines einheitlichen Thermoprofils macht es moglich, das Testsys-

5.2. Auswahl der Nachweismethode 107

tem beliebig um weitere relevante Erreger zu erweitern.

Die Detektionsmoglichkeiten fur eine real-time PCR umfassen spezifische und unspezifi-

sche DNA-Nachweismethoden (s. Kapitel 2.4.3.2 und 2.4.3.3). Die Zielstellung einer mul-

tiplex PCR schloss von vornherein unspezifische DNA-Detektionsmethoden aus (wie z. B.

SYBRTM-Green real-time PCR). Eine gut etablierte, robuste und weit verbreitete Tech-

nik stellt die TaqMan real-time PCR dar (Terry et al., 2002). Neben dieser Technik

besteht die Moglichkeit Molecular Beacons bzw. das PriProET System einzusetzen. Von

der ersten Moglichkeit wurde z. B. im Rahmen des EU Projektes QLK2-CT-2000-004861

fur den Nachweis der Viren des respiratorischen Clusters (ASPV, KSPV, PRRSV, SHV-1,

PPV) Gebrauch gemacht.

Die Molecular Beacon Technik stellt eine hochspezifische Methode dar. Fur wissenschaft-

lichen Fragestellungen (z. B. SNP single nucleotide polymorphism) ist die hohe Spezifitat

dieses Systems erwunscht, um Punktmutationen nachzuweisen. Fur den Einsatz in der

Diagnostik, in der zudem RNA-Viren, deren Mutationsrate relativ hoch ist, zu detek-

tieren sind, konnte eben dies zu erheblichen Nachweisproblemen fuhren. Zudem ist das

Design der Sonden sehr aufwendig und die Synthese teuer (Bustin, 2002). Aus dem im

Internet publizierten Bericht zu den Ergebnissen des oben genannten EU-Projekts2 geht

hervor, dass diese Problematik ein nicht unerhebliches Hindernis bei der Entwicklung einer

KSPV- bzw. PRRSV-spezifischen PCR darstellte. Eine erhebliche Anzahl Beacons und

Primer musste entwickelt werden, um eine akzeptable Losung zu finden. Die Detektion

der Genotypen konnte fur das KSPV nur uber die Integration mehrerer Beacons in einem

Ansatz gewahrleistet werden. Im Gegensatz dazu ist die TaqMan Technik wesentlich ro-

buster. Diese Technik erlaubte die Kombination der Vorteile einer real-time PCR mit der

Moglichkeit, mehrere Genfragmente gleichzeitig spezifisch zu detektieren (Bustin und

Nolan, 2004a).

Im Rahmen des EU-Projektes wurden PriProET Protokolle fur die Viren des hamorrhagi-

schen und vesikularen Clusters entwickelt. Die Methodik ist ebenfalls sensitiv und robust

und scheint den Ergebnissen des erwahnten Projektes nach, auch fur die Diagnostik geeig-

net. Zum Zeitpunkt des Entwurfes der vorliegenden Arbeit war diese Technik noch nicht

sehr verbreitet bzw. fur veterinarmedizinische Fragestellungen etabliert. Es wurde daher

1http://www.multiplex-eu.org2http://www.multiplex-eu.org/results.pdf, Stand 15.01.2006

108 5. Diskussion

auf die fur die gewahlte Fragestellung erprobte Technik zuruckgegriffen.

5.3 Literaturrecherche und Auswahl der Erreger

In der Entwurfsphase der PCRs wurden die differentialdiagnostisch relevanten Erkrankun-

gen viraler Genese in der Literatur gesucht. Die fur diesen Ansatz ausgewahlten viralen

Erreger sind die wichtigsten virusbedingten Differentialdiagnosen der KSP (Moennig

et al., 2003) und zeigen ein ahnliches Spektrum an Symptomen (s. Kapitel 2.3). Der

hier entwickelte Testansatz sollte nur virale Erreger einschließen, somit wurden wichtige

Differentialdiagnosen bakterieller Genese nicht berucksichtigt. Zu diesen Erkrankungen

gehoren u. a. Rotlauf, E. coli -, Salmonellen-, Pasteurellen- und Leptospireninfektionen

(Moennig et al., 2003). Die Konzeption des Systems ließe es zu, diese spater zu in-

tegrieren. Diese Option unterstreicht die Vorteile des vereinheitlichten Ansatzes. In der

Fragestellung, die bei der Auswahl der Erreger zugrunde gelegt wurde, unterscheidet sich

das vorliegende Konzept deutlich von der des EU-Projektes QLK2-CT-2000-00486. Ob-

gleich das Erregerspektrum sehr ahnlich ist, wurde die Auswahl nicht anhand der gleichen

Kriterien getroffen. Wahrend in der vorliegenden Arbeit ausschließlich das klinische Bild

im Sinne der differentialdiagnostischen Relevanz fur die KSP ausschlaggebend war, wur-

de im Rahmen des EU Projektes die okonomische Relevanz in den Vordergrund gestellt.

Dies fuhrte dazu, dass im vorliegenden Ansatz auch das porzine Influenza-A-Virus und

das PCV-2 eingeschlossen wurden, wahrend diese Viren im Gegensatz zum MKS-Virus,

VSV und SVDV im Spektrum des letzteren Ansatzes nicht vertreten waren.

Im Rahmen des Entwurfes und Entwicklung des vorliegenden PCR-Ansatzes erfolgten

Literaturrecherchen in der Datenbank Medline3. Ziel dieser Suche war es, anhand der

publizierten, TaqMan-basierten PCR-Protokolle eine Vorauswahl der Genomregionen zu

treffen und ein Thermoprofil zu erarbeiten. Mit Ausnahme des von Kleiboeker et al.

(2005) entwickelten Protokolls zur Detektion und Differenzierung der europaischen und

nordamerikanischen PRRSV-Stamme, welches in den multiplex-Ansatz integriert wurde,

wurden die publizierten Protokolle ausschließlich als Anhaltspunkt fur die eigenstandige,

3http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

5.3. Literaturrecherche und Auswahl der Erreger 109

auf einen multiplex-Ansatz abgestimmte Entwicklung genommen. Die Auswertung der

gefundenen TaqMan-PCR-Protokolle hinsichtlich der gewahlten Genomabschnitte, der

Fragmentgroßen und der Thermoprofile wurde in den Entwurf der PCR einbezogen.

Die Thermoprofile, die fur die gefundenen TaqMan-Protokolle eingesetzt wurden, wichen

in einigen Punkten deutlich voneinander ab. Die Zyklenzahl lag generell zwischen 35

(King et al., 2003) und 50 (Yoon et al., 2005; Hofmann, 2003; Watzinger et al.,

2004; Hindiyeh et al., 2005; Krafft et al., 2005) Zyklen. Fur die vorliegende Arbeit

wurde nach ersten Vorversuchen eine Zyklenzahl von 40 festgesetzt. Da es bekannt ist,

dass die TaqMan-Sonden im Laufe der PCR degradieren, und es zu einem schwachen An-

stieg der Fluoreszenz kommen kann, sind diese Werte kritisch zu beurteilen.

Unter den publizierten Thermoprofilen gab es solche, die einen separaten Elongation-

Schritt bevorzugten, und andere, die Annealing der Primer und Elongation simultan

durchfuhrten. Die gewahlten Produktlangen erlaubten die Wahl eines Thermoprofils ohne

getrennten Elongation-Schritt, daher wurden Annealing und Elongation in der vorlie-

genden Arbeit zusammengefasst. Insgesamt sieben der 24 Protokolle wurden mit einem

Denaturierungschritt uber 15 sec bei 95 ◦C und einer nachfolgenden Amplifikation bei

60 ◦C fur 60 sec durchgefuhrt (Olvera et al., 2004; Ophuis et al., 2006; van Elden

et al., 2001; Watzinger et al., 2004; Hindiyeh et al., 2005; Egli et al., 2001; Revilla-

Fernandez et al., 2005). Dabei wurden fast alle Virusspezies abgedeckt (PCV-2, KSPV,

Influenza-A-Virus, PRRSV). Weitere Protokolle wiesen ahnliche Spezifikationen auf (van

Rijn et al., 2004; Hofmann, 2003; Krafft et al., 2005). Aufgrund der breit gefacherten

Anwendung dieses Protokolls fur fast alle Virusspezies, die fur den vorliegenden Ansatz

in Frage kamen, wurde das oben genannte Thermoprofil fur die weitere Entwicklung aus-

gewahlt und erwies sich im Folgenden als praktikabel.

5.3.1 Auswahl der Genomregionen

Fur die Auswahl der Genomregionen wurden nach Moglichkeit konservierte Bereiche

gewahlt, die in der Literatur als etablierte Regionen fur den PCR-Nachweis publiziert

waren. Durch ein Alignment aller bis dato verfugbaren Sequenzen wurde die Umsetzbar-

keit fur das aktuelle System uberpruft und entsprechende Bereiche ausgewahlt.

Fur die Detektion des ASPV ist im OIE Manual of Standards for Diagnostic Tetsts and

110 5. Diskussion

Vaccines (CHAPTER 2.1.12) u. a. die von King et al. (2003) publizierte TaqMan-PCR

empfohlen. Sowohl dieses Protokoll als auch das von Zsak et al. (2005) publizierte PCR-

Protokoll basieren auf der Detektion eines Genomfragmentes des VP72-Strukturproteins

des ASPV. Das von Hjertner et al. (2005) publizierte Protokoll zur Detektion des ASPV

beruht hingegen auf einem Fragment des VP73. Bei diesem Protokoll handelt es sich je-

doch nicht um ein TaqMan-Protokoll, sondern um ein so genanntes Invader R© Assay. Der

Empfehlung des OIE Manual of Standards folgend, wurde fur die vorliegende Arbeit ein

Genomfragment des VP72 gewahlt. Dieses Genomfragment weist eine fast 100 %ige Nu-

kleotididentitat unter den ASPV-Stammen auf (Yu et al., 1996) und ist daher fur die

Detektion aller bekannten Stamme des ASPV geeignet.

Die in der Literatur verfugbaren real-time PCR-Protokolle zur Detektion des SHV-1 al-

leine bzw. in Kombination mit anderen Viren verwenden entweder die Genomsequenz des

gB-Proteins (van Rijn et al., 2004; Yoon et al., 2005), oder wie die im Rahmen des EU-

Projektes QLK2-CT-2000-00486 entwickelten Molecular Beacons die fur das gD-Protein

kodierende Sequenz. Das gB-Genomfragment wird auch im OIE Manual of Standards

als mogliches, hochkonserviertes PCR-Ziel erwahnt. Die Anzahl der fur ein weiterfuhren-

des Alignment verfugbaren Sequenzen war stark limitiert, zeigte jedoch eine hohe Se-

quenzidentitat im genannten Abschnitt. Daher wurde dieser Bereich auch fur die SHV-1-

spezifische PCR im Rahmen dieser Arbeit zugrunde gelegt.

Bei der Entwicklung der PCV-2-spezifischen PCR wurden 136 Sequenzen ausgewertet.

Der ausgewahlte Genombereich des ORF2 wurde in mehreren Publikationen als geeignet

beschrieben (Kim und Chae, 2003; Brunborg et al., 2004). Einerseits liegt hier ein ho-

her Konservierungsgrad der Genomsequenz vor, andererseits ist er fur die Differenzierung

zwischen PCV-1 und PCV-2 geeignet (Larochelle et al., 1999). Dies konnte sowohl im

ClustalW-Alignment als auch in weiteren Tests bestatigt werden.

PPV-spezifische TaqMan-PCR-Protokolle waren zum Zeitpunkt der Entwicklung nicht

publiziert. Die gewahlte Genomregion des VP2 erwies sich im Alignment der 45 verfugba-

ren Sequenzen als hoch konserviert und wurde fur das Primer- und Sondendesign ver-

wendet. In der Literatur bis dato publizierte PCR-Protokolle zur Detektion von PPV

amplifizieren hauptsachlich ein Genomfragment dieser Region.

Bei der Entwicklung der Influenza-A PCR kam in erster Linie der fur das Matrix-Protein

kodierende Genomabschnitt in Frage. Dieser Abschnitt ist hochkonserviert (> 80 %) un-

5.3. Literaturrecherche und Auswahl der Erreger 111

ter verschiedenen Influenza-A Subtypen (Stone et al., 2004). Die in der Literatur publi-

zierten TaqMan-PCR-Protokolle, die nicht zur Differenzierung unterschiedlicher Subty-

pen konzipiert wurden, nutzen ebenfalls diese hochkonservierte Genomregion zum Nach-

weis unterschiedlicher Influenza-A-Viren (van Elden et al., 2001; Watzinger et al.,

2004). Im ClustalW-Alignment der verfugbaren Sequenzen wurde die hohe Konservie-

rung bestatigt und dieser Bereich daher fur den Test verwendet.

Gangige Genomfragmente fur den Nachweis porziner Pestiviren liegen im Bereich der

5′NTR, des E2-Gens und des NS5B-Gens (Lowings et al., 1996; Bjorklund et al.,

1999; Risatti et al., 2003; Uttenthal et al., 2003; Gaede et al., 2005; Hoffmann

et al., 2005; Ophuis et al., 2006). Diese Bereiche werden auch fur phylogenetische Ver-

gleiche unterschiedlicher KSPV-Stamme im Rahmen molekular-epidemiologischer Studi-

en herangezogen (Frias-Lepoureau und Greiser-Wilke, 2002). Das im Rahmen des

EU-Projektes QLK2-CT-2000-00486 entwickelte PriProET System fur den Nachweis von

KSPV basiert auf Primern, die von Uttenthal et al. (2003) publiziert wurden. Die

pestivirenspezifischen Primer grenzen ein Genomfragment im Bereich des 5′NTR und

des NPRO-Gens ab. Das OIE Manual of Diagnostic tests empfiehlt die Regionen der

5′NTR und des E2-Gens. Da die meisten TaqMan-basierten Systeme die 5′NTR verwen-

den (Risatti et al., 2005; Hoffmann et al., 2005; Ophuis et al., 2006), wurde dieses

Genomfragment auch in der vorliegenden Arbeit verwendet. Beim Primer- und Sondende-

sign wurden 1000 verfugbare Sequenzen aller Pestiviren (BVDV-1, BVDV-2, BDV, KSPV)

ausgewertet und eine hochkonservierte Region fur das Design ausgewahlt.

Fur die PRRSV-spezifischen PCRs wurde das von Kleiboeker et al. (2005) publizierte

Protokoll ubernommen. Fur die PRRSV-EU-Stamme basierte der Ansatz auf einem Ge-

nomfragment des ORF7, fur PRRSV-NA auf Fragmenten des ORF7 und der 3′NTR.

Die auf Grundlage der oben genannten Daten entwickelten Primer und Sonden wurden in

einem ersten Schritt in einzelnen PCR-Ansatzen getestet. Um die Identitat des Amplifi-

kats zu verifizieren, wurden die Produkte dieser PCRs zur Sequenzierung eingeschickt. Da

fur alle PCR-Produkte korrekte Sequenzen nachgewiesen wurden, konnten diese Primer

und Sonden fur die weitere Entwicklung verwendet werden.

112 5. Diskussion

5.4 Aufteilung des multitube PCR-Ansatzes

Bei der Aufteilung der zu detektierenden Erreger auf die Tubes bot sich an, RNA-Viren

und DNA-Viren zu trennen, da sie in gleicher und somit passender Anzahl vorlagen. Fur

die Funktion der RT-PCRs zur Detektion der RNA-Viren konnten somit beste Reaktions-

bedingungen geschaffen und eine Interferenz mit DNA vermieden werden. Zudem konnte

die Entwicklung der internen Kontrolle spezifisch fur RNA bzw. DNA durchgefuhrt wer-

den. Die Konzeption der einzelnen multiplex Ansatze unterschied sich wesentlich von

der Konzeption der Ansatze im Rahmen des oben genannten EU Projektes. Wahrend in

der vorliegenden Arbeit virusspezifische und epidemiologische Kriterien zugrunde gelegt

und in ein einheitliches Testprofil eingepasst wurden, erfolgte die dortige Kombination in

symptomatischen Clustern mit unterschiedlichen Methoden. Die hier gewahlte Kombina-

tion der vereinheitlichten Ansatze erfolgte aus folgenden Grunden: Die DNA-Viren ASPV

und SHV-1 wurden in einem Ansatz kombiniert, da eine sichere und sensitive Detekti-

on dieser anzeigepflichtigen Erkrankungen von großer Bedeutung ist. Ein gleichzeitiges

Auftreten beider Erkrankungen in einem Schwein ist hochst unwahrscheinlich, daher ist

davon auszugehen, dass der PCR zur Detektion des in der Probe vorhandenen Erregers

alle Ressourcen (dNTPs, Polymerase, MgCl2) zur Verfugung stehen, und daher beste Re-

aktionsbedingungen gegeben sind.

Im zweiten Ansatz wurden die DNA-Viren PPV und PCV-2 kombiniert. PCV-2 ist ein

weit verbreitetes Virus, das v. a. Faktorenerkrankungen auslost und dessen Detektion

hauptsachlich in Zusammenhang mit einer Bestimmung der Viruslast aussagekraftig wird.

Fur eine verlassliche Diagnose ist es somit sinnvoll, eine Standardverdunnungsreihe mit-

zufuhren und die Viruslast quantitativ zu errechnen. Der Ansatz liess diese Option zu.

PPV ist ebenfalls weit verbreitet. Der Krankheitskomplex fuhrt zu schweren wirtschaftli-

chen Schaden. Im vorliegenden Ansatz wurden PPV daher durch die Wahl eines kurzeren

Amplifikationsfragmentes gunstigere Reaktionsbedingungen eingeraumt.

Die Ansatze drei und vier enthielten die RNA-Viren. Im dritten Ansatz wurde der Pesti-

virusnachweis mit der Influenza-A-spezifischen PCR kombiniert. Bei der Entwicklung der

PCR wurde dem pestiviruspezifischen Nachweis der Vorzug gegeben, um eine moglichst

umfassende Erfassung der beim Schwein vorkommenden KSPV-und Pestivirusisolate zu

gewahrleisten. Da die Bestatigung eines Primarausbruchs in Hausschweinebestanden auf

5.5. Nukleinsaureisolierung 113

der Grundlage des Kapitels VI der Entscheidung der Kommission 2002/106/EC4 (Diagno-

sehandbuch) in mindestens zwei Tests zum Genomnachweis erfolgen muss, ist es moglich,

den in der Entscheidung geforderten KSPV-spezifischen Nachweis in einem zweiten Schritt

durchzufuhren. Da ruminante Pestiviren nur selten zu einer nachweisbaren Viramie im

Schwein fuhren (Paton et al., 1994), ist davon auszugehen, dass positive Genomnach-

weise fast ausschließlich in Korrelation mit KSPV-Infektionen auftreten. Dem Pestivi-

rusnachweis konnten in diesem Falle aufgrund der beschrankten Moglichkeiten in der

Primer- und Sondenauswahl keine gunstigeren Reaktionsbedingungen eingeraumt wer-

den. Allerdings hatte es sich gezeigt, dass in einem multiplex-Ansatz die Effizienz der

pestivirusspezifischen-PCR konstanter bleibt. Ein gemeinsames Auftreten der beiden Er-

reger ist nicht auszuschließen. Sollte es daher zu einem gleichzeitigen Vorliegen der beiden

Erreger in einer Probe kommen, ist die Amplifikation der Pestiviren effizienter. In den

Fallen einer solitaren Influenzainfektion kommen diese Einschrankungen nicht zum Tra-

gen.

Da fur die Detektion und Differenzierung der PRRSV-Stamme ein etabliertes Protokoll

ubernommen wurde, war die Umsetzung in einem Ansatz (Ansatz 4) sinnvoll, um die fur

dieses Protokoll optimierten Bedingungen beizubehalten.

5.5 Nukleinsaureisolierung

Im Bestreben, moglichst einfach umzusetzende, standardisierte und unter den Bedingun-

gen unterschiedlicher Labore reproduzierbare Techniken zu nutzen, wurden, wo moglich,

kommerzielle Kits eingesetzt. Fur den Erfolg einer PCR ist die Qualitat der Nukleinsaure

von entscheidender Bedeutung, daher erfolgte die Isolierung der Nukleinsauren mit stan-

dardisierten kommerziellen Kits (s. Kapitel 3.2.2.1). Bis Mitte 2005 befanden sich diverse

Extraktionssysteme auf dem Markt. Die mit Abstand am weitesten verbreitete Methode

basiert auf dem Einsatz von Silica-Gel Membranen. Wie Scheibner (2000) feststellte,

ist der RNeasyR© Lipid Tissue Kit fur die RNA-Extraktion aus Organmaterial am bes-

ten geeignet. Fur die Isolierung von DNA stehen unterschiedliche kommerzielle Kits zur

4http://europa.eu.int/eur-lex/pri/en/oj/dat/2003/l_324/l_32420031211en00550056.pdf

114 5. Diskussion

Verfugung. Neben einer getrennten Isolierung von RNA und DNA besteht die Moglich-

keit einer simultanen Extraktion, fur die ebenfalls kommerzielle Kits existieren. Diese

sind allerdings nur fur zellfreies Material ausgelegt, was ihren Einsatz in der Diagnostik

einschrankt. Außerdem sah das Gesamtkonzept eine getrennte Handhabung von DNA-

bzw. RNA-Viren vor, so dass aus diesen Grunden auf eine simultane DNA- und RNA-

Extraktion verzichtet wurde.

5.6 Optimierung der PCRs

5.6.1 Optimierung der Reaktionsbedingungen

Jede neu entwickelte PCR bedarf einer Optimierung sowohl der physikalischen als auch

der chemischen Reaktionsbedingungen. Zu den physikalischen Bedingungen gehort in ers-

ter Linie das thermische Profil. Nach der Festlegung der Primersequenzen erfolgt eine

Anpassung der Annealing-Temperatur.

Da das Gesamtkonzept einen auf vier Tubes verteilten Ansatz bei einheitlichem Ther-

moprofil vorsah, wurden die physikalischen Reaktionsbedingungen fur jede PCR nicht

individuell variiert. Dadurch war notwendig, moglichst alle Primer und Sonden fur die

definierten Reaktionsbedingungen zu entwerfen. Primer- und Sondensequenzen mussten

hinsichtlich ihrer Schmelztemperatur an das ausgewahlte Thermoprofil angepasst werden.

Weitere Optimierungsmoglichkeiten bestehen generell bei den chemischen Reaktionsbe-

dingungen. Da es sich bei diesem Ansatz um ein sehr heterologes System handelte, waren

sie entsprechend beschrankt. Es wurde folglich entschieden, ein einheitliches, kommerziell

erhaltliches PCR-Mastermix zu verwenden. Der ausgewahlte QuantiTect R© Multiplex PCR

Kit wurde speziell fur multiplex real-time PCR konzipiert und hat sich wahrend der PCR

Validierung als geeignet erwiesen. Der große Vorteil kommerzieller Mastermixe besteht in

weitgehend konstanter Qualitat und Ubertragbarkeit der Ergebnisse.

5.6. Optimierung der PCRs 115

5.6.2 Optimierung der Primerkonzentrationen

Die Ermittlung des fur eine effektive Amplifikation geeigneten Konzentrationsbereichs er-

folgte mittels SYBRTM-Green real-time PCR in Doppelansatzen einer Primertitration.

Die Auswahlkriterien waren ein moglichst niedriger Ct-Wert bei hohen Fluoreszenzwer-

ten, da dies fur eine hohe Effizienz der PCR spricht (Nolan, 2004).

Fur den vorliegenden multiplex PCR-Ansatz war die Optimierung der Primer- und Son-

denkonzentrationen von besonders großer Bedeutung, da auf diese Weise gegenseitige In-

hibitionen und Interaktionen minimiert werden konnten (Elnifro et al., 2000). Es wurde

die kleinstmogliche Primerkonzentration ausgewahlt, die akzeptable Ct- und Fluoreszen-

zwerte (∆Rn) zeigte. Fur alle PCR-Ansatze konnte mittels einer graphischen Darstellung

der Titrationsergebnisse in MicrosoftR© Office Excel in Konzentrationsbereich gefunden

werden, der den Anforderungen entsprach.

Die Produktspezifitat und die Bildung unspezifischer Produkte wurden mittels einer NTC

mit unterschiedlichen Primerkonzentrationen getestet. Primerkonzentrationen von 900 nM

fuhrten zur Bildung eines unspezifischen Produktes. Es ist bekannt, dass hohe Primerkon-

zentrationen die Bildung von Primer-Dimeren und unspezifischen Produkten begunstigen

(Bustin, 2000). Im vorliegenden Fall war das Produkt jedoch anhand der Schmelztem-

peratur sicher vom spezifischen Produkt zu unterscheiden.

5.6.3 Optimierung der Sondenkonzentrationen

In gleicher Weise wurden die optimalen Sondenkonzentrationen bestimmt. Ziel war es,

niedrige Ct- und hohe ∆R-Werte zu kombinieren, da dies mit einer guten Funktion der

Sonde verbunden ist (Peters et al., 2004). Fur alle PCR-Ansatze konnten Konzentrati-

onsbereiche gefunden werden, die eine gute Funktion der Sonde gewahrleisteten.

5.6.4 Real-time PCR Effizienzen

Da die ermittelten Ct- und Fluoreszenzwerte alleine keine Auskunft uber die Effizienz und

Kinetik der PCR gaben, wurden Standardkurven erstellt und analysiert, die Aussagen zu

diesen Parametern ermoglichten (Higuchi et al., 1993; Bustin, 2000). Zur Erstellung

116 5. Diskussion

der Standardkurve wurden die Ct-Werte einer Standardverdunnungsreihe linearisierter

Plasmide ermittelt und gegen ihre logarithmische Genomaquivalentzahl aufgetragen. Die

Ansatze wurden dreifach sowohl in Einzel- als auch in multiplex-Ansatzen getestet. Die

Neigung der Standardkurve korrelierte mit der Effizienz der PCR (Bustin, 2000).

Fur einzel-PCRs werden Effizienzen zwischen 90 und 100 % angestrebt, fur multiplex-

Ansatze liegen sie in der Regel etwas darunter (Brisson et al., 2004). Fur alle einzel-

Ansatze konnten Effizienzen in diesem Effizienzbereich erzielt werden, und waren somit

zufriedenstellend. Die multiplex-Ansatze zeigten ausnahmslos niedrigere Effizienzen, wo-

bei die Reaktionen fur PPV und Pestiviren uber der fur einzel-Ansatze angestrebten

Effizienzmarke von 90 % blieben. Die Ansatze fur ASPV, SHV-1 und PCV-2 zeigten Effi-

zienzen von 82,4, 80,4 bzw. 85,6 %. Es ist davon auszugehen, dass diese Effizienzen fur eine

diagnostische PCR ausreichend sind, da bei 40 PCR-Zyklen davon auszugehen ist, dass

eine positive klinische Probe detektiert wurde. Die Influenza-A-spezifische PCR zeigte

eine Effizienz von knapp 70 %, die als grenzwertig anzusehen ist.

5.7 Auswahl der internen Kontrollen

Ublicherweise werden so genannte Housekeeping-Genes zur Etablierung interner Kontrol-

len verwendet, da diese kontinuierlich in allen Korperzellen exprimiert werden. Wahrend

fur Genexpressionsstudien eine Normalisierung der RNA-Expression anhand einer inter-

nen Referenz mit moglichst geringer Variabilitat sehr wichtig ist (Dheda et al., 2004),

sind fur eine nicht-quantitative Methode andere Kriterien von Bedeutung. Der interne

Standard in einer nicht-quantitativen real-time PCR dient dem Nachweis der erfolgrei-

chen Nukleinsaureextraktion und Amplifikation5. Wahrend zu diesem Zweck die absolute

Expression von untergeordneter Bedeutung ist, spielt die kontinuierliche Expression eine

wichtige Rolle.

Die getrennte Handhabung der RNA- und DNA-Viren machte die Entwicklung entspre-

chender interner Kontrollen notwendig. Im Bestreben, die internen Kontrollen auf der

Grundlage des gleichen Housekeeping-Genes zu etablieren, wurde GenBank nach entspre-

chenden Sequenzen durchsucht. Kriterien der Auswahl waren, dass sowohl eine mRNA als

5Greiser-Wilke personliche Mitteilung

5.8. Auswahl der Isolate und Organproben 117

auch entsprechende genomische Sequenz mit ausgewiesenen Introns und Exons verfugbar

waren. β-Aktin entsprach diesen Kriterien und ist auch im OIE Manual of Standards als

mogliche interne Kontrolle angegeben (Anonym, 2005a).

Im Rahmen der Uberprufung der internen Kontrollen wurde festgestellt, dass ein positives

Signal fur genomische DNA in Testlaufen zu verzeichnen war, die aus Organmaterial ex-

trahierte RNA als Probenmaterial beinhalteten. Somit bestand die Moglichkeit, dass die

extrahierte RNA eine DNA-Kontamination aufwies (s. Kapitel 4.2.2.4). Diese Moglich-

keit wird auch vom Hersteller in der Gebrauchsanweisung zum Extraktionskit eingeraumt

(Qiagen, RNeasy R©). Die Empfehlung zur Behebung des Problems ist ein DNase-Verdau.

Tatsachlich konnte im vorliegenden Fall festgestellt werden, dass nach einem Verdau keine

genomische DNA mehr nachweisbar war. In Anbetracht der Tatsache, dass es sich hier

um eine diagnostische PCR handelt, erscheint eine geringfugige Kontamination mit DNA

vernachlassigbar. Vielmehr spielt in diesem Zusammenhang eine robuste, qualitativ hoch-

wertige und konstante RNA-Extraktion eine entscheidende Rolle.

5.8 Auswahl der Isolate und Organproben

Bei der Auswahl der Virusisolate wurde versucht, die genetische Vielfalt der Erreger abzu-

decken und auf diese Weise die Detektion moglichst aller Stamme des betreffenden Virus

abzusichern. Bei der Auswahl klinischer Proben sollte der epidemiologischen Situation

Rechnung getragen werden. Die Verfugbarkeit fast aller Viren und klinischen Proben war

jedoch limitiert.

Das Arbeiten mit ASPV-haltigen Materialien war aufgrund der biologischen Sicherheits-

stufe unter den gegebenen Bedingungen nicht moglich. Alle Tests wurden daher mit in

Standardplasmide klonierten Sequenzen des VP72-Proteins durchgefuhrt. Die bereits oben

erwahnte fast 100 %ige Identitat der ASPV-Stamme im Bereich dieses Proteins lasst die

aus dieser Limitierung moglicherweise erwachsenden Probleme in den Hintergrund treten.

Uber 20 SHV-1-Isolate aus den Bestanden des nationalen Referenzlabors fur AK am

Friedrich-Loeffler-Institut (Wusterhausen) konnten hier getestet werden. Da Deutschland

seit Februar 2003 offiziell AK-frei ist (Teuffert et al., 2005), spiegelten diese Isolate

118 5. Diskussion

hauptsachlich die historische Situation in der deutschen, franzosischen und tschechischen

Schweinepopulationen wider. Da aktuell in der Schweinepopulationen in anderen Landern

zirkulierende SHV-1-Stamme nicht in die Untersuchung einbezogen werden konnten, ist

nicht mit absoluter Sicherheit davon auszugehen, dass alle Stamme erkannt wurden. Die

relativ hohe Konservierung der gewahlten Genomregion und die geringe Mutationsrate

des Virus legen dieses jedoch nahe.

Fur die Validierung der PPV-spezifischen PCR stand nur eine geringe Anzahl an Isolaten

zur Verfugung. Der Stamm NADL-2 ist gut charakterisiert und wird aufgrund seiner At-

tenuierung als Impfstamm eingesetzt (Prikhod’ko et al., 2003; Bergeron et al., 1996).

Es kann nicht eingeschatzt werden, ob die anderen Isolate die genetische Diversitat hin-

reichend wiedergeben. Jedoch wurde anhand des Alignments verfugbarer Sequenzen eine

hohe Konservierung des in der PCR nachzuweisenden VP2-Proteins gezeigt.

Vorberichtlich PCV-2-positive Seren und Organmaterial wurden fur die Uberprufung der

PCV-2-PCR verwendet. Da die Proben aus der aktuellen Routinediagnostik verschiedener

Untersuchungsamter stammten, ist davon auszugehen, dass die epidemiologische Situati-

on hinreichend wiedergegeben wurde. Da PCV-2-Infektionen in der Schweinepopulation

weit verbreitet sind, und Krankheitssymptome vornehmlich von der Viruslast abhangen

(Krakowka et al., 2000; Liu et al., 2000), ist eine quantitative Erfassung des Erregers

ratsam (McNeilly et al., 2002).

Alle verfugbaren Genotypen des KSPV (exkl. Gruppe 3) wurden durch gut charakteri-

sierte Isolate aus der Virusbank des EURL reprasentiert, die neben historischen Stammen

auch Feldisolate aus den letzten Jahren beinhaltet. Das Organmaterial stammte aus-

schließlich von experimentell infizierten Tieren, wurde jedoch ausgewahlt, um eine großtmogli-

che Vielfalt einzuschließen. Die Genotypen 2.3 und 2.1 gehoren zu den aktuell in wei-

ten Teilen der Erde zirkulierenden KSPV-Stammen (Paton und Greiser-Wilke, 2003;

Sandvik et al., 2005). Die epidemiologische Aktualitat der Isolate war somit ebenfalls

gegeben. Die am EURL zu diesem Zeitpunkt verfugbaren BDV-Isolate wurden in die Un-

tersuchungen einbezogen, wobei BDV-Stamme ovinen und porzinen Ursprungs vorhanden

waren. Organmaterial experimentell mit BDV infizierter Schweine konnte ebenfalls unter-

sucht werden.

Fur die Uberprufung und Validierung der PCR zur Detektion des porzinen Influenza-A-

Virus wurden zwolf Isolate unterschiedlicher Subtypen verwendet. Diese Isolate beinhal-

5.9. Validierung 119

teten die Subtypen H1N1, H3N2 und H1N2 und somit alle in der Schweinepopulation

kozirkulierenden Virusstamme (Reeth et al., 2004).

Fur die Umsetzung der PRRSV-spezifischen PCR wurde auf das Protokoll von Kleiboeker

et al. (2005) zuruckgegriffen, welches die Differenzierung der EU- und NA-Stamme des

PRRSV erlaubte. Zur Uberprufung in Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurden

die Impfstamme MLV (PRRSV-NA) und DV (PRRSV-EU) eingesetzt. Fur den Stamm

DV wurde gezeigt, dass er in der ORF5 Region eine uber 86 %ige Identitat auf Nukleotid-

ebene mit aktuellen Feldisolaten aufweist (Harder et al., 2004). Die fur die ORF5-Region

gezeigte Identitat und die geringe Variabilitat des ORF7 (Gall et al., 1998) legen nahe,

dass europaische PRRSV-Stamme durch den Impfstamm DV gut reprasentiert wurden.

Die in der vorliegenden Arbeit genutzten Genomregionen lagen allerdings im ORF7 und

der 3′NTR.

5.9 Validierung

Fur eine neu entwickelte PCR ist es von großer Bedeutung, ihre Leistungsfahigkeit und

Grenzen zu ermitteln. Dabei ist sie einerseits anhand von Validierungskriterien zu testen

und andererseits mit den bisher etablierten Methoden zur Diagnostik der gewahlten Erre-

ger zu vergleichen. Zu den Validierungskriterien gehoren die analytische Sensitivitat und

Spezifitat der Methode. Beide Kriterien wurden soweit wie moglich, nach OIE-Vorgaben

berucksichtigt. Fur den Einsatz in der Diagnostik sollte die neue PCR gleichwertig oder

besser als der zellkulturelle Nachweis sein. Hinsichtlich der analytischen Sensitivitat wur-

de in verschiedenen Untersuchungen gezeigt, dass TaqMan real-time RT-PCRs im Ver-

gleich zur Virusisolierung oder der konventionellen, gelbasierten einfachen oder nested

RT-PCR als sensitiver bzw. zumindest gleichwertig zu beurteilen sind (Kearns et al.,

2002; Locatelli et al., 2000; McGoldrick et al., 1998, 1999; Smith et al., 2001). Fur

die vorliegenden PCRs konnte dies ebenfalls bestatigt werden.

120 5. Diskussion

5.9.1 Sensitivitat

Die analytische Sensitivitat ist definiert als die kleinste Menge eines Pathogens, die von

Null unterschieden werden kann (Anonym, 2004b). Zur Bestimmung werden Genomaqui-

valente und infektiose Einheiten wie KID50 oder PFU herangezogen. Im Rahmen des vor-

liegenden Projektes erfolgte die Bestimmung der Nachweisgrenze in Genomaquivalenten

und, wo moglich, in Korrelation mit einer zellkulturell ermittelten Angabe zum Virustiter

in KID50. Genomaquivalente lassen sich in der quantitativen real-time PCR auf der Basis

von in Vektoren klonierter PCR-Produkte aus Standardkurven ermitteln (Bustin, 2000).

Fur ASPV und PCV-2 stand nur die Moglichkeit zur Verfugung, das Detektionslimit an-

hand der nachweisbaren Genomaquivalentzahl zu bestimmen. Im Falle des ASPV reichte

die Sicherheitsstufe des Labors nicht aus, um mit vermehrungsfahigem Virus zu arbeiten.

PCV-2 konnte nicht in Zellkultur vermehrt werden. Es wurden mehrere Versuche unter-

nommen, das Virus aus nachweislich positivem Organmaterial in Zellkultur (PK(15)A)

anzuzuchten und zu titrieren, welche jedoch scheiterten. Fur das PCV-2 ist bekannt, dass

die Anzucht in Zellkultur haufig nicht moglich ist (T. Harder, personliche Mitteilung).

Fur beide PCRs wurde mit in Vektoren klonierten PCR-Produkten eine Nachweisgrenze

von 10 Kopien pro Ansatz ermittelt.

Die Sensitivitatsprufung im Falle des SHV-1, des PPV, der Pestiviren, des Influenza-A-

Virus sowie beider PRRSV-Stamme erfolgte mittels titrierter Virussuspensionen, welche

als Ausgangsmaterial fur die PCRs eingesetzt wurden. Fur den direkten Vergleich wurde

das Probenvolumen der Virustitration korrigiert und die KID50 fur 6µl angegeben. Dieser

Vergleich wurde gewahlt, um die infektiosen Einheiten mit der Zahl der Genomaquiva-

lente zu korrelieren.

Ausschließlich gegenuber der SHV-1 spezifischen PCR zeigte die Virusisolierung bzw.

-titration eine hohere Sensitivitat. Hier konnte eine Virussuspension mit 60,5 KID50/6µl

von der PCR als positiv getestet werden, was 1,37 Genomaquivalenten entsprach. Der zell-

kulturelle Nachweis gelang auch fur die darauf folgenden zwei Verdunnungsstufen. Dies

konnte auf das G/C-reiche Genom des SHV-1 zuruckzufuhren (Klupp et al., 2004b), das

ein”schwieriges“ Ziel fur eine PCR darstellt. Daten zum Virustiter in klinischem Mate-

rial sind nicht publiziert; diese hangen jedoch stark vom gewahlten Organmaterial und

dem Zeitpunkt der Probennahme im Infektionsgeschehen ab. Legt man den hohen Titer

5.9. Validierung 121

des Zellkulturuberstandes als Anhaltspunkt an, ist davon auszugehen, dass eine PCR, die

einen Virustiter von 101,78 KID50 im Probenvolumen sicher erkennt, fur diagnostische

Zwecke ausreichend ist. Betrachtet man die Ergebnisse dieser Sensitivitatsprufung genau-

er, zeigt sich, wie der Tabelle A.14 zu entnehmen ist, dass die Stufe 5 der Verdunnungsreihe

bereits negativ war. Allerdings wurde in der nachst hoheren Verdunnungsstufe eine deut-

lich positive Reaktion verzeichnet. Dies konnte mit einer ungleichmaßigen Ausverdunnung

der DNA erklart werden, zumal einer der dreifach-Ansatze positiv war. Es ist davon aus-

zugehen, dass die oben genannte Sensitivitat nicht die maximale, sondern die minimale

Leistungsfahigkeit des vorliegenden Ansatzes reprasentiert.

Die PPV-PCR ergab ein positives Signal in der Stufe 7 der logarithmischen Verdunnungs-

reihe, und konnte somit 0,74 KID50/6µl bzw. 1,17 Genomaquivalente sicher nachweisen.

In diesem Fall erwiesen sich PCR und zellkultureller Nachweis als annahernd gleichwer-

tig.

Die Sensitivitatsprufung der pestivirusspezifischen PCR wurde ebenfalls anhand einer

titrierten Virussuspension durchgefuhrt. Die letzte Verdunnungsstufe, die als positiv ge-

testet wurde, hatte einen KID50/6µl-Wert von 0,60 oder 7,18 Genomaquivalenten. Es

ist somit auch in diesem Fall davon auszugehen, dass die Sensitivitat der PCR mit der

des Goldstandards in der KSPV-Diagnostik, der Virusisolierung (Moennig, 2000), ver-

gleichbar ist. Im Rahmen des EU Projektes QLK2-CT-2000-00486 konnte die gelbasierte

KSPV-multiplex-PCR eine Nachweisgrenze von 0,32 KID50 erreichen. Aus der Publikation

geht nicht hervor, auf welches Volumen sich diese Angabe bezieht. Da in Virustitrationen

eine Toleranz von 1/2 log-Stufen eingeraumt wird, ware sie mit der in der vorliegenden

Arbeit ermittelten Sensitivitat vergleichbar.

Fur das Influenza-A-Virus wurde die letzte positive Reaktion im zellkulturellen System bei

Verdunnungsstufe 4 verzeichnet, wobei auch der Ausgangstiter der Virussuspension mit

105,25 KID50/100µl relativ niedrig war. Die PCR konnte drei weitere Verdunnungsstufen

als positiv detektieren und war somit wesentlich sensitiver. Die in diesen Verdunnungs-

stufen detektierten Konzentrationen lagen bei 19,5, 2,1 und 0,81 Genomaquivalenten. Es

ist nicht auszuschließen, dass die suboptimalen Wachstumseigenschaften des Influenza-

A-Virus in der Zellkultur einen Einfluss auf das Ergebnis hatten. Zur Bestimmung der

analytischen Sensitivitat der beiden PRRSV-PCRs wurden je ein amerikanischer und eu-

ropaischer Stamm des Virus (PRRSV-EU, bzw. PRRSV-NA) in Zellkultur vermehrt und

122 5. Diskussion

anschließend titriert. Der zellkulturelle Nachweis dieses Virus ist schwierig und die Ver-

wendung der MARC-145 Zelllinie war dem OIE Manual of Standards zufolge suboptimal

fur den Nachweis europaischer PRRSV-Stamme. Fur den verwendeten Impfstamm DV

traten jedoch keine Probleme auf und auch der PRRSV-NA Stamm ließ sich problemlos

anzuchten. Wie im OIE Manual of Standards vorgeschlagen, erfolgte der zellkulturelle

Nachweis uber zwei Passagen. Die PRRSV-EU real-time PCR wies in der Verdunnungs-

stufe mit auf 6µl umgerechneten 0,6 KID50 26,4 Genomaquivalente nach, die PRRSV-NA

PCR entsprechend bei 0,06 KID50 373 Genomaquivalente. Bei beiden real-time PCRs

konnte jeweils eine weitere Verdunnungsstufe positiv detektiert werden. Die PRRSV-NA

ergab 13,5 die PRRSV-EU 1,07 Genomaquivalente. Auch in diesem Fall war die real-time

PCR dem zellkulturellen Nachweis uberlegen. Generell ist die Ubertragbarkeit dieser Aus-

sagen auf klinisches Organmaterial unterschiedlicher Qualitat und Art durchaus kritisch

zu betrachten, da hier die PCR jedoch auch bei klinischen Proben gute Ergebnisse zeigte,

ist eine akzeptables Detektionslimit auch fur PRRSV anzunehmen.

5.9.2 Spezifitat

Die analytische Spezifitat ist definiert als Fahigkeit eines diagnostischen Tests, einen Er-

reger von anderen Erregern zu unterscheiden. Zu diesem Zweck werden i. d. R. genetisch

verwandte Pathogene analysiert und klinisches Material von Tieren untersucht, die mit

Erregern infiziert sind, die sich in der klinischen Symptomatik der nachzuweisenden Er-

krankung ahneln (Anonym, 2004b).

Die zu detektierenden Erreger besaßen nur zum Teil genetische Verwandte, die im Schwein

nachweisbar waren. Das ASPV ist der einzige Vertreter im Genus Asfivirus der Familie

Asfarviridae (Dixon et al., 2000). Eine gewisse genetische Verwandtschaft besteht zu

Iridoviren (Murphy et al., 1999), die jedoch ausschließlich eine Rolle bei Fischen und

Amphibien spielen. Probleme mit genetisch verwandten Viren waren somit fur das ASPV

nicht zu erwarten.

Das SHV-1 gehort zur Subfamilie der Alphaherpesvirinae (Klupp et al., 2004b), welche

u. a. auch veterinarmedizinisch bedeutsame bovine, equine, caprine, canine, feline und

einige aviare Herpesviren sowie das Herpes simplex Virus des Menschen enthalt. Da die

Herpesviren speziesspezifisch sind (Modrow et al., 2003), ist eine Interaktion der Detek-

5.9. Validierung 123

tion des SHV-1 mit genetisch verwandten Erregern nicht anzunehmen.

Nur die Subfamilie Parvovirinae der Familie Parvoviridae enthalt Viren, die Vertebraten

im weitesten Sinne betreffen (Murphy et al., 1995). Nur das Genus Parvovirus enthalt

veterinarmedizinisch bedeutsame Erreger (Modrow et al., 2003). Neben dem porzinen

Parvovirus enthalt es Erreger wichtiger Erkrankungen der Katzen, Hunde, Nerze, Nager,

Ganse und Enten. Die phylogenetische Analyse der Parvoviren zeigt, dass das porzine

Parvovirus ein relativ eigenstandiger Zweig im phylogenetischen Baum ist. Die nachste

Verwandtschaft besteht auf Ebene der Genomsequenz zu felinen und caninen Parvoviren

(CPV-2) sowie zum Parvovirus der Waschbaren (Murphy et al., 1995). Fur keines die-

ser Parvoviren ist ein Nachweis im Schwein bekannt. Daher ist auch hier nicht von einer

Interferenz in der PCR auszugehen.

Fur die Analyse der Spezifitat der Circovirus-PCR war die enge Verwandtschaft des PCV-

2 zum PCV-1 von großer Bedeutung. Wahrend das PCV-1 nicht mit einem Krankheits-

bild in Verbindung gebracht wird, ist das PCV-2, wie bereits erwahnt, mit verschiedenen

Krankheitsbildern assoziiert (PMWS, PDNS, PRDC). Es konnte mit Plasmiden, die das

PCV-1-Genom enthielten, gezeigt werden, dass keine Kreuzreaktivitat zwischen diesen

beiden PCV-Typen in der PCR bestand. Andere Vertreter der Familie Circoviridae bzw.

wie das psittacine beak and feather virus spielen fur das Schwein keine Rolle (Todd et al.,

2001a,b).

Die PCR zur Detektion der porzinen Influenza wurde typspezifisch, d. h., fur Influenza-

A-Viren etabliert. Bei den Influenza-A-Viren handelt es sich um RNA-Viren mit einem

segmentierten Genom (Modrow et al., 2003). Dieses Charakteristikum bringt es mit sich,

dass neben den momentan in der Schweinepopulation kozirkulierenden Subtypen durch

Reassortment mit aviaren oder humanen Influenzastammen neue Stamme mit anderen

Subtypenkombinationen entstehen konnten (Reeth et al., 2004). Eine typspezifische De-

tektion ist somit sinnvoll. Da sowohl human- als auch veterinarmedizinisch ausschließlich

Influenza-A-Viren eine Rolle spielen (Truyen, 2003), konnte auf die Integration von In-

fluenza B und C in dieser Untersuchung verzichtet werden.

Die Wahl der so genannten Panpesti-Sonde zum Nachweis der KSP brachte es mit sich,

dass per se die nahe verwandten Viren der BVD und BD ebenfalls detektiert wurden.

Aus epidemiologischer Sicht ist diese Wahl moglich, eine Spezifitatsprufung konnte da-

her jedoch nur ausserhalb des Genus Pestivirus erfolgen. Die Familie Flaviviridae enthalt

124 5. Diskussion

keine weiteren Vertreter, die im Schwein zu erwarten waren. Probleme in der Detektion

sind somit unwahrscheinlich. Allerdings bleibt anzumerken, dass im Falle einer positiven

Reaktion eine weitere Differenzierung erfolgen muss. Eine weitere Abklarung ist jedoch oh-

nehin notwendig,da es die rechtlichen Grundlagen nicht gestatten (Council Directive

2001/89/EC), die Diagnose der anzeigepflichtigen Seuchen auf einen einzelnen positiven

Befund zu grunden.

Das PRRSV gehort zum Genus Arterivirus in der Familie der Arteriviridae (Cavanagh,

1997; Meulenberg et al., 1993b). Die verwandten Spezies des equinen Arteritis-Virus

und des Laktatdehydrogenase-Virus sind fur das Schwein aufgrund des beschrankten

Wirtsspektrums nicht von Bedeutung. Fur die Spezifitat der PCR war die Diskriminie-

rung der europaischen und amerikanischen Stamme von Bedeutung. Es konnte bestatigt

werden, dass, wie von Kleiboeker et al. (2005) gezeigt wurde, eine spezifische Differen-

zierung zwischen den Stammen stattfindet.

Da es sich um eine differentialdiagnostische PCR handelte, waren von vornherein Erre-

ger integriert, die mit einem ahnlichen Krankheitsbild einhergingen. Bei der Prufung der

Isolate und klinischen Proben konnte gezeigt werden, dass zwischen den verschiedenen Er-

regern keine Kreuzreaktivitat bestand. Die verfugbaren positiven und negativen Proben

wurden von allen PCRs korrekt erkannt. Allerdings reichte die Anzahl der Proben nicht

aus, um eine vollstandige Validierung entsprechend der OIE-Richtlinien durchzufuhren.

Um die Aussage betreffend der Spezifitat zu erhohen, mussten weitere Untersuchungen mit

Probenmaterial zusatzlicher differentialdiagnostisch in Frage kommender Erreger durch-

gefuhrt werden.

Die BLAST-Suche ergab fur alle entwickelten Primer und TaqMan-Sonden eine spezifi-

sche Bindung. Es wurden ausnahmslos geringfugige Identitaten (maximal 3-4 Basen) mit

fremden Sequenzen festgestellt.

Trotz der praktischen Limitierungen in der Uberprufung der Testspezifitat ist auf Grund-

lage der Ergebnisse aus dem Testen der Isolate und klinischen Proben sowie unter Zuhil-

fenahme der BLAST-Suche davon auszugehen, dass die gewahlten Genomregionen spezi-

fisch detektiert werden. Es ist jedoch ratsam die Prufung der analytischen Spezifitat mit

anderen Erregern fortzufuhren.

5.9. Validierung 125

5.9.3 Klinische Proben

Zur Uberprufung der diagnostischen Sensitivitat und Spezifitat sieht das OIE Manual of

Standards die Testung klinischer Proben bekannten Hintergrunds vor. Aufgrund der Limi-

tierung des zur Verfugung stehenden Untersuchungsmaterials war die Prufung klinischer

Proben nur in geringem Umfang moglich, zudem bestanden nur fur einen Teil der Proben

direkte Vergleichsmoglichkeiten hinsichtlich der Ergebnisse. Somit konnen die erhobenen

Befunde nur als Anhaltspunkte angesehen werden.

Neben 33 Proben aus der Routinediagnostik der Außenstelle fur Epidemiologie der TiHo

Hannover standen 17 Proben aus dem EURL zur Verfugung. Das Probenmaterial, das

aus dem EURL stammte, beinhaltete sowohl Proben, die von Tieren stammten, die ex-

perimentell mit verschiedenen KSPV-Stammen bzw. einem BDV-Stamm infiziert waren

als auch negatives Material, welches vor der Infektion von verschiedenen Tieren gewon-

nen wurde. Die KSPV-infizierten Tiere wurden mit der Ausnahme eines Tieres korrekt

erkannt. Ein Tier, welches mit BDV Gifhorn infiziert wurde, konnte nicht detektiert wer-

den. Die nicht detektierte Probe stammte von einem vorberichtlich mit dem KSPV-Stamm

CSF0309 infizierten Tier (Tier 266). In den Untersuchungen, die mit den Routinemetho-

den des EURLs durchgefuhrt worden waren, reagierte es positiv in real-time RT-PCR und

Virusisolierung. Dieses Tier konnte mit der vorliegenden PCR nicht schlussig detektiert

werden, da schwach positive Reaktionen bei hohen Ct-Werten neben negativen Laufen

auftraten. Eine nachfolgende Titration des nachgewiesenen Virus ergab einen niedrigen

Titer von 100,75 bzw. 101 KID50/ml Serum. Der Nachweis im Antigen-ELISA gelang nicht.

Diese Befunde legen nahe, dass mit einem niedrigen Virustiter auch in der vorliegenden

Probe gerechnet werden musste. Die dargestellten Ergebnisse des EURL wurden mit frisch

gewonnenem Material erzielt. Es ist nicht auszuschließen, dass durch die Lagerung bzw.

den Gefrier-Tau-Zyklus eine Abbau der Nukleinsaure stattfand, die zu einem Absinken

unter die Nachweisgrenze des vorliegenden Testsystems fuhrte.

Im Falle des vorberichtlich BDV-positiven Materials, das durch die vorliegende PCR nicht

detektiert werden konnte, ist zu bedenken, dass sich BDV in Schweinen nur selten (Paton

et al., 1994) und nicht zu hohen Titern vermehrt, so dass anzunehmen ist, dass das Ma-

terial nur geringe Virusmengen enthielt. Dieses Tier war mit den Routinemethoden des

EURL, real-time RT-PCR und Virusisolierung auf permanenten Schafthymuszellen, po-

126 5. Diskussion

sitiv gestestet worden. Allerdings zeigte das Organmaterial dieses Tieres auch hier hohe

Ct-Werte (Ct 35,3 bzw. 35,5) und negative Ergebnisse in der Virusisolierung auf porzinen

Zellen.

In drei Proben konnte zusatzlich PCV-2 nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse konnten

jedoch nicht mit vorberichtlichen Befunden korreliert werden, da die Voruntersuchungen

am EURL ausschließlich die Detektion von Pestiviren umfasste. Aus serologischen Unter-

suchungen ist bekannt, dass PCV-2 ubiquitar vorkommt und nicht unbedingt mit einem

Krankheitsbild korreliert sein muss (Rose et al., 2002). Die serologische Pravalenz wird

weltweit mit nahezu 100 % fur Mastschweine angenommen (Segales und Domingo,

2002). Somit war eine Detektion bei einem Teil der kommerziell bezogenen Tiere wahr-

scheinlich.

Bei der Uberprufung der Proben aus dem EURL wurden keine anderen Viren nachge-

wiesen. Dies spricht dafur, dass die multiplex-PCR die gewahlten Erreger spezifisch und

ohne hohe Hintergrundaktivitat detektiert. Die Tatsache, dass alle vorberichtlich negati-

ven Tiere bzw. Proben als negativ erkannt wurden, lasst den Schluss zu, dass auf dieser

limitierten Probengrundlage eine gute diagnostische Spezifitat erzielt wurde.

Im weiteren Verlauf der Validierung konnten 33 klinische Proben getestet werden. Diese

stammten aus der Routinediagnostik der Außenstelle fur Epidemiologie der TiHo Hanno-

ver in Bakum und waren im Vorfeld auf verschiedene porzine Viren und andere Pathoge-

ne untersucht worden. Ergebnisse dieser Untersuchungen lagen nur fur einen Teil dieser

Proben vor und schlossen i. d. R. nicht alle Viren ein, die mit dem vorliegenden multiplex-

Ansatz detektiert wurden. Die Bewertung der Ergebnisse gestaltete sich somit sehr schwie-

rig und konnte nur anhand der zur Verfugung stehenden Ergebnisse aus Bakum verglei-

chend erfolgen. Die Untersuchung zufallig ausgewahlter Proben zeigte, dass der Nach-

weis der anzeigepflichtigen Tierseuchen ASPV und SHV-1 negativ verlief. Auch der Test

auf pestivirale Erkrankungen verlief negativ. Da im fraglichen Zeitraum weder KSPV-,

SHV-1- noch ASPV-Infektionen in der deutschen Hausschweinepopulation nachgewiesen

wurden (Handistatus der OIE, http://www.oie.int/hs2/report.asp?lang=en, Stand

am 15.12.2005), war von diesen Ergebnissen auszugehen. PCV-2 konnte in 21 der 33 Pro-

ben detektiert werden. Nicht selten lagen Mehrfachinfektionen vor. Fur 16 dieser Proben

lagen auch Ergebnisse aus der Außenstelle fur Epidemiologie vor, die fur einen Vergleich

herangezogen werden konnten. Es zeigte sich, dass es zu Abweichungen in den Ergebnis-

5.9. Validierung 127

sen kam, wobei diese v. a. fur von der Außenstelle fur Epidemiologie fraglich beurteilte

Proben deutlich wurden.

Da die Kriterien, die zur Beurteilung der Ergebnisse als fraglich fuhrten, nicht bekannt

waren, ist eine Bewertung dieser Abweichungen nicht moglich. Funf der fraglichen Proben

wurden mit der vorliegenden PCR positiv getestet, zwei negativ. Eine Probe, die von der

Außenstelle fur Epidemiologie negativ getestet wurde, wurde in der vorliegenden PCR

wiederholt positiv detektiert. Generell ist festzuhalten, dass PCV-2 in der Schweinepopu-

lation weit verbreitet ist und v. a. in Kombination mit anderen Erregern und bei hoher

Viruslast bei der Entstehung von Krankheiten beteiligt sein kann (Allan et al., 2000;

Krakowka et al., 2001; Choi und Chae, 2000; Kim und Chae, 2003). Der Nachweis

allein musste also nicht mit einem Krankheitsgeschehen vergesellschaftet sein.

Da keine PPV-Ergebnisse zum Vergleich vorlagen, waren die positiven Befunde fur zwei

der 33 Proben nicht zu verifizieren. Die PPV-positiven Befunde traten in Kombination

mit PCV-2 auf. Wie oben bereits erwahnt, sind Mehrfachinfektionen in Zusammenhang

mit PCV-2 haufig. PPV ist dabei ein oftmals mit PCV-2 assoziierter Erreger, der die

Infektion mit PCV-2 verstarkt (Ellis et al., 1999; Allan et al., 1999; Kennedy et al.,

2000).

Neun Proben wurden positiv auf Influenza-A detektiert, wobei sechs Mehrfachinfektio-

nen vorlagen. Nur drei dieser Ergebnisse konnten vergleichend ausgewertet werden. Zwei

Mischinfektionen mit PCV-2 wurden in beiden Nachweissystemen detektiert, wobei mit

der vorliegenden multiplex-PCR fur eine Probe auch ein positives Signal fur PRRSV-NA

detektiert wurde. Eine Probe, die vorberichtlich Influenza-A-Virus positiv war, wurde ne-

gativ getestet. Auf Grundlage der vorliegenden Informationen zu dieser Probe und den

verwendeten Nachweistechniken konnte die Ursache dieser Abweichung nicht geklart wer-

den.

In drei (PRRSV-EU) bzw. vier (PRRSV-NA) Proben wurde PRRSV detektiert. Zwei

PRRSV-EU-Befunde konnten mit Ergebnissen aus Bakum verglichen werden und erwie-

sen sich als identisch. Die Ergebnisse des PRRSV-NA-spezifischen Nachweises wichen fur

die einzige vergleichend auswertbare Probe voneinander ab, wobei die fragliche Probe

vorberichtlich positiv war, jedoch in der vorliegenden PCR negativ getestet wurde. Diese

Probe zeigte in der vorliegenden PCR ein positives Ergebnis fur Influenza-A.

128 5. Diskussion

5.10 Schlussfolgerung und Ausblick

Die hier entwickelten real-time PCR-Protokolle wurden nach Maßgabe der OIE Richtlinien

zur Validierung und Qualitatskontrolle zur Diagnose infektioser Erkrankungen eingesetz-

ter PCR-Methoden etabliert und teilweise validiert. Die erste Stufe des Validierungssche-

mas, die Uberprufung der Umsetzbarkeit, wurde erfolgreich abgeschlossen und die PCRs

daraufhin optimiert und standardisiert. Wahrend die Untersuchung der analytischen Sen-

sitivitat und der Reproduzierbarkeit erfolgreich abgeschlossen werden konnten, waren die

Moglichkeiten der Spezifitatsprufung auf der Grundlage des limitierten Probenmateri-

als nur teilweise moglich. Die zweite Stufe der Validierung wurde somit in weiten Teilen

abgeschlossen, bedarf jedoch einer Fortfuhrung unter Praxisbedingungen an klinischen

Proben.

Die dritte Stufe der Validierung sieht die Bestimmung der diagnostischen Sensitivitat

(D-SN) und Spezifitat (D-SP) sowie der Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit des

Testsystems vor. Ein Vergleich mit etablierten”Goldstandards“ sollte im Rahmen dieser

Stufe ebenfalls erfolgen. Die Bestimmung der D-SN und D-SP sollte anhand einer großen

Probenanzahl bekannten Hintergrunds vorgenommen werden, die i. d. R. nicht verfugbar

ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese Stufe der Testvalidierung daher nicht hin-

reichend durchgefuhrt werden. Die OIE Richtlinien zur Validierung geben an, dass diese

Stufe in vielen Fallen im praktischen Einsatz parallel zum Goldstandard erfolgen kann. Es

sollte daher eine weitere Testung und Validierung des PCR-Protokolls in der Routinedia-

gnostik anhand des verfugbaren klinischen Materials durchgefuhrt werden. Der parallele

Einsatz des Goldstandards ist nicht fur alle Erreger durchfuhrbar, konnte jedoch in den

meisten Fallen erreicht werden. Der Vergleich mit dem Goldstandard, der Virusisolierung

in Zellkultur, wurde fur die meisten Protokolle bei der Prufung der analytischen Sensi-

tivitat durchgefuhrt und zeigte eine den Goldstandard ubertreffende bzw. in Einzelfallen

gleichwertige Sensitivitat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden soweit wie moglich sowohl

klinische Proben als auch unterschiedliche Isolate der entsprechenden Viren getestet, die

die Detektionssicherheit der gewahlten Genomfragmente trotz vorhandener Limitierungen

absichern sollten. Die unter diesen Umstanden moglichen Testschritte wurden erfolgreich

durchgefuhrt und ergaben zufriedenstellende Ergebnisse. Um eine weitere Validierung

entsprechend der OIE-Richtlinien zu gewahrleisten, sollten weitere Untersuchungen mit

5.10. Schlussfolgerung und Ausblick 129

klinischem Material folgen.

Trotz der Notwendigkeit der weiteren Validierung kann der etablierte PCR-Ansatz bereits

in der vorliegenden Form einen wichtigen Beitrag zur Differentialdiagnose der KSP leis-

ten. Neben der hohen Sensitivitat des Testsystems und der schnellen Verfugbarkeit einer

verlasslichen Diagnose bietet dieser Ansatz auch den erheblichen Vorteil einer moglichen

Erweiterung um zusatzliche, z. B. bakterielle Erreger. Da alle PCR-Protokolle unter glei-

chen Bedingungen durchgefuhrt werden, ist es moglich, sie beliebig zu erweitern. Außer-

dem besteht die Moglichkeit, diesen Ansatz auf Krankheitskomplexe anderer Tierspezies

zu ubertragen. Die vorliegende PCR ist aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Um-

setzbarkeit fur die Routinediagnostik besser geeignet als Systeme, die auf der Detektion

unter Zuhilfenahme unterschiedlichster Methoden beruhen. Ein Nachteil des vorliegenden

Konzeptes ist die Tatsache, dass sich aufgrund des”Panpesti“-Nachweises eine weitere

Differenzierung im Falle einer positiven Reaktion anschließen muss. Da es die rechtlichen

Grundlagen nicht gestatten (Council Directive 2001/89/EC), die Diagnose der an-

zeigepflichtigen Seuchen auf einen einzelnen positiven Befund zu grunden, ist jedoch eine

weitere Abklarung ohnehin notwendig. Die vorliegende Methode ist als ein Screeningtest

anzusehen. Sollten sich Verdachtsmomente ergeben, die auf eine anzeigepflichtige Seuche,

wie KSP, AK oder ASP hindeuten, mussen weitere Tests eingeleitet werden, die den Ver-

dacht bestatigen oder entkraften.

6. Zusammenfassung

Andreas Gavrilenko

Entwicklung einer real-time multiplex multitube RT-PCR zur Differentialdia-

gnostik der klassischen Schweinepest

Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine wirtschaftlich bedeutende, anzeigepflichti-

ge Tierseuche, deren Ausbruche weltweit enorme wirtschaftliche Verluste verursachen.

Die Erkrankung wird durch das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV), ein RNA-

Virus, das zum Genus Pestivirus der Virusfamilie Flaviviridae gehort, verursacht. Da das

klinische Bild einer KSPV-Infektion sehr variabel und haufig unspezifisch ist, kommen

viele andere Erkrankungen viraler, bakterieller und nicht-infektioser Genese differenti-

aldiagnostisch in Frage. Zu den viralen Differentialdiagnosen gehoren die Afrikanische

Schweinepest (ASP), porzine Circovirusinfektionen (PCV-2), porzine Parvovirusinfektio-

nen (PPV), porzine Influenza, Infektionen mit dem porzinen respiratorischen und repro-

duktiven Syndrom Virus (PRRSV) und die Aujeszkysche Krankheit (SHV-1 Infektionen).

Eine klinische Diagnose ist aufgrund der Vielzahl moglicher Differentialdiagnosen unmoglich

und rechtlich als alleiniges Entscheidungskriterium der Seuchenfeststellung nicht zulassig.

Sowohl fur die routinemaßige Uberwachung der Schweinepopulation als auch zur schnellen

und verlasslichen Detektion und Kontrolle eines KSP-Ausbruchs ist daher eine moderne

und effiziente Labordiagnostik von herausragender Bedeutung.

Zu den schnellsten und empfindlichsten Methoden des Virusgenomnachweises gehort die

Polymerasekettenreaktion (PCR), die es in so genannten multiplex Ansatzen zudem ge-

stattet, verschiedene Erreger gleichzeitig, und bei Nutzung fluoreszierend markierter Son-

131

132 6. Zusammenfassung

den, in Echtzeit (”real-time“) zu detektieren.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer multiplex real-time PCR

eine moderne und schnelle Nachweismethode differentialdiagnostisch relevanter viraler

Erreger zu Pestivirusinfektionen entwickelt. Aufgrund der Anzahl der zu detektierenden

Erregergenome erfolgte die Umsetzung in einem so genannten multitube Ansatz. Die Kom-

bination der Erreger in den Ansatzen erfolgte unter Berucksichtigung der erregerspezifi-

schen Eigenschaften und der Relevanz des Erregers.

Fur die PCR Ansatze wurden folgende Kombinationen gewahlt: ASPV und SHV-1, PPV

und PCV-2, porzine Influenza und Pestiviren sowie die beiden Stamme des PRRSV. Als

interne Kontrolle wurde das housekeeping gene beta-Aktin gewahlt. Nach der Entwick-

lung spezifischer Primerpaare und TaqMan-Sonden, wurden die entsprechenden real-time

PCRs zunachst einzeln und dann in den vorgesehenen Kombination getestet und opti-

miert. Eine bereits publizierte real-time PCR zum Nachweis und zur Diskriminierung

amerikanischer und europaischer PRRSV-Stammen (Kleiboeker et al., 2005) wurde

ubernommen und in das Gesamtkonzept integriert. Alle PCR-Reaktionen wurden mit ei-

nem einheitlichen Thermoprofil durchgefuhrt. Die Validierung der neu etablierten PCRs

erfolgte nach OIE Kriterien.

Die analytische Sensitivitat der PCRs wurde in infektiosen Einheiten bzw. Genomaqui-

valenten bestimmt und erwies sich im Vergleich zu dem Virusnachweis in Zellkultur als

uberlegen bzw. in Einzelfallen als gleichwertig. Die Spezifitat der Primer und TaqMan-

Sonden wurde mittels einer umfangreichen BLAST-Suche sichergestellt. Klinische Proben,

welche die genetische Variabiltat der Erreger und die epidemiologische Situation wider-

spiegelten, wurden in die Testung der PCRs einbezogen.

Der entwickelte PCR-Ansatz bietet die Moglichkeit einer schnellen und sicheren labordia-

gnostischen Differentialdiagnose der KSP. In der gewahlten Konzeption konnte er zudem

ein wichtiges Bindeglied darstellen, wenn es um den Ausschluss der KSP ohne konkre-

ten Seuchenverdacht geht. Das vorliegende Konzept unter Verwendung eines einheitlichen

Thermoprofils bietet zudem den Vorteil, dass das Testsystem beliebig um weitere relevante

Erreger erweitert werden kann, ohne die restlichen Ansatze zu beeinflussen.

7. Summary

Andreas Gavrilenko

Development of realtime multiplex multitube RT-PCR for differential diagno-

sis of classical swine fever

Classical swine fever (CSF) is an economically important viral disease of domestic pigs

worldwide. It is notifiable to the OIE. The causative agent, classical swine fever virus

(CSFV), is an enveloped RNA-virus which belongs to the family Flaviviridae, genus Pes-

tivirus.

The clinical picture is highly variable and often unspecific. For this reason, many other

viral, bacterial and non-infectious diseases have to be considered as differential diagnoses.

The diseases caused by viruses are African swine fever (ASF), porcine circovirus (PCV-2)

infections, porcine parvovirus (PPV) infections, porcine influenza, porcine reproductive

and respiratory syndrome (PRRS), and Aujeszky´s disease (caused by suid herpesvirus

type one, SHV-1). Diagnosis based on clinical signs alone is neither possible nor legitima-

te. As a consequence, a fast and reliable laboratory diagnosis is of utmost importance,

both for surveillance and in case of an CSF outbreak. Polymerase chain reaction (PCR)

is one of the fastest and most sensitive methods for the detection of viral genomes. The

use of fluorescent labelled probes enables detection of multiple targets using multiplex

real-time PCR.

In this project a rapid and reliable test based on real-time multiplex reverse transcription

(RT) PCR for differential diagnosis of CSFV was developed. Due to limitations of simul-

taneously detectable fluorescent dyes, the assay was designed as multitube test. The com-

bination of pathogens within the assay was designed under consideration of pathogens’-

133

134 7. Summary

specific characteristics and their relevance.

The following combinations were selected: ASFV and SHV-1, PPV and PCV-2, porcine

Influenza and Pestiviruses, as well as PRRSV strains. Beta-actin housekeeping gene was

chosen as internal control. After designing specific primers and TaqMan probes, the real-

time RT-PCRs were tested individually and subsequently optimized in the determined

combinations. An already published real-time PCR for the detection and discrimination

of American and European PRRSV strains (Kleiboeker et al., 2005) was integrated

in the assay. For all PCR reactions a uniform thermal profile was developed. The assay

was validated according to OIE validation criteria. The analytical sensitivity of the PCRs

was determined and expressed as infectious units and/or genome equivalents. It proved

to be superior or at least equivalent (for single PCRs) in comparison to virus isolation

in cell culture. Specificity of primers and probes was assured by means of an extensive

BLAST search. Clinical samples reflecting the genetic variability of the pathogens and

the epidemiological situation, were included in the evaluation of the PCRs.

The developed multiplex PCR provides a fast and reliable tool for differential diagnosis

of CSF. The selected concept could be an important link in terms of exclusion of CSF

without concrete epidemic suspicion. Furthermore, the uniform thermal profile offers the

opportunity to include additional relevant PCR targets without affecting the other PCRs.

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A. Anhang

A.1 Verwendete Virusisolate, Organ- und Blutpro-

ben, Antikorper

Die verwendeten Virusisolate sowie Organ- und Blutproben sind in Kapitel 3.1.2.1

aufgefuhrt.

PorcilisR© PRRS

Fa. Intervet, Unterschleißheim

Basiert auf europaischem PRRSV-Stamm DV

2 ml Dosis enthalt mind. 104 KID50 des PRRSV DV

IngelvacR© PRRS MLV

Fa. Boehringer Ingelheim Vetmedica, Ingelheim

20 ml, 10 Impfdosen, MLV (modified live virus)

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus MoAb

Fa. VMRD, USA

Kat. Nr. 2D6

BVD/C16 Antikorper, Peroxidase gekoppelt

177

178 A. Anhang

Institut fur Virologie

TiHo Hannover

A.2 Enzyme und kommerzielle Kits

QuantiTectR© Multiplex PCR Kit

25 ml PCR Kit (1000) QuantiTectR© Multiplex PCR Master Mix (mit ROX)

20 ml RNase-freies Wasser

Kat. Nr.: 204545, Fa. Qiagen, Hilden

BrilliantR© SYBR R©-Green QPCR Master Mix

2 × Brilliant SYBR R©-Green QPCR Master Mix

Referenzfarbstoff ROX (1 mM)

Kat. Nr.: 600548, Fa. Stratagene, Amsterdam, Niederlande

Abgene Thermo-Start Mastermix

20 × 1,8 ml

Kat. Nr.: AB-0938/15/B, Fa. ABgene, Hamburg

High Pure Viral RNA Kit

Kat. Nr.: 1858882, Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

RNeasy Lipid Tissue Mini Kit

Kat. Nr.: 74804, Fa. Qiagen GmbH, Hilden

QIAamp DNA Mini Kit

Kat. Nr.: 51304, Fa. Qiagen GmbH, Hilden

A.2. Enzyme und kommerzielle Kits 179

DNeasy Tissue Kit

Kat. Nr.: 69504, Fa. Qiagen GmbH, Hilden

P-GEM R©T-easy Kit

Kat.Nr.: A1380, Fa. Promega, Mannheim

TOPO TA Cloning R© Kit

Kat. Nr.: K4500-40 Fa. Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA

SuperScriptTMIII Reverse Transkriptase

Kat. Nr.: 18080-044, Fa. Invitrogen, Karlsruhe

Alkalische Phosphatase mit Puffer

Kat. Nr.: 2392376, Boehringer, Mannheim

SpeI mit Puffer Tango

Kat. Nr.: #ER1251, Fa. Fermentas, St.Leon-Rot

EcoRV mit Puffer REact

Kat. Nr.: 15425-010, Fa. Invitrogen, Karlsruhe

XmnI mit Puffer NEB2

Kat. Nr.: #ER1531, Fa. Fermentas, St.Leon-Rot

180 A. Anhang

A.3 Medien, Puffer, Losungen, Antibiotika

A.3.1 Zellkulturmedien

EMEM (Eagle´s minimum essential medium)

Pulvermedium 9,60 g Fa. Invitrogen, Karlsruhe

NaHCO 2,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Phenolrot 0,016 g Fa. Merck, Darmstadt

A. bidest. ad 1000,00 ml

Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.

EMEM wurde als Erhaltungsmedium fur die PK(15)A-Zelllinie unter Zugabe von 50 ml

fetalem Kalberserum (Fa. Biochrom, Hamburg) eingesetzt.

Fur zellkulturbasierte Nachweissysteme in Mikro- und Makrotiterplatten wurden dem

EMEM folgende Inhaltsstoffe zugefugt:

Penicillin G 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Streptomycinsulfat 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

fetales Kalberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg

EMEM/MEM-Hanks

MEM-Earle-Fertigpulver 4,76 g Fa. Invitrogen, Karlsruhe

MEM-Hanks-Fertigpulver 5,32 g Fa. Invitrogen, Karlsruhe

NaHCO3 1,52 g Fa. Merck, Darmstadt

Nichtessentielle Aminosauren 10 ml Fa. Biochrom, Hamburg

Natrium-Pyruvat 0,6 g Fa. Riedel-de Haen, Seelze

A. bidest. ad 1000 ml

Fetales Kalberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg

A.3. Medien, Puffer, Losungen, Antibiotika 181

Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 7,2 eingestellt.

EDulb (EMEM, modifiziert nach Dulbecco und Freeman)

EDulb-Pulvermedium 13,53 g Fa. Serva, Heidelberg

NaHCO2 2,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Penicilli G 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Streptomycin Sulfat 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Fetales Kalberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg

A. bidest. ad 1000 ml

Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.

Einfriermedium

EMEM 700 ml

DMSO 100 ml Fa. Sigma, Deisenhofen

Fetales Kalberserum 200 ml Fa. Biochrom, Hamburg

ATV (adjusted trypsin-versen)-Losung

NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,40 g Fa. Merck, Darmstadt

NaHCO3 0,58 g Fa. Merck, Darmstadt

Dextrose 1,00 g Fa. Sigma, Deisenhofen

EDTA (Versen) 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Trypsin(3U/mg) 0,50 g Fa. Serva, Heidelberg

A. bidest. ad 1000 ml

Versen-Trypsin-Losung (0,125%)

NaCl 8,0 g Fa. Merck, Darmstadt

182 A. Anhang

KCl 0,2 g Fa. Merck, Darmstadt

KH2PO4 0,2 g Fa. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 × 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt

CaCl2 × 2 H2O 0,132 g Fa. Merck, Darmstadt

Trypsin (3 U/mg) 1,25 g Fa. Serva, Heidelberg

EDTA (Versen) 1,25 g Fa. Merck, Darmstadt

Penicillin G 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Streptomycinsulfat 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

MgCl2 × 6 H2O 0,1 g Fa. Sigma, Deisenhofen

A. bidest. ad 1000 ml

Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 mit 1 N NaOH

AEC-Losung

3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) 20,00 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Dimethylformamid 3,00 ml Fa. Merck, Darmstadt

Natriumazetat-Puffer

(0,05 M, pH 5,0) ad 50,00 ml Fa. Merck, Darmstadt

H2O2 (3 %) 0,40 ml Fa. Merck, Darmstadt

PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlosung)

NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 × 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt

KH2PO4 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Fa. Merck, Darmstadt

MgCl2 × 6 H2O 0,10 g Fa. Sigma, Deisenhofen

A. bidest. ad 1000 ml

A.3. Medien, Puffer, Losungen, Antibiotika 183

PBSM (phosphatgepufferte Kochsalzlosung ohne Kalzium und Magnesium)

NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 × 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt

KH2PO4 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

A. bidest. ad 1000 ml

PBS/Tween

PBSM 1000 ml

Tween R© 20 100µl Fa. Serva, Heidelberg

10 × TBE-Puffer

TRIS 108 g Fa. USB, Cleveland, Ohio, USA

Borsaure 53,4 g Fa. Riedel-de-Haen, Seelze

EDTA 7,4 g

A. bidest. ad 1000 ml

5 × Probenpuffer zum Beladen von Agarose-Gelen

Glyzerin 25 % Fa. Merck, Darmstadt

EDTA 0,5 mM Fa. Merck, Darmstadt

Bromphenolblau 0,2 % Fa. Serva, Darmstadt

A. bidest. ad 50 ml

A.3.2 Puffer und Losungen

DEPC-Wasser

Kat.-Nr. 2420-204, Fa. BIO 101, Vista, USA

184 A. Anhang

A.4 Sonstige Reagenzien

peqGold 100 bp DNA-Leiter Plus

5 × 50µg

Kat. Nr.: 25-2021, Fa. Peqlab - Biotechnologie GmbH, Erlangen

A.5 Primer- und Sondensequenzen

Primer- und Sondensequenzen sind in Tabelle 4.3 auf Seite 83 dargestellt.

A.6 Gerate und Verbrauchsmittel

A.6.1 Gerate

Thermocycler

Mx 4000TMMultiplex Fa. Stratagene, Amsterdam, Niederlande

Quantitative PCR System Kat.-Nr.:401260

T personal Cycler Fa. Biometra, Gottingen

T3 Thermocycler Fa. Biometra, Gottingen

Agarosegelelektrophoresesystem

Mini Sub Cell Fa. Bio-Rad, Munchen

Wide Mini Sub Cell Fa. Bio-Rad, Munchen

Spannungsquelle Power Supply Fa. Bio-Rad, Munchen

A.6. Gerate und Verbrauchsmittel 185

Mikrowellengerat Fa. Privileg

UV-Transilluminator Fa. UVP, USA

Bildverarbeitungssystem Fa. MWG-Biotech AG, Ebersberg

Inkubatoren

CO2-Inkubator Typ B 5060 EK/CO2 Fa. Heraeus, Hanau

pH-Meter

Calimatic 766 Fa. Jurgens, Hannover

Zentrifugen

Biofuge pico Fa. Heraeus, Hanau

Kuhlzentrifuge 5417 R Fa. Eppendorf, Hamburg

Labofuge 400R Fa. Heraeus, Hanau

Vortex

K-550-GE Bender Fa. Hobein, Zurich, Schweiz

REAX 2000 Fa. Heidolph Elektro GmbH, Kelheim

Waagen

1213 MP Fa. Sartorius, Gottingen

EW Kern Fa. Landgraf, Langenhagen

Analysenwaage 1712 MP 8 Fa. Sartorius, Gottingen

186 A. Anhang

A.6.2 Verbrauchsmittel

Reaktionsgefaße

Volumen 0,5 ml Fa. Eppendorf, Hamburg

Volumen 1,5 ml Fa. Eppendorf, Hamburg

Volumen 2 ml Fa. Eppendorf, Hamburg

Glasgefaße 25 ml bis 3 l Fa. Jurgens, Hannover

Thermo-Strips and Ultra Clear Caps

Kat. Nr.: AB-1183, Fa. ABgene, Hamburg

Strip Tube, 8 × 0,2 ml Format

Kat. Nr.: 410022

Optical Cap, 8 × Strip

Kat. Nr.: 410024 Fa. Stratagene, Amsterdam, Niederlande

Gewebekulturflasche 50 ml / 25 cm2 Fa. Greiner, Frickenhausen

Gewebekulturflasche 250 ml / 75 cm2 Fa. Greiner, Nurtingen

96-Well-Gewebekulturplatten Fa. Costar, Bodenheim

24-Well-Gewebekulturplatten Fa. Greiner, Frickenhausen

Kryo-Vials 2 ml Fa. Greiner, Frickenhausen

Thomakammer neu Fa. Jurgens, Hannover

A.7 Software

MicrosoftR© Office Excel 2003 (11.6355.6408) SP1

Bestandteil von Microsoft Office Professional Edition 2003

Copyright c© 1985-2003 Microsoft Corporation.

Unterschleißheim

A.8. Tabellen und Abbildungen 187

Clustal W (1.81) Multiple Sequence Alignments

Toby Gibson, Des Higgins (now at the EBI, Hinxton, Great Britain), Julie Thompson

EMBL, Heidelberg

Thompson et al. (1994)

BioEdit Version 7.0.1.1

Copyright c© 1997-2004, Tom Hall

Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad, USA

Beacon Designer 2.13 Build 31904

Premier Biosoft International

Palo Alto, Kalifornien, USA

Copyright c© 2003 Premier Biosoft International

Mx4000 v4.20 Build 221, Schema 60

Fa. Stratagene, Kalifornien, USA

Copyright c© 2004 Stratagene

Kat.-Nr.:401260

Restriktionsmusteranalyse

The restriction enzyme database. New England Biolabs

http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

A.8 Tabellen und Abbildungen

188 A. Anhang

Tabelle A.1: Ergebnisse der ASPV-Primertitrationen mit SYBRTM-Green real-time

PCR. Die Tests wurden in Doppelansatzen mit in Standardvektoren klonierten PCR-

Produkten durchgefuhrt. Die jeweiligen Primerpaare sind unter Name aufgefuhrt; F steht

fur Forward, R fur Reverse-Primer. Als ∆Rn ist die finale Fluoreszenz angegeben. Ct, Ct

mittel und Ct SA bezeichnen die Ct-Werte, deren Mittel und die Standardabweichung. Die

Schmelztemperatur des PCR-Produktes befindet sich in der letzten Spalte.

Name ∆Rn Ct Ct mittel Ct SA Tm Produkt

50F50R 0,210 22,13 22,13 0,10 75,5

50F100R 0,217 20,83 20,83 0,04 75,5

50F300R 0,222 20,09 20,09 0,13 75,5

50F600F 0,231 19,93 19,93 0,04 75,5

50F900F 0,224 19,76 19,76 0,11 75,5

100F50R 0,224 22,79 22,79 0,16 74,5

100F100R 0,282 20,08 20,06 0,37 75,5

100F300R 0,307 19,35 19,36 0,22 75,5

100F600R 0,268 19,58 19,58 0,02 75,5

100F900F 0,245 19,49 19,53 0,31 75,5

300F50R 0,206 22,48 22,48 0,04 75,5

300F100R 0,279 20,03 20,03 0,01 75,5

300F300R 0,299 19,59 19,59 0,02 75,5

300F600R 0,328 19,33 19,33 0,04 75,5

300F900F 0,330 19,28 19,28 0,03 75,5

600F50R 0,230 21,51 21,51 0,13 75,5

600F100R 0,284 19,94 19,94 0,18 75,5

600F300R 0,304 19,51 19,51 0,14 75,5

600F600R 0,323 19,43 19,43 0,03 75,5

600F900F 0,329 19,31 19,32 0,13 75,5

900F50R 0,204 22,54 22,67 0,95 75,5

900F100R 0,269 20,12 20,13 0,23 75,5

900F300R 0,305 19,58 19,58 0,08 75,5

900F600R 0,224 19,01 18,99 0,24 75,5

900F900F 0,231 19,07 19,07 0,10 75,5

1µM-NTC 0,014 No Ct No Ct No Ct 68,5

5µM-NTC 0,245 34,09 34,07 0,49 72,5

A.8. Tabellen und Abbildungen 189

Tabelle A.2: Ergebnisse der SHV-1-Primertitrationen mit SYBRTM-Green real-time

PCR. Die Tests wurden in Doppelansatzen mit in Standardvektoren klonierten PCR-

Produkten durchgefuhrt. Die jeweiligen Primerpaare sind unter Name aufgefuhrt; F steht

fur Forward, R fur Reverse-Primer. Als ∆Rn ist die finale Fluoreszenz angegeben. Ct, Ct

mittel und Ct SA bezeichnen die Ct-Werte, deren Mittel und die Standardabweichung. Die

Schmelztemperatur des PCR-Produktes befindet sich in der letzten Spalte.

Name ∆Rn Ct Ct mittel Ct SA Tm Produkt

50F50R 0,214 19,83 19,83 0,12 82,5

50F100R 0,205 20,03 20,03 0,12 82,5

50F300R 0,192 19,91 19,92 0,18 82,5

50F600F 0,203 19,72 19,73 0,25 82,5

50F900F 0,212 19,56 19,56 0,10 81,5

100F50R 0,229 19,22 19,22 0,02 81,5

100F100R 0,250 19,15 19,15 0,09 81,5

100F300R 0,281 19,08 19,08 0,06 82,5

100F600R 0,263 19,11 19,11 0,02 82,5

100F900F 0,203 19,35 19,35 0,04 82,5

300F50R 0,200 19,33 19,33 0,04 82,5

300F100R 0,246 19,12 19,13 0,17 82,5

300F300R 0,276 19,11 19,11 0,06 82,5

300F600R 0,284 19,08 19,08 0,19 82,5

300F900F 0,308 19,02 19,01 0,10 82,5

600F50R 0,206 19,33 19,33 0,04 81,5

600F100R 0,265 19,06 19,06 0,09 82,5

600F300R 0,273 19,24 19,24 0,03 82,5

600F600R 0,296 19,26 19,26 0,09 82,5

600F900F 0,304 19,26 19,26 0,17 82,5

900F50R 0,200 19,47 19,47 0,12 82,5

900F100R 0,232 19,29 19,29 0,16 82,5

900F300R 0,243 19,64 19,67 0,36 82,5

900F600R 0,316 19,22 19,22 0,14 82,5

900F900F 0,316 19,31 19,31 0,07 82,5

1µM-NTC 0,003 No Ct No Ct No Ct 73,5

5µM-NTC 0,197 35,06 35,05 0,31 79,5

190 A. Anhang

Tabelle A.3: Ergebnisse der PCV-2-Primertitrationen mit SYBRTM-Green real-time

PCR. Die Tests wurden in Doppelansatzen mit in Standardvektoren klonierten PCR-

Produkten durchgefuhrt. Die jeweiligen Primerpaare sind unter Name aufgefuhrt; F steht

fur Forward, R fur Reverse-Primer. Als ∆Rn ist die finale Fluoreszenz angegeben. Ct, Ct

mittel und Ct SA bezeichnen die Ct-Werte, deren Mittel und die Standardabweichung. Die

Schmelztemperatur des PCR-Produktes befindet sich in der letzten Spalte.

Name ∆Rn Ct Ct mittel Ct SA Tm Produkt

50F50R 0,286 19,60 19,60 0,10 80,5

50F100R 0,320 18,18 18,19 0,19 80,5

50F300R 0,322 17,60 17,60 0,06 80,5

50F600F 0,331 17,38 17,38 0,13 80,5

50F900F 0,313 17,46 17,47 0,13 80,5

100F50R 0,307 19,54 19,54 0,01 80,5

100F100R 0,378 17,82 17,82 0,19 80,5

100F300R 0,397 17,33 17,33 0,10 80,5

100F600R 0,408 17,19 17,19 0,14 80,5

100F900F 0,386 17,16 17,16 0,07 80,5

300F50R 0,297 19,31 19,31 0,04 80,5

300F100R 0,365 17,62 17,64 0,27 80,5

300F300R 0,417 17,11 17,12 0,11 80,5

300F600R 0,412 17,13 17,13 0,05 80,5

300F900F 0,417 17,08 17,08 0,11 80,5

600F50R 0,313 19,01 19,00 0,09 80,5

600F100R 0,379 17,69 17,69 0,06 80,5

600F300R 0,406 17,27 17,27 0,00 80,5

600F600R 0,410 17,12 17,12 0,05 80,5

600F900F 0,425 17,02 17,00 0,11 80,5

900F50R 0,278 19,49 19,50 0,13 80,5

900F100R 0,339 17,88 17,88 0,21 80,5

900F300R 0,348 17,60 17,63 0,39 80,5

900F600R 0,399 17,32 17,33 0,11 80,5

900F900F 0,422 17,19 17,19 0,06 80,5

1µM-NTC 0,001 No Ct No Ct No Ct 68,5

5µM-NTC 0,205 36,33 36,34 0,16 69,5

A.8. Tabellen und Abbildungen 191

Tabelle A.4: Ergebnisse der PPV-Primertitrationen mit SYBRTM-Green real-time PCR.

Die Tests wurden in Doppelansatzen mit in Standardvektoren klonierten PCR-Produkten

durchgefuhrt. Die jeweiligen Primerpaare sind unter Name aufgefuhrt; F steht fur For-

ward, R fur Reverse-Primer. Als ∆Rn ist die finale Fluoreszenz angegeben. Ct, Ct mit-

tel und Ct SA bezeichnen die Ct-Werte, deren Mittel und die Standardabweichung. Die

Schmelztemperatur des PCR-Produktes befindet sich in der letzten Spalte.

Name ∆Rn Ct Ct mittel Ct SA Tm Produkt

50F/50R 0,162 25,43 25,43 0,08 71,5

50F100R 0,159 25,09 25,10 0,16 71,5

50F300R 0,171 24,68 24,68 0,11 71,5

50F600F 0,167 24,94 24,94 0,11 71,5

50F900F 0,163 24,78 24,78 0,12 71,5

100F50R 0,202 23,64 23,68 0,39 71,5

100F100R 0,228 22,25 22,26 0,25 71,5

100F300R 0,243 22,07 22,07 0,01 71,5

100F600R 0,230 22,06 22,05 0,18 71,5

100F900F 0,218 22,26 22,26 0,08 71,5

300F50R 0,197 23,09 23,08 0,25 71,5

300F100R 0,237 22,05 22,05 0,09 71,5

300F300R 0,257 21,67 21,67 0,02 71,5

300F600R 0,270 21,53 21,53 0,02 71,5

300F900F 0,279 21,35 21,35 0,02 71,5

600F50R 0,217 22,30 22,30 0,09 71,5

600F100R 0,261 21,48 21,48 0,06 71,5

600F300R 0,275 21,39 21,39 0,09 71,5

600F600R 0,272 21,40 21,40 0,09 72,5

600F900F 0,291 21,23 21,24 0,11 72,5

900F50R 0,198 22,67 22,67 0,02 71,5

900F100R 0,293 22,11 22,12 0,19 71,5

900F300R 0,352 21,70 21,70 0,07 71,5

900F600R 0,343 21,42 21,42 0,06 71,5

900F900F 0,352 21,44 21,44 0,04 72,5

1µM-NTC 0,000 No Ct No Ct No Ct 64,5

5µM-NTC 0,036 No Ct 39,64 0,51 67,5

192 A. Anhang

Tabelle A.5: Ergebnisse der Pestivirenspezifischen-Primertitrationen mit SYBRTM-

Green real-time PCR. Die Tests wurden in Doppelansatzen mit in Standardvektoren

klonierten PCR-Produkten durchgefuhrt. Die jeweiligen Primerpaare sind unter Name

aufgefuhrt; F steht fur Forward, R fur Reverse-Primer. Als ∆Rn ist die finale Fluoreszenz

angegeben. Ct, Ct mittel und Ct SA bezeichnen die Ct-Werte, deren Mittel und die Stan-

dardabweichung. Die Schmelztemperatur des PCR-Produktes befindet sich in der letzten

Spalte.

Name ∆Rn Ct Ct mittel Ct SA Tm Produkt

50F50R 0,300 21,81 21,81 0,10 82,5

50F100R 0,308 21,99 21,98 0,11 82,5

50F300R 0,298 22,15 22,15 0,14 82,5

50F600F 0,282 22,27 22,27 0,12 82,5

50F900F 0,291 22,69 22,69 0,10 82,5

100F50R 0,349 20,56 20,56 0,29 82,5

100F100R 0,406 20,26 20,27 0,22 82,5

100F300R 0,421 20,16 20,16 0,29 82,5

100F600R 0,366 20,51 20,51 0,11 82,5

100F900F 0,346 21,11 21,11 0,07 82,5

300F50R 0,320 20,14 20,15 0,31 82,5

300F100R 0,362 20,06 20,06 0,04 82,5

300F300R 0,394 20,33 20,34 0,04 82,5

300F600R 0,438 20,31 20,31 0,01 82,5

300F900F 0,420 20,44 20,44 0,13 82,5

600F50R 0,323 19,63 19,63 0,17 82,5

600F100R 0,419 19,35 19,35 0,10 82,5

600F300R 0,426 19,92 19,92 0,05 82,5

600F600R 0,418 20,27 20,28 0,22 82,5

600F900F 0,456 20,20 20,20 0,06 82,5

900F50R 0,298 20,04 20,03 0,27 82,5

900F100R 0,329 20,07 20,07 0,09 82,5

900F300R 0,399 20,13 20,13 0,01 82,5

900F600R 0,445 19,89 19,89 0,04 82,5

900F900F 0,485 19,86 19,86 0,20 82,5

1µM-NTC 0,155 38,22 38,29 1,43 81,5

5µM-NTC 0,296 34,76 34,78 0,60 82,5

A.8. Tabellen und Abbildungen 193

Tabelle A.6: Ergebnisse der Influenza-A-Primertitrationen mit SYBRTM-Green real-time

PCR. Die Tests wurden in Doppelansatzen mit in Standardvektoren klonierten PCR-

Produkten durchgefuhrt. Die jeweiligen Primerpaare sind unter Name aufgefuhrt; F steht

fur Forward, R fur Reverse-Primer. Als ∆Rn ist die finale Fluoreszenz angegeben. Ct, Ct

mittel und Ct SA bezeichnen die Ct-Werte, deren Mittel und die Standardabweichung. Die

Schmelztemperatur des PCR-Produktes befindet sich in der letzten Spalte.

Name ∆Rn Ct Ct mittel Ct SA Tm Produkt

50F50R 0,243 25,29 25,30 0,20 79,5

50F100R 0,244 21,65 21,69 0,36 79,5

50F300R 0,215 19,76 19,78 0,15 79,5

50F600F 0,158 20,01 20,00 0,14 79,5

50F900F 0,160 20,02 20,02 0,07 79,5

100F50R 0,280 26,06 26,04 0,41 78,5

100F100R 0,304 21,69 21,71 0,52 79,5

100F300R 0,267 19,12 19,12 0,11 79,5

100F600R 0,203 19,38 19,38 0,14 79,5

100F900F 0,173 19,67 19,67 0,14 79,5

300F50R 0,270 26,08 26,09 0,22 79,5

300F100R 0,323 21,47 21,49 0,18 79,5

300F300R 0,316 19,42 19,41 0,06 79,5

300F600R 0,305 19,35 19,35 0,02 79,5

300F900F 0,270 19,63 19,63 0,19 79,5

600F50R 0,252 25,15 25,16 0,14 78,5

600F100R 0,338 20,37 20,38 0,06 79,5

600F300R 0,301 19,31 19,33 0,30 79,5

600F600R 0,302 19,15 19,15 0,54 80,5

600F900F 0,313 19,27 19,28 0,40 79,5

900F50R 0,262 26,26 26,26 0,04 79,5

900F100R 0,315 21,70 21,71 0,11 79,5

900F300R 0,301 19,18 19,19 0,42 79,5

900F600R 0,309 19,13 19,13 0,01 79,5

900F900F 0,295 19,68 19,71 0,27 80,5

1µM-NTC -0,001 No Ct No Ct No Ct 58,5

5µM-NTC 0,098 37,21 37,24 0,28 73,5

194 A. Anhang

Tabelle A.7: Ergebnisse der pestivirusspezifischen PCR. Eigesetzt wurden in Tabelle 3.3

aufgefuhrten Virussuspensionen und Organmaterialien.

Name Farbstoff Ct Ergebnis

137/14 FAM 36,42 +

CSF-573 FAM 23,37 +

CSF-277 FAM 20,31 +

V 487 FAM 18,87 +

217 Milz FAM 24,27 +

209 / CSF0905 FAM 27,16 +

208 / CSF0905 FAM 25,87 +

BVDV NADL FAM 17,10 +

BDV Gifhorn FAM 17,97 +

240-1 / 0695 FAM 25,14 +

CSF0104 FAM 20,66 +

CSF0902 FAM 17,34 +

Moredun FAM 31,65 +

CSF0309 FAM 32,68 +

240-2 FAM 22,07 +

Arnsberg FAM 19,93 +

CSF-573 / 1 FAM 22,86 +

0081/2 FAM 20,18 +

217 Niere FAM 20,84 +

BDV Frijters FAM 32,95 +

219 BDV FAM 38,52 +

CSF-273 FAM 24,39 +

BDV 10574 FAM 20,90 +

277 Milz FAM 22,16 +

-RT FAM No Ct −

NTC FAM No Ct −

NTC FAM No Ct −

NTC FAM No Ct −

A.8. Tabellen und Abbildungen 195

Tabelle A.8: Ergebnisse der Influenza-A-spezifischen PCR. Eingesetzt wurden Influenza-

A-Virus-Isolate wie in Tabelle 3.2 angegeben. Die Auswertung erfolgte softwaregestutzt.

Name Farbstoff Ct Ergebnis

Infl.-A Iso.:1 HEX 25,3 +

Infl.-A Iso.:1 HEX 24,9 +

Infl.-A Iso.:2 HEX 23,8 +

Infl.-A Iso.:2 HEX 23,6 +

Infl.-A Iso.:3 HEX 24,8 +

Infl.-A Iso.:3 HEX 25,3 +

Infl.-A Iso.:4 HEX 22,5 +

Infl.-A Iso.:4 HEX 22,4 +

Infl.-A Iso.:5 HEX 21,2 +

Infl.-A Iso.:5 HEX 21,6 +

Infl.-A Iso.:6 HEX 23,3 +

Infl.-A Iso.:6 HEX 23,4 +

Infl.-A Iso.:7 HEX 21,8 +

Infl.-A Iso.:7 HEX 21,8 +

Infl.-A Iso.:8 HEX 24,5 +

Infl.-A Iso.:8 HEX 24,7 +

Infl.-A Iso.:9 HEX 24,2 +

Infl.-A Iso.:9 HEX 24,3 +

Infl.-A Iso.:10 HEX 28,6 +

Infl.-A Iso.:10 HEX 28,5 +

Infl.-A Iso.:11 HEX 23,0 +

Infl.-A Iso.:11 HEX 23,0 +

Infl.-A Iso.:12 HEX 20,3 +

Infl.-A Iso.:12 HEX 20,4 +

— HEX No Ct −

— HEX No Ct −

196 A. Anhang

Tabelle A.9: Ergebnisse der SHV-1-spezifischen PCR. Eingesetzt wurden SHV-1-Isolate

wie in Tabelle 3.1 angegeben. Die Auswertung erfolgte softwaregestutzt.

Name Farbstoff Ct Ergebnis

SHV-1 I1 HEX 22,36 +

SHV-1 I231 HEX 18,12 +

SHV-1 I427 HEX 20,18 +

SHV-1 I517 HEX 18,81 +

SHV-1 I527 HEX 29,44 +

SHV-1 I450 HEX 19,74 +

SHV-1 I57 HEX 18,52 +

SHV-1 I537 HEX 17,12 +

SHV-1 I311 HEX 17,83 +

SHV-1 I425 HEX 13,62 +

SHV-1 I321 HEX 16,81 +

SHV-1 I612 HEX 21,20 +

SHV-1 I397 HEX 23,83 +

SHV-1 I410 HEX 23,21 +

SHV-1 I351 HEX 19,56 +

SHV-1 I386 HEX 16,37 +

SHV-1 I549 HEX 18,38 +

SHV-1 I37 HEX 19,08 +

SHV-1 I387 HEX 26,54 +

SHV-1 I423 HEX 20,89 +

SHV-1 I18 HEX 18,30 +

SHV-1 I550 HEX 22,80 +

SHV-1 I611 HEX 20,98 +

NTC HEX No Ct −

NTC HEX No Ct −

A.8. Tabellen und Abbildungen 197

Tabelle A.10: Ergebnisse der ASPV- und SHV-1-spezifischen PCRs. Die PCRs wurden

durchgefuhrt mit in Standardvektoren klonierten PCR-Produkten. Es konnte eine Absen-

kung der PCR-Effizienz in multiplex-Ansatzen festgestellt werden.

Virus Farbstoff Ct Kopienzahl/ Ansatz Ergebnis R2 Effizienz (%)

ASPV FAM 16,87 1 × 106 + 0,998 91,0

ASPV FAM 20,12 1 × 105 + 0,998 91,0

ASPV FAM 23,32 1 × 104 + 0,998 91,0

ASPV FAM 27,75 1 × 103 + 0,998 91,0

ASPV FAM 31,09 1 × 102 + 0,998 91,0

ASPV FAM 34,30 1 × 101 + 0,998 91,0

SHV-1 HEX 17,70 1 × 106 + 1,000 96,7

SHV-1 HEX 21,15 1 × 105 + 1,000 96,7

SHV-1 HEX 24,62 1 × 104 + 1,000 96,7

SHV-1 HEX 28,12 1 × 103 + 1,000 96,7

SHV-1 HEX 31,30 1 × 102 + 1,000 96,7

SHV-1 HEX 34,73 1 × 101 + 1,000 96,7

ASPV+SHV-1 FAM 17,71 1 × 106 + 0,998 82,4

ASPV+SHV-1 FAM 21,08 1 × 105 + 0,998 82,4

ASPV+SHV-1 FAM 24,49 1 × 104 + 0,998 82,4

ASPV+SHV-1 FAM 29,05 1 × 103 + 0,998 82,4

ASPV+SHV-1 FAM 32,62 1 × 102 + 0,998 82,4

ASPV+SHV-1 FAM 36,70 1 × 101 + 0,998 82,4

ASPV+SHV-1 HEX 20,20 1 × 106 + 0,996 80,4

ASPV+SHV-1 HEX 23,82 1 × 105 + 0,996 80,4

ASPV+SHV-1 HEX 26,84 1 × 104 + 0,996 80,4

ASPV+SHV-1 HEX 32,19 1 × 103 + 0,996 80,4

ASPV+SHV-1 HEX 35,55 1 × 102 + 0,996 80,4

ASPV+SHV-1 HEX 39,42 1 × 101 + 0,996 80,4

198 A. Anhang

Tabelle A.11: Ergebnisse der PCV-2- und PPV-spezifischen PCRs. Die PCRs wurden

durchgefuhrt mit in Standardvektoren klonierten PCR-Produkten. Es konnte eine Absen-

kung der PCR-Effizienz in multiplex-Ansatzen festgestellt werden.

Virus Farbstoff Ct Kopienzahl/ Ansatz Ergebnis R2 Effizienz (%)

PCV-2 FAM 19,19 1 × 106 + 0,970 98,8

PCV-2 FAM 22,49 1 × 105 + 0,970 98,8

PCV-2 FAM 26,88 1 × 104 + 0,970 98,8

PCV-2 FAM 30,65 1 × 103 + 0,970 98,8

PCV-2 FAM 34,37 1 × 102 + 0,970 98,8

PCV-2 FAM 34,77 1 × 101 + 0,970 98,8

PPV HEX 19,59 1 × 106 + 0,983 99,5

PPV HEX 23,14 1 × 105 + 0,983 99,5

PPV HEX 27,06 1 × 104 + 0,983 99,5

PPV HEX 30,58 1 × 103 + 0,983 99,5

PPV HEX 34,42 1 × 102 + 0,983 99,5

PPV HEX 35,45 1 × 101 + 0,983 99,5

PCV-2+PPV FAM 16,40 1 × 107 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV FAM 22,03 1 × 106 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV FAM 25,58 1 × 105 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV FAM 29,81 1 × 104 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV FAM 33,47 1 × 103 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV FAM 37,18 1 × 102 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV FAM 38,42 1 × 101 + 0,982 85,6

PCV-2+PPV HEX 17,78 1 × 107 + 0,982 90,4

PCV-2+PPV HEX 23,21 1 × 106 + 0,982 90,4

PCV-2+PPV HEX 26,64 1 × 105 + 0,982 90,4

PCV-2+PPV HEX 30,66 1 × 104 + 0,982 90,4

PCV-2+PPV HEX 34,43 1 × 103 + 0,982 90,4

PCV-2+PPV HEX 37,55 1 × 102 + 0,982 90,4

PCV-2+PPV HEX 39,01 1 × 101 + 0,982 90,4

A.8. Tabellen und Abbildungen 199

Tabelle A.12: Ergebnisse der Pestiviren- und Influenza-A-spezifischen PCRs. Die PCRs

wurden durchgefuhrt mit in Standardvektoren klonierten Es konnte eine Absenkung der

PCR-Effizienz in multiplex-Ansatzen festgestellt werden. Sie macht sich besonders be-

merkbar im Falle der Influenza-A-PCR.

Virus Farbstoff Ct Kopienzahl/ Ansatz Ergebnis R2 Effizienz (%)

Pestiviren FAM 20,48 1 × 106 + 1,000 92,9

Pestiviren FAM 24,30 1 × 105 + 1,000 92,9

Pestiviren FAM 27,64 1 × 104 + 1,000 92,9

Pestiviren FAM 31,26 1 × 103 + 1,000 92,9

Pestiviren FAM 34,59 1 × 102 + 1,000 92,9

Pestiviren FAM 38,12 1 × 101 + 1,000 92,9

Influenza-A-Virus HEX 21,31 1 × 106 + 0,991 98,8

Infl.-A-Virus HEX 24,50 1 × 105 + 0,991 98,8

Influenza-A-Virus HEX 26,77 1 × 104 + 0,991 98,8

Influenza-A-Virus HEX 30,76 1 × 103 + 0,991 98,8

Influenza-A-Virus HEX 33,75 1 × 102 + 0,991 98,8

Influenza-A-Virus HEX 38,42 1 × 101 + 0,991 98,8

Pesti.+Infl.-A-Virus FAM 22,52 1 × 106 + 0,974 90,8

Pesti.+Infl.-A-Virus FAM 26,38 1 × 105 + 0,974 90,8

Pesti.+Infl.-A-Virus FAM 31,18 1 × 104 + 0,974 90,8

Pesti.+Infl.-A-Virus FAM 35,44 1 × 103 + 0,974 90,8

Pesti.+Infl.-A-Virus FAM 38,01 1 × 102 + 0,974 90,8

Pesti.+Infl.-A-Virus FAM 39,63 1 × 101 + 0,974 90,8

Pesti.+Infl.-A-Virus HEX 20,08 1 × 106 + 0,998 69,9

Pesti.+Infl.-A-Virus HEX 23,77 1 × 105 + 0,998 69,9

Pesti.+Infl.-A-Virus HEX 28,45 1 × 104 + 0,998 69,9

Pesti.+Infl.-A-Virus HEX 32,57 1 × 103 + 0,998 69,9

Pesti.+Infl.-A-Virus HEX 37,41 1 × 102 + 0,998 69,9

Pesti.+Infl.-A-Virus HEX NoCt 1 × 101 − 0,998 69,9

200 A. Anhang

Tabelle A.13: Ergebnisse der PRRSV-EU- und PRRSV-NA-spezifischen PCRs. Die

PCRs wurden durchgefuhrt mit in Standardvektoren klonierten PCR-Produkten.

Virus Farbstoff Ct Kopienzahl/ Ansatz Ergebnis R2 Effizienz (%)

PRRSV-EU 106 kopien FAM 24,29 + 1,00×106 0,982 99,7

PRRSV-EU 105 kopien FAM 27,5 + 1,00×105 0,982 99,7

PRRSV-EU 104 kopien FAM 30,08 + 1,00×104 0,982 99,7

PRRSV-EU 103 kopien FAM 34,56 + 1,00×103 0,982 99,7

PRRSV-EU 102 kopien FAM 38,85 + 1,00×102 0,982 99,7

PRRSV-EU 101 kopien FAM 39,87 + 1,00×101 0,982 99,7

PRRSV-NA-106 kopien HEX 21,69 + 1,00×106 0,999 95,1

PRRSV-NA-105 kopien HEX 25,36 + 1,00×105 0,999 95,1

PRRSV-NA-104 kopien HEX 28,99 + 1,00×104 0,999 95,1

PRRSV-NA-103 kopien HEX 31,96 + 1,00×103 0,999 95,1

PRRSV-NA-102 kopien HEX 35,69 + 1,00×102 0,999 95,1

PRRSV-NA-101 kopien HEX 39,01 + 1,00×101 0,999 95,1

A.8.

Tab

ellenund

Abbild

ungen

201

Tabelle A.14: Ergebnisse der Bestimmung von PCR-Nachweisgrenzen im Vergleich zur Virustitration (Virusisolierung). Die Be-

stimmung erfolgte anhand einer logarithmischen Verdunnungsreihe einer Virussuspension (Stufen bezeichnet als V1 bis V8). Die

Verdunnungsstufen sowie die Originalsuspension wurden in einer Virustitration getestet und die KID50/0,1 ml (VT – Virustiter in

der Virustitration [logKID50/0,1 ml]; OVT – Virustiter der Originalsuspension [KID50/0,1 ml]) ermittelt. Parallel wurden in den

Stufen V1-V8 Genomaquivalente mittels real-time PCR ermittelt (GA – Genomaquivalente pro PCR-Ansatz [logGenomaquivalen-

te/6 µl] um sie mit KID50 (VTK – Virustiter auf PCR-Volumen korrigiert [logKID50/6 µl]) in Beziehung zu setzen. Beispielsweise

betragt beim PRRSV-NA in der Stufe V2 der Virustiter (VT) 1 logKID50/0,1 ml=10 KID50/0,1 ml. Dies entspricht 3,76 logGe-

nomaquivalente/6µl (GA) = 5754 Genomaquivalente/6µl, oder -0,22 logKID50/6 µl (VTK) = 0,6 KID50/6 µl.

V1 V2 V3 V4

OVT VT GA VTK VT GA VTK VT GA VTK VT GA VTK

SHV-1 107,25 6,25 3,84 5,02 5 3,09 3,78 4 2,25 2,78 3 1,37 1,78

PPV 107,00 5,75 5,07 4,53 4,5 4,71 3,28 4 3,95 2,78 2,75 2,8 1,53

Pestiviren 107,25 6,25 5,85 5,03 5 4,89 3,78 3,75 3,42 2,53 3,25 2,64 2,03

Influenza-A-Virus 105,25 4 5,8 2,78 3 4,53 1,78 0,25 3,47 -0,97 0 2,28 -1,22

PRRSV-EU 104,50 3,25 5,93 2,23 2 4,47 0,78 2 2,77 0,78 1 1,42 -0,22

PRRSV-NA 103,00 1,75 4,50 0,53 1 3,76 -0,22 0 2,57 -1,22 − 1,64 −

V5 V6 V7 V8

VT GA VTK VT GA VTK VT GA VTK VT GA VTK

SHV-1 2,25 − 1,03 1 0,96 -0,22 − − -1,22 0,75 − -1,35

PPV 1,75 1,77 0,53 0,75 0,53 -0,47 0,75 0,07 -0,13 − − −

Pestiviren 2,75 1,39 1,53 1 0,86 -0,22 0 − -1,22 − − −

Influenza-A-Virus − 1,29 − − 0,32 − − 0,09 − − − −

PRRSV-EU − 0,03 − − − − − − − − − −

PRRSV-NA − − − − − − − − − − − −

Abbildungsverzeichnis

2.1 Schematische Darstellung des Virus der Klassischen Schweinepest . . . . . 5

2.2 Schematische Darstellung des Pestivirusgenoms . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.3 Genetische Diversitat der KSPV-Isolate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.4 Schematische Darstellung des ASP-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.5 Schematische Darstellung eines Herpesvirus . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.6 Schematische Darstellung des PRRSV-Genoms . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.7 Influenza-A Virus. Schematische Darstellung viraler Proteine. Nach

Modrow et al. (2003). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.8 Schematische Darstellung des Genoms des Porzinen Parvovirus. . . . . . . 24

2.9 Schematische Darstellung eines PCV-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.10 Schematische Darstellung einer Amplifikationsgrafik . . . . . . . . . . . . . 33

2.11 Schematische Darstellung eines TaqMan Assays . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.12 Prinzip des PriProET -Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.13 Emissonsspektren verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe . . . . . . . . . . . . 40

2.14 Das OIE-Validierungsschema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.1 Primeroptimierungsmatrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

4.1 Ergebnisse der gelbasierten β-Aktin PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

203

204 Abbildungsverzeichnis

4.2 Ermittlung von DNA-Sekundarstrukturen am Beispiel von PCV-2. . . . . . 81

4.3 Ermittlung von DNA-Sekundarstrukturen des Pestivirusgenoms. . . . . . . 82

4.4 Primertitration. Amplifikationsgraphen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

4.5 Primertitration. Schmelzkurven. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.6 Ergebnisse der Primertitration am Beispiel der ASPV. Fluoreszenzmessung 88

4.7 Ergebnisse der Primertitration am Beispiel der ASPV. Ermittelte Ct-Werte 89

4.8 β-Aktin Primer- und Sondenlokalisation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

4.9 β-Aktin RNA-DNA Diskriminierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.10 PPV PCR / Virustitration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

4.11 Influenza-A PCR / Virustitration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Tabellenverzeichnis

3.1 SHV-1 Isolate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.2 Influenza-A – Isolate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.3 Pestiviren-Isolate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.4 Reverse Transkription, thermisches Profil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.5 Einstellungen und Parameter der Primer- und Sondensuche im Beacon De-

signer 2.13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.6 Einstellungen und Parameter fur mFold . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.7 Abgene HotStart PCR. Thermisches Profil . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.8 SYBRTM-Green PCR. Thermisches Profil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.9 TaqMan real-time PCR. Zusammensetzung der PCR-Ansatze . . . . . . . 64

3.10 Kolonie-PCR. Zusammensetzung des Mastermixes . . . . . . . . . . . . . . 67

3.11 Kolonie-PCR. Thermische Profil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.12 Restriktionsenzymverdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.1 Ergebnisse der Literaturrecherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.2 TaqMan-PCR. Thermisches Profil. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.3 Ubersicht der eingesetzten Genomregionen und Sequenzen . . . . . . . . . 83

205

206 Tabellenverzeichnis

4.4 Die experimentell ermittelten optimalen Primer- und Sondenkonzentratio-

nen. Die Primer- und Sondenkonzentrationen fur die PRRSV-PCR wurden

aus dem Protokoll von Kleiboeker et al. (2005) ubernommen. . . . . . . 90

4.5 Zusammensetzung einzelner real-time PCR-Ansatze im Gesamtkonzept . . 93

4.6 Ergebnisse der Untersuchung KSPV-positiver sowie -negativer Proben. . . 101

4.7 Ergebnisse der Untersuchung klinischer Proben. . . . . . . . . . . . . . . . 102

4.7 (Fortsetzung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

A.1 Ergebnisse der ASPV-PCR-Primertitrationen . . . . . . . . . . . . . . . . 188

A.2 Ergebnisse der SHV-1-PCR-Primertitrationen . . . . . . . . . . . . . . . . 189

A.3 Ergebnisse der PCV-2-PCR-Primertitrationen . . . . . . . . . . . . . . . . 190

A.4 Ergebnisse der PPV-PCR-Primertitrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

A.5 Ergebnisse der Pestivirenspezifischen-PCR-Primertitrationen . . . . . . . . 192

A.6 Ergebnisse der Influenza-A-PCR-Primertitrationen . . . . . . . . . . . . . 193

A.7 Ergebnisse der pestivirusspezifischen PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194

A.8 Ergebnisse der Influenza-A-spezifischen PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . 195

A.9 Ergebnisse der SHV-1-spezifischen PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

A.10 Ergebnisse der ASPV- und SHV-1-spezifischen PCRs . . . . . . . . . . . . 197

A.11 Ergebnisse der PCV-2- und PPV-spezifischen PCRs . . . . . . . . . . . . . 198

A.12 Ergebnisse der Pestiviren- und Influenza-A-spezifischen PCRs . . . . . . . 199

A.13 Ergebnisse der PRRSV-EU- und PRRSV-NA-spezifischen PCRs . . . . . . 200

A.14 Ergebnisse der Bestimmung von PCR-Nachweisgrenzen im Vergleich zu

Virustitration (Virusisolierung). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

Veroffentlichungen und Tagungsbeitrage

Teile der vorliegenden Arbeit wurden auf folgenden Tagungen prasentiert:

Gavrilenko A., Meindl-Bohmer A., Greiser-Wilke I., Moennig V.

Development of a real-time multiplex PCR assay for differential diagnosis of classical

swine fever (CSF)

In: 6th Pestivirus Symposium, Thun, Schweiz, September 13–16, 2005

Gavrilenko A.

Workshop on classical swine fever, Hannover, 10–13 October 2005

Kurzvortrag: Differential diagnosis of CSF – laboratory diagnostic approaches

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. V. Moennig fur die freundliche Aufnahme im

Institut fur Virologie, die Uberlassung des Themas, die wissenschaftliche Betreuung der

Arbeit sowie die stete Unterstutzung und Gesprachsbereitschaft.

Frau Apl. Prof. Dr. I. Greiser-Wilke fur ihre konstruktiven Vorschlage, stetige wissen-

schaftliche Forderung und die jederzeit gewahrte Unterstutzung.

Dem Institut fur Parasitologie, insbesondere Herrn Prof. Dr. G. von Samson und Frau S.

Buschbaum danke ich fur die Bereitstellung des real-time PCR Gerates und die Einarbei-

tung in die Technik.

Frau Dr. A. Meindl-Bohmer mochte ich fur die fachlichen Diskussionen und vielfaltigen

Hilfestellungen danken.

Frau Prof. Dr. B. Grummer mochte ich fur die fachlichen Diskussionen und vielfaltigen

Anregungen danken.

Sehr herzlich danke ich allen Mitarbeitern des Instituts fur Virologie, insbesondere Frau

I. Betsch, Frau M. Giesecke, Frau G. Muller fur ihre freundliche Aufnahme und Hilfsbe-

reitschaft.

Allen meinen Mitdoktoranden, insbesondere Sandra Blome danke ich fur ihre Diskussi-

onsbereitschaft, die Korrektur der schriftlichen Arbeit und die moralische Unterstutzung.