This article was downloaded by: [University North Carolina - Chapel Hill]On: 09 November 2014, At: 14:24Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH, UK

Archives Of Phytopathology AndPlant ProtectionPublication details, including instructions for authors andsubscription information:http://www.tandfonline.com/loi/gapp20

Entwicklung einer Zellinie ausHämozyten von Mamestra brossicaeL. und ihre Empfindlichkeit für einhomologes Kernpolyeder-VirusDr. Wolfram Lehmann a & Vers.-Ing. Marlis Weilepp aa Institut für Phylopathologie Aschersleben der Akademieder Landwirtschaftswissenschaften der DeutschenDemokratischen Republik ,Published online: 11 Sep 2009.

To cite this article: Dr. Wolfram Lehmann & Vers.-Ing. Marlis Weilepp (1989) Entwicklungeiner Zellinie aus Hämozyten von Mamestra brossicae L. und ihre Empfindlichkeit für einhomologes Kernpolyeder-Virus, Archives Of Phytopathology And Plant Protection, 25:4,387-401, DOI: 10.1080/03235408909438893

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Arch. Phytopathol. Pflanzenschutz, Berlin 25 (1989) 4,387-401

Institut fur Phytopathologie Aschersleben der Akademie der Land\\irtschaftsn.issenschaften der Deutschen Demokratischen Republik

WOLFRAM LEHMANN und MARLIS WEILEPP

Entwicklung einer Zellinie aus Hamozyten von Mnniestrn brnssicne L. und ihre Empfindlichkeit fiir ein homologes Kernpolyeder-Virus

Eingegangen: 19.9. 1988

Einleitung

Jnter den biotischen Begrenzungsfaktoren fur Insektenschadlinge, die im Rahmen inte- rierter Bekampfungsmaflnahmen zunehmend an Bedeutung gewinnen, spielen Baculo-

. iren (Kernpolyeder-, Granuloseviren) eine beachtliche Rolle. Eine Vermehrung dieser riren in einem Umfang, der die Herstellung eines PAparates fur den Einsatz in der Praxis rmoglicht, wurde bisher fast ausschlieDlich unter Verwendung von Larven der Wirts- .rten (in-riro-Produktion) erzielt. Der zweite Weg, die Virusvermehrung in Zellkulturen ler Wirtsarten (in-Dim-Verfahren), bietet einige Vorteile (LEIIMANN, 1985), ist aber gleich- :eitig mit technologischen Problemen verbunden. Trotzdem werden in der Zukunft in- litro-Verfahren, z. B. Kultur von Insektenzellen und Virusvermehrung in Fermentoren, .n Bedeutung gewinnen ; in verschiedenen Landern wird intensiv an der Losung der Probleme :earbeitet (HINK und STRAUSS, 1980; POLLARD und KHOSROVI, 1978; RODER, 1981 u. a.). hndvoraussetzung und Ausgangspunkt aller in-citro-Verfahren der Virusproduktion st die Etablierung einer Dauerzellinie einer entsprechenden Viruswirts-Art. n den folgenden Ausfuhrungen wird uber erste Ergebnisse zur Etablierung einer Zellinie IUS Hamozyten im Institut fur Phytopathologie Aschersleben der AdL der DDR berichtet.

Material und Methode

:iir den Ansatz von Hamozytenkulturen verwendeten wir Larven des 5. Stadiums von Motiiestro brossicoe L. aus der Laborzucht. Sie wurden durch Eintauchen in Ethanol 70 %) desinfiziert. Die nach dem Abschneiden eines AfterfuDes austretende Hamolymphe ieDen wir - jeweils 1 Tropfen - unmittelbar in ein KulturgefaD tropfen. 41s KulturgefiBe verwendeten wir Glasringe (20 mm Durchmesser, 10 mm Hohe), die nit Paraffin auf Objekttragern befestigt waren und ca. 1 ml Kulturmedium faDten. Sie vurden nach Eintropfen der Hamolymphe mit einem Deckglas verschlossen und in eine ?etrischale gestellt (Abb. 1). 3as Kulturmedium entsprach der von GRACE (1 962) beschriebenen Mischung mit einem Zusatz von I5 % fetalem Kalberserum (FKS). Zur Verhinderung bnv. Einschrankung der Melaninbildung wurde dem Kulturmedium z. T. Phenylthioharnstoff bzw. Ascorbinsaure :20 mg/100 ml) zugesetzt. Der Wechsel des Kulturmediums erfolgte wochentlich.

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388 LEIIUASS; Wmmr: Ent\vicklung rincr Zellinic

Abb. I : Glasring-KulturgcfB

Zur Erniittlung der Zellvermehrungsrate wurdcn tiglich die Zellen gezihlt, die mit jeweils 170 festgelegten Punkten in cincni KulturgcfiO zusamnicntrafen. Fiir die Infektioii der Zellkulturen venvendeten wir Lnrven des 5. Stadiums \'on M. hmssi- cne, die mit cinem Kernpolyeder-Virus (KPV) infiziert worden waren. Die Larven \vurden bis zurn Abstcrbcn in Ethanol (70 x ) gclcgt und anschlieknd mchrmnls mit rrqira h s t . ge\\.iischen. Die nach dcm Abschncidcn cines AftcrfuBcs riustropfendc Himolymphc wurdc in Grace-Kulturmedium niit Phenylthiohnrnstoff aufgefangcn, bei 4000 rpm 5 Minuten zentrifiigiert und der oberstand durch Filtration (Seitz-Filter, Porengrok 0,45 pm) stcri- lisiert. Beini Medium\vechsel ersetzten wir das Kulturniedium durch jeweils 1 ml dieser Infektionslosung. Sic wurdc nach 3 Tagcn durch normalcs Kultumedium ausgctauscht. Allc Bcobachtungen und Kontrollen erfolgten niit Hilfe eines umgckchrtcn Mikroskops (Tclaval 2, Carl Zciss/Jcna) bci VergroDcrungen von 63, 125 und 200 x . Dcr AnschluI3 einer Aufsctzkamera an dieses Mikroskop ermoglichte Aufnahnien von lebcnden Zell- kulturcn. Fur die Anfcrtigung von rasterclcktroncnmikroskopischen Aufnahmen legten wir C- bcdanipftc Glasobjckttr~gcrstickclicn (ctwa 5 x 5 nini) in die KulturgeEiDe, auf dcncn sich die Zellcn festsctztcn und normal ent\vickeltcn. Nach einigen Tngen wurden die Glasstiickchen mit den Zellcn iius den KulturgefiOcn gc- nommcn, in 3 xigem Glutaraldchyd fixiert, 2 Stiinden in 0,66 xigem OsO, kontrastiert und in aufsteigcnden Acetonkonzcntrationsstufen cntwiisscrt. Nach dcr Kritischcn-Punkt-Trock- nung mit fliissigcrn CO, wurdcn dic Probcn auf AL-Blockc aufgcklcbt, rnit C bednrnpft und mit Au-Pd (60:40) bcsputtcrt: Die Aufnahmen erfolgtcn mit dem ISI-40-Rastcrclek- t roncnmikroskop.' ) ' Ffir die Anferligung dcr raslerelsk~ronennlikrosLopischcn Aufnahmcn danken \tir Koll. Dr. KLAUS Eisnus.

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Ergcbnisse

Vcnigc Stundcn nach dcni Eintropfen dcr HSmolymphe hattcn sich die Hiimozytcn am iodcn dcs KuIturgefiOes festgesetzt. Dnbci waren morphologisch 3 Zelltypcn zu untcr- chciden: 1. rundliche Zcllcn unterschiedlichcr Crone, die sich z. T. zu mchr oder weniger lichtcn Klumpen zusanimenschlossen; 2. langc und sehr schmnle Zcllcn; 3. sehr flnche ind brcitc, dcm GefiBboden dicht iinliegende Zellen von untcrschiedlicher Form (Abb. 2).

Abb. 2: PrimBrkuItur yon H h o z y t e n der Kohleule (,\lorrrcsrm hmssicne), 1 Stunde nach Kulturansatz. Vcrpr. 125x

Bci den ineisten Kulturen tratcn im witcren Verliiuf Degcncrationscrschciiiuiigcn auf, die sich in einer strirkercn Verklumpung und Melanisicrung dcr Zcllcn SuDertc, bcgleitet von eincr blascnartigen Auftrcibung einzclncr Zcllen. Es konnten diincbcn abcr auch in Vcrbindung mit den Zcllklumpen, vielleicht auch von ihncn ausgehend, z. T. groI3crc An- sainmlungen von fast ausschlieBlich rundcn Zcllcn fiir eincn gewisscn Zcitraum beobiichtet \vcrden. Dic Abbildungen 3 bis 6 zeigcn den Ablauf d i e m Entwicklung an dcr gleichen Stcllc einer Hiimozytcnprim~rkultur vom 13. bis Zuni 23. Tag nach Kulturnnsiitz. In cinigen Kulturen hielt dic Entwicklung derartigcr Zcllen fiir einen Iiingeren Zcitraum an. Die Abbildung 7 zcigt cine H~mozytenprimCrkultur im Alter von 49 Tngcn nach den1 An- sntz. Hier trcten ncbcn den runden Zellfornicn auch spindclformige Zellcn auf. Von Kulturen mit cincm dcrartigen Entwicklungsstand wurden die ersten Subkulturcn angclegt. Auch in dicscn konnte teihveise eine wi t c rc Zellvcrmehrung bcobachtct jvcrden; auf Ab- bildung 8 sind verschicdcnc Zcllformen in einer erstcn Subkultur 6 Tage nach dcr Passage

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390 L E i i m s s ; WEILEPP: Entukklung einer Zellinic

Abb. 3:

Abb. 4:

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Abb. 5 :

Abb. 6 :

Abb. 3-6: Ablauf der Zellentwicklung an der gleichen Stelle einer Primlrkultur von Himozyten der Kohl- eule 13, 16, 20 und 23 Tage nach Kulturansatz.Vergr. 125x

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392 LEIIMANS; \VmErr: Entwicklung einer Zellinic

Abb. 7: Primirkultur von Himozyten der Kohleule. 49 Tage nach Kulturansatz. Vergr. I25 x

. * . ; . L '

Abb. 8: Erstc Subkultur von Himozyten der Kohleule, 6 Tage nach der Passage, 42 Tage nach Ansatz der Primirkultur. Vergr. 125 x

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u c h . Phytopathol. PHanzenschutz 25 (1989) 4 393

:u erkennen. Aber auch in solchen Kulturen degenerierten die Zellen nach spätestens 2 bis 1 Monaten, so daß weitere Passagen nicht möglich waren. Von insgesamt 950 Hämozyten-)rimärkulturen vermehrten sich die Zellen nur in 22 Ansätzen in einem solchen Umfang, laß Subkulturen mit bis zu 4 Passagen durchgeführt werden konnten. Lediglich eine Hämo-lytenkultur (MB-H 260) eignete sich fiir fortgesetzte Passagen. Die erste Subkultur der iellinie MB-H 260 wurde 8 Wochen nach dem Ansatz angelegt, weitere Passagen waren ç wöchentlichen Abständen möglich. Bis zum 1. 9. 1988 konnten 40 Passagen mit insge-amt mehr als 1000 Subkulturen erzielt werden. Abbildung 9 zeigt eine Subkultur der 10.

\ b b . 9: Zellinie MB-H 260, 10. Passage, 7 Tage nach der Subkultivierung. Vergr. 200 χ

.^assage 5 Tage nach der Subkultivierung. Es sind verschiedene Zellformcn zu erkennen. Den größten Anteil mit etwa 70% machen rundliche Zellen unterschiedlicher Größe aus. Etwa 30% der Zellen haben eine breit-spindelförmige Gestalt, wobei diese beiden Formen iurch Übergänge verbunden sind. Außerdem sind einige lange, sehr schmale Zellen sowie 7ellklumpen zu unterscheiden. Bei höherer Zelleinsaatdichte entstehen bei gleicher Kul-lurdauer dichte Zellrasen (Monolayer) (Abb. 10). ^uf den rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (Abb. 11 und 12) sind die beiden :ypischen Zellformen ebenfalls zu unterscheiden. Außerdem sind bei vielen Zellen mehr Dder weniger zahlreich ausgebildete Ausläufer (Filopodien) zu erkennen, mit denen die Zellen in Kontakt traten (HALLE, 1976). Die Zunahme der Zellen in Abhängigkeit von der Zeit wurde bei unterschiedlichen ZcUeinsaatdichten ermittelt. Die entsprechenden Zell-Wachstumskurven sind in der Abbildung 13 dargestellt. Sie lassen erkennen, daß die ZcU-zunahme in den ersten Tagen nach Kulturansatz bei den Ausgangskonzentrationen 3 ÷ IQ*, 6 X 10*, 8 X 10* und 1,2 ÷ 10' Zellen/ml in etwa gleichem Maße erfolgt. Daraus ergibt

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394 L E H M A N N ; W E I L E P P : Entwicklung einer Zellinie

Abb. 10: Zellinie MB-H 260, 4. Passage, 7 Tage nach der Subkultivicrung. Vergr. 2 0 0 χ

sich eine Zellzahl-Verdoppelungszeit von 24 bis 30 Stunden. Bei geringen Zellcinsaat-dichten (1 ÷ 10*, 5 ÷ 10' Zellen/ml) ist keine Zunahme der Zellzahl zu beobachten, d. h. es erfolgt keine Zellvermchrung. Erste Versuche mit der Linie MB-H 260 ergaben, daß die Zellen mit einem Kernpolyeder-Virus der Kohleule infiziert werden konnten. Zehn Tage nach Zugabe der infektiösen Hämolymphe waren die von MILTENBURGER U. a. (1977) sowie von DAVID U. a. (1978) beschriebenen zytopathogenen Auswirkungen zu erkennen: Vakuolenbildung, starke Granu­lierung vieler Zellen, in Verbindung mit Abrundung und z. T. Hypertrophierung (Abb. 14). Im Phasenkontrast sind die in den Zellen gebildeten Polyeder deutlich zu erkennen (Abb. 15).

4. Diskussion

Im Vergleich zu der raschen Entwicklung der Kultur von Vcrtebratenzellen in den 40cr und 50er Jahren, begründet in ihrer Bedeutung für Medizin und Virusforschung, waren ähn­liche Tendenzen bei der Kultivierung von Insektenzellen erst wesentlich später zu erkennen. Die ersten Erfolge bei der //i-iZ/ra-Kultur von Insektenzellen erzielte GRACE (1959, 1962). HINK (1976) stellte in einer Liste 121 Zellinien von Evcrtebraten zusammen. Sie enthält 63 Dipteren-ZcIIinien von 21 Arten (hauptsächlich Mücken, die als Virusüberträger von medizinischem Interesse sind), aber nur 24 Zellinien von 15 Lepidoptercn-Arten. Die Er­kenntnis, daß sich insektenpathogenc Viren (insbesondere Kernpolyeder-Viren) in Lepido-ptcrcn-Zellinien vermehren, war Anlaß für eine zunehmend intensivere Forschung auf

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Abb. I I :

Abb. 1 I , 12: Zellinic hlB-H 260, 8. Pnssagc, rasterelektronenmikroskopische Aufnahme.

27.

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100-

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LEmi.\ss; WEILEPP: Ent\vicklung eincr Zellinic

Anzahl Linie MB-H 260 Zellen

i lo’ i i 3 4 5 6 i 8Tage

Abb. 13: Wachstumskun.cn der Zellinie LIB-H 260. hlittel\verte der Zellznhlen an je 170 fest- gelegten PunktenlKultur bei verschirdencn Zell- einsnntdichten.

Abb. 14: Zellinie hIB-H 260.7. Passage, IOTagenach der Infektion niitcinem KPVder Kohleule. Verg. 200 x

diesem Gebiet. Heute existieren Daucrzellinien von den mcisten wirtschaftlich bedeutsamcn Lepidopteren-Artcn. Zcllinien von 111. brtrssicnr wurden aus verschicdenen Organen und Ent\\’icklungsstadien gewonnen. MILTEX’BURGER u. a. (1977) entwickclten eine Zellinie aus einer Explantnt- Mischkultur von DorsalgeEiB- und Gonndenge\vebe (Larven des 4./5. Stadiums) sowie 4

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Abb. I: Zcllinie hlB-H 260, 7. Passage, 35 Tage nach der Infektion mit einem KPV der Kohleule. Phasen- konirast. Verpr. 600 x

Zcllinicn aus Hiimozytenkulturen. HILWIG und ALAPA-IT (1981 a) arbeiteten mit Zell- linien, die sie ;\us Explantaten von Ovarien gewonnen hatten. POSSEE (1987, unvcroffentlicht) berichtet iiber Zellinien von Af. brnssirne nus Puppenovarien. Hiimozyten und Larven, die kurz nach dem Schliipfen aus dem Ei verarbeikt wurden. MITSUSIASHI (1981) gewann cine permanente Zellinie aus dem Fcttkorper envachsener Larven. Diese Zellinien von 111. brnssicne waren die Grundlage fur verschiedene Untcrsuchungen, z. B. zur Anpassung an verschicdcne Kulturinedien (HILWIG und ALAPA-IT, 1981 a), zur Entwicklung eines serumfreien Kulturmediums (MILTENDURGER, 1983), zur Kultivierung in Rollerflaschen bzw. in Suspension (HILWIG, 1976; HILWIG und ALAPA-IT, 1981 b), zur Masscnproduktion in einem 12-l-Fcrinentor (MILTESDURGER U I I ~ DAVID, 1980) SOwiC zur Virusvermehrung (MILTEXBURGER u. a., 1977; DAVID u. a., 1978; BASSLNIR u. a., 1983; MILTESUURGER 1983). Im Gegensatz zu Ovarien oder embryonalem Material gehoren Hiimozyten zu den Ge- weben, die nicht von vornhcrein als geeignet fur die Entwicklung von Zellinien erscheinen (VACO, 1967). Trotzdem gelang es MITsUHAsSfl bereits 1967, eine Zellinie aus Himozyten von Chilo siipprcssalis Walker zu gewinncn. Inzwischen gibt es etabliertc Zellinien, die auf Hiimozyten zuriickgehcn, von vielen Lepidoptcren-Arten, z. B. von 111. hrnssirne (MIL- TENBURGER LI. a., 1977; POSSEE, 1987 unveroffentlicht; Lpinntrin riiorinrhn L. (SKATULLA, 1986); Estigriiciic ncren (Drury) (GRANADOS und NAuGiiToS, 1975); Afnlnrosonin disstrin (Hiibn.) (Sow, 1971); Smiiin cyithin (Drury) (C€fAO rind BALL, 1971) u. a. Der Vorteil

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398 LEiniAtiN, WEILEPP: Entwicklung einer Zellinie

bei der Anlage einer Hamozytenkultur besteht darin, daB die Gewinnung auch groBerer Mengen von Hamozyten ohne groBen Aufwand moglich ist. Nachteilig kann sich jedoch in den Anfangsstadien der Kultur die Entwicklung von Melanin auswirken. SOHI (1971) schatzt die Melanisierung bei seinen Hamozytenkulturen von Malacosotiia clissrria als ernstes Problem ein, da sie zu einer vollstandigen Zerstorung der Hamozyten fuhren kann. Glasi~ng-Kulturgefa13e, wie sie MITSUHASHI und MARAMOROSCH (1964), SOHI (1968, 1971) sowie NASU u. a. (1974) zur Kultur von Insektenzellen bzw. -geweben venvendeten, sind heute durch die verschiedensten GefiiDe aus Plast-Material ersetzt worden. Wir haben sie benutzt, weil sie - trotz eines gewissen Arbeitsaufwandes fur ihre Reinigung, Sterilisierung und Herstellung - eine Reihe von Vorteilen bieten: Unabhangigkeit von Importen, Einsparung von fetalem Kalberserum und gute Moglich- keiten der mikroskopischen Beobachtung sowie Fotografie. Unsere Zellinie wachst auch in Glasflaschen (Wachstumsflache 40 cm’); die schlechte Glasqualitat verhindert jedoch eine exakte mikroskopische Kontrolle. Untersuchungen der Himozyten von Lepidopteren-Arten rnit dem Ziel einer Differenzierung nach morphologischen bzw. ultrastrukturellen Kriterien wurden mehrfach unternommen. MITSUHASHI (1 967) unterschied bei Cliilo suppressalis 7 Hamozytentypen, von denen sich Prohamozyten und Plasmatozyten in Primarkulturen vermehrten; mit zunehmender An- zahl der Passagen verschwanden allmahlich die Plasmatozyten. RAINA (1976) beschrieb 5 Typen von Hamozyten bei Pectitiophora gossypiella Saund. Nach seinen Beobachtungen sind die Plasmatozyten pleomorph und treten am haufigsten in 2 Formen auf: als spindelformige und ovoide Zellen. Die gleichen 5 Hamozytentypen unter- schieden HOROIIOV und DUNN (1982) bei hlatzdirca sexta (L.). SUTULLA (1986) beobachtete 3 Hamozytentypen in seinen Primarkulturen von Lytimtitria tizotzaclzcr, die weitgehend mit unseren Ergebnissen iibereinstimmen. Der Entwicklungsablauf vom Kulturansatz bis zur Zellinie entsprach weitgehend dem von MILTENBURGER u. a. (1977) beschriebenen. Nach dem Anheften der Hamozyten folgte eine Periode der Anpassung der Zellen von Wochen bis Monaten an die itz-citro-Bedingun- gen, ehe eine regelmal3ige Zellzunahme zu beobachten war, die Subkulturen moglich machte. Die erste Subkultur der Zellinie MB-H 260 konnten wir bereits 2 Monate nach Kultur- ansatz vornehmen. Fur die Anpassungsperiode finden sich in der Literatur unterschiedliche Angaben. Bei der ersten erfolgreichen Kultur von Hamozyten (aus Clzilo sippressalis, MITSUIIASHI, 1967) dauerte es 6 Monate bis zum Beginn der Zellvermehrung. Die gleiche Zeitdauer be- obachteten SOHI (1971) und SKATULLA (1986) bei Hamozytenkulturen von hlalacosonia clisstria bzw . L y I iat I trio t I lot i n c h . Wesentlich Ianger (10 Monate) dauerte die Anpassung bei Zellkulturen von Aiitherclea eucalypti Scott (aus Ovarien, GRACE, 1962), bei hlcltizesfra brassicae (POSSE, 1987, unver- offentlicht) sogar 375 Tage. Dagegen konnte MITSUHASHI (1981) bereits 26 Tage nach An- satz seiner Kulturen aus Fettkorperzellen von hl. brassicae die erste Subkultur durch- fiihren. Zur Charakterisierung einer Zellinie sind ihre morphologischen Eigenschaften nur be- grenzt verwendbar (MARKS, 1980). Auch MILTENBURGER u. a. (1977) weisen darauf hin, daB die Konstanz derartiger Merkmale standig zu uberprufen ist. Das ist besonders be- achtenswert bei einer noch jungen Zellinie \vie der MB-H 260 mit erst 40 Passagen. Nach unseren Beobachtungen kann der Anteil der verschiedenen Zelltypen mit zunehmendem Alter der Kultur (Dichte der Zellschicht) wie auch unter dem EinfluD des Mediums (FKS-

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Anteil) wechseln. Eine exakte Beschreibung und Klassifizierung der Zellformen unserer Linie ist in Vorbereitung. Als gutes Kriterium zur Beurteilung einer Zellkultur wird die Zunahme der Zellzahl in einer bestimmten Zeiteinheit angesehen. Aus den Wachstumskurven, denen die Werte regel- maDiger Zellzahlungen zugrunde liegen, lassen sich die Zellzahl-Verdoppelungszeiten ab- lesen. Im Hinblick auf eine in-rho-Produktion insektenpathogener Viren sind Zellinien mit einer moglichst geringen Zellzahl-Verdoppelungszeit erstrebenswert, so daD dieses Kriterium bei der Selektion von Zellinien von besonderer Bedeutung ist. Fur die Hamo- zytenkultur M b 0503 ermittelten MILTENBURGER u. a. (1977) eine Zellzahl-Verdoppelungs- zeit (bei 1 bis 2 Passagen pro Woche) von 12 bis 14 Stunden, bei anderen Hamozytenkul- turen bis zu 40 Stunden. Die Werte fur unsere Zellinie MB-H 260 (20. Passage) liegen zwi- schen 24 und 30 Stunden (Abb. 13). Eine Iangere Zellzahl-Verdoppelungszeit (etwa 60 Stunden) beobachtete MITSUITASHI (1981) bei seiner Linie aus Fettkorperzellen von hl . brassicae; fur Zellinien aus Ovarien werden hohere Werte angegeben. Eine Hamozyten- kultur von Ljnzanfria riiorincha hatte nach 16monatiger Kultivierung eine Zellzahl-Ver- doppelungszeit von etwa 75 Stunden (SKATULLA, 1986). Als weitere Moglichkeit zur Charakterisierung einer Zellinie werden ihr Karyotyp und seine Stabilitat angesehen. Er wurde u. a. bei der Unterscheidung verschiedener Drosophila- Zellinien verwendet (MARKS, 1980). Fur Lepidopteren-Zellinien ist jcdoch dieses Merkmal ungeeignet. Chromosomenzahlen sind bisher nur fur wenige Lepidopteren-Zellinien be- schrieben worden; in jedem Fall wurde Polyploidie festgestellt. MILTENBURGER u. a. (1977) ermittelten fur ihre ~~a~nesstrn-br.tlssicne-Zellinien Chromosomenzahlen von bis zu mehr als 500 pro Zelle und stellten auDerdem Hetero-Polyploidie fest. Ihrer Meinung nach schei- den die Chromosomenzahlverhiiltnisse, auch wegen der geringen GroDe der Chromoso- men, fur die quantitative Analyse von Genomveranderungen aus. Die Prufung und Anwendung weiterer Charakterisierungs- und Identifizierungsmoglich- keiten fur Insektenzellinien wie Immunodiffusions- und Isozpanalysc-Techniken (GREE~E und OIARNEY, 1971) merden Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

5. Zusammenfassung

Es wird die Entwicklung einer Zellinie (MB-H 260) aus Hamozyten der Kohleule (Mmiesrra brassicae L.) beschrieben. Die Kultur erfolgte in Glasringgefaoen, verwendet wurde das Grace-Kulturmedium mit 15 % fetalem Kalberserum. 8 Wochen nach dem Ansatz der Kultur war eine erste Subkultivierung moglich. Weitere Passagen erfolgten in wochentlichem Abstand, insgesamt 40 bis zum 1. 9. 1988. Die Entwicklung der Zellinie und ihre Zellformen werden beschrieben und mikroskopisch bzw. rasterelektronenmikroskopisch abgebildet. Die Zellzahl-Verdoppelungszeit der Zellinie liegt zwischen 24 und 30 Stunden. Die Zellen konnten mit einem Kernpolyeder-Virus der Kohleule infiziert werden.

Onrrcario pasn~r-rrre h-neTowofi niIHiiir (MB-H 260) 113 reXiouIrToB conI;Ii ItanycTIroii (Ma- riicstrtl brassicae L.). KynLTIrnlrpoBaHrre npononrinocb B cocyAax, I ~ ~ ~ O T O ~ ~ ~ I I I I L I X 113

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Summary

Title of the paper: Establishment of a cell line frome hemocytes of Maiuesfra br-assicae L. and its sensitivity to a homologous nuclear polyhedrosis virus

The establishment of a cell line (MB-H 260) from hemocytes of the cabbage moth (Ma- inesfra bmssicne L.) is described. Glass ring-microslide vessels and Grace’s culture medium supplemented with 15 % fetal calf serum were used for culturing. The first subculture was made eight weeks after the culture had been set up. Further passages were performed every week, i. e. 40 passages up to 1 September, 1988. The development of the cell line and its cell types are described and represented by microscopic or scanning electron-microscopic pictures. The population doubling time of the cells is between 24 and 30 hours. The cells were suitable for infection with a nuclear polyhedrosis virus of the cabbage moth.

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Anschrift der Verfasser:

Dr. W. LEII~IAPI” Vers.-Ing. M. WEILEPP Institut f i r Phytopathologie Aschersleben der AdL der DDR Theodor-Roemer-Weg DDR-4320 Aschersleben D

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