Entwicklung eines EAG-Systems zur Analyse von komplexen ... · Entwicklung eines EAG-Systems zur...

Entwicklung eines EAG-Systems zur Analyse

von komplexen Duftstoff-Gemischen

Vom Fachbereich Biologie der

Technischen Universität Kaiserslautern

zur Verleihung des akademischen Grades

„Doktor der Naturwissenschaften“

genehmigte Dissertation

D 386

vorgelegt von

Martin Gabriel

Tag der Abgabe: 09.11.2004

wissenschaftliche Aussprache: 28.01.2005

Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. E. Friauf

1. Berichterstatter: Apl. Prof. Dr. U.T. Koch

2. Berichterstatter: Prof. Dr. B. Büdel

Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. U.T. Koch für die Betreuung der Arbeit, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und für die hilfreichen und anregenden Diskussionen. Dank seines Beistands im Bereich der Elektrotechnik konnte diese Arbeit vollendet werden. Für das gute Arbeitsklima und die tatkräftige Unterstützung der Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Pheromone der TU Kaiserslautern möchte ich mich sehr herzlich bedanken. Ohne den Beistand von Herrn Dipl.-Ing. J. Zastrau und Dipl. Biol. U. Andrick wäre die Umsetzung der elektronischen Fragestellungen sehr schwierig geworden. Besonderen Dank schulde ich Herrn Prof. Dr. S. Schütz, Lehrstuhlinhaber des Instituts für Forstzoologie und Waldschutz der Universität Göttingen, für die Bereitstellung des Labors, in dem die Überlagerungsversuche mit dem Kartoffelkäfer stattfanden. Ohne diese Versuche würde ein erheblicher Teil dieser Arbeit fehlen. In diesem Zusammenhang bedanke ich mich auch für die Unterstützung seiner Mitarbeiter vor Ort. Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. H. E. Hummel, aus dessen Abteilung Biologischer und Biotechnischer Pflanzenschutz der Universität Gießen ein großer Teil der Kartoffelkäfer kamen. Ebenfalls möchte ich mich für die Bereitstellung von Männchen des bekreuzten Traubenwicklers bei Herrn Dr. Louis, Abteilung Phytomedizin des Dienst-leistungszentrum Ländlicher Raum (DLR) Rheinpfalz, und Herrn E. Doye, Staatliches Weinbauinstitut Freiburg, bedanken. Wichtige Beiträge zum zügigen Gelingen meiner Arbeit wurde in verschiedenen Einrichtungen der Zentralen Technik der TU Kaiserslautern geleistet. Dafür möchte ich mich besonders bei den Mitarbeitern der ZBT Metallwerkstätte Herrn Dipl.-Ing. Harter und Herrn Dick, der ZBT Glasbläserei Herrn Tömör und Frau Eggert und den Mitarbeitern der ZBT Elektronik bedanken. Diese Arbeit ist Teil des Forschungsprojekts „MD-EAG-Biosensor“ Ko 630/7-1 der DFG. Mein größter Dank gilt meinen Eltern, die mich während meiner gesamten Ausbildung ideell und materiell unterstützten und mir so diesen Weg geebnet haben. Mehlbach, den 09.11.2004 Martin Gabriel

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Fragestellung 1

1.2 Duftdetektion bei Insekten 3

1.3 Theorien über das Zustandekommen des

Elektroantennogramms 8

1.4 Biologie des Kartoffelkäfers Leptinotarsus

decemlineata 9

1.5 Biologie des Traubenwicklers Lobesia botrana 10

2. Experimenteller Teil 12

2.1 Versuchstiere 12

2.1.1 Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata 12

2.1.2 Bekreuzter Traubenwickler Lobesia botrana 13

2.2 Verwendete Substanzen 13

2.3 Reproduzierbare und haltbare Duftstoffquellen 17

2.4 Durchführung der Versuche 20

2.4.1 Präparation 20

II

2.4.2 Versuchsdurchführung der

Überlagerungsversuche 21

2.4.3 Auswertungsverfahren für die

Überlagerungsversuche 24

2.4.4 Darstellungsproblematik der Ergebnisse

und deren Lösung 29

2.4.5 Bestimmung der Symmetrieeigenschaften 31

3. Apparativer Teil 39

3.1 Allgemeiner Aufbau und Technik eines EAG-Systems 39

3.2 Anforderungen an ein EAG-System 44

3.2.1 Verteilung des Duftstoffs entlang des

Querschnitts 45

3.2.2 Messungen zur Bestimmung des Meßfehlers

mit unterschiedlichen Mischeinrichtungen 47

3.3 Aufbau eines multidimensionalen EAG-Systems 49

3.3.1 Anforderungen an das multidimensionale

EAG-System 50

3.3.2 Grundsätzliche Realisierungsmöglichkeiten

und ihre Konsequenzen 51

3.4 Bedienungselemente zur Ansteuerung des

EAG-Systems 56

3.4.1 Meß – und Steuerungsprogramme 57

3.4.2 Ansteuerungselektronik (Interface) 57

III

4. Ergebnisse 61

4.1 Kontrollversuche 61

4.1.1 Unspezifische Antworten 61

4.1.2 Lagerungsversuch von Nonanal 62

4.2. Überlagerungsversuche 65

4.2.1 Überlagerungsversuche mit dem

bekreuzten Traubenwickler 65

4.2.2 Überlagerungsversuche mit dem Kartoffelkäfer 67

4.3 Dosis-Wirkungskurve der EAG-Antworten des

Kartoffelkäfers 94

5. Diskussion 97

5.1 Technische Überprüfung des MD-EAG-Meßsystems 97

5.2 Einflüsse und Artefakte durch die Reizung 99

5.3 Zersetzungserscheinungen des Duftstoffs Nonanal 100

5.4 Überlagerungsversuche 100

5.4.1 Pflanzenduftstoffe und Pheromon sind

orthogonal 102

5.4.2 Überlagerungsversuche beim Kartoffelkäfer

zeigen duftspezifische Abhängigkeiten 103

IV

5.5 Befunde aus den Dosis-Wirkungskurven 105

5.6 Verbesserungen am MD-EAG-Meßsystem 106

5.7 Alternative EAG-Systeme 107

6. Zusammenfassung 110

7. Literaturverzeichnis 111

Abkürzungsverzeichnis

Abb.: Abbildung

C3H1OL: (Z)-3-Hexen-1-ol

d. h.: das heißt

EAG: Elektroantennogramm

GUAJ: Guajacol

HEXEACE: (Z)-3-Hexenylacetat

LINA: Linalool

MD-EAG: multidimensionales Elektroantennogramm

NONA: Nonanal

OBP: odor binding protein

ORN: olfaktorisches Rezeptorneuron

PBP: pheromone binding protein

POS: Positionssymmetrie

SPS: Spritzensymmetrie

TS: Trennschärfe

TSS: Trennschärfenstufe

T2H1OL: (E)-2-Hexen-1-ol

ÜD: Überlagerungsduftstoff

UD: Untergrundduftstoff

υ: Verdünnungsfaktor

z. B.: zum Beispiel

z. T.: zum Teil

1OCT3OL: 1-Octen-3-ol

2EH1OL: 2-Ethyl-hexan-1-ol

2PEOL: 2-Phenyl-ethanol

1. Einleitung

1

1. Einleitung 1.1 Fragestellung In der Natur gibt es eine Vielzahl von Duftstoffen. Übermitteln Duftstoffe Informationen, so heißen sie Signalstoffe. Dabei lassen sich die Signalstoffe nach der Art der Information weiter unterteilen. Zieht z. B. nur der Empfänger einen Nutzen aus dem Signalstoff, so werden solche Signalstoffe Kairomone genannt. Erfährt der Sender gegenüber dem Empfänger einen Vorteil, so heißen sie Allomone. Oft besteht die Information nicht aus einer einzelnen Substanz, sondern aus einer Vielzahl von Duftstoffen. Dabei kann die Abwesenheit oder eine falsche Konzentration eines Duftstoffs im Duftstoffgemisch ausreichen, um beim Empfänger ein anderes Verhalten auszulösen. Gängige Geräte zur Untersuchung von unbekannten Duftstoffgemischen sind z. B. Gasdetektoren, „künstliche Nasen“ und Gaschromatographen. Gasdetektoren sind zum Teil hoch selektive Halbleiterelemente, die allerdings nicht sensibel genug sind um geringe Konzentrationen zuverlässig bestimmen zu können. Bei der „künstlichen Nase“ kommen verschiedene Sensor-typen zum Einsatz: Schwingquarze, Metalloxid- und Polymer-Sensoren. Die Duftstoffe binden an dem Adsorber, welcher dadurch seine Eigenschaften ändert. Diese Änderung wird in ein elektrisches Signal umgewandelt und kann so gemessen werden. Die Sensoren haben zum Teil nicht-lineare Kennlinien, wodurch quantitative Aussagen über einen Duftstoff in einem Gemisch problematisch werden. Da chemische Sensoren oft nicht selektiv auf Einzelsubstanzen ansprechen, faßt man mehrere unterschiedlich empfindliche Einzelsensoren zu einem Array zusammen. Das System bleibt dennoch im Verhältnis zu biologischen Systemen - wie einer Insektenantenne - unempfindlich bei geringen Konzentrationen. Messungen von Duftstoffgemischen mit dem Gaschromatograph erfordern einen relativ großen Aufwand. So muß zunächst das Duftstoffgemisch in einem Sampling-Verfahren angereichert werden. Dazu wird eine bestimmte Zeit lang, meist einige Stunden, Luft durch ein Röhrchen gepumpt, in dem sich ein Adsorber befindet. Im Labor werden dann die Duftstoffe vom Adsorber in ein Lösungsmittel überführt. Das Lösungsmittel mit den gelösten Duftstoffen wird anschließend in den Gaschromatographen injiziert. Die Duftstoffe wandern dann durch eine Trennsäule, in der die

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unterschiedlichen Bindungsaffinitäten der zu untersuchenden Substanzen an das Trägermaterial in der Säule genutzt werden. Auf Grund unterschiedlicher Retentionszeiten werden die einzelnen Duftstoffkomponenten getrennt voneinander als Signale im Gaschromatogramm dargestellt. Da sich Komponenten bei diesem Verfahren zeitlich überlagern können, müssen im Anschluß weitere Verfahren, wie das Massenspektrometer, zur genaueren Differenzierung herangezogen werden. Dieses Verfahren ist sehr selektiv und empfindlich, der zu betreibende Aufwand ist jedoch enorm. Wegen der langen Sampling - Dauer ist mit dieser Methode eine kurzfristige Änderung von Duftstoffkonzentrationen nicht zu ermittelt. Es besteht weiterhin ein Bedarf nach einem Verfahren, welches eine schnelle und dennoch sehr genaue Analyse von Duftstoff-gemischen ermöglicht. Ein Sensor mit selektiven, sensiblen und zugleich zeitlich hoch auflösenden Eigenschaften kann diesen Bedarf decken. In der Natur sind eine Vielzahl solcher biologischer Sensoren vorhanden. Insekten können geringste Mengen von Duftstoffen wahrnehmen. Insektenmännchen sind in der Lage, auf eine sehr geringe Konzentration von Pheromon zu reagieren. Schneider und Mitarbeiter (1967) stellten mittels Elektroantennogrammen (EAG) fest, daß Männchen der Art Bombyx mori bereits bei einer Konzentration von 200 Pheromonmolekülen/cm3 mit Verhaltensänderungen zu reagieren begannen. Kaissling (1986) konnte durch den Einsatz modernerer und sensiblerer Methoden nachweisen, daß schon ein Molekül des Pheromons Bombykol ausreichte um einen Nervenimpuls auszulösen. Die Männchen reagierten jedoch erst, wenn 200 Pheromonmoleküle auf 200 Rezeptorzellen fielen. Diese hohe Empfindlichkeit der Antennen von Insektenmännchen gegenüber Pheromonen fand ihre erste praktische Anwendung bei Messungen der Pheromondichte mittels EAG und konnte sich in diesem Bereich etablieren (Sauer 1991, Karg 1992, Milli 1993, Färbert 1995, Koch et al. 1997, Koch & Witzgall 2001). Wenn die Antenne Pheromone mit einer hohen Empfindlichkeit wahrnehmen kann, dann könnte dies auch mit anderen Duftstoffen wie z. B. Pflanzenduftstoffen möglich sein. Daraus entstand die Idee, eine Insektenantenne als sensorische Einheit zur Analyse von Duftstoffgemischen zu benutzen. Da EAG-Messungen vom Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata (Say 1824) deutliche Reaktionen auf offenkettige gesättigte Alkohole (Ma & Visser 1978)

1. Einleitung

3

und andere Pflanzenduftstoffe (Dickens 1999, 2002; Schütz et al. 1997) zeigten, wollte man auf diesen Erfahrungen und Ergebnissen aufbauen und die Antenne des Kartoffelkäfers als Biosensor für die Detektion von Pflanzenduftstoffen nutzen. Um ein Duftstoffgemisch analysieren zu können, werden sogenannte Basis-Reizstoffe benötigt. Diese sollten bei niedrigen Konzentrationen gute EAG-Amplituden auslösen und sich durch Gegenwart eines anderen Basis-Reizstoffs nicht beeinflussen lassen. Ein Duftstoffgemisch könnte durch einen Satz von Basis-Reizstoffen zur Analyse gewissermaßen abgetastet werden. Die Ergebnisse jedes Basis-Reizstoffs könnten dann in Form einer Vektordarstellung ein anschauliches Bild des Duftgemisches liefern. Eine solche Analyse wäre umso genauer, je mehr Basis-Reizstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen zur Verfügung stehden. Das bisher vorhandene EAG-Gerät zur Messung der Pheromondichte kann maximal 2 solcher Basis-Reizstoffe aufnehmen. Ziel dieser Arbeit ist ein Gerät zu entwickeln, mit dem die Analyse eines Duftstoffgemischs mit einer größeren Auswahl von Basis-Reizstoffen möglich ist. Dazu mußten erste experimentelle Messungen zur Ermittlung von Basis-Reizstoffen durchgeführt werden. Zudem sollten Messungen zeigen, welchen Einfluß die Gegenwart von Pflanzenduftstoffen auf die Bestimmung der Pheromonkonzentration im Freiland durch EAG-Messungen haben könnte. 1.2 Duftdetektion bei Insekten Insektenantennen kommen in vielen unterschiedlichen Formen vor. Der Aufbau ist bei allen jedoch gleich. Die Antenne besteht aus dem basalen Segment, dem Scapus, welches an der Kopfkapsel durch eine elastische Membran angeheftet ist und durch 4 Muskeln bewegt werden kann. Das zweite Segment ist der Pedicellus, welcher durch eine elastische Membran an dem Scapus befestigt ist und durch zwei Muskeln bewegt werden kann. Die restlichen Segmente bilden das Flagellum, welches in Flagellomere unterteilt wird. Da das Flagellum keine Muskeln besitzt, kann es nur passiv bewegt werden. Das Flagellum trägt den größten Teil der Sensillen. Eine Sensille besteht im Wesentlichen aus 2 bis 5 olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN) und 3 verschiedenen Hilfszellen. Die Anzahl der ORNs kann je nach Typ der Sensille und der Tierart

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auch weit darüber liegen wie z. B. bei dem Sensillum basiconicum der Heuschrecke Schistocerca gregaria 50 ORNs (Ochieng et al. 1998) oder der Wespe Sceliphon spirifex bis zu 140 ORNs (Martini 1986). Das bipolare ORN hat einen ellipsoiden Zellkörper, der sich verjüngt und das „innere Dendritensegment“ bildet. Der Dendrit bildet nun eine scharfe Einschnürung, das „äußere Dendriten-segment“ (Cilium), welches in das Haarlumen eintritt. Bei Insekten gibt es ein Cilium pro Neuron, dagegen kann bei anderen Arthropoden die Anzahl größer sein (2 bei Myriapoden und Crustaceen). Das ORN ist der einzige Zelltyp in der Sensille, der Duftstoffe wahrnehmen kann. Die 3 Hilfszellen lassen sich nach deren Morphologie und Funktion in Thecogenzelle, Tormogenzelle und Trichogenzelle einteilen: Die Thecogenzelle ist die innerste Hilfszelle, welches das Neuron vom Axon bis zum äußeren Dendriten wie eine Gliazelle umschließt. Die Thecogenzelle bildet den „inneren Sensillum-lymphraum“ um die Basis des äußeren Dendritensegments und sondert die cuticulare „Dendritenscheide“ ab. Die Trichogenzelle ist die größte Zelle der Sensille und sondert die Cuticula des Haarschafts während der Entwicklung ab. Die Tormogenzelle liegt am weitesten außen und sondert Teile der Haarbasis während der Entwicklung ab. In der voll entwickelten Sensille formen die Tormogen- und Trichogenzellen zusammen einen großen subcuticularen Raum, den „äußeren Lymphhohlraum“ des Sensillums. Dieser Hohlraum wird durch spezielle „ion-tight membrane-cuticule junctions“ (Keil 1984) von der allgemeinen subcuticularen Spalte isoliert. Die apikalen Membranen der Trichogen- und Tormogenzellen sind in zahlreiche Falten gelegt, welche an deren Cytoplasmaoberfläche von „Portasomen“ (Harvey 1980) bedeckt werden. Die „Portasome“ bestehen hauptsächlich aus V-ATPase (Klein & Zimmermann 1991; Wieczork 1992), welche bei dem Transport von K+ in den Lymphhohlraum eine Rolle spielen (Küpers & Bunse 1996). Der Transport hat erstens eine transepithale Spannung und zweitens eine hohe K+-Konzentration der Sensillumlymphe zur Folge (Thurm & Küppers 1980). Passive Diffusion von Ionen von der Hämolymphe in den subcuticularen Lymphraum und in den Sensillumlymphraum wird durch extensive septate junctions unterbunden (Keil & Steinbrecht 1987). Die Oberfläche der Cuticula der Antenne adsorbiert Duftstoff-moleküle, welche ins Innere der Sensille durch winzige Poren in der Cuticula diffundieren (Steinbrecht & Kasang 1972, Kanauji &

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Kaissling 1985). Wie die meist hydrophoben Duftstoffmoleküle die wäßrige Sensillenlymphe durchqueren und zu den Rezeptoren des ORN gelangen, ist noch unklar. Eine Hypothese lautet, daß die wachsartigen Poren eine Art Tubulus für die Duftstoffmoleküle bilden, wodurch die Duftstoffmoleküle die Dendritenmembran erreichen könnten ohne in die wäßrige Sensillenlymphe eintreten zu müssen (Keil 1982, reviewed von Kaissling 1986a, b, 1987, Steinbrecht 1987, 1997). Der größte Teil der Tubuli endet jedoch blind in das Lymphkompartiment (Ernst 1969, Steinbrecht 1980, Keil 1982). Die Sensillenlymphe ist ein wäßriges Medium aus Ionen und einer Vielzahl von wasserlöslichen Proteinen, die Duftstoff-moleküle binden können (Odour Binding Proteins = OBPs) (Vogt & Riddiford 1981b, Klein 1987, reviewed von Pelosi & Madai 1995). Es gibt drei Klassen von OBP bei Lepidoptera: Pheromon bindende Proteine (PBPs) und zwei Klassen von Duftstoffmolekül bindende Proteine (GOBP1 und GOBP2) (Vogt et al. 1990, 1991a, b). Ähnliche Proteine wie die PBPs und die OBPs wurden auch bei Coleoptera (Paesen & Happ 1995) gefunden. Es wird angenommen, daß die PBPs und die OBPs eine multifunktionale Rolle im Duftstofftransport, der Diskriminierung, der Rezeptor-interaktion und der Duftstoffdeaktivierung spielen (reviewed von Pelosi & Madai 1995, Ziegelberger 1996). Die PBPs haben Eigenschaften von globulären Proteinen und besitzen zwei große hydrophobe Domänen, welche eine Art "Bindungstasche" für die Pheromone bilden könnten. Die PBPs würden dann mit dem hydrophoben Pheromon einen Komplex bilden, welcher wasserlöslich ist und somit die Entfernung zwischen Pore und Rezeptor zurücklegen könnten (Vogt et al. 1985, Van der Berg & Ziegelberger 1991). Am Rezeptor kommt es zu einer Interaktion zwischen diesem und dem PBP-Komplex. Dabei erfährt das Rezeptorprotein eine Konformationsänderung und öffnet indirekt über ein „second messenger“-System, das im folgenden Abschnitt detaillierter beschrieben wird, Ionenkanäle in der Membran. Je mehr PBP-Komplexe an Rezeptoren binden, desto mehr Ionenkanäle werden geöffnet und desto größere Ionenströme können durch die Membran fließen. Die Gesamtleitfähigkeit der Membran für die verschiedenen Ionensorten ergibt sich aus der Summe der Leitfähigkeiten der gleichzeitig offenen Ionenkanäle. Nach dieser Interaktion wird das PBP möglicherweise oxidiert und dadurch unfähig, ein weiteres Mal mit dem Rezeptor zu interagieren (Ziegelberger 1995, Kaissling 1998b). Ähnlich wie bei den

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Pheromonen läuft der Prozeß mit den Molekülen von Pflanzenduftstoffen ab. OBPs binden die Duftstoffmoleküle mit einer gewissen Trennschärfe. Der Duftstoffmolekül-OBP-Komplex bindet am Rezeptor in der äußeren Membran des Dendriten. Im Inneren des ORN wird am Rezeptor das Golf-Protein aktiviert, welches die Phospholipase C zur Synthese von Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) veranlaßt. Der Anstieg der IP3-Konzentration führt zum Öffnen von IP3-abhängigen Ca2+-Kanälen in der äußeren Dendritenmembran. Der Ca2+-Einstrom löst nicht spezifische Kationenströme über Ca2+-abhängige Kanäle aus, welche die steigende Phase des Rezeptorpotentials bewirken. Diese Kationenströme, welche permeabel für Ca2+ sind, erhöhen die intrazelluläre Ca2+-Konzentration, bis die Kanäle in Abhängigkeit der Ca2+-Konzentration schließen. Dieser anhaltende Anstieg von intrazellulärem Ca2+ hält beide Kanäle geschlossen, öffnet aber einen zweiten Typ von nicht spezifischem Kationen-Kanal. Dies geschieht über Aktivierung von Ca2+-empfindlicher Protein-Kinase C (PKC), welche durch DAG aktiviert wird und das ORN weiter depolarisiert. Der Intrazelluläre Anstieg von Ca2+ öffnet ebenfalls Ca2+-abhängige K+-Kanäle, welche zusammen mit spannungs-abhänigen K+-Kanälen die Repolarisation des ORN herbeiführen. Diese graduierten Potentiale der Zellmembran breiten sich passiv elektrotonisch vom Cilium zur „Spike“-Entstehungszone im Axonhügel des ORN aus. Wie genau duftstoffabhängige Rezeptor-potentiale zu einem Aktionspotential führen ist noch ungeklärt. Die ORNs feuern spontan mit kurzen Bursts; die Verteilung der Spike-Pausen innerhalb der Bursts zeigt ein deutliches Maximum bei 10-30 ms. Das bedeutet, daß ORNs mit einer Frequenz von 33-100 Hz „oszillieren“ können. Dies könnte für den Spike-Schwellenwert von ca. –30 mV verantwortlich sein. Na+-Ströme in kultivierten ORNs starten mit einem depolarisierenden Spannungsschritt von –75 mV nach –30 mV (Zufall et al. 1991). Von der „Spike“-Entstehungszone im Axonhügel gelangen die Aktionspotentiale über das Axon im Antennennerv in den Antennallobus. Der Antennallobus hat die Gestalt einer Kugel und ist normalerweise gut abgegrenzt von anderen Teilen des Gehirns. Er ist in ein grobkörniges Neuropil und eine artspezifische Anzahl von neuropilen Kompartimenten (Glomeruli genannt) eingeteilt. Die Glomeruli sind kugelige, neuropile Strukturen, welche synaptische Kontakte zwischen Axonen der ORN und Interneuronen des Antennallobus beinhalten. Die Glomeruli sind durch Gliazellen voneinander getrennt (Tolbert & Hildebrand 1981, Hähnlein &

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Bicker 1996). Bei Hymenoptera, Lepidoptera und Dictyoptera wurde ein geschlechtsspezifischer Dimorphismus in der Organisation des glomerulären Antennallobus beschrieben (Rospars 1988). Der Antennallobus weiblicher Motten, Schaben und Arbeiterbienen beinhaltet zwischen 50 und 160 gleichförmiger Glomeruli. Der Antennallobus männlicher Motten, Schaben und Drohnen besitzt eine ähnliche Anzahl von Glomeruli, hat aber zusätzlich einige vergrößerte Glomeruli, die bei Motten makroglomerularer Komplex und bei Schaben Makroglomerulus genannt werden. Diese geschlechtsspezifischen Glomeruli erhalten exklusiven Input von pheromonempfindlichen ORNs (Boeckh et al. 1970, Hildebrand et al. 1980, Rospars 1983, 1988, Arnold et al. 1985, Christensen & Hildebrand 1987b, Rospars & Hildebrand 1992, Hansson 1997). Axone gleichspezifischer ORN projizieren in den gleichen Glomerulus. Somit ist ein Glomerulus für einen Duftstoff zuständig. Die Anzahl der Glomeruli schwankt zwischen 32 bei Apis aegypti (Bausenwein & Nick 1998) und 1000 bei Locusta migratoria bzw. Schistocerca sp. (Leitch & Laurent 1996, Laurent 1996). Die Glomeruli sind untereinander durch lokale Interneurone und Projektionsneurone verbunden, die auch inhibitorisch wirken können. Jeder Glomerulus hat ein oder wenige Ausgangsneurone. Die Ausgangsneurone aller Glomeruli laufen im Protocerebrum in den Pilzkörpern zusammen. Durch eine räumliche und zeitliche Codierung der Aktionspotentiale der Interneurone im Antennallobus entstehen Identifikationskarten für Gerüche (Laurent & Davidowitz 1994). Die zentralen Pathways, welche Informationen über Pheromone bzw. Duftstoffe weiterverarbeiten, verlaufen im Insektengehirn größtenteils getrennt (Hildebrand 1996). Je nach physiologischem Zustand des Insekts kann ein bestimmtes Duftbouquet eine Verhaltensweise auslösen, wie z. B. die Detektion von Pheromon den Flug zur Weibchenfindung auslösen kann.

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1.3 Theorien über das Zustandekommen des Elektroantennogramms Das Prinzip des EAG geht auf die Entdeckung von Schneider & Hecker (1957) zurück. Schneider konnte eine elektrische Potentialänderung zwischen der Spitze und der Basis der Antenne eines Seidenspinnermännchens Bombyx mori beobachten, wenn Luft mit ein wenig Bombykol (Pheromon des Seidenspinner-weibchens) über eine isolierte Antenne geleitet wurde. Schneider bezeichnete analog zu den Begriffen Elektroencephalogramm (EEG), Elektrokardiogramm (EKG) und Elektroretinogramm (ERG) diese Art von Antennenantwort als Elektroantennogramm (EAG). Schneider & Hecker (1956) fanden einen logarithmischen Zusammenhang zwischen der Antwortstärke und der Konzentration des Pheromons Bombykol in der Reizluft. Nach Schneider (1967, 1969) stellt das EAG die Summe aller Rezeptorpotentiale der einzelnen Sensillen dar, die gleichzeitig durch Duftstoffe aktiviert werden. Auch Venard & Pichon (1981, 1984) sind der Meinung, daß das graduierte Potential das Rezeptorpotential der ORNs widerspiegelt. Jedoch variiert die Amplitude des EAG auf der Antennenoberfläche und ist einzigartig für jeden Geruch (Venard & Pichon 1981, Ayer & Carlson 1992). Diese „Konturen“ für die unterschiedlichen Duftstoffe stellen vermutlich die Sensibilität der unterschiedlichen sensorischen Einheiten dar, welche sich an verschiedenen Stellen entlang der Cuticula der Antenne befinden (Ayers & Carlson 1992). Die Amplitude des EAG liegt jedoch weit unter der Amplitude des Rezeptorpotentials eines einzelnen Sensillums. Somit kann die Entstehung der EAG-Amplitude nicht allein auf die Summe der Rezeptorpotentiale zurückgeführt werden. Nagai (1983) beschreibt die Antenne als einen zylindrisch geformten Leiter (Hämolymphraum), welcher von einem äußeren Rohr mit leitender Flüssigkeit (Rezeptorlymphe) umschlossen ist. Die beiden leitfähigen Schichten sind durch eine nichtleitende Schicht (Epithelzellen mit tight junctions) voneinander getrennt. Die einzelnen Sensillen werden als Kondensatoren angesehen, welche durch Widerstände miteinander verbunden sind. Dadurch kann sich die Spannung der Sensille elektrotonisch über die Antenne ausbreiten. Die Summe der Potentiale, die an den Ableitstellen ankommt, erzeugt die Amplitude des EAG. Dabei könnte der

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Beitrag der Sensillen, die nahe am Ableitpunkt liegen, höher sein als der Beitrag der weiter weg liegenden Sensillen. Wenn man bedenkt, daß es nach Ayers & Carlson (1992) duftstoffabhängige „Konturen“ auf der Oberfläche der Antenne gibt, so könnte der Beitrag der Sensillen, die sich näher am Ableitpunkt befinden, duftstoffspezifisch sein. D.h., wenn sich viele Sensillen für nur einen bestimmten Duftstoff in der Nähe des Ableitpunktes befinden, wird deren Beitrag an der Amplitude des EAG auf Grund einer geringeren Abschwächung überproportional größer sein als der Beitrag anderer Sensillen, die sich weiter weg befinden. Nach der Occupation-Theorie (van Haastert 1980) ist die EAG-Amplitude ein Maß für die Gesamtheit aller durch einen Duftstoff besetzten Rezeptoren auf der Antenne. Die Dichte des verabreichten Duftstoffs bestimmt dabei die Anzahl der Rezeptoren, die auf diesen Duftstoff reagieren. Die Amplitude verändert sich bei anhaltender Reizung nicht, solang keine Effekte wie Adaptation auftreten. Nach der Rate-Theorie (Paton1961, Heck & Erikson 1973, van Haastert 1980) spiegelt die EAG-Amplitude die pro Zeiteinheit neu besetzten Rezeptoren wider. Bei Reizbeginn kommt es zu einer starken Potentialänderung, entsprechend der neu besetzten Rezeptoren. Die EAG-Amplitude nimmt bei gleich bleibender Reizstärke ab, da kaum neue Rezeptoren besetzt werden. Es stellt sich dann ein Gleichgewicht zwischen neu besetzten und noch besetzten Rezeptoren ein. Nach dieser Theorie würde sich erst dann ein Plateau einstellen, wenn sich das Gleichgewicht eingestellt hat. 1.4 Biologie des Kartoffelkäfers Leptinotarsus decemlineata (Say 1824) Der Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae) verläßt im Mai die Erde, in der er überwintert hat und sucht sich ein passendes Habitat. Nach einer mehrtägigen Fraßperiode findet die Begattung statt und die Weibchen beginnen mit der Eiablage, die sich über einen Zeitraum von 2 Monaten erstreckt. Die Weibchen legen ihre Eier in Gelegen von 20 bis 40 Eiern an der Blattunterseite der Wirtspflanze ab (Abb. 1.4.1). Die Weibchen können insgesamt bis zu 600 Eier in diesen 2 Monaten ablegen. Nach ca. einer Woche schlüpfen die Larven aus den Eiern. Die Larven durchlaufen innerhalb von 2 bis 3 Wochen 4 Larvenstadien (Abb. 1.4.1). Das 4. Larvenstadium vergräbt sich in

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Abb. 1.4.1: Das Kartoffelkäferweibchen (links) legt ein Gelege mit 20 bis 40 Eiern. Daraus schlüpfen die Larven. Rechts ist das 4. Larvenstadium abgebildet.

den Boden und verpuppt sich dort. Nach 1 bis 2 Wochen ist die Metamorphose abgeschlossen. Mitte Juli kommen die Käfer aus der Erde und beginnen mit dem Reifungsfraß, der 10 bis 20 Tage dauert. Während des Reifungsfraßes neigen die Käfer zu Wanderungen und Flügen und finden so neue Gebiete mit Wirtspflanzen. Zum Überwintern vergräbt sich der Kartoffelkäfer im Erdboden bis zu 60 cm tief. Diese Phase wird Diaphase genannt und durch Tageslänge, Umgebungstemperatur und Verfügbarkeit sowie Qualität der Wirtspflanze ausgelöst (De Wilde et al. 1969).

1.5 Biologie des bekreuzten Traubenwicklers Lobesia botrana Der bekreuzte Traubenwickler Lobesia botrana (Lepidoptera: Tortricidae) tritt in unseren Breitengraden in 2, in sehr warmen Regionen oder Jahren auch in 3 Generationen auf. Die erste Generation, der Heuwurm, tritt ab Mitte bis Ende Juni, die zweite Generation, der Sauerwurm, in der letzten Julidekade, und die seltene dritte Generation, der Süßwurm, im August auf. Die dritte Generation erreicht jedoch selten das Puppenstadium, da während des Larvenstadiums die Traubenernte anfängt. Der bekreuzte Traubenwickler überwintert als olivbraun gefärbte Puppe unter der Borke des alten Rebholzes, in hohlen Markhöhlen am Ende der einjährigen Triebe und in Ritzen der Pfähle. Ende April schlüpfen die Motten und beginnen zu fliegen (Abb. 1.5.1). Die Flugzeit erstreckt sich über 2 bis 3 Wochen im Mai. Die Hauptflugzeit der Motten liegt in den Dämmerungsstunden. Nach der Begattung legen die Weibchen im Durchschnitt 100 Eier auf einzelnen Vorblättern („Hüllschuppen“) und Kronblättern („Blütenkäppchen“) ab. Nach 6 bis 12 Tagen, abhängig von der

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Abb. 1.5.1: Der bekreuzte Traubenwickler Lobesia botrana(Dennis & Schiffermüller 1776).

Temperatur, schlüpfen die Raupen. Eine Raupe durchläuft 5 Larven-stadien. Sie frißt sich dabei in den Blütenstand ein und verspinnt mehrere Blütenstände miteinander. Nach 25 Fraßtagen verpuppt sich die Larve und schlüpft nach 8 bis 10 Tagen ab Mitte Juli (Stellwaag 1928, Balachowsky 1966, Hillebrand et al. 1995). Der Flug dieser 2. Generation findet ebenfalls in den Dämmerungsstunden statt. Die Weibchen legen jedoch die Eier einzeln auf die Beeren der Pflanze. Nach 5 bis 6 Tagen schlüpfen die Raupen. Nun beginnt der wirtschaftlich größte Schaden, da sich die Raupen in die Beeren hineinfressen und diese durch Pilzbefall gefährden. Die Larve begibt sich nach Ende der Fraßtätigkeit, welche 3 bis 4 Wochen dauert, in das Überwinterungsquartier unter die Borke. In warmen Jahren schlüpft die dritte Generation Ende August und fliegt bis Ende September.

2. Experimenteller Teil

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2. Experimenteller Teil 2.1 Versuchstiere In dieser Arbeit wurden 2 Insektenarten zur Behandlung zweier unterschiedlicher Schwerpunktfragen benutzt. Dies waren der Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata (Say 1824) und der bekreuzte Traubenwickler Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller 1776). Der Kartoffelkäfer wurde ausschließlich für Überlagerungs-versuche mit Blattduftstoffen der Kartoffelpflanze Solanum tuberosum (Lin.) benutzt. Der bekreuzte Traubenwickler wurde für die Überprüfung des neuen multidimensionalen EAG-Meßsystems (MD-EAG) und für Optimierungsversuche verwendet. Zusätzlich wurden Überlagerungsversuche von Pheromon mit allgemeinen Blattduftstoffen durchgeführt, um mögliche Wechselwirkungen zu untersuchen, die einen störenden Effekt für die Bestimmung der Pheromonkonzentration im Freiland mit dem EAG-System haben. 2.1.1 Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata (Say 1824) Bei Versuchen mit dem Kartoffelkäfer wurden Antennen beider Geschlechter benutzt und die Daten gemischt. Die Mischung der Daten beider Geschlechter beim Kartoffelkäfer hat keinen Einfluß auf die Ergebnisse, da kein geschlechtsspezifischer Unterschied in den Reizantworten auf Blattduftstoffe gefunden wurde (Schütz et al. 1997). Neben Käfern aus dem Freiland aus der Umgebung von Kaiserslautern und Göttingen wurden Käfer aus der Zucht der Universität Gießen verwendet. Die Bedingungen der Gießener Zucht waren eine 16 h : 8 h Licht-Dunkel-Periode, eine Temperatur von 26 °C, eine relative Luftfeuchtigkeit von 50 % und als Futterpflanze wurde Solanum tuberosum benutzt. Die Überlagerungsversuche wurden in der Zeit vom 19.5.03 bis 23.5.03, sowie vom 10.6.03 bis 18.6.03 und vom 11.9.03 bis 15.10.03 durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, daß die Empfindlichkeit der Antennen in den Monaten September und Oktober geringer war als in den Monaten Mai und Juni.


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2.1.2 Bekreuzter Traubenwickler Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller 1776) Um die neue Apparatur auf technische Mängel zu überprüfen sind hoch empfindliche Detektoren erforderlich. Mit diesen empfindlichen Systemen kann man sehr geringe Unterschiede erkennen wie sie z.B. bei Messungen der Positions- oder Spritzensymmetrie auftreten können. Die Antenne des bekreuzten Traubenwicklers Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller 1776) erwies sich schon in früheren Versuchen als sehr empfindlich für das artspezifische Pheromon. Deshalb wurde der bekreuzte Traubenwickler für Versuche zur technischen Überprüfung des Geräts verwendet. Die Versuchstiere stammen aus der Zucht des Staatlichen Weinbauinstitutes Freiburg i. Br. und dem Dienstleistungszentrum für den Ländlichen Raum (DLR) Neustadt an der Weinstraße. Die Tiere aus der Freiburger Zucht wurden bei einer Licht-Dunkel-Periode von 16 h : 8 h Stunden, einer relativen Luftfeuchtigkeit von ca. 60 % und einer Temperatur von 24 °C am Tag und 20 °C in der Nacht gehalten. Als Futter dient eine Diät nach Mani et al. (1978). Die Männchen wurden frühestens am 3. Tag nach der Imaglinalhäutung für die Versuche benutzt. Die Tiere aus der Zucht des DLR in Neustadt wurden bei einer Licht-Dunkel-Periode von 16 h : 8 h und einer Temperatur von 25 °C gehalten. Hier wurde ebenfalls die Diät nach Mani et al. (1978) als Futterquelle verwendet. 2.2 Verwendete Substanzen Die in dieser Arbeit benutzten Substanzen waren zum einen typische Komponenten des grünen Blattduftstoffs und zum anderen das Pheromon des bekreuzten Traubenwicklers. Von den Substanzen wurden Verdünnungsreihen in Paraffinöl (Uvasol) angelegt. Für die Erstellung der Verdünnungsreihen wurde ein gravimetrisches Verfahren verwendet, bei dem die Menge des Duftstoffs genau ein Zehntel der Menge des Duftstoff/Paraffin-Gemischs betrug. Die angegebenen Spritzenbeladungen sind demzufolge mg/mg Gemisch, d.h. T2H1OL 10-5 entspricht einer Konzentration von 10-5 mg T2H1OL pro mg T2H1OL/Paraffin-Gemisch. Von den so erstellten Verdünnungen wurden 250 µl auf ein Filterpapier (L: 150 mm, B: 15 mm, alle 7,5 mm gefaltet) aufgetragen. Daraus ergab sich eine Gesamtoberfläche von 45


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cm2, von der das Duftstoff/Paraffin-Gemisch verdampfen konnte. Das Filterpapier wurde in einem Eichstoffbehälter aufbewahrt, der sich in einer Glasspritze befand. In Tab. 2.2.1 werden die benutzten Chemikalien und die verwendete Konzentrationen aufgelistet.

Tab. 2.2.1: Liste der verwendeten Chemikalien. MS: Merck-Suchardt, die Stoffkenn-Nr. codiert den Duftstoff für den Spritzencode. Dadurch ist jede Spritze eindeutig gekennzeichnet.

Substanz Hersteller, Nummer

Stoffkenn-Nr. für

Spritzencode

Konzentration [mg/mg]

(Z)-3-Hexen-1-ol

MS, S 18031109

10

10-6, 10-5, 10-4

(E)-2-Hexen-1-ol

MS, Lot 53983900

11

10-6, 10-5, 10-4

2-Ethyl-hexan-1-ol

MS, S 34277207

12

10-5, 10-4, 10-3

2-Phenyl-ethanol

MS, S 35079148

13

10-4, 10-3

(Z)-1-Octen-3-ol

MS, S 31493047

14

10-5, 10-4

Linalool

MS, S 32412141

15

10-5, 10-4

Nonanal

MS, S 35726209

16

10-5, 10-4

Guajacol

Roth, 42151601

17

10-5, 10-4, 10-3

(Z)-3-Hexenyl-acetat

18

10-6, 10-5, 10-4

(E,Z)-7,9-Dodecandien-1-yl-acetat

BASF

51 bzw. 55

10-6, 10-5, 2·10-5, 5·10-5,

10-4

Paraffin/Uvasol MS, K 30881961249

0

-


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Um eventuelle Gemeinsamkeiten bzw. Unterschiede der Duftstoffe in der Struktur erkennen zu können werden diese nachfolgend dargestellt: (Z)-3-Hexen-1-ol (C3H1OL)1: entsteht während der Traumatinsäuresynthese, bei der Bildung eines Wundkallus und während Streßbedingungen; tritt bei mechanischem Schaden wie z.B. Käferfraß auf.

CH3

OH (E)-2-Hexen-1-ol (T2H1OL)1: siehe C3H1OL.

CH3 OH

2-Ethyl-hexan-1ol (2EH1OL)1: entsteht durch Pilzbefall Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule).

CH3 CH3

OH 2-Phenyl-ethanol (2PEOL)1: entsteht als Nebenprodukt der Phenylalanin-Ammoniumylase-Aktivierung bei der Induktion von de novo Synthese und ist ein Hinweis auf Käßerfraß.

OH

(Z)-1-Octen-3-ol (1OCT3OL):

CH3

CH3

OH


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Linalool (Lina)1: entsteht pH-abhängig im Extrazellularraum und zeigt das physiologische Alter der Pflanze an.

CH3

CH2

CH3 OH

CH3 Nonanal (Nona)1: entsteht pH-abhängig im Intrazellularraum und ist ein Indikator für allgemeinen Streß, Infektion und oxidativen Streß.

CH3

O

Guajacol (Guaj):

OH

OCH3

(Z)-3-Hexenyl-acetat (Hexeace):

CH3

O

CH3

O


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(E,Z)-7,9-Dodecandien-1-yl-acetat (Pheromon des bekreuzten Traubenwicklers): wird von Weibchen des bekreuzten Traubenwicklers synthetisiert und in die Luft als Pheromon abgegeben. Das Traubenwickler-männchen nutzt das Pheromonsignal um das Weibchen zu finden. Signal und Detektion sind so selektiv, daß nur Individuen der gleichen Art zueinander finden.

CH3O

O

CH3

1) Quelle Schütz, S. - Schütz, S (2001): Der Einfluß verletzungsinduzierter Emissionen der Kartoffelpflanze (S. tuberosum) auf die geruchliche Wirtspflanzenfindung und –auswahl durch den Kartoffelkäfer (L. decemlineata) – Ein Biosensor für die Diagnose von Pflanzenschäden-. Habilitationsschrift Wissenschaftlicher Fachverlag (ISBN 3-933303-14-1. 2.3 Haltbare und reproduzierbare Duftstoffquellen Die Duftstoffquellen, die als Reizgeber fungieren, müssen zumindest für eine Versuchsreihe haltbar sein und reproduzierbare Reizquantitäten und –qualitäten besitzen. Das Kriterium für haltbare Duftstoffquellen ist für eine Versuchsreihe deshalb so wichtig, weil man sonst nach jedem Einzelversuch die Duftstoffquelle erneuern müßte. Dies ist bei Freilandversuchen nicht immer ohne größere Umstände möglich. In der gängigen Literatur werden meist „Filterpapier-Quellen“ benutzt, bei denen der Duftstoff in einem schnell verdampfendem Lösungsmittel verdünnt und dann auf ein Filterpapier aufgetragen wird. Das Filterpapier wird anschließend in eine Pasteurpipette eingebracht, die mit einer definierten Luftmenge durchströmt wird. Durch die erzeugte Luftströmung entlang des Filterpapiers reichert sich der Duftstoff durch Konvektion und Diffusion (Sauer 1989) im Luftstrom an. Der so erzeugte Reizluftstrom gelangt in den zur Antenne gerichteten Hauptluftstrom. Bei den in dieser Arbeit verwendeten EAG-Systemen wird die Hauptluft durch einen Querluftstrom vermischt und verdünnt. Die Abgaberate des Duftstoffs vom Filterpapier in den Reizluftstrom hängt von vielen Parametern ab (z.B. Dampfdruck, Eigenschaften


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des Filterpapiers, Geschwindigkeit des Luftstroms). Diese Abhängigkeiten können bei einigen Duftstoffen dazu führen, daß die Proportionalität zwischen Duftstoffkonzentration auf dem Filterpapier und Duftstoffkonzentration im Reizluftstrom nicht erhalten bleibt (Sauer 1989, Bengtsson 1990). Die Duftstoffkonzentration in verschiedenen Exemplaren einer Filterpapierquelle, die exakt nach dem gleichen Verfahren hergestellt wurden, ist nur bis auf 50 % reproduzierbar (pers. Mitt. U.T. Koch). Um solchen Problemen von Anfang an aus dem Wege zu gehen, werden bei dem EAG-System Duftstoffquellen nach dem Prinzip des Spritzen-Olfaktometers (Kafka 1970) als Reizgeber benutzt. Der Duftstoff wird mit einem Lösungsmittel verdünnt, das annähernd den gleichen Dampfdruck besitzt wie der Duftstoff. Als Lösungsmittel wird in dieser Arbeit Paraffin (Merck, Uvasol 1.07161.0500) benutzt. Die Duftstoffkonzentration im Reizluftstrom hängt dann hauptsächlich von dem Mischungsverhältnis des Duftstoffes und dem Lösungsmittel in der flüssigen Phase (Verdünnungsreihe) und der Temperatur ab. Voraussetzung für dieses Verfahren ist, daß das Lösungsmittel nicht mit den Duftstoffen reagiert und keine physiologische Antwort erzeugt. Aus diesen Gründen werden 20 ml Glasspritzen (Fortuna Optima, Fa. Poulten & Graf GmbH) mit einem Vorderteil aus vernickeltem Messing benutzt. Der Glaskolben beinhaltet einen Gummieinsatz, in dem die Antriebsstange befestigt wird. In der Glasspritze befindet sich ein Eichstoffbehälter aus Teflon, in dem sich das Filterpapier befindet. Der verdünnte Duftstoff wird auf das im Eichstoffbehälter befindliche Filterpapier aufgebracht und es stellt sich ein Gleichgewichtszustand aus Duftstoff, Paraffin und Luft im Gasvolumen der Spritze ein (Barrow 1974). Dieser Gleichgewichtszustand wird nach ca. 30 Sekunden erreicht (Sauer 1989). Die Konzentration des Duftstoffs im Gasvolumen der Spritze ist direkt proportional zur Konzentration des Duftstoffs im Duftstoff/Paraffin-Gemisch (Kafka 1970). Ein weiterer Vorteil dieser Verfahrensweise liegt darin, daß sich die Konzentration des Duftstoffs an der Antenne reproduzierbar verändern läßt, indem man die Vorschubgeschwindigkeit des Glaskolbens in der Spritze variiert. Mittels eines schnelleren oder langsameren Vorschubs gelangt in der gleichen Zeit mehr oder weniger Reizluft aus der Spritze in den Hauptstrom und somit nimmt die Konzentration des Duftstoffs im Hauptluftsrom zu bzw. ab. Lüder (1997) erforschte die Zusammenhänge zwischen der Pheromonkonzentration und den


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Eigenschaften der Glasspritze (Reibungswiderstand, direkte Übertragung des Antriebs, Art der Öffnung) und modifizierte die Spritzen als Reizgeber. In dieser Arbeit wird mit einem Gummistopfen im Glaskolben gearbeitet, der als Verankerung der Antriebsstange dient und zugleich die Bewegung des Antriebs dämpft. Die Antriebsstange ist über ein Verbindungsstück mit einem Drahtseil verbunden. Das Drahtseil wird um die Antriebsachse eines Schrittmotors und um ein Umlenkrad durch eine Feder gespannt. Der Schrittmotor erhält elektrische Impulse von dem Interface und dreht sich abhängig von der Frequenz. Die Frequenz bestimmt somit die Vorschubrate des Glaskolbens und damit bis zu einer gewissen Grenze auch die Konzentration des Duftstoffs im Reizluftstrom. Je nach Drehsinn kann sich der Glaskolben auch wieder zum Ausgangspunkt zurück bewegen (Spritzenreturn). Durch zwei Mikroschalter wird gewährleistet, daß sich der Kolben nur innerhalb einer definierten Strecke bewegen kann. Sauer (1991) untersuchte die Reproduzierbarkeit der Duftstoffkonzentration der Reizluft, indem er eine Spritze als Reizgeber benutzte und die relativen EAG-Amplituden über die Anzahl der Reizluftimpulse miteinander verglich. Er fand heraus, daß selbst nach 20.000 Reizluftimpulsen die Konzentration des verwendeten Pheromons in der Reizluft konstant blieb. Diese Art von Duftstoffquelle ist folglich stabil gegenüber häufigem Gebrauch. Ein weiterer Punkt ist die Reproduzierbarkeit der Duftstoffquelle an sich. Sind gleich hergestellte Duftstoffquellen auch wirklich identisch? Um diese Frage zu klären wurden Spritzen mit der gleichen Beladung hergestellt und mit einer Spritze mit höherer Beladung verglichen. Dazu wurde der identische Versuchsablauf wie für die Messung der Positionsasymmetrie für unterschiedliche Mischvorrichtungen (siehe Kap. 2.3.5) durchgeführt.


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2.4 Durchführung der Versuche Im ersten Abschnitt wird die für alle Versuche erforderliche Präparation der Antenne behandelt. 2.4.1 Präparation Vor der Präparation wurden beide Vertiefungen des Antennenhalters (Lüder 1997) mit Ringer-Lösung (Kaissling & Thorson 1980) gefüllt bis die Oberfläche der Lösung eine Ebene mit der Querrinne für die Antenne bildete. Die Ringer-Lösung hat zum einen den Zweck, eine elektrisch leitende Verbindung zwischen den Antennenenden und den Ag/AgCl-Elektroden in den Vertiefungen herzustellen und zum anderen das Austrocknen der Antenne zu verhindern. Zudem liefert die Ringer-Lösung für den Stoffwechsel der Antenne benötigte Substanzen wie Glucose und Salze. Bei der Präparation von Lobesia botrana wird das Tier mit CO2-Gas betäubt. Danach wird dem Tier unter dem Binokular die Antenne mit einer Mikroschere abgeschnitten und die Antenne in den Antennenhalter gelegt. Nun werden am distalen Ende der Antenne 2 bzw. 3 Antennensegmente entfernt. Danach erfolgt die Überprüfung des Antennenwiderstands mit einer kleinen EAG-Testapparatur. Ist der Widerstand der Antenne zu hoch (> 10 MΩ), so wird ein weiteres Segment der Antenne entfernt. Liegt der Widerstand zwischen 5 MΩ und 10 MΩ, so wird die Antenne auf Empfindlichkeit für das Pheromon getestet. Entsprechen der Antennenwiderstand und die Empfindlichkeit der Antenne den Versuchsanforderungen, so wird das Meßkammerunterteil, in der sich der Antennenhalter befindet, an das Meßkammeroberteil angeschlossen. Bei dem Kartoffelkäfer kann auf die Betäubung mit CO2-Gas verzichtet werden, da das Tier für die Präparation mit der Hand fixiert werden kann. Das Abschneiden der Antenne erfolgt ohne Binokular. Die abgetrennte Antenne wird in den Antennenhalter gelegt. Nun wird der Widerstand der Antenne mit der EAG-Testapparatur gemessen. Ist der Widerstand der Antenne zu hoch (> 10 MΩ), so wird die Antenne des Käfers am proximalen Ende gekürzt. Dieser Unterschied zu Lobesia botrana ist deshalb notwendig, da sich 25 % der Geruchssensillen auf dem distalen Segment befinden und die verschiedenen Geruchssensillen auf der Antenne sich unterschiedlich verteilen (Schanz 1953). Eine solche


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Nachbehandlung war bei Pseudotarsus decemlineata jedoch selten nötig. Dies könnte daran liegen, daß die Antenne des Kartoffelkäfers größere Poren besitzt und somit der Antennenwiderstand geringer ist. Auf eine Empfindlichkeits-überprüfung wird verzichtet. Zum Schluß wird das Meßkammer-unterteil an das Meßkammeroberteil angeschlossen. 2.4.2 Versuchsdurchführung der Überlagerungsversuche Die Überlagerungsversuche hatten für beide Insektenarten den gleichen Verlauf. Die Antenne wird in den Antennenhalter eingelegt und das Meßkammerunterteil mit dem Meßkammeroberteil verbunden. Danach werden die 3 Applikationsstellen mit Duftstoffquellen besetzt. Die Applikationsstelle 1 wird mit dem Untergrundduftstoff (UD) und die Applikationsstelle 2 mit dem Überlagerungsduftstoff (ÜD) mit der geringen Konzentration und die Applikationsstelle 3 mit dem ÜD mit 10fach höherer Konzentration bestückt. Die Versuchsdurchführung erfolgt mittels PC und dem Meß- und Steuerungsprogramm „A04V14“. Der Versuch beginnt mit der „Kalibrierphase“, während der die Antenne zuerst mit zwei je 1 Sekunde dauernden Reizen des UD stimuliert wurde. Diese zwei Reize werden durch unterschiedliche Vorschubraten v1 und v2 des Schrittmotors generiert und dienen einer groben Abschätzung der Empfindlichkeit der Antenne für den UD. Nach der Applikation des UD wird der ÜD mit den Konzentrationen K1 und K2 appliziert. Dabei ist die Konzentration K2 immer 10fach höher als die Konzentration K1. Die Kalibrierung der Empfindlichkeit der Antenne für den ÜD erfolgt durch Verwendung der EAG-Antworten auf einen 1 Sekunde lang dauernden Stimulus der Konzentration K1 (z.B. 10-5 mg/mg) und einem darauffolgendem Stimulus gleicher Dauer mit der Konzentration K2 (z.B. 10-4 mg/mg). Zwischen diesen Reizen liegt jeweils eine 4 Sekunden dauernde Pause. Darauf folgt die „Überlagerungsphase“. Sie beginnt mit einer 4,6 Sekunden langen Dauerreizung der Antenne mit dem UD. 1,85 Sekunden nach dem Start der Reizung mit dem UD wurde zusätzlich der ÜD mit der Konzentration K1 für 1 Sekunde appliziert. Nach dem Ende des Reizes mit dem ÜD hält die Dauerreizung mit dem UD noch weitere 1,75 Sekunden an. Nun erfolgt wie in der „Kalibrierphase“ eine 4 Sekunden lange Pause. Nach dieser Pause


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Abb. 2.4.2.1: Überlagerungsversuch mit der Kartoffelkäferantenne. Die obere Abbildung zeigt den Verlauf eines Überlagerungsversuchs und die untere Abbildung den dazugehörigen Kontrollversuch. Als UD wurde T2H1OL mit der Konzentration 10-4 () und als ÜD 2PEOL mit den Konzentrationen 10-5 () und 10-4 () verwendet. Die rote Spur zeigt den zeitlichen Verlauf der Duftstoffapplikation an. obere Abb.: Während der „Kalibrierphase“ (3. und 4. Reiz) wird die Dosis-Wirkungskurve gemessen. Die „Überlagerungsphase“ beginnt mit Applikation des UD (), zu dem nach einer kurzen zeitlichen Verzögerung zusätzlich der ÜD C3H1OL mit der Konzentration 10-5 appliziert wird. Nach einer Pause wird die Überlagerung mit der höheren Konzentration des ÜD wiederholt. untere Abb.: Im Kontrollversuch wird während der „Überlagerungs-phase“ die Reizung mit dem UD nicht durchgeführt. Dabei wird die Antenne auf eine Änderung der Empfindlichkeit gegenüber dem ÜD gemessen. Eine auftretende Änderung der Empfindlichkeit der Antenne (Änderung der EAG-Amplitude) wird durch den Korrekturfaktor der EAG-Amplitude berücksichtigt.


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erfolgt nach gleichem Schema eine Überlagerungsreizung mit dem ÜD der Konzentration K2. Nach einem Überlagerungsversuch wird eine Kontrolle durchgeführt, bei der in der „Überlagerungsphase“ die Dauerreizung mit dem UD ausbleibt. Alle anderen Reizungen werden beibehalten. Dann folgt wieder ein Überlagerungsversuch. Zwei Überlagerungsversuche und die Kontrolle ergeben einen kompletten Versuch und werden in einer Datei zusammengefaßt. Abbildung 2.4.2.1 zeigt den typischen Versuchsablauf eines Überlagerungsversuchs mit einer Kartoffelkäferantenne. Als UD wurde T2H1OL (10-6) und als ÜD 2PEOL (10-5 und 10-4) benutzt. Die EAG-Amplituden in der „Kalibrierphase“ des Kontrollversuchs betrugen bei Reizung mit dem UD mit v1 0,168 mV bzw. 0,455 mV bei Reizung mit dem UD mit v2 und bei Reizung mit dem ÜD für die Konzentration K1 (10-5) 0,174 mV bzw. 0,304 mV für die Konzentration K2 (10-4). Im Kontrollversuch betrugen die EAG-Amplituden während der „Überlagerungsphase“ für den ÜD bei Abwesenheit des UD 0,176 mV für K1 und 0,304 mV für K2. Die EAG-Amplituden bei Reizung mit dem ÜD waren in diesem Kontrollversuch nahezu identisch. Die Korrekturfaktoren betrugen für die Konzentration K1 0,99 und für die Konzentration K2 1,00.


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2.4.3 Auswertungsverfahren für die Überlagerungsversuche Für die Auswertung der Überlagerungsversuche werden die Dateien (D02-Datei), welche vom Programm „A04V14“ erstellt werden, mit dem Programm „Pheromon“ (Lüder 1997) bearbeitet. Mit diesem Programm werden die EAG-Amplituden der „Kalibrierphase“ und die EAG-Amplituden auf Reizung mit dem ÜD während der „Überlagerungsphase“ manuell vermessen und die Werte der EAG-Amplituden in eine zweite Datei (E02-Datei) übertragen. Mit einem Tabellenkalkulationsprogramm werden die notwendigen Berechnungen durchgeführt. Die folgenden Gleichungen basieren auf den Annahmen für die Berechnung der Pheromondichte im Freiland (Milli 1993). Für den linearen Bereich der Dosis-Wirkungskurven gelten die Gesetzmäßigkeiten: Für den Überlagerungsduftstoff (ÜD) gilt die Gleichung 1A:

AÜD = R xÜD

AÜD: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem ÜD mit der Konzentration x R: Funktionaler Zusammenhang zwischen EAG-Amplitude und Konzentration des ÜD an der Antenne xÜD: Konzentration des ÜD Für den Untergrundduftstoff (UD) gilt die Gleichung 1B:

AUD = Q uUD

AUD: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem UD mit der Konzentration u Q: Funktionaler Zusammenhang zwischen EAG-Amplitude und Konzentration des UD an der Antenne uUD: Konzentration des UD


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Da die Konzentration der Duftstoffe verändert werden kann, wird die Konzentration wie folgt wiedergegeben (Gleichung 2A und Gleichung 2B):

AnÜD = R υÜD⋅SnÜD

AnUD = Q υUD⋅SnUD

AnÜD: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem ÜD mit der Spritzenbeladung SnÜD

νÜD: Anteil des Reizluftstroms des ÜD im Hauptluftstrom AnUD: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem UD mit der Spritzenbeladung SnUD

νUD: Anteil des Reizluftstroms des UD im Hauptluftstrom In der „Überlagerungsphase“ wird die EAG-Gesamtamplitude im idealen Fall ohne störende Wechselwirkungen wie folgt beschrieben (Gleichung 3):

AÜP = R xÜD

+ Q uÜD

AÜP: EAG-Gesamtamplitude auf Reizung mit dem ÜD mit der Konzentration x und dem UD mit der Konzentration u Für die Berechnung der Pheromonkonzentration im Freiland läßt sich nach Milli (1993) die durch den Zusatzreiz erzeugte EAG-Amplitude mathematisch wie folgt beschreiben (Gleichung 4):

∆An = R ϖx + υSn

− R x

+ Q ϖu

− Q u

∆An: EAG-Amplitude auf Zusatzreizung mit Kalibrierspritze n bei geöffnetem Filter (Umluftmessung) R: Funkt. Zusammenhang zwischen EAG-Amplitude und Pheromonkonzentration an der Antenne ω: Verringerung des Anteils der ungefilterten Umluft im Hauptluftstrom durch Verdrängung durch den Reizluftstrom, der durch die Applikation des Pheromon-Zusatzreizes entsteht x: Pheromonkonzentration in der Umluft ν: Anteil des Reizluftstroms mit Pheromon im Hauptluftstrom Sn: Kalibrierspritze n Q: Funkt. Zusammenhang zwischen EAG-Amplitude und Konzentration anderer Reize an der Antenne u: Konzentration anderer Reize in der Umluft


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Diese Gleichung läßt sich ebenfalls für die Berechnung der durch den UD vorgetäuschten Konzentration x verwenden, wenn folgende Annahmen berücksichtigt werden: 1. Bei der Berechnung des Pheromongehalts in der Umluft ist x die Konzentration des Pheromons in der Umluft (entspricht im Versuch der Hauptluft). Dieser Pheromongehalt in der Hauptluft wird beim Zusatzreizverfahren genau um den Anteil verringert, mit dem der Reizluftstrom (ν) in den Hauptluftstrom appliziert wird (ω=1-ν). Bei den Überlagerungsversuchen befindet sich in der Hauptluft nur die Konzentration des ÜD, die tatsächlich appliziert wird, da stets mit geschlossenem Filter gearbeitet wird. Dadurch findet keine Verringerung des Anteils des ÜD im Hauptluftstrom statt (ω=1). 2. Während bei der Pheromonberechnung x die Konzentration des Pheromons in der Umluft ist, verhält sich dies bei den Überlagerungsversuchen anders. Da im Hauptluftstrom nur die Duftstoffe vorhanden sind, mit denen gereizt wird, sind die Konzentrationen der beteiligen Duftstoffe zu jeder Zeit bekannt. Nur während der Reizung befinden sich Duftstoffe im Hauptluftstrom. Während der „Überlagerungsphase“ wird zuerst mit dem UD gereizt. Kann der UD an den Rezeptoren des ÜD binden, so wird eine Konzentration des ÜD vorgetäuscht. Wird nun zusätzlich zum UD der ÜD appliziert, so ist die Zusatzamplitude ∆An umso geringer, je höher die durch den UD vorgetäuschte Konzentration ist. Nun ist x nicht mehr die Konzentration des Pheromons in der Umluft, sondern spiegelt die durch den UD vorgetäuschte Konzentration des ÜD wider. Aus den Überlegungen 1 und 2 läßt sich die Gleichung 4 zu Gleichung 5 vereinfachen:

∆An = R x + υÜDSn

− R x

∆An: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem ÜD bei gleichzeitiger Reizung mit dem UD R: Funktionaler Zusammenhang zwischen EAG-Amplitude und Konzentration des ÜD an der Antenne x: durch den UD vorgetäuschte Konzentration des ÜD νÜD: Anteil des Reizluftstroms des ÜD im Hauptluftstrom Sn: Spritzenbeladung mit dem ÜD


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Den linearen Bereich der Dosis-Wirkungskurve im halblogarithmischen Maßstab beschreibt die 2-Punkt-Gleichung (Gleichung 6). Verläßt man jedoch diesen Bereich, so erhält man damit nur noch eine Annäherung.

y x

= y x1

+ m⋅log10xx1

y1 = y x1

= y x1

+ m⋅log10xx1

y2 = y x2

= y x1

+ m⋅log10

x2

x1

y2 − y1 = m⋅log10

x2

x1− m⋅log10

x1

x1 mit log10

x1

x1= 0

m =y2 − y1

log10x2

x1

y1: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem Duftstoff mit der Konzentration x1

y2: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem Duftstoff mit der Konzentration x2

x1: niedrigere Konzentration des Duftstoffreizes an der Antenne x2: höhere Konzentration des Duftstoffreizes an der Antenne m: Steigung der Geraden


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Setzt man Gleichung 6 in Gleichung 5 ein, so ergibt sich Gleichung 7:

∆An = y(x1) + m⋅logx + x2

x1

− y(x1) − m⋅logxx1

∆An = m⋅logx + x2

x1

− m⋅logxx1

∆An = m⋅logx + x2

x

10

∆An

m=

x + x2

x

x =x2

10

∆An

m− 1

∆An: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem ÜD bei gleichzeitiger Reizung mit dem UD x1: Konzentration x1 des Reizes mit dem ÜD (υ·S1) x2: Konzentration x2 des Reizes mit dem ÜD (υ·S2) x: Die durch den Untergrundduftstoff vorgetäuschte Konzentration des Überlagerungsduftstoffs Nun werden die Parameter für die Konzentration des Reizes des ÜD in Gleichung 7 eingesetzt und man erhält Gleichung 8:

x =υSn

10

∆An

m− 1

x: Die durch den UD vorgetäuschte Konzentration des ÜD υ: Anteil des Reizluftstroms des ÜD im Hauptluftstrom Sn: Spritzenbeladung mit dem ÜD ∆An: EAG-Amplitude auf Reizung mit dem ÜD bei gleichzeitiger Reizung mit dem UD in mV m: Steigung der Dosis-Wirkungskurve im linearen Bereich in mV/Dekade Mittels der durch den UD vorgetäuschten Konzentration x des ÜD läßt sich unter Berücksichtigung der unterschiedlichen


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Dampfdrücke der beteiligten Duftstoffe die Trennschärfe (TS) des Rezeptors, welcher für den ÜD empfindlich ist, bei Anwesenheit des UD berechnen (Gleichung 9).

TS =υSUD

x

pUD

pÜD TS: Trennschärfe des ÜD-empfindlichen Rezeptors υ: Anteil des Reizluftstroms des UD im Hauptluftstrom SUD: Spritzenbeladung mit dem UD x: Die durch den UD vorgetäuschte Konzentration des ÜD pUD: Dampfdruck des UD pÜD: Dampfdruck des ÜD 2.4.4 Darstellungsproblematik der Ergebnisse und deren Lösung Die Trennschärfe (TS) kann nun berechnet und als Maß für die Selektivität des Rezeptors eingeführt werden. Da der Bereich der Selektivität der Rezeptoren von sehr niedrigen bis zu einer sehr hohen TS reicht, werden für die Darstellung der duftstoff-abhängigen TS eines Rezeptors die Trennschärfenstufe (TSS) als zusätzliches Maß für die Selektivität eingeführt. Die TSS berechnet sich nach Gleichung 10 folgendermaßen:

TSS = log(TS) TSS: Trennschärfenstufe TS: Trennschärfe Damit kann der gesamte Bereich der TS eines Rezeptors in einem angepaßten Maßstab wiedergegeben werden. Da ein Duftstoff sowohl als ÜD als auch als UD in den Überlagerungsversuchen verwendet werden kann, werden die Ergebnisse eines Duftstoffs in 2 Abbildungen getrennt dargestellt. Durch die Trennung nach der Funktion des Duftstoffs im Überlagerungsversuch lassen sich symmetrische, d. h. unabhängig davon ob der Duftstoff als ÜD oder als UD in dem Versuch benutzt wurde, und asymmetrische Wechselwirkungen der Duftstoffe genau erkennen. Anschließend wird mit der Suche nach Duftstoffkombinationen mit hohen TS begonnen. Dabei gilt es gleichzeitig die TS als Berechnungsfehler für den ÜD bei Anwesenheit des UD zu


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bewerten. Der Berechnungsfehler ist der Kehrwert der TS, d.h. eine TS von 100 liefert bei einer Bestimmung der Konzentration des ÜD einen Fehler von 1% bei Anwesenheit des UD mit der im Überlagerungsversuch angegebenen Konzentration. In dieser Arbeit werden 4 Klassen für den Berechnungsfehler eingeführt: Klasse 1 (hellblau): TS: > 100, der Fehler liegt unter 1 % Klasse 2 (dunkelblau): TS: 100 - 10, der Fehler liegt zwischen 1 % - 10 % Klasse 3 (grün): TS: < 10 - 5, der Fehler liegt über 10 % und geht bis maximal 20 % Klasse 4 (rot): TS: < 5, der Fehler liegt bei mindestens 20 %. Mittels der Einteilung der TS in die 4 Klassen können die Wechselwirkungen zwischen den Duftstoffen als orthogonale oder linear abhängige Vektoren definiert werden. Mit den orthogonalen Vektoren läßt sich nach Berglund et al. (1973) ein Duftraum beschreiben. Jeder Punkt in diesem Duftraum läßt sich durch Addition der orthogonalen Vektoren der beteiligten Duftstoffe berechnen. Solche Duftstoffe werden als Basisreizstoffe bezeichnet. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, einen Versuchsablauf und ein Berechnungsverfahren für das Auffinden von Basisreizstoffen zu entwickeln. Für eine orthogonale Duftstoffkombination muß eine TS von mindestens 5 gefunden werden. Damit beträgt der maximale Berechnungsfehler 20 %. Ist die TS niedriger, so gilt die Duftstoffkombination als linear abhängig. Ist die TS für die Duftstoffkombination bei beiden Überlagerungsversuchen ≥ 5, so handelt es sich um eine symmetrische Orthogonalität. Ist nur bei einer der beiden Kombinationen die TS ≥ 5, so liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor. Hängt die Orthogonalität von dem Konzentrationsbereich ab, so spricht man von einer partiellen Orthogonalität. Um aus der Menge der erhaltenen Daten die Basisreizstoffe zu extrahieren wurde ein weiteres Verfahren entwickelt. Dabei werden zuerst alle Duftstoffkombinationen aufgetragen und dann schrittweise die Kombinationen entfernt, die keine Orthogonalität aufweisen. Am Ende werden nur die Kombinationen dargestellt, bei denen eine symmetrische Orthogonalität entdeckt wurde. So können Duftstoffe gefunden werden, die eine geringe Wechselwirkung mit anderen Duftstoffen haben.


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2.4.5 Versuchsdurchführung zur Bestimmung der Symmetrieeigenschaften Zur Beschreibung der Eigenschaften des Pheromon-EAG-Systems und des MD-EAG-Systems wurden Messungen der Duftstoffquellen (Spritzensymmetrie) und der Applikationsstellen (Positions-symmetrie) mit unterschiedlichen Mischeinrichtungen durchgeführt. Mit diesen Symmetriemessungen können systematische Fehler gefunden und bewertet werden. Systematische Fehler können z.B. durch geringe Konzentrationsunterschiede von gleich beladenen Spritzen zustande kommen oder durch eine schlechte Vermischung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom. Eine homogene Vermischung des Reizluftstrom mit der Hauptluftstrom ist notwendig, um eine genaue Bestimmung der Konzentration des Duftstoffs an der Stelle der Antenne durchführen zu können. Der Versuchsdurchlauf beginnt mit der Präparation der Antenne von Lobesia botrana (s.o.). Anschließend wird das Messkammer-unterteil an das Meßkammeroberteil angeschlossen. Die Applikationsstellen werden mit zwei gleich beladenen Spritzen und einer höher konzentrierten Spritze bestückt, z. B. 2 Spritzen mit der Konzentration 10-5 und eine Spritze mit der Konzentration 10-4. Die Steuerung des Versuchsablaufs erfolgt ebenfalls über das Programm „A04v14“. Jedoch muß der Ablauf zuvor an die Versuchsbedingungen für die Symmetriemessungen angepaßt werden. Nach 4 Sekunden erfolgt eine 1 Sekunde anhaltende Reizung mit einer der beiden gleich beladenen Spritzen. Nach 3,4 Sekunden wird mit der anderen Spritze für 1 Sekunde gereizt. Danach erfolgt ebenfalls nach 3,4 Sekunden die Reizung mit der Spritze mit der höchsten Duftstoffbeladung. Es folgt eine 5 Sekunden dauernde Pause, danach wiederholt sich die Serie von Reizen zweimal unterbrochen von einer 5 Sekunden langen Pause. Jede Spritze wird in einem Sweep somit dreimal benutzt. Nach dem Sweep werden die beiden gleich beladenen Spritzen so ausgetauscht, daß jede an der Applikationsstelle der anderen Spritze für den folgenden Sweep verwendet wird. Die Spritze mit der höchsten Duftstoffbeladung bleibt an der selben Applikationsstelle. Der Versuchsablauf des 2. Sweeps ist identisch mit dem des 1. Sweeps und beide werden in einer Datei zusammengefaßt. Mit dem Programm „Pheromon“ werden die EAG-Amplituden der beiden Sweeps vermessen und mit einem Tabellenkalkulationsprogramm die Berechnungen für die Symmetrie-eigenschaften durchgeführt.


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Zur Berechnung der Spritzensymmetrie wurden zuerst die Konzentrationen der beiden gleich beladenen Spritzen folgendermaßen berechnet: Zunächst wird die Antennenempfindlichkeit m berechnet:

m = A3P3 −A1P1 − A2P2

2 mit S3=10S1

m: Antennenempdindlichkeit A1P1: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Spritze 1 an der Applikationsstelle 1 A2P2: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Spritze 2 an der Applikationsstelle 2 A3P3: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Referenz-Spritze 3 an der Applikationsstelle 3 Sn: Beladung der Spritze n Nun kann die Konzentration K der Spritze n an der Position o berechnet werden.

KnPo = 10∆Am K3 ∆A = AnPo − A3

KnPo: ermittelte Konzentration der Spritze n an der Applikationsstelle o K3: Konzentzration der Referenz-Spritze 3 (höchst beladene Spritze, z.B. 10-4) ∆A: Differenz der EAG-Amplitude durch Reizung mit der Spritze n an der Applikationsstelle o und der EAG-Amplitude durch Reizung mit der Refferenzspritze 3 m: Antennenempfindlichkeit AnPo: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Spritze n an der Applikationsstelle o A3: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Referenz-Spritze 3


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Abb. 2.4.5.1: EAG-Messung zur Bestimmung der Symmetrie-eigenschaften. In diesem Versuch wurden Spritzen 4505 () und 5505 () mit dem Pheromon von Lobesia botrana mit der Konzentration 10-5 beladen. Es wurde getestet, ob trotz der gleichen Beladung gleiche EAG-Amplituden erzeugt werden, was auf eine tatsächliche Gleichheit der Konzentration der beiden Spritzen zurückzuführen ist. Als Referenz wird die 10fach höher konzentrierte Spritze 2504 () verwendet. Durch Positions-tausch der Spritzen 4505 und 5505 wird die Spritzen- und Positions-symmetrie ermittelt. Die rote Spur zeigt den Zeitpunkt der Applikation an.


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Wie in Abb. 2.4.5.1 zu sehen ist, wurde mit jeder Spritze 3 mal in einem Sweep gereizt. Die 3 EAG-Amplituden auf die Reize 4505, 5505 und 2504 werden immer zu einer Serie zusammengefaßt, so daß pro Sweep 3 Konzentrationswerte für eine Spritze entstehen. Diese Konzentrationswerte einer Spritze werden dann für eine Applikationsstelle geometrisch gemittelt. Somit ergeben sich pro Spritze 2 Konzentrationswerte. Aus diesen Werten läßt sich dann die Spritzensymmetrie (SPS) wie folgt ermitteln:

SPS =

K1P1

K2P1

K1P2

K2P2

SPS: Verhältnis der ermittelten Konzentrationen der beiden gleich beladenen Spritzen 1 und 2 K1P1: ermittelte Konzentration der Spritze 1 an der Applikationsstelle 1 K1P2: ermittelte Konzentration der Spritze 1 an der Applikationsstelle 2 K2P1: ermittelte Konzentration der Spritze 2 an der Applikationsstelle 1 K2P2: ermittelte Konzentration der Spritze 2 an der Applikationsstelle 2 Für die Berechnung der Positionssymmetrie (POS) wird ebenfalls mit den berechneten Konzentrationen der Spritzen gearbeitet. Dazu wird folgende Gleichung benutzt:

POS =K1P1

K1P2

K2P1

K2P2 POS: Verhältnis der ermittelten Konzentrationen einer Spritze in Abhängigkeit der verwendeten Applikationsstellen 1 und 2 K1P1: ermittelte Konzentration der Spritze 1 an der Applikationsstelle 1 K1P2: ermittelte Konzentration der Spritze 1 an der Applikationsstelle 2 K2P1: ermittelte Konzentration der Spritze 2 an der Applikationsstelle 1 K2P2: ermittelte Konzentration der Spritze 2 an der Applikationsstelle 2 Für SPS und POS gilt, daß der berechnete Wert 1 einer vollkommenen Übereinstimmung gleich kommt. Ein Wert von 1,05 für die SPS würde z. B. bedeuten, daß die Konzentration der Spritze 1 um 5 % höher wäre als die der Spritze 2. Ein Wert von 0,88 für die POS bedeutet, daß die gemessene Konzentration einer Spritze an der Applikationsstelle 1 88 % der gemessenen Konzentration an der Applikationsstelle 2 beträgt. Die Reizungen an Applikationsstelle 2 verursachen also höhere EAG-Amplituden. Der


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Einfluß der drei Applikationsstellen sollte jedoch gleich sein (POS=1), so daß am Ort der Antenne immer die gleiche Konzentration derselben Spritze unabhängig von der Applikationsstelle gemessen wird. Dadurch können zwei wichtige systematische Fehler vermieden werden. Die Spritzensymmetrie, die sich aus insgesamt 20 Messungen mit 4 verschiedenen Mischvorrichtungen ergab, liegt für die Spritzen 5505 und 4505 bei 1,037 ± 0,037. Dieses Verfahren zeigt, daß die beiden verwendeten Spritzen 5505 und 4505 gleich hohe EAG-Amplituden erzeugten. Einige Versuche zeigten deutliche Unterschiede der beiden gleich beladenen Spritzen auf. Dies ist möglicherweise auf einen apparativen Fehler zurückzuführen. Ist der Reibungswiderstand einer Spritze hoch, so nimmt der Gummistopfen so viel Energie auf, bis der Reibungswiderstand überwunden ist. Danach gleitet der Glaskolben leicht in der Glasspritze. Die im Gummistopfen gespeicherte Energie läßt den Glaskolben nun schneller bewegen als dies der Fall wäre, wenn der Glaskolben von Anfang an leicht gängig gewesen wäre. In diesem Fall wäre mit einer stetigen Bewegung zu rechnen. Blockiert der Glaskolben, so beschleunigt dieser nach Überwinden der Blockade überproportional im Vergleich zur leicht gängigen Spritze. Die Duftstoffkonzentration im Reizluftstrom ist dementsprechend höher, die Antenne reagiert mit einer höheren EAG-Amplitude. Mittels dieser Betrachtungsweise ließe sich ein variabler Konzentrationsunterschied der Spritzen erklären. Für die Symmetriemessung der Spritzen wurde ein zweites Verfahren eingeführt. Mit dem MD-EAG-System können an der Applikationsstelle 1 mehrere Spritzen nacheinander benutzt werden. Die gleich beladenen Spritzen werden auf der Trommel befestigt, die Spritze mit der höchsten Beladung an einer der beiden freien Applikationsstellen eingelegt und die andere freie Applikationsstelle dicht verschlossen. Nachdem das Meßkammerunterteil an das Meßkammeroberteil befestigt wird, wird das Programm „A04v14“ gestartet. Nach weiteren 4 Sekunden wird die Antenne mit einem 1 Sekunde dauernden Reiz mit der Vorschubrate 5 (υ=0.031) stimuliert. Nach einer Pause von 4 Sekunden wird ein 1 Sekunden langer Reiz mit der Vorschubrate 13 (υ=0.31) appliziert. Nach weiteren 4 Sekunden folgt eine Reizung mit der höchst beladenen Spritze. Der Spritzenwechsel folgte nach 14,25 Sekunden. 7,75 Sekunden nach Beginn des Spritzenwechsels erfolgt der gleiche Reizablauf, nur mit der zweiten gleich beladenen Spritze. Entsprechend diesem Verlauf wurde eine


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Serie von 8 Messungen durchgeführt. Nach der Serie wurde die Reihenfolge der beiden gleich beladenen Spritzen gewechselt und 6 Messungen durchgeführt. Die Spritze, mit der in der ersten Serie als erstes gereizt wurde, wurde in der zweiten Serie nach dem Spritzenwechsel verwendet. Dem Versuchsablauf entsprechend, muß die Berechnung für die Konzentration der beiden Spritzen angepaßt werden. Für die Berechnung der Spritzensymmetrie mit Versuchen mit dem MD-EAG-System gelten deshalb die Gleichungen: Zur Bestimmung der Antennenempfindlichkeit m:

m =

Ai + Ai+1

A1 + A2 m: Antennenempfindlichkeit Ai: EAG-Amplitude auf i-te Reizung mit der Referenz-Spritze 3 Ai+1: EAG-Amplitude auf i+1-te Reizung mit der Referenz-Spritze 3 A1: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Spritze 1 A2: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Spritze 2 Nun läßt sich die Konzentration der Spritzen wie folgt berechnen:

Kn = 10∆Am K3 ∆A = An − A3

Kn: ermittelte Konzentration der Spritze n K3: Konzentration der Referenz-Spritze 3 ∆A: Differenz der EAG-Amplitude zur Reizung mit der Spritze n und der EAG-Amplitude auf Reizung mit der Referenzspritze 3 in mV m: Steigung in mV/Dekade An: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Spritze n in mV A3: EAG-Amplitude auf Reizung mit der Referenz-Spritze 3 in mV


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Die Spritzensymmetrie läßt sich nun aus den beiden bekannten Konzentrationen der zu vergleichenden Spritzen wie folgt berechnen:

SPS =K1

K2 SPS: Verhältnis der beiden gleich beladenen Spritzen 1 und 2 K1: ermittelte Konzentration der Spritze 1 K2: ermittelte Konzentration der Spritze 2 Nun läßt sich das Verhältnis der Konzentrationen der gleich beladenen Spritzen berechnen. Die Spritze 5505 hatte in 13 der 14 Versuche eine höhere Konzentration (1,06·10-5 ± 1,27·10-7) als die Spritze 6505 (9,42·10-6 ± 1,27·10-7). Die Spritze 5505 hatte eine um 13 % ± 3 % höhere Konzentration als die Spritze 6505. Wurde die Spritze 5505 als erste Spritze verwendet, so war die ermittelte Konzentration um 15 % ± 4 % höher, wurde die Spritze 6505 dagegen als erste benutzt, so war die Konzentration der Spritze 5505 um 11 % ± 3 % höher. Abbildung 2.4.5.2 zeigt einen typischen Versuchsablauf zur Bestimmung der Spritzensymmetrie mit dem MD-EAG. Der Versuch begann mit Reizung durch die erste der beiden zu vergleichenden Spritzen mit niedriger Vorschubrate. Danach wurde die Vorschubrate um das 10fache erhöht. Dadurch sollte geklärt werden, ob eine Verzehnfachung der Vorschubrate gleiche EAG-Amplituden auslöst wie eine Verzehnfachung der Spritzenbeladung. Es folgte die Reizung mit der Referenz-Spritze. Danach vollzog sich der automatische Spritzenwechsel und nun konnte mit der zweiten zu untersuchenden Spritze gereizt werden. Im darauf folgenden Sweep wurde die Reihenfolge der zu vergleichenden Spritzen vertauscht. Dadurch brauchte man bei der Berechnung den Einfluß möglicher Störgrößen wie z. B. Ermüdungserscheinungen der Antenne nicht berücksichtigen.


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Abb. 2.4.5.2: Spritzensymmetriemessung mit dem MD-EAG. Obere Abb.: Applikation der Spritze 5505 () mit der Vorschubrate υ=0.031, danach Applikation mit υ=0.31. Es folgt die Reizung mit der Referenz-Spritze 2504 (). Nach dem automatischen Spritzen-wechsel erfolgt die Reizung durch die Spritze 6505 () mit der Vorschubrate υ=0.031 und anschließend mit υ=0.31. Danach wird erneut mit der Referenz-Spritze gereizt. Untere Abb.: Die Reihenfolge der Reizung mit den Spritzen 5115A und 5115B wird die Reihenfolge getauscht. Es erfolgt zuerst die Applikation der Spritze 5115B nach gleichem Ablauf. Die rote Spur zeigt den Zeitpunkt der Applikation.

3. Apparativer Teil

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3. Apparativer Teil Aufgabe dieser Arbeit ist ein EAG-System zu entwickeln, mit dem man komplexe Duftstoffgemische analysieren kann. Dazu benötigt man einen Satz von Basis-Reizstoffen, mit denen das Duftstoffgemisch „abgetastet“ werden kann. Ein Basis-Reizstoff soll bei niedriger Konzentration eine hohe EAG-Amplitude auslösen und sich durch Gegenwart eines anderen Basis-Reizstoffs nicht beeinflussen lassen. Ein solches Verhalten wird dann als Orthogonalität (TS 5) bezeichnet. Je mehr solche Basis-Reizstoffe zur Verfügung stehen, desto genauer wird die Analyse. Das vorhandene EAG-System zur Messung der Pheromonkonzentration im Freiland (Pheromon-EAG-System) kann maximal mit 2 Basis-Reizstoffen arbeiten. Das neue MD-EAG-System soll bis zu 7 Basis-Reizstoffe mit je 2 Konzentrationen für die Analyse verwenden. Dazu wurde das vorhandene EAG-System für die neue Aufgabe weiterentwickelt. Das neue MD-EAG-System soll weiterhin für Pheromonmessungen im Freiland verwendbar sein. 3.1 Allgemeiner Aufbau und Technik des EAG-Systems Um einen Überblick über den Aufbau eines EAG-Systems und die Aufgaben der Module zu bekommen, werden an dieser Stelle die Module des EAG-Systems für Freilandmessungen eingeführt und erklärt. Die Meßvorrichtung besteht aus drei Hauptkomponenten: der Meßsonde, der Registrier- und Steuereinheit und der Stromversorgung. Die Meßsonde ist über ein Kabel mit der Registrier- und Steuereinheit und mit der Stromversorgung verbunden. Die Stromversorgung generiert aus einer Spannungsquelle (Autobatterie 12 V) die Gleichspannungen von ±5 V, ±12 V und ±15 V versorgt damit die Meßsonde und den PC mit Strom. Die Registrier- und Steuereinheit besteht aus einem umgebauten 486-PC mit integrierter A/D-Karte (DT2814, DATA Translation, Fa. Stemmer), dem Interface und dem EAG-Hauptverstärker. Das Programm „A04V14“ steuert den Ablauf des Versuchs, indem es Codes über die parallele Schnittstelle des PC zum Interface sendet. Dort werden die Codes in Steuersignale umgesetzt, die über ein Kabel zur Meßsonde weitergeleitet werden. Der EAG-Hauptverstärker verstärkt die EAG-Signale und filtert das EAG-Signal. Die Abtastfrequenz des A/D-Wandlers beträgt 20 Hz.

3. Apparativer Teil

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Die Meßsonde ist der Teil der Apparatur, in dem die eigentliche Messung abläuft. Sie besteht im Wesentlichen aus einem vertikalen Glasrohr (Hauptrohr), an dem sich weitere Module befinden. Das obere Ende des Hauptrohrs kann durch einen Aktivkohlefilter geschlossen werden. Am unteren Ende sitzt die Meßkammer, in der die empfindliche Insektenantenne - von der Umgebung abgeschirmt – befestigt ist. Die Meßkammer besteht aus einem Meßkammeroberteil, welches fest mit dem Hauptrohr verbunden ist, und einem Meßkammerunterteil. Im Meßkammerunterteil befindet sich der Antennenhalter. Am Ausgang der Meßkammer erzeugt eine Saugpumpe einen gleichmäßigen Luftstrom (Hauptluftstrom). Zwischen Aktivkohlefilter und Meßkammer befindet sich der Injektor, durch den die Duftstoffquellen mit dem Hauptrohr verbunden sind. Wird eine Duftstoffquelle aktiviert, so wird ein Reizluftstrom erzeugt, der in den Hauptluftstrom und von dort zur Antenne gelangt. Die Antenne reagiert mit einer Änderung des Potentials (EAG-Amplitude) auf diesen Reiz. Dieses Signal wird an der Meßsonde vorverstärkt, gefiltert und über ein abgeschirmtes Kabel zur Registrier- und Steuereinheit geleitet. Die Meßsonde ist mit dem Rest der Meßeinrichtung nur über ein Kabel verbunden, so daß ein bestimmter Grad an Bewegungsfreiheit erreicht werden kann. Durch diese Trennung können z. B. Messungen in unterschiedlicher Höhe durchgeführt werden. Dazu wird die Meßsonde auf einem Laufwagen befestigt, der auf einem speziellen Stativ vertikal beweglich ist. Damit ist die Sonde vom Boden bis zu 3 m Höhe kontinuierlich verstellbar. Im Folgenden werden die Module der Meßsonde genauer beschrieben. Das Hauptrohr besteht aus Glasröhrchen mit einem Innendurchmesser von 6 mm und verbindet die Meßkammer mit dem Injektor. Das Hauptrohr hat je nach verwendeter Mischeinrichtung eine unterschiedliche Gesamtlänge und Anzahl an Glasröhrchen. Zwischen den Glasröhrchen befinden sich Ringe aus Edelstahl bzw. Teflon mit Düsen, welche eine homogene Vermischung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom erzeugen sollen. Das Hauptrohr endet am oberen Ende in der unteren Anschlußöffnung des Injektors und am unteren Ende im Meßkammeroberteil. Der Injektor ist das Verbindungsstück zwischen Hauptrohr, Aktivkohlefilter und den Duftstoffquellen. In der horizontalen Ebene befinden sich 3 Öffnungen mit jeweils einer Aussparung

3. Apparativer Teil

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(Applikationsstelle) für die Duftstoffquelle. Die Duftstoffquelle wird so eingeführt, daß das vordere Ende mit dem Einschußloch dicht abschließt. Damit die Duftstoffquelle fest positioniert ist, wird sie durch einen Federmechanismus im Aufnahmeblock gehalten. In der oberen Anschlußöffnung des Injektors befindet sich ein Glaskonus, mit dem der Aktivkohlefilter luftdicht angeschlossen werden kann. Der Aktivkohlefilter ist an zwei Drahtseilen befestigt, die über eine Antriebsstange und zwei Räder gewickelt sind. Die Antriebsstange wird über ein Tragegestell oberhalb des Injektor mit der Meßsonde gehalten und wird durch einen DC-Motor (Faulhaber 1524E-012S ) bewegt. Dadurch können die Drahtseile mit dem Filter nach oben gezogen werden, bis der Filter einen Endabschalter betätigt, der die Stromzufuhr zum DC-Motor unterbricht. Wenn der Filter auf dem Glaskonus des Injektors abgesenkt ist, gelangt nur gefilterte Luft in das Hauptrohr. In diesem Zustand wird die Kalibrierung des Systems für Freilandmessungen durchgeführt; in dieser Arbeit wurde nur mit geschlossenem Filter gearbeitet. Ist der Filter geöffnet, so kann die Messung zur Bestimmung der Konzentration in der Außenluft stattfinden. Die Duftstoffquellen sind mittels des Injektors mit dem Hauptrohr verbunden. Als Duftstoffquellen werden Spritzen (20ml Fortuna Optima Glasspritze, Firma Poulten & Graf) benutzt. Die Glasspritze wird am vorderen Ende durch einen eigens entwickelten Metallkonus abgeschlossen und am hinteren Ende grenzt ein Glaskolben das Spritzenvolumen von der Außenluft ab. Im Glaskolben befindet sich ein Gummistopfen. In den Gummistopfen wird die Antriebsstange gesteckt und diese mittels eines Antriebsklotzes mit einem Drahtseil verbunden. Das Drahtseil ist um die Antriebsachse eines Schrittmotors und um ein Umlenkrad gewickelt. Die zwei Enden des Drahtseils werden durch eine Feder miteinander verbunden. Durch eine Verbindung zwischen dem elastischen Gummistopfen und der Antriebsstange, die in den Gummistopfen gesteckt wird, werden einzelne ruckartige Schritte des Schrittmotors gedämpft und eine gleichmäßige Bewegung erzielt. Wird der Schrittmotor aktiviert, so wickelt sich das Drahtseil auf der Motorachse weiter, wodurch die Antriebsstange und der Glaskolben in der Spritze verschoben werden. Die Vorwärtsbewegung des Glaskolbens erzeugt einen Überdruck innerhalb der Spritze, der das mit Duftstoff gefüllte Spritzenvolumen in den Hauptstrom einströmen läßt (Reizluftstrom). Je nach Frequenz des Schrittmotors (Vorschubrate) wird mehr oder weniger des Spritzenvolumens in derselben Zeit in

3. Apparativer Teil

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den Hauptluftstrom injiziert und dadurch die Konzentration des Duftstoffs im Hauptluftstrom gesteuert. Die Mischeinrichtung befindet sich unterhalb des Injektors und soll den Reizluftstrom mit dem Hauptluftstrom homogen vermischen. Dies ist für eine genaue Kalibrierung bzw. Vermischung des Überlagerungsduftstoffs mit dem Untergrundduftstoff notwendig. Die Mischeinrichtung besteht aus einer definierten Anzahl von Edelstahlringen (Düsenringe), die je nach Typ eine oder mehrere Düsen mit radialer oder tangentialer Ausrichtung besitzen. Eine Druckpumpe erzeugt einen Luftstrom, der durch einen Aktivkohlefilter fließt, dort gefiltert wird und durch den Düsenring in den Hauptluftstrom gelangt. Dieser Querluftstrom soll zum einen Wandkontakte des Duftstoffs mit dem Hauptrohr vermindern und zum anderen für eine homogene Vermischung sorgen. Die EAG-Signale entstehen in der Meßkammer, die aus einem Meßkammeroberteil und einem Meßkammerunterteil besteht. In dem Meßkammerunterteil befindet sich der Antennenhalter, in den die Insektenantenne eingelegt wird. Der Antennenhalter ist so konstruiert, daß die Enden der eingelegten Antenne mit zwei Ag/AgCl-Elektroden Kontakt haben. Der Antennenhalter besitzt in der Mitte eine runde Öffnung mit einem Durchmesser von 5 mm, die durch eine Art unterbrochenen Steg durchquert wird. Dieser Steg hat die Aufgabe, die Enden der Antenne aufzunehmen und die Antenne über die Öffnung hinweg zu spannen. Dies ist notwendig, da viele Insektenantennen kürzer als 5 mm sind und die Antenne somit nicht über die Öffnung gelegt werden könnte. Der Antennenhalter besitzt zwei Vertiefungen, in denen Ringerlösung als leitendes Medium zwischen den Enden der Antennen und den Elektroden dient. Es gibt mehrere Typen des Antennenhalters, die sich in der Spaltbreite unterscheiden. Die Elektroden werden über ein Koaxialstecker an dem Meßkammerunterteil mit dem Vorverstärker verbunden. Weiterhin besitzt das Meßkammerunterteil eine Steckverbindung, an der ein Schlauch zur Saugpumpe angeschlossen wird, die den geregelten Hauptluftstrom erzeugt. Es folgt nun eine kurze Beschreibung des technischen Ablaufs der EAG-Messung: Kalibrierung des EAG-Systems:

3. Apparativer Teil

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Eine angeschlossene Saugpumpe erzeugt in der Meßkammer einen Unterdruck, welcher im Hauptrohr einen zur Antenne gerichteten und definierten Hauptluftstrom bewirkt. In diesen Hauptluftstrom können in den Injektor Reizluftströme verabreicht werden, welche in den Hauptluftstrom gelangen und sich mittels der Mischeinrichtung mit diesem vermischen. Der Hauptluftstrom gelangt durch das Hauptrohr zur Antenne. Ist der Filter geschlossen, so können keine Duftstoffe aus der Außenluft an die Antenne gelangen. In diesem Zustand kann der Null-Punkt des Systems gemessen werden. Wird ein Reizluftstrom erzeugt, so gelangt dieser in den Hauptluftstrom, vermischt sich mit diesem und gelangt zur Antenne, welche auf den Duftreiz mit einer Änderung des Potentials reagiert. Die Dauer des Reizluftstroms beträgt zwischen 0,5 Sekunden und 1,5 Sekunden, so daß danach das Potential der Antenne wieder auf den Anfangswert zurückkehren kann. Durch Änderung der Konzentration des Duftstoffs im Reizluftstrom kann dann eine Dosis-Wirkungskurve erstellt werden. Mittels dieser Kalibrierung kann die Konzentration des Duftstoffs in der Außenluft ermittelt werden. Messung der Duftstoffkonzentration in der Außenluft: Nach der „Kalibrierphase“ wird der Filter geöffnet und ungefilterte Außenluft gelangt in das Hauptrohr und mit dem Hauptluftstrom zur Antenne. Die Antenne reagiert auf Duftstoffe aus der Außenluft und das EAG-Signal zeigt einen schnellen Anstieg auf einen konstanten Wert (Plateau) an. Dieses Signal wird jedoch nicht nur durch Duftstoffmoleküle des zu untersuchenden Duftstoffs erzeugt, sondern auch durch zusätzliche andere Duftstoffe, Feuchtigkeit und CO2 in der Außenluft (Kennedy 1977, Guerin & Visser 1980, Fu-Shun & Visser 1982, Mankin & Mayer 1983, Nottingham & Coaker 1987, Light 1988). Die Höhe des Plateaus spiegelt somit nicht nur die Konzentration des zu untersuchenden Duftstoffs wider, sondern eher ein Gemisch aus allen erwähnten Faktoren. Um diese störenden Einflußfaktoren zu eliminieren, wird bei Freiland-messungen das Zusatzreizverfahren (Milli 1990, Sauer 1991, Termer 1992) benutzt. Bei diesem Verfahren werden bei geöffnetem Filter Reizluftströme in die Hauptluft verabreicht, so daß zu der Duftstoffmenge aus der Außenluft noch eine zusätzliche bekannte Duftstoffmenge durch den Reizluftstrom in den Hauptluftstrom beigemischt wird. Die auf dem Plateau entstehende Zusatzantwort der Antenne läßt Rückschlüsse auf die Gesamtmenge des Duftstoffs zu, die zum Zeitpunkt des Zusatzreizes vorhanden war. Die Genauigkeit der Konzentrations-bestimmung des zu untersuchenden Duftstoffs hängt u.a. von

3. Apparativer Teil

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möglichen Wechselwirkungen mit anderen Duftstoffen ab. Verhält sich der Duftstoff zu allen anderen Duftstoffen orthogonal, wie es bei Pheromon und Pflanzenduftstoffen oft vorkommt, so kann allein über die Höhe der Zusatzantwort der Antenne die Konzentration des Duftstoffs in der Außenluft berechnet werden. In der Literatur wird dieser Zusammenhang von sich nicht beeinflussenden Duftstoffen als „cross-adaption“ bezeichnet (Baker & Roelofs 1976, Miller et al. 1977, Roelofs 1978, 1979, Borst 1984, Mayer et al. 1984, Rumbo 1988, Borroni & Atema 1989). Nach dieser Hypothese läßt sich die Gesamt-EAG-Amplitude aus der Summe der Einzel-EAG-Amplituden aller aktivierter Rezeptortypen addieren. Dies konnte Sauer (1991) für bestimmte Pflanzen-duftstoffe und das Lobesia-Pheromon nachweisen. 3.2 Anforderungen an das EAG-System Ein EAG-System zur Bestimmung der Konzentration eines Duftstoffes muß mobil sein, um am Ort des Duftstoffs messen zu können. Dies wird erreicht, indem die Meßsonde vom Rest des Systems bis auf ein Kabel getrennt wird. Somit muß nur noch die Meßsonde bewegt werden. Um eine möglichst genaue quantitative Analyse eines Duftstoffs durchführen zu können, soll ein möglichst großer Konzentrations-bereich der Dosis-Wirkungskurve durch Applikation der Spritzen abgedeckt werden. Dazu benötigt man mehrere solcher Spritzen. Bei dem Verfahren zur Bestimmung der Pheromonkonzentration im Freiland werden für die Messung 3 Spritzen verwendet. Ein solches EAG-System muß ein geringes Gewicht haben, um einen mobilen Einsatz gewährleisten zu können. Zudem soll die angesaugte Außenluft oberhalb der Einstromlochs am oberen Ende des Glaskonus mit möglichst wenig adsorbierendem Material in Berührung kommen. Die wichtigsten Anforderungen an das EAG-System sind eine möglichst hohe Reproduzierbarkeit der Messungen und eine möglichst hohe Empfindlichkeit des Systems gegenüber geringen Konzentrationen. Daher ist zu fordern, daß die EAG-Amplitude auf Reizung mit ein und derselben Spritze immer die gleiche bleibt, unabhängig davon, an welcher Applikationsstelle diese verwendet wurde. Weiter muß eine möglichst gleichmäßige Verteilung des Duftstoffs im Hauptluftstrom vorhanden sein, damit das Zusatzreizverfahren reproduzierbare und berechenbare Ergebnisse liefert.

3. Apparativer Teil

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3.2.1 Verteilung des Duftstoffs entlang des Querschnitts Eine gleichmäßige Verteilung der Duftstoffmoleküle im Hauptluftstrom am Ort der Antenne ist eine der wichtigsten Anforderungen an das EAG-System, da die Sensillen auf der Antenne artspezifisch verteilt sind, die EAG-Amplituden konzentrationsabhängig sind und die Berechnung des Zusatzreizverfahrens eine gleichmäßige Verteilung der Duftstoffe im Hauptluftstrom voraussetzt. Abbildung 3.2.1.1 zeigt zwei Messungen mit der Mischeinrichtung 1 entlang des Querschnitts in Richtung der Applikationsstelle 2 (Spritze 5·10-5). Mit eingeschalteter Querluft von 16 l/h (obere Abbildungen) konnte in der Mitte des Hauptrohrs der erwartete logarithmische Zusammenhang zwischen der Konzentration der verwendeten Spritzen und den EAG-Amplituden beobachtet werden. Die Spritze (5·10-5), in deren Richtung die Meßkammerunterseite bewegt wurde, erzeugte bei eingeschalteter Querluft geringere EAG-Amplituden als bei ausgeschalteter Querluft. Diese Verringerung der EAG-Amplituden kam durch die Verdünnung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom zustande. Ohne Querluft findet die Vermischung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom nicht statt und der Reizluftstrom gelangt als Duftfahne unverdünnt zur Antenne. Dieser Mischeffekt fehlte bei Reizung mit den anderen beiden Spritzen ebenfalls. Somit müßten auch diese Reizluftströme höhere Amplituden erzeugen als Reizluftströme mit eingeschalteter Querluft. Dies war bei der Spritze 2·10-5 auch der Fall. Wieso die Spritze mit der höchsten Beladung (10-4) nicht die höchsten EAG-Amplituden auslöste, bleibt ungeklärt. Die Ergebnisse zeigen, daß im Zentrum der Querschnittsfläche (2.5 mm bis 1,5 mm), dort wo die Antenne positioniert ist, bei eingeschalteter Querluft eine gleichmäßige Verteilung des Duftstoffs im Hauptluftstrom vorhanden ist. In der Nähe des Randes (-0,05 mm bis 1 mm) ist keine homogene Verteilung mehr zu finden. Ohne Querluft findet nur bedingt eine Vermischung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom statt.

3. Apparativer Teil

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Messung mit Querluft

Messung ohne Querluft

Abb. 3.2.1.1.: EAG-Messung mit der Mischeinrichtung 1 zur Bestimmung der Verteilung des Duftstoffs entlang des Radius. Obere Abb.: Mit eingeschalteter Querluft erfolgt eine homogenere Vermischung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom um den Mittelpunkt (2,5 mm bis 1,5 mm). Am Rand (1 mm bis –0,05 mm) wird der erwartete logarithmische Zusammenhang zwischen Konzentration und EAG-Amplitude nicht gefunden. Untere Abb.: Ohne Querluft erfolgt auch in der Mitte keine homogene Verteilung des Duftstoffs. Die Spritze, zu der der Antennenhalter verschoben wird, löst die stärksten EAG-Amplituden aus. Weiße Balken: Spritzenbeladung 2•10-5; graue Balken: Spritzenbeladung 5•10-5, schwarze Balken: Spritzenbeladung 10-4.

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Simulationen mit dem Programm „Fluent“ zeigten, daß bei ausgeschalteter Querluft sich der Reizluftstrom nahe am Rand des Hauptrohrs nach unten zur Antenne bewegt (pers. Mitt. J. Zastrau). Dies konnte eindeutig durch die Meßergebnisse bestätigt werden (untere Abbildungen). Da der Antennenhalter zum Rand hin bewegt wurde, nahm die Konzentration des Reizluftstroms der Spritze 5·10-5 im Verhältnis zu den beiden anderen Reizluftströmen der beiden anderen Spritzen zu und die EAG-Amplituden wurden größer. Berücksichtigt man die im Laufe der Zeit geringer werdende Antennenempfindlichkeit, so traf dies zu. Dies zeigt der Vergleich der ersten Messung des Versuchs (links: 2,5 mm) mit der letzten Messung des Versuchs (rechts: 2,5 mm). Diese Messung veranschaulicht, wieso eine Mischeinrichtung notwendig ist. Ohne eine Mischeinrichtung existiert kein definierter Zusammenhang zwischen der Konzentration des Duftstoffs im Reizluftstrom und der ausgelösten EAG-Amplitude unabhängig von der Lage der Antenne im Hauptluftstrom. Man benötigt einen definierten Zusammenhang zwischen Konzentration des Reizluftstroms und der EAG-Amplitude, um eine Dosis-Wirkungskurve erstellen zu können. Mittels der Dosis-Wirkungskurve (Zwei-Punkt-Gleichung Kap. 2.3.3) läßt sich dann entweder die Konzentration des Duftstoffs im Freiland oder die durch den UD vorgetäuschte Konzentration des ÜD (2-Punkt-Gleichung Kap. 2.3.3) berechnen. 3.2.2 Messungen zur Bestimmung des Meßfehlers mit unterschiedlichen Mischeinrichtungen Für eine reproduzierbare Bestimmung der Dosis-Wirkungskurve ist zu fordern, daß die EAG-Amplitude auf Reizung mit einer bestimmten Spritze unabhängig davon ist, an welcher Applikationsstelle diese Spritze angebracht war. Die Überprüfung eines Zusammenhangs zwischen EAG-Amplitude und der Applikationsstelle der Spritze nennt man Messung der Positionssymmetrie (POS). Die POS ist dabei das Verhältnis der ermittelten Konzentrationen einer Spritze in Abhängigkeit der beiden verwendeten Applikationsstellen (siehe Kap. 2.4.5). Diese Forderung wurde mit folgenden 5 Mischeinrichtungen überprüft:

3. Apparativer Teil

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Mischeinrichtung 1: 2 Düsenringe auf 2 Ebenen mit je 3 tangential

ausgerichteten Düsen, Düsenposition beträgt 0° zur Applikationsstelle.

Mischeinrichtung 2: 1 Doppeldüsenring mit 3 radial ausgerichteten

Doppeldüsen, Düsenposition beträgt 0° zur Applikationsstelle.

Mischeinrichtung 3: 1 Düsenring mit 6 radial ausgerichteten Düsen,

Düsenposition beträgt 30° zur Applikationsstelle.

Mischeinrichtung 4: 1 Düsenring mit 6 radial ausgerichteten Düsen,

Düsenposition beträgt 0° zur Applikationsstelle.

Mischeinrichtung 5: 1 Düsenring mit 3 tangential ausgerichteten

Düsen, Düsenposition beträgt 0° zur Applikationsstelle.

Die Querluftströme betragen bei der Mischeinrichtung 1 16 l/h und bei den anderen 4 Einrichtungen jeweils 8 l/h. Diese Verminderung des Querluftstroms ist nötig, da die Mischeinrichtung 1 im Vergleich zu den anderen Mischeinrichtungen zwei Düsenringe besitzt und somit ein gleicher Querluftstrom pro Düsenring gewährleistet wird. Die Versuche zur Bestimmung der Positionssymmetrie werden wie in Kapitel 2.4.5 beschrieben durchgeführt. Abbildung 3.2.2.1 zeigt Messungen von 3 Mischeinrichtungen mit den besten Positionssymmetrieeigenschaften. Aufgetragen sind die Verhältnisse der ermittelten Konzentrationen einer Spritze in Abhängigkeit von jeweils zwei Applikationsstellen. Es wurde das Verhältnis für die Applikationsstellen 1 und 2, sowie 2 und 3 zugleich 1 und 3 berechnet. Für die Mischeinrichtungen 3 und 4 wurden ähnliche Werte für die Positionssymmetrie ermittelt. Bei beiden Mischeinrichtungen lösten die Reizluftströme, die an der Applikationsstelle 2 appliziert wurden, die höchsten EAG-Amplituden aus. Reizluftströme der Applikationsstelle 3 verursachten höhere EAG-Amplituden als Reizluftströme der Applikationsstelle 1. Bei beiden Mischeinrichtungen waren die EAG-Amplituden der Reizluftströme der Applikationsstelle 1 die schwächsten. Für die Mischeinrichtung 1 besteht ein maximaler Meßfehler von 10 % durch die Positionssymmetrie zwischen Applikationsstelle 1 und 2. Die Mischeinrichtung 2 erzeugt

3. Apparativer Teil

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Abb. 3.2.2.1: Messung zur Bestimmung der Positionssymmetrie von 3 Mischeinrichtungen. Abgebildet sind die Werte der Positionssymmetrie für die Mischeinrichtungen 2, 3 und 4 mit einem Querluftstrom von jeweils 8 l/h. Die beste Positionssymmetrie besitzt die Mischeinrichtung 4. Spritzen an der Applikationsstelle 1 lösten um 10% niedrigere EAG-Amplituden als wenn die gleichen Spritzen an Applikationsstelle 2 verwendet wurden (Mischeinrichtung 4).

möglicherweise eine gute, positionsunabhängige Vermischung des Reizluftstroms mit dem Hauptluftstrom, wenn bei dem Verhältnis der Applikationsstellen 1 und 2 eine geringere Differenz vorliegen würde. Um eine Mischeinrichtung zu entwickeln, die möglichst gute Positionssymmetrien erzeugt, sollten zusätzlich Messungen zur Bestimmung der Verteilung des Duftstoffs entlang des Querschnitts, wie in Kapitel 3.2.1 beschrieben, durchgeführt werden. 3.3 Aufbau eines multidimensionalen EAG-Systems An ein EAG-System, mit dem Überlagerungsversuche durchgeführt werden sollen, werden zusätzliche Anforderungen gestellt. Bei der Messung zur Bestimmung der Pheromonkonzentration werden die Duftstoffquellen nur nacheinander benutzt; bei Überlagerungs-versuchen werden die Duftstoffquellen z. T. gleichzeitig verwendet. So wird in der „Überlagerungsphase“ erst mit dem UD gereizt und nach einer bestimmten Dauer zusätzlich der ÜD appliziert. Dies war

zwar prinzipiell mit der Meßsonde des Pheromon-EAG-System möglich, jedoch nicht mit der damaligen Schnittstelle (Interface 99).

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Das MD-EAG-System ist grundsätzlich ähnlich aufgebaut wie das in Kapitel 3.1 beschriebene EAG-System. Es besitzt eine Meßkammer mit Antennenhalter, ein Hauptrohr mit Mischeinrichtung, einen Injektor, Lager für die Duftstoffquellen und einen Filter für den Hauptluftstrom. Der wesentliche Unterschied zwischen dem MD-EAG und dem Pheromon-EAG-System besteht in der Anzahl der zur Verfügung stehenden Duftstoffquellen. 3.3.1 Anforderungen an das multidimensionale EAG-System Das MD-EAG-System wurde entwickelt, um komplexe Duftstoffgemische analysieren zu können. Zusätzlich sollen aber auch Messungen zur Bestimmung der Pheromondichte im Freiland und Überlagerungsversuche im Labor möglich sein. Um ein Duftstoffgemisch quantitativ und qualitativ analysieren zu können, wird ein Satz von Basis-Reizstoffen benötigt. Je mehr solcher Basis-Reizstoffe mit unterschiedlichen Konzentrationen zur Untersuchung des Duftstoffgemischs zur Verfügung stehen, desto genauer kann die Analyse ausfallen. Bei der Messung der Pheromondichte im Freiland werden z. B. 3 unterschiedliche Konzentrationen benutzt und dadurch wird der Meßbereich über 2 Dekaden der Dosis-Wirkungskurve abgedeckt. Soll pro Basis-Reizstoff eine ähnlich genaue Aussage über die Konzentration des zu untersuchenden Duftstoffs angestrebt werden, so muß auch der Meßbereich durch unterschiedliche Konzentrationen angepaßt werden. Je genauer die Dosis-Wirkungskurve erstellt wird, desto genauer kann später die Konzentration des Duftstoffs analysiert werden. Soll ein Duftstoffgemisch z. B. auf die Anwesenheit von 2 Basis-Reizstoffen untersucht werden, so benötigt man z. B. pro Basisreizstoff 3 Duftstoffquellen für die unterschiedlichen Konzentrationen, was in diesem Fall zu einer Gesamtzahl von 6 Duftstoffquellen führt. Bei dem Pheromon-EAG-System ist jedoch nur für 3 Duftstoffquellen Platz vorhanden. Es besteht also die Forderung möglichst viele Duftstoffquellen für Messungen zur Verfügung zu haben. Zu diesem Zweck können die Duftstoffquellen in unterschiedlichster Art und Weise deponiert bzw. an dem System befestigt werden. Das multidimensionale-EAG-System (MD-EAG-Systems) soll dabei nicht wesentlich schwerer bzw. größer werden als das schon vorhandene EAG-System, damit die Freiland-Tauglichkeit erhalten

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bleibt. Bei einer Lösung, bei der die Duftstoffquellen in einem Magazin gelagert und wahlweise an die Applikationsstelle angeschlossen werden, soll der Wechsel schnell und zuverlässig ferngesteuert erfolgen. Unabhängig von der Lösung dieses Problems ist zu fordern, daß eine homogene Verteilung des Reizluftstroms im Hauptluftstrom gewährleistet wird. 3.3.2 Grundsätzliche Realisierungsmöglichkeiten und ihre Konsequenzen Um eine große Anzahl von Duftstoffquellen an dem MD-EAG-System unterzubringen gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten. Es wird nun auf einige Möglichkeiten mit deren Vor- und Nachteilen und auf die realisierte Umsetzung eingegangen. Das einfachste Modell wäre die Anzahl der Applikationsstellen im Injektor zu erhöhen. Hierzu bräuchte jede Duftstoffquelle einen eigenen Antrieb und die Anzahl der Duftstoffquellen wäre von der Größe des Injektors und der Größe der Duftstoffquellen abhängig. Sollte die Anzahl der Duftstoffquellen zu gering sein, so könnte man zusätzliche Applikationsstellen durch den Einbau eines weiteren Injektor gewinnen. Dieser zweite Injektor müßte dann aber in einer neuen Ebene an das Hauptrohr angeschlossen werden. Dabei müßte gewährleistet sein, daß die Mischeinrichtung für alle Reizlufteinleitungen eine homogene Verteilung im Hauptluftstrom erzeugen kann. Ein Vorteil dieses einfachen Lagersystems wäre die sofortige Aktivierbarkeit jeder Duftstoffquelle. Bei einem Modell mit mehreren Ebenen bleibt die Frage vorerst ungeklärt, ob ein unerwünschter Gasaustausch zwischen nicht benutzten Duftstoffquellen und dem Hauptluftstrom stattfindet. Ein weiterer Nachteil könnte das Material des Injektors darstellen, der aus Teflon besteht. Teflon ist zwar ein chemisch inerter Stoff, jedoch absorbiert Teflon gewisse Duftstoffe aus dem Hauptluftstrom. Durch zusätzliche Injektoren erhöht sich die Gesamtoberfläche aus Teflon im Hauptluftstrom. Da Teflon gegenüber Glas eine stärkere Speicherwirkung aufweist, könnte sich dies nachteilig auswirken. Sollen alle Applikationsstellen in gleicher Entfernung zur Antenne liegen und nur ein Injektor benutzt werden, so bleiben nur noch wenige Möglichkeiten übrig. Zum einen könnten an allen Applikationsstellen eine Vielzahl von Duftstoffquellen nacheinander benutzt werden. Oder man läßt zwei Applikationsstellen unverändert und macht nur eine Applikationsstelle variabel. Soll

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das System an allen Applikationsstellen variable Duftstoffquellen besitzen, so kann man sich eine Art „Lift“ vorstellen. Die unterschiedlichen Basis-Reizstoffe könnten in einem „Lift“ untereinander, die unterschiedlichen Konzentrationen eines Basis-Reizstoffs dagegen auf die drei „Lifte“ in einer Ebene verteilt werden. Mit diesem System könnten Überlagerungsversuche genauso durchgeführt werden wie Analysen von Duftstoffgemischen. Die Vermischungsvorgänge von Luftströmen wären identisch mit denen des schon vorhandenen Pheromon-EAG-Systems. Der Nachteil des „Lift-Modells“ ist, daß sich das Magazin mit den Duftstoffquellen über dem Einstromloch für die Außenluft befindet, wenn die untersten Duftstoffquellen in Benutzung sind. In der Nähe des Einstromlochs sollte sich jedoch möglichst wenig Material befinden, da dieses adsorbierende Eigenschaften besitzen und somit die Konzentration der Duftstoffe in der Außenluft verändern könnte. Statt eines „Lifts“ könnte man sich auch eine Trommel als Magazin vorstellen. Ein solches „Trommelmodell“ könnte entweder aus einer großen Trommel mit Platz für viele Duftstoffquellen bestehen oder aus drei kleineren Trommeln. Es wurde das „Trommelmodell“ mit einer Trommel mit Platz für 12 Duftstoffquellen entwickelt (Abb. 3.3.2.1), da dieses Modell bei Überlagerungsversuchen den Vorteil besitzt, daß ein ÜD mit 12 UD nacheinander getestet werden kann. Dies ist bei dem „Trommel-Modell“ mit 3 kleineren Trommeln nicht möglich. Auch schien das Modell mit einer großen Trommel rascher realisierbar und die Handhabung einer Trommel vorerst einfacher zu sein, denn für jedes Modell hätte ein neues Antriebssystem und eine mechanische Führung entwickelt werden müssen. Nach Festlegung auf das „Trommelmodell“ mußte eine Mechanik und Steuerungselektronik für die Trommel entwickelt werden. Zunächst muß eine notwendige Steuerung der Rotation zur Auswahl der Duftstoffquellen entwickelt werden. Damit die Verbindung zwischen Spritzenöffnung und Einschußloch der Applikationsstelle luftdicht abgeschlossen werden kann, muß die Spritze exakt in das Einschußloch der Applikationsstelle eingreifen. Dazu ist eine weitere Bewegung der Trommel in axial-linearer Richtung auf die Hauptrohrachse erforderlich.

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Abb. 3.3.2.1: MD-EAG-System. Die Luft strömt durch den Aktivkohlefilter (F), der hier geöffnet ist, zum Injektor (I). Dort sind die Spritzen (S) mit dem oberen Ende des Hauptrohrs verbunden. Am unteren Ende des Hauptrohrs befindet sich die Meßkammer (M). Eine Saugpumpe erzeugt über einen Schlauch, der am Meßkammerunterteil angebracht ist, einen zur Antenne gerichteten Hauptluftstrom. Wir ein Schrittmotor (SM) aktiviert, so wird über eine Mechanik ein Reizluftstrom erzeugt, der im Injektor in den Hauptluftstrom appliziert wird. Auf der Trommel (T) des MD-EAG-Systems können 12 Spritzen benutzt werden.

Der Ablauf besteht also aus zwei Bewegungen. Bei Beginn eines Spritzenwechsels ist die erste Bewegung die Linearbewegung. Dabei muß die Spritze aus dem Einschußloch der Applikationsstelle gezogen werden. Die Linearbewegung übernimmt ein DC-Motor (Faulhaber 1516E-012S), welcher an dem EAG-System fest verbunden ist und über ein Ritzel eine Zahnstange bewegt, welche über die Zugfeder mit Schlitten fixiert ist. An diesem Schlitten ist die gesamte Trommel samt Schrittmotor für den Spritzenvorschub befestigt. Somit gleitet die Trommel vom Einschußloch weg, wenn die Zahnstange zur Zugfeder bewegt wird. Das Ende der Längsbewegung wird durch zwei Endabschalter festgelegt, welche

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Abb. 3.3.2.2: Mechanik für die Rotationsbewegung der Trommel. Ein DC-Motor (M) dreht das Zahnrad (Z) so lange, bis der vom Potentiometer (P) erzeugte Istwert dem Sollwert entspricht. Danach erfolgt die Längsbewegung der Trommel in Richtung Hauptrohr.

die Stromzufuhr für den Motor unterbrechen, wenn das Ende der Längsbewegung erreicht wurde. Ist der Schlitten weit genug vom Einschußloch entfernt, so wird über einen weiteren Schalter die Drehung der Trommel freigegeben. Nun erst kann sich die Trommel um die eigene Achse drehen. Die Rotation erfolgt über einen DC-Motor (Faulhaber 1524E-009S), welcher ein Zahnrad dreht, das an der Achse der Trommel befestigt ist (Abb.3.3.2.2). Die Steuerelektronik für die Rotation und die Längsbewegung vergleicht den Istwert der Position mit dem Sollwert. Der Istwert wird durch Abgreifen der Spannung eines 10-Gang-Potentiometers erzeugt, der Sollwert wird entweder durch das Interface 2003 oder manuell vorgegeben. Die Trommel dreht sich nun so lange, bis die Differenz

zwischen Ist- und Sollwert einen Schwellenwert unterschreitet. Nun wird ein Relais geschaltet, welches den Motor für die Linearbewegung mit Strom versorgt. Der Motor bewegt die Zahnstange zum Einschußloch und spannt dadurch die Zugfeder. Daraufhin gleitet der Schlitten auf das Einschußloch zu. Der PI-Regler für die Rotationsposition erzeugt kleine Regelschwingungen, welche bewirken, daß die Spritzenöffnung um das Einschußloch schwingt und einrastet, wenn es sich genau davor befindet. Ist die Spritzenöffnung in das Einschußloch eingerastet, so unterbricht ein

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Abb. 3.3.2.3.: Schaltplan der Elektronik für die Positionierung der Trommel des MD-EAG.

Endabschalter die Stromzufuhr des Rotationsmotors. Abbildung 3.3.2.3 zeigt den Schaltplan für die Steuerungelektronik für die Längs- und Rotationsbewegung. Der große Vorteil dieser Schaltung liegt in der geringen Anzahl an Leitungen. Mit einer einzigen Leitung wird das komplette System gesteuert. Dies war eine der Voraussetzungen für eine Steuerung der Trommel, da nur noch eine einzige freie Leitung im Hauptkabel zur Meßsonde zur Verfügung stand.

Anschließend mußte das Antriebssystem für die Duftstoffquellen angepaßt werden. Die Steuerungselektronik für den Schrittmotor konnte beibehalten werden, jedoch mußte die mechanische Kraftübertragung von dem Drahtseil zur der Antriebsstange der Spritze modifiziert werden. Dazu wurde der bisherige Antriebsklotz am Drahtseil durch eine runde Verankerungsscheibe ersetzt. In den Schlitz der Verankerungsscheibe paßt die runde Antriebsscheibe, die auf der Antriebsstange der Spritze sitzt (Abb. 3.3.2.4). Die Kanten der beiden Scheiben sind schräg gestaltet, so daß sich die Antriebsscheibe in die Verankerungsscheibe einfügt, wenn sich die Trommel dreht und die Duftstoffquelle die Position zum Einrasten in die Applikationsstelle erreicht hat.

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Abb. 3.3.2.4: Mechanik für den Spritzenschub. Wird der Schrittmotor (SM) aktiviert, so dreht sich das Drahtseil (D) um die Antriebsachse des Schrittmotors. Die zwei Enden des Drahtseils werden durch eine Feder (F) verbunden und über zwei Umlenkräder (U) geleitet. Auf dem Drahtseil befindet sich die Verankerungsscheibe (VS), in deren Schlitz die Antriebsscheibe (AS) paßt. Die Antriebsscheibe sitzt auf der Antriebsstange (AT) der Spritze (S). Ein Gummistopfen dient als elastische Verbindung zwischen Antriebsstange und Glaskolben und dämpft einzelne ruckartige Schritte und eine gleichmäßige Bewegung wird erzielt. Durch Bewegung des Drahtseils werden beide Scheiben bewegt und über die Antriebsstange der Glaskolben (K) in der Spritze. Dadurch wird ein Überdruck innerhalb der Spritze erzeugt, der das Spritzenvolumen in den Hauptluftstrom am Injektor (I) einströmen läßt.

3.4 Bedienungselemente Zur Steuerung und Bedienung des EAG-Systems gehört eine Vielzahl von elektronischen Bauteilen und Programmen. Das Meß- und Steuerungsprogramm des Rechners schickt Befehle an die Schnittstelle zwischen Rechner und EAG-Meßsonde (Interface). Das Interface steuert die Elektronik der Ausführungseinheiten der EAG-Meßsonde. An der Meßsonde werden die Reize für die Insektenantenne generiert. In der Meßkammer wird von der Insektenantenne abgeleitet. Das EAG-Signal wird dann über einen

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Verstärker und einen Tiefpaßfilter zum A/D-Wandler geleitet. Die digitalen Signale werden dann vom Programm im Rechner bearbeitet und gespeichert. 3.4.1 Steuerungs- und Meßprogramm Das Steuerungs- und Meßprogramm „A04V14“ wurde in der ersten Version von Andreas Lorenz für die Aufzeichnung der Analog-Signale im EAG-Meßsystem für die Pheromonmessung im Freiland erstellt. Stefan Clemenz hat das Programm so weiterentwickelt, daß eine Online-Auswertung der Daten und eine Steuerung der Ausführungseinheiten durch das Programm ermöglicht wurde. Das Programm liest eine Ablaufdatei, in welcher die Befehle für das Interface aus zwei Hexadezimalzahlen codiert sind und sendet die Befehle über die parallele Schnittstelle des Rechners und über ein Kabel an das Interface. Gleichzeitig werden eingehende Signale wie das EAG, Winddaten und eine vom Interface erzeugte Protokollspur aufgenommen und in einer eigenen Datei gespeichert. Die registrierten Signale werden in Echtzeit auf einem Bildschirm dargestellt. Zusätzlich generiert das Programm eine zweite Datei, in der Daten über die verwendeten Spritzen, Temperatur, rel. Luftfeuchtigkeit, sowie Ort und Lage der Messung protokolliert werden. 3.4.2 Ansteuerungselektronik (Interface) Damit die digitalen Befehle des Steuerungs- und Meßprogramms „A04v14“ von der Meßsonde umgesetzt werden können, wird eine Schnittstelle (Interface) zwischen Rechner und Meßsonde benötigt. Das Interface steuert die Elektronik der Ausführungseinheiten der Meßsonde und erzeugt gleichzeitig eine Protokollspur für das Meßprogramm. Für den Datenaustausch wird die parallele Schnittstelle (8 Bit) des Rechners benutzt. Das Interface transformiert die gesendeten Bits in ein Signalmuster für die einzelnen Ausführungseinheiten um. Das Interface soll manuelle Funktionen, wie z. B. das Anheben des Filters, automatisch und ferngesteuert übernehmen. Das Interface steuert neben dem Filterhub die Nullstellung der EAG-Spur und der Windspur, die Schrittmotoren für den Spritzenvorschub und eine Protokollspur. Das Interface 03 generiert zudem die Sollspannung für die Rotation der Trommel. Die Schaltungen wurden so

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entwickelt, daß alle Funktionen auch ohne Rechner manuell ausgelöst werden können. Da das Interface 01 und Interface 03 Weiterentwicklungen des Interface 99 sind, welches für Messungen der Pheromondichte im Freiland entwickelt wurde, werden nun chronologisch die Entwicklungsschritte beschrieben. Das Konzept des Interface 99 ist, daß mit einem 8 Bit Code alle Funktionen vom Interface übernommen werden können. Dabei entspricht jedes Bit einer definierten Funktion. Je ein Bit regelt den Spritzenvorschub, ein Bit das Zurücksetzen der 3 Spritzen in die Ausgangsposition, ein Bit den Filterhub, ein Bit das Öffnen und Schließen des Ventils für die Windmessung und ein Bit die Nullstellung des EAG. Ein Bit bleibt ohne Funktion. Die 3 Schrittmotoren für den Spritzenvorschub werden durch Flipflops gesteuert, die durch ein gemeinsames Delay (Timer) in der Laufzeit begrenzt werden. Während der Aktivität des Flipflops werden über einen Impulsgenerator die Impulse für die Schrittmotoren erzeugt. Die Reizdauer kann bei dem Interface 99 nur manuell und für alle 3 Schrittmotoren gleich eingestellt werden. Die Schrittmotoren sind zwar einzeln aktivierbar, jedoch nur mit der gleichen Reizdauer und mit der gleichen Vorschubrate. Für Überlagerungsversuche sind jedoch unabhängige Reizdauern notwendig, damit in der „Überlagerungsphase“ ein Plateau durch den UD erreicht und dann der zusätzliche Reiz des ÜD appliziert werden kann. Diese Anforderung führte zur Entwicklung des Interface 01, welches für die Überlagerungsversuche des Kartoffelkäfers benutzt wurde. Das Interface 01 ermöglicht die Einstellung von variablen Vorschubraten (υ) der Schrittmotoren sowie eine voneinander unabhängige Aktivierung der Schrittmotoren. Die Steuerung der Vorschubrate gelang durch Benutzung eines 4 Bit Speichers. Durch ein Kontroll-Bit kann auf diesen Speicher zugegriffen werden und eine von 16 linear steigenden Frequenzen für die Schrittmotoren ausgewählt werden. Die Steuerung der Schrittmotoren wurde überarbeitet, so daß jeder Schrittmotor einzeln aktiviert bzw. deaktiviert werden kann, d.h. Zeitpunkt und Impulsdauer sind nun unabhängig. Dadurch wurden Überlagerungsversuche mit diesem EAG-Meßsystem erstmals möglich. Die Steuerung der anderen Befehle blieb unverändert. Um das MD-EAG-System steuern zu können, mußte eine weitere Aufgabe vom Interface übernommen werden. Das Interface sollte

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den Sollwert für die Position der Trommel erzeugen. Diese Aufgabe mußte von den vorhergehenden Interfaces nie in Angriff genommen werden. Gleichzeitig sollten die Frequenzen für den Spritzenvorschub nicht mehr linear steigen, sondern logarithmisch steigend sein. Außerdem sollten die Vorschubraten für jeden Schrittmotor individuell einstellbar sein, so daß bei Überlagerungs-versuchen während der „Überlagerungsphase“ die Schrittmotoren mit unterschiedlichen Vorschubraten laufen können. Es wurde ein neues Konzept für das Interface 03 entwickelt, welches nicht mehr mit TTL-Logikbausteinen wie z. B. NAND-Gattern und Speichern arbeitet, sondern die Funktionen werden von Mikrocontrollern (PIC 16F628) übernommen. Das Interface arbeitet mit drei unterschiedlich programmierten Mikrocontrollern: - Der Motor-PIC ist ausschließlich für Funktionen eines Schrittmotors zuständig. Er besitzt zwei Adressen. Die eine Adresse dient als Speicher und Generator für die 16 logarithmisch steigenden Frequenzen, über die andere Adresse kann der Schrittmotor aktiviert oder deaktiviert und somit der Spritzen-vorschub durchgeführt werden. - Der Master-PIC besitzt ebenfalls 2 Adressen. Die eine Adresse führt die Befehle für den Filterhub, die Steuerung des Ventils für die Windmessung, die Nullstellung der EAG-Spur und zudem das Zurücksetzen der Spritzen in die Ausgangsposition (Spritzenreturn) aus. Die andere Adresse wird benutzt um die Sollwerte für die Positionierung der Trommel zu generieren. Die Sollwerte liegen in genau definierten Stufen zwischen –8,25 V und +8,25 V. Diese Stufen werden vom Master-PIC codiert und an einen D/A-Wandler (LTC1451) gesendet. Der D/A-Wandler setzt den Code in Spannungen zwischen 0 V und 2,048 V um. Die Spannung wird durch einen Operationsverstärker (LF356) verstärkt. Der Operationsverstärker wird mit einer definierten Offset-Spannung versehen. Dadurch können auch die negativen Ausgangs-spannungen als Sollwerte erreicht werden. - Der Protokoll-PIC dient zur Erfassung der Abläufe. Der Protokoll-PIC erfaßt den genauen Zeitpunkt der Schrittmotor-Aktivierung und –Deaktivierung sowie den Zeitpunkt für den Filterhub. Diese Ereignisse werden über einen D/A Wandler in ein Analogsignal umgewandelt und als Protokollspur vom Steuerungs- und Meßprogramm erfaßt und gespeichert. Zusätzlich erzeugt der Protokoll-PIC ein Raster, das wie bei den vorherigen Interfaces der visuellen Ablesung dient und ebenfalls vom Rechner erfaßt und

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gespeichert wird. Der Protokoll-PIC zeigt zudem in diesem Raster Informationen über die Vorschubrate der Schrittmotoren und die Position der Trommel an. Diese Aufgaben werden durch einen D/A-Wandler und nachgeschaltete Operationsverstärker übernommen.

4. Ergebnisse

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4. Ergebnisse 4.1 Kontrollversuche Um Versuche mit dem EAG-System besser bewerten zu können, wurden unterschiedliche Kontrollversuche durchgeführt. 4.1.1 Unspezifische Antworten Um ausschließen zu können, daß die EAG-Amplituden nicht Antworten auf unspezifische Reize darstellen, wurden Kontrollversuche mit der Antenne des Kartoffelkäfers durchgeführt. Bei diesen Versuchen wurde der Duftstoff C3H1OL als Standardreiz benutzt. Paraffin und mit Aktivkohle gefilterte Luft wurden auf eine mögliche Reizantwort untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die EAG-Amplituden auf Reizungen mit Paraffin 13 % ± 2 % der EAG-Amplitude auf Reizung mit dem Duftstoff C3H1OL (10-3) betrug (n=18 Versuche). Wurde mit gefilterter Luft gereizt, so betrug die EAG-Amplitude sogar 20 % ± 2 % des Wertes der EAG-Amplitude auf Reizung mit dem Standard (Abb. 4.1.1.1). Dies bedeutet, daß bei allen gefundenen EAG-Amplituden ein Anteil der EAG-Amplitude allein durch Paraffin ausgelöst wird. Jedoch ist die EAG-Amplitude auf Reizung mit Paraffin geringer als wenn mit gefilterter Luft gereizt wird. Dies liegt an der Eigenschaft des Paraffins, daß es Duftstoffe aus der Luft zu einem gewissen Teil bindet und ein Gemisch aus Paraffin und den Duftstoffen entsteht. Nach dem Raoult´schen Gesetz ist dann der Partialdampfdruck einer Substanz (Duftstoff) im Gasvolumen über einer Lösung (Paraffin/Duftstoff-Gemisch) proportional zu ihrem Stoffmengenanteil und zu ihrem Dampfdruck in der reinen Form (Atkins 1993). Somit kann Paraffin als eine Art „Staubsauger“ betrachten werden, welches aus der Luft Duftstoffe bindet und diese dann in Abhängigkeit der Konzentration und des Dampfdrucks wieder abgibt.

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Abb. 4.1.1.1: Kontrollversuche mit der Kartoffelkäferantenne. Die EAG-Amplituden wurden in Bezug auf den Standardreiz C3H1OL (10-3) aufgetragen. Die EAG-Amplitude auf einen Paraffin-Reiz ist niedriger als auf gefilterte Luft (jeweils 18 Reizpräsentationen).

4.1.2 Lagerungsversuch von Nonanal Für den Duftstoff Nonanal, welcher sich in Relation zu den anderen verwendeten Duftstoffen schnell zersetzt (pers. Mitt. S. Schütz), wurde nach einem geeignetem Schutzstoff gesucht. Zu diesem Zweck wurde 1 % Vitamin E dem Paraffin/Nonanal-Gemisch zugefügt. Der Gedanke dabei war, daß Vitamin E freie Radikale im Gasvolumen der Spritze eliminieren sollte, welche möglicherweise Nonanal zersetzen könnten. Um zu prüfen, ob Vitamin E von der Kartoffelkäferantenne wahrgenommen wird, wurde eine Versuchsreihe mit insgesamt 18 Reizungen durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die Mittelwerte der EAG-Amplituden auf den Standardreiz C3H1OL (10-3) 0,133 mV ± 0,04 mV auf Reizung mit Paraffin 0,015 mV ± 0,005 mV und auf Reizung mit Paraffin + 1 % Vitamin E 0,008 mV ± 0,005 mV betrugen (Abb. 4.1.2.1). Diese Versuchsreihe zeigt, daß Vitamin E keine störenden Nebenwirkungen auf die Kartoffelkäferantenne hat und somit ein Kandidat als Schutzstoff für Nonanal ist.

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Abb. 4.1.2.1: Kontrollversuche mit der KArtoffelkäferantenne. Wurde Paraffin 1 % Vitamin E zugemengt, so verringerte sich die EAG-Amplitude auf Reizung mit diesem Gemisch im Vergleich zu einer reinen Paraffinreizung (jeweils 18 Reizpräsentationen).

Da gezeigt werden konnte, daß Vitamin E keine Auswirkung auf die Entstehung der EAG-Signale spielt, wurde über einen Zeitraum von 28 Tagen mit dem Standardreiz C3H1OL (10-3) , unbehandeltem Nonanal (10-3) und mit 1 % Vitamin E behandeltem Nonanal (10-3) gereizt. Die Glasspritzen mit dem Duftstoff Nonanal wurden für diese Versuchsreihe bei Raumtemperatur gelagert, um einen Zersetzungsprozeß zu beschleunigen, die Spritze mit dem Duftstoff C3H1OL wurde bei –20 °C gelagert. Die EAG-Amplituden (Abb. 4.1.2.2) von behandeltem Nonanal waren immer geringer als die von unbehandeltem Nonanal. Wie Abbildung 4.1.2.3 zeigt, ist die Reduktion der EAG-Amplitude am 23. Tag der Versuchsreihe eine Ausnahme. Während des ersten Tages [0d] bis zum 28. Tag [28d] war der Unterschied in der EAG-Amplitude zwischen Nonanal und Nonanal mit 1 % Vitamin E in etwa immer der gleiche. Auch waren die EAG-Amplituden in etwa vergleichbar. Dies bedeutet, daß Nonanal nach 28 Tagen immer noch EAG-Amplituden auslöste und sich nicht wesentlich zersetzt hatte. Das bedeutet, daß Nonanal keinen Schutzstoff benötigt und sich nicht so rasch zersetzt wie angenommen wurde. Nonanal muß demzufolge nicht jedesmal neu angesetzt werden für die Überlagerungsversuche.

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Abb. 4.1.2.3: Lagerungsversuch mit unbehandeltem Nonanal. Die EAG-Amplituden wurden in Bezug auf den Standardreiz C3H1OL (10-3) aufgetragen. Die EAG-Amplitude auf Nonanalreizung sinkt am 23. Tag, steigt dann am 26. Tag wieder auf den ursprünglichen Wert an und bleibt dann konstant. Relative Alterungs- bzw. Zersetzungsprozesse des Duftstoffs Nonanal sind nicht zu erkennen.

Abb. 4.1.2.2: Lagerungsversuch mit unbehandeltem und behandeltem Nonanal. Die EAG-Amplituden wurden in Bezug auf den Standardreiz C3H1OL (10-3) aufgetragen. Die EAG-Amplituden auf Nonanal (10-3) + 1% Vitamin E sind immer geringer als bei reiner Nonanalreizung (10-3).

4. Ergebnisse

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4.2 Überlagerungsversuche 4.2.1. Überlagerungsversuche mit dem bekreuzten Traubenwickler Die Überlagerungsversuche mit dem bekreuzten Traubenwickler Lobesia botrana sollten zur Klärung des Beitrags von Pflanzenduftstoffen bei Messungen zur Bestimmung der Pheromondichte im Freiland dienen. Dazu wurde das artspezifische Pheromon (E,Z)-7,9-Dodecandien-1-yl-acetat als ÜD und Nonanal (NONA) bzw. Linalool (LINA) als UD benutzt. Die UD wurden mit den Konzentrationen 10-4 und 10-3 verwendet und der ÜD (E,Z)-7,9-Dodecandien-1-yl-acetat in den Konzentrationen 10-6 und 10-5. Insgesamt wurden 39 Überlagerungsversuche und 19 Kontroll-versuche durchgeführt. Bei den durchgeführten Versuchen wurde ein möglicher Einfluß durch Zersetzungsprozesse der Duftstoffe untersucht. Dazu wurden die Versuche in 2 Gruppen eingeteilt. Die eine Gruppe beinhaltete Versuche mit Duftstoffquellen, die bis einschließlich 5 Tage (0 - 5 d) nach der Herstellung benutzt wurden. Die andere Gruppe wurde mit Duftstoffquellen gereizt, bei denen die Herstellung 7 bis 8 Tage (7 - 8 d) zurücklag. Es werden nun die Duftstoffkombinationen nach dem UD geordnet dargestellt. Die im Text erwähnten Werte sind geometrische Mittelwerte für die Trennschärfe (TS), die in Klammern gesetzten Werte sind die ebenfalls durch geometrisches Mitteln erhaltenen Vertrauens-intervalle. Nonanal (NONA): Der UD NONA wurde 13 mal mit der Konzentration 10-4 und 8 mal mit der Konzentration 10-3 verwendet und ausgewertet. Insgesamt konnten 10 Kontrollversuche in die Auswertung einfließen. Das Pheromon von Lobesia botrana wurde in den Konzentrationen 10-6 und 10-5 benutzt. Da kein signifikanter Unterschied in den Trennschärfen (TS) zwischen den 2 Gruppen festgestellt werden konnte (Abb. 4.2.1.1), wurden die Daten gemischt. Die TS für die Kombination UD NONA (10-4) betrug 181,93 (177,69; 186,27). Für die Konzentration 10-3 wurde eine TS von 1848,48 (1818,92; 1878,52) gefunden. Reziproke Versuche wurden nicht durchgeführt. Die Gegenwart von

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.1.1: Überlagerungsversuche mit dem bekreuzten Traubenwickler Lobesia botrana. Gezeigt werden die ermittelten Trennschärfen (TS) und Trennschärfenstufen (TSS) von Pheromon als Überlagerungsduftstofff (ÜD) und Pflanzenduftstoffen als Untergrundduftstoff (UD). Bei beiden Duftstoffen konnte auch 8 Tage nach der Herstellung der Duftstoffquelle kein signifikanter Unterschied zu frisch hergestellten Duftstoffquellen gefunden werden (obere Abb.). Deshalb wurden die 2 Altersgruppen zusammengefaßt (untere Abb.). Die gefundenen TS bzw. TSS sind sehr hoch, so daß keine störenden Wechselwirkungen vorliegen. Die Anwesenheit der beiden getesteten Pflanzenduftstoffe hat daher nur einen äußerst geringen Einfluß auf Messungen zur Bestimmung der Pheromondichte im Freiland.

Nonanal beeinträchtigt die Reaktionen der Antenne auf Pheromon nur äußerst wenig.

4. Ergebnisse

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Linalool (LINA): Der UD Linalool wurde in 12 Versuchen mit der Konzentration 10-4 mit 6 Kontrollversuchen und in 6 Versuchen mit der Konzentration 10-3 mit 3 Kontrollversuchen ausgewertet. Die Konzentration des Pheromons war die gleiche wie bei den Überlagerungsversuchen mit NONA als UD (10-6 und 10-5). Da auch bei diesem Duftstoff kein signifikanter Unterschied in der TS über die Zeit festgestellt werden konnte (Abb. 4.2.1.1), wurden die Daten ebenfalls gemischt. Die TS für die Konzentration 10-4 des UD lag bei 214.18 (184.95; 248.03) für alle 12 Versuche. Bei höherer Konzentration (10-3) ergab sich eine TS von 2192,43 (2165,03; 2220,17). Auch bei dieser Versuchsdurchführung wurden auf die reziproken Versuche verzichtet. Der Duftstoff Linalool beeinträchtigt die Erkennung des Pheromons nicht. Überlagerungsversuche von Pheromon als ÜD und Pflanzenduftstoffen (NONA, LINA) als UD haben gezeigt, daß es keine störenden Wechselwirkungen zwischen dem Pheromon und den getesteten Duftstoffen gibt. Das bedeutet, daß die Berechnung der Pheromonkonzentration im Freiland durch die EAG-Methode nicht durch die Anwesenheit von Pflanzenduftstoffen beeinflußt wird. 4.2.2 Überlagerungsversuche mit dem Kartoffelkäfer In den EAG-Versuchen mit dem Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata wurden acht Duftstoffe auf wechselseitige Einflüsse untersucht. Dabei wurde jeweils ein Duftstoff als UD und ein zweiter als ÜD verabreicht. Von den 56 möglichen Kombinationen wurden 34 Kombinationen untersucht. Abbildung 4.2.2.1 zeigt die untersuchten Kombinationen. Die Pfeilspitzen zeigen in Richtung des ÜD, die Pfeilbasis kommt vom UD. So wurde z. B. der Duftstoff 2-Phenyl-ethanol (2PEOL) in 7 Kombinationen als UD und in 4 Kombinationen als ÜD verwendet. In 3 Kombinationen konnte dieser Duftstoff sowohl als UD als auch als ÜD getestet werden (Geraden mit 2 Pfeilspitzen).

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.1: Von insgesamt 56 möglichen Duftstoffkombinationen sind die 34 untersuchten Duftstoffkombinationen dargestellt

Die Anzahl der möglichen Kombinationen erhöht sich erheblich, wenn man die unterschiedlichen Konzentrationen der Duftstoffe berücksichtigt. So wurden insgesamt 77 verschiedene Kombinationen durchgeführt, von denen 74 Kombinationen ausgewertet werden konnten. Von den 189 gespeicherten Dateien (entspricht 567 Versuchen) wurden 506 Versuche analysiert, und 383 Versuche ausgewertet. Von den 383 ausgewerteten Versuchen waren 183 Kontrollversuche und bei 200 Versuchen fand eine Überlagerung statt. Die Versuche verteilten sich ungleich auf die Duftstoffkombinationen. Abbildung 4.2.2.2 zeigt die Anzahl der ausgewerteten Versuche, der Kontrollversuche und der für die Bewertung der Trennschärfe benutzten Versuche.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.2: Anzahl der durchgeführten Überlagerungsversuche, der Kontrollversuche und ausgewerteten Überlagerungsversuche des Kartoffelkäfers. Insgesamt wurden 514 Überlagerungsversuche untersucht, von denen 512 ausgewertet wurden. 248 Kontroll-versuche konnten in die Berechnung einfließen.

4. Ergebnisse

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Es folgt nun eine detaillierte Betrachtung der Duftstoffkombinationen. Dabei wird auf jeden Duftstoff als UD und als ÜD einzeln eingegangen. Die in den Abbildungen dargestellten Werte sind geometrische Mittelwerte der Trennschärfenstufe (TSS), die im Text erwähnten Werte sind geometrische Mittelwerte der Trennschärfe (TS) und in Klammern werden die Vertrauensintervalle angezeigt. Diese Werte wurden ebenfalls durch geometrisches Mitteln erhalten. (Z)-3-Hexen-1-ol (C3H1OL): Der Duftstoff C3H1OL wurde in 4 Kombinationen als ÜD und in 3 Kombinationen als UD verwendet. Insgesamt konnten 24 Versuche mit C3H1OL als ÜD und 15 Versuche als UD ausgewertet werden. In der Kombination mit 2PEOL (10-4) als UD konnten 4 Versuche mit C3H1OL (10-6, 10-5) als ÜD ausgewertet werden. Dabei wurde eine TS von 0,27 (0,25; 0,29) gefunden. Die reziproke Kombination wurde nicht durchgeführt. Da allerdings in dieser Kombination die Kriterien für einen Basisreizstoff nicht erfüllt wurden, kommt selbst bei einer möglichen guten TS 2PEOL als Basisreizstoff für diese Kombination nicht in Frage. In der Kombination mit 1OCT3OL (10-4) als UD und C3H1OL (10-5, 10-4) als ÜD wurden 4 Versuche ausgewertet. Dabei konnte eine TS von 5,42 (3,78; 7,78) berechnet werden. Im reziproken Versuch mit 1OCT3OL (10-5, 10-4) als ÜD und C3H1OL (10-5) als UD lag die TS bei 7,47 (4,73; 11,81). Die beiden Duftstoffe verhalten sich symmetrisch, d.h. daß die TS unabhängig von der durchgeführten Kombination zu ähnlichen Ergebnissen führt. Die beiden Duftstoffe verhalten sich orthogonal, d.h. der wechselseitige Einfluß liegt innerhalb der gesetzten Kriterien (ein maximal zulässiger Berechnungsfehler durch den wechselseitigen Einfluß ist 20 %). Bei der Kombination mit GUAJ (10-4) als UD und C3H1OL (10-5, 10-4) ergab die Auswertung von 8 Versuchen eine TS von 1,81 (1,23; 2,67). Bei der reziproken Kombination mit GUAJ (10-4, 10-3) als ÜD und C3H1OL (10-5) als UD konnte bei 4 Versuchen eine TS von 25,90 (10,77; 62,30) gefunden werden. Bei dieser Kombination handelt es sich um eine asymmetrische Orthogonalität, bei der nur in einer der beiden Kombinationen das Kriterium der Orthogonalität erfüllt werden konnte.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.3: Trennschärfenstufe bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff C3H1OL.

Mit HEXEACE (10-5) als UD und C3H1OL (10-6, 10-5, 10-4) als ÜD wurden konzentrationsabhängige TS gefunden. Bei den 2 Versuchen mit den Konzentrationen 10-6 und 10-5 für C3H1OL wurde eine TS von 30,09 (8,58; 105,52) ermittelt. Für diese Kombination sollten weitere Versuche durchgeführt werden, damit genauere Werte ermittelt werden können. Bei den 4 Versuchen mit den Konzentrationen 10-5 und 10-4 des ÜD C3H1OL wurden wesentlich niedrigere TS gefunden. Diese niedrigeren Werte könnten durch einen Defekt des Schrittmotors, der bei dieser Versuchsserie herrschte, verursacht worden sein. Sie wurden nur deshalb ausgewertet um das Verhalten der TS in Abhängigkeit der Konzentration untersuchen zu können. Die Versuche ergaben eine TS von 0,94 (0,73; 1,20). Doch wegen dem damals vorliegendem Defekt sind diese Werte mit größter Vorsicht zu betrachten. Aus diesem Grund wurde eine erneute Versuchsreihe mit 6 Versuchen

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.4: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff C3H1OL.

gestartet. Die zusätzlichen Versuche bestätigten die früheren Ergebnisse. So betrug die TS 0,78 (0,44; 1,37). Im reziproken Versuch mit HEXEACE (10-5, 10-4) als ÜD und C3H1OL (10-5) als UD wurden 9 Versuche ausgewertet. Die Berechnung ergab eine TS von 7,21 (5,29; 9,83). Bei dieser Duftstoffkombination handelt es sich um eine partiell symmetrische Orthogonalität. D. h., daß die Art des ÜD bzw. des UD keine Rolle spielt, jedoch die Konzentration des Duftstoffs.

Abbildung 4.2.2.3 zeigt die gefundenen TSS der benutzten UD für den C3H1OL-empfindlichen Rezeptor. Bei 2 Kombinationen wird das Kriterium für orthogonales Verhalten (TS ≥ 5 bzw. TSS ≥ 0,7) erfüllt. Abbildung 4.2.2.4 zeigt die TSS für den Duftstoff C3H1OL in bezug auf andere empfindliche Rezeptoren. Hier liegt in allen 3 Kombinationen eine Orthogonalität vor. (E)-2-Hexen-1-ol (T2H1OL):

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.5: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff T2H1OL.

In 4 Kombinationen wurde T2H1OL sowohl als ÜD als auch als UD benutzt. In 41 Versuchen war T2H1OL ÜD und in 37 Versuchen UD. Bei der Kombination mit 2EH1OL (10-3) als UD und T2H1OL (10-6, 10-5) wurde in 13 Versuchen eine TS von 379,28 (180,95; 795,01) ermittelt. Dies ist die zweithöchste TS, die in den Versuchen festgestellt werden konnte. In der Kombination mit 2EH1OL (10-4, 10-3) als ÜD und T2H1OL (10-6) als UD wurde dagegen in 16 Versuchen eine sehr niedrige TS von 0,04 (0,02; 0,07) ermittelt. Es liegt somit eine asymmetrische Orthogonalität vor.

Bei Versuchen mit 2PEOL (10-5 und 10-4) als UD und T2H1OL als ÜD (10-5, 10-4) wurden in jeweils 7 Versuchen mit der Konzentration

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.6: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff T2H1OL.

10-5 eine TS von 0,07 (0,06; 0,09) und mit der Konzentration 10-6 eine TS von 0,94 (0,76; 1,15) ermittelt. Die reziproke Kombination wurde nicht untersucht. In der Versuchsreihe mit 1OCT3OL (10-4) als UD und T2H1OL (10-5, 10-4) als ÜD wurde in 6 Versuchen eine TS von 8,92 (7,98; 9,97) gefunden. In den 4 Versuchen mit 1OCT3OL (10-5, 10-4) als ÜD und T2H1OL (10-5) als UD betrug die TS 8,91 (2,74; 29,01). Auf Grund der großen Standardfehlers sollten hier weitere Versuche durchgeführt werden. Diese Duftstoffkombination weist eine symmetrische Orthogonalität auf, die beide Duftstoffe als Basisreizstoffe zuläßt.

Mit HEXEACE (10-6) als UD und T2H1OL (10-5, 10-4) als ÜD wurde in den 4 Versuchen eine TS von 0,08 (0,06; 0,10) gefunden. In den

4. Ergebnisse

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4 Versuchen mit HEXEACE (10-5, 10-4) als ÜD uns einer Konzentration von 10-5 für den UD T2H1OL wurde eine TS von 3,61 (2,45; 5,32) ermittelt. Bei dieser Kombination liegt eine lineare Abhängigkeit vor, so daß keiner der Duftstoffe als Basisreizstoff in Frage kommt. Abbildung 4.2.2.5 zeigt die gefundenen TSS für den T2H1OL-empfindlichen Rezeptor. Orthogonale Beziehungen sind nur bei 2 Kombinationen zu erkennen. Abbildung 4.2.2.6 stellt die TSS mit T2H1OL als UD dar. Orthogonalität ist auch hier nur bei 2 Kombinationen vorhanden. Betrachtet man die beiden Abbildungen gemeinsam, so ist nur bei einer Kombination eine symmetrische Orthogonalität auszumachen. 2-Ethyl-hexan-1-ol (2EH1OL): Der Duftstoff 2EH1OL wurde in 5 Kombinationen und 39 Versuchen als ÜD und in 4 Kombinationen und 26 Versuchen als UD getestet. Bei allen Kombinationen mit 2EH1OL als ÜD wurden die Konzentrationen 10-4 und 10-3 benutzt. Mit T2H1OL (10-6) als UD wurde in 16 Versuchen eine TS von 0,04 (0,02; 0,07) gefunden. Die reziproke Kombination mit T2H1OL (10-6, 10-5) als ÜD und 2EH1OL (10-3) als UD ergab in 13 versuchen eine TS von 379,28 (180,95; 795,01). Hier liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor. In den Versuchen mit 2PEOL als UD wurde bei den 4 Versuchen mit der Konzentration 10-5 für den UD eine TS von 0,03 (0,02; 0,04) gefunden. Bei den 7 Versuchen mit der Konzentration von 10-4 des UD stieg die TS auf einen Wert von 0,62 (0,26; 1,50). Der Umkehrversuch wurde nicht durchgeführt. In der Kombination mit 1OCT3OL (10-4) als UD ergab die Auswertung der 4 Versuche eine TS von 1,66 (1,39; 1,98). Mit 1OCT3OL (10-5, 10-4) als ÜD und 2EH1OL (10-3) als UD wurde bei den 2 Versuchen eine TS von 198,94 (69,01; 573,52) entdeckt. Diese Kombination liefert eine asymmetrische Orthogonalität. In den 4 Versuchen mit GUAJ (10-4) als UD wurde eine TS von 0,43 (0,35; 0,52) ermittelt. Im umgekehrten Fall mit GUAJ (10-4, 10-3) als ÜD und 2EH1OL (10-3) als UD betrug die TS bei 7 Versuchen

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.7: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff 2EH1OL.

175,26 (30,43; 1009,50). Es besteht hier eine asymmetrische Orthogonalität. In den 4 Versuchen mit HEXEACE (10-5) als UD wurde eine TS von 0,23 (0,12: 0,43) gefunden. In den jeweils 4 Versuchen mit HEXEACE (10-5, 10-4) als ÜD und 2EH1OL (10-4 und 10-3) wurden konzentrationsabhängige Orthogonalitäten gefunden. Die Werte für die TS lagen bei 21,77 (15,97; 29,69) bzw. 147,26 (98,63; 219,86). Auch in diesem Fall liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor. Hinzu kommt eine konzentrationsabhängige Orthogonalität.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff 2EH1OL.

Insgesamt läßt sich zu dem Duftstoff 2EH1OL sagen, daß die Höhe der TS davon abhing, ob 2EH1OL als ÜD oder als UD im Versuch benutzt wurde. Abbildung 4.2.2.7 zeigt die linearen Abhängigkeiten des 2EH1OL-empfindlichen Rezeptors. Wurde 2EH1OL als UD benutzt, so konnten nur Orthogonalitäten gefunden werden (Abb. 4.3.2.8). Somit liegen nur asymmetrische Orthogonalitäten vor. 2-Phenyl-ethanol (2PEOL): Der Duftstoff 2PEOL wurde in 4 Kombinationen und 62 Versuchen mit den Konzentrationen 10-5 und 10-4 als ÜD und in 6 Kombinationen und 45 Versuchen mit den Konzentrationen 10-5 und 10-4 als UD getestet.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.9: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff 2PEOL.

In der Kombination mit T2H1OL (10-6) als UD wurde in 13 Versuchen eine TS von 4,81 (1,32; 17,51) gefunden. Mit T2H1OL (10-5, 10-4) als ÜD und 2PEOL (10-5 und 10-4) als UD wurden in jeweils 7 Versuchen TS von 0,07 (0,06; 0,09) und 0,94 (0,76; 1,15) ermittelt. Es liegt hier eine bei beiden Kombinationen eine lineare Abhängigkeit vor. Mit 2PEOL als Überlagerungsduftstoff wird das Kriterium für die Orthogonalität nur knapp nicht erreicht. Bei den 6 Versuchen mit 1OCT3OL (10-5, 10-4) als ÜD und 2PEOL (10-4) als UD wurde eine TS von 2,33 (1,17; 4,63) gefunden. Der reziproke Versuch wurde nicht durchgeführt.

Mit LINA (10-4) als UD ergab die Auswertung von 39 Versuchen eine TS von 296,75 (95,72; 919,95). Der reziproke Versuch wurde

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.10: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff 2PEOL.

nicht durchgeführt. Deshalb kann LINA als Basis-Reizstoff nicht ausgeschlossen werden. In den 4 Versuchen mit GUAJ (10-4) als UD wurde eine TS von 65,93 (47,80; 90,94) entdeckt. Mit GUAJ (10-4, 10-3) als ÜD und 2PEOL (10-4) als UD wurde eine TS von 1,02 (0,57; 1,82) ermittelt. Es liegt somit eine asymmetrische Orthogonalität vor.

In der Kombination mit HEXEACE (10-5) als UD wurde bei 6 Versuchen die höchste TS der durchgeführten Versuche gefunden. Der Wert für die TS lag bei 6648,86 (341,75; 129357,14). Auf Grund der hohen Streuung sollten weitere Versuche durchgeführt werden. Der reziproke Versuch mit HEXEACE (10-5, 10-4) als ÜD und 2PEOL (10-4) als UD lieferte in 4 Versuchen eine TS von 4,73

4. Ergebnisse

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(2,21; 10,11). Insgesamt besteht eine asymmetrische Orthogonalität. Wird das Kriterium für den Basisreizstoff etwas verringert, so könnten beide Duftstoffe als Basisreizstoffe in Frage kommen. Es könnte auch reichen die Anzahl der Versuche zu erhöhen um einen genaueren Wert zu erhalten. Die Abbildung 4.2.2.9 stellt die TSS des 2PEOL-empfindlichen Rezeptors dar. Das Kriterium für einen Basis-Reizstoff ist in den abgebildeten Versuchen fast immer erfüllt. Wie aus Abbildung 4.2.2.10 ersichtlich wird, zeigen die TSS von 2PEOL als UD in keiner durchgeführten Kombination orthogonales Verhalten. Das Kriterium für einen Basis-Reizstoff wird nur einmal knapp erreicht. (Z)-1-Octen-3-ol (1OCT3OL): Dieser Duftstoff ist der in dieser Studie am besten untersuchte Duftstoff. Er wurde in 29 Versuchen in 7 Kombinationen als ÜD mit den Konzentrationen 10-5 und 10-4 benutzt und in 25 Versuchen und in 5 Kombinationen in der Konzentration 10-4 verwendet. Die Kombination mit C3H1OL (10-5) als UD ergab bei 2 Versuchen eine TS von 7.47 (4.73; 11.81). Die 4 Versuche mit der reziproken Kombination mit C3H1OL (10-5, 10-4) als ÜD wurde eine TS von 5,42 (3,78; 7,78) gefunden. Hier liegt eine symmetrische Orthogonalität vor. Somit könnten beide Duftstoffe Basisreizstoffe sein. Wurde T2H1OL (10-5) als UD verwendet, so ergab die Auswertung von 2 Versuchen eine TS von 8,91 (2,74; 29,01). Hier lohnen sich weitere Versuche um festzustellen, ob tatsächlich eine Orthogonalität vorliegt. Für die Kombination mit T2H1OL (10-5, 10-4) als ÜD wurden bei 6 Versuchen eine TS von 8,92 (7,98; 9,97) ermittelt. Die Werte für die TS sind für beide Kombinationen identisch und zeigen orthogonales Verhalten. In den 7 Versuch mit 2EH1OL (10-3) als UD wurde eine TS von 175,26 (30,43; 1009,50) ermittelt. Die Werte streuen stark, jedoch liegen sie immer innerhalb der Grenze für Orthogonalität. Bei den 4 Versuchen mit 2EH1OL (10-4, 10-3) als ÜD wurde eine TS von 1,66 (1,39; 1,98) ermittelt. Hier liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor. Mit 2PEOL (10-4) als UD wurde bei 6 Versuchen eine TS von 2,33 gefunden. Der reziproke Versuch erfolgte nicht. Auf Grund der

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.11: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff 1OCT3OL.

linearen Abhängigkeit kommt hier jedoch keiner der beiden Duftstoffe als Basisreizstoff in Frage. Bei den 4 Versuchen mit LINA als UD (10-4) wurde eine TS von 13,74 (6,58; 28,69) gefunden. Versuche mit LINA als ÜD blieben aus und somit muß auch hier noch geklärt werden, ob es sich um eine symmetrische Orthogonalität handeln könnte.

Die Kombination mit dem Duftstoff GUAJ (10-4 und 10-3) als UD wurden jeweils 4 mal durchgeführt. Die Auswertung der TS ergab für die Konzentration 10-4 einen Wert von 14,44 (11,12; 18,76) und für die Konzentration 10-3 einen Wert von 51,41 (32,22; 82,01). Die 4 Versuche mit GUAJ (10-3) als ÜD ergab einen Wert für die TS von 4,77 (3,54; 6,42). Alle Versuche zeigen, daß eine asymmetrische Orthogonalität vorliegt, die abhängig von der Konzentration ist. Je

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.12: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff 1OCT3OL.

höher die Konzentration des UD GUAJ, desto höher ist die Orthogonalität.

Mit HEXEACE (10-5) als UD wurden bei 4 Versuchen eine TS von 10,40 (0,34; 320,12) ermittelt. Die Streuung ist zu groß um eine verbindliche Aussage über eine mögliche Orthogonalität treffen zu können. Der reziproke Versuch, der 7 mal ausgewertet werden konnte, ergab einen Wert von 26,05 (18,59; 36,52) für die TS. Hier handelt es sich um eine symmetrische Orthogonalität, die sich jedoch in eine asymmetrische umwandeln könnte, wenn für die eine Kombination mehr Versuche durchgeführt werden. Die Abbildung 4.2.2.11 zeigt die TSS des 1OCT3OL-empfindlichen Rezeptors. In allen untersuchten Kombinationen konnte bis auf den UD 2PEOL eine Orthogonalität ermittelt werden. Die Abbildung

4. Ergebnisse

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4.2.2.12 zeigt die TSS von 1OCT3OL als UD. Hier wird nur in der Kombination mit GUAJ eine Orthogonalität knapp nicht erreicht werden. Bei dem Duftstoff 1OCT3OL fällt auf, daß bei sehr vielen Kombinationen orthogonales Verhalten gefunden wurde. Linalool (LINA): Der Duftstoff LINA (10-4) wurde in 2 Kombinationen mit insgesamt 43 Versuchen als UD benutzt. In den 39 Versuchen mit 2PEOL (10-4) als ÜD wurde eine TS von 296,75 (95,72; 919,95) gefunden. Auch wenn diese Werte stark streuen, so liegt jedoch immer eine Orthogonalität vor. Mit 1OCT3OL (10-4) als ÜD wurde bei den 4 Versuchen eine TS von 13,74 (6,58; 28,69) ermittelt. Diese Werte zeigen schon mal eine Orthogonalität, welche möglicherweise eine symmetrische sein könnte. Doch dazu müssen reziproke Versuche durchgeführt werden. Abbildung 4.2.2.13 zeigt die TSS für die 2 untersuchten Kombinationen mit LINA als UD. Dieser Duftstoff zeigt bei beiden Kombinationen orthogonales Verhalten. Weitere Versuche sollten unbedingt durchgeführt werden um zu klären, ob es sich dabei um symmetrische Orthogonalitäten handeln könnte. Auch sollten weitere Kombinationen getestet werden.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.13: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff LINA.

Guajacol (GUAJ): GUAJ wurde in 3 Kombinationen und 23 Versuchen in den Konzentrationen 10-5, 10-4 und 10-3 als ÜD verwendet. In 5 Kombinationen und 26 Versuchen kam GUAJ mit den Konzentrationen 10-4 und 10-3 als UD zum Einsatz. In den 4 Versuchen mit C3H1OL (10-5) als UD und GUAJ (10-5, 10-

4) als ÜD wurde eine TS von 25,90 (10,77; 62,30) ermittelt. Bei den ebenfalls 4 Versuchen mit der Kombination C3H1OL (10-5, 10-4) als ÜD uns GUAJ (10-4) als UD ergab sich eine TS von 1,81 (1,23; 2,67). Somit liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor.

4. Ergebnisse

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Abb. 2.4.4.14: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff GUAJ.

Bei der Kombination mit 2EH1OL (10-3) als UD und GUAJ (10-4, 10-3) als ÜD wurde in 7 Versuchen eine hohe TS von 175,26 (30,34; 1009,50) entdeckt. Die 4 Versuche mit GUAJ (10-4) als UD und 2EH1OL (10-4, 10-3) als ÜD ergaben eine TS von 0,43 (0,35; 0,52). Es liegt hier eine asymmetrische Orthogonalität vor. Die Kombination mit 2PEOL (10-4) als UD und GUAJ (10-4, 10-3) als ÜD ergab in 8 Versuchen eine TS von 1,02 (0,57; 1,82). Mit 2PEOL (10-5, 10-4) als ÜD und GUAJ (10-4) als UD ergab die Auswertung von 4 Versuchen eine TS von 65,93 (47,80; 90,94). Bei diesen beiden Duftstoffen wird nur eine asymmetrische Orthogonalität erreicht.

In der Kombination mit 1OCT3OL (10-4) als UD und GUAJ (10-4, 10-3) wurde von 4 Versuchen eine TS von 4,77 (3,54; 6,42) ermittelt. Mit 1OCT3OL (10-5, 10-4) als ÜD und GUAJ (10-4 und 10-3) als UD wurden in 4 bzw. 3 Versuchen TS von 14,44 (11,12; 18,76)

4. Ergebnisse

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Abb. 2.4.4.15: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff GUAJ.

bzw. 51,41 (32,22; 82,01) ermittelt. Die asymmetrische Orthogonalität ist konzentrationsabhängig. Mit HEXEACEACE (10-5, 10-4) als ÜD und GUAJ (10-4) als UD ergab die Auswertung von 8 Versuchen eine TS von 10,16 (6,96; 14,83). Hier muß noch geklärt werden, wie sich die gefundene Orthogonalität im reziproken Versuch verhält. Vorerst liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor. Die Abbildung 4.2.2.14 stellt die TSS des GUAJ-empfindlichen Rezeptors dar. Bei 2 Kombinationen liegt eine Orthogonalität vor, eine 3. Kombination hat das Kriterium fast erfüllt. Die in Abbildung 4.2.2.15 gezeigten Werte für die TSS zeigen, daß nur ein Duftstoff als Basis-Reizstoff in Frage kommt, wenn der Wert zum Erfüllen des Kriteriums ein wenig verringert wird.

4. Ergebnisse

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(Z)-3-Hexenyl-acetat (HEXEACE): Der Duftstoff HEXEACE ist der am zweitbesten untersuchte Duftstoffe in dieser Arbeit. Er wurde in Kombination mit 6 UD und 38 Versuchen sowie mit 5 ÜD und 36 Versuchen getestet. Die verwendeten Konzentrationen betrugen dabei als UD 10-6 und 10-5 und als ÜD 10-5 und 10-4. Mit dem UD C3H1OL (10-5) wurde in 9 Versuchen eine TS von 7,21 (5,29; 9,83) berechnet. Die Kombination mit HEXEACE (10-5) als UD und C3H1OL als ÜD wurde in verschiedenen Konzentrationen (10-6, 10-5, 10-4) durchgeführt. Dabei wurde eine Versuchsreihe (C3H1OL 10-5, 10-4) , bei der ein kleiner Fehler bei dem Antrieb vorlag wiederholt. Die TS für die Konzentration 10-6 und 10-5 für C3H1OL lag bei 30,09 (8,58; 105,52). Für die höhere Konzentration (10-5, 10-4) ergab die Auswertung der zwei Versuchsreihen (6 Versuche und 4 Versuche) TS von 0,78 (0,44; 1,37) und 0,94 (0,73; 1,20). Die zwei Versuchsreihen sind trotz des kleinen Antriebsproblems nahezu identisch, so daß dieser Wert als richtig angesehen werden kann. Insgesamt liegt hier eine symmetrische und partielle Orthogonalität vor. Die beiden Duftstoffe verhalten sich bei der Kombination mit C3H1OL als ÜD nur bei niedrigen Konzentrationen orthogonal. Bei den 4 Versuchen mit T2H1OL (10-5) als UD lag eine TS von 3,61 (2,45; 5,32) vor. In der reziproken Kombination mit T2H1OL (10-5, 10-4) als ÜD und HEXEACE (10-6) lag bei 8 Versuchen eine TS von 0,08 (0,06; 0,10) vor. Hier liegt eine lineare Abhängigkeit vor. Der Duftstoff 2EH1OL wurde in den Konzentrationen 10-4 und 10-3 als UD getestet. Dabei wurden in jeweils 4 Versuchen TS von 21,77 (15,97; 29,69) bzw. 147,26 (98,63; 219,86) ermittelt. In den 4 reziproken Versuch mit HEXEACE (10-5) als UD und 2EH1OL (10-4, 10-3) sank die TS auf 0,23 (0,12; 0,43). Es liegt eine asymmetrische Orthogonalität vor. In der Kombination mit dem UD 2PEOL (10-4) und HEXEACE (10-5) wurde bei 2 Versuchen eine TS von 4,73 (2,21; 10,11) ermittelt. In 6 Versuchen mit 2PEOL (10-5, 10-4) als ÜD und HEXEACE (10-5) als UD wurde eine TS von 6648,86 (341,75; 129357,14) gefunden. Die gefundene asymmetrische Orthogonalität sollte durch weitere Versuche überprüft werden. Es könnte sich nämlich auch um eine symmetrische handeln, wenn die Streuung der Werte abnimmt.

4. Ergebnisse

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Abb. 2.4.4.16: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Überlagerungsduftstoff HEXEACE.

Mit dem UD 1OCT3OL (10-4) und dem ÜD HEXEACE (10-5, 10-4) wurde in 7 Versuchen eine TS von 26,05 (18,59; 36,52) ermittelt. Im reziproken Versuch mit HEXEACE (10-5) als UD und 1OCT3OL (10-5, 10-4) wurde in 4 Versuchen eine TS von 10,40 (0,34; 320,12) gefunden. Leider reichen hier die Werte für die TS von linearer Abhängigkeit bis zur Orthogonalität, so daß durch weitere Versuche eine Klärung der Zugehörigkeit durchgeführt werden sollte. Im Moment liegt eine symmetrische Orthogonalität vor, so daß beide Duftstoffe als mögliche Basisreizstoffe angesehen werden. Die Kombination mit GUAJ (10-4) als UD und HEXEACE (10-5, 10-4) ergab in 8 Versuchen eine TS von 10,16 (6,96; 14,83). Der reziproke Versuch wurde nicht durchgeführt. Somit bleibt ungeklärt, ob hier eine asymmetrische oder eine symmetrische Orthogonalität herrscht.

4. Ergebnisse

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Abb. 2.4.4.17: Trennschärfenstufen bei Überlagerungsversuchen mit dem Untergrundduftstoff HEXEACE.

Die Abbildung 4.2.2.16 zeigt, daß der HEXEACE-empfindliche Rezeptor bei fast allen durchgeführten Kombinationen hohe TS aufweist, d.h. die Dufststoffe sich orthogonal verhalten. Wurde HEXEACE als UD verwendet, so konnte solch Verhalten nur noch in 2 der untersuchten Kombinationen beobachtet werden (Abb. 4.2.2.17).

Die Ergebnisse der Überlagerungsversuche mit dem Kartoffelkäfer werden in Abbildung 4.2.2.18 tabellarisch zusammengefaßt. In der Abbildung befinden sich die geometrisch ermittelten Mittelwerte für die Trennschärfe (TS) und die Trennschärfenstufen (TSS) aller ausgewerteten Duftstoffkombinationen. Die 4 Klassen (siehe Kap. 2.3.4) werden durch einen Farbcode dargestellt. Rot unterlegte Werte weisen auf Kombinationen hin, die linear abhängig sind. Grün unterlegte Werte zeigen Kombinationen an, die eine bemerkbare Wechselwirkung besitzen. Bei diesen Kombinationen liegt der Berechnungsfehler zwischen 10 % und 20 %. Blau

4. Ergebnisse

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unterlegte Werte spiegeln orthogonales Verhalten wider. Dabei liegt der Berechnungsfehler entweder zwischen 1 % und maximal 10 % (dunkelblau) oder unter 1 % (hellblau). Das Kriterium für einen Basis-Reizstoff erfüllt in dieser Arbeit nur der Duftstoff, der in Kombination mit einem anderen Duftstoff eine TS von mindestens 5 besitzt (Klasse 3, grüner Code). Damit ergibt sich ein Berechnungsfehler von maximal 20 % für die Bestimmung der tatsächlich vorhandenen Konzentration des zu untersuchenden Duftstoffs in einem binären Gemisch (bestehend aus ÜD und UD).

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.18: Trennschärfen (TS) und Trennschärfenstufen (TSS) der durchgeführten Überlagerungs- versuche mit dem Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata. Das Kriterium für einen Basis-Reizstoff liegt bei einer TS ≥ 5 bzw. TSS ≥ 0,7 für beide Duftstoffkombinationen eines Überlagerungsversuchs.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.19: Symmetrisch durchgeführte Überlagerungsversuche mit dem Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata.

Um zu klären, welche Duftstoffe Basis-Reizstoffe sind, wurde ein graphisches Konzept zur Ermittlung der Basis-Reizstoffe erarbeitet. Dabei werden zuerst alle symmetrisch durchgeführten Kombinationen in einem Diagramm zusammengestellt (Abb. 4.2.2.19). Anschließend werden die Kombinationen herausgesucht, bei denen eine symmetrische Orthogonalität (Klasse 1 bis Klasse 3) vorlag (Abb. 4.2.2.20). Mittels dieses Konzepts konnte ein Triplett von Basis-Reizstoffen gefunden werden. Dieses Triplett besteht aus den Duftstoffen C3H1OL, 1OCT3OL und HEXEACE.

Um mögliche weitere Tripletts zu finden, werden alle Kombinationen mit orthogonalem Verhalten aufgetragen (Abb. 4.2.2.21). Nun hält man in Abbildung 4.2.2.20 nach fehlenden orthogonalen Verbindungen Ausschau und sucht diese in Abbildung 4.2.2.21. Dabei fällt auf, daß oft eine asymmetrische Orthogonalität zwischen 2 Duftstoffen besteht. Dazu muß geklärt werden, ob es sich um eine tatsächliche asymmetrische Orthogonalität handelt, oder ob einer der beiden Überlagerungsversuche nicht durchgeführt wurde. So zeigt der Vergleich, daß bei der Duftstoffkombination GUAJ und HEXEACE nur eine Kombination getestet wurde. Sollte die zweite Kombination ebenfalls eine Orthogonalität aufzeigen, so wäre ein zweites Triplett mit den Duftstoffen HEXEACE, 1OCT3OL und GUAJ gefunden

4. Ergebnisse

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Abb. 4.4.20: Kombinationen mit symmetrischer Orthogonalität. Werden nur die Kombinationen dargestellt, die eine symmetrische Orthogonalität aufweisen, so ergibt sich ein Triplett aus Basis-Reizstoffen (C3H1OL, 1OCT3OL, HEXEACE).

worden. Auch sollten weitere Überlagerungsversuche mit dem Duftstoff LINA gemacht werden, da die bisherigen Überlagerungsversuche sehr viel versprechend sind.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.2.2.21: Kombinationen mit einer Orthogonalität. Je heller die Farbe der Verbindungslinie, desto größer ist der Grad der Orthogonalität. Die zwei dunkelgrünen Pfeile, die von 2PEOL wegführen, erfüllen das Kriterium nur knapp nicht.

4.3 Dosis-Wirkungskurven der EAG-Antworten des Kartoffelkäfers Die Daten aus den Überlagerungsversuchen werden zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurven verwendet. Dazu werden die EAG-Amplituden aus den „Kalibrierphasen“ der Überlagerungsversuche für jeden Duftstoff in Abhängigkeit von der Konzentration aufgetragen. Da nur 4 Duftstoffe (C3H1OL, T2H1OL, GUAJ und HEXEACE) mit 3 Konzentrationen (10-6, 10-5 und 10-4) in den Überlagerungsversuchen verwendet wurden, werden auch nur für diese 4 Duftstoffe Dosis-Wirkungskurven erstellt. In Abbildung 4.3.1 sind die Dosis-Wirkungskurven von 4 Duftstoffen und die Regressionsgeraden abgebildet. In den untersuchten Konzentrationsbereichen zeigten die Dosis-Wirkungskurven der Duftstoffe T2H1OL und GUAJ einen linearen Verlauf im halblogarithmischen Maßstab, während die Dosis-Wirkungskurven der Duftstoffe C3H1OL und HEXEACE im untersuchten Bereich nahezu identisch waren und eher einen sigmoiden Verlauf haben.

4. Ergebnisse

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Abb. 4.3.1: Dosis-Wirkungskurven für die Duftstoffe C3H1OL, T2H1OL, HEXEACE und GUAJ. Die EAG-Amplituden wurden gegen die Konzentration im halblogarithmischen Maßstab dargestellt. Die Gleichungen für die Dosis-Wirkungskurven ergeben sich aus logarithmischen Regressionen (gestrichelte Linien). leine Striche: Standardfehler; n: Anzahl der Versuche.

4. Ergebnisse

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Die stärksten Antworten wurden mit unverzweigten ungesättigten Alkoholen mit 6 C-Atomen erreicht. Dabei war die Antwort um so stärker, je näher die Doppelbindung am Alkohol lag (T2H1OL>C3H1OL). Die zweitstärkste Antwort wurde durch ein unverzweigtes ungesättigtes Acetat mit einer Kette aus 6 C-Atomen (HEXEACE) erzeugt. Die drittstärkste Antwort wurde durch eine ungesättigte Kohlenstoffkette mit 8 C-Atomen und dem Alkohol an der 3. Stelle und der Doppelbindung an der 1. Stelle hervorgerufen (1OCT3OL). Die folgenden Antworten betrugen schon weniger als 50% der maximalen Antwort auf T2H1OL. Es folgte die Antwort auf einen zyklischen Aromaten mit einer kurzen Alkoholkette (2PEOL). Die nächst stärkere Antwort wurde durch einen mehrfach ungesättigten langkettigen (C-8) und verzweigten Alkohol erzeugt (LINA). Die zweit schwächste Antwort wurde durch einen aromatischen Alkohol hervorgerufen (GUAJ) und die schwächste Antwort durch einen gesättigten und verzweigten Alkohol (2EH1OL).

5. Diskussion

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5. Diskussion 5.1 Technische Überprüfung des MD-EAG-Meßsystems Bevor das MD-EAG-System benutzt werden konnte, mußte das System auf mögliche technische Mängel überprüft werden. Dazu wurden unterschiedliche Versuche durchgeführt. So wurde die Positionssymmetrie, der Einfluß des Spritzenwechsels bei eingelegter Antenne sowie ein mögliches Übersprechen elektrischer Impulse der Ausführungseinheiten auf das EAG untersucht. Wegen der Bauform der Trommel, die bei dem bestehenden Pheromon-EAG-System nicht vorhanden ist, mußte die Mischeinrichtung wesentlich verändert werden. Das Hauptrohr wurde verlängert und der zweite Düsenring an einer anderen Position angebracht. Die erzielten Positionssymmetrien erreichten knapp 86 %. Dieser Wert ist im Vergleich zu den erzielten Positionssymmetrien aus den Versuchen mit den 5 Mischeinrichtungen (siehe Kap. 3.2.2) einer der schlechtesten. Es erscheint daher günstig, das Hauptrohr und die Mischeinrichtung ähnlich den Prototypen 3 bzw. 4 auszuführen. Doch dazu muß die Trommel erst umgebaut werden. Die Auflagescheibe für den Spritzenkonus müsste so gestaltet werden, daß sie sich zum Mittelpunkt der Scheibe nach innen wölbt, so daß eine Art Hohlraum für die Messkammer entsteht. Durch die dann mögliche Verkürzung des Hauptrohrs entstünde eine Angleichung der zur Zeit verwendeten Mischeinrichtung an einen der Prototypen. Wird mit eingeschalteter Hauptluft eine andere Spritze auf der Trommel angefahren, so gleitet die Spritze aus dem Einschußloch der Applikationsstelle 1 heraus (siehe Kap. 3.3.2) und durch das Einschussloch gelangt ungefilterte Außenluft in den Hauptluftstrom. Die Antenne reagiert mit einer Potentialänderung auf die ungefilterte Außenluft im Hauptluftstrom (Abb.2.3.2.5). Verdeckt der Spritzenkonus das Einschussloch während der Regelschwingung, so gelangt weniger Außenluft durch das kurzfristig verdeckte Einschussloch und die EAG-Amplitude verringert sich und steigt wieder an, wenn der Spritzenkonus am Einschussloch vorbeigleitet. Ist die ausgewählte Spritze in dem Einschussloch eingerastet, so gelangt keine ungefilterte Außenluft mehr in den Hauptluftstrom und die EAG-Amplitude sinkt fast auf den Ausgangswert vor dem Spritzenwechsel. Der Spritzenwechsel hat demzufolge den gleichen Einfluß, wie das Öffnen des Filters zur Bestimmung der

5. Diskussion

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Konzentration unbekannter Duftstoffe in der Außenluft. Denn bei diesem Vorgang gelangt ungefilterte Außenluft, diesmal beabsichtigt, in den Hauptluftstrom und zu diesem Hauptluftstrom wird nach dem Zusatzreizverfahren eine bekante Duftstoffmenge appliziert. Kurz darauf wird dann der Filter wieder geschlossen und die EAG-Amplitude nähert sich dem Ausgangswert vor Öffnen des Filters. Da die Vorgänge des Spritzenwechsels und des Öffnens des Filters eigentlich den gleichen Vorgang darstellen, scheint es nicht unbedingt nötig, einen speziellen Verschlußmechanismus zu entwickeln, der beim Spritzenwechsel das Einschußloch abdichtet. Jedoch können mit der Außenluft „klebrige“ Duftstoffe in den Hauptluftstrom gelangen und von der Oberfläche des Hauptrohrs adsorbiert werden. Solche Duftstoffmoleküle würden dann nach und nach von der Oberfläche emittiert werden und einen unerwünschten Untergrund erzeugen. Dieser Untergrund könnte zum einen eine Drift des EAG verursachen und zum anderen die Konzentrationsbestimmung beeinträchtigen. Aus diesem Grund muß die Mischeinrichtung nicht nur gute Positionssymmetrien erzeugen, sondern zudem sollte sie Kontakte des Reizluftstroms mit der Wand des Hauptrohrs verringern. Dadurch würden auch Wandkontakte mit Duftstoffmolekülen aus der ungefilterten Außenluft, die durch das Einschußloch der Applikationsstelle 1 in den Hauptluftstrom gelangt sind, vermindert werden. Weiter wurde überprüft, inwieweit die Aktivierung der Schrittmotoren einen Einfluß auf die registrierten EAG-Signale hat. Dazu wurde der Versuchsablauf eines Überlagerungsversuchs gestartet. Statt einer Antenne wurde ein Widerstand (4 MΩ) in die Meßkammer eingelegt. Spritzen als Duftstoffquelle wurden nicht verwendet. Sollte nun eine Änderung des EAG-Signals zu sehen sein, so konnte diese nur von elektrischen Signalen des Systems stammen. Abbildung 5.1.1 zeigt die gefundenen Änderungen des EAG-Signals von 3 durchgeführten Versuchen. Der Schrittmotor 1 (SM1), der den Spritzenvorschub für die Spritze des Untergrundduftstoffs (UD) generiert, erzeugt in der „Kalibrierphase“ und in der „Überlagerungsphase“ gleich starke Änderungen des EAG-Signals. Die Schrittmotoren 2 und 3 (SM2 und SM3), welche den Spritzenvorschub für den Überlagerungsduftstoff (ÜD) erzeugen, erzeugen ebenfalls in den beiden Phasen gleiche Änderungen der EAG-Signale. Die EAG-Signale der beiden Phasen sind nahezu identisch. Diese Messung zeigt, daß ein geringer Anteil der EAG-Amplituden bei Versuchen mit dem MD-EAG von der Spannung der Schrittmotoren erzeugt wird. Die stärkste Änderung mit 0,028 mV erzeugt der Schrittmotor 3. Dieser Anteil ist

5. Diskussion

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Abb. 5.1.1: Einfluß der Aktivierung der Schrittmotoren auf das EAG-Signal. Bei dem typischen Ablauf eines Überlagerungsversuchs wird zuerst der Schrittmotor 1 () zweimal hintereinander betätigt. Danach erfolgt die „Kalibrierungsphase“ mit dem Überlagerungsduftstoff, welcher durch Aktivierung des Schrittmotors 2 () und des Schrittmotors 3 () verabreicht wird. In der „Überlagerungsphase“ wird zuerst der Schrittmotor 1 und nach einer gewissen Zeit zusätzlich der Schrottmotor 2 aktiviert. Nach einer Pause wird erneut der Schrittmotor 1 und dann zusätzlich der Schrottmotor 3 aktiviert. Der Schrittmotor 3 hat mit einer Amplitude von 0,028 mV den größten Einfluß auf das EAG-Signal. In der Mitte und am Ende des Versuchs sind zwei Plateaus zu erkennen. Diese entstehen durch Übersprechen der Elektronik für den Spritzenwechsel. Dieses Übersprechen und das der Schrittmotoren wurde nachträglich beseitigt. Die rote Spur zeigt den Zeitverlauf der Aktivierung der Schrittmotoren.

reproduzierbar und konstant und hat daher keinen Einfluß auf die Berechnung, da nur die Differenzen der EAG-Amplituden für die Berechnungen benutzt werden. Dies ist wesentlich und entscheidend, da ansonsten der Einfluß ermittelt und in die

Berechnungen einbezogen werden müßte. 5.2 Einflüsse und Artefakte durch die Reizung Wie die Ergebnisse aus den Kontrollversuchen des Kapitels 4.1.1 zeigen, erzeugt Paraffin nur sehr geringe EAG-Amplituden. Bezieht man die aus Kapitel 5.1 gewonnenen Zusammenhänge zwischen Aktivierung der Schrittmotoren und EAG-Amplitude mit ein, so kann davon ausgegangen werden, daß der Einfluß von Paraffin für das Auslösen einer EAG-Amplitude zu vernachlässigen ist. Daß gefilterte Luft höhere EAG-Amplituden erzeugte als Paraffin, war zu vermuten. Paraffin bindet als Lösungsmittel Duftstoffe aus dem Gasvolumen innerhalb der Spritze und säubert dadurch die Luft. Es

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sind somit weniger Duftstoffmoleküle im Gasvolumen der Spritze vorhanden, wenn Paraffin ebenfalls anwesend ist. Befindet sich die gleiche Luft in einer Spritze ohne Paraffin, so ist zwar die gleiche Anzahl an Duftstoffmolekülen im Inneren der Spritze, jedoch befinden sie sich ohne Paraffin alle im Gasraum. Mit Paraffin befindet sich je nach Dampfdruck des Duftstoffs mehr oder weniger im Gasraum. Da die mit Paraffin bestückten Spritzen ebenfalls nur mit gefilterter Luft aufgezogen werden, übernimmt Paraffin sozusagen die Funktion eines Filters. 5.3 Zersetzungserscheinungen des Duftstoffs Nonanal Da vom Duftstoff Nonanal angenommen wurde, daß sich dieser im Laufe der Benutzung zersetzen würde (pers. Mittl. Schütz) und man deshalb die Duftstoffquellen nach einigen Tagen mit frischem Nonanal beladen müßte, wurde ein Konservierungsstoff gesucht, der keine physiologischen Auswirkungen hat und Nonanal vor der Zersetzung bewahrt. Aus diesem Grund wurde dem Paraffin 1 % Vitamin E beigemengt. Die Kontrollversuche zeigten, daß Paraffin mit 1 % Vitamin E geringfügig niedrigere EAG-Amplituden auslöste als reines Paraffin. Damit war gewährleistet, daß Vitamin E als Konservierungsmittel keine negativen Auswirkungen bei der Geruchswahrnehmung hat. Die durchgeführten Versuchsreihen zeigten, daß Vitamin E keine physiologische Auswirkung hatte und Nonanal ohne Vitamin E nach 28 Tagen Aufbewahrung bei Raumtemperatur gleich hohe EAG-Amplituden auslöste wie frisch angesetztes. Nonanal zersetzt sich innerhalb der 28 Tage nicht und benötigt somit kein Konservierungsmittel. 5.4 Überlagerungsversuche Für die mathematische Beschreibung von Mischungseffekten bei der olfaktorischen Wahrnehmung gibt es unterschiedliche Modelle für die „ungestörte Überlagerung“, für „Unterdrückungs-„ und „Verstärkungseffekte“. Das Antwortsummen-Modell geht von der Annahme aus, daß die Intensität der Antwort auf Reizung durch das binäre Gemisch gleich der Summe der Antworten auf Reizung durch die beiden Einzelkomponenten ist. Dieses Modell geht von einer unabhängigen Wirkung der Mischungsbestandteile auf unterschiedliche ORN aus (Frank 1989; Derby & Ache 1984; Carr & Derby 1986). Dies entspricht der in dieser Arbeit definierten Orthogonalität. Wirken mehrere Stimulusqualitäten, wie

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Luftfeuchtigkeit, Temperatur oder Geruchsreize, auf ein und dasselbe ORN, so kann dieses Modell nicht benutzt werden. Aus diesem Grund geht das Alternativstimulus-Substitutionsmodell nach Frank (1989) davon aus, daß eine Mischung aus zwei unterschiedlichen Duftstoffen in wirkungsgleichen Konzentrationen denselben Effekt hat wie die Verdoppelung der Konzentration eines einzigen Duftstoffs. Ein solcher Zusammenhang wird in dieser Arbeit als linear abhängig bezeichnet. Die zwei Modelle sind zwar nicht ineinander überführbar, jedoch stellen sie Grenzfälle dar. Um ein einheitliches Modell entwickeln zu können, müssen alle Fälle behandelt werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit die Trennschärfe (TS) eingeführt. Sie gibt die Selektivität des Rezeptors für das untersuchte binäre Gemisch an. Sie ist ein Maß dafür, wie viele Moleküle des UD die gleiche Reaktion am ÜD-spezifischen Rezeptor auslösen wie ein Molekül des ÜD. Das Antwortsummen-Modell würde sich in diesem Fall durch eine unendliche TS beschreiben lassen und das Alternativstimulus-Substitutionsmodell durch eine TS = 1. Borst (1984) leitete von der Oberfläche am proximalen Ende des Funiculus bei Drosophila melanogaster ab. Er untersuchte die Kreuzreaktionen von 2 Duftstoffen in einem binären Gemisch und stellte fest, daß je ähnlicher sich die untersuchten Duftstoffe waren, desto stärker war die Kreuzreaktion. Die Summe der einzelnen EAG-Amplituden, die durch Reizung mit 3-Octanol bzw. 4-Methyl-cyclo-hexanol erzeugt wurden, entsprach der EAG-Amplitude des binären Gemischs aus diesen zwei Komponenten. Die 2 Duftstoffe verhielten sich orthogonal zueinander. Bei den beiden Duftstoffen 3-Octanol und 3-Nonanol wurde eine starke Kreuzreaktion gefunden. Das binäre Gemisch aus diesen beiden Komponenten erzeugte eine niedrigere EAG-Amplitude als die Summe der EAG-Amplituden durch Reizung der Einzelkomponenten. Im Unterschied zu dem Versuchsaufbau von Borst (1984), bei dem die Einzelkomponenten vor der Applikation gemischt wurden, wurde in dieser Arbeit erst die eine Komponente verabreicht und etwas später die zweite zusätzlich. Bei der von Borst (1984) benutzten Stimulationsmethode konkurrieren die Moleküle beider Duftstoffe gleichzeitig am Rezeptor während bei den hier durchgeführten Überlagerungsversuchen der UD ungestört an den Rezeptor binden kann und erst wesentlich später durch den ÜD verdrängt werden muß. Payne & Dickens (1976) untersuchten die Spezifität des olfaktorischen Rezeptorsystems bei Dendroctonus frontalis mit der Adaptationsmethode. Dabei wurde die Insektenantenne so lange mit dem ersten Duftstoff gereizt, bis die Antenne komplett adaptiert

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war. Dann erst wurde statt des ersten Duftstoffs mit dem zweiten Duftstoff gereizt. Sie fanden heraus, daß bei Adaptation der Rezeptoren durch Frontalin, dem Hauptbestandteil des Aggregationspheromons, die Rezeptoren auf keinen der 6 untersuchten Duftstoffe antworteten. War die Antenne jedoch mit einem der 6 Duftstoffe adaptiert, so löste Frontalin eine geringere Antwort aus als mit nicht adaptierten Rezeptoren. Sie fanden ebenfalls heraus, daß eine olfaktorische Rezeptorzelle mehrere Akzeptortypen für unterschiedliche Duftstoffe besitzt. 5.4.1 Pflanzenduftstoffe und Pheromon sind orthogonal Seit einigen Jahren wird die Pheromonkonzentration im Freiland mit dem EAG-System bestimmt. Dabei kam die Frage auf, ob durch mögliche Wechselwirkungen zwischen Pflanzenduftstoffen am pheromonspezifischen Rezeptor die Konzentration genau genug ermittelt werden kann. Rumbo et al. (1995) und Karg et al. (1997) zeigten, daß bei Anwesenheit von Pflanzenduftstoffen die durch Pheromonapplikation ausgelösten EAG-Amplituden schwächer waren als bei Abwesenheit. Sie folgerten daraus, daß deshalb die EAG-Methode zur Bestimmung der Pheromonkonzentration keine genauen Werte liefern könne. Karg et al. (1997) beschrieben die Wechselwirkungen mathematisch durch ein „logarithmisch-additives Modell“. Dabei war die Stärke der Wechselwirkung von der Konzentration des Untergrunds abhängig. Um diesen Tatbestand eindeutig zu klären wurden Überlagerungsversuche von Pheromon des Bekreuzten Traubenwicklers Lobesia botrana und den Pflanzenduftstoffen Nonanal und Linalool durchgeführt. Die Ergebnisse der Überlagerungsversuche zeigten eine Abhängigkeit der Trennschärfe (TS) von der Konzentration des UD, wie sie Karg et al. (1997) gefunden haben. Diese Abhängigkeit kommt in dieser Arbeit dadurch zustande, daß die Konzentration des UD bei der Berechnung der TS berücksichtigt wird (siehe Gleichung 9 Kap. 2.3.3). Somit ist der Anstieg der TS um das Zehnfache bei zehnfach höherer Konzentration des UD zu erklären. Doch kann dies nur dann der Fall sein, wenn die beiden untersuchten Duftstoffe vollkommen orthogonal sind und auftretende Wechselwirkungen durch andere Faktoren hervorgerufen wurden. Die verwendeten Pflanzenduftstoffe sind orthogonal zu dem Pheromon. Das bedeutet, daß die Anwesenheit der Pflanzenduftstoffe die Bestimmung der Pheromonkonzentration

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nicht beeinflußt. Dies konnte durch Überlagerungsversuche zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden. Zumindest bei den von Karg et al. (1997) durchgeführten Versuchen wurde ein entscheidender Gesichtspunkt nicht berücksichtigt. Die Duftstoffquelle für den Untergrundreiz (UD) bestand aus einem Gummiseptum, das oberhalb der Applikationsstelle für den Zusatzreiz (ÜD) in den Hauptluftstrom gehängt wurde. Durch die Applikation des Zusatzreizes (ÜD), der keinen Untergrundduftstoff enthält, wird die Konzentration des UD im Hauptluftstrom verringert. Je größer das Verhältnis von Reizluftstrom zu Hauptluftstrom ist, desto stärker ist der auftretende Effekt. Während des Zusatzreizes sinkt folglich die EAG-Amplitude einerseits auf Grund der verringerten Konzentration des UD, andererseits steigt sie jedoch durch den neuen Zusatzreiz an. Insgesamt betrachtet sieht dies wie eine Kreuzreaktion aus, wenn man den Verdünnungseffekt durch den Zusatzreiz nicht berücksichtigt. Wird der Verdünnungseffekt berücksichtigt bzw. wird ein Versuchsablauf, ähnlich dem in dieser Arbeit, benutzt, so sind zumindest bei Lobesia botrana zwischen Pheromon und anderen Pflanzenduftstoffen keine Kreuzreaktionen zu finden. Dies widerlegt die von Rumbo et al. (1995) und Karg et al. (1997) vertretene Aussage, daß mit einem EAG-Meßsystem keine genauen Konzentrationsbestimmungen für Pheromone im Freiland durchgeführt werden können. 5.4.2 Überlagerungsversuche beim Kartoffelkäfer zeigen duftspezifische Abhängigkeiten Mit den Überlagerungsversuchen mit dem Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata sollten Basis-Reizstoffe gefunden werden, die später für die Analyse von Duftstoffgemischen benutzt werden können. Dazu mußte ein Versuchsablauf und eine Auswertungsmethode entwickelt werden, die mögliche Kreuzreaktionen zwischen einzelnen Duftstoffen ersichtlich werden läßt. Ein erster Ansatz war die Einführung der Orthogonalitätskennzahl Ω. Dabei wurde die Amplitudenverminderung des ÜD bei Anwesenheit des UD in Prozent des vorher gemessenen „Dekadensprungs“ angegeben. Der „Dekadensprung“ ist die Differenz zwischen der EAG-Amplitude auf einen Reiz der Konzentration k und der EAG-Amplitude auf einen Reiz mit der 10fach höheren Konzentration 10k. Von dem so erhaltenen Wert Ω wurde dann der Wert Ω des Kontrollversuchs subtrahiert. Bei

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diesem ersten Ansatz gingen die Konzentrationen der benutzten Duftstoffe nicht in die Berechnung mit ein. Aus diesem Grund wurde ein neues Berechnungsverfahren entwickelt, welches die unterschiedlichen Konzentrationen berücksichtigt und für die Auswertung der Versuche in dieser Arbeit verwendet wurde. Insgesamt wurden 34 Duftstoffkombinationen untersucht. Bei 7 Kombinationen wurden TS < 1 gefunden. Von 28 symmetrisch durchgeführten Kombinationen war eine symmetrisch linear abhängig und 6 symmetrisch orthogonal. Von diesen 6 symmetrisch orthogonalen Kombinationen konnte ein Triplett an Basis-Reizstoffen gefunden werden (Abb. 4.2.2.20). Dieses Triplett besteht aus den Basis-Reizstoffen C3H1OL, 1OCT3OL und HEXEACE. Die Matrix sollte vervollständigt werden, um einen genaueren Einblick in die Wechselwirkungen zwischen Duftstoffen und Rezeptoren zu bekommen. Die von Schütz (2001) beschriebenen Kreuzreaktionen des 2PEOL-empfindlichen Rezeptortypen B mit C3H1OL und mit 2EH1OL konnte in den Überlagerungsversuchen bestätigt werden, wenn 2PEOL als UD verwendet wurde. Kreuzreaktionen des 2EH1OL-empfindlichen Rezeptortypen H mit 2PEOL konnten in Überlagerungsversuchen mit 2EH1OL als ÜD und 2PEOL als UD bestätigt werden. Die von Schütz beschriebene geringe Kreuzreaktion des C3H1OL-empfindlichen Rezeptortypen A mit 2PEOL steht im Widerspruch zu den Ergebnissen dieser Arbeit. Hier wurde eine sehr starke Kreuzreaktion gefunden. Die Versuche von Schütz wurden jedoch aus Gründen der Vergleichbarkeit mit Daten von Ma & Visser (1978) mit sehr hohen Konzentrationen durchgeführt. Dies kann eine Ursache für die Unterschiede zwischen den Ergebnissen dieser Arbeit und den Ergebnissen von Schütz (2001) sein, da die Kreuzreaktionen von der Konzentration der benutzten Substanzen abhängen. Diese Abhängigkeit kommt durch unterschiedliche Rezeptorzelltypen, die für einen bestimmten Duftstoff spezifisch sind, zustande. Schütz schreibt, daß die Kreuzreaktionen gerade bei Rezeptorzelltypen mit hoher Empfindlichkeit, welche für die Wahrnehmung im niedrigen Konzentrationsbereich zuständig sind, stärker sind als bei Rezeptorzelltypen mit niedriger Empfindlichkeit, die für einen hohen Konzentrationsbereich zuständig sind. Die nun folgende These soll TS < 1 erklären: Bei den Überlagerungsversuchen wird davon ausgegangen, daß während der Applikation des UD alle Rezeptoren besetzt werden,

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die für den UD eine Empfindlichkeit besitzen. Dazu kann auch der für den ÜD-spezifische Rezeptor gehören. Wird nun auch der ÜD appliziert, so werden zusätzlich alle Rezeptoren besetzt, die eine Empfindlichkeit dem ÜD gegenüber besitzen bzw. der UD wird durch den ÜD am Rezeptor verdrängt auf Grund einer höheren Affinität. Falls der UD auch an anderen Rezeptoren reagiert und dort vom ÜD verdrängt wird, dann wird nicht allein die TS des ÜD-empfindlichen Rezeptors gemessen, sondern die TS aller Rezeptoren, die eine stärkere Affinität zum ÜD besitzen als zu dem UD. Dies mag auf den ersten Blick den Eindruck erwecken als würden dadurch falsche Ergebnisse erzielt werden, jedoch besetzt der ÜD bei alleiniger Anwesenheit ohne UD diese Rezeptoren ebenfalls. Bei TS < 1 ist die vom UD vorgetäuschte Konzentration größer als die Konzentration des UD. Dies bedeutet, daß ein Molekül des UD mehrere Moleküle des ÜD verdrängen würde. Dies ist nur dann vorstellbar, wenn der Rezeptor für den UD empfindlich wäre und nicht für den ÜD. Da dies der Annahme widersprechen würde, kann davon ausgegangen werden, daß es bei solchen Fällen möglicherweise gar keinen spezifischen Rezeptor für den ÜD gibt. So ergaben Überlagerungsversuche mit 2EH1OL als ÜD in 4 von 5 Fällen TS < 1. Nur in einem dieser Fälle lag die TS knapp über 1. Mit 2EH1OL als UD wurden nur hohe TS gefunden. Dies wäre nach der hier aufgestellten These ein Hinweis dafür, daß der Kartoffelkäfer keinen 2EH1OL-spezifischen Rezeptor besitzt. Dies steht jedoch im Widerspruch zu Ergebnissen von MA & Visser (1978) und von Schütz et al. (1999). In beiden Fällen konnten 2EH1OL-spezifische Rezeptoren nachgewiesen werden. Möglich wäre aber auch, daß die gefundenen Ergebnisse der Überlagerungsversuche mit 2EH1OL auf die gleichen Wirkungen zurückzuführen sind, wie sie Payne & Dickens (1976) beschrieben haben (siehe Kap. 5). 5.5 Befunde aus den Dosis-Wirkungskurven Die höchsten EAG-Amplituden wurden durch Reizung mit offenkettigen ungesättigten Alkoholen mit 6 Kohlenstoffatomen erzeugt. Dabei erzeugten (E)-Doppelbindungen stärkere EAG-Amplituden als (Z)-Doppelbindungen (T2H1OL > C3H1OL). Bei Alkoholen mit einer Kettenlänge von 8 Kohlenstoffatomen

5. Diskussion

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erzeugten unverzweigte, ungesättigte 3-Alkohole stärkere EAG-Amplituden als verzweigte, ungesättigte 3-Alkohole (1OCT3OL > LINA). Die Stärke der EAG-Amplituden von aromatischen Verbindungen hing von der Art der nicht-zyklischen Strukturelemente ab. Ein Aromat mit einem kurzkettigen 1-Alkohol löste stärkere EAG-Amplituden aus als ein Aromat mit einem 1-Alkohol und einem Ether (2PEOL > GUAJ). Acetate wie (Z)-3-Hexenyl-acetat lösten vergleichbare EAG-Amplituden aus wie offenkettige ungesättigte Alkohole (HEXEACE = C3H1OL). Da die EAG-Amplitude konzentrationsabhängig ist, spielt der Dampfdruck eine entscheidende Rolle. Die oben beschriebenen Befunde beziehen sich jedoch auf die Konzentration des Duftstoffs im Paraffin/Duftstoff-Gemisch. Würde man die EAG-Amplituden auf die tatsächlich vorhandene Konzentration beziehen, so würde sich eine andere Reihenfolge der Stärke der erzeugten EAG-Amplituden ergeben. Die Dosis-Wirkungskurven der Duftstoffe C3H1OL und HEXEACE zeigen in dem untersuchten Konzentrationsbereich einen sigmoiden Verlauf im halblogarithmischen Maßstab. Die Dosis-Wirkungskurven der Duftstoffe T2H1OL und GUAJ zeigen im untersuchten Bereich eher einen linearen Verlauf im halblogarithmischen Maßstab. Die in der Literatur beschriebenen Dosis-Wirkungskurven, die über 6 bis 8 Größenordnungen vermessen wurden, besitzen einen sigmoiden Verlauf im halblogarithmischen Maßstab (Beidler 1954, 1962; Boeckh & Ernst 1987; Kaissling 1987, 1998; Masson & Mustaparta 1990; Fujimura et al. 1991; Akers & Getz 1993). Der Verlauf der Dosis-Wirkungskurve ist entscheidend für die Genauigkeit der Ergebnisse der Überlagerungsversuche. Die in dieser Arbeit verwendete 2-Punktgleichung gibt nur dann genaue Ergebnisse wider, wenn der Verlauf der Dosis-Wirkungskurve im halblogarithmischen Maßstab im untersuchten Bereich linear ist. Ist der Verlauf dagegen sigmoid, so kommt es drauf an, ob die durch die 2-Punktgleichung beschriebene Gerade die Dosis-Wirkungskurve über- oder unterschreitet. Ja nachdem ist dann die berechnete vorgetäuschte Konzentration höher oder niedriger als die tatsächlich vorgetäuschte. 5.6 Verbesserungen am multidimensionalen EAG-System

5. Diskussion

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Nachdem das MD-EAG-System auf technische Fehler überprüft wurde, wurde die Tauglichkeit im Feld getestet. Dazu kam das MD-EAG-System in einem Erbsenfeld zur Bestimmung der Pheromonkonzentration zum Einsatz. Dabei wurde festgestellt, daß in dicht bewachsenen krautartigen Feldern es durchaus passieren kann, daß sich kleinere Äste in der Trommel verhaken bzw. die Längsbewegung beeinträchtigen können. Solche Mißgeschicke können zwar von vornherein verhindert werden, möglicherweise ist eine Art Hülle jedoch die zweckmäßigere Lösung dieses Problems. Das Steuerungs- und Auswerteprogramm „A04V14“ muß an die neuen Bedingungen angepaßt werden. Eine überarbeitete Version erlaubt eine beliebige Anzahl an unterschiedlichen Meßdurchläufen (Sweeps), jedoch kann das Programm „Pheromon“ nur maximal 3 Meßdurchläufe (Sweeps) pro gespeicherte Datei bearbeiten. Auch kann im Programm „A04V14“ nicht genug Information über die Spritzenbezeichnung angelegt werden. Für die Berechnung der Konzentration der Basis-Reizstoffe zur Analyse eines Duftstoffgemischs muß ein Gesamtkonzept entwickelt werden. Ein erstes Berechnungsverfahren wurde hierfür schon entwickelt, jedoch noch nicht überprüft. Dazu müßte ein Duftstoffgemisch mit bekannter Konzentration der Duftstoffe mittels der Basis-Reizstoffe und dem Berechnungsverfahren analysiert und die Ergebnisse auf Richtigkeit überprüft werden. 5.7 Alternative EAG-Systeme Das beschriebene MD-EAG-Meßsystem ist nur eines von einer Vielzahl von entwickelten und benutzten EAG-Systemen. Bei EAG-Systemen im Laborbetrieb werden oft die Elektroden in die Enden der Antenne gesteckt und so die Antenne gleichzeitig befestigt (Payne & Dickens 1976, Borst 1984, Park et al. 2002). Dabei spielt bei den EAG-Systemen im Laborbetrieb die Größe und das Gewicht des Systems keine Rolle. Oft werden bei solchen Systemen Flaschen benutzt, in denen das Gasvolumen mit dem Duftstoff gesättigt ist (Borst 1984). Aus diesem Gasvolumen wird dann über Ventile der Reizluftstrom in einen konstanten Hauptluftstrom zur Antenne geleitet. Über das Verhältnis von Reizluftstrom zu Hauptluftstrom läßt sich dann die Konzentration berechnen. Mit einer solchen Apparatur lassen sich binäre Gemische mit beliebigen Konzentrationen erzeugen. Auf Grund des

5. Diskussion

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offenen Systems kann die Konzentration eines Duftstoffs in der Außenluft nicht gemessen werden. Bei der von Payne & Dickens (1976) beschriebenen Apparatur wird ein Luftstrom durch Pasteurpipetten zur Antenne geleitet. Dabei kann der Luftstrom über ein Ventil durch eine der beiden Pipetten geleitet werden. In den Pipetten befindet sich ein mit Duftstoff beladenes Filterpapier. Die Pipettenspitzen sind in Richtung der Antenne ausgerichtet. Diese Apparatur eignet sich weder zur Erzeugung eines binären Gemischs noch zur Bestimmung der Konzentration im Freiland. Die von Park et al. (2002) benutzte Apparatur erlaubt eine Ableitung von 4 Antennen gleichzeitig. Der Antennenhalter für die 4 Antennen besteht aus einer gemeinsamen Referenzelektrode und 4 Ableitelektroden. Das EAG-System besitzt keine eigene Duftstoffquelle. Die 4 Antennen reagieren ausschließlich auf Duftstoffe in der Umgebungsluft. Mit diesem System läßt sich die unterschiedliche Empfindlichkeit von 4 Antennen auf ein und denselben Duftstoff testen, für binäre Mischungen bzw. Konzentrationsbestimmungen ist die Apparatur jedoch nicht benutzbar. Kuwana et al. (1999) entwickelten einen mobilen Roboter, der mittels EAG-Signalen den Ursprung einer Pheromonquelle ermitteln kann. Der nur wenige Zentimeter große Roboter (PheGMot-III) ändert dabei seine Richtung in Abhängigkeit der Stärke des EAG-Signals. Befindet sich die Antenne im Duftstoffstrom, der von der Duftstoffquelle mit dem Wind getragen wird, so ist das EAG-Signal stärker als wenn sich die Antenne außerhalb dieses Stroms befindet. Der Roboter vergleicht die Stärke der EAG-Signale und pendelt immer wieder in den Luftstrom mit dem Duftstoff ähnlich einem Männchen auf der Suche nach einem Weibchen. Bei diesem EAG-System sind die Antennen ständig mit der Außenluft in Kontakt. Für die Bestimmung der Konzentration eines Duftstoffs eignet es sich jedoch nicht. Das von Rumbo et al. (1995) und von Karg et al. (1997) beschriebene EAG-System ist ein geschlossenes System. Bei beiden Apparaturen befindet sich die Antenne in einem von der Außenluft isolierten Antennenhalter. Somit sind beide Apparaturen zur Bestimmung der Konzentration fähig. Primäre Gemische zur Ermittlung von Basis-Reizstoffen können sie nicht erzeugen, da beide Geräte nur mit einer Spritze arbeiten.

5. Diskussion

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Das von Schütz et al. (1999) beschrieben EAG-System mit 4 Duftstoffquellen ist eine modifizierte Version des von Färbert & Koch (1993) entwickelten EAG-Systems mit 3 Duftstoffquellen. Mit beiden EAG-Geräten wären binäre Mischungen in einem geschlossenen System möglich. Mit einem EAG-System nach Färbert & Koch (1993) wurden die Überlagerungsversuche in dieser Arbeit durchgeführt. Die neue Errungenschaft des MD-EAG-Systems ist die Anzahl der zur Verfügung stehenden Duftstoffquellen und die Möglichkeit sowohl binäre als auch tertiäre Gemische zu erzeugen. Solche Gemische sind notwendig um Basis-Reizstoffe finden zu können. Zudem ist das MD-EAG-System ein mobiles System mit dem Konzentrationen im Freiland bestimmt werden können. Eine Kombination aus all diesen Eigenschaften ist bisher noch nicht entwickelt worden. Somit stellt das MD-EAG-Meßsystem das erste EAG-System dar, welches 14 unterschiedliche Duftstoffquellen besitzt, mobil ist und mit dem Konzentrationsbestimmungen im Freiland durchgeführt werden können. Durch Integration anderer EAG-Systeme in das MD-EAG-Meßsystem, wie z. B. ein Antennenhalter für mehrere Antennen, könnte das System und die Analyse verbessert werden. Dazu müßte dann ein sehr komplexes Auswerteverfahren entwickelt werden, das die unterschiedlichen Empfindlichkeiten und Selektivitäten der verwendeten unterschiedlichen Antennen berücksichtigt. Dadurch könnten möglicherweise noch komplexere Duftstoff-Gemische analysiert werden.

6. Zusammenfassung

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6. Zusammenfassung Bei gängigen Verfahren zur Untersuchung von unbekannten Duftstoffgemischen sind entweder die Selektivität, die Empfindlichkeit oder aber die zeitliche Auflösung des Systems nicht ausreichend für eine gute und schnelle Analyse. Sollen diese Ansprüche erfüllt werden, so besteht Bedarf nach einem neuen Verfahren, welches schnell und dennoch sehr genau Duftstoffgemische analysieren kann. In dieser Arbeit wird ein solches Verfahren und ein neu entwickeltes Meßsystem vorgestellt, welches mittels Potentialänderung einer Insektenantenne (Elektroantennogramm, EAG) Duftstoffgemische auf deren Komponenten und Konzentrationen bestimmen kann. Dazu werden Basis-Reizstoffe ermittelt, welche ihrerseits zur Quantifizierung der Komponenten des zu untersuchenden Duftstoffgemischs benötigt werden. Je mehr dieser Basis-Reizstoffe bekannt und zur Bestimmung des Duftstoffgemischs eingesetzt werden können, desto genauer wird die Analyse. Zu diesem Zweck wurde ein multidimensionales EAG-Meßsystem entwickelt, mit dem 7 Basis-Reizstoffe mit je 2 Konzentrationen verwendet werden können. Zur Ermittlung der Basis-Reizstoffe wurde ein Verfahren entwickelt und Überlagerungsversuche von Duftstoffen mit dem Kartoffelkäfer Leptinotarsus decemlineata durchgeführt. Dabei konnte ein Triplett von Basis-Reizstoffen gefunden werden. Zudem konnte durch Überlagerungsversuche von Pflanzenduftstoffen und Pheromon mit dem Bekreuzten Traubenwickler Lobesia botrana gezeigt werden, daß die Anwesenheit von Pflanzenduftstoffen die Bestimmung der Konzentration des Pheromons mit dem EAG-Meßsystem und dem Zusatzreizverfahren nicht beeinträchtigt. Pheromon einerseits und Pflanzenduftstoffe andererseits werden getrennt voneinander mit einer hohen Selektivität von der Insektenantenne registriert. Das entwickelte Verfahren und Meßsystem kann ebenfalls zur Überprüfung der Selektivität einer Insektenantenne auf Duftstoffe benutzt werden.

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