Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays ... · des Arrays mit gleichbleibender...

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Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays zur Sicherung der Produktqualität in lebensmittelproduzierenden Betrieben Az.: 13053/21 Abschlußbericht Ein Projekt der Deutschen Bundesstiftung Umwelt Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft (BIOL) Verfasser: Dr. Bernhard Reck R-Biopharm AG 64293 Darmstadt Darmstadt, Dezember 2005

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Entwicklung eines innovativen

Mykotoxin-Antikörper-Arrays

zur

Sicherung der Produktqualität

in lebensmittelproduzierenden Betrieben Az.: 13053/21

Abschlußbericht

Ein Projekt der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

Förderschwerpunkt Biotechnologie:

Verbund Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft (BIOL)

Verfasser: Dr. Bernhard Reck

R-Biopharm AG

64293 Darmstadt

Darmstadt, Dezember 2005

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Abschlußbericht: 13053/21

Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays zur Sicherung

der Produktqualität in lebensmittelproduzierenden Betrieben Az.: 13053/21

Projektförderung: Deutsche Bundesstiftung Umwelt im Rahmen des Förderschwerpunktes

Biotechnologie: Verbund Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft (BIOL)

Projektpartner: R-Biopharm AG, 64293 Darmstadt

Projektleitung: Dr. Bernhard Reck

Kooperationspartner: Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch der LMU München, Prof. Dr. Erwin Märtlbauer

Verfasser: Dr. Bernhard Reck

R-Biopharm AG,

Landwehrstr 54

64293 Darmstadt

Projektbeginn: 15. Oktober 2001

Laufzeit 3 Jahre + Verlängerung

Darmstadt, 10. Januar 2006

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Danksagung

Im Namen von R-Biopharm danke ich der Deutschen Bundesstiftung Umwelt für die finanzielle

Unterstützung des Projekts und die ideelle Förderung durch drei Statusseminare, die von Herrn

Prof. Jastorff und seinem Team stets ausgezeichnet organisiert und moderiert wurden.

Bei Frau Prof. Dr. Heiden und Herrn Dr. Erb, sowie bei den Gutachtern bedanke ich mich für die

sachliche und konstruktive Kritik und die vielen interessanten Gespräche während der Seminare.

Herrn Prof. Dr. Märtlbauer und den MitarbeiterInnen des Kooperationspartners, Frau Dr. Christine

Bürk und Herrn Dr. Richard Dietrich danke ich für die Bereitstellung der spezifischen Testreagen-

zien und die fachliche Unterstützung bei der Bearbeitung des Themas.

Schließlich danke ich Frau Barbara Krautgärtner und Herrn Thomas Mentrup für ihre engagierte

Mitarbeit bei der Etablierung der HPLC-Methoden und der Entwicklung und Charakterisierung des

Mykotoxin-Antikörper-Arrays.

R-Biopharm AG 12/2005 I

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Inhaltsverzeichnis

Kapitel Titel Seite

Danksagung I

Inhaltsverzeichnis II

Liste der Tabellen IV

Liste der Abbildungen VI

Abkürzungen VII

B e r i c h t

1 Zusammenfassung 1

2 Hintergrund und Zielsetzung des Projekts 4

2.1 Hintergrund des Projekts 4

2.2 Zielsetzung des Projekts 7

3 Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden 8

3.1 HPLC Methoden 8

3.1.1 Bestimmung der Aflatoxine 9

3.1.2 Bestimmung von Deoxynivalenol 11

3.1.3 Bestimmung der Fumonisine 13

3.1.4 Bestimmung von Ochratoxin A 16

3.1.5 Bestimmung von Zearalenon 17

3.2 ELISA-Verfahren 19

3.3 Mykotoxin-Antikörper-Array 20

3.3.1 Testprinzip 21

3.3.2 Testkomponenten 22

3.3.3 Testdurchführung 23

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Inhaltsverzeichnis, Fortsetzung

Kapitel Titel Seite

3.3.4 Testformat 24

3.3.5 Auswertung und Interpretation der Ergebnisse 25

3.3.6 Probenaufarbeitung 28

4 Ergebnisse 29

4.1 Voruntersuchungen und Optimierungsphase 29

4.2 Festlegung der Messbereiche und cut off-Werte 32

4.3 Untersuchungen mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 33

4.3.1 Stabilität der Testkitkomponenten 33

4.3.2 Chargenkonformität und Testreproduzierbarkeit 39

4.4 Untersuchung von Proben 43

4.4.1 Untersuchung zur Testspezifität mit Nullproben 43

4.4.2 Untersuchung zur Testsensitivität mit kontaminierten Kontrollproben 46

4.4.3 Untersuchung von Proben in der Routine 56

4.4.4 Zusammenfassende Bewertung der Probenanalyse 65

4.5 Visueller Test 72

5 Diskussion 73

6 Fazit 79

7 Kooperationen innerhalb des Projekts 81

8 Öffentlichkeitsarbeit 81

9 Literaturverzeichnis 82

10 Anhang 84

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Liste der Tabellen

Tab Titel Seite

1 Schimmelpilze und ihre Mykotoxine 4

2 Mykotoxin Höchstmengenregulierung der EU 5

3 Empfohlene Mykotoxin Richtwerte in Futtermitteln 6

4 Belegung einer MTP 24

5 Testspezifische Reagenzien für die Mykotoxin-Antikörper-Array Entwicklung 29

6 Schachbretttitration mit Aflatoxin Antikörper P2G8 30

7 Zusammensetzung des Mykotoxin-Antikörper-Arrays 10/10 32

8 Messbereiche und cut off – Werte des Mykotoxin-Antikörper-Arrays 10/10 32

9 Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf Aflatoxin bei 4 °C Lagerung 34

10 Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf DON bei 4 °C Lagerung 35

11 Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf Fumonisin bei 4 °C Lagerung 36

12 Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf T-2 Toxin bei 4 °C Lagerung 37

13 Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf Zearalenon bei 4 °C Lagerung 38

14 Vergleich der Standardkurven von vier Chargen des Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 40

15 Überprüfung der Reproduzierbarkeit 42

16 Array-Resultate von Nullproben 44

17 Übersicht über die qualitativen Resultate der Nullproben 45

18 Array-Resultate von Kontrollproben 47

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Liste der Tabellen, Fortsetzung

Tab Titel Seite

19 Vergleichsdaten von Kontrollproben 48

20 Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Kontrollproben (a – e) 49

21 Übersicht über die qualitativen Resultate der Kontrollproben 55

22 Array-Resultate von Routineproben 57

23 Vergleichsdaten von Routineproben 58

24 Übersicht über die qualitativen Ergebnisse der Routineproben 59

25 Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Routineproben 60

26 Übersicht über die qualitativen Ergebnisse aller untersuchten Proben 65

27 Qualitative Auswertung aller Aflatoxin - Vergleichsdaten 66

28 Qualitative Auswertung aller DON– Vergleichsdaten 67

29 Qualitative Auswertung aller Fumonisin – Vergleichsdaten 68

30 Qualitative Auswertung aller T-2 Toxin– Vergleichsdaten 69

31 Qualitative Auswertung aller Zearalenon– Vergleichsdaten 70

32 Qualitative Auswertung aller Vergleichsdaten 71

33

Vergleichsdaten einer Parallel-Testung des Arrays mit H2SO4und visueller Stopp-Lösung

73

34 Gegenüberstellung der MRL-Werte und Mykotoxin-Messbereiche 79

35 Lösungsmittelverbrauch und Analysezeit im Vergleich 80

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Liste der Abbildungen

Abb. Titel Seite

1 Aflatoxin - HPLC Chromatogramms 10

2 DON - HPLC Chromatogramms 12

3 Fumonisin HPLC Chromatogramm 15

4 Ochratoxin - HPLC Chromatogramm 16

5 Zearalenon - HPLC Chromatogramm 18

6 RIDASCREEN® Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 mit allen Testkomponenten 20

7 Schematische Darstellung eines Mykotoxin-Antikörper-Arrays. 21

8 Beispiel einer Auswertung des Array Tests bezogen auf DON 26

9 Schachbretttitration mit Aflatoxin Antikörper P2G8 31

10 Stabilität des Arrays bezogen auf Aflatoxin 34

11 Stabilität des Arrays bezogen auf DON 35

12 Stabilität des Arrays bezogen auf Fumonisin 36

13 Stabilität des Arrays bezogen auf T-2 Toxin 37

14 Stabilität des Arrays bezogen auf Zearalenon 38

15 Vergleich der Standardkurven von vier Chargen des Testkits 41

16 Korrelationsdiagramm der Aflatoxin-belasteten Proben 66

17 Korrelationsdiagramm der DON-belasteten Proben 67

18 Korrelationsdiagramm der Fumonisin-belasteten Proben 68

19 Korrelationsdiagramm der Zearalenon-belasteten Proben 70

20 Korrelationsdiagramm für alle kontaminierten Proben 71

21 Darstellung einer visuellen Auswertung des Array Tests 72

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Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Beschreibung

B/Bo %

Prozent relatives Messsignal einer Messung bezogen auf das Maximalsignal Bo ohne Analyt (Standard 1)

DON Deoxynivalenol

i.d.R. in der Regel

mAk monoklonaler Antikörper

MRL Maximum Residue Level, erlaubte Höchstmengen eines Rückstands

MTP Mikrotiterplatte

NWG Nachweisgrenze

OD Optische Dichte (Absorption)

ODmax Maximale Optische Dichte, gemessen ohne Mykotoxinzusatz

ppb Parts per billion (µg/kg)

ppm Parts per million (mg/kg)

sd Standardabweichung

std Standardlösung

VK % Relative Standardabweichung (Variationskoeffizient)

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Abschlußbericht: 13053/21

1 Zusammenfassung

Im Rahmen des Projekts wurde auf der Basis von hochspezifischen monoklonalen Antikörpern

ein neuartiges immunologisches Testsystem für die simultane Analyse von fünf der wichtigsten

Mykotoxine entwickelt. Das Testkit wurde entsprechend der Inkubationszeiten von 2 x 10 Minu-

ten Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 genannt. Mit dem Test lassen sich innerhalb von nur ca.

30 Minuten Aflatoxine-, Deoxynivalenol (DON)-, Fumonisine-, T-2 Toxin- und Zearalenon-

Gehalte von Getreide- und Futtermittelproben detektieren. Die Proben werden nach einfacher

Extraktion mit 70 % Methanol und zwei Verdünnungsschritten in 1:10 und 1:50 Endverdünnung

im Test eingesetzt.

Die 50 %-Dosis-Werte, welche die mittleren Konzentrationsbereiche der Mykotoxin-

Standardkurven darstellen, lagen bei ca. 0,3 ppb (Aflatoxine), 22 ppb (DON), 23 ppb (Fumonisi-

ne), 1,0 ppb (T-2 Toxin) und 4,0 ppb (Zearalenon). Durch die Probenaufarbeitung wurde der je-

weilige Messbereich um Faktor 10 bzw. 50 verschoben. Die Messbereiche deckten für jedes der

analysierten Mykotoxine die für die Lebensmittel- und Futtermittelkontrolle relevanten Bereiche

ab und umfassten für Aflatoxine 1 – 45 µg/kg, für DON und Fumonisine 56 – 2500 µg/kg, für T-2

Toxin 2 – 100 µg/kg und für Zearalenon 11 – 200 µg/kg.

Die Auswertung der Tests wurde i.d.R. auf der Basis von einem Nullstandard (Standard 1) und 3

Mykotoxin-haltige Standardmischungen (Standard 2, 3 und 4) vorgenommen, welche den jeweili-

gen Standardbereich der Mykotoxine darstellten. Alternativ waren auch Untersuchungen auf der

Basis von Standard 1 unter Verwendung der mittleren Mykotoxin-Standardkurven möglich. Au-

ßerdem wurde für eine qualitative Auswertung erfolgreich ein visueller Test erprobt, der sich an-

hand eines geeigneten cut off Standards und mit Hilfe einer visuellen Stopplösung einfach durch-

führen ließ.

Für Vergleichsmessungen wurden in der Anfangsphase des Projekts außerdem die HPLC Metho-

den für Aflatoxine, DON, Fumonisine, Ochratoxin A und Zearalenon etabliert.

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Nach einem optimierten Herstellverfahren wurden vier Chargen des Arrays in gleicher Weise her-

gestellt und hinsichtlich Chargenkonformität, Lagerstabilität der Testkit-Komponenten und

Reproduzierbarkeit der Testergebnisse charakterisiert.

Kits der unterschiedlichen Chargen zeigten eine ausgezeichnete Übereinstimmung hinsichtlich

Lage und Form der Mykotoxin-Standardkurven, so dass von einer reproduzierbaren Herstellung

des Arrays mit gleichbleibender analytischer Qualität ausgegangen werden kann. Die Testkompo-

nenten waren bei 4 -8 °C Lagerung über den Beobachtungszeitraum von mindestens 6 Monaten

stabil.

Die Untersuchung der Intra- und Interassay Reproduzierbarkeit wurde auf der Basis von dotierten

Nullproben durchgeführt und ergab für die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Testlaufs VK-

Werte von 3 bis 10%. Für die Interassay-Reproduzierbarkeit wurden bei Auswertung von fünf

unabhängigen Tests VK-Werte zwischen 7 und 28% (Mittelwert 13,9%) im Bereich der 50% Do-

sis Werte gemessen.

Zur Charakterisierung der analytischen Leistungsfähigkeit wurden 22 unbelastete Getreide-

und Futtermittelproben, sowie 25 Mykotoxin-haltige Kontrollproben analysiert und die erhaltenen

Ergebnisse mit Referenzdaten verglichen. Anhand von cut off-Werten, die sich an den 50% Dosis

Werten der Standardkurven orientierten, wurden Ergebnisse ≥ cut off als positiv (POS) und Er-

gebnisse < cut off als negativ (NEG) eingestuft. Von 220 Analysenergebnissen der Nullproben

lagen 214 unterhalb der cut off-Werte und wurden somit als negativ deklariert. Eine Probe wies

eine zuvor nicht bekannte Fumonisin-Belastung auf, die mit einem HPLC-Vergleichstest bestätigt

werden konnte. Bei zwei Futtermittelproben wurden für DON und Zearalenon falsch positive Be-

funde mit dem Array detektiert; hier wurde von einem Matrixeffekt der Futtermittelprobe ausge-

gangen. Die Überstimmung mit den Referenzdaten war trotzdem insgesamt ausgezeichnet und

ergab eine Testspezifität von 95,4% (105 NEG von 110 Proben) für die 1:10 verdünnten Proben

und 100% für die 1:50 verdünnten Proben. Die Überprüfung der richtigen Einstufung der Myko-

toxin-haltigen Kontrollproben ergab eine Testsensitivität von 100% (53 von 53) bei den 1:10

verdünnten Proben und 97,6% (28 von 30) bei 1:50 Verdünnung. Alle zuvor bekannten 25 Myko-

toxin-Kontaminationen wurden in der 1:10 Verdünnung richtig erkannt. Zusätzlich wurden 38

positive Befunde in mehrfach kontaminierten Proben detektiert, die alle mit Referenzmethoden

bestätigt werden konnten.

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Der Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 wurde erfolgreich in der abschließenden Projektphase zur

routinemäßigen Untersuchung von Getreideproben im Applikationslabor von R-Biopharm ein-

gesetzt und bewährte sich hervorragend zum Screenen von Proben. Hier wurden aus acht Testse-

rien insgesamt 41 Proben mit dem Array überprüft und in Vergleichsmessungen die korrespondie-

renden HPLC-Referenzdaten erhoben. Für die Vergleichsmessung von T-2 Toxin stand bei R-

Biopharm bis dato noch keine HPLC Methode zur Verfügung, so dass die Array-Daten hier nur

mit ELISA Daten verglichen werden konnten.

Die Resultate des Array Tests wiesen eine sehr gute Übereinstimmung mit den Vergleichsdaten

auf. Es wurden 68 POS Ergebnisse ermittelt, von denen 52 Resultate durch Vergleichsmessungen

bestätigt werden konnten. Die nicht bestätigten positiven Ergebnisse lagen überwiegend im Be-

reich der cut off-Werte und könnten durch eine Anhebung der cut off Stufe deutlich reduziert

werden. Eine Korrektur der cut off-Werte bietet sich vor allem für DON und Fumonisin an, wo

mit 0,2 ppm sehr niedrige Werte gewählt worden waren.

Die gute Übereinstimmung von Array und Vergleichsdaten spiegelte sich auch in Korrelations-

diagrammen der einzelnen Mykotoxine wider. In einer Gesamtdarstellung aller quantitativ be-

stimmbaren Wertepaare (n=103) wurde eine Regressionsgerade mit Steigung 0,998 und einem

Bestimmtheitsmaß von r2 = 0,891 ermittelt, was die ausgezeichnete Korrelation der quantitativen

Ergebnisse dokumentierte.

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2 Hintergrund und Zielsetzung des Projekts

2.1 Hintergrund des Projekts

Mykotoxin-Kontaminationen finden sich in einer Vielzahl von Nahrungsmitteln, die als Lebensmit-

tel und Futtermittel eine bedeutende Rolle spielen. Allen voran sind Getreide und Nüsse zu nennen.

Die für die Toxinbildung verantwortlichen Schimmelpilze können das Nahrungsmittel bereits auf

dem Feld (Feldpilze wie Fusarien) oder während der Lagerung (Lagerpilze wie Aspergillen oder

Penicillien) unter den entsprechenden Umwelt- oder Lagerbedingungen befallen [1, 2]. Die wich-

tigsten Vertreter der Mykotoxine sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.

Tab. 1 Schimmelpilze und ihre Mykotoxine Schimmelpilz Gebildete Mykotoxine

Aspergillus Aflatoxine (Aflatoxin B1, B2, G1, G2 und M1)

Penicillium Ochratoxin A

Fusarium Trichothecene (Deoxynivalenol, T-2-Toxin, und weitere) Zearalenon Fumonisine (Fumonisin B1, B2 und B3)

Mykotoxine sind niedermolekulare Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen mit Molekularge-

wichten von ca. 300 bis ca. 500 Dalton und stellen auf Grund ihrer toxischen Bewertung für den

Verbraucher und für die Tierhaltung ein nicht zu unterschätzendes Gefährdungspotential dar.

Sie sind hitzestabil, sehr beständig und werden durch Verarbeitungsprozesse kaum abgebaut. Dabei

sind vor allem aufgrund des hohen mutagenen und kanzerogenen Potentials einiger Substanzen

chronische Gesundheitsschädigungen zu befürchten. In geringen Mengen sind sie für Warmblütler

toxisch und können schwere, irreparable Schädigungen des Organismus verursachen [3]. Eine Auf-

nahme von hoch belasteten Nahrungsmitteln bzw. von Futtermitteln in der tierischen Erzeugung

kann im Extremfall sogar zum Tod führen. Das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft

und Forsten hatte 1999 die Gesundheitsgefährdung durch Mykotoxine zum Schwerpunktthema in

der Zeitschrift Forschungs-Report gemacht [4, 5, 6]. Die wirtschaftlichen Verluste durch Pilzbefall

von Getreide und die Bedeutung einer effektiven Kontrolle wurden von Krska erläutert [7].

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Mykotoxine stehen deshalb besonders im Fokus der Gesundheits- und Überwachungsbehörden, die

immer wieder von hoch mit Mykotoxin belasteten Nahrungsmitteln berichten und vor deren Ver-

zehr warnen.

Innerhalb der EU sind durch diverse Verordnungen für die meisten der häufig vorkommenden My-

kotoxine inzwischen zulässige Höchstmengen (MRL) festgelegt. Seit etlichen Jahren schon gelten

nach der EU-Verordnung 1525/1998 als Höchstmenge für die Aflatoxin-Belastung von Getreide

und Nüssen 2 µg/kg (Aflatoxin B1) beziehungsweise 4 µg/kg (Gesamtmenge der Aflatoxine B1, B2,

G1 und G2). Für Säuglings- und Kleinkindernahrung wurden 2004 in einer Diätverordnung (EU Nr.

683/2004) die Höchstmengen von Aflatoxin B1, B2, G1, G2 einzeln oder insgesamt auf 0,1 µg/kg

herabgesetzt.

Tab. 2 Mykotoxin Höchstmengenregulierung in der EU

Mykotoxin Lebensmittel MRL *) µg/kg (ppb)

EU-Verordnung

Aflatoxine Getreide, Nüsse und Trockenfrüchte

4 Aflatoxin B1, B2, G1 und G2

2 Aflatoxin B1

1525/98 (in Kraft)

DON unbehandeltes Getreide außer Hartweizen, Hafer und Mais unbehandelter Hartweizen und Hafer unbehandelter Mais Getreidemehle, eingeschlossen Maismehle und Nudeln

1250 1750 1750 (in Diskussion) 750

856/2005 (gültig ab Juli 2006)

Fumonisine unbehandelter Mais Maismehl

2000 (in Diskussion) 1000 (in Diskussion)

856/2005

Zearalenon unbehandeltes Getreide außer Mais unbehandelter Mais und Maismehl Getreidemehl außer Maismehl Maismehl

100 200 (in Diskussion) 75 200 (in Diskussion)

856/2005 (gültig ab Juli 2006)

Ochratoxin unbehandelte Getreide verarbeitete Getreide zum direkten Verzehr

5 3

123/2005

T-2 Toxin und HT-2 Toxin

das Gesundheitsrisiko durch die Mykotoxine ist anerkannt. Es sind jedoch noch Studien notwendig, um zulässige Höchstwerte festlegen zu können Vorgesehener Termin für eine entsprechende Verordnung ist Juli 2007

856/2005

*) Maximum Residue Level (zulässiger Höchstwert) Im Jahr 2005 wurden aktuell mit zwei Erlassen Grenzwerte für Fusarien Toxine: Trichothecene

(DON, T-2 Toxin), Zearalenon und Fumonisine (EU Verordnung Nr.-856/2005), sowie für Ochra-

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toxin A (EU Verordnung Nr.-123/2005) neu geregelt, beziehungsweise zukünftige Regelungen

festgesetzt. Einen Überblick über die derzeit gültigen und für zukünftige Regulierung vorgeschla-

genen zulässigen Höchstwerte in Nahrungsmitteln für den Menschen gibt Tabelle 2.

In der europäischen Futtermittelverordnung (2002/32/EC) sind derzeit nur für Alfatoxine

Höchstgehalte streng geregelt. Die zulässigen Aflatoxingehalte liegen zwischen 5 µg/kg (für Milch-

tierfutter) und 50 µg/kg in Abhängigkeit von der Art des Futtermittels und der Tiere.

Das Bundesministerium für Landwirtschaft hat im Jahr 2000 „Orientierungswerte für Höchstmen-

gen von Deoxynivalenol und Zearalenon im Futter von Schwein, Rind und Huhn“ veröffentlicht,

bei deren Unterschreitung die Gesundheit und Leistungsfähigkeit nicht beeinträchtigt wird. Diese

Gehalte liegen für Deoxynivalenol zwischen 1000 und 5000 µg/kg, für Zearalenon zwischen 50 und

500 µg/kg.

International haben sich im Futtermittelbereich zusätzliche Höchst- und Richtwerte etabliert, die vor

allem in außereuropäischen Ländern wie den USA, Kanada, Lateinamerika und Asien beachtet

werden. Im Tabelle 3 sind diese Höchst- und Richtwerte zusammengefasst. Die empfohlenen

Höchstwerte überdecken aufgrund unterschiedlicher Suszeptibilitäten der Tiere teilweise sehr große

Konzentrationsbereiche und liegen deutlich über den für den Humanverzehr festgelegten Höchst-

mengen.

Tab. 3 Empfohlene Mykotoxin Richtwerte in Futtermitteln

Mykotoxin empfohlene Höchstmenge

Aflatoxine 5 (Milchtierfutter) – 50 µg/kg

Deoxynivalenol (DON) 1000 – 5000 µg/kg

Fumonisine 1000 – 50000 µg/kg

T-2 Toxin 100 – 1000 µg/kg

Zearalenon 50 - 500 µg/kg

Quellen: EU-Verordnung 2002/32/EC, Literatur [3], Rundschreiben des BML vom 30.Juni 2000, 324-3830/323 und Internet www.afma.co.za (Internetadresse von Animal Feed Manufacturers Association, SA)

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2.2 Zielsetzung des Projekts

Zur Vermeidung von Gesundheitsrisiken durch den Verzehr von Mykotoxin-belasteten Lebens-

bzw. Futtermitteln ist die Überwachung der Qualität der eingesetzten Rohstoffe unerlässlich. Die

erforderlichen Kontrollen werden derzeit maßgeblich mit HPLC und anderen chromatographischen

Methoden vorgenommen. Zum Proben-Screening werden ELISA Methoden eingesetzt, mit denen

einzelne Mykotoxine in einem einfachen Testsystem ohne großen apparativen Aufwand erfasst

werden können. Mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array sollte ein Test entwickelt werden, der es

ermöglicht in einem einzigen Analysensystem mehrere relevante Mykotoxine gleichzeitig zu erfas-

sen. Der Test sollte einfach durchzuführen sein, eine kurze Analysenzeit beinhalten und damit eine

schnelle Beurteilung der untersuchten Proben erlauben.

Die Gefahr, dass kontaminierte Lebens- bzw. Futtermittel in den Handel gelangen, kann nur durch

schnelle und einfach durchzuführende Testverfahren und umfangreiche Kontrollen gewährleistet

werden. Untersuchungen am Anfang der Produktionskette sparen nicht nur Transport- und Energie-

kosten, sondern auch Produktions- und Lagerkosten. Wenn ein Endprodukt vom Markt genommen

und vernichtet werden muss, hat dies i.d.R. immense wirtschaftliche Folgen für Hersteller und Ver-

treiber.

Zudem wird durch das hier vorgestellte Testsystem die Analysezeit und der Lösungsmittel-

verbrauch gegenüber den klassischen HPLC- oder GC Methoden deutlich reduziert, was gleichzei-

tig einen ökonomischen Nutzen bringt und zur Entlastung der Umwelt beiträgt.

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3 Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden

3.1 HPLC Methoden

Auf einer HPLC Anlage (Shimadzu, Duisburg, Deutschland) ausgestattet mit einem Fluoreszenzde-

tektor und einem Photodiodenarraydetektor (s. detaillierte Beschreibung in Zwischenbericht 1)

wurden die Nachweismethoden für die Aflatoxine B1, B2, G1 und G2, Deoxynivalenol (DON), Fu-

monisine (B1 und B2), Ochratoxin A und Zearalenon etabliert (s. Zwischenbericht 2).

Die Standardlösungen für die Kalibrierung der Methoden wurden von R-Biopharm Rhone bezogen

und durch entsprechende Verdünnung mit dem jeweiligen, aus der Probenaufarbeitung abgeleitete

Lösungsmittel auf die gewünschten Konzentrationen eingestellt. Üblicherweise wurden zwei Kalib-

rierlösungen zur Kalibrierung einer Methode eingesetzt.

Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden Verdünnungsreihen der Standards

wiederholt vermessen. Die Nachweisgrenzen wurden aus den Messdaten des Nullstandards (Fluss-

mittel ohne Standardzusatz) mittels der Berechnungsformel Nachweisgrenze = Mittelwert des Null-

standards+ 3 x Standardabweichung ermittelt. Die Bestimmungsgrenze, ab der eine zuverlässige

Quantifizierung möglich war, wurde auf der Basis der Variationskoeffizienten (VK) festgelegt, wo-

bei ein VK-Wert von deutlich unter 10 % bei möglichst niedriger Konzentration angestrebt wurde.

Vor der HPLC Analyse mussten die Proben jeweils über immunaffinitätschromatographische (IAC)

Verfahren aufgereinigt werden, um störende Matrixeffekte zu eliminieren. Die Probenaufarbeitung

erfolgte an IAC Säulen von R-Biopharm Rhone nach entsprechenden Verfahrensvorschriften des

Herstellers (s. CD-ROM).

Im folgenden werden die HPLC-Methoden vorgestellt, die im Wesentlichen in den Projektphasen 2

und 3 etabliert und validiert wurden.

R-Biopharm AG 12/2005 8

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Abschlußbericht: 13053/21

3.1.1 Bestimmung der Aflatoxine

Zur Bestimmung der Aflatoxine wurde eine vom Europäischen Komitee für Normung beschriebene

Methode als Methodengrundlage (CEN TC 275) benützt, die nach Einsatz der Kobrazelle zur Nach-

säulenderivatisierung nach Angabe des Herstellers entsprechend modifiziert wurde [8, 9, 10]

HPLC - Bedingungen

Säule: Waters Spherisorb ODS-2, 5 µm; 4,6 x 250 mm

Fluss: 1 ml/min (ca. 100 Bar)

Laufmittel: 60% Wasser, pro Liter Wasser wurden 564 µl 4 M HNO3 + 192 mg KBr zugesetzt

20 % Acetonitril

20 % Methanol

Säulenofen: 50 °C

Nachsäulenderivatisierung: Kobrazelle, 100 µA

Fluoreszenzdetektion: Anregung bei 330 nm, Emission bei 460 nm

Injektionsvolumen: 100 µl

Laufzeit: 20 Minuten

Retentionszeiten: Aflatoxin BB1 12,6 Minuten Aflatoxin B2 10,7 Minuten

Aflatoxin G1 9,3 Minuten Aflatoxin G2 8,1 Minuten Kalibrierung: 1,0 und 10 ppb einer Mischung der Metabolite Aflatoxin B1:Aflatoxin B2: Afltoxin G1:Aflatoxin G2 (25:25:25:25) Nachweisgrenze: ca. 5 ppt

Bestimmungsgrenze 0,1 ppb

Probenvorbereitung:

50 g fein gemahlenes Probenmaterial + 4 g NaCl wurden in einen Labormixer (z.B. Warring) ein-

gewogen und mit 250 ml Methanol/deionisiertes Wasser (Methanol:Wasser (v/v) 60:40) versetzt.

Der Behälter wurde verschlossen und das Probengut ca. 1 Min mit hoher Gechwindigkeit gemischt.

Der Extrakt wurde kurz mit 250 ml deionisiertem Wasser vermischt. Ein Anteil von ca. 25 ml der

R-Biopharm AG 12/2005 9

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Abschlußbericht: 13053/21

Mischung wurde danach über einen Faltenfilter (Whatman Nr. 4 oder ähnlichen Filter) filtriert und

ein Aliquot von 10 ml des Filtrats, entsprechend 1 g Probe, über eine AFLAPREP® Immunaffini-

tätssäule gereinigt.

Der filtrierte Extrakt wurde dazu mit einem Fluss von ca. 2 ml/min über die mit spezifischen anti-

Aflatoxin-Antikörpern beladene Säule gegeben. Aflatoxin der Probe wurde in diesem Schritt auf

der Säule gebunden. Zum Entfernen von Begleitkomponenten, die in der HPLC stören könnten,

wurden danach 2 x 10 ml deionisiertes Wasser mit einem Fluss von ca. 5 ml/min über die Säule

gegeben. Anschließend wurden mit einer Spritze wenige ml Luft durch die Säule gedrückt oder am

Austritt der Säule Vakuum angelegt, um Flüssigkeitsreste komplett aus der Säule zu entfernen. Vor

der nun folgenden Elution des gebundenen Mykotoxins wurde ein frisches Gefäß unter der Säule

platziert und der Analyt mit 1 ml Methanol p.a. (HPLC Qualität) in langsamen Fluss (ca. 1 ml/min)

von der Säule eluiert. Der kovalent auf der Säule fixierte Antikörper wurde in diesem Schritt dena-

turiert und das gebundene Aflatoxin frei gesetzt. Zum Verdünnen der Probe wurde danach 1 ml

deionisiertes Wasser über die Säule gegeben und ebenfalls aufgefangen.

Nach Mischen des Eluats konnte die Probe direkt in der HPLC analysiert werden oder bis zur Ana-

lyse bei –20 °C im Tiefkühlschrank aufbewahrt werden.

Alternativ zu dieser Vorschrift wurden auch kleinere Probenmengen aufgearbeitet und das Volumen

des Extraktionsmittels entsprechend angepasst.

Minutes0 2 4 6 8 10 12 14 16

Vol

ts

0.0000

0.0002

0.0004

0.0006

Vol

ts

0.0000

0.0002

0.0004

0.0006

0.

983

2.

007

2.

867

4.

570

4.

927

Afla

G2

8.1

33

8.43

0

Afla

G1

9.3

67

Afla

B2

10.

780

Afla

B1

12.

557

14

.283

14

.447

15

.250

15

.840

Detector A (Ex:362nm, Em:440nm)Afla Sat Tag 3 : 321_Afla_Stat_007

NameRetention Time

Abb. 1 Beispiel eines Aflatoxin - HPLC Chromatogramms mit einem Standardgemisch der Metaboliten von 32 ppt/Metabolit

R-Biopharm AG 12/2005 10

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Abschlußbericht: 13053/21

3.1.2 Bestimmung von Deoxynivalenol (DON)

Das Verfahren wurde auf der Grundlage einer Methode etabliert, die von Rhone Diagnostics Tech-

nology beschrieben ist. Einen Überblick über HPLC und andere chromatogrphische Methoden zur

Bestimmung von DON gibt eine Publikation von Gary Lombaert aus dem Jahr 2002 [11]. Als De-

tektor wurde ein Dioden Array Detektor mit einem Scan-Intervall von 200 – 300 nm eingesetzt. Zur

Auswertung des Chromatogramms wurde die Extinktion bei 224 nm (Absorptionsmaximum von

DON) benutzt. Die Retentionszeit von DON lag bei 4,8 Minuten (s. Abb. 1).

HPLC - Bedingungen

Säule: Hichrome ACE 5 C18 5µm, 150 x 4,6 mm

Fluss: 1 ml/min (ca. 100 Bar)

Laufmittel: 3 % Acetonitril / 94 % Wasser /3 % Methanol

(v/v/v), Mischen in der Anlage

Säulenofen: 40 °C

Dioden-Array-Detektor (DAD) 200 bis 300 nm , Messung bei 224 nm

Injektionsvolumen: 100 µl

Laufzeit 20 Minuten

Retentionszeit: 4,8 Minuten

Kalibrierung: 0,2 und 2,0 ppm DON

Bestimmungsgrenze: 0,1 ppm

Probenvorbereitung:

25 g fein gemahlenes Probenmaterial wurden in einen Labormixer (z.B. Warring) eingewogen und

mit 200 ml deionisiertes Wasser versetzt. Der Behälter wurde verschlossen und das Probengut ca. 2

Minuten mit hoher Geschwindigkeit gemischt. Ein Anteil von ca. 25 ml der Mischung wurde da-

nach über einen Faltenfilter (Whatman Nr. 4 oder ähnlichen Filter) filtriert. Das Filtrat wurde ge-

mischt und zusätzlich durch einen Glasfaserfilter filtriert, um Schwebeteilchen zu entfernen.

Ein Aliquot von 2 ml des Filtrats, entsprechend 0,25 g Probe, wurde über eine DONPREP® Im-

munaffinitätssäule gereinigt. Der filtrierte Extrakt wurde dazu mit einem Fluss von ca. 1 ml/min

über die mit spezifischen anti-DON-Antikörpern beladene Säule gegeben. DON Moleküle der Pro-

be wurden in diesem Schritt auf der Säule gebunden. Zum Entfernen von Begleitkomponenten, die

in der HPLC stören könnten, wurden danach 5 ml deionisiertes Wasser mit dem gleichen Fluss über

R-Biopharm AG 12/2005 11

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Abschlußbericht: 13053/21

die Säule gegeben. Anschließend wurden mit einer Spritze wenige ml Luft durch die Säule gedrückt

oder am Austritt der Säule Vakuum angelegt, um Flüssigkeitsreste komplett aus der Säule zu ent-

fernen. Vor der nun folgenden Elution des gebundenen Mykotoxins wurde ein frisches Gefäß unter

der Säule platziert und der Analyt mit 1,5 ml Methanol p.a. (HPLC Qualität) in langsamen Fluss

(ca. 1 ml/min) von der Säule eluiert.

Der kovalent auf der Säule fixierte Antikörper wurde in diesem Schritt denaturiert und das gebun-

dene DON frei gesetzt. Das Eluat wurde in einem Evaporator (Vapotherm, Barkey, Leopoldshöhe,

Deutschland) bei ca. 50 °C im Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft und danach für die HPLC

Analyse in 1 ml Laufmittel aufgenommen. (0,25 g Probe/1 ml).

Nach Lösen des trockenen Rückstandes konnte die Probe direkt in der HPLC analysiert werden

oder bis zur Analyse bei –20 °C im Tiefkühlschrank aufbewahrt werden. Alternativ zu dieser Vor-

schrift wurden auch kleinere Probenmengen aufgearbeitet und das Volumen des Extraktionsmittels

entsprechend angepasst.

Minutes

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0

mAU

0.0

2.5

5.0

mAU

0.0

2.5

5.0

Detector A-224 nmProben_Cal _500Proben_001

Retention TimeAreaESTD concentration

Spectrum at time 4.78 min.

nm

200 220 240

mA

U

0

1

2

3

mA

U

0

1

2

3

4.78 min

Abb. 2 Beispiel eines DON - HPLC Chromatogramms mit 2 ppm DON und

Darstellung eines Spektrums, das mit dem Dioden Array Detektor im Peakmaxi-mum (nach einer Retentionszeit von 4,78 Minuten) aufgenommenen wurde

R-Biopharm AG 12/2005 12

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Abschlußbericht: 13053/21

3.1.3 Bestimmung von Fumonisin

Das Verfahren wurde auf der Grundlage einer Methode etabliert, die von Rhone Diagnostics Tech-

nology in Anlehnung an die CEN Methode TC 275/WG5 document 217 entwickelt wurde [12]. Da

Fumonisin keine chromophoren Gruppen besitzt, ist das Molekül weder photometrisch noch fluo-

rimetrisch direkt zu detektieren. Für die Messung ist eine für die Detektion vieler solcher Moleküle

eingesetzte Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd (OPA) verwendet worden, die zu einer

Fluoreszenz bei 440 nm (Anregung bei 335 nm) führt. Die exakte Einhaltung der Derivatisierungs-

zeit von etwa drei Minuten bis zur Injektion in die HPLC erwies sich als essentiell für eine zufrie-

denstellende Reproduzierbarkeit der Messung. Derivatisierungsreagenz und Probe/Standard wurden

dazu im Autosampler mit Hilfe einer Programmroutine der Anlage automatisch in der immer glei-

chen zeitlichen Abfolge gemischt und injiziert. Die Retentionszeiten für die Fumonisine B1 und B2

lagen bei 4,2 und 8,6 Minuten (s. Abb. 3). Fumonisin B3 ist kommerziell nicht erhältlich und spielt

bei der Fumonisinanalyse keine Rolle, da bei Fumonisinbelastungen als Hauptmetabolite vorwie-

gend Fumonisin B1 und B2 vorkommen.

HPLC-Bedingungen

Säule : Hichrome ACE 5 C18 5µm, 150 X 4,6 mm

Fluss : 1 ml/min (ca. 70 bar)

Laufmittel: 25% 100 mM NaH2PO4 in H2O 75% Methanol (v/v)

mischen und mit Phosphorsäure auf pH 3,35 einstellen

Säulenofen: 40 °C

Injektionsvolumen: 100 µl

Fluoreszenzdetektion: Ex 335 nm, Em 440 nm

Laufzeit: 15 min

Retentionszeit: Fumonisin BB1 4,1 Minuten Fumonisin BB2 8,3 Minuten Kalibrierung: Cal 1: 250 ppb Fumonisin B1, 75 ppb Fumonisin B2

Cal 2: 1,0 ppm Fumonisin B1, 0,3 ppm Fumonisin B2

Bestimmungsgrenze: 0,1 ppm

R-Biopharm AG 12/2005 13

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Abschlußbericht: 13053/21

Probenvorbereitung:

25 g fein gemahlenes Probenmaterial + 2,5 g NaCl wurden in einen Labormixer (z.B. Warring) ein-

gewogen und mit 125 ml Acetonitril:Methanol:Wasser (v/v/v, 25:25:50) versetzt. Der Behälter

wurde verschlossen und das Probengut ca. 5 Min mit hoher Geschwindigkeit gemischt. Ein Anteil

von ca. 25 ml der Mischung wurde danach über einen Faltenfilter (Whatman Nr. 4 oder ähnlichen

Filter) filtriert. Ein Aliquot von 10 ml des Filtrats wurde mit 40 ml 10 mM Phosphatgepufferte

Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) versetzt, gründlich gemischt und durch einen Glasfaserfilter filtriert,

um Schwebeteilchen zu entfernen.

Ein Aliquot von 10 ml des Filtrats, entsprechend 0,4 g Probe, wurde über eine FUMONIPREP®

Immunaffinitätssäule (R-Biopharm Rhone, Glasgow, Schottland) gereinigt.

Dazu wurde der filtrierte Extrakt mit einem Fluss von ca. 1 ml/min über eine mit spezifischen anti-

Fumonisin-Antikörpern beladene Säule gegeben. Fumonisin der Probe wurde in diesem Schritt auf

der Säule gebunden. Zum Entfernen von Begleitkomponenten, die in der HPLC stören könnten,

wurden danach 10 ml deionisiertes Wasser mit dem gleichen Fluss über die Säule gegeben. An-

schließend wurden mit einer Spritze wenige ml Luft durch die Säule gedrückt, um Flüssigkeitsreste

komplett aus der Säule zu entfernen. Vor der nun folgenden Elution des gebundenen Mykotoxins

wurde ein frisches Gefäß unter der Säule platziert und der Analyt mit 1 ml Methanol p.a. (HPLC

Qualität) in langsamen Fluss (ca. 1 ml/min) von der Säule eluiert.

Der kovalent auf der Säule fixierte Antikörper wurde in diesem Schritt denaturiert und das gebun-

dene Fumonisin frei gesetzt. Anschließend wurde 1 ml deionisiertes Wasser über die Säule gegeben

und ebenfalls gesammelt (0,4 g Probe/2 ml)

Das Eluat wurde danach gut gemischt und ein Aliquot von 70 µl in ein HPLC Probengefäß gege-

ben, das zur Vorsäulenderivatisierung in den Autosampler der HPLC eingesetzt wurde. Alternativ

konnte die Probe bis zur Analyse bei –20 °C im Tiefkühlschrank aufbewahrt werden.

Alternativ zu dieser Vorschrift wurden auch kleinere Probenmengen aufgearbeitet und das Volumen

des Extraktionsmittels entsprechend angepasst.

R-Biopharm AG 12/2005 14

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Abschlußbericht: 13053/21

Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd (OPA)

Reagenz 1: 100 mM Di-Na-Tetraborat (1,18g in 50 ml dest. Wasser)

Reagenz 2: Methanol

Reagenz 3: Mercaptoethanol

Ansatz : 40 mg OPA wurden in 1 ml Methanol gelöst, danach wurden 5 ml Reagenz 1, und

50 µl Reagenz 3 zugegeben und der Ansatz auf dem Vortex ca. 1 min gemischt.

(Das Derivatisierungsreagenz wurde arbeitstäglich frisch hergestellt)

Proben/Standard und Derivatisierungsreagenz wurden 1 + 1 (70 µl + 70 µl) in der HPLC Anlage

mit einem automatischen Modus gemischt und nach konstanter Reaktionszeit (ca. 3 min) 100 µl der

Mischung eingespritzt.

Minutes

0 2 4 6 8 10 12 14

Vol

ts

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Vol

ts

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

108

0

2855

674

0

3706

305

0

6507

39 0

62

0829

0

2040

555

0

5091

54 2

50 C

AL

Fum

onis

ion

B1

4353

7 0

1014

200

0

6490

0

6858

0

7102

0

7735

0 7

5 C

AL

Fum

onis

ion

B2

6524

0

158

0

183

0

60 0

10

82 0

87

0

1499

0

7255

0

49 0

Detector A (Ex:335nm, Em:440nm)Proben_Cal_250_75Proben_001

AreaESTD concentrationName

Abb. 3 Fumonisin HPLC Chromatogramm am Beispiel der Kalibrierlösung 2

(250 ppb Fumonisin B1 + 75 ppb Fumonisin B2)

R-Biopharm AG 12/2005 15

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3.1.4 Bestimmung von Ochratoxin A

Zur Bestimmung von Ochratoxin A wurde eine vom Europäischen Komitee für Normung beschrie-

bene Methode als Methodengrundlage (CEN TC 275) benützt und entsprechend der Geräteparame-

ter angepasst.

Säule: Waters Spherisorb ODS-2, 5 µm; 4,6 x 250 mm

Fluss: 1 ml/min (ca. 90 Bar)

Laufmittel: 43 % Wasser mit 2 % Essigsäure, konz. /

57 % Acetonitril (v/v)

Säulenofen: 30 °C

Fluoreszenzdetektion: Anregung bei 330 nm, Emission bei 460 nm

Injektionsvolumen: 100 µl

Laufzeit: 20 Minuten

Retentionszeit: 7,1 Minuten

Kalibrierung: 1, 10 und 100 ppb Ochratoxin A

Nachweisgrenze: 0,05 ppb

Bestimmungsgrenze: 0,5 ppb

Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abb. 4 Ochratoxin - HPLC Chromatogramm am Beispiel einer Kalibrierlösung mit 0,36 ppb Ochratoxin A

Volts

0.0000

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

Volts

0.0000

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.

790

1.

097

1.

507

2.

673

4.

673

5.

430

5.

677

5.

973

6.

487

OT

A 7

.087

9.47

3

9.

750

Detector A (Ex:333nm, Em:460nm)OTA Stat. Tag 3 ; 0,36_OTA_Stat_Tag3_007

NameRetention Time

R-Biopharm AG 12/2005 16

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Abschlußbericht: 13053/21

3.1.5 Bestimmung von Zearalenon

Das Verfahren wurde auf der Grundlage einer Methode etabliert, die von Rhone Diagnostics

Technology beschrieben ist.

Säule: Waters Spherisorb ODS-2, 5 µm; 4,6 x 250 mm

Fluss: 1 ml/min (ca. 100 Bar)

Laufmittel: 50% Wasser mit 2 % Essigsäure / 50% Acetonitril

Säulenofen: 30 °C

Fluoreszenzdetektion: Anregung bei 274 nm, Emission bei 418 nm

Injektionsvolumen: 100 µl

Laufzeit: 30 Minuten

Retentionszeit 11,9 Minuten

Kalibrierung: 25, 100 und 250 ppb

Nachweisgrenze: 1,5 ppb

Bestimmungsgrenze: 20 ppb

Probenvorbereitung:

25 g fein gemahlenes Probenmaterial wurden in einen Labormixer (z.B. Warring) eingewogen und

mit 125 ml Acetonitril:Wasser (v/v, 75:25) versetzt. Der Behälter wurde verschlossen und das Pro-

bengut ca. 2 Min mit hoher Geschwindigkeit gemischt. Ein Anteil von ca. 25 ml der Mischung

wurde danach zentrifugiert (10 Min, 3000 g) oder über einen Faltenfilter (Whatman Nr. 4 oder ähn-

lichen Filter) filtriert. Ein Aliquot von 10 ml des Überstands/Filtrats wurde mit 40 ml 10 mM Phos-

phatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) versetzt, gründlich gemischt und durch einen Glasfa-

serfilter filtriert, um Schwebeteilchen zu entfernen.

Ein Aliquot von 25 ml des Filtrats, entsprechend 1 g Probe, wurde über eine EASI-EXTRACT

ZEARALENONE® Immunaffinitätssäule gereinigt. Der filtrierte Extrakt wurde dazu mit einem

Fluss von ca. 5 ml/min über eine mit spezifischen anti-Zearalenon-Antikörpern beladene Säule ge-

geben. Zearalenon der Probe wurde in diesem Schritt auf der Säule gebunden. Zum Entfernen von

Begleitkomponenten, die in der HPLC stören könnten, werden danach 20 ml deionisiertes Wasser

mit dem gleichen Fluss über die Säule gegeben. Anschließend wurden mit einer Spritze wenige ml

R-Biopharm AG 12/2005 17

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Abschlußbericht: 13053/21

Luft durch die Säule gedrückt, um Flüssigkeitsreste komplett aus der Säule zu entfernen. Vor der

nun folgenden Elution des gebundenen Mykotoxins wurde ein frisches Gefäß unter der Säule plat-

ziert und der Analyt mit 1 ml Acetonitril p.a. (HPLC Qualität) in langsamen Fluss (ca. 1 ml/min)

von der Säule eluiert. Der kovalent auf der Säule fixierte Antikörper wurde in diesem Schritt dena-

turiert und das gebundene Zearalenon frei gesetzt. Anschließend wurde 1 ml deionisiertes Wasser

über die Säule gegeben und ebenfalls gesammelt (1 g Probe/2 ml)

Nach Mischen des Eluats konnte die Probe direkt in der HPLC analysiert oder bis zur Analyse bei –

20 °C im Tiefkühlschrank aufbewahrt werden.

Alternativ zu dieser Vorschrift wurden auch kleinere Probenmengen aufgearbeitet und das Volumen

des Extraktionsmittels entsprechend angepasst.

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Volts

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

Vols

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.617 1.5

60 2.380 2.7

60 3.403

4.320

4.930 5.3

53 5.637 5.9

97

6.313

7.447

7.890

8.483

8.987

9.647

10.890

ZEA

11.900

12.523

13.153

13.340

Detector A (Ex:274nm, Em:418nm)Zea_Stat_Tag4: 50 1_Zea_Stat_Tag4_007

Name Retention Time

Abb. 5 Zearalenon - HPLC Chromatogramm am Beispiel einer Kalibrierlösung mit 50 ppb Zearalenon

R-Biopharm AG 12/2005 18

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Abschlußbericht: 13053/21

3.2 ELISA-Verfahren

Zusätzlich zur HPLC wurden die folgenden Mykotoxin ELISA Verfahren von R-Biopharm für die

Erstellung von Vergleichsdaten eingesetzt. Die ausführlichen Testkitbeschreibungen sind auf der

dem Bericht beigefügten CD-ROM zu finden.

RIDASCREEN®FAST DON (Produkt Nr. R5901)

Enzymimmunoassay zur quantitative Bestimmung von Deoxynivalenon

Schnelltest mit einem Messbereich von 222 – 6000 µg/kg

RIDASCREEN® DON (Produkt Nr. R5906)

Enzymimmunoassay zur quantitative Bestimmung von Deoxynivalenon

Test mit einem Messbereich von 18,5 – 500 µg/kg

RIDASCREEN®FAST T-2 Toxin (Produkt Nr. R5302)

Enzymimmunoassay zur quantitative Bestimmung von T-2 Toxin

Schnelltest mit einem Messbereich von 50 – 400 µg/kg

RIDASCREEN®FAST Zearalenon (Produkt Nr. R5502)

Enzymimmunoassay zur quantitative Bestimmung von Zearalenon

Schnelltest mit einem Messbereich von 50 – 400 µg/kg

RIDASCREEN® Zearalenon (Produkt Nr. R5906)

Enzymimmunoassay zur quantitative Bestimmung von Zearalenon

Test mit einem Messbereich von 1,8 – 142 µg/kg

R-Biopharm AG 12/2005 19

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Abschlußbericht: 13053/21

3.3 Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10

Der Mykotoxin-Antikörper-Array Test wurde auf der Basis von monklonalen Antikörpern und My-

kotoxin-Enzym Konjugaten entwickelt, die vom Kooperationspartner hergestellt worden waren oder

bei R-Biopharm aus eigenen oder anderen externen Quellen zur Verfügung standen. Alle anderen

Testkitkomponenten stammten aus der regulären R-Biopharm Produktion beziehungsweise wurden

nach den firmenüblichen Herstellanweisungen produziert und konfektioniert. Das unten gezeigte

Foto zeigt die Testkitkomponenten im typischen Testkit R-Biopharm Design.

Abb. 6: RIDASCREEN® Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 mit allen Testkomponenten Testkomponenten: Mikrotiterplatte (eingeschweißt in eine Aluminiumtasche), Tüte mit dem Salzgemisch für die Herstellung des Waschpuffers und Testreagenzien: Chromogen/Substrat-Lösung (Tropfflasche mit weißem Deckel), visuelle Stopp-Lösung (Tropfflasche mit orangerotem Deckel), H2SO4-Stopp-Lösung (Tropfflasche mit gelbem Deckel), 4 Standardlösungen (Braunglasflaschen mit weißem Deckel), Konjugatge-misch (Braunglasflasche mit rotem Deckel)

R-Biopharm AG 12/2005 20

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3.3.1 Testprinzip

Das Testprinzip beruht auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays. Die Kavitäten einer Mikroti-

terplatte (MTP) sind spaltenweise mit den fünf verschiedenen Mykotoxin-spezifischen monoklona-

len Antikörpern beschichtet. Mykotoxin-Enzymkonjugat und das entsprechende Mykotoxin der

Standardmischung bzw. Mykotoxin der Probe konkurrieren um den Antikörperbindungsplatz. Je

mehr Mykotoxin im Standard bzw. Probe vorhanden ist, desto weniger Enzymkonjugat wird ge-

bunden (kompetitiver Test). Überschüssiges Reagenz wird in einem Waschschritt entfernt und

Chromogen/Substrat zugegeben. Das farblose Chromogen wird durch die enzymatische Reaktion zu

einem blau gefärbten Produkt umgesetzt. Die enzymatische Reaktion wird mittels Schwefelsäure

abgestoppt, wodurch ein Farbumschlag nach gelb erfolgt. Alternativ dazu kann die enzymatische

Reaktion mit einer neutralen, sogenannten visuellen Stopp-Lösung beendet werden. Hierbei bleibt

die blaue Farbe erhalten. Da die visuelle Stopp-Lösung selbst orangerot eingefärbt ist, entsteht eine

visuell gut auswertbare Mischfarbe.

Abb. 7 Schematische Darstellung eines Mykotoxin-Antikörper-Arrays.

Oben: Konjugat-Mischung und Probe oder Standard-Mix werden vorgemischt und danach spal-tenweise in die Kavitäten einer Antikörper-beschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Mitte: Die einzelnen Mykotoxin-spezifischen monoklonalen Antikörper sind in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte spaltenweise nebeneinander angeordnet. Unten: Mykotoxin-Enzymkonjugate der Konjugat-Mischung und freies Mykotoxin einer Probe konkurieren um die Bindungsplätze der Antikörper. Nach einem Waschschritt wird in Abhän-gigkeit von gebundenem Enzymkonjugat durch Zusatz von Chromogen ein gefärbtes Produkt er-zeugt. Die intensivste Färbung bedeutet Abwesenheit von Mykotoxin. Keine oder schwache Fär-bung bedeutet hoher Mykotoxingehalt der Probe. Im dargestellten Beispiel wird für den DON- und den T-2 Toxin-Nachweis ein hoher Mykotoxingehalt angezeigt.

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3.3.2 Testkomponenten

Das Mykotoxin-Antikörper-Array Testkit besteht aus den folgenden Komponenten:

1 Mikrotiterplatte (40 Kavitäten, 5 Streifen á 8 Kavitäten) spaltenweise beschichtet mit Mykotoxin-spezifischen Antikörpern Spalte 1: Aflatoxin-spezifischer Antikörper, Spalte 2: DON-spezifischer Antikörper, Spalte 3: Fumonisin-spezifischer Antikörper, Spalte 4: T-2 Toxin-spezifischer Antikörper, Spalte 5: Zearalenon-spezifischer Antikörper

2 Konjugat Gemisch (3 ml)

gebrauchsfertige verdünnte Enzymkonjugate der Mykotoxine in einer gepufferten wässrigen Lösung

3 Standardreihe

Verdünnungsreihe des Standard-Mix (gebrauchfertige Lösungen der Mykotoxin-Standardsubstanzen in einer Methanol/Wasser Mischung, 35%/65%, v/v)

3.1 Standard 1 (1 ml) 0-Standard (35 % Methanol/65% Wasser (v/v) ohne Mykotoxin Zusatz)

3.2 Standard 2 (1 ml) Standard Mix 1/9: Aflatoxin 0,1 ppb, DON 5,6 ppb, Fumonisin 5,6 ppb, T-2 Toxin 0,22 ppb, Zearalenon 1,1 ppb

3.3 Standard 3 (1ml) Standard Mix 1/3: Aflatoxin 0,3 ppb, DON 16,7 ppb, Fumonisin 16,7 ppb, T-2 Toxin 0,66 ppb, Zearalenon 3,3 ppb

3.4 Standard 4 (1ml) Standard Mix: Aflatoxin 0,9 ppb, DON 50 ppb, Fumonisin 50 ppb, T-2 Toxin 2 ppb, Zearalenon 10 ppb

4 Red Chromogen Pro (6 ml) Chromogen/Substrat Lösung (gebrauchsfertige Lösung)

5 Stopp-Lösung (6 ml) (1 N H2SO4)

6 visuelle Stopp-Lösung (6 ml) (Enzyminhibitor Lösung, neutral)

7 Waschpuffer Puffersalzmischung (Sigma 3563) zum Herstellen von 1Liter 10 mM PBS, 0,05 % Tween 20, pH 7,4

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3.3.3 Testdurchführung

1 0,3 ml der Standard-Lösungen beziehungsweise der Proben + 0,3 ml Enzymkonjugat-

Mischung wurden in jeweils einem Reaktionsgefäß außerhalb der MTP gemischt.

2 Jeweils 100 µl der Mischungen wurden spaltenweise mit einer 8-Kanalpipette auf die MTP

übertragen. (siehe auch MTP-Belegung des Testformats auf der folgenden Seite)

3 Die Inkubationsmischungen wurden auf der MTP 10 Min bei Raumtemperatur inkubiert.

4 Der Inhalt der MTP wurde zum Entfernen der Inkubationslösungen in ein Auffangbecken

ausgeleert (oder abgesaugt) und die MTP auf einem Papiertuch ausgeschlagen.

5 Waschen der MTP: Zum gründlichen Entfernen von Resten der Inkubationslösung wurde

die MTP wie folgt gewaschen. Die MTP wurde mit 250 µl Waschpuffer/well gefüllt, diese

Lösung wieder ausgeleert (oder abgesaugt) und die MTP auf einem Papiertuch ausgeschla-

gen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt.

6 Zur Farbentwicklung wurden jeweils 100 µl Chromogen/Substrat Lösung in die Kavitäten

der MTP pipettiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.

7 Zum Abstoppen wurden danach weitere 100 µl einer Stopp-Lösung in die einzelnen Kavitä-

ten der MTP pipettiert.

8 Die MTP wurde entweder visuell ausgewertet (Verwendung der visuellen Stopp-Lösung)

oder bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Photometer gemessen (Verwendung von verdünnter

Schwefelsäure als Stopp-Lösung).

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3.3.4 Testformat

Die folgende Abbildung zeigt die Belegung einer MTP mit Standards und Proben. Um die zeitlich

bedingte Verschiebung der Bindungsreaktion bei der Auftragung von Standard/ Probe und Enzym-

konjugat Mischung möglichst klein zu halten, wurden Standard/Proben und Enzymkonjugat-

Mischung zuvor in Probegefäßen im Verhältnis 1 + 1 gemischt und aus diesen Mischungen jeweils

100 µl spaltenweise mit einer Mehrkanalpipette auf die MTP übertragen.

Tab. 4a Belegung einer MTP mit Standardreihe und Proben

Antikörperbeschichtung

Standard/Probe Aflatoxin DON Fumonisin T-2 Toxin Zearalenon MTP-Zeile

Standard 1 A

Standard 2 B

Standard 3 C

Standard 4 D

Probe 1 E

Probe 2 F

Probe 3 G

Probe 4 H

MTP-Spalte 1 2 3 4 5

Tab. 4b Belegung einer MTP mit Standard 1, cut off Standard und Proben

Antikörperbeschichtung

Standard/Probe Aflatoxin DON Fumonisin T-2 Toxin Zearalenon MTP-Zeile

Standard 1 (0) A

cut off Standard B

Probe 1 C

Probe 2 D

Probe 3 E

Probe 4 F

Probe 5 G

Probe 6 H

MTP-Spalte 1 2 3 4 5

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3.3.5 Auswertung und Interpretation der Ergebnisse

Die Messungen wurden nach Abstoppen der enzymatischen Reaktion mit einem Mikrotiterplatten-

Reader bei 450 nm vorgenommen. Die Mykotoxingehalte der Proben wurden anhand der jeweiligen

Mykotoxin-Standardkurven mit Hilfe der RIDA®Win Software bestimmt. Zur Auswertung wurde

eine logit-log - Kurvenanpassung gewählt. Durch die logit-log Umwandlung der Daten kann die

Standardkurve mittels linearer Regression als Gerade dargestellt und so zur Berechnung der Myko-

toxingehalte der Probe benutzt werden.

Die logit – log Transformation lässt sich allgemein durch die folgende Gleichung darstellen:

logit y = a + b log x

wobei die folgenden Gleichungen gelten

y = % B/Bo

a = intercept

b = slope

logit(y) = ln (y/100-y)

x = Standardkonzentration

also: ln ((%B/Bo/(100 - % B/Bo)) = a + b log (Standardkonzentration)

Die nachfolgende Abbildung zeigt am Beispiel der DON-Bestimmung ein typisches Auswertepro-

tokoll einer Array-Messung. Im Ausdruck werden auf Seite 1 die Rohdaten der Messung, sowie die

Standardkurve und Angaben zum Schnittpunkt der Geraden mit der x-Achse (= 50 % Dosis), Stei-

gung der Geraden, und Korrelationskoeffizient der Regressionsgeraden angezeigt. Auf Seite 2 wird

die Wertetabelle für die Standards und die Ergebnisse der Proben ausgedruckt.

Der Korrelationskoeffizient ist ein Maß für die Güte der Standardkurve und sollte für einen zuver-

lässigen Test > 0,98 sein (optimaler Wert = 1,00). Die Messungen mit dem Mykotoxin-Array erga-

ben in der Regel Korrelationswerte zwischen 0,99 und 1,00.

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Abb.8:a Beispiel einer Auswertung des Array Tests bezogen auf DON Seite 1 des Auswerteprotokolls mit Rohdaten und Standardkurve in logit –log Dar-stellung, Ausgedruckt werden zusätzlich die Werte für den Schnittpunkt mit der x-Achse (50% Dosis), Steigung und Korrelationskoeffizient der Geraden (unterhalb des Graphen), sowie Angaben zu den Standards (rechte Spalte)

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Abb. 8 b: Beispiel einer Auswertung des Mykotoxin Arrays bezogen auf DON Seite 2 des Auswerteprotokolls mit der Berechnung der Standards und den Pro-benwerten

Alternativ zur Auswertung auf der Basis der im Test mitgeführten Standardreihen wurden in den

Routineuntersuchungen auch Tests nur mit Standard 1 (100% B/Bo) durchgeführt. Die Auswertung

erfolgte in diesem Fall mit virtuellen Mykotoxin-Standardkurven, die in mindestens 10 unabhängi-

gen Tests einer Charge ermittelt worden waren und als B/Bo Werte hinterlegt wurden. Nach dem

gleichen Prinzip wird auch ein Test für die Bestimmung von Aflatoxin (RIDASCREEN®FAST

Aflatoxin SC).

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3.3.6 Probenaufarbeitung

Die gemahlenen und homogenisierten Proben (Getreide, Futtermittel und Nahrungsmittel) wurden

zunächst im Verhältnis 1/5 mit 70 % Methanol extrahiert (5 g Probe + 25 ml Extraktionsmedium),

danach über ein Faltenfilter filtriert und 1 + 1 mit deionisiertem Wasser verdünnt, so dass die Pro-

ben am Ende in einer 1/10 Verdünnung in 35 % Methanol vorlagen.

Diese Art der Probenvorbereitung hatte sich bereits bei anderen Mykotoxin-ELISA Tests bewährt

und diente neben dem effizienten Extrahieren der Mykotoxine aus der Probenmatrix gleichzeitig

dem Ausfällen von Matrixkomponenten wie Proteinen, die den Test stören könnten.

Die 1:10 verdünnten Proben wurden zusätzlich 1:5 mit 35 % Methanol weiterverdünnt und so in

einer Endverdünnung von 1/50 im Mykotoxin-Array Test gemessen. Damit wurde der Messbereich

um Faktor 5 zu höheren Konzentrationen verschoben. Der Faktor 10 beziehungsweise 50 der Pro-

benverdünnung muss später bei der Berechnung der Mykotoxin-Konzentration berücksichtigt wer-

den.

Die so erzielten Mykotoxin-Messbereiche entsprachen weitestgehend den Anforderungen der Fut-

termittel-Industrie, während mit der 1/10 Verdünnung die Testanforderungen für Lebensmittel ge-

troffen wurden.

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4 Ergebnisse

4.1 Voruntersuchungen und Optimierungsphase

Vom Kooperationspartner an der LMU München wurden die für die Testentwicklung erforderlichen

monoklonalen Mykotoxin-spezifischen Antikörper und Mykotoxin-Enzymkonjugate nach publizier-

ten Verfahren hergestellt und auf Eignung geprüft [13, 14, 15, 16, 17, 18]. Weitere Antikörper und

Konjugate wurden firmenintern hergestellt, beziehungsweise standen aus firmeninternen Ressour-

cen zur Verfügung. Die folgende Tabelle zeigt die für die Entwicklung verfügbaren Testspezifi-

schen Reagenzien.

Tab. 5 Testspezifische Reagenzien für die Mykotoxin-Antikörper-Array Entwicklung Liste der monoklonalen Antikörper und Mykotoxin-Peroxidase Konjugate

Mykotoxin monkolonaler Antikörper Enzymkonjugat

Aflatoxin

- 5G1, (Aflatoxin M1 Klon) - 4E1, Batch 17 - P2G8

Aflatoxin B1-BSA-HRP #03092

DON - 1B12, subtyp IgG2- 1H8, subtyp IgG1

DON-AE-HRP # 03372

Fumonisin - IC9, Batch P3 Fumonisin B1-PJ # 91437

Ochratoxin A - 4C5, Batch 3.6 - 10E2, Batch 0010401

Ochratoxin A-AE-HRP # 95109

T-2 Toxin - 3E2, Pool, affinitätsgereinigt

T-2 Toxin-HS-HRP # 04262

Zearalenon

- 1B11D7 affinitätsgereinigt - P8, Batch 2.07

Zearalenon-HRP # 05052

In Voruntersuchungen wurden zunächst die Machbarkeit des Arrays verifiziert und aus den zur Ver-

fügung stehenden Komponenten die am besten geeigneten Kombinationen ausgewählt.

Dazu wurden die monoklonalen Antikörper in Verdünnungsreihen von 1000 ng/ml bis 1,4 ng/ml

auf Kaninchen anti-Maus-Ig Fängerplatten inkubiert, um optimale Bindungsverhältnisse zu erzie-

len. Die monklonalen Antikörper wurden so über ihre Fc-Teile in den Vertiefungen der Mikroti-

terplatte (MTP) fixiert und die spezifische Bindungsseite des mAk blieb frei zugänglich für die

Bindung des Mykotoxin. Danach wurden unspezifische Bindungsplätze der MTP durch Inkubation

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mit einer Protein-haltigen Lösung blockiert, die MTP getrocknet und mit Trockenmittel in Alumi-

niumbeuteln bis zur Testung kühl gelagert.

Die Mykotoxin-Peroxidase Konjugate wurden in einer sogenannten Schachbretttitration senkrecht

zur Variation der Antikörperbeschichtung in Verdünnungsreihen titriert, wobei einmal Toxinfreies

Medium und einmal Mykotoxin in einer für die Methode relevanten Konzentration zugesetzt wurde.

Damit ließ sich gleichzeitig das Maximalsignal ohne Toxin (100% Signal) und das durch den kom-

petitiven Ansatz reduzierte Signal (% B/Bo) messen. Angestrebt wurde eine möglichst große Sig-

nalreduktion durch den kompetitiven Ansatz. Das Inkubationsgemisch wurde eine definierte Zeit

(10 – 30 Minuten) inkubiert. Danach wurden überschüßige Reagenzien in einem Waschschritt ent-

fernt und der Test mit einem Chromogen/Substratgemisch für 10 – 15 Minuten entwickelt. Die

Intensität der entstandenen gefärbten Produkte wurde photometrisch bei 450 nm gemessen und die

Resultate zur Optimierung des Tests ausgewertet. Die nachfolgende Tabelle zeigt beispielhaft für

Aflatoxin das Ergebnis einer Schachbretttitration

Tab. 6 Schachbretttitration mit Aflatoxin Antikörper P2G8 Dargestellt sind die OD-Werte gemessen in einer Schachbretttitration mit einem Aflatoxin spezi-fischen monoklonalen Antikörper P2G8 und dem korrespondierenden Enzymkonjugat. Die MTP war zeilenweise von A bis H mit abnehmenden Antikörperkonzentrationen beschichtet; die En-zymkonjugatverdünnung wurde spaltenweise von links nach rechts erhöht. In die Vertiefungen (well) der MTP wurden 50 µl Enzymkonjugat-Lösung und 50 µl Aflatoxin-Standard (0 und 4 ng/ml) pipettiert. danach wurde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubationslösung wurde nach 30 Minuten ausgeleert und nicht gebundene Reagenzien in einem Waschschritt entfernt. Zur Farbentwicklung wurden 100 µl Chromogen/Substrat Lösung pro well pipettiert. Die enzy-matische Reaktion wurde nach 15 Minuten durch Zusatz von Stopp-Lösung (100µl/well) abge-stoppt und die OD-Werte bei 450 nm gemessen. Geeignete Kombinationen sind gelb unterlegt

Konjugatverdünnung 1/900 1/2700 1/8100 1/24300

Beschichtung Mykotoxin-Standardkonzentration(ng/ml) Antikörper (ng/ml) 0 4 0 4 0 4 0 4 Reihe

3000 4,168 4,166 4,422 3,986 4,441 2,177 1,871 0,364 A

1000 4,675 5,375 4,609 3,738 4,269 1,780 1,855 0,699 B

333,3 4,347 4,367 4,422 3,227 4,050 1,402 1,917 0,533 C

111,1 4,518 2,281 4,433 1,026 3,627 0,418 1,566 0,177 D

37,0 4,297 0,885 4,644 0,380 2,572 0,177 1,023 0,110 E

12,3 4,204 0,406 3,073 0,208 1,365 0,120 0,519 0,099 F

4,1 2,087 0,397 1,310 0,160 0,548 0,108 0,241 0,090 G

1,4 0,791 0,275 0,462 0,166 0,223 0,097 0,127 0,088 H

MTP – Spalte 5 6 7 8 9 10 11 12

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1000 333 111 37 124 1

9002700

8100

24300

0

20

40

60

80

100

120

% M

axim

alsi

gnal

Beschichtung (ng/ml

Konjugat

Maximalsignal (OD) reduziertes Signal in % Maximalsignal bei Aflatoxinzusatz

1000 333,3 111,1 37 12,3 4,1 1,4

9002700

810024300

0

1

2

3

4

Max

imal

sign

al (O

D)

Beschichtung (ng/ml)

Konjugat

Abb. 9 Schachbretttitration mit Aflatoxin Antikörper P2G8,

graphische Darstellung der Maximalsignale (OD) und der normierten reduzierten Signale bei Zusatz von Aflatoxin (4 ng/ml)

Die Untersuchungen zeigten, dass die verschiedenen Enzymkonjugate und Standardsubstanzen der

Mischungen sich nicht gegenseitig störten und so das Testergebnis beeinflussten. Leider erwiesen

sich beide Ochratoxin A-spezifischen Antikörper als ungeeignet für die Entwicklung eines empfind-

lichen Tests, da selbst mit Zusatz von 5 ppb Ochratoxin A in keiner der überprüften Kombinationen

eine ausreichende Signalreduktion gegenüber dem Standard ohne Ochratoxin A-Zusatz erreicht

wurde. In Optimierungsschleifen wurde danach mit den fünf verbliebenen Mykotoxin-spezifischen

Antikörpern der hier beschriebene Mykotoxin-Antikörper-Array etabliert.

Der in Phase 2 des Projekts als Prototyp entwickelte Mykotoxin-Antikörper-Array 30/15 wurde

hinsichtlich einer Verkürzung der Gesamtanalysenzeit weiter optimiert. Dazu wurde Antikörper-

Beschichtung und Enzymkonjugat-Verdünnung mit Hilfe weiterer Schachbretttitrationen optimiert

und so eingestellt, dass mit einer Inkubationszeit von 10 Minuten (vorher 30 Minuten) und einer

enzymatischen Farbentwicklung von ebenfalls 10 Minuten (vorher 15 Minuten) ohne Mykotoxin-

Zusatz ein maximales Signal von 1,5 bis 3,0 OD erreicht wurde. Die eingestellten Verhältnisse

führten zu Mykotoxin-Standardkurven, die gegenüber dem Test mit den längeren Inkubationszeiten

zu etwas höheren Konzentrationen hin verschoben waren. Die Aflatoxin Standardkurve zeigte dabei

die mit etwa Faktor 2 größte Verschiebung, während die 50 % Dosis Werte der Standardkurven von

DON und Fumonisin nahezu unverändert blieben. Die Zusammenstellung des optimierten Mykoto-

xin-Antikörper-Arrays 10/10 mit den zugehörigen Standardkonzentrationen der Mykotoxine in der

Standardmischung ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.

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Tab. 7 Zusammensetzung des Mykotoxin-Antikörper-Arrays 10/10

Aufgeführt sind die im Mykotoxin-Antikörper-Array eingesetzten Kombinationen von Antikör-per und Mykotoxin-Enzymkonjugat-Verdünnung, sowie die Konzentrationen der Mykotoxine im Standard-Mix

Antikörper Enzymkonjugat Mykotoxin-Standardreihe (ppb) Mykotoxin

Klon Beschichtung(ng/ml)

Verdünnung std1 std2 std3 std4

Aflatoxine P2G8 20 1/ 3 000 0 0,1 0,3 0,9

DON 1H8 100 1/3 000 0 5,6 16,7 50

Fumonisine P3 100 1/30 000 0 5,6 16,7 50

T-2 Toxin 2E2 100 1/50 000 0 0,22 0,67 2

Zearalenon P8 500 1/1 250 0 1,1 3,3 10

4.2 Festlegung der Messbereiche und cut off-Werte

Durch die Probenvorbereitung ergaben sich entsprechend der Probenvorbereitung für die 1/10 be-

ziehungsweise 1/50 Verdünnung die folgenden in Tabelle 8 aufgeführten Messbereiche. Als cut off-

Werte wurden die abgerundeten Werte der jeweiligen 50 % Dosis der Mykotoxin-Standardkurven

genommen. In diesem Bereich sind die Standkurven am steilsten und weisen dadurch die höchste

Testempfindlichkeit auf. Die cut off-Werte lagen bei der 1/10 Verdünnung in allen Fällen unterhalb

der gesetzlich maximal erlaubten Konzentrationen für Lebensmittel, bei Verdünnungsfaktor 50 la-

gen die cut off-Werte i.d.R. unter den empfohlenen Richtwerten für Futtermittel. Damit stellten die

gewählten cut off-Werte eine geeignete analytische Größe zur Beurteilung der Proben dar.

Tab. 8 Messbereiche und cut off – Werte des Mykotoxin-Antikörper-Arrays 10/10 bezogen auf die Probenverdünnung 1/10 und 1/50, die cut off-Werte stellen gerundete 50%

Dosis Werte dar, alle Angaben in ppb.

Probenverdünnung 1/10 Probenverdünnung 1/50

Mykotoxin Messbereich cut off Messbereich cut off Aflatoxin 1 – 9 3 5 – 45 15 DON 56 – 500 200 280 – 2500 1000 Fumonisn 56 – 500 200 280 – 2500 1000 T-2 Toxin 2,2 – 20 10 11 – 100 50 Zearalenon 11 – 100 40 55 – 500 200

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4.3 Untersuchungen mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10

Die nach einem einheitlichen Verfahren hergestellten Chargen des Mykotoxin-Antikörper-Arrays

wurden zunächst auf der Grundlage gängiger Qualitätskriterien hinsichtlich der Testspezifikation,

Stabilität und Reproduzierbarkeit charakterisiert und danach zur Untersuchung von Proben einge-

setzt.

Die Stabilität aller hergestellten Chargen der Testkits unter den vorgeschriebenen Lagerbedingun-

gen wurde in regelmäßigen Intervallen kontrolliert. Gleichzeitig wurden die Kits auf Chargenüber-

greifende, gleichbleibende analytische Qualität hinsichtlich Form und Lage der Standardkurven

(Chargenkonformität) sowie auf Reproduzierbarkeit sowie die Wiederfindung mit dotierten

Nullproben überprüft.

Spezifität und Sensitivität des Tests im bezug auf die richtige Einstufung von Proben wurden in

Untersuchungen mit gut charakterisierten Laborproben ermittelt.

Schließlich wurde der Array im Applikationslabor zum Screenen von Proben im routinemäßigen

Laborbetrieb eingesetzt.

4.3.1 Stabilität der Testkitkomponenten

Die Kits der verschiednen Charge wurden in festgelegten Intervallen überprüft und erwiesen sich

unter den vorgeschriebenen Lagerungsbedingungen (4 – 8 °C) über den Beobachtungszeitraum von

mindestens 6 Monaten als zufriedenstellend stabil. Die Abbildungen geben die Stabilitätsdaten einer

Charge für einen Zeitraum von 12 Wochen wieder (s. Abb. 10-14 und Tab. 9-13). Später produzier-

te Chargen des Arrays bestätigten die gute Stabilität der Testkitkomponenten.

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0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8 10 12

OD

450

14

Aflatoxin Mykotoxin-Array, 4°C Stabilität

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14

Woche

% m

axim

al O

D

Std 1 Std 2 Std 3 Std 4

Aflatoxin Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

Abb. 10a Stabilität des Arrays #02314 bezogen auf Aflatoxin bei 4 °C Lagerung, dargestellt sind die OD-Messwerte der Standards gegen die Lagerzeit

Abb. 10b Stabilität des Arrays #02314 bezogen auf Aflatoxin bei 4 °C Lagerung, dargestellt sind die auf 100 % normierten Messwerte der Stan-dards gegen die La-gerzeit

Aflatoxin OD-Werte % maximal OD 50% Dosis

Woche Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 (ppb)1 1,031 0,806 0,523 0,305 100 78,2 50,7 29,6 0,352 1,088 0,818 0,496 0,269 100 75,2 45,6 24,7 0,284 1,256 0,912 0,591 0,359 100 72,6 47,1 28,6 0,298 1,096 0,881 0,606 0,276 100 80,4 55,3 25,2 0,35

12 1,280 0,924 0,716 0,406 100 72,2 55,9 31,7 0,36 Tab. 9: Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf Aflatoxin bei 4 °C Lagerung aufgeführt sind die OD-Messwerte (linke Hälfte der Tabelle) und die auf 100 % (=std 1) normierten Messwerte, sowie die jeweiligen 50 % Dosis Werte. Die Daten stammen aus Messungen der Charge #02314 und stellen jeweils Mittelwerte aus Doppelbestimmungen (n=2) dar.

R-Biopharm AG 12/2005 34

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Abschlußbericht: 13053/21

Abb. 11a Stabilität des Arrays #02314 bezogen auf DON bei 4 °C Lage-rung, dargestellt sind die OD-Messwerte der Standards gegen die Lagerzeit

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8 10 12 14

OD

450

DON Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

Abb. 11b: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf DON bei 4 °C Lagerung, dargestellt sind die auf 100 % nor-mierten-Messwerte der Standards gegen die Lagerzeit

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14

Woche

% m

axim

al O

D

DON Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

Std 1

DON OD-Werte % maximal OD 50% Dosis

Woche Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 (ppb)1 1,269 1,002 0,805 0,469 100 79,0 63,4 37,0 28,22 1,250 1,002 0,653 0,446 100 80,2 52,2 35,7 23,04 1,343 1,172 0,838 0,537 100 87,3 62,4 40,0 31,08 1,142 0,940 0,655 0,371 100 82,3 57,4 32,5 24,0

12 1,210 0,948 0,636 0,347 100 78,3 52,6 28,7 20,0

Tab. 10: Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf DON bei 4 °C Lagerung aufgeführt sind die OD-Messwerte (linke Hälfte der Tabelle) und die auf 100 % (=std 1) normierten Mess-werte, sowie die jeweiligen 50 % Dosis Werte. Die Daten stammen aus Messungen der Charge #02314 und stellen jeweils Mittelwerte aus Doppelbestimmungen (n=2) dar.

Std 2 Std 3 Std 4

R-Biopharm AG 12/2005 35

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Abschlußbericht: 13053/21

Abb. 12a: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf Fumonisin bei 4 °C Lagerung, dargestellt sind die OD-Messwerte der Stan-dards gegen die Lager-zeit

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 2 4 6 8 10 12 1

OD

450

4

Fumonisin Mykotoxin-Array, 4°C Stabilität

Abb. 12b: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf Fumonisin bei 4 °C Lagerung, dargestellt sind die auf 100 % normierten-Messwerte der Stan-dards gegen die Lager-zeit

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14

Woche

% m

axim

al O

D

Fumonisin Mykotoxin-Array, 4°C Stabilität

Std 1

Fumonisin OD-Werte % maximal OD 50% Dosis

Woche Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 (ppb)1 1,193 1,035 0,757 0,464 100 86,8 63,5 38,9 30,92 1,461 1,233 0,921 0,593 100 84,4 63,0 40,6 31,94 1,670 1,453 1,157 0,714 100 87,0 69,3 42,8 37,48 1,328 1,143 0,766 0,430 100 86,1 57,7 32,4 24,8

12 1,255 1,016 0,751 0,375 100 81,0 59,8 29,9 22,9

Tab. 11: Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf Fumonisin bei 4 °C Lagerung aufgeführt sind die OD-Messwerte (linke Hälfte der Tabelle) und die auf 100 % (=std 1) normierten Mess-werte, sowie die jeweiligen 50 % Dosis Werte. Die Daten stammen aus Messungen der Charge #02314 und stellen jeweils Mittelwerte aus Doppelbestimmungen (n=2) dar.

Std 2 Std 3 Std 4

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Abschlußbericht: 13053/21

Abb. 13a: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf T-2 Toxin bei 4 °C Lagerung, darge-stellt sind die OD--Messwerte der Stan-dards gegen die Lager-zeit

Abb. 13b: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf T-2 Toxin bei 4 °C Lagerung, darge-stellt sind die auf 100 % normierten-Messwerte der Standards gegen die Lagerzeit

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,22,42,62,8

0 2 4 6 8 10 12 1

OD

450

4

T-2 Toxin Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 1

Woche

% m

axim

al O

D

4

Std 1 Std 2 Std 3 Std 4

T-2 Toxin Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

T-2 Toxin OD-Werte % maximal OD 50% Dosis

Woche Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 (ppb)1 2,230 1,924 1,512 0,791 100 86,3 67,8 35,5 1,202 2,262 1,950 1,298 0,724 100 86,2 57,4 32,0 0,984 2,649 2,288 1,762 0,928 100 86,4 66,5 35,0 1,208 2,385 2,044 1,578 0,797 100 85,7 66,2 33,4 1,10

12 1,932 1,756 1,328 0,568 100 90,9 68,7 29,4 1,10

Tab. 12: Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf T-2 Toxin bei 4 °C Lagerung aufgeführt sind die OD-Messwerte (linke Hälfte der Tabelle) und die auf 100 % (=std 1) normierten Messwerte, sowie die jeweiligen 50 % Dosis Werte. Die Daten stammen aus Messungen der Charge #02314 und stellen jeweils Mittelwerte aus Doppelbestimmungen (n=2) dar.

R-Biopharm AG 12/2005 37

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Abschlußbericht: 13053/21

Abb. 14a: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf Zearalenon bei 4 °C Lagerung, dargestellt sind die OD-Messwerte der Stan-dards gegen die Lager-zeit

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 2 4 6 8 10 12 14

OD

450

Zearalenon Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

Abb. 14b: Stabilität des Arrays #02314 be-zogen auf Zearalenon bei 4 °C Lagerung, dar-gestellt sind die auf 100 % normierten-Mess-werte der Standards gegen die Lagerzeit

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14

Woche

% m

axim

al O

D

Zearalenon Mykotoxin-Array, 4 °C Stabilität

Std 1

Zearalenon OD-Werte % maximal OD 50% Dosis

Woche Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 (ppb)1 1,309 1,091 0,834 0,470 100 83,3 63,7 35,9 5,72 1,530 1,256 0,845 0,544 100 82,1 55,2 35,6 4,94 1,485 1,211 0,869 0,593 100 81,5 58,5 39,9 5,78 1,083 0,804 0,658 0,394 100 74,2 60,8 36,4 5,0

12 1,049 0,839 0,618 0,418 100 80,0 58,9 39,8 5,7

Tab. 13: Stabilität des Mykotoxin-Arrays #02314 bezogen auf Zearalenon bei 4 °C Lagerung aufgeführt sind die OD-Messwerte (linke Hälfte der Tabelle) und die auf 100 % (=std 1) normierten Messwerte, sowie die jeweiligen 50 % Dosis Werte. Die Daten stammen aus Messungen der Charge #02314 und stellen jeweils Mittelwerte aus Doppelbestimmungen (n=2) dar.

Std 2 Std 3 Std 4

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Abschlußbericht: 13053/21

4.3.2 Chargenkonformität und Testreproduzierbarkeit

Chargenkonformität

Während des Projekts wurden zunächst drei Kleinchargen (#02314, #04404, #02414) und in der

abschließenden Projektphase eine größere Produktionscharge (#04494) mit 100 Testkits des Myko-

toxin-Antikörper-Arrays 10/10 hergestellt. Die Messserien der mit den gleichen Antikörperbe-

schichtungen und Enzymkonjugatmischung hergestellten Testkitchargen des Mykotoxin-

Antikörper-Arrays 10/10 zeigten eine sehr gute Chargen-übergreifende Konformität (s. Tab. 14 und

Abb. 15). Die mittleren normierten Standardkurven der Chargen zeigten einen gut übereinstimmen-

den Verlauf bezogen auf Lage und Steigung der Kurven für die einzelnen Mykotoxine.

Besonders die DON- und Fumonisin-Standardkurven der vier Chargen waren nahezu deckungs-

gleich. Eine etwas größere Streuung konnte bei den T-2 Toxin - und Zearalenon – Standardkurven

beobachtet werden. Die zuletzt produzierte Charge (#04494) zeigte gegenüber den ersten drei Char-

gen eine leichte Verschiebung der Aflatoxin (+ 40%) und T-2 Toxin (+ 25 %) Standardkurven zu

höheren Konzentrationen, wie an den 50% Dosiswerten abzulesen war.

Die Interassay-VK-Werte der Standards lagen bei unabhängigen Tests (n=8, 10 und 32) innerhalb

einer Charge deutlich unter 20 %. Die höchsten Variationskoeffizienten wurden erwartungsgemäß

bei der Messung der OD-Werte festgestellt, wie an der Darstellung der ODmax-Werte (Standard 1)

der einzelnen Standardkurven zu erkennen war, die abhängig von Temperatur und Inkubationszei-

ten deutlich variieren konnten. Die Produktionscharge wies die höchsten VK-Werte der vier Char-

gen auf.

Bei der Überprüfung der Intraassay Reproduzierbarkeit mit 4-fach Messungen innerhalb einer

Mikrotiterplatte wurden üblicherweise über den Messbereich der Standardkurven VK-Werte unter-

halb von 10% gemessen.

R-Biopharm AG 12/2005 39

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 14: Vergleich der Standardkurven von vier Chargen des Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10

aufgeführt sind die mittleren OD-Werte von Standard 1 (ODmax = 100% B/Bo), die Mittelwerte der normierten Standards 2, 3 und 4 (% B/Bo) und die mittleren 50% Dosis-Werte, sowie die zugehörigen VK-Werte.

Chargen-Nr. #02314 #04404 #02414 #04494

Mykotoxin

n=8 % VK n=10 % VK n=10 % VK n=32 % VK

Aflatoxin Std 1 (ODmax) 1,130 10,0 1,524 5,7 1,539 5,7 1,406 22,0

Std 2 77,0 5,7 78,6 3,3 78,5 3,3 82,1 9,0

Std 3 51,9 9,2 52,4 6,2 51,0 6,2 59,5 10,5

% B

/Bo

Std 4 28,9 12,1 21,9 13,3 21,4 13,3 33,4 11,7 50% dosis (ppb) 0,35 16,3 0,34 18,1 0,32 18,05 0,47 13,5

DON Std 1 (ODmax) 1,224 4,7 1,311 8,5 1,317 8,5 1,248 28,8

Std 2 82,2 4,5 77,1 2,7 77,8 2,7 78,8 9,7

Std 3 56,4 7,7 56,1 4,3 57,0 4,3 57,0 14,0

% B

/Bo

Std 4 33,6 11,4 31,9 5,1 32,1 5,1 34,8 13,9 50% dosis (ppb) 24,17 17,0 21,72 8,6 22,28 8,57 24,85 19,2

Fumonisin Std 1 (ODmax) 1,445 9,2 1,409 6,4 1,459 6,44 1,371 29,1

Std 2 83,2 5,9 83,4 3,7 81,6 3,7 82,2 12,4

Std 3 59,7 8,9 57,9 5,6 56,0 5,6 58,7 17,0

% B

/Bo

Std 4 35,2 16,4 32,4 6,3 31,5 6,3 34,4 15,2 50% dosis (ppb) 27,03 24,2 24,26 10,8 22,88 10,82 25,63 30,7

T-2 Toxin Std 1 (ODmax) 2,309 11,3 1,546 6,9 1,549 6,94 1,766 21,6

Std 2 87,9 8,4 85,3 4,0 84,6 4,0 87,4 5,3

Std 3 65,4 13,2 64,1 2,8 63,9 2,8 68,1 7,6

% B

/Bo

Std 4 34,5 14,1 29,2 5,5 29,1 5,5 36,8 7,5 50% dosis (ppb) 1,09 21,4 1 6,3 0,99 6,26 1,29 13,5

Zearalenon Std 1 (ODmax) 1,257 15,8 2,233 9,8 2,214 9,8 1,202 20,8

Std 2 79,6 7,0 80,7 2,3 81,4 2,3 79,6 6,3

Std 3 60,3 5,3 54,0 2,1 55,0 2,1 56,8 7,7

% B

/Bo

Std 4 39,2 7,5 25,7 2,5 26,6 2,5 34,4 12,1 50% dosis (ppb) 5,67 13,3 3,88 4,7 4,04 4,67 4,55 24,0

R-Biopharm AG 12/2005 40

Page 50: Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays ... · des Arrays mit gleichbleibender analytischer Qualität ausgegangen werden kann. Die Testkompo-nenten waren bei 4

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0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,01 0,1 1 10 100Mykotoxinkonzentration (ppb)

% m

axim

ales

Sig

na

A f lato xin T -2 T o xin D ON F umo nisin

Z earaleno n

Abb. 15: Vergleich der Standardkurven von vier Chargen des Testkits % maximales Signal gegen Konzentration (ppb) der jeweiligen Mykotoxin-Standardkurve

dargestellt sind die mittleren normierten Standardkurven (Std 2 – Std 3 – Std 4) der Chargen #02314, 04404, 02414 und 04494 bezogen auf den jeweiligen Standard 1-Wert (maximales Sig-nal = 100 % ) Die zuletzt produzierte Charge #04494 ist mit einer stärkeren Linie in blau her-vorgehoben.

Testreproduzierbarkeit mit dotierten Proben

Die Reproduzierbarkeit und Wiederfindung des Tests bei Probentestung wurde mit Mykotoxin-

freien Nullproben und dotierten Proben überprüft. Dazu wurden nicht belastete Weizenproben auf

zwei Dotierstufen im Bereich der cut off-Werte mit einem Mykotoxin-Cocktail aufgestockt und

nach Probenaufarbeitung in 5 unabhängigen Tests in Vierfachbestimmung untersucht

Die Werte für die Nullprobenmessung lagen bei im Allgemeinen unter Standard 2 der Tests. Ledig-

lich für Aflatoxin wurden Werte oberhalb von std 2 (1 ppb) im Mittel bei 1,3 ppb gemessen. Für die

B/B0 Werte wurden VK-Werte zwischen 1 und 11 % gemessen.

Bei den dotierten Proben bewegten sich die VK Werte für die B/Bo Werte im gleichen Intervall,

während sie auf die Konzentrationen bezogen etwa um Faktor 3 höher lagen. Die Wiederfindung

der Dotierung bewegte sich zwischen 75 und 105 % (s. Tab. 15).

R-Biopharm AG 12/2005 41

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 15 Überprüfung der Reproduzierbarkeit Nullproben und dotierten Nullproben. (Dotierung auf zwei Stufen im Be-reich des cut off-Wertes) wurden mit Charge 04494 in fünf unabhängigen Tests in Vierfachbestimmung/Test gemessen.

Tab.15 a Nullproben

% B/Bo-Wert Konzentration (ppb) Lauf Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea 1 85,4 81,1 96,0 91,4 87,7 1,2 66,8 65,8 < Std2 <Std22 74,8 84,8 97,8 91,8 84,8 1,2 < Std2 < Std2 < Std2 < Std23 79,3 83,0 94,7 92,0 84,0 1,1 < Std2 <Std2 < Std2 < Std24 82,6 75,6 99,9 94,1 85,0 1,9 60,6 < Std2 < Std2 < Std25 103,5 85,0 100,5 91,4 88,7 < Std2 < Std2 < Std2 < Std2 < Std2Mw 85,1 81,9 97,8 92,1 86,0

sd 11,0 3,9 2,5 1,1 2,0

VK (%) 12,9 4,7 2,5 1,2 2,4

Tab 15 b Dotierlevel 1 % B/Bo-Wert Konzentration (ppb)

Lauf Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea 1 65,9 71,8 87,2 75,0 72,0 2,9 63,2 51,5# 4,8 21,42 61,4 64,7 69,2 70,0 67,1 3,1 130,3 98,2 7,2 21,83 62,8 67,8 82,9 85,0 68,3 2,4 101,9 63,6 3,1 19,84 60,3 68,4 67,1 74,2 70,8 2,9 125,5 77,8 5,2 15,45 54,7 59,4 86,4 70,8 74,1 3,5 92,2 59,8 5,7 15,6Mw 61,0 66,4 78,5 75,0 70,5 2,96 102,6 74,9 5,2 18,8sd 4,1 4,7 9,7 6,0 2,8 0,4 27,2 17,4 1,5 3,1VK (%) 6,7 7,0 12,3 8,0 4,0 13,4 26,5 23,2 28,4 16,5 Dotierung 3 100 100 5 100 Wiederfindung (%) 98,7 102,6 74,9 104,8 74,9

Tab. 15 c Dotierlevel 2 % B/Bo-Wert Konzentration (ppb)

Lauf Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea 1 47,5 56,2 56,5 57,0 49,5 4,1 228,9 175,0 9,2 33,22 50,2 56,5 48,2 57,8 45,0 5,0 204,3 213,1 9,2 37,73 51,0 48,3 60,8 57,3 56,2 4,4 182,9 165,1 10,0 35,14 47,5 56,2 56,5 57,0 49,5 4,8 145,5 144,9 9,7 38,45 41,2 61,1 43,9 56,5 39,5 4,6 289,0 135,0 11,6 31,8Mw 47,5 55,7 53,2 57,1 48,0 4,58 210,1 166,6 9,94 35,2sd 3,9 4,6 6,9 0,5 6,2 0,3 53,7 30,4 1,0 2,8VK (%) 8,1 8,3 13,0 0,9 12,9 7,6 25,5 18,3 9,9 8,0 Dotierung 6 200 200 10 40 Wiederfindung (%) 76,3 105,1 83,3 99,4 88,1

R-Biopharm AG 12/2005 42

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Abschlußbericht: 13053/21

4.4 Untersuchung von Proben

Aus Getreide- und Futtermittelproben, die bei R-Biopharm und den Kooperationspartnern aus

vorangegangenen Studien zur Verfügung standen, wurden zunächst 22 Nullproben zur Überprüfung

der Testspezifität und 26 natürlich kontaminierte Kontrollproben zur Überprüfung der Spezifität des

Mykotoxin-Antikörper-Array ausgewählt. Bei den kontaminierten Proben handelte es sich entweder

um zertifizierte Kontrollproben für bestimmte Mykotoxine oder um Proben aus früheren Studien

mit bekannter Mykotoxin-Kontamination. Ein großer Teil der Proben wurde von Trilogylab (USA)

als Kontrollproben für Mykotoxinuntersuchungen bezogen. Von den Kontrollproben war der Gehalt

eines Mykotoxins vorbestimmt und bekannt. Die meisten der Nullproben wurden von Lebensmit-

telgeschäften oder vom Futtermittelgroßhandel bezogen. Eine als DON-frei charakterisierte Serie

von Weizenproben wurde von Prof. Usleber (Universität Gießen) zur Verfügung gestellt. In der

Schlussphase wurde der Mykotoxin-Antikörper-Array zur Analyse von Routineproben eingesetzt.

4.4.1 Untersuchung zur Testspezifität mit Nullproben

Zur Überprüfung der Testspezifität wurden in dieser Projektphase insgesamt 22 unbelastete Getrei-

deproben, sogenannte Nullproben, untersucht, bei denen keine Mykotoxin-Kontamination bekannt

war.

Von 110 Messergebnissen mit 1/10 verdünnten Proben waren 104 kleiner als der jeweilige cut off-

Wert, 67 davon lagen unterhalb der jeweiligen Nachweisgrenze des Arrays. 6 Proben wurden ober-

halb des cut off-Wertes gefunden. In einer Maisprobe (620-1) wurde eine Fumonisin-Belastung mit

einem Gehalt von über 0,5 ppm gefunden. Nach weiterer 1:5 Verdünnung wurde die Probe mit 0,8

ppm gemessen. Die Fumonisin-Belastung dieser Probe konnte mit der HPLC bestätigt werden.

Unter Berücksichtigung der richtig bestimmten Fumonisin-Belastung ergab sich mit den1:10 ver-

dünnten Proben eine Testspezifität von 95,4 % .

R-Biopharm AG 12/2005 43

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Tab. 16 Array-Resultate von Nullproben die Proben wurden wie beschrieben aufgearbeitet und in den Verdünnungen 1/10 und 1/50 im Array getestet. Messergebnisse über dem jeweiligen cut off-Wert sind durch gelbe Schattierung des Feldes hervorgehoben.

Mykotoxin (Dimension)

Aflatoxin (ppb)

DON (ppm)

Fumonisin(ppm)

T-2 Toxin (ppb)

Zearalenon(ppb)

Probenverdünung Nr Art 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

766 Hafer < NWG < NWG 0,07 < NWG < NWG < NWG 3 < NWG 14 < NWG767 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 9 < NWG 17 < NWG768 Buchweizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 4 < NWG 27 < NWG770 Dinkel < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 3 < NWG 14 < NWG

620-1 Mais < NWG < NWG < NWG < NWG > 0,5 0,8 < NWG < NWG < NWG < NWG776-1 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG776-2 Weizen < NWG < NWG 0,08 < NWG < NWG < NWG 3 < NWG < NWG < NWG776-3 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 3 < NWG 15 < NWG776-4 Weizen < NWG < NWG 0,07 < NWG < NWG < NWG 2 < NWG < NWG < NWG776-5 Weizen < NWG < NWG 0,06 < NWG < NWG < NWG 4 < NWG 12 < NWG776-6 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 3 < NWG 17 < NWG776-7 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 4 < NWG 13 < NWG776-8 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG776-9 Weizen < NWG < NWG 0,06 < NWG < NWG < NWG 3 < NWG < NWG < NWG776-10 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG776-11 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 2 < NWG 20 < NWG776-12 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 3 < NWG 11 < NWG776-13 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 4 < NWG 13 < NWG814-5 Weizen < NWG < NWG 0,06 < NWG < NWG < NWG 3 < NWG 35 < NWG884-3 Gerste < NWG < NWG 0,06 < NWG < NWG < NWG 7 < NWG 44 < NWG

H3 Futtermittel < NWG < NWG 0,28 < NWG < NWG < NWG 6 < NWG > 100 < NWGH4 Futtermittel < NWG < NWG 0,27 < NWG < NWG < NWG 8 < NWG > 100 < NWG

Nachweisgrenze (NWG) 1 5 0,06 0,28 0,06 0,28 2,2 11 11 55 cut off 3 15 0,2 1,0 0,2 1,0 10 50 40 200

Anzahl < NWG 22 22 13 22 21 21 4 22 7 22 Anzahl < cut off 0 0 7 0 0 1 18 0 12 0 Anzahl > cut off 0 0 2 0 1 0 0 0 3 0

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Eine Gerstenprobe (884-3) kam im Zearalenon Test bei 44 ppb, in zwei Mischfutterproben (H3 und

H4) wurde DON mit 0,28 und 0,27 ppm und Zearalenon mit Werten über 100 ppb gemessen. Bei

den DON und Zearalenon Ergebnissen kann von falsch positiven Resultaten ausgegangen werden,

da diese Parameter in Vergleichstests unterhalb der Nachweisgrenzen lagen. In der Verdünnung von

1/50 lagen alle im Array untersuchten Proben (außer Probe 620-1, wo eine Fumonisin-Belastung

richtig erkannt wurde) unterhalb der Nachweisgrenzen. Der Test erreichte damit eine Spezifität von

100 %.

Tab. 17 Übersicht über die qualitativen Resultate der Nullproben Beurteilung der Testspezifität durch Einstufung der Proben nach NEG (< cut off) und POS (> cut off), zusätzliche Bewertung als falsch POS (fPOS) und falsch NEG (fNEG) anhand von Resultaten der Referenzmethode

Afla DON Fumo T-2 Toxin Zea

Probenverdünnung 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

Cut off 3 ppb 15 ppb 0,2 ppm 1,0 ppm 0,2 ppm 1,0 ppm 10 ppb 50 ppb 40 ppb 200 ppb

POS 0 0 2 0 1 0 0 0 3 0

NEG 22 22 20 22 21 22 22 22 19 22

fPOS/POS 0 0 2/2 0 0 0 0 0 3/3 0

fNEG/NEG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Spezifität 100 100 90,9 100 100 100 100 100 86,4 100

Gesamtspezifität bei 1/10 Verdünnung: 104 NEG von 109 negativen Probenwerten = 95,4 %

Gesamtspezifität bei 1/50 Verdünnung: 110 NEG von 110 negativen Probenwerten = 100 %

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4.4.2 Untersuchung zur Testsensitivität mit kontaminierten Kontrollproben

Zur Ermittlung der Testsensitivität wurden in dieser Projektphase neben den Nullproben 25 Proben

untersucht, die bei R-Biopharm als Kontrollproben für die Mykotoxin Tests dienten und deshalb

jeweils eine bekannte Mykotoxin.Konzentration aufwiesen. Im einzelnen waren dies 10 mit Aflato-

xin belastete Maisproben, 10 mit DON belastete Mais (2) und Weizen (8) Proben, 2 mit Fumonisin

belastete Maisproben, 2 mit T-2 Toxin belastete Proben und eine mit Zearalenon belastete Probe

Alle 25 bekanntermaßen mit Mykotoxinen kontaminierten Proben (vgl. fettgedruckte Konzentratio-

nen in Tab. 18 und 19 wurden in der 1:10 Verdünnung mit dem Array über dem jeweiligen cut off-

Wert gefunden (25/25). Dies bedeutet eine Sensitivität von 100 % bezogen auf die bekannten My-

kotoxin-Belastungen.

Neben den ursprünglich bekannten Mykotoxin-Belastungen wurden mit dem Array in 22 Proben

eine bis vier weitere Mykotoxin-Belastungen entdeckt. Von diesen insgesamt 35 zusätzlichen Kon-

taminationen konnte der größte Teil (26) mit Vergleichsmessungen bestätigt werden. Bei 6 Zearale-

non-Ergebnissen mit Probenverdünnung 1/10 wurde mit dem Array eine Konzentration knapp über

dem cut off von 40 ppb gemessen, der im Vergleichstest nicht zu bestätigen war und deswegen als

falsch positiv (fPOS) eingestuft wurde. Alle höher kontaminierten Zearalenon-haltigen Proben wur-

den mit dem Array sicher detektiert. Ebenfalls wurden drei Fumonisin-haltige Proben mit dem Ar-

ray in der 1/50 Probenverdünnung überbewertet und deshalb mit Werten über dem cut off (> 1

ppm) als falsch positiv eingestuft. Insgesamt 24 Bestimmungen mit 1/10 verdünnten Proben lagen

unterhalb der Nachweisgrenze des jeweiligen Parameters. Weitere 41 Testergebnisse lagen unter-

halb der jeweiligen cut off-Werte.

In einer detaillierten Vergleichsanalyse (s. Tab 20 a – e) wurden die mit dem Mykotoxin-

Antikörper-Array 10/10 gemessenen Werte den Vergleichsdaten gegenübergestellt. Dazu wurden

die Proben anhand der cut off-Werte als POS (> cut off) und NEG (< cut off) eingeteilt.

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 18: Array-Resultate von Kontrollproben

Getreideproben mit bekannten Mykotoxin-Gehalten wurden mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 in Probenverdünnung 1/10 und 1/50 getestet Messergebnisse über dem jeweiligen cut off-Wert sind durch gelbe Schattierung des Feldes her-vorgehoben. Die Testergebnisse von zuvor bekannten Mykotoxin-Belastungen sind durch Fettdruck gekennzeichnet.

Mykotoxin (Dimension)

Aflatoxin (ppb)

DON (ppm)

Fumonisin(ppm)

T-2 Toxin (ppb)

Zearalenon(ppb)

Probenverdünung Nr Art 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

7 Mais < NWG < NWG 0,09 < NWG > 0,5 > 2,5 4 < NWG 24 < NWG93 Maisgries < NWG < NWG < NWG < NWG > 0,5 0,83 5 < NWG < NWG < NWG747 Mais 4,2 < NWG 0,68 1,10 0,20 < NWG 14 < NWG 58 < NWG927 Mais 4,9 6,1 0,08 < NWG > 0,5 1,09 6 < NWG 34 < NWG

2378 Mais < NWG < NWG > 0,5 0,82 0,17 < NWG > 20 111 * > 100 427 2224 Mais < NWG < NWG > 0,5 1,69 0,15 < NWG > 20 231 * 76 63 378 Mais < NWG < NWG > 0,5 0,8 < NWG < NWG 9 < NWG 100 105

494B Mais < NWG < NWG 0,19 < NWG 0,06 < NWG 5 < NWG 109* 108 659-2 Mais > 9 24,4 < NWG < NWG 0,64 *) 0,64 6 < NWG 33 < NWG762-2 Weizen < NWG < NWG 0,9*) 1,2 < NWG < NWG 4 < NWG 15 < NWG764-5 Mais < NWG < NWG 0,62*) 0,48 0,36 0,40 7 < NWG 119*) 98 814-1 Weizen < NWG < NWG > 0,5 > 2,5 < NWG < NWG 5 < NWG > 100 716*)814-2 Weizen 1,1 < NWG > 0,5 4,7* < NWG < NWG 4 < NWG 165*) 558 814-3 Weizen 2,2 < NWG > 0,5 6,7* < NWG < NWG 19 34 268*) 1466*)814-4 Weizen 1,6 < NWG > 0,5 3* < NWG < NWG 8 12 154*) 315 814-6 Weizen < NWG < NWG 0,62*) 0,69 < NWG < NWG 6 < NWG 60 73 816-1 Weizen < NWG < NWG 1,31*) 1,84 0,06 < NWG 7 < NWG 98 147 816-2 Weizen < NWG < NWG 0,71*) 0,94 < NWG < NWG 6 < NWG 53 69 913-2 Mais 5,5 6,6 0,11 < NWG > 0,5 1,84 7 < NWG 55 < NWG913-3 Mais > 9 13,8 < NWG < NWG > 0,5 > 2,5 7 < NWG 41 < NWG913-4 Mais > 9 19,5*) 0,09 < NWG > 0,5 0,95 8 < NWG 42 < NWG913-5 Mais > 9 25,9*) 0,11 < NWG > 0,5 1,17 8 < NWG 39 < NWG913-6 Mais > 9 28,3* 0,06 < NWG > 0,5 1,16 8 < NWG 34 < NWG913-7 Mais > 9 > 45 0,09 < NWG > 0,5 > 2,5 7 < NWG 44 < NWG913-8 Mais > 9 > 45 0,15 < NWG > 0,5 > 2,5 15 13 55 < NWG

Nachweisgrenze (NWG) 1 5 0,06 0,28 0,06 0,28 2,2 11 11 55 cut off 3 15 0,2 1,0 0,2 1,0 10 50 40 200

Anzahl (< NWG) 12 16 3 12 8 13 0 20 1 13 Anzahl (NWG – cut off) 3 3 9 5 4 4 20 3 6 7 Anzahl (> cut off) 10 6 13 8 13 8 5 2 18 5

*) extrapolierte Konzentrationsangaben (Messwerte lagen außerhalb der Standardkurve)

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Tab. 19 Vergleichsdaten von Kontrollproben ermittelt mit HPLC Methoden Alle Messergebnisse über dem jeweiligen cut off-Wert des Mykotoxin-Arrays für die Probenverdünnung 1/10 sind durch gelbe Schattierung des Feldes hervorgehoben. Die Testergebnisse von zuvor bekannten Mykotoxinbelastungen sind durch Fettdruck kenntlich gemacht. Die Felder von nicht analysierten Proben sind grün unterlegt.

Proben-Nr. Probenart Aflatoxin(ppb)

DON (ppm)

Fumonisin(ppm)

T-2 Toxin (ppb)

Zearalenon(ppb)

7 Mais < NWG < NWG 13 < NWG < LOD 93 Maisgries < NWG < NWG 0,32 < NWG < LOD

747 Mais 3,7 1,2 0,26 < NWG < LOD 927 Mais 12,3 < NWG 1,3 < NWG < LOD 2378 Mais < NWG 1,3 0,12 150 n.a. 2224 Mais < NWG 2,0 0,12 362 n.a. 378 Mais < NWG 0,43 < NWG < NWG 113

494B Mais < NWG 0,13 < NWG < NWG 100 659-2 Mais 42 < NWG 1,86 < NWG < LOD 762-2 Weizen < NWG 1,2 < NWG < NWG < LOD 764-5 Mais < NWG 0,41 0,35 < NWG 87 814-1 Weizen < NWG 11,1 < NWG < NWG 756 814-2 Weizen < NWG 8,1 < NWG < NWG 498 814-3 Weizen < NWG 5 < NWG < NWG > 1200 814-4 Weizen < NWG 3,3 < NWG < NWG 231 814-6 Weizen < NWG 0,4 < NWG < NWG 54 816-1 Weizen < NWG 1,6 < NWG < NWG 111 816-2 Weizen < NWG 0,7 < NWG < NWG 46 913-2 Mais 4,3 < NWG 1,74 < NWG < LOD 913-3 Mais 12,6 < NWG 5,53 < NWG < LOD 913-4 Mais 19,9 < NWG 0,88 < NWG < LOD 913-5 Mais 30,2 < NWG 0,92 < NWG < LOD 913-6 Mais 39,9 < NWG 1,13 < NWG < LOD 913-7 Mais 67,2 < NWG 2,44 < NWG < LOD 913-8 Mais 91,7 < NWG 2,9 < NWG < LOD

Nachweisgrenze der HPLC (NWG) 0,1 ppb 0,1 ppm 0,1 ppm 100 ppb 10 ppb Cut off des Array 3 ppb 0,2 ppm 0,2 ppm 10 ppb 40 ppb Resultate (< NWG) 15 11 10 23 13 Resultate (NWG – cut off) 0 1 2 0 0 Resultate (< cut off) 10 13 13 2 10 nicht analysierte Proben (n.a.) 0 0 0 0 2 bekannte Belastung 10 10 2 2 1

zusätzlich gefundene Belastung 0 3 11 0 9

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Tab. 20 a Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Kontrollpro-

ben. Aflatoxin-Ergebnisse Aufgeführt sind die im Array mit den Proben-verdünnungen 1/10 und 1/50 ermittelten Mykotoxingehalte der Proben; eine Einstufung der Array-Ergebnisse als POS und NEG wurde anhand eines cut off Wertes vorgenommen. Als falsch positiv (fPOS) bzw. falsch negativ (fNEG) wurden Array Ergebnisse eingestuft, die nicht mit der Bewertung der Vergleichsmethode übereinstimmten

Aflatoxin (ppb)

Array Probenverdünnung1/10

Array Probenverdünnung1/50 Proben-Nr. Probenart Vergleichs-

test Messwert Beurteilung Messwert Beurteilung

7 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 93 Maisgries < NWG < NWG NEG < NWG NEG

747 Mais 3,7 4,2 POS < NWG NEG 927 Mais 12,3 4,9 POS 6,1 NEG 2378 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 2224 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 378 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG

494B Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 659-2 Mais 42 > 9 POS 24,4 POS 762-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 764-5 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 814-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 814-2 Weizen < NWG 1,1 NEG < NWG NEG 814-3 Weizen < NWG 2,2 NEG < NWG NEG 814-4 Weizen < NWG 1,6 NEG < NWG NEG 814-6 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 816-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 816-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 913-2 Mais 4,3 5,5 POS 6,6 NEG 913-3 Mais 12,6 > 9 POS 13,8 NEG 913-4 Mais 19,9 > 9 POS 19,5 *) POS 913-5 Mais 30,2 > 9 POS 25,9 *) POS 913-6 Mais 39,9 > 9 POS 28,3 *) POS 913-7 Mais 67,2 > 9 POS > 45 POS 913-8 Mais 91,7 > 9 POS > 45 POS

Nachweisgrenze (NWG) 0,1 ppb 1 ppb 5 ppb cut off #) 3 ppb 15 ppb

Anzahl (POS) 10 6 Anzahl (NEG) 15 19

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG)

#) cut off: Schwellenwert zur Beurteilung der Proben als POS (≥ cut off) und NEG (< cut off) *) extrapolierte Konzentrationsangaben (Messwerte lagen außerhalb der Standardkurve)

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 20 b Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Kontrollpro-

ben. DON-Ergebnisse Aufgeführt sind die im Array mit den Probenver-dünnungen 1/10 und 1/50 ermittelten Mykotoxingehalte der Proben; eine Einstufung der Array-Ergebnisse als POS und NEG wurde anhand eines cut off Wertes vorgenommen. Als falsch positiv (fPOS) bzw. falsch negativ (fNEG) wurden Array Ergebnisse eingestuft, die nicht mit der Bewertung der Vergleichsmethode übereinstimmten

DON (ppm)

Array Probenverdünnung1/10

Array Probenverdünnung1/50 Proben-Nr. Probenart Vergleichs-

test Messwert Beurteilung Messwert Beurteilung

7 Mais < NWG 0,09 NEG < NWG NEG 93 Maisgries < NWG < NWG NEG < NWG NEG

747 Mais 1,2 0,68 POS 1,1 POS927 Mais < NWG 0,08 NEG < NWG NEG2378 Mais 1,3 > 0,5 POS 0,82 fNEG2224 Mais 2 > 0,5 POS 1,69 POS378 Mais 0,43 > 0,5 POS 0,8 NEG

494B Mais 0,13 0,19 NEG < NWG NEG659-2 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG762-2 Weizen 1,2 0,9 *) POS 1,2 POS764-5 Mais 0,41 0,62 *) POS 0,48 NEG814-1 Weizen 11,1 > 0,5 POS > 2,5 POS814-2 Weizen 8,1 > 0,5 POS 4,7 *) POS814-3 Weizen 5 > 0,5 POS 6,7 *) POS814-4 Weizen 3,3 > 0,5 POS 3,0 *) POS814-6 Weizen 0,4 0,62 *) POS 0,69 NEG816-1 Weizen 1,6 1,31 *) POS 1,84 POS816-2 Weizen 0,7 0,71 *) POS 0,94 NEG913-2 Mais < NWG 0,11 NEG < NWG NEG913-3 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG913-4 Mais < NWG 0,09 NEG < NWG NEG913-5 Mais < NWG 0,11 NEG < NWG NEG913-6 Mais < NWG 0,06 NEG < NWG NEG913-7 Mais < NWG 0,09 NEG < NWG NEG913-8 Mais < NWG 0,15 NEG < NWG NEG

Nachweisgrenze (NWG) 0,1 ppm 0,06 ppm 0,3 ppb cut off #) 0,2 ppm 1 ppm

Anzahl (POS) 13 8 Anzahl (NEG) 12 17

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG) 1/17

#) cut off: Schwellenwert zur Beurteilung der Proben als POS (≥ cut off) und NEG (< cut off) *) extrapolierte Konzentrationsangaben (Messwerte lagen außerhalb der Standardkurve)

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 20 c Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Kontrollpro-

ben. Fumonisin-Ergebnisse Aufgeführt sind die im Array mit den Proben-verdünnungen 1/10 und 1/50 ermittelten Mykotoxingehalte der Proben; eine Einstufung der Array-Ergebnisse als POS und NEG wurde anhand eines cut off Wertes vorgenommen. Als falsch positiv (fPOS) bzw. falsch negativ (fNEG) wurden Array Ergebnisse eingestuft, die nicht mit der Bewertung der Vergleichsmethode übereinstimmten. Die Array Daten wurden mit Fak-tor 0,64 zur Standardangleichung korrigiert (s.Anhang)

Fumonisin (ppm)

Array Probenverdünnung1/10

Array Probenverdünnung1/50 Proben-Nr. Probenart Vergleichs-

test Messwert Beurteilung Messwert Beurteilung

7 Mais 13 > 0,5 POS > 2,5 POS 93 Maisgries 0,32 > 0,5 POS 0,83 NEG

747 Mais 0,26 0,20 POS < NWG NEG 927 Mais 1,3 > 0,5 POS 1,09 POS 2378 Mais 0,12 0,17 NEG < NWG NEG 2224 Mais 0,12 0,15 NEG < NWG NEG 378 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG

494B Mais < NWG 0,06 NEG < NWG NEG 659-2 Mais 1,86 > 0,5 POS 0,64 fNEG 762-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 764-5 Mais 0,35 0,36 POS 0,40 NEG 814-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 814-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 814-3 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 814-4 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 814-6 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 816-1 Weizen < NWG 0,06 NEG < NWG NEG 816-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 913-2 Mais 1,74 > 0,5 POS 1,84 POS 913-3 Mais 5,53 > 0,5 POS > 2,5 POS 913-4 Mais 0,88 > 0,5 POS 0,95 NEG 913-5 Mais 0,92 > 0,5 POS 1,17 fPOS 913-6 Mais 1,13 > 0,5 POS 1,16 POS 913-7 Mais 2,44 > 0,5 POS > 2,5 POS 913-8 Mais 2,9 > 0,5 POS > 2,5 POS

Nachweisgrenze (NWG) 0,1 ppm 0,06 ppm 0,3 ppb cut off #) 0,2 ppm 1 ppm

Anzahl (POS) 13 8 Anzahl (NEG) 12 17

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) 1/8 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG) 1/16

#) cut off: Schwellenwert zur Beurteilung der Proben als POS (≥ cut off) und NEG (< cut off)

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 20 d Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Kontrollpro-

ben. T-2 Toxin-Ergebnisse Aufgeführt sind die im Array mit den Probenverdünnungen 1/10 und 1/50 ermittelten Mykotoxingehalte der Proben; eine Einstufung der Array-Ergebnisse als POS und NEG wurde anhand eines cut off Wertes vorgenommen. Als falsch positiv (fPOS) bzw. falsch negativ (fNEG) wurden Array Ergebnisse eingestuft, die nicht mit der Bewertung der Vergleichsmethode übereinstimmten.Toxin Ergebnisse von Kontrollproben

T-2 Toxin (ppb)

Array Probenverdünnung1/10

Array Probenverdünnung1/50 Proben-Nr. Probenart Vergleichs

-test Messwert Beurteilung Messwert Beurteilung

7 Mais < NWG 4 NEG < NWG NEG93 Maisgries < NWG 5 NEG < NWG NEG

747 Mais < NWG 14 POS < NWG NEG927 Mais < NWG 6 NEG < NWG NEG2378 Mais 150 > 20 POS 111 *) POS2224 Mais 362 > 20 POS 231 *) POS378 Mais < NWG 9 NEG < NWG NEG

494B Mais < NWG 5 NEG < NWG NEG659-2 Mais < NWG 6 NEG < NWG NEG762-2 Weizen < NWG 4 NEG < NWG NEG764-5 Mais < NWG 7 NEG < NWG NEG814-1 Weizen < NWG 5 NEG < NWG NEG814-2 Weizen < NWG 4 NEG < NWG NEG814-3 Weizen < NWG 19 POS 34 NEG814-4 Weizen < NWG 8 NEG 12 NEG814-6 Weizen < NWG 6 NEG < NWG NEG816-1 Weizen < NWG 7 NEG < NWG NEG816-2 Weizen < NWG 6 NEG < NWG NEG913-2 Mais < NWG 7 NEG < NWG NEG913-3 Mais < NWG 7 NEG < NWG NEG913-4 Mais < NWG 8 NEG < NWG NEG913-5 Mais < NWG 8 NEG < NWG NEG913-6 Mais < NWG 8 NEG < NWG NEG913-7 Mais < NWG 7 NEG < NWG NEG913-8 Mais < NWG 15 POS 13 NEG

Nachweisgrenze (NWG) 100 ppb 2,2 ppb 11 ppb cut off #) 10 ppb 50 ppb

Anzahl (POS) 5 2Anzahl (NEG) 20 23

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG)

#) cut off: Schwellenwert zur Beurteilung der Proben als POS (≥ cut off) und NEG (< cut off) *) extrapolierte Konzentrationsangaben (Messwerte lagen außerhalb der Standardkurve)

R-Biopharm AG 12/2005 52

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 20 e Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Kontrollpro-

ben. Zearalenon-Ergebnisse Aufgeführt sind die im Array mit den Pro-benverdünnungen 1/10 und 1/50 ermittelten Mykotoxingehalte der Proben; eine Einstufung der Array-Ergebnisse als POS und NEG wurde anhand ei-nes cut off Wertes vorgenommen. Als falsch positiv (fPOS) bzw. falsch ne-gativ (fNEG) wurden Array Ergebnisse eingestuft, die nicht mit der Bewer-tung der Vergleichsmethode übereinstimmten.Toxin Ergebnisse von Kontrollproben

Zearalenon (ppb)

Array Probenverdünnung1/10

Array Probenverdünnung1/50 Proben-Nr. Probenart Vergleichs-

test Messwert Beurteilung Messwert Beurteilung

7 Mais < NWG 24 NEG < NWG NEG93 Maisgries < NWG < NWG NEG < NWG NEG

747 Mais < NWG 58 fPOS < NWG NEG927 Mais < NWG 34 NEG < NWG NEG2378 Mais n.a. > 100 POS 427 POS2224 Mais n.a. 76 POS 63 NEG378 Mais 113. 100 POS 105 NEG

494B Mais 100 109*) POS 108 NEG659-2 Mais < NWG 33 NEG < NWG NEG762-2 Weizen < NWG 15 NEG < NWG NEG764-5 Mais 87 119*) POS 98 NEG814-1 Weizen 756 > 100 POS 716*) POS814-2 Weizen 498 >100 POS 558 POS814-3 Weizen > 1200 >100 POS > 500 POS814-4 Weizen 231 154*) POS 315 POS814-6 Weizen 54 60 POS 73 NEG816-1 Weizen 111 98 POS 147 NEG816-2 Weizen 46 53 POS 69 NEG913-2 Mais < NWG 55 fPOS < NWG NEG913-3 Mais < NWG 41 fPOS < NWG NEG913-4 Mais < NWG 42 fPOS < NWG NEG913-5 Mais < NWG 39 NEG < NWG NEG913-6 Mais < NWG 34 NEG < NWG NEG913-7 Mais < NWG 44 fPOS < NWG NEG913-8 Mais < NWG 55 fPOS < NWG NEG

Nachweisgrenze (NWG) 20 ppb 11 ppb 55 ppb cut off #) 40 ppb 200 ppb

Anzahl (POS) 18 5Anzahl (NEG) 7 20

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) 6/18 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG)

#) cut off: Schwellenwert zur Beurteilung der Proben als POS (≥ cut off) und NEG (< cut off) *) extrapolierte Konzentrationsangaben (Messwerte lagen außerhalb der Standardkurve)

R-Biopharm AG 12/2005 53

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Abschlußbericht: 13053/21

Alle 10 Aflatoxin-belasteten Proben wurden in Probenverdünnung 1/10 mit dem Array richtig als

POS erkannt. Neben den bekannten Aflatoxin-belasteten Proben wurden keine weiteren Aflatoxin

belasteten Proben gefunden. Bei Probenverdünnung 1/50 reduzierten sich die POS Befunde (> 15

ppb) auf 6 Proben.

Ebenfalls alle 10 zuvor bekanntermaßen mit DON belastete Proben wurden mit dem Array in der

1:10 Probenverdünnung richtig erkannt. Zusätzlich wurden drei weitere der untersuchten Proben

(747, 2378, 2224) mit dem Array als mit DON belastet erkannt, die durch Vergleichstests bestätigt

werden konnten. Bei der Analyse der 1:50 verdünnten Proben reduzierten sich die positiven Befun-

de auf 8. Eine Probe wurde mit 0,82 ppm abweichend zum Referenztest unterhalb des cut off-Werts

gefunden (fNEG).

Bei der Fumonisin Testung standen ursprünglich nur zwei bekanntermaßen belastete Proben zur

Verfügung, die beide in der 1:10 Verdünnung mit dem Array richtig als POS detektiert wurden. Mit

den Mykotoxin-Antikörper-Array Tests wurden noch 11 weitere Proben übereinstimmend als Fu-

monisin-belastet detektiert.. Bei der Analyse der 1:50 verdünnten Proben reduzierte sich die Zahl

der positiven Befunde (> 1,0 ppm) auf 8, wobei Probe 913-5 mit 1,17 ppm fPOS eingestuft wurde;

Probe 659-2 wurde im Unterschied zum Vergleichstest mit 0,64 ppm als fNEG eingestuft.

Für die T-2 Toxin Analyse standen nur zwei definierte Kontrollproben mit Kontaminationen von

150 und 362 ppb aus einer früheren AOAC Studie zur Verfügung, die beide richtig mit dem Myko-

toxin-Antikörper-Array als POS erkannt wurden. Drei weitere Proben wurden mit den 1:10 ver-

dünnten Proben mit dem Array als schwach belastet (14, 15 und 19 ppb) gemessen. Diese Konzent-

rationen lagen unterhalb der Nachweisgrenze der HPLC und waren folglich nicht zu bestätigen.

Für den Zearalenon Vergleichstest stand zunächst lediglich eine definierte Kontrollprobe zur Ver-

fügung, die mit dem Array auch korrekt gemessen wurde. Bei den Untersuchungen mit dem Myko-

toxin-Antikörper-Array wurden jedoch 17 weitere Zearalenon-belastete Proben gefunden, 8 davon

lagen nur wenig über dem cut off-Wert von 40 ppb. Bei 6 dieser Proben konnte der Array Befund

nicht mit dem Vergleichstest bestätigt werden. Diese Proben wurden deshalb als falsch positiv

(fPOS) bewertet. Bei zwei der Proben (2378 und 2224), die aus einer T-2 Toxin Studie stammten,

stand für eine HPLC-Vergleichsmessungen nicht mehr genügend Material zur Verfügung. Die ver-

R-Biopharm AG 12/2005 54

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Abschlußbericht: 13053/21

gleichsweise hohen Kontaminationen von 427 und ca. 70 ppb wurden für die Auswertung als richtig

detektiert angenommen. Fünf der Proben wiesen in der 1/50 Probenverdünnung im Array Zearale-

non-Gehalte deutlich über dem cut off Wert von 200 ppb auf.

Tab. 21 Übersicht über die qualitativen Resultate der Kontrollproben Einstufung der Proben nach NEG (< cut off) und POS (> cut off), zusätzliche Bewertung als falsch POS (fPOS) und falsch NEG (fNEG) anhand von Resultaten der Referenzmethoden

Aflatoxin DON Fumonisin T-2 Toxin Zearalenon

Probenverdünnung 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

Cut off 3 ppb 15 ppb 0,2 ppm 1,0 ppm 0,2 ppm 1,0 ppm 10 ppb 50 ppb 40 ppb 200 ppb

POS 10 6 13 8 13 8 5 2 18 5

NEG 15 19 12 17 12 17 20 23 7 20

fPOS/POS 0 0 0 0 0 1/8 0 0 6/18 0

fNEG/NEG 0 0 0 1/17 0 1/17 0 0 0 0

Spezifität (%) 100 100 100 100 100 94,1 100 100 53,8 100

Sensitivität (%) 100 100 100 88,9 100 87,5 100 100 100 100 Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

Insgesamt ergab sich damit eine Sensitivität von 100 % mit dem Mykotoxin Antikörper Array für

die 1/10 verdünnten Proben. Alle Mykotoxin Kontrollproben wurden richtig als POS eingestuft und

auch die zusätzlich gefundenen Kontaminationen konnten alle mit Vergleichstests bestätigt werden.

Daneben wurden bei der Zearalenon-Detektion 6 falsch positve Befunde registriert, die eine redu-

zierte Spezifität des Tests zur Folge hatten.

Bei den 1/50 verdünnten Proben wurde im Fumonisin Array Test jeweils eine Probe als falsch posi-

tive und als falsch negativ zugeordnet, sowie eine DON-Bestimmung mit 0,82 ppm falsch negativ

bewertet. Damit ergaben sich hier eine Testsensitivität von 93,3% (28 von 30 Proben wurden richtig

als POS erkannt).

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4.4.3 Untersuchung von Proben in der Routine

Mit der zuletzt hergestellt Array Charge 04494 wurden 8 Probenserien mit insgesamt 41 Proben

untersucht, die im Rahmen von Kundenanfragen im Applikationslabor von R-Biopharm angeliefert

wurden. Die Proben wurden nach der Anlieferung vermahlen und bis zur Probenaufarbeitung bei

Raumtemperatur trocken gelagert. Zur Untersuchung im Mykotoxin-Antikörper-Array Test wurden

sie gemäß Aufarbeitungsprotokoll im Verhältnis 1:5 mit 70% Methanol extrahiert und zentrifugiert.

Danach wurde eine 1 + 1 Verdünnung der Überstände mit Reinstwasser hergestellt und diese 1/10

verdünnte Probe zusätzlich 1:5 mit 35 % Methanol/Wasser weiterverdünnt. Die Proben wurden in

beiden Verdünnungsstufen (1:10 und 1:50) in einem Mykotoxin-Antikörper-Array Tests gegen

Standard 1 analysiert. Die Auswertung wurde anhand von mittleren Mykotoxin–Standardkurven

vorgenommen, die in mehreren Tests mit Kits dieser Charge (n=32) ermittelt wurden. Auf diese

Weise konnten bis zu 7 Proben pro Testlauf analysiert werden.

Zur vergleichenden Untersuchung mit der HPLC wurden größere Aliquots der Proben (25 oder 50

g) extrahiert und mittels Immunaffinitätschromatographie mit einer entsprechenden Antikörper-

Säule aufgereinigt. Die Eluate wurden gesammelt und bis zur HPLC-Analyse bei –20 °C aufbe-

wahrt.

In einigen Fällen wurden Proben zusätzlich mit einem Standard ELISA Test untersucht.

In den zwei folgenden Tabellen sind die Array Ergebnisse (s. Tab. 22) und die Vergleichsdaten (s.

Tab. 23) aufgeführt. Werte oberhalb der für die 1:10 Verdünnung gewählten cut off-Werte sind gelb

unterlegt.

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 22 Array-Resultate von Routineproben

Messergebnisse über dem jeweiligen cut off-Wert des Mykotoxin-Arrays für die Pro-benverdünnung 1/10 beziehungsweise 1/50 sind durch gelbe Schattierung des Feldes hervorgehoben.

Mykotoxin (Dimension)

Aflatoxin (ppb)

DON (ppm)

Fumonisin(ppm)

T-2 Toxin (ppb)

Zearalenon(ppb)

Probenverdünung Nr Art 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

1045-1 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG1045-2 Gerste < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG1045-5 Mais > 9 9,3 0,10 < NWG > 0,5 0,36 4 17 50 55 1059-1 Mais < NWG < NWG 0,21 < NWG > 0,5 > 2,5 8 < NWG < NWG < NWG1059-2 Mais < NWG < NWG > 0,5 0,70 > 0,5 > 2,5 9 12 72 148 1059-3 Mais > 9 > 45 0,33 < NWG > 0,5 > 2,5 5 < NWG 30 58 1059-4 Mais < NWG < NWG 0,15 < NWG > 0,5 1,80 < NWG < NWG < NWG < NWG1059-5 Mais < NWG < NWG 0,37 0,91 > 0,5 > 2,5 8 < NWG 74 170 1059-6 Mais < NWG < NWG > 0,5 0,89 > 0,5 0,58 11 < NWG 94 187 1059-7 Mais 1,1 5,6 > 0,5 0,64 > 0,5 1,50 9 < NWG 46 112 1062-1 Mais 1,2 < NWG 0,19 < NWG > 0,5 0,98 < NWG < NWG < NWG < NWG1062-2 Mais < NWG < NWG 0,40 < NWG > 0,5 > 2,5 < NWG < NWG 18 86 1062-3 Mais 1,4 < NWG 0,50 0,44 > 0,5 > 2,5 5 < NWG 52 < NWG1062-4 Mais < NWG < NWG > 0,5 1,78 > 0,5 > 2,5 5 < NWG 25 < NWG1062-5 Mais < NWG < NWG 0,18 < NWG > 0,5 > 2,5 2 < NWG < NWG < NWG1089-1 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 10 34 < NWG < NWG1089-2 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 5 31 < NWG < NWG1089-3 Weizen < NWG < NWG 0,24 0,48 < NWG < NWG 9 33 < NWG 57 1089-4 Weizen < NWG < NWG 0,35 0,44 < NWG < NWG 4 21 14 77 1089-5 Weizen < NWG < NWG 0,11 0,44 < NWG < NWG 4 23 < NWG < NWG1098-1 Weizen < NWG < NWG 0,13 0,31 < NWG < NWG 12 12 < NWG < NWG1102-1 Roggen 1 < NWG < NWG 0,32 < NWG < NWG 6 25 11 < NWG1102-2 Roggen < NWG < NWG 0,06 < NWG < NWG < NWG 5 35 < NWG < NWG1130-1 Mais 3,7 < NWG 0,23 < NWG > 0,5 > 2,5 < NWG < NWG 49 < NWG1130-2 Mais 1,4 < NWG < NWG < NWG > 0,5 > 2,5 < NWG < NWG < NWG < NWG1130-3 Mais 2,8 < NWG 0,21 < NWG > 0,5 > 2,5 3 < NWG 55 < NWG1130-6 Mais 2,9 < NWG 0,18 < NWG > 0,5 > 2,5 4 < NWG 35 < NWG1130-7 Mais < NWG < NWG 0,13 < NWG > 0,5 > 2,5 4 < NWG 36 < NWG1131-1 Weizen < NWG < NWG 0,28 0,40 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG1131-2 Weizen < NWG < NWG 0,21 < NWG < NWG < NWG 12 < NWG < NWG < NWG1131-3 Weizen < NWG < NWG 0,45 0,35 < NWG < NWG 12 < NWG 40 < NWG1131-4 Weizen < NWG < NWG 0,44 0,65 < NWG < NWG 6 < NWG < NWG < NWG1131-5 Weizen < NWG < NWG > 0,5 > 2,5 < NWG < NWG 6 < NWG 68 73 1131-6 Weizen < NWG < NWG > 0,5 0,85 < NWG < NWG < NWG < NWG 39 < NWG1131-7 Weizen < NWG < NWG 0,21 < NWG 0,27 < NWG < NWG < NWG 31 < NWG

1134-2 (1) Polenta 1,5 < NWG > 0,5 0,97 0,10 < NWG 11 12 16 79 1134-2 (2) Maismehl 1,3 < NWG 0,32 < NWG < NWG < NWG 6 < NWG < NWG < NWG

1134-3 Maismehl < NWG < NWG > 0,5 1,10 0,29 < NWG > 20 25 > 100 > 5001134-4(1) Maismehl 1,6 < NWG 0,50 0,38 0,14 < NWG 9 12 < NWG < NWG

1134-8 Maismehl < NWG < NWG > 0,5 1,25 0,21 < NWG 9 < NWG 85 128 1139 Mais < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG

Nachweisgrenze (NWG) 1 5 0,06 0,28 0,06 0,28 2,2 11 11 55 cut off 3 15 0,2 1,0 0,2 1,0 10 50 40 200

Anzahl (< NWG) 28 38 7 21 18 23 11 28 19 28 Anzahl (NWG – cut off) 10 2 9 16 2 3 23 13 10 12 Anzahl (> cut off) 3 1 25 4 21 15 7 0 12 1

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Tab. 23 Vergleichsdaten von Routineproben ermittelt mit HPLC oder Standard-ELISA Messergebnisse über dem jeweiligen cut off-Wert des Mykotoxin-Arrays für die Pro-benverdünnung 1/10 sind durch gelbe Schattierung des Feldes hervorgehoben.

Proben-Nr. Probenart Aflatoxin (ppb)

DON (ppm)

Fumonisin (ppm)

T-2 Toxin *) (ppb)

Zearalenon (ppb)

1045-1 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1045-2 Gerste < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1045-5 Mais 15 < NWG 0,45 < NWG < NWG 1059-1 Mais < NWG 0,3 3,00 < NWG < NWG 1059-2 Mais < NWG 0,47 12,80 < NWG 174 1059-3 Mais 62 0,11 3,00 < NWG 24 1059-4 Mais < NWG < NWG 1,70 < NWG < NWG 1059-5 Mais < NWG 0,38 2,90 < NWG 138 1059-6 Mais < NWG 0,35 0,50 < NWG 109 1059-7 Mais < NWG 0,2 1,50 < NWG 46 1062-1 Mais < NWG < NWG 1,50 < NWG < NWG 1062-2 Mais < NWG 0,14 3,60 < NWG < NWG 1062-3 Mais < NWG 0,29 1,50 < NWG 31 1062-4 Mais < NWG 1,5 3,60 < NWG < NWG 1062-5 Mais < NWG < NWG 2,10 < NWG < NWG 1089-1 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1089-2 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1089-3 Weizen < NWG 0,31 < NWG < NWG < NWG 1089-4 Weizen < NWG 0,32 < NWG < NWG < NWG 1089-5 Weizen < NWG 0,16 < NWG < NWG < NWG 1098-1 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1102-1 Roggen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1102-2 Roggen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1130-1 Mais < NWG < NWG 17,00 < NWG 13 1130-2 Mais < NWG < NWG 6,00 < NWG < NWG 1130-3 Mais < NWG < NWG 18,00 < NWG 16 1130-6 Mais < NWG < NWG 12,00 < NWG < NWG 1130-7 Mais < NWG < NWG 27,00 < NWG < NWG 1131-1 Weizen < NWG 0,65 < NWG < NWG < NWG 1131-2 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1131-3 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 1131-4 Weizen < NWG 0,78 < NWG < NWG < NWG 1131-5 Weizen < NWG 4,2 < NWG < NWG 51 1131-6 Weizen < NWG 0,65 < NWG < NWG < NWG 1131-7 Weizen < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG

1134-2 (1) Polenta < NWG 0,46 0,10 < NWG < NWG 1134-2 (2) Maismehl < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG

1134-3 Maismehl < NWG 1,2 < NWG < NWG 525 1134-4(1) Maismehl < NWG 0,3 < NWG < NWG < NWG

1134-8 Maismehl < NWG 1,26 < NWG < NWG 73 1139 Mais < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG

Nachweisgrenze HPLC (NWG) 0,1 0,1 0,1 100 10

Nachweisgrenze ELISA (NWG) 1,7 0,02 0,03 50 2

cut off (Array) 3 0,2 0,2 10 40

Anzahl > cut off 2 17 18 2 7 *) Vergleichsuntersuchung mit RIDASCREEN®FAST T-2 Toxin

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Abschlußbericht: 13053/21

In einer detaillierten Vergleichsanalyse wurden die mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10

gemessenen Werte den Vergleichsdaten gegenübergestellt. Dazu wurden die Proben anhand der cut

off-Werte als POS (> cut off) und NEG (< cut off) eingestuft. Insgesamt wurden mit dem Array 410

Analysenwerte ermittelt. Davon waren 17 Befunde falsch positiv und zwei Befunde falsch negativ

ermittelt.

Tab. 24 Übersicht über die qualitativen Ergebnisse der Routineproben Einstufung der Proben nach NEG (< cut off) und POS (> cut off), zusätzliche Bewertung als falsch POS (fPOS) und falsch NEG (fNEG) anhand von Re-sultaten der Referenzmethoden

Aflatoxin DON Fumonisin T-2 Toxin Zearalenon Proben-

verdünnung 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

Cut off 3 ppb 15 ppb 0,2 ppm 1,0 ppm 0,2 ppm 1,0 ppm 10 ppb 50 ppb 40 ppb 200 ppb

POS 3 1 25 4 21 15 7 0 12 1

NEG 38 40 16 37 20 26 34 41 29 40

fPOS/POS 1/3 0 8/25 0 3/21 0 0 0 5/12 0

fNEG/NEG 0 1/40 0 0 0 1/26 0 0 0 0

Spezifität (%) 92,3 100 66,7 100 87,0 100 100 100 85,3 100

Sensitivität (%) 100 50,0 100 100 100 93,8 100 100 100 100

Die Sensitivität des Arrays lag für alle Mykotoxine bei 100 %, mit Ausnahme der Aflatoxin- und

Fumonisin-Bestimmung in den 1:50 verdünnten Proben, wo jeweils eine positive Proben unterhalb

des cut off-Werts gemessen wurde und damit fälschlicherweise als negativ deklariert wurde. Daraus

errechnete sich eine Gesamtsensitivität von 97,3 % (72 richtig detektierten POS von 74 positiven

Proben).

Die Spezifität des Tests, bezogen auf die 1:10 verdünnten Proben, lag dem gegenüber mit 17 falsch

positiv deklarierten Proben von insgesamt 154 negativen Proben bei 89,0 % (137/154): das heißt

etwa 10 % der negativen Proben wurden über dem jeweiligen cut off-Wert gemessen. Die Spezifität

bei den 1/50 verdünnten lag für alle Mykotoxine bei 100 %, alle Proben unterhalb des cut off-

Wertes wurden richtig deklariert. Die nachfolgenden Tabellen zeigen die Vergleichsdaten für die

einzelnen Mykotoxine.

R-Biopharm AG 12/2005 59

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 25 a: Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Routineproben bezogen auf Aflatoxin

Aflatoxin (ppb) Array Array

Proben-Nr. Probenart Probenverdünnung 1/10 Probenverdünnung 1/50

Vergleichs-test

Resultat Beurteilung Resultat Beurteilung1045-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG1045-2 Gerste < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1045-5 Mais 15 > 9 POS 9,3 fNEG1059-1 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-2 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-3 Mais 62 > 9 POS > 45 POS1059-4 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-5 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-6 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-7 Mais < NWG 1,1 NEG 5,6 NEG 1062-1 Mais < NWG 1,2 NEG < NWG NEG 1062-2 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1062-3 Mais < NWG 1,4 NEG < NWG NEG 1062-4 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1062-5 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-3 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-4 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-5 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1098-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1102-1 Roggen < NWG 1 NEG < NWG NEG 1102-2 Roggen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1130-1 Mais < NWG 3,7 fPOS < NWG NEG 1130-2 Mais < NWG 1,4 NEG < NWG NEG 1130-3 Mais < NWG 2,8 NEG < NWG NEG 1130-6 Mais < NWG 2,9 NEG < NWG NEG 1130-7 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-3 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-4 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-5 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-6 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-7 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG

1134-2 (1) Polenta < NWG 1,5 NEG < NWG NEG 1134-2 (2) Maismehl < NWG 1,3 NEG < NWG NEG

1134-3 Maismehl < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1134-4(1) Maismehl < NWG 1,6 NEG < NWG NEG

1134-8 Maismehl < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1139 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG

Nachweisgrenze (NWG) 0,1 ppb 1 ppb 5 ppb cut off 3 ppb 15 ppb

Anzahl (POS) 3 1 Anzahl (NEG) 38 40

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) 1/3 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG) 1/40

R-Biopharm AG 12/2005 60

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Abschlußbericht: 13053/21

Tab. 25 b Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Routineproben bezogen auf DON

DON (ppm) Array Array

Proben-Nr. Probenart Probenverdünnung 1/10 Probenverdünnung 1/50

Vergleichs-test

Resultat Beurteilung Resultat Beurteilung 1045-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG1045-2 Gerste < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1045-5 Mais < NWG 0,10 NEG < NWG NEG 1059-1 Mais 0,3 0,21 POS < NWG NEG1059-2 Mais 0,47 >0,5 POS 0,70 NEG1059-3 Mais 0,11 0,33 fPOS < NWG NEG1059-4 Mais < NWG 0,15 NEG < NWG NEG 1059-5 Mais 0,38 0,37 POS 0,91 NEG1059-6 Mais 0,35 >0,5 POS 0,89 NEG1059-7 Mais 0,2 >0,5 POS 0,64 NEG1062-1 Mais < NWG 0,19 NEG < NWG NEG 1062-2 Mais 0,14 0,40 fPOS < NWG NEG1062-3 Mais 0,29 0,50 POS 0,44 NEG1062-4 Mais 1,5 > 0,5 POS 1,78 POS1062-5 Mais < NWG 0,18 NEG < NWG NEG 1089-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-3 Weizen 0,31 0,24 POS 0,48 NEG1089-4 Weizen 0,32 0,35 POS 0,44 NEG1089-5 Weizen 0,16 0,11 NEG 0,44 NEG 1098-1 Weizen < NWG 0,13 NEG 0,31 NEG 1102-1 Roggen < NWG < NWG NEG 0,32 NEG 1102-2 Roggen < NWG 0,06 NEG < NWG NEG 1130-1 Mais < NWG 0,23 fPOS < NWG NEG1130-2 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1130-3 Mais < NWG 0,21 fPOS < NWG NEG1130-6 Mais < NWG 0,18 NEG < NWG NEG 1130-7 Mais < NWG 0,13 NEG < NWG NEG 1131-1 Weizen 0,65 0,28 POS 0,40 NEG1131-2 Weizen < NWG 0,21 fPOS < NWG NEG1131-3 Weizen < NWG 0,45 fPOS 0,35 NEG1131-4 Weizen 0,78 0,44 POS 0,65 NEG1131-5 Weizen 4,2 >0,5 POS > 2,5 POS1131-6 Weizen 0,65 >0,5 POS 0,85 NEG1131-7 Weizen < NWG 0,21 fPOS < NWG NEG

1134-2(1) Polenta 0,46 > 0,5 POS 0,97 NEG1134-2(2) Maismehl < NWG 0,32 fPOS < NWG NEG

1134-3 Maismehl 1,2 > 0,5 POS 1,10 POS1134-4(1) Maismehl 0,3 0,50 POS 0,38 NEG

1134-8 Maismehl 1,26 > 0,5 POS 1,25 POS1139 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG

Nachweisgrenze (NWG) 0,1 ppm 0,06 ppm 0,3 ppm cut off 0,2 ppm 1,0 ppm

Anzahl (POS) 25 4 Anzahl (NEG) 16 37

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) 8/25 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG)

R-Biopharm AG 12/2005 61

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Tab. 25 c Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Routineproben bezogen auf Fumonisin

Fumonisin (ppm) Array Array

Proben-Nr. Probenart Probenverdünnung 1/10 Probenverdünnung 1/50

Vergleichs-test

Resultat Beurteilung Resultat Beurteilung 1045-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG1045-2 Gerste < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1045-5 Mais 0,45 >0,5 POS 0,36 NEG 1059-1 Mais 3,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1059-2 Mais 12,80 > 0,5 POS > 2,5 POS 1059-3 Mais 3,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1059-4 Mais 1,70 > 0,5 POS 1,80 POS 1059-5 Mais 2,90 > 0,5 POS > 2,5 POS 1059-6 Mais 0,50 > 0,5 POS 0,58 NEG 1059-7 Mais 1,50 > 0,5 POS 1,50 POS 1062-1 Mais 1,50 > 0,5 POS 0,98 fNEG 1062-2 Mais 3,60 > 0,5 POS > 2,5 POS 1062-3 Mais 1,50 > 0,5 POS > 2,5 POS 1062-4 Mais 3,60 > 0,5 POS > 2,5 POS 1062-5 Mais 2,10 > 0,5 POS > 2,5 POS 1089-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-3 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-4 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-5 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1098-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1102-1 Roggen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1102-2 Roggen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1130-1 Mais 17,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1130-2 Mais 6,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1130-3 Mais 18,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1130-6 Mais 12,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1130-7 Mais 27,00 > 0,5 POS > 2,5 POS 1131-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-3 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-4 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-5 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-6 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-7 Weizen < NWG 0,27 fPOS < NWG NEG

1134-2(1) Polenta 0,10 0,10 NEG < NWG NEG 1134-2(2) Maismehl < NWG < NWG NEG < NWG NEG

1134-3 Maismehl < NWG 0,29 fPOS < NWG NEG 1134-4(1) Maismehl < NWG 0,14 NEG < NWG NEG

1134-8 Maismehl < NWG 0,21 fPOS < NWG NEG 1139 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG

Nachweisgrenze (NWG) 0,1 ppm 0,06 ppm 0,3 ppm cut off 0,2 ppm 1,0 ppm

Anzahl (POS) 21 15 Anzahl (NEG) 20 26

Anzahl (falsch POS)/Gesamtzahl (POS) 3/21 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG) 1/26

R-Biopharm AG 12/2005 62

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Tab. 25 d Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Routineproben bezogen auf T-2 Toxin

T-2 Toxin (ppb) Array Array

Proben-Nr. Probenart Probenverdünnung 1/10 Probenverdünnung

Vergleichs-test Resultat Beurteilung Resultat Beurteilung

1045-1 Weizen < nwg < NWG NEG < NWG NEG1045-2 Gerste < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1045-5 Mais < nwg 4 NEG 17 NEG 1059-1 Mais < nwg 8 NEG < NWG NEG 1059-2 Mais < nwg 9 NEG 12 NEG 1059-3 Mais < nwg 5 NEG < NWG NEG 1059-4 Mais < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1059-5 Mais < nwg 8 NEG < NWG NEG 1059-6 Mais < nwg 11 POS < NWG NEG 1059-7 Mais < nwg 9 NEG < NWG NEG 1062-1 Mais < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1062-2 Mais < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1062-3 Mais < nwg 5 NEG < NWG NEG 1062-4 Mais < nwg 5 NEG < NWG NEG 1062-5 Mais < nwg 2 NEG < NWG NEG 1089-1 Weizen < nwg 10 POS 34 NEG 1089-2 Weizen < nwg 5 NEG 31 NEG 1089-3 Weizen < nwg 9 NEG 33 NEG 1089-4 Weizen < nwg 4 NEG 21 NEG 1089-5 Weizen < nwg 4 NEG 23 NEG 1098-1 Weizen < nwg 12 POS 12 NEG 1102-1 Roggen < nwg 6 NEG 25 NEG 1102-2 Roggen < nwg 5 NEG 35 NEG 1130-1 Mais < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1130-2 Mais < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1130-3 Mais < nwg 3 NEG < NWG NEG 1130-6 Mais < nwg 4 NEG < NWG NEG 1130-7 Mais < nwg 4 NEG < NWG NEG 1131-1 Weizen < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1131-2 Weizen < nwg 12 POS < NWG NEG 1131-3 Weizen < nwg 12 POS < NWG NEG 1131-4 Weizen < nwg 6 NEG < NWG NEG 1131-5 Weizen < nwg 6 NEG < NWG NEG 1131-6 Weizen < nwg < NWG NEG < NWG NEG 1131-7 Weizen < nwg < NWG NEG < NWG NEG

1134-2 (1) Polenta < nwg 11 POS 12 NEG 1134-2 (2) Maismehl < nwg 6 NEG < NWG NEG

1134-3 Maismehl < nwg > 20 POS 25 NEG1134-4(1) Maismehl < nwg 9 NEG 12 NEG

1134-8 Maismehl < nwg 9 NEG < NWG NEG 1139 Mais < nwg < NWG NEG < NWG NEG

Nachweisgrenze (nwg) 50 ppb#) 2,2 ppb 11 ppb cut off 10 ppb 50 ppb

Anzahl (POS) 7 Anzahl (NEG) 34 41

Anzahl (fasch POS)/Gesamtzahl (POS) 0 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG)

#) Nachweisgrenze des RIDASCREEN®FAST T-2 Toxin -ELISA

R-Biopharm AG 12/2005 63

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Tab. 25 e: Gegenüberstellung von Array- und Vergleichsdaten bei Routineproben bezogen auf Zearalenon

Zearalenon (ppb) Array Array

Proben-Nr. Probenart Probenverdünnung 1/10 Probenverdünnung 1/50

Vergleichs-test

Resultat Beurteilung Resultat Beurteilung 1045-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG1045-2 Gerste < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1045-5 Mais < NWG 50 fPOS 55 NEG1059-1 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-2 Mais 174 72 POS 148 NEG 1059-3 Mais 24 30 NEG 58 NEG 1059-4 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1059-5 Mais 138 74 POS 170 NEG 1059-6 Mais 109 94 POS 187 NEG 1059-7 Mais 46 46 POS 112 NEG 1062-1 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1062-2 Mais < NWG 18 NEG 86 NEG 1062-3 Mais 31 52 fPOS < NWG NEG 1062-4 Mais < NWG 25 NEG < NWG NEG 1062-5 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1089-3 Weizen < NWG < NWG NEG 57 NEG 1089-4 Weizen < NWG 14 NEG 77 NEG 1089-5 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1098-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1102-1 Roggen < NWG 11 NEG < NWG NEG 1102-2 Roggen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1130-1 Mais 13 49 fPOS < NWG NEG 1130-2 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1130-3 Mais 16 55 fPOS < NWG NEG 1130-6 Mais < NWG 35 NEG < NWG NEG 1130-7 Mais < NWG 36 NEG < NWG NEG 1131-1 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-2 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-3 Weizen < NWG 40 fPOS < NWG NEG 1131-4 Weizen < NWG < NWG NEG < NWG NEG 1131-5 Weizen 51 68 POS 73 NEG 1131-6 Weizen < NWG 39 NEG < NWG NEG 1131-7 Weizen < NWG 31 NEG < NWG NEG

1134-2 (1) Polenta < NWG 16 NEG 79 NEG 1134-2 (2) Maismehl < NWG < NWG NEG < NWG NEG

1134-3 Maismehl 525 > 100 POS > 500 POS 1134-4(1) Maismehl < NWG < NWG NEG < NWG NEG

1134-8 Maismehl 73 85 POS 128 NEG 1139 Mais < NWG < NWG NEG < NWG NEG

Nachweisgrenze (NWG) 10 ppb 11 ppb 55 ppb cut off 40 ppb 200 ppb

Anzahl (POS) 12 1 Anzahl (NEG) 29 40

Anzahl (fasch POS)/Gesamtzahl (POS) 5/12 Anzahl (falsch NEG)/Gesamtzahl (NEG)

R-Biopharm AG 12/2005 64

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4.4.4 Zusammenfassende Bewertung der Probenanalyse

Im Folgenden werden die für 88 Proben erhobenen Daten aus den drei Untersuchungsblöcken im

Hinblick auf die Ermittlung einer Gesamt-Testsensitivität und Spezifität zusammenhängend ausge-

wertet und Daten, die mit dem Array Werte innerhalb des Messbereichs quantifiziert werden konn-

ten, den Vergleichsdaten in Korrelationsdiagrammen gegenüber gestellt.

Tabelle 26 zeigt eine Übersicht über alle mit dem Array ermittelten Daten in einer qualitativen Ein-

stufung nach POS und NEG, die auf der Grundlage der Vergleichsdaten vorgenommen wurde.

Ungefähr 75 % aller Analysenergebnisse lagen unterhalb der cut off Werte und wurden entsprechen

als NEG eingestuft Die höchste Anzahl von positiven Befunden wurde für DON, Fumonisine und

Zearalenon gefunden, wobei besonders für Zearalenon viele positiven Array-Resultate, die im Be-

reich des cut off-Werts lagen, nicht bestätigt werden konnten (s. Tab. 26).

Tab. 26 Übersicht über die qualitativen Ergebnisse aller untersuchten Proben

Aflatoxin DON Fumonisin T-2 Toxin Zearalenon

Probenverdünnung 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50 1/10 1/50

Cut off 3 ppb 15 ppb 0,2 ppm 1,0 ppm 0,2 ppm 1,0 ppm 10 ppb 50 ppb 40 ppb 200 ppb

POS 13 7 40 12 35 23 12 2 33 6

NEG 75 81 48 76 53 65 76 86 55 82

fPOS/POS 1/13 0 10/40 0 3/35 1/23 0 0 14/33 0

fNEG/NEG 0 1/81 0 1/76 0 2/65 0 0 0 0

Analysen total 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88

R-Biopharm AG 12/2005 65

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Abschlußbericht: 13053/21

Für Aflatoxin ergab die Auswertung aller mit dem Array in 1:10 Verdünnung untersuchten Proben

eine Sensitivität von 100 %, das heißt alle Proben mit Kontaminationen > 3 ppb wurden mit dem

Array detektiert. Eine Probe wurde mit 3,7 ppb falsch positiv bewertet, was die Testspezifität auf

98,7 % reduzierte, d.h. von den im Vergleichstest festgestellten 76 negativen Proben wurden 75

Proben mit dem Array korrekt detektiert. Von den 1:50 verdünnten Proben wurde eine Probe mit

9,3 gegenüber dem Vergleichstest unterbewertet. Dies führte zu einer falsch negativen Bewertung

und einer entsprechend reduzierten Sensitivität von 87,5 % (7 von 8 positiven Proben wurden kor-

rekt detektiert).

Von den Array-Daten waren 11 quantitativ auswertbar und konnten entsprechend in einem Korrela-

tionsdiagramm dargestellt werden, für das eine Regressionsgerade mit einem Bestimmtheitsmaß

von r2 = 0,855 und einer Steigung von 1,36 berechnet wurde (vgl. Abb.16).

Tab. 27 Qualitative Auswertung aller Aflatoxin - Vergleichsdaten

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Tests auf der Basis von 88 untersuchten Proben

Array 1/10 Array 1/50 Aflatoxin POS NEG total

POS NEG total

POS 12 0 12 POS 7 1 8

NEG 1 75 76 NEG 0 80 80

Verg

leic

hs-

Test

Total 13 75 88 Verg

leic

hs-

Test

Total 7 81 88

Spezifität 98,7 % Spezifität 100 % Sensitivität 100 % Sensitivität 87,5 % Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

Abb. 16: Korrelationsdiagramm der Aflatoxin-belasteten Proben. Gegen-überstellung von Vergleichsdaten und Array Daten

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60 70

Aflatoxin (ppb)Array

Afla

toxi

n (p

pb)

Verg

leic

hste

st

Bestimmtheitsmaß = 0,855Steigung = 1,36

n = 11

R-Biopharm AG 12/2005 66

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Abschlußbericht: 13053/21

Bei der DON-Bestimmung in den 1:10 verdünnten Proben wurden mit dem Array 40 Proben ober-

halb des cut off-Wertes von 0,2 ppm detektiert, nur 30 dieser Proben wurde mit dem Vergleichstest

als belastet bestätigt. Dies führte hier zu einer Spezifität von 82,8 %. Da alle im Vergleichstest de-

tektierten DON Belastungen vom Array gefunden wurden, ergab sich eine Sensitivität von 100 %.

Bei den 1:50 verdünnten Proben wurde eine Probe knapp unter dem cut off falsch negativ bewertet,

was hier eine Sensitivität von 92,3 % ergab (s. Tab.28).

In einem Korrelationsdiagramm aus 44 Wertepaaren wurde mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,818

und einer Steigung der Regressionsgeraden von 1,05 eine sehr gute Übereinstimmung zwischen

Array- und Vergleichsdaten ermittelt

Tab. 28 Qualitative Auswertung aller DON - Vergleichsdaten

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Tests auf der Basis von 88 untersuchten Proben

Array 1/10 Array 1/50 DON POS NEG total

POS NEG total

POS 30 0 30 POS 12 1 13

NEG 10 48 58 NEG 0 75 75

Verg

leic

hs-

Test

Total 40 48 88 Verg

leic

hs-

Test

Total 12 76 88

Spezifität 82,8 % Spezifität 100 % Sensitivität 100 % Sensitivität 92,3 % Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

Abb. 17: Korrelationsdiagramm der DON-belasteten Proben. Gegenüberstellung von Ver-gleichsdaten und Array Daten

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5DON (ppm)

Array

DO

N (p

pm)

Verg

leic

hste

st

Bestimmtheitsmaß = 0,818Steigung = 1,05

n = 44

R-Biopharm AG 12/2005 67

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Abschlußbericht: 13053/21

Bei der qualitativen Bewertung der Fumonisin Ergebnisse ergab sich mit den 1:10 verdünnten Pro-

ben eine Sensitivität von 100 % und infolge von 3 nicht bestätgten positven Befunden eine reduzier-

te Speziftät von 94,6 % (53 von 56). Bei den Proben im Bereich des cut off waren gegenüber den

Vergleichdaten zwei Proben falsch negativ und eine Probe falsch positiv bewertet.

Das Korrelationsdiagramm aus 17 Wertepaaren zeigte nach Eliminierung von zwei Aureißern ein

Bestimmheitsmaß von 0,920 und eine Steigung der Regressionsgerade von 0,98.

Tab. 29 Qualitative Auswertung aller Fumonisin - Vergleichsdaten Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Tests auf der Basis von 88 untersuchten Proben

Array 1/10 Array 1/50 Fumonisin POS NEG total

POS NEG total

POS 32 0 32 POS 22 2 24

NEG 3 53 56 NEG 1 63 64

Verg

leic

hs-

Test

Total 35 53 88 Verg

leic

hs-

Test

Total 23 65 88

Spezifität 94,6 % Spezifität 98,4 % Sensitivität 100 % Sensitivität 91,7 % Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

Abb. 18: Korrelationsdiagramm der Fumonisin-belasteten Pro-ben. Gegenüberstellung von Ver-gleichsdaten und Array Daten

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0Fumonisin (ppm)

Array

Fum

onis

in (p

pm)

Verg

leic

hste

st

Bestimmtheitsmaß = 0,920Steigung = 0,98

n = 17

( ) Ausreißer

( ) Ausreißer

R-Biopharm AG 12/2005 68

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Abschlußbericht: 13053/21

Bei der Bestimmung von T-2 Toxin wurden mit dem Array in der 1:10 Probenverdünnung außer

den hochbelasteten Kontrollproben noch 10 weitere Proben oberhalb des cut off-Wertes zwischen

10 ppb und 50 ppb gefunden. Für diesen Konzetrationsbereich stand keinVeregleichstest zur Verfü-

gung. Die Proben wurden für die qualitative Auswertung als richtig erkannt angenommen (s.

Tab.30).

Die Zahl der positven Proben reduzierte sich bei den 1:50 verdünnten Proben auf die zwei Kon-

trollproben, deren Konzentrationen außerhalb des Array-Messbereichs (> 100ppb) lagen und nur

durch Extrapolation der Standardkurve zu ermitteln waren. Für die Darstellung in einem Korrelati-

onsdiagramm lagen damit nicht genügend Wertepaare vor.

Tab. 30 Qualitative Auswertung aller T-2 Toxin - Vergleichsdaten

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Tests auf der Basis von 88 untersuchten Proben

Array 1/10 Array 1/50 T-2 Toxin POS NEG total

POS NEG total

POS 12 0 12 POS 2 0 2

NEG 0 76 76 NEG 0 86 86

Verg

leic

hs-

Test

Total 12 76 88 Verg

leic

hs-

Test

Total 2 85 88

Spezifität 100 % Spezifität 100 % Sensitivität 100 % Sensitivität 100 % Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

Bei der Bestimmung von Zearalenon in den 1:10 verdünnten Proben wurden mit dem Array 33 Pro-

ben oberhalb des cut off von 40 ppb gemessen. Insgesamt 14 dieser Proben konnten nicht mit dem

Vergleichtest bestätigt werden. Daraus errechnete sich eine Spezifität von 79,7 %; das heißt 55 von

69 negativen Proben waren mit dem Array korrekt eingestuft.

Bei den 1:50 verdünnten Proben wurden noch 6 Proben oberhalb des cut off von 200 ppb gemessen,

die alle bestätigt werden konnten.

R-Biopharm AG 12/2005 69

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Abschlußbericht: 13053/21

Für das Korrelationsdiagramm der 31 quantitativ ausgewerteten Zearalenon-Array-Ergebnisse wur-

de eine Regressiongerade mit einer Steigung von 0,87 und einem Bestimmheitsmaß von 0,869 er-

rechnet.

Tab. 31 Qualitative Auswertung aller Zearalenon - Vergleichsdaten Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Tests auf der Basis von 88 untersuchten Proben

Array 1/10 Array 1/50 Zearalenon POS NEG total

POS NEG total

POS 19 0 19 POS 6 0 6

NEG 14 55 69 NEG 0 82 82

Verg

leic

hs-

Test

Total 33 55 88 Verg

leic

hs-

Test

Total 6 82 88

Spezifität 79,7 % Spezifität 100 % Sensitivität 100 % Sensitivität 100 % Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

Abb. 19: Korrelationsdiagramm der Zearalenon-belasteten Pro-ben. Vergleichsdaten Gegenüber-stellung von Vergleichsdaten und Array Daten

0

100

200

300

400

500

600

700

0 100 200 300 400 500 600 700

Zearalenon (ppb)Array

Zear

alen

on (p

pb)

Verg

leic

hste

st

Bestimmtheitsmaß = 0,869Steigung = 0,87

n = 31

R-Biopharm AG 12/2005 70

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Abschlußbericht: 13053/21

Die qualitative Auswertung aller Ergebnisse ergab für die 1:10 verdünnten Proben eine Sensitivität

von 100 % und eine Spezifität von 91,6%, das heißt alle 105 mit Vergleichstests oberhalb der cut

off Werte gemessenen Proben waren korrekt detektiert. Auf der anderen Seite wurden etwa 10%

(28 von 307) der negativen Proben falsch positiv eingestuft. In der höheren Verdünnungsstufe ergab

sich durch 4 falsch negativ eingestufte kontaminierte Proben eine reduzierte Sensitivität von 92,5%

und eine Spezifität von 99,7% (386/387).

Das Korrelationsdiagramm auf der Grundlage aller quantitativen Array-Untersuchungsergebnisse

ergab ein Bestimmtheitsmass von 0,891 bei einer Steigung von 0,998, was eine insgesamt sehr zu-

friedenstellende Übereinstimmung der Mykotoxin-Array Messungen mit den Ergebnissen der Ver-

gleichsmethoden bedeutete.

Tab. 32 Qualitative Auswertung aller Vergleichsdaten Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Tests auf der Basis von 88 untersuchten Proben

Array 1/10 Array 1/50 alle Daten POS NEG total

POS NEG total

POS 105 0 105 POS 49 4 53

NEG 28 307 335 NEG 1 386 387

Verg

leic

hs-

Test

Total 133 307 440 Verg

leic

hs-

Test

Total 50 390 440

Spezifität 91,6 % Spezifität 99,7 % Sensitivität 100 % Sensitivität 92,5 % Spezifität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter NEG/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis < cut off Sensitivität (%) = 100 x Anzahl richtig erkannter POS/Gesamtzahl der Proben mit Vergleichstestergebnis ≥ cut off

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Mykotoxin (ppb)Array

Myk

otox

in (p

pb)

Verg

leic

hsda

ten

Bestimmtheitsmaß = 0,891Steigung = 0,998

n=103

Abb. 20: Korrelationsdiagramm für alle kontaminierten Proben Gegenüberstellung von Vergleichsdaten und Array Daten

R-Biopharm AG 12/2005 71

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Abschlußbericht: 13053/21

4.5 Visueller Test

Die visuelle Auswertung eines Mykotoxin-Antikörper-Array Tests war gedacht als eine Möglich-

keit, einen einfachen cut off-Test zu etablieren, der ohne Messinstrument eine Bewertung der Pro-

ben erlaubt. Dazu wurden Tests mit einer visuellen Stopp-Lösung abgestoppt, die im Gegensatz

zum Abstoppen mit verdünnter Schwefelsäure zu einer leicht mit dem Auge abzulesenden Färbung

führte. Anders als mit Schwefelsäure, wo ein Farbumschlag von blau nach gelb stattfindet, bleibt

mit der neutralen visuellen Stopp-Lösung die blaue Farbe erhalten und wird durch die orangerot

eingefärbte Stopp-Lösung zu einer visuell gut ablesbaren Mischfarbe. Die Farbpalette reicht damit

von einem grün-blau Ton (negative Proben) bis zu einen gelb-orange Ton (stark kontaminierte Pro-

ben).

Während des Projekts wurden einige Tests parallel mit visueller Stopp-Lösung und H2SO4 durchge-

führt. Die Ergebnisse waren bei photometrischer Auswertung der Tests nahezu identisch (s. Abb21

und Tab. 33) und der visuelle Test erwies sich hierbei als gut interpretierbar, da die Farbskala eine

gute Differenzierung der Proben im Bereich der cut off-Werte der Mykotoxin-Standarkurven er-

laubte.

Abb. 21 Darstellung einer visuellen Auswertung des Array Tests Paralleltestung mit visueller Stopp-Lösung (Teststreifen 6-10) und H2SO4 Stopp-Lösung (Teststreifen 1-5).

Reihe 1 bis 4 enthält die Standardlösungen std 1, 2, 3, 4 Reihe 5: Nullprobe 766 Reihe 6: dotierte Nullprobe 766 Reihe 7: Nullprobe 767 Reihe 8: dotierte Nullprobe 767

% B/B0-Werte mit H2SO4

% B/B0-Werte mit visueller Stopplösung

A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

B 77,7 76,7 76,1 83,8 83,3 83,3 70,0 81,5 85,7 75,8

C 47,1 53,1 48,5 62,7 58,4 48,7 50,1 58,7 70,2 56,4

D 22,5 29,0 26,9 29,0 30,2 31,0 33,5 36,8 36,3 31,0

E 93,6 75,2 94,4 42,8 55,5 81,6 69,4 91,5 47,5 50,4

F 40,5 38,9 37,9 33,7 36,2 44,3 40,9 46,1 40,1 34,9

G 93,2 81,9 95,1 85,4 68,8 88,2 80,3 95,5 80,1 61,7

H 37,4 44,1 40,7 44,2 42,9 40,0 43,3 46,1 48,7 42,0

Tab. 33 Vergleichsdaten einer Parallel- Testung des Arrays mit H2SO4 und viueller Stopp-Lösung (s. oben abgebildeter Test). Die Vergleichs-Daten sind als % B/Bo Werte angegeben.

R-Biopharm AG 12/2005 72

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Abschlußbericht: 13053/21

5 Diskussion

Mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 wurde ein immunologisches Nachweissystem etab-

liert, das in einem Analysengang gleichzeitig fünf der wichtigsten Mykotoxine (Aflatoxine, DON,

Fumonisine, T-2 Toxin und Zearalenon) in den jeweils relevanten Messbereichen erfasste. Der Test

wurde mit spezifischen monoklonalen Antikörpern, die vom Kooperationspartner an der LMU

München aus früher erzeugten Hybridomazellklonen produziert wurden oder aus firmeneigenen

Ressourcen stammten, in der Form eines ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) auf einer

96-er Mikrotoiterplatte aufgebaut. Dieses Testformat hat sich in vielen Immunoassays als geeignet

erwiesen und ist bei R-Biopharm die gängige Testplattform.

Für den Aufbau des Detektionssystems waren außerdem Mykotoxin-Peroxidase Konjugate notwen-

dig, die in einem kompetitiven Testansatz mit Mykotoxinen der Probe oder des Standards um die

Antikörperbindung konkurrierten. Der Test wurde nach dem Prinzip des kompetitiven ELISAs auf-

gebaut. Das heißt die gemessene Signalstärke verhielt sich umgekehrt proportional zur Mykotoxin-

konzentration in Probe und Standard, sodass sich mittels Mykotoxin-Standardkurven die Mykoto-

xingehalte von Proben bestimmen ließen.

Mit monoklonalen Antikörpern und den Enzymkonjugaten standen sehr gut charakterisierte und

reproduzierbar herstellbare Testspezifische Reagenzien zur Verfügung. Monoklonale Antikörper

lassen sich aus kryokonservierten Hybridomzellklonen im Bioreaktor und ohne Einsatz von Tieren

in jeder gewünschten Menge und gleichbleibender Qualität herstellen. Die Mykotoxin-Enzym Kon-

jugate waren beim Kooperationspartner nach gut reproduzierbaren und standardisierten Methoden

hergestellt worden.

Für die Herstellung der Standardlösungen wurden zertifizierte Standards von Trilogy und R-

Biopharm Rhone verwendet. Außerdem wurden Standardlösungen aus kommerziell erhältlichen

Mykotoxinen nach standardisierten Protokollen frisch hergestellt.

Die übrigen für die Testentwicklung verwendeten Komponenten wie Fängerplatten, Puffer, Medien

für die Zubereitung der Antikörper- und Konjugat-Verdünnungen, Chromogen/Substrat und Stopp-

lösung stammten aus der regulären Produktion von R-Biopharm, sodass eine gute Verfügbarkeit

aller eingesetzten Komponenten gewährleistet war.

R-Biopharm AG 12/2005 73

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Abschlußbericht: 13053/21

Die monoklonalen Antikörper wurden in einem Beschichtungsverfahren über Fänger-Antikörper

auf der Mikrotiterplatte fixiert und stabilisiert. Mit dieser Art der Beschichtung wurden die spezifi-

schen Antikörper über ihre Fc-Teile an den Fänger-Antikörper angedockt und die Mykotoxin-

Bindungsstellen blieben frei zugänglich. Aus den vorhandenen monklonalen Antikörpern wurden in

Verdünnungsreihen und sogenannten Schachbretttitrationen mit den Enzymkojugaten die am besten

geeigneten Kombinationen ausgewählt und daraus in nachfolgenden Optimierungsschritten das Ar-

ray-System entwickelt. Die für Ochratoxin A zur Verfügung stehenden monoklonalen Antikörper

erwiesen sich in den Voruntersuchungen wegen einer unzureichenden Sensitivität als nicht geeignet

für den Einsatz im geplanten Array. Im kompetitiven Ansatz mit 5 ppb Ochratoxin konnte eine Re-

duktion des Maximalsignals von höchstens 25 % erreicht werden, was für eine ausreichende Test-

empfindlichkeit innerhalb des angestrebten Messbereichs von 1 bis 10 ppb deutlich zu gering war.

Das Array-Testsystem wurde danach auf der Basis von fünf, den Anforderungen entsprechenden

monoklonalen Antikörpern weiter entwickelt und in der vorliegenden Form etabliert. Diese waren

P2G8 (Aflatoxin), 1H8 (DON), P3 (Fumonisin), 2E2 (T-2 Toxin) und P8 (Zearalenon).

Für den Aufbau des Testsystems wurden die verschiedenen Antikörper–Konjugat Kombinationen

der einzelnen Mykotoxine zunächst unabhängig von einander überprüft und optimiert. Die Stan-

dardreihen wurden auf einen Bereich der Signalstärke zwischen 80 und 30 % des Maximalsignals

getrimmt.

In diesem mittleren Bereich zeigten die Standardkurven bei halblogarithmischer Darstellung einen

pseudolinearen Verlauf und ließ sich entsprechend einfach auswerten.

Die fünf optimierten Konjugat-Verdünnungen wurden in einer Lösung als Enzymgemisch herge-

stellt und zusammen mit den Mischungen der Mykotoxin-Standardreihen im Array überprüft. Die

Standardkurven der Mischungen waren gegenüber der Untersuchung der Einzelkomponenten un-

verändert. Die monklonalen Antikörper erwiesen sich somit als ausreichend spezifisch und zeigten

keinerlei Beeinflussung des Bindungsverhaltens durch die zusätzlichen Enzymkonjugate oder My-

kotoxine der Mischungen.

Die Zeit für die Durchführung eines Tests lag bei etwa 30 Minuten und setzte sich im Wesentlichen

aus zwei Inkubationsschritten von jeweils 10 Minuten, Pipettierschritten und einem Waschschritt

zusammen.

R-Biopharm AG 12/2005 74

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Abschlußbericht: 13053/21

Enzymkonjugat und Probe/Standard wurden 1+1 vorgemischt und spaltenweise mit einer Mehrka-

nalpipette auf die beschíchtete MTP übertragen. Damit wurde die Bindungsreaktion innerhalb eines

Arraystreifens zeitgleich gestartet. Die Inkubationszeit für den kompetitive Ansatz auf der Platte

betrug 10 Minuten. Danach wurde die MTP ausgeleert und die Vertiefungen der MTP mit Wasch-

puffer gespült, um nicht gebundenes Enzymkonjugat zu entfernen. Zur Darstellung der gebundenen

Enzymkonjugate wurde eine hochsensitive Chromogen-Substrat Mischung auf die MTP gegeben

und weitere 10 Minuten inkubiert, bevor die enzymatische Reaktion mit einer Stoplösung beendet

wird. Dieses Verfahren garantiert einen gleichzeitigen Start und Ende der Bindungsreaktion inner-

halb einer Mykotoxin-Spezifität, sowie gleiche Farbentwicklungszeiten und verhinderte damit Re-

sultatverschiebungen durch unterschiedliche Inkubationszeiten. Die ursprüngliche Inkubationsfol-

gen von 30 + 15 Minuten konnte ohne eine größere Einbuße an Testempfindlichkeit auf 10 + 10

Minuten verkürzt werden; damit war eine deutliche Reduktion der Gesamtanalysezeit erreicht wor-

den.

Die mittleren Konzentrationen der Mykotoxin-Standardkurven lagen zwischen 0,3 (Aflatoxine) und

20 ppb (Fumonisine) und erlaubten eine empfindliche Quantifizierung der einzelnen Mykotoxine

im geforderten Messbereich. Die untersuchten Proben wurden nach einem einfachen Extraktions-

schritt 1:10 und 1:50 endverdünnten im Test eingesetzt. Dadurch wurden die Messbereiche entspre-

chend um Faktor 10 bzw. 50 zu höheren Konzentrationen verschoben und deckten die für Lebens-

mittel und Futtermittel relevanten Konzentrationen ab.

Nach einem optimierten Herstellungsprotokoll wurden im Anschluss an die Entwicklungsphase drei

Probechargen und eine größere Produktionscharge des Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 herge-

stellt und charakterisiert. Die wiederholte Stabilitätsprüfung der Testkitkomponenten zeigte eine

gleichbleibende, gute analytische Qualität über einen Zeitraum von mindestens 6 Monaten bei Ein-

haltung der vorgeschriebenen Lagerungstemperatur von 4 – 8 °C.

Der Test zeigte in wiederholten Untersuchungen von dotierten Proben im mittleren Bereich der

Mykotoxin-Standardkurven eine für ELISA Schnelltests übliche Reproduzierbarkeit von 3 bis 10

% innerhalb eines Testlaufs und 7 bis 28 % von Test zu Test. Die Wiederfindung der Dotierung war

mit 76 bis 105 % sehr zufriedenstellend.

Die analytische Leistungsfähigkeit des Tests im Bezug auf reelle Proben wurde in umfangreichen

Untersuchungen mit Getreide- und Futtermittelproben gezeigt.

R-Biopharm AG 12/2005 75

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Abschlußbericht: 13053/21

Zur Ermittlung von Vergleichsdaten waren in den ersten zwei Projektphasen die HPLC Methoden

für den Nachweis von vier der Mykotoxine (Aflatoxin, DON, Fumonisin und Zearalenon) etab-

liert worden. Für T-2 Toxin war keine geeignete empfindliche HPLC Methode verfügbar, so dass

hier auf externe Daten und Vergleichsdaten aus Standard-ELISA Tests zurückgegriffen werden

musste.

Die Array-Daten und Vergleichsdaten wurden sowohl quantitativ als auch qualitativ miteinander

verglichen. Für den qualitativen Vergleich wurden cut off Werte definiert, die sich an den 50%

Dosis Werten der Mykotoxin-Standardkurven orientierten. Probenergebnisse ≥ cut off wurden als

positiv (POS), Ergebnisse < cut off als negativ (NEG) eingestuft. Qualitative Array-Ergebnisse,

die nicht mit denen des Referenztests übereinstimmend, wurden als falsch negativ (fNEG) oder

falsch positiv (fPOS) bezeichnet.

Auf diese Weise wurden zur Beurteilung von Testspezifität und Sensitivität 22 unbelastete Nullpro-

ben und 25 Mykotoxin-belastete Kontrollproben untersucht, von denen jeweils eine Mykotoxin-

Kontamination bekannt war.

Mit den 1:10 verdünnten unbelasteten Getreide (20)- und Futtermittelproben (2) wurde eine

Testpezifität von 95,4 % gemessen; 104 von 110 negativen Befunden waren übereinstimmend

mit der Referenzmethode richtig bestimmt. Zwei Futtermittelproben zeigten im DON Test einen

Befund knapp oberhalb des cut off Wertes. Im Zearalenon Test wurde für die Futtermittelproben

Werte > 100 ppb gemessen, so dass hier von einem massiven Matrixeffekt ausgegangen werden

muss. Eine Gerstenprobe wurde im Zearalenon Test nur knapp über dem cut off Wert mit 44 ppb

gemessen. Mit den 1:50 verdünnten Proben wurden 100 % Spezifität erzielt.

Die Überprüfung der richtigen Einstufung der Mykotoxin-haltigen Kontrollproben ergab eine

Testsensitivität von 100% (53 von 53) bei den 1:10 verdünnten Proben. Alle 25 bekannten My-

kotoxin-Kontaminationen der Kontrollproben wurden richtig erkannt. Zusätzlich wurden 38 posi-

tive Befunde in mehrfach kontaminierten Proben detektiert, die alle mit Referenzmethoden bestä-

tigt werden konnten.

Mit den 1:50 verdünnten Proben ergab sich eine Sensitivität von 93,3%; 28 von 30 positiven Er-

gebnissen waren übereinstimmend mit der Referenzmethode. Lediglich zwei Befunde wurden mit

0.82 ppm bei einer mit DON belasteten Maisprobe und 0,64 ppm bei einer mit Fumonisin belaste-

R-Biopharm AG 12/2005 76

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Abschlußbericht: 13053/21

ten anderen Maisprobe abweichend vom Vergleichstest unterhalb des cut off-Wertes gemessen.

Während die DON Bestimmung eine vergleichsweise geringe Diskrepanz zum Vergleichstest

darstellte, könnte die größere Diskrepanz der Fumonisin-Resultate ihre Ursache in einer Inhomo-

genität der Probe haben, die durch wiederholte Analysen zu klären wäre. Vergleichstest und Array

Test beruhen auf getrennten Probeneinwaagen und Diskrepanzen können durchaus durch eine

ungleiche Verteilung der Mykotoxine in der Probe zustande kommen.

Der Array wurde in der abschließenden Projektphase zur routinemäßigen Untersuchung von

Getreideproben im Applikationslabor von R-Biopharm eingesetzt. Hier wurden aus acht Testse-

rien insgesamt 41 Proben mit dem Array überprüft und in Vergleichsmessungen die korrespondie-

renden HPLC-Referenzdaten und zusätzliche Daten mit Standard-ELISA Tests erhoben. Für die

Vergleichsmessung von T-2 Toxin stand bei R-Biopharm bis dato keine HPLC Methode zur Ver-

fügung, sodass hier nur mit ELISA-Daten verglichen werden konnte. In der Regel wurden zur

Vergleichsanalyse die HPLC Daten herangezogen. Insgesamt wurden mit den 1:10 verdünnten

Proben 68 Ergebnisse über dem jeweiligen cut off gefunden, 137 ergaben NEG Befunde. Im Ver-

gleich mit den Referenzdaten waren 17 Proben mit dem Array falsch positiv und keine der Proben

falsch negativ eingestuft. Daraus errechnete sich eine Sensitivität von 100% (51 von 51 positiven

Proben wurden korrekt detektiert) und eine Spezifität von 89,0% (137 von 154 negativen Analy-

senwerten waren übereinstimmend mit dem Vergleichstest).

In der 1:50 Verdünnung wurden übereinstimmend mit dem Vergleichstest noch 21 Proben als

POS und 184 Proben als negativ eingestuft, zwei davon waren falsch negativ bestimmt.

Bei der Bewertung aller untersuchten Proben wurde in der 1:10 Verdünnung eine Testspezifität

von 91,6 (307 NEG von 335 negativen Befunden) und eine Sensitivität von 100% (105 POS von

105 positiven Proben) gefunden; bezogen auf die 1:50 verdünnten Proben wurde eine Testspezifi-

tät von 99,7 (386 NEG von 387 negativen Befunden) und eine Sensitivität von 92,5% (49 POS

von 53 positiven Proben) ermittelt. In Korrelationsdiagrammen spiegelte sich die gute

Übereinstimmung zwischen Array und Vergleichsdaten wider. Auf der Basis von 103

Datenpaaren wurde ein Bestimmtheitsgrad von 0,891 bei einer Steigung von 0,998 berechnet.

Die Ergebnisse lassen sich für die einzelnen Mykotoxine wie folgt zusammenfassen.

R-Biopharm AG 12/2005 77

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Aflatoxin

Von den 12 in der 1:10 Verdünnung übereinstimmend positiven bestimmten Proben waren 11 be-

kannte Kontrollproben, eine mit 62 ppb kontaminierte Maisprobe wurde im Routinetest zusätzlich

detektiert. Der cut off-Wert von 3 ppb liegt 25 % unter dem MRL Wert und scheint hinsichtlich

Sensitivität und Spezifität gut gewählt.

DON

Insgesamt wurden in der 1:10 Probenverdünnung 31 mit Referenzdaten übereinstimmend positive

Proben gefunden, davon waren 10 Proben DON-haltige Kontrollproben. Die meisten der 10 falsch

positiv eingestuften Proben lagen zwischen 200 und 500 ppb. Mit einer Anhebung des cut off Wer-

tes könnte die Übereinstimmung mit dem Referenztest erhöht und damit die Testspezifität deutlich

verbessert werden.

Fumonisine

Bei Fumonisin wurden in der 1:10 Probenverdünnung 32 Probenübereinstimmend positiv gemes-

sen, davon waren 2 Proben bekannte Kontrollproben. 3 Falsch positive Probenergebnisse lagen zwi-

schen 200 und 300 ppb. 22 Proben waren hoch mit Fumonisinen belastet und lagen deutlich über

dem cut off-Wert von 1 ppm, viele davon oberhalb des Messbereichs (> 2,5 ppm)

T-2 Toxin

Hier standen nur zwei Kontrollproben mit Kontaminationen von 150 und 362 ppb zur Verfügung,

die beide richtig erkannt wurden. Daneben wurden 10 weitere Proben oberhalb des cut off Wertes

zwischen 10 und 50 ppb gemessen und entsprechend der Definition positiv bewertet. Die Relevanz

dieser Ergebnisse kann zur Zeit nicht geklärt werden, da für dieses Mykotoxin noch keine zulässige

Höchstmenge festgelegt wurde.

Zearalenon

Hier stand nur eine Kontrollprobe mit einer Belastung von 100 ppb zur Verfügung, die auch richtig

gefunden wurde. 18 weitere Proben wurden übereinstimmend positiv gemessen, 6 dieser Proben

wiesen Werte über 200 ppb.. 14 falsch positiv eingestuften lagen zwischen 40 und 60 ppb. Eine

Anhebung des cut off Wertes auf 50 oder 60 ppb wäre bei einem MRL-Wert von 75 ppb noch tole-

rabel und würde die Spezifität des Tests erhöhen.

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Abschlußbericht: 13053/21

6 Fazit

Beim Vergleich der Messbereiche der verwendeten Tests zeigt sich, dass HPLC, ELISA und Array

ähnliche Bereiche abdecken (s. Tab.34). Alle in EU-Verordnungen bisher festgelegten MRL-Werte

liegen innerhalb der Array-Messbereiche, wobei die cut off-Werte für DON und Fumonisin offen-

sichtlich noch zu niedrig gewählt wurden und von 200 auf 500 ppb angehoben werden könnten.

Bei T-2 Toxin sind noch keine Höchstmengen festgelegt, so dass hier über die Relevanz des im

Array etablierten Messbereiches keine Aussage getroffen werden kann. Die Testempfindlichkeit

sollte aber für zukünftige Regelungen in jedem Fall einen ausreichenden Spielraum lassen.

Tab. 34 Gegenüberstellung von MRL-Werten und Mykotoxin-Messbereichen von HPLC, ELISA und Array (Konzentrationsangaben in µg/kg

Methode

Mykotoxin HPLC FAST ELISA ELISA,lange Version Array MRL-Wert

Aflatoxin 0,1 - 10 1,7 - 45 1,75 - 142 1 – 45 4

DON 100 - 10000 222 - 6000 18,5 - 500 56 - 2500 750-1750

Fumonisin 100 - 10000 222 - 6000 25 - 2000 56 - 2500 1000-2000

T-2 Toxin 100 - 1000 50 - 400 3,5 - 56 2 – 100 nicht festgelegt

Zearalenon 20 - 1000 50 - 400 1,75 - 142 11 - 500 75-200

Mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 wurde auf der Basis von monoklonalen Antikörpern

ein immunologisches Nachweissystem etabliert, das in einem Analysengang gleichzeitig fünf der

wichtigsten Mykotoxine (Aflatoxine, DON, Fumonisine, T-2 Toxin und Zearalenon) in den je-

weils relevanten Messbereichen erfasst. Getreide und Futtermittelproben lassen sich nach einer

einfachen Probenaufarbeitung in 1:10 und 1:50 Verdünnung im Test innerhalb von ca. 30 Minuten

messen und ihre Mykotoxingehalte bestimmen.

Der Array Test kann sowohl quantitative Ergebnisse anhand der Mykotoxin-Standardkurven als

auch qualitative Ergebnisse anhand von cut off Werten liefern, die den in EU-Verordnungen fest-

gelegten Gehalten oder in Richtlinien für Futtermittel empfohlenen Höchstmengen weitest gehend

entsprechen.

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Abschlußbericht: 13053/21

Die Vorteile des Tests liegen außerdem in einem immensen Einsparpotenzial von Analysezeit und

Lösungsmittelverbrauch, der bei Durchführung einer gleichen Zahl von Analysen mit HPLC Me-

thoden zustande käme. Der Mykotoxin-Antikörper-Array weist selbst gegenüber den ELISA

Schnelltests noch Vorteile hinsichtlich einer kürzeren Analysezeit (s. Tab. 35) und einer einheitli-

chen Probenaufarbeitung auf.

Tab. 35 Lösungsmittelverbrauch und Analysezeit im Vergleich von HPLC, ELISA und Array, dargestellt für die Analyse von 7 Proben

ELISA HPLC lange Version FAST ELISA

Array

Verbrauch (ml) Zeitbedarf Zeitbedarf Zeitbedarf Mykotoxin

Methanol Acetonitril (Min) (Min) (Min) (Min)

Aflatoxine 28 28 140 90 15 DON 4 4 140 45 8

Fumonisine 79 0 105 45 15

Zearalenon 0 105 210 150 15

T-2 Toxin nicht bekannt nicht bekannt nicht bekannt 90 15

Total 111 137 595 420 68 20

R-Biopharm AG 12/2005 80

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Abschlußbericht: 13053/21

7 Kooperationen innerhalb des Projekts

Die Arbeitsgruppe von Professor Märtlbauer, LMU, München, hat in der ersten Phase des Projekts

die spezifischen Antikörper und Enzymkonjugate hergestellt und vorcharakterisiert. Der praktische

Teil der Zusammenarbeit war damit beendet. Der Kooperationspartner stand jedoch weiterhin zum

wissenschaftlichen Austausch zur Verfügung. Des weiteren bestehen enge Verbindungen zu Profes-

sor Usleber (TU, Giessen), der bei speziellen Fragestellungen zum Mykotoxin-Nachweis sehr wert-

volle Hinweise geben konnte und darüber hinaus auch bereits voruntersuchte Proben zur Verfügung

gestellt hat.

Darüber hinaus fand innerhalb des Firmenverbunds von R-Biopharm ein regelmäßiger Erfahrungs-

austausch mit den Mykotoxin Laboratorien von R-Biopharm Rhône (Glasgow, Schottland) und Tri-

logy Laboratory (Washington, MO, USA) statt, bei dem u.a. die Fortschritte des Projekts bespro-

chen werden.

8 Öffentlichkeitsarbeit

Das Projekt wurde in Form eines Flyers und Posters auf der ANUGA FOODTEC 2003 und auf der

ACHEMA 2003 vorgestellt sowie in einem Transkript Sonderband veröffentlicht

Reck B, Dietrich R, Bürk C, Lauer B, Reinard T „Innovative Nachweisverfahren für Mykotoxine“

in Transkript Sonderband 2003, 73 - 77

Die Veröffentlichung der Ergebnisse in einer Fachzeitschrift ist in Planung

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9 Literaraturverzeichnis

[1] Lebensmittel-Mykologie, edt. Martin Weidenbörner (1998) B. Behr’s Verlag, Hamburg

[2] Environmental Health Criteria 105 „Selected Mycotoxins“International Programme on chemical

Safety (IPCS), World Health Organisation 1990

[3] Mycotoxins: Risks in Plant, Animal and Human Systems, Task Force Report 139 (2003) edt by

the Council for Agricultural Science and Technology (CAST), Ames, Iowa, USA

[4] Gareis M (1999) Mykotoxine und Schimmelpilze. ForschungsReport-Zeitschrift des Senats der

Bundesforschungsanstalten 2, 4-5

[5] Rodemann B (1999) Mykotoxine in Getreide. ForschungsReport-Zeitschrift des Senats der

Bundesforschungsanstalten 2, 4-9

[6] Dänicke S, Valenta Hana (1999) Mykotoxine im Futter-Gefahr für landwirtschaftliche Nutztie-

re? ForschungsReport-Zeitschrift des Senats der Bundesforschungsanstalten 2, 10-13

[7] Krska R (1999) Analytik von Fusarium-Mykotoxinen in Europa. Nachr. Chem. Tech. Lab. 47

(Band 5) 553-556

[8] Candlish AAG, Haynes CA, Stimson WH (1988) Detection and determination of aflatoxins us-

ing affinity chromatography. Int. Journal Food Science and Technology 23, 479-485

[9] KOK WTh, Brinkmann UATh, Frei RW (1984) On-line electrochemical reagent production for

the detection in liquid chromatography and continuous flow systems. Analytica Chimica Archives

(1984), 19-32

[10] KOK WTh et al (1986) Determination of aflatoxins in cattle feed by liquid chromatography

and post column derivatization with electrochemically generated bromine. Journal of Chromatogra-

phy 367, 231-236

[11] Lombaert GA (2002) Methods for the determination of Deoxynivalenol and other Ttrichothe-

cenes in Food. in Mycotoxins and Food Safety edt by Trucksess et al KluwerAcademic/Plenum

Publishers, 141-153

[12] Shephard GS, Snydenham EW, Thiel PG, Gelderblom WCA (1990) Quantitative Determina-

tion of Fumonisin B1 and B2 by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence de-

tection. Journal Liquid Chromatography 13, 2077-2087

[13] Dietrich R, Schneider E, Usleber E, Märtlbauer E (1995) Use of Monoclonal Antibodies for the

Analysis of Mycotoxins Ntural Toxins 3, 288-293

R-Biopharm AG 12/2005 82

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Abschlußbericht: 13053/21

[14] Usleber E, Straka M, Terplan G (1994) Enzyme Immunoassay for Fumonisin B1 Applied to

Corn based Food. Journal of Agricultural and Food Chemistry 42, 1392-1396

[15] Gathumbi JK, Usleber E, Märtlbauer E (2001) Production of Ultrasensitive Antibodies against

Aflatoxin B1. Letters in Applied Microbiology 32, 349-351

[16] Hack R, Märtlbauer E, Terplan G (1989) A Monoclonal Antibody Based Enzyme Immunoas-

say for the Detection of T-2 Toxin at Picogram Levels. Letters in Applied Microbiology 9, 133-135

[17] Usleber E, RenzV, Märtlbauer E, Terplan G (1992) Studies on the Application of Enzyme Im-

munoassays for the Fusarium Mycotoxins Deoxynivalenonl, 3 Acetyldeoxynivalenol and

Zearalenone. Journal Vet. Med. B 39, 617-627

[18] Usleber E et al (1991) Direct Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay for the Detection of the

8-Ketotrichothecene Mycotoxins Deoxynivalenol, 3-Acetyl- , and 15- Acetyl in buffer solutions

Journal of Agricultural and Food Chemistry 39, 2091

R-Biopharm AG 12/2005 83

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 84

ANHANG Inhalt Seite

Liste der untersuchten Proben 85

Testreproduzierbarkeit mit Nullproben 86

Testreproduzierbarkeit mit dotierten Nullproben, Level 1 88

Testreproduzierbarkeit mit dotierten Nullproben, Level 2 90

Berechnung der Spezifität des Arrays bei Nullproben-Testung 92

Berechnung der Sensitivität des Arrays bei Kontrollproben-Testung 93

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Arrays bei Routine-Testung 95

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Arrays über alle Proben 97

Berechnung der Korrelationsdiagramme 99

Mykotoxin Höchstmengenverordnung der EU, ausführliche Tabelle 107

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 85

Liste der untersuchten Proben nach Probennummer, Probenart, Herkunft und Mykotoxinbelastung

Probennummer Probenart Herkunft Mykotoxinbelastung 776-1 bis –13 Weizen Universität Gießen DON Blankproben 913-1 bis 8 Mais Trilogy Aflatoxin belastet H3 Ergänzungsfutter für Pferde Raiffaisen Mykotoxin Blankprobe H4 Legehennenalleinfutter Raiffaisen Mykotoxin Blankprobe 766 Hafer Bioladen Mykotoxin Blankprobe 767 Weizen Bioladen Mykotoxin Blankprobe 768 Buchweizen Bioladen Mykotoxin Blankprobe 770 Dinkel Bioladen Mykotoxin Blankprobe 814-1 bis 5 Weizen Trilogy DON belastet 816-1 und 2 Weizen Trilogy DON belastet 884-3 Gerste Trilogy Aflatoxin Blankprobe 7 Mais Universität München Fumonisin belastet 93 Maisgries Universität München Fumonisin belastet 747 Mais FAPAS 10437 Aflatoxin belastet 2378 Mais AOAC Studie T-2 Toxin belastet 2224 Mais AOAC Studie T-2 Toxin belastet 378 Mais BCR, Referenzprobe DON belastet 494B Mais IFA Österreich, Ringstudie Zearalenon belastet 659-2 Mais Trilogy Aflatoxin belastet 762-2 Weizen Ringstudie Uruguay DON belastet 764-5 Mais R-Biopharm-Rhône DON belastet 1045-1 Weizen Trilogy Nullprobe 1045-2 Gerste Trilogy Nullprobe 1045-5 Mais Trilogy Aflatoxin Kontrollprobe 1059-1 bis 7 Mais Kundenanfrage Fumonisin? 1062-1 bis 5 Mais Kundenanfrage Fumonisin? 1089-1 bis 5 Weizen Kundenanfrage DON? 1098-1 Weizen Kundenanfrage diverse Mykotoxine? 1102-1 und 2 Roggen Kundenanfrage DON? 1130-1 bis 7 Mais Kundenanfrage Fumonisin ? 1131-1 bis 7 Weizen Kundenanfrage DON? 1134-2(1) Polenta Kundenanfrage Fumo und DON ? 1134-2(2) Maismehl Kundenanfrage Fumo und DON ? 1134-3 Maismehl Kundenanfrage Fumo und DON ? 1134-4(1) Maismehl Kundenanfrage Fumo und DON ? 1134-8 Maismehl Kundenanfrage Fumo und DON ? 1139 Mais Reformhaus Nullprobe

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R-Biopharm AG 2005 86

Testreproduzierbarkeit mit Nullproben (776-8) OD-Werte B/B0% - Werte und Auswertung

MTP1 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,027 0,826 1,037 1,096 0,759 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 0,905 0,699 1,081 0,989 0,651 std2 B/Bo 88,1 84,6 95,9 90,2 85,8

std 3 0,629 0,483 0,959 0,803 0,423 std3 B/Bo 61,2 58,5 88,7 73,3 55,7

std 4 0,338 0,337 0,455 0,445 0,318 std4 B/Bo 32,9 40,8 42,1 40,6 41,9

776-8 1,098 0,629 1,016 1,005 0,684 Korr. Koeff.: 0,994 0,968 0,957 0,999 0,929

776-8 0,818 0,715 1,030 0,997 0,654 50%-Dosis 0,479 29,6 44,1 1,5 5,7

776-8 0,773 0,646 1,064 1,006 0,654 Probe OD-Mw 0,877 0,670 1,038 1,002 0,666

776-8 0,820 0,690 1,041 1,002 0,672 VK (%) 17 5,9 2 0,4 2,2

MW 0,877 0,670 1,038 1,003 0,666 B/Bo 85,4 81,1 96 91,4 87,7

sd 0,149 0,040 0,020 0,004 0,015 Konz. 1,2 66,8 65,8 < Std2 <Std2

VK (%) 16,96 5,90 1,95 0,40 2,21

% B/Bo 85,4 81,1 100,1 91,5 87,7

MTP2 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,537 1,312 1,326 1,942 1,367 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,200 1,120 1,262 2,016 2,276 std2 B/Bo 78,1 85,4 87,6 88,4 78,7

std 3 0,853 0,802 0,872 1,344 0,765 std3 B/Bo 55,5 61,1 65,8 69,2 56,0

std 4 0,467 0,532 0,555 0,716 0,487 std4 B/Bo 30,4 40,5 41,9 36,9 35,6

776-8 1,163 1,084 1,278 1,765 1,160 Korr. Koeff.: 1,000 0,984 0,993 0,999 0,995

776-8 1,143 1,085 1,315 1,790 1,170 50%-Dosis 0,378 30,9 34,5 1,3 4,8

776-8 1,154 1,174 1,293 1,798 1,143 Probe OD-Mw 1,150 1,112 1,297 1,782 1,159

776-8 1,141 1,105 1,301 1,776 1,162 VK (%) 0,9 3,8 1,2 0,8 1,0

MW 1,150 1,112 1,297 1,782 1,159 B/Bo 74,8 84,8 97,8 91,8 84,8

sd 0,010 0,042 0,015 0,015 0,011 Konz. 1,2 < Std2 < Std2 < Std2 < Std2

VK (%) 0,89 3,82 1,19 0,82 0,98

% B/Bo 74,8 84,8 97,8 91,8 84,8

MTP3 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,463 1,324 1,349 1,733 1,296 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,168 1,079 1,160 1,575 0,960 std2 B/Bo 79,8 81,5 86 90,9 74,1

std 3 0,851 0,763 0,825 1,256 0,684 std3 B/Bo 58,2 57,6 61,2 72,5 52,8

std 4 0,452 0,442 0,527 0,617 0,394 std4 B/Bo 30,9 33,4 39,1 35,6 30,4

776-8 1,190 1,085 1,315 1,568 1,083 Korr. Koeff.: 1,000 0,998 0,986 0,998 1,000

776-8 1,185 1,087 1,320 1,585 1,109 50%-Dosis 0,406 24,2 29,9 1,3 3,8

776-8 1,222 1,088 1,268 1,619 1,126 Probe OD-Mw 1,160 1,099 1,277 1,595 1,089

776-8 1,044 1,134 1,207 1,606 1,038 VK (%) 6,8 2,2 4,1 1,4 3,5

MW 1,160 1,099 1,278 1,595 1,089 B/Bo 79,3 83 94,7 92 84,0

sd 0,079 0,024 0,053 0,023 0,038 Konz. 1,1 < Std2 <Std2 < Std2 < Std2

VK (%) 6,83 2,16 4,11 1,41 3,52

% B/Bo 79,3 83,0 94,7 92,0 84,0

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R-Biopharm AG 2005 87

OD-Werte B/B0% - Werte und Auswertung

MTP4 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,427 1,204 1,235 1,589 1,076 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,312 0,924 1,045 1,451 0,789 std2 B/Bo 91,9 76,0 84,6 91,3 73,3

std 3 1,031 0,672 0,795 1,147 0,545 std3 B/Bo 72,2 55,8 64,4 72,2 50,7

std 4 0,439 0,381 0,414 0,621 0,305 std4 B/Bo 30,8 31,6 33,5 39,1 28,3

776-8 1,117 0,941 1,243 1,463 0,924 Korr. Koeff.: 0,997 1,000 0,999 1,000 1,000

776-8 1,211 0,948 1,246 1,515 0,917 50%-Dosis 0,536 21,3 27,3 1,4 3,5

776-8 1,208 0,899 1,223 1,474 0,914 Probe OD-Mw 1,179 0,910 1,234 1,495 0,915

776-8 1,182 0,852 1,224 1,528 0,906 VK (%) 3,7 4,9 1 2,1 0,8

MW 1,180 0,910 1,234 1,495 0,915 B/Bo 82,6 75,6 99,9 94,1 85,0

sd 0,044 0,044 0,012 0,031 0,007 Konz. 1,9 60,6 < Std2 < Std2 < Std2

VK (%) 3,70 4,87 0,99 2,10 0,81

% B/Bo 82,7 75,6 99,9 94,1 85,1

MTP5 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,620 1,297 1,325 1,757 1,190 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,279 1,049 1,155 1,557 0,947 std2 B/Bo 79 80,9 87,2 88,6 79,6

std 3 0,926 0,739 0,794 1,219 0,644 std3 B/Bo 57,2 57 59,9 69,4 54,1

std 4 0,564 0,466 0,470 0,636 0,374 std4 B/Bo 34,8 35,9 35,5 36,2 31,4

776-8 1,755 1,068 1,321 1,569 1,024 Korr. Koeff.: 0,999 0,992 0,986 0,999 0,995

776-8 1,601 1,117 1,313 1,586 1,095 50%-Dosis 0,434 25,2 27,4 1,3 4,3

776-8 1,622 1,084 1,330 1,620 1,045 Probe OD-Mw 1,676 1,102 1,332 1,606 1,055

776-8 1,726 1,138 1,362 1,650 1,058 VK (%) 4,5 2,9 1,6 2,2 2,8

MW 1,676 1,102 1,332 1,606 1,056 B/Bo 103,5 85 100,5 91,4 88,7

sd 0,076 0,032 0,021 0,036 0,030 Konz. n a < Std2 n a < Std2 < Std2

VK (%) 4,53 2,87 1,61 2,24 2,83

% B/Bo 103,5 84,9 100,5 91,4 88,7

Zusammenfassung Nullproben

% B/Bo-Werte Konz. (ppb)

Lauf Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

1 85,4 81,1 96 91,4 87,7 1,2 66,8 65,8 < Std2 <Std2

2 74,8 84,8 97,8 91,8 84,8 1,2 < Std2 < Std2 < Std2 < Std2

3 79,3 83 94,7 92 84,0 1,1 < Std2 <Std2 < Std2 < Std2

4 82,6 75,6 99,9 94,1 85,0 1,9 60,6 < Std2 < Std2 < Std2

5 103,5 85 100,5 91,4 88,7 n a < Std2 n a < Std2 < Std2

Mw 85,1 81,9 97,8 92,1 86,0

sd 11,0 3,9 2,5 1,1 2,0

VK (%) 12,9 4,7 2,5 1,2 2,4

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 88

Testreproduzierbarkeit mit dotierten Nullproben, Level 1 OD-Werte B/B0% - Werte und Auswertung

MTP1 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea std 1 1,433 1,233 1,345 1,832 1,345 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,255 0,889 1,167 1,598 1,146 std2 B/Bo 87,6 72,1 86,8 87,2 85,2

std 3 0,897 0,732 0,79 1,288 0,766 std3 B/Bo 62,6 59,4 58,7 70,3 57

std 4 0,51 0,46 0,45 0,657 0,468 std4 B/Bo 35,6 37,3 33,5 35,9 34,8

Spike1 0,884 0,922 1,168 1,31 0,923 Korr. Koeff.: 0,994 0,984 0,988 0,992 0,981

Spike1 0,943 1,642# 1,172 1,493 0,947 50%-Dosis 0,513 24,80 25,80 1,300 5,100

Spike1 0,947 0,853 1,171 1,32 0,98 Probe OD-Mw 0,945 0,885 1,172 1,374 0,969

Spike1 1,006 0,88 1,178 1,372 1,025 VK (%) 5,3 3,9 0,4 6,1 4,6

MW 0,945 0,885 1,172 1,374 0,969 B/Bo 65,9 71,8 87,1 75 72

sd 0,050 0,035 0,004 0,084 0,044 Konz. 2,9 63,2 51,5# 4,8 21,4

VK (%) 5,27 3,93 0,36 6,12 4,56

% B/Bo 65,9 71,8 87,2 75,0 72,0

MTP2 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,541 1,350 1,621 1,890 1,331 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,329 1,072 1,326 1,723 1,075 std2 B/Bo 86,2 79,4 81,8 91,2 80,8

std 3 0,900 0,797 0,822 1,402 0,730 std3 B/Bo 58,4 59 50,71 74,2 54,8

std 4 0,519 0,493 0,475 0,693 0,435 std4 B/Bo 33,7 36,5 29,3 36,7 32,7

Spike1 0,930 0,902 0,966 1,316 0,839 Korr. Koeff.: 0,988 1 0,981 0,996 0,992

Spike1 1,002 1,816# 1,248 1,326 0,923 50%-Dosis 0,462 26,10 20,30 1,400 4,500

Spike1 0,933 0,862 1,119 1,350 0,888 Probe OD-Mw 0,946 0,873 1,121 1,323 0,894

Spike1 0,919 0,856 1,152 1,298 0,925 VK (%) 4 2,9 10,44 1,6 4,5

MW 0,946 0,873 1,121 1,323 0,894 B/Bo 61,4 64,7 69,2 70 67,1

sd 0,038 0,025 0,117 0,022 0,040 Konz. 3,1 130,3 98,2 7,2 21,8

VK (%) (%) 4,00 2,86 10,44 1,64 4,50

% B/Bo 61,4 64,7 69,2 70,0 67,1

MTP3 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,455 1,392 1,368 2,161 1,283 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,148 1,076 1,171 1,891 0,982 std2 B/Bo 78,9 77,3 85,6 87,5 76,5

std 3 0,823 0,829 0,812 1,667 0,780 std3 B/Bo 56,6 59,6 59,4 77,1 60,8

std 4 0,515 0,474 0,530 1,209 0,489 std4 B/Bo 35,4 34,1 38,7 55,9 38,1

Spike1 0,876 0,911 1,197 1,825 0,835 Korr. Koeff.: 0,997 0,996 0,979 0,993 0,997

Spike1 0,891 0,915 1,218 1,874 0,894 50%-Dosis 0,44 24,10 28,8 2,80 5,50

Spike1 0,975 0,867 1,113 1,791 0,901 Probe OD-Mw 0,914 0,944 1,134 1,837 0,877

Spike1 0,915 1,082 1,006 1,858 1,191# VK (%) 4,8 10 8,50 2 4,1

MW 0,914 0,944 1,134 1,837 0,877 B/Bo 62,8 67,8 82,9 85 68,3

sd 0,044 0,095 0,096 0,037 0,036 Konz. 2,4 101,9 63,61 3,1 19,8

VK (%) (%) 4,77 10,03 8,50 2,01 4,14

% B/Bo 62,8 67,8 82,9 85,0 68,3

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 89

OD-Werte B/B0% - Werte und Auswertung

MTP4 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,630 1,361 1,645 1,786 1,414 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,319 1,126 1,209 1,562 1,080 std2 B/Bo 80,9 82,7 73,5 87,5 76,4

std 3 0,958 0,830 0,824 1,286 0,794 std3 B/Bo 58,8 61 50,1 72 56,2

std 4 0,576 0,503 0,506 0,727 0,546 std4 B/Bo 35,3 37 30,8 40,7 38,6

Spike1 0,951 0,976 1,164 1,340 0,956 Korr. Koeff.: 0,999 0,999 0,996 0,994 0,994

Spike1 1,103 0,974 1,035 1,399 1,083 50%-Dosis 0,46 27,90 18,20 1,50 5,10

Spike1 0,935 0,872 1,069 1,299 0,937 Probe OD-Mw 0,983 0,93 1,104 1,326 1,0

Spike1 0,944 0,900 1,148 1,266 1,031 VK (%) 8,1 5,7 5,6 4,3 6,8

MW 0,983 0,931 1,104 1,326 1,002 B/Bo 60,3 68,3 67,1 74,2 70,9

sd 0,080 0,053 0,062 0,057 0,068 Konz. 2,9 125,5 77,8 5,4 15,4

VK (%) (%) 8,15 5,66 5,61 4,32 6,76

% B/Bo 60,3 68,4 67,1 74,2 70,8

MTP5 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,664 1,519 1,367 1,942 1,208 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,275 1,026 1,205 1,692 0,954 std2 B/Bo 76,6 67,5 88,1 87,1 79

std 3 0,996 0,748 0,817 1,329 0,739 std3 B/Bo 59,9 49,2 59,8 68,4 61,2

std 4 0,573 0,443 0,480 0,713 0,558 std4 B/Bo 34,4 29,2 35,1 36,7 46,2

Spike1 0,932 0,913 1,046 1,380 0,871 Korr. Koeff.: 0,994 0,999 0,983 0,998 0,989

Spike1 1,003 0,867 1,228 1,356 0,866 50%-Dosis 0,44 15,40 27,30 1,30 7,40

Spike1 0,860 0,866 1,287 1,374 0,896 Probe OD-Mw 0,91 0,902 1,181 1,375 0,9

Spike1 0,847 0,963 1,163 1,392 0,949 VK (%) 7,9 5,1 0,103 1,1 4,2

MW 0,911 0,902 1,181 1,376 0,896 B/Bo 54,7 59,4 86,4 70,8 74,1

sd 0,072 0,046 0,103 0,015 0,038 Konz. 3,5 92,2 59,8 5,7 15,6

VK (%) (%) 7,92 5,10 8,74 1,09 4,24

% B/Bo 54,7 59,4 86,4 70,8 74,1

Zusammenfassung Spike-Level 1

% B/Bo-Werte Konz. (ppb) Lauf Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

1 65,9 71,8 87,2 75,0 72,0 2,9 63,2 51,5# 4,8 21,4

2 61,4 64,7 69,2 70,0 67,1 3,1 130,3 98,2 7,2 21,8

3 62,8 67,8 82,9 85,0 68,3 2,4 101,9 63,6 3,1 19,8

4 60,3 68,4 67,1 74,2 70,8 2,9 125,5 77,8 5,24 15,4

5 54,7 59,4 86,4 70,8 74,1 3,5 92,2 59,8 5,7 15,6

Mw 61,0 66,4 78,5 75,0 70,5 2,96 102,6 74,9 5,2 18,8

sd 4,1 4,7 9,7 6,0 2,8 0,4 27,2 17,4 1,5 3,1

VK (%) 6,7 7,0 12,3 8,0 4,0 13,4 26,5 23,2 28,4 16,5

Dotierung 3 100 100 5 100 Wiederfindung (%) 98,7 102,6 74,9 104,8 74,9

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 90

Testreproduzierbarkeit mit dotierten Nullproben, Level 2

OD-Werte B/B0% - Werte und Auswertung

MTP1 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea std 1 2,058 1,335 1,951 2,134 1,364 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,306 1,090 1,205 1,720 1,091 std2 B/Bo 63,5 81,6 61,8 80,6 80

std 3 0,869 0,757 0,926 1,377 0,752 std3 B/Bo 42,2 56,7 47,5 64,5 55,1

std 4 0,483 0,554 0,532 0,758 0,450 std4 B/Bo 23,5 41,5 27,3 35,5 33

Spike2 0,733 0,714 0,847 1,188 0,752 Korr. Koeff.: 1,000 0,964 0,987 0,989 0,994

Spike2 0,739 0,744 0,835 1,154 0,800 50%-Dosis 0,201 28,8 12,4 1,1 4,5

Spike2 0,787 0,764 0,892 1,161 0,797 Probe OD-Mw 0,747 0,735 0,878 1,161 0,781

Spike2 0,728 0,716 0,878 1,143 0,774 VK 3,6 3,3 3,07 1,7 2,9

MW 0,747 0,735 0,863 1,162 0,781 B/Bo 36,3 55 44,2 54,4 57,2

sd 0,027 0,024 0,026 0,019 0,022 Konz. 4,1 228,9 175 9,2 33,2

VK (%) 3,64 3,26 3,07 1,65 2,87 ff

% B/Bo 36,3 55,0 44,2 54,4 57,2

MTP2 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea std 1 1,509 1,211 1,997 1,822 1,576 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,251 1,015 1,578 1,588 0,998 std2 B/Bo 82,9 83,8 79,0 87,2 63,3

std 3 0,904 0,723 0,949 1,250 0,766 std3 B/Bo 59,9 59,7 47,5 68,6 48,6

std 4 0,568 0,421 0,654 0,637 0,473 std4 B/Bo 37,6 34,8 32,7 35,0 30

Spike2 0,800 0,698 0,939 1,040 0,716 Korr. Koeff.: 0,994 0,997 0,9505 0,996 0,994

Spike2 0,744 0,659 0,905 1,006 0,692 50%-Dosis 0,502 26,2 19,9 1,2 2,7

Spike2 0,754 0,704 1,013 1,065 0,711 Probe OD-Mw 0,758 0,684 0,964 1,054 0,709

Spike2 0,733 0,674 0,997 1,103 0,718 VK (%) 3,9 3,1 5,2 3,9 1,7

MW 0,758 0,684 0,964 1,054 0,709 B/Bo 50,2 56,5 35,4 57,8 45

sd 0,029 0,021 0,050 0,041 0,012 Konz. 5,0 204,3 213,1 9,2 37,7

VK (%) 3,89 3,07 5,22 3,88 1,67

% B/Bo 50,2 56,5 48,2 57,8 45,0

MTP3 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea std 1 1,531 1,586 1,418 1,987 1,397 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,263 1,099 1,168 1,766 1,104 std2 B/Bo 82,5 69,3 82,4 88,9 79

std 3 0,905 0,790 0,842 1,352 0,779 std3 B/Bo 59,1 49,8 59,4 68 55,8

std 4 0,530 0,488 0,488 0,745 0,478 std4 B/Bo 34,6 30,8 34,4 37,5 34,2

Spike2 1,017# 0,758 0,891 1,139 0,810 Korr. Koeff.: 0,998 1,000 0,999 1,000 0,966

Spike2 0,773 0,788 0,869 1,124 0,750 50%-Dosis 0,461 16,7 25,6 1,3 4,6

Spike2 0,861 0,763 0,815 1,151 0,788 Probe OD-Mw 0,780 0,766 0,862 1,138 0,785

Spike2 0,707 0,753 0,872 1,137 0,793 VK (%) 9,9 2,0 3,8 1,2 3,2

MW 0,780 0,766 0,862 1,138 0,785 B/Bo 51 48,3 60,8 57,3 56,2

sd 0,077 0,016 0,033 0,011 0,025 Konz. 4,4 182,9 165,1 10,0 35,1

VK (%) 9,90 2,03 3,79 0,97 3,22

% B/Bo 51,0 48,3 60,8 57,3 56,2

Page 100: Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays ... · des Arrays mit gleichbleibender analytischer Qualität ausgegangen werden kann. Die Testkompo-nenten waren bei 4

Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 91

OD-Werte B/B0% - Werte und Auswertung

MTP4 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,320 1,328 1,524 1,786 1,285 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,086 0,955 1,013 1,599 0,955 std2 B/Bo 82,3 71,9 66,5 89,5 74,3

std 3 0,818 0,725 0,759 1,244 0,706 std3 B/Bo 62 54,6 49,8 69,7 54,9

std 4 0,407 0,443 0,425 0,601 0,366 std4 B/Bo 30,8 33,4 27,9 33,7 28,5

Spike2 0,606 0,695 0,852 0,993 0,623 Korr. Koeff.: 0,996 0,998 0,992 0,998 0,995

Spike2 0,645 1,058# 0,855 1,005 0,661 50%-Dosis 0,438 20,3 14,8 1,2 3,8

Spike2 0,613 0,798 0,848 1,003 0,625 Probe OD-Mw 0,627 0,747 0,862 1,018 0,636

Spike2 0,646 1,765# 0,891 1,071 0,917# VK (%) 3,3 9,8 2,3 3,5 3,4

MW 0,628 0,747 0,862 1,018 0,636 B/Bo 47,5 56,2 56,5 57 49,5

sd 0,021 0,073 0,020 0,036 0,021 Konz. 4,8 145,5 144,9 9,7 38,4

VK (%) 3,34 9,76 2,31 3,51 3,36

% B/Bo 47,5 56,2 56,5 57,0 49,5

MTP5 Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

std 1 1,710 1,162 2,101 1,870 1,665 std1 B/Bo 100 100 100 100 100

std 2 1,211 1,078 1,263 1,673 0,953 std2 B/Bo 70,8 92,8 60,1 89,5 57,2

std 3 0,871 0,905 0,834 1,367 0,644 std3 B/Bo 50,9 77,9 39,7 73,1 38,7

std 4 0,488 0,492 0,489 0,746 0,388 std4 B/Bo 28,5 42,3 23,3 39,9 23,3

Spike2 0,689 1,35# 0,910 1,079 0,642 Korr. Koeff.: 0,999 0,997 1 0,996 1

Spike2 0,763 0,694 0,891 1,020 0,661 50%-Dosis 0,301 40,1 9,7 1,5 1,7

Spike2 0,669 0,689 0,939 1,047 0,664 Probe OD-Mw 0,704 0,710 0,923 1,056 0,658

Spike2 0,696 0,747 0,950 1,079 0,665 VK (%) 5,8 4,5 2,9 2,7 1,6

MW 0,704 0,710 0,923 1,056 0,658 B/Bo 41,2 61,1 43,9 56,5 39,5

sd 0,041 0,032 0,027 0,028 0,011 Konz. 4,6 289 135 11,6 31,8

VK (%) 5,79 4,53 2,92 2,70 1,64

% B/Bo 41,2 61,1 43,9 56,5 39,5

Zusammenfassung Spike-Level 2

% B/Bo-Werte Konz. (ppb)

Lauf Afla DON Fumo T-2 Zea Afla DON Fumo T-2 Zea

1 47,5 56,2 56,5 57,0 49,5 4,1 228,9 175,0 9,2 33,2

2 50,2 56,5 48,2 57,8 45,0 5,0 204,3 213,1 9,2 37,7

3 51,0 48,3 60,8 57,3 56,2 4,4 182,9 165,1 10,0 35,1

4 47,5 56,2 56,5 57,0 49,5 4,8 145,5 144,9 9,7 38,4

5 41,2 61,1 43,9 56,5 39,5 4,6 289,0 135,0 11,6 31,8

Mw 47,5 55,7 53,2 57,1 48,0 4,58 210,1 166,6 9,94 35,2

sd 3,9 4,6 6,9 0,5 6,2 0,3 53,7 30,4 1,0 2,8

VK (%) 8,1 8,3 13,0 0,9 12,9 7,6 25,5 18,3 9,9 8,0

Dotierung 6 200 200 10 40

Wiederfindung % 76,3 105,1 83,3 99,4 88,1

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 92

Berechnung der Spezifität des Arrays bei Nullproben-Testung Spezifität = übereinstimmend neg. Proben / gesamte neg. Resultate d. Vergleichstest

Probenverdünnung 1/10 Afla DON Fumo T-2 Zea total

POS 0 2 1 0 3 6

NEG 22 20 21 22 19 104

fPOS/POS 0 2 von 2 0 0 3 von 3 5 von 6

fNEG/NEG 0 0 0 0 0

Spezifität 100 90,9 100 100 86,4 95,4

DON 1/10

Array-Resultate

POS NEG total

Vergleichs-Test pos 0 0

neg 2 20 22

total 2 20 22

Spezifität 20 von 22 90,9%

Zearalenon 1/10

Array-Resultate

POS NEG total

Vergleichs-Test pos 0 0 0

neg 3 19 22

total 3 19 22

Spezifität 19 von 22 86,4%

Gesamtresultate für 1/10 verdünnte Proben

Array-Resultate

POS NEG total

Vergleichs-Test pos 1 0 1

neg 5 104 109

total 6 104 110

Spezifität 104 von 110 95,4%

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R-Biopharm AG 2005 93

Berechnung der Sensitivität des Arrays bei Kontrollproben-Testung Sensitivität = übereinstimmend pos. Proben / gesamt pos Resultate d. Vergleichstest Spezifität = übereinstimmend neg. Proben / gesamt neg Resultate d. Vergleichstest

Probenverdünnung 1/10 Afla DON Fumo T-2 Zea total POS 10 13 13 5 18 59 NEG 15 12 12 20 7 66 fPOS 0 0 0 0 6 von 18 6 fNEG 0 0 0 0 0 0 Spezifität 100 100 100 100 53,8 91,7% Sensitivität 100 100 100 100 100 100,0% Zea Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 12 0 12 neg 6 7 13 total 18 7 25 Spezifität 7 von 13 53,8% Sensitivität 12 von 12 100,0% Gesamtresultate für 1/10 verdünnte Proben Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 53 0 53 neg 6 66 72 total 59 66 125 Spezifität 66 von 72 91,7% Sensitivität 53 von 53 100,0%

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R-Biopharm AG 2005 94

Berechnung der Sensitivität des Arrays bei Kontrollproben-Testung Sensitivität = übereinstimmend pos. Proben / gesamt pos Resultate d. Vergleichstest Spezifität = übereinstimmend neg. Proben / gesamt neg Resultate d. Vergleichstest

Probenverdünnung 1/50 Afla DON Fumo T-2 Zea total POS 6 8 8 2 5 29 NEG 19 17 17 23 20 96 fPOS 0 0 1 von 8 0 0 1 fNEG 0 1 von 17 1 von 17 0 0 2 Spezifität 100 100 94,1% 100 100 98,9% Sensitivität 100 88,9% 87,5% 100 100 93,3% DON Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 8 1 9 neg 0 16 16 total 8 17 25 Spezifität 16 von 16 100,0% Sensitivität 8 von 9 88,9%

Fumo Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 7 1 8 neg 1 16 17 total 8 17 25 Spezifität 16 von 17 94,1% Sensitivität 7 von 8 87,5%

Gesamtresultate für 1/50 verdünnte Proben Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 28 2 30 neg 1 94 95 total 29 96 125 Spezifität 94 von 95 98,9% Sensitivität 28 von 30 93,3%

Gesamtresultate für 1/10 und 1/50 verdünnte Proben Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 81 2 83 neg 7 160 167 total 88 162 250 Spezifität 94 von 95 95,8% Sensitivität 28 von 30 97,6%

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R-Biopharm AG 2005 95

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Arrays bei Routine-Testung Sensitivität = übereinstimmend pos. Proben / gesamt pos Resultate d. Vergleichstest Spezifität = übereinstimmend neg. Proben / gesamt neg Resultate d. Vergleichstest

Probenverdünnung 1/10 Afla DON Fumo T-2 Zea totalPOS 3 25 21 7 12 68 NEG 38 16 20 34 29 137 fPOS 1/3 8/25 3/21 0 5/12 17/68fNEG 0 0 0 0 0 0 spez 97,4% 66,7% 87,0% 100,0% 85,3% 89,0%sens 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Afla 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 2 0 2 neg 1 38 39 total 3 38 41 Spezifität 97,4% Sensitivität 100,0%

DON 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 17 0 17 neg 8 16 24 total 25 16 41 Spezifität 66,7% Sensitivität 100,0%

Fumo 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 18 0 18 neg 3 20 23 total 21 20 41 Spezifität 87,0% Sensitivität 100,0%

Zea 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 7 0 7 neg 5 29 34 total 12 29 41 Spezifität 85,3% Sensitivität 100,0%

total 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 51 0 51 neg 17 137 154 total 68 137 205 Spezifität 89,0% Sensitivität 100,0%

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R-Biopharm AG 2005 96

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Arrays bei Routine-Testung Sensitivität = übereinstimmend pos. Proben / gesamt pos Resultate d. Vergleichstest Spezifität = übereinstimmend neg. Proben / gesamt neg Resultate d. Vergleichstest Probenverdünnung 1/50 Afla DON Fumo T-2 Zea totalPOS 1 4 15 0 1 21 NEG 40 37 26 41 40 184 fPOS 0 0 0 0 0 0 fNEG 1 0 1/26 0 0 2/21 spez 100 100 100 100 100 100 sens 50,0% 100 93,8 100 100 95,5 Afla 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 1 1 2 neg 0 39 39 total 1 40 41 Spezifität 100,0% Sensitivität 50,0% Fumo 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 15 1 16 neg 0 25 25 total 15 26 41 Spezifität 100,0% Sensitivität 93,8% total 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 21 2 23 neg 0 182 182 total 21 184 205 Spezifität 100,0% Sensitivität 91,3% total 1/10 und 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 72 2 74 neg 17 319 336 total 89 321 410 Spezifität 94,9% Sensitivität 97,3%

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R-Biopharm AG 2005 97

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Arrays über alle Proben Probenverdünnung 1/10 Afla DON Fumo T-2 Zea totalPOS 13 40 35 12 33 133 NEG 75 48 53 76 55 307 fPOS 1/13 10/40 3/35 0 14/33 28/133fNEG 0 0 0 0 0 0spez 98,7% 82,8% 94,6% 100,0% 79,7% 91,6%sens 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100% Afla 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 12 0 12 neg 1 75 76 total 13 75 88 Spezifität 98,7% Sensitivität 100,0% DON 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 30 0 30 neg 10 48 58 total 40 48 88 Spezifität 82,8% Sensitivität 100,0% Fumo 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 32 0 32 neg 3 53 56 total 35 53 88 Spezifität 94,6%

Sensitivität 100,0%

Zea 1/10 Array-Resultate

POS NEG total

Vergleichs-Test pos 19 0 19

neg 14 55 69

total 33 55 88

Spezifität 79,7%

Sensitivität 100,0%

total 1/10 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 105 0 105 neg 28 307 335 total 133 307 440 Spezifität 91,6% Sensitivität 100,0%

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R-Biopharm AG 2005 98

Berechnung der Spezifität und Sensitivität des Arrays über alle Proben

Probenverdünnung 1/50 Afla DON Fumo T-2 Zea total POS 7 12 23 2 6 50NEG 81 76 65 86 82 390fPOS 0 0 1 0 0 1 von 50fNEG 1 1 2/65 0 0 4/390 spez 100,0% 100,0% 98,4% 100,0% 100,0% 99,7% sens 87,5% 92,3% 91,7% 100,0% 100,0% 92,5%

Afla 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 7 1 8 neg 0 80 80 total 7 81 88 Spezifität 100,0% Sensitivität 87,5%

DON 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 12 1 13 neg 0 75 75 total 12 76 88 Spezifität 100,0% Sensitivität 92,3%

Fumo 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 22 2 24 neg 1 63 64 total 23 65 88 Spezifität 98,4%

Sensitivität 91,7%

Zea 1/50 Array-Resultate POS NEG total

Vergleichs-Test pos 6 0 6 neg 0 82 82 total 6 82 88

Spezifität 100,0% Sensitivität 100,0%

total 1/50 Array-Resultate POS NEG total Vergleichs-Test pos 49 4 53 neg 1 386 387 total 50 390 440 Spezifität 99,7% Sensitivität 92,5%

total 1/10 und 1/50 Array-Resultate POS NEG total

Vergleichs-Test pos 154 4 158 neg 29 693 722 total 183 697 880 Spezifität 96,0% Sensitivität 97,5%

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 99

Berechnung der Korrelationsdiagramme Aflatoxin-Test

Proben-Nr. Art Array Vergleich

747 Mais 4,2 3,7 HPLC

927 Mais 4,9 12,3 HPLC

913-2 Mais 5,5 4,3 HPLC

927 Mais 6,1 12,3 HPLC

659-2 Mais 24,4 42 HPLC

913-2 Mais 6,6 4,3 HPLC

913-3 Mais 13,8 12,6 HPLC

913-4 Mais 19,5 19,9 HPLC

913-5 Mais 25,9 30,2 HPLC

913-6 Mais 28,3 39,9 HPLC

1045-5 Mais 9,3 15 HPLC

Anzahl der Datenpaare n = 11

Steigung m 1,3773

Achsenabschnitt b -1,0215

Bestimmtheitsmaß r2 = 0,8596

Regressionsgerade x Y

0,4 -0,4706

10 12,7511

50 67,8417

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 100

DON-Test

Proben-Nr. Art Array Vergleichstest 747 Mais 0,68 1,20 ELISA

494B Mais 0,19 0,13 ELISA

762-2 Weizen 0,9 1,20 HPLC

764-5 Mais 0,62 0,41 HPLC

814-6 Weizen 0,62 0,40 HPLC

816-1 Weizen 1,32 1,60 HPLC

816-2 Weizen 0,71 0,70 HPLC

2378 Mais 0,82 1,30 ELISA

2224 Mais 1,69 2,00 ELISA

747 Mais 1,1 1,20 ELISA

378, BCR Mais 0,8 0,43 HPLC

762-2 Weizen 1,2 1,20 HPLC

764-5 Mais 0,48 0,41 HPLC

814-4 Weizen 3 3,30 HPLC

814-6 Weizen 0,69 0,40 HPLC

816-1 Weizen 1,84 1,60 HPLC

816-2 Weizen 0,94 0,70 HPLC

1059-1 Mais 0,207 0,30 ELISA

1059-2 Mais 0,7 0,47 HPLC

1059-3 Mais 0,33 0,11 HPLC

1059-5 Mais 0,37 0,38 HPLC

1059-5 Mais 0,91 0,38 HPLC

1059-6 Mais 0,89 0,35 HPLC

1059-7 Mais 0,64 0,20 HPLC

1062-2 Mais 0,396 0,14 HPLC

1062-3 Mais 0,5 0,29 HPLC

1062-3 Mais 0,44 0,29 HPLC

1062-4 Mais 1,78 1,50 ELISA

1089-3 Weizen 0,24 0,31 HPLC

1089-3 Weizen 0,48 0,31 HPLC

1089-4 Weizen 0,35 0,32 HPLC

1089-4 Weizen 0,44 0,32 HPLC

1089-5 Weizen 0,11 0,16 HPLC

1089-5 Weizen 0,44 0,16 HPLC

1131-1 Weizen 0,28 0,65 HPLC

1131-1 Weizen 0,4 0,65 HPLC

1131-4 Weizen 0,44 0,78 HPLC

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 101

DON-Test, Fortsetzung

Proben-Nr. Art Array Vergleichstest

1131-4 Weizen 0,65 0,78 HPLC

1131-6 Weizen 0,85 0,65 HPLC

1134-2(1) Polenta 0,97 0,46 ELISA

1134-3 Maismehl 1,1 1,20 ELISA

1134-4(1) Maismehl 0,5 0,30 HPLC

1134-4(1) Maismehl 0,38 0,30 HPLC

1134-8 Maismehl 1,25 1,26 ELISA

x y Anzahl der Datenpaare n = 44

Steigung m= 1,0481

Achsenabschnitt b= -0,0923

Bestimmheitsmass r2 = 0,8182

Array Vergl

Regressionsgerade x y

0,3 0,2221

2 2,0039

4,7 4,8339

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 102

Fumonisin Vergleichsdaten Korrelationsdiagramm

Original Daten korrigierte Array - Daten (Faktor: 0,64)

Proben-Nr. Art Array Vergleich Array Vergleich Korrekturfaktor

659-2 Mais 1 1,86 659-2 0,64 1,86 0,64 Ausreißer

93 Mais 1,3 0,32 93 0,83 0,32 0,64 Ausreißer

2378 Mais 0,26 0,12 2378 0,17 0,12 0,64 HPLC

2224 Mais 0,23 0,12 2224 0,15 0,12 0,64 HPLC

747 Mais 0,32 0,26 747 0,20 0,26 0,64 HPLC 764-5 Mais 0,57 0,35 764-5 0,36 0,35 0,64 HPLC 927 Mais 1,7 1,30 927 1,09 1,3 0,64 HPLC

764-5 Mais 0,63 0,35 764-5 0,40 0,35 0,64 HPLC 913-2 Mais 2,87 1,74 913-2 1,84 1,74 0,64 HPLC 913-4 Mais 1,49 0,88 913-4 0,95 0,88 0,64 HPLC 913-5 Mais 1,83 0,92 913-5 1,17 0,92 0,64 HPLC 913-6 Mais 1,82 1,13 913-6 1,16 1,13 0,64 HPLC

1134-2(1) Mais 0,1 0,10 1134-2(1) 0,10 0,1 1 HPLC 1059-4 Mais 1,8 1,70 1059-4 1,80 1,7 1 HPLC 1059-6 Mais 0,58 0,50 1059-6 0,58 0,5 1 HPLC 1059-7 Mais 1,5 1,50 1059-7 1,50 1,5 1 HPLC 1062-1 Mais 0,98 1,50 1062-1 0,98 1,5 1 HPLC

n = 17 n = 15

Steigung m = 0,6289 m 0,9794

Achsenabschnitt b = 0,1026 b 0,0178

Bestimmtheitsmaß r2 = 0,5590 r2 = 0,9203

Regressionsgerade x y x y

0,1 0,1157 0,1 0,1157

5 4,9145 5 4,9145

10 9,8113 10 9,8113

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 103

Zearalenon Test

Proben-Nr. Art Array Vergleichstest

378, BCR Mais 100 113 ELISA 494B Mais 109 100 HPLC 814-4 Weizen 154 231 ELISA 816-1 Weizen 98 111 ELISA

378, BCR Mais 105 113 ELISA 494B Mais 108 100 HPLC 814-2 Weizen 558 498 ELISA 814-4 Weizen 315 231 ELISA 816-1 Weizen 147 111 ELISA 2378 Mais 427 384 ELISA 2224 Mais 63 39 ELISA 816-2 Weizen 53 53 ELISA 913-2 Mais 55 42 ELISA 913-8 Mais 55 41 ELISA

1059-2 Mais 72 174 HPLC 1059-3 Mais 30 24 HPLC 1059-5 Mais 74 138 HPLC 1059-6 Mais 94 109 HPLC 1059-7 Mais 46 46 HPLC 1062-3 Mais 52 31 ELISA 1130-1 Mais 49 13 HPLC 1130-3 Mais 55 16 HPLC 1131-5 Weizen 68 51 ELISA 1134-8 Maismehl 85 73 HPLC 1059-2 Mais 148 174 HPLC 1059-3 Mais 58 24 HPLC 1059-5 Mais 170 138 HPLC 1059-6 Mais 187 109 HPLC 1059-7 Mais 112 46 HPLC 1131-5 Weizen 73 51 ELISA 1134-8 Maismehl 128 73 HPLC

Anzahl der Datenpaare n= 31

Steigung m 0,8661 Achsenabschnitt b 4,0068 Bestimmtheitsmaß r2 = 0,8690 Regressionsgerade x y

1 4,9 100 90,6 670 584,3

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 104

Alle Daten Konzentration in ppb

Proben-Nr. Art Array Vergleichstest

Fumo 93 832 320Ausreißer

Fumo 659-2 640 1860Ausreißer

DON 747 680 1200

DON 494B 190 130

DON 762-2 900 1200

DON 764-5 620 410

DON 814-6 620 400

DON 816-1 1320 1600

DON 816-2 710 700

DON 2378 820 1300

DON 2224 1690 2000

DON 747 1100 1200

DON 378, BCR 800 430

DON 762-2 1200 1200

DON 764-5 480 410

DON 814-4 3000 3300

DON 814-6 690 400

DON 816-1 1840 1600

DON 816-2 940 700

DON 1059-1 207 300

DON 1059-2 700 470

DON 1059-3 330 110

DON 1059-5 370 380

DON 1059-5 910 380

DON 1059-6 890 350

DON 1059-7 640 200

DON 1062-2 396 140

DON 1062-3 500 290

DON 1062-3 440 290

DON 1062-4 1780 1500

DON 1089-3 240 310

DON 1089-3 480 310

DON 1089-4 350 320

DON 1089-4 440 320

DON 1089-5 110 160

DON 1131-1 280 650

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 105

Alle Daten, Fortsetzung Konzentration in ppb

Proben-Nr. Art Array Vergleichstest

DON 1131-1 400 650

DON 1131-4 440 780

DON 1131-4 650 780

DON 1131-6 850 650

DON 1134-2(1) 970 460

DON 1134-3 1100 1200

DON 1134-4(1) 500 300

DON 1134-4(1) 380 300

DON 1134-8 1250 1260

Fumo 2378 166,4 120

Fumo 2224 147,2 120

Fumo 747 204,8 260

Fumo 764-5 364,8 350

Fumo 927 1088 1300

Fumo 764-5 403,2 350

Fumo 913-2 1836,8 1740

Fumo 913-4 953,6 880

Fumo 913-5 1171,2 920

Fumo 913-6 1164,8 1130

Fumo 1134-2(1) 100 100

Fumo 1059-4 1800 1700

Fumo 1059-6 580 500

Fumo 1059-7 1500 1500

T-2 Toxin 2378 150 111 T-2 Toxin 2224 362 231

Zea 1062-1 980 1500

Zea 378, BCR 100 113

Zea 494B 109 100

Zea 814-4 154 231

Zea 816-1 98 111

Zea 378, BCR 105 113

Zea 494B 108 100

Zea 814-2 558 498

Zea 814-4 315 231

Zea 816-1 147 111

Page 115: Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays ... · des Arrays mit gleichbleibender analytischer Qualität ausgegangen werden kann. Die Testkompo-nenten waren bei 4

Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 106

Alle Daten, Fortsetzung Konzentration in ppb

Proben-Nr. Art Array Vergleichstest

Zea 2378 427 384

Zea 2224 63 39

Zea 816-2 53 53

Zea 913-2 55 42

Zea 913-8 55 41

Zea 1059-2 72 174

Zea 1059-3 30 24

Zea 1059-5 74 138

Zea 1059-6 94 109

Zea 1059-7 46 46

Zea 1062-3 52 31

Zea 1130-1 49 13

Zea 1130-3 55 16

Zea 1131-5 68 51

Zea 1134-8 85 73

Zea 1059-2 148 174

Zea 1059-3 58 24

Zea 1059-5 170 138

Zea 1059-6 187 109

Zea 1059-7 112 46

Zea 1131-5 73 51

Zea 1134-8 128 73

Afla 747 4,2 3,7

Afla 927 4,9 12,3

Afla 913-2 5,5 4,3

Afla 927 6,1 12,3

Afla 659-2 24,4 42,0

Afla 913-2 6,6 4,3

Afla 913-3 13,8 12,6

Afla 913-4 19,5 19,9

Afla 913-5 25,9 30,2

Afla 913-6 28,3 39,9

Afla 1045-5 9,3 15,0 Anzahl der Datenpaare n = 103 Steigung m 0,99765903 Achsenabschnitt b -27,459399 Bestimmheitsmass r x r 0,89101827 Regressionsgerade x y 0,3 -27,160102 500 471,370116 3900 3863,41082

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Endbericht: 13053/21, Anhang

R-Biopharm AG 2005 107

Mykotoxin Höchstmengenverordnung der EU, ausführliche Tabelle

Mykotoxin Lebensmittel MRL µg/kg (ppb)

EU-Verordnung

Aflatoxine Getreide, Nüsse und Trockenfrüchte Kindernahrungsmittel

4 Aflatoxin B1, B2, G1 und G2

2 Aflatoxin B1

0,1 Aflatoxin B1 oder Summe aller Metabolite

1525/98 683/2004

DON unbehandeltes Getreide außer Hartweizen, Hafer und Mais unbehandelter Hartweizen und Hafer unbehandelter Mais Getreidemehle, eingeschlossen Mais-mehle und Nudeln Brotware und Fühstücks-Zerealien Kindernahrungsmittel auf Getreidebasis

1250 1750 1750 (in Diskussion) 750 500 200

856/2005

Fumonisine unbehandelter Mais Maismehl Kindernahrungsmittel auf Maisbasis

2000 (in Diskussion) 1000 (in Diskussion) 200 (in Diskussion)

856/2005

Zearalenon unbehandeltes Getreide außer Mais unbehandelter Mais und Maismehl Getreidemehl außer Maismehl Maismehl Brot und Frühstück-Zerealien Kindernahrungsmittel auf Getreidebasis (außer Mais)

100 200 (in Diskussion) 75 200 (in Diskussion) 50 20

856/2005

Ochratoxin unbehandelte Getreide verarbeitete Getreide zum direkten Ver-zehr Kindernahrungsmittel auf Getreidebasis

5 3 0,5

123/2005

T-2 Toxin und HT-2 Toxin

das Gesundheitsrisiko durch die Mykotoxine ist anerkannt. Es sind jedoch noch Studien notwendig, um zulässige Höchstwerte festlegen zu können Vorgesehener Termin für eine entsprechende Verordnung ist Juli 2007

856/2005

*) Maximal Residue Level (zulässiger Höchstwert)