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Abschlussbericht Gesellschaft für Anwendungen biologischer Verfahren mbH

Zum Forschungsvorhaben

Entwicklung eines Verfahrens zum biologischen Pflanzenschutz durch den Einsatz bakterieller

Antagonisten gegen Bakteriosen im Pflanzenbau

Autoren des Berichts: Dr. Stefan Kunz (Bio-System GmbH, Konstanz) Dr. Peter Laux (BBA, Inst. für biol. Pflanzenschutz, Darmstadt)

Auftragnehmer: Bio-System GmbH

Auftraggeber: Bundesministerium für Bildung, Forschung und Wissenschaft

Förderkennzeichen: 0311785

Laufzeit des Vorhabens: 01. April 1998 bis 30. Juni 2001

Berichtszeitraum: 01. April 1998 bis 30. Juni 2001

Projektleiter: Dr. Stefan Kunz ( ab 01.04.1999)

Dr. Friedhelm Berger (01.04.1998-31.03.1999)

Mitarbeiter/innen: Prof. Dr. Eckart Frehland

Dipl. Biol. Michael Schuster

Dipl. Ing. Gudrun Mögel

Dipl. Biol. Clas Busack

Dipl. Biol. Thomas Reinberg

Inken Martens

Kristina Hofer

Abschlussbericht zum Projekt 0311785

Inhalt

1. AUFGABENSTELLUNG..........................................................................................................................4

2. VORAUSSETZUNGEN UNTER DENEN DAS PROJEKT DURCHGEFÜHRT WURDE ..............5

3. WISSENSCHAFTLICHER UND TECHNISCHER STAND, AN DEN ANGEKNÜPFT WURDE .6

4. ZUSAMMENARBEIT MIT ANDEREN STELLEN..............................................................................7

5. DARSTELLUNG DER ERZIELTEN ERGEBNISSE ...........................................................................8

5.1 AUSWAHL GEEIGNETER MIKROORGANISMEN ...........................................................................................8

5.2 ENTWICKLUNG VON PRODUKTIONSVERFAHREN .......................................................................................9

5.2.1 Bacillus subtilis .............................................................................................................................11

5.2.2 Rahnella aquatilis .........................................................................................................................13

5.2.3 Aureobasidium pullulans ..............................................................................................................13

5.2.4 Sporobolomyces roseus.................................................................................................................14

5.3 LAGERFÄHIGKEIT DER MIKROORGANISMEN ...........................................................................................14

5.3.1 Bacillus subtilis BD170.................................................................................................................15

5.3.2 Rahnella aquatilis 39 ....................................................................................................................17

5.3.3 Aureobasidium pullulans CF40 ....................................................................................................18

5.4 EINSATZ DER MIKROORGANISMEN GEGEN DEN FEUERBRANDERREGER..................................................18

5.4.1 Aufbau eines in vivo Testsystems ..................................................................................................19

5.4.1.1 Wirkung verschiedener Mikroorganismen ...........................................................................................20

5.4.1.2 Einfluss der Formulierung auf die Wirkung .........................................................................................21

5.4.1.3 Einfluss der Anwendungskonzentration auf die Wirkung ....................................................................22

5.4.1.4 Einfluss des Einsatzzeitpunktes auf die Wirkung.................................................................................23

5.4.2 Wirkung der Mikroorganismen im Freiland .................................................................................25

5.4.2.1 Freilandversuche mit künstlicher Inokulation ......................................................................................25

5.4.2.2 Kombinationsverfahren ........................................................................................................................27

5.4.2.3 Freilandversuche unter natürlichen Infektionsbedingungen .................................................................28

5.4.2.4 Wirkung auf im Freilandversuch entnommenen Apfelblüten...............................................................29

5.5 MISCHBARKEIT MIT PFLANZENSCHUTZMITTELN UND WACHSTUMSREGULATOREN................................30

5.6 WIRKUNGSMECHANISMEN DER MIKROORGANISMEN..............................................................................32

5.6.1 Bildung antibiotischer Substanzen durch die Mikroorganismen .................................................32

5.6.1.1 Agardiffusionstest ................................................................................................................................32

5.6.1.2 Extraktion von Überstand und Zellsubstanz mit organischen Lösungsmitteln .....................................33

5.6.1.3 Wachstum von E. amylovora 7/74 in Kulturfiltraten antagonistischer Stämme...................................34

5.6.3 Nährstoffkonkurrenz......................................................................................................................35

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5.6.3 Resistenzinduktion.........................................................................................................................36

6. DARSTELLUNG DER VERWERTBARKEIT DER ERGEBNISSE ................................................40

6.1 PRODUKTIONSVERFAHREN .....................................................................................................................40

6.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR FEUERBRANDBEKÄMPFUNG .............................................................................41

7. DARSTELLUNG DER WÄHREND DER DURCHFÜHRUNG VON DRITTER SEITE

BEKANNT GEWORDENEN ERGEBNISSE .......................................................................................42

8. VERÖFFENTLICHUNGEN...................................................................................................................43

9. LITERATUR............................................................................................................................................44

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1. Aufgabenstellung

Pflanzen werden in allen Entwicklungsstadien oberflächlich von einer Vielzahl von Bakte-

rien besiedelt. Besonders bei feuchten Bedingungen können diese epiphytisch lebenden

Organismen leicht durch Spaltöffnungen, Hydathoden, Lenticellen oder Wunden in das

Pflanzengewebe eindringen. Während sich bei kompatiblen Interaktionen eindringende

Bakterien in den Intercellularen der Pflanze vermehren, ausbreiten und Symptome bilden,

werden die Bakterien bei inkompatiblen Interaktionen durch pflanzliche Abwehrmecha-

nismen inaktiviert. Weltweit sind ca. 400 bakteriell bedingte Pflanzenkrankheiten mit zum

Teil erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung bekannt (Kleinhempel et al., 1989).

Viele Mikroorganismen besiedeln Pflanzen epiphytisch, ohne dabei Schäden zu verursa-

chen. Im biologischen Pflanzenschutz wird versucht, durch eine gezielte Ansiedlung

epiphytischer Mikroorganismen die Ansiedlung und Vermehrung phytopathogener Bakte-

rien auf der Pflanzenoberfläche zu reduzieren, und dadurch deren Eindringen und die

Infektion der Pflanze zu verhindern. Mehrere Forschungsarbeiten zeigen, dass die An-

siedlung von antagonistischen Bakterien auf den Narben von Apfel- und Birnblüten die

Vermehrung des Feuerbranderregers Erwinia amylovora unterdrückt, und dadurch der

Befall reduziert wird (Johnson und Stockwell, 1998; Pusey, 1997).

Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte im Rahmen dieses Forschungsvorhabens ein

biologisches Präparat mit pflanzenstärkender Wirkung gegen schwer bekämpfbare Bakte-

riosen im Obstbau entwickelt und zur Marktreife geführt werden. Der Schwerpunkt der

Forschung lag auf der Bekämpfung des Feuerbranderregers (Erwinia amylovora) mit

Mikroorganismen. Dazu mussten geeignete Stämme selektiert und charakterisiert werden,

für die dann ein biologisch und ökonomisch günstiges Produktionsverfahren entwickelt

werden sollte. Für ein kommerziell nutzbares Präparat musste eine geeignete Formulie-

rung gefunden werden. Die Formulierungsstoffe dürfen keinen negativen Einfluss auf die

Wirkung des Präparates haben und müssen die Lagerfähigkeit und die Handhabung des

Präparates verbessern.

Der Aufbau eines in vivo Testsystems, bei dem Obstbaumblüten auch außerhalb der

Blühperiode für Versuche zur Verfügung standen, erlaubte die Untersuchung der Wirk-

samkeit verschiedener Mikroorganismen und Formulierungen und auch eine Optimierung

der Anwendungskonzentration.

Zum Nachweis der Wirksamkeit mussten mit den Präparaten Freilandversuche unter

natürlichen und künstlichen Infektionsbedingungen durchgeführt werden. Untersuchungen

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zum Wirkungsmechanismus der eingesetzten Mikroorganismen sollten Rückschlüsse auf

den richtigen Applikationstermin geben. Um die Aktzeptanz der Präparate zu erhöhen,

wurden Daten zur Mischbarkeit mit handelsüblichen Fungiziden, Insektiziden und Wachs-

tumsregulatoren erarbeitet.

2. Voraussetzungen unter denen das Projekt durchgeführt wurde

Die Firma Bio-System GmbH arbeitet zusammen mit der Tochterfirma Bi-Utec GmbH an

der Entwicklung von mikrobiologischen Verfahren in der Abfallentsorgung und Abwasser-

reinigung. Der Einsatz von Mikroorganismen im biologischen Pflanzenschutz sollte als

weiterer Geschäftszweig etabliert werden. Die Erfahrung beider Unternehmen in der

Produktion und in der Handhabung von Mikroorganismen sollte in dieses Projekt einflie-

ßen. Die Forschungsarbeiten konzentrierten sich hauptsächlich auf die Bekämpfung des

Feuerbranderregers Erwinia amylovora. Hier konnte auf die Erfahrung aus über zehnjäh-

riger Forschung am Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA zurückgegriffen

werden. Außerdem war durch den Standort der Firma Bio-System im Bodenseegebiet,

welches selbst vom Feuerbrand betroffen ist, und durch die Kontakte zu Obstbauern und

den amtlichen und privaten Beratern ein ständiger Austausch mit der Praxis gewährleistet.

Die Nähe zur Schweiz, in der sich der Feuerbrand in den letzten Jahren sehr stark aus-

breitete, entpuppte sich als weiterer Vorteil. Da auch dort dringend nach Bekämpfungs-

möglichkeiten gesucht wird, konnten weitere Partner für die Durchführung von Freiland-

versuchen gewonnen werden.

Der Feuerbrand zählt zu den gefährlichsten Krankheiten im Obstbau. Unter günstigen

Befallsbedingungen können ganze Obstanlagen innerhalb eines Jahres absterben. Das

Bakterium E. amylovora wurde in Nordamerika bereits 1878 als Verursacher des Feuer-

brandes identifiziert. In Europa trat diese Krankheit erstmals 1957, in Deutschland 1971

auf. Mit den daraufhin erlassenen Quarantänemaßnahmen konnte eine weitere Ausbrei-

tung des Erregers nicht verhindert werden, so dass er seit Anfang der 1990er Jahre alle

Obstbaugebiete in Deutschland erreicht hatte. Bis im Jahr 2000 waren auch alle Anbau-

gebiete der Schweiz betroffen. Der Befall breitete sich innerhalb der Anbaugebiete weiter

aus, so dass vor allem im Streuobst auch schon eine umfangreiche Rodung nötig war.

Als mögliche Bekämpfungsmaßnahmen werden der Einsatz von Antibiotika, Gesteins-

mehlpräparaten, Pflanzenaktivatoren, Pflanzenextrakten oder bakterieller Antagonisten

diskutiert (Backhaus und Klingauf, 1998). Von den Obstbauverbänden und von den Pflan-

zenschutzdiensten der Länder wird seit Jahren die Zulassung von Plantomycin gefordert.

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Plantomycin enthält den Wirkstoff Streptomycin, der als Antibiotikum auch in der Human-

medizin eingesetzt wird. In den USA, Kanada und in Israel, wo dieser Wirkstoff in großem

Umfang angewendet wurde, hat der Feuerbranderreger Resistenzen entwickelt (Johnson

und Stockwell, 1998; Manulis et al., 1998; Sholberg et al., 2001). Obwohl in Deutschland

bisher keine resistenten Erreger aus dem Freiland isoliert werden konnten (Moltmann,

1999), darf diese Gefahr nicht vernachlässigt werden. Zusätzlich warnen Ökologen und

Mediziner davor, dass bei großflächigem Streptomycineinsatz in der Landwirtschaft auch

viele Nicht-Zielorganismen dem Selektionsdruck ausgesetzt werden, und sich die Strep-

tomycinresistenz in vielen Bakterien bis hin zu Humanpathogenen ausbreiten könnte.

Aufgrund dieser ständigen Diskussion zwischen Befürwortern und Gegnern eines Strep-

tomycineinsatzes herrschte in den letzten sieben Jahren eine unklare Zulassungssituation

für Plantomycin. So wurde in den Jahren 1994-1998 jeweils kurzfristig vor Saisonbeginn

eine Zulassung per Sonderverfügung der BBA erteilt. 1999 war Plantomycin nicht zuge-

lassen. Im Jahr 2000 wurde dann eine Zulassung für Streptomycin erteilt, die aber seit

März 2001 ausgesetzt ist, da Rückstände des Wirkstoffes in Honigen gefunden wurde.

Diese auch für die Obstbauern unbefriedigende Situation führte dazu, dass die Suche

nach möglichen Alternativen von vielen Seiten unterstützt wurde und das Interesse von

Pflanzenschutzdiensten, Obstbauern und Politikern an den Forschungsarbeiten groß war.

Die unklare Zulassungssituation beim Plantomycin führte aber auch dazu, dass eine

wirtschaftliche Kalkulation für den Aufbau einer Produktion eines alternativen Präparates

und für dessen Vertrieb bisher nicht möglich war, da der Markterfolg sehr stark von der

Verfügbarkeit von Plantomycin abhängig sein wird.

3. Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde

Am Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA in Darmstadt beschäftigt man sich

seit Ende der 1980er Jahren mit der Suche nach bakteriellen Antagonisten zum Einsatz

gegen den Feuerbrand. Mikroorganismen mit vielversprechender Wirkung wurden isoliert,

charakterisiert und auf Ihre Wirkung gegen den Feuerbranderreger mit verschiedenen

Methoden getestet (Wolf, 1994). Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte ein marktfähi-

ges Präparat zum Einsatz gegen den Feuerbrand im Obstbau entwickelt werden.

Die in den Vorversuchen am Institut für biologischen Pflanzenschutz verwendeten Bakte-

rienstämme wurden für die jeweiligen Versuche frisch angezogen. Die so gefundenen

Wirkungen in vitro und in vivo zeigen das Potenzial, das diese Mikroorganismen bei der

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Bekämpfung des Feuerbranderregers haben (Wolf, 1994). Ein ökonomisch günstiges

Produktionsverfahren musste gefunden werden, welches die großtechnische Produktion

der Mikroorganismen erlaubt, aber keinen negativen Einfluss auf deren Wirksamkeit hat.

Ebenso verhält es sich mit Formulierungsstoffen, die dem Präparat zur Verbesserung der

Lagerfähigkeit und des Handlings zugegeben werden müssen.

Ansätze zur Formulierung von Mikroorganismen zum Einsatz gegen Feuerbrand konnten

aus amerikanischen Forschungsarbeiten abgeleitet werden (Johnson et al., 1993). John-

son und Mitarbeiter (1993) setzten den Bakteriensuspensionen Milchpulver zu und ge-

wannen durch Lyophilisierung ein Bakterienpulver, das von Bienen ausgetragen wurde

oder in Wasser gelöst gespritzt werden konnte. Der Stamm A506 (Pseudomonas floures-

cens) ist in den USA in dem kommerziellen Präparat Blight Ban A506 enthalten, C9-1S

(Erwinia herbicola) wird in den USA hinsichtlich seiner Eignung zur Feuerbrandbekämp-

fung getestet. Beide Stämme haben eine Antibiotikaresistenz, was eine Genehmigung in

Deutschland erschweren würde. Allerdings konnten aus den Erfahrungen mit diesen

Antagonistenstämmen in den USA wertvolle Anhaltspunkte für die Entwicklung eines

Präparates gewonnen werden. So konnte für A506 und C9-1S gezeigt werden, daß sich

gefriergetrocknete Bakterien im Freiland auf Apfel– und Birnenblüten besser etablieren als

frisch angezogene Bakterien (Stockwell et al., 1998). Da getrocknete Bakterien auch

besser zu lagern und zu handhaben sind, war es naheliegend ein Präparat auf der Basis

von getrockneten Mikroorganismen anzustreben.

Weitere Versuchsergebnisse zeigen, daß ausgebrachte Mikroorganismen sich in Abhän-

gigkeit von der Witterung in der Obstanlage über mehrere Reihen ausbreiten (Nuclo et al.,

1998). Das Verteilen der Mikroorganismen durch Insekten wird beim kommerziellen Ein-

satz helfen, einen gleichmäßigen Besatz der Blüten zu bekommen. Selbst Blüten, die bei

der Applikation noch nicht geöffnet sind, können durch die Insekten später noch mit Mik-

roorganismen besetzt werden. Dadurch kann man im Vergleich zu Antibiotika eventuell

die Anzahl der Behandlungen reduzieren.

4. Zusammenarbeit mit anderen Stellen

Das Projekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für biologischen Pflanzenschutz

der BBA in Darmstadt durchgeführt. Dadurch konnte auf die dort bereits im Vorfeld getes-

teten Stämme zurückgegriffen werden. Die bereits vorhandenen Ergebnisse zur Wirkung

der Mikroorganismen dienten als Anhaltspunkt bei der Auswahl des Produktionsstammes.

Zusätzlich wurden am Institut für biologischen Pflanzenschutz Versuche zum Wirkungs-

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mechanismus der Isolate und zur Wirksamkeit der Stämme und der Präparate unter

künstlichen und natürlichen Infektionsbedingungen durchgeführt. Weitere Versuche unter

künstlichen oder natürlichen Infektionsbedingungen wurden von den Pflanzenschutz-

diensten der Länder Baden-Württemberg und Rheinland Pfalz, der Fachhochschule Wei-

henstephan (Versuchsstation Schlachters) sowie von der eidgenössischen Versuchsan-

stalt Wädenswil und den kantonalen Pflanzenschutzdiensten der Schweiz durchgeführt.

Den Versuchsanstellern wurden die Präparate zur Verfügung gestellt. Die Rückmeldun-

gen ergaben wichtige Anhaltspunkte für die weitere Entwicklung der Präparate.

Eine Kooperation mit der Universität Konstanz führte zum Aufbau eines in vivo Testsys-

tems. In den Gewächshäusern der Universität konnten Apfelblüten auch außerhalb der

Blühsaison gewonnen werden, an denen die Wirksamkeit verschiedener Mikroorganismen

und verschiedener Formulierungen getestet wurden. Für die Produktion der Mikroorga-

nismen wurde mit der Firma Bi-Utec GmbH und mit dem Interuniversitären Forschungsin-

stitut für Agrarbiotechnologie in Tulln (IFA) zusammengearbeitet. Bei Bi-Utec steht für die

Produktion eines mikrobiellen Rohrreinigungsmittels eine kleine Produktionseinheit (Vo-

lumen: 10l). Diese konnte für die Anzucht der Mikroorganismen für Freilandversuche

genutzt werden. Das Scale-up des Produktionsverfahrens in den technischen Maßstab

und die Pilotproduktion wurde am IFA durchgeführt.

5. Darstellung der erzielten Ergebnisse

5.1 Auswahl geeigneter Mikroorganismen

Vom Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA wurden drei Isolate zur Verfügung

gestellt, die in Vorarbeiten zur Bekämpfung des Feuerbranderregers eingesetzt wurden

(Wolf und Zeller, 1993). An der Universität Konstanz wurden diverse Bakterien und Pilze

von Apfelpflanzen isoliert und auf ihre Wirkung gegen Apfelfäuleerreger getestet (Falconi

und Mendgen, 1994; Leibinger, 1996; Schiewe und Mendgen, 1992). Da diese Mikroor-

ganismen auf Apfelpflanzen epiphytisch vorkommen wird eine gute Etablierung auf Apfel

erwartet, was Voraussetzung für die Wirkung ist. Vor allem die pilzlichen Isolate waren

von großem Interesse. Von Hefen ist bekannt, dass sie bei hohen Zuckerkonzentrationen

wie sie im Nektar von Apfelblüten vorkommen, besser wachsen können als viele Bakteri-

en (Pusey, 1999). Eine gute Vermehrung in der Apfelblüte ist zur Bekämpfung des Feuer-

branderregers von entscheidendem Vorteil.

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Alle im Projekt verwendeten Isolate wurden zur Bestimmung bei der DSMZ eingereicht

(Tab.1). Nur mit Isolaten, die der Risikogruppe 1 zugeordnet werden konnten wurden

weitere Versuche durchgeführt. Aus diesem Grund wurde der Stamm Pantoea agglome-

rans 21889 nicht weiter untersucht, obwohl er in Vorarbeiten gute Wirkung gegen den

Feuerbranderreger zeigte (Laux et al., 1999; Wolf, 1994).

Tabelle 1: Bezeichnung und Einordnung der Mikroorganismen

Bezeichnung Art (Nach Bestimmung bei der DSMZ)

Risikogruppe Herkunft

BD170 Bacillus subtilis 1 BBA Darmstadt

AG704 Bacillus subtilis 1 Uni Konstanz

HG77 Bacillus amyloliquefaciens 1 Uni Konstanz

Ra39 Rahnella aquatilis 1 BBA Darmstadt

Pa21889 Pantoea agglomerans 2 BBA Darmstadt

CF35 Sporobolomyces roseus 1 Uni Konstanz

CF10 Aureobasidium pullulans 1 Uni Konstanz

CF40 Aureobasidium pullulans 1 Uni Konstanz

Die anderen Stämme wurden in einem in vivo Test auf Apfelblüten auf Ihre Wirksamkeit

überprüft (Glp. 5.4.1). Parallel wurden Versuche zur wirtschaftlichen Produzierbarkeit der

Stämme durchgeführt (Glp. 5.2). Anhand beider Parameter wurde der Bacillus subtilis

Stamm BD170 als Wirkorganismus für das zu entwickelnde Präparat ausgewählt.

5.2 Entwicklung von Produktionsverfahren

Das Produktionsverfahren für ein mikrobielles Präparat wird in die Arbeitsschritte Stamm-

erhaltung, Fermentation, Aufarbeitung und Konfektionierung gegliedert (Abb. 1). Während

der Aufarbeitung und Konfektionierung können geeignete Formulierungsmittel zugesetzt

werden. Der gesamte Produktionsablauf muss mit geeigneten Methoden der Qualitäts-

kontrolle überwacht werden.

Die Stammerhaltung wird parallel im Labor und bei der Sicherheitshinterlegung der DSMZ

durchgeführt. Dauerkulturen werden entweder in Glycerin bei –20° C oder lyophilisiert

gelagert. Alle Experimente wurden mit aus Dauerkulturen angezogenen Kulturen durchge-

führt, um Stammveränderungen durch mehrmaliges überimpfen zu vermeiden. Auch bei

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der Produktion von Versuchschargen wurde die Anzucht jeweils mit einer Probe aus der

Sicherheitshinterlegung begonnen.

Stammerhaltung Fermentation Aufarbeitung Konfektionieren

Vermehrung und Konservierung des Produktionsstammes

Anzucht der Mikro-organismen in mehrstufiger Fer-mentation

Trennung von Zellen und Überstand

Trocknen oder flüssig formulieren

Einstellen der ge-wünschten Endkon-zentration

Verpacken

Zugabe von Formulierungsmitteln

Q u a l i t ä t s k o n t r o l l e

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Produktionsverfahrens für mikrobielle Präparate

Für die Fermentation eines Mikroorganismus muss das Medium optimiert und die Tempe-

ratur- und pH-Bereiche für optimales Wachstum müssen bekannt sein. Alle verwendeten

Mikroorganismen konnten in einem kostengünstigen Produktionsmedium ohne Zusatz von

organischem Stickstoff angezogen werden. Bei der Anzucht im Schüttelkolben, mussten

Pufferkomponenten entsprechend dem pH-Optimum zugegeben werden. Die einzelnen

Mikroorganismen zeigten unterschiedliche Ansprüche an die Wachstumsbedingungen

(Tab. 2).

Die Aufarbeitung, Formulierung, Qualitätskontrolle und Konfektionierung wurde nicht für

alle Mikroorganismen im Detail geklärt. Die Arbeiten konzentrierten sich auf den B. subtilis

Stamm BD170. Mit diesem Wirkorganismus wurde das Pflanzenstärkungsmittel BIOPRO®

entwickelt. Im folgenden sind die Produktionsbedingungen für die verschiedenen Arten

aufgeführt, soweit sie im Rahmen dieses Forschungsprojektes erarbeitet werden konnten.

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Tabelle 2: Wachstumsbedingungen für die Mikroorganismen. Zur Bestimmung der opti-malen Bedingungen wurden Wachstumskurven in Schüttelkulturen mit Produktionsmedi-um anhand der Zunahme der OD660 (Bakterien) bzw. der Zellzahl (Hefen) ermittelt.

Stamm Temperaturoptimum (Bereich)a

pH-Optimum (Bereich) a

Max. Zelldichte Verdopp-lungszeit bei Optimum (h)

BD170 42 (<22->50) 7 (<6->8) 5x 109 Sporen/ml 1,1

AG704 42 (<17->42) n.b. n.b. 1,4

HG77 32 (<17->42) n.b. n.b. 3,9

Ra39 22 (<17-32) n.b. 1x 1010 Zellen/ml 3,4

CF35 25 (<10-27) 7 (3->8) 5x 108 Zellen/ml 3,4

CF10 27 (<19-32) n.b. 5x 108 Zellen/ml 3,0

CF40 27 (<7-32) 5 (<3-7,5) 8x 108 Zellen/ml 2,9 a Angegeben wird der Bereich, in dem das Isolat gewachsen ist. < bzw. > bedeutet, dass

keine tieferen bzw. höheren Werte getestet wurden.

5.2.1 Bacillus subtilis

B. subtilis ist ein sporenbildendes Bakterium (Sneath et al., 1986). Die Endosporen wer-

den als Dauerorgane zur Überbrückung ungünstiger Wachstumsbedingungen wie Nähr-

stoffmangel und Austrocknung gebildet. Die Sporen sind hitzeresistent und bleiben über

Jahre keimfähig. Diese Eigenschaften erleichtern die Herstellung von stabilen Präparaten.

Deshalb war das Ziel, ein Produktionsverfahren zu finden, das eine möglichst hohe Aus-

beute an hitzeresistenten Sporen ergibt. Dazu mussten Fermentationsbedingungen (Me-

dium, Sauerstoffversorgung, Temperatur, pH) gefunden werden, die ein gutes Wachstum

der B. subtilis Kultur ermöglicht und am Ende der Wachstumsphase die Sporulation

induziert.

Vorversuche im Schüttelkolben (100ml) zeigten, dass B. subtilis in einem Medium ohne

organischen Stickstoff Zelldichten bis zu 5x109 Sporen/ml erreicht. Deshalb wurden die

weiteren Optimierungsschritte und das Scale-up mit diesem kostengünstigen Produkti-

onsmedium durchgeführt. Die Verwendung von größeren Schüttelkolben (1l) führte zu

einem deutlichen Rückgang bei der Ausbeute. Dies wird auf die schlechte Sauerstoffver-

sorgung in den Kolben zurückgeführt. Im Laborfermenter (Labfors, Infors GmbH) konnten

die Wachstums- und Sporulationsbedingungen optimiert werden, so dass eine reprodu-

zierbare Ausbeute von 5 x109 Sporen/ml nach 30h erreicht wurde.

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Das Scale-up in den technischen Maßstab wurde am IFA-Tulln durchgeführt. Fermentati-

onen im 800l und 3000l Fermenter ergaben Ausbeuten von 2 x109 – 5 x109 Sporen /ml.

Dies zeigt, dass die Fermentation des B. subtilis Stammes BD170 auch im Großfermenter

mit befriedigenden Ausbeuten möglich ist. Bei einer Ausbeute von 5x 109 Sporen/ml ist

eine wirtschaftliche Produktion möglich. Durch weitere Optimierungsschritte werden Aus-

beuten von 1x 1010 Sporen/ml angestrebt, wie sie für andere B. subtilis Stämme be-

schrieben wurden (Junge et al., 1998).

Zur Aufarbeitung der Sporensuspension zu einem handelsfähigen Produkt, wurden ver-

schiedene Methoden getestet. Zur Reduktion des Volumens wurde Zentrifugation oder

Filtration eingesetzt. Keine der Methoden wirkte sich negativ auf die Keimfähigkeit der

Sporen aus. Bei diesem Schritt werden auch die Reststoffe aus dem Fermentationsmedi-

um abgetrennt. Dies ist bei der Zulassung von mikrobiellen Präparaten von Bedeutung, da

im Medium diverse schwer definierbare Stoffwechselprodukte der Bakterien vorhanden

sein können (Lüth, 2000). Bei der Pilotproduktion im Großfermenter wurde die Sporen-

suspension über eine Zentrifuge aufkonzentriert. Dabei wurden ca. 95% des Fermentati-

onsmediums abgetrennt. Es entstand ein Bakterienschlamm mit einem Anteil von 14-

16% Trockensubstanz.

Neben der Verwendung dieses Bakterienschlammes in flüssigen Formulierungen wur-

den Möglichkeiten zum Trocknen der Sporen mit geeigneten Trägerstoffen getestet. Das

Ziel war, ein leicht resuspendierbares Pulver mit geringem Staubanteil zu bekommen. Die

Keimfähigkeit der Sporen sollte durch den Trocknungsprozess nicht beeinträchtigt wer-

den.

Mit dem Gerfriertrocknen, Sprühtrocknen, und Wirbelschichttrocknen stehen drei Verfah-

ren zum Trocknen von Mikroorganismen zur Auswahl. Die Gefriertrocknung wurde mit

kleineren Mengen nach Zugabe verschiedener Formulierungsmittel getestet. Das Gefrier-

trocknen hatte keinen Einfluss auf die Keimrate der Sporen. Die Keimraten wurden auch

nicht vom verwendeten Trägerstoff beeinflusst. Das Gefriertrocknen wurde zur Erstellung

von Proben mit verschiedenen Formulierungsmitteln eingesetzt.

Für die großtechnische Produktion ist das Sprühtrocknen wirtschaftlicher. Die Optimierung

der Sprühtrocknung wurde von der Firma Nubilosa in Konstanz auf einer Pilotanlage

durchgeführt. Dort gelang es wirtschaftlich vertretbare Trocknungsbedingungen zu finden,

die ein rieselfähiges, staubarmes Sporenpulver ergaben. Das Sporenpulver kann

problemlos in Wasser resuspendiert und mit praxisüblichen Spritzen im Obstbau ausge-

bracht werden. Das so gewonnene Sporenpulver des Isolates B. subtilis BD170 ist

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werden. Das so gewonnene Sporenpulver des Isolates B. subtilis BD170 ist Grundlage für

die Herstellung des Pflanzenstärkungsmittel BIOPRO® .

Zur Qualitätskontrolle wurde während des gesamten Produktionsablaufs die Konzentrati-

on an Zellen bzw. Sporen von B. subtilis überprüft. Auf geeigneten Selektivmedien, auf

denen B. subtilis nicht wächst, wurde nach Kontaminanten gesucht. Dadurch wurde si-

chergestellt, dass das Präparat nicht mit anderen Mikroorganismen verunreinigt ist.

Parallel zur Entwicklung von BIOPRO®, wurden auch Versuche zur Entwicklung einer

flüssigen Formulierung des B. subtilis Isolates durchgeführt. Es zeigte sich, dass die

Sporen in Wasser gelagert zwar stabil sind. Die Gefahr, dass Kontaminanten (anaerobe

Bakterien, Pilze) in oder auf der Sporensuspension wachsen, ist aber sehr groß. Deshalb

müssen der Sporensuspension geeignete Konservierungsmittel zugegeben werden, die

das Wachstum möglicher Kontaminanten verhindern.

5.2.2 Rahnella aquatilis

Das gram-negative Bakterium Rahnella aquatilis vermehrt sich im Schüttelkolben im

Produktionsmedium bis zu einer Bakteriendichte von 1010 Zellen/ml. Die Dichte der Kultur

war dabei nicht von der Größe des Schüttelkolbens abhängig. Durch diese hohen Aus-

beuten wäre dieses Bakterium für eine technische Produktion geeignet. Allerdings bildet

dieses Bakterium keine Dauerformen, so dass die Konservierung hoher Lebendkeimzah-

len sich als schwierig erwies. Die Aufarbeitung der Zellsuspension in der Zentrifuge über-

lebten noch 90% der eingesetzten Zellen. Das Gefriertrocknen mit Magermichpulver als

Trägerstoff führte jedoch zu Lebendkeimzahlen von maximal 7% der eingesetzten Zellen.

Dieses Pulver war nicht lagerstabil. Bisher konnte auch keine stabile Flüssigformulierung

entwickelt werden. Das Bakterium müsste also jeweils kurz vor dem Applikationstermin

produziert und ausgeliefert werden. Dies erschwert die Verwendung in einem Präparat

erheblich.

5.2.3 Aureobasidium pullulans

Aureobasidium pullulans wird der Gruppe der schwarzen Hefen zugeordnet. Die Art kann

Mycel und mehrere Sorten morphologisch unterschiedlicher Hefezellen bzw. Sporen

bilden (Andrews et al., 1994). Am einfachsten lassen sich die als Blastosporen bezeich-

neten Hefezellen in Submerskultur produzieren. In bisherigen Versuchen zur Bekämpfung

der Apfelfäulen (Leibinger, 1996) und zur Bekämpfung des Feuerbrandes (Glp. 5.5) wur-

den Blastosporen mit gutem Erfolg eingesetzt.

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Der Stamm Aureobasidium pullulans CF40 wächst im Schüttelkolben im Produktionsme-

dium bei pH 5,0 und 27°C auf eine Dichte von 5x 108 Zellen/ml. Auch bei der Fermentati-

on dieses Stammes im Laborfermenter konnte diese Zelldichte reproduzierbar erreicht

werden. Die Hefezellen eignen sich auch für eine kontinuierliche Anzucht, so dass mit

verhältnismäßig kleinen Fermentern große Mengen produziert werden können.

Als problematisch erwies sich allerdings die Aufarbeitung der Hefezellen zu einem stabi-

len, lagerfähigen Produkt. In weiteren Arbeiten sollen deshalb Produktionsbedingungen

für Chlamydosporen erarbeitet werden. Diese dienen bei A. pullulans als Dauerorgane

und sind vergleichbar den Bakteriensporen resistent gegenüber diversen Umweltbedin-

gungen. Chlamydosporen haben gegenüber Blastosporen auch den Vorteil, das sie

besser auf Blattoberflächen anhaften (Andrews et al., 1994). Dadurch erreicht man eine

bessere Etablierung des Wirkorganismus auf der Pflanze, wodurch die Wirkung bei der

biologischen Schädlingsbekämpfung verbessert wird.

5.2.4 Sporobolomyces roseus

Die rote Hefe S. roseus bildet weder Mycel noch Dauerformen. Im Schüttelkolben wurden

mit dem Isolat CF35 unter optimalen Bedingungen im Produktionsmedium Dichten von 5x

108 Hefezellen/ml erreicht. Auch hier war die Aufarbeitung der Hefezellen zu einem stabi-

len Präparat bisher nicht möglich.

5.3 Lagerfähigkeit der Mikroorganismen

Ein wichtiger Aspekt für die Vermarktung eines Präparates ist seine Haltbarkeit. Bei einer

Lagerstabilität von weniger als einem Jahr, muss die Produktion termingerecht zur Saison

erfolgen. Die Saison für Präparate, die gegen den Feuerbranderreger eingesetzt werden

sollen, ist mit ca. 4 Wochen kurz und der Einsatz des Mittels hängt von den Witterungs-

bedingungen ab. Die Bereitstellung von ausreichenden Mengen eines Präparates, das in

der darauffolgenden Saison nicht mehr eingesetzt werden kann, wäre mit einem hohen

wirtschaftlichen Risiko verbunden.

Deshalb war es notwendig, Formulierungen und Lagerbedingungen für die mikrobiellen

Präparate zu finden, die eine Haltbarkeit von mindestens 15 Monaten möglich machen.

14


5.3.1 Bacillus subtilis BD170

Die von B. subtilis gebildeten Endosporen sind als Dauerorgane resistent gegenüber

verschiedenen Umwelteinflüssen. Endosporen können über 10 Jahre lang keimfähig

bleiben (Sneath et al., 1986). Zur Beurteilung der Haltbarkeit eines Präparates reicht es

aber nicht aus, dass einzelne Sporen keimfähig bleiben, sondern der Titer an keimfähigen

Sporen muss hoch bleiben. Um den Einfluss der Formulierungsmittel und der Lagerbe-

dingungen auf die Haltbarkeit zu testen, wurden mit verschiedenen Proben Lagerversu-

che angesetzt.

Eine der ersten Proben war ein gefriergetrocknetes Sporenpulver (Trägerstoff: Mager-

milchpulver) mit einem Gehalt von 1,5x 1010 Sporen/g und einer Restfeuchte von 9%.

Dieses wurde in Alliquots aufgeteilt, die bei -20°C, bei 4° C, bei Raumtemperatur oder im

Freien, den natürlichen Temperaturschwankungen ausgesetzt, gelagert wurden. Nach 20

Monaten Lagerung konnten in den Varianten noch bis zu 8,4x109 Sporen/g festgestellt

werden. Dies entspricht noch über 50% der Ausgangskonzentration (Abb. 2). Die

Schwankungen zwischen den Messungen werden auf die Inhomogenität des Pulvers

zurückgeführt. Tendenziell sind die Sporen bei tiefen Temperaturen stabiler.

Die Haltbarkeit getrockneter Sporen hängt vom Restfeuchtegehalt des Pulvers ab. Die

Haltbarkeit ist bei geringen Restfeuchten besser (Junge et al., 1998). Beim Sprühtrocknen

konnte mit ca. 2,5% ein geringerer Restfeuchtegehalt im Pulver erreicht werden als beim

Gefriertrocknen. Dies sollte die Haltbarkeit der Sporen verbessern.

Die für die Freilandversuche 2001 produzierte Charge von BIOPRO® hatte einen Rest-

feuchtegehalt von 2,3%. Eine Rückstellprobe wurde nach zwei Monaten Lagerzeit auf die

Konzentration an keimfähigen Sporen überprüft. Direkt nach der Produktion wurden in 5

Stichproben Konzentrationen zwischen 1,8x1010 und 2,2 x1010 Sporen/g gefunden. Nach

zwei Monaten waren es in 5 Stichproben zwischen 1,7 x 1010 und 2,4 x 1010 Sporen/ g.

Die Sporenkonzentration im BIOPRO® war über den begrenzten Zeitraum stabil. Weitere

Bestimmungen werden Aufschluss darüber geben, ob das sprühgetrocknete Präparat

tatsächlich stabiler ist, als die gefriergetrockneten Pulver.

Zur Überprüfung der Lagerfähigkeit von B. subtilis Sporen in flüssiger Formulierung wurde

eine Sporensuspension zentrifugiert und in drei Alliquots aufgeteilt. Die Pellets wurden in

entionisiertem Wasser oder Leitungswasser aufgenommen, bzw. nach der Aufnahme in

entionisiertem Wasser mit 20% Milchpulver gefriergetrocknet. Die drei Proben wurden bei

20° C gelagert und in regelmäßigen Abständen wurde die Keimrate bestimmt (Abb. 3).

15


Die Sporenkonzentration nimmt im Pulver über den Versuchszeitraum von 300d um 50%

ab. Dies entspricht den Erfahrungen mit anderen gefriergetrockneten Pulvern. In den

flüssig formulierten Ansätzen, war die Konzentration über den Versuchszeitraum stabil.

6

7

8

9

10

11

0 100 200 300 400 500 600Zeit (d)

log

cfu/

g

20° C

-18°C

4°C

im Freien

Abbildung 2: Entwicklung der Konzentration von B. subtilis BD170 Sporen in gefriergetrocknetem Pulver bei der Lagerung unter verschiedenen Bedingungen.

8

9

10

11

0 50 100 150 200 250 300Zeit (d)

log

cfu/

g

ention. Wasser

Leitungswasser

Magermilchpulver

Abbildung 3: Entwicklung der Konzentration von BD170 Sporen in gefrierge-trocknetem Pulver und in Lösung in entionisiertem Wasser und in Leitungswasser bei der Lagerung bei 20°C.

16


Alternativ zum Trocknen ist also eine Lagerung der Sporen in flüssiger Formulierung

möglich. Hier müssen aber noch geeignete Maßnahmen gefunden werden, die das

Wachstum von Pilzen in der Suspension unterdrücken. Im Lagerversuch wurde die Spo-

rensuspension steril in sterilisierte Gefäße abgefüllt. Dies ist in einer Produktionsanlage

nicht praktikabel.

Deshalb müssen andere Möglichkeiten zur Konservierung der Sporen gefunden werden.

Zu diesem Zweck wurden Alliquots einer Sporensuspension mit Säure oder Base versetzt

und pH-Werte von pH 3,0 bis 11,0 eingestellt. Weder das Absenken noch das Anheben

des pH-Wertes in der Suspension hatte nach 3 Monaten einen Einfluss auf die Keimfähig-

keit der Sporen. Nur beim tiefsten und höchsten pH-Wert konnte allerdings das Wachstum

von Kontaminanten vollständig unterdrückt werden. Lagerversuche, zur Untersuchung der

Stabilität der flüssigen Formulierungen wurden angesetzt.

5.3.2 Rahnella aquatilis 39

0

25

50

75

100

125

150

0 20 40 60 80 100 120Zeit (d)

cfu

(% d

es S

tart

wer

tes) Pulver 20°C

Flüssig 4°CKonzentrat 4°CFlüssig 20°C

Abbildung 4: Entwicklung der Konzentration von Ra39 Kulturen bei der Lagerung als Pulver oder in flüssiger Formulierung.

Zwei Chargen von R. aquatilis 39 mit einer Zellzahl von 1x 1010 cfu/ml wurde mit Milchpul-

ver versetzt gefriergetrocknet. Nach dem Trocknen war die Keimrate um 94% verringert.

17


Das Pulver war auch nicht stabil. Die Keimrate sank innerhalb von 14 Tagen auf 1% ab

(Abb. 4). Bei Lagerung in flüssiger Formulierung bleibt die Keimrate bei 4°C höher als bei

20°C. Bei 4°C erfolgte nach 20 Tagen ein Rückgang um 75%. Danach blieb die Kultur

aber über 100 Tage stabil. Ein durch Zentrifugation gewonnenes Konzentrat (Startwert: 1

x 1011 cfu/ml) verhielt sich ähnlich.

Für das Isolat R. aquatilis 39 konnte bisher keine praktikable Formulierung gefunden

werden, die die Erhaltung des Titers über einen längeren Zeitraum garantiert. Proben für

Versuche wurden entweder frisch angezogen, oder maximal 3 Wochen bei 4°C gelagert.

5.3.3 Aureobasidium pullulans CF40

Aureobasidium pullulans CF40 wurde mehrfach in einer Flüssigformulierung bei 4°C und

als gefriergetrocknetes Pulver bei 20°C gelagert. Die Lebendzellzahl in der Flüssigformu-

lierung reduzierte sich nach 10 Tagen um über 90%. Außerdem ergab sich in dieser

Formulierung häufig das Problem von pilzlichen Kontaminanten.

Mit dem gefriergetrockneten Pulver gab es zwischen den einzelnen Ansätzen Unterschie-

de. Durch das Trocknen reduzierte sich die Keimzahl auf 50- 90%. Auch die Stabilität des

Pulvers war bei Raumtemperatur von Präparation zu Präparation unterschiedlich. Eine

Charge konnte bisher ohne Reduktion der Keimzahl über 80 Tage gelagert werden. Die

Faktoren, die diese Stabilität beeinflussen, müssen noch erforscht werden, bevor dieses

Isolat als Wirkorganismus in einem biologischen Präparat eingesetzt werden kann.

5.4 Einsatz der Mikroorganismen gegen den Feuerbranderreger

Der Feuerbrand, verursacht durch das Bakterium Erwinia amylovora, ist die gefährlichste

Bakteriose im Obstbau. Quarantänemaßnahmen konnten seine Ausbreitung in alle wichti-

gen Anbaugebiete Europas nicht verhindern (Backhaus und Klingauf, 1998). Der Erreger

infiziert die Wirtspflanzen (Apfel, Birne, Quitte und div. Ziersträucher) hauptsächlich über

Blüten und Wunden. Die Gefahr der Infektion über Wunden ist nach Hagel oder Schnitt-

maßnahmen besonders groß. Für die Infektion über die Blüte benötigt der Erreger eine

Wärmeperiode, in der er sich auf der Narbe der Blüte epiphytisch vermehrt, die dann

durch Regen oder starken Tau gefolgt wird (Moltmann, 1996). Mit dem Wasser wird der

Erreger auf den Blütenboden gespült, von wo er über die Nektarien ins Gefäßsystem der

Pflanze einwandert.

Für die Bekämpfung des Feuerbrandes steht die Blühperiode im Vordergrund. Jeder

Baum bietet während der Blüte hunderte von potenziellen Eintrittspforten für den Erreger.

18


Verschiedene Methoden zur Verringerung des Blütenbefalls werden diskutiert. Neben

dem Einsatz von Antibiotika werden Gesteinsmehle, Wachstumsregulatoren, Pflanzenex-

trakte und Mikroorganismen auf ihre Wirksamkeit gegen Feuerbrand getestet (Backhaus

und Klingauf, 1998; Zeller und Laux, 2001). Arbeiten aus den USA (Johnson und Stock-

well, 1998) zeigen, dass der Einsatz von Bakterien ein vielversprechender Ansatz in der

Feuerbrandbekämpfung darstellt. Zur Entwicklung von wirksamen Präparaten wird ein

Screening-System benötigt, das den natürlichen Infektionsvorgang nachahmt und trotz-

dem für den Durchsatz hoher Probenmengen geeignet ist.

Agarplattentests eignen sich zum Screening auf Mikroorganismen, die antibiotisch wirk-

same Substanzen bilden. Allerdings hängt die Bildung dieser Substanzen oft vom Nähr-

medium ab. So ist nicht sicher, dass alle Mikroorganismen, die solche Substanzen auf

Agarplatten bilden, diese auch auf der Obstbaumblüte unter Freilandbedingungen bilden.

Neben der Bildung von antibiotischen Substanzen kann der Antagonismus auch auf

Nährstoffkonkurrenz beruhen. Auch dieser hängt stark von der Zusammensetzung des

Mediums ab. Gesicherte Ergebnisse sind deshalb nur im natürlichen Habitat zu erwarten.

Die Obstbaumblüten als natürliches Habitat des Feuerbrandbakteriums stehen aber nur

wenige Wochen im Jahr für Versuche zur Verfügung. Deshalb wurde nach Möglichkeiten

gesucht, Blüten für Versuche auch außerhalb der Blühperiode zur Verfügung zu haben.

5.4.1 Aufbau eines in vivo Testsystems

Das in vivo Testsystem zur Untersuchung der Wirksamkeit von Mikroorganismen gegen

den Feuerbranderreger wurde in Anlehnung an Arbeiten von Pusey in den USA (Pusey,

1997; Pusey, 1999; Pusey, 2000) durchgeführt. Anstelle der dort verwendeten Holzapfel-

sorten, wurden blühfähige Birnen- (Conference auf QC) und Apfelbäume (Gala auf M9)

verwendet. Der Zeitpunkt der Blüte wurde entweder durch Aufstellen der Pflanzen im

Gewächshaus unter künstlicher Beleuchtung vorgezogen oder durch Lagerung des

Pflanzmaterials bei Dunkelheit im Kühlraum verzögert. Auf diese Weise konnten von

Januar bis September Blüten für Versuche bereitgestellt werden.

Die Blüten wurden abgenommen und mit dem Blütenstiel in eine 10% ige Saccharoselö-

sung gestellt (Abb. 5A). Dies gewährleistete, dass die Blüten über den Versuchszeitraum

intakt blieben (Abb. 5B). Die Blüten wurden in feuchten Kammern inkubiert. Nach dem

Aufbringen von Mikroorganismen und/oder E. amylovora konnte die Populationsentwick-

lung auf den Blüten mittels Ausplattierung von Waschlösungen verfolgt werden, oder es

konnte nach 6 Tagen Inkubation die Wirkung der Mikroorganismen auf die Symptombil-

dung durch das Feuerbrandbakterium ausgewertet werden (Abb. 5C).

19


C

B A

Abbildung 5: In vivo Test-System zur Untersuchung der Wirksamkeit von Mikroorga-nismen gegenüber dem Feuerbranderreger E. amylovora. A: Apfelblüten wurden in 10% Saccharoselösung gestellt und bei 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. B: Nicht befal-lene Blüte nach 6d Inkubation. C: Blüte mit Feuerbrandsymptomen. Am Blütenstiel tritt Bakterienschleim aus (Pfeil).

5.4.1.1 Wirkung verschiedener Mikroorganismen

Tabelle 3: Verringerung des Feuerbrandbefalls an abgeschnittenen Apfelblüten durch Mikroorganismen oder durch Streptomycin. Pro Blüte wurden ca. 500.000 Bakterien oder 50.000 Hefen auf die Narbe getropft. 24 h danach wurden 1.000 Zellen E. amylovora auf die Narben getropft. In jedem Versuch wurden pro Be-handlung 3 x 20 Blüten inokuliert und bei 24° C inkubiert.

Antagonist Anzahl der Versuche

Wirkungsgrad (%)

B. subtilis BD170 8 60

B. amyloliquefaciens Hg77 1 67

Bakterien

R. aquatilis 39 1 64

A. pullulans CF10 1 100

A. pullulans CF40 2 88

Hefen

S. roseus CF35 2 88

Streptomycin (0,02%) 3 92

20


Im in vivo Testsystem wurde B. subtilis BD170 am häufigsten eingesetzt. Bei 8 Versuchen

ergab sich ein durchschnittlicher Wirkungsgrad von 60%. Die anderen Bakterien hatten

vergleichbare Wirkungsgrade. Wegen der guten Fortschritte bei der Erarbeitung des

Produktionsverfahrens von B. subtilis BD170 und wegen der positiven Freilandversuche

mit diesem Stamm wurden die anderen Bakterien vorerst nicht weiter verfolgt.

Die drei Hefeisolate hatten gute Wirkung im in vivo Testsystem (Tab. 3). Weitere Versu-

che bei niedrigeren Temperaturen (18-23°C) zeigten, dass sich das Isolat A. pullulans

CF40 über den gesamten Temperaturbereich auf den Blüten vermehrte und die Feuer-

brandsymptome um 80-100% reduzierte.

5.4.1.2 Einfluss der Formulierung auf die Wirkung

Der Einfluss von verschiedenen Trägerstoffen auf die Wirkung von B. subtilis BD170

gegen Feuerbrand wurde im in vivo Testsystem überprüft (Abb. 6). Zum Trocknen der

Sporen wurden Milchpulver, Dextran und Aerosil verwendet. Zusätzlich wurde eine flüs-

sig formulierte Probe eingesetzt, die zur Lagerung auf pH 3,0 eingestellt war.

5869 69

44

67

0

20

40

60

80

Kultur Milchpulver Dextran Aerosil Säure pH 3,0

Wirk

ungs

grad

(%)

Abbildung 6: Einfluss der Formulierung von B. subtilis BD170 auf die Verringerung der Bakterienschleimbildung auf mit E.a.385 (1000 cfu/Blüte) inokulierten Birnenblüten. 24h vor der Inokulation wurden 5x105 cfu/Blüte B. ubtilis. BD170 auf die Narbe der Blüten ge-tropft. Dazu wurde eine 72h alte Kultur von BD170 oder 72h alte Kulturen, die mit 20% Milchpulver, 20% Dextran oder 20% Aerosil versetzt gefriergetrocknet wurden, oder eine mit Säure auf pH3,0 eingestellte Sporensuspension benutzt. Pro Behandlung wurden 2 Wie-derholungen mit je 20 Blüten durchgeführt.

21


Die mit Milchpulver und Dextran getrockneten Sporen hatten tendenziell eine höhere

Wirkung als die Flüssigkultur. Aerosil reduzierte die Wirkung der Sporen geringfügig. Die

flüssige Formulierung war vergleichbar mit den mit Milchpulver getrockneten Sporen. Als

Trägerstoff für das Pflanzenstärkungsmittel BIOPRO® wurde Milchpulver ausgewählt, da

dieses im Obstbau als Zusatz zu Viruspräparaten schon verwendet wurde und keine

phytotoxischen Nebeneffekte bekannt sind. Für Dextran lagen keine entsprechenden

Daten vor.

5.4.1.3 Einfluss der Anwendungskonzentration auf die Wirkung

Im in vivo Testsystem wurden verschiedene Konzentrationen eines gefriergetrockneten

Pulvers von B. subtilis BD170 eingesetzt (Abb. 7). In einem Konzentrationsbereich von

108 Sporen/ml bis 107 Sporen/ml wurde ein Wirkungsgrad von über 75% erreicht. Eine

Sporenkonzentration von 106/ml erbrachte keine Wirkung mehr. Für den Einsatz im Frei-

land wurde eine Anwendungskonzentration für BIOPRO® von 0,1-0,5% in Abhängigkeit

der Wasseraufwandmenge empfohlen. Dies entspricht einer Sporenkonzentration von 2x

107 – 1x 108 pro ml.

77 79 80

40

25

50

75

100

8 7,3 7 6B. subtilis Konzentration (log Sporen/ml)

Wirk

ung

(%

)

Abbildung 7: Reduktion der Bakterienschleimbildung auf mit E.amylovora 385 (1000 cfu/Blüte) inokulierten Apfelblüten. 24h vor der Inokulation wurden unterschiedlich konzentrierte Sporensuspensionen auf die Blüten gesprüht. Pro Behandlung wurden 3 Wiederholungen mit je 20 Blüten durchgeführt.

22


5.4.1.4 Einfluss des Einsatzzeitpunktes auf die Wirkung

3

4

5

6

7

8

9

0 24 48 72

Inkubationszeit (h)

E. a

myl

ovor

a (lo

g(cf

u/B

lüte

))

B

4

5

6

7

8

log(

cfu/

Blü

te)

A

Abbildung 8: A: Populationsentwicklung von B. subtilis BD170 oder A. pullulans CF40 auf Apfelblüten. B: Populationsentwicklung von E. amylovora auf Apfelblüten. Blüten wurden nicht behandelt (blau), mit Suspensionen von 108 Sporen /ml B. subtilis (grün) oder 107 Zel-len /ml A. pullulans (rot) besprüht und bei 21°C und 100% rel.LF inkubiert. Nach 1h (Drei-eck) oder 24h (Raute) wurden die Blüten mit E. amylovora inokuliert (5000 cfu/Blüte). Zu je-dem Zeitpunkt wurden je Behandlung 5 Blüten abgewaschen. Die Waschlösungen wurden zur Bestimmung der Konzentration von B. subtilis auf NBLiCl, von A. pullulans auf YM+Streptomycin und von E. amylovora auf Miller-Schroth Medium (Brulez und Zeller, 1981) ausplattiert.

23


Apfelblüten wurden mit B. subtilis BD170 oder A. pullulans CF40 besprüht und 1h danach

oder 24h danach mit E. amylovora inokuliert. Über einen Zeitraum von 72h wurde der

Populationsverlauf der Mikroorganismen verfolgt (Abb. 8). Unter den in diesem Versuch

gewählten Bedingungen von 21°C und 100% rF vermehrte sich BD170 in den ersten 24h

nur wenig. Ein deutlicher Populationsanstieg (Faktor 160) war erst nach 48h zu erkennen.

Allerdings wird die Vermehrung durch die Anwesenheit von E. amylovora gehemmt. Dies

zeigt sich an den Blüten, die schon nach 1h mit E. amylovora inokuliert wurden. Auf

diesen Blüten ist die Vermehrung von BD170 deutlich geringer (Abb. 8A). A. pullulans

CF40 vermehrt sich in den ersten 24h um Faktor 40. Die Population steigt auch am 2. Tag

weiter an. Die Inokulation mit E. amylovora hat keinen Einfluss auf den Populationsver-

lauf von A. pullulans CF40. Dies zeigt, dass sich A. pullulans CF40 bei 21°C schneller auf

der Blüte etabliert als B. subtilis BD170. In Versuchen bei 25°C vermehrte sich B. subtilis

BD170 in den ersten 24h um durchschnittlich Faktor 120. Die Temperatur hatte also einen

großen Einfluss auf die Etablierung der Mikroorganismen auf der Blüte.

Tabelle 4: Einfluss des Zeitpunktes der Inokulation mit E. amylovora (5000 cfu/Blüte) auf die Reduktion der E. amylovora Population auf der Blüte und auf die Wirkung gegen die Feuerbrandsymptombildung an der Blüte durch B. subtilis BD170 und A. pullulans CF40 im in vivo Test System.

Behandlung Inokulation (h nach der

Behandlung )

Reduktion der E. amy-

lovora Population

Wirkungsgrad (%)

B. subtilis BD170 1 0,45 12

B. subtilis BD170 24 0,11 51

A. pullulans CF40 1 0,07 68

A. pullulans CF40 24 0,002 100

In der unbehandelten Kontrolle vermehrt sich E. amylovora innerhalb 48h um Faktor

100.000 von 5x 103 cfu/Blüte auf 5x 108 cfu/Blüte. Die Populationsentwicklung von E.

amylovora wird bei der Inokulation 1h nach der Behandlung durch B. subtilis BD170

kaum beeinflußt. A. pullulans CF40 reduziert in diesem Fall die E. amylovora Population

nach 48h im Vergleich zur Kontrolle auf 0,1. Entsprechend der höheren Reduktion der E.

amylovora Population war auch die Wirkung auf die Feuerbrandsymptomentwicklung

durch A. pullulans CF40 höher als von B. subtilis BD170 (Tab. 4). Eine wesentlich deutli-

24


chere Reduktion des E. amylovora Population nach 48h wurde in den Varianten erreicht,

in denen die Inokulation 24h nach der Behandlung durchgeführt wurde. Entsprechend

konnte hier auch die Feuerbrandsymptome besser unterdrückt werden (Tab.4). Behand-

lungen im Freiland sollten deshalb mindestens 24h vor einem möglichen Befall durch den

Erreger stattfinden.

5.4.2 Wirkung der Mikroorganismen im Freiland

5.4.2.1 Freilandversuche mit künstlicher Inokulation

Die Mikroorganismen wurden im Freiland in mehreren Versuchen mit künstlicher Inokula-

tion durch den Feuerbranderreger eingesetzt. Die künstliche Inokulation soll einen ausrei-

chenden Befall für eine statistische Auswertung sicherstellen. Da für den Feuerbranderre-

ger Quarantänebestimmungen gelten, dürfen künstliche Inokulationen nur an isolierten

Standorten mit behördlicher Genehmigung durchgeführt werden. Solche Versuche wur-

den vom Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA in Darmstadt und von den

Pflanzenschutzdiensten der Länder Baden-Württemberg und Rheinland-Pfalz durchge-

führt. Diese Versuchsansteller haben verschiedene Präparationen von Mikroorganismen

getestet, die im Rahmen dieses Projektes produziert wurden (Tab. 5).

In den Versuchen mit künstlicher Inokulation mit dem Erreger wurde an Apfel mit den

Mikroorganismen B. subtilis BD170 und Rahnella aquatilis 39 eine maximale Befallsre-

duktion von 65% erreicht (Tab. 5). Im Jahr 2000 herrschten während der Obstbaumblüte

für den Feuerbranderreger sehr günstige Infektionsbedingungen. In Neustadt waren trotz

der geringen Inokulumsdichte von 106 cfu/ml an unbehandelten Pflanzen 98% der Blüten-

büschel befallen. Dieser starke Befall konnte mit keinem der eingesetzten Präparate

deutlich reduziert werden. Selbst eine Behandlung mit Plantomycin zeigte nur eine gerin-

ge Wirkung. Ähnlich war die Situation in Oppenheim, wo R. aquatilis eingesetzt wurde.

Bei Versuchen an Cotoneaster konnte 1999 auch sehr starker Befall von 98% befallener

Blütenbüschel an unbehandelten Pflanzen durch zwei Behandlungen mit B. subtilis

BD170 um 82% reduziert werden. Diese hohe Wirksamkeit dieses Stammes auf Coto-

neaster bestätigten Ergebnisse aus dem Jahr 1993 (Wolf, 1994). Die bessere Wirkung auf

Cotoneaster könnte mit den höheren Temperaturen während der Cotoneasterblüte im

Juni zusammenhängen.

25


Tabelle 5: Wirkung von Bacillus subtilis BD170 (BsBD170) und Rahnella aquatilis (Ra39) in Freilandversuchen mit künstlicher Inokulation mit E. amylovora .

Versuchsansteller / Jahr /Sorte/ E.amylovora Inokulum (cfu/ml)

Behandlung (Organismus/

Anzahl)

Befall in unbeh.

(%)

Wirkung (%)

Wirkung von 0,6%

Plantomycin (%/N Beh.)

BBA/99/ Idared/5 x 107 BsBD170/1 37 49

BBA/99/ Idared/5 x 107 Ra39/1 37 65

BBA/00/Idared/1 x 107 BsBD170/2 25 44

SLFA Neust./ 00/ Fuji/ 1 x 107 BsBD170/3 98 14 23/1

SLVA Oppenheim/00/Rubinette/ 1x 107

Ra 39/3 45,3 18 47/1

SLVA Oppenheim/00/Elstar/ 1x 107

Ra39/3 50,9 12 23/1

BBA/99/Cotoneaster/ 7 x 107 BsBD170/2 97 82 72/2

Insgesamt muss die Versuchsdurchführung mit künstlicher Inokulation kritisch betrachtet

werden, da dabei hohe Konzentrationen des Feuerbranderregers in die Blüte gebracht

werden. Bei der natürlichen Inokulation besiedelt E. amylovora zuerst die Narbe, ver-

mehrt sich dort und muss dann durch Regen oder starken Tau auf den Blütenboden

gewaschen werden, wo er über Nektarien in die Pflanze eindringt (Basarab et al., 1992;

Moltmann, 1996). Durch den hohen Eintrag an Feuerbrandbakterien bei der künstlichen

Inokulation wird die Vermehrung des Erregers auf der Narbe der Blüte umgangen. Die

Bakterien werden auch direkt auf den Blütenboden gesprüht, wo sie sofort in die Blüte

eindringen können.

Im Gegensatz zum Antibiotikum Streptomycin können die Mikroorganismen die Feuer-

brandbakterien nicht abtöten. Die Vermeidung des Feuerbrandbefalls durch Bakterien und

Hefen ist darauf ausgerichtet, die Vermehrung von E. amylovora auf der Narbe zu verhin-

dern (Johnson und Stockwell, 1998). Aus diesem Grund muss bei Versuchen mit künstli-

cher Inokulation mit einem geringeren Wirkungsgrad als bei natürlichen Infektionsbedin-

gungen gerechnet werden.

26


5.4.2.2 Kombinationsverfahren

Bei dieser Versuchsvariante wird in jeder Parzelle ein Teil der Bäume künstlich inokuliert.

Der Rest wird durch natürliche Übertragung des Erregers befallen. Ausgewertet werden

die inokulierten und die nicht inokulierten Bäume getrennt (Fried, 1999). Dieses Verfahren

soll in die EPPO-Richtlinie zur Prüfung von Präparaten gegen den Feuerbranderreger

eingehen.

Tabelle 6: Wirkung von Bacillus subtilis BD170 (BsBD170) im Vergleich zu Plantomycin (0,06%) in Freilandversuchen, die nach dem Kombinationsverfahren durchgeführt wurden. 1999 wurden frisch angezogene Zellen eingesetzt. Im Jahr 2000 gefriergetrocknete Spo-renpulver und ab dem Jahr 2001 das Pflanzenstärkungsmittel BIOPRO®. Die Anwen-dungskonzentration bei B. subtilis BD170 lag bei 1x 108 Bakterien/ml.

Versuchsansteller / Jahr / Sorte / E. amylovora Inokulum (cfu/ml)

Behandlung (Mittel/ Anzahl)

Wirkung inokulierte

Parzelle (%)

Wirkung nicht inokulierte

Parzelle (%)

BBA / 99 / Gloster / 1x108 (Laux et al., 1999)

BsBD170/2 43 71

BsBD170/2 7 22 RP Karlsruhe /2000 / James Grieve / 2x108 (Fried, 2001a)

Plantomycin/3 59 89

BIOPRO®/5 25 20 RP Karlsruhe / 2001 / James Grieve / 2x108 (Fried, 2001b)

Plantomycin/3 69 93

BIOPRO®/4 13 9

BsBD170 flüssig/4

31 38

SLFA Neustadt /2001 / Jonagold/1x 107 (Harzer, 2001)

Plantomycin/2 63 83

BBA / 2001 / Boskoop BIOPRO®/6 20 51

Im vom Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA 1999 durchgeführten Freiland-

versuch konnte in den inokulierten Parzellen der starke Befall an unbehandelten Pflanzen

durch zwei Behandlungen mit BD170 um 43% reduziert werden. Bei den nicht inokulierten

Pflanzen waren 45% der unbehandelten Blütenbüschel befallen. Hier reduzierten zwei

Behandlungen mit B. subtilis BD170 den Befall um 71%.

27


Dieser hohe Wirkungsgrad konnte in den Versuchen des Regierungspräsidiums Karlsruhe

(Fried, 2001a; Fried, 2001b) und der SFLA Neustadt (Harzer, 2001) nicht bestätigt wer-

den(Tab. 6). Im Jahr 2000 wurde das B. subtilis BD170 Präparat nicht zum optimalen

Zeitpunkt eingesetzt. Bei der herrschenden warmen Witterungen öffneten sich in den 3

Tagen zwischen der ersten Behandlung und der Inokulation sehr viele Blüten, die nicht

mit B. subtilis belegt wurden. Die Behandlung am Tag der Inokulation ist für B. subtilis

BD170 zu spät. Die Laboruntersuchungen zeigten, dass B. subtilis BD170 in Abhängigkeit

von der Temperatur mindestens einen Tag vor der Inokulation eingesetzt werden muss

(Glp. 5.4.1.3). Im Jahr 2001 wurden allerdings auch keine höheren Wirkungsgrade er-

reicht, obwohl die vorgegebenen Behandlungstermine eingehalten wurden. Auffallend

war, dass sowohl vom Regierungspräsidium Karlsruhe als auch der SLFA Neustadt ge-

ringere Wirkungsgrade in den nicht inokulierten Parzellen gefunden wurden. Dies wider-

spricht den bisherigen Versuchen, und auch dem Ergebnis des Instituts für biologischen

Pflanzenschutz der BBA aus dem Jahr 2001. In diesem Versuch wurde in der nicht inoku-

lierten Variante ein Wirkungsgrad von 51% erreicht.

5.4.2.3 Freilandversuche unter natürlichen Infektionsbedingungen

Tabelle 7: Wirkung von Bacillus subtilis BD170 (BsBD170) im Vergleich zu Plantomycin (0,06%) in Freilandversuchen. Im Jahr 1999 und 2000 wurden gefriergetrocknete Sporen-pulver, ab dem Jahr 2001 das Pflanzenstärkungsmittel BIOPRO® eingesetzt. Die Anwen-dungskonzentration bei B. subtilis BD170 lag bei 1x 108 Sporen/ml.

Ort / Jahr /Sorte Behandlung (Mittel/ Anzahl)

Befall in unbehandelt

(%)

Wirkung (%)

unbehandelt 9

BsBD170/4 4 56

Nobarya, Ägypten/ 1999/ Birne, Le

Conte

Plantomycin/4 3 67

Burdur, Türkei/1999/ Birne, Santa Maria (Basim et al., 2000)

BsBD170/4 64

Isparta, Türkei/1999/ Birne, Williams (Basim et al., 2000)

BSBD170/4 62

unbehandelt 17,2

BIOPRO®/4 25,7 0

Schlachters, Deutschland/2001/ Apfel, Elstar, Gloster, Jonagold,Idared, Golden Delicious, Cox Orange

Plantomycin/3 2,9 83

28


In zahlreichen Versuchen, die in Deutschland und in der Schweiz in den Jahren 1999 bis

2001 unter natürlichen Infektionsbedingungen angelegt wurden, kam es nicht zu einem für

die statistische Auswertung ausreichenden Feuerbrandbefall. Bisher liegen drei Ver-

suchsergebnisse aus Ägypten, der Türkei und aus Deutschland vor.

Bei den Versuchen in Ägypten und in der Türkei wurden mit B. subtilis BD170 hohe Wir-

kungsgrade erreicht (Tab. 7). In Ägypten wurden die Behandlungen nach dem Feuer-

brandprognoseprogramm Marblyt terminiert, so dass die Termine für den Einsatz von

Streptomycin optimal waren. B. subtilis BD170 müsste früher eingesetzt werden. Trotz-

dem war der Wirkungsgrad von Streptomycin nur wenig höher als der von B. subtilis

BD170. Im Gegensatz dazu konnte in einem Versuch in Deutschland mit B. subtilis keine

Verringerung des Feuerbrandbefalls erreicht werden. Auch hier könnte der Unterschied

von den höheren Temperaturen während der Obstbaumblüte in Ägypten und der Türkei

kommen.

5.4.2.4 Wirkung auf im Freilandversuch entnommenen Apfelblüten

Bei Versuchen zur Feuerbrandbekämpfung unter natürlichen Infektionsbedingungen,

reicht der Befall für eine statistische Auswertung häufig nicht aus. Mit der hier beschrie-

benen Methode, Blüten aus dem Versuch im Labor zu infizieren, erhält man trotzdem eine

Aussage über die Wirksamkeit der Präparate.

In Überlingen wurde im Jahr 2000 ein Feuerbrandversuch an der Sorte Jonagold vom

amtlichen Pflanzenschutzdienst durchgeführt. Die verschiedenen Varianten wurden in 4

Blöcken in einem randomisierten Design angelegt, um die Wirkung der Präparate unter

natürlichen Infektionsbedingungen zu überprüfen. Zur Vollblüte am 04.05.00 wurden aus

den Parzellen der unbehandelten, der mit B. subtilis BD170 behandelten und aus der

Plantomycinvariante je 20 Blüten entnommen. Diese wurden in 10% Zuckerlösung gestellt

und mit 400 cfu/Blüte E. amylovora 285 inokuliert. Nach 6d bei 25°C in einer feuchten

Kammer wurde die Anzahl infizierter Blüten bestimmt.

Die Proben wurden zur Vollblüte entnommen, so dass sich seit der letzten Behandlung

kaum noch neue Blüten öffneten. Die mit B. subtilis BD170 oder mit Plantomycin behan-

delten Blüten waren signifikant weniger anfällig gegenüber dem Feuerbranderreger als die

unbehandelten Blüten (Tab. 8). Die Behandlung mit B. subtilis BD170 schützte die Apfel-

blüten vergleichbar dem Antibiotikum Plantomycin.

29


Tabelle 8: Reduzierung des Feuerbrandbefalls auf im Freilandversuch entnommenen Blüten durch B. subtilis BD170. Die Blüten wurden am 04.05.2000 entnommen, in 10% Zuckerlösung gestellt und mit 400 cfu/Blüte E. amylovora 285 inokuliert. Nach 6d bei 25°C in einer feuchten Kammer wurde die Anzahl infizierter Blüten bestimmt.

Standort Mittel Behandlungs-termine

Befall (%)

Wirkung (%)

Unbehandelt 39

0,5% B. s. BD170 (108

cfu/ml) 25.04.;28.04; 02.05.

11 72 Überlingen Apfel, Jonagold Probenahme: 04.05.00 0,06% Plantomycin 28.04.; 03.05. 8 79

5.5 Mischbarkeit mit Pflanzenschutzmitteln und Wachstumsregulatoren

Im integrierten und ökologischen Obstbau werden diverse Fungizide und Insektizide

eingesetzt. Ein Teil der Behandlungen muss zur Bekämpfung von Apfelschorf und Fäuler-

regern auch während der Blüte durchgeführt werden. Ebenfalls werden während der Blüte

Wachstumsregulatoren zur Ausdünnung eingesetzt. Bei der Verwendung von Mikroorga-

nismen zur Bekämpfung von Blüteninfektionen des Feuerbrandes muss deshalb überprüft

werden, ob die eingesetzten Pflanzenschutzmittel und Wachstumsregulatoren die Wir-

kung der Mikroorganismen beeinflussen.

Pflanzenschutzmittel, die während der Blüte eingesetzt werden, und das Pflanzenstär-

kungsmittel Myco-Sin wurden deshalb auf ihre Wirkung auf das Wachstum von B. subtilis

BD170 getestet (Tab. 9). Die unspezifischen Fungizide (Schwefel, Dichlofluanid, Captan,

Mancoceb, Metiram, Dithianon) haben auch eine hemmende Wirkung auf B. subtilis

BD170. Ein gemeinsamer Einsatz von B. subtilis BD170 mit diesen Fungiziden muss also

vermieden werden. Da die spezifischen Fungizide keine hemmende Wirkung auf B. subti-

lis BD170 haben, sollten sie bei einem gleichzeitigen Einsatz mit den Mikroorganismen

keinen Einfluss auf deren Wirkung haben. Dadurch können die pilzlichen Erreger (Schorf,

Mehltau, Fäulen) auch bei einem Einsatz von B. subtilis BD170 mit Fungiziden bekämpft

werden, was die Akzeptanz von BIOPRO® bei den Obstbauern erhöhen sollte.

Die Unverträglichkeit von B. subtilis BD170 mit Schwefel kann allerdings zu Problemen

beim Einsatz im ökologischen Obstbau führen. Hier wird anstatt Schwefel manchmal das

Pflanzenstärkungsmittel Myco-Sin zur Pilzbekämpfung eingesetzt. Dieses zeigte in den

beiden Testmethoden unterschiedliche Wirkung auf B. subtilis BD170. Bei Myco-Sin hängt

die Wirkung auf Bakterien vom pH-Wert ab. Agarplatten, die 1% Myco-Sin enthalten

30


(Meth. A) haben einen pH-Wert von 4, bei dem sich B. subtilis BD170 nicht vermehrt.

Mischt man B. subtilis BD170 mit Myco-Sin und plattiert dann auf neutralen Platten aus

(Meth. B), wird das Bakterienwachstum nicht gehemmt. Deshalb muss festgestellt wer-

den, welcher pH-Wert in den Blüten nach Myco-Sin Applikation entsteht, um abschätzen

zu können, ob Myco-Sin die Vermehrung von B. subtilis BD170 in der Blüte verhindert.

Tabelle 9: Auswirkung von Pflanzenschutzmitteln auf die Überlebensrate von B. subtilis BD170 mit zwei verschiedenen Testmethoden: A: Ausplattieren von B. subti-lis BD170 auf Agarplatten, die das Präparat in der empfohlenen Anwendungskon-zentration enthalten. B: B. subtilis BD170 wird einer Suspension der empfohlenen Anwendungskonzentration zugegeben und 1h inkubiert. 50 µl des Gemisches werden dann zur Bestimmung der Überlebensrate auf NB-Platten ausplattiert.

Wirkstoff Handelsna-me

Konzentra-tion (%)

Wirkungsgrad (%)

Fungizide: A B

Captan Malvin 0,12 n.b. 100

Dichlofluanid Euparen 0,15 100 100

Dithianon Delan 0,2 100 96

Mancozeb Dithane Ultra 0,2 100 100

Metiram Polyram WG 0,15 100 n.b.

Cyprodinil Chorus 0,03 33 -2

Pyrimethanli Scala 0,075 n.b. -6

Fluquinconazol+Pyrimethanil Vision 0,1 n.b. 5

Kresoxim-methyl Discus 0,012 7 -20

Flusilazol Benocap 0,012 33 -14

Penconazol Topas 0,025 n.b. -18

Triforin Saprol 0,12 100 n.b.

Schwefel Sufran 0,25 92 100

Myco-sin 1,0 100 -23

Insektizide:

Tebufenozid Mimic 0,05 - 32

Wachstumsreegulatoren:

Alpha-Naphtylessigsäure Amidthin 0,10 0

Etephon Cerone 0,15 43

31


Während der Blüte werden nur wenige Insektizide eingesetzt. Deshalb wurde bisher nur

Tebufenozid auf seine Wirkung gegen B. subtilis BD170 überprüft. Der niedrige Wir-

kungsgrad (Tab. 7) deutet darauf hin, dass ein gleichzeitiger Einsatz beider Mittel in Frage

kommt.

Zwei Wachstumsregulatoren, die im integrierten Obstbau während der Blüte eingesetzt

werden wurden auf Ihre Wirkung gegen B. subtilis BD170 getestet. Alpha-

Naphtylessigsäure hat keine negative Auswirkung auf das Wachstum von BD170, und

kann daher gleichzeitig mit BIOPRO® eingesetzt werden. Etephon reduziert die Vermeh-

rung von B. subtilis BD170 und kann deshalb nicht empfohlen werden.

5.6 Wirkungsmechanismen der Mikroorganismen

Die Wirkung von Mikroorganismen in der biologischen Bekämpfung von

Pflanzenkrankheiten kann auf der Bildung antibiotischer Substanzen, auf Konkurrenz um

Raum oder Nährstoffe oder auf induzierter Resistenz beruhen. Für die gezielte

Anwendung von Mikroorganismen ist es von Vorteil den Wirkungsmechanismus zu

kennen. Am Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA wurden deshalb innerhalb

des Projektes Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus der Isolate Pantoea

agglomerans 21889, Rahnella aquatilis 39 und Bacillus subtilis BD170 durchgeführt. Als

Stamm des Pathogens wurde Ea7/74 verwendet, der auch in vorangehenden Arbeiten als

Testorganismus verwendet wurde und über eine gleichbleibende Virulenz verfügt.

5.6.1 Bildung antibiotischer Substanzen durch die Mikroorganismen

5.6.1.1 Agardiffusionstest

Um die Aktivität der Isolate gegen den Erwinia amylovora Stamm Ea7/74 in vitro zu über-

prüfen, wurden Agardiffusionstests durchgeführt (Gonzales und Kunka, 1987). Da die

Hemmaktivität antagonistischer Bakterien in vitro von der Nährstoffzusammensetzung

abhängig ist, wurde der Agardiffusionstest auf verschiedenen Medien (Miller Schroth

Selektivmedium (Brulez und Zeller, 1981) (MS); King`s Medium B; Tryptic soy agar (TSA);

Nutrient Saccharose Agar (NSA)) durchgeführt, auf denen alle zu testenden Bakterieniso-

late ein gutes Wachstum zeigten.

Einzelkolonien der antagonistischen Bakterienstämme wurden auf o.g. Medien transferiert

und 48h bei 26°C inkubiert. Die gewachsenen Kolonien wurden auf folgende Weise wei-

terbehandelt:

32


1. Variante: Überschichtung der Kolonien mit 3ml Ea7/74 Suspension (1x106 cfu/ml),

absaugen überschüssiger Suspension und anschließende Inkubation für 24 h Inkubation

bei 26°C.

2. Variante: Exposition der Kolonien in Chloroform-Dampf, weiter wie unter 1.

3. Variante: Für die Testung der bakteriziden Aktivität von Extrakten, Überständen oder

Pellets wurden zunächst 100 µl einer Ea7/74-Suspension (106 cfu/ml) auf MS oder KB-

Agar ausplattiert. Mittels eines Korkbohrers wurden pro Petrischale 4 Löcher ausgestanzt

und mit 100 µl der zu testenden Fraktion gefüllt.

Lediglich durch die Versuchsdurchführung nach Variante 2 konnte die Ausbildung repro-

duzierbarer Hemmhöfe durch P. agglomerans 21889 und R. aquatilis 39 erreicht werden.

Durch den Stamm B. subtilis BD170 wurde in keinem Fall ein reproduzierbarer Hemmhof

verursacht. Aufgrund der Abhängigkeit der Hemmhofausbildung vom Zellaufschluss durch

Chloroform im Falle von P. agglomerans 21889 und R. aquatilis 39 konnte eine Lokalisa-

tion bakterizider Substanzen in der Zellsubstanz vermutet werden. Um dieses zu überprü-

fen wurden nachfolgend die Teilfraktionen von Flüssigkulturen untersucht.

Zunächst wurden Zellsubstanz und Überstand im Agardiffusionstest eingesetzt (Variante

3). Um die Freisetzung bakterizider Substanzen aus dem Zellinneren zu erreichen, wurde

auch eine Ultraschall behandelte Probe des Pellets eingesetzt. 150 ml NS-Flüssigkulturen

der Mikroorganismen wurden bei 28°C kultiviert. Nach 48 h wurden die Kulturen abzentri-

fugiert, Zellsubstanz und Überstand wurden separiert, der Überstand sterilfiltrert. Die

beiden Fraktionen wurden anschließend im Agardiffusionstest untersucht.

Die Zellsubstanz wurde sowohl nativ als auch in durch Ultraschall aufgeschlossener

Form eingesetzt. Zum Ultraschall-Aufschluss wurden 2g Zellfrischmasse für 30 min mit

einem Sonificator behandelt. Weder Kulturüberstand noch die unterschiedlich vorbereite-

ten Proben des Pellets bewirkten im Agardiffusionstest die Ausbildung eines Hemmhofs.

Da eine zu geringe Konzentration der bakteriziden Substanz in Betracht gezogen werden

musste, wurde versucht durch verschiedene Extraktionsverfahren die Aktivität aufzukon-

zentrieren.

5.6.1.2 Extraktion von Überstand und Zellsubstanz mit organischen Lösungsmitteln

Als Lösungsmittel wurden zunächst Chloroform und Ethylacetat getestet. Nachdem sich

gezeigt hatte, dass der Ethylacetat-Extrakt in der DC intensivere Banden verursachte,

wurde für die folgenden Extraktionen nur noch Ethylacetat eingesetzt. Überstand und

Zellsubstanz von 150 ml NS-Flüssigkulturen (48h, 28°C, 100 upm) wurden mit jeweils

33


einem Lösungsmittel im Verhältnis 1/1 (v/v) extrahiert. Der Extrakt wurde nachfolgend am

Rotationsverdampfer auf ein Endvolumen von ca. 2 ml eingeengt. Zur Extraktion der

Zellsubstanz wurde das Pellet zunächst zweimal gewaschen und anschließend in 150 ml

Saline resuspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend analog dem Überstand

extrahiert.

Um die bakteriziden Substanzen aufzureinigen, erfolgte eine präparative Auftrennung des

Ethylacetat-Extraktes durch Dickschichtchromatographie. Da der bakterizide Substanz-

fleck aus dem Ethylacetat-Extrakt von B. subtilis BD170 den größten Hemmhof verursach-

te, wurde mit dieser Probe begonnen. Hierzu wurde 1 ml des Extraktes auf eine Dick-

schichtplatte (PSC, Merck) aufgetragen und mit Laufmittel A aufgetrennt.

Der bakterizid wirkende Substanzfleck (Rf = 0,8) wurde ausgekratzt und mit 20 ml Metha-

nol extrahiert. Die Probe wurde auf 5 ml eingeengt. Zur Identifizierung der inhibitorischen

Substanzen wurde eine HPLC-Untersuchung durch Dr. Ellner, Institut für ökologische

Chemie der BBA, Berlin durchgeführt.

Die HPLC-Untersuchung der Probe ergab zahlreiche Peaks. Die durch Dickschichtchro-

matografie versuchte Aufreinigung ist deshalb als unzureichend anzusehen. Die fünf

Hauptpeaks wurden fraktioniert und anschließend im Biotest auf ihre bakterizide Wirkung

untersucht.

Die Testung der Fraktionen erfolgte in 20 ml NS-Flüssigkulturen, die nach Zusatz von

jeweils 1% (v/v) der fraktionierten Substanzen und Inokulation mit 0,1% (v/v) NS-Vorkultur

bei 28°C inkubiert wurden. Als Kontrolle diente eine Kultur der 1% (v/v) HPLC-Eluent

zugesetzt wurde. Das Wachstum wurde anhand der OD590 verfolgt. Bei keiner der

getesteten Fraktionen konnte eine bakterizide Wirkung gegen E. amylovora 7/74 festge-

stellt werden. Als Gründe hierfür kommt neben einer Instabiliät der Substanz der Einsatz

der falschen Peakfraktionen in Betracht. Eventuell war die bakterizide Aktivität in einem

der kleineren Peaks enthalten, die nicht aufgefangen wurden, oder es wird eine Kombi-

nation verschiedener Komponenten für die bakterizide Aktivität benötigt, so dass die

Einzelkomponenten nach der Trennung nicht mehr aktiv sind.

5.6.1.3 Wachstum von E. amylovora 7/74 in Kulturfiltraten antagonistischer Stämme

Um zu untersuchen, ob P. agglomerans 21889, R. aquatilis 39 und B. subtilis BD170

Stoffe produzieren, die Ea7/74 erst in höherer Konzentration hemmen, oder das Wachs-

tum des Pathogens durch Nährstoffkonkurrenz beeinflussen wurden die Wachstumsraten

von Ea7/74 in sterilfiltrierten Überständen der antagonistischen Isolate getestet.

34


P. agglomerans 21889, R. aquatilis 39, B. subtilis BD170 und E. amylovora 7/74 wurden

48h bei 28°C in 150 ml NS-Flüssigkulturen angezogen. Die Kulturen wurden abzentrifu-

giert (15 min, 10000g) und die Überstände sterilfiltriert. Die Überstände wurden in sterile

150 ml Kolben überführt und mit 1% einer E. amylovora 7/74 Vorkultur inokuliert. Das

Wachstum wurde durch Bestimmung der OD590 verfolgt. Als Standard diente eine NS-

Flüssigkultur.

Das Wachstum von E. amylovora 7/74 in sterilfiltrierten Überständen der NS-

Flüssigkulturen von P. agglomerans 21889, R. aquatilis 39 und B. subtilis BD170 unter-

schied sich nicht von dem der Kontrolle mit frischem NS-Flüssigmedium. In sterilfiltriertem

Überstand von Ea 7/74 dagegen war ein geringerer Anstieg der Population zu verzeich-

nen. Dies zeigt, dass keines der Bakterienisolate im im Komplexmedium eine wirksame

bakterizide Verbindung in die Kulturflüssigkeit abgab.

Um zu testen ob durch Hitzeeinwirkung bakterizide Substanzen aus den Zellen der anta-

gonistischen Isolate freigesetzt werden, wurde E. amylovora 7/74 in autoklavierten Kultu-

ren von P. agglomerans 21889, R. aquatilis 39 und B. subtilis BD170 kultiviert. Über 48h

angezogene NS-Flüssigkulturen (28°C) von P. agglomerans 21889, R. aquatilis 39, B.

subtilis BD170 und E. amylovora 7/74 wurden autoklaviert und nachfolgend mit 1% (v/v)

einer E. amylovora 7/74 Vorkultur inokuliert. Als Standard diente eine NS-Flüssigkultur.

Das Wachstum wurde durch Ausplattierung von Verdünnungsreihen verfolgt.

Das Wachstum von E. amylovora 7/74 in allen autoklavierten Überständen unterschied

sich nicht signifikant von dem in der Kontrolle. Auch durch Hitzeeinwirkung wurden also

keine bakterizide Substanzen aus den Zellen freigesetzt.

5.6.3 Nährstoffkonkurrenz

Zur Untersuchung der Nährstoffkonkurrenz zwischen den Bakterienisolaten und dem

Feuerbranderreger wurde die Populationsentwicklung von Antogonist und Pathogen in

Kokultur untersucht. Dazu wurden antibiotikaresistente Mutanten eingesetzt. Die antibioti-

karesistenten Stämme wurden mit P. agglomerans 21889Rf, R. aquatilis 39Rf, und E.

amylovora 7/74Sm bezeichnet. Anschließend wurden 150 ml NS-Flüssigkulturen mit

jeweils 1% (v/v) von P. agglomerans 21889Rf, R. aquatilis 39Rf oder B. subtilis BD170

und E. amylovora 7/74Sm angeimpft und über 5 Tage bei 24°C kultiviert (100 rpm). Je-

weils nach 24 Stunden wurde eine Probe genommen und zur Analyse der Populations-

entwicklung auf Rf oder Sm haltigem NS-Selektivagar ausplattiert, die Proben aus der

Kokultur von B. subtilis BD170 und E. amylovora 7/74Sm wurden auf Sm haltigen Selekti-

35


vagar und TSA ausplattiert. Als Kontrolle wurde die Populationsentwicklung einer E.

amylovora 7/74Sm-Reinkultur verfolgt.

Aus den Wachstumskurven war festzustellen, dass B. subtilis BD170 in Kokultur die

Population von E. amylovora 7/74Sm nach 2 Tagen im Vergleich zur Kontrolle um Faktor

1000 reduziert (Abb.9). R. aquatilis 39Rf und P. agglomerans 21889Rf reduzierten die

Population von E. amylovora 7/74Sm erst nach 4 Tagen signifikant.

Die Reduktion der E.amylovora 7/74Sm Population durch B. subtilis BD170 in Kokultur

zeigt, dass eine Wachstumshemmung bei direktem Kontakt stattfindet. Da bisher keine

extrazellulären antibiotischen Substanzen bei B. subtilis BD170 nachgewiesen werden

konnten (Glp. 5.6.1), ist diese Reduktion des Erregerwachstums auf Konkurrenz zurück-

zuführen. Der endgültige Nachweis dafür könnte erbracht werden, wenn die Hemmung

durch Zugabe von Nährstoffen kompensiert wird.

2

5

8

11

0 1 2 3 4 5 6

Zeit (d)

log

(cfu

/ml)

E.a. alleinE.a. KokulturB.s. Kokultur

Abbildung 9: Wachstumskurven von E.amylovora 7/74Sm und B. subti-lis BD170 in Kokultur in NS-Medium im Vergleich zum Wachstum von E. amylovora 7/74Sm allein.

5.6.3 Resistenzinduktion

Da bei den Isolaten R. aquatilis 39 und P. agglomerans 21889 in vitro keine starke bakte-

rizide Wirkung gegen E. amylovora 7/74 nachzuweisen war, sollte untersucht werden ob

durch die Lipopolysaccharide (LPS) dieser Stämme eine Resistenzreaktion induziert wird.

36


Es sollte daher überprüft werden, ob durch Applikation von Kulturbestandteilen der

Stämme R. aquatilis 39 und P. agglomerans 21889 die Entstehung reaktiver Sauerstoff-

spezies und eine Resistenzinduktion erzielt werden kann. Für die Reproduzierbarkeit

dieser Untersuchungen ist es notwendig, mit der zu testenden Probe die Blattinterzellula-

ren vollständig zu infiltrieren. Aufgrund der schlechten Infiltrierbarkeit von Apfel oder

Birnenblättern wurde für den Versuch zunächst das Wirt/Parasit-System Buschbohne

(Phaseolus vulgaris L.)/Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Fettfleckenkrankheit der

Buschbohne) ausgewählt. Dabei handelt es sich um ein kompatibles System, bei dem das

Pathogen auf eine Wirtspflanze trifft.

Tabelle 10: Anfärbung von Superoxidradikalen (Doke, 1983) in Blättern der Buschbohne „Red Kidney“ durch Kulturfraktionen von P. agglomerans 21889 und R. aquatilis 39. Kulturübersstand und Pellets wurden durch Zentrifugation bei 600xg getrennt. Pellets wurden 2 mal in Saline resuspendiert. Resuspendierte Zel-len wurden 5 min. bei 70°C erhitzt (Hitzeabgetöte Zellen) oder 24h bei Raumtem-peratur mit 10µg/ml Proteinase K inkubiert. + = Formazanniederschlag stärker als Kontrolle, - = kein Unterschied zu Kontrolle

Bakterienstamm Probe

P.a. 21889 R.a.39

Gesamtkultur + + Kulturüberstand - + Pellet in Saline - + Hitzegetötete Zellen - + Proteinase behandelte Zellfragmente - +

Nachdem die verstärkte Bildung von Superoxidradikalen durch Infiltration von Buschboh-

nenblättern mit Gesamtkulturen von R. aquatilis 39 und P. agglomerans 21889 einen

Hinweis auf eine Resistenzinduktion durch die Stämme ergeben hatte (Tab. 10), sollte

getestet werden ob durch die Präparate auch die Entwicklung der Krankheitssymptome

der bakteriellen Fettfleckenkrankheit der Buschbohne beeinflusst werden kann. In diesem

Versuch wurde von P. agglomerans 21889 lediglich die Gesamtkultur als Resistenzinduk-

tor getestet, da nur durch diese eine verstärkte Bildung von Superoxidradikalen zu beo-

bachten war. Im Falle von R. aquatilis 39 wurden neben der Gesamtkultur auch mit Prote-

inase behandelte Zellfragmente eingesetzt.

37


Für den Versuch wurden pro Variante 12 Bohnenpflanzen in vier Töpfen eingesetzt. 24 h

nach Applikation der zu testenden Proben erfolgte die Inokulation der Trifoliaten mit

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1715. Psp 1715 wurde über 24 h in 150 ml KB-

Flüssigkulturen angezogen (28°C), einmal gewaschen und in Saline resuspendiert. Die

OD660 wurde auf 0,06 eingestellt, nachfolgend wurde die Bakteriensuspension 1:1000

verdünnt. Die Keimzahl des Inokulums betrug 1,5x105 CFU/ml. Inokuliert wurden die

obersten Trifoliaten durch Sprühinokulation. Die Bonitur erfolgte durch die Ermittlung von

Befallsgraden. Die Ergebnisse der Resistenzinduktion gegen Psp1715 (Tab. 11) entspre-

chen weitgehend denen des Superoxidradikal-Nachweises. Die Gesamtkulturen R.

aquatilis 39 und P. agglomerans 21889 sind als Resistenzinduktoren aktiv. Auch die

Proteinase-behandelten Zellfragmente von Ra39 verursachten eine deutliche Hemmung

der Krankheitsentwicklung. In beiden Fällen entwickelte sich die Krankheit auch nach dem

dargestellten Zeitraum von 12 Tagen nicht über das Stadium der wasserdurchtränkten

Flecke (Boniturstufe 1) hinaus. Proteinase-behandelte Zellfragmente des Stammes P.

agglomerans 21889 hatten nur eine geringfügige Verzögerung der Krankheitsentwicklung

zur Folge.

Tabelle 11: Resistenzinduktion an Buschbohne gegen Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Psp 1715 durch Kulturfraktionen von R. aquatilis 39 und P. agglome-rans 21889. 1 = wasserdurchtränkte Flecke, 2 = Chlorose, 3 = Chlorose, Nekrose

Befallsgrad an Tagen nach Inokulation Variante 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kontrolle - - - - 1 1 2 2 3 3 3 3

Gesamtkultur von P.a. 21889 - - - - - - - 1 1 1 1 1

Proteinase behandelte Zell-fragmente von P.a. 21889

- - - - - 1 1 2 2 2 3 3

Gesamtkultur von R.a. 39 - - - - - - - - 1 1 1 1

Proteinase behandelte Zell-fragmente von R.a. 39

- - - - - - - - 1 1 1 1

Als Konsequenz der bisher dargestellten Ergebnisse mit Kulturfraktionen von R. aquatilis

39 wurde das LPS von R. aquatilis 39 gereinigt und nachfolgend auf eine resistenzindu-

zierende Wirkung überprüft. Durch Infiltration von Apfel-, Buschbohen-, und Knollenbego-

nienblättern mit dem LPS-Präparat von R. aquatilis 39 konnte die Bildung von Superoxid-

38


Radikalen beobachtet werden. Das LPS von P. syrngae pv. phaseolicola 1715 hatte

diesen Effekt nur an Knollenbegonie, das von Xanthomonas campestris b525 nur an

Buschbohne (Tab. 12).

Tabelle 12: Anfärbung von Superoxidradikalen (Doke, 1983) in Blättern der Buschbohne „Red Kidney“, der Knollenbegonie „Oslo“ und des Apfels „Golden Delicious“ durch LPS von R. aquatilis 39, Pseudomonas syrngae pv. phaseoli-cola 1715 und Xanthomonas campestris b525; + = stärker als Kontrolle, - = kein Unterschied zur Kontrolle

Versuchspflanze LPS-Präparat

Apfel „Golden Delicious“

Buschbohne „Red Kidney“

Knollenbegonie „Oslo“

Ra39 + + +

Psp1715 + - +

Xcb525 + + -

Im kompatiblen System Buschbohne - Pseudomonas syringae pv. phaseolicola wurden

die LPS-Präparate von R. aquatilis 39 und Psp1715 zur Resistenzinduktion eingesetzt.

Mit dem LPS-Präparat von R. aquatilis 39 konnte eine Verzögerung der Symptomausprä-

gung um 3 Tage erreicht werden, während das LPS von Psp1715 keinen Effekt hatte

(Tab. 13).

Tabelle 13: Resistenzinduktion an Buschbohne gegen Pseudomonas syrin-gae pv. phaseolicola 1715 durch LPS von P. syringae pv. phaseolicola 1715 und R. aquatilis 39. 1 = wasserdurchtränkte Flecke, 2 = Chlorose, 3 = Chlorose, Nekrose

Befallsgrad an Tagen nach Inokulation Variante

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kontrolle - - - - 1 1 2 2 3 3 3 3

LPS von P.s.p. 1715 - - - - 1 2 2 3 3 3 3 3

LPS von R.a.39 - - - - - - - 1 1 1 1 1

39


Es wurde außerdem versucht mit den LPS-Präparaten von R. aquatilis 39, P. syringae pv.

phaseolicola 1715 und X. campestris b525 eine Resistenz gegen E. amylovora 7/74 in

Apfelsämlingen zu induzieren. Da sich die Blätter von Apfelsämlingen sehr schlecht infilt-

rieren lassen, wurden die Blätter in eine konzentrierte LPS-Lösung (10 mg/ml) getaucht

und 24 Stunden später durch Stichinokulation an 6 Punkten mit E. amylovora7/74 ioku-

liert. Hier konnten allerdings bis jetzt keine Ergebnisse erzielt werden, da die Infektion

unregelmäßig erfolgte. Dies hängt vermutlich mit den durch die Inokulationsmethode

bedingten Verletzungen zusammen, durch die allein es schon zu einer Resistenzreaktion

der Pflanze kommen kann. Für die Zukunft ist daher vorgesehen die Versuche zur Resis-

tenzinduktion an den Blütenständen von Zieräpfeln fortzuführen. Dabei sollen sowohl die

LPS-Applikation als auch die Inokulation durch Besprühen der geöffneten Blütenstände

erfolgen.

6. Darstellung der Verwertbarkeit der Ergebnisse

6.1 Produktionsverfahren

In der phytopathologischen Literatur finden sich viele Berichte über erfolgreiche Scree-

nings von Mikroorganismen zum Einsatz im biologischen Pflanzenschutz. Nur sehr weni-

ge dieser vielversprechenden Mikroorganismen wurden bis zum marktfähigen Präparat

weiterentwickelt. Der Weg vom wirksamen Isolat zum marktfähigen Produkt führt nur über

ein geeignetes Produktionsverfahren.

Im Rahmen dieses Projektes konnten Grundlagen zur Fermentation, Aufarbeitung und

Formulierung von Mikroorganismen für den biologischen Pflanzenschutz erarbeitet wer-

den, die auch bei der Produktion von weiteren wirksamen Isolaten hilfreich sein können.

Vor allem das Wachstum vieler Mikroorganismen in dem kostengünstigen Produktions-

medium ist ein wichtiger Schritt auf dem Weg zu ökonomischen Produktionsverfahren.

Das im Rahmen des Projektes entwickelte Produktionsverfahren für das Bacillus subtilis

Isolat BD170 (Glp. 5.2.1) ist Grundlage für die Produktion des mikrobiellen Präparates

BIOPRO®. Nach der Aufnahme von BIOPRO® in die Liste über Pflanzenstärkungsmittel

der BBA im Mai 2001 wird, darf dieses Präparat zur Feuerbrandbekämpfung in Deutsch-

land eingesetzt werden.

Die für die Produktion der Hefeisolate (A. pullulans CF10, A. pullulans CF40, S. roseus

CF35) gewonnenen Ergebnisse sollen in weiteren Forschungsprojekten zu einem prakti-

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kablen Produktionsverfahren führen. Die Produktion dieser Stämme ist besonders inte-

ressant, da sie sowohl gegen Apfelfäulen (Leibinger, 1996) als auch gegen den Feuer-

branderreger einsetzbar sind (Glp. 5.4.1.1).

6.2 Untersuchungen zur Feuerbrandbekämpfung

Trotz des zunehmenden Befalls mit Feuerbrand in allen Obstanbaugebieten ist die Durch-

führung von statistisch abgesicherten Freilandversuchen zur Feuerbrandbekämpfung

immer noch sehr schwierig. Viele der in den letzten Jahren angesetzten Versuche konn-

ten wegen eines zu geringen Befalls nicht ausgewertet werden. Gesicherte Ergebnisse

sind deshalb nur in Versuchen zu erwarten, wo durch Inokulation mit dem Erreger für ein

ausreichendes Inokulumspotenzial gesorgt wird. Beim Feuerbranderreger handelt es sich

aber um einen Quarantäneerreger. Deshalb darf die Inokulation nur an isolierten, von den

Behörden genehmigten Standorten stattfinden. Die Aggresivität des Erregers führt zu-

sätzlich dazu, dass solche Versuchsanlagen nach dem Versuch meist gerodet werden

müssen. Diese Umstände machen Versuche zur Feuerbrandbekämpfung schwierig und

teuer. Deshalb war es notwendig ein Testsystem zu finden, das es ermöglicht verschie-

dene Mikroorganismen und verschiedene Formulierungen zu testen. Dies gelang inner-

halb des Projektes mit dem Aufbau des in-vivo Testsystems. Dieses System kann weiter

zum Screening von Wirkorganismen und Wirkstoffen genutzt werden, so dass die Suche

nach wirksameren Präparaten mit einer höheren Effizienz fortgesetzt werden kann.

In den Freilandversuchen wurde hauptsächlich das B. subtilis Isolat BD170 eingesetzt.

Die Ergebnisse aus diesen Versuchen werden für das Zulassungsverfahren von

BIOPRO® in der Schweiz verwendet. Diese Ergebnisse werden auch zur Einschätzung

des Präparates für Berater und Anwender benötigt. Leider bestätigten sich die positiven

Versuchsergebnisse aus dem Jahr 1999 nicht in allen Versuchen, so dass sich Zweifel an

der Verwendbarkeit von BIOPRO® zur Feuerbrandbekämpfung ergaben. Neue Ergebnis-

se mit dem in vivo Testsystem zeigen, dass die Temperatur einen großen Einfluss auf die

Wirksamkeit von BIOPRO® hat. Bei Temperaturen unter 25°C nimmt die Vermehrung auf

der Blüte und damit die Wirksamkeit ab. Im Freiland kann die Temperatur natürlich nicht

beeinflußt werden. Allerdings zeigte sich, dass bei geringeren Temperaturen A. pullulans

CF40 wirksam ist. So könnte mit der Zugabe dieses Isolates zu BIOPRO® die Wirksam-

keit im unteren Temperaturbereich deutlich verbessert werden.

Die Ergebnisse zum Wirkungsmechanismus der Mikroorganismen bei der Feuerbrandbe-

kämpfung werden für die Planung weiterer Versuche berücksichtigt. Da die Wirkung von

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B. subtilis BD170 auf Konkurrenz beruht, muss hier darauf geachtet werden, dass eine

Möglichst gute Vermehrung in der Blüte stattfindet. Der Wirkung von R. aquatilis scheint

dagegen auf der Induktion einer Resistenz durch das LPS dieses Bakteriums zu beruhen.

Bei der Terminierung von Behandlungen müssen diese unterschiedlichen Wirkungswei-

sen berücksichtigt werden. Zusätzlich könnte ein Kombination beider Organismen eine

deutliche Steigerung der Wirksamkeit bringen.

7. Darstellung der während der Durchführung von dritter Seite bekannt gewordenen Ergebnisse

In Deutschland und in anderen europäischen Ländern wie der Schweiz, Österreich, Italien

und Ungarn (Németh, 1999) schritt die Ausbreitung des Feuerbranderregers im Berichts-

zeitraum weiter voran. Obwohl die Befallssituation in Süddeutschland und in der Schweiz

(FAW, 2001; Feuerbrandgruppe-FAW, 2001) im Jahr 2001 weniger gravierend war als im

Jahr 2000, sollte man nicht von einer Entspannung ausgehen, da diese Schwankungen

im Auftreten des Erregers von den Witterungsbedingungen während der Blüte abhängen.

Latenter Befall in symptomlosen Pflanzen kann unter günstigen Witterungsbedingungen

immer wieder zu neuen Epidemien führen (Crepel und Maes, 2000). Dies zeigt, dass in

der Zukunft weltweit vermehrt Präparate zur Bekämpfung des Feuerbrandes benötigt

werden. Dass man sich dabei nicht nur auf ein Präparat wie das Antibiotikum Streptomy-

cin verlassen kann, zeigen die Erfahrung mit der Resistenzentwicklung gegenüber diesem

Wirkstoff aus USA (Johnson und Stockwell, 1998), Israel (Manulis et al., 1998) und Kana-

da (Sholberg et al., 2001).

In Deutschland konnte das Antibiotikum Streptomycin (Handelsname: Plantomycin) über

eine Allgemeinverfügung der BBA von 1994 bis 1998 zur Feuerbrandbekämpfung einge-

setzt werden (Backhaus und Klingauf, 1998). Diese Allgemeinverfügung wurde für 1999

nicht mehr ausgesprochen, so daß Plantomycin in Deutschland nicht mehr eingesetzt

werden konnte. Im Jahr 2000 erfolgte dann eine auf drei Jahre befristete Zulassung von

Plantomycin als PfIanzenschutzmittel, so dass im Jahr 2000 Plantomycin zur Feuer-

brandbekämpfung eingesetzt wurde. Der im Vergleich zur Schweiz geringere Befall in

Deutschland wurde auf diesen Antibiotikaeinsatz zurückgeführt. Im März 2001 wurde in

Deutschland die Zulassung des Antibiotikums Streptomycin ausgesetzt, da Rückstände in

Honigen nachgewiesen wurden (Pressemitteilung der BBA vom 13.03.2001). Somit stand

im Jahr 2001 in Deutschland kein zugelassenes Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung

des Feuerbrandes zur Verfügung.

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Durch die Unsicherheit bei der Verfügbarkeit von Plantomycin und der Bedarf an Bekämp-

fungsmöglichkeiten im ökologischen Obstbau haben in den letzten Jahren zu erhöhten

Forschungsaktivitäten in Sachen Feuerbrandbekämpfung geführt. In Israel zeigten Feld-

versuche an Birnen, dass mit Oxolinsäure eine gute Wirkung gegen den Feuerbranderre-

ger erzielt werden kann (Shtienberg et al., 2001). Ob sich diese Versuche in anderen

Anbaugebieten bestätigen und ob dieses synthetisches Quinolinderivat, das von der

Japanischen Firma Sumitomo Chemicals als Bakterizid entwickelt wurde, eine Zulassung

als Pflanzenschutzmittel in Europa bekommen wird, ist bisher nicht absehbar.

In den USA wird das Präparat Blight Ban A506 mit dem Wirkorganismus Pseudomonas

flourescens Stamm A506 zum Einsatz gegen den Feuerbrand angeboten (Johnson und

Stockwell, 1998). Der Stamm trägt eine Antibiotikaresistenz, was eine Genehmigung in

Deutschland erschweren würde. Außerdem konnte mit dem Präparat in Deutschland

keine befriedigende Wirkung erzielt werden (Fried, 1999).

In Versuchen der Pflanzenschutzdienste der Länder Rheinland-Pfalz und Baden-

Württemberg wurden in den letzten Jahren diverse alternative Präparate getestet (Fried,

1999; Fried, 2001a; Fried, 2001b; Harzer, 2001; Knewitz und Lehn, 1999). Keines der

Präparate erreichte in den Versuchen mit dem Streptomycin vergleichbare Wirkungsgra-

de. Getestet wurden Wachstumsregulatoren (Prohexadion-Ca) Gesteinsmehlpräparate

(Myco-Sin) und mikrobielle Präparate. Neben den in diesem Forschungsprojekt entwickel-

ten Präparat BIOPRO® wurden noch weitere Präparate mit dem Wirkorganismus B. subti-

lis getestet (Serenade®; FZB24®WG). Die Schwankungen in der Wirkung der alternativen

Präparate war zwischen den einzelnen Versuchen größer als die Unterschiede zwischen

den Präparaten. Eine Bewertung der einzelnen Mittel ist deshalb schwierig. Insgesamt

waren die Wirkungsgrade mit maximal 58% zu gering, als dass die Präparate von den

Pflanzenschutzdiensten empfohlen werden könnten.

8. Veröffentlichungen

Teilergebnisse aus diesem Forschungsprojekt wurden vom Institut für biologischen Pflan-

zenschutz der BBA auf Tagungen vorgestellt und in den Tagungsbänden veröffentlicht

(Basim et al., 2000; Laux et al., 2000; Laux et al., 1999).

Die Ergebnisse der Freilandversuche, für die Präparate zur Verfügung gestellt wurden,

wurden von den Versuchsanstellern veröffentlicht (Fried, 1999; Fried, 2001a; Fried,

2001b; Harzer, 2001; Knewitz und Lehn, 1999).

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