Entwicklung säurelabiler Trigger-Gruppen auf Basis von ...

Entwicklung säurelabiler Trigger-Gruppen auf Basis von Schiffschen Basen des

p-Aminobenzylalkohols

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

vorgelegt von

Ivonne Anita Müller geboren in Fulda

2010

Die vorliegende Arbeit entstand im Zeitraum von Oktober 2006 bis

September 2010 in der Klinik für Tumorbiologie, Freiburg im Breisgau unter

Anleitung von Herrn Dr. A. Warnecke und Herrn Dr. F. Kratz in Kooperation mit

Herrn Prof. Dr. M. Jung am Institut für Pharmazeutische Chemie der Albert-

Ludwigs-Universität, Freiburg im Breisgau.

Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. R. Schubert

Referent: Prof. Dr. M. Jung

Koreferent: Prof. Dr. C. Unger

Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 04.11.10

Posterbeiträge

I. A. Müller, F. Kratz, A. Warnecke; Self-immolative linkers for the design of acid-

sensitive polymer conjugates of Camptothecin, 7th International Symposium on

Polymer Therapeutics: From Laboratory to Clinical Practice, Valencia, 2008,

Abstract book p. 141.

I. A. Müller, F. Kratz, M. Jung, A. Warnecke; Imines based on p-aminobenzyl

alcohol as versatile trigger groups for the design of pH-sensitive anticancer

prodrugs, 10th Tetrahedron Symposium, Paris, 2009, Abstract book B038.

A. Warnecke, I. A. Müller, F. Kratz; Linear self-eliminating systems – oligomers for

a controlled release of effector molecules, 10th Tetrahedron Symposium, Paris,

2009, Abstract book B019.

Publikationen

F. Kratz, I. A. Müller, C. Ryppa, A. Warnecke; Prodrug strategies in anticancer

chemotherapy, ChemMedChem, 2008, 3 (1), 20–53 (Review).

I. A. Müller, F. Kratz, M. Jung, A. Warnecke; Schiff bases derived from

p-aminobenzyl alcohol as trigger groups for pH-dependent prodrug activation,

Tetrahedron Lett., 2010, 51 (33), 4371–4374.

Patent

I. A. Müller, A. Warnecke; Acid-labile trigger units, Europäische Patentanmeldung,

EP 09008150.6.

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Manfred Jung für seine

hilfreichen Ratschläge, aufbauenden Worte und für sein großes Engagement bei

der Beschaffung finanzieller Mittel.

Weiterhin möchte ich Herrn Prof. Dr. Clemens Unger für die Annahme des

Koreferats danken.

Für die große Unterstützung bei der Überwindung zahlreicher Hindernisse und das

allseits offene Ohr danke ich Herrn Dr. André Warnecke.

Bei Herrn Dr. Felix Kratz möchte ich mich für die freundliche Aufnahme in seine

Arbeitsgruppe und die finanzielle Unterstützung bedanken.

An dieser Stelle gilt mein Dank Volker Brecht für die Aufnahme der NMR-

Spektren. Dr. Jürgen Wörth und Christoph Warth bin ich für das Erstellen der

Massenspektren zu Dank verpflichtet. Florian Tönnies danke ich für die

Durchführung der Elementaranalysen.

Vielen Dank sage ich auch unserer fleißigen Laborantin Tamara Huck und Florian

Vonberg, der im Rahmen seiner Ausbildung einen wesentlichen Beitrag zu dieser

Arbeit geleistet hat.

Lisa, Katrin und Steffi möchte ich für die Zerstreuung an so manch

feuchtfröhlichen und witzigen Abenden danken.

Abschließend möchte ich noch ein herzliches Dankeschön an alle aktuellen und

ehemaligen Kollegen der Arbeitsgruppen Kratz und Jung aussprechen, die durch

eine angenehme Arbeitsatmosphäre zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen

haben.

Abkürzungsverzeichnis

Å Längeneinheit (1 Å = 10-10 m) LC liquid chromatography

abs. absolut (engl.)

Ac Acetyl LFER linear free energy

MeCN Acetonitril relationship (engl.)

AMC 7-Amino-4-methylcumarin Me Methyl

Boc tert.-Butoxycarbonyl MeOH Methanol

CI Chemische Ionisation mPEGxk Monomethoxypoly-

CuAAC Kupfer-katalysierte Alkin-Azid- (ethylenglykol) (x kDa)

Cycloaddition Ms Methansulfonyl

∆ Erwärmen MS Massenspektrometrie

DBTL Dibutylzinndilaurat NEt3 Triethylamin

DC Dünnschichtchromatographie NMR nuclear magnetic

DCM Dichlormethan resonance (engl.)

DIEA N-Ethyldiisopropylamin Np p-Nitrophenyl

DMAP N,N-Dimethyl-4-aminopyridin PABA p-Aminobenzylalkohol

DMF N,N-Dimethylformamid PABC p-Aminobenzyloxy-

DMSO Dimethylsulfoxid carbonyl

EI Elektronenstoß-Ionisation PE Poly(ethylen)

em. Emission PEG Poly(ethylenglykol)

ESI Elektrospray-Ionisation PMDETA N,N,N’,N’,N’’-Penta-

Et2O Diethylether methyldiethylentriamin

EtOH Ethanol PPTS Pyridinium-p-

EPR enhanced permeability and toluolsulfonat

retention (engl.) RP reversed phase (engl.)

eq equivalent (engl.) RT Raumtemperatur

ex. Excitation Smp. Schmelzpunkt

ges. gesättigt t1/2 Halbwertszeit

Glch. Gleichung TBS tert.-Butyldimethylsilyl

HSA Humanserumalbumin TFA Trifluoressigsäure

I Fluoreszenzintensität THF Tetrahydrofuran

konz. konzentriert TMS Tetramethylsilan

IUPAC-Nomenklatur ausgewählter Verbindungen

Für die aufgeführten Verbindungen werden im Folgenden ausschließlich

Trivialnamen verwendet.

Doxorubicin (7S,9S)-7-[(2R,4S,5S,6S)-4-Amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-

yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-8,10-

dihydro-7H-tetracen-5,12-dion

OHOH

O

OO OH

OH O

OO

NH2

HO

Paclitaxel 4α,10β-Bis(acetyloxy)-13α-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-

hydroxy-3-phenylpropanoyloxy]-1,7β-dihydroxy-9-oxo-5β,20-

epoxytax-11-en-2α-yl-benzoesäureester

O

O

OO

OH

OOO

HO

NH

OH

OO

O

O

Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ........................................................................................................1 1.1 Prodrugstrategien in der antitumoralen Chemotherapie ...................................1

1.1.1 Aktives Tumor-Targeting ...................................................................3

1.1.2 Passives Tumor-Targeting unter Ausnutzung des EPR-Effekts ........3

1.2 Strategien für eine tumorspezifische Aktivierung von Prodrugs – Konzept der

säurelabilen Freisetzung...................................................................................5

1.3 Strategie der doppelten Prodrugs...................................................................12

1.4 Linker-Systeme für eine gezielte Freisetzung von Wirkstoffen .......................15

1.4.1 Selbsteliminierende Linker ..............................................................15

1.4.2 Chemische Adapter-Systeme..........................................................18

2. Zielsetzung....................................................................................................20 3. Ergebnisse und Diskussion.........................................................................22

3.1 Entwicklung niedermolekularer AMC-Modellverbindungen mit säurelabil

getriggertem PABC-Linker..............................................................................22

3.1.1 Synthese niedermolekularer, säurelabiler Modellverbindungen .......22

3.1.2 Synthese einer Modellsubstanz zur Untersuchung der

1,6-Eliminierungsreaktion.................................................................27

3.1.3 Untersuchung der pH-abhängigen Spaltungseigenschaften der

niedermolekularen AMC-Modellverbindungen 1b, 4b–14b und 17 ..28

3.1.4 Untersuchung der Substituenteneffekte hinsichtlich der Linearen

Freien Enthalpie-Beziehung (LFER).................................................34

3.1.5 Untersuchung der Hydrolyseeigenschaften von 13b und 14b im

physiologisch relevanten pH-Bereich ...............................................36

3.1.6 Untersuchung der Plasmastabilität ausgewählter Modell-

verbindungen ...................................................................................39

3.2 Entwicklung makromolekularer, säurelabiler Verbindungen unter Verwendung

eines neuen trifunktionellen Linker-Systems auf Basis von 3-Amido-4-

hydroxymethylanilin ........................................................................................42

3.2.1 Syntheseversuche makromolekularer PEG-geträgerter

Verbindungen...................................................................................45

3.2.1.1 Synthesestrategien ......................................................................45

3.2.1.2 Synthese niedermolekularer Vorstufen zur Darstellung

makromolekularer AMC-Modellverbindungen bzw. Prodrugs ......46

3.2.1.3 Untersuchungen der pH-abhängigen Spaltungseigenschaften der

niedermolekularen Modellverbindungen und Prodrugs 28, 29 und

38–41 ...........................................................................................50

3.2.1.4 Versuche zur Darstellung makromolekularer AMC-Modellverbin-

dungen und Prodrugs mittels CuAAC ..........................................53

3.2.2 Alternative Synthesestrategien zur Darstellung makromolekularer

AMC-Modellverbindungen................................................................58

3.2.3 Abschließende Untersuchungen zur Eignung von 3-Amido-4-

hydroxymethylanilin als Adapter-Baustein........................................62

3.3 Säurelabile PEG-Konjugate auf Basis des 2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin-

Linkers ............................................................................................................64

3.3.1 Synthese und Charakterisierung der makromolekularen AMC-

Modellverbindungen.........................................................................65

3.3.2 Synthese einer pH-unempfindlichen Vergleichsubstanz ..................68

3.3.3 Untersuchung der Stabilität der Vergleichsubstanzen (16 und 55)

sowie der Spaltungseigenschaften der PEG-Konjugate 53 und 54 ..70

3.3.4 Untersuchung der Plasmastabilität von 53 und 54 ..........................75

3.4 Untersuchung der nachgelagerten 1,4-Benzyleliminierung anhand

niedermolekularer AMC-Modellverbindungen.................................................76

4. Fazit und Ausblick ........................................................................................81

5. Zusammenfassung .......................................................................................82 6. Experimenteller Teil .....................................................................................87 6.1 Materialien und Methoden ..............................................................................87

6.1.1 Verwendete Reagenzien .................................................................87

6.1.2 Verwendete Geräte und Materialien................................................87

6.1.3 Chromatographie.............................................................................89

6.1.4 Fluorometrische Bestimmung der Halbwertszeiten der AMC-Modell-

verbindungen in Puffer-, Plasma- und Albuminlösungen..................89

6.2 Chemische Synthesen....................................................................................91

6.2.1 Synthese der niedermolekularen AMC-Modellverbindungen 1b und

4b–14b.............................................................................................91

6.2.2 Synthese der Modellsubstanz 17 ..................................................111

6.2.3 Synthese niedermolekularer Vorstufen für die Darstellung von PEG-

geträgerten AMC-Modellverbindungen mittels CuAAC ..................113

6.2.4 Synthese niedermolekularer Vorstufen für die Darstellung von PEG-

geträgerten Prodrugs mittels CuAAC .............................................125

6.2.5 PEG-Synthesen am Beispiel von PEG2k ........................................136

6.2.6 Synthese niedermolekularer Vorstufen zur Darstellung von AMC-

Modellverbindungen über zur CuAAC alternative Reaktionen .......138

6.2.7 Synthese der makromolekularen Modellverbindungen 53–55.......140

6.2.8 Synthese der niedermolekularen Modellverbindungen 56 und 57 .145

7. Literatur .......................................................................................................152

Anhang ...............................................................................................................158

Einleitung _________________________________________________________________

- 1 -

1. Einleitung

1.1 Prodrugstrategien in der antitumoralen Chemotherapie

Nach Herz- und Kreislauferkrankungen ist Krebs noch immer die zweithäufigste

Todesursache in Deutschland. Die Anzahl der an Krebs neuerkrankten Patienten

wächst vor allem aufgrund der gestiegenen Lebenserwartung kontinuierlich

(Tab. 1.1). Tab. 1.1: Zahlen zu registrierten Krebsneuerkrankungen und -sterbefällen in Deutschland aus dem

Jahr 2006 und eine Schätzung für 2010. Mit Ausnahme der Erkrankungen am malignen Melanom

wurden Hautkrebserkrankungen nicht berücksichtigt.1

Männer Frauen

Erkrankungsfälle 2006 229.200 197.600

Projektion für 2010 246.200 204.000

Sterbefälle 2006 112.438 98.492

Häufigste Krebserkrankung; Prostatakrebs Brustkrebs

daran in 2006 neu Erkrankte 60.100 58.000

Auch wenn die Überlebensraten in den letzten Jahren für einzelne Krebsarten wie

z. B. Prostatakrebs durch moderne Therapien deutlich gesteigert werden konnten,

gibt es noch immer viele Krebserkrankungen, bei denen konventionelle

Behandlungsmethoden versagen. Aus diesem Grund wurden auf der Suche nach

neuen Therapieoptionen in den letzten Jahrzehnten intensiv die Entstehung und

Pathophysiologie von Krebserkrankungen erforscht.2-4 Insbesondere die neuen

Erkenntnisse zu den auf biochemischer und molekularbiologischer Ebene

ablaufenden Vorgängen führten zu zahlreichen neuen Therapieansätzen. Dazu

gehören beispielsweise die Behandlung mit monoklonalen Antikörpern5-8 sowie mit

Inhibitoren von Tyrosinkinasen,9-11 DNA-Methyltransferasen bzw. Histondes-

acetylasen,12-15 der Angiogenese16,17 und des Proteasoms.18-20 Weitere neue

Entwicklungen sind Impfungen21 und die somatische Gentherapie.22

Einleitung _________________________________________________________________

- 2 -

Da sie zumeist nur gegen bestimmte Tumorentitäten gerichtet sind, ließen sich

diese neuen, vielversprechenden Methoden bisher nur in begrenztem Maße

erfolgreich etablieren. Die klassische und vielseitig einsetzbare Chemotherapie

von Tumoren mit zytostatischen, d. h. zellteilungshemmenden Wirkstoffen bildet

daher weiterhin eine der tragenden Säulen bei der Behandlung von

Krebserkrankungen. Gravierende systemische Nebenwirkungen wie Haarausfall,

Blutbildstörungen, Übelkeit und Diarrhöen, die sich dosislimitierend auswirken,

verhindern jedoch in vielen Fällen, dass sich das therapeutische Potenzial dieser

Arzneistoffe vollständig ausschöpfen lässt. Das grundlegende Problem hierfür liegt

in der mangelnden Tumorselektivität der klinisch eingesetzten Zytostatika. Zur

Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten von Krebspatienten sind deshalb

therapeutische Konzepte erforderlich, die das pharmakologische Potenzial eines

tumorhemmenden Wirkstoffs durch ein Anreichern (Tumor-Targeting, Abb. 1.1)

und gezieltes Freisetzen im Tumor erhöhen und gleichzeitig die toxischen

Wirkungen auf den gesunden Teil des Körpers verringern. In diesem

Zusammenhang wurden in der Vergangenheit sowohl aktive als auch passive

Targeting-Ansätze verfolgt, von denen sich insbesondere die Verwendung von

Makromolekülen als Transportvehikel bewährt hat.23-26

Träger-Wirkstoff-Konjugat

WirkstoffTargeting-Einheit

Aktives Targeting (Kap. 1.1.1)

monoklonale Antikörper

Rezeptor-affine Liganden

Passives Targeting (Kap. 1.1.2)

Polymere oder Proteine miteiner molaren Masse >30 kDa

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Tumor-Targeting-Strategie, bei der Wirkstoffe an einen

Träger gebunden werden.

Einleitung _________________________________________________________________

- 3 -

1.1.1 Aktives Tumor-Targeting

Das aktive Targeting basiert auf Antigenen und Rezeptoren, die in gesunden und

malignen Geweben an der Zelloberfläche unterschiedlich stark exprimiert werden.

Beispielsweise können Zellmarker wie die „Unterscheidungsgruppen“ (cluster of

differentiation (CD)),27,28 Integrine29-31 und der Folatrezeptor32,33 als Angriffsziele

für Wirkstoffkonjugate dienen, in die zum Erkennen eines spezifischen

Oberflächenmerkmals monoklonale Antikörper oder Liganden mit hoher

Rezeptoraffinität integriert wurden. Nach Bindung an der Zelloberfläche werden

die Konjugate schließlich entweder extrazellulär oder im Anschluss an die

endozytotische Aufnahme intrazellulär gespalten.

Nachteilig für dieses vielversprechende Konzept ist die oftmals nicht sonderlich

stark ausgeprägte Tumor-Spezifität der Liganden und Antikörper.34,35 Außerdem

wird der Therapieeffekt von der Anzahl der an der Zelloberfläche vorhandenen

Marker sowie deren Heterogenität begrenzt, und nur geringe Mengen des

Konjugats gelangen in die häufig schlecht vaskularisierten Regionen des

Tumors.36 Dennoch wurden mit der aktiven Targeting-Strategie Erfolge erzielt.37,38

Beispielsweise wurde das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat Gemtuzumab

Ozogamicin (Handelsname: Mylotarg®) (siehe Kap. 1.2) zur Behandlung der

akuten myeloischen Leukämie zugelassen.39

Gegenüber der aktiven Targeting-Strategie sind passive Ansätze deutlich

preisgünstiger zu realisieren. Daher lohnt es sich, diese trotz weniger stark

ausgeprägtem Targeting-Effekt zu verfolgen.

1.1.2 Passives Tumor-Targeting unter Ausnutzung des EPR-Effekts

Die Strategie des passiven Targetings basiert auf dem Phänomen, dass sich

synthetische Polymere, aber auch Serumproteine mit einem Molekulargewicht

>30 kDa im Tumorgewebe auf eine im Vergleich zu gesundem Gewebe um den

Faktor 5-10040 erhöhte Konzentration anreichern. Dieser passive Effekt, der auch

als EPR-Effekt (enhanced permeability and retention) bezeichnet wird (Abb. 1.2,

S. 4), beruht auf einer für Makromoleküle erhöhten kapillaren Durchlässigkeit des

Einleitung _________________________________________________________________

- 4 -

Tumorgewebes, verbunden mit einem defekten abführenden Lymphsystem.

Zudem verfügen Makromoleküle über eine gegenüber niedermolekularen

Verbindungen veränderte Pharmakokinetik, die aus einer herabgesetzten renalen

Filtration resultiert und zu höheren Plasmahalbwertszeiten führt.41,42 In späteren

Arbeiten konnte zudem gezeigt werden, dass sich der EPR-Effekt, z. B. durch

Gabe von blutflusserhöhenden Mitteln wie Glycerintrinitrat40 bzw. blutdrucker-

höhenden Mitteln wie Angiotensin II,43 zusätzlich verstärken lässt.

Die Anreicherung im Tumorgewebe wurde bereits für eine ganze Reihe

synthetischer Polymere wie Styrol-Maleinsäure-Copolymere (z. B. SMANCS),44 N-

(2-Hydroxypropyl)methacrylamid- (HPMA)-Copolymere,45-47 Poly(ethylenglyko-

le),48,49 Poly(L-glutaminsäure),50 Poly(vinylalkohol),51,52 aber auch für Biomoleküle

wie Serumproteine53,54 nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass

der EPR-Effekt eine universelle Erscheinung ist, die weitgehend unabhängig von

der chemischen Natur des Makromoleküls auftritt.

Lymphatic System

Normal tissue

pH ~7

Blood streamMacromolecules

Tumor tissue

pH ~6

Small Molecules

Lymphatic system

Small molecules

Macromolecules

Lymphatisches System

Makromoleküle

BlutstromKleine

Moleküle

Normales Gewebe

Tumorgewebe

Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines an gesundes und tumorales Gewebe grenzenden

Blutgefäßes.23

Neben der Größe müssen bei der Auswahl eines geeigneten Trägers für

Wirkstoffe weitere Faktoren berücksichtigt werden.55 Einerseits sollte das

Makromolekül einen gezielten Transport von eingeschlossenen oder gebundenen

Arzneistoffen ins Zielgewebe gewährleisten, andererseits ist ein effizientes und

möglichst spezifisches Freisetzen des Wirkstoffs am Zielort für eine erfolgreiche

Anwendung zwingend erforderlich. Weitere Anforderungen an den Träger sind

Einleitung _________________________________________________________________

- 5 -

Bioverträglichkeit, gute Wasserlöslichkeit sowie synthetisch-chemische Diversität.

All diese gewünschten Eigenschaften besitzt das synthetische Polymer

Poly(ethylenglykol) (PEG), weshalb es sich besonders für die Entwicklung

therapeutischer Polymerkonjugate eignet. So konnte durch "Pegylierung" von

Proteinen56-58 deren Immunogenität und Pharmakokinetik verbessert werden.

Zudem schützt PEG Wirkstoffe59-61 vor Angriffen durch Enzyme oder Antikörper.

Neben der Wahl des Trägermoleküls ist der Einbau einer geeigneten

Sollbruchstelle zwischen Wirkstoff und Makromolekül von entscheidender

Bedeutung für die Wirksamkeit von Konjugaten.

1.2 Strategien für eine tumorspezifische Aktivierung von Prodrugs – Konzept der säurelabilen Freisetzung

Zur Realisierung einer tumorspezifischen Freisetzung wurden zahlreiche

Methoden62 entwickelt, die biochemische oder pathophysiologische

Besonderheiten des Zielgewebes bzw. der Zielzellen zur Freisetzung des

Wirkstoffs ausnutzen. So wurden in der Vergangenheit erfolgreich

tumorassoziierte, d. h. im Tumor (über-)exprimierte, Proteasen für die Aktivierung

von Prodrugs (siehe Kap. 1.3) ausgenutzt. Zu diesen Enzymen gehören

beispielsweise Cathepsine,63,64 Matrixmetalloproteinasen,65 das Prostata-

spezifische Antigen66 und zahlreiche weitere Biokatalysatoren.67-69

Darüber hinaus können hypoxische Tumorzellen, die häufig nicht auf eine

klassische Behandlung durch Strahlentherapie oder Zytostatika ansprechen,

gezielt durch reduktiv-spaltbare Prodrugs abgetötet werden.70-75

Eine in der Regel vielseitigere Methode als beispielsweise die enzymatische

Aktivierung, die eine (Über-)Expression der Zielenzyme bei den zu behandelnden

Tumorentitäten voraussetzt, ist die Verwendung von säurelabilen Sollbruch-

stellen. Diese Freisetzungsstrategie beruht auf einem universellen, in allen

Tumorzellen beobachtbaren Phänomen. Durch nicht-invasive Techniken konnte

gezeigt werden, dass der interstitielle pH-Wert in Tumorgewebe häufig um 0.5–1.0

pH-Einheiten niedriger liegt als in gesundem Gewebe,73 während sich der

Einleitung _________________________________________________________________

- 6 -

zytosolische pH-Wert von Tumorzellen nicht von dem anderer Zellen

unterscheidet.

Einen deutlich größeren pH-Abfall erfährt ein makromolekulares Prodrug während

seiner zellulären Aufnahme. Makromoleküle werden – anders als niedermole-

kulare Verbindungen – nicht mittels Diffusion durch die Zellmembran, sondern

über Endozytose in eine Zelle aufgenommen. Abhängig von der chemischen Natur

des Makromoleküls kann dieser Vorgang unspezifisch und/oder rezeptorvermittelt

ablaufen (siehe Abb. 1.3).

Endosom

Primäre oder sekundäre Lysosome

pH 4

pH 6.5-5Recycling

Diffusion des Wirkstoffsin das Zytoplasma

Flüssig-Phasen-EndozytoseAdsorptive Endozytose

Rezeptor-vermittelteEndozytoseMakromolekulares

Prodrug

ExtrazellulärerRaumpH 7.2-7.4

Abb. 1.3: Zelluläre Mechanismen zur Aufnahme von makromolekularen Prodrugs.23

Im Verlauf der Endozytose werden durch Einstülpungen der Zellmembran kleine

Vesikel, die Endosomen, gebildet. In deren Inneren sinkt – verursacht durch eine

Adenosintriphosphat- (ATP-) abhängige Protonenpumpe – der pH-Wert von

ursprünglich 7.2–7.4 im extrazellulären Raum auf 6.5–5.0. Bei weiterer

Umwandlung in primäre oder sekundäre Lysosomen kann der pH-Wert bis auf

pH 4 abfallen. Eindrucksvolle Aufnahmen von Endosomen in HeLa-Zellen wurden

kürzlich von SERRESI et al.76 veröffentlicht (Abb. 1.4, S. 7). Durch Fusion zweier

Proteine (des ratiometrischen pH-Indikators E1GFP mit HIV-Tat, das eine

endozytotische Aufnahme des fusionierten Proteins gewährleistet) und

Einleitung _________________________________________________________________

- 7 -

anschließender Inkubation der Zellen ließen sich Echtzeitaufnahmen des

vollständigen endozytotischen Prozesses gewinnen. Abbildung 1.4 zeigt eine

Momentaufnahme des untersuchten Vorgangs 6 h nach Inkubation der Zellen mit

Tat-E1GFP. Zu diesem Zeitpunkt lag der pH-Wert im Inneren der Endosomen bei

pH 5.83.

Abb. 1.4: Messungen der pH-Änderungen in Vesikeln 6 h nach Inkubation mit Tat-E1GFP.

a) Konfokale Aufnahme von HeLa-Zellen, b) Ratiometrische Übersicht der pH-Werte in mit

Tat-E1GFP-angereicherten Vesikeln, c) Vergrößerter Ausschnitt aus Abbildung a, d) Vergrößerter

Ausschnitt aus Abbildung b (Diese Abbildung wurde entnommen aus SERRESI et al.76).

Insbesondere der deutliche pH-Sprung von 2–3 Einheiten nach zellulärer

Aufnahme lässt sich für das Design von Prodrugs mit einer säureempfindlichen

Bindungsstelle zwischen Wirkstoff und Träger ausnutzen. Chemisch lassen sich

pH-abhängige Sollbruchstellen beispielsweise durch Acetal-77,78 bzw. Orthoester-

Bindungen,79,80 cis-Aconityl-51,81,82 sowie Trityl-Spacer,83 N-Alkoxyalkylimidazole,84

Acylhydrazone85-89 und Imine26,90,91 realisieren (Abb. 1.5, S. 8). Bei der Wahl einer

für die Entwicklung von säurelabilen Prodrugs geeigneten Sollbruchstelle sind

Einleitung _________________________________________________________________

- 8 -

verschiedene Faktoren zu berücksichtigen. Die Bindung sollte bei neutralem

pH-Wert und im Blut stabil sein und im leicht Sauren rasch hydrolysieren.

Außerdem sollte sie vielseitig einsetzbar sein sowie einfach und effektiv zwischen

Wirkstoff und Träger aufgebaut werden können. Die Möglichkeit,

Spaltungseigenschaften durch geringfügige Strukturvariationen maßzuschneidern,

wäre ein weiterer Vorteil. Während Acylhydrazone zumeist für eine medizinische

Anwendung geeignete Spaltungseigenschaften besitzen, weisen Acetale und

Orthoester häufig eine zu hohe Stabilität bei pH 4–5 auf.77,79 Aliphatische Imine

sind in der Regel äußerst säureempfindlich, jedoch besitzen aromatische Imine

günstige Hydrolyseeigenschaften. Als Sollbruchstelle eignet sich ebenfalls die

cis-Aconityl-Bindung. Allerdings entsteht beim Aufbau dieser Bindung ein oftmals

deutlich stabileres trans-Isomer, welches aufwändig aus dem Gemisch entfernt

werden muss.51 Unter Berücksichtigung der säurelabilen Eigenschaften und des

Syntheseaufwands eignen sich Acylhydrazon- bzw. aromatische Imin-Bindungen

besonders für eine Anwendung als Sollbruchstelle in pH-empfindlichen Prodrugs

zu empfehlen.

R

NNH

R

NNH

O

R

N

NH

NH

O OHO O

NH

O O

R R

O O

R H

Imin-Bindung Hydrazon-Bindung Acylhydrazon-Bindung

Acetal-BindungKetal-Bindung

cis-Aconityl-Bindung Trityl-Bindung

O O

H

O O

Roder oder

Abb. 1.5: Die wichtigsten pH-sensitiven funktionellen Gruppen für die Entwicklung säurelabiler

Prodrugs.23

Ein säurelabiles Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit integrierter Acylhydrazon-

Bindung, das bereits zur Behandlung der akuten myeloischen Leukämie

zugelassen wurde, ist Gemtuzumab Ozogamicin (Handelsname: Mylotarg®).

Einleitung _________________________________________________________________

- 9 -

Dieses Prodrug besteht aus dem Antikörper P67.6 (für selektives Targeting von

CD33) und einem Acylhydrazid-Derivat des hochpotenten Endiin-Antibiotikums

Calicheamicin.39 Verbunden sind die beiden Einheiten über einen

4-(4’-Acetylphenoxy)butansäure-Linker. Nach endozytotischer Aufnahme des

Antikörper-Wirkstoff-Konjugats wird zunächst die säurelabile Acylhydrazon-

Bindung zwischen Linker und Wirkstoff gespalten und anschließend durch

Reduktion der Disulfid-Bindung das Endiin aktiviert (Abb. 1.6).

OO

OHMeOHO

I

OMe

OMe

O

OS

OH

O O

HO ONH

O

O

MeON

H

O

S

NHCO2MeHO

S

NHN

O

OO

NH

Et

O2-3

1. Hydrolyse

2. Reduktion

Abb. 1.6: Struktur des säurelabilen Prodrugs Mylotarg, das sich aus dem Antikörper P67.6, einem

4-(4’-Acetylphenoxy)butansäure-Linker und einem Derivat des Wirkstoffs Calicheamicin

zusammensetzt.23

Nicht immer lassen sich ein säurelabiler Ansatz und eine aktive Targeting-

Strategie so erfolgreich verbinden wie im Fall des Mylotarg. YANG et al.92 zeigten,

dass Folat-Wirkstoff-Konjugate mit integrierter Acylhydrazon-Bindung in Zellen nur

sehr langsam gespalten werden. Durch Fluoreszenzmessungen ermittelten sie

den pH-Wert in Endosomen, die durch Folatrezeptor-vermittelte Endozytose

entstanden. Dieser lag mit pH ~ 6.5 deutlich zu hoch für eine rasche Hydrolyse der

Acylhydrazon-Bindung. Darüber hinaus scheinen bei der Folatrezeptor-

vermittelten Endozytose keine Lysosomen gebildet zu werden, weshalb die

Konjugate keinen weiteren pH-Abfall erfahren können. Stattdessen wird der

Rezeptor durch Zurückkehren an die Zelloberfläche „recycelt“. Der Erfolg einer

säurelabilen Strategie ist folglich stark von der Art des endozytotischen

Aufnahmewegs abhängig.

Einleitung _________________________________________________________________

- 10 -

Beim passiven Targeting erfolgt die zelluläre Aufnahme über Flüssig-Phasen-

Endozytose oder adsorptive Endozytose.93 Neben Polymer-Wirkstoff-Konjugaten,

bei denen Wirkstoffe kovalent über säurelabile Bindungen mit ihrem Träger

verbunden werden, können ebenso Aggregate aus säurelabilen Polymeren wie

Micellen oder Hydrogele eine passive Anreicherung erfahren. Bei dieser neueren

Entwicklung werden Effektoren durch Polymere verkapselt, die in Folge des

pH-Abfalls während der endozytotischen Aufnahme gespalten werden und dabei

die eingeschlossenen Wirk- oder Farbstoffe freisetzen. Der Vorteil dieser Systeme

liegt in ihrer biologischen Abbaubarkeit. Zusätzlich zur Verhinderung einer

Vakuolbildung können solche Polymere nach ihrem Zerfall in eine große Anzahl

niedermolekularer Fragmente durch Destabilisierung der endosomalen Membran

den Austritt eines Effektors aus dem Endosom erleichtern.94 Als säurelabile

Sollbruchstellen wurden bislang hauptsächlich Imin-,26,95 Ketal-96,97 und Acetal-

Bindungen98-100 verwendet. Erfolgreich umgesetzt wurde die Strategie

beispielsweise mit dem Kinaseinhibitor Imatinib, der durch das aliphatische

Poly(ketal)-Copolymer (PK3) verkapselt wurde. In in-vivo-Experimenten konnte

eine verbesserte Wirksamkeit dieser Formulierung gegenüber freiem Inhibitor bei

Concanavalin A-induzierten Leberschäden in einem Mausmodell gezeigt

werden.97 Obgleich dieses Beispiel vielversprechend klingt, ist für eine breite

medizinische Anwendung der biologisch abbaubaren Polymere eine Optimierung

der Spaltungseigenschaften erforderlich. Bislang weisen die meisten Polymere mit

pH-empfindlichen Sollbruchstellen entweder eine zu hohe Stabilität im leicht

sauren oder eine zu geringe Stabilität im neutralen Milieu auf.26,99

Mehr Relevanz erlangten die säurelabilen Polymer-Wirkstoff-Konjugate, die in

Abbildung 1.7 (S. 11) dargestellt sind. Ein fortgeschrittenes klinisches Prüfstadium

erreichte beispielsweise das säurelabile, albuminbindende Doxorubicin-Derivat

INNO-206.85,101 In diesem Prodrug wurde der Wirkstoff über eine Acylhydrazon-

Bindung mit dem Linker 6-Maleinimidocapronsäurehydrazid verknüpft, der nach

i.v.-Applikation in situ an das Humanserumalbumin bindet. In Tiermodellen konnte

bereits gezeigt werden, dass aufgrund der passiven Anreicherung und der

gezielten säurelabilen Freisetzung in den Tumorzellen INNO-206 bei gleicher

Dosis viel wirksamer und dabei verträglicher ist als freies Doxorubicin.85 In Kürze

Einleitung _________________________________________________________________

- 11 -

wird die Wirksamkeit von INNO-206 in drei klinischen Phase-II-Studien gegen

Pankreas- und Magenkrebs sowie Weichteilsarkome untersucht werden.

Eine neuere Entwicklung stellen Nanopartikel dar, die aus PEG3.5k-PLA-Cisplatin-

Konjugaten (PLA = Poly(L-Lactid)) gebildet wurden.86 Ein aktiv wirksames

Cisplatin-Analogon wurde dabei kovalent über Acylhydrazon-Bindungen mit

jeweils zwei Copolymer-Ketten verknüpft. Die Halbwertszeiten für die

Wirkstofffreisetzung aus den Nanopartikeln betrugen in Pufferlösungen t1/2 = 4 h

(pH 5.0) und t1/2 = 22 h (pH 7.4). In-vitro-Untersuchungen ergaben, dass die

Nanopartikel in Tumorzellen zytotoxischer wirken als freies Cisplatin.

Über Imin-Bindungen wurde in einem weiteren Beispiel das Antimykotikum

Amphotericin B (AMB) an ein Copolymer aus PEG und Poly(L-Lysin) gebunden.102

In Pufferlösung bei pH 5.0 betrug die Halbwertszeit für die Wirkstofffreisetzung

t1/2 = 2 min. Hingegen wurden bei pH 7.4 innerhalb von 24 h weniger als 5 % des

AMB abgespalten.

NHN

O

OOCH3 OH

OH

OO

NH2

HO

H3C

OH

NO

O

O

OH

* HCl

S Cys34 HSA

INNO-206

PtCl

Cl NH3

NH3

O

O

O

O

N

NHN

NH

O

O

O

O

O

O

O

OHOOC-PEG-O

O

HOOC-PEG-O

O

90

90

Bi(PEG-PLA)-Pt (IV)-Konjugat

HN

O

NH

O

NAMB

NAMB

NH

OO

NH

O HN

HN

O

O

NAMB

NAMB

5 5228

Poly(ethylenglykol)-[b-poly(L-lysin)5]2-(AMB)12

O

OCOOH

H

OOH

OHOH

OH

OHOHO

OH

HO

O

OH

OHNH2

Amphotericin B (AMB)

A

B

Abb. 1.7: Beispiele für säurelabile Polymer-Wirkstoff-Konjugate mit Acylhydrazon-Bindung (A)

bzw. Imin-Bindung (B).

Die in den vorgestellten Beispielen verwendeten Wirkstoffe haben den Vorteil,

dass sie über funktionelle Gruppen verfügen, mit denen sie durch Aufbau

säurelabiler Acylhydrazon- oder Imin-Bindungen an einen makromolekularen

Träger gebunden werden können. Für potente Zytostatika, deren Strukturen keine

Einleitung _________________________________________________________________

- 12 -

reaktiven Carbonyl- bzw. Aminogruppen aufweisen, ist eine säurelabile

Formulierung durch Einbau tumorspezifisch spaltbarer Acylhydrazon- oder Imin-

Bindungen schwieriger zu realisieren. So müssten hydroxy-funktionalisierte

Wirkstoffe wie Paclitaxel und Camptothecin zunächst so derivatisiert werden, dass

eine Carbonyl- oder Aminofunktion in das Molekül integriert wird (Abb. 1.8).

N

N O

O

OOHO

O

OO

OH

OO

O

HO

NH

OH

OO

O

O

OHOH

O

OO OH

OH O

OO

NH2

HO

Paclitaxel Camptothecin Doxorubicin

Ester, Carbonat

Ester, CarbonatAmid, Carbamat

Hydrazon, Imin

Ester, Carbonat

Abb. 1.8: Möglichkeiten der Derivatisierung für Doxorubicin und die hydroxy-funktionalisierten

Wirkstoffe Camptothecin und Paclitaxel.

Dies kann beispielsweise durch Acylierung mit einem bifunktionalen Linker

geschehen.103 Allerdings ist bei dieser Strategie zwingend erforderlich, dass die

Wirksamkeit des Arzneistoffs auch nach der Derivatisierung erhalten bleibt, d. h.

die modifizierten Wirkstoffe eine der Stammverbindung vergleichbare

in-vivo-Wirksamkeit aufweisen. Da dies nicht immer gewährleistet ist, empfiehlt

sich die Verwendung einer doppelten Prodrug-Strategie, wie im Folgenden

erläutert wird.

1.3 Strategie der doppelten Prodrugs

Prodrugs im Allgemeinen sind inaktive Derivate von Arzneistoffen, die in vivo zur

aktiven Form metabolisiert werden.104,105 Insgesamt lassen sich ca. 5–7 %106 der

weltweit zugelassenen Wirkstoffe als Prodrugs klassifizieren. Diese können

abhängig von ihrem Anwendungsgebiet und ihrer Darreichungsform gegenüber

Einleitung _________________________________________________________________

- 13 -

klassischen Wirkstoffen verschiedene Vorteile bieten, z. B. eine geringere

Toxizität, erhöhte Wasserlöslichkeit oder Lipophilie, höhere chemische Stabilität,

verbesserte Passage der Blut-Hirn-Schranke, verbesserte orale Absorption oder

gesteigerte Selektivität für malignes Gewebe durch Drug Targeting*.

Die beiden häufigsten Methoden104 zur Derivatisierung von Wirkstoffen sind die

Veresterung von Carboxyl-, Hydroxyl- oder Thiol-Funktionalitäten und die

Synthese von Phosphatestern aus Hydroxyl- oder Amino-Gruppen. Darüber

hinaus können amino-funktionalisierte Wirkstoffe unter anderem in Prodrugs mit

Amid-, Carbamat- oder Imin-Funktion überführt werden. Beispiele für

niedermolekulare, bereits zugelassene Prodrugs sind in Abbildung 1.9 dargestellt.

NH

OOH H

N

OO OH

HNH

OHOH H

N

OO OH

H

Esterasen

Enalapril Enalaprilat

NHN

O

O

OPOH

HO

O

NHHN

O

O

Phosphatasen

Fosphenytoin Phenytoin

OHHO

NH2

O OH

OHHO

NH2

DOPA-Decarboxylase

L(evo)-DOPA Dopamin

ermöglichtorale Applikation

Vorteil des Prodrugs

erhöhteWasserlöslichkeit

verbesserte Passage derBlut-Hirn-Schranke

Anwendung

ACE-Hemmer

Epilepsie

Parkinson-Krankheit

Prodrug Aktiver Wirkstoff

Abb. 1.9: Beispiele für niedermolekulare Prodrugs.

Eine Weiterentwicklung des Prodrug-Konzepts stellt die doppelte Prodrug-

Strategie dar.107 In Abbildung 1.10 (S. 14) ist der schematische Aufbau und das

Prinzip der Wirkstofffreisetzung eines doppelten Prodrugs dargestellt.

* Der Begriff Drug Targeting lässt sich mit „zielgerichteter Wirkstofftransport“ nur schlecht ins Deutsche übersetzen und umfasst die in Kapitel 1.1.1 und 1.1.2 vorgestellten Targeting-Ansätze.

Einleitung _________________________________________________________________

- 14 -

Linker Wirkstoff

Wirkstoff

enzymatische oderchemische Aktivierung

spontaner Zerfall

WirkstoffLinker

Trigger

Abb. 1.10: Prinzip der Wirkstofffreisetzung bei doppelten Prodrugs.

Der Wirkstoff wird in diesem Fall über ein Linkermolekül an einen Trigger

(Auslöser, Sollbruchstelle) gebunden (bei makromolekularen Prodrugs kann der

Trigger mit der Bindungsstelle des Trägers gleichgesetzt werden). Am Zielort

erfolgt in zwei Schritten eine „kontrollierte“ Freisetzung des Wirkstoffs (engl.

controlled release). Zunächst wird der Trigger durch eine tumorspezifische

chemische oder enzymatische Reaktion gespalten, wodurch ein Wirkstoff-Linker-

Derivat freigesetzt wird. Dieses ist unter den vorherrschenden Bedingungen

instabil und zerfällt spontan unter Freisetzung des aktiven Wirkstoffs.

Beispielsweise entsteht durch enzymatische Spaltung des Phosphatesters in

Fosphenytoin (Abb.1.9, S. 13) ein instabiles Intermediat, das neben dem aktiven

Wirkstoff Phenytoin auch Formaldehyd freisetzt.

Trotz oftmals aufwändigerer Synthese bieten doppelte Prodrugs entscheidende

Vorteile. So kann beispielsweise die Spaltbarkeit von Peptid-Sollbruchstellen bei

einer direkten Kopplung des Peptids an einen amino-funktionalisierten Wirkstoff

herabgesetzt sein. Der Einbau von selbsteliminierenden Linkern* (siehe Kap. 1.4)

wie Aminobenzylcarbamoyl-Linkern108,109 zwischen Arzneistoff und Peptidsequenz

kann in vielen Fällen durch eine Reduktion der sterischen Hinderung am

Reaktionszentrum eine verbesserte Spaltbarkeit durch Proteasen bewirken.

* Im angloamerikanischen Sprachraum wurde für solche Linker-Systeme der Begriff self-immolative geprägt, der sich nur schlecht mit „selbstaufopfernd“ ins Deutsche übersetzen lässt. Daher werden im Folgenden alle Linker unabhängig vom ihnen zugrunde liegenden Reaktionstyp (Eliminierung, Zyklisierung) als „selbsteliminierend“ bezeichnet.

Einleitung _________________________________________________________________

- 15 -

Ebenso ist der Einbau selbsteliminierender Linker in Konjugate erforderlich, wenn

für die Realisierung der angestrebten, tumorspezifischen Spaltung funktionelle

Gruppen eingeführt werden müssen, die im Wirkstoff nicht vorhanden sind (z. B.

Carbonyl- oder Hydrazidgruppen für säurelabile Acylhydrazon-Bindungen).

1.4 Linker-Systeme für eine gezielte Freisetzung von Wirkstoffen

1.4.1 Selbsteliminierende Linker

In den letzten Jahren wurde eine beachtliche Anzahl selbsteliminierender Linker

für das Design von doppelten Prodrugs entwickelt, die sich infolge Eliminierungs-

oder Zyklisierungsreaktionen rasch vom Wirkstoff abspalten.110 In Tabelle 1.2

werden einige Vertreter beider Klassen vorgestellt.

Tab. 1.2: Beispiele für selbsteliminierende Linker und deren zugrunde liegender

Spaltungsmechanismus.

Linker Reaktions-typ Spaltungsmechanismus Ref.

R

Z

O X

O

Wirkstoff

Trigger

X, Z = O, NH

1,6-Benzyl-eliminierung

R

Z

O X

O

X, Z = O, NH

Wirkstof f

111-114

N

O

O X

O

Trigger

X = O, NH

Wirkstoff

1,6-Eliminierung

N

HO

O X

O

X = O, NH

Wirkstoff

115

R

ZTrigger

X, Z = O, NH

O X

O

Wirkstoff

1,4-Benzyl-eliminierung

R

Z

X, Z = O, NH

O X

O

Wirkstof f

112,114

NH

Trigger

O

O

O Wirkstoff

1,8-Eliminierung

H2N

O

O

O Wirkstof f

116

R

Trigger

X = O, NH

XOO

H O

Wirkstoff

β-Eliminierung

R

X = O, NH

XO

H

HO

O

Wirkstof f

117

Einleitung _________________________________________________________________

- 16 -

X

OO

R

Trigger

X = O, NH

Wirkstoff

Zyklisierung X

OOH

R

X = O, NH

Wirkstof f

118

NN O

O

TriggerWirkstoff

Zyklisierung

HNN O

O

Wirkstoff

119

NH

O O

O

TriggerWirkstoff

Zyklisierung

H2NO O

O

Wirkstoff

120

NN O

O

Trigger

O

OS

R

N Wirkstoff Zyklisierung NN O

O

O

OS

R

HN Wirkstof f

121

Verwendung fanden solche Linker bislang in chemisch-aktivierten, d. h. unter

nicht-physiologischen Bedingungen aktivierten, Modellverbindungen und in

enzymatisch- bzw. (bio-)reduktiv-aktivierten Prodrugs.113,118-123 Jedoch existieren

keine Beispiele für selbsteliminierende Linker-Systeme, die sich für die

Realisierung säurelabiler Prodrugs von Wirkstoffen mit Amino-, Hydroxy- oder

Thiol-Funktionalitäten eignen.

Auf Eliminierungsreaktionen beruhende selbsteliminierende Linker zeigen in den

meisten Fällen eine schnellere Freisetzung und werden seit einigen Jahren

bevorzugt eingesetzt.124-126 1981 beschrieben KATZENELLENBOGEN et al.111

erstmals die Verwendung eines p-Aminobenzyloxycarbonyl- (PABC-) Linkers, der

zwischen das Trypsin-Substrat Boc-Lys und den Farbstoff p-Nitroanilin integriert

wurde. Eine enzymatische Spaltung der Bindung zwischen Aminosäure und Linker

führte zu einer schnellen Freisetzung des Farbstoffs, was auf eine rasch

verlaufende 1,6-Benzyl-Eliminierung des PABC-Linkers (Tab 1.2, Zeile 1;

Abb. 1.11) zurückgeführt wurde.112 Heute ist das PABC-System der bekannteste

und meistverwendete selbsteliminierende Linker und wurde für die Entwicklung

verschiedener Krebsmedikamente114,116,124-129 wie auch für komplexere

selbsteliminierende Strukturen wie Oligomere,130 Polymere,131,132 und

Dendrimere133 ausgenutzt.

Eine gezielte Eliminierung des PABC-Linkers wird durch Freisetzen der

aromatischen Aminogruppe aus einer maskierten Vorstufe ausgelöst. In früheren

Arbeiten wurde gezeigt, dass das Anilin des PABC-Systems beispielsweise als

Azid, als Nitrogruppe oder durch Acylierung effektiv maskiert, d. h. so deaktiviert

Einleitung _________________________________________________________________

- 17 -

werden kann, dass eine Eliminierung unter physiologischen Bedingungen nicht

stattfindet. Eingeleitet wurde die Benzyleliminierung dieser Systeme schließlich

durch Reduktion,130,133 enzymatische Spaltung109,134-136 oder mittels Staudinger-

Reaktion.137

X

O Z

O

stabil

im wässrigen Milieuspontane 1,6-Benzyl-

eliminierung

X = maskierte Aminogruppe

z.B. N3, NO2, R-CO-NH

Demaskierungvon X H2N

O Z

OEE

E = Effektor (Wirk- oderFarbstoff)

Z = NH, O, S

H2N

OHCO2 HZ E+ +

A B

C D

Abb. 1.11: Aktivierung und Eliminierung des PABC-Linkers.

Abbildung 1.11 zeigt den Mechanismus der Eliminierung des PABC-Linkers einer

Verbindung (A), bestehend aus Trigger, PABC-Linker und einem amino-, thiol-

oder hydroxy-funktionalisierten Effektor. Nach Aktivierung des Triggers (Spaltung

der Bindung zwischen Trigger und Linker) entsteht ein vinyloges Halbaminal (B),

das nach 1,6-Eliminierung des PABC-Derivats intermediär ein Carbamin- bzw.

Kohlensäurederivat des Effektors sowie ein chinoides Zwischenprodukt

(p-Iminochinomethan) bildet. Beide Intermediate sind instabil. Unter

CO2-Abspaltung wird einerseits der Effektor (D) freigesetzt, während das

p-Iminochinomethan unter Addition von Wasser zu p-Aminobenzylalkohol (C)

reagiert.

Alle bisher vorgestellten doppelten Prodrugs besaßen einen linearen Aufbau

(Abb. 1.12, S. 18). Neben Spaltung einer Sollbruchstelle zwischen Wirkstoff und

Träger gibt es eine elegantere Methode, makromolekulare Prodrugs (bzw.

allgemein: Träger-Wirkstoff-Konjugate) zu aktivieren. Diese beruht auf der

Verwendung sogenannter Adapter-Bausteine (siehe Kap. 1.4.2).

Einleitung _________________________________________________________________

- 18 -

A

B

WirkstoffLinkerTräger

Trigger

Trigger

Träger WirkstoffLinker

Abb. 1.12: Schematische Darstellung spaltbarer Träger-Wirkstoff-Konjugate mit linearem

Linker (A) und mit chemischem Adapter-System (B).

1.4.2 Chemische Adapter-Systeme

Als Adapter bezeichnet man in diesem Zusammenhang einen trifunktionellen,

selbsteliminierenden Linker (orange), der makromolekularen Träger (grün),

Wirkstoff (blau) und die zur Aktivierung notwendige Trigger-Gruppe (rot)

miteinander verbindet (Abb. 1.12). Im Vergleich zur linearen Anordnung bietet der

Aufbau mit Hilfe eines chemischen Adapters mehrere Vorteile. Dazu gehört die

exponierte Stellung der Trigger-Gruppe, die zur Beschleunigung verschiedener

Aktivierungsreaktionen, z. B. enzymatische Spaltungen, beitragen kann. Zudem

erlaubt der Einsatz von Adapter-Bausteinen eine modulare Entwicklung

makromolekularer Prodrugs, bei der mit geringerem synthetischen Aufwand

Träger, Trigger-Gruppen und Effektoren variiert werden können.

In einer Veröffentlichung von SHABAT et al.138 wurden verschiedene trifunktionelle

Linker-Systeme vorgestellt, die nach Aktivierung entweder über Zyklisierungs-

oder über Eliminierungsreaktionen Effektoren freisetzen können. Abbildung 1.13

(S. 19) zeigt ein Beispiel für ein makromolekulares Prodrug des Wirkstoffs

Etoposid,138 das als Adapter-Einheit ein Phenylessigsäure-Derivat verwendet. Die

Aktivierung erfolgt über eine vom Antikörper 38C2 katalysierte Retro-Aldol-/Retro-

Michael-Tandemreaktion und der dadurch ausgelösten Kaskade von

Einleitung _________________________________________________________________

- 19 -

Zyklisierungs- und Eliminierungsreaktionen. Anschließend wird der Wirkstoff

freigesetzt, während die Adapter-Einheit am Träger verbleibt.

OO

N CH3

NH3CO

O

CH3OH

H3CO

O N

ONCH3

O

N

O

H3CH3C

H3CO

H3CO

OO

OO

O

O

OO

CH3

H

OHH

OHH

O

NH

H3COH

NH

HN

O

O

On m

CH3 CH3

NO CH3

Abb. 1.13: Beispiel für ein chemisches Adapter-System als makromolekulares Prodrug des

Wirkstoffs Etoposid.

Zahlreiche weitere Strukturen für chemische Adapter-Systeme sind denkbar.

Generell sollten sich für eine Verwendung als Adapter-Gruppe alle trifunktionellen

Linker eignen, mit denen einerseits eine stabile Bindung zu einem

(makromolekularen) Träger aufgebaut werden kann und die andererseits die

Weiterleitung eines Bindungsbruchs (infolge der Aktivierung des Triggers) durch

Zyklisierungs- oder Eliminierungsreaktionen ermöglichen.

Bislang ist kein Adapter bekannt, der auf dem häufig verwendeten PABC-Linker

basiert. Die Verwendung dieses effektiv-spaltenden Systems als Grundlage für

einen Adapter-Baustein könnte zu einer modularen und rationalen Konzeption

makromolekularer Prodrugs beitragen.

Zielsetzung _________________________________________________________________

- 20 -

2. Zielsetzung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine rationale und modulare Strategie zur

säurelabilen Aktivierung makromolekularer Prodrugs von hydroxy- oder amino-

funktionalisierten Wirkstoffen entwickelt werden. Dazu wurde das bereits gut

untersuchte und effektiv spaltende PABC-System als selbsteliminierender Linker

für die Entwicklung von doppelten Prodrugs ausgewählt. Obgleich für dieses

Linker-System bereits zahlreiche Aktivierungsmethoden bekannt sind, wurde die

Aminogruppe des Linkers bislang nicht über eine säurelabile Spaltung demaskiert.

Daher sollte zunächst anhand niedermolekularer Modellverbindungen mit dem

Fluorophor 7-Amino-4-methylcumarin (AMC)* untersucht werden, ob eine effektive

Maskierung, d.h. Stabilität der Sollbruchstelle bei pH 7.4 und rasche Spaltung bei

pH 5.0, durch Ausbildung einer säureempfindlichen Imin-Bindung realisiert werden

kann (Abb. 2.1).

R

O

N

H NH

O

O O

Abb. 2.1: Allgemeine Struktur der geplanten niedermolekularen AMC-Modellverbindungen.

Im Fall einer erfolgreichen Maskierung sollten durch Strukturvariation der für die

Synthese der Schiffschen Base verwendeten aromatischen Aldehyde die

Substituenteneinflüsse untersucht und anschließend die Hydrolyseeigenschaften

der Imin-Bindung in Pufferlösungen bei pH 5.0 und 7.4 sowie im Plasma optimiert

werden. Dabei sollte der Farbstoff AMC als Effektor und Modell für einen amino-

funktionalisierten Wirkstoff dienen, was eine einfachere und schnellere

Untersuchung von Freisetzungskinetiken einer Vielzahl verschiedener

Modellverbindungen ermöglicht.

Trigger-Gruppen mit besonders interessanten Spaltungseigenschaften sollten im

nächsten Schritt für die Synthese makromolekularer AMC-Modellverbindungen

* Dieser Farbstoff verfügt über eine stark blaue Fluoreszenz (ex. 390 nm; em. 460 nm), die selbst noch bei Konzentrationen im nanomolaren Bereich gemessen werden kann. Durch Acylierung der Aminogruppe lässt sich die Intensität der Fluoreszenz bei 460 nm stark herabsetzen. Aufgrund dieser besonderen Eigenschaft eignet sich AMC für die Bestimmung von Kinetiken solcher Reaktionen, in deren Verlauf der Farbstoff aus seiner acylierten Form freigesetzt wird.

Zielsetzung _________________________________________________________________

- 21 -

bzw. Prodrugs mit einem amino- bzw. hydroxy-funktionalisierten Wirkstoff (z. B.

Doxorubicin und Paclitaxel) ausgewählt werden. Als makromolekulare Träger

sollten sowohl das synthetische Polymer PEG als auch HSA verwendet und

bezüglich ihrer Einflüsse auf die pharmakokinetischen Eigenschaften der

jeweiligen Modellverbindung miteinander verglichen werden. Makromolekulare

Prodrugs sollten hierbei auf Basis eines zentralen Adapter-Bausteins entwickelt

werden. Dazu sollte ein um eine Funktionalität erweiterter PABC-Linker zum

Einsatz kommen, der über einen geeigneten Anknüpfungspunkt für den Träger

verfügt (Abb. 2.2).

NH

HN

O

O

O

O

Trigger

Effektor

Ankergruppe zur Bindungan einen polymeren

Träger über Kupfer-katalysierteAzid-Alkin-Cycloaddition

Abb. 2.2: Allgemeine Struktur des geplanten Adapter-Bausteins.

Nach erfolgreicher Synthese von makromolekularen Zielstrukturen sollten durch

kinetische Untersuchungen analog zu den niedermolekularen Messungen in

Pufferlösung bei pH 5.0 und 7.4 sowie im Plasma Antworten auf folgende Fragen

gefunden werden:

Lassen sich die Ergebnisse aus den kinetischen Untersuchungen der

niedermolekularen Modellverbindungen auf die Spaltungseigenschaften der

makromolekularen Verbindungen übertragen?

Welchen Einfluss übt die Einführung eines chemischen Adapters und eines

polymeren Trägers auf die Spaltungseigenschaften des Triggers aus?

Welches Polymer eignet sich besser als Träger für diese

Modellverbindungen?

Verfügen die neu entwickelten Trigger-Gruppen über geeignete

Hydrolyseeigenschaften zur Aktivierung von makromolekularen Prodrugs in

einer medizinischen Anwendung?

Welches Potenzial steckt im modularen Ansatz?

Ergebnisse und Diskussion _________________________________________________________________

- 22 -

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Entwicklung niedermolekularer AMC-Modellverbindungen mit säurelabil getriggertem PABC-Linker

Um eine auf dem PABC-Linker basierende, säurelabile Trigger-Gruppe zu

entwickeln, müssen folgende Voraussetzungen erfüllt sein:

1. effektive Maskierung der PABC-Aminogruppe, um eine vorzeitige

Eliminierung zu verhindern;

2. rasche Demaskierung bei pH 5, welche die für die Prodrug-Aktivierung

nötige Eliminierungsreaktion initiiert.

Neben Acylhydrazon-85-89 und Acetal-Bindung77,78 ist die Imin-Bindung26,90,91

bekannt für ihre pH-abhängigen Hydrolyseeigenschaften. Imine werden durch

Reaktion von Aldehyden oder Ketonen mit Ammoniak oder primären Aminen

erhalten. Am Stickstoffatom substituierte Imine werden oftmals nach ihrem

Entdecker (H. SCHIFF, 1834–1915) auch als Schiffsche Basen bezeichnet.139

Im Folgenden sollte zunächst durch Synthese einer Modellverbindung gezeigt

werden, dass der PABC-Linker in Form einer Schiffschen Base maskiert werden

kann. Anschließend sollten durch Strukturvariationen Substituenteneinflüsse

untersucht und mit Hilfe der erhaltenen Ergebnisse die Hydrolyseeigenschaften

der Imin-Bindung optimiert werden. Der Fluoreszenzfarbstoff AMC sollte als

Modell für einen amino-funktionalisierten Wirkstoff dienen und dabei eine

einfachere und schnellere Bestimmung der Freisetzungskinetiken ermöglichen.140

3.1.1 Synthese niedermolekularer, säurelabiler Modellverbindungen

Die Synthese von Schiffschen Basen basierend auf p-Aminobenzylalkohol (PABA)

wurde zunächst in verschiedenen Varianten durchgeführt. Tabelle 3.1 (S. 23) gibt


- 23 -

eine Übersicht der Reaktionsbedingungen der einzelnen Syntheseversuche. In

jeder Variante wurde Benzaldehyd im Überschuss (3–5 eq) zugesetzt.

Tab. 3.1: Übersicht der durchgeführten Synthesevarianten zur Darstellung einer Schiffschen Base

basierend auf p-Aminobenzylalkohol.

H

O

H2N

OHOH

N

H

Variante Lösungsmittel Katalysatorsystem Methodea

1 MeOH - I

2 MeOH PPTS, NEt3 I

3 MeOH AcOH I

4 MeOH BF3·OEt2 I

5 MeOH Sc(O3SCF3)3 I

6 THF TMSCl, NEt3 I

7 Toluol PPTS II

8 Benzol PPTS, NEt3 II

9 Benzol AcOH II

a) Dem Reaktionssystem wurde das während der Umsetzung freigesetzte Wasser durch den

Zusatz von Molekularsieb (I) oder Erhitzen am Wasserabscheider (II) entzogen.

Die Verfolgung des Reaktionsverlaufs mittels DC erwies sich als problematisch, da

die entstehenden Schiffschen Basen sowohl auf Kieselgel- als auch auf

Diol-beschichteten* Platten instabil waren, wodurch eine unvollständige

Umsetzung suggeriert wurde. Auch unter Verwendung von MeCN/H2O-Gemischen

und RP-Beschichtung konnte der Endpunkt der jeweiligen Reaktion nicht ermittelt

werden. Dies gelang erst durch Abbruch der Umsetzung nach unterschiedlichen

Zeitintervallen, Aufarbeitung und anschließender Reinheitskontrolle durch 1H-NMR. Die optimale Reaktionszeit für die Reaktion mit höchster Effizienz

(Variante 9), die im Folgenden als Standardmethode verwendet wurde, betrug 3 h.

* mit –(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH-Gruppen modifizierte Kieselgelplatten.


- 24 -

Zur Darstellung von AMC-Modellverbindungen war es zunächst erforderlich, die

Aminogruppe des AMC für eine Reaktion zu aktivieren. Erste Versuche mit

Triphosgen misslangen, was sich auf die nur schwach ausgeprägte Reaktivität des

AMC zurückführen lässt.141 Ebenso führte eine direkte Umsetzung mit

Chlorameisensäurephenylester nicht zum Erfolg. Allerdings gelang die Synthese

von Phenyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (2), einem geschützten Isocyanat,142

nach einer Vorbehandlung des AMC mit Chlortrimethylsilan (Abb. 3.1).

O OH2N O ONH

O

O

272 %

1. ChlortrimethylsilanDIEADCM (abs.), Δ

O Cl

O

2. DCM (abs.)0 °C RT

AMC

Abb. 3.1: Synthese von Phenyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (2).

Für die Darstellung der ersten AMC-Modellverbindung (1b) wurde 2 mit dem aus

der Reaktion von PABA mit Benzaldehyd (rot) erhaltenen Imin 1a umgesetzt

(Abb. 3.2). Dabei reagiert 2 beim Erhitzen unter Eliminierung von Phenol zum

7-Isocyanato-4-methylcumarin (AMC-NCO, 3) und mit 1a direkt weiter zum

Carbamat 1b.

OH

N

H

O

N

H NH

O

O OO ON

HO

O

1b52 %

1aDBTL, Dioxan (abs.), 80 °C

2

Abb. 3.2: Synthese der AMC-Modellverbindung 1b.

Die Ausbeute der Modellverbindung konnte erhöht werden (siehe Abb. 3.4, S. 25),

indem 3 nicht erst in situ sondern vorab generiert und isoliert wurde. Die

Herstellung erfolgte durch Erhitzen von 2 im Vakuum einer Sublimationsapparatur

(Abb. 3.3, S. 25). Dieses neu entwickelte Verfahren stellt im Vergleich zur

herkömmlichen Methode, der Umsetzung von AMC mit Phosgen,143 eine

gefahrlose Alternative dar.


- 25 -

O ONH

O

O

O ONC

O

2 3

Sublimations-apparatur

150 °C, Vakuum

Abb. 3.3: Synthese von AMC-NCO (3).

Durch Reaktion von 3 mit 1a wurde das Carbamat 1b schließlich in verbesserter

Ausbeute erhalten und mittels NMR charakterisiert (Abb. 3.4).

O ONC

O

DBTL, THF (abs.)

3OH

N

H

O

N

H NH

O

O O

1b66 %

1a

Abb. 3.4: Optimierte Synthese der AMC-Modellverbindung 1b.

Nach erfolgreicher Synthese von 1b wurden die Halbwertszeiten für die AMC-

Freisetzung fluorometrisch in Pufferlösungen bei zwei verschiedenen pH-Werten

bestimmt (siehe Kapitel 3.1.3). Bei pH 5.0 wurde AMC sehr schnell (t1/2 = 34 min)

freigesetzt. Bei pH 7.4 hingegen erwies sich 1b mit einer Halbwertszeit von 8 h als

deutlich stabiler. Diese Ergebnisse zeigten, dass der PABC-Linker als Schiffsche

Base effektiv maskiert werden kann. Allerdings ist eine Optimierung der

Hydrolyseeigenschaften von 1b notwendig, da für eine medizinische Anwendung

neben rascher Spaltung im leicht sauren Milieu eine Langzeitstabilität des Triggers

im Neutralen von t1/2 > 48 h wünschenswert ist. Für die weitere Entwicklung der

Trigger-Gruppe sollten daher die Faktoren, welche die Hydrolyseeigenschaften

der Modellverbindung beeinflussen, näher untersucht werden. Diese

Informationen sollten anschließend die Darstellung eines maßgeschneiderten

Triggers mit erhöhter Stabilität im Neutralen ermöglichen.

Dazu wurden zunächst analog zur Synthese von 1a eine kleine Bibliothek von

Schiffschen Basen ausgehend von PABA und verschiedenen Benzaldehyd-

derivaten mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Substituenten

dargestellt. Nach zu 1b analoger Umsetzung mit 3 wurden die

Modellverbindungen (4b–14b) erhalten. Die Ausbeuten dieser Reaktionen sind der

Tabelle 3.2 zu entnehmen.


- 26 -

Tab. 3.2: Ausbeuten für die Synthesen der Modellverbindungen 1b und 4b–14b.

OH

N

H

O

N

H NH

O

O O

R

Rxa

xb

O ONC

O

DBTL, THF (abs.)

3

O

H

R

OH

H2N

AcOHBenzol (abs.), Δ

Nr. R = Ausbeute

xa [%]

Ausbeute xb [%]

4a/b NMe2 77 87

5a/b OMe 81 95

1a/b H

77 66

6a/b F

73 84

7a/b Cl

71 76

8a/b O

34 37

9a/b CF3 90 85

10a/b NO2 67 74

11a/b

ClCl

Cl

36 63

12a/b F

F 66 63

13a/b

F F

F F

75 82

14a/b F

F F

F F

84 87


- 27 -

3.1.2 Synthese einer Modellsubstanz zur Untersuchung der 1,6-Eliminierungsreaktion

In der Vergangenheit wurde die Kinetik der 1,6-Benzyleliminierung bereits von

SHABAT et al.144 und WARNECKE et al.130 näher untersucht. Die Arbeitsgruppe um

SHABAT verwendete für ihre Studien einen PABC-Linker, der nach Demaskierung

durch das Enzym Penicillin-G-Amidase den Farbstoff p-Nitroanilin freisetzt. Da die

schnelle Eliminierungsreaktion von der langsameren enzymatischen Reaktion

überlagert wurde, konnte keine Quantifizierung der Eliminierungsgeschwindigkeit

erfolgen. Durch Reduktion einer Nitrogruppe mit Zink und Essigsäure

demaskierten WARNECKE et al. den PABC-Linker, der durch anschließende

Eliminierung den Effektor Tryptamin freisetzte. Die mittels HPLC-Messungen

bestimmte Halbwertszeit dieser 1,6-Benzyleliminierung betrug 4 min. Die

Spaltungsversuche wurden bei pH 3 durchgeführt, da im neutralen pH-Bereich

Löslichkeitsprobleme auftraten. Halbwertszeiten für die im physiologischen

pH-Bereich verlaufende 1,6-Benzyleliminierung waren bislang nicht bekannt.

Da die Freisetzungskinetiken der Modellverbindungen 1b und 4b–14b bei den

physiologisch relevanten pH-Werten pH 5.0 und 7.4 untersucht werden sollten,

sollte zunächst die Geschwindigkeit der 1,6-Benzyleliminierung bei diesen

pH-Werten ermittelt werden. Sollte die Eliminierung mit einer sehr viel höheren

Geschwindigkeit ablaufen als die Hydrolyse der Imin-Bindung, so ist sie bei der

Betrachtung der Kinetiken von 1b und 4b–14b vernachlässigbar.

Für die Untersuchung der 1,6-Benzyleliminierung wurde eine weitere

Modellverbindung ohne Trigger-Gruppe synthetisiert (Abb. 3.5, S. 28). Im ersten

Schritt wurde die Aminogruppe von PABA durch Reaktion mit (Boc)2O geschützt

und das erhaltene Produkt (15) anschließend analog zur Synthese von 1b mit

AMC-NCO (3) zum Carbamat (16) umgesetzt. Nach Abspaltung der Boc-

Schutzgruppe mit einem TFA/DCM-Gemisch konnte schließlich die Zielverbindung

17 isoliert werden. 17 liegt als Trifluoracetat vor und ist als Feststoff über längere

Zeit stabil.


- 28 -

(Boc)2ODCM (abs.)

RHN

OH

BocHN

O NH

O

O ODBTLTHF (abs.)

+H3N

O NH

O

O O

CF3COO-

TFADCM (abs.)

N O OC

O

1663 %

1798 %

R = H15: R = Boc (71 %)

3

Abb. 3.5: Synthese von Modellverbindung 17.

Die erhaltenen Modellverbindungen 1b, 4b–14b und 17 wurden anschließend im

Rahmen einer kinetischen Studie hinsichtlich ihrer pH-abhängigen Spaltungs-

eigenschaften untersucht, deren Durchführung und Ergebnisse im folgenden

Kapitel ausführlich diskutiert werden.

3.1.3 Untersuchung der pH-abhängigen Spaltungseigenschaften der niedermolekularen AMC-Modellverbindungen 1b, 4b–14b und 17

Der postulierte Mechanismus für die pH-abhängige Spaltung der Modellverbin-

dungen 1b, 4b–14b und 17 ist in Abbildung 3.6 dargestellt. Im ersten Schritt wird

die Aminogruppe des Linkers durch eine säurekatalysierte Hydrolyse der Imin-

Bindung demaskiert. Anschließend findet spontan eine irreversible 1,6-Benzyl-

eliminierung des PABC-Linkers statt, wobei AMC freigesetzt und infolgedessen die

Fluoreszenzintensität der Lösung bei 460 nm stark erhöht wird.

N

OH

O

NH

O O

O

H

H2N

OH

H2N O O

CO2+ +

AMCfluoreszierend

R

R

Imin-Hydrolysebei pH 5.0

stabil bei pH 7.4 H2N

O

O

NH

O O

spontane1,6-Benzyleliminierung

k1

k2

H2O

Abb. 3.6: Postulierter Mechanismus für die säurekatalysierte Freisetzung von AMC.


- 29 -

Die Geschwindigkeitskonstante der zweistufigen Freisetzung setzt sich aus der

Konstanten für die Imin-Hydrolyse k1 und der Konstanten für die

1,6-Benzyleliminierung k2 zusammen. Zunächst wurde die Eliminierungsge-

schwindigkeit k2 ermittelt. Dazu wurden die Freisetzungskinetiken von

10 μM Lösungen von 17 in Acetat-Puffer (pH 5.0, 20 mM) und in Phosphat-Puffer

(pH 7.4, 20 mM) bei 37 °C durch Messung der Fluoreszenzzunahme, die direkt mit

der Menge an freigesetztem AMC korreliert, aufgenommen (siehe Kap. 6.1.4).

Durch die Auftragung von ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

∞cc1ln * gegen t und anschließender linearer

Regression kann für die Reaktion mit einer Kinetik erster Ordnung die

Geschwindigkeitskonstante k2 (= Geradensteigung), ermittelt werden (Abb. 3.7).

Die Halbwertszeit ergibt sich anschließend aus der Beziehung: 2

2/12ln

kt = .

y = -0.0437x - 1.5034R2 = 0.9989

y = -0.0398x - 0.9731R2 = 0.9997

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0 10 20 30 40 50t /s

ln[1

-(c/c

∞)]

pH 5.0pH 7.4

Abb. 3.7: Auftragungen zur Bestimmung der Reaktionskonstanten k2 und der Halbwertszeit t1/2 für

die 1,6-Benzyleliminierung von 17 in Pufferlösungen (pH 5.0 und 7.4) bei 37 °C. Die Fehlerbalken

stellen in dieser und in allen folgenden Grafiken die Standardabweichungen dar.

Bei beiden pH-Werten verläuft die Eliminierung so rasch (t1/2 = 16 s bei pH 5.0 und

17 s bei 7.4), dass k2 >> k1 ist und Quasistationarität auftritt. Dies bedeutet, dass * c = Konzentration zum Zeitpunkt t; c∞ = extrapolierte Endkonzentration; Messungen im 15 sekündigen Abstand, bis sich die Konzentration erstmals um weniger als 0.1 % ändert)


- 30 -

der Eliminierungsschritt bei den Kinetikmessungen der Modellverbindungen

vernachlässigbar ist. Die Hydrolyse der Schiffschen Base ist daher der alleinige

geschwindigkeitsbestimmende Schritt der AMC-Freisetzung. Mit Hilfe der

Bodenstein´schen Näherung vereinfacht sich das Geschwindigkeitsgesetz

infolgedessen zu dem einer Kinetik pseudo-erster Ordnung (siehe Glch. 1).

(1)

Die Spaltungskinetiken von 1b und 4b–14b wurden wie zuvor für 17 beschrieben

aufgenommen. Alle Experimente wurden bei niedrigen Konzentrationen (10 μM)

durchgeführt, um mögliche katalytische oder hemmende Einflüsse der

Spaltungsprodukte zu minimieren. Abbildung 3.8 zeigt den zeitlichen Verlauf der

AMC-Freisetzung aus 1b und 4b–14b. Die Auftragungen zur Bestimmung der

Geschwindigkeitskonstanten k1 und der Halbwertszeiten t1/2 sind im Anhang (siehe

S. 158) abgebildet.

pH 5.0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200t /min

I x/I

AM

C

1b

4b

5b

6b

8b

9b

d[Imin]dt

= k1.[Imin]d[AMC]

dt= −


- 31 -

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200t /min

I x/I

AM

C

7b

10b

11b

12b

13b

14b

pH 7.4

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20 25t /h

I x/I

AM

C

1b

4b

5b

6b

8b

9b


- 32 -

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20 25t /h

I x/I

AM

C

7b

10b

11b

12b

13b

14b

Abb. 3.8: Zeitlicher Verlauf der AMC-Freisetzung aus 1b und 4b–14b bei pH 5.0 und 7.4 und

37 °C (Ix: Fluoreszenzintensität der Verbindung zum Zeitpunkt t; IAMC: Fluoreszenzintensität einer

10 μM AMC-Kontrolllösung zum Zeitpunkt t).

Aus den in Tabelle 3.3 (S. 33) aufgeführten Halbwertszeiten ergibt sich, dass die

Imin-Bindung generell rasch bei pH 5.0 gespalten wird (t1/2 = 17–173 min). Bei pH

7.4 hingegen zeigten die Modellverbindungen eine erheblich größere Stabilität

(t1/2 = 8−365 h). Ein deutlicher Einfluss der Substituenten am aromatischen Ring

des Benzaldehyds auf die Geschwindigkeitskonstante ist bei beiden pH-Werten zu

beobachten, wobei elektronenziehende Substituenten im Allgemeinen einen

stabilisierenden Effekt ausüben. Für die para-substituierten Benzaldehydderivate

1b und 4b–10b wurden die Substituenteneffekte unter Berücksichtigung von

Linearen Freien Enthalpie-Beziehungen näher untersucht (siehe Kapitel 3.1.4).


- 33 -

Tab. 3.3: Halbwertszeiten von 1b und 4b–14b für die AMC-Freisetzung in Pufferlösungen (pH 5.0

und 7.4) bei 37 °C.

R

O

N

H NH

O

O O

a) Acetat-Puffer, 20 mM; b) Phosphat-Puffer, 20 mM.

Nr. R = t1/2

pH 5.0a

[min]

t1/2 pH 7.4b

[h]

4b NMe2 17 26

5b OMe 20 13

1b H

34 8

6b F

27 14

7b Cl 37 36

8b O

28 9

9b CF3 61 36

10b NO2 81 65

11b

ClCl

Cl

50 50

12b F

F 33 39

13b

F F

F F

34 89

14b F

F F

F F

173 365


- 34 -

3.1.4 Untersuchung der Substituenteneffekte hinsichtlich der Linearen Freien Enthalpie-Beziehung (LFER)

Im Rahmen einer empirischen Korrelationsanalyse fand L. P. HAMMETT in der Mitte

der dreißiger Jahre145,146 eine Lineare Freie Enthalpie-Beziehung (LFER) zwischen

den logarithmierten Geschwindigkeitskonstanten der basenkatalysierten Hydrolyse

substituierter Benzoesäureethylester und den ebenfalls logarithmierten

Gleichgewichtskonstanten für die Ionisierung entsprechend substituierter

Benzoesäuren. In der Hammett-Gleichung (Glch. 2) fasste er später die bis dahin

gesammelten Daten über die Seitenkettenreaktivität von meta- und para-

substituierten Benzol-Derivaten zusammen:

(2) k0: Geschwindigkeitskonstante für die unsubstituierte Bezugsverbindung

ρ: Reaktionskonstante, Maß für die Empfindlichkeit der Reaktion gegenüber Substituenten-

einflüssen

σ: Substituentenkonstante, Maß für den polaren Effekt (Summe der induktiven und mesomeren

Effekte sowie der Feldeffekte) des Substituenten gegenüber Wasserstoff

Daraufhin wurden in den folgenden Jahren hunderte σp-Werte (Konstanten für

Substituenten in para-Stellung) bestimmt und gezeigt, dass die Hammett-

Gleichung auch auf zahlreiche, andere Reaktionssysteme erfolgreich angewendet

werden kann. Allerdings wurden ebenso Reaktionen gefunden, welche die

Hammett-Gleichung nicht erfüllen.147,148 Die Anwendbarkeit der Gleichung

ermöglicht Rückschlüsse auf den vorliegenden Reaktionsmechanismus. Eine

Gerade weist beispielsweise daraufhin, dass sowohl der Mechanismus als auch

der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion von der Art der

Substituenten unabhängig ist. Abweichungen von der Linearität sind hingegen ein

Indikator dafür, dass die Art der Substituenten einen Einfluss auf Mechanismus

und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ausübt. Um zu prüfen, ob die

Hammett-Gleichung auf die para-substituierten Modellverbindungen 1b und 4b–

14b anwendbar ist, wurde für beide pH-Werte 0logkk gegen σp

146 aufgetragen

(Abb. 3.9, S. 35).

ρσ+= 0loglog kk


- 35 -

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8

σ p

log

(k/k

0)

p-NMe2 p-OMe

p-H

p-F

p-Cl

p-CF3p-NO2

p-Ac

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8

σ p

log

(k/k

0)

p-NMe2

p-OMep-F

p-H

p-Cl

p-Ac

p-CF3

p-NO2

A

B

Abb. 3.9: Hammett-Auftragung für die Spaltung von 1b und 4b–14b bei pH 5.0 (A) und pH 7.4 (B).

Ein linearer Zusammenhang ist in guter Näherung für die Auftragung bei pH 5.0 zu

beobachten. Allerdings weichen die Datenpunkte für die Substituenten p-Ac und

p-NMe2 signifikant von der erhaltenen Gerade ab. Eine mögliche Erklärung für die

Abweichung des Dimethylamino-Substituenten liegt darin, dass die partielle

Protonierung bei pH 5.0 nicht berücksichtigt wird, da sich der entsprechende

σp-Wert nur auf die freie Base bezieht. Für die gravierende Abweichung des

Acetyl-Substituenten wurde bisher keine plausible Erklärung gefunden.

Bei der weiteren Auswertung der Daten ergab sich eine Reaktionskonstante

(ρ-Wert) von –0.57, was auf einen moderaten Einfluss der Substituenten bei

pH 5.0 hinweist, wobei eine Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit durch

Einführen von elektronenziehenden Substituenten in para-Stellung erreicht wird.

Im Gegensatz dazu wurde bei pH 7.4 keine Lineare Freie Enthalpie-Beziehung

gefunden. Der Einfluss der Substituenten auf die Stabilität war jedoch im

Allgemeinen stärker ausgeprägt als bei pH 5.0.


- 36 -

Der generelle Trend der pH-Abhängigkeit innerhalb des Spektrums der

untersuchten Modellverbindungen ist offensichtlich. Dennoch ist zu bedenken,

dass der Imin-Hydrolyse ein relativ komplexer Reaktionsmechanismus zugrunde

liegt149,150 und bei der Auswertung der kinetischen Daten nicht alle Effekte

berücksichtigt wurden, die durch allgemeine Säure-Base-Katalyse hervorgerufen

werden können.151

Durch das Einführen zusätzlicher elektronenziehender Substituenten gelang es

erwartungsgemäß, die Stabilität der mono-halogenierten Schiffschen Basen bei

pH 7.4 deutlich zu erhöhen (vgl. Tab. 3.3, S. 33, 11b–14b).

3.1.5 Untersuchung der Hydrolyseeigenschaften von 13b und 14b im physiologisch relevanten pH-Bereich

Besonders das 2,3,5,6-Tetrafluor- und das Pentafluorbenzaldehyd-Derivat (13b,

14b) verfügen über eine hinreichende Stabilität im neutralen Milieu (siehe Kapitel

3.1.3), was sie zu interessanten Kandidaten für eine medizinische Anwendung

macht. Deswegen wurden beide Verbindungen für eine ausführlichere

Betrachtung ihrer Hydrolyseeigenschaften im physiologisch relevanten pH-Bereich

(pH 4.5–7.4, Abb. 3.10) ausgewählt.

y = -0.8891x + 2.8414

y = -0.8748x + 1.9739

-5

-4

-3

-2

-1

04.0 5.0 6.0 7.0 8.0

pH

log

k obs

13b14b

Abb. 3.10: pH-Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten k1 von 13b und 14b (Acetat-Puffer:

4.5–6; Phosphat-Puffer: 6.5–7.4, 40 mM, 37 °C).


- 37 -

Beide Derivate zeigen im gesamten untersuchten pH-Bereich eine konstante

Abnahme der Hydrolysegeschwindigkeit. Zwischen pH und log kobs wurde in guter

Näherung eine lineare Beziehung gefunden. Erklären lässt sich diese

Beobachtung bei näherer Betrachtung des zweistufigen Spaltungsmechanismus

für die säurekatalysierte Imin-Hydrolyse (siehe Abb. 3.11):152

R H

NR' +H+

-H+R H

NR' H

R H

NR' H + H2O

- H2O R O

NR' H

HH

H

- H++ H+

R OH

NR' H

H

R OH

NR' H

H

H

- H+

+ H+

R H

OR'NH2

- H+

+ H+

Abb. 3.11: Mechanismus der säurekatalysierten Imin-Hydrolyse.152

Durch Protonierung entsteht ein Iminiumion, welches den Angriff eines

Wassermoleküls einleitet. Das daraus resultierende tetraedrische Additionsprodukt

zerfällt anschließend unter Austritt des Amins. Die Reaktionsgeschwindigkeit der

Hydrolyse stellt dabei eine Funktion des pH-Wertes und der Basizität des Amins

dar. Da nur die protonierte Spezies (Iminiumion) des vorgelagerten Säure-Base-

Gleichgewichts in den nächsten (geschwindigkeitsbestimmenden) Schritten weiter

zum Produkt reagiert, zählt die Imin-Hydrolyse zu den Reaktionen mit spezifischer

Säurekatalyse (Glch. 3).151

(3)

Das Produkt AMC wird folglich mit folgender Geschwindigkeit gebildet (Glch. 4):

(4)

Imin + H+ Imin.H+KS kAMC + Aldehyd + Amin

d[AMC]dt

= k .[Imin.H+]


- 38 -

Für die Gleichgewichtskonstante des vorgelagerten Säure-Base-Gleichgewichts

gilt (Glch. 5):

(5)

Einsetzen von (5) in das Geschwindigkeit-Zeit-Gesetz (4) liefert Ausdruck (6):

(6)

Bei konstantem pH liegt ein Geschwindigkeitsgesetz erster Ordnung bezüglich des

Imins vor. Die Säure selbst tritt – wie für eine Reaktion mit spezifischer

Säurekatalyse zu erwarten – nicht im Geschwindigkeitsgesetz auf.

Für die gemessene Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung (kobs) gilt im

vorliegenden Fall (Glch. 7):

(7)

kcat: Geschwindigkeitskonstante der katalysierten Reaktion.

Nach Logarithmieren von (7) erhält man Gleichung (8), die die beobachtete lineare

Beziehung zwischen log kobs und pH wiedergibt:

(8)

Gleichung 8 ist zu entnehmen, dass die Steigung der Geraden im Idealfall der

spezifischen Säurekatalyse theoretisch den Wert 1 annimmt. Für 13b und 14b

wurde jeweils eine Steigung von ~0.9 berechnet, was nur eine leichte Abweichung

vom Idealfall darstellt. Darüber hinaus liefert das lineare Verhalten einen Hinweis

darauf, dass sich der geschwindigkeitsbestimmende Schritt innerhalb des

untersuchten pH-Bereichs nicht ändert. Da diese beiden Modellverbindungen im

Vergleich zu den anderen Verbindungen am stärksten auf eine pH-Änderung

[Imin.H+][H+][Imin]

= KS [Imin.H+] = KS [H+][Imin]

d[AMC]dt

= k.KS[H+][Imin]

kobs

kobs = k.KS[H+]

kcat

log kobs = log kcat − pH


- 39 -

ansprechen, d. h. ihre Halbwertszeiten bei pH 5.0 und 7.4 annähernd den

größtmöglichen Abstand zueinander aufweisen und zudem für medizinische

Anwendungen günstige Werte annehmen, bieten sich 13b und 14b für die

Verwendung als Trigger in säurelabilen Prodrugs an.

3.1.6 Untersuchung der Plasmastabilität ausgewählter Modellverbindungen

Bei der Entwicklung pharmakologisch aktiver Substanzen ist die Berücksichtigung

der pharmakokinetischen Eigenschaften erforderlich. Hohe Bioverfügbarkeit,

gezielte Freisetzung des Wirkstoffs am Zielort und hinreichende Langzeitstabilität

in der Blutbahn sind unter anderem Grundvoraussetzungen für eine medizinische

Anwendung. Daher wurde eine Auswahl der Modellverbindungen (1b, 10b, 13b,

14b) hinsichtlich ihrer Plasmastabilität untersucht. Analog zu den Messungen in

Pufferlösungen (Kap. 3.1.3) wurden 10 μM Lösungen in Plasma hergestellt und

die Fluoreszenzzunahme, die aus der Freisetzung von AMC resultiert, nach 0 h,

2 h, 4 h, und 6 h bzw. 24 h für 13b und 14b gemessen (Abb. 3.12).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 1 2 3 4 5 6 7t /h

I x/I

AM

C

1b10b13b14b

Abb. 3.12: Zeitlicher Verlauf der AMC-Freisetzung von ausgewählten Verbindungen in humanem

Plasma.


- 40 -

Da die Auftragungen von ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

∞cc1ln gegen t keine linearen Beziehungen ergaben,

wurden die Halbwertszeiten aus der graphischen Darstellung des zeitlichen

Verlaufs der Fluoreszenzzunahme näherungsweise bestimmt. Die Halbwertszeit

entsprach dabei dem Zeitpunkt, an dem die Hälfte der aus der Verbindung

insgesamt freigesetzten Menge an AMC erreicht wurde. Die untersuchten

Verbindungen wiesen überaschenderweise nur eine geringe Stabilität im Plasma

auf. Entgegen der Erwartung entsprachen ihre Halbwertszeiten für die Freisetzung

von AMC im Plasma eher den Halbwertszeiten der Spaltung bei pH 5.0 statt bei

pH 7.4. (Tab. 3.4). Um die Ursache für die geringe Plasmastabilität zu ermitteln,

wurden die Messungen in Plasma wiederholt, aus dem zuvor durch

Ultrazentrifugalfiltration alle Moleküle der Größen > 10 kDa entfernt worden waren

(Tab. 3.4, Abb. 3.13, S. 41).

Tab. 3.4: Vergleich der Halbwertszeiten von 1b, 10b, 13b und 14b für die AMC-Freisetzung in

Pufferlösungen (5.0, 7.4) und im Plasma (pur bzw. nach Ultrazentrifugalfiltration).

t1/2 [h]

Nr. R = pH 5.0a pH 7.4b Plasmac Plasmad

1b H

0.57 8 < 0.33 ~ 7

10b NO2

1.35 65 < 0.33 > 72

13b F F

F F

0.57 ~ 89 1.30 > 72

14b F

F F

F F

2.88 ~ 365 2.33 > 72

a) Acetat-Puffer, 20 mM; b) Phosphat-Puffer, 20 mM; c) humanes Plasma; d) humanes Plasma, aus

dem alle Bestandteile >10 kDa durch Ultrazentrifugalfiltration abgetrennt wurden (siehe

Kap. 6.1.4).

In diesem Medium war die Stabilität der Verbindungen im Vergleich zum reinen

Plasma deutlich erhöht. Die Halbwertszeiten für die AMC-Freisetzung lagen dabei

in der Größenordnung der Halbwertszeiten, die in Phosphatpuffer (pH 7.4)

gemessen wurden. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich vermuten, dass die


- 41 -

Instabilität durch im Plasma vorliegende Proteine mit Molmassen >10 kDa

verursacht wurde.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 10 20 30 40 50t /h

I x/I

AM

C

1b10b13b14b

Abb. 3.13: Stabilität von 1b, 10b, 13b und 14b in Plasma, dem zuvor durch Ultrazentrifugalfiltration

Moleküle >10 kDa entfernt wurden.

Das Protein mit der höchsten Konzentration im Blutplasma (~ 750 μM) ist das

Humanserumalbumin (HSA) mit einer Molmasse von 66.5 kDa. Als

Transporterprotein verfügt HSA über ausgezeichnete und vielfältige

Bindungseigenschaften. Neben körpereigenen Liganden wie z. B. Fettsäuren,

Hormonen oder Bilirubin können auch zahlreiche Wirkstoffe oder Fluoreszenz-

Marker von HSA gebunden werden.153-155 Ebenso sind Beispiele für katalytische

Aktivitäten von Albuminen dokumentiert.131 Es war daher denkbar, dass HSA für

die Plasmainstabilität der Modellverbindungen verantwortlich ist. Um diese

Vermutung zu überprüfen, wurde die Stabilität von 14b analog zu den vorherigen

Messungen in HSA-Lösungen (750 μM, 500 μM, 250 μM) untersucht. Daraus

ergab sich für 14b in HSA (750 μM) eine Halbwertszeit von t1/2 = 272 min

(Abb. 3.14, S. 42). Der Verdacht, dass Albumin die AMC-Freisetzung katalysiert,

wurde mit diesem Ergebnis bestätigt. Die Abweichung zur Halbwertszeit im

Plasma (t1/2 = 140 min) lässt sich auf die zusätzlichen Bestandteile in diesem

Medium zurückführen.


- 42 -

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 5 10 15 20 25t /h

I x/I

AM

C

HSA, 750 µM HSA, 500 µMHSA. 250 µM

Abb. 3.14: Stabilität von 14b in Albumin-Lösungen (750 μM, 500 μM, 250 μM).

Die Untersuchung der Plasmastabilität zeigte, dass die niedermolekularen

Modellverbindungen keine hinreichende Stabilität besitzen. Eine denkbare

Ursache dafür könnte das Auftreten einer allgemeinen Säure-Basen-Katalyse auf

der Proteinoberfläche sein. In einer geeigneten makromolekularen Formulierung

könnte der Trigger allerdings die nötige Stabilität aufweisen. Der Träger sollte

hierbei die Bindung an Plasmaprotein zurückdrängen. Für diesen Zweck wäre

PEG ein gut geeigneter polymerer Träger.59-61,156 Des Weiteren könnte auch die

Ausnutzung von HSA als Wirkstoffträger erfolgversprechend sein, wenn eine

kovalente Bindung an den Träger die Beweglichkeit auf der Proteinoberfläche

herabsetzt.157

3.2 Entwicklung makromolekularer, säurelabiler Verbindungen unter Verwendung eines neuen trifunktionellen Linker-Systems auf Basis von 3-Amido-4-hydroxymethylanilin

Aufgrund ihrer vielversprechenden Spaltungseigenschaften wurden die beiden auf

2,3,5,6-Tetrafluorbenzaldehyd bzw. Pentafluorbenzaldehyd basierenden Trigger-

Gruppen für die Entwicklung makromolekularer Prodrugs ausgewählt. In

Abbildung 3.15 (S. 43) ist die Zielstruktur für ein solches Prodrug bzw. für eine


- 43 -

entsprechende AMC-Modellverbindung dargestellt. Die Trigger-Gruppen sollten

über ein PABC-analoges Adapter-System (orange) auf Basis von 3-Amido-4-

hydroxymethylanilin mit dem jeweiligen Effektor verbunden werden. Mögliche

Effektoren stellen amino- oder hydroxy-funktionalisierte Wirk- bzw. Farbstoffe dar,

die über eine Carbamat- oder Carbonat-Bindung mit dem Adapter verknüpft

werden sollten. Das Adapter-System sollte außerdem über eine Alkin-

Ankergruppe zur Kupplung an makromolekulare Träger mittels Kupfer-katalysierter

Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC) verfügen.

NH

HN

O

O

O

O

O

X

N

H

R

X = O, NH

Effektor

Ankergruppe zur Kupplungan makromolekulare Träger

über CuAACTrigger-Gruppe

Abb. 3.15: Beispielhafte Zielstruktur makromolekularer säurelabiler Verbindungen mit chemischem

Adapter (orange).

Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) 2001 stellte die Gruppe von SHARPLESS ein neues Konzept unter dem Namen

„Click“-Chemie vor, das verschiedene Reaktionstypen umfasst.158 „Click“-

Reaktionen bieten gegenüber vielen klassischen Methoden in der Regel

zahlreiche Vorteile wie beispielsweise kurze Reaktionszeiten, hohe Ausbeuten

und große Selektivität. Zudem können sie in Anwesenheit einer Vielzahl

unterschiedlicher Lösungsmittel und funktioneller Gruppen durchgeführt werden.

Gerade die Reaktionsfähigkeit im wässrigen Milieu prädestiniert diese

Reaktionsklasse für eine breite Anwendung in der pharmazeutischen

Chemie.159,160 Die populärste und am häufigsten angewandte „Click“-Reaktion ist

die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, bei der regioselektiv ein

gegenüber vielen Reaktionsbedingungen inertes Triazol gebildet wird.

N N NR1

H R2 Cu(I)

NN

N

R2

R1


- 44 -

Klassisch wird eine solche Cycloaddition im wässrigen Milieu mit Kupfer(II)sulfat,

welches durch Natriumascorbat in situ zu Cu(I) reduziert wird, durchgeführt. Doch

ebenso effektiv ist eine Umsetzung in organischen Lösungsmitteln mit Cu(I)-

Salzen als Katalysatoren.

Als potenzielle Träger für die säurelabilen Verbindungen wurden das synthetische

Polymer PEG sowie das körpereigene Protein HSA ausgewählt, da beide

kostengünstig in größeren Mengen zu erwerben sind und über folgende

vorteilhafte Eigenschaften verfügen:

passives Tumor-Targeting;

verbesserte Pharmakokinetik, d. h. erhöhte Plasmahalbwertszeiten durch

Zurückdrängen der raschen Eliminierung;

Aufnahme über Endozytose (Grundvoraussetzung für säurelabile

Spaltung);

bessere Applizierbarkeit durch Erhöhung der Wasserlöslichkeit;

schwächere Bindung an Plasmaproteine und damit höhere Stabilität im

Plasma.

Welchen Einfluss die Einführung eines polymeren Trägers sowie eines

chemischen Adapter-Systems auf die Spaltungseigenschaften der Trigger-Gruppe

ausübt, sollte anhand von AMC-Modellverbindungen untersucht werden.


- 45 -

3.2.1 Syntheseversuche makromolekularer PEG-geträgerter Verbindungen

3.2.1.1 Synthesestrategien

Im Rahmen eines anderen Projekts der Arbeitsgruppe wurde von BAKHEET

ELSADEK ein PABC-analoger Baustein synthetisiert (Abb. 3.16).

NH

N3

O

O

O

O

O

NH

O O

"geschütztes"Isocyanat

gegenüber Nucleophilenaktivierte Funktionalität

Abb. 3.16: In der Arbeitsgruppe vorhandener Adapter-Baustein.

Die Aminogruppe des PABC-Systems war in ein Phenylcarbamat, ein „maskiertes“

Isocyanat,142 überführt worden, welches nach thermischer Aktivierung mit

Alkoholen Carbamate bilden kann. In para-Stellung wurde AMC über eine

Carbamat-Bindung in Benzylstellung eingeführt. Darüber hinaus verfügte der

Baustein in meta-Position zur Aminogruppe über eine Acylazid-Funktion, die eine

Reaktivität gegenüber Nucleophilen besitzt und damit den Einbau einer

Ankergruppe wie beispielsweise einer Alkingruppe ermöglicht. Über diese

Ankergruppe sollte durch CuAAC eine Bindung an einen polymeren Träger

erfolgen. Da dieser Baustein über die benötigten Funktionalitäten für den Aufbau

makromolekularer, säurelabiler AMC-Modellverbindungen verfügte und dessen

Synthese in ihren Grundzügen bekannt war, wurde er als Adapter-System für die

Darstellung säurelabiler AMC-Modellverbindungen ausgewählt.

Ein Nachteil der bekannten Syntheseroute zu diesem Baustein bestand darin,

dass sie sich nicht für den Aufbau makromolekularer Prodrugs eignet. Manche

Wirkstoffe wie beispielsweise Paclitaxel neigen bei niedrigen pH-Werten zur

Zersetzung.161 In der erprobten Syntheseroute ist die Verwendung starker Säuren

nach Einführen des Effektors allerdings unumgänglich (siehe Abb. 3.18, S. 47).

Daher wurde eine alternative Synthesestrategie entwickelt, die in Abbildung 3.17

(S. 46) retrosynthetisch dargestellt ist.


- 46 -

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

RF

F

Wirkstoff

R = H, F

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

RF

FR = H, F

NH

HN

O

O

O

O

O

O

O

NO2

NO2

H2NHN

O

OH

O2NHN

O

OH

O2NO

O

6-Nitrophthalidkäuflich

Abb. 3.17: Retrosynthese des Adapter-Bausteins für die Darstellung makromolekularer Prodrugs.

Im letzten Syntheseschritt sollte der Wirkstoff durch Reaktion mit der als

p-Nitrophenylcarbonat aktivierten Benzylalkohol-Funktion des Linkers eingeführt

werden. Die Integration der Trigger-Gruppe sollte in Analogie zur Darstellung der

AMC-Modellverbindungen über ein „maskiertes“ Isocyanat erfolgen. Die erforderte

Carbonat- bzw. Carbamat-Bindung sollte aus einem verzweigten PABC-Derivat

aufgebaut werden. Als käufliche Ausgangsverbindung bot sich 6-Nitrophthalid an,

dessen Lactonring durch nucleophilen Angriff der späteren Ankergruppe geöffnet

werden sollte.

Eine ausführliche Diskussion der einzelnen Syntheseschritte zur Darstellung

niedermolekularer AMC-Modellverbindungen bzw. Prodrugs, die über eine

Ankergruppe durch CuAAC an makromolekulare Träger gekuppelt werden

können, erfolgt im nächsten Kapitel.

3.2.1.2 Synthese niedermolekularer Vorstufen zur Darstellung makromolekularer AMC-Modellverbindungen bzw. Prodrugs

Zwei niedermolekulare AMC-Modellverbindungen wurden ausgehend vom

käuflichen 6-Nitrophthalid in einer 11-stufigen Synthese (Abb. 3.18, S. 47)

dargestellt, wobei die ersten Syntheseschritte in Anlehnung an die Arbeiten von

BAKHEET ELSADEK162 durchgeführt und dabei optimiert wurden.


- 47 -

OO2N

O

N2H4 H2OMeOH (abs.)

O2NHN

ONH2

OH(Boc)2ODioxan (abs.)

t-Butanol O2NHN

ONH

OH

Boc

TBSClImidazolDMF (abs.) O2N

HN

ONH

OTBS

Boc

Ni(NO3)2 / SiO2NaBH4, -18 °CMeOH (abs.)

H2NHN

ONH

OTBS

BocO Cl

O

DIEA, 0 °CDCM (abs.)N

H

HN

ONH

OTBS

BocO

OMeOH/1 M HCl

50:1

NH

HN

ONH

OH

BocO

O

NH

HN

ONH

O

BocO

O

O

AMC

DBTLTHF (abs.)

N O OCO

TFA/DCM 1:1

NH

HN

ONH3

+

O

O

O

O

AMC

NH

N3

O

O

O

O

O

AMC1 M HClNaNO2, 0 °C

H2N

NH

HN

O

O

O

O

O

AMC

DBTL in ToluolDioxan (abs.), Δ

NH

HN

O

O

O

AMC

O

O

DMF (abs.)

OHN

HFF

F F

R

2357 %

2270 %

2172 %

2495 %

3

2596 %

2691 %

2774 %

R = H: 13aR = F: 14a

1894 %

1997 %

2093 %

R = H: 28 (64 %)R = F: 29 (66 %)

CF3COO-

N

HFF

RF

F

Abb. 3.18: Darstellung der säurelabilen AMC-Modellverbindungen 28 und 29.

Im ersten Schritt wurde der Lactonring des käuflichen 6-Nitrophthalids mit

Hydrazin geöffnet. Die Hydrazidfunktion des entstandenen Produkts 18 wurde im

Folgenden Boc-geschützt. Ebenso musste der erhaltene Benzylalkohol 19 in den

TBS-Ether 20 überführt werden, da die anschließende Reduktion der Nitrogruppe

zum Amin im Fall einer freien Alkoholfunktion zu zahlreichen Nebenprodukten

führte. Als Reduktionsmittel lieferte Natriumborhydrid in Kombination mit einem

durch Kieselgel aktivierten Nickelnitrat-Katalysator163 21 in einer deutlich höheren

Ausbeute als ein Zink/Essigsäure-Gemisch. Die nun freie Aminogruppe wurde

schließlich mit Chlorameisensäurephenylester zum Phenylcarbamat 22, einem

maskierten Isocyanat,142 umgesetzt. Nach Spaltung des TBS-Ethers mit einem

MeOH/HCl-Gemisch (50:1) wurde durch Reaktion des Benzylalkohols 23 mit

AMC-NCO (3) der Farbstoff AMC über eine Carbamat-Bindung eingeführt (24).

Abspaltung der Boc-Gruppe mit einem TFA/DCM-Gemisch und Behandlung der


- 48 -

Hydrazidfunktion von 25 mit HCl und Natriumnitrit lieferte das Acylazid 26. Durch

nucleophilen Angriff von Propargylamin auf das Azid wurde das Amid 27 gebildet.

Im letzten Syntheseschritt wurde das Phenylcarbamat durch Erhitzen in ein

Isocyanat überführt, welches in situ mit den Benzylalkoholen 13a bzw. 14a zu den

niedermolekularen Modellverbindungen 28 bzw. 29 reagierte.

Parallel zu den Arbeiten an den AMC-Modellverbindungen wurde mit der Synthese

niedermolekularer Vorstufen für makromolekulare Prodrugs begonnen.

Doxorubicin und Paclitaxel wurden hierbei als Vertreter für amino- bzw. hydroxy-

funktionalisierte Wirkstoffe ausgewählt. Im ersten Syntheseschritt wurde der

Lactonring durch Propargylamin geöffnet (Abb. 3.19, S. 49). Der entstandene

Benzylalkohol 30 wurde zunächst als TBS-Ether (31) geschützt und die

Nitrogruppe anschließend unter Standardbedingungen mit Zink-Pulver und

Essigsäure zum Amin 32 reduziert. Nach Umsetzung mit Chlorameisensäure-

phenylester zum geschützten Isocyanat 33 wurde der TBS-Ether mit einem

MeOH/Wasser-Gemisch (50:1) gespalten. Das Produkt 34 mit freier

Benzylalkoholgruppe wurde durch Reaktion mit Chlorameisensäure-p-

nitrophenylester in die aktivierte Carbonatform 35 überführt. In einer zur Synthese

von 28 bzw. 29 analog durchgeführten Reaktion gelang es, die jeweilige Trigger-

Gruppe über eine Isocyanat-Zwischenstufe einzuführen.


- 49 -

OO2N

O

H2N

AlCl3, NEt3, 45 °C

1,2-Dichlorethan O2NHN

OH2N

HN

O

Zn/AcOHDCM (abs.)

NH

HN

OO

O

OR OR

OR

31: R = TBS (97 %)

ImidazolTBSClDMF (abs.)

34: R = H (87 %)MeOH/HCl

50:1

DIEA, 0 °CDCM (abs.)

OCl

ONO2

NH

HN

O

O

O

O

O

O

NO2

DBTL, ΔDioxan (abs.)

NH

HN

O

O

O

O

O

O

OHN

HFF

F F

R

NO2

N

HFF

RF

F

O Cl

O

Pyridin (abs.)THF (abs.)0 °C RT

3052 %

3265 %

3594 %

R = H: 36 (63 %)R = F: 37 (63 %)

R = H

R = TBS

3373%

R = H: 13aR = F: 14a

Abb. 3.19: Darstellung niedermolekularer Vorstufen für die Synthese von makromolekularen

Prodrugs.

Die beiden erhaltenen Verbindungen 36 und 37 wurden jeweils mit den

Wirkstoffen Doxorubicin und Paclitaxel zu den niedermolekularen Carbamaten 38

und 39 bzw. Carbonaten 40 und 41 umgesetzt (Abb. 3.20, S. 50).


- 50 -

NH

HN

O

O

O

O

O

O

NO2

N

HFF

RF

FR = H: 36R = F: 37

Doxurubicin HClDIEADMF (abs.)

PaclitaxelDIEADMAPDCM (abs.)

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

RF

F

O

O

O

H3CO

HO

OH

O

O

NH

HOCH3

OHOH

NH

HN

O

O

O

N

HFF

FFR

R = H: 38 (72 %)R = F: 39 (61 %)

R = H: 40 (75 %)R = F: 41 (40 %)

O

O

O

OO

O

OH

OO

O

HO

HN

OO

O

O

O

Abb. 3.20: Synthese niedermolekularer Prodrugs mit einer Alkin-Ankergruppe zur Bindung an

PEG-Diazid via CuAAC.

Im Unterschied zu den AMC-Modellverbindungen, die im Kapitel 3.1 vorgestellt

wurden, verfügen die erhaltenen niedermolekularen Vorstufen 28, 29 und 38–41

über ein zwischen PABC-Linker und Effektor integriertes zusätzliches PABC-

analoges System. Welchen Einfluss die Einführung eines solchen chemischen

Adapters auf die Freisetzungsgeschwindigkeit von AMC ausübt, sollte im

Folgenden anhand der niedermolekularen Vorstufen 28 und 29 untersucht

werden.

3.2.1.3 Untersuchungen der pH-abhängigen Spaltungseigenschaften der niedermolekularen Modellverbindungen und Prodrugs 28, 29 und 38–41

Die Halbwertszeiten der AMC-Freisetzung in Pufferlösungen (pH 5.0 und 7.4) und

im Plasma wurden für 28 und 29 analog zu den Kinetikmessungen der

Modellverbindungen 1b und 4b–14b durch Messung der Fluoreszenzzunahme

bestimmt (siehe Kapitel 6.1.4, S. 89). Nach säurekatalysierter Hydrolyse der


- 51 -

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 100 200 300 400t /min

I x/I

AM

C

2829

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 40 80 120 160t /h

I x/I

AM

C

2829

Schiffschen Base sollten die beiden Linker spontan in zwei aufeinander folgenden

1,6-Benzyleliminierungen unter Abspaltung von AMC reagieren (Abb. 3.21).

NH

HN

O

O

O

AMC

O

O

R = H: 28R = F: 29

N

HFF

RF

F

H2NHN

O

OH

AMCOH

H2N

HFF

RF

F

O

2 x CO2

1. Benzyleliminierungen2. "Recycling" der PABC-Systeme

Abb. 3.21: Spaltung der Verbindungen 28 und 29 unter AMC-Freisetzung nach saurer Hydrolyse.

Im Folgenden sind die Ergebnisse der durchgeführten Spaltungsstudien

abgebildet (Abb. 3.22).

A

B


- 52 -

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20 25t /h

I x/I

AM

C

2829

C

Abb. 3.22: Zeitlicher Verlauf der AMC-Freisetzung von 28 und 29 in Pufferlösungen und im Plasma

(pH 5.0 (A), pH 7.4 (B), Plasma (C)).

Die Auftragung von ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

∞cc1ln gegen t zeigte keinen linearen Zusammenhang.

Daher wurden die Halbwertszeiten aus den graphischen Darstellungen des

zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenzzunahme näherungsweise bestimmt. Die

Halbwertszeit entsprach dabei dem Zeitpunkt, an dem die Hälfte der aus dieser

Verbindung insgesamt freigesetzten Menge an AMC erreicht wurde.

Da sich der Kurvenverlauf nicht durch eine Exponentialfunktion beschreiben lässt,

scheinen sich mehrere, voneinander unabhängige Reaktionsschritte zu

überlagern. Ein Vergleich der Halbwertszeiten von 13b und 14b bzw. 28 und 29

lieferte ein überraschendes Ergebnis (Tab. 3.5, S. 53). Entgegen der Erwartungen

verlief die AMC-Freisetzung aus den komplexeren Verbindungen 28 und 29 in den

Pufferlösungen tendenziell rascher als aus den entsprechenden Analoga. Im

Plasma lagen die Halbwertszeiten hingegen in einer ähnlichen Größenordnung.


- 53 -

Tab. 3.5: Vergleich der Halbwertszeiten von 13b und 14b bzw. 28 und 29 in Pufferlösungen bei

pH 5.0, pH 7.4 und im Plasma.

t1/2 [h] bei pH 5.0a t1/2 [h] bei pH 7.4b t1/2 [h] im Plasma

R = 13b/14b 28/29 13b/14b 28/29 13b/14b 28/29

F F

F F

0.57 0.28 96 ~ 72 ~ 1.30 ~ 1.25

F

F F

F F

2.88 1.00 360 ~ 72 ~ 2.33 ~ 1.25

a) Acetat-Puffer, 20 mM; b) Phosphat-Puffer, 20 mM.

Analog zu den niedermolekularen AMC-Modellverbindungen 28 und 29 sollten die

Spaltungseigenschaften der niedermolekularen Prodrugs (38–41) untersucht und

deren Halbwertszeiten miteinander verglichen werden. Da der Effektor als

Abgangsgruppe bei der Freisetzung kaum einen Einfluss auf die

Spaltungsgeschwindigkeit haben sollte, wurde angenommen, dass sich die

Halbwertszeiten von 28 und 29 bzw. 38, 39 und 40, 41 in einer ähnlichen

Größenordnung bewegen. In ersten Voruntersuchungen konnte mittels DC gezeigt

werden, dass alle vier Verbindungen (38–41) in Pufferlösungen den Wirkstoff

freisetzen. Die Spaltung verlief bei pH 5.0 deutlich schneller als bei pH 7.4. Auf

eine Quantifizierung mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

wurde an dieser Stelle jedoch aufgrund der sich andeutenden Löslichkeits-

probleme verzichtet.

3.2.1.4 Versuche zur Darstellung makromolekularer AMC-Modellverbin-dungen und Prodrugs mittels CuAAC

Nach der Untersuchung ihrer Hydrolyseeigenschaften sollten die

niedermolekularen AMC-Modellverbindungen 28 und 29 sowie die

niedermolekularen Prodrugs 38–41 durch CuAAC an PEG-Diazide

unterschiedlicher Kettenlänge (2 kDa, 4 kDa, 35 kDa) gekuppelt werden. Für eine

gezielte Anreicherung im Tumor unter Ausnutzung des EPR-Effekts ist ein

Prodrug mit hoher Molmasse (>30 kDa) erforderlich. Allerdings lassen sich


- 54 -

Moleküle in dieser Größenordnung nur schwer charakterisieren. Daher sollten

zusätzlich durch Reaktionen unter identischen Bedingungen analoge

Modellverbindungen mit PEG2k bzw. PEG4k dargestellt und anstelle des PEG35k

charakterisiert werden. Außerdem sollte durch Variation der Kettenlänge des

Polymers der Einfluss des Trägers auf die Stabilität der Verbindungen in

Pufferlösungen und im Plasma näher untersucht werden.

Zunächst wurden die PEG-Diazide in einer zweistufigen Synthese (Abb. 3.23)

hergestellt. Durch Reaktion von PEG mit Mesylchlorid und Triethylamin wurde 42

erhalten, welches nach nucleophilem Angriff von aktiviertem Natriumazid164 zum

PEG-Diazid (43) reagierte.

OOHHO n

OOMsMsO n

ON3N3 n

DCM (abs.)0 °C

NEt3MsCl

NaN3DMF (abs.)70 °C

4292 %

4377 %

Abb. 3.23: Darstellung von PEG-Diaziden.

Mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie wurde schließlich die Struktur des PEG2k-

Diazids bestätigt. Durch Integration konnte das Verhältnis der Protonen c und d zu

den vier Protonen a in Nachbarstellung des Azidsubstituenten bestimmt werden.

Daraus ergab sich für 43 eine Beladung von ungefähr 94 % (Abb. 3.24, S. 55).


- 55 -

1H-NMR

c, d

b a DMSO

13C-NMR

c, d

DMSO

b a

Abb. 3.24: 1H- und 13C-NMR-Spektren von PEG2k-Diazid (43) (n ~ 45).

PPM 3.70 3.60 3.50 3.40 3.30 3.20 3.10 3.00 2.90 2.80 2.70 2.60 2.50 2.40

0.

993

47

.83

3.

6106

3.

5985

3.

5965

3.

5859

3.

5453

3.

5391

3.

5347

3.

5318

3.

5070

3.

3944

3.

3814

3.

3696

3.

3186

N3O

OnN3

a

ab

b

c

d

N3O

OnN3

a

ab

b

c

d

PPM 68.0 66.0 64.0 62.0 60.0 58.0 56.0 54.0 52.0 50.0 48.0 46.0 44.0 42.0 40.0

69.

6331

69.

0929

49.

8591


- 56 -

Vor der Umsetzung der erhaltenen PEG-Diazide durch CuAAC mit den

niedermolekularen Vorstufen wurden in Testansätzen mit 29 und käuflichem

Benzylazid geeignete Reaktionsbedingungen ermittelt. Der erste Syntheseversuch

erfolgte in einem Wasser/DMSO-Gemisch mit dem klassischen Katalysatorsystem

bestehend aus Kupfersulfat und Natriumascorbat. Es konnte mittels DC keine

Reaktion detektiert werden, was vermutlich auf die äußerst geringe Löslichkeit von

29 in Wasser und Wassergemischen zurückzuführen ist. Die Bedingungen der

anschließenden Probeansätze, bei denen sowohl DMSO als auch DMF als

Lösungsmittel (LM) dienten, sind in Tabelle 3.6 zusammengestellt.

Tab. 3.6: Übersicht der verschiedenen getesteten Bedingungen zur Darstellung des CuAAC-

Produkts aus 29 und Benzylazid.

CuINatriumascorbatAminLM (abs.)

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

HFF

FF

NNN

F29

N3

N

HFF

FF

F

Variante

Reagenz 1 2 3 4 5

29 1 eq 1 eq 1 eq 1 eq 1 eq

Benzylazid 1 eq 1 eq 1 eq 1 eq 1 eq

Cu(I)I 10 mol%

10 mol%

20 mol%

20 mol%

10 mol%

DIEA 2 eq - 2 eq - 1 eq

PMDETA - 1.6 eq - 1.6 eq -

Neben den beiden Lösungsmitteln wurden die Katalysatormenge sowie die amino-

funktionalisierten Liganden variiert. In DMF wurde keine Reaktion beobachtet, was

vermutlich auf die hohe Verdünnung aufgrund geringer Löslichkeit zurückzuführen

ist. In DMSO hingegen konnte eine Umsetzung der Reaktanden festgestellt

werden. Nach Auswertung der DC zeigte Variante 1 in DMSO über Nacht den

größten Umsatz. Die ersten Reaktionsversuche mit 29 und PEG-Diazid wurden


- 57 -

daher in Anlehnung an diese Synthesevariante durchgeführt. Allerdings wurden

die Bedingungen an das veränderte Edukt angepasst und optimiert (Abb. 3.25). Im

Vergleich zu Reaktionen zwischen zwei niedermolekularen Reaktionspartnern sind

bei Reaktionen mit makromolekularer Komponente aufgrund des erhöhten

Lösungsmittelbedarfs längere Reaktionszeiten zu erwarten. Um zu gewährleisten,

dass dauerhaft das aktive Cu(I) statt des unreaktiven Cu(II) für die Reaktion zur

Verfügung stand, wurde Natriumascorbat zum Recyceln des stark sauerstoff-

empfindlichen Katalysators zugesetzt. Ebenso wurde das Verhältnis der einzelnen

Reagenzien zueinander angepasst: PEG-Diazid (1 eq), 29 (3 eq), Cu(I)I (2 eq),

Natriumascorbat (2 eq), DIEA (4 eq). Als Lösungsmittel dienten entweder DMSO,

THF oder DMF; in Dioxan und MeOH konnte aufgrund der geringen Löslichkeit der

Edukte nicht konzentriert genug (30 – 40 mM) gearbeitet werden.

CuINatriumascorbatDIEALM (abs.)

NH

HN

O

O

O

NH

O O

PEG-Diazid (43)

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

HFF

FF

NNN

PEG

2

RR = H 28R = F 29

O

O

N

HFF

RF

F

instabil

Abb. 3.25: Versuchte Synthese zur Darstellung makromolekularer AMC-Modellverbindungen

mittels CuAAC.

Mittels DC konnte die Umsetzung zu einem Produkt verfolgt werden, welches, wie

für die Zielverbindung erwartet, das Lauf- und Anfärbeverhalten eines PEG

aufwies und darüber hinaus UV- bzw. Fluoreszenzaktivität besaß. Allerdings

ließen sich auch Nebenprodukte beobachten. Es wurden zahlreiche Versuche

unternommen, um das vermeintliche Produkt zu isolieren. Fällungen mit unpolaren

Lösungsmitteln wie Et2O oder Hexan und Extraktionen inklusive Waschschritten

(z. B.: DCM/Phosphat-Puffer pH 7.4) lieferten ebenso wenig die Zielverbindung

wie Säulenchromatographien unter Verwendung verschiedener stationärer

Phasen (Kieselgel, Diol, RP). Stattdessen wurde ausschließlich AMC isoliert, das

sich während der Aufreinigung aus dem mutmaßlichen Produkt bildete.


- 58 -

In Anlehnung an die AMC-Modellverbindungen wurden Syntheseversuche zur

Darstellung makromolekularer Prodrugs durch Umsetzung der niedermolekularen

Vorstufen 38–41 mit PEG-Diaziden in einer CuAAC unternommen (Abb. 3.26).

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

RF

F

Wirkstoff

R = H 38, 40R = F 39, 41

CuINatriumascorbatDIEALM (abs.)

PEG-Diazid (43)

NH

HN

O

O

O

O

O

Wirkstoff

N

HFF

FF

NNN

PEG

2

R

instabil

Abb. 3.26: Versuchte Darstellung von makromolekularen Prodrugs durch Umsetzung der

niedermolekularen Vorstufen 38–41 mit PEG-Diaziden in einer CuAAC.

Analog zu den Beobachtungen, die bei den Syntheseversuchen der AMC-

Modellverbindungen gemacht wurden, konnte mittels DC zunächst die Bildung

eines Produkts mit zu der Zielverbindung passenden Eigenschaften verfolgt

werden. Spätestens während der zahlreichen Isolierungsversuche durch

beispielsweise Fällungen, Chromatographien unter Verwendung verschiedener

Trägermaterialien oder Extraktionen entstand allerdings ein nicht zu

charakterisierender, geleeartiger Niederschlag, welcher auf Aggregatbildung

hindeuten könnte.

3.2.2 Alternative Synthesestrategien zur Darstellung makromolekularer AMC-Modellverbindungen

Da bislang alle Versuche scheiterten, den polymeren Träger durch eine CuAAC

mit einer der niedermolekularen Vorstufen zu verknüpfen, wurden schließlich

alternative Synthesestrategien verfolgt. Zur Evaluierung geeigneter

Reaktionsbedingungen wurden die Synthesen ausschließlich mit

niedermolekularen Vorstufen der AMC-Modellverbindungen durchgeführt.


- 59 -

In einer Variante sollte PEG in Form seines Diamins (44), welches zuvor durch

Reduktion der PEG-Diazide mit Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle

gewonnen wurde (Abb. 3.27), als makromolekularer Träger eingeführt werden.

ON3 N3n

OH2N NH2n

Pd/CH2

EtOH (abs.)RT

43 4460 %

Abb. 3.27: Darstellung des PEG-Diamins 44.

Durch Umsetzung des Diamins mit Acylazid 26 sollte analog zur Reaktion mit

Propargylamin (siehe Abb. 3.18, S. 47) das PEG-Diamid 45 erhalten werden. Im

nächsten Schritt sollte dann der Trigger eingeführt werden (Abb. 3.28).

H2NO

NH2DMF (abs.)

NH

NHO

O O

HN

O

O

ONH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O


NH

NHO

O O

HN

O

O

ONH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

HFF

RF

F

26

44 45

R = H: 13aR = F: 14a

NH

N3

O

O

O

O

O

NH

O O

n

n

n

OH

N

HFF

RF

F

O

O

O

O

N

HFF

RF

F

instabil

Abb. 3.28: Versuchte Darstellung von makromolekularen AMC-Modellverbindungen durch

Umsetzung mit PEG-Diamin.

Bei dieser Umsetzung konnte in Analogie zu den zuvor durchgeführten CuAAC

mittels DC die Bildung eines Produkts mit zur Zielverbindung passenden

Eigenschaften (UV-Aktivität, Lauf- und Anfärbeverhalten) beobachtet werden,


- 60 -

dessen Isolierung abermals scheiterte. Statt des erwarteten Produkts wurden

AMC und ein nicht zu charakterisierendes, geleeartiges Nebenprodukt, welches

auf Aggregatbildung hindeuten könnte, erhalten.

Da alle Versuche scheiterten, das Polymer PEG mittels CuAAC oder durch Aufbau

einer Amid-Bindung mit dem Adapter zu verknüpfen, sollten in einer weiteren

Variante AMC-Modellverbindungen hergestellt werden, die an HSA als

Trägermolekül binden können. Dazu sollte eine Maleinimido-Ankergruppe anstelle

der Propargylgruppe in den bereits bekannten Linker basierend auf 3-Amido-4-

hydroxymethylanilin integriert werden. Diese Maleinimidofunktion bindet selektiv

und kovalent an die Cystein-34-Position von HSA.165

Für die Synthese der Zielverbindungen (Abb. 3.29) wurde zunächst

6-Maleinimidocapronsäurehydrazid durch Reaktion mit Natriumnitrit in HCl (1 M) in

das Acylazid 46 überführt. Diese labile Verbindung wurde mit DCM extrahiert und

direkt nach Entfernen des Lösungsmittels in Dioxan aufgenommen. Durch äußerst

langsames Zutropfen der organischen Phase zu siedendem, mit einem Äquivalent

konz. HCl versetztem Wasser und anschließendem Lyophilisieren konnte

1-Maleinimidopentan-5-amin (47) erhalten werden. Dieses Amin sollte im

nächsten Schritt mit dem Acylazid 26 zum Amid reagieren. Durch zur Synthese

von 28 bzw. 29 analoge Umsetzung mit den Benzylalkoholen 13a und 14a

(Abb. 3.18, S. 47) sollten schließlich die beiden Zielverbindungen erhalten werden.

+H3NHN

ON

O

O

CF3COO-1 M HClNaNO2, 0° C N3

ON

O

O

Dioxan/H2Okonz. HCl, Δ

+H3N N

O

O

26NH

N3

O

O

O

O

O

NH

O O DIEADMF (abs.)

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

O

O

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

HFF

FF


OH

N

HFF

FFR

R

N

O

O

Cl-

4790 %

46

R = H: 13aR = F: 14a

Abb. 3.29: Versuchte Darstellung von AMC-Modellverbindungen mit Maleinimido-Ankergruppe zur

Bindung an HSA.


- 61 -

Obwohl in einer analogen Reaktion von 26 mit Propargylamin das Amid 27

erhalten werden konnte (Abb. 3.18, S. 47), war eine Umsetzung mit dem Amin 47

nicht erfolgreich. Langsames Zutropfen der mit Lösungsmittel verdünnten Base

DIEA zum Reaktionsgemisch mit dem basenlabilen Maleinimid führte zur Bildung

zahlreicher Produkte. Die säulenchromatographisch isolierten, zum Teil instabilen

Verbindungen wurden mittels NMR-Spektroskopie untersucht und entsprachen

nicht der Zielverbindung. Da sich 47 mit Acetanhydrid acetylieren ließ, kann eine

Empfindlichkeit von 47 als alleinige Ursache für das Scheitern der Synthese

ausgeschlossen werden.

In einem weiteren Versuch sollte eine abgeänderte Variante des Linkers

synthetisiert werden (Abb. 3.30), bei der die Ankergruppe nicht als Amid sondern

über eine Hydrazid-Bindung mit dem Linker verknüpft wird. Dazu wurde Hydrazid

25 zunächst mit 6-Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester zu 48

umgesetzt. Bei den Versuchen eine Trigger-Gruppe analog zu der Reaktion von

27 mit den Benzylalkoholen 13a bzw. 14a (Abb. 3.18, S. 47) einzuführen, wurde

jedoch wiederum ausschließlich das Zersetzungsprodukt AMC erhalten. Ob diese

Beobachtung auf ein Stabilitätsproblem des Produkts oder auf die Inkompatibilität

der Maleinimidofunktion mit den Reaktionsbedingungen zurückzuführen war,

konnte nicht geklärt werden.

NH

HN

ONH3

+

O

O

O

O

NH

O O

NH

HN

ONH

O

O

O

O

NH

O O

ON

O

ODIEADMF (abs.)

DBTL in ToluolDioxan (abs.), Δ

OHN

HFF

F F

R

NH

HN

ONH

O

O

NH

O O

ON

O

O

N

HF

FF

F

R

25

N

O

O

O

O

N OO

R = H: 13aR = F: 14a

4845 %

O

O

CF3COO-

Abb. 3.30: Versuchte Darstellung von AMC-Modellverbindungen mit Maleinimido-Ankergruppe zur

Bindung an HSA.


- 62 -

3.2.3 Abschließende Untersuchungen zur Eignung von 3-Amido-4-hydroxymethylanilin als Adapter-Baustein

Bei Betrachtung der Ergebnisse aus den Kapiteln 3.2.1.4 und 3.2.2 zeigt sich,

dass alle bisherigen Versuche misslangen, makromolekulare Systeme mit dem

integrierten Adapter-Baustein 3-Amido-4-hydroxymethylanilin darzustellen. Das

Scheitern der Synthesen ist auf die Bildung von Produkten zurückzuführen, die

aus unbekannten Gründen nicht stabil waren und sich daher nicht isolieren ließen.

Die gewonnenen Erkenntnisse werfen die Frage auf, ob sich der Linker auf Basis

von 3-Amido-4-hydroxymethylanilin überhaupt als Adapter-Baustein eignet. Zur

Verifizierung, dass nicht die Methoden selbst einer erfolgreichen Synthese im

Wege standen, sollten zu den gescheiterten Synthesen aus den vorherigen

Kapiteln analoge Reaktionen mit niedermolekularen Reaktionspartnern

durchgeführt werden. Folgende Vorteile wurden sich davon versprochen: kürzere

Reaktionszeiten, erleichterte Verfolgung des Reaktionsverlaufs mittels DC,

geringerer Lösungsmittelbedarf und Verfügbarkeit zahlreicher Charakterisierungs-

methoden. Zudem wurden für die Reaktionen Vorstufen ohne säurelabile Imin-

Bindung ausgewählt, um mögliche Einflüsse einer vorzeitigen Imin-Hydrolyse

ausschließen zu können.

Zunächst wurde eine CuAAC von 27 mit dem niedermolekularen Reaktionspartner

Benzylazid durchgeführt (Abb. 3.31, S. 63). Dabei wurden zu den Umsetzungen

mit den PEG-Diaziden analoge Bedingungen gewählt. In einem weiteren Versuch

sollte 26 mit Methoxyethylamin anstelle des PEG-Diamins in einer nucleophilen

Substitution zum Amid umgesetzt werden. Interessanterweise wurde statt der

Zielverbindungen in beiden Fällen nahezu ausschließlich das Zersetzungsprodukt

AMC erhalten.


- 63 -

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O ON3

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

NNNCuI

NatriumascorbatDIEATHF (abs.)

NH

N3

O

O

O

O

O

NH

O OH2N

DMF (abs.)

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O OO

O

27

26

instabil

instabil

Abb. 3.31: Zu den Syntheseversuchen der makromolekularen Verbindungen aus den Kapiteln

3.2.1.4 und 3.2.2 analoge Reaktionen mit niedermolekularem Reaktionspartner.

In Analogie zu den Versuchen, makromolekulare AMC-Modellverbindungen und

Prodrugs über CuAAC, Amid-Bindungen oder Einführung eines HSA-bindenden

Linkers zu synthetisieren, wurden bei den analytisch gut zu verfolgenden

Umsetzungen mit niedermolekularen Reaktionspartnern keine stabilen Produkte

erhalten. Da das Versagen unabhängig von der jeweiligen Darstellungsmethode

und der Struktur des Effektors ist, scheint eine Unbeständigkeit der

Zielverbindungen vorzuliegen. Diese wird vermutlich durch die im Vergleich zu den

stabilen Modellverbindungen 1b und 4b–14b zusätzlich integrierte Amid-Bindung

zur Kupplung an den polymeren Träger hervorgerufen. Der verwendete Linker

eignet sich daher nicht als Adapter-Baustein. In Abbildung 3.32 werden denkbare

Zyklisierungsreaktionen vorgestellt, die zur vorzeitigen Abspaltung des Effektors

führen könnten. Ebenso könnten katalytische Effekte der Amid-Funktion sowie die

Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Proton am

Stickstoffatom und dem Sauerstoffatom der Carbonyl-Funktion die Freisetzung

des Effektors beschleunigen.

NH

HN

O

O

O

R''

O

OR'

XEffektor

X = NH, O

Abb. 3.32: Mögliche Zyklisierungsreaktionen, die zur Abspaltung des Effektors führen.


- 64 -

Die Erkenntnis, dass der Linker sich nicht für den Aufbau der makromolekularen

Verbindungen eignet, wurde leider erst nach zahlreichen Bemühungen gewonnen.

Dies lag vorwiegend daran, dass Verbindung 27 und ihre Folgestufen

bemerkenswerte Ausnahmen darstellten. So gelang ihre Isolierung und

Charakterisierung, was vermutlich auf die durch die Ethinylgruppe hervorgerufene

starrere Struktur der Verbindungen zurückzuführen ist. Allerdings zeigten auch

diese Verbindungen Anzeichen von Instabilität (vgl. Freisetzungsstudien, Kapitel

3.2.1.3, S. 50). Entgegen der Erwartung setzten sie AMC schneller frei als die

analogen Modellsubstanzen 13b und 14b ohne chemischen Adapter.

Für die weitere Entwicklung ist die Verwendung eines anderen Adapters

erforderlich. Da sich sowohl die Trigger-Gruppen als auch die benzylischen

Carbamat-Bindungen den Modellsubstanzen 1b und 4b–14b als stabil erwiesen,

sollte in einem neuen System das Polymer z. B. über eine benzylische Carbamat-

Bindung gekuppelt werden.

3.3 Säurelabile PEG-Konjugate auf Basis des 2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin-Linkers

Da alle Versuche zur Synthese von makromolekularen Modellverbindungen und

Prodrugs mit dem auf 3-Amido-4-hydroxymethylanilin basierenden chemischen

Adapter-System nicht zum Ziel führten, wurde als Alternative der verzweigte

Linker 2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin130 eingesetzt. Zur Evaluierung des neuen

Systems sollten zunächst ausschließlich AMC-Modellverbindungen dargestellt

werden. Die verfolgte Synthesestrategie wird retrosynthetisch in Abbildung 3.33

dargelegt. Als Ausgangsverbindung für die Synthese diente ein Baustein, der von

A. WARNECKE zur Verfügung gestellt wurde.166


- 65 -

NHNO

OO

O CO

NH

O

O

O

HN

ONH

O

O

O O

NH

O

O

O

N3

O

HNO

OO

O

O O

NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

R

NH

O

n

nNH

OHNO

OO

O

NH

O

n

n

O

NH

O O

NH

O

O

OH

HN

ONH

O

O

O O

vorhandener Baustein

R = H, F

Abb. 3.33: Retrosynthese von makromolekularen AMC-Modellverbindungen auf Basis eines

2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin-Adapters.

Im letzten Schritt der Darstellung sollte der Trigger durch Umsetzung des

jeweiligen säurelabilen Imins mit einem Isocyanat, welches durch eine Curtius-

Umlagerung aus einem Acylazid intermediär gebildet wird, eingeführt werden. Das

Acylazid kann durch Behandlung mit HCl und Natriumnitrit aus einer Hydrazid-

Vorstufe dargestellt werden. Diese lässt sich wiederum durch Reaktion eines

PEG-Isocyanats mit dem vorliegenden Baustein erhalten. Im folgenden Kapitel

werden die einzelnen Syntheseschritte zur Darstellung der PEG-Konjugate

ausführlich erläutert.

3.3.1 Synthese und Charakterisierung der makromolekularen AMC-Modellverbindungen

Die makromolekularen AMC-Modellverbindungen wurden in mehrstufigen

Synthesen dargestellt. Im ersten Schritt wurde mPEG5k dabei durch Umsetzung

mit einem großen Überschuss an 1,6-Hexyldiisocyanat in PEG-Isocyanat 49

überführt (Abb. 3.34, S. 66). Anschließend wurde durch Reaktion mit dem von

A. WARNECKE zur Verfügung gestellten Benzylalkohol 50166 der trifunktionelle

Linker durch den Aufbau einer Carbamat-Bindung eingeführt. Nach Abspaltung


- 66 -

der Boc-Schutzgruppe in 5 M HCl wurde durch Zugabe von Natriumnitrit aus dem

Hydrazid 51 das Acylazid 52 erhalten. Dieses reagierte beim Erhitzen in einer

Curtius-Umlagerung unter Stickstoffabspaltung zum Isocyanat, welches in situ mit

den Schiffschen Basen 13a bzw. 14a umgesetzt wurde. Die Produkte 53 und 54

wurden schließlich nach Fällung mit Et2O erhalten.

NHNO

OO

O CO

NH

O

O

O

HN

ONH

O

O

DBTL, 80 °CDioxan (abs.)

OH

N

HFF

RF

F

1. 5 M HCl2. NaNO2, H2O

NH

O

O

OH

HN

ONH

O

O

O O

O O

NH

O

O

O

N3

O

HNO

OO

O

O O

NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

R53: R = H (21 %)54: R = F (35 %)

NH

O

n

13a: R = H14a: R = F

n

4998 %

OHO

On

NH

OHNO

OO

O

50

NH

O

n

n

5168 %

DBTL, 80 °CDioxan (abs.)

DBTLBenzol (abs.)

NN

CO

CO

5292 %

O

NH

O O

Abb. 3.34: Synthese der makromolekularen AMC-Modellverbindungen 53 und 54 (n ~ 114).

Zur Charakterisierung und zur Bestimmung der Beladung am Polymer wurden von

den beiden Zielverbindungen 53 und 54 1H-NMR-Spektren in DMSO-d6

aufgenommen (Abb. 3.35, S. 67). Im Bereich von 1.21–1.23 ppm und 1.33–

1.40 ppm treten die Signale von vier CH2-Gruppen des Hexyllinkers auf. Der Peak

bei 2.36 ppm ist charakteristisch für die Methylgruppe des AMC. Die zum Teil sehr

breiten Peaks bei 2.90–2.97 ppm, 3.24 ppm, 3.44–3.66 ppm und 4.02–4.04 ppm

lassen sich den zahlreichen Protonen am Polymer (CH2 und OCH3) und zwei

weiteren CH2-Gruppen des Hexyllinkers zuordnen. Die Signale der drei


- 67 -

benzylischen CH2-Gruppen erscheinen bei 4.98 ppm und 5.19–5.21 ppm. Das

Proton am Lactonring des AMC erzeugt ein charakteristisches Signal bei

6.19 ppm. Im Bereich von 7.16–7.69 ppm treten die Signale der aromatischen

Protonen sowie die der beiden Protonen an den Stickstoffatomen des Hexyllinkers

auf. Dem aldehydischen Proton lässt sich der Peak bei 8.61 ppm und den beiden

übrigen Carbamat-Protonen die Peaks bei 9.34 und 10.30 ppm zuordnen.

Zusätzlich zu den bereits aufgelisteten Peaks zeigt das Spektrum von 53 bei 8.05–

8.14 ppm ein Signal für das einzelne Proton am fluorierten Benzolring.

Durch Integration konnte das Verhältnis der Protonen am PEG zu den zwölf

Protonen im Bereich von 7.16–7.69 ppm (zehn aromatische Protonen und zwei

NH) bestimmt werden. Daraus ergab sich für 53 eine Beladung von 61 % und für

54 eine Beladung von 69 %.

A PEG, c DMSO i h g Aromaten, f e d b a

B PEG, c DMSO b g Aromaten, f e d a h

Abb. 3.35: 1H-NMR-Spektren von 53 (A) und 54 (B).

PPM 9.6 9.2 8.8 8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2

12

.00

742

.65

NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

H

NH

O

n

O

NH

O O

53

a

a

a

ab

c

c

dd

d

e

f

f

g

h

i

i

PPM 9.6 9.2 8.8 8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2

659

.68

12

.00

NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

F

NH

O

n

O

NH

O O

54

a

a

a

ab

c

c

dd

d

e

f

f

g

h

h


- 68 -

Die Stabilität der beiden PEG-Konjugate 53 und 54 sowie zweier

Vergleichsubstanzen (16 und 55; siehe Kapitel 3.3.2) ohne Trigger-Gruppe sollte

in Analogie zu den zuvor durchgeführten Freisetzungsstudien (vgl. Kapitel 3.1.3) in

Pufferlösungen (pH 5.0 und 7.4; siehe Kapitel 3.3.3, S. 70) und im Plasma (siehe

Kapitel 3.3.4, S. 75) untersucht werden.

3.3.2 Synthese einer pH-unempfindlichen Vergleichsubstanz

Die Strukturen der AMC-Modellverbindungen 1b, 4b–14b, 53 und 54 verfügen

über zahlreiche Carbamat-Bindungen, die unspezifisch gespalten werden könnten.

Um die Stabilität dieser Bindungen untersuchen zu können, wurde eine

Vergleichsubstanz ohne säurelabile Sollbruchstelle synthetisiert. Dazu wurde das

zu 53 und 54 analoge Methylcarbamat 55 durch Erhitzen des Azids 52 in MeOH

synthetisiert und – wie für die PEG-Konjugate in Kapitel 3.3.1 beschrieben –

aufgearbeitet (Abb. 3.36).

NH

O

O

O

N3

O

HNO

OO

O

O O

NH

O

n

52

MeOH (abs.), Δ

NH

O

O

O

NH

HNO

OO

O

O O

NH

O

n

5537 %

O

O

Abb. 3.36: Synthese der Vergleichsubstanz 55 ohne säurelabile Trigger-Gruppe.

Die Charakterisierung und Bestimmung der Beladung von 55 erfolgte mittels 1H-NMR-Spektroskopie in DMSO-d6 (Abb. 3.37, S. 69). Im Bereich von 1.21–

1.22 ppm und 1.35–1.36 ppm treten die Signale von vier CH2-Gruppen des

Hexyllinkers auf. Der charakteristische Peak bei 2.39 ppm lässt sich der

Methylgruppe des AMC zuschreiben. Die zum Teil sehr breiten Peaks bei 2.93–


- 69 -

2.94 ppm, 3.24 ppm, 3.31 ppm 3.40–3.78 ppm und 4.02–4.03 ppm lassen sich

den zahlreichen Protonen am Polymer (CH2 und OCH3), zwei weiteren CH2-

Gruppen des Hexyllinkers und der Methylgruppe des Carbamats zuordnen. Die

Signale der beiden benzylischen CH2-Gruppen erscheinen bei 4.97 ppm und

5.19 ppm. Das Proton am Lactonring des AMC erzeugt ein charakteristisches

Signal bei 6.24 ppm. Im Bereich von 7.16–7.72 ppm treten die Signale der

aromatischen Protonen sowie die der beiden Protonen an den Stickstoffatomen

des Hexyllinkers auf. Den beiden übrigen Carbamat-Protonen lassen sich die

Peaks bei 9.16 und 10.31 ppm zuordnen.

Durch Integration konnte das Verhältnis der Protonen am PEG zu den drei

Protonen der Methylgruppe des AMC bestimmt werden. Daraus ergab sich für 55

eine Beladung von 57 %.

PEG, c, d DMSO

b a Aromaten, g f e h

Abb. 3.37: 1H-NMR-Spektrum von 55.

NH

O

O

O

O

NH

OHNO

OO

On

55

O

NH

O O

d

a

a

a

ab

c

c

e

e

f

g

g

h

h

PPM 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

2.

994

774

.43


- 70 -

3.3.3 Untersuchung der Stabilität der Vergleichsubstanzen (16 und 55) sowie der Spaltungseigenschaften der PEG-Konjugate 53 und 54

Zur Bestimmung der Stabilität der Carbamat-Bindungen gegenüber unspezifischer

Spaltung wurden die beiden Vergleichsubstanzen 16 und 55 (Abb. 3.38) ohne

säurelabile Trigger-Gruppe in Analogie zu den bisher durchgeführten

Spaltungsstudien (siehe Kapitel 6.1.4) in Puffer- (pH 5.0 und 7.4) bzw.

Plasmalösungen untersucht.

NH

O NH

O

O O

O

O NH

O

O

O

O

NH

OHNO

OO

On

16 55

O

NH

O O

Abb. 3.38: Vergleichsubstanzen 16 und 55 ohne säurelabile Trigger-Gruppe.

Beide Verbindungen setzten in einem Zeitraum von drei Tagen in diesen Medien

nur äußerst geringfügige Mengen an AMC frei. Diese Ergebnisse zeigten, dass

unter den Messbedingungen keine unspezifische Spaltung der Carbamat-

Bindungen auftritt und die bei den Modellverbindungen 1b, 4b–14b beobachtete

AMC-Freisetzung allein auf der Hydrolyse der Imin-Bindung und den

anschließenden Eliminierungsreaktionen beruht. Eine unspezifische Spaltung der

beiden PEG-Konjugate 53 und 54 sollte aufgrund der Stabilität von 55 in den

folgenden Spaltungsstudien nicht auftreten.

In kinetischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass sowohl die 1,6- als auch die

1,4-Benzyleliminierung sogar im sauren Milieu rasch verlaufen, wobei die 1,6-

Benzyleliminierung schneller als die 1,4-Eliminierung ist.130,144 Daher kann

folgender Mechanismus für die spezifische AMC-Freisetzung aus 53 und 54

angenommen werden (Abb. 3.39, S. 71). Im ersten Schritt wird die Imin-Bindung

säurekatalysiert gespalten. Dabei wird die Aminogruppe des PABC-Linkers

freigesetzt, was in spontan ablaufenden 1,6-Benzyleliminierungen der beiden

Linker-Systeme resultiert. Nach Regeneration des PABC-Linkers durch den Angriff

von Wasser auf die p-Iminochinomethan-Zwischenstufe wird AMC durch eine


- 71 -

spontane 1,4-Benzyleliminierung abgespalten, was einen Anstieg der

Fluoreszenzintensität in der Lösung zur Folge hat.

H2N

OH

H2N O O

CH3

2 x CO2++

AMCfluoreszierend

Iminhydrolysebei pH 5.0

stabil bei pH 7.4

zweifache, spontane1,6-Benzyleliminierung

NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

R

NH

O

n

O

NH

O O H

O

FF

FF

R

NH

O

O

O

H2N O

HNO

OO

ONH

O

n

O

NH

O O

HN

O

O

NH

O O

HNO

OO

ONH2n

H2N

OHCO2++

OH

H2O

H2N

O

O

NH

O O

OHspontane1,4-Benzyleliminierung

H2O

Abb. 3.39: Postulierter Mechanismus für die säurekatalysierte Freisetzung von AMC aus den

Verbindungen 53 und 54.

Die Messung der Fluoreszenzzunahme wurde analog zu den Untersuchungen der

niedermolekularen Analoga durchgeführt (pH 5.0 und 7.4; 10 μM; siehe Kapitel

3.1.3 bzw. 6.1.4). Beim Herstellen der DMSO-Stammlösungen wurde die jeweilige

Beladung am Polymer von 61 % (53) bzw. 69 % (54) berücksichtigt. Obwohl in

diesem Fall die Modellverbindungen wasserlöslich sind, ist der Zusatz eines

organischen Lösungsmittels wie DMSO erforderlich, da wasserunlösliche

Spaltprodukte entstehen.

Die Auftragung von ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

∞cc1ln gegen t ergab keine lineare Beziehung. Daher

wurden die Halbwertszeiten aus den graphischen Darstellungen des zeitlichen

Verlaufs der Fluoreszenzzunahme näherungsweise bestimmt. Die Halbwertszeit

entsprach dabei dem Zeitpunkt, an dem die Hälfte der aus der Verbindung

insgesamt freigesetzten Menge an AMC erreicht wurde (Abb. 3.40, S. 72).


- 72 -

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250 300t /min

I x/I

AM

C

13b14b5354

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20 25t /h

I x/I

AM

C

13b14b5354

A

B

Abb. 3.40: Ergebnisse der Spaltungsstudien an 53 und 54 im Vergleich zu ihren

niedermolekularen Analoga 13b bzw. 14b in Pufferlösungen bei pH 5.0 (A) und pH 7.4 (B).

Die Halbwertszeiten der Spaltung lagen in Acetat-Puffer (pH 5.0) bei t1/2 = 15 min

(53) bzw. t1/2 = 17 min (54) und in Phosphat-Puffer (pH 7.4) bei t1/2 = 65 min (53)

bzw. t1/2 = 104 min (54). Beide makromolekularen Verbindungen waren in den

Pufferlösungen demzufolge deutlich labiler als die vergleichbaren

niedermolekularen Verbindungen (siehe Tab. 3.7, S. 73). Auch der zuvor stark

ausgeprägte Effekt des Substituenten in para-Stellung der Benzaldehyd-

komponente verlor drastisch an Einfluss. Eine mögliche Erklärung für die raschere

Freisetzung liegt im Auftreten von übergeordneten Strukturen innerhalb der


- 73 -

Lösung. So sind beispielsweise Block-Copolymere aus einem PEG-Block und

einem unpolaren Block dafür bekannt, in wässrigen Lösungen Micellen

auszubilden. 167,168

Tab. 3.7: Vergleich der Halbwertszeiten für die AMC-Freisetzung von 13b und 14b

(niedermolekular) bzw. 53 und 54 (makromolekular) in Pufferlösungen bei pH 5.0 und 7.4.

O

NR

H NH

O

O O NH

O

O

O

NR

H

O

NH

O O O

O

NH

HNO

OO

On

53 bzw. 5413b bzw. 14b

R = Nr. t1/2 [h] bei pH 5.0

t1/2 [h] bei pH 7.4

13b 0.57 89

F F

F F

53 0.25 1.10

14b 2.88 365 F

F F

F F

54 0.28 1.70

Micellen sind sphärische Aggregate aus amphiphilen

Substanzen, bei denen sich die unpolaren Gruppen in

wässrigen Systemen spontan zusammenlagern,

während die hydrophilen Teile nach außen ragen und

dort eine hydratisierte Hülle bilden (Abb. 3.41). Bedingt

durch die wasserfreie Umgebung und die räumliche

Nähe der hydrophoben Reste könnte die Hydrolyse der

Imin-Bindung möglicherweise aufgrund autokata-

lytischer Effekte begünstigt sein. Abb. 3.41: Aufbau einer Micelle.169

Zudem ist der pH-Wert nur in wässrigen Systemen eindeutig definiert, so dass

dieser als Maß für die Protonierung innerhalb des hydrophoben Kerns einer

Micelle nicht verwendet werden kann.


- 74 -

Ferner wurde bei der Messung der Freisetzungskinetiken von 53 und 54

beobachtet, dass nur ca. 40 % (pH 5.0) bzw. 55 % (pH 7.4) des Farbstoffs

freigesetzt wurden. DE GROOT et al. lieferten in einem Patent aus dem Jahr 2004

den Hinweis,170 dass bei Verwendung von 2,4,6-Tri(hydroxymethyl)anilin als

Mehrfach-Eliminierungslinker im Fall eines als Carbamat gebundenen amino-

funktionalisierten Effektors nur eine unvollständige Freisetzung zu beobachten

war. Im Gegensatz dazu konnten mit demselben Linker-System über eine

Carbonat-Bindung gekuppelte hydroxy-funktionalisierte Effektoren vollständig

freigesetzt werden (Abb. 3.42).

O2N

O

OO NH

O

NH

O

Effektor

Ef fektor

NH

OEffektor

O2N

O

OO O

O

O

O

Effektor

Effektor

O

OEffektor

Reduktion

Reduktion

H2N

OH

OH

HO

3 CO2 3 H2N-Effektor

H2N

OH

OH

HO

3 CO2 3 HO-Effektor

Abb. 3.42: In Untersuchungen von DE GROOT et al. setzte der Mehrfach-Eliminierungslinker

2,4,6-Tri(hydroxymethyl)anilin nur hydroxy-funktionalisierte Effektoren vollständig frei.170

In späteren Arbeiten von SHABAT et al.144 und WARNECKE et al.130 wurde

2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin als Mehrfach-Eliminierungslinker für amino-

funktionalisierte Effektoren eingesetzt. Eine Quantifizierung des freigesetzten

Effektors erfolgte in diesen Untersuchungen allerdings nicht. Bei WARNECKE et al.

lag dies vor allem an aufgetretenen Löslichkeitsproblemen.130

Im Unterschied zu den Modellverbindungen 1b und 4b–14b setzten 53 und 54 den

Farbstoff nicht direkt, sondern erst nach einer vorgelagerten 1,6-Benzyl-

eliminierung und anschließender Regeneration des PABC-Systems durch Angriff

von Wasser auf das intermediär gebildete Iminochinomethan frei. Es ist denkbar,

dass unerwünschte Nebenreaktionen auftreten, die durch Bildung stabiler

Produkte bzw. von Verbindungen mit Quencheigenschaften eine vollständige

Freisetzung verhindern. Zwar zeigten die nach dem postulierten Mechanismus

entstehenden Produkte (PABA- oder Benzaldehydderivate) in einer Untersuchung


- 75 -

keine Quencheffekte, aber es ist nicht ausgeschlossen, dass weitere, bisher nicht

identifizierte Produkte mit einer solchen Eigenschaft entstanden sind. Eine

umfangreiche Literaturrecherche ergab, dass die Regenerierung von PABA durch

Addition von Wasser an das intermediär entstehende Iminochinomethan zwar

stets postuliert, aber nur unzureichend untersucht wurde.

3.3.4 Untersuchung der Plasmastabilität von 53 und 54

Bei der Untersuchung der Plasmastabilität von 53 und 54 wurde analog zu den

Messungen in den Pufferlösungen verfahren. Der zeitliche Verlauf der AMC-

Freisetzung ist in Abbildung 3.43 dargestellt.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 100 200 300 400t /min

I x/I

AM

C

13b14b5354

Abb. 3.43: AMC-Freisetzung aus den makromolekularen Modellverbindungen 53 und 54 und ihren

niedermolekularen Analoga 13b und 14b im Plasma.

Die graphische Auswertung ergab, dass beide Verbindungen AMC mit einer

Halbwertszeit von t1/2 = 374 min freisetzten. Damit erwiesen sie sich als deutlich

stabiler als ihre niedermolekularen Analoga (t1/2 = 78 min (13b) bzw. t1/2 = 140 min

(14b)). Die Ergebnisse der Hydrolysestudien zeigten, dass es prinzipiell möglich

ist, die Freisetzung von Effektoren aus makromolekularen Verbindungen durch

säurelabile Trigger-Gruppen zu initiieren. Wie erhofft konnte die Plasmastabilität


- 76 -

der Imin-Bindungen durch die Kupplung an einen polymeren Träger etwas erhöht

werden. Die durch HSA katalysierte Hydrolyse der Imin-Bindung scheint in der

makromolekularen Formulierung zurückgedrängt zu werden. Der Vergleich der

Halbwertszeiten von 53 und 54 in Plasma und in Pufferlösung bei pH 7.4 zeigte,

dass die Stabilität im Plasma um ungefähr Faktor sechs höher ist als in der

Pufferlösung. Die Ausprägung des stabilisierenden Effekts, der durch das

Einführen eines Fluoratoms in para-Stellung der Benzaldehydkomponente bewirkt

wurde, war im Plasma und in den Pufferlösungen für die PEG-geträgerten

Verbindungen gegenüber 13b und 14b stark vermindert. Da im Plasma – anders

als im Puffer – bemerkenswerterweise ein Endwert von 100 % Freisetzung

gemessen wurde, scheint der Freisetzung in Plasma ein anderer Mechanismus

zugrunde zu liegen.

3.4 Untersuchung der nachgelagerten 1,4-Benzyleliminierung anhand niedermolekularer AMC-Modellverbindungen

Bei der Untersuchung der Spaltungseigenschaften von 53 und 54 fiel auf, dass der

Farbstoff AMC in Pufferlösungen nur zu maximal 55 % freigesetzt wird. Um zu

klären, ob die unvollständige Spaltung auf die Verwendung von PEG als Träger

zurückzuführen ist oder ob diese generell bei Mehrfacheliminierungen aus

2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin auftritt, sollten niedermolekulare AMC-Modellverbin-

dungen mit sowohl einfachem (56) als auch mit verzweigtem (57) PABC-analogen

System (Abb. 3.44, S. 77) synthetisiert und hinsichtlich ihrer Spaltungseigen-

schaften miteinander verglichen werden. Während anhand von Verbindung 56 die

Kinetik der direkten 1,4-Benzyleliminierung bestimmt werden sollte, ermöglicht 57

eine Untersuchung der Spaltungseigenschaften einer 1,4-Benzyleliminierung, die

einer 1,6-Benzyleliminierung sowie der Regeneration des PABC-Systems

nachgelagert ist.


- 77 -

56

+H3N

O NH

O

O O

CF3COO-

57

+H3N

O

O

NH

O NH

O

O O

CF3COO-

Abb. 3.44: Zielstrukturen niedermolekularer AMC-Modellverbindungen zur Untersuchung der

1,4-Benzyleliminierung.

Die Synthese von 56 (Abb. 3.45) erfolgte ausgehend von o-Aminobenzylalkohol

analog zur Darstellung von 17 (siehe Kapitel 3.1.2, S. 27).

H2N

DBTLTHF (abs.)

N O OCO

TFA/DCM 1:1

35891 %

NH

Boc

5987 %

NH

Boc

OH O NH

O

O O

5668 %

+H3N

O NH

O

O O

CF3COO-

OH

(Boc)2ODCM (abs.)

Abb. 3.45: Synthese der Modellverbindung 56.

Für die Synthese der Modellverbindung 57 wurde zunächst 2-((tert.-

Butyldimethylsilyloxy)methyl)-4-(hydroxymethyl)anilin*166 durch Umsetzung mit

(Boc)2O geschützt (60) (Abb. 3.46, S. 78). Im nächsten Schritt wurde mit

Propylisocyanat zum Propylcarbamat 61 umgesetzt. Nach Spaltung des TBS-

Ethers mit einem MeOH/HCl-Gemisch (50:1) wurde durch Reaktion des

Benzylalkohols 62 mit AMC-NCO (3) der Farbstoff AMC über eine Carbamat-

Bindung eingeführt. Abspaltung der Boc-Schutzgruppe von 63 mit einem

TFA/DCM-Gemisch lieferte schließlich die Zielverbindung 57.

* Diese Verbindung wurde von A. WARNECKE zur Verfügung gestellt.


- 78 -

H2N

OH

MeOH/1 M HCl50:1

DBTLTHF (abs.)

N O OCO

TFA/DCM 1:1

3

6099 %

NH

OH

Boc

DBTLTHF (abs.)

NC

O

6198 %

NH

O

Boc

O

NH

6279 %

NH

O

Boc

O

NH

6394 %

NH

O

Boc

O

NH

OTBSOTBS

OHO NH

O

O O

5764 %

+H3N

O

O

NH

O NH

O

O O

CF3COO-

OTBS

(Boc)2ODCM (abs.)

Abb. 3.46: Synthese der Modellverbindung 57.

Beide Verbindungen lagen als TFA-Salze vor und waren als Feststoffe stabil. Die

Bestimmung ihrer Kinetiken zur Freisetzung von AMC erfolgte analog zu den

bisherigen Messungen (vgl. Kapitel 6.1.4). Da die Eliminierungsreaktionen im

Allgemeinen mit hoher Geschwindigkeit ablaufen und geringfügige

pH-Änderungen keinen entscheidenden Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit

ausüben, wurden die Messungen ausschließlich im Phosphat-Puffer (pH 7.4)

durchgeführt. In Abbildung 3.47 (S. 79) ist der zeitliche Verlauf für die AMC-

Freisetzung durch 1,4-Benzyleliminierung von 56 und 57 dargestellt.


- 79 -

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250t /min

I x/I

AM

C

5657

Abb. 3.47: Zeitlicher Verlauf der AMC-Freisetzung aus 56 und 57 bei pH 7.4.

Für die Kinetiken erster Ordnung wurden Halbwertszeiten von t1/2 = 13 min (56)

und t1/2 = 49 min (57) durch Auftragung von ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

∞cc1ln * gegen t und anschließende

lineare Regression ermittelt (siehe Anhang, S. 161). Beide Verbindungen weisen

darüber hinaus deutliche Unterschiede in den von ihnen erreichten AMC-

Endkonzentrationen auf. Während 56 vollständig freisetzte, wurden von 57 nur

etwa 30 % der maximalen Konzentration an AMC erreicht.

Für die Freisetzung von AMC ist daher entscheidend, ob die 1,4-Benzyl-

eliminierung direkt oder nachgelagert auftritt. Die Untersuchung von 57 ergab,

dass ein amino-funktionalisierter Effektor durch eine nachgelagerte

1,4-Eliminierung nur unvollständig abgespalten wird. Damit wurden sowohl die

Beobachtungen von DE GROOT et al.170 als auch die Ergebnisse aus den

Spaltungsstudien von 53 und 54 bestätigt. Darüber hinaus konnten die von

SHABAT et al.144 veröffentlichten Ergebnisse zur Geschwindigkeit der direkten

1,4-Eliminierung, die unter Verwendung eines enzymatisch-spaltbaren Analogon

ermittelt wurde, reproduziert werden. Diese gewonnenen Erkenntnisse zeigen,

dass sich der 2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin-Adapter nur bedingt für die Freisetzung

amino-funktionalisierter Effektoren durch 1,4-Eliminierung eignet. Für die weitere

* c∞ = extrapolierte Endkonzentration (Messungen im 30 minütigen Abstand, bis sich die Konzentration erstmals um weniger als 0.1 % ändert.)


- 80 -

Entwicklung von säurelabilen makromolekularen Prodrugs ist die Verwendung

eines anderen Linkers zu empfehlen, der eine vollständige Freisetzung des

Effektors gewährleistet.

Fazit und Ausblick _________________________________________________________________

- 81 -

4. Fazit und Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit wurden säurelabile Trigger-Gruppen auf Basis von

Schiffschen Basen des PABC-Linkers entwickelt und gezeigt, dass deren

Hydrolyseeigenschaften durch die Verwendung verschiedener Substituenten am

aromatischen Ring des Benzaldehyds maßgeschneidert werden können. Die

dargestellten pH-empfindlichen Imine können vielseitig eingesetzt werden. So

wurde anhand eines PEG-geträgerten Modell-Prodrugs basierend auf einem

2,4-Bis(hydroxybenzyl)anilin-Adapter gezeigt, dass durch saure Hydrolyse der

Trigger-Gruppe ein Effektor freigesetzt werden kann. Weitere denkbare

Anwendungen wären ein Einsatz als pH-Sensoren oder in der Entwicklung von

pH-empfindlichen Materialien, z. B. basierend auf selbsteliminierenden Polymeren,

die säurelabil getriggert werden.26,95

Ein Nachteil des verwendeten chemischen Adapters auf Basis von

2,4-Bis(hydroxybenzyl)anilin ist, dass über die nachgelagerte 1,4-Benzylelimi-

nierung ein amino-funktionalisierter Effektor nur unvollständig freigesetzt wird.

Daher ist dieser Baustein nur bedingt für die Entwicklung makromolekularer

Prodrugs geeignet.

Zukünftige Strategien sollten folgende im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen

Erkenntnisse berücksichtigen:

Für eine effektive und rasche Abspaltung des Effektors sollte ein

alternativer Adapter-Baustein verwendet werden, der den Farb- oder

Wirkstoff über eine 1,6-Benzyleliminierung freisetzt.

Zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit könnte auf den Einbau eines

zusätzlichen Linkers verzichtet werden, indem der Adapter-Baustein direkt

durch Aufbau einer Imin-Bindung getriggert wird.

Um die Spaltungseigenschaften besser vorhersagen zu können, sollten

Aggregatbildungen möglichst verhindert werden. Dies könnte z. B. durch

Einsatz wasserlöslicher Linker geschehen,115 welche die Amphiphilie des

Prodrugs und damit die Ausbildung supramolekularer Strukturen in

wässrigen Systemen herabsetzen können.

Zusammenfassung _________________________________________________________________

- 82 -

5. Zusammenfassung

Im Zuge einer klassischen Chemotherapie zur Behandlung von Krebser-

krankungen treten oftmals gravierende systemische Nebenwirkungen auf, die sich

dosislimitierend auswirken. Das grundlegende Problem hierfür liegt in der

mangelnden Tumorselektivität der klinisch eingesetzten Zytostatika. Das Konzept

des Drug Targeting, eines gezielten Wirkstofftransports, bei dem die Wirkstoffe mit

Trageting-Einheiten wie beispielsweise Antikörper (aktives Targeting) oder

Polymere mit einer Molmasse >30 kDa (passives Targeting) verknüpft werden,

ermöglicht eine Anreicherung von Wirkstoffen in Tumorgewebe. Die pH-abhängige

Freisetzung des Wirkstoffs nach zellulärer Aufnahme ist eine der universellsten

und effektivsten Methoden zur Aktivierung solch makromolekularer Prodrugs. Bei

dieser Strategie wird der nach endosomaler Aufnahme auftretende pH-Sprung von

mehr als zwei Einheiten für die Spaltung von säurelabilen Sollbruchstellen

ausgenutzt. Da dieser Ansatz bislang nahezu ausschließlich für Wirkstoffe mit

einer reaktiven Carbonylgruppe verwirklicht wurde, sollte im Rahmen dieser Arbeit

eine rationale und modulare Strategie zur säurelabilen Aktivierung

makromolekularer Prodrugs von hydroxy- und amino-funktionalisierten Wirkstoffen

entwickelt werden. Dazu wurde das bereits gut untersuchte und effektiv spaltende

PABC-System als selbsteliminierender Linker für die Entwicklung der Prodrugs

ausgewählt. Anhand von strukturverwandten, niedermolekularen AMC-

Modellverbindungen (1b, 4b–14b) konnte gezeigt werden, dass die

Hydrolyseeigenschaften des Triggers durch Einführung verschiedener

Substituenten am aromatischen Ring des Benzaldehyds maßgeschneidert werden

können. Während im neutralen Milieu die 1,6-Benzyleliminierung des Linkers

blockiert wurde, erfolgte im schwach sauren pH-Bereich durch rasche Hydrolyse

der Imin-Bindung und anschließender Eliminierung eine Freisetzung des

Farbstoffs.


- 83 -

O

NR

H NH

O

O O

Me2N

4b MeO

5b H

1b F

6b Cl

7b O

8b

F3C

9b

O2N

10b

ClCl

Cl

11b

FF

12b

F

FF

F

13b

F

FF

F

F

14b

Für die para-substituierten Benzaldehydderivate 1b und 4b–10b wurden durch

Auftragung von 0logkk gegen σp die Substituenteneffekte unter Berücksichtigung

von Linearen Freien Enthalpie-Beziehungen näher untersucht. Für pH 5.0 wurde

die Hammett-Gleichung in guter Näherung erfüllt und ein moderater Einfluss der

Substituenten festgestellt. Bei pH 7.4 war der Substituenteneinfluss zwar

ausgeprägter, eine deutliche LFER-Beziehung jedoch nicht erkennbar.

Erwartungsgemäß ließ sich die Stabilität durch das Einfügen zusätzlicher

elektronenziehender Substituenten erhöhen. Besonders gute Eigenschaften bei

pH 5.0 und 7.4 wiesen die auf Tetrafluor- (13b) bzw. Pentafluorbenzaldehyd (14b)

basierenden Imine auf, deren Freisetzungskinetiken zusätzlich zwischen pH 4.5

und 7.4 genauer untersucht wurden. Dabei ergab sich, dass für beide

Verbindungen im physiologisch relevanten pH-Bereich ein linearer

Zusammenhang zwischen pH und log kobs bestand. Diese lineare Beziehung ist für

eine Reaktion mit spezifischer Säurekatalyse zu erwarten.

Im Plasma wurden die Imin-Bindungen der Modellverbindungen 1b, 10b, 13b und

14b überraschend schnell gespalten (t1/2 < 140 min). In weiteren Untersuchungen

konnte gezeigt werden, dass diese Instabilität hauptsächlich durch eine

katalytische Aktivität von HSA

hervorgerufen wird.

Im Folgenden sollten auf Basis der

meistversprechenden Trigger-Gruppen

makromolekulare Modellverbindungen und

NH

HN

O

O

O

O

O

X

Träger

N

H

R

Effektor

X = O, NH


- 84 -

Prodrugs synthetisiert werden. Dazu wurden zunächst mit einem chemischen

Adapter-Baustein auf Basis von 3-Amido-4-hydroxymethylanilin ausgehend von

käuflichem 6-Nitrophthalid niedermolekulare AMC-Modellverbindungen (28, 29) in

einer elfstufigen Synthese in Anlehnung an die von BAKHEET ELSADEK162

entwickelte Route dargestellt. Außerdem konnten über eine alternative achtstufige

Syntheseroute analoge Prodrugs der Zytostatika Doxorubicin und Paclitaxel (38–

41) erhalten werden.

Im letzten Syntheseschritt sollten die niedermolekularen Vorstufen schließlich über

eine Alkin-Ankergruppe mittels „Click-Chemie“ (CuAAC) an PEG gebunden

werden, was an der Instabilität der gebildeten Produkte scheiterte.

NH

HN

O

O

O

O

OTrigger

Effektor

NH

N3

O

O

O

O

O

Effektor

NH

HN

ONH

O

O

O

O

Effektor

ON

O

O

OH

N

HFF

R'F

F R' = H, FΔ

NH

HN

O

O

O

O

O

Effektor

Trigger NNN

PEG

2instabil

H2NO

NH2

NH

NHO

O O

Effektor

ONH

HN

O

O

O

O

O

Effektor

n

n

O

O

instabil

NH

HN

ONH

O

O

OTrigger

O

Effektor

ON

O

O

N3O

N3n

Da es ebenso nicht möglich war, stabile Produkte durch Umsetzung einer

niedermolekularen Vorstufe mit PEG-Diamin sowie durch Reaktion des Triggers

mit einer HSA-bindenden Vorstufe zu erhalten, scheint die Struktur des Adapter-

Bausteins ausschlaggebend für die Unbeständigkeit der Verbindungen zu sein.

Als alternativen Adapter-Baustein wurde ein 2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin-Linker

verwendet, an den das Polymer über

eine benzylische Carbamat-Bindung

gekuppelt werden kann. Unter

Verwendung eines bereits vorhanden-

den Bausteins166 gelang es in einer

jeweils vierstufigen Synthese, die

säurelabilen PEG-Konjugate (53, 54) darzustellen. Mittels NMR-Spektroskopie

NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

NH

O O OR

O

NH

HNO

OO

On

R = H: 53R = F: 54


- 85 -

wurden die Zielverbindungen eindeutig charakterisiert und deren Beladung

ermittelt. Die sich anschließenden Spaltungs- und Stabilitätsstudien zeigten

allerdings, dass die makromolekularen Verbindungen in Pufferlösungen AMC

deutlich schneller freisetzen als ihre niedermolekularen Analoga. Im Gegensatz

dazu konnte die Plasmastabilität durch die makromolekulare Formulierung erhöht

werden. Überraschenderweise verlief die Freisetzung des Farbstoffs aus 53 und

54 in den Pufferlösungen unvollständig. Um zu klären, ob die unvollständige

Spaltung auf die PEG-Trägerung zurückzuführen ist oder ob diese generell bei

Mehrfacheliminierungen aus 2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin auftritt, wurden

niedermolekulare AMC-Modellverbindungen mit sowohl einfachem (56) als auch

mit verzweigtem (57) PABC-analogen System synthetisiert und hinsichtlich ihrer

Spaltungseigenschaften miteinander verglichen. Während anhand von Verbindung

56 die Kinetik der einfachen 1,4-Benzyleliminierung bestimmt wurde, ermöglichte

57 eine Untersuchung der Spaltungseigenschaften einer 1,4-Benzyleliminierung,

die einer 1,6-Benzyleliminierung sowie der Regeneration des PABC-Systems

nachgelagert ist.

56

+H3N

O NH

O

O O

CF3COO-

57

+H3N

O

O

NH

O NH

O

O O

CF3COO-

Spaltungsstudien ergaben, dass der verzweigte PABC-analoge Linker 57 in

Pufferlösung (pH 7.4) AMC ebenfalls nur unvollständig freisetzt, wogegen 56 den

Farbstoff vollständig eliminiert. Adapter-Systeme auf Basis von

2,4-Bis(hydroxymethyl)anilin sind daher für eine Prodrug-Entwicklung nur bedingt

geeignet.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuartiges Konzept vorgestellt, das Imine des

bekannten selbsteliminierenden PABC-Linkers als säurelabile Trigger-Gruppen

nutzt, die in der Lage sind, Kaskadenreaktionen zu initiieren und sich daher

modular und vielseitig verwenden lassen. Durch Strukturvariationen der Aldehyd-

Komponente ließen sich die säurelabilen Eigenschaften gezielt beeinflussen. Die


- 86 -

Versuche, makromolekulare Prodrugs auf Basis der entwickelten Trigger-Gruppen

aufzubauen, waren hingegen durch vielfältige Probleme geprägt, die aus der

Verwendung eines zentralen Adapter-Bausteins als Bindeglied von Trigger,

makromolekularem Träger und Wirkstoff resultierten. Aus den Untersuchungen

zweier verschiedener Adapter-Systeme konnten schließlich wertvolle Erkenntnisse

gewonnen werden, die zum Gelingen zukünftiger Prodrug-Strategien beitragen

können.

Experimenteller Teil _________________________________________________________________

- 87 -

6. Experimenteller Teil

6.1 Materialien und Methoden

6.1.1 Verwendete Reagenzien

Die für die Synthesen verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel wurden von

den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich und Fluka (Seelze) sowie Roth

(Karlsruhe) in handelsüblicher Qualität bezogen. AMC wurde von Echinachem

(China) und Doxorubicin-Hydrochlorid sowie Paclitaxel von Yick-Vic (China)

geliefert. 2,3,5,6-Tetrafluorbenzaldehyd und Chlortrimethylsilan wurden vor ihrer

Verwendung frisch destilliert; alle weiteren Reagenzien wurden ohne zusätzliche

Aufreinigung eingesetzt. Für die Herstellung der verschiedenen Lösungen und

Puffer wurde destilliertes Wasser verwendet. Als Trockenmittel für die organischen

Phasen diente wasserfreies Natriumsulfat von Roth (Karlsruhe).

Das Anfärben von DC-Platten erfolgte durch Eintauchen in eine

Anisaldehydlösung (2.14 mL Anisaldehyd, 100 mL EtOH, 1 mL konz.

Schwefelsäure) und anschließendem Entwickeln im heißen Luftstrom einer

Heißluftpistole.

6.1.2 Verwendete Geräte und Materialien

Schmelzpunktbestimmung Die Schmelzpunkte wurden mit dem Digital Melting Point Apparatus (Barnstead

international/Electrothermal, IA9000 series) bestimmt und sind unkorrigiert.

pH-Messungen Das Einstellen des pH-Wertes von Pufferlösungen erfolgte unter Verwendung

eines Microprocessor pH/ION Meter pMX 3000 von den Wissenschaftlich-

Technischen Werkstätten.


- 88 -

Elementaranalysen Die Elementaranalysen wurden mit einem VarioEL der Firma Elementaranalysen-

systeme GmbH am Institut für Organische Chemie und Biochemie der Universität

Freiburg aufgenommen. Bei fluorierten und nichtkristallinen Verbindungen wurde

auf die Durchführung einer Elementaranalyse verzichtet und die Reinheit mittels

NMR-Spektroskopie ermittelt.

Massenspektrometrie (MS) Die EI- und CI-Massenspektren wurden mit einem TSQ700 MS instrument

(Thermoelectron) und die ESI-Massenspektren mit einem LCQ-Advantage MS

instrument (Thermoelectron) am Institut für Organische Chemie und Biochemie

der Universität Freiburg aufgenommen.

Am Institut für Organische Chemie und Biochemie der Freien Universität Berlin

diente ein Agilent 6210 ESI-TOF (Agilent Technologies) zur Aufnahme der HRMS-

Massenspektren.

Kernresonanzspektrometrie (NMR) Für die Aufnahme der 1H- und 13C-NMR-Spektren wurden ein 400 MHz Avance

DRX Spectrometer (Bruker) bzw. ein 300 MHz Varian Unity 300 Spectrometer

verwendet. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur in den deuterierten

Lösungsmitteln DMSO-d6, THF-d8 und D2O. Die chemischen Verschiebungen (δ)

der Signale bzw. derer Schwerpunkte sind in ppm zum internen Standard

Tetramethylsilan (TMS, δ = 0 ppm) und die Kopplungskonstanten (J) in Hz

angegeben. Für die Multiziplitäten werden folgende Abkürzungen verwendet:

(breites) Singulett ((br) s), Dublett (d), Triplett (t), Quartett (q), Multiplett (m). Die 13C-NMR-Spektren wurden protonenbreitbandentkoppelt aufgenommen.

Durchgeführt wurden die Messungen am Institut für Pharmazie der Universität

Freiburg.

Fluoreszenzmessungen Zur Messung von Fluoreszenzintensitäten wurde ein POLARstar OPTIMA der

BMG LABTECH GmbH mit der Software FLUOstar OPTIMA verwendet. Die 96-

Well-Platten Fluotrac 200 (schwarz) wurden von Greiner Microlon geliefert. Die


- 89 -

Messungen wurden im Arbeitskreis von Prof. Dr. M. Jung am Institut für

Pharmazeutische Wissenschaften der Universität Freiburg durchgeführt.

6.1.3 Chromatographie

Dünnschichtchromatographie (DC) Die Reaktionskontrollen erfolgten mittels Dünnschichtchromatographie auf

Fertigplatten von Merck (Darmstadt) mit Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumfolie bzw.

auf HPTLC-Platten DIOL F254s. Für die Detektion der einzelnen Substanzen auf

den Platten wurden eine UV-Lampe (254 nm, 366 nm) von Benda (Wiesloch) bzw.

Anisaldehyd-Entwicklerlösung verwendet.

Säulenchromatographie Zur säulenchromatographischen Trennung wurde, wenn in der entsprechenden

Vorschrift nicht anders vermerkt, als Säulenmaterial Kieselgel 60 (Korngröße:

0.040–0.063 mm) der Firma Roth (Karlsruhe) eingesetzt. Die Chromatographie

erfolgte unter Verwendung von Druckluft. Die als Eluens dienenden

Lösungsmittelgemische sind den Synthesevorschriften der einzelnen

Verbindungen zu entnehmen.

6.1.4 Fluorometrische Bestimmung der Halbwertszeiten der AMC-Modellverbindungen in Puffer-, Plasma- und Albuminlösungen Messbedingungen:

200 μL Lösung pro Well

Wellenlängen: λex = 390 nm, λem = 460 nm

Messtemperatur: 37 °C

Medien: Acetat-Puffer (40 mM, pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5):

1.64 g CH3COONa, 1.14 mL konz. CH3COOH, 1 L H2O


- 90 -

Phosphat-Puffer (40 mM, pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.4):

3.12 g NaH2PO4 · 2 H2O, 3.56 g Na2HPO4 · 2 H2O, 1 L H2O

Acetat-Puffer (20 mM, pH 5.0):

820 mg CH3COONa, 572 μL konz. CH3COOH, 1 L H2O

Phosphat-Puffer (20 mM, pH 7.4):

1.56 g NaH2PO4 · 2 H2O, 1.78 g Na2HPO4 · 2 H2O, 1 L H2O

Die Einstellung der pH-Werte erfolgte durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M

Natronlauge.

Plasma:

Das durch Blutentnahme und anschließender Zentrifugation gewonnene Plasma

wurde in der Regel ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt. Lediglich die

Verbindungen 1b, 10b, 13b und 14b wurden zusätzlich in Plasmalösungen

untersucht, denen zuvor durch Ultrazentrifugalfiltration alle Bestandteile > 10 kDa

entfernt wurden (s. Kap.3.1.4). Zur Bereitung dieser Lösungen wurden Centriprep®

Zentrifugen-Filtereinheiten (Ultragel YM-10) der Millipore corporation (USA)

verwendet.

Albumin:

Die verwendete Albuminlösung (HSA, ~750 μM) enthielt 5 % Octalbin und wurde

von OCTAPHARMA GmbH (Langenfeld) bezogen.

Probenbereitung:

Endkonzentration: 10 μM in Puffer-, Plasma- oder Albumin-Lösungen mit 5 %

DMSO

Stammlösungen: 1 mM in DMSO; vor den Messungen frisch hergestellt

Verdünnung auf 200 μM: 200 μL der 1 mM Stammlösung mit 800 μL DMSO

versetzen


- 91 -

Auftragung auf die Platte: in jedes Well 10 μL der 200 μM Lösung einfüllen und

direkt vor der Messung 190 μL Puffer zugeben (jede Verbindung wurde sechsmal

gemessen)

Vergleichslösungen: Auf jeder Platte wurden folgende Vergleichslösungen vierfach mitgemessen:

10 μM AMC-Lösung (Puffer-, Plasma- oder Albumin-Lösungen mit 5 % DMSO)

15 μM AMC-Lösung (Puffer-, Plasma- oder Albumin-Lösungen mit 5 % DMSO)

Stammlösung: 1 mM in DMSO

Verdünnungen:

100 μM: 100 μL der 1 mM Stammlösung mit 900 μL des für die Messung

relevanten Mediums;

10 μM: 100 μL der 100 μM Lösung mit 40 μL DMSO und 860 μL Medium;

15 μM: 150 μL der 100 μM Lösung mit 35 μL DMSO und 815 μL Medium;

Auftragung auf die Platte: 200 μL pro Well.

6.2 Chemische Synthesen

Alle Synthesen in organischen Medien wurden in wasserfreien Lösungsmitteln

unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Die anschließende

Aufarbeitung erfolgte ohne Schutzatmosphäre. Die Lösungsmittel wurden

üblicherweise in einem Wasserbad bei 40 °C am Rotationsverdampfer entfernt.

6.2.1 Synthese der niedermolekularen AMC-Modellverbindungen 1b und 4b–14b

Allgemeine Synthesevorschrift zur Darstellung der 4-(Benzylidenamino)benzylalkohole 1a und 4a–14a Eine Suspension von 200 mg (1.62 mmol) 4-Aminobenzylalkohol in 20 mL Benzol

wird unter Rühren mit einem Benzaldehydderivat (4.86 mmol) versetzt. Zum

Reaktionsgemisch werden 5 μL konz. Essigsäure als Katalysator zugegeben. Der


- 92 -

Ansatz wird 3 h am Wasserabscheider erhitzt. Nach Entfernen des Lösungsmittels

unter vermindertem Druck wird das Produkt bei – 20 °C aus einem Gemisch aus

Ethylacetat und n-Hexan kristallisiert. Die Charakterisierung der Produkte wird für

jede Verbindung im Folgenden beschrieben:

4-(Benzylidenamino)benzylalkohol (1a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 1a in einer

Ausbeute von 252 mg (77 % d. Theorie) erhalten.

OHN

H

Smp.: 62–63 °C

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 4.51 (d, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 5.20 (t,

J = 5.6 Hz, 1H, OH), 7.23–7.25 (m, 2H, Ar-H), 7.35–7.37 (m, 2H, Ar-H), 7.52–7.53

(m, 3H, Ar-H), 7.93–7.94 (m, 2H, Ar-H), 8.63 (s, 1H, C(N)H).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 62.5 (CH2), 120.7, 127.2, 128.5, 128.7,

131.3, 136.0, 140.4, 149.8, 160.0 (Ar-C, C(N)H).

APCI-MS (5 μA, MeOH): m/z (%) = 212 (100) [M + H]+.

Elementaranalyse: C14H13NO [211.26]

berechnet: C: 79.59 % H: 6.20 % N: 6.63 %

gefunden: C: 79.35 % H: 6.29 % N: 6.55 %

4-(4-Dimethylaminobenzylidenamino)benzylalkohol (4a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 4a in einer


OHN

HN


- 93 -

Smp.: 144–146 °C

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.00 (s, 6H, CH3), 4.49 (d, J = 5.6 Hz, 2H,

CH2), 5.16 (t, J = 5.6 Hz, 1H, OH), 6.76–6.79 (m, 2H, Ar-H), 7.14–7.16 (m, 2H, Ar-

H), 7.30–7.32 (m, 2H, Ar-H), 7.72–7.75 (m, 2H, Ar-H), 8.40 (s, 1H, C(N)H).


130.1, 139.2, 150.8, 152.2, 159.4 (Ar-C, C(N)H).

Das 13C-Signal der Methylgruppen am Stickstoffatom (N(CH3)2) wird vom

Lösungsmittelsignal (DMSO-d6: δ = 39.4 ppm) überlagert.

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 255 (100) [M + H]+.

Elementaranalyse: C16H18N2O [254.33]

berechnet: C: 75.56 % H: 7.13 % N: 11.01 %

gefunden: C: 75.29 % H: 7.46 % N: 10.96 %

4-(4-Methoxybenzylidenamino)benzylalkohol (5a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 5a in einer


OHN

HO

Smp.: 114–115 °C



H), 7.32–7.35 (m, 2H, Ar-H), 7.86–7.90 (m, 2H, Ar-H), 8.54 (s, 1H, C(N)H).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 55.3 (CH3), 62.5 (CH2), 114.2, 120.6, 127.3,

129.0, 130.3, 139.9, 150.2, 159.2, 161.7 (Ar-C, C(N)H).


- 94 -


Elementaranalyse: C15H15NO2 [241.29]

berechnet: C: 74.67 % H: 6.27 % N: 5.80 %

gefunden: C: 74.43 % H: 6.33 % N: 5.68 %

4-(4-Fluorbenzylidenamino)benzylalkohol (6a) Nach dem Trocknen des hellbeigen Feststoffs im Hochvakuum wird 6a in einer


OHN

HF

C14H12FNO

Smp.: 88–89 °C



(m, 2H, Ar-H), 8.63 (s, 1H, C(N)H).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 62.5 (CH2), 115.8 (d, J = 21.8 Hz, FCCH),

120.7, 127.2 (Ar-C), 130.8 (d, J = 8.8 Hz, FCCHCH), 132.7 (d, J = 2.9 Hz,

FCCHCHC), 140.4, 149.7, 158.7 (Ar-C, C(N)H), 163.8 (d, J = 249.2 Hz, FC).


4-(4-Chlorbenzylidenamino)benzylalkohol (7a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 7a in einer


OHN

HCl


- 95 -

Smp.: 142–143 °C





134.9, 135.9, 140.7, 149.5, 158.8 (Ar-C, C(N)H).

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 246 (100) [M + H]+.*

Elementaranalyse: C14H12ClNO [245.70]

berechnet: C: 68.44 % H: 4.92 % N: 5.70 %

gefunden: C: 68.19 % H: 4.94 % N: 5.74 %

4-(4-Acetylbenzylidenamino)benzylalkohol (8a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 8a in einer


OHN

H

O

Smp.: 142–144 °C



H), 8.74 (s, 1H, C(N)H).


129.1, 138.9, 140.3, 141.5, 149.9, 159.5 (Ar-C, C(N)H), 198.1 (C(O)CH3).

ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 254 (100) [M + H]+. * Neben dem angegebenen Basispeak wiesen die Spektren der chlorhaltigen Verbindungen 7a, 7b, 11a und 11b charakteristische Isotopensignale auf.


- 96 -


berechnet: C: 75.87 % H: 5.97 % N: 5.53 %

gefunden: C: 74.28 % H: 5.86 % N: 5.23 %

4-(4-Trifluormethylbenzylidenamino)benzylalkohol (9a) Nach dem Trocknen des hellgelben Feststoffs im Hochvakuum wird 9a in einer


OHN

HF3C

C15H12F3NO

Smp.: 124–126 °C




13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 62.5 (CH2), 120.9 (Ar-C), 124.0 (q,

J = 272.3 Hz, CF3), 125.6 (q, J = 3.7 Hz, CHCCF3), 127.3, 129.1 (Ar-C), 130.8 (q,

J = 31.7 Hz, CCF3), 139.6, 141.1, 149.2, 158.7 (Ar-C, C(N)H).

ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 280 (100) [M + H]+.

4-(4-Nitrobenzylidenamino)benzylalkohol (10a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 10a in einer


OHN

HO2N

Smp.: 154–155 °C


- 97 -



(m, 2H, Ar-H), 8.82 (s, 1H, C(N)H).


141.5, 141.6, 148.7, 149.0, 158.1 (Ar-C, C(N)H).


Elementaranalyse: C14H12N2O3 [256.26]

berechnet: C: 65.62 % H: 4.72 % N: 10.93 %

gefunden: C: 65.25 % H: 4.77 % N: 10.89 %

4-(2,3,6-Trichlorbenzylidenamino)benzylalkohol (11a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 11a in einer


OHN

HClCl

Cl

Smp.: 84–87 °C





131.7, 131.9, 132.2, 134.5, 141.5, 148.9, 156.0 (Ar-C, C(N)H).

CI-MS (130 eV, 300 μA, NH3): m/z (%) = 314 (100) [M + H]+.


- 98 -

Elementaranalyse: C14H10Cl3NO [314.59]

berechnet: C: 53.45 % H: 3.20 % N: 4.45 %

gefunden: C: 53.35 % H: 3.22 % N: 4.43 %

4-(3,4-Difluorbenzylidenamino)benzylalkohol (12a) Nach dem Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 12a in einer


OHN

HF

F

C14H11F2NO

Smp.: 86–87 °C



(m, 1H, Ar-H), 7.77–7.80 (m, 1H, Ar-H), 7.92–7.99 (m, 1H, Ar-H), 8.63 (s, 1H,

C(N)H).

13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6): δ = 62.5 (CH2), 116.4 (d, J = 17.7 Hz, FCCH),

118.0 (d, J = 16.9 Hz, FCCH), 120.8 (Ar-C), 126.0 (m, Ar-C), 127.3 (Ar-C), 133.8

(m, Ar-C), 140.8 (Ar-C), 148.9 (dd, J = 111.5 Hz, J = 13.1 Hz, FC), 149.2 (Ar-C),

152.1 (dd, J = 115.7 Hz, J = 13.1, FC), 157.8 (m, C(N)H).


4-(2,3,5,6-Tetrafluorbenzylidenamino)benzylalkohol (13a) Nach dem Trocknen des hellbeigen Feststoffs im Hochvakuum wird 13a in einer


OHN

HF F

F F


- 99 -

C14H9F4NO

Smp.: 164–165 °C



(m, 1H, Ar-H), 8.69 (s, 1H, C(N)H).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 62.4 (CH2), 108.8 (dd, J1 = J2 = 19.6 Hz, Ar-

C), 115.8 (dd, J1 = J2 = 11.1 Hz, Ar-C), 120.8, 127.4, 141.9 (Ar-C), 144.0 (m, CF),

146.4 (m, CF), 149.3, 149.4 (Ar-C, C(N)H).


4-(Pentafluorbenzylidenamino)benzylalkohol (14a) Nach dem Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 14a in einer


OHN

HF F

F F

F

C14H8F5NO

Smp.: 135–136 °C


J = 5.7 Hz, 1H, OH), 7.28–7.30 (m, 2H, Ar-H), 7.38–7.40 (m, 2H, Ar-H), 8.65 (s,

1H, C(N)H).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 62.4 (CH2), 111.1 (ddd, J1 = 11.3 Hz,

J2 = 7.1 Hz, J3 = 3.9 Hz, Ar-C), 120.8, 127.3 (Ar-C), 137.3 (m, CF), 141.7 (m, CF),

141.8 (Ar-C), 145.5 (m, CF), 148.5, 149.2 (Ar-C, C(N)H).



- 100 -

Phenyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (2) Zu einer Suspension von 1.50 g (8.56 mmol) AMC in 18 mL DCM werden 3.22 mL

(18.8 mmol) DIEA und 2.40 mL (18.8 mmol) Chlortrimethylsilan gegeben. Das

Reaktionsgemisch wird für 3 h unter Reflux erhitzt und direkt im Anschluss im

Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Innerhalb von 5 min werden 2.15 mL (17.1 mmol)

Chlorameisensäurephenylester zugetropft und die Mischung weitere 16 h bei RT

gerührt. Nach beendeter Reaktion wird die Reaktionslösung mit 600 mL DCM

versetzt und zweimal mit 400 mL Wasser und einmal mit 400 mL ges.

Natriumchloridlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden mit

900 mL DCM extrahiert und die organische Phase anschließend erneut einmal mit

900 mL ges. Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird das Produkt

aus 1 L Ethylacetat kristallisiert. Nach dem Trocknen des farblosen Feststoffs im

Hochvakuum wird 2 in einer Ausbeute von 1.83 g (72 % d. Theorie) erhalten.

O ONH

O

O

Smp: 139 °C (unter Zersetzung)

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.39 (s, 3H, CH3), 6.26 (s, 1H, CH3CCH),

7.26–7.31 (m, 3H, Ar-H), 7.43–7.48 (m, 3H, Ar-H), 7.55–7.56 (m, 1H, Ar-H), 7.72–

7.74 (m, 1H, Ar-H), 10.73 (s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3), 104.7, 112.1, 114.4, 114.7

(CH3CCH, Ar-C), 121.9, 125.6, 126.1, 129.4, 142.1, 150.2, 151.5, 153.0, 153.7,

159.9 (C(O)NH, CH3C, Ar-C, C(O)CH).



berechnet: C: 69.15 % H: 4.44 % N: 4.74 %

gefunden: C: 68.97 % H: 4.40 % N: 4.64 %


- 101 -

7-Isocyanato-4-methylcumarin (3) 1 g (3.39 mmol) 2 werden in einer Sublime im Vakuum (2 × 10-3 bis 5 × 10-2 mbar)

für vier Tage auf 150 °C erhitzt. Das Produkt wird als farbloser Feststoff in einer

Ausbeute von 382 mg (56 % d. Theorie) erhalten und direkt mit den Schiffschen

Basen 1a und 4a–14a umgesetzt.

O ONC

O

Allgemeine Synthesevorschrift zur Darstellung der 4-(Benzyliden-amino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamate 1b und 4b–14b

Zu einer Lösung von 100 mg (497 μmol) 3 in 8 mL THF werden 20 mg

Molekularsieb 4 Å und 4-(Benzylidenamino)benzylalkohol (497 μmol) gegeben.

Nach Hinzufügen von 24.9 μL (2.49 μmol) einer 100 mM Lösung von DBTL in

Toluol wird das Reaktionsgemisch 0.5 h bei RT gerührt. Der dabei entstandene

Feststoff wird vorsichtig ohne Molekularsieb abfiltriert und mit 15 mL n-Hexan

gewaschen. Die weitere Aufreinigung und Charakterisierung der Produkte wird für

jede Verbindung im Folgenden beschrieben:

4-(Benzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (1b) Der Feststoff wird in ca. 40 mL DCM gelöst. Die resultierende Lösung wird unter

vermindertem Druck auf ein Volumen von ca. 4 mL eingeengt und auf – 20 °C

abgekühlt, wobei das Produkt erneut als farbloser Feststoff ausfällt. Nach der

Isolierung durch Filtration und anschließender Trocknung im Hochvakuum wird 1b

in einer Ausbeute von 135 mg (66 % d. Theorie) erhalten.

N

OH NH

O

O O

C25H20N2O4

Smp.: 231 °C (unter Zersetzung)


- 102 -

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.39 (s, 3H, CH3), 5.22 (s, 2H, CH2), 6.22 (s,

1H, CH3CCH), 7.28–7.30 (m, 2H, Ar-H), 7.43–7.56 (m, 7H, Ar-H), 7.68–7.70 (m,

1H, Ar-H), 7.93–7.95 (m, 2H, Ar-H), 8.63 (s, 1H, C(N)H), 10.18 (br s, 1H, NH).


114.2 (CH3CCH, Ar-C), 120.7, 125.6, 128.4, 128.5, 129.0, 131.2, 133.6, 135.7,

142.4, 151.1 (Ar-C), 152.7, 152.9, 153.6, 159.6, 160.6 (C(O)NH, CH3C, Ar-C,

C(N)H, C(O)CH).


4-(4-Dimethylaminobenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (4b) Nach Trocknung des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 4b in einer Ausbeute

von 197 mg (87 % d. Theorie) erhalten.

N

OH NH

O

O O

N

C27H25N3O4


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.39 (s, 3H, CH3C), 3.01 (s, 6H, N(CH3)2),

5.19 (s, 2H, CH2), 6.24 (s, 1H, CH3CCH), 6.77–6.79 (m, 2H, Ar-H), 7.20–7.22 (m,

2H, Ar-H), 7.41–7.46 (m, 3H, Ar-H), 7.56 (s, 1H, Ar-H), 7.69–7.75 (m, 3H, Ar-H),

8.41 (s, 1H, C(N)H), 10.29 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3C), 66.1 (CH2), 104.3, 111.4,

111.8, 114.2, 114.3 (CH3CCH, Ar-C), 120.9, 123.6, 126.0, 129.4, 130.3, 132.5,

142.7 (Ar-C), 152.27, 152.34, 153.1, 153.2, 153.8, 160.0, 160.2 (Ar-C, C(O)NH,

CH3C, C(N)H, C(O)CH).


- 103 -

Das 13C-Signal der Methylgruppen am Stickstoffatom (N(CH3)2) wird vom

Lösungsmittelsignal (DMSO-d6: δ = 39.4 ppm) überlagert.


4-(4-Methoxybenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (5b) Nach Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 5b in einer


N

OH NH

O

O O

O

C26H22N2O5


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.38 (s, 3H, CH3C), 3.83 (s, 3H, CH3O), 5.20

(s, 2H, CH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 7.06–7.08 (m, 2H, Ar-H), 7.25–7.27 (m, 2H,

Ar-H), 7.41–7.49 (m, 3H, Ar-H), 7.56 (s, 1H, Ar-H), 7.68–7.70 (m, 1H, Ar-H), 7.87–

7.89 (m, 2H, Ar-H), 8.53 (s, 1H, C(N)H), 10.29 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3C), 55.3 (CH3O), 66.0 (CH2),

104.3, 111.8, 114.1, 114.2, 114.3 (CH3CCH, Ar-C), 120.9, 126.0, 128.8, 129.4,

130.4, 133.2, 142.6, 151.7, 153.10, 153.12, 153.8, 160.0, 160.1, 161.9 (C(O)NH,

CH3C, Ar-C, C(N)H, C(O)CH).


4-(4-Fluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (6b) Nach Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 6b in einer



- 104 -

N

OH NH

O

O O

F

C25H19FN2O4




2H, Ar-H), 7.56–7.57 (m, 1H, Ar-H), 7.68–7.70 (m, 1H, Ar-H), 7.99–8.02 (m, 2H,

Ar-H), 8.63 (s, 1H, C(N)H), 10.30 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 115.8 (m, Ar-C), 121.0, 126.0, 129.4 (Ar-C), 131.0 (m, Ar-

C), 132.5 (m, Ar-C), 133.8, 142.6, 151.1, 153.0, 153.1, 153.7, 159.7, 159.9 (Ar-C,

C(O)NH, CH3C, C(N)H, C(O)CH), 164.0 (m, CF).

APCI-MS (5 μA, MeCN): m/z (%) = 431 (100) [M + H]+.

4-(4-Chlorbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (7b) Nach Trocknung des hellgelben Feststoffs im Hochvakuum wird 7b in einer


N

OH NH

O

O O

Cl

C25H19ClN2O4



- 105 -




Ar-H), 8.65 (s, 1H, C(N)H), 10.30 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 121.1, 126.0, 128.9, 129.4, 130.2, 134.0, 134.7, 136.0,

142.6, 150.9, 153.1, 153.2, 153.7, 159.7, 159.9 (Ar-C, C(O)NH, CH3C, C(N)H,

C(O)CH).


4-(4-Acetylbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (8b) Nach Lösen des Feststoffs in 12 mL DCM werden 15 mL n-Hexan zugegeben und

das Gemisch auf – 20 °C abgekühlt. Das Produkt wird im Anschluss erneut

abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. 8b wird als gelber Feststoff in einer


N

OH NH

O

O O

O

C27H22N2O5


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.38 (s, 3H, CH3CCH), 2.63 (s, 3H,

C(O)CH3), 5.22 (s, 2H, CH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 7.34–7.43 (m, 3H, Ar-H),

7.51–7.56 (m, 3H, Ar-H), 7.68–7.70 (m, 1H, Ar-H), 8.07–8.08 (m, 4H, Ar-H), 8.74

(s, 1H, C(N)H), 10.31 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3CCH), 26.9 (C(O)CH3), 65.9

(CH2), 104.3, 111.8, 114.2, 114.3 (CH3CCH, Ar-C), 121.2, 126.0, 128.6, 128.8,


- 106 -

129.4, 134.3, 138.5, 139.6, 142.6, 150.8, 153.1, 153.2, 153.8, 159.9, 160.1 (Ar-C,

CH3C, C(O)NH, C(N)H, C(O)CH), 197.6 (C(O)CH3).


4-(4-Trifluormethylbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (9b) Die Reaktionslösung wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von ca.

3 mL eingeengt. Der dabei entstandene, gelbe Feststoff wird anschließend

abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. 9b wird in einer Ausbeute von 203 mg

(85 % d. Theorie) erhalten.

N

OH NH

O

O O

F3C

C26H19F3N2O4





Ar-H), 8.76 (s, 1H, C(N)H), 10.30 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 121.2 (Ar-C), 123.9 (q, J = 272.5 Hz, CF3), 125.7 (q,

J = 3.7 Hz, CHCHCF3), 125.9, 129.2, 129.4, (Ar-C), 131.0 (q, J = 31.7 Hz,

CHCF3), 134.4, 139.4, 142.6, 150.6, 153.08, 153.09, 153.8, 159.7, 159.9 (Ar-C,

C(O)NH, CH3C, C(O)CH, C(N)H).

ESI-MS (5 kV, DCM): m/z (%) = 481 (100) [M + H]+.


- 107 -

4-(4-Nitrobenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (10b) Nach Trocknung des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 10b in einer


N

OH NH

O

O O

O2N

C25H19N3O6




1H, Ar-H), 8.18–8.21 (m, 2H, Ar-H), 8.36–8.38 (m, 2H, Ar-H), 8.83 (s, 1H, C(N)H),

10.31 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 121.3, 124.0, 126.0, 129.4, 129.6, 134.7, 141.3, 142.6,

148.8, 150.4, 153.1, 153.2, 153.7, 159.2, 159.9 (Ar-C, C(O)NH, CH3C, C(N)H,

C(O)CH).


4-(2,3,6-Trichlorbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (11b) Nach beendeter Reaktion wird das Molekularsieb abfiltriert und das Lösungsmittel

unter vermindertem Druck entfernt. Zum Rückstand werden 15 mL Et2O gegeben

und die Lösung auf – 20 °C abgekühlt. Der dabei entstandene hellgelbe Feststoff

wird abfiltriert und anschließend mit 5 mL Et2O gewaschen. Nach Trocknung im

Hochvakuum wird 11b in einer Ausbeute von 163 mg (63 % d. Theorie) erhalten.


- 108 -

N

OH NH

O

O OClCl

Cl

C25H17Cl3N2O4




3H, Ar-H), 7.63–7.70 (m, 2H, Ar-H), 7.78–7.80 (m, 1H, Ar-H), 8.71 (s, 1H, C(N)H),

10.31 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 120.8, 125.9, 129.3, 129.8, 131.4, 131.85, 131.89, 132.2,

134.3, 134.9, 142.6, 150.2, 153.04, 153.05, 153.7, 157.0, 159.9 (C(O)NH, CH3C,

Ar-C, C(N)H, C(O)CH).


4-(3,4-Difluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (12b) Nach Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 12b in einer


N

OH NH

O

O OF

F

C25H18F2N2O4



- 109 -




Ar-H), 8.63 (s, 1H, C(N)H), 10.30 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 116.5 (d, J = 17.7 Hz, FCCH), 118.0 (d, J = 17.7 Hz,

FCCH), 121.1, 126.0 (Ar-C), 126.2 (m, Ar-C), 129.4 (Ar-C), 133.6 (m, Ar-C), 134.1,

142.6 (Ar-C), 149.3 (m, CF), 150.6 (Ar-C), 151.7 (m, CF), 153.0, 153.1, 153.7,

158.8, 159.9 (C(O)NH, CH3C, Ar-C, C(O)CH, C(N)H).


4-(2,3,5,6-Tetrafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (13b) Nach Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 13b in einer


N

OH NH

O

O OF

F

FF

C25H16F4N2O4




3H, Ar-H), 7.68–7.71 (m, 1H, Ar-H), 8.08–8.13 (m, 1H, CFCH), 8.69 (s, 1H,

C(N)H), 10.32 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3), 65.8 (CH2), 104.4 (Ar-C), 109.0

(dd, J1 = J2 = 23.1 Hz, CFCCF), 111.9, 114.2, 114.4 (CH3CCH, Ar-C), 115.6 (dd,

J1 = J2 = 10.8 Hz, CFCCF), 121.1, 126.0, 129.4, 135.1, 142.6 (Ar-C), 144.0 (m,


- 110 -

CF), 146.4 (m, CF), 150.4, 150.7, 153.10, 153.13, 153.8, 160.0 (Ar-C, C(O)NH,

CH3C, C(N)H, C(O)CH).


HRMS (ESI, 4 kV): C25H16F4N2O4

berechnet: 507.0944 [M + Na]+ 485.1124 [M + H]+

gefunden: 507.0942 [M + Na]+ 485.1124 [M + H]+

4-(Pentafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (14b) Nach Trocknung des gelben Feststoffs im Hochvakuum wird 14b in einer


N

OH NH

O

O OF

F

FFF

C25H15F5N2O4




3H, Ar-H), 7.69–7.71 (m, 1H, Ar-H), 8.66 (s, 1H, C(N)H), 10.32 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3), 65.7 (CH2), 104.3 (Ar-C), 110.9

(m, CFCCF), 111.8, 114.1, 114.3 (CH3CCH, Ar-C), 121.1, 126.0, 129.3, 135.1 (Ar-

C), 137.1 (m, CF), 139.3 (m, CF), 142.6 (Ar-C), 146.1 (m, CF), 149.6, 150.5,

153.06, 153.10, 153.7, 159.9 (Ar-C, C(O)NH, CH3C, C(N)H, C(O)CH).



- 111 -

HRMS (ESI, 4 kV): C25H15F5N2O4

berechnet: 525.0850 [M + Na]+ 503.1030 [M + H]+

gefunden: 525.0841 [M + Na]+ 503.1021 [M + H]+

6.2.2 Synthese der Modellsubstanz 17

tert.-Butyl-N-4-(hydroxymethyl)phenylcarbamat (15) Zu einer Lösung von 1 g (8.12 mmol) 4-Aminobenzylalkohol in 40 mL DCM

werden 2.66 g (12.2 mmol) (Boc)2O gegeben. Nach drei Tagen Rühren bei RT

wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt aus

einem Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat bei – 20 °C kristallisiert. Nach dem

Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 15 in einer Ausbeute von

1.28 g (71 % d. Theorie) erhalten.

NH

OH

O

O

Smp.: 82–83 °C



H), 9.27 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 28.0 (CH3), 62.5 (CH2), 78.7 (C(CH3)3),

117.7, 126.8, 136.0, 138.0 (Ar-C), 152.7 (C(O)NH).

APCI-MS (5 μA, MeOH): m/z (%) = 222 (100) [M – H]–.


berechnet: C: 64.55 % H: 7.67 % N: 6.27 %

gefunden: C: 64.47 % H: 7.87 % N: 6.24 %


- 112 -

4-(tert.-Butoxycarbonylamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (16)

Zu einer Lösung von 180 mg (896 μmol) 3 in 15 mL THF werden Molekularsieb

4 Å (20 mg), 200 mg (896 μmol) 15 und 45 μL (4.5 μmol) einer 100 mM Lösung

von DBTL in Toluol gegeben. Nach 18 h Rühren bei RT wird das Molekularsieb

abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Kristallisation

aus einem Gemisch von n-Hexan und THF bei – 20 °C und anschließendes

Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum liefert 16 in einer Ausbeute von

239 mg (63 % d. Theorie).

NH

O NH

O

O O

O

O


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 1.47 (s, 9H, OC(CH3)3), 2.37 (s, 3H,

CH3CCH), 5.09 (s, 2H, CH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 7.32–7.34 (m, 2H, Ar-H),

7.39–7.41 (m, 1H, Ar-H), 7.46–7.48 (m, 2H, Ar-H), 7.54 (s, 1H, Ar-H), 7.67–7.69

(m, 1H, Ar-H), 9.42 (br s, 1H, NH), 10.24 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3CCH), 28.0 (OC(CH3)3), 66.1

(CH2), 79.0 (OC(CH3)3), 104.3, 111.8, 114.1, 114.2 (CH3CCH, Ar-C), 117.8, 125.9,

129.1, 129.3, 139.5, 142.6, 152.6, 153.07, 153.1, 153.7, 159.9 (C(O)NH, CH3CCH,

C(O)CH, Ar-C).

APCI-MS (5 μA, MeCN): m/z (%) = 423 (100) [M – H]–.


berechnet: C: 65.08 % H: 5.70 % N: 6.60 %

gefunden: C: 65.18 % H: 5.73 % N: 6.32 %


- 113 -

4-Aminobenzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat-Trifluoracetat (17)

Zu einer Lösung von 50 mg (118 μmol) 16 in 2 mL DCM werden 2 mL TFA

gegeben. Die Reaktionslösung wird 35 min bei RT gerührt und das Produkt

anschließend mit 30 mL Et2O (abs.) gefällt. 17 wird als gelber Feststoff in einer

Ausbeute von 50.8 mg (98 % d. Theorie) erhalten und weist laut DC keine

Verunreinigungen auf.

+H3N

O NH

O

O O

CF3COO-

C20H17F3N2O6

APCI-MS (5 μA, MeCN): m/z (%) = 323 (11) [M – H]–, 113 (100) [CF3COO]–.

6.2.3 Synthese niedermolekularer Vorstufen für die Darstellung von PEG-geträgerten AMC-Modellverbindungen mittels CuAAC

2-(Hydroxymethyl)-5-nitrobenzohydrazid (18) Zu einer Suspension von 50 g (279 mmol) 6-Nitrophthalid in 1.7 L MeOH werden

21.0 g (20.3 mL, 419 mmol) Hydrazin-Hydrat gegeben. Nach 23 h Rühren bei RT

wird der farblose Feststoff abfiltriert. Das Filtrat wird auf ein Volumen von ca.

100 mL eingeengt und auf 4 °C abgekühlt, wobei sich ein farbloser, schaumartiger

Feststoff bildet. Nach erneuter Filtration werden die Feststoffe vereint und im

Hochvakuum getrocknet. 18 wird in einer Ausbeute von 55.5 g (94 % d. Theorie)

erhalten.

O2NHN

ONH2

OH

C8H7N3O4


- 114 -

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 4.60 (br s, 2H, NH2), 4.72 (s, 2H, CH2), 5.57

(br s, 1H, OH), 7.85–7.87 (m, 1H, Ar-H), 8.15–8.16 (m, 1H, Ar-H), 8.31–8.33 (m,

1H, Ar-H), 9.78 (br s, 1H, NH).


145.6, 148.9 (Ar-C), 165.6 (C(O)NH).


1-tert.-Butylcarbonyl-2-(2-(hydroxymethyl)-5-nitrobenzoyl)hydrazin (19) Zu einer Suspension von 55.0 g (260 mmol) 18 in 900 mL Dioxan und 1.8 L tert.-

Butanol werden 113 g (111 mL, 520 mmol) (Boc)2O gegeben. Nach 88 h Rühren

bei RT werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt

wird bei 4 °C aus einem Gemisch aus Ethylacetat und n-Hexan kristallisiert,

abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. 19 wird als farbloser Feststoff in einer

Ausbeute von 78.7 g (97 % d. Theorie) erhalten.

O2NHN

ONH

OH

Boc

Smp.: 123–125 °C



H), 8.35–8.38 (m, 1H, Ar-H), 9.06 (br s, 1H, NH), 10.25 (br s, 1H, NH).


121.8, 124.9, 127.9, 133.0, 145.6, 149.1 (Ar-C), 155.1, 166.1 (C(O)NH).

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 310 (100) [M – H]–.


- 115 -


berechnet: C: 50.16 % H: 5.50 % N: 13.50 %

gefunden: C: 49.95 % H: 5.87 % N: 13.35 %

1-tert.-Butylcarbonyl-2-[2-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-5-nitrobenzoyl]hydrazin (20) Zu einer Lösung von 41.3 g (274 mmol) tert.-Butyldimethylchlorsilan und 25.5 g

(374 mmol) Imidazol in 300 mL DMF werden 77.4 g (249 mmol) 19, gelöst in

450 mL DMF, innerhalb von 20 min zugetropft. Nach 2.5 h Rühren bei RT wird die

Reaktionslösung auf 700 mL Wasser gegeben und das Produkt anschließend

dreimal mit 800 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden

einmal mit 800 mL Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach

Entfernen des Trockenmittels durch Filtration wird das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wird bei 4 °C aus einem Gemisch aus

MeOH und Wasser kristallisiert. Filtration und Trocknung des farblosen Feststoffs

im Hochvakuum liefert 20 in einer Ausbeute von 98.6 g (93 % d. Theorie).

O2NHN

ONH

OTBS

Boc

Smp.: 176–178 °C

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 0.10 (s, 6H, SiCH3), 0.92 (s, 9H, SiC(CH3)3),

1.44 (s, 9H, OC(CH3)3), 4.96 (s, 2H, CH2), 7.87–7.89 (m, 1H, Ar-H), 8.19–8.20 (m,

1H, Ar-H), 8.40–8.43 (m, 1H, Ar-H), 9.07 (br s, 1H, NH), 10.29 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = -5.6, 17.9, 25.7, 27.9 (SiCH3, SiC(CH3)3,

SiC(CH3)3, OC(CH3)3), 61.5 (CH2), 79.5 (OC(CH3)3), 121.7, 125.1, 127.5, 132.7,

145.7, 147.7 (Ar-C), 155.2, 166.0 (C(O)NH).



- 116 -

Elementaranalyse: C19H31N3O6Si [425.55]

berechnet: C: 53.63 % H: 7.34 % N: 9.87 %

gefunden: C: 53.67 % H: 7.38 % N: 9.82 %

Aktivierung des Nickelkatalysators für die Synthese von 21 Zu einer Lösung von 50.0 g Nickelnitrat-Hexahydrat in 400 mL Wasser werden

100 g Kieselgel 60 (0.040–0.063 mm) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 1 h

bei RT gerührt und anschließend für 15 h stehengelassen. Das Lösungsmittel wird

unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.

1-tert.-Butylcarbonyl-2-[5-amino-2-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-benzoyl]hydrazin (21) Zu einer Lösung von 40.0 g (94.0 mmol) 20 in 1 L MeOH werden 18.8 g des zuvor

aktivierten Ni(NO3)2/SiO2-Katalysators gegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit

einem Eis/NaCl-Bad auf – 18 °C abgekühlt. Innerhalb von 40 min werden 8.80 g

(233 mmol) Natriumborhydrid portionsweise bis zur intensiven Schwarzfärbung

des Gemisches zugegeben. Nach beendeter Zugabe werden weitere 15 min im

Kältebad gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 240 mL Wasser versetzt und das

Produkt anschließend dreimal mit 1 L Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet. Nach einer Filtration

wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt

mittels Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetat 1:1

(v/v)). Einengen der Lösung und Trocknung des braunen, schaumartigen

Feststoffs im Hochvakuum liefert 21 in einer Ausbeute von 53.8 g (72 % d.

Theorie).

H2NHN

ONH

OTBS

Boc

C19H33N3O4Si


- 117 -


1.42 (s, 9H, OC(CH3)3), 4.67 (s, 2H, CH2), 5.21 (br s, 2H, NH2), 6.63–6.66 (m, 2H,

Ar-H), 7.14–7.16 (m, 1H, Ar-H), 8.85 (br s, 1H, NH), 9.71 (br s, 1H, NH).



133.4, 147.3 (Ar-C), 155.1, 168.4 (C(O)NH).


1-tert.-Butylcarbonyl-2-[2-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-5-(phenoxy-carbonylamino)benzoyl]hydrazin (22) Zu einer Lösung von 53.1 g (134 mmol) 21 in 750 mL DCM werden bei 0 °C

17.8 mL (22.1 g, 141 mmol) Chlorameisensäurephenylester und 24.1 mL (18.2 g,

141 mmol) DIEA gegeben. Die Reaktionslösung wird für 1 h im Eisbad gerührt und

anschließend dreimal mit 600 mL ges. Natriumhydrogencarbonatlösung sowie

einmal mit 600 mL ges. Natriumchloridlösung gewaschen. Die vereinigten

organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet. Nach einer Filtration

wird die Lösung bis zur Trockene eingeengt und das Rohprodukt mittels Flash-

Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetat 4:1 (v/v)).

Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck und Trocknung des

farblosen, schaumartigen Feststoffs im Hochvakuum liefert 22 in einer Ausbeute

von 48.7 g (70 % d. Theorie).

NH

HN

ONH

OTBS

BocO

O

C26H37N3O6Si

1H-NMR (400.1 MHz, THF-d8): δ = 0.12 (s, 6H, SiCH3), 0.95 (s, 9H, SiC(CH3)3),

1.46 (s, 9H, OC(CH3)3), 4.92 (s, 2H, CH2), 7.15–7.19 (m, 3H, Ar-H), 7.33–7.36 (m,


- 118 -


Ar-H), 8.23 (br s, 1H, NH), 9.32–9.36 (m, 2H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, THF-d8): δ = -5.2, 19.0, 26.4, 28.5 (SiCH3, SiC(CH3)3,


129.0, 129.9, 134.6, 135.2, 138.8, 152.2, 152.3, 156.7, 168.6 (Ar-C, C(O)NH).

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 538 (100) [M + Na]+.

1-tert.-Butylcarbonyl-2-[2-(hydroxymethyl)-5-(phenoxycarbonylamino)-benzoyl]hydrazin (23) Eine Lösung von 48.1 g (93.3 mmol) 22 in 1 L eines 50:1-Gemisches aus MeOH

und HCl (1M) wird bei RT 2 h gerührt und anschließend mit 1 L Ethylacetat und

500 mL Wasser versetzt. Das Produkt wird dreimal mit 700 mL Ethylacetat

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden zweimal mit 500 mL ges.

Natriumhydrogencarbonatlösung sowie einmal mit 500 mL ges. Natriumchlorid-

lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abtrennen des

Trockenmittels wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das

Rohprodukt wird aus einem Gemisch aus Ethylacetat und n-Hexan bei – 20 °C

kristallisiert. Filtration und Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum

liefert 23 in einer Ausbeute von 21.5 g (57 % d. Theorie).

NH

HN

ONH

OH

BocO

O

Smp.: 156–158 °C

1H-NMR (400.1 MHz, THF-d8): δ = 1.46 (s, 9H, CH3), 4.53 (t, J = 5.9 Hz, 1H, OH),

4.61 (d, J = 5.9 Hz, 2H, CH2), 7.17–7.19 (m, 3H, Ar-H), 7.32–7.39 (m, 3H, Ar-H),

7.64–7.71 (m, 2H, Ar-H), 8.30 (br s, 1H, NH), 9.38 (br s, 1H, NH), 9.62 (br s, 1H,

NH).


- 119 -

13C-NMR (100.6 MHz, THF-d8): δ = 28.5 (CH3), 63.2 (CH2), 80.2 (C(CH3)3), 119.0,

120.6, 122.4, 125.8, 129.9, 130.7, 135.7, 136.2, 139.1, 152.2, 152.3, 156.7, 169.2

(Ar-C, C(O)NH).



berechnet: C: 59.84 % H: 5.78 % N: 10.47 %

gefunden: C: 59.95 % H: 5.64 % N: 10.32 %

1-tert.-Butylcarbonyl-2-[2-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-5-(phenoxycarbonylamino)benzoyl]hydrazin (24) Zu einer Lösung von 2.99 g (7.46 mmol) 23 in 150 mL THF werden 20 mg

zerstoßenes Molekularsieb 4 Å, 1.50 g (7.46 mmol) 3 und 221 μL (22.1 μmol)

einer 100 mM Lösung von DBTL in Toluol gegeben. Die Reaktionslösung wird

30 min bei RT gerührt und das Molsieb anschließend abfiltriert. Nach Entfernen

des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird das Rohprodukt aus einem

Gemisch aus Ethylacetat und n-Hexan bei – 20 °C kristallisiert. Filtration und

Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum liefert 24 in einer Ausbeute


NH

HN

ONH

O

BocO

O

O

NH

O O


1H-NMR (400.1 MHz, THF-d8): δ = 1.55 (s, 9H, OC(CH3)3), 2.39 (s, 3H, CH3CCH),

5.39 (s, 2H, CH2), 6.08 (s, 1H, CH3CCH), 7.20–7.23 (m, 3H, Ar-H), 7.37–7.41 (m,


Ar-H), 7.73–7.74 (m, 1H, Ar-H), 8.54 (br s, 1H, NH), 9.47–9.50 (m, 3H, NH).


- 120 -

13C-NMR (100.6 MHz, THF-d8): δ = 18.3 (CH3CCH), 28.5 (OC(CH3)3), 64.6 (CH2),

80.7 (OC(CH3)3), 105.6, 113.3, 114.5, 115.5 (CH3CCH, Ar-C), 118.4, 120.0, 122.4,

125.9, 126.0, 129.9, 130.8, 131.0, 136.5, 139.8, 144.0, 152.1, 152.3, 152.7, 153.9,

155.7, 157.3, 160.3, 168.9 (C(O)NH, CH3CCH, C(O)CH, Ar-C).

ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 625 (100) [M + Na]+.


berechnet: C: 61.79 % H: 5.02 % N: 9.30 %

gefunden: C: 60.55 % H: 5.31 % N: 8.77 %

[2-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-5-(phenoxycarbonyl-amino)benzoyl]hydrazin-Trifluoracetat (25) Eine Lösung von 4.05 g (6.72 mmol) 24 in 40 mL eines 1:1-Gemisches aus DCM

und TFA wird 45 min bei RT gerührt. Nach beendeter Reaktion wird das Produkt

mit 2 L Et2O gefällt und zur Vervollständigung der Fällung für 1 h auf 4 °C

abgekühlt. Filtration und Trocknung des farblosen, schaumartigen Feststoffs im

Hochvakuum liefert 25 in einer Ausbeute von 3.25 g (96 % d. Theorie).

NH

HN

ONH3

+

O

O

O

O

NH

O O

CF3COO-

C28H23F3N4O9



2H, Ar-H), 7.68–7.70 (m, 2H, Ar-H), 7.76–7.78 (m, 1H, Ar-H), 8.00–10.18 (br s,

3H, NH3), 10.30 (s, 1H, NH), 10.58 (s, 1H, NH), 11.24 (br s, 1H, NH).


114.3 (CH3CCH, Ar-C), 116.5 (q, J = 296.4 Hz, CF3), 117.5, 120.6, 121.8, 125.6,


- 121 -

125.9, 129.1, 129.4, 130.3, 132.6, 138.5, 142.6, 150.2, 151.7, 153.0, 153.1, 153.8

(C(O)NH, CH3CCH, C(O)CH, Ar-C), 158.3 (q, J = 33.3 Hz, CCF3), 160.0, 167.0

(C(O)NH).

ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 548 (100) [M + 2 Na]+.

[2-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-5-(phenoxycarbonyl-amino)benzoyl]azid (26) Zu einer Suspension von 3.17 g (6.31 mmol) 25 in 100 mL HCl (1M) wird im

Eisbad eine Lösung von 653 mg (9.47 mmol) Natriumnitrit in 2 mL Wasser

gegeben. Nach 3 h Rühren bei 0 °C wird der gelbe Feststoff abfiltriert, mit ca.

15 mL Wasser gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. 26 wird in einer

Ausbeute von 2.95 g (91 % d. Theorie) erhalten und ohne weitere Aufreinigung

eingesetzt.

NH

N3

O

O

O

O

O

NH

O O

C26H19N5O7

Phenyl-N-[4-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenyl]carbamat (27)

Zu einer Lösung von 179 mg (349 μmol) 26 in 3 mL DMF werden 23.9 μL (192 mg,

349 μmol) Propargylamin gegeben. Nach 4 h Rühren bei RT wird die Lösung bis

zur Trockene eingeengt und das Rohprodukt mittels Flash-

Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Chloroform/MeOH 50:1 (v/v)). Nach

Entfernen der Lösungs-mittel unter vermindertem Druck und Trocknung des

farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 27 in einer Ausbeute von 136 mg (74 %

d. Theorie) erhalten.


- 122 -

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

C29H23N3O7


1H-NMR (400.1 MHz, THF-d8): δ = 2.36 (s, 3H, CH3), 2.61 (t, J = 2.6 Hz, 1H,

C≡CH), 4.15 (dd, J1 = 5.4 Hz, J2 = 2.6 Hz, 2H, NHCH2), 5.36 (s, 2H, OCH2), 6.07

(s, 1H, CH3CCH), 7.16–7.20 (m, 3H, Ar-H), 7.33–7.37 (m, 2H, Ar-H), 7.39–7.42

(m, 1H, Ar-H), 7.46–7.50 (m, 2H, Ar-H), 7.55–7.57 (m, 1H, Ar-H), 7.61–7.63 (m,

1H, Ar-H), 7.68–7.69 (m, 1H, Ar-H), 8.02 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NHCH2), 9.31 (s, 1H,

NH), 9.42 (s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, THF-d8): δ = 18.2 (CH3CCH), 29.4 (NCH2), 64.7 (OCH2),

71.9 (C≡CH), 81.2 (C≡CH), 105.8, 113.4, 114.6, 115.6 (CH3CCH, Ar-C), 118.1,

120.1, 122.4, 125.9, 126.1, 129.9, 130.6, 130.8, 137.7, 139.7, 144.0, 152.1, 152.3,

152.6, 154.0, 155.7, 160.3, 168.4 (C(O)NH, CH3CCH, C(O)CH, Ar-C).

APCI-MS (5 μA, MeOH): m/z (%) = 526 (67) [M + H]+, 432 (100) [M – PhOH + H]+.

4-(2,3,5,6-Tetrafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (28)

Zu einer Lösung von 400 mg (761 μmol) 27 und 216 mg (761 μmol) 13a in 25 mL

Dioxan werden 381 μL (38.1 μmol) einer 100 mM Lösung von DBTL in Toluol und

30 mg Molekularsieb 4 Å gegeben. Nach 3 h Rühren unter Reflux wird das

Molekularsieb durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck auf ein Volumen von ca. 7 mL eingeengt, wobei das Produkt als hellgelber

Feststoff ausfällt. Dieses wird anschließend abfiltriert, mit ca. 4 mL iso-Hexan

gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. 28 wird in einer Ausbeute von

348 mg (64 % d. Theorie) erhalten.


- 123 -

NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

HFF

FF

C37H26F4N4O7


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.38 (s, 3H, CH3), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1H,


(s, 2H, OCH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 7.34–7.36 (m, 2H, Ar-H), 7.40–7.47 (m, 2H,

Ar-H), 7.51–7.53 (m, 3H, Ar-H), 7.56–7.58 (m, 1H, Ar-H), 7.63–7.64 (m, 1H, Ar-H),

7.67–7.70 (m, 1H, Ar-H), 8.08–8.13 (m, 1H, Ar-H), 8.69 (s, 1H, C(N)H), 8.86 (t,

J = 5.6 Hz, 1H, NHCH2), 10.03 (s, 1H, NH), 10.24 (s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 18.4 (CH3), 28.8 (NCH2), 64.0, 65.9 (OCH2),

73.4 (C≡CH), 81.4 (C≡CH), 104.8 (Ar-C), 109.5 (dd, J1 = J2 = 23.6 Hz, CFCCF),

112.3, 114.7, 114.8 (CH3CCH, Ar-C), 116.1 (dd, J1 = J2 = 10.9 Hz, CFCCF), 117.4,

119.6, 121.6, 126.4, 128.3, 129.7, 130.3, 135.9, 136.7, 139.3, 143.2 (Ar-C), 145.3

(m, CF), 145.9 (m, CF), 150.8 (dd, J1 = J2 = 3.0 Hz, C(N)H), 151.1, 153.5, 153.6,

153.7, 154.2, 160.5, 168.1 (C(O)NH, CH3CCH, C(O)CH, Ar-C).


4-(Pentafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (29)



30 mg Molekularsieb 4 Å gegeben. Nach 2.5 h Rühren unter Reflux wird das

Molekularsieb durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck auf ein Volumen von ca. 7 mL eingeengt, wobei das Produkt als hellgelber


- 124 -

Feststoff ausfällt. Dieses wird anschließend abfiltriert, mit ca. 4 mL iso-Hexan

gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. 29 wird in einer Ausbeute von


NH

HN

O

O

O

O

O

NH

O O

N

HFF

FF

F

C37H25F5N4O7


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 2.38 (s, 3H, CH3), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1H,


(s, 2H, OCH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 7.34–7.36 (m, 2H, Ar-H), 7.40–7.48 (m, 2H,

Ar-H), 7.51–7.59 (m, 4H, Ar-H), 7.64–7.70 (m, 2H, Ar-H), 8.66 (s, 1H, C(N)H), 8.86

(t, J = 5.5 Hz, 1H, NHCH2), 10.03 (s, 1H, NH), 10.24 (s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 18.4 (CH3), 28.8 (NCH2), 64.0, 65.9 (OCH2),

73.4 (C≡CH), 81.4 (C≡CH), 104.8 (Ar-C), 111.4 (m, Ar-C), 112.3, 114.7, 114.8

(CH3CCH, Ar-C), 117.4, 119.6, 121.6, 126.4, 128.3, 129.7, 130.3, 136.0, 136.7

(Ar-C), 137.8 (m, CF), 139.3 (Ar-C), 142.3 (m, CF), 143.2 (Ar-C), 146.0 (m, CF),

150.1, 150.9, 153.5, 153.6, 153.7, 154.2, 160.5, 168.1 (C(O)NH, C(N)H, CH3CCH,

C(O)CH, Ar-C).



- 125 -

6.2.4 Synthese niedermolekularer Vorstufen für die Darstellung von PEG-geträgerten Prodrugs mittels CuAAC

2-(Hydroxymethyl)-5-nitro-N-(prop-2-ynyl)benzamid (30) Zu einer Suspension von 14.9 g (112 mmol) Aluminiumchlorid in 75 mL

Dichlorethan werden im Eisbad innerhalb von 45 min 27.0 mL (19.7 g, 195 mmol)

Triethylamin in 35 mL Dichlorethan zugetropft. Anschließend werden zu der

Mischung 10.0 g (55.8 mmol) 6-Nitrophthalid und 13.3 mL (10.7 g, 195 mmol)

Propargylamin in 240 mL Dichlorethan innerhalb von 45 min zugetropft. Nach

Entfernen des Kühlbades wird das Reaktionsgemisch für 22 h auf 45 °C erwärmt.

Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt (Wasserbad: 30 °C)

und der Rückstand in ges. Natriumchloridlösung aufgenommen. Das Produkt wird

mit 15 L Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden im

Anschluss nochmals mit ges. Natriumchloridlösung gewaschen, über Natrium-

sulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von ca. 2 L

eingeengt. Nach Kristallisation bei – 20°C und Trocknung im Hochvakuum wird 30,

ein beigefarbener Feststoff, in einer Ausbeute von 6.85 g (52 % d. Theorie)

erhalten.

O2NHN

O

OH


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.20 (t, J =2.5 Hz, 1H, C≡CH), 4.06 (dd,

J1 = 5.4 Hz, J2 = 2.5 Hz, 2H, NHCH2), 4.72 (d, J = 5.6 Hz, 2H, OCH2), 5.59 (t,


(m, 1H, Ar-H), 9.13 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 28.9 (NHCH2), 60.6 (CH2OH), 73.7 (C≡CH),

81.1 (C≡CH), 122.4, 125.1, 128.5, 134.9, 146.2, 149.3 (Ar-C), 166.5 (C(O)NH).


- 126 -

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 217 (100) [M – H2O + H]+.


berechnet: C: 56.41 % H: 4.30 % N: 11.96 %

gefunden: C: 56.34 % H: 4.54 % N: 11.86 %

2-((tert.-Butyldimethylsilyloxy)methyl)-5-nitro-N-(prop-2-ynyl)benzamid (31) Zu einer Lösung von 3.20 g (47.0 mmol) Imidazol und 3.90 g (25.9 mmol) tert.-

Butyldimethylsilylchlorid in 130 mL DMF werden nach 30 min Rühren bei RT

5.50 g (23.5 mmol) 30 zugegeben. Nach weiteren 2.5 h Rühren werden 150 mL

DCM zugegeben. Die organische Phase wird dreimal mit je 300 mL Natrium-

hydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach

Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der Rückstand

mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetat 10:1 (v/v))

gereinigt. Trocknen des farblosen Öls im Hochvakuum liefert 31 in einer Ausbeute


O2NHN

O

OTBS

Smp.: 62–64 °C


3.20 (t, J = 2.5 Hz, 1H, C≡CH), 4.07 (dd, J1 = 5.4 Hz, J2 = 2.5 Hz, 2H, NHCH2),

4.95 (s, 2H, OCH2), 7.84–7.86 (m, 1H, Ar-H), 8.23–8.24 (m, 1H, Ar-H), 8.36–8.39

(m, 1H, Ar-H), 9.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH).


SiC(CH3)3, NHCH2), 62.2 (CH2O), 73.7 (C≡CH), 81.0 (C≡CH), 122.5, 125.3, 128.2,

134.6, 146.4, 147.9 (Ar-C), 166.2 (C(O)NH).

APCI-MS (5 μA, MeCN): m/z (%) = 349 (100) [M + H]+, 217 (50) [M – OTBS]+.


- 127 -


berechnet: C: 58.59 % H: 6.94 % N: 8.04 %

gefunden: C: 58.94 % H: 7.12 % N: 7.78 %

5-Amino-2-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-N-(prop-2-ynyl)benzamid (32) Zu einer Suspension von 1.55 g (4.45 mmol) 31 und 1.03 g (15.8 mmol) Zink in

80 mL DCM werden 1.52 mL (1.60 g, 26.7 mmol) konz. Essigsäure gegeben.

Nach vier Tagen Rühren bei RT wird das Zink abfiltriert und mit 30 mL MeOH

ausgewaschen. Die organischen Phasen werden vereint und die Lösungsmittel

unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird mittels Flash-Säulen-

chromatographie (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetat 5:1 (v/v)) gereinigt. Trocknen

des gelben Feststoffs im Hochvakuum liefert 32 in einer Ausbeute von 928 mg

(65 % d. Theorie).

H2NHN

O

OTBS

C17H26N2O2Si

Smp.: 75–77 °C



4.62 (s, 2H, OCH2), 5.20 (s, 2H, NH2), 6.58–6.63 (m, 2H, Ar-H), 7.08–7.10 (m, 1H,

Ar-H), 8.56 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH).



129.2, 135.7, 148.0 (Ar-C), 168.8 (C(O)NH).



- 128 -

Phenyl-N-4-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)-phenylcarbamat (33) Zu einer Lösung von 1.93 g (6.06 mmol) 32 in 35 mL DCM werden im Eisbad

801 μL (996 mg, 6.36 mmol) Chlorameisensäurephenylester und 1.09 mL

(822 mg, 6.36 mmol) DIEA gegeben. Nach 4.5 h Rühren bei 0 °C wird die

Reaktionslösung dreimal mit je 50 mL ges. Natriumhydrogencarbonatlösung und

zweimal mit je 50 mL ges. Natriumchloridlösung gewaschen und über

Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem

Druck wird der Rückstand mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel,

n-Hexan/Ethylacetat 4:1 (v/v)) gereinigt. Trocknen des farblosen Feststoffs im

Hochvakuum liefert 33 in einer Ausbeute von 1.93 g (73 % d. Theorie).

NH

HN

O

OTBS

O

O

Smp.: 146–148 °C



4.76 (s, 2H, OCH2), 7.22–7.29 (m, 3H, Ar-H), 7.42–7.47 (m, 3H, Ar-H), 7.56–7.58

(m, 2H, Ar-H), 8.77 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NHCH2), 10.36 (s, 1H, OC(O)NH).



125.9, 128.2, 129.9, 133.7, 135.3, 137.7, 150.8, 152.2, 168.2 (Ar-C, C(O)NH).

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 439 (87) [M + H]+, 307 (100) [M – OTBS]+.


berechnet: C: 65.72 % H: 6.89 % N: 6.39 %

gefunden: C: 65.61 % H: 7.00 % N: 6.37 %


- 129 -

Phenyl-N-4-(hydroxymethyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (34) Eine Lösung von 1.92 g (4.38 mmol) 33 in 30 mL eines 50:1-Gemisches aus

MeOH und HCl (1M) wird für 15 min bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wird mit

50 mL Wasser und 150 mL Ethylacetat versetzt und die Phasen getrennt. Nach

der Extraktion des Produkts aus der wässrigen Phase mit Ethylacetat (2 × 75 mL)

werden die vereinigten organischen Phasen zweimal mit je 200 mL ges.

Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit 200 mL ges. Natriumchlorid-

lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wird in der

organischen Phase unter vermindertem Druck aufkonzentriert und anschließend

unter Zugabe von n-Hexan bei – 20 °C kristallisiert. Trocknen des beigen

Feststoffs im Hochvakuum liefert 34 in einer Ausbeute von 1.24 g (87 % d.

Theorie).

NH

HN

O

OH

O

O

Smp.: 135–137 °C

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.14 (t, J = 2.5 Hz, 1H, C≡CH), 4.03 (dd,

J1 = 5.5 Hz, J2 = 2.5 Hz, 2H, NHCH2), 4.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H, OCH2), 5.27 (t,


(m, 2H, Ar-H), 8.84 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NHCH2), 10.34 (s, 1H, OC(O)NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 28.8 (NHCH2), 60.9 (CH2OH), 73.4 (C≡CH),

81.4 (C≡CH), 117.8, 120.0, 122.3, 125.9, 128.9, 129.9, 134.9, 135.6, 137.6, 150.9,

152.2, 168.4 (Ar-C, C(O)NH).

ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 347 (65) [M + Na]+, 307 (100) [M – H2O + H]+.


berechnet: C: 66.66 % H: 4.97 % N: 8.64 %

gefunden: C: 66.14 % H: 5.21 % N: 8.56 %


- 130 -

Phenyl-N-4-[((4-nitrophenoxy)carbonyloxy)methyl]-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)-phenylcarbamat (35) Zu einer Lösung von 1.54 g (7.64 mmol) Chlorameisensäure-4-nitrophenylester

und 614 μL (604 mg, 7.64 mmol) Pyridin in 15 mL THF werden nach 20 min

Rühren im Eisbad innerhalb von 13 min 1.65 g (5.09 mmol) 34 in 35 mL THF

zugetropft. Das Kältebad wird entfernt und die Reaktionsmischung für 2.5 h bei RT

gerührt. Nach Filtration und Waschen des Filterkuchens mit THF wird das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mittels Flash-

Säulenchromatographie (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetat 3:1 (v/v)) gereinigt.

Trocknen des beigen Feststoffs im Hochvakuum liefert 35 in einer Ausbeute von

2.35 g (94 % d. Theorie).

NH

HN

O

O

O

O

O

O

NO2


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.36 (t, J = 2.5 Hz, 1H, C≡CH), 4.04 (dd,

J1 = 5.5 Hz, J2 = 2.5 Hz, 2H, NHCH2), 5.40 (s, 2H, OCH2), 7.24–7.28 (m, 3H, Ar-

H), 7.43–7.46 (m, 2H, Ar-H), 7.51–7.57 (m, 3H, Ar-H), 7.63–7.65 (m, 1H, Ar-H),

7.69–7.70 (m, 1H, Ar-H), 8.31–8.34 (m, 2H, Ar-H), 8.96 (t, J = 5.5 Hz, 1H,

NHCH2), 10.51 (s, 1H, OC(O)NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 28.8 (NHCH2), 68.2 (CH2O), 73.4 (C≡CH),

81.2 (C≡CH), 117.9, 119.9, 122.3, 123.0, 125.8, 126.0, 127.3, 129.9, 130.8, 136.9,

139.3, 145.5, 150.7, 152.1, 152.2, 155.7, 168.0 (Ar-C, C(O)NH, OC(O)O).

ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 512 (100) [M + Na]+, 307 (91) [M – OC(O)ONp]+.


- 131 -


berechnet: C: 61.35 % H: 3.91 % N: 8.59 %

gefunden: C: 61.27 % H: 4.20 % N: 8.35 %

4-(2,3,5,6-Tetrafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-[((4-nitrophenoxy)carbonyl-oxy)methyl]-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (36)



20 mg Molekularsieb 4 Å gegeben. Nach 3 h Rühren unter Reflux wird das

Molekularsieb abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Kristallisation aus einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat bei – 20 °C und

anschließendes Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum liefert 36 in einer

Ausbeute von 218 mg (63 % d. Theorie).

NH

HN

O

O

O

O

O

O

NO2

N

HFF

FF

C33H22F4N4O8


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.14 (m, 1H, C≡CH), 4.03 (m, 2H, NHCH2),

5.22 (s, 2H, OCH2), 5.37 (s, 2H, OCH2), 7.35–7.37 (m, 2H, Ar-H), 7.47–7.61 (m,

6H, Ar-H), 7.66 (m, 1H, Ar-H), 8.10–8.11 (m, 1H, Ar-H), 8.31–8.33 (m, 2H, Ar-H),

8.70 (s, 1H, C(N)H), 8.92–8.93 (m, 1H, NHCH2), 10.08 (s, 1H, OC(O)NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 28.8 (NHCH2), 65.9, 68.3 (CH2O), 73.4

(C≡CH), 81.3 (C≡CH), 109.5 (dd, J1 = J2 = 23.6 Hz, CFCCF), 116.1 (dd,

J1 = J2 = 12.0 Hz, CFCCF), 117.6, 119.6, 121.6, 123.0, 125.8, 126.7, 129.7, 130.8,

135.9, 136.9, 139.8 (Ar-C), 145.4 (m, CF), 145.5 (Ar-C), 146.0 (m, CF), 150.8,

151.1, 152.2, 153.7, 155.7, 168.1 (Ar-C, C(O)NH, OC(O)O, C(N)H).


- 132 -

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 679 (100) [M + H]+, 496 (56) [M – OC(O)ONp]+.

4-(Pentafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-[((4-nitrophenoxy)carbonyloxy)-methyl]-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (37)



20 mg Molekularsieb 4 Å gegeben. Nach 2.5 h Rühren unter Reflux wird das

Molekularsieb abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Kristallisation aus einem Gemisch von n-Hexan und Ethylacetat bei – 20 °C und

anschließendes Trocknen des hellgelben Feststoffs im Hochvakuum liefert 37 in

einer Ausbeute von 223 mg (63 % d. Theorie).

NH

HN

O

O

O

O

O

O

NO2

N

HFF

FFF

C33H21F5N4O8


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.14 (m, 1H, C≡CH), 4.02 (m, 2H, NHCH2),

5.22 (s, 2H, OCH2), 5.37 (s, 2H, OCH2), 7.35–7.66 (m, 9H, Ar-H), 8.31–8.33 (m,

2H, Ar-H), 8.67 (s, 1H, C(N)H), 8.93–8.94 (m, 1H, NHCH2), 10.08 (s, 1H,

OC(O)NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 28.8 (NHCH2), 65.9, 68.3 (CH2O), 73.4

(C≡CH), 81.3 (C≡CH), 111.5 (m, Ar-C), 117.6, 119.6, 121.6, 123.0, 125.8, 126.7,

129.7, 130.8, 135.9, 136.9 (Ar-C), 137.8 (m, CF), 139.8 (Ar-C), 142.3 (m, CF),

145.5 (Ar-C), 146.0 (m, CF), 150.1 (m, C(N)H), 151.0, 152.2, 153.7, 155.7, 168.1

(Ar-C, C(O)NH, OC(O)O).

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 697 (46) [M + H]+, 514 (100) [M – OC(O)ONp]+.


- 133 -

4-(2,3,5,6-Tetrafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-((doxorubicin-4’-yl-carbamato)methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (38)

Zu einer Lösung von 80.0 mg (147 μmol) Doxorubicin-Hydrochlorid und 27.7 μL

(20.9 mg, 162 μmol) DIEA in 7 mL DMF werden nach 5 min Rühren bei RT

100 mg (147 μmol) 36 in 3 mL DMF gegeben. Nach 26 h Rühren bei RT wird das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in 50 mL

Ethylacetat aufgenommen und die unlöslichen Bestandteile abfiltriert. Nach

Einengen der Lösung unter vermindertem Druck auf ca. 30 mL wird das Produkt

durch Zugabe von 50 mL iso-Hexan bei – 20 °C kristallisiert. Wiederholte

Kristallisation und anschließendes Trocknen des roten Feststoffs im Hochvakuum

liefert 38 in einer Ausbeute von 114 mg (72 % d. Theorie).

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

FF

O

O

O

H3CO

HO

OH

O

O

NH

HOCH3

OHOH

C54H46F4N4O16


ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 1081 (100) [M – H]–.

4-(Pentafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-((doxorubicin-4’-yl-carbamato)-methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (39)

Zu einer Lösung von 19.5 mg (35.9 μmol) Doxorubicin-Hydrochlorid und 12.3 μL

(9.28 mg, 71.8 μmol) DIEA in 4 mL DMF werden nach 5 min Rühren bei RT 25 mg

(35.9 μmol) 37 in 2 mL DMF gegeben. Nach 4.5 h Rühren bei RT wird das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in 25 mL


- 134 -

Ethylacetat aufgenommen und die unlöslichen Bestandteile abfiltriert. Nach

Einengen der Lösung unter vermindertem Druck auf ca. 10 mL wird das Produkt

durch Zugabe von 4 mL iso-Hexan bei – 20 °C kristallisiert. Trocknen des roten

Feststoffs im Hochvakuum liefert 39 in einer Ausbeute von 24 mg (61 % d.

Theorie).

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

FF

F

O

O

O

H3CO

HO

OH

O

O

NH

HOCH3

OHOH

C54H45F5N4O16



4-(2,3,5,6-Tetrafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-((paclitaxel-2’-yl-carbonato)-methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (40)

Zu einer Lösung von 41.9 mg (49.1 μmol) Paclitaxel und 8.41 μL (6.35 mg,

49.1 μmol) DIEA in 3 mL DCM werden nach 5 min Rühren bei RT 50 mg

(73.7 μmol) 36 und 9.00 mg (73.7 μmol) DMAP in 2 mL DCM gegeben. Nach 4.5 h

Rühren bei RT wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der

Rückstand wird in 5 mL Ethylacetat aufgenommen. Durch Zugabe von 10 mL

iso-Hexan bei – 20 °C wird das Produkt kristallisiert. Wiederholte Kristallisation

und anschließendes Trocknen des gelben Feststoffs im Hochvakuum liefert 40 in



- 135 -

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

FF

O

OO

O

OH

OO

O

HO

HN

OO

O

O

O

C74H68F4N4O19



4-(Pentafluorbenzylidenamino)benzyl-N-4-((paclitaxel-2’-yl-carbonato)-methyl)-3-(prop-2-ynylcarbamoyl)phenylcarbamat (41)

Zu einer Lösung von 40.9 mg (47.9 μmol) Paclitaxel und 8.20 μL (6.19 mg,

47.9 μmol) DIEA in 3 mL DCM werden nach 5 min Rühren bei RT 50 mg

(71.8 μmol) 37 und 8.77 mg (71.8 μmol) DMAP in 2 mL DCM gegeben. Nach 4 h

Rühren bei RT wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der

Rückstand wird in 7 mL Ethylacetat aufgenommen und die unlöslichen

Bestandteile abfiltriert. Durch Zugabe von 20 mL iso-Hexan bei – 20 °C wird das

Produkt kristallisiert. Wiederholte Kristallisation und anschließendes Trocknen des

hellgelben Feststoffs im Hochvakuum liefert 41 in einer Ausbeute von 27 mg

(40 % d. Theorie).

NH

HN

O

O

O

O

O

N

HFF

FF

F

O

OO

O

OH

OO

O

HO

HN

OO

O

O

O


- 136 -

C74H67F5N4O19



6.2.5 PEG-Synthesen am Beispiel von PEG2k

PEG2k-Dimesylat (42) Zu einer Lösung von 5.00 g (2.50 mmol) PEG2k in 40 mL DCM werden im Eisbad

innerhalb von 1 min 693 μL (506 mg, 5.00 mmol) Triethylamin zugetropft. Nach

10 min Rühren bei 0 °C werden 580 μL (859 mg, 7.50 mmol) Mesylchlorid in

10 mL DCM innerhalb von 5 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für

weitere 10 h gerührt, wobei es langsam auf RT auftaut. Nach beendeter Reaktion

wird das Produkt mit 500 mL Et2O gefällt, abfiltriert, in 15 mL MeOH gelöst und

erneut mit 500 mL Et2O gefällt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit n-Pentan

gewaschen. Nach Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 42 in

einer Ausbeute von 4.97 g (92 % d. Theorie) erhalten.

MsOO

OMsn

Aktivierung von Natriumazid für die Synthese von 43164 Zu einer Lösung von 15.9 g (245 mmol) Natriumazid in 50 mL Wasser werden

2.37 mL (2.45 g, 49.0 mmol) Hydrazin-Hydrat gegeben. Nach 15 min Rühren bei

RT wird die Lösung filtriert und das Salz mit 1 L Aceton gefällt. Nach Filtration und

Trocknung des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird das aktivierte

Natriumazid direkt bei der Synthese von 43 eingesetzt.

PEG2k-Diazid (43) Zu einer Lösung von 4.97 g (2.31 mmol) 42 in 80 mL DMF werden 1.50 g

(23.1 mmol) aktiviertes Natriumazid gegeben. Die dabei entstandene Suspension

wird unter Rühren für 18.5 h im Ölbad auf 70 °C erhitzt. Nach beendeter Reaktion

wird die Reaktionsmischung heiß filtriert und das Lösungsmittel unter


- 137 -

vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wird mit 250 mL 2-Propanol in der

Siedehitze umkristallisiert, abfiltriert und anschließend mit 15 mL 2-Propanol und

20 mL n-Pentan gewaschen. Nach Trocknung des farblosen Feststoffs im

Hochvakuum wird 43 in einer Ausbeute von 3.71 g (77 % d. Theorie) erhalten.

N3O

OnN3

a

ab

b

c

d

siehe Abb. 3.24, S. 55 1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 3.39 (t, J = 5.0 Hz, 4H, CH2N), 3.51 (br s,

176H, OCH2CH2O), 3.61 (t, J = 5.0 Hz, 4H, CH2CH2N).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 50.0 (CH2N), 69.2 (CH2CH2N), 69.6

(CH2OCH2CH2N), 69.7 (OCH2CH2O).

Durch Integration konnte das Verhältnis der Protonen c und d zu den vier

Protonen a in Nachbarstellung des Azidsubstituenten bestimmt werden. Daraus

ergab sich für 43 eine Beladung von ungefähr 94 %.

PEG2k-Diamin (44)

Zu einer Lösung von 653 mg (314 μmol) 43 in 75 mL EtOH werden 900 mg

Palladium auf Aktivkohle (10 % Pd) gegeben. Unter einer Wasserstoffatmosphäre

wird für fünf Tage bei RT gerührt. Nach beendeter Reaktion wird der Katalysator

über einen Glasfasermikrofilter abfiltriert. Das Lösungsmittel wird unter

vermindertem Druck entfernt und der Rückstand anschließend in 20 mL MeOH

aufgenommen. Nach erneuter Filtration wird die organische Phase unter

vermindertem Druck auf ein Volumen von ca. 5 mL eingeengt und das Produkt mit

75 mL Et2O gefällt. Nach Filtration, Waschen mit 10 mL n-Pentan und Trocknung

des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 44 in einer Ausbeute von 358 mg

(60 % d. Theorie) erhalten.

H2NO

NH2n


- 138 -

6.2.6 Synthese niedermolekularer Vorstufen zur Darstellung von AMC-Modellverbindungen über zur CuAAC alternative Reaktionen

1-Maleinimidopentan-5-amin-Hydrochlorid (47) Zu einer Lösung von 15 g (44.2 mmol) 6-Maleinimidocapronsäurehydrazid-

Trifluoracetat in 100 mL HCl (1M) werden im Eisbad 4.57 g (66.3 mmol)

Natriumnitrit in 20 mL Wasser gegeben. Nach 1.5 h Rühren bei 0 °C wird das

entstandene Azid dreimal mit 200 mL DCM extrahiert und die vereinigten

organischen Phasen anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen

des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der Rückstand in 10 mL

Dioxan aufgenommen und unter starkem Rühren innerhalb von 5 min zu 300 mL

siedendem Wasser mit 3.68 mL (44.2 mmol) konz. HCl getropft. Nach beendeter

Zugabe wird das Reaktionsgemisch für weitere 2 min zum Sieden erhitzt, filtriert

und das Wasser durch lyophylisieren entfernt. 47 wird als beigefarbener Feststoff

in einer Ausbeute von 8.75 g (90 % d. Theorie) erhalten.

+H3N N

O

O

Cl-

Smp.: 134–136 °C

1H-NMR (400.1 MHz, D2O): δ = 1.34–1.37 (m, 2H, CH2), 1.57–1.69 (m, 4H, CH2),

2.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 3.51 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2), 6.82 (s, 2H, CH).

13C-NMR (100.6 MHz, D2O): δ = 22.7, 26.1, 27.0, 37.1, 39.2 (CH2), 134.2 (CH),

173.3 (C(O)).

CI-MS (130 eV, 300 μA, NH3): m/z (%) = 183 (100) [M + H]+.

Elementaranalyse: C9H15ClN2O2 [218.68]

berechnet: C: 49.43 % H: 6.91 % N: 12.81 %

gefunden: C: 49.13 % H: 6.95 % N: 12.52 %


- 139 -

Phenyl-N-4-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)-3-(2-(6-malein-imidohexanoyl)hydrazincarbonyl)phenylcarbamat (48) Zu einer Suspension von 300 mg (597 μmol) 25 in 20 mL DMF werden 368 mg

(1.19 mmol) 6-Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester und 102 μL

(597 μmol) DIEA gegeben. Nach 24 h Rühren bei RT wird die Lösung zur

Trockene eingeengt und der Rückstand anschließend mittels Flash-

Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Chloroform/MeOH 40:1 (v/v)). Nach

Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck und Trocknung des

farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 48 in einer Ausbeute von 186 mg (45 %


NH

HN

ONH

O

O

O

O

NH

O O

ON

O

O

C36H33N5O10

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 1.21–1.29 (m, 2H, CH2), 1.48–1.54 (m, 4H,

CH2), 2.12 (t, J = 7.80 Hz, 2H, CH2), 2.38 (s, 3H, CH3), 3.38 (t, J = 7.21 Hz, 2H,

CH2), 5.28 (s, 2H, OCH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 6.99 (s, 2H, NC(O)CH), 7.22–

7.31 (m, 3H, Ar-H), 7.40–7.46 (m, 3H, Ar-H), 7.51–7.56 (m, 2H, Ar-H), 7.63–7.71

(m, 3H, Ar-H ), 9.96 (s, 1H, NH), 10.18 (s, 1H, NH), 10.24 (s, 1H, NH), 10.49 (s,

1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 18.4 (CH3), 24.9, 26.1, 28.1, 33.4, 37.3

(CH2), 64.0 (OCH2), 104.8, 112.3, 114.6, 114.8, 115.6 (CH3CCH, Ar-C), 122.3,

126.0, 126.4, 129.0, 129.8, 129.9, 130.2, 134.8, 135.4, 138.8, 143.1, 150.8, 152.1,

153.4, 153.6, 154.2, 160.4, 167.5, 171.5, 172.0 (Ar-C, C(O)NH, CH3CCH,

C(O)CH, NC(O)CH, NC(O)CH).


- 140 -

6.2.7 Synthese der makromolekularen Modellverbindungen 53–55 Da für 13C-NMR-Spektren von PEG`s mit hoher Molmasse große

Substanzmengen und lange Messzeiten erforderlich sind, wurde bei den

folgenden Verbindungen auf die Aufnahme solcher Spektren verzichtet.

Neutralisierung von mPEG5k Zu einer Lösung von 25 g (5 mmol) mPEG5k in 100 mL DCM werden 1 g

Amberlyst 15 gegeben. Nach 18 h Rühren bei RT wird filtriert und das PEG

anschließend in 2 L Et2O gefällt. Zur Vervollständigung der Fällung wird die

Suspension für 30 min bei 5 °C gelagert. Der farblose Feststoff wird im Anschluss

abfiltriert, mit Et2O und n-Pentan gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Es

werden 24.3 g (97 % d. Theorie) neutralisiertes mPEG5k erhalten.

6-Hexylisocyanato-1-mPEG5k-carbamat (49) Eine Lösung von 10 g (2 mmol) des zuvor aktivierten mPEG5k in 100 mL Benzol

wird für eine Stunde am Wasserabscheider erhitzt. Nach Abkühlen auf RT werden

zur Lösung 3.20 mL (20 mmol) 1,6-Hexyldiisocyanat und 50 μL DBTL in 10 mL

Benzol innerhalb von 1 h tropfenweise unter starkem Rühren zugesetzt. Nach 3 h

Rühren bei RT wird das PEG in 1 L abs. Et2O gefällt und unter Schutzgas

abfiltriert. Zur weiteren Aufreinigung wird der Feststoff in 20 mL DCM gelöst und

die Fällung wiederholt. Nach Waschen mit Et2O und n-Pentan sowie Trocknen des

farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 49 in einer Ausbeute von 9.80 g (98 %


OO

O NH

NO

COn

tert.-Butyl-2-[4-(hydroxymethyl)-2-((4-methylcumarin-7-yl-carbamoyloxy)methyl)benzoyl]hydrazincarboxylat (50) Diese Verbindung war innerhalb der Arbeitsgruppe vorrätig und wurde von einer

Mitarbeiterin in einer 8-stufigen Synthese ausgehend von 2,4-Dimethylbenzoe-

säure dargestellt.166


- 141 -

O ONH

O

O

OHHN

ONH

O

O

mPEG5k-OC(O)N-Hexyl-[4-(2-(tert.-butoxycarbonyl)hydrazincarbonyl)-3-((hydroxymethyl)-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat)]benzylcarbamat (51)

Zu einer Lösung von 2.54 g (489 μmol) 49 und 364 mg (734 μmol) 50 in 30mL

Dioxan werden 250 mg zerstoßenes Molekularsieb 4 Å gegeben. Nach 30 min

Rühren bei RT werden 245 μL (24.5 μmol) einer 100 mM Lösung von DBTL in

Dioxan zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird für 3 h auf 80 °C erhitzt und

anschließend über Celite filtriert, wobei zweimal mit heißem Dioxan gewaschen

wird. Nach Lyophilisieren wird der Rückstand in 38 mL Toluol aufgenommen und

die erhaltene Lösung erneut über Celite filtriert. Das Produkt wird mit 280 mL Et2O

gefällt und die Suspension für 1 h bei RT gerührt. Zur weiteren Aufreinigung wird

der Feststoff in 5 mL DCM gelöst und die Fällung mit 200 mL Et2O wiederholt.

Nach Waschen mit Et2O, n-Pentan und PE 30-50 sowie Trocknen des farblosen

Feststoffs im Hochvakuum wird 51 in einer Ausbeute von 1.91 g (68 % d. Theorie)

erhalten.

NH

O

O

O

HN

ONH

O

O

O O

NH

OHNO

OO

On

mPEG5k-OC(O)N-Hexyl-[4-(azidocarbonyl)-3-((hydroxymethyl)-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat)]benzylcarbamat (52)

Eine Lösung von 1.80 g (316 μmol) 51 in 11 mL HCl (5M) wird für 30 min bei RT

gerührt. Anschließend wird der Ansatz mit 44 mL Wasser verdünnt und auf 0 °C

abgekühlt. Nach Zugabe einer Lösung von 87.0 mg (1.26 mmol) Natriumnitrit in

1 mL Wasser wird das Reaktionsgemisch für weitere 30 min im Eisbad gerührt.

Schließlich werden 50 mL einer gesättigten Natriumchloridlösung zugegeben und

das Produkt mit fünfmal je 20 mL DCM extrahiert. Nach Trocknen der organischen

Phase über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck


- 142 -

entfernt und der Rückstand mit 180 mL Et2O gefällt. Zur Vervollständigung der

Fällung wird die Suspension für 10 min bei 5 °C gelagert. Der farblose Feststoff

wird im Anschluss abfiltriert, mit Et2O und n-Pentan gewaschen und im

Hochvakuum getrocknet. 52 wird in einer Ausbeute von 1.63 g (92 % d. Theorie)

erhalten.

NH

O

O

O

N3

O

HNO

OO

O

O O

NH

O

n

mPEG5k-OC(O)N-Hexyl-[4-(4-(2,3,5,6-tetrafluorbenzylidenamino)benzyl-carbamat)-3-((hydroxymethyl)-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat)]benzylcarbamat (53)

Zu einer Lösung von 285 mg (50.9 μmol) 52 und 28.8 mg (102 μmol) 13a in

2.5 mL Dioxan werden 100 mg zerstoßenes Molekularsieb 4 Å und 25 μL

(2.5 μmol) einer 100 mM Lösung von DBTL in Dioxan gegeben. Nach 30 min

Rühren bei RT wird das Reaktionsgemisch für 3 h auf 80 °C erhitzt und

anschließend über Celite filtriert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem

Druck entfernt und der Rückstand in 4 mL Toluol aufgenommen. Nach Filtration

über Celite und Waschen mit 1 mL Toluol wird das Produkt in 28 mL Et2O gefällt.

Zur Vervollständigung der Fällung wird die Suspension für 30 min bei 5 °C

gelagert. Der farblose Feststoff wird im Anschluss abfiltriert, mit Et2O und n-

Pentan gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. 53 wird in einer Ausbeute von


NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

H

NH

O

n

O

NH

O O


- 143 -

siehe Abb. 3.35, S. 67: 1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 1.21–1.23 (br m, CH2), 1.33–1.40 (br m,

CH2), 2.36 (s, CH3), 2.90–2.97 (m, CH2), 3.24 (s, OCH3), 3.44–3.66 (br m, CH2),

4.02–4.04 (m, CH2), 4.98 (s, CH2), 5.19–5.21 (m, CH2), 6.19 (s, CH3CCH), 7.16–

7.69 (m, Ar-H, NH), 8.05–8.14 (m, Ar-H), 8.61 (s, C(N)H), 9.34 (br s, NH), 10.30

(br s, NH).



NH) bestimmt werden. Daraus ergab sich für 53 eine Beladung von 61 %.

mPEG5k-OC(O)N-Hexyl-[4-(4-(pentafluorbenzylidenamino)benzylcarbamat)-3-((hydroxymethyl)-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat)]benzylcarbamat (54)

Zu einer Lösung von 283 mg (50.5 μmol) 52 und 30.4 mg (101 μmol) 14a in

2.5 mL Dioxan werden 100 mg zerstoßenes Molekularsieb 4 Å und 25 μL

(2.5 μmol) einer 100 mM Lösung von DBTL in Dioxan gegeben. Nach 30 min

Rühren bei RT wird das Reaktionsgemisch für 3 h auf 80 °C erhitzt und

anschließend über Celite filtriert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem

Druck entfernt und der Rückstand in 4 mL Toluol aufgenommen. Nach Filtration

über Celite und Waschen mit 1 mL Toluol wird das Produkt in 28 mL Et2O gefällt.

Zur Vervollständigung der Fällung wird die Suspension für 30 min bei 5 °C

gelagert. Der farblose Feststoff wird im Anschluss abfiltriert, mit Et2O und n-

Pentan gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. 54 wird in einer Ausbeute von


NH

O

O

O

N

HFF

FF

O

HNO

OO

O

F

NH

O

n

O

NH

O O


- 144 -


CH2), 2.37 (s, CH3), 2.90–2.95 (m, CH2), 3.24 (s, OCH3), 3.41–3.67 (br m, CH2),

4.00–4.05 (m, CH2), 4.97 (s, CH2), 5.19–5.21 (m, CH2), 6.21 (s, CH3CCH), 7.16–

7.69 (m, Ar-H, NH), 8.59 (m, C(N)H), 9.34 (br s, NH), 10.30 (br s, NH).



NH) bestimmt werden. Daraus ergab sich für 54 eine Beladung von 69 %.

mPEG5k-OC(O)N-Hexyl-[4-(methylcarbamat)-3-((hydroxymethyl)-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat)]benzylcarbamat (55)

Zu einer Lösung von 152 mg (27.1 μmol) 52 in 3 mL MeOH werden 50 mg

zerstoßenes Molekularsieb 3 Å und 14 μL (1.4 μmol) einer 100 mM Lösung von

DBTL in Dioxan gegeben. Nach 10 min Rühren bei RT wird das Reaktionsgemisch

für 3 h unter Reflux erhitzt und anschließend über Celite filtriert. Das Produkt wird

in 15 mL Et2O gefällt. Zur Vervollständigung der Fällung wird die Suspension für

30 min bei – 20 °C gelagert. Der farblose Feststoff wird im Anschluss abfiltriert, mit

Et2O und n-Pentan gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. 55 wird in einer


NH

O

O

O

O

NH

OHNO

OO

On

O

NH

O O


CH2), 2.36 (s, CH3), 2.90–2.97 (m, CH2), 3.24 (s, CH2OCH3), 3.44–3.66 (br m,

CH2, NC(O)OCH3), 4.02–4.04 (m, CH2), 4.96 (s, CH2), 5.19 (s, CH2), 6.19 (s,

CH3CCH), 7.13–7.68 (m, Ar-H, NH), 9.18 (br s, NH), 10.25 (br s, NH).


- 145 -

Durch Integration konnte das Verhältnis der Protonen am PEG zu den drei

Protonen im Bereich von 7.16–7.69 ppm bestimmt werden. Daraus ergab sich für

55 eine Beladung von 57 %.

6.2.8 Synthese der niedermolekularen Modellverbindungen 56 und 57

tert.-Butyl-N-2-(hydroxymethyl)phenylcarbamat (58) Zu einer Lösung von 500 mg (4.06 mmol) 2-Aminobenzylalkohol in 10 mL DCM

werden 2.19 mL (10.2 mmol) (Boc)2O gegeben. Nach 24 h Rühren bei RT wird

das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt mittels

Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, iso-Hexan/Ethylacetat 4:1

(v/v)). Nach Trocknen des farblosen Öls im Hochvakuum wird 58 in einer


NH

O

O

OH

C12H17NO3



H), 7.29–7.31 (m, 1H, Ar-H), 7.56–7.58 (m, 1H, Ar-H), 8.52 (br s, 1H, NH).


121.8, 123.3, 127.2, 127.4, 132.7, 136.3 (Ar-C), 152.9 (C(O)NH).


2-(tert.-Butoxycarbonylamino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat (59)

Zu einer Lösung von 102 mg (507 μmol) AMC-NCO (3) in 12 mL THF werden

zerstoßenes Molekularsieb 4 Å (20 mg), 103 mg (461 μmol) 58 und 231 μL


- 146 -

(23.1 μmol) einer 100 mM Lösung von DBTL in Dioxan gegeben. Nach 4.5 h

Rühren bei RT wird das Molekularsieb über Celite abfiltriert und das Lösungsmittel

im Wasserbad bei 30 °C unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird

mittels Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Chloroform/Ethylacetat

8:1 (v/v)). Nach Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 59 in

einer Ausbeute von 169 mg (87 % d. Theorie) erhalten.

NH

O

O

O

O

NH

O O

Smp.: 189–191 °C

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 1.45 (s, 9H, OC(CH3)3), 2.38 (s, 3H,

CH3CCH), 5.20 (s, 2H, CH2), 6.23 (s, 1H, CH3CCH), 7.16–7.20 (m, 1H, Ar-H),

7.29–7.34 (m, 1H, Ar-H), 7.39–7.44 (m, 3H, Ar-H), 7.56 (s, 1H, Ar-H), 7.67–7.70

(m, 1H, Ar-H), 8.82 (br s, 1H, NH), 10.29 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 17.9 (CH3CCH), 28.0 (OC(CH3)3), 62.8

(CH2), 79.0 (OC(CH3)3), 104.3, 111.8, 114.1, 114.2 (CH3CCH, Ar-C), 124.5, 124.7,

125.9, 128.4, 129.0, 129.3, 136.3, 142.6, 153.05, 153.11, 153.5, 153.7, 159.9

(C(O)NH, CH3CCH, C(O)CH, Ar-C).


berechnet: C: 65.08 % H: 5.70 % N: 6.60 %

gefunden: C: 65.43 % H: 6.02 % N: 6.19 %

2-(Amino)benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat-Trifluoracetat (56)

Zu einer Lösung von 30 mg (70.7 μmol) 59 in 1.5 mL DCM werden 1.5 mL TFA


anschließend mit 10 mL Et2O (abs.) gefällt. Nach Waschen des farblosen

Feststoffs mit n-Pentan (abs.) und Trocknen im Hochvakuum wird 56 in einer



- 147 -

+H3N

O

O

NH

O OCF3COO-

C20H17F3N2O6


tert.-Butyl-N-[2-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-4-(hydroxymethyl)]-phenylcarbamat (60) Zu einer Lösung von 2.50 g (9.35 mmol) 2-((tert.-Butyldimethylsilyloxy)methyl)-4-

(hydroxymethyl)anilin*166 in 25 mL DCM werden 5 mL (23.4 mmol) (Boc)2O

gegeben. Nach 40 h Rühren bei RT wird das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck entfernt und das Rohprodukt mittels Flash-Säulenchromatographie gereinigt

(Kieselgel, iso-Hexan/Ethylacetat 3:1 (v/v)). Nach Trocknen des farblosen

Feststoffs im Hochvakuum wird 60 in einer Ausbeute von 3.42 g (99 % d. Theorie)

erhalten.

NH

O

O

OTBS

OH


1.44 (s, 9H, OC(CH3)3), 4.43 (d, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 4.69 (s, 2H, CH2), 5.14 (t,


(m, 1H, Ar-H), 8.41 (br s, 1H, NH).


SiC(CH3)3, OC(CH3)3), 62.4, 62.6 (CH2), 79.0 (OC(CH3)3), 121.9, 125.4, 125.6,

131.5, 134.6, 137.7 (Ar-C), 152.9 (C(O)NH).

* Diese Verbindung war innerhalb der Arbeitsgruppe vorrätig und wurde von einer Mitarbeiterin in einer 6-stufigen Synthese ausgehend von 3-Methyl-4-nitrobenzoesäureethylester dargestellt.


- 148 -

Elementaranalyse: C19H33NO4Si [367.56]

berechnet: C: 62.09 % H: 9.05 % N: 3.81 %

gefunden: C: 62.16 % H: 9.11 % N: 3.47 %

tert.-Butyl-N-[2-((tert.-butyldimethylsilyloxy)methyl)-4-(hydroxymethyl-N-propylcarbamat)]phenylcarbamat (61) Zu einer Suspension von 400 mg (1.09 mmol) 60 in 5 mL THF werden

zerstoßenes Molekularsieb 4 Å (20 mg) und 544 μL (54.4 μmol) einer 100 mM

Lösung von DBTL in Dioxan gegeben. Nach 30 min Rühren bei RT werden 164 μL

(1.74 mmol) Propylisocyanat zugetropft. Die nach 26 h Rühren bei RT

entstandene Lösung wird über Celite filtriert, und das Lösungsmittel wird

anschließend unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird mittels

Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, iso-Hexan/Ethylacetat 7:1

(v/v)). Nach Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum wird 61 in einer


NH

O

O

OTBS

O

O

NH

C23H40N2O5Si

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 0.08 (s, 6H, SiCH3), 0.81–0.86 (m, 3H,

CH2CH2CH3), 0.91 (s, 9H, SiC(CH3)3), 1.37–1.43 (m, 2H, CH2CH2CH3), 1.45 (s,

9H, OC(CH3)3), 2.91–2.96 (m, 2H, CH2CH2CH3), 4.71 (s, 2H, OCH2), 4.95 (s, 2H,

OCH2), 7.18–7.22 (m, 2H, Ar-H, NH), 7.30–7.31 (m, 1H, Ar-H), 7.51–7.53 (m, 1H,

Ar-H), 8.48 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = -5.6, 11.1, 17.7, 22.5, 25.6, 27.9 (SiCH3,

SiC(CH3)3, SiC(CH3)3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH3, OC(CH3)3), 41.9, 62.1, 64.7

(OCH2, CH2CH2CH3), 79.0 (OC(CH3)3), 121.8, 126.6, 127.0, 131.6, 132.4, 135.5

(Ar-C), 152.7, 156.0 (C(O)NH).


- 149 -

tert.-Butyl-N-[2-(hydroxymethyl)-4-((hydroxymethyl)-N-propylcarbamat)]-phenylcarbamat (62) Eine Lösung von 2.46 g (5.44 mmol) 61 in 90 mL eines 50:1-Gemisches aus

MeOH und HCl (1M) wird 22 h bei RT gerührt. Es werden 250 mL Wasser

zugegeben und das Produkt dreimal mit je 100 mL DCM extrahiert. Die

organischen Phasen werden anschließend dreimal mit je 100 mL einer gesättigten

Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Kristallisation

aus einem Gemisch von Ethylacetat und iso-Hexan bei – 20 °C, anschließendes

Waschen mit n-Pentan und Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum

liefert 62 in einer Ausbeute von 1.45 g (79 % d. Theorie).

NH

O

O

OH

O

O

NH

Smp.: 68–70 °C

1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 0.80–0.84 (m, 3H, CH2CH2CH3), 1.37–1.42

(m, 2H, CH2CH2CH3), 1.45 (s, 9H, OC(CH3)3), 2.91–2.96 (m, 2H, CH2CH2CH3),

4.49 (d, J = 5.3 Hz, 2H, OCH2), 4.94 (s, 2H, OCH2), 5.47 (t, J = 5.3 Hz, 1H, OH),

7.17–7.20 (m, 2H, Ar-H, NH), 7.29–7.30 (m, 1H, Ar-H), 7.53–7.55 (m, 1H, Ar-H),

8.53 (br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 11.2, 22.6, 28.0 (CH2CH2CH3, CH2CH2CH3,

OC(CH3)3), 42.0, 60.6, 64.9 (OCH2, CH2CH2CH3), 79.2 (OC(CH3)3), 121.7, 126.9,

127.2, 132.1, 132.7, 135.9 (Ar-C), 152.9, 156.1 (C(O)NH).


berechnet: C: 60.34 % H: 7.74 % N: 8.28 %

gefunden: C: 60.09 % H: 8.01 % N: 8.07 %


- 150 -

tert.-Butyl-N-[2-((hydroxymethyl)-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat)-4-((hydroxymethyl)-N-propylcarbamat)]phenylcarbamat (63) Zu einer Lösung von 400 mg (1.18 mmol) 62 in 5 mL THF werden zerstoßenes

Molekularsieb 4 Å (20 mg) und 590 μL (59.0 μmol) einer 100 mM Lösung von

DBTL in Dioxan gegeben. Nach 10 min Rühren bei RT werden 238 mg

(1.18 mmol) 3 zugesetzt. Zur entstandenen Suspension werden nach 19 h Rühren

bei RT 10 mL THF gegeben, und das Gemisch wird anschließend bis zur Lösung

leicht erwärmt. Das Molekularsieb wird über Celite abfiltriert und das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Kristallisation aus einem

Gemisch von Ethylacetat und iso-Hexan bei – 20 °C, anschließendes Waschen

mit n-Pentan und Trocknen des farblosen Feststoffs im Hochvakuum liefert 63 in


NH

O

O

O

O

O

NH

O

NH

O

O


1H-NMR (400.1 MHz, DMSO-d6): δ = 0.78–0.82 (m, 3H, CH2CH2CH3), 1.35–1.41

(m, 2H, CH2CH2CH3), 1.45 (s, 9H, OC(CH3)3), 2.39 (s, 3H, CH3CCH), 2.89–2.94

(m, 2H, CH2CH2CH3), 4.98 (s, 2H, OCH2), 5.19 (s, 2H, OCH2), 6.24 (s, 1H,

CH3CCH), 7.21–7.23 (m, 1H, NH), 7.28–7.30 (m, 1H, Ar-H), 7.41–7.42 (m, 3H, Ar-

H), 7.56–7.57 (m, 1H, Ar-H), 7.69–7.71 (m, 1H, Ar-H), 8.84 (br s, 1H, NH), 10.31

(br s, 1H, NH).

13C-NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 11.2, 18.0, 22.6, 28.0 (CH3CCH,

CH2CH2CH3, CH2CH2CH3, OC(CH3)3), 42.0, 62.7, 64.7 (OCH2, CH2CH2CH3), 79.2

(OC(CH3)3), 104.4, 111.9, 114.2, 114.3 (CH3CCH, Ar-C), 124.7, 126.0, 128.1,


- 151 -

128.7, 129.2, 133.5, 135.9 (Ar-C), 142.7, 153.17, 153.21, 153.6, 153.8, 156.0,

160.0 (C(O)NH, CH3CCH, C(O)CH, Ar-C).

ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 1101 (15) [2M + Na]+, 562 (100) [M + Na]+.


berechnet: C: 62.33 % H: 6.16 % N: 7.79 %

gefunden: C: 61.90 % H: 6.25 % N: 7.63 %

[2-Amino-5-((hydroxymethyl)-N-propylcarbamat)]benzyl-N-4-methylcumarin-7-yl-carbamat-Trifluoracetat (57)

Zu einer Lösung von 50 mg (92.7 μmol) 63 in 500 μL DCM werden 500 μL TFA


anschließend mit 5 mL Et2O (abs.) gefällt. Nach Waschen des gelben Feststoffs

mit n-Pentan (abs.) und Trocknen im Hochvakuum wird 57 in einer Ausbeute von


+H3N

O

O

O

NH

O

NH

O

O

CF3COO-

C25H26F3N3O8

APCI-MS (5 μA, MeCN): m/z (%) = 396 (100) [X1 + H]–, 337 (30) [X2 + H]–.

H2N

O NH

O

O O

NH

X1

HN

O NH

O

O O

X2

Literatur _________________________________________________________________

- 152 -

7. Literatur 1. Robert Koch-Institut (Hrsg.) und die Gesellschaft der epidemiologischen

Krebsregister in Deutschland e. V. (Hrsg.): Krebs in Deutschland 2005/2006. Häufigkeiten und Trends. 7. Ausgabe. Berlin, 2010.

2. Heng, H. H.; Stevens, J. B.; Bremer, S. W.; Ye, K. J.; Liu, G.; Ye, C. J., J. Cell. Biochem. 2010, 109 (6), 1072-1084.

3. Brooks, S. A.; Lomax-Browne, H. J.; Carter, T. M.; Kinch, C. E.; Hall, D. M., Acta Histochem. 2010, 112 (1), 3-25.

4. Urruticoechea, A.; Alemany, R.; Balart, J.; Villanueva, A.; Vinals, F.; Capella, G., Curr. Pharm. Des. 2010, 16 (1), 3-10.

5. Reichert, J. M., MAbs 2010, 2 (1), 84-100. 6. Shapira, S.; Lisiansky, V.; Arber, N.; Kraus, S., Expert Opin. Invest. Drugs

2010, 19 Suppl 1, S67-77. 7. Cuesta, A. M.; Sainz-Pastor, N.; Bonet, J.; Oliva, B.; Alvarez-Vallina, L.,

Trends Biotechnol. 2010, 28 (7), 355-362. 8. Riaz, W.; Hernandez-Ilizaliturri, F. J.; Czuczman, M. S., Immunol. Res.

2010, 46 (1-3), 192-205. 9. Agrawal, M.; Garg, R. J.; Cortes, J.; Quintas-Cardama, A., Curr. Hematol.

Malig. Rep. 2010, 5 (2), 70-80. 10. Stegmeier, F.; Warmuth, M.; Sellers, W. R.; Dorsch, M., Clin. Pharmacol.

Ther. 2010, 87 (5), 543-552. 11. Klyuchnikov, E.; Kroger, N.; Brummendorf, T. H.; Wiedemann, B.; Zander,

A. R.; Bacher, U., Biol. Blood Marrow Transplant. 2010, 16 (3), 301-310. 12. Jovanovic, J.; Ronneberg, J. A.; Tost, J.; Kristensen, V., Mol. Oncol. 2010,

4 (3), 242-254. 13. Albert, M.; Helin, K., Semin. Cell Dev. Biol. 2010, 21 (2), 209-220. 14. Spannhoff, A.; Sippl, W.; Jung, M., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2009, 41 (1),

4-11. 15. Müller, S.; Kramer, O. H., Curr. Cancer Drug Targets 2010, 10 (2), 210-228. 16. Ghayad, S. E.; Cohen, P. A., Recent Pat. Anti-Cancer Drug Discovery

2010, 5 (1), 29-57. 17. Kessler, T.; Bayer, M.; Schwoppe, C.; Liersch, R.; Mesters, R. M.; Berdel,

W. E., Recent Results Cancer Res. 2010, 180, 137-163. 18. Allende-Vega, N.; Saville, M. K., Semin. Cancer Biol. 2010, 20 (1), 29-39. 19. Genin, E.; Reboud-Ravaux, M.; Vidal, J., Curr. Top. Med. Chem. 2010, 10

(3), 232-256. 20. Colland, F., Biochem. Soc. Trans. 2010, 38 (Pt 1), 137-143. 21. Fry, T. J.; Lankester, A. C., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2010, 24 (1),

109-127. 22. Bell, D. W., J. Pathol. 2010, 220 (2), 231-243. 23. Kratz, F.; Müller, I. A.; Ryppa, C.; Warnecke, A., ChemMedChem 2008, 3

(1), 20-53. 24. Thanou, M.; Duncan, R., Curr. Opin. Invest. Drugs 2003, 4 (6), 701-709. 25. Ouchi, T.; Ohya, Y., Prog. Polym. Sci. 1995, 20, 211-257. 26. Xu, S.; Kramer, M.; Haag, R., J. Drug Targeting 2006, 14 (6), 367-374. 27. Wahl, R. L., J. Nucl. Med. 2005, 46 Suppl 1, 128S-140S. 28. Luczynski, W.; Krawczuk-Rybak, M., Postepy Hig. Med. Dosw. 2002, 56 (6),

789-801.

Literatur _________________________________________________________________

- 153 -

29. Mousa, S. A., Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6 (4), 534-541. 30. Meyer, A.; Auernheimer, J.; Modlinger, A.; Kessler, H., Curr. Pharm. Des.

2006, 12 (22), 2723-2747. 31. Desgrosellier, J. S.; Cheresh, D. A., Nat. Rev. Cancer 2010, 10 (1), 9-22. 32. Low, P. S.; Kularatne, S. A., Curr. Opin. Chem. Biol. 2009, 13 (3), 256-262. 33. Ross, J. F.; Chaudhuri, P. K.; Ratnam, M., Cancer 1994, 73 (9), 2432-2443. 34. Richards, F. F.; Konigsberg, W. H.; Rosenstein, R. W.; Varga, J. M.,

Science 1975, 187 (4172), 130-137. 35. Cameron, D. J.; Erlanger, B. F., Nature 1977, 268 (5622), 763-765. 36. Jain, R. K., Annu. Rev. Biomed. Eng. 1999, 1, 241-263. 37. Alley, S. C.; Okeley, N. M.; Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14

(4), 529-537. 38. Markman, B.; Tabernero, J., Curr. Clin. Pharmacol. 2010, 5 (3), 160-165. 39. Stasi, R., Expert Opin. Biol. Ther. 2008, 8 (4), 527-540. 40. Seki, T.; Fang, J.; Maeda, H., Cancer Sci. 2009, 100 (12), 2426-2430. 41. Fox, M. E.; Szoka, F. C.; Frechet, J. M., Acc. Chem. Res. 2009, 42 (8),

1141-1151. 42. Torchilin, V., Adv. Drug Delivery Rev. 2010, in press. 43. Maeda, H., Bioconjugate Chem. 2010, 21 (5), 797-802. 44. Matsumura, Y.; Maeda, H., Cancer Res. 1986, 46 (12 Pt 1), 6387-6392. 45. Kopecek, J.; Kopeckova, P., Adv. Drug Delivery Rev. 2010, 62 (2), 122-149. 46. Duncan, R., Pharm. Sci. Technol. Today 1999, 2 (11), 441-449. 47. Kissel, M.; Peschke, P.; Subr, V.; Ulbrich, K.; Schuhmacher, J.; Debus, J.;

Friedrich, E., PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2001, 55 (3), 191-201. 48. Yamaoka, T.; Tabata, Y.; Ikada, Y., J. Pharm. Sci. 1994, 83 (4), 601-606. 49. Murakami, Y.; Tabata, Y.; Ikada, Y., Drug Delivery 1997, 4, 23-31. 50. Singer, J. W.; Bhatt, R.; Tulinsky, J.; Buhler, K. R.; Heasley, E.; Klein, P.; de

Vries, P., J. Control. Release 2001, 74, 243-247. 51. Kakinoki, A.; Kaneo, Y.; Ikeda, Y.; Tanaka, T.; Fujita, K., Biol. Pharm. Bull.

2008, 31 (1), 103-110. 52. Kakinoki, A.; Kaneo, Y.; Tanaka, T.; Hosokawa, Y., Biol. Pharm. Bull. 2008,

31 (5), 963-969. 53. Wunder, A.; Stehle, G.; Sinn, H.; Schrenk, H. H.; Hoff-Biederbeck, D.;

Bader, F.; Friedrich, E. A.; Peschke, P.; Maier-Borst, W.; Heene, D. L., Int. J. Oncol. 1997, 11, 497-507.

54. Qu, X.; Yang, C.; Zhang, J.; Ding, N.; Lu, Y.; Huang, L.; Xiang, G., J. Drug Targeting 2010, 18 (5), 351-361.

55. Ghosh, S., J. Chem. Res. 2004, 241-246. 56. Leonard, M.; Dellacherie, E., Biochim. Biophys. Acta 1984, 791 (2), 219-

225. 57. Katre, N. V.; Knauf, M. J.; Laird, W. J., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987,

84 (6), 1487-1491. 58. Okada, M.; Matsushima, A.; Katsuhata, A.; Aoyama, T.; Ando, T.; Inada, Y.,

Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1985, 76 (1), 79-81. 59. Pasut, G.; Canal, F.; Dalla Via, L.; Arpicco, S.; Veronese, F. M.; Schiavon,

O., J. Control. Release 2008, 127 (3), 239-248. 60. Pasut, G.; Veronese, F. M., Adv. Drug Delivery Rev. 2009, 61 (13), 1177-

1188. 61. Zhu, S.; Hong, M.; Tang, G.; Qian, L.; Lin, J.; Jiang, Y.; Pei, Y., Biomaterials

2010, 31 (6), 1360-1371.

Literatur _________________________________________________________________

- 154 -

62. D'Souza, A. J.; Topp, E. M., J. Pharm. Sci. 2004, 93 (8), 1962-1979. 63. Guiotto, A.; Canevari, M.; Orsolini, P.; Lavanchy, O.; Deuschel, C.; Kaneda,

N.; Kurita, A.; Matsuzaki, T.; Yaegashi, T.; Sawada, S.; Veronese, F. M., J. Med. Chem. 2004, 47 (5), 1280-1289.

64. Dubowchik, G. M.; Mosure, K.; Knipe, J. O.; Firestone, R. A., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8 (23), 3347-3352.

65. Hofmann, U. B.; Westphal, J. R.; Waas, E. T.; Zendman, A. J.; Cornelissen, I. M.; Ruiter, D. J.; van Muijen, G. N., Br. J. Cancer 1999, 81 (5), 774-782.

66. Jones, G. B.; Crasto, C. F.; Mathews, J. E.; Xie, L.; Mitchell, M. O.; El-Shafey, A.; D'Amico, A. V.; Bubley, G. J., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14 (2), 418-425.

67. Gullbo, J.; Wickström, M.; Tullberg, M.; Ehrsson, H.; Lewensohn, R.; Nygren, P.; Luthman, K.; Larsson, R., J. Drug Targeting 2003, 11 (6), 355-363.

68. Shamis, M.; Lode, H. N.; Shabat, D., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126 (6), 1726-1731.

69. Duimstra, J. A.; Femia, F. J.; Meade, T. J., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127 (37), 12847-12855.

70. Denny, W. A., Future Oncol. 2010, 6 (3), 419-428. 71. Granchi, C.; Funaioli, T.; Erler, J. T.; Giaccia, A. J.; Macchia, M.; Minutolo,

F., ChemMedChem 2009, 4 (10), 1590-1594. 72. Huang, B.; Tang, S.; Desai, A.; Cheng, X. M.; Kotlyar, A.; Van Der Spek, A.;

Thomas, T. P.; Baker, J. R., Jr., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19 (17), 5016-5020.

73. Tannock, I. F.; Rotin, D., Cancer Res. 1989, 49 (16), 4373-4384. 74. Hay, M. P.; Sykes, B. M.; Denny, W. A.; O`Connor, C. J., J. Chem. Soc.,

Perkin Trans. 1 1999, 2759-2770. 75. Senter, P. D.; Pearce, W. E.; Greenfield, R. S., J. Org. Chem. 1989, 55 (9),

2975-2978. 76. Serresi, M.; Bizzarri, R.; Cardarelli, F.; Beltram, F., Anal. Bioanal. Chem.

2009, 393 (4), 1123-1133. 77. Gillies, E. R.; Goodwin, A. P.; Frechet, J. M., Bioconjugate Chem. 2004, 15

(6), 1254-1263. 78. Svarovsky, S. A.; Taraban, M. B.; Barchi Jr., J. J., Org. Biomol. Chem.

2004, 2 (21), 3155-3161. 79. Bruyère, H.; Westwell, A. D.; Jones, A. T., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010,

20, 2200-2203. 80. Huang, X.; Du, F.; Cheng, J.; Dong, Y.; Liang, D.; Ji, S.; Lin, S.-S.; Li, Z.,

Macromol. 2009, 42, 783-790. 81. Remenyi, J.; Csik, G.; Kovacs, P.; Reig, F.; Hudecz, F., Biochim. Biophys.

Acta 2006, 1758 (3), 280-289. 82. Lavignac, N.; Nicholls, J. L.; Ferruti, P.; Duncan, R., Macromol. Biosci.

2009, 9 (5), 480-487. 83. Kratz, F.; Beyer, U.; Schütte, M. T., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 1999,

16 (3), 245-288. 84. Yang, J.; Kong, S. D.; Luong, A.; Howell, S., Acid-sensitive linkers for drug

delivery. WO 2007/114946 A2, 2006. 85. Kratz, F., Expert Opin. Invest. Drugs 2007, 16 (6), 855-866. 86. Aryal, S.; Hu, C. M.; Zhang, L., ACS Nano 2010, 4 (1), 251-258. 87. Kale, A. A.; Torchilin, V. P., Bioconjugate Chem. 2007, 18 (2), 363-370.

Literatur _________________________________________________________________

- 155 -

88. Rodrigues, P. C. A.; Roth, T.; Fiebig, H. H.; Unger, C.; Mülhaupt, R.; Kratz, F., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14 (12), 4110-4117.

89. Bae, Y.; Fukushima, S.; Harada, A.; Kataoka, K., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42 (38), 4640-4643.

90. Yao, K.; Peng, T.; Xu, M.; Yuan, C., Polym. Int. 1994, 34, 213-219. 91. Sedlak, M.; Pravda, M.; Staud, F.; Kubicova, L.; Tycova, K.; Ventura, K.,

Bioorg. Med. Chem. 2007, 15 (12), 4069-4076. 92. Yang, J.; Chen, H.; Vlahov, I. R.; Cheng, J. X.; Low, P. S., J. Pharmacol.

Exp. Ther. 2007, 321 (2), 462-468. 93. Mukherjee, S.; Ghosh, R. N.; Maxfield, F. R., Physiol. Rev. 1997, 77 (3),

759-803. 94. Jain, R.; Standley, S. M.; Fréchet, J. M. J., Macromol. 2007, 40, 452-457. 95. Ding, C.; Gu, J.; Qu, X.; Yang, Z., Bioconjug. Chem. 2009, 20 (6), 1163-

1170. 96. Knorr, V.; Ogris, M.; Wagner, E., Pharm. Res. 2008, 25 (12), 2937-2945. 97. Yang, S. C.; Bhide, M.; Crispe, I. N.; Pierce, R. H.; Murthy, N., Bioconjug.

Chem. 2008, 19 (6), 1164-1169. 98. Murthy, N.; Xu, M.; Schuck, S.; Kunisawa, J.; Shastri, N.; Frechet, J. M.,

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100 (9), 4995-5000. 99. Chan, Y.; Wong, T.; Byrne, F.; Kavallaris, M.; Bulmus, V.,

Biomacromolecules 2008, 9 (7), 1826-1836. 100. Chen, W.; Meng, F.; Li, F.; Ji, S. J.; Zhong, Z., Biomacromolecules 2009,

10, 1727-1735. 101. Kratz, F.; Warnecke, A.; Schmid, B.; Chung, D.-E.; Gitzel, M., Curr. Med.

Chem. 2006, 13, 763-771. 102. Sedlak, M.; Pravda, M.; Kubicova, L.; Mikulcikova, P.; Ventura, K., Bioorg.

Med. Chem. Lett. 2007, 17 (9), 2554-2557. 103. Etrych, T.; Sirova, M.; Starovoytova, L.; Rihova, B.; Ulbrich, K., Mol. Pharm.

2010, 7 (4), 1015-1026. 104. Campo, V. L.; Carvalho, I., Curr. Methods Med. Chem. Biol. Phys. 2008, 2,

187-214. 105. Ettmayer, P.; Amidon, G. L.; Clement, B.; Testa, B., J. Med. Chem. 2004,

47 (10), 2393-2404. 106. Rautio, J.; Kumpulainen, H.; Heimbach, T.; Oliyai, R.; Oh, D.; Jarvinen, T.;

Savolainen, J., Nat. Rev. Drug Discov. 2008, 7 (3), 255-270. 107. Bundgaard, H., Adv. Drug Delivery Rev. 1989, 3, 39-65. 108. Elsadek, B.; Gräser, R.; Warnecke, A.; Unger, C.; Saleem, T.; El-Melegy,

N.; Madkor, H.; Kratz, F., ACS Med. Chem. Lett. 2010, 1 (5), 234-238. 109. Dubowchik, G. M.; Firestone, R. A., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8 (23),

3341-3346. 110. Tranoy-Opalinski, I.; Fernandes, A.; Thomas, M.; Gesson, J. P.; Papot, S.,

Anti-Cancer Agents Med. Chem. 2008, 8 (6), 618-637. 111. Carl, P. L.; Chakravarty, P. K.; Katzenellenbogen, J. A., J. Med. Chem.

1981, 24 (5), 479-480. 112. Wakselman, M., Nouv. J. Chem. 1983, 7, 439-447. 113. de Groot, F. M.; de Bart, A. C.; Verheijen, J. H.; Scheeren, H. W., J. Med.

Chem. 1999, 42 (25), 5277-5283. 114. Greenwald, R. B.; Pendri, A.; Conover, C. D.; Zhao, H.; Choe, Y. H.;

Martinez, A.; Shum, K.; Guan, S., J. Med. Chem. 1999, 42, 3657-3667.

Literatur _________________________________________________________________

- 156 -

115. Perry-Feigenbaum, R.; Baran, P. S.; Shabat, D., Org. Biomol. Chem. 2009, 7 (23), 4825-4828.

116. Damen, E. W. P.; Nevalainen, T. J.; van den Bergh, T. J. M.; de Groot, F. M. H.; Scheeren, H. W., Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 71-77.

117. Rivault, F.; Tranoy-Opalinski, I.; Gesson, J. P., Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 675-682.

118. Greenwald, R. B.; Choe, Y. H.; Conover, C. D.; Shum, K.; Wu, D.; Royzen, M., J. Med. Chem. 2000, 43 (3), 475-487.

119. de Groot, F. M.; van Berkom, L. W.; Scheeren, H. W., J. Med. Chem. 2000, 43 (16), 3093-3102.

120. Ge, Y.; Wu, X.; Zhang, D.; Hu, L., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19 (3), 941-944.

121. Meyer, Y.; Richard, J. A.; Delest, B.; Noack, P.; Renard, P. Y.; Romieu, A., Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 1777-1780.

122. Wang, B.; Zhang, H.; Wang, W., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 945. 123. Wang, B.; Zhang, H.; Zheng, A.; Wang, W., Bioorg. Med. Chem. 1998, 6

(4), 417-426. 124. Abu Ajaj, K.; Biniossek, M. L.; Kratz, F., Bioconjugate Chem. 2009, 20 (2),

390-396. 125. Burke, P. J.; Senter, P. D.; Meyer, D. W.; Miyamoto, J. B.; Anderson, M.;

Toki, B. E.; Manikumar, G.; Wani, M. C.; Kroll, D. J.; Jeffrey, S. C., Bioconjugate Chem. 2009, 20 (6), 1242-1250.

126. Miller, K.; Erez, R.; Segal, E.; Shabat, D.; Satchi-Fainaro, R., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48 (16), 2949-2954.

127. Niculescu-Duvaz, D.; Niculescu-Duvaz, I.; Friedlos, F.; Martin, J.; Spooner, R.; Davies, L.; Marais, R.; Springer, C. J., J. Med. Chem. 1998, 41, 5297-5309.

128. Barthel, B. L.; Zhang, Z.; Rudnicki, D. L.; Coldren, C. D.; Polinkovsky, M.; Sun, H.; Koch, G. G.; Chan, D. C.; Koch, T. H., J. Med. Chem. 2009, 52 (23), 7678-7688.

129. Gao, S. Q.; Lu, Z. R.; Petri, B.; Kopeckova, P.; Kopecek, J., J. Control. Release 2006, 110 (2), 323-331.

130. Warnecke, A.; Kratz, F., J. Org. Chem. 2008, 73 (4), 1546-1552. 131. Sagi, A.; Weinstain, R.; Karton, N.; Shabat, D., J. Am. Chem. Soc. 2008,

130 (16), 5434-5435. 132. Weinstain, R.; Baran, P. S.; Shabat, D., Bioconjugate Chem. 2009, 20 (9),

1783-1791. 133. de Groot, F. M.; Albrecht, C.; Koekkoek, R.; Beusker, P. H.; Scheeren, H.

W., Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42 (37), 4490-4494. 134. Niculescu-Duvaz, I.; Niculescu-Duvaz, D.; Friedlos, F.; Spooner, R.; Martin,

J.; Marais, R.; Springer, C. J., J. Med. Chem. 1999, 42 (13), 2485-2489. 135. de Groot, F. M. H., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2371-2376. 136. Jeffrey, S. C.; Torgov, M. Y.; Andreyka, J. B.; Boddington, L.; Cerveny, C.

G.; Denny, W. A.; Gordon, K. A.; Gustin, D.; Haugen, J.; Kline, T.; Nguyen, M. T.; Senter, P. D., J. Med. Chem. 2005, 48, 1344-1358.

137. van Brakel, R.; Vulders, R. C.; Bokdam, R. J.; Grull, H.; Robillard, M. S., Bioconjugate Chem. 2008, 19 (3), 714-718.

138. Shabat, D.; Amir, R. J.; Gopin, A.; Pessah, N.; Shamis, M., Chemistry 2004, 10 (11), 2626-2634.

139. Tidwell, T. T., Angew. Chem. 2008, 120 (6), 1032-1036.

Literatur _________________________________________________________________

- 157 -

140. Müller, I. A.; Kratz, F.; Jung, M.; Warnecke, A., Tetrahedron Lett. 2010, 51 (33), 4371-4374.

141. Maly, D. J.; Leonetti, F.; Backes, B. J.; Dauber, D. S.; Harris, J. L.; Craik, C. S.; Ellman, J. A., J. Org. Chem. 2002, 67, 910-915.

142. Wicks, Z. W., Prog. Org. Coat. 1975, 3, 73-99. 143. Linn, C. P.; Mize, P. D.; Hoke, R. A.; Quante, J. M.; Pitner, J. B., Anal.

Biochem. 1992, 200, 400-404. 144. Erez, R.; Shabat, D., Org. Biomol. Chem. 2008, 6 (15), 2669-2672. 145. Hammett, L. P., J. Am. Chem. Soc. 1937, 59 (1), 96-103. 146. Chapman, N. B.; Shorter, J., Correlation analysis in chemistry - recent

advances. Plenum Press: New York, 1978. 147. Hart, H.; Sedor, E. A., J. Am. Chem. Soc. 1967, 89 (10), 2342-2347. 148. Um, I. H.; Lee, J. Y.; Kim, H. T.; Bae, S. K., J. Org. Chem. 2004, 69, 2436-

2441. 149. Cordes, E. H.; Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 1962, 84 (5), 832-837. 150. Cordes, E. H.; Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 1963, 85 (18), 2843-2848. 151. Pitea, D.; Favini, G.; Grasso, D., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1974, 2,

1595-1600. 152. Carey, F. A.; Sundberg, R. J., Organische Chemie - Ein weiterführendes

Lehrbuch. 2. korr. Nachdruck; WILEY-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA: Weinheim, 2004; 434-435.

153. Kragh-Hansen, U.; Chuang, V. T.; Otagiri, M., Biol. Pharm. Bull. 2002, 25 (6), 695-704.

154. Vallner, J. J., J. Pharm. Sci. 1977, 66 (4), 447-465. 155. Kratz, F., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 2010, 48 (7), 453-455. 156. Veronese, F. M.; Schiavon, O.; Pasut, G.; Mendichi, R.; Andersson, L.;

Tsirk, A.; Ford, J.; Wu, G.; Kneller, S.; Davies, J.; Duncan, R., Bioconjugate Chem. 2005, 16 (4), 775-784.

157. Nuhn, P., Pharmazie 1975, 30 (8), 544-545. 158. Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.

2001, 40 (11), 2004-2021. 159. Hein, C. D.; Liu, X.-M.; Wang, D., Pharm. Res. 2008, 25 (10), 2216-2230. 160. van Dijk, M.; Rijkers, D. T. S.; Liskamp, R. M. J.; van Nostrum, C. F.;

Hennink, W. E., Bioconjugate Chem. 2009, 20 (11), 2001-2016. 161. Dordunoo, S. K.; Burt, H. M., Int. J. Pharm. 1996, 133 (1-2), 191-201. 162. Elsadek, B., unveröffentlichte Ergebnisse. 163. Rahman, A.; Jonnalagadda, S. B., Catal. Lett. 2008, 123, 264-268. 164. Sander, M., Monatsh. Chem. 1964, 95 (2), 608-616. 165. Kratz, F.; Beyer, U., Drug Delivery 1998, 5, 281-299. 166. Warnecke, A., unveröffentlichte Ergebnisse. 167. Matsumura, Y., Jpn. J. Clin. Oncol. 2008, 38 (12), 793-802. 168. Musacchio, T.; Laquintana, V.; Latrofa, A.; Trapani, G.; Torchilin, V. P., Mol.

Pharm. 2009, 6 (2), 468-479. 169. Children's Hospital Boston: New oral angiogenesis inhibitor offers potential

nontoxic therapy for a wide range of cancers. ScienceDaily 30 June, 2008, <http://www.sciencedaily.com /releases/2008/06/080630114209.htm>.

170. de Groot, F. M. H.; Beusker, P. H.; Scheeren, J. W., Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers. WO 2004/043493 A1, 2004.

http://www.sciencedaily.com/

Anhang _________________________________________________________________

- 158 -

Anhang

A-1: Auftragungen zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k1 und der

Halbwertszeiten t1/2 für die AMC-Freisetzung aus 1b und 4b–14b:*

pH 5.0 (Acetat-Puffer, 20 mM)

y = -0.0205x - 0.5578R2 = 0.9837

y = -0.0415x - 0.4088R2 = 0.9942

y = -0.0346x - 0.5242R2 = 0.9927

-3.2

-2.7

-2.2

-1.7

-1.2

-0.7

0 10 20 30 40 50 60t /min

ln[1

-(c/c

∞)]

1b

4b

5b

y = -0.026x - 0.3282R2 = 0.9918

y = -0.0245x - 0.6904R2 = 0.9778

y = -0.0114x - 0.1446R2 = 0.9949

-2.3

-1.8

-1.3

-0.8

-0.3

0 10 20 30 40 50 60t /min

ln[1

-(c/c

∞)]

6b

8b

9b

* c = Konzentration zum Zeitpunkt t; c∞ = extrapolierte Endkonzentration (pH 5: Messungen im 30 minütigen Abstand, bis sich die Konzentration erstmals um weniger als 0.1 % ändert; pH 7.4: Da die Messungen aufgrund der langsamen Hydrolysegeschwindigkeit vor Ende der Reaktion abgebrochen werden mussten, wurden die bei pH 5 ermittelten Konzentrationen für die Auswertung verwendet.)

Anhang _________________________________________________________________

- 159 -

y = -0.0185x - 0.2183R2 = 0.9926

y = -0.0086x - 0.2091R2 = 0.9985

y = -0.0138x - 0.0924R2 = 0.9941

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

00 10 20 30 40 50 60

t /minln

[1-(c

/c∞)]

7b

10b

11b

y = -0,0213x - 0,1842R2 = 0,9973

y = -0.0204x - 0.0808R2 = 0.9974

y = -0.004x - 0.0421R2 = 0.9999

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

00 10 20 30 40 50 60

t /min

ln[1

-(c/c

∞)]

12b

13b

14b

Anhang _________________________________________________________________

- 160 -

pH 7.4 (Phosphat-Puffer, 20 mM)

y = -0.0836x - 0.1048R2 = 0.9985

y = -0.0266x - 0.0308R2 = 0.9971

y = -0.055x - 0.0172R2 = 0.9994

-2.75

-2.25

-1.75

-1.25

-0.75

-0.25

0 5 10 15 20 25t /h

ln[1

-(c/c

∞)]

1b

4b

5b

y = -0.0486x + 0.0085R2 = 0.9957

y = -0.0731x - 0.0642R2 = 0.998

y = -0.0192x - 0.0207R2 = 0.9987

-2.25

-1.75

-1.25

-0.75

-0.25

0 5 10 15 20 25t /h

ln[1

-(c/c

∞)]

6b

8b

9b

y = -0.0192x - 0.0643R2 = 0.999

y = -0.0107x - 0.0411R2 = 0.9858

y = -0.0138x - 0.0648R2 = 0.9848

-0.65

-0.55

-0.45

-0.35

-0.25

-0.15

-0.050 5 10 15 20 25

t /h

ln[1

-(c/c

∞)]

7b

10b

11b

Anhang _________________________________________________________________

- 161 -

y = -0.0178x - 0.0408R2 = 0.9963

y = -0.0078x - 0.0648R2 = 0.9935

y = -0.0019x - 0.0525R2 = 0.9907

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

00 5 10 15 20 25

t /h

ln[1

-(c/c

∞)]

12b

13b

14b

A-2: Auftragung zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k2 und der

Halbwertszeit t1/2 für die AMC-Freisetzung durch 1,4-Benzyleliminierung von 56

und 57 bei pH 7.4 (c∞ = extrapolierte Endkonzentration; Messungen im

30 minütigen Abstand, bis sich die Konzentration erstmals um weniger als 0.1 %

ändert):

y = -0.0533x + 0.0517R2 = 0.9961

y = -0.0141x - 0.0096R2 = 0.999

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

00 5 10 15 20 25 30 35

t /min

ln[1

-(c/c

∞)] 56

57

Entwicklung säurelabiler Trigger-Gruppen auf Basis von ...

Documents

Transcript of Entwicklung säurelabiler Trigger-Gruppen auf Basis von ...