Enzym-katalytische Entschleimung von Sonnenblumenöl zur ...edoc.sub.uni- · PDF...

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  • Enzym-katalytische Entschleimung von Sonnenblumenöl zur Steigerung der

    Ölausbeute

    Von der Fakultät für Maschinenbau

    der Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg

    zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktor-Ingenieurs

    genehmigte

    DISSERTATION

    vorgelegt von

    Oliver Wenzel

    aus Eberswalde

    Hamburg 2015

  •  

    Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2015

    Erster Gutachter: Prof. Dr.-Ing. Bernd Niemeyer

    Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg

    Zweiter Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Wierschem

    Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

  • Für meine Eltern

  •  

  • Danksagung Diese Arbeit entstand an der Professur für Verfahrenstechnik insbesondere Stofftrennung der Fakultät

    für Maschinenbau an der Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg im

    Rahmen meiner Tätigkeit als wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Zeit von April 2012 bis März 2015.

    Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr.-Ing. Bernd Niemeyer für die Überlassung dieses spannenden

    Themas, die gute Zusammenarbeit und den steten fachlichen Rat. Ferner danke ich Prof. Dr. rer. nat.

    Andreas Wierschem für die Übernahme des zweiten Gutachtens.

    Meinen Kollegen Dr.-Ing. José Fernández, Dr.-Ing. Daniela Herbst und Johann Puerta danke ich für

    die Gespräche und zahlreichen Diskussionen, die stets neue und kritische Perspektiven auf meine

    Arbeit gewährten und so zum Fortgang der Untersuchungen maßgeblich beitrugen. Für die tatkräftige

    Unterstützung im Labor danke ich ganz besonders Tatjana Distel, ebenso wie den studentischen

    Hilfskräften Salim Erdal, Sabrina Förster und Alexandra Hinsch.

    Dem Kollegium der Clariant Produkte GmbH Dr. Ulrich Sohling, Dr. Kirstin Suck, Dr. Andrea Stege,

    Marion Roßbauer und Karin Oberprieler gilt großer Dank für den fachlichen Rat und

    Gedankenaustausch bei der Methodenentwicklung und praktischen Umsetzung, sowie für die

    Bereitstellung von Analysekapazitäten im Rahmen des Projektes P38.

    Christian Lüder von der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover danke ich für die Durchführung

    der Versuche mit dem In-situ-Videomikroskop.

    Zuletzt danke ich meinen Eltern, die mich zu jedem Zeitpunkt unterstützen und immer an mich

    glauben.

  •  

  • Aus dieser Arbeit sind folgende Veröffentlichungen hervorgegangen:

    Beiträge in Monographien:

    U. Sohling, K. Suck, P. Jonczyk, F. Sander, S. Beutel, T. Scheper, A. Thiefes, U. Schuldt, C. Aldenhoven, G. Egri, L. Dähne, A. Fiethen, H. Kuhn, O. Wenzel, H. Temme, B. Niemeyer, P. Bubenheim, A. Liese, 2015, Inorganic Adsorbents in Enzymatic Processes: Adsorption of Substrates, Reaction Products, Enzymes, Surface Modification, and Enzyme Immobilization, in: L. Hilterhaus, A. Liese, U. Ketting, G. Antranikian (eds.), Applied Biocatalysis – From Fundamental Science to Industrial Applications, VCH-Wiley, Weinheim, FRG, voraussichtlich 2016.

    Beiträge in referierten Zeitschriften:

    O. Wenzel, J. Fernández, U. Sohling, B. Niemeyer, 2015, Quantitative Determination of Natural Glycolipids from Oil Seed by High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC), Journal of the American Oil Chemists’ Society, 92, 633-644.

    Beiträge zu Konferenzen:

    O. Wenzel, B. Niemeyer, 2014, Quantitative Determination of Natural Glycolipids in Vegetable Oils by High-Performance Thin-Layer Chromatography (P), 21st International Congress of Chemical and Process Engineering CHISA 2014 Prague, 17th Conference on Process Integration, Modelling and Optimisation for Energy Saving and Pollution Reduction PRES 2014, 23.-27. August 2014, Prag, Tschechische Republik, Section: Symposium on Progress in Chemical Technology and Biotechnology, Serial no 151.

    U. Sohling, A. Weckbecker, A. Thiefes, S. Beutel, C. Aldenhoven, C. Leggewie, A. Fiethen, J.-C. Antony, K. Suck, H. Kuhn, L. Dähne, A. Liese, L. Herring, B. Niemeyer, O. Wenzel, P. Bubenheim, S. Schreiber, T. Scheper, U. Schuldt, 2015, Biokatalyse 2021: Verbundprojekt – Neue Reaktionskonzepte für enzymatische Reaktionen auf Basis von immobilisierten Enzymen (V), Deutsche Biotechnologietage 2015, 22.-23. April 2015, Köln, Vortrag 22.04.2015.

  •  

  • Inhaltsverzeichnis Vorbemerkung

    I

    Abkürzungsverzeichnis

    I

    Formelverzeichnis

    III

    1 Motivation

    1

    2 Theoretische Grundlagen 2.1 Sonnenblumenöl – Ursprung und Zusammensetzung 2.2 Ölgewinnung aus der Saat 2.3 Pflanzenölraffination a) Entschleimung b) Neutralisation (chemische Entfernung der FFA) c) Bleichen d) Desodorierung & physikalische Entfernung freier Fettsäuren 2.4 Enzymatische Entschleimung 2.5 Enzymatische Katalyse an Grenzflächen

    3

    3

    8

    10 11 15 16 17

    18

    21

    3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Chemikalien 3.1.1 Handelsübliche Geräte und Chemikalien 3.1.2 Versuchsapparatur „Ölentschleimung“ 3.1.3 In-situ-Videomikroskop 3.2 Methoden 3.2.1 Ölentschleimung 3.2.2 Externe Analysen a) Optische Atomemissions-Spektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES) b) Bestimmung freier Fettsäuren (FFA) c) Karl Fischer Titration (KF-Ttration) 3.2.3 In-situ-Videomikroskopie 3.2.4 Enzym-Peptid-Modifikationen a) Konjugation von Enzym und Peptid b) Bestimmung der Aktivität

    3.2.5 Ober- und Grenzflächenspannung a) Ringmethode

    25

    25

    25

    25

    26

    27

    27

    30 30

    30 31

    32

    33 33 36

    36 37

  •  

    b) Plattenmethode c) Grenzflächenspannungen d) Dichtebestimmung 3.2.6 Glycolipidanalytik (GL-Analytik) a) Fraktionierung b) High-Performance Thin-Layer Chromatogrphy

    37 38 38

    38 39 40

    4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Ölentschleimung a) Systemoptimierung b) Vergleich unterschiedlicher Ansätze der Ölentschleimung

    4.2 Charakterisierung der Vorgänge während der Entschleimung a) Saure Entschleimung b) Enzymatische Entschleimung 4.3 Enzym-Peptid-Modifikationen a) Enzymaktivität b) Oberflächenspannung c) Ölentschleimung

    4.4 Glycolipidanalytik (GL-Analytik) a) Trennmethodik b) Optimierung der Derivatisierung und Detektion c) Kalibrierung d) Analyse von Ölschleimproben e) Einsatz der HPTLC zum Nachweis von Enzymaktivität

    43

    43 43 53

    59 63 65

    68 68 72 74

    80 80 82 86 89 92

    5 Zusammenfassung und Ausblick

    97

    Literaturverzeichnis

    V

    Abbildungsverzeichnis

    X

    Tabellenverzeichnis

    XIII

    Anhang A

  • I  

    Vorbemerkung Diese vorliegende Arbeit entstand durch die Förderung des Clusters „BIOKATALYSE2021“ durch das

    Bundesministerium für Bildung und Forschung. Die Professur für Verfahrenstechnik, insb.

    Stofftrennung, der Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg beteiligte sich

    hierbei am Konsortium des Projektes P38 „Neue Reaktionskonzepte für enzymatische Reaktionen auf

    der Basis von immobilisierten Enzymen“. Im Rahmen dieses Projektes entstand durch inhaltliche

    Parallelen eine enge Zusammenarbeit mit der Clariant Produkte (Deutschland) GmbH in Moosburg.

    Aufbauend auf jahrelanger Erfahrung im Bereich der Entschleimung pflanzlicher Öle konnte der Autor

    zum Teil auf hausinterne Analysekapazitäten der Clariant GmbH zurückgreifen. Zur Wahrung des

    Geschäftsgeheimnisses wird daher an einigen Stellen auf eine allzu detaillierte Darstellung einzelner

    Methoden verzichtet.

    Abkürzungsverzeichnis A Alanin

    ADC2 Automatic Developing Chamber 2

    ASG Acyliertes Sterylglucosid

    Ca Calcium

    CAC kritische Aggregatbildungskonzentration (Critical Aggregate Concentration)

    CCD Charge-coupled Device

    Cer bzw. CerOH Cerebroside

    D Asparaginsäure

    DGDG Digalactosyldiglycerid

    E Glutaminsäure

    EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochlorid

    FFA freie Fettsäure

    GL Glycolipide

    HPLC High-Performance Liquid Chromatography

    HPTLC High-Performance Thin-Layer Chromatogrphy

    ICP-OES Atomemissions-Spektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma

    KF Karl-Fischer

    kDa Kilo-Dalton 1 Da 1,66054 ∙ 10 kg L Leucin

    LAT Lipidacyltransferase

    MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Monohydrat

    Mg Magnesium

    MGDG Monogalactosyldiglycerid

  • II  

    MWCO Molecular Weight Cut-Off

    nd nicht detektierbar

    NHP nonhydratable phosphatides (nichthydratisierbare Phospholipide)

    P Phosphor

    PA Phosphatidsäure

    PC Phosphatidylcholin

    PE Phosphatidylethanolamin

    PI Phosphatidylinositol

    PL Phospholipide

    PLA1 Phospholipase A1

    PLA2 Phospholipase A2

    PLC Phospholipase C

    PLD Phospholipase D

    pNP para-Nitrophenol