ENZYME Teil 1: Grundlagen und Substratbestimmungen.

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ENZYME Teil 1: Grundlagen und Substratbestimmungen

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ENZYME

Teil 1: Grundlagen und Substratbestimmungen

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Metastabiler ZustandBeispiel:

Glucose-6-Phosphat + H2O Glucose + Pi

[Glc6P] [H20]

[Glc] [Pi]• K = = 1.135 x 10-3

Gleichgewicht stark auf Seite von Glc + Pi

• Go‘ = - 4.02 kcal mol-1 (Exergonische Reaktion)

Reaktion läuft freiwillig ab!

ABER: Beim Lösen von Glc6P in Wasser passiert aber scheinbar nichts!

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Vorrausetzungen für den Ablauf einer Reaktion

Zusammenstoß der Moleküle:

• Räumlich richtig !

• Energiereich genug !

25 °C

notwendigeEnergie

Aktivierungsenergiedie Energie, die man einem Systemzuführen muß, damit die Reaktion

messbar schnell abläuft

Energiezufuhr (Temperaturer-höhung) steigert die Reaktions-

geschwindigkeit !

75 °C

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Energieprofil(unkatalysierte Reaktion)

GH

GR

G

A+ B

C+ D

Aktivierungsenergie

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Energieprofil(enzymkatalysierte Reaktion)

GH

E+C+D

E+A+B

GR

G

EA

B

EC

DA+B+E EAB ECD C+D+E

EAB = Enzym-Substrat Komplex

ECD = Enzym-Produkt Komplex

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Enzymkatalysierte Reaktionen

benötigen geringere Aktivierungsenergie, weil:

• Nährungseffekträumlich richtige Ausrichtung der Substrate durch Bindung an Enzym

• Milleueffektoptimale Bedingungen für Reaktion am Enzym (pH, Solvatisierung, etc)

• Konformationsstreckungseffektdurch Substratbindung Gestaltänerung des Enzyms (Übergangszustand)

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Enzymkatalysierte Reaktionen

• GleichgewichtEin Enzym verändert die Geschwindigkeit einer Reaktion in Richtung des Gleichgewichts.Das Gleichgewicht selbst kann aber nicht verändert werden!Wenn das Gleichgewicht einer Reaktion stark auf einer Seite liegt spricht man von einer nicht umkehrbaren Reaktion.

• Hin- und RückreaktionEin Enzym kann eine Reaktion in beide Richtungen beschleunigen. Die Reaktion läuft aber immer in Richtung Gleichgewicht ab.

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Was sind Enzyme

Enzyme sind Biokatalysatoren, die die Aktivierungs-energie einer Reaktion herabsetzen können!

Unterschiede zu anderen Katalysatoren sind:

• Spezifitätfür die Substrate (Gruppen) und Reaktionen

• Kapazitätsehr hohe Effizienz (Beschleunigung bis zu 1014-fach)

• RegulationAktivität kann an Umweltbedingungen angepasst werden.

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Regulation von Enzymen• Proteinsynthese und Proteinabbau

Neusynthese des gewünschten Enzyms; Aktivierung oder Deaktivierung von Genen

• Konformationsänderung(a) Allosterische Effekte Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an regulatorisches Zentrum des Proteins

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Allosterische Effekte

Inhibitor Aktivator

Enzyminaktiv

Enzymaktiv

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Regulation von Enzymen• Proteinsynthese und Proteinabbau

Neusynthese des gewünschten Enzyms; Aktivierung oder Deaktivierung von Genen

• Konformationsänderung(a) Allosterische Effekte Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an regulatorisches Zentrum des Proteins(b) Kompetitive Hemmung „Konkurenz“ um das aktive Zentrum

• Chemische VeränderungPhosphorylierungen (Protein-Kinasen) oder Dephosphorylierungen (Phosphatasen)

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Einteilung von Enzymen

1. OxidoreduktasenTransfer von H, O oder e- von einem Substrat auf ein anderes

2. TransferasenTransfer von chem. Gruppen zwischen Substraten

3. Hydrolasen hydrolytischer Abbau

4. Lyasen nicht-hydrolytische Spaltung von Bindungen

5. Isomerasen Intramolekulare Umlagerungen

6. Ligasen Knüpfung von kovalenten Bindungen unter ATP-Verbrauch

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Benennung von EnzymenBeispiel:

Fructose + NADP+ 5-Anhydro-D-Fruktose + NADH + H+

Bezeichnung Fructose 5-DehydrogenaseFructose:NADP 5-Oxidoreduktase

EinteilungEC-Nummer, hier EC 1.1.1.124(Oxidoreduktase, wirkt an CH-OH Donoren, NAD oder NADP als Akzeptor, Enzymnummer)

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Analytisches Arbeiten mit Enzymen

1. EnzymbestimmungBestimmung der Biologische Aktivität Bestimmung der EnzymaktivitätDaneben kann auch der Proteingehalt bestimmt werden (z.B. mit Immunologischen Methoden)

2. Substratbestimmung

Bestimmung eines Analyten (eines Substrates) mit Hilfe eines EnzymsDas Enzym muß dazu aber käuflich erhältlich sein, oder selbst gereinigt werden.

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Enzymreaktionen

Zeit

Kon

zent

ratio

nS

ubst

rat o

d. P

rodu

kt

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Enzymreaktionen

Zeit

Kon

zent

ratio

nS

ubst

rat o

d. P

rodu

kt

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Enzymatische Substratbestimmung

1. Spezifisches EnzymEnzym sollte nur das Substrat umsetzen

2. Co-Substratewo notwendig muß man Co-Substrate (Co-Enzyme) einsetzen

3. ReaktionsmilleupH-Wert, Pufferung, Aktivatoren, etc

4. Detektionsmöglichkeit(a) Direkte Messung mittels Extinktion Produkt absorbiert, Substrat nicht (oder umgekehrt); Co-Substrat oder Co-Produkt absorbiert(b) Produktnachweis chemisch

5. Abfangreaktionensind notwendig wenn das Gleichgewicht ungünstig liegt.

Aufbau eines Testsystems

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Das NAD(P)H-System

Die reduzierte Form des Co-Substrats NADH oder NADPH absorbiert Licht im UV-Bereich bei 340 nm.

Die oxidierte Form NAD+ oder NADP+ aber nicht.

Universell mit Oxido-reduktasen anwendbar!

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Bespiel: Sorbitbestimmung

D-Sorbit + NAD+ D-Fruktose + NADH + H+ SDH

Zeit

Ext

inkt

ion

(340

nm

)

Probe + NAD+

SDH

E (NADH)

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Allgemeine Überlegungen 1

Zeit

Ext

inkt

ion

(340

nm

) Vorraussetzungen

• Gleichgewicht der Reaktion liegt auf Seite von C +D

• [Cosubstrat] > [Probe]sonst kann nicht alles an Probe verbraucht werden

A + B C + D

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Allgemeine Überlegungen 2

Zeit

Extinktion

(340

nm

)

Steigung =Geschwindigkeit

Regeln

• v nimmt ab, wenn [c] kleiner wird.

• Wenn A+B mit C+D im Gleichgewicht, dann v = 0 (kein Netto-Umsatz)

• Konzentration (Aktivität) des

Enzyms ändert v, hat aber keinen Einfluß auf den Endpunkt (E bleibt gleich)

A + B C + D

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Bestimmung von Glu & Frc

1. Glukose + ATP Glukose-6-P + ADPReaktion nicht umkehrbar (vollständig)Auch Fruktose wird umgesetzt

2. Glu-6-P + NADP+ Glukonat-6P + NADPH + H+

Indikatorreaktion

3. Fructose-6-P Glucose-6-PZusatzreaktion

HK

G6PDH

PGI

E

t

HK

GDHPGI

Frc

Glu

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Fehlersuche

t

E

• [NAD+] hoch

• [Enzym] hoch

• Probe A

• Reaktion nicht umkehrbar

Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E

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Fehlersuche

t

E

• [NAD+] nicht aus- reichend• [Enzym] hoch

• Probe A

• Reaktion nicht umkehrbar

Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E

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Fehlersuche

t

E

• [NAD+] hoch

• [Enzym] gering

• Probe A

• Reaktion nicht umkehrbar

Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E

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Fehlersuche

t

E

• [NAD+] hoch

• [Enzym] hoch

• Keine Probe A

• Reaktion nicht umkehrbar

Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E

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Fehlersuche

t

E

• [NAD+] hoch

• [Enzym] hoch

• Keine Probe A

• Reaktion nicht umkehrbar

Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E