Tierärztliche Hochschule Hannover

Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens

zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung

von Rhodococcus equi

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anne Riesenberg

Steinheim / Westfalen

Hannover 2016

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Stefan Schwarz Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee

PD Dr. Christiane Werckenthin Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg

1. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee

PD Dr. Christiane Werckenthin Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg

2. Gutachter: Jun. Prof. Dr. Diana Meemken, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2016

Ergebnisse dieser Dissertation wurden in international anerkannten

Fachzeitschriften mit Gutachtersystem (peer review) veröffentlicht

oder sind zur Veröffentlichung angenommen:

1. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN, L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ: Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin. J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68, 2173-5.

2. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.

STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ: MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin. J. Antimicrob. Chemother. 2014; 69, 1045-9.

3. RIESENBERG, A., H, KASPAR, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, S.

SCHWARZ: Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test. Vet. Microbiol. 2015 Nov 26, doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]

Teilergebnisse dieser Dissertation wurden bei folgenden

Fachtagungen im In- und Ausland in Form einer Posterpräsentation

oder eines Vortrages präsentiert:

1. RIESENBERG, A.*, K. KADLEC, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, D.

KLARMANN, S. SCHWARZ (2012): Development of guidelines for the susceptibility testing of veterinary pathogens. Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 10.–11.8.2012, Germany, Vortrag.

2. RIESENBERG, A., L. KREIENBROCK, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D.

KLARMANN, S. SCHWARZ*, C. WERCKENTHIN (2013): Development of susceptibility testing standards for Rhodococcus equi as a veterinary pathogen. Meeting of the CLSI-Subcommittee on Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST), 10. - 11.01.2013, Tampa, FL, USA, Vortrag.

3. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D. KLARMANN, S.

SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2013): Revised recommendation for susceptibility testing of Rhodococcus equi. 16. Internationales Symposium der World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 05. - 08.06.2013, Berlin, Germany, Poster.

4. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,

L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013): Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. 5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 30.06. - 03.07.2013, Ghent, Belgium, Poster.

5. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,

L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013): Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 21. - 24.08.2013, Jena, Germany, Poster.

6. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,

L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2014): Development of a new protocol for antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi by broth microdilution. Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26. - 28.05.2014, Freising, Germany, Poster.

7. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I. STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, S. SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2014):

Minimum Inhibitory Concentrations of 200 Rhodococcus equi Isolates to 32 Antimicrobial Agents. Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26.–28.05.2014, Freising, Germany, Poster.

8. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.

STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ* (2014): Susceptibility of 200 Rhodococcus equi isolates from North America and Europe to 32 antimicrobial agents. Tagung “Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine (AAVM)”, 16.–19.09.2014, Berlin, Germany, Vortrag.

9. RIESENBERG, A.*, C. WERCKENTHIN, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, H.

KASPAR, L. KREIENBROCK, S. SCHWARZ (2015): Erarbeitung standardisierter Verfahren zur Empfindlichkeitsbestimmung von Rhodococcus equi, Trueperella pyogenes und Arcobacter spp. 34. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe AVID, 09. - 11.09.2015, Bad Staffelstein, Germany, Vortrag.

* Präsentierender Autor

Mr. X. has a sore throat.

He buys some penicillin and gives himself, not enough to kill the

streptococci, but enough to educate them to resist penicillin.

He then infects his wife. Mrs. X gets pneumonia and is treated with penicillin.

As the streptococci are now resistant to penicillin, the treatment fails.

Mrs. X dies.

Sir Alexander Fleming

Nobel Lecture, December 11, 1945

Inhaltsverzeichnis

KAPITEL 1 Einleitung……………………….………………………........................09

KAPITEL 2 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung

mittels Bouillon-Mikrodilution von Rhodococcus equi tierischen

Ursprungs………………………………………………………………. 12

Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin

KAPITEL 3 MHK-Werte von Rhodococcus equi-Isolaten tierischen

Ursprungs für 32 Wirkstoffe.......................................................... 13

MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin

KAPITEL 4 Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine

Laborvergleichsuntersuchung ……….…………........................... 14

Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test

KAPITEL 5 Diskussion……………………………………………………………… 15

5.1 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung ……. 16 5.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi in verschiedenen Studien....... 18

5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin……………………………………………………………….. 23

5.4 Laborvergleichsuntersuchung.......................................................... 24 5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI………………………….25

KAPITEL 6 Schlußfolgerungen………………………………………………….... 27

KAPITEL 7 Zusammenfassung………………………………………………........ 28

KAPITEL 8 Summary.......................................................................................... 30

KAPITEL 9 Literaturverzeichnis........................................................................ 32

KAPITEL 10 Tabellenverzeichnis........................................................................ 37

Abkürzungsverzeichnis

A. Arcobacter

BAL bronchoalveoläre Spülflüssigkeit

BHI Hirn-Herz-Glucose-Bouillon (engl. Brain Heart Infusion)

bp Basenpaare

CAMHB Kationen-angepasste Mueller Hinton Bouillon (engl. cation-adjusted Mueller Hinton broth)

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

DIN Deutsches Institut für Normung

DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid)

E. coli Escherichia coli

EUCAST Europäischer Ausschuss für Antimikrobielle Empfindlichkeitstestung

(engl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)

FKS fetales Kälberserum

LHB lysiertes Pferdeblut (engl. laked horse blood)

MHK Minimale Hemmkonzentration

NaCl Natriumchlorid

PCR Polymerase Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction)

R. Rhodococcus

T. Trueperella

spp. Spezies (Pl.)

Vap Virulenz-assoziiertes Protein

Einleitung

9

KAPITEL 1 Einleitung

Bakterielle Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen stellt sowohl in der

Veterinär- als auch in der Humanmedizin ein zunehmendes Problem dar, da sie

mitunter fehlende therapeutische Optionen bei bakteriellen Infekten zur Folge haben

kann. Daher wird das Thema nicht nur in Fachkreisen und Fachzeitschriften, sondern

auch in den allgemeinen Medien thematisiert, indem immer wieder über ein Auftreten

von resistenten Bakterien zum Beispiel in Krankenhäusern berichtet und das Thema

damit in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt wird. Um die Entstehung von

Resistenzen zu vermindern und ihre Ausbreitung einzudämmen, existieren

verschiedene Programme in Tier- und Humanmedizin. Mit den Antibiotika-Leitlinien

ermahnt die Bundestierärztekammer die Tierärzteschaft, antimikrobielle Wirkstoffe

sorgsam und zielgerichtet einzusetzen und den anzuwendenden Wirkstoff nebst

anderen Faktoren aufgrund der Resistenzlage des ursächlichen Erregers

auszuwählen (BTK 2015). Zur Ermittlung der Resistenzlage ist eine antimikrobielle

Empfindlichkeitsprüfung unumgänglich. Während es für viele bakterielle Tier- und

Humanpathogene bereits standardisierte Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung gibt

(CLSI 2013), ist dies für andere bakterielle Infektionserreger von Tieren bisher noch

nicht der Fall. Zur letzteren Gruppe gehört auch Rhodococcus (R.) equi.

Die Gattung Rhodococcus gehört zur Familie der Nocardiaceae innerhalb der

Unterordnung Corynebacterineae der Ordnung Actinomycetales

(http://www.bacterio.net/). Sie umfasst derzeit 49 Spezies (http://www.ncbi.nlm.nih.

gov/taxonomy), von denen die Mehrheit aus Umweltproben isoliert wurde. Während

für die meisten Spezies der Gattung Rhodococcus keine pathogene Bedeutung

bekannt ist, konnte ein schwedischer Forscher R. equi 1923 als ursächlichen Erreger

einer Bronchopneumonie beim Fohlen identifizieren (MAGNUSSON 1923).

Rhodococcus equi kann auch bei anderen Säugetieren wie Schweinen,

Wiederkäuern, Hunden und Katzen purulente Erkrankungen verursachen (CARMAN

u. HODGES 1987, PRESCOTT 1991, TAKAI et al. 1986) und als zoonotischer

Erreger sogar zu Infektionen immunsupprimierter Menschen führen (PRESCOTT u.

HOFFMAN 1993, KEDLAYA et al. 2001). Die Hauptzieltierart von R. equi ist

allerdings das Pferd, bei dem Vertreter dieser Spezies in Fohlen purulente

Bronchopneumonien mit teils letalem Ausgang hervorrufen können. Als Grund für die

überwiegend bei Fohlen auftretenden Infektionen wird das noch unreife

Einleitung

10

Immunsystem angesehen (YAGER 1987, TAKAI et al. 1995). Pferde ab einem Alter

von sechs Monaten erkranken nicht mehr an Rhodokokkose (WILSON 1955, YAGER

1987), können jedoch Träger des Erregers sein und somit zu seiner Ausbreitung

beitragen. Da R. equi Teil der physiologischen Darmflora beim Pferd sein kann

(PRESCOTT 1991) und der Erreger zudem eine hohe Tenazität in der Umwelt

aufweist (PRESCOTT u. HOFFMANN 1993), ist R. equi nur schwer aus Beständen

zu eliminieren und in einigen Zuchtbetrieben als endemisch anzusehen. Die

Symptomatik bei Infektionen mit R. equi reicht von subklinischen Infekten über milde

respiratorische Symptome bis hin zu schwerwiegenden fiebrigen Infekten mit teils

letalem Ausgang (VENNER 2009). Die Gruppe der Virulenz-assoziierten Proteine

(Vap), im Besonderen das VapA-Protein, spielt eine übergeordnete Rolle für die

Pathogenität des Erregers (GIGUÈRE et al. 1999). Da die Symptomatik insgesamt

wenig spezifisch ist (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993), kann eine sichere Diagnose

am lebenden Tier nur durch Anzucht des Erregers aus bronchoalveolärer

Spülflüssigkeit (BAL) erfolgen (MEYER-HAMME 2004). Die Anzucht von R. equi

erfolgt auf bluthaltigen Medien in aerober Atmosphäre, wobei der Erreger nicht

hämolysierende, mukoide, grau-weiße Kolonien bildet. Mikroskopisch stellt sich R.

equi als grampositives, säurefestes, pleomorphes Stäbchen dar (WILSON 1955,

WOOLCOCK u. MUTIMER 1980). Während subklinische Infektionen mit R. equi teils

spontan ausheilen (VENNER 2009), ist bei einer klinischen Manifestation der

Rhodokokkose eine antimikrobielle Therapie notwendig (SWEENEY et al. 1987). Sie

erfolgt üblicherweise mit einer Kombination aus Rifampicin, welches zur Klasse der

Ansamycine gehört, und einem Wirkstoff aus der Gruppe der Makrolide, wie

Erythromycin, Clarithromycin oder Azithromycin (VENNER et al. 2013, GIGUÈRE et

al. 2004). Zwar ist keine dieser Substanzen in Deutschland zur Anwendung beim

Pferd zugelassen (www.vetidata.de), im Falle eines Therapienotstandes dürfen sie

allerdings umgewidmet und bei nicht Lebensmittel liefernden Tieren eingesetzt

werden.

Eine Monotherapie mit Rifampicin ist nicht empfehlenswert, da es im rpoB-Gen,

welches für die β-Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert, rasch zu Mutationen

kommt, die zu einer verminderten Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber

Rifampicin führen können.

Um eine effiziente Therapie einleiten zu können, sollte vor Therapiebeginn die

antimikrobielle Empfindlichkeit des ursächlich am Krankheitsgeschehen beteiligten

Einleitung

11

Erregers bestimmt werden. Die Bestimmung und Beurteilung der antimikrobiellen

Empfindlichkeit von R. equi ist bisher jedoch nicht vereinheitlicht. Das Dokument

M24-A2 des US-amerikanischen Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

enthält einige Informationen zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R.

equi-Isolaten von Menschen. Dieses Dokument definiert die Inokulumdichte sowie

das zu verwendende Medium und die Inkubationstemperatur (CLSI 2011). Die Dauer

der Inkubation wird mit 24-48 h, bei schlechtem Wachstum auch bis zu 5 Tagen,

angegeben. Zudem haben einige Arbeitsgruppen über die letzten Jahre Studien zur

Resistenzlage von R. equi veröffentlicht (BARTON u. FULTON 1980, BOWERSOCK

et al. 2000, BOYEN et al. 2011, BUCKLEY et al. 2007, BURTON et al. 2013,

CARLSON et al. 2010, HOLLBERG 2011, JACKS et al. 2003, NIWA et al. 2005,

NORDMANN u. RONCO 1992, MCNEILL u. BROWN 1992, PRESCOTT 1981,

ROTHAAAR 2006, WOOLCOCK u. MUTIMER 1980). Hierbei wurden diverse Agar-

und Bouillon-basierte Methoden verwandt, um den Erreger auf seine Empfindlichkeit

gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen zu testen. Die Methoden unterschieden sich

hinsichtlich der Inkubationsdauer und -temperatur, sowie des verwendeten Mediums

und seiner Zusätze. Somit sind die Ergebnisse dieser Studien nicht miteinander

vergleichbar.

Ziele der hier vorliegenden Studie waren:

(1) ein für die veterinärmedizinische Routinediagnostik universell einsetzbares und

gut ablesbares Testsystem auf der Grundlage der Bouillon-Mikrodilution zu

entwickeln,

(2) dieses Testsystem an einer größeren Anzahl epidemiologisch unverwandter

R. equi-Feldisolate zu überprüfen,

(3) dieses Testsystem in einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung

auf seine Praxistauglichkeit in verschiedenen Laboratorien zu untersuchen und

(4) letztendlich die Anerkennung der neuen Methode seitens CLSI zu erlangen.

MHK von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs

12

KAPITEL 2

Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeits-

prüfung mittels Bouillon-Mikrodilution

von Rhodococcus equi tierischen Ursprungs

Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for

Rhodococcus equi of animal origin

Anne Riesenberg, Andrea T. Feßler, Cornelia Frömke, Kristina Kadlec, Dieter

Klarmann, Lothar Kreienbrock, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2013) 68: 2173-2175

doi: 10.1093/jac/dkt134.

MHK von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs

13

KAPITEL 3

MHKs von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate

tierischen Ursprungs

MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin

Anne Riesenberg, Andrea T. Feßler, Erdal Erol, Ellen Prenger-Berninghoff, Ivonne

Stamm, Reinhard Böse, Anton Heusinger, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2014) 69: 1045-1049

doi: 10.1093/jac/dkt460

Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine Laborvergleichsuntersuchung

14

KAPITEL 4

Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine

Laborvergleichsuntersuchung

Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test.

Anne Riesenberg, Heike Kaspar, Andrea T. Feßler,

Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz

Veterinary Microbiology (2015) doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]

Diskussion

15

KAPITEL 5 Diskussion

Um bakterielle Infektionen sinnvoll zu therapieren ist der Einsatz von antimikrobiellen

Wirkstoffen das Mittel der Wahl (SINGER et al. 2003). Antimikrobielle Wirkstoffe sind

unverzichtbar für die Versorgung veterinär- und humanmedizinischer Patienten. Da

die Wirkstoffe häufig systemisch eingesetzt werden, wirken sie jedoch nicht

ausschließlich in dem von der Erkrankung betroffenen Organsystem, sondern im

gesamten Organismus. Daher unterliegen nahezu alle Bakterien, die den

behandelten Patienten besiedeln, einem Selektionsdruck, der die Entstehung und

Ausbreitung von Resistenzen fördern kann (MEYER et al. 2013). Um den

Selektionsdruck möglichst niedrig zu halten, muss eine zielgerichtete Antibiose

erfolgen (BTK 2015). Zu diesem Zweck wird in vielen Fällen eine mikrobiologische

Untersuchung inklusive eines Resistenztestes des Erregers vor Therapiebeginn

notwendig sein. Allerdings müssen bei der Auswahl des antimikrobiellen Wirkstoffes

auch andere Parameter, wie z.B. erreichbare Gewebespiegel oder der Immunstatus

des Patienten, berücksichtigt werden.

Die verfügbaren Methoden zur antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung

können grob in Diffusions- und Dilutionsverfahren eingeteilt werden. Beim

Agardiffusionstest wird der zu testende Erreger in definierter Dichte auf eine

Agarplatte aufgebracht. Anschließend werden Testplättchen, die mit einer definierten

Menge eines antimikrobiellen Wirkstoffs beschickt sind, aufgelegt. Die so

präparierten Agarplatten werden bebrütet und anschließend die Hemmhöfe um die

Testplättchen ausgemessen. Über den Vergleich mit klinischen Grenzwerten wird der

Erreger dann als sensibel, intermediär oder resistent gegenüber dem jeweiligen

Wirkstoff eingestuft. Da hierbei verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe auf einer

Agarplatte getestet werden können, wird der Agardiffusionstest in der

Routinediagnostik nach wie vor eingesetzt. Allerdings erlaubt diese Methode keine

quantitative Aussage und die ermittelten Hemmhofdurchmesser können auch nicht in

Minimale Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) „umgerechnet“ werden (SCHWARZ et

al. 2010).

In der vorliegenden Studie wurden Dilutionsverfahren (Bouillon-Mikrodilution

und -Makrodilution) zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi

verwendet. In diesen Verfahren wird die Wirksamkeit verschiedener

Diskussion

16

Konzentrationsstufen der Wirkstoffe auf den Erreger überprüft. Das Ergebnis der

Testung wird als MHK-Wert angegeben. Der MHK-Wert ist die niedrigste

Wirkstoffkonzentration in einer zweifachen Verdünnungsreihe (gemessen in mg/L),

bei der kein sichtbares Erregerwachstum mehr zu verzeichnen ist (CLSI 2013). Im

Gegensatz zur Agardiffusion liefern Reihenverdünnungstests wie Bouillon-

Mikrodilution und Bouillon-Makrodilution quantative Ergebnisse, die es besser

ermöglichen, eine Veränderung der antimikrobiellen Empfindlichkeit zu beurteilen.

Die Einstufung der Ergebnisse in die Kategorien sensibel, intermediär und resistent

erfolgt für diese Methoden ebenfalls über den Vergleich mit klinischen Grenzwerten,

die für jeden antimikrobiellen Wirkstoff und Erreger tierart- und indikationsspezifisch

definiert werden (CLSI 2015).

5.1 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung

Um ein standardisiertes Verfahren zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von

R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution zu entwickeln, wurden zunächst Methoden aus

verschiedenen Studien miteinander verglichen. Eine Literaturrecherche ergab, dass

sich bisher nur wenige Autoren mit der Bouillon-Mikrodilution zur antimikrobiellen

Empfindlichkeitsprüfung von R. equi befasst haben. Die hierfür verwendeten

Verfahren unterschieden sich hinsichtlich des verwendeten Mediums, der

Inkubationstemperatur sowie der Inkubationsdauer (KAPITEL 2,Tabelle 1).

Diskussion

17

Tabelle 1: Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren zur

Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution

Referenz Medium Temperatur Bebrütungs-

dauer

CARLSON et al. 2010 CAMHB 35 °C 24-48 h

HOLLBERG 2011 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h

BACH 2011 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h

ROTHAAR 2006 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h

BOWERSOCK et al. 2000 CAMHB 35 °C „overnight“

JACKS et al. 2003 CAMHB 37 °C 18-24 h

MCNEIL u. BROWN 1992 CAMHB 35 °C 24-48 h

PRESCOTT 1981 CAMHB 35 °C 36 h

FEY u. SCHMID 1995 Iso-Sensitest Bouillon 37 °C 24 h

GIACOMETTI et al. 1999 CAMHB 37 °C 18 h

SPARKS et al. 1988 Fildes-enriched Mueller-Hinton Bouillon + 2 % (v/v) LHB

37 °C 18 h

Da die meisten Autoren Verfahren auf der Basis von Kationen-angepasster

Mueller Hinton Bouillon (engl. Cation-adjusted Mueller Hinton Broth, CAMHB) mit

oder ohne Zusatz von lysiertem Pferdeblut (engl. laked horse blood, LHB) verwendet

haben, wurden diese beiden Medien in unsere Vergleichsstudie einbezogen. Die

vom CLSI für die Testung von humanen R. equi Isolaten vorgeschriebene Methode

sieht die Verwendung von CAMHB ohne jedwede Medienzusätze vor (CLSI 2011).

Als Inkubationstemperatur wurde 35 ± 2 °C gewählt, da diese Temperatur in den

meisten in der Literatur beschriebenen Studien verwendet wurde und vom CLSI für

die Empfindlichkeitsprüfung verschiedener Erreger, inklusive R. equi von Menschen,

empfohlen wird (CLSI 2013). Die Ablesung der MHK-Werte erfolgte sowohl nach 24

als auch nach 48 Stunden, um einen möglichen Einfluß der Inkubationszeit auf die

Ergebnisse bewerten zu können.

Diskussion

18

Die Empfindlichkeitsprüfung in CAMHB mit und ohne 2 % LHB (v/v) bei einer

aeroben Inkubation bei 35 ± 2 °C und Ablesung der MHK-Werte nach 24 h und 48 h

wurde an sechs R. equi Feldisolaten sowie dem R. equi-Typstamm ATCC®25729

jeweils sechsmal durchgeführt und die Ergebnisse statistisch ausgewertet (KAPITEL

2). Die Chance, exakt gleiche MHK-Werte zu erzielen, war am höchsten für CAMHB

+ 2 % (v/v) LHB mit Ablesung der MHK-Werte nach 24 h (0,648), gefolgt von CAMHB

ohne Supplement mit Ablesung der MHK-Werte nach 48 h (0,463), CAMHB ohne

Supplement mit Ablesung der MHK-Werte nach 24 h (0,427) und CAMHB + 2 % (v/v)

LHB mit einer Ablesung der MHK-Werte nach 48 h (0,286).

Die statistische Auswertung zeigte demnach, dass die Testung von R. equi

mittels CAMHB + 2 % (v/v) LHB bei einer aeroben Inkubation bei 35 ± 2 °C und einer

Ablesung der MHK-Werte nach 24 h die zuverlässigste Methode zur antimikrobiellen

Empfindlichkeitsprüfung von R. equi ist (KAPITEL 2).

Neben den statistischen Ergebnissen soll bemerkt werden, dass die Ermittlung

von MHK-Werten mit beiden Medien sowohl nach 24 h als auch nach 48 h möglich

war, wobei aber der Einsatz von LHB zu einem deutlicheren Wachstum und somit zu

einer besseren Ablesbarkeit führte.

5.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi in verschiedenen Studien

Die im ersten Schritt etablierte Methode wurde im Anschluss an einem

Stammkollektiv von 200 R. equi Feldisolaten verschiedenen Ursprungs auf ihre

allgemeine Anwendbarkeit getestet (KAPITEL 3). Dabei wurden 29 Wirkstoffe aus

verschiedenen Klassen mittels Bouillon-Mikrodilution getestet. Da Rifampicin sowie

die beiden unter Umständen ebenfalls therapeutisch relevanten Makrolide

Azithromycin und Clarithromycin nicht in den verfügbaren Mikrotiterplatten enthalten

waren, wurden diese drei Wirkstoffe im Bouillon-Makrodilutionsverfahren getestet,

wobei Medium und Inkubationsbedingungen analog zum vorab genannten Protokoll

waren. Die Testung der Feldisolate verlief sowohl in der Bouillon-Mikrodilution als

auch in der Bouillon-Makrodilution problemlos. Für die meisten der Wirkstoffe waren

die MHK-Werte normalverteilt. Für Rifampicin wurden sechs Isolate mit erhöhtem

MHK-Wert ermittelt, sowie ein weiteres Isolat mit erhöhten MHK-Werten für

Azithromycin, Clarithromycin und Erythromycin.

Diskussion

19

Im Folgenden soll trotz der methodischen Abweichungen zwischen den

verschiedenen in der Literatur beschriebenen Studien eine vergleichende Darstellung

der Ergebnisse mit denen unserer Studie erfolgen.

Tabelle 2: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegenüber Rifampicin und

verschiedenen Makrolid-Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien

Wirkstoff

KA

PIT

EL 3

JAC

KS

et a

l. 2

003

CA

RL

SO

N

et a

l. 2

010

BO

WE

RS

OC

K

et a

l. 2

000

PR

ES

CO

TT

1981

HO

LLB

ER

G

2011

BA

CH

2011

RO

TH

AA

R

2006

Rifampicin MHK50 0,06 <0,5 <0,5

0,06 0,06 0,06

MHK90 0,125 <0,5 <0,5 0,06 0,06 0,06

Azithromycin MHK50 1 0,5 1

0,5 8 2

MHK90 1 1 2 4 8 4

Clarithromycin MHK50 0,06 <0,06 <0,06

<0,03 0,12 0,06

MHK90 0,06 0,12 0,12 0,06 0,12 0,06

Erythromycin MHK50 0,5 <0,5 0,5

<0,25 0,12 1 0,25

MHK90 0,5 <0,25 0,5 <0,25 0,5 1 0,5

Tulathromycin MHK50 64

>64

64 >1024

MHK90 64 >64 >128 >1024

Tilmicosin MHK50 32

32 16

MHK90 32 64 32

Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51 110 21 127

Bei den therapeutisch wirksamen Substanzen aus der Gruppe

Makrolidantibiotika und dem Ansamycin-Wirkstoff Rifampicin ergab der Vergleich mit

anderen Studien relativ ähnliche MHK50- und MHK90-Werte (Tabelle 2). Allerdings

konnten BACH (2011) und ROTHAAR (2006) für Azithromycin höhere Werte für

MHK50 und MHK90 feststellen. BACH (2011) konnte auch für Clarithromycin und

Erythromycin etwas höhere MHK-Werte feststellen als die anderen Studien. Für

Tulathromycin ist die Abweichung der von BACH (2011) übermittelten MHK50- und

MHK90-Werte deutlich. Diese Ergebnisse könnten auf eine verminderte

Makrolidempfindlichkeit in der bei BACH (2011) und ROTHAAR (2006) untersuchten

Populationen zurückzuführen sein. Die entsprechenden Isolate aus diesen Studien

stammten allesamt von unterschiedlichen Tieren eines Bestandes mit endemischer

Rhodokokkose, in dem auch Makrolide therapeutisch eingesetzt wurden. Für

Erythromycin sind die von JACKS et al. (2003) und PRESCOTT (1981) publizierten

Diskussion

20

MHK50- und MHK90-Werte geringfügig niedriger als die der anderen Studien. Der

Grund für die Abweichungen lässt sich nicht mit Sicherheit definieren. In Betracht

kommt hier neben einer empfindlicheren Testpopulation auch die methodische

Abweichung bei der Empfindlichkeitsprüfung; in beiden Studien wurde CAMHB ohne

LHB als Supplement verwendet.

CARLSON et al. (2010) berichteten für Clarithromycin von vier Isolaten mit

erhöhten MHK-Werten (0,5 - 4 mg/L); auch ROTHAAR (2006) konnte ein Isolat mit

erhöhtem MHK-Wert (0,5 mg/L) gegenüber Clarithromycin identifizieren. Des

Weiteren berichteten CARLSON et al. (2010) von Isolaten mit erhöhten MHK-Werten

gegenüber Erythromycin, beschrieben jedoch keine Resistenz gegenüber mehreren

Wirkstoffen. In unserer Studie (KAPITEL 3) wies lediglich ein Isolat moderat erhöhte

MHK-Werte (jeweils 1 – 2 MHK-Stufen über den Werten der normalverteilten

Population) gegen Clarithromycin, Azithromycin und Erythromycin auf.

Auch eine verminderte Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Rifampicin ist

bereits beschrieben worden. BUCKLEY et al. (2007) und BOYEN et al. (2011)

konnten mittels E-Test auf Mueller Hinton Agar mit Blutzusatz für ihre

Stammkollektive MHK-Werte gegenüber Rifampicin ermitteln. BUCKLEY et al. (2007)

beobachteten über einen 10-Jahres-Zeitraum ein Anstieg der MHK-Werte von R.

equi gegenüber Rifampicin um zwei MHK-Stufen. BOYEN et al. (2011) haben bei

zwei Isolaten eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin (MHK 1 mg/L

bzw. 8 mg/L) beschrieben. Auch im Rahmen unserer Studie wurden sechs Isolate mit

verminderter Rifampicin-Empfindlichkeit nachgewiesen, deren MHK-Werte entweder

4-8 mg/L (n=3) oder 64-256 mg/L (n=3) aufwiesen (KAPITEL 3).

Für die β-Laktam-Antibiotika zeigen sich einige Abweichungen bezüglich der

von den verschiedenen Autoren publizierten MHK50- und MHK90-Werte (Tabelle 3).

Für Ampicillin lagen die von JACKS et al. (2003) übermittelten Werte niedriger als in

der Studie von PRESCOTT (1981) und auch niedriger al in unserer Studie (KAPITEL

3). Auch bei Ceftiofur und Penicillin haben JACKS et al. (2003) niedrigere MHK50-

und MHK90-Werte ermittelt als die anderen Studien. CARLSON et al. (2010) konnten

hingegen für Penicillin höhere MHK-Werte feststellen als die anderen Autoren. Bei

BOWERSOCK et al. (2000) zeigte sich eine recht große Differenz zwischen den

MHK50- und MHK90-Werten für Ceftiofur. Während dre MHK50-Wert sich mit dem von

JACKS et al. (2003) ermittelten Wert deckt, ist der MHK90-Wert eher vergleichbar mit

den von CARLSON et al. (2000) und in unserer Studie ermittelten Werten (Kapitel 3).

Diskussion

21

Diese Unterschiede könnten durch die unterschiedlichen Testpopulationen bedingt

sein, allerdings könnte ihr Ursprung auch in den methodischen Unterschieden

zwischen den unterschiedlichen Studien liegen.

Tabelle 3: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegen verschiedene β -Laktam-

Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien

Wirkstoff

KA

PIT

EL 3

JAC

KS

et a

l. 2

003

CA

RL

SO

N

et a

l. 2

010

BO

WE

RS

OC

K

et a

l. 2

000

PR

ES

CO

TT

1981

Ampicillin MHK50 4 1

8

MHK90 8 4 8

Ceftiofur MHK50 8 <0,5 4 0,5

MHK90 16 1 >8 8

Penicillin MHK50 4 0,25 16

4

MHK90 4 1 >16 8

Vancomycin MHK50 0,5

0,5

MHK90 0,5 0,5

Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51

Bei den Wirkstoffen anderer Klassen zeigen sich abgesehen von der

Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol nur geringe Unterschiede

zwischen den verschiedenen Studien (Tabelle 4). Für Clindamycin ist der von JACKS

et al. (2003) übermittelte MHK50-Wert ein wenig niedriger als in unserer Studie

(Kapitel 3), zum MHK90-Wert lässt sich kaum eine Aussage treffen, da JACKS et al.

(2003) nur bis zu einer Konzentration von 2 mg/L getestet haben. Für Tetrazyklin

sind die MHK50- und MHK90-Werte, die PRESCOTT (1981) angibt, eine Stufe

niedriger als bei den anderen Studien, die untereinander eine sehr gute

Übereinstimmung zeigen. Bei Enrofloxacin schwanken die ermittelten MHK50- und

MHK90-Werte geringfügig; CARLSON et al. (2010) konnten etwas höhere Werte

feststellen als PRESCOTT (1981) und unsere Studie (KAPITEL 3), während der

MHK50-Wert, den JACKS et al. (2003) feststellen konnten, etwas niedriger ist. Auch

bei Gentamicin zeigen sich nur geringe Abweichungen. Bei der Kombination aus

Trimethoprim und Sulfamethoxazol waren die Abweichungen hingegen deutlich. Die

MHK50- und MHK90-Werte, die CARLSON et al. (2010) für diese Wirkstoffkombination

ermittelten, liegen höher als die der anderen Studien. Einzig ROTHAAR (2006)

Diskussion

22

konnte vergleichbare für MHK50- und MHK90-Werte feststellen. Eine mögliche

Erklärung für die höheren MHK-Werte ist eine unterschiedliche Beurteilung des

Wachstumsverhaltens, da bei der Wirkstoffkombination Trimethoprim/

Sulfamethoxazol laut CLSI eine Wachstumshemmung von 80% als Endpunkt

verwendet werden sollte (CLSI, 2011).

Tabelle 4: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegen verschiedene Wirkstoffe:

Ergebnisse verschiedener Studien

Wirkstoff

KA

PIT

EL 3

JAC

KS

et a

l. 2

003

CA

RL

SO

N

et a

l. 2

010

BO

WE

RS

OC

K

et a

l. 2

000

PR

ES

CO

TT

1981

HO

LLB

ER

G

2011

BA

CH

2011

RO

TH

AA

R

2006

Chloramphenicol MHK50 8 8 8

16

MHK90 16 16 16 16

Florfenicol MHK50 16 >8

16

MHK90 16 >8 32

Clindamycin MHK50 4 2

MHK90 8 >2

Doxyzyklin MHK50 1 0,5 1

MHK90 1 1 1

Tetrazyklin MHK50 4 4

4 2

MHK90 8 8 8 4

Enrofloxacin MHK50 1 0,5 2 1

MHK90 1 1 2 1

Gentamicin MHK50 0,5 <1 0,5

<0,25 0,25 0,5 0,5

MHK90 0,5 <1 1 <0,25 0,5 1 0,5

Trimethoprim/ Sulfamethoxazol

MHK50 0,25/4,8

1/19

0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 MHK90 0,5/9,5 4/76 0,5/9,5 0,5/9,5 2/38

Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51 110 21 127

Die Unterschiede in den MHK-Werten, die von den verschiedenen Studien

ermittelt wurden, sind teils deutlich, teils auch nur gering ausgeprägt. Die möglichen

Gründe hierfür sind vielfältig. Möglich ist eine unterschiedliche Empfindlichkeit der

jeweiligen Testpopulationen. Auch ein Einfluss der Methodik (Medium-Zusätze,

Inkubationstemperatur und Inkubationsdauer) ist eine mögliche Erklärung. Die

Verwendung von geeigneten Stämmen zur Qualitätskontrolle der verwendeten

antimikrobiellen Wirkstoffe sowie die Anwendung einer einheitlichen, wie der von uns

Diskussion

23

publizierten und vom CLSI anerkannten Methodik (KAPITEL 2) sind notwendig, um

durch die Methode bedingte Einflüsse ausschließen zu können.

5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber

Rifampicin

Da sechs Isolate unseres Stammkollektivs eine verminderte Empfindlichkeit

gegenüber Rifampicin aufwiesen, wurde der genetische Hintergrund hierzu näher

untersucht. Von mehreren Autoren wurde über Mutationen im rpoB-Gen als Ursache

für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin in verschiedenen

bakteriellen Organismen berichtet (CRUCHAGA et al. 2003, KADLEC et al. 2011,

ZACZEK et al. 2009). Auch bei R. equi sind Mutationen in diesem Gen bereits als

Ursache für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin beschrieben

worden (ASOH et al. 2003, FINES et al. 2001). ASOH et al. (2003) beschreiben die

Mutationen Ser531Trp und His256Tyr als ursächlich für eine High-Level-Resistenz

(MHK ≥ 128 mg/L), sowie Ser531Leu für eine Low-Level-Resistenz (MHK 8 mg/L).

Es macht laut ASOH et al. (2003) einen merklichen Unterschied, welche Aminosäure

an Position 531 das Serin ersetzt.

In der Studie von FINES et al. (2001) wurde der Aminosäureaustausch

His526Tyr mit einem MHK-Wert von ≥256 mg/L in Verbindung gebracht, während

His526Asp einen MHK-Wert von 128 mg/L und His526Asn einen MHK-Wert von

8 mg/L zur Folge hatten. Auch hier hat demnach die das Histidin ersetzende

Aminosäure einen deutlichen Einfluss auf die MHK-Werte gegenüber Rifampicin.

Mutationen Ser531Leu führten auch diesen Autoren zufolge zu einem MHK-Wert von

8 mg/L und eine Mutation Asp516Val zu einem Wert von 2 mg/L.

In unseren Untersuchungen (KAPITEL 3) konnten wir die Ergebnisse von

FINES et al. 2001 bestätigen, denen zufolge eine Mutation His526Asp zu einem

hohen MHK-Wert gegenüber Rifampicin (256 mg/L) führt. Ebenfalls bestätigen

konnten wir die in derselben Studie beschriebene geringe Erhöhung des MHK-

Wertes (4 mg/L) bei Vorliegen einer Mutation Asp516Val. Unsere Studie ergab

darüber hinaus einen Zusammenhang zwischen einer Mutation Gln513Leu und

einem Rifampicin-MHK-Wert von 64 mg/L. Eine Mutation an dieser Lokalisation ist

bei R. equi bisher nicht beschrieben worden.

Diskussion

24

Auch konnten wir mit unserer Studie die Annahme von ASOH et al. 2003

bestätigen, dass die Mutation Ser531Leu eine verminderte Empfindlichkeit

gegenüber Rifampicin bedingt. Zwei unserer Isolate mit erhöhten MHK-Werten

gegenüber Rifampicin wiesen diese Mutation auf, ihre MHK-Werte waren jedoch

unterschiedlich (8 bzw. 128 mg/L), sodass wir einen zusätzlichen, bislang

unbekannten Resistenzmechanismus als Ursache für die unterschiedlich hohen

MHK-Werte bei gleicher Mutation im rpoB-Gen vermuten. Die These eines weiteren,

bisher unbekannten Resistenzmechanismusses wird vom Auftreten eines Isolates

mit einem Rifampicin-MHK-Wert von 8 mg/L gestützt, bei dem keine Mutation im

rpoB-Gen festgestellt werden konnte. Welcher Mechanismus zusätzlich bzw.

alternativ zu Mutationen im rpoB-Gen für die Erhöhung des MHK-Wertes gegenüber

Rifampicin verantwortlich ist, konnte in dieser Studie nicht festgestellt werden.

5.4 Laborvergleichsuntersuchung

In einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung wurde die erarbeitete

Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi an zwei Isolaten

(einem R. equi Feldisolat und dem Typstamm R. equi ATCC® 25729) in 18

verschiedenen, in der Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Erreger erfahrenen

Laboratorien angewendet (KAPITEL 4). Als Qualitätskontrolle wurde der E. coli-

Stamm ATCC® 25922 verwendet. Das Ziel der Laborvergleichsuntersuchung war es,

zu überprüfen, ob die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik praktikabel ist,

und ob die von den verschiedenen Laboren übermittelten MHK-Werte innerhalb

eines akzeptablen Bereiches liegen. Dieser akzeptable Bereich wurde - analog zur

Studie von WALLMANN et al. (2006) - auf den am häufigsten angegebenen MHK-

Wert ± 1 Verdünnungsstufe festgelegt.

In der Laborvergleichsuntersuchung zeigte sich, dass die Labore die von uns

erarbeitete Methode problemlos anwenden konnten. Als Grenze für eine erfolgreiche

Teilnahme der Labore wurde festgelegt, dass 80 % aller übermittelten MHK-Werte

innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen sollten (WALLMANN et al. 2006).

Insgesamt waren für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC® 25922 98,3 %

aller MHK-Werte im akzeptablen Bereich. Die beiden R. equi-Stämme wiesen

Diskussion

25

durchschnittlich 92,2 % (ATCC® 25729) und 94,8 % (R. equi-Feldisolat) aller

übermittelten MHK-Werte im akzeptablen Bereich auf. Für eines der Labore und den

R. equi ATCC®25729 lagen nur 72,2 % aller übermittelten Werte im akzeptablen

Bereich. Da dieses Labor keine Probleme mit der Testung des R. equi-Feldisolates

hatte (91,7 % der MHK-Werte im akzeptablen Bereich) und auch die Testung des E.

coli ATCC® 25922 problemlos verlief (93,8 % der MHK-Werte im akzeptablen

Bereich), ist die Ursache hierfür nicht geklärt.

Bei Betrachtung der Ergebnisse für die einzelnen Wirkstoffe ergab sich die

schlechteste Übereinstimmung mit dem akzeptablen MHK-Bereich bei beiden R.

equi-Stämmen für Ceftiofur und Cefotaxim (R. equi ATCC® 25729 79,6 % und

75,9 %; R. equi-Feldisolat 88,9 % und 87,0 %). Die Testung des E. coli ATCC®

25922 mit diesen Wirkstoffen verlief problemlos (100 % bzw 98,1 %); was zu den

Problemen bei der Testung der R. equi-Isolate geführt hat, konnte retrospektiv nicht

geklärt werden. Die beste Übereinstimmungen mit dem akzeptablen Bereich zeigten

sich bei R. equi ATCC®25729 für Gentamicin, Oxacillin und Vancomycin (jeweils 100

%). Für das R. equi-Feldisolat wiesen Enrofloxacin, Marbofloxacin, Oxacillin, Tylosin

und Vancomycin die beste Übereinstimmung mit dem akzeptablen Bereich auf

(jeweils 100 %).

Abschließend lässt sich sagen, dass die Laborvergleichsuntersuchung

erfolgreich verlaufen ist; die Methode war problemlos von allen 18 Laboren

anzuwenden und die von den Laboren übermittelten MHK-Werte wiesen verglichen

mit den für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC® 25922 übermittelten MHK-

Werten eine gute Übereinstimmung mit den entsprechenden akzeptablen Bereichen

auf.

5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI

Die im Rahmen der Studie vorgestellte Methode wurde dem CLSI-Subkomitee

Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST) am 11.01.2013 vorgestellt. Die

neue Methode der Testung unter Verwendung von CAMHB + 2 % (v/v) LHB und

einer Inkubationszeit von 24 h wurde als neue Methode akzeptiert und wurde in die

erste Auflage des neuen CLSI-Dokuments VET06-A („Methods for Antimicrobial

Diskussion

26

Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria Isolated from

Animals“), das noch im Jahr 2016 erscheinen soll, aufgenommen.

Schlußfolgerungen

27

KAPITEL 6 Schlußfolgerungen

Der Vergleich verschiedener in der Literatur beschriebener Medien für die

antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution

zeigte, dass die bisher verwendeten Medien prinzipiell geeignet waren, um eine

Empfindlichkeitsprüfung durchzuführen. Die Ablesbarkeit war bei beiden

verwendeten Medien [CAMHB mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] sowohl nach

24 h als auch nach 48 h möglich, beim Einsatz von LHB aber deutlich besser. Die

statistische Auswertung einer wiederholten Empfindlichkeitsprüfung zeigte, dass die

Kombination aus einem Zusatz von 2 % (v/v) LHB zur CAMHB und einer Ablesung

der MHK-Werte nach 24 h die homogensten Ergebnisse ergab.

Die Testung eines Stammkollektivs von 200 R. equi-Stämmen verschiedenen

Ursprungs verlief mit dieser Methode problemlos. Die MHK-Werte für die meisten

Wirkstoffe waren normalverteilt und nur wenige Isolate wiesen eine verminderte

Empfindlichkeit gegenüber einem oder mehreren Wirkstoffen auf. Ein Isolat zeigte

eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber den Makrolid-Antibiotika Azithromycin,

Clarithromycin und Erythromycin. Insgesamt sechs Isolate wiesen unterschiedlich

stark erhöhte MHK-Werte gegenüber Rifampicin auf. Bei fünf dieser Isolate konnte

eine Mutation im rpoB-Gen als Ursache für die verminderte Empfindlichkeit

festgestellt werden. Jedoch zeigt die Studie, dass es neben Mutationen im rpoB-Gen

mindestens einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von

R. equi gegenüber Rifampicin beeinflusst.

Eine Laborvergleichsuntersuchung mit 18 teilnehmenden Laboren zeigte, dass

die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik geeignet ist. Die Ergebnisse der

MHK-Testung in den verschiedenen Laboren zeigten eine gute Übereinstimmung.

Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelte Methode wurde zudem dem CLSI

vorgestellt, als Methode für die Empfindlichkeitstestung von R. equi anerkannt und in

das neue CLSI-Dokument VET06-A aufgenommen.

Zusammenfassung

28

KAPITEL 7 Zusammenfassung

Anne Riesenberg: Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur

antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von

Rhodococcus equi

Als Erreger purulenter Bronchopneumonien beim Fohlen ist Rhodococcus equi

schon lange bekannt. Da der Erreger beim Fohlen schwerwiegende Erkrankungen

hervorruft und auch bei anderen Tierarten und beim Menschen Erkrankungen

auslösen kann, ist eine erfolgreiche Therapie der Rhodokokkose von großer

Bedeutung. Um einen Therapieerfolg sicherzustellen; sollte der Erreger vor Beginn

der Therapie auf seine antimikrobielle Empfindlichkeit getestet werden. Dies ist

insbesondere deshalb von Bedeutung, weil für das therapeutisch relevante

Rifampicin, sowie die ebenfalls häufig verwendeten Makrolide, bereits Isolate mit

verminderter Empfindlichkeit beschrieben wurden. Um die Ergebnisse verschiedener

Studien zur Empfindlichkeitsbestimmung von R. equi vergleichen zu können, ist es

notwendig, die Methodik der Testung zu standardisieren. Um dieses Ziel zu

erreichen, wurden zwei verschiedene in der Literatur beschriebene Medien [CAMHB

mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung

von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution für eine vergleichende

Empfindlichkeitsprüfung verwendet; die MHK-Werte wurden nach 24 und 48 Stunden

abgelesen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse wiederholter

Empfindlichkeitsprüfungen zeigte, dass bei Verwendung von CAMHB mit 2 % (v/v)

LHB und einer Ablesung der MHK-Werte nach 24 Stunden die Wahrscheinlichkeit,

homogene MHK-Werte für das gleiche R. equi Isolat zu erzielen, am höchsten ist.

Mit dieser Methode wurde die Empfindlichkeit von 200 R. equi Isolaten

gegenüber 32 antimikrobiellen Wirkstoffen und Wirkstoff-Kombinationen getestet. Es

zeigten nur wenige Isolate erhöhte MHK-Werte für einige Wirkstoffe. Eines dieser

Isolate wies für die therapeutisch relevanten Makrolid-Antibiotika Erythromycin,

Clarithromycin und Azithromycin moderat erhöhte MHK-Werte auf. Weitere sechs

Isolate zeigten eine unterschiedlich stark ausgeprägte verminderte Empfindlichkeit

gegenüber Rifampicin. Bei der molekularen Untersuchung letzterer Isolate zeigte

sich, dass es zusätzlich zu Mutationen im rpoB-Gen, die dafür bekannt sind, die

Zusammenfassung

29

Empfindlichkeit von verschiedenen Bakterien gegenüber Rifampicin zu vermindern,

einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von R. equi

gegenüber Rifampicin vermindert.

Das Ergebnis einer Laborvergleichsuntersuchung, an der 18 deutsche

Laboratorien beteiligt waren, bestätigte, dass die von uns publizierte Methode zur

antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung probemlos von den Laboren angewendet

werden kann. Die Ergebnisse der MHK-Testung der verschiedenen Labore zeigten

eine gute Übereinstimmung.

Die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung mittels Bouillon-Mikrodilution von R.

equi in CAMHB + 2 % (v/v) LHB mit Inkubation in aerobem Milieu bei 35 ± 2 °C für 24

h ist eine zuverlässige, praxistaugliche Methode. Sie wurde vom Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI) für die Testung von R. equi Isolaten von Tieren

anerkannt und stellt nach Aufnahme in das CLSI-Dokument VET06-A die künftige

Standardmethode zur Empfindlichkeitsprüfung von R. equi dar.

Summary

30

KAPITEL 8 Summary

Anne Riesenberg: Development of a standardised method for the

antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi

As a causative agent of purulent bronchopneumonia in foals, Rhodococcus

equi is known a fairly long time. As the pathogen causes severe infections in foals

and is furthermore capable of infecting other animals and humans, a successful

therapy is of utmost importance. To ensure therapeutical success the pathogen

should be tested for antimicrobial resistance before starting the treatment. This is of

particular importance since isolates with a reduced susceptibility have been reported

previously for the therapeutically relevant drug rifampicin as well as for the commonly

used macrolides. In order to allow a comparison of the results from different studies,

it is necessary to standardize the antimicrobial susceptibility testing of R. equi. To

achieve this goal, two media that were described in literature (CAMHB with and

without supplementation with 2 % (v/v) LHB) were used for antimicrobial

susceptibility testing of R. equi via broth microdilution; MIC values were read after 24

and 48 hours. Statistical analysis of repeated susceptibility testing showed, that the

probability to achieve homogenous MIC values was highest when using CAMHB with

2 % (v/v) LHB and reading the MIC values after 24 hours.

With this method we determined the susceptibility of 200 R. equi isolates

against 32 antimicrobial agents and combinations of agents. Only few isolates

showed elevated MIC values for one or few antimicrobial agents. One of these

isolates displayed moderately elevated MIC values against erythromycin,

clarithromycin and azithromycin. Further six isolates showed a reduced susceptibility

to rifampicin. Investigation of the molecular background of these six isolates showed,

that in addition to mutations in the rpoB-gene, that are well-known for their influence

on the susceptibility of different bacteria against rifampicin, there must be an

additional mechanism that influences the susceptibility of R. equi to rifampicin.

The results of an interlaboratory test, in which 18 German laboratories

participated, confirmed that our standardized method for the antimicrobial

susceptibility testing of R. equi could be applied without any problems and the results

of the MIC testing showed a good concordance.

Summary

31

The antimicrobial susceptibility testing of R. equi via broth microdilution using

CAMHB + 2 % (v/v) LHB and incubation in an aerobic atmosphere at 35 ± 2 °C für 24

hours is a reliable and applicable method. It has been approved by the Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI) for testing of R. equi from animal origin, will be

included in the forthcoming CLSI-document Vet06-A and will therefore become the

future standard method for antimicrobial susceptibility testing of R. equi.

Literaturverzeichnis

32

KAPITEL 9 Literaturverzeichnis

ASOH N., WATANABE H., FINES-GUYON M., WATANABE K., OISHI K., KOSITSAKULCHAI W., SANCHAI T., KUNSUIKMENGRAI K., KAHINTAPONG S., KHANTAWA B., THARAVICHITKUL P., SIRISANTHANA T., NAGATAKE T. (2003): Emergence of rifampin-resistant Rhodococcus equi with several types of mutations in the rpoB gene among AIDS patients in northern Thailand. J. Clin. Microbiol. 41, 2337-2340. BACH, N. (2011): Behandlung von Fohlen mit Tulathromycin (Draxxin®) zur Vorbeugung der Rhodococcus equi-Pneumonie: Klinische Wirksamkeit, Verträglichkeit und Ausscheidung des Erregers. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. BARTON, M. D., FULTON, I. C. (1980): Antibiotic sensitivity of Corynebacterium equi. Aust. Vet. J. 56, 339-342. BOWERSOCK, T. L., SALMON, S. A., PORTIS, E. S., PRESCOTT, J. F., ROBISON, D. A., FORD, C. W., WATTS, J. L. (2000): MICs of oxazolidinones for Rhodococcus equi strains isolated from humans and animals. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1367-1369. BOYEN, F., PASMANS, F., HAESEBROUCK, F. (2011): Acquired antimicrobial resistance in equine Rhodococcus equi isolates. Vet. Rec. 168,101a. BUCKLEY, T., MCMANAMON E., STANBRIDGE S. (2007). Resistance studies of erythromycin and rifampin for Rhodococcus equi over a 10-year period. Ir. Vet. J. 60, 728-731. BUNDESTIERÄRZTEKAMMER (2015): Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln – mit Erläuterungen –. Beilage zum Dtsch. Tierärztebl. 3/2015 BURTON, A. J., GIGUÈRE, S., STURGILL, T. L., BERGHAUS, L. J., SLOVIS, N. M., WHITMAN, J. L., LEVERING, C., KUSKIE, K. R., COHEN, N.D. (2013): Macrolide- and rifampin-resistant Rhodococcus equi on a horse breeding farm, Kentucky, USA. Emerg. Infect. Dis. 19, 282-285. CARLSON, K. L., KUSKIE, K. R., CHAFFIN, K. M., LIBAL, M. C., GIGUÈRE, S., LAWHON, S. D., COHEN, N.D. (2010): Antimicrobial activity of tulathromycin and 14 other antimicrobials against virulent Rhodococcus equi in vitro. Vet. Ther. 11, E1-9.

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Tabellenverzeichnis

37

KAPITEL 10 Tabellenverzeichnis

Seite

Tabelle 1………………………………………………………………………………………………………………………….. 17

Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung

von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution

Tabelle 2………………………………………………………………………………………………………..………………… 19

MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für Rifampicin und verschiedene Makrolid-Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien

Tabelle 3………………………………………………………………………………………………………..………………… 21

MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für verschiedene β-Laktam-Antibiotika:

Ergebnisse verschiedener Studien

Tabelle 4………………………………………………………………………………………………..………………………… 22

MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für verschiedene Wirkstoffe: Ergebnisse

verschiedener Studien

Danksagung

Ganz besonderer Dank gilt Prof. Dr. Stefan Schwarz und PD Dr. Christiane

Werckenthin, die mir die Bearbeitung dieses Projektes anvertraut haben. Danke für Eure Unterstützung, die Hilfestellung bei Problemen jeglicher Art und die vielen sehr fruchtbaren Gespräche.

Sehr dankbar bin ich auch Andrea Feßler, PhD, für ihr außergewöhnlich großes Engagement und Herz. Du hattest zu jeder Tages- und Nachtzeit ein offenes Ohr für meine Probleme und meist auch eine Lösung. Deine unglaubliche Sorgfalt bei der Durchsicht von Manuskripten ist trotz der Nerven, die sie uns beide gekostet hat, unbezahlbar!

Prof. Dr. Heiner Niemann danke ich für die freundliche Aufnahme ins Institut für Nutztiergenetik, Friedrich-Loeffler-Institut, in Neustadt-Mariensee und die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes.

Die Laborvergleichsuntersuchung, deren Auswertung Teil dieser Arbeit ist, hat Dr.

Heike Kaspar organisiert und mir die Ergebnisse zur Verfügung gestellt. Neben dieser fachlichen Unterstützung danke ich Dir aber auch für Deine fröhliche und unkomplizierte Art, die mir so machen Nervenzusammenbruch erspart hat.

Danke an das gesamte Laborteam der MMA in Mariensee für die Einarbeitung in die Mikrobiologie sowie Eure zahlreichen Ratschläge bei jeglichen Kapriolen meiner Rhodokokken. Im Besonderen danke ich Vivian Hensel für die Begleitung meiner ersten Schritte im Labor und für ihr Radio; Ina Ott für ihre großartige Hilfe bei der Massenabfertigung und ‚Hakuna Matata’ und Regina Ronge für die Herstellung absurder Mengen Flüssigmedien und Agarplatten sowie ihre unermüdliche Arbeit in der Spülküche.

Dr. Dieter Klarmann gebührt nicht nur ein Dankeschön für die freundliche Aufnahme im LVI Oldenburg. Darüber hinaus hat er mit den zahlreichen fachlichen Gesprächen, die unter anderem beim Einhalten der Kühlkette entstanden sind, meinen Horizont erweitert.

Das Diagnostik-Team des LVI Oldenburg hat bereits im Vorfeld meiner Arbeit unermüdlich Arcobacter- und Trueperella-Isolate gesammelt und asserviert – Danke dafür, auch wenn sie nun kein Teil dieser Dissertation geworden sind. Trotz Eures eigenen Routine-Stresses habt ihr all meine Fragen immer freundlich beantwortet, mir geholfen, wo ihr nur konntet, mich ab und zu in meinem Container-Exil besucht und mir zugehört, wenn ich mal Probleme loswerden musste. Danke an Euch alle für die wunderbare Zeit in Oldenburg!

Auch dem fröhlichen PCR-Team des LVI Oldenburg möchte ich einen Dank aussprechen. Ihr habt mir sehr geholfen und mich darin bestätigt, dass nicht ich zu blöd bin, sondern meine PCR.

Ein großes Dankeschön geht an Erdal Erol PhD, Dr. Ellen Prenger-Berninghoff,

Dr. Ivonne Stamm, Dr. Anton Heusinger und Dr. Reinhard Böse. Die vielen Rhodokokken, die all diese Kollegen mir zur Verfügung gestellt haben, waren die Basis meiner Arbeit und somit wäre ohne Sie alle diese Arbeit nie zustande gekommen.

Sarah, Moni, Sonja, Kristina und Carmen: Ihr seid absolut wundervolle Kolleginnen! Dank Eurer guten Laune und Verrücktheit, Euren jederzeit offenen Ohren und Türen, und vielen fachlichen und privaten Gesprächen war meine Zeit in Mariensee großartig. Doktor-Schwestern for life!

Andreas, Ralf, Sven und Boyung, sowie allen ‚Nebendarstellern’ unserer Laufgruppe danke ich für den gemeinsamen Kampf gegen den inneren Schweinehund und den Ausgleich zur Laborarbeit.

Für Ablenkung zur rechten Zeit, motivierende Worte, kleine und große Abenteuer und für’s Zuhören, obwohl ihr nicht immer alles versteht, was ich so ‚blubbere’, danke ich all meinen Freundinnen – im besonderen Kerstin, Sarah, Lotte, Anita und Catherina – und meinen WGs, sowie Klaus.

Das riesenbergigste Dankeschön von allen geht an meine Familie. Euer Glaube an mich, Eure Unterstützung in allen Belangen und Euer Optimismus sind wertvollst. Ihr habt mich zu dem gemacht, was ich heute bin – danke dafür!

Der Beste kommt zum Schluss: Ich bin Dir unendlich dankbar für Deine Rücksichtnahme auf dieses Projekt und Deine Unterstützung dabei, für zahlreiche Motivationen, für’s Zuhören und für’s Reden. Mit Dir an meiner Seite ist der Alltag kunterbunt. Danke für Alles!