Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen
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Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI) Zielzellen in Kulturschale ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasmatisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasmatisches Retikulum ERGIC G O LG I Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC G O LG I Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC G O LG I Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC G O LG I Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasmatisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasmatisches Retikulum Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen GI GI GI ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GOLGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GO LGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum ERGIC GO LGI Lysosom Endosom Zellkern endoplasm atisches Retikulum Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein)
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Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen. Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein). Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI). Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen. GI. GI. GI. - PowerPoint PPT Presentation
Transcript of Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen
Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen
Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI)
Zielzellen in Kulturschale
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Endosom
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Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen
GI GI
GI
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Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein)
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Stabil transfizierte Zellen
in-vitro Testung der Efflux-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen
Zugabe von Substrat
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Nicht transfizierte Kontrollzellen
transfizierte Zellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist, Kontrollzellen nicht oder deutlich weniger, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird
Abwaschen des nicht aufgenommenen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen.
in-vitro Testung der Transporterinhibition von endogen exprimierenden oder stabil transfizierten Zellen
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GOLGI Lysosom
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endoplasmatischesRetikulum
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Inhibitor zu den den zu untersuchenden Transporter exprimierenden Zellen geben, Kontrollzellen ohne Inhibitor
Kontrollzellen
Inhibitor lagert sich an Transporter an Abwaschen des überschüssigen Inhibitors Zugabe von Substrat Kontrollzellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist. Die inhibierten Zellen nehmen weniger oder kein Substrat auf, da der Transporter blockiert ist
Abwaschen des überschüssigen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen inhibierten Zellen und Kontrollzellen.
in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen
Zellen lysieren
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ERGIC
GOLGI Lysosom
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endoplasmatischesRetikulum
Stabil transfizierte Zellen Nicht transfizierte Kontrollzellen
Membranen isolieren ggfs. apikale und balolaterale Membranen trennen Membranen bilden inside-out-Vesikel, d.h. die inneren Membranbestandteile liegen außen und umgekehrt Zugabe von Substrat Substrat gelangt über Influx-Transporter in das Innere der Vesikel über Membranen der transfizierte Zellen, wenn Substrat transporterspezifisch ist, die Vesikel der Membranen der Kontrollzellen nehmen kein Substrat oder nur wenig auf, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird
Abwaschendes nicht aufgenommenen Substrates Homogenisieren der Vesikel Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen.
