Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain...

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Aus der Klinik für Pferde und dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie dem Institut für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin ___________________________________________________________________ Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von MYRIAM VON BORSTEL aus Bremerhaven Hannover 2003

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Aus der Klinik für Pferde und dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen

der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie dem Institut für Virologie

des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin ___________________________________________________________________

Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit

des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2)

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von MYRIAM VON BORSTEL

aus Bremerhaven

Hannover 2003

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen PD Dr. rer. nat. K. Borchers 1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen 2. Gutachter: Prof. Dr. M.H. Boevé Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 03

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite 1 Einleitung 15

2 Literaturübersicht 17

2.1. Anatomie und Funktion von Konjunktiva und Kornea 17 2.2. Entzündliche Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea beim Pferd 19

2.2.1. Konjunktivitis beim Pferd 19 2.2.2. Keratitis beim Pferd 20

2.3. Keratitis superficialis 22 2.3.1. Viruskeratitis 23

2.3.1.1. Keratitis punctata 24 2.3.1.2. Ulzerative Viruskeratitis 26 2.3.1.3. Keratitis maculosa 27 2.3.1.4. Weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien 27

2.4. Keratitis profunda 27 2.5. Keratitis interstitialis 29 2.6. Diagnostische Verfahren bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea 29

2.6.1. Exfoliative Zytologie 30 2.6.1.1. Technik der Probengewinnung 32

2.6.1.1.1. Abdruckzytologie 32 2.6.1.1.2. Tupfer 32 2.6.1.1.3. Geschabsel 33 2.6.1.1.4. Cytobrush 33

2.6.2. Erregernachweis 34 2.6.2.1. Mikrobiologische Untersuchung 34 2.6.2.2. Virologische Untersuchung 35

2.6.2.2.1. Indirekter Nachweis 35 2.6.2.2.2. Direkter Nachweis 35

2.7. EHV-2 beim Pferd 36 2.7.1 Vorkommen von EHV-2 in der Pferdepopulation 36 2.7.2 Klinische Relevanz und Nachweis von EHV-2 beim Pferd 37

3 Material und Methode 40

3.1 Versuchsplanung 40 3.2 Patientengut 40 3.3 Klinische Untersuchung 43

3.3.1 Spezielle ophtalmologische Untersuchung 43 3.3.1.1 Untersuchung im beleuchteten Raum 43 3.3.1.2 Untersuchung im abgedunkelten Raum 44

3.3.2 Klinische Diagnosen 44 3.4 Probenentnahme 48 3.5 Mikrobiologische Untersuchungen 50

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Inhaltsverzeichnis

3.6 Virologische Untersuchungen 50 3.6.1 DNA-Isolierung aus peripheren Blutleukozyten (PBL) 50 3.6.2 DNA-Präparation aus Augentupfer-und Augencytobrushproben 51

sowie aus Nasentupferproben 3.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis des EHV-2- 52

Genoms 3.6.4 Virus-Anzucht 53

3.7 Exfoliative Zytologie 54 3.8 Statistische Auswertung 55

4 Ergebnisse 56

4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 56 4.1.1 Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung 56 4.1.2 Ergebnisse der ophtalmologischen Untersuchung 56

4.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen 63 4.2.1 Ergebnisse des direkten EHV-2 Nachweises mittels PCR 63 4.2.2 Virologischer Nachweis von EHV-2 mittels Virusanzucht 74

4.3 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung 75 4.4 Ergebnisse der zytologischen Untersuchung 85

5 Diskussion 98 5.1 Material und Methode 98 5.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels PCR 101 5.3 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels Virusanzucht 104 5.4 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 104 5.5 Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen 107 5.6 Schlussfolgerung 109

6 Zusammenfassung 112 7 Summary 114

8 Literaturverzeichnis 116 9 Anhang 126

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Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis A Anzucht

Abb. Abbildung

α-hämolys. alpha-hämolysierend

anhämolys. anhämolysierend

Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

CB Cytobrush

CMC Carboxymethylcellulose

DNA Desoxyribonucleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

etc. et cetera

ED-Zellen equine Dermis Zellen

EDM Eagle´s minimum essential medium, Dulbecco´s

modification

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EHV Equines Herpes Virus

et al. et alii

FHV Felines Herpesvirus

FITC Fluoresceinisothiocyanat

G (Gravitationskraft)

ggr. geringgradig

gramneg. gramnegativ

grampos. grampositiv

°C Grad Celsius

hgr. hochgradig

HSV Hepes simplex Virus

IDU Idoxuridin

IE internationale Einheiten

IFT Immunfluoreszenstest

J Jahre

Kerat. Keratitis

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Abkürzungsverzeichnis

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

koag.- koagulasenegativ

mac. maculosa

mg Milligramm

mgr. mittelgradig

min Minute(n)

ml Milliliter

mm Millimeter

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM Mikromol

n Anzahl

NaCl Natriumchlorid

NCS newborn calf serum (Serum neugeborener Kälber)

nm Nanometer

nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase

Kettenreaktion)

Nr. Nummer

NT Nasentupfer

n.u. nicht untersucht

obB ohne besonderen Befund

oberfl. oberflächlich

OD Oculus dextra

OS Oculus sinistra

p p-Wert (Signifikanz)

PBS phosphat buffered saline (Phosphatpuffer)

PBL periphere Blutleukozyten

PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)

PFU plaque forming units (Plaquebildende Einheit)

pos. positiv

prof. profunda

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Abkürzungsverzeichnis

punct. punctata

punktf. punktförmig

® eingetragenes Warenzeichen

s. siehe

spf. superficialis

SPF spezifisch pathogenfrei

spp. species

subsp. subspecies

Tab. Tabelle

Taq Thermus aquaticus

TBS Tracheobronchialsekret

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Unit

u. und

UpM Umdrehungen pro Minute

US Untersuchung

UV ultraviollett

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

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Tabellenverzeichnis

Verzeichnis der Tabellen

Nr. Titel Seite

Tab. 1: Patienten mit Keratitis oder Keratokonjunktivitis (Gruppe 1) 41

Tab. 2: Kontrolltiere ohne Augenerkrankung (Gruppe 2) 42

Tab. 3: Gruppe 1 – Klinische Diagnosen bei der Erst- und Zweituntersuchung 57

im Abstand von vier Wochen

Tab. 4: Gruppe 1 – Befunde und Diagnosen bei der ophtalmologischen 60

Erstuntersuchung

Tab. 5: Gruppe 1 - Ergebnisse der ophtalmologischen Zweituntersuchung 61

(vier Wochen nach der Erstuntersuchung), [n = 25]

Tab. 6: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei 64

der Erstuntersuchung

Tab. 7: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei 66

der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)

Tab. 8: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Nachweishäufigkeit 68

von EHV-2 Genom in Cytobrush und Wattetupfer am einzelnen Auge

in Prozent

Tab. 9: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Positiver Nachweis 69

von EHV-2 Genom im Wattetupfer bei gleichzeitigem positiven

Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge

Tab. 10: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei 71

erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush

bei der Erstuntersuchung [ n = 28]

Tab. 11: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei 72

erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush

bei der Zweituntersuchung [n = 25]

Tab. 12: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom in den verschiedenen 73

Proben bei Erst- und Zweituntersuchung

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Tabellenverzeichnis

Tab. 13: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden 76

und erkrankten Augen bei der Erstuntersuchung, n [Augen] = 112

Tab. 14: Gruppe 1 und 2, Erstuntersuchung – Nachweise der Keimgruppen 77

bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent

Tab. 15: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden 80

und erkrankten Augen bei der Zweituntersuchung, n [Augen] = 100

Tab. 16: Gruppe 1 und 2, Zweituntersuchung – Nachweise der Keimgruppen 82

bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent

Tab. 17: Gruppe 1 und 2 – Nachweise verschiedener Entzündungszellen 85

bei gesunden und erkrankten Augen (n = 112)

Tab. 18: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen 87

aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus

Gruppe 1

Tab. 19: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen 88

aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus

Gruppe 2

Tab. 20: Gruppe 1 und 2 - Virologische Ergebnisse bei Augen mit dem 89

Vorkommen von Entzündungszellen, unabhängig von einer

klinischen Erkrankung

Tab. 21: Gruppe 1 – Zytologische Befunde bei erkrankten Augen mit und 90

ohne Begleitsymtom Konjunktivitis in Zusammenhang mit dem

Nachweis von EHV-2 Genom

Tab. A1: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der 126

Erstuntersuchung

Tab. A2: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der 128

Zweituntersuchung

Tab. A3: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der 130

Erstuntersuchung

Tab. A4: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der 131

Zweituntersuchung

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Tabellenverzeichnis

Tab. A5: Nachweis von EHV-2 in Gruppe 2 bei der Erst- und 132

Zweituntersuchung

Tab. A6: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 133

bei der Erstuntersuchung

Tab. A7: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 135

bei der Zweituntersuchung

Tab. A8: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 137

bei der Erstuntersuchung

Tab. A9: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 139

bei der Zweituntersuchung

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Abbildungsverzeichnis

Verzeichnis der Abbildungen

Nr. Titel Seite Abb. 1 : Querschnitt durch die Kornea 18

Abb. 2: Keratitis superficialis 46

Abb. 3: Keratitis punctata seu maculosa 46

Abb. 4: Hornhautabrasion 46

Abb. 5: Keratitis punctata seu maculosa 46

Abb. 6: Keratitis profunda 46

Abb. 7: Keratitis vasculosa 46

Abb. 8: Befundbogen zur Dokumentation der ophtalmologischen 47

Untersuchungsbefunde

Abb. 9: Instrumentarium zur Probengewinnung 49

Abb. 10: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels 65

PCR bei der Erstuntersuchung

Abb. 11: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels 67

PCR bei der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der

Erstuntersuchung)

Abb. 12: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Vergleich von 70

Cytobrush und Wattetupfer beim positiven EHV-2 Nachweis

am einzelnen Auge

Abb. 13: Gesunde Augen (n = 84) – Prozentualer Anteil der nach- 78

gewiesenen Keimgruppen bei der Erstuntersuchung

Abb. 14: Erkrankte Augen (n = 28) - Prozentualer Anteil der nach- 79

gewiesenen Keimgruppen bei der Erstuntersuchung

Abb. 15: Gesunde Augen (n = 75) – Prozentualer Anteil der nach- 83

gewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung

Abb. 16: Erkrankte Augen (n = 25) - Prozentualer Anteil der nach- 84

gewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung

Abb. 17: Epithelzellverband 93

Abb. 18: Lymphozyt, umgeben von Epithelzellen 93

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Abbildungsverzeichnis

Abb. 19: Einzelne Epithelzellen mit zwei neutrophilen Granulozyten (NG) 95

und einem Lymphozyten (LZ)

Abb. 20: Lymphozyt (LZ) neben Epithelzellverband 95

Abb. 21: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen 97

Abb. 22: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen liegend 97

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Einleitung

1 Einleitung

Als Ursache für spontan auftretende Keratitiden oder Keratokonjunktivitiden wird

beim Pferd häufig eine Virusätiologie vermutet, oft begründet durch den erfolgreichen

therapeutischen Einsatz von lokalen Virostatika. Hierbei wird in den meisten Fällen

eine Virusinfektion dem klinischen Bild einer Keratitis superficialis in den Formen

einer Keratitis punctata, Keratitis maculosa oder Keratitis ulcerosa zugeordnet

(THEIN und BÖHM 1976, THEIN 1978, SCHMIDT 1988, KELLNER 1990, MILLER et

al. 1990, COLLINS et al. 1994, BARNETT et al. 1998, STADES et al. 1998).

Als mögliches krankheitsverursachendes Virus wird von THEIN (1976) in einem

ersten Fallbericht das equine Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) isoliert. Auch andere

Autoren wiesen in späteren Untersuchungen EHV-2 nach ( THEIN und BÖHM 1976,

MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1994, VON OPPEN 2000).

Der Nachweis des EHV-2 ist durch unterschiedliche Methoden möglich. Die

serologische Untersuchung auf EHV-2-Antikörper im Blut ist eine indirekte

Nachweismethode (THEIN 1976, BORCHERS et al. 1997, BORCHERS et al. 1999).

Eine Virusisolierung durch Anzüchtung in Zellkulturen weist nach einer längeren

Inkubation in den meisten Fällen einen zytopathischen Effekt mit Bildung

intranukleärer Einschlusskörperchen des Typs Cowdry A auf (THEIN 1976, THEIN

1978, MILLER et al. 1990, ROLLE und MAYR 1993, COLLINSON et al. 1994,

BROWNING und AGIUS 1996). Mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (nested

PCR) konnte EHV-2-Genom in Material aus Augen- und Nasentupfern nachgewiesen

werden (BORCHERS et al. 1997, RIZVI et al. 1997, BORCHERS et al. 1998,

WOLFINGER 1998), wobei diese Methode einen 1000fach sensitiveren Nachweis im

Vergleich zu der Isolierung in Zellkulturen erlaubt. Eine zytologische Untersuchung

von Konjunktivalausstrichen konnte bisher keinen Zusammenhang zwischen dem

Nachweis von intranukleären Einschlusskörperchen und dem virologischen

Nachweis von EHV-2 erkennen lassen (KRÜDEWAGEN et al. 2001, KELLNER

1990).

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Einleitung

Bislang ist es nicht gelungen, einen Zusammenhang zwischen dem bisher als

„Viruskeratitis“ beschriebenen klinischen Bild und der Isolierung des EHV-2

nachzuweisen (VON OPPEN 2000). VON OPPEN (2000) und KERSHAW (2001)

konnten jedoch in Augentupfern von Pferden, die an einer Keratitis oder

Keratokonjunktivitis erkrankt waren, einen signifikant häufigeren Nachweis von EHV-

2 Genom mittels PCR führen als bei augengesunden Tieren einer Kontrollgruppe. Im

Gegensatz dazu konnte in einer jüngeren Studie (BESTHORN 2002) kein

signifikanter Unterschied beim Nachweis von EHV-2 Genom zwischen

augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden festgestellt werden. Somit

ist eine Beteiligung des EHV-2 an den häufig beschriebenen „Viruskeratitiden“ nach

wie vor unklar.

Ziel dieser Arbeit ist es, erweiterte Untersuchungsmethoden den herkömmlichen

Verfahren der Probenentnahme gegenüberzustellen. Dabei soll untersucht werden,

ob durch die Verwendung von Cytobrush-Tupfern ein zuverlässigerer Nachweis des

EHV-2 gelingt und ob dieser Nachweis mit einem klinischen Bild und einem

zytologischem Ausstrich des gewonnenen Probenmaterials in Zusammenhang zu

bringen ist. Diese Methode könnte dann als einfaches und schnelles

Nachweisverfahren etabliert werden.

Häufig werden bei Keratitiden oder Konjunktivitiden des Pferdes mikrobiologische

Untersuchungen von Augentupfern durchgeführt. Die Ergebnisse dieser

Untersuchungen sind meist sehr unspezifisch und häufig durch saisonalen Einfluss,

geographische Lage und lokale Umgebung beeinflusst und wenig aussagekräftig

(WHITLEY et al. 1983, BARNETT et al. 1998).

In dieser Arbeit soll durch mikrobiologische Untersuchungen von Konjunktivatupfern

ein Vergleich der nachgewiesenen Keime in gesunden und an einer Keratitis oder

Keratokonjunktivitis erkrankten Augen erfolgen, um möglicherweise eine bessere

Beurteilung über eine eventuelle klinische Relevanz von isolierten Keimen zu

ermöglichen.

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Literaturübersicht

2 Literaturübersicht 2.1 Anatomie und Funktion von Konjunktiva und Kornea

Die Tunica conjunctiva oder Bindehaut wird in bulbäre, palpebrale und die Membrana

nicitans überziehende Anteile unterteilt. Sie erfüllt als Schleimhaut im wesentlichen

eine Schutzfunktion. Intraepitheliale Becherzellen liefern den mukösen Sekretanteil

des praeokularen Tränenfilms, ergänzt wird dieser durch Produktion von Flüssigkeit

in den Tränendrüsen des Tränenapparates. Dadurch wird die Bulbusfläche feucht

gehalten und eine Selbstreinigungsfunktion erfüllt .

Am Limbus corneae geht das mehrschichtige Zylinderepithel der Konjunktiva in das

Hornhautepithel und am Lidrand in das Epithel der Haut über (NICKEL et al. 1990,

MARTIN 1994, BARNETT et al. 1998).

Die gefäßlose Kornea oder Hornhaut ist durchsichtig und queroval. Sie geht am

Sulcus sclerae in die undurchsichtige Sklera über. Gemeinsam bilden sie die Tunica

fibrosa bulbi oder äußere Augenhaut, wobei die gefäßarme Sklera etwa 4/5 des

Bulbus bildet (NICKEL et al. 1990).

Unter dem praeokularen Tränenfilm wird die äußerste Schicht der Kornea durch ein

mehrschichtiges, nicht verhornendes Plattenepithel gebildet. Dieses liegt einer

Basalmembran auf und ist mit sensiblen Nervenendigungen durchsetzt.

Als stärkste Schicht der Kornea folgt das Stroma. Die in einer regelmäßigen

Gitterstruktur angeordneten Typ-I-Kollagenfasern machen neben dem hohen

Wassergehalt die Transparenz der Hornhaut aus. Dieser Aufbau erklärt Trübungen

der Kornea bei Veränderungen der Gitterstruktur.

Dem Stroma schließt sich nach innen die Descemetsche Membran an. Sie besteht

aus einer engen Anordnung von Typ-I-Kollagenfibrillen, welche eine hohe Elastizität

aufweisen.

Als letzte und innerste Schicht folgt das durch ein einschichtiges Plattenepithel

gebildetes Endothel (MARTIN 1994, BARNETT 1998).

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Literaturübersicht

Die Kornea besteht zu 70% aus Wasser, 21% aus Proteinen, 7% aus

Polysacchariden und jeweils 1% aus Lipiden bzw. Metaboliten. Die Ernährung der

gefäßlosen Hornhaut erfolgt durch Diffusion und aktiven Stoff- und Ionenaustausch

aus perilimbalen Gefäßen, dem praeokularen Tränenfilm und zum größten Teil aus

dem Kammerwasser (HOLLWICH 1988).

2

3

4

5

1

6

Abb.1: Querschnitt durch die Kornea (nach STADES):

1 Tränenfilm; 2 Epithel; 3 sensibler Nervenast; 4 Stroma; 5 Descemetsche

Membran; 6 Endothel

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Literaturübersicht

2.2 Entzündliche Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea beim Pferd Eine Entzündung von Konjunktiva oder Kornea, bzw. beider Strukturen, kann sowohl

infektiöse als auch nicht infektiöse Grundlagen haben.

Da Kornea und Konjunktiva äußeren Einflüssen wie Staub, Wind und

Mikroorganismen ausgesetzt sind, bereitet häufig ein äußerer Reiz den Weg für ein

infektiöses Agens (STADES et al. 1998).

Obwohl bei einer Erkrankung oftmals beide Strukturen beteiligt sind, gibt es in der

Literatur nur wenige Berichte über eine „gemeinsame“ Erkrankung von Konjunktiva

und Kornea. So wird bei THEIN und BÖHM (1976) eine „virusbedingte

Keratokonjunktivitis“ beim Pferd beschrieben. Verschiedene Autoren berichten über

eine „eosinophile Keratokonjunktivitis“ (RAMSEY et al. 1994, BRANDT et al. 1995,

YAMAGATA et al. 1996, SLATTER 2001). Die beim Kleintier relativ häufig

vorkommende Keratokonjunktivitis sicca, bei der ein Defizit des wässrigen Anteils

des präokularen Tränenfilms besteht, ist beim Pferd eine seltene Erkrankung

(REILLY u. BEECH 1994, BARNETT et al. 1998).

Nachfolgend werden Erkrankungen beider Strukturen getrennt beschrieben.

2.2.1 Konjunktivitis beim Pferd

Die klinische Symptomatik bei einer Konjunktivitis umfasst eine Hyperämie der

Konjunktiva sowie Augenausfluss unterschiedlicher Qualität. Man unterscheidet

zwischen einer primären Konjunktivitis, die durch infektiöse Agenzien, Traumata oder

andere Stimuli ausgelöst wird, und einer sekundären Konjunktivitis, die bei

Erkrankungen anderer Augenstrukturen, wie z. B. der Kornea auftritt (BARNETT et

al. 1998).

Ferner kann eine Konjunktivitis auch ein Initial- und Begleitsymptom bei

systemischen Infektionskrankheiten sein (SCHMIDT 1987, LAVACH 1992). Im

Rahmen eines Infektionsversuches mit EHV-2 bei Ponies traten Konjunktivitiden auf

(BORCHERS et al. 1998), ebenso werden sie im Zusammenhang mit Infektionen

durch EHV-1 und EHV-4 beschrieben (THEIN 1993).

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Literaturübersicht

Das Milieu des Konjunktivalsackes ist physiologischerweise nicht steril. So wurden in

einer Studie an augengesunden Pferden in bakteriellen Kulturen aus Augentupfern

vor allem Corynebakterien spp., Staphylokokken spp., Streptokokken spp. und

Bacillus spp. nachgewiesen (WHITLEY et al. 1983). Außerdem konnten in einer

Untersuchung von Konjunktivatupfern augengesunder Pferde bei 95% der Tiere

Pilze, davon allein bei 56% Aspergillus spp. isoliert werden. Penicilliumarten wurden

ubiquitär gefunden (SAMUELSON et al. 1984).

Bei BARNETT et al. (1998) werden als häufig in gesunden Augen isolierte Keime

ebenfalls Corynebakterien spp., Staphylokokken spp., Streptokokken spp. und

Bacillus spp., Moraxella spp., Neisseria spp. und Enterobacteriaceae erwähnt. Von

erkrankten Augen können nach BARNETT et al. (1998) häufig Pseudomonaden,

Staphylokokken, Streptokokken, Aktinobazillen, Moraxellen, Klebsiellen,

Enterobacteriaceae und Bacillus spp. isoliert werden, diese benötigen jedoch

begünstigende Faktoren, um pathogen zu wirken. Eine in den USA erstmals

berichtete primäre Konjunktivitis durch Moraxella equi scheint in Deutschland bisher

keine klinische Bedeutung zu haben. BARNETT et al. (1998) schreiben, dass

gramnegative Keime häufiger von kranken als gesunden Augen isoliert werden

können.

2.2.2 Keratitis beim Pferd

Die Einteilung der verschiedenen Keratitiden beim Pferd erfolgt in der Literatur nicht

einheitlich. Die Klassifizierung kann nach verschiedenen Gesichtspunkten erfolgen

wie beispielsweise nach der Ätiologie, der Lokalisation oder ihrem Charakter. Die

einzelnen Strukturen der Hornhaut können verschieden auf denselben Reiz

reagieren, dasselbe klinische Bild kann durch verschiedene Formen der Entzündung

verursacht werden (SLATTER 2001). Ferner muss bedacht werden, dass sich

Keratitiden komplizieren können und somit die Entwicklung zu einer anderen

klinischen Form oft fließend sind.

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Literaturübersicht

Die Einteilung der Keratitiden des Pferdes erfolgt durch BARNETT et al. (1998) in

drei Gruppen nach ihrer anatomischen Lokalisation unter Angabe einer möglichen

Ätiologie.

Bei einer oberflächlichen Erkrankung sind lediglich Hornhautepithel und vorderes

Stroma betroffen. Als Ursache für diese Keratitis superficialis werden natürliche

Exposition, Traumata und Viren genannt.

Wenn neben Epithel und Stroma auch die in der Tiefe folgende Descemetsche

Membran betroffen ist, sprechen die Autoren von einer Keratitis profunda. Neben

Traumata werden hierbei Infektionen mit Bakterien, Pilzen und Parasiten

verantwortlich gemacht.

Bei einer Keratitis interstitialis sind primär nur Stroma und Descemetsche Membran

betroffen, nicht aber das Epithel. Sie wird meist ohne offensichtliche Ätiologie

beobachtet (BARNETT et al. 1998).

Auch bei anderen Autoren findet sich eine entsprechende Einteilung der

Keratitislokalisationen (SCHMIDT 1987, STADES et al. 1998). Hier erfolgt aber keine

Festlegung hinsichtlich der Ätiologie.

So gehen STADES et al. (1998) davon aus, dass eine Keratitis superficialis durch

Mikroorganismen aller Art – Viren, Bakterien, Pilze, etc. – verursacht werden kann.

SPIESS (1994) unterscheidet die entzündlichen Korneaveränderungen in ulzerative

und nichtulzerative Keratitiden.

Im Folgenden werden die Einteilungen der Keratitiden und ihre klinischen Befunde

näher erläutert. Dabei erscheint es nach obigen Ausführungen sinnvoll, sich an der

Einteilung von BARNETT et al. (1998) zu orientieren unter der Berücksichtigung

weiterer Autoren.

21

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Literaturübersicht

2.3 Keratitis superficialis

Eine oberflächliche Hornhautentzündung mit Gefäßeinsprossungen und möglichen

Komplikationen, wie z. B. der Ausbildung flacher Ulzera oder Epithelabschilferungen,

wird auch als Expositionskeratitis bezeichnet. Sie ist Folge von anormaler

Tränenproduktion oder –verteilung und kann im Rahmen einer Keratokonjunktivitis

sicca, aber auch durch einen Exophtalmus, Neoplasien und Traumata sowie eine

chronische Konjunktivitis entstehen.

Bei einer Hornhautabrasion, entstanden durch ein Trauma, Entropium, ektopische

Zilien oder Fremdkörper, ist das Auge in allen Fällen akut schmerzhaft. Es zeigt eine

Abwehrtrias, bestehend aus Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie. Die

Kornea zeigt ein oberflächliches Ulkus mit einem Ödem und, je nach Dauer der

Erkrankung, eine oberflächliche Gefäßeinsprossung sowie eine konjunktivale

Hyperämie.

Ein chronisches oberflächliches Ulkus entsteht dann, wenn durch das Ersatzepithel

keine normale Basalmembran gebildet werden kann. Dies tritt häufig bei älteren

Tieren auf. Die klinischen Reizerscheinungen sind meist nur gering, das flache Ulkus

ist von einem schmalen Stromaödem umgeben und zeigt keine Gefäßeinssprossung

(BARNETT et al. 1998).

Desweiteren führen BARNETT et al. (1998) noch drei Keratitisformen unbekannter

Ätiologie auf. Die Pigmentkeratitis zeichnet sich durch eine oberflächliche

Gefäßeinsprossung und vom Limbus ausgehende Pigmentierung aus. Sie geht mit

einer Hyperämie der Konjuktiva und einer Abwehrtrias einher.

Ebenfalls durch eine oberflächliche Gefäßeinsprossung charakterisiert ist die

idiopathische Keratitis vasculosa, die jedoch ohne Pigmentierung und mit einem

perivaskulären Ödem einhergeht.

Als chronische Keratitis superficialis wird eine wiederkehrende Keratitis mit mäßiger

Reizung bezeichnet, bei der in der akuten Phase ein epitheliales und subepitheliales

Ödem mit einzelnen oberflächlichen Gefäßen auftritt.

22

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Literaturübersicht

2.3.1 Viruskeratitis Ebenfalls in den Bereich der Keratitis superficialis werden die vermutlich

virusbedingten Keratopathien eingeordnet. Eine Virusätiologie wird in Deutschland

bei Hornhauterkrankungen des Pferdes häufig vermutet. Diese wird zum Teil wegen

der schnellen klinischen Besserung auf lokal applizierte Virostatika zurückgeführt

(BARNETT et al. 1998). Außerdem sind bei anderen Spezies Herpesinfektionen, die

zu lokalen Entzündungen des Auges führen, bekannt.

So werden in der Humanmedizin bei der Herpes corneae simplex, ausgelöst durch

das Herpes-simplex-Virus, drei klinische Erscheinungsformen unterschieden. Es

werden die herpetische Keratitis punctata oder stellata superficialis, die Keratitis

dendritica und die Keratitis disciformis beschrieben (STRAUB und KÖHLER 1992).

Bei der Katze wird das feline Herpesvirus (FHV-1) als Auslöser einer Keratitis mit

Beteiligung von Epithel und Stroma beschrieben und bei Katzen im Rahmen einer

experimentellen Herpesinfektion am Auge nachgewiesen (NASISSE et al. 1989).

Beim Pferd gelang bei Tieren mit einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis der

Nachweis des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) signifikant häufiger als bei

augengesunden Pferden. Es konnte bisher jedoch kein Zusammenhang zu den in

der Literatur als vermeintlich pathognomonisch beschriebenen klinischen Bildern der

Viruskeratitis nachgewiesen werden (VON OPPEN et al. 2001, KERSHAW et al.

2001). Auch andere Autoren wiesen bei Keratitiden EHV-2 nach (THEIN und BÖHM

1976, MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1994). In einer Studie von BESTHORN

(2002) konnte kein signifikanter Unterschied im Nachweis von EHV-2 Genom bei

augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden festgestellt werden.

23

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Literaturübersicht

KELLNER (1990) unterscheidet beim Pferd zwei klinische Formen einer

Viruskeratitis. Zum einen beschreibt er eine diffuse Trübung der vorderen

Stromaschichten mit intaktem Hornhautepithel, die mit einer leichten Rötung der

Konjunktiva einhergeht, wobei das betroffene Auge wenig schmerzhaft ist. Die

andere, häufiger beobachtete Form zeigt sich mit einer deutlichen Beteiligung der

Bindehaut und oberflächlichen anfärbbaren Epitheldefekten in der Hornhaut, wobei

eine ausgeprägte Schmerzsymptomatik besteht.

Bei BARNETT et al. (1998) werden vier klinische Bilder der Viruskeratitis

unterschieden:

- Keratitis punctata

- ulzerative Viruskeratitis

- Keratitis maculosa

- weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien.

2.3.1.1 Keratitis punctata Die Keratitis punctata tritt als häufigste Form der Erkrankung akut und meist einseitig

auf. Das betroffene Auge ist in der Regel hochgradig schmerzhaft. Die Konjunktiva

ist ödematisiert und hyperämisch. Hornhautläsionen erscheinen als unregelmäßige

fluoreszeinpositive oberflächliche Trübungen mit einem Ödem des darunterliegenden

Stromas. Die epithelialen Veränderungen stellen sich als schwache, streifige bis

linienförmige und zum Teil verzweigte, aber auch typische nadelstichartige,

oberflächliche Läsionen dar. Meist werden die Veränderungen durch eine Miosis als

Ausdruck der Schmerzhaftigkeit begleitet, eine Gefäßeinsprossung in die Hornhaut

tritt nicht auf (BARNETT et al. 1998).

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Literaturübersicht

Auch bei anderen Autoren finden sich ähnliche Beschreibungen einer Keratitis

punctata oder Keratitis punctata superficialis im Zusammenhang mit einer

vermuteten Herpesvirusätiologie. So beschreibt SCHMIDT (1988) eine nicht

ulzerierende Keratitis mit multiplen, punktförmigen, epithelialen und subepithelialen

Trübungen bei intaktem Hornhautepithel, die sich bei zunehmender

Schmerzhaftigkeit als Erosionen darstellen. Dabei weist er auf EHV-2 als möglichen

Verursacher hin.

Andere Autoren haben in Einzelfällen EHV-2 nachgewiesen und diskutieren dessen

ätiologische Bedeutung. So beschreiben THEIN und BÖHM (1976) eine einseitige

Keratitis, wobei die Pferde eine unregelmäßig umschriebene, nicht homogene

rauchige Hornhauttrübung mit multiplen, höckrigen Vorwölbungen und eine

Abwehrtrias als Ausdruck der Schmerzhaftigkeit aufweisen. Die epithelialen

Vorwölbungen werden dabei als punktförmige, milchig-weiße Herde beschrieben, die

je nach Lage und Häufigkeit linienförmige Strukturen bilden. Bei einem Teil der

Pferde war die Hornhaut punktförmig fluoreszeinpositiv, auch konnte bei einigen

Tieren schon früh eine oberflächliche Gefäßeinsprossung ausgemacht werden. Bei

einem Fohlen konnte aus Hornhautmaterial EHV-2 isoliert werden.

MILLER et al. (1990) berichten von einer schmerzhaften Hornhauttrübung mit

Korneaödem und oberflächlicher Gefäßeinsprossung bei einer Vollblutstute. Hierbei

konnte EHV-2 aus Augentupfer und Hornhautgeschabsel nachgewiesen werden.

COLLINSON et al. (1994) beschreiben eine Keratokonjunktivitis bei Fohlen, wobei

sich die punktförmigen Trübungen der Hornhaut nicht anfärben lassen.

LAVACH (1990) berichtet von multiplen, punktförmigen, weißlichen, schmerzhaften

Kornealäsionen und führt als mögliches verusachendes Virus EHV-1 an.

Auch DAVIDSON (1991) charakterisiert das klinische Bild mit einer streifigen

weißlichen Trübung mit multifokalen punktförmigen Läsionen und geht von einer

Infektion mit EHV-1 als möglichen Urheber aus.

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Literaturübersicht

Beim Menschen wird von STRAUB und KÖHLER (1992) die Form der herpetischen

Keratitis punctata oder stellata beschrieben, bei der die Hornhaut mit grauen

Trübungen verschiedener Größe auffällt, die teilweise sternförmig angeordnet sind.

Treten auf der Hornhaut multiple kleine Effloreszenzen auf, die zu verzweigten Linien

ästchenförmig zusammenziehen, so sprechen die Autoren von einer Keratitis

dendritica. Diese Gebilde sind aufgrund des losen Epithels mit Fluoreszein

anfärbbar.

Bei der Katze findet sich eine ähnliche Beschreibung für das klinische Bild einer

Herpeskeratitis. So schildert NASISSE (1991) im akuten Verlauf verzweigte

dendritische Trübungen der Kornea zusammen mit einer Konjunktivitis und einer

Abwehrtrias. Mit zunehmender Dauer der Erkrankung entwickelt sich ein

Hornhautödem sowie eine oberflächliche Gefäßeinsprossung.

2.3.1.2 Ulzerative Viruskeratitis

Die ulzerative Viruskeratitis tritt seltener auf als die Keratitis punctata. Wie bei der

ersten Form zeigen die Tiere eine hochgradige Schmerzhaftigkeit des betroffenen

Auges. Auf der Hornhaut findet sich ein flaches, gut abgegrenztes und anfärbbares

Ulkus, welches von einem Stromaödem umgeben ist. In diesem Bereich können

mehrere kleine Epitheldefekte vorliegen. Eine Gefäßeinsprossung tritt in der Regel

auch bei dieser Form nicht auf (BARNETT 1998).

Beim Menschen berichten STRAUB und KÖHLER (1992), dass aus einer rein

epithelialen Keratitis dendritica besonders bei Rezidiven durch Beteiligung der

oberflächlichen Parenchymschichten und durch Zusammenschluß der linienförmigen

Defekte ein sogenanntes dendritisches Ulkus entsteht.

Auch bei der Katze wird von NASISSE (1992) eine oberflächliche Ulzeration mit

Beteiligung oberflächlicher Hornhautschichten beschrieben.

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Literaturübersicht

2.3.1.3 Keratitis maculosa Diese Form stellt eine Folge der rezidivierenden Keratitis punctata und der

ulzerativen Viruskeratitis dar. Sie tritt meist einige Wochen nach Abheilung der

aufgetretenen Veränderungen auf. Dabei zeigt das Auge bei deutlich geringerer

Schmerzhaftigkeit eine dichte, fokale, oberflächliche Hornhauttrübung mit einer

oberflächlichen Gefäßeinsprossung (BARNETT et al. 1998).

2.3.1.4 Weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien

Bei BARNETT et al. (1998) werden weitere krankhafte Veränderungen der Hornhaut

beschrieben, die mit einer möglichen Virusätiologie in Zusammenhang gebracht

werden. Dazu zählen eine nicht anfärbbare epitheliale Bläschenbildung, herdförmige

Stromaödeme mit darüberliegenden fluoreszeinpositiven Epitheldefekten, sowie

sonnenstrahlartig („sunburst“) angeordnete Epitheldefekte mit deutlichem

subepithelialen Ödem.

2.4 Keratitis profunda

Bei einer tiefen Keratitis sind neben dem Hornhautepithel auch Stroma und

Descemetsche Membran betroffen. Sie kann durch infektiöse Ursachen

hervorgerufen werden oder aber auch durch Verletzungen, wie zum Beispiel durch

perforierende Fremdkörper entstehen. Dabei kann sich ein Hornhautulkus

entwickeln, welches durch eine mikrobielle Infektion der Kornea verursacht werden

kann und im Prinzip eine Sonderform der Keratitis profunda darstellt. Klinisch zeigen

die Pferde auf dem betroffenen Auge eine ausgeprägte Schmerzhaftigkeit. Das Ulkus

weist einen fluoreszeinpositiven Stromadefekt unterschiedlicher Tiefe auf. Im

fortgeschrittenem Stadium kann es zur Descemetozele und sogar zu einer

Hornhautperforation kommen. Die Hornhaut weist eine Trübung von

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Literaturübersicht

unterschiedlichem Ausmaß und Färbung sowie meist eine oberflächliche und tiefe

Gefäßeinsprossung auf (BARNETT et al. 1998).

Bei der bakteriellen Keratitis lassen sich meist gramnegative Keime wie

Enterobacteriaceae, aber auch Pseudomonaden und Proteus spp. isolieren

(BARNETT et al. 1998).

Bei einer mykotischen Keratitis werden vermehrt Aspergillus spp., Penicillium spp.

und Fusarien spp. nachgewiesen (BARNETT et al. 1998, DAVIDSON 1991). Der

beim Menschen häufig vorkommende Candida albicans wird beim Pferd nur selten

als Erreger einer mykotischen Keratitis gefunden (DAVIDSON 1991).

Die in Deutschland nur selten anzutreffende parasitäre Keratitis wird durch

Mikrofilarien von Onchocerca spp., Setaria spp. und Artionema spp. hervorgerufen

(BARNETT et al. 1998).

Pferde, die an einer tiefen Keratitis mit ungeklärter Ätiologie erkrankt sind, zeigen oft

eine weniger ausgeprägte Schmerzsymptomatik. Der Hornhautdefekt präsentiert sich

als schlecht heilendes Ulkus oder als peripheres Ulkus. Es besteht dabei ein

Stromadefekt mit Gefäßeinsprossung. Die kulturellen Untersuchungen von

Hornhautgeschabseln oder –tupfern verlaufen meist ohne besonderen Befund

(BARNETT et al. 1998).

Die chronisch rezidivierende tiefe Keratitis kann über mehrere Jahre hinweg in

unregelmäßigen zeitlichen Abständen auftreten, wobei ursprünglich ein Trauma

vorgelegen haben kann. Auch ein autoimmunes Geschehen wird diskutiert. Die

hauptsächlichen Veränderungen liegen mit hoher Wahrscheinlichkeit am Endothel

mit Ausprägung eines Stromaödems und einer Vaskularisation in akuten Stadien. Es

kann zur Bläschenbildung im Stroma kommen, die sich eventuell flüssigkeitsgefüllt

mit typischer grüner Farbe bis hin zu Kalziumablagerungen präsentieren (BARNETT

et al. 1998).

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Literaturübersicht

2.5 Keratitis interstitialis Die interstitielle Keratitis ist gekennzeichnet durch eine dauerhafte, diffuse, nicht

ulzerierende, tiefe Stromatrübung. Ihre Ätiologie ist unklar. Das betroffene Auge ist

dabei schmerzfrei und eventuell ist eine tiefe Gefäßeinsprossung auf Niveau des

hinteren Stromas oder sogar der Descemetschen Membran zu sehen (BARNETT et

al 1998).

Beim Menschen wird eine Keratitis disciformis als Form der herpetischen

Hornhautinfektion beschrieben. Sie kann isoliert im Stroma auftreten oder mit den

oberflächlichen Formen gemeinsam vorkommen. Dabei zeigt das Stroma eine

typische scheibenförmige Trübung mit Bildung von konzentrischen Trübungsringen

und einem Ödem der Hornhaut (STRAUB u. KÖHLER 1992).

2.6 Diagnostische Verfahren bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea

Zur Diagnostik bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea können verschiedene

Methoden zum Einsatz kommen. Zum einen kann versucht werden, durch

virologische und mikrobiologische Untersuchungen von Probenmaterial des

betroffenen Auges einen möglichen Erregernachweis zu führen. Weiterhin können

zur Diagnosefindung zytologische Untersuchungen von Zellmaterialien aus den

betroffenen Strukturen durchgeführt werden.

Im Folgenden werden die verschiedenen möglichen Methoden erläutert.

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Literaturübersicht

2.6.1 Exfoliative Zytologie Bei der exfoliativen Zytologie wird Zellmaterial mikroskopisch untersucht, welches

durch verschiedene, im folgenden beschriebene, Methoden von dem zu

untersuchenden Gewebe gewonnen werden kann.

Zur genaueren Diagnose bei Konjunktivitiden und Keratitiden wird gewöhnlich vom

erkrankten Auge aus dem Bereich der Konjunktiva, der Kornea oder des Lidrandes

Probenmaterial gewonnen. Dieses dient zum einem der Erregerdifferenzierung, zum

anderen aber auch zur Gewinnung von Zellmaterial. Dieses wird nach Fixation und

Färbung auf einem Objektträger mikroskopisch untersucht. Beurteilt werden dabei

Zellart und –typ (z.B. oberflächliche, tiefe und jugendliche Epithelzellen, Menge und

Art von Entzündungszellen, etc.) sowie eventuelle Hinweise auf Erreger wie

beispielsweise Pilzhyphen, Einschlusskörperchen bei Virusinfektionen oder

intrazelluläre Erreger wie Chlamydien. Die Färbung des gewonnenen

luftgetrockneten Materials erfolgt mit Giemsa, Lactophenolblau, neuer

Methylenblaulösung oder einer May-Grünwald/Giemsa Kombination (BAUER 1999).

Diese Art der Diagnostik stellt ein schnelles und wenig aufwendiges Verfahren dar

und wird beim Menschen besonders zur Quantifizierung von Becherzellen und zur

morphologischen Beurteilung der Epithelzellen bei Keratokonjunktivits sicca und

okularem Pemphigoid genutzt (ADAMS et al. 1988, DE ROJAS et al. 1993, MASKIN

et al 1989, NELSON 1988). Außerdem ist die exfoliative Zytologie hilfreich zur

Diagnostik von Speicherkrankheiten, wie beispielsweise der Mucopolysaccharidose,

bei infektiösen Erkrankungen wie Chlamydienkonjunktivitis oder Herpes zoster

Keratitiden und bei allergischen Geschehen, wie beispielsweise der

Frühlingskonjunktivitis (MASKIN et al. 1989, WILHELMS et al. 1986).

Auch beim Kleintier wird die exfoliative Zytologie bereits eingesetzt. So gibt es

Studien über Quantifizierung und Verteilung von Becherzellen bei augengesunden

Hunden im Vergleich zu Hunden mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996).

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Literaturübersicht

WILLIS et al. (1997) untersuchten bei Hunden und Katzen zytologische Präparate

der Konjunktiva bei Tieren mit entzündlichen Veränderungen vergleichend mit

gesunden Kontrolltieren. Gleichzeitig wurden in dieser Studie verschiedene

Techniken der Probenentnahme verglichen. Bei beiden Tierarten ließen sich in der

Patientengruppe signifikante Unterschiede in der Zellquantität und –qualität im

Vergleich zur Kontrollgruppe feststellen. Dabei lag die Zellquantität bei erkrankten

Katzen signifikant höher als bei erkrankten Hunden. Außerdem konnten bei 2 von 9

Katzen in den Präparaten Chlamydien erkannt werden, bei einem Hund wurde das

Staupevirus in Form von intranukleären Einschlusskörperchen nachgewiesen.

BAUER (1999) führte die exfoliative Zytologie von Kornea und Konjunktiva bei

verschiedenen Haustierarten durch und gelangte zusammenfassend zu dem

Ergebnis, dass dies eine hilfreiche und leicht durchführbare Methode bei der

Diagnostik von Erkrankungen von Kornea und Konjunktiva ist.

Beim Pferd wird diese Methode bisher nur ausnahmsweise angewendet. BOLLIGER

et al. (2000) beschreibt zur Diagnostik von Keratomykosen beim Pferd die Zytologie

zum Nachweis der Pilzhyphen.

KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleichen die Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und

EHV-5 mittels PCR und exfoliativer Zytologie bei 15 Pferden mit Keratitis oder

Konjunktivitis sowie bei 15 gesunden Kontrolltieren. Bei 4 Pferden der

Patientengruppe sowie 2 Tieren der Kontrollgruppe wurden intranukleäre

Einschlusskörperchen vom Typ Cowdry A gefunden. Dabei konnte jedoch kein

signifikanter Unterschied zwischen der Häufigkeit des Vorkommens von EHV-2 und-

5 und von Einschlusskörperchen zwischen der Kontrollgruppe und der

Patientengruppe nachgewiesen werden.

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Literaturübersicht

2.6.1.1 Technik der Probengewinnung

2.6.1.1.1 Abdruck –Zytologie

Diese Methode wird in der Humanmedizin bei der Diagnostik von Erkrankungen von

Konjunktiva oder Kornea eingesetzt (MASKIN et al. 1989). Auch BAUER et al. (1996)

berichten über eine vergleichende Studie bei Hunden mit Keratokonjunktivitis sicca,

bei der diese Methode angewandt wurde.

Nach Lokalanästhesie der Konjunktiva wird ein Cellulose- Acetat –Papierstreifen mit

einem Glasstab auf die Schleimhaut gedrückt und danach vorsichtig abgezogen

(MASKIN et al 1989). Der Nachteil dieser Methode ist, dass nur zwei oder drei

Zelllagen gewonnen werden. Sie eignet sich jedoch hervorragend zur

Quantifizierung von Becherzellen in der oberen Zellschicht (NELSON 1988).

Diese Methode eignet sich nicht zur Beprobung der Kornea (BAUER 1999).

Auch BARNETT et al. (1998) beschreibt beim Pferd eine Methode der

Abdruckzytologie, wobei ein trockener Objektträger vorsichtig, aber fest auf

veränderte Bereiche von Kornea, Konjunktiva oder Adnexen aufgedrückt wird und

nach Fixation und Färbung z. B. zur pathohistologischen Diagnose von

Plattenepithelkarzinomen dient.

2.6.1.1.2 Tupfer Der Wattetupfer nimmt nur wenige oberflächliche Zellen und Sekret der Konjunktiva

auf. Dieses Material reicht in der Regel nicht zur zytologischen Auswertung. Bei einer

bereits geschädigten Kornea kann man vorsichtig Zellmaterial von der Oberfläche

gewinnen. Bei intaktem Epithel ist keine ausreichende Materialgewinnung mit dem

Wattetupfer möglich (BAUER 1999).

Bei bakteriellen oder mykotischen Infektionen ist der Tupfer jedoch hilfreich für die

Erregerkultivierung und Identifizierung (BARNETT et al. 1998). VON OPPEN (2000)

und BESTHORN (2002) wiesen mittels PCR EHV-2-Genom aus Augensekrettupfern

nach.

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Literaturübersicht

2.6.1.1.3 Geschabsel Zur Gewinnung von Zellmaterial aus dem Bereich der Konjunktiva oder Kornea

eignet sich am besten ein Kimura-Platinum-Spatel ( BARNETT et al. 1998, WILLIS et

al. 1997, BAUER 1999). Mit diesem wird nach lokaler Anästhesie vorsichtig

Gewebematerial abgeschabt. Man gewinnt damit auch tiefer gelegene Zellschichten

zur Beurteilung. Diese Art der Probengewinnung liefert gute Ergebnisse, ist jedoch

für den Patienten ein invasiver Eingriff und erfordert neben der Lokalanästhesie

häufig weitere Zwangsmaßnahmen oder Sedierung ( WILLIS et al. 1997, BAUER

1999).

2.6.1.1.4 Cytobrush Der Cytobrush besteht an seinem distalen Ende aus ca. 3 bis 4 mm langen

Nylonborsten, die rundbürstenartig angeordnet sind. Ursprünglich in der

Humanmedizin zur Zervixzytologie entwickelt, wurde dieses Instrument zur

Gewinnung von Konjunktivalzellen weiter modifiziert (TSUBOTA et al. 1990).

Durch vorsichtiges Drehen des Cytobrush auf dem zu beprobenden Gewebe werden

Zellen der verschiedenen Schichten gewonnen und später auf einem Objektträger

luftgetrocknet und gefärbt (BAUER 1999).

Sowohl mit dem Geschabsel als auch mit dem Cytobrush lassen sich sehr gute

Ergebnisse erzielen. Ein deutlicher Vorteil des Cytobrush gegenüber dem

Geschabsel ist die geringe Invasivität der Methode. So ist die Probennahme auch für

den wenig geübten Untersucher oder bei schwierigen Patienten möglich, da die

Gefahr der iatrogenen Verletzung im Gegensatz zu den harten unflexiblen Spateln

deutlich geringer ist. Außerdem ist diese Methode kostengünstig ( WILLIS et al.

1997, BAUER 1999).

Beim Menschen wird berichtet, dass die durch den Einsatz des Cytobrush

entstehende Irritation an Konjunktiva und Kornea des Patienten mit der eines

normalen Wattetupfers vergleichbar ist (TSUBOTA et al. 1990).

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Literaturübersicht

2.6.2 Erregernachweis 2.6.2.1 Mikrobiologische Untersuchung Der Nachweis von bakteriellen Erregern bei Keratitiden und Konjunktivitiden erfolgt

durch Kultivierung auf spezifischen Nährböden. Die Probenentnahme geschieht

dafür meist mit einem sterilen Wattetupfer, der in einem spezifischen Nährmedium

transportiert wird. Es können auch Geschabsel von veränderten Bereichen

untersucht werden. Auch der Nachweis von Pilzen erfolgt zum Teil kulturell

(WHITLEY et al. 1983, BARNETT et al. 1998).

Das Mileu im Bindehautsack ist physiologischerweise unsteril. Die normale Mikroflora

besteht nach BARNETT et al. (1998) aus überwiegend grampositiven Keimen wie

beispielsweise Streptococcus epidermis, Streptococcus spp., Corynebacterium spp.

und Bacillus cereus. Bei einer bakteriellen Keratitis werden nach Aussage der

Autoren meist gramnegative Keime isoliert, so zum Beispiel Enterobacteriaceae,

Pseudomonas aeruginosa und Proteus spp.. Diese Keime sind alle nur fakultativ

pathogen und benötigen verschiedene Faktoren, wie beispielsweise eine

Vorschädigung der Hornhaut, um krankheitsauslösend zu sein.

Auch MOORE et al. (1983) beschreiben bei 37 untersuchten Pferden mit ulzerativer

Keratitis eine hohe Nachweishäufigkeit von gramnegativen Bakterien und Pilzen.

WHITLEY et al. (1983) isolieren in einer Studie mit 25 klinisch augengesunden

Pferden am häufigsten grampositive Kokken wie Staphylococcus spp., außerdem

Corynebacterium spp., Bacillus spp., Acinetobacter spp. sowie in sechs Augen

Fadenpilze der Gattung Streptomyces spp. Als auffällig beschreiben die Autoren die

hohe Prävalenz (70%) von negativen Kultivierungsergebnissen, die auf die

klimatischen Umstände der winterlichen Verhältnisse und kalten Temperaturen

zurückgeführt werden.

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Literaturübersicht

2.6.2.2 Virologische Untersuchung Die Untersuchung von Probenmaterial auf das Vorliegen einer Virusinfektion kann

auf verschiedene Arten erfolgen.

2.6.2.2.1 Indirekter Nachweis Bei dieser Methode wird nicht das Virus, sondern die vom Immunsystem als Antwort

auf die Infektion gebildeten Antikörper nachgewiesen. Für die Bestimmung des

Antikörpertiters im Blut können verschiedene Methoden herangezogen werden,

beispielsweise der Virusneutralisationstest, der Immunfluoreszenstest oder die

Komplementbindungsreaktion (THEIN und BÖHM 1976, BORCHERS et al 1997,

BORCHERS et al. 1999). Um einen signifikanten Anstieg des Titers als Hinweis auf

eine akut durchlebte Infektion nachweisen zu können, ist eine zweimalige

Blutentnahme im Abstand von 3 bis 4 Wochen notwendig.

2.6.2.2.2 Direkter Nachweis Bei dieser Methode wird Probenmaterial aus den erkrankten Bereichen gewonnen,

aus welchem durch verschiedene Verfahren ein Nachweis von Virusmaterial

versucht werden kann. An dieser Stelle sollen jedoch nur zwei unterschiedliche

Methoden vorgestellt werden, die im Rahmen dieser Arbeit für den Nachweis von

EHV-2 von Bedeutung sind.

Die Virusisolierung durch Anzüchtung in Zellkulturen setzt das Vorhandensein von

vermehrungsfähigem Virusmaterial voraus und weist bei Infektion mit Herpesviren in

den meisten Fällen nach 12 bis 16tägiger Inkubation zytopathische Effekte mit

Bildung intranukleärer Einschlusskörperchen vom Typ Cowdry A auf (THEIN 1976,

THEIN und BÖHM 1978, MILLER et al. 1990, ROLLE und MAYR 1993, COLLINSON

et al. 1994, BROWNING und AGIUS 1996).

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Literaturübersicht

Beim Nachweis von Virusgenom durch die Polymerase Kettenreaktion (PCR) werden

bestimmte Gensequenzen des Virus durch Zugabe von spezifischen Primerpaaren

und einer hitzebeständigen Polymerase gezielt vermehrt. Diese Gensequenzen

werden dann beispielsweise durch Gelelektrophorese isoliert und unter UV-Licht

sichtbar gemacht. Vorteil dieser Methode ist, dass auch nicht mehr

vermehrungsfähiges Virusmaterial erfasst werden kann. Die Sensitivität und

Spezifität lassen sich durch die Durchführung einer nested PCR (nPCR) noch

erhöhen, indem in zwei PCR-Durchgängen mit zwei verschiedenen Primerpaaren

gearbeitet wird, wobei das erste Primerpaar die vom zweiten Primerpaar amplifizierte

Sequenz mit einschließt (BORCHERS et al. 1997, REUBEL et al. 1995).

2.7 EHV-2 beim Pferd 2.7.1 Vorkommen von EHV-2 in der Pferdepopulation Das equine Herpesvirus Typ 2 wird ebenso wie das equine Herpesvirus Typ 5 seit

1993 zur Gruppe der Gammaherpesviren gezählt (TELFORD et al. 1993, AGIUS et

al. 1994).

Seropositive Tiere werden in Pferdepopulationen weltweit gefunden (BROWNING

und STUDDERT 1988), bei bis zu 89% klinisch unauffälliger Tiere wird EHV-2 in

Leukozyten nachgewiesen (KEMENEY und PEARSON 1970, ROEDER und SCOTT

1975).

Auch in jüngeren Untersuchungen wird EHV-2 in einer Gruppe klinisch unauffälliger

Tiere bei 42% nachgewiesen. Bei Pferden mit unterschiedlichen klinischen

Erscheinungen gelingt der Nachweis bei bis zu 71% der Tiere (BORCHERS et al.

1997). Bei der Untersuchung von 19 gesunden Tieren gelingt bei allen der Nachweis

eines positiven Antikörpertiters im Blut (BORCHERS et al. 1997).

Bei VON OPPEN (2000) sind alle Tiere einer gesunden Kontrollgruppe Antikörper-

positiv, bei 47,6% dieser Pferde wird mittels PCR EHV-2 Genom in Blutleukozyten

gefunden.

36

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Literaturübersicht

ROLLE und MAYR (1993) sprechen von einem Durchseuchungsgrad in der

Pferdepopulation zwischen 45 und 85 %, EDINGTON et al. (1994) konnten in 39 von

40 Schlachtpferden EHV-2 Genom in Milz, verschiedenen Körperlymphknoten,

Trigeminusganglion und Lungenmakrophagen mittels PCR nachweisen.

Auch unter Wildequiden finden sich seropositive Tiere, so werden Antikörper bei

Zebras und Przewalskipferden gefunden (BORCHERS und FRÖHLICH 1997,

BORCHERS et al. 1999).

Der Infektionsweg mit EHV-2 verläuft vermutlich horizontal in den ersten

Lebensmonaten. Das Virus wird dabei wahrscheinlich per Inhalation aufgenommen

und gelang über die Nasenschleimhaut in den Körper (STUDDERT 1974).

Über eine vertikale Infektion gibt es widersprüchliche Literaturstellen. Während

STUDDERT (1974) diese Möglichkeit verneint, da ihm keine Virusisolierung aus

Feten oder Neonaten gelang, geht THEIN (1993) von einer möglichen Infektion des

Feten mit EHV-2 aus und berichtet vom wiederholten Nachweis in fetalem Gewebe.

2.7.2 Klinische Relevanz und Nachweis von EHV-2 beim Pferd Die klinische Relevanz einer Infektion mit EHV-2 ist weitgehend unklar.

Es werden Erkrankungen des oberen und tiefen Respirationstraktes, Fieber,

Inappetenz und Leistungsdepression, aber auch Keratokonjunktivitiden damit in

Zusammenhang gebracht. WOLFINGER (1998) untersuchte eine größere Zahl

Pferde im Raum Berlin/Brandenburg und konnte keinen statistischen

Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und einem bestimmten

klinischen Krankheitsbild aufzeigen.

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Literaturübersicht

Hinweise für eine Beteiligung von EHV-2 an respiratorischen Erkrankungen finden

sich bei verschiedenen Autoren. PALFI et al. (1978) gelingt die Isolierung von EHV-2

bei 3 - 4 Wochen alten Fohlen, die klinisch mit erhöhter Temperatur, Dyspnoe,

serösem Nasenausfluß und Apathie auffielen. In einer weiteren Untersuchung dieser

Gruppe werden Fohlen mit Hyperimmunseren behandelt und zeigen im Vergleich zu

einer negativen Kontrollgruppe keine respiratorischen Symptome oder eine

Virusausscheidung im Verlauf einer natürlichen Infektion (BELAK et al. 1980).

Desweiteren wird bei einem intrauterin mit EHV-2 infizierten Fohlen, welches

pathogenfrei aufgezogen wurde, wenige Tage nach der Geburt muköser Augen- und

Nasenausfluß beobachtet und aus Augen- und Nasentupfern wiederholt EHV-2

isoliert (GLEESON und STUDDERT 1977).

Auch neuere Untersuchungen bringen EHV-2 mit Erkrankungen der Atemwege in

Zusammenhang. So gelingt bei Pferden mit einer chronisch obstruktiven Bronchitis

die Virusisolierung aus Lungenmakrophagen häufiger als bei gesunden Tieren

(SCHLOCKER 1995). Auch MURRAY et al. (1996) können bei der Untersuchung von

Tracheobronchialsekret klinisch gesunder und respiratorisch erkrankter Fohlen bei

letzteren häufiger EHV-2 isolieren. In dieser Studie wird außerdem berichtet, dass

bei nahezu allen Fohlen EHV-2 aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

isoliert wurde.

WOLFINGER (1998) zeigt, dass in fünf von sieben Pferdebeständen mit

respiratorischen Erkrankungen ein hoher Prozentsatz der Tiere EHV-2 positiv ist und

findet bei fünf Pferden post mortem EHV-2 DNA in Lungengewebe und

Lungenlymphknoten.

Im Rahmen eines Infektionsversuches bei Ponies entwickeln diese Konjunktivitis,

Lymphknotenschwellungen sowie Husten, es konnte EHV-2 in Augen- und

Nasentupfern nachgewiesen werden (BORCHERS et al. 1998, WOLFINGER 1998).

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Literaturübersicht

Auch bei Pferden mit Erkrankungen des Auges wurde wiederholt EHV-2

nachgewiesen. So gelingt es THEIN und BÖHM (1976) bei einem Fohlen, welches

neben anderen Tieren des Bestandes an einer Keratokonjunktivitis superficialis

erkrankt war, aus Korneamaterial EHV-2 mittels Virusanzüchtung in Zellkultur sowie

mittels positivem Antikörpertiter nachzuweisen. Auch MILLER et al. (1990) isolieren

bei einer Vollblutstute mit einer Keratitis punctata EHV-2 aus Korneamaterial durch

Anzucht in Zellkultur, können aber in einem zytologischen Ausstrichpräparat keine

Einschlusskörperchen nachweisen.

COLLINSON et al. (1994) können EHV-2 in Augensekrettupfern von Fohlen eines

Bestandes, die an einer Keratokonjunktivitis erkrankt waren, ebenfalls durch

Virusanzucht in Zellkultur nachweisen. Auch hier sind keine Einschlusskörperchen in

Ausstrichen erkennbar.

Weitere Autoren zeigen, dass der Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR aus

Augensekrettupfern signifikant häufiger bei Pferden mit einer Keratitis oder

Keratokonjunktivitis gelingt als bei augengesunden Tieren (VON OPPEN et al. 2001,

KERSHAW et al. 2001). Gleichzeitig wird gezeigt, dass bei augengesunden Pferden

signifikant weniger Nachweise in Nasentupfern und Tracheobronchialsekret geführt

werden. Ein Zusammenhang zwischen einem spezifischen klinischen Bild und dem

Nachweis von EHV-2 konnte dabei jedoch nicht nachgewiesen werden (VON

OPPEN 2000). Antikörpertiter gegen EHV-2 waren bei allen untersuchten Pferden

vorhanden, diese unterschieden sich zwischen den augengesunden und erkrankten

Tieren jedoch nicht signifikant Tieren (VON OPPEN et al. 2001, KERSHAW et al.

2001).

Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von THEIN (1978), der bei

12 augenkranken Pferden höhere Antikörpertiter im Blut als bei gesunden Tieren

feststellen konnte.

In einer jüngeren Studie von BESTHORN (2002) konnten entgegen der Ergebnisse

von VON OPPEN et al. (2001) und KERSHAW et al. (2001) keine signifikanten

Unterschiede im Nachweis von EHV-2 Genom bei Pferden mit einer Keratitis im

Vergleich zu einer augengesunden Kontrollgruppe festgestellt werden.

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Material und Methode

3 Material und Methode

3.1 Versuchsplanung

Die Untersuchungen wurden in dem Zeitraum von April 2001 bis April 2003 in der

Klinik für Pferde und am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule

sowie in Zusammenarbeit mit PD Dr. K. Borchers aus der Arbeitsgruppe Equine

Herpesviren des Instituts für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin an der

freien Universität Berlin durchgeführt.

Die untersuchten Pferde werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1 besteht aus 28

Tieren, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt waren. Gruppe 2

beinhaltet 28 Pferde ohne klinische Hinweise einer Augenerkrankung und dient als

Kontrollgruppe.

3.2 Patientengut

Bei den Pferden der Gruppe 1 handelt es sich um Patienten der Klinik für Pferde der

Tierärztlichen Hochschule Hannover, die hier im oben genannten Zeitraum zumeist

ambulant vorgestellt wurden. Ein Großteil dieser Pferde waren

Überweisungspatienten, so dass bei diesen Tieren die Erkrankung bereits länger

bestand und oft bereits vorbehandelt wurde.

Eine zweite Untersuchung dieser Pferde erfolgte im Rahmen einer Nachkontrolle

nach 3 bis 4 Wochen. Zu diesen zwei Zeitpunkten wurden auch die Proben zur

mikrobiologischen, virologischen, serologischen und zytologischen Untersuchung

entnommen.

Die Pferde der Gruppe 2 wiesen keine klinischen Anzeichen einer

Allgemeinerkrankung auf und waren klinisch augengesund.

Alter, Rasse und Geschlecht der Pferde der einzelnen Gruppen sind in Tabelle 1 und

2 aufgeführt.

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Material und Methode

Tab. 1: Patienten mit Keratitis oder Keratokonjunktivitis (Gruppe 1)

Nr. Alter (J) 10 Rasse 11 Geschlecht 1 8 Hannoveraner Wallach 2 11 Oldenburger Wallach 3 5 Holsteiner Stute 4 12 Hannoveraner Stute 5 6 Hannoveraner Wallach 6 9 Hannoveraner Stute 7 9 Traber Wallach 8 9 Oldenburger Wallach 9 13 Hannoveraner Stute 10 6 Hannoveraner Wallach 11 22 Württemberger Wallach 12 13 Isländer Wallach 13 12 Vollblut XX Wallach 14 6 Oldenburger Wallach 15 17 Warmblut Stute 16 12 Oldenburger Wallach 17 10 Hannoveraner Wallach 18 11 Hannoveraner Wallach 19 7 Isländer Stute 20 5 Warmblut Wallach 21 6 Holsteiner Wallach 22 11 Maultier Stute 23 21 Maultier Stute 24 19 Maultier Stute 25 4 Hannoveraner Wallach 26 9 Hesse Stute 27 3 Maultier Wallach 28 6 Holsteiner Wallach

J : Jahre

Gruppe 1 besteht aus 10 Stuten und 18 Wallachen. Die Tiere sind zwischen 3 und 22

Jahren alt. Das durchschnittliche Alter beträgt 9,7 Jahre.

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Material und Methode

Tab. 2: Kontrolltiere ohne Augenerkrankung (Gruppe 2)

Nr. Alter (J) 12 Rasse 13 Geschlecht 1 15 Reitpony Wallach 2 17 Warmblut Wallach 3 9 Hannoveraner Wallach 4 3 Traber Stute 5 7 Trakehner Wallach 6 16 Hannoveraner Wallach 7 6 Hannoveraner Wallach 8 7 Westfale Stute 9 5 Warmblut Stute 10 16 Westfale Wallach 11 5 Hannoveraner Stute 12 3 Reitpony Stute 13 13 Westfale Wallach 14 5 Oldenburger Stute 15 14 Westfale Wallach 16 3 Hannoveraner Stute 17 2 Hannoveraner Stute 18 10 Hannoveraner Wallach 19 11 Hannoveraner Wallach 20 4 Traber Wallach 21 4 Traber Wallach 22 3 Traber Wallach 23 5 Traber Wallach 24 19 Warmblut Wallach 25 5 Traber Wallach 26 17 Warmblut Wallach 27 3 Traber Stute 28 9 Warmblut Wallach

J : Jahre

Gruppe 2 besteht aus 9 Stuten und 21 Wallachen. Die Pferde dieser Kontrollgruppe

sind zwischen 2 und 19 Jahren alt. Das durchschnittliche Alter beträgt 8,4 Jahre.

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Material und Methode

3.3 Klinische Untersuchung Die Untersuchung der Pferde bestand aus einer klinischen Allgemeinuntersuchung

und einer speziellen ophtalmologischen Untersuchung. Diese Untersuchungen

wurden zweimal im Abstand von drei bis vier Wochen durchgeführt.

Bei der klinischen Allgemeinuntersuchung wurden Haltung, Verhalten, Ernährungs-

und Pflegezustand beurteilt. Weiterhin wurden Körpertemperatur, Atem- und

Pulsfrequenz bestimmt sowie Nasenausfluß, Auslösbarkeit von Husten und Farbe

und Beschaffenheit der Schleimhäute beurteilt. Ferner wurde eine Auskultation von

Herz und Lunge durchgeführt.

3.3.1 Spezielle ophtalmologische Untersuchung 3.3.1.1 Untersuchung im beleuchteten Raum

Die spezielle ophtalmologische Untersuchung beider Augen wurde zunächst in

einem hell beleuchteten Raum durchgeführt. Dabei wurde auf die Ausprägung einer

Abwehrtrias, bestehend aus Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie, geachtet.

Die Sehfähigkeit beider Augen wurde anhand des Drohreflexes getestet. Dabei

wurde mit der Hand vor jedem Auge ohne Luftbewegungen, Berührungen oder

Geräusche zu provozieren eine Drohgebärde durchgeführt. Es wurde die Reaktion

des Pferdes in Form eines Lidschlages beurteilt.

Dann erfolgte die Untersuchung der Umgebung des Auges mittels Adspektion und

Palpation. Dabei wurde auf Größe und Position des Bulbus in Relation zur Orbita

geachtet, sowie eine vergleichende transpalpebrale Bulbuspalpation vorgenommen.

Zur Untersuchung der Conjunktiva palpebrarum und der Conjunctiva bulbi wurden

diese mit Daumen und Zeigefinger oder einem Lidhalter nach Desmarres

ektropioniert. Die Oberfläche der Membrana nicitans wurde untersucht, indem sie

durch transpalpebralen Druck auf den Bulbus durch das Oberlid vorgelagert wurde.

Die Untersuchung der Kornea erfolgte zunächst bei Tageslicht auf ihre Form, Größe,

Durchsichtigkeit und Oberflächenbeschaffenheit.

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Material und Methode

3.3.1.2 Untersuchung im abgedunkelten Raum Während der weiteren speziellen Untersuchung in abgedunkelter Umgebung wurde

eine fokussierte Lichtquelle (Fa. Carl Zeiss, Oberkochen) und ein direktes

Ophtalmoskop (Beta 2000, Fa. Heine, Herrsching) verwendet. Ferner wurden eine

Lupenbrille mit fünffacher Vergrößerung (Fa. Carl Zeiss, Oberkochen) sowie ein

Lidhalter nach Desmarres eingesetzt.

Zu Beginn der Untersuchung in abgedunkelter Umgebung wurde mit Hilfe der

fokussierten Lichtquelle der Pupillarreflex überprüft.

Dann erfolgte eine eingehende Untersuchung der Kornea mittels fokussierter

Lichtquelle unter Zuhilfenahme der Lupenbrille. Dabei wurde die Kornea aus

verschiedenen Richtungen beleuchtet sowie mit und entgegen die Lichtquelle

betrachtet, um vorhandene Veränderungen in Art und Ausdehnung zu erfassen.

Zum Nachweis eventuell vorliegender Hornhautdefekte wurde mittels eines

Papierstreifens Fluoreszin 0,5 % (Fa. Alcon Thilo, Freiburg) in den unteren

Bindehautsack eingebracht. Durch Lidschlag wurde der Farbstoff auf der Kornea

verteilt und anschließend durch Spülung des Auges mit 10 bis 15 ml steriler

Kochsalzlösung (Fa. Braun, Melsungen) überschüssiges Fluoreszin entfernt.

Bei jedem Pferd erfolgte ferner mittels direkter Ophtalmoskopie eine Untersuchung

von vorderer Augenkammer, Linse, Glaskörper und Fundus auf pathologische

Veränderungen.

3.3.2 Klinische Diagnosen Bei jedem Patienten wird nach der speziellen ophtalmologischen Untersuchung eine

klinische Diagnose in Anlehnung an die Einteilung nach BARNETT et al. (1998)

gestellt. Im Folgenden sind die wesentlichen Befunde für die gestellten Diagnosen

aufgeführt:

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Material und Methode

Keratitis superficialis: - oberflächliche Korneatrübungen unterschiedlicher

Ausprägung, z.T. mit darunterliegendem

Korneaödem

- oberflächliche Gefäßeinsprossung

- intaktes Korneaepithel, aber auch

Epithelabrasionen bis zu oberflächlichen Ulzera

Keratitis punctata: - schwache punkt- und streifenförmige

Hornhauttrübungen

- eventuell unregelmäßige fluoreszeinpositive

epitheliale Läsionen mit darunterliegendem

Stromaödem

Keratitis maculosa: - dichte, umschriebene, fokale oberflächliche

Korneatrübung

- oberflächliche Gefäßeinsprossung

Keratitis profunda: - Korneatrübung von unterschiedlichem Ausmaß und

Färbung

- zumeist oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung

- Epithel- und Stromadefekte bis hin zu tiefen Ulzera

Bullöse Keratopathie: - epitheliale Bläschenbildung, zum Teil mit

Trübungen der Hornhaut

Keratitis vasculosa: - oberflächliche Gefäßeinsprossung, z.T. mit

darunterliegendem geinggradigen Korneaödem

Hornhautabrasion: - oberflächliche Epithelabschürfung mit

darunterliegendem Stromaödem

Da die Keratitis punctata und die Keratitis maculosa oft ineinander übergehen

(BARNETT et al. 1998) und nicht immer klar voneinander zu trennen sind, werden

diese Diagnosen in dieser Arbeit zusammengefasst unter der Bezeichnung Keratitis

punctata seu maculosa. In den Abbildungen 2 bis 7 sind beispielhaft einige klinische

Formen der Keratitiden dargestellt. Die bei der speziellen ophtalmologischen

Untersuchung erhobenen Befunde wurden auf dem in Abbildung 8 folgenden

Befundbogen der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover

dokumentiert und mehrfarbig skizziert.

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Material und Methode

Abb. 2: Keratitis superficialis, Abb. 3: Keratitis punctata seu maculosa,

mit oberflächlicher punktförmige rauchige Trübung Gefäßeinsprossung

Abb. 4: Hornhautabrasion, Abb. 5: Keratitis punctata seu maculosa,

mit darunterliegendem Stromaödem nach temporal konfluierende punkt- förmige Trübung mit oberflächlicher

Gefäßeinsprossung

Abb. 6: Keratitis profunda, Abb. 7: Keratitis vasculosa, mit zikulärer tiefer Gefäßeinsprossung dorsotemporale oberflächliche

und tiefer stromaler, teilweise Gefäßeinsprossung gelblicher Hornhauttrübung

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Drohreflex Tonus Umgebung des

Auges

Augenlider

Konjunktiva Nickhaut

Sklera

Kornea

Vordere Augenkammer

Iris

Pupillenreaktion

Linse

Glaskörper

Papilla optica

Retinagefäße

Tapetum lucidum

Tapetum nigrum

Andere Veränderungen

14 Kornea, Sklera 15 Linse Glaskörper Augenhintergrund

Abb. 8: Befundbogen zur Dokumentation der ophtalmologischen

Untersuchungsbefunde

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Material und Methode

3.4 Probenentnahme Im Anschluß an die klinische Untersuchung und Befundung erfolgte die Entnahme

von Untersuchungsmaterial. Diese wurde sowohl am erkrankten als auch am klinisch

gesunden Auge durchgeführt und erfolgte immer nach folgendem Schema.

Für die mikrobiologische Untersuchung wurde zunächst ein steriler, trockener

Wattetupfer (cultiplast®, Fa. LP Italiana Spa, Italien) im Lidbindehautsack zwischen

Unterlid und Nickhaut eingelegt und vorsichtig um die eigene Achse gedreht. Dieser

wurde dann in das in der Tupferhülle enthaltene Nährmedium verbracht .

Für die weitere Entnahme zur virologischen Untersuchung erfolgte dann zunächst

eine Oberflächenanästhesie des Auges mittels Tetracain enthaltenden Augentropfen

(Ophtocain®, Fa. Winzer, Olching). Anschließend wurde ein steriler, trockener

Wattetupfer wie bereits beschrieben im Lidbindehautsack um die eigene Achse

gedreht. Die Tupferspitze wurde mit einer Schere in ein Eppendorfhütchen verbracht,

welches ein Transportmedium enthält, bestehend aus EDM (Fa. Life Technologies,

Gaithersburg, USA), supplementiert mit 100 IE/ml Penicillin und 200 µl/ml

Streptomycin.

Dann erfolgte die Entnahme von Zellmaterial mittels eines Cytobrushs

(Cytobrush®Plus GT, Fa. Medscand Medical, Schweden). Dieser wurde wie zuvor die

Wattetupfer in den Lidbindehautsack eingebracht und mehrfach vorsichtig um die

eigene Achse gedreht. Dabei wurde darauf geachtet, das die Nickhaut vollständig

über der Hornhaut liegt, um epitheliale Läsionen durch die Nylonborsten zu

vermeiden. Der Cytobrush wurde zur exfoliativen Zytologie auf zwei Objektträgern

abgerollt und anschließend nochmals im Lidbindehautsack gedreht. Die Spitze des

Cytobrush wurde dann für die virologische Untersuchung ebenfalls mit einer Schere

in ein mit Transportmedium befülltes Eppendorfhütchen verbracht. Bei den Patienten

11 bis 28 sowie den Kontrolltieren 3 bis 28 wurde zusätzlich ein zweiter Cytobrush

zur virologischen Untersuchung entnommen. Dieser wurde ebenfalls in ein mit

Transportmedium befülltes Eppendorfhütchen verbracht.

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Material und Methode

Ferner wurde eine Tupferprobe der Nasenschleimhaut mittels eines sterilen,

trockenen Tupfers innerhalb des Nasenvorhofs proximal von der

Tränennasenkanalmündung entnommen und ebenfalls in Transportmedium

verbracht.

Die Entnahme von Citratvollblut erfolgte aus der Vena jugularis mit einem

Vakuumblutentnahmesystem in Citratblutröhrchen (Vacutainer Systems, Fa. Becton

Dickinson, Frankreich).

Abb. 9: Instrumentarium zur Probengewinnung: a.) Wattetupfer, b.) Cytobrush

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Material und Methode

3.5 Mikrobiologische Untersuchung

Die mikrobiologischen Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit dem Institut

für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt.

Die entnommenen Tupferproben wurden zunächst zur Anreicherung in einer

Nährbouillion für 10-24 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann folgte die Kultivierung auf

Blutagar, Gassnernährboden und Kochblutagar. Nach einer 48stündigen Inkubation

bei 37°C erfolgte die Spezifizierung der gewachsenen Kolonien.

Zusätzlich wurde im Direktkulturverfahren der mykologische Nachweis auf

Hamburger Testagar bei einer 48stündigen Inkubation mit 37°C durchgeführt.

3.6 Virologische Untersuchung Die virologischen und molekularbiologischen Untersuchungen wurden in

Zusammenarbeit mit PD Dr. K. Borchers aus der Arbeitsgruppe Equine Herpesviren

des Instituts für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin an der freien

Universität Berlin durchgeführt.

3.6.1 DNA-Isolierung aus peripheren Blutleukozyten (PBL)

Zur Isolierung von EHV-2-Genom aus den peripheren Blutleukozyten wurden

zunächst die Citratvollblutproben für 10 min bei 1700 UpM zentrifugiert (Fa. Heraeus,

Minifuge 2, Osterode). Das Plasma wurde dann nahezu vollständig abgenommen

und durch steriles PBS ersetzt. Nach vorsichtigem Durchmischen wurde das

verdünnte Blut auf Ficoll der Dichte 1,077 (Fa. Seromed, Berlin) im Verhältnis

Blut:Ficoll von 3:1 aufgeschichtet und bei 1500 UpM für 20 min zentrifugiert. Der so

entstandene Gradient enthielt eine Schicht aus Erythrozyten und Granulozyten. Über

dieser Schicht stellte sich beige-weiß eine gut abgrenzbare Lymphozyten- und

Monozytenbande dar. Diese wurde mit einer Pipette abgesaugt und in ein neues

Zentrifugenröhrchen überführt.

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Material und Methode

Nach Auffüllen dieser Zellsuspension mit PBS erfolgte eine erneute Zentrifugation

(Fa. Eppendorf, Zentrifuge 403) für 10 min bei 1700 UpM. Das entstandene Zellpellet

wurde dann noch zweimal in sterilem PBS gewaschen.

Nach der Isolierung der PBL wurden pro Ansatz 101-106 Zellen in 100-200 µl

Proteinase-K Verdauungspuffer 1 (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 % Tween)

aufgenommen, mit Proteinase-K (Fa. Böhringer, Mannheim) bis zur

Endkonzentration von 0,2 mg/ml versetzt und im Wasserbad bei 56 °C über Nacht

inkubiert. Dann wurde diese Suspension für 10 min auf 94 °C erhitzt, um die

Proteinase-K zu inaktivieren.

Anschließend wurde die Suspension bei 10000 UpM für 5 min zentrifugiert (Fa.

Eppendorf, Zentrifuge 403) und die DNA-Konzentration im Photometer (Fa.

Shimandzu, UV-1202, Japan) bei 260 nm bestimmt. 1 bis 2 µg Gesamt-DNA wurden

dann in die PCR eingesetzt.

3.6.2 DNA-Präparation aus Augentupfer- und Augencytobrushproben sowie aus Nasentupferproben Die im Transportmedium befindlichen Tupfer und Cytobrushs wurden zunächst

aufgeschüttelt und gründlich ausgedrückt, dann aus dem Eppendorfhütchen

entnommen und verworfen. Anschließend wurde die Probe bei 15000 g zentrifugiert

(Fa. Ole Dich, Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge, Dänemark). Der Überstand

wurde abgegossen und das Zentrifugat in 100 µl Proteinase-K-Verdauungspuffer

resuspendiert. Dann wurde die Probe mit Proteinase-K bei einer Endkonzentration

von 0,2 mg/ml über Nacht inkubiert. Nach Inaktivierung der Proteinase-K durch

Erhitzung auf 96 °C wurden 10 µl in die PCR eingesetzt.

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3.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis des EHV-2-Genoms Die PCR zum Nachweis des EHV-2-Genoms wurde am Institut für Virologie des

Fachbereich Veterinärmedizin der FU Berlin nach der von Borchers et al. (1997)

beschriebenen Methode durchgeführt. Um die Sensivität und Spezifität der

Nachweismethode zu erhöhen, wurden die Reaktionen als nested PCR (nPCR)

durchgeführt. Dabei wurden bei jedem Virusnachweis nacheinander zwei PCR-

Runden mit zwei verschiedenen Primerpaaren durchgeführt, wobei das erste

Primerpaar die vom zweiten Primerpaar amplifizierte Sequenz mit einschloß. Aus der

ersten Runde der PCR (äußeres Primerpaar) wurde ein Aliquot aus diesem

Reaktionsansatz in die zweite Runde der PCR (inneres Primerpaar) überführt. Zusätzlich wurde eine PCR zur Kontrolle der DNA-Qualität durchgeführt. Diese dient

dazu, falsch-negative Ergebnisse, die auf Inhibitoren in der Probe oder Degradierung

von DNA beruhen, auszuschliessen. Das Prinzip beruht auf dem Nachweis des

Zellstrukturgens, das für das Protein β-Actin kodiert. Dieses kommt in allen

eukaryotischen Zellen vor (Shankar et al. 1992). Deshalb sollte dieses Gen nach

DNA-Präparation aus Geweben und Blut immer nachweisbar sein.

Die PCRs wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Dabei wurden zu 1-2 µg

Gesamt-DNA als Matrize zusätzlich 0,4 µM jeden Primers, 0,2 mM dNTPs (Fa.

Perkin Elmer, Überlingen), 1,5 U Taq-Polymerase (Fa. Quiagen, Hilden) und 1*

Reaktionspuffer (Quiagen, Hilden) pipettiert. Das fehlende Volumen wurde mit

Dnase- und Rnase-freiem Aqua dest. (Fa. Promega, Madison, USA) aufgefüllt und

der Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl (Fa. Sigma, Deisenhofen) überschichtet. Für

den PCR-Ansatz wurde ein Heizblockcycler (MWG, Fa. Biotech, Hybaid omnigene)

nach Protokoll verwendet.

Vom fertigen PCR-Produkt werden 15 µl auf einem 2 %igen Agarosegel (Fa. Life

Technologies, Gaithersburg, USA) aufgetragen, gelelektrophoretisch aufgetrennt und

mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht.

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3.6.4 Virus-Anzucht Die Präparation des zweiten Cytobrushs erfolgte auf die gleiche Weise wie zuvor

beschrieben. Es wurden 300 µl des Transportmediums für die Azucht eingesetzt.

In einer 6-Lochplatte wurden 5x105 ED-Zellen mit 4 ml Medium pro Vertiefung

ausgesäht. Es folgt eine 1-2stündige Inkubation bei 37°C und 5% CO2 im

Feuchtbrutschrank.

Nach Anwachsen der Zellen werden pro Vertiefung 2,5 ml Medium entfernt, so dass

die ED-Zellen innigeren Kontakt zu den Zellen aus der Cytobrushpräparation haben.

In jede Vertiefung werden nun 150 µl vom Cytobrushmedium gegeben.

Es folgt eine weitere 24stündige Inkubation, nach der wieder 2,5 ml Medium

hinzugegeben wird.

Anschließend erfolgt mehrmaliges Passagieren der Zellen. Dabei wird zunächst das

Medium abgenommen und Trypsin auf die Zellen gegeben. Nach kurzem

Schwenken wird das Trypsin wieder entfernt und die Zellen bei Raumtemperatur für

10 min stehen gelassen. Dann werden die angelösten Zellen in 2ml Medium

aufgenommen. Davon wird 1 ml wieder verworfen, 1ml wird erneut ausgesäht und

3ml Medium zugegeben.

Die zweite Passage (p2) erfolgt auf einer Petrischale (Durchmesser 5 cm) mit 5ml

Medium nach dem oben beschriebenen Prinzip. Nach 5-7 Tagen erfolgt p3 auf einer

Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm und 10 ml Medium, nach weiteren 3-6

Tagen p4 mit derselben Methode wie p3. Wenn nach 7 Tagen keine Plaques sichtbar

sind, wird der Ansatz verworfen.

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3.7 Exfolitive Zytologie Die mikroskopische Auswertung der zytologischen Präparate erfolgte in

Zusammenarbeit mit Prof. Dr. R. Mischke aus der Klinik für kleine Haustiere der

Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Nach Abrollen des Cytobrushs auf Objektträgern wurden diese zunächst

luftgetrocknet. Anschließend erfolgte eine Färbung mit Maygrünwald/Giemsa-

Kombination (Fa. Merck, Darmstadt). Nach Trocknung wurden die Präparate unter

Verwendung von Schnelleindeckmittel (Fa. Merck, Darmstadt) mit Glasplättchen

eingedeckelt.

Bei der mikroskopischen Untersuchung wurde zunächst in einer

Übersichtsvergrößerung (16 x 10) das Präparat meanderförmig nach vorkommenden

Zellarten sowie deren Qualität und Quantität durchgesichtet. Anschließend folgte in

einer Detailvergrößerung (40 x 10 und 100 x 10, Ölimmersion) eine genauere

Betrachtung der vorhandenen Zellen. Die Quantität der vorhandenen

inflammatorischen Zellen wurde durch die Betrachtung von acht Ölimmersions-

Gesichtsfeldern bei einer Vergrößerung von 100 x 10 bestimmt. Dabei wurde

zunächst die Anzahl der untersuchten Zellart pro Gesichtsfeld ausgezählt und dann

daraus ein Mittelwert bestimmt.

54

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Material und Methode

3.8 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mittels der Software

SAS® im Rechenzentrum der Tieräztlichen Hochschule Hannover. Die Beratung fand

am Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

statt.

Es wurden die Nachweishäufigkeiten von Virusgenom und von Keimgruppen bei den

Gruppen 1 und 2 abhängig von der Stichprobengröße mittels des Fisher-Exact Tests

oder des χ2 –Tests statistisch verglichen. Weiterhin wurden zum Vergleich von

paarigen Stichproben Vierfeldertafeln anhand des McNemar Tests ausgewertet.

Als Signifikanzstufe wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05

angenommen. Die Signifikanzstufen werden wie folgt angegeben:

p > 0,05 nicht signifikant (n.s.)

p < 0,05 schwach signifikant (*)

p < 0,01 signifikant (**)

55

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Ergebnisse

4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 4.1.1. Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung Die untersuchten Pferde der Gruppen 1 und 2 wiesen bei der Allgemeinuntersuchung

ein ungestörtes Allgemeinbefinden auf. Pferd Nr. 17 der Gruppe 1 zeigte eine

geringgradige chronische Lungenerkrankung. Pferd Nr. 4 der Gruppe 1 zeigte bei der

Zweituntersuchung eine erhöhte Puls- und Atemfrequenz sowie beginnendes

Schwitzen. Im weiteren Verlauf des Untersuchungstages wurde das Pferd wegen

eines akuten Schockgeschehens behandelt und verstarb spontan unter der

Behandlung. Bei einer durchgeführten Sektion wurde ein rupturiertes

Hämangiosarkom der Milz festgestellt.

4.1.2. Ergebnisse der ophtalmologischen Untersuchung

Die klinischen Diagnosen und eine detailierte Auflistung der bei der

ophtalmologischen Untersuchung erhobenen Befunde der Pferde aus Gruppe 1 sind

in Tabelle A1 im Anhang aufgeführt.

Bei allen Pferden war der durchgeführte Drohreflex positiv, die transpalpebrale

Bulbuspalpation ergab bei keinem Pferd Hinweise auf eine auffällige Veränderung

des Augeninnendruckes.

Alle Pferde der Gruppe 2 waren zu beiden Untersuchungszeitpunkten klinisch

augengesund.

In Tabelle 3 sind die klinischen Diagnosen der Pferde aus Gruppe 1 bei der Erst- und

Zweituntersuchung, welche im Abstand von 4 Wochen durchgeführt wurden,

aufgeführt.

56

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Ergebnisse

Tab. 3: Gruppe 1 – Klinische Diagnosen bei der Erst- und Zweituntersuchung im Abstand von vier Wochen

Klinische Diagnose bei [n Pferden]

Erstuntersuchung n = 28

Zweituntersuchung n = 25

Kerat. punct. / mac. 12 5* Kerat. spf. 6 3

Kerat. vasculosa 3 2 Kerat. profunda 3 3 Konjunktivitis 2 0

bullöse Keratopathie 1 1 Hornhautabrasion 1 0

klinisch obB 0 11 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Kerat. : Keratitis

spf. : superficialis

punct. : punctata

mac. : maculosa

* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt

obB : ohne besonderen Befund

Aus der Tabelle 3 ist zu ersehen, dass die Diagnose Keratitis punctata seu maculosa

bei zwölf Pferden (Nr. 1, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 22, 23, 24, 27 und 28) gestellt wurde. Bei

drei Pferden mit Keratitis punctata seu maculosa erfolgte keine Zweituntersuchung

(Nr. 22, 23 und 24), bei fünf Pferden (Nr. 8, 10, 12, 27 und 28) konnte die Diagnose

auch in der Zweituntersuchung noch gestellt werden.

Die Diagnose Keratitis superficialis konnte bei sechs Pferden (Nr. 7, 9, 17, 18, 19

und 25) gestellt werden, bei drei Pferden (Nr. 18, 19 und 25) lag die Keratitis

superficialis auch bei der Zweituntersuchung noch vor.

Von drei Pferden (Nr. 2, 21 und 26) mit einer Keratitis vasculosa wiesen noch zwei

Patienten (Nr. 21 und 26) bei der Zweituntersuchung Befunde auf.

Bei drei Pferden (Nr. 3, 11 und 14) konnte zu beiden Untersuchungszeitpunkten eine

Keratitis profunda diagnostiziert werden.

Die Diagnose einer einseitigen Konjunktivitis wurde bei den Patienten Nr. 16 und 20

gestellt. Beide Pferde zeigten bei der Zweituntersuchung keine Symptome mehr.

57

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Ergebnisse

Bei einem Pferd (Nr. 4) wurde eine bullöse Keratopathie diagnostiziert, diese lag bei

der Zweituntersuchung unverändert vor.

Bei Pferd Nr. 13 konnte eine oberflächliche Hornhautabrasion festgestellt werden,

diese war bei der Zweituntersuchung vollständig ausgeheilt.

Insgesamt 11 Pferde waren bei der Zweituntersuchung klinisch unauffällig.

In Tabelle 4 sind die klinischen Symptome bei den gestellten Diagnosen der

Erstuntersuchung zusammengefasst. Das Symptom Konjunktivitis wurde ohne

Unterteilung in geringgradig, mittelgradig und hochgradig aufgenommen. Der Begriff

Rezidiv beinhaltet ein wiederholtes Auftreten der Augenerkrankung oder ein

Bestehen seit mindestens 6 Monaten.

Bei den Patienten mit einer Keratitis superficialis war bei fünf von sechs Pferden eine

begleitende Konjunktivitis vorhanden. Bei diesen fünf Patienten lag ebenfalls eine

Abwehrtrias vor, bestehend aus Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie.

Ferner bestand bei diesen fünf Patienten ein Rezidiv. Bei einem dieser fünf Pferde

(Nr. 19) war die Fluoreszeinprobe positiv und es fiel eine Leukombildung auf. Bei

einem Pferd (Nr. 25) konnte keine oberflächliche Gefäßeinsprossung festgestellt

werden.

Von zwölf Patienten mit einer Keratitis punctata seu maculosa lag bei neun Pferden

ein Rezidiv vor. Nur sechs Patienten zeigten eine Abwehrtrias, bei diesen Pferden

lag ebenfalls eine Konjunktivitis vor. Bei einem Pferd (Nr. 23) wurde zusätzlich ein

Leukom diagnostiziert. Eine Gefäßeinsprossung lag bei fünf Patienten vor. Bei

keinem dieser Pferde gelang eine positive Fluoreszeinprobe.

Bei drei Pferden wurde eine Keratitis vasculosa diagnostiziert (Nr. 2, 21 und 26). Bei

diesen Patienten lag keine Hornhauttrübung vor, sondern ausschließlich eine

oberflächliche Gefäßeinsprossung, verbunden mit einer Konjunktivitis und einer

deutlichen Abwehrtrias.

58

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Ergebnisse

Von den drei Pferden mit einer Keratitis profunda (Nr. 3, 11 und 14) zeigte nur ein

Tier eine deutliche Abwehrtrias (Nr. 11). Bei diesem Pferd verlief die

Fluoreszeinprobe positiv. Bei den beiden anderen Pferden war das Auge klinisch

reizfrei, bei Pferd Nr. 3 konnte ein Leukom festgestellt werden. Pferd Nr. 14 wies eine

oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung auf. Bei allen 3 Patienten lag ein Rezidiv

vor.

Bei zwei Patienten (Nr. 16 und 20) wurde ausschließlich eine einseitige Konjunktivitis

diagnostiziert, die bei beiden Pferden eine deutliche Abwehrtrias hervorrief und als

Rezidiv vorlag.

Bei einem Patienten (Nr. 13) lag eine Hornhautabrasion vor, bei der schon eine

oberflächliche Gefäßeinsprossung erfolgt war. Vorberichtlich war dieser Defekt mit

hoher Wahrscheinlichkeit durch eine Verletzung und nicht durch eine primäre

Keratitis bedingt.

Bei einem Patienten (Nr. 4) wurde eine bullöse Keratopathie diagnostiziert. Bei

diesem Pferd lag keine Trübung der Hornhaut vor, sondern eine subepitheliale

Bläschenbildung. Dieses Auge zeigte sich klinisch reizfrei, die Veränderung bestand

bereits seit mehreren Jahren.

59

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Ergebnisse

Tab. 4: Gruppe 1 – Befunde und Diagnosen bei der ophtalmologischen

Erstuntersuchung

Gefäß -einsprossung

Diagnose bei

n [Pferden]

n = 28

Trias Rezidiv Konjunk-tivitis

Hornhaut-trübung

/ Leukom Fluoresz.

positiv oberfl. tief Kerat. spf. 6 5 5 5 6 / 1 1 5 0

Kerat. punct. /mac. 12 6 9 6 12 / 1 0 5 0 Kerat.

vasculosa 3 3 2 3 0 0 3 0 Kerat.

profunda 3 1 3 2 3 / 1 1 3 1 Konjunktivitis 2 2 2 2 0 0 0 0

Bullöse Keratopathie 1 0 1 0 0 0 0 0

Kornea-abrasion 1 1 0 1 1 1 1 0

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Kerat. : Keratitis

spf. : superficialis

punct. : punctata

mac. : maculosa

oberfl. : oberflächlich

* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt

obB : ohne besonderen Befund

Trias : Abwehrtrias (Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie)

60

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Ergebnisse

Tabelle 5 zeigt die bei der Zweituntersuchung erhobenen Befunde der Pferde aus

Gruppe 1.

Tab. 5: Gruppe 1 - Ergebnisse der ophtalmologischen Zweituntersuchung (vier

Wochen nach der Erstuntersuchung), [n = 25]

Gefäß -einsprossung Diagnose

bei n [Pferden]

n = 25

Trias Konjunk-

tivitis Hornhaut-trübung

/ Leukom Fluoresz.

positiv oberfl. tief

Kerat. spf. 3 0 0 3 / 1 0 0 0 Kerat. punct.

/mac. 5* 0 1 4 / 1 0 1 0

Kerat. vasculosa 2 0 0 0 0 2 0

Kerat. profunda 3 1 2 3 / 2 1 3 2 Konjunktivitis 0 0 0 0 0 0 0

Bullöse Keratopathie 1 0 0 0 0 0 0

Hornhaut-abrasion 0 0 0 0 0 0 0

klinisch obB 11 0 0 0 0 0 0 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Kerat. : Keratitis

spf. : superficialis

punct. : punctata

mac. : maculosa

oberfl. : oberflächlich

* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt

obB : ohne besonderen Befund

Trias : Abwehrtrias (Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie)

Bei der Zweituntersuchung wurde noch bei drei von ursprünglich sechs Pferden die

Diagnose einer Keratitis superficialis gestellt. Bei einem dieser Patienten (Nr. 19)

zeigte sich eine Leukombildung, bei den Patienten Nr. 18 und 25 lag noch eine

geringgradige Resttrübung der Hornhaut vor. Keines der Pferde zeigte noch eine

Abwehrtrias oder Gefäßeinsprossung, die bei der Erstuntersuchung vorhanden war.

61

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Ergebnisse

Von den Patienten, die an einer Keratitis punctata seu maculosa erkrankt waren,

konnte bei drei Pferden keine Zweituntersuchung durchgeführt werden. Von den zur

Nachuntersuchung vorgestellten Pferden wiesen noch fünf Tiere eine Keratitis

punctata seu maculosa auf. Bei einem Pferd (Nr. 8) konnte eine Leukombildung

festgestellt werden. Alle Augen waren reizfrei, bei Patient Nr. 12 zeigte sich noch

eine oberflächliche Gefäßeinsprossung. Bei den Patienten Nr. 10, 27 und 28 zeigte

sich die Hornhaut auch bei weiteren Nachuntersuchungen im Abstand von mehreren

Wochen unverändert mit punktförmigen Trübungen ohne eine weitere entzündliche

Reaktion des Auges. Patient Nr.1 war bei der Zweituntersuchung unauffällig, wurde

aber 8 Monate später erneut mit der gleichen Symptomatik vorgestellt. Auch dieses

Mal war eine vollständige Ausheilung nach ca. 2 Wochen zu beobachten.

Bei zwei von drei Patienten wurde bei der Zweituntersuchung noch eine Keratitis

vasculosa festgestellt. Bei Pferd Nr. 26 war auch bei einer dritten Nachkontrolle nach

weiteren 4 Wochen noch eine dezente Gefäßeinsprossung festzustellen. Bei einer

vierten Verlaufskontrolle war das Auge unauffällig. Patient Nr. 2 zeigte bei der

Zweituntersuchung keine Befunde mehr. Dieses Pferd wurde nach 13 Monaten

erneut mit derselben klinischen Symptomatik auf dem anderen Auge vorgestellt.

Auch hier war bei einer Zweituntersuchung das Auge wieder unauffällig.

Alle Patienten mit einer Keratitis profunda wiesen auch bei der Zweituntersuchung

noch Befunde auf. Pferd Nr. 11 zeigte eine unveränderte Abwehrtrias sowie weiterhin

eine positive Fluoreszeinprobe. Zusätzlich bestand bei diesem Patienten inzwischen

eine tiefe Gefäßeinsprossung. Trotz intensiver Therapiemaßnahmen verschlechterte

sich der klinische Verlauf weiter, so dass nach weiteren 6 Wochen das Auge entfernt

wurde. Bei Patient Nr. 14 zeigte sich noch eine Hornhauttrübung, sowie eine

oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung, diese waren im Vergleich zur

Erstuntersuchung deutlich zurückgegangen. In weiteren Nachkontrolluntersuchungen

konnte eine vollständige Ausheilung festgestellt werden, es blieb ein Leukom

zurück. Auch bei Patient Nr. 3 kam es zu einer Leukombildung.

Beide Patienten, die bei der Erstuntersuchung eine einseitige Konjunktivitis

aufwiesen, waren bei der Zweituntersuchung klinisch unauffällig.

62

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Ergebnisse

Das Pferd mit der bullösen Keratopathie wies bei der Zweituntersuchung

unveränderte Befunde im Vergleich zur Erstuntersuchung auf.

Bei dem Patienten mit der Hornhautabrasion waren in der Zweituntersuchung keine

klinischen Befunde mehr zu erheben.

4.1 Ergebnisse der virologischen Untersuchung 4.1.1 Ergebnisse des direkten EHV-2 Nachweises mittels PCR Die Ergebnisse des direkten EHV-2-Nachweises in Verbindung mit den klinischen

Diagnosen bei den untersuchten Gruppen sind in den Tabellen A3, A4 und A5 im

Anhang aufgeführt. In beiden Gruppen wurden diese Untersuchungen 4 Wochen

nach der Erstuntersuchung wiederholt. Bei den Pferden 23, 24 und 25 der Gruppe 1

sowie bei den Pferden 1, 2 und 13 der Gruppe 2 konnte keine Zweituntersuchung

durchgeführt werden.

Tabelle 6 zeigt, bei wie vielen Pferden aus Gruppe 1 und 2 der Nachweis von EHV-2

Genom mittels PCR in den verschiedenen Untersuchungsmaterialien bei der

Erstuntersuchung geführt wurde. Dabei wurde unterschieden, ob bei einem Tier eine

Augenerkrankung vorliegt oder nicht.

63

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Ergebnisse

Tab. 6: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei der Erstuntersuchung

EHV-2 Nachweis bei [n Pferden] in

Gruppe 1 n = 28

Gruppe 2 n = 28

Wattetupfer 7 (25,0%) 2 (7,1%) Cytobrush 16 (57,1%) 17 (60,7%)

Nasentupfer 3 (10,7%) 3 (10,7%) PBL 10 (35,1%) 13 (46,4%)

gesamt positive Pferde 19 (67,9%) 23 (82,14%) PBL : periphere Blutleukozyten

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

Hier ist zu sehen, dass bei 16 Pferden aus Gruppe 1 und bei 17 Pferden aus Gruppe

2 der Nachweis von EHV-2 Genom im Cytobrush gelang. Nachweise in Wattetupfern

gelang bei 7 Pferden der Gruppe 1 und bei 2 Pferden der Gruppe 2.

Aus Nasentupfern wurde bei jeweils drei Pferden der Gruppe 1 und 2 EHV-2 Genom

isoliert. Der Nachweis in peripheren Blutleukozyten gelang bei zehn Pferden der

Gruppe 1 sowie dreizehn Pferden der Gruppe 2. Insgesamt gelang mit den

verschiedenen untersuchten Materialien bei 19 Pferden der Gruppe 1 der Nachweis

von EHV-2 Genom, sowie bei 23 Pferden der Gruppe 2.

Mittels des Fisher Exact Test wird gezeigt, dass in allen untersuchten Materialien

keine signifikanten Unterschiede zwischen augenkranken und augengesunden

Tieren dargestellt werden können (Abbildung 10).

64

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Ergebnisse

0

5

10

15

20

25

Gruppe 1Gruppe 2

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

PBL : periphere Blutleukozyten

n.s. : nicht signifikant

Abb. 10: Gruppe 1 und 2 - Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei in der Erstuntersuchung

65

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Ergebnisse

Die Ergebnisse der Zweituntersuchung bei den Pferden der Gruppen 1 und 2 sind in

Tabelle 7 und Abbildung 11 dargestellt. Bei jeweils 3 Pferden der Gruppen 1 und 2

konnte keine Zweituntersuchung durchgeführt werden.

Tab. 7: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)

EHV-2 Nachweis bei [n Pferden] in

Gruppe 1 n = 25

Gruppe 2 n = 25

Wattetupfer 7 (28%) 4 (14,3%) Cytobrush 13 (52%) 13 (52%)

Nasentupfer 1 (4%) 1 (4%) PBL 5 (20%) 12 (48%)

gesamt positive Pferde 16 (64%) 18 (72%) PBL : periphere Blutleukozyten

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

Bei jeweils dreizehn Pferden der Gruppen 1 und 2 gelang der positive EHV-2

Nachweis im Cytobrush. Bei sieben Pferden der Gruppe 1 sowie vier Pferden der

Gruppe 2 war der Wattetupfer EHV-2 positiv. Bei jeweils einem Pferd der beiden

Gruppen war der Nasentupfer postiv, in den peripheren Blutleukozyten konnte bei

fünf Pferden der Gruppe 1 sowie zwölf Pferden der Gruppe 2 EHV-2 Genom

nachgewiesen werden. Insgesamt gelang ein Nachweis bei 16 Pferden der Gruppe 1

und 18 Pferden der Gruppe 2.

Mit dem Fisher Exact Test wird gezeigt, dass auch zum Zeitpunkt der

Zweituntersuchung keine signifikanten Unterschiede (n.s.) in den untersuchten

Materialien zwischen den an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankten

Pferden und augengesunden Kontrolltieren festgestellt werden können (Abbildung 5).

66

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Ergebnisse

02468

101214161820

Gruppe 1Gruppe 2n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

PBL : periphere Blutleukozyten

n.s. : nicht signifikant Abb. 11: Gruppe 1 und 2 - Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR in bei der

Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)

67

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Ergebnisse

Tabelle 8 betrachtet die bei der Erst- und Zweituntersuchung geführten Nachweise

von EHV-2 Genom in Wattetupfer und Cytobrush für jedes einzelne Auge der Pferde

aus den Gruppen 1 und 2 zusammengefasst, unabhängig von einer klinischen

Erkrankung.

Tab. 8: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Nachweishäufigkeit von EHV-2 Genom in Cytobrush und Wattetupfer am einzelnen Auge in Prozent

1. US 2. US Nachweis von

EHV-2 Genom

in % Cytobrush Wattetupfer p- Wert Cytobrush Wattetupfer p- Wert

positiv

35,7% 8,0% < 0,01

(**) 34% 10% < 0,01 (**)

negativ

64,3% 92% < 0,01

(**) 66% 90% < 0,01 (**)

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

1. US : Erstuntersuchung

2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)

(**) : signifikanter Unterschied

Der positive Nachweis von EHV-2 Genom gelang in der Erstuntersuchung bei 35,7%

Cytobrushproben sowie 8% Wattetupferproben. Bei 64,3% der beprobten Augen

blieb der Cytobrush EHV-2 negativ, bei 92% der beprobten Augen waren die

Wattetupfer EHV-2 negativ. In der Zweituntersuchung konnte aus 34% der

Cytobrushproben ein positiver Nachweis von EHV-2 Genom geführt werden, bei 66%

gelang kein Nachweis von EHV-2. Im Wattetupfer gelang der Nachweis von EHV-2

Genom aus 10% der Augen, 90% der Wattetupfer blieben EHV-2 negativ.

Es besteht kein signifikanter Unterschied in den Nachweishäufigkeiten zwischen der

Erst- und Zweituntersuchung. Im Vergleich von Wattetupfer zu Cytobrush besteht ein

signifikanter Unterschied in der Nachweishäufigkeit von EHV-2 Genom.

68

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Ergebnisse

In Tabelle 9 wird die Häufigkeit des positiven EHV-2 Nachweises im Wattetupfer bei

gleichzeitig positivem EHV-2 Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge in der Erst-

und Zweituntersuchung gezeigt.

Tab. 9: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Positiver Nachweis von EHV-2 Genom im Wattetupfer bei gleichzeitigem positiven Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge

positiver EHV-2 Nachweis bei

[n Augen] Cytobrush

positiv davon

Wattetupfer positiv p - Wert

Erstuntersuchung 40 7 < 0,01 (**)

Zweituntersuchung 34 6 < 0,01 (**)

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

(**) : signifikanter Unterschied

Hier ist zu sehen, dass in der Erstuntersuchung bei 40 Augen ein positiver EHV-2

Nachweis im Cytobrush gelang. Von diesen gelang bei sieben Augen ein

gleichzeitiger EHV-2 Nachweis im Wattetupfer. In der Zweituntersuchung waren 34

Augen EHV-2 positiv im Cytobrush, davon gelang bei sechs Augen der Nachweis im

Wattetupfer.

Eine statistische Auswertung mittels des McNemar Tests konnte zeigen, dass zu

beiden Untersuchungszeitpunkten ein Nachweis von EHV-2 Genom signifikant

häufiger im Cytobrush als im Wattetupfer gelingt. In Abbildung 12 wird der Vergleich

von positivem EHV-2 Nachweis in Cytobrush und Wattetupfer graphisch dargestellt.

69

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Ergebnisse

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1. US 2.US

Cytobrush pos.davon Tupfer pos.

**

**

1. US : Erstuntersuchung

2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)

pos. : positiv

** : signifikanter Unterschied

Abb. 12: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Vergleich von Cytobrush zu Wattetupfer beim positiven EHV-2 Nachweis am einzelnen Auge

70

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Ergebnisse

In Tabelle 10 wird der Nachweis von EHV-2 Genom in erkrankten und gesunden

Augen bei den Pferden der Gruppe 1 in Wattetupfer und Cytobrush zum Zeitpunkt

der Erstuntersuchung vergleichend dargestellt.

Tab. 10: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush bei der Erstuntersuchung [ n = 28]

EHV-2 Nachweis bei n [Pferden]

Wattetupfer positiv n = 7

Cytobrush positiv n = 16

Cytobrush und Wattetupfer positiv

n = 4 auf erkranktem Auge 4 8 2 auf gesundem Auge 3 6 2

auf beiden Augen 0 2 0 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Bei vier Pferden war bei der Erstuntersuchung der Wattetupfer ausschließlich auf

dem erkrankten Auge EHV-2 positiv, bei drei Pferden erfolgte der Nachweis im

Wattetupfer nur auf dem gesunden Auge. Bei keinem Pferd war der Wattetupfer auf

beiden Augen positiv. Von 16 Pferden, bei denen der Nachweis von EHV-2 im

Cytobrush gelang, wurde bei acht Tieren der Nachweis ausschließlich auf dem

erkrankten Auge geführt. Sechs Pferde waren nur auf dem gesunden Auge positiv,

bei zwei Pferden waren beide Augen im Cytobrush EHV-2 positiv. Bei zwei Pferden

waren sowohl Wattetupfer als auch Cytobrush auf dem erkrankten Auge EHV-2

positiv, ebenso bei zwei Pferden auf dem gesunden Auge. Bei keinem Pferd waren

beide Proben auf beiden Augen positiv. Diese Aufstellung zeigt, dass die Nachweise

von EHV-2 Genom in beiden Untersuchungsmethoden zu gleichen Anteilen auf

erkrankten und gesunden Augen erfolgen und kein signifikant häufigerer Nachweis

auf dem erkrankten Auge erfolgte.

Tabelle 11 zeigt den Nachweis von EHV-2 Genom bei den Pferden der Gruppe 1

zum Zeitpunkt der Zweituntersuchung vergleichend auf erkranktem und gesunden

Auge in Wattetupfer und Cytobrush.

71

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Ergebnisse

Tab. 11: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush bei der Zweituntersuchung [n = 25]

EHV-2 Nachweis bei

n [Pferden] Wattetupfer

positiv n = 7

Cytobrush positiv n = 13

Cytobrush und Wattetupfer positiv

n = 5 auf erkranktem/

ehemals erkranktem Auge 7 6 5

auf gesundem Auge 0 1 0 auf beiden Augen 0 6 0

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Hier ist zu erkennen, dass bei sieben Pferden in der Zweituntersuchung im

Wattetupfer ausschließlich auf dem erkrankten oder ehemals erkrankten Auge ein

positiver EHV-2 Nachweis geführt wurde.

Bei keinem Tier gelang ein Nachweis im Wattetupfer nur auf dem gesunden oder in

beiden Augen. Ein positiver EHV-2 Nachweis im Cytobrush gelang bei sechs Pferden

ausschließlich auf dem erkrankten Auge. Bei einem Pferd erfolgte der Nachweis nur

auf dem gesunden Auge, sechs Pferde waren auf beiden Augen im Cytobrush EHV-

2 positiv. Bei fünf Pferden gelang der Nachweis auf dem erkrankten Auge in beiden

Proben gleichzeitig.

Die Tabelle 12 zeigt die Anzahl der Pferde in Gruppe 1, bei denen der Nachweis von

EHV-2 in der Erst- und Zweituntersuchung in den verschiedenen Proben geführt

wurde.

72

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Ergebnisse

Tab. 12: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom in den verschiedenen Proben bei Erst- und Zweituntersuchung

Nachweis von EHV-2 Genom bei

n =

Wattetupfer EHV-2 positiv

Cytobrush EHV-2 positiv

Nasentupfer EHV-2 positiv

PBL EHV-2 positiv

1. US n [Pferde] 28 7 16 3 10

2. US n [Pferde] 25 7 13 1 5

1. und 2. US n [Pferde] 53 5 11 0 4

PBL : periphere Blutleukozyten

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

1. US : Erstuntersuchung

2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)

Bei sieben Pferden war der Wattetupfer in der Erstuntersuchung positiv, ebenso bei

sieben Pferden in der Zweituntersuchung. Bei fünf Pferden gelang der Nachweis

sowohl in der Erst- als auch in der Zweituntersuchung. Bei 16 Pferden gelang in der

Erstuntersuchung der Nachweis von EHV-2 im Cytobrush, bei 13 Pferden war der

Cytobrush in der Zweituntersuchung EHV-2 positiv. Ein wiederholter Nachweis von

EHV-2 Genom im Cytobrush gelang bei elf Pferden.

Der Nasentupfer war in der Erstuntersuchung bei drei Tieren positiv, in der

Zweituntersuchung bei einem Pferd. Ein wiederholter Nachweis gelang bei keinem

Tier.

Die Untersuchung der peripheren Blutleukozyten erbrachte bei zehn Pferden einen

positiven Nachweis in der Erstuntersuchung und bei fünf Pferden in der

Zweituntersuchung. Bei vier Pferden gelang ein wiederholter Nachweis von EHV-2 in

den peripheren Blutleukozyten.

Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2

Genom auf dem erkrankten und/oder gesundem Auge und dem gleichzeitigem

Nachweis in Nasentupfer und peripheren Blutleukozyten besteht nicht.

73

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Ergebnisse

4.1.2 Virologischer Nachweis von EHV-2 mittels Virusanzucht Der zweite entnommene Cytobrush wurde zur Virusanzucht nach beschriebener

Methode eingesetzt. Dieser Nachweis von vermehrungsfähigem Virusmaterial gelang

jedoch nur in einem einzigen Fall bei einem Pferd der Kontrollgruppe (Nr. 9) zu

beiden Untersuchungszeitpunkten. Bei diesem Pferd lag keine klinische Erkrankung

vor.

Daher kann hier eine Aussage über die klinische Relevanz bei Nachweis von

lebendem Virusmaterial oder die Sensitivität dieser Methode nicht getroffen werden.

74

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Ergebnisse

4.2 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung Die mikrobiologischen Untersuchungen der Augentupferproben wurden im Institut für

Mikrobiologie und Tierseuchen der tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

Die nachgewiesenen Keime bei den Pferden der Gruppen 1 und 2 in der Erst- und

Zweituntersuchung sind in den Tabellen A6, A7, A8 und A9 im Anhang aufgeführt.

Der kulturelle Gehalt der nachgewiesenen Keime wurde in geringgradig, mittelgradig

und hochgradig unterschieden. Der Nachweis von hochgradigem Gehalt erfolgte

sowohl bei gesunden als auch erkrankten Augen überwiegend bei Streptokokken,

Staphylokokken sowie bei Acinetobacter spp., Pantoea spp. und Escherichia coli. Bei

zwei der erkrankten Augen lag auch ein hochgradiger Gehalt an Pseudomonas spp.

vor. In gering- und mittelgradiger Menge konnten Pseudomonaden sowohl in

erkrankten als auch gesunden Augen isoliert werden.

In der Tabelle 13 sind Art und Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und

erkrankten Augen der Gruppen 1 und 2 bei der Erstuntersuchung zusammengefasst.

Insgesamt wurden 112 Augen im Abstand von vier Wochen untersucht, davon waren

28 Augen an einer Keratitis oder Kojunktivitis erkrankt.

Die Tabelle zeigt, dass bei der Erstuntersuchung koagulasenegative Staphylokokken

in insgesamt 49 Augen isoliert werden konnten, davon waren 14 Augen klinisch

erkrankt. Der Nachweis von alpha-hämolysierenden Streptokokken wurde bei 14

Augen geführt, davon waren sechs Augen klinisch erkrankt. Acinetobacter spp.

wurde bei 52 Augen isoliert, von denen neun erkrankt waren. In 57 Augen gelang der

Nachweis von Bacillus spp., zwölf Augen wiesen davon eine Erkrankung auf.

Bacillus cereus konnte in 17 gesunden und fünf erkrankten Augen nachgewiesen

werden. Bei 31 gesunden und sechs erkrankten Augen erfolgte der Nachweis von

Pantoea agglomerans. Pseudomonas spp. konnte bei sechs Augen isoliert werden,

von denen drei erkrankt waren, Pseudomonas fluoreszens wurde bei einem

erkrankten Auge nachgewiesen. Bei nur einem erkrankten Auge wurden Sprosspilze

nachgewiesen, bei jeweils zwei gesunden Augen erfolgte der Nachweis von

Sprosspilzen, Schimmelpilzen und niederen Pilzen (Mucor spp.). Aus drei gesunden

Augen konnten Schwärzepilze der Gattung Alternaria spp. isoliert werden.

75

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Ergebnisse

Tab. 13: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und erkrankten Augen bei der Erstuntersuchung, n [Augen] = 112

nachgewiesene Keimen [Nachweise] in gesunden

Augen Gruppe 1

n [Nachweise] in erkrankten

Augen Gruppe 1

n [Nachweise] in gesunden

Augen Gruppe 2

n [Nachweise] gesamt

(davon klinisch erkrankt)

koag.- Staphylokokken 13 14 22 49 (14) Staphylococcus aureus - 2 - 2 (2) Staphylococcus xylosus - 1 - 1 (1)

anhämolys. Streptokokken 2 - 3 5 (0) α-hämolys. Streptokokken 4 5 5 14 (6)

Streptococcus equi subsp.zooepidemicus - - 1 1 (0)

Bacillus spp. 14 12 31 57 (13) Bacillus cereus 5 7 5 17 (5)

Acinetobacter spp. 13 9 30 52 (9) Moraxella spp. - - 2 2 (0)

Pseudomonas spp. - 3 3 6 (3) Pseudomonas fluorescens - 1 - 1 (1) Flavimonas orizyhabitans - - 2 2 (0)

Ralstonia picketii (früher: Pseudomonas p.) - 1 - 1 (1)

Pantoea agglomerans 6 6 19 31 (6) Enterobacter spp. - - 2 2 (0) Enterococcus spp. - - 1 1 (0)

Escherichia coli 2 3 4 9 (3) coryneforme Bakterien - - 3 3 (0) Chryseobacterium spp. - - 4 4 (0)

Alcaligenes spp. - 1 - 1 (1) Arthrobacter spp. 2 1 - 3 (1) Micrococcus spp. 1 - - 1 (0) Geotrichum spp. - 1 - 1 (1)

Mucor spp. 2 - - 2 (0) Schimmelpilze - - 1 1 (0)

Aspergillus spp. 1 - - 1 (0) Alternaria spp. - - 3 3 (0)

Sprosspilze 1 1 1 3 (1) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

koag.- : koagulasenegativ spp. : species

α-hämolys. : alphahämolysierend subsp. : subspecies

anhämolys. : anhämolysierend

76

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Ergebnisse

In Tabelle 14 sind die prozentualen Anteile der nachgewiesenen Keimgruppen bei

gesunden und erkrankten Augen aus Gruppe 1 und 2 in der Erstuntersuchung

dargestellt. Diese prozentualen Anteile an den verschiedenen Keimgruppen wird in

den Abbildungen 7 und 8 für gesunde und erkrankte Augen graphisch dargestellt.

Tab. 14: Gruppe 1 und 2, Erstuntersuchung – Nachweise der Keimgruppen bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent

Keimgruppe Nachweis in

gesunden Augen [n = 84] in %

Nachweis in erkrankte Augen

[n = 28] in % p - wert

grampos. Kokken 59,5% 82,1% < 0,05 (*) gramneg. Stäbchen,

aerob 48% 50% > 0,05 (n.s.)

gramneg. Stäbchen, fakultativ anaerob 39,3% 39,3% > 0,05 (n.s.)

grampos. Stäbchen, aerob sporenbildend 65,5% 60,7% > 0,05 (n.s.)

grampos. coryneforme Stäbchen 8,3% 0% > 0,05 (n.s.)

Schimmelpilze 2,4% 0% > 0,05 (n.s.) Sprosspilze 2,4% 3,5% > 0,05 (n.s.)

niedere Pilze 5,9% 0% > 0,05 (n.s.) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

grampos. : grampositiv

gramneg. : gramnegativ

(*) : schwach signifikant

(n.s.) : nicht signifikant

Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass in 59,5% der gesunden Augen beider

Untersuchungsgruppen grampositive Kokken isoliert werden konnten, dieser

Nachweis gelang bei 82,1% der erkrankten Augen. Bei 48% der gesunden und 50%

der erkrankten Augen wurden gramnegative aerobe Stäbchen isoliert. Gramnegative

fakultativ anaerobe Stäbchen konnten bei jeweils 39,3% der gesunden und

erkrankten Augen isoliert werden. Obligat aerobe sporenbildende Stäbchen konnten

in 65,5% der gesunden und 60, 7% der erkrankten Augen nachgewiesen werden.

77

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Ergebnisse

Grampositive corynefome Stäbchen wurden bei 8,3% der gesunden Augen isoliert,

Schimmelpilze bei 2,4%, Sprosspilze in 2,4% und niedere Pilze bei 5,9% der

gesunden Augen. Sprosspilze konnten ferner in 3,5% der erkrankten Augen

gefunden werden.

Mittels des χ2 – Tests und des Fisher- Exact Tests wurden die Nachweishäufigkeiten

der einzelnen Keimgruppen in gesunden und erkrankten Augen statistisch

untersucht. Dabei ergab sich bei den grampositiven Kokken in erkrankten Augen ein

schwach signifikant häufigerer Nachweis als in gesunden Augen. Bei allen anderen

untersuchten Keimgruppen konnten keine signifikanten Unterschiede im Nachweis

bei erkrankten und gesunden Augen festgestellt werden.

In den Abbildungen 13 und 14 sind die prozentualen Nachweishäufigkeiten bei

gesunden und erkrankten Augen in der Erstuntersuchung graphisch dargestellt.

47,6%

5,9%2,4%2,4%

8,3%

65,5%

39,3%

59,5%

grampos. Kokken

gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. Stäbchensporenbildendgrampos. coryneformeStäbchenFadenpilze

Sprosspilze

niedere Pilze

grampos. : grampositiv

gramneg. : gramnegativ

Abb. 13: Gesunde Augen [n = 84] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen

Keimgruppen bei der Erstuntersuchung

78

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Ergebnisse

82,10%

50,00%

39,30%

60,70%

3,50%grampos. Kokken

gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. StäbchensporenbildendSprosspilze

grampos. : grampositiv

gramneg. : gramnegativ

Abb. 14 : Erkrankte Augen [n = 28] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen

Keimgruppen bei der Erstuntersuchung Aus den Abbildungen ist zu ersehen, dass kein signifikanter Unterschied in den

Anteilen den gramnegativen Keimgruppen im Verhältnis zu der gesamten Keimflora

zwischen gesunden und erkrankten Augen besteht.

Tabelle 15 zeigt Art und Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und

erkrankten bzw. ehemals erkrankten Augen der Gruppen 1 und 2 bei der

Zweituntersuchung. Jeweils drei Tiere der Gruppen 1 und 2 wurden nicht zur

Zweituntersuchung vorgestellt. Es wurden insgesamt 100 Augen untersucht, davon

waren 25 klinisch erkrankt oder ehemals erkrankt.

79

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Ergebnisse

Tab. 15: - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und erkrankten Augen bei der , n [Augen] = 100

nachgewiesene Keime n [Nachweise] in gesunden

Augen Gruppe 1

n [Nachweise]

Gruppe 1

n [Nachweise]

Gruppe 2

n [Nachweise] gesamt

(davon klinisch erkrankt/ehemals erkrankt)

koag.- Staphylokokken 9 10 13 Staphylococcus aureus - 2 - 2 (2)

α-hämolys. Streptokokken 2 4 7 (4) Streptococcus equi

subsp. equi 1 - - 1 (0) Streptococcus equi

subsp.zooepidemicus - - 2 2 (0) Bacillus spp. 11 33 54 (8)

Bacillus cereus 5 5 6 16 (5) Acinetobacter spp. 9 6 18 33 (6) Pseudomonas spp. 2 1 5 (2)

Pseudomonas fluorescens - 1 1 2 (1) Flavimonas orizyhabitans - 1 - 1 (1)

Pantoea agglomerans

Gruppe 1 und 2Zweituntersuchung

in erkrankten in gesunden Augen Augen

32 (10)

1

8

2

7 6 14 27 (6) Enterobacter spp. - 1 - 1 (1) Enterococcus spp. 1 - - 1 (0)

Escherichia coli 3 6 6 15 (6) Serratia spp. 1 1 - 2 (1)

coryneforme Bakterien 2 1 3 (2) Mucor spp. 1 - - 1 (0)

Schimmelpilze - - 1 1 (0) Aspergillus spp. 1 - 1 2 (0)

Streptomyces spp. - 1 - 1 (0) Alternaria spp. - - 4 4 (0) Fusarium spp - - 4 4 (0)

Cladosporium spp. - - 3 3 (0) Sprosspilze 1 1 - 2 (1)

-

spp. : species

α-hämolys. : alphahämolysierend

koag.- : koagulasenegativ

subsp. : subspecies

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

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Ergebnisse

In der Tabelle ist zu erkennen, dass der Nachweis von koagulasenegativen

Staphylokokken insgesamt 32 mal gelang, davon zehn mal aus erkrankten bzw.

ehemals erkrankten Augen. Bacillus spp. wurde 54 mal isoliert, dabei waren acht

Nachweise aus erkrankten Augen. Aus 27 gesunden Augen sowie sechs erkrankten

Augen gelang der Nachweis von Acinetobacter spp. . Pantoea agglomerans wurde

aus 21 gesunden und sechs erkrankten Augen isoliert. Aus zwei erkrankten sowie

drei gesunden Augen wurde Pseudomonas spp. isoliert, aus jeweils einem gesunden

und erkrankten Auge konnte Pseudomonas fluoreszens nachgewiesen werden.

Escherichia coli wurde insgesamt 15 mal isoliert, davon waren sechs Augen erkrankt

oder ehemals erkrankt. Aus gesunden Augen konnte jeweils vier mal Fusarium spp.

und Alternaria spp. nachgewiesen werden, Aspergillus wurde in zwei gesunden

Augen isoliert, sonstige Schimmelpilze aus einem gesunden Auge. Sprosspilze

wurden in jeweils einem gesunden und einem erkrankten Auge nachgewiesen.

In Tabelle 16 sind die prozentualen Anteile der nachgewiesenen Keimgruppen in

gesunden und erkrankten bzw. ehemals erkrankten Augen aus den Gruppen 1 und 2

bei der Zweituntersuchung aufgeführt.

81

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Ergebnisse

Tab. 16: Gruppe 1 und 2, Zweituntersuchung – Nachweise der Keimgruppen bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent

Keimgruppe Nachweis in

gesunden Augen [n = 75] in %

Nachweis in erkrankten Augen

[n = 25] in % p - wert

grampos. Kokken 37,3% 64% < 0,05 (*) gramneg. Stäbchen,

aerob 28% 40% > 0,05 (n.s.)

gramneg. Stäbchen, fakultativ anaerob 42,7% 56% > 0,05 (n.s.)

grampos. Stäbchen, aerob sporenbildend 73,3% 52% > 0,05 (n.s.)

grampos. coryneforme Stäbchen 1,3% 8% > 0,05 (n.s.)

Fadenpilze 18,7% 4 % > 0,05 (n.s.) Sprosspilze 1,3% 4 % > 0,05 (n.s.)

niedere Pilze 1,3% 0% > 0,05 (n.s.)

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

grampos. : grampositiv

gramneg. : gramnegativ

(*) : schwach signifikant

(n.s.) : nicht signifikant

Hier ist zu erkennen, dass in 37,3% der gesunden Augen grampositive Kokken

nachgewiesen werden konnten, in erkrankten Augen erfolgte der Nachweis zu 64%.

Der Nachweis von aeroben gramnegativen Stäbchen erfolgte in 28% der gesunden

und 40% der erkrankten Augen. Fakultativ anaerobe Stäbchen wurden aus 42,7%

der gesunden und 56% der erkrankten Augen isoliert. Obligat aerobe sporenbildende

grampositive Stäbchen wurden in 73,3% der gesunden und 52% der erkrankten

Augen nachgewiesen. Aus 1,3% der gesunden und 8% der erkrankten Augen

konnten coryneforme Bakterien isoliert werden. Der Nachweis von Fadenpilzen

gelang in 18,7% der gesunden sowie in 4% der erkrankten Augen, Sprosspilze

wurden aus 4% der erkrankten und 1,3% der gesunden Augen isoliert. Der Nachweis

niederer Pilze gelang in 1,3% der gesunden Augen.

82

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Ergebnisse

Auch in der Zweituntersuchung wurden die Nachweishäufigkeiten der einzelnen

Keimgruppen in gesunden und erkrankten Augen mittels des χ2 – Tests und des

Fisher- Exact Tests statistisch untersucht. Dabei ergab sich bei den grampositiven

Kokken in erkrankten Augen ein schwach signifikant häufigerer Nachweis als in

gesunden Augen. Bei allen anderen untersuchten Keimgruppen konnten keine

signifikanten Unterschiede im Nachweis bei erkrankten und gesunden Augen

festgestellt werden.

Abbildung 15 und 16 zeigen die prozentuale Verteilung der nachgewiesenen

Keimgruppen in gesunden und erkrankten Augen bei der Zweituntersuchung.

37,30%

28%

42,70%

73,30%

1,30%

18,70%

2,60%grampos. Kokken

gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. Stäbchensporenbildendgrampos. coryneformeStäbchenFadenpilze

Sprosspilze und niederePilze

grampos. : grampositiv

gramneg. : gramnegativ

fakult. : fakultativ

Abb. 15: Gesunde Augen [n = 75] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung

83

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Ergebnisse

4%4%

8%

52%

56%40%

64%

grampos. Kokken

gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. Stäbchensporenbildendgrampos. coryneformeStäbchenFadenpilze

Sprosspilze

grampos. : grampositiv

gramneg. : gramnegativ

fakult. : fakultativ

Abb. 16: Erkrankte Augen [n = 25] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung

In der Zweituntersuchung ist der Anteil der gramnegativen Keimgruppen im

Verhältnis zur Gesamtflora bei den erkrankten Augen höher als bei den gesunden

Augen, dieser Unterschied ist statistisch nicht signifikant.

84

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Ergebnisse

4.3 Ergebnisse der zytologischen Untersuchung

Die Integrität der Zellen in den untersuchten Präparaten war größtenteils

zufriedenstellend.

Alle untersuchten Präparate beider Gruppen enthielten zu ca. 98 % Epithelzellen der

beprobten Konjunktiva palpebralis. Diese lagen sowohl einzeln als auch in größeren

Zellverbänden vor. Es konnten überwiegend ausgereifte als auch in geringerem

Prozentsatz unreife Epithelzellen der tieferen Konjunktivaschichten gefunden

werden.

Eine Übersicht über die Anteile weiterer Zellarten bei den Augen der Pferde aus

Gruppe 1 und 2 zeigt Tabelle 17.

Tab. 17 : Gruppe 1 und 2 – Nachweise verschiedener Entzündungszellen bei gesunden und erkrankten Augen (n = 112)

Vorkommende

Entzündungszellen bei n [Augen]

Gruppe 1 erkrankte Augen

[n = 28]

Gruppe 1 gesunde Augen

[n = 28]

Gruppe 2 gesunde Augen

[n = 56] neutrophile Granulozyten 3 (10,7 %) 3 (10,7 %) 3 (5,4 %)

Lymphozyten 7 (25 %) 4 (14,2 %) 6 (21,4 %) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

Es fanden sich in Gruppe 1 bei drei erkrankten Augen (10,7 %) neutrophile

Granulozyten (Pferd Nr. 1, 5 und 17), ebenso bei drei gesunden Augen (10,7 %) aus

der Patientengruppe (Pferd Nr. 1, 17 und 20). In der Kontrollgruppe konnten

ebenfalls in drei Augen (5,4 %) neutrophile Granulozyten gefunden werden, hier

jeweils nur in einem Auge pro Pferd.

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Ergebnisse

Lymphozyten konnten bei sieben Pferden (25 %) der Gruppe 1 (Nr. 3, 11, 16, 17, 20,

24 und 28) auf dem erkrankten Auge nachgewiesen werden, bei 4 Pferden der

Gruppe 1 (14,2 %) konnten Lymphozyten auf dem gesunden Auge gefunden werden.

In der Gruppe 2 konnten bei sechs Augen (21,4 %) vereinzelte Lymphozyten

gefunden werden, bei einem dieser Pferde auf beiden Augen, bei den anderen

Tieren jeweils nur auf einem Auge.

Eine statistische Auswertung ist hier aufgrund der zu geringen Zahlenwerte nicht

möglich. Es scheint jedoch kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von

Entzündungszellen und einer klinischen Erkrankung der Augen zu bestehen.

Die Quantität der vorkommenden Entzündungszellen bei den einzelnen Augen der

Pferde aus Gruppe 1 zeigt Tabelle 18. Dabei wurden die betroffenen Zellen in acht

Ölimmersions- Gesichtsfeldern (Vergrößerung 100 x 10) zunächst addiert und dann

ein Mittelwert gebildet. Die Werte sind durch einen Schrägstrich für klinisch erkrankte

und gesunde Augen unterteilt.

Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass die Anzahl der vorkommenden

Entzündungszellen bei allen Präparaten sehr gering ist. Bei den Patienten Nr. 1, 17

und 20 aus der Gruppe 1 kommen beide Arten der Entzündungszellen auf einem

Auge vor, dabei bei Patient Nr. 17 auf beiden Augen. Bei Patient Nr. 1 sind in den

Präparaten beider Augen neutrophile Granulozyten zu finden, nur auf dem gesunden

Auge erfolgte hier auch der Nachweis von Lymphozyten. Bei Patient Nr. 20 hingegen

sind in den Präparaten beider Augen Lymphozyten zu finden, ein gemeinschaftliches

Vorkommen mit neutrophilen Granulozyten ist wiederum nur auf dem gesunden

Auge festzustellen.

86

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Ergebnisse

Tab. 18: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus Gruppe 1

Pferd Anzahl neutrophile Granulozyten

(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)

Anzahl Lymphozyten

(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)Patient 1

(erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0,5 / 0,8 0 / 0,4

Patient 3 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0 0,8 / 0

Patient 5 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0,3 / 0 0 / 0

Patient 11 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0 0,5 / 0

Patient 16 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0 0,4 / 0,8

Patient 17 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0,5 / 0,4 1,6 / 1, 5

Patient 20 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0,4 0,8 / 0,8

Patient 22 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0 0 / 0,5

Patient 24 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0 0,6 / 0

Patient 28 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)

0 / 0 0,5 / 0

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

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Ergebnisse

In Tabelle 19 ist die durchschnittliche Anzahl der Entzündungszellen bei den Pferden

der Gruppe 2 aufgeführt. Da auch hier teilweise der Nachweis auf beiden Augen

erfolgte, wurde in linkes und rechtes Auge durch einen Teilstrich unterschieden,

beide Augen sind ohne eine klinische Erkrankung.

Der Nachweis von Lymphozyten auf beiden Augen gelingt in Gruppe 2 nur bei

Kontrollpferd Nr. 5. Bei den anderen Pferden, bei denen Entzündungszellen in den

Präparaten der einzelnen Augen gefunden werden, liegen diese jeweils nur auf

einem Auge vor. Auch ein gemeinsames Vorkommen beider Zellarten in einem

Präparat kann nicht festgestellt werden, wohl aber der Nachweis beider Zellarten in

einem Pferd. So sind bei Kontrollpferd Nr. 6 auf dem rechten Auge neutrophile

Granulozyten und auf dem linken Auge Lymphozyten zu finden. Bei Kontrollpferd Nr.

15 finden sich auf dem linken Auge Lymphozyten und auf dem rechten Auge

neutrophile Granulozyten.

Tab. 19: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus Gruppe 2

Pferd Anzahl neutrophile Granulozyten

(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)

Anzahl Lymphozyten

(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)Kontrollpferd 3 (linkes Auge/ rechtes Auge)

0,5 / 0 0 / 0

Kontrollpferd 5 (linkes Auge/ rechtes Auge)

0 / 0 1,5 / 0,8

Kontrollpferd 6 (linkes Auge/ rechtes Auge)

0 / 0,4 0,8 / 0

Kontrollpferd 9 (linkes Auge/ rechtes Auge)

0 / 0 0,8 / 0

Kontrollpferd 13 (linkes Auge/ rechtes Auge)

0 / 0 0 / 0,7

Kontrollpferd 15 (linkes Auge/ rechtes Auge)

0,4 / 0 0 / 0,5

Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung

88

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Ergebnisse

In Tabelle 20 sind die zytologischen Befunde der Augen beider Gruppen den

Ergebnissen der virologischen Untersuchung gegenübergestellt, unabhängig von

einer klinischen Erkrankung.

Tab. 20: Gruppe 1 und 2 - Virologische Ergebnisse bei Augen mit dem Vorkommen von Entzündungszellen, unabhängig von einer klinischen Erkrankung

Entzündungszellen bei

n [Augen]

EHV-2 Nachweis im Wattetupfer

EHV-2 Nachweis im Cytobrush

EHV-2 Nachweis in Wattetupfer

und Cytobrush

EHV-2 Nachweis

negativ

neutrophile Granulozyten 0 2 1 6

Lymphozyten 0 3 1 13

Dabei zeigt sich, dass von neun Augen, in deren Präparaten neutrophile

Granulozyten gefunden wurden, in zwei Augen bei der virologischen Untersuchung

EHV-2 Genom im Cytobrush nachgewiesen wurde. In einem Auge gelang der

Nachweis in Cytobrush und Wattetupfer, sechs Augen blieben im Nachweis von

EHV-2 negativ.

Lymphozyten konnten in den Präparaten von insgesamt 17 Augen gefunden werden.

Davon waren zwölf Augen EHV-2 negativ, bei einem Auge gelang der Nachweis von

EHV-2 Genom in Wattetupfer und Cytobrush, bei drei Augen nur im Cytobrush.

In Präparaten von zehn Augen konnten intranukleäre Einschlusskörperchen erkannt

werden, davon waren vier Augen in der virologischen Untersuchung EHV-2 negativ.

Bei sechs Augen konnte EHV-2 Genom nachgewiesen werden, davon fünfmal im

Cytobrush sowie einmal in Cytobrush und Wattetupfer.

Eine statistische Auswertung kann aufgrund der geringen Zahlenwerte nicht erfolgen.

Es scheint jedoch kein Zusammenhang zwischen den einzelnen zytologischen

Befunden und einem Nachweis von EHV-2 Genom erkennbar zu sein.

89

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Ergebnisse

Tabelle 21 stellt erkrankte Augen mit und ohne dem Symptom Konjunktivitis den

zytologischen Befunden und dem Nachweis von EHV-2 Genom gegenüber.

Tab. 21: Gruppe 1 – Zytologische Befunde bei erkrankten Augen mit und ohne Begleitsymtom Konjunktivitis in Zusammenhang mit dem Nachweis von EHV-2 Genom

erkrankte Augen mit Konjunktivitis

[n = 19]

erkrankte Augen ohne Konjunktivititis

[n = 9]

Zytologische Befunde bei

n [Augen] EHV-2 pos. EHV-2 neg. EHV-2 pos. EHV-2 neg.

neutrophile Granulozyten 2 1 0 0 Lymphozyten 1 3 0 3

Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind

Dabei zeigt sich, dass bei allen drei erkrankten Augen, in deren Präparate

neutrophile Granulozyten gefunden wurden, eine Konjunktivitis vorgelegen hat. Bei

zwei dieser Augen erfolgte ein positiver Nachweis von EHV-2 Genom.

Lymphozyten konnten bei jeweils vier erkrankten Augen mit und drei Augen ohne

Konjunktivitis gefunden werden. Alle Augen ohne Konjunktivitis blieben im Nachweis

von EHV-2 negativ, bei einem Auge mit Konjunktivitis konnte EHV-2 Genom

nachgewiesen werden.

Auch hier ist aufgrund der geringen Zahlenwerte keine statistische Auswertung

möglich.

90

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Ergebnisse

Auf den folgenden Seiten sind auf den Abbildungen 17 bis 22 beispielhaft

mikroskopische Darstellungen der zytologischen Befunde gezeigt.

91

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Ergebnisse

Abb. 17: Epithelzellverband

Kontrollpferd Nr. 13, rechtes Auge;

Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion

Abb. 18: Lymphozyt (LZ), umgeben von Epithelzellen

Einige Zellkerne der Epithelzellen zeigen bereits eine starke Auflockerung des

Chromatins und Vakuolisierung im Zuge der eingesetzten Lysis.

Kontrollpferd 13, rechtes Auge;

Vergrößerung 100 x 10, Ölimmersion

92

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Ergebnisse

Abb. 17

LZ

Abb. 18

93

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Ergebnisse

Abb. 19: Einzelne Epithelzellen mit zwei neutrophilen Granulozyten (NG) und einem

Lymphozyten (LZ)

Die Epithelzellen zeigen bereits deutliche Lysiserscheinungen, die neutrophilen

Granulozyten liegen als reife segmentkernige Granulozyten vor.

Patient Nr. 1, linkes Auge (klinisch gesund)

Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion

Abb. 20: Lymphozyt (LZ) neben Epithelzellverband

Patient Nr. 1, linkes Auge (klinisch gesund)

Vergrößerung 100 x 10, Ölimmersion

94

Page 95: Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Nr. Nummer NT Nasentupfer n.u. nicht untersucht

Ergebnisse

Abb. 19

Abb. 20

NG

LZ

LZ

95

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Ergebnisse

Abb. 21: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen

In den Epithelzellen liegen als Nebenbefund zytoplasmatische Melanineinschlüsse

(M) vor; diese können in einer Vielzahl der Präparate beobachtet werden und haben

keine klinische Relevanz.

Patient Nr. 17, linkes Auge (klinisch gesund);

Vergrößerung 100x 10, Ölimmersion

Abb. 22: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen liegend

Die Epithelzellen zeigen bereits deutliche Lysiserscheinungen.

Kontrollpferd Nr. 9, linkes Auge;

Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion

96

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Ergebnisse

LZ M

Abb. 21

LZ

LZ

Abb. 22

97

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Diskussion

5 Diskussion 5.1 Material und Methode In der vorliegenden Arbeit wurden im Zeitraum von April 2001 bis April 2003 in der

Klinik für Pferde der tierärztlichen Hochschule Hannover 56 Pferde untersucht. Diese

wurden in zwei Gruppen unterschieden.

Gruppe 1 (n = 28) beinhaltet Tiere, die klinisch an einer Keratitis, Keratokonjunktivitis

oder Konjunktivitis erkrankt waren. Vier dieser Tiere sind Maultiere, die eine Keratitis

punctata seu maculosa aufwiesen. Maultiere gehören zur Familie der Equiden und

es besteht eine direkte Verwandschaft zum Pferd aufgrund der Züchtung mit

Pferdestute und Eselhengst. Eine Infektion mit equinen Herpesviren ist bei Eseln und

Kreuzungen beider Arten möglich, so dass die Maultiere in die Patientengruppe mit

aufgenommen wurden.

In dieser Gruppe wurden 10 Stuten und 18 Wallache untersucht, das

durchschnittliche Alter beträgt 9,7 Jahre.

Gruppe 2 (n = 28) besteht aus Pferden, die klinisch keine Augenerkrankung

aufwiesen und als Kontrollgruppe untersucht wurden. Es wurden 9 Stuten und 21

Wallache untersucht, das durchschnittliche Alter liegt bei 8,4 Jahren.

In einer ähnlichen Studie, in der 29 Pferde mit Keratitis sowie 21 klinisch

augengesunde Pferde untersucht wurden, konnte VON OPPEN (2000) bereits einen

Zusammenhang vom Nachweis von EHV-2 Genom mit dem Auftreten von

Keratitiden beim Pferd darstellen. Im Gegensatz dazu untersuchte BESTHORN

(2002) in einer jüngeren Studie 96 pathologisch veränderte und 129 klinisch gesunde

Augen von insgesamt 148 Pferden und konnte keinen signifikanten Zusammenhang

zwischen dem Nachweis von EHV-2 oder EHV-5 und Keratitiden beim Pferd

feststellen.

Sonstige Autoren berichten über den Nachweis von EHV-2 bei Keratitiden oder

Keratokonjunktivitiden nur in Fallberichten über Einzeltiere (THEIN und BÖHM 1976,

COLLINSON et al. 1994, MILLER et al. 1990).

98

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Diskussion

Die Probenentnahme am Auge für die virologische PCR-Untersuchung wurde sowohl

bei VON OPPEN (2000) als auch bei BESTHORN (2002) durch Entnahme von

Augensekret mittels eines Wattetupfers aus dem Konjunktivalsack durchgeführt.

Diese Methode der Materialgewinnung stellt einen wenig invasiven Eingriff dar, der

die Verletzungsgefahr minimiert. Entnahmen von Hornhautgeschabseln erforderten

aufgrund der Verletzungsgefahr bei Abwehrbewegungen des Pferdes aufwendigere

Zwangsmaßnahmen.

Auch COLLINSON et al. (1994) führte die Probenentnahme am Auge für die

virologische Untersuchung mit Wattetupfern durch.

Der Einsatz des Cytobrushs wird bei BAUER (2001) und WILLIS et al. (1997) zur

Gewinnung von Zellmaterial für zytologische Untersuchungen beschrieben. Auch in

der Humanmedizin wird der Cytobrush unter anderem zur Gewinnung von

Konjunktivalzellen eingesetzt (TSUBOTA et al. 1990). Beim Pferd beschreiben

BOLLIGER et al. (2000) die Gewinnung von zytologischen Präparaten mittels

Cytobrush zur Diagnostik von Keratomykosen.

Eine virologische Untersuchung der gewonnenen Cytobrush- Proben wurde bisher

nicht beschrieben.

In dieser Arbeit wurden für die virologischen Untersuchungen sowohl Wattetupfer als

auch Cytobrush- Proben aus dem Konjunktivalsack des Auges entnommen. Dieser

Vergleich sollte zeigen, ob mit der Gewinnung von mehr Probenmaterial durch den

Cytobrush auch ein zuverlässigerer Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR

möglich ist und damit möglicherweise eine bessere Methode zur virologischen

Diagnostik bei Keratitiden des Pferdes darstellt. Außerdem sollte überprüft werden,

ob mit dieser Methode ein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und

einem klinischem Erscheinungsbild erkennbar ist. VON OPPEN (2000) hatte gezeigt,

dass es im Gegensatz zum Menschen und zur Katze bisher kein pathognomonisches

Bild einer „Viruskeratitis“ beim Pferd gibt.

99

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Diskussion

Als weiteres diagnostisches Verfahren bei verschiedenen Erkrankungen des Auges

beim Menschen wie beispielsweise der Keratokonjunktivitis sicca, Herpes zoster

Keratitiden oder Chlamydienkonjunktivitis wird als schnelles und wenig aufwendiges

Verfahren die exfoliative Zytologie genutzt (ADAMS et al. 1988, MASKIN et al. 1989,

WILHELMS et al. 1986).

Auch beim Kleintier wird die exfoliative Zytologie erfolgreich zur Diagnostik genutzt.

So gibt es Studien über Verteilung und Quantifizierung von Becherzellen bei Hunden

mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996). WILLIS et al. (1997) untersuchten

bei Hunden und Katzen zytologische Präparate bei entzündlichen Erkrankungen des

Auges. Beim Pferd wird diese Methode bisher nur in Einzelfällen angewandt. So

beschreibt KELLNER (1990) als schnelleres Verfahren zur Diagnostik von

Herpeskeratitiden die Färbung eines Bindehautgeschabsels zum mikroskopischen

Nachweis von Herpesviruseinschlusskörperchen. BOLLIGER et al. (2000)

beschreiben die Zytologie beim Pferd zum Nachweis von Pilzmycel bei

Keratomykosen. KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleichen in einer Studie mit 15

Pferden die Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und EHV-5 mittels PCR in

Verbindung mit dem Vorhandensein von intranukleären Einschlusskörperchen im

zytologischen Präparat, konnte dabei jedoch keinen Zusammenhang nachweisen.

In dieser Arbeit wurden zusätzlich zu den für die virologischen Untersuchungen

entnommenen Cytobrush-Proben jeweils ein weiterer Cytobrush aus dem

Konjunktivalsack entnommen und auf einem Objektträger für die zytologische

Untersuchung ausgerollt.

Die für die mikrobiologischen Untersuchungen aus dem Konjunktivalsack

entnommenen Wattetupfer dienen zum Nachweis des vorhandenen Keimspektrums

vergleichend in gesunden und klinisch erkrankten Augen und wurden, um

Verfälschungen durch Lokalanästhesie und mechanische Manipulation zu

vermeiden, vor den Proben zur virologischen Untersuchung entnommen.

100

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Diskussion

5.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels PCR Das equine Herpesvirus Typ 2 wird in der Literatur immer wieder als Verursacher von

Keratitiden oder Keratokonjunktivitiden des Pferdes diskutiert (THEIN und BÖHM

1976, MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1996, VON OPPEN 2000). Dabei wird

von vielen Autoren als klinisches Bild einer „Viruskeratitis“ eine Keratitis punctata

oder Keratitis maculosa vermutet (SCHMIDT 1988, KELLNER 1990, BARNETT

1998). Dabei handelt es sich aber offensichtlich um Analogschlüsse zum Menschen

und Kleintier, für die bisher die Bestätigung fehlt, da beim Pferd bisher im Gegensatz

zu Mensch und Katze kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und

einem klinischen Bild einer „Viruskeratitis“ nachgewiesen werden konnte (VON

OPPEN 2000, KERSHAW et al. 2001). Wurde in früheren Studien zunächst mittels

PCR ein signifikant häufigerer Nachweis von EHV-2 Genom bei Pferden, die an einer

Keratitis erkrankt waren, im Vergleich zu einer augengesunden Kontrollgruppe

geführt (VON OPPEN 2000, KRÜDEWAGEN et al. 2001), so kann in einer jüngeren

Studie mittels PCR kein signifikanter Unterschied im Nachweis von EHV-2 bei

augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden dargestellt werden

(BESTHORN 2002).

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Probenmaterialien auf das

Vorhandensein von EHV-2 Genom bei an einer Keratitis, Konjunktivitis oder

Keratokonjunktivitis erkrankten Pferden sowie bei einer augengesunden

Kontrollgruppe mittels PCR untersucht.

Dabei wurden in der Erstuntersuchung im Wattetupfer, der aus dem Konjunktivalsack

entnommen wurde, bei 25 % der erkrankten Pferde sowie bei 7, 1 % der

augengesunden Pferde EHV-2 Genom nachgewiesen. Der gleichfalls aus dem

Bindehautsack entnommene Cytobrush war bei 57,1 % der erkrankten Tiere sowie

bei 60,7 % der gesunden Tiere positiv im Nachweis von EHV-2. In der

Zweituntersuchung konnte im Wattetupfer bei 28% der erkrankten sowie bei 14,3 %

der gesunden Pferde ein positiver Nachweis erfolgen. Im Cytobrush gelang der

Nachweis bei 13 % beider Untersuchungsgruppen.

101

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Diskussion

Bei diesen Werten werden, ähnlich wie in der Studie von VON OPPEN (2000),

zunächst nicht einzelne Augen unterschieden, der Nachweis auf einem oder beiden

Augen gilt für das Einzeltier als positiv, unabhängig davon, welches Auge erkrankt

war. Sowohl im Wattetupfer als auch im Cytobrush bestehen zu beiden

Untersuchungszeitpunkten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich von

erkrankten zu augengesunden Tieren, wobei der Nachweis im Wattetupfer bei der

Erstuntersuchung im Vergleich der erkrankten und gesunden Tiere auf den ersten

Blick auffällig erscheint, statistisch hier jedoch keine Signifikanz nachzuweisen ist.

Auch in den weiterhin untersuchten Proben (Nasentupfer, periphere Blutleukozyten)

konnten weder in der Erst- noch in der Zweituntersuchung signifikante Unterschiede

im Nachweis von EHV-2 zwischen beiden Untersuchungsgruppen dargestellt

werden.

Insgesamt wurden mit den verschiedenen untersuchten Probenmaterialien in der

Erstuntersuchung bei 67, 9 % der erkrankten und 82, 1 % der gesunden Pferde EHV-

2 Genom nachgewiesen. In der Zweituntersuchung wurden bei 64 % der erkrankten

und 72 % der gesunden Pferde der Nachweis von EHV-2 Genom geführt.

Diese Ergebnisse sind abweichend von Ergebnissen früherer Studien (VON OPPEN

2000, KRÜDEWAGEN 2001), in denen bei erkrankten Pferden der Nachweis von

EHV-2 signifikant häufiger geführt werden konnte. Sie bestätigen jedoch eine jüngere

Studie, in der ebenfalls kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2

Genom und dem Vorliegen einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis festgestellt

werden konnte (BESTHORN 2002).

Im Vergleich der untersuchten Proben untereinander interessierte vor allem die

Nachweishäufigkeit von EHV-2 im Wattetupfer vergleichend zur Nachweishäufigkeit

im Cytobrush. Dabei wurde nicht in klinisch erkrankte und gesunde Augen

unterschieden, sondern nur in positiven und negativen EHV-2 Nachweis mittels PCR.

Beide Proben wurden durch vorsichtiges Drehen im Bindehautsack zur Aufnahme

von Augensekret und Zellmaterial gewonnen. Dabei gelang zu beiden

Untersuchungszeitpunkten ein signifikant (p< 0,01) häufigerer Nachweis im

Cytobrush als im gleichzeitig entnommenen Wattetupfer. In der Erstuntersuchung

war in beiden Gruppen zusammengefasst der Cytobrush bei 40 Augen positiv im

102

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Diskussion

Nachweis von EHV-2, während von diesen Augen nur sieben mal der Wattetupfer

ebenfalls einen positiven Nachweis erbrachte. Von 72 Augen, die im Cytobrush EHV-

2 negativ blieben, waren 70 auch im Wattetupfer EHV-2 negativ. In der

Zweituntersuchung wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. So blieben von 34 Augen,

die im Cytobrush EHV-2 positiv waren, 28 Augen im Wattetupfer EHV-2 negativ.

Diese Zahlen zeigen, dass der Cytobrush offensichtlich eine wesentlich sensitivere

Methode der Probenentnahme zum Nachweis von EHV-2 Genom darstellt. Da der

Cytobrush in der Probengewinnung immer erst nach dem Wattetupfer eingesetzt

wurde, kann der Grund dafür nicht in bereits entfernten Sekret- und Zellbestandteilen

durch vorangegangene Probenentnahmen liegen. Durch die Nylonborsten des

Cytobrushs können jedoch wesentlich mehr Sekret und Zellbestandteile gewonnen

werden als mit dem herkömmlichen Wattetupfer.

Für EHV-2 werden für die Viruslatenz verschiedene Orte vermutet, so unter anderem

Leukozyten, Lungenmakrophagen und das Ziliar- und Trigeminusganglion

(BROWNING und STUDDERT 1987, REUBEL et al. 1995, BORCHERS et al. 1997

RIZVI et al. 1997). Möglicherweise besteht für EHV-2 eine Viruslatenz auch in den

Epithelzellen der Konjunktiva, so dass durch die vermehrte Aufnahme von

Zellmaterial, auch aus den tieferen und damit „jüngeren“ Epithelschichten, hier ein

derartig signifikant häufigerer Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR im

Cytobrush gelang.

Diese Arbeit zeigt, dass durch die signifikant höhere Nachweisrate von EHV-2 mittels

des Cytobrushs sowohl in erkrankten als auch in gesunden Augen zwar eine

offensichtlich sensitivere Methode beschrieben wird, die klinische Relevanz des

EHV-2 jedoch bei Keratitiden des Pferdes zumindest als alleiniger Verursacher in

Frage gestellt werden muss.

103

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Diskussion

5.3 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels Virusanzucht Die für die Virusanzucht bestimmten Cytobrush- Proben wurden in dem gleichen

Verfahren gewonnen wie die Proben für die PCR Untersuchung.

Die Anzucht von EHV-2 gelang nur in einem Fall bei einem augengesunden

Kontrolltier.

Der Nachweis von vermehrungsfähigem EHV-2 mittels Anzuchtverfahren stellt

bereits im Vorfeld deutlich höhere Ansprüche an die Probenverarbeitung. Exogene

Einflüsse wie Transportdauer, Temperatur, Kontamination des Probenmaterials etc.

können bereits im Vorfeld zu ausreichender Schädigung des eventuell vorhandenen

vermehrungsfähigen Virusmaterials führen. Weiterhin ist in der relativ langen

Inkubationszeit des Anzuchtverfahrens ausreichend Raum für weitere schädigende

Faktoren. Dieses Verfahren stellt damit eine für äußere Einflüsse wesentlich

anfälligere Methode dar als die zum Nachweis von Virusgenom eingesetzte PCR.

Dennoch wäre es wissenschaftlich interessant, wenn durch Anzuchtverfahren eine

genauere Spezifizierung der EHV-2 Stämme in erkrankten und gesunden Augen

gelingen könnte. Dies könnte dann vielleicht in weiteren Untersuchungen eine

genauere Beurteilung der Pathogenität einzelner Stämme erlauben.

5.4 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen Das Milieu des Bindehautsackes ist physiologischerweise nicht steril. Bereits in

vorangegangenen Studien wurden bei augengesunden Tieren vor allem

Staphylokokken, Corynebakterien, Streptokokken sowie Bacillus spp., Nesseria spp.

und Enterobacteriaceae nachgewiesen (WHITLEY et al. 1983, BARNETT et

al.1998). Bei BARNETT et al. (1998) werden als häufig aus erkrankten Augen

isolierte Keime ebenfalls Staphylokokken, Streptokokken, Pseudomonaden,

Moraxellen sowie Bacillus spp. aufgeführt, diese benötigen jedoch begünstigende

Faktoren, um pathogen zu wirken.

104

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Diskussion

Auch Pilze können in einer Studie von SAMUELSON et al. (1984) bei 95 %

augengesunder Tiere gefunden werden. BARNETT et al. (1998) geben an, dass

gramnegative Keime häufiger von erkrankten als gesunden Augen isoliert werden

können. Auch MOORE et al. (1983) wiesen in 37 Fällen mit ulzerativen Keratitiden

überwiegen gramnegative Keime nach.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass grampositive Kokken in 59,5 %

der gesunden und 82,1 % der erkrankten Augen zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung

nachgewiesen werden konnten. Bei der Zweituntersuchung erfolgte der Nachweis

grampositiver Kokken in 37,3 % der gesunden und 64 % der erkrankten bzw.

ehemals erkrankten Augen. Diese Werte zeigen zu beiden

Untersuchungszeitpunkten einen schwach signifikant höheren Nachweis

grampositiver Kokken in erkrankten Augen.

Der Nachweis von grampositiven aerob sporenbildenden Stäbchen, gramnegativen

aeroben sowie fakultativ anaeroben Stäbchen, coryneformen Bakterien, Fadenpilzen,

Sprosspilzen und niederen Pilzen erfolgte in beiden Untersuchungsgruppen mit

keinem signifikanten Unterschied.

Der kulturelle Gehalt der nachgewiesenen Keime wurde in geringgradig, mittelgradig

und hochgradig unterschieden. Der Nachweis von hochgradigem Gehalt erfolgte

sowohl bei gesunden als auch erkrankten Augen überwiegend bei Streptokokken,

Staphylokokken sowie bei Acinetobacter spp., Pantoea spp. und Escherichia coli. Bei

zwei der erkrankten Augen lag auch ein hochgradiger Gehalt an Pseudomonas spp.

vor. In gering- und mittelgradiger Menge konnten Pseudomonaden sowohl in

erkrankten als auch gesunden Augen isoliert werden.

Die Art und prozentuale Verteilung der nachgewiesenen Keime bestätigen zum

großen Teil die in der Literatur beschriebenen Beobachtungen. Allerdings lässt sich

in dieser Studie bei erkrankten Augen nicht, wie beschrieben, ein häufigerer

Nachweis gramnegativer Bakterien führen. Vielmehr sind hier in erkrankten Augen

Staphylokokken und Streptokokken schwach signifikant häufiger als in gesunden

Augen nachzuweisen. Die klinische Relevanz an einer bestehenden

Hornhauterkrankung lässt sich daraus jedoch nicht ohne weiteres ableiten. Alle hier

105

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Diskussion

nachgewiesenen Keime sind nur fakultativ pathogen und brauchen begünstigende

Faktoren, um maßgeblich an einer Erkrankung der Hornhaut und/oder Konjunktiva

beteiligt zu sein. Im Gegensatz dazu ist beim Rind und Schaf die infektiöse

Keratokonjunktivitis (Weidekeratitis) beschrieben, als dessen wichtigster primärer

Erreger Moraxella bovis angesehen wird (ROLLE und MAYR, 1993). In den USA ist

eine primäre Konjunktivitis durch Moraxella equi beschrieben (BARNETT et al.

1998).

Begünstigende Faktoren können in einer wegbereitenden Virusinfektion, in einer

Immunsupression, eventuell durch eine systemische Erkrankung oder durch

vorangegangene lokale Cortikoid- Behandlungen, oder in einer Vorschädigung der

Hornhaut durch mechanische Verletzung o. ä. liegen.

Auch die Menge der fakultativ pathogen wirkenden Keime kann einen Einfluss auf

die klinische Erkrankung haben. Hierbei ist auch der klimatische Einfluss

beispielsweise bei sehr warmer oder feuchter Witterung von Bedeutung, die

ebenfalls eine Auswirkung auf die Keimmenge ausüben können und durch die

Verbreitung über Vektoren wie beispielsweise Weidefliegen einen zusätzlichen

Keimdruck verursachen können.

Eine Entnahme von mikrobiologischen Tupferproben aus dem Bindehautsack ist, wie

diese Arbeit zeigt, häufig sehr unspezifisch und lässt auch bei klinisch erkrankten

Augen nicht immer einen Rückschluss auf die tatsächlich an einer Erkrankung

beteiligten Keime zu. Sinnvoller wäre bei Vorliegen einer ulzerativen

Hornhauterkrankung die Probenentnahme direkt von den erkrankten Bereichen der

Kornea, um beispielsweise bei Nachweisen von kollagenasebildenden Bakterien

(z.B. Pseudomonaden) mit einem Antibiogramm gezielter eine Therapie einleiten zu

können. Auch sollte die nachgewiesene Keimmenge in der Beurteilung der

mikrobiologischen Ergebnisse unter Berücksichtigung klimatischer Faktoren und

eventueller antibiotischer Vorbehandlungen mit einbezogen werden.

Auch der Nachweis von Pilzen in der Kultur lässt keinesfalls bereits die Diagnose

einer Hornhautmykose zu. Erst der Nachweis von Pilzmycel im zytologischen

Präparat (BOLLIGER et al. 2001) kann eine derartige Diagnose bestätigen.

106

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Diskussion

Diese Arbeit bestätigt einmal mehr, dass die Auswertung eines mikrobiologischen

Tupfers aus dem Konjunktivalsack keinesfalls einen direkten Rückschluss auf die

Ursache einer vorliegenden Augenerkrankung zulässt und deswegen immer

differenziert betrachtet und beurteilt werden sollte.

5.5 Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen

Beim Menschen wird als weiteres diagnostisches Verfahren bei verschiedenen

Augenerkrankungen wie beispielsweise der Keratokonjunktivitis sicca, Herpes zoster

Keratitiden oder Chlamydienkonjunktivitis als schnelle und wenig aufwendige

Methode die exfoliative Zytologie genutzt (ADAMS et al. 1988, MASKIN et al. 1989,

WILHELMS et al. 1986).

Auch beim Kleintier wird die exfolitive Zytologie erfolgreich zur Diagnostik eingesetzt.

So gibt es Studien über Verteilung und Quantifizierung von Becherzellen bei Hunden

mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996). Auch WILLIS et al. (1997)

untersuchten bei Hunden und Katzen zytologische Präparate bei entzündlichen

Erkrankungen des Auges und konnten dabei signifikante Unterschiede in

Zellquantität und –qualität feststellen, sowohl im Vergleich der Patienten- und

Kontrollgruppen als auch im Vergleich der Spezies Hund und Katze.

Bei einigen Katzen erfolgte der Nachweis von Chlamydien im Präparat, bei einem

Hund konnte das Staupevirus in Form von intranukleären Einschlusskörperchen

nachgewiesen werden (WILLIS et al. 1997).

Beim Pferd wird diese Methode bisher nur in Einzelfällen angewandt. So beschreibt

KELLNER (1990) als schnelleres Verfahren zur Diagnostik von Herpeskeratitiden die

Färbung eines Bindehautgeschabsels zum mikroskopischen Nachweis von

Herpesviruseinschlusskörperchen. BOLLIGER et al. (2000) beschreiben die

Zytologie beim Pferd zum Nachweis von Pilzmycel bei Keratomykosen.

KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleicht in einer Studie mit 30 Pferden die

Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und EHV-5 mittels PCR in Verbindung mit dem

Vorhandensein von intranukleären Einschlusskörperchen im zytologischen Präparat,

konnte dabei jedoch keinen Zusammenhang nachweisen.

107

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Diskussion

Die Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei

Pferden, die an einer Keratitis erkrankt waren, sehr wenig inflammatorische Zellen im

Präparat zu finden sind, selbst dann, wenn eine begleitende Konjunktivitis

vorgelegen hat. Es ließen sich keine auffälligen Unterschiede beim Vergleich der

Präparate zwischen den klinisch erkrankten und klinisch gesunden Augen feststellen.

In der Literatur beschriebene intranukleäre Einschlusskörperchen (KELLNER 1990,

KRÜDEWAGEN et al. 2001) ließen sich nicht mit Sicherheit nachweisen. Bei

wenigen Pferden wäre der Verdacht auf solche Einschlusskörperchen möglich

gewesen, eine Unterscheidung zu Kernkörperchen (Nukleoli) oder

Chromatinverdichtungen bei lytischen Zellen konnte hier aber nicht mit Sicherheit

erfolgen.

Eine mögliche Erklärung für das nur vereinzelte Auftreten von Entzündungszellen

(neutrophile Granulozyten und Lymphozyten) lässt sich vielleicht darin finden, dass

hier nicht die erkrankte Kornea, sondern die Conjunctiva palpebralis beprobt wurde.

Selbst beim Vorliegen einer klinischen Konjunktivitis äußert sich diese hauptsächlich

in einer Hyperämie und damit zwar mit einer Rötung und Schwellung der Bindehäute,

aber eine wirkliche mukopurulente Exsudation bleibt in vielen Fällen aus, der

Charakter des Augenausflusses wird meist als serös bis seromukös beschrieben. Im

Gegensatz dazu wird beim Kleintier häufig bei Vorliegen einer Keratokonjunktivitis

eine oft starke mukopurulente Exsudation beobachtet.

Wenn bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Pferden Epiphora vorgelegen

hat, so äußerte sich diese meist mit serösem bis seromukösem Augenausfluss. Dies

lässt zwar auf eine eventuell durch die Hyperämie und den Schmerzreiz verursachte

vermehrte Sekretion der Tränendrüsen (seröse Komponente), Meibomschen Drüsen

(Fettkomponente) und Becherzellen der Konjunktiva (muköse Komponente)

schließen, eine durch verschiedene Mediatoren bedingte massive Auswanderung der

Entzündungszellen aus den kapillären Blutgefäßen ins umliegende epitheliale

Gewebe scheint jedoch hier auszubleiben. Hierbei bleibt außerdem zu beachten,

dass ein Großteil der erkrankten Pferde als Überweisungspatienten bereits längere

Zeit erkrankt waren und somit bereits ein chronischer Erkrankungszustand vorlag.

108

Page 109: Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Nr. Nummer NT Nasentupfer n.u. nicht untersucht

Diskussion

Offenbar handelt es sich beim Pferd im Gegensatz zum Kleintier häufig um einen

lokal auf die Hornhaut konzentrierten Entzündungsprozess, so dass die klinisch oft

beobachtete begleitende Konjunktivitis überwiegend auf eine Rötung durch

reflektorische Hyperämie zu erklären ist.

Die exfoliative Zytologie von der Conjunctiva palpebralis kann den Ergebnissen

dieser Arbeit zur Folge als Routinediagnostik von möglicherweise viral bedingten

Keratitiden bisher nicht eingesetzt werden. Beim Vorliegen von bestimmten

Erkrankungen des Auges wie beispielsweise der Keratomykose, eosinophilen

Granulomen oder Neoplasien im Bereich der Hornhaut und Konjunktiva (z. B.

Plattenepithelkarzinom) stellt sie jedoch ein sicheres und schnelles Verfahren zur

Sicherung einer Verdachtsdiagnose dar.

5.6 Schlussfolgerung Die Ergebnisse dieser Arbeit geben keine Hinweise auf eine tatsächlich bestehende

ätiologische Rolle des EHV-2 bei Keratitiden des Pferdes. Auch konnte kein

klinisches Bild einer vermeintlichen „Viruskeratitis“ mit einem vermehrten Nachweis

von EHV-2 in Zusammenhang gebracht werden. In früheren Studien durchgeführte

Infektionsversuche mit EHV-2 haben bis jetzt nicht ergeben, dass sich eine Keratitis

entwickeln könnte. WILCOX und RAIDAL (2001) diagnostizierten nur milde

respiratorische Symptome, BORCHERS et al. (1998) stellten bei zwei infizierten

Ponies eine Konjunktivitis fest. Allerdings kann in Verbindung mit jeder

Allgemeininfektion eine Hyperämie der Bindehäute auftreten (LAVACH 1992,

BROOKS 1998).

Diese Ergebnisse der virologischen Untersuchungen stehen im Gegensatz zu

früheren Untersuchungen, in denen bei Pferden mit einer Keratitis ein signifikant

häufigerer Nachweis von EHV-2 gelang als bei augengesunden Kontrollpferden

(VON OPPEN 2000, KRÜDEWAGEN et al. 2001).

109

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Diskussion

In einer jüngeren Arbeit von BESTHORN (2002) konnten jedoch ähnliche Ergebnisse

wie in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden. Sonstige Autoren berichten nur in

einzelnen Fallberichten über den Nachweis von EHV-2 bei Keratitiden (THEIN und

BÖHM 1976, MILLER 1990, COLLINSON 1994). Da auch in dieser Arbeit in einem

großen Prozentsatz der gesunden Pferde EHV-2 Genom aus dem Auge isoliert

werden konnte, stellt sich die Frage, ob der Nachweis in Einzelfällen nur zufällig

zusammen mit einer klinischen Erkrankung der Hornhaut erfolgte.

Weiterhin wäre auch die mögliche ätiologische Beteiligung anderer Faktoren zu

untersuchen. So werden beispielsweise beim Menschen Adenoviren für klinische

Veränderungen der Hornhaut im Sinne einer Keratitis punctata verantwortlich

gemacht (SUNDMACHER et al. 2001). Beim Pferd werden Adenoviren bisher eher

mit respiratorischen Symptomen in Zusammenhang gebracht (ROLLE u. MAYR

1993). Auch sollten andere epitheliotrope Herpesviren wie beispielsweise EHV-1 und

EHV-4 beachtet werden, deren Pathogenität bereits in anderen klinischen

Zusammenhängen nachgewiesen ist. In der Literatur finden sich hier einzelne

Berichte, die Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Infektionen mit EHV-1

und – 4 und der Beteiligung an Augenerkrankungen liefern. So zeigte ein intranasal

mit EHV-1 infiziertes SPF-Fohlen nach 28 Tagen schwere Chorioretinopathien,

postmortal konnte im Augengewebe EHV-1 Genom nachgewiesen werden (SLATER

et al. 1992). RIIS (1981) beschreibt EHV-1 als Ursache für eine Keratitis. Neben der

Isolierung aus Geweben des Respirationstraktes gelang auch die Isolierung von

EHV-4 aus Kornea und Konjunktiven von Fohlen, die in der akuten Phase einer

experimentellen Infektion getötet wurden (PATEL et al. 1982).

Auch wäre eine mögliche Beteiligung von Chlamydien oder Mykoplasmen, wie sie

beim Menschen oder der Katze bereits diskutiert werden, zu untersuchen. Da eine

Vielzahl der Fälle bei der Behandlung mit Virostatika eine schnelle klinische

Besserung zeigt (BARNETT et al. 1993), ist es durchaus auch denkbar, dass erst

durch Co- Faktoren eine klinische Erkrankung durch EHV-2 ausgelöst wird. Auch

eine Bestimmung der Virusmenge im Probenmaterial oder eine nähere

Spezifizierung des Virustammes könnte in Relation zum klinischen Bild gesetzt

werden.

110

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Diskussion

Letztlich könnten auch immunologische Mechanismen beispielsweise durch

vermehrte Expression von inflammatorischen Zytokinen oder Komplexbildungen in

der Hornhaut auslösend für eine klinische Erkrankung sein. Dieser Mechanismus ist

beim Menschen bereits beim Vorhandensein chronischer rheumatischer

Erkrankungen und dem rezidivierenden Auftreten von Hornhautulzera beschrieben

(PRADA et al. 2003).

Die exfoliative Zytologie könnte trotz der bisher ungenügenden Ergebnisse

weitergeführt werden. Es wäre beispielsweise möglich, durch Spezialfärbungen

Chlamydien oder Mykoplasmen nachzuweisen, oder mit Immunfluoreszenzmethoden

möglicherweise vorliegende Viruseinschlusskörperchen zuverlässig zu identifizieren.

Zur Sicherung spezieller Verdachtsdiagnosen wie beispielsweise einer

Keratomykose oder eosinophilen Keratitis stellt diese Methode ein sicheres, wenig

aufwendiges und wenig invasives Verfahren dar.

Insgesamt bleibt die Ätiologie der Keratitiden des Pferdes nach wie vor unklar und

sollte in zukünftigen Untersuchungen weiter erforscht werden, ohne sich dabei

jedoch zu sehr auf den alleinigen Nachweis von EHV-2 zu konzentrieren. Auch das

equine Herpesvirus Typ 5 (EHV-5) wurde bereits in einigen Studien ohne erkennbare

Beteiligung an einer Hornhauterkrankung nachgewiesen (KRÜDEWAGEN et al.

2001, BESTHORN 2002) und scheint bei Keratitiden keine klinische Relevanz zu

haben.

Für die virologischen Untersuchungen bleibt anzumerken, dass statt eines

Wattetupfers der Einsatz des Cytobrushs deutliche Vorteile aufgrund der höheren

Sensitivität im Nachweis von Virusmaterial aufweist. Da die Probenentnahme keine

größeren Schwierigkeiten als die Entnahme eines Wattetupfers aus dem

Bindehautsack darstellt, sollte man diese Methode dem Wattetupfer vorziehen, um

zuverlässigere Nachweisergebnisse zu erzielen.

111

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Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Myriam von Borstel (2003): Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) Bei verschiedenen Formen von Keratitiden oder Keratopathien des Pferdes wird in

vielen Fällen eine virale Ätiologie vermutet. In der Literatur wird dabei als möglicher

Verursacher das equine Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) diskutiert. Bisher konnte jedoch

kein spezifisches klinisches Bild einer „Viruskeratitis“ mit dem Nachweis von EHV-2

in Zusammenhang gebracht werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde bei 28 Pferden mit einer Keratitis,

Keratokonjunktivitis oder Konjunktivitis (Gruppe 1) sowie 28 Kontrollpferden ohne

klinische Augenerkrankung (Gruppe 2) zweimal im Abstand von vier Wochen eine

klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle ophthalmologische Untersuchung

durchgeführt. Dabei wurden jeweils aus dem Konjunktivalsack beider Augen

Wattetupfer zur mikrobiologischen Untersuchung sowie Wattetupfer und

Cytobrushproben zur virologischen Untersuchung auf EHV-2 Genom mittels nPCR

entnommen. Ferner wurden noch Nasentupfer und periphere Blutleukozyten mittels

nPCR auf EHV-2 Genom untersucht. Außerdem wurde bei der Erstuntersuchung

mittels Cytobrush ein zytologischer Abstrich aus dem Konjunktivalsack angefertigt

und mikroskopisch untersucht.

Im Vergleich der Pferde der Gruppe 1 zu den augengesunden Kontrolltieren der

Gruppe 2 konnte in keiner der untersuchten Proben ein signifikanter Unterschied im

Nachweis von EHV-2 Genom mittels nPCR festgestellt werden.

Bei den aus dem Konjunktivalsack entnommenen Proben konnte zu beiden

Untersuchungszeitpunkten im Cytobrush signifikant (p < 0,01) häufiger der Nachweis

von EHV-2 Genom im Vergleich zum ebenfalls entnommenen Wattetupfer geführt

werden.

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Zusammenfassung

Bei den mikrobiologischen Untersuchungen konnte in erkrankten Augen zu beiden

Untersuchungszeitpunkten ein schwach signifikant (p < 0,05) häufigerer Nachweis

von grampositiven Kokken erfolgen. Die Auswertungen der mikrobiologischen

Untersuchungen zeigen, dass eine große Vielzahl verschiedener Keime sowohl in

erkrankten als auch in klinisch gesunden Augen nachzuweisen sind und eine

Auswertung eines mikrobiologischen Konjunktivaltupfers immer unter

Berücksichtigung des klinischen Erscheinungsbildes erfolgen sollte, da keine der

nachgewiesenen Keime als obligat pathogen einzustufen sind.

Bei den mikroskopischen Untersuchungen der zytologischen Präparate sind auch in

den erkrankten Augen, welche eine begleitende klinische Konjunktivitis aufwiesen,

nur sehr wenig inflammatorische Zellen zu finden. Nur in wenigen Fällen konnten

vereinzelte Lymphozyten oder neutrophile Granulozyten gefunden werden, dabei ließ

sich kein Unterschied im Vergleich von erkrankten und gesunden Augen feststellen.

Eine Korrelation zum Nachweis von EHV-2 Genom in der virologischen

Untersuchung konnte ebenfalls nicht hergestellt werden.

In der vorliegenden Arbeit konnte eine ursächliche Beteiligung des EHV-2 an

Keratitiden des Pferdes nicht nachgewiesen werden. Bei den virologischen

Untersuchungen mittels nPCR stellt der Cytobrush jedoch eine signifikant sensitivere

Methode der Probenentnahme dar.

113

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Summary

7 Summary

Myriam von Borstel (2003): Advanced diagnostic methods for keratitis in horses with particular consideration of the detection of equine herpesvirus type 2 (EHV-2)

Different forms of keratitis or keratopathies in the horse are associated with a viral

aetiology. A review of the literature showed that EHV-2 is suspected as the causitive

agent, but no specific clinical signs corresponding to the detection of EHV-2 have

been determined.

In this study 28 horses showing keratitis, keratoconjunctivitis or conjunctivitis (group

1) were examined for their general state of health and subjected to a detailed

ophtalmological examination, as were 28 horses with no ocular disease (group 2). In

addition, samples of the conjunctiva were taken with cotton wool swabs for

microbiologic examination; for the detection of EHV-2 genome with nested PCR,

samples were taken with cotton wool swabs and cytobrushes. Cotton wool swab

samples from the nasal mucosa and isolated peripheral blood leukocytes were also

taken and examined by nested PCR for presence of the EHV-2 genome. These

investigations were carried out twice over a course of four weeks. Furthermore,

conjunctival scrapings were taken with the cytobrush during the first examination for

cytological evaluation.

Comparison of the horses showing keratitis, keratoconjunctivitis or conjunctivitis with

those without ocular diseases showed no significant difference in any of the samples

examined for the presence of the EHV-2 genome. For both examination times, the

rate of detection of the EHV-2 genome in the samples taken with cytobrushes was

significantly higher than in those taken with cotton wool swabs (p < 0,01).

The microbiological examination showed a slightly significantly higher rate of

detection of gram-positive cocci in the diseased eyes (p < 0,05). Microbiological

114

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Summary

examination revealed a wide variety of different infective agents in both diseased

and healthy eyes. As none of the infective agents found are obligatorily pathogenic, a

microbiological swab from the conjunctiva must always be assessed in consideration

of the clinical signs.

Microscopic examination of the cytological preparations revealed only a few

inflammatory cells, even in the diseased eyes with conjunctivitis. Lymphocytes and

neutrophile granulocytes were found in only a few cases, with no difference between

diseased and healthy eyes, nor was there a correlation of these findings with the

detection of the EHV-2 genome.

No aetiological participation of EHV-2 in keratitis in horses was determined in this

study. Use of the cytobrush was found to be a significantly more sensitive sampling

method for virological examination.

115

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Conjunctival Cytology of Adult Chlamydial Conjunctivitis

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124

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125

Page 126: Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Nr. Nummer NT Nasentupfer n.u. nicht untersucht

Anhang

9 Anhang Tab. A1: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der

Erstuntersuchung

Pferd Nr.

Klinische Diagnose

Rezidiv Konj. Trias Hornhaut- trübung

Fluoresz.-Probe

Gefäß-einsprossung

epith. Bläschen

1 Kerat.punct./mac. + mgr. + fokal punktf. rauch. - - - 2 Kerat.vasculosa + ggr. + - - oberfl. - 3 Kerat.prof./

,Leukom + - - fokal rauch.-

milchig, stromal - oberfl. -

4 Bullöse Keratopathie

+ - - - - - +

5 Kerat.punct./mac. + mgr. + punktf. rauch., fokal konfluierend

- oberfl. -

6 Kerat.punct./mac. - ggr. + punktf.,fädig rauch. - oberfl. - 7 Kerat.spf. + mgr. + lokal rauch. - oberfl. - 8 Kerat.punct./mac. + ggr. + fokal punktf. rauch.,

konfluierend milchig

- oberfl. -

9 Kerat.spf. - - - lokal rauch. - oberfl. - 10 Kerat.punct. + - - diffus punktf. rauch. - - - 11 Kerat.prof. + mgr.-

hgr. + diffus rauch.-

milchig, stromal + oberfl. -

12 Kerat.punct. + ggr.-mgr.

+ fokal punktf. rauchig, pigment.

- oberfl. -

13 Hornhautabrasion - mgr. + fokal bläulich + oberfl. - 14 Kerat.prof. + ggr. - fokal stromal

grünlich, epithelial rauch.

- oberfl. u. tief -

15 Kerat.punct. + ggr. + fokal punktf. rauch. - - - 16 Konjunktivitis + mgr.-

hgr. + - - - -

17 Kerat.spf. + ggr. + lokal rauch. - oberfl. - 18 Kerat.spf. + ggr. + diffus rauch. - oberfl. - 19 Kerat.spf./

Leukom + ggr.-

mgr. + diffus rauch.,

teilweise milchig + oberfl. -

20 Konjunktivitis + hgr. + - - - - 21 Kerat.vasculosa - ggr. + - - oberfl. - 22 Kerat.punct. + - - diffus punktf. rauch. - - - 23 Kerat.punct./

Leukom + - - diffus punktf.rauch.,

fokal milchig

24 Kerat.punct./mac. + - - diffus punktf., fokal konfluierend

- - -

25 Kerat.spf. + mgr. + lokal rauch. - - - 26 Kerat.vasculosa - ggr. + - - oberfl. - 27 Kerat.punct. ? - - diffus punktf. auch. - - - 28 Kerat.punct. ? - - diffus punktf.rauch. - oberfl. -

126

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Anhang

Kerat. : Keratitis

Konj. : Konjunktivitis

punct. : punctata

mac. : maculosa

spf. : superficialis

prof. : profunda

punktf. : punktförmig

rauch. : rauchig

ggr. : geringgradig

mgr. : mittelgradig

hgr. : hochgradig

? : Vorbericht nicht bekannt

- : Befund nicht vorhanden

+ : Befund vorhanden

127

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Anhang

Tab. A2: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der Zweituntersuchung

Pferd

Nr. Klinische Diagnose

Konj. Trias Hornhaut- trübung

Fluoresz.-Probe

Gefäß-einsprossung

epithel. Bläschen

1 obB - - - - - - 2 obB - - - - - - 3 Kerat.prof.,

Leukom - - fokal rauch.-milchig

stromal - oberfl. -

4 Bullöse Keratopathie

- - - - - +

5 obB - - - - - - 6 obB - - - - - - 7 obB - - - - - - 8 Kerat.punct./mac,

Leukom - - fokal punktf. rauch.,

konfluierend milchig

- oberfl. -

9 obB - - - - - - 10 Kerat.punct. - - diffus punktf. rauch. - - - 11 Kerat.prof. mgr.-

hgr. + diffus rauch.-

milchig, stromal + oberfl. u. tief -

12 Kerat.punct. - - fokal punktf. rauchig, pigment.

- oberfl. -

13 obB - - - - - - 14 Kerat.prof.,

Leukom - - fokal stromal rauch,

teilw.milchig - oberfl. u. tief -

15 obB - - - - - - 16 obB - + - - - - 17 obB - + - - - - 18 Kerat.spf. - - Diffus ggr. rauch. - - - 19 Kerat.spf./

Leukom - - diffus ggr.rauch.,

teilweise milchig - - -

20 obB - - - - - - 21 Kerat.vasculosa ggr. + - - oberfl. - 22 Kerat.punct. - - diffus punktf. rauch. - - - 23 Kerat.punct./

Leukom - - diffus punktf.rauch.,

fokal milchig

24 Kerat.punct./mac. - - diffus punktf., fokal konfluierend

- - -

25 Kerat.spf. ggr. - lokal rauch. - - - 26 Kerat.vasculosa ggr. - - - oberfl. - 27 Kerat.punct. - - diffus punktf. auch. - - - 28 Kerat.punct. - - diffus punktf.rauch. - oberfl. -

128

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Anhang

Kerat. : Keratitis

Konj. : Konjunktivitis

punct. : punctata

mac. : maculosa

spf. : superficialis

prof. : profunda

punktf. : punktförmig

rauch. : rauchig

ggr. : geringgradig

mgr. : mittelgradig

hgr. : hochgradig

? : Vorbericht nicht bekannt

- : Befund nicht vorhanden

+ : Befund vorhanden

129

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Anhang

Tab. A3: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der Erstuntersuchung

Linkes Auge Rechtes Auge PCR A PCR A

PCR Pferd

Nr. Diagnose

T CB CBDiagnose

T CB CB NT PBL 1 obB - - nd Kerat.punct./mac. + + nd - - 2 obB - + nd Kerat.vasc. + - nd - - 3 obB - + nd Kerat.prof./ Leukom - - nd + - 4 obB - - nd bullöse Keratopathie + - nd - - 5 Kerat.punct./mac. - + nd obB - - nd - - 6 Kerat.punct./mac. - - nd obB - - nd - - 7 obB - - nd Kerat.spf. - - nd - - 8 Kerat.punct./mac. - - nd obB - - nd - - 9 Kerat.spf. - - nd obB - - nd - - 10 obB - - - Kerat.punct. - + - - + 11 obB - - - Kerat.prof. - - - - - 12 obB + + - Kerat.punct. - - - - - 13 Hornhautabrasion - - - obB - + - - + 14 Kerat.prof. - + - obB - - - - + 15 Kerat.punct. - + - obB - - - - - 16 Konjunktivitis - - - obB - - - + - 17 obB - - - Kerat.spf. - - - - + 18 obB - + - Kerat.spf. - - - - + 19 obB + + - Kerat.spf./Leukom - - - - + 20 Konjunktivitis - + - obB - + - - + 21 Kerat.vasculosa - + - obB - - - - + 22 obB - - - Kerat. punct. - - - - - 23 obB - - - Kerat. punct./Leukom - - - - - 24 obB - - - Kerat. punct./mac. - - - - - 25 obB - - - Kerat.spf. - + - - + 26 obB - - - Kerat.vasculosa - - - - - 27 obB - + - Kerat.punct. + + - + + 28 Kerat.punct. - - - obB + + - - -

CB : Cytobrush Kerat. : Keratitis

NT : Nasentupfer punct. : punctata

T : Tupfer mac. : maculosa

A : Anzucht prof. : profunda

PBL : periphere Blutleukozyten spf. : superficialis

PCR : Polymerase Kettenreaktion + : positiv

nd : nicht durchgeführt - : negativ

obB : ohne besonderen Befund

130

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Anhang

Tab. A4: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der Zweituntersuchung

Linkes Auge Rechtes Auge

PCR A PCR A 16 PCR Pferd

Nr. Diagnose T CB CB

17 Diagnose T CB CB NT PBL

1 obB - - nd obB * - - nd - - 2 obB - + nd obB * + - nd - - 3 obB - - nd Kerat.prof., Leukom + + nd - - 4 obB - - nd bullöse Keratopathie + - nd - - 5 obB * - - nd obB - - nd - - 6 obB * - - nd obB - - nd - - 7 obB - - nd obB * - - nd - - 8 Kerat.punct./mac.,

Leukom - - nd obB - - nd - -

9 obB * - - nd obB - - nd - - 10 obB + + - Kerat.punct. - - - - + 11 obB - - - Kerat.prof. - - - - - 12 obB - - - Kerat.punct. + + - - - 13 obB * - - - obB - - - + + 14 Kerat.prof., Leukom - - - obB - - - - + 15 obB * - + - obB - - - - - 16 obB * - + - obB - + - - + 17 obB - - - obB * - - - - - 18 obB - + - Kerat.spf. - + - - - 19 obB - - - Leukom - - - - - 20 obB* + + - obB - + - - + 21 Kerat.vasculosa - + - obB - + - - - 22 (Keine Zweit-US) 23 (Keine Zweit-US) 24 (Keine Zweit-US) 25 obB - - - Kerat.spf. - + - - - 26 obB - - - Kerat.vasculosa - + - - - 27 obB + + - Kerat.punct - + - - - 28 Kerat.punct. + + - obB - + - - -

CB : Cytobrush Kerat. : Keratitis

NT : Nasentupfer punct. : punctata

T : Tupfer mac. : maculosa

A : Anzucht prof. : profunda

PBL : periphere Blutleukozyten spf. : superficialis

PCR : Polymerase Kettenreaktion + : positiv

obB : ohne besonderen Befund - : negativ

* : ehemals erkranktes Auge nd : nicht durchgeführt

131

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Anhang

Tab. A5: Nachweis von EHV-2 in Gruppe 2 bei der Erst- und Zweituntersuchung

Erstuntersuchung Zweituntersuchung PCR A PCR A

T CB CB T CB CB

Pferd Nr.

li re li re NT PBL

li re li re li reNT PBL

li re1 - - - - - - nd nd (keine Zweituntersuchung) 2 - - - + - - nd nd (keine Zweituntersuchung) 3 - - - + - - - - - - - + - - - - 4 - - + - - + - - - - + - - + - - 5 - - - + - - - - - - - + - - - - 6 - - + - - + - - - - + - - + - - 7 - - - + - + - - - + - - + - - 8 - - + + - + - - - + - - - + - - 9 + - + - - - + - - - - - - - + -

10 - - - - - - - - - - - - - - - - 11 - - - - - + - - - - - - - - - - 12 + - + - + + - - - - - - - + - - 13 - - - - - - - - (keine Zweituntersuchung) 14 - - - - - + - - - - - + - - - - 15 - - - - - + - - - + - - - + - - 16 - - - - - - - - - - + + - + - - 17 - - - - - - - - + - + + - + - - 18 - - - - - + - - - + - + - - - - 19 - - + + - - - - - - + - + + - - 20 - - + + - + - - - - + + - - - - 21 - - - + - - - - - - - - - - - - 22 - - + + + - - - - - - + - - - - 23 - - - + - + - - - - - - - - - - 24 - - + + - - - - - - - - - - - - 25 - - - - - - - - - - - - - - - - 26 - - - + - + - - - - - - - + - - 27 - - - + - + - - - - - - - + - - 28 - - - - + - - - - - - + - + - -

-

A : Anzucht nd : nicht durchgeführt

CB : Cytobrush li : links

T : Tupfer re : rechts

NT : Nasentupfer - : negativ

PCR : Polymerasekettenreaktion + : positiv

PBL : periphere Blutleukozyten

132

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Anhang

Tab. A6: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Erstuntersuchung

gesundes Auge erkranktes Auge Pferd

Nr. nachgewiesene Keime Gehalt nachgewiesene Keime Gehalt 1 koag.- Staphylokokken

Bacillus spp. anhämolysierende Streptokokken

Acinetobacter spp.

+ + + +

koag.- Staphylokokken α-hämolysierende Streptokokken

Pantoea agglomerans

+ + +

2 Acinetobacter spp. + Staphylococcus xylosus Weeksella spp.

Pantoea agglomerans α-hämolysierende Streptokokken

+ + + +

3 koag.- Staphylokokken + Staphylococcus aureus + 4 Pantoea agglomerans

Bacillus spp. + +

Pantoea agglomerans Bacillus spp.

++ +

5 Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

Pseudomonas spp. Bacillus spp.

+ +

6 Acinetobacter spp. Bacillus cereus

++ +

koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

Pseudomonas spp. Acinetobacter spp.

++ +

++ ++

7 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

+ +

koag.- Staphylokokken +

8 Escherichia coli Pantoea agglomerans

Bacillus cereus Mucor spp.

+++ +++

+ +

Escherichia coli Pantoea agglomerans

Bacillus cereus Pseudomonas fluorescens

Sprosspilze

+ +++

+ +++

+ 9 Bacillus cereus +

Pantoea agglomerans

Bacillus spp. + +

10 α-hämolysierende Streptokokken Pantoea agglomerans

+ +

Escherichia coli Bacillus cereus

+ +

11 Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

α-hämolysierende Streptokokken Bacillus cereus

+ +

12 Bacillus cereus + Bacillus cereus + 13 Pantoea agglomerans

Bacillus spp. koag.- Staphylokokken

Sprosspilze

+ + + +

koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

+ +

14 Koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans

Bacillus spp. Escherichia coli

+ + + +

Koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans

Bacillus spp. Escherichia coli

+ + + +

15 α-hämolysierende Streptokokken + Staphylococcus aureus + 16 α-hämolysierende Streptokokken

Pantoea agglomerans + +

koag.- Staphylokokken α-hämolysierende Streptokokken

+ +

17 Koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.

Bacillus spp.

++ ++ +

Koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.

Bacillus spp.

+ + +

18 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp.

+ + +

koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp.

+ + +

19 koag.- Staphylokokken + Ralstonia picketii +++

133

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Anhang

anhämolysierende Streptokokken Micrococcus spp.

Bacillus spp. Acinetobacter spp.

+ + + +

(früher: Pseudomonas p.) Alcaligenes spp.

koag.- Staphylokokken

+ +

20 Aspergillus spp. + koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.

+ +

21 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp. E.coli

+ ++ ++ +

koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp.

+ + +

22 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp. Arthrobacter spp.

+ +

++ ++

Pseudomonas spp. * Bacillus spp.

Acinetobacter spp. Arthrobacter spp. Geotrichum spp.

++ ++ ++ ++ +

23 koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

Acinetobacter spp. Arthrobacter spp.

++ +

+++ +++

koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Arthrobacter spp.

+ +

++

24 koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

Acinetobacter spp.

++ +

+++

koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

Acinetobacter spp.

++ +

+++ 25 koag.- Staphylokokken

Bacillus cereus + +

koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

+ +

26 Bacillus spp. Mucor spp.

+ +

Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

27 Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

Acinetobacter spp. +++

28 α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.

+ α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.

+ +

spp. : species hämolys. : hämolysierend

subsp. : subspecies anhämolys. : anhämolysierend

koag.- : koagulasenegativ

+ : geringgradiger Gehalt

++ : mittelgradiger Gehalt

+++ : hochgradiger Gehalt

134

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Anhang

Tab. A7: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Zweituntersuchung

gesundes Auge erkranktes /ehemals erkranktes Auge Pferd

Nr. nachgewiesene Keime Gehalt nachgewiesene Keime Gehalt1 koag.- Staphylokokken

Bacillus spp. + +

koag.- Staphylokokken Escherichia coli

+ +

2 Bacillus spp. Pseudomonas spp.

+ +

Bacillus spp. Acinetobacter spp.

+ +

3 koag.- Staphylokokken Escherichia coli

+ +

koag.- Staphylokokken Escherichia coli

Pseudomonas spp.

+ + +

4 Serratia spp. Bacillus cereus

+ +

Serratia spp. Pantoea agglomerans

Flavimonas oryzihabitans

++ ++ ++

5 Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

Pseudomonas spp. Bacillus spp.

+ +

6 Escherichia coli +++ Escherichia coli Enterobacter cloacae

Bacillus cereus

+++ +++ ++

7 koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.

++ +++

koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.

++ ++

8 Escherichia coli Pantoea agglomerans

Bacillus cereus Mucor spp.

Escherichia coli ++

+++ +++

+ +

Pantoea agglomerans Pseudomonas fluoreszens

Sprosspilze

++

9 Bacillus cereus Pantoea agglomerans koag.- Staphylokokken

+

+

Sprosspilze

+ + +

Pantoea agglomerans koag.- Staphylokokken coryneforme Bakterien

+

++

10 α-hämolysierende Streptokokken Pantoea agglomerans

+ + +

Escherichia coli Bacillus cereus +

11 Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ + +

α-hämolysierende Streptokokken Bacillus cereus +

12 Pantoea agglomerans + koag.- Staphylokokken α-hämolysierende Streptokokken

Pantoea agglomerans Bacillus spp.

+ + + +

13 Pantoea agglomerans Bacillus spp.

+ +

koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans coryneforme Bakterien

+ + +

14 α-hämolysierende Streptokokken Bacillus cereus

Acinetobacter spp. Aspergillus spp.

+ + + +

α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.

+ +

15 Bacillus spp. + Bacillus cereus Staphylococcus aureus

+ +

16 koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

+ +

koag.- Staphylokokken Bacillus cereus

Pantoea agglomerans

+ + +

17 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp.

++ + +

koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Acinetobacter spp.

+ + +

18 koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.

+ +

Kein Keimgehalt nachweisbar +

19 Bacillus spp. + koag.- Staphylokokken +

135

Page 136: Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Nr. Nummer NT Nasentupfer n.u. nicht untersucht

Anhang

Acinetobacter spp. Pantoea agglomerans

+ +

20 koag.- Staphylokokken + Staphylococcus aureus Acinetobacter spp.

Bacillus spp.

+ +

21 Pantoea agglomerans Pseudomonas spp.

+ +

koag.- Staphylokokken Streptomyces spp. Pseudomonas spp.

+ + +

22 (Keine Zweituntersuchung) 23 (Keine Zweituntersuchung) 24 (Keine Zweituntersuchung) 25 koag.- Staphylokokken

Bacillus spp. Acinetobacter spp.

Streptococcus equi subspecies equi

+ + + +

koag.- Staphylokokken Escherichia coli

+ +

26 Bacillus spp.

+

Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

27 Acinetobacter spp. Bacillus spp.

+ +

Acinetobacter spp. +++

28 Enterococcus spp. + α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.

+ +

spp. : species hämolys. : hämolysierend

subsp. : subspecies anhämolys. : anhämolysierend

koag.- : koagulasenegativ

+ : geringgradiger Gehalt

++ : mittelgradiger Gehalt

+++ : hochgradiger Gehalt

136

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Anhang

Tab. A8: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Erstuntersuchung

Pferd

Nr. Gehalt

linkes Auge nachgewiesene Keime Gehalt

rechtes Auge 1

+ +

koag.- Staphylokokken Bacillus spp.

Pantoea agglomerans

+

2 + + +

Pantoea agglomerans Escherichia coli Moraxella spp.

+ +

3

+ koag.- Staphylokokken

Bacillus spp. + +

4 + +

Pantoea agglomerans Bacillus spp.

++ +

5 + +

Pseudomonas spp. Bacillus spp.

+ +

+ +

Pantoea agglomerans Bacillus spp.

Enterobacter spp.

+ + +

+ +

Pantoea agglomerans Bacillus spp.

Enterobacter spp.

+ + +

+ +++

Acinetobacter spp. Pantoea agglomerans

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

+++

+ ++

9

++ +

++

Enterococcus spp. Pantoea agglomerans

Flavimonas orizyhabitans Bacillus spp.

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

Schimmelpilze Sprosspilze

+ + + + + + + +

10 +++ ++ +

++

anhämolys. Streptokokken Pantoea agglomerans

Bacillus spp. Acinetobacter spp.

koag.- Staphylokokken

+ +

+++ 11 +

++ ++

+++

Bacillus spp. koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans coryneforme Bakterien

Acinetobacter spp.

+ ++

+++

+ ++ ++

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp.

+ +

++ 13 +

++

Bacillus spp. Pantoea agglomerans

Acinetobacter spp. Chryseobacterium spp.

++ ++ ++

14 +

++

Bacillus cereus koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp. Moraxella spp.

+

+ ++

6

7

8 ++

++ 12

137

Page 138: Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... · nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Nr. Nummer NT Nasentupfer n.u. nicht untersucht

Anhang

15

+ ++

+ +

Bacillus spp. Acinetobacter spp.

anhämolys.Streptokokken Pantoea agglomerans

alpha-hämolys.Streptokokken

+

+

16 +

+++

Pantoea agglomerans Acinetobacter spp.

coryneforme Bakterien

+ +++

17 + +

++ Acinetobacter spp.

Chryseobacterium spp. ++

Pantoea agglomerans

18 +

+ +

Chryseobacterium spp. Acinetobacter spp.

anhämolys.Streptokokken Bacillus spp.

+ +

19 + +

Bacillus cereus Acinetobacter spp.

alpha-hämolys.Streptokokken Chryseobacterium spp.

+ + + +

20 + + +

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp.

+ +

21 +

+

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp.

+ +

22 + +

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp. alpha-hämolys.Streptokokken

+ + + +

23 +

++

Bacillus cereus koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp.

+

24 +

Bacillus cereus Bacillus spp.

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

+

+ +

25 +

+

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

alpha-hämolys.Streptokokken Escherichia coli

+ +

26 + +

++

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

alpha-hämolys.Streptokokken Escherichia coli

Pseudomonas spp.

+ ++ + +

27 Acinetobacter spp. + 28 + Bacillus spp. +

spp. : species koag.- : koagulasenegativ

subsp. : subspecies + : geringgradiger Gehalt

hämolys. : hämolysierend ++ : mittelgradiger Gehalt

+++ : hochgradiger Gehalt

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Anhang

Tab. A9: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Zweituntersuchung

Pferd

Nr. Gehalt

linkes Auge nachgewiesene Keime Gehalt

rechtes Auge 1 (keine Zweituntersuchung) 2 (keine Zweituntersuchung) 3 +

+ Pantoea agglomerans

Bacillus cereus + +

4 + Bacillus spp. + 5 +

+ Pantoea agglomerans

Bacillus cereus + +

6 +++

++ +

Pantoea agglomerans Pseudomonas spp. Acinetobacter spp.

Schimmelpilze

+++ ++

7 + +

+

Pantoea spp. Bacillus spp.

Escherichia coli koag.- Staphylokokken

+ +

8 +

+ +

+

Escherichia coli Pantoea spp. Bacillus spp.

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

Fusarium spp Cladosporium spp.

Alternaria spp.

+

+ +

+ +

9 + + + +

+

Escherichia coli Bacillus spp.

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

Aspergillus spp. Cladosporium spp.

Alternaria spp.

+

+ + +

10 + + +

+ +

Escherichia coli Pantoea spp. Bacillus spp.

Acinetobacter spp. Fusarium spp Alternaria spp.

+

+ + + +

11 + + +

Bacillus spp. koag.- Staphylokokken

Streptococcus equi subsp.zooepidemicus

Cladosporium spp.

+ +

+ 12 +

+ +

Bacillus spp. + koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp.

+ 13 (keine Zweituntersuchung) 14 +

+++ Bacillus spp.

Acinetobacter spp. + +

15 + Bacillus spp. + 16 +

+ Pantoea agglomerans

Acinetobacter spp. + +

139

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Anhang

17 + Bacillus spp. + 18 + Bacillus spp. + 19 + Bacillus spp. +

+ +

Bacillus spp. Acinetobacter spp.

+ +

21 + +

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

+

22 + Bacillus spp. Escherichia coli

Corynebacterium spp. alpha-hämolys.Streptokokken

+ + + +

23 +

Bacillus spp. koag.-Staphylokokken

Acinetobacter spp. Pantoea agglomerans

+ + + +

24 + +

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

+ +

25 + koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

+ +

26

+++

koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.

Pantoea agglomerans Pseudomonas fluoreszens

+ ++ ++

+ Bacillus cereus

Streptococcus equi subsp. zooepidemicus

+ +

28 + +

Bacillus spp. Pantoea agglomerans

+

20

27

spp. : species

subsp. : subspecies

koag.- : koagulasenegativ

hämolys. : hämolysierend

+ : geringgradiger Gehalt

++ : mittelgradiger Gehalt

+++ : hochgradiger Gehalt

140

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Danksagung Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen möchte ich an dieser Stelle ganz herzlich für die Überlassung des interessanten Themas und die jederzeit gewährte freundliche und unkomplizierte Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit danken. Bei Frau PD Dr. rer. nat. Kerstin Borchers und ihren Mitarbeitern möchte ich mich für die freundliche Aufnahme im Labor des Instituts für Virologie des FB Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin und die stets gewährte, engagierte und unkomplizierte Unterstützung danken. Ebenso danke ich Prof. Dr. G. Amtsberg und den Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der TiHo Hannover für die Betreuung der Arbeit und die zuverlässige und schnelle mikrobiologische Diagnostik. Prof. Dr. R. Mischke danke ich für die stets freundliche und engagierte Unterstützung bei der Auswertung der zytologischen Präparate. Besonders danke ich Marco Ebert für die hervorragende Zusammenarbeit und Hilfe. Ich wünsche ihm einen guten Endspurt für die Fertigstellung seiner eigenen Dissertation. Dr. Tassilo von Oppen möchte ich ganz besonders herzlich danken für sein Engagement, die fachliche Betreuung, Unterstützung und Motivation bei der Anfertigung dieser Arbeit, und nicht zuletzt für die nette Zusammenarbeit. Vielen Dank! Dr. Frauke Glitz danke ich ganz herzlich für dafür, dass sie den Stein für diese Dissertation überhaupt erst ins Rollen gebracht hat. Ohne Dich wäre wahrscheinlich keine ophthalmologische Thematik für die Anfertigung einer Dissertation in Frage gekommen, Danke! Ich möchte allen Mitarbeitern der Klinik für Pferde der TiHo Hannover danken für gute Zusammenarbeit und geleistete Hilfe. Besonders danke ich Astrid für ihre konstruktiven Kritiken und Korrekturen sowie der moralischen Unterstützung während der „Endphase“, für die ich ebenso Kirstin, Viola und Bianka danke. Claus danke ich für die Beprobung der Maultiere, Robert und Rolf für diverse Erste-Hilfe-Leistungen bei Computernotfällen. Für geistigen Beistand und konstruktive „Teestunden“ möchte ich außerdem Angela und Sarah danken. Bei Dr. Karl Rohn aus dem Institut für Biometrie und Statistik der TiHo bedanke ich mich für die Beratung und Durchführung der statistischen Untersuchungen. Nicht zuletzt danke ich Sascha, der geduldig jede Phase der Doktorarbeitszeit „ertragen“ hat, für sein Verständnis, seine Unterstützung und seine Liebe!

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