Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes ... nPCR nested Polymerase chain reaction

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  • Aus der Klinik fr Pferde und dem Institut fr Mikrobiologie und Tierseuchen

    der Tierrztlichen Hochschule Hannover sowie dem Institut fr Virologie

    des Fachbereiches Veterinrmedizin der Freien Universitt Berlin ___________________________________________________________________

    Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Bercksichtigung der Nachweishufigkeit

    des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2)

    INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

    DOKTORIN DER VETERINRMEDIZIN (Dr. med. vet.)

    durch die Tierrztliche Hochschule Hannover

    Vorgelegt von MYRIAM VON BORSTEL

    aus Bremerhaven

    Hannover 2003

  • Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen PD Dr. rer. nat. K. Borchers 1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen 2. Gutachter: Prof. Dr. M.H. Boev Tag der mndlichen Prfung: 18. November 03

  • meiner Familie

  • Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite 1 Einleitung 15

    2 Literaturbersicht 17

    2.1. Anatomie und Funktion von Konjunktiva und Kornea 17 2.2. Entzndliche Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea beim Pferd 19

    2.2.1. Konjunktivitis beim Pferd 19 2.2.2. Keratitis beim Pferd 20

    2.3. Keratitis superficialis 22 2.3.1. Viruskeratitis 23

    2.3.1.1. Keratitis punctata 24 2.3.1.2. Ulzerative Viruskeratitis 26 2.3.1.3. Keratitis maculosa 27 2.3.1.4. Weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien 27

    2.4. Keratitis profunda 27 2.5. Keratitis interstitialis 29 2.6. Diagnostische Verfahren bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea 29

    2.6.1. Exfoliative Zytologie 30 2.6.1.1. Technik der Probengewinnung 32

    2.6.1.1.1. Abdruckzytologie 32 2.6.1.1.2. Tupfer 32 2.6.1.1.3. Geschabsel 33 2.6.1.1.4. Cytobrush 33

    2.6.2. Erregernachweis 34 2.6.2.1. Mikrobiologische Untersuchung 34 2.6.2.2. Virologische Untersuchung 35

    2.6.2.2.1. Indirekter Nachweis 35 2.6.2.2.2. Direkter Nachweis 35

    2.7. EHV-2 beim Pferd 36 2.7.1 Vorkommen von EHV-2 in der Pferdepopulation 36 2.7.2 Klinische Relevanz und Nachweis von EHV-2 beim Pferd 37

    3 Material und Methode 40

    3.1 Versuchsplanung 40 3.2 Patientengut 40 3.3 Klinische Untersuchung 43

    3.3.1 Spezielle ophtalmologische Untersuchung 43 3.3.1.1 Untersuchung im beleuchteten Raum 43 3.3.1.2 Untersuchung im abgedunkelten Raum 44

    3.3.2 Klinische Diagnosen 44 3.4 Probenentnahme 48 3.5 Mikrobiologische Untersuchungen 50

  • Inhaltsverzeichnis

    3.6 Virologische Untersuchungen 50 3.6.1 DNA-Isolierung aus peripheren Blutleukozyten (PBL) 50 3.6.2 DNA-Prparation aus Augentupfer-und Augencytobrushproben 51

    sowie aus Nasentupferproben 3.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis des EHV-2- 52

    Genoms 3.6.4 Virus-Anzucht 53

    3.7 Exfoliative Zytologie 54 3.8 Statistische Auswertung 55

    4 Ergebnisse 56

    4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 56 4.1.1 Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung 56 4.1.2 Ergebnisse der ophtalmologischen Untersuchung 56

    4.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen 63 4.2.1 Ergebnisse des direkten EHV-2 Nachweises mittels PCR 63 4.2.2 Virologischer Nachweis von EHV-2 mittels Virusanzucht 74

    4.3 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung 75 4.4 Ergebnisse der zytologischen Untersuchung 85

    5 Diskussion 98 5.1 Material und Methode 98 5.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels PCR 101 5.3 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels Virusanzucht 104 5.4 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 104 5.5 Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen 107 5.6 Schlussfolgerung 109

    6 Zusammenfassung 112 7 Summary 114

    8 Literaturverzeichnis 116 9 Anhang 126

  • Abkrzungsverzeichnis

    Abkrzungsverzeichnis A Anzucht

    Abb. Abbildung

    -hmolys. alpha-hmolysierend

    anhmolys. anhmolysierend

    Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

    CB Cytobrush

    CMC Carboxymethylcellulose

    DNA Desoxyribonucleinsure

    dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

    etc. et cetera

    ED-Zellen equine Dermis Zellen

    EDM Eagles minimum essential medium, Dulbeccos

    modification

    EDTA Ethylendiamintetraessigsure

    EHV Equines Herpes Virus

    et al. et alii

    FHV Felines Herpesvirus

    FITC Fluoresceinisothiocyanat

    G (Gravitationskraft)

    ggr. geringgradig

    gramneg. gramnegativ

    grampos. grampositiv

    C Grad Celsius

    hgr. hochgradig

    HSV Hepes simplex Virus

    IDU Idoxuridin

    IE internationale Einheiten

    IFT Immunfluoreszenstest

    J Jahre

    Kerat. Keratitis

  • Abkrzungsverzeichnis

    kg Kilogramm

    KGW Krpergewicht

    koag.- koagulasenegativ

    mac. maculosa

    mg Milligramm

    mgr. mittelgradig

    min Minute(n)

    ml Milliliter

    mm Millimeter

    g Mikrogramm

    l Mikroliter

    M Mikromol

    n Anzahl

    NaCl Natriumchlorid

    NCS newborn calf serum (Serum neugeborener Klber)

    nm Nanometer

    nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase

    Kettenreaktion)

    Nr. Nummer

    NT Nasentupfer

    n.u. nicht untersucht

    obB ohne besonderen Befund

    oberfl. oberflchlich

    OD Oculus dextra

    OS Oculus sinistra

    p p-Wert (Signifikanz)

    PBS phosphat buffered saline (Phosphatpuffer)

    PBL periphere Blutleukozyten

    PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)

    PFU plaque forming units (Plaquebildende Einheit)

    pos. positiv

    prof. profunda

  • Abkrzungsverzeichnis

    punct. punctata

    punktf. punktfrmig

    eingetragenes Warenzeichen

    s. siehe

    spf. superficialis

    SPF spezifisch pathogenfrei

    spp. species

    subsp. subspecies

    Tab. Tabelle

    Taq Thermus aquaticus

    TBS Tracheobronchialsekret

    Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

    U Unit

    u. und

    UpM Umdrehungen pro Minute

    US Untersuchung

    UV ultraviollett

    z.B. zum Beispiel

    z.T. zum Teil

  • Tabellenverzeichnis

    Verzeichnis der Tabellen

    Nr. Titel Seite

    Tab. 1: Patienten mit Keratitis oder Keratokonjunktivitis (Gruppe 1) 41

    Tab. 2: Kontrolltiere ohne Augenerkrankung (Gruppe 2) 42

    Tab. 3: Gruppe 1 Klinische Diagnosen bei der Erst- und Zweituntersuchung 57

    im Abstand von vier Wochen

    Tab. 4: Gruppe 1 Befunde und Diagnosen bei der ophtalmologischen 60

    Erstuntersuchung

    Tab. 5: Gruppe 1 - Ergebnisse der ophtalmologischen Zweituntersuchung 61

    (vier Wochen nach der Erstuntersuchung), [n = 25]

    Tab. 6: Gruppe 1 und 2 Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei 64

    der Erstuntersuchung

    Tab. 7: Gruppe 1 und 2 Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei 66

    der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)

    Tab. 8: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung Nachweishufigkeit 68

    von EHV-2 Genom in Cytobrush und Wattetupfer am einzelnen Auge

    in Prozent

    Tab. 9: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung Positiver Nachweis 69

    von EHV-2 Genom im Wattetupfer bei gleichzeitigem positiven

    Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge

    Tab. 10: Gruppe 1 Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei 71

    erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush

    bei der Erstuntersuchung [ n = 28]

    Tab. 11: Gruppe 1 Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei 72

    erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush

    bei der Zweituntersuchung [n = 25]

    Tab. 12: Gruppe 1 Nachweis von EHV-2 Genom in den verschiedenen 73

    Proben bei Erst- und Zweituntersuchung

  • Tabellenverzeichnis

    Tab. 13: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden 76

    und erkrankten Augen bei der Erstuntersuchung, n [Augen] = 112

    Tab. 14: Gruppe 1 und 2, Erstuntersuchung Nachweise der Keimgruppen 77

    bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent

    Tab. 15: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden 80

    und erkrankten Augen bei der Zweituntersuchung, n [Augen] = 100

    Tab. 16: Gruppe 1 und 2, Zweituntersuchung Nachweise der Keimgruppen 82

    bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent

    Tab. 17: Gruppe 1 und 2 Nachweise verschiedener Entzndungszellen 85

    bei gesunden und erkrankten Augen (n = 112)

    Tab. 18: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzndungszellen 87

    aus acht limmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus

    Gruppe 1

    Tab. 19: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzndungszellen 88

    aus acht limmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus

    Gruppe 2

    Tab. 20: Gruppe 1 und 2 - Virologische Ergebnisse bei Augen mit dem 89

    Vorkommen von Entzndungszellen, unabhngig von einer

    klinischen Erkr