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  • Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen.

    Versuche zur transgenen Rettung der wobbler

    Mutation der Maus

    Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (rer. nat.)

    Fakultät für Biologie

    Universität Bielefeld

    vorgelegt von

    Volker Christopher Schmidt

    Juni 2002

  • Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________

    Inhalt I

    Inhaltsverzeichnis

    1. Zusammenfassung................................................................ ............1

    2. Einleitung................................................................ ........................... 2

    2.1 Grundlagen der Genomforschung ..................................................................2

    2.1.1 genetische Kartierung des Mausgenoms.................................................2 2.1.2 genomische Kartierung mittels Bestrahlungshybrid-Zellen...................3 2.1.3 Entwicklung von genomischen Klonen und sequence ready BAC-Contigs ...............................................................................................3 2.1.4 Die draft-Sequenz des humanen Genoms................................................4 2.1.5 funktionelle Genomanalyse (functional genetics) ...................................5

    2.2 Die Signalproteine des Neuregulin1 Gens .....................................................6

    2.2.1 Knock-out verschiedener Nrg1-Isoformen...............................................8 2.2.2 Die SMDF-Isoform des Nrg1-Gens ............................................................8

    2.3 Die pleiotrope Mutation wobbler der Maus ....................................................9

    2.3.1 Das Krankheitsbild der Wobbler-Individuen ............................................9 2.3.2 Chromosomale Lokalisation des wr-Gens .............................................10 2.3.3 genetische Einflüße auf den Phänotyp der Mutanten ...........................11 2.3.4 Positionsklonierung am Beispiel des wr-Gens......................................12

    2.4 Ziele dieser Arbeit ..........................................................................................13

    3. Material und Methoden ................................................................ ...15

    3.1 Material ............................................................................................................15

    3.1.1 Verwendete Mausstämme........................................................................15 3.1.1.1 Mus musculus castaneus .....................................................................15 3.1.1.2 Mus musculus C57BL/6J-wr .................................................................15 3.1.1.3 Der Mausstamm CD129Clc2-..................................................................15 3.1.1.4 Der Mausstamm C57BL/6J-gfp ............................................................15 3.1.1.5 weitere verwendete Mausstämme ........................................................16 3.1.1.6 Intraspezies Kreuzung CAST/B6-wr .....................................................16

    3.1.2 Materialien für die Kultur von Praeimplantationsembryonen...............16 3.1.2.1 Verwendete Hormone...........................................................................16 3.1.2.2 Kulturmedien für Praeimplantationsembryonen....................................16 3.1.2.3 Weitere verwendete Lösungen .............................................................16

    3.1.3 Zellkulturmaterialien ................................................................................17 3.1.3.1 Herkunft der verwendeten embryonalen Stammzellen .........................17 3.1.3.2 Feeder- und ES-Zellkulturmedien.........................................................17 3.1.3.3 Weitere verwendete Medien und Lösungen in der ES-Zellkultur ..........18

  • Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________

    Inhalt II

    3.1.4. molekularbiologische Materialien ..........................................................19 3.1.4.1 Oligodesoxynucleotide..........................................................................19 3.1.4.2 Maus BAC-Bank ...................................................................................20 3.1.4.3 Fragmentlängenstandards....................................................................20 3.1.4.4 Verwendete Enzyme.............................................................................20

    3.2 Methoden.........................................................................................................21

    3.2.1 Embryologische Methoden......................................................................21 3.2.1.1 Vasektomie von männlichen Mäusen ...................................................21 3.2.1.2 Ovulationszyklusbestimmung bei Spendermäusen ..............................21 3.2.1.3 Präparation der befruchteten Eizellen ..................................................22 3.2.1.4 Herstellung transgener Mäuse durch Vorkerninjektion von DNA-Konstrukten..................................................................................23 3.2.1.5 Retransfer der Zygoten.........................................................................24 3.2.1.6 Herstellung von chimären Mäusen .......................................................25

    3.2.1.6.1 Injektion von embryonalen Stammzellen in Blastozysten ...............25 3.2.1.6.2 Aggregation von frühen Morulastadien mit ES-Zellen.....................26

    3.2.2 Zellkulturmethoden ..................................................................................28 3.2.2.1 Präparation embryonaler Fibroblasten als Feederzellen für die ES-Zellkultur .........................................................................................28 3.2.2.2 Bestrahlen von Feederzellen ................................................................30 3.2.2.3 Füttern von Zellen.................................................................................30 3.2.2.4 Trypsinisieren von Feeder- und ES-Zellkulturen...................................31 3.2.2.5 Einfrieren von Feeder- und ES-Zellen ..................................................32

    3.2.3 Gezielter Austausch genomischer Regionen in ES-Zellen (ES-Zell-Targeting) ...................................................................................32

    3.2.3.1 Elektroporation von ES-Zellen ..............................................................33 3.2.3.2 Vereinzeln (Picken) der positiv selektionierten ES-Zellklone ................34 3.2.3.3 Splitten und Einfrieren der vereinzelten ES-Zellklone...........................35 3.2.3.4 Auftauen der positiv getesteten Klone ..................................................36 3.2.3.5 Vorbereitung der ES-Zellen für die Morulaaggregation ........................36

    3.2.4 Molekularbiologische Methoden.............................................................36 3.2.4.1 DNA Präparationen...............................................................................36

    3.2.4.1.1 DNA-Präparation aus genomischen BAC-Klonen (Qiagen Maxi-Präp., modifiziert) .....................................................36 3.2.4.1.2 DNA-Präparation aus ES-Zellkulturen (96-well-Format, Ramirez-Solis et al., 1992) ..................................37 3.2.4.1.3 DNA-Präparation aus Maus-Schwanzspitzen-Biopsien (Tailcuts) ..38 3.2.4.1.4 DNA-Präparation aus Geweben (Niere, Lunge) .............................38

    3.2.4.2 Konzentrationsbestimmung von DNA...................................................39 3.2.4.3 Restriktionsspaltung von genomischer ES-Zell-DNA............................39 3.2.4.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).....................................................40 3.2.4.5 Agarose-Gelelektrophoresen................................................................41

    3.2.4.5.1 Analytische Gelelektrophorese .......................................................41 3.2.4.5.2 physiologische Gelelektrophorese..................................................42 3.2.4.5.3 Elektroelution von BAC-Inserts aus Agarose-Gelen .......................42

    3.2.4.6 DNA-Transfer auf Nylonmembranen („Southern-Blotting“) ...................43 3.2.4.7 RNA-Methoden.....................................................................................43

    3.2.4.7.1 RNA-Isolierung aus Geweben (Chomczynski und Sacchi, 1987) ...43

  • Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________

    Inhalt III

    3.2.4.7.2 Präparation von mRNA mittels magnetischer Kügelchen (Dynabeads) ...................................................................................44 3.2.4.7.3 RNA-Minigele .................................................................................45 3.2.4.7.4 Große, denaturierende RNA-Gele ..................................................45 3.2.4.7.5 RNA-Transfer auf Nylonmembranen („Northern-Blotting“)..............45

    3.2.4.8 Radioaktive Markierung von DNA-Sonden ...........................................46 3.2.4.9 Hybridisierung (Church & Gilbert, 1984) ...............................................46 3.2.4.10 Autoradiographie ................................................................................47

    4. Ergebnisse................................................................ ...............