ESTROGEN WIRKSAMER SUBSTANZEN„Entwicklung und Anwendung chemisch – analytischer Verfahren zur...

„Entwicklung und Anwendung chemisch – analytischer Verfahren

zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen“

Von der Fakultät für Bauingenieurwesen

der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Angelika Stehmann

aus

Steinfurt

Berichter: Professor Dr.rer.nat. Horst Friedrich Schröder

Universitätsprofessor Dr.rer.nat. Andreas Schäffer

Universitätsprofessor Dr.-Ing. Peter Doetsch

Tag der mündlichen Prüfung: 9. Januar 2007

„Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.“

Inhaltsverzeichnis I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG .....................................1

1.1 Ziel der Arbeit ............................................................................................... 2

2 KLASSIFIZIERUNG ENDOKRIN WIRKSAMER SUBSTANZEN......................................................................4

2.1 Klassifizierung nach Art der endokrinen Wirksamkeit................................... 4 2.1.1 Estrogene Wirkung ...........................................................................................4

2.1.2 Anti-estrogene Wirkung ....................................................................................4

2.1.3 Androgene Wirkung ..........................................................................................4

2.1.4 Anti-androgene Wirkung ...................................................................................5

2.1.5 Thyroide Wirkung..............................................................................................5

2.2 Klassifizierung nach Struktur........................................................................ 5 2.2.1 Natürliche und synthetische Steroide ...............................................................5

2.2.2 Xenoestrogene .................................................................................................5

2.2.3 Auswahl von EDCs ...........................................................................................6

3 ANTHROPOGENE UND BIOGENE ENTSTEHUNG ESTROGEN WIRKSAMER SUBSTANZEN.........................8

3.1 Alkylphenole................................................................................................. 8 3.1.1 Metabolismus von Alkylphenolethoxylaten .......................................................9

3.1.2 Metabolismus von Nonylphenol......................................................................10

3.2 Bisphenol A ................................................................................................ 11 3.2.1 Biologischer Abbau von Bisphenol A im aeroben Abwasserreinigungsprozess.

........................................................................................................................12

3.3 Natürliche Estrogene.................................................................................. 13 3.3.1 Metabolismus von 17�-Estradiol im menschlichen Körper ...............................14

3.4 Synthetische Estrogene ............................................................................. 15 3.4.1 Metabolismus von 17�-Ethinylestradiol..........................................................16

4 ENDOKRINE WIRKUNGEN IN DER AQUATISCHEN UMWELT ............................................................................18

II Inhaltsverzeichnis

5 VERHALTEN VON EDCS IM ABWASSERREINIGUNGSPROZESS ...............................20

5.1 Vorkommen und Elimination von endokrin wirksamen Substanzen in der

Kläranlage .................................................................................................. 20

5.2 Sorption am Schlamm................................................................................ 25

6 VERFAHREN ZUR ANALYTISCHEN BESTIMMUNG VON EDCS IN UMWELTPROBEN .............................................26

6.1 Chemisch-analytische Bestimmungsverfahren .......................................... 26 6.1.1 Extraktion........................................................................................................26

6.1.2 Abtrennung störender Matrixbestandteile (clean – up)...................................27

6.1.3 Derivatisierung................................................................................................27

6.1.4 Chromatographische Trennung und anschließende Detektion ......................28

6.2 Biologische Wirktests ................................................................................. 35

7 MATERIAL UND METHODEN ZUR BESTIMMUNG ENDOKRIN WIRKSAMER SUBSTANZEN........................37

7.1 Vorversuche ............................................................................................... 37 7.1.1 Derivatisierung mittels fluorhaltiger Reagenzien ............................................37

7.1.2 Gaschromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Identifikation

zum Nachweis und zur Quantifizierung endokrin wirksamer Substanzen ......38

7.1.3 Qualitative und quantitative Auswertung ........................................................40

7.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen

Matrices...................................................................................................... 43 7.2.1 Probennahme und Probenvorbereitung..........................................................43

7.2.2 Festphasenextraktion .....................................................................................45

7.2.3 Probenaufreinigung ........................................................................................45


7.2.5 Durchführung der GC/MS-Analyse zur qualitativen und quantitativen

Bestimmung....................................................................................................46

7.2.6 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässriger Matrix eingesetzen

Methode..........................................................................................................46

7.2.6.1 Bestimmung der Wiederfindungen..............................................................46

7.2.6.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode...........................................47

Inhaltsverzeichnis III

7.2.6.3 Ermittlung der Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenzen................................48

7.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus

Klärschlämmen........................................................................................... 50 7.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung .............................................................50

7.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung.....................................................................52

7.3.3 Probenahme und Probenvorbereitung realer Proben.....................................53

7.3.4 Herstellung von dotiertem Probematerial .......................................................53

7.3.5 Extraktion........................................................................................................54

7.3.6 Anreicherung ..................................................................................................55

7.3.7 Probenaufreinigung ........................................................................................57


7.3.9 GC/MS-Messung und anschließende Auswertung der Ergebnisse................58

7.3.10 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten

Methode..........................................................................................................58



7.3.10.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen .................................59

7.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten .

................................................................................................................... 60 7.4.1 Beschreibung des beprobten Sees Volvi ........................................................60

7.4.2 Probenahme ...................................................................................................60

7.4.3 Analysengang .................................................................................................61

7.4.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten

Methode..........................................................................................................62




7.4.5 Analyse der realen Proben .............................................................................63

8 ERGEBNISSE.....................................................................64

8.1 Vorversuche ............................................................................................... 64 8.1.1 Massenspektren .............................................................................................66

8.1.1.1 Massenspektren der Fluorderivate der endokrin wirksamen Substanzen,

bestimmt unter EI-Bedingungen .................................................................69


bestimmt unter NCI-Bedingungen...............................................................76

IV Inhaltsverzeichnis

8.1.2 Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Detektors in Abhängigkeit des

Derivatisierungreagenzes ...............................................................................84

8.1.3 Responsefaktoren...........................................................................................85


Matrices...................................................................................................... 85 8.2.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässrigen Matrices

eingesetzten Methode ....................................................................................88





Klärschlämmen........................................................................................... 91 8.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung .............................................................91

8.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung.....................................................................95

8.3.3 Einfluss unterschiedlicher ASE – Extraktionsparameter auf die Wiederfindung

der Analyten....................................................................................................95

8.3.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten

Methode........................................................................................................103

8.3.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen............................................................103

8.3.4.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode.........................................103

8.3.4.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ...............................104


..................................................................................................................105 8.4.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten

Methode........................................................................................................107

8.4.1.1 Bestimmung der Wiederfindungen............................................................107

8.4.1.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode.........................................107

8.4.1.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ...............................108

8.4.2 Gehalt an EDCs in Sedimentproben des Sees Volvi ....................................108

9 DISKUSSION....................................................................117

9.1 Vorversuche ..............................................................................................117 9.1.1 Derivatisierungsverfahren.............................................................................117

9.1.2 Quantifizierungsverfahren.............................................................................118


Matrices.....................................................................................................118

Inhaltsverzeichnis V

9.2.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Abwässern......................................119

9.2.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus

Abwässern ....................................................................................................120


Klärschlämmen..........................................................................................121 9.3.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Klärschlämmen...............................121


Klärschlämmen .............................................................................................122


..................................................................................................................122 9.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Sedimenten ....................................122


Sedimenten...................................................................................................123

9.4.3 Belastung des Sees Volvi .............................................................................124

10 ZUSAMMENFASSUNG....................................................126

11 ANHANG ..........................................................................128

12 LITERATUR......................................................................129

13 DANKSAGUNG................................................................139

14 LEBENSLAUF..................................................................141

VI Verzeichnis der Abbildungen

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN

Abbildung ‎2.1: Strukturformeln der ausgewählten endokrin wirksamen Substanzen ...........7

Abbildung ‎3.1: Aerober und anaerober Abbau von Alkylphenolethoxylaten im

Abwasserreinigungsprozess.......................................................................10

Abbildung ‎3.2: Metabolismus von Bisphenol A...................................................................12

Abbildung ‎3.3: Molekularer Mechanismus der Estrogenwirkung ........................................14

Abbildung ‎3.4: Metabolismus von 17�-Estradiol im menschlichen Körper.........................15

Abbildung ‎3.5: Metabolismus von Ethinylestradiol im menschlichen Körper ......................16

Abbildung ‎6.1: Reaktionsgleichung der Derivatisierung von NP mittels fluorhaltiger

Anhydride....................................................................................................28

Abbildung ‎7.1: Fließschema der chemischen Analytik von EDCs aus Abwässern.............44

Abbildung ‎7.2: Fließschema der chemische Analytik von EDCs aus Klärschlämmen........51

Abbildung ‎7.3: Schematische Darstellung eines ASE-Gerätes ..........................................55

Abbildung ‎7.4: Extraktionsapparatur...................................................................................57

Abbildung ‎7.5: Die Lage des Sees Volvi auf dem griechischen Staatsgebiet sowie

markante Landschaftspunkte im Umfeld des Sees sowie die

Probenahmestellen.....................................................................................61

Abbildung ‎8.1: Ionenstrom-Chromatogramme der Trifluor- und Pentafluorderivate,

bestimmt im EI- Modus ...............................................................................65

Abbildung ‎8.2: Ionenstrom-Chromatogramme der Heptafluorderivate, bestimmt im EI-

Modus .........................................................................................................66

Abbildung ‎8.3: Ionenstrom-Chromatogramme aller Derivate, bestimmt im NCI-Modus .....67

Abbildung ‎8.4: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter EI-Bedingungen .............69

Abbildung ‎8.5: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter EI-Bedingungen. ...........70

Abbildung ‎8.6: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter EI-Bedingungen ..............71

Abbildung ‎8.7: Fragmentbildung der Estronderivate unter EI-Bedingungen.......................72

Abbildung ‎8.8: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter EI-Bedingungen ...................73

Abbildung ‎8.9: Fragmentbildung der Estriolderivate unter EI-Bedingungen .......................74

Abbildung ‎8.10: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter EI-Bedingungen.........75

Abbildung ‎8.11: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter NCI-Bedingungen ..........76

Verzeichnis der Abbildungen VII

Abbildung ‎8.12: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter NCI-Bedingungen .........77

Abbildung ‎8.13: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter NCI-Bedingungen ...........78

Abbildung ‎8.14: Fragmentbildung der Estronderivate unter NCI-Bedingungen....................79

Abbildung ‎8.15: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter NCI-Bedingungen ................80

Abbildung ‎8.16: Fragmentbildung der Estriolderivate unter NCI-Bedingungen. ...................81

Abbildung ‎8.17: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter NCI-Bedingungen......82

Abbildung ‎8.18: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus

Kläranlagenzuläufen ...................................................................................86

Abbildung ‎8.19: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus

Kläranlagenabläufen...................................................................................87

Abbildung ‎8.20: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von

Belebtschlammextrakten.............................................................................92

Abbildung ‎8.21: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von

Faulschlammextrakten................................................................................93

Abbildung ‎8.22: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Kieselgel mit verschiedenen

Elutionslösungsmitteln ................................................................................94

Abbildung ‎8.23: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Florisil und

Aluminiumoxid.............................................................................................94

Abbildung ‎8.24: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Menge des verwendeten

HFBAA........................................................................................................95

Abbildung ‎8.25: Wiederfindungen nach Resuspendierung des Extraktes in Wasser,

Anreicherung auf C18-Material und einem Kieselgel-clean-up...................96

Abbildung ‎8.26: Wiederfindungen nach Kieselgel-clean-up .................................................97

Abbildung ‎8.27: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Temperatur...............................98

Abbildung ‎8.28: Wiederfindungen in Abhängigkeit vom Druck .............................................99

Abbildung ‎8.29: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Extraktionszeit..........................99

Abbildung ‎8.30: Wiederfindung in Abhängigkeit von den Extraktionscyclen ......................100

Abbildung ‎8.31: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Probemenge...........................100

Abbildung ‎8.32: Wiederfindungen in sterilisierten Schlämmen...........................................102

Abbildung ‎8.33: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Sedimentextrakten

..................................................................................................................106

VIII Verzeichnis der Abbildungen

Abbildung ‎8.34: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie A

(Frühjahr) ..................................................................................................109

Abbildung ‎8.35: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie B

(Sommer) ..................................................................................................109

Abbildung ‎8.36: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie C

(Herbst) .....................................................................................................110

Abbildung ‎8.37: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie D

(Winter) .....................................................................................................110

Abbildung ‎8.38: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie E

(Frühjahr) ..................................................................................................111

Abbildung ‎8.39: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie F

(Sommer) ..................................................................................................111

Abbildung ‎8.40: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie G

(Herbst) .....................................................................................................112

Abbildung ‎8.41: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie H

(Winter) .....................................................................................................112

Abbildung ‎8.42: EI-Massenspektren der Probe A6 im Vergleich mit einer Standardlösung .....

..................................................................................................................114

Abbildung ‎8.43: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestellen

in der Nähe der Berge..............................................................................115

Abbildung ‎8.44: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestelle

in der Nähe des Flusses Megalo Rema...................................................115

Abbildung ‎8.45: Ergebnisse der EDC-Bestimmungen aus Sedimenten der

Probenahmestelle in der Nähe der Stadt Nea Madytos...........................116

Verzeichnis der Tabellen IX

VERZEICHNIS DER TABELLEN Tabelle ‎1.1: Relative estrogene Potenz bezogen auf 17β-Estradiol.....................................6

Tabelle ‎1.2: Produktion und Verbrauch von Alkylphenolen in der EU 1997.........................9

Tabelle ‎1.3: Verbrauch von Alkylphenolen zur Weiterverarbeitung in Deutschland 1995....9

Tabelle ‎1.4: Produktion und Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland ..........................11

Tabelle ‎1.5: Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland ...................................................12

Tabelle ‎1.6: Übersicht über die beschriebenen LOEC Werte von EDCs und deren Effekte

auf verschiedene Testorganismen..................................................................19

Tabelle ‎1.7: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und

–abläufen ........................................................................................................21

Tabelle ‎1.8: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Schlämmen ..........23

Tabelle ‎1.9: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Sedimenten..........24

Tabelle ‎1.10: Physikalische Stoffgrößen von endokrin wirksamen Substanzen ..................25

Tabelle ‎1.11: Übersicht über die in der Literatur vorhandenen Methoden zur Bestimmung

von EDCs aus Abwässern ..............................................................................29


von EDCs aus Klärschlämmen .......................................................................33


von EDCs aus Sedimenten.............................................................................34

Tabelle ‎2.1: GC/MS-Bedingungen zur Bestimmung von EDCs aus Abwässern mittels EI-

und NCI- Ionisation .........................................................................................39

Tabelle ‎2.2: Verwendete interne Standards .......................................................................41

Tabelle ‎2.3: Anreicherungsparameter ................................................................................45

Tabelle ‎2.4: Vorversuche zur chromatographischen Reinigung von Stadardlösungen......52

Tabelle ‎2.5: ASE-Extraktionsvarianten...............................................................................56

Tabelle ‎2.6: Probenahmezeitpunkte...................................................................................61

Tabelle ‎3.1: Zur Quantifizierung verwendete Ionen (m/z) der unterschiedlichen EDC-

Derivate ..........................................................................................................84

Tabelle ‎3.2: Massenspektrometrische Nachweisgrenzen, bestimmt im EI-Modus, in

Abhängigkeit von den verschiedenen Derivatisierungsreagenzien ................84

X Verzeichnis der Tabellen

Tabelle ‎3.3: Ermittelte Responsefaktoren der estrogen wirksamen EDCs bei der MS-

Detektion im EI- Modus ..................................................................................85

Tabelle ‎3.4: Wiederfindungen der EDCs in wässrigen Medien ..........................................88

Tabelle ‎3.5: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Reinstwasser)..........89

Tabelle ‎3.6: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Zulauf) .....................89

Tabelle ‎3.7: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Ablauf) .....................90

Tabelle ‎3.8: Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Analyten sowie deren

Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Abwässern ......................................90

Tabelle ‎3.9: Wiederfindungen von E1 und E2, bestimmt zur Überprüfung des mikrobiellen

Abbaus von E2 zu E1 ...................................................................................101

Tabelle ‎3.10: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Belebt- und Faulschlamm, mittels

optimierter Methodenparameter bestimmt....................................................103

Tabelle ‎3.11: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Belebtschlamm).....104

Tabelle ‎3.12: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Faulschlamm)........104

Tabelle ‎3.13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der Analyten sowie deren

Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Belebtschlamm..............................105

Tabelle ‎3.14: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Sedimenten ...................................107

Tabelle ‎3.15: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Sediment) ..............107

Tabelle ‎3.16: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sowie Korrelationskoeffizienten der

Kalibriergeraden unterschiedlicher EDCs, bestimmt aus Sedimenten .........108

Tabelle ‎4.1: Gegenüberstellung der in dieser Arbeit erzielten Wiederfindungen für EDCs

aus Abwässern mit den in der Literatur berichteten Methoden

(zusammengesetzt aus den Teilschritten Festphasenanreicherung, clean-up,

Derivatisierung und GC/MS- Bestimmung)...................................................119

Tabelle ‎4.2: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs in Abwässern mit entsprechenden

Literaturmethoden. In die Nachweisgrenzen gehen ein:

Festphasenanreicherung, clean- up, Derivatisierung und GC/MS-Bestimmung

......................................................................................................................120

Tabelle ‎4.3: In dieser Arbeit ermittelte Wiederfindungraten der EDCs aus Klärschlämmen

im Vergleich mit Daten aus der Literatur (Identifizierung und Quantifizierung

mittels GC/MS bzw. GC/MS/MS)..................................................................121

Verzeichnis der Tabellen XI

Tabelle ‎4.4: Vergleich der in dieser Arbeit ermittelten Wiederfindungsraten mit

Literaturmethoden, die zur Identifizierung und Quantifizierung der

untersuchten EDCs ebenfalls GC/MS- Methoden verwendeten...................123

Tabelle ‎4.5: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs, bestimmt aus Sedimenten, mit in

der Literatur beschriebenen Bestimmungsmethoden, die sich aus den

Arbeitsschritten - Extraktion, clean-up, Derivatisierung und GC/MS-

Bestimmung - zusammensetzten ................................................................124

Tabelle ‎6.1: Im Rahmen der Erstellung dieser Arbeit verwendete Chemikalien...............128

XII Verzeichnis der Abkürzungen

VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN

AP Alkylphenol

APCI atmospheric pressure chemical ionization

APEO Alkylphenolethoxylate

ASE accelerated solvent extraction

BG Bestimmungsgrenze

BPA Bisphenol A

BPA-d16 per-deuteriertes Bisphenol A

c Konzentration (concentration)

DAD diode array detection

E1 Estron

E2 17β-Estradiol

E3 Estriol

E2ac 17β-Estradiolacetat

ECD electron capture detection

ED electrochemical detection

EDC endocrine disrupting compound

EE2 17α-Ethinylestradiol

EI Elektronenionisation

ELRA enzyme-linked receptorassay

EPA environmental protection agency

ER Estrogenrezeptor

ESI electrospray interface

eV Elektronenvolt

FD fluorescence detection

FID Flammenionisationsdetektion

GC Gaschromatograph bzw. Gaschromatographie

GC/MS Gaschromatograph gekoppelt mit einem Massenspektrometer

HFBAA Heptafluorbuttersäureanhydrid (heptafluorobutyric acid anhydride)

LOEC lowest observed effect concentration

NOEC no observed effect concentration

[M]+ Molekülion

MeOH Methanol

MS Massenspektrometer bzw. Massenspektrometrie

Verzeichnis der Abkürzungen XIII

MS/MS Tandemmassenspektrometrie

m/z Massenzahl (Masse/Ladung)

NCI negative chemische Ionisation

NG Nachweisgrenze

NP 4-Nonylphenol

4nNP 4n-Nonylphenol

NPD Stickstoff- und Phosphor-selektiver Detektor

NPEO Nonylphenolethoxylate

OP Octylphenol

OPEO Octylphenolethoxylate

PFPAA Pentafluorpropionsäureanhydrid (pentafluoropropionic acid anhydride)

PLE pressurized liquid extraction

R Responsefaktor

r2 Korrelationskoeffizient

RIC reconstructed ion chromatogram (Ionstromchromatogramm einzelner,

ausgewählter Ionen mit definiertem m/z-Verhältnis)

S/N Signal/Rausch-Verhältnis (signal to noise ratio)

SPE Festphasenextraktion (solid phase extraction)

TBT Tributylzinn

TIC total ion chromatogram (Totalionstromchromatogramm, Aufnahme aller Ionen

eines ausgewählten m/z Bereichs)

TFAAA Trifluoressigsäureanhydrid (trifluoroacetic acid ahydride)

TS Trockensubstanz

W Wiederfindung

1 Einleitung und Zielsetzung 1

1 Einleitung und Zielsetzung

In den fünfziger und sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden die ersten Fälle von

Veränderungen der endokrinen Systeme einzelner Tierspezies bekannt, die auf schädigende

Wirkungen von Chemikalien zurückzuführen waren. 1996 wurden diese durch die

Veröffentlichung des Buches „Our stolen future“ von Theo Colborn der breiten Öffentlichkeit

zugänglich gemacht (Colborn et al., 1996).

1996 wurde auf der in Weybridge, England, abgehaltenen Konferenz „European workshop

on the impact of endocrine disrupters on human health and wildlife“ unter der Federführung

der Europäischen Kommission eine Definition für endokrin wirksame Substanzen aufgestellt:

„An endocrine disrupter is an exogenous substance that causes adverse health effects in an

intact organism, or its progeny, consequent to changes in endocrine functions“ (Bei endokrin

wirksamen Substanzen handelt es sich um körperfremde Verbindungen, die in das endokrine

System eines gesunden Organismus oder das seiner Nachkommen eingreifen und zu

signifikanten Gesundheitsstörungen führen.) Davon zu unterscheiden sind potentiell endokrin

wirksame Substanzen: „A potential endocrine disruptor is a substance, that possesses

properties that might be expected to lead to endocrine disruption in an intact organism.“ (Bei

potentiell endokrin wirksamen Substanzen handelt es sich um Verbindungen, die über die

Möglichkeit verfügen, in das endokrine System eines gesunden Organismus einzugreifen zu

können.) (Europäische Kommission, 1996).

Nach dieser Weybridge-Definition gilt ein Stoff nur dann als EDC (endocrine disrupting

compound), wenn an gesunden Organismen in vivo deutliche Gesundheitsschäden als Folge

von Veränderungen endokriner Funktionen aufgetreten sind. Der alleinige Nachweis, dass

eine Verbindung einen Einfluss auf das endokrine System ausüben kann, reicht demnach

nicht für eine Einstufung als EDC aus.

Etwas umfassender ist die Definition der US-Umweltbehörde EPA (environmental protection

agency) aus dem Jahre 1997: „An environmental endocrine disrupter is defined as an

exogenous agent that interferes with the synthesis, secretion, transport, binding, action or

elimination of natural hormones in the body that are responsible for the maintenance of

homeostatis, reproduction, development, and/or behavior.“ (Unter einem in der Umwelt

relevanten endokrin wirksamen Substanz versteht man eine körperfremde Substanz, die mit

der Synthese, der Ausscheidung, dem Transport, der Bindung, der Wirkung oder dem Abbau

der natürlichen Hormone im Körper konkurriert, welche für die Aufrechterhaltung der

physiologischen Körperfunktionen, der Fortpflanzung, die Entwickung und/oder das

Verhalten verantwortlich sind.) (Crisp et al., 1997). Nach der EPA-Definition werden also alle

Chemikalien als EDCs bezeichnet, die in irgendeiner Weise auf das natürliche

2 1 Einleitung und Zielsetzung

Hormonsystem Einfluss nehmen. Im Gegensatz zur engeren Weybridge-Definition werden

auch jene Verbindungen eingeschlossen, die Änderungen der Hormonkonzentration

auslösen, die Aktivität endokriner Drüsen und Gewebe beeinflussen sowie

hormonspezifische Effekte auslösen bzw. hemmen aber keine Gesundheitsschäden

auslösen.

1.1 Ziel der Arbeit

Kommunale Abwässer werden zunehmend durch umweltrelevante Spurenstoffe belastet.

Erst die gezielte Suche („What you see depends on what you look for.“ (Erickson, 2002))

bestätigte diese Tatsache und wies Kläranlagenabläufe als Punktquellen dieser Schadstoffe

aus. Insbesondere der Eintrag von endokrin wirksamen Substanzen erscheint bedenklich, da

sie während des Klärprozesses meist nur unvollständig eliminiert werden und somit, wie

Untersuchungen mittels sensitiver und spezifischer Verfahren belegen, mit den

Kläranlagenabläufen in relevanten Konzentrationen in die Umwelt entlassen werden.

Das Ziel der Arbeit ist es:

- Auswahl von umweltrelevanten, endokrin wirksamen Substanzen, insbesondere mit

estrogem Potential. Dazu gehören sowohl Substanzen, die eine starke estrogene

Potenz besitzen als auch Substanzen mit einer geringeren estrogenen Potenz, die

aber aufgrund ihrer Anwendung bzw. ihrer Ausscheidung in großen Mengen in der

Umwelt vorkommen.

- Prüfung und Bewertung der in der Literatur vorhandenen Methoden zur quantitativen

Anreicherung und Bestimmung dieser EDCs aus Umweltmatrices auf ihre

Anwendbarkeit im Abwasserreinigungsprozess.

- Entwicklung einer simultanen Bestimmungsmethode für diese EDCs aus wässrigen

Matrices. Die Extraktion der wässigen Proben soll möglichst mittels Festphasen

durchführbar sein.

- Derivatisierung der endokrin wirksamen Substanzen mittels fluorhaltiger Reagenzien.

Dadurch wird die Flüchtigkeit der Moleküle erhöht, was die gaschromatographische

Trennung erleichtert und es werden darüber hinaus elektronegative Gruppen in die

Moleküle integriert.

- Detektion und Quantifizierung mittels substanzspezifischer Verfahren wie

Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (GC/MS).

- Vergleich unterschiedlicher Ionisierungsmethoden, wie z.B. positiver

Elektronenionisation (EI) und negativer chemischer Ionisation (NCI), im Hinblick auf

ihre Nachweisempfindlichkeit. Um eine Ionisierung mittels NCI überhaupt möglich zu

1 Einleitung und Zielsetzung 3

machen, wurden durch die Derivatisierung elektronegative Gruppen in die Moleküle

eingefügt. Die Nachweisempfindlichkeit der negativen chemischen Ionisation soll in

Abhängigkeit des Fluorgehaltes der unterschiedlichen Derivate überprüft werden.

- Entwicklung einer simultanen Bestimmungmethode für diese EDCs aus festen

Matrices wie Klärschlamm und Sediment. Die Extraktion der festen Matrices soll mit

der „accelerated solvent extraction“ (ASE) durchgeführt werden, die gegenüber der

klassischen Soxhletextraktion den Vorteil einer verkürzten Extraktionszeit und eines

geringeren Lösungsmittelbedarfs - bei gleichzeitig erschöpfender Extraktion - hat.

- Anpassung der für die wässrigen Matrices entwickelten Reinigung, Derivatisierung,

Detektion und Quantifizierung an die, durch andere Matrices verursachten

Gegebenheiten.

Die entwickelten Analysenmethoden sind zu validieren und möglichst weitgehend als

Routinemethoden zu etablieren und auf reale Proben anzuwenden

Die größte Gefahr geht von den endokrin wirksamen Sustanzen aus, wenn sie in der

Kläranlage nicht eliminiert werden und in die Oberflächengewässer gelangen. Dort können

sie Einfluss auf die vorhandenen aquatischen Lebewesen nehmen und sich durch

Adsorption an Sedimenten anreichern. Deshalb soll für die Untersuchung realer Proben nicht

der Belastungsverlauf einer Kläranlage ausgewählt, sondern ein besonders zu schützender

See identifiziert werden, dessen Sediment in regelmäßigen Zeitabständen auf den Gehalt

von EDCs untersucht werden soll.

4 2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen

2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen

Inzwischen sind mehrere hundert Substanzen unterschiedlicher Struktur und Herkunft

bekannt, die eine endokrine Wirkung zeigen. Dementsprechend handelt es sich um keine

einheitliche Substanzklasse.

Es gibt zwei Möglichkeiten diese Vielfalt der endokrinen Substanzen zu gliedern. Zum Einen

ist eine Klassifizierung nach Art der endokrinen Wirkung möglich, zum Anderen lassen sie

sich nach ihrem strukturellen Aufbau bzw. ihrer Herkunft unterteilen.

2.1 Klassifizierung nach Art der endokrinen Wirksamkeit

2.1.1 Estrogene Wirkung

Estrogen wirksame Substanzen sind Substanzen, die eine ähnliche Wirkung hervorrufen wie

das weibliche Geschlechtshormon 17β-Estradiol, d.h. der Estrogenrezeptor wird aktiviert. Zu

dieser Gruppe gehören Substanzen wie z. B. 17α-Ethinylestradiol (EE2), Diethylstilboestrol,

4-Nonylphenol (NP) und Bisphenol A (BPA).

2.1.2 Anti-estrogene Wirkung

Durch Substanzen mit anti-estrogener Wirkung wird der Estrogenrezeptor blockiert und die

Wirkung natürlicher estrogener Substanzen kann sich nicht mehr voll entfalten. Die anti-

estrogene Wirkung kann entweder direkt durch Hemmung der Bindung von Estrogenen an

den Estrogenrezeptor verursacht sein, oder indirekt durch Beeinflussung des Metabolismus

oder der Biosynthese von Estrogenen oder der Estrogenrezeptoren. Zu den anti-estrogenen

Substanzen gehören z.B. die polycylischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (Tran et al.,

1996).

2.1.3 Androgene Wirkung

Androgene wie Testosteron bewirken die Ausprägung der männlichen

Geschlechtsmerkmale. Wirkungen von Testosteron und anderen androgen wirkenden

Substanzen in der Umwelt sind bisher kaum bekannt und nur wenig untersucht. Zur Wirkung

des Tributylzinnkations (TBT) wurden die meisten Untersuchungen durchgeführt (Oehlmann

et al., 1996).

2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen 5

2.1.4 Anti-androgene Wirkung

Analog zu der anti-estrogenen Wirkung tritt hier eine Hemmung des androgenen Rezeptors

auf. Diese Wirkung wird für einige Pestizide und PAKs (Sultan et al., 2001) beschrieben.

2.1.5 Thyroide Wirkung

Substanzen mit einer thyroiden Wirkung beeinflussen die Bildung und die Wirkung des

Schilddrüsenhormons Thyroxin. Diese Wirkung wird z. B. für das Organophosphorpestizid

Dimecron beschrieben (Thangavel et al., 2005).

2.2 Klassifizierung nach Struktur

Die EDCs stellen strukturell keine homogene Stoffklasse dar, sondern unterscheiden sich

sehr stark in ihrer chemischen Struktur, was sich wiederum auf die Wirkung niederschlägt.

Es kann von einer stärkeren Wirkung ausgegangen werden, je höher die Wechselwirkung

der endokrin wirksamen Substanz mit dem Estrogenrezeptor ist. Die meisten der bisher

identifizierten Chemikalien enthalten mindestens einen Phenolring, wie z.B. Alkylphenole

oder Bisphenole, andere dagegen besitzen keine aromatischen Strukturen, wie z.B.

Tributylzinn.

2.2.1 Natürliche und synthetische Steroide

Steroidhormone weisen von ihrer Struktur her ein Steroidgerüst auf und unterscheiden sich

nur in ihren funktionellen Gruppen. Hierzu zählen die natürlichen Hormone Testosteron und

17β-Estradiol, dessen Metabolite Estron und Estriol, sowie synthetisch hergestellte Hormone

wie 17α-Ethinylestradiol und Mestranol, die Hauptbestandteile von Kontrazeptiva sind.

2.2.2 Xenoestrogene

Bei den Xenoestrogenen handelt es sich vorwiegend um Industriechemikalien und ihre

Abbauprodukte, die wie ihr Name sagt, eine estrogene Wirkung besitzen. Sie sind, wie in

Tabelle 2.1 ersichtlich, um mehrere Größenordnungen weniger wirksam als Steroidhormone,

doch werden sie meist in großen Mengen produziert, so dass trotz der niedrigeren

Wirksamkeit ein Effekt zu erwarten ist. Haupteintragsweg von Xenoestrogenen in die Umwelt

ist der Eintrag über das Abwasser. Die wichtigsten Xenoestrogene sind Alkylphenole und

6 2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen

Bisphenole. Beim Nonylphenol, als wichtigstem Vertreter der Alkylphenole ist die endokrine

Wirksamkeit sowohl von der Stellung der Seitenkette (para > meta > ortho) (Routledge and

Sumpter, 1997) als auch von der Verzweigung der Seitenkette abhängig. Die endokrine

Wirksamkeit ist bei Anwesenheit eines tertiären C-Atoms größer als bei Anwesenheit von

sekundären C-Atomen. Am schwächsten ist die endokrine Wirksamkeit bei einer

unverzweigten Seitenkette. Die größte Aktivität wird bei einer einzelnen tertiären

Verzweigung zwischen dem sechsten und achten C-Atom beobachtet, wenn sich die

Seitenkette in para-Position befindet. Dabei hat das Alkylphenol in der räumlichen

Ausdehnung die größte Ähnlichkeit mit der Steroidstruktur (Routledge and Sumpter, 1997).

Tabelle 2.1: Relative estrogene Potenz bezogen auf 17β-Estradiol

Substanz relative estrogene Potenz (Hefezellassay)

Quelle

17β-Estradiol (E2) 1,0 Gaido et al., 1997, Schultis et al., 2004

17α-Ethinylestradiol (EE2) 0,78 Schultis et al., 2004

Diethylstilbestrol 0,64 Gaido et al., 1997

Estron (E1) 0,22 Schultis et al., 2004

Estriol (E3) 0,0036 Gaido et al., 1997

Dihydro-Testosteron 0,0005 Gaido et al., 1997

4-Nonylphenol (NP) 0,0002 Gaido et al., 1997

Bisphenol A (BPA) 0,000067 Gaido et al., 1997

β-Sitosterin 0,0000045 Gaido et al., 1997

Testosteron 0,0000044 Gaido et al., 1997

Methoxychlor 0,0000002 Gaido et al., 1997

o,p´-DDT 0,000000125 Gaido et al., 1997

o,p´-DDD 0,000000067 Gaido et al., 1997

o,p´-DDE 0,000000042 Gaido et al., 1997

2.2.3 Auswahl von EDCs

Für diese Arbeit wurden aus der Fülle der endokrin wirksamen Substanzen estrogen

wirkende Stoffe, namentlich die Xenoestrogene 4-Nonylphenol (NP), Octylphenol (OP) und

Bisphenol A (BPA) das natürliche Steroidhormon 17β-Estradiol (E2), dessen Metabolite

Estron (E1) und Estriol (E3) sowie das am häufigsten in Kontrazeptiva verwendete

synthetische Hormon 17α-Ethinylestradiol (EE2) ausgewählt. Bei den ausgewählten Stoffen

handelt es sich einerseits um Industriechemikalien (NP, OP, BPA), andererseits sind die

natürlichen Steroidhormone und deren Metaboliten endogener Natur und werden vom

2 Klassifizierung endokrin wirksamer Substanzen 7

Menschen ausgeschieden. Die Kontrazeptiva werden nach bestimmungsgemäßer

Anwendung ebenfalls vom Menschen ausgeschieden. Daher ist für diese Stoffe eine hohe

Umweltrelevanz zu erwarten. Die Strukturen der ausgewählten sieben Verbindungen sind in

Abbildung 2.1 dargestellt.

OH

CH3 OH

H

HH

OH

CH3 OH

H

HH

OH

CH3

H

HH

O

OH

CH3 OH

H

HH

OH

H19C9 OH

CH3

CH3OH OHH17C8 OH

17ß-Estradiol (E2)Estron (E1) Estriol (E3)

Nonylphenol (NP) Bisphenol A (BPA)Octylphenol (OP)

natürliche Steroidhormone

synthetische Steroidhormone

Xenoestrogene

17α-Ethinylestradiol (EE2) Abbildung 2.1: Strukturformeln der ausgewählten endokrin wirksamen Substanzen

8 3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen

3 Anthropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen

3.1 Alkylphenole

Bei den Alkylphenolen handelt es sich um phenolische Derivate, die am aromatischen Ring

eine oder zwei Alkylgruppen tragen. Alkylphenole dienen hauptsächlich als

Zwischenprodukte für die Herstellung von Phenolharzen, von Ethoxylaten, d.h. von Stoffen

mit tensidischer Wirkung, sowie von antioxidativ wirkenden Additiven. Aus dieser ca. 130

Einzelverbindungen umfassenden Substanzgruppe zeigen Nonylphenole und Octylphenole

endokrine Effekte. Unter Nonyl- bzw. Octylphenolen werden Alkylphenole mit einem C9- bzw.

C8-Alkylrest verstanden. Der Alkylrest kann unterschiedlich verzweigt sein. Technisches

Nonylphenol stellt synthesebedingt eine Mischung verschiedener Isomerer dar.

In Europa werden hauptsächlich drei Methoden zur Synthese von Nonylphenol angewendet

(EU, 2002).

1. Phenol und Nonen, als Isomerengemisch, reagieren in einem Batchprozess in

Gegenwart eines Katalysators zu Nonylphenol. Als Katalysator wird Montmorillonit

und Phosphorsäure verwendet.

2. Phenol und Nonen, als Isomerengemisch, reagieren in Gegenwart eines sulfonierten

Ionenaustauscherharzes in einem Batchprozess zu Nonylphenol.

3. Phenol und Nonen, als Isomerengemisch, reagieren in Gegenwart von einem

Festbettionenaustauscherharzes in einem kontinuierlichen Prozess zu Nonylphenol.

In der EU wurden so 1997 ca. 73.500 Mg Nonylphenol produziert (Tabelle 3.1). Der Anteil an

in Deutschland verarbeiteten NP betrug 1995 14.000 Mg (Tabelle 3.2).

Mittels zweidimensionaler Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie

(GC X GC/MS) sind bisher 102 Komponenten des technischen Gemisches identifiziert

worden (Ieda et al., 2005). Moeder et al. haben 2006 mittels zweidimensionaler

Gaschromatographie in Verbindung mit time of flight Massenspektrometrie 40 Isomere im

technischen Nonylphenolgemisch identifizieren können.

Die Nonylkette weist unterschiedliche Verzweigungen auf und kann am Phenolring in p- oder

in o-Stellung stehen. Die p-o-Normalverteilung liegt im technischen Nonylphenol bei 9:1.

Para-, d.h. 4-Nonylphenol ist der Hauptbestandteil von technischem Nonylphenol, mit einem

geringen Anteil des bedeutungslosen Nebenprodukts 2-Nonylphenol. Es enthält daneben in

geringen Mengen u.a. Dinonylphenol. Der größte Teil der NPs dienen in der EU als

Zwischenprodukt für die Herstellung von Ethoxylaten, die z.B. als Wasch- und

Reinigungsmittel, Emulgatoren für Pflanzenschutzmittel, als Hilfsmittel und Additive in der

3 Antropogene und biogene Entstehung estrogen wirksamer Substanzen 9

Textil- und Lederindustrie, der Papier- und Zementindustrie und in der chemischen

Reinigung eingesetzt werden (EU, 2002). Die Verbrauchsstruktur hat sich gegenüber Ende

der 80er Jahre (BUA) deutlich verändert, da der Anteil, der zur Ethoxylierung verwendet wird,

wegen eines weitgehenden Verzichts auf Verwendung von Alkylphenolethoxylaten in Wasch-

und Reinigungsmitteln deutlich zurückgegangen ist. In nächster Zukunft ist eine weitere

Verminderung zu erwarten, wenn die Richtlinie 2003/53/EG, welche der Reduzierung von

Nonylphenol und Nonylphenolethoxylaten dient, vollständig umgesetzt sein wird. Diese

gestattet in den meisten Anwendungsbereichen nur noch eine Verwendung sowohl von NP

als auch von NPEO in Konzentrationen bis zu 0,1 Massenprozent.

Von besonderer Bedeutung sind in diesem Zusammenhang die Alkylphenolethoxylate

(APEO), von denen fast ausschließlich Nonylphenol- und Octylphenolethoxylate zum Einsatz

kommen. Sie sind wassergängig und werden unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen

leicht zum Alkylphenol abgebaut.

Tabelle 3.1: Produktion und Verbrauch von Alkylphenolen in der EU 1997 (EU, 2002)

Nonylphenol [Mg] Produktion 73.500

Export 3.500

Import 8.500

Verbrauch zur Weiterverarbeitung (Produktion + Import – Export)

78.500

Tabelle 3.2: Verbrauch von Alkylphenolen zur Weiterverarbeitung in Deutschland 1995 (Leisewitz et al., 1997)

Verarbeitungsbereich Alkylphenole [Mg] Nonylphenol [Mg] Verarbeitungsmenge insgesamt 20.000 14.000

zu Alkylphenol-Ethoxylat 13.500 11.500

zu Alkylphenol-Harz 4.500 1.800

zu Antioxidantien, Additiven etc. 2.000 800

3.1.1 Metabolismus von Alkylphenolethoxylaten

Beim biologischen Abbau von Alkylphenolethoxylaten während des

Abwasserreinigungsprozess entsteht, wie in Abbildung 3.1 zu sehen ist, sowohl unter

aeroben als auch unter anaeroben Verhältnissen Alkylphenol. Dieses ist im Vergleich zu den

Ausgangsprodukten stärker endokrin wirksam (Ahel et al., 1994). Während des aeroben

Abbaus entstehen zunächst kürzerkettige Alkylphenoxycarbonsäuren und kurzkettige


Alklyphenolethoxylate, bevor die Ethoxylatkette entfernt ist und das entsprechende

Alkylphenol entsteht. Beim anaeroben Abbau der Alkylphenolethoxylate wird aus der

Ethoxylatkette direkt ein Ethoxylatrest nach dem anderen durch eine β-Oxidation entfernt, bis

das Alkylphenol entstanden ist.

R OO

Hn

R OO

Hn

R OO

Hn

R OH

R OH

OHR OO

O

n

+ +

n=1-40 (APnEO)

n= 0,1 (AP1EC, AP2EC)

n= 0,1 (AP1EO, AP2EO)

n= 0,1 (AP1EO, AP2EO)

AP

AP

aerober Abbau anaerober Abbau

anaerober Abbau

Abbildung 3.1: Aerober und anaerober Abbau von Alkylphenolethoxylaten im Abwasserreinigungsprozess (Ahel et al., 1994)

3.1.2 Metabolismus von Nonylphenol

Über den weiteren Metabolismus von Nonylphenol ist bisher wenig bekannt. Bisher wurde

meistens nur die biologische Abbaubarkeit bestimmt. Unter aeroben Bedingungen wird NP

(c = 8,33 mg/L, 47 Tage) in Belebtschlamm bei einer Temperatur von 28 °C vollständig

abgebaut, bei niedrigeren Temperaturen sinkt die Abbaubarkeit auf 13 – 86 % (Tanghe et al.,

1998). Unter anaeroben Bedingungen wird NP (c = 5 mg/L) erst innerhalb von 84 Tagen, bei

einer Halbwertzeit von 23,9 Tagen vollständig abgebaut. Dabei wurde ebenfalls eine

Temperaturabhängigkeit festgestellt (Chang et al., 2005). Über welche Zwischenstufen die

Metabolisierung verläuft, ist bisher weitestgehend unbekannt. Eine allgemein akzeptierte

Hypothese ist, dass der NP-Abbau über eine Oxidation am Ring mit nachfolgender


Ringöffnung läuft, ähnlich dem Metabolismus anderer aromatischer Substanzen (Corvini et

al., 2004, Tanghe et al., 1999). Bei Metabolismusuntersuchungen von Telscher et al., 2005

an einem definierten NP-Isomer in einem Schlamm-Boden-Gemisch wurde die Bildung einer

NO2-Verbindung beobachtet.

3.2 Bisphenol A

4,4‘-Bisphenol A (BPA) kann durch sauer oder alkalisch katalysierte Kondensation von 2 mol

Phenol mit 1 mol Aceton hergestellt werden. Großtechnisch erfolgt die Herstellung nur in

sauer katalysierter Reaktion, da in Gegenwart von Alkali die Bildung von Nebenprodukten

stark zunimmt. Die Produktionsmenge in der Bundesrepublik Deutschland betrug 1995 ca.

210.000 Mg (Tabelle 3.3). Berücksichtigt man den Export von 25.000 Mg und den Import von

5.000 Mg, ergibt sich ein Gesamtverbrauch von etwa 190.000 Mg (Leisewitz et al., 1997).

Damit gehört BPA zu den in Synthesen am häufigsten eingesetzten Chemikalien.

Tabelle 3.3: Produktion und Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland (Leisewitz et al., 1997)

Menge Bisphenol A 1995 [Mg] Produktionskapazität 240.000

Produktion 210.000

Import 5.000

Export 25.000

Verbrauch 190.000

Bisphenol A wird in der Bundesrepublik Deutschland fast ausschließlich als Zwischenprodukt

eingesetzt. (Tabelle 3.4) Es stellt in der Kunststoffindustrie eine bedeutende

Ausgangskomponente für die Erzeugung von Polycarbonaten und Epoxidharzen dar.

Polycarbonat-Kunststoffe sind sehr stabile Verbindungen, die sich durch hohe Zähigkeit,

Wärmeformbeständigkeit und elektrisches Isolationsvermögen auszeichnen. Sie sind

transparent und praktisch farblos. Polycarbonate eignen sich daher in vielen

Anwendungsbereichen als Konstruktionswerkstoff. Epoxidharze auf BPA-Basis werden z. B.

für Zahnfüllungen und Innenlackierung von Metallverpackungen eingesetzt. Unter sonstigen,

mengenmäßig relevanten Verwendungen von Bisphenol A sind seine Bromierung zu dem als

Flammschutzmittel verwendeten Tetrabrombisphenol A, sein Einsatz als Entwicklersubstanz

in Thermopapieren sowie die Verwendung als Stabilisator (PVC- und Gummi-Additiv) zu

erwähnen (Leisewitz et al., 1997).


Tabelle 3.4: Verbrauch von Bisphenol A in Deutschland (Leisewitz et al., 1997)

Verbrauchssektor Bisphenol A [Mg] Prozent [%]

Polycarbonate 133.000 70,0

Epoxidharze 56.000 29,5

Sonstige Verwendungen 700 0,5

Insgesamt 190.000 100

3.2.1 Biologischer Abbau von Bisphenol A im aeroben Abwasserreinigungsprozess

In einer japanischen Studie mit drei verschiedenen Belebtschlämmen und 40 Flusswässern

(Ike et al., 2000) wurde festgestellt, dass ein Belebtschlamm aus einer industriell mit BPA

belasteten Kläranlage in der Lage war, BPA innerhalb von 24 h vollständig zu mineralisieren.

Die beiden anderen Schlämme kommunaler Herkunft benötigten hierzu 48 bzw. 56 h. BPA

wurde in den Flusswässern, die stärker verschmutzt waren, besser abgebaut, als in den

leichter verschmutzen. Wobei eine komplette Mineralisierung nur in 6 der 40 Wässer zu

beobachten war. Die entstehenden Abbauprodukte sind bisher nicht untersucht.

CH3

CH3

OH OH

OHOH

CH3OH

CH3

OH OH

CH2OH

OHOH

CH3

HO

OH

CH3O

OH

O OH

OH

OH

OHO CH2OHO

OH

CH3

OH OH

COOHOH

OH OH

CH2OH

+

+

+CO2 Biomasse

BPA

85 %15 %

Abbildung 3.2: Metabolismus von Bisphenol A (Lobos et al., 1992; Spivack et al., 1994)


Eine Untersuchung mittels des gramnegativen Bakteriums MV1 (Lobos et al.; 1992, Spivack

et al., 1994) zeigt den in Abbildung 3.2 dargestellten Weg. Dabei existieren zwei alternative

Abbauwege, einen Hauptweg und einen Nebenweg. BPA wird hauptsächlich unter Bildung

der Intermediate 4-Hydroxyacetophenol und 4-Hydroxybenzoesäure zu Kohlendioxid und

Biomasse abgebaut bzw. umgebaut, während ein geringerer Teil zum Triol oxidiert wird.

3.3 Natürliche Estrogene

Natürliche Estrogene sind weibliche Geschlechtshormone, die hauptsächlich im Ovar sowie

in geringen Mengen auch in der Nebenniere und in den Hoden gebildet werden. Das

Folikelhormon 17β-Estradiol (E2) ist unter den Estrogenen dabei von besonderer Bedeutung.

Zu den wesentlichen Zielorganen körpereigener Estrogene gehören die Brustdrüsen und die

Gebärmutter, wo sie Wachstumsprozesse stimulieren. Eine erhöhte Exposition dieser

Organe durch antrophogene Estrogene kann möglicherweise von toxikologischer Bedeutung

sein. Besonders kritisch für eine umweltbedingte Estrogeneinwirkung ist die Embryonalphase

und die Kindheit, in der nur ein geringer endogener Estrogenspiegel vorliegt, und in der der

Organismus empfindlich auf äußere Einflüsse reagiert. Erhöhte Estrogenspiegel führen zu

Fehlfunktionen in der Gebärmutterschleimhaut, zu gestörten Zyklen und einer geringeren

oder fehlgesteuerten Fruchtbarkeit. In einer repräsentativen Studie mit 73 Frauen lag die

normale tägliche Ausscheidung von Estrogenen bei 106 µg/d E3, 14 µg/d E2 und 32 µg/d E1

(D’Ascenzo et al., 2003).

Die Wirkung der steroidalen Sexualhormone wird durch spezifische Rezeptoren, die zur

Gruppe der Steroidhormonrezeptoren gehören, vermittelt. Diese Rezeptoren befinden sich

im Inneren der Zelle. Die Steroidhormone gelangen durch Diffusionsvorgänge ins Zellinnere

und binden an die inaktive Form des Rezeptors, entweder im Zytoplasma oder im Zellkern

(Abbildung 3.3). Durch die Bindung des Hormons verändert der Rezeptor seine

Tertiärstruktur und wird aktiviert. Dabei werden bestimmte am Rezeptor angelagerte

Eiweißmoleküle (Heat-Shock-Proteine) abgestoßen, und der Bereich des Rezeptors, der sich

danach an die Desoxyribonukleinsäure (DNA) anlagert, wird frei. Im Zellkern lagert sich der

Rezeptor mit seiner DNA-Bindungsdomäne an bestimmte Stellen der DNA, den sog.

Response Elements (ERE = estrogen response element) an. Durch die Bildung des

aktivierten Rezeptor-Hormonkomplexes an die DNA wird die Transkription eines bestimmten

Gens stimuliert und die Neusynthese von Proteinen gestartet. Die klassische Wirkung von

Steroidhormonen besteht demnach in einer Änderung der Genexpression.


Abbildung 3.3: Molekularer Mechanismus der Estrogenwirkung (Schlumpf et al., 1996); SR = Steroidrezeptor; Hsp = Hitzeschockprotein; ERE= estrogen responsive element; F = Fremdkörper

3.3.1 Metabolismus von 17β-Estradiol im menschlichen Körper

17β-Estradiol wird im menschlichen Körper überwiegend zu Estron und teilweise zu Estriol

hydroxyliert, mit Glucuronsäure oder Sulfat verestert oder methoxyliert, um so als Konjugate

über die Niere ausgeschieden werden zu können (Abbildung 3.4) (Bolt, 1979; Xu et al.,

2005). Die Konjugate sind weniger wirksam als die freien Estrogene. Estron wird

hauptsächlich als Estron-3-Sulfat und nicht als Glucuronid ausgeschieden (Schlumpf et al.,

1996).


OH

OH

H

HH

OH

OH

H

HH

OH

OH

H

HH

O

OH

OH

H

HH

O

OH

H

HHOH

O

H

HHOH

O

OMe

H

HHOH

OH

O

H

HHOH

OH

OH

H

HHOH

OH

MeO

H

HHOH

OH

O

H

HH

OH

OH

OH

H

HH

O

OH

MeO

H

HHMeO

OH

H

HHOH

OH

OMe

H

HHOH

OH

OH

O

17ß-Estradiol

Estriol

Estron

16a-Hydroxyestron2-Hydroxyestron

Konjugation (Glucoronierung und Sulfatierung)

Ausscheidung (Urin)

4-Hydroxyestron

2-Hydroxyestron-3-methylether

2-Hydroxyestradiol 4-Methoxyestron

17-Epiestron

2-Methoxyestron

2-Methoxyestradiol4-Methoxyestradiol

16-Epiestriol16-Ketoestradiol

Abbildung 3.4: Metabolismus von 17β-Estradiol im menschlichen Körper (Bolt, 1979; Xu et al., 2005)

3.4 Synthetische Estrogene

Der Hauptteil der heutzutage hergestellten synthetischen Estrogene entfällt auf das 17α-

Ethinylestradiol (EE2), welches zur Kontrazeption eingesetzt wird und Hauptbestandteil der

sogenannten „Anti-Baby-Pille“ ist. In Deutschland werden jährlich ca. 50 kg EE2 (persönliche

Mitteilung Schering AG) produziert. Nach bestimmungsgemäßer Anwendung wird

überschüssiges EE2 mit dem Urin ausgeschieden. EE2 wird während der

Abwasserbehandlung nicht oder nur zum Teil entfernt und gelangt so in die

Oberflächengewässer. Durch Bioakkumulation verbleibt EE2 im Fettgewebe der Fische und

stellt somit eine zunehmende Gefährdung dar. Der Gehalt an EE2 in Regenbogenforellen,


die unterhalb von Kläranlagenabläufen gehalten wurden, ist 104–106-fach höher als im

umgebenen Wasser (Larsson et al., 1999).

3.4.1 Metabolismus von 17α-Ethinylestradiol

Das synthetische Steroidhormon 17α-Ethinylestradiol (EE2) liegt im Plasma überwiegend als

3-Sulfat vor. Im Gegensatz zum natürlichen E2 ist beim EE2 der oxidative Angriff am 17-C-

Atom durch die Ethinylgruppe blockiert. Diese wurde eingeführt, um die pharmakologische

Wirkung von EE2 bei oraler Aufnahme zu gewährleisten und es vor einer enzymatischen

Spaltung im Magen zu schützen. Dadurch bedingt, sorgt die Ethinylgruppe bei nicht

resorbiertem EE2 für eine hohe Persistenz in der Umwelt.

OH

CH3 OH

H

HHOH

CH3 OH

H

HH

OH

OH

CH3 OH

H

HH

OH

Glc-O

CH3 OH

H

HH

OH

CH3 OH

H

HH

OCH3

O

CH3 OH

H

HHCH3

OH

CH3 OH

H

HHOS

O

OO

4-Hydroxy-EE2 17a-Ethinylestradiol (EE2)

2-Hydroxy-EE2EE2-3-Sulfat

EE2-3-Glucuronid

2-Hydroxy-3-methoxy-EE22-Methoxy-3-Hydroxy-EE2

D-Homoestrogene

16ß-Hydroxy-EE2

Estron bzw. Estradiol

6ß-Hydroxy-EE2

weitere Konjugation

Ausscheidung (Urin)

-

Abbildung 3.5: Metabolismus von Ethinylestradiol im menschlichen Körper (Bolt, 1979; Guengerich, 1990)


Die wichtigste oxidative Metabolisierungsreaktion ist die 2- Hydroxylierung. Das 2-

Hydroxyethinylestradiol wird vor der Ausscheidung durch den Urin hauptsächlich sulfatisiert

und glucoronidiert (Bolt, 1979; Guengerich, 1990) oder durch das Enzym Catechol-O-

methyltransferase methoxyliert (Bolt, 1973). Eine direkte Glucuronidierung von EE2 wurde

ebenfalls beobachtet. Die Hydroxylate und Konjugate sind, ähnlich wie die Konjugate von

E2, weniger endokrin wirksam. Selten treten Hydroxylierung an der 4, 6α- und 6β-Position,

Bildung eines D-Ring-Homoestrogens und der Verlust der Ethinylgruppe auf. Eine 16α-

Hydroxylierung wie bei E2 wird nicht beobachtet, vermutlich spielt dort die Bildung des

Estrons als Vorläufer eine wichtige Rolle (Guengerich, 1990). Der Metabolismus von EE2 ist

in Abbildung 3.5 schematisch dargestellt.

18 4 Endokrine Wirkungen in der aquatischen Umwelt

4 Endokrine Wirkungen in der aquatischen Umwelt

Es wurden bereits in verschiedenen in vivo Studien mit unterschiedlichen Tierspezies wie der

Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) (Thorpe et al., 2001), dem Japankärpfling

(Oryzias latipes) (Nozaka et al., 2004) und dem Zebrafisch (Danio rerio) (Segner et al., 2003;

Thorpe et al., 2003) endokrine Effekte festgestellt. Die physiologischen Auswirkungen der

estrogenen Substanzen auf die aquatischen Lebewesen und die Wirkschwellen-

konzentrationen waren unterschiedlich. Die lowest observed effect concentration (LOEC) für

die einzelnen Stoffe variierten je nach Entwicklungsstand und Geschlecht des Individuums

sowie nach Testsystem und Expositionsdauer. So wurden neben dem Anstieg des

Vitellogeninlevels, einem Eidotterprotein, das normalerweise nur von weiblichen Tieren

gebildet wird, teilweise Veränderungen in den Gonaden und eine Behinderung der

Spermatogenese beobachtet. In manchen Fällen kam es zu einer Reduktion oder totalen

Hemmung des Hodenwachstums (Metcalfe et al., 2001). Tabelle 4.1 gibt eine Übersicht über

die Wirksamkeit der endokrin wirksamen Substanzen in verschiedenen in vivo Tests.

Dabei fällt auf, dass steroidale estrogen wirksame Substanzen eine lowest observed effect

concentration zeigen, die ca. eine 10er Potenz niedriger ist, als die der Xenoestrogene. Die

Steroide liegen alle im unteren ng/L-Bereich. Eine Ausnahme bildet nur Estriol, das mit

einem LOEC von 0,75 µg/L (Metcalfe et al., 2001) einen relativ hohen LOEC zeigt. Die

Xenoestrogene NP und BPA liegen dagegen im µg/L-Bereich, OP sogar im mg/L-Bereich.

Damit ist die Gefahr, die von Xenoestrogenen ausgeht, wesentlich geringer, als die Gefahr,

die von Steroiden ausgeht. Allerdings werden Xenoestrogene in erheblich größeren Mengen

produziert und in die Umwelt freigesetzt, so dass sich die endokrine Wirkung aufsummiert.

Die meisten biologischen Testsysteme untersuchen, in wieweit die Substanzen einzeln in der

Lage waren, einen endokrinen Effekt zu stimulieren. Mischungen sind mit wenigen

Ausnahmen bisher noch nicht betrachtet worden. Rajapakse et al. und Silva et al. fanden

2002 heraus, dass bei einer Mischung von Estradiol und Xenoestrogenen die Wirkung

wenigstens additiv war, wenn sie nicht sogar potentiert wurde. Selbst unterhalb der no

observed effect concentration (NOEC) jeder einzelnen Komponente, ist die Mischung

effektiver, als es die simple Addition der Effekte der einzelnen Substanzen vermuten ließe.

Für die Zukunft wäre es nicht nur wünschenswert größere Bandbreiten von Mischungen zu

betrachten, um ein möglichst reales Abbild der Wirkungen zu erhalten, sondern auch durch

Wahl verschiedener Testspezies die nicht unerheblichen Unterschiede in der endokrinen

Wirkung zu untersuchen.

4 Endokrine Wirkungen in der aquatischen Umwelt 19

Tabelle 4.1: Übersicht über die beschriebenen LOEC Werte von EDCs und deren Effekte auf verschiedene Testorganismen

EDC Testorganismus LOEC Effekt Referenz NP Juvenile Regenbogenforellen

(Oncorhynchus mykiss) 6,1 µg/L Anstieg des

Vitellogeninlevels Thorpe et al., 2001

BPA Juvenile Zebrafische (Danio rerio)

375 µg/L Anstieg des Vitellogeninlevels

Segner et al., 2003

OP Japankärpfling (Oryzias latipes)

64,1 mg/L Anstieg des Vitellogeninlevels

Nozaka et al., 2004

E1 Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)

44 ng/L Anstieg des Vitellogeninlevels

Thorpe et al., 2003

E2 Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)

4,7 ng/L 9 ng/L

Anstieg des Vitellogeninlevels Anstieg des Vitellogeninlevels

Thorpe et al., 2001 Thorpe et al., 2003

E3 Japankärpfling (Oryzias latipes)

0,75 µg/L Verweiblichung

Metcalfe et al., 2001

EE2 Juvenile Zebrafische (Danio rerio) Juvenile Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)

1,67 ng/L 0,1 ng/L

Anstieg des Vitellogeninlevels Anstieg des Vitellogeninlevels

Segner et al., 2003 Thorpe et al., 2003

20 5 Verhalten von EDCs im Abwasserreinigungsprozess

5 Verhalten von EDCs im Abwasserreinigungsprozess

5.1 Vorkommen und Elimination von endokrin wirksamen Substanzen in der Kläranlage

Im Menschen werden die Estrogene meist renal zu polareren Verbindungen degradiert und

mit dem Urin als Glucuronid oder Sulfat ausgeschieden. Diese Substanzen haben zwar ein

geringeres endokrines Potential als die Ausgangssubstanzen, aber durch die β-

Glucuronidase coliformer Bakterien werden die Glucuronide bereits auf dem Weg in die

Kläranlage wieder in ihre unkonjugierte, und damit potentere, Form zurückverwandelt

(D’Ascenzo et al., 2003; Desbrow et al., 1998).

E2 wird während des Klärprozesses zu E1 metabolisiert, welches im Kläranlagenablauf in

größeren Konzentrationen vorkommt als E2. E1 selber wird hauptsächlich als Sulfat

ausgeschieden, das persistenter ist als die Glucuronide (Baronti et al., 2000). Das Estron-3-

Sulfat wird erst im Laufe des biologischen Reinigungsprozesses gespalten, so dass nur ein

unvollständiger Abbau des Estrons möglich ist.

Aufgrund der Persistenz von EE2 und seiner niedrigen Wirkschwelle ist auf EE2 im

Abwasserreinigungsprozess ein besonderes Augenmerk zu legen.

Im Gegensatz zu den Steroidhormonen werden die Xenoestrogene NP, OP und BPA

unmetabolisiert in die Kläranlagen eingetragen, oder im Fall von NP und OP entstehen sie

erst teilweise während des Abwasserreinigungsprozesses durch Abbau der entsprechenden

Ethoxylate (siehe Abschnitt 3.1.1).

Neben den menschlichen Ausscheidungen sind auch Industrieabwässer Quellen endokrin

wirksamer Substanzen. In den Kläranlagen werden die endokrin wirksamen Substanzen

mineralisiert oder aber nur teilweise abgebaut oder am Klärschlamm adsorbiert. Ein Großteil

aber wird nicht ausreichend entfernt und gelangt so über die Kläranlagenabflüsse in die

Oberflächengewässer – teilweise sogar noch in ökologisch relevanten Konzentrationen.

In den Gewässern werden sie an Suspenser oder im Sediment adsorbiert. Durch

Strömungen kann es zu einer Resuspendierung kommen. Einen Überblick über das

Vorkommen von EDCs in Kläranlagenzu- und –abläufen (Tabelle 5.1), in Schlämmen

(Tabelle 5.2) und Sedimenten (Tabelle 5.3) ist in den folgenden Tabellen zu sehen.

Die Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und –abläufen

(Tabelle 5.1) sind abhängig vom Untersuchungsort und –zeitpunkt sehr unterschiedlich.

Insbesondere hat sich der Gehalt an Nonylphenol seit Ende der 90er Jahre deutlich

verringert. So wiesen Snyder et al., 1999 noch bis zu 37.000 ng/L Nonylphenol in einem

Kläranlagenablauf in den USA nach. 2005 wiesen Lee et al. in kanadischen

5 Verhalten im Abwasserreinigungsprozess 21

Kläranlagenabläufen nur noch bis zu 3.210 ng/L und damit ungefähr eine 10er Potenz

weniger Nonylphenol nach. Dieser Rückgang wird wahrscheinlich durch einen

weitestgehenden Verzicht auf Nonylphenolethoxylate in Wasch- und Reinigungsmitteln

verursacht. Eine Abhängigkeit der weiteren sechs endokrin wirksamen Substanzen vom

Untersuchungsort bzw. –zeitpunkt ist nicht zu sehen.

Auffällig ist, dass für EDC-Gehalte in Kläranlagenzuläufen wesentlich weniger Daten

vorliegen als für EDC-Gehalte in Kläranlagenabläufen. Dies ist wahrscheinlich darin

begründet, dass die zugrunde liegenden analytischen Methoden nicht in der Lage waren,

das, in Vergleich zu den Abläufen, erhöhte Matrixaufkommen in den Zuläufen zu bewältigen.

Tabelle 5.1: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und –abläufen

Analyt Konzentration

Kläranlagenzulauf [ng/L]

Konzentration Kläranlagenablauf

[ng/L]

Land

Referenz

NP 25.000–33.000

82.000 57.640 10.000

2.720–25.000

16.000 171–37.000

331–956 <1.000–33.000

12.000 650

1.000 426–4.926 320–3.210

USA USA

Deutschland USA

Spanien Spanien Japan USA

Kanada

Rudel et al., 1998 Snyder et al., 1999

Spengler et al., 1999 Hale et al., 2000

Petrovic et al., 2001 Planas et al., 2002 Onda et al., 2003

Drewes et al., 2005 Lee et al., 2005

BPA 94–150

10.000–37.000 193–2.440

550

210–2.400

20–55 83,1–126

n. d.–2.500 31–223 18–702

140 n. d.–50 20–450

USA Deutschland Österreich

Kanada Deutschland

Japan USA

Kanada

Rudel et al., 1998 Spengler et al., 1999 Fürhacker et al., 2000

Lee et al., 2000 Fromme et al., 2002

Onda et al., 2003 Drewes et al., 2005

Lee et al., 2005

OP 200–740

3.900

380–3.560

150 n. d.–673

1.200 n. d.–180 10–470

USA USA

Spanien USA

Kanada

Rudel et al., 1998 Snyder et al., 1999 Petrovic et al., 2001 Drewes et al., 2005

Lee et al., 2005 n. d. = non detectable (nicht nachweisbar)


Fortsetzung Tabelle 5.1: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Kläranlagenzu- und –abläufen

Analyt

Konzentration Kläranlagenzulauf

[ng/L]

Konzentration Kläranlagenablauf

[ng/L]

Land

Referenz

E1

25–132 1,6–18

54,9-76,6 44 51

7,3–75

19–78 8–52

1,4–76 <0,4–47

n. d.–16,8 2,5–82

<1 17 16

0,5–8,6 0,6–50,4

1–96 <1–54

GB Niederlande Deutschland

Italien ?

Deutschland Italien Japan

Deutschland USA

Kanada Kanada

Desbrow et al., 1998 Belfroid et al., 1999

Spengler et al., 1999 Baronti et al., 2000

Ferguson et al., 2001 Andersen et al., 2003 D’Ascenzo et al., 2003

Onda et al., 2003 Joss et al., 2004

Drewes et al., 2005 Servos et al., 2005

Lee et al., 2005

E2

4,0–25 0,77–6,4 12,2–19,5

11 37

4,9–11

2,4–26 3–22

2,7–48 <0,6–12

0,477–3,66 n. d.–4,4 0,41–3,5

<1 1,6 0,8

<0,5–1,0 <0,6–6

0,2–14,7 <1–2

GB Niederlande

USA Deutschland

Italien ?

Deutschland Italien Japan

Deutschland USA

Kanada Kanada

Desbrow et al., 1998 Belfroid et al., 1999 Snyder et al., 1999


Ferguson et al., 2001 Andersen et al., 2003 D’Ascenzo et al., 2003

Onda et al., 2003 Joss et al., 2004

Drewes et al., 2005 Servos et al., 2005

Lee et al., 2005

E3 24–188 72 580

0,44–18 2,3 3,6

<1–4,9

Italien Italien Japan USA

Baronti et al., 2000 D’Ascenzo et al., 2003

Onda et al., 2003 Drewes et al., 2005

EE2

4,0–13 6,2–10,1 0,7–5,2

n. d.–7,0 <0,2–7,5

n. d.–0,759 n. d.–2,0 n. d.–1,7

<1 <0,5 <0,7

GB Niederlande

USA Deutschland

Italien Deutschland Deutschland

USA

Desbrow et al., 1998 Belfroid et al., 1999 Snyder et al., 1999


Andersen et al., 2003 Joss et al., 2004

Drewes et al., 2005 n. d. = non detectable (nicht nachweisbar)


Bei einem Vergleich der Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen im Abwasser

mit den in Tabelle 4.1 beschriebenen LOEC-Werten, wird ersichtlich, dass von den

untersuchten Abwässern zwar keine akute Gefahr ausgeht, dennoch liegen die

Konzentrationen in kritischen Bereichen. Im Sinne des vorsorglichen Umweltschutzes ist es

deshalb wichtig, die Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in

Kläranlagenabläufen weiter zu verringern.

Die meisten Daten für den Gehalt an endokrin wirksamen Substanzen in Klärschlämmen

(Tabelle 5.2) liegen für Nonylphenol vor. Durch die relativ hohe Lipophilität des Nonylphenols

wird Nonylphenol bevorzugt am Schlamm adsorbiert. Dies schlägt sich in den gefundenen

hohen Konzentrationen nieder. Durch die Komplexizität der Matrix verursacht, war es erst

einer Arbeitsgruppe um Ternes und Andersen gelungen, Estron, Estradiol und

Ethinylestradiol in Klärschlämmen nachzuweisen. Estriol ist bisher in Klärschlämmen noch

nicht untersucht worden.

Tabelle 5.2: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Schlämmen

Analyt

Konzentration Schlamm [µg/kg TS]

Land

Referenz

NP 255.600–823.500 41.100–470.000

243.900 25.000–600.000

172.000 <125–4.590

GroßbritannienKanada Taiwan Spanien Spanien

Deutschland

Sweetman, A.J., 1994Lee et al., 1995 Lin et al., 1999

Petrovic et al., 2000 Petrovic et al., 2001 Meesters et al., 2002

BPA 197–12.500 4–1.363

<125–780

Kanada Deutschland Deutschland

Lee et al., 2000 Fromme et al., 2002 Meesters et al., 2002

OP 910–9.200 7.500

Kanada Spanien

Lee et al., 1995 Petrovic et al., 2001

E1 16–37 22,8–27,8

Deutschland Deutschland

Ternes et al., 2002 Andersen et al., 2003

E2 5–49 4,9–5,4



E3 noch nicht untersucht

EE2 2–17 <1,5



Da ein Teil der endokrin wirksamen Substanzen bereits durch Mineralisation oder Adsorption

am Schlamm aus dem Abwasser entfernt wird, sind die Konzentrationen von endokrin

wirksamen Substanzen in Sedimenten (Tabelle 5.3) insgesamt niedriger als in Schlämmen.


Da Sedimente während des analytischen Prozesses einfacher zu händeln sind als

Schlämme, liegen für Sedimente bereits mehr Daten vor. Auch Estriol wurde von Mibu et al.,

2004 bereits untersucht. Es konnte allerdings nicht nachgewiesen werden.

Tabelle 5.3: Konzentrationen von endokrin wirksamen Substanzen in Sedimenten

Analyt

Konzentration Sediment [µg/kg TS]

Land

Referenz

NP <5–12.400 10–259

17.000–1.378.000 <1–1.040 <15–590 27–430 n. d.–46

2–5 11,8–21.000

44–567

USA Deutschland Deutschland

Korea Spanien

Deutschland Japan

GroßbritannienJapan Italien

Hale et al., 2000 Bolz et al., 2001

Heemken et al., 2001 Khim et al., 2001

Petrovic et al., 2001 Stachel et al., 2003

Kawahata et al., 2004 Liu et al., 2004

Mibu et al., 2004 Vitali et al., 2004

BPA <0,5–15 66.000–343.000

<1–53,5 <10–40 10–380 n. d.–13

5–9


Korea Spanien

Deutschland Japan

Großbritannien

Bolz et al., 2001 Heemken et al., 2001

Kim et al., 2001 Petrovic et al., 2001 Stachel et al., 2003

Kawahata et al., 2004 Liu et al., 2004

OP <0,5–8 <1–120 <10–204

2–12

Deutschland Korea

Spanien Großbritannien

Bolz et al., 2001 Kim et al., 2001

Petrovic et al., 2001 Liu et al., 2004

E1 11,9 3–7

<0,05–3,5 0,16–1,17

Spanien Großbritannien

Japan Australien

Lopez de Alda et al., 2002Liu et al., 2004

Mibu et al., 2004 Braga et al., 2005

E2 2–4 n. d.

0,22–2,48

GroßbritannienJapan

Australien

Liu et al., 2004 Mibu et al., 2004 Braga et al., 2005

E3 n. d. Japan Mibu et al., 2004

EE2 22,8 n. d. 2–12

< 0,05–0,5

Spanien Japan

GroßbritannienAustralien

Lopez de Alda et al., 2002Mibu et al., 2002 Liu et al., 2004

Braga et al., 2005 n. d. = non detectable (nicht nachweisbar)


5.2 Sorption am Schlamm

Wenn man das Verhalten von endokrin wirksamen Stoffen während der

Abwasserbehandlung erklären will, muss man die Sorption an Schlamm ebenfalls mit

einbeziehen. Die meisten bisherigen Untersuchungen beziehen sich allerdings auf die

Konzentrationen in der Wasserphase. Studien über den Verbleib im Schlamm oder Sediment

scheiterten bisher meist noch an der unzureichenden chemischen Analytik. Somit ist keine

gleichzeitige Bilanzierung für alle sieben, in dieser Arbeit untersuchten, endokrin wirksamen

Substanzen über den gesamten Abwasserreinigungsprozess möglich.

Betrachtet man die log KOW- und die log KOC-Werte der einzelnen Substanzen (Tabelle 5.4),

wird deutlich, dass insbesondere NP, OP und EE2 eine starke Neigung zur Sorption an

Schlamm haben.

Tabelle 5.4: Physikalische Stoffgrößen von endokrin wirksamen Substanzen

Analyt Molmasse [g/mol]

log KOW log KOC Referenz

NP 220,36 3,28-4.48 4,7-5,6 Rippen, 1998 ; Seleka et al., 1999

BPA 228,29 3,4 2,50-3,18 Staples et al., 1998

OP 206,33 4,12 3,91 Ahel et al., 1993, Ferguson et al., 2001

E1 270,38 3,43 3,5 Lai et al., 2000

E2 272,39 3,94 3,5 Lai et al., 2000

E3 288,39 2,81 3,5 Lai et al., 2000

EE2 296,41 4,15 3,8 Lai et al., 2000 log KOW = Octanol – Wasser – Verteilungskoeffizient

log KOC = organic carbon – Wasser – Verteilungskoeffizient im Boden

26 6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben

6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben

6.1 Chemisch-analytische Bestimmungsverfahren

Um Xenoestrogene und Steroidhormone in Spurenkonzentrationen im Abwasser chemisch-

analytisch detektieren und quantifizieren zu können, sind sehr empfindliche instrumentelle

Nachweismethoden mit aufwendiger Probenvorbereitung erforderlich. Die Art der

Probenvorbereitung ist aufgrund der Komplexität der Matrix und der geringen Konzentration

der Analyten in der Probe von großer Bedeutung. Dabei bestehen die Bestimmungs-

methoden meist aus den Teilschritten Extraktion, Abtrennung störender Matrixbestandteile,

Derivatisierung und chromatographische Trennung mit anschließender Detektion.

Die Tabellen 6.1–6.3 geben einen Überblick über die derzeit in der Literatur vorhandenen

Methoden zur Bestimmung von endokrin wirksamen Substanzen aus Abwässern,

Klärschlämmen und Sedimenten.

In den folgenden Abschnitten werden diese beschriebenen Bestimmungsmethoden,

eingeteilt in ihre Teilschritte, näher beschrieben.

6.1.1 Extraktion

Zur Anreicherung von EDCs aus flüssigen Proben wird häufig eine flüssig/flüssig-Extraktion

mit Dichlormethan (Wahlberg et al.; 1990, Shin et al., 2001; Rinken, 2002; Cathum et al.,

2001) oder Ethylacetat (Mol et al., 2000) angewendet oder auf den Gebrauch

unterschiedlicher Festphasen zurückgegriffen. Am häufigsten wird dazu eine C18-Festphase

(Pendersen et al., 1999; Mol et al., 2000; Kojima et al., 2005; Jeannot et al., 2002; López de

Alda et al., 2000; Bolz et al., 2000; Ingrand et al., 2003; Spengler et al., 1999) oder

verschiedene Polymerphasen wie Oasis HLB (Quintana et al., 2004; Jeannot et al., 2002;

Laganà et al., 2004; Komori et al., 2004; Hernando et al., 2004), SDB-RPS (Inoue et al.,

2002) und PLRP-s (López-Roldán et al., 2004) verwendet.

Zur Extraktion aus Klärschlämmen oder Sedimenten werden abhängig von den

nachzuweisenden Analyten verschiedenste Methoden eingesetzt. Für NP zeigt die

Wasserdampfdestillation (Sweetman, 1994) gute Ergebnisse, sollen aber gleichzeitig BPA

und OP mit extrahiert werden, wird meist auf eine Soxhletextraktion mittels Cyclohexan

(Naassner et al., 2002) oder Dichlormethan (Chalaux et al., 1994, Li et al., 2003, Hale et al.,

2000) zurückgegriffen. In neueren Verfahren wird die sogenannte accelerated solvent

6 Verfahren zur analytischen Bestimmung von EDCs in Umweltproben 27

extraction (ASE) angewendet. Dieses Verfahren ist in der Literatur zusätzlich unter der

Bezeichnung pressurized liquid extraction (PLE) bekannt. Dieses Verfahren hat gegenüber

der Soxhletextraktion den Vorteil in wesentlich kürzerer Zeit und mit höherer

Extraktionsausbeute durchführbar zu sein. Als Lösungsmittel wird hier

Ethylacetat/Ameisensäure (Meesters et al., 2002) oder Dichlormethan (Li et al., 2003; Hale

et al., 2000) verwendet.

In der einzigen bisher beschriebenen Methode zur Bestimmung von Steroidhormonen aus

Schlämmen wird eine Ultraschallextraktion mit einer Folge von unterschiedlichen

Lösungsmitteln verwendet (Ternes et al., 2002).

6.1.2 Abtrennung störender Matrixbestandteile (clean – up)

Bei den Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Stoffe aus Abwässern werden

meistens keine zusätzlichen Maßnahmen zur Abtrennung störender Matrixbestandteile

durchgeführt. In einigen Fällen wird Kieselgel (Quintana et al., 2004, Cathum et al., 2001;

Spengler et al., 1999) oder Florisil (Ingrand et al., 2003) verwendet.

Bei Schlämmen und Sedimenten dagegen ist aufgrund der größeren Menge mit extrahierter

Matrix immer eine Reinigung notwendig. Dabei reicht die Bandbreite von Adsorbentien wie

Aluminiumoxid (Chalaux et al., 1994; Meesters et al., 2002) oder modifiziertem Kieselgel

(Ferguson et al., 2000) bis zu aufwendigen aparativen Methoden mittels Gelpermeations-

chromatographie (GPC) (Ternes et al., 2002; Hale et al., 2000) oder präparativer HPLC

(Sweetman, 1994).

6.1.3 Derivatisierung

Eine Derivatisierung wird meist dann durchgeführt, wenn sich hochauflösender GC-

Methoden, die eine unzersetze Flüchtigkeit der Analyten voraussetzen, anschließen.

Dadurch werden die Moleküle flüchtiger und stabiler. Eine Reihe verschiedener

Derivatierungsreagenzien lassen sich dafür einsetzen. Entweder erfolgt eine Silylierung

mittels unterschiedlicher Reagenzien (Quintana et al., 2004; Mol et al., 2000; Jeannot et al.,

2002; Spengler et al., 1999; Hernando et al., 2004; Ternes et al., 2002; Li et al., 2003) oder

eine Acetylierung mit fluorhaltigen Reagenzien (Rinken, 2002; Croley et al., 2000; Chalaux et

al., 1994; Wahlberg et al., 1990; Kojima et al., 2005; Cathum et al., 2001). Als Beispiel ist in

Abbildung 6.1 die Acetylierung von NP zu sehen. Die dabei ablaufende Reaktion stellt eine

Veresterungsreaktion dar.


H19C9 OH

O

O O

OH19C9 Ac+

F(2x+1)Cx CxF(2x+1)

+

x=1-3

Ac2O AcOH

Ac2O =

Abbildung 6.1: Reaktionsgleichung der Derivatisierung von NP mittels fluorhaltiger Anhydride

In einer weiteren Studie wurde eine Methylierung mittels Phenyltrimethylammoniumhydroxids

(Bolz et al., 2000) durchgeführt.

6.1.4 Chromatographische Trennung und anschließende Detektion

Für die Spurenanalyse der endokrin wirksamen Substanzen erfolgt die chromatographische

Trennung entweder mittels gaschromatographischer oder flüssigchromatographischer

Verfahren in Verbindung mit massenspektrometrischer und/oder tandemmassen-

spektrometrischer, d.h. letztendlich, mittels substanzspezifischer Detektion. Einige wenige

Methoden nutzen auch nicht substanzspezifische Detektionsverfahren wie die

Flammenionisationsdetektion (FID) (Hale et al., 2000), die electron capture detection (ECD)

(Wahlberg et al., 1990; Chalaux et al., 1994) oder die Bestimmung mittels eines

Stickstoff/Phosphor selektivem Detektors nach Derivatisation mit Bromacetonitril (Shin et al.,

2001). In Verbindung mit der HPLC wurde auch eine Fluoreszenzbestimmung beschrieben

(Naassner et al., 2002).


6.2 Biologische Wirktests

Eine weitere Möglichkeit endokrin wirksame Substanzen nachzuweisen, ist die Verwendung

biologischer Wirktests. Dabei werden allerdings die endokrin wirksamen Substanzen nicht

als Einzelsubstanz identifiziert und quantifiziert, sondern als Summe der Wirkungen der

Einzelsubstanzen erfasst. Dazu können entweder in-vitro Testsysteme oder in-vivo

Testsysteme verwendet werden.

In-vitro Testsysteme:

In-vitro Verfahren zum Nachweis endokriner Stoffe nutzen zelluläre und subzelluläre

Systeme. Soto et al. (1995) entwickelten beispielsweise den als „E-Screen“ bekannten

Assay, der auf der estrogensensitiven Brustkrebszelllinie MCF-7 basiert. In diesem Test wird

die Veränderung der Zellzahl nach einer Induktionszeit von vier bis sechs Tagen erfasst. Zu

den zellulären in-vitro Verfahren zählen auch Reportergen-Assays. Hierzu werden

rekombinate Zelllinien eingesetzt, die sowohl den Hormonrezeptor exprimieren als auch den

Teil der Signaltransduktion enthalten, die mit einem estrogeninduzierbaren Reportergen

verknüpft ist. Die Messungen erfolgen über die Ermittlung von Reporterenzym-Aktivitäten,

z.B. von Luciferase oder ß-Galactosidase. Subzelluläre Testverfahren nutzen die Bindung

von Analyten an Hormonrezeptoren. Eine gängige Variante sind die radioaktiven

Rezeptorassays. Dabei konkurriert der zu messende Analyt mit einem radioaktiv markierten

Liganden um die Bindungsstelle des Rezeptors. Die Rezeptoren stammen entweder aus

Gewebeextrakten von Säugetieren oder werden rekombinant hergestellt. Das einfachste

subzelluläre Testsystem zum Nachweis estrogener Wirkstoffe ist der enzyme-linked

receptorassay (ELRA) (Seifert et al., 1999) bei dem der Estrogenrezeptor (ER) als

Bindungsprotein für estrogene Wirkstoffe eingesetzt wird. Hier konkurrieren die estrogenen

Wirkstoffe der Probe mit einem Beschichtungskonjugat (Estradiol-Rinderserumalbumin) um

die freien ER-Bindungstellen. Gemessen wird die Menge des an die Festphase gebundenen

Rezeptors; sie lässt sich mit Hilfe eines rezeptorspezifischen Antikörpers erfassen. In einem

weiteren Inkubationsschritt wird dieser Antikörper von einem Sekundärantikörper, der mit

dem Enzym Peroxidase gekoppelt ist, erkannt. Der Umsatz eines Farbstoff- oder

Lumineszenzsubstrats durch dieses Enzym kann im Plattenphotometer detektiert werden.

Bei diesem Verfahren kann wie bei den radioaktiven Rezeptorassays nicht zwischen

Agonisten und Antagonisten unterschieden werden. Allerdings wird die Summe aller

rezptorbindenden Substanzen richtig wiedergegeben, so dass der Assay für das

Umweltmonitoring gut geeignet ist. Nicht erfasst werden Substanzen, die in die


Estrogensynthese oder den –abbau eingreifen, sowie Effekte, die durch Veränderungen der

Estrogen-Signal-Transduktionskette entstehen (Hock et al., 2000).

In-vivo Testsysteme:

In-vivo Testsysteme zeichnen sich durch ihre große Aussagekraft aus, haben aber auch alle

Nachteile typischer Biotestverfahren: Lange Testdauer, ggf. über Tage oder Wochen, sowie

hohe Streuungen aufgrund der Inhomogenität des biologischen Materials. Zudem benötigen

in-vivo Testsysteme Versuchstiere. Die am häufigsten eingesetzten Methoden zur in-vivo

Erfassung estrogener Wirkstoffe nutzen Veränderungen vom Uterusgewicht bei Säugetieren

(Laws et al., 2000). Eine weitere Methode ist die Erfassung von Biomarkern als Indikatoren

für eine Estrogenexposition. Das bekannteste Beispiel ist der Nachweis von Vitellogenin,

einem, normalerweise nur von weiblichen Tieren gebildetem Eidotterprotein, bei männlichen

Fischen. Das Vorhandensein dieses Proteins gilt als sicherer Hinweis für eine

Estrogenexposition (Thorpe et al., 2001; Segner et al., 2003).

7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen 37

7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen

7.1 Vorversuche

Bevor die ausgewählten endokrin wirksamen Substanzen (Nonylphenol, Bisphenol A,

Octylphenol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol und 17α-Ethinylestradiol) aus verschiedenen

Matrices isoliert und quantifiziert werden konnten, wurden zunächst in Vorversuchen eine

optimierte Derivatisierungsweise, eine gaschromatographische Trennmethode und die

Parameter zur massenspektrometrischen Detektion entwickelt.

7.1.1 Derivatisierung mittels fluorhaltiger Reagenzien

Die zu bestimmenden Analyten sind relativ polar und nur bedingt flüchtig. Deshalb ist es

nicht möglich, sie alle gleichzeitig ohne Vorbehandlung direkt gaschromatographisch zu

trennen. Durch eine für alle sieben Komponenten verwendbare Derivatisierung sollte die

Flüchtigkeit erhöht werden. In dieser Arbeit wurde eine Acetylierung mittels fluorhaltiger

Anhydriden gewählt. Da sich die Empfindlichkeit von Detektoren in Abhängigkeit des

Fluorgehaltes stark verändern kann, wurde die Derivatisierung mit den unterschiedlich stark

fluorierten Reagenzien Trifluoressigsäureanhydrid, Pentafluorpropionsäureanhydrid und mit

Heptafluorbuttersäureanhydrid getestet.

Dazu wurde eine sich in einem verschließbaren Glasröhrchen befindende Standardlösung

der sieben EDCs, gelöst in Aceton, zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde, unter der

Modifizierung der Methode von Choi et al. (1998) in 200 µL Acetonitril wieder aufgenommen

und mit 30 µL des jeweiligen Derivatisierungsreagenzes versetzt. Das Glasröhrchen wurde

dann verschlossen und zur Reaktion bei 60 °C in einen Metallblock-Thermostaten (Barkey,

Bielefeld) gestellt. Nach 30 min wurde die Reaktion durch Abblasen des überschüssigen

Derivatisierungsreagenzes und des Lösungsmittels im Stickstoffstrom bei 60 °C

unterbrochen. Die Dämpfe wurden mit Hilfe einer VakuUsog Saugpumpe (Gerhardt,

Königswinter) abgesaugt.

Um zu überprüfen, welche Derivate empfindlicher detektiert werden können, wurde eine

Stammlösung aus einer Mischung der sieben EDCs von je 20.000 ng/mL in Aceton

hergestellt. Aus dieser wurde durch Verdünnung mit Aceton eine Konzentrationsreihe mit

Konzentrationen von 0,2; 2; 20; 200; 2000 und 20.000 ng/mL hergestellt. Aus den

Ergebnissen wurde wie unter Abschnitt 7.2.6.3 genauer beschrieben, die jeweiligen

38 7 Material und Methoden zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen

Nachweisgrenzen bestimmt. Die Ergebnisse für die einzelnen Derivate wurden miteinander

verglichen.

7.1.2 Gaschromatographische Trennung mit massenspektrometrischer Identifikation zum Nachweis und zur Quantifizierung endokrin wirksamer Substanzen

Für die Identifizierung und Quantifizierung der ausgewählten EDCs wurde eine

gaschromatographische Trennungsmethode in Verbindung mit massenspektrometrischer

Detektion entwickelt. Für jede Substanz wurden zunächst einzeln die charakteristischen

Massenfragmente (m/z) ermittelt. Im Anschluss wurde die chromatographische Trennung

optimiert. In Tabelle 7.1 sind die optimierten Geräte- und Methodenparameter aufgeführt. Um

die Moleküle zu ionisieren wurde sowohl die positive Elektronenionisation (EI) als auch die

negative chemische Ionisation (NCI) verwendet und die Ergebnisse verglichen. Die

Ionisierungsparameter sind in Tabelle 7.1 einander gegenübergestellt.

Bei der Elektronenionisation wird die verdampfte Probe in der Ionenquelle mit einem Strahl

thermischer Elektronen der kinetischen Energie von 70 eV beschossen. Durch diese

Ionisation werden hauptsächlich Radikalkationen M+• (Molekülionen) gebildet (Cammann,

2001). Bei der Elektronenionisation wird generell Energie im Überschuss an die zunächst

gebildeten Molekülionen abgegeben. Dadurch kommt es zu zahlreichen Bindungsbrüchen.

Es entstehen relativ komplexe Massenspektren mit zahlreichen Fragmenten, aber häufig

ohne Molekülion. Das auf diese Weise erhaltene Fragmentierungsmuster, welches aufgrund

der charakteristischen Bindungungsenergien der Atome in einem definierten Molekül

zustande kommt, kann zur Identifikation der gesuchten Substanzen genutzt werden. Dies

läuft nach folgendem Schema ab:

M + e- → M+• + 2 e-

M+• → F+1+ N1

M+• → F+2+ N2 etc.

M = Molekül

M+• = Molekülion

e- = Elektron

F = Fragment

N = neutrales Fragment


Tabelle 7.1: GC/MS-Bedingungen zur Bestimmung von EDCs aus Abwässern mittels EI- und NCI- Ionisation

Einstellung EI NCI Scan Time 1,76 s 0,82 s

electron multiplier voltage 1100 V 1700 V

Reaktionsgas - Methan

Autosampler Finnigan MAT A 200 S, San Jose, USA

Temperatur Injektor 250 °C

Trägergas Helium

Druck 40 cm/s konstant

Injektionsvolumen 2 µL (split 1:10)

Spülen der Spritze vor der Injektion mit Hexan 3 x 10 µL

Spülen der Spritze von der Injektion mit Probenmaterial

3 x 10 µL

Spülen der Spritze nach der Injektion 4 x 10 µL

Gaschromatograph Finnigan MAT, GCQ - Gaschromatograph

Säule Valcobond VB-5 fused silica; l =60 m; i.d. = 0,25 mm; Filmdicke = 0,25 µm

Temperaturprogramm 80 °C (3 min); 10 °C/min auf 280 °C (7 min)

Massenselektiver Detektor Finnigan MAT, GCQ – Massenspektrometer (ion Trap)

Tuning-Reagenz Perfluortributylamin (PFTBA)

Temperatur Transferline 275 °C

Temperatur Ionenquelle 200 °C

Detektionsmodus Full-Scan; Massenbereich 30 - 1000

Software zur Ergebnissauswertung XcaliburTM Version 1.2

emission current 250 µA

solvent delay 8 min

electron engergy 70 eV

Die negative chemische Ionisation stellt eine wesentlich sanftere Methode zur Ionisation dar.

Sie fragmentiert die zu untersuchenden Substanzen nicht oder nur geringfügig. Sie erzeugt

vor allem die häufig für eine Molmassenbestimmung gewünschten Molekülionen. Die

Ionisation erfolgt mit Hilfe eines Reaktantgases, meist Methan. Dieses wird zunächst ionisiert

und reagiert dann, durch Übertragung von Elektronen, mit den zu bestimmenden

Substanzen, wie in den folgenden Reaktionsgleichungen zu sehen ist.

CH4 + e- → CH4+• + 2 e-

CH4 + e- → CH3+• + e- + H- etc.

M + e- → M-


Insbesondere für Substanzen mit einer hohen Elektronenaffinität, wie man sie z. B. bei

halogenhaltigen Substanzen findet, kann der NCI-Modus sehr selektiv und sensitiv sein

(Thermo Quest Finnigan, 1999).

7.1.3 Qualitative und quantitative Auswertung

Die graphische Auswertung erfolgt entweder als total ion chromatogram (TIC) oder als

reconstructed ion chromatogram (RIC). Beim TIC erfolgt die Auswertung über den gesamten

Massenbereich, während beim RIC nach der Messung gewünschte Massenfragmente

vorgegeben werden, deren Massenspuren dann selektiv angezeigt werden.

Die qualitative Identifizierung der Analyten erfolgte anhand der Retentionszeiten und anhand

evtl. erzeugter charakteristischer Massenfragmente (m/z). Zunächst wurden die

charakteristischen Fragmente, die für jedes Molekül spezifisch und selektiv sind, im EI-

Modus unter Verwendung des Full Scan–Modus bestimmt. Dabei wurden Scans über einen

m/z-Bereich von 30–1000 aufgenommen, so dass das gesamte Massenspektrum (Molekül-

und Produktionenspektrum) erkennbar war. Die quantitative Auswertung erfolgte meist mit

Hilfe der beiden signalintensivsten Massenfragmente. Die Intensität der Peakflächen dieser

Fragmentionen wurde im RIC-Modus bestimmt.

Zunächst sollte festgestellt werden, ob eine quantitative Auswertung mittels internem

Standard, der vor jeglichem Aufarbeitungsschritt zugegeben wird, möglich ist. Auf diese

Weise lassen sich die meisten Fehler bei der Probenaufbereitung korrigieren. Dazu gehören

Volumenfehler und Analytverluste bei der Aufarbeitung der Proben, Fehler bei der

Probenaufgabe (z.B. Dosierfehler oder Undichtigkeiten) werden kompensiert, Zersetzungen

im Trennsystem werden berücksichtigt und Schwankungen der Detektoranzeige werden

korrigiert. Der interne Standard kompensiert die möglichen Verluste durch Adsorption an

Glaswänden, Einschluss in Matrixbestandteile, Verluste beim Einengen mit Stickstoff etc.

während des gesamten Analysengangs. Das Prinzip besteht darin, dass zu der zu

analysierenden Probe vor der Aufarbeitung eine definierte Konzentration einer als „interner

Standard“ dienenden Substanz zugefügt wird. Idealerweise sollte dieser den zu

bestimmenden Verbindungen möglichst ähnlich sein bzw. sich bei der Aufarbeitung und

chromatographischen Trennung sehr ähnlich wie diese verhalten, aber in der Probe auf

keinen Fall vorhanden sein und sich sauber von den Analyten trennen lassen. Hier bieten

sich insbesondere die mittels Stabilisotopen markierten deuterierten (2H) bzw. 13C-markierten

Homologen der Analyten an.

Da bei der Messung die Konzentration an zugegebenem internem Standard bekannt ist,

kann die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen über die Verhältnisse der

Peakflächen berechnet werden. Der Detektor-Response (Intensität des Signals in Bezug zur


injezierten Konzentration) kann jedoch für verschiedenartige Substanzen, selbst wenn sie

sich nur durch Isotopensubstitution unterscheiden, ggf. unterschiedlich sein. Dieser

Unterschied muss bei der Berechnung berücksichtigt werden. Dazu wird eine

Kalibrationslösung analysiert, die den internen Standard und die zu bestimmenden

Substanzen in definierten Konzentrationsverhältnissen zueinander enthält. Mit Hilfe der

erhaltenen Signale errechnet man den „Responsefaktor“ R, der das Verhältnis der

Peakfläche des internen Standards zur Peakfläche des Analyten beschreibt (Cammann,

2001).

xISTD

xISTD

FccFR

××

= Gleichung 1

R = Responsefaktor

ISTDF = Peakfläche interner Standard

xc = Konzentration zudotierter Analyt

ISTDc =Konzentration zudotierter interner Standard

xF = Peakfläche Analyt

Im Idealfall verhält sich der Analyt während des Analysengangs genauso wie der interne

Standard, so dass der Responsefaktor bei 1 liegt. In der Realität weicht der Wert aber

meistens von 1 ab. Wichtiger als ein Wert nahe 1 ist allerdings, dass der Responsefaktor

über mehrere Messungen konstant bleibt. Die für die einzelnen Analyten verwendeten

internen Standards sind in Tabelle 7.2 aufgelistet.

Tabelle 7.2: Verwendete interne Standards

Analyt interner Standard 4-Nonylphenol 4n-Nonylphenol

Octylphenol 4n-Nonylphenol

Bisphenol A Bisphenol A-d16

17β-Estradiol 17β-Estradiol-17-acetat

Estron 17β-Estradiol-17-acetat

Estriol 17β-Estradiol-17-acetat

17α-Ethinylestradiol 17β-Estradiol-17-acetat

Unter Verwendung eines internen Standards lässt sich die Konzentration der Analyten in der

Probelösung mit Hilfe folgender Gleichung (Cammann 2001) berechnen:


RF

cFcISTD

ISTDxx ×

×= Gleichung 2

xc = Konzentration Analyt


ISTDc = Konzentration interner Standard

ISTDF = Peakfläche interner Standard

R = Responsefaktor

Sind die Schwankungen des Responsefaktors zu hoch, wird statt des internen

Standardverfahrens, die Quantifizierung mittels eines externen Standards gewählt. Dabei

analysiert man zum einen die Probe und separat dazu eine Lösung mit definierten

Konzentrationen an den zu bestimmenden Substanzen („Standardlösung“). Durch Vergleich

der Peakflächen in der Standardlösung und in der Probenlösung lassen sich die Gehalte in

der Probe errechnen. Unter der Voraussetzung, dass gleiche Probenvolumina injiziert

wurden, wird die Probenkonzentration im linearen Bereich der Messkurve nach folgender

Gleichung (Cammann 2001) berechnet:

STD

STDxx F

cFc ×= Gleichung 3

xc = Konzentration Analyt


STDc = Konzentration externer Standard

STDF = Peakfläche externer Standard

Bei der Quantifizierung mittels externem Standard ist es besonders wichtig, sehr exakt zu

arbeiten, um die nun möglichen Fehlerquellen, welche durch interne Standards kompensiert

werden, auszuschließen. Nach höchstens fünf Proben ist eine neue Standardlösung zu

injizieren, um eine evtl. Veränderung der Empfindlichkeit des Analysengerätes zu

berücksichtigen.

Sowohl bei der Quantifizierung mittels internem als auch externem Standard müssen

zusätzlich die individuellen Anreicherungs- oder Verdünnungsfaktoren berücksichtigt werden.


7.2 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus wässrigen Matrices

Die simultane chemische Analytik der ausgewählten sieben endokrin wirksamen Substanzen

setzt sich aus sieben verschiedenen Schritten zusammen, deren Fließschema in

Abbildung 7.1 gezeigt ist und die im Folgenden näher erläutert werden.

7.2.1 Probennahme und Probenvorbereitung

Die Proben wurden der Abwasserreinigungsanlage Aachen Soers entnommen. In dieser wird

überwiegend kommunales Abwasser in einer Mischwasserbehandlung zusammen mit dem

anfallenden Regenwasser gereinigt. Dazu kommt ein zusätzlicher Anteil an industriellem

Abwasser. Die Abwasserreinigung besteht aus einer mechanischen Reinigung, einer

biologischen Reinigung, einer weitergehenden Reinigung und einer Schlammbehandlung. Im

Anschluss wird der Ablauf in den Vorfluter, die Wurm, abgeschlagen (Stadt Aachen, 1998).

Die Proben wurden grundsätzlich in mit Aceton gereinigte Glasgefäße (4 Liter) gefüllt. Vor

Ort wurden die Probenahmegefäße zunächst mit einem kleinen Teil der Probe konditioniert,

die dafür verwendete Probenmenge wurde verworfen. Für eine qualifizierte Stichprobe

wurden 5 Probenaliquote in äquidistanten Zeitabständen innerhalb von 10 min in dasselbe

Probenahmegefäß gefüllt und gut geschüttelt (DIN 38402-11 (DEV A11)). Mit 15%-iger

Salzsäure wurde die Probe auf einen pH von 4-5 angesäuert, um eine mögliche bakterielle

Umsetzung der EDCs während des Transportes und der Anreicherung zu verhindern. Die

Proben wurden, wenn möglich, unmittelbar nach Eintreffen im Labor aufgearbeitet. War eine

direkte Aufarbeitung nicht möglich, wurden die Proben kühl (< 4°C) und dunkel gelagert. Die

Aufarbeitung erfolgte maximal einen Tag später, da ansonsten Veränderungen des

Probenmaterials nicht mehr auszuschließen waren.


Festphasenextraktion an C18-Material

Elution mit Aceton

Reinigung an Kieselgel

Elution mit Aceton/Pentan (2:1), trocknen

Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids

GC/MS-Detektion

Probenahme (500 mL Zulauf bzw.

1000 mL Ablauf)

Abbildung 7.1: Fließschema der chemischen Analytik von EDCs aus Abwässern


7.2.2 Festphasenextraktion

Zur automatischen Anreicherung der EDCs wurde eine Festphasenextraktion (solid phase

extraction – SPE) durchgeführt. Dazu wurde eine Zymark Autotrace SPE Workstation

(Hopkinton, USA) verwendet. Als SPE-Material wurden Octadecyl- (C18)-SPE-Säulen (J.T.

Baker, Niederlande) (Korngröße 47 - 60 µm, aktive Oberfläche 320 - 350 m2/g,

Kohlenstoffbelegung 7 %) verwendet. Entsprechend der zu extrahierenden Abwassermenge

wurden Säulenfüllungen von 500 und 1000 mg C18-Material verwendet.

Die Konditionierung der SPE Phase erfolgte bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 mL/min

zuerst mittels 6 mL Aceton, im Anschluss mit 6 mL Methanol und zum Schluss mit 6 mL

demineralisiertem Wasser (Millipore). Um eine Verblockung des Festphasenmaterials zu

vermeiden wurden die Proben vor der Anreicherung durch einen Glasfaserfilter (∅ 150 mm,

Macherey Nagel, Deutschland) filtriert. Im Anschluss an die Konditionierung wurden die

Proben, 500 mL Zulauf, bzw. 1000 mL Ablauf mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 mL/min

auf die Kartuschen geladen. Nachdem die Proben aufgebracht waren, wurden die

Kartuschen im Stickstoffstrom für 30 min getrocknet. Die Analyten wurden mit einem Fluss

von 2 mL/min mit 3 x 2 mL Aceton wieder eluiert. Das Eluat wurde bei 60 °C im Metallblock-

Thermostat im Stickstoffstrom auf ca. 0,5 mL eingeengt. Das SPE-Material wurde verworfen.

Die Anreicherungsparameter sind in Tabelle 7.3 zusammengestellt.

Tabelle 7.3: Anreicherungsparameter

Parameter Fließgeschwindigkeit [mL/min]

Volumen [mL]

Zeit [min]

Konditionierung 2 Aceton 6 Methanol 6

demineralisiertes Wasser 6

3 3 3

Anreicherung 10 Zulauf 500 Ablauf 1000

34 67

Trocknung 30

Elution 2 Aceton 3 x 2 3

7.2.3 Probenaufreinigung

Das eingeengte Eluat der Festphasenextraktion wurde manuell auf eine mit 1000 mg

Kieselgel gefüllte Säule (J.T. Baker, Niederlande) (Korngröße 47–60 µm, aktive Oberfläche

535 m2/g) gegeben, die zuvor dreimal mit je 1 mL Aceton/Pentan (2:1) konditioniert worden

war. Nachdem das Eluat auf das Kieselgel aufgezogen war, wurden die Analyten mit dreimal


2 mL der gleichen Aceton/Pentan-Mischung eluiert. Das Eluat wurde in verschließbaren

Glasröhrchen aufgefangen und zur Trockene eingeengt. Das zur Reinigung eingesetzte

Säulenmaterial wurde verworfen.


In den Vorversuchen (siehe Abschnitt 7.1.1) hatte sich gezeigt, dass die Verwendung von

Heptafluorbuttersäureanhydrid (HFBAA) als Derivatisierungsreagenz bei der MS-Detektion

und der Quantifizierung die besten Ergebnisse lieferte (siehe Abschnitt 8.1.2). Deshalb

wurde HFBAA auch für die Derivatisierung der EDCs aus wässrigen Matrices verwendet.

Dazu wurde der mittels clean-up an Kieselgel (Abschnitt 7.2.4) gereinigte und im

Stickstoffstrom bis zur Trockene eingeengte Probenextrakt in 200 µL Acetonitril wieder

aufgenommen und mit 30 µL HFBAA versetzt. Nach 30 min Reaktionszeit bei 60 °C

Reaktionstemperatur wurde die Derivatisierung durch Abblasen im Stickstoffstrom

unterbrochen und der Rückstand in mindestens 100 µL Aceton wiederaufgenommen und

konnte so für die GC/MS-Analyse eingesetzt werden.

7.2.5 Durchführung der GC/MS-Analyse zur qualitativen und quantitativen Bestimmung

Die eingesetzen Parameter zur GC/MS-Analyse im EI-Ionisierungsmodus und die qualitative

sowie quantitative Auswertung sind in den Abschnitten 7.1.2 und 7.1.3 beschrieben.

7.2.6 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässriger Matrix eingesetzen Methode

Um die entwickelte Methode zur Bestimmung der ausgewählten endokrin wirksamen

Substanzen zu validieren, wurden die Wiederfindungen der Analyten, die Reproduzierbarkeit

der Bestimmungsmethode sowie die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der EDCs

ermittelt.

7.2.6.1 Bestimmung der Wiederfindungen

Um die Wiederfindungen der Analyten zu bestimmen wurde entmineralisiertes Wasser

(Millipore) sowie der Zulauf zur Kläranlage und der Ablauf der Nachklärung der Kläranlage

Aachen Soers mit den zu bestimmenden Analyten dotiert. Das Probenvolumen des


entmineralisierten Wassers und des Ablaufs der Nachklärung betrug jeweils 4000 mL, das

mit 400 µL einer Stammlösung, gemischt aus den sieben EDCs, dotiert wurde. Die

Stammlösung enthielt ca. 100 µg/mL eines jeden Analyten, gelöst in Aceton. Es wurden

dreimal je 1000 mL wie oben beschrieben aufgearbeitet. Das Endvolumen der Probenlösung

vor Injektion in das GC/MS-System betrug 1000 µL.

Zur Bestimmung der Wiederfindung im Zulauf der Kläranlage wurden 2000 mL Zulauf mit

200 µL Stammlösung dotiert. Davon wurden dreimal 500 mL aufgearbeitet und ebenfalls auf

ein Endvolumen von 1000 µL angereichert. Parallel dazu wurde von der jeweiligen Matrix

eine Blindprobe aufgearbeitet, der nur die entsprechende Menge Aceton ohne EDCs

zugesetzt worden war. Der dadurch erhaltene Blindwert wurde von dem Probenwert

subtrahiert. Die mathematische Berechnung der Probenkonzentration folgt Gleichung 3. Die

Wiederfindung ergibt sich aus Gleichung 4.

100)(×

−=

dotiert

bx

cccW Gleichung 4

W = Wiederfindung [%]

xc = bestimmte Konzentration [µg/mL]

bc = Konzentration Blindwert [µg/mL]

dotiertc = zudotierte Konzentration [µg/mL]

Aus den drei bestimmten Werten wurde der Mittelwert gebildet.

7.2.6.2 Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode

Unter der Reproduzierbarkeit einer Methode versteht man die „Wiederholbarkeit von

Messgrößen unter gleichen Bedingungen über die Zeit“ (Gottwald 1995). Die

Reproduzierbarkeit ist also eine Angabe, wie groß der Fehler einer Bestimmungsmethode

ist. Mathematisch lässt sich dies, als absolute Zahl, durch die Standardabweichung (s)

(Gleichung 5) ausdrücken.

( )1

2

−

−= ∑

nxx

s i Gleichung 5

s = Standardabweichung

ix = Messwert

x = Mittelwert über alle Messungen

n = Anzahl der Messungen


Zur relativen Beurteilung, wird der Variationskoeffizient (V) verwendet (Gleichung 6).

%100×=xsV Gleichung 6

V = Variationskoeffizient in %

s = Standardabweichung

x = Mittelwert über alle Messungen

Um die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse aus wässrigen Proben zu gewährleisten

wurden je 1000 mL demineralisiertes Wasser, Zulauf und Ablauf der Nachklärung mit ca.

20 µg der Substanzen dotiert und wie beschrieben aufgearbeitet. Die Proben wurden auf ein

Volumen von 1000 µL gestellt. Jede Probe wurde fünfmal gaschromatographisch getrennt

und die Inhaltstoffe massenspektrometrisch im EI- Modus detektiert. Die Reproduzierbarkeit

wurde aus den Mittelwerten der Peakflächen der EDC-Signale bestimmt.

7.2.6.3 Ermittlung der Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenzen

Als Nachweisgrenze (NG) einer Methode wird der kleinste Messwert bezeichnet, bei dem die

Analyten gerade noch nachgewiesen werden können. Die Bestimmungsgrenze (BG) einer

Methode ist der kleinste Messwert, bei dem die Analyten noch quantifiziert werden können.

Für die Berechnung der NG und der BG der Analysenmethode wurde die

Kalibriergeradenmethode der DIN 32654 (1994) herangezogen. Dafür wurden

Kläranlagenzu- und -ablauf mit je 6 äquidistanten Analytkonzentrationen im Bereich der

Nachweisgrenze dotiert und versucht, die entsprechende Konzentrationen zu bestimmen.

Die Nachweisgrenzen der EDCs wurden nach folgender Gleichung berechnet:

xfx Q

xnm

tsNG2

:011++××= α Gleichung 7

f = n – 2 Freiheitsgrade

0xs = Verfahrensstandardabweichung

α:ft = Quantil der t-Verteilung für ƒ Freiheitsgerade mit einem Signifikanzniveau α

von 0,05

m = Anzahl der Messungen an der Analysenprobe

n = Anzahl der Messungen der Kalibrierproben

x = arithmetisches Mittel der Gehalte aller Kalibrierproben

xQ = Summe der Abweichungsquadrate von x bei der Kalibrierung.


Für die Bestimmungsgrenze (BG) galt entsprechend:

( )x

NGfx Q

xxknm

tskBG2

:011 −×++×××= α Gleichung 8

f = n – 2 Freiheitsgrade

k = relative Ergebnisunsicherheit zur Charakterisierung der BG

(k = 3 angenommen, was einer Ergebnisungenauigkeit von 33,3 %

entspricht)

0xs = Standardabweichung des Verfahrens

α:ft = Quantil der t-Verteilung für ƒ Freiheitsgerade mit einem Signifikanzniveau α

von 0,05

m = Anzahl der Messungen an der Analysenprobe

n = Anzahl der Messungen der Kalibrierproben

NGx = Nachweisgrenze

x = arithmetisches Mittel der Gehalte aller Kalibrierproben

xQ = Summe der Abweichungsquadrate von x bei der Kalibrierung.

Gleichzeitig wurde in diesem Schritt die Linearität der Kalibriergeraden durch Bestimmung

der Korrelationskoeffizienten überprüft. Dieser wird wie folgt berechnet:

2

22

2

)()())((

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

−−∑

−−∑=

FFccFFccr

nn

nn Gleichung 9

2r = Korrelationskoeffizient

nc = Konzentration Analyt Nr. n (n = 1 - 6)

c = arithmetisches Mittel aus n Konzentrationen

nF = Peakfläche Analyt, verursacht durch Konzentration n

F = arithmetisches Mittel aus n Peakflächen


7.3 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Klärschlämmen

Die chemische Analytik von EDCs aus Klärschlamm setzt sich aus den in Abbildung 7.2

übersichtsweise dargestellten Schritten zusammen, die im Folgenden näher erläutert

werden.

7.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung

Da die Matrixeffekte der Schlammextrakte höher waren, als die der untersuchten Abwässer,

mussten für die vollständige Extraktion der EDCs aus Klärschlämmen noch effizientere

Extraktionsverfahren eingesetzt werden.

Aus diesem Grunde wurde zunächst 1 mL einer Standardlösung mit einer Konzentration von

ca. 20 µg/mL der ausgewählten EDCs, gelöst in Aceton, an verschiedenen Adsorbentien

(Tabelle 7.4) getestet und die Wiederfindungen bestimmt. Es sollte untersucht werden, ob

durch Vergrößerung der Adsorbensmenge bereits eine Auswirkung auf die Wiederfindung

der Analyten zu spüren war. Die Wiederfindungen wurden dann mit den Ergebnissen der

bisher für wässrige Matrices verwendeten Reinigung verglichen.

Da keine vorgefertigten chromatographischen Säulen käuflich zu erwerben waren, wurden

diese manuell gepackt. Dazu wurden Glassäulen mit einem Innendurchmesser von 1 cm

verwendet. Unten war die Glassäule mit einer Glasfritte (Porendurchmesser G0) versehen.

Auf diese wurde zunächst 1 cm Natriumsulfat gefüllt, dann das Adsorbens mit der

Lösungsmittelmischung eingeschlämmt, die auch später zur Elution genutzt wurde. Den

Abschluss bildete wiederum eine 1 cm dicke Schicht aus Natriumsulfat. War die

Laufmittelfront bis auf die Oberfläche des Natriumsulfates abgesunken, wurde die

Standardlösung aufgebracht. Nachdem diese bis auf die Oberfläche des Natriumsulfates

gesunken war, wurde das Elutionsmittel aufgebracht und eine Tropfgeschwindigkeit von ca.

1 Tropfen/s eingestellt. Die genaue Kombination der einzelnen Parameter ist in Tabelle 7.4

aufgeführt. Die Reinigungsleistung der unterschiedlichen Adsorbentzien in Verbindung mit

verschiedenen Elutionsmitteln wurde durch Bestimmung der Wiederfindungen der

zudotierten Analyten bestimmt.


Zentrifugieren, gefriertrocknen,

mahlen

ASE-Extraktion

Probennahme ca. 5 L

Klärschlammsuspension

Anreicherung an

C18-Festphasenmaterial

Elution mit Aceton

Elution mit Aceton/Pentan (2:1), trocknen

Reinigung an Kieselgel

Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids

n

Abbildung 7.2: Fließschema der chem

GC/MS-Detektio

ische Analytik von EDCs aus Klärschlämmen


Tabelle 7.4: Vorversuche zur chromatographischen Reinigung von Stadardlösungen

Probe Nr.

Adsorbens Menge [g]

Elutionsmittel (v/v)

Volumen [mL]

1 Kieselgel 5 Ethylacetat/Toluol 3 + 1

30

2 Kieselgel 5 Ether/Methanol/ Ameisensäure 1 + 1 + 0,05

20

3 Florisil 5 Ethylacetat/Toluol 3 + 1

30

4 Florisil 5 Ether/Methanol/ Ameisensäure 1 + 1 + 0,05

20

5 Aluminiumoxid 5 Ethylacetat/Toluol 3 + 1

30

6 Aluminiumoxid 5 Ether/Methanol/ Ameisensäure 1 + 1 + 0,05

20

7 Kieselgel 5 Aceton/Pentan 3 + 1

30


30


50


30


30


30


6

7.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung

Um zu überprüfen, ob die für die wässrigen Proben verwendete Menge

Derivatisierungsreagenz von 30 µL ausreichend ist, oder ob durch die höheren

Konzentrationen an Matrix Interferenzen in Form von Mehr- oder Minderbefunden auftraten,

wurde ein Schlammextrakt mit je ca. 20 µg/mL der verwendeten EDCs, in Aceton gelöst,

dotiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach dem in Abschnitt 7.2.4 beschriebenen

Schema. Nur die Derivatisierung wurde mit unterschiedlichen Mengen

Derivatisierungsreagenz (20, 30, 40, 50, 60 und 70 µL) durchgeführt. Die Reaktionszeit und

–temperatur wurden bei 60 °C und 30 min belassen. Nach GC/MS-Detektion wurden die


Wiederfindungen der EDCs bestimmt. Die Menge des Derivatisierungsreagenzes mit der

höchsten Wiederfindung wurde für die weitere Derviatisierung des Probematerials

verwendet.

7.3.3 Probenahme und Probenvorbereitung realer Proben

Der Kläranlage Aachen Soers wurden jeweils je 20 Liter Belebt- und

Faulschlammsuspension entnommen. Zur Sedimentation wurde die Klärschlammsuspension

für 1–3 h stehen gelassen. Das überstehende Abwasser wurde dekantiert und verworfen.

Die verbleibende Suspension aus Abwasser und Schlamm wurde in

Metallzentrifugenbehälter überführt und für 10 min bei 2000 U/min zentrifugiert (Heraeus

Christ GmbH, Osterode). Der Überstand wurde verworfen. Um einen mikrobiellen Abbau der

endokrin wirksamen Substanzen zu verhindern wurde den entwässerten Schlammproben

direkt nach der Zentrifugation 0,1 % Natriumazid zusetzt. Die Suspension wurde in den

folgenden 30min mehrfach manuell geschüttelt und im Anschluss auf - 86 °C gekühlt und

gefriergetrocknet. Konnten die Proben nicht direkt weiter bearbeitet werden, wurden die mit

Natriumazid stabilizierten Proben dunkel und kühl (< 4 °C) gelagert und innerhalb der

nächsten zwei Wochen weiterverarbeitet.

7.3.4 Herstellung von dotiertem Probematerial

Um eine Methode zur Analytik von EDCs aus Klärschlämmen zu entwickeln, musste

zunächst dotiertes Material mit bekannter Konzentration der EDCs hergestellt werden, da

kein Referenzklärschlamm mit allen sieben EDCs käuflich zu erwerben war. Die Herstellung

folgte weitgehend dem von Meesters et al. (2002) publiziertem Verfahren.

Die Probenahme und die Probenvorbereitung wurde bereits unter 7.3.3 beschrieben. Nach

der Zentrifugation wurde von den Abwasserschlammkonzentraten, für die Bestimmung des

Trockensubstanzgehalts (TS), eine geringe Menge abgenommen und in Aluminiumschalen

bei 105 °C im Trockenschrank (Memmert, Deutschland) bis zur Gewichtskonstanz

getrocknet. Aus den Massen vor und nach der Trocknung wurde der vorläufige

Trockensubstanzgehalt bestimmt.

Das verbleibende Abwasserschlammkonzentrat wurde auf je zwei 2 Liter Glasflaschen

verteilt. Um einen vorzeitigen biologischen Abbau der zu betrachtenden EDCs zu verhindern,

wurde die Biocenose möglichst weitgehend abgetötet. Zu diesem Zweck wurden zum einen

je 2 Glasflaschen mit Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrat mit 0,1 % Natriumazid und drei

Wolframcarbidkugeln versetzt. Während der folgenden 30 min wurde die Suspension

mehrfach durch manuelles Schütteln durchmischt. Zum anderen wurden je 2 Glasflaschen


mit Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrat für 15 min bei 120 °C sterilisiert. Jeweils eine

Flasche des mit Natriumazid abgetöteten Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrats sowie je

eine Flasche des autoklavierten Belebt- bzw. Faulschlammkonzentrats wurden mit der

gewünschten Menge der zu bestimmenden EDCs, gelöst in Aceton, dotiert. Diese Menge

wurde auf den angenommenen Trockensubstanzgehalt bezogen. Nach der Bestimmung des

TS durch Gefriertrocknung erfolgte später die genaue Berechnung der durch Zugabe

erzielten EDC-Gehalte. Die übrigen Flaschen mit Belebt- bzw. Faulschlamm wurden zur

Bestimmung der Blindwerte genutzt und nur mit der entsprechenden Menge Aceton dotiert.

Um eine gründliche Durchmischung der Schlammkonzentrate zu gewährleisten und um den

Analyten die Chance zu geben an der Matrix zu adsorbieren oder in Bakterienzellen

eingelagert zu werden, wurden die Flaschen 24 h auf einem Überkopfschüttler (Gerhardt,

Königswinter) durchmischt und dabei homogenisiert. Durch diese Prozedur sollten die

natürlichen Vorgänge der Adsorption soweit wie möglich nachvollzogen werden. Im

Anschluss wurde das noch feuchte Schlammkonzentrat zur Gänze gefriergetrocknet (Christ

Alpha 1 + 4, Heraeus Christ GmbH, Osterode) und in einer Kugelmühle (Retsch, Haan) bei

50 Umdrehungen/s 30 min lang gemahlen und homogenisiert. Durch Bestimmung der Masse

vor und nach der Gefriertrocknung wurde der endgültige Trockensubstanzgehalt bestimmt,

mit dessen Hilfe die tatsächlich vorhandenen Konzentrationen der EDCs berechnet werden

konnten. Die dotierten, trockenen und gemahlenen Schlämme wurden in Braunglasgefäße

gefüllt und bei 4 °C bis zur Analyse gelagert. Diese Schlämme wurden im weiteren Verlauf

der Methodenentwicklung eingesetzt, um die Wiederfindungen der EDCs unter den

verschiedenen beschriebenen Parametern zu optimieren. Als optimierte Parameter werden

die Bedingungen ausgewählt, bei denen die Wiederfindungen möglichst nah um 100 %

lagen.

7.3.5 Extraktion

Um die ausgewählten endokrinen Substanzen aus Klärschlamm zu extrahieren wurde ein

„accelerated solvent extraction“-System (ASE) der Firma Dionex verwendet. Der Aufbau des

ASE-Gerätes ist in Abbildung 7.3 dargestellt. Dabei wird die Probe in eine verschließbare

Edelstahlextraktionszelle gegeben, diese wird im geschlossenen Zustand über ein

Pumpensystem mit dem gewünschten Lösungsmittel gefüllt. Im Ofen wird die

Extraktionszelle erhitzt und unter Druck gesetzt. Durch das Anlegen eines hohen Druckes

siedet das Lösungsmittel bei einer höheren Temperatur und somit ist eine bessere

Extraktionsausbeute zu erwarten. Nach der gewünschten Extraktionszeit wird der Extrakt

wiederum durch ein Pumpensystem in ein Sammelgefäß gedrückt, die Extraktionszelle wird


mit frischem Lösungsmittel gespült und Lösungsmittelreste werden im Stickstoffstrom

entfernt. Der Extrakt ist dann für die weitere Analyse bereit.

Im Laufe der Methodenentwicklung und –optimierung wurden die möglichen

Extraktionsparameter, wie z.B. die Art des Lösungsmittels, die Temperatur, der Druck usw.

variiert und angepasst. Die im Einzelnen untersuchten Extraktionsvarianten sind in

Tabelle 7.5 aufgeführt.

Im Anschluss an die Extraktion wurde der Extrakt mittels eines Rotationsverdampfers (Büchi,

Schweiz) bei einem Vakuum von 100 mbar und einer Temperatur von 50 °C auf ca. 1 mL

eingeengt. Der eingeengte Extrakt wurde quantitativ in einen 10 mL Messkolben überführt

und mit dem verwendeten Extraktionsmittel auf das gewünschte Endvolumen aufgefüllt.

Abbildung 7.3: Schematische Darstellung eines ASE-Gerätes (Dionex)

7.3.6 Anreicherung

Im Laufe der Methodenentwicklung zeigte sich, dass die Derivatisierung des

Schlammextraktes direkt nach der Reinigung an Kieselgel schwer möglich war. Der

Rückstand war in Aceton schwer löslich und stark mit Matrix belastet, was die folgende

GC/MS-Detektion durch schnelle Verschmutzung des Systems störte. Da dies bei den

wässrigen Proben nicht aufgetreten war, wurde aus den Schlammextrakten zunächst eine

wässrige Mischung hergestellt. Dazu wurde, wenn ein wasserlösliches

Extraktionslösungsmittel verwendet wurde, 1 mL des Extraktes in 100 mL Wasser gelöst. Bei

der Extraktion mit wasserunlöslichem Lösungsmittel wurde 1 mL des Extraktes im

Stickstoffstrom getrocknet, in Aceton wieder aufgenommen und anschließend in 100 mL


Wasser gelöst. Der nachfolgende Anreicherungsschritt entspricht weitestgehend dem

Verfahren, das bei der Anreicherung wässriger Proben, wie unter Abschnitt 7.2.3 erläutert ist,

verwendet wurde. Zur Sicherstellung der quantitativen Überführung des geringen

Probenvolumens von 100 mL wurde auf die automatische Anreicherung verzichtet und diese

manuell in der in Abbildung 7.4 gezeigten Apparatur (Schleicher & Schüll Dassel, Werkstatt

ISA) durchgeführt.

Tabelle 7.5: ASE-Extraktionsvarianten

Probe Nr.

Schlamm EDCs Lösungs- mittel

Temp-eratur [°C]

Druck[psi]

Extrak-tions-zeit

[min]

Extrak-tions-cyclen

Ein-waage

[g] 1 belebt alle Aceton 170 2000 45 1 2

2 belebt alle Aceto-nitril 170 2000 45 1 2

3 belebt alle Dichlor-methan

170 2000 45 1 2

4 belebt alle Ethyl-acetat 170 2000 45 1 2

5 belebt alle Methanol 170 2000 45 1 2

6 belebt alle Toluol 170 2000 45 1 2

7 faul alle Methanol 170 2000 45 1 2












19 belebt E1 + 0,1 % NaN3

Methanol 170 2000 45 1 2

20 belebt E2+ 0,1 % NaN3

Methanol 170 2000 45 1 2

21 belebt E1, E2 Methanol 170 2000 45 1 2 22 belebt E2 + 1 %

NaN3

Methanol 170 2000 45 1 2

23 belebt sterilisiert

alle Methanol 170 2000 45 1 2

24 faul sterilisiert

alle Methanol 170 2000 45 1 2

Die Probe wurde in einen Edelstahlzylinder geben, der mit der C18-Säule (1000 mg, J.T.

Baker, Niederlande) verbunden war. An der Verbindungsstelle war ein Glasfaserfilter


(∅ 50 mm, Schleicher & Schüll, Dassel, geglüht bei 450 °C) angebracht. Die als

Vorratsgefäß dienende Edelstahlhülse wurde mit Reistwasser vorgespült, um eine

quantitative Erfassung der Analyten zu gewährleisten. Mit Hilfe von Druckluft wurde die

Probe durch die C18-Säule gedrückt. Dabei wurde eine Tropfgeschwindigkeit von ca.

1 Tropfen/s eingestellt. Die feuchte Säule wurde 30 min lang im Stickstoffstrom getrocknet.

Im Anschluss daran wurden die Analyten mit 3 x 2 mL Aceton wieder eluiert. Das Eluat

wurde bei 60 °C im Stickstoffstrom auf ca. 0,5 mL eingeengt. Die Säulen wurden im

Anschluss verworfen.

Druckluftzufuhr

Glasfaserfilter (geglüht, T: 450°C)

Edelstahlhülse mitC -Anreicherungskartusche18

Sammelgefäß für das abgereicherte Probematerial

Adapter

Edelstahlvorratsgefäß mit Probematerial

Abbildung 7.4: Extraktionsapparatur (Schleicher & Schüll Dassel, Werkstatt ISA)

7.3.7 Probenaufreinigung

In den Vorversuchen hat sich gezeigt, dass eine Reinigung an 1000 mg Kieselgel und

Elution mit Aceton/Pentan die besten Ergebnisse geliefert hat, deshalb wurde diese zur

Reinigung der Probenextrakte eingesetzt. Dazu wurden sowohl die nicht vorbehandelten

ASE-Extrakte direkt, als auch die nach Zwischenreinigung durch Einbringung in

Reinstwasser und Anreicherung auf C18-Material erhaltenen Eluate verwendet. Der Extrakt

bzw. das Eluat wurde auf eine mit 3 x 1 mL Aceton/Pentan (2:1) konditionierte Kieselgelsäule

(1000 mg, J.T. Baker, Niederlande) gegeben. Nach vollständiger Aufgabe des Extraktes


wurden die Analyten mit 3 x 2 mL derselben Aceton/Pentan-Mischung eluiert. Das Eluat

wurde zur Trockene eingeengt und, wie in Abschnitt 7.3.8 beschrieben, derivatisiert.


Wie aus den Vorversuchen hervor ging, war die Derivatisierung mit 30 µL die effizienteste.

Deshalb wurde diese Menge an Reagenz beibehalten. Die weiteren Bedingungen sind mit

denen unter Abschnitt 7.2.4 identisch.

7.3.9 GC/MS-Messung und anschließende Auswertung der Ergebnisse

Die Parameter für die an die Derivatisierung anschließende GC/MS-Detektion und die

Ergebnissauswertung sind in Abschnitten 7.1.2 und 7.1.3 beschrieben.

7.3.10 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten Methode

Um die entwickelte Methode zur Bestimmung der ausgewählten endokrin wirksamen

Substanzen aus verschiedenen Klärschlämmen zu validieren, wurden die Wiederfindungen

der Analyten, die Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode und die Nachweis- sowie die

Bestimmungsgrenzen ermittelt.


Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurde die während der Methodenentwicklung

optimierte Variante verwendet, d. h. 2 g des mit ca. 35 µg/g TS der sieben EDCs dotierten

und sterilisierten Belebtschlamms sowie der mit ca. 40 µg/g TS der ausgewählten EDCs

dotierten und sterilisierten Faulschlamms wurde je dreimal mit Methanol in der ASE

extrahiert. Parallel dazu wurde jeweils ein undotierter Schlamm extrahiert, der zur

Bestimmung der Blindwerte herangezogen wurde. Die Extraktionen wurden bei einem Druck

von 2000 psi bei 170 °C über 45 min durchgeführt. 1 mL des auf 10 mL gestellten Extrakts

wurde in 100 mL entmineralisiertem Wasser gelöst, auf 1 g C18-Material angereichert, mit

6 mL Aceton eluiert, eingeengt und an 1 g Kieselgel gereinigt. Die Analyten wurden mit 6 mL

Aceton/Pentan (2:1) eluiert und das Lösungsmittel wurde im Stickstoffstrom entfernt. Der

Rückstand wurde in 200 µL Acetonitril wieder aufgenommen und mit 30 µL

Heptafluorbuttersäureanhydrid für 30 min im verschlossenem Reaktionsgefäß bei 60 °C


derivatisiert. Nach der Derivatisierung wurde das überschüssige Derivatisierungsreagenz

durch Trocknung im Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde in 1000 µL Aceton gelöst,

ein Aliquot von 2 µL wurde zur gaschromatographischen Trennung und

massenspektrometrischen Detektion verwendet. Die Wiederfindungen wurden, wie in

Gleichung 4 beschrieben, berechnet. Aus den drei bestimmten Wiederfindungen wurde der

Mittelwert gebildet.


Zur Gewährleistung der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse wurden je 2 g

gefriergetrockneter Belebt- und Faulschlamm (EDC-Gehalt ca. 40 µg/g TS) wie beschrieben

aufgearbeitet. Das Endvolumen der Probenlösung betrug 1000 µL. Jede Probe wurde

fünfmal gaschromatographisch getrennt und massenspektrometrisch im EI-Modus detektiert.

Die Peakflächen wurden verglichen. Die Berechnung erfolgte nach Gleichung 7 und 8.

7.3.10.3 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen

Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde der sterilisierte

Belebtschlamm, der mit ca. 35 µg/g TS dotiert war, mit undotiertem Belebtschlamm

gemischt, so dass unter der Veraussetzung, dass der undotierte Klärschlamm keine der

EDCs enthielt, Konzentrationen von ca. 2; 4; 7,5; 15 und 30 µg/g TS entstanden. Diese

Proben wurden wie beschrieben extrahiert und aufgearbeitet. Die mathematische

Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erfolgte analog zu Abschnitt 7.2.6.3.

Gleichzeitig wurde in diesem Schritt die Linearität der Bestimmungsmethode überprüft. Der

Extrakt wurde auf ein Volumen von 10 mL aufgefüllt. Von diesem Extrakt wurde 1 mL für die

oben beschriebene Aufarbeitung verwendet. Das Endvolumen betrug 100 µL. Die

Bestimmung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde an diesem Belebtschlamm

exemplarisch durchgeführt. Sollten weitere Schlämme aus anderen Kläranlagen oder

Klärstufen vorliegen, können sich die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen aufgrund von

Unterschieden in der Matrix geringfügig ändern.


7.4 Analytische Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Sedimenten

7.4.1 Beschreibung des beprobten Sees Volvi

Der See Volvi (Abbildung 7.5) ist ein meso- bis euthrophischer See, der im Norden von

Griechenland, ca. 11,5 km nordöstlich der Stadt Thessaloniki gelegen ist. Das gesamte

Gebiet ist durch die Ramsar Convention on Wetlands als ein international bedeutendes

Feuchtgebiet ausgewiesen. Aus diesem Grund ist es besonders wichtig, Kenntnisse über

das Vorkommen von Schadstoffen, wie z. B. endokrin wirksamen Substanzen zu gewinnen.

Das Feuchtgebiet enthält komplexe natürliche Lebensräume wie Süßwassergrenzgebiete,

Flussuferbewaldung und Buschwerk sowie landwirtschaftlich genutzte Flächen. Der See wird

hauptsächlich durch Regenwasser, Oberflächen- und Grundwasser sowie durch

Thermalquellen gespeist. Als Hauptkontaminationsquellen, die die Wasserqualität und den

trophischen Status beeinträchtigen können, treten landwirtschaftlicher Abfluss, Abwasser

aus der Tierhaltung, unbehandeltes oder teilweise behandeltes kommunales Abwasser und

Industrieabwasser hauptsächlich aus Färbereien und der Nahrungsmittelindustrie auf.

Weitere wichtige Quellen sind re-suspendierte Flusssedimente und erodiertes

Flussufermaterial (Kaiserli et al., 2002). An der Probenahmestelle 8 fließt der Fluss Megalo

Rema in den See. An diesem Fluss liegt eine kleine Kläranlage, deren Abwasser über den

Fluss in den See gelangt. An der Probenahmestelle 7 liegt die Stadt Nea Madytos mit ca.

5000 Einwohnern.

7.4.2 Probenahme

Die Probenahmen an den in Abbildung 7.5 bezeichneten Stellen des Sees erfolgten durch

Mitarbeiter des Arbeitskreises von Prof. K. Fytianos, Aristotle Universität Thessaloniki. Die

Oberflächensedimente wurden in einer Tiefe von 0–10 cm mit Hilfe eines Eckman Sammlers

genommen. Sie wurden alle drei Monate im Zeitraum von April 2003 bis März 2005

(Tabelle 7.6) gezogen, um einen saisonalen Überblick über das Vorkommen der endokrin

wirksamen Substanzen zu erhalten. Die Proben wurden in gekühlte Glasgefäße gefüllt und

bei 4 °C ins Labor transportiert. Dort wurden die Proben gefriergetrocknet und mit Hilfe einer

Kugelmühle homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch ein 75 µm Edelstahlsieb

gegeben. Diese getrockneten und gesiebten Sedimente wurden nach Deutschland

verschickt und hier weiter bearbeitet. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C.


12 3

4

5

6

7

8

9

Stadt

Fluss

BergeBerge

Abbildung 7.5: Die Lage des Sees Volvi auf dem griechischen Staatsgebiet sowie markante Landschaftspunkte im Umfeld des Sees sowie die Probenahmestellen

7.4.3 Analysengang

Die Sedimente wurden auf die EDCs analog zu den Klärschlämmen analysiert (optimiertes

Verfahren siehe Abschnitt 7.3.10.1).

Tabelle 7.6: Probenahmezeitpunkte

Probeserie Probenahmezeitpunkt A-Sedimente 21.04.03

B-Sedimente 03.07.03

C-Sedimente 23.11.03

D-Sedimente 25.02.04

E-Sedimente 26.04.04

F-Sedimente 01.07.04

G-Sedimente 08.10.04

H-Sedimente 16.03.05


7.4.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten Methode


Da hier kein Material unmittelbar nach Entnahme mit den entsprechenden EDCs dotiert

worden war, wurde aus den Sedimenten der ersten beiden Probenahmen ein Mischsediment

hergestellt. Dadurch sollte eine Beeinflussung der Wiederfindungen durch regionale

Unterschiede der Probenmatrix weitgehend ausgeschlossen werden. Nach

Homogenisierung wurden dreimal je 2 g Mischsediment mit 1 mL einer Standardlösung der

Analyten in Aceton mit einer Konzentration von ca. 40 µg/mL versetzt, durchmischt und über

Nacht stehen gelassen. Das zu extrahierende Sediment hatte somit eine Konzentration von

20 µg/g je Analyt. Gleichzeitig wurden 2 g des Mischsedimentes mit 1 mL Aceton versetzt

und genauso weiterbehandelt. Daraus wurden die Blindwerte der Analyten bestimmt, die von

den Ergebnissen für die dotierten Sedimente abgezogen wurden. Die Berechnung der

Wiederfindungen, die als Dreifachbestimmung durchgeführt wurde, erfolgt nach Gleichung 6.

Aus den drei bestimmten Werten wurde der Mittelwert gebildet.


Um die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zu gewährleisten wurden 2 g des dotierten

Mischsediments wie beschrieben extrahiert. Der Extrakt wurde auf ein Volumen von 10 mL

aufgefüllt. Davon wurde 1 mL wie beschrieben angereichert, gereinigt und derivatisiert. Der

Rückstand wurde in 250 µL Aceton wiederaufgenommen und in einer Fünffachbestimmung

mittels GC/MS-Messung untersucht. Die Peakflächen der Analyten wurden verglichen. Die

mathematische Bestimmung erfolgt nach Gleichung 7 und 8.


Die Nachweis- und die Bestimmungsgrenzen wurden durch eine Konzentrationsreihe

bestimmt. Zu diesem Zweck wurden je 2 g des undotierten Mischsediments mit 50, 125, 250,

500 und 1.000 µL einer Standardlösung, die die Analyten in einer Konzentration von

20 µg/mL gelöst in Aceton enthielt, dotiert. Ein Aliquot wurde nur mit 500 µL Aceton dotiert.

Die in dieser Probe enthaltenen EDCs werden als Blindwerte von den Ergebnissen der

dotierten Proben subtrahiert.


Die Sedimente wurden homogenisiert und über Nacht stehen gelassen. In den Proben waren

so schließlich Konzentrationen von je 0,5; 1,25; 2,5; 5 und 10 µg EDCs je Gramm TS

vorhanden. Nach Extraktion mittels ASE (Abschnitt 7.3.10.1) wurden die Extrakte dann auf

10 mL aufgefüllt. Je 1 mL der Extrakte wurden zur Anreicherung verwendet und

entsprechend der in Kap. 2.3.7 aufbereitet. Nach erfolgter Aufarbeitung waren die Analyten

in 100 µL Aceton gelöst. Die mathematische Auswertung entspricht der unter Absatz 2.2.7.3

vorgestellten Weise. Gleichzeitig wurde anhand dieser Messwerte die Linearität der GC/MS-

Bestimmungsmethode überprüft.

7.4.5 Analyse der realen Proben

Zur Analyse der realen Proben wurde je 2,5 g gefriergetrocknetes Sediment eingewogen und

extrahiert. Der Extakt wurde auf 5 mL aufgefüllt. Davon wurde 1 mL aufgearbeitet und zum

Schluss in 100 µL Aceton aufgenommen.

64 8 Ergebnisse

8 Ergebnisse

8.1 Vorversuche

Um bei der Methodenentwicklung zur Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen die

Derivatisierung, die GC-Trennung und die MS-Detektion beurteilen zu können, wurden

zunächst Reinstsubstanzen derivatisiert, gaschromatographisch getrennt und

massenspektrometrisch detektiert. Die Ergebnisse der chromatographischen Trennung der

verschiedenen Derivate sind in den Abbildungen 8.1 und 8.2 zu sehen. Dabei eluierten die

EDCs mit Hilfe der eingesetzten Säule in folgender Reihenfolge: NP, OP, BPA, EE2, E3, E2

und E1. Dies wurde bereits im TIC sichtbar, in den ausgewählten Massenspuren des RICs

ließen sich Matrixeinflüsse ausblenden und die Trennung der einzelnen Substanzen,

insbesondere aber die Trennung der unterschiedlichen NP-Isomeren, wurde deutlich

erkennbar.

Die Länge des Carboxylatrestes, und damit auch die Anzahl der Fluoratome des

Derivatisierungsreagenz hatte nur einen geringen Einfluss auf die Retentionszeit der

Derivate. Die mit unterschiedlichen Derivatisierungsreagenzien synthetisierten Verbindungen

desselben EDCs wurden mit vergleichbaren Retentionszeiten gefunden. Die Detektion

erfolgte hier im EI-Modus. In diesem Modus wurden die Trifluor- und die Pentafluorderivate

im TIC mit einer Intensität von E4 bis E5, d.h., mit ähnlichen relativen Intensitäten detektiert.

Die Heptafluorderivate der Xenoestrogene und der Steroide ließen sich jedoch um den

Faktor 10 empfindlicher detektieren.

In Abbildung 8.3 wurden dieselben Derivate der Reinsubstanzen in denselben

Konzentrationen wie in den Abbildungen 8.1 und 8.2 getrennt, die Detektion erfolgte dann

jedoch im NCI-Modus. Hier zeigten sich deutliche Unterschiede bei den

Nachweisempfindlichkeiten und den damit verknüpften S/N-Verhältnissen zwischen den

Derivaten unterschiedlichen Fluorgehaltes. So waren die Trifluorderivate von NP und OP im

NCI-Modus überhaupt nicht erkennbar. Die übrigen Trifluorderivate erschienen mit gutem

S/N-Verhältnis, die Empfindlichkeit war aber relativ zu den Pentafluor- und

Heptafluorderivaten wesentlich geringer. NP ließ sich auch als Pentafluorderivat im NCI-

Modus nicht detektieren, während OP erst im RIC durch Massenspuranalyse sichtbar wurde.

Als Heptafluorderivate ließen sich alle Substanzen mit einer ausreichenden Empfindlichkeit

detektieren.

8 Ergebnisse 65

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

Zeit [min]

A

B

C

D

E

F

Abbildung 8.1: Ionenstrom-Chromatogramme der Trifluor- und Pentafluorderivate, bestimmt im EI- Modus. (A): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton, derivatisiert mit TFAAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z: 203, 231, 245), BPA (m/z: 405, 420) und OP (m/z: 302); (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 322, 366), E2 (m/z: 351,464), E3 (m/z: 235, 349) und EE2 (m/z: 359, 374); (D): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton, derivatisiert mit PFPAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene NP (m/z: 253, 267, 281), BPA (m/z: 505, 520) und OP (m/z: 352); (F): RIC (D) der Steroide E1 (m/z: 372, 416), E2 (m/z: 429, 564), E3 (m/z: 399, 726) und EE2 (m/z: 396, 424)

66 8 Ergebnisse

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

010 12 14 16 18 20 22 24 26 3028

NP

OP

BPA

EE2

E3E2E1

NP

OP

BPA

EE2

E3

E2E1

Zeit [min]

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

MassenspurenSteroideHeptafluorderivate

2,00 E5

MassenspurenXenoestrogeneHeptafluorderivate

5,44 E6

TICHeptafluorderivate

1,30 E6

C

B

A

Abbildung 8.2: Ionenstrom-Chromatogramme der Heptafluorderivate, bestimmt im EI-Modus. (A): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z: 303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402); (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466), E2 (m/z: 237, 451), E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474)

8.1.1 Massenspektren

Die C-F-Bindungen sind aufgrund der hohen Elektronegativität des Fluors wesentlich stabiler

als die C-C-Bindungen. Deshalb wurden die C-C-Bindungen im Gegensatz zu den C-F-

Bindungen bevorzugt bei der Ionisierung fragmentiert. Aus diesem Grund unterschied sich

das Fragmentationsverhalten der Derivate unterschiedlichen Fluorgehalts ein und derselben

Substanz im EI-Modus vom Prinzip her nicht, nur die Massenzahlen der Fragmentionen

änderten sich in Abhängigkeit des Fluorgehalts.

Bei den isomeren NP-Derivaten (Abbildung 8.4) wurden aus der Alkylkette Fragmentionen

mit jeweils immer einer CH2- Gruppe zusätzlich abgespalten. Nicht jedes Fragment war in

den einzelnen NP-Isomeren enthalten. Ebenfalls waren die Intensitäten der Fragmente

zueinander bei den Isomeren unterschiedlich. Betrachtete man die sich im RIC unter dem

gesamten NP-Signal verbergenden Fragmente, so erscheinen, wie in Abbildung 8.4 zu

erkennen, alle neun möglichen Fragmente. Die Molekülionen der Derivate waren aber bei

allen drei NP-Derivaten nicht, oder nur sehr schwach ausgeprägt, zu erkennen.

8 Ergebnisse 67

0

Zeit [min]

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

A

B

C

D

E

F

Abbildung 8.3: Ionenstrom-Chromatogramme aller Derivate, bestimmt im NCI-Modus. (A): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton derivatisiert mit TFAAA; (B): RIC von (A) der EDCs NP (m/z: n.d.), BPA (m/z: 211, 323), OP (m/z: n.d.), E1 (m/z: 269), E2 (m/z: 133), E3 (m/z: 367) und EE2 (m/z: 277); (C): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton derivatisiert mit PFPAA; (D): RIC von (C) der EDCs NP (m/z: n.d.), BPA (m/z: 148), OP (m/z: 148), E1 (m/z: 148), E2 (m/z: 148), E3 (m/z: 164) und EE2 (m/z: 148); (E): TIC einer Lösung der sieben EDCs (c = 20 µg/L) in Aceton derivatisiert mit HFBAA; (F): RIC von (E) der EDCs NP (m/z: 199), BPA (m/z: 199), OP (m/z: 199), E1 (m/z: 199), E2 (m/z: 199), E3 (m/z: 215) und EE2 (m/z: 199)

68 8 Ergebnisse

Bei der Ionisierung der BPA-Dervate (Abbildung 8.5) entstand neben dem Molekülionenpeak

bei allen drei Derivaten mit unterschiedlichem Fluorgehalt jeweils nur ein einziges Fragment,

welches von der Abspaltung einer CH3-Gruppe herrührte.

Die OP-Derivate (Abbildung 8.6) zeigten ein dem NP ähnliches Fragmentierungsverhalten.

Allerdings war das Molekülion ausgeprägter und nicht jede mögliche Abspaltung einer CH2-

Gruppe wurde sichtbar, vielmehr wurden C4H9- und C7H5-Fragmente abgespalten.

Die Massenspektren der E1-Derivate enthielten die Molekülionen aller drei Derivate als

base-peaks (Abbildung 8.7). Desweiteren waren die Abspaltung von H2O, von C2H4O und

von einer Carboxylatgruppe erkennbar.

Die Spektren der E2-Derivate (Abbildung 8.8) wiesen das Molekülion und Fragmentionen mit

ungefähr gleicher Intensität auf. Diese waren durch die Abspaltung von einer bzw. zwei

fluorierten Carboxylatgruppen entstanden.

Eine Abspaltung dieser Carboxylatgruppen war neben dem Molekülion auch bei den

Spektren von E3 (Abbildung 8.9) zu sehen, wobei das Ion mit m/z 235 den base-peak

bildete.

Bei der Ionisierung der EE2-Derivate (Abbildung 8.10) trat nur die Fragmentierung von einem

Carboxylatrest auf. Die weiteren Fragmente entstanden durch die zusätzliche

Fragmentierung von einer CH3- bzw. CH-Gruppe. Es war jedoch kein Molekülion zu

erkennen.

Die Muster der EI-Fragmentspekten der Pentafluorderivate von E1 und E2 waren mit denen

von Croley et al., 2000 beschriebenen identisch.

Üblicherweise wird die Ionisierung im NCI-Modus als die gegenüber der EI-Ionisation

sanftere Ionisierungsmethode angesehen und dazu genutzt, Massenspektren zu erzeugen,

die neben dem Molekülion ([M+1]+) möglichst wenige Fragmente enthalten und die

Information der Molmasse liefern. Häufig stellt in NCI-Spektren das Molekülion sogar das

einzige Ion dar.

Die hier im NCI-Modus erzeugten Spektren der fluorierten EDC-Derivate (Abbildungen 8.11–

8.17) zeigten dagegen überhaupt keine Molekülionen sondern die Spektren enthielten

unspezifische, für die Identifizierung ungeeignete Fragmente. Die Trifluor- und

Pentafluorderivate der NP-Isomeren (Abbildung 8.11), sowie das Trifluorderivat des OP

(Abbildung 8.13) waren überhaupt nicht empfindlich genug detektierbar, um ein

Massenspektrum zu erhalten. Auch eine Optimierung der Einstellungen des

Massenspektrometers führte zu keinen sichtbaren NCI-Spektren. Es wird vermutet, dass der

relativ geringe Fluorgehalt der Detektion nicht förderlich war. Substanzen hingegen, die mehr

als eine derivatisierte Hydroxygruppe hatten oder deren Moleküle mehr als 5 Fluoratome

enthielten, zeigten einen NCI-MS-Response und deshalb auch ein Massenspektrum.

8 Ergebnisse 69


bestimmt unter EI-Bedingungen

100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

366

301287

273259

245

231

217203

189

239

253 267

281

295

309323

337225

303317

331

345

359373

387416

- C H2 5

- C H3 7

- C H4 9

- C H5 11

- C H6 13

- C H7 15

- C H8 17

-C H9 19

M+

M+

- C H2 5

- C H3 7

- C H4 9

- C H3 7

- C H4 9

- C H2 5

- C H5 11

- C H5 11

- C H6 13

- C H6 13

- C H7 15- C H8 17

- C H7 15

- C H8 17

-C H9 19

-C H9 19

289

0

20

40

60

80

100

9,87 E3

7,84 E3

4,76 E3

A

B

C

Abbildung 8.4: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

70 8 Ergebnisse

100 200 300 400 500 600 700m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

420

405

505

520

605

620

M+

M+

M+

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

2,27 E5

3,05 E5

1,04 E5

C

B

A

Abbildung 8.5: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter EI-Bedingungen.(A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 71

100 200 300 400 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

203

302

245

253

295

352

303

345

402

- C H4 9

- C H7 15

M+

- C H4 9

- C H7 15

M+

- C H4 9

- C H7 15

M+

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

9,76 E4

1,42 E5

9,21 E4

A

B

C

Abbildung 8.6: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

72 8 Ergebnisse

100 200 300 400 500 600m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

235253

322

348

366

309

416

398

372

359235

253

235253368

409

422

448

466

M+

M+

M+

- C F COO2 5

- C H O2 4

- H O2

- CF COO3

- C H O2 4

- H O2

- C F COO3 7

- C H O2 4

- H O2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 3,23 E3

1,64 E4

1,75 E4

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

A

B

C

Abbildung 8.7: Fragmentbildung der Estronderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 73

100 200 300 400 500 600 700 800m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

143

237 351

464

143

237

401

564

143

237

451

664

M+

M+

M+

- C F COO2 5

- CF COO3

- C F COO3 7

- 2 x C F COO3 7

- 2 x C F COO2 5

- 2 x CF COO3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

9,06 E3

4,69 E4

4,38 E4

A

B

C

Abbildung 8.8: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

74 8 Ergebnisse

200 400 600 800 1000m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

143

235

349

576

463

143

235

399 562

726

143

235

449

663876

M+

M+

M+

- C F COO2 5

- CF COO3

- C F COO3 7

- CF COO- CF COOH

3

3

- CF COO- 2 x CF COOH

3

3

- C F COO- C F COOH

2 5

2 5

- C F COO- 2 x C F COOH

2 5

2 5

- C F COO- C F COOH

3 7

3 7

- C F COO- 2 x C F COOH

3 7

3 7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100R

elat

ive

Inte

nsitä

t [%

]1,21 E4

5,43 E4

1,22 E5

C

B

A

Abbildung 8.9: Fragmentbildung der Estriolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 75

200100 300 400 500 600m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

245 304

331

346

374

429

359

245354

361

396

424

409

245

404

431

446

459

474

- C F COOH2 5

- CF COOH3

- C F COOH3 7

- CH3

- CH

- CH3

- CH

- CH

- CH3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

6,63 E3

3,20 E4

2,98 E4

A

B

C

Abbildung 8.10: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter EI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

76 8 Ergebnisse


bestimmt unter NCI-Bedingungen

200 300 400100m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

199

nicht nachweisbar

nicht nachweisbar

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

7,73 E4C

B

A

Abbildung 8.11: Fragmentbildung der Nonylphenolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 77

69

113

133

211

226

323

148

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

199

100 200 300 400 500m/z

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

2,86 E2

1,01 E5

7,12 E5

A

B

C

Abbildung 8.12: Fragmentbildung der Bisphenol A-Derivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

78 8 Ergebnisse

148

199

100 200 300 400 500

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

m/z

nicht nachweisbar

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

C1,41 E5

B1,01 E5

A

Abbildung 8.13: Fragmentbildung der Octylphenolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 79

113

145

212

269

363

148

199

100 200 300 400 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

C8,89 E5

B7,97 E4

A1,89 E1

Abbildung 8.14: Fragmentbildung der Estronderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

80 8 Ergebnisse

69

113

148

199

430

100 200 300 400 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

A

5,63 E2

B7,97 E4

C6,75 E5

Abbildung 8.15: Fragmentbildung der Estradiolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 81

5995

113

367

148

164

120

199

215

100 200 300 400 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C3,77 E5

B8,27 E4

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

A1,13 E2

Abbildung 8.16: Fragmentbildung der Estriolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

82 8 Ergebnisse

113 167

277

480

148

199

518

100 200 300 400 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C4,07 E4

B5,18 E4

A5,20 E1

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

Abbildung 8.17: Fragmentbildung der Ethinylestradiolderivate unter NCI-Bedingungen. (A): TFAAA-, (B): PFPAA- und (C): HFBAA-Derivat.

8 Ergebnisse 83

Die nachweisbaren Spektren wiesen in Abhängigkeit vom Derivatisierungsreagenz typische

Fragmente (Trifluor (3F): m/z = 113; Pentafluor (5F): m/z = 148; Heptafluor (7F): m/z = 199)

auf. Da dies häufig die einzigen Fragmente waren, die im NCI-Modus erhalten wurden,

erschien die Verwendung der NCI-Ionisierung zum substanzspezifischen Nachweis der

EDCs wenig geeignet. Denn die im NCI-Modus aus jedem Derivat erhaltenen Fragmente

waren derivatisierungsreagenz-spezifisch, d.h., sie waren aus der jeweiligen

Carboxylatgruppe und nicht aus der endokrin wirksamen Substanz entstanden. Welcher Teil

der Carboxylatgruppe letztendlich für das Fragment verantwortlich war oder ob das

Fragment durch Reaktion der Carboxylatgruppe mit dem Reaktantgas Methan und

anschließender Fragmentation entstand, konnte mit Hilfe der hier gezeigten Ergebnisse nicht

nachvollzogen werden.

Die quantitative Bestimmung der Substanzen erfolgte deshalb im EI-Modus, wobei jeweils

die Massenspuren der zwei intensivsten Fragmente genutzt wurden. Die hier ausgewählten

Fragmente sind in Tabelle 8.1 aufgelistet. Zur Quantifizierung der NP-Isomeren wurde

zusätzlich noch eine dritte Massenspur hinzugenommen, da die Alkylkette der NP-Isomeren

stark variierende Fragmentintensitäten aufwies. Zur repräsentativen und vollständigen

Erfassung wurden deshalb drei charakteristische NP-Derivatfragmente eingesetzt. Für OP

konnte nur die Massenspur des Molekülionenpeaks ([M]+) genutzt werden, da alle weiteren

vorkommenden Fragmentionen auch in den Spektren der NP-Derivate enthalten waren. Die

Quantifizierung von NP wurde dadurch nicht gestört, da die Spektren der NP-Derivate

genügend Fragmente zeigten, die nicht in den OP-Spektren enthalten waren.

Der Versuch der Quantifizierung im NCI-Modus gestaltete sich sehr viel schwieriger. Hier

war mit Ausnahme der Trifluorderivate meist nur ein Fragmention vorhanden. Dieses

Fragmention war kein substanzspezifisches Fragmention, da es aus dem Teil des Moleküls,

der durch die Derivatisierung angekoppelt worden war, entstand und somit für alle

Substanzen identisch war, d.h., es waren keine substanzspezifischen Fragmentionen

vorhanden. Hinzu kam, dass die NP-Isomeren und das OP als Trifluorderivat nicht detektiert

werden konnten. Dadurch ließ sich die übrige Fragmentvielfalt der Trifluorderivate nicht für

alle Substanzen ausnutzen.

Nach Beurteilung der erhaltenen Ergebnisse und Abwägung aller der Vor- und Nachteile

wurden zur Quantifizierung der ausgewählten EDCs im weiteren Verlauf dieser Arbeit die

Flächen der Peaks der im EI-Modus registrierten Massenspuren der EDCs genutzt. Als

Derivate wurden die aus HFBAA (Heptafluorbuttersäureanhydrid) erzeugten Verbindungen

genutzt.

84 8 Ergebnisse

Tabelle 8.1: Zur Quantifizierung verwendete Ionen (m/z) der unterschiedlichen EDC-Derivate

Fragmentionen (m/z) TFAAA-Derivate

Fragmentionen (m/z) PFPAA-Derivate

Fragmentionen (m/z) HFBAA-Derivate

Analyt

EI NCI EI NCI EI NCI NP 203, 231,

245 n.d. 253, 267,

281 n.d. 303, 331,

345 199

BPA 405, 420 211, 323 505, 520 148 605, 620 199

OP 302 n.d. 352 148 402 199

E1 322, 366 269 372, 416 148 422, 466 199

E2 351, 464 133 429, 564 148 237, 451 199

E3 235, 349 367 399, 726 164 235, 449 215

EE2 359, 374 277 396, 424 148 446,474 199 n.d.: nicht detektierbar

8.1.2 Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Detektors in Abhängigkeit des Derivatisierungreagenzes

Da die NCI-Massenspektren aufgrund fehlender Selektivität wenig aussagekräftig waren und

zudem nicht für jede Substanz detektierbar waren, wurde auf die Bestimmung der

Nachweisgrenze mit Hilfe der NCI-Detektion verzichtet. Die NG (Tabelle 8.2) im EI-Modus

lagen für die EDCs aus einer Standardlösung und ohne eine vorherige Anreicherung für alle

Derivate bei ca. 1 µg/mL. Für keines der untersuchten Derivatisierungsreagenzien ließen

sich signifikant bessere Nachweisgrenzen erreichen. Da die NG von EE2 als Trifluorderivat

und die NG von E2 als Pentafluorderivat aufgrund von Schwankungen in der

Kalibrationsgerade nicht bestimmbar war, konnte die Derivatisierung mittels

Heptafluorbuttersäureanhydrids als die Methode der Wahl bezeichnet werden.

Tabelle 8.2: Massenspektrometrische Nachweisgrenzen, bestimmt im EI-Modus, in Abhängigkeit von den verschiedenen Derivatisierungsreagenzien

Analyt TFAAA-Derivate [µg/mL] PFPAA-Derivate [µg/mL] HFBAA-Derivate [µg/mL] NP 0,96 1,19 0,11

BPA 0,33 1,80 0,35

OP 0,72 1,67 0,87

E1 0,98 1,59 0,97

E2 0,80 n.a. 1,61

E3 0,56 1,71 1,38

EE2 n.a. 1,21 0,67 n.a. nicht auswertbar

8 Ergebnisse 85

8.1.3 Responsefaktoren

Damit eine Quantifizierung mittels internem Standard erfolgen konnte, sollten die

Responsefaktoren (Definition und Berechnung siehe Abschnitt 7.1.3) möglichst konstant sein

und im Idealfall nahe bei 1 liegen. Diese Konstanz war aber wie in Tabelle 8.3 zusehen in

keinem Fall gegeben. Der Fehler bei der zwölffachen Bestimmung der Responsefaktoren,

ausgedrückt als Variationskoeffizient liegt zwischen 9,5 % für BPA und 94,3 % für NP. Da

keine Konstanz der Faktoren gegeben war, wurde auf eine Quantifizierung mittels internem

Standard verzichtet und auf eine Quantifizierung mittels externem Standard zurückgegriffen.

Tabelle 8.3: Ermittelte Responsefaktoren der estrogen wirksamen EDCs bei der MS-Detektion im EI- Modus

Analyt Mittelwert Responsefaktoren

Standardabweichung[± s]

Variationskoeffizient[%]

NP 0,92 0,87 94,3

BPA 0,83 0,08 9,51

OP 1,47 0,74 50,1

E1 1,04 0,39 37,8

E2 0,71 0,38 53,8

E3 0,53 0,29 54,7

EE2 1,81 1,40 77,1


Die Ergebnisse der chromatographischen Trennung von realen (nicht dotieren) und dotierten

Abwasserproben nach MS-Detektion im EI-Modus werden in den Abbildungen 8.18 und 8.19

gezeigt. Sowohl im TIC des Zulaufs als auch des Ablaufs waren in der Blindprobe keine

EDCs erkennbar. Erst die Massenspuranalyse machte deutlich, dass sowohl im Zulauf als

auch im Ablauf NP und BPA enthalten waren. In den dotierten Proben waren die EDCs

bereits im TIC erkennbar, wurden aber teilweise noch durch Matrixkomponenten überlagert.

In den RICs konnte durch gezielte Auswahl der Massenspuren die Matrix weitestgehend

ausgeblendet werden, so dass eine Quantifizierung erfolgen konnte.

86 8 Ergebnisse

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

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0

100

80

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0100

80

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20

0

100

80

60

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0

100

80

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0

100

80

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0

100

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0100

80

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0

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20

0

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20

0

100

80

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40

20

0

100

80

60

40

20

010 15 20 25 30 35

EE2NP

NP

BPA

OP

BPA

E3

E2

E1

NP

OP

BPA

EE2

E3E2

E1

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

AZulauf blind

TIC

4,24 E5

5,28 E3

1,52 E3

BZulauf blind

Massenspuren Xenoestrogene

CZulauf blind

Massenspuren Steroide

DZulauf dotiert

TIC

EZulauf dotiert


FZulauf dotiert


3,15 E5

1,27 E5

3,57 E5

Zeit [min] Abbildung 8.18: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus Kläranlagenzuläufen: (A): TIC einer undotierten Zulaufprobe, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC einer mit den sieben EDCs dotierten Zulaufprobe (c = 20 µg/L), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)

8 Ergebnisse 87

100

80

60

40

20

0

100

80

60

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20

0

100

80

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0

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0

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0100

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0

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0

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0

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0100

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0

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20

0

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80

60

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0

100

80

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20

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0

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0

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100

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60

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0

100

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20

0

100

80

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20

0100

80

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0

100

80

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20

0

100

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60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

010 15 20 25 30 35

NP

BPA

NP

OP

BPA E3

E2

E1EE2

NP

OP

BPA

EE2

E3

E2E1

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

Zeit [min]

AAblauf blind

TIC

BAblauf blind


CAblauf blind


DAblauf dotiert

TIC

EAblauf dotiert


FAblauf dotiert


2,20 E5

4,80 E3

1,07 E3

8,86 E5

4,51 E5

2,91 E5

Abbildung 8.19: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Extrakten aus Kläranlagenabläufen: (A): TIC einer undotierten Ablaufprobe, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC einer mit den sieben EDCs dotierten Ablaufprobe (c = 20 µg/L), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)

88 8 Ergebnisse

8.2.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus wässrigen Matrices eingesetzten Methode


Nach Anreicherung auf 500 mg C18-Material lagen die Wiederfindungen, wie in Tabelle 8.4

zu sehen, sowohl in den Extrakten aus dotierten demineralisierten Wasser als auch in den

Extrakten aus den dotierten Zulauf- und Ablaufproben unter 72,3 % (meistens sogar noch

weit darunter). Das lässt vermuten, dass die Kapazität der Kartuschen erschöpft war. Da

diese Wiederfindungen nicht akzeptabel waren, wurde auf eine Wiederholung der

Untersuchungen verzichtet.

Durch Verdopplung der Menge an Adsorbens erhöhten sich die Wiederfindungen

(Tabelle 8.4). Sie lagen für Extrakte aus dotiertem demineralisiertem Wasser zwischen

89,4 % für E3 und 119,0 % für NP. Die Wiederfindungen in Extrakten aus dotierten

Zulaufproben betrugen minimal 76,7 % für EE2 und maximal 112,9 % für NP. In den

Extrakten aus den dotieren Ablaufproben lagen die Wiederfindungen zwischen 84,1 % für E1

und 122,9 % für BPA. Die Wiederfindungen lagen damit im akzeptablen Bereich von 80-

120 % und deshalb wurden für die weitere Anreicherungen aus wässrigen Proben C18-

Kartuschen mit 1000 mg Füllung eingesetzt. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurde die

Bestimmung der Wiederfindungen an 1000 mg Adsorbens als Dreifachbestimmung

durchgeführt. Der Variationskoeffizient lag im Bereich von 2,1 und 23,7 %. Unter

Berücksichtigung der komplexen Matrix waren dies realistische Werte.

Tabelle 8.4: Wiederfindungen der EDCs in wässrigen Medien

Wiederfindung [%] ± Variationskoeffizient [%] Analyt demineralisiertes Wasser Zulauf Ablauf

500 mg 1000 mg a) 500 mg 1000 mg a) 500 mg 1000 mg a)

NP 35,8 119,0 ± 17,3 61,4 112,9 ± 9,1 39,4 116,3 ± 3,0

BPA 72,3 114,8 ± 3,8 14,3 92,3 ± 8,9 49,6 122,9 ± 5,5

OP n.b. 106,4 ± 6,4 n.b. 105,6 ± 3,3 n.b. 99,0 ± 17,4

E1 61,1 100,2 ±2,9 10,2 93,0 ± 3,0 38,3 84,1 ± 2,6

E2 59,9 115,7 ± 2,4 36,3 102,7 ± 2,1 20,2 88,7 ± 12,5

E3 45,9 89,4 ± 20,7 9,7 86,1 ± 23,7 12,7 104,1 ± 4,9

EE2 25,1 100,5 ± 8,3 5,5 76,7 ± 18,7 20,7 99,4 ± 8,0 a) Mittelwert aus jeweils einer Dreifachbestimmung

n.b.: nicht bestimmt

8 Ergebnisse 89


Der Fehler, der bei einer fünfmaligen Bestimmung der endokrin wirksamen Substanzen aus

Reinstwasser, entstand, lag, wie Tabelle 8.5 zeigt, zwischen 1,5 und 17,2 %. Wurden reale

Proben untersucht, sank der Fehler und die Ergebnisse waren noch besser reproduzierbar.

Für Zulaufproben lag der Fehler für die einzelnen Substanzen zwischen 1,7 und 7,5 %

(Tabelle 8.6). Bei der Ablaufprobe sah das Ergebnis ähnlich aus. Dort waren die Ergebnisse

mit einem Fehler von 3,0–6,8 % reproduzierbar (Tabelle 8.7).

Tabelle 8.5: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Reinstwasser)

Analyt Mittelwert Peakflächen

Standardabweichung [± s]

Variationskoeffizient [%]

NP 533934 32068 6,0

BPA 920436 13698 1,5

OP 194872 13305 6,8

E1 202032 34694 17,2

E2 376107 25792 6,9

E3 365840 26196 7,2

EE2 204053 17072 8,4

Tabelle 8.6: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Zulauf)




NP 205683 9104 4,4

BPA 293436 7395 2,5

OP 87222 2100 2,4

E1 71881 1187 1,7

E2 77517 5820 7,5

E3 115715 3463 3,0

EE2 42136 2036 4,8

90 8 Ergebnisse

Tabelle 8.7: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Ablauf)




NP 307944 18669 6,1

BPA 876493 26322 3,0

OP 121306 8214 6,8

E1 265060 16940 6,4

E2 362540 17249 4,8

E3 653043 36622 5,6

EE2 265502 12815 4,8


Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für endokrin wirksame Substanzen aus Abwässern

wurden nach der Kalibrationsgeradenmethode der DIN 32645 (1994) bestimmt. Die genauen

Werte für die NG und BG, sowie der Korrelationskoeffizient als Maß für die Linearität der

Kalibrationsgeraden sind in Tabelle 8.8 aufgelistet. Die Nachweisgrenzen der endokrin

wirksamen Substanzen lagen in Zulaufproben zwischen 2,7 ng/L und 7,7 ng/L. Die

Nachweisgrenzen in den Ablaufproben lagen in einem ähnlichen Bereich zwischen 1,1 ng/L

und 9,8 ng/L. Da die Korrelationskoeffizienten nur wenig von 1 abwichen, war die Methode

über den untersuchten Bereich linear.

Tabelle 8.8: Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Analyten sowie deren Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Abwässern

Zulauf Ablauf Analyt NG

[ng/L] BG

[ng/L] Korrelations-koeffizient

[r2] NG

[ng/L] BG

[ng/L] Korrelations-koeffizient

[r2]

NP 5,5 8,3 0,9979 6,6 9,9 0,9999

BPA 7,7 11,6 0,9964 4,8 7,2 0,9999

OP 3,2 4,8 0,9993 9,8 14,7 0,9998

E1 7,5 11,2 0,9998 7,2 10,7 0,9999

E2 3,6 5,4 1,0000 5,4 8,2 0,9999

E3 5,2 7,7 0,9999 6,7 10,1 0,9999

EE2 2,7 4,1 1,0000 1,1 1,6 0,9998

8 Ergebnisse 91


In Abbildung 8.20 sind die Ergebnisse der gaschromatographischen Trennung von

Belebtschlammextrakten dargestellt. In der undotierten Probe war nur Bisphenol A

nachweisbar, wie im „RIC Xenoestrogene“ zu erkennen ist. Wurde der Belebtschlammextrakt

dotiert, waren die Signale mit guten S/N- Verhältnissen schon im TIC erkennbar, eine

Quantifizierung war allerdings noch nicht möglich, da keine klare Basislinie zu erkennen war.

Im RIC, das nur die Massenspuren ausgewählter Fragmente der Analyten wiedergibt, wurde

die Matrix ausgeblendet und die Signale wurden deutlicher erkennbar.

In der Blindprobe des Faulschlammextraktes (Abbildung 8.21) war NP vorhanden. Die

dotierte Probe zeigte die gleichen Ergebnisse wie der dotierte Belebtschlamm, so dass die

chromatographische Trennung für beide Schlammarten angewendet werden konnte.

8.3.1 Vorversuche zur Probenaufreinigung

Da Schlammextrakte im Vergleich zu Abwässern eine in Konzentration und Vielfalt sehr viel

komplexere Matrix enthalten, war zu überprüfen, in wie weit sich eine Erhöhung der Menge

und eine Änderung der Art des Adsorbens auf die Wiederfindungen einer EDC-

Standardlösung auswirkten. Die Ergebnisse wurden mit denen der Reinigung für

Abwässerextrakte verglichen.

In Abbildung 8.22 werden die Wiederfindungen an Kieselgel gezeigt, wobei unterschiedliche

Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische zur Elution (Probenummern vgl. Abschnitt 7.3.1)

eingesetzt wurden. Erkennbar wurde, dass die Probe Nr. 13, die unter denselben

Bedingungen behandelt wurde, wie die Abwässer, Resultate erbrachte, die am nächsten an

100 % heranreichten.

Florisil und Aluminiumoxid eigneten sich nicht als Adsorbens (Abbildung 8.23) im

Reinigungsprozess. Dort lagen die Wiederfindungen immer unterhalb von 60 %. Die

Reinigung, die bereits bei den Abwasserextrakten erfolgreich eingesetzt wurde, wurde für die

Reinigung der Schlammextrakte übernommen.

92 8 Ergebnisse

10 15 20 25 30 35

100

80

60

40

20

0

100

80

60

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0

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20

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60

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20

0

100

80

60

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100

80

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100

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20

0

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0

100

80

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20

0

100

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0

100

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0

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0

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0

100

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20

0

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80

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40

20

0100

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0

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20

0

100

80

60

40

20

0

BPA

NPOP

BPA

EE2

E2 + E3

E1

NP

BPA

OP

EE2

E2 + E3

E1

Zeit [min]

FBelebtschlamm dotiert


EBelebtschlamm dotiert


DBelebtschlamm dotiert

TIC

CBelebtschlamm blind


BBelebtschlamm blind


ABelebtschlamm blind

TIC

8,71 E5

9,27 E3

3,86 E3

3,58 E5

9,44 E4

5,82 E4

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

Abbildung 8.20: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Belebtschlammextrakten: (A): TIC eines undotierten Belebtschlamms, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC eines mit den sieben EDCs dotierten Belebtschlamms (c = 30 µg/g TS), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)

8 Ergebnisse 93

NP

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

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60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

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0

100

80

60

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20

0

100

80

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20

0

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80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

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20

0

100

80

60

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20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

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80

60

40

20

0

100

80

60

40

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0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

010 15 20 25 30 35

NPOP

BPAE2 + E3

NP

OP

BPA

EE2

E2 + E3

E1

Zeit [min]

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

FFaulschlamm dotiert


2,38 E3

EFaulschlamm dotiert


4,76 E3

DFaulschlamm dotiert

TIC

2,97 E4

CFaulschlamm blind


9,30 E1

BFaulschlamm blind


3,17 E2

AFaulschlamm blind

TIC

1,96 E4

Abbildung 8.21: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Faulschlammextrakten: (A): TIC eines undotierten Faulschlamms, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC eines mit den sieben EDCs dotierten Faulschlamms (c = 30 µg/g TS), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)

94 8 Ergebnisse

0

50

100

150

200

1 2 7 8 9 10 11 12 13

Probennummer

Wie

derf

indu

ngen

[%]

NP BPA OP E1 E2 E3 EE2

Abbildung 8.22: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Kieselgel mit verschiedenen Elutionslösungsmitteln

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

3 4 5 6

Probennummer

Wie

derf

indu

ngen

[%]


Abbildung 8.23: Wiederfindungen der EDCs nach Reinigung an Florisil und Aluminiumoxid

8 Ergebnisse 95

8.3.2 Vorversuche zur Derivatisierung

Die Überprüfung der zur Derivatisierung eingesetzten Menge an HFBAA zeigte, dass auch

hier die Verwendung von 30 µL Reagenz pro Probe die optimale Menge zur Derivatisierung

der EDCs aus Schlammextrakten darstellte (Abbildung 8.24). Bei einer weiteren Erhöhung

der Reagenzmenge sanken die Wiederfindungen kontinuierlich. Im Folgenden wurden

deshalb weiterhin 30 µL HFBAA verwendet.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

20 30 40 50 60 70

Menge HFBAA [µL]

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.24: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Menge des verwendeten HFBAA

8.3.3 Einfluss unterschiedlicher ASE – Extraktionsparameter auf die Wiederfindung der Analyten

Ausgehend von der von Meesters et al. (2002) veröffentlichten Methode zur Extraktion für

NP und BPA mittels ASE (Lösungsmittel: Ethylacetat/Ameisensäure, Temperatur 170 °C,

Druck 2000 psi, 1 Extraktionscyclus und 2 g Einwaage) wurde zunächst der Einfluss des

Lösungsmittels auf die Wiederfindungen der Analyten getestet.

Die Abbildungen 8.25 und 8.26 zeigen die Ergebnisse für sieben Lösungsmittel. Dabei wurde

der Schlammextrakt im Anschluss in Wasser gelöst und an C18-Material angereichert. Nach

einer Elution mit Aceton folgte eine Reinigung an Kieselgel. Die Analyten wurden mit einem

96 8 Ergebnisse

Aceton/Pentan-Gemisch (2 + 1) eluiert. Die anschließende Derivatisierung wurde in

Abschnitt 8.3.2 beschrieben (Abbildung 8.25). Abbildung 8.26 zeigt die Ergebnisse derselben

Extrakte ohne Lösen in Wasser und Anreicherung, nur an Kieselgel gereinigt. Die Elution der

Analyten und die Derivatisierung wurde nicht verändert.

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

Ethylacetat Methanol Dichlormethan Toluol Acetonitril Aceton Methanol Faul

Extraktionslösungsmittel

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.25: Wiederfindungen nach Resuspendierung des Extraktes in Wasser, Anreicherung auf C18-Material und einem Kieselgel-clean-up

Mit vorhergehender Anreicherung liegen die Ergebnisse generell näher bei 100 %.

Außerdem entstand bei alleiniger Verwendung des Kieselgel clean-ups ohne eine vorherige

Reinigung durch Lösen in Wasser und erneuter Anreicherung an C18-Material bei der

Aufkonzentrierung ein hochviskoser schwarzer Rückstand, der nur schwer in Aceton wieder

aufnehmbar war und das GC/MS-System schnell stark verschmutzte. Die Konzentrate nach

einem zusätzlichen wässrigen Zwischenreinigungsschritt waren deutlich besser in Aceton

löslich und waren auch nur noch schwach gefärbt. Deshalb war es notwendig der Reinigung

mittels Kieselgels die zusätzliche Anreicherung an C18-Material vorzuschalten. Von den

sieben Lösungsmitteln lieferte Methanol das beste Ergebnis. Bis auf E2, das zu 50 % und

E1, das mit einer Wiederfindung weit über 200 % zurückgefunden wurde, lagen die

Wiederfindungen bei 100 %. Methanol wurde als Lösungsmittel für die weiteren Extraktionen

verwendet.

8 Ergebnisse 97

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

Methanol Dichlormethan Toluol Acetonitril Aceton Methanol Faul

Extraktionslösungsmittel

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.26: Wiederfindungen nach Kieselgel-clean-up

Wie aus den Balkendiagrammen in den Abbildungen 8.27-8.31 ersichtlich wird, bestimmen

mehrere Einflussgrößen die Wiederfindungen der EDCs.

Temperatureinfluss:

Die Varianz der Temperatur (Abbildung 8.27) zeigte schlechte Wiederfindungen für 150 °C

und 200 °C. Zwischen 100 °C und 170 °C waren die Unterschiede geringer. Bei 100 °C

lagen die Wiederfindungen für BPA und OP zwischen 110–120 %, EE2 wurde sogar mit

130 % wiedergefunden. E3 hatte dagegen eine Wiederfindung von nur 70 %. Bei 170 °C

lagen die Wiederfindungen mit Ausnahme von E1 und E2 alle um 100 %. 170 °C wurde

deshalb als Temperatureinstellung übernommen.

Druckeinfluss:

Im nächsten Schritt wurde der Einfluss des Drucks untersucht (Abbildung 8.28). Bei 1000

und 1500 psi lagen die Wiederfindungen alle weit unter 50 %, so dass ein Druck von

2000 psi nötig war, um Wiederfindungen von rund 100 % zu erhalten.

98 8 Ergebnisse

Zeiteinfluss:

Als Extraktionszeiten wurden 15, 45 und 60 min gewählt (Abbildung 8.29). Bei 15 und 60 min

war insbesondere die Wiederfindung von EE2 sehr niedrig und die Wiederfindung von E3

über 150 %. Deshalb wurde die Extraktionszeit bei 45 min belassen.

Einfluss der Anzahl der Extraktionscyclen:

Die Erhöhung der Anzahl der Extraktionscyclen (Abbildung 8.30) hatte keinen verbessernden

Einfluss auf die Wiederfindungen. Die weiteren Extraktionen wurden deshalb mit nur einem

Extraktionscyclus durchgeführt.

Einfluss der Probemenge:

Zum Schluss wurde der Einfluss der Probemenge untersucht. Sie wurde auf 1 g halbiert und

auf 4 g verdoppelt. (Abbildung 8.31) Bei 4 g Einwaage sanken die Wiederfindungen,

während sie bei 1 g Einwaage etwa identisch blieben. Da eine höhere Einwaage als 1 g für

die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen vorteilhafter war, 4 g jedoch Minderbefunde

verursachte, wurde als Kompromiss für die weiteren Untersuchungen 2 g Probematerial

eingesetzt.

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

100 150 170 200

Temperatur [°C]

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.27: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Temperatur

8 Ergebnisse 99

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

1000 1500 2000

Druck [psi]

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.28: Wiederfindungen in Abhängigkeit vom Druck

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

15 45 60

Extraktionszeit [min]

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.29: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Extraktionszeit

100 8 Ergebnisse

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

1 2 3

Extraktionscyclen

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.30: Wiederfindung in Abhängigkeit von den Extraktionscyclen

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

1 2 4

Einwaage [g]

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.31: Wiederfindungen in Abhängigkeit von der Probemenge

8 Ergebnisse 101

Allen durchgeführten Extraktionen war gemeinsam, dass die Wiederfindung von E1

unrealistisch hoch lag, während die Wiederfindung für E2 nie über 50 % hinausging. Da E1

ein Metabolit von E2 ist, lag die Vermutung nahe, dass die Menge des während der

Herstellung des dotierten Materials zur Abtötung der Mikroorganismen zugegebenen

Natriumazids nicht ausreichend war, um die E2 abbauenden Bakterien vollständig abzutöten.

Während der 24 stündigen Homogenisierung wurde dann wahrscheinlich ein großer Teil des

E2 zu E1 metabolisiert. Um dies zu überprüfen, wurde ein Teil eines Belebtschlamms mit

0,1 % Natriumazid und mit E1 (Probe 19), ein Teil mit 0,1 % Natriumazid und mit E2

(Probe 20), ein Teil mit E1 und E2 (Probe 21) sowie ein Teil mit E2 und der zehnfachen

Menge Natriumazid (1%) (Probe 22) versetzt und wie beschrieben behandelt. Die nur mit E1

(Tabelle 8.9) dotierte Probe zeigte mit 77,4 % eine akzeptable Wiederfindung von E1. Waren

E1 und E2 gemeinsam enthalten, entstand das bekannte Bild, hohe Wiederfindung für E1,

niedrige für E2. In den beiden Proben, die nur E2 enthielten, war E1 nachweisbar. Selbst die

höhere Menge an Natriumazid konnte den biologischen Abbau von E2 zu E1 nicht

verhindern.

Tabelle 8.9: Wiederfindungen von E1 und E2, bestimmt zur Überprüfung des mikrobiellen Abbaus von E2 zu E1

Wiederfindungen [%] Probe Nr. E1 E2

19 77,4 -

20 nachweisbar, obwohl nicht zudotiert

21,0

21 123,0 43,6

22 nachweisbar, obwohl nicht zudotiert

6,6

102 8 Ergebnisse

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

Belebtschlamm Faulschlamm

Schlammart

Wie

derf

indu

ng [%

]


Abbildung 8.32: Wiederfindungen in sterilisierten Schlämmen

Zur Überprüfung, ob der mikrobielle Abbau von E2 der einzige Grund für die niedrigen

Wiederfindungen von E2 war oder ob die Extraktionsmethode noch weiter optimiert werden

musste, wurde eine Belebt- und eine Faulschlammprobe vor dem Zudotieren der endokrin

wirksamen Substanzen sterilisiert (Abbildung 8.32). Die weitere Behandlung war identisch.

Durch diese Vorbehandlung erreichte die Wiederfindung für E1 ca. 90 % und die

Wiederfindung von E2 stieg auf etwa den gleichen Wert. Damit lagen die Wiederfindungen

der sieben endokrin wirksamen Substanzen alle in akzeptabelen Bereichen. Die optimierten

Extraktionsparameter (Lösungsmittel Methanol, Temperatur 170 °C, Druck 2000 psi,

Extrationszeit 45 min, Anzahl der Extraktionscyclen 1, Einwaage 2 g) konnten zur Analyse

der EDCs aus Schlämmen genutzt werden.

Um die mikrobielle Umsetzung von E2 zu E1 möglichst gering zu halten, wurden den realen

Schlammproben möglichst direkt nach der Probenahme das Wasser durch Gefriertrocknung

entzogen.

8 Ergebnisse 103

8.3.4 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Klärschlämmen eingesetzten Methode


Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurden der dotierte und sterilisierte Belebt- und

Faulschlamm dreimal mit Hilfe der optimierten ASE-Methode extrahiert (Abschnitt 8.3.3). Der

Gehalt einer Blindprobe wurde von dem erhaltenen Ergebnis subtrahiert. Die Ergebnisse

sind in Tabelle 8.10 zusehen. Die Werte für die Wiederfindungen lagen im Belebtschlamm

zwischen 81,9 % für EE2 und 115,8 % für OP. Im Faulschlamm lagen die Werte zwischen

84,2 % für E3 und 101,3 % für EE2. Die Variationskoeffizienten, als Maß für die

Fehlerangabe der Bestimmung, liegen zwischen 1,6 und 18,2 %. Unter Berücksichtigung der

komplexen Matrix und dem geringen Gehalt an Analyten ist dies ein akzeptabler Bereich.

Tabelle 8.10: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Belebt- und Faulschlamm, mittels optimierter Methodenparameter bestimmt

Wiederfindungen [%] a) ± Variationskoeffizient [%]Analyt Belebtschlamm Faulschlamm

NP 108,1 ± 5,5 100,7 ± 6,6

BPA 97,8 ± 7,4 83,1 ± 2,2

OP 115,8 ± 1,6 94,7 ± 17,4

E1 90,7 ± 4,8 89,8 ± 8,2

E2 88,9 ± 14,9 86,5 ± 6,6

E3 106,2 ± 3,2 84,2 ± 4,3

EE2 81,9 ± 18,2 101,3 ± 15,9 a) Mittelwert aus einer Dreifachbestimmung


Der Fehler, der bei fünfmaliger Injektion ein und derselben Probe entstand, lag bei der

Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen aus Belebtschlammextrakten zwischen 0,6 und

6,0 % (Tabelle 8.11). Bei der Untersuchung von Faulschlammextrakten ergab sich ein

ähnliches Bild mit einem Fehler von 0,6–5,9 % (Tabelle 8.12).

104 8 Ergebnisse

Tabelle 8.11: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Belebtschlamm)




NP 75401 1470 1,9

BPA 124547 3508 2,8

OP 11757 702 6,0

E1 16871 490 2,9

E2 35658 853 2,4

E3 73868 420 0,6

EE2 3822 58 1,5

Tabelle 8.12: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Faulschlamm)




NP 85128 1353 1,6

BPA 129927 5725 4,4

OP 11869 697 5,9

E1 17450 340 1,9

E2 35581 947 2,7

E3 72770 414 0,6

EE2 4169 203 4,9


Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für die ausgewählten endokrin wirksamen

Substanzen aus Belebtschlamm wurden nach der Kalibrationsgradenmethode der

DIN 32645 (1994) bestimmt. Die genauen Werte für die NG und BG, sowie der

Korrelationskoeffizient als Maß für die Linearität der Kalibrationsgerade sind in Tabelle 8.13

aufgelistet. Die NG liegen zwischen 1,5 µg/g TS für EE2 und 2,9 µg/g TS für BPA. Die

entsprechenden BG liegen zwischen 2,2 µg/g TS für EE2 und 4,7 µg/g TS für BPA. Die

Korrelationskoeffizienten liegen alle in der Nähe von 1, so dass die Methode über den

untersuchten Bereich linear ist.

8 Ergebnisse 105

Tabelle 8.13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der Analyten sowie deren Korrelationskoeffizienten, bestimmt aus Belebtschlamm

Analyt NG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]

BG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]

Korrelationskoeffizient [r2]

NP 2,0 ± 14,2 3,0 ±14,4 0,9994

BPA 2,9 ± 19,5 4,7 ±19,9 0,9983

OP 2,5 ± 13,6 3,3 ±32,5 0,9992

E1 2,8 ± 5,5 3,7 ±22,0 0,9996

E2 1,8 ± 35,4 2,7 ±35,3 0,9997

E3 2,7 ± 21,0 4,0 ±20,8 0,9995

EE2 1,5 ± 51,2 2,2 ±51,1 0,9995


Abbildung 8.33 zeigt das Ergebnis gaschromatographischer Trennungen eines undotierten

und eines mit den sieben ausgewählten EDCs dotierten Sediments. Im TIC der Blindprobe

war noch keine endokrin wirksame Substanz erkennbar. Erst im RIC mit den Massenspuren

der Xenoestrogene ließ sich das Vorhandensein von Bisphenol A bestätigen. Steroidale

EDCs waren dagegen nicht nachweisbar. Die gaschromatographische Trennung des mit den

ausgewählten EDCs dotierten Sediments zeigte dagegen bereits im TIC-Chromatogramm,

mit Ausnahme von NP, das Vorhandensein der EDCs an. Jedoch aufgrund des hier

beobachtbaren ungünstigen S/N-Verhältnisses war eine Quantifizierung noch nicht möglich,

da durch Überlagerung mit Signalen der Matrix keine klare Basislinie zu erkennen war. Im

sodann ausgewählten RIC ließ sich durch Darstellung der EDC-relevanten Massenspuren

die Matrix so ausblenden, dass die Trennung der EDCs sofort erkennbar und damit eine

Quantifizierung möglich wurde. Die Signale von E2 und E3 sind nicht basisliniengetrennt.

Ursache bei diesem chromatographischen Lauf war der aktuelle Zustand der verwendeten

GC-Säule. Diese war zuvor bereits für eine große Anzahl von Trennungen verwendet

worden. Dennoch war eine Quantifizierung möglich, da die nicht-basisliniengetrennten

Substanzen unterschiedliche Massenfragmente ausbildeten. Über diese erfolgte mittels ihrer

Massenspuren dann die Quantifizierung.

106 8 Ergebnisse

BPA

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

010 15 20 25 30 35

BPAOP

E2 + E3 E1

NP

OP

BPA

EE2

E2 + E3

E1

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

ASediment blind

TIC

2,19 E4

BSediment blind


4,62 E2

CSediment blind


1,99 E2

DSediment dotiert

TIC

2,50 E5

ESediment dotiert


3,98 E4

FSediment dotiert


9,85 E3

Zeit [min] Abbildung 8.33: Totalionenstrom- und Massenspurchromatogramme von Sedimentextrakten: (A): TIC einer undotierten Sedimentprobe, derivatisiert mit HFBAA; (B): RIC von (A) der Xenoestrogene NP (m/z:303, 331, 345), BPA (m/z: 605, 620) und OP (m/z: 402): (C): RIC von (A) der Steroide E1 (m/z: 422, 466); E2 (m/z: 237, 451); E3 (m/z: 235, 449) und EE2 (m/z: 446, 474); (D): TIC einer mit den sieben EDCs dotierten Sedimentprobe (c = 20 µg/g TS), derivatisiert mit HFBAA; (E): RIC von (D) der Xenoestrogene (m/z: siehe B); (F): RIC von (D) der Steroide (m/z: siehe C)

8 Ergebnisse 107

8.4.1 Validierung der zur Bestimmung von EDCs aus Sedimenten eingesetzten Methode


Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurden drei Proben des dotierten Mischsediments mit

der optimierten ASE-Methode extrahiert und wie beschrieben aufgearbeitet. Von den

Ergebnissen wurde der Gehalt der EDCs, die zuvor in der Blindprobe bestimmt worden

waren, abgezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.14 zu sehen. Sie liegen zwischen

73,5 % für Estradiol und 103,5 % für das NP-Isomerengemisch.

Tabelle 8.14: Wiederfindungen der sieben EDCs aus Sedimenten

Analyt Wiederfindung [%] a) ± Variationskoeffizient [%]NP 103,5 ± 22,5

BPA 83,2 ± 4,3

OP 82,1 ± 15,7

E1 97,3 ± 9,2

E2 73,5 ± 13,2

E3 93,1 ± 13,0

EE2 82,9 ± 10,1 a) Mittelwerte aus einer Dreifachbestimmung


Tabelle 8.15 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung einer Sedimentprobe, durchgeführt als

Fünffachbestimmung. Der dabei ermittelte Variationskoeffizient lag zwischen 5,0 und 16,1 %.

Tabelle 8.15: Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode (Matrix: Sediment)




NP 22595 1321 5,8

BPA 70391 3941 5,6

OP 5963 961 16,1

E1 17567 885 5,0

E2 15328 1309 8,5

E3 26301 2321 8,8

EE2 1906 137 7,2

108 8 Ergebnisse


Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für endokrin wirksame Substanzen aus

Sedimenten wurde nach der Kalibrationsgradenmethode der DIN 32645 (1994) bestimmt.

Die ermittelten Werte für die NG und BG, sowie der Korrelationskoeffizient als Maß für die

Linearität der Kalibrationsgeraden, sind in Tabelle 8.16 aufgelistet. Die NG liegen zwischen

0,2 µg/g TS für OP und 0,9 µg/g TS für BPA. Die entsprechenden BG liegen zwischen

0,4 µg/g TS für OP und 1,2 µg/g TS für BPA. Die Korrelationskoeffizienten liegen alle in der

Nähe von 1, so dass die Methode über den untersuchten Bereich linear ist.

Tabelle 8.16: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sowie Korrelationskoeffizienten der Kalibriergeraden unterschiedlicher EDCs, bestimmt aus Sedimenten

Analyt NG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]

BG [µg/g TS] ± Variationskoeffizient [%]

Korrelationskoeffizient

NP 0,6 ± 8,4 1,0 ± 8,6 0,9996

BPA 0,9 ± 9,2 1,2 ± 9,0 0,9994

OP 0,2 ± 41,2 0,4 ± 41,8 0,9997

E1 0,9 ± 14,1 1,3 ± 13,9 0,9997

E2 0,4 ± 12,1 0,5 ± 13,6 0,9997

E3 0,5 ± 17,2 0,8 ± 17,7 0,9996

EE2 0,3 ± 23,9 0,5 ± 24,8 0,9998

8.4.2 Gehalt an EDCs in Sedimentproben des Sees Volvi

Die Ergebnisse der zweiundsiebzig untersuchten Sedimentproben des Sees Volvi sind in

den Abbildungen 8.34–8.41 dargestellt. Dabei sind die Ergebnisse in Abhängigkeit vom

Probenahmezeitpunkt aufgetragen. Daraus sollte ein möglicher jahreszeitlicher Einfluss

erkennbar werden.

Insgesamt war die Belastung der Sedimente mit endokrin wirksamen Substanzen sehr

gering. Bisphenol A war die einzige Substanz, die in jeder Probe zu finden war. Die

Steroidhormone, die eine wesentlich höhere endokrine Wirksamkeit besitzen, waren

dagegen nur selten nachweisbar. Die Ergebnisse veränderten sich erwartungsgemäß in

Abhängigkeit mit den Jahreszeiten. Der niedrigste Gesamtgehalt an EDCs wurde im Frühjahr

und Sommer gemessen. Zu diesem Zeitpunkt war der mikrobielle Abbau der Substanzen am

größten, weil die erhöhte Umgebungstemperatur den biochemischen Abbau begünstigte. Im

Herbst nahm dagegen die Umgebungstemperatur ab und damit auch der mikrobielle Abbau

durch die an wärmere Umgebungstemperaturen adaptierten Bakterien. So ließen sich

8 Ergebnisse 109

verschiedene EDCs mit estrogenem Potential nachweisen, die zuvor nur vereinzelt gefunden

wurden. Zu ihnen gehörten insbesondere Nonylphenol und Octylphenol. Im Winter hatten

sich dann die Bakterien an die veränderte Umgebungstemperatur angepasst, so dass der

Abbau wieder schneller von statten ging und die Gesamtbelastung wieder sank.

A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.34: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie A (Frühjahr)

B 1 B 2 B 3 B 4 B 5 B 6 B 7 B 8 B 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.35: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie B (Sommer)

110 8 Ergebnisse

C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.36: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie C (Herbst)

D 1 D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 D 7 D 8 D 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.37: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie D (Winter)

8 Ergebnisse 111

E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 E 6 E 7 E 8 E 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.38: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie E (Frühjahr)

F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 7 F 8 F 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.39: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie F (Sommer)

112 8 Ergebnisse

G 1 G 2 G 3 G 4 G 5 G 6 G 7 G 8 G 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.40: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie G (Herbst)

H 1 H 2 H 3 H 4 H 5 H 6 H 7 H 8 H 9

NPBPA

OPE1

E2E3

EE2

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.41: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmeserie H (Winter)

8 Ergebnisse 113

Insgesamt wurden in den Sedimenten nur vereinzelt Steroidhormone gefunden. Waren diese

dann vorhanden, so lagen die Konzentrationen auch nur im unteren ng/g TS Bereich

(Abbildungen 8.34-8.41). Eine Ausnahme wurde beobachtet: Probe A 6 (Abbildung 8.34)

enthielt mit 5,3 µg/g TS einen extrem hohen Gehalt an Estron. Um zu überprüfen, ob es sich

dabei um den tatsächlichen Gehalt der Probe handelte, oder ob irgendwelche Interferenzen

vorhanden waren, die die Bestimmung störten, wurde eine GC/MS/MS-Analyse

durchgeführt. Abbildung 8.42 zeigt im Teil a bzw. c die Massenspektren von E1 von

Standard und Probe und in b bzw. d die Produktionenspektren, die von dem jeweiligen Ion

mit der Masse 466 erzeugt worden waren. Im Vergleich zeigten die Spektren von reinem E1

und der Probe keine Abweichungen. In den GC/MS-Spektren traten 422 und 466 als

intensivste Fragmente auf und die Produktionenspektren, erzeugt aus der Masse 466,

zeigten beide die Fragmente 422, 407 und 394 als dominierende Fragmente. Es war kein

zusätzliches Signal erkennbar, das durch eine Überlagerung des E1-Signals mit einer

unbekannten Substanz aus z.B. der Matrix verursacht wurde. Warum diese Probe dann

allerdings einen solch hohen Gehalt an E1 enthielt, konnte unter den gegebenen Umständen

nicht aufgeklärt werden. Eine Alternative wäre, dass in der Sedimentprobe ein mikrobieller

Abbau von E2 hin zu E1 stattgefunden hatte, weil das Probenmaterial bis zur Aufbereitung

nicht entsprechend gelagert worden war. Da aber sämtliche Proben unter den gleichen

Bedingungen entnommen, gelagert und sowohl durch Gefriertrocknung als auch durch

Temperaturabsenkung auf 4°C stabilisiert worden waren, erscheint diese Möglichkeit aber

als sehr unwahrscheinlich.

Um zu überprüfen, ob die geographische Lage der Entnahmestelle einen Einfluss auf den

Gehalt an EDCs in den Sedimenten hatte, wurden in Abbildungen 8.43-8.45 die Ergebnisse

des Probenmaterials, welches in der Nähe der Berge entnommen worden war, den

Ergebnissen des in der Nähe der Stadt Nea Madytos bzw. in der Nähe der Mündung des

Flusses Megalo Rema entnommenen Probenmaterials einander gegenübergestellt.

Theoretisch müsste der Gehalt an EDCs in der Nähe der Stadt und im Flussmündungsgebiet

aufgrund der erhöhten antropogenen Einträge durch die höhere Populationsdichte größer

sein, als in der Nähe der dünner besiedelten Bergregion. Es war aber kein signifikanter

Unterschied erkennbar. Eine Erklärung könnte sein, dass die Strömung und die

Durchmischung im See unabhängig von der Jahreszeit so hoch ist, dass die EDCs zuerst im

gesamten See verteilt werden, bevor sie letztendlich an das Sediment adsorbiert werden.

114 8 Ergebnisse

422

409

235

253

422

407

394

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 200 300 400 500

m/z100 200 300 400 500

m/z

448

235

253

409

422

422

407

394

AStandardE1MS

CProbe A6E1MS

BStandardE1MS/MS466

DProbe A6E1MS/MS466

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

Abbildung 8.42: EI-Massenspektren der Probe A6 im Vergleich mit einer Standardlösung. (A): GC/MS- Spektrum einer Lösung von Estron (m/z: 422, 466) in Aceton, derivatisiert mit HFBAA; (B): GC/MS/MS-Tochterionenspektum von (A), der Massenspur 466; (C): GC/MS- Spektrum des Sedimentextraktes A6 (m/z: 422, 466), derivatisiert mit HFBAA; (D): GC/MS/MS-Tochterionenspektrum von (C), der Massenspur 466

8 Ergebnisse 115

A 2 B 2 C 2 D 2 E 2 F2 G 2 H 2 A 3 B 3 C 3 D 3 E 3 F 3 G 3 H 3 A 4 B 4 C 4 D 4 E 4 F 4 G 4 H 4

NPOP

E2EE2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle Anal

yt

Abbildung 8.43: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestellen in der Nähe der Berge

A 8 B 8 C 8 D 8 E 8 F 8 G 8 H 8

NP

BPAOP

E1E2

E3EE2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.44: Ergebnisse der EDC-Bestimmung aus Sedimenten der Probenahmestelle in der Nähe des Flusses Megalo Rema

116 8 Ergebnisse

A 7 B 7 C 7 D 7 E 7 F 7 G 7 H 7

NP

BPAOP

E1E2

E3EE2

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Kon

zent

ratio

n [µ

g/g

TS]

Probenahmestelle

Anal

yt

Abbildung 8.45: Ergebnisse der EDC-Bestimmungen aus Sedimenten der Probenahmestelle in der Nähe der Stadt Nea Madytos

9 Diskussion 117

9 Diskussion

Diese Arbeit beschreibt validierte, analytische Methoden zur Bestimmung der endokrin

wirksamen Substanzen Nonylphenol, Bisphenol A, Octylphenol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol

und 17α-Ethinylestradiol aus Abwässern, Klärschlämmen und Sedimenten. Die Methoden

wurden bereits in der Routineanalytik eingesetzt und haben sich dort bewährt. Für ihre

Durchführung ist allerdings ein erheblicher Zeitaufwand von nöten, der durch die einzelnen

Schritte - Anreicherung bzw. Extraktion, Reinigung (clean-up), Derivatisierung,

chromatographische Trennung und Quantifizierung – bedingt ist.

9.1 Vorversuche

9.1.1 Derivatisierungsverfahren

In den Vorversuchen sollten verschiedene Derivatisierungsarten für die sieben ausgewählten

endokrin wirksamen Substanzen getestet und miteinander verglichen werden. Dazu wurden

die Ionenstromchromatogramme und die zugehörigen Massenspektren der einzelnen

Derivate erstellt, um anhand dieser Ergebnisse die Abhängigkeit der Empfindlichkeit des

massenspektrometrischen Detektors von den unterschiedlichen Derivatisierungsreagenzien

zu ermitteln. Dabei hat sich gezeigt, dass die Derivatisierung mittels

Heptafluorbuttersäureanhydrids sowohl für die Detektion nach positiver Elektronenionisation

(EI) als auch während der negativen chemischen Ionisation (NCI) die Methode der Wahl

darstellte. Die Massenspektren waren für alle sieben EDCs in beiden Ionisierungarten

abbildbar, während bei der Derivatisation mit Trifluoressigsäureanhydrid und

Pentafluorpropionsäureanhydrid im NCI-Modus keine Massenspektren von Nonylphenol und

mit Trifluoressigsäureanhydrid zusätzlich kein Massenspektrum von Octylphenol

nachweisbar war.

Bei der Bestimmung im EI-Modus der Nachweisgrenzen der Derivate aus einer acetonischen

Lösung heraus hatten sich, entgegen der Vermutung, jedoch keine signifikanten

Unterschiede in der Empflindlichkeit des Detektors zwischen den verschiedenen Derivaten

gezeigt. Da aber bei der Bestimmung der Nachweisgrenzen von EE2 als Trifluorderivat und

von E2 als Pentafluorderivat keine Linearität der Geraden gewährleistet war, stellte sich auch

aus diesem Grund die Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids als die

Methode der Wahl heraus. In der Literatur wird über Ergebnisse berichtet, die sowohl nach

Derivatisierung mit Trifluoressigsäureanhydrid (Rinken, 2002) als auch mit

Pentafluorpropionsäuranhydrid (Croley et al., 2000; Lee et al., 2005) erhalten wurden.

118 9 Diskussion

Allerdings wird hier nicht das große Spektrum der endokrin wirksamen Substanzen

untersucht, welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Rinken bestimmte nur BPA,

Croley nur die Steroidhormone E1, E2, E3 und EE2, wohingegen Lee NP, BPA, OP, E1 und

E2 ermittelte. Die in der Literatur am häufigsten verwendete Derivatisierungsmethode, die

Silylierung (Spengler et al., 1999; Bolz et al., 2000; Mol et al., 2000; Jeannot et al., 2002;

Ternes et al., 2002; Li et al., 2003; Hernando et al., 2004 und Quintana et al., 2004) stellte in

der vorliegenden Arbeit keine Alternative dar, da aufgrund der fehlenden Elektronegativität

der Silylderivate kein Vergleich der positiven Elektronenionisation mit der negativen

chemischen Ionisation möglich gewesen wäre.

9.1.2 Quantifizierungsverfahren

Das idealste Verfahren zur Quantifizierung wäre die Bestimmung unter Zuhilfenahme

stabilisotopen-markierter, interner Standards, die jeweils zu Beginn der Aufarbeitung

zugegeben werden. Durch dieses Verfahren ließen sich mögliche Fehler durch die

stabilisotopen-markierten Standards ausgleichen. Stabilisotopen-markierte Standards

existierten jedoch nur vereinzelt und waren sehr teuer, daher mussten andere interne

Standard gefunden werden, die sich bei allen Verfahrensschritten den Analyten möglichst

ähnlich verhielten. Zudem sollte das Verhältnis der Peakflächen des Analyten zum internen

Standard möglichst konstant und nahe bei eins liegen. Wie in Abschnitt 8.1.3 zu sehen ist, ist

diese Konstanz für keinen der Analyten gegeben. In der Literatur wird die Quantifizierung

zwar meist mit internem Standard durchgeführt, allerdings ist die Quantifizierung nicht so

detailiert beschrieben, dass ein Vergleich der Konstanz der Responsefaktoren möglich wäre.

Um den durch die Schwankungen der Responsefaktoren verursachten großen Fehler zu

vermeiden, wurde in dieser Arbeit auf die Quantifizierung mittels extrerner Standards

zurückgegriffen.


Wie auch sonst in der Literatur häufig für Stoffe aus wässriger Matrix üblich (Spengler et al.,

1999; Baronti et al., 2000; Bolz et al., 2000; Croley et al., 2000; Hernando et al., 2004;

Quintana et al., 2004; Kojima et al., 2005 und Lee et al., 2005), wurde eine Methode

entwickelt, die sich aus Festphasenextraktion, evtl. einem Reinigungsschritt mit

anschließender Derivatisierung und Bestimmung mittels GC/MS zusammensetzte. Die

Auswahl der eingesetzten Festphasen variiert in der Literatur sehr. Für die vorliegenden

9 Diskussion 119

Abwässer hat sich die Kombination aus C18-Festphase mit anschließender Reinigung an

Kieselgel, Derivatisierung mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids sowie Identifizierung und

Quantifizierung mittels GC/MS bewährt.

9.2.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Abwässern

Für eine zu entwickelnde Analysenmethode, die sich nicht stabilisotopen-markierter, interner

Standards bedienen konnte, war es wichtig, dass die Analyten möglichst vollständig aus der

Matrix extrahiert wurden und auch während der weiteren Aufbereitungsschritte der Proben

nicht verloren gingen. D.h. die Wiederfindung eines jeden Analyten sollte möglichst nahe bei

100 % liegen. Wie aus Tabelle 9.1 erkennbar, ist in der Literatur keine Methode zu finden,

bei der die Wiederfindungen aller in dieser Arbeit ausgewählter endokrin wirksamer

Substanzen zugleich bestimmt wurden. Vergleicht man die gefundenen Werte miteinander,

so sieht man, dass sie alle in einem ähnlichen Bereich zwischen 80 und 120 % liegen. Das

ist unter Berücksichtigung der Matrix ein durchaus angemessener Bereich. Dabei wurden

keine signifikaten Unterschiede zwischen den Wiederfindungen in Zu- bzw. Abläufen

festgestellt, so dass in der Übersicht auf eine Unterteilung in Zu- und Ablauf verzichtet

wurde.

Tabelle 9.1: Gegenüberstellung der in dieser Arbeit erzielten Wiederfindungen für EDCs aus Abwässern mit den in der Literatur berichteten Methoden (zusammengesetzt aus den Teilschritten Festphasenanreicherung, clean-up, Derivatisierung und GC/MS- Bestimmung)

Wiederfindungen [%] Analyt diese Arbeit Bolz

et al., 2000 Quintana

et al., 2004 Kojima

et al., 2005 Lee

et al., 2005 NP 112,9–116,3 96–117 n. b. 103–108 102–104

BPA 92,3–122,9 101–106 n. b. n. b. 98–99

OP 99–105,6 95–99 n. b. 92–103 94–95

E1 84,1–93,0 n. b. 83–102 n. b. 105–109

E2 88,7–102,7 n. b. 94–97 n. b. 89–95

E3 86,1–104,1 n. b. 79–92 n. b. n. b.

EE2 76,7–99,4 n. b. 95–98 n. b. n. b. n. b. = nicht bestimmt

120 9 Diskussion

9.2.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus Abwässern

Tabelle 9.2 gibt einen Überblick über die in der Literatur berichteten Nachweisgrenzen neben

den Nachweisgrenzen, die mit der in dieser Arbeit entwickelten Analysenmethode zur

Bestimmung endokrin wirksamer Substanzen erzielt werden konnten. Die Nachweisgrenzen

von Spengler et al. sind um den Faktor 10 niedriger, allerdings haben Spengler et al. nur

Abläufe untersucht. Die von Quintana et al. erzielten Nachweisgrenzen in Zu- und Abläufen

von Kläranlagen liegen in demselben Bereich, wie die mit den hier entwickelten Methoden

erreichbaren. Da die üblicherweise in Abwässern vorkommenden Konzentrationen an

Steroidhormen im unteren ng/L Bereich liegen und diese Konzentrationen auch bereits eine

endokrine Wirkung entfalten können, kann die entwickelte Bestimmungsmethode zwar

genutzt werden, um EDCs aus Abwässern zu bestimmen. Es besteht aber schnell die

Gefahr, dass die Bestimmungsmethode an ihre Grenzen gerät. Deshalb erscheint es wichtig,

in Zukunft die Nachweisgrenzen noch weiter zu vebessern, um dann noch niedrigere

Konzentrationen erfassen zu können.

Tabelle 9.2: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs in Abwässern mit entsprechenden Literaturmethoden. In die Nachweisgrenzen gehen ein: Festphasenanreicherung, clean- up, Derivatisierung und GC/MS-Bestimmung

Nachweisgrenzen [ng/L] Analyt diese Arbeit Spengler et

al., 1999 Hernando et al., 2004

Quintana et al., 2004

Kojima et al., 2005

NP 5,5–6,6 k. A. n. b. n. b. 76

BPA 4,8–7,7 k. A. 26,5 n. b. n. b.

OP 3,2–9,8 n. b. 13,0 n. b. 7,9

E1 7,2–7,5 0,7 8,5 1 n. b.

E2 3,6–5,4 0,4 17,0 2 n. b.

E3 5,2–6,7 n. b. n. b. 3 n. b.

EE2 1,1–2,7 0,4 4,0 3 n. b. n. b. = nicht bestimmt

k. A. = keine Angabe

9 Diskussion 121


Die ASE-Extraktion wird bisher noch relativ selten zur Extraktion von endokrin wirksamen

Substanzen aus Klärschlämmen eingesetzt. Sie bietet sehr viele Vorteile gegenüber

klassischen Extraktionsmethoden wie z.B. der Soxhlet- oder der Heissdampfextration. Einer

dieser Vorteile ist in der erheblichen Zeitersparnis zu sehen. So dauert eine ASE-Extraktion

ca. 45 min gegenüber einer Extraktionsdauer von mindestens 24 Stunden für eine

Soxhletextraktion. Ein weiterer Vorteil ist in dem geringeren Lösungsmittelverbrauch zu

sehen. Dieser liegt mit ca. 12 mL wesentlich geringer als die üblicherweise für eine

Soxhletextraktion benötigten 30–50 mL. Der wichtigste Vorteil war aber in einer nahezu

vollständigen Extraktionsausbeute von rund 100 % für alle sieben extrahierten endokrin

wirksamen Substanzen zu sehen. Allerdings wird durch die größere Effizienz der ASE-

Extraktion auch eine größere Menge Matrix mitextrahiert. Dieser Nachteil kann nur durch

einen zusätzlichen Reinigungsschritt beseitigt werden.

9.3.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Klärschlämmen

Die Wiederfindungen der ausgewählten sieben Substanzen aus Schlämmen wurde bisher

selten bestimmt. In Tabelle 9.3 sind die in der Literatur beschriebenen Methoden zur

Bestimmung von endokrin wirksamen Substanzen mittels GC/MS- bzw. GC/MS/MS-

Identifizierung und Quantifizierung gegenübergestellt.

Tabelle 9.3: In dieser Arbeit ermittelte Wiederfindungraten der EDCs aus Klärschlämmen im Vergleich mit Daten aus der Literatur (Identifizierung und Quantifizierung mittels GC/MS bzw. GC/MS/MS)

Wiederfindungen [%] Analyt diese Arbeit Sweetman, 1994 Meesters et al., 2002 Ternes et al., 2002

NP 100,7–108,1 82 101 n. b.

BPA 83,1–97,8 n. b. 100 n. b.

OP 94,7–115,8 n. b. n. b. n. b.

E1 89,8–90,7 n. b. n. b. 77–104

E2 86,5–88,9 n. b. n. b. 66–73

E3 84,2–106,2 n. b. n. b. n. b.

EE2 81,9–101,3 n. b. n. b. 57–99 n. b. = nicht bestimmt

122 9 Diskussion

Die einzige Methode mit vergleichbaren Ergebnissen wurde 2002 von Meesters et al.

veröffentlicht, jedoch wurden dort nur die beiden Xenoestrogene Nonylphenol und Bisphenol

A bestimmt. Ternes et al. (2002), die einzige Arbeitsgruppe, die bisher Steroidhormone in

Klärschlämmen untersucht hatte, konnten trotz aufwendigster Aufreinigung mittels

Ultraschalls und unter Verwendung verschiedenster Lösungsmittel sowie

Gelpermeationschromatographie mit ihrer Methode prozentual weniger EDCs wieder finden,

als dies mit der in der in dieser Arbeit entwickelten Methode möglich war.

9.3.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus Klärschlämmen

In dieser Arbeit wurden für die Bestimmung ausgewählter endokrin wirksamer Substanzen

mit estrogenem Potential aus Klärschlämmen Nachweisgrenzen im Bereich von 1,5–2,9 µg/g

TS bestimmt. In der Literatur sind keinerlei Vergleichswerte publiziert.


Wenn endokrin wirksame Substanzen während des Klärprozesses aus dem Abwasser nicht

vollständig entfernt werden, gelangen sie in die Oberflächengewässer, wo sie von der Flora

und Fauna aufgenommen werden, in das Grundwasser gelangen oder aber an Sedimenten

adsorbiert werden können. Dort besteht durch Re-Suspendierung die Gefahr einer

Beeinträchtigung der Umwelt. Deshalb ist es besonders wichtig, über eine Analysenmethode

zu verfügen, mit deren Hilfe man die realen Gegebenheiten vor Ort abbilden kann. Die in

dieser Arbeit entwickelte Methode ist ausreichend empfindlich und reproduzierbar, um den

Gehalt an endokrin wirksamen Substanzen in realen Sedimentproben bestimmen zu können.

9.4.1 Bestimmung der Wiederfindungen aus Sedimenten

Die bisher in der Literatur veröffentlichten Methoden zur Bestimmung von EDCs aus

Sedimenten (Tabelle 9.4) beziehen sich auf ein wesentlich schmaleres Spektrum an

endokrin wirksamen Substanzen mit estrogenem Potential. Es werden nur die

Xenoestrogene wie z.B. Nonylphenol, Octylphenol und Bisphenol A bestimmt (Ferguson et

al., 2000; Hale et al., 2000; Li et al., 2003 und Patrolecco et al., 2004). Dem entsprechend

liegen in der Literatur auch nur wenige Vergleichsdaten vor.

9 Diskussion 123

Tabelle 9.4: Vergleich der in dieser Arbeit ermittelten Wiederfindungsraten mit Literaturmethoden, die zur Identifizierung und Quantifizierung der untersuchten EDCs ebenfalls GC/MS- Methoden verwendeten

Wiederfindungen [%] Analyt diese Arbeit Ferguson

et al., 2000 Hale et al., 2000 Li et al., 2003 Patrolecco et

al., 2004 NP 103,5 82,8 96 91–97 79–89

BPA 83,2 k. A. n. b. 83,5–93 89–108

OP 82,1 n. b. n. b. 87–99 n. b.

E1 97,3 n. b. n. b. n. b. n. b.

E2 73,5 n. b. n. b. n. b. n. b.

E3 93,1 n. b. n. b. n. b. n. b.

EE2 82,9 n. b. n. b. n. b. n. b. n. b. = nicht bestimmt


Die Wiederfindungen (Tabelle 9.4) bewegen sich in allen veröffentlichen Methoden ebenso

wie bei der in dieser Arbeit entwickelten Methode im Bereich von ca. 80 bis gut 100 %. Das

ist ein durchaus üblicher Bereich, wenn man die Komplexität der Matrix berücksichtigt. Diese

Arbeit zeigt den ersten Versuch, Steroidhormone in Sedimenten zu bestimmen, weshalb

auch kein Vergleich mit anderen Daten zur Wiederfindung möglich ist. Mit Ergebnissen von

73,5 % für Estradiol bis 97,3 % für Estron liegen die Wiederfindungsraten aber in einem für

solch komplexe Matrices üblichen Bereich.

9.4.2 Bestimmung der Nachweisgrenzen von endokrin wirksamen Substanzen aus Sedimenten

Die in der Literatur besschriebenen Nachweisgrenzen sind sehr unterschiedlich. Li et al.

(2003) beschreiben die niedrigsten Nachweisgrenzen (Tabelle 9.5) mit nur 0,6 bis 2,8 ng/g

TS für die Xenoestrogene Nonylphenol, Bisphenol A und Octylphenol. Auch Patrolecco et al.

(2004) bestimmte die Stoffe mit niedrigeren Nachweisgrenzen als sich mit der Methode, die

in dieser Arbeit entwickelt wurde, erzielen ließen. Allerdings ist keine direkte Vergleichbarkeit

zwischen den Methoden gegeben, da sowohl Li et al. als auch Patrolecco et al. eine völlig

andere Aufarbeitung des Probenmaterials einsetzten. Durch die universellere Einsetzbarkeit

zur Bestimmung von EDCs, d.h., da es nämlich mit Hilfe der hier entwickelten Methode

möglich ist, zusätzlich auch biogene und anthropogene Steroidhormone quantitativ in einem

Arbeitsgang mit zu bestimmen, erscheinen die etwas weniger empfindlichen

Nachweisgrenzen akzeptabel.

124 9 Diskussion

Tabelle 9.5: Vergleich der Nachweisgrenzen von EDCs, bestimmt aus Sedimenten, mit in der Literatur beschriebenen Bestimmungsmethoden, die sich aus den Arbeitsschritten - Extraktion, clean-up, Derivatisierung und GC/MS-Bestimmung - zusammensetzten

Nachweisgrenzen [µg/g TS] Analyt diese Arbeit Hale et al., 2000 Li et al., 2003 Patrolecco et al., 2004

NP 0,6 5 0,0028 0,06

BPA 0,9 n. b. 0,0006 0,03

OP 0,2 n. b. 0,0024 n. b.

E1 0,9 n. b. n. b. n. b.

E2 0,4 n. b. n. b. n. b.

E3 0,5 n. b. n. b. n. b.

EE2 0,3 n. b. n. b. n. b. n. b. = nicht bestimmt


In Zukunft wäre es sinnvoll, zu untersuchen, ob die Nachweisgrenzen durch einen

zusätzlichen Reinigungschritt oder durch eine stärkere Aufkonzentrierung weiter abgesenkt

werden können. Ebenfalls würde der routinemäßige Einsatz von

Tandemmassenspektrometrie (GC/MS/MS) für die Quantifizierung zu einer weiter

verbesserten Nachweisgrenze führen.

9.4.3 Belastung des Sees Volvi

Eine so umfangreiche Untersuchung eines natürlichen aquatischen Lebensraumes auf

EDCs, wie sie in dieser Arbeit erfolgte, ist nach dem derzeitigen Kenntnisstand bisher noch

nicht durchgeführt worden. Deshalb stellen die hier präsentierten Ergebnisse auch nur eine

sehr individuelle Wiedergabe der isolierten Situation dieses Sees dar und kann nur bedingt

mit vergleichbaren Lebensräumen nicht aber mit den Gegebenheiten anderer Lebensräume

verglichen werden.

Die Belastungen sind insgesamt erstaunlich niedrig. Wie in Abschnitt 8.4.2 beschrieben,

nimmt zudem die Belastung im Laufe des Untersuchungszeitraums von immerhin zwei

Jahren noch weiter ab.

Die beobachteten Belastungen des Sees Volvi mit endokrin wirksamen Substanzen stellen

zwar keine akute Bedrohung der Umwelt dar, dennoch erscheint es wichtig, die Belastung

auch weiterhin zu verfolgen und vor allen Dingen mit den Belastungen in anderen

Gewässern ähnlicher Art und davon abweichenden aquatischen Lebensräumen zu

vergleichen. Nur so wird es in Zukunft möglich sein, die Belastung von Gewässern mit

endokrin wirksamen Substanzen weiterhin kritisch zu verfolgen, um so dann letztendlich eine

9 Diskussion 125

integrale Bewertung der Belastung vornehmen zu können. Es ließen sich so mögliche

Gefahrenquellen besser erkennen und als Folge daraus, könnten Strategien sowie

Methoden primär zur Eintragsvermeidung und, sollte das nicht möglich sein, zur Elimination

der endokrin wirksamen Substanzen entwickelt werden.

126 10 Zusammenfassung

10 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, Analysenmethoden zum Nachweis, zur Identifizierung und zur

Quantifizierung endokrin wirksamer Substanzen (EDCs) aus Matrices, die während des

Abwasserreinigungsprozesses anfallen, zu entwickeln. Dazu sollte ein besonderes

Augenmerk auf Matrices gelegt werden, die in die Umwelt ausgebracht werden und dort

durch Resuspendierung Quellen endokrin wirksamer Subtanzen darstellen. Dazu gehören

insbesondere Klärschlämme und Sedimente.

Aus der Fülle der EDCs wurden die Xenoestrogene Nonylphenol, Bisphenol A und

Octylphenol sowie die estrogenen Steroidhormone Estron, 17β-Estradiol, Estriol und 17α-

Ethinylestradiol ausgewählt. Diese Substanzen besitzen eine hohe Umweltrelevanz. Sie

werden entweder in großen Mengen industriell hergestellt und eingesetzt, ggf.

weiterverarbeitet, sie entstehen teilweise aber auch durch biochemischen Abbau im

Klärprozess oder sie werden im menschlichen Körper gebildet und gelangen über die

menschlichen Ausscheidungen in die Kläranlagen.

Für Zulauf- und Ablaufproben wurde ein Verfahren, bestehend aus einer Anreicherung an

C18-Festphasenmaterial mit anschließendem clean-up an Kieselgel und einer Derivatisierung

mittels Heptafluorbuttersäureanhydrids, entwickelt. Der Nachweis der endokrin wirksamen

Substanzen und ihre anschließende Identifizierung und Quantifizierung erfolgte mittels

massenspektrometrischer Detektion nach vorheriger gaschromatographischer Trennung

(GC/MS) der EDC-haltigen Extrakte. Besonders wurde der Einfluss unterschiedlicher

Derivatisierungsreagenzien auf die Nachweisbarkeit hinterleuchtet. Dabei wurde u.a. der

Einfluss unterschiedlicher Fluorgehalte der Derivate auf die Empfindlichkeit bei der

Ionisierung entweder mittels Elektronenionisation oder mittels negativer chemischer

Ionisation untersucht. Als optimales Derivatisierungsreagenz erwies sich das

Heptafluorbuttersäuranhydrid. Für den routinemäßigen Nachweis der EDCs wurde im

Anschluss an diese bewertenden Untersuchungen die positive Elektronenionisation (EI)

verwendet.

Die Wiederfindungen dieser optimierten Bestimmungsmethode lagen zwischen 77 und

116 % und die Nachweisgrenzen lagen im unteren ng/L-Bereich, so dass die Methode zur

Analyse realer Abwasserproben auf EDCs geeignet ist.

Die Besonderheit an der Bestimmung aus den festen Matrices Klärschlamm bzw. Sediment,

war die Extraktion mittels „accelerated solvent extraction“ (ASE) bzw. „pressurized liquid

extraction“ (PLE). Dieses Verfahren wurde bisher kaum, bzw. nicht für die komplette

Bandbreite der ausgewählten EDCs genutzt. Die Extraktion wurde in Bezug auf Temperatur,

Druck, verwendetem Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch - nach Art und Menge -

10 Zusammenfassung 127

sowie in Bezug auf die Extraktionszeit und Einwaage des Probenmaterials optimiert. Die

erarbeitete Methode ist besonders effizient in Bezug auf die Extraktionsausbeute, d. h., die

Wiederfindungen liegen im Bereich von 82 bis 116 % für Klärschlämme und 74 bis 104 % für

Sedimente. Im Vergleich zu der häufig angewendeten Soxhlet-Extraktion ist die entwickelte

ASE-Extraktion zum einen wesentlich schneller und verbraucht zum anderen geringere

Volumina an Extraktionsmitteln. Das nachfolgende clean-up des Probenextraktes erfolgte

entsprechend der Aufarbeitung wässriger Proben, nachdem der organische Extrakt zuvor in

Reinstwasser suspendiert worden war.

Die optimierte Bestimmungsmethode der EDCs in festen Matrices wurde auch eingesetzt,

um die Belastung des Sediments eines in Griechenland gelegenen Sees mit Namen Volvi

über einen Zeitraum von zwei Jahren abzubilden. Dieser See ist durch die Ramsar

Convention on Wetlands als ein international bedeutendes Feuchtgebiet ausgewiesen.

Aufgrund dieses Schutzes ist die Information über eine Belastung mit endokrin wirksamen

Substanzen von großem Interesse. Die Ergebnisse zeigten, dass die Belastung im

Untersuchungszeitraum stark zurückgegangen ist. Am Anfang der Untersuchungen waren

noch die besonders potenten Steroide nachweisbar, am letzten Probenahmetermin war

dagegen nur noch Bisphenol A zu beobachten, dieses jedoch in deutlich geringeren

Konzentrationen als zu Beginn der Untersuchungen.

Damit stehen nunmehr validierte analytische Methoden zur Bestimmung der endokrin

wirksamen Substanzen Nonylphenol, Bisphenol A, Octylphenol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol

und 17α-Ethinylestradiol aus flüssigen und festen Matrices, d.h., aus Abwässern,

Klärschlämmen und Sedimenten, zur Verfügung. Diese haben bereits in der Routineanalytik

ihre Bewährungsprobe bestanden.

128 11 Anhang

11 Anhang Tabelle 11.1: Im Rahmen der Erstellung dieser Arbeit verwendete Chemikalien

Chemikalie Lieferant, Firmensitz Helium 99,999 % Linde Gas, Höllriegelskreuth

Methan 99,999 % Linde Gas, Höllriegelskreuth

Stickstoff, 99,999 % Westfalen Gas, Münster

Aceton, tech. Chemikalien Scheins, Aachen

Aceton, picograde Promochem, Wesel

Acetonitril, für HPLC Promochem, Wesel

Hochreines, entmineralisiertes Wasser Reinigung von entionisiertem Aachener Trinkwasser mittels Milli-Q System (Millipore, Milford, MA, USA)

Dichlormethan, picograde Promochem, Wesel

Diethylether, picograde Promochem, Wesel

Ethylacetat, picograde Promochem, Wesel

Hexan, picograde Promochem, Wesel

Methanol, picograde Promochem, Wesel

n-Pentan, picograde Promochem, Wesel

Toluol, picograde Promochem, Wesel

Bisphenol A Dow, Stade

Bisphenol A d16, 98 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen

17-β-Estradiol, 97 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen

17-β-Estradiol-acetat, 99,3 % Riedel de Heen, Seelze

Estriol, 98 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen

Estron, 99 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen

17-α-Ethinylestradiol, 98 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen

4-Nonylphenol, tech. Fluka, Taufkirchen

4n-Nonylphenol, 99,6 % Riedel de Haën, Seelze

Octylphenol, 99 % Sigma - Aldrich, Taufkirchen

Heptafluorbuttersäureanhydrid, 98 % Acros, Geel, Belgien

Pentafluorpropionsäureanhydrid, 98 % Acros, Geel, Belgien

Trifluoressigsäureanhydrid, 99 % Fluka, Taufkirchen

Ameisensäure, 98 – 100 % Merck, Darmstadt

Natriumazid, 99,0 % Merck, Darmstadt

Natriumsulfat, wasserfrei Merck, Darmstadt

Salzsäure, 37 % Riedel de Haën, Seelze

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13 Danksagung 139

13 Danksagung

Diese Arbeit entstand im Rahmen des Aachener Graduiertenkollegs zur Eliminierung

endokrin wirksamer Substanzen aus Abwasser (AGEESA) im Umweltanalytischem Labor

des Instituts für Siedlungswasserwirtschaft der Rheinisch-Westfälischen Technischen

Hochschule Aachen.

Allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich an dieser Stelle

herzlich danken, insbesondere:

Herrn PD. Dr. rer. nat. habil. H. Fr. Schröder für die Möglichkeit der Durchführung dieser

Arbeit, für die fachliche und anderweitige Unterstützung zu jedem Zeitpunkt.

Herrn Univ.-Prof. Dr. rer. nat. A. Schäffer und Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. P. Doetsch für die

Übernahme der Co-Referate.

Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. M. Dohmann und Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. J. Pinnekamp für die

Unterstützung des Graduiertenkollegs AGEESA und der Möglichkeit die Arbeit am Institut für

Siedlungswasserwirtschaft durchzuführen.

Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. M. Dohmann und Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. T. Melin für die Leitung

des Graduiertenkollegs AGEESA.

Dem Umweltforum der RWTH Aachen für die Einrichtung und Unterstützung des

Graduiertenkollegs AGEESA.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Finanzierung.

Allen Mitarbeiten des Umweltanalytischen Labors, insbesondere Herrn R.J.W. Meesters und

Herrn Gschwendtner für die unermüdliche Hilfe mit dem GC/MS und der ASE. Ebenso allen

Mitarbeitern für die anregenden Diskussionen und die freundliche Arbeitsatmosphäre.

Den Mitarbeitern des Arbeitskreises um Herrn Prof. Dr. K. Fytianos für die Bereitstellung der

Sedimentproben.

Allen AGEESA Mit-Stipendiaten, vor allem denen der 1. Phase, die mir, obwohl verspätet

dazu gestoßen, mit ihrer Unterstützung einen tollen Einstieg in die Arbeit ermöglicht haben.

Steffi, Daniela und Uwe, danke dass Ihr einen Blick auf die Arbeit geworfen habt.

Den Haus D Mitbewohnern, die immer ein offenes Ohr für Fragen und Probleme hatten.

Meiner Mutter, die mich zu jeder Zeit unterstützt hat.

14 Lebenslauf 141

14 Lebenslauf

Persönliche Daten: Name Angelika Stehmann

Anschrift Grünenthaler Str. 42

52072 Aachen

Geburtsdatum/-ort 27.02.1976 in Steinfurt

Familienstand ledig

Beruf: seit 02.2006 Ass. Quality Assurance Manager

Greenpower B.V., Kerkrade, NL

Promotion: 08.2001 – 07.2004 DFG-Promotionsstipendium im

Graduiertenkolleg AGEESA

(Aachener Graduiertenkolleg zur Eliminierung

Endokrin wirksamer Substanzen aus

Abwasser)

am Institut für Siedlungswasserwirtschaft,

RWTH-Aachen

08.2004 – 12.2005 wiss. Mitarbeiterin

am Institut für Siedlungswasserwirtschaft

Praktisches Jahr: 07.2000 – 09.2000 Praktikum bei der Sourcing Unit Reken der

Langnese-Iglo GmbH

10.2000 – 11.2000 Praktikum im Fachbereich Tiere und

Lebensmittel des Kreises Borken

12.2000 – 08.2001 Praktikum im Chemischen Landes- und

Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt

Münster

Abschluss: 2. Staatsexamen für

Lebensmittelchemiker

142 14 Lebenslauf

Studium:

10.1995 – 05.2000 Studium der Lebensmittelchemie an der

Westf. Wilhelmsuniversität Münster

Abschluss: 1. Staatsexamen für

Lebensmittelchemiker

04.1997 – 03.2001 Diplomstudiengang Chemie an der

Westf. Wilhelmsuniversität Münster

Schulabschluss:

06.1995 Abitur am Städtischen Gymnasium

Borghorst

ESTROGEN WIRKSAMER SUBSTANZEN„Entwicklung und Anwendung chemisch – analytischer Verfahren zur...

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