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Etablierung der Lasermikrodissektion zur proteomischen Analyse

von humanem Filaminopathiegewebe und murinen Myoblasten

Dissertation

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

angefertigt

in der Abteilung Funktionelle Proteomik am Medizinischen Proteom-Center

vorgelegt

der Fakultät für Chemie und Biochemie

an der Ruhr-Universität Bochum

von

Verena Theis, geb. Schwarz

Bochum

Juni, 2013

Establishment of proteomic studies in patients with filaminopathy

and murine myoblasts

Dissertation

To obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

Dept. Functional Proteomics Medical Proteom Center

International Graduate School of Chemistry and Biochemistry,

Faculty of Chemistry and Biochemistry, Ruhr-University Bochum

Submitted by

Verena Theis, geb. Schwarz

Bochum

Juni 2013

Referent: Prof. Dr. Katrin Marcus

Funktionelle Proteomik

Ruhr Universität Bochum

Korreferent: Prof. Dr. Rolf Heumann

Molekulare Neurobiochemie

Ruhr Universität Bochum

Für Krümel und Cassian

i

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................................. I

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................... I

1. EINLEITUNG ........................................................................................................................ 1

1.1. Die Skelettmuskulatur ......................................................................................................................... 1

1.1.1. Aufbau der Myofibrillen ..................................................................................................................... 2

1.1.2. Die Filamine....................................................................................................................................... 3

1.1.3. Die Bedeutung von Intermediärfilamenten ........................................................................................ 5

1.2. Myofibrilläre Myopathien (MFM) ........................................................................................................ 7

1.3. Die Filaminopathie ............................................................................................................................ 10

1.4. Lasermikrodissektion ......................................................................................................................... 12

1.5. Grundlagen der Proteomanalyse ....................................................................................................... 14

1.5.1. Proteomanalysen von Skelettmuskulatur ....................................................................................... 15

1.5.2. Auftrennung mittels 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D PAGE) ............................................ 17

1.5.3. Differentielle Proteomstudie und Quantifizierung von Proteinen ................................................... 17

1.6. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ............................................................................ 19

1.7. Massenspektrometrie........................................................................................................................ 19

1.7.1. Ionenquellen ................................................................................................................................. 21

1.7.2. Massenanalysatoren ...................................................................................................................... 23

1.8. Quantitative Massenspektrometrie ................................................................................................... 27

1.8.1. Isotopen-Labeling .......................................................................................................................... 27

1.8.2. Label-freie Quantifizierug mittels Spectral Index Calculation .......................................................... 29

2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT ................................................................................................ 32

3. MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................ 34

3.1. Verwendete Chemikalien .................................................................................................................. 34

3.2. Verwendete Geräte und Materialien ................................................................................................. 38

Inhaltsverzeichnis

ii

3.3. Präparation von Gewebeschnitten .................................................................................................... 43

3.4. Patientendaten .................................................................................................................................. 43

3.5. Immunfluorezenzfärbungen .............................................................................................................. 45

3.5.1. Immunfluoreszenzfärbungen auf Glasobjektträgern ....................................................................... 45

3.5.2. Immunfluoreszenzfärbung aufPET-Membran ................................................................................. 45

3.5.3. Validierung differentieller Proteine mittels Immunfluoreszenz ....................................................... 46

3.6. Herstellen von Muskellysaten ........................................................................................................... 46

3.7. Kultivierung von murinen Myoblasten .............................................................................................. 47

3.8. Zellbiologische Methoden ................................................................................................................. 48

3.8.1. Transformation von Konstrukten in E.coli-Zellen ............................................................................ 49

3.8.2. DNA-Extraktion und Überprüfung der Plasmid-DNA ....................................................................... 49

3.8.3. Herstellen von Glycerolstocks ........................................................................................................ 50

3.8.4. Transfektion der FLNc Konstrukte in murine Myoblasten ............................................................... 50

3.9. Lasermikrodissektion (LMD) .............................................................................................................. 51

3.10. Solubilisierung der Aggregate ............................................................................................................ 52

3.11. In-Lösung-Verdau .............................................................................................................................. 52

3.12. Aufreinigung der Proben nach dem In-Lösung-Verdau ...................................................................... 53

3.13. Differentielle In-Gel Elektrophorese des Proteoms von Patienten mit Filaminopathie ...................... 54

3.13.1. Markierung der Proteine durch CyDye™Farbstoffe ......................................................................... 54

3.13.2. Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten ........................................................................ 55

3.13.3. Proteinauftrennung nach Molekulargewicht .................................................................................. 57

3.13.4. Differentielle Bildanalyse ............................................................................................................... 58

3.13.5. Mini 2D Gel Elektrophorese ........................................................................................................... 59

3.14. Proteolytische Spaltung von Proteinen für LC-ESI-MS/MS und MALDI............................................... 60

3.14.1. Verdau der Spots ........................................................................................................................... 60

3.14.2. Extraktion der Peptide für MALDI................................................................................................... 60

3.14.3. Extraktion der Peptide für die LC-ESI-MS/MS ................................................................................. 61

3.15. Proteinidentifizierung mittels MALDI ................................................................................................ 61

3.15.1. Datenauswertung der MALDI-Messung .......................................................................................... 62

3.16. Proteinidentifizierung mittels LC-ESI-MS/MS ..................................................................................... 63

3.16.1. LTQ Orbitrap .................................................................................................................................. 64

3.16.2. LTQ Velos Pro ................................................................................................................................ 65

3.16.3. Datenauswertung der LC-ESI-MS/MS ............................................................................................. 65

3.17. Auswertung massenspektrometrischer Daten nach Datenabgleich ................................................... 67

3.17.1. Die pseudo-qualitative Auswertung ............................................................................................... 68

3.17.2. Spectral Index Calculation .............................................................................................................. 68

3.18. Western Blot ..................................................................................................................................... 70

Inhaltsverzeichnis

iii

4. ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 72

4.1. Etablierung der LMD zur Label-freien Proteomanalyse ...................................................................... 73

4.1.1. Darstellbarkeit der Aggregate ........................................................................................................ 73

4.1.2. Solubilisierung der Aggregate ........................................................................................................ 74

4.1.3. Optimierung der Anzahl von Aggregaten ........................................................................................ 77

4.2.. Ergebnisse der Label-freien Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe......................................... 80

4.2.1. Entwicklung einer geeigneten Auswertestrategie ........................................................................... 81

4.2.1.1. Vergleichende Analyse Aggregatproben - Patientenkontrollen ....................................................... 82

4.2.1.2. Vergleichende Analyse Patientenkontrollen - Negativkontrollen .................................................... 87

4.2.1.3. Vergleich der manuellen und automatisierten quantitativen Auswertung ...................................... 92

4.2.2. Validierung differentieller Proteine der Aggregatanalyse ................................................................ 97

4.3. Etablierung der 2D Differentiel In-Gel Elektrophorese mittels 2D DIGE.............................................. 98

4.3.1. Optimierung der Probenmenge ..................................................................................................... 98

4.3.2. Ergebnisse der differentiellen Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe mittels 2D DIGE ......... 100

4.3.2.1. Ergebnisse der differentiellen Analyse mittels DeCyder ................................................................ 101

4.3.2.2. Identifizierung differentieller Proteins mittels MALDI ................................................................... 103

4.3.2.3. Überprüfen der Spectral Index Daten in Patientenkontrollen mittels 2D DIGE .............................. 104

4.3.3. Untersuchung einer posttranslationalen Modifikation an Desmin mittels 2D Blot ......................... 105

4.4. Murine Myoblasten als MFM-Zellkulturmodell ............................................................................... 110

4.4.1. Transfektion der p.W2710X-Mutation in murine Myoblasten ....................................................... 111

4.4.2. Optimierung der LMD .................................................................................................................. 113

4.4.3. Ergebnisse der Label-freien Aggregatanalyse im Zellkulturmodell ................................................. 117

5. DISKUSSION ....................................................................................................................120

5.1. Lasermikrodissektion ................................................................................................................... 121

5.2. Etablierung der differentiellen Proteomanalysen in Filaminopathien .............................................. 122

5.2.1. Label-freie Proteomanalyse ......................................................................................................... 123

5.2.1.1. Solubilisierung der Aggregate ...................................................................................................... 123

5.2.1.2. Optimierung der Probenmenge ................................................................................................... 124

5.2.1.3. Auswertestrategien ..................................................................................................................... 125

5.2.1.4. Die physiologische Bedeutung der differentiell exprimierten Proteine in den Aggregaten ............. 130

5.2.2. Gelbasierte differentielle Analyse ................................................................................................ 133

5.2.2.1.. Optimierung der Probenmenge ................................................................................................... 134

5.2.2.2. Detektion differentiell exprimierter Proteine ............................................................................... 135

5.2.2.3. Die physiologische Bedeutung der differentiell exprimierten Proteine in Patientenkontrollen ...... 137

5.2.2.4. Die biologische Relevanz der Desminphosphorylierung ................................................................ 143

5.2.2.5. Die Relevanz der Desminphosphorylierung in Filaminopathien ..................................................... 145

5.2.2.6. Die Detektion der Phosphorylierung in Desmin ............................................................................ 147

5.2.2.7. Lokalisation von Phosphorylierungen in der Aminosäuresequenz ................................................. 148

5.3. Proteomstudien im Zellkulturmodell ............................................................................................... 152

5.4. Fazit und Ausblick .......................................................................................................................... 157

6. ZUSAMMENFASSUNG .....................................................................................................159

Inhaltsverzeichnis

iv

7. SUMMARY ......................................................................................................................164

8. LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................164

9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................192

10. TABELLENVERZEICHNIS .................................................................................................192

11. LEBENSLAUF ..................................................................................................................192

12. DANKSAGUNG...............................................................................................................198

13. ANHANG .......................................................................................................................201

I

Abkürzungsverzeichnis

1D-PAGE Eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese

2D PAGE Zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese

A Ampere

°A Anström

Abb. Abbildung

ABD Aktin-bindende Domäne

Agg

AK

Aggregatprobe

Antikörper

APEX absolute protein abundance index

APS Ammoniumpersulfat

ADP Adenosindiphosphat

ATP Adenosintriphosphat

AS Aminosäuren

AQUA absolute quantification of proteins

BAG3 BCL2-associated athanogene 3/ family molecular chaperone regulator 3

Bis-Tris Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan

Bp Basenpaare

BR Broad-range

BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

BT Bis-Tris

BVA Biological Variance Analysis

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

CBM Cytoplasmatische Body Myopathie

CHAPS

CID

3-[(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-propansulfonsäure

Collision induced dissociation

CK Creatin Kinase

cm Zentimeter

cm3 Kubikzentimeter

COX Cytochrome C Oxidase

CRYAB Alpha B Crystallin

Cy Cyanin Fluoreszenzfarbstoff

Da Dalton


II

DCM Dilatative Cardiomyopathie

DES Desmin-Gen

DIA Differential In-Gel Analysis

DIGE differential in-gel electrophoresis (Differentielle In-Gel Elektrophorese)

DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

ds double strain

DTT 1,4 – Dithiothreitol

Engl. englisch

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGFP Enhanced Green fluorescent Protein

emPAI exponentially modified protein abundance index

ESI electrospray-ionization (Elektrosprayionisation)

ETD Elektronentransferdissoziation

fl Full length

FLNC Filmain-Gen

FHL-1 Four and a half LIM domains protein 1

FA formic acid (Ameisensäure)

FCS fetal bovine serum (Fötales Kälberserum)

GFP Green fluorescent Protein

GGA Geranylgeranylaceton

GIST Global Internal Standard

h Stunde

HPLC high performance liquid chromatography

(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)

Hskm Humane Skelettmuskelzellen

HSP Heat Shock Protein

IAA Iodacetamid

ICAT isotope coded affinity tag

ICPL isotope coded protein label

IEF

IMAC

iTRAQ

kDa

Isoelelektrische Fokussierung

Metallaffinitätschromatographie

Isotope Tags For Relative and Absolute Quantification

Kilodalton

kV Kilovolt

LB-Medium Lysogeny Broth Medium (Nährmedium zur Kultivierung von Bakterien)

LC Liquid Chromatography (Flüssigkeitschromatographie)

LMD Lasermikrodissektion


III

M Mol

mA Milliampere

ml Milliliter

mM Millimol

mgf Mascot generic format

min Minute

m/z Masse-zu-Ladungsverhältnis

MOAC Metalloxidaffinitätschromatographie

MOPS Morpholinopropansulfonsäure

MS Massenspektrometrie

MS/MS Tandemmassenspektrometrie

Msec Millisekunde

Mut Mutante

MYL3 Myosin leichte Kette 3

MW molecular weight (Molekulargewicht)

n Anzahl unabhängiger Experimente

NADH Nicotinamidadenosindinukleotid

NEAA Non essential amino acids

NegKO Negativkontrolle

nL Nanoliter

nm Nanometer

Nmol Nanomol

NP-HPLC Normalphasen-Chromatographie

NRAP Nebulin-related-anchoring protein

Nr. Nummer

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PBS

PDA

PET

phosphate buffered saline (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung)

Piperazin-Diacrylamid

Polyethylentetraphtalat

PEN Polyethylene Naphthalate

pI

PatKO

Isoelektrischer Punkt

Patientenkontrolle

PGM Phosphoglucomutase

PLEC1 Plectin 1-Gen

PMF

ppm

PYG

RP

rpm

peptide mass fingerprint (Peptidmassenfingerabdruck)

parts per million

Glykogen Phosphorylase

reversed phase

rounds per minute

RBM Reducing Body Myopathie

RT-HPLC Umkehrphasenchromatographie


IV

RT

SAX

SCX

Raumtemperatur

Anionaustauscher

Kationaustauscher

SDS

sec

sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)

Sekunde

Seq Sequenz

SI Spectral Index

SILAC stable isotope labelling by amino acids in cell culture

SIMAC Sequential Elution from IMAC

SOC- Medium Super Optimal Broth (SOB) Nährmedium mit Zugabe von 20 mM

Glucose

TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung

TCEP

TEMED

tris(2-carboxyethyl)phosphine

N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

TE Tris/EDTA

TFA Trifluoressigsäure

TMT tandem mass tagging

TOF time of flight (Flugzeit)

Tris Base Tris(hydroxymethyl-)aminomethan

Tris HCl

TTID

Tween 20

UV

Tris(hydroxymethyl-)aminomethan Hydrochlorid

Myotilin-Gen

Polyoxyethylensorbitan-monolaurat

Ultraviolett

U Unit

V Volt

VDAC Voltage-dependent anion-selective Channel

VDCC Voltage-dependent calcium-selective Channel

Vers. Version

v/v volume per volume (Volumen pro Volumen)

w/v

Xin

Xirp2

weight per volume (Gewicht pro Volumen)

Xin actin-binding repeat-containing protein 1

Xin actin-binding repeat-containing protein 2

Z Ladungszahl

ZASP Z-band alternatively spliced PDZ motif containing protein

z.B. Zum Beispiel

z.T. Zum Teil

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µm2 Quadratmikrometer

1

1. Einleitung

Myofibrilläre Myopathien (MFM) bilden eine genetisch wie klinisch heterogene

Gruppe von neuromuskulären Erkrankungen. Auf zellulärer Ebene zeichnen sie sich durch

fokale myofibrilliäre Zerstörung und intrazelluläre Proteinaggregation aus [Selcen et al.

2004]. Die Filaminopathie ist ein Subtyp der MFM und wird durch Mutationen im

codierenden Gen für Filamin C (FLNC) verursacht. Filamin C wird vorwiegend in Skelett- und

Herzmuskulatur exprimiert und ist innerhalb der Muskelzellen an der Z-Scheibe lokalisiert.

An den Z-Scheiben interagiert Filamin C mit diversen Proteinen, einschließlich Aktin und

Myotillin. Im Mittelpunkt der hier vorliegenden Dissertation stand die proteomische

Untersuchung der Proteinaggregate und des umliegenden Gewebes von 6

Filaminopathiepatienten mit 3 verschiedenen Mutationen im für Filamin C codierenden Gen.

Dafür war es zunächst notwendig entsprechende Protokolle zu etablieren, basierend auf der

Lasermikrodissektion (LMD). Für die Analyse der Proteinaggregate wurde ein Label-freier

Ansatz mit anschließender quantitativer Auswertung etabliert, zur Charakterisierung von

möglichen Frühmarkern in dem umliegenden Gewebe wurde die 2D DIGE Analyse gewählt.

Zusätzlich sollte ein Zellmodell etabliert werden, um zukünftige funktionelle Analysen zu

ermöglichen.

1.1. Die Skelettmuskulatur

Die Skelettmuskulatur umfasst die Muskeln des Bewegungsapparates sowie die

Muskeln in der Zunge, im Pharynx und im des oberen Anteils des Oesophagus [Schiebler

Anatomie 9. Auflage 2005]. Zusammen mit der Herzmuskulatur wird die Skelettmuskulatur

als quergestreift bezeichnet, da die kontraktilen Einheiten im Lichtmikroskop als helle und

dunkle Areale erscheinen. Ein Skelettmuskel ist hierarchisch aufgebaut und setzt sich aus

zahlreichen Muskelfaserbündeln zusammen. Die Muskelfaserbündel bestehen aus

Einleitung

2

Muskelfasern. Durch die Fusion vieler einkerniger Myoblasten in der Embryonalentwicklung

entsteht eine vielkernige Skelettmuskelzelle. Eine Zelle beinhaltet bis zu 100 randständige

Kerne, die unter dem Plasmalemm lokalisiert sind [Schiebler Anatomie 9. Auflage 2005].

1.1.1. Aufbau der Myofibrillen

Die Myofibrillen bilden die kleinste Untereinheit des Skelettmuskels. Die 1-2 µm

dicken Myofibrillen verlaufen parallel zur Muskellängsachse und bilden zylindrische

Strukturen. Sie werden durch die Z-Scheiben in Sarkomere unterteilt, welche die kleinsten

funktionellen Einheiten des Muskels bilden. Ein Sarkomer besteht neben dicken

Myosinfilamenten (10-15 nm) hauptsächlich aus dünnen Aktinfilamente (5-6 nm). Die

Myosinfilamente verschieben sich während der Muskelkontraktion gegeneinander [Schiebler

Anatomie 9. Auflage 2005]. Die Myosinmoleküle bestehen aus einem dünnen Schaft und

einem kugelförmigen Kopf. Die Myosinköpfchen verfügen über einen Myosin-ADP-Komplex

und weisen eine hohe ATPase-Aktivität auf. Sobald ATP in ADP und Phosphat gespalten wird,

bindet das Aktin an die Köpfchen und das Myosin gleitet entlang der Aktinfilamente. Die Z-

Scheiben nähern sich an und daraufhin verkürzt sich das Sarkomer aktiv.

Im Lichtmikroskop lassen sich einzelne Streifen als strukturelles Merkmal der

Myofibrillen erkennen (Abb. 1.1.). Die Streifen erscheinen aufgrund ihrer Lichtdurchlässigkeit

als helle und dunkle Zonen. Die I-Streifen werden im polarisierten Licht nur schwach

gebrochen und erscheinen deswegen hell. In diesen Streifen befinden sich ausschließlich

dünne Aktinfilamente. Im Gegensatz zu den I-Streifen erscheinen die A-Streifen im

polarisierten Licht dunkel, weil sie doppelt gebrochen werden. Sie werden von dicken

Myosinfilamenten mit zwischengelagerten dünnen Aktinfilamenten gebildet. In den A-

Streifen befindet sich die H-Zone, in dieser Zone befinden sich keine Aktinfilamente. Die

Mitte der H-Zone wird als M-Streifen bezeichnet. Hier sorgen Strukturproteine wie

Myomesin für die regelmäßige Anordnung der Myosinfilamente. Indirekt werden die dicken

Filamente mit den Z-Scheiben auch über Titin verbunden. Titin ist mit 3000-3800 kDa das

größte bekannte Molekül und ist in den Z-Scheiben wie auch in der M-Bande verankert.

Einleitung

3

Abbildung 1.1.: lichtmikroskopische Aufnahme und strukturelle Darstellung einer Myofibrille im Skelettmuskel,

modifiziert nach Schmidt et al. Physiologie des Menschen 29.Auflage 2005

Die hell erscheinende I-Bande wird durch die Z-Schreibe in zwei Hälften unterteilt und enthält

ausschließlich dünne Aktin-Filamente. An der Z-Scheibe sind die dünnen Filamente (Aktin) durch das

Gerüstprotein alpha-Aktinin befestigt. Die dicken Myosin-Filamente werden indirekt über Titin mit der

Z-Scheibe verbunden. Die Lokalisation von Myosinfilamenten beschränkt sich nur auf die im

Lichtmikroskop dunkel erscheinenden A-Streifen.

1.1.2. Die Filamine

Beim Menschen gibt es drei verschiedenen Filamine: A, B und C. Filamin A wurde

erstmals 1975 von Hartwig und Stossel beschrieben [Hartwig and Stossel 1975, Nakaumra et

al. 2011]. Die Struktur der verschiedenen Filamine ist sehr ähnlich, sie bestehen aus drei

strukturellen Komponenten. Eine schematische Darstellung eines Filamin Moleküls ist in

Abbildung 1.2. dargestellt. N-Terminal befindet sich die Aktin-bindende Domäne (ABD),

welche aus einer CH-Domäne und drei hydrophoben Aktinbindungstellen besteht [Pollard et

al. 1994]. An die ABD schließen sich 24 Wiederholungen aus Immunglobin-ähnlichen

Strukturen (Ig-like domäne) an [Xie et al. 1998]. Jede Domäne setzt sich aus 2 ß-Faltblätter

Einleitung

4

zusammen, die sich wiederum zu insgesamt 7 ß-Strängen zusammenlagern. Die Domänen 15

und 16 sowie 23 und 24 sind durch Gelenkregionen voneinander getrennt. Die sogenannten

„hinges“ verleihen der Quervernetzung Flexibilität. Die Domäne 24 ist essentiell für die

Dimerisierung von Filamin-Molekülen [Himmel et al. 2003]. Filamine gehören zu den Aktin-

bindenden Proteinen. Sie sind an der Quervernetzung von Aktinfilamenten, welche einen

Hauptbestandteil des Zytoskeletts bilden sowie an der Vernetzung von Aktinfilamienten mit

Zellmembranproteinen beteiligt. Indirekt spielen sie ebenfalls eine Rolle in der Zell-Zell und

Zell-Matrix-Verbindung. Die Sequenzhomologie zwischen den Filaminen A, B und C beträgt

60-80 % [Gorlin et al. 1990]. Filamin C ist die muskelspezifische Isoform der Filamine und

unterscheidet sich durch die Insertion von 81 Aminosäuren in die Domäne 20 (Abb. 1.2.,

grün dargestellt) von den anderen beiden Isoformen. Diese Modifizierung scheint die direkte

Verankerung mit den Z-Scheiben ermöglichen [Van der Veen et al. 2000]. Seine

Hauptaufgabe besteht darin, die Aktinfilamente mit den Z-Scheiben zu verankern und ist

daher entscheidend für die Stabilität der Myofibrillen. Im Laufe der Jahre wurden diverse

Bindungspartner des Filamin C beschrieben, u.a. γ-Sarkoglykan [Thompson et al. 2000],

Myotilin [van der Ven et al. 2000] und Xin [van der Ven et al. 2006]. Auf Grundlage des hier

etablierten Label-freien Ansatzes zur Proteomanalyse konnte kürzlich ein neuer

Bindungspartner beschrieben werden: Xirp2 [Kley et al. 2012]. Zusätzlich übernimmt das

Filamin C neben der mechanischen Funktion auch eine Rolle in der Signaltransduktion. Es

wird vermutet, dass durch die Bindung kleiner GTPasen der Rho-Familie an das C-Terminale

Ende das Filamin C direkt an Umbauprozesse des Aktinzyoskeletts beteiligt ist [Ohta et al.

1999].

Abbildung 1.2.: Schematische Darstellung des Filamin C Moleküls, modifiziert nach Duff et al. 2011

Das Filamin C Molekül besteht aus drei strukturellen Komponenten. N-Terminal befindet sich die

Aktin-bindende Domäne. Daran schließen sich 24 Immunogloblin-ähnliche Domänen an. Die Domäne

24 ist entscheidend für die Dimerisierung von Filamin C Molekülen. Im Gegensatz zu den Filaminen A

und B verfügt Filamin C über eine zusätzliche Domäne, die Domäne 20 (grün dargestellt).

Einleitung

5

1.1.3. Die Bedeutung von Intermediärfilamenten

Zusammen mit den Mikrofilamenten und den Mikrotubuli bilden die

Intermediärfilamente die Hauptkomponenten des Zytoskeletts. Die Hauptaufgabe der

Intermediärfilamente liegt in der mechanischen Stabilisierung der Myofibrillen [Lazarides

1980]. Die Bezeichnung Intermediärfilamente wurde aufgrund ihres Durchmessers (8-10 nm)

gewählt, da dieser zwischen dem Durchmesser der dünnen (Aktinfilamente) und der dicken

Filamente (Myosinfilamente) liegt. Im Vergleich zu den Aktinfilamenten und

Myosinfilamenten sind Intermediärfilamente flexibler und formbarer [Georgatos et al. 1996].

Die Familie der Intermediärfilamente setzt sich aus 6 Gruppen zusammen, welche in Tabelle

1.1. dargestellt sind [Stewart 1990, Kim and Couloombe 2007, Iwatsuki and Suda 2010].

Tabelle 1.1: Unterteilung der Intermediärfilament-Familie in 6 Gruppen

Klasse Vertreter und Vorkommen

I saure Keratine: Epitelien

II basische Keratine: Epithelien

III

GFAP ( glial fibrillar acidic protein): Gliazellen und Astrozyten Desmin, Syncollin: Muskelzellen

Vimentin: Zellen mesenchymaler Herkunft Peripherin: periphere Neurone

IV

Synemin: Muskulatur NF-L, alpha-/beta-Internexin, NF-M,

NF-H: Neurone Nestin: neuroepitheliale Stammzellen

V

Lamin A, B und C: Zellkern

VI Phakinin, Filensin: Auge

Die Struktur aller Mitglieder der Intermediärfilament-Familie setzt sich aus 3

Komponenten zusammen: einer zentralen alpha-helikalen Stabregion, die von einem nicht

alpha-helikalen N-Terminus (head) und einem nicht-helikalen C-Terminus (tail) flankiert wird

[Stuurman et al. 1998]. Ein Monomer ist ca. 48 nm lang und sehr dünn. Sobald sich zwei

Monomere longitudinal entlang der Stabregion in head-tail-Orientierung zusammenlagern

entstehen Protofilamente (Tetramere). Aus zwei Tetrameren werden Protofibrillen gebildet

und vier Protofibrillen ergeben letztendlich ein Intermediärfilament. Über Bindungspartner,

die sogenannten Intermediärfilament-assoziierten Proteine, werden die Filamente zum

Einleitung

6

einen untereinander und zum anderen mit diversen Komponenten des Zytoskeletts vernetzt.

Das Intermediärfilament der Klasse III, Desmin, zählt zu den wichtigsten

Intermediärfilamenten in der Skelett-, Herz und glatten Muskulatur. Desmin spielt eine

entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung der zellulären Integrität. Durch den Ausbau

eines dreidimensionales Gerüstes werden die verschiedensten Kompartimente miteinander

vernetzt, z.B. Z-Scheiben untereinander und mit der Plasmamembran sowie die

Zellmembran mit cytosolischen Membranorganellen [Capetanaki et al. 1997]. Studien an

Desmin knock-out Mäusen zeigten neben der mechanischen Funktion eine zusätzliche

Vernetzung zwischen den Desminfilamenten und der Lokalisation, Form und Funktion von

Mitochondrien [Capetanaki 2002, Costa et al. 2004, Goldfarb et al. 2004]. Die gestörte

Desmin-Expression wird mit verschiedenen Myopathien in Verbindung gebracht [Goebel

1997]. 1998 wurde von Goldfarb et al. die erste Mutation im Desmin-Gen beschrieben,

seitdem wurden mehr als 60 verschiedene Mutationen im Desmin-Gen identifiziert

[Goldfarb et al. 1998, Maerkens et al. 2013]. Neben der proximalen und distalen

Muskelschwäche können bei dreiviertel aller Patienten mit Desminopathien auch

Kardiomyopathien beobachtet werden [Clemen et al. 2013].

Neben Desmin können auch weitere Intermediärfilamente mit neuromuskulären

Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Vimentin ist in reifen Muskelzellen nicht

nachweisbar [Goebel 1995], in der embryonalen Entwicklung hingegen ist es hoch abundant

und mit Desmin ko-lokalisiert. Die Expression von Vimentin konnte in regenerierenden

Muskelfasern, in inflammatorischen Myopathien und Muskeldystrophien sowie in atrophen

Fasern der spinalen Muskelatrophie Type I nachgewiesen werden [Bornemann et al. 1993].

Plectin zählt zu den Intermediärfilament-assoziierten Proteinen. Plectin wird im

Skelettmuskel vermehrt an den Z-Scheiben exprimiert. Zusätzlich lässt es sich im

Sarkolemma und im intermyofibrillären Netzwerk nachweisen [Banwell et al. 1999].

Wichtige Interaktionspartner des Plectin sind u.a. Desmin [Reipert et al. 1999], Vimentin

[Wiche et al. 1989] und Aktin [Steinbock et al. 1999]. Mutationen im Plectin1-Gen

verursachen schwere Formen der Hautkrankheit Epidermolysis Bullosa Simplex (EBS) mit

einhergehender Muskeldystrophie. Von Geburt an leiden die Patienten unter schmerzhafter

Blasenbildung auf der Haut, die proximale und distale Muskelschwäche entwickelt sich im

Laufe der späten Kindheit [Smith et al. 1996, Pulkkinen et al. 1996, Rezniczeck et al. 2009].

Einleitung

7

1.2. Myofibrilläre Myopathien

Die Myofibrillären Myopathien (MFM) bilden eine genetisch und phänotypisch

heterogene Gruppe neuromuskulärer Erkrankungen. Ein phänotypisches Merkmal der

Erkrankung ist die langsam progrediente Muskelschwäche der proximalen wie auch distalen

Skelettmuskulatur. Die Muskelschwäche macht sich vor allem im Bereich der Oberschenkel

und Arme deutlich. Das Hervorstechen der Schulterblätter ist typisch für einen Teil der

MFM-Patienten (Abb. 1.3. A und B). Zusätzlich können die Gesäß-, Waden- und

Unterarmmuskulatur von der Atrophie betroffen sein. Histologisch zeichnen sich die

Myofibrillären Myopathien durch die fokale Zerstörung der Myofibrillen und die Bildung von

Desmin-positiven Proteinaggregaten in den Muskelzellen aus [Schröder and Schoser 2009].

Das Auflösen der Struktur bewirkt einen Stabilitäts- und Funktionsverlust der Muskelzellen.

Elektronenmikroskopisch lässt sich der Zerfall der Myofibrillen deutlich nachweisen. Eine

vom Zerfall betroffene Myofibrille (Abb. 1.3. C, durch Pfeile gekennzeichnet) weist nicht

mehr die charakteristische Hell-Dunkel-Struktur auf. In direkter Nähe der zerstörten Z-

Scheiben lassen sich filamentäre Ablagerungen (Abb. 1.3. C, Sterne) erkennen. Im Vergleich

dazu ist eine intakte Myofibrille im oberen Teil des Bildes zu sehen (schwarzer Balken). Ein

weiteres histologisches Merkmal ist die Entstehung von Proteinaggregaten innerhalb der

Muskelzellen. In Abb. 1.3. sind zwei verschiedene Nachweistechniken dargestellt. Mittels

Gomori-Trichrom-Färbung und Immunfluoreszenzfärbung lassen sich die Proteinaggregate

spezifisch anfärben [Kley et al. 2007]. Myofibrilläre Myopathien werden in den meisten

Fällen autosomal dominant vererbt. Die Symptomatik und die klinische Manifestation sind

variabel. Erste Beschwerden treten allerdings meist ab dem Beginn der 4. Lebensdekade auf

[Selcen et al. 2004]. Die Lebenserwartung der Patienten kann durch das Auftreten einer

Kardiomyopathie sowie der Beeinträchtigung der Atemmuskulatur stark eingeschränkt sein.

Die Kardiomyopathie wird vor allem bei Patienten mit Desminopathie beobachtet [Levin et

al. 2010].

Einleitung

8

Abbildung 1.3: Phänotypische und histologische Merkmale der Myofibrillären Myopathie, von Dr. Rudolf A. Kley

Die Abbildung zeigt einen Filaminopathiepatienten mit proximaler Muskelschwäche und Scapula alata

(A und B). Die elektronenmikroskopische Aufnahme (C, noch nicht publizierte Abbildung) zeigt die

Disintegration der Z-Scheiben (Pfeile) der Myofibrillen sowie die Akkumulation von

granaulofilamentösem Material (Sterne). Durch die fokale Zerstörung der Myofibrillen geht die Hell-

Dunkel-Struktur der A- und I-Banden verloren. Der Balken markiert im Vergleich zu den zerstörten

Strukturen eine intakte Z-Scheibe. In Abb. D ist eine Trichrom-Färbung dargestellt, mit deren Hilfe

Proteinaggregate und vakuoläre Veränderungen innerhalb der Myofibrillen nachgewiesen werden.

Mittels Immunfluoreszenz wurde Filamin C in den Aggregaten nachgewiesen.

Bei etwa 50% der MFM-Patienten wird die Erkrankung durch Mutationen in Genen

verursacht, die für die Proteine Desmin (DES) [Goldfarb et al. 1998], Myotilin (TTID) [Olive et

al.2005], ZASP (LDB3) [Selcen et al. 2005], Filamin C (FLNC) [Vorgerd et al. 2005], Plectin

(PLEC1) [Schröder et al. 2002], FHL1 (FHL1) [Qunizii et al. 2008], alpha B Crystallin (CRYAB)

[Vicart et al. 1998] oder BAG3 (BAG3) [Selcen et al .2011] kodieren (Tabelle 1.2.). Diese

Proteine sind alle mit der sarkomerischen Z-Scheibe assoziiert, entweder direkt wie z.B.

Filamin C und Myotilin oder indirekt wie z.B. Desmin (Abb. 1.4.). Bei etwa der Hälfte der

MFM-Patienten ist der ursächliche Gendefekt bislang allerdings unklar.

Einleitung

9

Tabelle 1.2. Übersicht über alle bekannten MFM verursachenden Mutationen

Codierendes Gen Protein Literaturnachweis

DES Desmin Goldfarb et al. 1998

CRYAB Alpha B Crystallin Vicart et al. 1998

FLNC Filamin C Vorgerd et al. 2005

TTID Myotilin Olive et al. 2005

ZASP/ LBD3 ZASP (Z-band alternatively spliced

PDZ motif containing protein) Selcen et al. 2005

Plec1 Plectin 1 Schröder et al. 2002

FHL1 FHL-1 (Four-and-a-half-LIM-Protein

1) Qunizii et al. 2008

BAG3 BAG 3 (BAG family molecular

chaperone regulator 3) Selcen et al. 2011

Abbildung 1.4: Zusammenfassung wichtiger Proteine des Skelettmuskels [Goldfarb et al. 2009]

Diese Abbildung gewährt einen detaillierten Einblick in den menschlichen Skelettmuskel. Desmin ist

das wichtigste Intermediärfilament und interagiert mit diversen Proteinen, wie z.B. alpha B Crystallin

Einleitung

10

und Plectin, und Strukturen (Z-Scheiben). Durch den Ausbau eines filamentären Netzwerks wird die

zelluläre Integrität der Zelle aufrechterhalten. Mutationen im Desmin führen zu einer Desorganisation

der Z-Scheiben, es bilden sich Proteinaggregate in den Myofibrillen, welche MFM verursachen.

Ähnliche Mechanismen werden für andere sarkomerische und cytoskeletale Proteine, wie Filamin C,

Plectin, BAG3, Myotilin und ZASP als krankheitsverursachend vermutet.

1.3. Die Filaminopathie

Die Filamin-C-assoziierten Myopathien werden durch Mutationen im Filamin C-Gen

(FLNC) verursacht. Es werden zwei Gruppen unterschieden: MFM-Filaminopathien und

Distale Filaminopathien [Fürst et al. 2013]. Die MFM-Filaminopathie ist eine progressive

Muskelerkrankung, die sich in den meisten Fällen zwischen der 4. und 6. Lebensdekade

manifestiert. Zu Beginn der klinischen Manifestation zeigen die Patienten eine proximal-

betonte Muskelschwäche, welche ihnen z.B. das Treppensteigen erschwert. Im Laufe der

Erkrankung wird es für die Patienten immer schwieriger lange Strecken zu laufen. Die

zunehmende Muskelschwäche kann schließlich zu einem Verlust der Gehfähigkeit führen.

Ein Teil der Patienten zeigt zusätzlich eine Beteiligung der Herz- und Atemmuskulatur [Kley

et al. 2007, Luan et al. 2010]. Insgesamt lässt sich sagen, dass die Patienten einen relativ

homogenen klinischen Phänotyp zeigen. Die erste Mutation p.W2710X (auch p.Tryp2710X, X

= Stopcodon) wurde 2005 von Vorgerd et al. beschrieben. Diese Punktmutation befindet sich

in der Dimerisierungsdomäne des Filamin C und wurde zunächst in einer großen deutschen

Familie nachgewiesen. Als Folge der Mutation wird das Filamin C um 16 Aminosäuren

verkürzt. Die p.W2710X-Mutation macht das Filamin C instabiler und anfälliger für die

Proteolyse [Vorgerd et al. 2005]. Die Dimerisierung des Filamin C wird so gestört und das

mutierte Protein bildet stattdessen Aggregate innerhalb der Myofibrillen [Vorgerd et al.

2005, Löwe et al. 2007]. Die p.W2710X- Mutation konnte kurz nach der ersten Beschreibung

in weiteren deutschen Familien, in Patienten der Majo MFM Kohorte und erst kürzlich in

jeweils einer mazedonischen und chinesischen Familie nachgewiesen werden [Kley et al.

2007, Selcen 2011, Kley et al. 2012]. Neben der p.W2710X-Mutation befindet sich eine

weitere Mutation in der Dimersierungsdomäne des Filamin C, die sogenannte d24Δ2-

Mutation (unpublizierte) Daten, mündliche Mitteilung durch Dr. Rudolf. A. Kley). Die

Mutation p.V930_T933del wurde 2009 in einer deutschen Familie (10 Mitglieder)

Einleitung

11

nachgewiesen. Hierbei handelt es sich um eine In-Frame Deletion in der lg-like-repeat-

Domäne 7 des Filamin C-Gens [Shatunov et al. 2009]. Die lg-ähnlichen-Domäne spielt eine

wichtige Rolle in der Protektion der zytoskeletalen Architektur. Während mechanischer

Belastung kann die Domäne entfaltet und im Anschluss wieder in ihren nativen Zustand

zurückgeführt werden. Dieser Mechanismus ist essentiell für die intrinsische Flexibilität des

Aktinnetzwerks [Furuike et al. 2001, Yamazaki et al. 2002]. Eine In-Frame Deletion in der Ig-

like-Domäne 7 des Filamin C bewirkt die Dysfunktion des kodierten Proteins [Shatunov et al.

2009]. Ebenfalls in dieser Domäne befindet sich die Mutation pK899-V964de/V899_C900ins

[Luan et al. 2010]. Die komplexe Deletion-Insertion-Mutation ist in der intermolekularen

Verbindung der 2 ß-Faltblätter lokalisiert. Der Zusammenhalt der Faltblätter wird

geschwächt und führt zu Dysfunktionen im Filamin C-Gen. Bei der p.Y1216N-Mutation

handelt es sich um eine Punktmutation in der Ig-ähnlichen Domäne 10 [Avila-Smirnov et al.

2010]. Die Mutation p.T2419M (Ig- ähnliche Domäne 22) wurde bislang in nur einem MFM-

Patienten nachgewiesen [Tasca et al. 2012]. Ergänzend zu den oben beschriebenen

Veränderungen im Filamin C-Gen konnten auch Mutationen identifiziert werden, die nicht

mit einer MFM-typischen Aggregatbildung einhergehen [Guergueltcheva et al. 2011, Duff et

al. 2011]. Die Mutation c.5160del_p.F1720LfsX63 befindet sich in der Ig-ähnlichen Domäne

15 und die Mutation p.A193T und p.M251T in der Aktin-bindenden Domäne (ABD) des Gens.

Die Mutationen in der ABD führt weder zur Bildung von Proteinaggregate noch konnten

andere MFM-spezifische Merkmale gefunden werden [Duff et al. 2011]. Diese beiden

Varianten der Erkrankung werden zu den distalen Filaminopathien gezählt. Sie manifestieren

sich um die 3. Lebensdekade und schädigen hauptsächlich die spezifischen Greifmuskeln in

der Hand. Erst später kommt zu es zur Beeinträchtigung der Beinmuskulatur.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden insgesamt 6 Filaminopatihepatienten

analysiert. Bei 3 Patienten wurde die p.W2710X-Mutation nachgewiesen, bei 2 Patienten die

p.V930_T933del-Mutation und ein Patient zeigte die d24Δ2-Mutation (Abb. 1.5.).

Einleitung

12

Abbildung 1.5.: Zusammenfassung aller bekannten Mutationen im Filamin C-Gen, modifiziert nach Fürst et al.

2012

Insgesamt sind 9 Mutationen im Filamin C-Gen bekannt. Die p.W2710X-Mutation wurde 2005 erstmals

von Vorgerd et al. beschrieben und befindet sich, wie auch die d24Δ2-Mutation (noch nicht

veröffentlichte Daten), in der Dimersierungsdomäne des Gens. Einen gleichen Phäno- und Genotyp

wie die p.W2710X-Mutation zeigen die p.V930_T933del-Mutation [Shatunov et al. 2009] und die

pK899-V964de/V899_C900ins [Luan et al. 2010]. Mutationen in der Aktin-bindenden Domäne [Duff et

al. 2011] und die c.5160del_p.F1720LfsX63-Mutation [Guergueltcheva et al.2011] führen nicht zu einer

Aggregatbildung in Muskelzellen. Die Mutation p.T2419M wurde bislang in nur einem MFM-Patienten

mit spät einsetzender zerebellärer Ataxie nachgewiesen. Der Zusammenhang zwischen der Mutation

und den Symptomen ist noch ungeklärt. [Tasca et al. 2012]. In dieser Dissertation wurden 6

Filamimopathiepatienten mit 3 verschiedenen Mutationen (rot umrandet) analysiert.

1.4. Lasermikrodissektion

Die Lasermikrodissektion (LMD) ist ein Standardverfahren zum Isolieren von definierten

Zellstrukturen (z.B. Proteinaggregate) aus verschiedenen Gewebearten, das seit Mitte der

70er Jahre angewendet wird [Isenberg et al. 1976]. Im Laufe der Jahre erlangte die Methode

eine immer größer werdende Bedeutung in der Bioanalytik. Neben der manuellen

Mikrodissektion [Sitek et al. 2005, Poschmann et al. 2009] werden zwei laser-unterstütze

Systeme zur Mikrodissektion unterschieden. Die Laser Capture Mikrodissektion (LCM) wurde

Mitte der 90er Jahre von Michael R. Emmert-Buck etabliert [Emmert-Buck et al 1996] und

beruht auf der Verwendung einer thermoplastischen Membran, die von einem Infrarot- oder

Ultraviolettlaser geschmolzen wird. Dabei verbindet sich die inerte Membran mit dem zu

isolierenden Gewebe und kann im nächsten Schritt entfernt werden. Im Gegensatz dazu

Einleitung

13

wird bei der Laser Microbeam Mikrodissektion die gewünschte Region oder Zellpopulation

mithilfe eines Infrarot- oder Ultraviolettlasers aus dem Gewebe herausgeschnitten. Die

Probe wird dann entweder unter Einfluss der Schwerkraft in einem Reaktionsgefäß

gesammelt (Leica System) oder gegen die Schwerkraft in ein Reaktionsgefäß katapultiert

(PALM System). Die Proben werden mit größter Genauigkeit gesammelt. Das gewünschte

Areal wird exakt und schonend aus dem umliegenden Gewebe geschnitten. Dies bietet die

Möglichkeit, selbst kleinste Mengen an Probe zu untersuchen und z.B. mittels differentieller

Proteomanalyse Unterschiede zwischen krankem und gesundem Gewebe zu

charakterisieren [XU et al. 2010]. Ein weiterer Vorteil der LMD liegt darin, dass die Proben

mittels Gravitation in einem Reaktionsgefäß aufgefangen und somit Kontakt- und

Kontaminations-frei gesammelt werden können. Die Methode der LMD verbindet

(Fluoreszenz-)Mikroskopie mit Mikrodissektion mittels Laser-Technik. Das Mikroskop ist mit

einer Digitalkamera gekoppelt. Die Bilder der zu untersuchenden Probe werden direkt auf

einen angeschlossenen Computer übertragen. Eine spezielle Software sowie ein

Steuerelement sind ebenfalls direkt mit dem Mikroskop gekoppelt. So können die

gewünschten Areale direkt über den Bildschirm des Rechners markiert und ausgeschnitten

werden. Als Probe können Gewebe-Kryoschnitte auf eine spezielle Polyethylentetraphtalat-

(PET)-Membran (Leica, Wetzlar, Deutschland) übertragen oder Zellkulturen auf einer mit

Polyethylene Naphthalate-(PEN)-Membran in speziellen Petrischalen (WillCo-dish,

Amsterdam, Niederlande) kultiviert werden. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten LMD

6500 (Leica, Wetzlar, Deutschland) war es möglich, die Proben sowohl im Durchlicht als auch

mit Fluoreszenzlicht zu mikroskopieren. Dies ermöglichte die eindeutige Identifizierung der

Proteinaggregate. In Abbildung 1.6. ist das Funktionsprinzip des LMD-Gerätes dargestellt.

Der gewünschte Bereich im Gewebe (hier ein Fluoreszenz markiertes Aggregat in einem

Filaminopathie-Kryoschnitt) wird markiert und anschließend ausgeschnitten. Das

mikrodissektierte Areal wird automatisch in einem sich darunter befindenden

Reaktionsgefäß aufgefangen. Die isolierten Proben können dann mit weiterführenden

Methoden wie z.B. solchen der Proteomanalyse weiter untersucht werden.

Einleitung

14

Abbildung 1.6.: Darstellung des LMD-Prozesses

In Abbildung A ist ein schematischer Ablauf der LMD, modifiziert nach Leica, dargestellt. Die 10 µm

dicken Gefrierschnitten befinden sich auf einem Membran-Objektträger. Der gewünschte Bereich

wird mit Hilfe eines Lasers, der mit dem Mikroskop gekoppelt ist, aus dem umliegenden Gewebe

isoliert. Die Probe fällt automatisch in ein sich darunter befindendes Einmal-Reaktionsgefäß.

Abbildung B spiegelt den Prozess anhand einer Mikrodissektion aus Filaminopathiegewebe wieder.

Das Aggregat wird umrandet und anschließend mittels Laser exakt aus dem umliegenden Gewebe

herausgeschnitten.

1.5. Grundlagen der Proteomanalyse

Proteomanalysen ermöglichen die globale Untersuchung der Gesamtheit der

Proteine von Zellen bzw. Geweben [Wilkins et al. 1996]. Die Analyse des Proteoms stellt eine

wichtige Ergänzung zur Genomanalyse dar, weil so auch Zustände, die auf der Ebene des

Genoms nicht zu ermitteln sind, erfasst werden können. Im Gegensatz zum Genom ist das

Proteom höchst dynamisch. Die Expression von Proteinen in einer Zelle variiert in

Abhängigkeit von physiologischen Funktionen, des Differenzierungsstatus und

Umweltfaktoren. Durch alternatives Spleißen der prä-mRNA sowie die zusätzliche

Einführung posttranslationaler Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen, Glykosilierungen,

Ubiquitinierungen) entsteht ein komplexes Muster, das nur auf Proteinebene detektierbar

Einleitung

15

ist [Pandey and Mann 2000]. All diese Veränderungen werden in der Genomanalyse nicht

berücksichtigt und unterstreicht die enorme Bedeutung der Proteomanalytik [Patterson et

al. 2003]. Die Proteomanalyse gewährt einen Einblick in das Expressionsmuster von

Proteinen einer Zelle oder eines Gewebes und erlaubt es, Aussagen über qualitative und

quantitative Analyse der enthaltenen Proteine. Auf Genomebene ist dies nicht möglich, da

nur eine geringe Korrelation zwischen der mRNA-Menge und den entsprechenden

Genprodukten besteht.

1.5.1. Proteomanalysen von Skelettmuskulatur

In den vergangenen Jahren erwies sich die Proteomanalyse als vielversprechende

Methode zur Analyse von Skelettmuskulatur. Es wurden verschiedene Gel- und

Massenspektrometrie basierte Studien durchgeführt, die darauf abzielten die biochemische

Charakterisierung des Muskelproteoms von Nagern [Capitanio et al. 2009] oder zellulärer

Strukturen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu beschreiben [Ferreira et al.

2010]. So wurden z.B. in Muskeln von Versuchstieren mit hohem Alter Veränderungen in der

Abundanz von Proteinen des Stoffwechsels, des kontraktilen Apparates, der

Myofibrillogenese und der zellulären Stressantwort gefunden [Ohlendieck et al. 2001]. Die

klinische Forschung nutzt proteomische Ansätze zur Identifizierung neuer Biomarker in

neuromuskulären Erkrankungen. Neben verschiedenen Tiermodellstudien z.B. Analyse von

Muskelgewebe einer Maus mit Duchenne Dystrophie [Lewis et al. 2009] wurden diverse

Proteomstudien an Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen durchgeführt. 2005

wurden 19 Patienten mit Desminopatihe, Plectinopathie, Myotillinopathie und unbekannten

MFM-Formen analysiert. Dabei wurde die lösliche Fraktion aus Muskellysaten mittels 2D

PAGE (siehe 1.5.2.) aufgetrennt und anschließend mittels MALDI MS (siehe 1.6.2.2.)

identifiziert. Ein aus dieser Studie resultierendes Ergebnis, die Identifizierung von Hsp27,

ermöglichte die Differenzierung der primären Desminopathie von anderen MFM-Formen

[Clemen et al. 2005]. 2006 wurde von Palma et al. eine auf 2D PAGE basierender

differentieller Analyse von Dysferlinopathie-Patienten unter der Verwendung von

Muskellysaten durchgeführt. Es konnten 35 differentiell exprimierte Proteine identifiziert

werden, darunter befanden sich viele metabolische wie kontraktile Proteine [Palma et al.

2006]. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde vermutet, dass eine Dysfunktion des Dysferlins zu

einem aktiven Umbau und Regeneration der Filamente führt. In allen bisher durchgeführten

Einleitung

16

Studien zur Proteomanalyse wurden komplette Muskellysate verwendet. Muskelgewebe ist

eine komplexe Mischung aus verschiedenen Zelltypen des Epi-, Endo- und Perimysium,

Blutgefäßen und Binde- bzw. Fettgewebe. Um die Komplexität der Proben zu reduzieren,

wurden neue Methoden eingeführt, gezielt definierte Bereiche aus dem Gewebe zu

isolieren. Dazu zählt die Mikrodissektion, welche manuell [Sitek et al. 2005, Poschmann et al.

2009] oder mit Unterstützung eines Lasers verwendet wird. Die erfolgreiche Kombination

von LMD und Massenspektrometrie wurde erstmals bei der Reducing Body Myopathie

beschrieben [Schessl et al. 2008]. Die Reducing Body Myopathie (RBM) ist eine hereditäre

Muskelerkrankung, die durch intracytoplasmatische Einschlüsse charakterisiert ist. Im

Rahmen der Studie wurden diese Einschlüsse mittels LMD aus dem Gewebe isoliert und

anschließend mittels MS analysiert. Das Protein FHL-1 wurde als das am höchsten abundante

Protein identifiziert. Parallel durchgeführte Mutationsanalysen bestätigten 4 verschiedenen

pathogene FHL-1-Mutationen. Diese Studie ist das erste Beispiel zum Nachweis einer

Krankheit-verursachenden Mutation in hereditären Myopathien. In 2012 veröffentlichten

Feldkirchner et al. eine Studie zur differentiellen Proteomanalyse von pathologischen

Proteinaggregaten in Skelettmuskel. Hier wurden Plaques aus 6 MFM-Patienten mit

verschiedenen Mutationen mittels LMD ausgelasert, welche mittels iTRAQ (isotope tags for

relative and absolute quantification) quantitativ ausgewertet wurden. Es wurde deutlich,

dass die Plaques der verschiedenen Patienten gewisse Gemeinsamkeiten in ihrer

Zusammensetzung aufwiesen und gleichzeitig wurden mutationsbedingte Unterschiede

deutlich wurden.

Die proteomische Analyse von Skelettmuskulatur hat sich im Laufe der Jahre von der

Analyse des kompletten Muskellysates hin zu einer spezifischen Analyse von definierten

Arealen entwickelt. Die in dieser Dissertation angewendete Methodik zur Analyse von

Filaminopathie gliedert sich optimal in die aktuelle Proteomanalyse von pathologischem

Muskelmaterial und trägt einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis der MFM

zugrundeliegenden molekularen Mechanismen [Kley et al. 2012, Maerkens et al. 2013].

Einleitung

17

1.5.2. Auftrennung mittels 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D PAGE)

Die 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorse wurde in den 70er Jahren zeitgleich von

Klose und O’Farrell [Klose 1975, O’Farrell 1975] entwickelt. In der ersten Dimension werden

die Proteine entlang eines pH-Gradienten aufgetrennt. Hier ist zu erwähnen, dass es zwei

etablierte Verfahren gibt: Beim Trägerampholyt-System [Klose 1975] wird der pH-Gradient

während der isoelektrischen Fokussierung durch die Anwesenheit von Trägerampholyten

aufgebaut. Bei der Verwendung eines immobilisierten pH-Gradienten, IPG-System,

[Bjellqvist et al. 1982; Görg et al. 1988] ist der pH-Gradient in das Gel einpolymerisiert und

sehr stabil. In der zweiten Dimension erfolgt die Auftrennung der Proteine anhand ihres

Molekulargewichtes in einem SDS-Gel [Laemmli 1970]. Die 2D PAGE stellt eine exzellente

Methode zur Analyse komplexer Proteinproben dar. Durch die Auftrennung der Proteine ist

es möglich, eine Übersicht über das Proteom eines Organismus oder eines Gewebes zu

bekommen [Nesterenko et al. 1994]. Mit bis zu 10000 Proteinspots ist die Auflösung der 2D

PAGE extrem hoch [Klose et al. 1995]. Besonders gut lässt sich die 2D PAGE für hydrophile

Proben anwenden. Membranproteine und andere hydrophobe Proteine können aufgrund

ihrer Eigenschaften nur schwer dargestellt werden. Ähnliches gilt für die Darstellung gering

abundanter oder extrem saurer bzw. basischer Proteine. Besonders gering abundante

Proteine lassen sich nur schwer darstellen, da sie schnell von hoch abundanten Proteinen

überdeckt werden. Zum anderen ist die Empfindlichkeit gängiger Färbemethoden zu gering

um diese Proteine sichtbar zu machen. Die Einführung der Fluoreszenzfarbstoffe verbesserte

die Möglichkeit gering abundante Proteine zu detektieren.

1.5.3. Differentielle Proteomstudie und Quantifizierung von Proteinen

Mittels 2D PAGE war es bereits möglich, komplexe Proben zu analysieren und

Differenzen zwischen zwei Proben zu detektieren. Hierfür wurden die Proben über die erste

und zweite Dimension aufgetrennt und anschließend wurde die Intensität der Spots über

spezielle Bildprogramme ermittelt. Viele Proteinfärbemethoden, die eine Visualisierung der

Proteine im Gel ermöglichen, u.a. Silberfärbung und Kolloidal Coomassie, eignen sich

allerdings nur begrenzt für eine quantitative Analyse. Sie verfügen über einen zu geringen

linearen und auch dynamischen Bereich [Marcus et al. 2009]. Hinzu kommt, dass mit

herkömmlichen Methoden die Spots aus unterschiedlichen Gelen miteinander verglichen

werden müssen. Dies resultiert in einer geringen Reproduzierbarkeit und eine große

Einleitung

18

technische Streuung. Die Einführung der Zwei-Dimensionalen In-Gel Elektrophorese (2D

DIGE) erfolgte im Jahr 1997 und erhöhte die Reproduzierbarkeit und die Sensitivität der

Methode [Ünlü et al. 1997,Marcus et al. 2009]. Die zu vergleichenden Proben werden vor

der Auftrennung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (CyDyes™, GE Healthcare Europe

GmbH) gelabelt. Zusätzlich wird aus allen Proben ein interner Standard hergestellt, welcher

der Normalisierung der Spots über den Vergleich mit einem Referenzgel dient [Alban et al.

2003]. Anschließend werden die Proben mit dem internen Standard zeitgleich mittels 2D

PAGE aufgetrennt. So ist es möglich, die verschiedenen Gele miteinander zu vergleichen und

die Proteinspots anhand von Spotintensitäten-Verhältniswerte zu quantifizieren. Das DIGE-

System bietet zwei verschiedene Farbstoffe zur Auswahl: das CyDye™ minimal labeling und

das CyDye™ Saturation labeling. Beim minimal labeling reagieren die Farbstoffe mit den Ɛ-

Aminogruppen der Lysinreste durch Aminolyse der NHS-Ester-Bindungen. Mit dieser

Methode werden ca. 3-5 % aller Proteine markiert, wobei in jedem Protein nur ein Lysinrest

markiert wird. Es stehen drei Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung. Ein Farbstoff wird für den

internen Standard verwendet, die anderen beiden werden zur Markierung der Proben

verwendet. Dies ermöglicht es, 2 Proben und einen internen Standard pro Gel aufzutrennen.

Beim Saturation labeling reagieren die Fluoreszenzfarbstoffe mit den Thiolgruppen der

Cysteinreste. Die Cysteine aller Proteine werden markiert, wodurch es möglich ist, Proben

mit sehr geringen Proteinkonzentrationen zu analysieren, die Nachweisgrenze liegt bei ca. 3

µg Protein [Sitek et al. 2005, Helling et al. 2006]. Wie beim minimal labeling gibt es auch hier

einen Farbstoff zum Markieren des internen Standards. Ein weiterer Farbstoff steht zur

Markierung einer Probe zur Verfügung. Das Spotmuster ist allerdings nicht mit einem

ungefärbten Spotmuster vergleichbar, da die Anzahl an Cysteinresten in den Aminosäure der

einzelnen Proteine variiert und somit die Proteinmasse unterschiedlich beeinflusst wird. Ein

Nachteil der Methode ist, dass Proteine, die keine Cysteine enthalten, nicht dargestellt

werden können und in einer differentiellen Studie nicht berücksichtigt werden. Im Anschluss

an die zweidimensionale Auftrennung werden die Gele über einen Fluoreszenzscanner

digitalisiert. Die Verwendung einer speziellen Auswertesoftware ermöglicht die Detektion

und Quantifizierung der einzelnen Spots.

Einleitung

19

1.6. Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Es bestehen zwei Möglichkeiten ein Peptidgemisch zu analysieren. Zum einen kann

das Gemisch direkt in ein Massenspektrometer injiziert werden. Zum anderen ist es möglich,

das Gemisch zunächst über ein chromatographisches Verfahren aufzutrennen. In den

häufigsten Fällen wird hier die Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed-Phase

Chromatography, RT-HPLC) verwendet [Steen et al. 2004]. Im Gegensatz zur Normalphasen-

Chromatographie (NP-HPLC), welche die Analytmoleküle aufgrund ihrer unterschiedlichen

Polarität auftrennt, ist hier die stationäre Phase der RT-HPLC apolar bzw. hydrophob. Die

Moleküle werden in umgekehrter Elutionsreihenfolge nach ihrer Hydrophobizität getrennt.

Die hydrophobsten Peptide werden als letztes von der Säule eluiert. In der Regel wird

Acetonitril mit ansteigendem Gradienten zur Elution der Peptide verwendet. In einem

nächsten Schritt werden die eluierten Peptide mittels Online-Kopplung ins

Massenspektrometer geleitet. Dieses Vorgehen ermöglicht die Konzentrierung niedrig-

abundanter Peptide sowie das Trennen unterschiedlicher Peptide.

1.7. Massenspektrometrie

Die Massenspektrometrie gehört heute zu den bedeutendsten Methoden in der

Peptid- und Proteinanalytik. Die Entwicklung dorthin dauerte allerdings viele Jahre, da es

lange lediglich möglich war kleine, organische Moleküle mittels Massenspektrometrie zu

analysieren. Dies änderte sich mit der Etablierung von Matrix-unterstützte Laser

Desorption/Ionisation (MALDI) und Elektrosprayionisation (ESI) als Ionisierungstechniken in

den 80er Jahren [Karas und Hillenkamp 1988, Fenn et a. 1989]. Von diesem Zeitpunkt an

gelang es große, organische Moleküle aus dem Festzustand (mittels MALDI) oder

Flüssigzustand (mittels ESI) in die Gasform zu überführen und anschließend zu ionisieren.

Ein Massenspektrometer besteht aus folgenden Hauptkomponenten: der

Ionenquelle, einem Massenanalysator und einem Detektor. Im Massenanalysator werden

die Massen nach ihrem Masse/Ladungsverhältnis (m/z) aufgetrennt. Der Detektor zeichnet

die Anzahl der entsprechenden Ionen auf. Am Ende einer Messung erhält man ein

Massenspektrum, das die Intensität der detektierten Ionen gegen den m/z-Wert aufzeigt

Einleitung

20

[Aebersold et al. 2003]. In den meisten Fällen sind Massenspektrometer, mit Ausnahme des

MALDI, mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (high performance liquid

chromatography, HPLC) gekoppelt.

Abbildung 1.7.: Schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus von Massenspektrometern

In der vorliegenden Arbeit sollten Proteine aus flüssigem Material wie auch aus

Gelspots identifiziert werden. Die in Lösung vorliegenden Proben werden mittels In-Lösung-

Verdau für die massenspektrometrische Analyse vorbereitet. Zur Identifizierung

differentieller Proteinspots aus 2D-Gelen werden diese aus der Gelmatrix herausgestanzt

und im Gel verdaut. In beiden Fällen werden die Proteine mit Hilfe der am häufigsten

verwendeten Endoprotease Trypsin, welche spezifisch am C-terminalen Ende bevorzugt

Arginin und Lysin schneidet, in Peptide gespalten [Steen et al 2004]. Von den extrahierten

Peptiden werden in der massenspektrometrischen Analyse MS/MS-Spektren aufgenommen.

Um Peptidsequenzen aufnehmen zu können und diese anschließend einem Protein

zuordnen zu können, müssen die Peptide zunächst fragmentiert werden. Dafür werden

Ionenmassen eines bestimmten Massenbereichs ausgewählt. Diese Massen werden als

Precursor bezeichnet. Die Precursor werden dann einer Fragmentierung unterzogen, in den

meisten Fällen handelt es sich um die Fragmentierung mittels CID (collison induced

dissociation). Die Fragmentierung mittels ETD (electron transfer dissociation) wird vor allem

für die Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen verwendet. Die daraus

resultierenden Massenspektren lassen Rückschlüsse auf die Peptidsequenz zu. Die

generierten Massenspektren werden in einem nächsten Schritt in Proteindatenbänke

geladen, welche auf der Zusammenfassung aller bekannten und vorhersehbaren

Proteinsequenzen basieren. Die darin enthaltenden MS/MS-Spektren resultieren auf dem

Einleitung

21

theoretischen Verdau von Proteinen. Die Identifizierung der Proteine erfolgt durch den

Abgleich mit diesen theoretisch verdauten Proteinen und deren theoretisch generierten

MS/MS-Spektren. Mit Hilfe von speziellen Suchalgorithmen werden die Spektren

miteinander verglichen und deren Übereinstimmung errechnet. Zu den häufigsten

Algorithmen gehören MASCOT und Sequest [Yates et al. 1995, Perkins et al. 1999].

1.7.1. Ionenquellen

Die Ionenquelle ist ein elementarer Bestandteil eines Massenspektrometers. In der

Ionenquelle werden die Analyt-Moleküle durch Zufuhr von Energie in gasförmige Ionen

umgewandelt. Für die Ionisierung von Molekülen sind vor allem zwei Methoden von

Bedeutung: die Elektrospray-Ionisation (ESI) [Fenn et al. 1989] und die Matrix-assisted

Desorption/Ionisation [Karas et al. 1988].

1.7.1.1. Elektrospray-Ionisation (ESI)

Bei der Elektrospray-Ionisation werden die in Lösung vorliegenden Analyt-Moleküle

über eine Kapillare in ein elektrisches Feld geleitet [Fenn et al. 1989, Steen et al. 2004]. Die

Kapillare dient hier als Elektrode und der Massenanalysator wird als Gegenelektrode

eingesetzt. Es ist möglich, die Polaritäten der Elektroden anzupassen und je nach

Versuchsaufbau Anionen oder Kationen zu messen. Folglich ist es möglich, Messung in

einem Positiv- oder Negativmodus durchzuführen. In Abbildung 1.8. ist der Positivmodus

schematisch dargestellt. Die in Lösung vorliegenden Ionen bewegen sich aufgrund ihrer

Ladung im elektrischen Feld zur Gegenelektrode. An der Oberfläche des Flüssigkeitsstroms

entstehen positive Ladungen. Dies führt zur Bildung des sogenannten Taylor-Konus. In

ausreichendem Abstand zur Gegenelektrode wird der Taylor-Konus zunehmend instabil,

positiv geladene Tröpfchen entstehen. Durch den Einstrom eines neutralen Trägergases

(Stickstoff) werden die Lösungsmittelmoleküle verdampft. Dadurch erhöht sich die

Ladungsdichte an der Oberfläche der Tröpfchen. Die immer stärker werdende Abstoßung

zwischen den Teilchen führt zur Coulombexplosition. Die Tröpfchen zerfallen am Rayleigh-

Limit in viele kleine Tröpfchen mit positiver Nettoladung. Als Ergebnis weiterer

Desolvatisierungen entstehen letztendlich freie, gasförmige mehrfach geladene Ionen [Irbani

und Thompson 1976]. Im Anschluss an die ESI erfolgt meist die Weiterleitung an ein triple-

Quadrupol-Instrument oder eine Ionenfalle [Aebersold und Mann 2003]. Für die

Einleitung

22

massenspektrometrische Analyse des humanen Muskelgewebes sowie der murinen

Myoblasten wurde eine LTQ Orbitrap verwendet. Das Funktionsprinzip der der LTQ Orbitrap

im speziellen wird im Punkt 1.6.5. beschrieben.

Abbildung 1.8.: Schematische Darstellung der Elektrospray-Ionisation (ESI), modifiziert nach Cech und Enke

2001

Die Elektrospray-Ionisation wird dazu verwendet aus organischen und anorganischen Substanzen

Ionen zu erzeugen und diese mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Die in der Lösung

vorhandenen Ionen bewegen sich aufgrund ihrer Ladung zu der entgegengesetzten Elektrode. Es bildet

sich ein Überschuss an Ionen mit gleicher Ladung. Dieser Zustand wird als Taylor-Konus bezeichnet.

Durch gezieltes Einströmen von Stickstoff wird die Verdampfung des Lösungsmittels verstärkt,

wodurch die Tröpfchengröße sich im gleichbleibenden elektrischen Feld verringert. Die Dichte des

elektrischen Feldes steigt auf der Oberfläche der Tröpfchen bis hin zur Stabilitätsgrenze (Raleigh-

Limit). Beim Überschreiten der Grenze zerfallen die Tröpfchen aufgrund ihrer Ladung in noch kleinere

Tröpfchen. Der Zerfall wird als Coulomb-Explosion bezeichnet. Letztendlich entstehen aus sehr kleinen

Tröpfchen (wenige Nanometer groß) Ionen, die dann in den Masseanalysator geleitet werden.

1.7.1.2. Matrix-assisted Desorption/Ionisation (MALDI)

MALDI beruht auf einer Entwicklung von Karas und Hillenkamp aus dem Jahre 1988

[Karas und Hillenkamp 1988]. Das Peptidgemisch wird auf einem metallischen Probenträger

mit einer im Überschuss vorliegenden speziellen Matrix ko-kristallisiert. In den meisten

Fällen wird für die Peptidanalystik als Matrix alpha-Cyano-4-Hydroyzimtsäure oder 2,5-

Dihydroxybenzoesäure (DHB) verwendet. Im Hochvakuum der Ionenquelle wird die Probe

Laserpulsen ausgesetzt. Die Energie wird von der Matrix absorbiert. Nach der Relaxation im

Kristallgitter werden explosionsartig Analyt- und Matrixmoleküle von dem Probenträger

abgelöst und ionisiert [Karas und Hillenkamp 1988]. Im Gegensatz zum ESI-Verfahren

entstehen hier hauptsächlich einfach geladene Ionen. Der Desorptions- und

Einleitung

23

Ionierungsprozess konnte bis heute nicht komplett aufgeklärt werden, die Optimierung der

analytischen Protokolle basiert zum größten Teil auf empirischen Daten [Karas et. al., 2000].

Die MALDI-Analyse eignet sich besonders gut zur Analyse wenig komplexer Proben, wie z.B.

2D Gelspots.

1.7.2. Masseanalysatoren

Zu den am häufigsten eingesetzten Masseanalysatoren gehören u.a. der Time-of-

Flight (TOF), die Ionenfalle und die Orbitrap. Zusätzlich werden auch noch Quadrupole und

das Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR) verwendet. Im Masseanalysator

werden die zuvor in der Ionenquelle erzeugten und beschleunigten Ionen nach

Masse/Ladungsverhältnis (m/z) getrennt. Die verschiedenen Masseanalysatoren werden in

der Regel mit den Ionenquellen gekoppelt. Die gängigste Kombination des MALDI ist der

TOF-Analysator. Bei der ESI existiert eine größere Vielfalt. In den meisten Fällen wird aber

eine Kombination aus ESI und Ionenfallen- oder Quadrupol-Analysatoren verwendet.

1.7.2.1. Time of Flight (TOF)

MALDI-Massenspektrometer werden in der Regel mit Flugzeit-Massenanalysatoren

(engl. Time-of-flight) gekoppelt. Die Analyt-Ionen durchlaufen eine feldfreie Strecke, in der

die sie gemäß ihres m/z-Verhältnis aufgetrennt werden. Es wird davon ausgegangen, dass

die Teilchen mit gleicher kinetischer Energie auf unterschiedlichen Geschwindigkeiten

beschleunigt werden, wenn sie unterschiedliche Massen besitzen [Abersold et al. 2003].

Sofern die Beschleunigungsspannung sowie die Länge der feldfreien Driftstrecke bekannt

sind, ist es möglich m/z für jedes Teilchen abhängig von der Flugzeit zu ermitteln.

1.7.2.2. Ionenfalle

Bei der Ionenfalle werden zwei Arten unterschieden: die 3D-Ionenfalle und die

lineare Ionenfalle (2D-Ionenfalle) [Aebersold et al. 2003]. In der 3D-Ionenfalle wird ein

zeitlich veränderliches elektromagnetisches Feld verwendet, um die Ionen festzuhalten und

anschließend gezielt auszustoßen. Die 3D-Ionenfalle besteht aus einer Ringelektrode, einer

Eintritts- und einer Endkappenelektrode. An die Ringelektrode wird eine hochfrequente

Wechselspannung angebracht, durch die ein elektrisches Feld im Inneren der Falle erzeugt

wird und die Ionen auf stabile Bahnen geleitet werden. Nach einer definierten Zeitspanne

Einleitung

24

wird die hochfrequente Wechselspannung variiert. Dies hat zur Folge, dass die Bahnen der

Ionen destabilisiert werden. Über die Endkappenelektrode werden die Ionen selektiv nach

ihrem m/z-Verhältnis aus der Ionenfalle zum Detektor geleitet. Die lineare Ionenfalle setzt

sich aus insgesamt vier hyperbolischen Metallstäben (Quadrupolstäbe) zusammen und durch

die Anordnung der Stäbe ergibt sich ein zweidimensionales elektrisches Feld. Die jeweils

gegenüberliegenden Stäbe bilden ein Paar und besitzen das gleiche Potential. An den

jeweiligen Paaren liegen eine entgegengesetzte Gleichspannung und eine um 180° versetzte

Wechselspannung an. In Abhängigkeit von der Amplitude und der Frequenz der

Wechselspannung bewegen sich Ionen mit definiertem m/z-Verhältnis auf stabilen Bahnen

[Paul 1989, Paul and Raether 1995]. Alle anderen Ionen bewegen sich auf instabilen Bahnen.

Die lineare Ionenfalle verfügt über zwei seitliche Öffnungen, über die Ionen bei Änderung

des elektrischen Potentials ausgschleust und zum Detektor geführt werden können [Mann et

al. 2001]. Im Gegensatz zu der 3D-Ionenfalle besitzt die lineare Ionenfalle eine höhere

Kapazität, welches es ermöglicht mehr Ionen zu fangen und zu speichern [Aebersold et al.

2003]. Aufgrund der beiden seitlichen Öffnungen ist es zusätzlich möglich, eine höhere

Anzahl an Ionen zu detektieren.

1.7.2.3. Orbitrap

Die Orbitrap gehört zu den modernsten Massenanalysatoren. Das Analysatorkonzept

basiert auf den Arbeiten von Alexander Makarov [Makarov 2000] und wurde vor 20 Jahren

entwickelt. Die Orbitrap ist eine Ionenfalle, in der die gasförmigen Ionen in einem

elektrostatischen Feld gefangen werden. In der Ionenfalle befindet sich zentral eine

spindelförmige Elektrode. Sobald der Ionenstrahl in die Orbitrap geleitet wird, bewegen sich

die Ionen aufgrund der elektrostatischen Anziehungskraft auf Kreisbahnen (Orbitalen) um

die Elektrode. Gleichzeitig wird eine z-axiale Oszillation der Ionen beobachtet, welche von

zwei äußeren Elektroden detektiert wird [Scigelova und Makarov, 2006]. Die Frequenz der

harmonischen Oszillation ist umgekehrt proportional zur Quadratwurzel von m/z [Hu et al.

2005, Yates et al. 2006]. Es ist möglich, die angelegten Spannungen an den Elektroden zu

ändern umso unterschiedliche Massen detektieren zu können. Die detektierten Signale

werden verstärkt und mittels Fourier Transformation in Frequenzspektren umgewandelt,

woraus letztendlich durch Zweipunktkalibrierung Massenspektren entstehen. Die Orbitrap

bietet eine hohe Massengenauigkeit, eine hohe Auflösung sowie einen hohen dynamischen

Einleitung

25

Bereich und eine hohe Sensitivität [Makarov et al. 2006 und Makarov et al. 2006].

Abbildung 1.9.: Querschnitt des Orbitrap-Massenanalysators, modifiziert nach Thermo Scientific

Die Ionen werden im elektrischen Feld gefangen. In der Ionenfalle befindet sich eine spindelförmige

Elektrode (A). Die Ionen gelangen radial in die Orbitrap und bewegen sich aufgrund der

elektrostatischen Anziehungskraft auf Kreisbahnen um die Zentralelektrode. Gleichzeitig oszillieren die

Ionen um die z-Achse. Die Außenelektrode (B) besteht aus zwei Teilen, die durch einen Keramikring (C)

isoliert werden.

In Abbildung 1.10. Ist der schematische Aufbau der LTQ Orbitrap Velos von Thermo Fisher

(Schwerte, Deutschland) dargestellt. Sie besteht aus einer linearen Ionenfalle (LTQ) und

einer C-Trap, die die LTQ und die Orbitrap miteinander verbindet. Das ionisierte

Peptidgemisch erreicht das Massenspektrometer in Gasform. Über mehrere Multipole

werden die Ionen transferiert und in einem Ionenstrahl fokussiert. Dabei durchqueren die

Ionen eine Pumpstrecke, in der stufenweise ein Hochvakuum aufgebaut wird. Dann

gelangen die Ionen in die lineare Ionenfalle. Daraufhin werden die Ionen aus der Falle

herausgeschleust und in die C-Trap geleitet. Die hier fokussierten Ionen werden gebündelt in

die Orbitrap überführt. In der Orbitrap werden dann die Precursor-Massen detektiert und

die MS-Spektren generiert. Die intensivsten Precursor-Massen werden über die C-Trap

zurück in die LTQ übermittelt. Durch Anlegen einer hochfrequenten Wechselspannung an

den Ringelektroden wird erreicht, dass sich die Ionen mit entsprechenden Precursor-Massen

aus dem ankommenden Ionenstrahl gesammelt werden und sich in stabilen Bahnen

bewegen. Nach einer definierten Zeit werden die elektrischen Potentiale an den

Ringelektroden geändert, die Bahnen der Ionen werden instabil. Die Ionen werden aus der

Ionenfalle herausgeschleust und über die C-Trap in die Kollisionszelle geleitet. Die dort

fragmentierten Ionen gelangen dann in die Orbitrap, in der die MS/MS-Spektren generiert

werden. Die Orbitrap verfügt über eine sehr hohe Massengenauigkeit und gleichzeitig eine

hohe Massenauflösung. Die Messung von Pepidionen bei hoher Auflösung benötigt längere

Einleitung

26

Zeit. Aufgrund der integrierten LTQ ist es möglich, zeitgleich zur MS-Generierung in der

Orbitrap MS/MS-Spektren in der LTQ zu erstellen.

Abbildung 1.10.: Schematischer Aufbau der LTQ Orbitrap Velos™, modifiziert nach Thermo Fisher

Nachdem die Ionen mittels ESI ionisiert worden sind, werden sie in die C-förmige C-Trap geleitet. Dort

werden die Ionen gesammelt. Anschließend werden die gebündelten Ionen in die Orbitrap geleitet,

um dort die Precursor Massen zu detektieren. Die Ionen werden tangential in das elektrische Feld

geleitet. Aufgrund des elektrischen Feldes können einige Ionen in festen ringförmigen Bahnen um die

innere Elektrode kreisen. Diese harmonischen Schwingungen sind umgekehrt proportional zu der

Quadratwurzel von m/Z. Die Änderung der angelegten elektrischen Spannung ermöglicht die

Detektion von Ionen unterschiedlicher Massen. Die Massen der einzelnen Precursor-Massen werden

ausgelesen und die am intensivsten gemessenen Massen werden über die C-Trap an die lineare

Ionenfalle geleitet. Die Ionen erreichen allerdings nicht alle gleichzeitig die LTQ, sondern werden nach

Masse getrennt und nacheinander in die LTQ abgegeben. Die in die LTQ geleiteten Massen werden

über den Einstrom vom Helium über CID fragmentiert. Die Massen der fragmentierten Ionen werden

gemessen und die entsprechenden MS/MS-Spektren generiert. Das Auswählen der Precursor-Massen

und das Fragmentieren der Ionen kann aufgrund der Kopplung von LTQ und Orbitrap parallel

durchgeführt werden.

1.7.2.4. Fragmentierung der Peptidonen

In der Massenspektrometrie werden zwei generelle Fragmentierungsarten

unterschieden. Die Fragmentierung der Peptide erfolgt mittels stoßinduzierter Kollision

(engl. Collison-induced dissociation, CID) durch niederenergetische Stöße mit einem

Kollisionsgas wie z.B. Helium, Argon oder Stickstoff [Stehen et al. 2004]. Die Kollision der

Moleküle ruft spezifische Bindungsbrüche im Peptidgerüst hervor. Durch den Bruch der

Amidbrücken entstehen hauptsächlich N-terminale y-Ionen und C-terminale b-Ionen

[Roepstorff and Fohlman. 1984, Biemann et al. 1990]. Eine Alternative zur CID stellt die

Einleitung

27

Elektronen Captur Dissoziation (ECD) dar. Die ECD wurde 1998 von Zubarev et al. eingeführt

[Zubarev et al. 1998]. Die ECD basiert auf der Freisetzung der elektrischen, potenziellen

Energie, die bei Aufnahme eines Elektrons entsteht [Zubarev et al. 1998]. Die

Fragmentierung erfolgt zwischen der Amidgruppe und des alpha-Kohlenstoffatoms der

Peptidbindung. So entstehen c- und z-Ionen. Anhand dieses Fragmentierungsmusters lassen

sich Phosphorylierungen lokalisieren [Stensballe et al. 2000]. Die Anregung der Elektronen

erfordert ein statisches Magnetfeld und beschränkt so die Anwendung der ECD auf FT-ICR-

Massenspektrometern [Thingholm et al. 2009]. Um eine ähnliche Fragmentierung auch für

andere Massenspektrometer nutzbar zu machen, wurde die ETD eingeführt. Die

Elektronentransferdissoziation (ETD) stellt eine Weiterentwicklung [Syka et al. 2004] der ECD

dar. Hier wird ein Anion mit geringer Elektronenaffinität zur Fragmentierung verwendet. Die

niedrigenergetische CID ist die am häufigsten angewendete Methode zur Fragmentierung

von Ionen. Allerdings eignet sie sich nur bedingt zur Charakterisierung von

posttranslationalen Modifikationen.

1.8. Quantitative Massenspektrometrie

Eine quantitative Auswertestrategie bietet die Möglichkeit Unterschiede in der

Synthese verschiedener Proteine zwischen zwei Proben zu ermitteln. Hierfür wird die

massenspektrometrische Analyse mit der quantitativen Auswertung kombiniert. Es gibt

verschiedene Ansätze, um dies zu erreichen, das Labeln der Proben durch Isotopen-

Markierung [Gygi et al. 1999, Ong et al. 2005] oder Label-freie Methoden [Neilson et al.

2011]. Generell wird zwischen relativer und absoluter Quantifizierung unterschieden.

1.8.1. Isotopen-Labelling

Das Isotopen-Labeling ist eine der am häufigsten angewendeten Methoden zur Gel-

freien Analyse. Es wird zwischen chemischen, enzymatischen und metabolischen Strategien

unterschieden. Die Verwendung des Isotopen-Labelings hat den Nachteil, dass es sehr teuer

ist und die Gefahr eines nicht vollständigen Labelns besteht [Hamacher et al. 2011]. 1999

wurde das sogenannte ICAT (isotope coded affinity tag) entwickelt [Gygi et al 1999]. Diese

Methode richtet sich spezifisch gegen die SH-Gruppen der Cysteine. Die Proben werden mit

Einleitung

28

einem Isotopen-gelabelten Affinitätstag gekoppelt, welches eine leichte (12C) oder schwere

(13C) C-Atome enthält. Um zwei Proben differentiell miteinander vergleichen zu können, wird

die eine Probe mit schweren bzw. leichten C-Atomen markiert. Anschließend werden die

Proben miteinander vermischt, enzymatisch verdaut und massenspektrometrisch analysiert.

Der größte Nachteil dieser Methode ist, dass nicht alle Proteine über Cysteinreste verfügen

und so nur ein Teil der Proteine quantifiziert werden können. Des Weiteren kann nur ein

geringer Teil der Sequenz ermittelt werden [Bantscheff et al. 2007]. Dies führt dazu, dass

Informationen über potentielle posttranslationale Modifikationen oder Proteinisoformen

verloren gehen. Ross und Thompson führten zwei weitere Methoden zum chemischen

Labeln ein: iTRAQ (isotope tags for relative and absolute quantification) und TMT (tandem

mass tagging) [Thompson et al. 2003, Ross et al. 2004]. Mit iTRAQ und TMT können Proteine

wie auch Peptide mit verschiedenen Tags, die die gleiche Masse besitzen und als

Reporterionen fungieren, markiert werden. iTraq sowie TMT bieten die Möglichkeit

gleichzeitig mehrere Proben relativ und absolut zu quantifizieren [Aggarwal et al. 2006,

Bantscheff et al. 2008]. Allerdings lassen sich mit diesen beiden Methoden keine komplexen

Proben analysieren. Hinzu kommt die Einschränkung bei der Wahl des

Massenspektrometers. Aufgrund der sehr geringen Masse der Reporterionen eignen sich nur

sehr sensitive Geräte (z.B. LTQ Orbitrap) [Bantscheff et al. 2008].

ICPL (isotope coded protein label) basiert auf dem isotopen Labeln aller freien

Aminosäuren in Proteinen [Schmidt et al. 2005]. Die Proteine in zwei verschiedenen Proben

werden zunächst extrahiert, alkyliert und dann entweder mit Isotopen-freien ICPL (leicht)

oder der dem ICPL-tag (schwer) markiert. Um die Komplexität des Proteingemisches zu

verringern wird dieses über eine 1D PAGE aufgetrennt. Nach dem enzymatischen Verdau der

Proteine können in der massenspektrometrischen Analyse aufgrund der schweren und

leichten Peptide Unterschiede detektiert werden. Mit dieser Methode ist es möglich, hoch

komplexe Proben zu analysieren und zu quantifizieren. Es besteht allerdings die Gefahr, dass

nicht alle Proteine vollständig markiert werden.

Die sogenannte 16O/18O-Methode beschreibt das enzymatische Labeln mit schwerem

Wasser und basiert auf dem Einbau von bis zu 2 O-Atomen während des tryptischen Verdaus

[Yao et al. 2001]. Die Proteine werden in Anwesenheit von schwerem (H218O) bzw. normalen

(H216O) Wasser verdaut [Staes et al. 2004]. Der Einbau von 18O-Atomen führt zu einem

Masseshift von 4 Da im Vergleich zu den Peptiden, die in Anwesenheit von normalem

Einleitung

29

Wasser (H216O) gespalten wurden. Die Methode ist einfach und eignet sich auch für

komplexe Proteingemische. Als nachteilig ist allerdings das Risiko zu erwähnen, dass schwere

O-Atome während der Prozessierung erneut gegen leichte ersetzt werden.

Beim GIST-Verfahren (global internal standard) werden die Proteine im Vorfeld der

Isotopenmarkierung enzymatisch in Peptide gespalten [Lottspeich, Bioanalytik, Elsevier

2006]. Diese Methode zieht allerdings gravierende Nachteile mit sich. Zum einen ist es nicht

möglich hoch komplexe Proben zu analysieren, da nur wenige Peptide detektiert und

quantifiziert werden können. Zum anderen gehen durch den vorzeitigen Verdau der Proteine

wichtige Informationen verloren.

SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture) ist ein metabolisches

Labeln basierend auf dem Einbringen von spezifischen Aminosäuren in vivo, die schwere

Isotope enthalten [Ong et al. 2005]. In der Regel erfolgt die Markierung in Zellkultur, es

lassen sich aber auch Proteine einfacher Organismen (z.B. Caenorhabditis elegans) oder

Mäusen [Krijgsveld et al. 2003, Kruger et al. 2008]. In höheren Mechanismen, wie z. B. dem

Menschen, ist diese Art der relativen Quantifizierung nicht durchführbar.

Im Rahmen dieser Dissertation sollten Filaminopathie-spezifische Proteinaggregate,

komplexe Proben aus humanem Gewebe, isoliert und quantitativ analysiert werden. Einige

der oben beschriebenen Methoden zur Isotopen-Markierung (SILAC, ICAT, GIST) eignen sich

nicht zur Analyse von komplexen Gewebeproben. Weitere Methoden mussten aufgrund der

Gefahr des unvollständigen Labelns ebenfalls für die hier durchgeführten Analysen

ausgeschlossen werden. Es wird vermutet, dass die Struktur der Proteine in gesundem und

erkranktem Muskelgewebe stark voneinander abweicht. Dies könnte direkte Auswirkungen

auf die Effizienz des Labeln haben und auch den Verdau der Proteine beeinflussen. Aus den

angeführten Gründen wurde ein Label-freier Ansatz für die Analyse der Proteinaggregate in

Filaminoapthiepatienten gewählt.

1.8.2. Label-freie Quantifizierung mittels Spectral Index Calculation

Die Entwicklung der Label-freien Quantifizierung sollte helfen, die folgenden

Nachteile des Isotopen-Labelings zu überwinden: unvollständiges Labeln, Verlust von

Proteinen durch Probenaufbereitung und hohe Kosten [Old et al. 2005, Mueller, L.N. et al.

2008]. Die Spectral Index Calculation ist ein von unserer Gruppe entwickeltes Label-freies

Verfahren zur semi-quantitativen Analyse, mit dem es möglich ist, unterschiedlich

Einleitung

30

abundante Proteine zwischen zwei Proben zu identifizieren [Müller et al. 2011]. Die

Methode basiert auf der Summierung aller in der massenspektrometrischen Analyse

generierten MS/MS-Spektren für jedes einzelne Peptid. Die aufsummierten Spektren werden

als Compounds bezeichnet. Die identifizierten Peptide werden mittels spezieller

Suchalgorithmen (z.B. Mascot™) entsprechenden Proteinen zugeordnet. Daraus ergibt sich

für jedes Protein eine unterschiedliche Anzahl an zugeordneten Peptiden und MS/MS-

Spektren, sogenannte Spectral Peptidcounts. Über den Vergleich der Summen aller Spectral

Peptide Counts ist es möglich, Rückschlüsse auf das relative Verhältnis der Menge des

Proteins in den Proben zu ziehen. Es wird davon ausgegangen, dass das Verhältnis von

Spectral Peptide Counts und die Abundanz eines Proteins proportional zueinander ist. So

zeigt ein Protein mit einer höheren Anzahl an Spectral Peptidcounts auch eine höhere

Abundanz im Vergleich zu der Kontrollprobe [Müller et. al 2011]. Bevor allerdings eine

eindeutige Aussage über die Abundanz eines Proteins in zu vergleichenden Proben getroffen

werden kann, ist es notwendig, die Werte zu normalisierten. Die Normalisierung beruht auf

der Tatsache, dass Unterschiede in der Probenbeschaffenheit, Probenaufarbeitung sowie in

der massenspektrometrischen Analyse Einfluss auf das Ergebnis haben und ausgeglichen

werden müssen. Alle Werte werden über die Gesamtzahl der Spectral Peptidcounts in den

jeweiligen Proben durch Bildung des Spectral Index normalisiert [Müller et al. 2011]. Der

Spectral Index bildet letztendlich die Grundlage, um Aussagen über die unterschiedliche

Abundanz von Proteinen in zu vergleichenden Proben treffen zu können.

Eine Alternative zum Spectral Counting stellt die vergleichende oder differentielle LC-

MS-Analyse dar [America and Cordewener 2008]. Hierbei werden zwei Proben (z.B. Zustand

A und B) mittels LC-MS/MS analysiert. Die gemessenen Intensitäten der einzelnen Peaks

werden dann miteinander verglichen, um Rückschlüsse auf die Abundanz zu ziehen. Um

sicherzugehen, dass es sich bei den verglichenen Peaks um die gleichen Moleküle handelt,

wird neben dem Masse-Ladungsverhältnis zusätzlich die Retentionszeit in den Vergleich

miteinbezogen. Im Vergleich zum Spectral Index Calculation ist die differentielle LC-MS

weniger sensitiv und zeigt Schwächen in der Reproduzierbarkeit [Old et al. 2005]. Die zu

untersuchenden Proben müssen hochgradig homolog sein müssen, da abweichende

Bestandteile Einfluss auf die Ionisierung anderer Moleküle haben können und so die

gemessenen Intensitäten beeinflussen können. Hinzu kommt der Nachteil, dass sich die

Methode nicht für die simultane Analyse mehrerer Proben eignet und sich Variationen

Einleitung

31

zwischen den verschiedenen Läufen nicht vermeiden lassen. Dennoch konnte die Methode

in einigen Studien erfolgreich angewendet werden [Lai et al. 2013]

32

2. Zielsetzung der Arbeit

Myofibrillären Myopathien stellen eine Gruppe von neuromuskulären Erkrankungen

dar, die sehr selten ist. Weltweit sind insgesamt 11 Familien bekannt, in denen die

Filaminopathie diagnostiziert werden konnte. In den letzten Jahren beschränkte sich die

Forschung größtenteils auf die genetische Analyse von Patienten sowie den

immunhistologischen Nachweis von Kandidatengenen im Skelettmuskel. Bis zum Beginn

dieser Dissertation war die Zusammensetzung der Proteinaggregate, die die MFM

kennzeichnen, bis auf wenige Komponenten unbekannt. Ziel der hier vorliegenden

Dissertation war es, ein Protokoll zur Identifizierung der Zusammensetzung der

Proteinaggregate zu etablieren. Dafür wurde eine Kombination aus LMD und Label-freier

massenspektrometrischer Analyse gewählt. Mittels LMD wurden eine definierte Fläche von

Proteinaggregate und Areale von nicht betroffenen Muskelzellen aus Filaminopathiegewebe

isoliert. Im Anschluss an die massenspektrometrische Analyse sollten die Daten mit einer

qualitativen Auswertung und 2 verschiedenen Ansätzen zur Quantifizierung analysiert

werden, um spezifisch akkumulierte Proteine in den Aggregaten zu identifizieren. Ein

weiteres Ziel stellte die Charakterisierung von Frühstadien in der Pathogenese der

Filaminopathie dar. Die Erkrankung manifestiert sich in den meisten Fällen ab dem 40.

Lebensjahr. Erst dann lassen sich Proteinaggregate im Muskel nachweisen. Eine differentielle

Proteomstudie von Filaminopathiegewebe sollte helfen, regulierte Proteine in Gewebe, das

(noch) keine Aggregate ausweist, zu identifizieren und deren Bedeutung in der frühen

Pathogenese zu klären. In Ergänzung zu den Analysen des humanen Materials sollte die

Proteomanalyse in die Zellkultur übertragen werden. In der hier vorliegenden Dissertation

wurde ein Vergleich von murinen Myoblasten und humanem Gewebe hinsichtlich ihrer

Aggregatzusammensetzung angestrebt. Es sollte untersucht werden, ob die Zellen bezüglich

der Aggregation von Proteinen ein geeignetes Modell für die Myofibrillären Myopathien

darstellen. Um eine Grundlage für nachfolgende Therapiestudien (z.B. durch Behandlung mit

Zielsetzung

33

Substanzen, die Aggregat-lösend wirken) zu ebnen, wurde Plasmid-DNA der p.W2710X-

Mutation in murine Myoblasten transfiziert. Im Rahmen einer Zeitreihe (24h, 48h und 72h

nach Transfektion) wurden positiv transfizierte Zellen, die Proteinaggregate gebildet hatten,

mittels LMD isoliert und analog zu den humanen Aggregaten massenspektrometrisch

analysiert.

34

3. Material und Methoden

3.1. Verwendete Chemikalien

Chemikalie Hersteller, Ort, Land

Aceton Riedel de Haën Sigma-Aldrich

Laborchemikalien GmbH, Seelze,

Deutschland

Acetonitril JT Baker, Deventer , Niederlande

Acrylamid (Elektrophoresegrade) Bio-Rad Laboratories, München,

Deutschland

Acrylamid-Bis Lösung

(30% Acrylamid, 0,4% Bis)

SERVA Electrophoresis GmbH,

Heidelberg, Deutschland

Agarose Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Ammoniumacetat Biomol GmbH, Hamburg, Deutschland

Ammoniumhydrogencarbonat AppliChem, Darmstadt, Deutschland

Ammoniumpersulfat (APS) Bio-Rad Laboratories GmbH,

München, Deutschland

Ammoniumsulfat Bio-Rad Laboratories GmbH, München,

Deutschland

Amberlite IRN 150 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

Ampholin 3,5-10 GE Healthcare, München, Deutschland

Ameisensäure, 98% Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

BioRad Protein Assay Bio-Rad Laboratories GmbH,


Bis-Tris Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Bromphenolblau Bio-Rad Laboratories, München,

Deutschland

Cassettes 1,0 mm 25/Pk Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

BSA (bovine serum albumin) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

CHAPS SERVA Electrophoresis GmbH,

Material und Methoden

35

Heidelberg, Deutschland

Complete REact® Buffer Set Invitrogen/Life Technologies, Karlsruhe,

Deutschland

Complete Mini EDTA-free Roche Applied Science, Mannheim,

Deutschland

α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure

(rekristallisiert)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


DIGE Saturation Labelling System GE Healthcare, München, Deutschland

DMEM + GlutMAXTM – I,

Dilbecco’s Modified Eagle Medium

Gibco/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Di-Natriumhydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Dimethylformamid (DMF) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


1,4-Dithiothreitol (DTT) AppliChem, Darmstadt, Deutschland

EcoR I Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

EDTA, 1% v/v in PBS Ca 2+ und Mg 2+ Biochrom AG, Berlin, Deutschland

E-Gel iBase Power System Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

E-Gel 96 High Range DNA Marker Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

E-Gel Safe Imager Real-Time TR Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

E-Gel Sample Loading Puffer Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Essigsäure, 100% VWR International GmbH, Darmstadt,

Deutschland

Ethanol absolut Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Ethylendiamin Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

FBS Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

Iodacetamid AppliChem, Darmstadt, Deutschland

Glycerin JT Baker, Deventer, Niederlande

ß-Glycerophosphat Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Kaliumchlorid Merck KGaA, Darmstadt

Harnstoff Bio-Rad, München, Deutschland

Horse Serum, heat inactivated,

steril filtered

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland


36

Kaliumhdrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Kanamycin 100x Invitrogen/Life Technologies,

Darmstadt, Deutschland

LB-Agar Invitrogen/Life Technologies,


Lipofectamine LTX and Plus TM Reagents Invitrogen/Life Technologies,


Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Natriumchlorid Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumhydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumdodecylsulfat (SDS) Biomol GmbH, Hamburg, Deutschland

Natriumdodecylsulfat (2D PAGE) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Natriumorthovanadat Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Natriumfluorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Natrium-pyrophosphat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,

Deutschland

Natriumpyruvat , 100 mM Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

NEAA (non essentila amino acids) MEM,

100x

Gibco/ Invitrogen, Life Technologies,


OneShot® Match1 TM-T1R Chemically

Competent E.coli

Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

PBS pH 7,4, w/o Ca2+ und Mg2+ Biochrom AG, Berlin, Deutschland

PDA Bio-Rad Laboratories, München,

Deutschland

Plasmid Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland

Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Deutschland

Pharmalyt 4,0-6,5 Amersham GE Healthcare, Freiburg,

Deutschland

Pharmalyt 5,0-8,0 GE Healthcare, München, Deutschland

o-Phosphorsäure JT Baker, Deventer, Niederlande

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Quant iT ™ ds DNA BR Assay Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Quant iT ™ ds DNA BR Assay Fluorometer Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland


37

Qubit™ Assay Tubes Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Qubit™ Fluorometer Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Sal I Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

SDS Bio-Rad Laboratories, München,

Deutschland

Servalyt 2,0-11 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg,

Deutschland

Servalyt 2,0-4,0 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg,

Deutschland

Servalyt 6,0-9,0 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg,

Deutschland

Sephadex G-75 GE Healthcare, München, Deutschland

SOC-Medium Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

TE-Puffer Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

TEMED Bio-Rad Laboratories, München,

Deutschland

Thiourea Merck KGaA, Darmstadt

Trifluoressigsäure, 99% Fluka (Sigma-Aldrich Chemie

GmbH),Steinheim, Deutschland

Tris(hydroxymethyl-)aminomethan (Tris

Base)



Tris(hydroxymethyl-)aminomethan

Hydrochlorid (Tris HCl)



Trypsin (aus Schweinepankreas) SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg,

Deutschland

Trypsin 0,25& EDTA, 100 ml Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Urea (IEF Gele) Bio-Rad Laboratories GmbH,


Urea (IEF Puffer) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland


38

3.2. Verwendete Geräte und Materialien

Allgemein:

Analysenwaage BL 1500 S und BP 121 S Sartorius AG, Göttingen, Deutschland

AnchorChip-target (MTP 384-600) Bruker Corporation, Bremen, Deutschland

Binokular Olympus Deutschland GmbH,

Hamburg, Deutschland

Brutschrank Kendro Laboratory Products GmbH,

Langenselbold, Deutschland

Deckgläschen Menzel-Gläser (Thermo Fisher Scientific

Inc.), Braunschweig, Deutschland

Einfrierbehälter für Zellen Thermo Fisher Scientific Inc.,

Bonn, Deutschland

Einmal-Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml , 2,0

ml)

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Einmal-Reaktionsgefäße (0,2 ml)

Elektronenionisationsquelle Thermo Fisher Scientific Inc.,

Schwerte, Deutschland

Feinwaage Scaltec SBA 31 Sartorius, Göttingen, Deutschland

Fettstift Dako Deutschland GmbH, Hamburg,

Deutschland

Fluoreszenzmikroskop Olympus Deutschland GmbH, Hamburg,

Deutschland

Gewebe-Einbettmedium (Tissue Freezing

Medium®)

Jung (Leica Microsystems), Wetzlar,

Deutschland

Glasobjektträger SuperFrost® Menzel-Gläser (Thermo Fisher Scientific

Inc.), Braunschweig, Deutschland

Glyceringelatine Roti®-Mount FluorCare Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Heizbad GFL, Burgwedel, Deutschland

HPLC-System Ultimate 3000 RSLCnano Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Kryostat CM 1950 Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland

LMDsgerät LMD 6500 Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland

Mikroskop CK X 31 Olympus Deutschland GmbH, Hamburg,

Deutschland

Muffelofen Carbolite CWF 1100,Watertown, USA

Omix C18, 100µl Varian Medical Systems, Zug, Schweiz

Bezeichnung Hersteller, Ort, Land


39

pH Indikatorstäbchen (pH 6,5-10,0 , nicht

blutend)

Knick, Berlin, Deutschland

pH-Meter Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland

Pipetten (Eppendorf Pipetten Research

1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL)

Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland

Polyethylentetraphtalat (PET-) Membran Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland

Qubit® Fluorometer Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Sterilbank Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland

Transferkapillare, metallbedampft Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Ultraschallbad Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Wasseranlage TKA Lab Tower Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Immunoblot:

Blottkammer (Nova Blot) GE Healthcare, München, Deutschland

Blottingmembran

(Nitrocellulose Protan 0,1 µm)

Whatman, Schleicher & Schüll GmbH

Dassel, Deutschland

Blottpapier Whatman, Schleicher & Schüll GmbH,

Dassel, Deutschland

Schüttler:

Schüttler für Gele (Typ 3005) GFL, Burgwedel, Deutschland

Schüttler für Reaktionsgefässe

(Thermomixer comfort)


Vortex Mixer SA7 Bibby Scientific Limited, Staffordshire,

England

Zentrifugen:

Rotations-Vakuumkonzentrator (Speedvac)

RVC 2-25 CD plus

Martin Christ GmbH, Osterode am Harz,

Deutschland

Sprout Minizentrifuge Biozym Scientific GmbH, Hessisch

Oldendorf, Deutschland

Tischzentrifuge (Multifuge 3 S-R) Kendro Laboratory Products GmbH,

Langenselbold, Deutschland

Tischzentrifuge 5415 D Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland


40

Tischzentrifuge 5415 R Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland

Tischzentrifuge 5702 Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland

HPLC Zubehör:

Gradientenpumpe Ultimate LC-Packings Dionex GmbH, Idstein,

Deutschland

Hauptsäule C18 Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Ladepumpe Switchos LC-Packings Dionex GmbH, Idstein,

Deutschland

PicoTip™ Emitter Nadeln New Objective Inc., Woburn, USA

Probennehmer Famos LC-Packings Dionex GmbH, Idstein,

Deutschland

Trennsäule, C18 Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Vorsäule C18 Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

Waters Multi λ Fluorescence Detector 2475 Waters GmbH, Eschborn, Deutschland

Massenspektrometer:

HPLC-System UltiMate 3000 RSLCnano Thermo Fisher Inc., Schwerte, Deutschland

LTQ Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

LTQ™ Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich,

Deutschland

MALDI-TOF/TOF-MS/MS (Ultraflex™ II) Bruker Corporation, Bremen, Deutschland

Scanner:

Fluoreszenzscanner (Typhoon Trio™) GE Healthcare, München, Deutschland

Infrarotfluoreszenzscanner (Odyssey™) LI-COR Biosciences GmbH, Bad Homburg,

Deutschland

Netzteile:

Netzanschlussgerät (Consort E833) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,

Deutschland

Netzanschlussgerät

(EPS 3501XL für Blotkammer)

GE Healthcare, München, Deutschland


41

Netzanschlussgerät (Consort EV231) Bio-Rad Laboratories GmbH, München,

Deutschland

Gelzubehör:

Abstandhalter, 1,5 x 10 x 300 mm Desaga GmbH, Wiesloch, Deutschland

Cellophanfolie Pütz GmbH & Co. Folien KG, Taunusstein,

Deutschland

E-Gele® mit SYBR Safe ™ Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland

Gelgießstand Desaga GmbH, Wiesloch, Deutschland

Gelkammer angefertigt

(für IEF nach Klose et al.)

Plexiglas Lehmann, Dortmund, Deutschland

Gelkammer Desaphor VA300

(für 2D PAGE 2. Dim.)

Desaga GmbH, Wiesloch, Deutschland

Gelkammer XCell-SureLock MidiCell Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Gelkammer Xcell-SureLock MiniCell Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

GELoader™-Spitzen Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland

Gelschienen, 250 mm angefertigt Plexiglas Lehmann, Dortmund, Deutschland

Geltrockner Bio-Rad Laboratories GmbH, München,

Deutschland

Glasplatten, 250 mm x 300 mm Desaga GmbH, Wiesloch, Deutschland

IEF Glasröhrchen, 1,5 x 250 mm Schott AG, Wertheim, Deutschland

Verbrauchsmaterial:

Kryoröhrchen TPP AG, Tragadingen, Schweiz

LMD Zellkulturschalen (30 mm PEN) WillCo-dish, Amsterdam, Niederlande

Parafilm Brand GmbH Co. KG, Wertheim,

Deutschland

Pipettenspitzen (für IEF, TipOne Extended

Length, Natural, 0,1-10 µL, 2-20 µL, 20

200 µL, 200-1000 µL

Starlab GmbH, Ahrensburg, Deutschland

Pipettenspitzen 100 mm lang Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland

Pipettenspitzen 62 mm lang Eppendorf GmbH, Hamburg, Deutschland

BD Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 ml

und 50 ml)

Thermo Fisher Scientific, Deutschland

Reaktionsgefässe 0,25 ml, 0,5 ml,

1,5 ml, 2 ml



42

Computerprogramme:

Adobe Photoshop (Vers. 8.0) Adobe Systems Inc., Ratingen, Deutschland

Bildbearbeitungssoftware (IQ Tools™, Vers.

3.0)

GE Healthcare, General Electric Company,


Corel Graphics Suite (Vers. X4) Corel Corp., Unterschleißheim, Deutschland

DeCyder™ (Vers. 6.5) GE Healthcare, General Electric Company,


Image Quant (Vers. 5.2) GE Healthcare, General Electric Company,


Mascot 2.3.02 Matrixscience, London, England

Microsoft Office (Vers. 2007) Microsoft Office Corp., München,

Deutschland

Odyssey® (Vers. 3.0) LI-COR Biosciences GmbH, Bad Homburg,

Deutschland

ProteinScape™ Datenbank

(Vers. 1.4 und 2.1)

Bruker Corporation, Bremen, Deutschland

ProteomeDiscoverer 1.3™ Thermo Scientific Inc., Deutschland

Primärantikörper:

Antikörper Verdünnung Hersteller

Desmin, clone 33, monoclonal

Maus

1:500 Dako, Hamburg, Deutschland

Myotilin, monoclonal Maus 1:20 Novocastra/Leica

Microsystems, Wetzlar,

Deutschland

Phospho Serine, PSR-45,

monoclonal Maus

1:500 Abcam, UK

Rab35, polyclonal Hase

1:500 Abcam, UK

Xirp2, polyclonal Hase

1:1000 Biogenes, Berlin, Deutschland


43

Sekundärantikörper:

Antikörper Verdünnung Hersteller

Ziege-anti-Hase IgG, Dylight

488™ (grün)

1:1000 Dianova GmbH, Hamburg,

Deutschland

Ziege-anti-Maus IgG Texas

Red ™ (rot),

1:400 Dianova GmbH, Hamburg,

Deutschland

Maus IR680, Maus

1:15 000 LI-COR Biosciences, Bad

Homburg, Deutschland

Maus IR800, Maus

1:15 000 LI-COR Biosciences, Bad

Homburg, Deutschland

3.3. Präparation von Gefrierschnitten

Bei den hier verwendeten Gewebeproben handelte es sich um Skelettmuskel-

Biopsien von Filaminopathiepatienten, die im Rahmen eines operativen Eingriffs gewonnen

wurden. Die Biopsien wurden vorzugsweise aus dem Musculus medial gastrocnemius sowie

dem Musculus vastus lateralis entnommen. Das Gewebe wurde unmittelbar nach Entnahme

für die folgenden Analysen in 0,5 cm3 große Stücke geschnitten, in spezielles Eindeckmedium

(Tissue-Freezing Medium®, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) eingebettet und in

flüssigem Stickstoff eingefroren. Für die folgenden Analysen wurden von den Biopsien mit

Hilfe eines Kryostaten (Kryostat CM 1950 Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland)

Gefrierschnitte angefertigt. Für die Immunfluoreszenzfärbungen (siehe 3.5.1) wurden 6µm

dicke Gefrierschnitte auf Glasobjektträgern hergestellt, für die LMD der Proben 10µm dicke

Schnitte.

3.4. Patientendaten

Die Grundlage der Analysen bildeten Muskelbiopsien von insgesamt 6 verschiedenen

Filaminopathiepatienten. Die Genehmigung der Versuche erfolgte durch die Ethik-Komission

der Ruhr Universität Bochum [# 4078-11]. Bei allen 6 Patienten konnte mittels genetischen

Analysen sowie Immunfluorezenz-Studien von Skelettmuskelproben eine fortschreitende

Muskelschwäche diagnostiziert werden. Bei den hier beschriebenen Filaminopathie-

patienten handelt es sich um 6 Patienten mit 3 unterschiedlichen genetisch gesicherten


44

Mutationen im für Filamin C codierenden Gen FLNC. In den folgenden Tabellen sind

Mutation, Geschlecht, Alter und Herkunft der Skelettmuskelbiopsie aller Patienten

zusammengefasst. Es wurden Proben von 3 Patienten mit der Mutation p.W2710X in der

Dimerisierungsdomäne von Filamin C (d24Δ1) analysiert. Ein Patient zeigte eine weitere

Mutation in der Dimierisierungsdomäne (d24Δ2). Ergänzend dazu wurden Proben von 2

weiteren Patienten mit der Mutation p.V930_933del in der Ig-like-repeat-Domäne 7 des

Filamin C Gens analysiert. Alle Filaminopathiepatienten wurden nach Alter, Herkunft der

Muskelbiopsie und Geschlecht mit einer gesunden Kontrolle (Negativkontrolle) abgeglichen.

Die wichtigsten Parameter zum Abgleichen der Filaminopathiepatienten mit den

Negativkontrollen stellten das Alter bei Entnahme sowie die Herkunft der Biopsie. Das

Geschlecht spielte eine untergeordnete Rolle.

Tabelle 3.1.: Daten der analysierten Filaminopathiepatienten

Patient Alter

bei Biopsie

Herkunft

Muskelbiopsie FLNc-Mutation Geschlecht

1 52 Medial

gastrocnemius p.W2710X Weiblich

2 49 Vastus lateralis p.V930_930del Männlich

3 42 Vastus lateralis p.W2710X Männlich

4 46 Vastus lateralis p.W2710X Weiblich

5 46 Medial

gastrocnemius p.V930_930del Weiblich

6 41 Medial

gastrocnemius d24Δ2 weiblich

Tabelle 3.2.: Daten der gematchten Negativkontrollen

Gematchte Negativkontrolle

Alter bei Biopsie

Herkunft Muskelbiopsie Geschlecht

Zu Patient 1 50 Medial gastrocnemius männlich

Zu Patient 2 52 Vastus lateralis Männlich

Zu Patient 3 44 Vastus lateralis Männlich

Zu Patient 4 44 Vastus lateralis Weiblich

Zu Patient 5 42 Medial gastrocnemius Männlich

Zu Patient 6 42 Medial gastrocnemius Männlich


45

3.5. Immunfluoreszenzfärbungen

Im Rahmen der durchgeführten Analysen wurden zwei unterschiedliche

Färbeprotokolle erarbeitet. Zunächst wurden 6 µm dicke Gefrierschnitte auf

Glasobjektträgern angefertigt. Die Schnitte wurden mit einem Myotilin-Antikörper sowie

einem fluoreszenz-gekoppelten sekundären Antikörper gefärbt. Ziel war es, die

durchschnittliche Anzahl an für Myofibrilläre Myopathien (MFM) typische Proteinaggregaten

in den Proben zu ermitteln. Für die Lasermikrodissektion wurden 10 µm Gefrierschnitte auf

Polyethylenterephthalat(PET)-Membranen angefertigt. Zur Detektion der MFM-spezifischen

Proteinaggregate mittels Myotilin-Antikörper wurde ein optimiertes Färbeprotokoll

angewendet.

3.5.1. Immunfluoreszenzfärbungen auf Glasobjektträgern

Die Immunfluoreszenzfärbung auf Glasobjektträgern erfolgte mit 6 µm dicken Serien-

Gefrierschnitten der einzelnen Gewebeproben. Der Myotilin-Antikörper wurde in einer 1:20

Verdünnung verwendet, der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus IgG, Texas Red ™) in

einer 1:400 Verdünnung. Nach Anfertigung der Serienschnitte wurde das Gewebe zunächst

10 min bei RT mit reinem Aceton fixiert und anschließend getrocknet. Um das Verlaufen der

Lösungen auf den Objektträgern zu verhindern, wurden die Schnitte mit einem Fettstift

umrandet. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch die Inkubation mit 2% (v/v) BSA

(bovine serum albumine)-Lösung geblockt. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem

primären Antikörper über Nacht bei 4°C. Nach zweimaligem Waschen mit PBS-Puffer für

2min wurden die Schnitte für 1h mit dem sekundären Antikörper bei RT im Dunkeln

inkubiert. Die Schnitte wurden erneut zweimal mit PBS (jeweils 2 min) gewaschen. Direkt im

Anschluss werden die Schnitte in Glyceringelatine unter Deckgläschen eingedeckt.

3.5.2. Immunfluoreszenzfärbungen auf PET-Membran

Um die MFM-spezifischen Proteinaggregate mittels LMD isolieren zu können, wurde

das in Punkt 3.5.1. beschriebene Protokoll modifiziert. Anstelle von Glasobjektträgern

wurden spezielle Objektträger mit PET-Membran verwendet. 10 µm dicke Kryoschnitte

wurden auf die Membranobjektträger übertragen und anschließend fluoreszenz-markiert.


46

Nach Anfertigung der Serienschnitte wurden die Schnitte ohne Fixierung mit dem ersten

Antikörper (Myotilin, 1:20) für 45 min im Dunkeln bei RT inkubiert. Nach dreimaligem

Waschen mit PBS-Puffer für jeweils 2 min wurden die Schnitte 45 min mit dem sekundären

Antikörper bei RT im Dunkeln inkubiert. In einem letzten Schritt wurden die Schnitte

getrocknet und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.

3.5.3. Validierung differentieller Proteine mittels Immunfluoreszenz

Für die Validierung von Proteinen, die als spezifisch in den Proteinaggregaten

identifiziert wurden, wurden Immunfluoreszenzfärbungen angefertigt. Hierfür wurden vom

Filaminopathiepatient 6 (s. Tabelle 3.4., Punkt 3.4) Serien-Kryoschnitte hergestellt. Die

Validierung erfolgte unter der Verwendung des Protokolls für Immunfluoreszenzen auf

Glasobjektträgern. Um die Proteine Xirp2 und Rab35 zu validieren wurden folgende

Verdünnungen der Antikörper eingesetzt: Xirp2 (polyklonal, Hase, 1:1000) und Rab35

(polyklonal, Hase, 1:500) und entsprechenden Sekundärantikörpern (Ziege-anti-Hase,

konjugiert mit DyLight 488™, 1:1000). Die Analyse der gefärbten Schnitte erfolgte mit Hilfe

eines Fluoreszenzmikroskops (Modell BX61, Olympus, Hamburg) bei 20facher Vergrößerung.

3.6. Herstellen von Skelett-Muskellysaten

Für die Herstellung von Muskellysaten wurden 10 µm dicke Kryoschnitte von

Filaminopathie- und Kontrollgewebe angefertigt. Je 5 komplette Schnitte wurden in ein

eisgekühltes Einmal-Reaktionsgefäß (1,5 ml) gegeben. Die Zugabe des ebenfalls eisgekühlten

DIGE-Lysepuffers erfolgte sofort. Um die Aktivität von Phosphatasen zu minimieren wurde

der Lysepuffer mit Phosphatase-Inhibitoren versetzt. Das Gewebe wurde in dem Puffer

sorgfältig resuspendiert und anschließend 10 min im Ultraschallbad behandelt. Die

Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des BioRad Protein Assays nach Bradford [Bradford

1976] bestimmt. Die Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.


47

Zusammensetzung Lysepuffer Chemikalie Endkonzentration Tris Base 1 M 30 mM Harnstoff 7 M Thioharnstoff 2 M CHAPS 4% (w/v) Natrium-orthovanadat 1 mM ß-Glycerophosphat 10 mM Natrium-Fluorid 9,5 mM Natrium-pyrophosphat 10 mM Complete Mini™ EDTA-free pH 8,0 mit HCl

3.7. Kultivierung von murinen Myoblasten

Alle in vitro Analysen wurden mit der Zelllinie C2C12 durchgeführt. C2C12-Zellen sind

murine Myoblasten, die aus isolierten Myoblasten eines Mausskelettmuskels kultiviert

werden und erstmals durch Yaffe et al. 1977 beschrieben wurden. Die Zellen besitzen die

Eigenschaft sehr schnell in Myotuben zu differenzieren und muskelspezifische Proteine zu

expremieren. Die Kryostabilate wurden Prof. Dr. Dieter O. Fürst, Leiter des Instituts für

Zellbiologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, zur Verfügung gestellt. Zu

Beginn der Kultivierung wurden die Zellen bei 37°C langsam aufgetaut und mit 10 ml DMEM

(37°C) aufgefüllt. Die Zellsuspension wurde vorsichtig gemischt und anschließend bei 900

rpm 5 min zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Überstand abgesaugt und dass Zellpellet in

5 ml Proliferationsmedium (37°C) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in eine 10 cm

Zellkulturschale, befüllt mit 5 ml Proliferationsmedium (37°C), gegeben. Die Kultivierung

erfolgte bei 5% Kohlenstoffdioxid und 37°C. Das Passagieren erfolgte alle 2-3 Tage, die Zellen

sollten eine Konfluenz von ca. 80 % aufweisen. Das Kulturmedium wurde zunächst

abgesaugt. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte mit 0,02 % EDTA in PBS um

verbleibende Mediumreste zu lösen. Danach wurden 2 ml 0,05 % Trypsin in PBS auf die

adhärenten Zellen gegeben. Nach ca. 5 min Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch

Zugabe von 4 ml frischem Proliferationsmedium gestoppt. Zur Kryokonservierung wurden

die konfluenten Zellen zweimal mit 0,02 % EDTA in PBS gewaschen. Anschließend wurden 2

ml Trypsin auf die adhärenten Zellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von ca. 5 min bei


48

37°C wurden 4 ml frisches Proliferationsmedium auf die Zellen gegeben. Die resuspendierten

Zellen wurden bei 900 rpm 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das

Pellet in FCS mit 10 % DMSO resuspendiert. Je 1 ml der Zellsuspension wurde in

Kryoröhrchen überführt und zunächst 4h bei -80°C gelagert. Danach erfolgte die Lagerung im

flüssigen Stickstoff.

Zusammensetzung Proliferationsmedium 500 ml Gesamtvolumen 410 ml DMEM + GlutMAXTM – I, Dilbecco’s Modified Eagle Medium 15 % FCS 2 %l Natrium-Pyruvat 1 %l NEAA

3.8. Zellbiologische Methoden

Die hier beschriebenen zellbiologischen Arbeiten basieren auf der Verwendung

zweier Vektoren: pEGFP N3 und pEGFP C2 (Clontech). Beide Vektoren eignen sich für die

Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen. Im N3-Vektor ist das Zielprotein am C-

Terminus mit dem Fluoreszenzprotein EGFP fusioniert, im C2-Vektor sind Zielprotein und

EGFP am N-Terminus fusioniert. In die Vektoren wurde zum einen die humane Filamin C-

Wildtyp-Sequenz und zum anderen die humane Sequenz von Filamin C mit eingebrachter

Mutation in der Dimerisierungsdomäne hineinkloniert. Die Konstrukte wurden von der AG

Prof. Dr. Dieter O. Fürst, Institut für Zellbiologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-

Universität Bonn, zur Verfügung gestellt. Die Klonierungsarbeiten wurden von Dipl. Biologin

Yvonne Leber, Doktorandin in der AG Prof. Dr. Fürst, durchgeführt.

Tabelle 3.3.: Übersicht über die verwendeten FLNC-Konstrukte

Bezeichnung Konstrukt

Mutation

FLNC fl C2 pEGFP wt Wildtyp

FLNC fl C2 pEGFP mut W2710X

FLNC fl N3 pEGFP wt Wildtyp

FLNC fl N3 pEGFP mut W2710X

FLNC fl N3 pEGFP Leervektor -


49

3.8.1. Transformation von Konstrukten in E. Coli-Zellen

Für die Transformation der DNA-Konstrukte wurden One Shot ®Mach1 ™ -T1R

chemisch kompetente E.Coli–Zellen (Invitrogen) verwendet. Die Zellen (50µl) wurden

langsam auf Eis aufgetaut. Sobald die Zellen aufgetaut waren, wurde 1µl DNA-Konstrukt

hinzugefügt und 30 min auf Eis inkubiert. Der Transformationsansatz wurde einem 30 sec

Hitzeschock unterzogen, dann folgte eine weitere Inkubation über 2 min auf Eis.

Anschließend wurden 250 µl SOC Medium (Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt,

Deutschland) hinzugegeben und der Ansatz bei 37°C und leichtem Schütteln (225 rpm) 30

min inkubiert. 50µl des Transformationsansatzes wurden auf einer 10 cm Agarplatte

ausgestrichen. Die vereinzelten Zellen wuchsen über Nacht. Am nächsten Tag wurden 2 - 3

vereinzelte Kolonien gepickt und in 3 ml LB Medium (mit 15 µl Kanamycin) überführt. Die

Mini-Kultur schüttelte über Nacht bei 37°C. 2ml der Mini-Kultur wurden für eine Plasmid

Mini Präparation (Qiagen, siehe unten) verwendet. 1,5 ml der Kultur wurden in 100 ml LB-

Medium (mit 500 µl Kanamycin) beimpft, der Rest der Kultur wurde bei 4°C gelagert. Nach

ca. 12h Inkubation erfolgte eine Plasmid Midi-Präparation (Qiagen) nach Protokoll des

Herstellers.

3.8.2. DNA-Extraktion und Überprüfen der Plasmid-DNA

Die Extraktion der DNA erfolgte als Miniprep sowie als Midiprep nach

Herstellerprotokoll. Im Anschluss an die Midiprep wurden die DNA-Konzentrationen der

Proben gemessen. Hierfür wurde das Quant iT ™ ds DNA Assay Kit von Invitrogen nach

Herstellerprotokoll verwendet. Die DNA-Konzentrationsmessung erfolgte mit dem Qubit®

Fluorometer von Invitrogen. Zur Überprüfung der Plasmid-DNA wurde ein 1µg DNA im

Restriktionsverdau mit EcoR I und Sal I für 1h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die

entstandenen Fragmente in einem AgaroseGel (E-Gel 1,2%, Invitrogen/Life Technologies,

Darmstadt, Deutschland) auf ihre Größe untersucht. Das Insert wies die erwartete Größe

von. 8,1 kb und der Vektor von 4,7 kb auf. 5 µl des Restriktionsansatzes wurden mit 15 µl

nuklease freiem H2O vermischt und auf ein E-Gel® mit SYBR SAFE ™ von Invitrogen gegeben.


50

Ansatz Restriktionsverdau, 20µl Menge Substanz 1 µg DNA 0,5 µl EcoR I (5U) 0,5 µl Sal I (5U) 2 µl Reaktionspuffer 16 µl Nukelase freies H2O

3.8.3. Herstellen von Glycerol Stocks

Hierfür wurden 3 ml LB-Medium mit 15 µl Kanamycin und 100 µl der Kultur versetzt.

Die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurden 500 µl Glycerol

in ein 1,5, ml Einmal-Reaktionsgefäß vorgelegt. 500 µl der Über-Nacht-Kultur wurden dann

hinzugeben und beide Bestandteile wurden gut miteinander vermischt. Die Glycerol Stocks

wurden bei -80°C gelagert. Zur Herstellung einer Midi-Kultur wurden bei Bedarf 500 µl des

Glyercol Stocks in 100 ml LB-Medium (mit Kanamycin) bei 37°C über Nacht geschüttelt. Am

nächsten Tag wurde eine Plasmid Midi-Präparation (Qiagen) nach Protokoll des Herstellers

durchgeführt.

3.8.4. Transfektion muriner Myoblasten

Ziel der hier durchgeführten Transfektionen war es, die MFM-spezifischen

Aggregatbildung in C2C12-Zellen zu analysieren und mit dem humanen Proteom zu

vergleichen. In Anlehnung an die Analyse von humanem Material wurden die Aggregate

sowie die entsprechenden Kontrollflächen aus murinen Zellen mittels LMD isoliert. Die

C2C12-Zellen wurden in speziellen LMD-Zellkulturschalen (WillCo dish, PEN Membran 30 mm)

ausplattiert. Hierfür wurden 1000 µl Proliferationsmedium in die LMD-Schalen gegeben und

mit 250 µl Zellsuspension vermischt. Die Zellen wuchsen 24h bei 37°C bis zu einer Konfluenz

von ca. 70 %. Am nächsten Tag erfolgte die transiente Transfektion mit der Plasmid-DNA. Pro

Schale wurden 300 µl DMEM in ein Falcon vorgelegt. Anschließend wurden 2,25 µg der DNA

hinzugefügt und mit Hilfe des Vortexers gemischt. Als nächstes wurden 2,25 µl Plus ™

Reagent in das Falcon pipettiert. Zum Mischen wurde das Falcon vorsichtig geschwenkt. Es

folgte eine Inkubationszeit von 5 min bei RT. Im Anschluss wurden 4,5 µl Lipofectamin ™ LTX

zum Transfektionsansatz hinzugeben. Der Ansatz wurde mittels Vortexer gemischt und 30


51

min im Dunkeln bei RT inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionsansatz

tröpfchenweise auf die C2C12-Zellen pipettiert. Die LMD erfolgte 24h, 48h und 72h nach

Transfektion.

3.9. Lasermikrodissektion (LMD)

Die LMD ist eine Methode, mit der es möglich ist, spezielle Areale aus dem Gewebe

zu isolieren und anschließend zu analysieren. Diese Methode wird hauptsächlich zur

Gewinnung von Proben eingesetzt, die durch ihr limitiertes Vorkommen charakterisiert sind.

Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Muskelbiopsien wurden zum einen durch die geringe

Anzahl der Aggregate pro Patient limitiert, in einem gefärbten Kryoschnitt konnten ca. 10-15

Aggregate detektiert werden. Zum anderen stellten die wenigen vorhandenen

Filaminopathiepatienten eine Limitierung dar. Im Rahmen dieser Dissertation wurde das

LMD 6500 von Leica (Wetzlar, Deutschland) verwendet. Eine mit dem Mikroskop

verbundene Digitalkamera übertrug Bilder der 10 µm dicken Gefrierschnitte an einen

Rechner. Zur Erkennung und Isolierung der Aggregate wurde die 40fach Vergrößerung des

Mikroskops gewählt, im Falle des umliegenden Gewebes reichte die 20fache Vergrößerung

aus. Die Aggregate und die umliegenden Muskelfasern wurden über ein Steuerelement

markiert und anschließend automatisch mittels Laser ausgeschnitten. Die Gewebestücke

fielen senkrecht in ein leeres 0,5 µl Einmalgefäß. Im Anschluss an das Sammeln wurde der

Lysepuffer auf die Proben gegeben und für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die

Proben 10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Die Proben wurden bei -80°C gelagert und vor

der Weiterverarbeitung 5 min im Ultraschallbad behandelt. Ziel der LMD war es die

Proteinaggregate hinsichtlich ihrer Zusammensetzung zu analysieren und Frühstadien der

Erkrankung anhand von aggregatfreiem Gewebe zu identifizieren. Um dies zu erreichen,

wurden drei verschiedene Gruppen an Skelettmuskelgewebe gesammelt:

(1) MFM-spezifische Proteinaggregate aus Filaminopathiegewebe

(2) umliegendes Gewebe ohne Proteinaggregate aus Filaminopathiegewebe

(3) gesundes Gewebe aus Kontrollgewebe


52

Im Vorfeld der Studien war es zunächst notwendig die Mengen an Probenmaterial zu

optimieren. Definierte Mengen an Gewebe wurden mittels Lasermikrodissektion ausgelasert.

Am Ende der Vortests stand fest, dass 100 Aggregate ≈ 250 000 µm2 für die Analyse optimal

zu sein scheint. Zur Charakterisierung von Frühmarkern erwiesen sich 6,7 mio µm2 als

optimal.

3.10. Solubilisierung der Aggregate

Zu Beginn der Arbeiten gab es in der Literatur keine Hinweise auf die Löslichkeit von

MFM-spezifischen Proteinaggregaten. Um die Zusammensetzung der Aggregate

aufschlüsseln zu können, musste im Anschluss an die LMD zunächst untersucht werden, in

welchem Puffer bzw. Lösungsmittel die Aggregate am besten solubilisiert werden können.

Für diese Vorstudien wurden 3 verschiedene Lösungen verwendet: in jeweils 20 µl 6M

Guanidin-HCl und 8M Urea und 20 bzw. 40 µl 98% Ameisensäure. 250 000 µm2

Aggregatfläche wurden aus Immunfluoreszenz-gefärbten Filaminopathiegewebe

ausgeschnitten. Nachdem die Proben gesammelt worden waren, wurden sie 30 min in den

Lösungen inkubiert und anschließend zentrifugiert. Bis zur massenspektrometrischen

Analyse wurden die Proben bei -80°C gelagert. Für die nachfolgende Studie erwies sich 98%

Ameisensäure als das Mittel der Wahl.

3.11. In-Lösung-Verdau

Für die massenspektrometrischen Analysen wurden die LMD-Proben einem

tryptischen Verdau unterzogen, um die Proteine in Peptide zu spalten. Zunächst wurden die

Proben 1h 30 min aufkonzentriert (Rotations-Vakuum-Konzentrator RVC 2-25 CD plus,

Martin Christ GmbH, Osterode am Harz). Anschließend wurden 74,25 µl 50 mM

Ammoniumbicarbonat (pH 7,8) auf die Proben gegeben. Durch die Zugabe und Inkubation

(20 min bei 56°C und 600 rpm) von 0,25 µl 2M DTT vorhandene Disulfidbrücken reduziert.

Um eine Reoxidation der Cysteinreste zu verhindern, wurden 2,7 µl 0,55 M Iodacetamid zu


53

den Proben gegeben und 15 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Im nächsten Schritt wurde 1 µl

1 % (v/v) Trypsin Enhancer ProteaseMAX ™ Surfactant hinzugefügt. Vor der Zugabe von 1,8

µl (1µg/µl in 50 mM Essigsäure) wurde bei allen Proben der pH-Wert überprüft. Der pH-Wert

sollte bei 7,4–7,5 liegen um optimale Bedingungen für den tryptischen Verdau zu

gewährleisten. Der In-Lösung-Verdau erfolgte über Nacht bei 37°C. Am nächsten Morgen

wurde der Verdau durch die Zugabe von 5,25 µl 10 % TFA gestoppt.

3.12. Aufreinigung der Proben nach dem In-Lösung-Verdau

Für die Aufreinigung der Proben wurden spezielle Filter-Pipettenspitzen mit C18-

Membranen (OMIX C18-Tips, Varian Medical Systems, Schweiz) verwendet. Die hydrophoben

C18-Gruppen in den Filter-Pipettenspitzen binden spezifisch hydrophobe Peptide und

trennen diese von anderen Bestandteilen, wie z.B. unverdaute Proteine mit stark

hydrophilen Oberflächen und Salze des tryptischen Verdaus. Zu Beginn der Aufreinigung

wurden die OMIX C18-Tips zunächst zweimal mit 100 µl 50 %-igen Acetonitril-Lösung und

zweimal mit 100 µl einer 0,1 %-igen TFA-Lösung äqulibriert. Nachdem die OMIX C18-TIps

vorbereitet wurden, wurde jede einzelne Probe insgesamt 8-mal über die Säule pipettiert.

Anschließend wurde die C18-Membranen zweimal mit je 100 µl 0,1 % (v/v) TFA gewaschen

um Salze, unverdaute Proteine und andere nicht gebundene Bestandteile zu entfernen. Im

nächsten Schritt wurden die gebundenen Peptide durch zweimalige Zugabe einer Lösung aus

55% (v/v) Acetonitril und 0,1% (v/v) TFA eluiert. Die Eluate wurden 5 min im Rotations-

Vakuum-Konzentrator auf ein Gesamtvolumen von 18 µl eingeengt. Die eingeengten Eluate

wurden durch die Zugabe von 45 µl 0,1% (v/v) TFA-Lösung auf ein Gesamtvolumen von 63 µl

aufgefüllt. Für die massenspektrometrische Analyse wurden jeweils 16 µl Ansatz verwendet.


54

3.13. Differentielle In-Gel Elektrophorese des Proteoms von Patienten mit

Filaminopathie

Die Analyse des Proteoms von Filaminopathiepatienten erfolgte mittels differentieller

In-Gel Elektrophorese (DIGE). In der ersten Dimension erfolgt die Auftrennung nach dem

isoelektrischen Punkt (pI). Die Proteine wandern im elektrischen Feld entlang eines pH-

Gradienten bis zum dem pH-Wert, bei dem ihre Nettoladung gleich null ist. In der zweiten

Dimension erfolgt eine Auftrennung nach der elektrophoretischen Mobilität in einer SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese [Laemmli 1970].

3.13.1. Markierung der Proteine durch CyDye®-Farbstoffe

Im Vorfeld der Zweidimensionalen Auftrennung wurden die Proteine zunächst mit

Fluoreszenzfarbstoffen markiert [Marouga et al. 2005]. Für analytische Gele wurden 100

nMol Farbstoff bei 4°C mit 50 µl wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) versetzt, für

präparative Gele wurden 400 nmol mit 20 µl DMF versetzt. Anschließend wurden die

Ansätze 30 sec gemischt und bei 12 000 x g 30 sec zentrifugiert. Die Endkonzentration der

Farbstoffe für analytische Gele betrug 2 mM und für präparative 20 mM. Aufgrund der

äußerst geringen Proteinkonzentration der Proben wurde das Saturation Labelling System

(GE Healthcare, München Deutschland) verwendet [Helling et al. 2006]. Hierfür wurden

zunächst die Proben mit 0,5 µl 2 mM Tris-2-carboxyethylphosphin-hydrochlorid (TCEP) bei

37°C für 1h im Dunkeln reduziert. Dieser Schritt diente der Entfaltung der Proteine sowie

dem Lösen der Disulfidbrücken. Die komplette Probe (ca. 5 µg) wurde anschließend mit 1µl

Farbstoff für 30 min bei 37°C inkubiert. Die optimale Menge von TCEP und Farbstoff wurde

in Vorstudien ermittelt. Um Farbstoff-spezifische Effekte zu verhindern, wurde ein

sogenannter „Color-Switch“ bei der Zugabe der Cy-Farbstoffe beachtet. Dies bedeutet, dass

die Patienten- und Negativkontrollen abwechselnd mit Cy3 und Cy5 markiert wurden. Zum

Abstoppen der Reaktion wurden die Proben direkt im Anschluss mit Dithiothreitol (DTT) 15

min bei RT inkubiert. Das eingesetzte DTT-Volumen richtete sich nach dem Gesamtvolumen

der Probe, es wurde jeweils 1/10 DTT zum Gesamtvolumen verwendet. Die Proben wurden

maximal 3 Tage vor dem Start der isoelektrischen Fokussierung markiert und bis zur

weiteren Verwendung wurden die Proben bei -80°C gelagert.


55

3.13.2. Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten

In der ersten Dimension wurden die Proben durch elektrische Fokussierung nach

Klose [Klose 1975] mittels Trägerampholyten in Rundgelen (20 cm, 1,5 cm Durchmesser mit

Beule) aus Polyacrylamid aufgetrennt. Die Gele bestanden aus einem Trenngel und dem

Abschlussgel an der Kathode. Die Probe wurde an der Anodenseite auf das Trenngel

aufgetragen und mit Schutzgel sowie Anodenpuffer überschichtet. Die Auftrennung erfolgte

in einem pH-Bereich von 2 bis 11. Zur Fokussierung der Proteine wurde der unten

beschriebene Spannungsgradient verwendet.

Spannungsgradient für die isoelektrische Fokussierung, 20 cm

Spannung (V) Dauer 100 1 h 200 1 h 400 17,5 h 650 1 h 1000 0,5 h 1500 10 min 2000 5 min

Trägerampholytgemisch pH 2 - 11, Stammlösung Menge/ Großansatz Ampholin, pH Bereich 8 ml Ampohlin pH 3,5 – 10 8 ml Servalyte pH 2 - 11 24 ml Pharmalyt pH 4 – 6,5 16 ml Pharmalyt pH 5 – 8 Trägerampholytgemisch, komplett Menge/ Großansatz Ampholin, pH Bereich 7 ml Trägerampholytgemisch Stammlösung 1 ml Servalyte pH 6 - 9


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Separationsgel

EndKonzentration Substanz 9 M Harnstoff 5,1 % (w/v) Glycerin 3,59 % (w/v) Acrylamid 0,31 % (w/v) PDA 0,06 % (v/v) TEMED 4,1 % (v/v) Trägerampholytgemisch komplett Sephadexgemisch Menge Substanz 331 mg Harnstoff/Thioharnstoff-Gemisch (7 M/ 2M) 25 µL Trägerampholytmischung 270 mg Sephadexsuspension 25 µL DTT (1,08 g/ 5 mL) 2 M Abschlussgel, pH 2-11 Endkonzentration Substanz 12,3 % (w/v) Acrylamid 0,13 % (w/v) PDA 4,0 % (v/v) Trägerampholytmischung 9 M Harnstoff 0,5 % (w/v) Glycerin 0,06 % (v/v) TEMED Schutzlösung Endkonzentration Substanz 30 % (w/v) Harnstoff 5 % (w/v) Glycerin 2 % (v/v) Servalyte 2-4 Anodenpuffer

Konzentration Substanz 0,742 M Phosphorsäure 3,0 M Harnstoff Kathodenpuffer Konzentration Substanz 5 % (v/v) Ethylendiamin 5 % (v/v) Glycerin 9 M Harnstoff


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Inkubationspuffer Endkonzentration Substanz 125 mM Tris Base-Lösung (1M, pH 6,8) 40 % Glycerin 65 mM DTT 104 mM SDS

3.13.3 Proteinauftrennung nach Molekulargewicht

Nach Beendigung der isoelektrischen Fokussierung wurden die Rundgele 15 min in

Inkubationspuffer inkubiert. Dieser Schritt war notwendig, um die Proteine mit SDS zu

beladen und die Gele für die zweite Dimension zu puffern. Anschließend wurden die

Rundgele mehrfach mit 1x SDS-Laufpuffer gewaschen. Im Anschluss wurden die Rundgele

luftblasenfrei auf die Geloberkante eines Polyacrylamidgels (15 %,250 mm x 300 mm x

15 mm) gelegt. Zur Fixierung wurden die Rundgele mit 0,4 % Agarose überschichtet. Der

Agarose wurde Bromphenolblau zugesetzt, welches als Markierung der Lauffront während

der zweiten Dimension diente. Zu Beginn der Auftrennung liefen die Proteine 15 min bei

75mA und 20°C in das Polyacrylamidgel ein. Anschließend wurde die Elektrophorese bei

einem Stromfluss von 100 mA pro Gel durchgeführt. Der Auftrennung wurde beendet als

sich die Lauffront ca. 2 cm vor der unteren Gelkante befand.

Trenngelpuffer, pH 8,8 EndKonzentration Substanz 15 % Acrylamid 0,2 % Bisacrylamid 0,75 M Tris HCl 0,06 % TEMED 0,2 % SDS Laufpuffer EndKonzentration Substanz 0,3 % Tris Base 1,44 % Glycin 0,1 % SDS


58

3.13.4. Differentielle Gelbildanalyse

Die Gele verblieben bis zur Bilderfassung zwischen den Glasplatten. Die Platten

wurden vor dem Scan gründlich mit 100 % Ethanol gereinigt. Anschließend wurden die Gele

im Typhoon Trio Fluorescence Imager (GE Healthcare) digitalisiert. Die Exitations- und

Emissionswellen wurden wie folgt eingestellt: Cy3 550 nm und Cy5 500nm. Bei der

Einstellung wurde darauf geachtet, dass die maximale Intensität aller Kanäle vergleichbar ist.

Der Vorscan wurde bei 1000 Microns durchgeführt, der Hauptscan bei 100 Microns.

Nach dem Erfassen der Bilder wurden diese mittels ImageQuant TL™ zurecht

geschnitten. Dies schloss das Abschneiden der Lauffront ein, da das Bromphenolblau die

Detektion der fluoreszierenden Spots stören und zu falsch positiven Signalen führen könnte.

Mit der DeCyder™ Software 6.5 wurden die Gele dann analysiert. Zunächst wurden alle Gele

über den Image Loader in die Software eingeladen und mit Hilfe der Differentiellen In-Gel

Analyse (DIA) ausgewertet. In diesem Schritt wurden die Rahmenbedingungen der Analyse

festgelegt. Die Spotanzahl pro Gel wurde auf maximal 5000 begrenzt und das Spotvolumen

musste einen Wert von 30 000 übersteigen. Am Ende des ersten Schrittes wurde das

qualitativ beste Gel ausgewählt, das sogenannte Mastergel. Mit der Biologischen Varianz

Analyse (BVA) wurden die Gele zunächst automatisch mit dem Mastergel verglichen. Bei

Bedarf wurden Spots manuell korrigiert. Für die nachfolgende Erfassung einzelner Spots in

die differentielle Analyse war es wichtig, dass die Spots in mindestens 80% der Gele

auffindbar waren. Die statistische Signifikanz der Daten wurde mittels Student’s t-test

überprüft. Spots mit einem p-Wert ≤ 0,05 wurden als signifikant angesehen. Um die

Änderung in der Spotintensität als signifikante Expressionserhöhung bewerten zu können,

galt generell, dass Änderungen in der Expression ab einem Wert von 1,5fach im Western Blot

validiert werden können. Aus diesem Grund wurden zur Beurteilung von signifikant

exprimierten Proteinen wie folgt festgelegt: Spots mit Werten ˂ - 1,5 wurden mit einer

reduzierten Expression in den Filaminopathieproben gedeutet, Werte > 1,5 mit einer

gesteigerten Expression im Vergleich zu den Kontrollen. Die Festlegung der Parameter wie

auch das manuelle Sichten der als differentiell angegebenen Spots bildeten die Grundlage

der Analyse und sollten Artefakte verhindern.


59

3.13.5. Mini 2D Gelelektrophorese

In den Punkten 3.12.1 – 3.12.3. wurde die Vorgehensweise zur 2D DIGE-Analyse von

großen Gelen (20cm) beschrieben. Analog dazu wurden kleine 2D-Gele (7cm) angefertigt.

Vor Beginn der Proteinauftrennung wurden 50 µg Muskellysat mit Fluorophoren markiert

und anschließend mittels Trägerampholyten auf Rundgelen (Länge 7 cm, Durchmesser

1,5mm) aus Polyacrylamid aufgetrennt. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte nach dem

unten beschriebenen Spannungsgradienten.

Spannungsgradient für die isoelektrische Fokussierung, 7 cm

Spannung (V) DAUER 100 75 min 200 75 min 400 75 min 600 75 min 800 10 min 1000 5 min

Nach Beendigung der isoelektrischen Fokussierung wurden die Rundgele 15 min in

Inkubationspuffer inkubiert und im Anschluss auf selbst hergestellte 12 % Bis-Tris-Gele (8 cm

x 8 cm) aufgetragen. Zur Fixierung wurden die Gele mit 0,4 % Agarose überschichtet. Als

Elektrophorsepuffer wurde bei allen Gelen N-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)-Puffer

pH 7,3 verwendet. Der Einlauf der Proben erfolgte für 15 min bei 50 V, dann erfolgte die

Elektrophorese bei einer maximalen Spannung von 180 V für ca. 1h. Zur Überprüfung des

Spotmusters wurden die kleinen Gele nach Beendigung der 2. Dimension auf einem Typhoon

Trio Fluorescence Imager (GE Healthcare) digitalisiert.

MOPS-Puffer Konzentration Substanz 1 M MOPS 1 M Tris Base 2 % SDS 16 mM EDTA


60

3.14. Proteolytische Spaltung von Proteine für LC-ESI-MS/MS und MALDI

Die differentiellen Spots wurden für die Identifizierung aus dem Gel gestanzt und in

Verdauröhrchen überführt.

3.14.1. Verdau der Spots

Die Gelstücke wurden anschließend zur Entfernung möglicher Farbstoffreste und zur

Umpufferung des pH-Wertes dreimal im Wechsel mit je 20 µl Lösung A und B gewaschen.

Die Spots inkubierten für jeweils 10 min in den Lösungen. Im Anschluss an den dritten

Waschschritt in Lösung B wurden die Spots im Vakuumkonzentrator komplett eingeengt. Auf

die dehydratisierten Spots wurden dann je 2 µl Trypsinlösung gegeben (Trypsin in 10 mM

HCl gelöst, gemischt mit 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat). Der Verdau erfolgte über

Nacht bei 37°C.

Lösung A

Konzentration Substanz 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat Lösung B Konzentration Substanz 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat 50 % (v/v) Acetonitril Trypsinlösung Konzentration Substanz 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat 0,033 µg/µl Trypsin

3.14.2. Extraktion der Peptide fürs MALDI

Die Peptide wurden direkt im Anschluss an den tryptischen Verdau mit 10 µl 0,1 %

TFA aus den Gelstücken extrahiert. Die Extrakte wurden 30 min bei RT inkubiert und

anschließend auf ein AnchorChip-target von Bruker, Deutschland präpariert. Die α-Cyano-4-

hydroxy-zimtsäure-Matrix wurde mit 194 µl Acteon und 6 µl 0,1 % TFA vermischt, 5 min im

Ultraschallbad behandelt und weitere 5 min bei 16 000 g zentrifugiert. 10 µl des


61

Überstandes wurden auf die Ankerpositionen wie auch Zwischenräume des AnchorChip-

targets vorgelegt. Im nächsten Schritt wurden 3 µl des Peptidgemisches auf die

Ankerpositionen pipettiert. Nach 3 min wurde die Probe vorsichtig mit einer Pipette

abgezogen. Auf die Zwischenräume wurden 0,5 µl Standardlösung gegeben und komplett

eingetrocknet. Zum Abschluss wurden alle Positionen mit je 2,5 µl 0,1 % TFA gewaschen.

3.14.3. Extraktion der Peptide für LC-ESI-MS/MS

Direkt im Anschluss an den tryptischen Verdau wurden die Peptide mit 20 µl 0,1 %

TFA/ 100 % Acetonitril (1:1 Mischverhältnis) aus den Gelstücken extrahiert und 15 min im

Ultraschallbad behandelt. Der Überstand wurde in ein Verdauröhrchen überführt. Auf die

Gelstücken wurden erneut 20 µl der TFA/Acetonitril-Mischung gegeben und weitere 15 min

im Ultraschallbad behandelt. Nachdem der Überstand in das gleiche Verdauröhrchen wie

oben gegeben wurde, wurden die Proben in der SpeedVac ca. 45 min eingeengt. Die

eingetrockneten Peptide wurden mit 0,1 % TFA auf 20 µl aufgefüllt und bis zur Messung auf

der LTQ Velos Pro (Thermo) bei -80°C gelagert.

3.15. Proteinidentifizierung mittels MALDI

Die differentiellen Spots der DIGE-Analyse wurden mittels Matrix-assisted Laser

Desorption/Ionization (MALDI) identifiziert. MALDI eignet sich sehr gut zur Analyse von

wenig komplexen Proben und bietet zudem den Vorteil einer schnellen und sicheren

Identifizierung von Proteinen. Die Kalibrierung des MALDI-TOF/TOF (Ultaflex™, Bruker

Corporation Bremen, Deutschland) erfolgte zunächst durch Aufnahme von Spektren des

Peptidstandards. Im Anschluss wurden für jede Probe manuell mehrere Peptide Mass

Fingerprint (PMF) Spektren aufgenommen und aufsummiert. Die Spektren wurden im

Positivmodus des Geräts mit einer Targetspannung von 20 kV und einer gepulsten

Beschleunigungsspannung von 17,25 kV aufgenommen. Die Reflektorspannung betrug 21 kV

und die Detektorspannung 1,7 kV. Nach der Aufnahme der Spektren wurden diese intern

nachkalibriert mit 13 mono-isotopischen Massen von Autolyseprodukten von Trypsin und

Keratinfragmenten. Die generierten Spektren wurden durch das Erstellen von Massenlisten


62

der einzelnen Peptide ergänzt. Dies erfolgte durch den Gebrauch der Software FlexAnalysis

™ (Vers. 2.4, Bruker Corporation, Bremen, Deutschland). Bei der Erstellung der Listen

wurden folgende Parameter berücksichtigt: snap Peak Detektionslogarithmus, Signal-

Rausch-Verhältnis = 6, maximale Peak-Anzahl = 100, Grenzwert des Qualitätsfaktors = 50

und Subtraktion der Basislinie.

Matrixlösung

Menge Substanz α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure (gesättigt) 194 µl Aceton 6 µl Trifluoressigsäure Peptidstandard Konzentration Peptid m/z 2 mg/ mL Bradykinin 7,57 Da 10 mg/ mL Angiotensin 1296,66 Da 2 mg/ mL Bombesin 1619,82 Da 2 mg/ mL ACTH 1-17 2093,09 Da 2 mg/ mL Somatostatin 31477 Da

3.15.1. Datenauswertung der MALDI-Messung

Die mittels FlexAnalysis ™ (Vers. 2.4, Bruker Corporation, Bremen, Deutschland)

generierten Massenlisten wurden in ProteinScape 1.4 (Bruker Daltonics, Bremen,

Deutschland) geladen. Unter der Verwendung des Mascot Algorithmus wurden

Datenbanksuchläufe gegen die humane Decoy-Datenbank [Reidegeld et al. 2008]

(uniprot_sprot_decoy human) gestartet. Die folgenden Suchparameter wurden vor Start der

Suchen festgelegt: es wurde nur nach tryptischen Peptiden gesucht. Die Massentoleranz

zwischen dem theoretischen durchschnittlichen Wert und dem gemessenen Wert durfte

maximal 50 ppm betragen. Als feste Modifikation wurde Carbamidomethylierungen von

Cysteinen festgelegt, Methionin-Oxidationen sowie die Phosphorylierungen von Serin,

Tyrosin und Threonin wurden als variable Modifikationen gewählt. Zusätzlich wurde

festgelegt, dass eine übersprungene Schnittstelle akzeptiert und der Mascot™Score den

Wert 20 übertreffen sollte. Nach Beendigung der Suchläufe wurden die Ergebnisse in Form

einer Liste dargestellt. Mittels Mascot™Score wurde die Zuordnung der Peptide zu den


63

jeweiligen Spektren bewertet. Ein Protein wurde als identifiziert markiert, wenn mindestens

zwei Peptide dem Protein eindeutig zugeordnet werden konnten und wenn die theoretische

Masse des Proteins sowie der isoelektrische Punkt mit der Lokalisation des Spots im 2D-Gel

übereinstimmten.

Tabelle 3.4.: Zusammenfassung der Suchparameter in Protein Scape 1.4 für die Identifizierung von Gelspots

Suchparameter

Erlaubte fehlende Spaltungen 1

Feste/Variable Modifikationen Carbamidomethyl (C)

Oxidation (M)

Phospho (S,T,Y)

Massentoleranz (MS) 50 ppm

Parameter für die Datenbanksuche

Suchmaschine Mascot 2.3.02

Datenbank uniprot_sprot_decoy, human

Enzym Trypsin

MW Range 0.0 kDa

Kriterien für die Identifizierung von Proteinen

Mascot™ Score >20

3.16. Proteinidentifizierung mittels nanoLC-ESI-MS/MS

Für die Proteinidentifizierung mittels LC-ESI-MS/MS-Systeme wurden 2 verschiedene

Massenspektrometer verwendet: LTQ Orbitrap und LTQ Velos Pro (beide Thermo Fisher). In

Ergänzung zu der Identifizierung mittels MALDI wurden die differentiellen Spots der 2D DIGE

Analyse zusätzlich auf der LTQ VelosPro gemessen, um u.a. potentielle posttranslationale

Modifikationen zu detektierten. Hierfür wurden die Proteine in den Gelspots tryptsich

verdaut und anschließend extrahiert. Die mikrodissektierten Aggregatproben aus humanem

Gewebe und Zellkultur sowie der zugehörigen Kontrollen wurden auf der LTQ Orbitrap

gemessen. Die Proben wurden mittels In-Lösung-Verdau (beschrieben unter 3.10.) für die

massenspektrometrische Analyse vorbereitet.


64

3.16.1. LTQ Orbitrap

Die nanoLC wurde auf einem UltiMate 3000 RSLCnano LC-System (Thermo Fisher

Scientific Inc., Dreieich, Deutschland) durchgeführt. Zunächst wurden 15 µl der verdauten

Proben für 10 min auf eine Vorsäule (75 µm x 2 cm, C18-Säule, Partikelgröße 3 µm,

Porengröße 100 °A, Thermo Fisher Scientific Inc., Dreieich, Deutschland) injiziert und

aufkonzentriert. Der Lösungsmittelfluss betrug zu diesem Zeitpunkt 30 µl 0,1 % TFA/min. Die

Vorsäule wurde mit einer Trennsäule (300 µm x 25 cm für humanes Gewebe und 300 µm x

50 cm für Zellkultur, C18-Säule, Partikelgröße 3 µm, Porengröße 100 °A, Thermo Fisher

Scientific Inc., Dreieich, Deutschland) in Reihe geschaltet. Die Übertragung der Peptide von

der Vorsäule auf die Trennsäule erfolgte in einem Lösungsgemisch von 94 % Lösung A und

6 % Lösung B. Auf der C18-Trennsäule erfolgte die Auftrennung der Peptide mit einer

Flussrate von 400 nL/min. In einem ersten Gradienten über 95 min wurde der Anteil von

Lösung B auf 40 % erhöht und in einem zweiten Gradienten innerhalb von 2 min auf 95 %.

Durch den Anstieg des Acetonitril-Anteils erfolgte die Auftrennung der Peptide nach

steigender Hydrophobizität. In einem letzten Gradientenschritt wurde innerhalb von 5 min

der Anteil von Lösung B von 95 % auf 5 % verringert. Es folgte ein 60 minütiger Spülschritt.

Durch die Wahl unterschiedlicher Konzentrationen von Lösung B war es möglich Rückstände

der Peptidauftrennung von der Trennsäule zu waschen. Für die Elektrospray-Ionisation (ESI)

wurde die HPLC-Anlage direkt über eine entsprechende ESI-Quelle (Thermo Fisher Inc.,

Dreieich, Deutschland) mit der LTQ Orbitrap Velos™ (Thermo Fisher Inc., Dreieich,

Deutschland) gekoppelt. Die Peptide wurden für die ESI durch eine metallbedampfte

Glaskapillare (Pico™ Emitter, New Objective Inc., Woburn, USA) geleitet, an der eine

Spannung von 1,5 – 1,6 kV angelegt war. Die Temperatur betrug 275 °C. Durch das Anlegen

einer positiven Spannung wurden die Peptide in ein fein verteiltes Spray hochgeladener

Lösungsmitteltröpfchen überführt, aus denen ionisierte und positiv geladene

Analytmoleküle entstanden. Diese Moleküle wurden anschließend fragmentiert und

analysiert. Die Generierung der Spektren erfolgte in der Orbitrap mit einer Auflösung von R =

30 000 zwischen 300 und 2000 m/z. Die maximale Füllzeit betrug 500 ms. Für die interne

Kalibrierung wurde Polydimethylcyclosiloxan (m/z = 445.120) verwendet. Für die

anschließende MS/MS-Fragmentierung in der Ionenfalle LTQ wurden die 20 intensivsten

Massen ausgewählt. Die Füllzeit der LTQ betrug 50 ms. Die Fragmentierung der Peptide


65

erfolgte mittels low-energy collision-induced dissociation (CID) mit einer Kollisionsenergie

von 35 %. Alle gemessenen Massen wurden nach der Spektrenaufnahme für 35 sec auf eine

sogenannte Exklusionsliste gesetzt. So sollte verhindert werden, dass Peptide mehrfach

fragmentiert und gemessen werden.

3.16.2. LTQ Velos Pro

Die gewählten Parameter zur Auftrennung mittels nano LC und die

Elektrosprayionisation entsprachen generell der in Punkt 3.16.1. beschriebenen

Vorgehensweise. Die Messprotokolle unterscheiden sich allerdings in der Zusammensetzung

des Lösungsmittelgemisches während der Übertragung der Peptide auf die Trennsäule und

in der Wahl der Gradienten. Die Peptide wurden in einem in einem Lösungsmittelgemisch

von 96 % Lösung A und 4 % Lösung B übertragen. Zwischen der 6. und der 53. Minute wurde

der Anteil von Lösung B linear auf 40 % erhöht, innerhalb von 3 min auf 95 %. Ab der 59.

Minute wurde der Anteil von Lösung B wieder auf 4 % reduziert. Es folgte ein 5 minütiger

Waschschritt und die Re-Equilibrierung der Säule. Im Anschluss an die ESI wurden die

ionisierten Peptide in die LTQ Velos Pro geleitet. Der Scanbereich lag im Bereich von 300 bis

1500 m/z. Nach einem Übersichtscan wurden die 5 intensivsten Ionen ausgewählt und

mittels CID (365 – 2000 m/z, normalisierte Kollisionsenergie 35, Aktivierungszeit 10 ms) und

anschließend mittels ETD fragmentiert (50 – 2000 m/z, Aktivierungszeit 150 ms). Die m/z-

Werte von fragmentierten Ionen werden für 35 s auf eine Ausschlussliste gesetzt, um

mehrmaliges Messen desselben Ions zu verhindern.

Verwendete Lösungen für die HPLC

Lösung Zusammensetzung Lösung A 0,1 % (v/v) Ameisensäure Lösung B 80 % (v/v) Acetonitril, 0,1 % (v/v) Ameisensäure

3.16.3. Datenauswertung der nanoHPLC-ESI-MS/MS

Für die weitere Auswertung der massenspektrometrischen Analyse war es zunächst

notwendig die generierten Rohdaten (*raw-file-format) in das Mascot generic format (*mgf-

file) zu überführen. Dies erfolgte mit dem Programm Proteom Discoverer 1.3 von Thermo


66

Scientific, Deutschland. Die Rohdaten wurden erst in die Software importiert, dann wurden

die Massen der Precursor-Spektren zwischen 400 und 10000 Da gefiltert und am Ende

wurden die gefilterten Spektren in das *mgf-format überführt. Zur Identifizierung der

Proteine wurden die generierten mgf-files der einzelnen Proben in ProteinScape 2.1™

(Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) eingeladen und ein Abgleich mittels

Mascot™Suchalgorithmus (Matrixscience, London, England) gegen eine humane bzw. gegen

eine murine Protein-Datenbank durchgeführt. Zunächst wurde die IPI-decoy-Datenbank

verwendet. Im Laufe der Arbeiten wurde allerdings auf die uniprot_sprot-Datenbank

umgestellt. Die Suchkriterien für den Datenabgleich wurden wie folgt für beide Datenbanken

gewählt: Die Datenbanksuche wurde auf tryptisch verdaute Peptide beschränkt. Eine

überlesene Schnittstelle wurde akzeptiert. Insgesamt wurden 5 variable Modifikationen

berücksichtigt. Phosphorylierung von Serin, Tyrosin und Threonin wurden aufgrund von

posttranslationalen Modifikationen berücksichtigt. Carbamidomethylierung von Cysteinen

durch Acrylamid sowie die Methionin-Oxidation konnten während der Probenpräparation

beobachtet werden. Die Massentoleranz zwischen der theoretischen und der gemessenen

Masse durfte maximal 10 ppm betragen. In dem hier gewählten ESI-Verfahren war die

Wahrscheinlichkeit der Bildung mehrfach positiv geladener Ionen am höchsten. Dennoch

wurden in der Datenauswertung auch ein- und zweifach positiv geladene Ionen

berücksichtigt. Für die Peptididentifizierung wurden nur solche Peptide akzeptiert, die einen

minimalen Mascot™Score von 10 zeigten. Für die Proteinidentifikation wurden nur Peptide

bzw. MS/MS-Spektren zugelassen, die einen höheren Mascot™Score als 15 aufwiesen.

Diesen Peptiden werden Proteine zugeordnet, wenn für das jeweilige Protein mindestens 1

Peptid mit einem Mascot™Score von minimal 20 identifiziert wurde. Letztendlich können nur

Proteine als identifiziert angesehen werden, wenn die Summe aller Peptid-Mascot™Scores

den Wert 50 übersteigt. Nach Beendigung des Datenbankabgleichs wurden die

identifizierten Proteine in einer Liste zusammengefasst und sortiert.


67

Tabelle 3.5.: Zusammenfassung der Suchparameter in ProteinScape 2.1 zur Charakterisierung der

Proteinaggregatzusammensetzung

Suchparameter

Erlaubte fehlende Spaltungen 1

Variable Modifikationen Carbamidomethyl (C)

Oxidation (M)

Phospho (S,T,Y)

Massentoleranz (MS) 10 ppm

Massentoleranz (MS/MS) 0,5 Da Ladungen +1, +2, +3

Parameter für die Datenbanksuche

Suchmaschine Mascot 2.3.02

Datenbank uniprot_sprot_decoy, human

uniprot_sprot_decoy, Maus

Enzym Trypsin

Peptide score threshold 15

Minimum 1 Peptid mit Score >20

Kriterien für die Identifizierung von Proteinen

Mascot™ Score >50

Kriterien für die Identifizierung von Peptiden

Mascot™ Score >20

3.17. Auswertung massenspektrometrischer Daten nach Datenbankabgleich

Die Auswertung der Proteinlisten erfolgte in der hier vorliegenden Dissertation auf

drei verschiedene Weisen. Zu Beginn der Analysen von humanem Gewebe wurde ein

qualitativer Ansatz verfolgt. Im Anschluss an die massenspektrometrische Analyse wurden

alle identifizierten Proteine aus den Proben in einer separaten Liste zusammengefasst. An

die qualitative Auswertung schloss sich die manuell durchgeführte quantitative Auswertung

an. Ziel war es Proteine zu finden, die spezifische Bestandteile der Aggregatproben sowie der

Patientenkontrollen zu darstellten. Im Laufe der Arbeiten wurde die manuelle Auswertung

zu einer automatisierten quantitativen Strategie, basierend auf Spectral Index Calculation,

weiterentwickelt. Die Spectral Index Calculation ermöglichte es, differentiell exprimierte

Proteine herauszufiltern. Die Spectral Index Calculation für MFM-Proben wurde von M.Sc.

Alexandra Maerkens im Rahmen ihrer Masterarbeit etabliert und optimiert. Die optimierte

Auswertung wurde zur Auswertung der Analyse von Patientenkontrollen und


68

Negativkontrollen angewendet. Für den Datenbankabgleich wurden die in Punkt 3.15.2.

beschriebenen Parameter angewendet.

3.17.1. Die pseudo-quantitative Auswertung

Die hier angewendeten Parameter beruhten auf Erfahrungswerten früherer Analysen

sowie aus selbstgewählten Kriterien zur Identifizierung spezifischer Proteine in

Proteinaggregaten. Die Auswertungen basierten wie vorne beschrieben auf der Analyse von

6 Filaminopathiepatienten und 6 Kontrollen. Die in ProteinScape 2.1. generierte Proteinliste

wurde in Excel überführt. Nach Erstellung der Proteinlisten wurde wie folgt vorgegangen, um

spezifische Proteinkomponenten in den Aggregaten und dem umliegenden Gewebe der

Filaminopathiepatienten herauszufiltern. In einem ersten Schritt wurden jedem Protein die

durchschnittliche Anzahl an identifizierten Peptiden sowie der durchschnittliche

Mascot™Score zugeteilt. Es wurden nur Proteine akzeptiert, die mit mindestens 2 Peptiden

identifiziert werden konnten und gleichzeitig einen höheren Mascot™Score als 80 aufwiesen.

Innerhalb dieser Proteinliste wurden die Proteine hinsichtlich ihres Vorkommens in den

Patientenproben gruppiert. Jedes akzeptierte Protein wurde in mindestens 3 von 6 der

analysierten Proben identifiziert.

3.17.2. Spectral Index Calculation

Die Auswertung mittels Spectral Index Calculation basiert auf der Summierung aller

MS/MS-Spektren, die für ein Peptid in der massenspektrometrischen Analyse generiert

wurden [Müller et al. 2011. Der daraus resultierende Wert wird als Compound bezeichnet. In

der Datenbanksuche wurden die Peptide den entsprechenden Proteinen zugeordnet. Die

Spectral Peptide Counts (PC) drückten aus, wie viele Peptide bzw. MSM/MS-Spektren einem

Protein zugeordnet wurden. Für die Bildung des Spectral Index wurde zunächst der

Mittelwert (MW) der gesamten Spectral Peptidecounts (SP) aller Proben (Gleichung 1)

gebildet. In einem nächsten Schritt wurde der Ausgleichsfaktor (AF) gebildet. Hierzu wurde

der Quotient aus der Summe der SPs der jeweiligen Probe und dem Mittelwert der

gesamten SPs aus allen Proben errechnet. So wurden die SPs der einzelnen Proteine in jeder

Probe über die Gesamtanzahl der SPs in allen Proben normalisiert (Gleichung 2).

Die Berechnung des Spectral Index (SI) erfolgte für jedes einzelne Protein in jeder


69

Probe, indem der Quotient aus der nicht normalisierten Anzahl der Spectral Peptidecounts

eines Proteins und dem Ausgleichsfaktor gebildet wurde (Gleichung 3). Die Spectral Indices

dienten als Grundlage für die Identifizierung differentiell exprimierter Proteine in den

einzelnen Proben. Hierfür wurde die sogenannte Ratio (Verhältnis) gebildet. Die Ratio

beschrieb das Verhältnis für ein Protein zwischen den zu vergleichenden Proben. Die Ratio

wurde wie folgt berechnet: Es wurde der Mittelwert der Spectral Indices für ein einzelnes

Protein für alle Aggregat- und Patientenproben gebildet. Aus den gebildeten Mittelwerten

wurde dann für jedes einzelne Protein das Verhältnis Aggregatprobe zu Patientenkontrolle

(4a) und Patientenprobe zu Negativkontrolle gebildet (4b).

In allen Vergleichen wurden Proteine als differentiell exprimiert eingestuft, wenn für diese

ein mindestens 1,8fach (p-Wert ≤ 0.05 im Zweistichproben-t-Test) höherer Spectral Index im

erkrankten Gewebe im Verhältnis zu gesunden Kontrollen berechnet werden konnten.

Proteine, die eine Ratio von > 1,8 aufwiesen, wurden als akkumuliert im

(4b)

m = Anzahl der Proben in der Analyse PK = Patientenkontrolle NK = Negativkontrolle

(3)

m = Anzahl der Proben in der Analyse n = Anzahl Proteine innerhalb einer Probe Pc = peptidecounts

(2)

(1) m = Anzahl der Proben in der Analyse n = Anzahl Proteine innerhalb einer Probe Pc = peptidecounts

m = Anzahl der Proben in der Analyse n = Anzahl Proteine innerhalb einer Probe Pc = peptidecounts

m = Anzahl der Proben in der Analyse AG = Aggregatprobe PK = Patientenkontrolle

(4a)


70

Filaminopathiegewebe angesehen. Eine Ratio von ≤ 0,55 ließ auf eine verminderte

Expression der Proteine in den Filaminopathieproben schließen. Alle Werte wurden mittels

implementierten Zweistichproben-t-Test auf ihre statistische Signifikanz überprüft. Das

Signifikanzniveau wurde auf 5 % (p ≤ 0,05) festgelegt.

3.18. Western Blot

Für immunologische Nachweise wurden Mini 2D Blots angefertigt. Es wurden

Muskellysate von Filaminopathiepatienten sowie von gesundem Gewebe hergestellt. Die

Proteinmenge wurde mittels Bio-Rad Protein Assay nach Bradford bestimmt (beschrieben

unter Punkt 3.6.). Die Auftrennung der Proteine in der ersten Dimension erfolgte nach der

Methode von Klose [Klose 1975]. Die Vorgehensweise und die verwendeten Puffer bzw.

Lösungen zur isoelektrischen Fokussierung wurde in den Punkten 3.12.1. und 3.12.2.

beschrieben. Der Elektrotransfer der Proteine aus der Gelmatrix auf die Nitrocellulose-

Membran erfolgte mittels Semi-Dry-Blotting unter der Verwendung eines

diskontinuierlichen Puffersystems. Der Elektrotransfer erfolgte über 1h bei einer

Stromstärke von 2 mA/ cm2. Nach Beendigung des Elektrotransfers wurde die Membran in

Blocking Puffer für 2h bei RT und Schütteln inkubiert und anschließend mit Primäranitkörper

in TBS-T 5 % BSA inkubiert. Als Primärantikörper wurden PhosphoSerin und Desmin

verwendet. Die Antikörper wurden in einer 1: 500 Verdünnung verwendet und über Nacht

bei 4°C auf die Membran gegeben. Im Anschluss an die Primärantikörper-Inkubation wurde

die Membran 3x 10 min mit TBS gewaschen und dann mit Sekundärantikörper 2h inkubiert.

Als Sekundärantikörper wurden Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Sekundäranti-

körper in einer Verdünnung von 1: 15000 in TBS (LI-COR Biosciences, Bad Homburg,

Deutschland) verwendet, die mit einen Infrarot-Fluoreszenz-Scanner (Odyssey™, LI-COR

BioSciences, Bad Homburg, Deutschland) detektiert wurden.


71

12 % Bis-Tris-Gele Konzentration Substanz 2,5 M Bis-Tris (BT)-Puffer 7fach, pH 6,5 Menge Substanz 20 ml Acrylamid, 30 % Lösung 7,1 ml BT 7fach 50 µl APS (40 %) 10 µl TEMED Anodenpuffer Konzentration Substanz 300 mM Tris 100 mM Tricin pH 8,7 – 8,8 Kathodenpuffer Konzentration Substanz 300 mM Aminocapronsäure 30 mM Tris pH 8,6 – 8,7 Blocking Puffer Konzentration Substanz 50 ml TBS 5 % BSA 0,1 % Tween TBS-Tween-Puffer, pH 7,4 Menge Substanz 73 mM Kaliumchlorid 2,7 mM Natriumchlorid 25 mM Tris 0,1 % Tween 20

72

4. Ergebnisse

Die Analyse von Muskelgewebe aus 6 Filaminopathiepatienten mit 3 verschiedenen

Mutationen erfolgte durch die Etablierung der Lasermikrodissektion in Kombination mit 2

proteomischen Ansätzen: eine 2D DIGE-Studie und die Label-freie massenspektrometrische

Analyse. Durch den Vergleich der Proteinzusammensetzung der Aggregate mit

entsprechenden nicht betroffenen Muskelzellen desselben Filaminopathiepatienten sollten

Rückschlüsse auf die Proteinzusammensetzung in den Aggregaten gezogen werden.

Zusätzlich sollte der Vergleich von (noch) nicht betroffenem Muskelgewebe

(Patientenkontrollen) aus Filaminopathiepatienten mit gesundem Kontrollgewebe die Frage

klären, ob es möglich ist, spezifische Marker für das Frühstadium der Filaminiopathie zu

identifizieren. In bereits veröffentlichten Transfektionsstudien konnte gezeigt werden, dass

sich das Zellkulturmodell sehr gut zur Charakterisierung von Filamin C-Mutationen eignet

[Vorgerd et al. 2008, Duff et al. 2011]. Nun sollte gezeigt werden, ob die Proteomanalyse in

eine murine Myoblasten-Zelllinie übertragen werden kann. Hierfür wurde die Plasmid-DNA

der von Vorgerd et al. 2005 erstmalig beschriebenen Mutation p.W2710X in die murinen

Myoblasten transfiziert, um die Zusammensetzung der Proteinaggregate in den Zellen mit

der Zusammensetzung der humanen Aggregate zu vergleichen. Ziel war es zu klären, ob sich

das gewählte Zellkultursystem hinsichtlich der Aggregation als Modellsystem eignet.

Ergebnisse

73

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Protokolle zur Proteomanalyse von

Muskelgewebe entwickelt. In Voranalysen war es notwendig, folgende Parameter zu

optimieren:

Solubilisierung der Proteinaggregate

Optimierung der Größe der mikrodissektierten Fläche von humanem Muskelgewebe

für die Label-freie Proteomanalyse und für die 2D DIGE Studie

Optimierung der mikrodissektierten Fläche muriner Myoblasten für die

Proteomanalyse

4.1. Etablierung der LMD zur Label-freien Proteomanalyse

Mittels LMD war es möglich, die Filaminopathie-spezifischen Aggregate exakt aus

dem umliegenden Gewebe zu isolieren. Die Proben konnten schonend gewonnen werden,

so dass die Aggregate trotz geringen Vorkommens für nachfolgende Downstream-Analysen

genutzt werden konnten. Als Kontrolle dienten zum einen das umliegende, augenscheinlich

keine Aggregate enthaltende Gewebe desselben Patienten sowie das Gewebe gesunder

Kontrollen. Ziel war es, die proteomische Zusammensetzung der Proteinaggregate zu

entschlüsseln. In einem weiteren Schritt sollten proteomische Analyse von kultivierten

Maus-Myoblasten durchgeführt werden.

4.1.1. Darstellbarkeit der Aggregate

Im Vorfeld der Analysen wurde zunächst die Anzahl der Proteinaggregate pro

Filaminopathiepatient ermittelt. Hierfür wurden 10 µm dicke fluoreszenzgefärbte Schnitte

auf Glasobjektträger gebracht, die Dokumentation der Aggregate erfolgte mittels des LMD

6500 (Leica, Wetzlar, Deutschland). Die Zahl und Größe der Aggregate in den Patienten

variierte zum Teil stark. In einigen Patienten konnten zahlreiche (>20) große Aggregate

gefunden werden. In anderen Patienten belief sich die Zahl auf ca. 10 – 12 Aggregate pro

Schnitt. Für die LMD mussten die Gefrierschnitte auf spezielle Membranobjektträger

übertragen werden. Aufgrund der Beschaffenheit der Polyethylentetraphthalat (PET)-

Membran wurde das Färbeprotokoll angepasst. Die Inkubationszeiten der Antikörper wie

auch die Waschschritte wurden auf ein Minimum reduziert (unter Punkt 3.5. beschrieben).

Der größte Unterschied zwischen den beiden Protokollen lag jedoch darin, dass die Schnitte

Ergebnisse

74

auf den speziellen Membranobjektträgern nicht unter Deckgläschen eingedeckt werden

konnten. Dadurch verschlechterte sich die Darstellung des Gewebes und der Aggregate in

den Schnitten (Abb. 4.1. B und C). Die Struktur des Gewebes auf Glasobjektträgern mit

Deckgläschen (Abb. 4.1. A) ließ sich klarer und ohne Hintergrundfärbung darstellen. Die

Qualität der auf PET-Membran angefärbten Schnitte war im direkten Vergleich zu den

Glasobjektträgern schlechter (Abb. 4.1. B). Einige sehr kleine Aggregate waren im Gewebe

nicht wieder auffindbar. Dennoch konnte der Großteil an Aggregaten eindeutig im Gewebe

identifiziert werden (Abb. 4.1. C). Pro Schnitt belief sich die Zahl der Aggregate auf

durchschnittlich 10-12 Aggregate in jedem Patienten.

Abbildung 4.1.: Darstellung des Muskelgewebe aus Glasobjektträger und PET-Membran

In Abbildung A ist der Muskelschnitt (10 µm) eines Filaminopathiepatienten auf einem

Glasobjektträger dargestellt. Das Gewebe erscheint in seinen Strukturen sehr viel klarer und mit

weniger Hintergrund. Auf PET-Membran (B) erscheinen die Zellgrenzen nicht mehr so klar definierbar.

Trotz der verminderten Darstellbarkeit des Gewebes auf PET-Membran sind durchschnittlich 10-12

Aggregate pro Schnitt in jedem Patienten eindeutig zu identifizieren (C).

4.1.2. Solubilisierung der Aggregate

Im Vorfeld der Aggregatanalysen wurden Versuche durchgeführt, um optimale

Voraussetzungen zur Lösung der Aggregate festzulegen. Hierfür wurden 10 µm dicke

Serienschnitte von Filaminopathiegewebe hergestellt. Zur Visualisierung der Aggregate

wurden die Schnitte mittels Immunfluoreszenz (Myotilin-AK) angefärbt. Zur Solubilisierung

der Aggregate wurden folgende Lösungsmittel bzw. Puffer ausgetestet: 8M Urea, 6M

Guanidin-HCl (GuHCl) und 98% Ameisensäure. 250 Aggregate wurden aus dem

Filaminopathiegewebe mikrodissektiert, in 20 µl der verschiedenen Lösungen aufgenommen

Ergebnisse

75

und anschließend mittels nanoLC-MS/MS analysiert. Eine Zusammenfassung der

massenspektrometrischen Analyse ist in Tabelle 4.1. dargestellt.

Die Analyse der in GuHCl gelösten Aggregate ergab keine Ergebnisse. In der

massenspektrometrischen Messung konnten keine Spektren aufgenommen werden. In den

Proben konnten somit keine Proteine identifiziert werden. Das Lösen der Aggregate in 8M

Urea ermöglichte die Identifizierung von insgesamt 16 Proteinen. Filamin C wurde dabei

eindeutig identifiziert. Ebenfalls unter den identifizierten Proteinen befanden sich 2

bekannte MFM-Proteine: Desmin und dessen Interaktionspartner Alpha-B-Crystallin

[Goldfarb et al. 2008]. Zusätzlich konnten verschiedene Isoformen von Myosin, einem

wichtigen Motorprotein in der Muskelkontraktion, detektiert werden. Das beste Ergebnis

ergab die Solubilisierung der Aggregate mit 98% Ameisensäure. Insgesamt wurden 40

Proteine identifiziert, darunter erneut Filamin C, das Z-Banden assoziierte Protein Desmin

und dessen Interaktionspartner Alpha-B-Crystallin. Xirp2, ein Interaktionspartner von Filamin

C [Kley et al. 2012] konnte zusätzlich identifiziert werde. Des Weiteren wurden Troponin und

Myosin-Isoformen sowie Strukturproteine wie Vimentin und Nebulin detektiert.

Fazit dieses ersten Vorversuchs war, dass durch Solubilisierung der Aggregate in

Ameisensäure mehr Proteine identifiziert wurden als mit Urea. Im Vergleich von 8M Urea

und 98% Ameisensäure konnte beobachtet werden, dass mit Ameisensäure 80 % aller mit

Urea identifizierten Proteinen nachgewiesen werden konnten. Generell ist zu sagen, dass es

mit Hilfe der angewendeten Methode möglich ist, wichtige Muskelproteine und MFM-

assoziierte Proteine zu identifizieren.

Ergebnisse

76

Tabelle 4.1.: Zusammenfassung des Vergleichs von 3 verschiedenen Lösungsmitteln zur Solubilisierung von 250

Aggregaten

Es wurden jeweils 250 Aggregate aus Filaminopathiegewebe isoliert. Die Proben wurden dann in

jeweils 20 µl 6M GuHCl, 8M Urea oder 98% Ameisensäure inkubiert. Anschließend wurden die Proben

mittels In-Lösung-Verdau für die massenspektrometrische Analyse vorbereitet. Die Messung der

Proben erfolgte auf einer Orbitrap. Mit GuHCl konnten keine Proteine identifizierte werden. Das Lösen

der Aggregate in 8M Urea ermöglichte die Identifizierung von insgesamt 16 Proteinen. Die meisten

Proteine konnten nach der Inkubation der Aggregate in Ameisensäure identifiziert werden.

Lösungsmittel/ Puffer Anzahl identifizierte Proteine Auswahl an identifizierten Proteinen

Guanidin-HCl (GUHCl) - -

8M Urea 16 u.a. Filamin C, Desmin, Alpha-B-

Crystallin, Myosin

98% Ameisensäure 40

u.a. Filamin C, Desmin, Alpha-B-

Crystallin, Xirp2, Myosin, Vimentin,

Troponin, Nebulin

Ergänzend zu den hier beschriebenen Ergebnissen wurden parallel 250 Aggregate

und zusätzlich eine geringere Menge an Aggregaten (100 Aggregate) aus

fluoreszenzgefärbten Schnitten gelöst in 1fach LDS-Puffer, auf ein 1D-Gel aufgetragen und

aufgetrennt. Die Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und die Proteine in den

Gelstücken tryptisch verdaut. Nach Extraktion der Peptide aus dem Gel wurden die Proben

auf der Orbitrap gemessen. In 100 Aggregaten konnten insgesamt 33 Proteine und in 250

Aggregaten 7 Proteine identifiziert werden.

Ergebnisse

77

Tabelle 4.2.: Zusammenfassung der Analyse von 100 und 250 mikrodissektierten Aggregaten, 1D Gel

In diesem Versuch wurden 100 und 250 mikrodissektierte Aggregate aus fluoreszenzgefärbten

Schnitten isoliert, in 30 µl 1fach LDS-Puffer aufgenommen und nach Auftrennung über die SDS PAGE

anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert. In 100 Aggregaten konnten 33 Proteine

identifiziert werden und in 250 Aggregaten nur 7 Proteine. Der Vergleich zeigt, dass deutlich mehr

Proteine identifiziert werden, wenn die Aggregate in 40 µl Ameisensäure gelöst werden.

Anzahl isolierte Aggregate

Puffer (30 µl)

Anzahl identifizierte

Proteine

Auswahl an identifizierten Proteinen

100 1fach LDS-

Puffer 33

u.a. Filamin C, Desmin, Alpha-B-Crystallin, Xirp2,

Myosin, Vimentin, Troponin, Nebulin, , Obscurin,

250 1fach LDS-

Puffer 7 Filamin C, Desmin

Bei der Bewertung der Ergebnisse stand die Anzahl der identifizierten Proteine im

Vordergrund. Beim näheren Betrachten der Proteinlisten war es wichtig, den Großteil der

identifizierten Proteine in einen bereits bekannten oder neuen Kontext mit

Skelettmuskulatur einordnen zu können. Ziel war es, einen Überblick über das Potential der

Methode und des jeweiligen Lösungsmittels zu gewinnen. Die genauere Betrachtung der

Proteinlisten unter Berücksichtigung strenger technischer Parameter wurde im Laufe der

eigentlichen Aggregatstudien durchgeführt.

4.1.3. Optimierung der Anzahl von Aggregaten

Für die Ermittlung des optimalen Lösungsmittels wurden 250 Aggregate aus

Filaminopathiegewebe ausgelasert. Um zu testen, ob sich auch eine geringere Menge für die

Analysen eignet, wurden aus fluoreszenzgefärbten Kryoschnitten jeweils 50 und 100

Aggregate aus dem Gewebe isoliert. Erneut wurden die Aggregate in den 3 bereits

erwähnten Lösungsmitteln aufgenommen. 50 mikrodissektierte Aggregate erwiesen sich bei

der Auswertung der massenspektrometrischen Daten als eine zu geringe Probenmenge.

Unter der Verwendung von Ameisensäure konnten lediglich 8 Proteine identifiziert werden,

darunter keine MFM-assoziierten Proteine. In den Proben, die in GuHCl und Urea

aufgenommen wurden, konnten keine Proteine identifiziert werden. Die Analyse von 100

Ergebnisse

78

Aggregaten führte nach Solubilisierung in Urea zu einem Verlust von

Proteinenidentifikationen, es konnten nur noch 10 Proteine identifiziert werden. Die in

Ameisensäure analysierten Proben wiesen eine Gesamtzahl von 119 Proteinen auf. Es

konnten diverse MFM-relevante Proteine identifiziert werden, u.a. Filamin C, Desmin, die

Interaktionspartner Alpha-B-Crystallin und Plectin [Reipert et al. 1999], Myotilin. Ein

weiteres wichtiges Ergebnis war, dass 99% aller in den 250 Aggregaten identifizierten

Proteine auch in den 100 Aggregaten detektiert werden konnten. Hinzu kam die

Identifizierung vieler zusätzlicher muskelspezifischer Proteine.

Tabelle 4.3: Zusammenfassung der Analyse von 50 und 100 mikrodissektierten Aggregaten

Für die Analyse wurden 50 und 100 Aggregate aus Filaminopathiegewebe mittels Laser ausgeschnitten

und in je 20 µl 6M GuHCl, 8M Urea oder 98% Ameisensäure inkubiert. Nach anschließendem In-

Lösung-Verdau wurden die Proben auf der Orbitrap analysiert. Die Verringerung der Aggregate zeigte

lediglich bei der Verwendung der Ameisensäure ein positives Ergebnis, die Zahl der identifizierten

Proteine konnte auf 119 gesteigert werden. Die Zahl der identifizierten Proteine nach Lösen in Urea

verringerte sich auf 10, mit GuHCl wurden erneut keine Proteine identifiziert. Die Mikrodissektion von

100 Aggregaten, aufgenommen in 20 µl Ameisensäure schien optimal zum Lösen der Aggregate zu

sein.

Anzahl isolierte Aggregate

Lösungsmittel/Puffer (20 µl)


Proteine


100

Guanidin-HCl (GuHCl) - -

8M Urea 10 Filamin C, Desmin, Myosin

98% Ameisensäure 119

u.a. Filamin C, Desmin, Alpha-B-

Crystallin, Xirp2, Myosin, Vimentin,

Troponin, Nebulin, NRAP, BAG3,

Obscurin, Nebulin, Nestin

50

Guanidin-HCl (GuHCl) - -

8M Urea - -

98% Ameisensäure 8 Keine relevanten MFM- oder

Muskelproteine identifiziert

Ergebnisse

79

Auffällig war, dass in der ersten Versuchsreihe in 250 Aggregaten 40 Proteine

identifiziert werden konnten und in 100 Aggregaten die Zahl um das Dreifache gesteigert

werden konnte. Um die unerwartete Steigerung der Zahl der identifizierten Proteine zu

überprüfen, wurden in einer 3. Versuchsreihe im direkten Vergleich 100 und 250 Aggregaten

gegenüber gestellt. Die Aggregatproben wurden in jeweils 20 µl und 40 µl Ameisensäure

aufgenommen. Dies sollte zeigen, ob das Volumen der Ameisensäure die Zahl der

identifizierten Proteine nachhaltig beeinflusst. Das Ergebnis des Vergleichs ist in Tabelle 4.4.

dargestellt. Erneut wurden unter der Verwendung von 20 µl Ameisensäure in 250

Aggregaten deutlich weniger Proteine identifiziert als in 100 Aggregaten. Das Solubilisieren

der Aggregate in 40 µl zeigte ein sehr homogenes Ergebnis, die Zahl der identifizierten

Proteine unterschied sich nur gering von 100 und 250 analysierten Aggregaten. Beide

Proteinlisten enthielten viele MFM-assoziierte Proteine.

Tabelle 4.4.: Zusammenfassung der Analyse von 100 und 250 mikrodissektierten Aggregaten

Um das optimale Volumen zum Solubilisieren der Aggregate zu ermitteln, wurden in dieser

Versuchsreihe 100 bzw. 250 Aggregate in 20 bzw. 40 µl Ameisensäure gelöst. Das Ergebnis zeigte keine

deutlichen Unterschiede in der Anzahl der identifizierten Proteine. Deutlich wurde hingegen, dass das

höhere Volumen an Ameisensäure die Solubilisierung der Aggregate fördert.

Anzahl isolierte Aggregate Lösungsmittel/Puffer


Proteine


250

20 µl 98% Ameisensäure 51 u.a. Filamin C, Desmin, Alpha-

Crystallin, Xirp2, Xirp1, Myotilin,

Myosin, Myomesin, Vimentin,

Troponin, Nebulin, NRAP, BAG3,

Obscurin, Nebulin, Nestin, diverse

Hitzeschockproteine

40 µl 98% Ameisensäure 157

100

20 µl 98 %Ameisensäure 127

40 µl 98% Ameisensäure 138

Im Zuge der hier durchgeführten Vorversuche wurden 3 verschiedene Lösungsmittel

(8M Urea, 6M Gu-HCl und 98% Ameisensäure) zur Solubilisierung der Aggregate verwendet.

Zusätzlich wurden die Aggregate in 1fach LDS-Puffer aufgenommen und mittels 1D-Gel

aufgetrennt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Filaminopathie-spezifischen Aggregate

am effektivsten in 98% Ameisensäure solubilisieren ließen. Die In-Gel basierte Analyse des

Ergebnisse

80

mikrodissektierten Materials erwies sich im Vergleich zur Solubilisierung in Ameisensäure als

wenig erfolgreich, da sie mit hohen Verlusten an Proteinidentifizierungen einhergeht. In 100

Aggregaten konnten ca. 70% und in 250 Aggregaten ca. 95% weniger Proteine identifiziert

werden. Aufgrund der in dieser Arbeit durchgeführten Versuchsreihen und der daraus

resultierenden Ergebnisse lässt sich zusammenfassen, dass die Solubilisierung von 100

Aggregaten in 40 µl Ameisensäure in Bezug auf die anschließende massenspektrometrische

Analyse die besten Ergebnisse erzielte und zusätzlich einen sehr detaillierten Einblick in das

Proteom von Filaminopathie-Aggregaten gewährte. Da die Größe der Aggregate innerhalb

des Patientengewebes und auch zwischen den Patienten zum Teil enorm variierte, wurde

mit Hilfe des LMD 6500 (Leica, Wetzlar, Deutschland) die durschnittschliche Fläche von 100

Aggregaten ermittelt, diese betrug 250000 µm2. Für alle weiteren Analysen wurde diese

Fläche eingesetzt.

4.2. Ergebnisse der Label-freien Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe

Zu Beginn dieser Dissertation waren lediglich vereinzelte Bestandteile der

Filaminopathie-spezifischen Proteinaggregate bekannt. Mittels Immunfluoreszenzstudien

konnten u.a. Filamin C, Desmin, Myotilin und Xin als feste Komponenten der Aggregate

charakterisiert werden [Kley et al. 2007]. Um einen detaillierteren Einblick in die

Zusammensetzung der Aggregate in Filaminopathien zu erlangen, wurde eine Fläche von 250

000 µm2 aus 6 Filaminopathiepatienten sowie aus 6 gesunden Kontrollen mittels LMD

isoliert. Aus dem Filaminopathiegewebe wurden einmal die spezifischen Proteinaggregate

(Aggregatproben) und einmal Muskelzellen ohne Aggregate (Patientenkontrolle, PatKO)

gesammelt, als Kontrolle dienten gesunde Muskelfasern (Negativkontrolle, NegKO). Alle

Proben wurden in Ameisensäure aufgenommen. Anschließend wurden die Proben mittels

Label-freier Proteomanalyse analysiert, die Kriterien zur Datenbanksuche sind unter Punkt

3.16.3. beschrieben.

Ergebnisse

81

4.2.1. Entwicklung einer geeigneten Auswertestrategie

Im Anschluss an die Datenbanksuche wurden die identifizierten Proteine in einer

Proteinliste zusammengefasst. Das Erstellen der Proteinlisten ermöglichte einen ersten,

qualitativen Eindruck von der Zusammensetzung der Proteinaggregate sowie des

umliegenden Gewebes und der Negativkontrollen. In den Aggregatproben konnten

durchschnittlich 415 Proteine identifiziert werden. In den zugehörigen Patienten- und

Negativkontrollen wurden 335 bzw. 324 Proteine identifiziert. In allen Proben wurden

diverse MFM-spezifische Proteine wie Filamin C, Desmin, BAG 3, Xin, Myotilin und N-Rap

identifiziert werden. Zusätzlich befanden sich zahlreiche Strukturproteine (z.B. Aktin,

Myosin) und Hitzeschockproteine in den generierten Proteinlisten. Im Vergleich zu den

Vorversuchen zum Optimieren der Parameter konnten in den Analysen deutlich mehr

Proteine analysiert werden. Dies lässt sich mit einem zwischenzeitlichen Umbau am

Orbitrap-Massenspektrometer und der daraus resultierenden höheren Sensitivität erklären.

Neben einer allgemeinen Charakterisierung der Zusammensetzung war ein quantitativer

Vergleich der verschiedenen Proben von großem Interesse. Hierfür wurden die Proteinlisten

der Aggregatproben mit denen der Patientenkontrollen sowie die der Patientenkontrollen

mit denen der Negativkontrollen verglichen. Ziel der hier durchgeführten Vergleiche war es,

spezifische Bestandteile der Filaminopathie-spezifischen Aggregate und des umliegenden

Gewebes zu charakterisieren. Hierfür war es wichtig, eine quantitative Auswertestrategie zu

entwickeln. Zu Beginn der Analysen konnte auf keine automatisierte Methode zur

quantitativen Auswertung zurückgegriffen werden. Aus diesem Grund wurden in einem

ersten Versuch die vorliegenden Daten mit Hilfe einer manuellen Strategie quantitativ

ausgewertet. Neben den unter Punkt 3.16.3. beschriebenen Parametern zur

Datenbanksuche wurden strenge, eigens gewählte technische Parameter herangezogen

(beschrieben unter Punkt 3.17.1.). Das Ansetzen der technischen Parameter diente der

Vorsortierung der Proteine. Zusätzlich wurden nur Proteine in die finale Proteinliste

aufgenommen, die ausschließlich in den Aggregaten bzw. im umliegenden

Filaminopathiegewebe und in keiner Kontrolle identifiziert wurden. Mittels dieses Kriteriums

sollten Rückschlüsse auf spezifische Bestandteile des erkrankten Gewebes gezogen werden.

Ergebnisse

82

4.2.1.1. Vergleichende Analyse Aggregatproben - Patientenkontrolle

Die Daten der Aggregatproben sowie die Daten der Patientenkontrollen wurden

zunächst in unabhängigen Excel-Tabellen zusammengefasst. Alle Proteine wurden

hinsichtlich ihres durchschnittlichen maximalen MascotScores sortiert. Alle Proteine mit

einem MascotScore über 50 wurden berücksichtigt. Als nächstes wurden diese Proteine nach

der Häufigkeit ihres Vorkommens in den Patienten sortiert. Es wurden die Proteine in der

Liste belassen, die in mindestens 3 von 6 Patienten zu identifizieren waren. Der

Datenbankabgleich der Aggregatproben ergab eine Gesamtzahl an 687 identifizierten

Proteinen. Nach Ansetzen der technischen Parameter verblieben 255 Proteine in der Liste.

Es Konnten 12 MFM-assoziierte Proteine identifiziert werden, u.a. Filamin C, Desmin, Plectin,

Obscurin, FHL1, Myotilin, BAG3, NRAP und Titin. Zusätzlich war es möglich diverse Motor-

und Strukturproteine des Skelettmuskels (z.B. Desmin, Myosin, Aktin, Tropomyosin),

Bindungspartner der Strukturproteine sowie ihre Isoformen zu detektierten. Die Analyse der

Patientenkontrollen zeigte ein vergleichbares Abbild des Proteoms. Die Zahl der

identifizierten Proteine belief sich auf 634, nach Sortieren der Proteine blieben 165 Proteine

erhalten. Auch hier wurden typische MFM-assoziierte Proteine und Strukturproteine des

Skelettmuskels identifiziert.

An die individuelle Analyse der beiden Probensätze schloss sich der Vergleich an. Die

Proteinlisten der Aggregatproben wurden den Daten der Patientenkontrollen (PatKO)

gegenübergestellt. In dieser finalen Proteinliste wurden nur die Proteine akzeptiert, die in

mindestens 3 der 6 Aggregatproben von Filaminopathiepatienten auftauchten und

gleichzeitig in keiner Patientenkontrolle. Mittels dieses Kriteriums sollten Rückschlüsse auf

spezifisch in den Aggregaten akkumulierte Proteine gezogen werden. Die Proteinlisten der

beiden Gruppen wurden zusammengefügt und alle doppelt identifizierten Proteine gelöscht.

Daraufhin wurden insgesamt 394 Proteine in den Vergleich miteinbezogen. 179 dieser

Proteine konnten ausschließlich den Aggregatproben zugeordnet werden, von diesen

wurden 111 in mindestens 3 der Patienten identifiziert. 202 Proteine wurden in beiden

Proben gefunden und 13 Proteine traten lediglich in den Patientenkontrollen auf. In Tabelle

4.5. sind alle Proteine aufgeführt, die als spezifische Charakteristika für Filaminopathien

gewertet werden könnten. Einige MFM-assoziierte Proteine konnten als spezifische

Bestandteile der Aggregate detektiert werden, darunter u.a. Xirp2, BAG3 und FHL1.

Ergebnisse

83

Zusätzlich konnten zahlreiche Muskel-spezifische Proteine (u.a. Myosin, Dystrohpin, Nexilin,

Tropomodulin), verschiedene Hitzeschockproteine (Hsp 3,6,7, 90) und Membranproteine

identifiziert werden. Es fiel allerdings auf, dass Proteine wie z.B. Filamin C, Desmin, Titin,

Myosin, Obscurin und Myotilin in der Auswertung nicht berücksichtigt wurden. Diese

Proteine tauchten sowohl in den Aggregatproben als auch in den Patientenproben auf.

Tabelle 4.5.: Liste der als spezifisch für Filaminopathie identifizierten Proteine

Die Aggregatproben und die Patientenkontrollen wurden miteinander verglichen. Die Proteinliste

spiegelt alle Proteine wider, die zum einen in mindestens 3 von 6 Patienten und gleichzeitig nicht in den

Patientenkontrollen identifiziert wurden

Accession Nr. Protein Anzahl Proben MascotScore

P02768 Serumalbumin Precursor 6 237,9

Q2TBA0 Sarcosynapsin 6 211,1

Q0ZGT2 Nexilin 6 143,7

O14950 Myosin leichte regulatorische Kette 6 141,8

Q15836 Vesikel-assoziiertes Membranprotein 3 6 89,9

Q8IVN3 Embryonales Skelettmuskel-Kern Protein 1 6 84,4

Q00325 Phosphat Transportprotein, mitochondriale

Form 6 73,6

P56385 ATP5I, ATP Synthase Untereinheit E,

mitochondriale Form 6 72,2

O14950 Myosin leichte regulatorische Kette 6 141,8

Q15836 Vesikel-assoziiertes Membranprotein 3 6 89,9

A4UGR9 Xirp2 5 3606,7

P35580 Myosin 10 5 518,6

P05023 Natrium-Kalium-ATPase, Untereinheit Alpha 1 5 378,0

Q15124 Aciculin 5 348,7

P28074 Proteasom Untereinheit Beta Typ-5 5 317,9

Q86TC9 Myopalladin 5 210,7

P13591 Neurales Zelladhäsionsmolekül 1 5 196,1

Q5BKX8 Muskel-spezifisches coiled-coil Protein 5 182,2

Ergebnisse

84

P54289 Spannungs-abhängiger Calcium-Kanal,

Untereinheit Alpha-2/Delta-1 5 172,9

Q0D2I5 Intermediarfilament Familie Orphan 1 5 162,1

Q9H7C4 Syncoilin 5 155,1

O95817 BAG Familie molekularer Chaperone Regulator

3 5 137,4

Q92614 Myosin 18 5 136,7

P08238 HSPB 90 5 95,0

P28289 Tropomodulin 1 5 93,5

Q6P5Q4 Leiomodin 2 5 84,1

P28072 Proteasom beta-Untereinheit Typ-6 5 78,2

O00487 26S Proteasome nicht-ATPase regulatorische

Untereinheit 14 5 77,1

Q8TDC0 Myozenin 3 5 73,9

O14558 Hitzeschockprotein Beta 6 5 72,9

O14880 Mikrosomale Glutathione S-Transferase 3 5 67,4

P55290 Cadherin 13 Vorläufer 5 65,3

O43760 Synaptogyrin 2 5 65,1

P05026 Natrium-Kalium ATPase, Untereinheit Beta 1 5 63,6

Q9UNI1 Chymotrypsin-ähnliches Elastase

Familienmitglied

5 61,3

O95168 NADH Dehydrogenase 1 beta-Subkomplex

Untereinheit 4 5 60,3

Q9Y3D6 Mitochondriales Spaltungsprotein 1 5 55,8

P07585 Decorin 5 55,0

Q14764 Major Vault Protein 4 411,0

P01857 Ig gamma-1 Kette C Region –

4 291,3

Q9BQE3 Tubulin Alpha-1C-Kette 4 291,3

P11532 Dystrophin 4 270,4

Q9P0J0 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha

SubKomplex Untereinheit 13 4 270,4

Q9UDY4 DnaJ homolog Subfamilie B4 4 258,6

Q13501 Sequestosome 1 4 255,0

Ergebnisse

85

P62879 Guanine nucleotide-bindendes Protein

(I)/G(S)/G(T) beta 2 Untereinheit 4 255

P25686 DnaJ homolog Unterfamilien Mitglied 4 232,5

P62140 Serin/Threonine Protein Phosphatase PP-beta-

katalytische Untereinheit 4 232,5

Q9UBY9 Hitzschockprotein Beta 7 4 198,6

Q14204 Cytoplasmsatisches Dynein

4 188,9

P50225 Sulfotransferase 1A1 4 137,7

Q14BN4 Sarkolemmales Membran-assoziiertes Protein 4 137,5

Q9UQM7 Calcium/calmodulin-abhängige Protein Kinase

Typ II Alpha-Untereinheit 4 135,2

O95425 Supervillin 4 116

P35080 Profilin-2 4 90,7

P02461 Collagen Alpha-1(III) Kette Vorläufer 4 90,3

A6ZKI3 Protein FAM127A 4 86,2

O75955 Flotillin 1 4 84

Q13643 Four and a half LIM domains Protein 3 4 80,2

P01834 Ig kappa chain C region 4 79,8

P62424 60S ribosomes Protein L7a 4 79,2

Q9HCP6 Glycerol Aufnahme/Transporter homolog 4 78,4

P35232 Prohibitin 4 77,2

P98164 Geringe Dichte Lipoprotein Rezeptor

verwandtes Protein 2 4 76,8

Q0VAK6 Leiomodin-3 4 72,1

Q7Z7L7 Zyg-11 protein homolog - 4 72

Q14596 Next zu BRCA1 Gen 1 3 301,5

Q9P0L0 Vesikel-assoziiertes Membranprotein A 3 65,4

Q53FT3 Uncharakterisiertes Protein C11orf73 3 62,8

Q71UI9 Histone H2AV 3 58,6

P28070 Proteasome beta-Untereinheit Typ 4 Precursor

3 50,6

Q9Y371 SH3 domain GRB2-like Protein B1 3 82,1

Ergebnisse

86

Q8N5J2 FAM63A 3 79,8

P16930 Fumarylacetoacetase 3 79,8

Q13033 Striatin-3 3 79,5

Q9Y281 Cofilin-2 3 76,6

Q9BRX2 Protein pelota homolog 3 75,7

P60842 Eukaryotisches Initiationsfaktor 4A-I 3 72,3

P24298 Alanine Aminotransferase 1 3 71

P61019 Ras-related protein Rab-2A 3 70,8

Q96Q27 Ankyrin repeat und SOCS box Protein 2 3 70,6

Q9Y285 Phenylalanyl-tRNA synthetase Alpha-Kette 3 64,8

Q12988 HSPB3 3 60,8

O14818 Proteasome Alpha-Untereinheit Typ 7 3 59,6

Q53GQ0 Estradiol 17-beta-Dehydrogenase 12 3 59,4

Q92629 Delta-sarcoglycan 3 58,6

Q9BSH3 Nicolin 1 3 56,1

Q96AQ6 Prä-B-Zell leukemia transcriptionsfactor-

interacting Protein 1 3 55,4

Q8NAP3 Zinck-Finger und BTB domain-enthaltendes

Protein 38 3 55

O95197 Reticulon 3 3 54,9

P20774 Mimecan-Vorläufer 3 54

P11021 78 kDa Glucose-regulatorisches Protein

Vorläufer

3 51,9

Q7Z4W1 L-xylulose Reductase 3 51

Q00G26 Perilipin-5 3 50,4

Q0D2K2 Kelch-like Protein 30 3 50,1

Q04828 Aldo-keto reductase Familie 1 Mitglied C1 3 202,9

Q6UXN9 WD repeat-containing protein 82 3 185,9

Q86SG2 Ankyrin repeat Domain enthaltendes Protein

23 3 184,4

P11047 Laminin Gamma-1-Untereinheit 3 180,5

Ergebnisse

87

O75147 Obscurin-ähnliches Protein 1 Vorläufer 3 159

P17174 Aspartate aminotransferase, cytoplasmatische

Form 3 138,7

P08865 40S ribosomal Protein SA 3 136,4

Q02218 2-oxoglutarate Dehydrogenase E1 Komponente mitochondriale Form

3 128,4

Q96MF6 Protein COQ10 A, mitochondriale Form 3 117,4

P59780 AP-3 Komplex Sigma-2-Untereinheit 3 106

Q9UJW0 Dynactin Untereinheit 4 3 104,4

P27816 Microtubule-assoziiertes Protein 4 3 101,1

P60900 Proteasome Alpha-Untereinheit Typ 6 3 95,1

Q9H992 E3 ubiquitin-Protein ligase MARCH7 3 92,9

4.2.1.2. Vergleichende Analyse Patientenkontrolle – Negativkontrolle

Der Vergleich der Patientenkontrolle und der Negativkontrolle diente der

Identifizierung von Proteinen zur Charakterisierung von möglichen Frühstadien der

Filaminopathie. Für die Patientenkontrollen wurden Muskelfaserzellen aus Filaminopathie-

patienten mittels Lasermikrodissektion gesammelt, die augenscheinlich keine Aggregate

enthielten und somit innerhalb des Patienten möglicherweise das Frühstadium der

Erkrankung darstellten. Die Rohdaten der Negativkontrollen wurden wie die in Punkt

4.2.1.1. sortiert. 675 Proteine wurden insgesamt in der Gruppe der Negativkontrollen

identifiziert, nach Ansetzen der technischen Parameter verblieben 247 Proteine in der

finalen Proteinliste. Wie auch schon in den zuvor analysierten Proben konnten viele MFM-

spezifische wie auch muskelspezifische Proteine erfasst werden. Anschließend wurden die

Proteinlisten der Patienten- und Negativkontrollen zusammengefügt und hinsichtlich ihrer

Unterschiede untersucht. Nach Entfernung aller doppelt identifizierten Proteine gingen

insgesamt 280 Proteine in den Vergleich ein. 36 dieser Proteine wurden ausschließlich in den

Patientenkontrollen gefunden, davon aber nur 17 Proteine in mindestens der Hälfte aller

Proben. Der Großteil der identifizierten Proteine (176 Proteine) wurde in beiden Gruppen

identifiziert. 68 Proteine konnten nur den Negativkontrollen zugeordnet werden. In der

Ergebnisse

88

untenstehenden Tabelle 4.6. sind alle Proteine dargestellt, die ausschließlich in

Patientenkontrollen identifiziert wurden.

Tabelle 4.6.: Liste aller Proteine, die ausschließlich in den Patientenkontrollen identifiziert wurden

Für den Vergleich wurde umliegendes, aggregatfreies Gewebe aus Filaminopathiegewebe mit

Kontrollgewebe verglichen. In der Tabelle sind alle Proteine zusammengefasst, die in mindestens 3 von

6 Patienten und in keiner Negativkontrolle identifiziert wurden.

Accession Nr.

Protein Anzahl Proben MascotScore

P02545 Lamin-A/C 5 182,8

O95299 NADH dehydrogenase 1 Alpha SubKomplex

Untereinheit 10, mitochondrial Precursor 5 153,4

Q702N8 Xirp1-Xin actin-binding repeat-containing

protein 1 5 153,1

P40926 Malate Dehydrogenase, mitochondrial 5 103,6

O75923 Dysferlin 4 224,3

O75298 Reticulon 2 4 163,2

P08133 Annexin A6 4 152,6

Q86VF7 NRAP-Nebulin-related-anchoring protein 4 137,6

P00387 NADH-cytochrome b5 Reduktasee 3 4 115,6

Q13203 Myosin-binding protein H 4 96,5

P13535 Myosin 8 3 3753

P02452 Collagen alpha-1(I) Kette 3 144,8

P31040 Succinate Dehydrogenase [ubiquinone]

Flavoprotein Untereinheit, mitochondrial Precursor

3 139,3

P31151 Protein S100-A7 3 128,5

P14923 Junction plakoglobin 3 83,9

Q96P63 Serpin B12 2 98,6

P47929 Galectin 7 2 81,0

Mit Hilfe der hier angewandten manuellen Auswertestrategie zur Analyse von

Filaminopathiegewebe ist es gelungen, Proteine herauszufiltern, die spezifische

Komponenten der Aggregate sein könnten und mögliche Frühstadien der Erkrankung

Ergebnisse

89

charakterisieren könnten. Der größte Nachteil der hier beschriebenen Auswertestrategie lag

allerdings darin, dass in keiner analysierten Gewebegruppe Aussagen über die Abundanz der

Proteine innerhalb der Aggregate getroffen werden können. Die Wahl der technischen

Parameter ermöglichte es, die Auswahl an identifizierten Proteinen sinnvoll einzuschränken.

Dies gab aber keinerlei Auskunft über eine differentielle Expression von

Gewebekomponenten. Für die Entstehung der Filaminopathie wird es aber wichtig sein zu

sehen, welche Proteine angereichert, in ihrer Abundanz verringert oder abgebaut werden.

Aus diesem Grund war es wichtig, die manuell durchgeführte Strategie zur quantitativen

Auswertung hinsichtlich der quantitativen Aussagekraft weiter zu entwickeln, um eine

mögliche Regulation von Proteinen zu berücksichtigen. Im Rahmen einer bei uns

durchgeführten Masterarbeit von M.Sc. Alexandra Maerkens wurde eine automatisierte

Methode zur quantitativen Datenauswertung mittels Spectral Index Calculation entwickelt.

Die Spectral Index Calculation ist ein Label-freies Verfahren, basierend auf der Summierung

aller für ein Peptid aufgenommene MS/MS-Spektren. Im Rahmen dieses Projektes wurde

zwischen zwei Strategien unterschieden. Die allgemeine Auswertung bezog alle Peptide in

die Auswertung mit ein. Dies hatte allerdings den Nachteil, dass nicht-unique Peptide

mehreren Proteinen zugeordnet werden konnten. Somit war es nicht möglich, eindeutige

Aussagen zu der Zugehörigkeit eines Peptids zu einem Protein zu treffen. Daraus entwickelte

sich die zweite Strategie, die auf die Einbeziehung nur uniquer Peptiden abzielte. Unique

Proteine können eindeutig einem einzigen Protein zugeordnet werden. M.Sc. Alexandra

Maerkens optimierte die Spectral Index Calculation für unique Peptide im Zuge ihrer

Masterarbeit am Medizinischen Proteom-Center. Auf Grundlage der hier durchgeführten

massenspektrometrischen Analysen von mikrodissektierten Aggregaten aus 6

Filaminopathiepatienten führte sie die automatisierte Datenauswertung durch. Im Vergleich

zu meiner durchgeführten manuellen Auswertung war es mittels Spectral Index Calculation

möglich, differentiell exprimierte Proteine in den Aggregatproben zu detektieren. Hierfür

wurden zunächst innerhalb der Aggregatproben bzw. der Patientenkontrollen die Summen

aller Peptidcounts gebildet. Oft konnten deutliche Unterschiede der Summen innerhalb der

Gruppen beobachtet werden. Die Unterschiede entstanden aufgrund der Beschaffenheit

und Eigenschaften der Proben, Ungleichmäßigkeiten in der Probensammlung und in der

massenspektrometrischen Analyse. Um diese Unterschiede auszugleichen erfolgte eine

Ergebnisse

90

Normalisierung über die Gesamtzahl der Spectral Peptidcounts und dem Ausgleichsfaktor

(beschrieben unter 3.17.2.). Für die Berechnung der differentiell exprimierten Proteine

wurden zunächst die Spectral Indices berechnet und anschließend der durchschnittliche

Spectral Index für jedes einzelne Protein gebildet. Die Ratio beschrieb das Verhältnis

zwischen identifizierten Proteinen in Aggregaten und Patientenkontrollen. Ab einer Ratio

von ≥ 1,8 und einem p-Wert ≤ 0,05 wurden Proteine als höher abundant in den Aggregaten

bezeichnet, bei einer Ratio von ≤ 0,55 (p-Wert von ≤ 0,05) als geringer exprimiert im

Vergleich zu den Patientenkontrollen. Insgesamt konnten 69 Proteine als signifikant

hochreguliert identifiziert werden. Filamin C wies den höchsten durchschnittlichen Spectral

Index (SI) auf und stellte somit das am stärksten akkumulierte Protein in den Aggregaten dar.

Auf den nachfolgenden Rängen erschienen Desmin, Xirp2 und N-RAP. Die vollständigen

Proteinlisten sind im Anhang in den Tabellen 13.1. und 13.2. dargestellt.

Im Zuge der neu entwickelten automatisierten quantitativen Auswertung wurden die

generierten Daten der Patientenkontrollen und Negativkontrollen im Rahmen dieser

Dissertation neu ausgewertet. Der Vergleich von Patientenkontrollen und Negativkontrollen

wurde unter denselben Kriterien durchgeführt wie oben beschrieben. Insgesamt konnten 9

Proteine identifiziert werden, die in den Patientenkontrollen höher abundant sind als in den

Negativkontrollen (Tabellen 4.7, 4.8.). Unter den höher abundanten Proteinen befinden sich

2 Muskel-spezifische Proteine (LM 3 und Obscurin). Bei den anderen Proteinen handelt es

sich vorzugsweise um Enzyme und Bestandteile der Genexpression. Als niedrig abundante

Proteine in Patientenkontrollen wurden hauptsächlich Muskel-spezifische Proteine (u.a.

Aktin, Myosin, Myozenin, Troponin) identifiziert. Dies lässt vermuten, dass in Frühstadien

der Erkrankung vorzugsweise strukturgegebene Komponenten im Muskel zerstört werden.

Tabelle 4.7.: Liste der in Patientenkontrollen höher abundanten Proteine

Zusammenfassung der Proteine, die über Spectral Index Calculation als differentiell exprimiert in den

Patientenkontrollen identifiziert wurden. Die dargestellten Proteine weisen eine Ratio ≥ 1,8 mit einem

p-Wert ≤ 0,05 auf und gelten somit als höher abundant im Vergleich zu den Negativkontrollen. Für die

Patientenkontrollen (PatKO) wie auch die Negativkontrollen (NegKO) wurde für jedes einzelne Protein

der durchschnittliche Spectral Index (SI) aufgeführt. Die Liste wurde nach absteigendem SI in den

Patientenproben sortiert.

Ergebnisse

91

Accession Protein PatKO (SI) NegKO (SI) Ratio p-Wert

O75112 LIM Domain-bindendes

Protein 3

11,7 6,1 1,9 0,0003

Q5VST9 Obscurin OS 9,7 4,4 2,2 0,02

P12111 Collagen alpha-3(VI) Kette 3,9 0,9 4,6 0,03

P12235 ADP/ATP Translocase 1 3,6 1,9 1,8 0,01

P23396 40S Ribosomales Protein S3 3,4 0,7 4,8 0,01

P33121 Langkettige Fettsäure CoA

Ligase 1

2,6 1,1 2,3 0,01

P10606 Cytochrome c oxidase

Untereinheit 5B,

mitochondrialer Precursor

2,1 0,6 3,7 0,03

P30049 ATP Synthase delta Kette,


2,0 1,0 2,0 0,02

P24310 Cytochrome c oxidase

Polypeptide VIIa-Herz,


1,6 0,4 3,8 0,02

Tabelle 4.8.: Zusammenfassung aller gering abundanter Proteine in Patientenkontrollen

Die Liste stellt die Proteine dar, die über Spectral Index Calculation als differentiell exprimiert in den

Patientenkontrollen identifiziert wurden. Insgesamt wurden 16 Proteine als geringer abundant in den

Patientenkontrollen im Vergleich zu den Negativkontrollen identifiziert. Die dargestellten Proteine

weisen eine Ratio ˂ 0,55 mit einem p-Wert ≤ 0,05 auf. Die Proteine sind weniger abundant in den

Patientenkontrollen im Vergleich zu den Negativkontrollen. Für die Patientenkontrollen (PatKO) wie

auch die Negativkontrollen (NegKO) wurde für jedes einzelne Protein der durchschnittliche Spectral

Index (SI) aufgeführt. Die Liste wurde nach absteigendem SI in den Patientenproben sortiert.

Accession Protein PatKO (SI) NegKO (SI) Ratio p-Wert

P68133 Actin, Alpha Skelettmuskel 18,4 55,7 0,3 0,0006

P12882 Myosin 1 14,7 65,1 0,2 0,02

P48788 Troponin I, schneller

Skelettmuskel

5,6 15,2 0,4 0,04

Ergebnisse

92

Q9NP98 Myozenin 1 5,0 13,4 0,4 0,002

P11217 Glycogen Phosphorylase,

Muskelform

3,6 11,5 0,3 0,005

Q08043 Alpha-actinin 3 2,7 13,8 0,2 0,04

Q9P2D7 Dynein schwere Kette 1,

axonemale Form

0,9 2,7 0,3 0,01

O15273 Telethonin 0,2 1,1 0,2 0,02

P07451 Carbonic Anhydrase 3 0,2 0,9 0,2 0,005

Q9NQC3 Reticulon 4 0,2 1,9 0,1 0,0004

P24539 ATP synthase Untereinheit b,

mitochondrial

0 1,1 0 0,0001

Q96T58 Msx2-interagierendes Protein 0 1,3 0 0,01

P54289 VDCC Untereinheit alpha-

2/delta-1

0 0,7 0 0,02

A2RUB1 Uncharakterisiertes Protein

C17orf104

0 0,4 0 0,05

O14558 HSPB6 0 0,4 0 0,05

P60174 Triosephosphate Isomerase 0 0,4 0 0,05

4.2.1.3. Vergleich der manuellen und automatisierten quantitativen Auswertung

In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Label-freie Proteomanalyse von

Filaminopathiegewebe etabliert. Zu Beginn der Analysen waren keine etablierten

automatisierten Auswertestrategien verfügbar. Aus diesem Grund wurde zunächst eine

einfache manuelle Auswertung durchgeführt. Hierfür wurden strenge, eigens gewählte

Kriterien festgelegt. Im Vergleich mit den entsprechenden Patientenkontrollen konnten

insgesamt 111 Proteine identifiziert werden, die nur in den Aggregaten und gleichzeitig in

Ergebnisse

93

keiner Patientenkontrolle detektiert werden konnten. Der Vergleich der Patientenkontrollen

mit den Negativkontrollen zeigte insgesamt 17 Proteine auf, die als mögliche Marker für

Frühstadien dienen könnten. Die manuelle Auswertung gewährte einen detaillierten Einblick

in die Zusammensetzung der Proteinaggregate. Allerdings ließ diese Art der Auswertung

keinerlei Aussagen über die Regulation von Proteinen zu. Aus diesem Grund wurde im

Rahmen einer Masterarbeit eine automatisierte Datenauswertung in Form des Spectral

Index Calculation entwickelt. Diese Strategie ermöglichte verlässliche und relevante

Aussagen über die Regulation von Proteinen in den Aggregaten. Insgesamt konnten so 100

regulierte Proteine, 69 davon akkumuliert und 31 geringer abundant in den Aggregaten,

identifiziert werden (siehe Anhang, Tabellen 13.1. und 13.2.) und 25 differentielle Proteine in

den Patientenkontrollen im Vergleich zu gesundem Gewebe identifiziert werden. Im

direkten Vergleich der beiden Auswertestrategien konnten 38 Proteine mittels beider

Methoden als spezifische Komponenten der Proteinaggregate identifiziert werden (Tabelle

4.9.), die prozentuale Übereinstimmung lag bei ca. 38%. Im Gegensatz dazu konnten keine

Übereinstimmungen der beiden Strategien bezüglich der Identifizierung möglicher

Frühmarker beobachtet werden.

Tabelle 4.9.: Zusammenfassung aller Proteine, die in der manuellen und automatisierten Auswertung als

spezifische Bestandteile der Aggregate in Filaminopathiepatienten identifiziert werden konnten

Im direkten Vergleich der manuellen und automatisierten Datenauswertung konnten 38 Proteine

detektiert werden, die in beiden Strategien als spezifische Bestandteile der Filaminopathie-

spezifischen Aggregate identifiziert wurden. In der Tabelle sind diese Proteine zusammengefasst. Die

Liste ist nach Anzahl der Proben, in denen das Protein identifiziert wurde, sortiert. Zusätzlich wurden

der durchschnittliche Spectral Index (SI) der Aggregatproben und der PatKO sowie die Ratio und der p-

Wert der automatisierten Auswertung aufgeführt.

Accession Nr.

Protein Anzahl Proben

Aggregate (SI) PatKO

(SI) Ratio p-Wert

P02768 Serumalbumin Precursor 6 2,8 0,5 5,3 0,02

Q0ZGT2 Nexilin 6 3 0,5 6,2 1,4x10-5

Q2TBA0 Sarcosynapsin 6 2 0,7 3,1 0,01

Q8IVN3 Embryonales

Skelettmuskel-Kern Protein 1

6 1,4 0,4 3,3 0,02

A4UGR9 Xirp2 5 64,4 0 n.a.* 1,9x10-6

Ergebnisse

94

O00487 26S Proteasom-

Untereinheit 14, nicht ATP-reguliert

5 1 0 n.a. 0,001

O14558 Hitzeschockprotein Beta 6 5 1,2 0,1 8,8 0,01

O43760 Synaptogyrin 2 5 1,3 0 n.a. 8,7x10-5

O95817 BAG 3 5 1,9 0,3 6 0,01

P05023 Natrium-Kalium-ATPase,

Untereinheit Alpha 1 5 1,8 0 n.a. 0,0009


Untereinheit Beta 1 5 1,1 0 n.a. 1,1x10

-9

P13591 neurales

Zelladhäsionsmolekül 1 5 2,8 0 n.a. 9,6x10-5

P28072 Proteasome Untereinheit

Beta Typ-6 Precursor 5 0,9 0 n.a. 0,02


Beta Typ-5 5 3,8 0,2 24,6 0,001

P28289 Tropomodulin 1 5 1,4 0,2 8,9 0,02

P35580 Myosin-10 5 2,1 0,3 6,7 0,03

P54289

Spannungs-abhängiger Calcium-Kanal,

Untereinheit Alpha-2/Delta-1

5 1,6 0,3 5,4 0,01

Q0D2I5 Intermediärfilament-

Familie Orphan 1 5 1,3 0 n.a. 0,0002

Q15124 Aciculin 5 3,1 0 n.a. 0,04

Q5BKX8 Muskel-spezifisches coiled-coil-Protein

5 2,1 0 n.a. 0,04

Q6P5Q4 Leiomodin 2 5 1,2 0,2 7,8 0,01

Q86TC9 Myopalladin 5 3,3 0 n.a. 0,001

Q8TDC0 Myozenin 3 5 1,5 0,5 2,9 0,02

Q9H7C4 Syncoilin 5 1,8 0 n.a. 0,003

P02786 Transferrin Receptor

Protein 1 4 0,7 0 n.a. 0,01

P11532 Dystrophin 4 1,3 0 n.a. 0,02

Ergebnisse

95

P62140

Serin/Threonin-Proteinphosphatase PP1-

Beta, katalytische Untereinheit

4 1,3 0 n.a. 0,01

Q14204 Cytoplasmatisches Dynein

1 4 1,6 0 n.a. 0,03

Q14764 Major Vault Protein 4 4,2 0 n.a. 0,01

Q15286 Rab 35 4 0,9 0 n.a. 0,001

Q6ZMU5 Tripartite motif-

containing-Protein 72 4 0,7 0 n.a. 0,01

Q9UBY9 Hitzeschockprotein Beta 7 4 2,7 0,2 18,2 0,04

Q9UDY4 DnaJ Homolog, Subfamilie

4 4 2,4 0 n.a. 0,01

A5YM72 Carnosin Synthase 1 3 0,7 0 n.a. 0,01

P11047 Laminin, Untereinheit

gamma 3 1,3 0 n.a. 0,03


Beta Typ 4 Precursor 3 1,4 0 n.a. 0,003

Q14596 Next to BRCA1 gene 1

Protein 3 2,6 0 n.a. 0,02

Q9UJW0 Dynactin, Untereinheit 4 3 1 0 n.a. 0,02

In Abbildung 4.2. ist eine schematische Gegenüberstellung der manuellen und

automatisierten Auswertestrategie dargestellt. In der Schnittmenge der identifizierten

Proteine befanden sich u.a. auch Xirp2 und Rab 35, die in Punkt 4.2.2. erfolgreich validiert

werden konnten. Proteine wie Filamin C, Desmin, Myotilin wurden in der Schnittmenge nicht

berücksichtigt, weil sie in allen analysierten Proben zu finden waren.

Ergebnisse

96

Abbildung 4.2.: Vergleich der gewählten Auswertestrategien

In der qualitativen (Schwarz-Weiß) Auswertung konnten insgesamt 111 Proteine identifiziert werden,

die ausschließlich in Filaminopathiegewebe vorkamen. 23 dieser Proteine, darunter auch Xirp2 und

Rab35, konnten ebenfalls in der Gesamtheit aller regulierten Proteine (31 akkumulierte und 10 niedrig

abundante Proteine) mittels Spectral Index Calculation identifiziert werden.

Es hat sich gezeigt, dass es sinnvoller ist, einen automatisierten Ansatz zur quantitativen

Analyse von Filaminopathiegewebe zu wählen. Das alleinige Wissen über die

Zusammensetzung der Aggregate war zu Beginn der Arbeiten hilfreich, führte im Weiteren

jedoch nicht zu den gewünschten Erkenntnissen. Erst die Möglichkeit differentielle Aussagen

zu den identifizierten Proteinen zu treffen, ermöglichte es vielversprechende Daten zu

generieren. Die Spectral Index Calculation bietet eine exzellente Grundlage differentiell

exprimierte Proteine zu identifizieren. Die Normalisierung über die Gesamtzahl der Spectral

Peptidcounts und das Einsetzen eines Ausgleichfaktors lässt es zu z.B. Proben mit

Unterschieden in der Beschaffenheit miteinander quantitativ vergleichen zu können.

Allerdings handelt es sich beim Spectral Index Calculation um eine relative Quantifizierung.

Für zukünftige Analysen wird es von enormer Bedeutung sein, eine Strategie zur absoluten

Quantifizierung zu etablieren (siehe Punkt 5.2.1.3.).

Ergebnisse

97

4.2.2. Validierung differentieller Proteine der Aggregatanalyse

Die Validierung der Ergebnisse der Aggregatanalyse wurde von M.Sc. Alexandra

Maerkens im Rahmen ihrer Masterarbeit durchgeführt. Hierfür wurden in 10 µm dicke

Kryoschnitte eines Filaminopathiepatienten verwendet. Für die Validierung von spezifischen

Proteinen in Aggregaten wurden 2 Proteine ausgewählt: Xirp2 und Rab35, welche im

Rahmen der manuellen quantitativen Auswertung als spezifische Bestandteile der Aggregate

identifiziert werden konnten. In Abbildung 4.3. sind die Ergebnisse der

Immunfluoreszenzfärbungen mit Antikörpern gegen Xirp2 (A) und Rab35 (B) dargestellt.

Xirp2 konnte nur in Zellen mit Aggregaten detektiert werden. Mittels eines spezifischen

Rab35-Antikörpers konnte in der Immunfluoreszenzfärbung ebenfalls ein deutliches Signal in

Zellen mit Aggregaten detektiert werden. Normale Muskelzellen zeigten ein nur schwaches

Signal.

Abbildung 4.3.: Validierung spezifischer Proteine in Aggregaten von Filaminopathiepatienten

Für die Immunfluoreszenzfärbungen wurden Serienschnitte eines Filaminopathiepatienten

angefertigt. Die Proteine Xirp2 und Rab35 wurden im Rahmen der Label-freien

Proteomanalyse als spezifische Komponenten der Proteinaggregate von Filaminopathiepatienten

identifiziert. Die Ergebnisse wurden mittels Immunfluoreszenz mit primären Antikörpern gegen Xirp2

und Rab35 validiert. Mit gelben Pfeilen wurden Muskelzellen ohne Aggregate markiert, mit grauen

Pfeilen Muskelzellen mit Aggregaten. A: Mit Xirp2 wurden nur die Filaminopathie-spezifischen

Aggregate angefärbt, in den umliegenden Muskelzellen konnte das Protein nicht nachgewiesen

werden. B: Rab35 konnte ebenfalls mit einem deutlichen Signal in Zellen mit Aggregaten als

spezifische Komponente bestätigt werden.

Ergebnisse

98

4.3. Etablierung der 2D Differential In-Gel Elektrophorese mittels 2D DIGE

4.3.1. Optimierung der Probenmenge

Für die differentielle Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe wurde in

Vorversuchen zunächst die optimale Probenmenge ermittelt. Hierfür wurden folgende

Mengen an querangeschnittenen Muskelfaserzellen aus Kontrollgewebe mikrodissektiert:

1000 (Daten nicht gezeigt), 2000, 3000 und 5000. Die mikrodissektierten Muskelzellen

wurden in 20µl DIGE-Puffer aufgenommen, mit 1µl Cy3 für Saturation Labeling markiert

(beschrieben unter Punkt 3.13.3.) und dann mittels 2D PAGE aufgetrennt. In Abbildung 4.4.

sind repräsentative Gele der verschiedenen Probenmengen dargestellt. Die Auftrennung in

der 1. Dimension wie auch in der 2. Dimension erfolgte mit allen Probenmengen ohne

Probleme, es war ein gut aufgetrenntes Proteinmuster zu erkennen. Im direkten Vergleich

der verschiedenen Probenmengen wurde deutlich, dass das Spotmuster von 3000

mikrodissektierten Zellen das vielversprechendste Ergebnis hervorbrachte (Abb. 4.4. B). Die

Abundanz der Spots konnte im Vergleich zu 2000 mikrodissektierten Zellen (Abb. 4.4. A, B

Rote Pfeile) gesteigert werden. Das Gelbild der 5000 mikrodissektierten Zellen zeigte, dass

besonders gering abundante, nebeneinander liegende Spots nicht mehr optimal aufgetrennt

werden konnten und miteinander verschmolzen (Abb. 4.4., B C rote Kreise).

Ergebnisse

99

Abbildung 4.4.: A-C: Optimierung der mikrodissektierten Fläche von quer angeschnittenen Muskelfasern

Für die 2D-DIGE-Analyse wurden 3 verschiedenen Mengen an mikrodissektierten querangeschnittenen

Muskelfasern gesammelt: 2000, 3000 und 5000 Fasern. Die mikrodissektierten Muskelzellen wurden in

20 µl DIGE-Puffer aufgenommen und mit Cy3 Farbstoff gelabelt. In Abbildung A ist die Auftrennung

von 2000 Fasern zu sehen. Im Vergleich zur Auftrennung von 3000 Fasern (Abbildung B) ist zu

erkennen, dass die Abundanz der Spots durch die erhöhte Probenmenge positiv beeinflusst wurde

(rote Pfeile). Die Verwendung von 5000 Fasern (Abbildung C) erhöht nicht die Spotanzahl im Gel. Es ist

allerdings zu beobachten, dass kleine nebeneinander liegende Spots in Abbildung C zu einem großen

Spot verschmelzen (rote Umrandungen in B und C).

Die Größe der Muskelfaserzellen variierte in den Filaminopathiepatienten zum Teil extrem.

Aus diesem Grund wurde mit Hilfe des LMD 6500 (Leica, Wetzlar, Deutschland) die

durchschnittliche Flächengröße von 3000 Fasern ermittelt. Diese betrug 1,6 Mio. µm2. Für

die folgende 2D DIGE Analyse wurde aus jedem Patienten diese optimierte Fläche

ausgelasert.

Ergebnisse

100

4.3.2. Ergebnisse der differentiellen Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe

mittels 2D DIGE

Die Grundlage für die differentielle Proteomstudie bildeten die unter Punkt 3.4.

beschriebenen Filaminopathiepatienten. Eine Patientin konnte in die Studie nicht mit

einbezogen werden, da das Gewebe durch die fortschreitende Erkrankung bereits zu sehr

geschädigt war. Ziel dieser Studie war es, durch die Identifizierung von differentiellen

Proteinen Rückschlüsse auf Frühstadien der Filaminopathie ziehen zu können. Hierfür

wurden aus 10 µm dicken Kryoschnitten von Filaminopathiepatienten mittels LMD

Muskelfaserzellen isoliert, die (noch) keine Aggregate enthielten. Als Kontrolle diente

gesunde Skelettmuskulatur. Für die Analyse der gering konzentrierten Gewebegruppen

wurde das 2D DIGE System in Kombination mit dem Saturation Labeling angewendet [Helling

et al. 2006]. Insgesamt wurden 10 2D-Gele angefertigt. Eine Patientenkontrolle bzw.

Negativkontrolle wurde zusammen mit dem internen Standard auf ein Gel aufgetragen. Der

interne Standard setzte sich aus allen mikrodissektierten Patientenproben und

Negativkontrollen zusammen. Im Wechsel wurden die Proben und der interne Standard mit

Cy3 bzw. Cy5 gelabelt. Der genannte Color-Switch führte zur Minimierung Farbstoff-

bedingter Differenzen. In Abb. 4.5. ist ein repräsentatives Gel der 2D DIGE Studie abgebildet.

Ergebnisse

101

Abbildung 4.5.: Repräsentatives Gel der 2D DIGE Studie

Die Probe setzte sich aus einem internen Standard und Patienten- bzw. Negativkontrolle zusammen.

Die verschiedenen Kontrollen wurden abwechselnd mit Cy3 und Cy5 markiert. Die Proteine aus dem

Probengemisch wurden in der 1. Dimension horizontal nach dem pI und in der 2. Dimension vertikal

nach dem Molekulargewicht aufgetrennt.

4.3.2.1. Ergebnisse der differentiellen Analyse mittels DeCyder

Die Auswertung der Gele erfolgte mit Hilfe der DeCyder™ Software. Alle Gele

konnten für die Analyse verwendet werden und wurden zunächst auf dieselbe Größe

zurechtgeschnitten. Ziel war es störende Bereiche, wie z.B. die Lauffront des

Bromphenolblau, zu entfernen um mögliche Falschsignale zu vermeiden. Das Anpassen der

Gele erleichterte das Zuordnen der Spots. Auf Anhieb wurde ein Großteil der Spots durch die

Software automatisch korrekt zugeordnet. Dennoch musste die Zuordnung einiger Spots, vor

allem im hochmolekularen Bereich, nachbearbeitet werden. Insgesamt konnten in den Gelen

Ergebnisse

102

durchschnittlich 4300 Proteinspots detektiert werden. Die DeCyder™ 6.5 Software bot die

Möglichkeit einer statistischen Auswertung. Es wurden folgende Bedingungen zur

Identifizierung differentiell exprimierter Proteine festgelegt:

Der Spot musste in mindestens 80% der Gele reguliert vorliegen.

Die Signifikanz der Spotintensität wurde mittels Student’s t-test kontrolliert,

der p-Wert musste ≤ 0,05 sein

Als statistisch signifikant wurde eine Änderung der Spotintensität mit dem

Faktor 1,5 akzeptiert

Der Vergleich Kontrollgewebe gegen Filaminopathiegewebe resultierte in der Identifizierung

von insgesamt 15 differentiell exprimierten Spots. In Abbildung 4.6. ist das Mastergel

dargestellt, in dem alle 15 differentiell exprimierten Spots markiert sind.

Ergebnisse

103

Abbildung 4.6.: Mastergel der 2D DIDE Studie mit allen als differentiell identifizierten Spots

Insgesamt wurden in allen Gelen durchschnittlich 4300 Spots identifiziert, darunter 15 Spots

differentiell exprimierte Spots. Wichtige Anmerkung: In dem Gelbild ist die Desmin-Kette, bestehend

aus 4 Spots, nicht klar zu sehen. Die Daten der 2D-DIGE-Studie befanden sich auf einem speziellen

DeCyder-Rechner. Aufgrund eines technischen Defektes des Rechners war es nicht möglich die

Qualität des Gelbildes nachträglich zu verbessern.

4.3.2.2. Identifizierung differentieller Proteine

Die Identifizierung der 15 differentiell exprimierten Spots aus Filaminopathiegewebe

erfolgte mittels MALDI (Matrix-unterstütze Laser Desorption/Ionisation)- MS. Die

generierten Spektren wurden mittels Mascot-Algorithmus in ProteinScape 1.4™ gegen eine

humane Protein-Datenband mit theoretischen Spektren abgeglichen. Von den 15

differentiellen Spots konnten insgesamt 7 Spots identifiziert werden (Tabelle 4.10.). Die

verbleibenden 8 Spots konnten auch in mehrfach wiederholten Analysen nicht identifiziert

werden. Bei den nicht identifizierten Spots handelt es sich um sehr gering abundante Spots,

vorzugsweise im niedrigen Molekularbereich.

Tabelle 4.10: Zusammenfassung aller identifizierten Spots

In dieser Tabelle sind alle Proteine dargestellt, die aus den differentiellen Spots der

Patientenkontrollen (Filaminopathiegewebe ohne Aggregate) identifiziert werden konnten.

Spot Nr. Accession Nr. Protein Ratio pI MW (kDa)

Sequenz- Abdeckung

(%) 690 P11217

Glykogen Phosphorylase

-1,72 6,6 97 61,5

818 P06396 Gelsolin 4,78 28,4 5,9 81

1569 P17661 Desmin 2,33 5,1 53 64,5

1570 P17661 Desmin 1,98 5,1 53 70,2

2050 P06732 Creatin Kinase

M-Typ -1,50 6,9 43 54,1

2247 P68133 Alpha Aktin,

Skelettmuskel -2,38 5,3 42 30,5

3585 P08590 Myosin leichte

Kette 3 1,53 4,9 21,9 58,5

Ergebnisse

104

4.3.2.3. Überprüfen der Spectral Index Daten aus Patientenkontrollen mittels 2D

DIGE

Das umliegende Gewebe ohne Aggregate aus Filaminopathiepatienten

(Patientenkontrolle) wurde über die Label-freie Proteomanalyse und parallel auch in einer

2D DIGE Studie analysiert. Von insgesamt 247 identifizierten Proteinen konnten in der Label-

freien Analyse mittels Spectral Index Calculation 10 abundante und 16 niedrig abundante

Proteine in den Patientenkontrollen ermittelt werden. In der 2D DIGE Studie konnten aus

insgesamt 15 differentiellen Spots 7 Proteine identifiziert werden. Nach genauer Durchsicht

aller mittels Spectral Index Calculation identifizierten Proteine konnten 2

Übereinstimmungen mit der 2D Studie beobachtet werden: Aktin und die Glykogen

Phosphorylase wurden in beiden Studien identifiziert. Für Aktin wie auch für die Glykogen

Phosphorylase, konnte in beiden Studien eine verringerte Exprimierung der Proteine

beobachten werden. Die leichte Kette des Myosins, die Creatin Kinase M-Typ, Desmin und

Gelsolin wurden nur in der 2D Studie als differentielle Proteine in den Patientenkontrollen

identifiziert. In der Label-freien Analyse konnte für diese Proteine keine Regulation

beobachtet werden. Die Ergebnisse der 2D DIGE Studie und der Label-freien Proteomstudie

mittels Spectral Counting überschnitten sich zum Teil. Nachfolgende Versuche müssen

genutzt werden, um die hier beschriebenen und weitere Proteine bzw. deren Regulation

eindeutig zu validieren. Hierfür würden sich der Western Blot oder die Immunhistochemie

mittels spezifischer Antikörper anbieten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde bei den

Validierung der Fokus auf das Desmin gelegt (Punkt 4.4.3.), weil dem Intermediärfilament

eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Myofibrillären Myopathie zugeschrieben

wird [Caron and Chapon 1999, Janue et al. 2007] (siehe Punkt 5.2.2.4. und 5.2.2.5).

Ergebnisse

105

Tabelle 4.11.: Darstellung der Übereinstimmungen zwischen den Spectral Index Daten und der 2D DIGE Studie

In beiden Studien konnten differentiell exprimierte Proteine identifiziert werden. 2 Proteine tauchten

in beiden Auswertungen auf: Aktin und Glykogen Phosphorylase. Aktin und Glykogen Phosphorylase

konnten in beiden Studien als niedrig abundante Proteine ermittelt werden. Desmin wurde in der 2D

Studie als hochreguliert identifiziert, in der Label-freien Studie aufgrund des durchschnittlichen

Spectral Indices von 1,706 als nicht reguliert. Gelsolin konnte lediglich in der 2D Studie als differentiell

exprimiertes Protein identifiziert werden. In der Label-freien Studie wurde es aufgrund des zu

schlechten p-Wertes (≥ 0,05) nicht berücksichtigt. Die leichte Kette des Myosins sowie die Creatin

Kinase M-Typ wurden in der Label-freien Proteomanalyse nicht identifiziert

Accession Protein

2D DIGE Spectral Index

Ratio Regulation Ratio Regulation

P08590 Myosin leichte Kette 3 1,53 ↑ - -

P06396 Gelsolin 4,78 ↑ - -

P17661 Desmin

2,33 ↑

- -

1,98 ↑

P06732 Creatin Kinase M-Typ 1,50 ↓ - -

P11217 Glykogen

Phosphorylase 1,72 ↓ 0,31 ↓

P68133 Alpha Aktin,

Skelettmuskel 2,38 ↓ 0,33 ↓

4.3.3. Untersuchung einer posttranslationalen Modifikation an Desmin mittels 2D

Blot

Aus den 2D Gelen konnten insgesamt 7 Proteine identifiziert werden, zwei der Spots

erwiesen sich als Desmin. Die beiden differentiellen Spots befanden sich in einer Kette

bestehend aus insgesamt 4 Spots, die ebenfalls als Desmin identifiziert wurden. Da die

beiden regulierten Spots einen pI-Shift ins saure Milieu aufwiesen, wurde die Vermutung

aufgestellt, dass es sich hier um eine mögliche posttranslationale Modifikation handelt (Abb.

Ergebnisse

106

4.7.). Da es außer dem pI-Shift keine sichtbaren Veränderungen des Molekulargewichts gab,

schien lediglich eine Phosphorylierung als posttranslationale Modifikation in Frage zu

kommen. In der Literatur sind einige Studien bekannt, die sich mit posttranslationalen

Modifikationen, insbesondere der Phosphorylierung, am Desmin beschäftigt haben. Desmin

verfügt über zahlreiche Phosphorylierungsstellen, welche die Polymerisierung regulierten

[Costa et al. 2004]. Eine Erhöhung des phosphorylierten Anteils von Desmin führt zum Abbau

der Intermediärfilamente [Cohen et al. 2012]. In Myofibrillären Myopathien wurde die

zerstörende Wirkung von Phosphorylierungen 1999 erstmals beschrieben [Caron and

Chapon 1999]. Dieses Vorwissen rückte die Untersuchung der möglichen

Desminphosphorylierung in den Fokus der Validierungsarbeiten (siehe Punkt 5.2.2.5).

Abbildung 4.7.: pI-Shift der regulierten Desmin Spots in den sauren Bereich

Die DeCyder-Gelanalyse deckte die Regulierung von 2 Desmin Spots (Spot Nr. 1569 und 1570) auf. Die

beiden anliegenden Spots (Pfeile) wurden ebenfalls analysiert und als Desmin identifiziert. Die

Verschiebung der beiden differentiellen Spots in den sauren pI-Bereich ließ eine Phosphorylierung

vermuten. Wichtige Anmerkung: Die regulierten Spots sind in der Abbildung zu erahnen. Aufgrund des

technischen Defekts des DeCyder-Rechners war es nicht möglich, die Spots in besserer Qualität

darzustellen (siehe Abb. 4.6.).

Um die mögliche Phosphorylierung von Desmin zu untersuchen, wurde ein 2D Blot

durchgeführt. Es wurden je 50 µg Muskellysat aus Filaminopathiegewebe (Punkt 3.6.) und

gesundem Gewebe mit Fluorophoren markiert. Anschließend wurden die Proben mittels 2D

PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Jeweils direkt im

Ergebnisse

107

Anschluss an die 2. Dimension bzw. den Proteintransfer wurden die Gele bzw. Membranen

im Typhoon Scanner (GE Healthcare) gescannt. Aufgrund der Fluorophor-Markierung und

des Vergleichs mit den Gelen aus der 2D DIGE Studie war es möglich, die Desmin-Kette im

Blot zu lokalisieren (Abbildung 4.8.) und eindeutig zuzuordnen (Abb. 4.9. rote Kreise).

Abbildung 4.8.:Darstellung der 2D Blots und Nitrocellulose-Membranen

Für die 2D Blots wurde Muskellysat aus Filaminopathiegewebe sowie aus gesundem Kontrollgewebe

hergestellt. 50 µg Gesamtprotein wurden mit 1 µl CyDye-Farbstoff markiert und anschließend nach

mittels 2D PAGE aufgetrennt. Im Anschluss an die 2.Dimension wurden die Gele in den Gelkammern

auf dem Typhoon Scanner (GE Healthcare Life Sciences, USA) gescannt. In A ist das aufgetrennte

Proteom des Kontrollgewebes vor dem Proteintransfer und in B nach dem Proteintransfer dargestellt,

in C das Proteom des Filaminopathiegewebe vor und in D nach dem Proteintransfer. Die

Lokalisation der Desmin-Kette ist in allen Abbildungen durch einen roten Kreis gekennzeichnet. Die rot

markierten Bereiche sind in E (Kontrolle) und F (Filaminopathiegewebe) vergrößert dargestellt.

Die Blots wurden im Anschluss mit Primärantikörpern gegen PhosphoSerin und

Desmin inkubiert. Desmin wird vorzugsweise in der Head-Domäne an Serin-Resten

phosphoryliert [Geisler and Weber 1988]. Aus diesem Grund wurde ein PhosphoSerin-

Ergebnisse

108

Antikörper zur Validierung der vermuteten Phosphorylierung verwendet. Der Desmin-

Antikörper wurde verwendet, um zu zeigen, dass es sich bei den regulierten Spots

tatsächlich um Desmin handelt. Zur Visualisierung der Signale wurde als Sekundärantikörper

jeweils ein Maus IR800 (grün)- bzw. IR680 (rot)-Antikörper verwendet. Die Entwicklung der

Blots erfolgte im Odyssey Scanner (LI-COR Biosciences GmbH, Bad Homburg, Deutschland).

In Abbildung 4.9. ist das Ergebnis der Immunoblots zu sehen. In Filaminopathiegewebe wie

auch im Kontrollgewebe konnten die 4 im 2D Gel als Demin identifizierten Spots auch mittels

Desmin-Antikörper detektiert werden (Abb.4.9, B und D). Die Spots wurden in den

Abbildungen von 1-4 nummeriert. Die Spots 3 und 4 wurden in der 2D DIGE Studie als

reguliert identifiziert, die Spots 1 und 2 stellen die nicht regulierten Desmin-Spots dar. Mit

Hilfe des PhosphoSerin-Antikörpers konnten ebenfalls in beiden Gewebegruppen alle 4 als

Desmin identifizierten Spots detektiert werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass Desmin stets

phosphoryliert vorliegt. Nachfolgende Studien müssen allerdings klären, ob der Anteil an

phosphoryliertem Desmin im Vergleich zum Kontrollgewebe in den Filaminopathiepatienten

erhöht ist. Zusätzlich zu den erwarteten Spots konnten unter der Verwendung des

PhosphoSerin-Antikörpers weitere Spots in den Blots detektiert werden. Zum einen wurde

im Filaminopathiegewebe und in der Kontrolle ein in der 2D Studie nicht erkannter 5.

Desminspot detektiert (Abb. 4.9., B, D), der nur im Filaminopathiegewebe phosphoryliert

vorlag (Abb. 4.9., A und C). Zum anderen tauchten insgesamt 4 weitere unbekannte Spots (a-

d) in den Blots auf. Die mit a und d gekennzeichneten Spots konnten in Filaminopathie- und

Kontrollgewebe detektiert werden, im kranken Gewebe lagen sie auch phosphoryliert vor.

Die Spots (b) und (c) wurden jedoch nur in Filaminopathiegewebe detektiert und könnten

spezifisch für Filaminopathiegewebe sein. Die Identifizierung und die Bedeutung der

zusätzlichen Desmin-Spots muss in weiteren Studien untersucht werden. Möglicherweise

können andere posttranslationale Modifikationen (höheres Molekulargewicht) oder

Abbauprodukte des Desmins (niedrigeres Molekulargewicht) identifiziert werden.

Ergebnisse

109

Abbildung 4.9: Ergebnis der Immunoblots zur Validierung der Desmin-Phosphorylierung

Die Blots wurden mit einem spezifischen PhosphoSerin-Antikörper inkubiert, als Sekundärantikörper

wurde ein Maus IR800 (grün) eingesetzt (Abb. A und C). Zur Validierung des in der 2D DIGE Studie

identifizierten Desmin wurde ein Desmin-Antikörper in Kombination mit einem Maus IR680 (rot) als

Sekundärantiköper verwendet (Abb. B und D). Die Visualisierung erfolgte mit Hilfe des Odyssey

Scanners. Die 4 bekannten Spots (1-4) aus der 2D DIGE Studie wurden in beiden Gewebegruppen als

Desmin detektiert (B, D). Zudem lagen sie phosphoryliert vor (A, C). Außerdem wurden zusätzliche

Spots von dem Desmin-Antikörper und dem PhosphoSerin-Antikörper detektiert. Der 5. Spot in der

Desminkette wurde in der 2D Studie nicht erkannt und lag auch nur im Filaminopathiegewebe

phosphoryliert vor (A, C). Die Spots a und d wurden in Filaminopathie-wie auch in Kontrollgewebe als

Desminspots detektiert (A, B, D). In krankem Gewebe liegen diese Spots auch phosphoryliert vor. Der

mit c gekennzeichnete Spot hingegen trat nur in Proben aus Filaminopathiegewebe auf (A, B).

Dies könnte auf eine Spezifität für das kranke Gewebe hindeuten. Weitere Studien müssen die

Bedeutung und die Identität der zusätzlichen Spots klären. Es wäre möglich, dass es sich um

Abbauprodukte des Desmin handelt und /oder weitere posttranslationale Modifikationen in den Spots

identifiziert werden können.

Ergebnisse

110

An den Nachweis der Phosphorylierung mittels spezifischer Antikörper schloss sich

die Lokalisation der phosphorylierten Aminosäuren mittels massenspektrometrischer

Analyse an. Hierfür wurden 50 µg Muskellysat aus Filaminopathiepatienten mit

Fluoreophoren markiert und anschließend mittels 2D PAGE aufgetrennt. Nach Beendigung

der 2. Dimension wurden die Gele im Typhoon Scanner (GE Healthcare) gescannt. Die

Fluorophor-Markierung und vergleichbare Gele aus der 2D Studie erleichterten die

Identifizierung der Desmin-Kette im Gel (siehe 4.3.2.1.). Die regulierten Spots wurden aus

dem Gel isoliert und anschließend wurden die Proteine über Nacht im Gel mit Trypsin

verdaut. Am nächsten Tag wurden die Peptide aus den Gelstücken verdaut und direkt auf

der LTQ (Thermo) gemessen. Um in der massenspektrometrischen Analyse bestmögliche

Voraussetzungen für die Identifizierung und Lokalisation der Serin-Phosphorylierung im

Desmin zu gewähren, wurden die Proben im Wechsel mittels CID und ETD gemessen (siehe

Punkt 5.2.2.7.). Trotz der Kombination der CID- und ETD-Fragmentierungstechnik konnten

keine Phosphorylierungen detektiert werden. Nach Durchsicht der UV-Spektren wurde

deutlich, dass die Proben zu gering konzentriert waren. Es konnten keine Spektren

aufgenommen werden.

4.4. Murine Myoblasten als MFM-Zellkulturmodell

In der hier vorliegenden Dissertation wurden erste Schritte zur Etablierung der

Proteomanalyse von Myofibrillären Myoblasten unternommen. Hierfür wurden C2C12-

Zellen verwendet. C2C12-Zellen sind Zellen, die aus isolierten Myoblasten eines

Mausskelettmuskels kultiviert und erstmals durch Yaffe et al. 1977 beschrieben wurden. Die

Zellen besitzen die Eigenschaft sehr schnell in Myotuben zu differenzieren und

muskelspezifische Proteine zu exprimieren. Das humane Material von

Filaminopathiepatienten ist limitiert. Um aber weitreichende Erkenntnisse über die

Pathomechnismen der Filaminopathie zu erlangen, wurde die Zellkultur als leicht

zugängliches System gewählt. Bereits 2008 konnten Vorgerd et al. (Kongressbeitrag) zeigen,

dass das Einbringen der humanen p.W2710X-Mutation in C2C12-Zellen zur Bildung von

Proteinaggregaten führt. Infolgedessen bestätigten andere Forschergruppen die C2C12-

Ergebnisse

111

Zelllinie als exzellentes Modellsystem für die Filaminopathie [Duff et al. 2011, Kley et al.

2012]. Ziel der hier durchgeführten Proteomanalysen in murinen Myoblasten war es, die

Zusammensetzung der Aggregate in den Zellen mit der Zusammensetzung der humanen

Aggregate zu vergleichen, um zu schauen, ob die Zellen hinsichtlich der Aggregation ein

geeignetes Modellsystem für die MFM darstellen.

4.4.1. Transfektion der p.W2710X Mutation in murine Myoblasten

Die kompletten Sequenzen des Filamin C-Wildtyps und der p.W2710X-Mutation

wurden in C2 pEGFP- und N3 pEGFP-Vektoren (Clonetech, USA) eingebracht. Beide Vektoren

eignen sich für die Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen. Im N3-Vektor ist das

Zielprotein am C-Terminus mit dem Fluoreszenzprotein EGFP fusioniert, im C2-Vektor sind

Zielprotein und EGFP am N-Terminus fusioniert. Die Klonierungsarbeiten wurden von Dipl.

Biologin Yvonne Leber, AG Fürst, Institut für Zellbiologie, Rheinische Friedrich-Wilhelms-

Universität Bonn, durchgeführt. Kley et al. zeigten 2012, dass C2C12-Zellen nach

Transfektion der p.W2710X Mutante MFM-charakteristische intrazelluläre Proteinaggregate

ausbilden. Für die Transfektion wurden die C2C12-Zellen mit Plasmid-DNA der C2-und N3-

Konstrukte verwendet. Ein Vorversuch sollte zeigen, ob die Aggregatbildung ausschließlich

auf die eingebrachte Mutation zurückzuführen ist. Hierfür wurden die C2C12-Zellen zunächst

ausplattiert und nach 24h mit Plasmid-DNA der p.W2710X Mutation und des Wildtyps sowie

des Leervektors transfiziert. Die Zellen wurden nach 12h, 18h, 24h, 48h und 72h unter einem

Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Hamburg, Deutschland) dokumentiert. Nach 12h und 18h

konnten weder transfizierte (grün leuchtende Zellen, weiße Pfeile) noch Zellen mit

Aggregaten beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Im Zeitraum zwischen 18h und 24h

setzte die Aggregatbildung in den Zellen ein. Die Aggregate befanden sich z.T. in den

Ausläufern der Zelle oder im Zellsoma. Die Transfektionseffizienz war beim Leervektor nach

24h mit ca. 75% am höchsten und blieb über die Zeitreihe konstant. Nach Transfektion mit

den Konstrukten, die den Wildtyp und die p.W2710X Mutation enthielten, konnten nur ca.

30% positiv transfizierte Zellen nach 24h beobachtet werden. Die Zahl der transfizierten

Zellen sank im Laufe der Zeitreihe bis auf ca. 20%. Wie in der letzten Spalte der Abbildungen

4.10. und 4.11. zu sehen ist, zeigten ausschließlich die Zellen Proteinaggregate, die mit der

Plasmid-DNA der Filamin C-Mutation transfiziert wurden. Die Anzahl variierte von einem

Ergebnisse

112

punktförmigen Aggregat hin zu vielen kleinen Aggregaten innerhalb einer Zelle (rote Pfeile).

Abbildung 4.10.: Transfektion der C2C12-Zellen mit Plasmid-DNA des C2-Konstrukts

Der Leervektor, der Filamin C Wildtyp sowie die p.W2710X Mutation wurden in die C2C12-Zellen

transfiziert. Nach 24h, 48h und 72h wurden die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

Die Transfektionseffizienz war beim Leervektor mit ca. 75% am höchsten. Die Transfektionsrate sank

auch nach 72h nicht unter 75%. Die Transfektionseffizienz des Wildtyps und der Mutante lag nach 24h

bei ca. 25%, nach 72h reduzierte sie sich auf ca. 20%. Lediglich die Zellen, die mit der p.W2710X

Mutante transfiziert wurden, zeigten deutlich intrazelluläre Proteinaggregate (rote Pfeile). Die anderen

Zellen leuchteten aufgrund der gelungenen Transfektion ausschließlich grün (weiße Pfeile).

Ergebnisse

113

Abbildung 4.11.: Transfektion der C2C12-Zellen mit Plasmid-DNA des N3-Konstrukts

Der Leervektor, der Filamin C Wildtyp sowie die p.W2710X Mutation wurden in die C2C12-Zellen

transfiziert. Die Zellen wurden nach 24h, 48h und 72h nach der Transfektion unter dem

Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Transfektion des Leervektors sowie des Wildtyps zeigte

ausschließlich grün leuchtende (weiße Pfeile) Zellen. Die Zellen, in die die Mutation transfiziert wurde,

zeigten hingegen charakteristische Proteinaggregate, z.T. in den Ausläufern der Zelle oder im Zellsoma

der Zelle (rote Pfeile).

4.4.2. Optimierung der Lasermikrodissektion für das Zellkulturmodell

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Aggregatbildung in den C212-Zellen durch

die eingebrachte p.W2710X-Mutation zurückzuführen war, lag das nächste Ziel in der

Analyse der murinen Filaminopathie-Aggregate. Hierzu musste das bestehende Protokoll der

LMD hinsichtlich der Probenmenge optimiert und für die Anwendung auf Zellkulturproben

adaptiert werden. Für die Optimierung wurden die Zellen mit dem pEGFP C2 p.W2710X-

Konstrukt in die Zellen transfiziert. Die C2C12-Zellen wurden in LMD-Petrischalen (spezielle

Petrischalen mit Polyethylennaphthalte-(PEN) Membran, WillCo-dish, Niederlande)

kultiviert, nach 24h erfolgte die Transfektion der Mutante. Als Kontrolle dienten nicht

transfizierte Zellen. 24h ,48h und 72h nach Transfektion wurden 3 verschieden große

Flächen der C2C12-Zellen mittels Laser ausgeschnitten: 75 000 µm2, 150 000 µm2 und 250

Ergebnisse

114

000 µm2. Die Größe der Areale richtete sich nach der für humanes Gewebe etablierten

Fläche (250 000 µm2). Zusätzlich wurden geringere Flächen (75 000 µm2, 150 000 µm2)

gesammelt um zu testen, inwieweit die Menge für die nachfolgende MS-Analyse reduziert

werden konnte. Im Gegensatz zu den humanen Proben, bei denen nur die Proteinaggregate

aus den Muskelzellen ausgeschnitten wurden, wurden hier die kompletten Zellen isoliert.

Innerhalb der C2C12-Zellen bildeten sich mehrere runde Aggregate (Abb. 4.12. A, weiße

Pfeile), aber auch viele kleine punktförmige Aggregate (Abb. 4.12. A, roter Pfeil). Die

punktförmigen Aggregate konnten nur in Zellen zu beobachten, die mit der Mutante

transfiziert wurden (siehe Punkt 4.4.1.). Ein Vergleich der humanen Aggregate und der

Aggregate, die in Zellen gebildet werden, wird ein deutlicher Größenunterschied der

Aggregate deutlich (Abb. 4.12.).

Abbildung 4.12.: Vergleich von Proteinaggregaten in C2C12-Zellen und humanen Skelettmuskelschnitten

In Abbildung A sind 2 nebeneinanderliegende C2C12-Zellen dargestellt. Innerhalb dieser Zellen

befinden sich mehrere runde Aggregate (weiße Pfeile), aber auch viele kleine punktförmige Aggregate

(roter Pfeil). Die punktförmigen Aggregate treten nur in Zellen zu beobachten, die mit der Mutante

transfiziert wurden (siehe Punkt 4.6.1.). Die humanen Aggregate sind deutlich größer als die Aggregate

in den Zellen (Abb. B).

Ergebnisse

115

Im Anschluss an die LMD wurden die Proben in 40 µl Ameisensäure aufgenommen. Nach

dem tryptischen Verdau der Proben wurden diese mittels nanoLC-MS/MS analysiert. Um die

optimale Fläche für die LMD von MFM-spezifischen Proteinaggregaten aus C2C12-Zellen

festzulegen, wurden die verschiedenen Zeitpunkte sowie die unterschiedlichen Flächen

miteinander vergleichen. Das Hauptaugenmerk wurde auf die Anzahl der identifizierten

Proteine gelegt. Die Zahl der identifizierten Proteine lag zwischen 227 und 813. Hier wurde

deutlich, dass die Zahl identifizierter Proteine nicht proportional zur Größe der ausgelaserten

Fläche anstieg (Tabelle 4.12.). In allen transfizierten Zellen konnten weniger Proteine

identifiziert werden als in den Kontrollen. Aufgrund der hier erzielten Ergebnisse wurde die

Fläche von 75 000 µm2 als optimal für die folgenden Aggregatanalysen in C2C12-Zellen

festgelegt. Generell konnten in allen Proben viele MFM- und Muskel-spezifische Proteine

identifiziert werden: u.a. Filamin C, Desmin, Myosin, Nestin, Tropomyosin, Aktin, Vimentin,

Lamin, diverse Hitzeschockproteine. Die meisten der identifizierten Proteine waren aus den

humanen Analysen bekannt. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass die beiden Systeme

prinzipiell miteinander vergleichbar sind. Weiterführende Analysen müssen allerdings noch

zeigen, ob und inwieweit eine quantitative Auswertung der Zellkulturdaten möglich ist und

ob sich ein ähnliches Akkumulierungsmuster zeigt wie in den humanen Muskelproben.

Ergebnisse

116

Tabelle 4.12.: Vergleich mikrodissektierter Areale aus murinen Myoblasten

Um die optimale Fläche zur Analyse von MFM-spezifischen Proteinaggregaten in C2C12-Zellen zu

ermitteln, wurden 75 000, 150 000 und 250 000 µm2 ausgelasert. Hierfür wurden die Zellen in LMD-

Schalen kultiviert und nach 24h mit der p.W2710X Mutante (C2-Konstrukt) transfiziert. Als Kontrolle

dienten nicht transfizierte Zellen. Nach weiteren 24h, 48h und 72h wurden die Proben gesammelt. In

den transfizierten Zellen konnten im Durchschnitt 400 Proteine identifiziert werden, in den nicht

transfizierten Zellen 660 Proteine. Hier wurde deutlich, dass die Zahl identifizierter Proteine nicht

proportional zur Größe der ausgelaserten Fläche anstieg. In allen transfizierten Zellen konnten weniger

Proteine identifiziert werden als in den Kontrollen. Besonders auffällig war, dass mit steigender Fläche

die Anzahl der identifizierten Proteine nicht deutlich erhöht werden konnte. Aus diesem Grund

wurden 75 000 µm2 als optimale Fläche ausgewählt.

Zeitpunkt (h) Fläche (µm2) Probe Anzahl identifizierte

Proteine

24

75 000 transfizierte Zellen 227

nicht transfizierte Zellen 739





48







72







Ergebnisse

117

4.4.3. Ergebnisse der Label-freien Aggregatanalyse im Zellkulturmodell

Im Anschluss an die Optimierungsarbeiten der LMD von Zellkulturmaterial wurde

eine Label-freie Aggregatanalyse mittels Spectral Index Calculation durchgeführt. Für die

Studie wurden die in Punkt 3.8. beschriebenen C2pEGFP- und N3pEGFP-Konstrukte transient

in die C2C12-Zellen eingebracht. Als Kontrolle wurden nicht transfizierte Zellen verwendet.

Um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, wurde pro Konstrukt 5mal dieselbe Fläche

(75 000 µm2) gesammelt. Für diese Analyse wurden komplette Zellen, die Aggregate

enthielten, mikrodissektiert. Nach 24h, 48h und 72h wurden die Proben gesammelt und in

40 µl Ameisensäure 30 min inkubiert. Die massenspektrometrische Analyse erfolgte analog

zum etablierten Protokoll zur Analyse von humanen Aggregaten. Ziel dieser Analyse sollte

sein, die Komposition der Proteinaggregate in Zellkultur zu charakterisieren und die

Zusammensetzung der Proteinaggregate im Zellmodell mit der Zusammensetzung der

humanen Aggregate abzugleichen. Die semi-quantitative Auswertung sollte zeigen, ob in

Zellkultur die gleichen Proteine hoch bzw. niedrig abundant vorliegen wie in humanen

Filaminopathie-Aggregaten. Die Ergebnisse der Label-freien Aggregatanalyse in C2C12-Zellen

wurden als Diagramm in Abbildung 4.13. zusammengefasst. Auf den ersten Blick wird

deutlich, dass die Zahl an identifizierten Proteinen in allen Gruppen extrem schwankt. In den

Kontrollen konnten die geringsten Schwankungen beobachtet werden. Trotz der extremen

Schwankungen konnten Gemeinsamkeiten in der Zusammensetzung der humanen

Aggregate und der Aggregate im Zellkulturmodell beobachtet werden. Es konnten diverse

Proteine identifiziert werden, die in beiden Studien als Bestandteile der Proteinaggregate

charakterisiert wurden. Dazu gehörten Filamin C und dessen Bindungspartner N-Rap, die

Intermediärfilamente Desmin und Vimentin, die Strukturproteine Aktin und Myosin sowie

diverse Hitzeschockproteine und andere Muskel-spezifische Proteine.

Ergebnisse

118

Abbildung 4.13.: Zusammenfassung der Label-freien Proteomanalyse in Zellkultur, Spalte links C2-, Spalte

rechts N3-Konstrukt

Die murinen Myoblasten wurden in speziellen LMD-Schalen ausplattiert und nach 24h mit Plasmid-

DNA des Leervektors, des Wildtyps und der Mutante p.W2710X transfiziert. Als Kontrollen dienten

nicht transfizierte Zellen. Nach weiteren 24h, 48h und 72h wurden 75 000 µm2 an Zellmaterial (ganze

Zellen) gesammelt. Es wurden 5 Replikate gesammelt. Das restliche Protokoll entsprach dem

etablierten Protokoll zur Analyse von humanem Skelettmuskel. In der linken Spalte ist die Anzahl aller

identifizierten Proteine in C2C12-Zellen dargestellt, in die das C2-Konstrukt hinein transfiziert wurde.

Die rechte Spalte zeigt die Ergebnisse der Zellen, die das N3-konstrukt exprimierten. Die Reihen A-C

zeigen auf, wie viele Proteine zu den verschiedenen Zeitpunkten identifiziert werden konnten. Auf den

ersten Blick wird deutlich, dass die Messungen sehr heterogene Ergebnisse hervorgebracht haben. Die

Ergebnisse

119

Zahl der identifizierten Proteine schwankt in allen Gruppen extrem. Nach 48h konnten z.B. in Zellen, in

die die Mutante hinein transfiziert wurde, zwischen 34 und 269 Proteinen identifiziert werden. In den

Kontrollen konnten die geringsten Schwankungen beobachtet werden.

Die Analyse der humanen Aggregate und deren Kontrollen zeigten im Vergleich zu den

Ergebnissen der Zellkultur deutlich homogenere Resultate. Die Anzahl der identifizierten

Proteine in 6 Filaminopathiepatienten (Aggregatproben sowie Patientenkontrollen) und 6

Negativkontrollen schwankte nur in geringem Maße. In den Aggregatproben konnten die

meisten Proteine identifiziert werden, die Zahl schwankte hier zwischen 398 und 439. In den

Patientenkontrollen wie auch in den Negativkontrollen konnten zwischen 282 und 378

Proteine identifiziert.

Abbildung 4.14.: Anzahl aller identifizierter Proteine in humane Skelettmuskelproben

Die Analyse der humanen Filaminopathieproben zeigt im Vergleich zu der Aggregatanalyse im

Zellkulturmodell deutlich homogenere Ergebnisse. Das Diagramm zeigt die Anzahl der identifizierten

Proteine in 6 Filaminopathiepatienten (Aggregatproben sowie Patientenkontrollen) und 6

Negativkontrollen. In den Aggregatproben konnten die meisten Proteine identifiziert werden, die Zahl

schwankte hier zwischen 398 und 439. In den Patientenkontrollen wie auch in den Negativkontrollen

konnten zwischen 282 und 378 Proteine identifiziert.

Aufgrund der extrem schwankenden Ergebnisse wurde davon abgesehen, eine semi-

quantitative Auswertung durchzuführen. Für weitere Analysen ist es wichtig mehrere

Versuchsreihen pro Konstrukt durchzuführen, um die Ursache für die schwankenden Werte

in der Anzahl identifizierter Proteine aufzudecken. Zusätzlich müssen die Parameter für die

LMD optimiert werden.

120

5. Diskussion

Die Myofibrillären Myopathien (MFM) bilden eine phänotypisch und genotypisch

heterogene Gruppe von erblichen Muskelerkrankungen. Charakterisiert werden sie durch

die fokale Zerstörung von Myofibrillen im Bereich der Z-Scheiben, die zum Strukturverlust

der Myofibrillen und Funktionseinschränkungen von Muskelfaserzellen führt. Ein weiteres

histologisches Merkmal der MFM ist die Bildung von intrazellulären Proteinaggregaten in

den Skelettmuskelzellen. [Selcen et al. 2004]. Verursacht werden MFM durch autosomal

dominante Mutationen in codierenden Genen von wichtigen Proteinen der Myofibrillen:

Filamin C, Desmin, Myotilin, Plectin, FHL-1, ZASP, alpha B-Crystallin und BAG 3. Entsprechend

der zugrunde liegenden Mutation setzt sich die Bezeichnung des jeweiligen Subtyps aus dem

Gennamen und der Endung –opathie, z.B. Filaminopathie, Desminopathie usw. zusammen.

In den meisten Fällen treten die ersten Symptome zu Beginn zwischen der 4. und 6.

Lebensdekade auf [Selcen et al. 2004, Kley et al. 2007]. Die Lebenserwartung der MFM-

Patienten ist durch Beteiligung der Atem- und Herzmuskulatur zum Teil drastisch reduziert

[Selcen and Engel 2003, Kley et al. 2007]. Die Filaminopathie ist ein Subtyp der

Myofibrillären Myopathien. Betroffen sind meist proximale Muskelgruppen. Der Verlauf der

Filaminopathie ist langsam progredient [Fürst et al. 2013]. Die Patienten haben zunächst

Schwierigkeiten, Treppen zu bewältigen, zum Ende hin können sie sich nur noch mit Hilfe

eines Rollstuhls fortbewegen.

In der hier vorliegenden Dissertation wurden Muskelproben von 6

Filaminopathiepatienten mit 3 verschiedenen Mutationen in der Stabregion des Filamin C

analysiert. Als Grundlage der Analysen dienten Gefrierschnitte von Muskelbiopsien der

Filaminopathiepatienten sowie von 6 gesunden Kontrollen. Ziel war es, die

Zusammensetzung der Proteinaggregate in den Muskelzellen zu entschlüsseln, sowie Marker

für das Frühstadium der Erkrankung zu identifizieren. Die Analyse der Aggregate und des

umliegenden Gewebes sollte einen neuen, detaillierten Einblick in die Pathogenese der

Diskussion

121

Filaminopathien geben. Es wurden 2 verschiedene auf LMD basierende Ansätze zur

Proteomanalyse der Filaminopathieproben und 3 unterschiedliche Auswertestrategien

etabliert. Mittels LMD wurden definierte Areale aus allen Proben isoliert. Für die Analyse der

Proteinaggregate wurde ein Massenspektrometrie-basierter Label-freier Ansatz gewählt. Im

Anschluss an die massenspektrometrische Messung wurden die generierten Daten mit einer

humanen Proteindatenbank abgeglichen. In einem ersten Schritt erfolgte eine qualitative

Auswertung der Daten. Daran schlossen sich eine manuelle sowie eine automatisierte

Quantifizierung an. Die automatisierte Quantifizierung erfolgte mittels Spectral Index

Calculation. So war es möglich diverse differentielle Proteine in den Aggregaten zu

identifizieren. In einer 2D DIGE Studie konnten insgesamt 6 differentielle Proteine

identifiziert werden, die als mögliche Frühmarker der Erkrankung in Frage kämen.

5.1. Lasermikrodissektion

In bereits veröffentlichten Studien konnten mittels immunhistologischen Färbungen

einzelne Bestandteile der Filaminopathie-spezifischen Proteinaggregate aufgedeckt werden.

Zu diesen Komponenten gehören u.a. Filamin C, Desmin, alpha B Crystallin, Myotilin, Xin

sowie diverse Hitzschockprotein [Kley et al. 2007, Kley et al. 2012]. Weitere Einblicke und

neue Rückschlüsse auf die Pathomechanismen der Erkrankung sollten proteomische

Analysen gewähren. Die Grundlage der hier durchgeführten Analysen bildeten humane

Muskelbiopsien von Filaminopathiepatienten. Das Gewebe der Patienten wurde im Rahmen

einer OP gewonnen. Die Anzahl und Größe der Proteinaggregate in den einzelnen Patienten

war äußerst limitiert. Um dennoch die Zusammensetzung der Proteinaggregate analysieren

zu können, wurde mit der der LMD eine Methode gewählt, die es ermöglicht, definierte

Zellstrukturen exakt und schonend aus dem umliegenden Gewebe zu isolieren. In der hier

vorliegenden Dissertation wurde das LMD 6500 von Leica verwendet. Unter Verwendung

des Systems von Leica wurden die Proteinaggregate präzise von einem Laser umfahren und

durch Schwerkraft kontakt- und kontaminationsfrei in einem Einmal-Reaktionsgefäß

gesammelt. Das Gewebe blieb dabei intakt. Bei älteren Systemen, wie der Laser Capture

Mikrodissektion (LCM), wird das Gewebe nicht herausgeschnitten sondern in einer Art

Raspelbewegung abgekratzt und mit einer Membran verschmolzen. Problematisch ist

hierbei die mögliche thermische Denaturierung der Proteine. Im Gegensatz zu älteren

Diskussion

122

Geräten bietet das LMD 6500 die Möglichkeit, die LMD in Kombination mit

Immunfluoreszenz einzusetzen. Während der Vorversuche stellte sich heraus, dass die

Filaminopathie-spezifischen Aggregate durch eine Immunfluoreszenzfärbung sehr effektiv im

Gewebe identifiziert werden konnten. Aus diesem Grund war die Fluoreszenzmikroskopie

essentiell für die Analysen. Ein zusätzlicher Vorteil des gewählten LMDs lag in der einfachen

und zeitsparenden Handhabung. Die LMD wurde stets bei Raumtemperatur durchgeführt

und um die Proteine vor vorzeitiger Denaturierung zu bewahren, war ein zügiges Arbeiten

von großem Vorteil.

5.2. Etablierung der differentiellen Proteomanalyse in Filaminopathien

Im Rahmen dieser Arbeit war es notwendig zwei Methoden zur differentiellen

Proteomanalyse von Proben aus Filaminopathiepatienten zu etablieren. Ziel der

differentiellen Proteomanalyse war es, spezifische Proteinkomponenten des

Filaminopathiegewebes und mögliche Frühstadien der Erkrankung zu charakterisieren. Für

die Charakterisierung von möglichen Frühstadien wurde das gut etablierte 2D DIGE System

gewählt. Diese Methode eignete sich allerdings aus zweierlei Gründen nicht für die

Identifizierung von spezifischen Proteinkomponenten des erkrankten Gewebes. Zum einen

erwiesen sich die Proteinaggregate als nur bedingt löslich in für die 2D-kompatiblen Urea

haltigen Puffern. Die äußerst geringe Größe und die limitierte Anzahl der Proteinaggregate in

den Patienten führten dazu, dass die Gesamtproteinkonzentration der Proben als extrem

niedrig einzustufen war. Obwohl es mit etablierten Methoden nicht möglich war, die

Proteinmenge in den Aggregaten zu bestimmen, kann davon ausgegangen werden, dass die

Proteinmenge deutlich unter 3 µg liegt, das ist die Nachweisgrenze des Saturation Labelings

[Helling et al. 2006]. Diese Umstände führten dazu, dass ein Label-freier Ansatz entwickelt

wurde, um die Proteinaggregate dennoch qualitativ und quantitativ analysieren zu können.

Diskussion

123

5.2.1. Label-freie Proteomanalyse

Die Analyse der Proteinzusammensetzung der Proteinaggregate erfolgte mittels einer

Label-freien Proteomanalyse. Die Filaminopathie-spezifischen Aggregate wurden mittels

LMD isoliert und massenspektrometrisch analysiert. Für die Auswertung der Daten wurden

eine qualitative und eine 2-stufige quantitative Strategie angewendet. Die Charakterisierung

neuer Proteinkomponenten der Aggregate und des umliegenden Gewebes sollte

Rückschlüsse auf die Pathogenese der Filaminopathie ermöglichen.

5.2.1.1. Solubilisierung der Aggregate

Für die Solubilisierung der Proteinaggregate wurden drei verschiedene Lösungsmittel

ausgetestet: 6 M Guanidin HCl (GuHCl), 8M Urea und 98 % Ameisensäure. Die chaotrophen

Substanzen 6 M GuHCl und 8 M Urea wurden verwendet, da sie bereits erfolgreich zum

Solubilisieren von Einschlusskörpern in Escherichia Coli (E.coli) verwendet wurden [Patra et

al. 2000, Tsumoto et al. 2003]. Es wurde vermutet, dass die hohe Konzentration der

chaotrophen Substanzen zu intra- und intermolekularen Interaktionen führt, infolgedessen

die Verklumpungen gelöst werden können. Die Verwendung hoch konzentrierter

Ameisensäure zum Lösen von Proteinaggregaten wurde ebenfalls mehrfach erfolgreich

durchgeführt [Klunk et al. 1994, Hazeki et al. 2000]. In der hier vorliegenden Arbeit wurden

250 Aggregate mittels LMD aus dem umliegenden Gewebe isoliert. Die

massenspektrometrische Analyse ergab, dass die Verwendung von Guanidin HCl sich nicht

zum Lösen der MFM-spezifischen Aggregate eignete. Es konnten keine Proteine identifiziert

werden. Auch die Verwendung von 8M Urea erwies sich als wenig erfolgreich. Es konnten

zwar 16 muskelspezifische Proteine identifiziert werden, doch die Zahl identifizierter

Proteine lag deutlich unter dem Ergebnis, welches mit Ameisensäure erzielt wurde.

Insgesamt konnten 119 Proteine nach Solubilisierung in hoch konzentrierter Ameisensäure

identifiziert werden. In der Literatur wurde eine mögliche Modifizierung der Proteine nach

Behandlung mit Ameisensäure in Form eines Esters an einem Serinrest beschrieben [Klunk et

al. 1994]. Diese mögliche Modifizierung wurde bei der Datenbanksuche berücksichtigt. Es

stellte sich heraus, dass keinerlei Einfluss auf die identifizierten Proteine beobachtet werden

konnte. Die Solubilisierung mit 98 % Ameisensäure erwies sich daher für die Analysen dieser

Arbeit als am erfolgversprechendsten. Dieses Protokoll für alle weiteren Analysen eingesetzt.

Diskussion

124

5.2.1.2. Optimierung der Probenmenge

Im vorangegangenen Punkt wurde beschrieben, dass sich die Aggregate am

erfolgreichsten in Ameisensäure lösen ließen. In einem nächsten Schritt sollte die optimale

Probenmenge für die massenspektrometrischen Analysen festgelegt werden. Ziel war es,

eine möglichst geringe Menge einzusetzen. In den ersten Analysen wurden 250 Aggregate

aus dem erkrankten Gewebe von Filaminopathiepatienten isoliert. Da die Zahl der Aggregate

in den einzelnen Patienten variierte und es nicht möglich war aus jedem Patienten 250

Aggregate zu isolieren, wurde versucht diese Menge zu reduzieren. Hierfür wurden 50 und

100 Aggregate mittels LMD gewonnen und anschließend massenspektrometrisch analysiert.

In 50 Aggregaten konnten lediglich 8 Proteine identifiziert werden, wobei keines der

Proteine in einen muskelspezifischen oder MFM-relevanten Kontext gebracht werden

konnte. Im Vergleich von 100 und 250 analysierten Aggregaten viel auf, dass trotz

verringerter Probenmenge die Zahl an identifizierten Proteinen in 100 Aggregaten gesteigert

werden konnte. Für eine weitere Optimierung wurden 250 und 100 Aggregate in

unterschiedlichen Volumina (20 und 40 µl) Ameisensäure aufgenommen und im direkten

Vergleich analysiert. Nach Solubilisierung von 100 Aggregaten in 20 µl Ameisensäure

konnten erneut mehr Proteine als in 250 Aggregaten identifiziert werden (siehe Tabelle 4.4.).

Die Durchsicht der UV-Spektren konnte ausschließen, dass Probleme während der

massenspektrometrischen Analyse verantwortlich für die unterschiedlichen Mengen an

identifizierten Proteinen waren. Der Grund für die extremen Schwankungen in der Zahl der

identifizierten Proteine, könnte in der Beschaffenheit der Aggregate zu finden sein. Es wird

davon ausgegangen, dass eine sehr hohe Proteinkonzentration in den Aggregaten vorliegt.

Zusätzlich könnten die Proteine sehr dicht aneinander oder ineinander gepackt sein. Umso

höher die mikrodissektierte Menge ist, umso höher ist auch die Dichte an akkumulierten

Proteinen. Das Volumen von 20 µl Ameisensäure könnte somit zu gering sein um die

akkumulierten Proteine ausreichend voneinander zu lösen. So würde nur ein minimaler

Anteil des Gesamtproteins in die massenspektrometrische Analyse mit eingehen. Unter der

Verwendung von 40 µl Ameisensäure wurden deutlich mehr Proteine identifiziert, was

suggeriert, dass mehr Proteine aus der Verklumpung gelöst wurden und für die

massenspektrometrischen Analyse zu Verfügung standen. Im direkten Vergleich zwischen

250 und 100 Aggregaten gelöst in 40 µl Ameisensäure unterschied sich die Anzahl an

Diskussion

125

identifizierten Proteinen nur gering. Aufgrund der Limitierung des Gewebes und der

Aggregatanzahl pro Schnitt erschienen 100 Aggregate, gelöst in 40 µl Ameisensäure, als

optimale Probenmenge. Die Größe der Aggregate variierte in den Patienten zum Teil extrem.

Um dennoch gewährleisten zu können, dass vergleichbare Mengen Gewebe isoliert werden,

wurden mit Hilfe des LMD 6500 die durchschnittliche Fläche von 100 Aggregaten ermittelt.

Diese belief sich auf 250 000 µm2 und wurde für alle weiteren Aggregatanalysen verwendet.

Eine zusätzliche Verbesserung der Zahl identifizierter Proteine konnte durch diverse

Aufrüstungen des Orbitrap-Massenspektrometers erreicht werden, welche die Sensitivität

des Gerätes deutlich verbesserten. Im Verlauf der Analysen konnte die Zahl der Proteine auf

durchschnittlich 450 erhöht werden.

5.2.1.3. Auswertestrategien

Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei verschiedene Ansätze zur Auswertung

der massenspektrometrischen Daten getestet. Zu Beginn des Projektes war die

Zusammensetzung der Filaminopathie-spezifischen Proteinaggregate sowie des umliegenden

Gewebes nahezu unklar. In Immunfluoreszenzstudien konnten zwar einige Bestandteile der

Aggregate aufgedeckt werden [Kley et al. 2007 und 2012], eine detaillierte Übersicht des

Proteoms von Filaminopathiegewebe lag jedoch nicht vor. Um eine detaillierte

Charakterisierung des Gewebes zu erreichen, wurden Aggregatproben und nicht betroffene

Muskelfasern (Patientenkontrolle) von 6 Filaminopathiepatienten mit 3 verschiedenen

Mutationen in der Stabregion des Filamin C analysiert. Als Kontrolle dienten Muskelfasern

aus gesunden Patienten (Negativkontrolle). Zwei Vergleiche wurden angestrebt: 1.

Aggregatproben gegen Patientenkontrollen, 2. Patientenkontrollen gegen Negativkontrollen.

Der Vergleich von Aggregatproben und Patientenkontrollen sollte helfen, Proteine zu

identifizierten, die ausschließlich in den Aggregaten vorkommen und somit spezifische

Bestandteile der Aggregate darstellen. Der 2. Vergleich (Patientenkontrollen gegen

Negativkontrollen) wurde gewählt, um Unterschiede in der Proteinzusammensetzung der

Patientenkontrolle zu den Negativkontrollen aufzudecken. Die Identifizierung spezifischer

Proteine in den Patientenkontrollen sollte neue Erkenntnisse über Frühstadien ermöglichen.

Mit den hier gewählten Vergleichen war es möglich intraindividuelle Unterschiede in den

Proben zu ermitteln und so spezifische Charakteristika im Gewebe der Patienten zu

Diskussion

126

identifizieren. In einem Vergleich von Aggregatproben aus Patienten und Negativkontrollen

aus gesundem Gewebe ist es nicht möglich intraindividuelle Unterschiede zu detektieren.

Aus diesem Grund wurde im Vorfeld der Analysen diese Art des Vergleichs ausgeschlossen.

Es wurde davon ausgegangen, dass generelle Unterschiede im Proteinmuster von

Filaminopathie-spezifischen Aggregaten und Normalgewebe bestehen.

Etablierung einer qualitativen und manuell durchgeführten

quantitativen Auswertestrategie

Für die qualitative Auswertung wurden aus den generierten MS/MS-Spektren mittels

Datenbankabgleich Proteinlisten erstellt. Es konnten durchschnittlich 415 Proteine in den

Aggregatproben der Filaminopathiepatienten identifiziert werden, von denen einige durch

bereits veröffentlichte Immunfluoreszenzstudien als feste Bestandteile der Filaminopathie-

spezifischen Aggregate bekannt waren. Der Großteil der generierten Proteinliste setzte sich

jedoch aus unbekannten Komponenten zusammen. Die Identifizierung von möglichen

Filaminopathie-spezifischen Proteinen in den Aggregaten, die nicht im umliegenden Gewebe

gefunden werden können, war von besonders großem Interesse. Um dies zu erreichen

musste zunächst eine manuell durchgeführte quantitative Auswertestrategie hinzugezogen

werden, da zu Beginn der Analyse auf keine etablierte automatisierte Auswertestrategie

zurückgegriffen werden konnte. Die Proteinlisten aus der qualitativen Auswertung wurden

zunächst nach stringenten Maßstäben sortiert (beschrieben unter Punkt 3.17.1.). Alle

Proteine, die in den Aggregatproben und in den Patientenkontrollen auftraten, wurden in

dieser Auswertung vernachlässigt. Insgesamt konnten durch diese Auswertestrategie 111

Proteine ausschließlich in den Aggregaten gefunden werden (siehe Tabelle 4.5.). Die

Proteinliste enthielt interessante Aggregat-spezifische Kandidaten, z.B. Xirp2, Rab35 und

DNAJB4. Im Laufe dieser Arbeit konnten die Proteine Xirp2 und Rab35 mittels

Immunfluoreszenfärbungen als neue Komponenten der Filaminopathie-spezifischen

Aggregate validiert werden. Zusätzlich befand sich das Protein DNAJB4 (Hitzeschockprotein

40 Homolog) unter den spezifischen Proteinen. DNAJB4 wird hauptsächlich im Herzen und

im Skelettmuskel exprimiert [Hoe et al. 1998]. Das Protein fungiert als Co-Chaperon und ist

in die Regulation des Hitzeschockproteins Hsp70-Aktivität involviert [Qiu et al. 2006]. In

Patienten mit Lungenkrebs konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression von

Diskussion

127

DNAJB4 die Apoptose in Zellen verstärkt [Wang et al. 2005 und 2007, Tsai et al. 2006, Lei et

al. 2011]. Die Sequenzhomologie zu anderen Mitgliedern der J-Proteinfamilie beträgt ca.

84% [Hoe et al. 1998]. Nach Durchsicht der MS/MS-Spektren konnte allerdings das

identifizierte Protein eindeutig als DNAJB4 bestätigt werden. Die Proteine DNAJB6 und

DNAJB1 wurden bereits in Verbindung mit Myofibrillären Myopathien gebracht: DNAJB6

[Sarparanta et al. 2012] und DNAJB1, welches erst kürzlich als Komponente der Aggregate

bestätigt werden konnte [Kley et al. 2013]. Die in früheren Immunfluoreszenzstudien als

Bestandteile der Aggregate identifizierten Proteine Filamin C, Desmin, Xin und Myotilin [Kley

et al. 2007] wurden unter der Verwendung der manuellen Auswertung nicht als spezifische

Merkmale der Aggregate identifiziert, sondern konnten wie zu erwarten ebenfalls in den

Patientenkontrollen identifiziert werden. Dies lässt sich mit der Funktion der erwähnten

Proteine begründen. Vor allem Desmin und Filamin C übernehmen eine wichtige Rolle zur

Aufrechterhaltung der intrazellulären Integrität. So ist es nicht verwunderlich, dass diese

Proteine in Aggregaten und Patientenkontrollen gefunden wurden. Bei dem Vergleich der

Patientenkontrollen mit den Negativkontrollen wurden mit der manuellen Strategie 17

Proteine als spezifische Bestandteile der Patientenkontrollen identifiziert, darunter

befanden sich u.a. die Filamin C-Bindungspartner Xin und N-Rap. 68 Proteine wurden nur in

den Negativkontrollen identifiziert, der Großteil der Proteine (176) konnte in den Patienten-

wie auch den Negativkontrollen identifiziert werden. Die massenspektrometrische Analyse

gekoppelt mit der hier gewählten Auswertestrategie ermöglichte neue Einblicke in die

Proteinzusammensetzung der Filaminopathie-spezifischen Aggregate. Dabei wurden viele

interessante Komponenten der Aggregate und mögliche Frühmarker im umliegenden

Gewebe der Patienten aufgedeckt, die eine entscheidende Rolle in der Filaminopathie

spielen könnten.

Die hier dargestellte Auswertung zur manuell durchgeführten quantitativen Analyse von

Filaminopathiegewebe stellte eine einfache Methode zur quantitativen Analyse des

Filaminopathiegewebes dar und war zu Beginn der Analysen die einzige Möglichkeit die

generierten Daten auszuwerten. In der Auswertung wurden lediglich die Proteine

berücksichtigt, die nur im Gewebe der Patienten identifiziert werden konnten. Diese

Einschränkung führte dazu, dass bereits durch Immunfluoreszenzstudien bestätigte

Komponenten der Aggregate in der finalen Proteinliste nicht berücksichtigt wurden. Es

Diskussion

128

wurde deutlich, dass sich physiologische Vorgänge nur bedingt über „Schwarz-Weiß“-Effekte

in der Proteinzusammensetzung beschreiben lassen. Es ist wichtig, die Regulation von

Proteinen miteinzubeziehen. Diese mögliche differentielle Expression von Proteinen in

unterschiedlichen Proben wurde durch die Entwicklung eines automatisierten Ansatzes

mittels Spectral Countings berücksichtigt.

Die relative Quantifizierung mittels Spectral Counting

Um differentielle Proteine in den Aggregaten bzw. in den Patientenkontrollen

identifizieren zu können, wurde im Rahmen der Masterarbeit von Alexandra Maerkens das

sogenannte Spectral Index Calculation als alternative Methode zur Analyse von

Filaminopathiegewebe etabliert. Die Spectral Index Calculation stellt eine Weiterentwicklung

der im Rahmen dieser Dissertation entwickelten manuellen quantitativen Auswertung. Unter

Verwendung des Spectral Countings konnten insgesamt 69 Proteine als statistisch signifikant

akkumuliert in den Aggregaten identifiziert werden. Unter den identifizierten Proteinen

befanden sich auch die Proteine, die in vorangegangen Studien als Bestandteile der

Proteinaggregate in Filaminopathien beschrieben wurden: Filamin C, Desmin, Xin, Myotilin,

alpha B Crystallin und diverse Hitzeschockproteine. In den Patientenkontrollen wurden im

Vergleich zu den Negativkontrollen 27 differentielle Proteine nachgewiesen (siehe Anhang

Tabellen 13.1. und 13.2.).

Bei dem Spectral Index Calculation handelt es sich um eine relative Quantifizierung

der identifizierten Proteine [Müller et al. 2011]. Die relative Quantifizierung erfasst

Unterschiede von Probe zu Probe ohne dabei die absolute Menge der darin enthaltenen

Proteine zu beachten. Die Spectral Index Calculation ist eine schnelle und kostengünstige

Methode, die vorzugsweise ihre Anwendung in der klinischen Forschung zur Identifizierung

neuer Biomarker findet [Zhou et al. 2010]. Die Ergebnisse und die daraus resultierende

Rangordnung der Proteine basieren auf der Summierung der Spektren detektierbarer

Peptide pro Proteine, welche proportional zur Konzentration eines Peptides ist [Liu et al.

2004, Müller et al. 2011]. Ein Nachteil des Spectral Index Calculation besteht darin, dass die

Anzahl der detektierbaren Peptide wahrscheinlich mit der Länge eines Proteins korreliert.

Dies bedeutet, je länger ein Protein ist, desto mehr Peptide können massenspektrometrisch

erfasst werden. Längere Proteine mit vielen Spaltstellen für Trypsin werden in dieser Analyse

Diskussion

129

bevorzugt detektiert. Kürzere, möglicherweise relevante Proteinen bleiben hingegen

unterrepräsentiert. Mittels absoluter Quantifizierung ist es möglich, über die Einbeziehung

der tatsächlich detektierten Peptide auch die theoretischen Peptide exaktere Informationen

über die Zusammensetzung von Proben zu gewinnen. Eine etablierte Methode zur absoluten

Quantifizierung stellt AQUA (absolute quantification of proteins) dar [Gerber et al. 2003].

AQUA erlaubt die direkte Quantifizierung von Differenzen in Proteinen und

posttranslationalen Modifikationen. Die Methode basiert auf der Verwendung chemisch

synthetisierter Isotopen-Peptide, welche unique für die Proteine der Wahl sind. Eine

definierte Menge der Peptide wird als interner Standard der Probe zugesetzt [Lil 2003,

Langenfeld et al. 2008]. Ein Nachteil der Methode ist, dass sie sehr aufwendig und kostspielig

ist. Alternative Methoden zur absoluten Quantifizierung sind: emPai (exponentially modified

protein abundance index) [Ishihama et al. 2005] und APEX (absolute protein abundance

index) [Lu et al. 2007]. Beide Methoden beruhen auf der Label-freien Quantifizierung. Im

Gegensatz zur Spectral Index Calculation werden bei diesen Methoden auch die Anzahl an

theoretisch entstehenden Peptiden berücksichtigt. Die Etablierung einer Methode zur

absoluten Quantifizierung könnte die Rangordnung an akkumulierten Proteinen in den

Filaminopathie-spezifischen Aggregaten (beschrieben im Anhang Tabellen 13.1. und 13.2.)

um weitere interessante Proteine ergänzen. Das Einbeziehen kleinerer Proteine und

Proteine, die über weniger Trypsinschnitt dahin verfügen, könnte zu einer noch

detaillierteren Aufklärung der Zusammensetzung der Aggregate führen. Daraus könnten sich

zusätzliche Hinweise auf die Pathomechanismen ergeben.

Vergleich der Auswertestrategien

Im Laufe dieser Arbeit entwickelte sich die Auswertestrategie von einer manuellen

(„pseudo-quantitativen“) Auswertung hin zu einer automatisierten relativen Quantifizierung.

Die manuelle Auswertung ermöglichte einen sehr interessanten Überblick über die

Zusammensetzung der Proteinaggregate und schien sehr gut geeignet um subtypische

Proteine zu identifizieren. 111 Proteine konnten mittels der einfachen und manuellen

Auswertung als Bestandteile der Proteinaggregate identifiziert werden. Zusätzlich konnten

17 Proteine in den Patientenkontrollen als mögliche Biomarker für Frühstadien der

Filaminopathie gefunden werden. Trotz dieser Erfolge musste die Aussagekraft dieses

Diskussion

130

Ansatzes als begrenzt eingeschätzt werden. Die manuelle Auswertung ermöglichte lediglich

Aussagen über das (Nicht-) Vorhandensein von Proteinen. Die Entstehung der

Filaminopathie unterliegt allerdings einem Entwicklungsprozess, erste Symptome der

Filaminopathie manifestieren sich erst zwischen dem 40. und 60. Lebensjahr [Vorgerd et al.

2005, Kley et al. 2007]. Die Entwicklung von gesundem zu erkranktem Gewebe wird mittels

der manuellen Auswertung nicht widergespiegelt. Durch die Weiterentwicklung der

Auswertestrategie hin zu einer automatisierten Analyse mittels Spectral Index Calculation

konnten Veränderungen während des Entwicklungsprozesses detektiert werden. Durch die

Spectral Index Calculation konnten regulierte Proteine dargestellt und eine Rangordnung der

identifizierten Proteine erstellt werden (siehe Anhang Tabellen 13.1. und 13.2.). 38 % (38

Proteine) der Proteine aus der manuellen Auswertung konnten auch mittels Spectral Index

Calculation identifiziert werden. In den Patientenkontrollen konnten dagegen keine

Gemeinsamkeiten beobachtet werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Auswertestrategien sehr schnell und

einfach durchzuführen sind. Die Spectral Index Calculation stellt jedoch eine sinnvolle

Weiterentwicklung der hier manuell durchgeführten quantitativen Auswertung dar, um

differentiell regulierte Proteine zu identifizieren. Zusätzlich zeichnen sich beide Strategien als

einfache und kostengünstige Methoden aus. 38% aller Proteine, die ausschließlich in den

Aggregaten gefunden wurden, konnten mit beiden quantitativen Auswertestrategien

identifiziert werden. Die restlichen 62% der Proteine könnten sich gegenseitig ergänzen und

einen Schritt zur Aufklärung des Pathomechanismis beitragen. Beide Strategien bieten

ausreichend Potential für weiterführende (Validierungs-) Studien in den Aggregaten.

5.2.1.4. Die physiologische Bedeutung der differentiell exprimierten Proteine in

den Aggregaten

In der massenspektrometrischen Analyse konnten durchschnittlich 415 Proteine in

Filaminopathie-Aggregatproben und 335 Proteine in den entsprechenden

Patientenkontrollen identifiziert werden. Demnach konnten in den Aggregatproben ca. 20 %

mehr Proteine identifiziert werden als in den Patientenkontrollen. Dieses Ergebnis deckt sich

mit der Vermutung, dass die Proteinkonzentration in den Aggregaten erhöht ist. In der

qualitativen Proteomanalyse der Filaminopathie-Aggregatproben konnten viele Z-Scheiben

Diskussion

131

assoziierte Proteine, wie Filamin C und dessen Bindungspartner N-Rap, Obscurin, Myotilin

und Xin [Dalkilic et al. 2002, Lu et al. 2003, Van der Veen et al. 2000 und 2006] identifiziert

werden. Alle Proteine, bis auf N-Rap und Obscurin, wurden bereits früheren

Immunfluoreszenzstudien als Bestandteile der Aggregate verifiziert [Kley et al. 2007].

Mutationen im Filamin C können zu strukturellen Veränderungen führen, die sich direkt auf

die Z-Scheiben der Myofibrillen und Z-Scheiben assoziierte Proteine auswirken können. So ist

es nicht verwunderlich, dass neben Filamin C auch dessen Bindungspartner zu finden sind.

Dies sind allerdings nicht alle Proteine, die im direkten Kontakt zur Z-Scheibe stehen.

Proteine wie alpha Actinin und dessen Bindungspartner Myopodin [Faul et al. 2007,

Linnemann et al. 2010] konnten weder in der Label-freien Proteomstudie noch in

Immunfluoreszenzstudien als Bestandteile der Aggregate identifiziert werden [Kley et al.

2012]. Aufgrund dieser Erkenntnisse lassen sich zwei Gruppen von Z-Scheiben assoziierten

Proteine bilden: die erste Gruppe umschließt Filamin C und dessen Interaktionspartner, die

zweite Gruppe alpha Actinin samt Bindungspartner [Kley et al. 2012]. Diese Einteilung lässt

die Vermutung zu, dass Filamin C und dessen Bindungspartner eine bedeutende Rolle in der

Pathogenese der MFM, im speziellen der Filaminopathien, spielen. Actinin und dessen

Bindungspartner hingegen könnten in der Entwicklung anderer Myopathien involviert sein

[Claeys et al. 2009]. Als eine weitere Muskel-spezifische Proteingruppe wurden

Intermediärfilamente und einige ihrer Bindungspartner in den Aggregatproben identifiziert.

Desmin und dessen Interaktionspartner Vimentin, Nestin [Steinert et al. 1999], Syncollin

[Poon et al. 2002], Nexilin [Hassel et al. 2009] und alpha B Crystallin [Bennardini et al. 1992].

Die Intermediärfilamente spielen eine extrem wichtige Bedeutung in den Myofibrillen. Durch

die Verbindung anliegender Myofibrillen im Bereich der Z-Scheiben wird ein

dreidimensionales Netzwerk geschaffen, das die Stabilität der Myofibrillen gewährleistet.

In der manuell durchgeführten quantitativen Analyse konnten 111 Proteine als

spezifische Bestandteile der Aggregate identifiziert werden, darunter Xirp2 und Rab35. Xirp2

(Xin repeat protein 2) wurde ausschließlich in den Aggregatproben von

Filaminopathiepatienten identifiziert. 2004 wurde es von Pacholsky et al. erstmals

beschrieben. Xirp2 enthält eine sich wiederholende Sequenz bestehend aus 16

Aminosäuren, die sich auch in Xin wiederfindet [Wang et al. 1999]. Xirp2 wie auch Xin

verfügen über ein Aktin-bindendes Motiv und sind somit an der (Re-)Organisation des

Diskussion

132

Zytoskeletts beteiligt [Huang et al. 2006]. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass nicht nur Xin

ein Bindungspartner von Filamin C ist sondern auch Xirp2 [Kley et al. 2013]. Auch wenn beide

Proteine gleichzeitig mit Filamin C assoziieren können, konnte in Konkurrenzessays gezeigt

werden, dass die Bindung zwischen Xirp2 und Filamin C stärker ist als die Bindung zwischen

Filamin C und Xin [Kley et al. 2012]. Es bleibt zu klären, welche Rolle genau Xirp2, Xin und

Filamin C während der Proteinaggregation und der Destabilisierung der Myofibrillen spielen.

Rab35 (Ras related Protein 35) konnte als weiterer neuer Bestandteil von Filaminopathie-

spezifischen Aggregaten identifiziert werden. Rab35 ist eine kleine GTPase, dessen

Hauptaufgabe vor allem in der Beeinflussung der Aktin-Dynamik liegt [Chua et al. 2010]. Die

genaue Rolle in der Pathogenese der Filaminopathie und in anderen MFM-Subtypen muss in

Zukunft geklärt werden. Unter den 111 als spezifisch für Aggregate identifizierten Proteine

befanden sich allerdings weder Filamin C noch Desmin und deren Bindungspartner. Um

spezifische Proteinkomponenten der Aggregate identifizieren zu können, wurden strikte

Kriterien gewählt (beschrieben unter 3.17.1.). Es wurden nur die Proteine als spezifische

Bestandteile akzeptiert, die ausschließlich in den Aggregatproben und gleichzeitig in keiner

Patientenkontrolle gefunden wurden. Filamin C, Desmin und deren Bindungspartner sind

wichtige strukturgebende Proteine im gesunden Muskel, so dass es zu erwarten war, dass

diese Proteine keine spezifischen Komponenten der Aggregate darstellen können.

Durch die Weiterentwicklung der manuellen Auswertung zu einer automatisierten

Strategie war es möglich, differentielle Proteine in den Filaminopathie-spezifischen

Aggregaten zu identifizieren und eine Rangordnung der akkumulierten Proteine zu erstellen.

Proteine wie z.B. Filamin C, Desmin und deren Bindungspartner, die in der manuell

durchgeführten Analyse nicht berücksichtigt wurden, konnten mittels Spectral Index

Calculation als differentielle Proteine identifiziert werden. Die Spectral Index Calculation-

basierte Analyse der Proteinaggregate ergab ein sehr homologes Muster in der

Zusammensetzung. In allen Patienten konnte Filamin C, unabhängig von der vorliegenden

Mutation, als das am höchsten akkumulierte Protein nachgewiesen werden. Die

nachfolgenden Positionen waren ebenfalls mit Desmin, Xirp2 und N-Rap immer gleich

besetzt. Dieses homologe Muster in der Zusammensetzung steht in Einklang mit den

klinischen Merkmalen der Filaminopathie, welche unabhängig von der Mutation große

Ähnlichkeiten aufweisen [Kley et al. 2007].

Diskussion

133

Ziel der differentiellen Proteomanalyse von Proteinaggregaten war es, spezifische

Proteine zu identifizieren, die im Vergleich zum umliegenden Gewebe bevorzugt in die

Aggregate integriert bzw. eingebaut werden. Zusätzlich war es interessant zu sehen, ob

einige dieser Proteine als eindeutige Marker für die Filaminopathie dienen könnten. Das im

Rahmen dieser Arbeit validierte Protein Xirp2 konnte nur in den Aggregaten und nicht im

umliegenden Gewebe identifiziert werden. Allerdings zeigte eine erst kürzlich veröffentlichte

Proteomanalyse von Aggregaten aus Desminopathiepatienten, dass Xirp2 auch ein fester

Bestandteil der Desminopathie-Aggregate ist [Maerkens et al. 2012]. Rab35 hingegen konnte

ausschließlich in den Aggregaten der Filaminopathiepatienten als akkumuliertes Protein

identifiziert werden. In Zukunft müssen die Aggregate weiterer MFM-Subtypen analysiert

werden, um genau zu klären, welche Proteine subtypisch akkumulieren und inwieweit ein

gemeinsamer Pathomechanismus der verschiedenen Subtypen vorliegt.

5.2.2. Gel-basierte differentielle Analyse

Die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D PAGE) gehört zu der am

häufigsten angewandten Technik in der Proteomik [May et al. 2012]. Besonders die

Weiterentwicklung zur zweidimensionalen Differential-In-Gel-Elektrophorese (2D DIGE)

ermöglichte und vereinfachte den quantitativen Vergleich von mehreren Proben [Rabilloud

2012]. Doch in Bezug auf die hier durchgeführten Analysen der Proteinaggregate stieß die 2D

DIGE auf ihre Grenzen. In der Planungsphase der differentiellen Studien wurde die Analyse

der Aggregate und des umliegenden Gewebes (PatKO) mit beiden Ansätzen (DIGE und Label-

frei) in Betracht gezogen, um die erzielten Ergebnisse besser absichern zu können. Doch die

begrenzte Löslichkeit der Aggregate in Urea-haltigen Puffern verhinderte den Einsatz der 2D

DIGE als ergänzende Methode zum Label-freien Ansatz (siehe Punkt 4.1.2. und 4.1.3.). So

wurden lediglich Muskelzellen ohne Aggregate aus den Filaminopathiepatienten isoliert und

mittels der Label-freien Methode und mittels 2D DIGE analysiert, um diese auf mögliche

Marker für Frühstadien zu analysieren.

Essentiell für eine differentielle Proteomanalyse mittels 2D PAGE ist eine hohe

technische Reproduzierbarkeit. Technische Varianten entstehen z.B. während der

Probenpräparation und führen zu Unterschieden in der Spotanzahl sowie in der Abundanz

der Proteine. Daraus resultieren falsche Quantifizierungen. Besonders bei einer hohen

Diskussion

134

Probenzahl bzw. Gelanzahl ist es wichtig, die technischen Varianzen zu minimieren. Die

Weiterentwicklung der 2D PAGE zur zweidimensionalen 2D DIGE minimiert die technische

Variabilität [Ünlü et al. 1999]. Für die Analyse der mikrodissektierten Skelettmuskelproben

bietet sich die Verwendung des Saturation-Labeling-System an, weil es sich optimal für die

Markierung von gering konzentrierten Proben eignet [Helling et al .2006] Beim Saturation-

Labeling stehen zwei Farbstoffe zur Verfügung (Farbstoffe Cy3 und Cy5). Vor Beginn der

ersten Dimension werden die zu analysierenden Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen

markiert. Der Einsatz der CyDye-Farbstoffe ermöglichte es, 2 Proben gleichzeitig auf ein Gel

aufzutragen und separieren zu können. Dadurch werden die Reproduzierbarkeit und auch

die Quantifizierbarkeit der Proteinspots verbessert [Klose 2009]. Durch die simultane

Auftrennung mehrerer Proben auf einem Gel wird die Gesamtzahl der Gele drastisch

reduziert [Tonge et al. 2001]. Durch den Einsatz des DIGE-Systems ist neben der

Minimierung technischer Variationen die Steigerung der relativen Quantifizierung [Tonge et

al. 2001] und Sensitivität durch Fluoreszenzdetektion möglich [Ünlü et al. 1997].

5.2.2.1. Optimierung der Probenmenge

Zu Beginn der Arbeiten war unklar, wie viele mikrodissektierte Muskelzellen für die

2D DIGE benötigt werden würde. Sitek et al. isolierten 1000 Zellen mittels LMD aus

Patienten mit Adenokarzinom und trennten diese nach Saturation Labeling über die 2D

PAGE auf [Sitek et al. 2005]. In der Studie konnte eine vergleichbare Menge an Proteinspots

wie in vorangegangen Studien detektiert werden, allerdings mit einem deutlich verringerten

Einsatz an Material. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kombination aus LMD und 2D

Saturation Labeling sich optimal dazu eignet, gering konzentrierte Proben mittels 2D PAGE

aufzutrennen. Um in der hier vorliegenden Arbeit die optimale Menge an Muskelzellen

herauszufiltern, wurden 1000, 2000, 3000 und 5000 Zellen mittels LMD isoliert. 1000 (Daten

nicht gezeigt), 2000 und 5000 mikrodissektierte Zellen erwiesen sich als ungeeignet. Die

Auftrennung von 1000 mikrodissektierten Zellen erwies sich als zu wenig. Der direkte

Vergleich von 2000 und 3000 mikrodissektierten Zellen resultierte in einer vergleichbaren

Anzahl an detektierten Spots. Dennoch wurde das Ergebnis mit 3000 Zellen als am besten

eingestuft (siehe Punkt 4.3.1.). Es konnte eine sehr gute Auftrennung der Proteine erzielt

werden und die einzelnen Proteinspots distinkt dargestellt werden. Die Verwendung von

Diskussion

135

5000 mirkodissektierten Zellen verschlechterte das Proteinmuster. Zum einen verschmolzen

mehrere gering abundante Proteinspots zu einem großen Spot oder die gering abundanten

Spots wurde durch die erhöhte Proteingesamtkonzentration von anderen Spots überlagert.

Aufgrund der variierenden Größe der Muskelfasern wurde auch hier die

durchschnittliche Fläche von 3000 Zellen mit Hilfe des LMD 6500 (Leica, Wetzlar,

Deutschland) ermittelt. Diese betrug 1,6 Mio. µm2 und wurde für die folgenden Analysen

isoliert. Die Fläche war mehr als 6mal so groß wie die Fläche, die für die Label-freien

Aggregatanalysen (250 000 µm2) gesammelt wurde. Eine 2D DIGE Studie wurde aufgrund der

begrenzten Löslichkeit der Aggregate in Urea-haltigen Puffern im Vorfeld ausgeschlossen.

Die benötigte Fläche an Material von 1,6 Mio. µm2 hätte eine 2D Studie mit den ohnehin

limitierten Aggregaten zusätzlich erschwert.

5.2.2.2. Detektion differentiell exprimierter Proteine

Die 2D PAGE stellt eine exzellente Methode zur Auftrennung komplexer

Proteingemische (z.B. Zell- und Gewebelysate) dar. Besonders gut lassen sich Proteine mit

hydrophilen Eigenschaften darstellen. Membranproteine und andere hydrophobe Proteine

hingegen sind eher unterrepräsentiert [Santoni et al. 2000, Rabilloud 2002]. Die Bildanalyse

stellt einen elementaren Schritt zur Identifizierung differentieller Proteine dar. Nach der

Separation im Gel erfolgte die Quantifizierung durch einen Software-basierten Gelvergleich

(DeCyder™ Software). Vor Beginn der Analyse wurden die Gele zurechtgeschnitten. Es wurde

darauf geachtet, dass die Lauffront, bestehend aus Bromphenolblau, entfernt wurde, da

diese zu falsch positiven Detektionen führen kann Die verschiedenen Fluoreszenzbilder

wurden dann übereinander gelegt. Die Spotzuordnung erfolgte zunächst automatisch.

Allerdings musste die Zuordnung manuell nachbearbeitet werden. In früheren Studien

konnte gezeigt werden, dass eine falsche Spotzuordnung zu einer Abweichung von bis zu

einem Drittel bei der Quantifizierung führt [Schroder et. al. 2008]. Insgesamt wurden pro ca.

4300 Proteinspots pro Gel detektiert, darunter befanden sich 15 differentiell exprimierte

Spots. Die Proteine wurden tryptisch im Gel verdaut und mittels MALDI analysiert. Die

MALDI-MS [Karas und Hillenkamp 1988, Karas et al. 2000] ist eine schnelle und zuverlässige

Methode zur Hochdurchsatzanalyse. Die Identifizierung der Proteine erfolgt meist mittels

Peptidmassen-Fingerprint [Shevchenko et al. 1996]. 7 der 15 differentiell exprimierten Spots

Diskussion

136

konnten eindeutig identifiziert werden. In den restlichen Spots hingegen konnten auch nach

mehrfachen Wiederholungen keine Proteine identifiziert werden. Generell ist zu bemerken,

dass die Proteinmenge innerhalb der Spots als sehr gering einzuschätzen war. Somit könnte

dies eine Hauptursache für die fehlenden Proteinidentifizierungen sein. Um zu klären, ob die

geringe Proteinmenge das einzige Problem darstellt, wäre es in zukünftigen Versuchen

sinnvoll die Menge an mikrodissektierten Gewebe zu steigern. Allerdings wurde bereits in

den Vorstudien gezeigt, dass 2D Analysen mit 5000 mikrodissektierten Muskelzellen zu

keinem optimalen Ergebnis führen, da gering abundante Spots zu einem großen Spot

verschmolzen (beschrieben in Punkt 4.3.). In diesem Falle wäre es am sinnvollsten ein

sensitiveres Massenspektrometer zu wählen. Für die Wahl eines sensitiveren

Massenspektrometers sprechen auch die Arbeiten von Kondo et al. Kondo und dessen

Mitarbeiter führten diverse differentielle Studien unter Verwendung der LMD und

Saturation CyDyes durch [Fujii et al. 2005, Fujii et al. 2006; Kondo 2008]. Ihnen war es

möglich viele der als differentiell exprimierten Proteine zu identifizieren. Allerdings stellten

sie Probleme in der Identifizierung von fluoreszenz-markierten Proteinen mittels MALDI fest.

Sie vermuten, dass das Markieren der Proteine mit CyDyes die Ionisation der Peptide stört

und somit die Identifizierung verhindert. Im Weiteren wäre es sinnvoll die Effektivität des

tryptischen Verdaus zu überprüfen oder zu optimieren. Bao et al. beschrieben 2008 eine

alternatives Protokoll zum tryptischen Verdau. Darin wurden die Gelstückchen mit einer

Infrarot-Lampe behandelt. Die Dauer des Verdau konnte von 16h auf 5 min reduziert werden

[Bao et al .2008, Wang et al. 2008]. Die anschließende Analyse der Peptide mittels MALDI

resultierte in einer gesteigerten Sequenzabdeckung der identifizierten Proteine. Eine

ebenfalls von Wang et al. veröffentlichte Methode zur Optimierung des tryptischen Verdaus

beschreibt den beschleunigten In-Lösung-Verdau von Proteinen in einem elektrischen Feld

mit Wechselspannung [Wang et al. 2008]. Die Dauer des Verdaus konnte von 12h auf 5 min

reduziert werden. Die Tauglichkeit der Methode konnte auch für den In-Gel-Verdau bestätigt

werden.

Diskussion

137

5.2.2.3. Die physiologische Bedeutung der differentiell exprimierten Proteine in

Patientenkontrollen

Ziel der hier durchgeführten 2D DIGE Studie war es, differentiell exprimierte Proteine

in Filaminopathiegewebe zu identifizieren. Hierzu wurde Gewebe ohne Aggregate aus den

Patienten isoliert und gegen Gewebe von Gesunden verglichen. Das Aggregat-freie

Patientenmaterial stellte in der 2D Studie eine Art frühes Krankheitstadium dar. Die

Identifizierung von differentiellen Proteinen und deren Einordnung in den biologischen

Kontext sollte helfen, Rückschlüsse auf die Pathomechnismen der Filaminopathien zu

gewinnen. In der 2D DIGE konnten 15 differentielle Proteinspots in erkranktem Gewebe

detektiert werden. Die Gelspots wurden aus dem Gel ausgestanzt, tryptisch im Gel verdaut

und anschließend mittels MALDI analysiert. Insgesamt konnten 7 der 15 Spots eindeutig

identifiziert werden. Zwei der regulierten Spots wurden als Desmin identifiziert. Zusätzlich

wurden in den Spots die Proteine Glykogen Phosphorylase (muskelspezifische Form),

Creatine Kinase M-Typ (CKM), Aktin (alpha Aktin 1, Skelettmuskel), Gelsolin und die leichte

Kette 3 von Myosin. Desmin, CKM, Aktin und die Glykogen Phosphorylase konnten zusätzlich

in der Label-freien Proteomanalyse im Vergleich von Patienten- und Negativkontrollen als

differentielle Proteine identifiziert werden.

Desmin ist ein 53 kDa großes Intermediärfilament der Gruppe III. Es wird

hauptsächlich in Skelett- und Herzmuskulatur sowie in der glatten Muskulatur exprimiert.

Die Hauptaufgabe des Desmins liegt in der Ausbildung eines stabilen dreidimensionalen

Fasernetzwerks, dass die Integrität der Muskelzelle aufrecht erhält [Herrmann et al. 2004,

Olive et al. 2011]. Dieses Netz erstreckt sich durch die gesamte Zelle und vernetzt die

verschiedensten Kompartimente miteinander, z.B. Z-Scheiben untereinander und mit der

Plasmamembran sowie Zellmembran mit zytosolischen Membranorganellen [Herrmann et

al. 2004].Im Herzmuskel stellt Desmin die Hauptkomponente der Purkinje-Fasern dar und ist

besonders im Bereich der interkallierenden Scheiben vermehrt zu finden [Goldfarb 2004].

Bis heute sind über 60 Mutationen im für Desmin codierenden Gen bekannt, die u.a. MFM

verursachen können [Maerkens et al. 2013]. Die Desminopathie wurde erstmals von

Goldfarb 1998 beschrieben. Ähnlich wie in den Filaminopathien sind proximale aber auch

distale Muskelgruppen von der Erkrankung betroffen. Hinzu kommt, dass bei

Desminopathiepatienten auch Kardiomyopathien beobachtet werden können [Goldfarb et

Diskussion

138

al. 2004], die die Lebenserwartung der Patienten deutlich einschränken. Erst kürzlich

konnten wir zeigen, dass Desmin in Filaminopathie-spezifischen Aggregaten das am

zweithöchsten akkumulierte Proteinen ist [Kley et al. 2012]. In Desminopathien ist es das am

höchsten akkumulierte Protein in den Aggregaten [Maerkens et al. 2013].

Die Glykogen Phosphorylase (PYG) ist ein zytosolisches Enzym des

Glykogenstoffwechsels, welches die phosphorolytische Spaltung des Glykogens in Glukose-1-

Phosphat katalysiert. Es gibt drei verschiedene Isoformen: PYGB (Gehirn, Herz), PYGL (Leber)

und PYGM (Muskel). Die Glykogen Phosphorylase wird durch Glukose und ATP inhibiert und

durch AMP aktiviert [Berg, Tymoczko, Stryer, Biochemie. 5. Auflage. Spektrum Akademischer

Verlag, Heidelberg 2003]. 1951 wurde die Fehlfunktion der Glykogen Phosphorylase erstmals

mit einer Erkrankung der Muskulatur in Verbindung gebracht: McArdle-Krankheit [McArdle

1951]. Es handelt sich dabei um eine autosomal-rezessiv vererbbare Krankheit, in der der

Abbau von Glykogen in Glukose gestört ist. Dadurch kommt es zu einer Anhäufung von

Glykogen und zu einer Energieunterversorgung der Muskulatur. Die Folge sind

Muskelschmerzen und geringe Belastbarkeit der Muskeln. In schwerwiegenden Fällen kann

es zu akutem Nierenversagen kommen, da aufgrund der Störung der Integrität der

Muskelfasern große Proteine wie z.B. Myoglobin in den Blutkreislauf gelangen und die

Nieren schädigen können. 1993 wurde die erste Mutation von Tsujion et al. beschrieben.

Weitere 4 Mutationen konnten 1998 in 9 Patienten acht nicht verwandter Familien

identifiziert werden [Vorgerd et al. 1998]. Inzwischen sind über 50 Mutationen in der

Glykogen Phosphrylase bekannt. Bei ca. 70% aller Patienten tritt die R50X-Mutationen auf

[Deschauer et al. 2007]. Sie stellt ein Stopcodon dar, wodurch die Produktion des Enzyms

eingestellt wird. Als Folge wird ein verkürztes Enzym oder gar unwirksames Enzym

produziert. In der hier durchgeführten differentiellen Studie wurde die muskelspezifische

Isoform in den Patientenkontrollen als herunterreguliert identifiziert. Die Label-freie

Proteomanalyse bestätigte die Regulierung der Glykogen Phosphorylase. In der Literatur

wurde bis heute kein Zusammenhang zwischen einer verminderten Expression der Glykogen

Phosphorylase und den Filaminopathien bzw. MFM beschrieben. Es ist jedoch denkbar, dass

die verminderte Expression mit einer Typ-1-Muskelfaserdominanz in

Filaminopathiepatienten zu erklären ist [Kley et al. 2007]. Die Gründe für die Typ-1-

Faserdominanz in Patienten mit Filaminopathie sind noch unklar. Es ist anzunehmen, dass in

Diskussion

139

Typ-1-Muskelfasern generell weniger Glykogen Phosphorylase exprimiert wird [Schiaffiano

and Reggiani 2011]. Typ-1-Muskelfasern werden langsam zuckende Muskelfasern oder auch

oxidative Fasern genannt. Sie zeichnen sich durch eine hohe Anzahl an Mitochondrien und

eine hohe Aktivität an oxidativen Enzymen aus [Scherzmann et al. 1989, Jackmann and Willis

1996]. Die Energie gewinnen sie aerob und sind auf Dauerleistung mit begrenztem

Kraftauswand ausgelegt. Im Gegensatz dazu werden die Typ-2-Muskelfasern als schnell

kontrahierende Muskelfasern bezeichnet und dienen der schnellen Kraftentwicklung.

Dadurch benötigen sie sehr viel mehr Energie, welche überwiegend anaerob aus

Glykogenspeichern bereitgestellt wird.

Das Strukturprotein Aktin hat ein Molekulargewicht von 42 kDa und gehört zu den

hoch konservierten Proteinen in Eukaryonten. In Säugetieren gibt es 6 verschiedene

Isoformen [Vandekerckhove and Weber 1978]. Das in der 2D Studie identifizierte Alpha Aktin

1 stellt die skelettmuskelspezifische Form dar. In der Zelle bildet Aktin dynamische

Filamente, die Aktinfilamente oder auch dünne Filamente. Aktin ist ein essentieller

Bestandteil des kontraktilen Apparates und stabilisiert durch den Ausbau des

Filamentnetzwerkes die äußere Zellform. Veränderungen in dem für Alpha Aktin 1

codierenden Gen führen zu sogenannten Kongenitalen Myopathien. Die Gruppe der

Kongenitalen Myopathien beschreiben langsam progrediente Erkrankungen, die meist im

Neugeborenen- oder Kindesalter auftreten und durch proximale oder generalisierte

Muskelschwäche charakterisiert sind. In einigen Fällen wird auch eine Ateminsuffizienz

beobachtet [Sparrow et al. 2003]. In der Literatur wurden zusätzlich spät einsetzende

Formen der Erkrankung beschrieben [Niwa et. al. 2009]. Die Nemalin Myopathie (Typ 3) wird

zu den Kongenitalen Myopathien gezählt und wurde 1963 erstmals von Shy et al.

beschrieben. Betroffene Patienten leiden ab der Geburt unter Hypotonie der Muskulatur

und einer verzögerten motorischen Entwicklung. In den meisten Fällen erwerben die

Patienten im Laufe ihres Lebens die Fähigkeit zu laufen. Auf morphologischer Ebene wird die

Nemalin Myopathie durch stäbchen- und fadenförmige Strukturen charakterisiert. In der

hier durchgeführten 2D DIGE Studie wurde das Alpha Aktin 1 im Vergleich zu Kontrollgewebe

als niedrig abundantes Protein in Filaminopathiegewebe identifiziert. Aktin wird als dünnes

Filament bezeichnet. Cohen et al. stellten 2012 eine Theorie zu Auswirkungen einer

erhöhten Desminphosphorylierung auf. Sie gingen in ihrer Studie davon aus, dass durch die

Diskussion

140

verstärkte Phosphorylierung des N-Terminus die Stabilität der Myofibrillen verloren geht und

weitere Komponenten des Systems Schaden nehmen. Dazu wurden auch die dünnen

Filamente gezählt, welche in Folge der Phosphorylierung des Desmins ebenfalls

phosphoryliert und anschließend degradiert werden [Cohen et al. 2012]. Die verstärkte

Phosphorylierung des Desmins und das verminderte Vorkommen des Aktins in

Filaminopathiegewebe könnten im Einklang mit dieser Hypothese stehen.

Die Creatin Kinase (CK) ist ein Enzym, das eine N-Phosphoryl-Gruppe von Phospho-

Kreatin auf Adenosindiphosphat (ADP) überträgt. Dadurch entsteht Adenosintriphosphat als

universelle Energiequelle. Bei kurzfristigen Belastungen bietet die CK eine optimale

Möglichkeit des Gehirn oder den Muskel schnell mit Energie zu versorgen. Es sind 4

verschiedene Isoformen bekannt: CK-MM (Skelettmuskel), CK-MB (Myokard), CK-BB (Gehirn)

und CK-MiMi (Mitochondrien) [Göthert et al. 1975, Schlattner et al. 2005, Wallimann et al.

2007]. Eine Erhöhung der CK-Aktivität im Serum, welche als Folge einer Störung der

Faserintegrität und des Übertritts der CK in das Serum auftritt, ist oft ein Indiz für eine Herz-

oder Skelettmuskelerkrankung. Zu den häufigsten Skelettmuskelerkrankungen mit erhöhter

CK gehören die progressiven Muskeldystrophien, zu denen auch die Filaminopathien

gehören. In einer Studie von 2007 konnten bei 31 Patienten normale bis deutlich erhöhte

CK-Werte im Serum beobachtet werden [Kley et al. 2007]. In der im Rahmen dieser

Dissertation durchgeführten 2D Studie wurden mikrodissektierte Muskelfaserzellen

analysiert. Als Ergebnis wurde eine verringerte Expression der muskelspezifischen Form der

Creatin Kinase in den Filaminopathiepatienten beobachtet. In der Literatur ist keine

vergleichbare Studie an MFM-Gewebe durchgeführt worden um abschätzen zu können,

welche Gründe eine verminderte Expression der Creatin Kinase im Muskel haben könnte.

Eine 2011 veröffentlichte Studie beschreibt eine erniedrigte CK-Exprimierung im Muskel

aufgrund von dilatativer Kardiomyopathy [Diguet et al. 2011]. Als Folge der veränderten

Expression der CK konnten verringerte Mengen an Alpha Aktin und eine erhöhte Abundanz

von Desmin identifiziert werden. Die verminderte Exprimierung der CK wirkte sich negativ

auf die Stabilität des Aktinnetzwerkes aus und induzierte posttranslationale Modifizierungen

in Desmin, wodurch auch die Desorganisation der Intermediärfilamente hervorgerufen

wurde [Diguet et al. 2011]. Diese Ergebnisse ermöglichten neue Einblicke in die

Pathomechanismen der dilatativen Kardiomyopathie und könnten gleichzeitig interessante

Diskussion

141

Anstöße zur Aufdeckung der Pathogenese in Filaminopathien geben. Immerhin zeigt auch

ein großer Teil der Patienten mit Filaminopathie kardiale Symptome. Zusammenfassend lässt

sich sagen, dass in der 2D DIGE Analyse wie auch in der Studie von Diguet et al. die gleichen

Proteine (CK, Desmin und Alpha Aktin, ähnlich reguliert) detektiert werden konnten. Es

bleibt zu klären, inwieweit die von Diguet beschriebenen Abläufe auch für die Filaminopathie

relevant sein könnten.

Gelsolin ist Teil der Superfamilie der Aktin-bindenden und schneidenden Proteine

[Sun et al. 1999]. Das Protein hat ein Molekulargewicht von 81 kDa und liegt intrazellulär im

Zytosol und in den Mitochondrien sowie extrazellulär im Blutplasma vor, wo es die

Polymerisation von freiem Aktin aus zugrunde gegangen Zellen verhindert [Kwiatkowski

1999]. Im Skeletmuskel wird es als das Schlüsselprotein im Auf- und Abbau der

Aktinfilamente bezeichnet. Gelsolin bindet nach Ca2+ Aktivierung an Aktinfilamente [Hartwig

1992]. So wird eine Konformationsänderung des Aktins erreicht, die die Schwächung der

hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Aktinmonomeren zur Folge hat

[McGough et al. 1998]. Dies führt zum Bruch der Filamentstruktur. Direkt im Anschluss an

das Zerschneiden der Aktinfilamente, setzt sich das Gelsolin an das schnellwachsende Ende

eines Monomers („Capping“) und blockiert so das Anlagern oder die weitere Dissoziation

von Monomeren. Durch das Ablösen des Gelsolins wird die erneute Polymerisation von

Aktinfilamenten gefördert. So ist es möglich, dass sich das Aktingerüst des Zytoskeletts

erneuern kann [Yin and Stull 1999.] Gelsolin wurde in der 2D Studie in

Filaminopathiegewebe als das am stärksten hoch regulierte Protein identifiziert (Ratio 4,3).

In der Label-freien Proteomanalyse von Muskelzellen ohne Aggregate aus

Filaminopathiepatienten wurde das Protein im Vergleich zu gesundem Gewebe aufgrund

eines zu schlechten p-Wertes (> 0,05, Ratio = 9,2) nicht als signifikant reguliert identifiziert.

In den MFM-spezifischen Proteinaggregaten hingegen befand sich Gelsolin unter den

signifikant akkumulierten Proteinen (Ratio 2,1, p-Wert ≤ 0,05). Im Hinblick der hier erzielten

Ergebnisse sollte die Validierung des Gelsolins in immunhistologischen Färbungen in einem

nächsten Schritt folgen. Die Rolle des Gelsolins innerhalb der Pathogenese der

Filaminopathie ist zurzeit unklar und sollte in nachfolgenden Studien geklärt werden. Es ist

jedoch denkbar, dass Gelsolin als eine Art protektives Protein für Aktin in Frühphasen der

Filaminopathie fungieren könnte. Die Bindung des Gelsolins an Aktin verhindert die

Diskussion

142

Verbindung von zwei Aktinmonomeren, gleichzeitig verhindert es aber auch den weiteren

Abbau des Monomers. Aktin wurde im Vergleich zu gesundem Gewebe in der 2D Studie als

signifikant geringer exprimiert in krankem Gewebe identifiziert, Gelsolin signifikant höher

abundant. Die Regulierung der Gelsolin-Expression könnte dem Zweck dienen, noch

bestehende Aktinfilamente zu spalten und durch das Capping die Aktinmonomere vor dem

Untergang zu bewahren.

Die leichte Kette 3 des Myosins (MYL3) ist neben den schweren Ketten Bestandteil

des funktionalen Myosins. Myosin bezeichnet die Gruppe von Motorproteinen in

eukaryontischen Zellen. Neben Aufgaben beim intrazellulären Transport von Vesikeln und

Zellorganellen ist Myosin ein wesentlicher Bestandteil des kontraktilen Apparates. Durch ein

Ineinanderschieben von Myosin- und Aktinfilamenten wird die Muskelkontraktion bewirkt.

Die Struktur des Myosins beinhaltet 2 schwere Ketten und 4 leichte Ketten. Es gibt zwei

Arten von leichten Ketten: essentielle leichte Ketten, die rein strukturelle Aufgaben

übernehmen und die regulatorischen leichten Ketten. Die leichte Kette 3 des Myosins wird

zu den regulatorischen Ketten gezählt. Sie binden an die schweren Ketten und können dort

die Myosinköpfchen während der Muskelkontraktion regulieren. Mutationen in der MYL3

führen zu hypertrophen Kardiomyopathien [Poetter et al. 1996, Richard et al. 2003]. In der

hier durchgeführten differentiellen Studie wurde das Protein MYL3 im Vergleich zu dem

Kontrollgewebe als geringer abundantes Protein in den Patientenkontrollen identifiziert.

Anderson et al. beschrieben 2012 eine neue Mutation in MYL3 in einem Patienten mit

hypertropher Kardiomyopathie, die mit einer verringerten Expression des Proteins

einhergeht [Andersen et al. 2012]. In der differentiellen 2D Studie von Lam et al. hingegen

konnte die MYL3 nicht als gering exprimiertes Protein identifiziert werden [Lam et al. 2010].

In Bezug auf MFM lässt sich sagen, dass bei diversen Patienten kardiale Beeinträchtigungen

beobachtet werden konnten. So zeigten Patienten mit der p.R120G Mutation in alpha B

Crystallin ebenfalls eine hypertrophe Kardiomyopathie [Vicart et al. 1998]. Auch bei

Patienten mit Desminopathien und Filaminopathien traten Komplikationen in Form von

Kardioyopathien auf [Goldfarb et al. 2004, Kley et al. 2007]. Die Ursache für die kardiale

Beteiligung bei MFM-Patienten sind nicht Mutationen im MYL3-Gen. Es wäre dennoch

interessant zu klären, inwieweit die Patienten der verschiedenen MFM-Subtypen eine

Mutation im MYL3-Gen verfügen und ob das Protein im aggregat-freien Gewebe differentiell

Diskussion

143

exprimiert vorliegt. Es wäre möglich, dass Mutationen im MYL3-Gen die Ausprägung der

kardialen Symptome beeinflusst.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Hälfte der hier durchgeführten 2D

Studie identifizierten Proteine in einen Kontext mit den MFM oder im speziellen mit der

Filaminopathie gebracht werden konnten. Für zukünftige Studien ist es wichtig, dass die

Proteine zu validieren und deren genaue Bedeutung in der Pathogenese zu klären. Auffällig

ist, dass 4 von 6 Proteine (CK, MYL3, Desmin und Aktin) in der Literatur mit kardialen

Symptomen in Verbindung gesetzt werden. Es scheint als könnte die kardiale Komponente in

Patienten mit Filaminopathie deutlich dominanter sein als bislang vermutet.

5.2.2.4. Die biologische Relevanz der Desminphosphorylierung

Die reversible Phosphorylierung von Proteinen spielt in der Regulation vieler

Prozesse, wie z.B. Metabolismus, Transduktion, Translation und Proteindegradation eine

entscheidende Rolle. Im Skelettmuskel ist die Phosphorylierung an Signalkaskaden beteiligt,

die den Substrat- und Energiemetabolismus, die Muskelkontraktion sowie die Muskelmasse

regulieren [Schiaffino et al. 2007]. Das generelle Verhältnis von Serin-, Threonin- und

Tyrosin-Phosphorylierungen liegt bei 1800:200:1. Es ist allerdings davon auszugehen, dass

das Verhältnis Gewebe-spezifische Unterschiede aufweist. So liegt in Skelettmuskel das

Verhältnis der Serin-, Threonin- und Tyrosin-Phosphorlylierungen bei 18:4:1 [Hojlund et al.

2009]. Im Skelettmuskel sind zwischen 2- und 5-fach so viele Threonine phosphoryliert wie in

anderen Geweben, so beträgt das Verhältnis z.B. in der Leber 90:9:1 [Han et al. 2008]. Das

Sarkomer bildet die wichtigste Untereinheit im Skelettmuskel. Durch eine optimierte

Anreicherung über Ionenaustauscher konnten Holjund et al. in allen wichtigen Komponenten

des Skelettmuskels Phosphorylierungen nachweisen. So konnten u.a. 26 verschiedene

Phosphorylierungsorte in Z-Scheiben assoziierten Proteinen, darunter befanden sich auch

Desmin, Filamin C, ZASP und Myotilin, identifiziert werden. Z-Scheiben-assoziierten

Proteinen, M-Banden Proteinen sowie Intermediärfilamente (Desmin) übernehmen wichtige

Rollen beim Zusammenbau, der Organisation und in der Funktion des kontraktilen

Apparates. In mehreren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass reversible

Phosphorylierungen in zentralen Zellprozessen eine wichtige Rolle zu spielen scheinen

[Kawajiiri et al. 2003, Frank et al. 2006, Schiaffino et al. 2007]. Mutationen in für Z-Scheiben

Diskussion

144

codierenden Genen bilden die Ursache für erbliche Kardiomyopathien [Frank et al. 2006],

Muskeldystrophien [Cardamone et al. 2008] und Myopathien [u.a. Vorgerd et al. 2005, Kley

et al. 2007, Goldfarb et al. 2009]. Es ist wahrscheinlich, dass die Mutationen in den

jeweiligen Proteinen auch zu abnormalen Phosphorylierungen führen könnten. Die

Charakterisierung der Rolle von Phosphorylierungen in gesundem und krankem

Muskelgewebe könnte ein entscheidender Schritt zur Aufklärung der Pathomechnismen in

verschiedenen Muskelerkrankungen sein. Im Zuge der differentiellen Proteomanalyse von

Filaminopathiegewebe wurde in der vorliegenden Arbeit Desmin in zwei differentiellen Spots

sowie in zwei nicht regulierten Spots identifiziert (beschrieben unter Punkt 4.4.3.). Die Spots

befanden sich in einer Perlenketten-artigen Anordnung, wobei die regulierten Spots einen pI

Shift ins Saure aufwiesen. Da aber keine Änderungen des Molekulargewichts zu erkennen

waren, wurde die Phosphorylierung als wahrscheinlichste posttranslationale Modifikation im

Desmin als Ursache erachtet, welche als einzige einen solchen pI Shift zu verursachen.

Desmin ist das höchst abundante Intermediärfilament im menschlichen Skelettmuskel. Die

Hauptaufgabe der Intermediärfilamente liegt in der Aufrechterhaltung der Organisation des

Zytoplasmas [Lazarides 1982]. Durch die Verbindung verschiedener Membranstrukturen mit

den Z-Scheiben wird die Integration und Koordination des Zellwachstums der Myozyten

gewährleistet [Capetanaki et al. 2007]. Die Struktur des Desmins besteht aus 3 strukturellen

Komponenten: einer zentralen alpha-helikalen Stabregion, die von einem nicht alpha-

helikalen N-Terminus (head) und einem nicht helikalen C-Terminus (tail) flankiert wird

[Geißler and Weber 1982, Stuurman et al. 1998]. Durch das Zusammenlagern von zwei

Monomeren entlang der Stabregion entstehen die sogenannten Protofilamente. Aus zwei

Protofilamenten entstehen die Protofibrillen und vier Protofibrillen bilden letztendlich ein

Intermediärfilament. Der N-Terminus spielt bei der Polymerisation der einzelnen Filamente

und der Stabilität eine entscheidende Rolle [Nelson and Traub 1983, Kaufmann et al. 1985].

Kaufmann et al. konnte 1985 zeigen, dass ein Entfernen des N-Terminus von Desmin die

Polymerisation verhindert. Die Rolle des C-Terminus ist dagegen weniger klar definiert.

Während einige Studien davon ausgehen, dass das Fehlen einer intakten C-terminalen

Domäne keinen Einfluss auf den Ausbau des filamentären Netzwerkes hat [Kaufmann et al.

1985], schreiben andere der Domäne eine Aufgabe in der Kontrolle beim Zusammenbau der

Filamente zu [Birkenberger et al. 1990]. Der Prozess der reversiblen Phosphorylierung

Diskussion

145

reguliert im Desmin die (De-)Polymerisierung der Filamente sowie die Muskeldifferenzierung

und Mitose [Inagaki et al. 1988], der N-, wie auch der C-Terminus verfügen über

Phosphorylierungsstellen [Evans 1988].

5.2.2.5. Die Relevanz der Desminphosphorylierung in Filaminopathien

Die reversible Phosphorylierung des Desmins übernimmt eine wichtige Aufgabe in

der Organisation der Myofibrille, sie essentiell für den Ausbau des filamentären Netzwerkes

und für die Zellteilung. Im Zuge der Zellteilung depolymerisieren die Intermediärfilamente zu

Monomeren [Kawajiiri et al. 2003]. Während des gesamten Prozesses liegt Desmin in seiner

phosphorylierten Form vor [Geisler and Weber 1988, Inagaki et al. 1988]. Durch die

Dephosphorylierung vereinigen sich die einzelnen Monomere erneut zu

Intermediärfilamenten, so dass das filamentäre Netzwerk erneut ausgebaut werden kann. Es

ist zu vermuten, dass ein Ungleichgewicht in der Phosphorylierung und der

Dephosphorylierung zum Verlust des stabilisierenden Netzwerkes innerhalb der Muskelzelle

führt. Die MFM charakterisieren sich durch die fokale Zerstörung der Myofibrillen [Selcen et

al. 2004]. Ein zu hoher Anteil an phosphoryliertem Desmin könnte das Auflösen der

Myofibrillen begünstigen bzw. beschleunigen [Caron and Chapon 1999]. Diese These konnte

erst kürzlich in einer 2012 veröffentlichten Studie bekräftigt werden [Cohen et al. 2012]. In

der Studie wurde die Zusammensetzung der Skelettmuskulatur von Ratten nach

Nahrungsentzug untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass als Folge der Unterernährung die

Phosphorylierung des Desmins zunahm und die Desorganisation der Filamente einsetzte.

Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Studien, die den Zusammenhang zwischen

Phosphorylierung und Demontage der Filamente zeigten [Chou et al. 1989, Sihag et al.

2007]. Allerdings wurde in diesen Studien die reversible Depolymerisation durch

Phosphorylierung als Folge zellulärer Prozesse (z.B. Mitose, Zelldifferenzierung, zellulärer

Proteintransport] beschrieben. Dephosphorylierte Filamente neigen zu einer

Wiedervereinigung, so dass kein Schaden für die Zelle entsteht [Geisler and Weber 1988,

Inagaki et al. 1988]. Im Gegensatz dazu zeigt die Studie von 2012, dass langanhaltende

Phosphorylierung die Struktur der Desminfilamente nachhaltig stört. Cohen et al. bieten

zwei Hypothesen für nachfolgende Mechanismen an. Zum einen werden die

phoshporylierten Desminfilamente ubiquitiniliert und anschließend degradiert. Die zweite

Diskussion

146

Hypothese besagt, dass die Modifizierung des Intermediärfilaments den myofibrillären

Untergang fördert. Die Desminfilamente spielen eine essentielle Rolle in der Stabilität der Z-

Scheiben und der anliegenden dünnen Filamente [Fuseler and Shay 1982, Conover et al.

2009]. Beim Verlust der Desminfilamente verliert das gesamte System an Stabilität und die

einzelnen Filamente werden zugänglicher für Ubiquitinilierungen. Dieser Mechanismus

könnte auch im Falle der in der Arbeit untersuchten Filaminopathie zum Tragen kommen.

Um die Hypothesen von Cohen et al. auf ihre Richtigkeit hin zu überprüfen würde es sich

anbieten, Muskellysat von Filaminopathiepatienten und von Negativkontrollen mittels 2D

PAGE aufzutrennen und im anschließenden Immunoblot mittels spezifischer Antikörper zu

überprüfen, ob die detektierten Desminspots in ubiquitinilierter Form vorliegen. Zusätzlich

zum Antikörper-basierten Nachweis von Ubiquitinilierungen könnte das Spotmuster im

Immunblot Hinweise auf mögliche Degradation des Desmins geben (siehe Punkt 5.2.2.6.).

Bislang konnte in der Literatur kein direkter Zusammenhang zwischen der

Filaminopathie und Desmin-Phosphorylierungen hergestellt werden. 1988 wurde von

Rappaport et al. das erste Mal von phosphoryliertem Desmin in erblichen Myopathien

berichtet. Auch in der zytoplasmatischen Body Myopathie (CBM) und der Desmin-

verwandten Myopathie (DRM) konnten 1999 phosphorylierte Isoformen von Desmin

identifiziert werden [Caron and Chapon 1999]. In beiden Fällen wurden die

Hyperphosphorylierung des Desmins mittels 2D PAGE nach O’Farrell [O’Farrell 1975] und

Western Blot charakterisiert. Als Erklärung für die Hyperphosphorylierung des Desmin in

CBM und DRM sowie die Akkumulation von Proteinen in anderen Myopathien wurde eine

gestörte Interaktion des Intermediärfilaments mit dem Chaperon alpha B Crystallin, welches

zur Stabilität der Intermediärfilamente beitragt [Bennardini et al. 1992], in Betracht gezogen.

Generell lässt sich vermuten, dass Störungen im Phosphorylierungsprozess diverser Proteine

zu erblich bedingten Myopathien führen. Dies konnte in Arbeiten belegt werden. 2005

beschrieben Clemen et al. die Hyperphosphorylierung von Hsp27, welche als spezifisches

Merkmal von Myopathien mit Desmin-Mutationen anzusehen ist. Ähnliche Ergebnisse

konnten bei der Analyse von verschiedenen alpha B Crystallin-Mutanten (R120G, Q151X,

464delCT) erzielt werden. Die Phosphorylierung dreier Mutanten in alpha B Crystallin

könnten Teil des Aggregierungsprozesses in Desminopathien sein [den Engelsman et al.

2005, Simon et al. 2007]. Ebenfalls 2007 konnten in Desmino- und Myotilinopathien weitere

Diskussion

147

posttranslationale Modifizierungen in Desmin beobachtet werden. Janue et al. untersuchten

5 Myotilinopathie-, und 3 Desminopathienpatienten. Sie konnten zeigen, dass Desmin in

diesen beiden Subtypen der Myofibrillären Myopathien oxidiert und nitriert vorliegt. Im

Vergleich zu gesundem Gewebe konnten signifikante Expressionsänderungen festgestellt

werden [Janue et al. 2007]. In zukünftigen Studien wäre es wichtig und interessant zu klären,

ob die Funktion von Desmin durch weitere posttranslationale Modifikationen (z.B.

Nitrierung, Oxidation, Ubiquitinilierung) in Filaminopathiepatienten beeinflusst wird.

5.2.2.6. Die Detektion der Phosphorylierung in Desmin

In der hier vorliegenden Dissertation wurde eine potentielle Phosphorylierung mittels

spezifischer Antikörper nachgewiesen. Für alle O-Phosphate gibt es spezifische Antikörper:

anti-Phospho-Serin (z.B. PSR-45, 3C171), anti-Phospho-Threonin (42H4) und anti-Phospho-

Tyrosin (z.B. 4G10, PY99). Desmin liegt stets phosphoryliert in der Muskelzelle vor [Costa et

al. 2004], dabei werden meist Serin-Reste im N-Terminus phosphoryliert [Geißler and Weber

1988, Inagaki et al. 1988, Cohen et al. 2012] Allerdings liegen nicht alle Serinreste komplett

phosphoryliert vor [Geisler and Weber 1988]. Zur Detektion der vermuteten Serin-

Phosphorylierung wurde ein spezifischer Phospho-Serin-Antikörpers (PSR-45) verwendet. Die

Phosphorylierung in Filaminopathiegewebe konnte eindeutig in allen Desminspots

nachgewiesen werden (beschrieben unter Punkt 4.4.3.). Auffällig war jedoch, dass mit einem

spezifischen Antikörper gegen Desmin zusätzliche als Desmin identifizierte Spots detektiert

wurden, die in der 2D Studie nicht als differentielle Spots detektiert werden konnten (Abb.

4.10., Spots a-d). Die mit a und d gekennzeichneten Spots konnten in Filaminopathie- und

Kontrollgewebe detektiert werden, im kranken Gewebe auch phosphoryliert. Die Spots (b)

und (c) wurden jedoch nur in Filaminopathiegewebe detektiert und könnten spezifisch für

Filaminopathiegewebe sein. Die Identifizierung und die Bedeutung der zusätzlichen Desmin-

Spots muss in weiteren Studien untersucht werden. Möglicherweise können andere

posttranslationale Modifikationen (höheres Molekulargewicht) oder Abbauprodukte des

Desmins (niedrigeres Molekulargewicht) identifiziert werden. Um mögliche Abbauprozesse

des Desmins näher untersuchen zu können, würde es sich anbieten Muskellysat aus

Filaminopathie- und Kontrollgewebe in einem 1D Gel aufzutrennen und die Banden mittels

eines spezifischen Antikörpers gegen Desmin sichtbar machen. Ein direkter Vergleich der

Diskussion

148

entstandenen Bandemuster könnte durch zusätzlich Banden im Filaminopathiegewebe erste

Hinweise darauf geben, ob Abbauprodukte des Desmins vorliegen. Ein weiterer Hinweis

wäre der Nachweis von ubiquitiniliertem Desmin in krankem Gewebe, da fehlgefaltete oder

nicht funktionstüchtige Proteine über eine Ubiquitinilierung für den Abbau im Proteasom-

System vorbereitet werden. Zusätzlich wäre es sinnvoll spezifische Antikörper gegen Tyrosin

und Threoin einzusetzen, um weitere posttranslationale Modifikationen im Desmin zu

detektieren. Alternativ wäre es möglich, die Spots a-d aus einem 2D Gel auszuschneiden und

mittels quantitativer Phosphoprotemics auf weitere potentielle posttranslationale

Modifikation zu analysieren. Hierfür wäre es jedoch unerlässlich die modifizierten

Aminosäuren anzureichern, um diese erfolgreich detektieren und lokalisieren zu können

(beschrieben in Punkt 5.2.2.7).

Die Detektion phosphorylierter Proteine mittels Western Blot ist eine hoch sensitive

Methode und erlaubt die Visualisierung von gering abundanten Proteinen. Dies könnte auch

der Grund dafür sein, dass die Spots a-d in der 2D Studie unentdeckt blieben. Der hier

durchgeführte 2D Western Blot eignet sich nicht zur Quantifizierung von Proteinen. Es kann

jeweils nur eine Probe auf ein Gel aufgetragen werden. Dies macht es schwierig die

verschiedenen Gele bzw. Membranen miteinander zu vergleichen. Eine quantitative

Auswertung von Immunoblots ist unter der Verwendung densitometrischer Methoden

dennoch möglich. Hier ist es jedoch nur sinnvoll ein 1D Gel als Versuchsgrundlage zu wählen.

Die zu vergleichenden Proben können zusammen auf ein Gel aufgetragen und verglichen

werden [Janue et al. 2007]. Die Verwendung eines Antikörpers für ein nicht reguliertes

Protein gewährt, dass für alle Proben die gleichen Mengen aufgetragen wurden. Alternativ

zur Detektion phosphorylierter Aminosäuren mittels Antikörper stehen weitere Methoden

zur Wahl.

5.2.2.7. Lokalisation von Phosphorylierungen in der Aminosäuresequenz

Die Phosphorylierung des Desmins in Filaminopathiegewebe konnte eindeutig

nachgewiesen werden (beschrieben unter Punkt 4.4.3). Wie unter Punkt 5.2.2.4. bereits

beschrieben, besteht Desmin aus drei strukturellen Komponenten. Besonders der N-

terminalen Region wird eine essentielle Rolle in der Aufrechterhaltung der Stabilität des

filamentären Netzwerkes zugeschrieben [Sihag et al. 2007]. Um die Lokalisation der mittels

Diskussion

149

Antikörper identifizierten Phosphorylierung von Desmin zu klären, wurde die LTQ (Thermo)

verwendet. Zur Aufklärung der patho-physiologischen Bedeutung der Phosphorylierung ist

es sehr wichtig die genaue(n) Phosphorylierungstellen zu lokalisieren. Die im Medizinischen

Proteom-Center Bochum verfügbare LTQ bietet die Möglichkeiten die Ionen mittels

Kollisionsdissoziation (CID) sowie Elektronentransferdissoziation (ETD) zu fragmentieren. Die

CID-Methode ist die am häufigsten angewandte Fragmentierungsmethode und führt in der

Analyse von Phosphoserin zu einem neutralen Verlust der HPO3 oder H2PO4-Gruppe (80 Da).

Die Fragmentierung mittels ETD ist schonender, labile Phosphorylierungen bleiben dabei

intakt. [Wiesner et al. 2008]. Um bestmögliche Voraussetzung für die Identifizierung und

Lokalisation der Serin-Phosphorylierung im Desmin zu gewähren, wurde eine Kombination

aus CID und ETD angewendet. In bereits veröffentlichten Studien konnte gezeigt werden,

dass die Kombination der beiden Fragmentierungsarten die Wahrscheinlichkeit, die

Phosphorylierung lokalisieren zu können, deutlich steigern konnte [Molina et al. 2007,

Tekirian et al. 2007, Lopez et al. 2011, Helling et al 2012]. Trotz der kombinierten

Fragmentierungen konnten in dem Filaminopathiegewebe die Serinphosphorylierung

detektiert nicht lokalisiert werden.

Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Identifizierung der Phosphorylierung in

Filaminopathiegewebe ist eine ausreichende Menge an phosphorylierten Aminosäuren. Für

die generelle Identifizierung von Proteinen reichen in der Regel wenige beliebige Peptide aus

um diese eindeutig einem Protein zuordnen zu können. Für die Lokalisation einer

Phosphorylierung hingegen ist es notwendig die Sequenz zu detektieren, die die

Modifizierung enthält. Neben der kompletten Detektion der Sequenz ist die Abundanz der

Phosphorylierung entscheidend. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation ist es nicht

gelungen die Phosphorylierung des Desmins zu lokalisieren. In der Regel können extreme

Konzentrationsunterschiede zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten

Proteinen beobachtet werden. Neben der sehr geringen Abundanz erschwert die

schlechtere Ionisationseffizienz phosphorylierter Proteine die Detektion mittels

Massenspektrometrie [Craig et al. 1994]. Die Charakterisierung von Phosphopeptiden kann

durch die Reduzierung der Komplexität der Proben und die Anreicherung der

Phosphoproteine bedeutend verbessert werden [Dunn et al. 2010]. In der Literatur sind

verschiedene Methoden beschrieben, um die Komplexität der Proben erfolgreich zu

Diskussion

150

reduzieren, u.a. 1D Gelelektrophorese mit anschließender Anfärbung von

Phosphorylierungen [Black et al. 2007], Ionenaustauschchromatographie [Gruhler et al 2005]

und Isoelektrische Fokussierung [Beranova-Giorgianni et al. 2006 und 2009, Chen et al.

2010]. Um die Phosphorylierung im Filaminopathiegewebe zu lokalisieren wäre es sinnvoll

die Komplexität des Muskellysates mittels Isoelektrischer Fokussierung und anschließender

2D PAGE-Auftrennung zu reduzieren, das zugehörige Protokoll wurde im Rahmen dieser

Dissertation etabliert. Für die erfolgreiche Anreicherung von Phosphopeptiden bieten sich

verschiedene Methoden an. Alle derzeitigen Methoden zur Anreicherung von

Phosphopeptiden basieren auf der Metallaffinitätschromatographie, die sich die Anziehung

verschiedener Metallionen oder Oxide zum Sauerstoffatom der Phosphatgruppe zunutze

macht. Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) stellt die am weitesten

verbreitete Methode zur Anreicherung von Phosphoproteinen dar. Das Prinzip der Methode

basiert auf der Affinität der Phosphatgruppe zu Metallionen, Fe3+-, Al3+, Ga3+, oder Co2+ Ionen

[Neville et al. 1997, Posewitz et al. 1999, Lopez et al. 2011]. Ein großer Nachteil der Methode

ist die Anreicherung von nicht phosphorylierten, negativ geladenen Peptide. Diese lassen

sich in der massenspektrometrischen Analyse besser ionisieren und können so die Signale

der phosphorylierten Peptide unterdrücken. Eine Weiterentwicklung des IMAC ist

Sequential Elution from IMAC (SIMAC) [Thingholm et al. 2009]. SIMAC ist eine schnelle und

einfache Methode, die gleichzeitig eine Verbesserung in der großflächigen Analyse von

mono- und multiphosphorylierten Peptiden aus hoch komplexen Proben darstellt. Auch hier

mindert die Anreicherung von nicht phosphorylierten Peptiden die Spezifität der Methoden.

Trotz der beschriebenen Schwächen konnte SIMAC in vielen Studien zur globalen

Phosphoanalytik angewendet werden [Lopez et al. 2011, Goldstrohm et al. 2011]. Die

Metalloxidaffinitätschromatographie (MOAC) sowie eine zugehörige 2D-LC-Strategie wurde

von Pinske et al. 2004 beschrieben. Am häufigsten wird eine Titanium-Oxid (TiO2)-Säule zur

Anreicherung verwendet [Gerrits and Bodenmiller 2010], welche die negativ geladenen

Phosphopeptide in wässriger Lösung bindet. Mit Hilfe des MOAC ist es möglich, sehr effektiv

einfach phosphorylierte Peptide anzureichern. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Zahl der

Arbeitsschritte im Vergleich zu anderen Methoden reduziert wird und so der Verlust an

modifizierten Aminosäuren und Informationen verringert wird. Als nachteilig ist

anzumerken, dass die Elution multi-phosphorylierter Peptide mit einem hohen Aufwand

Diskussion

151

verbunden ist, da diese sehr stark an die Säule binden (Bahk et al. 2013, Review]. Zusätzlich

ist die Menge an nicht phosphorylierten Peptiden durch die Online-Messung relativ hoch.

Die Entwicklung einer Offline-Methode unter Verwendung der TiO2-Säule konnte die

Sensitivität und Spezifität der Anreicherung deutlich steigern [Jensen and Larsen 2007]. Die

Anreicherung TiO2 wurde bereits in vielen Studien erfolgreich angewendet [Helling et al

2012, Richardson et al. 2013]. Aufgrund der 2D-Kompatibilität und der verminderten

Arbeitsschritte im Vergleich zu anderen Methoden würde ich die Anreichung der

Phosphopeptide in Filaminopathiegewebe mittels TiO2 in zukünftigen Studien als Methode

der Wahl wählen. Die Anreicherung mittels Ionenaustausch-(Kation und Anion)

Chromatographie wurde bereits erfolgreich zur Anreicherung von Phosphoproteinen im

Skelettmuskel angewendet [Holjund et al. 2009]. Die Proteine wurden mittels tryptischen In-

Lösung-Verdau in Peptide gespalten und anschließend angereichert. Die Methode basiert

auf der negativ geladenen Phosphatgruppe PO4-. Unter der Verwendung von

Kationenaustauschern (SCX) werden positiv geladene Analyten auf eine negativ geladenen

stationäre Phase gegeben, bei Anionenaustauschern (SAX) sind die Ladungen genau

entgegensetzt. Die Kombination von SCX und IMAC erwies sich als erfolgreich in der

Identifizierung tausender phosphorylierter Peptide in komplexen biologischen Proben

[Nühse et al. 2003, Gruhler et al .2005]. Diese Art der Anreicherung wäre als Alternative zur

TiO2-Anreicherung denkbar.

Mit Hilfe der hier beschrieben Methoden zur Anreicherung von phosphorylierten

Aminosäuren in Kombination mit der massenspektrometrischen Analyse (Fragmentierung

durch CID/ETD) sollte es in Zukunft möglich sein, die Phosphorylierung im

Filaminopathiegewebe eindeutig zu lokalisieren.

Diskussion

152

5.3. Proteomstudien im Zellkulturmodell

Die Zellkultur ist ein leicht zugängliches System um Stoffwechselwege,

Signaltransduktion sowie die Proteinexpression zu untersuchen. Die Einteilung der

Zellkulturen erfolgt zum einen nach Ursprung der Zellen und zum anderen nach Art des

Wachstums. Als primäre Zelllinien (z.B. humane Skelettmuskelzellen, Hskm) werden Zellen

bezeichnet, die direkt aus dem Gewebe der Patienten entnommen und anschließend in

Kultur gebracht werden. Zu Beginn der Kultivierung ähneln diese Zellen noch am meisten der

in vivo Situation. Allerdings zeigen die Primärzellen nur eine begrenzte Teilungsfähigkeit und

sind nur über wenige Tage bis Wochen kultivierbar. In den hier durchgeführten Studien

wurden C2C12-Zellen als Zellmodell verwendet, welche zur Gruppe der immortalisierten

Zellen zählen [Yaffe et al. 1977, Blau et al. 1985]. Sie sind nahezu unbegrenzt teilbar. Ein

weiterer Vorteil gegenüber Primärzellen ist die große Robustheit, die das Kultivieren deutlich

vereinfacht. C2C12-Zellen gehören zur Gruppe der adhärenten Zelllinien, sie wachsen an

inerten Oberflächen und bilden einen einschichtigen Zellrasen (Monolayer). Im Gegensatz

dazu werden andere Zelllinien (z.B. Blutzellen oder Stammzellen) als Suspension im Medium

kultiviert. C2C12-Zellen gelten als ausgezeichnetes Modell zur Aufklärung der

Pathomechnismen in Filaminopathien und wurden bereits mehrfach in Transfektionsstudien

erfolgreich eingesetzt um das Verhalten mutierter Proteine im Skelettmuskel zu untersuchen

[Duff et al., 2011. Kley et al. 2012].

Ziel dieses Teils der Doktorarbeit war es, die C2C12-Zellen als geeignetes

Modellsystem für die Filaminopathie zu evaluieren und den Einfluss mutierter Proteine auf

die murinen Muskelzellen über einen Zeitspanne von bis zu 72h zu untersuchen. Um dies zu

erreichen wurde im Vorfeld der Arbeiten der Wildtyp wie auch die p.W2710X-Mutante des

humanen Filamin C in ihrer gesamten Länge (ca. 8,1 kb) in 2 Vektoren kloniert, die entweder

am N- oder am C-Terminus mit EGFP fusioniert waren. Beide Konstrukte wurden in die Zellen

eingebracht. Die Gesamtgröße des N3-, und C2-Konstrukts lag bei 13 kb. Die Transfektion

von derart großen Konstrukten ist erfahrungsgemäß problematisch und äußert sich in einer

geringeren Transfektionseffizienz. Dieser Effekt konnte auch in den hier durchgeführten

Studien beobachtet werden. Die Zellen, die mit isolierter Plasmid-DNA des Wildtyps oder der

Mutante transfiziert wurden, wiesen eine Transfektionseffizienz von ca. 30 % auf. Dieser

Wert ist aufgrund des extrem großen Konstrukts als sehr hoch anzusehen und entsprach den

Diskussion

153

Erwartungen aus vorangegangen Transfektionsstudien [Kley et al. 2012]. Als Kontrolle wurde

der Leervektor (4,7 kb) in die Zellen eingebracht, hier lag die Transfektionseffizienz bei ca.

70%. In den hier durchgeführten Transfektionsstudien konnten keine eindeutigen

Unterschiede der beiden transfizierten Konstrukte in Bezug auf Stabilität und

Transfektionsunterschiede beobachtet werden. Aufgrund einer Transfektionsstudie aus dem

Jahr 2012 ist allerdings anzunehmen, dass C212-Zellen nach Transfektion des C2-Konstruktes

deutlich mehr intrazelluläre Aggregate nach 24h bildeten als nach Transfektion des N3-

Konstruktes [Kley et al. 2012]. Im Rahmen der von Kley et al. durchgeführten

Transfektionsstudie wurden mehrere tausend Zellen systematisch ausgewertet.

Für die Label-freie Proteomanalyse wurden die C2C12-Zellen transient mit isolierter

Plasmid-DNA des Wildtyps, der Mutante p.W2710X und des Leervektors transfiziert. Um im

Vorfeld der Analysen auszuschließen, dass die Transfektion der pEGFP-Konstrukte zur

Aggregatbildung in Zellen führt, wurden die Zellen mit dem Leervektor, dem Filamin C-

Wildtyp und der p.W2710X-Mutante transfiziert. Im Einklang mit vorangegangen

Transfektionsstudien konnte gezeigt werden, dass lediglich die Zellen Aggregate ausbilden,

die mit der p.W2710X transfiziert wurden (beschrieben unter 4.4.1.). In den hier

beobachteten C2C12-Zellen, die mit Plasmid-DNA des Leervektors oder des Wildtyp

transfiziert wurden, konnten keine aggregat-ähnliche Strukturen nachgewiesen werden. Die

Zellen wurden nach 24h, 48h und 72h mittels LMD und analog zum humanen Protokoll

analysiert. Anstelle von 250 000 µm2 wurde aber eine Fläche von 75 000 µm2 Zellmaterial

(vollständige Zellen mit Aggregaten) ausgeschnitten. In Vorstudien hatte sich diese Fläche als

optimal für die Analysen erwiesen. Viele der identifizierten Proteine wurden auch in den

humanen Aggregaten identifiziert, darunter das Z-Scheiben assoziierte Protein Filamin C, die

Intermediärfilamente Vimentin und Desmin, dessen Interaktionspartner alpha B Crystallin,

Strukturproteine Tropomyosin und Aktin sowie diverse Hitzeschockproteine (Hsp 70, 71, 90).

Der erst kürzlich von uns charakterisierte neue Bindungspartner von Filamin C und

Bestandteil der humanen Aggregate, Xirp2, konnte nicht in den Aggregaten ausfindig

gemacht werden [Kley et al. 2012]. Es wäre möglich, dass diese Proteine erst nach >72h von

den murinen Myoblasten exprimiert werden. Dieses Ergebnis würde für ein Fortführen der

Zeitreihe (96h, 120h, usw.) sprechen. Allerdings muss erwähnt werden, dass nach

Ausdifferenzieren der Zellen das Konstrukt in den Myotuben abgebaut wird und so die Zahl

Diskussion

154

der transfizierten Zellen drastisch sinkt. Dieses Wissen beruht auf Transfektionsstudien, die

im Rahmen dieses Projektes durchgeführt wurden und deckt sich mit den Beobachtungen

der Transfektionseffizienz nach 72h. Die Zahl an aggregathaltigen Zellen verringerte sich

bereits nach 72h von 30 % auf ca. 20%. Es ist zu erwarten, dass sich die Zahl der

aggregathaltigen Zellen nach 96h, 120h usw. weiter verringert. Es könnte sich schwierig

gestalten genügend Zellen mit Aggregaten nach mehr als 72h zu isolieren. Um dennoch die

Zeitreihe ausbauen und testen zu können, ob sich weitere Komponenten der humanen

Aggregate, z.B. die Bindungspartner des Filamin C, würde es sich anbieten

Immunhistochemische Färbungen mit spezifischen Antikörpern in transfizierten Zellen

durchzuführen.

Die C2C12-Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die die humane Form des

Filamin C enthielten. Filamin C wurde eindeutig als Bestandteil der Aggregate identifiziert.

Allerdings war es nicht möglich, das humane von dem murinen Filamin C zu unterscheiden.

Die Homologie der beiden Filamin C-Formen beträgt 98,4 %. Bei einer Gesamtlänge von

2725 (human) bzw. 2726 (murin) Aminosäuren unterschieden sich die beiden Formen in 45

Aminosäuren. Der theoretische Verdau der beiden Filamin C Proteine mit Trypsin (Protein

Prospector, Version 5.10.11.) zeigte, dass es möglich ist, durch die Identifizierung

spezifischer Peptide die jeweilige Form eindeutig zu bestimmen. Allerdings war es anhand

der identifizierten Peptide nicht möglich, in den durchgeführten massenspektrometrischen

Analysen eines dieser spezifischen Peptide zu identifizieren, so dass anhand der

identifizierten Peptide keine Unterschiede zwischen dem humanen und dem murinen

Filamin C detektiert werden konnten.

Ziel der Transfektionsstudien war es, analog zu den humanen Proben eine

quantitative Auswertung zu erstellen. Die daraus resultierende Proteinliste über die

Zusammensetzung der murinen Aggregate sollte dann mit den humanen Ergebnissen

verglichen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde allerdings deutlich, dass eine

quantitative Auswertung der murinen Aggregatproben nicht möglich war. Die Anzahl an

identifizierten Proteinen schwankte in allen analysierten Gruppen extrem (beschrieben

unter Punkt 4.4.3.). Die Analyse der humanen Aggregatproben hingegen wies deutlich

geringere Schwankungen in der Anzahl an identifizierten Proteinen auf (Abb. 4.14.). Die

Gründe für die Unterschiede in der Zahl der identifizierten Proteine sind vielfältig. Für die

Diskussion

155

humanen Analysen wurden stets 10 µm dicke Gefrierschnitte aus Muskelbiopsien

verwendet. Dies gewährte eine gleichbleibende und vor allem vergleichbare Beschaffenheit

der Proben. Bei den Zellkulturproben konnten diese Voraussetzungen nicht geschaffen

werden. Die Zellen wurden 24h vor Transfektion ausplattiert und bei einer Konfluenz von ca.

60 – 70 % (empfohlene Konfluenz Protokoll Lipofectamin LTX, Invitrogen) transfiziert. Im

Laufe der Zeitreihe verweilten die Zellen in Proliferationsmedium und wuchsen somit weiter.

Während der LMD wurde nicht deutlich, ob und inwieweit die Zellen in mehreren Schichten

gewachsen sind. Aufgrund dieser Unsicherheit ist es möglich, an einigen Stellen deutlich

mehr Material ausgeschnitten zu haben und an anderen Stellen im Vergleich dazu deutlich

weniger. Dies würde die extremen Schwankungen erklären. Ein weiteres, generelles Problem

bei der Probensammlung ist, dass die mikrodissektierten Mengen extrem gering sind. Aus

diesem Grund ist weder bei den humanen noch bei den murinen Proben eine

Konzentrationsbestimmung durchführbar. Die homogene Beschaffenheit der humanen

Proben gewährleistet aber trotz fehlender Konzentrationsbestimmung eine vergleichbarere

Probenmenge. In nachfolgenden Experimenten mit Zellkulturmaterial müsste eine bessere

Kontrolle der Zellmenge praktiziert werden. Hierfür könnten z.B. weniger Zellen ausplattiert

werden und diese bei einer geringeren Konfluenz transfiziert werden. Eine andere

Möglichkeit wäre, die Zellen nach spätestens 48h auf Differenzierungsmedium umzustellen.

Die Umstellung des Mediums würde das Wachstum der Zellen und somit auch mögliche

Überlagerungen der Zellen zu verhindern. Bei diesem Ansatz müsste das Problem des

Plasmid-Abbaus in den Myotuben beachtet werden. Eine Testreihe müsste zeigen, ob eine

verstärkte Ausdifferenzierung der Myotuben die Stabilität der Konstrukte negativ

beeinflussen würde.

Der direkte Vergleich der humanen und murinen Proteinlisten wäre auch nach

erfolgreicher Quantifizierung mit Schwierigkeiten verbunden gewesen. Nach Transfektion

der Plasmid DNA der Mutanten bildeten sich in den C2C12-Zellen mehrere runde Aggregate.

Zusätzlich konnten punktförmige aggregat-ähnliche Strukturen beobachtet werden. Weder

im Leervektor noch im Wildtyp konnten vergleichbare Strukturen beobachtet werden

(beschrieben unter 4.4.2.). Um die Gesamtheit der Veränderungen innerhalb der C2C12-

Zellen, auch die sehr kleinen punktförmigen Strukturen, für die Analyse erfassen zu können,

mussten komplette Zellen ausgeschnitten werden. Die humanen Aggregate konnten mittels

Diskussion

156

Laser exakt aus dem umliegenden Gewebe isoliert werden. Die Unterschiede in der

Probengewinnung lassen auf Seiten der Zellkulturproben Proteine mit einfließen, die keine

direkten Komponenten der Aggregate darstellen. Es ist jedoch fraglich, ob das alleinige

Isolieren der Aggregate aus Zellkultur aufgrund ihrer sehr geringen Größe realisierbar ist. Die

Analyse der punktförmigen aggregat-ähnlichen Strukturen wäre auf jeden Fall unmöglich. In

hier durchgeführten Vorstudien konnte gezeigt werden, dass die Aggregatbildung in den

C2C12-Zellen ungefähr 18h - 24h nach Transfektion einsetzt (beschrieben unter Punkt

4.6.1.). Diese Zeitspanne könnte analog zu den nicht betroffenen Muskelzellen aus den

Filaminopathiepatienten als Frühstadium bezeichnet werden. Es wäre interessant zu

schauen, ob und welche, Proteine bzw. Proteingruppen an der Aggregatbildung maßgeblich

beteiligt sind. Hinsichtlich der punktförmigen Strukturen wären in einer zukünftigen Studie 2

Fragestellungen von Interesse: 1. Handelt es sich bei diesen Strukturen um Aggregat-

ähnliche Strukturen? und 2. vereinigen sich diese Strukturen im Zeitverlauf zu einem

größeren Aggregat?

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass erste Schritte zur Proteomanalyse der

p.W2710X-Mutation in Zellkultur im Rahmen dieser Dissertation bewältigt werden konnten.

In nachfolgenden Studien müssen allerdings noch einige Versuchsreihen zur Optimierung

durchgeführt werden. Ein auf Zellkultur angepasstes Protokoll wäre eine optimale Grundlage

um neben der p.W2710X-Mutation auch weitere Filamin C-Mutationen auf Proteomebene

zu charakterisieren. Ein wichtiger Schritt in der Methodenoptimierung wird die Etablierung

einer stabil transfizierten Zelllinie sein. Der Nachteil von transienten Transfektionen liegt in

der geringen Lebensdauer der aufgenommenen DNA. Die Etablierung einer stabil

transfizierten Zelllinie würde die Erforschung vielfältiger Fragestellungen ermöglichen. Es

wäre möglich, die Proteinaggregate über einen längeren Zeitraum als 72h zu beobachten

und anschließend deren Zusammensetzung mit der der humanen Aggregate vergleichen. Auf

Basis der gemeinsamen Komponenten könnten gezielt therapeutische Ansätze in Zellkultur

(z.B. die Behandlung mit Aggregat-lösenden Substanzen) durchgeführt werden, um diese im

Anschluss für die Entwicklung von Therapien für die Patienten zu nutzen. Für die

Plectinopathie wie auch die desmin-verwandten Myopathien wurden bereits therapeutische

Studien im Zellkultur- bzw. Tiermodell durchgeführt. Im Falle der Plectinopathien wurden

Myocyten im Zellmodell mit 4-Phenylbutyrate, einem chemischen Chaperon, behandelt

Diskussion

157

[Yam et al. 2007]. Dies führte zu einer Verringerung der Proteinaggregate in den Zellen

(Vortrag von Lilli Winter, Wien, im Rahmen des DGNN Meeting in Erlangen 2012). Ein

ähnliches Ergebnis erzielte die Anwendung der Substanz Gernayl-Geranyl-Aceton (GGA),

welches die Expression kleiner Hitzeschockproteine veranlasst [Ooie et al. 2001]. Die R120G-

Missense-Mutation in alpha B Crystallin verursacht desmin-verwandte Kardiomyopathien

[Vicart et al. 1998]. R120G-transgene Mäuse wurden oral mit GGA behandelt. Neben der

erwarteten Hochregulierung der kleinen Hitzeschockproteine konnte zusätzlich ein Rückgang

der amyloider Aggregate beobachtet werden [Sanbe et al. 2009]. Die hier erwähnten

Substanzen zeigten im Zellkultur- bzw. Tiermodell eine Aggregat-auflösende Wirkung.

5.4. Fazit und Ausblick

In der hier vorliegenden Dissertation ist es gelungen, die LMD erfolgreich für die

Isolierung spezifischer Gewebeareale aus Filaminopathiepatienten zu etablieren. Ein

Massenspektrometrie-basierter Label-freier Ansatz wurde gewählt, um die

Zusammensetzung der Filaminopathie-spezifischen Proteinaggregate aufzuschlüsseln und

spezifische Bestandteile zu identifizieren. Die LMD erwies sich im Rahmen dieses Projektes

als äußerst erfolgreiche Methode zur Isolierung spezifischer Gewebeareale. Neben bereits

bekannten Proteinen wurden zahlreiche neue Komponenten der Proteinaggregate

aufgedeckt und validiert. Der Erfolg des Label-freien Ansatzes konnte durch die

Veröffentlichung von 2013 sowie die Übertragung auch auf einen weiteren Subtypen der

MFM, den Desminopathien, unterstrichen werden [Kley et al. 2013, Maerkens et al. 2013].

Ziel der hier durchgeführten 2D DIGE Studie war es, mögliche Marker für Frühstadien der

Filaminopathien zu identifizieren. Zusätzlich konnten 6 differentielle Proteine identifiziert

werden, die eine entscheidende Rolle im Frühstadium der Erkrankung spielen könnten. Im

Desmin wurde aufgrund der Perlenketten-artigen Anordnung der Spots eine potentielle

posttranslationale Modifikation vermutet, welche im weiteren Verlauf der Arbeiten als

Phosphorylierung validiert werden konnte. Die Phosphorylierung des Desmin könnte ein

entscheidendes Ereignis in der frühen Pathogenese der Filaminopathie sein, dass zur

Desorganisation der Myofibrillen beitragen könnte. Ob phosphoryliertes Desmin vor allem

eine Rolle im Frühstadium der Filaminopathie oder auch in der Aggregatbildung spielt,

müssen weitere Studien zeigen. Um dies zu untersuchen wäre es sinnvoll die mittels LMD

Diskussion

158

gesammelten Filaminopathie-spezifischen Proteinaggregate in 98 % Ameisensäure zu lösen,

tryptisch zu verdauen und anschließend die modifizierten Aminosäuren mittels TiO2-Säule

anzureichern. Die kombinierte Fragmentierung aus CID/ETD könnte in der

massenspektrometrischen Analyse zur Detektion potentieller posttranslationaler

Modifikationen führen. Ergänzend zu der Validierung der Desmin-Phosphorylierung müssten

die anderen als differentiell identifizierte Proteine mittels unabhängigen Methoden validiert

werden. Hier würden sich zum einen der 1D Western Blot zur Quantifizierung und zum

anderen die Immunhistochemie anbieten.

Murine Myoblasten stellten sich im Zuge diverser Transfektionsstudien als

exzellentes Modell zur Charakterisierung von Filamin C-Mutationen heraus. Die

Proteomanalyse in Zellkultur würde einen weiteren Beitrag zum besseren Verständnis der

Pathomechnismen der Filaminopathie leisten. Allerdings stellt die Etablierung der LMD von

C2C12-Zellen eine große Herausforderung dar. Das hier etablierte Protokoll für

Gewebeschnitte von humanen Filaminopathiepatienten konnte ohne weitere

Optimierungsarbeiten auf andere Subtypen der Myofibrillären Myopathien übertragen

werden. Die Übertragung des Protokolls auf die Zellkultur hingegen verlief nicht reibungslos.

Die Expression der humanen p.W2710X-Mutation führte in den C2C12-Zellen wie erwartet

zur Aggregatbildung innerhalb der Zellen, die in ihrer Zusammensetzung den humanen

Aggregaten ähnelten. Eine quantitative Analyse der Aggregatzusammensetzung war jedoch

nicht möglich, dies lässt sich vor allem vor allem durch die geringe Größe der Aggregate in

den Zellen und die schwer vergleichbare Probenbeschaffenheit erklären. Trotz dieser

Schwierigkeiten konnte gezeigt werden, dass sich die Zusammensetzung der

Proteinaggregate in Zellkultur und die der humanen Aggregate sehr ähnelt. In Zukunft wird

es wichtig sein, die Parameter zur differentiellen Proteomanalyse zu optimierten um einen

quantitativen Vergleich mit den humanen Aggregaten durchführen zu können. Auf Basis

dieses Vergleichs kann die Aggregat-lösende Wirkung diverser Substanzen ausgetestet

werden, welche die Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten von betroffenen Patienten

beschleunigen könnten.

159

6. Zusammenfassung

Die Filaminopathie ist ein Subtyp einer seltenen Gruppe hereditären

neuromuskulären Erkrankungen, den Myofibrillären Myopathien (MFM). Die Ursache für die

Filaminopathie liegt in Mutationen in dem für Filamin C codierenden Gen (FLNC). Die

Filaminopathie und die Myofibrillären Myopathien im Allgemeinen zeichnen sich durch die

fokale Zerstörung der Myofibrillen sowie die Bildung von intrazellulären Proteinaggregaten

in den Skelettmuskelzellen aus. Im Rahmen der vorliegenden Arbeite sollte erstmals die

Zusammensetzung der Filaminopathie-spezifischen Aggregate sowie des umliegenden

Gewebes analysiert werden, um 1. Filaminopathie-spezifische Bestandteile der Aggregate

und 2. mögliche Marker für Frühstadien zu identifizieren. Diese Daten sollten helfen, neue

Erkenntnisse bezüglich der Pathogenese der Filaminopathien zu gewinnen. Um dies zu

erreichen, wurden in dieser Arbeit zwei auf LMD basierende verschiedene proteomische

Ansätze mit drei verschiedenen Auswertestrategien etabliert. Für die Analysen wurden

mittels LMD aus Schnitten von Muskelbiopsien aus 6 Filaminopathiepatienten mit 3

unterschiedlichen Mutation und 6 gesunden Kontrollen gleich große Areale isoliert.

Die Aggregatanalyse erfolgte unter Verwendung eines Massenspektrometrie-

basierten Label-freien Ansatzes. Die Aggregate wurden aus dem Filaminopathiegewebe

isoliert und mit nicht betroffenen Muskelzellen desselben Patienten verglichen.

Anschließend erfolgte die massenspektrometrische Analyse. Im Rahmen einer qualitativen

Auswertung konnten durchschnittlich 415 Proteine in den Aggregatproben der

Filaminopathiepatienten identifiziert werden, von denen einige bereits aus früheren

Immunfluoreszenzanalysen bekannt waren. Den Großteil der identifizierten Proteine

machten jedoch unbekannte Komponenten der Aggregate aus. Zur Identifizierung von

möglichen Filaminopathie-spezifischen Proteinen in den Aggregaten, die nicht im

umliegenden Gewebe gefunden werden können, wurde eine manuell durchgeführte

quantitative Auswertestrategie hinzugezogen. Insgesamt konnten 111 Proteine als

Zusammenfassung

160

spezifische Bestandteile der Proteinaggregate identifiziert. 2 der nur in Aggregat-

vorkommenden Proteine konnten im Laufe der hier vorliegenden Arbeit validiert werden:

Xirp2 und Rab35. Xirp2 konnte erst kürzlich von uns als neuer Bindungspartner des Filamin C

charakterisiert werden. Allerdings ist Xirp2 kein spezifischer Marker für Filaminopathie, da es

auch in den Proteinaggregaten von Patienten mit Desminopathien gefunden wurde. Rab35

hingegen, dessen Rolle in der Aggregatbildung in der Filaminopathie noch ungeklärt ist,

könnte als ein spezifischer Marker der Filaminopathie dienen. Um Rab35 als eindeutigen

Marker für die Filaminopathie bestätigen zu können, müssen Aggregatanalysen anderer

MFM-Subtypen folgen. Die manuelle Auswertung ermöglichte einen sehr interessanten

Überblick über die Zusammensetzung der Proteinaggregate, ließ jedoch keine differentiellen

Aussagen zum Entwicklungsprozess der Filaminopathie zu. Mittels der weiter entwickelten

automatisierten Auswertestrategie in Form des Spectral Index Calculation konnten 69

akkumulierte und 31 niedrig abundante Proteine identifiziert werden. Die Übereinstimmung

zwischen den beiden quantitativen Auswertestrategien lag bei 38 % (38 Proteine). Beide

Auswertestrategien deckten viele neue, interessante Bestandteile der Aggregate auf, die in

zukünftigen Studien validiert werden müssen.

Zur Charakterisierung möglicher Frühstadien der Filaminopathie wurde Aggregat-

freies Gewebe aus den Patienten mittels einer Kombination aus LMD und 2D DIGE Analyse

untersucht. Insgesamt konnten 6 differentiell exprimierte Proteine identifiziert werden.

Darunter befand sich das Intermediärfilament Desmin, welches eine extrem wichtige Rolle in

der Aufrechterhaltung der zellulären Integrität übernimmt. Im Desmin wurde aufgrund der

Perlenketten-artigen Anordnung der Spots eine potentielle posttranslationale Modifikation

in Form einer Phosphorylierung vermutet. Meine Ergebnisse bestätigten diese Vermutung

und so könnte die Phosphorylierung des Desmin ein entscheidendes Ereignis in der frühen

Pathogenese der Filaminopathie darstellen. Die übermäßige Phosphorylierung des Desmins

führt zu einer Desorganisation des filamentären Netzwerks und könnte so zur Zerstörung der

Myofibrillen beitragen. Es bleibt zu klären, ob die Phosphorylierung des Desmin ein

spezifisches Merkmal für die Frühstadien der Filaminopathien darstellt. Generell scheint

Desmin in der Filaminopathie wie auch in anderen Subtypen der MFM eine Art Schlüsselrolle

in der Pathogenese zu übernehmen.

Zusammenfassung

161

In Ergänzung zu den Analysen des humanen Materials wurde in der hier vorliegenden

Dissertation ein Vergleich von murinen Myoblasten und humanem Gewebe hinsichtlich ihrer

Aggregatzusammensetzung angestrebt. Die p.W2710X-Mutation wurde in C2C12-Zellen

transfiziert. Die intrazelluläre Proteinaggregation, die in Muskelfasern von Filaminopathie-

patienten stattfindet, ließ sich durch Expression der Mutante in den kultivierten Zellen

reproduzieren. Die qualitative Analyse der murinen Zellaggregate zeigte, dass viele der

identifizierten Proteine auch als Bestandteile der humanen Aggregate detektiert werden

konnten. Eine quantitative Auswertung konnte aufgrund von stark schwankenden Zahlen an

identifizierten Proteinen nicht durchgeführt werden. Es bedarf aber noch einiger

Optimierungsarbeiten, um diese erfolgreich durchzuführen. Dennoch konnte in dieser

Dissertation gezeigt werden, dass die C2C21-Zellen ein geeignetes Modellsystem für

proteomische Studien darstellen.

162

7. Summary

The filaminopathy is a subtype of a rare group of hereditary neuromuscular diseases,

the myofibrilliar myopathies (MFM). The filaminopathies are caused by several mutations in

the gene coding for Filamin C (FLNC). The filaminopathy and myofibrilliar myopathies in

general are characterized by focal destruction of myofibrils and the formation of intracellular

protein aggregates in skeletal muscle cells. The most important aim of this work was to

elucidate the composition of the specific aggregates and the surrounding tissue in order to

identify 1. filaminopathy-specific components of the aggregates and 2 possible markers for

early stages of the disease. These data should help to gain new insights into the

pathogenesis of filaminopathies. Two different proteomic approaches, based on

lasermicrodissection, in combination with three different evaluation strategies were

established. The tissue of 6 filaminopathy patients with 3 different mutation and 6 healthy

controls was isolates by lasermicrodissection. The composition of the aggregates was

analyzed by a mass spectrometry analysis based label-free approach. The aggregates were

isolated from the muscle biopsies and compared to non-affected muscle of the same

patient. In a quantitative evaluation 415 proteins were identified in the aggregate, some of

which were already known from previous immunofluorescence analysis. However, the

majority of the proteins had not been identified as components of the aggregates. To

identify possible specific proteins which are specific markers for the aggregation process in

filaminopathy and could not be found in the surrounding tissue, a manually performed

quantitative evaluation strategy was consulted. A total of 111 proteins were identified as

specific components of protein aggregates. Two of these accumulated proteins in aggregates

could be validated: Xirp2 and Rab35. Recently we could characterize Xirp2 as a new binding

partner of the filamin C recently. However it is not a specific marker for filaminopathies

because of its presence in aggregates in patients with desminopathy. Whereas Rab35, whose

role in the formation of aggregates in filaminopathies is still unknown, might be considered

Summary

163

as a specific marker for filaminopathies. In order to confirm Rab35 as a unique marker for

filaminopathies, further studies of aggregates must follow. Manual analysis facilitated a very

interesting overview of the composition of the protein aggregates, but left no differential

statements to the development process of filaminopathy. By means of advanced automated

evaluation 69 accumulated and 31 low abundant proteins could be identified. The

quantitative agreement between the two evaluation strategies were (38 proteins) at 38%.

Both evaluation strategies revealed many new and interesting components of the

aggregates, which need to be validated in future studies.

To characterize early stages of aggregate-free tissue from patients with filaminopathy was

analyzed by a combination of LMD and 2D DIGE analysis. A total of 6 differentially expressed

proteins were identified. Among them we found the intermediate filament desmin, which

assumes an extremely important role in the maintenance of cellular integrity. In desmin a

potential post-translational modification has been suggested in the form of phosphorylation

due to the pearl chain-like arrangement of the spots. My results confirmed this assumption

and thus the phosphorylation of desmin could be a critical event in the pathogenesis of early

filaminopathy. An increased amount of phosphorylated desmin leads to disorganization of

the filamentous network and could thus contribute to the destruction of myofibrils. It

remains to be determined whether the phosphorylation of desmin represents a specific

feature of the early stages of filaminopathies. Generally desmin seems to play a key roll in

filaminopathies as well as in other subtypes of MFM. In addition to the analysis of human

muscle biopsies, a comparison of murine myoblasts and human tissue was intended in terms

of their aggregate composition. The p.W2710X mutation was transfected into C2C12 cells.

The intracellular protein aggregation that occurs in muscle fibers of patients with

filaminopathy was reproduced by expression of the mutant in the cultured cells. The

qualitative analysis of the murine cell aggregates showed that many of the identified

proteins could also be identified in the human aggregates. A quantitative analysis was not

performed due to fluctuating Pay nan identified proteins. It still requires some optimization

work to carry out the quantitative comparison successfully. Nevertheless, in this thesis it was

shown that the C2C21 cells represent a suitable model system for proteomic studies.

164

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192

9. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1.: Strukturelle Darstellung einer Myofibrille__________________________________________ 3

Abbildung 1.2.: Schematische Darstellung eines Filamin C Moleküls _________________________________ 4

Abbildung 1.3: Phänotypische und histologische Merkmale der Myofibrillären Myopathie ________________ 8

Abbildung 1.4.: Zusammenfassung wichtiger Proteine des Skelettmuskels ____________________________ 9

Abbildung 1.5.: Zusammenfassung aller bekannten Mutationen im Filamin C-Gen _____________________ 12

Abbildung 1.6.: Schematische Darstellung Lasermikrodissektionsprozess ____________________________ 14

Abbildung 1.7.: Schematischer Aufbau eines Massenspektrometers ________________________________ 20

Abbildung 1.8.: Schematische Darstellung der Elektrospray-Ionisation_______________________________ 22

Abbildung 1.9.: Querschnitt durch den Orbitrap-Massenanalysator _________________________________ 25

Abbildung 1.10.: Schematische Darstellung der LTQ-Orbitrap ______________________________________ 26

Abbildung 4.1: Darstellung der Aggregate auf Glasobjektträgern und PET-Membran ___________________ 74

Abbildung 4.2: Vergleich der gewählten Auswertestrategien ______________________________________ 96

Abbildung 4.3.: Validierung spezifischer Proteine in Aggregaten von Filaminopathienpatienten __________ 97

Abbildung 4.4.: Optimierung der mikrodissektierten Fläche von Muskelfasernzellen ___________________ 99

Abbildung 4.5.: Repräsentatives Gel der 2D DIGE Studie _________________________________________ 101

Abbildung 4.6.: Mastergel der 2D DIDE Studie mit allen als differentiell identifizierten Spots ____________ 102

Abbildung 4.7.: pI-Shift der regulierten Desmin Spots in den sauren Bereich _________________________ 106

Abbildung 4.8.: Darstellung der 2D Blots und Nitrocellulose-Membranen ___________________________ 107

Abbildung 4.9.: Ergebnis Immunoblots zur Validierung der Desmin-Phosphorylierung _________________ 109

Abbildung 4.10.: Transfektion C2C12-Zellen mit C2-Konstrukt ____________________________________ 112

Abbildung 4.11.: Transfektion C2C12-Zellen mit N3-Konstrukt ____________________________________ 113

Abbildung 4.12.: Vergleich von Proteinaggregaten in C2C12-Zellen und humanen Skelettmuskelschnitten _ 114

Abbildung 4.13.: Zusammenfassung der Label-freien Proteomanalyse in Zellkultur ____________________ 118

Abbildung 4.14.: Darstellung aller identifizierter Proteine in humane Skelettmuskelproben _____________ 119

193

10. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1.: Unterteilung der Intermediärfilament-Familie in 6 Gruppen _________________________ 5

Tabelle 1.2.: Übersicht über alle bekannten MFM verursachenden Mutationen ____________________ 9

Tabelle 3.1.: Daten der analysierten Filaminopathiepatienten _________________________________ 44

Tabelle 3.2.: Daten der gematchten Negativkontrollen _______________________________________ 44

Tabelle 3.3.: Übersicht über die verwendeten FLNC-Konstrukte ________________________________ 48

Tabelle 3.4.: Suchparameter für die Identifizierung von Gelspots _______________________________ 63

Tabelle 3.5.: Suchparameter für die Charakterisierung von spezifischer Aggregatbestandteile ________ 67 Tabelle 4.1.: Vergleichs von 3 verschiedenen Lösungsmitteln zur Solubilisierung von 250 Aggregaten __ 76

Tabelle 4.2.: Analyse von 100 und 250 mikrodissektierten Aggregaten, Auftrennung 1D Gel _________ 77

Tabelle 4.3.: Analyse von 50 und 100 mikrodissketierten Aggregaten____________________________ 78

Tabelle 4.4.: Analyse von 50 und 100 mikrodissketierten Aggregaten in 20 und 40 µl Ameisensäure ___ 79

Tabelle 4.5.: Liste der als spezifisch für Filaminopathie identifizierte Proteine in Aggregaten _________ 83

Tabelle 4.6.: Proteine, die ausschließlich in den Patientenkontrollen identifiziert wurden ___________ 88

Tabelle 4.7.: Liste der in Patientenkontrollen höher abundanten Proteinen_______________________ 91

Tabelle 4.8.: Liste der in Patientenkontrollen gering abundanten Proteine _______________________ 91

Tabelle 4.9.: Proteine, die in der manuellen und automatisierten Auswertung als spezifische Bestandteile

der Aggregate in Filaminopathiepatienten identifiziert werden konnten _________________________ 93

Tabelle 4.10: Zusammenfassung aller identifizierten Spots ___________________________________ 103

Tabelle 4.11.: Übereinstimmungen zwischen den Spectral Index Daten und der 2D DIGE Studie _____ 105

Tabelle 4.12.: Vergleich mikrodissektierter Areale aus murinen Myoblasten _____________________ 116

194

11. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Verena Theis, geb. Schwarz

Geburtsdatum, -ort 18. Mai 1982 in Bochum

Familienstand verheiratet, 1 Sohn

Nationalität deutsch

Hochschulbildung

02/2009 Beginn der Promotion bei Prof. Dr. Katrin Marcus und Prof. Dr.

Matthias Vorgerd/ Dr. Rudolf A. Kley

03/2009 Abschluss des Masterstudiums

10/2006 – 03/2009 Studium der Neurowissenschaften, Universität zu Köln

Masterarbeit: „Einfluss von miRNA auf die Lokalisation von

mRNA“ bei Qiagen GmbH, Hilden

10/2003 – 09/2006 Studium der Molekularen Medizin, Georg-August-Universität

Göttingen

Bachelorarbeit „Charakterisierung von Enzymmutanten, die mit

lysosomalen Speichererkrankungen einhergehen“, in der

Pädiatrie 2 des Universitätsklinikums Göttingen

10/2001 – 09/2003 Studium der Humanbiologie, Ernst-Moritz-Arndt Universität

Greifswald

Schulbildung

09/1990 – 06/2001 Städt. Helmholtz Gymnasium, Hilden

08/1988 – 02/1990 Gemeinschaftsgrundschule, Hilden

Lebenslauf

195

Lehrtätigkeiten

Vorlesungsnummer

Mitbetreuung des Praktikums der Biochemie / Molekularbiologie II 200512

(mit pathobiochemischen Bezügen):

Mitbetreuung des Praktikums der medizinischen Mikrobiologie: 200122

Expertise

Methoden

Elektrophorese und Chromatographie:

Ein- und zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE: Ampholine)

2D-DIGE-System („minimal“ und „saturation Labeling“)

Massenspektrometrie von Peptiden und Proteinen:

Orbitrap LTQ (Thermofisher), LTQ (Bruker)

MALDI-TOF-TOF-MS (Ultraflex™, Bruker Daltonik)

Sonstiges:

Lasermikrodissektion

Analyse und Charakterisierung von modifizierten Proteinen (Phosphorylierungen)

Immunoblotting (Westernblotting), Immunfluoreszenz

Zellkultur

EDV

MS Office

Bildbearbeitungsprogramme (Corel Draw, Corel Photo paint)

Auswertungsprogramme für Massenspektrometrie- und Proteomdaten

(ProteinScape, DeCyder™)

Veröffentlichungen

RA Kley, A. Maerkensᵻ, Y. Leber, V. Theis, A. Schreiner, PFM. van der Ven, J. Uszkoreit, C.

Stephan, S. Eulitz, N. Euler, J. Kirschner, K. Müller, HE. Meyer, M. Tegenthoff, DO.

Fürst, M. Vorgerd, T. Müller, K. Marcus . „A combined laser microdissection and mass

spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in

aggregates of filaminopathy patients. Mol Cell Protoemics, Januar 2013

Lebenslauf

196

A Maerkens, RA Kley, M. Olivé M, V. Theis, PF van der Ven, J. Reimann, H. Milting, A.

Schreiner, J Uszkoreit, M. Eisenacher, K. Barkovits, AK. Güttsches, J. Tonillo, K.

Kuhlmann, HE Meyer, R. Schröder, M. Tegenthoff, DO Fürst, T Müller, LG Goldfarb, M

Vorgerd, K Marcus. Differential proteomic analysis of abnormal intramyoplasmic

aggregates in desminopathy. J Proteomics, April 2013

Ausgewählte Vorträge

November 2010:

DFG Forschergruppen Treffen FOR 1228, Bonn, Germany

“Label-free analysis of aggregates in patients with Filaminopathie”

Ausgewählte Posterpräsentationen

2009:

3th Summer School in Proteomic Basics, Brixen, Italy

“Establishment of laser microdissection and differential proteomic analysis

using samples from patients with myofibrilliar myopathy”

2010:

FoRUM Tagung 2010, Bochum, Germany

“Etablierung der Laser-Mikrodissektion und Proteomanalysen bei Patienten mit

Myofibrillären Myopathien (MFM) zur Identifikation neuer Kandidaten-Gene”

2012:

DGNN Kongress, Erlangen, Germany

“LMD-assisted Comparison of Muscle Proteome in Patients with

Filaminopathy and matched Controls”

Sonstige Kongresse

2009:

Arbeitstagung – Mikromethoden in der Proteinbiochemie, Martinsried, Deutschland

2011:

Jahrestagung MD-NET

Lebenslauf

197

Stipendien und Preise

08/2009 Reisestipendium Rektoratsprogramm der Ruhr Universität Bochum

für die Summer School in Brixen, Italien

08/2009 Reisestipendium der DGPF für die Summer School in Brixen, Italien

11/2010 Posterpreis bei der FoRUM Tagung 2010

12/2010 Posterpreis bei der Jahresabschlusstagung des MPC 2010

Zusatzqualifikationen

Leistungsnachweis in Gewerblicher Rechtsschutz: Patentwesen in den

Ingenieurwissenschaften (Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Ruhr-Universität

Bochum 2011, Bochum, Germany)

Mitgliedschaften

Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung (DGPF)

198

12. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich bei den Menschen bedanken, die mich in all den Jahren

unterstützt und begleitet haben. Vor allem während und nach meiner Schwangerschaft

konnte ich auf die Unterstützung vieler zählen.

An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Katrin Marcus bedanken: Liebe Katrin, ich

danke dir für die Möglichkeit in deiner Gruppe promovieren zu können. In den vergangenen

Jahren durfte ich so viel lernen und konnte mich, dank deiner Hilfe, wissenschaftlich wie

auch persönlich weiterentwickeln.

Ein großer Dank gilt auch Dr. Rudolf Andre Kley und Prof. Dr. Matthias Vorgerd: Lieber Rudi,

lieber Matthias, ich möchte mich bei euch für die Unterstützung und das mir

entgegengebrachte Vertrauen in den letzten Jahren bedanken. Dank euch hatte ich die

Möglichkeit dieses interessante Thema zu bearbeiten.

Vielen Dank Alexandra Maerkens für die produktive und angenehme Zusammenarbeit!

Liebe Alex, ich danke dir, dass du während meiner Abwesenheit das Projekt so erfolgreich

weitergeführt hast.

Ich bedanke mich sehr herzlich bei Prof. Dr. Rolf Heumann für die freundliche Übernahme

des Korreferats.

Bei Herrn Prof. Dr. Helmut Meyer möchte ich mich für die Möglichkeit bedanken, am

Medizinischen Proteom Center zu arbeiten und die ausgezeichnet ausgestatteten

Laboratorien nutzen zu dürfen.

Danksagung

199

Ich möchte mich ganz herzlich bei der DFG-Forschergruppe FOR 1228 „Molekulare

Pathogenese der Myofibrillären Myopathien“, unter der Leitung von Prof. Dr. Rolf Schröder,

für die Unterstützung meiner Promotion bedanken.

Ich danke Dr. Thorsten Müller für die Einführung in die Proteomik zu Beginn meiner

Promotion und die Hilfestellung während der gesamten Zeit.

Ein großer Dank gilt auch Dr. Katja Rosenkranz. Ich möchte mich für die Hilfestellung bei der

Korrektur dieser Arbeit, die vielen Diskussionen und den guten Zuspruch bedanken.

Ein herzlicher Dank gilt Kathy Pfeiffer für ihre große Hilfsbereitschaft inner- und außerhalb

des Labors. Ohne sie und ihre Babysitterqualitäten wären viele Frühschichten im Labor nicht

denkbar gewesen!

Ich möchte mich bei allen anderen Mitarbeitern (teilweise ehemaligen Mitarbeitern) der

Abteilung Funktionelle Proteomik für das freundliche Arbeitsklima, die vielen Gespräche,

die fachlichen Diskussionen und die seelische Unterstützung bedanken. Besonders

hervorheben möchte ich Regina Küßner, Marie Lutz, Caroline May, Bettina Serschnitzki,

Frederic Brosseron, Peter Chartowski, Andre Przyborski und Christina Looße.

Ich möchte mich auch bei Anja Schreiner und Janine Mertens-Rill für die sehr angenehme

Zusammenarbeit im Muskellabor bedanken. Besonders Anja danke ich für die vielen

unterhaltsamen Stunden am LMD.

Thilo Lerari möchte ich für die unerschütterliche Geduld danken, mit er versucht hat mir die

LTQ und die Phosphoanalytik nahe zu bringen. Ohne den speziellen Phosphopinhibitor-

Cocktail hätte ich vielleicht nie die Phosphorylierung gefunden!

Christina John, Jason Tonillo und Heiner Falkenberg danke ich für die zuverlässige und

schnelle Messung meiner Proben.

Ein herzlicher Dank gilt auch allen anderen Mitarbeitern des Medizinischen Proteoms

Centers für die vier schönen Jahre und die angenehme Zusammenarbeit!

Danksagung

200

Bedanke möchte ich mich auch bei der Medizinischen Fakultät der Ruhr Universität, die im

Rahmen der „Forschungsförderung der Ruhr Universität Bochum“ (FoRUM) diese Arbeit mit

einer Anschubfinanzierung ermöglicht hat.

Zum Schluss möchte ich mich bei meiner Familie von Herzen danken:

Liebe Mama, lieber Papa! Ich möchte euch für die letzten 31 Jahre danken, in denen ihr

immer für mich da wart und mich auch in den schwierigsten Zeiten unterstützt habt. Ohne

euch wäre ich nie da, wo ich heute stehe. Ihr habt mir so viel ermöglicht, dafür werde ich

euch immer dankbar sein!

Lieber Christian! Als ich meine Masterarbeit 2008 schrieb, konntest du nur erahnen, welche

Naturgewalten während der Schreibphase der Dissertation auf dich zu kommen würden. Ich

bin mir sicher, dass ich deine Erwartungen deutlich übertreffen konnte. Ich danke dir, dass

du in den letzten Monaten jede erdenkliche Emotion mit mir durchlebt und mich zum

Durchhalten motiviert hast. Ich liebe dich!

Mein innigster Dank gilt Krümel und Cassian: Für euch schlägt mein Herz!

201

13. Anhang

Tabelle 13.1.: Darstellung aller als höher abundant identifizierte Proteine in Aggregatproben mittels Spectral

Index Calculation

Die Liste zeigt alle Proteine, die über Spectral Index Calculation als differentiell exprimiert in den

Aggregaten identifiziert wurden. Die dargestellten Proteine weisen eine Ratio ≥ 1,8 mit einem p-Wert

≤ 0,05 auf. Für die Aggregatproben wie auch die Patientenkontrollen (PatKO) wurde für jedes einzelne

Protein der durchschnittliche Spectral Index (SI) aufgeführt. Die Liste wurde nach absteigendem SI in

den Aggregatproben sortiert.

Accession Nr.

Protein Aggregate (SI) PatKO (SI) Ratio p-Wert

Q14315 Filamin-C 207,7 29,5 7,0 8,3x10-7

P17661 Desmin 116,4 29,0 4,0 5,2x10-7

A4UGR9 Xirp2 64,4 0,0 n.a.* 1,9x10-6

Q86VF7 N-RAP 49,8 0,8 62,9 6,0x10-9

P02511 αB-Crystallin 31,0 3,0 10,3 1,8x10-7

Q5VST9 Obscurin 30,3 10,0 3,0 2,1x10-4

Q702N8 Xin 29,7 1,1 25,9 5,4x10-8

P48681 Nestin 26,8 0,4 67,6 7,0x10-7

P12111 Collagen Typ VI,Alpha-3 16,9 3,5 4,8 0,0001

Q13203 Myosin-bindendes Protein H 16,5 1,1 14,8 0,0009

Q9UBF9 Myotilin 16,1 8,7 1,8 0,002

O75923 Dysferlin 12,7 1,7 7,3 0,0001

P04792 Hitzeschockprotein Beta-1 12,0 2,1 5,8 0,0003

P62805 Histon H4 9,9 3,4 2,9 0,003

Anhang

202

P06396 Gelsolin-Precursor 5,4 2,5 2,1 0,02

P02545 Lamin-A/C 5,1 0,8 6,5 0,0009

P08670 Vimentin 4,3 1,0 4,1 0,001

Q14764 Major vault-Protein 4,2 0,0 n.a. 0,01

P11142 HSC 71 4,0 1,7 2,3 0,03

P28074 Proteasom-Untereinheit Beta

Typ-5 3,8 0,2 24,6 0,001

Q86TC9 Myopalladin 3,3 0,0 n.a. 0,001

Q7Z406 Myosin-14 3,3 0,1 23,9 0,03

P54652 Hitzeschockprotein 72 3,1 1,1 2,7 0,01

Q15124 Aciculin 3,1 0,0 n.a. 0,04

Q0ZGT2 Nexilin 3,0 0,5 6,2 1,4x10-5

Q13642 FHL 1 3,0 1,6 1,8 0,04

P13591 neurales Zelladhäsionsmolekül

1 2,8 0,0 n.a. 9,6x10

-5

P02768 Serumalbumin-Precursor 2,8 0,5 5,3 0,02

Q9UBY9 Hitzeschockprotein Beta-7 2,7 0,2 18,2 0,04

O75298 Reticulon-2 2,7 1,3 2,1 0,03

P21333 Filamin-A 2,6 0,3 9,2 7,0x10-6

Q14596 Next to BRCA1 gene 1-Protein 2,6 0,0 n.a. 0,02

Q9UDY4 DnaJ Homolog, Subfamilie B 2,4 0,0 n.a. 0,01

P35580 Myosin-10 2,1 0,3 6,7 0,03

Q5BKX8 Muskel-spezifisches coiled-

coil-Protein 2,1 0,0 n.a. 0,04

Q2TBA0 Sarcosynapsin 2,0 0,7 3,1 0,01

Q92614 Myosin-XVIIIa 2,0 0,1 14,5 0,01

O95817 BAG 3 1,9 0,3 6,0 0,01

Q9H7C4 Syncoilin 1,8 0,0 n.a. 0,003


Untereinheit Alpha-1 1,8 0,0 n.a. 0,0009

Anhang

203

O14958 Calsequestrin 1,7 0,9 1,8 0,05

Q14204 Cytoplasmatisches Dynein 1 1,6 0,0 n.a. 0,03

P54289 Spannungs-abhängiger

Calcium-Kanal, Untereinheit Alpha-2/Delta-1

1,6 0,3 5,4 0,01

Q8TDC0 Myozenin-3 1,5 0,5 2,9 0,02

P28289 Tropomodulin-1 1,4 0,2 8,9 0,02


Typ-4 1,4 0,0 n.a. 0,003

P00387 NADH-Cytochrom b5-

Reduktase 3 1,4 0,5 2,9 0,02

Q8IVN3 Embryonales Skelettmuskel-

Kern Protein 1 1,4 0,4 3,3 0,02

Q0D2I5 Intermediärfilament-Familie

Orphan 1 1,3 0,0 n.a. 0,0002

P62140 Serin/Threonin-

Proteinphosphatase PP1-Beta, katalytische Untereinheit

1,3 0,0 n.a. 0,01

P11532 Dystrophin 1,3 0,0 n.a. 0,02

P11047 Laminin, Untereinheit Gamma-

1 1,3 0,0 n.a. 0,03

O75369 Filamin-B 1,3 0,0 n.a. 0,0001

O43760 Synaptogyrin-2 1,3 0,0 n.a. 8,7x10-5

O14558 Hitzeschockprotein Beta-6 1,2 0,1 8,8 0,01

Q6P5Q4 Leiomodin-2 1,2 0,2 7,8 0,01


Untereinheit Beta-1 1,1 0,0 n.a. 1,1x10-9

Q9UJW0 Dynactin, Untereinheit 4 1,0 0,0 n.a. 0,02

Q3KRA9 α-Ketoglutarat-abhängige

Dioxygenase ABH6 1,0 0,0 n.a. 0,02

O00487 26S Proteasom-Untereinheit 14, nicht ATPase-regulierend

1,0 0,0 n.a. 0,001

Q8NF91 Nesprin-1 1,0 0,0 n.a. 0,02

P09382 Galectin-1 0,9 0,0 n.a. 0,02

Q15286 Rab-35 0,9 0,0 n.a. 0,001

O75665 Oral-facial-digital-Syndrom 1-

Protein 0,9 0,0 n.a. 0,02


Typ-6 0,9 0,0 n.a. 0,02

Anhang

204

P68371 Tubulin 0,7 0,0 n.a. 0,01

P02786 Transferrin-Receptor-Protein 1 0,7 0,0 n.a. 0,01

A5YM72 Carnosin-Synthase 1 0,7 0,0 n.a. 0,01

Q6ZMU5 Tripartite motif-containing-

Protein 72 0,7 0,0 n.a. 0,01

Tabelle 13.2.: Liste aller Proteine, die in den Aggregaten mittels Spectral Index Calculationals weniger abundant

identifiziert wurden

Die Liste enthält die Proteine, die über Spectral Index Calculation als differentiell exprimiert in den

Aggregaten identifiziert wurden. Die dargestellten Proteine weisen eine Ratio ≤ 0,55 mit einem p-Wert

≤ 0,05 auf und gelten somit als geringer exprimiert. Für die Aggregatproben wie auch die

Patientenkontrollen (PatKO) wurde für jedes einzelne Protein der durchschnittliche Spectral Index (SI)

aufgeführt. Die Liste wurde nach absteigendem SI in den Aggregatproben sortiert.

Accession Protein Aggregate (SI) PatKO

(SI) Ratio p-Wert

Q9UKX2 Myosin-2 39,7 83,2 0,5 0,03

Q96A32 Myosin 2, regulatorische

leichte Kette 13,4 40,6 0,3 0,009

P54296 Myomesin-2 13,4 34,3 0,4 1,9x10-6

P52179 Myomesin-1 14,5 31,2 0,5 2,8x10-6

P08590 Myosin-3, leichtes Polypeptid 14,9 31,1 0,5 0,02

P13535 Myosin-8 7,8 27,5 0,3 0,02

P02585 Troponin C 4,7 13,6 0,3 0,04

P48788 Troponin I 0,9 6,1 0,1 0,02

P31415 Calsequestrin-1-Precursor 1,9 5,3 0,4 0,01

Q13423 NAD(P)-Transhydrogenase 2,2 5,2 0,4 0,03

P31930 Komplex III-Untereinheit 1 0,9 3,8 0,2 0,001

O75746 Calcium-bindendes

mitochondriales Trägerprotein Aralar 1

0,7 3,7 0,2 0,002

P00403 Cytochrome c –Oxidase,

Untereinheit 2 0,7 3,6 0,2 0,0004

P35573 Glycogen-Entzweigungsenzym 0,8 3,6 0,2 0,003

P28331 NADH-Ubiquinon-

Oxidoreductase, 75 kDa-Untereinheit

0,7 2,9 0,2 0,03

Anhang

205

P20674 Cytochrome c-Oxidase,

Untereinheit 5A 1,2 2,7 0,4 0,02

P06733 Alpha-enolase 1,2 2,5 0,5 0,03

P36542 ATP-Synthase, Gamma-Kette 0,9 2,3 0,4 0,008

Q16891 Mitochondriales innere

Membran-Protein 0,8 2,2 0,4 0,007

P33121 Langkettige Fettsäure-CoA-

Ligase 1 0,2 2,2 0,1 0,02

P30049 ATP-Synthase, Delta-Kette 1,0 1,9 0,5 0,04

P10606 Cytochrome c-Oxidase,

Untereinheit 5B 0,8 1,9 0,4 0,03

P19404 NADH Dehydrogenase, Flavo-

protein 2 0,0 1,8 n.a.* 0,0003

P24310 Cytochrome c-Oxidase

Polypeptide VIIa, aus Herz 0,1 1,6 0,1 0,002

O75489 NADH-Dehydrogenase

Eisen-Schwefel-Protein 3 0,7 1,6 0,4 0,04

Q02880 DNA-Topoisomerase 2-beta 0,0 1,3 n.a. 0,0007

O95299 NADH-Dehydrogenase 1 Alpha-Subkomplex, Untereinheit 10

0,2 1,2 0,1 0,03

P40926 Malate-Dehydrogenase 0,0 1,1 n.a. 0,004

Q07020 ribosomales Protein L18 der

60S-Untereinheit 0,0 1,0 n.a. 0,02

P47985 Ubiquinol-Cytochrome c -

Reduktase 0,0 0,8 n.a. 0,02

Q16795 NADH-Dehydrogenase 1 Alpha-

Subkomplex, Untereinheit 9 0,0 0,7 n.a. 0,01

Q92523 Carnitin-O-Palmitoyltransferase

1 0,0 0,6 n.a. 0,01

n.a.: not applicable (nicht anwendbar)

206

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig

übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, Juni 2013

Verena Theis

Etablierung der Lasermikrodissektion zur proteomischen ... · DIGE differential in-gel...

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