Etablierung der Lasermikrodissektion zur proteomischen ... · DIGE differential in-gel...

Click here to load reader

  • date post

    20-Aug-2019
  • Category

    Documents

  • view

    214
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Etablierung der Lasermikrodissektion zur proteomischen ... · DIGE differential in-gel...

  • Etablierung der Lasermikrodissektion zur proteomischen Analyse

    von humanem Filaminopathiegewebe und murinen Myoblasten

    Dissertation

    zur Erlangung des Grades

    eines Doktors der Naturwissenschaften

    Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

    angefertigt

    in der Abteilung Funktionelle Proteomik am Medizinischen Proteom-Center

    vorgelegt

    der Fakultät für Chemie und Biochemie

    an der Ruhr-Universität Bochum

    von

    Verena Theis, geb. Schwarz

    Bochum

    Juni, 2013

  • Establishment of proteomic studies in patients with filaminopathy

    and murine myoblasts

    Dissertation

    To obtain the degree

    Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

    Dept. Functional Proteomics Medical Proteom Center

    International Graduate School of Chemistry and Biochemistry,

    Faculty of Chemistry and Biochemistry, Ruhr-University Bochum

    Submitted by

    Verena Theis, geb. Schwarz

    Bochum

    Juni 2013

  • Referent: Prof. Dr. Katrin Marcus

    Funktionelle Proteomik

    Ruhr Universität Bochum

    Korreferent: Prof. Dr. Rolf Heumann

    Molekulare Neurobiochemie

    Ruhr Universität Bochum

  • Für Krümel und Cassian

  • i

    Inhaltsverzeichnis

    INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................................. I

    ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................... I

    1. EINLEITUNG ........................................................................................................................ 1

    1.1. Die Skelettmuskulatur ......................................................................................................................... 1

    1.1.1. Aufbau der Myofibrillen ..................................................................................................................... 2

    1.1.2. Die Filamine....................................................................................................................................... 3

    1.1.3. Die Bedeutung von Intermediärfilamenten ........................................................................................ 5

    1.2. Myofibrilläre Myopathien (MFM) ........................................................................................................ 7

    1.3. Die Filaminopathie ............................................................................................................................ 10

    1.4. Lasermikrodissektion ......................................................................................................................... 12

    1.5. Grundlagen der Proteomanalyse ....................................................................................................... 14

    1.5.1. Proteomanalysen von Skelettmuskulatur ....................................................................................... 15

    1.5.2. Auftrennung mittels 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D PAGE) ............................................ 17

    1.5.3. Differentielle Proteomstudie und Quantifizierung von Proteinen ................................................... 17

    1.6. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ............................................................................ 19

    1.7. Massenspektrometrie........................................................................................................................ 19

    1.7.1. Ionenquellen ................................................................................................................................. 21

    1.7.2. Massenanalysatoren ...................................................................................................................... 23

    1.8. Quantitative Massenspektrometrie ................................................................................................... 27

    1.8.1. Isotopen-Labeling .......................................................................................................................... 27

    1.8.2. Label-freie Quantifizierug mittels Spectral Index Calculation .......................................................... 29

    2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT ................................................................................................ 32

    3. MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................ 34

    3.1. Verwendete Chemikalien .................................................................................................................. 34

    3.2. Verwendete Geräte und Materialien ................................................................................................. 38

  • Inhaltsverzeichnis

    ii

    3.3. Präparation von Gewebeschnitten .................................................................................................... 43

    3.4. Patientendaten .................................................................................................................................. 43

    3.5. Immunfluorezenzfärbungen .............................................................................................................. 45

    3.5.1. Immunfluoreszenzfärbungen auf Glasobjektträgern ....................................................................... 45

    3.5.2. Immunfluoreszenzfärbung aufPET-Membran ................................................................................. 45

    3.5.3. Validierung differentieller Proteine mittels Immunfluoreszenz ....................................................... 46

    3.6. Herstellen von Muskellysaten ........................................................................................................... 46

    3.7. Kultivierung von murinen Myoblasten .............................................................................................. 47

    3.8. Zellbiologische Methoden ................................................................................................................. 48

    3.8.1. Transformation von Konstrukten in E.coli-Zellen ............................................................................ 49

    3.8.2. DNA-Extraktion und Überprüfung der Plasmid-DNA ....................................................................... 49

    3.8.3. Herstellen von Glycerolstocks ........................................................................................................ 50

    3.8.4. Transfektion der FLNc Konstrukte in murine Myoblasten ............................................................... 50

    3.9. Lasermikrodissektion (LMD) .............................................................................................................. 51

    3.10. Solubilisierung der Aggregate ............................................................................................................ 52

    3.11. In-Lösung-Verdau .............................................................................................................................. 52

    3.12. Aufreinigung der Proben nach dem In-Lösung-Verdau ...................................................................... 53

    3.13. Differentielle In-Gel Elektrophorese des Proteoms von Patienten mit Filaminopathie ...................... 54

    3.13.1. Markierung der Proteine durch CyDye™Farbstoffe ......................................................................... 54

    3.13.2. Isoelektrische Fokussierung mit Trägerampholyten ........................................................................ 55

    3.13.3. Proteinauftrennung nach Molekulargewicht .................................................................................. 57

    3.13.4. Differentielle Bildanalyse ............................................................................................................... 58

    3.13.5. Mini 2D Gel Elektrophorese ........................................................................................................... 59

    3.14. Proteolytische Spaltung von Proteinen für LC-ESI-MS/MS und MALDI............................................... 60

    3.14.1. Verdau der Spots ........................................................................................................................... 60

    3.14.2. Extraktion der Peptide für MALDI................................................................................................... 60

    3.14.3. Extraktion der Peptide für die LC-ESI-MS/MS ................................................................................. 61

    3.15. Proteinidentifizierung mittels MALDI ................................................................................................ 61

    3.15.1. Datenauswertung der MALDI-Messung .......................................................................................... 62

    3.16. Proteinidentifizierung mittels LC-ESI-MS/MS ..................................................................................... 63

    3.16.1. LTQ Orbitrap .................................................................................................................................. 64

    3.16.2. LTQ Velos Pro ................................................................................................................................ 65

    3.16.3. Datenauswertung der LC-ESI-MS/MS ............................................................................................. 65

    3.17. Auswertung massenspektrometrischer Daten nach Datenabgleich ................................................... 67

    3.17.1. Die pseudo-qualitative Auswertung ............................................................................................... 68

    3.17.2. Spectral Index Calculation .............................................................................................................. 68

    3.18. Western Blot ..................................................................................................................................... 70

  • Inhaltsverzeichnis

    iii

    4. ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 72

    4.1. Etablierung der LMD zur Label-freien Proteomanalyse ...................................................................... 73

    4.1.1. Darstellbarkeit der Aggregate ........................................................................................................ 73

    4.1.2. Solubilisierung der Aggregate ........................................................................................................ 74

    4.1.3. Optimierung der Anzahl von Aggregaten ........................................................................................ 77

    4.2.. Ergebnisse der Label-freien Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe......................................... 80

    4.2.1. Entwicklung einer geeigneten Auswertestrategie ........................................................................... 81

    4.2.1.1. Vergleichende Analyse Aggregatproben - Patientenkontrollen ....................................................... 82

    4.2.1.2. Vergleichende Analyse Patientenkontrollen - Negativkontrollen .................................................... 87

    4.2.1.3. Vergleich der manuellen und automatisierten quantitativen Auswertung ...................................... 92

    4.2.2. Validierung differentieller Proteine der Aggregatanalyse ................................................................ 97

    4.3. Etablierung der 2D Differentiel In-Gel Elektrophorese mittels 2D DIGE.............................................. 98

    4.3.1. Optimierung der Probenmenge ..................................................................................................... 98

    4.3.2. Ergebnisse der differentiellen Proteomanalyse von Filaminopathiegewebe mittels 2D DIGE ......... 100

    4.3.2.1. Ergebnisse der differentiellen Analyse mittels DeCyder ................................................................ 101

    4.3.2.2. Identifizierung differentieller Proteins mittels MALDI ................................................................... 103

    4.3.2.3. Überprüfen der Spectral Index Daten in Patientenkontrollen mittels 2D DIGE .............................. 104

    4.3.3. Untersuchung einer posttranslationalen Modifikation an Desmin mittels 2D Blot ......................... 105

    4.4. Murine Myoblasten als MFM-Zellkulturmodell ............................................................................... 110

    4.4.1. Transfektion der p.W2710X-Mutation in murine Myoblasten ....................................................... 111

    4.4.2. Optimierung der LMD .................................................................................................................. 113

    4.4.3. Ergebnisse der Label-freien Aggregatanalyse im Zellkulturmodell ................................................. 117

    5. DISKUSSION ....................................................................................................................120

    5.1. Lasermikrodissektion ................................................................................................................... 121

    5.2. Etablierung der differentiellen Proteomanalysen in Filaminopathien .............................................. 122

    5.2.1. Label-freie Proteomanalyse ......................................................................................................... 123

    5.2.1.1. Solubilisierung der Aggregate ...................................................................................................... 123

    5.2.1.2. Optimierung der Probenmenge ................................................................................................... 124

    5.2.1.3. Auswertestrategien ..................................................................................................................... 125

    5.2.1.4. Die physiologische Bedeutung der differentiell exprimierten Proteine in den Aggregaten ............. 130

    5.2.2. Gelbasierte differentielle Analyse ................................................................................................ 133

    5.2.2.1.. Optimierung der Probenmenge ................................................................................................... 134

    5.2.2.2. Detektion differentiell exprimierter Proteine ............................................................................... 135

    5.2.2.3. Die physiologische Bedeutung der differentiell exprimierten Proteine in Patientenkontrollen ...... 137

    5.2.2.4. Die biologische Relevanz der Desminphosphorylierung ................................................................ 143

    5.2.2.5. Die Relevanz der Desminphosphorylierung in Filaminopathien ..................................................... 145

    5.2.2.6. Die Detektion der Phosphorylierung in Desmin ............................................................................ 147

    5.2.2.7. Lokalisation von Phosphorylierungen in der Aminosäuresequenz ................................................. 148

    5.3. Proteomstudien im Zellkulturmodell ............................................................................................... 152

    5.4. Fazit und Ausblick .......................................................................................................................... 157

    6. ZUSAMMENFASSUNG .....................................................................................................159

  • Inhaltsverzeichnis

    iv

    7. SUMMARY ......................................................................................................................164

    8. LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................164

    9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................192

    10. TABELLENVERZEICHNIS .................................................................................................192

    11. LEBENSLAUF ..................................................................................................................192

    12. DANKSAGUNG...............................................................................................................198

    13. ANHANG .......................................................................................................................201

  • I

    Abkürzungsverzeichnis

    1D-PAGE Eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese

    2D PAGE Zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese

    A Ampere

    °A Anström

    Abb. Abbildung

    ABD Aktin-bindende Domäne

    Agg

    AK

    Aggregatprobe

    Antikörper

    APEX absolute protein abundance index

    APS Ammoniumpersulfat

    ADP Adenosindiphosphat

    ATP Adenosintriphosphat

    AS Aminosäuren

    AQUA absolute quantification of proteins

    BAG3 BCL2-associated athanogene 3/ family molecular chaperone regulator 3

    Bis-Tris Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan

    Bp Basenpaare

    BR Broad-range

    BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

    BT Bis-Tris

    BVA Biological Variance Analysis

    bzw. beziehungsweise

    °C Grad Celsius

    ca. circa

    CBM Cytoplasmatische Body Myopathie

    CHAPS

    CID

    3-[(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-propansulfonsäure

    Collision induced dissociation

    CK Creatin Kinase

    cm Zentimeter

    cm3 Kubikzentimeter

    COX Cytochrome C Oxidase

    CRYAB Alpha B Crystallin

    Cy Cyanin Fluoreszenzfarbstoff

    Da Dalton

  • Abkürzungsverzeichnis

    II

    DCM Dilatative Cardiomyopathie

    DES Desmin-Gen

    DIA Differential In-Gel Analysis

    DIGE differential in-gel electrophoresis (Differentielle In-Gel Elektrophorese)

    DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure

    DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

    DMF Dimethylformamid

    DMSO Dimethylsulfoxid

    DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

    ds double strain

    DTT 1,4 – Dithiothreitol

    Engl. englisch

    EDTA Ethylendiamintetraacetat

    EGFP Enhanced Green fluorescent Protein

    emPAI exponentially modified protein abundance index

    ESI electrospray-ionization (Elektrosprayionisation)

    ETD Elektronentransferdissoziation

    fl Full length

    FLNC Filmain-Gen

    FHL-1 Four and a half LIM domains protein 1

    FA formic acid (Ameisensäure)

    FCS fetal bovine serum (Fötales Kälberserum)

    GFP Green fluorescent Protein

    GGA Geranylgeranylaceton

    GIST Global Internal Standard

    h Stunde

    HPLC high performance liquid chromatography

    (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)

    Hskm Humane Skelettmuskelzellen

    HSP Heat Shock Protein

    IAA Iodacetamid

    ICAT isotope coded affinity tag

    ICPL isotope coded protein label

    IEF

    IMAC

    iTRAQ

    kDa

    Isoelelektrische Fokussierung

    Metallaffinitätschromatographie

    Isotope Tags For Relative and Absolute Quantification

    Kilodalton

    kV Kilovolt

    LB-Medium Lysogeny Broth Medium (Nährmedium zur Kultivierung von Bakterien)

    LC Liquid Chromatography (Flüssigkeitschromatographie)

    LMD Lasermikrodissektion

  • Abkürzungsverzeichnis

    III

    M Mol

    mA Milliampere

    ml Milliliter

    mM Millimol

    mgf Mascot generic format

    min Minute

    m/z Masse-zu-Ladungsverhältnis

    MOAC Metalloxidaffinitätschromatographie

    MOPS Morpholinopropansulfonsäure

    MS Massenspektrometrie

    MS/MS Tandemmassenspektrometrie

    Msec Millisekunde

    Mut Mutante

    MYL3 Myosin leichte Kette 3

    MW molecular weight (Molekulargewicht)

    n Anzahl unabhängiger Experimente

    NADH Nicotinamidadenosindinukleotid

    NEAA Non essential amino acids

    NegKO Negativkontrolle

    nL Nanoliter

    nm Nanometer

    Nmol Nanomol

    NP-HPLC Normalphasen-Chromatographie

    NRAP Nebulin-related-anchoring protein

    Nr. Nummer

    PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

    PBS

    PDA

    PET

    phosphate buffered saline (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung)

    Piperazin-Diacrylamid

    Polyethylentetraphtalat

    PEN Polyethylene Naphthalate

    pI

    PatKO

    Isoelektrischer Punkt

    Patientenkontrolle

    PGM Phosphoglucomutase

    PLEC1 Plectin 1-Gen

    PMF

    ppm

    PYG

    RP

    rpm

    peptide mass fingerprint (Peptidmassenfingerabdruck)

    parts per million

    Glykogen Phosphorylase

    reversed phase

    rounds per minute

    RBM Reducing Body Myopathie

    RT-HPLC Umkehrphasenchromatographie

  • Abkürzungsverzeichnis

    IV

    RT

    SAX

    SCX

    Raumtemperatur

    Anionaustauscher

    Kationaustauscher

    SDS

    sec

    sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)

    Sekunde

    Seq Sequenz

    SI Spectral Index

    SILAC stable isotope labelling by amino acids in cell culture

    SIMAC Sequential Elution from IMAC

    SOC- Medium Super Optimal Broth (SOB) Nährmedium mit Zugabe von 20 mM

    Glucose

    TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung

    TCEP

    TEMED

    tris(2-carboxyethyl)phosphine

    N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

    TE Tris/EDTA

    TFA Trifluoressigsäure

    TMT tandem mass tagging

    TOF time of flight (Flugzeit)

    Tris Base Tris(hydroxymethyl-)aminomethan

    Tris HCl

    TTID

    Tween 20

    UV

    Tris(hydroxymethyl-)aminomethan Hydrochlorid

    Myotilin-Gen

    Polyoxyethylensorbitan-monolaurat

    Ultraviolett

    U Unit

    V Volt

    VDAC Voltage-dependent anion-selective Channel

    VDCC Voltage-dependent calcium-selective Channel

    Vers. Version

    v/v volume per volume (Volumen pro Volumen)

    w/v

    Xin

    Xirp2

    weight per volume (Gewicht pro Volumen)

    Xin actin-binding repeat-containing protein 1

    Xin actin-binding repeat-containing protein 2

    Z Ladungszahl

    ZASP Z-band alternatively spliced PDZ motif containing protein

    z.B. Zum Beispiel

    z.T. Zum Teil

    µg Mikrogramm

    µl Mikroliter

    µm Mikrometer

    µm2 Quadratmikrometer

  • 1

    1. Einleitung

    Myofibrilläre Myopathien (MFM) bilden eine genetisch wie klinisch heterogene

    Gruppe von neuromuskulären Erkrankungen. Auf zellulärer Ebene zeichnen sie sich durch

    fokale myofibrilliäre Zerstörung und intrazelluläre Proteinaggregation aus [Selcen et al.

    2004]. Die Filaminopathie ist ein Subtyp der MFM und wird durch Mutationen im

    codierenden Gen für Filamin C (FLNC) verursacht. Filamin C wird vorwiegend in Skelett- und

    Herzmuskulatur exprimiert und ist innerhalb der Muskelzellen an der Z-Scheibe lokalisiert.

    An den Z-Scheiben interagiert Filamin C mit diversen Proteinen, einschließlich Aktin und

    Myotillin. Im Mittelpunkt der hier vorliegenden Dissertation stand die proteomische

    Untersuchung der Proteinaggregate und des umliegenden Gewebes von 6

    Filaminopathiepatienten mit 3 verschiedenen Mutationen im für Filamin C codierenden Gen.

    Dafür war es zunächst notwendig entsprechende Protokolle zu etablieren, basierend auf der

    Lasermikrodissektion (LMD). Für die Analyse der Proteinaggregate wurde ein Label-freier

    Ansatz mit anschließender quantitativer Auswertung etabliert, zur Charakterisierung von

    möglichen Frühmarkern in dem umliegenden Gewebe wurde die 2D DIGE Analyse gewählt.

    Zusätzlich sollte ein Zellmodell etabliert werden, um zukünftige funktionelle Analysen zu

    ermöglichen.

    1.1. Die Skelettmuskulatur

    Die Skelettmuskulatur umfasst die Muskeln des Bewegungsapparates sowie die

    Muskeln in der Zunge, im Pharynx und im des oberen Anteils des Oesophagus [Schiebler

    Anatomie 9. Auflage 2005]. Zusammen mit der Herzmuskulatur wird die Skelettmuskulatur

    als quergestreift bezeichnet, da die kontraktilen Einheiten im Lichtmikroskop als helle und

    dunkle Areale erscheinen. Ein Skelettmuskel ist hierarchisch aufgebaut und setzt sich aus

    zahlreichen Muskelfaserbündeln zusammen. Die Muskelfaserbündel bestehen aus

  • Einleitung

    2

    Muskelfasern. Durch die Fusion vieler einkerniger Myoblasten in der Embryonalentwicklung

    entsteht eine vielkernige Skelettmuskelzelle. Eine Zelle beinhaltet bis zu 100 randständige

    Kerne, die unter dem Plasmalemm lokalisiert sind [Schiebler Anatomie 9. Auflage 2005].

    1.1.1. Aufbau der Myofibrillen

    Die Myofibrillen bilden die kleinste Untereinheit des Skelettmuskels. Die 1-2 µm

    dicken Myofibrillen verlaufen parallel zur Muskellängsachse und bilden zylindrische

    Strukturen. Sie werden durch die Z-Scheiben in Sarkomere unterteilt, welche die kleinsten

    funktionellen Einheiten des Muskels bilden. Ein Sarkomer besteht neben dicken

    Myosinfilamenten (10-15 nm) hauptsächlich aus dünnen Aktinfilamente (5-6 nm). Die

    Myosinfilamente verschieben sich während der Muskelkontraktion gegeneinander [Schiebler

    Anatomie 9. Auflage 2005]. Die Myosinmoleküle bestehen aus einem dünnen Schaft und

    einem kugelförmigen Kopf. Die Myosinköpfchen verfügen über einen Myosin-ADP-Komplex

    und weisen eine hohe ATPase-Aktivität auf. Sobald ATP in ADP und Phosphat gespalten wird,

    bindet das Aktin an die Köpfchen und das Myosin gleitet entlang der Aktinfilamente. Die Z-

    Scheiben nähern sich an und daraufhin verkürzt sich das Sarkomer aktiv.

    Im Lichtmikroskop lassen sich einzelne Streifen als strukturelles Merkmal der

    Myofibrillen erkennen (Abb. 1.1.). Die Streifen erscheinen aufgrund ihrer Lichtdurchlässigkeit

    als helle und dunkle Zonen. Die I-Streifen werden im polarisierten Licht nur schwach

    gebrochen und erscheinen deswegen hell. In diesen Streifen befinden sich ausschließlich

    dünne Aktinfilamente. Im Gegensatz zu den I-Streifen erscheinen die A-Streifen im

    polarisierten Licht dunkel, weil sie doppelt gebrochen werden. Sie werden von dicken

    Myosinfilamenten mit zwischengelagerten dünnen Aktinfilamenten gebildet. In den A-

    Streifen befindet sich die H-Zone, in dieser Zone befinden sich keine Aktinfilamente. Die

    Mitte der H-Zone wird als M-Streifen bezeichnet. Hier sorgen Strukturproteine wie

    Myomesin für die regelmäßige Anordnung der Myosinfilamente. Indirekt werden die dicken

    Filamente mit den Z-Scheiben auch über Titin verbunden. Titin ist mit 3000-3800 kDa das

    größte bekannte Molekül und ist in den Z-Scheiben wie auch in der M-Bande verankert.

  • Einleitung

    3

    Abbildung 1.1.: lichtmikroskopische Aufnahme und strukturelle Darstellung einer Myofibrille im Skelettmuskel,

    modifiziert nach Schmidt et al. Physiologie des Menschen 29.Auflage 2005

    Die hell erscheinende I-Bande wird durch die Z-Schreibe in zwei Hälften unterteilt und enthält

    ausschließlich dünne Aktin-Filamente. An der Z-Scheibe sind die dünnen Filamente (Aktin) durch das

    Gerüstprotein alpha-Aktinin befestigt. Die dicken Myosin-Filamente werden indirekt über Titin mit der

    Z-Scheibe verbunden. Die Lokalisation von Myosinfilamenten beschränkt sich nur auf die im

    Lichtmikroskop dunkel erscheinenden A-Streifen.

    1.1.2. Die Filamine

    Beim Menschen gibt es drei verschiedenen Filamine: A, B und C. Filamin A wurde

    erstmals 1975 von Hartwig und Stossel beschrieben [Hartwig and Stossel 1975, Nakaumra et

    al. 2011]. Die Struktur der verschiedenen Filamine ist sehr ähnlich, sie bestehen aus drei

    strukturellen Komponenten. Eine schematische Darstellung eines Filamin Moleküls ist in

    Abbildung 1.2. dargestellt. N-Terminal befindet sich die Aktin-bindende Domäne (ABD),

    welche aus einer CH-Domäne und drei hydrophoben Aktinbindungstellen besteht [Pollard et

    al. 1994]. An die ABD schließen sich 24 Wiederholungen aus Immunglobin-ähnlichen

    Strukturen (Ig-like domäne) an [Xie et al. 1998]. Jede Domäne setzt sich aus 2 ß-Faltblätter

  • Einleitung

    4

    zusammen, die sich wiederum zu insgesamt 7 ß-Strängen zusammenlagern. Die Domänen 15

    und 16 sowie 23 und 24 sind durch Gelenkregionen voneinander getrennt. Die sogenannten

    „hinges“ verleihen der Quervernetzung Flexibilität. Die Domäne 24 ist essentiell für die

    Dimerisierung von Filamin-Molekülen [Himmel et al. 2003]. Filamine gehören zu den Aktin-

    bindenden Proteinen. Sie sind an der Quervernetzung von Aktinfilamenten, welche einen

    Hauptbestandteil des Zytoskeletts bilden sowie an der Vernetzung von Aktinfilamienten mit

    Zellmembranproteinen beteiligt. Indirekt spielen sie ebenfalls eine Rolle in der Zell-Zell und

    Zell-Matrix-Verbindung. Die Sequenzhomologie zwischen den Filaminen A, B und C beträgt

    60-80 % [Gorlin et al. 1990]. Filamin C ist die muskelspezifische Isoform der Filamine und

    unterscheidet sich durch die Insertion von 81 Aminosäuren in die Domäne 20 (Abb. 1.2.,

    grün dargestellt) von den anderen beiden Isoformen. Diese Modifizierung scheint die direkte

    Verankerung mit den Z-Scheiben ermöglichen [Van der Veen et al. 2000]. Seine

    Hauptaufgabe besteht darin, die Aktinfilamente mit den Z-Scheiben zu verankern und ist

    daher entscheidend für die Stabilität der Myofibrillen. Im Laufe der Jahre wurden diverse

    Bindungspartner des Filamin C beschrieben, u.a. γ-Sarkoglykan [Thompson et al. 2000],

    Myotilin [van der Ven et al. 2000] und Xin [van der Ven et al. 2006]. Auf Grundlage des hier

    etablierten Label-freien Ansatzes zur Proteomanalyse konnte kürzlich ein neuer

    Bindungspartner beschrieben werden: Xirp2 [Kley et al. 2012]. Zusätzlich übernimmt das

    Filamin C neben der mechanischen Funktion auch eine Rolle in der Signaltransduktion. Es

    wird vermutet, dass durch die Bindung kleiner GTPasen der Rho-Familie an das C-Terminale

    Ende das Filamin C direkt an Umbauprozesse des Aktinzyoskeletts beteiligt ist [Ohta et al.

    1999].

    Abbildung 1.2.: Schematische Darstellung des Filamin C Moleküls, modifiziert nach Duff et al. 2011

    Das Filamin C Molekül besteht aus drei strukturellen Komponenten. N-Terminal befindet sich die

    Aktin-bindende Domäne. Daran schließen sich 24 Immunogloblin-ähnliche Domänen an. Die Domäne

    24 ist entscheidend für die Dimerisierung von Filamin C Molekülen. Im Gegensatz zu den Filaminen A

    und B verfügt Filamin C über eine zusätzliche Domäne, die Domäne 20 (grün dargestellt).

  • Einleitung

    5

    1.1.3. Die Bedeutung von Intermediärfilamenten

    Zusammen mit den Mikrofilamenten und den Mikrotubuli bilden die

    Intermediärfilamente die Hauptkomponenten des Zytoskeletts. Die Hauptaufgabe der

    Intermediärfilamente liegt in der mechanischen Stabilisierung der Myofibrillen [Lazarides

    1980]. Die Bezeichnung Intermediärfilamente wurde aufgrund ihres Durchmessers (8-10 nm)

    gewählt, da dieser zwischen dem Durchmesser der dünnen (Aktinfilamente) und der dicken

    Filamente (Myosinfilamente) liegt. Im Vergleich zu den Aktinfilamenten und

    Myosinfilamenten sind Intermediärfilamente flexibler und formbarer [Georgatos et al. 1996].

    Die Familie der Intermediärfilamente setzt sich aus 6 Gruppen zusammen, welche in Tabelle

    1.1. dargestellt sind [Stewart 1990, Kim and Couloombe 2007, Iwatsuki and Suda 2010].

    Tabelle 1.1: Unterteilung der Intermediärfilament-Familie in 6 Gruppen

    Klasse Vertreter und Vorkommen

    I saure Keratine: Epitelien

    II basische Keratine: Epithelien

    III

    GFAP ( glial fibrillar acidic protein): Gliazellen und Astrozyten Desmin, Syncollin: Muskelzellen

    Vimentin: Zellen mesenchymaler Herkunft Peripherin: periphere Neurone

    IV

    Synemin: Muskulatur NF-L, alpha-/beta-Internexin, NF-M,

    NF-H: Neurone Nestin: neuroepitheliale Stammzellen

    V

    Lamin A, B und C: Zellkern

    VI Phakinin, Filensin: Auge

    Die Struktur aller Mitglieder der Intermediärfilament-Familie setzt sich aus 3

    Komponenten zusammen: einer zentralen alpha-helikalen Stabregion, die von einem nicht

    alpha-helikalen N-Terminus (head) und einem nicht-helikalen C-Terminus (tail) flankiert wird

    [Stuurman et al. 1998]. Ein Monomer ist ca. 48 nm lang und sehr dünn. Sobald sich zwei

    Monomere longitudinal entlang der Stabregion in head-tail-Orientierung zusammenlagern

    entstehen Protofilamente (Tetramere). Aus zwei Tetrameren werden Protofibrillen gebildet

    und vier Protofibrillen ergeben letztendlich ein Intermediärfilament. Über Bindungspartner,

    die sogenannten Intermediärfilament-assoziierten Proteine, werden die Filamente zum

  • Einleitung

    6

    einen untereinander und zum anderen mit diversen Komponenten des Zytoskeletts vernetzt.

    Das Intermediärfilament der Klasse III, Desmin, zählt zu den wichtigsten

    Intermediärfilamenten in der Skelett-, Herz und glatten Muskulatur. Desmin spielt eine

    entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung der zellulären Integrität. Durch den Ausbau

    eines dreidimensionales Gerüstes werden die verschiedensten Kompartimente miteinander

    vernetzt, z.B. Z-Scheiben untereinander und mit der Plasmamembran sowie die

    Zellmembran mit cytosolischen Membranorganellen [Capetanaki et al. 1997]. Studien an

    Desmin knock-out Mäusen zeigten neben der mechanischen Funktion eine zusätzliche

    Vernetzung zwischen den Desminfilamenten und der Lokalisation, Form und Funktion von

    Mitochondrien [Capetanaki 2002, Costa et al. 2004, Goldfarb et al. 2004]. Die gestörte

    Desmin-Expression wird mit verschiedenen Myopathien in Verbindung gebracht [Goebel

    1997]. 1998 wurde von Goldfarb et al. die erste Mutation im Desmin-Gen beschrieben,

    seitdem wurden mehr als 60 verschiedene Mutationen im Desmin-Gen identifiziert

    [Goldfarb et al. 1998, Maerkens et al. 2013]. Neben der proximalen und distalen

    Muskelschwäche können bei dreiviertel aller Patienten mit Desminopathien auch

    Kardiomyopathien beobachtet werden [Clemen et al. 2013].

    Neben Desmin können auch weitere Intermediärfilamente mit neuromuskulären

    Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Vimentin ist in reifen Muskelzellen nicht

    nachweisbar [Goebel 1995], in der embryonalen Entwicklung hingegen ist es hoch abundant

    und mit Desmin ko-lokalisiert. Die Expression von Vimentin konnte in regenerierenden

    Muskelfasern, in inflammatorischen Myopathien und Muskeldystrophien sowie in atrophen

    Fasern der spinalen Muskelatrophie Type I nachgewiesen werden [Bornemann et al. 1993].

    Plectin zählt zu den Intermediärfilament-assoziierten Proteinen. Plectin wird im

    Skelettmuskel vermehrt an den Z-Scheiben exprimiert. Zusätzlich lässt es sich im

    Sarkolemma und im intermyofibrillären Netzwerk nachweisen [Banwell et al. 1999].

    Wichtige Interaktionspartner des Plectin sind u.a. Desmin [Reipert et al. 1999], Vimentin

    [Wiche et al. 1989] und Aktin [Steinbock et al. 1999]. Mutationen im Plectin1-Gen

    verursachen schwere Formen der Hautkrankheit Epidermolysis Bullosa Simplex (EBS) mit

    einhergehender Muskeldystrophie. Von Geburt an leiden die Patienten unter schmerzhafter

    Blasenbildung auf der Haut, die proximale und distale Muskelschwäche entwickelt sich im

    Laufe der späten Kindheit [Smith et al. 1996, Pulkkinen et al. 1996, Rezniczeck et al. 2009].

  • Einleitung

    7

    1.2. Myofibrilläre Myopathien

    Die Myofibrillären Myopathien (MFM) bilden eine genetisch und phänotypisch

    heterogene Gruppe neuromuskulärer Erkrankungen. Ein phänotypisches Merkmal der

    Erkrankung ist die langsam progrediente Muskelschwäche der proximalen wie auch distalen

    Skelettmuskulatur. Die Muskelschwäche macht sich vor allem im Bereich der Oberschenkel

    und Arme deutlich. Das Hervorstechen der Schulterblätter ist typisch für einen Teil der

    MFM-Patienten (Abb. 1.3. A und B). Zusätzlich können die Gesäß-, Waden- und

    Unterarmmuskulatur von der Atrophie betroffen sein. Histologisch zeichnen sich die

    Myofibrillären Myopathien durch die fokale Zerstörung der Myofibrillen und die Bildung von

    Desmin-positiven Proteinaggregaten in den Muskelzellen aus [Schröder and Schoser 2009].

    Das Auflösen der Struktur bewirkt einen Stabilitäts- und Funktionsverlust der Muskelzellen.

    Elektronenmikroskopisch lässt sich der Zerfall der Myofibrillen deutlich nachweisen. Eine

    vom Zerfall betroffene Myofibrille (Abb. 1.3. C, durch Pfeile gekennzeichnet) weist nicht

    mehr die charakteristische Hell-Dunkel-Struktur auf. In direkter Nähe der zerstörten Z-

    Scheiben lassen sich filamentäre Ablagerungen (Abb. 1.3. C, Sterne) erkennen. Im Vergleich

    dazu ist eine intakte Myofibrille im oberen Teil des Bildes zu sehen (schwarzer Balken). Ein

    weiteres histologisches Merkmal ist die Entstehung von Proteinaggregaten innerhalb der

    Muskelzellen. In Abb. 1.3. sind zwei verschiedene Nachweistechniken dargestellt. Mittels

    Gomori-Trichrom-Färbung und Immunfluoreszenzfärbung lassen sich die Proteinaggregate

    spezifisch anfärben [Kley et al. 2007]. Myofibrilläre Myopathien werden in den meisten

    Fällen autosomal dominant vererbt. Die Symptomatik und die klinische Manifestation sind

    variabel. Erste Beschwerden treten allerdings meist ab dem Beginn der 4. Lebensdekade auf

    [Selcen et al. 2004]. Die Lebenserwartung der Patienten kann durch das Auftreten einer

    Kardiomyopathie sowie der Beeinträchtigung der Atemmuskulatur stark eingeschränkt sein.

    Die Kardiomyopathie wird vor allem bei Patienten mit Desminopathie beobachtet [Levin et

    al. 2010].

  • Einleitung

    8

    Abbildung 1.3: Phänotypische und histologische Merkmale der Myofibrillären Myopathie, von Dr. Rudolf A. Kley

    Die Abbildung zeigt einen Filaminopathiepatienten mit proximaler Muskelschwäche und Scapula alata

    (A und B). Die elektronenmikroskopische Aufnahme (C, noch nicht publizierte Abbildung) zeigt die

    Disintegration der Z-Scheiben (Pfeile) der Myofibrillen sowie die Akkumulation von

    granaulofilamentösem Material (Sterne). Durch die fokale Zerstörung der Myofibrillen geht die Hell-

    Dunkel-Struktur der A- und I-Banden verloren. Der Balken markiert im Vergleich zu den zerstörten

    Strukturen eine intakte Z-Scheibe. In Abb. D ist eine Trichrom-Färbung dargestellt, mit deren Hilfe

    Proteinaggregate und vakuoläre Veränderungen innerhalb der Myofibrillen nachgewiesen werden.

    Mittels Immunfluoreszenz wurde Filamin C in den Aggregaten nachgewiesen.

    Bei etwa 50% der MFM-Patienten wird die Erkrankung durch Mutationen in Genen

    verursacht, die für die Proteine Desmin (DES) [Goldfarb et al. 1998], Myotilin (TTID) [Olive et

    al.2005], ZASP (LDB3) [Selcen et al. 2005], Filamin C (FLNC) [Vorgerd et al. 2005], Plectin

    (PLEC1) [Schröder et al. 2002], FHL1 (FHL1) [Qunizii et al. 2008], alpha B Crystallin (CRYAB)

    [Vicart et al. 1998] oder BAG3 (BAG3) [Selcen et al .2011] kodieren (Tabelle 1.2.). Diese

    Proteine sind alle mit der sarkomerischen Z-Scheibe assoziiert, entweder direkt wie z.B.

    Filamin C und Myotilin oder indirekt wie z.B. Desmin (Abb. 1.4.). Bei etwa der Hälfte der

    MFM-Patienten ist der ursächliche Gendefekt bislang allerdings unklar.

  • Einleitung

    9

    Tabelle 1.2. Übersicht über alle bekannten MFM verursachenden Mutationen

    Codierendes Gen Protein Literaturnachweis

    DES Desmin Goldfarb et al. 1998

    CRYAB Alpha B Crystallin Vicart et al. 1998

    FLNC Filamin C Vorgerd et al. 2005

    TTID Myotilin Olive et al. 2005

    ZASP/ LBD3 ZASP (Z-band alternatively spliced

    PDZ motif containing protein) Selcen et al. 2005

    Plec1 Plectin 1 Schröder et al. 2002

    FHL1 FHL-1 (Four-and-a-half-LIM-Protein

    1) Qunizii et al. 2008

    BAG3 BAG 3 (BAG family molecular

    chaperone regulator 3) Selcen et al. 2011

    Abbildung 1.4: Zusammenfassung wichtiger Proteine des Skelettmuskels [Goldfarb et al. 2009]

    Diese Abbildung gewährt einen detaillierten Einblick in den menschlichen Skelettmuskel. Desmin ist

    das wichtigste Intermediärfilament und interagiert mit diversen Proteinen, wie z.B. alpha B Crystallin

  • Einleitung

    10

    und Plectin, und Strukturen (Z-Scheiben). Durch den Ausbau eines filamentären Netzwerks wird die

    zelluläre Integrität der Zelle aufrechterhalten. Mutationen im Desmin führen zu einer Desorganisation

    der Z-Scheiben, es bilden sich Proteinaggregate in den Myofibrillen, welche MFM verursachen.

    Ähnliche Mechanismen werden für andere sarkomerische und cytoskeletale Proteine, wie Filamin C,

    Plectin, BAG3, Myotilin und ZASP als krankheitsverursachend vermutet.

    1.3. Die Filaminopathie

    Die Filamin-C-assoziierten Myopathien werden durch Mutationen im Filamin C-Gen

    (FLNC) verursacht. Es werden zwei Gruppen unterschieden: MFM-Filaminopathien und

    Distale Filaminopathien [Fürst et al. 2013]. Die MFM-Filaminopathie ist eine progressive

    Muskelerkrankung, die sich in den meisten Fällen zwischen der 4. und 6. Lebensdekade

    manifestiert. Zu Beginn der klinischen Manifestation zeigen die Patienten eine proximal-

    betonte Muskelschwäche, welche ihnen z.B. das Treppensteigen erschwert. Im Laufe der

    Erkrankung wird es für die Patienten immer schwieriger lange Strecken zu laufen. Die

    zunehmende Muskelschwäche kann schließlich zu einem Verlust der Gehfähigkeit führen.

    Ein Teil der Patienten zeigt zusätzlich eine Beteiligung der Herz- und Atemmuskulatur [Kley

    et al. 2007, Luan et al. 2010]. Insgesamt lässt sich sagen, dass die Patienten einen relativ

    homogenen klinischen Phänotyp zeigen. Die erste Mutation p.W2710X (auch p.Tryp2710X, X

    = Stopcodon) wurde 2005 von Vorgerd et al. beschrieben. Diese Punktmutation befindet sich

    in der Dimerisierungsdomäne des Filamin C und wurde zunächst in einer großen deutschen

    Familie nachgewiesen. Als Folge der Mutation wird das Filamin C um 16 Aminosäuren

    verkürzt. Die p.W2710X-Mutation macht das Filamin C instabiler und anfälliger für die

    Proteolyse [Vorgerd et al. 2005]. Die Dimerisierung des Filamin C wird so gestört und das

    mutierte Protein bildet stattdessen Aggregate innerhalb der Myofibrillen [Vorgerd et al.

    2005, Löwe et al. 2007]. Die p.W2710X- Mutation konnte kurz nach der ersten Beschreibung

    in weiteren deutschen Familien, in Patienten der Majo MFM Kohorte und erst kürzlich in

    jeweils einer mazedonischen und chinesischen Familie nachgewiesen werden [Kley et al.

    2007, Selcen 2011, Kley et al. 2012]. Neben der p.W2710X-Mutation befindet sich eine

    weitere Mutation in der Dimersierungsdomäne des Filamin C, die sogenannte d24Δ2-

    Mutation (unpublizierte) Daten, mündliche Mitteilung durch Dr. Rudolf. A. Kley). Die

    Mutation p.V930_T933del wurde 2009 in einer deutschen Familie (10 Mitglieder)

  • Einleitung

    11

    nachgewiesen. Hierbei handelt es sich um eine In-Frame Deletion in der lg-like-repeat-

    Domäne 7 des Filamin C-Gens [Shatunov et al. 2009]. Die lg-ähnlichen-Domäne spielt eine

    wichtige Rolle in der Protektion der zytoskeletalen Architektur. Während mechanischer

    Belastung kann die Domäne entfaltet und im Anschluss wieder in ihren nativen Zustand

    zurückgeführt werden. Dieser Mechanismus ist essentiell für die intrinsische Flexibilität des

    Aktinnetzwerks [Furuike et al. 2001, Yamazaki et al. 2002]. Eine In-Frame Deletion in der Ig-

    like-Domäne 7 des Filamin C bewirkt die Dysfunktion des kodierten Proteins [Shatunov et al.

    2009]. Ebenfalls in dieser Domäne befindet sich die Mutation pK899-V964de/V899_C900ins

    [Luan et al. 2010]. Die komplexe Deletion-Insertion-Mutation ist in der intermolekularen

    Verbindung der 2 ß-Faltblätter lokalisiert. Der Zusammenhalt der Faltblätter wird

    geschwächt und führt zu Dysfunktionen im Filamin C-Gen. Bei der p.Y1216N-Mutation

    handelt es sich um eine Punktmutation in der Ig-ähnlichen Domäne 10 [Avila-Smirnov et al.

    2010]. Die Mutation p.T2419M (Ig- ähnliche Domäne 22) wurde bislang in nur einem MFM-

    Patienten nachgewiesen [Tasca et al. 2012]. Ergänzend zu den oben beschriebenen

    Veränderungen im Filamin C-Gen konnten auch Mutationen identifiziert werden, die nicht

    mit einer MFM-typischen Aggregatbildung einhergehen [Guergueltcheva et al. 2011, Duff et

    al. 2011]. Die Mutation c.5160del_p.F1720LfsX63 befindet sich in der Ig-ähnlichen Domäne

    15 und die Mutation p.A193T und p.M251T in der Aktin-bindenden Domäne (ABD) des Gens.

    Die Mutationen in der ABD führt weder zur Bildung von Proteinaggregate noch konnten

    andere MFM-spezifische Merkmale gefunden werden [Duff et al. 2011]. Diese beiden

    Varianten der Erkrankung werden zu den distalen Filaminopathien gezählt. Sie manifestieren

    sich um die 3. Lebensdekade und schädigen hauptsächlich die spezifischen Greifmuskeln in

    der Hand. Erst später kommt zu es zur Beeinträchtigung der Beinmuskulatur.

    Im Rahmen dieser Dissertation wurden insgesamt 6 Filaminopatihepatienten

    analysiert. Bei 3 Patienten wurde die p.W2710X-Mutation nachgewiesen, bei 2 Patienten die

    p.V930_T933del-Mutation und ein Patient zeigte die d24Δ2-Mutation (Abb. 1.5.).

  • Einleitung

    12

    Abbildung 1.5.: Zusammenfassung aller bekannten Mutationen im Filamin C-Gen, modifiziert nach Fürst et al.

    2012

    Insgesamt sind 9 Mutationen im Filamin C-Gen bekannt. Die p.W2710X-Mutation wurde 2005 erstmals

    von Vorgerd et al. beschrieben und befindet sich, wie auch die d24Δ2-Mutation (noch nicht

    veröffentlichte Daten), in der Dimersierungsdomäne des Gens. Einen gleichen Phäno- und Genotyp

    wie die p.W2710X-Mutation zeigen die p.V930_T933del-Mutation [Shatunov et al. 2009] und die

    pK899-V964de/V899_C900ins [Luan et al. 2010]. Mutationen in der Aktin-bindenden Domäne [Duff et

    al. 2011] und die c.5160del_p.F1720LfsX63-Mutation [Guergueltcheva et al.2011] führen nicht zu einer

    Aggregatbildung in Muskelzellen. Die Mutation p.T2419M wurde bislang in nur einem MFM-Patienten

    mit spät einsetzender zerebellärer Ataxie nachgewiesen. Der Zusammenhang zwischen der Mutation

    und den Symptomen ist noch ungeklärt. [Tasca et al. 2012]. In dieser Dissertation wurden 6

    Filamimopathiepatienten mit 3 verschiedenen Mutationen (rot umrandet) analysiert.

    1.4. Lasermikrodissektion

    Die Lasermikrodissektion (LMD) ist ein Standardverfahren zum Isolieren von definierten

    Zellstrukturen (z.B. Proteinaggregate) aus verschiedenen Gewebearten, das seit Mitte der

    70er Jahre angewendet wird [Isenberg et al. 1976]. Im Laufe der Jahre erlangte die Methode

    eine immer größer werdende Bedeutung in der Bioanalytik. Neben der manuellen

    Mikrodissektion [Sitek et al. 2005, Poschmann et al. 2009] werden zwei laser-unterstütze

    Systeme zur Mikrodissektion unterschieden. Die Laser Capture Mikrodissektion (LCM) wurde

    Mitte der 90er Jahre von Michael R. Emmert-Buck etabliert [Emmert-Buck et al 1996] und

    beruht auf der Verwendung einer thermoplastischen Membran, die von einem Infrarot- oder

    Ultraviolettlaser geschmolzen wird. Dabei verbindet sich die inerte Membran mit dem zu

    isolierenden Gewebe und kann im nächsten Schritt entfernt werden. Im Gegensatz dazu

  • Einleitung

    13

    wird bei der Laser Microbeam Mikrodissektion die gewünschte Region oder Zellpopulation

    mithilfe eines Infrarot- oder Ultraviolettlasers aus dem Gewebe herausgeschnitten. Die

    Probe wird dann entweder unter Einfluss der Schwerkraft in einem Reaktionsgefäß

    gesammelt (Leica System) oder gegen die Schwerkraft in ein Reaktionsgefäß katapultiert

    (PALM System). Die Proben werden mit größter Genauigkeit gesammelt. Das gewünschte

    Areal wird exakt und schonend aus dem umliegenden Gewebe geschnitten. Dies bietet die

    Möglichkeit, selbst kleinste Mengen an Probe zu untersuchen und z.B. mittels differentieller

    Proteomanalyse Unterschiede zwischen krankem und gesundem Gewebe zu

    charakterisieren [XU et al. 2010]. Ein weiterer Vorteil der LMD liegt darin, dass die Proben

    mittels Gravitation in einem Reaktionsgefäß aufgefangen und somit Kontakt- und

    Kontaminations-frei gesammelt werden können. Die Methode der LMD verbindet

    (Fluoreszenz-)Mikroskopie mit Mikrodissektion mittels Laser-Technik. Das Mikroskop ist mit

    einer Digitalkamera gekoppelt. Die Bilder der zu untersuchenden Probe werden direkt auf

    einen angeschlossenen Computer übertragen. Eine spezielle Software sowie ein

    Steuerelement sind ebenfalls direkt mit dem Mikroskop gekoppelt. So können die

    gewünschten Areale direkt über den Bildschirm des Rechners markiert und ausgeschnitten

    werden. Als Probe können Gewebe-Kryoschnitte auf eine spezielle Polyethylentetraphtalat-

    (PET)-Membran (Leica, Wetzlar, Deutschland) übertragen oder Zellkulturen auf einer mit

    Polyethylene Naphthalate-(PEN)-Membran in speziellen Petrischalen (WillCo-dish,

    Amsterdam, Niederlande) kultiviert werden. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten LMD

    6500 (Leica, Wetzlar, Deutschland) war es möglich, die Proben sowohl im Durchlicht als auch

    mit Fluoreszenzlicht zu mikroskopieren. Dies ermöglichte die eindeutige Identifizierung der

    Proteinaggregate. In Abbildung 1.6. ist das Funktionsprinzip des LMD-Gerätes dargestellt.

    Der gewünschte Bereich im Gewebe (hier ein Fluoreszenz markiertes Aggregat in einem

    Filaminopathie-Kryoschnitt) wird markiert und anschließend ausgeschnitten. Das

    mikrodissektierte Areal wird automatisch in einem sich darunter befindenden

    Reaktionsgefäß aufgefangen. Die isolierten Proben können dann mit weiterführenden

    Methoden wie z.B. solchen der Proteomanalyse weiter untersucht werden.

  • Einleitung

    14

    Abbildung 1.6.: Darstellung des LMD-Prozesses

    In Abbildung A ist ein schematischer Ablauf der LMD, modifiziert nach Leica, dargestellt. Die 10 µm

    dicken Gefrierschnitten befinden sich auf einem Membran-Objektträger. Der gewünschte Bereich

    wird mit Hilfe eines Lasers, der mit dem Mikroskop gekoppelt ist, aus dem umliegenden Gewebe

    isoliert. Die Probe fällt automatisch in ein sich darunter befindendes Einmal-Reaktionsgefäß.

    Abbildung B spiegelt den Prozess anhand einer Mikrodissektion aus Filaminopathiegewebe wieder.

    Das Aggregat wird umrandet und anschließend mittels Laser exakt aus dem umliegenden Gewebe

    herausgeschnitten.

    1.5. Grundlagen der Proteomanalyse

    Proteomanalysen ermöglichen die globale Untersuchung der Gesamtheit der

    Proteine von Zellen bzw. Geweben [Wilkins et al. 1996]. Die Analyse des Proteoms stellt eine

    wichtige Ergänzung zur Genomanalyse dar, weil so auch Zustände, die auf der Ebene des

    Genoms nicht zu ermitteln sind, erfasst werden können. Im Gegensatz zum Genom ist das

    Proteom höchst dynamisch. Die Expression von Proteinen in einer Zelle variiert in

    Abhängigkeit von physiologischen Funktionen, des Differenzierungsstatus und

    Umweltfaktoren. Durch alternatives Spleißen der prä-mRNA sowie die zusätzliche

    Einführung posttranslationaler Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen, Glykosilierungen,

    Ubiquitinierungen) entsteht ein komplexes Muster, das nur auf Proteinebene detektierbar

  • Einleitung

    15

    ist [Pandey and Mann 2000]. All diese Veränderungen werden in der Genomanalyse nicht

    berücksichtigt und unterstreicht die enorme Bedeutung der Proteomanalytik [Patterson et

    al. 2003]. Die Proteomanalyse gewährt einen Einblick in das Expressionsmuster von

    Proteinen einer Zelle oder eines Gewebes und erlaubt es, Aussagen über qualitative und

    quantitative Analyse der enthaltenen Proteine. Auf Genomebene ist dies nicht möglich, da

    nur eine geringe Korrelation zwischen der mRNA-Menge und den entsprechenden

    Genprodukten besteht.

    1.5.1. Proteomanalysen von Skelettmuskulatur

    In den vergangenen Jahren erwies sich die Proteomanalyse als vielversprechende

    Methode zur Analyse von Skelettmuskulatur. Es wurden verschiedene Gel- und

    Massenspektrometrie basierte Studien durchgeführt, die darauf abzielten die biochemische

    Charakterisierung des Muskelproteoms von Nagern [Capitanio et al. 2009] oder zellulärer

    Strukturen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu beschreiben [Ferreira et al.

    2010]. So wurden z.B. in Muskeln von Versuchstieren mit hohem Alter Veränderungen in der

    Abundanz von Proteinen des Stoffwechsels, des kontraktilen Apparates, der

    Myofibrillogenese und der zellulären Stressantwort gefunden [Ohlendieck et al. 2001]. Die

    klinische Forschung nutzt proteomische Ansätze zur Identifizierung neuer Biomarker in

    neuromuskulären Erkrankungen. Neben verschiedenen Tiermodellstudien z.B. Analyse von

    Muskelgewebe einer Maus mit Duchenne Dystrophie [Lewis et al. 2009] wurden diverse

    Proteomstudien an Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen durchgeführt. 2005

    wurden 19 Patienten mit Desminopatihe, Plectinopathie, Myotillinopathie und unbekannten

    MFM-Formen analysiert. Dabei wurde die lösliche Fraktion aus Muskellysaten mittels 2D

    PAGE (siehe 1.5.2.) aufgetrennt und anschließend mittels MALDI MS (siehe 1.6.2.2.)

    identifiziert. Ein aus dieser Studie resultierendes Ergebnis, die Identifizierung von Hsp27,

    ermöglichte die Differenzierung der primären Desminopathie von anderen MFM-Formen

    [Clemen et al. 2005]. 2006 wurde von Palma et al. eine auf 2D PAGE basierender

    differentieller Analyse von Dysferlinopathie-Patienten unter der Verwendung von

    Muskellysaten durchgeführt. Es konnten 35 differentiell exprimierte Proteine identifiziert

    werden, darunter befanden sich viele metabolische wie kontraktile Proteine [Palma et al.

    2006]. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde vermutet, dass eine Dysfunktion des Dysferlins zu

    einem aktiven Umbau und Regeneration der Filamente führt. In allen bisher durchgeführten

  • Einleitung

    16

    Studien zur Proteomanalyse wurden komplette Muskellysate verwendet. Muskelgewebe ist

    eine komplexe Mischung aus verschiedenen Zelltypen des Epi-, Endo- und Perimysium,

    Blutgefäßen und Binde- bzw. Fettgewebe. Um die Komplexität der Proben zu reduzieren,

    wurden neue Methoden eingeführt, gezielt definierte Bereiche aus dem Gewebe zu

    isolieren. Dazu zählt die Mikrodissektion, welche manuell [Sitek et al. 2005, Poschmann et al.

    2009] oder mit Unterstützung eines Lasers verwendet wird. Die erfolgreiche Kombination

    von LMD und Massenspektrometrie wurde erstmals bei der Reducing Body Myopathie

    beschrieben [Schessl et al. 2008]. Die Reducing Body Myopathie (RBM) ist eine hereditäre

    Muskelerkrankung, die durch intracytoplasmatische Einschlüsse charakterisiert ist. Im

    Rahmen der Studie wurden diese Einschlüsse mittels LMD aus dem Gewebe isoliert und

    anschließend mittels MS analysiert. Das Protein FHL-1 wurde als das am höchsten abundante

    Protein identifiziert. Parallel durchgeführte Mutationsanalysen bestätigten 4 verschiedenen

    pathogene FHL-1-Mutationen. Diese Studie ist das erste Beispiel zum Nachweis einer

    Krankheit-verursachenden Mutation in hereditären Myopathien. In 2012 veröffentlichten

    Feldkirchner et al. eine Studie zur differentiellen Proteomanalyse von pathologischen

    Proteinaggregaten in Skelettmuskel. Hier wurden Plaques aus 6 MFM-Patienten mit

    verschiedenen Mutationen mittels LMD ausgelasert, welche mittels iTRAQ (isotope tags for

    relative and absolute quantification) quantitativ ausgewertet wurden. Es wurde deutlich,

    dass die Plaques der verschiedenen Patienten gewisse Gemeinsamkeiten in ihrer

    Zusammensetzung aufwiesen und gleichzeitig wurden mutationsbedingte Unterschiede

    deutlich wurden.

    Die proteomische Analyse von Skelettmuskulatur hat sich im Laufe der Jahre von der

    Analyse des kompletten Muskellysates hin zu einer spezifischen Analyse von definierten

    Arealen entwickelt. Die in dieser Dissertation angewendete Methodik zur Analyse von

    Filaminopathie gliedert sich optimal in die aktuelle Proteomanalyse von pathologischem

    Muskelmaterial und trägt einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis der MFM

    zugrundeliegenden molekularen Mechanismen [Kley et al. 2012, Maerkens et al. 2013].

  • Einleitung

    17

    1.5.2. Auftrennung mittels 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D PAGE)

    Die 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorse wurde in den 70er Jahren zeitgleich von

    Klose und O’Farrell [Klose 1975, O’Farrell 1975] entwickelt. In der ersten Dimension werden

    die Proteine entlang eines pH-Gradienten aufgetrennt. Hier ist zu erwähnen, dass es zwei

    etablierte Verfahren gibt: Beim Trägerampholyt-System [Klose 1975] wird der pH-Gradient

    während der isoelektrischen Fokussierung durch die Anwesenheit von Trägerampholyten

    aufgebaut. Bei der Verwendung eines immobilisierten pH-Gradienten, IPG-System,

    [Bjellqvist et al. 1982; Görg et al. 1988] ist der pH-Gradient in das Gel einpolymerisiert und

    sehr stabil. In der zweiten Dimension erfolgt die Auftrennung der Proteine anhand ihres

    Molekulargewichtes in einem SDS-Gel [Laemmli 1970]. Die 2D PAGE stellt eine exzellente

    Methode zur Analyse komplexer Proteinproben dar. Durch die Auftrennung der Proteine ist

    es möglich, eine Übersicht über das Proteom eines Organismus oder eines Gewebes zu

    bekommen [Nesterenko et al. 1994]. Mit bis zu 10000 Proteinspots ist die Auflösung der 2D

    PAGE extrem hoch [Klose et al. 1995]. Besonders gut lässt sich die 2D PAGE für hydrophile

    Proben anwenden. Membranproteine und andere hydrophobe Proteine können aufgrund

    ihrer Eigenschaften nur schwer dargestellt werden. Ähnliches gilt für die Darstellung gering

    abundanter oder extrem saurer bzw. basischer Proteine. Besonders gering abundante

    Proteine lassen sich nur schwer darstellen, da sie schnell von hoch abundanten Proteinen

    überdeckt werden. Zum anderen ist die Empfindlichkeit gängiger Färbemethoden zu gering

    um diese Proteine sichtbar zu machen. Die Einführung der Fluoreszenzfarbstoffe verbesserte

    die Möglichkeit gering abundante Proteine zu detektieren.

    1.5.3. Differentielle Proteomstudie und Quantifizierung von Proteinen

    Mittels 2D PAGE war es bereits möglich, komplexe Proben zu analysieren und

    Differenzen zwischen zwei Proben zu detektieren. Hierfür wurden die Proben über die erste

    und zweite Dimension aufgetrennt und anschließend wurde die Intensität der Spots über

    spezielle Bildprogramme ermittelt. Viele Proteinfärbemethoden, die eine Visualisierung der

    Proteine im Gel ermöglichen, u.a. Silberfärbung und Kolloidal Coomassie, eignen sich

    allerdings nur begrenzt für eine quantitative Analyse. Sie verfügen über einen zu geringen

    linearen und auch dynamischen Bereich [Marcus et al. 2009]. Hinzu kommt, dass mit

    herkömmlichen Methoden die Spots aus unterschiedlichen Gelen miteinander verglichen

    werden müssen. Dies resultiert in einer geringen Reproduzierbarkeit und eine große

  • Einleitung

    18

    technische Streuung. Die Einführung der Zwei-Dimensionalen In-Gel Elektrophorese (2D

    DIGE) erfolgte im Jahr 1997 und erhöhte die Reproduzierbarkeit und die Sensitivität der

    Methode [Ünlü et al. 1997,Marcus et al. 2009]. Die zu vergleichenden Proben werden vor

    der Auftrennung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (CyDyes™, GE Healthcare Europe

    GmbH) gelabelt. Zusätzlich wird aus allen Proben ein interner Standard hergestellt, welcher

    der Normalisierung der Spots über den Vergleich mit einem Referenzgel dient [Alban et al.

    2003]. Anschließend werden die Proben mit dem internen Standard zeitgleich mittels 2D

    PAGE aufgetrennt. So ist es möglich, die verschiedenen Gele miteinander zu vergleichen und

    die Proteinspots anhand von Spotintensitäten-Verhältniswerte zu quantifizieren. Das DIGE-

    System bietet zwei verschiedene Farbstoffe zur Auswahl: das CyDye™ minimal labeling und

    das CyDye™ Saturation labeling. Beim minimal labeling reagieren die Farbstoffe mit den Ɛ-

    Aminogruppen der Lysinreste durch Aminolyse der NHS-Ester-Bindungen. Mit dieser

    Methode werden ca. 3-5 % aller Proteine markiert, wobei in jedem Protein nur ein Lysinrest

    markiert wird. Es stehen drei Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung. Ein Farbstoff wird für den

    internen Standard verwendet, die anderen beiden werden zur Markierung der Proben

    verwendet. Dies ermöglicht es, 2 Proben und einen internen Standard pro Gel aufzutrennen.

    Beim Saturation labeling reagieren die Fluoreszenzfarbstoffe mit den Thiolgruppen der

    Cysteinreste. Die Cysteine aller Proteine werden markiert, wodurch es möglich ist, Proben

    mit sehr geringen Proteinkonzentrationen zu analysieren, die Nachweisgrenze liegt bei ca. 3

    µg Protein [Sitek et al. 2005, Helling et al. 2006]. Wie beim minimal labeling gibt es auch hier

    einen Farbstoff zum Markieren des internen Standards. Ein weiterer Farbstoff steht zur

    Markierung einer Probe zur Verfügung. Das Spotmuster ist allerdings nicht mit einem

    ungefärbten Spotmuster vergleichbar, da die Anzahl an Cysteinresten in den Aminosäure der

    einzelnen Proteine variiert und somit die Proteinmasse unterschiedlich beeinflusst wird. Ein

    Nachteil der Methode ist, dass Proteine, die keine Cysteine enthalten, nicht dargestellt

    werden können und in einer differentiellen Studie nicht berücksichtigt werden. Im Anschluss

    an die zweidimensionale Auftrennung werden die Gele über einen Fluoreszenzscanner

    digitalisiert. Die Verwendung einer speziellen Auswertesoftware ermöglicht die Detektion

    und Quantifizierung der einzelnen Spots.

  • Einleitung

    19

    1.6. Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)

    Es bestehen zwei Möglichkeiten ein Peptidgemisch zu analysieren. Zum einen kann

    das Gemisch direkt in ein Massenspektrometer injiziert werden. Zum anderen ist es möglich,

    das Gemisch zunächst über ein chromatographisches Verfahren aufzutrennen. In den

    häufigsten Fällen wird hier die Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed-Phase

    Chromatography, RT-HPLC) verwendet [Steen et al. 2004]. Im Gegensatz zur Normalphasen-

    Chromatographie (NP-HPLC), welche die Analytmoleküle aufgrund ihrer unterschiedlichen

    Polarität auftrennt, ist hier die stationäre Phase der RT-HPLC apolar bzw. hydrophob. Die

    Moleküle werden in umgekehrter Elutionsreihenfolge nach ihrer Hydrophobizität getrennt.

    Die hydrophobsten Peptide werden als letztes von der Säule eluiert. In der Regel wird

    Acetonitril mit ansteigendem Gradienten zur Elution der Peptide verwendet. In einem

    nächsten Schritt werden die eluierten Peptide mittels Online-Kopplung ins

    Massenspektrometer geleitet. Dieses Vorgehen ermöglicht die Konzentrierung niedrig-

    abundanter Peptide sowie das Trennen unterschiedlicher Peptide.

    1.7. Massenspektrometrie

    Die Massenspektrometrie gehört heute zu den bedeutendsten Methoden in der

    Peptid- und Proteinanalytik. Die Entwicklung dorthin dauerte allerdings viele Jahre, da es

    lange lediglich möglich war kleine, organische Moleküle mittels Massenspektrometrie zu

    analysieren. Dies änderte sich mit der Etablierung von Matrix-unterstützte Laser

    Desorption/Ionisation (MALDI) und Elektrosprayionisation (ESI) als Ionisierungstechniken in

    den 80er Jahren [Karas und Hillenkamp 1988, Fenn et a. 1989]. Von diesem Zeitpunkt an

    gelang es große, organische Moleküle aus dem Festzustand (mittels MALDI) oder

    Flüssigzustand (mittels ESI) in die Gasform zu überführen und anschließend zu ionisieren.

    Ein Massenspektrometer besteht aus folgenden Hauptkomponenten: der

    Ionenquelle, einem Massenanalysator und einem Detektor. Im Massenanalysator werden

    die Massen nach ihrem Masse/Ladungsverhältnis (m/z) aufgetrennt. Der Detektor zeichnet

    die Anzahl der entsprechenden Ionen auf. Am Ende einer Messung erhält man ein

    Massenspektrum, das die Intensität der detektierten Ionen gegen den m/z-Wert aufzeigt

  • Einleitung

    20

    [Aebersold et al. 2003]. In den meisten Fällen sind Massenspektrometer, mit Ausnahme des

    MALDI, mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (high performance liquid

    chromatography, HPLC) gekoppelt.

    Abbildung 1.7.: Schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus von Massenspektrometern

    In der vorliegenden Arbeit sollten Proteine aus flüssigem Material wie auch aus

    Gelspots identifiziert werden. Die in Lösung vorliegenden Proben werden mittels In-Lösung-

    Verdau für die massenspektrometrische Analyse vorbereitet. Zur Identifizierung

    differentieller Proteinspots aus 2D-Gelen werden diese aus der Gelmatrix herausgestanzt

    und im Gel verdaut. In beiden Fällen werden die Proteine mit Hilfe der am häufigsten

    verwendeten Endoprotease Trypsin, welche spezifisch am C-terminalen Ende bevorzugt

    Arginin und Lysin schneidet, in Peptide gespalten [Steen et al 2004]. Von den extrahierten

    Peptiden werden in der massenspektrometrischen Analyse MS/MS-Spektren aufgenommen.

    Um Peptidsequenzen aufnehmen zu können und diese anschließend einem Protein

    zuordnen zu können, müssen die Peptide zunächst fragmentiert werden. Dafür werden

    Ionenmassen eines bestimmten Massenbereichs ausgewählt. Diese Massen werden als

    Precursor bezeichnet. Die Precursor werden dann einer Fragmentierung unterzogen, in den

    meisten Fällen handelt es sich um die Fragmentierung mittels CID (collison induced

    dissociation). Die Fragmentierung mittels ETD (electron transfer dissociation) wird vor allem

    für die Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen verwendet. Die daraus

    resultierenden Massenspektren lassen Rückschlüsse auf die Peptidsequenz zu. Die

    generierten Massenspektren werden in einem nächsten Schritt in Proteindatenbänke

    geladen, welche auf der Zusammenfassung aller bekannten und vorhersehbaren

    Proteinsequenzen basieren. Die darin enthaltenden MS/MS-Spektren resultieren auf dem

  • Einleitung

    21

    theoretischen Verdau von Proteinen. Die Identifizierung der Proteine erfolgt durch den

    Abgleich mit diesen theoretisch verdauten Proteinen und deren theoretisch generierten

    MS/MS-Spektren. Mit Hilfe von speziellen Suchalgorithmen werden die Spektren

    miteinander verglichen und deren Übereinstimmung errechnet. Zu den häufigsten

    Algorithmen gehören MASCOT und Sequest [Yates et al. 1995, Perkins et al. 1999].

    1.7.1. Ionenquellen

    Die Ionenquelle ist ein elementarer Bestandteil eines Massenspektrometers. In der

    Ionenquelle werden die Analyt-Moleküle durch Zufuhr von Energie in gasförmige Ionen

    umgewandelt. Für die Ionisierung von Molekülen sind vor allem zwei Methoden von

    Bedeutung: die Elektrospray-Ionisation (ESI) [Fenn et al. 1989] und die Matrix-assisted

    Desorption/Ionisation [Karas et al. 1988].

    1.7.1.1. Elektrospray-Ionisation (ESI)

    Bei der Elektrospray-Ionisation werden die in Lösung vorliegenden Analyt-Moleküle

    über eine Kapillare in ein elektrisches Feld geleitet [Fenn et al. 1989, Steen et al. 2004]. Die

    Kapillare dient hier als Elektrode und der Massenanalysator wird als Gegenelektrode

    eingesetzt. Es ist möglich, die Polaritäten der Elektroden anzupassen und je nach

    Versuchsaufbau Anionen oder Kationen zu messen. Folglich ist es möglich, Messung in

    einem Positiv- oder Negativmodus durchzuführen. In Abbildung 1.8. ist der Positivmodus

    schematisch dargestellt. Die in Lösung vorliegenden Ionen bewegen sich aufgrund ihrer

    Ladung im elektrischen Feld zur Gegenelektrode. An der Oberfläche des Flüssigkeitsstroms

    entstehen positive Ladungen. Dies führt zur Bildung des sogenannten Taylor-Konus. In

    ausreichendem Abstand zur Gegenelektrode wird der Taylor-Konus zunehmend instabil,

    positiv geladene Tröpfchen entstehen. Durch den Einstrom eines neutralen Trägergases

    (Stickstoff) werden die Lösungsmittelmoleküle verdampft. Dadurch erhöht sich die

    Ladungsdichte an der Oberfläche der Tröpfchen. Die immer stärker werdende Abstoßung

    zwischen den Teilchen führt zur Coulombexplosition. Die Tröpfchen zerfallen am Rayleigh-

    Limit in viele kleine Tröpfchen mit positiver Nettoladung. Als Ergebnis weiterer

    Desolvatisierungen entstehen letztendlich freie, gasförmige mehrfach geladene Ionen [Irbani

    und Thompson 1976]. Im Anschluss an die ESI erfolgt meist die Weiterleitung an ein triple-

    Quadrupol-Instrument oder eine Ionenfalle [Aebersold und Mann 2003]. Für die

  • Einleitung

    22

    massenspektrometrische Analyse des humanen Muskelgewebes sowie der murinen

    Myoblasten wurde eine LTQ Orbitrap verwendet. Das Funktionsprinzip der der LTQ Orbitrap

    im speziellen wird im Punkt 1.6.5. beschrieben.

    Abbildung 1.8.: Schematische Darstellung der Elektrospray-Ionisation (ESI), modifiziert nach Cech und Enke

    2001

    Die Elektrospray-Ionisation wird dazu verwendet aus organischen und anorganischen Substanzen

    Ionen zu erzeugen und diese mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Die in der Lösung

    vorhandenen Ionen bewegen sich aufgrund ihrer Ladung zu der entgegengesetzten Elektrode. Es bildet

    sich ein Überschuss an Ionen mit gleicher Ladung. Dieser Zustand wird als Taylor-Konus bezeichnet.

    Durch gezieltes Einströmen von Stickstoff wird die Verdampfung des Lösungsmittels verstärkt,

    wodurch die Tröpfchengröße sich im gleichbleibenden elektrischen Feld verringert. Die Dichte des

    elektrischen Feldes steigt auf der Oberfläche der Tröpfchen bis hin zur Stabilitätsgrenze (Raleigh-

    Limit). Beim Überschreiten der Grenze zerfallen die Tröpfchen aufgrund ihrer Ladung in noch kleinere

    Tröpfchen. Der Zerfall wird als Coulomb-Explosion bezeichnet. Letztendlich entstehen aus sehr kleinen

    Tröpfchen (wenige Nanometer groß) Ionen, die dann in den Masseanalysator geleitet werden.

    1.7.1.2. Matrix-assisted Desorption/Ionisation (MALDI)

    MALDI beruht auf einer Entwicklung von Karas und Hillenkamp aus dem Jahre 1988

    [Karas und Hillenkamp 1988]. Das Peptidgemisch wird auf einem metallischen Probenträger

    mit einer im Überschuss vorliegenden speziellen Matrix ko-kristallisiert. In den meisten

    Fällen wird für die Peptidanalystik als Matrix alpha-Cyano-4-Hydroyzimtsäure oder 2,5-

    Dihydroxybenzoesäure (DHB) verwendet. Im Hochvakuum der Ionenquelle wird die Probe

    Laserpulsen ausgesetzt. Die Energie wird von der Matrix absorbiert. Nach der Relaxation im

    Kristallgitter werden explosionsartig Analyt- und Matrixmoleküle von dem Probenträger

    abgelöst und ionisiert [Karas und Hillenkamp 1988]. Im Gegensatz zum ESI-Verfahren

    entstehen hier hauptsächlich einfach geladene Ionen. Der Desorptions- und

  • Einleitung

    23

    Ionierungsprozess konnte bis heute nicht komplett aufgeklärt werden, die Optimierung der

    analytischen Protokolle basiert zum größten Teil auf empirischen Daten [Karas et. al., 2000].

    Die MALDI-Analyse eignet sich besonders gut zur Analyse wenig komplexer Proben, wie z.B.

    2D Gelspots.

    1.7.2. Masseanalysatoren

    Zu den am häufigsten eingesetzten Masseanalysatoren gehören u.a. der Time-of-

    Flight (TOF), die Ionenfalle und die Orbitrap. Zusätzlich werden auch noch Quadrupole und

    das Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR) verwendet. Im Masseanalysator

    werden die zuvor in der Ionenquelle erzeugten und beschleunigten Ionen nach

    Masse/Ladungsverhältnis (m/z) getrennt. Die verschiedenen Masseanalysatoren werden in

    der Regel mit den Ionenquellen gekoppelt. Die gängigste Kombination des MALDI ist der

    TOF-Analysator. Bei der ESI existiert eine größere Vielfalt. In den meisten Fällen wird aber

    eine Kombination aus ESI und Ionenfallen- oder Quadrupol-Analysatoren verwendet.

    1.7.2.1. Time of Flight (TOF)

    MALDI-Massenspektrometer werden in der Regel mit Flugzeit-Massenanalysatoren

    (engl. Time-of-flight) gekoppelt. Die Analyt-Ionen durchlaufen eine feldfreie Strecke, in der

    die sie gemäß ihres m/z-Verhältnis aufgetrennt werden. Es wird davon ausgegangen, dass

    die Teilchen mit gleicher kinetischer Energie auf unterschiedlichen Geschwindigkeiten

    beschleunigt werden, wenn sie unterschiedliche Massen besitzen [Abersold et al. 2003].

    Sofern die Beschleunigungsspannung sowie die Länge der feldfreien Driftstrecke bekannt

    sind, ist es möglich m/z für jedes Teilchen abhängig von der Flugzeit zu ermitteln.

    1.7.2.2. Ionenfalle

    Bei der Ionenfalle werden zwei Arten unterschieden: die 3D-Ionenfalle und die

    lineare Ionenfalle (2D-Ionenfalle) [Aebersold et al. 2003]. In der 3D-Ionenfalle wird ein

    zeitlich veränderliches elektromagnetisches Feld verwendet, um die Ionen festzuhalten und

    anschließend gezielt auszustoßen. Die 3D-Ionenfalle besteht aus einer Ringelektrode, einer

    Eintritts- und einer Endkappenelektrode. An die Ringelektrode wird eine hochfrequente

    Wechselspannung angebracht, durch die ein elektrisches Feld im Inneren der Falle erzeugt

    wird und die Ionen auf stabile Bahnen geleitet werden. Nach einer definierten Zeitspanne

  • Einleitung

    24

    wird die hochfrequente Wechselspannung variiert. Dies hat zur Folge, dass die Bahnen der

    Ionen destabilisiert werden. Über die Endkappenelektrode werden die Ionen selektiv nach

    ihrem m/z-Verhältnis aus der Ionenfalle zum Detektor geleitet. Die lineare Ionenfalle setzt

    sich aus insgesamt vier hyperbolischen Metallstäben (Quadrupolstäbe) zusammen und durch

    die Anordnung der Stäbe ergibt sich ein zweidimensionales elektrisches Feld. Die jeweils

    gegenüberliegenden Stäbe bilden ein Paar und besitzen das gleiche Potential. An den

    jeweiligen Paaren liegen eine entgegengesetzte Gleichspannung und eine um 180° versetzte

    Wechselspannung an. In Abhängigkeit von der Amplitude und der Frequenz der

    Wechselspannung bewegen sich Ionen mit definiertem m/z-Verhältnis auf stabilen Bahnen

    [Paul 1989, Paul and Raether 1995]. Alle anderen Ionen bewegen sich auf instabilen Bahnen.

    Die lineare Ionenfalle verfügt über zwei seitliche Öffnungen, über die Ionen bei Änderung

    des elektrischen Potentials ausgschleust und zum Detektor geführt werden können [Mann et

    al. 2001]. Im Gegensatz zu der 3D-Ionenfalle besitzt die lineare Ionenfalle eine höhere

    Kapazität, welches es ermöglicht mehr Ionen zu fangen und zu speichern [Aebersold et al.

    2003]. Aufgrund der beiden seitlichen Öffnungen ist es zusätzlich möglich, eine höhere

    Anzahl an Ionen zu detektieren.

    1.7.2.3. Orbitrap

    Die Orbitrap gehört zu den modernsten Massenanalysatoren. Das Analysatorkonzept

    basiert auf den Arbeiten von Alexander Makarov [Makarov 2000] und wurde vor 20 Jahren

    entwickelt. Die Orbitrap ist eine Ionenfalle, in der die gasförmigen Ionen in einem

    elektrostatischen Feld gefangen werden. In der Ionenfalle befindet sich zentral eine

    spindelförmige Elektrode. Sobald der Ionenstrahl in die Orbitrap geleitet wird, bewegen sich

    die Ionen aufgrund der elektrostatischen Anziehungskraft auf Kreisbahnen (Orbitalen) um

    die Elektrode. Gleichzeitig wird eine z-axiale Oszillation der Ionen beobachtet, welche von

    zwei äußeren Elektroden detektiert wird [Scigelova und Makarov, 2006]. Die Frequenz der

    harmonischen Oszillation ist umgekehrt proportional zur Quadratwurzel von m/z [Hu et al.

    2005, Yates et al. 2006]. Es ist möglich, die angelegten Spannungen an den Elektroden zu

    ändern umso unterschiedliche Massen detektieren zu können. Die detektierten Signale

    werden verstärkt und mittels Fourier Transformation in Frequenzspektren umgewandelt,

    woraus letztendlich durch Zweipunktkalibrierung Massenspektren entstehen. Die Orbitrap

    bietet eine hohe Massengenauigkeit, eine hohe Auflösung sowie einen hohen dynamischen

  • Einleitung

    25

    Bereich und eine hohe Sensitivität [Makarov et al. 2006 und Makarov et al. 2006].

    Abbildung 1.9.: Querschnitt des Orbitrap-Massenanalysators, modifiziert nach Thermo Scientific

    Die Ionen werden im elektrischen Feld gefangen. In der Ionenfalle befindet sich eine spindelförmige

    Elektrode (A). Die Ionen gelangen radial in die Orbitrap und bewegen sich aufgrund der

    elektrostatischen Anziehungskraft auf Kreisbahnen um die Zentralelektrode. Gleichzeitig oszillieren die

    Ionen um die z-Achse. Die Außenelektrode (B) besteht aus zwei Teilen, die durch einen Keramikring (C)

    isoliert werden.

    In Abbildung 1.10. Ist der schematische Aufbau der LTQ Orbitrap Velos von Thermo Fisher

    (Schwerte, Deutschland) dargestellt. Sie besteht aus einer linearen Ionenfalle (LTQ) und

    einer C-Trap, die die LTQ und die Orbitrap miteinander verbindet. Das ionisierte

    Peptidgemisch erreicht das Massenspektrometer in Gasform. Über mehrere Multipole

    werden die Ionen transferiert und in einem Ionenstrahl fokussiert. Dabei durchqueren die

    Ionen eine Pumpstrecke, in der stufenweise ein Hochvakuum aufgebaut wird. Dann

    gelangen die Ionen in die lineare Ionenfalle. Daraufhin werden die Ionen aus der Falle

    herausgeschleust und in die C-Trap geleitet. Die hier fokussierten Ionen werden gebündelt in

    die Orbitrap überführt. In der Orbitrap werden dann die Precursor-Massen detektiert und

    die MS-Spektren generiert. Die intensivsten Precursor-Massen werden über die C-Trap

    zurück in die LTQ übermittelt. Durch Anlegen einer hochfrequenten Wechselspannung an

    den Ringelektroden wird erreicht, dass sich die Ionen mit entsprechenden Precursor-Massen

    aus dem ankommenden Ionenstrahl gesammelt werden und sich in stabilen Bahnen

    bewegen. Nach einer definierten Zeit werden die elektrischen Potentiale an den

    Ringelektroden geändert, die Bahnen der Ionen werden instabil. Die Ionen werden aus der

    Ionenfalle herausgeschleust und über die C-Trap in die Kollisionszelle geleitet. Die dort

    fragmentierten Ionen gelangen dann in die Orbitrap, in der die MS/MS-Spektren generiert

    werden. Die Orbitrap verfügt über eine sehr hohe Massengenauigkeit und gleichzeitig eine

    hohe Massenauflösung. Die Messung von Pepidionen bei hoher Auflösung benötigt längere

  • Einleitung

    26

    Zeit. Aufgrund der integrierten LTQ ist es möglich, zeitgleich zur MS-Generierung in der

    Orbitrap MS/MS-Spektren in der LTQ zu erstellen.

    Abbildung 1.10.: Schematischer Aufbau der LTQ Orbitrap Velos™, modifiziert nach Thermo Fisher

    Nachdem die Ionen mittels ESI ionisiert worden sind, werden sie in die C-förmige C-Trap geleitet. Dort

    werden die Ionen gesammelt. Anschließend werden die gebündelten Ionen in die Orbitrap geleitet,

    um dort die Precursor Massen zu detektieren. Die Ionen werden tangential in das elektrische Feld

    geleitet. Aufgrund des elektrischen Feldes können einige Ionen in festen ringförmigen Bahnen um die

    innere Elektrode kreisen. Diese harmonischen Schwingungen sind umgekehrt proportional zu der

    Quadratwurzel von m/Z. Die Änderung der angelegten elektrischen Spannung ermöglicht die

    Detektion von Ionen unterschiedlicher Massen. Die Massen der einzelnen Precursor-Massen werden

    ausgelesen und die am intensivsten gemessenen Massen werden über die C-Trap an die lineare

    Ionenfalle geleitet. Die Ionen erreichen allerdings nicht alle gleichzeitig die LTQ, sondern werden nach

    Masse getrennt und nacheinander in die LTQ abgegeben. Die in die LTQ geleiteten Massen werden

    über den Einstrom vom Helium über CID fragmentiert. Die Massen der fragmentierten Ionen werden

    gemessen und die entsprechenden MS/MS-Spektren generiert. Das Auswählen der Precursor-Massen

    und das Fragmentieren der Ionen kann aufgrund der Kopplung von LTQ und Orbitrap parallel

    durchgeführt werden.

    1.7.2.4. Fragmentierung der Peptidonen

    In der Massenspektrometrie werden zwei generelle Fragmentierungsarten

    unterschieden. Die Fragmentierung der Peptide erfolgt mittels stoßinduzierter Kollision

    (engl. Collison-induced dissociation, CID) durch niederenergetische Stöße mit einem

    Kollisionsgas wie z.B. Helium, Argon oder Stickstoff [Stehen et al. 2004]. Die Kollision der

    Moleküle ruft spezifische Bindungsbrüche im Peptidgerüst hervor. Durch den Bruch der

    Amidbrücken entstehen hauptsächlich N-terminale y-Ionen und C-terminale b-Ionen

    [Roepstorff and Fohlman. 1984, Biemann et al. 1990]. Eine Alternative zur CID stellt die

  • Einleitung

    27

    Elektronen Captur Dissoziation (ECD) dar. Die ECD wurde 1998 von Zubarev et al. eingeführt

    [Zubarev et al. 1998]. Die ECD basiert auf der Freisetzung der elektrischen, potenziellen

    Energie, die bei Aufnahme eines Elektrons entsteht [Zubarev et al. 1998]. Die

    Fragmentierung erfolgt zwischen der Amidgruppe und des alpha-Kohlenstoffatoms der

    Peptidbindung. So entstehen c- und z-Ionen. Anhand dieses Fragmentierungsmusters lassen

    sich Phosphorylierungen lokalisieren [Stensballe et al. 2000]. Die Anregung der Elektronen

    erfordert ein statisches Magnetfeld und beschränkt so die Anwendung der ECD auf FT-ICR-

    Massenspektrometern [Thingholm et al. 2009]. Um eine ähnliche Fragmentierung auch für

    andere Massenspektrometer nutzbar zu machen, wurde die ETD eingeführt. Die

    Elektronentransferdissoziation (ETD) stellt eine Weiterentwicklung [Syka et al. 2004] der ECD

    dar. Hier wird ein Anion mit geringer Elektronenaffinität zur Fragmentierung verwendet. Die

    niedrigenergetische CID ist die am häufigsten angewendete Methode zur Fragmentierung

    von Ionen. Allerdings eignet sie sich nur bedingt zur Charakterisierung von

    posttranslationalen Modifikationen.

    1.8. Quantitative Massenspektrometrie

    Eine quantitative Auswertestrategie bietet die Möglichkeit Unterschiede in der

    Synthese verschiedener Proteine zwischen zwei Proben zu ermitteln. Hierfür wird die

    massenspektrometrische Analyse mit der quantitativen Auswertung kombiniert. Es gibt

    verschiedene Ansätze, um dies zu erreichen, das Labeln der Proben durch Isotopen-

    Markierung [Gygi et al. 1999, Ong et al. 2005] oder Label-freie Methoden [Neilson et al.

    2011]. Generell wird zwischen relativer und absoluter Quantifizierung unterschieden.

    1.8.1. Isotopen-Labelling

    Das Isotopen-Labeling ist eine der am häufigsten angewendeten Methoden zur Gel-

    freien Analyse. Es wird zwischen chemischen, enzymatischen und metabolischen Strategien

    unterschieden. Die Verwendung des Isotopen-Labelings hat den Nachteil, dass es sehr teuer

    ist und die Gefahr eines nicht vollständigen Labelns besteht [Hamacher et al. 2011]. 1999

    wurde das sogenannte ICAT (isotope coded affinity tag) entwickelt [Gygi et al 1999]. Diese

    Methode richtet sich spezifisch gegen die SH-Gruppen der Cysteine. Die Proben werden mit

  • Einleitung

    28

    einem Isotopen-gelabelten Affinitätstag gekoppelt, welches eine leichte (12C) oder schwere

    (13C) C-Atome enthält. Um zwei Proben differentiell miteinander vergleichen zu können, wird

    die eine Probe mit schweren bzw. leichten C-Atomen markiert. Anschließend werden die

    Proben miteinander vermischt, enzymatisch verdaut und massenspektrometrisch analysiert.

    Der größte Nachteil dieser Methode ist, dass nicht alle Proteine über Cysteinreste verfügen

    und so nur ein Teil der Proteine quantifiziert werden können. Des Weiteren kann nur ein

    geringer Teil der Sequenz ermittelt werden [Bantscheff et al. 2007]. Dies führt dazu, dass

    Informationen über potentielle posttranslationale Modifikationen oder Proteinisoformen

    verloren gehen. Ross und Thompson führten zwei weitere Methoden zum chemischen

    Labeln ein: iTRAQ (isotope tags for relative and absolute quantification) und TMT (tandem

    mass tagging) [Thompson et al. 2003, Ross et al. 2004]. Mit iTRAQ und TMT können Proteine

    wie auch Peptide mit verschiedenen Tags, die die gleiche Masse besitzen und als

    Reporterionen fungieren, markiert werden. iTraq sowie TMT bieten die Möglichkeit

    gleichzeitig mehrere Proben relativ und absolut zu quantifizieren [Aggarwal et al. 2006,

    Bantscheff et al. 2008]. Allerdings lassen sich mit diesen beiden Methoden keine komplexen

    Proben analysieren. Hinzu kommt die Einschränkung bei der Wahl des

    Massenspektrometers. Aufgrund der sehr geringen Masse der Reporterionen eignen sich nur

    sehr sensitive Geräte (z.B. LTQ Orbitrap) [Bantscheff et al. 2008].

    ICPL (isotope coded protein label) basiert auf dem isotopen Labeln aller freien

    Aminosäuren in Proteinen [Schmidt et al. 2005]. Die Proteine in zwei verschiedenen Proben

    werden zunächst extrahiert, alkyliert und dann entweder mit Isotopen-freien ICPL (leicht)

    oder der dem ICPL-tag (schwer) markiert. Um die Komplexität des Proteingemisches zu

    verringern wird dieses über eine 1D PAGE aufgetrennt. Nach dem enzymatischen Verdau der

    Proteine können in der massenspektrometrischen Analyse aufgrund der schweren und

    leichten Peptide Unterschiede detektiert werden. Mit dieser Methode ist es möglich, hoch

    komplexe Proben zu analysieren und zu quantifizi