Etablierung und Validierung eines kombinierten Verfahrens ... · PDF fileAus dem Institut...

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  • Aus dem Institut für

    Hygiene und Technologie der Lebensmittel tierischen Ursprungs

    der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians-Universität München

    Lehrstuhl: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Dr. h.c. A. Stolle

    Etablierung und Validierung eines kombinierten Verfahrens aus kulturellen Methoden und der PCR zum Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica in Lebensmitteln

    Inaugural-Dissertation

    zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde

    der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians-Universität München

    von

    Christine Knödl

    aus Annweiler am Trifels

    München 2008

  • Gedruckt mit Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians-Universität München

    Dekan: Univ.-Prof. Dr. Braun

    Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Dr. h.c. Stolle

    Korreferent: Univ.-Prof. Dr. Kienzle

    Tag der Promotion: 18. Juli 2008

  • INHALTSVERZEICHNIS 3

    INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................6

    EINLEITUNG............................................................................................................................9

    LITERATURÜBERSICHT.......................................................................................................10

    1 Yersinia enterocolitica ...................................................................................................10

    1.1 Systematik und Eigenschaften ...............................................................................10

    1.2 Pathogenität ...........................................................................................................13

    1.3 Yersinia enterocolitica-Infektionen..........................................................................16

    1.3.1 Yersinia enterocolitica-Infektionen bei Menschen...........................................16

    1.3.2 Yersinia enterocolitica-Infektionen bei Tieren .................................................17

    1.4 Yersinia enterocolitica in Lebensmitteln .................................................................20

    2 Nachweismethoden für Yersinia enterocolitica .............................................................23

    2.1 Kulturelle Nachweismethoden ................................................................................23

    2.1.1 Anreicherung von Yersinia enterocolitica........................................................23

    2.1.2 KOH-Behandlung ............................................................................................24

    2.1.3 Isolierung von Yersinia enterocolitica..............................................................24

    2.1.4 Biochemische und serologische Identifizierung von Yersinia enterocolitica ...25

    2.1.5 Prüfung auf Pathogenität ................................................................................26

    2.2 Molekularbiologische Nachweismethoden..............................................................28

    2.2.1 Polymerase Chain Reaction............................................................................28

    2.2.2 Kolonie-DNA-Hybridisierung ...........................................................................34

    3 Normen bezüglich des Nachweises von Yersinia enterocolitica ...................................35

    3.1 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren L 00.00-90 Horizontales

    Verfahren zum Nachweis von präsumtiv pathogenen Yersinia enterocolitica........36

    3.2 Nordic Committee on Food Analysis Nr. 163, 1998

    Pathogenic Yersinia enterocolitica. PCR methods for detection in foods ..............39

    3.3 Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln – Polymerase-Kettenreaktion

    (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln...........41

    3.3.1 DIN EN ISO 22174:2005 Allgemeine Anforderungen und Begriffe.................41

    3.3.2 DIN EN ISO 20837:2006 Anforderungen an die Probenvorbereitung für den

    qualitativen Nachweis .....................................................................................42

    3.3.3 DIN EN ISO 20838:2006 Anforderungen an Amplifikation und Nachweis bei

    qualitativen Verfahren .....................................................................................42

    4 Validierung mikrobiologischer Verfahren ......................................................................44

    EIGENE UNTERSUCHUNGEN .............................................................................................51

    5 Material .........................................................................................................................51

    5.1 Probenmaterial .......................................................................................................51

  • INHALTSVERZEICHNIS 4

    5.1.1 Zur In house-Validierung eingesetztes Probenmaterial ..................................51

    5.1.2 Untersuchte Lebensmittelproben ....................................................................51

    5.2 Mikroorganismenstämme .......................................................................................52

    5.3 Arbeitsmaterial........................................................................................................52

    6 Methoden ......................................................................................................................53

    6.1 Verfahren zum Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica.........................54

    6.2 In house-Validierung des Verfahrens zum Nachweis von pathogenen Yersinia

    enterocolitica ..........................................................................................................65

    6.2.1 Überprüfung der Inklusivität und der Exklusivität des PCR-Screenings .........65

    6.2.2 Verfahrensvergleichsuntersuchung.................................................................68

    6.2.3 Bestimmung der Nachweisgrenze ..................................................................72

    6.3 Anwendung des Verfahrens zum Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica

    zur Untersuchung der Proben ................................................................................73

    ERGEBNISSE........................................................................................................................75

    7 Ergebnisse der In house-Validierung............................................................................75

    7.1 Ergebnisse der Überprüfung der Inklusivität und der Exklusivität des PCR-

    Screenings .............................................................................................................75

    7.2 Ergebnisse der Verfahrensvergleichsuntersuchung...............................................76

    7.2.1 Anwendungsbereich und Überblick.................................................................76

    7.2.2 Überprüfung der Eignung der PCR als Screening-Verfahren .........................78

    7.2.3 Vergleich des kulturellen Nachweises des eigenen Verfahrens mit dem

    amtlichen Verfahren L 00.00-90 nach § 64 des Lebensmittel- und

    Futtermittelgesetzbuches ................................................................................79

    7.3 Ergebnisse der Bestimmung der Nachweisgrenze.................................................82

    8 Ergebnisse der Untersuchung der Lebensmittelproben................................................86

    8.1 Ergebnisse des PCR-Screenings ...........................................................................86

    8.2 Ergebnisse des kulturellen Nachweises .................................................................89

    8.3 Ergebnisse des PCR-Screenings und des kulturellen Nachweises im Vergleich...94

    DISKUSSION .........................................................................................................................96

    9 Aufbau des Verfahrens zum Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica ..........96

    10 In house-Validierung .....................................................................................................99

    10.1 Inklusivität und Exklusivität .....................................................................................99

    10.2 Verfahrensvergleichsuntersuchung ......................................................................100

    10.3 Nachweisgrenze ...................................................................................................102

    11 Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica in Lebensmittelproben .................104

    11.1 PCR-Screening.....................................................................................................104

    11.2 Kultureller Nachweis.............................................................................................105

  • INHALTSVERZEICHNIS 5

    11.3 Vergleich des PCR-Screenings und des kulturellen Nachweises.........................107

    ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................109

    SUMMARY...........................................................................................................................111

    ANHANG..............................................